JP7072114B2

JP7072114B2 - 抗ＥｐｈＡ４抗体

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Publication number: JP7072114B2
Application number: JP2021184594A
Authority: JP
Inventors: 英二井上; 章夫山田; 智生川勝; 俊夫今井; 真紀出口; 亜季中谷
Original assignee: Eisai R&D Management Co Ltd
Current assignee: Eisai R&D Management Co Ltd
Priority date: 2019-07-01
Filing date: 2021-11-12
Publication date: 2022-05-19
Anticipated expiration: 2040-06-29
Also published as: US20210002378A1; TW202248216A; TW202115116A; CL2021003326A1; CA3139398A1; EP3995582A1; TWI808882B; CN113906050B; CN113906050A; CO2021016588A2; BR112021025161A2; JP6979147B2; TWI779307B; CN117398459A; AU2020300205A1; US11136400B2; WO2021002312A1; KR20220027825A; SG11202112433VA; JP2022031271A

Description

本発明は、ＥｐｈＡ４に結合する抗体、当該抗体をコードする核酸、当該核酸を含むベクター、当該ベクターを含む細胞、当該抗体の作製方法、および、当該抗体を含む医薬組成物に関する。

ＥｐｈＡ４は、レセプター型チロシンキナーゼファミリーの１つである。ＥｐｈｒｉｎｔｙｐｅＡおよびｔｙｐｅＢがＥｐｈＡ４のリガンドとして知られており、ＥｐｈＡ４とそのリガンドであるｅｐｈｒｉｎが結合すると、脱接着シグナルが誘導される。これまでに、アルツハイマー病（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓｄｉｓｅａｓｅ、以下「ＡＤ」とも称する）の病態においてＥｐｈＡ４の関与が示唆されており（非特許文献１から４）、ＥｐｈＡ４とｅｐｈｒｉｎとの結合阻害が、神経伝達のアミロイドβ（Ａβ）_{（１－４２）}オリゴマー媒介機能障害を救済することが報告されている（特許文献１）。ＡＤにおいては、過剰にリン酸化されたタウによって形成される凝集体（神経原線維変化）が神経細胞死に関与していると考えられており（非特許文献５）、また、タウのリン酸化抑制により、シナプス消失の神経変性が抑制されること（非特許文献６および非特許文献７）、および、記憶障害や認知機能障害が改善されることが報告されている（非特許文献８から１１）。タウのリン酸化の要因として、ＣＤＫ５の活性化によることを示唆する報告がある（非特許文献１２および非特許文献１３）。家族性前頭側頭型認知症から見出されたＰ３０１Ｌ変異を有するヒトタウ遺伝子を発現させた遺伝子改変マウス（ｒＴｇ４５１０マウス）は、ＡＤモデルマウスであり、ＡＤ同様にタウの過剰リン酸化および神経細胞内のタウの異常蓄積が起きる。ｒＴｇ４５１０マウスではＡＤの病理学的特徴である神経原線維変化が起き、脳の萎縮及び神経細胞脱落による認知機能障害が引き起こされている（非特許文献１４および非特許文献５）。

ＥｐｈＡ４は海馬や大脳皮質で多く発現しており、神経活動依存的にマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）、ＡＤＡＭ（ａｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎａｎｄｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ）およびγセクレターゼによって切断される。このＥｐｈＡ４の切断反応が、神経機能に重要な構造体であるスパインを安定化させることが知られている（非特許文献１５）。ＡＤにおいてはスパインの密度が減少していることが報告されており（非特許文献１６）、また、ＮＦＴｓｔａｇｅＶおよびＶＩのＡＤではＥｐｈＡ４の切断断片の減少も確認されていることから、ＡＤの病態にＥｐｈＡ４の切断反応が関与していることが考えられている（非特許文献１７）。

既存のＥｐｈＡ４阻害薬として、ＫＹＬペプチドや化合物１等が知られているが（特許文献２、非特許文献１８および非特許文献１９）、ＥｐｈＡ４の切断を促進する活性を有する抗体については報告がない。

ＷＯ２０１６／０１９２８０Ａ１ＷＯ２０１２／１５６３５１Ａ１

ＶａｒｇａｓＬＭｅｔａｌ．，，ＰＬｏＳＯｎｅ．２０１４Ｍａｒ２１；９（３）ＦｕＡＫｅｔａｌ．，ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ．２０１４Ｊｕｌ８；１１１（２７）：９９５９－６４ＲｏｓｅｎｂｅｒｇｅｒＡＦｅｔａｌ．，ＡｃｔａＮｅｕｒｏｐａｔｈｏｌＣｏｍｍｕｎ．２０１４Ｊｕｌ１６；２：７９ＨｕａｎｇＴＹｅｔａｌ．，ＪＥｘｐＭｅｄ．２０１７Ｄｅｃ４；２１４（１２）：３６６９－３６８５．ＳａｎｔａＣｒｕｚｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２００５Ｊｕｌ１５；３０９（５７３３）：４７６－８１ＳｅｏＪｅｔａｌ．，ＪＮｅｕｒｏｓｃｉ．２０１７Ｏｃｔ１１；３７（４１）：９９１７－９９２４ＰａｔｒｉｃｋＧＮｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．１９９９Ｄｅｃ９；４０２（６７６２）：６１５－２２．ＯｎｉｓｈｉＴｅｔａｌ．，ＪＮｅｕｒｏｃｈｅｍ．２０１１Ｄｅｃ；１１９（６）：１３３０－４０ＢｅｌｆｉｏｒｅＲｅｔａｌ．，ＡｇｉｎｇＣｅｌｌ．２０１９Ｆｅｂ；１８（１）：ｅ１２８７３．ＷｅｂｓｔｅｒＳＪｅｔａｌ．，ＦｒｏｎｔＧｅｎｅｔ．２０１４Ａｐｒ２３；５：８８．ＧｒａｙｓｏｎＢｅｔａｌ．，ＢｅｈａｖＢｒａｉｎＲｅｓ．２０１５Ｍａｙ１５；２８５：１７６－９３．ＣａｎｃｉｎｏＧＩｅｔａｌ．，ＮｅｕｒｏｂｉｏｌＡｇｉｎｇ．２０１１Ｊｕｌ；３２（７）：１２４９－６１．ＶａｒｇａｓＬＭｅｔａｌ．，ＢｉｏｃｈｉｍＢｉｏｐｈｙｓＡｃｔａＭｏｌＢａｓｉｓＤｉｓ．２０１８Ａｐｒ；１８６４：１１４８－１１５９. ＲａｍｓｄｅｎＭｅｔａｌ．，ＪＮｅｕｒｏｓｃｉ．２００５Ｎｏｖ１６；２５（４６）：１０６３７－４７．ＩｎｏｕｅＥｅｔａｌ．，ＪＣｅｌｌＢｉｏｌ．２００９Ｍａｙ４；１８５（３）：５５１－６４Ｂｏｒｏｓｅｔａｌ．，ＡｎｎＮｅｕｒｏｌ．２０１７Ｏｃｔ；８２（４）：６０２－６１４ＭａｔｓｕｉＣｅｔａｌ．，ＢｒａｉｎＰａｔｈｏｌ．２０１２Ｎｏｖ；２２（６）：７７６－８７．ｄｏｉ：１０．１１１１／ｊ．１７５０－３６３９Ｇｏｌｄｓｈｍｉｔｅｔａｌ．，ＰＬｏＳｏｎｅ．２０１１；６（９）：ｅ２４６３６ＶａｎＨｏｅｃｋｅｅｔａｌ．，ＮａｔｕｒｅＭｅｄｉｃｉｎｅ．２０１２Ｓｅｐ；１８（９）：１４１８－２２，２０１２

本開示において、ＥｐｈＡ４に結合し、ＥｐｈＡ４の切断を促進し得る、抗ＥｐｈＡ４抗体、および、前記抗体を有効成分として含む医薬組成物を提供することを課題とする。

本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、ＥｐｈＡ４に結合し、ＥｐｈＡ４の切断を促進し得る、マウス抗ＥｐｈＡ４モノクローナル抗体を取得し、当該抗体のヒト化抗体を作製することによって、目的の抗体を完成するに至った。

本開示は、以下の特徴を包含する。
（１）抗ＥｐｈＡ４抗体であって、前記抗ＥｐｈＡ４抗体は、重鎖および軽鎖を含み、
（ａ）配列番号４４に示すアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号２７に示すアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号２８に示すアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３；
（ｄ）配列番号２９に示すアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１；
（ｅ）配列番号３０に示すアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ２；および
（ｆ）配列番号３１に示すアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３
を含む、
抗ＥｐｈＡ４抗体。

（２）（１）に記載の抗ＥｐｈＡ４抗体であって、
前記抗ＥｐｈＡ４抗体は、ヒト化されている、
抗ＥｐｈＡ４抗体。

（３）（１）または（２）に記載の抗ＥｐｈＡ４抗体であって、
前記抗ＥｐｈＡ４抗体は、ＥｐｈＡ４に特異的に結合し、ＥｐｈＡ４の切断を促進する、
抗ＥｐｈＡ４抗体。

（４）（１）～（３）のいずれかに記載の抗ＥｐｈＡ４抗体であって、
前記抗ＥｐｈＡ４抗体は、ＥｐｈＡ４に特異的に結合し、ＥｐｈＡ４とｅｐｈｒｉｎとの結合を阻害する、
抗ＥｐｈＡ４抗体。

（５）（１）～（４）のいずれかに記載の抗ＥｐｈＡ４抗体であって、
前記重鎖の可変領域は、配列番号４５に示すアミノ酸配列からなり、
前記軽鎖の可変領域は、配列番号４６に示すアミノ酸配列からなる、
抗ＥｐｈＡ４抗体。

（６）（１）～（５）のいずれかに記載の抗ＥｐｈＡ４抗体であって、
前記重鎖の定常領域および前記軽鎖の定常領域がヒト抗体由来のアミノ酸配列を含む、
抗ＥｐｈＡ４抗体。

（７）（６）に記載の抗ＥｐｈＡ４抗体であって、
前記重鎖の定常領域はヒトＩｇＧの定常領域である、
抗ＥｐｈＡ４抗体。

（８）（７）に記載の抗ＥｐｈＡ４抗体であって、
前記ヒトＩｇＧの定常領域はヒトＩｇＧ_２の定常領域である、
抗ＥｐｈＡ４抗体。

（９）（８）に記載の抗ＥｐｈＡ４抗体であって、
前記ヒトＩｇＧ_２の定常領域は、配列番号４７に示すアミノ酸配列を含む、
抗ＥｐｈＡ４抗体。

（１０）（６）～（９）のいずれかに記載の抗ＥｐｈＡ４抗体であって、
前記軽鎖の定常領域はヒトＩｇκの定常領域である、
抗ＥｐｈＡ４抗体。

（１１）（１０）に記載の抗ＥｐｈＡ４抗体であって、
前記ヒトＩｇκの定常領域は、配列番号４８に示すアミノ酸配列を含む、
抗ＥｐｈＡ４抗体。

（１２）抗ＥｐｈＡ４抗体であって、
前記抗ＥｐｈＡ４抗体は、重鎖および軽鎖を含み、
前記重鎖は、配列番号５９に示すアミノ酸配列を含み、
前記軽鎖は、配列番号６０に示すアミノ酸配列を含む、
抗ＥｐｈＡ４抗体。

（１３）（１２）に記載の抗ＥｐｈＡ４抗体であって、
前記重鎖のＣ末端リシンが欠失されている、
抗ＥｐｈＡ４抗体。

（１４）抗ＥｐｈＡ４抗体であって、
前記抗ＥｐｈＡ４抗体は、重鎖および軽鎖を含み、
前記重鎖は、配列番号５９に示すアミノ酸配列を含み、
前記軽鎖は、配列番号６０に示すアミノ酸配列を含み、
前記重鎖のＣ末端リシンが欠失されている、
抗ＥｐｈＡ４抗体。

（１５）（１）～（１４）のいずれかに記載の抗ＥｐｈＡ４抗体をコードする単離された核酸。

（１６）（１５）に記載の核酸を含むベクター。

（１７）（１６）に記載のベクターを含む宿主細胞。

（１８）（１７）に記載の宿主細胞を培養する工程を含む、抗ＥｐｈＡ４抗体の作製方法。

（１９）（１）～（１４）のいずれかに記載の抗ＥｐｈＡ４抗体を含む、医薬組成物。

（２０）（１９）に記載の医薬組成物であって、少なくとも一つの薬剤学的に許容される担体を含む、医薬組成物。

（２１）（１９）または（２０）に記載の医薬組成物であって、
アルツハイマー病の治療のための医薬組成物。

（２２）アルツハイマー病の治療において使用するための（１）～（１４）のいずれかに記載の抗ＥｐｈＡ４抗体。

（２３）治療上有効量の（１）～（１４）のいずれかに記載の抗ＥｐｈＡ４抗体を、それを必要とする患者に投与することを含む、アルツハイマー病の治療方法。

（２４）アルツハイマー病治療用の医薬組成物を製造するための（１）～（１４）のいずれかに記載の抗ＥｐｈＡ４抗体の使用。

（２５）（１９）または（２０）に記載の医薬組成物であって、
タウオパチーの治療のための医薬組成物。

（２６）タウオパチーの治療において使用するための（１）～（１４）のいずれかに記載の抗ＥｐｈＡ４抗体。

（２７）治療上有効量の（１）～（１４）のいずれかに記載の抗ＥｐｈＡ４抗体を、それを必要とする患者に投与することを含む、タウオパチーの治療方法。

（２８）タウオパチー治療用の医薬組成物を製造するための（１）～（１４）のいずれかに記載の抗ＥｐｈＡ４抗体の使用。

（２９）タウオパチーがアルツハイマー病またはタウ病理を有する前頭側頭葉変性症である、（２５）～（２８）のいずれかに記載の医薬組成物、抗ＥｐｈＡ４抗体、治療方法または使用。

（３０）タウオパチーがアルツハイマー病である、（２９）に記載の医薬組成物、抗ＥｐｈＡ４抗体、治療方法または使用。

（３１）タウオパチーがタウ病理を有する前頭側頭葉変性症である、（２９）に記載の医薬組成物、抗ＥｐｈＡ４抗体、治療方法または使用。

（３２）タウ病理を有する前頭側頭葉変性症が進行性核上性麻痺、大脳皮質基底核変性症、嗜銀顆粒性認知症、神経原線維変化型老年期認知症またはピック病である、（３１）に記載の医薬組成物、抗ＥｐｈＡ４抗体、治療方法または使用。

（３３）タウ病理を有する前頭側頭葉変性症が進行性核上性麻痺である、（３２）に記載の医薬組成物、抗ＥｐｈＡ４抗体、治療方法または使用。

（３４）タウ病理を有する前頭側頭葉変性症が大脳皮質基底核変性症である、（３２）に記載の医薬組成物、抗ＥｐｈＡ４抗体、治療方法または使用。

（３５）タウ病理を有する前頭側頭葉変性症が嗜銀顆粒性認知症である、（３２）に記載の医薬組成物、抗ＥｐｈＡ４抗体、治療方法または使用。

（３６）タウ病理を有する前頭側頭葉変性症が神経原線維変化型老年期認知症である、（３２）に記載の医薬組成物、抗ＥｐｈＡ４抗体、治療方法または使用。

（３７）タウ病理を有する前頭側頭葉変性症がピック病である、（３２）に記載の医薬組成物、抗ＥｐｈＡ４抗体、治療方法または使用。

本開示において、ＥｐｈＡ４に結合し、ＥｐｈＡ４の切断を促進し得る抗ＥｐｈＡ４抗体、当該抗体をコードする核酸、当該核酸を含むベクター、当該ベクターを含む細胞、当該抗体の作製方法、および、当該抗体を有効成分として含む医薬組成物が提供される。

図１は、抗ＥｐｈＡ４モノクローナル抗体（抗体Ａ）のマウスおよびヒトＥｐｈＡ４に対する結合親和性を示す。図２は、海馬ニューロンを用いた抗ＥｐｈＡ４モノクローナル抗体（抗体Ａ）のＥｐｈＡ４切断促進活性を示す。図３は、抗ＥｐｈＡ４モノクローナル抗体（抗体Ａ）のマウスＥｐｈＡ４－マウスリガンド結合阻害活性を示す。図４は、抗ＥｐｈＡ４モノクローナル抗体（抗体Ａ）のヒトＥｐｈＡ４－ヒトリガンド結合阻害活性を示す。図５は、抗ＥｐｈＡ４モノクローナル抗体（抗体Ａ）の各ヒトＥｐｈレセプターに対する選択性を示す。図６は、抗ＥｐｈＡ４モノクローナル抗体（抗体Ａ）の各マウスＥｐｈレセプターに対する選択性を示す。図７は、抗ＥｐｈＡ４モノクローナル抗体（抗体Ａ）のマウス、ラット、サルおよびヒトＥｐｈＡ４に対する反応性を示す。図８は、抗ＥｐｈＡ４モノクローナル抗体（抗体Ａ）の、ヒトＥｐｈＡ４細胞外領域（ＥＣＤ）、リガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）、フィブロネクチンIII型ドメイン１（ＦＮ１）、およびフィブロネクチンIII型ドメイン２（ＦＮ２）に対する反応性を示す。図９は、抗ＥｐｈＡ４モノクローナル抗体（抗体Ａ）による海馬ニューロンのスパイン数に対する増加効果を示す。図１０は、抗ＥｐｈＡ４モノクローナル抗体のｉｎｖｉｖｏにおけるタウのリン酸化抑制効果を示す。図１１Ａは、横軸にＥｐｈＡ４－ＬｉｇａｎｄＢｉｎｄｉｎｇＤｏｍａｉｎ（ＥｐｈＡ４－ＬＢＤ）のアミノ酸、縦軸に抗体Ａ－Ｆａｂの構造領域を示す。黒のビットは相互作用が存在する組み合わせの交点を示す。図１１Ｂは、ＥｐｈＡ４－ＬｉｇａｎｄＢｉｎｄｉｎｇＤｏｍａｉｎ（ＥｐｈＡ４－ＬＢＤ）の表面構造を示す。図１１Ｂにおいて、結合領域に含まれるアミノ酸名と残基番号が該当する位置に示され、結合する抗体Ａ－ＦａｂのＨ鎖およびＬ鎖のＣＤＲがリボンモデルで示される。図１２は、ヒト化抗ＥｐｈＡ４モノクローナル抗体（抗体Ｂ）のヒトＥｐｈＡ４に対する親和性を示す。図１３は、ヒト化抗ＥｐｈＡ４モノクローナル抗体（抗体Ｂ）の海馬ニューロンにおけるＥｐｈＡ４切断促進活性を示す。図１４は、ヒト化抗ＥｐｈＡ４モノクローナル抗体（抗体Ｂ）のヒトＥｐｈＡ４－ヒトリガンド結合阻害活性を示す。図１５は、ヒト化抗ＥｐｈＡ４モノクローナル抗体（抗体Ｂ）のマウスＥｐｈＡ４－マウスリガンド結合阻害活性を示す。図１６は、ヒト化抗ＥｐｈＡ４モノクローナル抗体（抗体Ｂ）のヒトＥｐｈレセプターに対する選択性を示す。図１７は、ヒト化抗ＥｐｈＡ４モノクローナル抗体（抗体Ｂ）のマウスＥｐｈレセプターに対する選択性を示す。図１８は、ヒト化抗ＥｐｈＡ４モノクローナル抗体（抗体Ｂ）のマウス、ラット、サルおよびヒトＥｐｈＡ４に対する反応性を示す。図１９は、ヒト化抗ＥｐｈＡ４モノクローナル抗体（抗体Ｂ）のヒトＥｐｈＡ４細胞外領域（ＥＣＤ）、リガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）、フィブロネクチンIII型ドメイン１（ＦＮ１）、およびフィブロネクチンIII型ドメイン２（ＦＮ２）に対する反応性を示す。図２０は、ヒト化抗ＥｐｈＡ４モノクローナル抗体（抗体Ｂ）による海馬ニューロンのスパイン数に対する増加効果を示す。図２１は、ヒト化抗ＥｐｈＡ４モノクローナル抗体（抗体Ｂ）の海馬ニューロンにおけるヒトＥｐｈＡ４切断促進活性を示す。図２２は、ヒト化抗ＥｐｈＡ４モノクローナル抗体（抗体Ｂ）によるＭＭＰおよびＡＤＡＭを介した海馬ニューロンのスパイン数に対する増加効果を示す。図２３は、ヒト化抗ＥｐｈＡ４モノクローナル抗体（抗体Ｂ）のｉｎｖｉｖｏにおけるタウのリン酸化抑制効果を示す。

