ES2602611T3 - Anticuerpos inhibidores de BACE1 - Google Patents

Abstract

Un anticuerpo monoclonal anti-BACE1 aislado consistente en 2 cadenas pesadas y 2 cadenas ligeras, caracterizado por que dicho anticuerpo monoclonal inhibe la escisión mediada por BACE1 de la proteína precursora de amiloide beta (APP), y en donde dicho anticuerpo monoclonal se une a un epítopo conformacional de BACE1 que comprende los residuos de aminoácidos 332 a 334 del bucle D y los residuos de aminoácidos 376 a 379 del bucle F de BACE1, tal como se recoge en SEQ ID NO:1.

Description

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superficie de la célula (véase también la sección de Antecedentes). Anticuerpos monoclonales inhibidores de BACE1 pueden fijar como objetivo BACE1 en la superficie celular y pueden ser internalizados para inhibir la generación de Aß en la vía endocítica.

Sin embargo, se sabe por el experto en la materia que un anticuerpo que ha sido obtenido para una diana terapéuticamente útil requiere una modificación adicional con el fin de prepararlo para la terapia humana, a fin de evitar una reacción inmunológica no deseada en un individuo humano tras la administración. El proceso de modificación se denomina comúnmente "humanización". Es conocido por el experto en la materia que los anticuerpos desarrollados en especies, excepto en los seres humanos, requieren una humanización para hacer que el anticuerpo sea terapéuticamente útil en los seres humanos ((1) injerto de CDR: Protein Design Labs: documentos US6180370, US5693761; Genentech documento US6054297; Celltech: documentos EP626390, US5859205; (2) Recubrimiento: Xoma: documentos US5869619, US5766886, US5821123). La humanización de anticuerpos implica la tecnología de ADN recombinante, y se aparta de partes de secuencias de ADN genómicas de roedores y/o humanas que codifican las cadenas H y L o de clones de ADNc que codifican cadenas H y L. Técnicas para la humanización de anticuerpos no humanos son conocidas por el experto en la materia, ya que éstas forman parte del estado actual de la técnica. Anticuerpos de mamíferos no humanos o anticuerpos de animales pueden humanizarse (véase, por ejemplo, Winter y Harris 1993). Los anticuerpos o anticuerpos monoclonales pueden ser versiones humanizadas de anticuerpos de, por ejemplo, anticuerpos de roedores o anticuerpos monoclonales de roedores.

También se prevén en esta memoria fragmentos activos de los anticuerpos anti-BACE1 inhibidores tal como se describe en esta memoria.

La expresión "fragmento activo" se refiere a una porción de un anticuerpo que por sí misma tiene alta afinidad para un determinante antigénico, o epítopo, y contiene una o más CDRs que representan tal especificidad. Ejemplos no limitantes incluyen Fab, F(ab)'2, scFv, dímeros de cadena pesada-ligera, nanocuerpos, anticuerpos de dominio y estructuras de cadena sencilla tal como una cadena ligera completa o una cadena pesada completa. Un requisito adicional para la "actividad" de dichos fragmentos es que dichos fragmentos sean capaces de inhibir la actividad de BACE1. Los anticuerpos tal como se describen en esta memoria, o sus fragmentos activos, pueden marcarse mediante un marcador adecuado, dicho marcador puede ser, por ejemplo, del tipo enzimático, colorimétrico, quimioluminiscente, fluorescente o radiactivo.

También se describen en esta memoria líneas celulares de hibridoma con el número de acceso LMBP 6871CB o LMBP 6872CB o LMBP 6873CB que secretan los anticuerpos anti-BACE1 inhibidores.

Los anticuerpos anti-BACE1 inhibidores, tal como se describen en esta memoria, son útiles como un medicamento, en particular en muchas aplicaciones para prevenir o tratar la enfermedad de Alzheimer en sujetos en necesidad del mismo. En particular, los anticuerpos se pueden utilizar para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de enfermedades asociadas con una sobre-expresión de BACE1. Un ejemplo de una enfermedad en la que se produce una sobre-expresión de BACE1 es la enfermedad de Alzheimer. En una realización particular, los anticuerpos de la invención o fragmentos activos de los mismos se pueden utilizar en la prevención y/o en la reducción de la formación de péptido ameloide beta (Aß) y/o la proteína precursora de amiloide beta (APP).

