JP5138851B2 - 触媒的に活性な組換えメマプシンおよびその使用方法 - Google Patents

Description

【０００１】
発明の背景
本発明は、アルツハイマー病の治療および／または予防において有用な、特異的インヒビターの設計およびスクリーニングにおける触媒的に活性なメマプシン２（Ｍｅｍａｐｓｉｎ ２）（ベータ−セクレターゼ）の発現およびその使用の分野に関する。
【０００２】
アルツハイマー病（ＡＤ）は、認識能力が著しく低下し汎発性痴呆を有する患者の１人を調べたアリオス・アルツハイマー（Ａｌｉｏｓ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ）によって１９０７年に最初に記載された脳の変性障害である（Ｔｈｅ ｅａｒｌｙ ｓｔｏｒｙ ｏｆ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ， Ｂｉｃｋら編（Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １９８７））。ＡＤは、高齢者の痴呆の主な原因である。ＡＤ患者は、記憶力低下、および正常な個体のように機能することができない程度にまで進行する知的機能に関して、深刻な問題を有する。知的能力の低下により、患者は、性格の変化、社会的にふさわしくない行動、および精神分裂病の様相を呈する（Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ ｔｈｅ Ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ ｏｆ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ， Ｊｏｒｍ編（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １９８７））。この不可避な神経変性に対する有効な待期的または予防的治療法がないため、ＡＤは罹患者およびその家族にとって大きな悲劇である。
【０００３】
ＡＤは、皮質、海馬、鉤状回、海馬傍回、および扁桃内の直径が２００μｍにもなる神経炎性斑（ｎｅｕｒｉｔｉｃ ｐｌａｑｕｅ）に関係している。神経炎性斑の主な構成要素の１つはアミロイドであり、これは、コンゴ レッド（Congo Red）によって染色される（Ｆｉｓｈｅｒ （１９８３）； Ｋｅｌｌｙ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｓｃｉ． １（９）：２１４−２１９（１９８４））。コンゴ レッドによって染色されたアミロイド斑は、細胞外であり、明視野においてピンク色または赤色であり、および偏光中では複屈折する。この斑は、ポリペプチド筋原線維から構成され、しばしば血管周辺に存在し、脳内の様々なニューロンへの血液供給を減少させる。
【０００４】
遺伝的素因、感染因子、毒素、金属および頭部損傷などの様々な要因は全て、ＡＤ神経細胞障害の可能なメカニズムとして提唱されてきた。有力な証拠は、ＡＤの遺伝的素因には異なるタイプが存在することを強力に裏付けている。まず、分子分析により、ＡＤ患者のいるある家族においてアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）遺伝子における突然変異の証拠が得られた（Ｇｏａｔｅら，Ｎａｔｕｒｅ ３４９：７０４−７０６（１９９１）； Ｍｕｒｒｅｌｌら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４：９７−９９（１９９１）； Ｃｈａｒｔｉｅｒ−Ｈａｒｌｉｎら，Ｎａｔｕｒｅ ３５３：８４４−８４６（１９９１）； Ｍｕｌｌａｎら，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ． １：３４５−３４７（１９９２））。早期発症ＡＤの優性形態の更なる遺伝子は第１４染色体および第１染色体上に存在する（Ｒｏｇａｅｖら，Ｎａｔｕｒｅ ３７６：７７５−７７８（１９９５）；Ｌｅｖｙ−Ｌａｈａｄら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６９：９７３−９７７（１９９５）；Ｓｈｅｒｒｉｎｇｔｏｎら，Ｎａｔｕｒｅ ３７５：７５４−７６０（１９９５））。ＡＤに関係する他の遺伝子座は、第１９染色体上にあり、アポリポタンパク質Ｅの異型をコードする（Ｃｏｒｄｅｒ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６１：９２１−９２３（１９９３））。
【０００５】
アミロイド斑は、ＡＤ患者および４０歳まで生き残っているダウン症患者において豊富に存在する。ダウン症におけるＡＰＰの過剰発現は、３０歳を超えたダウン症患者におけるＡＤの発生の原因となりうることが認識されている（Ｒｕｍｂｌｅら，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊ． Ｍｅｄ． ３２０：１４４６−１４５２（１９８９））；Ｍａｎｎら，Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ． Ａｇｉｎｇ １０：３９７−３９９（１９８９））。また斑は、数は少ないが、正常な高齢者の脳内にも存在する。これらの斑は主に、脳血管のアミロイド沈着物の中の主要なタンパク質成分でもあるアミロイドβペプチド（Ａβ；文献中においてβ−アミロイドペプチドまたはβペプチドと呼ばれることもある）（ＧｌｅｎｎｅｒおよびＷｏｎｇ，Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍ． １２０：８８５：８９０（１９８４））で構成されている。アミロイドは、β−プリーツシート状に配列される線維状物質である。Ａβは、最長で４３アミノ酸を含む疎水性ペプチドである。
【０００６】
そのアミノ酸配列の決定により、ＡＰＰ ｃＤＮＡがクローニングされた（Ｋａｎｇら，Ｎａｔｕｒｅ ３２５：７３３−７３５（１９８７）； Ｇｏｌｄｇａｂｅｒら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３５：８７７−８８０（１９８７）； Ｒｏｂａｋｉｓら，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８４：４１９０−４１９４（１９８７）； Ｔａｎｚｉら，Ｎａｔｕｒｅ ３３１：５２８：５３０（１９８８）およびゲノムＡＰＰ ＤＮＡ（Ｌｅｍａｉｒｅら，Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １７：５１７：５２２（１９８９）； Ｙｏｓｈｉｋａｉら，Ｇｅｎｅ ８７， ２５７−２６３（１９９０））。ＡＰＰ ｃＤＮＡの多くの形態が同定されており、そのうち最も豊富な３つの形態は、ＡＰＰ６９５、ＡＰＰ７５１およびＡＰＰ７７０である。これらの形態は、単一の前駆体ＲＮＡからの選択的スプライシングによって発生する。この遺伝子は１８個のエキソンを有する１７５ｋｂを超える大きさである（Ｙｏｓｈｉｋａｉら， （１９９０））。ＡＰＰは、細胞外ドメイン、膜貫通領域および細胞質ドメインを含む。Ａβは、疎水性膜貫通ドメインのすぐ外側の最長で２８個のアミノ酸と、最長で１５残基からなるこの膜貫通ドメインとで構成される。Ａβは通常、脳および他の組織（例えば心臓、腎臓および脾臓など）の中に見られる。しかしＡβ沈着物は、通常は脳内のみに豊富に見られる。
【０００７】
Ｖａｎ Ｂｒｏｅｃｋｈａｖｅｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４８：１１２０−１１２２（１９９０）は、ＡＰＰ遺伝子が２組のオランダ人家族におけるアミロイド症を伴う遺伝性脳出血（ｈｅｒｅｄｉｔａｒｙ ｃｅｒｅｂｒａｌ ｈｅｍｏｒｒｈａｇｅ ｗｉｔｈ ａｍｙｌｏｉｄｏｓｉｓ，ＨＣＨＷＡ−Ｄ）と強く関連していることを示した。これは、２人のオランダ人患者におけるＡＰＰコード領域の中の点突然変異の発見によって確認された（Ｌｅｖｙら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４８：１１２４−１１２８（１９９０））。この突然変異は、Ａβの２２番目（ＡＰＰ６９５の６１８番目、またはＡＰＰ７７０の６９３番目）のグルタミン酸をグルタミンに置き換えたものであった。さらに、ある家族は、全長タンパク質の７１７番目にアミノ酸置換をもたらす突然変異により、アルツハイマー病に遺伝的にかかり易い（家族性アルツハイマー病（ＦＡＤ）とも呼ばれる症状）（Ｇｏａｔｅら，（１９９１）；Ｍｕｒｒｅｌｌら（１９９１）；Ｃｈａｒｔｉｅｒ−Ｈａｒｌｉｎら（１９９１））。これらの突然変異は、その家族において病気と一致分離し（ｃｏ‐ｓｅｇｒｅｇａｔｅ）、後期発症ＡＤを有する家族においては存在しない。７１７番目のアミノ酸におけるこの突然変異は、ＡＰＰからのＡβのＡβ_1-42形態の産生量を増加させる（Ｓｕｚｕｋｉら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６４：１３３６−１３４０（１９９４））。他の突然変異形態は、全長タンパク質の６７０番目および６７１番目のアミノ酸における変化を含む（Ｍｕｌｌａｎら，（１９９２））。６７０番目および６７１番目のアミノ酸のこの突然変異により、ＡＰＰからの総Ａβ産生量が増加する（Ｃｉｔｒｏｎら，Ｎａｔｕｒｅ ３６０：６２２−６７４（１９９２））。
【０００８】
ＡＰＰは３つの部位でｉｎ ｖｉｖｏでプロセッシングされる。この証拠は、膜会合メタロプロテアーゼによるβ−セクレターゼ部位での開裂が生理現象であることを示唆している。この部位は原形質膜の内腔表面から離れたＡＰＰ１２残基の中に位置している。β−セクレターゼ部位（原形質膜の内腔表面から２８残基）とβ−セクレターゼ部位（膜貫通領域内）の切断により、４０／４２−残基β−アミロイドペプチド（Ａβ）が生成される。脳内におけるその産生および蓄積量の上昇は、アルツハイマー病の病的発生過程における中心的な事象である（概説についてはＳｅｌｋｏｅ，Ｄ．Ｊ．Ｎａｔｕｒｅ ３９９：２３−３１（１９９９）を参照されたい）。ヒト脳内に見られる他の膜タンパク質であるプレセニリン１（Ｐｒｅｓｅｎｉｌｉｎ １）は、ＡＰＰ（βセクレターゼ部位）での加水分解を制御し、それ自体が原因プロテアーゼであると考えられていた（Ｗｏｌｆｅ，Ｍ．Ｓ．ら，Ｎａｔｕｒｅ ３９８：５１３−５１７（１９９９））。プレセニリン１は一本鎖分子として発現され、その急速な分解を防ぐためには、プロテアーゼ（プレセニリナーゼ（ｐｒｅｓｅｎｉｌｉｎａｓｅ））によるそのプロセッシングが必要である（Ｔｈｉｎａｋａｒａｎ，Ｇ．ら，Ｎｅｕｒｏｎ １７：１８１−１９０（１９９６）およびＰｏｄｌｉｓｎｙ，Ｍ．Ｂ．ら，Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．Ｄｉｓ．３：３２５−３７（１９９７））。プレセニリナーゼの正体は不明である。β‐セクレターゼ部位のｉｎ ｖｉｖｏプロセッシングは、Ａβ産生における律速段階であると考えられており（Ｓｉｎｈａ，Ｓ．＆ Ｌｉｅｂｅｒｂｕｒｇ，Ｉ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９６：１１０４９−１１０５３（１９９９））、よって、有力な治療標的である。
【０００９】
アミロイド斑の形成を減少させるのに有効なインヒビターの設計は、ＡＰＰを切断して４２アミノ酸ペプチド（ＡβのＡβ_1-42形態）を生じるのに不可欠な酵素の同定にかかっている。幾つかの酵素は同定されたが、活性酵素を産生することは不可能であった。活性酵素無しでは、基質特異性を確認することも、基質特異性を決定することも、速度論や重要な活性部位残基を決定することもできない（これらは全てインヒビターの設計に必須である）。
【００１０】
メマプシン２は、ヒト脳におけるベータ−アミロイド前駆体タンパク質からのベータ−アミロイドペプチドの産生に関与する重要なプロテアーゼである、ベータ−セクレターゼであることが分かった（概説についてはＳｅｌｋｏｅ，Ｄ．Ｊ．Ｎａｔｕｒｅ ３９９：２３−３１（１９９９）を参照されたい）。現在では、ヒト脳内におけるベータ−アミロイドペプチドの蓄積がアルツハイマー病の主な原因であることは、一般的に受け入れられている。ヒトメマプシン２に対して特異的に設計されるインヒビターは、ベータ−アミロイドペプチドの形成およびアルツハイマー病の進行を阻害または減少させるものでなければならない。
【００１１】
メマプシン２は、アスパラギン酸プロテアーゼファミリーに属する。メマプシン２は、他の真核生物のアスパラギン酸プロテアーゼと相同なアミノ酸配列を有し、このファミリーに独特なモチーフを含む。これらの構造的類似性は、メマプシン２および他の真核生物のアスパラギン酸プロテアーゼが共通の触媒機構を共有することを暗示している（Ｄａｖｉｅｓ，Ｄ．Ｒ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．１９，１８９（１９９０））。アスパラギン酸プロテアーゼの最も優秀なインヒビターは、これらの酵素の遷移状態の模倣体（mimics）である。これらのインヒビターは、カルボニル基の炭素とアミド基の窒素との間の開裂された平面構造ペプチド結合が２つの四面体原子（ｔｅｔｒａｈｅｄｒａｌ ａｔｏｍ）（例えばヒドロキシエチレン［−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ₂ −］）に置きかえられた基質様構造（もとはペプスタチンの構造において発見された（Ｍａｒｃｉｎｉｓｚｙｎら，１９７６））を有する。
【００１２】
しかし、臨床使用する場合、血液脳関門を通過し且つ簡単に合成することができる小分子インヒビターとすることが好ましい。また、インヒビターは比較的製造コストが安価であり、経口投与することができるものであることが望ましい。これらの特性について数千もの化合物をスクリーニングするには、膨大な労力が必要である。アルツハイマー病を治療するためのメマプシン２インヒビターを合理的に設計するためには、メマプシン２の三次元構造、特にこのプロテアーゼの活性部位におけるインヒビターの結合様式を知ることが重要である。
【００１３】
従って、本発明の目的は、精製され組換えされた活性メマプシン２のみならず、その基質およびサブサイト特異性、ならびに重要な活性部位残基を提供することである。
【００１４】
本発明の他の目的は、メマプシン２のインヒビターを合成するための組成物および方法を提供することである。
【００１５】
本発明のさらに他の目的は、メマプシン２またはその基質と相互作用してメマプシン２による切断を阻害する組成物であって、血液脳関門（ＢＢＢ）を通過することができる組成物を提供することである。
【００１６】
従って、本発明の目的は、メマプシン２を阻害する化合物の合理的な設計およびスクリーニングのための手段を提供することである。
【００１７】
発明の概要
触媒的に活性な精製組換えメマプシン２の生産方法を開発した。触媒的に活性な該酵素の基質およびサブサイト特異性を決定した。活性酵素および触媒活性についてのアッセイは、該酵素のインヒビターについてライブラリーをスクリーニングする際に有用である。
【００１８】
基質およびサブサイト特異性情報を用いて、メマプシン２の機能を阻害することができる天然メマプシン２基質の基質アナログを設計した。この基質アナログは、メマプシン２の天然ペプチド基質に関係することが判明したペプチド配列に基づく。この基質アナログは、メマプシン２により切断されえないアミド（ペプチド）結合の少なくとも１つのアナログを含む。重要なアミノ酸残基からなる部位にアイソスター（isostere）を含む２つの基質アナログを合成する方法を開発し、基質アナログＯＭ９９−１およびＯＭ９９−２を合成した。ＯＭ９９−２は、オクタペプチドＧｌｕ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ（配列番号２８）に基づき、Ｌｅｕ−Ａｌａペプチド結合が遷移状態のアイソスターであるヒドロキシエチレン基によって置換されたものである。ＯＭ９９−２の阻害定数は組換えプロメマプシン２に対して１．６×１０^-9Ｍである。このインヒビターに結合したメマプシン２の結晶学を用いて、該タンパク質の三次元構造、ならびに結合における様々な残基の重要性を決定した。
【００１９】