本明細書で使用される配列番号によって特定またはコードされる領域は下記のとおりである：

本開示は、ＥｐｈＡ４に結合する抗ＥｐｈＡ４抗体に関する。
本開示に係る抗ＥｐｈＡ４抗体は、ＥｐｈＡ４を認識して結合することができる抗体であり、以下に述べるように、当該抗体は、無傷の抗体であってもよいし、あるいは、ＥｐｈＡ４との結合親和性を有する限り、合成抗体（例えば組換え抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体等）であってもよい。本明細書において、ＥｐｈＡ４は、ヒト、マウス、ラットおよびサル由来のＥｐｈＡ４を指すものと理解することができる。ヒト、マウス、ラットおよびサル由来のＥｐｈＡ４は、米国生物工学情報センターが提供するＧｅｎｂａｎｋ等、配列情報が登録された公共のデータベースから入手できるほか、近縁関係にある動物種のＥｐｈＡ４の塩基配列情報を元にプライマーを設計し、所望の動物種から抽出したＲＮＡからクローニングすることで、ＥｐｈＡ４遺伝子の配列情報を入手することが可能である。例えば、ヒト、マウス、ラット、サルのＥｐｈＡ４の塩基配列情報は、それぞれＧｅｎｂａｎｋＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．ＮＭ＿００４４３８．５、ＮＭ＿００７９３６．３、ＮＭ＿００１１６２４１１．１、ＮＭ＿００１２６０８７０．１としてデータベース上に登録されている。

一態様において、抗ＥｐｈＡ４抗体は、ＥｐｈＡ４に特異的に結合する抗体である。「特異的な結合」という用語は、当該技術分野において当業者に周知の用語であり、抗体またはその抗原結合断片の、抗原やエピトープに対する特異的な結合を決定するための方法も周知である。一実施形態において、「特異的な結合」は、抗ＥｐｈＡ４抗体が、他の標的分子に結合するよりも、より大きな結合親和性、結合活性で、より迅速に、および／または、より長時間持続して、ＥｐｈＡ４に免疫学的反応により結合可能であると理解される。これは、ＥｐｈＡ４に特異的に結合する抗体が他の標的分子に結合しないことを意味するものではない。別の実施形態において、「特異的な結合」は、ＥｐｈＡ４に対して少なくとも約１０^－７Ｍ、または少なくとも約１０^－８Ｍ、または少なくとも約１０^－９Ｍ、またはそれ以下のＫＤを持つ抗体によって示されうる。また、さらに別の実施形態では、「特異的な結合」は、ＥｐｈＡ４と免疫学的反応により結合するが、Ｅｐｈレセプターの他のファミリー分子とは実質的に結合しないと理解される。

一態様において、抗ＥｐｈＡ４抗体は、ＥｐｈＡ４の細胞外領域に結合する抗体である。一実施形態において、抗ＥｐｈＡ４抗体は、ＥｐｈＡ４の細胞外領域のうちリガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）に結合する抗体である。

一実施形態において、抗ＥｐｈＡ４抗体は、ＥｐｈＡ４に特異的に結合し、ＥｐｈＡ４の切断を促進することができる。特定の実施形態において、抗ＥｐｈＡ４抗体は、ＥｐｈＡ４に特異的に結合し、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）やＡＤＡＭ（ａｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎａｎｄｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ）によるＥｐｈＡ４細胞外ドメインの切断を促進することができる。

一実施形態において、抗ＥｐｈＡ４抗体は、ＥｐｈＡ４に特異的に結合し、ＥｐｈＡ４とそのリガンドであるｅｐｈｒｉｎとの結合を阻害することができる。

別の実施形態において、抗ＥｐｈＡ４抗体は、ＥｐｈＡ４に特異的に結合し、海馬ニューロンのスパイン数を増加または海馬ニューロンのスパインを安定化することができる。

本開示は、一実施形態において、ヒトＥｐｈＡ４、マウスＥｐｈＡ４、ラットＥｐｈＡ４、およびサルＥｐｈＡ４のうちの少なくとも１つに特異的に結合し、そのリガンドとの結合を阻害することができる抗ＥｐｈＡ４抗体を包含する。本開示は、別の実施形態において、ヒトＥｐｈＡ４、マウスＥｐｈＡ４、ラットＥｐｈＡ４、およびサルＥｐｈＡ４のうち２つ以上に特異的に結合し、そのリガンドとの結合を阻害することができる抗ＥｐｈＡ４抗体を包含する。本開示は、さらに別の実施形態において、ヒトＥｐｈＡ４、マウスＥｐｈＡ４、ラットＥｐｈＡ４、およびサルＥｐｈＡ４の全てと特異的に結合し、そのリガンドとの結合を阻害することができる抗ＥｐｈＡ４抗体を包含する。

抗ＥｐｈＡ４抗体の、抗原への結合特性（例えば、結合親和性および種交差反応性）を測定する方法は、当該技術分野において当業者に公知の方法を用いてよい。例えば、結合親和性は、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）バイオセンサー、ＫｉｎＥｘＡバイオセンサー、シンチレーション近接アッセイ、ＥＬＩＳＡ、ＯＲＩＧＥＮ免疫測定法（ＩＧＥＮ社）、フローサイトメトリー、蛍光消光、蛍光転移、酵母ディスプレイ、および／または、免疫染色を使用して測定してよいが、これらに限定されない。抗ＥｐｈＡ４抗体の、ＥｐｈＡ４とそのリガンドの結合に対する中和活性は、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）バイオセンサー、ＥＬＩＳＡ、および／または、フローサイトメトリーを使用して測定してよいが、これらに限定されない。

本開示に係る抗ＥｐｈＡ４抗体は、ＥｐｈＡ４と結合する限り、モノクローナル抗体であってよい。

本開示に係る抗ＥｐｈＡ４抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＡまたはＩｇＭ（またはこれらのサブクラス）等の任意のクラスであってよく、特定のクラスに限定されない。重鎖（Ｈ鎖と呼ぶこともある）の定常領域の抗体アミノ酸配列により、免疫グロブリンは、異なるクラスに分類される。５つの主な免疫グロブリンのクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭがあり、これらの幾つかは、例えば、ＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２、ＩｇＧ_３、ＩｇＧ_４、ＩｇＡ_１およびＩｇＡ_２というサブクラス（アイソタイプ）にさらに細分化され得る。異なるクラスの免疫グロブリンの対応する重鎖の定常領域は、それぞれ、α、δ、ε、γおよびμと呼ばれている。また、抗体の軽鎖（Ｌ鎖と呼ぶこともある）の種類にはλ鎖およびκ鎖が存在する。本開示に係る抗ＥｐｈＡ４抗体は、ＩｇＧ抗体であってよく、例えば、ＩｇＧ_１抗体またはＩｇＧ_２抗体等であってよい。また、本開示に係る抗ＥｐｈＡ４抗体は、場合により、単量体、二量体または多量体の形態であってよい。

本開示に係る抗体の可変領域は、抗体軽鎖の可変領域および／または抗体重鎖の可変領域を意味してよく、抗体の定常領域は、抗体軽鎖の定常領域および／または抗体重鎖の定常領域を意味してよい。重鎖および軽鎖の可変領域は、それぞれ、相補性決定領域としても知られる３つのＣＤＲにより連結される４つのフレームワーク領域（ＦＲ）からなる。各鎖におけるＣＤＲは、ＦＲにより、近傍に保持されており、他方の鎖におけるＣＤＲと共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与している。ＣＤＲを決定するための技術としては、限定はされないが、例えば、（１）異種間配列可変性に基づくアプローチ（例えば、Ｋａｂａｔｅｔａｌ，ＳｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆＰｒｏｔｅｉｎｓｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＩｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈｅｄ．，１９９１，ＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅｓｏｆＨｅａｌｔｈ，ＢｅｔｈｅｓｄａＭＤ）；および（２）抗原－抗体複合体の結晶構造学的研究に基づくアプローチ（Ａｌ－ｌａｚｉｋａｎｉｅｔａｌ．，１９９７Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２７３：９２７－９４８）が挙げられる。これらのアプローチや、他のアプローチを組合せて用いてもよい。

本明細書において、モノクローナル抗体は、実質的に均一な抗体のポピュレーションから得られる抗体を意味してよい。すなわち、そのポピュレーションに含まれる個々の抗体は、若干存在し得る可能性のある天然の突然変異体を除いて同一である。モノクローナル抗体は、単一抗原部位に対するものであり、非常に特異的である。さらに、異なる抗原や異なるエピトープを標的とする典型的なポリクローナル抗体とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原の単一のエピトープを標的とするものである。修飾語「モノクローナル」は、実質的に均一な抗体ポピュレーションから得られる抗体の特性を示し、特定の方法による抗体の生産を必要とするものとして限定的に解されるべきではない。

本開示に係る抗ＥｐｈＡ４抗体は、マウス抗体、キメラ抗体またはヒト化抗体であってよい。キメラ抗体は、例えば、非ヒト（例えば、マウスまたはラット）抗体の可変領域をヒト抗体の定常領域に融合させた抗体であり、例えば、可変領域は非ヒト抗体由来、定常領域はヒト抗体由来となっている抗体を指してよい。ヒト化抗体は、例えば、非ヒト抗体の相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ－ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇｒｅｇｉｏｎ：ＣＤＲ（超可変領域ということもある））をヒト抗体に導入した抗体であり、例えば、ＣＤＲは非ヒト抗体由来、それ以外の抗体領域はヒト抗体由来となっている抗体を指してよい。ただし、キメラ抗体とヒト化抗体の境界は必ずしも明確である必要はなく、キメラ抗体ともヒト化抗体とも呼びうるような状態であってもよい。また、キメラ抗体またはヒト化抗体において、ヒト抗体由来の抗体領域（ＦＲ、定常領域）は、必ずしもすべてがヒト抗体由来のアミノ酸から構成される必要はなく、ヒト対象において正常に使用できる限り、一個または複数個の非ヒト抗体由来のアミノ酸を含んでもよい。ヒト化抗体の一実施態様としては、ＣＤＲはげっ歯類抗体由来、それ以外の抗体領域はヒト抗体由来となっている抗体である。ヒト化抗体の特定の実施態様としては、ＣＤＲはマウス抗体由来、それ以外の抗体領域はヒト抗体由来となっている抗体である。これらの実施態様において、ＣＤＲは、一個または複数個の非げっ歯類抗体由来のアミノ酸、または、一個または複数個の非マウス抗体由来のアミノ酸を含んでいてもよく、ＣＤＲ以外の抗体領域は一個または複数個の非ヒト抗体由来のアミノ酸を含んでもよい。ここで、「複数個」は、これに限定されるものではないが、２個～２０個、または２個～１５個、例えば、１４個、１３個、１２個、１１個、１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個または２個であり、またはアミノ酸配列中のアミノ酸数の１０％以内、９％以内、８％以内、７％以内、６％以内、５％以内、４％以内、３％以内、２％以内または１％以内である。ヒト化は、ＣＤＲ移植法（ＫｏｎｔｅｒｍａｎｎａｎｄＤｕｂｅｌ，ＡｎｔｉｂｏｄｙＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ＳｐｒｉｎｇｅｒＬａｂＭａｎｕａｌ（２００１）およびＴｓｕｒｕｓｈｉｔａｅｔａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ３６：６９－８３（２００５））を用いて行うことができる他、当該技術分野において公知の方法（例えばＪｏｎｅｓｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３２１：５２２－５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３３２：３２３－３２７（１９８８）；およびＶｅｒｈｏｅｙｅｎｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ２３９：１５３４－１５３６（１９８８）を参照）を用いて、ＣＤＲ配列を、ヒト抗体の対応する配列に対して置換することによっても行うことができる。

抗原性を減少させるためには、ヒト化抗体の作製において、軽鎖および重鎖の両方でヒト可変領域の使用を選択することが重要であり得る。「最良適合」法によれば、既知のヒトＦＲ配列の全ライブラリーに対して、げっ歯類抗体の可変領域の配列がスクリーニングされる。次に、げっ歯類の配列に最も近いヒト配列が、ヒト化抗体のヒトＦＲとして受け入れられる。例えば、Ｓｉｍｓｅｔａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２２９６－２３０８（１９９３）およびＣｈｏｔｈｉａｅｔａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７（１９８７）を参照されたい。別の方法では、軽鎖または重鎖の特定の亜群の、全てのヒト抗体の共通配列に由来する特定のフレームワークが用いられる。いくつかの異なるヒト化抗体に対して、同じフレームワークが用いられ得る。例えば、Ｃａｒｔｅｒｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＳｅｔＵＳＡ８９：４２８５－４２８９（１９９２）およびＰｒｅｓｔａｅｔａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２６２３－２６３２（１９９３）を参照されたい。

さらに、ヒト化抗体は一般に、抗原に対する高い結合親和性およびその他の好ましい生物学的性質を保持されることが望ましい。この目標を達成するため、一方法によれば、ヒト化抗体は、親配列およびヒト化配列の三次元モデルを用いた、親配列および様々な概念的ヒト化産物の分析工程によって調製される。一般に三次元の免疫グロブリンモデルが利用可能であり、当業者に知られている。選択された候補である免疫グロブリン配列の有望な三次元立体構造を模式化し、表示するコンピュータプログラムが利用可能である。これらの表示を検討することにより、候補である免疫グロブリン配列の機能における残基の可能性のある役割の分析、すなわち、候補である免疫グロブリンがその抗原に結合する能力に影響を及ぼす残基の分析が可能となる。この方法により、単数または複数の標的抗原（例えばＥｐｈＡ４またはその断片）に対する結合親和性の増大のような、望ましい抗体の特性が達成されるように、ＦＲ残基をレシピエント配列およびインポート配列から選択して、組み合わせることができる。

言うまでもなく、上記に例示したキメラ抗体またはヒト化抗体を、当該抗体の機能を保持させたまま（あるいは、当該抗体の機能を付加、向上させるために）適宜改変（例えば、抗体の修飾、または、抗体のアミノ酸配列の部分的な置換、付加および／または欠失）した抗体も、本開示に係る抗ＥｐｈＡ４抗体に含まれる。より具体的には、抗体のエフェクター機能を修飾するために定常領域のアミノ酸配列を改変した抗体も本開示の範囲に含まれ、例えば、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性および／または抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）活性を低下させるために、ヒトＩｇＧ_２抗体のＥｕｎｕｍｂｅｒｉｎｇにおける２３４位のバリン（Ｖａｌ）がアラニン（Ａｌａ）に置換され、２３７位のグリシン（Ｇｌｙ）がアラニン（Ａｌａ）に置換された抗体等も本開示の範囲に含まれる。さらに、本開示に係る抗ＥｐｈＡ４抗体のＣＤＲ配列を有する抗体結合部位と共に、異なる抗原に結合する抗原結合部位を併せ持つ二重特異性抗体（Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ（２０１２），ｍＡｂｓ４, １８２－９７）も本開示の範囲に含まれる。

本開示に係る抗ＥｐｈＡ４抗体は、所望により、修飾してもよい。抗ＥｐｈＡ４抗体の修飾は、（ａ）例えばシートまたはヘリックスコンホメーション等の、修飾領域におけるアミノ酸配列の三次元的な構造；（ｂ）標的部位での分子の電荷または疎水性の状態；または、（ｃ）側鎖の容積の維持に対する修飾の効果、を変化させる修飾であってもよく、あるいはこれらの変化が明白に観察されないような修飾であってもよい。

