JP2016147859A - Bace1抑制性抗体 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明の第1の態様は、BACE1の活性を抑制しうることにより特徴づけられる単離された抗BACE抗体に関する。
(i)非ヒト動物をBACE1で免疫化し、
(ii)BACE1の活性を抑制しうる抗体に関して複数のハイブリドーマ系をスクリーニングし、
(iii)該抗体を産生するハイブリドーマを単離することを含む、BACE1の活性を抑制しうる抗体の製造方法を含む。
定義
「抗原」なる語は、抗体のような免疫グロブリンが有するアフィニティーおよび特異性の対象である構造体、多くの場合はポリペプチドまたはタンパク質を意味する。「抗原決定基」、「抗原標的」および「エピトープ」なる語は全て、抗原上の、または抗体のような免疫グロブリンが有するアフィニティーおよび特異性の対象である抗原性構造体上の、特異的結合部位を意味する。
BACE1はアルツハイマー病(AD)治療のための確立された主要薬物標的となっているが、BACE1に対する有効なインヒビター薬の開発は依然としてかなりの難題である。多くの労力はBACE1インヒビターの論理的設計に集中している。しかし、有効なBACE1インヒビター薬の出現は遅々たるものである。ADに対する可能な療法としてのBACE1を標的とする代替的アプローチが現われることが必要とされている。
(i)非ヒト動物をBACE1で免疫化し、
(ii)BACE1の活性を抑制しうる抗体に関して複数のハイブリドーマ系をスクリーニングすることを含む、BACE1の活性を抑制しうる抗体の製造または作製または選択方法を含む。
(i)非ヒト動物をBACE1で免疫化し、
(ii)BACE1の活性を抑制しうる抗体に関して複数のハイブリドーマ系をスクリーニングし、
(iii)該抗体を産生するハイブリドーマを単離することを含む、BACE1の活性を抑制しうる抗体の製造または作製または選択方法を含む。
(i)該抗体または抗体フラグメントの組換え発現により、あるいは該抗体または抗体フラグメントの化学合成により、該抗体または抗体フラグメントの粗調製物を得、(ii)(i)において得られた粗調製物から該抗体または抗体フラグメントを精製する工程を含みうる。あるいは、
(i)該抗体の組換え発現により、あるいは該抗体の化学合成により、該フラグメントを含む抗体の粗調製物を得、
(ii)(i)において得られた粗調製物から該抗体を精製し、
(iii)(ii)において精製された抗体から活性フラグメントを単離する工程を含む方法により、本発明の抗BACE1抗体を抑制する活性フラグメントが入手または製造されうる。
本明細書の全体に記載されているモノクローナル抗体を分泌する以下のハイブリドーマ細胞系はブダペスト条約に従い寄託された。
免疫化およびハイブリドーマの製造
5匹の9週齢BACE1−/BACE2−/−マウスに4週間隔で4回の免疫化を行った。それぞれの免疫化はフロイントアジュバントとの1:1混合物中の精製ヒトBACE1エクトドメインタンパク質(アミノ酸45−460;HEK293細胞培養から産生)の1回の腹腔内注射を含むものであった。第1の免疫化はフロイント完全アジュバントとの1:1混合物中の50μgの免疫原を含むものであった。一方、全ての後続の免疫化はフロイント不完全アジュバントとの混合物中の40μgの免疫原を使用した。4回目の免疫化の2週間後、各免疫化マウスの血清中のBACE1特異的抗体をELISAにより力価測定した。最高力価(ELISAにおいて40,000回の希釈の後で検出可能)を示す2匹のマウスをハイブリドーマの作製のために選択した。
抗BACE1抗体を産生する陽性ハイブリドーマクローンのELISAスクリーニングを標準的なELISAプロトコールに従い行った。簡潔に説明すると、96ウェル塩化ポリビニルプレート(BD Falcon)を1μg/ml 精製BACE1エクトドメインタンパク質(PBS中)で50μl/ウェルで4℃で一晩コーティングした。PBS中の2% BSAで室温(RT)で1時間ブロッキングした後、50μlのハイブリドーマ上清を該プレートに加え、2時間温置した。ついで該プレートをPBS+0.05% Tween−20で洗浄し、ブロッキングバッファー中の1:5000希釈の抗マウスIgG−HRP(Innova Biosciences)と共に室温で1時間温置した。洗浄後、プレートを0.1M NaAc(pH 4.9)および0.03% H2O2中の50μlの0.2mg/ml テトラメチルベンジジン(sigma)で25分間現像した。50μlの2M H2SO4を加えることにより反応を停止させ、OD450nmでELISAリーダー上でプレートを読取った。