この情報を当業者が用いることにより、市販されているソフトウェアプログラム、ならびに有機化学および酵素学の分野で良く知られている新しいインヒビターの設計技法を用いて、新しいインヒビターを設計することができる。例えば、インヒビターの側鎖は、阻害力を強化するために、（水素結合、疎水性相互作用、電荷相互作用、および／またはファン−デル−ワールス相互作用を介した）より強力な相互作用をもたらすように修飾することができる。このタイプの情報に基づいて、相互作用の小さな残基を新しいインヒビター設計から排除して、インヒビターの分子量を小さくしてもよい。該酵素から構造的障害を受けない側鎖を架橋して、効果的なインヒビターの立体配座を閉じ込めることができる。またこのタイプの構造は、メマプシン２の結合部位を効率的に埋めつつより良い医薬的特性を生み出すペプチド代用薬の設計を可能とする。
【００２０】
実施例は、触媒的に活性な酵素の生産、インヒビターの設計および合成、ならびに結晶構造がどのように得られたかを示す。したがって、実施例は、化合物のライブラリーを他のインヒビターについてスクリーニングするため、およびインヒビターを設計するために、本明細書中に記載される方法および物質をどのように用いるのかを示す。これらのインヒビターは、ＡＰＰの切断におけるベータ−セクレターゼメマプシン２の作用により媒介される、アルツハイマー病の予防および／または治療法において有用である。
【００２１】
発明の詳細な説明
Ｉ．触媒活性を有する組換えメマプシン２の調製
メマプシン２のクローニング及び発現
実施例１に記載のようにして、メマプシン２がクローニングされ、ヌクレオチド配列（配列番号：１）及び予測アミノ酸配列（配列番号：２）が決定された。ｃＤＮＡは、断片から構築した。ヌクレオチド配列及び推定タンパク質配列は、それぞれ配列番号：１及び２に示されている。タンパク質は、ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ Ｂｅｅｃｈａｍ ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓによるＥＰ０８５５４４４Ａ（１９９８年７月２９日公開）に記載され、後にＳｉｎｈａら，Ｎａｔｕｒｅ ４０２，５３７−５４０（１９９９年１２月）及びＶａｓｓａｒら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８６，７３５−７４１（１９９９年１０月２２日）により報告されたアスパラギン酸プロテイナーゼ２（ＡＳＰ２）と同一である。
【００２２】
プロメマプシン２は、他のヒトアスパラギン酸プロテアーゼと相同である。アラインメントによると、プロメマプシン２は、ｐｒｏ領域、アスパラギン酸プロテアーゼ領域、及びＣ末端近傍の膜貫通領域を含有する。Ｃ末端ドメインは、８０残基超の長さである。活性酵素はメマプシン２であり、そのプロ酵素がプロメマプシン２である。
【００２３】
触媒活性を有する酵素のリフォールディング（ refolding ）
基質特異性を決定し、インヒビターを設計するためには、触媒活性を有する組換え酵素を発現させる必要がある。膜貫通ドメインを含有するプロテアーゼは他には知られていない。膜貫通ドメインの存在は、これらのタンパク質の組み換え発現を、より予測しにくく、より困難なものにする。タンパク質の分泌が起こるためには、膜貫通領域の除去が必要である場合が多い。しかしながら、膜貫通領域の除去は、タンパク質の構造及び／又は機能を改変させる場合が多い。
【００２４】
出発仮定は、他のアスパラギン酸プロテアーゼと相同なメマプシン２の領域は、膜貫通ドメインの非存在下でも独立にフォールディングされ、Ｃ末端膜貫通領域の非存在下でもプロテアーゼ活性を保持しているであろうというものであった。膜貫通領域は膜アンカーとして機能すると考えられる。活性部位は膜貫通領域には存在せず、活性は膜への固定を必要としないため、実施例３に記載のようにして、大腸菌において、いずれも膜貫通領域を含まない２つの異なる長さのメマプシン２を発現させ、精製した。トランスフェクトされた細菌の培養、組換えタンパク質の合成の誘導、並びに組換えタンパク質を含有する封入体の回収及び洗浄のための手法は、Ｌｉｎら（１９９４）により記載されたものと本質的に同様である。しかしながら、リフォールディングは、単純ではなかった。２つの異なるリフォールディング法はいずれも、満足のゆく結果を生じた。いずれの方法においても、８Ｍ尿素／１００ｍＭ β−メルカプトエタノールのような強力な変性／還元溶液にタンパク質を溶解させた。タンパク質がリフォールディングされる速度及び溶液の種類が、活性にとって重要であった。一方の方法においては、タンパク質を、８Ｍ尿素／１００ｍＭ β−メルカプトエタノールに溶解させ、次いで２０容量の２０ｍＭトリス（ｐＨ９．０）で迅速に希釈し、次いで１Ｍ ＨＣｌにより徐々にｐＨ８へと調整した。次いで、リフォールディング用溶液を４℃で２４〜４８時間維持した後、精製へと進んだ。第２の方法においては、等容量の２０ｍＭトリス、０．５ｍＭ酸化型／１．２５ｍＭ還元型グルタチオン（ｐＨ９．０）を、急速に撹拌されたプロメマプシン２を含む８Ｍ尿素／１００ｍＭ β−メルカプトエタノールへと添加する。その過程を１時間間隔でさらに３回繰り返す。次いで、最終尿素濃度が０．４Ｍとなるよう、得られた溶液を十分な容量の２０ｍＭトリス塩基に対して透析する。次いで、溶液のｐＨを、１Ｍ ＨＣｌにより徐々に８．０へと調整する。
【００２５】
次いで、リフォールディングされたタンパク質を、分子量排除に基づくカラムクロマトグラフィ、及び／又は塩勾配を使用した溶出によりさらに精製し、還元条件下及び非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により分析する。
【００２６】
ＩＩ． メマプシン２の基質特異性及び酵素反応速度論
基質特異性
メマプシン２の組織分布を、実施例２に記載のようにして決定した。脳におけるメマプシン２（Ｍ２）の存在は、該メマプシン２の存在がβ−アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）を加水分解するかもしれないことを示した。下記のように、詳細な酵素的及び細胞的な研究により、Ｍ２がβ−セクレターゼとしての基準に全て合致することが証明された。
【００２７】
Ｍ２の三次構造は、Ｉ型内在性膜タンパク質としてモデル化された。モデルは、その球状プロテアーゼ単位が、膜表面から２０〜３０残基の範囲の距離で、膜に固定されたポリペプチドを加水分解しうることを示唆した。脳の膜貫通タンパク質として、ＡＰＰは、可能性のある基質であり、原形質膜表面から約２８残基に位置した、そのベータ−セクレターゼ部位は、Ｍ２によるタンパク質分解の範囲内である。
【００２８】
この部位に由来する合成ペプチド（ＳＥＶＫＭ／ＤＡＥＦＲ）（配列番号：４）は、ベータ−セクレターゼ部位（／により示されている）において、Ｍ２_pd（Ａｌａ^-8P からＡｌａ³²⁶ までのアミノ酸を含む改変Ｍ２）により加水分解された。ＡＰＰベータ−セクレターゼ部位に由来し、かつ細胞におけるアルファ−ベータ産生のレベルを上昇させることが既知（Ｃｉｔｒｏｎ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ２６０：６７２−６７４（１９９２））である「スウェーデン型変異（Ｓｗｅｄｉｓｈ ｍｕｔａｔｉｏｎ）」（Ｍｕｌｌａｎ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．２：３４０−３４２（１９９２））を含む第２のペプチド（ＳＥＶＮＬ／ＤＡＥＦＲ）（配列番号：５）は、より高い触媒効率でＭ２_pdにより加水分解された。両基質は、ｐＨ４．０において最適に分解された。プレセニリン１のプロセシング部位に由来するペプチド（ＳＶＮＭ／ＡＥＧＤ）（配列番号：６）も、比較的低効率の反応速度論パラメータでＭ２_pdにより加水分解された。ＡＰＰガンマ−セクレターゼ部位に由来するペプチド（ＫＧＧＶＶＩＡＴＶＩＶＫ）（配列番号：７）は、Ｍ２_pdにより加水分解されなかった。ペプスタチンＡによりＭ２_pdをわずかに阻害した（およそのＩＣ₅₀は約０．３ｍＭ）。反応速度論的パラメータは、プレセニリン１（ｋ_cat 、０．６７ｓ^-1；Ｋ_m 、１５．２ｍＭ；ｋ_cat ／Ｋ_m 、４３．８ｓ^-1Ｍ^-1）と天然ＡＰＰペプチド（ｋ_cat ／Ｋ_m 、３９．９ｓ^-1Ｍ^-1）との両方が、スウェーデン型ＡＰＰペプチド（ｋ_cat 、２．４５ｓ^-1；Ｋ_m 、１ｍＭ；Ｋ_cat ／Ｋ_m 、２４５０ｓ^-1Ｍ^-1）ほど優れた基質ではないことを示す。
【００２９】
Ｍ２が哺乳動物細胞におけるＡＰＰベータ−セクレターゼ機能を保持しているか否かを決定するため、メマプシン２をＨｅＬａ細胞において一過性発現させ（Ｌｉｎ，Ｘ．，ｅｔ ａｌ．，ＦＡＳＥＢ Ｊ．７：１０７０−１０８０（１９９３））、³⁵Ｓ−Ｍｅｔで代謝的にパルス標識し、次いでＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動及びイメージングの後、ＡＰＰより生成した断片の可視化のため、抗ＡＰＰ抗体により免疫沈降させた。パルスチェイス実験の順化培地（２ｈ）からの免疫沈降されたＡＰＰ Ｎβ−断片（９７ｋＤバンド）のＳＤＳ−ＰＡＧＥパターンは、ＡＰＰがＭ２により分解されたことを示した。ＡＰＰ単独でトランスフェクトされた対照、及びバフィロマイシンＡ１が添加されたＡＰＰとＭ２とによる共トランスフェクトを、実施した。ＡＰＰ βＣ−断片（１２ｋＤ）のＳＤＳ−ＰＡＧＥパターンは、前記と同じ実験の順化培地から免疫沈降させた。ＡＰＰ単独でトランスフェクトされた対照、ＡＰＰとＭ２とによる共トランスフェクト、バフィロマイシンＡ１を用いたＡＰＰとＭ２とによる共トランスフェクト、スウェーデン型ＡＰＰのトランスフェクション、並びにスウェーデンＡＰＰとＭ２とによる共トランスフェクションを実施した。免疫沈降されたＭ２（７０ｋＤ）、Ｍ２トランスフェクト細胞、長時間のフィルム感光後の非トランスフェクトＨｅＬａ細胞、及びＨＥＫ２９３細胞由来の内因性Ｍ２のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルも泳動させた。異なるＡＰＰ領域に特異的な抗体を使用した免疫沈降後に順化培地から回収されたＡＰＰ断片（１００ｋＤのベータＮ−断片及び９５ｋＤのベータＮ−断片）のＳＤＳ−ＰＡＧＥパターンは、メマプシン２がＡＰＰを切断することを示した。
【００３０】
ＡＰＰとＭ２との両方を発現する細胞は、順化培地中に９７ｋＤのＡＰＰベータＮ−断片（Ｎ末端からベータ−セクレターゼ部位まで）を産生し、細胞溶解物中に１２ｋＤのベータＣ−断片（ベータ−セクレターゼ部位からＣ末端まで）を産生した。ＡＰＰ単独でトランスフェクトされた対照は、ほとんど検出不可能なベータＮ−断片を産生し、ベータＣ−断片は産生しなかった。リソソーム／エンドソームの小胞内ｐＨを上昇させることが既知であり、かつベータ−セクレターゼによるＡＰＰ分解を阻害することが示されているバフィロマイシンＡ１（Ｋｎｏｐｓ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：２４１９−２４２２（１９９５））は、共トランスフェクト細胞におけるベータＮとベータＣとの両方のＡＰＰ断片の産生を消失させた。スウェーデン型ＡＰＰ単独でトランスフェクトされた細胞は、細胞溶解物中にベータＣ−断片バンドを産生しなかったが、スウェーデン型ＡＰＰとＭ２との共トランスフェクションは産生した。このスウェーデン型ベータＣ−断片バンドは、野生型ＡＰＰのバンドよりも強かった。９７ｋＤのベータＮ−バンドも順化培地中に見られるが、その強さは野生型ＡＰＰトランスフェクションとほぼ同等である。
【００３１】
これらの結果は、Ｍ２が、エンドソームのような酸性コンパートメントにおいて、ＡＰＰのベータ−セクレターゼ部位をプロセシングすることを示している。トランスフェクトされたＭ２遺伝子の発現を確立するため、パルス標識された細胞を溶解させ、抗Ｍ２抗体により免疫沈降させた。Ｍ２遺伝子でトランスフェクトされた細胞においては、ベータ−セクレターゼを発現することが既知のＨＥＫ２９３細胞（Ｃｉｔｒｏｎ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ２６０：６７２−６７４（１９９２））由来の主要なバンドと同一の移動度を有する７０ｋＤのＭ２バンドが見られた。また、非トランスフェクトＨｅＬａ細胞において、長いフィルム感光の後、Ｍ２の極めて希薄なバンドが見られ、このことから、Ｍ２トランスフェクションなしではベータＮ−断片及びベータＣ−断片を産生するには不十分である極めて低いレベルの内因性Ｍ２を示した。アルファ−ベータペプチドの残基１〜１７を特異的に認識する抗体アルファ−ベータ_1-17を用い、正確なベータ−セクレターゼ部位切断を確認した。ＡＰＰとＭ２とによりトランスフェクトされた細胞においては、両断片に存在するＡＰＰのＮ末端領域を認識する抗体を使用して、ベータＮ−断片とベータＮ−断片との両方が可視である。抗体Ａベータ_1-17は、非トランスフェクト細胞において内因性ベータ−セクレターゼにより産生されたベータＮ−断片を認識する。しかしながら、この抗体は、ＡＰＰとＭ２とにより共トランスフェクトされた細胞に存在することが既知のベータＮ−断片を認識することはできなかった。これらの観察は、ベータＮ−断片が、Ｍ２によるベータ−セクレターゼ部位切断の産物であり、それがアルファ−ベータ_1-17の認識エピトープを消失させたことを追認した。
【００３２】
Ｍ２によるＡＰＰのプロセシングは、２つのタンパク質の細胞内局在が予測される。ＡＰＰとＭ２とを共発現するＨｅＬａ細胞を、ＡＰＰ及びＭ２に対する抗体で染色し、１００×対物レンズを使用してＣＳＬＭにより同時に可視化した。共存の領域は、黄色で出現した。
【００３３】
ＡＰＰとＭ２との両方の共焦点顕微鏡により観察された免疫検出は、スーパーインポーズスキャンにおいて、それらの共存を明らかにした。両タンパク質の分布は、リソソーム／エンドソームコンパートメントにおけるそれらの存在と一致する。
【００３４】
特異性研究において、Ｍ２_pdが、活性化後１６ｈのインキュベーション中に、そのｐｒｏペプチド（２部位）及びプロテアーゼ部分（２部位）を切断することが見出された（表１）。前記の３つのペプチドの他に、Ｍ２_pdも酸化型ウシインスリンＢ鎖及び合成ペプチドＮｃｈを切断した。天然タンパク質は、Ｍ２_pdにより切断されなかった。
【００３５】
データは、ヒトＭ２がβ−アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）を切断するベータ−セクレターゼとしての基準を全て満たすことを示している。（ａ）Ｍ２及びＡＰＰは、いずれも、ヒト脳に存在する膜タンパク質であり、哺乳動物細胞において共存している。（ｂ）Ｍ２は、合成ペプチド及び細胞内ＡＰＰのベータ−セクレターゼ部位を特異的に切断する。（ｃ）Ｍ２は、野生型ＡＰＰよりもスウェーデン型ＡＰＰに由来するベータ−セクレターゼ部位を優先的に切断する。（ｄ）Ｍ２活性に酸性ｐＨが最適であること、及び細胞中においてＭ２によるＡＰＰプロセシングがバフィロマイシンＡ１により阻害されることは、ベータ−セクレターゼによる切断が酸性小胞において起こるという以前の観察（Ｋｎｏｐｓ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：２４１９−２４２２（１９９５））と一致する。酸性溶液中の組換えプロＭ２の活性の自然発生は、細胞内で、このチモーゲンが自らエンドソームのような酸性小胞において活性を生成させうることを示唆する。
【００３６】
ＩＩ． 阻害剤の設計及び合成
メマプシン２の基質アナログの設計
５つのヒトアスパラギン酸プロテアーゼは、相同なアミノ酸配列を有しており、かつ類似した三次構造を有している。活性部位には２個のアスパラギン酸残基が存在し、各残基は特徴的なアスパラギン酸プロテアーゼ配列モチーフＡｓｐ−Ｔｈｒ／Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−（配列番号：８）の内に見出される。一般に、アスパラギン酸プロテアーゼには２つの相同ドメインがあり、三次構造において、基質結合部位はこれら２つのドメインの間に位置する。アスパラギン酸プロテアーゼの基質結合部位は、一般に、８個のアミノ酸残基を認識する。一般に、アスパラギン酸プロテアーゼにより切断されるアミド結合の両側に４個の残基が存在する。
【００３７】
典型的には、各アミノ酸の側鎖は、基質／アスパラギン酸プロテアーゼ相互作用の特異性に関与する。各基質残基の側鎖は、集合的にサブサイトと呼ばれる酵素の領域により認識される。プロテアーゼサブサイトのための一般に認められている記号、及びそれらの対応する基質残基を以下に示す。なお、ダブルスラッシュは結合切断の位置を表す。