本開示に係る抗ＥｐｈＡ４抗体の修飾は、例えば、構成するアミノ酸残基の置換、欠失、付加等によって達成してよい。

本明細書において、アミノ酸とは、その最も広い意味で用いられ、天然のアミノ酸、例えばセリン（Ｓｅｒ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、バリン（Ｖａｌ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、アラニン（Ａｌａ）、チロシン（Ｔｙｒ）、グリシン（Ｇｌｙ）、リシン（Ｌｙｓ）、アルギニン（Ａｒｇ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、スレオニン（Ｔｈｒ）、システイン（Ｃｙｓ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、プロリン（Ｐｒｏ）のみならず、アミノ酸変異体および誘導体といった、非天然アミノ酸も含まれる。当業者であれば、この広い定義を考慮して、本明細書におけるアミノ酸として、例えばＬ－アミノ酸；Ｄ－アミノ酸；アミノ酸変異体、アミノ酸誘導体等の化学修飾されたアミノ酸；ノルロイシン、β－アラニン、オルニチン等、生体内でタンパク質の構成材料とならないアミノ酸；および当業者に公知のアミノ酸の特性を有する、化学的に合成された化合物等が挙げられることを当然に理解する。非天然アミノ酸の例としては、α－メチルアミノ酸（α－メチルアラニン等）、Ｄ－アミノ酸（Ｄ－アスパラギン酸、Ｄ－グルタミン酸等）、ヒスチジン様アミノ酸（２－アミノ－ヒスチジン、β－ヒドロキシ－ヒスチジン、ホモヒスチジン、α－フルオロメチル－ヒスチジン、α－メチル－ヒスチジン等）、側鎖に余分なメチレンを有するアミノ酸（「ホモ」アミノ酸）および側鎖中のカルボン酸官能基アミノ酸がスルホン酸基で置換されるアミノ酸（システイン酸等）等が挙げられる。

天然に存在するアミノ酸残基は、例えば、一般的な側鎖特性に基づいて、次のグループに分類され得る：
（１）疎水性：Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）中性親水性：Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖配向に影響を及ぼす残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；および
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。

抗体を構成するアミノ酸配列の非保存的置換は、これらのグループの１つに属するアミノ酸を他のグループに属するアミノ酸と交換することにより行ってもよい。より保存的な置換は、これらのグループの１つに属するアミノ酸を同一グループの他のアミノ酸と交換することにより行ってもよい。同様に、アミノ酸配列の欠失または置換を適宜行ってもよい。

抗体を構成するアミノ酸の修飾としては、例えば、糖によるグリコシル化、アセチル化またはリン酸化等の翻訳後修飾であってもよい。抗体は、その定常領域における保存された位置でグリコシル化され得る。抗体のグリコシル化は、通常、Ｎ－結合型またはＯ－結合型のいずれかである。Ｎ－結合型は、アスパラギン残基の側鎖に対する糖質部分の結合を意味する。トリペプチド配列であるアスパラギン－Ｘ－セリン、アスパラギン－Ｘ－スレオニン、および、アスパラギン－Ｘ－システイン（式中、Ｘはプロリン以外の任意のアミノ酸である）は、アスパラギン側鎖に対する糖質部分を酵素的に付加するための認識配列である。これらのトリペプチド配列のいずれかが抗体に存在することにより、潜在的なグリコシル化部位が存在する。Ｏ－結合型グリコシル化は、Ｎ－アセチルガラクトサミン、ガラクトース、または、キシロースのいずれかの、ヒドロキシアミノ酸（例えば、セリンまたはスレオニン）への結合であってよく、場合により、５－ヒドロキシプロリンまたは５－ヒドロキシリシンへの結合であってもよい。グリコシル化の条件（グリコシル化を、生物学的手法を用いて行う場合には、例えば、宿主細胞や細胞培地の種類、ｐＨ等）を、当業者は目的に応じて適宜、選択することができる。

本開示に係る抗ＥｐｈＡ４抗体は、さらに、当業者に公知の技術常識に基づいて、その他の修飾方法により、単独または組み合わせて、修飾されてよい。

本開示に係る抗ＥｐｈＡ４抗体は、当業者に周知の方法によって産生することができる。例えば、本開示に係る抗ＥｐｈＡ４抗体をコードする核酸を発現ベクターに組み込み、当該発現ベクターを宿主細胞に導入し、当該宿主細胞を培養することによって抗体を産生させてもよい。したがって、本開示は、抗ＥｐｈＡ４抗体をコードする核酸、当該核酸を含むベクター、当該ベクターを含む宿主細胞、および当該宿主細胞を培養する工程を含む抗ＥｐｈＡ４抗体の作製方法を包含する。

本開示に係る抗ＥｐｈＡ４抗体をコードする核酸は、シグナル配列をコードするＤＮＡを有してもよく、重鎖可変領域をコードするＤＮＡ、および、軽鎖可変領域をコードするＤＮＡの５´末端にシグナル配列をコードするＤＮＡを有してもよい。シグナル配列は、分泌タンパク質や膜内在性タンパク質が、リボソーム上で合成された後に、脂質２重層を通り抜けるのに必要な、タンパク質のＮ末端に存在するアミノ酸残基であり、本開示においては、この機能を有する配列であれば特に限定されるものではない。本開示に係る抗ＥｐｈＡ４抗体が含み得るシグナル配列としては、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ロバ、ヤギ、ウマ、トリ、イヌ、ネコ、酵母等に由来するシグナル配列が挙げられる。本開示においては、具体的に、重鎖に関するシグナル配列として、配列番号１２または１６で表されるアミノ酸配列を含むペプチドを挙げることができ、軽鎖に関するシグナル配列としては、配列番号１４または１８で表されるアミノ酸配列を含むペプチドを挙げることができる。また、機能的に同等であれば、配列番号１２または１６で表されるアミノ酸配列、配列番号１４または１８で表されるアミノ酸配列において、１または複数個（例えば２、３、４または５個）のアミノ酸の置換、付加および／または欠失を有してもよい。

本開示に係る抗ＥｐｈＡ４抗体は、当業者に公知の方法に従って、単離または精製されたものであってよい。

本明細書において、「単離された」または「精製された」は、自然の状態から、人為的に単離されたか、精製されたことを意味する。分子または組成物が自然に発生したものである場合、それが変化したかもしくは本来の環境から除去されたか、またはその両方であるとき、それは「単離された」かまたは「精製された」である。単離または精製の方法の例としては、電気泳動的、分子生物学的、免疫学的またはクロマトグラフィー的手法等が挙げられ、具体的には、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィー、等電点電気泳動、または、アルカリ抽出法等が挙げられるがこれらに限定されない。

一実施形態において、抗ＥｐｈＡ４抗体は、以下のＣＤＲを含んでいる：
（ａ）配列番号４４に示すアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号２７に示すアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号２８に示すアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３；
（ｄ）配列番号２９に示すアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１；
（ｅ）配列番号３０に示すアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ２；および
（ｆ）配列番号３１に示すアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３。

一実施態様において、前記抗ＥｐｈＡ４抗体は、ヒト化抗体またはキメラ抗体であり、特定の実施態様においてはヒト化抗体である。

別の実施形態において、抗ＥｐｈＡ４抗体は、重鎖および軽鎖を含んでおり、前記重鎖の可変領域は、配列番号４５に示すアミノ酸配列を含み、前記軽鎖の可変領域は、配列番号４６に示すアミノ酸配列を含んでいる。なお、当該実施形態において、前記重鎖の可変領域および／または前記軽鎖の可変領域は、配列番号４５に示すアミノ酸配列および／または配列番号４６に示すアミノ酸配列において１個または複数個のアミノ酸が置換、付加および／または欠失したアミノ酸配列を含んでもよい。ここで、「複数個」は、ＥｐｈＡ４に対する結合親和性を保持し、ＥｐｈＡ４の切断を促進する限り限定されないが、２個～１５個、または２個～１０個、例えば、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個または２個であり、またはアミノ酸配列中のアミノ酸数の１０％以内、例えば９％以内、８％以内、７％以内、６％以内、５％以内、４％以内、３％以内、２％以内または１％以内である。

一実施形態において、抗ＥｐｈＡ４抗体の重鎖は、ヒトＩｇＧ_２の定常領域を含んでいる。

特定の実施形態において、ヒトＩｇＧ_２の定常領域は、配列番号４７のアミノ酸配列を含んでいる。

一実施形態において、抗ＥｐｈＡ４抗体の軽鎖は、ヒトＩｇκの定常領域を含んでいる。

特定の実施形態において、ヒトＩｇκの定常領域は、配列番号４８のアミノ酸配列を含んでいる。

一実施形態において、抗ＥｐｈＡ４抗体は、配列番号５９に示すアミノ酸配列を含む重鎖と配列番号６０に示すアミノ酸配列を含む軽鎖を含んでいる。

別の実施形態において、例えば、抗体産生細胞により産生される抗体の不均一性を減少させる等の理由から（米国特許出願公開第２０１０／０２９７６９７号明細書やＬｉｕＨｅｔａｌ．，ＭＡｂｓ．２０１４Ｓｅｐ－Ｏｃｔ；６（５）：１１４５－１１５４）、抗ＥｐｈＡ４抗体は、重鎖のＣ末端（カルボキシ末端）に位置するリシンが欠失されている。本開示において、重鎖のＣ末端リシンが欠失されている抗ＥｐｈＡ４抗体には、重鎖のＣ末端リシンを遺伝子改変によって欠失させた抗ＥｐｈＡ４抗体やカルボキシペプチダーゼ等によって翻訳後に重鎖のＣ末端リシンが切断された抗ＥｐｈＡ４抗体等も含まれる。また、本開示において、重鎖のＣ末端リシンが欠失されている抗ＥｐｈＡ４抗体には、両方の重鎖においてＣ末端リシンが欠失されている抗ＥｐｈＡ４抗体だけでなく、片方のみの重鎖においてＣ末端リシンが欠失されている抗ＥｐｈＡ４抗体も含まれる。

一態様において、本開示は、抗ＥｐｈＡ４抗体をコードする単離された核酸に関する。抗ＥｐｈＡ４抗体をコードする単離された核酸は、抗ＥｐｈＡ４抗体の重鎖および／または軽鎖をコードする一以上の核酸分子を指す。一実施形態において、本開示に係る核酸は抗ＥｐｈＡ４抗体の重鎖をコードする。別の実施形態において、本開示に係る核酸は抗ＥｐｈＡ４抗体の軽鎖をコードする。さらに別の実施形態において、本開示に係る核酸は、抗ＥｐｈＡ４抗体の重鎖および軽鎖をコードする。本開示に係る核酸には、抗ＥｐｈＡ４抗体の重鎖をコードする第一の核酸分子、および抗ＥｐｈＡ４抗体の軽鎖をコードする第二の核酸分子も含まれる。

別の態様において、本開示は、抗ＥｐｈＡ４抗体をコードする単離された核酸を含むベクターに関する。本開示に係るベクターは、抗ＥｐｈＡ４抗体をコードする単離された核酸を含む一以上のベクターを指す。一実施形態において、本開示に係るベクターは、抗ＥｐｈＡ４抗体の重鎖をコードする核酸および抗ＥｐｈＡ４抗体の軽鎖をコードする核酸を含むベクターである。別の実施形態において、本開示に係るベクターは、抗ＥｐｈＡ４抗体の重鎖および軽鎖をコードする核酸を含むベクターである。さらに別の実施形態において、本開示に係るベクターは、抗ＥｐｈＡ４抗体の重鎖をコードする核酸を含む第一のベクター、および抗ＥｐｈＡ４抗体の軽鎖をコードする核酸を含む第二のベクターを含む。本開示に係るベクターは、特にこれらに限定されるものではないが、プラスミド、コスミド、ウイルス、ファージ等であってよい。例えば、ウイルスベクターとしては、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルスまたは単純ヘルペスウイルスベクター等も本開示に係るベクターに含まれる。

さらに別の態様において、本開示に係るベクターを含む宿主細胞、および当該宿主細胞を培養する工程を含む抗ＥｐｈＡ４抗体の作製方法も本開示に含まれる。本開示に係る宿主細胞は、特にこれらに限定されるものではないが、大腸菌細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＮＳ０細胞等であってよい。一実施形態において、抗ＥｐｈＡ４抗体の作製方法は、宿主細胞を培養する工程、および当該宿主細胞（または宿主細胞の培養培地）から分泌された抗ＥｐｈＡ４抗体を回収する工程を含む。

一態様において、本開示は、抗ＥｐｈＡ４抗体を含む医薬組成物に関する。本開示に係る医薬組成物は、例えば、日本薬局方（ＪＰ）、米国薬局方（ＵＳＰ）または欧州薬局方（ＥＰ）に記載された方法等、既知の方法に従って製造することができる。

本開示に係る抗ＥｐｈＡ４抗体は、アルツハイマー病の治療に有用であり得る。すなわち、本開示は、他の態様において、治療上有効量の抗ＥｐｈＡ４抗体をアルツハイマー病の対象に投与する工程を含む、アルツハイマー病の治療方法を包含する。また、本開示は、他の態様において、アルツハイマー病の治療薬を製造するための、抗ＥｐｈＡ４抗体の使用を包含する。本開示は、他の態様において、アルツハイマー病の治療において使用するための抗ＥｐｈＡ４抗体を包含する。

本開示に係る抗ＥｐｈＡ４抗体は、タウオパチーの治療に有用であり得る。すなわち、本開示は、他の態様において、治療上有効量の抗ＥｐｈＡ４抗体をタウオパチーの対象に投与する工程を含む、タウオパチーの治療方法を包含する。また、本開示は、他の態様において、タウオパチーの治療薬を製造するための、抗ＥｐｈＡ４抗体の使用を包含する。本開示は、他の態様において、タウオパチーの治療において使用するための抗ＥｐｈＡ４抗体を包含する。本開示のタウオパチーには、アルツハイマー病やタウ病理を有する前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ－ｔａｕ）が含まれる。また、タウ病理を有する前頭側頭葉変性症には、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、大脳皮質基底核変性症（ＣＢＤ）、嗜銀顆粒性認知症（ＡＧＤ）、神経原線維変化型老年期認知症（ＳＤ－ＮＦＴ）およびピック病（ＰｉＤ）等が含まれる。

本開示に係る抗ＥｐｈＡ４抗体は、治療法において単独か、または、その他の薬剤または組成物と併用して用いることができる。例えば本開示に係る抗ＥｐｈＡ４抗体は、別の薬剤と同時または異時に投与されてよい。このような併用療法には、併用投与（同じかまたは別々の製剤に２以上の薬剤が含まれる）および分離投与（例えば同時にまたは連続的に）が含まれる。２以上の薬剤を別々に投与する場合、本開示に係る抗ＥｐｈＡ４抗体の投与は、付随する治療法に先立つか、または続いて行われてよい。

本開示に係る医薬組成物を投与する対象は限定されず、例えば、ヒトまたは非ヒト哺乳動物（サル、マウス、ラット、ウサギ、ウシ、ウマ、ヤギ等）に対して用いることができる。

本開示に係る医薬組成物の対象への投与方法（投与経路、投与量、１日の投与回数、投与のタイミング、等）は限定されず、対象の健康状態、疾患の程度、併用する薬剤の種類等に応じて、当業者（例えば、医師）が適宜決定することができる。

技術的に矛盾しない限り、本明細書に記載の、あらゆる態様の任意の一または複数を、適宜組み合わせて、本発明を実施してよいことを当業者は理解する。さらに、技術的に矛盾しない限り、本明細書に記載の、好ましいまたは有利なあらゆる態様を、適宜組み合わせて、本発明を実施することが好ましいであろうことを当業者は理解する。

本明細書中に引用される文献は、参照により、それらのすべての開示が、明確に本明細書に援用されているとみなされるべきであって、当業者は、本明細書の文脈に従って、本発明の精神および範囲を逸脱することなく、それらの文献における関連する開示内容を、本明細書の一部として援用して理解できる。

本明細書中に引用される文献は、本出願の出願日前の関連技術の開示のみを目的として提供され、本発明者らが、先行発明または任意の他の理由によって、かかる開示に先行する権利を持たないことを自認するものとして解釈されてはならない。これらの文献のすべての記述は、本出願人が入手可能であった情報に基づいており、これらの記述内容が正確であるという自認を何ら構成しない。

本明細書において用いられる用語は、特定の実施態様を説明するために用いられるのであり、発明を限定する意図ではない。

本明細書において用いられる「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という用語は、文脈上明らかに異なる理解をすべき場合を除き、記載された事項（部材、ステップ、要素または数字等）が存在することを意図するものであり、それ以外の事項（部材、ステップ、要素または数字等）が存在することを排除しない。「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｏｆ）」という用語は、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｏｆ）」および／または「実質的に～からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙｏｆ）」という用語で記載される態様を包含する。

本明細書において用いられる「中和活性」という用語は、ＥｐｈＡ４とそのリガンドの結合を阻害する活性、および／または、ＥｐｈＡ４がそのリガンドの結合によりヒト生体内で誘導する、シグナル伝達や、細胞の分子発現応答もしくは機能性変化を阻害する活性を意味する。

異なる定義が無い限り、ここに用いられるすべての用語（技術用語および科学用語を含む。）は、本発明が属する技術の当業者によって広く理解されるのと同じ意味を有する。ここに用いられる用語は、異なる定義が明示されていない限り、本明細書および関連技術分野における意味と整合的な意味を有するものとして解釈されるべきであり、理想化され、または、過度に形式的な意味において解釈されるべきではない。

第１の、第２の等の用語が種々の要素を表現するために用いられるが、これらの要素はこれらの用語自身によって限定されるべきではないことが理解される。これらの用語は一つの要素を他の要素と区別するためのみに用いられているのであり、例えば、第１の要素を第２の要素と記し、同様に、第２の要素は第１の要素と記すことは、本発明の範囲を逸脱することなく可能である。

本明細書において、成分含有量や数値範囲等を示すのに用いられる数値は、特に明示がない限り、用語「約」で修飾されているものと理解されるべきである。例えば、「４℃」とは、特に明示がない限り、「約４℃」を意味するものと理解され、その程度を、当業者は技術常識と本明細書の文意に従って、合理的に理解できることは当然である。

文脈上明白に他の意味を示す場合を除き、本明細書および請求の範囲で使用される場合、単数形で表される各態様は、技術的に矛盾しない限り、複数形であってもよいことが理解され、逆もまた真である。

以下において、本発明を、実施例を参照してより詳細に説明する。しかしながら、本発明はいろいろな態様により具現化することができ、ここに記載される実施例に限定されるものとして解釈されてはならない。関連技術分野の当業者は、本発明の精神または範囲を変更させることなく、様々な改変、付加、欠失、置換等を伴って本発明を実施できる。

