ES2748021T3

ES2748021T3 - Proteínas de unión a Fn14 y usos de las mismas

Info

Publication number: ES2748021T3
Application number: ES12826494T
Authority: ES
Inventors: Nicholas Johannes Hoogenraad; Amelia Jane Johnston; John Silke
Original assignee: La Trobe University
Current assignee: La Trobe University
Priority date: 2011-08-23
Filing date: 2012-08-23
Publication date: 2020-03-12
Anticipated expiration: 2032-08-23
Also published as: US20200002430A1; AU2012300191A1; JP2014529597A; CA2845946A1; EP2748203A4; US20150218278A1; US10287359B2; AU2012300191B2; EP2748203A1; HK1198832A1; US9006397B2; EP2748203B1; US20200239586A1; US20180057599A1; US20130273036A1; US20170029519A1; WO2013026099A1; SG2014010334A

Abstract

Una proteína de unión a Fn14 que comprende un dominio de unión a antígeno de un anticuerpo anti-Fn14 para uso en el tratamiento o prevención de caquexia que está asociada con otra afección, en donde la proteína de unión a Fn14 se une a un péptido que consiste en la secuencia establecida en SEQ ID NO: 56, reduce la señalización de NFκB inducida por Tweak en una célula HEK293T que expresa Fn14, y en donde la proteína de unión a Fn14 comprende al menos una región variable de cadena pesada (VH) y una región variable de cadena ligera (VL), en donde VH y VL se unen para formar un Fv que comprende el dominio de unión a antígeno, y en donde el Fv comprende uno cualquiera de los siguientes: (i) una VH que comprende, según lo determinado de acuerdo con el sistema de numeración Kabat, las CDR 1, 2 y 3 de una VH que comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 15 y una VL que comprende, según lo determinado de acuerdo con el sistema de numeración Kabat, las CDR 1, 2 y 3 de una VL que comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 22; (ii) una VH que comprende, según lo determinado de acuerdo con el sistema de numeración Kabat, las CDR 1, 2 y 3 de una VH que comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 16 y una VL que comprende, según lo determinado de acuerdo con el sistema de numeración Kabat, las CDR 1, 2 y 3 de una VL que comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 23; y (iii) una VH que comprende, según lo determinado de acuerdo con el sistema de numeración Kabat, las CDR 1, 2 y 3 de una VH que comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 19 y una VL que comprende, según lo determinado de acuerdo con el sistema de numeración Kabat, las CDR 1, 2 y 3 de una VL que comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 26.

Description

DESCRIPCIÓN

Proteínas de unión a Fn14 y usos de las mismas

DATOS DE LA SOLICITUD RELACIONADA

Esta solicitud reivindica la prioridad de la Solicitud de Patente de Estados Unidos 61/526.599 titulada "Proteínas de unión a Fn14 y usos de las mismas" presentada el 23 de agosto de 2011.

LISTADO DE SECUENCIAS

La presente solicitud se presenta con un Listado de Secuencias en forma electrónica.

Campo

La presente divulgación se refiere a proteínas de unión a Fn14 que comprenden dominios de unión a antígeno de anticuerpos anti-Fn14 y sus usos y métodos de tratamiento, prevención, diagnóstico o pronóstico de diversas afecciones incluyendo los trastornos de desgaste, como caquexia.

Antecedentes

Factor de crecimiento de fibroblastos Inducible 14

El factor de crecimiento de fibroblastos inducible 14 (Fn14, también conocido como inductor débil del receptor de apoptosis similar a TNF [Tweak-R] o TNFRSF12A), es un miembro de la superfamilia de receptores del factor de necrosis tumoral. La expresión de Fn14 está regulada por factores de crecimiento in vitro e in vivo como respuesta a una lesión, regeneración e inflamación tisulares. Como sugiere uno de los nombres de Fn14, esta proteína es un receptor para la proteína denominada Tweak. La unión de Tweak a Fn14, o sobreexpresión constitutiva de Fn14, activa la ruta de señalización de NPkB, que se sabe que desempeña un papel importante en los procesos inmunes e inflamatorios, oncogénesis y resistencia a la terapia del cáncer. Esta interacción también controla muchas actividades celulares que incluyen, proliferación, migración, diferenciación, apoptosis, angiogénesis e inflamación. Tweak y Fn14 también están involucrados en la reparación de tejidos y la regulación de funciones inmunes y crecimiento tumoral. Por tanto, la señalización mediada por Fn14 está involucrada en vías que desempeñan un papel importante en las enfermedades humanas. Se ha sugerido que la señalización mediada por Fn14 desempeña un papel en numerosas enfermedades, incluyendo, cáncer, metástasis, trastornos inmunológicos (incluyendo enfermedades autoinmunes, rechazo a injerto y enfermedad de injerto contra hospedador y afecciones neurológicas crónicas y agudas [incluyendo apoplejía]).

Fn14 se expresa por muchos tipos de células no linfoides (epiteliales, mesenquimales, células endoteliales y neuronas), por muchas células progenitoras de tejido, incluyendo todas las células progenitoras del linaje mesenquimatoso. Esta proteína es altamente inducible por factores de crecimiento, por ejemplo, en suero que se encuentran in vivo en sitios de lesiones tisulares y/o remodelación tisular. Como consecuencia la expresión de Fn14 es relativamente baja en la mayoría de los tejidos sanos, pero aumenta en tejidos lesionados y/o enfermos.

El documento WO 2009/140177 describe anticuerpos y fragmentos de los mismos que se unen a Fn14 y que se proponen para inducir la muerte de células tumorales.

Basándose en la descripción anterior, el experto en la materia sabrá que los compuestos que se unen a Fn14 son deseables. Estos compuestos se pueden usar para tratar, prevenir, diagnosticar o pronosticar afecciones mediadas por Fn14. Además, es deseable identificar y comprender mejor el papel de Fn14 en diversas afecciones y enfermedades biológicas. En particular, el papel de Fn14 en los trastornos de desgaste no se ha demostrado previamente.

Trastornos de desgaste

Los trastornos de desgaste son una clase de trastornos que se caracterizan por la pérdida progresiva de uno o más tejidos, por ejemplo, músculo y/o grasa. Los trastornos de desgaste pueden clasificarse en dos tipos: (i) aquellos en donde el tejido que se pierde es el sitio del trastorno (por ejemplo, distrofia muscular); y (ii) trastornos de desgaste asociados con otras afecciones o causados por ellas. Este último tipo puede estar asociado con una variedad de afecciones, incluyendo enfermedad de neuronas motoras, denervación, y envejecimiento. Los trastornos de desgaste asociados con otros trastornos también incluyen una subclase de trastornos de desgaste conocidos como caquexia.

La caquexia es un trastorno metabólico asociado con una enfermedad subyacente (es decir, una afección) y se caracteriza por la pérdida de peso corporal y pérdida de músculo con o sin pérdida de masa grasa. La caquexia generalmente se asocia con un mayor catabolismo proteico debido a enfermedades subyacentes. Los factores contribuyentes al inicio de la caquexia son la anorexia y las alteraciones metabólicas (por ejemplo, aumento del estado inflamatorio, aumento de la proteólisis muscular y disminución de carbohidratos, metabolismo de proteínas y lípidos). Las afecciones asociadas a la caquexia incluyen, pero no se limitan a, cáncer, ciertas enfermedades infecciosas (por ejemplo, tuberculosis, SIDA), algunos trastornos autoinmunes (como caquexia neuropática diabética y caquexia reumatoide), o la adicción a drogas como las anfetaminas o la cocaína, alcoholismo crónico y cirrosis hepática. La caquexia debilita físicamente a los pacientes a un estado de inmovilidad derivado de la pérdida de apetito, astenia y anemia, y la respuesta al tratamiento estándar suele ser deficiente. La caquexia se ve regularmente asociada con el cáncer, y en ese contexto se llama "caquexia por cáncer". También se observan síndromes caquécticos en pacientes que sufren trastornos, como, pero no limitados a enfermedad renal, insuficiencia cardiaca congestiva, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, diabetes y algunos casos graves de esquizofrenia pueden presentar este trastorno donde se denomina caquexia vesánica.

Una forma común de caquexia está asociada con el cáncer. En este sentido, la caquexia es una de las manifestaciones más comunes de cáncer y está presente en hasta el 80 % de los pacientes con cáncer avanzado, incluyendo, pero no limitado a cánceres de mama, pulmón, colon, próstata, páncreas y tracto gastrointestinal. La caquexia también está presente inicialmente en la progresión del cáncer con, por ejemplo, 85 % de pacientes con cánceres gastrointestinales, 83 % de pacientes con cáncer de páncreas y 60 % de pacientes con cáncer de pulmón que presentan caquexia al momento del diagnóstico. La caquexia representa > 20 % de todas las muertes relacionadas con el cáncer y se asocia con una movilidad reducida, mayor riesgo de complicaciones en la cirugía, respuesta alterada a la quimioterapia/radioterapia, disminución del tiempo de supervivencia y aumento de la angustia psicológica, conduciendo a una reducción general en la calidad de vida de los enfermos. En la actualidad, el único tratamiento definitivo de la caquexia por cáncer es la extirpación del tumor causante. A falta de conseguir este objetivo, que a menudo se ve comprometido por la incapacidad de los pacientes para tolerar tratamientos contra el cáncer debido a su caquexia, se han tomado varias medidas para mejorar la caquexia, sin embargo con un éxito limitado. Se han administrado varios agentes en intentos de retrasar o detener la caquexia progresiva en pacientes con cáncer. Estos agentes incluyen agentes orexigénicos (estimulantes del apetito), corticoesteroides, cannabinoides, antagonistas de serotonina, agentes procinéticos, andrógenos y agentes anabólicos, agentes anticitoquinas, fármacos antiinflamatorios no esteroideos y reguladores del ritmo circadiano.

Será evidente para los expertos en la materia a partir de lo anterior que la identificación de proteínas de unión a Fnl4 mejoradas para el tratamiento médico y de diagnóstico sería útil. Además, el tratamiento de los trastornos de desgaste, como caquexia, es una importante necesidad médica no satisfecha. Así, existe una necesidad en la técnica de terapias que puedan mejorar, retrasar o prevenir los trastornos de desgaste, incluyendo, pérdida involuntaria de peso corporal, caquexia, pérdida de masa muscular y/o grasa, debilidad y/o fatiga asociada con uno o más trastornos. De manera deseable, tales terapias reducen la mortalidad y/o mejoran y/o prolongan la calidad de vida de los pacientes, que puede ayudar con métodos terapéuticos y/o profilácticos, por ejemplo, para tratar una afección que causa o está asociada con el trastorno de desgaste.

Sumario

Los inventores han producido una clase de anticuerpos que se unen específicamente a Fn14 y reducen la señalización de NF^kB inducida por Tweak en una célula que expresa Fnl4. Por tanto, estos anticuerpos son antagonistas de una actividad mediada por Tweak a través de Fnl4. Los anticuerpos identificados por los inventores son capaces de antagonizar o reducir varias actividades mediadas por Tweak (por ejemplo, señalización de NFkB y/o muerte celular Kyml inducida por Tweak). Los anticuerpos identificados por los inventores no inducen la señalización de NFkB cuando se unen a Fnl4, por ejemplo, en ausencia de Tweak, lo que significa que estos anticuerpos podrían evitar efectos secundarios indeseables en situaciones en las que es deseable el tratamiento de afecciones mediadas por Tweak usando anticuerpos contra Fnl4. Esta diferencia funcional no solo proporciona un beneficio práctico, sino que también distingue los anticuerpos producidos por los inventores de varios anticuerpos anti-Fnl4 conocidos que pueden sufrir efectos secundarios indeseables (por ejemplo, ITEM-1, ITEM-2 e ITEM-3 y derivados de los mismos).

Algunos anticuerpos identificados por los inventores son capaces de inducir o agonizar algunas actividades mediadas por Tweak, como secreción de citoquinas (por ejemplo, secreción de interleuquina (IL)-8).

Los inventores también han determinado que los anticuerpos se unen a un epítopo, por ejemplo, un epítopo conformacional, contenido dentro de una región común del dominio extracelular de Fnl4. Además, los inventores encontraron que diferentes restos dentro del epítopo estaban involucrados en la unión de diferentes subclases de anticuerpos. Al realizar estos análisis, los inventores determinaron que podían distinguir los anticuerpos particularmente efectivos en el tratamiento de las condiciones de desgaste (como se discute a continuación) de los anticuerpos que fueron ineficaces o menos eficaces en función de los restos de aminoácidos involucrados dentro del epítopo en la unión del anticuerpo.

Al desarrollar modelos animales para caracterizar los anticuerpos que produjeron, los inventores se sorprendieron al descubrir que los ratones administrados con células tumorigénicas que expresan ectópicamente Fnl4 desarrollaron caquexia severa. Los inventores también determinaron que una clase de anticuerpos que modulan la actividad de Fn14 es capaz de tratar la caquexia, incluyendo la inducción de aumento de peso en un sujeto después de la progresión de la caquexia. Tras una caracterización adicional de este hallazgo, los inventores determinaron que los anticuerpos estaban ejerciendo un efecto terapéutico al unirse y modular la señalización de Fnl4 en las células tumorales. Así, modulando la señalización de Fnl4 en un tumor, los inventores inducían un efecto positivo en un tejido distinto, por ejemplo, músculo esquelético.

Los inventores han ampliado estos estudios para mostrar que los anticuerpos anti-Fnl4 que produjeron eran capaces de prevenir o retrasar la caquexia en un modelo de ratón con cáncer de colon. Un anticuerpo probado por los inventores también fue capaz de reducir el tamaño de los tumores en los ratones.

Los inventores demostraron además que una clase de anticuerpos era capaz de extender la vida de un sujeto que padecía cáncer y/o caquexia.

Los inventores también han demostrado que un anticuerpo que han producido impide la capacidad del cáncer de invadir el tejido, tal como músculo, indicando utilidad en la prevención de invasión de tejidos o metástasis de cáncer. Los inventores ampliaron aún más sus estudios al mostrar que podían reducir o prevenir el desgaste muscular en un modelo de ratón de desgaste/caquexia inducido por diabetes. Estos datos indican que los inventores han producido anticuerpos útiles para el tratamiento o prevención de una variedad de trastornos de desgaste.

Al tratar ratones que padecen diabetes con un anticuerpo, los inventores observaron que los ratones mostraron una ingesta reducida de agua y niveles de glucosa en sangre en comparación con los ratones diabéticos no tratados. La presente invención proporciona una proteína de unión a Fn14 que comprende un dominio de unión a antígeno de un anticuerpo anti-Fn14 para usar en el tratamiento o prevención de la caquexia que está asociada con otra afección, en donde la proteína de unión a Fn14 se une a un péptido que consiste en la secuencia establecida en SEQ ID NO: 56, reduce la señalización de NF^kB inducida por Tweak en una célula HEK293T que expresa Fn14, y en donde la proteína de unión a Fn14 comprende al menos una región variable de cadena pesada (VH) y una región variable de cadena ligera (VL), en donde VH y VL se unen para formar un Fv que comprende el dominio de unión a antígeno, y en donde el Fv comprende uno cualquiera de los siguientes:

(i) una VH que comprende, según lo determinado de acuerdo con el sistema de numeración Kabat, las CDR 1, 2 y 3 de una VH que comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 15 y una VL que comprende, según lo determinado de acuerdo con el sistema de numeración Kabat, las CDR 1, 2 y 3 de una VL que comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 22;

(ii) una VH que comprende, según lo determinado de acuerdo con el sistema de numeración Kabat, las CDR 1, 2 y 3 de una V^hque comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 16 y una VL que comprende, según lo determinado de acuerdo con el sistema de numeración Kabat, las CDR 1, 2 y 3 de una VL que comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 23; y

(iii) una VH que comprende, según lo determinado de acuerdo con el sistema de numeración Kabat, las CDR 1, 2 y 3 de una VH que comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 19 y una VL que comprende, según lo determinado de acuerdo con el sistema de numeración Kabat, las CDR 1, 2 y 3 de una VL que comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 26.

La invención también proporciona un anticuerpo anti-Fn14 que comprende cualquiera de los siguientes:

(i) una Vh que comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 15 o una versión humanizada, sinhumanizada o desinmunizada de la misma y una Vl que comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 22 o una versión humanizada, sinhumanizada o desinmunizada de la misma;

(ii) una VH que comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 16 o una versión humanizada, sinhumanizada o desinmunizada del mismo y una VL que comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 23 o una versión humanizada, sinhumanizada o desinmunizada de la misma;

(iii) una VH que comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 19 o una versión humanizada, versión sinhumanizada o desinmunizada del mismo y una VL que comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 26 o una versión humanizada, sinhumanizada o desinmunizada de la misma;

(iv) una VH que comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 20 o una versión humanizada, sinhumanizada o desinmunizada de la misma y una VL que comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 27 o una versión humanizada, sinhumanizada o desinmunizada de la misma; o

(v) una VH que comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 21 o una versión humanizada, sinhumanizada o desinmunizada de la misma y una VL que comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 28 o una versión humanizada, sinhumanizada o desinmunizada de la misma.

Así, la presente divulgación proporciona diversos reactivos para diagnosticar/pronosticar/tratar/prevenir afecciones mediadas por Fn14, incluyendo afecciones de desgaste, como caquexia. La presente divulgación también proporciona métodos para tratar o prevenir afecciones de desgaste, tales como caquexia o invasión de tejidos o metástasis de cáncer.

En un ejemplo, la presente divulgación proporciona una proteína de unión a Fn14 que comprende un dominio de unión a antígeno, en donde el dominio de unión a antígeno se une específicamente a Fn14 y en donde la proteína antagoniza al menos un efecto de señalización de Fn14 mediado por Tweak, y en donde la proteína no induce detectablemente el efecto de señalización de Fn14 mediado por Tweak cuando se pone en contacto con una célula que expresa Fn14 en ausencia de Tweak. En un ejemplo, el dominio de unión a antígeno es o se deriva de una proteína de unión a Fn14 que no es anticuerpo.

En un ejemplo, la presente divulgación proporciona una proteína de unión a Fn14 que comprende un dominio de unión a antígeno de un anticuerpo anti-Fn14, en donde el dominio de unión a antígeno se une específicamente a Fn14 y en donde la proteína antagoniza al menos un efecto de señalización de Fn14 mediado por Tweak, y en donde la proteína no induce detectablemente el efecto de señalización de Fn14 mediado por Tweak cuando se pone en contacto con una célula que expresa Fn14 en ausencia de Tweak.

En un ejemplo, la actividad mediada por Tweak es la señalización de NFkB inducida por Tweak en una célula y/o la muerte de células Kyml inducida por Tweak.

En un ejemplo, la presente divulgación proporciona una proteína de unión a Fn14 que comprende un dominio de unión a antígeno, en donde el dominio de unión a antígeno se une específicamente a Fn14 y en donde la proteína de unión a Fn14 reduce la señalización de NFkB inducida por Tweak en una célula que expresa Fn14, y en donde la proteína de unión a Fn14 no induce de manera detectable la señalización de NFkB cuando se pone en contacto con una célula que expresa Fn14 en ausencia de Tweak.

En un ejemplo, la presente divulgación proporciona una proteína de unión a Fnl4 que comprende un dominio de unión a antígeno de un anticuerpo anti-Fnl4, en donde el dominio de unión a antígeno se une específicamente a Fnl4 y en donde la proteína de unión a Fnl4 reduce la señalización de NF^kB inducida por Tweak en una célula que expresa Fnl4, y en donde la proteína de unión a Fnl4 no induce de manera detectable la señalización de NFkB cuando se pone en contacto con una célula que expresa Fnl4 en ausencia de Tweak.

Por ejemplo, La señalización de NF^kB se detecta en una célula (por ejemplo, una célula HEK293T) que comprende una proteína fluorescente que codifica un ácido nucleico unida operativamente a un promotor que facilita la expresión génica como resultado de la unión de NFkB. Por ejemplo, la señalización de NFkB se detecta mediante clasificación celular activada por fluorescencia. La señalización de NF^kB inducida por Tweak puede inducirse poniendo en contacto la célula con Tweak (por ejemplo, aproximadamente 100 ng o 200 ng de Tweak) en presencia o ausencia de la proteína. En un ejemplo, la proteína de unión a Fnl4 reduce o previene la señalización de NFkB inducida por Tweak (por ejemplo, inducida por 100 ng o 200 ng de Tweak) a una concentración de 100 ng/ml o 1 |jg/ml.

Por ejemplo, la proteína de unión a Fnl4 se une específicamente a un epítopo en Fn14 que comprende restos contenidos dentro de la secuencia establecida en SEQ ID NO: 34.

En un ejemplo, la proteína de unión a Fnl4 no se une de manera detectable a un polipéptido que comprende una región de Fnl4, la región que consiste en una secuencia establecida en SEQ ID NO: 33 o 46. Por ejemplo, el polipéptido se muestra en la superficie de un fago.

En un ejemplo, la proteína de unión a Fnl4 no se une de manera detectable a un péptido que consiste en una secuencia establecida en la SEQ ID NO: 33 o 46.

En un ejemplo, la proteína de unión a Fnl4 se une a un dominio extracelular de Fnl4 que comprende una prolina o alanina sustituida por la arginina en la posición 56 de SEQ ID NO: 1. En un ejemplo, la proteína de unión a Fnl4 se une a un dominio extracelular de Fnl4 que comprende una prolina o alanina sustituida por la arginina en la posición 56 de SEQ ID NO: 1 a un nivel similar o sustancialmente igual al que se une a un dominio extracelular de Fn14 (por ejemplo, que comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 2). Por ejemplo, la proteína de unión a Fnl4 se une a un péptido que consiste en la secuencia establecida en SEQ ID NO: 52 o 54 opcionalmente que comprende además seis restos de histidina en un extremo, por ejemplo, a un nivel similar o sustancialmente igual al que se une a un dominio extracelular de Fnl4 (por ejemplo, que comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 2). En un ejemplo, el nivel de unión se evalúa inmovilizando el péptido y poniendo en contacto el péptido con la proteína de unión a Fnl4. Las proteínas de unión a Fnl4 ejemplares descritas en el presente documento que tienen tales características de unión comprenden las regiones variables y/o CDR de un anticuerpo designado CRCBT-06-001, CRCBT-06-002 o CRCBT-06-005. Así, en un ejemplo, la proteína de unión a Fnl4 se une a un péptido que consiste en la secuencia establecida en SEQ ID NO: 52 o 54 (opcionalmente con seis restos de histidina adicionales en un extremo) a un nivel similar o sustancialmente igual o con un nivel similar o sustancialmente misma afinidad que un anticuerpo designado CRCBT-06-001 o CRCBT-06-002 o CRCBT-06-005. En otro ejemplo, la proteína de unión a Fnl4 inhibe competitivamente la unión de un anticuerpo designado CRCBT-06-001 o CRCBT-06-002 o CRCBT-06-005 a un péptido que consiste en la secuencia establecida en SEQ ID NO: 52 o 54 (opcionalmente con un seis restos de histidina adicionales en un extremo).

En un ejemplo, la proteína de unión a Fnl4 se une a un dominio extracelular de Fnl4 que comprende una alanina sustituida por la arginina en la posición 58 de SEQ ID NO: 1. En un ejemplo, la proteína de unión a Fnl4 se une a un dominio extracelular de Fn14 que comprende una alanina sustituida por la arginina en la posición 58 de SEQ ID NO: 1 a un nivel similar o sustancialmente igual al que se une a un dominio extracelular de Fn14 (por ejemplo, que comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 2). Por ejemplo, la proteína de unión a Fnl4 se une a un péptido que consiste en la secuencia establecida en SEQ ID NO: 56 que opcionalmente comprende además seis restos de histidina en un extremo, por ejemplo, a un nivel similar o sustancialmente igual al que se une a un dominio extracelular de Fn14 (por ejemplo, que comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 2). En un ejemplo, el nivel de unión se evalúa inmovilizando el péptido y poniendo en contacto el péptido con la proteína de unión a Fnl4 o expresando el péptido en la superficie de un fago y poniendo en contacto el fago con una proteína de unión a Fn14 inmovilizada. Las proteínas de unión a Fnl4 ejemplares descritas en el presente documento que tienen tales características de unión comprenden las regiones variables y/o CDR de un anticuerpo designado CRCBT-06-001, CRCBT-06-002 o CRCBT-06-005. Así, en un ejemplo, la proteína de unión a Fnl4 se une a un péptido que consiste en la secuencia establecida en SEQ ID NO: 56 (opcionalmente con seis restos de histidina adicionales en un extremo) a un nivel similar o sustancialmente igual o con una afinidad similar o sustancialmente igual como un anticuerpo designado CRCBT-06-001 o CRCBT-06-002 o CRCBT-06-005. En otro ejemplo, la proteína de unión a Fnl4 inhibe competitivamente la unión de un anticuerpo designado CRCBT-06-001 o CRCBT-06-002 o CRCBT-06-005 a un péptido que consiste en la secuencia establecida en SEQ ID NO: 56 (opcionalmente con seis adicionales restos de histidina en un término).

En un ejemplo, la proteína de unión a Fnl4 se une a un dominio extracelular de Fnl4 que comprende una alanina sustituida por la histidina en la posición 60 de SEQ ID NO: 1. En un ejemplo, la proteína de unión a Fnl4 se une a un dominio extracelular de Fn14 que comprende una alanina sustituida por la histidina en la posición 60 de SEQ ID NO: 1 a un nivel similar o sustancialmente igual al que se une a un dominio extracelular de Fn14 (por ejemplo, que comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 2). Por ejemplo, la proteína de unión a Fnl4 se une a un péptido que consiste en la secuencia establecida en SEQ ID NO: 63 que opcionalmente comprende además seis restos de histidina en un extremo, por ejemplo, a un nivel similar o sustancialmente igual al que se une a un dominio extracelular de Fn14 (por ejemplo, que comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 2). En un ejemplo, el nivel de unión se evalúa inmovilizando el péptido y poniendo en contacto el péptido con la proteína de unión a Fnl4. Las proteínas de unión a Fnl4 ejemplares descritas en el presente documento que tienen tales características de unión comprenden las regiones variables y/o CDR de un anticuerpo designado CRCBT-06-001 o CRCBT-06-002. Así, en un ejemplo, la proteína de unión a Fnl4 se une a un péptido que consiste en la secuencia establecida en SEQ ID NO: 63 (opcionalmente con seis restos de histidina adicionales en un extremo) a un nivel similar o sustancialmente igual o con una afinidad similar o sustancialmente igual como un anticuerpo designado CRCBT-06-001 o CRCBT-06-002. En otro ejemplo, la proteína de unión a Fnl4 inhibe competitivamente la unión de un anticuerpo designado CRCBT-06-001 o CRCBT-06-002 a un péptido que consiste en la secuencia establecida en SEQ ID NO: 63 (opcionalmente con seis restos de histidina adicionales en un extremo).

En un ejemplo, la proteína de unión a Fn14 se une a un péptido que consiste en la secuencia establecida en SEQ ID NO: 48 (opcionalmente con seis restos de histidina adicionales en un extremo). En un ejemplo, la proteína de unión a Fnl4 se une a un péptido que consiste en la secuencia establecida en SEQ ID NO: 48 (opcionalmente con seis restos de histidina adicionales en un extremo) a un nivel similar o sustancialmente igual al que se une a un dominio extracelular de Fn14 (por ejemplo, que comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 2). En un ejemplo, el nivel de unión se evalúa inmovilizando el péptido y poniendo en contacto el péptido con la proteína de unión a Fn14. Las proteínas de unión a Fnl4 ejemplares descritas en el presente documento que tienen tales características de unión comprenden las regiones variables y/o CDR de un anticuerpo designado CRCBT-06-001 o CRCBT-06-002. Así, en un ejemplo, la proteína de unión a Fnl4 se une a un péptido que consiste en la secuencia establecida en SEQ ID NO: 48 (opcionalmente con seis restos de histidina adicionales en un extremo) a un nivel similar o sustancialmente igual o con una afinidad similar o sustancialmente igual como un anticuerpo designado CRCBT-06-001 o CRCBT-06-002. En otro ejemplo, la proteína de unión a Fnl4 inhibe competitivamente la unión de un anticuerpo designado CRCBT-06-001 o CRCBT-06-002 a un péptido que consiste en la secuencia establecida en SEQ ID NO: 48 (opcionalmente con seis restos de histidina adicionales en un extremo).

En un ejemplo, la proteína de unión a Fnl4 se une a un dominio extracelular de Fnl4 que comprende una alanina sustituida por el triptófano en la posición 42 de SEQ ID NO: 1. En un ejemplo, la proteína de unión a Fnl4 se une a un dominio extracelular de Fnl4 que comprende una alanina sustituida por el triptófano en la posición 42 de SEQ ID NO: 1 a un nivel similar o sustancialmente igual al que se une a un dominio extracelular de Fnl4 (por ejemplo, que comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 2). Por ejemplo, la proteína de unión a Fnl4 se une a un péptido que consiste en la secuencia establecida en SEQ ID NO: 57 que opcionalmente comprende además seis restos de histidina en un extremo, por ejemplo, a un nivel similar o sustancialmente igual al que se une a un dominio extracelular de Fn14 (por ejemplo, que comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 2). En un ejemplo, el nivel de unión se evalúa inmovilizando el péptido y poniendo en contacto el péptido con la proteína de unión a Fnl4. Las proteínas de unión a Fnl4 ejemplares descritas en el presente documento que tienen tales características de unión comprenden las regiones variables y/o CDR de un anticuerpo designado CRCBT-06-001, CRCBT-06-002 o CRCBT-06-004. Así, en un ejemplo, la proteína de unión a Fnl4 se une a un péptido que consiste en la secuencia establecida en SEQ ID NO: 57 (opcionalmente con seis restos de histidina adicionales en un extremo) a un nivel similar o sustancialmente igual o con una afinidad similar o sustancialmente igual como un anticuerpo designado CRCBT-06-001 o CRCBT-06-002 o CRCBT-06-004. En otro ejemplo, la proteína de unión a Fnl4 inhibe competitivamente la unión de un anticuerpo designado CRCBT-06-001 o CRCBT-06-002 o CRCBT-06-004 a un péptido que consiste en la secuencia establecida en SEQ ID NO: 57 (opcionalmente con seis adicionales restos de histidina en un término).

En un ejemplo, la proteína de unión a Fnl4 se une a un dominio extracelular de Fnl4 que comprende una de las siguientes sustituciones de aminoácidos (numeración relativa a SEQ ID NO: 1) T33N, A34S, R38S, R56P, L77M, R56A, R56K, R58A, W42A, L46A, D51A, S54A, A57G, P59A, H60A, S61A, D62A, F63A, L65A o H60K. En un ejemplo, el nivel de unión es similar o sustancialmente el mismo nivel que la proteína de unión a Fnl4 que se une a un dominio extracelular de Fnl4 (por ejemplo, que comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 2).

En un ejemplo, la proteína de unión a Fnl4 se une a un dominio extracelular de Fnl4 que comprende una o más sustituciones de aminoácidos seleccionadas individual o colectivamente del grupo que consiste en (numeración relativa a la SEQ ID NO: 1) T33N, A34S, R38S, R56P, L77M, R56A, R56K, R58A, W42A, L46A, D51A, S54A, A57G, P59A, H60A, S61A, D62A, F63A, L65A o H60K. En un ejemplo, el nivel de unión es similar o sustancialmente el mismo nivel que la proteína de unión a Fnl4 que se une a un dominio extracelular de Fnl4 (por ejemplo, que comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 2).

En un ejemplo, la proteína de unión a Fnl4 es capaz de unirse a un péptido que consiste en una secuencia establecida en cualquiera de SEQ ID NOs: 49-68, opcionalmente con seis restos de histidina adicionales en un extremo.

En un ejemplo, la proteína de unión a Fnl4 es capaz de unirse a una serie de péptidos, en donde la serie comprende péptidos que tienen todas las secuencias establecidas en cualquiera de las SEQ ID NOs: 49-68, opcionalmente con seis restos de histidina adicionales en un extremo.

En un ejemplo, la proteína de unión a Fnl4 es capaz de unirse a un péptido que consiste en una secuencia establecida en SEQ ID NOs: 47, opcionalmente con seis restos de histidina adicionales en un extremo.

En un ejemplo, la proteína de unión a Fnl4 es capaz de unirse a un péptido que consiste en una secuencia establecida en SEQ ID NO: 48, opcionalmente con seis restos de histidina adicionales en un extremo.

En un ejemplo, la proteína de unión a Fnl4 se une a un péptido que consiste en una secuencia establecida en SEQ ID NO: 35 en una cantidad dentro del 75% de la cantidad de unión de un anticuerpo que comprende una Vh que comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 19 y una V^lque comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 26. En un ejemplo, la cantidad de proteína o anticuerpo unido se evalúa poniendo en contacto la proteína de unión a Fn14 a un péptido que consiste en la secuencia establecida en SEQ ID NO: 35 y una cantidad de la proteína de unión a Fnl4 (por ejemplo, 2 pg/ml) introducida en contacto con el péptido. Luego se determina la cantidad de proteína de unión a Fnl4 unida al péptido y se compara con la cantidad de un anticuerpo que comprende una Vh que comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 19 y una Vl que comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 26 unida al péptido. En un ejemplo, la cantidad de proteína de unión a Fnl4 unida al péptido está dentro de aproximadamente 73 % o 60 % o 45 % de la cantidad de anticuerpo unido.

En un ejemplo, la proteína de unión a Fnl4 se une a un péptido que consiste en una secuencia establecida en SEQ ID NO: 34 en una cantidad dentro del 80% de la cantidad unida por un anticuerpo que comprende una Vh que comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 15 y una Vl que comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 22 o que comprende una V^hque comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 16 y una V^lque comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 23. En un ejemplo, la cantidad de proteína o anticuerpo unido se evalúa poniendo en contacto la proteína de unión a Fnl4 a un péptido que consiste en la secuencia establecida en SEQ ID NO: 34 y una cantidad de la proteína de unión a Fnl4 (por ejemplo, 5ng/ml) introducida en contacto con el péptido. Luego se determina la cantidad de proteína de unión a Fnl4 unida al péptido y se compara con la cantidad de anticuerpo unido al péptido. En un ejemplo, la cantidad de proteína de unión a Fnl4 unida al péptido está dentro de aproximadamente 50 % o 48 % o 45 % o 40 % de la cantidad de anticuerpo unido.