【００３８】
アスパラギン酸プロテアーゼの基質認識のための一般的なモチーフは存在するが、各プロテアーゼは極めて異なる基質特異性及び特異性の広さを有する。アスパラギン酸プロテアーゼの特異性が既知となれば、その特異性に基づき、天然基質が効率的に切断されるのを防止する様式で、アスパラギン酸プロテアーゼと相互作用するインヒビターを設計することができる。いくつかのアスパラギン酸プロテアーゼは、加水分解の成功のため、サブサイトのそれぞれにおいて多くの異なる残基を適応させうるような特異性を有する。ペプシン及びカテプシンＤは、この型の特異性を有し、「広域」基質特異性を有すると言われる。レニンの場合など、あるサブサイトにおいて極少数の残基のみが認識されうる場合には、そのアスパラギン酸プロテアーゼは、厳密な、又は狭い特異性を有すると言われる。
【００３９】
アスパラギン酸プロテアーゼの特異性に関する情報は、特定のサブサイトに好ましい残基が位置しており、かつ分解されるペプチド結合が遷移状態アナログに置換されている特異的インヒビターを設計するために使用されうる。これらのアナログは、遷移状態アイソスターと呼ばれる。アスパラギン酸プロテアーゼは、加水分解メカニズムによりアミド結合を切断する。この反応メカニズムは、アミノ酸のβ−炭素に対する水酸化物イオンによる攻撃を含む。切断対象である結合を介してβ−炭素に付いた他の原子にはプロトン化が起こらなければならない。β−炭素の求電子性が不十分であるか、又は切断対象の結合に付いた原子の求核性が不十分である場合には、その結合は加水分解メカニズムによって切断されないであろう。遷移状態を模倣しないが、加水分解できないアナログも存在するが、遷移状態アイソスターは、遷移状態を特異的に模倣し、かつ加水分解できない。
【００４０】
遷移状態理論は、酵素が最も高い親和性を有する中間体であって、酵素が触媒する反応の遷移状態中間体であることを示す。特定の酵素に対して最も高い親和性を有するのは、基質の定常状態構造ではなく遷移状態構造である。アミド結合の加水分解の遷移状態は、四面体であるが、定常状態構造は、平面である。アスパラギン酸プロテアーゼの典型的な遷移状態アイソスターは、Ｍａｒｃｉｎｉｓｚｙｎら（１９７６）により、ペプスタチンにおいて最初に発見されたように、−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ₂ −である。遷移状態アナログ原理は、アスパラギン酸プロテアーゼであるヒト免疫不全ウイルスプロテアーゼのためのインヒビター薬物に適用され成功を収めている。これらの多くは、現在、臨床使用されている。インヒビターの構造、特異性、及び型に関する情報は、Ｔａｎｇ，Ａｃｉｄ Ｐｒｏｔｅａｓｅｓ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｄｖ．ｉｎ Ｅｘｐｔｌ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．第９５巻（Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ １９７７）；Ｋｏｓｔｋａ，Ａｓｐａｒｔｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ（Ｗａｌｔｅｒ ｄｅ Ｇｒｕｙｔｅｒ，Ｂｅｒｌｉｎ １９８５）；Ｄｕｎｎ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｆｕｎｃｉｔｏｎｓ ｏｆ ｔｈｅ Ａｓｐａｒｔｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ，Ａｄｖ．ｉｎ Ｅｘｐｔｌ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．３０６（Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ １９９１）；Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ａｓｐａｒｔｉｃ Ｐｒｏｔｅａｓｅｓ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｕｎｃｉｔｏｎ，Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｄｖ．ｉｎ Ｅｘｐｔｌ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．３６２（Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ １９９５）；及びＪａｍｅｓ，Ａｓｐａｒｔｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ，Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｅｎｚｙｍｅｓ，Ａｄｖ．ｉｎ Ｅｘｐｔｌ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．４３６（Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ １９９８）に見出される。
【００４１】
基質アナログの構成は、一般に、一般式Ｘ−Ｌ₄ −Ｐ₄ −Ｌ₃ −Ｐ₃ −Ｌ₂ −Ｐ₂ −Ｌ₁ −Ｐ₁ −Ｌ₀ −Ｐ₁ ' −Ｌ₁ ' −Ｐ₂ ' −Ｌ₂ ' −Ｐ₃ ' −Ｌ₃ ' −Ｐ₄ ' −Ｌ₄ ' −Ｙである。基質アナログの構成は、小ペプチド分子のアナログである。それらの基本構造は、構造／機能研究により決定されたペプチド配列に由来する。Ｐ_x により表される位置は、−Ｌ₀ −により表される切断部位からの相対的な基質特異性位置を表すことが理解される。Ｌ_x により表される組成の位置は、各基質特異性位置Ｐ_x の間の連結領域を表す。
【００４２】
メマプシン２の天然基質において、Ｐ_x −Ｌ_x 対は、切断対象のペプチドの単一アミノ酸を表すであろう。本一般式において、式の各Ｐ_x 部分は、アミノ酸であろうもののα−炭素及び側鎖官能基をいう。従って、アラニンのＰ_x −Ｌ_x 対のＰ_x 部分はＨＣ−ＣＨ₃ を表す。一般的な組成のＰ_x 部分を表す一般式は、−Ｒ₁ ＣＲ₃ −である。
【００４３】
一般に、Ｒ₁ はＣＨ₃ （アラニンの側鎖）、ＣＨ（ＣＨ₃ ）₂ （バリンの側鎖）、ＣＨ₂ ＣＨ（ＣＨ₃ ）₂ （ロイシンの側鎖）、（ＣＨ₃ ）ＣＨ（ＣＨ₂ ＣＨ₃ ）（イソロイシンの側鎖）、ＣＨ₂ （インドール）（トリプトファンの側鎖）、ＣＨ₂ （ベンゼン）（フェニルアラニンの側鎖）、ＣＨ₂ ＣＨ₂ ＳＣＨ₃ （メチオニンの側鎖）、Ｈ（グリシンの側鎖）、ＣＨ₂ ＯＨ（セリンの側鎖）、ＣＨＯＨＣＨ₃ （トレオニンの側鎖）、ＣＨ₂ （フェノール）（チロシンの側鎖）、ＣＨ₂ ＳＨ（システインの側鎖）、ＣＨ₂ ＣＨ₂ ＯＨＮＨ₂ （グルタミンの側鎖）、ＣＨ₂ ＣＯＮＨ₂ （アスパラギンの側鎖）、ＣＨ₂ ＣＨ₂ ＣＨ₂ ＣＨ₂ ＮＨ₂ （リジンの側鎖）、ＣＨ₂ ＣＨ₂ ＣＨ₂ ＮＨＣ（ＮＨ）（ＮＨ₂ ）（アルギニンの側鎖）、ＣＨ₂ （イミダゾール）（ヒスチジンの側鎖）、ＣＨ₂ ＣＯＯＨ（アスパラギン酸の側鎖）、ＣＨ₂ ＣＨ₂ ＣＯＯＨ（グルタミン酸の側鎖）、並びにこれらの機能的な天然及び非天然の誘導体又は合成代用物（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）である。
【００４４】
Ｒ₃ が単独のＨであるのが最も好ましい。しかしながら、一般に、Ｒ₃ はメマプシン２との結合を可能にする基であるアルケニル、アルキナル（ａｌｋｙｎａｌ）、アルケニルオキシ、及びアルキニルオキシ基でありうる。好ましくは、アルケニル基、アルキニル基、アルケニルオキシ基、及びアルキニルオキシ基は、２〜４０個の炭素を有し、より好ましくは２〜２０個の炭素、２〜１０個の炭素、又は２〜３個の炭素を有し、これらの機能的な天然及び非天然の誘導体又は合成代用物でありうる。
【００４５】
Ｐ_x −Ｌ_x 対のＬ_x 部分は、Ｐ_x 領域を互いに連結する原子を表す。天然の基質において、Ｌ_x は、鎖内の次のアミノ酸であろうもののアミノ部分と付いたβ−炭素を表す。従って、Ｌ_x は、−ＣＯ−ＮＨ−により表されるであろう。Ｌ_x の一般式は、Ｒ₂ により表される。一般に、Ｒ₂ は、ＣＯ−ＨＮ（アミド）、ＣＨ（ＯＨ）（ＣＨ₂ ）（ヒドロキシエチレン）、ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ（ＯＨ）（ジヒドロキシエチレン）、ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ₂ ＮＨ（ヒドロキシエチルアミン）、ＰＯ（ＯＨ）ＣＨ₂ （ホスフィネート）、ＣＨ₂ ＮＨ（還元アミド）でありうる。基質アナログがアスパラギン酸プロテアーゼ機能を阻害するよう機能するのであれば、複数個のＬがアイソスターでありうることが理解される。
【００４６】
アイソスターでないＬは、アミド結合、又は加水分解できないアミド結合の模倣体（mimetic）のいずれかでありうる。
【００４７】
Ｘ及びＹは、典型的には、アスパラギン酸プロテアーゼ認識部位による認識に関与せず、認識を妨害しない分子を表す。これらの分子は：基質アナログの分解に対する抵抗性を与えることが好ましい。好ましい例は、加水分解できない結合を介して基質アナログとカップリングしたアミノ酸であろう。その他の好ましい化合物は、キャッピング剤（ｃａｐｐｉｎｇ ａｇｅｎｔ）であろう。さらに他の好ましい化合物は、基質アナログの精製において使用されうるビオチンなどの化合物であろう。
【００４８】
本明細書において使用されるように、アルキルとは、置換又は非置換の直鎖状、分岐状、又は環状のアルキル基をいい、アルコキシル（ａｌｋｏｘｙｌ）とは、置換又は非置換の直鎖状、分岐状、又は環状のアルコキシをいう。好ましくは、アルキル基及びアルコキシ基は、１〜４０個の炭素を有し、より好ましくは１〜２０個の炭素、１〜１０個の炭素、又は１〜３個の炭素を有する。
【００４９】
本明細書において使用されるように、アルケニルとは、置換又は非置換の直鎖状又は分岐状のアルケニル基をいい、アルキニルとは、置換又は非置換の直鎖状又は分岐状のアルキニル基をいい、アルケニルオキシとは、置換又は非置換の直鎖状又は分岐状のアルケニルオキシをいい、アルキニルオキシとは、置換又は非置換の直鎖状又は分岐状のアルキニルオキシをいう。好ましくは、アルケニル基、アルキニル基、アルケニルオキシ基、及びアルキニルオキシ基は、２〜４０個の炭素を有し、より好ましくは２〜２０個の炭素、２〜１０個の炭素、又は２〜３個の炭素を有する。
【００５０】
本明細書において使用されるように、アルカリール（ａｌｋａｒｙｌ）とは、アリール置換基を有するアルキル基をいい、アラルキルとは、アルキル置換基を有するアリール基をいい、複素環−アルキルとはアルキル置換基を有する複素環基をいい、アルキル−複素環とは複素環置換基を有するアルキル基をいう。
【００５１】
アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アルコキシ基、アルケニルオキシ基、及びアルキニルオキシ基の置換基は、ハロゲン、シアノ、アミノ、チオ、カルボキシ、エステル、エーテル、チオエーテル、カルボキシアミド、ヒドロキシ、又はメルカプトでありうる。さらに、前記官能基は、所望によりＯ、ＮＨ、又はＳなどのヘテロ原子と置換されたメチレン基を１個以上有していてもよい。
【００５２】
多数の異なる基質が試験され、分析され、メマプシン２の切断法則が決定された。分析された基質の結果は表１に示されており、これらの結果から決定された法則は以下のように要約される。
（１）メマプシン２基質の第１の特異性部位は、サブサイト部位Ｐ₁ ' である。これは、メマプシン２における基質特異性のための最も重要な決定基がアミノ酸Ｓ１' であることを意味している。メマプシン２が基質を認識するためには、Ｐ₁ ' は小さい側鎖を含まなければならない。好ましい態様は、Ｐ₁ ' 位のＲ₁ がＨ（グリシンの側鎖）、ＣＨ₃ （アラニンの側鎖）、ＣＨ₂ ＯＨ（セリンの側鎖）、又はＣＨ₂ ＯＯＨ（アスパラギン酸の側鎖）である基質アナログである。ＣＨ₃ （アラニンの側鎖）又はＣＨ₂ ＯＨ（セリンの側鎖）よりも構造的に小さいＲ１を有する態様も、好ましい。
（２）Ｐ₄ 位、Ｐ₃ 位、Ｐ₂ 位、Ｐ₁ 位、Ｐ₂ ' 位、Ｐ₃ ' 位、及びＰ₄ ' 位における特異的配列要件はない。各部位は、第３法則が満たされるのであれば、任意の他の単独アミノ酸を適合させうる。
（３）残りの７個の位置Ｐ₄ 、Ｐ₃ 、Ｐ₂ 、Ｐ₁ 、Ｐ₂ ' 、Ｐ₃ ' 、及びＰ₄ ' のうちの少なくとも２個は、疎水性残基から構成されたＲ₁ を有していなければならない。残りの７個の位置Ｐ₄ 、Ｐ₃ 、Ｐ₂ 、Ｐ₁ 、Ｐ₂ ' 、Ｐ₃ ' 、及びＰ₄ ' には、少なくとも３個の疎水性残基が存在することが好ましい。疎水性基を含む位置のための好ましいＲ₁ 基は、ＣＨ₃ （アラニンの側鎖）、ＣＨ（ＣＨ₃ ）₂ （バリンの側鎖）、ＣＨ₂ ＣＨ（ＣＨ₃ ）₂ （ロイシンの側鎖）、（ＣＨ₃ ）ＣＨ（ＣＨ₂ ＣＨ₃ ）（イソロイシンの側鎖）、ＣＨ₂ （インドール）（トリプトファンの側鎖）、ＣＨ₂ （ベンゼン）（フェニルアラニンの側鎖）、ＣＨ₂ ＣＨ₂ ＳＣＨ₃ （メチオニンの側鎖）、ＣＨ₂ （フェノール）（チロシンの側鎖）である。疎水性基は大きい疎水性基であることが、より好ましい。大きい疎水性基を含む好ましいＲ₁ は、ＣＨ（ＣＨ₃ ）₂ （バリンの側鎖）、ＣＨ₂ ＣＨ（ＣＨ₃ ）₂ （ロイシンの側鎖）、（ＣＨ₃ ）ＣＨ（ＣＨ₂ ＣＨ₃ ）（イソロイシンの側鎖）、ＣＨ₂ （インドール）（トリプトファンの側鎖）、ＣＨ₂ （ベンゼン）（フェニルアラニンの側鎖）、ＣＨ₂ ＣＨ₂ ＳＣＨ₃ （メチオニンの側鎖）、ＣＨ₂ （フェノール）（チロシンの側鎖）である。疎水性Ｒ₁ を有する位置は、ＣＨ（ＣＨ₃ ）₂ （バリンの側鎖）、ＣＨ₂ ＣＨ（ＣＨ₃ ）₂ （ロイシンの側鎖）、ＣＨ₂ （ベンゼン）（フェニルアラニンの側鎖）、ＣＨ₂ ＣＨ₂ ＳＣＨ₃ （メチオニンの側鎖）、又はＣＨ₂ （フェノール）（チロシンの側鎖）であることが、最も好ましい。
（４）８個の位置Ｐ₄ 、Ｐ₃ 、Ｐ₂ 、Ｐ₁ 、Ｐ₁ ' 、Ｐ₂ ' 、Ｐ₃ ' 、及びＰ₄ ' は、いずれも、Ｒ１位にプロリン側鎖を有していてはならない。
（５）全てのサブサイトがアナログ中に表されたＰを有している必要はない。例えば、基質アナログは、Ｘ−Ｐ₂ −Ｌ₁ −Ｐ₁ −Ｌ₀ −Ｐ₁ ' −Ｌ₁ ' −Ｐ₂ ' −Ｌ₂ ' −Ｐ₃ ' −Ｌ₃ ' −Ｙを有してもよく、Ｘ−Ｌ₁ −Ｐ₁ −Ｌ₀ −Ｐ₁ ' −Ｌ₁ ' −Ｐ₂ ' −Ｌ₂ ' −Ｐ₃ ' −Ｌ₃ ' −Ｐ₄ ' −Ｌ₄ ' −Ｙを有してもよい。
【００５３】
好ましい基質アナログは、Ｐ１とＰ１' との間に加水分解できないアナログを有する、表１に開示された配列を有するアナログである。
【００５４】
インヒビターを作製するためのコンビナトリアルケミストリー
コンビナトリアルケミストリーとしては、限定されないが、小分子又は他の巨大分子のいずれかと結合することができる分子を単離するための全ての方法が挙げられる。タンパク質、オリゴヌクレオチド、及び多糖が、巨大分子の例である。例えば、所定の機能、触媒又はリガンド結合を有するオリゴヌクレオチド分子が、「インビトロ遺伝学」と呼ばれるものにおいて、ランダムオリゴヌクレオチドの複雑な混合物から単離されうる（Ｓｚｏｓｔａｋ，ＴＩＢＳ １９：８９，１９９２）。ランダムな及び決められた配列を保持する大きな分子プールを合成し、その複雑な混合物、例えば、１００μｇの１００ヌクレオチドＲＮＡにおける約１０¹⁵個の各配列を、何らかの選択及び濃縮の過程に供する。Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ ａｎｄ Ｓｚｏｓｔａｋ（１９９０）は、カラム上のリガンドと結合した分子のアフィニティクロマトグラフィ及びＰＣＲ増幅の繰り返しサイクルにより、１０¹⁰個のＲＮＡ分子のうちの１個が小分子色素と結合するようフォールディングされることを推定した。かかるリガンド結合挙動を有するＤＮＡ分子も、同様に単離されている（Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ ａｎｄ Ｓｚｏｓｔａｋ，１９９２；Ｂｏｃｋ ｅｔ ａｌ，１９９２）。
【００５５】
小有機分子、タンパク質、及びペプチド、並びに当業者に既知のその他の分子のための、類似した目標を目的とした技術が存在する。小さい合成分子のライブラリー、オリゴヌクレオチドのライブラリー、タンパク質のライブラリー又はペプチドのライブラリーに基づくのであろうとなかろうとも、所望の活性に関して分子セットをスクリーニングすることを、広義に、コンビナトリアルケミストリーという。
【００５６】
新たな（ｄｅ ｎｏｖｏ）活性又は修飾された活性を有するタンパク質を単離するための多数の方法が存在する。例えば、ファージディスプレイライブラリーは、長年にわたり使用されている。一定の機能を有するタンパク質を単離するための好ましい方法は、Ｒｏｂｅｒｔｓ及びＳｚｏｓｔａｋ（Ｒｏｂｅｒｔｓ Ｒ．Ｗ．ａｎｄ Ｓｚｏｓｔａｋ Ｊ．Ｗ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９４（２３）１２９９７−３０２（１９９７））により記載されている。ペプチドを単離するために設計されたもう１つの好ましいコンビナトリアル法は、Ｃｏｈｅｎら（Ｃｏｈｅｎ Ｂ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９５（２４）：１４２７２−７（１９９８））に記載されている。この方法は、修飾されたツーハイブリッド技術を利用する。酵母ツーハイブリッド系は、タンパク質−タンパク質相互作用の検出及び分析のため有用である。酵母サッカロミセス セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）において最初に記載されたツーハイブリッド系は、目的のタンパク質に特異的な新規制御分子を同定するための強力な分子遺伝学的技術である（Ｆｉｅｌｄｓ ａｎｄ Ｓｏｎｇ，Ｎａｔｕｒｅ ３４０：２４５−６（１９８９））。Ｃｏｈｅｎらは、選択された分子と結合する合成ペプチド又は工作ペプチドの配列間の新規相互作用を同定することができるよう、この技術を修飾した。この型の技術の利点は、選択が細胞内環境において実施される点である。その方法は、酸性活性化ドメインと接着するペプチド分子のライブラリーを利用する。選択されたペプチド、例えばメマプシン２の細胞外部分を、Ｇａｌ４のような転写活性化タンパク質のＤＮＡ結合ドメインと接着させる。この型の系においてツーハイブリッド技術を実施することにより、メマプシン２の細胞外部分と結合する分子が同定されうる。