参考例１：抗ＥｐｈＡ４モノクローナル抗体の作製
（Ａ）マウス抗ＥｐｈＡ４モノクローナル抗体の作製
マウスＥｐｈＡ４（ＧｅｎｂａｎｋＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．ＮＰ＿０３１９６２．２、配列番号１）に結合するモノクローナル抗体を作製するため、マウスＥｐｈＡ４の細胞外領域（２０～５４７位）（配列番号２）に分泌型アルカリフォスファターゼ（ＳＥＡＰ）およびヒスチジンタグを融合したタンパク質（以下、「マウスＥｐｈＡ４細胞外領域－ＳＥＡＰ－Ｈｉｓタンパク質」という、配列番号３）を以下の工程により調製した。

まず、マウスＥｐｈＡ４のシグナル配列（配列番号４）と細胞外領域（配列番号２）をコードするＤＮＡ配列をマウスの脳由来のＴｏｔａｌＲＮＡを用いて、ＲＴ－ＰＣＲによって増幅し、ＳＥＡＰ、およびヒスチジンタグをコードするＤＮＡ配列を有するｐＥＮＴＲ１Ａベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）のＳａｌＩ／ＮｏｔＩサイトにクローニングした。次に、マウスＥｐｈＡ４のシグナル配列と細胞外領域、ＳＥＡＰ、およびヒスチジンタグをコードするＤＮＡ配列をＧａｔｅｗａｙＳｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）のＬＲ反応により、ｐｃＤＮＡ３．１＿ｒｆｃＢベクターに移し、ｐｃＤＮＡ３．１－マウスＥｐｈＡ４細胞外領域－ＳＥＡＰ－Ｈｉｓ発現ベクターを構築した。構築したｐｃＤＮＡ３．１－マウスＥｐｈＡ４細胞外領域－ＳＥＡＰ－Ｈｉｓ発現ベクターを、ＴｒａｎｓＩＴ－ＬＴ１（ＴＡＫＡＲＡ）を用いてＨＥＫ２９３ＥＢＮＡ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）へ形質移入した。６日間のインキュベーション（５％ＣＯ_２、３７℃）の後、培養上清を回収した。回収した培養上清より、マウスＥｐｈＡ４細胞外領域－ＳＥＡＰ－Ｈｉｓタンパク質（配列番号３）を、Ｐｒｏｔｉｎｏカラム（ＭＡＣＨＥＲＥＹ－ＮＡＧＥＬ）を用いて精製した。

２０μｇのマウスＥｐｈＡ４細胞外領域－ＳＥＡＰ－Ｈｉｓタンパク質を、同量のＴｉｔｅｒＭａｘＧｏｌｄアジュバント（ＴｉｔｅｒＭａｘＵＳＡ）、あるいはＧＥＲＢＵアジュバント（ＧＥＲＢＵＢｉｏｔｅｃｈｎｉｋＧｍｂＨ）と混合し、Ｂａｌｂ／ｃマウスの足蹠へ皮下注射した。その後、３、７、および１０日目に同様にマウスＥｐｈＡ４細胞外領域－ＳＥＡＰ－Ｈｉｓタンパク質を投与した。このとき、ＴｉｔｅｒＭａｘＧｏｌｄアジュバント（ＴｉｔｅｒＭａｘＵＳＡ）は１０日目のみ、ＧＥＲＢＵアジュバント（ＧＥＲＢＵＢｉｏｔｅｃｈｎｉｋＧｍｂＨ）は３、７、および１０日目に使用した。１３日目にマウスを屠殺し（ｓａｃｒｉｆｉｃｅｄ）、末梢リンパ節を回収してリンパ節細胞を調製した。ＧｅｎｏｍｅＯＮＥ－ＣＦ（ＩｓｈｉｈａｒａＳａｎｇｙｏＫａｉｓｈａ，Ｌｔｄ．）の存在下で、調製したリンパ節細胞とＰ３Ｕ１ミエローマ細胞（京都大学より分与）とを５：１の割合で融合した。前記融合細胞は、９６ウェルプラスチックプレートで培養した。７日間のインキュベーション（５％ＣＯ_２、３７℃）の後、培養上清を回収した。

得られた培養上清を用いて、マウス、ラットおよびヒトＥｐｈＡ４に対する反応性を有するウェルをピックアップした。

マウス、ラットおよびヒトのＥｐｈＡ４に対する反応性は、マウスＥｐｈＡ４の細胞外領域、ラットＥｐｈＡ４（ＧｅｎｂａｎｋＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．ＮＰ＿００１１５５８８３．１）の細胞外領域（２０～５４７位）またはヒトＥｐｈＡ４（ＧｅｎｂａｎｋＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．ＮＰ＿００４４２９．１、配列番号５）の細胞外領域（２０～５４７位）（配列番号６）に対して、ヒトＩｇＧ_１のＦｃ領域とヒスチジンタグを融合したタンパク質（以下、それぞれ「マウスＥｐｈＡ４細胞外領域－Ｆｃ－Ｈｉｓタンパク質」、「ラットＥｐｈＡ４細胞外領域－Ｆｃ－Ｈｉｓタンパク質」または「ヒトＥｐｈＡ４細胞外領域－Ｆｃ－Ｈｉｓタンパク質」という）を用い、ＥＬＩＳＡにて評価した。

マウス、ラットまたはヒトＥｐｈＡ４細胞外領域－Ｆｃ－Ｈｉｓタンパク質は、以下の工程により調製した。最初に、ｐｃＤＮＡ３．１－マウス、ラットまたはヒトＥｐｈＡ４細胞外領域－Ｆｃ－Ｈｉｓ発現ベクターを構築した。まず、マウス、ラットまたはヒトＥｐｈＡ４のシグナル配列と細胞外領域をコードするＤＮＡ配列をマウス、ラットまたはヒトの脳由来のＴｏｔａｌＲＮＡを用いて、ＲＴ－ＰＣＲによって増幅し、ＦｃおよびヒスチジンタグをコードするＤＮＡ配列を有するｐＥＮＴＲ１Ａベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）のＳａｌＩ／ＮｏｔＩサイトにクローニングした。次に、マウス、ラットまたはヒトのＥｐｈＡ４のシグナル配列と細胞外領域、ＦｃおよびヒスチジンタグをコードするＤＮＡ配列をＧａｔｅｗａｙＳｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）のＬＲ反応により、ｐｃＤＮＡ３．１＿ｒｆｃＢベクターに移し、ｐｃＤＮＡ３．１－マウス、ラットまたはヒトＥｐｈＡ４細胞外領域－Ｆｃ－Ｈｉｓ発現ベクターを構築した。構築したこれらの発現ベクターを、ＴｒａｎｓＩＴ－ＬＴ１（ＴＡＫＡＲＡ）を用いてＨＥＫ２９３ＥＢＮＡ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）へ形質移入した。６日間のインキュベーション（５％ＣＯ_２、３７°Ｃ）の後、培養上清を回収した。

マウス、ラットまたはヒトＥｐｈＡ４細胞外領域－Ｆｃ－Ｈｉｓタンパク質を用いたＥＬＩＳＡは、以下の工程に従って行った。抗ヒトＩｇＧ抗体（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を、９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ）のウェル上にコートした。４℃にて一晩インキュベートした後、１ｘブロックエース（大日本製薬）により、ウェルを室温にて１時間ブロッキングした。０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳ（ナカライテスク）で３回洗浄した後、各ウェルにマウス、ラットまたはヒトＥｐｈＡ４細胞外領域－Ｆｃ－Ｈｉｓタンパク質を含む培養上清を加え（最終濃度１ｎＭ）、室温にて１時間インキュベートした。３回洗浄した後、各ウェルに前記融合細胞の培養上清を添加した。室温にて１時間インキュベートして３回洗浄した後、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を加え、室温にて１時間インキュベートした。３回洗浄した後、各ウェルにＴＭＢＺ（３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン、Ｓｉｇｍａ）溶液を加え、５～２０分、室温にてインキュベートした。各ウェルに等量の反応停止溶液（２ＮＨ_２ＳＯ_４、和光純薬）を加え、マイクロプレートリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）により４５０ｎｍの吸光度を読み取った。

上記工程を経てピックアップしたウェルより限界希釈法にてハイブリドーマをクローニングし、最終的にマウス、ラットおよびヒトのＥｐｈＡ４に対する結合活性を有するマウス抗ＥｐｈＡ４抗体を発現するハイブリドーマクローンを得た。

得られたハイブリドーマクローンを培養し、培養上清からＰｒｏｔｅｉｎＡ（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いてマウス抗ＥｐｈＡ４モノクローナル抗体を精製した。

（Ｂ）ＥｐｈＡ４切断促進活性の評価
ラット海馬ニューロンの調製は、以下の工程に従って行った。妊娠１８日目のラット（日本チャールズ・リバー）から胎仔を取り出し、頭部を切開して脳を取り出した。実体顕微鏡下で海馬領域を切り出したのち、ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ溶液（１３７ｍＭＮａＣｌ（和光純薬），５ｍＭＫＣｌ（和光純薬），７ｍＭＮａ_２ＨＰＯ_４（和光純薬），２５ｍＭＨｅｐｅｓ（ＤＯＪＩＮＤＯ）、０．５ｍｇ／ｍＬＤＮａｓｅ（Ｓｉｇｍａ），０．２５％トリプシン（Ｌｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））に入れて３７℃で１０分間振とうした。溶液を除き、２０％Ｆｅｔａｌｂｏｖｉｎｅｓｅｒｕｍ／Ｈａｎｋｓ緩衝液（Ｓｉｇｍａ）を加えた。液を除いて、Ｈａｎｋｓ緩衝液で２回洗浄したのち、Ｈａｎｋｓ緩衝液中で海馬組織をピペッティングして細胞懸濁液を作製した。培養液（Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌｍｅｄｉｕｍ（Ｌｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１×Ｂ－２７ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｌｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、０．５ｍＭＬ－グルタミン（Ｌｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））を入れたポリＬリジンをコートした９６ウェルディッシュ（Ｆａｌｃｏｎ）に細胞を播種した。

海馬ニューロンを用いたＥｐｈＡ４切断促進活性評価は、以下の工程に従って行った。９６ウェルディッシュ（Ｆａｌｃｏｎ）に播種したラット海馬ニューロンに、抗ＥｐｈＡ４モノクローナル抗体（６７ｎＭ）およびγセクレターゼ阻害薬であるＣｏｍｐｏｕｎｄＥ（５０ｎＭ、ＥｎｚｏＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ）を処置して１６時間後にＰＢＳ（和光純薬）で洗浄して、ＳＤＳｓａｍｐｌｅｂｕｆｆｅｒ（Ｌａｅｍｍｌｉサンプルバッファー（バイオ・ラッド）、５％２－メルカプトエタノール（バイオ・ラッド））を加えて細胞を回収し、５分間煮沸した。このサンプルを用いてＳＤＳ－ＰＡＧＥを行い、抗ＥｐｈＡ４モノクローナル抗体（Ａｂｎｏｖａ）を用いたウェスタンブロッティングを行い、バンド強度を定量化し、ＥｐｈＡ４Ｃ末端フラグメント／全長ＥｐｈＡ４の値を算出した。

ＥｐｈＡ４の切断を促進する活性を有するマウス抗ＥｐｈＡ４モノクローナル抗体（抗体Ａ）を得た。抗体Ａのアイソタイプは、モノクローナル抗体アイソタイピングキット（Ｓｅｒｏｔｅｃ）にて決定し、重鎖に対してはＩｇＧ_１、軽鎖に対してはκであった。

（Ｃ）抗体Ａの配列解析
抗体Ａの重鎖および軽鎖のシグナル配列、および可変領域をコードするＤＮＡ配列を、５’－ＲＡＣＥ（５’－ｒａｐｉｄａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｃＤＮＡｅｎｄｓ）法によって増幅した。前記ハイブリドーマから、ＲＮｅａｓｙ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて全ＲＮＡを調製し、ＤＮａｓｅ（ＱＩＡＧＥＮ，ＲＮａｓｅｆｒｅｅＤＮａｓｅｓｅｔ）で処理した。ｃＤＮＡ合成キット（ＴＡＫＡＲＡ）を用いて、前記全ＲＮＡから二本鎖ｃＤＮＡを調製した。オリゴＤＮＡａｄ２９Ｓ（ACATCACTCCGT）（配列番号７）およびオリゴＤＮＡａｄ２９ＡＳ（ACGGAGTGATGTCCGTCGACGTATCTCTGCGTTGATACTTCAGCGTAGCT）（配列番号８）のアニーリングによって得られた５’アダプターを前記ｃＤＮＡに付加した。得られたｃＤＮＡを、５’フォワードプライマー（５’－ＰＣＲ４ｐｒｉｍｅｒ、AGCTACGCTGAAGTATCAACGCAGAG) （配列番号９）および３’リバースプライマー（マウスＩｇＧ重鎖の増幅にはGCCAGTGGATAGACTGATGG（配列番号１０）を用い、マウスＩｇκ軽鎖の増幅にはGATGGATACAGTTGGTGCAGC（配列番号１１）を用いた）によって増幅した。増幅されたｃＤＮＡを、ｐＣＲ２．１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に挿入した。抗体Ａの遺伝子配列を、ＡＢＩ３１３０ＸＬを用いて解析した。本解析によって同定された抗体Ａの遺伝子配列にコードされたアミノ酸配列として、重鎖シグナル配列は配列番号１２に示す配列であり、重鎖可変領域は配列番号１３に示す配列であり、軽鎖シグナル配列は配列番号１４に示す配列であり、軽鎖可変領域は配列番号１５に示す配列である。抗体Ａの遺伝子配列をコードするヌクレオチド配列として、重鎖シグナル配列は配列番号１６に示す配列であり、重鎖可変領域は配列番号１７に示す配列であり、軽鎖シグナル配列は配列番号１８に示す配列であり、軽鎖可変領域は配列番号１９に示す配列である。

抗体Ａの重鎖および軽鎖の全長配列は、以下の工程により取得した。前記ハイブリドーマから、ＲＮｅａｓｙ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて全ＲＮＡを調製し、ＤＮａｓｅ（ＱＩＡＧＥＮ，ＲＮａｓｅｆｒｅｅＤＮａｓｅｓｅｔ）で処理した。ＲＮＡＰＣＲキット（ＴＡＫＡＲＡ）を用いて、前記全ＲＮＡから逆転写産物を調製した。得られた逆転写産物を鋳型に用い、抗体Ａの重鎖および軽鎖をコードする遺伝子配列を５’フォワードプライマー（重鎖の増幅にはGCGAAGCTTGCCGCCACCATGGCTGTCCTGGTGCTGCTCC（primerID7455）（配列番号２０）を使用し、軽鎖の増幅にはGCGAAGCTTGCCGCCACCATGGACATGAGGGTTCCTGCTCACG（primerID7453）（配列番号２１）を使用した）と３’リバースプライマー（重鎖の増幅にはGCGGAATTCATCATTTACCAGGAGAGTGGGAGAGGC（primerID7257）（配列番号２２）を使用し、軽鎖の増幅にはCGCGAATTCACTAACACTCATTCCTGTTGAAGCTCTTGAC（primer ID7249）（配列番号２３）を使用した）を用いて、ＰＣＲにて増幅し、ｐＥＥ６．４、およびｐＥＥ１２．４ベクター（Ｌｏｎｚａ）にそれぞれクローニングした。遺伝子配列を、ＡＢＩ３１３０ＸＬを用いて解析した。本解析によって同定された抗体Ａの遺伝子配列にコードされたアミノ酸配列として、重鎖定常領域は配列番号２４に示す配列であり、軽鎖定常領域は配列番号２５に示す配列である。

抗体ＡのＣＤＲは、以下の方法で決定した。抗体Ａのアミノ酸配列を、Ｋａｂａｔの番号付システム（Ｋａｂａｔｎｕｍｂｅｒｉｎｇｓｙｓｔｅｍ）に従って、Ａｂｙｓｉｓソフトウェア（ＵＣＬ）を用いて番号付けした。この番号を基に、ＣＤＲの同定のためのＫａｂａｔの定義（Ｋａｂａｔｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ）に従って決定した。抗体ＡのＣＤＲのアミノ酸配列を表１に示す。

参考例２：抗ＥｐｈＡ４モノクローナル抗体のマウスおよびヒトＥｐｈＡ４に対する結合親和性
抗体ＡのマウスおよびヒトＥｐｈＡ４に対する結合親和性をＢｉａｃｏｒｅＴ２００(ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ)を用いた表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ法）により決定した。まず、抗Ｈｉｓ抗体（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ、２８－９９５０－５６）をセンサーチップＣＭ５へ固定化した。固定化は、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、および、Ｎ－エチル－Ｎ’－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）を用いたアミンカップリング法にて行い、ブロッキングにはエタノールアミンを用いた（センサーチップや固定化用試薬は、全てＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）。固定化用緩衝液（１０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．５）を用いて３．５μｇ／ｍＬに希釈し、ＢｉａｃｏｒｅＴ２００付属のプロトコルに従い、センサーチップ上に固定した。マウスもしくはヒトＥｐｈＡ４細胞外領域－ＳＥＡＰ－Ｈｉｓ１０をランニング緩衝液ＨＢＳ－ＥＰ（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＢＲ－１００１－８８）を用いて希釈し、フローセル上に１２０秒間送液しキャプチャーさせた（１０ＲＵ程度のキャプチャー量）。続いてＨＢＳ－ＥＰを用いて１００、５０、２５、１２．５、６．３、３．２、１．６、０ｎＭの範囲で系列希釈した抗体Ａを１２０秒間センサーチップに添加し、添加時（結合相、１２０秒間）、および、添加終了後（解離相、６００秒間）の結合反応曲線を順次観測した。各々の観測終了後に、４ＭＭｇＣｌ_２（６０秒間、和光純薬）を添加してセンサーチップを再生した。得られた結合反応曲線に対して、システム付属ソフトＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトを用いた１：１の結合モデルによるフィッティング解析を行い、マウスおよびヒトのＥｐｈＡ４に対する結合親和性（ＫＤ＝ｋｄ／ｋａ）を算出した。

