ES2778100T3 - Anticuerpos monoclonales anti-gpc-1 y usos de los mismos - Google Patents

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Abstract

Una población de anticuerpos monoclonales aislada que comprende: primeros anticuerpos y/o fragmentos de unión al antígeno de los mismos, en la que los primeros anticuerpos y/o fragmentos de unión al antígeno de los mismos comprenden: (a) una región variable de la cadena pesada que comprende: una región determinante de complementariedad 1 (CDR1) que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos definida por las posiciones 50-54 de la SEQ ID NO: 3; una región determinante de complementariedad 2 (CDR2) que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos definida por las posiciones 69-85 de la SEQ ID NO: 3; una región determinante de complementariedad 3 (CDR3) que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos definida por las posiciones 118-126 de la SEQ ID NO: 3; y (b) una región variable de la cadena ligera que comprende: una región determinante de complementariedad 1 (CDR1) que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos definida por las posiciones 44-54 de la SEQ ID NO: 4; una región determinante de complementariedad 2 (CDR2) que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos definida por las posiciones 70-76 de la SEQ ID NO: 4; una región determinante de complementariedad 3 (CDR3) que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos definida por las posiciones 109-117 de la SEQ ID NO: 4; y en la que la población de anticuerpos no contiene segundos anticuerpos que comprenden una región variable de la cadena ligera que comprende: una región determinante de complementariedad 1 (CDR1) que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos definida por las posiciones 48-58 de la SEQ ID NO: 6; una región determinante de complementariedad 2 (CDR2) que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos definida por las posiciones 74-80 de la SEQ ID NO: 6; una región determinante de complementariedad 3 (CDR3) que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos definida por las posiciones 113-121 de la SEQ ID NO: 6.

Description

DESCRIPCIÓN
Anticuerpos monoclonales anti-gpc-1 y usos de los mismos
Campo técnico
La presente invención en general se refiere al campo de la inmunología y la medicina. Más específicamente, la presente invención se refiere a anticuerpos monoclonales y usos de los mismos.
Antecedentes
El cáncer es una de las principales causas de muerte en todo el mundo, donde el cáncer de pulmón, mama, colorrectal, estómago y próstata provocan la mayoría de las muertes. El cáncer de próstata es el tumor más frecuente en los hombres y es el segundo en mortalidad solo después del cáncer de pulmón. El tratamiento con cirugía y/o radioterapia es exitoso en muchos pacientes si el cáncer de próstata se diagnostica temprano. Sin embargo, muchos pacientes con enfermedad avanzada y una proporción considerable de todos los pacientes con cáncer de próstata eventualmente desarrollan enfermedad metastásica después de la terapia localizada.
Los anticuerpos (Ab) son un instrumento principal en el campo de la terapia dirigida y el diagnóstico debido a su especificidad/afinidad de unión y potencial para las propiedades efectoras tras la interacción con sus antígenos afines. Se ha aprobado un número creciente de Ab para uso médico y muchos están bajo evaluación clínica. Los anticuerpos pueden ser medios de diagnóstico eficaces para identificar individuos con una predisposición a enfermedades tal como el cáncer de próstata y/o para diagnosticar tales enfermedades. Además, se ha demostrado que el uso terapéutico de algunos anticuerpos reduce el tamaño del tumor y extiende la supervivencia de los pacientes afectados.
La patente de Estados Unidos núm. 5,622,836 de Walker y otros divulga un anticuerpo llamado BLCA-38 (BLCA -"cáncer de vejiga"). El documento enseña que BLCA-38 es un anticuerpo monoclonal específico para un antígeno desconocido expresado por las células de carcinoma de vejiga. También se ha demostrado que BLCA-38 muestra especificidad para las líneas celulares de cáncer de ovario y colon de ser humano, así como algunas líneas celulares de melanoma, pero no para líneas linfoides (linfoides T o linfoides B) y leucémicas.
Posteriormente, Russell y otros. (2004) (Russell y otros, "Cytotoxic properties of immunoconjugates containing melittinlike peptide 101 against prostate cancer: in vitro & in vivo studies". Cancer Immunol Immunother 2004: 53(5): 411-421) publicaron un estudio en el que BLCA-38 se usó para dirigir un péptido citotóxico a las células de cáncer de próstata. Los autores indican que BLCA-38 es un anticuerpo monoclonal murino producido contra la línea celular humana de cáncer de vejiga UCRU-BL-17CL.
Una publicación adicional de Russell y otros en 2004 (Russell y otros, "Immunohistochemical characterization of the monoclonal antibody, BLCA38, forthe detection of prostate cancer". Cancer Immunol Immunother 2004: 53: 995-1004) también enseñan que BLCA-38 es un anticuerpo monoclonal murino producido contra una línea celular humana de vejiga que es capaz de unirse a células de carcinoma de vejiga, células de cáncer de próstata y células epidermoides vulvares, pero no a células de cáncer de mama. El artículo indica que BLCA-38 es específico para un antígeno de aproximadamente 30 kDa de tamaño que es difícil de caracterizar o identificar.
Carter y otros. (2004) (Carter y otros, "Biodistributions of intact monoclonal antibodies and fragments of BLCA38, a new prostate cancer directed antibody". Cancer Immunol Immunother 2004: 53:533-542) analizaron el momento y la dosificación para dirigir agentes terapéuticos a células de cáncer de próstata con el uso de BLCA-38, también indicando que es un anticuerpo monoclonal murino que se dirige a un antígeno de alrededor de 30 kDa expresado en la superficie celular y en el citoplasma. Los autores afirman que la naturaleza del antígeno es elusiva e indican que se expresa en las células de cáncer de vejiga y próstata.
Un artículo de Khatri y otros publicado en 2010 (Khatri y otros, "Promise of BLCA38 as a Targeting Antibody for Tissue-Specific Gene Delivery to Prostate Cancer". Austral-Asian J. Cancer 2010: 9(3): 195-203) reiteró que BlCa -38 es un anticuerpo monoclonal murino específico para células de cáncer de próstata. Los autores revelan que aunque BLCA-38 no se internaliza cuando se une a su antígeno, la conjugación con un virus facilita la internalización del anticuerpo, lo que da como resultado una mayor expresión del gen reportero.
El documento WO 2016/168885 se refiere al hallazgo de que el anticuerpo BLCA-38 es una combinación de dos anticuerpos monoclonales distintos en una población mixta. Se ha determinado que solo una de estas especies de anticuerpos es capaz de unirse fuertemente al antígeno diana relevante presente en las células de cáncer de próstata, mientras que la segunda especie no puede.
A pesar de que los anticuerpos son prometedores como agentes de diagnósticos y terapéuticos, sigue existiendo la necesidad de agentes más eficaces para diagnosticar y/o tratar diversas formas de cáncer, incluido el cáncer de próstata.
Sumario de la invención
Los presentes inventores han identificado sorprendentemente que el anticuerpo BLCA-38 al que se hace referencia y usado en la técnica anterior mencionada anteriormente no es un anticuerpo monoclonal discreto como se indica, sino más bien una combinación de dos anticuerpos monoclonales distintos en una población mixta. Los presentes inventores han determinado que el hibridoma usado para generar el anticuerpo BLCA-38, una muestra representativa del cual fue depositado en la Colección Americana de Cultivos Tipos de Tejidos con el número de acceso HB11785, es una población mixta de células de hibridoma, que produce al menos dos especies de anticuerpos discretos. Solo una de estas especies de anticuerpos es capaz de unirse al antígeno diana relevante presente en algunas formas de células cancerosas, mientras que la segunda especie no puede.
La determinación inesperada de que BLCA-38, como se hace referencia en la técnica anterior, representa una población mixta de hibridomas/anticuerpos, ha facilitado la generación de un hibridoma monoclonal capaz de producir una única población de anticuerpos monoclonales con especificidad de unión por el antígeno diana en diversas formas de células cancerosas. Además de evitar la producción y aplicación innecesarias de un anticuerpo ineficaz, los datos proporcionados en los Ejemplos de la presente descripción indican que el uso del hibridoma monoclonal/anticuerpo monoclonal único de acuerdo con la presente invención puede permitir la generación de una señal más fuerte en comparación con la población mixta de la técnica anterior cuando se aplican cantidades equivalentes de anticuerpo. La invención se dirige, por ejemplo, a una población de anticuerpos monoclonales aislados que comprende: primeros anticuerpos y/o fragmentos de unión al antígeno de los mismos, en la que los primeros anticuerpos y/o fragmentos de unión al antígeno de los mismos comprenden:
(a) una región variable de la cadena pesada que comprende:
una región determinante de complementariedad 1 (CDR1) que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos definida por las posiciones 50-54 de la SEQ ID NO: 3;
una región determinante de complementariedad 2 (CDR2) que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos definida por las posiciones 69-85 de la SEQ ID NO: 3;
una región determinante de complementariedad 3 (CDR3) que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos definida por las posiciones 118-126 de la SEQ ID NO: 3; y
(b) una región variable de la cadena ligera que comprende:
una región determinante de complementariedad 1 (CDR1) que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos definida por las posiciones 44-54 de la SEQ ID NO: 4;
una región determinante de complementariedad 2 (CDR2) que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos definida por las posiciones 70-76 de la SEQ ID NO: 4;
una región determinante de complementariedad 3 (CDR3) que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos definida por las posiciones 109-117 de la SEQ ID NO: 4;
y en la que la población de anticuerpos no contiene segundos anticuerpos que comprenden una región variable de la cadena ligera que comprende:
una región determinante de complementariedad 1 (CDR1) que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos definida por las posiciones 48-58 de la SEQ ID NO: 6;
una región determinante de complementariedad 2 (CDR2) que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos definida por las posiciones 74-80 de la SEQ ID NO: 6;
una región determinante de complementariedad 3 (CDR3) que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos definida por las posiciones 113-121 de la SEQ ID NO: 6.
En una primera realización se divulga un anticuerpo monoclonal aislado o fragmento de unión al antígeno del mismo que comprende una región variable de la cadena pesada y una región variable de la cadena ligera, en el que: (a) la región variable de la cadena pesada comprende: una región determinante de complementariedad 1 (CDR1) que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos definida por las posiciones 50-54 de la SEQ ID NO: 3; una región determinante de complementariedad 2 (CDR2) que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos definida por las posiciones 69-85 de la SEQ ID NO: 3; una región determinante de complementariedad 3 (CDR3) que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos definida por las posiciones 118-126 de la SEQ ID NO: 3; y (b) la región variable de la cadena ligera comprende: una región determinante de complementariedad 1 (CDR1) que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos definida por las posiciones 44-54 de la SEQ ID NO: 4; una región determinante de complementariedad 2 (CDR2) que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos definida por las posiciones 70-76 de la SEQ ID NO: 4; una región determinante de complementariedad 3 (CDR3) que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos definida por las posiciones 109-117 de la SEQ ID NO: 4.
El anticuerpo monoclonal aislado o fragmento de unión al antígeno del mismo puede comprender además: (a) una o más regiones variables de la cadena pesada FR (regiones marco) como se definen por una secuencia seleccionada de cualquiera o más de: residuos 20-49 de la SEQ ID NO: 3, los residuos 55-68 de la SeQ ID NO: 3, los residuos 86-117 de la SEQ ID NO: 3, y/o los residuos 127-137 de la SEQ ID NO: 3; y/o (b) una o más regiones variables de la cadena ligera FR (regiones marco) como se definen por una secuencia seleccionada de cualquiera o más de: los residuos 21-43 de la SEQ ID NO: 4, los residuos 55-69 de la SEQ ID NO: 4, los residuos 77-108 de la SEQ ID NO: 4, y/o los residuos 118-127 de la SEQ ID NO: 4.
El anticuerpo monoclonal aislado o fragmento de unión al antígeno del mismo puede comprender además cualquiera o más de: (a) una secuencia de dominio constante de la cadena pesada tal como se define por las posiciones 138-461 de la SEQ ID NO: 3; (b) una secuencia de dominio constante de la cadena ligera tal como se define por las posiciones 128­ 234 de la SEQ ID nO: 4; (c) una región de bisagra.
El anticuerpo monoclonal aislado o el fragmento de unión al antígeno del mismo puede tener especificidad de unión por un epítopo presente en el proteoglicano sulfato de heparán glipicano-1 (GPC-1).
El anticuerpo monoclonal puede ser un anticuerpo de isotipo IgG. El anticuerpo monoclonal puede ser un anticuerpo de isotipo IgG1. El anticuerpo monoclonal o el fragmento de unión al antígeno puede comprender un marcador detectable. El marcador detectable puede ser uno o más de un marcador fluorescente, un radiomarcador, biotina o avidina.
El anticuerpo monoclonal puede ser cualquiera o más de un anticuerpo humanizado, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo multimérico y/o un anticuerpo sintético.
El anticuerpo puede ser un anticuerpo biespecífico, un avicuerpo, un diacuerpo, una tricuerpo un tetracuerpo, un nanocuerpo, un anticuerpo de dominio único, un dominio VHH, un anticuerpo humano, un anticuerpo completamente humanizado, un anticuerpo parcialmente humanizado, anticalina, adnectina o un afficuerpo.
El anticuerpo puede ser un anticuerpo quimérico que comprende una región variable de cadena pesada y una región variable de la cadena ligera, en el que: (a) la región variable de la cadena pesada comprende: una región determinante de complementariedad 1 (CDR1) que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos definida por las posiciones 50-54 de la SEQ ID NO: 9; una región determinante de complementariedad 2 (CDR2) que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos definida por las posiciones 69-85 de la SEQ ID NO: 9; una región determinante de complementariedad 3 (CDR3) que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos definida por las posiciones 118-126 de la SEQ ID NO: 9; y (b) la región variable de la cadena ligera comprende: una región determinante de complementariedad 1 (CDR1) que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos definida por las posiciones 44-54 de la SEQ ID NO: 10; una región determinante de complementariedad 2 (CDR2) que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos definida por las posiciones 70-76 de la SEQ ID NO: 10; una región determinante de complementariedad 3 (CDR3) que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos definida por las posiciones 109-117 de la SEQ ID NO: 10.
El anticuerpo puede ser un anticuerpo quimérico que comprende una región variable de cadena pesada y una región variable de la cadena ligera, en el que: (a) la región variable de la cadena pesada comprende: una región determinante de complementariedad 1 (CDR1) que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 % o al menos 95 % de homología de secuencia con una secuencia de aminoácidos definida por las posiciones 50-54 de la SEQ ID NO: 9; una región determinante de complementariedad 2 (CDR2) que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 % o al menos 95 % de homología de secuencia con una secuencia de aminoácidos definida por las posiciones 69-85 de la SEQ ID NO: 9; una región determinante de complementariedad 3 (CDR3) que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 % o al menos 95 % de homología de secuencia con una secuencia de aminoácidos definida por las posiciones 118-126 de la SEQ ID NO: 9; y (b) la región variable de la cadena ligera comprende: una región determinante de complementariedad 1 (CDR1) que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 % o al menos 95 % de homología de secuencia con una secuencia de aminoácidos definida por las posiciones 44-54 de la SEQ ID NO: 10; una región determinante de complementariedad 2 (CDR2) que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 % o al menos 95 % de homología de secuencia con una secuencia de aminoácidos definida por las posiciones 70-76 de la SEQ ID NO: 10; una región determinante de complementariedad 3 (CDR3) que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 % o al menos 95 % de homología de secuencia con una secuencia de aminoácidos definida por las posiciones 109-117 de la SEQ ID NO: 10.
El anticuerpo puede ser un anticuerpo quimérico que comprende: (a) una cadena pesada que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos como se define en los residuos 20-467 de la SEQ ID NO: 9; y (b) una cadena ligera que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos como se define en los residuos 21-234 de la SEQ ID NO: 10.
El anticuerpo puede ser un anticuerpo quimérico que comprende: (a) una cadena pesada que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 % o al menos 95 % de homología de secuencia con una secuencia de aminoácidos como se define en los residuos 20-467 de la SEQ ID NO: 9; y (b) una cadena ligera que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 % o al menos 95 % de homología de secuencia con una secuencia de aminoácidos como se define en los residuos 21-234 de la SEQ ID NO: 10.
El anticuerpo quimérico puede comprender un marcador detectable. El marcador detectable puede ser uno o más de un marcador fluorescente, un radiomarcador, biotina o avidina.
El fragmento de unión al antígeno puede ser uno o más de un fragmento variable de cadena sencilla (scFv), un fragmento de dominio variable (Fv), un fragmento de unión al antígeno (Fab), un fragmento F(ab)2, un péptido o un fragmento proteolítico que contiene una región de unión al epítopo.
El anticuerpo puede comprender o consistir en una secuencia de cadena pesada tal como se define por las posiciones 20-461 de la SEQ ID NO: 3 y una secuencia de cadena ligera como se define por las posiciones 21-234 de la SEQ ID NO: 4.
En una segunda realización se divulga una variante o derivado de unión al antígeno aislado de un anticuerpo monoclonal como se define en la primera realización, en la que la variante o derivado y el anticuerpo como se define en la primera realización son capaces de unirse específicamente al mismo antígeno.
Cualquiera o más secuencia de aminoácidos de CDR1, CDR2 y/o CDR3 de la cadena pesada de la variante o derivado, y/o cualquiera o más secuencias de aminoácidos CDR1, CDR2 y/o CDR3 de la cadena ligera de la variante o derivado, pueden comprender una, dos, tres, cuatro o cinco deleciones, inserciones, y/o sustituciones de aminoácidos en comparación con una secuencia de aminoácidos del CDR correspondiente presente en un anticuerpo como se define en la primera realización.
La variante o derivado aislado puede comprender una región variable de cadena pesada y una región variable de la cadena ligera, en donde: (a) la región variable de la cadena pesada comprende: una región determinante de complementariedad 1 (CDR1) que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 % o al menos 95 % de homología de secuencia con una secuencia de aminoácidos definida por las posiciones 50-54 de la SEQ ID NO: 3; una región determinante de complementariedad 2 (CDR2) que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 % o al menos 95 % de homología de secuencia con una secuencia de aminoácidos definida por las posiciones 69-85 de la SEQ ID NO: 3; una región determinante de complementariedad 3 (CDR3) que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 % o al menos 95 % de homología de secuencia con una secuencia de aminoácidos definida por las posiciones 118-126 de la SEQ ID NO: 3; y (b) la región variable de la cadena ligera comprende: una región determinante de complementariedad 1 (CDR1) que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 % o al menos 95 % de homología de secuencia con una secuencia de aminoácidos definida por las posiciones 44-54 de la SEQ ID NO: 4; una región determinante de complementariedad 2 (CDR2) que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 % o al menos 95 % de homología con una secuencia de aminoácidos definida por las posiciones 70-76 de la SEQ ID NO: 4; una región determinante de complementariedad 3 (CDR3) que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 % o al menos 95 % de homología de secuencia con una secuencia de aminoácidos definida por las posiciones 109-117 de la SEQ ID NO: 4.
La variante o derivado puede comprender: (a) al menos una región variable de cadena pesada FR (región marco) seleccionada de una región variable de cadena pesada FR que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos: que tiene al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, o al menos 95 % de homología de secuencia con los residuos 20-49 de la SEQ ID NO: 3, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 % o al menos 95 % de homología de secuencia con los residuos 55-68 de la SEQ ID NO: 3, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 % o al menos 95 % de homología de secuencia con los residuos 86-117 de la SEQ ID NO: 3, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 % o al menos 95 % de homología de secuencia con los residuos 127-137 de la SEQ ID NO: 3; y/o (b) al menos una región variable de la cadena ligera FR (región marco) seleccionada de una región variable de la cadena ligera FR que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos: que tiene al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, o al menos 95 % de homología de secuencia con los residuos 21-43 de la SEQ ID NO: 4, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 % o al menos 95 % de homología de secuencia con los residuos 55-69 de la SEQ ID NO: 4, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 % o al menos 95 % de homología de secuencia con los residuos 77-108 de la SEQ ID NO: 4, y/o al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, o al menos 95 % de homología de secuencia con los residuos 118-127 de la SEQ ID NO: 4.
La variante o derivado puede comprender uno o más de: (a) una secuencia de dominio constante de la cadena pesada que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 % o al menos 95 % de homología con una secuencia de aminoácidos como se define por las posiciones 138-461 de la SEQ ID NO: 3; (b) una secuencia de dominio constante de la cadena ligera que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 % o al menos un 95 % de homología con una secuencia de aminoácidos definida por las posiciones 128-234 de la SEQ ID NO: 4; (c) una región de bisagra.
La variante o derivado puede tener especificidad de unión por un epítopo presente en el proteoglicano heparán sulfato glipicano-1 (GPC-1).