ハイブリドーマのmca−Fretアッセイスクリーニングを、Eli Lillyにより提供された標準的なプロトコールを幾らか変更したものにより行った。簡潔に説明すると、酵素BACE1Fcを反応バッファー(50mM 酢酸アンモニウム,pH 4.6,3% BSA,0.7% TritonX−100)中で1μg/mlの濃度で希釈し、小さなFRETペプチド基質MCA−SEVENLDAEFRK(Dnp)−RRRR−NH2を反応バッファー中で125μMの濃度で希釈した。96ウェル黒色ポリスチレンプレート(Costar)内で20μlのハイブリドーマ上清を30μlの酵素希釈液および50μlの基質希釈液と混合し、該プレートをベースラインシグナルに関してEnvision(355nm励起、430nm発光、1秒/ウェル)で直ちに読取り、ついで暗所で室温で一晩温置した。翌朝、同じ読取りプロトコールを用いて該プレートを読取った。
BACE1を安定に発現するHEK293細胞を、0.2mg/ml ポリ−L−リシンで予め処理された96ウェルプレート上で増殖させた。細胞をPBSで洗浄し、ついで4% パラホルムアルデヒドで固定し、0.1% Triton X−100中で透過性亢進させた。ブロッキングバッファー(PBS中の2%FCS,2% BSAおよび0.2% ゼラチン)中で希釈された5% ヤギ血清で該細胞を4℃で一晩ブロッキングした後、50μlのハイブリドーマ上清を各ウェルの細胞に加え、室温で2時間温置した。ついで細胞を洗浄し、ブロッキングバッファー中で1:1000希釈のAlexa Fluor 488ヤギ抗マウスIgG(Invitrogen)と共に室温で1時間にわたり更に温置した。洗浄後、IN Cell Analyser 1000(Ammersham/GE Healthcare)により96ウェルプレートを読取った。
APPを安定に発現するSH−SY5Y細胞を90%コンフルエントまで24ウェルプレート上で増殖させた。洗浄後、4.5g/L グルコース、0.11g/L ピルビン酸ナトリウムおよび15% FCSで補足された100μlの新鮮増殖培地DMEMと混合された100μlのハイブリドーマ上清で、37℃、5%CO2および70%相対湿度で細胞を処理した。新鮮培地と混合された陰性ハイブリドーマ細胞からの上清を陰性対照として使用した。24時間の処理の後、順化培地を集め、13,000rpm、4℃で5分間遠心分離し、抗体抗sAPPβポリクローナル抗体(Covance)および6E10(Signet)を使用するウエスタンブロットによりsAPPβおよびsAPPαに関して上清を分析した。
Mouse Monoclonal Antibody Isotypingキット(Roche)を該製造業者の説明に従い使用して、1A11、5G7、14F10および2G3のイソタイプを1gG1(1A11,5G7)、1gG2b(14F10)およびIgM(2G3)と決定した。ハイブリドーマクローン1A11、5G7および14F10を限界希釈により4回サブクローニングした。4mM グルタミン、4g/L D−グルコースおよび15% FCSで補足されたDMEM培地を使用してCellineCL−1000バイオリアクター(VWR)においてハイブリドーマクローンを37℃、5%CO2および70%相対湿度で培養することにより、抗体産生を行った。該抗体を、プロテインGセファロース4(Sigma)を使用するアフィニティークロマトグラフィーにより精製し、透析膜MWCO 6000−8000ダルトン(Spectrum)を使用してPBS中で透析した。それぞれの6〜7日間培養されたバイオリアクターからの抗体の収量は約4〜10mgであった。抗体のアリコートを液体窒素により急速凍結した後、−70℃で貯蔵した。
