JP6993228B2 - 抗トランスフェリン受容体/抗bace1多重特異性抗体および使用方法 - Google Patents
抗トランスフェリン受容体/抗bace1多重特異性抗体および使用方法 Download PDFInfo
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Description
本出願は米国特許仮出願第62/081,965号(2014年11月19日出願)の優先権の利益を主張するものであり、如何なる目的に対しても参照によりその全体が本明細書に援用される。
本出願は、電子形式の配列表と共に出願される。配列表は、2015年11月18日に作成されたサイズが352,040バイトの「2015-11-18_01146-0041-00PCT_ST25.txt」と題されたファイルとして提供され、2018年6月25日に作成されたサイズが352,761バイトの「2018-06-25_01146-0041-00US_Seq_List_Revised.txt」と題されたファイルと置き換えられる。この配列表の電子形式の情報は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
a)配列番号151~156から選択されたHVR-H1配列、配列番号172~175から選択されたHVR-H2配列、配列番号200及び201から選択されたHVR-H3配列、配列番号212及び213から選択されたHVR-L1配列、配列番号219及び220から選択されたHVR-L2配列、配列番号225~228及び248から選択されたHVR-L3配列、あるいは
b)配列番号157~171、376,381及び382から選択されたHVR-H1配列、配列番号176~199、377、383及び405から選択されたHVR-H2配列、配列番号202~211、378、379、384及び385から選択されたHVR-H3配列、配列番号214~218から選択されたHVR-L1配列、配列番号219~224及び375から選択されたHVR-L2配列、配列番号229~247から選択されたHVR-L3配列を含む抗体後半を備えた多重特異性抗体TfRを提供する。
a)配列番号151~156から選択されたHVR-H1配列、配列番号172~175から選択されたHVR-H2配列、配列番号200及び201から選択されたHVR-H3配列、配列番号212及び213から選択されたHVR-L1配列、配列番号219及び220から選択されたHVR-L2配列、配列番号225~228及び248から選択されたHVR-L3配列、あるいは
b)配列番号157~171、376,381及び382から選択されたHVR-H1配列、配列番号176~199、377、383及び405から選択されたHVR-H2配列、配列番号202~211、378、379、384及び385から選択されたHVR-H3配列、配列番号214~218から選択されたHVR-L1配列、配列番号219~224及び375から選択されたHVR-L2配列、配列番号229~247から選択されたHVR-L3配列を含む抗体後半を備えた多重特異性抗体TfRを提供する。
a)配列番号249~297、352~358及び367~374から選択したアミノ酸配列と少なくとも90%配列同一性を有する重鎖可変領域配列、または
a)配列番号298~328、345~351及び359~366から選択したアミノ酸配列と少なくとも90%配列同一性を有する軽鎖可変領域配列、または
c)(a)にあるような重鎖可変領域配列及び(b)にあるような軽鎖可変ドメイン配列を含む。
いくつかの実施形態において、第2結合部位は、
a)配列番号249~297、352~358及び367~374から選択した重鎖可変領域配列、または
a)配列番号298~328、345~351及び359~366から選択した軽鎖可変領域配列、または
c)(a)にあるような重鎖可変領域配列及び(b)にあるような軽鎖可変ドメイン配列を含む。
a)配列番号288、352~358及び367~374から選択したアミノ酸配列と少なくとも90%配列同一性を有する重鎖可変領域配列、または
b)配列番号306、345~351及び359~366から選択したアミノ酸配列と少なくとも90%配列同一性を有する軽鎖可変ドメイン配列、または
c)(a)にあるような重鎖可変領域配列及び(b)にあるような軽鎖可変ドメイン配列を含む。
いくつかの実施形態において、第2結合部位は、
a)配列番号288、352~358及び367~374から選択した配列を有する重鎖可変領域配列、または
b)配列番号306、345~351及び359~366から選択した配列を有する軽鎖可変領域配列、または
c)(a)にあるような重鎖可変領域配列及び(b)にあるような軽鎖可変ドメイン配列、または
d)6266及び6266変異体1-15から選択した抗体の重鎖可変ドメイン配列及び軽鎖可変ドメイン配列を含む。
いくつかの態様において、抗体は、網状赤血球レベルまたは急性臨床症状への影響を緩和する、あるいは当該影響の減少に寄与する更なる化合物と併用される。1つのかかる態様において、更なる化合物は網状赤血球を抗体関連の枯渇から保護し、あるいは網状赤血球の成長、発達または再建を支持する。別のかかる態様において、更なる化合物はエリスロポエチン(EPO)、鉄分補充剤、ビタミンC、葉酸及びビタミンB12から選択され、または赤血球若しくは網状赤血球である。
・ 第1重鎖および第1軽鎖は、配列番号329及び330、配列番号333及び334、配列番号337及び338、配列番号341及び342、配列番号394及び342から選択され、
・ 第2重鎖及び第2軽鎖は、配列番号331及び332、配列番号335及び336、配列番号339及び340、及び配列番号343及び344から選択される多重特異性抗体を提供する。
・ 第1重鎖及び第1軽鎖が配列番号333及び334、配列番号341及び342、及び配列番号394及び342から選択され、
・ 第2重鎖及び第2軽鎖が配列番号335及び336、及び配列番号343及び344から選択されることを備える。
・ 抗体前半は、配列番号394の配列を有する第1重鎖と配列番号342の配列を有する第1軽鎖を含み、抗体後半は、配列番号343の配列を有する第2重鎖と配列番号344の配列を有する第2軽鎖を含む、あるいは、
・ 抗体前半は、配列番号396の配列を有する第1重鎖可変領域と配列番号398の配列を有する第1軽鎖可変領域を含み、抗体後半は、配列番号399の配列を有する第2重鎖可変領域と配列番号400の配列を有する第2軽鎖可変領域を含む。
「親和性」は、分子(例えば、抗体)の単一結合部位とその結合パートナー(例えば、抗原)との非共有相互作用の総量の強さを意味する。特に明記しない限り、本明細書で使用するとき、「結合親和性」は、結合対(例えば、抗体と抗原)のメンバー間の1:1相互作用を反映する固有結合親和性を意味する。分子XのパートナーYに対する親和性は、一般的に解離定数(KD、XのYからのオフ速度(kdまたはKoff)対XのYへのオン速度(kaまたはkon)の比)によって表すことができる。1つ以上の抗体の標的に対する親和性の代理測定は、抗体標的への既知リガンドの結合を50%阻害するのにどの程度の抗体量が必要であるかの測定値、最大半減抑制濃度(IC50)である。親和性は、本明細書に記載される方法を含む、当該技術分野で既知の一般的な方法によって測定することができる。結合親和性を測定するための具体的な例示及び例示的な実施形態を本明細書に記載する。「血液脳関門」または「BBB」は、末梢循環及び脳、ならびに脳毛細血管内皮細胞原形質膜内の密接な結合によって結成される脊髄(すなわち、CNS)の間の生理学的なバリアを意味し、尿素のような非常に低分子(60ダルトン)でも分子の脳への輸送を制限する厳格なバリアを造る。脳内の血液-脳関門バリア、脊髄内の血液-脊髄バリア及び網膜内の血液-網膜バリアはCNS内の隣接する毛管バリアであり、本明細書では集合的に血液-脳関門またはBBBと称する。BBBは、バリアが毛細管内皮細胞よりもむしろ脳室上衣細胞から構成される血液CSFバリア(脈絡叢)も包含する。
表A:非限定例の神経障害薬剤とそれらを治療に使用することができる対応障害
MAQALPWLLLWMGAGVLPAHGTQHGIRLPLRSGLGGAPLGLRLPRETDEEPEEPGRRGSFVEMVDNLRGKSGQGYYVEMTVGSPPQTLNILVDTGSSNFAVGAAPHPFLHRYYQRQLSSTYRDLRKGVYVPYTQGKWEGELGTDLVSIPHGPNVTVRANIAAITESDKFFINGSNWEGILGLAYAEIARPDDSLEPFFDSLVKQTHVPNLFSLQLCGAGFPLNQSEVLASVGGSMIIGGIDHSLYTGSLWYTPIRREWYYEVIIVRVEINGQDLKMDCKEYNYDKSIVDSGTTNLRLPKKVFEAAVKSIKAASSTEKFPDGFWLGEQLVCWQAGTTPWNIFPVISLYLMGEVTNQSFRITILPQQYLRPVEDVATSQDDCYKFAISQSSTGTVMGAVIMEGFYVVFDRARKRIGFAVSACHVHDEFRTAAVEGPFVTLDMEDCGYNIPQTDESTLMTIAYVMAAICALFMLPLCLMVCQWCCLRCLRQQHDDFADDISLLK(配列番号147)
(a)アミノ酸残基26-32(L1)、50-52(L2)、91-96(L3)、26-32(H1)、53-55(H2)、及び96-101(H3)に生じる超可変ループ(Chothia and Lesk,J.Mol.Biol.196:901-917(1987))、
(b)アミノ酸残基24-34(L1)、50-56(L2)、89-97(L3)、31-35b(H1)、50-65(H2)及び95-102(H3)に生じるCDR(Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991))、
(c)アミノ酸残基27c-36(L1)、46-55(L2)、89-96(L3)、30-35b(H1)、47-58(H2)および93-101(H3)に生じる抗原接着(MacCallum et al.J.Mol.Biol.262:732-745(1996))、及び
(d)HVRアミノ酸残基46-56(L2)、47-56(L2)、48-56(L2)、49-56(L2)、26-35(H1)、26-35b(H1)、49-65(H2)、93-102(H3)及び94-102(H3)を含む(a)、(b)、及び/または(c)の組み合わせを挙げることができる。
100×分数X/Y