La variante o derivado puede ser un anticuerpo de isotipo IgG. La variante o derivado de anticuerpo aislado puede ser un anticuerpo de isotipo IgG1.
La variante o derivado puede comprender un marcador detectable.
El marcador detectable puede ser uno o más de un marcador fluorescente, un radiomarcador, biotina o avidina.
La variante o derivado del anticuerpo monoclonal puede ser cualquiera o más de un anticuerpo humanizado, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo multimérico y/o un anticuerpo sintético.
En una tercera realización se divulgan células de hibridoma capaces de producir un anticuerpo monoclonal o un fragmento de unión al antígeno del mismo como se define en la primera realización, o una variante o derivado de unión al antígeno del anticuerpo monoclonal como se define en la segunda realización.
Las células de hibridoma pueden ser las depositadas en Cellbank Australia el 22 de Agosto de 2014 y número de acceso asignado CBA20140026.
En una cuarta realización se divulga un cultivo celular que comprende una sola especie de células de hibridoma capaces de producir una única especie monoclonal de anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo como se define en la primera realización, o una especie única de una variante de unión al antígeno o derivado de la monoclonal anticuerpo como se define en la segunda realización.
Las células de hibridoma pueden depositarse en Cellbank Australia con el número de acceso CBA20140026.
En una quinta realización se divulga un cultivo celular que comprende múltiples especies de células de hibridoma, en el que: (a) el cultivo celular comprende células de hibridoma como se define en la tercera realización; y (b) el cultivo celular no comprende células de hibridoma que producen un anticuerpo que comprende:
una región variable de la cadena ligera que comprende uno o más de:
una región determinante de complementariedad 1 (CDR1) que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos definida por las posiciones 48-58 de la SEQ ID NO: 6;
una región determinante de complementariedad 2 (CDR2) que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos definida por las posiciones 74-80 de la SEQ ID NO: 6;
una región determinante de complementariedad 3 (CDR3) que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos definida por las posiciones 113-121 de la SEQ ID NO: 6.
El cultivo celular puede no comprender células de hibridoma que producen un anticuerpo que comprende una o más regiones variables de la cadena ligera FR (regiones marco) como se define por una secuencia seleccionada de uno o más de: los residuos 25-47 de la SEQ ID NO: 6, los residuos 59-73 de la SeQ ID NO: 6, los residuos 81-112 de la SEQ ID NO: 6, los residuos 122-131 de la SEQ ID NO: 6.
Las múltiples especies de células de hibridoma en el cultivo celular pueden ser capaces de producir una sola especie de anticuerpo monoclonal o fragmento de unión al antígeno del mismo como se define en la primera realización, o una sola especie de una variante o derivado de unión al antígeno como se define en la segunda realización.
En una sexta realización se divulga una composición que comprende una sola especie de anticuerpo monoclonal o fragmento de unión al antígeno del mismo como se define en la primera realización, o una especie única de una variante o derivado de unión al antígeno como se define en la segunda realización.
En una séptima realización se divulga una composición que comprende una mezcla de diferentes especies de anticuerpos monoclonales o fragmentos de unión al antígeno de los mismos, en el que: (a) la composición comprende una especie única de anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo como se define en la primera realización, o una especie única de una variante o derivado de unión al antígeno como se define en la segunda realización; y (b) la composición no comprende un anticuerpo que comprende una región variable de la cadena ligera que comprende uno o más de:
una región determinante de complementariedad 1 (CDR1) que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos definida por las posiciones 48-58 de la SEQ ID NO: 6;
una región determinante de complementariedad 2 (CDR2) que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos definida por las posiciones 74-80 de la SEQ ID NO: 6;
una región determinante de complementariedad 3 (CDR3) que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos definida por las posiciones 113-121 de la SEQ ID NO: 6.
La mezcla de diferentes especies de anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno de los mismos puede tener especificidad de unión por un epítopo presente en el proteoglicano heparán sulfato glipicano-1 (GPC-1).
En una octava realización se divulga una molécula de ácido nucleico que codifica un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo como se define en la primera realización, o una variante o derivado de unión al antígeno como se define en la segunda realización.
La molécula de ácido nucleico puede comprender o consistir en una secuencia como se define en la SEQ ID NO: 1. La molécula de ácido nucleico puede comprender o consistir en una secuencia como se define en la SEQ ID NO: 2. El anticuerpo monoclonal o el fragmento de unión al antígeno del mismo, o la variante o derivado de unión al antígeno, pueden tener especificidad de unión por un epítopo presente en el proteoglicano sulfato de heparán glipicano-1 (GPC-1).
En una novena realización se divulga un vector que comprende una molécula de ácido nucleico como se define en la octava realización.
En una décima realización se divulga una célula huésped que comprende un vector como se define en la novena realización.
En una undécima realización se divulga un procedimiento de producción de un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo como se define en la primera realización, o una variante o derivado de unión al antígeno como se define en la segunda realización, en el que el procedimiento comprende cultivar células de hibridoma como se define en la tercera realización, o una célula huésped como se define en la décima realización, en un medio de cultivo en condiciones adecuadas para producir de ese modo el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo, o la variante o derivado de unión al antígeno.
El procedimiento puede comprender además aislar el anticuerpo monoclonal o el fragmento de unión al antígeno del mismo, o la variante o derivado de unión al antígeno, del cultivo.
El anticuerpo monoclonal o el fragmento de unión al antígeno del mismo, o la variante o derivado de unión al antígeno, pueden tener especificidad de unión por un epítopo presente en el proteoglicano sulfato de heparán glipicano-1 (GPC-1).
En una duodécima realización se divulga un procedimiento de producción de un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo como se define en la primera realización, o una variante o derivado de unión al antígeno como se define en la segunda realización, en el que el procedimiento comprende cultivar un cultivo celular como se define en la cuarta o quinta realización en condiciones adecuadas para producir de ese modo el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo, o la variante o derivado de unión al antígeno.
El procedimiento puede comprender además aislar el anticuerpo monoclonal o el fragmento de unión al antígeno del mismo, o la variante o derivado de unión al antígeno, del cultivo.
El anticuerpo o el fragmento de unión al antígeno del mismo, o la variante o derivado de unión al antígeno, pueden tener especificidad de unión por un epítopo presente en el proteoglicano sulfato de heparán glipicano-1 (GPC-1).
En una decimotercera realización se divulga un anticuerpo monoclonal o un fragmento de unión al antígeno del mismo, o una variante o derivado de unión al antígeno, obtenido u obtenible de un procedimiento como se define en la undécima o duodécima realización.
El anticuerpo monoclonal o el fragmento de unión al antígeno del mismo, o la variante o derivado de unión al antígeno, puede comprender un marcador detectable.
El marcador detectable puede ser uno o más de un marcador fluorescente, un radiomarcador, biotina o avidina.
En una decimocuarta realización se divulga un procedimiento para la obtención de células de hibridoma como se define en la tercera realización a partir de una población mixta de hibridomas, el procedimiento que comprende aislar al menos una porción de las células de hibridoma de la población mixta de hibridomas.
El aislamiento puede comprender la clonación de células de hibridoma individuales de la población mixta de hibridomas, y determinar que la descendencia clonal es capaz de producir un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo como se define en la primera realización, o una variante o derivado de unión al antígeno como se define en la segunda realización.
La población mixta de hibridomas puede depositarse en la Colección Americana de Cultivos Tipo de Tejidos (ATCC) con el número de acceso HB11785.
En una decimoquinta realización se divulga un kit que comprende cualquiera o más de un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo, variante o derivado de unión al antígeno, anticuerpo quimérico o células de hibridoma de acuerdo con la presente invención.
Las células de hibridoma pueden depositarse en Cellbank Australia con el número de acceso CBA20140026.
El kit puede ser un kit fragmentado o un kit combinado. El kit puede comprender además uno o más componentes adicionales seleccionados de reactivos para cultivo celular, muestras de referencia, tampones, marcadores e instrucciones escritas para realizar un ensayo con el uso de los componentes del kit.
En una decimosexta realización se divulga una composición que comprende cualquiera o más anticuerpos monoclonales o fragmentos de unión al antígeno de los mismos, variante o derivado de unión al antígeno, anticuerpo quimérico o células de hibridoma de acuerdo con la presente invención.
La composición puede ser una composición farmacéutica. La composición farmacéutica puede comprender además un diluyente, un excipiente y/o un vehículo farmacéuticamente aceptable.
En una decimoséptima realización se divulga un procedimiento para detectar y/o cuantificar la expresión de GPC-1 en un sujeto, el procedimiento que comprende (a) obtener células, una muestra de tejido y/o una muestra de fluido corporal del sujeto; (b) poner en contacto las células, la muestra de tejido y/o la muestra de fluido corporal con un anticuerpo, variante de anticuerpo, fragmento de anticuerpo, variante de anticuerpo, derivado de anticuerpo o anticuerpo quimérico, de acuerdo con la presente invención, y (c) determinar y/o cuantificar la unión de dicho anticuerpo, variante de anticuerpo, fragmento de anticuerpo, derivado de anticuerpo o anticuerpo quimérico a las células, muestra de tejido o muestra de fluido corporal del sujeto.
El nivel de expresión de GPC-1 detectado en las muestras de células, tejidos y/o fluidos corporales obtenidos del sujeto puede compararse con una muestra de control de células o una población de muestras de referencia de los niveles de expresión de GPC-1. En algunas realizaciones, una determinación del aumento de la expresión de GPC-1 en el sujeto en comparación con el control o la referencia puede ser el diagnóstico de una enfermedad, o, una mayor probabilidad de desarrollar una enfermedad, en el sujeto. La enfermedad puede ser cáncer de próstata.
El GPC-1 para detección puede estar presente en la superficie de las células y/o expresarse internamente. El fluido corporal puede ser orina, sangre o componentes de la misma (por ejemplo, suero o plasma). Las células o la muestra de tejido pueden ser células prostáticas o tejido prostático.
El anticuerpo, la variante de anticuerpo, el fragmento de anticuerpo, el derivado de anticuerpo o el anticuerpo quimérico pueden ser producidos por células de hibridoma de acuerdo con la presente invención. Las células de hibridoma pueden depositarse en Cellbank Australia con el número de acceso CBA20140026.
En una decimoctava realización se divulga una solución que comprende una única especie de anticuerpo monoclonal, variante de anticuerpo, fragmento de anticuerpo, derivado de anticuerpo o anticuerpo quimérico, capaz de unirse específicamente a GPC-1 que puede aplicarse a las células, muestra de tejido o fluido corporal muestra que potencialmente puede contener GPC-1. La especie individual puede ser producida por células de hibridoma depositadas en Cellbank Australia con el número de acceso CBA20140026.
En una decimonovena realización se divulga una solución que comprende múltiples especies de anticuerpo, variante de anticuerpo, fragmento de anticuerpo, derivado de anticuerpo o anticuerpo quimérico que puede aplicarse a las células, muestra de tejido o muestra de fluido corporal que potencialmente puede contener GPC-1, en el que al menos una especie de la especie múltiple en la solución es capaz de unirse específicamente a GPC-1. La especie capaz de unirse específicamente a GPC-1 puede ser producida por células de hibridoma depositadas en Cellbank Australia con el número de acceso CBA20140026. La solución que comprende múltiples especies puede no comprender un anticuerpo que comprende una región variable de la cadena ligera que comprende uno o más de:
una región determinante de complementariedad 1 (CDR1) que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos definida por las posiciones 48-58 de la SEQ ID NO: 6;
una región determinante de complementariedad 2 (CDR2) que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos definida por las posiciones 74-80 de la SEQ ID NO: 6;
una región determinante de complementariedad 3 (CDR3) que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos definida por las posiciones 113-121 de la SEQ ID NO: 6.
Las siguientes realizaciones también se divulgan:
Realización 1: Una población aislada de anticuerpos monoclonales que comprende:
primeros anticuerpos y/o fragmentos de unión al antígeno de los mismos, en la que los primeros anticuerpos y/o fragmentos de unión al antígeno de los mismos comprenden:
(a) un región variable de la cadena pesada que comprende:
una región determinante de complementariedad 1 (CDR1) que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos definida por las posiciones 50-54 de la SEQ iD NO: 3;
una región determinante de complementariedad 2 (CDR2) que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos definida por las posiciones 69-85 de la SEQ iD NO: 3;
una región determinante de complementariedad 3 (CDR3) que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos definida por las posiciones 118-126 de la SEQ ID NO: 3; y
(b) una región variable de la cadena ligera que comprende:
una región determinante de complementariedad 1 (CDR1) que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos definida por las posiciones 44-54 de la SEQ ID NO: 4;
una región determinante de complementariedad 2 (CDR2) que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos definida por las posiciones 70-76 de la SEQ ID NO: 4;
una región determinante de complementariedad 3 (CDR3) que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos definida por las posiciones 109-117 de la SEQ ID NO: 4;
y en la que la población de anticuerpos no contiene segundos anticuerpos, que comprenden una región variable de la cadena ligera que comprenden:
una región determinante de complementariedad 1 (CDR1) que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos definida por las posiciones 48-58 de la SEQ ID NO: 6;
una región determinante de complementariedad 2 (CDR2) que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos definida por las posiciones 74-80 de la SEQ ID NO: 6;
una región determinante de complementariedad 3 (CDR3) que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos definida por las posiciones 113-121 de la SEQ ID NO: 6.
Realización 2: La población de anticuerpos de acuerdo con la realización 1, en la que la población de anticuerpos no contiene fragmentos de unión al antígeno de dichos segundos anticuerpos.
Realización 3: La población de anticuerpos de acuerdo con la realización 1 o la realización 2, en la que los primeros anticuerpos y/o fragmentos de unión al antígeno de los mismos tienen especificidad de unión por un epítopo presente en el proteoglicano sulfato de heparán glipicano-1 (GPC-1).
Realización 4: La población de anticuerpos de acuerdo con cualquiera de las realizaciones 1 a 3, en la que los primeros anticuerpos y/o fragmentos de unión al antígeno de los mismos son de isotipo IgG1.
Realización 5: La población de anticuerpos de acuerdo con cualquiera de las realizaciones 1 a 4, en la que los primeros anticuerpos y/o fragmentos de unión al antígeno de los mismos son uno o más de anticuerpos humanizados, anticuerpos quiméricos, anticuerpos multiméricos y/o anticuerpos sintéticos.
Realización 6: La población de anticuerpos de acuerdo con cualquiera de las realizaciones 1 a 5, en la que los fragmentos de unión al antígeno son uno o más fragmentos variables de cadena sencilla (scFv), fragmentos de dominio variable (Fv), fragmentos de unión al antígeno (Fab), fragmentos F(ab)2, péptidos o fragmentos proteolíticos que contienen una región de unión al epítopo.
Realización 7: La población de anticuerpos de acuerdo con cualquiera de las realizaciones 1 a 6, en la que los primeros anticuerpos y/o fragmentos de unión al antígeno de los mismos comprenden además:
(a) una o más regiones variables de la cadena pesada FR (regiones marco) como se define por una secuencia seleccionada de uno cualquiera o más de: los residuos 20-49 de la SEQ ID NO: 3, los residuos 55-68 de la SEQ ID NO: 3, los residuos 86-117 de la SEQ ID NO: 3, los residuos 127-137 de la SEQ ID NO: 3; y/o
(b) una o más regiones variables de la cadena ligera FR (regiones marco) como se define por una secuencia seleccionada de uno o más de: los residuos 21-43 de la SEQ ID NO: 4, los residuos 55-69 de la SEQ ID NO: 4, los residuos 77-108 de la SEQ ID NO: 4, los residuos 118-127 de la SEQ ID NO: 4.
Realización 8: La población de anticuerpos de acuerdo con cualquiera de las realizaciones 1 a 7, en la que los primeros anticuerpos y/o fragmentos de unión al antígeno de los mismos comprenden además cualquiera o más de: (a) una secuencia de dominio constante de la cadena pesada tal como se define por las posiciones 138-461 de la SEQ ID NO: 3;
(b) una secuencia de dominio constante de la cadena ligera tal como se define por las posiciones 128-234 de la SEQ ID NO: 4;
(c) una región de bisagra.
Realización 9: La población de anticuerpos de acuerdo con una cualquiera de las realizaciones 1 a 8 en la que los primeros anticuerpos comprenden o consisten de una secuencia de cadena pesada como se define por las posiciones 20-461 de la SEQ ID NO: 3 y una secuencia de cadena ligera como se define por las posiciones 21-234 de la SEQ ID NO: 4.
Realización 10: Células de hibridoma capaces de producir la población de anticuerpos de acuerdo con cualquiera de las realizaciones 1 a 9.
Realización 11: Un cultivo celular que comprende una única especie de células de hibridoma capaces de producir una población de anticuerpos de acuerdo con una cualquiera de las realizaciones 1 a 9, en el que la población de anticuerpos contiene solo una especie de anticuerpo y/o fragmentos de unión al antígeno del mismo.
Realización 12: Las células de hibridoma de acuerdo con la realización 9, o el cultivo celular de acuerdo con la realización 10, en el que las células de hibridoma se depositan en Cellbank Australia con el número de acceso CBA20140026.
Realización 13: Un cultivo celular que comprende múltiples especies de células de hibridoma, en el que:
(a) el cultivo celular comprende las células de hibridoma de acuerdo con la realización 10 o la realización 12; y
(b) el cultivo celular no comprende células de hibridoma que producen un anticuerpo que comprende:
una región variable de la cadena ligera que comprende uno o más de:
una región determinante de complementariedad 1 (CDR1) que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos definida por las posiciones 48-58 de la SEQ ID NO: 6;
una región determinante de complementariedad 2 (CDR2) que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos definida por las posiciones 74-80 de la SEQ ID NO: 6;
una región determinante de complementariedad 3 (CDR3) que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos definida por las posiciones 113-121 de la SEQ ID NO: 6.
Realización 14: El cultivo celular de acuerdo con la realización 13, en el que el cultivo celular no comprende células de hibridoma que producen un anticuerpo que comprende una o más regiones variables de la cadena ligera FR (regiones marco) como se define por una secuencia seleccionada de uno o más de: los residuos 25-47 de la SEQ ID NO: 6, los residuos 59-73 de la SEQ ID NO: 6, los residuos 81-112 de la SEQ ID NO: 6, los residuos 122-131 de la SEQ ID NO: 6.
Realización 15: Una composición que comprende una población de anticuerpos de acuerdo con una cualquiera de las realizaciones 1 a 9, en la que la población de anticuerpos contiene solo una especie de anticuerpo y/o fragmentos de unión al antígeno del mismo.
Realización 16: Una composición que comprende una población de anticuerpos de acuerdo con cualquiera de las realizaciones 1 a 9, en la que la población de anticuerpos contiene múltiples especies de anticuerpos y/o fragmentos de unión al antígeno de los mismos.
Realización 17: La composición de acuerdo con la realización 16, en la que las múltiples especies de anticuerpos y/o fragmentos de unión al antígeno de los mismos tienen especificidad de unión por un epítopo presente en el proteoglicano sulfato de heparán glipicano-1 (GPC-1).
Realización 18: Una molécula de ácido nucleico que codifica al menos uno de los primeros anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno de los mismos de acuerdo con una cualquiera de las realizaciones 1 a 9.
Realización 19: La molécula de ácido nucleico de acuerdo con la realización 18, en la que la molécula de ácido nucleico comprende o consiste en una secuencia como se define en la SEQ ID NO: 1.
Realización 20: La molécula de ácido nucleico de acuerdo con la realización 18 o la realización 19, en la que la molécula de ácido nucleico comprende o consiste en una secuencia como se define en la SEQ ID NO: 2.
Realización 21: Un vector que comprende la molécula de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las realizaciones 18 a 20.
Realización 22: Una célula huésped que comprende el vector de acuerdo con la realización 21.
Realización 23: Un procedimiento de producción de anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno de los mismos, en el que el procedimiento comprende cultivar las células de hibridoma de acuerdo con la realización 10 o la realización 12, o la célula huésped de acuerdo con la realización 22, en un medio de cultivo en condiciones adecuadas para producir de ese modo el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo.
Realización 24: Un procedimiento de producción de anticuerpos monoclonales o fragmentos de unión al antígeno de los mismos, en el que el procedimiento comprende cultivar el cultivo celular de cualquiera de las realizaciones 11 a 14 en condiciones adecuadas para producir de ese modo los anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno de los mismos.
Realización 25: El procedimiento de acuerdo con la realización 23 o la realización 24, que comprende además aislar los anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno de los mismos del cultivo.
Realización 26: Los anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno de los mismos obtenidos o que pueden obtenerse a partir del procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las realizaciones 23 a 25.