野生型マウス由来の混合皮質ニューロンの初代培養を作製するために、14日齢の胚の全脳をHBSS培地(Gibco)内で解剖し、トリプシン処理し、ポリ−L−リシン(Sigma−Aldrich)で予めコーティングされたディッシュ(Nunc)上でプレーティングした。グリア細胞増殖を防ぐためにB27補足物(Gibco BRL)および5μM シトシンアラビノシドを含有する神経基礎培地(Gibco)内で培養を維持した。3日間培養された初代ニューロンを、セムリキ森林ウイルス(SFV)を使用してヒトAPP(APP野生型またはAPP Swedish)で形質導入した。1時間のSFV形質導入の後、該培地を新鮮神経基礎培地と交換し、ついで2時間の形質導入後時間に付した。2時間の形質導入後時間の後、該神経基礎培地を、100μCi/ml[35S]メチオニン(ICN Biomedicals)で補足された無メチオニンMEM(Gibco BRL)と交換し、その一方でmAb(PBS中)を該培地に加えた。6時間の代謝標識の後、該順化培地を集め、該細胞を氷冷PBS中で洗浄し、完全プロテアーゼインヒビター(Roche)で補足されたIPバッファー(20mM Tris−HCl,pH 7.4,150mM NaCl,1% Triton X−100,1% デオキシコール酸ナトリウムおよび0.1% SDS)中で細胞溶解した。25μlのプロテインGセファロースおよびAPP C末端抗体B63.9を使用して、4℃で一晩にわたり細胞抽出物を免疫沈降させた。最後に免疫沈降物をNuPageサンプルバッファー(Invitrogen)中で溶出し、ランニングバッファー(Invitorogen)中のMESおよび還元条件下で10% アクリルアミドNuPAGE Bis−Trisゲル上で電気泳動した。Phosphor Imager(Molecular Dynamics)およびlmagQuaNT4.1を使用して結果を解析した。抗sAPPβポリクローナル抗体(Covance)およびWO−2(The Genetics Company)を使用する直接ウエスタンブロットにより、順化培地からのsAPPβおよびAβを分析した。
全てのBACE1欠失突然変異体を、ヒトBACE1をコードするcDNAからのPCR増幅により作製し、pGEX4Tベクター内にサブクローニングした。全ての突然変異体をDNA配列決定により確認した。
QuikChange II XL Site−Directed Mutagenesis Kit(Strategene)を提供されている手順に従い使用して、ループFのSQDD(配列番号11)からWAAA(配列番号12)(アミノ酸376−379)への、およびループDのQAGからAGA(アミノ酸332−334)への突然変異誘発を行った。構築物pGEX4T−BACE46−460およびpcDNA3−BACE1−501を鋳型として使用した。全ての突然変異体をDNA配列決定により確認した。
pGEX4T−BACE1欠失突然変異体で形質転換された大腸菌(Escherichia coli)BL21(Novagen)を対数増殖させ(100ml、A600=0,8)、0.2mM IPTG(Sigma)で3時間誘導した。ついで細胞をペレット化し、Complete Protease Inhibitor(Roche)で補足された15mlのBugBuster Master Mix(Novagen)に再懸濁させた。細菌を、回転させながら室温で15分間溶菌し、ついで20,000×g、4℃で30にわたりペレット化した。上清を300μlのグルタチオン−セファロースビーズ(Pharmacian)と4℃で1時間混合した。温置後、ビーズをPBSで洗浄し、50mM Tris−HClバッファー(pH 8.0)中の10mM L−グルタチオン(Sigma)でタンパク質を溶出した。
実施例1.ハイブリドーマのスクリーニングからの候補BACE1 mAbインヒビターの特定
抗BACE1モノクローナル抗体を作製するために、精製ヒトBACE1エクトドメインタンパク質(アミノ酸45−460)(配列番号13)でのBACE1−/−BACE2−/−マウスの一連の免疫化の後、ハイブリドーマを製造した。96ウェルプレート上での該細胞のプレーティングの2〜3週間後(このとき、該ウェルのほとんどは>80%コンフルエントとなっていた。)に、ハイブリドーマのスクリーニングを開始した。BACE1 FRETアッセイスクリーニングおよび細胞に基づくアッセイスクリーニングを含む機能性スクリーニングを初期ハイブリドーマスクリーニング段階において適用した(図1Aを参照されたい)。ハイブリドーマ上清を、まず、固定化BACEエクトドメイン(免疫原)上のELISAによりスクリーニングした。このアッセイにおいては、約2400個中377個のハイブリドーマが陽性と評価された(陽性ウェルのELISAシグナルはバックグラウンドの5から30倍であった。)。