抗体ＡのマウスおよびヒトＥｐｈＡ４に対する結合親和性（ＫＤ値）は、それぞれ１．３２×１０^－９Ｍ、１．１９×１０^－９Ｍであった（図１）。マウスおよびヒトＥｐｈＡ４に対するその他の結合パラメータもほぼ同程度であった。よって、抗体Ａは、マウスおよびヒトのＥｐｈＡ４に対して同程度の結合親和性を持つと考えられる。

参考例３：抗ＥｐｈＡ４モノクローナル抗体の海馬ニューロンにおけるＥｐｈＡ４切断促進活性
抗体Ａについて、海馬ニューロンを用いたＥｐｈＡ４切断促進活性の評価を以下の工程に従って行った。９６ウェルディッシュ（Ｆａｌｃｏｎ）に播種したラット海馬ニューロンに、抗体Ａ（２．０、６．７、２０ｎＭ）およびγセクレターゼ阻害薬であるＣｏｍｐｏｕｎｄＥ（５０ｎＭ、ＥｎｚｏＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ）を処置して２４時間後にＰＢＳ（和光純薬）で洗浄して、ＳＤＳｓａｍｐｌｅｂｕｆｆｅｒ（Ｌａｅｍｍｌｉサンプルバッファー（バイオ・ラッド）、５％２－メルカプトエタノール（バイオ・ラッド））を加えて細胞を回収し、５分間煮沸した。このサンプルを用いてＳＤＳ－ＰＡＧＥを行い、抗ＥｐｈＡ４モノクローナル抗体（Ａｂｎｏｖａ）を用いたウェスタンブロッティングを行い、バンド強度を定量化し、ＥｐｈＡ４Ｃ末端フラグメント／全長ＥｐｈＡ４の値を算出した。

抗体Ａは、海馬ニューロンにおいて、濃度依存的にＥｐｈＡ４切断反応を促進した（図２）。

参考例４：抗ＥｐｈＡ４モノクローナル抗体のマウスＥｐｈＡ４－マウスリガンド結合阻害活性
抗体Ａについて、マウスＥｐｈＡ４とマウスリガンドとの結合阻害活性の評価は、以下の工程に従って行った。抗アルカリフォスファターゼ抗体（ＴｈｅｒｍｏＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）を、９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ）のウェル上にコートした。４℃にて一晩インキュベートした後、１％ブロックエース（ＤＳファーマバイオメディカル）により、ウェルを室温にて１時間ブロッキングした。０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳ（ＴｈｅｒｍｏＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）で３回洗浄した後、ウェルにマウスＥｐｈＡ４細胞外領域－ＳＥＡＰ－Ｈｉｓタンパク質を加え（最終濃度１０ｎＭ）、室温にて１時間インキュベートした。３回洗浄した後、ウェルにリガンドと抗体Ａを（０、０．００３、０．０１、０．０３、０．１、０．３、１、３、１０、３０、１００、３００、１０００、３０００ｎＭ）を添加した。なお、リガンドにはビオチン化マウスＥｐｈｒｉｎＡ１－Ｆｃキメラ（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ、最終濃度６ｎＭ）およびビオチン化マウスＥｐｈｒｉｎＢ２－Ｆｃキメラ（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ、最終濃度２．５ｎＭ）を用いた。室温にて１時間インキュベートして３回洗浄した後、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）を加え、室温にて１時間インキュベートした。３回洗浄した後、ウェルにＴＭＢＺ（３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン、Ｓｉｇｍａ）溶液を加え、２分、室温にてインキュベートした。ウェルに等量の反応停止溶液（１ＮＨ_２ＳＯ_４、和光純薬）を加え、マイクロプレートリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）により４５０ｎｍの吸光度を読み取った。

抗体Ａは、マウスＥｐｈＡ４とマウスリガンドとの結合を濃度依存的に抑制し、マウスＥｐｈｒｉｎＡ１、ＥｐｈｒｉｎＢ２結合に対するＩＣ_５０値はそれぞれ約５．９ｎＭ、３．１ｎＭであった（図３）。よって、抗体ＡはマウスＥｐｈＡ４とマウスリガンドとの結合を強く阻害することが示された。

参考例５：抗ＥｐｈＡ４モノクローナル抗体のヒトＥｐｈＡ４－ヒトリガンド結合阻害活性
抗体Ａについて、ヒトＥｐｈＡ４とヒトリガンドとの結合阻害活性の評価は、以下の工程に従って行った。抗アルカリフォスファターゼ抗体（ＴｈｅｒｍｏＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）を、９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ）のウェル上にコートした。４℃にて一晩インキュベートした後、１％ブロックエース（ＤＳファーマバイオメディカル）により、ウェルを室温にて１時間ブロッキングした。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳ（ＴｈｅｒｍｏＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）で３回洗浄した後、ウェルにヒトＥｐｈＡ４細胞外領域－ＳＥＡＰ－Ｈｉｓタンパク質を加え（最終濃度１０ｎＭ）、室温にて１時間インキュベートした。３回洗浄した後、ウェルにリガンドと系列希釈した抗体Ａ（０、０．００３、０．０１、０．０３、０．１、０．３、１、３、１０、３０、１００、３００、１０００、３０００ｎＭ）を添加した。なお、リガンドにはビオチン化ヒトＥｐｈｒｉｎＡ５－Ｆｃキメラ（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ、最終濃度０．７ｎＭ）およびビオチン化ヒトＥｐｈｒｉｎＢ３－Ｆｃキメラ（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ、最終濃度２．３ｎＭ）を用いた。室温にて１時間インキュベートして３回洗浄した後、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）を加え、室温にて１時間インキュベートした。３回洗浄した後、ウェルにＴＭＢＺ（３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン、Ｓｉｇｍａ）溶液を加え、２～５分、室温にてインキュベートした。ウェルに等量の反応停止溶液（１ＮＨ_２ＳＯ_４、和光純薬）を加え、マイクロプレートリーダー（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓまたはＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）により４５０ｎｍの吸光度を読み取った。

抗体Ａは、ヒトＥｐｈＡ４とヒトリガンドとの結合を濃度依存的に抑制し、ヒトＥｐｈｒｉｎＡ５、ＥｐｈｒｉｎＢ３結合に対するＩＣ_５０値はそれぞれ約２．８ｎＭ、１．４ｎＭであった（図４）。よって、抗体ＡはヒトＥｐｈＡ４とヒトリガンドとの結合も強く阻害することが示された。

参考例６：抗ＥｐｈＡ４モノクローナル抗体のヒトＥｐｈレセプターに対する選択性
参考例１に記載のマウスＥｐｈＡ４細胞外領域－ＳＥＡＰ－Ｈｉｓタンパク質の調製方法に従って、ヒトの各Ｅｐｈレセプター（ＥｐｈＡ１、ＥｐｈＡ２、ＥｐｈＡ３、ＥｐｈＡ４、ＥｐｈＡ５、ＥｐｈＡ６、ＥｐｈＡ７、ＥｐｈＡ８、ＥｐｈＡ１０、ＥｐｈＢ１、ＥｐｈＢ２、ＥｐｈＢ３、ＥｐｈＢ４、ＥｐｈＢ６）のシグナル配列と細胞外領域をコードするＤＮＡ配列を組織由来のＴｏｔａｌＲＮＡを用いて、ＲＴ－ＰＣＲによって増幅し、ＳＥＡＰおよびヒスチジンタグをコードするＤＮＡ配列を有するｐＥＮＴＲ１Ａベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）にクローニングした。次に、ヒトの各Ｅｐｈレセプターのシグナル配列と細胞外領域、ＳＥＡＰおよびヒスチジンタグをコードするＤＮＡ配列をＧａｔｅｗａｙＳｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）のＬＲ反応により、ｐｃＤＮＡ３．１＿ｒｆｃＢベクターに移し、ヒトの各Ｅｐｈレセプターの細胞外領域に対してＳＥＡＰとＨｉｓタグを融合したタンパク質（「Ｅｐｈレセプター細胞外領域－ＳＥＡＰ－Ｈｉｓタンパク質」という）を発現するベクター（「Ｅｐｈレセプター細胞外領域－ＳＥＡＰ－Ｈｉｓタンパク質発現ベクター」という）を構築した。

次に、Ｅｘｐｉ２９３発現システム（Ｇｉｂｃｏ／ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いて、ヒトの各Ｅｐｈレセプター細胞外領域―ＳＥＡＰ―Ｈｉｓタンパク質発現ベクターを、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞（Ｇｉｂｃｏ／ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）に導入した。５日間の培養（５％ＣＯ２、３７℃、１２０ｒｐｍ）の後、培養上清を回収し、室温で１５００ｒｐｍ、５分間遠心した。遠心上清を０．４５μｍフィルター (Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ)でろ過した。

抗体Ａについて、ヒトＥｐｈレセプターの結合活性の評価は、以下の工程に従って行った。
ウサギ抗６―Ｈｉｓ抗体（ＢｅｔｈｙｌＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を、９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ）のウェル上にコートした。４℃にて一晩インキュベートした後、１％ブロックエース（ＤＳファーマバイオメディカル）により、ウェルを室温にて１時間ブロッキングした。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳ（ＴｈｅｒｍｏＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）で３回洗浄した後、各ウェルにヒトの各Ｅｐｈレセプター細胞外領域‐ＳＥＡＰ－Ｈｉｓタンパク質（最終濃度１ｎＭ）を播種し、室温にて１時間インキュベートした。３回洗浄した後、ウェルにヒトＩｇＧ溶液（１００μｇ／ｍＬ、三菱ウェルファーマ）および抗体Ａ（１０μｇ／ｍＬ）を添加し、室温にて１時間インキュベートした。西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ロバ抗マウスＩｇＧ抗体（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を加え、室温にて１時間インキュベートした。３回洗浄した後、ウェルにＴＭＢＺ（３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン、Ｓｉｇｍａ）溶液を加え、適度な発色を確認したらウェルに等量の反応停止溶液（１ＮＨ_２ＳＯ_４、和光純薬）を加え、マイクロプレートリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）により４５０ｎｍの吸光度を読み取った。

抗体Ａは、ヒトＥｐｈレセプターファミリー間ではヒトＥｐｈＡ４にのみ特異的に結合活性を有していた（図５）。

参考例７：抗ＥｐｈＡ４モノクローナル抗体のマウスＥｐｈレセプターに対する選択性
参考例１に記載のＥｐｈＡ４細胞外領域－Ｆｃ－Ｈｉｓタンパク質の調製方法に従って、マウスの各Ｅｐｈレセプター（ＥｐｈＡ１、ＥｐｈＡ３、ＥｐｈＡ４、ＥｐｈＡ５、ＥｐｈＡ６、ＥｐｈＡ７、ＥｐｈＡ８、ＥｐｈＡ１０、ＥｐｈＢ１、ＥｐｈＢ２、ＥｐｈＢ３、ＥｐｈＢ４、ＥｐｈＢ６）のシグナル配列と細胞外領域をコードするＤＮＡ配列を組織由来のＴｏｔａｌＲＮＡを用いて、ＲＴ－ＰＣＲによって増幅し、ヒトＩｇＧ_１のＦｃ領域およびヒスチジンタグをコードするＤＮＡ配列を有するｐＥＮＴＲ１Ａベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）にクローニングした。次に、マウスの各Ｅｐｈレセプター（ＥｐｈＡ１、ＥｐｈＡ３、ＥｐｈＡ４、ＥｐｈＡ５、ＥｐｈＡ６、ＥｐｈＡ７、ＥｐｈＡ８、ＥｐｈＡ１０、ＥｐｈＢ１、ＥｐｈＢ２、ＥｐｈＢ３、ＥｐｈＢ４、ＥｐｈＢ６）のシグナル配列と細胞外領域、ＦｃおよびヒスチジンタグをコードするＤＮＡ配列をＧａｔｅｗａｙＳｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）のＬＲ反応により、ｐｃＤＮＡ３．１＿ｒｆｃＢベクターに移し、マウスの各Ｅｐｈレセプターの細胞外領域－Ｆｃ－Ｈｉｓタンパク質発現ベクターを構築した。マウスＥｐｈＡ２の細胞外領域－Ｆｃ－Ｈｉｓタンパク質発現ベクターの構築では、マウスＥｐｈＡ２のシグナル配列と細胞外領域をコードするＤＮＡ配列を組織由来のＴｏｔａｌＲＮＡを用いて、ＲＴ－ＰＣＲによって増幅し、ＦｃおよびヒスチジンタグをコードするＤＮＡ配列を有するｐｃＤＮＡ３．１ベクターにクローニングして、マウスＥｐｈＡ２細胞外領域－Ｆｃ－Ｈｉｓタンパク質発現ベクターを構築した。

次に、Ｅｘｐｉ２９３発現システム（Ｇｉｂｃｏ／ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いて、マウスの各Ｅｐｈレセプター細胞外領域―Ｆｃ―Ｈｉｓタンパク質発現ベクターを、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞（Ｇｉｂｃｏ／ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）に導入した。５日間の培養（５％ＣＯ２、３７℃、１２０ｒｐｍ）の後、培養上清を回収し、室温で１５００ｒｐｍ、５分間遠心した。遠心上清を０．４５μｍフィルター (Ｍｉｌｌi
ｐｏｒｅ)でろ過した。

抗体Ａについて、マウスＥｐｈレセプターの結合活性の評価は、以下の工程に従って行った。
ウサギ抗６―Ｈｉｓ抗体（ＢｅｔｈｙｌＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を、９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ）のウェル上にコートした。４℃にて一晩インキュベートした後、１％ブロックエース（ＤＳファーマバイオメディカル）により、ウェルを室温にて１時間ブロッキングした。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳ（ＴｈｅｒｍｏＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）で３回洗浄した後、各ウェルにマウスの各Ｅｐｈレセプター細胞外領域‐Ｆｃ－Ｈｉｓタンパク質（最終濃度１ｎＭ）を播種し、室温にて１時間インキュベートした。３回洗浄した後、ウェルにヒトＩｇＧ溶液（１００μｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ）および抗体Ａ（１０μｇ／ｍＬ）を添加し、室温にて１時間インキュベートした。西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ロバ抗マウスＩｇＧ抗体（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を加え、室温にて１時間インキュベートした。３回洗浄した後、ウェルにＴＭＢＺ（３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン、Ｓｉｇｍａ）溶液を加え、適度な発色を確認したらウェルに等量の反応停止溶液（１ＮＨ_２ＳＯ_４、和光純薬）を加え、マイクロプレートリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）により４５０ｎｍの吸光度を読み取った。

抗体Ａは、マウスＥｐｈレセプターファミリー間ではマウスＥｐｈＡ４にのみ特異的に結合活性を有していた（図６）。

参考例８：抗ＥｐｈＡ４モノクローナル抗体のマウス、ラット、サルおよびヒトＥｐｈＡ４に対する反応性
マウス、ラット、サルおよびヒトＥｐｈＡ４細胞外領域－Ｆｃ－Ｈｉｓタンパク質の作製は、以下の工程に従って行った。まず、参考例１に記載のＥｐｈＡ４細胞外領域－Ｆｃ－Ｈｉｓタンパク質の調製方法に従って、サルＥｐｈＡ４細胞外領域－Ｆｃ－Ｈｉｓタンパク質発現ベクターを構築した。ベクター構築において利用するサルＥｐｈＡ４のアミノ酸配列を配列番号３２、その細胞外領域は配列番号３３として示す。サルＥｐｈＡ４細胞外領域－Ｆｃ－Ｈｉｓタンパク質発現ベクター、および参考例１に記載のマウス、ラットおよびヒトＥｐｈＡ４細胞外領域－Ｆｃ－Ｈｉｓタンパク質発現ベクターを用いて、各種ＥｐｈＡ４細胞外領域－Ｆｃ－Ｈｉｓタンパク質を調製した。

抗体Ａについて、各種ＥｐｈＡ４細胞外領域との結合活性の評価は、以下の工程に従って行った。
ロバ抗ヒトＩｇＧ抗体（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を、９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ）のウェル上にコートした。４℃にて一晩インキュベートした後、１％ブロックエース（ＤＳファーマバイオメディカル）により、ウェルを室温にて１時間ブロッキングした。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳ（ＴｈｅｒｍｏＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）で３回洗浄した後、ウェルにマウス、ラット、サルおよびヒトＥｐｈＡ４細胞外領域－Ｆｃ－Ｈｉｓタンパク質（最終濃度１ｎＭ）を播種し、室温にて１時間インキュベートした。３回洗浄した後、ウェルにヒトＩｇＧ溶液（１００μｇ／ｍＬ、三菱ウェルファーマ）および抗体Ａ（０、０．０００１３、０．０００６４、０．００３２、０．０１６、０．０８、０．４、２、１０、μｇ／ｍＬ）を添加し、室温にて１時間インキュベートした。西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ロバ抗マウスＩｇＧ抗体（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を加え、室温にて１時間インキュベートした。３回洗浄した後、ウェルにＴＭＢＺ（３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン、Ｓｉｇｍａ）溶液を加え、適度な発色を確認したらウェルに等量の反応停止溶液（１ＮＨ_２ＳＯ_４、和光純薬）を加え、マイクロプレートリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）により４５０ｎｍの吸光度を読み取った。