Realización 27: Un procedimiento para obtener células de hibridoma de acuerdo con la realización 10 o la realización 12 de una población mixta de hibridomas, el procedimiento que comprende aislar al menos una porción de las células de hibridoma de la población mixta de hibridomas.
Realización 28: El procedimiento de acuerdo con la realización 27, en el que el aislamiento comprende clonar células de hibridoma individuales de la población mixta de hibridomas, y determinar que la descendencia clonal es capaz de producir la población de anticuerpos de acuerdo con cualquiera de las realizaciones 1 a 9.
Realización 29: El procedimiento de acuerdo con la realización 27 o la realización 28, en el que la población mixta de hibridomas se deposita en la Colección Americana de Cultivo Tipo de Tejido (ATCC) con el número de acceso HB11785.
Realización 30: La población de anticuerpos de acuerdo con la realización 5, en la que los primeros anticuerpos y/o fragmentos de unión al antígeno de los mismos son quiméricos.
Realización 31: La población de anticuerpos de acuerdo con la realización 5 o la realización 30, en la que los primeros anticuerpos y/o fragmentos de unión al antígeno de los mismos son anticuerpos quiméricos que comprenden:
(a) una región constante de la cadena pesada que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos como se define en los residuos 138-467 de la SEQ ID NO: 9; y
(b) una región constante de la cadena ligera que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos como se define en los residuos de 128-234 de la SEQ ID NO: 10.
Realización 32: La población de anticuerpos de acuerdo con una cualquiera de las realizaciones 1 a 9, en la que los primeros anticuerpos y/o fragmentos de los mismos comprenden un marcador detectable.
Realización 33: La población de anticuerpos de acuerdo con las realizaciones 32, en la que el marcador detectable es uno o más de un marcador fluorescente, un radiomarcador, biotina o avidina.
Breve descripción de los dibujos
Las realizaciones preferentes de la presente invención se describirán ahora, a modo de ejemplo solamente, con referencia a las figuras adjuntas en las que:
La Figura 1 muestra los resultados de análisis de transferencia Western con el uso de anticuerpos MIL-38 de diversas fuentes en extractos de líneas celulares DU-145, C3 y CA-HPV-10. Las puntas de flecha indican la reactividad equivalente de las diferentes preparaciones de anticuerpos con el antígeno MIL-38. Las flechas indican las bandas dobles para la cadena pesada y las cadenas ligeras en cada una de las tres preparaciones. Abreviaturas: 37A = preparación de anticuerpos MIL-38 internos; "original" (1-O) = preparación de anticuerpos MIL-38 a partir de células de hibridoma de ATCC (HB11785); 40A = preparación de anticuerpos MIL-38 a partir de células de hibridoma internas; Sypro = tinción en gel de proteínas Sypro® Ruby. Carriles: 1 (marcador de mW); 2 (DU145 MPEK 16/7/12); 3 (C3 MPEK 20/4/12); 4 (CA-HPV-10 MPEK 28/3/12); 5 (-); 6 (marcador de MW); 7 (DU145 MPEK 16/7/12); 8 (C3 MPEK 20/4/12); 9 (CA-HPV-10 MPEK 28/3/12); 10 (marcador de MW); 11 (DU145 MPEK 16/7/12); 12 (C3 MPEK 20/4/12); 13 (CA-HPV-10 MPEK 28/3/12); 14 (-); 15 (preparación 1 de MIL-38 "original"); 16 (preparación 40A de MIL-38); 17 (preparación 37A de MIL-38); 18 (marcador de MW);
La Figura 2 muestra una comparación de las preparaciones de anticuerpos MIL-38 procedentes de reservas de hibridoma internas (clon 1 de células de hibridoma AusMAb) o células re-clonadas de la reserva de hibridoma HB11785 original de ATCC (líneas de hibridoma AusMAb 3, 4 y 5) con la preparación 33A de anticuerpos MIL-38 internos. La Figura 2A muestra la segregación de los componentes de la cadena pesada y ligera en cada preparación de anticuerpos por electroforesis SDS-PAGE; Carriles: 1 (Magic Marker); 2 (AusMab 1); 3 (AusMab 3); 4 (AusMab 4); 5 (AusMab 5); 6 (preparación 33A de MIL-38); 7 (véase Blue Plus2); la Figura 2B muestra los resultados del análisis de transferencia Western con el uso de anticuerpos MIL-38 de diversas preparaciones en extractos de las líneas celulares DU-145 y C3;
La Figura 3 muestra una comparación de varias preparaciones de anticuerpos MIL-38 generadas y almacenadas internamente (16A, 16B, 16C, 17B, 23A-1, 23A-2, 24A, 25A, 25B, 26B, 30A, 31A, 31B, 31C, 31D, 32B, 32C, 33A, 33B, 33C, 33D, 34A, 34B, 35A, 35C, 35D, 40A, 40B, AM-3, AM-4). La Figura 3A muestra la segregación de componentes de la cadena pesada y ligera en cada preparación de anticuerpos MIL-38 por electroforesis SDS-PAGE. La Figura 3B muestra los resultados del análisis de transferencia Western con el uso de anticuerpos MIL-38 de cada preparación en extractos de células DU-145;
La Figura 4 muestra los resultados de análisis de población de anticuerpos MIL-38. La Figura 4A muestra los resultados de los análisis de transferencia Western con el uso de preparaciones de anticuerpos MIL-38 IIA original, Alfio I, Alfio II, 36A y AusMAb 4 (AM-4) en extractos de células DU-145 y C3. La Figura 4B muestra un Syprogel reductor que demuestra la segregación de los componentes de la cadena pesada y ligera de las preparaciones de anticuerpos MIL-38 (IIA original, Alfio I, Alfio II, 36A y AusMAb 4 (AM-4)) por electroforesis SDS-PAGE. IIA original = preparación interna derivada de las reservas del número de acceso de ATCC HB11785 (hibridoma murino BLCA-38); Alfio I = población mixta de anticuerpos MIL-38 derivada del número de acceso de ATCC HB11785; Alfio II = población de anticuerpos únicos derivada de la población mixta del número de acceso de ATCC HB11785.
La Figura 5 muestra las imágenes de ensayos de inmunofluorescencia con el uso de varias preparaciones de anticuerpos MIL-38. Específicamente, la Figura 5A muestra imágenes de ensayos de inmunofluorescencia con el uso de varias preparaciones de anticuerpos MIL-38 en células DU-145. Las Partes A, D, G, J y M muestran imágenes de campo brillante de las células teñidas; las Partes B (AM-4) E (Alfio I), H (Alfio II), y K (IIA original) muestran la unión de preparaciones de anticuerpos MIL-38 a células DU145; la Parte N muestra el control de anticuerpos secundarios para células DU-145; las Partes C, F, I, L y O muestran la tinción DAPI de las células. La La Figura 5B muestra imágenes de ensayos de inmunofluorescencia con el uso de varias preparaciones de lA anticuerpos MIL-38 en células C3. Las Partes A, D, G, J y M muestran imágenes de campo brillante de las células teñidas; las Partes B (AM-4) E (Alfio I), H (Alfio II), y K (original IIa) muestran la unión de preparaciones de anticuerpos MIL-38 a células C3; la Parte N muestra el control de anticuerpos secundarios para células C3; las Partes C, F, I, L y O muestran la tinción DAPI de las células;
La Figura 6 muestra los resultados de los ELISA tipo sándwich comparativos realizados con el uso de diferentes preparaciones de anticuerpos como anticuerpos de captura. La Figura 6A muestra los ELISA tipo sándwich comparativos con el uso de AM-3 y AM-4 como anticuerpos de captura. La Figura 6B muestra los ELISA tipo sándwich comparativos con el uso de una preparación mixta (34A) o una población clonal (AM-4 1F5) como anticuerpos de captura.
La Figura 7 muestra la SDS-PAGE (Figura 7A) y el análisis de transferencia Western (Figura 7B) de un anticuerpo MIL-38 quimérico. Carril M = marcador de proteínas; Carril 1 = condiciones reductoras; Carril 2 = condiciones no reductoras; Carril P = IgG1 humana, Kappa (Sigma, núm. de Catálogo 15154) como control positivo.
La Figura 8 muestra imágenes de ensayos de inmunofluorescencia con el uso de anticuerpos MIL-38 quiméricos y controles en células DU-145. La Figura 8A-D muestra imágenes combinadas de campo brillante y DAPI de las células teñidas. La Figura 8E-H muestra la tinción de células DU-145 con la preparación 33A de MIL-38 (8E, control positivo), MIL-38 quimérico (8F), Cetuximab (8G, control positivo para IgG1k humana) y control negativo (8H, anticuerpo no 1°);
La Figura 9 muestra el análisis de transferencia western del anticuerpo MIL-38 quimérico. La Figura 9A muestra la reactividad de MIL-38 murino con extracto de MPEK DU-145, extracto de MPEK C3 y antígeno GPC-1 recombinante producido por NSO. La Figura 9B muestra la reactividad de MIL-38 quimérico con extracto de MPEK DU-145, extracto de MPEK C3 y antígeno GPC-1 recombinante producido por NSO. La Figura 9C muestra la reactividad de MIL-38 murino con extracto de MPEK DU-145, extracto de MPEK C3 y antígeno GPC-1 recombinante producido por NSO en condiciones equivalentes a la Figura 9B.
Definiciones
Como se usa en la presente solicitud, la forma singular "un", "una" y "el/la" incluye las referencias al plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Por ejemplo, la frase "un anticuerpo" también incluye múltiples anticuerpos. Como se usa en la presente memoria, el término "que comprende" significa "que incluye". Las variaciones de la palabra "que comprende", como "comprenden" y "comprende", tienen significados correspondientemente variables. Así, por ejemplo, una muestra que "comprende" el anticuerpo A puede consistir exclusivamente en el anticuerpo A o puede incluir uno o más componentes adicionales (por ejemplo, el anticuerpo B).
Como se usa en la presente memoria, el término "múltiple" significa más de uno. En ciertos aspectos o realizaciones específicas, múltiple puede significar 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51 o más, y cualquier número entero derivable del mismo, y cualquier intervalo derivable del mismo.
Tal como se usa en la presente memoria, los términos "anticuerpo" y "anticuerpos" incluyen IgG (que incluye IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4), IgA (que incluye IgA1 e IgA2), IgD, IgE, IgM e IgY, anticuerpos completos, que incluyen anticuerpos completos de cadena sencilla, y fragmentos de unión al antígeno de los mismos. Los fragmentos de anticuerpos de unión al antígeno incluyen, pero no se limitan a, Fv, Fab, Fab' y F(ab')2, Fd, Fvs de cadena sencilla (scFv), anticuerpos de cadena sencilla, Fvs unidos por disulfuro (sdFv) y fragmentos que comprenden un dominio VL o VH. Los anticuerpos pueden ser de cualquier origen animal o huésped de producción apropiado. Los fragmentos de anticuerpos de unión al antígeno, incluidos los anticuerpos de cadena sencilla, pueden comprender la(s) región(ones) variable(s) sola(s) o en combinación con la totalidad o una porción de los siguientes: región de bisagra, dominios CH1, CH2 y CH3. También se incluye cualquier combinación de región(ones) variable(s) y de región de bisagra, dominios CHI, CH2 y CH3. Los anticuerpos pueden ser anticuerpos monoclonales, policlonales, quiméricos, multiespecíficos, humanizados, y monoclonales y policlonales humanos que se unen específicamente a la molécula biológica. El anticuerpo puede ser un anticuerpo biespecífico, un avicuerpo, un diacuerpo, un tricuerpo, un tetracuerpo, un nanocuerpo, un anticuerpo de dominio único, un dominio VHH, un anticuerpo humano, un anticuerpo completamente humanizado, un anticuerpo parcialmente humanizado, anticalina, adnectina o un afficuerpo.
Como se usa en la presente memoria, el término "anticuerpo monoclonal" se refiere a un anticuerpo que reconoce un único epítopo antigénico, y que se obtiene de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos que se unen específicamente al mismo epítopo antigénico, y son idénticos con la posible excepción de la ocurrencia de mutación(ciones) natural(es) que puede(n) estar presente(s) en cantidades menores.
Como se usa en la presente memoria, el término "anticuerpo humanizado" se refiere a formas de anticuerpos que contienen secuencias de anticuerpos humanos, así como anticuerpos no humanos (por ejemplo, anticuerpos murinos).
Por ejemplo, un anticuerpo humanizado puede comprender sustancialmente todo de al menos uno y típicamente dos dominios variables, en los que todos o sustancialmente todos los lazos hipervariables corresponden a los de una inmunoglobulina no humana y todos o sustancialmente todos los residuos de la región FR son los de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado opcionalmente también puede comprender al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fc), que puede ser típicamente la de una inmunoglobulina humana.
Como se usa en la presente memoria, el término "anticuerpo quimérico" se refiere a un anticuerpo que exhibe una actividad biológica deseada, y en el que una porción de la cadena ligera y/o cadena pesada es idéntica u homóloga con las secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie específica, mientras que las cadenas restantes son idénticas u homólogas con las secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otras especies diferentes. Por ejemplo, un anticuerpo quimérico puede comprender regiones variables que se derivan de una primera especie y comprender regiones constantes que se derivan de una segunda especie. Los anticuerpos quiméricos pueden construirse, por ejemplo, mediante ingeniería genética a partir de segmentos génicos de inmunoglobulina pertenecientes a diferentes especies.
Como se usa en la presente memoria, el término "hibridoma" se refiere a una célula producida por la fusión de una célula inmortal (por ejemplo, una célula de mieloma múltiple) y una célula productora de anticuerpos (por ejemplo, un linfocito B), que es capaz de producir anticuerpos monoclonales de una especificidad de unión única.
Como se usa en la presente memoria, las expresiones "unirse específicamente" y "se une específicamente" en referencia a un anticuerpo, variante de anticuerpo, derivado de anticuerpo, fragmento de unión al antígeno, y similares se refiere a su capacidad para unirse a una molécula diana dada preferentemente sobre otras moléculas diana. Por ejemplo, si el anticuerpo, variante de anticuerpo, derivado de anticuerpo o fragmento de unión al antígeno ("molécula A") es capaz de "unirse específicamente" o "se une específicamente" a una molécula diana dada ("molécula B"), la molécula A tiene la capacidad de discriminar entre la molécula B y cualquier otro número de posibles parejas de unión alternativas. Por consiguiente, cuando se expone a una pluralidad de moléculas diferentes pero igualmente accesibles como posibles parejas de unión, la molécula A se unirá selectivamente a la molécula B y otras posibles parejas de unión alternativas permanecerán sustancialmente no unidas por la molécula A. En general, la molécula A se unirá preferentemente a la molécula B al menos 10 veces, preferentemente 50 veces, más preferentemente 100 veces, y con la máxima preferencia más de 100 veces con mayor frecuencia que otras posibles parejas de unión. La molécula A puede ser capaz de unirse a moléculas que no son la molécula B a un nivel débil pero detectable. Esto se conoce comúnmente como unión de fondo y se puede distinguir fácilmente de la unión específica de la molécula B, por ejemplo, mediante el uso de un control apropiado.
Como se usa en la presente memoria, el término "sujeto" incluye cualquier animal de importancia económica, social o de investigación, incluidas las especies bovina, equina, ovina, primate, aviar y roedor. Por lo tanto, un "sujeto" puede ser un mamífero tal como, por ejemplo, un mamífero humano o no humano.
Como se usa en la presente memoria, el término "aislado" en referencia a una molécula biológica (por ejemplo, un anticuerpo) es una molécula biológica que está libre de al menos algunos de los componentes con los que se produce naturalmente.
Como se usa en la presente memoria, los términos "proteína" y "polipéptido" se refieren cada uno a un polímero compuesto de aminoácidos unidos por enlaces peptídicos y se usan indistintamente. Para los fines de la presente invención, un "polipéptido" puede constituir una proteína de longitud completa o una porción de una proteína de longitud completa.
Como se usa en la presente memoria, el término "polinucleótido" se refiere a un polímero monocatenario o bicatenario de bases de desoxirribonucleótidos, bases de ribonucleótidos, análogos conocidos o nucleótidos naturales, o mezclas de los mismos.
Como se usa en la presente memoria, el término "kit" se refiere a cualquier sistema de suministro para suministrar materiales. Tales sistemas de suministro incluyen sistemas que permiten el almacenamiento, transporte o suministro de reactivos de reacción (por ejemplo, marcadores, muestras de referencia, material de soporte, etc. en los contenedores apropiados) y/o materiales de soporte (por ejemplo, tampones, instrucciones escritas para realizar un ensayo, etc.) de un lugar a otro. Por ejemplo, los kits pueden incluir uno o más recintos, como cajas, que contienen los reactivos de reacción y/o materiales de soporte relevantes. El término "kit" incluye kits fragmentados y combinados. Un "kit fragmentado" se refiere a un sistema de suministro que comprende dos o más recipientes separados que contienen cada uno una sub porción del total de componentes del kit. Los contenedores pueden ser suministrados al destinatario previsto juntos o por separado. Cualquier sistema de suministro que comprenda dos o más recipientes separados que contengan cada uno una sub porción del total de componentes del kit se incluye dentro del significado del término "kit fragmentado". Un "kit combinado" se refiere a un sistema de suministro que contiene todos los componentes de un ensayo de reacción en un único recipiente (por ejemplo, en una sola caja que contiene cada uno de los componentes deseados).
Se entenderá que el uso del término "entre" en la presente memoria, cuando se refiere a un intervalo de valores numéricos, abarca los valores numéricos en cada punto final del intervalo. Por ejemplo, un polipéptido de entre 10 residuos y 20 residuos de longitud incluye un polipéptido de 10 residuos de longitud y un polipéptido de 20 residuos de longitud.
Cualquier descripción de documentos de la técnica anterior en la presente memoria, o declaraciones en la presente memoria derivadas o basadas en dichos documentos, no es una admisión de que los documentos o declaraciones derivadas son parte del conocimiento general común de la técnica relevante. A los fines de la descripción, todos los documentos a los que se hace referencia en la presente memoria se incorporan por referencia en su totalidad a menos que se indique lo contrario.
Descripción detallada
Sigue existiendo la necesidad de procedimientos y agentes más eficaces para diagnosticar y/o tratar diversas formas de cáncer, tal como el cáncer de próstata. Los anticuerpos son agentes de diagnóstico y terapéuticos útiles para el cáncer, ya que se han convertido en un instrumento exitoso e importante para diagnosticar y tratar pacientes con neoplasias hematológicas y tumores sólidos. La identificación de nuevos anticuerpos relevantes dirigidos a antígenos específicos de tumor ofrece un posible medio para mejorar los resultados de diagnóstico y/o terapéuticos para pacientes con cáncer. Otro medio por el cual estos resultados pueden mejorarse es a través de la mejora de los diagnósticos y/o terapias basados en anticuerpos existentes.
El "anticuerpo BLCA-38" ha sido objeto de investigaciones previas en el diagnóstico y/o tratamiento del cáncer, incluido el cáncer de vejiga y de próstata. En la técnica anterior, el "anticuerpo BLCA-38" se denomina de manera persistente un anticuerpo monoclonal murino dirigido a un antígeno desconocido de aproximadamente 30 kDa de tamaño1-5. Los presentes inventores han identificado sorprendentemente que el anticuerpo BLCA-38 divulgado y usado en la técnica anterior no es una única población de anticuerpos monoclonales como se indicó anteriormente, sino una combinación de dos anticuerpos monoclonales distintos en una población mixta. Esto se deriva de la determinación del presente inventor de que el hibridoma usado para generar el anticuerpo BLCA-38, una muestra representativa de la cual se depositó en la Colección Americana de Cultivos Tipo de Tejidos con el número de acceso HB11785, es una población biclonal (en lugar de monoclonal) de células de hibridoma, que produce una mezcla de dos especies de anticuerpos discretos. Solo una de estas especies de anticuerpos es capaz de unirse al antígeno relevante en las células de cáncer de próstata, mientras que la segunda especie no puede. Además, el antígeno unido por este anticuerpo es significativamente mayor que los 30 kDa indicados en la técnica anterior3-4.
Estos hallazgos inesperados han facilitado la generación de un hibridoma monoclonal capaz de producir una única población de anticuerpos con especificidad de unión solo por el antígeno diana. Además de evitar la producción y aplicación innecesarias de un anticuerpo ineficaz (es decir, la segunda población de anticuerpos monoclonales presente en la población mixta de la técnica anterior), el uso del hibridoma monoclonal/anticuerpo único de acuerdo con la presente invención proporciona una señal más fuerte en comparación con la mezcla población de la técnica anterior cuando se utilizan cantidades equivalentes de anticuerpo.