La presente divulgación también proporciona proteína de unión a Fnl4 que comprende un dominio de unión a antígeno de un anticuerpo anti-Fnl4, en donde el dominio de unión a antígeno se une específicamente a un péptido que comprende restos de un epítopo unido por anticuerpos identificados por los inventores. Por ejemplo, la divulgación proporciona una proteína de unión a Fnl4 que comprende un dominio de unión a antígeno de un anticuerpo anti-Fnl4, en donde el dominio de unión a antígeno se une específicamente a Fn14, en donde el dominio de unión a antígeno se une a un epítopo en Fnl4 que comprende restos contenidos dentro de la secuencia establecida en SEQ ID NO: 34.

Por ejemplo, el dominio de unión a antígeno se une específicamente a un epítopo en Fnl4 que comprende restos contenidos dentro de una o más secuencias establecidas en SEQ ID NOs: 3 a 9 o 34.

En un ejemplo, la proteína de unión a Fnl4 se une a un epítopo conformacional en Fnl4. Por ejemplo, el epítopo conformacional depende de la formación de enlaces disulfuro dentro de Fnl4. Por ejemplo, el epítopo conformacional unido por la proteína de unión a Fnl4 no está presente en una proteína Fnl4 que carece de enlaces disulfuro, por ejemplo, Fnl4 en forma reducida.

En un ejemplo, la proteína de unión a Fnl4 no se une sustancialmente a Fnl4 en forma reducida o en forma reducida y alquilada. En un ejemplo, la proteína de unión a Fnl4 no se une sustancialmente a un polipéptido que comprende un dominio extracelular de Fnl4 fusionado a una región Fc de un anticuerpo, en donde el polipéptido se reduce o se reduce y alquila. Por ejemplo, la unión se detecta realizando un ensayo de inmunoabsorción unida a enzimas (ELISA) para detectar la unión de la proteína de unión a Fnl4 al polipéptido inmovilizado.

Por ejemplo, la proteína de unión a Fnl4 no se une de manera detectable a Fnl4 en forma reducida o en forma reducida y alquilada. En un ejemplo, la proteína de unión a Fnl4 no se une de manera detectable a un polipéptido que comprende un dominio extracelular de Fn14 fusionado a una región Fc de un anticuerpo, en donde el polipéptido se reduce o se reduce y alquila.

En un ejemplo, la proteína de unión a Fnl4 reduce la secreción de interleuquina-8 (IL-8) inducida por Tweak desde una célula (es decir, tiene actividad antagonista de la secreción de IL-8), por ejemplo, una célula de melanoma humano A375. En un ejemplo, la proteína de unión a Fnl4 (por ejemplo, a una concentración de aproximadamente 10 |jg/ml) reduce la secreción de IL-8 por las células de melanoma A375 (por ejemplo, aproximadamente 1x104 células) en contacto con Tweak fusionado a la región Fc de un anticuerpo (por ejemplo, a una concentración de aproximadamente 300 ng/ml). Un anticuerpo ejemplar que tiene dicha actividad comprende las regiones variables o CDR de un anticuerpo seleccionado entre el grupo que consiste en CRCBT-06-002, CRCBT-06-005 y CRCBT-06-007 o anticuerpos que comprenden CDR de los mismos.

En el caso de CRCBT-06-005, el anticuerpo es, por ejemplo, IgG2b de ratón (el equivalente de IgG3 humana). En este sentido, los inventores han demostrado que CRCBT-06-005 y CRCBT-06-006 tienen regiones V muy similares, sin embargo, difieren en el isotipo y la actividad (por ejemplo, CRCBT-06-006 [IgG2a de ratón, equivalente de IgG1 humana] es un agonista de la secreción de IL-8 inducida por Tweak).

En un ejemplo, la proteína de unión a Fnl4 tiene un nivel de antagonismo de al menos aproximadamente 80 % o 90 % o 100 % cuando se evalúa usando la siguiente ecuación (b-d)/(b-a), donde a = la cantidad de IL-8 secretada en presencia de 10 jg/ml de anticuerpo, b = la cantidad de IL-8 secretada en presencia de 300 ng/ml de Tweak-Fc, c = la cantidad de IL-8 secretada por las células en ausencia de anticuerpos o Tweak-Fc, d = la cantidad de IL-8 secretada en presencia de 10 jg/ml de anticuerpo y 300 ng/ml de Tweak-Fc.

En un ejemplo, la proteína de unión a Fnl4 induce la secreción de interleuquina-8 (IL-8) inducida por Tweak desde una célula (es decir, tiene actividad agonista de secreción de IL-8), por ejemplo, una célula de melanoma humano A375 cuando la célula se pone en contacto con la proteína de unión a Fnl4 en ausencia de Tweak. En un ejemplo, la proteína de unión a Fnl4 (por ejemplo, a una concentración de aproximadamente 10, 1, 0,1 o 0,01 jg/ml) induce la secreción de IL-8 por las células de melanoma A375 (por ejemplo, aproximadamente 1x104 células) en ausencia de Tweak. Un anticuerpo ejemplar que tiene dicha actividad comprende las regiones variables o CDR de un anticuerpo seleccionado entre el grupo que consiste en CRCBT-06-001 y CRCBT-06-006.

En un ejemplo, la proteína de unión a Fnl4 tiene un nivel de agonismo de al menos aproximadamente 80 % o 90 % cuando se evalúa usando la siguiente ecuación (a-c)/(b-c), donde a = la cantidad de IL-8 secretada en presencia de 10 jg/ml de anticuerpo, b = la cantidad de IL-8 secretada en presencia de 300 ng/ml de Tweak-Fc, c = la cantidad de IL-8 secretada por las células en ausencia de anticuerpos o Tweak-Fc, d = la cantidad de IL-8 secretada en presencia de 10 jg/ml de anticuerpo y 300 ng/ml de Tweak-Fc.

En un ejemplo, la proteína de unión a Fnl4 retrasa o previene la pérdida de peso tras la administración a un sujeto que padece cáncer o caquexia por cáncer o diabetes o caquexia inducida por diabetes.

En un ejemplo, la proteína de unión a Fnl4 se une a una proteína que comprende un dominio extracelular de Fnl4 fusionado a una región Fc de un anticuerpo con una constante de disociación de afinidad (Kd) de 2 nM o menos, como, 1,5 nM o menos, por ejemplo, 1 nM o menos. En un ejemplo, la K^dse evalúa inmovilizando la proteína de unión a Fnl4 (por ejemplo, un Fab o un anticuerpo) y evaluando la unión de una región extracelular de Fn14 fusionada a un Fc a la proteína de unión a Fn14 inmovilizada usando resonancia de plasmones superficiales.

En un ejemplo, la K^destá entre aproximadamente 0,01 nM y aproximadamente 2 nM, tal como entre aproximadamente 0,05 nM y aproximadamente 1 nM, por ejemplo, entre aproximadamente 0,1 nM a aproximadamente 1 nM, por ejemplo, entre aproximadamente 0,5 nM a aproximadamente 1 nM. En un ejemplo, la Kd se evalúa inmovilizando la proteína de unión a Fnl4 (por ejemplo, un Fab o un anticuerpo) y evaluando la unión de una región extracelular de Fnl4 fusionada a un Fc a la proteína de unión a Fnl4 inmovilizada usando resonancia de plasmones superficiales.

Una proteína de unión a Fnl4 ejemplar de la descripción tiene una Kre de aproximadamente 0,9 nM (por ejemplo, /-0,1 nM) para una proteína que comprende un dominio extracelular de Fn14 fusionado a una región Fc de un anticuerpo. Otra proteína de unión a Fnl4 ejemplar de la descripción tiene una K^dde aproximadamente 0,7 nM (por ejemplo, /- 0,1 nM) para una proteína que comprende un dominio extracelular de Fn14 fusionado a una región Fc de un anticuerpo.

En un ejemplo, la proteína de unión a Fnl4 se une a Fn14 humana recombinante con una Kd de 0,6 nM o menos. En un ejemplo, la proteína de unión a Fnl4 se une a Fn14 humana recombinante con una K^dde 1 nM o menos, como, 0,9 nM o menos, por ejemplo, 0,8 nM o menos, por ejemplo, 0,7 nM o menos, por ejemplo, 0,6 nM o menos. En un ejemplo, la Kd se evalúa inmovilizando la proteína de unión a Fnl4 (por ejemplo, un Fab o un anticuerpo) y evaluando la unión de Fnl4 recombinante humano a la proteína de unión a Fnl4 inmovilizada usando resonancia de plasmones superficiales.

En un ejemplo, la Kd está entre aproximadamente 0,01 nM y 1 nM, tal como entre aproximadamente 0,05 nM y 0,9 nM, por ejemplo, entre aproximadamente 0,09 nM y 0,7 nM, por ejemplo, entre aproximadamente 0,1 nM y 0,6 nM. Una proteína de unión a Fnl4 ejemplar de la descripción tiene una K^dde aproximadamente 0,5 nM (por ejemplo, /-0,1 nM) para Fnl4 humano recombinante. Por ejemplo, la proteína de unión a Fn-14 es CRCBT-06-001 o un anticuerpo que comprende el dominio de unión a antígeno, regiones variables o CDR de los mismos.

Otra proteína de unión a Fnl4 ejemplar de la descripción tiene una K^dde aproximadamente 0,2 nM (por ejemplo, /-0,1 nM) para Fnl4 humano recombinante. Por ejemplo, la proteína de unión a Fn-14 es CRCBT-06-002 o un anticuerpo que comprende el dominio de unión a antígeno, regiones variables o CDR de los mismos.

En un ejemplo, la proteína de unión a Fnl4 se une a una proteína que comprende un dominio extracelular de Fnl4 fusionado a una región Fc de un anticuerpo con una tasa de activación (Ka) de 5x103 M 'V o mayor, como aproximadamente 2x103 M 'V 1 o mayor, por ejemplo, aproximadamente 1,5x104 M 'V 1 o mayor. En un ejemplo, la Ka se evalúa inmovilizando la proteína de unión a Fnl4 (por ejemplo, un Fab o un anticuerpo) y evaluando la unión de una región extracelular de Fnl4 fusionada a un Fc a la proteína de unión a Fnl4 inmovilizada usando resonancia de plasmones superficiales.

Por ejemplo, la Ka mide entre 5x103 M-1s-1 a aproximadamente 5x105 M-1s-1, por ejemplo, entre aproximadamente 1 x104 M-1s-1 a aproximadamente 4x105 M-1s-1, por ejemplo, entre aproximadamente 2x104 M-1s-1 a aproximadamente 4x105 M-1s-1. En un ejemplo, la Ka se evalúa inmovilizando la proteína de unión a Fnl4 (por ejemplo, un Fab o un anticuerpo) y evaluando la unión de una región extracelular de Fnl4 fusionada a un Fc a la proteína de unión a Fnl4 inmovilizada usando resonancia de plasmones superficiales.

Una proteína de unión a Fnl4 ejemplar de la descripción tiene una Ka de aproximadamente 2,2 x 104 M-1s-1. Una proteína de unión a Fnl4 ejemplar adicional de la descripción tiene una Ka de aproximadamente 3,9x105 M-1s-1. En un ejemplo, la Ka se evalúa inmovilizando la proteína de unión a Fnl4 (por ejemplo, un Fab o un anticuerpo) y evaluando la unión de una región extracelular de Fnl4 fusionada a un Fc a la proteína de unión a Fnl4 inmovilizada usando resonancia de plasmones superficiales.

En un ejemplo, la proteína de unión a Fnl4 se une a Fn14 humana recombinante con una Ka de 1 x105 M-1s-1 o mayor, como aproximadamente 1,2x105 M-1s-1 o mayor, por ejemplo, aproximadamente 1,3x105 M-1s-1 o mayor. En un ejemplo, la Ka se evalúa inmovilizando la proteína de unión a Fnl4 (por ejemplo, un Fab o un anticuerpo) y evaluando la unión de Fnl4 humano recombinante a la proteína de unión a Fnl4 inmovilizada usando resonancia de plasmones superficiales.

Por ejemplo, la Ka está entre aproximadamente 1 x105 M-1s-1 a aproximadamente 3,5x105 M-1s-1. En un ejemplo, la Ka se evalúa inmovilizando la proteína de unión a Fnl4 (por ejemplo, un Fab o un anticuerpo) y evaluando la unión de Fnl4 humano recombinante a la proteína de unión a Fnl4 inmovilizada usando resonancia de plasmones superficiales.

Una proteína de unión a Fnl4 ejemplar de la descripción tiene una Ka de aproximadamente 1,8x105 M-1s-1 para recombinante humano Fnl4. Por ejemplo, la proteína de unión a Fn-14 es CRCBT-06-001 o un anticuerpo que comprende el dominio de unión a antígeno, regiones variables o CDR de los mismos. En un ejemplo, la Ka se evalúa inmovilizando la proteína de unión a Fnl4 (por ejemplo, un Fab o un anticuerpo) y evaluando la unión de Fnl4 humano recombinante a la proteína de unión a Fnl4 inmovilizada usando resonancia de plasmones superficiales. Una proteína de unión a Fnl4 ejemplar adicional de la descripción tiene una Ka de aproximadamente 1,3x105 M-1s-1 para recombinante humano Fnl4. Por ejemplo, la proteína de unión a Fn-14 es CRCBT-06-002 o un anticuerpo que comprende el dominio de unión a antígeno, regiones variables o CDR de los mismos. En un ejemplo, la Ka se evalúa inmovilizando la proteína de unión a Fnl4 (por ejemplo, un Fab o un anticuerpo) y evaluando la unión de Fnl4 humano recombinante a la proteína de unión a Fnl4 inmovilizada usando resonancia de plasmones superficiales.

En un ejemplo, la proteína de unión a Fnl4 se une a una proteína que comprende un dominio extracelular de Fnl4 fusionado a una región Fc de un anticuerpo con una tasa de desactivación (Kd) de 9x10-5 s-1 o menos, como, 7x10-5 s-1 o menos, por ejemplo, 6x10-5 s-1 o menos, por ejemplo, 5,5x10-5 s-1 o menos. En un ejemplo, la Kd se evalúa inmovilizando la proteína de unión a Fnl4 (por ejemplo, un Fab o un anticuerpo) y evaluando la unión de una región extracelular de Fnl4 fusionada a un Fc a la proteína de unión a Fnl4 inmovilizada usando resonancia de plasmones superficiales.

Por ejemplo, la Kd está entre aproximadamente 1x10-4 s-1 a aproximadamente 1x10-5 s-1, por ejemplo, entre aproximadamente 6x10-5 s-1 a aproximadamente 1 x10-5 s-1, por ejemplo, entre aproximadamente 5,5x10-5 s-1 a aproximadamente 1,4x10-5 s-1, por ejemplo, entre aproximadamente 2x10-5 s-1 a aproximadamente 1,4x10-5 s-1. En un ejemplo, la Kd se evalúa inmovilizando la proteína de unión a Fnl4 (por ejemplo, un Fab o un anticuerpo) y evaluando la unión de una región extracelular de Fnl4 fusionada a un Fc a la proteína de unión a Fn14 inmovilizada usando resonancia de plasmones superficiales.

Una proteína ejemplar de la divulgación tiene una Kd de aproximadamente 1,85x10-5 s-1. Una proteína de unión a Fnl4 ejemplar adicional de la descripción tiene una Kd de aproximadamente 1,45x10-5 s-1. En un ejemplo, la Kd se evalúa inmovilizando la proteína de unión a Fnl4 (por ejemplo, un Fab o un anticuerpo) y evaluando la unión de una región extracelular de Fn14 fusionada a un Fc a la proteína de unión a Fnl4 inmovilizada usando resonancia de plasmones superficiales.

En un ejemplo, la proteína de unión a Fnl4 se une al Fn14 humano recombinante con una Kd de 3x10-3 s-1 o menos. En un ejemplo, la proteína de unión a Fnl4 se une a Fn14 humana recombinante con una Kd de aproximadamente 8x10-4 s-1 o menos, como, 5x10-4 s-1 o menos, por ejemplo, 4x10-4 s-1 o menos, por ejemplo, 2x10-4 s-1 o menos. En un ejemplo, la Kd se evalúa inmovilizando la proteína de unión a Fnl4 (por ejemplo, un Fab o un anticuerpo) y evaluando la unión de Fnl4 humana recombinante a la proteína de unión a Fnl4 inmovilizada usando resonancia de plasmones superficiales.

Por ejemplo, la Kd está entre aproximadamente 9x10-4 s-1 a aproximadamente 1x10-5 s-1, por ejemplo, entre aproximadamente 5x10-4 s-1 a aproximadamente 1 x10-5 s-1, por ejemplo, entre aproximadamente 2x10-4 s-1 a aproximadamente 2x10-5 s-1. En un ejemplo, la Kd se evalúa inmovilizando la proteína de unión a Fnl4 (por ejemplo, un Fab o un anticuerpo) y evaluando la unión de Fn14 humana recombinante a la proteína de unión a Fnl4 inmovilizada usando resonancia de plasmones superficiales.

Una proteína ejemplar de la divulgación tiene una Kd de aproximadamente 1,02x10-4 s-1 para recombinante humano Fnl4. Por ejemplo, la proteína de unión a Fnl4 es CRCBT-06-001 o un anticuerpo que comprende el dominio de unión a antígeno, regiones variables o CDR de los mismos. En un ejemplo, la Kd se evalúa inmovilizando la proteína de unión a Fnl4 (por ejemplo, un Fab o un anticuerpo) y evaluando la unión de Fnl4 humana recombinante a la proteína de unión a Fnl4 inmovilizada usando resonancia de plasmones superficiales.

Una proteína de unión a Fnl4 ejemplar adicional de la descripción tiene una Kd de aproximadamente 1,45x10-5 s-1 para recombinante humano Fnl4. Por ejemplo, la proteína de unión a Fn-14 es CRCBT-06-001 o un anticuerpo que comprende el dominio de unión a antígeno, regiones variables o CDR de los mismos. En un ejemplo, la Kd se evalúa inmovilizando la proteína de unión a Fnl4 (por ejemplo, un Fab o un anticuerpo) y evaluando la unión de Fnl4 humana recombinante a la proteína de unión a Fnl4 inmovilizada usando resonancia de plasmones superficiales. En un ejemplo, El nivel de unión de la proteína de unión a Fn14 de la divulgación a un polipéptido que comprende una secuencia establecida en cualquiera de SEQ ID NOs: 29-32 es similar al nivel de unión a un polipéptido que comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 2.

En un ejemplo, La unión de Fn14 de la descripción no se une de manera detectable a un péptido que comprende una o más de las siguientes secuencias:

(i) una secuencia de aminoácidos en SEQ ID NO: 12, en donde el péptido no comprende los aminoácidos 1 a 61 de SEQ ID NO: 1;

(ii) una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 10; y/o

(iii) una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 11.

En un ejemplo, una proteína de unión a Fnl4 de la divulgación se une a Fn14 humano y Fnl4 de ratón. En un ejemplo, la unión de la proteína se evalúa mediante ELISA usando el dominio extracelular Fnl4 recombinante.

En un ejemplo, la proteína de unión a Fnl4 inhibe competitivamente la unión de cualquiera de los siguientes anticuerpos a Fnl4 y/o Fnl4 humano y/o un polipéptido que comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 1, 2 o 34: (i)

(i) un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada (Vh) que comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 15 y una región variable de cadena ligera (V^l) que comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 22;

(ii) un anticuerpo que comprende una Vh que comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 16 y una Vl que comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 23;

(iii) un anticuerpo que comprende una V^hque comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 17 y una V^lque comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 24;

(iv) un anticuerpo que comprende una Vh que comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 18 y una Vl que comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 25;

(v) un anticuerpo que comprende una V^hque comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 19 y una V^lque comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 26;

(vi) un anticuerpo que comprende una Vh que comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 20 y una Vl que comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 27; y

(vii) un anticuerpo que comprende una Vh que comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 21 y una Vl que comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 28.

En un ejemplo, la proteína de unión a Fnl4 se une al mismo epítopo en Fnl4 o a un epítopo en Fnl4 que se superpone con el epítopo unido por uno o más de los siguientes anticuerpos:

(i) un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada (Vh) que comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 15 y una región variable de cadena ligera (Vl) que comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 22;

(ii) un anticuerpo que comprende una V^hque comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 16 y una V^lque comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 23;

(iii) un anticuerpo que comprende una Vh que comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 17 y una Vl que comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 24;

(v) un anticuerpo que comprende una Vh que comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 19 y una Vl que comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 26;

(vii) un anticuerpo que comprende una V^hque comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 21 y una V^lque comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 28.

En un ejemplo, la proteína de unión a Fnl4 neutraliza una actividad Tweak en una célula que expresa Fnl4. Por ejemplo, la proteína de unión a Fnl4 inhibe o reduce la muerte mediada por Tweak de las células de Kyml.

Por ejemplo, a una concentración de aproximadamente 100 ng/ml, la proteína de unión a Fnl4 es capaz de reducir la muerte celular inducida por aproximadamente 50 ng/ml de una proteína que comprende Tweak fusionado a una región Fc de un anticuerpo. En un ejemplo, la reducción en la muerte celular es aproximadamente una reducción de

1,5 veces o una reducción de 2 veces en comparación con el nivel de muerte celular en presencia de la mism concentración de una proteína que comprende Tweak fusionado a una región Fc de un anticuerpo y la ausencia de

Fnl4- proteína de unión.

Por ejemplo, a una concentración de aproximadamente 1 pg/ml, la proteína de unión a Fnl4 es capaz de reducir la muerte celular inducida por aproximadamente 200 ng/ml de una proteína que comprende Tweak fusionado a una región Fc de un anticuerpo. En un ejemplo, la reducción en la muerte celular es aproximadamente una reducción de

1,2 veces o una reducción de 1,5 veces o una reducción de 2 veces o una reducción de 3 veces en comparación con

el nivel de muerte celular en presencia de la misma concentración de una proteína que comprende Tweak fusionado a una región Fc de un anticuerpo y la ausencia de la proteína de unión a Fnl4.

Alternativa, o adicionalmente, la proteína de unión a Fnl4 reduce o previene la producción de citoquinas mediada por

Fnl4 (por ejemplo, hFn14), por ejemplo, producción de IL-6 por células tumorales, por ejemplo, fibroblastos genéticamente modificados para expresar vl2Hras y hFn14. En un ejemplo, la proteína de unión a Fnl4 reduce la producción de IL-6 mediada por Fnl4 (por ejemplo, hFnl4) mediante fibroblastos genéticamente modificados para expresar v12Hras y hFnl4 (por ejemplo, como se describe aquí) en al menos 1,5 veces o al menos 2 veces cuando se pone en contacto con las células en una concentración de aproximadamente 0,5 pg/ml.

Alternativa, o adicionalmente, la proteína de unión a Fnl4 reduce o inhibe la señalización de NFkB inducida por Tweak en una célula que expresa Fn14 (por ejemplo, hFnl4), por ejemplo, como se describe en el presente documento.

En un ejemplo, la proteína de unión a Fnl4 que comprende un dominio de unión a antígeno no anticuerpo, tal como una proteína de unión a Fn-14 no derivada de anticuerpo que comprende uno o más pliegues de Ig (por ejemplo, una inmunoglobulina, como un receptor de linfocitos T o un dominio V o un IgNAR), una adnectina, un afficuerpo, un atrímero, una evasina, una proteína diseñada de repetición de anquirina (DARPin) o una anticalina.

En un ejemplo, la proteína de unión a Fnl4 comprende un dominio de unión a antígeno de anticuerpo.

En un ejemplo, el dominio de unión a antígeno comprende:

(i) una V^hque comprende una secuencia establecida en cualquiera de las SEC ID NO: 13 o 15 a 21 o una versión humanizada, quimérica o desinmunizada del mismo; y/o

(¡i) una Vl que comprende una secuencia establecida en cualquiera de las SEC ID NO: 14 o 22 a 28 o una versión humanizada, quimérica o desinmunizada de los mismos.

En un ejemplo, la proteína de unión a Fnl4 comprende una Vh y una Vl, en donde la Vh y Vl se unen para formar un Fv que comprende el dominio de unión a antígeno. Por ejemplo, el Fv comprende:

(i) una Vh que comprende tres regiones determinantes de complementariedad (CDR) de una Vh que comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 13, en donde si el aminoácido en una posición correspondiente al resto 101 de la SEQ ID NO: 13 es una timidina, el residuo en la posición 107 es una histidina y/o el resto en la posición 53 de SEQ ID NO: 13 es una serina; y

(ii) una Vl que comprende tres CDR de una Vl que comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 14. En un ejemplo, el Fv comprende:

(i) una Vh que comprende las CDR 1, 2 y 3 de una Vh que comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 15 y una Vl que comprende las CDR 1, 2 y 3 de una Vl que comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 22;

(ii) una Vh que comprende las CDR 1, 2 y 3 de una Vh que comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 16 y una VL que comprende las CDR 1, 2 y 3 de una VL que comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 23;

(iii) una V^hque comprende las CDR 1, 2 y 3 de una V^hque comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 17 y una VL que comprende las CDR 1, 2 y 3 de una VL que comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 24;

(iv) una Vh que comprende las CDR 1, 2 y 3 de una Vh que comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 18 y una VL que comprende las CDR 1, 2 y 3 de una VL que comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 25;

(v) una V^hque comprende las CDR 1, 2 y 3 de una V^hque comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 19 y una V^lque comprende las CDR 1, 2 y 3 de una V^lque comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 26;

(vi) una V^hque comprende las CDR 1, 2 y 3 de una V^hque comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 20 y una VL que comprende las CDR 1, 2 y 3 de una VL que comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 27; y

(vii) una VH que comprende las CDR 1, 2 y 3 de una VH que comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 21 y una VL que comprende las CDR 1, 2 y 3 de una VL que comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 28.

En un ejemplo, Las CDR están definidas por el sistema de numeración Kabat y se muestran en las Figuras 11A-11D en negrita.

En un ejemplo, Las CDR están definidas por el sistema de numeración Chothia y se muestran en las Figuras 11A-11D en texto subrayado.

En un ejemplo, una proteína de unión a Fnl4 de la descripción es un anticuerpo de dominio (por ejemplo, comprende solo una Vh o solo una Vl, por ejemplo solo una Vh, opcionalmente unido a otro resto, como uno o más dominios constantes o una región constante o un Fc). En este sentido, los inventores han producido CRCBT-06-003 y CRCBT-06-004, que tienen dominios VL que contienen mutaciones de desplazamiento de marco, lo que significa que las CDR2 y 3 no son fácilmente identificables. Así, se espera que al menos la mayoría de la unión de estas proteínas sea el resultado de la VH. Las secuencias de los dominios VH es muy similar a las secuencias de VH de otras proteínas ejemplares de la divulgación.

En un ejemplo de una proteína de unión a Fn14 de la divulgación, la V^hy la V^lestán en una sola cadena polipeptídica. Por ejemplo, la proteína de unión a Fn14 es:

(i) un fragmento Fv de cadena sencilla (scFv);

(ii) un scFv dimérico (di-scFv);

(iii) al menos uno de (i) y/o (ii) unido a una región constante de cadena pesada o un Fc o un dominio constante de cadena pesada (C^h) 2 y/o C^h3; o

(iv) al menos uno de (i) y/o (ii) unido a una proteína que se une a una célula efectora inmune.

En otro ejemplo, de la divulgación V^ly V^hestán en cadenas polipeptídicas separadas. Por ejemplo, la proteína de unión a Fn14 es:

(i) un diacuerpo;

(ii) un triacuerpo;

(iii) un tetracuerpo;

(iv) un Fab;

(v) un F(ab')2;

(vi) un Fv; o

(vii) al menos uno de (i) a (vi) unido a una región constante de cadena pesada o un Fc o un dominio constante de cadena pesada (Ch) 2 y/o Ch3).

(viii) al menos uno de (i) a (vi) unido a una proteína que se une a una célula efectora inmune.

En una forma ejemplar de la divulgación, la proteína de unión a Fn14 es un anticuerpo.

La presente descripción además se refiere a un anticuerpo anti-Fn14, el anticuerpo comprende uno cualquiera de los siguientes:

(i) una V^hque comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 13 o una versión humanizada, sinhumanizada o desinmunizada de la misma y una V^lque comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 14 o un humanizado, versión sinhumanizada o desinmunizada de la misma;

((i) una Vh que comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 15 o una versión humanizada, sinhumanizada o desinmunizada de la misma y una Vl que comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 22 o una versión humanizada, sinhumanizada o desinmunizada de la misma;

(iii) una Vh que comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 16 o una versión humanizada, sinhumanizada o desinmunizada de la misma y una Vl que comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 23 o un humanizado, versión sinhumanizada o desinmunizada de la misma;

(iv) una V^hque comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 17 o una versión humanizada, sinhumanizada o desinmunizada de la misma y una V^lque comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 24 o un humanizado, versión sinhumanizada o desinmunizada de la misma;

(v) una Vh que comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 18 o una versión humanizada, sinhumanizada o desinmunizada de la misma y una Vl que comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 25 o un humanizado, versión sinhumanizada o desinmunizada de la misma;

(vi) una V^hque comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 19 o una versión humanizada, sinhumanizada o desinmunizada de la misma y una V^lque comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 26 o un humanizado, versión sinhumanizada o desinmunizada de la misma;

(vii) una V^hque comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 20 o una versión humanizada, sinhumanizada o desinmunizada de la misma y una V^lque comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 27 o un humanizado, versión sinhumanizada o desinmunizada de la misma; o

(viii) una V^hque comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 21 o una versión humanizada, sinhumanizada o desinmunizada de la misma y una Vl que comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 28 o un humanizado, versión sinhumanizada o desinmunizada de la misma.

La presente divulgación proporciona adicionalmente un anticuerpo anti-Fn14, el anticuerpo comprende una V^hque comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 15 o una versión humanizada, sinhumanizada o desinmunizada de la misma y una Vl que comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 22 o un humanizado, versión sinhumanizada o desinmunizada de la misma.

La presente divulgación proporciona adicionalmente un anticuerpo anti-Fn14, el anticuerpo comprende una Vh que comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 16 o una versión humanizada, sinhumanizada o desinmunizada de la misma y una Vl que comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 23 o un humanizado, versión sinhumanizada o desinmunizada de la misma.

La presente descripción también proporciona un anticuerpo quimérico que comprende una V^hy una V^lcomo se discutió anteriormente (por ejemplo, en los listados anteriores), en donde la VH está vinculada a una región constante de cadena pesada humana y la Vl está vinculada a una región constante de la cadena ligera humana.

Para la persona experta será evidente basándose en la divulgación del presente documento que la presente divulgación abarca proteínas humanas, humanizadas, sinhumanizadas, quiméricas y primatizadas.

La presente divulgación también abarca anticuerpos monoclonales. Por ejemplo, la presente divulgación proporciona un anticuerpo monoclonal anti-Fn14, el anticuerpo comprende uno cualquiera de los siguientes:

(i) una V^hque comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 13 y una V^lque comprende una secuencia establecida en S^eQ ID NO: 14;

(ii) una V^hque comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 15 y una V^lque comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 22;

(iii) una VH que comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 16 y una Vl que comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 23;

(iv) una VH que comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 17 y una Vl que comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 24;

(v) una Vh que comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO>: 18 y una Vl que comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 25;

(vi) una VH que comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 19 y una Vl que comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 26;

(vii) una VH que comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 20 y una Vl que comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 27; o

(viii) una VH que comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 21 y una V_lque comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 28.

En un ejemplo, una proteína o anticuerpo de unión a Fn14 de la presente descripción se conjuga con un compuesto. Por ejemplo, el compuesto se selecciona entre el grupo que consiste en un radioisótopo, una etiqueta detectable, un compuesto terapéutico, un coloide, una toxina, un ácido nucleico, un péptido, una proteína, un compuesto que aumenta la vida media de la proteína de unión a Fn14 en un sujeto y sus mezclas.

La presente divulgación también se refiere a un ácido nucleico aislado o recombinante que codifica la proteína o anticuerpo de unión a Fn14 de la divulgación.

La presente divulgación se refiere adicionalmente a un constructo de expresión que comprende el ácido nucleico de la divulgación unido operativamente a un promotor.

Tal constructo de expresión puede estar en un vector, por ejemplo, un plásmido.

En ejemplos de la divulgación dirigida a proteínas de unión a polipéptido único Fn14, el constructo de expresión puede comprender un promotor unido a un ácido nucleico que codifica esa cadena polipeptídica.

En los ejemplos dirigidos a múltiples polipéptidos que forman una proteína de unión a Fn14, un constructo de expresión de la divulgación comprende un ácido nucleico que codifica uno de los polipéptidos (por ejemplo, que comprende una Vh) unido operativamente a un promotor y un ácido nucleico que codifica otro de los polipéptidos (por ejemplo, que comprende una Vl) unido operativamente a otro promotor.

En otro ejemplo, el constructo de expresión es un constructo de expresión bicistrónico, por ejemplo, que comprende los siguientes componentes unidos operativamente en la dirección 5' a 3':

(i) un promotor

(ii) un ácido nucleico que codifica un primer polipéptido;

(iii) un sitio interno de entrada al ribosoma; y

(iv) un ácido nucleico que codifica un segundo polipéptido.

Por ejemplo, el primer polipéptido comprende una V^hy el segundo polipéptido comprende una V^l, o el primer polipéptido comprende una Vl y el segundo polipéptido comprende una Vh.

La presente divulgación también se refiere a constructos de expresión separados, uno de las cuales codifica un primer polipéptido (por ejemplo, que comprende una Vh) y otro de los cuales codifica un segundo polipéptido (por ejemplo, que comprende una Vl). Por ejemplo, la presente divulgación también proporciona una composición que comprende:

(i) un primer constructo de expresión que comprende un ácido nucleico que codifica un polipéptido (por ejemplo, que comprende una V^hunida operativamente a un promotor); y

(ii) un segundo constructo de expresión que comprende un ácido nucleico que codifica un polipéptido (por ejemplo, que comprende una Vl unida operativamente a un promotor),

en donde el primer y el segundo polipéptidos se asocian para formar una proteína de unión a Fn14 de la presente divulgación.