En general, "cantidad terapéuticamente eficaz", "dosis terapéuticamente eficaz" y "cantidad eficaz" significa la cantidad necesaria para conseguir el resultado o los resultados (de inhibición de la unión de BACE1; tratar o prevenir la enfermedad de Alzheimer) deseados. Una persona de experiencia ordinaria en la técnica reconocerá que la potencia y, por lo tanto, una "cantidad eficaz" puede variar para el anticuerpo que inhibe la unión de BACE1. Un experto en la técnica puede evaluar fácilmente la potencia del anticuerpo. Por "farmacéuticamente aceptable" se quiere dar a entender un material que no es biológicamente o de otro modo indeseable, es decir, el material puede administrarse a un individuo junto con el compuesto sin provocar un efecto biológico indeseable o interactuar de una manera perjudicial con cualquiera de los otros componentes de la composición farmacéutica en la que está contenido. La expresión ‘medicamento para tratar' se refiere a una composición que comprende anticuerpos tal como se describe anteriormente y un soporte o excipiente farmacéuticamente aceptable (ambas expresiones pueden utilizarse indistintamente) para tratar o para prevenir enfermedades tal como se describe en esta memoria. La administración de un anticuerpo tal como se describe anteriormente o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma puede ser por medio de administración oral, inhalada o parenteral. En realizaciones particulares el anticuerpo se administra a través de administración intratecal o intracerebroventricular. El compuesto activo puede administrarse solo o preferiblemente formulado como una composición farmacéutica. Una cantidad eficaz para tratar

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nanopartículas, nanogeles, entre otros) para facilitar la administración al cerebro de fármacos a base de anticuerpos (Patel et al. 2009), y todos ellos se pueden utilizar en la práctica de la solicitud.

La solicitud describe, además, una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo o el fragmento activo de la presente invención y al menos un soporte farmacéuticamente aceptable, adyuvante o diluyente.

También se proporciona en esta memoria la composición farmacéutica anteriormente descrita para su uso en el tratamiento y/o la profilaxis trastornos descritos en esta memoria, que comprende una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, o un solvato farmacéuticamente aceptable del mismo y, si se requiere, un soporte farmacéuticamente aceptable del mismo.

Un "soporte", o "adyuvante", en particular un "soporte farmacéuticamente aceptable" o "adyuvante farmacéuticamente aceptable" es cualquier excipiente, diluyente, soporte y/o adyuvante que, por sí mismos, no inducen la producción de anticuerpos perjudiciales para el individuo que recibe la composición ni tampoco educen protección. Preferiblemente, un soporte o adyuvante farmacéuticamente aceptable potencia la respuesta inmunitaria educida por un antígeno. Soportes o adyuvantes adecuados típicamente comprenden uno o más de los compuestos incluidos en la siguiente lista no exhaustiva: macromoléculas grandes metabolizadas lentamente tales como proteínas, polisacáridos, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácidos y partículas de virus inactivos.

Un "diluyente", en particular un "vehículo farmacéuticamente aceptable", incluye vehículos tales como agua, solución salina, soluciones salinas fisiológicas, glicerol, etanol, etc. Sustancias auxiliares tales como agentes humectantes o emulsionantes, sustancias tamponantes del pH, conservantes se pueden incluir en tales vehículos.

Debe quedar claro que el método terapéutico tal como se describe en esta memoria para la enfermedad de Alzheimer también se puede utilizar en combinación con cualquier otra terapia de la enfermedad AD conocida en la técnica tales como inhibidores de la gamma-secretasa, u otros inhibidores de la beta-secretasa.

También se describe aquí una región determinante de la complementariedad (CDR) aislada de un anticuerpo anti-BACE1, capaz de inhibir la actividad de BACE1. Dicha CDR también puede ser incorporada en una composición que comprende además, por ejemplo, un soporte, adyuvante o diluyente. También se describen en esta memoria secuencias de ácidos nucleicos de CDR aisladas, así como cualquier vector o ácido nucleico recombinante (ADN, ARN, PNA, LNA, o cualquier híbrido de los mismos; lineal o circular; independientes del tipo de cadena) que comprende dicho ácido nucleico de CDR. Cualquier célula huésped que comprende una secuencia de ácido nucleico de CDR de este tipo, vector o ácido nucleico recombinante es también parte de la solicitud. También queda abarcada en esta memoria una región variable de un anticuerpo anti-BACE1 aislado capaz de inhibir la actividad de BACE1. Dicha región variable también se puede incorporar en una composición que comprende, además, por ejemplo, un soporte, adyuvante o diluyente. Las secuencias de ácidos nucleicos de la región variable aisladas son parte de la solicitud, así como cualquier vector o ácido nucleico (ADN, ARN, PNA, LNA, o cualquier híbrido de los mismos; lineal o circular; independiente del tipo de cadena) recombinante, que comprende un ácido nucleico de la región variable de este tipo. Cualquier célula huésped que comprende esta secuencia de ácido nucleico de la región variable, vector o ácido nucleico recombinante es también parte de la solicitud.