抗体Ａは、マウス、ラット、サルおよびヒトＥｐｈＡ４いずれにおいても同等の結合活性を有していた（図７）。

参考例９：抗ＥｐｈＡ４モノクローナル抗体のヒトＥｐｈＡ４細胞外領域、リガンド結合ドメイン、フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン１、フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン２に対する反応性
ヒトＥｐｈＡ４の細胞外領域（ＥＣＤ）、リガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）、フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン１（ＦＮ１）あるいはフィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン２（ＦＮ２）とマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）およびヒスチジンタグを融合したタンパク質（以下、「ヒトＥｐｈＡ４細胞外領域－ＭＢＰ－Ｈｉｓタンパク質」、「ヒトＥｐｈＡ４リガンド結合ドメイン－ＭＢＰ－Ｈｉｓタンパク質」、「ヒトＥｐｈＡ４フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン１－ＭＢＰ－Ｈｉｓタンパク質」、および「ヒトＥｐｈＡ４フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン２－ＭＢＰ－Ｈｉｓタンパク質」という）の作製は、以下の工程に従って行った。最初に、ｐｃＤＮＡ３．４－ヒトＥｐｈＡ４細胞外領域、リガンド結合ドメイン、フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン１、あるいはフィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン２－ＭＢＰ－Ｈｉｓ発現ベクターを構築した。まず、ヒトＥｐｈＡ４のシグナル配列（配列番号３４）あるいはプレプロトリプシンのシグナル配列（配列番号３５）とヒトＥｐｈＡ４の各ドメインをコードするＤＮＡ配列をＰＣＲによって増幅し、ＭＢＰおよびヒスチジンタグをコードするＤＮＡ配列を有するｐｃＤＮＡ３．４ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）にクローニングして、ヒトＥｐｈＡ４細胞外領域－ＭＢＰ－Ｈｉｓタンパク質、ヒトＥｐｈＡ４リガンド結合ドメイン－ＭＢＰ－Ｈｉｓタンパク質、ヒトＥｐｈＡ４フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン１－ＭＢＰ－Ｈｉｓタンパク質、およびヒトＥｐｈＡ４フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン２－ＭＢＰ－Ｈｉｓタンパク質の発現ベクターを構築した。ベクター構築において利用するヒトＥｐｈＡ４のアミノ酸配列を配列番号５、その細胞外領域は配列番号３６、リガンド結合ドメインは配列番号３７、フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン１は配列番号３８、フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン２は配列番号３９として示す。Ｅｘｐｉ２９３発現システム（ＴｈｅｒｍｏＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）を用いて、上記発現ベクターをＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞（ＴｈｅｒｍｏＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）へ形質移入した。４日後に培養上清を回収し、０．４５μｍフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を通した。Ａｍｙｌｏｓｅｒｅｓｉｎ（ＮＥＢ）を用いて粗精製を行い、ＺｅｂａＳｐｉｎＤｅｓａｌｔｉｎｇｃｏｌｕｍｎ（ＴｈｅｒｍｏＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）を用いてＰＢＳ（和光純薬）にバッファー置換した。Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００１０／３００（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）にて単量体画分を分画精製した。

抗体Ａについて、各種ヒトＥｐｈＡ４内ドメインとの結合活性の評価は、以下の工程に従って行った。
ウサギ抗６―Ｈｉｓ抗体（ＢｅｔｈｙｌＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を、９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ）のウェル上にコートした。４℃にて一晩インキュベートした後、１％ブロックエース（ＤＳファーマバイオメディカル）により、ウェルを室温にて１時間ブロッキングした。０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳ（ナカライテスク）で２回洗浄した後、ウェルにヒトＥｐｈＡ４細胞外領域－ＭＢＰ－Ｈｉｓタンパク質、ヒトＥｐｈＡ４リガンド結合ドメイン－ＭＢＰ－Ｈｉｓタンパク質、ヒトＥｐｈＡ４フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン１－ＭＢＰ－Ｈｉｓタンパク質、およびヒトＥｐｈＡ４フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン２－ＭＢＰ－Ｈｉｓタンパク質（最終濃度１０ｎＭ）を播種し、室温にて１時間インキュベートした。３回洗浄した後、ウェルに抗体Ａ（最終濃度１０ｎＭ）を添加し、室温にて１時間インキュベートした。西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＧＦｃγフラグメント抗体（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を加え、室温にて１時間インキュベートした。５回洗浄した後、ウェルにＴＭＢ溶液（ＫＰＬ）を加え、適度な発色を確認したらウェルに等量の反応停止溶液（２ＮＨ_２ＳＯ_４、和光純薬）を加え、マイクロプレートリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）により４５０ｎｍおよび６５０ｎｍの吸光度を読み取った。

抗体Ａは、ヒトＥｐｈＡ４細胞外領域（ＥＣＤ）およびリガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）に結合活性を有していた（図８）。フィブロネクチンIII型ドメイン１（ＦＮ１）およびフィブロネクチンIII型ドメイン２（ＦＮ２）には反応しなかった。よって、抗体ＡはヒトＥｐｈＡ４細胞外領域のリガンド結合ドメインに特異的に結合することが分かった。

参考例１０：抗ＥｐｈＡ４モノクローナル抗体の海馬ニューロンのスパイン数に対する増加効果
ラット海馬ニューロンの調製は、上記参考例１の（Ｂ）に記載されるように行った。ラット海馬ニューロンにＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ(Ｌｏｎｚａ)を用いてＥＧＦＰ遺伝子を導入し、遺伝子導入を行わないラット海馬ニューロンと混合して、ポリＬリジンをコートしたカバーガラス（松浪硝子工業）を入れた２４ウェルプレート（Ｆａｌｃｏｎ）に播種した。

海馬ニューロンを用いたスパインの計数は、以下の工程に従って行った。ポリＬリジンをコートしたカバーガラス（松浪硝子工業）を入れた２４ウェルプレート（Ｆａｌｃｏｎ）に播種した培養１３日目のＥＧＦＰ導入ラット海馬ニューロンに、コントロール抗体（マウスIｇＧ_１；ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）もしくは抗体Ａ（６．７、２０ｎＭ）を２４時間処置した。その後、カバーガラスを２％ＰＦＡ（和光純薬）／４％Ｓｕｃｒｏｓｅ（和光純薬）／ＰＢＳに移し、２０分間静置し、細胞を固定した。固定液を除き、細胞をＰＢＳで３回洗浄したのち、０．２５％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００（和光純薬）／ＰＢＳを加えて、１５分間、細胞透過処理を行った。液を除き、２％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）／０．２５％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００／Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ）にカバーガラスを移して、１時間ブロッキングを施したあと、抗ＧＦＰ抗体（ナカライテスク）を１時間３０分反応させた。１次抗体液を除き、ＰＢＳで３回洗浄したのち、２次抗体を１時間反応させた。２次抗体液を除き、ＰＢＳで３回洗浄したのち、ＰｒｏｌｏｎｇＧｏｌｄａｎｔｉｆａｄｅｒｅａｇｅｎｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｐｒｏｂｅｓ）を加えて封入し、ＬＳＭ８００（ＺＥＩＳＳ）で観察を行った。上述の実験を３回実施し、１回の実験につき、カバーガラス２枚からニューロンを抽出し、それぞれの樹状突起にあるスパインを画像解析ソフトＩｍａｒｉｓ（登録商標）（Ｂｉｔｐｌａｎｅ）を用いて計数し、各ニューロンにおける１０ μｍあたりのスパイン数を算出した。

抗体Ａは、海馬ニューロンのスパイン数を増加させた（図９）。本結果は、抗体Ａが海馬ニューロンにおいてスパインを安定化させる活性を有することを示すものである。

参考例１１：抗ＥｐｈＡ４モノクローナル抗体のｉｎｖｉｖｏにおけるタウのリン酸化抑制効果
タウトランスジェニックマウス（ｒＴg４５１０）を用いたｉｎｖｉｖｏにおけるタウのリン酸化抑制効果の評価は、以下の工程に従って行った。タウトランスジェニックマウス（ｒＴg４５１０）に、抗体Ａもしくは、ジニトロフェノールをマウスに免疫して常法により作製したコントロール抗体（マウス抗ジニトロフェノール抗体）をそれぞれ１００ｍｇ／ｋｇの用量（１０ｍＬ／ｋｇ）で、２０週齢から２６週齢まで週２回皮下投与した。最終投与から３．５日後に２％イソフルラン（インターベット）および３種混合麻酔薬（４．０ｍｇ／ｋｇドルミカム（アステラス製薬）、０．３ｍｇ／ｋｇドミトール（日本全薬工業）、５．０ｍｇ／ｋｇベトルファール（ＭｅｉｊｉＳｅｉｋａファルマ））で麻酔し、麻酔下で３ユニット／ｍＬヘパリン（味の素）と１％ホスファターゼ阻害剤カクテル（ナカライテスク）含有のＰＢＳ（和光純薬）で潅流を行い、大脳半球を摘出した。採材した大脳半球を、２％パラホルムアルデヒド（ＴＡＡＢ）／０．１Ｍリン酸緩衝液（和光純薬）に一晩振とうしながら４℃で固定した。大脳半球を２０％Ｓｕｃｒｏｓｅ（和光純薬）／０．１Ｍリン酸緩衝液（和光純薬）、続いて２５％Ｓｕｃｒｏｓｅ／０．１Ｍリン酸緩衝液（和光純薬）で置換したのち、ティッシュー・テックＯ．Ｃ．Ｔ．コンパウンド（サクラファインテックジャパン）／２５％Ｓｕｃｒｏｓｅに包埋して液体窒素にて凍結した。クライオスタットＣＭ１８６０（ライカ）を用いて７μｍ厚で切片を作製し、スライドグラス（武藤化学）に貼付したのち、冷風で風乾させた後、密封した袋の中に入れ、－８０℃で保存した。免疫染色に使用するスライドガラスを融解し、冷風で風乾させた後、ＰＢＳ（和光純薬）で洗浄し、１％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）／１０％正常ロバ血清（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）／０．５％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００（和光純薬）／ＰＢＳ液に浸して、１時間ブロッキングを施したあと、抗リン酸化タウ抗体ＡＴ８（ＦｕｊｉｒｅｂｉｏＥｕｒｏｐｅＮ．Ｖ．）を一晩常温で反応させた。ＰＢＳで３回洗浄したのち、２次抗体を１時間反応させた。ＰＢＳで３回洗浄したのち、ＰｒｏｌｏｎｇＧｏｌｄａｎｔｉｆａｄｅｒｅａｇｅｎｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｐｒｏｂｅｓ）を切片に載せて封入し、ＬＳＭ７００（ＺＥＩＳＳ）で観察を行った。海馬ＣＡ１放射状層におけるＡＴ８シグナル陽性の面積を、画像解析ソフトＩｍａｇｅＪを用いて計測し、総面積に対するＡＴ８陽性シグナル面積の割合を算出した。

抗体Ａは、海馬ＣＡ１領域のリン酸化タウのシグナルを減少させた（図１０）。本結果は、抗体Ａがタウトランスジェニックマウス（ｒＴg４５１０）においてタウ病理の進行を抑制する活性を有することを示すものである。

参考例１２：Ｘ線結晶構造解析によるＥｐｈＡ４－リガンド結合ドメイン（ＥｐｈＡ４－ＬＢＤ）のエピトープマッピング
抗体Ａ－Ｆａｂの調製は、以下の工程に従って行った。抗体Ａ１０１．１ｍｇを、１５ｍｇ／ｍＬの濃度で３０ｍＭＬ－システインおよび２ｍＭＥＤＴＡを含む０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解した。この抗体溶液に、パパイン（Ｓｉｇｍａ）を抗体に対して１／２００量加えて、３７℃で１８時間酵素消化を行った。抗体Ａ酵素消化液は、ＰＢＳに対して透析したのち、遠心分離にて沈殿を除去した（生じた沈殿はＰＢＳで再溶解して、遠心分離上清と混合した）。次に、抗体Ａ－Ｆａｂ以外の不純物を除去する目的で、以下の工程を行った。
１）ＰｒｏｔｅｉｎＡカラムによる精製
この酵素消化溶液を、ＰＢＳで平衡化した２ｍＬのＰｒｏＳｅｐｖＡＨｉｇｈＣａｐａｃｉｔｙ (Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ)にアプライして、素通り画分および、ＰＢＳでの洗浄画分を回収した。
２）抗ヒトＩｇＧＦｃγ抗体を用いたアフィニティー精製
抗ヒトＩｇＧＦｃγ抗体（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を、ＮＨＳ－ＡｃｔｉｖａｔｅｄＳｅｐｈａｒｏｓｅ４ＦＦ（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）に共有結合させたアフィニティーカラムを、このＳｅｐｈａｒｏｓｅのマニュアルに従って調製した。このアフィニティーカラムに対して、上記１）で回収した溶液をチャージして、その素通り溶液とＰＢＳでの洗浄液を回収した。
３）ゲルろ過による精製
上記２）で得た素通り画分を、限外ろ過膜を用いて濃縮した。Ｓｕｐｅｒｏｓｅ１２（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）をＰＢＳで平衡化し、濃縮した標品をアプライして分離精製した。分離精製した画分の一部を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで分析して、純度高く抗体Ａ－Ｆａｂを含む画分を回収してプールした。このようにして精製した標品を、抗体Ａ－Ｆａｂとした。

抗体Ａ－Ｆａｂと抗原であるＥｐｈＡ４－ＬＢＤの複合体を作製するため、ＥｐｈＡ４－ＬＢＤを調製した（ＱｉｎＨ. ｅｔａｌ., Ｊ. Ｂｉｏｌ. Ｃｈｅｍ., ２８３: ２９４７３－２９４８４ (２００８)）。ＥｐｈＡ４－ＬＢＤが抗体Ａ－Ｆａｂに対して約１．５倍のモル比になるように、０．６８μｍｏｌ（２００μＭ、３．４ｍＬ）のＥｐｈＡ４－ＬＢＤと０．４５μｍｏｌ（３００μＭ、１．５ｍＬ）の抗体Ａ－Ｆａｂを混合した。次に混合液をＨＩＬＯＡＤ２６／６０Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５ｐｒｅｐｇｒａｄｅ（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）にアプライし、クロマト用緩衝液（２５ｍＭＴｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭＮａＣｌ）で溶出を行った。複合体を含む画分をＳＤＳＰＡＧＥで分析し、高純度の画分を集めて約４０．８ｍｇ／ｍＬまで濃縮し、これを結晶化に用いた。

複合体の結晶化は、自動結晶化装置ＨｙｄｒａＩＩＰｌｕｓＯｎｅシステム（ＭａｔｒｉｘＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓＣｏｒｐ., Ｌｔｄ.）を用いたシッティングドロップ蒸気拡散法によって行った。プレートはＭＲＣ－２（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｉｍｅｎｓｉｏｎｓ）を使用した。リザーバー溶液の組成は１００ｍＭＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１０％ＰｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅＧｌｙｃｏl ８０００、８％ＥｔｈｙｌｅｎｅＧｌｙｃｏｌで、このリザーバー溶液と上記の複合体溶液の体積比が１：１になるよう混合して結晶化ドロップレットを作製した。作製した結晶化プレートは２０℃で静置した。

上記の条件で結晶化を行ったところ、空間群Ｐ２１２１２１、格子定数ａ＝７１．０Å、ｂ＝８４．５Å、ｃ＝１１６．１Åの結晶が得られた。得られた結晶に放射光Ｘ線（１．０Å）を入射して１．７９Åの回折データを取得した。回折データをＨＫＬ２０００（ＨＫＬＲｅｓｅａｒｃｈＩｎｃ.）によって処理し、分子置換法によって位相決定を行った。分子置換法にはＣＣＰ４ＳｏｆｔｗａｒｅＳｕｉｔｅ（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌｐｒｏｊｅｃｔｎｕｍｂｅｒ４、［ＣＣＰ４］ｖｅｒｓｉｏｎ６.５．０、ＡｃｔａＣｒｙｓｔ. Ｄ６７：２３５－２４２（２０１１））に含まれるプログラムＰＨＡＳＥＲ（ｖｅｒｓｉｏｎ２.５．０、ＭｃＣｏｙＡ. Ｊ. ｅｔａｌ., Ｊ. Ａｐｐｌ. Ｃｒｙｓｔ. ４０：６５８－６７４（２００７））を用いた。分子置換法のサーチモデルとしてはＥｐｈＡ４－ＬＢＤの結晶構造（ＰＤＢＩＤ：３ＣＫＨ）とＩｇＧのＦａｂ領域の結晶構造（ＰＤＢＩＤ：２ＶＸＴ（Ｌ鎖）と１ＦＧＮ（Ｈ鎖））を用いた。決定した位相から得られた電子密度に合うように分子モデルをプログラムＣＯＯＴ（ＥｍｓｌｅｙＰ. ｅｔａｌ., ＡｃｔａＣｒｙｓｔ. Ｄ６０：２１２６－２１３２ｎ（２００４）)を用いて構築し、構造精密化をプログラムＲＥＦＭＡＣ（ＭｕｒｓｈｕｄｏｖＧ.Ｎ., ＡｃｔａＣｒｙｓｔ. Ｄ５３：２４０－２５５（１９９７））を用いて行った。
以上の構造計算によって２．０Å分解能の複合体結晶構造を得た（Ｒ＝０．２１２、Ｒｆｒｅｅ＝０．２５８）。

得られた抗体Ａ－Ｆａｂ／ＥｐｈＡ４－ＬＢＤ複合体の結晶構造を計算化学システムＭＯＥ２０１８．０１０１（ＣｈｅｍｉｃａｌＣｏｍｐｕｔｉｎｇＧｒｏｕｐＩｎｃ.）に搭載されている相互作用検出ツールを用いて解析し、抗体Ａ－Ｆａｂと直接接触しているＥｐｈＡ４－ＬＢＤ上のアミノ酸残基を同定した（図１１Ａ）。同定されたアミノ酸残基は、Ｇｌｕ５１、Ｇｌｙ５２、Ｉｌｅ５９、Ｇｌｎ７１、Ｃｙｓ７３、Ａｓｎ７４、Ｖａｌ７５、Ｍｅｔ７６、Ｇｌｕ７７、Ｔｈｒ１０４、Ａｒｇ１０６、Ｌｅｕ１１１、Ｐｒｏ１１２、Ｍｅｔ１１５、Ａｒｇ１６２、Ｍｅｔ１６４、Ｃｙｓ１９１、Ａｌａ１９３、Ｖａｌ１９５である。図１１Ｂに、Ｍａｅｓｔｒｏ（ｖｅｒｓｉｏｎ１１．０、Ｓｃｈｒoｄｉｎｇｅｒ、ＬＬＣ）で作成したＥｐｈＡ４－ＬＢＤの表面構造を示す。この結果、本発明者らはこれらのアミノ酸残基が存在する領域がＥｐｈＡ４－ＬＢＤにおける抗体Ａ－Ｆａｂ結合領域であると結論づけた。