La presente divulgación se refiere adicionalmente a una célula aislada que expresa la proteína o anticuerpo de unión a Fn14 de la presente divulgación o una célula recombinante modificada genéticamente para expresar una proteína o anticuerpo de unión a Fn14 de la divulgación. En un ejemplo, la célula es un hibridoma aislado. En otro ejemplo, la célula comprende el ácido nucleico o el constructo de expresión de la divulgación o:

(i) un primer constructo de expresión que comprende un ácido nucleico que codifica un polipéptido (por ejemplo, que comprende una Vh) unido operativamente a un promotor; y

(ii) un segundo constructo de expresión que comprende un ácido nucleico que codifica un polipéptido (por ejemplo, que comprende una V^l) unido operativamente a un promotor,

en donde el primer y segundo polipéptidos se asocian para formar una proteína o anticuerpo de unión a Fn14 de la presente divulgación.

La presente divulgación se refiere adicionalmente a una composición que comprende la proteína de unión a Fn14 o el anticuerpo o el ácido nucleico o el constructo de expresión o la célula de la presente divulgación y un vehículo adecuado. En un ejemplo, la composición comprende la proteína de unión a Fn14 o el anticuerpo de la presente divulgación.

En un ejemplo, el vehículo es farmacéuticamente aceptable.

La presente divulgación además se refiere a un método para tratar o prevenir una afección mediada por Fn14 en un sujeto, comprendiendo el método administrar la proteína de unión a Fn14 o el anticuerpo o el ácido nucleico o el constructo de expresión o la célula o la composición de la presente divulgación al sujeto.

En un ejemplo, la afección mediada por Fn14 es cáncer, metástasis, invasión tisular por un cáncer, vascularización excesiva o angiogénesis, una enfermedad autoinmunitaria, una enfermedad inflamatoria, enfermedades neurodegenerativas, un trastorno de desgaste, cicatrización queloide, enfermedad de injerto contra hospedador, rechazo a injerto o isquemia.

En un ejemplo, la afección mediada por Fn14 es una enfermedad inflamatoria o una enfermedad autoinmune. En un ejemplo, la afección es una enfermedad del tejido conectivo (incluyendo artritis inflamatoria, como artritis reumatoide, artritis psoriásica, artritis reactiva o gota), lupus (incluyendo lupus eritematoso sistémico), diabetes tipo 1, esclerosis múltiple, vasculitis (incluyendo granulomatosis de Wegener y síndrome de Schonlein de Henoch), nefritis (incluyendo glomerulonefritis y neumonitis), aterosclerosis o inflamación ocular (incluyendo uveítis).

En un ejemplo, la afección es enfermedad cardiovascular.

En un ejemplo, la afección mediada por Fn14 se selecciona entre enfermedad de injerto contra hospedador, vasculopatía por aloinjerto cardiaco, infarto intramiocárdico, lesión de reperfusión por isquemia, enfermedad del tejido conectivo (como artritis reumatoide) o esclerodermia.

Como se ejemplifica en el presente documento, los inventores han demostrado que una proteína de unión a Fn14 descrita en el presente documento es útil para reducir o prevenir la invasividad de un cáncer en el tejido de un sujeto. Tal invasividad es un componente de la progresión del cáncer o metástasis. Por tanto, en un ejemplo, la afección mediada por Fn14 es la invasividad de un cáncer en el tejido.

En un ejemplo, la proteína de unión a Fn14 se une a Fn14 humana recombinante con una KD de 1 nM o menos, como, 0,9 nM o menos, por ejemplo, 0,8 nM o menos, por ejemplo, 0,7 nM o menos, por ejemplo, 0,6 nM o menos. En un ejemplo, la K^dse evalúa inmovilizando la proteína de unión a Fn14 (por ejemplo, un Fab o un anticuerpo) y evaluando la unión de Fnl4 recombinante humano a la proteína de unión a Fnl4 inmovilizada usando resonancia de plasmones superficiales.

En un ejemplo, la K^destá entre aproximadamente 0,01 nM y 1 nM, tal como entre aproximadamente 0,05 nM y 0,9 nM, por ejemplo, entre aproximadamente 0,09 nM y 0,7 nM, por ejemplo, entre aproximadamente 0,1 nM y 0,6 nM. Una proteína de unión a Fnl4 ejemplar de la descripción tiene una K^dde aproximadamente 0,5 nM (por ejemplo, /-0,1 nM) para Fnl4 humano recombinante. Por ejemplo, la proteína de unión a Fnl4 es CRCBT-06-001 o un anticuerpo que comprende el dominio de unión a antígeno, regiones variables o CDR de los mismos.

En un ejemplo, la proteína de unión a Fnl4 se une a un dominio extracelular de Fnl4 que comprende una prolina o alanina sustituida por la arginina en la posición 56 de SEQ ID NO: 1 a un nivel similar o sustancialmente igual al que se une a un dominio extracelular de Fn14 (por ejemplo, que comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 2). Por ejemplo, la proteína de unión a Fnl4 se une a un péptido que consiste en la secuencia establecida en SEQ ID NO: 52 o 54 opcionalmente que comprende adicionalmente seis restos de histidina en un extremo a un nivel similar o sustancialmente igual al que se une a un dominio extracelular de Fnl4 (por ejemplo, que comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 2). En un ejemplo, el nivel de unión se evalúa inmovilizando el péptido y poniendo en contacto el péptido con la proteína de unión a Fnl4. Las proteínas de unión a Fnl4 ejemplares descritas en el presente documento que tienen tales características de unión comprenden las regiones variables y/o CDR de un anticuerpo designado CRCBT-06-001, CRCBT-06-002 o CRCBT-06-005. Así, en un ejemplo, la proteína de unión a Fnl4 se une a un péptido que consiste en la secuencia establecida en SEQ ID NO: 52 o 54 (opcionalmente con seis restos de histidina adicionales en un extremo) a un nivel similar o sustancialmente igual o con un nivel similar o sustancialmente misma afinidad que un anticuerpo designado CRCBT-06-001 o CRCBT-06-002 o CRCBT-06-005.

En otro ejemplo, la proteína de unión a Fnl4 inhibe competitivamente la unión de un anticuerpo designado CRCBT-06-001 o CRCBT-06-002 o CRCBT-06-005 a un péptido que consiste en la secuencia establecida en SEQ ID NO: 52 o 54 (opcionalmente con un seis restos de histidina adicionales en un extremo).

En un ejemplo, la proteína de unión a Fnl4 se une a un dominio extracelular de Fnl4 que comprende una alanina sustituida por la arginina en la posición 58 de SEQ ID NO: 1 a un nivel similar o sustancialmente igual al que se une a un dominio extracelular de Fnl4 (por ejemplo, que comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 2). Por ejemplo, la proteína de unión a Fnl4 se une a un péptido que consiste en la secuencia establecida en SEQ ID NO: 56 que opcionalmente comprende adicionalmente seis restos de histidina en un extremo a un nivel similar o sustancialmente igual al que se une a un dominio extracelular de Fnl4 (por ejemplo, que comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 2). En un ejemplo, el nivel de unión se evalúa inmovilizando el péptido y poniendo en contacto el péptido con la proteína de unión a Fnl4 o expresando el péptido en la superficie de un fago y poniendo en contacto el fago con una proteína de unión a Fn14 inmovilizada. Las proteínas de unión a Fnl4 ejemplares descritas en el presente documento que tienen tales características de unión comprenden las regiones variables y/o CDR de un anticuerpo designado CRCBT-06-001, CRCBT-06-002 o CRCBT-06-005. Así, en un ejemplo, la proteína de unión a Fnl4 se une a un péptido que consiste en la secuencia establecida en SEQ ID NO: 56 (opcionalmente con seis restos de histidina adicionales en un extremo) a un nivel similar o sustancialmente igual o con una afinidad similar o sustancialmente igual como un anticuerpo designado CRCBT-06-001 o CRCBT-06-002 o CRCBT-06-005. En otro ejemplo, la proteína de unión a Fnl4 inhibe competitivamente la unión de un anticuerpo designado CRCBT-06-001 o CRCBT-06-002 o CRCBT-06-005 a un péptido que consiste en la secuencia establecida en SEQ ID NO: 56 (opcionalmente con seis adicionales restos de histidina en un término).

En un ejemplo, la proteína de unión a Fnl4 se une a un dominio extracelular de Fnl4 que comprende una alanina sustituida por la histidina en la posición 60 de SEQ ID NO: 1 a un nivel similar o sustancialmente igual al que se une a un dominio extracelular de Fnl4 (por ejemplo, que comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 2). Por ejemplo, la proteína de unión a Fnl4 se une a un péptido que consiste en la secuencia establecida en SEQ ID NO: 63 que opcionalmente comprende adicionalmente seis restos de histidina en un extremo a un nivel similar o sustancialmente igual al que se une a un dominio extracelular de Fnl4 (por ejemplo, que comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 2). En un ejemplo, el nivel de unión se evalúa inmovilizando el péptido y poniendo en contacto el péptido con la proteína de unión a Fnl4. Las proteínas de unión a Fnl4 ejemplares descritas en el presente documento que tienen tales características de unión comprenden las regiones variables y/o CDR de un anticuerpo designado CRCBT-06-001 o CRCBT-06-002. Así, en un ejemplo, la proteína de unión a Fnl4 se une a un péptido que consiste en la secuencia establecida en SEQ ID NO: 63 (opcionalmente con seis restos de histidina adicionales en un extremo) a un nivel similar o sustancialmente igual o con una afinidad similar o sustancialmente igual como un anticuerpo designado CRCBT-06-001 o CRCBT-06-002. En otro ejemplo, la proteína de unión a Fnl4 inhibe competitivamente la unión de un anticuerpo designado CRCBT-06-001 o CRCBT-06-002 a un péptido que consiste en la secuencia establecida en SEQ ID NO: 63 (opcionalmente con seis restos de histidina adicionales en un extremo).

En un ejemplo, el método comprende administrar un anticuerpo que comprende uno o más de los siguientes:

(i) una Vh que comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 15 o una versión humanizada o desinmunizada de la misma y una V^lque comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 22 o una versión humanizada o desinmunizada de la misma; o

(ii) una V^hque comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 16 o una versión humanizada o desinmunizada de la misma y una Vl que comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 23 o una versión humanizada o desinmunizada de la misma.

En un ejemplo, el método reduce la invasividad de un tumor en un tejido que lo rodea. En un ejemplo, el método reduce la invasividad de un tumor en el músculo esquelético.

Dada la capacidad de la proteína de unión a Fn14 para reducir la invasión de tejidos, también es útil para reducir o prevenir la metástasis tumoral. Así, la presente descripción se refiere además a un método para prevenir metástasis o reducir el riesgo de metástasis en un sujeto que padece cáncer, comprendiendo el método administrar la proteína de unión a Fn14 o el anticuerpo o el ácido nucleico o el constructo de expresión o la célula o la composición de la presente divulgación al sujeto.

Como se ejemplifica en el presente documento, los inventores han demostrado que una proteína de unión a Fn14 desvelada en el presente documento es útil para tratar un cáncer (por ejemplo, cáncer de colon) en un sujeto.

En un ejemplo, la proteína de unión a Fn14 se une al Fn14 humano recombinante con una K^dde 0,4 nm, como, 0,3 nM o menos, por ejemplo, 0,25 nM o menos. En un ejemplo, la Kd se evalúa inmovilizando la proteína de unión a Fn14 (por ejemplo, un Fab o un anticuerpo) y evaluando la unión de Fn14 recombinante humano a la proteína de unión a Fn14 inmovilizada usando resonancia de plasmones superficiales.

En un ejemplo, la Kd está entre aproximadamente 0,01 nM y 0,3 nM, tal como entre aproximadamente 0,05 nM y 0,25 nM.

Otra proteína de unión a Fn14 ejemplar de la descripción tiene una Kd de aproximadamente 0,2 nM (por ejemplo, /-0,1 nM) para Fn14 humano recombinante. Por ejemplo, la proteína de unión a Fn-14 es CRCBT-06-002 o un anticuerpo que comprende el dominio de unión a antígeno, regiones variables o CDR de los mismos.

En un ejemplo, la proteína de unión a Fn14 se une a un dominio extracelular de Fn14 que comprende una prolina o alanina sustituida por la arginina en la posición 56 de SEQ ID NO: 1 a un nivel similar o sustancialmente igual al que se une a un dominio extracelular de Fn14 (por ejemplo, que comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 2). Por ejemplo, la proteína de unión a Fnl4 se une a un péptido que consiste en la secuencia establecida en SEQ ID NO: 52 o 54 opcionalmente que comprende adicionalmente seis restos de histidina en un extremo a un nivel similar o sustancialmente igual al que se une a un dominio extracelular de Fnl4 (por ejemplo, que comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 2). En un ejemplo, el nivel de unión se evalúa inmovilizando el péptido y poniendo en contacto el péptido con la proteína de unión a Fnl4. Las proteínas de unión a Fnl4 ejemplares descritas en el presente documento que tienen tales características de unión comprenden las regiones variables y/o CDR de un anticuerpo designado CRCBT-06-001, CRCBT-06-002 o CRCBT-06-005. Así, en un ejemplo, la proteína de unión a Fnl4 se une a un péptido que consiste en la secuencia establecida en SEQ ID NO: 52 o 54 (opcionalmente con seis restos de histidina adicionales en un extremo) a un nivel similar o sustancialmente igual o con un nivel similar o sustancialmente misma afinidad que un anticuerpo designado CRCBT-06-001 o CRCBT-06-002 o CRCBT-06-005. En otro ejemplo, la proteína de unión a Fnl4 inhibe competitivamente la unión de un anticuerpo designado CRCBT-06-001 o CRCBT-06-002 o CRCBT-06-005 a un péptido que consiste en la secuencia establecida en SEQ ID NO: 52 o 54 (opcionalmente con un seis restos de histidina adicionales en un extremo).

(i) una V^hque comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 15 o una versión humanizada o desinmunizada de la misma y una Vl que comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 22 o una versión humanizada o desinmunizada de la misma; o

(ii) una V^hque comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 16 o una versión humanizada o desinmunizada de la misma y una V^lque comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 23 o una versión humanizada o desinmunizada de la misma.

La presente divulgación proporciona adicionalmente la proteína de unión a Fnl4 o el anticuerpo o el ácido nucleico o el constructo de expresión o la célula o la composición de la presente divulgación para uso en medicina.

La presente divulgación proporciona adicionalmente la proteína de unión a Fnl4 o el anticuerpo o el ácido nucleico o el constructo de expresión o la célula o la composición de la presente divulgación para su uso en el tratamiento o la profilaxis de una afección mediada por Fnl4. En un ejemplo, la afección mediada por Fn14 es metástasis de cáncer o invasividad tumoral.

La presente divulgación se refiere además al uso de la proteína de unión a Fn14 o el anticuerpo o el ácido nucleico o el constructo de expresión o la célula o la composición de la presente divulgación en medicina.

La presente divulgación además se refiere al uso de la proteína de unión a Fn14 o el anticuerpo o el ácido nucleico o el constructo de expresión o la célula de la presente divulgación en la fabricación de un medicamento para el tratamiento o profilaxis de una afección mediada por Fn14. En un ejemplo, la afección mediada por Fn14 es metástasis de cáncer o invasividad tumoral.

La presente divulgación se refiere adicionalmente a un método para detectar Fn14 en una muestra, comprendiendo el método poner en contacto una muestra con la proteína de unión a Fn14 o el anticuerpo de la divulgación de modo que se forme un complejo antígeno-proteína y detectar el complejo, en donde la detección del complejo es indicativa de Fn14 en la muestra. En un ejemplo, la muestra es de un sujeto que padece una afección mediada por Fn14. La presente divulgación proporciona adicionalmente un método para diagnosticar una afección mediada por Fn14 en un sujeto, comprendiendo el método realizar el método descrito en el presente documento para detectar Fn14 en una muestra del sujeto, en donde la detección de Fn14 en la muestra es indicativa de la afección.

En un ejemplo, el método comprende determinar el nivel de Fn14 en la muestra, en donde un nivel aumentado o disminuido de Fn14 en la muestra en comparación con una muestra de control es indicativo de la afección.

La presente divulgación se refiere además a un método para localizar y/o detectar y/o diagnosticar y/o pronosticar una afección mediada por Fn14, comprendiendo el método detectar in vivo la proteína o anticuerpo de unión a Fn14 de la presente divulgación unida a Fn14, si está presente, en donde la proteína o anticuerpo de unión a Fn14 se conjuga con una etiqueta detectable.

En un ejemplo, el método comprende además administrar la molécula de unión al sujeto.

En un ejemplo de cualquier método de tratamiento/profilaxis/diagnóstico/pronóstico descrito en el presente documento, la afección mediada por Fn14 es cáncer, metástasis, vascularización excesiva o angiogénesis, una enfermedad autoinmunitaria, una enfermedad inflamatoria, enfermedades neurodegenerativas, un trastorno de desgaste o isquemia.

Como se analiza en el presente documento, los presentes inventores también han determinado que pueden tratar o prevenir un trastorno de desgaste asociado con una afección usando una proteína de unión a Fn14 que se une a Fn14. Por tanto, la presente divulgación se refiere además a un método para tratar o prevenir un trastorno de desgaste que está asociado con una afección, comprendiendo el método administrar a un sujeto una proteína de unión a Fnl4 que comprende un dominio de unión a antígeno de un anticuerpo anti-Fnl4.

En un ejemplo, el trastorno de desgaste se selecciona entre el grupo que consiste en pérdida de peso corporal no deseada, caquexia, precaquexia, desgaste muscular y pérdida de grasa. Por ejemplo, el trastorno de desgaste es caquexia.

En un ejemplo, el trastorno de desgaste se asocia con una afección seleccionada entre el grupo que consiste en cáncer, acidosis metabólica, enfermedades infecciosas, diabetes, síndrome de inmunodeficiencia autoinmune (SIDA), trastornos autoinmunitarios, adicción a drogas, cirrosis hepática, trastornos inflamatorios crónicos, anorexia, insuficiencia cardiaca crónica, enfermedad renal crónica, osteoporosis, enfermedad del músculo esquelético, enfermedad de la neuronas motoras, esclerosis múltiple, atrofia muscular y enfermedad neurodegenerativa.

En un ejemplo, el trastorno de desgaste es caquexia, precaquexia o sarcopenia (por ejemplo, desgaste muscular asociado con el envejecimiento).

En un ejemplo, el trastorno de desgaste es caquexia.

En un ejemplo, la caquexia está asociada con el cáncer, enfermedad infecciosa (por ejemplo, tuberculosis o lepra), SIDA, enfermedad autoinmune (incluyendo artritis reumatoide o diabetes tipo 1), fibrosis quística, drogadicción, alcoholismo o cirrosis hepática.

En un ejemplo, la caquexia está asociada con una afección seleccionada entre artritis reumatoide, diabetes, cardiopatía, enfermedad renal crónica, inflamación pulmonar crónica, inflamación intestinal, enfermedad inflamatoria intestinal, la edad, sepsis o SIDA.

En una forma ejemplar de la presente divulgación el trastorno de desgaste es caquexia asociada con el cáncer. Numerosos tipos de cáncer están asociados con la caquexia, incluyendo tumores sólidos, carcinoma, neuroma, melanoma, leucemia, linfoma, sarcoma, fibroma, cáncer de tiroides, cáncer de vejiga, cáncer de pulmón, blastoma, cáncer de hueso, tumor óseo, glioma del tronco encefálico, tumor cerebral, cáncer de mama, tumores bronquiales, cáncer cervical, cáncer de colon, cáncer colorrectal, tumor neuroepitelial, cáncer de endometrio, cáncer uterino endometrial, cáncer de las trompas de Falopio, cáncer de riñón, cáncer oral, mieloma, neoplasia, neurinoma, neuroblastoma, cáncer de ovario, cáncer de páncreas, cáncer de próstata, cáncer rectal o carcinoma de células renales. En el presente documento se describen cánceres adicionales.

En una forma ejemplar de la presente divulgación, el trastorno de desgaste es caquexia asociada con diabetes. Como se analiza en el presente documento, los inventores también han determinado que pueden tratar un trastorno de desgaste, por ejemplo, desgaste muscular (como caquexia) al poner en contacto Fn14 en un tejido afectado por la afección asociada con el trastorno de desgaste. Por ejemplo, los inventores han descubierto que al poner en contacto a Fn14 con un cáncer pueden tratar el desgaste muscular. Así, en algunos ejemplos, el método relacionado con la divulgación comprende administrar una cantidad de la proteína de unión a Fn14 eficaz para unirse a Fn14 en un tejido afectado por la afección asociada con la enfermedad degenerativa, en donde el tejido no es tejido muscular. En el caso de caquexia asociada con cáncer, el método comprende administrar una cantidad de la proteína de unión a Fn14 eficaz para unirse a Fn14 en las células cancerosas.

En algunos ejemplos, el método de la divulgación comprende administrar una proteína de unión a Fn14 durante un tiempo y bajo condiciones eficaces para unirse a Fn14 en un tejido afectado por la afección asociada con la enfermedad degenerativa, en donde el tejido no es tejido muscular. En el caso de caquexia asociada con cáncer, el método comprende administrar una proteína de unión a Fn14 durante un tiempo y bajo condiciones eficaces para unirse a Fn14 en las células cancerosas.

En un ejemplo, el método comprende administrar la proteína de unión a Fn14 a un sujeto que padece una afección asociada con un trastorno de desgaste, en donde la afección está asociada o causada por una célula que expresa Fn14. Por ejemplo, el método comprende administrar la proteína de unión a Fn14 a un sujeto que padece caquexia por cáncer, en donde el sujeto padece un cáncer que expresa Fn14.

En un ejemplo, el método comprende además seleccionar un sujeto que padece un trastorno de desgaste asociado con una afección asociada o causada por una célula que expresa Fn14. Por ejemplo, el método comprende además seleccionar un sujeto que padece caquexia por cáncer, en donde el sujeto padece un cáncer que expresa Fn14. En un ejemplo, la proteína de unión a Fn14 modula la señalización de Fn14 mediada por Tweak.

Por ejemplo, los inventores han demostrado que los anticuerpos que antagonizan la señalización de NFkB mediada por Tweak son útiles en los métodos de la divulgación. En un ejemplo, la proteína de unión a Fn14 es la proteína o anticuerpo de unión a Fn14 de la presente divulgación.

Los inventores también han demostrado que los anticuerpos que antagonizan o agonizan la secreción de IL-8 mediada por Tweak son útiles en los métodos de la divulgación. Los inventores han demostrado que los anticuerpos que tienen una velocidad de disociación lenta o una constante de disociación de alta afinidad son útiles en los métodos de la divulgación. Dichos anticuerpos se muestran en el presente documento para proporcionar un efecto superior en comparación con otros anticuerpos anti-Fn4.

Por ejemplo, la proteína de unión a Fn14 se une a Fn14 humana recombinante con una KD de 1 nM o menos, como, 0,9 nM o menos, por ejemplo, 0,8 nM o menos, por ejemplo, 0,7 nM o menos, por ejemplo, 0,6 nM o menos. En un ejemplo, la Kd se evalúa inmovilizando la proteína de unión a Fnl4 (por ejemplo, un Fab o un anticuerpo) y evaluando la unión de Fnl4 recombinante humano a la proteína de unión a Fnl4 inmovilizada usando resonancia de plasmones superficiales. En el presente documento se describen valores de Kd ejemplares adicionales y se deben tomar para aplicar mutatis mutandis a este ejemplo de la divulgación.

En otro ejemplo, la proteína de unión a Fnl4 se une a Fn14 humana recombinante con una Kd de aproximadamente 8x10-4 s-1 o menos, como, 5x10-4 s-1 o menos, por ejemplo, 4x10-4 s-1 o menos, por ejemplo, 2x10-4 s-1 o menos. En un ejemplo, la Kd se evalúa inmovilizando la proteína de unión a Fnl4 (por ejemplo, un Fab o un anticuerpo) y evaluando la unión de Fnl4 humana recombinante a la proteína de unión a Fnl4 inmovilizada usando resonancia de plasmones superficiales. En el presente documento se describen valores de Kd ejemplares adicionales y se deben tomar para aplicar mutatis mutandis a este ejemplo de la divulgación.

En un ejemplo, la proteína de unión a Fnl4 se une a un dominio extracelular de Fnl4 que comprende una prolina o alanina sustituida por la arginina en la posición 56 de SEQ ID NO: 1 a un nivel similar o sustancialmente igual al que se une a un dominio extracelular de Fn14 (por ejemplo, que comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 2). Por ejemplo, la proteína de unión a Fnl4 se une a un péptido que consiste en la secuencia establecida en SEQ ID NO: 52 o 54 opcionalmente que comprende adicionalmente seis restos de histidina en un extremo a un nivel similar o sustancialmente igual al que se une a un dominio extracelular de Fnl4 (por ejemplo, que comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 2). En un ejemplo, el nivel de unión se evalúa inmovilizando el péptido y poniendo en contacto el péptido con la proteína de unión a Fnl4. Las proteínas de unión a Fnl4 ejemplares descritas en el presente documento que tienen tales características de unión comprenden las regiones variables y/o CDR de un anticuerpo designado CRCBT-06-001, CRCBT-06-002 o CRCBT-06-005. Así, en un ejemplo, la proteína de unión a Fnl4 se une a un péptido que consiste en la secuencia establecida en SEQ ID NO: 52 o 54 (opcionalmente con seis restos de histidina adicionales en un extremo) a un nivel similar o sustancialmente igual o con un nivel similar o sustancialmente misma afinidad que un anticuerpo designado CRCBT-06-001 o CRCBT-06-002 o CRCBT-06-005. En otro ejemplo, la proteína de unión a Fnl4 inhibe competitivamente la unión de un anticuerpo designado CRCBT-06-001 o CRCBT-06-002 o CRCBT-06-005 a un péptido que consiste en la secuencia establecida en SEQ ID NO: 52 o 54 (opcionalmente con un seis restos de histidina adicionales en un extremo).

En un ejemplo, la proteína de unión a Fnl4 es un anticuerpo que comprende uno o más de los siguientes:

(i) una V^hque comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 15 o una versión humanizada, sinhumanizada o desinmunizada de la misma y una V^lque comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 22 o una versión humanizada, sinhumanizada o desinmunizada de la misma; o

(ii) una V^hque comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 16 o una versión humanizada, sinhumanizada o desinmunizada de la misma y una V^lque comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 23 o una versión humanizada, sinhumanizada o desinmunizada de la misma.

En un ejemplo, la proteína de unión a Fnl4 es un anticuerpo que comprende una V^hque comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 15 o una versión humanizada, sinhumanizada o desinmunizada de la misma y una Vl que comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 22 o una versión humanizada, sinhumanizada o desinmunizada de la misma.

En un ejemplo, la proteína de unión a Fnl4 es un anticuerpo que comprende una VH que comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 16 o una versión humanizada, sinhumanizada o desinmunizada de la misma y una V^l que comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 23 o una versión humanizada, sinhumanizada o desinmunizada de la misma.

En un ejemplo, el peso corporal y/o la salud general del sujeto aumentan al menos una semana después de la administración de la proteína de unión a Fnl4.

En un ejemplo, el peso corporal y/o la salud general del sujeto aumenta dentro de al menos uno o dos o tres o cuatro o cinco o seis días de la administración de la proteína de unión a Fnl4.

En un ejemplo, el peso corporal y/o la salud general del sujeto aumenta dentro de al menos una o dos o tres o cuatro o cinco o seis semanas de la administración de la proteína de unión a Fnl4.

En otro ejemplo, el sujeto a quien se administra la proteína de unión a Fnl4 pierde menos peso corporal que un sujeto que padece el trastorno de desgaste a quien no se le administra la proteína de unión a Fnl4.

En un ejemplo adicional, el peso corporal del sujeto permanece detectablemente aumentado durante al menos 7 días después de la administración de la proteína de unión a Fnl4.

En otro ejemplo más, el peso corporal del sujeto no se reduce a un nivel significativamente inferior al peso antes de la administración de la proteína de unión a Fn14 al menos aproximadamente 7 días después de la administración de la proteína de unión a Fnl4.

En otro ejemplo, la administración de la proteína de unión a Fnl4 extiende la vida del sujeto en comparación con un sujeto o una población de sujetos que padecen el trastorno de desgaste a quienes no se les ha administrado la proteína de unión a Fnl4. En este sentido, cuando se compara con una población de sujetos, la extensión de la vida puede compararse con el término medio o mediano de la vida de la población.

En un ejemplo, la administración de la proteína de unión a Fnl4 extiende significativamente la vida del sujeto o una población de sujetos a quienes se administra en comparación con un sujeto o una población de sujetos que padecen el trastorno de desgaste a quienes no se les ha administrado la proteína de unión a Fnl4.

En un ejemplo, la administración de la proteína de unión a Fnl4 extiende la vida del sujeto a quien se administra durante un tiempo suficiente para permitir uno o más tratamientos adicionales del trastorno asociado con el desgaste en comparación con un sujeto o una población de sujetos que padecen el trastorno de desgaste a quien no se le ha administrado la proteína de unión a Fnl4.

En un ejemplo, la vida del sujeto se extiende por al menos aproximadamente 1 mes o 6 meses o 24 meses.

En un ejemplo, la vida del sujeto se extiende mientras el sujeto recibe el tratamiento como se describe en el presente documento.

En otro ejemplo, la vida del sujeto se extiende en 1 % o 5 % o 10 % o 20 % o 40 % del periodo de vida de un sujeto o una población de sujetos que padecen el trastorno de desgaste a quienes no se les ha administrado la proteína de unión a Fnl4.

En un ejemplo, la proteína de unión a Fnl4 se administra a una dosis entre 0,5 mg/kg y aproximadamente 20 mg/kg. Por ejemplo, la proteína de unión a Fn14 se administra a una dosis entre 1 mg/kg y 15 mg/kg, tal como entre 2 mg/kg y 10 mg/kg.

En un ejemplo, la proteína de unión a Fn14 se administra a una dosis de al menos aproximadamente 2 mg/kg. Por ejemplo, la proteína de unión a Fnl4 se administra a una dosis de al menos aproximadamente 3 mg/kg o 4 mg/kg o 5 mg/kg o 6 mg/kg o 7 mg/kg u 8 mg/kg o 9 mg/kg o 10 mg/kg. En un ejemplo, la proteína de unión a Fnl4 se administra a una dosis entre 2 mg/kg y 20 mg/kg, como, entre 3 mg/kg y 15 mg/kg, por ejemplo, entre 5 mg/kg y 10 mg/kg, inclusive. En un ejemplo, la proteína de unión a Fnl4 se administra a una dosis de aproximadamente 5 mg/kg. En otro ejemplo, la proteína de unión a Fnl4 se administra a una dosis de aproximadamente 10 mg/kg.

En un ejemplo, la proteína de unión a Fnl4 se administra en múltiples dosis.

Por ejemplo, la proteína de unión a Fnl4 se administra dos veces por semana durante al menos dos semanas o tres semanas o cuatro semanas.

En otro ejemplo, la proteína de unión a Fnl4 se administra en dosis múltiples, cada una separada por al menos aproximadamente 7 días o 14 días o 21 días o 28 días o un mes calendario.

En un ejemplo adicional, la proteína de unión a Fnl4 se administra a una dosis de carga y a una dosis de mantenimiento. Por ejemplo, la dosis de carga está entre aproximadamente 0,5 mg/kg y 2 mg/kg (como entre 0,5 mg/kg y 1 mg/kg) y la dosis de mantenimiento de aproximadamente 2 mg/kg a aproximadamente 20 mg/kg (como entre aproximadamente 3 mg/kg y aproximadamente 15 mg/kg, por ejemplo, entre aproximadamente 5 mg/kg y 10 mg/kg, inclusive). En un ejemplo, la dosis de carga es una dosis de aproximadamente 0,5 mg/kg o 1 mg/kg y la dosis de mantenimiento es de aproximadamente 5 mg/kg o 10 mg/kg. Este régimen de dosificación también se llama régimen de dosificación intensificado.

En un ejemplo, la dosis de mantenimiento se administra aproximadamente 5 días o 6 días o 7 días u 8 días después de la administración de la dosis de carga. Por ejemplo, la dosis de mantenimiento se administra aproximadamente 7 días después de la administración de la dosis de carga.

En un ejemplo, el método de tratamiento comprende además medir el peso corporal del sujeto antes de administrar la proteína de unión a Fnl4, y administrar la proteína de unión a Fnl4 si el peso del sujeto ha disminuido en más de aproximadamente 5 % en aproximadamente 30 días.

En otro ejemplo, el método comprende además medir el peso corporal del sujeto antes de administrar una dosis de la proteína de unión a Fnl4, y administrar la proteína de unión a Fnl4 si el peso del sujeto ha disminuido en más de aproximadamente 1 % desde la administración de una dosis previa de Fnl4- proteína de unión.

En otro ejemplo más, el método comprende además evaluar la caquexia del sujeto. Por ejemplo, la caquexia del sujeto se evalúa midiendo la masa corporal total del sujeto, masa corporal magra y/o índice de masa corporal. En un ejemplo, la medición de la masa corporal total del sujeto, masa corporal magra y/o el índice de masa corporal no incluyen el peso estimado de los tumores y/o la recogida(s) de líquido extravascular del sujeto.

En un ejemplo, el método comprende adicionalmente tratar el trastorno asociado con el trastorno de desgaste. En un ejemplo, el método comprende además tratar el cáncer, por ejemplo, un cáncer asociado con caquexia. Por ejemplo, el tratamiento comprende la administración de un medicamento contra el cáncer o radioterapia.

En un ejemplo, el tratamiento para el cáncer o trastorno asociado con el trastorno de desgaste se realiza o administra al mismo tiempo o después de administrar la proteína de unión a Fnl4. Por ejemplo, la proteína de unión a Fn14 se administra al menos una vez y se permite que el peso del sujeto aumente antes de realizar o administrar el tratamiento para el cáncer o trastorno asociado con el trastorno de desgaste.