式中、Xは、A及びBのプログラム配列で配列アラインメントプログラムALIGN-2による同一マッチスコア一のアミノ酸残基の数であり、Yは、Bのアミノ酸残基の総数である。アミノ酸配列Aの長さがアミノ酸配列Bの長さと等しくない場合、Bに対するAの%アミノ酸配列同一性はAに対するBの%アミノ酸配列同一性に等しくないであろうことは理解されよう。特に記載されない限り、本明細書で使用されるすべてのアミノ酸配列同一性値%は、ALIGN-2コンピュータプログラムを使用して前節に記載したように得られる。
A.抗TfR/BACE1抗体およびその複合体の製造
いくつかの態様において、本発明は、一つには、BBBを横断して所望の分子を輸送するのに使用が可能な抗TfR抗体に基づく。かかる実施形態において、抗TfR/BACE1抗体を提供する。特定の実施形態において、ヒトTfRに結合する抗体を提供する。特定の実施形態において、ヒトTfR及び霊長類TfRに結合する抗体を提供する。本発明の抗体は、脳及び/またはCNSに影響を及ぼす疾患の診断または治療に役立つ。
いくつかの態様において、本発明はTfR及びBACE1に結合する単離した多重特異性抗体を提供する。特定の実施形態において、本発明の多重特異性抗体の抗TfRアームはヒトTfR及び霊長類TfRの両方に対して特異的に結合する。特定の実施形態において、本発明の多重特異性抗体の抗TfRアームはTfRに対するトランスフェリンの結合を阻害しない。特定の実施形態において、本発明の多重特異性抗体の抗TfRアームはTfRの先端ドメインに結合する。特定の実施形態において、本発明の多重特異性抗体の抗TfRアームはTfRの非先端ドメインに結合する。特定の実施形態において、多重特異性抗体の抗TfRアームは、例えば、抗BACE1抗体が多重特異性抗体の第二アームを形成するなど、1つ以上の複合化造影化合物または治療化合物輸送を、BBBを横断して輸送するのに使用することができる。
いくつかの態様において、本発明は、(a)配列番号80のアミノ酸配列を含むHVR-H1、(b)配列番号83のアミノ酸配列を含むHVR-H2、(c)配列番号84のアミノ酸配列を含むHVR-H3、(d)配列番号77のアミノ酸配列を含む HVR-L1、(e)配列番号78のアミノ酸配列を含むHVR-L2、及び(f)配列番号79のアミノ酸配列を含むHVR-L3から選択された、少なくとも1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、または6つのHVRを含む抗TfR抗体アームを含む抗TfR/BACE1多重特異性抗体を提供する。いくつかの態様において、抗体は前述のHVR配列の全6つを含む。いくつかの態様において、図3D及び表3で示すように抗TfRアームはクローン4C2である。
いくつかの態様において、本発明は、(a)配列番号32のアミノ酸配列を含むHVR-H1、(b)配列番号33のアミノ酸配列を含むHVR-H2、(c)配列番号34のアミノ酸配列を含むHVR-H3、(d)配列番号29のアミノ酸配列を含む HVR-L1、(e)配列番号30のアミノ酸配列を含むHVR-L2、及び(f)配列番号127のアミノ酸配列を含むHVR-L3から選択された、少なくとも1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、または6つのHVRを含む抗TfR抗体アームを含む抗TfR/BACE1多重特異性抗体を提供する。いくつかの態様において、抗体は前述のHVR配列の全6つを含む。いくつかの態様において、図4B及び表4で示すように抗TfRアームはクローン7A4.v15である。
HVR-L1:Arg-Ala-Ser-Glu-Ser-Val-Asp-[SerまたはAsp]-Tyr-Gly-[AsnまたはPro]-Ser-Phe-Met-His(配列番号45);
HVR-L2:Arg-Ala-Ser-Asn-Leu-Glu-Ser(配列番号30);
HVR-L3:Gln-[GlnまたはHis]-Ser-Asn-Glu-[Ala、GlyまたはAsp]-Pro-Pro-Thr(配列番号46)、
HVR-H1:Asp-Tyr-[AlaまたはGly]-Met-His(配列番号47);
HVR-H2:[GlyまたはVal]-Ile-Ser-[Thr、PheまたはPro]-Tyr-[PheまたはSer]-Gly-[ArgまたはLys]-Thr-Asn-Tyr-[AsnまたはSer]-Gln-[LysまたはAsn]-Phe-[LysまたはMet]-Gly(配列番号48);
HVR-H3:Gly-Leu-Ser-Gly-Asn-[TyrまたはPhe]-Val-[MetまたはVal]-Asp-[TyrまたはPhe](配列番号49)。(表3を参照)。クラスII及びIVのコンセンサス配列も表3で提供する。
いくつかの実施形態において、抗TfR/BACE1多重特異性抗体を提供する。いくつかの実施形態において、本明細書で提供した抗TfR/BACE1多重特異性抗体はBACE1活性のアロステリック阻害剤である。非限定的な代表的抗TfR/BACE1多重特異性抗体としては、表1に掲げた抗体の重鎖及び軽鎖可変領域を含む抗体が挙げられる。表1に掲げた抗体の重鎖及び軽鎖可変領域をそれぞれ図23と24に示す。
表1:抗BACE1抗体
特定の実施形態において、本明細書で提供した抗体は、解離定数(Kd)≦1μM、≦100nM、10nM、1nM、≦0.1nM、≦0.01nM、または≦0.001nM(例えば、10-8M以下、例えば10-8M~10-13M、例えば10-9M~10-13M)を有する。
ある特定の実施形態において、本明細書に提供される抗体は、抗体断片である。抗体フラグメントとしては、限定はされないが、Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)2、Fv、及びscFvフラグメント、ならびに下に記載する他のフラグメントが挙げられる。特定の抗体フラグメントの概要に関しては、Hudson et al.Nat.Med.9:129-134(2003)を参照されたい。scFvフラグメントの概要に関しては、例えばPluckthun,in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,vol.113,Rosenburg and Moore eds.,(Springer-Verlag,New York),pp.269-315(1994)を参照、また 国際公開第 93/16185号、及び米国特許第5,571,894号及び 同5,587,458号を参照されたい。エピトープ残基に結合し、インビボ半減期を増加させるサルベージ受容体を含むFab及びF(ab’)2フラグメントの考察に関しては、米国特許第5,869,046号を参照されたい。
ある特定の実施形態において、本明細書に提供される抗体は、キメラ抗体である。特定のキメラ抗体は、例えば米国特許第4,816,567号、及びMorrison et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855(1984)に記載されている。一例において、キメラ抗体は、非ヒト可変領域(例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、またはサル等の非ヒト霊長類に由来する可変領域)およびヒト定常領域を含む。本明細書での対象のキメラ抗体は、非ヒト霊長類(例えば、ヒヒ、赤毛猿またはカニクイザルなどの旧世界ザル)由来の可変ドメイン抗原結合配列とヒト定常領域配列を含む「霊長類化(primatized)」抗体を含む(米国特許第5,693,780号)。さらなる実施例において、キメラ抗体は、クラスまたはサブクラスが親抗体のそれから変更された、「クラススイッチされた」抗体である。キメラ抗体には、それらの抗原結合断片が含まれる。
ある特定の実施形態において、本明細書に提供される抗体は、ヒト抗体である。ヒト抗体は、当該技術分野において既知の種々の技法を使用して生成され得る。ヒト抗体は、一般にvan Dijk and van de Winkel,Curr.Opin.Pharmacol.5: 368-74(2001)及びLonberg,Curr.Opin.Immunol.20:450-459(2008)の中で記載されている。
本発明の抗体は、コンビナトリアルライブラリーを、所望の活性(単数または複数)を有する抗体についてスクリーニングすることによって、単離されてもよい。例えば、ファージディスプレイライブラリーを生成し、かかるライブラリーを、所望の結合特性を保有する抗体についてスクリーニングするための、多様な方法が当該技術分野で知られている。そのような方法は、例えばHoogenboom et al.in Methods in Molecular Biology 178:1-37(O’Brien et al.,ed.,Human Press,Totowa,NJ,2001)に概説されており、更に、例えばMcCafferty et al.,Nature 348:552-554;Clackson et al.,Nature 352: 624-628(1991);Marks et al.,J.Mol.Biol.222: 581-597(1992);Marks and Bradbury,in Methods in Molecular Biology 248:161-175(Lo,ed.,Human Press,Totowa,NJ,2003);Sidhu et al.,J.Mol.Biol.338(2): 299-310(2004);Lee et al.,J.Mol.Biol.340(5): 1073-1093(2004);Fellouse,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(34): 12467-12472(2004);and Lee et al.,J.Immunol.Methods 284(1-2): 119-132(2004)に記載されている。
ある特定の実施形態において、本明細書に提供される抗体は、多重特異性抗体、例えば、二重特異性抗体である。多重特異性抗体は、少なくとも2つの異なる部位に対する結合特異性を有する、モノクローナル抗体である。特定の実施形態において、結合特異性の1つはTfRに対するものであり、他はBACE1に対するものである。二重特異性抗体を使用して、TfRを発現する細胞に細胞毒性薬を局在させることもできる。二重特異性抗体は、完全長抗体または抗体断片として調製することができる。
多重特異性抗体の作製方法としてのノブ・イントゥ・ホール(Knob-into-Hole)の使用は、例えば米国特許第5,731,168号、国際公開第2009/089004号、US2009/0182127、US2011/0287009、Marvin and Zhu,Acta Pharmacol.Sin.(2005)26(6):649-658、及び Kontermann(2005)Acta Pharmacol.Sin.,26:1-9.に記載されている。簡潔な非限定的考察が、以下に提供される。