También se describen en esta memoria compuestos que son capaces de inhibir la actividad de BACE1, comprendiendo dichos compuestos al menos una CDR tal como se describió anteriormente o al menos una región variable tal como se describió anteriormente. Un compuesto de este tipo se puede utilizar en la prevención y/o el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer. Dichos compuestos también se pueden incorporar en una composición que comprende, además, por ejemplo, un soporte, adyuvante o diluyente. Ejemplos no limitantes de tales compuestos son los aptámeros de proteínas y anticuerpos biespecíficos o fragmentos activos de los mismos.

También se describe en esta memoria un método para producir o generar o seleccionar anticuerpos capaces de inhibir la actividad de BACE1, que comprende

(i)

inmunizar un animal no humano con BACE1, y

(ii)

rastrear una pluralidad de líneas de hibridoma para anticuerpos capaces de inhibir la actividad de BACE1.

Alternativamente, también se abarca en esta memoria un método de producir o generar o seleccionar anticuerpos capaces de inhibir la actividad de BACE1, que comprende

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(i)

inmunizar un animal no humano con BACE1, y

(ii)

rastrear una pluralidad de líneas de hibridoma para anticuerpos capaces de inhibir la actividad de BACE1, y

(iii) aislar una línea de hibridoma que produce dicho anticuerpo.

Cualquier animal adecuado, p. ej., un animal de sangre caliente, en particular un mamífero tal como un conejo, ratón, rata, camello, oveja, vaca o cerdo o un ave tal como un pollo o pavo, se puede inmunizar con BACE1 o al menos una parte, fragmento, determinante antigénico o epítopo de la misma, utilizando cualquiera de las técnicas bien conocidas en la técnica adecuada para generar una respuesta inmune. Procedimientos para la inmunización de animales son bien conocidos en la técnica. Tal como se apreciará por un experto normal en la técnica, el inmunógeno puede mezclarse con un adyuvante o hapteno con el fin de aumentar la respuesta inmune (por ejemplo, adyuvante de Freund completo o incompleto o adyuvante de lípido A), o con un soporte tal como hemocianina de lapa bocallave (KLH).

Una vez que un animal adecuado ha sido inmunizado y una respuesta inmune contra el antígeno ha sido establecida por el animal, se seleccionan células productoras de anticuerpos a partir del animal para identificar las células que producen anticuerpos que tienen una actividad deseada. A menudo, estos métodos emplean la tecnología de hibridomas, en la que células del bazo del animal inmunizado se fusionan con una célula inmortal adecuada para producir células de hibridoma. Los sobrenadantes de estas células de hibridoma se pueden rastrear y los clones positivos se expanden de acuerdo con procedimientos estándares (p. ej., Harlow et al. 1998) Antibodies: A Laboratory Manual, Primera edición (1998) Cold Spring Harbor, N.Y.).

La inmunización en la etapa (i) de los métodos anteriores se puede hacer con BACE1 o al menos una parte, fragmento, determinante antigénico o epítopo de la misma. En particular, dicha inmunización se puede hacer con el ectodominio de BACE1. El rastreo de las líneas de hibridoma en la etapa (ii) puede realizarse utilizando una o más técnicas de rastreo conocidas per se. Preferiblemente, se hace un rastreo funcional midiendo la actividad inhibidora de BACE1 en un ensayo de rastreo basado en células y/o un ensayo de rastreo libre de células, según se ejemplifica de una manera no limitativa en la sección de Ejemplos. Preferiblemente, los anticuerpos son anticuerpos monoclonales.