3つの候補BACE1インヒビター1A11、5G7および14F10を、まず、大きな基質であるAPPsweのC末端の125アミノ酸配列を基質として使用するMBP−ELISAにより特徴づけした。このMBP−ELISAアッセイにおいては、全3個のmAbはBACE1活性を完全に抑制しうる(図1B)。5G7、14F10および1A11のIC50は、それぞれ、0.47nM、0.46nMまたは0.76nMである。本発明者らはまた、小さなFRETペプチドを基質として使用するmca−Fretアッセイにおいて、それらの3つのmAbを試験した(図2)。このアッセイにおいては、5G7および14F10は、それぞれ0.06nMおよび1.6nM(14F10)のIC50で、BACE1活性を完全に抑制しうる。意外なことに、該細胞アッセイから回収されたBACE1インヒビターである1A11はBACE1活性を刺激した。
3つの候補mAbインヒビター5G7、14F10および1A11を細胞アッセイにおいて試験した。野生型APPを安定に発現するSH−SY5Y細胞を6ウェルプレート内で90%のコンフルエンシーまで培養し、300nM mAbと共に24時間培養した。PBSを陰性対照として使用し(mAbをPBSに溶解させた。)、PBS中で1μMに希釈されたBACE1インヒビター化合物III(Merck Company)を陽性対照として使用した。24時間の処理の後、順化培地からのAβ、sAPPβおよびsAPPαをウエスタンブロットにより分析した。図3に示されているとおり、1A11 mAbはAβおよびsAPPβの生成を抑制したが、5G7および14F10処理は細胞BACE1活性に対する抑制効果を示さなかった。
mAb 5G7、14F10および1A11を初代ニューロン培養において更に試験した。3日間培養されたマウス初代ニューロンをセムリキ森林ウイルス(SFV)によりヒトAPPwtで形質導入し、300nM mAb(PBS中)で24時間処理した。PBSを陰性対照として使用し、1μM BACE1インヒビター化合物III(Merck Company)を陽性対照として使用した。24時間の処理の後、順化培地からのAβ、sAPPβおよびsAPPαを、細胞ライセートからの完全長APP、CTFβおよびCTFαと共に、ウエスタンブロットにより分析した。図4に示されているとおり、1A11処理はAβ、sAPPβおよびCTFβの生成を有意に減少させたが、α−セクレターゼ切断産物であるCTFαおよびsAPPαは増加した。残りの2つのmAbである5G7および14F10はAPPwtのBACE1切断に対する抑制効果を示さなかった。
5G7、14F10および1A11の3つのmAbからの抗原結合フラグメント(Fab)を、Fab調製キット(Pierce)を該製造業者の説明に従い使用して作製した。作製されたFabの純度をNuPAGEゲル上で青色染色により試験した。ニューロンアッセイにおいて該Fabを試験するために、3日間培養されたマウス初代ニューロンを、セムリキ森林ウイルス(SFV)を使用してヒトAPPwtで形質導入し、200nM Fab(PBS中)で処理した。24時間の処理の後、順化培地からのAβ、sAPPβおよびsAPPαを、細胞ライセートからの完全長APP、CTFβおよびCTFαと共に、ウエスタンブロットにより分析した。図6に示されているとおり、1A11 Fabは、Aβ、sAPPβおよびCTFβの生成を減少させているため、BACE1活性を抑制したが、5G7Fabおよび14F10FabはBACE1活性に対する抑制効果を示さなかった。
野生型マウスの脳内への立体空間的注射により、mAb 1A11の活性をインビボで試験した。簡潔に説明すると、3月齢の野生型マウスの脳内に立体空間座標(ブレグマ −2.46mm;外側 +/−2.6mm;腹側 −2.5mm)においてmAb 1A11を投与した。mAbサンプルを4μgの用量(合計体積1μl)で右脳内に注射し、対照として1μlのPBSを左脳内に注射した。注射の24時間後、マウスを犠死させて脳を解剖した。注射部位を含む脳薄片(〜1.5mmの厚さ)を海馬および皮質に関して更に解剖した。脳サンプルをCTFβに関してウエスタンブロットにより分析した。図7に示されているとおり、1A11の投与はCTFβの生成を減少させた。このことは、該mAbが野生型マウス脳においてBACE1活性を抑制しうることを示唆している。