La presente divulgación también proporciona una proteína de unión a Fnl4 que comprende un dominio de unión a antígeno de un anticuerpo anti-Fnl4 para usar en el tratamiento o prevención de un trastorno de desgaste asociado con una afección.

La presente divulgación también proporciona el uso de una proteína de unión a Fnl4 que comprende un dominio de unión a antígeno de un anticuerpo anti-Fnl4 en la fabricación de un medicamento para tratar o prevenir un trastorno de desgaste que está asociado con una afección.

Los presentes inventores han demostrado que una proteína de unión a Fnl4 descrita en el presente documento es útil para reducir o prevenir la invasividad de un tumor en el músculo de un sujeto. Por tanto, Un ejemplo específico de la presente divulgación proporciona un método para reducir o prevenir la invasión tumoral en el músculo de un sujeto que padece cáncer, comprendiendo el método administrar al sujeto una proteína de unión a Fn14 que comprende un dominio de unión a antígeno de un anticuerpo anti-Fnl4, en donde la proteína de unión a Fnl4 neutraliza una actividad Tweak en una célula que expresa Fnl4.

En un ejemplo, la proteína de unión a Fnl4 reduce la señalización de NF^kB inducida por Tweak en una célula que expresa Fnl4.

En un ejemplo, la proteína de unión a Fnl4 reduce la señalización de NFkB inducida por Tweak en una célula que expresa Fnl4, y en donde la proteína de unión a Fnl4 no induce de manera detectable la señalización de NFkB cuando se pone en contacto con una célula que expresa Fnl4 en ausencia de Tweak.

En un ejemplo, el método comprende administrar la proteína o anticuerpo de unión a Fnl4 de la presente divulgación. En un ejemplo, el método comprende administrar un anticuerpo que comprende uno o más de los siguientes:

(i) una Vh que comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 15 o una versión humanizada o desinmunizada de la misma y una V^lque comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 22 o una versión humanizada, sinhumanizada o desinmunizada de la misma; o

(ii) una Vh que comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 16 o una versión humanizada o desinmunizada de la misma y una V^lque comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 23 o una versión humanizada, sinhumanizada o desinmunizada de la misma.

En un ejemplo, la proteína de unión a Fn14 se administra al mismo tiempo o antes del tratamiento para el tumor. Tal tratamiento es útil para reducir las metástasis que pueden ser inducidas o asociadas con el tratamiento del tumor. La presente divulgación también se refiere a una proteína de unión a Fn14 que comprende un dominio de unión a antígeno de un anticuerpo anti-Fn14 para uso en el tratamiento o prevención de la invasión tumoral en un músculo. La presente divulgación también proporciona el uso de una proteína de unión a Fn14 que comprende un dominio de unión a antígeno de un anticuerpo anti-Fn14 en la fabricación de un medicamento para tratar o prevenir la invasión tumoral en un músculo.

Los inventores también han demostrado que los anticuerpos que antagonizan la señalización de NFkB mediada por Tweak son útiles para tratar o prevenir un trastorno del metabolismo de la glucosa, tal como diabetes, por ejemplo, diabetes tipo 1. En un ejemplo, la proteína de unión a Fn14 es la proteína o anticuerpo de unión a Fn14 de la presente divulgación.

Por ejemplo, la proteína de unión a Fn14 se une a Fn14 humana recombinante con una KD de 1 nM o menos, como, 0,9 nM o menos, por ejemplo, 0,8 nM o menos, por ejemplo, 0,7 nM o menos, por ejemplo, 0,6 nM o menos, o 0,3 nM o menos o 0,25 nM o menos. En un ejemplo, la K^dse evalúa inmovilizando la proteína de unión a Fn14 (por ejemplo, un Fab o un anticuerpo) y evaluando la unión de Fn14 recombinante humano a la proteína de unión a Fn14 inmovilizada usando resonancia de plasmones superficiales. En el presente documento se describen valores de Kd ejemplares adicionales y se deben tomar para aplicar mutatis mutandis a este ejemplo de la divulgación.

En un ejemplo, la proteína de unión a Fn14 se une a un dominio extracelular de Fn14 que comprende una prolina o alanina sustituida por la arginina en la posición 56 de SEQ ID NO: 1 a un nivel similar o sustancialmente igual al que se une a un dominio extracelular de Fn14 (por ejemplo, que comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 2). Por ejemplo, la proteína de unión a Fn14 se une a un péptido que consiste en la secuencia establecida en SEQ ID NO: 52 o 54 opcionalmente que comprende adicionalmente seis restos de histidina en un extremo a un nivel similar o sustancialmente igual al que se une a un dominio extracelular de Fn14 (por ejemplo, que comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 2). En un ejemplo, el nivel de unión se evalúa inmovilizando el péptido y poniendo en contacto el péptido con la proteína de unión a Fn14. Las proteínas de unión a Fn14 ejemplares descritas en el presente documento que tienen tales características de unión comprenden las regiones variables y/o CDR de un anticuerpo designado CRCBT-06-001, CRCBT-06-002 o CRCBT-06-005. Así, en un ejemplo, la proteína de unión a Fnl4 se une a un péptido que consiste en la secuencia establecida en SEQ ID NO: 52 o 54 (opcionalmente con seis restos de histidina adicionales en un extremo) a un nivel similar o sustancialmente igual o con un nivel similar o sustancialmente misma afinidad que un anticuerpo designado CRCBT-06-001 o CRCBT-06-002 o CRCBT-06-005. En otro ejemplo, la proteína de unión a Fnl4 inhibe competitivamente la unión de un anticuerpo designado CRCBT-06-001 o CRCBT-06-002 o CRCBT-06-005 a un péptido que consiste en la secuencia establecida en SEQ ID NO: 52 o 54 (opcionalmente con un seis restos de histidina adicionales en un extremo). En un ejemplo, la proteína de unión a Fnl4 se une a un dominio extracelular de Fnl4 que comprende una alanina sustituida por la arginina en la posición 58 de SEQ ID NO: 1 a un nivel similar o sustancialmente igual al que se une a un dominio extracelular de Fnl4 (por ejemplo, que comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 2). Por ejemplo, la proteína de unión a Fnl4 se une a un péptido que consiste en la secuencia establecida en SEQ ID NO: 56 que opcionalmente comprende adicionalmente seis restos de histidina en un extremo a un nivel similar o sustancialmente igual al que se une a un dominio extracelular de Fnl4 (por ejemplo, que comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 2). En un ejemplo, el nivel de unión se evalúa inmovilizando el péptido y poniendo en contacto el péptido con la proteína de unión a Fnl4 o expresando el péptido en la superficie de un fago y poniendo en contacto el fago con una proteína de unión a Fn14 inmovilizada. Las proteínas de unión a Fnl4 ejemplares descritas en el presente documento que tienen tales características de unión comprenden las regiones variables y/o CDR de un anticuerpo designado CRCBT-06-001, CRCBT-06-002 o CRCBT-06-005. Así, en un ejemplo, la proteína de unión a Fnl4 se une a un péptido que consiste en la secuencia establecida en SEQ ID NO: 56 (opcionalmente con seis restos de histidina adicionales en un extremo) a un nivel similar o sustancialmente igual o con una afinidad similar o sustancialmente igual como un anticuerpo designado CRCBT-06-001 o CRCBT-06-002 o CRCBT-06-005. En otro ejemplo, la proteína de unión a Fnl4 inhibe competitivamente la unión de un anticuerpo designado CRCBT-06-001 o CRCBT-06-002 o CRCBT-06-005 a un péptido que consiste en la secuencia establecida en SEQ ID NO: 56 (opcionalmente con seis adicionales restos de histidina en un término).

(i) una Vh que comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 15 o una versión humanizada, sinhumanizada o desinmunizada de la misma y una Vl que comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 22 o una versión humanizada, sinhumanizada o desinmunizada de la misma; o

En un ejemplo, la proteína de unión a Fnl4 es un anticuerpo que comprende una Vh que comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 15 o una versión humanizada, sinhumanizada o desinmunizada de la misma y una V^lque comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 22 o una versión humanizada, sinhumanizada o desinmunizada de la misma.

En un ejemplo, la proteína de unión a Fnl4 es un anticuerpo que comprende una VH que comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 16 o una versión humanizada, sinhumanizada o desinmunizada de la misma y una V^lque comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 23 o una versión humanizada, sinhumanizada o desinmunizada de la misma.

Los inventores también han producido un modelo de trastorno de desgaste, por ejemplo, caquexia por cáncer. Por tanto, la presente divulgación también proporciona un mamífero no humano que comprende células tumorales, en donde las células tumorales capaces de expresar ectópicamente Fn14 humana recombinante, y en donde el mamífero no humano desarrolla un trastorno de desgaste. La presente divulgación también proporciona las células tumorales capaces de expresar ectópicamente Fn14 humano recombinante.

La presente divulgación también se refiere a un método para producir un modelo animal no humano de un trastorno de desgaste, comprendiendo el método administrar a un mamífero no humano una célula tumoral de expresión de Fn14 humana recombinante en condiciones suficientes para que se exprese el Fn14 y para que se desarrolle el trastorno de desgaste.

En un ejemplo, el Fn14 se expresa induciblemente. Por ejemplo, el ácido nucleico que codifica Fn14 está unido operativamente a un promotor inducido por 4-hidroxitamoxifeno.

En un ejemplo, el Fn14 se expresa constitutivamente.

En un ejemplo, la célula tumoral es una célula de fibroblastos modificada genéticamente para expresar v12Hras. Los inventores también han producido una forma sin señalización de Fn14 útil como control en experimentos para evaluar el efecto de un compuesto en una afección de desgaste, por ejemplo, caquexia por cáncer. Los animales a los que se les ha administrado células tumorales que expresan la proteína de fusión no señalizadora desarrollan cáncer, pero no desarrollan la afección de desgaste.

En un ejemplo, la presente divulgación se refiere a una proteína de fusión que comprende la región extracelular de Fn14 y una región de anclaje de glicosilfosfatidilinositol (GPI) de un receptor pero que carece de la región citosólica del receptor. Por ejemplo, la proteína de fusión no media la señalización Tweak cuando se expresa en una célula La presente divulgación también se refiere a una célula recombinante que expresa una proteína de fusión que comprende una región extracelular de Fn14 y una región de anclaje de glicosilfosfatidilinositol (GPI) de un receptor pero que carece de la región citosólica del receptor, en donde la proteína de fusión no media la señalización Tweak en la célula.

En un ejemplo, la región extracelular de Fn14 es la región extracelular de Fn14 humano.

En un ejemplo, la región GPI es del Receptor Trail 3.

Por ejemplo, la proteína de fusión comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 36 o entre los restos 28 a 126 de SEQ ID NO: 36.

La presente divulgación también se refiere a un método para identificar un compuesto para el tratamiento de un trastorno de desgaste, comprendiendo el método:

(i) administrar el compuesto al modelo de mamífero no humano de un trastorno de desgaste descrito en el presente documento e inducir la expresión de Fn14 (si fuera necesario) y determinar el nivel del trastorno de desgaste;

(ii) comparar el nivel del trastorno de desgaste en (i) con los niveles de un trastorno de desgaste en un mamífero no humano al que se le administró la célula que expresa una proteína de fusión que comprende una región extracelular de Fn14 y una región de anclaje de glucosilfosfatidilinositol (GPI) de un receptor pero que carece de la región citosólica del receptor y determina el nivel del trastorno de desgaste,

en donde un nivel similar del trastorno de desgaste en (i) en comparación con (ii) indica que el compuesto es útil para tratar un trastorno de desgaste.

(ii) administrar a un mamífero no humano la célula que expresa una proteína de fusión que comprende una región extracelular de Fn14 y una región de anclaje de glicosilfosfatidilinositol (GPI) y determinar el nivel del trastorno de desgaste,

En un ejemplo, al mamífero no humano que expresa una proteína de fusión que comprende una región extracelular de Fn14 y una región de anclaje de glicosilfosfatidilinositol (GPI) y determina el nivel del trastorno de desgaste, también se le administra el compuesto.

En un ejemplo, el método comprende adicionalmente aislar o proporcionar el compuesto o la estructura del compuesto.

En un ejemplo, el compuesto es una proteína de unión a Fn14 que comprende un dominio de unión a antígeno de un anticuerpo anti-Fn14.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1 es una serie de representaciones gráficas que muestran los resultados de la detección de sueros de ratones inmunizados con una proteína recombinante que comprende el dominio extracelular de hFn14. El panel A muestra los resultados de los ensayos en los que las células vivas MEFv12Hras que expresan Fn14 humano (inducción de /- 4-OHT) se tiñeron con el suero de ratones inmunizados y posteriormente se analizaron por citometría de flujo. Trazos de histograma: el trazo punteado representa la tinción en células no inducidas y el trazo sólido representa la tinción en células inducidas. El panel A.i. muestra la población celular cerrada en dispersión lateral y hacia adelante para el análisis de todas las muestras. Panel Aii. muestra células sin teñir, Paneles Aiii. y Aiv. muestran células teñidas con suero de 2 ratones no inmunizados, Paneles Av. y Avi. muestran sueros de 2 ratones inmunizados con un antígeno no relacionado en PBS o adyuvante, respectivamente. Panel Avii. muestra control positivo anti-hFnl4. El panel B. muestra los resultados usando suero de ratones inmunizados con células suspendidas en PBS o adyuvante como se indica (ratones N.° 1318-1323), con cuadros punteados que indican sueros de ratones que muestran una respuesta inmune positiva a hFnl4. Todas las muestras de suero se usaron a una dilución 1:50 para la tinción.

Figura 2 es una serie de representaciones gráficas que muestran los resultados de detección de sueros de ratones inmunizados con Fnl4-Fc recombinante en células D645 humanas. El panel A muestra los resultados de detección usando células vivas de glioma humano D645 teñidas con suero de ratón o controles y analizadas por citometría de flujo. Los trazos de histograma de puntos representan células sin teñir y las trazas sólidas representan células teñidas. El panel A.i. muestra una población celular cerrada para el análisis de todas las muestras, Panel ii. muestra células sin teñir, Panel iii. muestra control positivo anti-hFnl4. Paneles iv. y v. muestran células teñidas con suero de 2 ratones no inmunizados. Paneles vi. y vii. muestran suero de 2 ratones inmunizados con un antígeno no relacionado en adyuvante o PBS, respectivamente. El panel B. muestra sueros de ratones inmunizados con una proteína recombinante que comprende el dominio extracelular de hFnl4 en adyuvante o PBS como se indica (ratones N.° 1318-1323), con cuadros punteados que indican ratones con respuesta inmune positiva. Todas las muestras de suero se usaron a una dilución 1:50 para la tinción.

Figura 3 es una serie de representaciones gráficas que muestran la detección de anticuerpos monoclonales que reconocen específicamente el Fnl4 humano expresado en la superficie celular. Las células MEFv12Hras inducibles con Fnl4 humano (+/- 4-OHT como se indica) se tiñeron con anticuerpos de control (Panel A) o sobrenadante de hibridoma para una selección de hibridomas (Panel B) o sobrenadante de hibridoma de los clones CRCBT-06-001, CRCBT-06-002, CRCBT-06-003 y CRCBT-06-004 (Panel C). Los trazos sólidos representan la tinción sobrenadante de las células y los trazos punteados representan la superposición de una tinción de un anticuerpo secundario solo como control (del panel A).

Figura 4 es una serie de representaciones gráficas que muestran el efecto de los anticuerpos monoclonales antihFnl4 positivos en la activación de NFkB. Las células HEK293T que albergan un promotor sensible a NFkB unido operativamente a un indicador GFP se incubaron durante 24 horas en presencia/ausencia de Tweak-Fc (concentraciones como se indica) y anticuerpos de control (Panel A) o sobrenadantes de clones de hibridoma parentales (como se indica, Panel B) o anticuerpo monoclonal purificado CRCBT-06-001 a concentraciones variables (como se indica, Panel C). Las células se recogieron y la fluorescencia GFP se evaluó por citometría de flujo. Todos los sobrenadantes se diluyeron 1:10 para este ensayo. A modo de comparación la superposición de trazos punteados representa células solas o en presencia de Tweak-Fc solo en cada concentración. Spn/t; sobrenadante

Figura 5 es una serie de representaciones gráficas que muestran resultados de la detección de sueros de ratones inmunizados con células HEK293T que sobreexpresan hFnl4. Las células vivas MEFv12Hras que expresan Fnl4 humano (inducción /- 4-OHT) se mezclaron en una proporción 1:1 y se tiñeron usando suero de los controles (Panel A) o ratones inmunizados (Panel B). Las células fueron analizadas por citometría de flujo. Los trazos de histograma punteados representan la tinción de células con suero de un ratón inmunizado con células que expresan un antígeno no relacionado para comparación. Paneles A.i. y ii. muestran tinción de células con suero de ratones inmunizados con células HEK293T que expresan otras proteínas humanas no relacionadas, Panel Aiii. muestra control positivo anti-hFnl4 y Panel Aiv. muestra células teñidas con anticuerpo secundario solo. Panel B. Suero de ratones inmunizados con células HEK293T que expresan hFnl4 suspendido en PBS o adyuvante como se indica (ratones N.° 31-36), Respuesta positiva evaluada en función de la aparición de un pico doble como lo indica la caja de puntos.

Figura 6A es una serie de representaciones gráficas que muestran el efecto de CRCBT-06-001, CRCBT-06-002, CRCBT-06-003 y CRCBT-06-004 purificados en la activación de NFkB inducida por Tweak. Las células HEK293T que albergan un promotor sensible a NFkB unido operativamente a un indicador GFP se incubaron durante 24 horas en presencia/ausencia de Tweak-Fc (concentraciones como se indica) y anticuerpos CRCBT-06-001, CRCBT-06-002, CRCBT-06-003 o CRCBT-06-004 purificados. Las células se recogieron y la fluorescencia GFP se evaluó por citometría de flujo. Todos los sobrenadantes se diluyeron 1:50 para este ensayo. A efectos de comparación, la superposición de trazos punteados representa células solas o en presencia de Tweak-Fc solamente (como se muestra en la Figura 6C, panel i).

Figura 6B es una serie de representaciones gráficas que muestran el efecto del anticuerpo de control negativo purificado sobre la activación de NFkB inducida por Tweak. Las células HEK293T que albergan un promotor sensible a NFkB unido operativamente a un indicador GFP se incubaron durante 24 horas en presencia/ausencia de Tweak-Fc (concentraciones como se indica) y anticuerpo de control purificado. Las células se recogieron y la fluorescencia GFP se evaluó por citometría de flujo. A efectos de comparación, la superposición de trazos punteados representa las células solas o solo en presencia de Tweak-Fc (como en la Figura 6C Panel i.).

Figura 6C es una serie de representaciones gráficas que muestran el efecto de los controles (como se indica) en la activación de NFkB inducida por Tweak. Las células HEK293T que albergan un promotor sensible a NFkB unido operativamente a un indicador de GFP se incubaron durante 24 horas en presencia/ausencia de Tweak-Fc (concentraciones como se indica) y controles. Las células se recogieron y la fluorescencia GFP se evaluó por citometría de flujo. Todos los sobrenadantes se diluyeron 1:50 para este ensayo. A efectos de comparación, la superposición de trazos punteados representa las células solas o solo en presencia de Tweak-Fc (como en el panel i.).

Figura 7A es una serie de representaciones gráficas que muestran el efecto de CRCBT-06-001 purificado, CRCBT-06-005, CRCBT-06-006, CRCBT-06-007, ITEM-1 e ITEM-2 en la activación de NFkB inducida por Tweak. Las células HEK293T que albergan un promotor sensible a NFkB unido operativamente a un indicador GFP se incubaron durante 24 horas en presencia/ausencia de Tweak-Fc (100 ng/ml o 200 ng/ml) y cualquiera de las células solas, control de isotipo IgG2b (trazo discontinuo), CRCBT-06-001 purificado, CRCBT-06-005, CRCBT-06-006 o CRCBT-06-007 (trazos sólidos; a las concentraciones indicadas). Las células se recogieron y la fluorescencia GFP se evaluó por citometría de flujo.

Figura 7B es una serie de representaciones gráficas que muestran el efecto de CRCBT-06-001 purificado, ITEM-1 e ITEM-2 en la activación de NFkB inducida por Tweak. Las células HEK293T que albergan un promotor sensible a NF^kB unido operativamente a un reportero GFP se incubaron durante 24 horas en presencia/ausencia de Tweak-Fc (100 ng/ml o 200 ng/ml) y cualquiera de las células solas (trazo discontinuo como capa subyacente para gráficos de anticuerpo), CRCBT-06-001 purificado, ITEM-1 o ITEM-2 (trazos sólidos; a las concentraciones indicadas). Las células se recogieron y la fluorescencia GFP se evaluó por citometría de flujo.

Figura 8 es una representación gráfica que muestra los resultados de un ensayo para determinar la capacidad del CRCBT-06-001, CRCBT-06-002, CRCBT-06-003 y CRCBT-06-004 purificados para bloquear la muerte celular de Kyml inducida por Tweak. Las células de Kyml se incubaron durante 24 horas en presencia/ausencia de Tweak-Fc (concentraciones como se indica) y anticuerpo purificado (a las concentraciones indicadas) o TweakR-Fc como control positivo. Las células totales se cosecharon y se incubaron con yoduro de propidio. Las células se analizaron por citometría de flujo y se representaron gráficamente como un porcentaje de muerte celular en cada muestra.

Figura 9 es una representación gráfica que muestra los resultados del ensayo de secreción de IL-8 para evaluar las propiedades agonísticas de los anticuerpos. Las células A375 se incubaron en presencia de anticuerpos (10, 1, 0,1 o 0,01 |jg/ml) durante 24 horas. Los sobrenadantes del cultivo celular se evaluaron para determinar la cantidad de IL-8. Los experimentos se realizaron con 3 réplicas biológicas independientes y los resultados se promediaron y se representaron como IL-8 (pg/ml) con barras de error que representan el ETM.

Figura 10 es una representación gráfica que muestra el ensayo de secreción de IL-8 para la determinación de las propiedades antagonistas de anticuerpos de los anticuerpos. Las células A375 se incubaron en presencia o ausencia de anticuerpo (10 jg/ml) en presencia o ausencia de Tweak-Fc (300 ng/ml) durante 24 horas. Los sobrenadantes del cultivo celular se evaluaron para determinar la cantidad de IL-8. Los experimentos se realizaron con 3 réplicas biológicas independientes y los resultados se promediaron y se representaron como IL-8 (pg/ml) con barras de error que representan el ETM.

Figura 11A es una representación esquemática que muestra secuencias de las regiones variables de cadenas ligeras de anticuerpos monoclonales CRCBT-06-001, CRCBT-06-002, CRCBT-06-003, CRCBT-06-004, CRCBT-06-005, CRCBT-06-006 y CRCBT-06-007 (etiquetados 001, 002, 003, 004, 005, 006 y 007, respectivamente). Las secuencias se han alineado. Se indican las CDR 1-3 y las regiones marco 1-4. Las CDR de acuerdo con el sistema de numeración Kabat se indican en negrita. Las CDR de acuerdo con el sistema de numeración Chothia se indican en texto subrayado.

Figura 11B es una representación esquemática que muestra secuencias de una clase de regiones variables de cadenas ligeras altamente relacionadas de anticuerpos monoclonales representados en la Figura 11A (etiquetados 001, 002, 003, 004, 005 y 006). Las secuencias se han alineado. Se indican las CDR 1-3 y las regiones flanqueantes 1-4. Las CDR de acuerdo con el sistema de numeración Kabat se indican en negrita. Las CDR de acuerdo con el sistema de numeración Chothia se indican en texto subrayado. También se muestra una secuencia consenso en la que "X" indica un sitio de variación. Debajo de la "X" se indican todos los aminoácidos que se encuentran en ese sitio en las secuencias analizadas.

Figura 11C es una representación esquemática que muestra secuencias de las regiones variables de cadenas pesadas de anticuerpos monoclonales CRC^bT-06-001, CRCBT-06-002, CRCBT-06-003, CRCBT-06-004, CRCBT-06-005, CRCBT-06-006 y CRCBT-06-007 (etiquetados 001, 002, 003, 004, 005, 006 y 007, respectivamente). Las secuencias se han alineado. Se indican las CDR 1-3 y las regiones flanqueantes 1-4. Las CDR de acuerdo con el sistema de numeración Kabat se indican en negrita. Las CDR de acuerdo con el sistema de numeración Chothia se indican en texto subrayado.

Figura 11D es una representación esquemática que muestra secuencias de una clase de regiones variables de cadenas pesadas altamente relacionadas de anticuerpos monoclonales representados en la Figura 11C (etiquetados 001, 002, 005, 006 y 007). Las secuencias se han alineado. Se indican las CDR 1-3 y las regiones flanqueantes 1-4 (definidas según el sistema de numeración Kabat). Las CDR de acuerdo con el sistema de numeración Kabat se indican en negrita. Las CDR de acuerdo con el sistema de numeración Chothia se indican en texto subrayado. También se muestra una secuencia consenso en la que "X" indica un sitio de variación. Debajo de la "X" se indican todos los aminoácidos que se encuentran en ese sitio en las secuencias analizadas.

Figura 12A es una serie de representaciones gráficas que muestran que el anticuerpo anti-Fnl4 CRCBT-06-001 reconoce un epítopo conformacional. El panel A.i. muestra que CRCBT-06-001 se une a Fnl4 nativo pero no a Fn14 (cuadrados) reducido y alquilado (R+A) mediante ELISA. Panel Aii. muestra que Fnl4 nativo y R+A Fnl4 retienen la unión al anticuerpo anti-Fc indicando que se conserva la integridad de R+A Fnl4. ♦ = Fnl4 nativo, ■ = R+A Fn14, ▲ = Blanco.

Figura 12B. es una copia de una representación fotográfica que muestra los resultados del análisis de transferencia Western de Fn14 y R+A Fnl4 que muestra que R+A Fnl4 no es detectado por CRCBT-06-001, mientras que el Fnl4 nativo se detecta fuertemente. Calles de Fnl4-Fc 1 y 2 etiquetado preparación 1: Calle 1 = Fnl4-Fc nativo, calles 2 = R A Fnl4, Calles 3 y 4 = Fnl4-Fc preparación 2: calles 3 = Fnl4-Fc nativo, calle 4 = R A Fn14-Fc. M = marcadores de peso molecular. a-Fc = detección usando anticuerpo anti-Fc. aFn14 = detección usando CRCBT-06-001.

Figura 12C es una representación gráfica que muestra que CRCBT-06-001, CRCBT-06-002, CRCBT-06-003, CRCBT-06-004, CRCBT-06-005, CRCBT-06-006 y CRCBT-06-007 reconocen un epítopo conformacional. Los anticuerpos se analizaron mediante ELISA para determinar la unión a Fnl4-Fc nativo y reducido y alquilado. El antígeno se revistió en la placa a 2 jg/ml y los anticuerpos se ensayaron a 1 jg/ml. El Fc antihumano reconoció la porción Fc de Fnl4 indicando que se conserva la integridad de R+A Fnl4. Como controles negativos se usaron un anticuerpo irrelevante (5G8) y un anticuerpo secundario solo (HRP anti-ratón).

Figura 13 es una serie de representaciones. El panel A muestra secuencias de una selección de clones probados para unión a CRCBT-06-001. El fragmento más corto identificado al desplazar la biblioteca de visualización de fagos (RW129) se resalta en negrita. El Panel B es una representación gráfica que muestra la unión de los fragmentos enumerados en el Panel A a CRCBT-06-001.

Figura 14A es una serie de representaciones gráficas que muestran constructos de dominio extracelular hFnl4 para su visualización en fagos. El panel A muestra una alineación de los constructos hFn14 mostrados en el fago, que incluye: El dominio extracelular de longitud completa de hFnl4; Los mutantes D45A, K48A, M50A y D62E, todos conocidos por tener una afinidad reducida por el ligando natural Tweak; y Subdominios 1-3.

Figura 14B muestra imágenes de pymol de la estructura de solución resuelta por RMN de la estructura de dominio extracelular Fnl4 humana (adaptada de He et al. 2009). Los subdominios 1 y 2 (SD1 y SD2, respectivamente) se representan como los restos K48, D45, M50 y D62, que se sabe que son importantes para la unión a Tweak.

Figura 15 es una serie de representaciones gráficas que muestran constructos de dominio extracelular hFn14 que se unen diferencialmente a Tweak-Fc recombinante. El panel A muestra los resultados de un ELISA que compara la reactividad de cada constructo de hFnl4 normalizada con MAb 9E10. Cada preparación de fagos se diluyó en serie 10 veces y se añadió al MAb 9E10 unido a la fase sólida. El panel B muestra los resultados del mismo ELISA que en el panel A comparando la unión de la concentración más alta de fago con MAb 9E10 y MAb 5G8. El panel C muestra los resultados de un ELISA que compara la reactividad de cada constructo de hFnl4 exhibida en fago normalizada con Tweak-Fc recombinante. El panel D muestra los resultados del mismo ELISA que en el panel C comparando la unión de la concentración más alta de cada preparación de fago con Tweak-Fc recombinante y Fc recombinante solo. La unión se detectó usando IgG policlonal anti-M13 conjugada con HRP y sustrato TMB. La densidad óptica a 450 nm se cuantificó usando un espectrofotómetro Spectramax. Las barras de error para cada dilución representan la desviación estándar de ensayos duplicados. En esta figura, la referencia al "Ectodominio FN14" o "WT" es una referencia al dominio extracelular de hFnl4. Métodos de acuerdo con el mapeo de Epítopos usando Fnl4 expresado en fago - Método 1.

Figura 16A es una serie de representaciones gráficas que muestran constructos hFnl4 mostrados en fagos se unen a MAbs anti-Fnl4. ELISA que muestran la reactividad del repertorio de constructos de fagos hFnl4 con los anticuerpos monoclonales anti-Fnl4 CRCBT-06-001, CRCBT-06-002, CRCBT-06-003 y CRCBT-06-004. La unión se detectó usando IgG policlonal anti-M13 conjugada con HRP y sustrato TMB. La densidad óptica a 450 nm se cuantificó usando un espectrofotómetro Spectramax. Las barras de error para cada dilución representan la desviación estándar de ensayos duplicados. En esta figura, la referencia al "Ectodominio FN14" es una referencia al dominio extracelular de hFnl4. Métodos de acuerdo con el mapeo de Epítopos usando Fnl4 expresado en fago - Método 1.

Figura 16B es una serie de representaciones gráficas que muestran constructos de dominio extracelular hFnl4 exhibidos en fagos que se unen específicamente a MAbs anti-Fnl4. Los resultados representados son de los mismos ELISA que en la Figura 16A, que comparan la reactividad del repertorio de constructos de fagos hFnl4 con los anticuerpos monoclonales anti-Fnl4 CRCBT-06-001, CRCBT-06-002, CRCBT-06-003 y CRCBT-06-004 y MAb 5G8 (como se indica). La unión se detectó usando IgG policlonal anti-M13 conjugada con HRP y sustrato TMB. La densidad óptica a 450 nm se cuantificó usando un espectrofotómetro Spectramax. Las barras de error para cada dilución representan la desviación estándar de ensayos duplicados. En esta figura, La referencia a "WT" es una referencia al dominio extracelular de hFnl4.

Figura 17 es una serie de representaciones gráficas que muestran que el anticuerpo monoclonal anti-Fnl4 ITEM-1 se une bien a los 4 mutantes Tweak. El panel A muestra los resultados de los ELISA que muestran la reactividad del repertorio de constructos de fagos hFnl4 con MAb 9E10 y los anticuerpos monoclonales anti-Fnl4 CRCBT-06-001 e ITEM-1. La concentración de cada preparación de fago se ajustó para dar una reactividad aproximadamente igual con MAb 9E10, para normalizar la cantidad de hFnl4 mostrada en cada preparación de fagos. Cada preparación normalizada se diluyó en serie 10 veces y se añadió en solución a los MAbs unidos a la fase sólida. Todos los ELISA que se muestran aquí se realizaron simultáneamente con las mismas preparaciones de fago. La unión se detectó usando IgG policlonal de fago anti-M13 conjugada con HRP y sustrato TMB. La densidad óptica a 450 nm se cuantificó usando un espectrofotómetro Spectramax. Las barras de error para cada dilución representan la desviación estándar de ensayos duplicados. El panel B muestra los resultados de los mismos ELISA que en el panel A, mostrando que ninguno de los constructos de hFn14 exhibidos en fagos se unen significativamente al control negativo MAb 5G8. En esta figura, La referencia a "FN14" es una referencia al dominio extracelular de hFn14. Métodos de acuerdo con el mapeo de Epítopos usando Fn14 expresado en fago - Método 1.

Figura 18A es una serie de representaciones gráficas que muestran que los anticuerpos monoclonales anti-Fn14 se unen específicamente al subdominio 2 del dominio extracelular hFn14. Los resultados de los ELISA se muestran mostrando la reactividad del dominio extracelular hFnl4 exhibido en fagos, subdominio 1 (SD1) y subdominio 2 (SD2) con los anticuerpos monoclonales anti-Fn14 CRCBT-06-001, CRCBT-06-002, C_1-CbT-06-003, CRCBT-06-004, CRCBT-06-005, CRCBT-06-006, ITEM-1 e ITEM-2. La concentración de cada preparación de fago se ajustó para dar una reactividad aproximadamente igual con MAb 9E10, para normalizar la cantidad de hFn14 mostrada en cada preparación de fagos. Cada preparación normalizada se diluyó en serie 10 veces y se añadió en solución a los MAbs unidos a la fase sólida. Todos los ELISA mostrados se realizaron simultáneamente con las mismas preparaciones de fagos. La unión se detectó usando IgG policlonal de fago anti-M13 conjugada con HRP y sustrato TMB. La densidad óptica a 450 nm se cuantificó usando un espectrofotómetro Spectramax. Las barras de error para cada dilución representan la desviación estándar de ensayos duplicados. En esta figura, La referencia a "FN14 Ecto" es una referencia al dominio extracelular de hFn14. Métodos de acuerdo con el mapeo de Epítopos usando Fn14 expresado en fago - Método 1.