Los anticuerpos tal como se describen en esta memoria se pueden utilizar para la preparación de un ensayo de diagnóstico. BACE1 puede ser detectada en una diversidad de células y tejidos, especialmente en células y tejidos del cerebro, en donde el grado de expresión corrobora la gravedad de la enfermedad de Alzheimer. Por lo tanto, se proporciona un método de detectar in situ la localización y la distribución de la expresión de BACE1 en una muestra biológica. El método comprende la etapa de hacer reaccionar la muestra biológica con un anticuerpo anti-BACE1 detectable tal como se describe en esta memoria y detectar la localización y distribución de dicho anticuerpo. La expresión "muestra biológica" se refiere a células y tejidos, incluyendo, pero no limitados a las células y tejidos del cerebro. La expresión se refiere, además, a los fluidos corporales. Por lo tanto, en esta memoria se describe un método para detectar la proteína BACE1 en un fluido corporal de un paciente. El método comprende las etapas de hacer reaccionar el fluido corporal con un anticuerpo anti-BACE1 tal como se describe en esta memoria y vigilar la reacción. El fluido corporal es, por ejemplo, plasma, orina, líquido cefalorraquídeo, efusiones pleurales o saliva. La vigilancia de la reacción se puede efectuar haciendo que el anticuerpo sea marcado con un resto detectable, o para utilizar su región constante como un resto detectable inherente, al que un segundo anticuerpo que incluye un resto detectable puede unirse específicamente. BACE1 de CSF se puede detectar, por ejemplo, en pacientes que padecen la enfermedad de Alzheimer. Preferiblemente, la reacción del fluido corporal con el anticuerpo anti-BACE1 se efectúa en disolución. Alternativamente, la reacción del fluido corporal con el anticuerpo anti-BACE1 se efectúa sobre un sustrato capaz de adsorber las proteínas presentes en el fluido corporal, todo ello como es bien conocido en la técnica de diagnóstico basada en anticuerpos. Además se describe en esta memoria un método para detectar la presencia, ausencia o el nivel de proteína BACE1 en una muestra biológica. El método comprende las siguientes etapas. En primer lugar, las proteínas se extraen de la muestra biológica y se obtiene de este modo una pluralidad de proteínas. El extracto de proteínas puede ser un extracto bruto y también puede incluir material no proteináceo. En segundo lugar, las proteínas se separan por tamaño, p. ej., mediante electroforesis, filtración en gel, etc. En cuarto lugar, las proteínas separadas por tamaño se hacen interactuar con un anticuerpo anti-BACE1. Finalmente se detecta la presencia, ausencia o el nivel del anticuerpo anti-BACE1 que ha interactuado. En el caso de electroforesis en gel, la interacción con el anticuerpo se lleva a cabo típicamente después de transferencia de las proteínas separadas por tamaño sobre un soporte sólido (membrana).

Los métodos para producir los anticuerpos anti-BACE1 descritos anteriormente, o fragmentos activos de los mismos, forman un aspecto integral de la solicitud. En particular, tales métodos pueden comprender las etapas de: (i) obtener una preparación bruta de dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo por medio de la expresión recombinante del

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anticuerpo o fragmento de anticuerpo, o mediante síntesis química del anticuerpo o fragmento de anticuerpo; (ii) purificar dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la preparación bruta obtenida en (i). Alternativamente, un fragmento activo de los anticuerpos anti-BACE1 inhibidores tal como se describe en esta memoria puede obtenerse o producirse por un método que comprende las etapas de:

(i)

obtener una preparación bruta de un anticuerpo que comprende dicho fragmento por medio de expresión recombinante del anticuerpo o por medio de síntesis química del anticuerpo;

(ii)

purificar dicho anticuerpo a partir de la preparación bruta obtenida en (i);

(iii) aislar el fragmento activo del anticuerpo purificado en (ii). En los métodos citados anteriormente, la expresión recombinante no se limita a la expresión en líneas celulares de hibridoma.

Cualquier célula huésped que comprende y/o secreta (i) un anticuerpo anti-BACE1 inhibidor tal como se describe en esta memoria, (ii) un fragmento activo de (i), (iii) una secuencia de aminoácidos de CDR (i), (iv) una variable región de la secuencia de aminoácidos de (i), o (v) un compuesto que comprende (i), (ii), (iii) o (iv) es también parte de la solicitud.

EJEMPLOS

Depósitos biológicos

Las siguientes líneas celulares de hibridoma que secretan anticuerpos monoclonales tal como se mencionado a lo largo de la memoria descriptiva se depositaron de acuerdo con el Tratado de Budapest:

Línea celular de hibridoma

Fecha de depósito Institución para el depósito Número de Acceso

MAB-B1-1A11

13 de de mayo de 2009 Colección de plásmidos BCCM / LMBP LMBP 6871 CB

MAB-B1-14F10

13 de de mayo de 2009 Colección de plásmidos BCCM / LMBP LMBP 6872CB

MAB-B1-5G7

13 de de mayo de 2009 Colección de plásmidos BCCM / LMBP LMBP 6873CB

Los particulares de la institución para el depósito son:

-Colección de Plásmido BCCM/LMBP: Departamento de Biología Molecular Biomédica de la Universidad de Gante, edificio 'Fiers-Schell-Van Montagu', Technologiepark 927, B-9052 Gent -Zwijnaarde, Bélgica

Las notaciones "MAB-B1-1A11" y "1A11" se utilizan indistintamente a lo largo de la memoria descriptiva para la línea celular de hibridoma objeto o el anticuerpo monoclonal secretado por la línea celular de hibridoma.

Las notaciones "MAB-B1-14F10" y "14F10" se utilizan indistintamente a lo largo de la memoria descriptiva para la línea celular de hibridoma objeto o el anticuerpo monoclonal secretado por la línea celular de hibridoma.

Las notaciones "MAB-B1-5G7" y "5G7" se utilizan indistintamente a lo largo de la memoria descriptiva para la línea celular de hibridoma objeto o el anticuerpo monoclonal secretado por la línea celular de hibridoma.