Por consiguiente, ciertas realizaciones de la presente invención se refieren a la provisión de una población de anticuerpos monoclonales derivados de células de hibridoma clonal, cada miembro de la población de anticuerpos es capaz de unirse específicamente a un antígeno presente en ciertas células cancerosas (por ejemplo, células de cáncer de vejiga y próstata). La presente invención también proporciona fragmentos de unión al antígeno de estos anticuerpos, así como derivados y variantes de los anticuerpos que mantienen la misma especificidad de unión.
También se proporcionan hibridomas capaces de producir anticuerpos de la presente invención. Un ejemplo de tal hibridoma fue depositado bajo los términos del Tratado de Budapest en Cellbank Australia en 214 Hawkesbury Road, Westmead, NSW 2145, Australia el 22 de agosto de 2014 con el número de acceso CBA20140026.
Además se proporcionan procedimientos de producción y/o aislamiento de anticuerpos de la presente invención, y métodos de detección/diagnóstico que utilizan los anticuerpos.
Anticuerpos monoclonales
La presente invención proporciona anticuerpos monoclonales, derivados de tales anticuerpos y fragmentos de unión al antígeno de los mismos.
Los anticuerpos monoclonales, variantes, derivados y fragmentos de unión al antígeno son capaces de unirse específicamente a un epítopo antigénico presente en el proteoglicano sulfato de heparán glipicano-1 (GPC-1). La proteína GPC-1 puede ser una proteína glipicano-1 humana (por ejemplo, como se define mediante una secuencia establecida en cualquiera de: secuencia de referencia NCBI núm. de acceso NP_002072.2, núm. de acceso de GenBank AAH51279.1, núm. de acceso de GenBank AAA98132.1, número de acceso de GenBank EAW71184.1, o número de acceso de UniProtKB/Swiss-Prot P35052.2). En algunas realizaciones, la proteína GPC-1 puede no incluir un péptido señal y/o un propéptido. Adicionalmente o en variante, los anticuerpos monoclonales, derivados y fragmentos de unión al antígeno pueden ser capaces de unirse específicamente a un epítopo antigénico presente en una variante GPC-1 (por ejemplo, una isoterma GPC-1, variante de empalme o alotipo).
A modo de ejemplo no limitante, los anticuerpos monoclonales, variantes, derivados y fragmentos de unión al antígeno pueden comprender una cadena pesada y/o una cadena ligera, combinaciones de las mismas, o componentes de las mismas.
La cadena pesada o componentes de la misma pueden comprender una región variable de la cadena pesada que comprende una, dos o tres regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 y/o CDR3), también conocidas en la técnica como regiones hipervariables (HV) de la cadena pesada. La CDR1 de la cadena pesada puede comprender o consistir en una secuencia de aminoácidos como se define por los residuos 50-54 de la SEQ ID NO: 3. La CDR2 de la cadena pesada puede comprender o consistir en una secuencia de aminoácidos como se define por los residuos 69-85 de la SEQ ID NO: 3. La CDR3 de la cadena pesada puede comprender o consistir en una secuencia de aminoácidos como se define por los residuos 118-126 de la SEQ ID NO: 3.
Adicionalmente o en variante, la región variable de la cadena pesada puede comprender una, dos, tres o cuatro regiones marco (FR1, FR2, FR3 y/o FR4). La FR1 de la cadena pesada puede comprender o consistir en una secuencia de aminoácidos como se define por los residuos 20-49 de la SEQ ID NO: 3. La FR2 de la cadena pesada puede comprender o consistir en una secuencia de aminoácidos como se define por los residuos 55-68 de la SEQ ID NO: 3. La FR3 de la cadena pesada puede comprender o consistir en una secuencia de aminoácidos como se define por los residuos 86-117 de la SEQ ID NO: 3. La FR4 de la cadena pesada puede comprender o consistir en una secuencia de aminoácidos como se define por los residuos 127-137 de la SEQ ID NO: 3.
Adicionalmente o en variante, la región variable de la cadena pesada puede comprender una secuencia líder. La secuencia líder de la cadena pesada puede comprender o consistir en una secuencia de aminoácidos como se define por los residuos 1-19 de la SEQ ID NO: 3. El experto reconocerá que la secuencia líder es una secuencia señal que facilita el transporte de una cadena pesada recién sintetizada al retículo endoplásmico, y generalmente no está presente en la cadena pesada de la forma ensamblada final del anticuerpo monoclonal.
Adicionalmente o en variante, la cadena ligera o los componentes del mismo pueden comprender una región variable de la cadena ligera que comprende una, dos o tres regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2, CDR3) también conocidas en la técnica como regiones hipervariables (HV) de la cadena ligera. La CDR1 de la cadena ligera puede comprender o consistir en una secuencia de aminoácidos como se define por los residuos 44-54 de la SEQ ID NO: 4. La CDR2 de la cadena ligera puede comprender o consistir en una secuencia de aminoácidos como se define por los residuos 70-76 de la SEQ ID NO: 4. La CDR3 de la cadena ligera puede comprender o consistir en una secuencia de aminoácidos como se define por los residuos 109-117 de la SEQ ID NO: 4.
Adicionalmente o en variante, la región variable de la cadena ligera puede comprender una, dos, tres o cuatro regiones marco (FR1, FR2, FR3, FR4). La FR1 de la cadena ligera puede comprender o consistir en una secuencia de aminoácidos como se define por los residuos 21-43 de la SEQ ID NO: 4. La FR2 de la cadena ligera puede comprender o consistir en una secuencia de aminoácidos como se define por los residuos 55-69 de la SEQ ID NO: 4. La FR3 de la cadena ligera puede comprender o consistir en una secuencia de aminoácidos como se define por los residuos 77-108 de la SEQ ID NO: 4. La FR4 de la cadena ligera puede comprender o consistir en una secuencia de aminoácidos como se define por los residuos 118-127 de la SEQ ID No : 4.
Adicionalmente o en variante, la región variable de la cadena ligera puede comprender una secuencia líder. La secuencia líder de la cadena ligera puede comprender o consistir en una secuencia de aminoácidos como se define por los residuos 1-20 de la SEQ ID NO: 4. El experto reconocerá que la secuencia líder es una secuencia señal que facilita el transporte de una cadena ligera recién sintetizada al retículo endoplásmico, y generalmente no está presente en la cadena ligera de la forma ensamblada final del anticuerpo monoclonal.
Adicionalmente o en variante, la cadena pesada puede comprender una, dos o tres regiones constantes de la cadena pesada. La región constante de la cadena pesada puede comprender o consistir en una secuencia de aminoácidos como se define por los residuos 138-461 de la SEQ iD NO: 3.
Adicionalmente o en variante, la cadena ligera puede comprender una región constante de la cadena ligera. La región constante de la cadena ligera puede comprender o consistir en una secuencia de aminoácidos como se define por los residuos 128-234 de la SEQ ID NO: 4.
En algunas realizaciones, los anticuerpos monoclonales, variantes, derivados y fragmentos de unión al antígeno de acuerdo con la presente invención pueden comprender una región variable de cadena pesada que comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos como se define por los residuos 20-137 de la SEQ ID NO: 3. Los anticuerpos monoclonales, variantes, derivados y fragmentos de unión al antígeno pueden comprender una o dos de las regiones variables de la cadena pesada.
En algunas realizaciones, los anticuerpos monoclonales, variantes, derivados y fragmentos de unión al antígeno de acuerdo con la presente invención pueden comprender una región variable de la cadena ligera que comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos como se define por los residuos 21-127 de la SEQ ID NO: 4. Los anticuerpos monoclonales, variantes, derivados y fragmentos de unión al antígeno pueden comprender una o dos de las regiones variables de la cadena ligera.
En algunas realizaciones, los anticuerpos monoclonales, variantes, derivados y fragmentos de unión al antígeno de acuerdo con la presente invención pueden comprender una región variable de cadena pesada que comprende o consiste en los residuos 20-137 de la SEQ ID NO: 3, y una región variable de la cadena ligera que comprende o consiste en los residuos 21-127 de la SEQ ID NO: 4. Los anticuerpos monoclonales, variantes, derivados y fragmentos de unión al antígeno pueden comprender una combinación de dos de las regiones variables de la cadena pesada y dos de las regiones variables de la cadena ligera.
En algunas realizaciones, los anticuerpos monoclonales, variantes, derivados y fragmentos de unión al antígeno de acuerdo con la presente invención pueden comprender una cadena pesada que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos como se define por los residuos 20-461 de la SEQ ID NO: 3. Los anticuerpos monoclonales, variantes, derivados y fragmentos de unión al antígeno pueden comprender una o dos de las cadenas pesadas.
En algunas realizaciones, los anticuerpos monoclonales, variantes, derivados y fragmentos de unión al antígeno de acuerdo con la presente invención pueden comprender una cadena ligera que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos como se define por los residuos 21-234 de la SEQ ID NO: 4. Los anticuerpos monoclonales, variantes, derivados y fragmentos de unión al antígeno pueden comprender una o dos de las cadenas ligeras.
En algunas realizaciones, los anticuerpos monoclonales, variantes, derivados y fragmentos de unión al antígeno de acuerdo con la presente invención pueden comprender una cadena pesada que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos como se define por los residuos 20-461 de la SEQ ID NO: 3, y una cadena ligera que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos como se define por los residuos 21-234 de la SEQ ID NO: 4. Los anticuerpos monoclonales, variantes, derivados y fragmentos de unión al antígeno pueden comprender o consistir en una combinación de dos de las cadenas pesadas y dos de las cadenas ligeras.
Los anticuerpos monoclonales, variantes y derivados de dichos anticuerpos, y los fragmentos de unión al antígeno de los mismos de acuerdo con la presente invención no están restringidos a ningún isotipo particular, y por lo tanto pueden ser IgA (IgA1 o IgA2), IgD, IgE, IgG (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4) o isotipo IgM. En algunas realizaciones, son del isotipo IgG1.
Se incluyen dentro del ámbito de la presente invención los anticuerpos monoclonales producidos por células de hibridoma sometidas bajo los términos del Tratado de Budapest en Cellbank Australia en 214 Hawkesbury Road, Westmead NSW 2145, Australia el 22 de agosto de 2014 con el número de acceso CBA20140026. El hibridoma es una población clonal que produce una única especie de anticuerpo que tiene una unión específica para un epítopo existente en el proteoglicano sulfato de heparán glipicano-1 (GPC-1).
Fragmentos de anticuerpos, derivados y variantes.
Se incluyen dentro del ámbito de la presente invención los "fragmentos" de los anticuerpos descritos en la presente memoria. En general, los fragmentos son "fragmentos de unión al antígeno" en el sentido de que son capaces de unirse específicamente al mismo antígeno/epítopo (por ejemplo, GPC-1) que el anticuerpo original del que se obtienen o en el que se basan. Típicamente, un fragmento de unión al antígeno retiene al menos el 10 % de la capacidad de unión al antígeno/epítopo del anticuerpo original o, al menos, 25 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 99 % o 100 % (o más) de la capacidad de unión al antígeno/epítopo del anticuerpo original. También se contempla que un fragmento de unión al antígeno de un anticuerpo descrito en la presente memoria puede incluir sustituciones conservadoras de aminoácidos que no alteren sustancialmente su especificidad/capacidad de unión al antígeno/epítopo (por ejemplo, al menos 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 99 % o 100 % (o más) de su especificidad/capacidad de unión al antígeno/epítopo puede ser retenida).
Los ejemplos no limitantes de fragmentos de unión al antígeno incluyen porciones de un anticuerpo de longitud completa, péptidos y derivados de los mismos que incluyen, por ejemplo, Fab, Fab', F(ab)2, F(ab ')2, F(ab)3, Fv, Fv de cadena sencilla (scFv), dsFv, fragmentos Fd, fragmentos dAB Fse, VH, VL, VhH y dominios V-NAR, paratopos, regiones CDR, moléculas de anticuerpos de cadena sencilla (por ejemplo, Sc-Fv), minicuerpos, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos, cuerpos kappa, anticuerpos lineales, anticuerpos multiespecíficos, anticuerpos de dominio formados a partir de fragmentos de anticuerpos, fragmentos de anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpos y cualquier porción o secuencia peptídica del anticuerpo que sea capaz de unirse específicamente al antígeno relevante/epítopo (por ejemplo, GPC-1).
También se incluyen dentro del ámbito de la presente invención los "derivados" de los anticuerpos descritos en la presente memoria. Un "derivado" de un anticuerpo de la presente invención se refiere a un anticuerpo descrito en la presente memoria que se modifica para incorporar componentes adicionales o que tiene componentes alterados, pero que todavía es capaz de unirse específicamente al mismo antígeno/epítopo (por ejemplo, GPC-1) como el anticuerpo original del que se obtiene. Típicamente, un derivado de anticuerpo como se contempla en la presente memoria retiene al menos el 10 % de la capacidad de unión al antígeno/epítopo del anticuerpo original, o, al menos 25 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 99 % o 100 % (o más) de la capacidad de unión al antígeno/epítopo del anticuerpo original. Los ejemplos no limitantes de modificaciones adecuadas para formar derivados de anticuerpos incluyen amidación, glicosilación, fosforilación, pegilación, unión a un ligando celular u otra proteína, derivación por grupos protectores/bloqueadores conocidos, acetilación y similares. Adicionalmente o en variante, el derivado puede contener uno o más aminoácidos no clásicos.
Los derivados de anticuerpos pueden incluir anticuerpos marcados tales como, por ejemplo, anticuerpos monoclonales marcados con yodo radioactivo, indio, azufre, carbono, tritio o similares; anticuerpos monoclonales conjugados con avidina o biotina, anticuerpos monoclonales conjugados con enzimas (p. ej., rábano picante, glucosa 6-fosfato deshidrogenasa glucosa oxidasa, beta-D-galactosidasa, fosfatasa alcalina, glucoamilasa, acetilcolina esterasa, anhidrasa de ácido carboxílico, malato deshidrogenasa pero lisozima peroxidasa, peroxidasa) y anticuerpos monoclonales conjugados con agentes quimioluminiscentes (por ejemplo, ésteres de acridina), agentes bioluminiscentes (por ejemplo, luciferasa) o agentes fluorescentes (por ejemplo, ficobiliproteínas). Otros ejemplos de derivados de anticuerpos incluyen anticuerpos bifuncionales, tales como anticuerpos biespecíficos generados mediante la combinación de partes de dos anticuerpos separados que reconocen dos grupos antigénicos diferentes (por ejemplo, mediante técnicas recombinantes o reticulación).
Los derivados de anticuerpos pueden formarse a partir de la modificación covalente de los anticuerpos descritos en la presente memoria, por ejemplo, haciendo reaccionar residuos de aminoácidos específicos del anticuerpo con un agente capaz de reaccionar con cadenas laterales seleccionadas o residuos terminales. Por ejemplo, la derivatización con agentes bifuncionales es un medio útil para reticular un anticuerpo o fragmento del mismo con vehículos macromoleculares tales como matrices de soporte insolubles en agua. Los derivados de anticuerpos como se contemplan en la presente memoria pueden tener un agente unido a un anticuerpo base o un fragmento del mismo capaz de aumentar su vida media in vivo (por ejemplo, extender el período de tiempo antes de la eliminación del flujo sanguíneo). Un ejemplo no limitante de tal técnica incluye la adición de restos de PEG.
En ciertas realizaciones, el derivado de anticuerpo puede ser un multímero, tal como, por ejemplo, un dímero, que comprende uno o más monómeros, donde cada monómero incluye (i) una región de unión al antígeno de un anticuerpo anti-GPC-1 como se describe en la presente memoria, o una región polipeptídica derivada de la misma (como, por ejemplo, por sustitución conservadora de uno o más aminoácidos), y (ii) una región polipeptídica multimerizante (por ejemplo, dimerizante), de modo que el derivado de anticuerpo forme multímeros (por ejemplo, homodímeros) que se unen específicamente a GPC-1. Por ejemplo, una región de unión al antígeno de un anticuerpo anti-GPC-1 como se describe en la presente memoria, o una región de polipéptido derivada del mismo, puede fusionarse recombinante o químicamente con una proteína heteróloga, en el que la proteína heteróloga comprende un dominio de dimerización o multimerización. El derivado puede estar sujeto a condiciones que permitan la formación de un homodímero o heterodímero. El heterodímero puede comprender dominios de dimerización idénticos pero diferentes regiones de unión al antígeno anti-GPC-1, regiones de unión al antígeno anti-GPC-1 idénticas pero diferentes dominios de dimerización, o diferentes regiones de unión al antígeno anti-GPC-1 y diferentes dominios de dimerización. Los dominios de dimerización adecuados incluyen aquellos que se originan a partir de factores de transcripción (por ejemplo, una cremallera de leucina de región básica), una proteína hélice-lazo-hélice de región básica y una región constante de inmunoglobulina (por ejemplo, una región constante de la cadena pesada o un dominio de la misma como un dominio CH1, un dominio CH2 o un dominio CH3).
En otras realizaciones, el derivado de anticuerpo puede ser un anticuerpo anti-GPC1 como se describe en la presente memoria conjugado con un segundo anticuerpo (un "heteroconjugado de anticuerpo").
También se contemplan en la presente memoria los derivados humanizados de los anticuerpos descritos en la presente memoria. Un anticuerpo "humanizado" como se contempla en la presente memoria es un anticuerpo quimérico de ser humano/no humano que contiene una secuencia mínima derivada de inmunoglobulina no humana. Por ejemplo, un anticuerpo humanizado puede ser una inmunoglobulina humana (anticuerpo receptor) en la que los residuos de la región(ones) CDR del receptor se reemplazan por residuos de una región CDR de una especie no humana (anticuerpo donante) (por ejemplo, un ratón, rata, conejo o primate no humano que tiene la especificidad y afinidad deseadas por un antígeno/epítopo GPC-1). Los residuos de la región marco (FR) de la inmunoglobulina humana también pueden (opcionalmente) ser reemplazados por los residuos no humanos correspondientes, y en algunos casos los anticuerpos humanizados pueden comprender residuos no presentes en el anticuerpo receptor o en el anticuerpo donador para mejorar el rendimiento del anticuerpo.
En la presente memoria se contempla además un anticuerpo "quimérico" en el que una porción de la cadena pesada y/o ligera es idéntica con u homóloga a una secuencia correspondiente en los anticuerpos derivados a partir de una especie particular o pertenecientes a una clase o subclase particular de anticuerpo, mientras que el resto de la cadena(s) es(son) idéntica(s) u homóloga(s) a una secuencia correspondiente en los anticuerpos derivados a partir de otras especies o pertenecientes a otra clase o subclase de anticuerpos. Por ejemplo, un anticuerpo quimérico como se contempla en la presente memoria puede comprender regiones variables derivadas de un anticuerpo monoclonal anti-GPC-1 como se describe en la presente memoria, y regiones constantes derivadas de una segunda especie. Los anticuerpos quiméricos pueden generarse, por ejemplo, mediante ingeniería genética, a partir de segmentos génicos de inmunoglobulina pertenecientes a diferentes especies.
A modo de ejemplo no limitante, un anticuerpo quimérico de acuerdo con la presente invención puede comprender una secuencia quimérica de cadena CH1-CH3 humana de ratón y una secuencia de cadena CH1-CH3 humana de VH de ratón (cadena pesada) y/o una secuencia de cadena Kappa humana de ratón, una secuencia de CK humana-VK de ratón y una secuencia VK de ratón de MIL-38 (cadena ligera). La cadena pesada del anticuerpo quimérico puede comprender o consistir en una secuencia de aminoácidos como se establece en los residuos 20-467 de la SEQ ID NO: 9. La cadena ligera del anticuerpo quimérico puede comprender o consistir en una secuencia de aminoácidos como se establece en los residuos 21-234 de la SEQ iD NO: 10. La región variable de la cadena pesada puede comprender: una región determinante de complementariedad 1 (CDR1) que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos definida por las posiciones 50-54 de la SEQ ID NO: 9; y/o una región determinante de complementariedad 2 (CDR2) que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos definida por las posiciones 69-85 de la SEQ ID NO: 9; y/o una región determinante de complementariedad 3 (CDR3) que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos definida por las posiciones 118-126 de la SEQ ID NO: 9. Adicionalmente o en variante, la región variable de la cadena ligera puede comprender: una región determinante de complementariedad 1 (CDR1) que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos definida por las posiciones 44-54 de la SEQ ID NO: 10; y/o una región determinante de complementariedad 2 (CDR2) que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos definida por las posiciones 70-76 de la SEQ ID NO: 10; y/o una región determinante de complementariedad 3 (CDR3) que comprende oque consiste en una secuencia de aminoácidos definida por las posiciones 109-117 de la SEQ ID NO: 10. Un anticuerpo quimérico de acuerdo con la presente invención puede ser una "variante" de este anticuerpo quimérico.