ある特定の実施形態において、本明細書に提供される抗体のアミノ酸配列変異形が企図される。例えば、抗体の結合親和性および/または他の生物学的特性を改善することが望ましいことがある。抗体のアミノ酸配列変異形は、適切な修飾を、抗体をコードするヌクレオチド配列中に導入することによって、またはペプチド合成によって、調製されてもよい。かかる修飾には、例えば、抗体のアミノ酸配列からの残基の欠失、および/またはそこへ残基の挿入、および/またはその内の残基の置換が含まれる。欠失、挿入、および置換の任意の組み合わせを作製して、最終構築物に到達することができるが、但し、その最終構築物が、所望の特性、例えば、抗原結合性を保有することを条件とする。
ある特定の実施形態において、1つ以上のアミノ酸置換を有する抗体変異形が提供される。置換型突然変異生成に対する目的の部位には、HVRおよびFRが含まれる。保存的置換は「好ましい置換」の項目の下で表2に示す。より実質的な変化は、表2において、「例示的な置換」の見出しの下に提供され、またアミノ酸側鎖クラスを参照して以下でさらに説明される。アミノ酸置換が目的の抗体中に導入され、産物が、所望の活性、例えば、保持/改善された抗原結合、減少した免疫原性、または改善されたADCCもしくはCDCについて、スクリーニングされてもよい。
表2
(1)疎水性:ノルロイシン、Met、Ala、Val、Leu、Ile、
(2)中性親水性:Cys、Ser、Thr、Asn、Gln、
(3)酸性:Asp、Glu、
(4)塩基性:His、Lys、Arg、
(5)鎖配向に影響を及ぼす残基:Gly、Pro、
(6)芳香族:Trp、Tyr、Pheに従ってグループ化することができる。
ある特定の実施形態において、本明細書に提供される抗体は、抗体がグリコシル化される程度を増加または減少させるように変化させられる。抗体へのグリコシル化部位の付加または欠失は、1つ以上のグリコシル化部位が作り出されるか、または除去されるように、アミノ酸配列を変化させることによって、好都合に遂行されてもよい。
ある特定の実施形態において、1つ以上のアミノ酸修飾が、本明細書に提供される抗体のFc領域に導入され、それによってFc領域変異形を生成してもよい。Fc領域変異体は、1つ以上のアミノ酸位置でアミノ酸修飾(例えば置換)を含むヒトFc領域配列(例えば、ヒトIgG1、IgG2、IgG3またはIgG4 Fc領域)を含むことができる。
ある特定の実施形態において、抗体の1個以上の残基がシステイン残基で置換されている、システイン操作された抗体、例えば、「チオMab」を作り出すことが望ましい場合がある。特定の実施形態において、置換残基は、抗体の利用しやすい部位において生じる。それらの残基をシステインで置換することによって、反応性のチオール基はそれによって、抗体の利用しやすい部位に位置付けられ、それを使用して、抗体を、薬物部分またはリンカー-薬物部分等の他の部分に複合して、本明細書にさらに記載される、免疫複合体を作り出してもよい。ある特定の実施形態において、1つ以上の下記残基、軽鎖のV205(Kabat番号付け)、重鎖のA118(EU番号付け)、及び重鎖Fc領域のS400(EU番号付け)をシステインで置換することができる。システイン操作抗体は、例えば米国特許第7,521,541号に記載されているように作製することができる。
ある特定の実施形態において、本明細書に提供される抗体は、当該技術分野で既知であり、容易に入手可能な、追加の非タンパク質性部分を含有するようにさらに修飾されてもよい。抗体の誘導体化に好適な部分には、水溶性ポリマーが含まれるが、これらに限定されない。水溶性ポリマーの非限定的な例としては、ポリエチレングリコール(PEG)、エチレングリコール/プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ-1,3-ジオキソラン、ポリ-1,3,6-トリオキサン、エチレン/無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸(ホモポリマーまたはランダムコポリマーのいずれか)、およびデキストランまたはポリ(n-ビニルピロリドン)ポリエチレングリコール、プロプロピレン(propropylene)グリコールホモポリマー、プロリプロピレン(prolypropylene)オキシド/エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール(例えば、グリセロール)、ポリビニルアルコール、ならびにそれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、水中でのその安定性に起因して、製造における利点を有し得る。ポリマーは、任意の分子量のものであってもよく、分岐していても非分岐であってもよい。抗体に結合したポリマーの数は、様々であってもよく、1つを超えるポリマーが結合される場合、それらは、同じ分子または異なる分子であり得る。一般に、誘導体化に使用されるポリマーの数および/または種類は、改善対象の抗体の特定の特性または機能、抗体誘導体が規定の条件下で療法において使用されるかどうか等を含むが、これらに限定されない考慮に基づいて、決定することができる。
抗体は、例えば、米国特許第4,816,567号に記載された組換え方法と組成物を使用して作製することができる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載した抗TfR/BACE1多重特異性抗体をコード化する単離した核酸を提供する。かかる核酸は、抗体のVLを含むアミノ酸配列および/またはVHを含むアミノ酸配列(例えば、抗体の軽鎖および/または重鎖)をコードし得る。さらなる実施形態において、かかる核酸を含む1つ以上のベクター(例えば、発現ベクター)が提供される。さらなる実施形態において、かかる核酸を含む宿主細胞が提供される。1つのかかる実施形態において、宿主細胞は、(1)抗体のVLを含むアミノ酸配列および抗体のVHを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含むベクター、または(2)抗体のVLを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第1のベクター、および抗体のVHを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第2のベクターを含む(例えば、それらで形質転換されている)。いくつかの実施形態において、宿主細胞は真核生物、例えばチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞又はリンパ系細胞(例えば、Y0、NS0、Sp20細胞)である。いくつかの実施形態において、抗TfR/BACE1多重特異性抗体の作製方法を提供し、当該方法は、抗体の発現、及び任意選択で宿主細胞(または宿主細胞培地)から抗体を回収するのに好適な条件下、上で提供したように、抗体をコード化する核酸を含む宿主細胞を培養することを含む。
本明細書で提供した抗TfR/BACE1多重特異性抗体は、当該技術分野で公知な様々なアッセイによって物理的/化学的性質及び/又は生物活性に関して、同定、スクリーニング、又は特徴づけることができる。
抗体のTfR及び/又はBACE1との結合の決定に関して様々な技術が利用できる。1つのかかるアッセイは、ヒトTfR及び/又はBACE1と結合する能力を確認するための酵素結合免疫測定法(ELISA)である。このアッセイに従って、抗原(例えば、組換え体TfR 又はBACE1)で被覆したプレートを、抗体を含む試料とインキュベートし、抗体の対象抗原との結合を測定する。
いくつかの態様において、生物活性を有する抗体の同定のためのアッセイを提供する。生物活性は、例えば、抗体と会合/複合体化した化合物を、BBBを横断して脳及び/又はCNSの中に輸送することを含むことができる。生体内及び/又は生体外でのかかる生物活性を有する抗体も提供する。
本発明は、1つ以上の細胞毒性薬、例えば化学療法剤又は薬剤、成長阻害剤(例えば、タンパク毒素、細菌、真菌、植物若しくは動物起源の酵素的活性毒素、又はそれらの断片)、又は放射性同位元素と複合体化した本明細書の抗体を含む免疫複合体も提供する。
ある特定の実施形態において、本明細書に提供した任意の抗体は生体試料中の抗原の存在の検出に有用である。本明細書で使用される「検出すること」という用語は、定量または定性検出を包含する。特定の実施形態において、生体試料は細胞又は組織、例えば血液(すなわち、未成熟赤血球)、CSF、及びBBB含有組織を含む。
本明細書に記載した抗体抗TfR/BACE1多重特異性抗体の医薬製剤は、1つ以上の任意な薬剤的に許容される担体、賦形剤又は安定剤(Remington’s Pharmaceutical Sciences 16th edition,Osol,A.Ed.(1980))と所望の純度を有した当該抗体を、凍結乾燥された製剤又は水溶液の形態で混合して調製される。(1980))と混合することによって、凍結乾燥製剤または水溶液の形態で、調製される。薬剤的に許容される担体、賦形剤又は安定剤は一般に、用いられる投与量及び濃度でレシピエントに無毒性であり、限定はされないが、バッファー(例えばホスファート、シトラート及び他の有機酸);アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤;防腐剤(例えばオクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド;ヘキサメトニウムクロリド;塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム;フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール;アルキル・パラベン(例えばメチルまたはプロピル・パラベン);カテコール;レゾルシノール;シクロヘキサノール;3-ペンタノール;及びm-クレゾール);低分子量(約10未満の残基)ポリペプチド;タンパク質(例えば血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリン);ポリビニルピロリドンなどの親水性のポリマー;アミノ酸(例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン又はリシン);ブドウ糖、マンノース又はデキストリンを含む単糖、二糖類及び他の炭水化物;EDTAなどのキレート化剤;砂糖(例えば蔗糖、マンニトール、トレハロース又はソルビトール);ナトリウムなどの塩成型対イオン;金属錯塩(例えばZn-蛋白質錯体);及び/又はポリエチレングリコール(PEG)などの非イオン界面活性剤を挙げることができる。本明細書の例示的な薬剤的に許容される担体としては、更に、可溶性中性活性ヒアルロニダーゼ糖蛋白質(sHASEGP)(例えば、ヒト可溶性pH-20ヒアルロニダーゼ糖蛋白質(例えばrHuPH20( HYLENEX(登録商標)、Baxter International,Inc.))などの侵入型薬分散剤が挙げられる。rHuPH20を含むある特定の例示的なsHASEGP及び使用方法は、米国特許公開第2005/0260186号及び同第2006/0104968号に記載されている。いくつかの態様において、sHASEGPは、コンドロイチン分解酵素などの1つ以上の追加的グリコサミノグリカナーゼと組み合わせる。