Materiales y Métodos

Inmunización y producción de hibridomas. Cinco ratones BACE1-/-BACE2-/-de 9 semanas de edad recibieron cuatro inmunizaciones en un intervalo de cuatro semanas, componiéndose cada una de las inmunizaciones por una inyección intraperitoneal de la proteína purificada del ectodominio BACE1 humano (aminoácidos 45-460, generados a partir de cultivo celular HEK293) en mezcla 1: 1 con adyuvante de Freund. La primera inmunización contenía 50 µg de inmunógeno en mezcla con adyuvante completo de Freund, mientras que todas las inmunizaciones posteriores utilizaban 40 μg en mezcla de inmunógeno con adyuvante incompleto de Freund. Dos semanas después de la cuarta inmunización, anticuerpos específicos para BACE1 en el suero de cada uno de los ratones inmunizados se titularon por ELISA. Para la generación de hibridomas se eligieron los dos ratones con los títulos más altos (detectables después de dilución durante 40.000 veces en ELISA). Los hibridomas se produjeron tres meses después de la cuarta inmunización, cuando los títulos de anticuerpos en suero cayeron significativamente. Cada uno de los ratones recibió un refuerzo final que consistía en una inyección intravenosa en la vena de la cola usando 30 μg de inmunógeno. Los ratones fueron sacrificados y se aisló el bazo y se fusionó con células de mieloma en una relación 4: 1. En total, se recogieron 200 millones de células de bazo y se

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fusionaron con 50 millones de células de mieloma para generar hibridomas, y la mezcla de células se dividió en veintisiete placas de 96 pocillos recubiertas con capa de alimentación de ratón. Las células se cultivaron primero en medio HAT durante dos semanas para la selección de hibridomas, a continuación, se cultivaron en medio de HA durante otra semana antes del cambio a medio de crecimiento normal DMEM (Invitrogen) suplementado con FCS al 15% (Hyclone). Más del 90% de los pocillos tienen células que crecen después de la selección de hibridomas.

Rastreo de hibridomas mediante ELISA. El rastreo ELISA de clones de hibridoma positivos que producen anticuerpos anti-BACE1 se realizó de acuerdo con el protocolo estándar de ELISA. Brevemente, placas de poli(cloruro de vinilo) de 96 pocillos (BD Falcon) se recubrieron con 1 µg/ml de proteína del ectodominio de BACE1 purificado (en PBS) a razón de 50 µl/pocillo durante la noche a 4°C. Después de bloquear con BSA al 2% en PBS durante una hora a temperatura ambiente (TA), se añadieron 50 µl de sobrenadantes de hibridoma a las placas y se incubaron durante 2 horas. A continuación, las placas se lavaron con PBS + Tween-20 al 0,05%, y se incubaron con IgG-HRP de anti-ratón (Innova Biosciences) a una dilución de 1: 5000 en tampón de bloqueo durante 1 hora a TA. Después del lavado, las placas se desarrollaron con 50 µl de 0,2 mg/ml de tetrametil bencidina (Sigma) en NaAc 0,1 M de pH 4.9 y H2O2 al 0,03% durante 25 minutos. Las reacciones se detuvieron mediante la adición de 50 µl de H2SO4 2M y las placas se leyeron en un lector ELISA a una DO de 450 nm.

Rastreo de hibridomas mediante el ensayo mca-Fret. El rastreo del ensayo mca-Fret de hibridomas se realizó de acuerdo con el protocolo estándar proporcionado por Eli Lilly con alguna modificación. Brevemente, enzima BACE1Fc se diluyó en tampón de reacción (acetato de amonio 50 mM, pH 4,6, BSA al 3%, Triton X-100 al 0,7%) a una concentración de 1 µg/ml, y un pequeño sustrato de péptido FRET MCA-SEVENLDAEFRK(Dnp)-RRRR-NH2 se diluyó en tampón de reacción a una concentración de 125 uM. 20 µl de sobrenadantes de hibridoma se mezclaron con 30 μl de dilución de enzima y 50 µl de dilución de sustrato en placas de poliestireno negro de 96 pocillos (Costar), las placas se leyeron inmediatamente para la señal de línea de base con Envision (excitación 355 nm, emisión 430 nm, 1 s/pocillo), y después se incubaron durante la noche en la oscuridad a temperatura ambiente. Las placas se leyeron a la mañana siguiente utilizando el mismo protocolo lector.