【００５７】
小分子ライブラリーのスクリーニング
これらのより専門的な技術に加え、様々な小分子ライブラリー又はコンビナトリアルライブラリーと組み合わされた、当業者に周知の方法を、所望の標的、メマプシン２又はその基質のいずれかと結合するか、又は相互作用する分子を単離し特徴決定するために使用することができる。これらの化合物の相対的な結合親和性を比較し、当業者に周知の競合的又は非競合的な結合研究を使用して最適なインヒビターを同定することができる。好ましい競合的インヒビターは、メマプシン２の非加水分解性のアナログである。もう１つは、メマプシン２が正確に機能すること又はフォールディングされることを防止するアロステリックな再編成を引き起こす。
【００５８】
コンピュータを利用した合理的薬物設計
インヒビターを単離するためのもう一つの手段は、合理的設計によるものである。これは、構造情報及びコンピュータモデリングにより達成される。コンピュータモデリング技術は、選択された分子の三次元的原子構造の可視化、及び分子と相互作用するであろう新化合物の合理的設計を可能にする。三次元構築物は、典型的には、選択された分子のｘ線結晶解析又はＮＭＲイメージングからのデータに依存する。分子動力学は、力場データを必要とする。コンピュータグラフィックスシステムは、新化合物が標的分子とどのように関連しているかの予測を可能にし、結合特異性を完全化するための化合物及び標的分子の構造の実験的操作を可能にする。例えば、ＮＭＲ分光法を使用して、Ｉｎｏｕｙｅらは、ＴＳＨＫ（膜貫通センサーヒスチジンキナーゼ（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｓｅｎｓｏｒ ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ ｋｉｎａｓｅｓ））の触媒部位の各サブドメインの構造を保持しているＮ末端短縮ＴＳＨＫ断片の構造情報を得ることができた。ＮＭＲ研究に基づき、彼らは、可能性のあるＴＳＨＫインヒビターを同定することができた（Ｉｎｏｕｙｅの米国特許第６，０７７，６８２号）。もう１つの好例は、カルシニュリン活性部位結合ポケット及び補助的ＦＫＢＰ１２／ＦＫ５０６結合ポケットの両方の形状及び構造を得るため、高分解能Ｘ線結晶学を使用して決定されたカルシニュリン／ＦＫＢＰ１２／ＦＫ５０６複合体の三次元構造に基づく（Ａｒｍｉｓｔｅａｄの米国特許第５，９７８，７４０号）。この情報を入手すれば、研究者は、天然のリガンド又は基質とそれらの対応する受容体又は酵素の結合ポケットとの会合をよく理解することができ、従って効率的なインヒビターを設計し作製することができる。
【００５９】
一方又は両方に小さな変更がなされる場合、分子−化合物相互作用の予測は、分子設計プログラムとユーザーとの間のユーザーフレンドリーなメニュー選択方式のインターフェースと通常接続された、分子力学ソフトウェア及び計算集中コンピュータ（ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌｌｙ ｉｎｔｅｎｓｉｖｅ ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ）を必要とする。分子モデリングシステムの例は、ＣＨＡＲＭｍ及びＱＵＡＮＴＡプログラム（Ｐｏｌｙｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）である。ＣＨＡＲＭｍは、エネルギー最小化及び分子動力学のファンクションを実行する。ＱＵＡＮＴＡは、分子構造の構築、グラフィックモデリング、及び分析を実行する。ＱＵＡＮＴＡは、相互対話式の分子挙動の構築、修飾、可視化、及び分析を可能にする。
【００６０】
Ｒｏｔｉｖｉｎｅｎ，ｅｔ ａｌ．，１９８８ Ａｃｔａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａ Ｆｅｎｎｉｃａ ９７，１５９−１６６；Ｒｉｐｋａ，Ｎｅｗ Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔ ５４−５７（１９８８年６月１６日）；ＭｃＫｉｎａｌｙ ａｎｄ Ｒｏｓｓｍａｎｎ，１９８９ Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｉｏｌ．２９，１１１−１２２；Ｐｅｒｒｙ ａｎｄ Ｄａｖｉｅｓ，ＯＳＡＲ；Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ １８９−１９３頁（Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．１９８９）；Ｌｅｗｉｓ ａｎｄ Ｄｅａｎ，１９８９ Ｐｒｏｃ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄ．２３６，１２５−１４０及び１４１−１６２のような多数の論文が、特異的タンパク質と相互作用する薬物のコンピュータモデリングを概説しており、核酸成分のためのモデル酵素に関してはＡｓｋｅｗ，ｅｔ ａｌ．，１９８９ Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１１，１０８２−１０９０が概説している。化学物質をスクリーニングし図形的に描写するその他のコンピュータプログラムは、ＢｉｏＤｅｓｉｇｎ，Ｉｎｃ．（Ｐａｓａｄｅｎａ，ＣＡ．，Ａｌｌｅｌｉｘ，Ｉｎｃ，Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，Ｏｎｔａｒｉｏ，Ｃａｎａｄａ）及びＨｙｐｅｒｃｕｂｅ，Ｉｎｃ．（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｏｎｔａｒｉｏ）のような会社から入手可能である。
【００６１】
結合を改変することができる化合物の設計及び生成に関して記載したが、天然生成物又は合成化学物質を含む既知の化合物、及びタンパク質を含む生物学的活性を有する材料のライブラリーを、基質結合活性又は酵素活性を改変させる化合物に関して、スクリーニングすることもできる。
【００６２】
ライブラリーのスクリーニング
基質アナログの設計及び合理的薬物設計は、活性部位及び標的の知識に基づいており、酵素及びその基質の詳細な構造、並びに単独で、又はインヒビターの存在下でそれらが相互作用する様式を作出するコンピュータソフトウェアプログラムを利用する。これらの技術は、ｘ線結晶解析データを入手することにより大きく増強される。インヒビターは、触媒活性を有する酵素を阻害する化合物に関して、既存の化合物のライブラリーをスクリーニングすることによっても得られる。メマプシン２に関する文献における報告とは対照的に、本明細書に記載の酵素は、天然に産生された酵素と類似した活性を有し、内因性活性を阻害する化合物を同定するための手段を提供する。これらの可能性のあるインヒビターは、典型的には、酵素、基質（好ましくは、発色性基質）、及び可能性のあるインヒビター（通常、一連の濃度においてスクリーニングされる）が混合されたハイスループットアッセイを使用して同定され、基質の分解の程度が決定される。有用である可能性のあるインヒビターは、分解の量を減少させるものである。
【００６３】
III ．診断及び治療の方法
インヒビターは、４２アミノ酸ペプチド分解産物のレベルの上昇、及び老人斑におけるペプチドの蓄積のような、アルツハイマー病、及びそれと関連した状態の診断及び治療及び／又は予防において使用されうる。
【００６４】
診断的使用
基質アナログは、実施例に記載のように、メマプシン２又はメマプシン２アナログと特異的に結合し、メマプシン２の単離及び精製又は特徴決定を補助するための試薬として使用されうる。インヒビター及び精製された組換え酵素は、遺伝学的にアルツハイマー病を発症する傾向が高い個体のスクリーニングにおいて使用されうる。
【００６５】
治療的使用
組換えヒトメマプシン２は、配列ＬＶＮＭ／ＡＥＧＤ（配列番号：９）を有する基質を分解する。この配列は、ヒトプレセニリンのインビボプロセシング部位の配列である。プレセニリン１及びプレセニリン２は、いずれも、内在性膜タンパク質である。それらは、未プロセシング型からＮ末端配列を除去するプロテアーゼ分解によりプロセシングされる。プロセシングされた後、プレセニリンは、未プロセシングのプレセニリンと比較して安定な２本鎖のヘテロ二量体を形成する（Ｃａｐｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３，３２０５（１９９８）；Ｔｈｉｎａｋａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．Ｄｉｓ．４，４３８（１９９８）；Ｙｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｌｅｔｔ．２：２５４（３）；１２５−８（１９９８））。未プロセシングのプレセニリンは、迅速に崩壊する（Ｔｈｉｎａｋａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２，２８４１５（１９９７）；Ｓｔｅｉｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３，３２３２２（１９９８））。プレセニリンは、ベータ−セクレターゼのインビボ活性を調節し、ベータ−セクレターゼは、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）を分解し、アルファ−ベータ４２の形成をもたらすことが知られている。脳細胞におけるアルファ−ベータ４２の蓄積は、アルツハイマー病の主因であることが知られている（概説については、Ｓｅｌｋｏｅ，１９９８を参照のこと）。従って、プレセニリンの活性は、アルツハイマー病の進行を増強する。これは、プレセニリン遺伝子の非存在下では、アルファ−ベータ４２ペプチドの産生が低下するという観察（Ｄｅ Ｓｔｒｏｏｐｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３９１，３８７（１９９８））により支持される。未プロセシングのプレセニリンは迅速に崩壊するため、プロセシングされたヘテロ二量体プレセニリンが、アルツハイマー病へと至るアルファ−ベータ４２の蓄積の原因であるはずである。メマプシン２によるプレセニリンのプロセシングは、アルファ−ベータ４２の産生を増強し、従ってアルツハイマー病の進行をさらに増強する。従って、血液脳関門を通過するメマプシン２インヒビターは、アルファ−ベータ４２の沈積により媒介されるアルツハイマー病の発症の確率を減少させるか、又はその進行を遅延させるために使用されうる。メマプシン２はベータ分解部位でＡＰＰを分解するため、ベータ分解部位におけるＡＰＰ分解の防止により、アルファ−ベータ４２の増大が防止されるであろう。
【００６６】
ワクチン
触媒活性を有するメマプシン２、又は２つの触媒性アスパラギン酸残基及び基質結合間隙の存在により定義される活性部位を含むその断片は、メマプシン２に対する免疫応答を誘導するために使用されうる。メマプシン２は、ブロッキング抗体、即ち脳におけるメマプシン２の天然に存在する基質の分解を防止する抗体を誘発するために有効な量で投与される。未修飾のワクチンは、アルツハイマー病の予防及び治療において有用でありうる。ワクチンに対する応答は、アジュバントの包含、組換え酵素の産生からのウイルスタンパク質のような組成、及び／又は投与方式（量、投与部位、投与頻度等）に影響されうる。酵素は活性であるためには適切にフォールディングされていなければならないことは明らかであるため、内因性メマプシン２に対して活性な抗体が誘発されるはずである。内因性酵素に対して有効である抗体は、適切にリフォールディングされていない酵素に対しては産生される可能性が低い。
【００６７】
薬学的に許容される担体
インヒビターは、典型的には、経口又は注射により投与されよう。経口投与が好ましい。又は、肺、粘膜、又は経皮的な経路による送達のための、その他の製剤が使用されうる。インヒビターは、通常、製薬学的に許容される担体と組み合わせて投与されよう。製薬学的担体は、当業者に既知である。適当な担体は、典型的には、投与の様式に基づき選択されよう。医薬組成物は、抗微生物剤、抗炎症剤、及び鎮痛剤のような活性成分を１個以上含んでいてもよい。
【００６８】
非経口投与又は注射による投与のための調製物には、無菌の水性又は非水性の溶液、懸濁液、及び乳濁液が含まれる。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油のような植物油、及びオレイン酸エチルのような注射可能な有機エステルである。水性担体には、生理食塩水及び緩衝媒質を含む、水、アルコール性／水性溶液、乳濁液、又は懸濁液が含まれる。好ましい非経口用賦形剤には、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース（Ｒｉｎｇｅｒ’ｓ ｄｅｘｔｒｏｓｅ）、デキストロース、及び塩化ナトリウム、乳酸化リンゲル（ｌａｃｔａｔｅｄ Ｒｉｎｇｅｒ’ｓ）、又は固定油が含まれる。静脈内賦形剤には、流体、及び栄養補給剤、及び（リンゲルデキストロースに基づくもののような）電解質補給剤が含まれる。
【００６９】
局所投与（口腔、肺、鼻腔、膣、又は直腸を含む粘膜表面への適用を含む）のための製剤には、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、滴下剤、坐剤、スプレー、液体、及び粉末が含まれる。これらの適用のための製剤は既知である。例えば、典型的には、１〜３ミクロンの空気力学的直径を有する粒子を有する粉末を製剤化するための噴霧乾燥を使用して、薬物、又は重合体及び／もしくは界面活性剤と組み合わされた薬物からなる多数の肺製剤が、開発されている。
【００７０】
経口投与用組成物には、粉末又は顆粒、懸濁液、又は水もしくは非水性媒質の溶液、カプセル、サチェット、又は錠剤が含まれる。濃化剤、香料、希釈剤、乳化剤、分散補助剤、又は結合剤が望ましい場合もある。
【００７１】
本明細書に記載のようなペプチドは、塩酸、臭化水素酸、過塩素酸、硝酸、チオシアン酸、硫酸、及びリン酸のような無機酸、並びにギ酸、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、乳酸、ピルビン酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、及びフマル酸のような有機酸との反応、又は水酸化ナトリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カリウムのような無機塩基、及びモノアルキルアミン、ジアルキルアミン、トリアルキルアミン、アリールアミン、及び置換されたエタノールアミンのような有機塩基との反応により形成される、製薬学的に許容される酸付加塩又は塩基付加塩としても投与されうる。
【００７２】
用量
投薬は、治療する状態の重度及び応答性に依存するが、通常、１日１回以上であり、治療コースは数日から数ヶ月、又は医師がさらなる利益は得られないであろうと決定するまで継続されよう。当業者であれば、最適な用量、投薬方法、及び反復速度を決定することができる。
【００７３】
用量範囲は、メマプシン２により媒介される障害の症状が緩解するか（典型的には、老人斑のサイズ及び／又は数の減少、又はサイズもしくは量の増加の停止により特徴付けられる）、又はアルファ−ベータ４２ペプチドの分解が減少する、所望の効果を生じるために十分な大きさのものである。用量は、反対適応（ｃｏｕｎｔｅｒｉｎｄｉｃａｔｉｏｎｓ）の場合には、各医師により調整されうる。
【００７４】
以下の非制限的な実施例を参照することにより、本発明はさらに理解されるであろう。
【００７５】
実施例１．メマプシン２のクローニング
１．プロ−メマプシン２のクローニングと塩基配列
ＥＳＴ ＩＭＡＧＥデータベース中の以下の登録配列の中にヒトアスパラギン酸プロテアーゼに相同な新規の配列が見い出された。ＡＡ１３６３６８妊婦子宮由来ＡＴＣＣ９４７４７１、ＡＡ２０７２３２神経上皮由来ＡＴＣＣ２１４５２６、およびＲ５５３９８ヒト乳房由来ＡＴＣＣ３９２６８９。これらに対応するバクテリア菌株で、ＥＳＴ配列を含む＃９４７４７１、＃２１４５２６および＃３９２６８９をＡＴＣＣ（メリーランド州のロックビル（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， ＭＤ））から入手した。ＡＴＣＣから入手したこれらのクローンの配列を決定したところ、既知のヒトアスパラギン酸プロテアーゼとは一致しない配列を含んでいることが確認された。これらのクローンの全配列をまとめたところ、約８０％のプレプロ−Ｍ２ ｃＤＮＡになった。以下の方法を用いて、これらのクローンの全長ｃＤＮＡを得た。
【００７６】
ヒト膵臓マラソン既製ｃＤＮＡ（Ｈｕｍａｎ Ｐａｎｃｒｅａｓ Ｍａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ ｃＤＮＡ）（クローンテック社（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ））は、ヒト組織に由来するｍＲＮＡの逆転写、プライマー付加、および第二鎖合成によって得られた二本鎖ＤＮＡであるが、これをＰＣＲ増幅用の鋳型として用いた。アダプタープライマー（ＡＰ１）およびネスティドアダプタープライマー（ＡＰ２）を５' −および３' −ＲＡＣＥ ＰＣＲに用いた。メマプシン２ｃＤＮＡの５' −領域のＰＣＲには、ＡＰ１およびＮＨＡＳＰＲ１というプライマーを用いた。ｃＤＮＡの３' 末端に対するプライマーは、ＮＨＡＳＰＦ２およびＡＰ１である。ｃＤＮＡの中央は、ＮＨＡＳＰＦ１プライマーおよびＮＨＡＳＰＲ２プライマーによって増幅された。プライマーの配列は以下の通りである。
ＮＨＡＳＰＦ１：