本明細書で提供したあらゆる抗体は、治療方法で使用することができる。いくつかの態様において、薬剤として使用するための抗TfR/BACE1多重特異性抗体を提供する。例えば、本発明は、抗体がBBBを横断して輸送されるように抗TfR/BACE1多重特異性抗体をBBBに曝露することを含め、赤血球個体群に減少又は排除の影響をもつ血液脳関門を横断して治療化合物を輸送する方法を提供する。別の例において、本発明は、抗体が赤血球個体群に減少又は排除の影響をもつBBBを横断して輸送されるようにBBBに本発明の抗TfR/BACE1多重特異性抗体を曝露することを含む血液脳関門を横断して神経障害薬剤を輸送する方法を提供する。いくつかの実施形態において、当該BBBは、例えば限定はされないが、アルツハイマー病(AD)、脳卒中、痴呆、筋ジストロフィー(MD)、多発性硬化症(MS)、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、嚢胞性線維症、Angelman症候群、リドル症候群、パーキンソン病、ピック病、ページェット病、癌、外傷性脳損傷を含む神経障害がある哺乳類哺乳類(例えばヒト)に在る。
本発明の別の態様において、上述の障害の治療、予防、および/または診断に有用な物質を含有する製品が提供される。製品は、容器、および容器上のまたは容器と関連したラベルまたは添付文書を含む。好適な容器としては、例えばビン、バイアル、注射器、IV溶液バッグなどが挙げられる。容器は、ガラスまたはプラスチックなどの様々な材料から)から成形することができる。容器は、組成物を、それ自体で、または症状を治療する、予防する、および/もしくは診断するのに有効な別の組成物と組み合わせて保有し、また滅菌アクセスポートを有し得る(例えば容器は、静脈注射用溶液バッグまたは皮下注射針によって貫通可能な栓を有するバイアルであり得る)。組成物中の少なくとも1つの活性な薬剤は、本発明の抗体である。ラベルまたは添付文書は、組成物が選定した病態を治療するために使用されることを表示する。さらに、製品は、(a)組成物がその中に含有された第1の容器(この組成物は本発明の抗体を含む)、および(b)組成物がその中に含有された第2の容器(この組成物はさらなる細胞傷害性薬剤または治療剤を含む)を含んでもよい。本発明のこの実施形態の製品は、組成物が特定の病態を治療するために使用され得ることを表示する、添付文書をさらに含んでもよい。代替または追加として、製品は、注射用静菌水(BWFI)、リン酸緩衝食塩水、リンガー溶液、及びデキストロース溶液といった、薬学的に許容されるバッファーを含む第2(または第3)の容器を更に含んでもよい。それは、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針、およびシリンジを含む、商業的およびユーザの立場から望ましい他の材料をさらに含んでもよい。
最初に、ナイーブ抗体ファージパンニング法を、ヒトTfRとカニクイザル(「cyno」)のTfR(TfRへの結合で、Tfと一層競合しない)の両方と交差反応性を示す抗体を同定する試みで行った(Lee et al.JMB(2004)1073-1093)。かかる交差反応がない、非-Tf-競合クローンをファージパンニング法から同定した。しかし、その後発生するハイブリドーマクローンを特徴付けるのに有用な2つの抗体を同定した。
表3:交差反応性抗cyno/ヒトTfR抗体の軽鎖及び重鎖CDR
表4:ヒト化抗体/Fabの軽鎖及び重鎖CDR
表5:選択したFabフォーマット化変異体のBiacore結合データ
上述のヒト化変異体に加えて、更なる親和性操作変異体を作成した。本明細書での例証は、15G11.v5及び7A4.v15の親和性操作である親和性変異体は標準的な技術を使用して、CDR-L3またはCDR-H3の個別のアラニン置換を行うことによって作製した。これらの変異体を、ELISAとSPRでIgGとしてスクリーニングし、ヒト及びcyno TfRへの結合に重要な位置を確認した。Fabとしての選択した変異体の一価親和性も決定した。アラニン走査変異体IgGまたはFabを293個の細胞で発現させ、ヒトまたはcyno TfRへの結合を、PBS中、4℃で一晩、1.8μg/mlのヤギ抗ヒトFcγ(Jackson ImmunoResearch)で被覆したマキシソーププレートでELISAによって定量した。プレートをPBS/0.05%のTween20で洗浄し、PBS(Thermo Scientific,Hudson,NH)中、SuperBlockブロッキングバッファーを使用してブロックした。発現したIgGを含む上清を順次1:5に希釈し、1時間プレートに加えた。精製したhu15G11.v5またはhu7A4.v15を標準(1ug/mlで開始し1:5に希釈した)として使用した。プレートをPBS/0.05%Tween20で洗浄し、1:1000に希釈したHRP-ヤギ-抗カッパ(Southern Biotech) をプレートに加えて、室温で1時間インキュベートした。プレートをPBS/0.05%Tween20で洗浄し、TMB基質(BioFX Laboratories,Owings Mills)を使って検出した。上述のように、結合をSPRによっても評価した。結果は、図7A(15G11.v5変異体)と7B(7A4.v15変異体)で示す。
表6:hu15G11.v5 IgG Ala変異体のELISA分析
ある特定の前述の抗体変異体を、BACE1と特異的に結合する第2のアームをもつ二重特異性抗体として再フォーマット化した。抗ヒトTfR抗体Hu15G11.v5,Hu15G11.LC92A ,Hu15G11.HC52A及び Hu15G11.HC53Aを使用し、「ノブと穴(knob in hole)]二重特異性抗体構築技術(Carter,P.(2001)J.Immunol.Methods 248,7-15;Ridgway,J.B.,Presta,L.G.,and Carter,P.(1996)Protein Eng.9,617-621;Merchant,A.M.,Zhu,Z.,Yuan,J.Q.,Goddard,A.,Adams,C.W.,Presta,L.G.,and Carter,P.(1998)Nat.Biotechnol.16,677-681;Atwell,S.,Ridgway,J.B.,Wells,J.A.,and Carter,P.(1997)J.Mol.Biol.270,26-35)によって二重特異性のTfR結合アームを操作した。抗TfR(穴)及び抗BACE1(ノブ)でのFcのノブとホール変異に加えて、全半抗体がエフェクター機能を排除したFc領域(N297G)に変異を含み、またHu15G11.v5及びHu15G11.LC92Aはエフェクター機能を排除した追加的なFc変異(D265A)を含んだ。ノブとホール半抗体を大腸菌から別々に精製し、抗TfRホモ二量体の形成を回避するために抗TfRの1:1.1の比率で結合した。二重特異性抗体の組立ては、抗体及び200mmアルギニン(pH 8.0)に100xの比率で還元型グルタチオンを含むバッファー中、少なくとも3日間、室温で還元的アニーリングによって完了した。組立ての後、二重特異性抗体を疎水的相互作用クロマトグラフィーによって精製した。組立体を液体クロマトグラフィー質量分析及びSDS-PAGEによって確認した。精製した抗体が均一かつ単分散であることをサイズ排除多角度光散乱分光法で確認した。
表8:15G11.v5(TfR1)及び15G11.W92A(LC92A、TfR2)の一価SPR分析
表9
マウスの先行研究では、エフェクター機能及び/または補体結合能力を有する抗体結合マウスTfRは、選択的にTfR発現網状赤血球を除去すると判定された。マウス研究で観察された除去がマウス系に特有であるかどうかを確認するため、ヒトTfRに結合する抗TfRを利用して更に実験を行った。
試料希釈液のADCC値を抗体濃度に対してプロットし、用量-応答曲線をSoftMax Proを使用した4つのパラメータモデルに当てはめた。
A. 薬物動態、薬力学及び安全試験
インビボで二重特異性抗ヒトTfR抗体の薬剤濃度、薬力学的影響、及び安全性を評価するために、カニクイザル(Macaca fascicularis)に、先の実施例(抗TfR1/BACE1)で使用した同じ抗BACE1アームを対合した抗TfR抗体クローン15G11(抗TfR1/BACE1)、または先の実施例で使用した同じ抗BACE1アームを対合したクローン15G11.LC92A(抗TfR2/BACE1)を使用する二重特異性抗体を投与した。これらの二重特異性抗体は、前述のとおり、エフェクター機能を排除するN297GまたはD265A及びN297G変異を有したヒトIgG1の形式であった。対照として、ヒトIgG1の抗gD分子を使用した。本試験は、これらの抗TfR抗体の交差反応性が非ヒト霊長類及びヒトに限定されるため非ヒト霊長類で行った加えて、試験は、脳脊髄液(CSF)と血漿区画の間の薬剤輸送の機構がヒトと霊長類の間で類似する可能性があることを示した(Poplack et al,1977)。抗体は、留置大槽カテーテルを用いて、覚醒カニクイザルに30mg/kgの用量で伏在静脈に、単回静脈内(IV)ボーラス注入法で投与した。投与後60日までの様々な時点で、血漿、血清、及び(CSF)を採取した。試料分析は、血液学(全血)、臨床化学(血清)、抗体濃度(血清とCSF)、及び抗体に対する応じた薬力学的応答(血漿とCSF)を含んだ。詳細な試料採スキームに関しては図10を参照されたい。
CSFにおける抗体薬力学と脳における薬物動態の間の関連性を調査するために、前の実施例のように、カニクイザル(Macaca fascicularis)に二重特異性抗体、抗TfR1/BACE1または抗TfR2/BACE1を投与した。これらの二重特異性抗体は、エフェクター機能を排除するD265A及びN297G変異を有したヒトIgG1の形式であった。対照として、ヒトIgG1の抗gD分子を使用した。比較のために、二重特異性抗体に使用される同じクローンの二価抗BACE1抗体も投与した。抗体は、留置大槽カテーテルを用いて、覚醒カニクイザルに30mg/kgの用量で伏在静脈に、単回静脈内(IV)ボーラス注入法で投与した。ベースラインCSF試料を処方24時間と48時間前に収集し、別のCSF試料を投与24時間後に収集した(図14に図式的に示す)。投与24時間後のCSF収集の後、動物に食塩水を潅流し、脳を抗体濃度の分析のために収集した。Mini,EDTA-フリープロテアーゼインヒビターカクテル錠(Roche Diagnostics)を含むPBS中、1% NP-40(Cal-Biochem)で異なる脳領域を均質化した。均質化脳試料を、4℃で1時間回転した後に14,000rpmで20分間遠心分離した。上清は、前の実施例で記載するELISA法を用いて、脳抗体測定のために単離した。血液も収集して末梢性曝露及び薬力学的応答を確認し、実施例5での観察と類似した。