Rastreo de hibridomas mediante tinción de inmunofluorescencia. Células HEK293 que expresan de forma estable BACE1 se cultivaron en placa de 96 pocillos pretratada con 0,2 mg/ml de poli-L-lisina. Las células se lavaron con PBS y después se fijaron con paraformaldehído al 4% y se permeabilizaron en Triton X-100 al 0,1%. Después de bloquear las células con 5% de suero de cabra diluido en tampón de bloqueo (FCS al 2%, BSA al 2% y gelatina al 0,2% en PBS) durante la noche a 4°C, se añadieron 50 µl de sobrenadantes de hibridoma a cada uno de los pocillos de las células y se incubaron durante 2 horas a TA. Después, las células se lavaron y se incubaron adicionalmente con IgG anti-ratón de cabra Alexa Fluor 488 (Invitrogen) a una dilución 1:1000 en tampón de bloqueo durante 1 hora a TA. Después del lavado, la placa de 96 pocillos se leyó mediante el analizador IN Cell Analyzer 1000 (Ammersham/GE Healthcare).

Rastreo de hibridomas mediante ensayo celular. Células SH-SY5Y que expresan de manera estable APP se cultivaron en placas de 24 pocillos hasta el 90% de confluencia. Después del lavado, las células fueron tratadas con 100 µl de sobrenadantes de hibridoma mezclados con 100 µl de medio de crecimiento DMEM reciente complementado con 4,5 g/L de glucosa, 0,11 g/L de piruvato de sodio y FCS al 15% a 37ºC con 5% de CO2 y 70% de humedad relativa. Sobrenadantes de células de hibridoma negativos mezclados con medio reciente se utilizaron como control negativo. Después del tratamiento durante 24 horas, el medio acondicionado se recogió y se centrifugó a 13.000 rpm durante 5 min a 4°C, los sobrenadantes se analizaron mediante transferencia Western para sAPPβ y sAPPα utilizando anticuerpos anticuerpo policlonal anti-sAPPβ (Covance) y 6E10 (Signet).

Isotipificación, Subclonación y Purificación de Anticuerpos. Los isotipos de 1A11, 5G7, 14F10 y 2G3 se determinaron mediante un kit de Isotipado de Anticuerpos Monoclonales de Ratón (Roche) de acuerdo con las instrucciones del fabricante como IgG1 (1A11, 5G7), IgG2b (14F10) e IgM (2G3). Los clones de hibridoma 1A11, 5G7 y 14F10 se subclonaron cuatro veces por dilución limitante. La producción de anticuerpos se llevó a cabo mediante el cultivo de clones de hibridoma en biorreactores CellineCL-1000 (VWR) utilizando medio DMEM complementado con glutamina 4 mM, 4 g/L de D-glucosa y FCS al 15% a 37°C con 5% de CO2 y 70% de humedad relativa. Los anticuerpos se purificaron mediante cromatografía de afinidad de proteína G Sepharose 4 (Sigma) y se dializaron en PBS utilizando membrana de diálisis MWCO 6000-8000 Daltons (Spectrum). El rendimiento de los anticuerpos cada uno de los biorreactores cultivados durante 6-7 días fue de alrededor de 4 ~ 10 mg. Partes alícuotas de los anticuerpos fueron rápidamente congeladas con nitrógeno líquido antes de su almacenamiento a -70 ° C.

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Prueba de ensayo neuronal de mAbs utilizando Transducción del Virus del Bosque Semliki y marcaje metabólico. Para generar cultivos primarios de neuronas corticales mixtas derivados de ratón de tipo salvaje, el cerebro total de embriones de 14 días de edad se diseccionó en medio HBSS (Gibco), se tripsinizó y se sembró en platos (Nunc) pre-revestidas con poli-L-lisina (Sigma-Aldrich). Los cultivos se mantuvieron en medio neurobasal (Gibco) con suplemento B27 (Gibco BRL) y 5 μM de arabinósido de citosina para prevenir la proliferación de células gliales. Neuronas primarias cultivadas durante tres días fueron transducidas con APP humana (APP tipo salvaje o APP sueca) utilizando Virus del Bosque Semliki (SFV). Después de 1 hora de transducción del SFV, se reemplazó el medio con medio neurobasal reciente seguido de un período post-transducción de 2 horas. Después de 2 horas de post-transducción, el medio neurobasal se reemplazó por MEM libre de metionina (Gibco BRL) complementado con 100 μCi/ml de [35S]metionina (ICN Biomedicals), mientras tanto se añadieron al medio mAbs (en PBS). Después de 6 horas marcaje metabólico, se recogió el medio acondicionado y las células se lavaron en PBS enfriado con hielo y se lisaron en tampón IP (Tris-HCl 20 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM, Triton X-100 al 1%, desoxicolato de sodio al 1% y SDS al 0,1%) complementado con inhibidor de proteasa completo (Roche). Extracto de células se inmunoprecipitó utilizando 25 µl de proteína G Sepharose y anticuerpo APP C-terminal B63.9 durante la noche a 4°C. Los inmunoprecipitados se eluyeron finalmente en tampón de muestra NuPage (Invitrogen) y se sometieron a electroforesis en geles al 10% de acrilamida NuPAGE Bis-Tris en condiciones reductoras y MES en el tampón de desarrollo (Invitrogen). Los resultados se analizaron mediante un Phosphor Imager (Molecular Dynamics) e ImagQuaNT4.1. sAPPβ y Aß del medio acondicionado se analizaron por transferencia Western directa utilizando anticuerpo policlonal anti-sAPPβ (Covance) y WO-2 (The Genetics Company).