（配列番号：１０）、
ＮＨＡＳＰＲ１：

（配列番号：１１）、
ＮＨＡＳＰＦ２：

（配列番号：１２）、
ＮＨＡＳＰＲ２：

（配列番号：１３）、
ＡＰ１：

（配列番号：１４）、および
ＡＰ２：

（配列番号：１５）。
【００７７】
メマプシン２も、ラムダｇｔ１０およびラムダｇｔ１１ベクターに組み込まれているヒト膵臓ライブラリー（クイックスクリーニングヒトｃＤＮＡライブラリーパネル（Ｑｕｉｃｋ−Ｓｃｒｅｅｎ Ｈｕｍａｎ ｃＤＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐａｎｅｌ））からクローニングされた。ベクター由来のプライマー、ＧＴ１０ＦＷＤ、ＧＴ１０ＲＥＶ、ＧＴ１１ＦＷＤ、およびＧＴ１１ＲＥＶを外部プライマーとして使用した。用いたプライマーの配列は、
ＧＴ１０ＦＷＤ：

（配列番号：１６）、
ＧＴ１０ＲＥＶ：

（配列番号：１７）、
ＧＴ１１ＦＷＤ：

（配列番号：１８）、
ＧＴ１１ＲＥＶ：

（配列番号：１９）であった。
【００７８】
なお、メマプシン２ｃＤＮＡは、ヒト膵臓ラムダｇｔ１０およびラムダｇｔ１１ライブラリーから直接増幅した。プライマーの配列は、
ＰＡＳＰＮ１：