Figura 18B es una serie de representaciones gráficas que muestran resultados de ELISA usando los mismos constructos de fagos que en la Figura 18A y que muestran que ninguno de los constructos de hFn14 mostrados en fagos se unen significativamente al control negativo MAb 5G8. Los ELISA se realizaron en condiciones similares a las descritas para la Figura 16A. En esta figura, La referencia a "FN14 Ecto" es una referencia al dominio extracelular de hFn14.

Figura 19 es una serie de representaciones gráficas que muestran que el anticuerpo monoclonal anti-Fn14 CRCBT-06-007 se une específicamente al subdominio 2 del dominio extracelular hFnl4. Panel A Los resultados de los ELISA se muestran mostrando la reactividad del dominio extracelular hFn14 exhibido en fagos (Fn14 Ecto), subdominio 1 (SD1) y subdominio 2 (SD2) con el anticuerpo monoclonal anti-Fn14 CRCBT-06-007. La concentración de cada preparación de fago se ajustó para dar una reactividad aproximadamente igual con MAb 9E10, para normalizar la cantidad de hFn14 mostrada en cada preparación de fagos. Cada preparación normalizada se diluyó en serie 10 veces y se añadió en solución a los MAbs unidos a la fase sólida. Los ELISA que se muestran aquí se realizaron simultáneamente con las mismas preparaciones de fagos. La unión se detectó usando IgG policlonal de fago anti-M13 conjugada con HRP y sustrato TMB. La densidad óptica a 450 nm se cuantificó usando un espectrofotómetro Spectramax. Las barras de error para cada dilución representan la desviación estándar de ensayos duplicados. El panel B muestra los resultados de los ELISA usando los mismos constructos de fagos que en la Figura Panel A y mostrando que ninguno de los constructos de hFn14 mostrados en fagos se unen significativamente al control negativo MAb 5G8. Los ELISA se realizaron en condiciones similares a las descritas para el Panel A. Métodos de acuerdo con el mapeo de Epítopos usando Fn14 expresado en fago - Método 1.

Figura 20 es una serie de representaciones esquemáticas. El panel A. muestra el dominio extracelular Fn14, El panel B. muestra el subdominio 1p de Fn14 (una forma más larga del subdominio 1 expresada en fago), El panel C. muestra el subdominio 2 de Fn14 y el panel D. muestra el subdominio 3 de Fn14. El panel E. muestra el subdominio 2 de Fn14 en el que el tercer y sexto resto de cisteína en ECD de Fn14 que forman enlaces disulfuro se mutan a serina (denominado en el presente documento "Subdominio 2 Cys 3 y 6 AS"). El panel F. muestra el subdominio 2 de Fn14 en el que los restos de cisteína cuarto y quinto en ECD de Fn14 que forman enlaces disulfuro se mutan a serina (denominado en el presente documento "Subdominio 2 Cys 4 y 5 AS"). Todos los paneles muestran conectividad de disulfuro de acuerdo con la estructura de la solución (He et al. 2009). La letra mayúscula en negrita "S" representa el resto de serina sustituido en lugar del resto de cisteína natural.

Figura 21A es una representación gráfica que muestra la especificidad de los mAb anti-Fn14. Los mAb anti-Fn14 CRCBT-06-001, CRCBT-06-002, CRCBT-06-003, CRCBT-06-004, CRCBT-06-005, CRCBT-06-006 y CRCBT-06-007 son reactivos con los subdominios 2 y 3 pero no con el subdominio 1. Se observó muy baja reactividad al péptido de control para todos los mAb anti-Fn14. El péptido de control también fue reactivo con su anticuerpo afín (control de isotipo).

Figura 21B es una representación gráfica que muestra la reactividad de los mAb anti-Fn14 CRCBT-06-001, CRCBT-06-002, CRCBT-06-003, CRCBT-06-004, CRCBT-06-005, CRCBT-06-006, CRCBT-06-007 e ITEM-1 con un péptido sintético que representa el subdominio 2 de Fn14. Las placas se recubrieron con péptido del subdominio 2 y se permitió que se unieran varias diluciones de anticuerpo, el anticuerpo unido se detectó con HRP anti-ratón y sustrato TMB. El promedio de lecturas duplicadas se representa, las barras de error representan desviaciones estándar. El ELISA se repitió para garantizar resultados coherentes. La línea vertical a 5 ng/ml dentro de la parte lineal de las curvas es el punto en el que se analizó una comparación de la reactividad de cada mAb.

Figura 21C es una representación gráfica que muestra la reactividad de los mAb anti-Fn14 CRCBT-06-001, CRCBT-06-002, CRCBT-06-003, CRCBT-06-004, CRCBT-06-005, CRCBT-06-006, CRCBT-06-007 e ITEM-1 con un péptido sintético que representa el subdominio 3 de Fn14. Las placas se recubrieron con péptido del subdominio 3 y se permitió que se unieran varias diluciones de anticuerpo, el anticuerpo unido se detectó con HRP anti-ratón y sustrato TMB. El promedio de lecturas duplicadas se representa, las barras de error representan desviaciones estándar. El ELISA se repitió para garantizar resultados coherentes.

Figura 22 es una representación gráfica que muestra la reactividad de constructos de fagos hFn14 con control de mAb 9E10 (Panel i), CRCBT-06-002 (Panel II) e ITEM-1 (Panel iii) para fago exhibieron fragmentos de Fn14 y mutantes de los mismos. La unión se detectó usando anticuerpo anti-M13-fago conjugado con HRP y sustrato TMB. La densidad óptica a 450 nm se cuantificó usando un lector de placas Spectramax. Las barras de error para cada dilución representan los intervalos de valores duplicados. Métodos de acuerdo con el mapeo de Epítopos usando Fn14 expresado en fago - Método 1.

Figura 23A es una representación gráfica que muestra la reactividad de hFn14 con los anticuerpos monoclonales anti-Fn14 (como se indica en la Figura) según se determina mediante ELISA. La unión se detectó usando IgG anti-ratón conjugada con HRP y sustrato TMB. La densidad óptica a 450 nm se cuantificó usando un espectrofotómetro Spectramax. Concentración de anticuerpos en pg/ml.

Figuras 23B y C son representaciones gráficas que muestran resultados de ELISA similares a los de la Figura 23A, sin embargo, usando anticuerpos monoclonales Fn14 a anti-Fn14 de ratón (como se indica). La concentración de anticuerpo en pg/ml. incluye una serie de representaciones gráficas que muestran la unión de anticuerpos CRCBT-Figuras 24A-E son representaciones gráficas que muestran unión de mutantes R56P mutantes para hFn14, R56A y R56K a anticuerpos anti-Fn14. Figuras 24A y 24B muestran los resultados de los ELISA que muestran la reactividad del mutante R56Ph de Fn14 con los anticuerpos monoclonales anti-Fn14 (como se indica en la Figura). La unión se detectó usando IgG anti-ratón conjugada con HRP y sustrato TMB. La densidad óptica a 450 nm se cuantificó usando un espectrofotómetro Spectramax. Figuras 24C y D muestran los resultados de los ELISA realizados comparando la unión de mutante R56A de hFn14 a anticuerpos monoclonales anti-Fn14 (como se indica). Figuras 24E y F muestran los resultados de los ELISA realizados comparando la unión de mutante R56A de hFn14 con anticuerpos monoclonales anti-Fn14 (como se indica). Concentración de anticuerpos en |jg/ml.

Figuras 25A y B son representaciones gráficas que muestran la unión de mutantes R58A de hFn14 purificados a anticuerpos anti-Fn14 (como se indica en la Figura). La unión se detectó usando IgG anti-ratón conjugada con HRP y sustrato TMB. La densidad óptica a 450 nm se cuantificó usando un espectrofotómetro Spectramax. Concentración de anticuerpos en jg/ml.

Figura 26 es una representación gráfica que muestra los resultados de un ELISA que prueba la reactividad del constructo de fago hFn14 mutante que comprende una mutación R58A con los anticuerpos monoclonales anti-Fn14 CRCBT-06-001, CRCBT-06-002, C_1-CbT-06-004 en comparación con ITEM-1 e ITEM-4. La unión se detectó usando anticuerpo monoclonal anti-M13-fago conjugado con biotina seguido de estreptavidina conjugada con HRP y sustrato TMB. La densidad óptica a 450 nm se cuantificó usando un espectrofotómetro Spectramax. Las barras de error para cada dilución representan la desviación estándar de ensayos duplicados. Eje X = dilución del fago. Métodos de acuerdo con el mapeo de Epítopos usando Fn14 expresado en fago - Método 2. Figuras 27 son una serie de representaciones gráficas que muestran la unión de constructos de hFn14 mutantes exhibidos en fagos a los mAb anti-Fn14. Se muestran los resultados de ELISA que prueban la reactividad de constructos de fago hFn14 mutantes con los anticuerpos monoclonales anti-Fn14 CRCBT-06-001, CRCBT-06-002, CRCBT-06-004 en comparación con ITEM-1 e ITEM-4 y, en algunos casos, ITEM-2. Para los mutantes P59A y F63A, la unión se detectó usando IgG policlonal anti-M13 conjugada con HRP y sustrato TMB. Para todos los demás mutantes, la unión se detectó usando anticuerpo monoclonal anti-Ml3-fago conjugado con biotina seguido de estreptavidina conjugada con HRP y sustrato t Mb . La densidad óptica a 450 nm se cuantificó usando un espectrofotómetro Spectramax. Las barras de error para cada dilución representan la desviación estándar de ensayos duplicados. Figura 27A. Fn14 tipo silvestre, Figura 27B. W42A, Figura 27C. S54A, Figura 27D. A57G, Figura 27E. P59A, Figura 27F. S61A, Figura 27G. F63A, Figura 27H. L65A. En todos los casos las barras de error representan la desviación estándar. Eje X = dilución del fago. Métodos de acuerdo con el mapeo de Epítopos usando Fn14 expresado en fago - Método 2.

Figuras 28 son una serie de representaciones gráficas que muestran la unión de constructos de hFn14 mutantes exhibidos en fagos a los mAb anti-Fn14. ELISA que muestran la reactividad de constructos de fago hFn14 mutantes con los anticuerpos monoclonales anti-Fn14 CRCBT-06-001, CRCBT-06-002, CRCBT-06-004 en comparación con ITEM-1 e ITEM-4. La unión se detectó usando anticuerpo monoclonal anti-M13-fago conjugado con biotina seguido de estreptavidina conjugada con HRP y sustrato TMB. La densidad óptica a 450 nm se cuantificó usando un espectrofotómetro Spectramax. Las barras de error para cada dilución representan la desviación estándar de ensayos duplicados. Figura 28A. L46A, Figura 28B. D51A y Figura 28C. D62A. En todos los casos las barras de error representan la desviación estándar. Eje X = dilución del fago. Métodos de acuerdo con el mapeo de Epítopos usando Fn14 expresado en fago - Método 2.

Figuras 29A y 29B son representaciones gráficas que muestran la unión de constructos de hFn14 mutantes exhibidos en fagos a mAbs anti-Fn14. ELISA que muestran la reactividad de los constructos de fago H60A y H60K hFn14 mutantes con los anticuerpos monoclonales anti-Fn14 CRCBT-06-001, CRCBT-06-002, CRCBT-06-004 en comparación con ITEM-1 e ITEM-4. ITEM-2 se evaluó en H60K. La unión se detectó usando anticuerpo monoclonal anti-M 13-fago conjugado con biotina seguido de estreptavidina conjugada con HRP y sustrato TMB. La densidad óptica a 450 nm se cuantificó usando un espectrofotómetro Spectramax. Las barras de error para cada dilución representan la desviación estándar de ensayos duplicados. Eje X = dilución del fago. Métodos de acuerdo con el mapeo de Epítopos usando Fn14 expresado en fago - Método 2. Figuras 30A y 30B. son representaciones gráficas que muestran la unión de anticuerpos anti-Fn14 a péptidos mutantes de enlace disulfuro. Figura 30A muestra resultados de ELISA en los que se valoraron los anticuerpos anti-Fn14 (0,1-0,0001 jg/ml) y se evaluó la unión al subdominio 2 cys 3 y 6AS mutante. Figura 30B es similar a la figura 27A, sin embargo, se evaluó la unión al mutante cys4 y 5AS del subdominio 2 (1-0,0001 jg/ml).

Figura 31 es una serie de representaciones gráficas que muestran la tinción de células cultivadas in vitro para niveles de expresión de Fn14. Las células se cultivaron en presencia o ausencia de 4-OHT 100 nM durante 24 horas (el panel A muestra los resultados para MEF SV40v12Hras Fn14, el panel B muestra los resultados para MEF SV40 y el panel C muestra los resultados para el carcinoma de pulmón de Lewis). Las células se cosecharon y se tiñeron para la expresión de hFn14 usando un anticuerpo anti-Fn14 disponible en el mercado seguido de un anticuerpo Alexafluor-647 anti-ratón para la detección por citometría de flujo. Tinción con anti-Fn14 indicado por trazo sólido, tinción de control de anticuerpos secundarios por trazo discontinuo y células no teñidas por trazo punteado.

Figura 32 es una serie de representaciones gráficas que muestran el análisis de la secreción de citoquinas por las líneas celulares tumorales MEF. Las líneas celulares tumorales MEF que contienen Fn14 o Fn14-GPI fueron inducidas con 4-OHT o no inducidas. Después de 48 horas en condiciones normales de crecimiento se recogieron los medios de las células y se evaluaron los niveles de IL-6 usando el kit de inflamación de ratón BD CBA y se realizó un análisis cuantitativo usando el software FCAP Array (BD Biosciences).

Figura 33 es una serie de representaciones que muestran la creación de un modelo de tumor in vivo Fn14. El día 1 se inyectaron células tumorales a ratones hembra C57BL/6. El panel A es una representación gráfica que muestra los resultados de las mediciones tomadas a medida que se formaron los tumores y se calculó el volumen tumoral para cada ratón ([longitud*anchura2]/2) y los promedios grupales se representaron. El panel B es una representación gráfica que muestra los resultados del análisis en que el peso corporal de cada ratón se evaluó diariamente y se estandarizó frente al peso del día 1 como 100. El promedio para cada grupo se calculó y se hizo la gráfica. Los grupos incluyen tumores que contienen hFn14 tipo silvestre (v12Hras Fn14; ♦; n = 6) o línea celular tumoral parental (v12Hras; ■; n = 6). Los experimentos se repitieron de forma reproducible varias veces, datos de un experimento presentado. Las barras de error representan el ETM. Observación - el eje Y del Panel B no comienza en 0.

Figura 34A es una serie de representación esquemática de la secuencia de la región extracelular de Fn14 humano (NEGRITA) fusionado a la región codificante de anclaje GPI de TrailR3 (CURSIVA) para crear hFn14-GPI. El resto de serina de unión a GPI previsto se indica en texto en negrita con una flecha. La región subrayada indica la secuencia señal de Fn14.

Figura 34B incluye dos representaciones gráficas que muestran los resultados de la introducción de tumores que expresan hFn14 o tumores que no expresan hFn14 en ratones. El día 1 se inyectaron células tumorales a ratones hembra C57BL/6. Los grupos incluyen tumores que contienen Fn14 tipo silvestre (♦; n = 14) o tumores Fn14-GPI (■; n = 14). El panel i muestra los resultados del análisis realizado a medida que se formaron los tumores y se tomaron medidas y se calculó el volumen tumoral para cada ratón ([longitud*anchura2]/2). El panel ii muestra resultados de análisis del peso corporal para cada ratón. Los promedios grupales se calcularon y representaron con el tiempo. Observación - el panel ii no comienza en 0. Los datos se representaron como promedios grupales. Los experimentos se repitieron de forma reproducible varias veces, se presentan datos de un experimento representativo. Las barras de error representan el ETM.

Figura 35 incluye dos representaciones gráficas que muestran los efectos de los tumores que expresan constitutivamente Fn14 humano. El día 1 se inyectaron células tumorales a ratones hembra C57BL/6. Los grupos incluyen tumores que contienen Fn14 de bajo nivel (n = 3, ratones 137-139) y Fn14 expresado constitutivamente (n = 6, ratones 149-154) como se indica al lado de la leyenda. El panel A muestra los resultados del análisis en que el peso corporal de cada ratón se evaluó diariamente y se representó con el tiempo. Observación - El eje Y del panel A no comienza en 0. El panel B muestra los resultados de las mediciones del volumen tumoral. Se tomaron medidas y se calculó el volumen tumoral para cada ratón ([longitud*anchura2]/2) y se representó individualmente con el tiempo.

Figura 36 es una representación gráfica que muestra los resultados del tratamiento de tumores hFn14 con CRCBT-06-001. Se inyectaron ratones hembra C57BL/6 con células tumorales hFn14 o hFn14-GPI el día 1. El día 6 cada grupo se segregó de manera uniforme y la mitad se trató dos veces por semana con una inyección IP de CRCBT-06-001 (10 mg/kg) durante un total de 4 semanas. La otra mitad del grupo no recibió tratamiento. El peso corporal se midió diariamente, estandarizado contra el peso inicial como 100 y los promedios grupales se representaron. ■ = anticuerpo tratado con Fn14, ♦ = Fn14 sin tratar, • = tratado con anticuerpo Fn14-GPI, ▲ = Fn14-GPI sin tratar. Los días de tratamiento se indican con una flecha negra hacia abajo (j). Las flechas apuntando hacia arriba indican que un ratón fue sacrificado, el símbolo hacia abajo indicando de qué grupo. Cada grupo n = 3 y las barras de error representan ETM. Observación - el eje Y no comienza en 0.

Figura 37A es una representación gráfica que muestra los resultados del tratamiento de ratones con tumor hFn14 con CRCBT-06-001, CRCBT-06-002, CRCBT-06-004 o ITEM-1. Se inyectó a las hembras C57BL/6 ratones con células tumorales Fn14 el día 1. El día 7, los grupos de ratones (n = 6) recibieron una única inyección IP de anticuerpo purificado (5 mg/kg) o ningún tratamiento. A. El peso corporal se midió diariamente y se representó como peso estandarizado frente al peso inicial como 100 % y se representó como promedio grupal. Día de tratamiento indicado por una flecha negra hacia abajo (j). Las barras de error representan ETM. Observación - el eje Y no se cruza en 0.

Figura 37B incluye dos representaciones gráficas que muestran la supervivencia de ratones con tumor hFn14 con CRCBT-06-001, CRCBT-06-002, CRCBT-06-004 o ITEM-1. El panel de la izquierda indica el día en que se sacrificó cada ratón y el día de supervivencia promedio del grupo. Observación * indica que un punto de datos representa ratones sanos sin pérdida de peso al final del experimento (día 27). La línea discontinua (- -) representa el tratamiento con anticuerpos (día 7). El panel de la derecha es una curva de Kaplan-Meier que muestra la supervivencia.

Figura 38 es una representación gráfica que muestra la respuesta a la dosis de CRCBT-06-001 y el rescate de ratones de pérdida de peso y enfermedad. Se inyectó a las hembras C57BL/6 ratones con células tumorales hFn14 el día 1. El día 6 los grupos fueron tratados con una única inyección IP de CRCBT-06-001 (0-10 mg/kg). Los ratones no tratados recibieron una inyección de vehículo (PBS). El día 9 o 10 como se indica, los ratones que exhibían una pérdida de peso evidente se trataron con una única inyección IP de 10 mg/kg de CRCBT-06-001. El peso corporal se midió diariamente, estandarizado contra el peso inicial (día 1) como 100 y se representaron los promedios grupales. Los pesos estandarizados para cada grupo se representaron como promedios grupales. Las barras de error representan el ETM. El día de tratamiento de la dosis de anticuerpos se indica mediante una flecha negra hacia abajo. Cada grupo n = 3. Los símbolos representan que se sacrificó un ratón del grupo designado con ese símbolo. Observación - el eje Y no comienza en 0.

Figura 39A es una representación gráfica que muestra los efectos de CRCBT-06-001 en la masa corporal en ratones inyectados con células MEF Fn14. El día 1, A ratones C57BL/6 hembra de 11 semanas de edad se les administró una inyección subcutánea única de MEF Fn14 o con la línea celular parental (Hras). El día 6, a los ratones se les administró una única inyección intraperitoneal de anticuerpo de control de isotipo IgG2b (Hras+IgG2b, MEF Fn14+IgG2b, n = 8/grupo) o CRCBT-06-001 (MEF Fn14+001, n = 8). La masa corporal se midió los días 1 y 11. Los datos son medias ± ETM. *P<0,01 contra Hras+IgG2b; f P<0,05 contra MEFFn14+IgG2b.

Figura 39B es una representación gráfica que muestra los efectos de CRCBT-06-001 en la masa corporal libre de tumor en ratones inyectados con células MEF Fn14. El día 11, el tumor de ratones descrito en relación con la Figura 28A se extirpó quirúrgicamente y se pesó, lo que permitió calcular el porcentaje de cambio en la masa corporal libre de tumor de la preinoculación (B). Los datos son medias ± ETM. *P<0,01 contra Hras+IgG2b; fP<0,05 contra MEFFn14+IgG2b.

Figura 40A es una representación gráfica que muestra los efectos de CRCBT-06-001 en la masa tumoral en ratones inyectados con células MEF Fn14. El día 11, el tumor de ratones descrito en relación con la Figura 39A se extirpó quirúrgicamente y se pesó permitiendo el cálculo del cambio porcentual en la masa tumoral.

Figura 40B es una representación gráfica que muestra los efectos de CRCBT-06-001 en el volumen tumoral en ratones inyectados con células MEF Fn14. El día 11, El tumor de ratones descrito en relación con la Figura 39A se extirpó quirúrgicamente y se calculó el volumen tumoral.

Figuras 41A y B Hay una serie de representaciones gráficas que muestran los efectos de CRCBT-06-001 en la masa muscular en ratones inyectados con células MEF Fn14. El día 11, los músculos seleccionados de las extremidades posteriores (como se indica en la Figura 41A); y la grasa epididimaria y el corazón (como se indica en la Figura 42B) se extirparon y pesaron en una balanza analítica. EDL, extensor largo de los dedos; Planta, plantar; TA, tibial anterior; Gastroc, gastrocnemio; Cuád, cuádriceps. Los datos son medias ± ETM. *P<0,05 contra Hras+IgG2b; fP<0,05 contra MEF Fn14+IgG2b.

Figuras 42A y B son representaciones gráficas que muestran los efectos de CRCBT-06-001 en la fuerza de todo el cuerpo en ratones inyectados con células MEF Fn14. El día 11, la fuerza de todo el cuerpo se evaluó usando un medidor de fuerza de agarre y se expresó en valores absolutos (Figura 42A) y se normalizó a la masa corporal (Figura 42B). Los datos son medias ± ETM. Figuras 43A-D son representaciones gráficas que muestran los efectos de CRCBT-06-001 en las propiedades funcionales de los músculos tibiales anteriores (TA) in situ en ratones inyectados con MEFFn14. El día 11, se evaluó fuerza de contracción máxima (Figura 43A), fuerza tetánica máxima (Figure 43B), relación frecuencia-fuerza (Figure 43C) y producción de fuerza durante y después de 4 minutos de estimulación intermitente fatigante (Figura 43D) en músculos TA in situ. Los datos son medias ± ETM. aP<0,05 efecto principal Hras+IgG2b contra MEF Fn14+IgG2b.

Figura 44 es una serie de representaciones gráficas que muestran los efectos de CRCBT-06-001 en el tamaño de la fibra, composición de tipo de fibra y capacidad de enzima oxidativa de fibra en músculos tibiales anteriores (TA) de ratones inyectados con células MEF Fn14. El día 11, los músculos TA fueron extirpados y congelados para posteriores análisis histológicos. Se muestra cuantificación de laminina, N2.261 y SDH basado en determinación facilitada de intensidad de la proporción de fibras tipo IIa y tipo IIx/b (fibras que no reaccionan con N2.261) (panel izquierdo), el área de las fibras tipo IIa y tipo IIx/b (panel central) y la actividad SDH basada en la intensidad de reacción de las fibras tipo IIa y tipo IIx/b (panel derecho). Los datos son medias ± ETM. *P<0,05 contra Hras+IgG2b; fP<0,05 contra MEF Fn14+IgG2b.

Figuras 45A y B son representaciones gráficas que muestran el efecto del efecto de CRCBT-06-002 en el modelo Colon-26 para caquexia por cáncer. Se inocularon ratones CD2F1 macho de 11 semanas de edad con 1x106 células s/c en el costado el día 1 para formar tumores sólidos. Los grupos incluyeron Colon-26 sin tratar (n = 5), Colon-26 CRCBT-06-002 tratado (n = 5), Alimentado por pares (n = 4) y controles no tratados sin tumor (n = 3). Los días 5, 12, 15 y 20, los ratones fueron tratados con una inyección IP de 10 mg/kg CRCBT-06-002 (j). Los ratones no tratados no recibieron tratamiento. Para la figura 45A, la masa corporal se midió diariamente y se representó como pesos promedio grupales estandarizados contra el peso inicial (día 1) como 100 %. Para la Figura 45B la supervivencia diaria después del inicio del tratamiento con anticuerpos (día 5) se representó como una curva de Kaplan-Meier. Observación - dos ratones tratados con anticuerpos fueron sacrificados debido al punto final del volumen máximo del tumor y, por lo tanto, no se incluyen en este gráfico.

Figuras 46A y B son representaciones gráficas que muestran el efecto del efecto de CRCBT-06-002 en tumores en el modelo Colon-26 para caquexia por cáncer. Para la figura 46A, a medida que se formaron los tumores, se tomaron medidas y se calculó el volumen tumoral para cada ratón ([longitud*anchura2]/2). Los datos se representaron como promedios grupales Las barras de error representan el ETM. La aparente disminución del volumen tumoral (de aproximadamente 1200 a 400 mm3) el día 20 refleja la reducción en el número de grupo debido a la muerte de varios ratones que habían alcanzado el tamaño máximo permitido del tumor. Los ratones supervivientes en 21 tenían un volumen tumoral promedio de aproximadamente 400 mm3. Para la Figura 46B, se inocularon ratones Balb/c hembra de 9-10 semanas de edad con 1x106 células s/c en el costado el día 1 para formar tumores sólidos. Los grupos incluyeron Sin tratar (n = 5) y CRCBT-06-002 tratados (n = 5). Los días 8, 12, 15, 19 y 22, los ratones fueron tratados con una inyección IP de 10 mg/kg de CRCBT-06-002 como se indica. A medida que se formaron tumores, se tomaron medidas y se calculó el volumen tumoral para cada ratón. Los datos se representan para promedios grupales. Las barras de error representan el ETM.

Figuras 47A a C son representaciones gráficas que muestran el efecto de CRCBT-06-001 en ratones CD2F1 administrados con células Colon-26. Se inocularon ratones CD2F1 macho de 12 semanas de edad con 1x106 células s/c en el costado el día 1 para formar tumores sólidos. Los grupos incluyeron Sin tratamiento (n = 5; ratones números 1-5) y tratados con CRCBT-06-001 (n = 5; ratones números 6-10). Los días 16 y 20, los ratones fueron tratados con una inyección IP de 10 mg/kg CRCBT-06-001. Días de tratamiento con anticuerpos como se indica j. Los datos se representaron estandarizados contra la masa corporal inicial como 100 % para los promedios grupales (mostrados en Figura 47A) Las barras de error representan el ETM. Figura 47B. muestra la supervivencia representada como una curva de Kaplan-Meier. Figura 47C muestra los promedios grupales del volumen tumoral. Las barras de error representan el ETM.

Figuras 48 A a C son representaciones gráficas que muestran los efectos de CRCBT-06-002 en la masa corporal en el modelo Colon-26 de caquexia por cáncer. Se inocularon ratones CD2F1 macho de 11 semanas de edad con 1x106 células s/c en el costado el día 1 para formar tumores sólidos. Los grupos incluyeron sin tratamiento (n = 9), alimentado por pares tratado con IgG (n = 10) y alimentado por pares tratado con c Rc BT-06-002 (n = 10). Los días 8, 12 y 16, los ratones fueron tratados con una inyección IP de 10 mg/kg de IgG o 10 mg/kg de CRCBT-06-002 (j). La masa corporal se midió diariamente y se expresó como masa corporal absoluta (y se muestra en Figura 48A) y la masa corporal normalizada al peso inicial como 100. Observación: el eje Y no comienza en 0 (Figura 48B). El día 22, el tumor se extirpó quirúrgicamente y se pesó permitiendo calcular el cambio porcentual de la masa corporal libre de tumor de la preinoculación (Figura 48C). Los datos son medias ± ETM. *P<0,05 contra C-26; fP<0,05 contra C-26 IgG. Figuras 49A a C son representaciones gráficas que muestran el efecto de CRCBT-06-002 en el tamaño del tumor en el modelo Colon-26 de caquexia por cáncer. El tamaño del tumor se midió diariamente con calibradores digitales (resultados representados en Figura 49A). El día 22, el tumor se extirpó quirúrgicamente y se pesó (los resultados se muestran en Figura 49B) y se normalizó a la masa corporal total (como se muestra en Figura 49C). Los datos son medias ± ETM. *P<0,05 contra C-26; fP<0,05 contra C-26 IgG Figuras 50A y B son representaciones gráficas que muestran los efectos de CRCBT-06-002 en la masa muscular en el modelo Colon-26 de caquexia por cáncer. El día 22, los músculos seleccionados de las extremidades posteriores (Figura 50A), la grasa epididimaria y el corazón (Figura 50B) se extirparon y se pesaron en una balanza analítica. EDL, extensor largo de los dedos; Planta, plantar; TA, tibial anterior; Gastroc, gastrocnemio; Cuád, cuádriceps. Los datos son medias ± ETM. *P<0,05 contra C-26; fP<0,05 contra C-26 IgG.

Figuras 51A y B son representaciones gráficas que muestran los efectos de CRCBT-06-002 en la fuerza y movilidad de todo el cuerpo en el modelo Colon-26 de caquexia por cáncer. El día 21, la fuerza de todo el cuerpo se evaluó usando un medidor de fuerza de agarre (Figura 51A) y la movilidad de todo el cuerpo se evaluó mediante la latencia hasta la caída durante un ensayo rotarod (Figura 51B). Los datos son medias ± ETM. *P<0,05 contra C-26; fP<0,05 contra C-26 IgG.

Figuras 52A a D son representaciones gráficas que muestran el efecto de los efectos CRCBT-06-002 en las propiedades funcionales de los músculos tibiales anteriores (TA) in situ en el modelo Colon-26 de caquexia por cáncer. El día 22, se evaluó la fuerza de contracción máxima (Figura 52A), fuerza tetánica máxima (Figura 52B), relación frecuencia-fuerza (Figura 52C) y producción de fuerza durante y después de 4 minutos de estimulación intermitente fatigante (Figura 52D) en músculos TA in situ. Los datos son medias ± ETM. *P<0,01 contra C-26; fP<0,05 contra C-26 IgG; cP<0,03 efecto principal C-26+002 mayor que C-26+IgG.

Figuras 53A a C son representaciones gráficas que muestran los efectos de CRCBT-06-002 en la arquitectura de la fibra muscular, tamaño de fibra, composición del tipo de fibra y capacidad de la enzima oxidativa de la fibra en los músculos tibiales anteriores (TA) del modelo Colon-26 de caquexia por cáncer. El día 22, los músculos TA se extirparon y congelaron para análisis posteriores. La cuantificación de las reacciones de laminina y N2.261 permitió la evaluación del área de sección transversal (CSA) de las fibras tipo IIa y tipo IIx/b, así como la CSA de fibra muscular promedio (Figura 53A). También permitió evaluar la proporción de fibras musculares tipo IIa y tipo IIx/b (Figura 53b ). La cuantificación de SDH y N2.261 permitió evaluar la capacidad enzimática oxidativa de las fibras tipo IIa y tipo IIx/b, así como la capacidad enzimática oxidativa promedio de las fibras musculares (Figura 53C). *P<0,05 contra C-26; fP<0,05 contra C-26 IgG.

Figura 54 es una representación gráfica que muestra que la administración de un anticuerpo anti-Fnl4 después de la aparición de diabetes previene parcialmente la pérdida de peso asociada con diabetes inducida por estreptozotocina (STZ). La diabetes se indujo en ratones C57B1/6 machos mediante la administración de dosis bajas múltiples de STZ. Los grupos incluyeron STZ, Vehículo, Alimentado por pares y 20 mg/kg de CRCBT-06-002. j = Día de tratamiento con anticuerpos. Las mediciones diarias de peso corporal se estandarizaron contra el peso inicial (día 1) como 100 % y se representaron los promedios del grupo. n = 8, Las barras de error representan SE. Observación el eje Y no se cruza en 0.

Figura 55 es una representación gráfica que muestra la ingesta acumulada de agua en ratones representada en la Figura 54. La ingesta de agua se midió diariamente para cada grupo (n = 8) y se representó como ingesta acumulativa de agua.

Figura 56 es una representación gráfica que muestra el análisis de glucosa en sangre de ratones tratados como se describe con respecto a la Figura 54. La glucosa en sangre se evaluó en ratones no en ayunas el último día del experimento usando un monitor de glucosa en sangre Accu-check y se representó como promedio del grupo. Las barras de error representan ETM. Cuando se detectó una lectura fuera de rango, se asignó la lectura máxima posible de 600 mg/dl. n = 8 por grupo.

Figura 57 es una serie de representaciones gráficas que muestran que la administración de anticuerpos anti-Fn14 después del inicio de la diabetes atenúa el desgaste muscular asociado con la diabetes inducida por STZ. La diabetes fue inducida en ratones machos C57B1/6 mediante la administración de dosis bajas de STZ múltiples como en la Figura 54. Los grupos incluyeron STZ, Vehículo, Alimentado por pares y 20 mg/kg de CRCBT-06-002 tratamiento con anticuerpos. El tratamiento con anticuerpos se administró el día 7. El panel A muestra que la masa de tejido promedio del grupo se calculó y representó. La masa tisular se estandarizó a la masa corporal final (Panel B) e inicial (Panel C) y se representó como promedios grupales, Los paneles B y C muestran respectivamente la masa de i. Cuádriceps ii. Corazón iii. Tibial anterior iv. Grasa epididimaria. Las barras de error representan el ETM. n = 8. Observar que algunos ejes Y no se cruzan en 0.