Se incluyen dentro del ámbito de la presente invención las "variantes" de los anticuerpos descritos en la presente memoria. Un anticuerpo "variante" se refiere a un anticuerpo que difiere en la secuencia de aminoácidos de una secuencia de aminoácidos del anticuerpo anti-GPC-1 "original" en virtud de la adición, eliminación y/o sustitución de uno o más residuos de aminoácidos en la secuencia de anticuerpos original. Por ejemplo, el anticuerpo variante puede comprender una o más sustituciones de aminoácidos en una o más CDR y/o región (ones) marco del anticuerpo original (por ejemplo, entre 1 y 10, entre 2 y 5, o 1, 2, 3, 4 o 5 sustituciones en una o más CDR de cadena pesada y/o ligera y/o regiones marco del anticuerpo original). La variante de anticuerpo puede comprender una secuencia de aminoácidos de secuencia de dominio variable de cadena pesada y/o una secuencia de aminoácidos de secuencia de dominio variable de cadena ligera que tiene al menos 50 %, al menos 60 %, al menos 70 %, al menos 80 %, al menos 85 %, a al menos 90 %, al menos 95 % o al menos 98 % de homología de secuencia de aminoácidos (es decir, identidad de secuencia) con el correspondiente dominio variable del anticuerpo original.
La identidad u homología de secuencia entre dos secuencias se define en la presente memoria como el porcentaje de residuos de aminoácidos en la secuencia del candidato que son idénticos a los residuos del anticuerpo original, después de alinear las secuencias e introducir interrupciones, si es necesario, para lograr el por ciento máximo de identidad de secuencia. Si las dos secuencias que se van a comparar entre sí difieren en longitud, la identidad de la secuencia se relaciona con el porcentaje de residuos de aminoácidos de la secuencia más corta que son idénticos a los residuos de aminoácidos de la secuencia más larga. La identidad de secuencia puede determinarse convencionalmente con el uso de programas de computadora tal como el programa Bestfit (Paquete de análisis de secuencia de Wisconsin, Versión 8 para Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive Madison, Wis. 53711) y/o el programa "fasta20u66" (versión 2.0u66, septiembre de 1998 por William R. Pearson y la Universidad de Virginia; véase también W. R. Pearson (1990), Methods in Enzymology 183, 63-98).
En algunas realizaciones, un anticuerpo variante como se describe en la presente memoria puede diferir de un anticuerpo original por medio de cambio(s) conservador(es) de aminoácidos en la secuencia del anticuerpo variable. Un "cambio conservador" se refiere a una alteración que es sustancialmente antigénica o conformacionalmente neutra, que produce cambios mínimos en la estructura terciaria del anticuerpo variante, o que produce cambios mínimos en los determinantes antigénicos del anticuerpo variante, en comparación con el anticuerpo original, y una que hace que el derivado no pueda unirse al mismo epítopo en GPC-1 que el anticuerpo original. Los ejemplos no limitantes de cambios conservadores de aminoácidos incluyen la sustitución de aminoácidos hidrófobos y la sustitución de aminoácidos fisioquímicamente similares. Las personas con experiencia en la técnica pueden evaluar de manera rutinaria y sin dificultad si puede realizarse una sustitución de aminoácidos dada mientras se mantiene la neutralidad conformacional y antigénica (véase, por ejemplo, Berzofsky, (1985) Science 229:932-940; Bowie y otros. (1990) Science 247:1306-1310). Pueden lograr alteraciones en la conformación de proteínas con el uso de ensayos bien conocidos que incluyen, entre otros, procedimientos de fijación de microcomplemento (véase Wasserman y otros (1961) J. Immunol. 87:290-295; Levine y otros (1967) Meth. Enzymol 11:928-936) y mediante estudios de unión con anticuerpos monoclonales dependientes de la conformación (véase Lewis y otros (1983) Biochem. 22:948-954). Los cambios conservadores de aminoácidos pueden ocurrir en una o más CDR y/o región(ones) marco del anticuerpo original (por ejemplo, entre 1 y 10, entre 2 y 5, o 1, 2, 3, 4, o 5 sustituciones conservadoras en una o más regiones CDR y/o marco del anticuerpo original).
En general, los anticuerpos humanizados, quiméricos, derivados, de fragmentos y variantes que se contemplan en la presente memoria todavía pueden unirse específicamente al mismo antígeno/epítopo (por ejemplo, GPC-1) que el anticuerpo original del que derivan o del que contienen componentes. Típicamente, pueden retener al menos el 10 % de la capacidad de unión al antígeno/epítopo del anticuerpo original o, al menos, el 25 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 99 % o 100 % (o más) de la capacidad de unión al antígeno/epítopo del anticuerpo original. Por ejemplo, pueden tener una mayor afinidad de unión y/o especificidad de unión en comparación con el anticuerpo original.
La capacidad de un fragmento de anticuerpo, derivado o variante para unirse específicamente a un antígeno/epítopo al que se dirige el anticuerpo original (es decir, un antígeno/epítopo GPC-1) puede probarse con el uso de procedimientos conocidos en la técnica que incluyen, por ejemplo, sistemas de ensayo competitivos y no competitivos con el uso de técnicas tales como transferencias de Western, radioinmunoensayos, ensayo de inmunosorción enzimática (ELISA), ensayos de inmunoprecipitación, inmunoensayos "sándwich", ensayos de inmunodifusión, reacciones de precipitina, inmunoensayos de proteína A, inmunoensayos fluorescentes, reacciones de precipitina de difusión de gel, ensayos de fijación del complemento, ensayos inmunoradiométricos, ensayos de aglutinación y similares (véase, por ejemplo, Ausubel y otros, Eds., Short Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, Inc., Nueva York, 4a ed. 1999); Harlow & Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1999))). Se divulgan específicamente variantes de cualquier anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo descrito en la presente memoria, que incluye, pero no se limita a, anticuerpos (incluidos anticuerpos quiméricos) y fragmentos de unión al antígeno definidos por secuencias específicas en la presente memoria, y anticuerpos producidos por hibridomas descritos en la presente memoria, incluido el hibridoma presentado bajo el términos del Tratado de Budapest en Cellbank Australia en 214 Hawkesbury Road, Westmead NSW 2145, Australia el 22 de agosto de 2014 con el número de acceso CBA20140026.
Hibridomas
La presente invención proporciona células de hibridoma capaces de producir anticuerpos monoclonales, derivados y variantes de dichos anticuerpos, y fragmentos de unión al antígeno de los mismos.
En algunas realizaciones, los hibridomas producen anticuerpos monoclonales y/o fragmentos de unión al antígeno de los mismos como se establece en la sección anterior titulada "Anticuerpos monoclonales ".
En algunas realizaciones, los hibridomas producen fragmentos, derivados y/o variantes de los anticuerpos monoclonales descritos en la presente memoria como se establece en la sección anterior titulada "Fragmentos de anticuerpos, derivados y variantes".
Las técnicas para la producción de células de hibridoma capaces de producir anticuerpos monoclonales son bien conocidas en la técnica. Los ejemplos no limitantes incluyen el procedimiento del hibridoma (véase Kohler y Milstein, (1975) Nature, 256:495-497; Coligan y otros sección 2.5.1-2.6.7 en Methods In Molecular Biology (Humana Press 1992); y Harlow and Lane Antibodies: A Laboratory Manual, página 726 (Cold Spring Harbor Pub. 1988)), el procedimiento del hibridoma EBV de producción de anticuerpos monoclonales humanos (véase Cole y otros 1985, en Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., págs. 77-96), la técnica del hibridoma de células B humanas (véase Kozbor y otros 1983, Immunology Today 4:72), y la técnica del trioma.
En resumen, los anticuerpos monoclonales de la presente invención pueden prepararse administrando el inmunógeno (antígeno) de interés (es decir, GPC-1), por ejemplo, mediante inyección intraperitoneal, a ratones de tipo endogámico o salvaje (por ejemplo, ratones BALB/c o C57BL/6), conejos, ratas u otras especies animales, o ratones transgénicos capaces de producir anticuerpos nativos o humanos. Para inducir una respuesta inmune, el inmunógeno puede, por ejemplo, mezclarse con un adyuvante, administrarse solo, expresarse por un vector, administrarse como ADN o administrarse como una proteína de fusión. El animal puede estimularse, por ejemplo, al menos dos veces, y las células del bazo pueden cosecharse del animal inmunizado. Los hibridomas pueden generarse fusionando células del bazo sensibilizadas con una línea celular de mieloma (por ejemplo, células de mieloma SP2/O murinas con el uso de, por ejemplo, la metodología establecida en Kohler y Milstein y Harlow y Lane).
Una construcción antigénica GPC-1 de acuerdo con la presente invención (por ejemplo, una composición de vacuna que comprende la construcción antigénica GPC-1 en una forma farmacéuticamente aceptable) puede administrarse a un animal apropiado en dosificaciones repetidas (por ejemplo, entre 1-15 dosis, entre 2-10 dosis, entre 3-7 dosis, entre 4-6 dosis), durante un intervalo de tiempo apropiado (por ejemplo, entre 1-10 semanas, entre 1-6 semanas, entre 1-4 semanas o entre 2-3 semanas). La respuesta inmune del animal puede controlarse tomando muestras de suero en un momento adecuado después del refuerzo (por ejemplo, entre 3-10 días después del refuerzo, entre 4-8 días después del refuerzo, entre 5-6 días después del refuerzo), y después determinando el inmunogenicidad de la construcción antigénica con el uso de técnicas conocidas (por ejemplo, mediante ELISA). La inmunización de esta manera puede conducir a una respuesta inmune en los animales. Los animales con títulos terapéuticos son generalmente aquellos que proporcionan un resultado positivo mediante ELISA en una dilución apropiada (por ejemplo, entre 1:4.000 y 1:6.000, entre 1:4.500 y 1:5.500, o 1:5.000). Aquellos con títulos terapéuticos pueden seleccionarse para la fusión de sus células productoras de anticuerpos (linfocitos B) con una línea celular inmortal/de reproducción continua (por ejemplo, una línea celular de mieloma). Puede inducirse la fusión de las células con el uso de un agente apropiado tal como polietilenglicol. Las células híbridas resultantes pueden clonarse entonces de una manera convencional (por ejemplo, con el uso de dilución limitante) y los clones generados se prueban para determinar la capacidad de producir los anticuerpos monoclonales anti-GPC-1 deseados en cultivo. Los hibridomas pueden seleccionarse químicamente colocando las células en un medio de selección que contiene hipoxantina, aminopterina y timidina (HAT). Los hibridomas pueden seleccionarse para determinar la capacidad de producir anticuerpos monoclonales y los hibridomas positivos pueden clonarse, expandirse y almacenarse.
En realizaciones preferentes de la presente invención, el hibridoma es una población de células monoclonales capaz de producir una única especie de anticuerpo capaz de unirse específicamente a GPC-1. Ejemplos no limitantes de tales anticuerpos monoclonales se exponen en las secciones anteriores tituladas "Anticuerpos monoclonales" y "Fragmentos de anticuerpos, derivados y variantes".
En algunas realizaciones, un hibridoma de acuerdo con la presente invención puede ser el hibridoma presentado bajo los términos del Tratado de Budapest en Cellbank Australia en 214 Hawkesbury Road Westmead NSW 2145 Australia el 22 de agosto de 2014 con el número de acceso CBA20140026. Los procedimientos para el cultivo y la propagación de estas células de hibridoma para producir anticuerpos monoclonales de acuerdo con la presente invención son bien conocidos por los expertos en la técnica.
También se contemplan en la presente memoria cultivos celulares que comprenden células de hibridoma de la presente invención.
En algunas realizaciones, los cultivos celulares comprenden una especie individual (monoclonal) de células de hibridoma capaces de producir una sola especie de anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo que se une específicamente a GPC-1. Ejemplos no limitantes de tales anticuerpos monoclonales se exponen en las secciones anteriores tituladas "Anticuerpos monoclonales" y "Fragmentos de anticuerpos, derivados y variantes". Las especies individuales (monoclonales) de células de hibridoma pueden depositarse bajo los términos del Tratado de Budapest en Cellbank Australia con el número de acceso CBA20140026.
En algunas realizaciones, los cultivos celulares comprenden múltiples especies de células de hibridoma (es decir, poblaciones de células de hibridoma mixtas). La población mixta de células de hibridoma puede comprender una sola especie (monoclonal) de células de hibridoma capaces de producir una sola especie de anticuerpo que se une específicamente a GPC-1. Ejemplos no limitantes de tales anticuerpos monoclonales se exponen en las secciones anteriores tituladas "Anticuerpos monoclonales" y "Fragmentos de anticuerpos, derivados y variantes". Las especies individuales (monoclonales) de células de hibridoma pueden depositarse bajo los términos del Tratado de Budapest en Cellbank Australia con el número de acceso CBA20140026. La población mixta de células de hibridoma puede no comprender células de hibridoma depositadas en ATCC con el número de acceso HB11785 y/o células de hibridoma capaces de producir un anticuerpo que comprende;
una región variable de la cadena ligera que comprende uno o más de:
una región determinante de complementariedad 1 (CDR1) que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos definida por las posiciones 48-58 de la SEQ ID NO: 6;
una región determinante de complementariedad 2 (CDR2) que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos definida por las posiciones 74-80 de la SEQ ID NO: 6;
una región determinante de complementariedad 3 (CDR3) que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos definida por las posiciones 113-121 de la SEQ ID NO: 6;
y/o
una o más regiones variables de la cadena ligera FR (regiones marco) como se define por una secuencia seleccionada de uno cualquiera o más de: residuos 25-47 de la SEQ ID NO: 6, los residuos 59-73 de la SEQ ID NO: 6, los residuos 81-112 de la SEQ ID NO: 6, los residuos 122-131 de la SEQ ID NO: 6.
Procedimientos de producción de anticuerpos
Los procedimientos para la preparación de los anticuerpos monoclonales, derivados y variantes de los mismos, y fragmentos de unión al antígeno de los mismos están fácilmente disponibles y pueden ser realizados sin dificultad por expertos en la técnica.
Aparte del procedimiento de hibridoma de Kohler y otros (1975) y descrito anteriormente en la sección titulada "Hibridomas", otro procedimiento no limitante que puede utilizarse es la tecnología de ADN recombinante (véase, por ejemplo, patente de los Estados Unidos núm. 4816567). Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales, derivados y variantes de los mismos, y los fragmentos de unión al antígeno de los mismos, pueden producirse de forma recombinante en cualquier sistema de expresión bien establecido que incluye, pero no se limita a, baculovirus, levadura (por ejemplo Pichia sp., Saccharomyces sp.) E. coli, células de mamíferos, plantas o animales transgénicos (véase Breitling y Dubel, 1999, Recombinant Antibodies, John Wiley & Sons, Inc., NY, págs. 119-132).
En algunas realizaciones, las secuencias de ácido nucleico que codifican anticuerpos monoclonales, derivados y variantes de los mismos, y fragmentos de unión al antígeno de los mismos de acuerdo con la presente invención pueden usarse en procedimientos de producción basados en tecnologías de ADN recombinante. Los ejemplos no limitantes incluyen una secuencia de polinucleótidos de cadena pesada como se define en la SEQ ID NO: 1 o una variante o fragmento de la misma, y/o una secuencia de polinucleótidos de cadena ligera como se define en la SEQ ID NO: 2 o una variante o fragmento de la misma.
Un polinucleótido "variante" se refiere en la presente memoria a un polinucleótido que difiere en secuencia de un polinucleótido original o de referencia. La divergencia de la secuencia de polinucleótidos puede resultar de cambios mutacionales tales como deleciones, sustituciones o adiciones de uno o más nucleótidos. Cada uno de estos cambios puede producirse solo o en combinación, una o más veces en una secuencia dada. Un polinucleótido "variante" se refiere a un polinucleótido que tiene una secuencia sustancialmente similar a un polinucleótido original o de referencia. En general, dos secuencias son "sustancialmente similares" si las dos secuencias tienen un porcentaje especificado de nucleótidos que son iguales (porcentaje de "homología" de secuencia o "identidad" de secuencia). La homología o identidad de secuencia entre dos secuencias de polinucleótidos se define en la presente memoria como el porcentaje de nucleótidos en la secuencia candidata ("variante") que son idénticos a los de la secuencia de polinucleótidos original/de referencia, después de alinear las secuencias e introducir espacios, si es necesario, para lograr el máximo porcentaje de identidad de secuencia. Si las dos secuencias que se van a comparar entre sí difieren en longitud, la identidad de la secuencia se relaciona con el porcentaje de nucleótidos de la secuencia más corta que son idénticos a los nucleótidos de la secuencia más larga. La identidad de secuencia puede determinarse convencionalmente con el uso de programas de computadora como el programa Bestfit (Paquete de análisis de secuencia de Wisconsin, Versión 8 para Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive Madison, Wis. 53711) y/o el programa "fasta20u66" (versión 2.0u66, septiembre de 1998 por William R. Pearson y la Universidad de Virginia; véase también WR Pearson (1990), Methods in Enzymology 183, 63-98). El grado de homología/identidad de secuencia entre el polinucleótido variante y el polinucleótido de referencia/original puede ser, por ejemplo, al menos 75 %, 80 %, 83 % 85 %, 88 %, 90 %, 93 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 %.
Un "fragmento" polinucleotídico es una molécula polinucleotídica que codifica un constituyente o es un constituyente de un polinucleótido original/de referencia grande. En general, el fragmento codificará un fragmento de un anticuerpo de la presente invención, siendo el fragmento capaz de unirse específicamente a GPC-1.
Los anticuerpos monoclonales, derivados y variantes de los mismos, y los fragmentos de unión al antígeno de los mismos producidos de acuerdo con la presente invención pueden aislarse de diversas fuentes con el uso de procedimientos apropiados que incluyen, pero no se limitan a, moléculas de unión a inmunoglobulina (por ejemplo, proteínas A, L, G o H), etiquetas unidas operativamente al anticuerpo o fragmento de anticuerpo (por ejemplo, etiqueta His, etiqueta c-myc), cromatografía de afinidad y similares.
Los anticuerpos monoclonales, derivados y variantes de los mismos, y los fragmentos de unión al antígeno de los mismos, como se describe en la presente memoria, pueden producirse mediante hibridomas y/o cultivos celulares que comprenden poblaciones únicas o mixtas de hibridomas que incluyen, por ejemplo, los descritos en la sección anterior titulada "Hibridomas", después aislados con el uso de técnicas conocidas. En algunas realizaciones, los anticuerpos monoclonales pueden producirse cultivando una sola especie (monoclonal) de células de hibridoma depositadas bajo los términos del Tratado de Budapest en Cellbank Australia con el número de acceso CBA20140026, y aisladas del cultivo.
Los procedimientos para la preparación y cultivo de las líneas celulares de hibridoma y el aislamiento del anticuerpo producido son bien conocidos por los expertos en la técnica y son procedimientos estándar.
Composiciones y kits
Los anticuerpos monoclonales, derivados y variantes de los mismos, y fragmentos de unión al antígeno de los mismos de acuerdo con la presente invención, incluidos los descritos en las secciones anteriores tituladas "Anticuerpos monoclonales" y "Fragmentos de anticuerpos, derivados y variantes", pueden incluirse como componentes de kits y/o composiciones (por ejemplo, composiciones farmacéuticas).
A modo de ejemplo no limitante, los kits de la presente invención pueden comprender cualquiera o más de un anticuerpo, variante de anticuerpo, fragmento de anticuerpo, derivado de anticuerpo, anticuerpo quimérico o células de hibridoma de acuerdo con la presente invención, en cualquier combinación. Las células de hibridoma pueden depositarse en Cellbank Australia con el número de acceso CBA20140026.
Los kits pueden incluir adicionalmente cualquier número de componentes adicionales que incluyen, por ejemplo, reactivos para cultivo celular, muestras de referencia, tampones, marcadores e instrucciones escritas para realizar un ensayo de detección con el uso de los componentes del kit.
Los kits pueden ser kits fragmentados o combinados.
La presente invención también proporciona composiciones que comprenden uno cualquiera o más de un anticuerpo, variante de anticuerpo, fragmento de anticuerpo, derivado de anticuerpo, anticuerpo quimérico o células de hibridoma de acuerdo con la presente invención.