（配列番号：２０）、および
ＮＨＡＳＰＣ１：

（配列番号：２１）であった。
【００７９】
増幅されたメマプシン２の断片を中間ＰＣＲベクター（インビトロジェン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））にクローニングし、シーケンスした。
【００８０】
前記断片から集められたｃＤＮＡ、ヌクレオチド、および推定されるタンパク質配列を配列番号：１と配列番号：２に示す。
【００８１】
プロメマプシン２は、別のヒトアスパラギン酸プロテアーゼに相同である。アラインメントによれば、プロメマプシン２は、ｐｒｏ領域、アスパラギン酸プロテアーゼ領域、およびＣ−末端側に膜貫通領域を持っている。この活性型酵素は、メマプシン２であり、そのプロ酵素はプロメマプシン２である。
【００８２】
実施例２．ヒト組織におけるメマプシン２の分布
クローンテック社から入手した多数組織ｃＤＮＡパネルを、メマプシン２ｃＤＮＡの０．８２ ｋｂの断片をＰＣＲ増幅するための鋳型として用いた。メマプシン２用に使用したプライマーはＮＨＡＳＰＦ１およびＮＨＡＳＰＲ２であった。メマプシン２またはメマプシン２の断片を含む組織から増幅されたＰＣＲ産物が得られた。増幅産物の量から、メマプシン２は、以下の組織に多い順に存在していることが示された。膵臓、脳、肺、腎臓、肝臓、胎盤、および心臓。また、メマプシン２は、脾臓細胞、前立腺細胞、精巣細胞、卵巣細胞、小腸細胞および結腸細胞にも存在している。
【００８３】
実施例３．大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）におけるプロメマプシン２ｃＤＮＡの発現、プロメマプシン２のリフォールディングと精製
プロメマプシン２をＰＣＲ増幅して、ｐＥＴ１１ａベクターのＢａｍＨＩ部位にクローニングした。得られたベクターは、Ａｌａ−８ｐからＡｌａ３２６までの配列をもつプロメマプシン２を発現する。図１に２種類の発現ベクターｐＥＴ１１−メマプシン２−Ｔ１（以下Ｔ１）とｐＥＴ１１−メマプシン２−Ｔ２（以下Ｔ２）の構造を示す。いずれのベクターにおいても、発現された組換えタンパク質のＮ−末端側の１５残基は、発現ベクターに由来するものである。プロメマプシン２の残基は、残基Ａｌａ−１６から開始する。２種類の組換えプロメマプシン２は、Ｃ−末端側の長さが異なっている。クローンＴ１はＴｈｒ−４５６で終わっており、クローンＴ２はＡｌａ−４２１で終わっている。Ｔ１構築物はＴ２構築物よりも長いＣ−末端を持っているが、予想される膜貫通ドメインを全く発現しない。
【００８４】
組換えタンパク質の発現と封入体の回収
Ｔ１およびＴ２発現ベクターを別々に大腸菌の菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）にトランスフェクトした。トランスフェクトされた細菌を培養する方法、組換えタンパク質の合成誘導、および組換えタンパク質を含む封入体の回収と洗浄は、本質的には、既述した通りである（Ｌｉｎら、１９９４）。
【００８５】
３つの異なるリフォールディング方法は，満足な結果を生じた。
【００８６】
（ｉ）迅速希釈法
８Ｍ尿素／１００ｍＭベータ−メルカプトエタノールに入れたＯＤ_280nm ＝５のプロメマプシン２を、２０倍容量の２０ｍＭ−トリス、ｐＨ９．０に直ちに希釈した。この溶液を１Ｍ ＨＣｌでゆっくりとｐＨ８に調整した。そして、精製に移る前にリフォールディング用溶液を２４時間４℃に置いた。
【００８７】
（ｉｉ）逆透析法
等量の２０ ｍＭトリス、０．５ ｍＭの酸化型／１．２５ ｍＭの還元型グルタチオン、ｐＨ ９．０を、８ Ｍ尿素／１０ ｍＭベータ−メルカプトエタノールに入れたＯＤ_280nm ＝５のプロメマプシン２を激しく撹拌したものに加える。この処理を１時間置きにさらに３回繰り返す。そして、得られた溶液を十分な量の２０ ｍＭトリス塩基に対して透析して、尿素の最終濃度を０．４ Ｍとした。次に、この溶液のｐＨを、１ Ｍ ＨＣｌによってゆっくりと８．０に調整する。
【００８８】
ｉｉｉ． リフォールディングのための好適な方法
封入体を８ Ｍ尿素、 ０．１ Ｍトリス、１ ｍＭグリシン、１ ｍＭ ＥＤＴＡ、１００ ｍＭベータ−メルカプトエタノール、ｐＨ１０．０に溶解させる。封入体のＯＤ₂₈₀ 値を、ベータ−メルカプトエタノールを含まない８ Ｍ尿素溶液で５．０に調整する。最終溶液には、以下の還元剤を入れる。
１０ ｍＭベータ−メルカプトエタノール、１０ ｍＭ ＤＴＴ（ジチオスレイトール）、１ ｍＭ還元型グルタチオン、および０．１ Ｍ酸化型グルタチオン。溶液の最終ｐＨは１０．０である。
【００８９】
上記溶液は、２０倍容量の２０ ｍＭ−トリスベースに速やかに希釈してｐＨを９．０に調整し、得られた溶液を１６時間４℃に置く。この溶液を、６時間で室温まで平衡化させ、ｐＨを８．５に調整する。溶液を再び４℃に戻して１８時間置く。
【００９０】
この溶液を、再び６時間、室温まで平衡化させ、ｐＨを８．０に調整する。溶液を再び４℃に戻して４日から７日置く。
【００９１】
リフォールディング方法は、Ｍ２のサブサイト特異性を調べるため、Ｍ２インヒビターの阻害能力を解析するため、無作為構造物ライブラリーまたは既存の化合物ライブラリーコレクションのいずれかを用いてインヒビターをスクリーニングするため、Ｍ２の構造を結晶学的に研究するための結晶を製造するため、およびＭ２のモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を製造するために使用することのできる、酵素活性のある調製物を得るために非常に重要である。
【００９２】
組換えプロメマプシン２−Ｔ２の精製
リフォールディングした材料を限外濾過によって濃縮し、２０ ｍＭトリス塩酸、０．４Ｍ尿素、ｐＨ ８．０で平衡化させたセファクリル（ＳＥＰＨＡＣＲＹＬ^TM）Ｓ−３００カラム上で分離する。Ｓ−３００カラムからのリフォールディング物ピーク（２番目のピーク）は、２０ ｍＭトリス塩酸、０．４Ｍ尿素、ｐＨ ８．０で平衡化したＦＰＬＣリソース−Ｑ（ＦＰＬＣ ＲＥＳＯＵＲＣＥ−Ｑ ^TM ）カラムでさらに精製することができる。ＮａＣｌの直線的勾配によって、酵素をカラムから溶出させる。Ｓ−３００からのリフォールディング物ピークは、さらなる精製を行なう前に活性化することもできる。活性化するためには、画分を等量の０．２ Ｍ酢酸ナトリウム、７０％グリセロール、ｐＨ ４．０と混合する。この混合液は、２２℃で１８時間インキュベートしてから、２０倍容量の２０ ｍＭ−ビス−トリス（Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ）、０．４ Ｍ尿素、ｐＨ ６．０に対し２回透析する。そして、透析された材料を、２０ ｍＭ−ビス−トリス、０．４ Ｍ尿素、ｐＨ ６．０で平衡化したＦＰＬＣリソース−Ｑ（ＦＰＬＣ ＲＥＳＯＵＲＣＥ−Ｑ ^TM ）カラム上でさら精製する。酵素をＮａＣｌの直線的勾配によって溶出させる。
【００９３】
還元条件下および非還元条件下でＳ−３００画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析したところ、プロメマプシン２は、非還元条件下で、まず、非常に高分子量のバンド（約４２ ｋＤよりも大きい）として溶出することを示した。このことは、タンパク質のジスルフィド架橋によって、このタンパク質が、これらの分画では正しくフォールディングされないことを示している。その後の画分は、予想されたプロメマプシン２−Ｔ２のサイズ（約４２ ｋＤａ）のタンパク質を含んでいる。これらの画分で得られたプロ酵素は、自己触媒による活性化を行なうためのタンパク質分解活性ももつ。これらの画分をプールして、ＦＰＬＣリソース（ＦＰＬＣ ＲＥＳＯＵＲＣＥ ^TM ）カラムでクロマトグラフィーを行ない、ＮａＣｌの直線的勾配によって溶出した。いくつかの画分は、非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて解析した。この解析によって、画分６および７が活性タンパク質の大部分を含んでいることが明らかになり、このことは、活性タンパク質を含む１番目のＦＰＬＣピークと一致していた。主要ピークは、ショルダーピークと一緒になっており、これは、同じリソースＱ（ＲＥＳＯＵＲＣＥ ^TM Ｑ）カラムで精製を繰り返しても出現した。主要なショルダーピークは、これらの条件下で異なったコンフォメーションで存在する活性プロメマプシン２であることが確認された。
【００９４】
実施例４．組換えメマプシン２のタンパク質分解活性と切断部位選択性
メマプシン２の特異性を確認するために、タンパク質切断部位近傍のアミノ酸配列を決定した。自己触媒切断を生じさせるため、組換えプロメマプシン２−Ｔ１を０．１ Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ ４．０に入れ室温で１６時間インキュベートした。この産物をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いて解析した。プロ−メマプシン２の分子量よりも小さい分子量に相当するバンドがいくつか観察された。電気泳動によるバンドをＰＶＤＦ膜上にトランスブロットした。４本のバンドを選んで、タンパク質シークエンサーでＮ−末側配列を決定した。これらのバンドのＮ−末側配列によって、プロメマプシン２上のタンパク質切断部位の位置を確認した。
【００９５】
さらに、ウシインシュリンの酸化型β−鎖と２種類の合成ペプチドをメマプシン２に対する基質として用いて、他の加水分解部位の範囲を決定した。これらの反応は、０．１ Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ ４．０中で自己活性化したプロメマプシン２を、次いでペプチドとインキュベートすることによって行なった。加水分解産物を逆相Ｃ−１８カラム上でＨＰＬＣを行ない、断片の分子量を測定するために、溶出ピークをエレクトロスプレー質量解析にかけた。酸化型インシュリンＢ−鎖については２つの加水分解部位を同定した（表１）。ペプチドＮＣＨ−ガンマからは３個の加水分解部位が同定された。合成ペプチドＰＳ１−ガンマには１個の切断部位が見られ、その配列（ＬＶＮＭＡＥＧＤ）（配列番号：９）は、ヒトプレセニリン１のβ−プロセッシング部位に由来するものである（表１）。
【００９６】
【表１】

【００９７】
実施例５．プロメマプシン２の活性化および酵素の反応速度論
０．１ Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ ４．０に入れ２２℃で１６時間インキュベートしたところ、自己触媒によってプロ−Ｍ２_pdがＭ２_pdに変換した。まず、加水分解試験を行うために２種類の合成ペプチドを別々にプロ−Ｍ２_pdとともに０．１ Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ ４．０の中で時間を変えて２時間から１８時間インキュベートした。インキュベートした試料について、加水分解産物を同定するためにＬＣ／ＭＳを行なった。反応速度論研究のため、同定済みのＨＰＬＣ（ベックマン・システムゴールド（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｓｙｓｔｅｍ Ｇｏｌｄ）産物のピークを定量するためにまとめた。プレセニリン１およびスウェーデン型ＡＰＰペプチド（表１）についてのＫ_m 値とｋ_cat 値を定常状態の反応速度論によって測定した。ＡＰＰペプチドの各Ｋ_m 値とｋ_cat 値は、常法によっては正確に測定することができなかったため、プレセニリン１ペプチドに対する混合基質の競合的加水分解によって、そのｋ_cat ／Ｋ_m 値を測定した（Ｆｅｒｓｈｔ， Ａ．「酵素の構造と作用（Ｅｎｚｙｍｅ Ｓｔｒｕｃｔｒｅ ａｎｄ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ）」第２版、ニューヨークのダブリュ・エイチ・フリーマン・アンド・カンパニー社（Ｗ． Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐｎａｎｙ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）（１９８５））。
【００９８】
結果を図２Ａおよび２Ｂに示す。ｐＨ ４．０におけるプロ−Ｍ２_pdの小断片への変換をＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動によって示した。プロ−Ｍ２_pdと変換された酵素で移動度が異なることは、この２つを混同したものにおいて明らかである。図２Ａは、さまざまなｐＨにおける、Ｍ２_pdによる合成ペプチドｓｗＡＰＰ（表１参照）の加水分解初速度を示すグラフである。図２Ｂは、Ｍ２_pdによるペプチド基質の加水分解の定常状態における反応速度論に関する相対的ｋ_cat ／Ｋ_m 値を示すグラフである。
【００９９】
実施例６．哺乳動物細胞における発現
方法
ＰＭ２ ｃＤＮＡをｐＳｅｃＴａｇＡベクター（インビトロジェン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））のＥｃｏＲＶ部位にクローニングした。ヒト胎盤８−ｇｔ１１ライブラリー（クローンテック社（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））からヒトＡＰＰ ｃＤＮＡをＰＣＲ増幅し、ｐＳｅｃＴａｇＡのＮｈｅＩ部位とＸｂａＩ部位にクローニングした。Ｔ７による発現を行わせるためのヒーラ（ＨｅＬａ）細胞への形質転換およびワクシニアウイルス感染を行うための方法は、Ｌｉｎ， Ｘ．， ＦＡＳＥＢ Ｊ． ７：１０７０−１０８０ （１９９３）に記載されている方法と実質的に同一である。
【０１００】
トランスフェクトされた細胞を、０．５ ｍｌの無血清／無メチオニン培地において、２００マイクロＣｉ³⁵Ｓメチオニンおよびシステイン（トランスラベル（ＴｒａｎｓＬａｂｅｌ）； ＩＣＮ）によって３０分間代謝標識し、１ ｍｌの培地で洗浄し、２ ｍｌのＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳで置き換えた。小胞の酸性化を防止するために、バフィロマイシン（Ｂａｆｉｌｏｍｙｃｉｎ）Ａ１を培地に加えた（Ｐｅｒｅｚ， Ｒ． Ｇ．ら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７１：９１００−９１０７ （１９９６））。さまざまな時点（追跡）で培地を取り出し、細胞を回収して、１０ｍＭヨードアセトアミド、１０：Ｍ ＴＰＣＫ、１０：Ｍ ＴＬＣＫ、および２マイクログラム／ｍｌのロイペプチンを含む５０ ｍＭトリス、０．３ Ｍ ＮａＣｌ、５ ｍＭ ＥＤＴＡ、１％トリトンＸ−１００、ｐＨ ７．４中で溶菌した。溶菌液の上清（１４，０００×ｇ）および培地を、プロテインＧセファロース（シグマ社（Ｓｉｇｍａ））に結合した抗体上に免疫吸着させた。抗ＡＰＰ Ｎ−末端ドメイン抗体（ケミコン社（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ））を用いてＡＰＰのベータＮ−断片を回収し、抗アルファ−ベータ_1-17抗体（ケミコン社（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ））、アルファ−ベータのＮ−末端側１７残基を認識する）を用いて１２ ｋＤａのβＣ−断片を回収した。前者の抗体は、変性したタンパク質しか認識しなかったため、免疫吸着させる前に、まず、培地を２ ｍＭジチオスレイトール、０．１％ ＳＤＳの中で３０分間５５℃でインキュベートした。試料を冷却し、抗ＡＰＰ Ｎ−末端ドメイン（ケミコン社（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ））を加える前に等量の細胞溶解用バッファーで希釈した。ビーズを洗浄し、泳動用バッファーで溶出し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ノベックス（ＮＯＶＥＸ^TM））を行ない、アンプリファイ（Ａｍｐｌｉｆｙ）（アマーシャム社（Ａｍｅｒｓｈａｍ））によって増感されたゲルのオートラジオグラムまたはホスフォールイメージング（ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｉｎｇ）（モレキュラー・ダイナミクス社（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ））によって可視化した。ＰＶＤＦ膜へのトランスブロット、および抗アルファ−ベータ_1-17および化学発光基質（アマーシャム社（Ａｍｅｒｓｈａｍ））を用いる検出法によりベータＮ−末側断片の免疫検出を行なった。
【０１０１】
結果
４穴のチャンバースライドに入れた、ＡＰＰまたはＭ２によってトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞をアセトンで１０分間固定し、ＰＢＳ中０．２％トリトンＸ−１００（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）の中で６分間透過化処理を行なった。Ｍ２を局在化させるために、ヤギ抗−プロ−Ｍ２_pdポリクローナル抗体をＤＥＡＥ−セファロース６Ｂ上で精製し、アフィゲル（Ａｆｆｉｇｅｌ）（バイオラド社（ＢｉｏＲａｄ））上に固定化した組換えプロ−Ｍ２_pdに対するアフィニティー精製を行なった。製造業者のプロトコールに従って、精製した抗−プロ−Ｍ２_pd抗体をＡｌｅｘａ５６８（モレキュラー・プローブ社（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ））に結合させた。固定化した細胞を、０．１％ ＢＳＡ入りＰＢＳで１：１００に希釈した抗体とともに一晩インキュベートしてから、ＰＢＳで４回洗浄した。ＡＰＰについては、２種類の抗体を用いた。抗体Ａβ_1-17（上記）、およびベータ−セクレターゼ切断部位に続く最初の２６残基を認識する抗体Ａβ_17-42 （ケミコン社（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ））。ＰＢＳで４回洗った後、１：２００の希釈率で細胞を抗マウスＦＩＴＣ結合体とともに一晩インキュベートした。プロロング（Ｐｒｏｌｏｎｇ）抗フェード（ａｎｔｉ−ｆａｄｅ）試薬（モレキュラー・プローブ社（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ））中で細胞をマウントし、ライカ（Ｌｅｉｃａ）ＴＣＳ共焦点レーザー走査型顕微鏡上で可視化した。
【０１０２】
実施例７：ＯＭ９９−１およびＯＭ９９−２の設計と合成
メマプシン２の特異性研究の結果に基づいて、Ｐ１およびＰ１' の位置に適した残基はＬｅｕとＡｌａであろうと推定された。そして、特異性データから、Ｐ１' は、ＡｌａやＳｅｒなどの小さな残基の方を好むと測定されたが、結晶構造（以下の実施例９で決定された）からは、この部位はもっと大きな残基を収容できることが示される。メマプシン２のＰ１' は、Ａｌａ、ＳｅｒおよびＡｓｐなど、小さな側鎖をもつ残基が選択されるという、最も厳格な特異性条件をもつ位置であることが実証された。アルツハイマー病を治療するためのメマプシン２インヒビター薬物を設計するための条件である、血液脳関門を通過する上では、Ａｌａの方がＳｅｒやＡｓｐよりも疎水性があって好適であるため、Ｐ１' には主にＡｌａが選択された。このため、ＬｅｕとＡｌａの間で遷移状態アナログ等配電子体（Ｌｅｕ＊Ａｌａと表示する。ここで、＊は遷移状態にある等配電子体、−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ₂ −を意味する）が置かれるようにインヒビターを設計し、サブサイトＰ４、Ｐ３、Ｐ２、Ｐ２' 、Ｐ３' およびＰ４' は、ベータ−アミロイドタンパク質のスウェーデン型変異のベータ−セクレターゼ部位配列を充填した。インヒビターＯＭ９９−１およびＯＭ９９−２の構造を、以下、および図３Ａと３Ｂにそれぞれ示す。
ＯＭ９９−１：

（配列番号：２７）
ＯＭ９９−２：

（配列番号：２８）
【０１０３】
Ｌｅｕ＊Ａｌａジペプチド等配電子体は、以下の通りに合成した。
【０１０４】
Ｍ₂ インヒビターに対するＬｅｕ−Ａｌａジペプチド等配電子体をＬ−ロイシンから調製した。スキーム１に示すように、Ｌ−ロイシンをジエチルエーテル中１０％ ＮａＯＨ存在下でＢＯＣ₂ Ｏで１２時間処理することによって、そのＢＯＣ誘導体２として保護した。そして、クロロギ酸イソブチルおよびＮ−メチルピペリジンで処理した後、得られた混合無水物をＮ，Ｏ−ジメチルヒドロキシアミンで処理することによって、Ｂｏｃ−ロイシン２をウエインレブアミド３（Ｗｅｉｎｒｅｂ ａｍｉｄｅ ３）に変換した（ＮａｈｍとＷｅｉｎｒｅｂ、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ １９８１， ３２， ３８１５）。ジエチルエーテルに入れたリチウムアルミニウム水素化物によって３を還元したところアルデヒド４がえられた。エチルプロピオラート（ethyl propiolate）とリチウムジイソプロピルアミドの処理から生じるリチウムプロピオラート（lithium propiolate）とアルデヒド４を反応させると、４２％の単離収率でジアステレオマーの分離不可能な混合物（５．８：１）としてアセチレンアルコール５が生成された（Ｆｒａｙ， ＫａｙｅおよびＫｅｉｎｍａｎ， Ｊ． Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ． １９８６， ５１， ４８２８−３３）。Ｐｄ／ＢａＳＯ₄ 上で５の触媒的な水素化を行ない、得られたガンマ−ヒドロキシエステルの酸触媒作用によるラクトン化を、還流しているトルエン中で触媒量の酢酸を用いて行ない、７３％の収率でガンマ−ラクトン６および７を得た。これらの異性体は、溶離剤であるヘキサン中４０％酢酸エチルを用いて、シリカゲルクロマトグラフィーによって分離した。７をヨウ化メチルによって立体選択的にアルキル化することによって、Ｃ−２位へのメチル基の付加を行なった（スキーム２）。このように、テトラヒドロフラン中−７８℃でリチウムヘキサメチルジシラジド（ｌｉｔｈｉｕｍ ｈｅｘａｍｅｔｈｙｌｄｉｓｉｌａｚｉｄｅ）（２．２当量）（３０分）によってラクトン７の２価アニオンを生成し、−７８℃で３０分間ヨウ化メチルによってアルキル化した後、プロピオン酸（５当量）で急冷したところ、少量（５％未満）の対応エピマーとともに所望のアルキル化ラクトン８が提供された（収率７６％）（ＧｈｏｓｈとＦｉｄａｎｚｅ， １９９８ Ｊ． Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ． １９９８， ６３， ６１４６−５４）。溶媒系として酢酸エチルおよびヘキサンの混合液（３：１）を用いた、シリカゲルに対するカラムクロマトグラフィーによって、エピマーのシス−ラクトンを除去した。アルキル化ラクトン８の立体化学的な配分は、広範な¹ Ｈ−ＮＭＲ ＮＯＥ実験に基づいて行われた。水性リチウム水酸化物は、ラクトン８の加水分解を促進し、その後、ジメチルホルムアミド中、イミダゾールとジメチルアミノピリジン存在下、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル（ｔｅｒｔ−ｂｕｔｙｌｄｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｙｌ）塩化物によってガンマ位のヒドロキシル基が保護され、常法による精密操作とクロマトグラフィーの後に９０％の収率で酸９が生じた。ジクロロメタンに入れたトリフルオロ酢酸によって０℃で１時間処理することによってＢＯＣ基の選択的な除去を行なった。次に、得られたアミン塩を、水性ＮａＨＣＯ₃ 存在下ジオキサンの中で市販の（ミルウォーキーのアルドリッチ社（Ａｌｄｒｉｃｈ， Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ））Ｆｍｏｃ−スクシニミド誘導体と反応させたところ、クロマトグラフィーの後、６５％の収率でＦｍｏｃ−保護されたＬ＊Ａ等配電子体１０が得られた。保護された等配電子体１０は、無作為配列インヒビターライブラリーの調製に使用した。
【０１０５】
実験手順
Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−ロイシン（２）
ジエチルエーテル１４０ ｍＬ中１０ ｇ（７６．２ ｍｍｏｌ）のＬ−ロイシンの懸濁液に８０ ｍＬの１０％ＮａＯＨを加えた。全ての固体を溶解した後、２０ ｍＬ（８７．１ ｍｍｏｌ）のＢＯＣ₂ Ｏを反応混合物に加えた。得られた反応混合物を２３℃で１２時間撹拌した。この時間経過後、層を分離して、１ＮのＨＣｌ水溶液を０℃で慎重に加えて、水層をｐＨ １になるまで酸性化した。得られた混合液を酢酸エチル（３×１００ ｍＬ）で抽出した。有機層をまとめ、鹹水で洗浄してから、無水Ｎａ₂ ＳＯ₄ の上で乾燥させた。減圧下で溶剤を除去して、表題の産物を得、さらなる精製を行なうことなく次の反応に直接用いた（収率９７％）。¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) ( 4.89 (broad d, 1 H, J = 8.3 Hz), 4.31 (m, 1 H), 1.74 - 1.49 (m, 3 H), 1.44 (s, 9 H), 0.95 (d, 6 H, J = 6.5 Hz).
【０１０６】
Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−ロイシン−Ｎ' −メトキシ−Ｎ' −メチルアミド（３）
０℃のＮ₂ 雰囲気下で無水ジクロロメタン（２５ ｍＬ）に入れたＮ，Ｏ−ジメチルヒドロキシアミン塩酸塩（５．５２ ｇ， ５６．６ ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、メチルピペリジン（６．９ ｍＬ， ５６．６ ｍｍｏｌ）を一滴ずつ加えた。得られた混合液を０℃で３０分間撹拌した。別のフラスコの中で、Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル）−Ｌ−ロイシン（１）（１１．９ ｇ， ５１．４ ｍｍｏｌ）を、Ｎ₂ 雰囲気下でＴＨＦ（４５ ｍＬ）とジクロロメタン（１８０ ｍＬ）の混合液に溶解した。得られた溶液を−２０℃に冷却した。この溶液に１−メチルピペリジン（６．９ ｍＬ， ５６．６ ｍｍｏｌ）を加えてから、クロロギ酸イソブチル（７．３ ｍＬ， ５６．６ ｍｍｏｌ）を加えた。得られた混合液を−２０℃で５分間撹拌して、これに上記Ｎ，Ｏ−ジメチルヒドロキシアミン溶液を加えた。反応混合液を３０分間−２０℃に保った後、２３℃まで温めた。反応液を水で急冷して層分離させた。水層をジクロロメタン（３×１００ ｍＬ）で抽出した。一緒にした有機層を１０％クエン酸、飽和重炭酸ナトリウムおよび鹹水で洗浄した。有機層を無水Ｎａ₂ ＳＯ₄ で乾燥させ、減圧下で濃縮した。残留物をフラッシュ・シリカゲルクロマトグラフィー（２５％酢酸エチル／ヘキサン）で精製して、表記化合物３を黄白色のオイルとして回収した（１３．８ ｇ， ９７％）。¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) ( 5.06 (broad d, 1 H, J = 9.1 Hz), 4.70 (m, 1 H), 3.82 (s, 3 H), 3.13 (s, 3 H), 1.70 (m, 1 H), 1.46 - 1.36 (m, 2 H) 1.41 (s, 9 H), 0.93 (dd, 6 H, J = 6.5, 14.2 Hz).