CLAVE PARA EL LISTADO DE SECUENCIAS

SEQ ID NO 1: secuencia de aminoácidos de Fn14 humano

SEQ ID NO 2: secuencia de aminoácidos del dominio extracelular Fn14

SEQ ID NO 3: secuencia de aminoácidos del fragmento RW129 del gen Fn14

SEQ ID NO 4: secuencia de aminoácidos del fragmento RW131 del gen Fn14

SEQ ID NO 5: secuencia de aminoácidos del fragmento RW127 del gen Fn14

SEQ ID NO 6: secuencia de aminoácidos del fragmento RW125 del gen Fn14

SEQ ID NO 7: secuencia de aminoácidos del fragmento RW120 del gen Fn14

SEQ ID NO 8: secuencia de aminoácidos del fragmento RW118 del gen Fn14

SEQ ID NO 9: secuencia de aminoácidos del fragmento RW114 del gen Fn14

SEQ ID NO 10: secuencia de aminoácidos del fragmento RW98 del gen Fn14

SEQ ID NO 11: secuencia de aminoácidos del fragmento RW95 del gen Fn14

SEQ ID NO 12: secuencia de aminoácidos del fragmento RW91 del gen Fn14

SEQ ID NO 13: secuencia de aminoácidos para secuencia consenso para V^h

SEQ ID NO 14: secuencia de aminoácidos para secuencia consenso para V^l

SEQ ID NO 15: secuencia de aminoácidos de Vh de CRCBT-06-001

SEQ ID NO 16: secuencia de aminoácidos de Vh de CRCBT-06-002

SEQ ID NO 17: secuencia de aminoácidos de Vh de CRCBT-06-003

SEQ ID NO 18: secuencia de aminoácidos de V^hde CRCBT-06-004

SEQ ID NO 19: secuencia de aminoácidos de Vh de CRCBT-06-005

SEQ ID NO 20: secuencia de aminoácidos de VH de CRCBT-06-006

SEQ ID NO 21: secuencia de aminoácidos de Vh de CRCBT-06-007

SEQ ID NO 22: secuencia de aminoácidos de VL de CRCBT-06-001

SEQ ID NO 23: secuencia de aminoácidos de VL de CRCBT-06-002

SEQ ID NO 24: secuencia de aminoácidos de VL de CRCBT-06-003

SEQ ID NO 25 secuencia de aminoácidos de VL de CRCBT-06-004

SEQ ID NO 26: secuencia de aminoácidos de VL de CRCBT-06-005

SEQ ID NO 27: secuencia de aminoácidos de VL de CRCBT-06-006

SEQ ID NO 28: secuencia de aminoácidos de VL de CRCBT-06-007

SEQ ID NO 29: secuencia de aminoácidos del constructo mutante D45A de dominio extracelular hFn14 SEQ ID NO 30: secuencia de aminoácidos del constructo mutante K48A de dominio extracelular hFn14 SEQ ID NO 31: secuencia de aminoácidos del constructo mutante M50A de dominio extracelular hFn14 SEQ ID NO 32: secuencia de aminoácidos del constructo mutante D62E de dominio extracelular hFn14 SEQ ID NO: 33: secuencia de aminoácidos del subdominio 1 de hFn14

SEQ ID NO 34: secuencia de aminoácidos del subdominio 2 de hFn14

SEQ ID NO: 35: secuencia de aminoácidos del subdominio 3 de hFn14

SEQ ID NO 36: secuencia de aminoácidos de control de Fn14-GPI

SEQ ID NO 37: secuencia de nucleótidos de un cebador para amplificar el ácido nucleico que codifica el dominio extracelular de Fn14.

SEQ ID NO 38: secuencia de nucleótidos de un cebador para amplificar el ácido nucleico que codifica el dominio extracelular de Fn14.

SEQ ID NO 39: secuencia de nucleótidos de un cebador para amplificar la región codificante de anclaje Trail R3 GPI.

SEQ ID NO 40: secuencia de nucleótidos de un cebador para amplificar la región codificante de anclaje Trail R3 GPI.

SEQ ID NO 41: secuencia de nucleótidos de un cebador para amplificar la región variable de cadena ligera de un anticuerpo.

SEQ ID NO 42: secuencia de nucleótidos de un cebador para amplificar la región variable de cadena ligera de un anticuerpo.

SEQ ID NO 43: secuencia de nucleótidos de un cebador para amplificar la región variable de cadena pesada de un anticuerpo.

SEQ ID NO 44: secuencia de nucleótidos de un cebador para amplificar la región variable de cadena pesada de un anticuerpo.

SEQ ID NO 45: secuencia de nucleótidos de un cebador para amplificar la región variable de cadena pesada de un anticuerpo.

SEQ ID NO: 46: secuencia de aminoácidos del subdominio 1p.

SEQ ID NO: 47 subdominio 2 de Fn14 en que el tercer y sexto restos de cisteína en Fnl4 ECD que forman enlaces disulfuro se mutan a serina (denominado en el presente documento "Subdominio 2 Cys 3 y 6 AS"). SEQ ID NO: 48: Subdominio 2 de Fn14 en que los restos de cisteína cuarto y quinto en ECD de Fn14 que forman enlaces disulfuro se mutan a serina (denominado en el presente documento "Subdominio 2 Cys 4 y 5 AS"). SEQ ID NO: 49: mutante T33N de Fn14

SEQ ID NO 50 mutante A34S de Fn14

SEQ ID NO 51 mutante R38S de Fn14

SEQ ID NO: 52: mutante R56P de Fn14

SEQ ID NO 53 mutante L77M de Fn14

SEQ ID NO: 54: mutante R56A de Fn14

SEQ ID NO 55 mutante R56K de Fn14

SEQ ID NO: 56: mutante R58A de Fn14

SEQ ID NO 57 mutante W42A de Fn14

SEQ ID NO 58 mutante L46A de Fn14

SEQ ID NO 59 mutante D51A de Fn14

SEQ ID NO mutante S54A de Fn14

SEQ ID NO 61 mutante A57G de Fn14

SEQ ID NO 62 mutante P59A de Fn14

SEQ ID NO 63 mutante H60A de Fn14

SEQ ID NO 64 mutante S61A de Fn14

SEQ ID NO 65 mutante D62A de Fn14

SEQ ID NO 66 mutante F63A de Fn14

SEQ ID NO 67 mutante L65A de Fn14

SEQ ID NO 68 mutante H60K de Fn14

SEQ ID NO 69 Cebador para amplificar la cadena ligera de anticuerpos

SEQ ID NO 70 Cebador para amplificar la cadena ligera de anticuerpos

Descripción detallada

General

A lo largo de la presente memoria descriptiva, a menos que se indique específicamente lo contrario o el contexto requiera lo contrario, la referencia a una sola etapa, composición de materia, grupo de etapas o grupo de composiciones de materia se tomará para abarcar una y una pluralidad (es decir, una o más) de esas etapas, composiciones de materia, grupos de etapas o grupo de composiciones de materia.

Los expertos en la materia apreciarán que la presente descripción es susceptible de variaciones y modificaciones distintas de las descritas específicamente. Debe entenderse que la divulgación incluye todas esas variaciones y modificaciones. La divulgación también incluye todas las etapas, características, composiciones y compuestos referidos o indicados en la presente memoria descriptiva, individual o colectivamente, y cualquiera y todas las combinaciones o cualesquiera dos o más de dichas etapas o características.

La presente divulgación no tiene un alcance limitado por los ejemplos específicos descritos en el presente documento, que solo tienen el propósito de ejemplo. Los productos funcionalmente equivalentes, composiciones y los métodos están claramente dentro del alcance de la divulgación.

Cualquier ejemplo de la presente divulgación en el presente documento se tomará para aplicar mutatis mutandis a cualquier otro ejemplo de divulgación a menos que se indique específicamente lo contrario.

Salvo que se defina específicamente de otra manera, se considerará que todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que comúnmente entiende un experto en la materia (por ejemplo, en cultivo celular, genética molecular, inmunología, inmunohistoquímica, química de proteínas, y bioquímica).

A menos que se indique lo contrario, la proteína recombinante, el cultivo celular y las técnicas inmunológicas usadas en la presente divulgación son procedimientos convencionales, bien conocidos por el experto en la materia. Tales técnicas se describen y se explican a través de las fuentes bibliográficas tales como, Perbal (1984), Sambrook y col., (1989), Brown (1991), Glover y Hames (1995 y 1996), y Ausubel et al., (1988, incluyendo todas las actualizaciones hasta el momento), Harlow y Lane, (1988), Coligan et al., (incluyendo todas las actualizaciones hasta el momento) y Zola (1987).

La descripción y las definiciones de regiones variables y partes de las mismas, inmunoglobulinas, anticuerpos y fragmentos de los mismos en el presente documento pueden aclararse adicionalmente mediante la discusión en Kabat, 1987 y/o 1991, Bork et al., 1994 y/o Chothia y Lesk, 1987 y/o 1989 o Al-Lazikani et al., 1997.

El término "y/o", por ejemplo, "X y/o Y" se deber interpretar bien como "X e Y" o "X o Y", y se debe considerar que proporcionan un soporte explícito para ambos significados o para cualquiera de los significados.

A lo largo de la presente memoria descriptiva, la palabra "comprender", o variaciones tales como "comprende", o "comprendiendo", se entenderá que implican la inclusión de un elemento indicado, un número entero o etapa, o grupo de elementos, números enteros o etapas, pero no la exclusión de cualquier otro elemento, un número entero o etapa, o grupo de elementos, números enteros o etapas.

Como se usa en el presente documento, el término "derivado de" se tomará para indicar que se puede obtener un número entero especificado de una fuente particular aunque no necesariamente directamente de esa fuente.

En un ejemplo de la presente divulgación, la X en la posición 103 es una glicina. En un ejemplo de la presente divulgación, la X en la posición 103 es un glutamato o ácido glutámico.

Definiciones Seleccionadas

C o m o se u s a e n e l p re s e n te d o c u m e n to , e l té rm in o "F n 14 " s e re f ie re c o le c t iv a m e n te a F n 14 d e to d o s lo s m a m ífe ro s , c o m o d e h u m a n o s y ro e d o re s . E l té rm in o "h F n 14 " o "F n 14 h u m a n o " s e re f ie re a F n 14 d e h u m a n o s . A e fe c to s d e n o m e n c la tu ra y n o d e lim ita c ió n , u n a s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s d e un h F n 14 s e e x p o n e e n S E Q ID N O : 1.

Para los fines de la presente divulgación, el término "anticuerpo" incluye una proteína capaz de unirse específicamente a uno o algunos antígenos estrechamente relacionados (por ejemplo, Fn14) en virtud de un Fv. Este término incluye cuatro anticuerpos de cadena (por ejemplo, dos cadenas ligeras y dos cadenas pesadas), anticuerpos recombinantes o modificados (por ejemplo, anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados, anticuerpos primatizados, anticuerpos y medios anticuerpos desinmunizados, anticuerpos biespecíficos). Un anticuerpo generalmente comprende dominios constantes, que pueden organizarse en una región constante o fragmento constante o fragmento cristalizable (Fc). Las formas ejemplares de anticuerpos comprenden una estructura de cuatro cadenas como su unidad básica. Los anticuerpos de longitud completa comprenden dos cadenas pesadas (~50-70 kDa) unidas covalentemente y dos cadenas ligeras (~23 kDa cada una). Una cadena ligera generalmente comprende una región variable y un dominio constante y en los mamíferos es una cadena ligera o una cadena ligera A. Una cadena pesada generalmente comprende una región variable y uno o dos dominios constantes enlazados mediante una región de bisagra a un(os) dominio(s) constante(s) adicional(es). Las cadenas pesadas de mamíferos son de uno de los siguientes tipos a, 8, £, y o |^j . Cada cadena ligera está unida covalentemente a una de las cadenas pesadas. Por ejemplo, las dos cadenas pesadas y las cadenas pesada y ligera se mantienen unidas por enlaces disulfuro entre cadenas y por interacciones no covalentes. El número de enlaces disulfuro entre cadenas puede variar entre los diferentes tipos de anticuerpos. Cada cadena tiene una región variable N-terminal (Vh o Vl en donde cada una tiene ~110 aminoácidos de longitud) y uno o más dominios constantes en el extremo C-terminal. El dominio constante de la cadena ligera (Cl que tiene una longitud de ~110 aminoácidos) está alineada y unida por disulfuro al primer dominio constante de la cadena pesada (CH que tiene una longitud de -330-440 aminoácidos). La región variable de la cadena ligera está alineada con la región variable de la cadena pesada. La cadena pesada del anticuerpo puede comprender 2 o más C adicionalesH dominios (como, C^h2, C^h3 y similares) y puede comprender una región de bisagra que puede identificarse entre los dominios constantes Ch1 y Ch2. Los anticuerpos pueden ser de cualquier tipo (por ejemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY), clase (por ejemplo, IgGi, IgG2, IgG3, IgG4, IgAi e IgA2) o subclase. En un ejemplo, el anticuerpo es un anticuerpo murino (ratón o rata) o una forma humanizada del mismo o un anticuerpo de primate (como el humano).

Los términos "anticuerpo de longitud completa", "anticuerpo intacto" o "anticuerpo completo" se usan indistintamente para referirse a un anticuerpo en su forma sustancialmente intacta, en oposición a un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo. Específicamente, los anticuerpos completos incluyen aquellos con cadenas pesadas y ligeras que incluyen una región constante. La región constante puede ser regiones constantes de secuencia de tipo silvestre (por ejemplo, regiones constantes de secuencia de tipo silvestre humano) o variantes de secuencia de aminoácidos de la misma.

El término "proteína de unión a Fnl4" se considerará que incluye una sola cadena polipeptídica, (es decir, una serie de aminoácidos contiguos unidos por enlaces peptídicos) o una serie de cadenas polipeptídicas unidas covalentemente o no covalentemente (es decir, un complejo polipeptídico) capaces de unirse a Fn14 de la manera descrita y/o reivindicada en el presente documento. Por ejemplo, la serie de cadenas polipeptídicas se puede unir covalentemente usando un enlace químico o disulfuro adecuado. Los ejemplos de enlaces no covalentes incluyen enlaces de hidrógeno, enlaces iónicos, fuerzas de Van der Waals e interacciones hidrofóbicas. Un enlace no covalente contemplado por la presente descripción es la interacción entre una V^hy una V^l, por ejemplo, en algunas formas de diacuerpo o triacuerpo o tetracuerpo o Fv.

Se entenderá que el término "cadena polipeptídica" significa a partir del párrafo anterior una serie de aminoácidos contiguos unidos por enlaces peptídicos.

Como sugiere el término, "anticuerpo anti-Fn14" significa un anticuerpo que se une específicamente a Fn14.

La referencia en el presente documento al anticuerpo CRCBT-06-001 es a un anticuerpo que comprende una Vh que comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 15 y una Vl que comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 22.

La referencia en el presente documento al anticuerpo CRCBT-06-002 es a un anticuerpo que comprende una V^hque comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 16 y una V^lque comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 23.

La referencia en el presente documento al anticuerpo CRCBT-06-003 es a un anticuerpo que comprende una V^hque comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 17 y una Vl que comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 24.

La referencia en el presente documento al anticuerpo CRCBT-06-004 es a un anticuerpo que comprende una V^hque comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 18 y una V^lque comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 25.

La re fe re n c ia e n e l p re s e n te d o c u m e n to a l a n t ic u e rp o C R C B T -06 -005 e s a un a n t ic u e rp o q u e c o m p re n d e u n a V h q u e c o m p re n d e u n a s e c u e n c ia e s ta b le c id a e n S E Q ID N O : 19 y u n a V l q u e c o m p re n d e u n a s e c u e n c ia e s ta b le c id a en S E Q ID N O : 26.

La referencia en el presente documento al anticuerpo CRCBT-06-006 es a un anticuerpo que comprende una V^hque comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 20 y una V^lque comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 27.

La referencia en el presente documento al anticuerpo CRCBT-06-007 es a un anticuerpo que comprende una V^hque comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 21 y una Vl que comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 28.

Como se usa en el presente documento, "región variable" se refiere a las porciones de las cadenas ligeras y/o pesadas de un anticuerpo como se define en el presente documento que es capaz de unirse específicamente a un antígeno e incluye secuencias de aminoácidos de CDR; es decir, CDR1, CDR2, y CDR3, y FRs. Por ejemplo, la región variable comprende tres o cuatro FR (por ejemplo, FR1, FR2, FR3 y opcionalmente f R4) junto con tres CDR. V^hse refiere a la región variable de la cadena pesada. V^lse refiere a la región variable de la cadena ligera.

Como se usa en el presente documento, el término "regiones determinantes de complementariedad" (sin. CDR; es decir, CDR1, CDR2 y CDR3) se refiere a los restos de aminoácidos de una región variable de anticuerpos cuya presencia son los principales contribuyentes a la unión de antígeno específico. Cada región variable generalmente tiene tres regiones CDR identificadas como CDR1, CDR2 e CDR3. Cada región determinante de complementariedad puede comprender restos de aminoácidos de una "región determinante de complementariedad" como lo define Kabat et al., (1987 y/o 1991). Por ejemplo, en una región variable de cadena pesada, CDRH1 está entre los restos 31-35, CDRH2 está entre los restos 50-65 y CDRH3 está entre los restos 95-102. En una cadena ligera, CDRL1 está entre los restos 24-34, CDRL2 está entre los restos 50-56 y CDRL3 está entre los restos 89-97. Estas CDR también pueden comprender numerosas inserciones, por ejemplo, como se describe en Kabat (1987 y/o 1991). La presente divulgación no se limita a las FR y CDR definidas por el sistema de numeración Kabat, pero incluye todos los sistemas de numeración, incluyendo el sistema de numeración canónica o de Chothia y Lesk (1987); Chothia et al. (1989); y/o Al-Lazikani et al., (1997); el sistema de numeración de Honnegher y Plükthun (2001); el sistema IMGT discutido en Giudicelli et al., (1997); o el Esquema mejorado de numeración de Chothia (http://www.bioinfo.org.uk/mdex.html). En un ejemplo, las CDR y/o FR se definen de acuerdo con el sistema de numeración Kabat, por ejemplo, como se muestra en las Figuras 11A-11D en negrita. Opcionalmente, la CDR2 de cadena pesada de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat no comprende los cinco aminoácidos C-terminales enumerados en el presente documento o uno o más de esos aminoácidos están sustituidos con otro aminoácido natural. En una opción adicional, o alternativa, la CDR1 de cadena ligera no comprende los cuatro aminoácidos N-terminales enumerados el presente documento o uno cualquiera o más de esos aminoácidos están sustituidos con otro aminoácido natural. En este sentido, Padlan et al., 1995 estableció que los cinco aminoácidos C-terminales de la cadena pesada CDR2 y/o los cuatro aminoácidos N-terminales de la cadena ligera CDR1 no están generalmente involucrados en la unión al antígeno. En un ejemplo, las CDR y/o las FR se definen de acuerdo con el sistema de numeración Chothia, por ejemplo, como se muestra en las Figuras 9A-9D en texto subrayado.

Como se usa en el presente documento, el término "sistema de numeración de Kabat" se refiere al esquema para numerar regiones variables de anticuerpos e identificar CDR (regiones hipervariables) como se establece en Kabat et al., (1987 y/o 1991).

Como se usa en el presente documento, el término "sistema de numeración Chothia" se refiere al esquema para numerar regiones variables de anticuerpos e identificar CDR (bucles estructurales) tal como se establece en Chothia y Lesk (1987) o Al-Lazikani et al., (1997).

Las "regiones marco" (en adelante FR) son aquellos restos de región variable distintos de los restos de CDR.

Como se usa en el presente documento, el término "Fv" se debe interpretar como que se refiere a cualquier proteína, bien comprendida de múltiples polipéptidos o un único polipéptido, en que una V^ly una V^hse asocian y forman un complejo que tiene un dominio de unión a antígeno, es decir, capaz de unirse específicamente a un antígeno (por ejemplo, Fn14). La V^hy la V^lque forman el dominio de unión a antígeno puede estar en una cadena polipeptídica única o en diferentes cadenas polipeptídicas. Además un Fv de la divulgación (así como cualquier proteína de la divulgación) puede tener múltiples sitios de unión a antígeno que pueden o no unirse al mismo antígeno. Se entenderá que este término abarca fragmentos directamente derivados de un anticuerpo, así como proteínas producidas usando medios recombinantes. En algunos ejemplos, la VH no está unida a un dominio constante de cadena pesada Ch1 y/o la Vl no está unida a un dominio constante de la cadena ligera (Cl), por ejemplo, un anticuerpo de dominio. Los Fv ejemplares que contienen polipéptidos o proteínas incluyen un fragmentos Fab, un fragmento Fab', un fragmento F(ab'), un scFv, un diacuerpo, un triacuerpo, un tetracuerpo o un complejo de mayor orden, o cualquiera de los anteriores enlazados a una región constante o dominio del mismo, por ejemplo, dominio Ch2 o Ch3, por ejemplo, un minicuerpo. Un "fragmento Fab" consiste en un fragmento monovalente de unión a antígeno de una inmunoglobulina, y puede producirse por digestión de un anticuerpo completo con la enzima papaína, para producir un fragmento que consiste en una cadena ligera intacta y en una parte de una cadena pesada o se puede producir usando medios recombinantes. Un "fragmento Fab'" de un anticuerpo se puede obtener tratando un anticuerpo completo con pepsina, seguido por reducción, para producir una molécula que consiste en una cadena ligera intacta y una porción de una cadena pesada que comprende una Vh y un solo dominio constante. Se obtienen dos fragmentos Fab' por anticuerpo tratado de esta manera. También se puede producir un fragmento Fab' por medios recombinantes. Un fragmento "F(ab')2" de un anticuerpo consiste en un dímero de dos fragmentos Fab' unidos por dos enlaces disulfuro, y se obtiene tratando una molécula de anticuerpo completa con la enzima pepsina, sin la posterior reducción. Un fragmento "Fab2" es un fragmento recombinante que comprende dos fragmentos Fab unidos usando, por ejemplo una cremallera de leucina o un dominio C^h3. Una "Fv de cadena simple" o "scFv" es una molécula recombinante que contiene el fragmento de región variable (Fv) de un anticuerpo en el que la región variable de la cadena ligera y la región variable de la cadena pesada están unidas covalentemente por un conector polipeptídico flexible. A continuación en el presente documento se proporciona una discusión de proteínas que contienen Fv ejemplares que caen dentro del alcance de este término.

Como se usa en el presente documento, el término "dominio de unión a antígeno" se entenderá como una región de un anticuerpo que es capaz de unirse específicamente a un antígeno, es decir, una Vh o una Vl o un Fv o una región variable como se define en el presente documento. El dominio de unión a antígeno no necesita estar en el contexto de un anticuerpo completo, por ejemplo, puede estar aislado (por ejemplo, un anticuerpo de dominio) o en otra forma, por ejemplo, como se describe en el presente documento, como un scFv.

El término "región constante" (sin. CR) como se usa en el presente documento, se refiere a una porción de un anticuerpo que comprende dominios constantes y que generalmente está (aunque no necesariamente) glicosilada y que se une a uno o más receptores Fc y/o componentes de la cascada del complemento (por ejemplo, confiere funciones efectoras). La región constante de la cadena pesada se puede seleccionar a partir de cualquiera de los cinco isotipos: a, 8, £, y o p. Además, las cadenas pesadas de las diversas subclases (tales como las subclases de IgG de cadenas pesadas) son responsables de las diferentes funciones efectoras y, por lo tanto, eligiendo la región constante de cadena pesada, se pueden producir proteínas con la función efectora deseada. Ejemplos de regiones constantes de cadena pesada son gamma 1 (IgG1), gamma 2 (IgG2) y gamma 3 (IgG3).

Un "dominio constante" es un dominio en un anticuerpo cuya secuencia es muy similar en anticuerpos/anticuerpos del mismo tipo, por ejemplo, IgG o IgM o IgE. Una región constante de un anticuerpo generalmente comprende una pluralidad de dominios constantes, por ejemplo, la región constante de ^y, las cadenas pesadas a y 8 comprenden tres dominios constantes y la Fc de y, las cadenas pesadas a y 8 comprenden dos dominios constantes. Una región constante de las cadenas pesadas p y £ comprende cuatro dominios constantes y la región del Fc comprende dos dominios constantes.

Como se usa en el presente documento, el término "se une" en referencia a la interacción de una proteína o un dominio de unión a antígeno de la misma con un antígeno significa que la interacción depende de la presencia de una estructura particular (por ejemplo, un determinante antigénico o epítopo) en el antígeno. Por ejemplo, un anticuerpo reconoce y se une a una estructura proteica específica en lugar de a proteínas en general. Si un anticuerpo se une al epítopo "A", la presencia de una molécula que contiene el epítopo "A" (o "A" libre, sin etiquetar), en una reacción que contiene "A" etiquetado y el anticuerpo, reducirá la cantidad de "A" etiquetado unido al anticuerpo.

Como se usa en el presente documento, se entenderá que el término "se une específicamente" significa que una proteína de la divulgación reacciona o se asocia con mayor frecuencia, más rápidamente, con mayor duración y/o con mayor afinidad con un antígeno o antígenos particulares o células que expresan lo mismo que con antígenos o células alternativos. Por ejemplo, una proteína que se une específicamente a un antígeno se une a ese antígeno con mayor afinidad (por ejemplo, 2o veces o 40 veces o 60 veces u 80 veces a 100 veces o 150 veces o 200 veces más afinidad), avidez, más fácilmente y/o con mayor duración de la que se une a otros antígenos, por ejemplo, a otros receptores de la superfamilia de TNF o a antígenos comúnmente reconocidos por anticuerpos naturales polirreactivos (es decir, por anticuerpos naturales que se sabe que se unen a una variedad de antígenos que se encuentran naturalmente en humanos). También se entiende al leer esta definición que, por ejemplo, una proteína que se une específicamente a un primer antígeno puede o no unirse específicamente a un segundo antígeno. Como tal "unión específica" no requiere necesariamente una unión exclusiva o una unión no detectable de otro antígeno, esto se entiende por el término "unión selectiva".

Como se usa en el presente documento, se entenderá que la referencia a un nivel de unión "similar" significa que un anticuerpo se une a un antígeno a un nivel dentro de aproximadamente 30 % o 25 % o 20 % del nivel al que se une a otro antígeno. Este término también puede significar que un anticuerpo se une a un antígeno a un nivel dentro de aproximadamente 30 % o 25 % o 20 % del nivel en el que otro anticuerpo se une al mismo antígeno.

Como se usa en el presente documento, se entenderá que la referencia a "sustancialmente el mismo nivel" de unión significa que un anticuerpo se une a un antígeno a un nivel dentro de aproximadamente 15 % o 10 % o 5 % del nivel al que se une a otro antígeno. Este término también puede significar que un anticuerpo se une a un antígeno a un nivel dentro de aproximadamente 5 % o 4 % o 3 % del nivel en el que otro anticuerpo se une al mismo antígeno.

Como se usa en el presente documento, el término "epítopo" (sin. "determinante antigénico") se entenderá que significa una región de Fn14 a la que se une un anticuerpo designado CRCBT-06-001 y/o CRCBT-06-002 y/o CRCBT-06-003 y/o CRCBT-06-004 y/o CRCBT-06-005 y/o CRCBT-06-006 y/o CRCBT-06-007. Este término no se limita necesariamente a los restos específicos o la estructura con la que el anticuerpo hace contacto. Por ejemplo, este término incluye la región que abarca los aminoácidos contactados por el anticuerpo y/o 5-10 o 2-5 o 1-3 aminoácidos fuera de esta región. En algún ejemplo, el epítopo es una serie de aminoácidos consecutivos de Fn14. Sin embargo, un epítopo también puede comprender una serie de aminoácidos discontinuos que se colocan uno cerca del otro cuando Fn14 se pliega, es decir, un "epítopo conformacional". En este sentido, el término "epítopo" puede abarcar un polipéptido único que comprende algunas o todas las series de aminoácidos discontinuos suficientes para unirse a una proteína de unión a Fn14 de la presente descripción y/o puede comprender una serie de péptidos que comprenden la serie de aminoácidos. El experto en la materia también sabrá que el término "epítopo" no se limita a péptidos o polipéptidos. Por ejemplo, los anticuerpos son capaces de unirse a carbohidratos o péptidos o polipéptidos glicosilados, fosfatos o fosfopéptidos o polipéptidos entre otros epítopos. Un epítopo o péptido o polipéptido que lo comprende puede administrarse a un animal para generar anticuerpos contra el epítopo. Por "aislado" se entiende que la proteína se elimina sustancialmente de su entorno natural, por ejemplo, está en un ambiente heterólogo y/o que está sustancialmente libre de agentes contaminantes, por ejemplo, al menos aproximadamente 70 % o 75 % u 80 % u 85 % o 90 % o 95% o 96 % o 97 % o 98 % o 99 % libre de agentes contaminantes.

Se entenderá que el término "inhibe competitivamente" significa que una proteína de la descripción reduce o evita la unión de un anticuerpo recitado producido a Fn14 o un fragmento del mismo. De lo anterior resultará evidente que la proteína no necesita inhibir completamente la unión del anticuerpo, más bien solo necesita reducir la unión en una cantidad estadísticamente significativa, por ejemplo, en al menos aproximadamente 10 % o 20 % o 30 % o 40 % o 50 % o 60 % o 70 % u 80 % o 90 % o 95 %. Los métodos para determinar la inhibición competitiva de la unión se conocen en la técnica y/o se describen en el presente documento. Por ejemplo, el anticuerpo se expone a Fn14 o un fragmento del mismo en presencia o ausencia de la proteína. Si se une menos anticuerpo en presencia de la proteína que en ausencia de la proteína, se considera que la proteína inhibe competitivamente la unión del anticuerpo. En un ejemplo, la proteína y el anticuerpo están expuestos a Fn14 de manera sustancialmente simultánea. Los métodos adicionales para determinar la inhibición competitiva de la unión serán evidentes para el experto en la técnica y/o se describen en el presente documento. En un ejemplo, El dominio de unión a antígeno de la proteína inhibe competitivamente la unión del anticuerpo.

La referencia en el presente documento a "un epítopo que comprende restos contenidos dentro de" una secuencia recitada se entenderá que significa que el epítopo (que puede ser conformacional) al que se une una proteína comprende restos dentro de la secuencia recitada, sin embargo, puede contener restos adicionales. Los restos contenidos dentro de la secuencia son suficientes para permitir que la secuencia se una a una proteína descrita en el presente documento de acuerdo con cualquier ejemplo.

Por "superposición" en el contexto de dos epítopos se entenderá que dos epítopos comparten un número suficiente de restos de aminoácidos para permitir que un anticuerpo que se une a un epítopo inhiba competitivamente la unión de un anticuerpo que se une al otro epítopo. Por ejemplo, los epítopos comparten al menos uno o dos o tres o cuatro o cinco o seis o siete u ocho o nueve o diez aminoácidos.

Como se usa en el presente documento, se entenderá que el término "no se une de manera detectable" significa que una proteína, por ejemplo, un anticuerpo, se une a un antígeno candidato a un nivel inferior al 10 %, u 8 % o 6 % o 5 % por encima del fondo. El fondo puede ser el nivel de señal de unión detectado en ausencia de la proteína y/o en presencia de una proteína de control negativo (por ejemplo, un anticuerpo de control de isotipo) y/o el nivel de unión detectado en presencia de un control negativo antígeno. El nivel de unión se detecta mediante análisis biosensor (por ejemplo, Biacore) en el que la proteína se inmoviliza y se pone en contacto con un antígeno.

Como se usa en el presente documento, se entenderá que las frases que se refieren a "unión reducida" o "unión que está en un nivel inferior" en relación con la unión de una proteína de unión a Fn14 a un péptido que comprende una región de Fn14 o una forma mutante del mismo significan que la proteína se une a la proteína péptido con una afinidad de al menos aproximadamente 2 veces o 5 veces o 10 veces o 20 veces o 40 veces o 60 veces menos que un epítopo o antígeno de control (por ejemplo, Fn14 o un péptido que comprende una secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 2).

Como se usa en el presente documento, Se entenderá que el término "nivel similar" en el contexto de una proteína de unión a Fn14 significa que una proteína de la presente descripción se une a dos antígenos (por ejemplo, Fn14 o un péptido que comprende una secuencia establecida en la SEQ ID NO: 2 y un péptido que comprende una secuencia establecida en cualquiera de SEQ ID NOs: 29-32, 34 o 49-68) con afinidades que están dentro de 2 veces o menos entre sí, por ejemplo, dentro de aproximadamente 1 veces el uno del otro, como, dentro de aproximadamente 0,5 veces entre sí o los niveles de unión son sustancialmente idénticos.

Por "individualmente" se entiende que la divulgación abarca una proteína de unión a Fn14 que se une a los a n tíg e n o s o g ru p o s d e a n tíg e n o s c ita d o s p o r s e p a ra d o , y q u e , a p e s a r d e q u e lo s a n tíg e n o s in d iv id u a le s o lo s g ru p o s d e a n tíg e n o s n o se p u e d e n e n u m e ra r p o r s e p a ra d o e n e l p re s e n te d o c u m e n to , la s re iv in d ic a c io n e s a d ju n ta s p u e d e n d e f in ir d ic h o s a n tíg e n o s o g ru p o s d e a n tíg e n o s p o r s e p a ra d o y d e m a n e ra d iv is ib le e n tre sí.

Por "colectivamente" se entiende que la invención abarca cualquier número o combinación de los antígenos o grupos de antígenos citados, y que, a pesar de que tales números o combinaciones de antígenos o grupos de antígenos pueden no estar específicamente enumerados en el presente documento, las reivindicaciones adjuntas pueden definir tales combinaciones o subcombinaciones por separado y de manera divisible de cualquier otra combinación de antígenos o grupos de antígenos.