A modo de ejemplo no limitante, las composiciones de acuerdo con la presente invención pueden comprender uno o más de un anticuerpo, variante de anticuerpo, fragmento de anticuerpo, derivado de anticuerpo, anticuerpo quimérico o células de hibridoma de acuerdo con la presente invención, en cualquier combinación. Las células de hibridoma pueden depositarse en Cellbank Australia con el número de acceso CBA20140026.
Las composiciones pueden ser composiciones farmacéuticas. Las composiciones farmacéuticas pueden comprender un diluyente farmacéuticamente aceptable, excipiente y/o vehículo, como conocen los expertos en la técnica. Para preparar las composiciones farmacéuticas, los componentes que se incluirán pueden mezclarse con el diluyente, vehículo y/o excipiente farmacéuticamente aceptable (véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences y US Pharmacopeia: National Formulary, Mack Publishing Company, Easton, Pa. (1984)). Las formulaciones de agentes terapéuticos y de diagnóstico pueden prepararse mezclando con vehículos, excipientes o estabilizadores fisiológicamente aceptables en forma de, por ejemplo, soluciones o suspensiones acuosas, polvos liofilizados, suspensiones (véase, Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott, Williams, and Wilkins, Nueva York, N.Y.; Weiner y Kotkoskie (2000) Excipient Toxicity and Safety, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N.Y.; Avis y otros (eds.) (1993)Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications, Marcel Dekker, NY; Lieberman, y otros (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets, Marcel Dekker, NY; Hardman, y otros (2001) Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, McGraw-Hill, Nueva York, N.Y.; Lieberman, y otros (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems, Marcel Dekker, NY).
Procedimientos de detección
La presente invención proporciona procedimientos para detectar y/o cuantificar la expresión de la proteína GPC-1 en un sujeto (por ejemplo, por células de un sujeto). Los procedimientos comprenden obtener células, una muestra de tejido y/o una muestra de fluido corporal del sujeto, poner en contacto las células, la muestra de tejido y/o fluido corporal con un anticuerpo, variante de anticuerpo, fragmento de anticuerpo, derivado de anticuerpo o anticuerpo quimérico, de acuerdo con a la presente invención (por ejemplo, las descritas en las secciones anteriores tituladas "Anticuerpos monoclonales" y "Fragmentos de anticuerpos, derivados y variantes") y determinar y/o cuantificar la unión de dicho anticuerpo, variante de anticuerpo, fragmento de anticuerpo, derivado de anticuerpo o anticuerpo quimérico a las células, muestra de tejido o muestra de fluido corporal del sujeto.
El GPC-1 para detección puede estar presente en la superficie de las células y/o expresarse internamente. El fluido corporal puede ser orina. Las células o la muestra de tejido pueden ser células prostáticas o tejido prostático. La detección y/o cuantificación de la expresión de GPC-1 puede llevarse a cabo con el uso de cualquier medio conocido en la técnica, incluyendo, por ejemplo, citometría de flujo y/o ELISA.
En algunas realizaciones, los anticuerpos, variantes de anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, derivados de anticuerpos o anticuerpos quiméricos, utilizados en los procedimientos, son producidos por un hibridoma de acuerdo con la presente invención (por ejemplo, un hibridoma descrito en la sección anterior titulada "Hibridomas"). En algunas realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal producido por células de hibridoma depositadas en Cellbank Australia con el número de acceso CBA20140026.
En algunas realizaciones, se aplica una solución que comprende una única especie de anticuerpos, variantes de anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, derivados de anticuerpos o anticuerpos quiméricos, capaces de detectar GPC-1 a las células, tejidos y/o muestra de fluido corporal que potencialmente puede contener GPC-1. La especie única puede ser producida por células de hibridoma depositadas en Cellbank Australia con el número de acceso CBA20140026.
Alternativamente, una solución que comprende múltiples especies de anticuerpos, variantes de anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, derivados de anticuerpos y/o anticuerpos quiméricos, puede aplicarse a las células, tejidos y/o muestras de fluidos corporales que pueden contener GPC-1, en el que al menos una especie en la solución es capaz de detectar GPC-1. La especie capaz de detectar GPC-1 puede ser producida por células de hibridoma depositadas en Cellbank Australia con el número de acceso CBA20140026. En tales realizaciones, la solución que comprende múltiples especies no comprende un anticuerpo producido por células de hibridoma depositadas en la Colección Americana de Cultivos Tipo de Tejidos (ATCC) con el número de acceso HB11785 y/o células de hibridoma capaces de producir un anticuerpo que comprende;
una región variable de la cadena ligera que comprende uno o más de:
una región determinante de complementariedad 1 (CDR1) que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos definida por las posiciones 48-58 de la SEQ ID NO: 6;
una región determinante de complementariedad 2 (CDR2) que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos definida por las posiciones 74-80 de la SEQ ID NO: 6;
una región determinante de complementariedad 3 (CDR3) que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos definida por las posiciones 113-121 de la SEQ ID NO: 6;
y/o
una o más región variable de la cadena ligera FR (regiones marco) como se define por una secuencia seleccionada de uno cualquiera o más de: residuos 25-47 de la SEQ ID NO: 6, los residuos de 59-73 de la SEQ ID NO: 6, los residuos de 81-112 de la SEQ ID NO: 6, los residuos de 122-131 de la SEQ ID NO: 6.
En algunas realizaciones, el nivel de expresión de GPC-1 detectado en las células, la muestra de tejido y/o fluido corporal obtenida del sujeto puede compararse con una muestra de células de control o una población de muestras de referencia de niveles de expresión de GPC-1. En algunas realizaciones, una determinación del aumento de la expresión de GPC-1 en el sujeto en comparación con el control o la referencia puede ser diagnóstico de una enfermedad, o, una mayor probabilidad de desarrollar una enfermedad, en el sujeto. La enfermedad puede ser cáncer de próstata.
Los expertos en la técnica apreciarán que pueden realizarse numerosas variaciones y/o modificaciones a la presente invención como se divulgó en las realizaciones específicas sin apartarse del espíritu o ámbito de la presente invención como se describe ampliamente. Por lo tanto, las presentes realizaciones deben considerarse en todos los aspectos como ilustrativas y no restrictivas.
Ejemplos
La presente invención se describirá ahora con referencia a ejemplos específicos, que no deben interpretarse de ningún modo como limitantes.
Ejemplo 1: análisis de anticuerpos de poblaciones de hibridoma MIL-38
1.1 Materiales y procedimientos
- preparaciones de anticuerpos MIL-38
Las preparaciones de los hibridomas de anticuerpos MIL-38 se obtuvieron de las siguientes fuentes:
(i) Se usaron reservas de células internas del hibridoma BLCA-38 para generar una serie de preparaciones de anticuerpos MIL-38 designadas 16A, 16B, 16C, 17B, 23A-1, 23A-2, 24A, 25A, 25B, 26B, 30A, 31A, 31B, 31C, 31D, 32B, 32C, 33A, 33B, 33C, 33D, 34A, 34B, 35A, 35C, 35D, 40A, 40B.
(ii) Se usó un lote de células de las reservas internas para generar preparaciones de hibridoma MIL-38 AusMAb 1 y 2 (AM-1 y AM-2).
(iii) Se recuperó del ATCC un vial del depósito original del hibridoma BLCA-38 (número de acceso HB11785: hibridoma murino BLCA-38). Este se cultivó y se prepararon reservas de células internas. Las preparaciones de anticuerpos de esta reserva original se denominaron "Original" (1-O) y "Original NA";
(iv) Se usó un vial de las células "Original" para generar la preparación de anticuerpos AusMAb 3 (AM-3) y posteriormente las preparaciones de anticuerpos AusMAb 4 y 5 (AM-4, AM-5). Las células usadas para generar AusMAb3 y las células usadas para generar AusMAb 4 y 5 se congelaron por separado en dos lotes.
(v) A partir de estas células congeladas, se generó una preparación denominada "Alfio I" a partir de la reserva celular usada para preparar AM-4 y AM-5, y se generó una preparación denominada "Alfio II" a partir de la reserva celular usada para generar AM -3.
(vi) Se usó un congelamiento de paso temprano (<6) de células del depósito original del hibridoma BLCA-38 (HB11785) para realizar la clonación de células individuales y proporcionar una serie de clones para caracterizar. El clon MIL-381F5 fue seleccionado y depositado en CellBank Australia con el número de depósito CBA20140026. La reserva de hibridoma usada como base para generar las preparaciones descritas en (i) - (vi) anteriormente se preparó como se describe en la patente de los Estados Unidos núm. 5,622,8361 de Walker y otros, cuyo contenido completo se incorpora en la presente memoria por referencia cruzada.
Para la purificación del anticuerpo MIL-38, las reservas celulares congeladas se descongelaron rápidamente seguido de resuspensión en medio RPMI 1640 y se dejaron crecer a 37 °C con 5 % de CO2 por 24 h. Las células se expandieron, dividieron y escalaron en un procedimiento secuencial. En cada paso, las células se resuspendieron en medio nuevo y se incubaron a 37 °C con 5 % de CO2. Después del escalado, las células se transfirieron a medio estéril libre de suero y se cultivaron hasta el comienzo de la fase de muerte. El sobrenadante se cosechó para recoger el anticuerpo MIL-38 y se esterilizó por filtración. El sobrenadante de anticuerpo se almacenó a -80 °C hasta que se requirió. El anticuerpo se purificó con el uso de la proteína G de Pierce de acuerdo con las recomendaciones del fabricante.
Las células usadas para generar los clones de AusMab AM-1-AM-5 se prepararon como sigue. Las células fueron revividas en DMEM FCS al 10 %. Una vez que crecieron bien, fueron clonados (véase abajo), expandidos y congelados. A continuación, a las células se les extrajo el FCS y se transfirieron al medio libre de suero Gibco HSFM (la extracción típicamente tomó 5 días).
Antes de sembrar células en un biorreactor, se realizó una dilución en serie modificada para obtener células individuales por pocillo en placas de 96 pocillos. Se usó medio acondicionado para promover el crecimiento de células individuales. Se observaron pocillos individuales 3 días después de plaquear y se contó un número de 4-8 colonias de células por pozo. Solo los pocillos que contenían una sola colonia se seleccionaron para la expansión. La expresión del anticuerpo se confirmó antes de la expansión.
Después de la expansión, una parte de las células se transfirió a un biorreactor Integra de dos compartimientos mientras que las células restantes se congelaron. Las células se cultivaron en el biorreactor de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Después de la cosecha, el anticuerpo se purificó con el uso de técnicas estándar.
- transferencia Western y análisis en gel Sypro
Extracción de proteínas: Las células DU-145 (antígeno MIL-38 positivo) o C3 (antígeno MIL-38 negativo) se cultivaron de acuerdo con técnicas estándar de cultivo de tejido. Las proteínas de la membrana celular se enriquecieron con el uso del kit de extracción de proteínas de membrana nativa Merck Millipore ProteoExtract (MPEK) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Transferencia: Los geles se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa durante 10 minutos a 2,5 A y 25 V como máximo con el uso del sistema Transblot Turbo (Biorad).
Transferencia Western: Brevemente, después de la transferencia, las membranas se bloquearon con leche descremada al 5 % en PBS-Tween (0,1 %) durante 2 horas a temperatura ambiente. Los anticuerpos primarios (1 pg/ml en leche descremada al 5 % - PBS-Tween (0,1 %) se aplicaron e incubaron durante la noche a 4 °C. Después del lavado (3x 10 min PBS-Tween (0,1 %)) las membranas se incubaron con anticuerpo secundario (1:2.000 de anti-ratón de cabra marcado con HRP en leche descremada al 5 % - PBS-Tween (0,1 %). Después del lavado (3x 10 min PBS-Tween (0,1 %)) se detectó el antígeno con el uso del kit de detección ECL (Biorad) y la formación de imágenes con LAS4000 mini (GE Life Science).
Geles Sypro: Los geles se fijaron en solución de fijación (etanol al 10 %, ácido acético al 7 %) durante 2h antes de ser transferidos a la tinción de proteína Sypro®Ruby y se incubaron durante la noche a temperatura ambiente en la oscuridad. Antes de la formación de imágenes, los geles se enjuagaron y lavaron con una solución desteñidora (etanol al 10 %, ácido acético al 7 %) durante un mínimo de 2 h. Las imágenes se realizaron con un escáner Pharos X.
- Ensayo de Inmunofluorescencia (IFA)
IFA: Las células se cultivaron en cubreobjetos hasta un 75 % de confluencia y se colocaron en placas de 6 pocillos. Las células se lavaron con PBS seguido de fijación con acetona. Las células se lavaron nuevamente con PBS seguido de incubación con TBS y después se bloquearon con PBS que contenía leche descremada al 5 %. A continuación, las células se incubaron en la oscuridad con MIL-38, MIL-38 quimérico o Cetuximab, seguido de incubación con un anticuerpo anti-ratón de cabra o anti-humano de cabra marcado con FITC o Alexa488. Ambos anticuerpos se prepararon en PBS que contenía leche descremada al 1 %. El lavado con PBS se realizó entre las incubaciones de anticuerpos primarios y secundarios. Después de la incubación secundaria, las células se lavaron con PBS que contenía DAPI y se visualizaron para fluorescencia verde (MIL-38 positivo).
- Electroforesis SDS-PAGE
SDS-PAGE: Las muestras se mezclaron con tampón de muestra no reductor que contenía SDS y se cargaron en un gel de poliacrilamida prefabricado al 4-15 % (Criterio TGX; Biorad). Los geles se corrieron durante 10 minutos a 80 V y 50 minutos adicionales a 200 V en tampón de corrida Tris-Glycine.
1.2 Resultados
- transferencia Western
Las preparaciones de anticuerpos MIL-38 derivados de las siguientes fuentes se compararon una al lado de la otra: (i) células de hibridoma del ATCC (preparación 1-O, "original");
(ii) dos preparaciones separadas de anticuerpos producidos a partir de células de hibridoma mantenidas por la empresa solicitante (preparaciones 37A y 40A);
Se observó reactividad en la transferencia Western equivalente para las tres preparaciones (Figura 1). Las tres preparaciones proporcionaron una doble banda para la cadena pesada y ligera, lo que sugiere una población no clonal. - Ensayo de Inmunofluorescencia (IFA)
Las diferentes preparaciones de anticuerpos ("I-Original" (1-O), 40A y 37A) usadas en una variedad de líneas celulares proporcionaron una reactividad de IFA equivalente (Tabla 1).
Tabla 1: Reactividad de IFA de diferentes preparaciones de anticuerpos MIL-38 en diversas líneas celulares
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- Análisis de diferentes preparaciones de anticuerpos MIL-38
El tamaño y la reactividad de las preparaciones de anticuerpos MIL-38 procedentes de las preparaciones AM-1-AM-5 (generadas por AusMAb Pty Ltd) y la preparación de anticuerpos MIL-38 interna 33A se compararon mediante SDS-PAGE (Figura 2A) y transferencia Western (Figura 2B).
La preparación interna de anticuerpos MIL-38 exhibió una doble banda tanto para la cadena pesada como ligera, lo que sugiere una población no clonal (véase la Figura 2A). Las preparaciones de anticuerpos AusMAb MIL-38 (AusMab 1, AusMab 3, AusMab 4, AusMab 5) mostraron bandas individuales para cadenas pesadas y ligeras. La preparación de anticuerpos MIL-3833A mostró una doble banda tanto para la cadena pesada como ligera, lo que sugiere una población no clonal. En particular, las bandas AusMAb 3 exhibieron un MW más alto que AusMab 1, AusMab 4, AusMab 5 y 33A, lo que sugiere la existencia de dos poblaciones clonales distintas en las reservas de 1-O fuente.
Los anticuerpos AusMAb 3 (AM-3) tampoco reaccionaron con el antígeno MIL-38, mientras que los anticuerpos AusMab 1, AusMab 4, AusMab 5 y la preparación 33A sí lo hicieron (Figura 2B).
- Análisis de preparaciones internas de MIL-38 adicionales
La electroforesis SDS-PAGE se usó para analizar el MW de cadena ligera y pesada de varias otras preparaciones de anticuerpos MIL-38 generadas a partir de reservas de hibridoma BLCA-38 y almacenadas internamente. Se observaron bandas dobles para cadenas pesadas y ligeras en todas las preparaciones (Figura 3A). En contraste, la preparación de anticuerpos AusMab 4 (AM-4) mostró bandas individuales para cadenas pesadas y ligeras.
La reactividad de la transferencia Western de varias preparaciones de anticuerpos MIL-38 internas para el extracto de MPEK DU-145 fue consistente en todas las preparaciones. AusMab 4 (AM-4) reaccionó al extracto de DU-145 MPEK, mientras que AusMab 3 (AM-3) no reaccionó al extracto de DU-145 Mp Ek (Figura 3B).
1.2 Discusión
A partir de estos resultados, es evidente que las reservas de hibridoma MIL-38 de las reservas internas y de ATCC contenían una población mixta de células. La clonación de las dos poblaciones identificables (poblaciones de AusMab) dio dos anticuerpos de diferentes pesos moleculares. Una de estas dos especies de anticuerpos no es reactiva al antígeno MIL-38, mientras que la otra muestra una reactividad equivalente a MIL-38 producida a partir de la población mixta.
Ejemplo 2: análisis de poblaciones adicionales de anticuerpos MIL-38
2.1 Materiales y procedimientos
- Preparación de anticuerpos MIL-38
Se usaron preparaciones de poblaciones de células de hibridoma congeladas derivadas de AusMab 3 (AM-3) o AusMab 4 (AM-4) y AusMab 5 (AM-5). Las células usadas en la derivación de AM-3 se denominaron "Alfio II". Después de la detección que indica que AM-3 no era reactivo a los extractos de MPEK DU-145, se investigaron las reservas de pases anteriores para identificar un clon positivo. Estas células de paso temprano se usaron para obtener AM-4 y se denominaron "Alfio I". Ambas reservas de células se mantuvieron para su almacenamiento y para permitir la producción interna del anticuerpo MIL-38.
Para la producción por lotes MIL-38 de Original IIA, Alfio I y Alfio II, las existencias se descongelaron rápidamente seguido de resuspensión en medio RPMI 1640 y se dejó crecer a 37 ° C con 5 % de CO2 por 24 h. Las células se expandieron, dividieron y escalaron en un procedimiento secuencial. En cada paso, las células se resuspendieron en medio nuevo y se incubaron a 37 °C con 5 % de CO2. Después de la ampliación, las células se transfirieron a medio estéril libre de suero y se cultivaron hasta el comienzo de la fase de muerte. El sobrenadante se recogió para recoger el anticuerpo MIL-38 y se esterilizó por filtración. El sobrenadante de anticuerpo se almacenó a -80 °C hasta que se requirió. El anticuerpo se purificó con el uso de proteína G de Pierce de acuerdo con las recomendaciones del fabricante.
- transferencia Western y geles Sypro
El ensayo de la transferencia Western y la preparación de geles Sypro se realizaron esencialmente de acuerdo con los métodos establecidos en Ejemplo 1 arriba (véase la sección 1.1)
El ensayo de transferencia Western se realizó bajo las siguientes condiciones:
4-12 % de gel Bis-Tris
Bloqueo: durante la noche
Régimen de la transferencia Western: Anticuerpo primario 1hr, 10 pg por pieza de membrana,
Lavados 3x 10 minutos,
Anticuerpo secundario 1 hora, anticuerpo secundario 1/2.000 Cabra-ratón HRP
Células: probadas contra extractos de MPEK DU-145 y C3
- Ensayos de Inmunofluorescencia
Los ensayos de inmunofluorescencia se realizaron esencialmente de acuerdo con los procedimientos establecidos en el Ejemplo 1 anterior (véase la sección 1.1)
2.2 Resultados
- transferencias Western
La reactividad de la transferencia Western de Alfio I, Alfio II, 36A, AusMAb y "original IIA" (una preparación MIL-38 preparada a partir de células de hibridoma de ATCC HB11785) se probó en extractos de células DU-145 y C3 MPEK. La reactividad de la transferencia Western de Alfio II se parecía a la de la preparación AM-3 (Figura 4A). Original IIA y Alfio I se parecían a la preparación 36A(Biclonal interna) (Figura 4A).
- Análisis de gel Sypro
Las bandas dobles en las fracciones de cadena pesada separadas no eran tan claras como se observó anteriormente, mientras que las bandas duales en fracciones de cadena ligera separadas se podían distinguir claramente. Las fracciones separadas de la cadena ligera de las preparaciones originales de anticuerpos IIA, Alfio I y 36A MIL-38 contenían dos bandas. Por el contrario, la fracción de cadena ligera separada de Alfio II contenía una sola especie de cadena ligera, con un MW más alto (es decir, como la preparación del anticuerpo AM-3 MIL-38). Tenga en cuenta que se cargó más anticuerpo Alfio II en el gel que para los otros anticuerpos, lo que dio como resultado una banda más amplia para la especie de cadena ligera. Las fracciones de cadena pesada y ligera separadas del anticuerpo AM-4 MIL-38 fueron claramente distintas de las formas biclonales o similares a AM-3 (Figura 4B).