【０１０７】
Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−ロイシナール（４）
−４０℃でＮ₂ 雰囲気下にある無水ジエチルエーテル（６０ ｍＬ）に入れたリチウムアルミニウム水素化物（７７０ ｍｇ， ２０．３ ｍｍｏｌ）の撹拌懸濁液に、ジエチルエーテル（２０ ｍＬ）に入れたＮ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−Ｌ−ロイシン−Ｎ' −メトキシ−Ｎ' −メチルアミド（５．０５ ｇ， １８．４ ｍｍｏｌ）を加えた。得られた反応混合液を３０分間撹拌した。この時間経過後、反応液を１０％ ＮａＨＳＯ₄ 溶液（３０ ｍＬ）で急冷した。次に、得られた反応混合液を２３℃まで温め、この温度で３０分間撹拌した。得られた溶液を濾過し、濾過ケーキを二部のジエチルエーテルで洗浄した。まとめた有機層を飽和重炭酸ナトリウム、鹹水で洗浄してから、無水ＭｇＳＯ₄ の上で乾燥させた。減圧下で溶剤を蒸発させると、表題のアルデヒド４（３．４１ ｇ）が黄白色のオイルとして得られた。得られたアルデヒドは、それ以上精製することなく直ちに使用した。¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) ( 9.5 (s, 1 H), 4.9 (s, 1 H), 4.2 (broad m, 1 H), 1.8 - 1.6 (m, 2 H), 1.44 (s, 9 H), 1.49 - 1.39 (m, 1 H), 0.96 (dd, 6 H, J = 2.7, 6.5 Hz).
【０１０８】
エチル（４Ｓ，５Ｓ）−および（４Ｒ，５Ｓ）−５−［（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ］−４−ヒドロキシ−７−メチロクト（ｍｅｔｈｙｌｏｃｔ）−２−イノエート（ｙｎｏａｔｅ）（５）
【０１０９】
Ｎ₂ 雰囲気下で０℃で無水ＴＨＦ（６０ ｍＬ）に入れたジイソプロピルアミンの撹拌溶液（１．１ ｍＬ， ７．９ ｍｍｏｌ）に、ｎ−ＢｕＬｉ（ヘキサン中１．６ Ｍ， ４．９５ ｍＬ， ７．９ ｍｍｏｌ）を一滴ずつ加えた。得られた溶液を０℃で５分間撹拌してから、２３℃に温めて１５分間撹拌した。この混合液を−７８℃に冷却して、ＴＨＦ（２ ｍＬ）に入れたエチルプロピオラート（８０１ μＬ）を５分間にわたって一滴ずつ加えた。この混合液を３０分間撹拌した後、８ ｍＬの無水ＴＨＦに入ったＮ−Ｂｏｃ−Ｌ−ロイシナール４（１．５５ ｇ， ７．２ ｍｍｏｌ）を加えた。得られた混合液を−７８℃で１時間撹拌した。この時間経過後、反応液をＴＨＦ（２０ ｍＬ）に入れた酢酸（５ ｍＬ）で急冷した。反応混合液を２３℃まで温め、鹹水溶液を加えた。層を分離させて、有機層を飽和重炭酸ナトリウムで洗浄し、Ｎａ₂ ＳＯ₄ 上で乾燥させた。溶剤を減圧下で蒸発させて残留物を得、それをフラッシュ・シリカゲルクロマトグラフィー（１５％酢酸エチル／ヘキサン）で精製すると、アセチレンアルコール５の混合物（３：１）が得られた（０．９６ｇ、４２％）。¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) ( 4.64 (d, 1 H, J = 9.0 Hz), 4.44 (broad s, 1 H), 4.18 (m, 2 H), 3.76 (m, 1 H), 1.63 (m, 1 H), 1.43 - 1.31 (m, 2 H), 1.39 (s, 9 H), 1.29 - 1.18 (m, 3 H), 0.89 (m, 6 H).
【０１１０】
（５Ｓ，１’Ｓ）−５−［１’−［（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ］−３’−メチルブチル］−ジヒドロフラン−２（３Ｈ）−オン（７）
酢酸エチル（２０ｍＬ）に入れた上記アセチレンアルコールの混合物（１．７３ ｇ， ５．５ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に５％ Ｐｄ／ＢａＳＯ₄ （１ｇ）を加えた。得られた混合液は、５０ ｐｓｉで１．５時間水素化した。この時間経過後、セライト（Ｃｅｌｉｔｅ）の詰め物で触媒を濾過して除き、濾液を減圧下で濃縮した。残留物をトルエン（２０ｍＬ）と酢酸（１００μＬ）に溶解した。反応混合液を６時間還流した。この時間経過後、反応液を２３℃に冷却し、溶剤を蒸発させると残留物が得られたので、これをフラッシュ・シリカゲルクロマトグラフィー（４０％ジエチルエーテル／ヘキサン）で精製すると、（５Ｓ，１Ｓ' ）−ガンマ−ラクトン７（０．９４ｇ， ６２．８および（５Ｒ，１Ｓ' ）−ガンマ−ラクトン６（０．１６ｇ， １０．７％）が得られた。¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) ( 4.50 - 4.44 (m, 2 H), 3.84 - 3.82 (m, 1 H), 2.50 (t, 2 H, J = 7.8 Hz), 2.22 - 2.10 (m, 2 H), 1.64 - 1.31 (m, 3 H), 1.41 (s, 9 H), 0.91 (dd, 6 H, J = 2.2, 6.7 Hz); ¹³C NMR (75 MHz, CDCl₃) ( 177.2, 156.0, 82.5, 79.8, 51.0, 42.2, 28.6, 28.2, 24.7, 24.2, 23.0, 21.9.
【０１１１】
（３Ｒ，５Ｓ，１Ｓ' ）−５−［１' −［（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ］−３' −メチルブチル］−３−メチルジヒドロフラン−２（３Ｈ）−オン（８）
−７８℃でＮ₂ 雰囲気下、無水ＴＨＦ（８ ｍＬ）中のラクトン７の撹拌溶液（４５１．８ ｍｇ， １．６７ ｍｍｏｌ）にリチウムヘキサメチルジシラザン（ｄｉｓｉｌａｚａｎｅ）（ＴＨＦ中、３．６７ ｍＬ， １．０ Ｍ）を３分間にわたって加えた。得られた混合液を−７８℃で３０分間撹拌して、リチウムエノラートを生成させた。この時間経過後、Ｍｅｌ（２２８μＬ）を一滴ずつ加えて、得られた混合液を−７８℃で２０分間撹拌した。この反応液を飽和ＮＨ₄ Ｃｌ水溶液で急冷し、２３℃まで温めた。この反応混合液を減圧下で濃縮し、残留物を酢酸エチル（３×１００ ｍＬ）で抽出した。まとめた有機層を鹹水で洗浄してから、無水Ｎａ₂ ＳＯ₄ の上で乾燥させた。溶剤を蒸発させると、シリカゲルクロマトグラフィー（１５％酢酸エチル／ヘキサン）で精製されて、アモルファス固体としてアルキル化ラクトン８（０．３６ ｇ， ７６％）を提供する残留物が生成された。¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) ( 4.43 (broad t, 1 H, J = 6.3 Hz), 4.33 (d, 1 H, J = 9.6 Hz), 3.78 (m, 1 H), 2.62 (m, 1 H), 2.35 (m, 1 H), 1.86 (m, 1 H), 1.63 - 1.24 (m, 3 H), 1.37 (s, 9 H), 1.21 (d, 3 H, J = 7.5 Hz), 0.87 (dd, 6 H, J = 2.6, 6.7 Hz); ¹³C NMR (75 MHz, CDCl₃) ( 180.4, 156.0, 80.3, 79.8, 51.6, 41.9, 34.3, 32.5, 28.3, 24.7, 23.0, 21.8, 16.6.
【０１１２】
（２Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−５−［（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ］−４−［（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ］−２，７−ジメチルオクタン酸（９）
ＴＨＦ（２ ｍＬ）中のラクトン８の撹拌溶液（０．３３ ｇ， １．１７ ｍｍｏｌ）に１Ｎ ＬｉＯＨの水溶液（５．８ ｍＬ）を加えた。得られた混合液を２３℃で１０時間撹拌した。この時間経過後、この反応混合液を減圧下で濃縮し、残った水性残留物を０℃に冷却してから、２５％クエン酸溶液でｐＨ ４まで酸性化した。得られた酸性溶液を酢酸エチル（３×５０ ｍＬ）で抽出した。まとめた有機層を鹹水で洗浄してから、Ｎａ₂ ＳＯ₄ の上で乾燥して濃縮し、対応するヒドロキシ酸（３３０ ｍｇ）を白色の泡として回収した。このヒドロキシ酸をさらに精製することなく、そのまま次の反応に用いた。
【０１１３】
無水ＤＭＦ中の上記ヒドロキシ酸（３３０ ｍｇ， １．１ ｍｍｏｌ）にイミダゾール（１．５９ ｇ， ２３．３４ ｍｍｏｌ）とブチルジメチルクロロシラン（１．７６ ｇ， １１．６７ ｍｍｏｌ）を加えた。得られた混合液を２３℃で２４時間撹拌した。この時間経過後、ＭｅＯＨ（４ ｍＬ）を加えて、混合液を１時間撹拌した。この混合液を２５％クエン酸（２０ ｍＬ）で希釈し、酢酸エチル（３×２０ ｍＬ）で抽出した。抽出物をまとめたものを水、鹹水で洗浄してから、無水Ｎａ₂ ＳＯ₄ の上で乾燥した。溶剤を蒸発させると、粘性のあるオイルが得られ、それをシリカゲル（３５％酢酸エチル／ヘキサン）上でフラッシュクロマトグラフィーによって精製すると、シリル（ｓｉｌｙｌ）保護された酸９（０．４４ ｇ， ９０％）が生成した。IR (neat) 3300-3000 (broad) 2955, 2932,2859,1711cm^-1; ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d⁶, 343 K) delta 6.20 (broad s, 1 H), 3.68 (m, 1 H), 3.51 (broad s, 1 H), 2.49 - 2.42 (m, 1 H), 1.83 (t, 1 H, J = 10.1 Hz), 1.56 (m, 1 H), 1.37 (s, 9 H), 1.28 - 1.12 (m, 3 H), 1.08 (d, 3 H, J = 7.1 Hz), 0.87 (d, 3 H, J = 6.1 Hz) 0.86 (s, 9 H), 0.82 (d, 3 H, J = 6.5 Hz), 0.084 (s, 3 H), 0.052 (s, 3 H).
【０１１４】
（２Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−５−［（フルオルエニルメチルオキシカルボニル）アミノ］−４−［（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ］−２，７−ジメチルオクタン酸（１０）
ジクロロメタン（２ ｍＬ）中の酸９溶液（０．１７ ｇ， ０．４１ ｍｍｏｌ）に、０℃でトリフルオロ酢酸（５００μＬ）を加えた。得られた混合液を０℃で１時間撹拌し、さらにこの混合液にトリフルオロ酢酸を一部（５００μＬ）加えた。混合液をさらに３０分間撹拌して、反応の進行をＴＬＣでモニターした。この時間経過後、水浴の温度が５℃を超えないようにして、減圧下で溶剤を慎重に除去した。残留物を５ ｍＬのＨ₂ Ｏ中のジオキサン（３ｍＬ）とＮａＨＣＯ₃ （３００ ｍｇ）に溶解した。この溶液に５ ｍＬのジオキサンに入れたＦｍｏｃスクシニミド（１６６．５ ｍｇ， ０．４９ ｍｍｏｌ）を加えた。得られた混合液を２３℃で８時間攪拌した。次に、この混合液をＨ₂ Ｏ（５ ｍＬ）で希釈し、２５％水性クエン酸でｐＨ ４に酸性化した。この酸性溶液を酢酸エチル（３×５０ ｍＬ）で抽出した。抽出物をまとめたものを鹹水で洗浄してから、Ｎａ₂ ＳＯ₄ の上で乾燥し、減圧下で濃縮して、粘性のあるオイル残留物を得た。残留物をシリカゲルによるフラッシュ・クロマトグラフィーで精製したところ、Ｆｍｏｃ保護された酸１０（１３７ ｍｇ， ６１％）が白色の泡となって生じた。¹H NMR (400 MHz, DMSO-d⁶, 343 K) ( 7.84 (d, 2 H, J = 7.4 Hz), 7.66 (d, 2 H, J = 8 Hz), 7.39 (t, 2 H, J = 7.4 Hz), 7.29 (m, 2 H), 6.8 (s, 1 H), 4.29 - 4.19 (m, 3 H), 3.74 - 3.59 (m, 2 H), 2.49 (m, 1 H), 1.88 (m, 1 H), 1.58 (m, 1 H), 1.31 - 1.17 (m, 3 H), 1.10 (d, 3 H, J = 7.1 Hz), 0.88 (s, 9 H), 0.82 (d, 6 H, J = 6.2 Hz), 0.089 (s, 3 H), 0.057 (s, 3 H).
【０１１５】
第４工程でＬｅｕ＊Ａｌａを取り込む固体状態ペプチド合成法（ｓｏｌｉｄ ｓｔａｔｅ ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）によってＯＭ９９−１とＯＭ９９−２の合成を行なった。合成されたインヒビターを逆相ＨＰＬＣによって精製し、質量分析法によってそれらの構造を確認した。
【０１１６】
実施例８．ＯＭ９９−１およびＯＭ９９−２によるメマプシン２の阻害
ＯＭ９９−１またはＯＭ９９−２を付加する以外は、上記した通りに酵素活性を測定した。ＯＭ９９−１は、図５Ａに示された通り、組換えメマプシン２を阻害した。計算されたＫｉは３×１０^-8Ｍである。用いられた基質は蛍光発生性合成ペプチド基質であった。同じ蛍光発生性基質を用いて組換えメマプシン２に対するＯＭ９９−２の阻害を測定した。Ｋｉ値は、図５Ｂに示すように、９．５８×１０^-9Ｍであると判定された。
【０１１７】
これらの結果は、予想されたサブサイト特異性が正確であることと、予想された特異性に基づいてインヒビターを設計できることを実証している。
【０１１８】
Ｍ２インヒビターは、血液脳関門（ＢＢＢ）を通過しなければならないため、Ｐ１およびＰ１' における残基が非常に重要である。Ｐ１' にＡｌａを選択すると、ＢＢＢの通過が容易になる。Ａｌａ側鎖のアナログも有効であろう。例えば、Ａｌａのメチル側鎖以外に、置換されたメチル基、およびメチル基やエチル基とほぼ同じ大きさの基でＡｌａの側鎖を置換することができる。Ｐ１におけるＬｅｕも、同じような大きさの基、またはＬｅｕの側鎖上の置換によって置き換えることができる。ＢＢＢを通過するには、インヒビターを小さくすることが望ましい。したがって、ＯＭ９９−１を出発点として、外側のサブサイトＰ４，Ｐ３、Ｐ３' およびＰ４' を切り捨てることができる。そして、強固に結合するＭ２インヒビターでＢＢＢを通過することもできるものを置換することによって、Ａｓｎ−Ｌｅｕ＊Ａｌａ−Ａｌａ（配列番号：２９）という保持された構造はさらに改善される。
【０１１９】
実施例９．特に設計されたインヒビターＯＭ９９−２と複合体化したヒトメマプシン２のプロテアーゼドメインの結晶化およびＸ線回折研究
ＯＭ９９−２と複合体化した組換えヒトメマプシン２の結晶化の条件および予備的Ｘ線回折データを測定した。
【０１２０】
組換えメマプシン２の製造
約５０ ｍｇの組換えメマプシン２を、実施例３に記載した通りに精製した。最適な結晶成長を得るためには、メマプシン２を高度に精製する必要がある。ｐＥＴ１１ａ−Ｍ２ｐｄベクターからメマプシン２を過剰発現させた。このメマプシン２は、Ｃ末端側の伸長部分の末端までに前駆体ドメインおよび触媒ドメインを含むが、膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインを含まない酵素原ドメインである。このベクターを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換して、５０ ｍｇ／リットルのアンピシリンを含むＺＢアガー上に植菌した。シングルコロニーを選び出して、５ ｍｇのアンピシリンを含む１００ ｍｌの液体ＺＢに接種し、２２０ ＲＰＭで振とうしながら３０℃で１８時間培養した。一晩培養した培養液から約１５ ｍｌの当量液を用いて、５０ ｍｇのアンピシリンを含むＬＢ各１リットルに植菌した。１８０ ＲＰＭで振とうしながら３７℃で培養菌を光学濃度が６００ ｎｍでほぼ０．８になるまで増殖させた。この時点で、各１リットルの培養液に１１９ ｍｇのＩＰＴＧを加えることによって発現を誘導した。誘導後さらに３時間インキュベーションを続けた。
【０１２１】
細菌を回収し、５０ ｍＭトリス、１５０ ｍＭ ＮａＣｌ， ｐＨ ７．５（ＴＮバッファー）に懸濁し、６ ｍｇのリゾチームと３０分間インキュベートして溶菌した後、−２０℃で１８時間凍結した。溶菌液を融解して、撹拌しながら、１ ｍＭ ＭｇＣｌ₂ 、その後１０００ ＫｕｎｉｔｚユニットのＤＮＡｓｅを加えて、３０分間インキュベートした。０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含むＴＮ（ＴＮＴバッファー）によって容量を５００ ｍｌに増加させた。９０％よりも多量のメマプシン２タンパク質を含む不溶性の封入体を遠心分離してペレットにし、１〜２時間撹拌しながらＴＮＴで再懸濁して洗浄した。さらに３回ＴＮＴで洗浄した後、４０ ｍｌの８ Ｍ尿素、１ ｍＭ ＥＤＴＡ、１ ｍＭグリシン、１００ ｍＭトリス塩基、１００ ｍＭ β−メルカプトエタノール（８ Ｍ尿素バッファー）にメマプシン２の封入体を溶かした。２８０ ｎｍにおける光学濃度を測定し、最終Ｏ．Ｄ．がほぼ０．５になるように、全部で１０ ｍＭとなるように十分な量のβ−メルカプトエタノール加え、また、１０ ｍＭ ＤＴＴ、１ ｍＭ還元型グルタチオン、および０．１ ｍＭ酸化型グルタチオンを加えつつ、８ Ｍ尿素緩衝液を用いて容量を増加させた。溶液のｐＨを１０．０以上になるように調整してから、各２００ ｍｌの当量液４つに分けた。各２００ ｍｌを迅速に撹拌しながら、４リットルの２０ ｍＭトリス塩基で直ちに希釈した。１ Ｍ ＨＣｌでｐＨをすぐに９．０に調整してから、４℃で一晩保存した。翌朝、希釈したメマプシン２溶液を室温に４〜６時間維持した後、ｐＨを８．５に調整してから、該フラスコを４℃の部屋に置き換えた。翌日、ｐＨを８．０に調整しながら同じ手順を行なった。
【０１２２】
このメマプシン２溶液を４℃に２〜３週間置いた。限外濾過（ミリポア社（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ））およびスター−セル（ｓｔｉｒ−ｃｅｌｌｓ）（アミコン社（Ａｍｉｃｏｎ））を用いて、全量で約１６リットルを４０ ｍｌまで濃縮し、予め４℃に平衡化させておいたローターの中で１４０，０００×ｇで３０分間遠心分離した。回収した上清を、０．４ Ｍ尿素、２０ ｍＭトリス塩酸、ｐＨ ８．０で平衡した２．５×１００ ｃｍのＳ−３００カラムにアプライして、同じ緩衝液によって３０ ｍｌ／時で溶出を行なった。メマプシン２の活性画分を集めて、１ ｍｌのリソース−Ｑ（ファルマシア社（Ｐｈａｒｍａｃｉａ））カラムを用いたＦＰＬＣでさらに精製した。試料を濾過し、０．４ Ｍ尿素、５０ ｍＭトリス塩酸、ｐＨ ８．０で平衡化したリソース−Ｑカラムにアプライした。試料を同一緩衝液中０〜１ Ｍ ＮａＣｌの勾配によって、２ ｍｌ／分で３０ ｍｌを超えるまで溶出した。メマプシン２を含む溶出液は、ほぼ０．４ Ｍ ＮａＣｌ付近に出現したので、結晶化処理のためにほぼ５ ｍｇ／ｍｌの濃度でプールした。
【０１２３】
結晶化前に、このタンパク質のアミノ末端配列を決定したところ、それぞれ２８ｐと３０ｐの残基で開始する２種類の配列を示した。明らかに、組換えプロメマプシン２の前駆ペプチドは、未確認のタンパク質分解活性によって調製を行っている間に切断された。
【０１２４】
フォールディングされた酵素前駆体から成熟酵素であるメマプシン２への活性化は、上記したようにして、すなわち、０．１ Ｍの酢酸ナトリウムｐＨ ４．０中、２２℃で１６時間インキュベートして実施した。リソース−Ｑ陰イオン交換カラムによる陰イオン交換カラムクロマトグラフィーを用いて、活性化された酵素をさらに精製した。酵素の純度は、ＳＤＳ−ゲル電気泳動によって明らかにした。酵素の活性を確認するため、精製の各工程で上記したようにして酵素の比活性を測定した。
【０１２５】
ＯＭ９９−２による予備的結晶化
Ｋｉ ＝ １０ ｎＭをもち、基質ベースの遷移状態にあるインヒビターＯＭ９９−２と複合体になっている精製メマプシン２について結晶実験を行なった。ＯＭ９９−２は、Ｓ１とＳ１' （Ｌ−Ａ）の間のペプチド結合が、遷移状態の等配電子体であるヒドロキシエチレンによって置換されている８個のアミノ酸残基（ＥＶＮＬＡＡＥＦという配列中にサブサイトＳ４、Ｓ３、Ｓ２、Ｓ１ Ｓ１' 、Ｓ２' 、Ｓ３' 、およびＳ４' を含む）に相当する。精製したＭ２を濃縮して、１０倍過剰モル量のインヒビターと混合した。この混合液を室温で２〜３時間インキュベートして、インヒビターの結合を最適化した。水滴蒸気拡散法（ｈａｎｇｉｎｇ ｄｒｏｐ ｖａｐｏｒ ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ）を用いて２０℃で結晶化実験を行なった。メマプシン２／ＯＭ９９−２インヒビター複合体の最適な結晶化条件を見つけるために、さまざまな結晶化条件を用いた体系的な調査を行なった。第一段階では、可能な条件範囲を広くカバーすることを目指して、ハンプトンリサーチ社（Ｈａｍｐｔｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）から購入したスパースマトリクス結晶化スクリーニングキット（Ｓｐａｒｓｅ Ｍａｔｒｉｘ Ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｔｉｏｎ Ｋｉｔｓ）を用いて大まかなスクリーニングを行なった。タンパク質濃度と温度を付加的な変数として用いた。続いて、ｐＨ、沈殿剤濃度などの細密なグリッドを用いて、有望な（微小）結晶を生じた条件を最適化の出発点として用いた。
【０１２６】
３０％ＰＥＧ８０００、０．１ Ｍ Ｎａコカダイレート（Ｃｏｃａｄｙｌａｔｅ）、ｐＨ ６．４でメマプシン−インヒビター複合体の結晶が得られた。溶解した結晶のＳＤＳゲル電気泳動によって、結晶の内容がメマプシン２であることを確認した。Ｒａｘｉｓ ＩＶ画像プレート上でデータ収集するために、いくつかの単結晶（約０．３ ｍｍ×０．２ ｍｍ×０．１ ｍｍのサイズをもつ）を塊から注意深く取り出した。これらの結果は、結晶が２．６Åまで回折することを示していた。典型的なタンパク質の回折パターンを図６に示す。Ｘ線画像の可視化および統合用ソフトウエア−Ｄｅｎｚｏを用いて可視化し、回折データを指標化した。Ｄｅｎｚｏによって、原始的な斜方晶格子が、偏向度指数が有意に低く、最も高い対称性をもつことを確認した。単位格子パラメータは、α＝８９．１Å，ｂ＝９６．６Å，ｃ＝１３４．１Å，α＝β＝γ＝９０°であると測定された。結晶学的な非対称単位当たり２個のメマプシン２／ＯＭ９９−２複合体が存在し、結晶のＶｍ値は２．９ų ／Ｄａである。回折の消滅によって、空間群はＰ２₁ ２₁ ２₁ であることを示唆していた。
【０１２７】
本結晶が２．６Åまで回折することから、これらのデータから得られた結晶構造は、原子的な解決、すなわち、原子の三次元的配置を明らかにする可能性があり、インビボおよびメマプシン２における化学結合を導き出すことができるかもしれない。メマプシン２の配列は、例えば、ペプシンまたはカテプシンＤなど、哺乳動物の他のアスパラギン酸プロテアーゼに相同性があるため、メマプシン２の三次構造は、それらの構造物に類似（同一ではないが）していると予想される。したがって、本結晶から得られた回折データからＸ線構造を決定するときには、アスパラギン酸プロテアーゼの既知の結晶構造を検索モデルとして用いる分子置換法から位相の解が得られる可能性が高い。
【０１２８】
さらなる結晶化研究
濃縮したメマプシン２を１０倍モル過剰のインヒビターと混合した。この混合液を室温で２〜３時間インキュベートして、インヒビター結合を最適化してから、０．２ミクロンのフィルターによって、遠心分離を用いて清澄化した。同量の酵素−インヒビターおよび充分量の溶液を用いた水滴蒸気拡散法によって、メマプシン２−インヒビター複合体の結晶を２０℃で成長させた。回折実験に適した品質の結晶が、０．１ Ｍカコダイレート（ｃａｃｏｄｙｌａｔｅ）ナトリウム、ｐＨ ７．４、０．２ Ｍ （ＮＨ₄ ）₂ ＳＯ₄ 、および２２．５％ＰＥＧ８０００において２週間で得られた。結晶の一般的な大きさは約０．４×０．４×０．２ ｍｍ³ であった。
【０１２９】
回折データは、リガク（Ｒｉｇａｋｕ）Ｘ線発生器を有するＲａｘｉｓ ＩＶ画像プレート上で測定し、ＨＫＬプログラムパッケージによって処理した［Ｚ． Ｏｔｗｉｎｏｗｓｋｉ、Ｗ． Ｍｉｎｏｒ， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． ２７６， ３０７ （１９９７）］。大きさが約０．４×０．４×０．２ ｍｍ³ の単一結晶を、２５％ＰＥＧ８０００、２０％グリセロール、０．１ Ｍカコダイレートナトリウム、ｐＨ ６．６、および０．２Ｍ （ＮＨ₄ ）₂ ＳＯ₄ からなる凍結防止液で処理してから、データを集めるため、液体窒素によって瞬時に−１８０℃まで冷却した。回折は１．９Å以上で観察された。結晶形は、空間群Ｐ２₁ に属し、結晶学的な非対称ユニット当たり２個のメマプシン２／ＯＭ９９−２複合体をもち、溶剤含量が５６％であった。
【０１３０】
分子置換は、プログラムＡｍｏＲｅ、ＣＣＰ４パッケージ［Ｎａｖａｚａ， Ｊ．，Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇ． Ｓｅｃｔ． Ａ． ５０， １５７ （１９９４）］を使用し、１５．０〜３．５Åの範囲にあるデータを用いて行なった。２２％の配列同一性を有するヒトアスパラギン酸プロテアーゼであるペプシンを検索モデル（ＰＤＢ ｉｄ １ｐｓｎ）として使用した。ローテーションおよびトランスレーション検索を行なった後、リジッドボディーリファインメント（ｒｉｇｉｄ ｂｏｄｙ ｒｅｆｉｎｅｍｅｎｔ）を行なって、最上解（ｔｏｐ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を確認し、両方の分子を非対称ユニット内に位置づけた。最初の解は、相関係数が２２％で、Ｒ−ファクターが０．５１であった。プログラムＣＮＳを用いて修正を行なった［Ｂｒｕｎｇｅｒら、Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｇｒ． Ｓｅｃｔ． Ｄ， ５４， ９０５ （１９９８）］。Ｒ_freeモニタリングに対するリファインメントを行なう前に、１０％の反射を無作為に選択した［Ｂｒｕｇｅｒ， Ａ．Ｔ．， Ｘ−ＰＬＯＲバージョン３．１：Ｘ線結晶学およびＮＭＲのための装置（Ａ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｘ−ｒａｙ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ ａｎｄ ＮＭＲ）、コネチカット州ニューヘブン（Ｎｅｗ Ｈｅａｖｅｎ， ＣＴ）のイェール大学出版（Ｙａｌｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ）（１９９２）］。マップを表示し、モデルを構築するために分子グラフプログラム（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｇｒａｐｈｉｃ ｐｒｏｇｒａｍ）［Ｊｏｎｅｓ， Ｔ．Ａ．ら、電子密度マップにおけるタンパク質モデルを構築するための改良法、およびこれらのモデルにおける誤差の位置（Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｂｕｉｌｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍｏｄｅｌｓ ｉｎ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｄｅｎｓｉｔｙ ｍａｐｓ ａｎｄ ｌｏｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｒｒｏｒｓ ｉｎ ｔｈｅｓｅ ｍｏｄｅｌｓ）、Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ． Ｓｅｃｔ． Ａ ４７， １１０ （１９９１）］を用いた。配列アラインメントに従って、最初のペプシンモデルから、対応するアミノ酸残基をメマプシン２のアミノ酸残基に変えた。最初の電子密度マップおよびロトマー（ｒｏｔｏｍｅｒ）ライブラリーによって側鎖のコンフォメーションを決定した。分子の動態およびＣＮＳのエネルギー最小化作用によってこのモデルを修正した［Ｂｒｕｇｅｒ，ＡＴら、Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｇｒ． Ｓｅｃｔ． Ｄ， ５４， ９０５ （１９９８）］。最初のサイクルの修正では、Ｒ_working が４１％、Ｒ_freeが４５％となった。この段階では、オミットマップ（ｏｍｉｔ ｍａｐ）における電子密度は、活性部位の間隙におけるインヒビターコンフィギュレーションを明らかに示していた。鎖トレーシング、二次構造、挿入、欠失、および伸長（検索モデルと比較して）において、メマプシン２に独特な構造的な特徴を同定して、さらに、結晶学的なリファインメントとマップへのフィッティングを繰り返した。インヒビターを対応する電子密度の中に構築した。
【０１３１】
次に、３シグマレベルに合わせた｜Ｆｏ｜−｜Ｆｃ｜マップにおいて同定された構造体に約４４０個の溶媒分子を徐々に加えた。非結晶学的な対称限定および平均化法をリファインメントおよびモデル構築の初期の段階で用いた。リファインメントを行なっている間、大量の溶媒と異方性全Ｂファクター補正を適用した。Ｌａｓｋｏｗｓｋｉ， Ｒ．Ａ．ら、Ｊ． Ａｐｐｌ． Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇ． ２６， ２８３ （１９９３）のＰＲＯＣＨＥＣＫプログラムによって最終構造物を確認したところ、９５％の残基がラマチャンドラン（Ｒａｍａｃｈａｎｄｒａｎ）プロットの最も好適な領域に位置づけられている。主鎖および側鎖のパラメータはすべて、標準的な基準の範囲内にあるか、それよりも優れている。最終的なＲ_working とＲ_freeは、それぞれ１８％と２２％である。リファインメントの統計値は表２に挙げてある。
【０１３２】
【表２】