Fc領域における他の変異(N297GとD265Aへのエフェクター付加作用を排除する)を、TfRを発現する網状赤血球の欠失を減少または予防する能力について試験した。具体的には、参照することにより本書に援用される米国特許出願公開第2012/0251531号に記載されたFc変異L234A、L235A及びP329G(「LALAPG」)、は、抗TfRD/BACE1抗体に組み込まれる(国際出願公開第WO 2013/177062号に記載されており、参照することにより全体が本書に援用される)。
ACE1と特異的に結合する完全ヒト抗体を、酵母に基づくヒト抗体ディスプレイライブラリーを使用して作製し、ヒトBACE1細胞外ドメイン(BACE1-ECD)、配列番号179のアミノ酸1-457に対して選択した。
実施例8に記載した抗BACE1抗体を更に以下に記載したアッセイを使用して特徴づけた。
ヒト及びマウスBACE1 ECDに関して実施例1で選別した78の抗BACE1抗体に対する結合親和性を、次の通りOctet(登録商標)システムを使用して決定した。アッセイバッファー中の60秒間ベースラインに従って抗ヒトキャプチャー(AHC)センサー(チップ)に抗BACE1抗体を負荷させた。次いで、チップを200nMのヒトBACE1 ECD(CHO細胞で産生またはR&D Systemsから購入)またはマウスBACE1 ECD(CHO細胞で産生;配列番号389)に曝露させた。チップをオフレート測定ではオフレートに応じて5分間、30分間または120分間アッセイバッファーに移した。アッセイバッファーは、PBS+0.1%のBSA,pH 7.5 または PBS+0.1%のBSA,pH 5.0のどちらかであった。速度論を、1:1結合モデルを使用して解析した。
ある特定の抗BACE1 IgGの結合親和性をBIAcore(商標)-T100を使用した表面プラズモン共鳴(SRP)によって測定した。抗BACE1ヒトIgGを、M5バイオセンサーチップ上に被覆したマウス抗ヒトFc抗体(GE Healthcare,cat# BR-1008-39)によって捕捉し、およそ150のレスポンスユニット(RU)を得た。動態測定では、ヒトBACE1(R&D Systems)の2倍階段希釈液(125nM~0nM)を、HBS-Pバッファー(0.01 M HEPES pH 7.4,0.15 M NaCl,0.05% v/v Surfactant P20,GE Healthcare)に25°C、流速30μl/分で注入した。会合速度(kon)と解離速度(koff)は、単純一対一ラングミュア結合モデル(BIAcore Evaluation Software version 3.2)を使用して計算した。平衡解離定数(KD)は、koff/kon比として計算した。
78の抗体のエピトープビニングをOctet(登録商標)システムを使用して行った。簡潔には、アッセイバッファー、pH 7.5で60秒間ベースラインに従って第1抗体をAHCチップ上に負荷させた。次いで、抗原結合を可能にするため、チップを200nMヒトBACE1に180秒間曝露する。チップを、アッセイバッファー中、50μg/ml第2の抗体を含むウエルに90秒間移した。仮に第2の抗体が明白な結合を示せば、非競合(すなわち、第1抗体と異なるエピトープビン)であるとみなせる。仮に第二抗体が明白な結合を示さなければ、競合(すなわち、第1抗体と同じエピトープビン)であるとみなせる。結合決定は、第1抗体の存在下でBACE1に結合する第2抗体と、それを遮断する第1抗体を比較することによって結合決定を行った。第1の抗体を選択するため、上記のアッセイと類似したアッセイを行い、相互に排他的な結合を示す抗体を選別する。
更に、BACE基質上のBACE1蛋白質分解活性を調節する抗体の能力をHTRFアッセイを使用してインビトロで評価した。
APP処理で観察された抗BACE1抗体のインビトロ阻害作用が細胞文脈にも存在するかどうかを決定するために、インビボ試験も行った。内因性レベルの野生型ヒトアミロイド前駆体蛋白質を発現するマウス皮質ニューロン初代培養で、Aβx-40産生を阻害する抗体の能力を以下の通りに評価した。簡潔には、解離皮質ニューロン培養物をE16.5 CD1マウスから調製した。ニューロンを96ウエルプレートに2.5×104細胞/ウエルの密度で接種し、インビトロで、Neurobasal培地(Life Technologies)で5日間増殖した。8ポイント段階希釈で調製した抗BACE抗体または対照IgG1を含む50μlの新鮮培地を37℃で24時間、ニューロンとインキュベートした。細胞上清を集め、サンドイッチELISA法を使用してマウスAβX-40の存在について評価した。簡潔には、Aβx-40(Millipore,Bedford,MA)のC末端に特異的なウサギポリクローナル抗体をプレート上に被覆し、ビオチン化抗マウスAβモノクローナル抗体M3.2(Covance,Dedham,MA)を検出用に使用した。アッセイは、血漿で1.96 pg/ml及び脳で39.1 pg/gの下限の定量化値を有した。CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay(Promega)を使用して決定するとき、Aβx-40値を細胞生存性用に正規化した。データは、4-パラメータ非線形回帰曲線適合プログラム(Prism,Graphpad)を使用してプロットした。
ある特定の前記抗体変異体を、BACE1(抗BACE1抗体 6266)と特異的に結合する第2のアームをもつ二重特異性抗体として再フォーマット化した。抗ヒトTfR抗体15G11.v5(抗TfR1)、15G11.LC92A(抗TfR52A)、及び 15G11.HC53A(抗TfR53A)を使用し、「ホールのノブ(knob in hole)]二重特異性抗体構築技術(Carter,P.(2001)J.Immunol.Methods 248,7-15;Ridgway,J.B.,Presta,L.G.,and Carter,P.(1996)Protein Eng.9,617-621;Merchant,A.M.,Zhu,Z.,Yuan,J.Q.,Goddard,A.,Adams,C.W.,Presta,L.G.,and Carter,P.(1998)Nat.Biotechnol.16,677-681;Atwell,S.,Ridgway,J.B.,Wells,J.A.,and Carter,P.(1997)J.Mol.Biol.270,26-35)を用いて二重特異性のTfR結合アームを設計した。抗TfR(ホール)及び抗BACE1(ノブ)のFcでのノブとホール変異に加えて、半抗体は、(N297G)またはL234A/L235A/P329Gを含め、エフェクター機能を排除したFc領域に変異を含む。加えて、YTE(M252Y/S254T/T256E)及びAI(N434/Y436I)変異が 抗TfR52A/BACE1と抗TfR2/BACE1二重特異性抗体の両方に組込まれた。M252Y,S254T及びT256E(YTE)を含むFc受容体-新生児(FcRn)結合ドメイン変異(FcRnHIGH変異)がFcRn結合を増加させる結果、抗体の半減期を増加させることが記載されている。米国特許出願公開第2003/0190311及びDall’Acqua et al.,J.Biol.Chem.281:23514-23524(2006)を参照されたい。更に、FcRn結合ドメイン変異N434A 及びY436I(AI)がFcRn結合も増加させることが記載されている。Yeung et al.,J.Immunol.182: 7663-7671(2009)を参照されたい。
表11:ヒト及びcyno FcRnに対するFcRnHIGH二重特異性抗体の親和性
表12:ヒト及びcyno TfRに対する二重特異性抗体の親和性
細胞の文脈におけるAPP処置への抗BACE1抗体及び二重特異性抗体の阻害作用を評価するため、内因性レベルの野生型ヒトアミロイド前駆体蛋白質を発現するマウス皮質ニューロン初代培養におけるAβx-40産生を阻害する抗体の能力を以下の通りに評価した。簡潔には、解離皮質ニューロン培養物をE16.5 CD1マウスから調製した。ニューロンを96ウエルプレートに2.5×104細胞/ウエルの密度で接種し、インビトロで、Neurobasal培地(Life Technologies)で5日間増殖した。8ポイント段階希釈で調製した抗BACE抗体または対照IgG1を含む50mlの新鮮培地を37℃で24時間、ニューロンとインキュベートした。細胞上清を集め、サンドイッチELISA法を使用してマウス Aβx-40 の存在について評価した。簡潔には、Aβx-40(Millipore,Bedford,MA)のC末端に特異的なウサギポリクローナル抗体をプレート上に被覆し、ビオチン化抗マウスAβモノクローナル抗体M3.2(Covance,Dedham,MA)を検出用に使用した。CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay(Promega)を使用して決定するとき、Aβx-40値を細胞生存性用に正規化した。データは、4-パラメータ非線形回帰曲線適合プログラム(Prism,Graphpad)を使用してプロットした。
マウスでの単回抗体投与後の薬物動態及び薬力学分析を以下の通りに行った。野生型雌のC57B/6匹のマウス6~8週齢を全試験で使用した。動物の管理は機関ガイドラインに従った。マウスに、各々、huIgG1 N297Gアイソタイプの形式とした単回25mg/kg用量の抗gD抗体(ヒトIgG1)、抗TfRD/YW412.8.31抗体(ラット/ヒトキメラ)、または抗TfRD/6266抗体(ラット/ヒトキメラ)を静脈投与した。全注入量は250μLを超えなかった。また抗体は必要なときにD-PBSに希釈した。24時間後に、全血をEDTAマイクロティナ管(BD Diagnostics)に潅注する前に収集し、室温で30分間静置し、10分間5000x gで遠沈させた。血漿の上層を抗体測定用の新しい管に移した。