Construcción de plásmidos para el mapeo de epítopos. Todos los mutantes de deleción BACE1 se generaron mediante amplificación por PCR a partir de ADNc que codifica BACE1 humana y se subclonaron en vectores pGEX4T. Todos los mutantes fueron validados mediante secuenciación de ADN.

Mutagénesis dirigida al sitio. La mutagénesis del bucle F SQDD (SEQ ID NO: 11) a WAAA (SEQ ID NO: 12) (aminoácidos 376-379) y el bucle D QAG a AGA (aminoácidos 332-334) se realizó utilizando el Kit de Mutagénesis Dirigido al Sitio QuikChange II XL (Stratagene) de acuerdo con el procedimiento previsto. Construcciones pGEX4TBACE46-460 y pcDNA3-BACE1-501 se utilizaron como moldes. Todos los mutantes fueron validados mediante secuenciación de ADN.

Expresión y purificación de proteínas de fusión GST. Escherichia coli BL21 (Novagen) transformada con mutantes de deleción pGEX4T-BACE1 se desarrolló de manera logarítmica (100 ml, A600 = 0,8) y se indujo con IPTG 0,2 mM (Sigma) durante 3 horas. Las células se sedimentaron después y se resuspendieron en 15 ml de BugBuster Master Mix (Novagen) complementada con Inhibidor de Proteasa Completo (Roche). Los componentes bacterianos se lisaron durante 15 min a TA con rotación, y después se sedimentaron a 20.000xg durante 30 a 4°C. Los sobrenadantes se mezclaron con 300 μl de perlas de glutatión-sefarosa (Pharmacian) durante 1 hora a 4°C. Después de la incubación, las perlas se lavaron con PBS y las proteínas se eluyeron con L-glutatión 10 mM (Sigma) en Tris-HCl 50 mM pH 8,0.

Resultados

Ejemplo 1. Identificación de inhibidores del mAb de BACE1 candidatos a partir del rastreo de hibridomas

Con el fin de generar anticuerpos monoclonales anti-BACE1, los hibridomas se produjeron después de una serie de inmunizaciones de ratones BACE1-/-BACE2-/-con la proteína ectodominio de BACE1 humana purificada (aminoácidos 45-460) (SEQ ID NO: 13). El rastreo del hibridoma se inició 2-3 semanas después de la siembra de las células en placas de 96 pocillos, cuando la mayoría de los pozos eran > 80% confluentes. Se aplicaron rastreos funcionales, incluyendo el rastreo del ensayo FRET de BACE1 y el rastreo del ensayo basado en células en la etapa de rastreo temprano de hibridoma (véase la Figura 1A). Sobrenadantes de hibridoma se rastrearon primero mediante ELISA en el ectodominio BACE inmovilizado (inmunógeno). 377 de alrededor de 2400 hibridomas dieron un resultado positivo en este ensayo (las señales ELISA de los pocillos positivos fueron de 5 a 30 veces por encima del fondo).

Los hibridomas positivos del rastreo de ELISA fueron testados adicionalmente en el ensayo mca-Fret de BACE1. Sobrenadantes de 6 pocillos (2G3, 5G7, 2G6, 10G1, 14F10, 17B12) de un total de 377 pocillos testados inhibían la actividad de BACE1 en el ensayo Fret. Hibridoma (2G6, 10G1, 17B12) no creció o se convirtió en negativo en ensayos adicionales, probablemente debido a la proliferación rápida de hibridomas no secretores y, por lo tanto, no estaban disponibles para su posterior análisis. Los otros pocillos (2G3, 5G7, 14F10) fueron seleccionados como

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inhibidores de BACE1 candidatos potenciales para una caracterización adicional. 2G3 resultó ser una IgM y, por lo tanto, no se caracterizó adicionalmente.

En paralelo al rastreo mediante ensayo mca-Fret, la tinción de inmunofluorescencia de células HEK293 que expresan de forma estable BACE1 se utilizó para rastrear los sobrenadantes de hibridomas. Se testaron 96 pocillos de los hibridomas que exhibían las señales más altas en el rastreo ELISA y 25 pocillos de ellos mostraron una fuerte inmunorreactividad para BACE1 en la tinción de inmunofluorescencia.