興味深いことに、5G7および14F10の2つの候補BACE1インヒビターは、無細胞アッセイにおいては強力な活性を示すが、細胞アッセイにおいてはBACE1に対する抑制効果を示さないことが示された。本発明者らは、5G7が、細胞表面に露出したBACE1には結合しないことを見出した。免疫蛍光染色(図8)により示されているとおり、5G7は天然条件下では細胞表面BACE1に結合しなかった。5G7は、BACE1を安定に発現するHEK293細胞の順化培地からの遊離BACE1を免疫沈降させるが、膜結合完全長BACE1を免疫沈降させず、一方、1A11はBACE1の両方の形態を免疫沈降させることを、免疫沈降実験は示した。これらの結果は、5G7結合のためのエピトープが膜結合BACE1上では利用可能でないことを示唆している。これはBACEの複雑な構造に起因すると考えられ、例えば、結合部位を含むタンパク質の結合、または膜により引き起こされる立体障害によるものであると考えられうるであろう。これを更に例証するために、5G7がBACE1エクトドメインの表面上の別のコンホメーションエピトープに結合することが、エピトープマッピングにより示された(K299、E303およびQ386を含むこのエピトープ内の幾つかの残基に対する抗体反応性が突然変異誘発により確認された。)。このエピトープは、他のタンパク質と結合することが可能であるため、細胞表面においては「接近不可能」であると推定される。
Claims (15)
- BACE1の活性を抑制しうることにより特徴づけられる単離された抗BACE1抗体。
- BACE1のエクトドメインに対する、請求項1に記載の抗体。
- アクセッション番号LMBP 6871CBまたはLMBP 6872CBまたはLMBP 6873CBを有するハイブリドーマ細胞系により分泌されることにより更に特徴づけられる、請求項1または2に記載の抗体。
- ヒトモノクローナル抗体またはヒト化モノクローナル抗体であることにより更に特徴づけられる、請求項1から3のいずれかに記載の抗体。
- BACE1の活性を抑制しうることにより特徴づけられる、請求項1から4のいずれかに記載の抗体の活性フラグメント。
- アクセッション番号LMBP 6871CBまたはLMBP 6872CBまたはLMBP 6873CBを有するハイブリドーマ細胞系。
- 医薬として使用するための、請求項1から4のいずれかに記載の抗体または請求項5に記載の活性フラグメント。
- アミロイドベータペプチドおよび/またはアミロイドベータ前駆体タンパク質の生成の予防および/または軽減において使用するための、請求項1から4のいずれかに記載の抗体または請求項5に記載の活性フラグメント。
- アルツハイマー病の予防および/または治療において使用するための、請求項1から4のいずれかに記載の抗体または請求項5に記載の活性フラグメント。
- 請求項1から4のいずれかに記載の抗体または請求項5に記載の活性フラグメントと少なくとも1つの医薬上許容される担体、アジュバントまたは希釈剤とを含む医薬組成物。
- アルツハイマー病を予防および/または治療するための医薬の製造のための、請求項1から4のいずれかに記載の抗体または請求項5に記載の活性フラグメントまたは請求項10記載の医薬組成物の使用。
- (i)非ヒト動物をBACE1で免疫化し、
(ii)BACE1の活性を抑制しうる抗体に関して複数のハイブリドーマ系をスクリーニングすることを含む、BACE1の活性を抑制しうる抗体の製造方法。 - 該抗体を産生するハイブリドーマ系を単離する工程を更に含む、請求項12に記載の製造方法。
- 工程(i)において、BACE1のエクトドメインを使用して該免疫化を行う、請求項12または13に記載の製造方法。
- 該スクリーニングが、細胞に基づくスクリーニングアッセイおよび/または無細胞スクリーニングアッセイにおいてBACE1の抑制活性を測定することによる機能性スクリーニングである、請求項12から14のいずれかに記載の製造方法。
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