インビボでの薬剤濃度、薬力学的影響、及び二重特異性抗体ヒトTfR/BACE1抗体の安全性を評価するため、実施例5で実質上記載したように、カニクイザル(Macaca fascicularis)に抗TfR1/YW412.8.31または抗TfR1/6266二重特異性抗体を投与した。これらの二重特異性抗体は、前述のとおり、エフェクター機能を排除するN297G変異をもつヒトIgG1の形式であった。対照として、ヒトIgG1の抗gD分子を使用した。抗体は、留置大槽カテーテルを用いて、覚醒カニクイザルに30mg/kgの用量で伏在静脈に、単回静脈内(IV)ボーラス注入法で投与した。様々な時点で、血漿、血清、及び(CSF)を採取した。試料分析は、実施例5で実質上記載したように、血液学(全血)、臨床化学(血清)、抗体濃度(血清とCSF)、及び抗体に対する薬力学的応答(血漿とCSF)を含んだ。
表13:カニクイザル(n=5)における30mg/kgでの単回IVボーラス投与処方後の全試験抗体の平均(±SD)PKパラメータ推定値
インビボでの薬剤濃度、薬力学的影響、及びFcRnHIGH ニ重特異性抗ヒトTfR/BACE1抗体の安全性を評価するため、カニクイザル(Macaca fascicularis)に抗TfR2/6266(IgG1.LALAPG)、抗TfR2/6266 FcRnHIGH(IgG1.LALAPG.YTE)、抗TfR52A/6266(IgG1.LALAPG)、及び抗TfR52A /6266 FcRnHIGH(IgG1.LALAPG.YTE)を投与した。対照として、ヒトIgG1の抗gD分子を使用した。抗体は、留置大槽カテーテルを用いて、覚醒カニクイザルに30mg/kgの用量で伏在静脈に、単回静脈内(IV)ボーラス注入法で投与した。様々な時点で、血漿、血清、及び(CSF)を採取した。試料分析は、血液学(全血)、臨床化学(血清)、抗体濃度(血清とCSF)、及び抗体に対する応じた薬力学的応答(血漿とCSF)を含んだ。詳細な試料採スキームに関しては図33を参照されたい。
表14:FcRnHIGH二重特異性抗体の薬物動態
抗体6266は以下の通り親和性が最大化した。
ライブラリーランダム化のため、CDRの各位置を「NNK」コドンを使ったオリゴヌクレオチド特異的突然変異生成によってランダム化し、Nは任意の4つの天然ヌクレオチドであり、Kは50% T(チミン)と50% G(グアニン)である。NNKコドンは20個の任意のアミノ酸をコード化することができる。軽鎖及び重鎖のライブラリーを別々に作製し、各鎖の3つの各CDRを同時にランダム化した。この結果、各鎖に0~3個のアミノ酸変化を有するクローンが得られ、各CDRで最大1つの変異が起きた。ライブラリーは、標準方法によりファージFab断片展示ベクターで作製した。結合クローンは、連続の選別ラウンドで5,0.5,及び0.1 nMビオチン化BACE1とファージディスプレイライブラリーをインキュベートした後、BACE1への親和性がより低いクローンの結合を抑制するため、室温または37°Cで100 nM 非ビオチン化BACE1で競合させることよって選別した。結合クローンを、ニュートラアビジン(NeutrAvidin)で被覆したELISAプレートで捕捉し、100mMのHCl中、20分間、室温で溶出した。溶出したファージを1/10体積の1M Tris pH 8.0で中和し、選別の次ラウンドの増幅用大腸菌に感染させるために使用した。
ディープシークエンシングのため、ファージミドDNAを選別ラウンドから分離した。各試料からのVH及び VLをPhusion DNAポリメラーゼ(New England Biolabs)を使用して18サイクルPCR増幅によって増幅させた。アンプリコンを2%アガロースゲル上で精製した。アンプリコンをTruSeq DNA Sample Prep(Illumina)を使用した標準Illuminaライブラリー調製方法で調製した。アダプターを結合したライブラリーをPCRの単一サイクルにかけて、アンプリコンの全長をカバーするために手適切な末端対200bpまたは300bpをIllumina MiSeqで配列決定した。配列決定データは、統計プログラミング言語、RパッケージとShortReadパッケージを使用して解析した。品質管理は、識別されたCDR配列に対して行い、各CDR配列で正確な長さのチェック、NNK変異及び非NNK変異だけを調査した。全てのランダム化位置の全変異の頻度を計算し、位置重みづけマトリックスを作成した。全単一変異の濃縮比は、Fowler等よって以前記載されたように、分類化試料の所定位置での所定変異の頻度を、非分類化試料における所定位置での所定変異の頻度で除することによって計算した。二重変異の濃縮比は、2つの所定位置でのNNK変異をもつ全クローンの濃縮比を計算することによって得、第3のNNK変異は無視した。試料採取の影響を除去するため、分類化または非分類化試料のいずれかで10個の配列カウントを分析から除いた。エピスタシスを、乗法的モデル:EnrichAB=EnrichA x EnrichBにおける単一及び重複変異からの濃縮比を結合することによって計算した。従って、エピスタシスは、Epistasis=EnrichAB - EnrichA x EnrichB.として定義される。単一変異分析と重複変異分析からの最大濃縮化変異を合成のために選別した。
シングルサイクルカイネティクスによる抗BACE1Fab抗体の結合親和性を、BIAcore(商標)-T200機器を使った表面プラズモン共鳴(SRP)測定によって決定した。簡潔には、シリーズSセンサーチップCM5を、供給者の使用説明書に従ってEDC及びNHS試薬で活性化し、抗His抗体を結合して約1000レスポンスユニット(RU)を得た後、1Mのエタノールアミンで非反応基をブロックした。速度論測定のために、最初にHisタグBACE1蛋白質を10μl/分の流速で注入し、FC1(参照)以外の3つの異なるフローセル(FC)上で約100Ruを捕獲し、次いでHBS-P バッファー(0.01M HEPES pH7.4、0.15MのNaCl、0.005%界面活性剤P20)中、Fabの5倍段階希釈を低(0.08nM)から高(50nM)まで交互に、注入の間に再生せずに、同じ周期で注入(流速:30ml/分)した。センサーグラムを記録し、基準に従ってバッファー控除してからBIAcore(商標)T200 Evaluation Software(version 2.0)を使用して評価した。会合速度(kon)及び解離速度(koff)は、単純一対一ラングミュア結合モデルを使用して計算した。平衡解離定数(Kd)は、koff/kon比として計算した。
DSFは蛍光色素の存在下で蛋白質の熱アンフォールディングを監視し、一般的にリアルタイムPCR機器(例えば、Bio-Rad CFX)を使用して行う。SYPROオレンジ色素(Invitrogen,cat.no.S6650)がPBSで1:20に希釈される。1μlの希釈色素を1ウエルの24μlのFab蛋白質(~100ug/ml)に加える。温度をリアルタイムPCR機器(BioRad CFX)で20℃から100℃まで上昇させ、蛍光強度をプロットし、遷移曲線(Tm)の変曲点を,例えばボルツマン方程式を使って計算する。Nature Protocols,2007,2:2212-2221を参照されたい。
抗TfR/BACE1二重特異性抗体の安定性を促進するため、位置108のメチオニンがロイシン(M108L)へ変化した重鎖可変領域の変異を組み込むことができる。表15に示すように、M108L変異を含む抗TfR Fabの結合親和性は非修飾Fabと類似した。
表15;抗TfR Fabの結合親和性
Claims (90)
- 多重特異性抗体であって、ヒトトランスフェリン受容体(TfR)及び非ヒト霊長類TfRに結合する第1抗原結合部位を含む抗体前半及びBACE1に結合する第2抗原結合部位を含む抗体後半を備え、前記抗体がトランスフェリンのTfRへの結合を阻害せず、かつ前記第2抗原結合部位が、HVR-H1配列、HVR-H2配列及びHVR-H3配列を含み、それぞれが、
配列番号165、179及び202; 配列番号165、383及び385; 配列番号165、179及び379; 配列番号376、377及び202; 配列番号376、377及び378; 配列番号376、377及び379; 配列番号380、179及び384; 配列番号381、179及び202; または配列番号382、179及び202から選択され、ならびに前記第2抗原結合部位が、HVR-L1配列、HVR-L2配列及びHVR-L3配列を含み、それぞれが、
配列番号215、221及び230; 配列番号215、223及び230; または配列番号215、375及び230から選択される、多重特異性抗体。 - 多重特異性抗体であって、ヒトTfR及び非ヒト霊長類TfRに結合する第1抗原結合部位を含む抗体前半及びBACE1に結合する第2抗原結合部位を含む抗体後半を備え、前記抗体がトランスフェリンのTfRへの結合を阻害せず、抗体の1つ以上の特性が修飾されて、網状赤血球への抗体の影響が低減または除去され、及び/または抗体で処置した対象または哺乳類の急性臨床症状の重症度または存在が低減し、かつ前記第2抗原結合部位が、HVR-H1配列、HVR-H2配列及びHVR-H3配列を含み、それぞれが、
配列番号165、179及び202; 配列番号165、383及び385; 配列番号165、179及び379; 配列番号376、377及び202; 配列番号376、377及び378; 配列番号376、377及び379; 配列番号380、179及び384; 配列番号381、179及び202; または配列番号382、179及び202から選択され、ならびに前記第2抗原結合部位が、HVR-L1配列、HVR-L2配列及びHVR-L3配列を含み、それぞれが、
配列番号215、221及び230; 配列番号215、223及び230; または配列番号215、375及び230から選択される、多重特異性抗体。 - 前記1つ以上の特性は、前記抗体のFc領域のエフェクター機能、前記抗体の補体活性機能、前記抗体の半減期及びTfRに対する前記抗体の親和性から選択される、請求項2に記載の抗体。
- 前記1つ以上の特性は、前記抗体のFc領域のエフェクター機能及び前記抗体の補体活性機能から選択され、前記エフェクター機能または補体活性機能は同アイソタイプの野生型抗体と比較して低減または除去されている、請求項2または請求項3に記載の抗体。
- 前記抗体のグリコシル化が減少されているか、エフェクター機能を低減または排除するアイソタイプへ抗体アイソタイプが修飾されているか、またはFc領域が修飾されており、それによって前記エフェクター機能が低減または除去されている、請求項4に記載の抗体。
- 前記抗体が、野生型グリコシル化を可能にしない環境で得られているか、前記抗体上に既に存在していた炭水化物基が除去されているか、または前記抗体が修飾されて野生型グリコシル化が起こることを阻止されており、それによって前記抗体のグリコシル化が減少されている、請求項5に記載の抗体。
- 前記抗体は、非哺乳類細胞産生系由来である、または前記抗体は合成産生系由来である、請求項6に記載の抗体。
- 前記抗体のFc領域は、位置297の変異を含み、その位置の野生型アスパラギン残基がその位置のグリコシル化を妨げる別のアミノ酸で置換される、請求項6に記載の抗体。