Los 25 pocillos de hibridomas que dieron mejor señal tanto en el ELISA como en la tinción de inmunofluorescencia, se rastrearon adicionalmente mediante un ensayo celular para ver si inhibían la actividad de BACE1. Células SH-SY5Y que expresan de manera estable APP fueron tratadas con sobrenadantes de hibridoma durante 24 horas, sAPPβ de medio acondicionado se analizó como lectura de la actividad de BACE1. En este ensayo celular, el sobrenadante del pocillo 1A11 disminuyó la generación de sAPPβ. Por lo tanto, 1A11 fue elegido como uno de los candidatos para la inhibición de BACE1.

En resumen, la recuperación con éxito de los inhibidores del mAb BACE1 validó la viabilidad de esta estrategia en el rastreo de inhibidores de mAb.

Ejemplo 2. Los mAbs 1A11, 5G7 y 14F10 modulan la actividad de BACE1 en ensayos enzimáticos

Los tres inhibidores de BACE1 candidatos, 1A11, 5G7 y 14F10, se caracterizaron primero por MBP-ELISA, que utiliza como sustrato la secuencia C-terminal de 125 aminoácidos de APPswe, que es un sustrato de gran tamaño. En este ensayo MBP-ELISA, los tres mAbs pueden inhibir completamente la actividad de BACE1 (Figura 1 B). Las IC50 de 5G7, 14F10 y 1A11 son 0,47nM, 0,46nM o 0,76nM, respectivamente. También se testaron los tres mAbs en el ensayo mca-Fret (Figura 2), que utiliza un pequeño péptido FRET como sustrato. En este ensayo, 5G7 y 14F10 pueden inhibir completamente la actividad de BACE1 con una IC50 de 0,06 nM y 1,6 nM (14F10), respectivamente. Inesperadamente, 1A11, el inhibidor de BACE1 recuperado del ensayo celular, estimulaba la actividad de BACE1.

Los resultados de los dos ensayos enzimáticos sugieren que el mAb 1A11 es un inhibidor estérico para la interacción del sustrato grande de BACE1 (BACE1-APP).

Ejemplo 3. Mab 1A11 inhibe BACE1 en células de neuroblastoma humano

Los tres inhibidores de mAb candidatos, 5G7, 14F10 y 1A11 se testaron en un ensayo celular. Células SH-SY5Y que expresan establemente APP de tipo salvaje se cultivaron en placas de 6 pocillos a 90% de confluencia y se incubaron con mAbs 300 nM durante 24 horas. PBS se utilizó como control negativo (los mAbs se disolvieron en PBS) y el compuesto III inhibidor de BACE1 (Merck Company) diluido a 1 µM en PBS se utilizó como control positivo. Después de tratamiento durante 24 horas, Aß, sAPPβ y sAPPα de medio condicionado se analizaron por transferencia Western. Tal como se muestra en la Figura 3, el mAb 1A11 inhibía la generación de Aß y sAPPβ, mientras que el tratamiento con 5G7 y 14F10 no tuvo efectos inhibidores sobre la actividad de BACE1 celular.

Ejemplo 4. Mab 1A11 inhibe significativamente la escisión con BACE1 de APPwt en neuronas cultivadas Los mAbs 5G7, 14F10 y 1A11 se testaron adicionalmente en cultivos neuronales primarios. Neuronas primarias de ratón cultivadas durante tres días fueron transducidas con APPwt humano utilizando virus del bosque Semliki (SFV) y fueron tratadas con mAbs 300 nM (en PBS) durante 24 horas. El PBS se utilizó como control negativo y 1 μM de compuesto inhibidor III de BACE1 (Merck Company) se utilizó como control positivo. Después de 24 horas de tratamiento, Aß, sAPPβ y sAPPα de medio acondicionado, junto con APP de longitud completa, CTFβ y CTFα de lisados celulares se analizaron por transferencia Western. Tal como se muestra en la Figura 4, el tratamiento con 1A11 disminuyó significativamente Aß, sAPPβ, y la generación de CTFβ, mientras que los productos de escisión de α-secretasa CTFα y sAPPα aumentaron. Los otros dos mAbs, 5G7 y 14F10, no tuvieron efectos inhibidores sobre la escisión con BACE1 de APPwt.

Se estableció una curva de dosis-respuesta para el mAb 1A11 utilizando neuronas como antes, transducidas con SFV-humano APPwt y se marcaron metabólicamente con marcaje metabólico de 35S-metionina durante 6 horas. APP de longitud completa y CTFs de lisados de células se detectaron con phosphor imaging después de la inmunoprecipitación con anticuerpos policlonales de APP C-terminales. Aß y sAPPβ de medio acondicionado se analizaron por transferencia Western directa. Los niveles de CTFβ se cuantificaron para la actividad de BACE1. Tal

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