【０１３３】

、ここで、Ｉ_hkl.i は、ｉｔｈ測定値の強度を示し、＜Ｉ_hkl＞は、Ｉ_hkl の測定値すべての重みづけをした平均値である。

、ここで、Ｆ₀ およびＦｃは、測定され計算された構造因子である。かっこ内の数字は、最高の解像構造（ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｓｈｅｌｌ）（２．００〜１．９Å）に対して対応する数である。

による反射は、リファインメントとＲファクターの計算の中に含まれる。
【０１３４】
メマプシン２の結晶構造
メマプシン２の二裂片性（bilobal）構造（図７）は、球形のコアという保存されたフォールディングをもつアスパラギン酸プロテアーゼの特徴である（Ｔａｎｇ， Ｊ．，ら、Ｎａｔｕｒｅ ２７１， ６１８−６２１ （１９７８））。基質結合間隙は、インヒビターが結合するところである（図７）が、２つのローブ（lobes）の間にある。Ｎ−末側ローブ（１〜１８０位の残基）およびＣ−末側ローブ（１８１〜３８５位の残基）の間にある（図７）疑似二重対称体は、４Åカットオフを用いると、全体で２．３Åｒｍｓの偏差で６１個の重ね合わせ可能な原子を共有する。ペプシンでこれらに相当する数字は６７個の原子および２．２Åである。活性部位のＡｓｐ³²とＡｓｐ²²⁸ 、および周囲の水素結合ネットワークは、間隙の中央に位置し（図７）、一般的な活性部位のコンフォメーションによって保存されている（Ｄａｖｉｅｓ， Ｄ．Ｒ．，Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｃｈｅｍ． １９， １８９ （１９９０））。しかし、活性部位にあるカルボキシル基は、同一平面上にはなく、その角度（５０°）は以前に測定されたものを上回っている。
【０１３５】
ペプシンと比較すると、Ｎ−末側ローブのコンフォメーションは実質的に保存されている（Ｓｉｅｌｅｃｋｉら、１９９０）。もっとも重要な構造上の違いは、Ｃ−末側ローブにおける挿入とＣ末端の伸長である。ヘリックスおよびループにある４つの挿入（図７）は、隣接する分子表面上にある。挿入Ｆは、４個の酸性残基を有しているが、この分子上で最も負に荷電した表面である。まとめると、これらの挿入によって、ペプシンと比較すると、メマプシン２の分子の境界線が有意に広がったのである（図８）。これらの表面の構造変化は、メマプシン２が他の細胞表面成分と結合するときに機能するのかもしれない。挿入ＢおよびＥは、分子の別の側面上にある（図７）。後者は、Ｃ末端から伸長したＧの一部と対合するベータ鎖を有している。活性部位間隙の反対面上のフラップに面しているループ上の３２９位のところで６残基の欠失が起きていて、外見上、より結合しやすい間隙ができている。Ｃ末端伸長の大部分（３５９〜３９３位の残基）は非常に秩序正しい構造になっている。３６９〜３７６位の残基は、鎖２９３〜２９９位に対する７個の水素結合によってベータ構造を形成し、一方、３７８〜３８３位の残基は、ヘリックスを形成している（図７および８）。メマプシン２に独特な２個のジスルフィド対（１５５／３５９位および２１７／３８２位の残基）は、伸長した領域の両端をＣ−末側ローブに固定化している。このＣ末端伸長は、以前観察されたものよりもずっと長く、コンフォメーションからして異なっている［Ｃｕｔｆｉｅｌｄ， Ｓ． Ｍ．ら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ３， １２６１ （１９９５）；Ａｂａｄ−Ｚａｐａｔｅｒｏ， Ｃ．ら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ． ５， ６４０ （１９９６）； Ｓｙｍｅｒｓｋｙ， Ｊ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３６， １２７００ （１９９７）；Ｙａｎｇ， Ｊ．ら、Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ． Ｄ ５５， ６２５ （１９９９）］。最後の８残基（３８６〜３９３位）は電子密度マップでは見られず、それらは、球形の触媒ドメインと膜アンカードメインの間で結合用ステムを形成するのかもしれない。
【０１３６】
２１個の推定前駆体残基のうち、最後の６個、４３ｐ〜４８ｐだけが電子密度マップで可視化することができる。残りは、移動する可能性が高い。哺乳動物培養細胞中で発現したプロメマプシンはＧｌｕ^33p がＮ末側位置である。しかし、残基４３ｐ〜４４ｐに存在するＡｒｇ−Ａｒｇ配列は、例えば、プロレニン（ｐｒｏｒｅｎｉｎ）（Ｃｏｒｖｏｌ， Ｐ．ら、Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ ５． １３−９ （１９８３））におけるように、プロタンパク質プロセッシングのための頻出シグナルである。この切断に由来する組換えメマプシン２は完全に活性をもつ。残基２８ｐ〜４２ｐの移動性は、これらが成熟メマプシン２の構造の一部でないことを示唆している。
【０１３７】
メマプシン２−ＯＭ９９−２相互作用
８残基からなるインヒビターＯＭ９９−２の活性部位間隙における結合は、他のアスパラギン酸プロテアーゼ−インヒビター複合体といくつか共通の構造的な特徴を有する〔Davies, D.R., Annu. Rev. Biophys. Chem. 19,189(1990);BaileyとCooper,(1994);Dealwisら，(1994)〕。これらには、遷移状態にある等配電子体のヒドロキシル基に対する、活性部位にある２つのアスパラギン酸の間における４個の水素結合、インヒビターの中央部分をフラップ（６９〜７５位の残基）で覆うこと、およびインヒビターの骨格に対する１０個の水素結合が含まれる（図９）。後者の大部分はアスパラギン酸プロテアーゼの中で高度に保存されている〔Davies, D.R., Annu. Rev. Biophys. Chem. 19,189(1990);BaileyとCooper,(1994);Dealwisら，(1994)〕。ただし、Ｇｌｙ¹¹およびＴｙｒ¹⁹⁸ への水素結合はメマプシン２に固有のものである。これらの観察結果は、基質ペプチドの骨格に対するメマプシン２の遷移状態にある鋳型、および触媒の機序が、他のアスパラギン酸プロテアーゼと同様になる方法を具体的に示している。しかしながら、これらの共通の特徴は、高度な選択性をもつ特定のメマプシン２インヒビターを設計する上で決定的な要因ではない。
【０１３８】
インヒビター薬物を設計する上で重要な観察結果は、インヒビターの各側鎖と接触しているメマプシン２の残基（図９）は、他のアスパラギン酸プロテアーゼの残基とは全く異なっているということである。これら側鎖の接触は、高い選択性をもって固く結合するインヒビターを設計する上で重要である。ＯＭ９９−２の５個のＮ末端残基は、引き延ばされた形のコンフォメーションになっているが、Ｐ₁ ' Ａｌａ以外はすべて、活性部位の間隙にある酵素残基と、明らかに限定された（インヒビターの側鎖の４Å以内で）接触をもつ（図９）。
【０１３９】
プロテアーゼのＳ₄ サブサイト（subsite）は、ほとんど親水性で、溶媒に対して開いている。インヒビターのＰ₄ Ｇｌｕの側鎖位置は、Ｇｌｙ¹¹およびＰ₂ Ａｓｎ（図９）、および近傍にあるＡｒｇ²³⁵ およびＡｒｇ³⁰⁷ の側鎖への水素結合によって規定されるが、このことが、ＯＭ９９−２からこの残基をなくすとＫｉ値が１０倍増加する理由を説明している。同様に、プロテアーゼのＳ₂ サブサイトは、比較的親水性が高く、溶媒に対して開いている。インヒビターのＰ₂ Ａｓｎ側鎖は、Ｐ₄ ＧｌｕとＡｒｇ²³⁵ に水素結合している。比較的小さなＳ₂ である残基Ｓｅｒ³²⁵ とＳｅｒ³²⁷ （ペプシンではそれぞれＧｌｎおよびＭｅｔ）は、Ａｓｎよりも大きな側鎖に適合することができる。メマプシン２のＳ₁ およびＳ₃ サブサイトは、大部分が疎水性残基からできているが、ペプシンのヘリクスｈ_H2が欠失しているために、ペプシンとは非常に異なったコンフォメーションをもっている〔Ｄｅａｌｗｉｓら、（１９９４）〕。インヒビターの側鎖であるＰ₃ ＶａｌおよびＰ₁ Ｌｅｕは、互いに対して密接に折り畳まれており、この酵素と実質的に疎水性結合しており（図９）、特に、Ｐ₃ は、Ｔｙｒ⁷¹およびＰｈｅ¹⁰⁸ と相互作用する。未変性のＡＰＰのベータ−セクレターゼ部位において、Ｐ₂ およびＰ₁ 残基はそれぞれＬｙｓおよびＭｅｔである。スウェーデン型変異ＡＰＰは、これらの位置にそれぞれＡｓｎおよびＬｅｕをもち、その結果、ｋ_cat ／Ｋ_m 値が未変性のＡＰＰの値よりも６０倍増加し、Ｍｕｌｌａｎ， Ｍ．ら［Ｎａｔ． Ｇｅｎｅｔ． ２， ３４０（１９９２）］が記載した早期ＡＤ発病がもたらされた。この構造は、インヒビターのＰ₂ Ｌｙｓがその正の電荷をＡｒｇ²³⁵ との好ましからざる相互作用に投入して、Ａｒｇ²³⁵ との水素結合を失う一方で、Ｐ₁ Ｍｅｔは、ロイシンがこの部位でもつ接触よりも好ましからざる接触をメマプシン２との間でもつことを示唆している（図１０）。メマプシン２との密接な接触は、Ｐ₁'Ａｌａでは見られないので、この位置にあるアスパラギン酸は、ＡＰＰにおけると同じように、Ａｒｇ²²⁸ と相互作用することによって居場所を確保する可能性がある。
【０１４０】
インヒビターの鎖の方向は、Ｐ₂'のところで変化して、Ｐ₃'およびＰ₄'をタンパク質の表面に導く（図１０）。その結果、Ｐ₂'Ａｌａの側鎖位置が、通常の伸長型のコンフォメーションよりずれる。Ｐ₃'ＧｌｕおよびＰ₄'Ｐｈｅの側鎖は両方とも、プロテアーゼとの重要な相互作用をほとんどすることなく分子表面に向かわされる（図１０）。比較的高いＢ−ファクター（Ｇｌｕについては５８．２Ų 、Ｐｈｅについては７５．６Ų ）と、十分には定義されていない電子密度は、これら２つの残基が、レニン（ｒｅｎｉｎ）インヒビター（ＣＨ−６６）複合体（Ｄｅａｌｗｉｓら、１９９４）中のＳ₃'およびＳ₄'サブサイトの特定された構造とは対照的に比較的可動的であることを示唆している。これらのレニンサブサイトとトポロジー的に同等の領域（ペプシンの残基番号では２９２〜２９７位）は、メマプシン２では欠失している。これらの観察結果は、ＯＭ９９−２の３個のＣ末端残基のコンフォメーションがメマプシン２の機能的な特徴であり、活性部位間隙から長いタンパク質基質を導きだす方法であるかもしれないことを示唆している。
【０１４１】
実施例１０．インヒビターを設計するための結晶構造の使用
製薬学的に許容されるインヒビター薬物には、通常、８００ダルトンよりも小さいというサイズ限定が付されている。メマプシン２インヒビターの場合、薬物が血液脳関門を通過しなければならないために、この要件はさらに厳格であろう［ＫｅａｒｎｅｙとＡｗｅｅｋａ、（１９９９）］。今回のモデルでは、Ｐ₄ からＰ₂'までを使用する十分に定義されたサブサイト構造によって、このような薬物を合理的に設計するための十分な鋳型領域が提供される。この結晶構造から明らかであるように、それぞれのインヒビターの側鎖と、それに対応する酵素のサブサイトとの空間的な関係によって、これらの位置それぞれにおいて、新しいインヒビター構造物の設計が可能である。サブサイトＰ₂'、Ｐ₃'およびＰ₄'のユニークなコンフォメーションをメマプシン２インヒビターの選択性の中に取り込むことも可能である。今回の結晶構造に基づいたインヒビター設計の実例を以下に示す。
【０１４２】
実施例Ａ：Ｐ₃ ＶａｌおよびＰ₁ Ｌｅｕの側鎖は、互いに対して固くまとまっていて、その間に酵素構造がないため、これらの側鎖を架橋すれば、インヒビターのメマプシン２に対する結合強度を高めることができよう。これは、酵素に結合するときに、架橋したインヒビターは架橋していない同じものよりも遊離型と結合型の間にエントロピーの違いがでにくいであろう［Ｋｈａｎ， Ａ．Ｒ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３７， １６８３９ （１９９８）］。架橋した側鎖の取りうる構造には、図１１に示すものが含まれる。
【０１４３】
実施例Ｂ：同じ状況が、Ｐ４ＧｌｕとＰ２Ａｓｎの間に存在する。今回の結晶構造は、これらの側鎖がすでに互いに水素結合しているので、これらの間を架橋しても、実施例Ａに記載したような結合利益が派生するだろう。架橋した構造物には、図１２に示すものなどがある。
【０１４４】
実施例Ｃ：今回の結晶構造に基づいて、新しい疎水性、ファンデルワールス力、およびＨ−結合による相互作用を付加するため、Ｐ１’Ａｌａ側鎖を延長させることができる。このような設計の一例が図１３の略図に含まれている。
【０１４５】
実施例Ｄ：今回の結晶構造に基づいて、Ｐ１領域、Ｐ２領域およびＰ３領域の中のポリペプチド骨格、およびＰ１−Ｌｅｕの側鎖を２個の原子を付加することによって橋架けして環にすることができる（図１４のＡおよびＢ）。また、メチル基をＰ１−Ｌｅｕのベータ位炭素に付加することもできる（図１４）。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、ベクターｐＥＴ−１１ａ−メマプシン２−Ｔ１およびｐＥＴ−１１ａ−メマプシン２−Ｔ２のプラスミド構築物を示す。Ｔ７プロモーター、該ベクター由来のアミノ酸配列（Ｔ７タンパク質）（配列番号：３）およびメマプシン２ Ｔ１およびＴ２構築物の始点および終点を示す。構築物プロメマプシン２−Ｔ１は、結晶化用のタンパク質の調製に用いた。これは、ベクターｐＥＴ−１１ａに由来する残基１ｖ〜１５ｖを含む。残基１ｐ〜４８ｐは推定プロペプチドである。残基１〜３９３は成熟プロテアーゼドメインおよびＣ末端伸長に対応する。メマプシン２の残基のナンバリングはアラインメントを行ったペプシンのＮ末端位置で始まる（図３）。
【図２】 図２Ａは、異なるｐＨでのＭ２_pdによる合成ペプチドｓｗＡＰＰ（表１を参照）の加水分解の初速度を示すグラフである。図２Ｂは、Ｍ２_pdによるペプチド基質の加水分解の定常状態の速度論についての相対的なｋ_cat ／Ｋ_m 値を示すグラフである。
【図３】 図３Ａおよび図３Ｂは、メマプシン２インヒビターＯＭ９９−２およびＯＭ９９−１の化学構造である。
【図４】 図４Ａは、ＯＭ９９−１による組換えメマプシン２の阻害を示すグラフである。図４Ｂは、ＯＭ９９−２による組換えメマプシン２の阻害を示すグラフである。
【図５】 図５Ａ〜図５Ｅは、組換えメマプシン２‐ＯＭ９９−２複合体の結晶の写真である。
【図６】 図６は、ＯＭ９９−２が結合したメマプシン２プロテアーゼドメインの結晶構造の立体図である。メマプシン２のポリペプチド骨格をリボン図で示す。Ｎ‐ローブおよびＣ−ローブは、それぞれ「青色」および「黄色」で示される。ただし例外として、Ｃ−ローブ中の挿入ループ（Ａ〜Ｇで示す、図６参照）は「マゼンタ色」で示され、Ｃ末端伸長は「緑色」で示される。これらのローブの間のインヒビター結合は「赤色」で示される。
【図７】 図７は、メマプシン２およびペプシンの三次元構造の比較を示す立体図である。前者の分子表面は、表面ループならびにヘリックスの挿入およびＣ末端伸長により、かなり大きいものとなっている。ヒトメマプシン２の鎖のトレースは「濃い青色」で示され、ヒトペプシンの場合は「グレー色」で示される。「淡い青色」で示されたボールは、トポロジー同等である同じ残基を示す。ジスルフィド結合は、メマプシン２の場合は「赤色」で示され、およびペプシンの場合は「オレンジ色」で示される。Ｃ末端伸長は「緑色」で示される。
【図８】 図８は、ＯＭ９９−２とメマプシン２プロテアーゼドメインとの相互作用を示す概略図である。Ｓ₃ ’およびＳ₄ ’サブサイトは規定されていない。
【図９】 図９は、インヒビターＯＭ９９−２（「オレンジ色」で示される）とメマプシン２（「淡い青色」で示される）との相互作用を示す立体図である。窒素原子および酸素原子はそれぞれ「青色」および「赤色」で示される。水素結合は破線で示される。結合サブサイトを含むメマプシン２残基が含まれる。ＯＭ９９−２の残基Ｐ₄ 、Ｐ₃ 、Ｐ₂ 、Ｐ₁ およびＰ₁ ’（図８中で規定）は、より広い範囲の立体配座の中にある。インヒビター鎖は残基Ｐ _２ ’で折り返しており、この位置で目立ったキンク（kink）を形成する。Ｐ₃ ’およびＰ₄ ’の骨格により、該インヒビターは活性部位からはみ出ている。
【図１０】 図１０は、今回の結晶構造に基づくメマプシン２の新しいインヒビターの設計におけるＰ₃ Ｖａｌ側鎖とＰ₁ Ｌｅｕ側鎖との間の架橋を示す概略図である。位置Ｐ₂ およびＰ₁ ’のＲおよびＲ’は、アミノ酸側鎖を示す。明瞭に示すため、インヒビターの他の構造的要素は省いてある。
【図１１】 図１１は、今回の結晶構造に基づくメマプシン２の新しいインヒビターの設計におけるＰ₄ Ｇｌｕ側鎖とＰ₂ Ａｓｎ側鎖との間の架橋を示す図である。位置Ｐ₃ のＲは、アミノ酸側鎖を示す。明瞭に示すため、インヒビターの他の構造的要素は省いてある。
【図１２】 図１２は、今回の結晶構造に基づく新しいメマプシン２インヒビターのＰ₁ ’サブサイトにある側鎖の設計を示す概略図である。矢印はメマプシン２とインヒビターとの間で起こりうる相互作用を示す。明瞭に示すため、インヒビターの他の構造的要素は省いてある。
【図１３】 図１３は、原子ＡおよびＢを加えることによるインヒビター構造内での２つの６員環の設計を示す概略図である。環形成は、Ｐ₁ 、Ｐ₂ およびＰ₃ 付近のペプチド骨格のＰ₁ −Ｌｅｕ側鎖を含む。新しい結合は破線で示す。Ｐ₁ −Ｌｅｕのβ炭素にメチル基を加えることができる。明瞭に示すため、インヒビターの他の構造的要素は省いてある。
【配列表】

Claims (7)

1. 配列番号：３のアミノ酸残基1〜456からなり、かつベータ−セクレターゼ活性を有する組換えメマプシン２タンパク質であって、該メマプシン２タンパク質は、細菌細胞中で発現され、細菌細胞中での発現後にリフォールディングされたものである、組換えメマプシン２タンパク質。
2. 該メマプシン２タンパク質が、
   (a)メマプシン２タンパク質を含む封入体を、8Mの尿素濃度および少なくとも１つの還元剤を有する少なくともpH 8.0のpHの尿素溶液中に溶解する工程；
   (b)工程(a)で得られた溶液を、少なくともpH 9のpHを有する水性緩衝液中に希釈する工程；
   (c)工程(b)で得られた溶液のpHをpH 8に調整する工程；ならびに
   (d)工程(c)で得られた溶液を、24〜48時間の範囲の時間、4℃の温度で維持する工程
   を含む方法によってリフォールディングされる、請求項１記載のメマプシン２タンパク質。
3. 該メマプシン２タンパク質が、
   (a)メマプシン２タンパク質を含む封入体を、8Mの尿素濃度および少なくとも１つの還元剤を有する少なくともpH 8.0のpHの尿素溶液中に溶解する工程；
   (b)工程(a)で得られた溶液を、少なくともpH 9のpHを有し、酸化型グルタチオンおよび還元型グルタチオンを含む水性緩衝液中に希釈し、それによって、メマプシン２タンパク質の希釈溶液の尿素濃度が0.4Mまで減少される工程；ならびに
   (c)工程(b)で得られた溶液のpHをpH 8に調整する工程
   を含む方法によってリフォールディングされる、請求項１記載のメマプシン２タンパク質。
4. 該メマプシン２タンパク質が、
   (a)メマプシン２タンパク質を含む封入体を、8Mの尿素濃度およびpH 10以上のpHを有する尿素溶液中に溶解する工程；
   (b)工程(a)で得られた溶液を水性緩衝液中に希釈する工程；
   (c)工程(b)で得られた溶液のpHをpH 9.0に調整する工程；ならびに
   (d)工程(c)で得られた溶液を、4℃の温度で１６時間維持する工程
   を含む方法によってリフォールディングされる、請求項１記載のメマプシン２タンパク質。
5. 該方法が、
   (e)工程(d)で得られた溶液を６時間室温まで平衡化する工程；
   (f)工程(e)で得られた溶液のpHを8.5に調整する工程；
   (g)工程(f)で得られた溶液を１８時間４℃の温度まで冷却する工程；
   (h)工程(g)で得られた溶液を６時間室温まで平衡化する工程；
   (i)工程(h)で得られた溶液のpHを8.0に調整する工程；および
   (j)工程(i)で得られた溶液を４〜７日間４℃の温度まで冷却する工程
   をさらに含む、請求項４記載のメマプシン２タンパク質。
6. 配列番号：３のアミノ酸残基43〜456または配列番号：３のアミノ酸残基45〜456からなる、メマプシン２タンパク質。
7. 請求項６記載のメマプシン２タンパク質、または配列番号：３のアミノ酸残基43〜456からなるメマプシン２タンパク質および配列番号：３のアミノ酸残基45〜456からなるメマプシン２タンパク質の混合物を含む、組成物。

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