Se entenderá que un "efecto de señalización de Fn14 mediado por Tweak" significa uno cualquiera o un grupo de fenotipos afectados por la señalización de Tweak a través de Fn14 en una célula. Tales efectos incluyen cambios en la expresión génica, señalización de NF^kB, inducción o inhibición de apoptosis o necrosis, inducción o inhibición de angiogénesis o inducción o inhibición de secreción de citoquinas. Los métodos adecuados para determinar el efecto de señalización de Fn14 mediado por Tweak se describen en el presente documento.

Como se usa en el presente documento, se entenderá que el término "señalización de NFkB inducida por Tweak" significa transducción de señal que ocurre dentro de una célula que expresa Fn14 que ocurre a través de NFkB como resultado de la unión de Tweak a Fn14. Los métodos para determinar dicha señalización son conocidos en la técnica y/o se describen en el presente documento. Por ejemplo, un promotor que comprende un sitio de unión a NFkB y que facilita la expresión génica como resultado de la unión a NFkB está unido operativamente a un gen indicador. La señalización de NF^kB inducida por ajustes se determina detectando la expresión del gen indicador, por ejemplo, detectar un gen indicador fluorescente usando la clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS). La señalización de NF^kB inducida por ajustes también se puede determinar detectando el nivel de expresión de un gen inducido por NFkB, por ejemplo, a nivel de ARNm o nivel de proteína.

Como se usa en el presente documento, el término "no induce de manera detectable la señalización de NF^kB" en el contexto de una proteína contactada con una célula que expresa Fn14 en ausencia de Tweak se entenderá que la proteína no induce la señalización de NFkB a un nivel significativamente mayor que un control proteína, por ejemplo, un anticuerpo de control de isotipo. En algunos ejemplos, la inducción de la señalización no es más de 1,5 veces o 1,4 veces o 1,3 veces o 1,2 veces o 1,1 veces en comparación con la inducción de la señalización por una proteína de control. Los métodos para determinar la señalización de NFkB se describen en el presente documento.

Como se usa en el presente documento, se entenderá que el término "neutralizar" significa una proteína es capaz de bloquear, reducir o prevenir cualquiera o más efectos de señalización mediados por Tweak en una célula a través de Fn14. Los métodos para determinar la neutralización son conocidos en la técnica y/o se describen en el presente documento.

El término "afección mediada por Fn14" se tomará para abarcar cualquier enfermedad o trastorno causado por o asociado con un número excesivo de células que expresan Fn14 y/o sobreexpresión de Fn14 por las células y/o actividad excesiva de Fn14 y/o un nivel excesivo de Retocar, por ejemplo, en suero de un sujeto. Las afecciones mediadas por Fn14 ejemplares son cáncer, metástasis, vascularización excesiva o angiogénesis, enfermedades autoinmunitarias, enfermedades inflamatorias, enfermedades neurodegenerativas, cicatrización queloide, enfermedad de injerto contra hospedador, el rechazo de injertos, enfermedad cardiovascular e isquemia (incluyendo apoplejía).

Como se usa en el presente documento, El término "trastorno de desgaste" se refiere a un trastorno que implica, resulta al menos en parte de, o incluye pérdida de peso, atrofia muscular, fatiga, debilidad en alguien que no está tratando activamente de perder peso. Los trastornos de desgaste se caracterizan comúnmente por la pérdida involuntaria y/o no controlada (en ausencia de intervención médica) de músculo y/o grasa. El término abarca caquexia u otras formas de desgaste, por ejemplo, desgaste inducido por denervación.

Se entenderá que el término "trastorno de desgaste asociado con otra afección" significa un desgaste que se observa en un sujeto que padece una afección, es decir, el desgaste puede ser el resultado de cambios (por ejemplo, cambios metabólicos) causados por la afección. En un ejemplo, la afección es una afección mediada por Fn14. En un ejemplo, la afección está causada o asociada con la expresión de Fn14 en una célula (o una célula que expresa Fn14) que no sea músculo.

Como se usa en el presente documento, se entenderá que el término "caquexia" se refiere a una afección metabólica asociada con una condición subyacente (u otra), en donde la caquexia se caracteriza por la pérdida de peso corporal y la pérdida de músculo con o sin pérdida de masa grasa. La caquexia generalmente se asocia con un mayor catabolismo proteico debido a enfermedades subyacentes. Los factores contribuyentes al inicio de la caquexia son la anorexia y las alteraciones metabólicas (por ejemplo, aumento del estado inflamatorio, aumento de la proteólisis muscular y disminución de carbohidratos, metabolismo de proteínas y lípidos). Una característica clínica destacada de la caquexia es la pérdida de peso en adultos (opcionalmente, corregida por retención de líquidos) o la falla de crecimiento en niños (excluyendo los trastornos endocrinos). Anorexia, inflamación, resistencia a insulina y aumento de degradación de las proteínas musculares se asocian frecuentemente con la caquexia. La caquexia es distinta al ayuno, depresión primaria, malabsorción e hipertiroidismo y se asocia con una mayor morbilidad. La caquexia puede estar asociada o ser el resultado (directa o indirectamente) de varios trastornos subyacentes, incluyendo cáncer, acidosis metabólica (por disminución de la síntesis de proteínas y aumento del catabolismo proteico), ciertas enfermedades infecciosas (por ejemplo, infecciones bacterianas, incluyendo tuberculosis, SIDA), algunos trastornos autoinmunes, adicción a drogas como anfetaminas o cocaína, alcoholismo crónico y/o cirrosis hepática, trastornos inflamatorios crónicos, anorexia, afecciones neurológicas y/o enfermedades neurodegenerativas. En un ejemplo, la caquexia es caquexia por cáncer (caquexia asociada al cáncer). En otros ejemplos, desgaste muscular y/o pérdida de peso corporal involuntaria asociada con afecciones neurológicas, inmovilidad o movilidad reducida debido a diversas enfermedades como enfermedad neurodegenerativa, esclerosis múltiple, lesión de la médula espinal, están incluidos en el término. La caquexia se puede diagnosticar basándose en uno o más de los siguientes:

• Pérdida de peso de al menos 5 % durante un periodo de seis meses (en ausencia de ayuno);

• Un IMC <20 junto con pérdida de peso; o

• Índice de músculo esquelético apendicular compatible con sarcopenia (hombres <7,26 kg/m2; hembras <5,45 kg/m2) junto con pérdida de peso.

Como se usa en el presente documento, se entenderá que el término "pre-caquexia" significa una afección asociada con una afección subyacente (por ejemplo, afección crónica) y caracterizada por una pérdida de peso involuntaria de menos de aproximadamente el 5 % del peso corporal de un sujeto; y una respuesta inflamatoria sistémica crónica o recurrente.

Como se usa en el presente documento, el término "pérdida de peso corporal no intencional" se refiere a una afección en que el sujeto es incapaz de mantener un peso corporal saludable o pierde una cantidad considerable de peso corporal, sin intentar realmente reducir el peso corporal. Por ejemplo, un índice de masa corporal de menos de 18,5 (o cualquier otro intervalo de IMC definido por un médico especialista) se considera bajo peso.

Para los fines de la presente divulgación, el término "índice de masa corporal" se calcula mediante la siguiente fórmula: masa (kg)/(altura (m)2).

Para los fines de la presente divulgación, el término "masa corporal magra" debe entenderse como la masa de tejidos distintos de la grasa (por ejemplo, tejido adiposo blanco) en un sujeto. La masa corporal magra se puede calcular o estimar estimando el porcentaje de contenido de grasa de un sujeto (por ejemplo, usando calibradores) y restando esta cantidad de su masa o usando pletismografía de desplazamiento de aire o absorciometría de rayos X de energía dual (DEXA).

Se entenderá que el término "masa corporal total" significa el peso de un sujeto.

La persona experta comprenderá a partir de la descripción en el presente documento que la referencia a la "salud general" de un sujeto incluye uno o más de letargo o fatiga, frecuencia respiratoria, la postura, dolor u otras puntuaciones de salud de un sujeto (por ejemplo, como se conoce en la técnica). Por ejemplo, el tratamiento de un sujeto con una proteína de unión a Fn14 de la divulgación que da como resultado resultados mejorados de salud general en uno o más de un nivel reducido de letargo o fatiga, aumento de la frecuencia respiratoria, respiración profunda o postura mejorada en comparación con un sujeto que padece la afección relevante a la que no se le ha administrado la proteína de unión a Fn14.

Como se usa en el presente documento, se entenderá que el término "trastorno del metabolismo de la glucosa" significa cualquier trastorno en el que un sujeto no puede o tiene una capacidad reducida para descomponer o metabolizar o para tomar o usar una o más formas de carbohidratos, generalmente conduce a mayores niveles de ese/esos carbohidratos en el torrente sanguíneo del sujeto. Por ejemplo, el trastorno del metabolismo de los carbohidratos está asociado o causado por la producción reducida por el páncreas de una hormona involucrada en la descomposición de un carbohidrato, por ejemplo, producción de amilasa. En un ejemplo, el trastorno del metabolismo de los carbohidratos está asociado o causado por la producción reducida por el páncreas de una hormona involucrada en la absorción de un carbohidrato, por ejemplo, producción de insulina. Los trastornos ejemplares del metabolismo de carbohidratos incluyen diabetes mellitus tipo I, diabetes mellitus tipo II, diabetes idiopática tipo I (Tipo Ib), diabetes tipo II (EOD) de inicio temprano, diabetes atípica de inicio juvenil (YOAD), diabetes de inicio en la madurez del joven (MODY), diabetes relacionada con desnutrición, diabetes gestacional, afecciones de intolerancia a la glucosa (IGT), afecciones de glucosa plasmática en ayunas alterada, acidosis metabólica, cetosis, síndrome X, hiperglucemia, hipoinsulinemia, resistencia a la insulina, alfa manosidis, beta manosidosis, intolerancia a la fructosa, fucosidosis, galactosemia, enfermedad de Leigh, mucolipidosis, mucopolisacaridosis o una complicación de uno o más de los anteriores. En un ejemplo, el trastorno del metabolismo de la glucosa es diabetes, por ejemplo, Diabetes tipo I.

En un ejemplo, un sujeto que padece diabetes tiene un marcador clínicamente aceptado de diabetes, tales como: • Glucosa en plasma en ayunas mayor o igual a 7 mmol/l o 126 mg/dl;

• Glucosa plasmática casual (tomada en cualquier momento del día) mayor o igual a 11,1 mmol/l o 200 mg/dl con los síntomas de diabetes.

• Valor del ensayo oral de tolerancia a la glucosa (OGTT) mayor o igual a 11,1 mmol/l o 200 mg/dl medido en un intervalo de dos horas. El OGTT se administra durante un periodo de dos o tres horas.

Como se usa en el presente documento, los términos "previniendo", "prevenir" o "prevención" incluyen administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de una proteína de la divulgación suficiente para detener u obstaculizar el desarrollo de al menos un síntoma de una enfermedad o afección específica.

Como se usa en el presente documento, los términos "tratando", "tratar" o "tratamiento" incluyen administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de una proteína descrita en el presente documento, suficiente para reducir o eliminar al menos un síntoma de una enfermedad o afección específica.

Como se usa en el presente documento, se entenderá que el término "sujeto" significa cualquier animal, incluyendo mamíferos. Los sujetos ejemplares incluyen humanos o primates no humanos. En un ejemplo, el sujeto es un ser humano.

El término "muestra" se tomará para abarcar la muestra mencionada (por ejemplo, una muestra de sangre u orina) y cualquier fracción de la misma (por ejemplo, plasma, suero o capa leucocitaria) o células derivadas de las mismas (por ejemplo, células mononucleares de sangre periférica) o formas procesadas de las mismas.

Se entenderá que el término "expresado ectópicamente" significa que una célula ha sido modificada genéticamente para permitirle expresar la proteína recitada. Por ejemplo, una célula que expresa ectópicamente Fn14 ha sido modificada genéticamente para permitirle expresar Fn14. En este sentido, antes de la modificación genética puede tener o no haber expresado Fn14 endógeno.

Proteínas de unión a Fn14 basadas en anticuerpos

Anticuerpos

Los métodos para generar anticuerpos son conocidos en la técnica y/o se describen en Harlow y Lane (1988) o Zola (1987). Generalmente, en tales métodos, una proteína Fn14 o fragmento inmunogénico o epítopo que contiene la misma o una célula que lo expresa y muestra (es decir, un inmunógeno), opcionalmente formulado con cualquier vehículo adecuado o deseado, adyuvante o excipiente farmacéuticamente aceptable, se administra a un sujeto animal no humano, por ejemplo, un ratón, de pollo, rata, conejo, cobaya, perro, caballo, vaca, cabra o cerdo. El inmunógeno puede administrarse por vía intranasal, intramuscular, subcutánea, por vía intravenosa, por vía intradérmica, intraperitoneal, o por otra ruta conocida.

La producción de anticuerpos policlonales se puede controlar tomando muestras de sangre del animal inmunizado en varios momentos después de la inmunización. Se pueden administrar una o más vacunas adicionales, si fuera necesario para lograr un título de anticuerpos deseado. El proceso de refuerzo y titulación se repite hasta lograr un título adecuado. Cuando se obtiene un nivel deseado de inmunogenicidad, se extrae sangre al animal inmunizado y se aísla y almacena el suero, y/o el animal se usa para generar anticuerpos monoclonales (mAbs).

Los anticuerpos monoclonales son anticuerpos ejemplares contemplados por la presente divulgación. El término "anticuerpo monoclonal" o "mAb" o "MAb" se refiere a una población de anticuerpos homogénea capaz de unirse al mismo antígeno(s) y, por ejemplo, al mismo epítopo dentro del antígeno. Este término no pretende limitarse con respecto a la fuente del anticuerpo o la forma en que se prepara.

Para la producción de mAbs se puede usar cualquiera de una serie de técnicas conocidas, como, por ejemplo, el procedimiento ejemplificado en US 4.196.265 o Harlow y Lane (1988) o Zola (1987).

Por ejemplo, un animal adecuado se inmuniza con una cantidad eficaz de la proteína o fragmento inmunogénico o epítopo de la misma o célula que lo expresa en condiciones suficientes para estimular las células productoras de anticuerpos. Los roedores como conejos, ratones y ratas son animales ejemplares, con ratones usándose con mayor frecuencia. También pueden usarse ratones diseñados genéticamente para expresar proteínas de inmunoglobulina humana, y no expresar proteínas de inmunoglobulina murina, para generar un anticuerpo de la presente divulgación (por ejemplo, como se describe en el documento WO2002/066630).

Después de la inmunización, se seleccionan células somáticas con potencial para producir anticuerpos, específicamente linfocitos B (células B), para usar en el protocolo de generación de MAb. Estas células pueden obtenerse a partir de biopsias de bazos, amígdalas o ganglios linfáticos, o de una muestra de sangre periférica. Los linfocitos B del animal inmunizado se fusionan con células de una célula de mieloma inmortal, generalmente derivadas de la misma especie que el animal que fue inmunizado con el inmunógeno. Los linfocitos B y las células inmortales se fusionan incubando una mezcla de los tipos de células en presencia de un agente o agentes (químicos o eléctricos) que promueven la fusión de las membranas celulares. Los métodos de fusión que usan el virus Sendai han sido descritos por Kohler y Milstein, (1975); y Kohler y Milstein, (1976). Métodos que usan polietilenglicol (PEG), tal como PEG al 37 % (v/v), son descritos por Gefter et al, (1977). El uso de métodos de fusión inducidos eléctricamente también es apropiado.

Los híbridos se amplifican por cultivo en un medio selectivo que comprende un agente que bloquea la síntesis de nucleótidos de novo en los medios de cultivo de tejidos. Ejemplos y agentes ejemplares son aminopterina, metotrexato y azaserina.

Los hibridomas amplificados se someten a una selección funcional para especificidad de anticuerpos y/o título, como, por ejemplo, por citometría de flujo y/o inmunohistoquímica y/o inmunoensayo (por ejemplo, radioinmunoensayo, inmunoensayo enzimático, ensayo de citotoxicidad, ensayo en placa, inmunoensayo puntual, y similares). La presente divulgación también contempla la subclonación de células productoras de anticuerpos, por ejemplo, como se ilustra en el presente documento.

Como alternativa, la tecnología ABL-MYC (NeoClone, Madison WI 53713, USA) se usa para producir líneas celulares que secretan MAb (por ejemplo, como se describe en Kumar et al, 1999).

Los anticuerpos también se pueden producir o aislar seleccionando una biblioteca de visualización, por ejemplo, una biblioteca de presentación de fagos, por ejemplo, como se describe en US6300064 EP0368684 y/o US5885793. Anticuerpos y proteínas quiméricas

En un ejemplo, un anticuerpo o proteína de unión a Fn14 de la divulgación es un anticuerpo quimérico o una proteína de unión a Fn14 es una proteína quimérica. El término "proteínas quiméricas" se refiere a proteínas en que un dominio de unión a antígeno V^ho V^les de secuencias idénticas u homólogas a las correspondientes en proteínas derivadas de una especie particular (por ejemplo, murinos, como ratón o rata) o que pertenecen a una clase o subclase particular de anticuerpos, mientras que el resto de la cadena(s) de proteína es idéntica u homóloga a las secuencias correspondientes de una proteína derivada de otra especie (por ejemplo, primate, como humano) o perteneciente a otra clase o subclase de anticuerpos. En un ejemplo, una proteína quimérica es un anticuerpo quimérico que comprende una V^hy una V^lde un anticuerpo no humano (por ejemplo, un anticuerpo murino) y las regiones restantes del anticuerpo son de un anticuerpo humano. La producción de tales proteínas quiméricas se conoce en la técnica, y se puede lograr por medios convencionales (como se describe, por ejemplo, en US6331415; US5807715; US4816567 y US4816397).

Anticuerpos/Proteínas Humanizados y Humanos

Los anticuerpos o las proteínas de unión a Fn14 de la presente divulgación pueden ser humanizados o humanos. Se entenderá que el término "proteína humanizada" se refiere a una proteína que comprende una región variable similar a la humana que incluye CDR de un anticuerpo de una especie no humana injertada o insertada en FR de un anticuerpo humano (este tipo de anticuerpo también se conoce a un "anticuerpo injertado con CDR"). Las proteínas humanizadas también incluyen proteínas en las que uno o más restos de la proteína humana se modifican mediante una o más sustituciones de aminoácidos y/o uno o más restos FR de la proteína humana se reemplazan por los restos no humanos correspondientes. Las proteínas humanizadas también pueden comprender restos que no se encuentran ni en el anticuerpo humano ni en el anticuerpo no humano. Cualquier región adicional de la proteína (por ejemplo, región Fc) es generalmente humana. La humanización se puede realizar usando un método conocido en la técnica, por ejemplo, US5225539, US6054297, US7566771 o US5585089. El término "proteína humanizada" también abarca una proteína superhumanizada, por ejemplo, como se describe en el documento US7732578.

En un ejemplo, una proteína humanizada comprende las regiones entre 27d y 34, 50 y 55 y 89 y 96 en una secuencia de cadena ligera descrita en el presente documento; y 31 y 35b, 50 y 58, y 95 y 101 en una secuencia de cadena pesada descrita en el presente documento (numeración según el sistema de numeración de Kabat). En este sentido, Padlan et al., FASEB J., 9: 133-139, 1995 presenta evidencia de que estas regiones son las que tienen más probabilidades de unirse o entrar en contacto con el antígeno.

El término "proteína humana" como se usa en el presente documento se refiere a proteínas que tienen variables y, opcionalmente, regiones de anticuerpos constantes derivadas o correspondientes a secuencias encontradas en humanos, por ejemplo, en la línea germinal humana o en células somáticas. Los anticuerpos "humanos" pueden incluir restos de aminoácidos no codificados por secuencias humanas, por ejemplo, mutaciones introducidas por mutaciones aleatorias o dirigidas al sitio in vitro (en particular mutaciones que implican sustituciones conservadoras o mutaciones en un pequeño número de restos de la proteína, por ejemplo, en 1, 2, 3, 4 o 5 de los restos de la proteína. Estos "anticuerpos humanos" en realidad no necesitan ser generados como resultado de una respuesta inmune de un humano, más bien, pueden generarse usando medios recombinantes (por ejemplo, seleccionando una biblioteca de presentación de fagos) y/o por un animal transgénico (por ejemplo, un ratón) que comprende ácido nucleico que codifica regiones constantes y/o variables de anticuerpos humanos y/o usando selección guiada (por ejemplo, como se describe en o US5565332). Este término también abarca formas maduradas por afinidad de tales anticuerpos. También se considerará que una proteína humana incluye una proteína que comprende FR de un anticuerpo humano o FR que comprende secuencias de una secuencia consenso de FR humanos y en la que una o más de las CDR son aleatorias o semialeatorias, por ejemplo, como se describe en US6300064 y/o US6248516. Las proteínas o anticuerpos humanos que reconocen un epítopo seleccionado también se pueden generar usando una técnica denominada "selección guiada". En este enfoque, un anticuerpo monoclonal no humano seleccionado, por ejemplo, un anticuerpo de ratón, se usa para guiar la selección de un anticuerpo completamente humano que reconoce el mismo epítopo (Jespers et al, 1988).

Una proteína de unión a Fn14 humana de la descripción comprende una región variable de un anticuerpo humano. Proteínas Sinhumanizadas y Primatizadas

Las proteínas de unión a Fn14 de la presente descripción pueden ser proteínas sinhumanizadas. El término "proteína sinhumanizada" se refiere a una proteína preparada por un método descrito en el documento WO2007/019620. Una proteína de unión a Fn14 sinhumanizada incluye una región variable de un anticuerpo, en donde la región variable comprende FR de una región variable de anticuerpos de primates del Nuevo Mundo y CDR de una región variable de anticuerpos de primates no del Nuevo Mundo. Por ejemplo, una proteína de unión a Fn14 sinhumanizada incluye una región variable de un anticuerpo, en donde la región variable comprende FR de una región variable de anticuerpos de primates del Nuevo Mundo y CDR de un anticuerpo de ratón, por ejemplo, como se describe en el presente documento. En un ejemplo, la proteína de unión a Fn14 sinhumanizada es un anticuerpo de unión a Fn14 en el que una o ambas regiones variables están sinhumanizadas.

Las proteínas de unión a Fn14 de la presente descripción pueden ser proteínas primatizadas. Una "proteína primatizada" comprende región (es) variable (s) a partir de un anticuerpo generado después de la inmunización de un primate no humano (por ejemplo, un macaco cynomolgus). Opcionalmente, Las regiones variables del anticuerpo de los primates no humanos están unidas a las regiones constantes humanas para producir un anticuerpo primatizado. En el documento US6113898 se describen métodos ejemplares para producir anticuerpos primatizados. Anticuerpos y proteínas desinmunizados

La presente divulgación también contempla un anticuerpo desinmunizado o una proteína de unión a Fn14. Los anticuerpos desinmunizados y las proteínas de unión a Fn14 tienen uno o más epítopos, por ejemplo, epítopos de linfocitos B o epítopos de linfocitos T eliminados (es decir, mutados) para reducir así la probabilidad de que un sujeto genere una respuesta inmune contra el anticuerpo o la proteína. Los métodos para producir anticuerpos y proteínas desinmunizados son conocidos en la técnica y se describen, por ejemplo, en los documentos WO00/34317, WO2004/108158 y WO2004/064724.

Los métodos para introducir mutaciones adecuadas y expresar y analizar la proteína resultante serán evidentes para el experto en la materia basándose en la descripción en el presente documento.

Proteínas que Contienen Región Variable de Anticuerpo

Anticuerpos de dominio único

En algunos ejemplos, una proteína de unión a Fn14 de la divulgación es un anticuerpo de dominio único (que se usa indistintamente con el término "anticuerpo de dominio" o "dAb"). Un anticuerpo de dominio único es una cadena polipeptídica única que comprende la totalidad o una porción de la región variable de la cadena pesada de un anticuerpo. En cierto ejemplo, un anticuerpo de dominio único es un anticuerpo de dominio único humano (Domantis, Inc., Waltham, MA; véase, por ejemplo, US6248516; WO90/05144 y/o WO2004/058820).

Diacuerpos, Triacuerpos, Tetracuerpos

Las proteínas de unión a Fn14 ejemplares que comprenden un dominio de unión a antígeno de anticuerpo son diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos y complejos de proteínas de orden superior tales como los descritos en los documentos WO98/044001 y WO94/007921.

Por ejemplo, un diacuerpo es una proteína que comprende dos cadenas polipeptídicas asociadas, cada cadena polipeptídica comprende la estructura V^l-XV^ho V^h-XV^l, en donde V^les una región variable de la cadena ligera de anticuerpos, Vh es una región variable de cadena pesada de anticuerpo, X es un conector que comprende restos insuficientes para permitir la V^hy V^len una sola cadena polipeptídica para asociar (o formar un Fv) o está ausente, y en donde la Vh de una cadena polipeptídica se une a una Vl de la otra cadena polipeptídica para formar un sitio de unión a antígeno, es decir, para formar una molécula Fv capaz de unirse específicamente a uno o más antígenos. La V^ly V^hpuede ser la misma en cada cadena polipeptídica o en la V^ly VHpuede ser diferente en cada cadena polipeptídica para formar un diacuerpo biespecífico (es decir, que comprende dos Fvs que tienen una especificidad diferente).

Fragmentos de cadena simple Fv (scFv)

El artesano experto sabrá que los scFv comprenden regiones V^hy V^len una sola cadena polipeptídica. La cadena polipeptídica comprende además un conector polipeptídico entre la V^hy V^lque permite que scFv forme la estructura deseada para la unión al antígeno (es decir, para la Vh y Vl de la cadena polipeptídica única para asociarse entre sí para formar un Fv). Por ejemplo, el conector comprende más de 12 restos de aminoácidos con (Gly4Ser)3 siendo uno de los conectores más favorecidos para un scFv.

La presente divulgación también contempla un Fv estabilizado con disulfuro (o diFv o dsFv), en que se introduce un solo resto de cisteína en una FR de Vh y una FR de Vl y los restos de cisteína unidos por un enlace disulfuro para producir un Fv estable (véase, por ejemplo, Brinkmann et al., 1993).

Como alternativa, o además, la presente divulgación proporciona un scFv dimérico, es decir, una proteína que comprende dos moléculas scFv unidas por un enlace no covalente o covalente, por ejemplo, por un dominio de cremallera de leucina (por ejemplo, derivado de Fos o Jun) (véase, por ejemplo, Kruif y Logtenberg, 1996). Como alternativa, dos scFv están unidos por un conector peptídico de longitud suficiente para permitir que ambos scFv se formen y se unan a un antígeno, por ejemplo, como se describe en el documento US20060263367.

Para una revisión de scFv, véase Pluckthun (1994).

Minicuerpos

El artesano experto sabrá que un minicuerpo comprende los dominios de Vh y Vl de un anticuerpo fusionado al dominio Ch2 y/o C^h3 dominio de un anticuerpo. Opcionalmente, el minicuerpo comprende una región de bisagra entre la Vh y una Vl, a veces esta conformación se conoce como Minicuerpo Flexible. Un minicuerpo no comprende una Ch1 o una Cl. En un ejemplo, los dominios de Vh y Vl se fusionan con la región de la bisagra y el dominio Ch3 de un anticuerpo. Al menos una de las regiones variables de dicho minicuerpo se une a Fn14 en la forma de la divulgación. Se describen ejemplos de minicuerpos y métodos para su producción, por ejemplo, en WO94/09817.

Otras proteínas que contienen región variable de anticuerpo

La presente divulgación también contempla otra región variable que contiene proteínas de unión a Fn14, tales como:

(i) proteínas biespecíficas de "llave y cerradura" como se describe en el documento US 5.731.168;

(ii) proteínas heteroconjugadas, por ejemplo, como se describe en el documento US 4.676.980;

(iii) proteínas heteroconjugadas producidas usando un reticulador químico, por ejemplo, como se describe en el documento US 4.676;

(iv) fragmentos Fab'-SH, por ejemplo, como se describe en Shalaby (1992);

(v) Fab de cadena sencilla; o

(vi) Fab3 (por ejemplo, como se describe en EP19930302894).

Proteínas que contienen dominio de unión a antígeno no basados en anticuerpo

Inmunoglobulinas y fragmentos de inmunoglobulinas

Un ejemplo de un compuesto de la presente divulgación es una proteína que comprende una región variable de una inmunoglobulina, tal como un receptor de linfocitos T o una inmunoglobulina de cadena pesada (por ejemplo, una IgNAR, un anticuerpo camélido).

Se entenderá que el término "inmunoglobulina" incluye cualquier proteína de unión a antígeno que comprenda un dominio de inmunoglobulina. Las inmunoglobulinas ejemplares son anticuerpos. Las proteínas adicionales abarcadas por el término "inmunoglobulina" incluyen anticuerpos de dominio, anticuerpos camélidos y anticuerpos de peces cartilaginosos (es decir, nuevos receptores de antígenos de inmunoglobulina (IgNAR)). Generalmente, los anticuerpos de camélido y los IgNAR comprenden una V^h, sin embargo falta una V^ly a menudo se denominan inmunoglobulinas de cadena pesada. Otras "inmunoglobulinas" incluyen receptores de linfocitos T.

Inmunoglobulinas de cadena pesada

Las inmunoglobulinas de cadena pesada difieren estructuralmente de muchas otras formas de inmunoglobulina (por ejemplo, Anticuerpos), en la medida en que comprenden una cadena pesada, pero no comprenden una cadena ligera. Por tanto, estas inmunoglobulinas también se denominan "anticuerpos de cadena pesada solamente". Las inmunoglobulinas de cadena pesada se encuentran en, por ejemplo, camélidos y peces cartilaginosos (también llamados IgNAR).

Las regiones variables presentes en las inmunoglobulinas de cadena pesada de origen natural generalmente se denominan "dominios V^hh" en camélidos Ig y V-NAR en IgNAR, para distinguirlos de las regiones variables de cadena pesada que están presentes en los anticuerpos convencionales de 4 cadenas (que se conocen como "dominios Vh") y de las regiones variables de cadena ligera que están presentes en los anticuerpos convencionales de 4 cadenas (que se denominan "dominios Vl").

Las inmunoglobulinas de cadena pesada no requieren la presencia de cadenas ligeras para unirse con alta afinidad y con alta especificidad a un antígeno relevante. Esto significa que los fragmentos de unión a un solo dominio pueden derivarse de inmunoglobulinas de cadena pesada, que son fáciles de expresar y generalmente son estables y solubles.

Una descripción general de las inmunoglobulinas de cadena pesada de camélidos y regiones variables de las mismas y métodos para su producción y/o aislamiento y/o uso se encuentra entre otros en las siguientes referencias WO94/04678, WO97/49805 y WO 97/49805.

Una descripción general de las inmunoglobulinas de cadena pesada de peces cartilaginosos y regiones variables de las mismas y métodos para su producción y/o aislamiento y/o uso se encuentra entre otros en WO2005/118629. Proteínas de tipo V

Un ejemplo de una proteína de unión a Fn14 de la divulgación es un receptor de linfocitos T. Los receptores de linfocitos T tienen dos dominios V que se combinan en una estructura similar al módulo Fv de un anticuerpo. Novotny et al., Proc Natl Acad Sci USA 88: 8646-8650, 1991 describe cómo los dos dominios V del receptor de linfocitos T (denominados alfa y beta) pueden fusionarse y expresarse como un polipéptido de cadena única y, además, cómo alterar los restos superficiales para reducir la hidrofobicidad directamente análoga a un anticuerpo scFv. Otras publicaciones que describen la producción de receptores de células T de cadena sencilla o receptores de linfocitos T multiméricos que comprenden dos dominios V-alfa y V-beta incluyen WO1999/045110 o WO2011/107595.

Otras proteínas que no son anticuerpos que comprenden dominios de unión a antígeno incluyen proteínas con dominios tipo V, que son generalmente monoméricos. Los ejemplos de proteínas que comprenden tales dominios de tipo V incluyen cTlA-4, CD28 e ICOS. La divulgación adicional de proteínas que comprenden tales dominios de tipo V se incluye en el documento WO1999/045110.

Adnectinas

En un ejemplo, una proteína de unión a Fn14 de la descripción es una adnectina. Las adnectinas se basan en el décimo dominio de fibronectina tipo III (10Fn3) de la fibronectina humana en la que las regiones del bucle se alteran para conferir la unión al antígeno. Por ejemplo, tres bucles en un extremo del sándwich p del dominio 10Fn3 se puede diseñar para permitir que una Adnectina reconozca específicamente un antígeno. Para más detalles véanse US20080139791 o WO2005/056764.

Anticalinas

En un ejemplo adicional, una proteína de unión a Fn14 de la divulgación es una anticalina. Las anticalinas se derivan de las lipocalinas, que son una familia de proteínas extracelulares que transportan pequeñas moléculas hidrofóbicas como los esteroides, bilinas, retinoides y lípidos. Las lipocalinas tienen una estructura secundaria rígida de lámina p con una pluralidad de bucles en el extremo abierto de la estructura cónica que puede diseñarse para unirse a un antígeno. Dichas lipocalinas modificadas se conocen como anticalinas. Para una descripción más detallada de las anticalinas, véase US7250297B1 o US20070224633.

Aficuerpos

En un ejemplo adicional, una proteína de unión a Fn14 de la divulgación es un aficuerpo. Un aficuerpo es un armazón derivado del dominio Z (dominio de unión a antígeno) de la proteína A de Staphylococcus aureus que puede diseñarse para unirse al antígeno. El dominio Z consiste en un paquete de tres hélices de aproximadamente 58 aminoácidos. Se han generado bibliotecas mediante aleatorización de restos superficiales. Para más detalles véase EP1641818.

Avímeros

En un ejemplo adicional, una proteína de unión a Fn14 de la descripción es un Avímero. Los Avímeros son proteínas multidominio derivadas de la familia de armazones de dominio A. Los dominios nativos de aproximadamente 35 aminoácidos adoptan una estructura unida por disulfuro definida. La diversidad se genera al mezclar la variación natural exhibida por la familia de los dominios A. Para más detalles véase WO2002088171.