- モノクローナル抗体である、請求項1~8のいずれか1項に記載の抗体。
- 前記第1抗原結合部位は、ヒト化抗原結合部位である、請求項1~9のいずれか1項に記載の抗体。
- 前記第2抗原結合部位は、ヒト抗原結合部位である、請求項1~9のいずれか1項に記載の抗体。
- 第1抗原結合部位は、配列番号31、33及び34、配列番号36、38及び39、配列番号36、40及び34、配列番号42、43及び44、配列番号31、33及び34、配列番号46、48及び49、配列番号52、54及び55、配列番号52、58及び59、配列番号62、63及び55、配列番号52、65及び55、配列番号68、69及び70、配列番号73、75及び76、配列番号79、81及び82、配列番号79、83及び84、配列番号87、89及び90、配列番号93、95及び96、配列番号99、101及び102、配列番号127、33及び34、配列番号52、406及び55、配列番号52,407及び55、または配列番号408,54及び55のアミノ酸配列をそれぞれ含むHVR-L3、HVR-H2、及びHVR-H3を備える、請求項1~11のいずれか1項に記載の抗体。
- 前記第1抗原結合部位は、配列番号32、33及び34、配列番号37、38及び39、配列番号32、40及び34、配列番号37、43及び44、配列番号32、33及び34、配列番号47、48及び49、配列番号53、54及び55、配列番号53、58及び59、配列番号53、63及び55、配列番号53、65及び55、配列番号53、69及び70、配列番号74、75及び76、配列番号80、81及び82、配列番号80、83及び84、配列番号88、89及び90、配列番号94、95及び96、配列番号100、101及び102、配列番号53、406及び55または配列番号53,407及び55のアミノ酸配列をそれぞれ含むHVR-H1、HVR-H2、及びHVR-H3を備える、請求項1~12のいずれか1項に記載の抗体。
- 前記第1抗原結合部位は、配列番号29、30及び31、配列番号35、30及び36、配列番号41、30及び42、配列番号29、30及び31、配列番号45、30及び46、配列番号50、51及び52、配列番号56、57及び52、配列番号60、61及び62、配列番号60、64及び52、配列番号66、67及び68、配列番号71、72及び73、配列番号77、78及び79、配列番号85、86及び87、配列番号91、92及び93、配列番号97、98及び99、配列番号29、30及び127または配列番号50,51及び408のアミノ酸配列をそれぞれ含むHVR-L1、HVR-L2、及びHVR-L3を備える、請求項1~13のいずれか1項に記載の抗体。
- 前記第1抗原結合部位は、
a)配列番号47、53または100のHVR-H1配列、
b)配列番号48、69、101、406または407のHVR-H2配列、
c)配列番号49、76または102のHVR-H3配列、
d)配列番号45、66または97のHVR-L1配列、
e)配列番号30、67または98のHVR-L2配列、及び
f)配列番号46、68または99のHVR-L3配列から選択される少なくとも1つのHVR-H1、HVR-H2、HVR-H3、HVR-L1、HVR-L2またはHVR-L3を含む、請求項1~14のいずれか1項に記載の抗体。 - 前記第1抗原結合部位は、(a)配列番号7,8,9,10,15,16,17,18,20,25,26,27,28,108,114,120,126,403若しくは404のアミノ酸配列と少なくとも95%の配列同一性を有するVH配列、(b)配列番号4,5,6,11,12,13,14,19,21,22,23,24,105,111,117,123,401、402のアミノ酸配列と少なくとも95%の配列同一性を有するVL配列、または(c)(a)に記載のVH配列及び(b)に記載のVL配列を含む、請求項1~15のいずれか1項に記載の抗体。
- 前記第1抗原結合部位は、
a)配列番号108;
b)配列番号114;
c)配列番号120;
d)配列番号126;
e)配列番号403;または
f)配列番号404の重鎖可変領域(VH)配列を含む、請求項1~16のいずれか1項に記載の抗体。 - 前記第1抗原結合部位は、
a)配列番号105;
b)配列番号111;
c)配列番号117;
d)配列番号123;
e)配列番号402;または
f)配列番号401の軽鎖可変領域(VL)配列を含む、請求項1~17のいずれか1項に記載の抗体。 - 前記第1抗原結合部位は、
a)配列番号108のVH配列及び配列番号105のVL配列;
b)配列番号114のVH配列及び配列番号111のVL配列;
c)配列番号120のVH配列及び配列番号117のVL配列;
d)配列番号126のVH配列及び配列番号123のVL配列;
e)配列番号403のVH配列及び配列番号105のVL配列;
f)配列番号404のVH配列及び配列番号105のVL配列;
g)配列番号108のVH配列及び配列番号401のVL配列;
h)配列番号108のVH配列及び配列番号402のVL配列;
i)配列番号403のVH配列及び配列番号401のVL配列;
j)配列番号404のVH配列及び配列番号401のVL配列;
k)配列番号403のVH配列及び配列番号105のVL配列;または
l)配列番号404のVH配列及び配列番号105のVL配列を含む、請求項1~18のいずれか1項に記載の抗体。 - 前記抗体は、1pM~100μMのヒトTfRに対する親和性(KD)を有する、請求項1~19のいずれか1項に記載の抗体。
- 前記抗体は、20nM~1μM、または30nM~1μM、または40nM~1μMのヒトTfRに対する親和性(KD)を有する、請求項1~20のいずれか1項に記載の抗体。
- 前記第2抗原結合部位は、
a)配列番号288、352~358及び367~374から選択される配列と少なくとも90%の配列同一性を有する重鎖可変ドメイン配列、または
b)配列番号306、345~351及び359~366から選択される配列と少なくとも90%の配列同一性を有する軽鎖可変ドメイン配列、または
c)(a)に記載の重鎖可変ドメイン配列及び(b)に記載の軽鎖可変ドメイン配列を含む、請求項1~21のいずれか1項に記載の抗体。 - 前記第2抗原結合部位は、
a)配列番号288、352~358及び367~374から選択される配列を有する重鎖可変ドメイン配列、または
b)配列番号306、345~351及び359~366から選択される配列を有する軽鎖可変ドメイン配列、または
c)(a)に記載の重鎖可変ドメイン配列及び(b)に記載の軽鎖可変ドメイン配列を含む、請求項1~22のいずれか1項に記載の抗体。 - 前記抗体は、BACE1の活性を調節する、請求項1~23のいずれか1項に記載の抗体。
- 前記抗体は、BACE1の活性を阻害する、請求項24に記載の抗体。
- BACE1活性は、均一時間分解蛍光(HTRF)アッセイを使用して測定される、請求項24または請求項25に記載の抗体。
- BACE1活性は、BACE1基質を発現する細胞株を使用して測定される、請求項24または請求項25に記載の抗体。
- BACE1基質は、アミロイド前駆体蛋白質(APP)である、請求項27に記載の抗体。
- BACE1活性は、多重特異性抗体を投与された動物からの組織で測定される、請求項24または請求項25に記載の抗体。
- 前記組織は脳組織である、請求項29に記載の抗体。
- 前記動物は、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、サル及び非ヒト霊長類から選択される、請求項29または請求項30に記載の抗体。
- 前記抗体は、IgG抗体である、請求項1~31のいずれか1項に記載の抗体。
- 前記抗体は、IgG1またはIgG4抗体である、請求項32に記載の抗体。
- 前記抗体は、IgG1抗体である、請求項33に記載の抗体。
- 前記抗体は、第1重鎖定常領域及び第2重鎖定常領域を含み、前記第1重鎖定常領域はノブ変異を含み、前記第2重鎖定常領域はホール変異を含む、請求項1~34のいずれか1項に記載の抗体。
- 第1重鎖定常領域は、前記第1抗原結合部位と融合される、請求項34に記載の抗体。
- 前記第2重鎖定常領域は、前記第2抗原結合部位と融合される、請求項35または請求項36に記載の抗体。
- 前記第1重鎖定常領域は、前記第2抗原結合部位と融合される、請求項35に記載の抗体。
- 前記第2重鎖定常領域は、前記第1抗原結合部位と融合される、請求項35または請求項38に記載の抗体。
- 前記抗体は、IgG1抗体であり、前記ノブ変異はT366W変異を含む、請求項35~39のいずれか1項に記載の抗体。
- 前記抗体は、IgG1抗体であり、前記ホール変異はT366S、L368A及びY407Vから選択される少なくとも1つ、少なくとも2つ、または少なくとも3つの変異を含む、請求項35~40のいずれか1項に記載の抗体。
- 前記抗体は、IgG4抗体であり、前記ノブ変異はT366W変異を含む、請求項35~39のいずれか1項に記載の抗体。
- 前記抗体は、IgG4抗体であり、前記ホール変異はT366S、L368A及びY407V変異から選択される少なくとも1つ、少なくとも2つ、または少なくとも3つの変異を含む、請求項35~39及び42のいずれか1項に記載の抗体。
- Fc領域が、エフェクター機能を低減または除去する少なくとも1つの修飾を有する、請求項1~43のいずれか1項に記載の抗体。
- 前記Fc領域の全部または一部が欠失されているか、あるいは前記エフェクター機能または補体活性化機能に適格なFc領域または非Fc領域を含まないように前記抗体が操作されており、それによって前記エフェクター機能または補体活性化機能が低減または除去されている、請求項44に記載の抗体。
- 前記修飾は、234、235、238、239、248、249、252、254、265、268、269、270、272、278、289、292、293、294、295、296、297、298、301、303、322、324、327、329、333、335、338、340、373、376、382、388、389、414、416、419、434、435、437、438、及び439の位置から選択される1つ以上のFc受容体への結合を損なう前記Fc領域の点突然変異;270、322、329、及び321の位置から選択されるC1qへの結合を損なう前記Fc領域の点突然変異;前記Fc領域の一部または全部の除去、及びCH1ドメインの位置132の点突然変異から選択される、請求項45に記載の抗体。
- 前記修飾は、位置234、235、265、297及び329から選択される1つ以上のFc受容体への結合を損なう前記Fc領域の少なくとも1つの点突然変異である、請求項46に記載の抗体。
- 前記修飾は、位置297、または位置265及び297にある、請求項47に記載の抗体。