実施例１：抗体Ａのヒト化抗体の作製
ヒト化抗ＥｐｈＡ４抗体の調製
ヒト化抗体の可変領域を設計した。抗体Ａのフレームワーク領域（ＦＲ）に対する高い相同性を基に、ヒト抗体のＦＲの中から、重鎖についてはＩＧＨＶ３－３３＊０３（配列番号４２）、およびＪＨ６（配列番号４３）、軽鎖についてはＩＧＫＶ１－１７＊０１（配列番号４０）、およびＪＫ４（配列番号４１）をヒト化抗体のＦＲとして選択した。その後、マウス抗体Ａの３Ｄ構造予測モデルを用いて、ＣＤＲのアミノ酸と相互作用するＦＲにおけるアミノ酸を予測し、重鎖のＣＤＲ１にＹ３２Ｆの変異を有する抗体ＡのＣＤＲ（配列番号４４、２７、２８、および２９－３１）とともに移植し、ヒト化抗体の重鎖可変領域としてＨＫ２－４２（配列番号４５）が設計され、ヒト化抗体の軽鎖可変領域としてＬ１－８（配列番号４６）が設計された。移植したＣＤＲのアミノ酸配列を表２に示し、核酸配列を表３に示す。

重鎖定常領域として、ヒトＩｇＧ_２の定常領域（配列番号４７）を用いた。軽鎖定常領域としては、ヒトＩｇκ（配列番号４８）を用いた。Ｅｘｐｉ２９３発現システム（Ｇｉｂｃｏ／ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いて、ヒト化抗体のアミノ酸配列をコードする遺伝子配列を含む発現ベクター（ｐｃＤＮＡ３．４）をＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞（Ｇｉｂｃｏ／ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）へ形質移入した。ヒト化抗体のアミノ酸配列をコードする遺伝子配列として、それぞれ、重鎖可変領域については配列番号５５に示す核酸配列を用い、軽鎖可変領域については配列番号５６に示す核酸配列を用い、重鎖定常領域については配列番号５７に示す核酸配列を用い、軽鎖定常領域については配列番号５８に示す核酸配列を用いた。ヒト化抗体の重鎖全長（シグナル配列は含まない）のアミノ酸配列は、配列番号５９に示すアミノ酸配列であり、軽鎖全長（シグナル配列は含まない）のアミノ酸配列は、配列番号６０に示すアミノ酸配列である。ヒト化抗体の重鎖全長をコードする核酸配列は、配列番号６１に示す核酸配列であり、軽鎖全長をコードする核酸配列は、配列番号６２に示す核酸配列である。上清を回収し、ＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕＲｅ（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて抗体Ａのヒト化抗体（抗体Ｂ）を精製した。

実施例２：ヒト化抗ＥｐｈＡ４モノクローナル抗体のヒトＥｐｈＡ４に対する親和性
実施例１で得た抗体ＢのヒトＥｐｈＡ４に対する結合親和性をＢｉａｃｏｒｅＴ２００(ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ)を用いた表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ法）により決定した。まず、抗Ｈｉｓ抗体（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ，２８－９９５０－５６）をセンサーチップＣＭ５へ固定化した。固定化は、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、および、Ｎ－エチル－Ｎ’－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）を用いたアミンカップリング法にて行い、ブロッキングにはエタノールアミンを用いた（センサーチップや固定化用試薬は、全てＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）。固定化用緩衝液（１０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．５）を用いて３．５μｇ／ｍＬに希釈し、ＢｉａｃｏｒｅＴ２００付属のプロトコルに従い、センサーチップ上に固定した。ヒトＥｐｈＡ４細胞外領域－ＳＥＡＰ－Ｈｉｓ１０をランニング緩衝液ＨＢＳ－ＥＰ（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＢＲ－１００１－８８）を用いて希釈し、フローセル上に１２０秒間送液しキャプチャーさせた（１０ＲＵ程度のキャプチャー量）。続いてＨＢＳ－ＥＰを用いて１００、５０、２５、１２．５、６．３、３．２、１．６、０ｎＭの範囲で系列希釈した抗体Ｂを１２０秒間センサーチップに添加し、添加時（結合相、１２０秒間）、および、添加終了後（解離相、６００秒間）の結合反応曲線を順次観測した。各々の観測終了後に、４ＭＭｇＣｌ_２（６０秒間、和光純薬）を添加してセンサーチップを再生した。得られた結合反応曲線に対して、システム付属ソフトＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトを用いた１：１の結合モデルによるフィッティング解析を行い、ヒトのＥｐｈＡ４に対する親和性（ＫＤ＝ｋｄ／ｋａ）を算出した。

抗体ＢのヒトＥｐｈＡ４に対する結合親和性（ＫＤ値）は、１．３４×１０^－９Ｍであった（図１２）。抗体Ｂは、ヒト化を行う前の抗体Ａとほぼ同等の親和性を示すことが分かった。

実施例３：ヒト化抗ＥｐｈＡ４モノクローナル抗体の海馬ニューロンにおけるＥｐｈＡ４切断促進活性
実施例１で得た抗体Ｂについて、海馬ニューロンを用いたＥｐｈＡ４切断促進活性の評価は、以下の工程に従って行った。
９６ウェルディッシュ（Ｆａｌｃｏｎ）に播種したラット海馬ニューロンに、抗体Ｂ（２．０、６．７、２０ｎＭ）およびγセクレターゼ阻害薬であるＣｏｍｐｏｕｎｄＥ（５０ｎＭ、ＥｎｚｏＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ）を処置して２４時間後にＰＢＳ（和光純薬）で洗浄して、ＳＤＳｓａｍｐｌｅｂｕｆｆｅｒ（Ｌａｅｍｍｌｉサンプルバッファー（バイオ・ラッド）、５％２－メルカプトエタノール（バイオ・ラッド））を加えて細胞を回収し、５分間煮沸した。このサンプルを用いてＳＤＳ－ＰＡＧＥを行い、抗ＥｐｈＡ４モノクローナル抗体（Ａｂｎｏｖａ）を用いたウェスタンブロッティングを行い、バンド強度を定量化し、ＥｐｈＡ４Ｃ末端フラグメント／全長ＥｐｈＡ４の値を算出した。

抗体Ｂは、海馬ニューロンにおいて、濃度依存的にＥｐｈＡ４切断反応を促進した（図１３）

実施例４：ヒト化抗ＥｐｈＡ４モノクローナル抗体のヒトＥｐｈＡ４－ヒトリガンド結合阻害活性
実施例１で得た抗体Ｂについて、ヒトＥｐｈＡ４とヒトリガンドとの結合阻害活性の評価は、以下の工程に従って行った。抗アルカリフォスファターゼ抗体（ＴｈｅｒｍｏＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）を、９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ）のウェル上にコートした。４℃にて一晩インキュベートした後、１％ブロックエース（ＤＳファーマバイオメディカル）により、ウェルを室温にて１時間ブロッキングした。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳ（ＴｈｅｒｍｏＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）で３回洗浄した後、ウェルにヒトＥｐｈＡ４細胞外領域－ＳＥＡＰ－Ｈｉｓタンパク質（最終濃度１０ｎＭ）を播種し、室温にて１時間インキュベートした。３回洗浄した後、ウェルにリガンドと系列希釈した抗体Ｂ（０、０．００３、０．０１、０．０３、０．１、０．３、１、３、１０、３０、１００、３００、１０００、３０００ｎＭ）を添加した。なお、リガンドにはビオチン化ヒトＥｐｈｒｉｎＡ５－Ｆｃキメラ（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ、最終濃度０．７ｎＭ）およびビオチン化ヒトＥｐｈｒｉｎＢ３－Ｆｃキメラ（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ、最終濃度２．３ｎＭ）を用いた。室温にて１時間インキュベートして３回洗浄した後、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）を加え、室温にて１時間インキュベートした。３回洗浄した後、ウェルにＴＭＢＺ（３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン、Ｓｉｇｍａ）溶液を加え、２～５分、室温にてインキュベートした。ウェルに等量の反応停止溶液（１ＮＨ_２ＳＯ_４、和光純薬）を加え、マイクロプレートリーダー（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓまたはＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）により４５０ｎｍの吸光度を読み取った。

抗体Ｂは、ヒトＥｐｈＡ４とヒトリガンドとの結合を濃度依存的に抑制し、ヒトＥｐｈｒｉｎＡ５、ＥｐｈｒｉｎＢ３結合に対するＩＣ_５０値はそれぞれ約４．９ｎＭ、１．６ｎＭであった。よって、抗体Ｂは、ヒトＥｐｈＡ４とヒトリガンドとの結合を強く阻害し、ヒト化を行う前の抗体Ａとほぼ同等の阻害活性を示すことが分かった（図１４）。

実施例５：ヒト化抗ＥｐｈＡ４モノクローナル抗体のマウスＥｐｈＡ４－マウスリガンド結合阻害活性
実施例１で得た抗体Ｂについて、マウスＥｐｈＡ４とマウスリガンドとの結合阻害活性の評価は、以下の工程に従って行った。抗アルカリフォスファターゼ抗体（ＴｈｅｒｍｏＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）を、９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ）のウェル上にコートした。４℃にて一晩インキュベートした後、１％ブロックエース（ＤＳファーマバイオメディカル）により、ウェルを室温にて１時間ブロッキングした。０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳ（ＴｈｅｒｍｏＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）で３回洗浄した後、ウェルにマウスＥｐｈＡ４細胞外領域－ＳＥＡＰ－Ｈｉｓタンパク質を加え（最終濃度１０ｎＭ）、室温にて１時間インキュベートした。３回洗浄した後、ウェルにリガンドと系列希釈した抗体Ｂ（０、０．００３、０．０１、０．０３、０．１、０．３、１、３、１０、３０、１００、３００、１０００、３０００ｎＭ）を添加した。なお、リガンドにはビオチン化マウスＥｐｈｒｉｎＡ１－Ｆｃキメラ（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ、最終濃度６ｎＭ）およびビオチン化マウスＥｐｈｒｉｎＢ２－Ｆｃキメラ（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ、最終濃度２．５ｎＭ）を用いた。室温にて１時間インキュベートして３回洗浄した後、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）を加え、室温にて１時間インキュベートした。３回洗浄した後、ウェルにＴＭＢＺ（３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン、Ｓｉｇｍａ）溶液を加え、２分、室温にてインキュベートした。ウェルに等量の反応停止溶液（１ＮＨ_２ＳＯ_４、和光純薬）を加え、マイクロプレートリーダー（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓまたはＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）により４５０ｎｍの吸光度を読み取った。

抗体Ｂは、マウスＥｐｈＡ４とマウスリガンドとの結合を濃度依存的に抑制し、マウスＥｐｈｒｉｎＡ１、ＥｐｈｒｉｎＢ２結合に対するＩＣ_５０値はそれぞれ約８．７ｎＭ、４．２ｎＭであった。よって、抗体Ｂは、マウスＥｐｈＡ４とマウスリガンドとの結合を強く阻害し、ヒト化を行う前の抗体Ａとほぼ同等の阻害活性を示すことが分かった（図１５）。

実施例６：ヒト化抗ＥｐｈＡ４モノクローナル抗体のヒトＥｐｈレセプターに対する選択性
参考例１に記載のマウスＥｐｈＡ４細胞外領域－ＳＥＡＰ－Ｈｉｓタンパク質の調製方法と同様に、ヒトの各Ｅｐｈレセプター（ＥｐｈＡ１、ＥｐｈＡ２、ＥｐｈＡ３、ＥｐｈＡ４、ＥｐｈＡ５、ＥｐｈＡ６、ＥｐｈＡ７、ＥｐｈＡ８、ＥｐｈＡ１０、ＥｐｈＢ１、ＥｐｈＢ２、ＥｐｈＢ３、ＥｐｈＢ４、ＥｐｈＢ６）のシグナル配列と細胞外領域をコードするＤＮＡ配列を組織由来のＴｏｔａｌＲＮＡを用いて、ＲＴ－ＰＣＲによって増幅し、ＳＥＡＰタンパク質およびヒスチジンタグをコードするＤＮＡ配列を有するｐＥＮＴＲ１Ａベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）にクローニングした。次に、ヒトの各Ｅｐｈレセプターのシグナル配列と細胞外領域、ＳＥＡＰタンパク質およびヒスチジンタグをコードするＤＮＡ配列をＧａｔｅｗａｙＳｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）のＬＲ反応により、ｐｃＤＮＡ３．１＿ｒｆｃＢベクターに移し、ヒトの各Ｅｐｈレセプターの細胞外領域に対してＳＥＡＰタンパク質とＨｉｓタグを融合したタンパク質（「Ｅｐｈレセプター細胞外領域―ＳＥＡＰ―Ｈｉｓタンパク質」という）を発現するベクター（「Ｅｐｈレセプター細胞外領域―ＳＥＡＰ―Ｈｉｓタンパク質発現ベクター」という）を構築した。

次に、Ｅｘｐｉ２９３発現システム（Ｇｉｂｃｏ／ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いて、ヒトの各Ｅｐｈレセプター細胞外領域―ＳＥＡＰ―Ｈｉｓタンパク質発現ベクターを、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞（Ｇｉｂｃｏ／ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）に導入した。５日間のインキュベーション（５％ＣＯ_２、３７℃）の後、培養上清を回収し、室温で１５００ｒｐｍ、５分間遠心した。遠心上清を０．４５μｍフィルター (Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ)でろ過した。

実施例１で得た抗体Ｂについて、ヒトＥｐｈレセプターの結合活性の評価は、以下の工程に従って行った。
ウサギ抗６―Ｈｉｓ抗体（ＢｅｔｈｙｌＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を、９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ）のウェル上にコートした。４℃にて一晩インキュベートした後、１％ブロックエース（ＤＳファーマバイオメディカル）により、ウェルを室温にて１時間ブロッキングした。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳ（ＴｈｅｒｍｏＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）で３回洗浄した後、各ウェルにヒトの各Ｅｐｈレセプター細胞外領域‐ＳＥＡＰ－Ｈｉｓタンパク質（最終濃度１ｎＭ）を播種し、室温にて１時間インキュベートした。３回洗浄した後、ウェルにヒトＩｇＧ溶液（１００μｇ／ｍＬ、三菱ウェルファーマ）および抗体Ｂ（１０μｇ／ｍＬ）を添加し、室温にて１時間インキュベートした。西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ロバ抗ヒトＩｇＧ抗体（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を加え、室温にて１時間インキュベートした。３回洗浄した後、ウェルにＴＭＢＺ（３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン、Ｓｉｇｍａ）溶液を加え、適度な発色を確認したらウェルに等量の反応停止溶液（１ＮＨ_２ＳＯ_４、和光純薬）を加え、マイクロプレートリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）により４５０ｎｍの吸光度を読み取った。

抗体Ｂは、ヒト化を行う前の抗体Ａ同様、ヒトＥｐｈレセプターファミリー間ではヒトＥｐｈＡ４に対して特異的に結合することが分かった（図１６）。

実施例７：ヒト化抗ＥｐｈＡ４モノクローナル抗体のマウスＥｐｈレセプターに対する選択性
参考例１に記載のＥｐｈＡ４細胞外領域－Ｆｃ－Ｈｉｓタンパク質の調製方法に従って、マウスの各Ｅｐｈレセプター（ＥｐｈＡ１、ＥｐｈＡ３、ＥｐｈＡ４、ＥｐｈＡ５、ＥｐｈＡ６、ＥｐｈＡ７、ＥｐｈＡ８、ＥｐｈＡ１０、ＥｐｈＢ１、ＥｐｈＢ２、ＥｐｈＢ３、ＥｐｈＢ４、ＥｐｈＢ６）のシグナル配列と細胞外領域をコードするＤＮＡ配列を組織由来のＴｏｔａｌＲＮＡを用いて、ＲＴ－ＰＣＲによって増幅し、ヒトＩｇＧ_１のＦｃ領域およびヒスチジンタグをコードするＤＮＡ配列を有するｐＥＮＴＲ１Ａベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）にクローニングした。次に、マウスの各Ｅｐｈレセプター（ＥｐｈＡ１、ＥｐｈＡ３、ＥｐｈＡ４、ＥｐｈＡ５、ＥｐｈＡ６、ＥｐｈＡ７、ＥｐｈＡ８、ＥｐｈＡ１０、ＥｐｈＢ１、ＥｐｈＢ２、ＥｐｈＢ３、ＥｐｈＢ４、ＥｐｈＢ６）のシグナル配列と細胞外領域、ＦｃおよびヒスチジンタグをコードするＤＮＡ配列をＧａｔｅｗａｙＳｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）のＬＲ反応により、ｐｃＤＮＡ３．１＿ｒｆｃＢベクターに移し、マウスの各Ｅｐｈレセプターの細胞外領域－Ｆｃ－Ｈｉｓタンパク質発現ベクターを構築した。マウスＥｐｈＡ２の細胞外領域－Ｆｃ－Ｈｉｓタンパク質発現ベクターの構築では、マウスＥｐｈＡ２のシグナル配列と細胞外領域をコードするＤＮＡ配列を組織由来のＴｏｔａｌＲＮＡを用いて、ＲＴ－ＰＣＲによって増幅し、ＦｃおよびヒスチジンタグをコードするＤＮＡ配列を有するｐｃＤＮＡ３．１ベクターにクローニングして、マウスＥｐｈＡ２細胞外領域－Ｆｃ－Ｈｉｓタンパク質発現ベクターを構築した。

次に、Ｅｘｐｉ２９３発現システム（Ｇｉｂｃｏ／ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いて、マウスの各Ｅｐｈレセプター細胞外領域―Ｆｃ―Ｈｉｓタンパク質発現ベクターを、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞（Ｇｉｂｃｏ／ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）に導入した。５日間の培養（５％ＣＯ２、３７℃、１２０ｒｐｍ）の後、培養上清を回収し、室温で１５００ｒｐｍ、５分間遠心した。遠心上清を０．４５μｍフィルター (Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ)でろ過した。

抗体Ｂについて、マウスＥｐｈレセプターの結合活性の評価は、以下の工程に従って行った。
ウサギ抗６―Ｈｉｓ抗体（ＢｅｔｈｙｌＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を、９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ）のウェル上にコートした。４℃にて一晩インキュベートした後、１％ブロックエース（ＤＳファーマバイオメディカル）により、ウェルを室温にて１時間ブロッキングした。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳ（ＴｈｅｒｍｏＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）で３回洗浄した後、各ウェルにマウスの各Ｅｐｈレセプター細胞外領域‐Ｆｃ－Ｈｉｓタンパク質（最終濃度１ｎＭ）を播種し、室温にて１時間インキュベートした。３回洗浄した後、ウェルにヒトＩｇＧ溶液（１００μｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ）および抗体Ｂ（１０μｇ／ｍＬ）を添加し、室温にて１時間インキュベートした。西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトＫａｐｐａＬｉｇｈｔＣｈａｉｎ抗体（ＩＢＬ）を加え、室温にて１時間インキュベートした。３回洗浄した後、ウェルにＴＭＢＺ（３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン、Ｓｉｇｍａ）溶液を加え、適度な発色を確認したらウェルに等量の反応停止溶液（１ＮＨ_２ＳＯ_４、和光純薬）を加え、マイクロプレートリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）により４５０ｎｍの吸光度を読み取った。