- Ensayo de Inmunofluorescencia
De acuerdo con los resultados de la transferencia Western, el análisis IFA de las células DU-145 mostró que AM-4, Alfio I y IIA original dieron buena reactividad IFA, mientras que Alfio II (equivalente a AM-3 en la transferencia western) no mostró reactividad en IFA (Figura 5A). No se observó reactividad de ninguna preparación con la línea celular de control negativo C3 (Figura 5B).
2.3 Discusión
Estos análisis indican que Alfio I es una población biclonal de anticuerpos MIL-38, mientras que Alfio II es una población de anticuerpos tipo a M-3 (monoclonal), y confirman además que la preparación de anticuerpos MIL-38 AM-4 es una población de anticuerpos monoclonales.
Por lo tanto, es evidente que las poblaciones de anticuerpos biclonales MIL-38 como Alfio I contienen una mezcla de las distintas poblaciones de anticuerpos monoclonales AM-3 y AM-4.
Ejemplo 3: comparación de poblaciones de anticuerpos MIL-38 para el ensayo ELISA
3.1 Materiales y procedimientos
Placas de noventa y seis pocillos fueron revestidas con preparaciones AM-3 o AM-4 de MIL-38 (1 pg/pocillo) en tampón de carbonato pH 9,5 durante la noche. Las placas se bloquearon con PBS-Tween (0,1 %) que contenía leche descremada al 5 % a 37 ° C y se lavaron. Antígeno (GPC-1 recombinante humano producido a partir de células NS0) diluido en Tampón II (HEPES 20mM pH 7,5, EDTA 0,5mM, Tritón X-100 al 0,5 %) con la adición de NaCl 150mM e incubado durante la noche a 37 °C. La detección se realizó con AM-4 biotinilado seguido de detección con avidina HRP (1 pg/ml). Se añadió TMB (Sigma núm. de cat. T0440) y se detuvo con solución de parada TMB (Sigma S5814). La absorbancia se leyó a 450 nm. Los resultados se muestran en la Figura 6A.
En un segundo experimento, se revistieron placas de noventa y seis pocillos con preparaciones MIL-3834A o AM-4 (2,5 pg/pocillo) en PBS pH 7,2 durante 1 hora a temperatura ambiente. Las placas se bloquearon con Blocker Casein (Thermo) en PBS-Tween (0,05 %) durante 1 hora a 37 °C. Después del lavado, el antígeno (GPC-1 NS0) se diluyó en TBS pH 7,2 que contenía Tricina 50mM y NaCl 150mM y se incubó a 37 °C durante 1 h. La detección se realizó con el clon 1F5 de AM-4 biotinilado seguido de la detección con avidina HRP (1 pg/ml). Se añadió TMB (Sigma núm. de cat. T0440) y se detuvo con solución de parada TMB (Sigma S5814). La absorbancia se leyó a 450 nm. Los resultados se muestran en la Figura 6B.
3.2.1 Resultados
El primer ELISA descrito anteriormente se desarrolló con el uso de MIL-38 para capturar GPC-1 recombinante producido por NSO (es decir, antígeno MIL-38). Este experimento comparó el monoclonal a M-3 MIL-38 y el monoclonal AM-4 MIL-38 para la captura. AM-3 no funcionó como agente de captura en un ensayo ELISA tipo sándwich (Figura 6A).
El segundo ELISA descrito anteriormente comparó la señal de ELISA obtenida cuando se comparó una población mixta de MIL-38 (34A) con la obtenida de un clon monoclonal AM-4-1F5. El uso de AM-4 1F5 como agente de captura proporcionó una señal ELISA más alta que el uso de la población mixta de anticuerpos 34A (Figura 6B).
3.2.2 Discusión
Los resultados de ELISA en sándwich demuestran que solo las formas similares a AM-4 del anticuerpo monoclonal MIL-38 tienen utilidad para detectar el antígeno como reactivo de captura y que un agente de captura que contiene una población monoclonal proporciona una señal de ELISA superior a la que consiste en una mezcla población.
Ejemplo 4: análisis de secuencia de poblaciones de anticuerpos MIL-38
4.1 Materiales y procedimientos
- Secuenciación de cadenas pesadas y ligeras (ADN)
Se realizaron tres ejecuciones de secuenciación separadas. La primera prueba (codificada 224945) utilizó células de hibridoma bi-clonales de la preparación 1-O. La segunda corrida (codificada 449295-1) utilizó células de Alfio I, una muestra existente de hibridoma que se usó para generar AM-4. La tercera corrida (codificada 449295-5) utilizó células de Alfio II, una muestra existente de hibridoma que se usó para generar AM-3.
Para las secuencias 224945 (1-O) y 449295-1 (Alfio I), el ARN total se extrajo de las células de hibridoma congeladas y el ADNc se sintetizó a partir del ARN. A continuación se realizó la PCR para amplificar las regiones variables (cadenas pesadas y ligeras) y las regiones constantes del anticuerpo, que después se clonaron en un vector de clonación estándar por separado y se secuenciaron.
El ARN total se aisló de las células de hibridoma siguiendo el manual técnico del Sistema de purificación de ARN TRIzol® Plus. El ARN total se analizó por electroforesis en gel de agarosa.
El ARN total se transcribió inversamente en ADNc usando cebadores antisentido específicos de isotipo o cebadores universales siguiendo el manual técnico del Sistema de síntesis de primer filamento SuperScript™ III. Los fragmentos de anticuerpos de Vh, Vl, Ch y Cl se amplificaron de acuerdo con el procedimiento de operación estándar de RACE de GenScript.
Los fragmentos de anticuerpos amplificados se clonaron por separado en un vector de clonación estándar usando procedimientos de clonación molecular estándar.
Se realizó un examen de PCR de colonias para identificar clones con insertos de tamaños correctos. Se secuenciaron no menos de cinco colonias individuales con insertos de tamaños correctos para cada fragmento de anticuerpo.
Los plásmidos Vh y Vl codificaron la longitud completa de las regiones variables del anticuerpo y una parte de Ch1 y Cl. El plásmido Ch codificó una parte de Ch1 y la secuencia completa de Ch2 y Ch3. El plásmido Cl codificó una parte de Cl. Para obtener regiones constantes de longitud completa o cadena pesada/ligera, la parte de las regiones constantes codificadas por los plásmidos Vh y Vl y la parte de regiones constantes codificadas por Ch y Cl los plásmidos se amplificaron por PCR por separado, y después se empleó la PCR de extensión solapada para obtener ADN de longitud completa. Cinco colonias individuales con correctos tamaños de inserto de Vh, Vl, Ch y Cl se enviaron para secuenciación.
La secuencia de ejecución 449295-5 (Alfio II) encontró dificultades para obtener la secuencia correspondiente a la secuencia esperada de la cadena pesada de lgG1. Se realizaron dos preparaciones de ARN. Para el 1er lote de células, se usaron el cebador oligo-dT y los cebadores CDS III para la transcripción inversa (RT). Vh/Ch y V v k &/C ^ s kc e amplificaron por PCR con el uso de lgG1 y cebadores específicos de ^ 8 ^ el gen parcial de (3-actina de ratón se amplificó como control positivo. Se obtuvieron fácilmente bandas de cadena ligera normales mientras que solo V h se pudo observar en el gel débilmente. Cinco colonias individuales con tamaños de inserto de V k y Ck correctos se enviaron para secuenciación. Se encontró que los genes de V k y Ck de cinco clones diferentes eran casi idénticos. Las secuencias de consenso de la cadena ligera del hibridoma Alfio II se enumeran a continuación. Se obtuvo una secuencia de cadena pesada improductiva de ocho clones positivos de Vh secuenciados al azar, que se muestran a continuación. Se obtuvieron tres tipos de secuencias de la región constante de la cadena pesada de diez clones positivos de Ch secuenciados al azar (una IgG1CH, una IgG2aCH y ocho IgG2bCH). Para evitar la influencia del cambio de clase potencial, para la amplificación de la Ch se utilizó un cebador específico de IgM, pero no se obtuvo un producto de PCR objetivo. Tampoco hubo un producto de PCR objetivo cuando la cadena pesada de longitud completa (Vh-Ch) se amplificó utilizando cebadores degenerados FR1 de cadena pesada.
Como no se pudo obtener una cadena pesada productiva después de varios intentos, se intentó aislar la secuencia de la cadena pesada del 2do vial de células Alfio II. Para el 2do vial de células, inicialmente se usó el cebador oligo-dT para la transcripción inversa. Vh se amplificó usando cebadores específicos de lgG1, lgG2b, IgM, IgAy cebador degenerado de IgG, respectivamente, y V k se amplificó con el uso de cebadores específicos de ^8 ^ . Se obtuvieron la cadena ligera productiva y la cadena pesada no productiva, que eran idénticas a los resultados anteriores. La transcripción inversa con el uso de cebadores de 6 mers aleatorios también se intentó sin éxito.
En sumario, se realizaron múltiples intentos para aislar la secuencia de la cadena ligera y la cadena pesada. Una secuencia de cadena ligera reordenada se obtuvo de manera consistente después de diferentes intentos en dos lotes de células. Sin embargo, solo productos débiles objetivos de PCR de Vh se observaron y la secuenciación no dio como resultado ninguna secuencia de cadena pesada consistente.
Resultados
- Tabla sumario de secuencias
La Tabla 2 a continuación ofrece una descripción general de las secuencias de proteínas y ácido nucleico de cadena pesada y ligera de los anticuerpos estudiados, indicando las posiciones de varias regiones internas.
Figure imgf000029_0001
- Secuenciación (ADN)
El ARN total aislado de la muestra se procesó junto con un marcador de ADN (Marcador III - TIANGEN, núm. de catálogo: MD103) en un gel de agarosa/GelRed™ al 1,5 %.
Se corrieron cuatro microlitros de productos de PCR de cada muestra junto con el marcador de ADN (Marker III) en un gel de agarosa/GelRed™ al 1,5 %. Los productos de PCR se purificaron y almacenaron a -20 °C hasta su uso posterior. Los genes de Vh, Vl, Ch y Cl de cinco clones diferentes eran casi idénticos. Se determinó que la secuencia de consenso, que se enumera a continuación, es la secuencia del anticuerpo producido por la población de hibridoma monoclonal (AM-4).
Secuencia consenso de ADN de la cadena pesada de IgG1 de ratón AM-4 MIL-38 (SEQ ID NO:1)
Figure imgf000030_0001
CTC:A; GJATTACGi’C::rGACTCC']G GGGTC;ACG TGTGGTGTGGTAGAGAJ'CGíGCAGGGArGATCCCGAüíGrCCAG TTCAGC'iGKACÍTGAÍXGATGX'GArGiGAGGGGOAGACAGGTCGGGACXAGGAG'GAXGGGAGGAGCAGArGGG'CAGG' aCTGTCCXXGTCAGTCACAGGAá C'G 'A X a XTCXGCGXACCACGGa CAA(:;(a ;:AAATGGAGAAGA AGGTG’AAA.TGC.' AGG P tiípp l88S II8S fl;S iS M 88IS iÍS 3S *8ifflÉ 88P $ÍS ÍI8B S P 6S 8ilto8h81^8i8IS S 8ÍÍ$8fc($3 i \ X X C ;TG TA XX X A A X C C X íX X A X C X A G X aGXXa ;ATGtGCXAXGXX.TAA ACXX'AGTCT GAGXAXC ATGAAAAOA GACITGALXGAXXXñAGACAa jGGG'GGG:X7\G:GXXAGTGGAAG0;GGCAGCCAGCGGAGA.:GGTAC/\AGAACACT
CAGCCCATCATGGACACAGATGGCTCTTACTTCGTCTACAGCAAGCTCAATGTGCAGAAGAGCAACTGGGAG
g c a g g a a a t a c t t t c a c c t g c t c t g t g t t a c a t g a g g g c c t g c a c a a c c a c c a t a c t g a g a a g a g c c t c t c c
Figure imgf000030_0002
Las regiones individuales de la secuencia codificada de la cadena pesada de ratón se resaltan alternando texto sombreado/texto sin sombrear. Posiciones: 1-57 = secuencia líder; 58-147 = región marco (HFR1); 148-162 = región determinante de complementariedad (HCDR1); 163-204 = HFR2; 205-255 = HCDR2; 256-351 = HFR3; 352-378 = HCDR3; 379-411 = h Fr 4; 412-1383 = regiones constantes (CH1-CH3); 703-741 = región de bisagra (subrayado); 1384­ 1386 = codón de parada.
Secuencia consenso de ADN de cadena ligera Kappa de ratón AM-4 MIL-38 (SEQ ID NO:2)
AIAAGTGGGCTCAÍGA'AGATA f;TGGCGGTGCGlACTGCGATGGCTTACAGGTGCCAGA:~:’G:LiGACATCCAGATG
ACTCAGTCTCCAGCCTCCCTATCTGCATCTGTGGGAGAAACTGTCACCATCACATGT
Figure imgf000031_0001
GTTCAOIGVA'ATTGAGÜATGGTATCAGCAGAAACAGGGAAAATCTCCTCAACTCCTGGTCTATACTGCAAAA
ACCGAAGCAGArGGTGTGCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGAACACAATATTCTCTCAAGATCAAT AGCCTGCAGCCTGAAGATTTTGGGACTTATTACTGTCAACATTTTTAAa C'JAATGCGTGGACGTTCGGTGGA
GGCACCAAGCTGGAAATCAAACGGGCTG/AYPGYGCACCAACTGTATCCATCTTCCCACCATCCAGTGAGCAG
TTAAGA\:G:TGGAGG",GCC2!,CAGTCGTGTGC'TTCT"'G7^CAAGTTCT/!CCGCAíj'iGA|G7!.TCiV'-,.rGTCAAG,¡,GO AftC?A;YGATGGCAGTGAACG?'jGAAAATGGCGTARRG:AACÁYGTTGGACTGATCAGGACAGCAAAvGACACA7ACC TACAGG AJTAYGTA&AArOAIGftCGTTGACCAAGGAí GÁÜTAT&ÁAA7AGAAAACAAAr7AAGCTGTGAGGC;C ACTC:ACAA7;AGA'A2A:GjTTCACCCA77;7:GA;;/AA;?iCG‘:TGGAA(::A(-;GAA!í:GAGT¡vrTAG
Las regiones individuales de la secuencia codificada de la cadena ligera del ratón se resaltan alternando texto sombreado/texto sin sombrear. Posiciones: 1-60 = secuencia líder; 61-129 = región marco (LFR1); 130-162 = región determinante de complementariedad (LCDR1); 163-207 = LFR2; 208-228 = LCDR2; 229-324 = LFR3; 325-351 = LCDR3; 352-381 LFR4; 382-702 = regiones constantes (CK); 703-705 = codón de parada.
Las secuencias consenso de ADN de la cadena pesada AM-4 MIL-38 y ligera anteriores se traducen a las siguientes secuencias de aminoácidos de la cadena pesada y la cadena ligera:
Secuencia consenso de aminoácidos de cadena pesada IgG1 de ratón AM-4 MIL-38 (SEQ ID NO:3)
MAWVWTLLFLMAAAQSIQAQIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYAFTDYSMNWVKQAPGKGLRWMGWINT
ETGEPTYTDDFKGRFAFSLETSASTAFLQINNLRNEDTATYFCARHYDYGGFPYWGQGTLVTVSAAKTTPPS
VYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSET
VTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVWDISKDDPEVQ
FSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAP
QVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWE
Figure imgf000031_0002
Las regiones individuales de la secuencia de cadena pesada de IgG1 de ratón se indican en la secuencia de aminoácidos anterior. Posiciones 1-19 = secuencia líder; 20-49 = región marco (HFR1); 50-54 = región determinante de complementariedad 1 (HCD1); 55-68 = HFR2; 69-85 = HCDR2; 86-117 = HFR3; 118-126 = HCDR3; 127-137 = HFR4 (también llamada región de unión o región J); 138-461 = regiones constantes de la cadena de IgG1 (CHI - CH3) y codón de parada (* *). Región de bisagra: está subrayada en la secuencia anterior.
Secuencia consenso de aminoácidos de cadena ligera AM-4 MIL-38 (SEQ ID NO:4)
MSVLTQVLALLLLWLTGARCDIQMTQSPASLSASVGETVTITCRASGNVHNYLAWYQQKQGKSPQLLVYTAK
TLADGVPSRFSGSGSGTQYSLKINSLQPEDFGTYYCQHFWSNPWTFGGGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSEQ
LTSGGASWCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEA
THKTSTSPIVKSFNRNEC *
Las regiones individuales de la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera se indican como marcadas: Posiciones 1­ 20 = secuencia líder; 21-43 = región marco (LFR1); 44-54 = región determinante de complementariedad 1 (LCDR1); 55­ 69 = LFR2; 70-76 = LCDR2; 77-108 = LFR3; 109-117 = LCDR3; 118-127 = LFR4; 128-234 = región constante kappa (CK) y codón de parada (*)
La comparación de la secuencia de consenso entre las secuencias de secuenciación 224945 (1-O) y 449295-1 (Alfio I) mostró que las secuencias para la cadena ligera y la cadena pesada eran idénticas (véase las alineaciones de secuencias a continuación). Como estas secuencias son consistentes entre la población biclonal (1-O) y la población de Alfio I tipo AM-4, se denominan "secuencias consenso de AM-4" como anteriormente.
1.Alineamiento de cadena ligera: alineamiento de Biclonal vs AM-4 (Alfio I) vs AM-3 (Alfio III
Res-Itaces de afeamiento de cacena ligera ce 224945 y 449295
I3EQ K> N
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- - ------ « ,- -
I3EQ K> NO: 4) ¿4*135-1: Cadera lisera de ‘ tío I - » iSEQ O NO: B) ¿¿*295-5: Cadera líje la de *no II O í------ pWSsüsjtew sjrc«fes«:v «a .íi> ^;5 r¿ s»eH B 'íl*f Ol MílSKJsqía^rTvBti.!;;# ‘i'SaívurgS'a j r r » s - 3 * ' j » ? - * 7 ! r c i r . s s f - m ¿ y # , 7 5 1 se ................5.0................... _..y.).S._...............1.1.D............... ?.2.C .........1.3..0..................
(8EQ ID NO: 4) 224945-1: Cadena lisera ae 1-0 encinal ¡TI) í47 ? jy l3 ,.'M 7 F ji'5S 3S 3T C > rs:.* ::'» iM s.:r3?y^?¿!iíW :^?»{T . r.'.-JF -rn isiR B A c;1*S T ' s i í í ???£•; (8EQ ID NO: 4) 449295-1: canena ligera oe Ano I !H| A r í t ii - '.-E A r - 'a : - - .A.. :aV»: * : E l . ; : - > > 7 R « J* IU Ú » M X V M r# í * « Q ÍSEQ ID NO: <1449295-5: Cadena lisera de Ano ■ (K |A ív a Y iS V . - íL fS e -íiS ír cS l . ií- > t .. - s E - .. i iE i r j f c c .d " i r t l* r i . iT i s e i i i a a a f tA s r r íF P f í s s E Q - ■■■■■ ■■■■— — ■ - — Soaclún 3 (149) 149__________ 160__________170________JW _________ 190 ..............200 _________210_______ 222 (SEO ID NO: 41224915-1: Cadena ligera de 1-0 odgl-al 145) ÍTSSS ¡k¿V:TtÍ N~TTpT.riSirXÍ-'ÍÍ.YceSSP.iSST£ÍFJlJTIiÓESStí7"2í.!i¿£ ÍT*:.TK&e'íE?.H>rSYTJEJkIv (SEO ID NO: 4| 449295-1: Cadene ligera oe I jn o I 1451 i t a s k ■- v r : t r : . ? •. c r n sv r . ?,i c i a e f ; : - r - ¿x - ; i t e íc s r c s rv 4 rs s ít k á s i i í k ; »«•?: a t .1 (SEO O NO: 6| 449295-5 Cadena ligera oe Ajnc II 149) Í.IE S -1 S ÍF J .« ¡!rV ÍX £ IS !''ír .'fX it- iiE B .2 :;S V n ííW ja O -E « t íTV3!tSS9E?t,rr-t'»'ÍE!1KSS'í £ 2iS.ru -----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Stertini ■'2?3j Jíí_. !J9
ISEQ » N O :4 ) 224945-1: Callera lisera He 1-C « tuna l (219) S rs ríS IV T .9 FU SU) E 2
ISEQ ID NO: 4 ) 445295-1: Cadera ligera de Ajile I
ISEQ ID NO: ai 445295-5: cadera ligera se Ajile II (219) KrSTSPXT.* T-p.yBC
(223) R is ^ s p r '. 'T é fírp rr :
2.Alineamiento de cadena pesada: Biclonal vs AM-4 (Alfio I. No pudo determinarse la secuencia traducida de AM-3 (AlfioD
Resaltados de a f eamierto de cadena pesaca de 224945 y 449295.apr
Figure imgf000032_0002
AM-3 secuencias consenso
No pudo obtenerse una secuencia de cadena pesada consistente de las células Alfio II de tipo AM-3. La secuencia de la cadena ligera obtenida de la ejecución de secuenciación 449295-5 (Alfio II) se obtuvo consistentemente y mostró diferencias claras tanto en las regiones marco como en las regiones determinantes de la complementariedad en comparación con la secuencia para las otras dos ejecuciones de secuenciación como se muestra en la alineación anterior (véase "1. Alineación de la cadena ligera" anterior).