- 前記修飾は、位置234、235及び329にある、請求項47に記載の抗体。
- 前記修飾は、N297G;D265A及びN297AまたはD265A及びN297Gである、請求項47に記載の抗体。
- 前記修飾は、L234A、L235A、及びP329Gである、請求項49に記載の抗体。
- 前記抗体は、252、254、256、434及び436から選択される位置で前記抗体のFcRn結合ドメインでの修飾を含む、請求項1~51のいずれか1項に記載の抗体。
- 半減期は、前記FcRn結合ドメインでの修飾を欠く親適用の半減期より大きい、請求項52に記載の抗体。
- 前記修飾は、位置252、254、及び256にある、請求項52または請求項53に記載の抗体。
- 前記修飾は、位置434及び436にある、請求項52または請求項53に記載の抗体。
- 前記修飾は、M252Y、S254T及びT256Eである、請求項54に記載の抗体。
- 前記修飾は、N434A及びY436Iである、請求項55に記載の抗体。
- 前記抗体前半は第1重鎖及び第1軽鎖を含み、ならびに前記抗体後半は第2重鎖及び第2軽鎖を含み、
a)前記第1重鎖及び前記第1軽鎖は、配列番号329及び330、配列番号333及び334、配列番号337及び338、配列番号341及び342、配列番号394及び342から選択され、かつ
b)前記第2重鎖及び前記第2軽鎖は、配列番号331及び332、配列番号335及び336、配列番号339及び340、及び配列番号343及び344から選択される、請求項1~57のいずれか1項に記載の抗体。 - a)前記第1重鎖及び前記第1軽鎖は、配列番号333及び334、配列番号341及び342、及び配列番号394及び342から選択され、かつ
b)前記第2重鎖及び前記第2軽鎖は、配列番号335及び336、及び配列番号343及び344から選択される、請求項58に記載の抗体。 - 多重特異性抗体であって、ヒトトランスフェリン受容体(TfR)及び非ヒト霊長類TfRに結合する第1抗原結合部位を含む抗体前半とBACE1に結合する第2抗原結合部位を含む抗体後半を含み、
a)前記抗体前半は、配列番号394の配列を有する第1重鎖と配列番号342の配列を有する第1軽鎖を含み、前記抗体後半は、配列番号343の配列を有する第2重鎖と配列番号344の配列を有する第2軽鎖を含む、または、
b)前記抗体前半は、配列番号396の配列を含む第1重鎖可変領域と配列番号398の配列を含む第1軽鎖可変領域を含み、前記抗体後半は、配列番号399の配列を含む第2重鎖可変領域と配列番号400の配列を含む第2軽鎖可変領域を含む、多重特異性抗体。 - a)請求項1~60のいずれか1項に記載の抗体、または
b)請求項1~60のいずれか1項に記載の抗体後半、をコードする単離された核酸。 - 請求項1~60のいずれか1項に記載の抗体前半をコードする第1単離核酸と請求項1~60のいずれか1項に記載の抗体後半をコードする第2単離核酸を含む組成物。
- 請求項61に記載の核酸または請求項62に記載の組成物を含む宿主細胞。
- 抗体または半抗体を作成する方法であって、請求項63に記載の宿主細胞を培養して、抗体または半抗体を作製する、ならびに任意選択で宿主細胞から抗体または半抗体を回収することを含む、方法。
- 請求項1~60のいずれか1項に記載の抗体と薬剤的に許容される担体を含む製剤。
- 網状赤血球レベルまたは急性臨床症状への影響を緩和する、あるいは影響の減少に寄与する化合物を含む、請求項65に記載の製剤。
- 前記化合物は、網状赤血球を抗体関連の枯渇から保護し、あるいは網状赤血球の成長、発達または再建を支持する、請求項66に記載の製剤。
- 前記化合物は、エリスロポエチン(EPO)、鉄分補充剤、ビタミンC、葉酸、およびビタミンB12から選択される、または赤血球若しくは網状赤血球である、請求項66または請求項67に記載の製剤。
- 対象における神経疾患または障害を治療するための医薬であって、請求項1~60のいずれか1項に記載の抗体の有効量を含む、医薬。
- 神経疾患または障害を患う対象または感染の危険性がある対象におけるアミロイド斑を低減するための医薬であって、請求項1~60のいずれか1項に記載の抗体の有効量を含む、医薬。
- 神経疾患または障害を患う対象または発症の危険性がある対象におけるアミロイド斑形成を阻害するための医薬であって、請求項1~60のいずれか1項に記載の抗体の有効量を含む、医薬。
- 前記神経疾患または障害は、アルツハイマー病(AD)、外傷性脳損傷、脳卒中、緑内障、痴呆、筋ジストロフィー(MD)、多発性硬化症(MS)、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、嚢胞性線維症、Angelman 症候群、リドル症候群、ページェット病、外傷性脳損傷、レヴィー小体病、ポリオ後症候群、シャイ・ドレーガー症候群、オリーブ橋小脳萎縮、パーキンソン病、多系統萎縮症、線条体黒質変性、核上まひ、牛海綿状脳症、スクラピー、クロイツフェルト-ヤコブ症候群、クールー、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー病、慢性消耗症、致死性家族性不眠症、延髄麻痺、運動ニューロン疾患、カナバン病、ハンチントン舞踏病、ニューロンセロイド-リポフスチノーシス、アレグザンダー病、トゥレット症候群、メンケス癖毛症候群、コケイン症候群、ハレルフォルデン-スパッツ症候群、ラフォラ(Lafora)病、レット症候群、肝レンズ核変性症、レッシューナイハン症候群、ウンフェルリヒト・ルントボルク病、ピック病及び脊髄小脳失調症から選択される、請求項69~71のいずれか1項に記載の医薬。
- 前記神経疾患または障害は、アルツハイマー病、脳卒中、外傷性脳損傷及び緑内障から選択される、請求項72に記載の医薬。
- 対象におけるアミロイド-β(Aβ)蛋白質を低減するための医薬であって、請求項1~60のいずれか1項に記載の抗体の有効量を含む、医薬。
- 前記対象は、神経疾患または障害を患っている、または感染の危険性にある、請求項74に記載の医薬。
- 前記神経疾患または障害は、アルツハイマー病、脳卒中、外傷性脳損傷及び緑内障から選択される、請求項75に記載の医薬。
- 抗体の投与量及び/または投与頻度を調節し、赤血球が曝露される抗体の濃度を低減する、請求項69~76のいずれか1項に記載の医薬。
- 赤血球の枯渇について前記対象が監視される、請求項77に記載の医薬。
- 投与はTfR飽和である、請求項69~78のいずれか1項に記載の医薬。
- 急性臨床症状を最小化するために前記抗体の用量及び/または投与頻度が調整される、請求項69~79のいずれか1項に記載の医薬。
- 対象における神経疾患または障害を診断するためのキットであって、請求項1~60のいずれか1項に記載の抗体を含み、前記対象から単離した生物学的試料が、請求項1~60のいずれか1項に記載の抗体と、BACE1ポリペプチドへの抗体の結合に好適な条件下で接触させられ、及び複合体が抗体とBACE1ポリペプチドの間で形成される場合に、該複合体が検出される、キット。
- 対象が抗BACE1抗体による治療に適格であるかどうかを決定するためのキットであって、請求項1~60のいずれか1項に記載の抗体を含み、前記対象から単離した生物学的試料が、請求項1~60のいずれか1項に記載の抗体と、BACE1ポリペプチドへの抗体の結合に好適な条件下で接触させられ、及び複合体が抗体とBACE1ポリペプチドの間で形成される場合に、該複合体が検出され、抗体とBACE1ポリペプチドの間の複合体の検出が、抗BACE1抗体による治療に適格な対象であることを示す、キット。
- 前記生物学的試料は、血清、血漿、唾液、胃液分泌、粘液、脳脊髄液、リンパ液、神経組織、脳組織、心臓組織または維管束組織から選択される、請求項81または請求項82に記載のキット。
- 薬剤として使用するための請求項1~60のいずれか1項に記載の抗体。
- 神経障害の治療で用いる、請求項1~60のいずれか1項に記載の抗体。
- アルツハイマー病(AD)、外傷性脳損傷、脳卒中、緑内障、痴呆、筋ジストロフィー(MD)、多発性硬化症(MS)、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、嚢胞性線維症、Angelman症候群、リドル症候群、ページェット病、外傷性脳損傷、レヴィー小体病、ポリオ後症候群、シャイ・ドレーガー症候群、オリーブ橋小脳萎縮、パーキンソン病、多系統萎縮症、線条体黒質変性、核上まひ、牛海綿状脳症、スクラピー、クロイツフェルト-ヤコブ症候群、クールー、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー病、慢性消耗症、致死性家族性不眠症、延髄麻痺、運動ニューロン疾患、カナバン病、ハンチントン舞踏病、ニューロンセロイド-リポフスチノーシス、アレグザンダー病、トゥレット症候群、メンケス癖毛症候群、コケイン症候群、ハレルフォルデン-スパッツ症候群、ラフォラ(Lafora)病、レット症候群、肝レンズ核変性症、レッシューナイハン症候群、ウンフェルリヒト・ルントボルク病、ピック病及び脊髄小脳失調症から選択される神経障害の治療で用いる、請求項85に記載の抗体。
- アミロイド-β(Aβ)蛋白質産生の減少及び/または阻害で用いる、請求項1~60のいずれか1項に記載の抗体。
- 医薬の製造における、請求項1~60のいずれか1項に記載の抗体の使用。
- 医薬は、アルツハイマー病(AD)、外傷性脳損傷、脳卒中、緑内障、痴呆、筋ジストロフィー(MD)、多発性硬化症(MS)、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、嚢胞性線維症、Angelman 症候群、リドル症候群、ページェット病、外傷性脳損傷、レヴィー小体病、ポリオ後症候群、シャイ・ドレーガー症候群、オリーブ橋小脳萎縮、パーキンソン病、多系統萎縮症、線条体黒質変性、核上まひ、牛海綿状脳症、スクラピー、クロイツフェルト-ヤコブ症候群、クールー、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー病、慢性消耗症、致死性家族性不眠症、延髄麻痺、運動ニューロン疾患、カナバン病、ハンチントン舞踏病、ニューロンセロイド-リポフスチノーシス、アレグザンダー病、トゥレット症候群、メンケス癖毛症候群、コケイン症候群、ハレルフォルデン-スパッツ症候群、ラフォラ(Lafora)病、レット症候群、肝レンズ核変性症、レッシューナイハン症候群、ウンフェルリヒト・ルントボルク病、ピック病及び脊髄小脳失調症からなる群から選択される神経障害の治療用である、請求項88に記載の使用。
- 前記医薬は、アミロイド-β(Aβ)蛋白質産生の低減及び/または阻害用である、請求項88に記載の使用。
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