抗体Ｂは、マウスＥｐｈレセプターファミリー間ではマウスＥｐｈＡ４にのみ特異的に結合活性を有していた（図１７）。

実施例８：ヒト化抗ＥｐｈＡ４モノクローナル抗体のマウス、ラット、サルおよびヒトＥｐｈＡ４に対する反応性

抗体Ｂについて、各種ＥｐｈＡ４との結合活性の評価は、以下の工程に従って行った。
抗アルカリフォスファターゼ抗体（ＴｈｅｒｍｏＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）を、９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ）のウェル上にコートした。４℃にて一晩インキュベートした後、１％ブロックエース（ＤＳファーマバイオメディカル）により、ウェルを室温にて１時間ブロッキングした。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳ（ＴｈｅｒｍｏＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）で３回洗浄した後、ウェルにマウス、ラット、サルおよびヒトＥｐｈＡ４細胞外領域－ＳＥＡＰ－Ｈｉｓタンパク質（最終濃度１ｎＭ）を播種し、室温にて１時間インキュベートした。３回洗浄した後、ウェルにヒトＩｇＧ溶液（１００μｇ／ｍＬ、三菱ウェルファーマ）および抗体Ｂ（０、０．０００１３、０．０００６４、０．００３２、０．０１６、０．０８、０．４、２、１０μｇ／ｍＬ）を添加し、室温にて１時間インキュベートした。西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ロバ抗ヒトＩｇＧ抗体（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を加え、室温にて１時間インキュベートした。３回洗浄した後、ウェルにＴＭＢＺ（３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン、Ｓｉｇｍａ）溶液を加え、適度な発色を確認したらウェルに等量の反応停止溶液（１ＮＨ_２ＳＯ_４、和光純薬）を加え、マイクロプレートリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）により４５０ｎｍの吸光度を読み取った。

抗体Ｂは、マウス、ラット、サルおよびヒトＥｐｈＡ４いずれにおいても同等の結合活性を有していた（図１８）。

実施例９：ヒト化抗ＥｐｈＡ４モノクローナル抗体のヒトＥｐｈＡ４細胞外領域、リガンド結合ドメイン、フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン１、フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン２に対する反応性
実施例１で得た抗体Ｂについて、各種ヒトＥｐｈＡ４内ドメインとの結合活性の評価は、以下の工程に従って行った。
ウサギ抗６―Ｈｉｓ抗体（ＢｅｔｈｙｌＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を、９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ）のウェル上にコートした。４℃にて一晩インキュベートした後、１％ブロックエース（ＤＳファーマバイオメディカル）により、ウェルを室温にて１時間ブロッキングした。０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳ（ナカライテスク）で２回洗浄した後、ウェルにヒトＥｐｈＡ４細胞外領域－ＭＢＰ－Ｈｉｓタンパク質、ヒトＥｐｈＡ４リガンド結合ドメイン－ＭＢＰ－Ｈｉｓタンパク質、ヒトＥｐｈＡ４フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン１－ＭＢＰ－Ｈｉｓタンパク質、およびヒトＥｐｈＡ４フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン２－ＭＢＰ－Ｈｉｓタンパク質（最終濃度１０ｎＭ）を播種し、室温にて１時間インキュベートした。３回洗浄した後、ウェルに抗体Ｂ（最終濃度１０ｎＭ）を添加し、室温にて１時間インキュベートした。西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ウサギ抗ヒトＩｇＧＦｃγフラグメント抗体（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を加え、室温にて１時間インキュベートした。５回洗浄した後、ウェルにＴＭＢ（ＫＰＬ）溶液を加え、適度な発色を確認したらウェルに等量の反応停止溶液（２ＮＨ_２ＳＯ_４、和光純薬）を加え、マイクロプレートリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）により４５０ｎｍおよび６５０ｎｍの吸光度を読み取った。

抗体Ｂは、ヒトＥｐｈＡ４細胞外領域（ＥＣＤ）およびリガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）に結合活性を有していた（図１９）。フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン１（ＦＮ１）およびフィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン２（ＦＮ２）には反応しなかった。よって、抗体ＢはヒトＥｐｈＡ４細胞外領域のリガンド結合ドメインに特異的に結合することが分かった。

実施例１０：ヒト化抗ＥｐｈＡ４モノクローナル抗体の海馬ニューロンのスパイン数に対する増加効果
ラット海馬ニューロンの調製は、参考例１の（Ｂ）に記載されるように行った。ラット海馬ニューロンにＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ(Ｌｏｎｚａ)を用いてＥＧＦＰ遺伝子を導入し、ポリＬリジンをコートしたカバーガラス（松浪硝子工業）を入れた２４ウェルプレート（Ｆａｌｃｏｎ）に播種した。

海馬ニューロンを用いたスパインの計数は、以下の工程に従って行った。ポリＬリジンをコートしたカバーガラス（松浪硝子工業）を入れた２４ウェルプレート（Ｆａｌｃｏｎ）に播種した培養１３日目のＥＧＦＰ導入ラット海馬ニューロンに、コントロール抗体（ヒトIｇＧ_２；Ｓｉｇｍａ）あるいは抗体Ｂ（６．７、２０ｎＭ）を２４時間処置した。その後、カバーガラスを２％ＰＦＡ（和光純薬）／４％Ｓｕｃｒｏｓｅ（和光純薬）／ＰＢＳに移し、２０分間静置し、細胞を固定した。固定液を除き、細胞をＰＢＳで３回洗浄したのち、０．２５％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００（和光純薬）／ＰＢＳを加えて、１５分間、細胞透過処理を行った。液を除き、２％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）／０．２５％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００／ＯＰＴＩ－ＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ）にカバーガラスを移して、１時間ブロッキングを施したあと、抗ＧＦＰ抗体（ナカライテスク）を１時間３０分反応させた。１次抗体液を除き、ＰＢＳで３回洗浄したのち、２次抗体を１時間反応させた。２次抗体液を除き、ＰＢＳで３回洗浄したのち、ＰｒｏｌｏｎｇＧｏｌｄａｎｔｉｆａｄｅｒｅａｇｅｎｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｐｒｏｂｅｓ）を加えて封入し、ＬＳＭ８００（ＺＥＩＳＳ）で観察を行った。上述の実験を３回実施し、１回の実験につき、カバーガラス２枚からニューロンを抽出し、それぞれの樹状突起にあるスパインを画像解析ソフトＩｍａｒｉｓ（登録商標）（Ｂｉｔｐｌａｎｅ）を用いて計数し、各ニューロンにおける１０ μｍあたりのスパイン数を算出した。

抗体Ｂは、海馬ニューロンのスパイン数を増加させた（図２０）。本結果は、抗体Ｂが海馬ニューロンにおいてスパインを安定化させる活性を有することを示すものである。

実施例１１：ヒト化抗ＥｐｈＡ４モノクローナル抗体のヒトＥｐｈＡ４切断促進活性
実施例１で得た抗体Ｂについて、ヒトＥｐｈＡ４に対する切断促進活性の評価は、以下の工程に従って行った。
ラット海馬ニューロンの調製は、参考例１の（Ｂ）に記載されるように行った。ラット海馬ニューロンにＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ(Ｌｏｎｚａ)を用いてヒトＥｐｈＡ４－ＨＡタンパク質発現ベクターを導入し、ポリＬリジンをコートした９６ウェルディッシュ（Ｆａｌｃｏｎ）に播種した。播種したラット海馬ニューロンに、抗体Ｂ（６．７、２０、６７ｎＭ）およびγセクレターゼ阻害薬であるＣｏｍｐｏｕｎｄＥ（５０ｎＭ、ＥｎｚｏＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ）を処置して約２４時間後にＰＢＳ（和光純薬）で洗浄して、ＳＤＳｓａｍｐｌｅｂｕｆｆｅｒ（Ｌａｅｍｍｌｉサンプルバッファー（バイオ・ラッド）、５％２－メルカプトエタノール（バイオ・ラッド））を加えて細胞を回収し、５分間煮沸した。このサンプルを用いてＳＤＳ－ＰＡＧＥを行い、ラット抗ＨＡモノクローナル抗体（Ｒｏｃｈｅ）を用いたウェスタンブロッティングを行い、バンド強度を定量化し、ＥｐｈＡ４Ｃ末端フラグメント／全長ＥｐｈＡ４の値を算出した。

抗体Ｂは、海馬ニューロンにおいてヒトＥｐｈＡ４切断反応を促進した（図２１）。

実施例１２：ヒト化抗ＥｐｈＡ４モノクローナル抗体の海馬ニューロンのスパイン数増加効果に対するＭＭＰおよびＡＤＡＭの関与
ラット海馬ニューロンの調製は、参考例１の（Ｂ）に記載されるように行った。一部のラット海馬ニューロンにＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ(Ｌｏｎｚａ)を用いてＥＧＦＰ遺伝子を導入し、ポリＬリジンをコートしたカバーガラス（松浪硝子工業）を入れた２４ウェルプレート（Ｆａｌｃｏｎ）に播種した。

海馬ニューロンを用いたスパインの計数は、以下の工程に従って行った。ポリＬリジンをコートしたカバーガラス（松浪硝子工業）を入れた２４ウェルプレート（Ｆａｌｃｏｎ）に播種した培養１３日目のＥＧＦＰ導入ラット海馬ニューロンに、コントロール抗体（ヒトIｇＧ_２；Ｓｉｇｍａ）あるいは抗体Ｂ（２０ｎＭ）と、ＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ）あるいはＭＭＰおよびＡＤＡＭの阻害剤であるＧＭ６００１（２．５μＭ、ＭｅｄＣｈｅｍＥｘｐｒｅｓｓ）を２４時間処置した。その後、カバーガラスを２％ＰＦＡ（和光純薬）／４％Ｓｕｃｒｏｓｅ（和光純薬）／ＰＢＳに移し、２０分間静置し、細胞を固定した。固定液を除き、細胞をＰＢＳで３回洗浄したのち、０．２５％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００（和光純薬）／ＰＢＳを加えて、１５分間、細胞透過処理を行った。０．２５％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００／ＰＢＳを除き、２％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）／０．２５％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００／ＯＰＴＩ－ＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ）にカバーガラスを移して、１時間ブロッキングを施したあと、抗ＧＦＰ抗体（ナカライテスク）を１時間３０分反応させた。１次抗体液を除き、ＰＢＳで３回洗浄したのち、２次抗体を１時間反応させた。２次抗体液を除き、ＰＢＳで３回洗浄したのち、ＰｒｏｌｏｎｇＧｏｌｄａｎｔｉｆａｄｅｒｅａｇｅｎｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｐｒｏｂｅｓ）を加えて封入し、ＬＳＭ８００（ＺＥＩＳＳ）で観察を行った。上述の実験を３回実施し、１回の実験につき、カバーガラス２枚からニューロンを抽出し、それぞれの樹状突起にあるスパインを画像解析ソフトＩｍａｒｉｓ（登録商標）（Ｂｉｔｐｌａｎｅ）を用いて計数し、各ニューロンにおける１０ μｍあたりのスパイン数を算出した。

抗体Ｂによる海馬ニューロンのスパイン数増加は、ＧＭ６００１を同時処理することにより阻害された（図２２）。本結果は、抗体Ｂが海馬ニューロンにおいて、ＭＭＰおよびＡＤＡＭを介したスパイン安定化活性を有することを示すものである。

実施例１３：ヒト化抗ＥｐｈＡ４モノクローナル抗体のｉｎｖｉｖｏにおけるタウのリン酸化抑制効果
タウトランスジェニックマウス（ｒＴg４５１０）を用いたｉｎｖｉｖｏにおけるタウのリン酸化抑制効果の評価は、以下の工程に従って行った。タウトランスジェニックマウス（ｒＴg４５１０）に、抗体Ｂを１００ｍｇ／ｋｇの用量（１０ｍＬ／ｋｇ）で、２０週齢から２６週齢まで週２回皮下投与した。対照群にはＰＢＳ（和光純薬）を１０ｍＬ／ｋｇで皮下投与した。最終投与から３．５日後に、マウスを２～２．５％イソフルラン吸入麻酔薬（インターベット）および３種混合麻酔薬（４．０ｍｇ／ｋｇドルミカム（アステラス製薬）、０．３ｍｇ／ｋｇドミトール（日本全薬工業）、５．０ｍｇ／ｋｇベトルファール（ＭｅｉｊｉＳｅｉｋａファルマ））で麻酔し、麻酔下で３ユニット／ｍＬヘパリン（味の素）と１％ホスファターゼ阻害剤カクテル（ナカライテスク）含有のＰＢＳ（和光純薬）で灌流を行い、マウスの大脳半球を摘出した。採材した大脳半球を、２％パラホルムアルデヒド（ＴＡＡＢ）／０．１Ｍリン酸緩衝液（和光純薬）に浸漬し４℃で一晩振とうしながら固定した。大脳半球を１０％スクロース（和光純薬）／０．１Ｍリン酸緩衝液（和光純薬）、続いて２０％スクロース／０．１Ｍリン酸緩衝液（和光純薬）で置換したのち、ティッシュー・テックＯ．Ｃ．Ｔ．コンパウンド（サクラファインテックジャパン）／２０％スクロースに包埋して液体窒素にて冷却したアルミブロックを用いて凍結した。クライオスタットＣＭ１８６０（ライカ）を用いて７μｍ厚で大脳半球の切片を作製した。切片をシランコーティングスライドガラス（武藤化学）に貼付し、冷風で風乾させた後、密封した袋の中に入れ、－８０℃で保存した。免疫染色に使用するスライドガラスを－８０℃より取り出し冷風で風乾させた後、ＰＢＳ（和光純薬）で洗浄し、１％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）／１０％正常ロバ血清（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）／０．５％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００（和光純薬）／ＰＢＳ液に浸して、１時間ブロッキングを施したあと、抗リン酸化タウ抗体ＡＴ８（ＦｕｊｉｒｅｂｉｏＥｕｒｏｐｅＮ．Ｖ．）を一晩常温で反応させた。ＰＢＳで３回洗浄したのち、２次抗体を１時間反応させた。ＰＢＳで３回洗浄したのち、ＰｒｏｌｏｎｇＧｏｌｄａｎｔｉｆａｄｅｒｅａｇｅｎｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｐｒｏｂｅｓ）を切片に載せて封入し、ＬＳＭ７００（ＺＥＩＳＳ）で観察を行った。海馬ＣＡ１放射状層におけるＡＴ８シグナル陽性の面積を、画像解析ソフトＭｅｔａｍｏｒｐｈを用いて計測し、総面積に対するＡＴ８陽性シグナル面積の割合を算出した。

抗体Ｂは、海馬ＣＡ１領域のリン酸化タウのシグナルを減少させた（図２３）。本結果は、抗体Ｂがタウトランスジェニックマウス（ｒＴg４５１０）においてタウ病理の進行を抑制する活性を有することを示すものである。

Claims

抗ＥｐｈＡ４抗体であって、
前記抗ＥｐｈＡ４抗体は、重鎖および軽鎖を含み、
（ａ）配列番号４４に示すアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号２７に示すアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号２８に示すアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３；
（ｄ）配列番号２９に示すアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１；
（ｅ）配列番号３０に示すアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ２；および
（ｆ）配列番号３１に示すアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３
を含む、
抗ＥｐｈＡ４抗体。
請求項１に記載の抗ＥｐｈＡ４抗体であって、
前記抗ＥｐｈＡ４抗体は、ヒト化されている、
抗ＥｐｈＡ４抗体。
請求項１または２に記載の抗ＥｐｈＡ４抗体であって、
前記抗ＥｐｈＡ４抗体は、ＥｐｈＡ４に特異的に結合し、ＥｐｈＡ４の切断を促進する、
抗ＥｐｈＡ４抗体。
請求項１～３のいずれか１項に記載の抗ＥｐｈＡ４抗体であって、
前記抗ＥｐｈＡ４抗体は、ＥｐｈＡ４に特異的に結合し、ＥｐｈＡ４とｅｐｈｒｉｎとの結合を阻害する、
抗ＥｐｈＡ４抗体。
請求項１～４のいずれか１項に記載の抗ＥｐｈＡ４抗体であって、
前記重鎖の定常領域および前記軽鎖の定常領域がヒト抗体由来のアミノ酸配列を含む、
抗ＥｐｈＡ４抗体。
請求項５に記載の抗ＥｐｈＡ４抗体であって、
前記重鎖の定常領域はヒトＩｇＧの定常領域である、
抗ＥｐｈＡ４抗体。
請求項６に記載の抗ＥｐｈＡ４抗体であって、
前記ヒトＩｇＧの定常領域はヒトＩｇＧ_２の定常領域である、
抗ＥｐｈＡ４抗体。
請求項７に記載の抗ＥｐｈＡ４抗体であって、
前記ヒトＩｇＧ_２の定常領域は、配列番号４７に示すアミノ酸配列を含む、
抗ＥｐｈＡ４抗体。
請求項５～８のいずれか１項に記載の抗ＥｐｈＡ４抗体であって、
前記軽鎖の定常領域はヒトＩｇκの定常領域である、
抗ＥｐｈＡ４抗体。
請求項９に記載の抗ＥｐｈＡ４抗体であって、
前記ヒトＩｇκの定常領域は、配列番号４８に示すアミノ酸配列を含む、
抗ＥｐｈＡ４抗体。
請求項１～１０のいずれか１項に記載の抗ＥｐｈＡ４抗体をコードする単離された核酸。
請求項１１に記載の核酸を含むベクター。
請求項１２に記載のベクターを含む宿主細胞。
請求項１３に記載の宿主細胞を培養する工程を含む、抗ＥｐｈＡ４抗体の作製方法。
請求項１～１０のいずれか１項に記載の抗ＥｐｈＡ４抗体を含む、医薬組成物。
請求項１５に記載の医薬組成物であって、アルツハイマー病の治療のための医薬組成物。