Secuencia consenso de ADN de la cadena ligera AM-3 MIL-38 Kappa (SEQ ID NO:5)
;VG GG A A> A A A G G VA AG A AT A A A G G A ' T A G A GG' A A';: A GP 7>/pA A A A G A G G :'G XG ■ A A7;: A - A A A A-, G T G T : A - A T ' A ■ A
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a AGCÁYC\AG0AGC/L\ACAGCATGAGCAGGA0CpGTCACC-7TGGGCA?\GGACGGV:.TATCXAAC(GACAG!G\ACAGCTá T AGGTGTGAGGCa YAC7CACAAG.s .CATA .AACGr'rOACGGÁTGGTCAAGAGCj'TCGGC AGGAATGAGTGTTAG
* Las regiones individuales de la secuencia codificada de la cadena ligera se resaltan alternando texto sombreado/texto sin sombrear. Posiciones: 1-72 = secuencia líder; 73-141 = región marco (LFR1); 142-174 = región determinante de complementariedad (LCDR1); 175-219 = LFR2; 220-240 = LCDR2; 241-336 = LFR3; 337-363 = LCDR3; 364-393 = LFR4; 394-714 = región constante (CK); 715-717 = codón de parada
Secuencia consenso de aminoácidos de cadena ligera AM-3 MIL-38 (SEQ ID NO: 6)
MGIKMESQTQVFVYMLLWLSGVDGDIVMTQSQKFMSTSIGDRVSVTCKASONVGSHVAWFQQKPGQSPKALI
YSASYRYSGVTDRFTGSGSGTDFTLTINNVQSEDLAEYFCQQYNSFPFTFGSGTKLEIKRADAAPTVSIFPP
SSEQLTSGGASWCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNS:a7TDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSY T C EAT HKT S T S P I 'VKSFNRNEC *
Las regiones individuales de la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera se indican como marcadas: Posiciones 1­ 24 = secuencia líder; 25-47 = región marco (LFR1); 48-58 = región determinante de complementariedad 1 (LCDR1); 59­ 73 = LFR2; 74-80 = LCDR2; 81-112 = LFR3; 113-121 = LCDR3; 122-131 = LFR4; 132-238 = región constante kappa (CK) y codón de parada (*)
Ejemplo 5: preparación y prueba de anticuerpos MIL-38 quiméricos
5.1 Materiales y procedimientos
- Preparación de anticuerpos quiméricos
Se desarrollaron dos secuencias de ADNc optimizadas para fines de clonación. Estos se basaron en las secuencias consenso de la cadena pesada y la cadena ligera AM-4 identificadas anteriormente en
Ejemplo 4.
La primera secuencia de ADNc optimizada se usó en la generación de una secuencia de cadena pesada quimérica humano-ratón:
Secuencia de ADNc optimizada con codón CHO #1 - cadena pesada quimérica humana de ratón 1.404 pb (SEQ ID NO:7)
Figure imgf000034_0001
GATAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAriCGjTGTTGJTGAAPGTAGCGTtG^ TGíAAGGAGÍTO^ TGCAGAACCACTAC S ÍB f i Í Í l iW S Í Í Í Í Í i i i f l i i Í i lM S i8 ® I^ P lT ga
Las regiones individuales de la secuencia codificada de la cadena pesada quimérica humana-ratón se resaltan alternando texto sombreado/texto sin sombrear. Posiciones: 1-57 = secuencia líder; 58-147 = región marco (FR1); 148­ 162 = región determinante de complementariedad (CDR1); 163-204 = FR2; 205-255 = CDR2; 256-351 = FR3; 352-378 = CDR3; 379-411 = FR4; 412-1401 = regiones constantes humanas (CH1-CH3); 706-750 = región de bisagra (subrayada); 1402-1405 = codón de parada.
La segunda secuencia de ADNc optimizada generada se usó en la generación de un cadena ligera quimérica humanaratón secuencia:
Secuencia de ADNc optimizada con codón CHO #2 - cadena ligera quimérica humana de ratón 705 pb (SEQ ID NO:8)
ATGAGíGGi-GCTGACCG'AGCGI'GCTGGCCGTGCTGCGGCTGTGGCTGACCGGAGCCCCGrTGCGACATCCAGATG
Figure imgf000034_0002
Las regiones individuales de la secuencia codificada de la cadena ligera quimérica humana-ratón se resaltan alternando texto sombreado/texto sin sombrear. Posiciones: 1-60 = secuencia líder; 61-129 = región marco (LFR1); 130-162 = región determinante de complementariedad (LCDR1); 163-207 = LFR2; 208-228 = LCDR2; 229-324 = LFR3; 325-351= LCDR3; 352-381 = LFR4; 382-702 = región constante humana (CK); 703-705 = codón de parada.
Las cadenas Ch1-Ch3 de MIL-38 quimérico ratón humano se expresaron transitoriamente en células CHO-3E7 en suspensión usando medio sin suero, seguido de una purificación en un solo paso.
Las células CHO-3E7 se cultivaron en medio de expresión FreeStyle™ CHO sin suero (Life Technologies, Carlsbad, CA, Estados Unidos). Las células se mantuvieron en matraces Erlenmeyer (Corning Inc., Acton, MA) a 37 °C con 5 % de CO2 en un agitador orbital (VWR Scientific, Chester, PA). El día de la transfección, el ADN y la PEI (Polysciences, Eppelheim, Alemania) se mezclaron en una proporción óptima y después se añadieron al matraz con células listas para la transfección. El sobrenadante recogido el día 6 se usó para purificación adicional.
El caldo de cultivo celular se centrifugó y después se filtró. El sobrenadante filtrado se cargó en una columna CIP de proteína A de 5 ml (GenScript, núm. de cat. L00433) a 3,0 ml/min. Después de lavar y eluir con tampón apropiado, las fracciones se recogieron y neutralizaron con Tris-HCl 1M, pH 9,0. La proteína purificada se analizó por s DS-PAGE, la transferencia Western usando protocolos estándar para mediciones de peso molecular, rendimiento y pureza.
- Ensayos de anticuerpos MIL-38 quiméricos (inmunofluorescencia de diapositivas)
El anticuerpo MIL-38 quimérico se usó en ensayos de inmunofluorescencia con células DU-145. La preparación 33A de MIL-38 murino se usó como control positivo para la tinción de antígeno GPC-1, mientras que Cetuximab (un anticuerpo quimérico dirigido al EGFR) se usó como control positivo para la tinción de regiones constantes de IgG humana. Se usó una placa sin anticuerpo primario como control negativo. La tinción se realizó esencialmente como se describe en la Sección 1.1, con la excepción de que los anticuerpos secundarios se marcaron con Alexafluor 488 y que los anticuerpos antihumanos se usaron para teñir las muestras quiméricas y cetuximab.
- transferencias Western de MIL-38 quimérico
La reactividad del MIL-38 quimérico y el MIL-38 murino frente a los extractos de MPEK DU-145 y C3, así como al antígeno GPC-1 recombinante producido por NSO, se ensayó mediante transferencia Western. Los ensayos de la transferencia Western se sondearon con MIL-38 murino o MIL-38 quimérico. El MIL-38 quimérico fue detectado por un anticuerpo secundario antihumano de cabra seguido por un anticuerpo HRP de oveja anti-cabra. Como control, el MIL-38 murino fue detectado por un anticuerpo secundario anti-ratón de cabra seguido de un anticuerpo HRP de oveja anti­ cabra. Se observaron reactividades equivalentes para MIL-38 quimérico y MIL-38 murino cuando se detectaron en condiciones equivalentes. La Figura 9A muestra una transferencia Western sondeada con MIL-38 murino, seguido de anticuerpo secundario anti-HRP de ratón. La Figura 9B muestra una transferencia Western sondeada con MIL-38 quimérico, seguido de anticuerpo secundario antihumano de cabra. El complejo se detectó usando un anticuerpo HRP de oveja anti-cabra. La Figura 9C muestra una transferencia Western sondeada con MIL-38 murino, seguido de anticuerpo de ratón antihumano de cabra. El complejo se detectó usando un anticuerpo HRP de oveja anti-ratón.
5.2 Resultados
- Expresión de secuencias de anticuerpos quiméricos
Los plásmidos recombinantes que codifican la cadena pesada y la cadena ligera de la cadena CH1-CH3 humana de MIL-38 quimérico de ratón se transfectaron transitoriamente en cultivos de células en suspensión CHO-3E7. La proteína diana se capturó del sobrenadante del cultivo celular mediante una columna de 5 ml de Proteína A CIP y se siguió con el intercambio de tampón. La proteína purificada se analizó por SDS-PAGE y la transferencia Western como se muestra en las Figuras 7A y 7B. Se cargaron 3 |jg de muestra en SDS-PAGE y se cargaron 0,3 |jg de proteína total en la transferencia Western. El anticuerpo primario para la transferencia Western fue IgG-HRP anti-humano de cabra (GenScript, núm. de cat. A00166).
- Secuencias de anticuerpos quiméricos
La secuencia optimizada de ADNc #1 (SEQ ID NO:7) se usó para generar una cadena pesada de anticuerpo MIL-38 quimérico con la siguiente secuencia de aminoácidos:
Secuencia quimérica de cadena CH1-CH3 humana de MIL-38 de ratón y una secuencia de cadena CH1-CH3 humana de VH de ratón (cadena pesada) (SEQ ID NO:9)
MAWVWTLLFLMAAAQSIQ&QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYAFTDYSMNWVKQAPGKGLRWMGÍÍINT
ETGEPTYTDDFKGRFAFSLETSASTAFLQINNLRNEDTATYFCARHYDYGGFPYWGQGTLVTVSSASTKGPS
VFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQ
TYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSH
EDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNS.TYRWS.VLTVLH.QDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK
GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV
DKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK*
Las regiones individuales de la secuencia de cadena pesada quimérica humana-ratón se indican en la secuencia de aminoácidos anterior: Posiciones 1-19 = secuencia líder; 20-49 = región marco (HFR1); 50-54 = región determinante de complementariedad 1 (HCD1); 55-68 = HFR2; 69-85 = HCDR2; 86-117 = HFR3; 118-126 = HCDR3; 127-137 = HFR4 (también llamada región de unión o región J); 138-467 = regiones constantes de cadena IgG1 (CH1-CH3), y codón de parada (*). Secuencia de bisagras: la secuencia de bisagra de cadena pesada de IgGl humana se subraya anteriormente.
Secuencia optimizada de ADNc #2 (SEQ ID NO:8) se usó para generar una cadena ligera de anticuerpos MIL-38 quiméricos con la siguiente secuencia de aminoácidos:
Secuencia quimérica de cadena ligera Kappa de ratón humano MIL-38: Secuencia VK-CK humana de ratón (SEQ ID NO:10)
MSVLTQVLALLLLWLTGAKCDIQMTQSPASLSASVGETVTITCRASGNVHNYLAWYQQKQGKSPQLLVYTAK
TLADGVPSRFSGSGSGTQYSLKINSLQPEDFGTYYCQHFWSNPWTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQ
LKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEV
THQGLSSPVTKSFNRGEC*
Las regiones individuales de la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera quimérica humana-ratón se indican como se marca: Posiciones 1-20 = secuencia líder; 21-43 = región marco (LFR1); 44-54 = región determinante de complementariedad 1 (LCDR1); 55-69 = LFR2; 70-76 = LCDR2; 77-108 = LFR3; 109-117 = LCDR3; 118-127 = LFR4; 128-234 = región constante kappa (CK) y codón de parada (*)
- Ensayos de anticuerpos MIL-38 quiméricos (inmunofluorescencia de diapositivas)
Las Figuras 8A-D muestran imágenes de campo brillante de células. La Figura 8E muestra la tinción del control positivo 33A. La Figura 8F muestra la tinción del anticuerpo MIL-38 quimérico. La Figura 8G muestra la tinción de un control positivo de anticuerpo monoclonal quimérico (ratón/humano) (Cetuximab) comercial, y la Figura 8H muestra la tinción de control negativo de anticuerpo no primario. Se observó una fuerte tinción en las Figuras 8E, F y G y no se observó tinción en Figura 8H. Estos resultados demuestran que el anticuerpo MIL-38 quimérico se une con éxito a las células DU-145 en IFA, lo que indica que se ha mantenido la especificidad de unión del anticuerpo MIL-38 murino parental.
- Ensayos de anticuerpos quiméricos MIL-38 (transferencia Western)
La Figura 9A muestra una transferencia Western sondeada con MIL-38 murino, seguido de anticuerpo secundario anti-HRP de ratón. El tiempo de exposición para la transferencia Western mostrada en la Figura 9A fue de 30 segundos. La Figura 9B muestra una transferencia Western sondeada con MIL-38 quimérico, seguido de anticuerpo secundario antihumano de cabra. El complejo se detectó con el uso de un anticuerpo HRP de oveja y cabra. El tiempo de exposición para la transferencia Western mostrada en la Figura 9B fue de 30 minutos. La Figura 9C muestra una transferencia Western sondeada con MIL-38 murino, seguido de anticuerpo anti-ratón de cabra. El complejo se detectó con el uso de un anticuerpo HRP de oveja y cabra. El tiempo de exposición para la transferencia western mostrada en la Figura 9C fue de 30 minutos.
El anti-ratón MIL-38 murino reconoce el antígeno en los lisados DU-145 y GPC-1 NS0 recombinante. No se observó reactividad en los lisados C3 como se esperaba (Figura 9A).
Se requirió un procedimiento de detección de tres anticuerpos para evaluar la reactividad del MIL-38 quimérico con extractos DU-145 y C3, así como NS0 GPC-1 recombinante (Figura 9B). También se realizó una transferencia western de control usando un procedimiento de detección de tres anticuerpos con MIL-38 murino (Figura 9C). Cuando se usó un procedimiento de detección de tres anticuerpos, la detección fue mucho menos sensible que usar el procedimiento

Claims (14)

REIVINDICACIONES
1. Una población de anticuerpos monoclonales aislada que comprende:
primeros anticuerpos y/o fragmentos de unión al antígeno de los mismos, en la que los primeros anticuerpos y/o fragmentos de unión al antígeno de los mismos comprenden:
(a) una región variable de la cadena pesada que comprende:
una región determinante de complementariedad 1 (CDR1) que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos definida por las posiciones 50-54 de la SEQ ID NO: 3;
una región determinante de complementariedad 2 (CDR2) que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos definida por las posiciones 69-85 de la SEQ ID NO: 3;
una región determinante de complementariedad 3 (CDR3) que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos definida por las posiciones 118-126 de la SEQ ID NO: 3; y y
(b) una región variable de la cadena ligera que comprende:
una región determinante de complementariedad 1 (CDR1) que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos definida por las posiciones 44-54 de la SEQ ID NO: 4;
una región determinante de complementariedad 2 (CDR2) que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos definida por las posiciones 70-76 de la SEQ ID NO: 4;
una región determinante de complementariedad 3 (CDR3) que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos definida por las posiciones 109-117 de la SEQ ID NO: 4;
y en la que la población de anticuerpos no contiene segundos anticuerpos que comprend len una región variable de la cadena ligera que comprende:
una región determinante de complementariedad 1 (CDR1) que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos definida por las posiciones 48-58 de la SEQ ID NO: 6;
una región determinante de complementariedad 2 (CDR2) que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos definida por las posiciones 74-80 de la SEQ ID NO: 6;
una región determinante de complementariedad 3 (CDR3) que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos definida por las posiciones 113-121 de la SEQ ID NO: 6,
2 La población de anticuerpos de acuerdo con la reivindicación 1, en la que los primeros anticuerpos y/o fragmentos de unión al antígeno de los mismos son de isotipo IgG1.
3. La población de anticuerpos según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en la que los primeros anticuerpos y/o fragmentos de unión al antígeno de los mismos son uno o más de anticuerpos humanizados, anticuerpos quiméricos, anticuerpos multiméricos y/o anticuerpos sintéticos.
4. La población de anticuerpos de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que los fragmentos de unión al antígeno son uno o más de fragmentos variables de cadena sencilla (scFv), fragmentos de dominio variable (Fv), fragmentos de unión al antígeno de fragmento (Fab), F (ab) 2 fragmentos, péptidos o fragmentos proteolíticos que contienen una región de unión al epítopo.
5. La población de anticuerpos de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que los primeros anticuerpos y/o fragmentos de unión al antígeno de los mismos comprenden además:
(a) una o más regiones variables de la cadena pesada FR (regiones marco) como se define por una secuencia seleccionada de uno o más de: los residuos 20-49 de SEQ ID NO: 3, los residuos 55-68 de la SEQ ID NO: 3, los residuos 86-117 de la SEQ ID NO: 3, los residuos 127-137 de la SEQ ID NO: 3; y/o
(b) una o más regiones variables de la cadena ligera FR (regiones marco) como se define por una secuencia seleccionada de uno o más de: los residuos 21-43 de la SEQ ID NO: 4, los residuos 55-69 de la SEQ ID NO: 4, los residuos 77-108 de la SEQ ID NO: 4, los residuos 118-127 de la SEQ ID NO: 4.
6. La población de anticuerpos de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que los primeros anticuerpos y/o fragmentos de unión al antígeno de los mismos comprenden además uno cualquiera o más de: (a) una secuencia de dominio constante de la cadena pesada tal como se define por las posiciones 138-461 de la SEQ ID NO: 3;
(b) una secuencia de dominio constante de la cadena ligera tal como se define por las posiciones 128-234 de la SEQ ID NO: 4;
(c) una región de bisagra.
7. La población de anticuerpos de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que los primeros anticuerpos comprenden o consisten en una secuencia de cadena pesada como se define por las posiciones 20-461 de la SEQ ID NO: 3 y una secuencia de cadena ligera como se define por las posiciones 21-234 de la SEQ ID NO: 4.
8. Células de hibridoma capaces de producir la población de anticuerpos de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.
9. Las células de hibridoma de acuerdo con la reivindicación 8, en las que las células de hibridoma se depositan en Cellbank Australia con el número de acceso CBA20140026.
10. Una molécula de ácido nucleico que codifica al menos uno de los primeros anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno de los mismos de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.
11. La molécula de ácido nucleico aislada de conformidad con la reivindicación 10, en la que la molécula de ácido nucleico comprende la secuencia como se expone en la SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2.
12. Un procedimiento de producción de anticuerpos monoclonales o fragmentos de unión al antígeno de los mismos, en el que el procedimiento comprende cultivar las células de hibridoma de acuerdo con la reivindicación 8 o la reivindicación 9 en un medio de cultivo en condiciones adecuadas para producir de ese modo el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo.
13. Un procedimiento para obtener células de hibridoma de acuerdo con la reivindicación 8 o la reivindicación 9 de una población mixta de hibridomas, el procedimiento comprende aislar al menos una porción de las células de hibridoma de una población mixta de hibridomas, en el que la población mixta de hibridomas se deposita en la Colección Americana de Cultivos Tipos de Tejidos (ATCC) con el número de acceso HB11785.
14. La población de anticuerpos de acuerdo con la reivindicación 3, en la que los primeros anticuerpos y/o fragmentos de unión al antígeno de los mismos son anticuerpos quiméricos que comprenden:
(a) una región constante de la cadena pesada que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos como se define en los residuos 138-467 de la s Eq ID NO: 9; y
(b) una región constante de la cadena ligera que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos como se define en los residuos de 128-234 de la SEQ ID NO: 10.
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