DARPins

En un ejemplo adicional, una proteína de unión a Fn14 de la descripción es una proteína repetida diseñada de anquirina (DARPin). Las DARPins se derivan de Anquirina, que es una familia de proteínas que median la unión de proteínas integrales de membrana al citoesqueleto. Una única repetición de anquirinA es un motivo de 33 restos que consiste en dos hélices a y un giro p. Se pueden diseñar para unir diferentes antígenos diana aleatorizando los restos en la primera hélice a y un giro p de cada repetición. Su interfaz de unión puede aumentarse aumentando el número de módulos (un método de maduración de afinidad). Para más detalles véase US20040132028.

Otros polipéptidos no anticuerpos

Otras proteínas que no son anticuerpos que comprenden dominios de unión incluyen aquellas basadas en ycristalina humana y ubiquitina humana (afilinas), dominios de tipo kunitz de inhibidores de proteasa humana, dominios PDZ de la proteína de unión a Ras AF-6, toxinas de escorpión (caribdotoxina), dominio de lectina de tipo C (tetranectinas).

Regiones constantes

La presente divulgación abarca proteínas de unión a Fn14 que comprenden una región variable y una región constante o un dominio o dominios de las mismas, por ejemplo, Fc, dominio Ch2 y/o Ch3. El experto en la materia conocerá el significado de los términos región constante y dominio constante basándose en la divulgación en el presente documento y referencias discutidas en el presente documento.

Las secuencias de región constante útiles para producir las proteínas de unión a Fn14 de la presente descripción pueden obtenerse de varias fuentes diferentes. En algunos ejemplos, la región constante o porción de la misma de la proteína de unión a Fn14 se deriva de un anticuerpo humano. Además, el dominio constante o parte del mismo puede derivarse de cualquier clase de anticuerpo, incluyendo IgM, IgG, IgD, IgA e IgE, y cualquier isotipo de anticuerpo, incluyendo IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. En un ejemplo, Se usa el isotipo humano IgGl.

Una variedad de secuencias de genes de región constante está disponibles en forma de depósitos accesibles públicamente o la secuencia de los mismos está disponible en bases de datos disponibles públicamente. Se pueden seleccionar regiones constantes que tengan una función efectora particular (o que carezcan de una función efectora particular) o con una modificación particular para reducir la inmunogenicidad.

En un ejemplo, una proteína de la presente descripción tiene o muestra una función efectora que facilita o permite al menos un agotamiento parcial, agotamiento sustancial o eliminación de células que expresan Fn14. Dicha función efectora puede mejorar la afinidad de unión a los receptores Fc, citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC), fagocitosis mediada por células dependientes de anticuerpos (ADCP) y/o citotoxicidad dependiente del complemento (CDC).

En un ejemplo, la proteína de unión a Fn14 es capaz de inducir un nivel mejorado de función efectora.

En un ejemplo, el nivel de la función efectora inducida por la región constante aumenta con respecto a una región Fc de tipo silvestre de un anticuerpo o una región Fc de tipo silvestre de un anticuerpo IgG3.

En otro ejemplo, la región constante se modifica para aumentar el nivel de la función efectora que es capaz de inducir en comparación con la región constante sin la modificación. Dichas modificaciones pueden estar en el nivel de aminoácidos y/o el nivel estructural secundario y/o el nivel estructural terciario y/o la glicosilación de la región Fc. El destinatario experto apreciará que una mayor función efectora se puede manifestar de varias maneras, por ejemplo como un mayor nivel de efecto, un efecto más sostenido o una tasa de efecto más rápida.

Las modificaciones ejemplares de la región constante incluyen sustituciones de aminoácidos, como, S239D/I332E, numerados según el índice de la UE de Kabat o S239D/A330L/I332E, numerado según el índice de la UE de Kabat. Las sustituciones de aminoácidos adicionales que aumentan la capacidad de una región Fc para inducir la función efectora se conocen y/o se describen en la técnica, por ejemplo, en US6737056 o US7317091.

En un ejemplo, la glicosilación de la región constante se altera para aumentar su capacidad de inducir una función efectora mejorada. En algunos ejemplos, las regiones Fc de acuerdo con la presente descripción comprenden una estructura de carbohidrato que carece de fucosa unida (directa o indirectamente) a una región Fc, es decir, la región Fc está "afucosilada". Dichas variantes pueden tener una capacidad mejorada para inducir ADCC. Los métodos para producir anticuerpos afucosilados incluyen, expresar la proteína de unión a Fn14 en una línea celular incapaz de expresar a-1,6-fucosiltransferasa (FUT8) (por ejemplo, como se describe en Yumane-Ohnuki et al., 2004). Otros métodos incluyen el uso de líneas celulares que producen inherentemente anticuerpos capaces de inducir una función efectora mejorada (por ejemplo, células madre derivadas de embriones de pato para la producción de vacunas virales, WO2008/129058; Producción de proteínas recombinantes en células aviares EBX®, WO 2008/142124).

L a s p ro te ín a s d e u n ió n a F n 14 ta m b ié n p u e d e n c o m p re n d e r u n a re g ió n F c c a p a z d e in d u c ir n iv e le s m e jo ra d o s d e C D C . P o r e je m p lo , lo s h íb r id o s d e IgG 1 e Ig G 3 p ro d u c e n a n t ic u e rp o s q u e t ie n e n u n a a c t iv id a d C D C m e jo ra d a (N a ts u m e e t al., 2008 ).

Métodos para determinar la capacidad de un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo para inducir la función efectora se conocen en la técnica y/o se describen en el presente documento.

En otro ejemplo, la proteína comprende una o más sustituciones de aminoácidos que aumentan la vida media de la proteína de unión a Fn14. Por ejemplo, la proteína de unión a Fn14 comprende una región constante que comprende una o más sustituciones de aminoácidos que aumentan la afinidad de la región constante por la región Fc neonatal (FcRn). Por ejemplo, la región constante ha aumentado la afinidad por FcRn a pH más bajo, por ejemplo, aproximadamente pH 6,0, para facilitar la unión de Fc/FcRn en un endosoma. En un ejemplo, la región constante ha aumentado la afinidad por FcRn a aproximadamente pH 6 en comparación con su afinidad a aproximadamente pH 7,4, lo que facilita la re-liberación de Fc en la sangre luego del reciclaje celular. Estas sustituciones de aminoácidos son útiles para extender la vida media de una proteína, reduciendo la eliminación de la sangre.

Las sustituciones de aminoácidos ejemplares incluyen T250Q y/o M428L o T252A, T254S y T266F o M252Y, S254T y T256E o H433K y N434F según el sistema de numeración de la UE. Se describen sustituciones de aminoácidos adicionales o alternativas, por ejemplo, en US20070135620 o US7083784.

Las proteínas de unión a Fn14 neutralizantes de la presente divulgación pueden comprender una región constante de IgG4 o una región constante de IgG4 estabilizada. El término "región constante de IgG4 estabilizada" se entenderá que significa una región constante de IgG4 que ha sido modificada para reducir el intercambio del brazo Fab o la propensión a experimentar el intercambio del brazo Fab o la formación de un medio anticuerpo o una propensión a formar un medio anticuerpo. "Intercambio de brazo Fab" se refiere a un tipo de modificación de proteínas para IgG4 humana, en el que una cadena pesada de IgG4 y una cadena ligera unida (media molécula) se intercambia por un par de cadena pesada de otra molécula de IgG4. Así, Las moléculas de IgG4 pueden adquirir dos brazos Fab distintos que reconocen dos antígenos distintos (dando como resultado moléculas biespecíficas). El intercambio de brazos Fab ocurre naturalmente in vivo y puede ser inducido in vitro por células sanguíneas purificadas o agentes reductores como glutatión reducido. Se forma un "medio anticuerpo" cuando un anticuerpo IgG4 se disocia para formar dos moléculas cada una de las cuales conteniendo una cadena pesada y una cadena ligera.

En un ejemplo, una región constante de IgG4 estabilizada comprende una prolina en la posición 241 de la región bisagra de acuerdo con el sistema de Kabat. Esta posición corresponde a la posición 228 de la región de bisagra de acuerdo con el sistema de numeración de la UE. En IgG4 humana, este resto es generalmente una serina. Tras la sustitución de la serina por prolina, la región de bisagra IgG4 comprende una secuencia CPPC. En este sentido, la persona experta sabrá que la "región bisagra" es una porción rica en prolina de una región constante de cadena pesada de anticuerpo que une las regiones Fc y Fab que confiere movilidad en los dos brazos Fab de un anticuerpo. La región de bisagra incluye restos de cisteína que están implicados en enlaces disulfuro de cadena interpesada. Generalmente se define como el estiramiento de Glu226 a Pro243 de IgG1 humana de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat. Las regiones de bisagra de otros isotipos de IgG pueden alinearse con la secuencia de IgG1 colocando el primer y el último resto de cisteína formando enlaces disulfuro de cadena interpesada (S-S) en las mismas posiciones (véase, por ejemplo, el documento WO2010/080538).

Proteínas mutantes

La presente divulgación proporciona una proteína de unión a Fn14 que tiene al menos un 80 % de identidad con una secuencia de la divulgación y que tiene las mismas características funcionales descritas o reivindicadas en el presente documento.

En un ejemplo, una proteína de unión a Fn14 de la descripción comprende una secuencia que tiene al menos 80 % u 85 % o 90 % o 91 % o 92 % o 93 % o 94 % o 95 % o 96 % o 97 % o 98 % o 99 % de identidad a una Vl secuencia desvelada en el presente documento, con la condición de que la secuencia comprenda una serina en una posición correspondiente al resto 57 de SEQ ID NO: 14. En este sentido, los inventores han identificado varios anticuerpos que comparten al menos aproximadamente un 92 % de identidad en toda su longitud.

En otro ejemplo, una proteína de unión a Fn14 de la descripción comprende una secuencia que tiene al menos 70 % o 75 % u 80 % u 85 % o 90 % o 91 % o 92 % o 93 % o 94 % o 95 % o 96 % o 97 % o 98 % o 99 % de identidad a una V^hde la divulgación descrita en el presente documento, siempre que la secuencia comprenda uno o más de un triptófano en una posición correspondiente a la posición 31 de SEQ ID NO: 13, una glutamina en una posición correspondiente a la posición 54 de SEQ ID NO: 13, una arginina o una serina en una posición correspondiente a la posición 101 de SEQ ID NO: 13, una histidina en una posición correspondiente a la posición 107 de SEQ ID NO: 13 o una histidina en una posición correspondiente a la posición 108 de SEQ ID NO: 13. En este sentido, los inventores han identificado varios anticuerpos que comparten al menos aproximadamente un 92 % de identidad en toda su longitud. los inventores también han identificado una serie de HCDR1 según el sistema de numeración Kabat que comparte una identidad del 60 % en toda su longitud. los inventores también han identificado una serie de HCDR2 según el sistema de numeración Kabat que comparte una identidad del 74 % en toda su longitud. Los inventores también han identificado una serie de HCDR3 de acuerdo con el sistema de numeración Kabat que comparte aproximadamente el 63 % de identidad en toda su longitud.

Como se ha analizado anteriormente, También se sabe en la técnica que los cinco restos C-terminales de la CDR2 de la cadena pesada pueden mutar a sustituciones de aminoácidos conservativas o no conservativas (26 % de los restos) (Padlan et al., 1995). Esto combinado con los sitios variables identificados por los inventores (cinco) significa hasta un 52 % de variación (o al menos un 48 % de identidad) a una secuencia de un CDR2 (según el sistema de numeración de Kabat) como se enseña en el presente documento.

La presente divulgación también proporciona un ácido nucleico que codifica las proteínas o ácidos nucleicos anteriores que se hibridan con los mismos en condiciones de rigurosidad moderada a alta.

La presente divulgación también abarca ácidos nucleicos que codifican una proteína que comprende una secuencia establecida en cualquiera de SEQ ID NOs: 13-28, que difiere de una secuencia ejemplificada en el presente documento como resultado de la degeneración del código genético.

El % de identidad de un ácido nucleico o polipéptido está determinado por análisis GAP (programa GCG) (Needleman y Wunsch. 1970) con una penalización de creación de hueco = 5, y una penalización de extensión de hueco = 0,3. La secuencia de consulta tiene al menos 50 restos de longitud, y el análisis GAP alinea las dos secuencias sobre una región de al menos 50 restos. Por ejemplo, la secuencia de consulta tiene al menos 100 restos de longitud y el análisis GAP alinea las dos secuencias sobre una región de al menos 100 restos. En un ejemplo, las dos secuencias están alineadas en toda su longitud.

La presente divulgación contempla formas mutantes de una proteína de unión a Fn14 de la divulgación. Por ejemplo, dicha proteína de unión a Fn14 mutante comprende una o más sustituciones conservadoras de aminoácidos en comparación con una secuencia establecida en el presente documento. En algunos ejemplos, la proteína de unión a Fn14 comprende 10 o menos, por ejemplo, 9 u 8 o 7 o 6 o 5 o 4 o 3 o 2 o 1 sustituciones conservadoras de aminoácidos. Una "sustitución conservadora de aminoácidos" es aquella en la que el resto de aminoácido se reemplaza con un resto de aminoácido que tiene una cadena lateral y/o hidropática y/o hidrofilia similar.

Se han definido en la técnica familias de restos de aminoácidos que tienen cadenas laterales similares, incluyendo cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares no cargadas (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano), cadenas laterales ramificadas @ (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina). Los índices hidropáticos se describen, por ejemplo, en Kyte y Doolittle (1982) y los índices hidrofílicos se describen en, por ejemplo, US4554101. La presente divulgación también contempla cambios de aminoácidos no conservadores. Por ejemplo, de particular interés son las sustituciones de aminoácidos cargados con otro aminoácido cargado y con aminoácidos neutros o cargados positivamente. En algunos ejemplos, la proteína de unión a Fn14 comprende 10 o menos, por ejemplo, 9 u 8 o 7 o 6 o 5 o 4 o 3 o 2 o 1 sustituciones de aminoácidos no conservativas.

Una forma mutante de una proteína de unión a Fn14 descrita en el presente documento de acuerdo con cualquier ejemplo conserva la capacidad de unirse específicamente a Fn14. Los métodos para determinar la unión específica a Fn14 se describen en el presente documento. Por ejemplo, una proteína de unión a Fn14 etiquetada se pone en contacto con Fn14 inmovilizado. Tras lavar, la etiqueta unida se detecta. La proteína de unión a Fn14 etiquetada también se pone en contacto con Fn14 inmovilizado y una proteína relacionada o una forma mutante de Fn14 o un fragmento de Fn14 y, tras lavar, la etiqueta unida se detecta. La detección de la etiqueta unida a Fn14 pero no a la proteína mutante o relacionada o un fragmento de Fn14 indica que la proteína de unión a Fn14 mutante conserva la capacidad de unirse específicamente a Fn14.

En un ejemplo, la mutación(s) se produce dentro de una FR de una proteína de unión a Fn14 de la divulgación. En otro ejemplo, la mutación(s) se produce dentro de una CDR de una proteína de unión a Fn14 de la divulgación. Maduración de afinidad

En un ejemplo adicional, una proteína de unión a Fn14 existente de la divulgación se madura por afinidad para producir un anticuerpo capaz de unirse a Fn14 con mayor afinidad. Por ejemplo, la secuencia que codifica la Vl y/o V^hestá aislada y la región codificante de CDR (por ejemplo, la región que codifica CDR3 de la V^ly/o V^h) está mutada de tal manera que se introduce una o más sustituciones de aminoácidos. La proteína de unión a Fn14 mutante resultante se analiza luego para su unión a Fn14, por ejemplo, en un ensayo competitivo.

Las proteínas de unión a Fn14 según la divulgación pueden ser proteínas secretadas solubles o pueden presentarse como una proteína de fusión en la superficie de una célula o partícula (por ejemplo, un fago u otro virus, un ribosoma o una espora). Se describen métodos ejemplares de visualización de fagos, por ejemplo, en US5821047; US6248516 e US6190908. Las partículas de presentación en fagos producidas usando estos métodos se seleccionan para identificar una proteína de unión a Fn14 exhibida que tiene una conformación suficiente para unirse a un antígeno diana, por ejemplo, Fn14.

Producción de proteínas

En un ejemplo, una proteína de unión a Fn14 de la divulgación se produce cultivando una línea celular, por ejemplo, un hibridoma en condiciones suficientes para producir la proteína, por ejemplo, como se describe en el presente documento y/o como se conoce en la técnica.

Expresión recombinante

En el caso de una proteína recombinante, el ácido nucleico que lo codifica se coloca en una o más constructos de expresión, por ejemplo, vector(es) de expresión, que luego se transfecta(n) en células hospedadoras, como las células que pueden producir un puente o enlace disulfuro, tales como células de E. coli, células de levadura, células de insectos o células de mamíferos. Las células de mamífero ejemplares incluyen células COS de simio, células de ovario de hámster chino (CHO) o células de mieloma que de otro modo no producen proteína de inmunoglobulina. Las técnicas de clonación molecular para lograr estos fines se conocen en la materia y se describen, por ejemplo, en Ausubel o Sambrook. Una amplia variedad de clonación y los métodos de amplificación in vitroson adecuados para el constructo de ácidos nucleicos recombinantes. Los métodos para producir anticuerpos recombinantes también son conocidos en la técnica. Véanse US4816567; US7923221 y US7022500.

Tras el aislamiento, el ácido nucleico que codifica una proteína de la divulgación se inserta en un constructo de expresión o vector replicable para clonación adicional (amplificación del ADN) o para expresión en un sistema libre de células o en células. Por ejemplo, el ácido nucleico está unido operativamente a un promotor.

Como se usa en el presente documento, el término "promotor" debe tomarse en su contexto más amplio e incluye las secuencias reguladoras transcripcionales de un gen genómico, incluyendo la caja TATA o elemento iniciador, que se requiere para una iniciación de la transcripción precisa, con o sin elementos reguladores adicionales (por ejemplo, secuencias de activación aguas arriba, sitios de unión de factor de transcripción, potenciadores y silenciadores) que alteran la expresión de un ácido nucleico, por ejemplo, en respuesta a un estímulo de desarrollo y/o externo, o de una forma específica de tejido. En el presente contexto, el término "promotor" también se usa para describir un ácido nucleico recombinante, sintético o de fusión, o derivado que confiere, activa o mejora la expresión de un ácido nucleico al que está unido de manera operativa. Los promotores ejemplares pueden contener copias adicionales de uno o más elementos reguladores específicos para mejorar aún más la expresión y/o alterar la expresión espacial y/o la expresión temporal de dicho ácido nucleico.

Como se usa en el presente documento, el término "unido de manera operativa a" significa colocar un promotor en relación con un ácido nucleico de manera que la expresión del ácido nucleico esté controlada por el promotor.

Los sistemas de expresión sin células también se contemplan mediante la presente divulgación. Por ejemplo, un ácido nucleico que codifica una proteína de unión a Fn14 de la divulgación está unido operativamente a un promotor adecuado, por ejemplo, un promotor T7, y el constructo de expresión resultante expuesto a condiciones suficientes para transcripción y traducción. Se han descrito vectores de expresión típicos para expresión in vitro o expresión libre de células e incluyen, pero no se limitan a los sistemas TNT T7 y TNT T3 (Promega), los vectores pEXP1-DEST y pEXP2-DEST (Invitrogen).

Hay muchos vectores disponibles para la expresión en células. Los componentes del vector generalmente incluyen, pero no se limitan a, uno o más de los siguientes: una secuencia señal, una secuencia que codifica la proteína de unión a Fn14 de la presente divulgación (por ejemplo, derivada de la información proporcionada en el presente documento), un elemento potenciador, un promotor y una secuencia de terminación de la transcripción. El experto en la materia sabrá de secuencias adecuadas para la expresión de una proteína. Por ejemplo, las secuencias señal ejemplares incluyen señales de secreción en procariotas (por ejemplo, pelB, fosfatasa alcalina, penicilinasa, Ipp, o enterotoxina II termoestable), señales de secreción en levadura (por ejemplo, líder de invertasa, líder de factor a o líder de fosfatasa ácida) o señales de secreción en mamíferos (por ejemplo, señal gD de herpes simple).

Los promotores ejemplares incluyen aquellos activos en procariotas (por ejemplo, el promotor phoA, sistemas promotores de p-lactamasa y lactosa, fosfatasa alcalina, un sistema de promotor de triptófano (trp) y promotores híbridos, tales como el promotor tac).

Los promotores ejemplares activos en células de mamífero incluyen el promotor temprano inmediato de citomegalovirus (CMV-IE), promotor 1-a del factor de elongación humano (EF1), promotores de ARN nuclear pequeño (U1a y U1b), promotor de la cadena pesada de a-miosina, promotor del virus Simio 40 (SV40), promotor del virus del sarcoma de Rous (RSV), el promotor tardío principal de adenovirus, promotor de p-actina; elemento regulador híbrido que comprende un potenciador de CMV/promotor de p-actina o un promotor de inmunoglobulina o fragmento activo del mismo. Ejemplos de líneas celulares de mamífero hospedadoras útiles son la línea CV1 de riñón de mono transformada por SV40 (COS-7, AUSTRALIAN CELL BANK Cr L 1651); línea de riñón embrionario humano (células 293 o 293 subclonadas para crecimiento en cultivo en suspensión; células de riñón de cría de hámster (BHK, AUSTRALIAN CELL BANK CCL 10); o células de ovario de hámster chino (CHO).

Los promotores típicos adecuados para la expresión en células de levadura tales como por ejemplo una célula de levadura seleccionada entre el grupo que comprende Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae y S. pombe, incluyen, pero no se limitan a, el promotor ADH1, el promotor GAL1, el promotor GAL4, el promotor CUP1, el promotor PHO5, el promotor nmt, el promotor RPR1, o el promotor TEF1.

Los medios para introducir la molécula de ácido nucleico aislada o un constructo génico que comprenda a la misma en una célula para la expresión son conocidos por los expertos en la materia. La técnica usada para una célula dada depende de las técnicas de éxito conocidas. Los medios para introducir ADN recombinante en las células incluyen microinyección, transfección mediada por DEAE-dextrano, transfección mediada por liposomas tales como usando lipofectamina (Gibco, MD, USA) y/o cellfectina (Gibco, MD, USA), captación de ADN mediada por PEG, electroporación, transducción viral (por ejemplo, usando un lentivirus) y bombardeo de micropartículas, como el uso de tungsteno recubierto con ADN o partículas de oro (Agracetus Inc., WI, USA) entre otros.

Las células hospedadoras usadas para producir la proteína de unión a Fn14 de esta divulgación pueden cultivarse en una variedad de medios, en función del tipo celular usado. Los medios comercialmente disponibles tales como de Ham F10 (Sigma), Medio esencial mínimo ((MEM), (Sigma), RPM1-1640 (Sigma) y el medio de Eagle modificado de Dulbecco ((DMEM), Sigma) son adecuados para cultivar células de mamífero. Los medios para cultivar otros tipos celulares tratados en el presente documento son conocidos en la materia.

Aislamiento de proteínas

Una proteína de unión a Fn14 de la presente divulgación se puede aislar o purificar.

Los métodos para purificar una proteína de unión a Fn14 de la divulgación son conocidos en la técnica y/o se describen en el presente documento.

Cuando se usan técnicas recombinantes, la proteína de unión a Fn14 de la divulgación puede producirse intracelularmente, en el espacio periplásmico, o directamente secretada en el medio. Si la proteína se produce intracelularmente, como primera etapa, los restos de partículas, ya sean células hospedadoras o fragmentos lisados, se retiran, por ejemplo, mediante centrifugación o ultrafiltración. Cuando la proteína se secreta en el medio, los sobrenadantes de tales sistemas de expresión pueden concentrarse primero usando un filtro de concentración de proteínas disponible comercialmente, por ejemplo, una unidad de ultrafiltración Amicon o Millipore Pellicon. Se puede incluir un inhibidor de la proteasa como ^pM^sF en cualquiera de las etapas anteriores para inhibir la proteólisis y se pueden incluir antibióticos para prevenir el crecimiento de contaminantes adventicios.

La proteína preparada a partir de las células se puede purificar usando, por ejemplo, intercambio iónico, cromatografía con hidroxiapatito, cromatografía de interacción hidrofóbica, electroforesis en gel, diálisis, cromatografía de afinidad (por ejemplo, cromatografía de afinidad de proteína A o cromatografía de proteína G), o cualquier combinación de las anteriores. Estos métodos son conocidos en la técnica y se describen, por ejemplo en WO99/57134 o Zola (1997).

El experto en la materia también sabrá que una proteína de unión a Fn14 de la divulgación puede modificarse para incluir una etiqueta para facilitar la purificación o detección, por ejemplo, una etiqueta de polihistidina, por ejemplo, una etiqueta de hexa-histidina, o una etiqueta de hemaglutinina (HA) del virus de la gripe, o una etiqueta de Virus Simio 5 (V5), o una etiqueta FLAG, o una etiqueta de glutatión S-transferasa (GST). Por ejemplo, la etiqueta es una etiqueta hexa-his. La proteína resultante se purifica luego usando métodos conocidos en la técnica, como, purificación por afinidad. Por ejemplo, una proteína que comprende una etiqueta hexa-his se purifica poniendo en contacto una muestra que comprende la proteína con níquel-ácido nitrilotriacético (Ni-NTA) que se une específicamente a una etiqueta hexa-his inmovilizada en un soporte sólido o semisólido, lavando la muestra para eliminar la proteína no unida y, posteriormente, eluyendo la proteína unida. Alternativamente, o además, se usa un ligando o anticuerpo que se une a una etiqueta en un método de purificación por afinidad.

Conjugados

La presente divulgación también proporciona conjugados de proteínas de unión a Fn14 descritos en el presente documento de acuerdo con cualquier ejemplo. Los ejemplos de compuestos a los que se puede conjugar una proteína se seleccionan entre el grupo que consiste en un radioisótopo, una etiqueta detectable, un compuesto terapéutico, un coloide, una toxina, un ácido nucleico, un péptido, una proteína, un compuesto que aumenta la semivida de la proteína en un sujeto y mezclas de los mismos. Los agentes terapéuticos ejemplares incluyen, pero no se limitan a un agente antiangiogénico, un agente anti-neovascularización y/u otro agente de vascularización, un agente antiproliferativo, un agente pro-apoptótico, un agente quimioterapéutico o un ácido nucleico terapéutico. Una toxina incluye cualquier agente que sea perjudicial para (por ejemplo, matar) las células. Para una descripción de estas clases de fármacos que se conocen en la materia y sus mecanismos de acción, véase Goodman et al., (1990). Técnicas adicionales relevantes para la preparación de conjugados inmunoglobulina-inmunotoxina se proporcionan, por ejemplo, en el documento US5194594. Las toxinas ejemplares incluyen la cadena A de difteria, los fragmentos activos de no unión de la toxina de difteria, la cadena A de la exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa), la cadena A de ricina, la cadena A de abrina, la cadena A de modeccina, sarcina alfa, las proteínas de Aleurites fordii, las proteínas de diantina, las proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII, y PAP-S), el inhibidor de Momordica charantia, curcina, crotina, el inhibidor de Sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina y los tricotecenos. Véase, por ejemplo, WO93/21232.

Los agentes quimioterapéuticos adecuados para formar inmunoconjugados de la presente descripción incluyen taxol, citocalasina B, gramicidina D, bromuro de etidio, emetina, mitomicina, etopósido, tenopósido, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorrubicina, daunorrubicina, dihidroxiantracindiona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-deshidrotestosterona, glucocorticoides, procaína, tetracaína, lidocaína, propranolol y puromicina, antimetabolitos (como metotrexato, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, fludarabina, 5-fluorouracilo, dacarbazina, hidroxiurea, asparaginasa, gemcitabina, cladribina), agentes alquilantes (tales como mecloretamina, tioepa, clorambucilo, melfalán, carmustina (BSNU), lomustina (CCNU), ciclofosfamida, busulfán, dibromomanitol, estreptozotocina, dacarbazina (DTIC), procarbazina, mitomicina C, cisplatino y otros derivados del platino, tales como carboplatino), antibióticos (tales como dactinomicina (formalmente actinomicina), bleomicina, daunorrubicina (formalmente daunomicina), doxorrubicina, idarrubicina, mitramicina, mitomicina, mitoxantrona, plicamicina, antramicina (AMC)). En un ejemplo, una proteína de unión a Fn14 como se describe en el presente documento de acuerdo con cualquier ejemplo se conjuga o se une a otra proteína, incluyendo otra proteína de unión a Fn14 de la divulgación o una proteína que comprende una región variable de anticuerpo, tal como un anticuerpo o una proteína derivada del mismo, por ejemplo, como se describe en el presente documento. Otras proteínas no se excluyen. Las proteínas adicionales serán evidentes para el experto en la materia e incluyen, por ejemplo, un inmunomodulador o una proteína que extiende la semivida o un péptido u otra proteína que se une a la albúmina sérica, entre otros.

Se describen péptidos o proteínas de unión a albúmina de suero ejemplares en los documentos US20060228364 o US20080260757.

Hay una variedad de radionucleidos disponible para la producción de proteínas radioconjugadas. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, núcleos radiactivos de baja energía (por ejemplo, adecuados para fines de diagnóstico), como 13C 15N, 2H, 125I, 123I, 99Tc, 43K, 52Fe, 67Ga, 68Ga, 111In y similares. Por ejemplo, el radionúclido es un radionúclido gamma, fotón o emisor de positrones con una semivida adecuada para permitir la actividad o detección después del tiempo transcurrido entre la administración y la localización en el sitio de imagen. La presente divulgación también abarca núcleos radiactivos de alta energía (por ejemplo, con fines terapéuticos), como 125I, 131I, 123I, 111In, 105Rh, 153Sm, 67Cu, 67Ga, 166Ho, 177Lu, 186Re y 188Re. Estos isótopos típicamente producen partículas a o p de alta energía que tienen una longitud de trayectoria corta. Tales radionucleidos destruyen las células con las que están en estrecha proximidad, por ejemplo, células neoplásicas a las que se ha unido o en las que ha entrado el conjugado. Tienen poco o ningún efecto en las células no localizadas y son esencialmente no inmunogénicos. Como alternativa, los isótopos de alta energía pueden generarse por irradiación térmica de un isótopo estable, por ejemplo, como en la terapia de captura de neutrones de boro (Guan et al., 1998).

En otro ejemplo, la proteína se conjuga con un "receptor" (tal como estreptavidina) para su uso en el pretratamiento celular en el que el conjugado se administra al paciente, seguido de la eliminación del conjugado no unido de la circulación usando un agente clarificador y después la administración de un "ligando" (por ejemplo avidina) que se conjuga con un agente terapéutico (por ejemplo un radionucleótido).

Las proteínas de unión a Fn14 de la presente divulgación pueden modificarse para contener restos no proteicos adicionales que son conocidos en la técnica y fácilmente disponibles. Por ejemplo, los restos adecuados para la derivatización de la proteína son polímeros fisiológicamente aceptables, por ejemplo, un polímero soluble en agua. Tales polímeros son útiles para aumentar la estabilidad y/o reducir la eliminación (por ejemplo, por el riñón) y/o para reducir la inmunogenicidad de una proteína de unión a Fn14 de la divulgación. Los ejemplos no limitantes de polímeros solubles en agua incluyen, pero no se limitan a, polietilenglicol (PEG), alcohol polivinílico (PVA) o propropilenglicol (PPG).

En un ejemplo, una proteína de unión a Fn14 como se describe en el presente documento de acuerdo con cualquier ejemplo comprende uno o más marcadores detectables para facilitar la detección y/o aislamiento. Por ejemplo, el compuesto comprende una etiqueta fluorescente tal como, por ejemplo, fluoresceína (FITC), 5,6-carboximetil fluoresceína, rojo Texas, nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-ilo (NBD), cumarina, cloruro de dansilo, rodamina, 4'-6-diamidino-2-fenilinodol (DAPI), y los colorantes de cianina Cy3, Cy3.5, Cy5, Cy5.5 y Cy7, fluoresceína (éster de 5-carboxifluoresceína-N-hidroxisuccinimida), rodamina (5,6-tetrametil rodamina). Los máximos de absorción y emisión, respectivamente, para estos flúor son: FITC (490 nm; 520 nm), Cy3 (554 nm; 568 nm), Cy3.5 (581 nm; 588 nm), Cy5 (652 nm: 672 nm), Cy5.5 (682 nm; 703 nm) y Cy7 (755 nm; 778 nm).

Como alternativa, o además, la proteína de unión a Fn14 como se describe en el presente documento de acuerdo con cualquier ejemplo está etiquetada con, por ejemplo, un nanocristal semiconductor fluorescente (como se describe, por ejemplo, en US 6.306.610).

Como alternativa, o además, la proteína de unión a Fn14 está etiquetada con, por ejemplo, un compuesto magnético o paramagnético, como, hierro, acero, níquel, cobalto, materiales de tierras raras, neodimio-hierro-boro, ferrosocromo-cobalto, níquel-ferroso, cobalto-platino, o ferrita de estroncio.

Proteínas inmovilizadas

En un ejemplo una proteína de unión a Fn14 se inmoviliza en una matriz sólida o semisólida. Debe entenderse que el término "inmovilización" involucra varios métodos y técnicas para fijar proteínas en matrices específicas, por ejemplo, como se describe en WO99/56126 o WO02/26292. Por ejemplo, la inmovilización puede servir para estabilizar las proteínas de modo que su actividad no se reduzca o modifique negativamente por factores biológicos, exposición química o física, especialmente durante el almacenamiento o en el uso de un solo lote.

En el sentido de la divulgación, se pueden usar tres métodos básicos para la inmovilización:

Varios métodos para inmovilizar una proteína en una matriz son conocidos en la técnica e incluyen reticulación, unión a un vehículo, retención dentro de una matriz semipermeable.

Las matrices ejemplares incluyen geles porosos, óxido de aluminio, bentonita, agarosa, almidón, nylon o poliacrilamida.

Ensayo de actividad de una proteína de la divulgación

Ensayos de unión

Una forma de tal ensayo es un ensayo de unión a antígeno, por ejemplo, como se describe en Scopes (1994). Tal método generalmente implica etiquetar la proteína de unión a Fn14 y ponerla en contacto con el antígeno inmovilizado o un fragmento del mismo, por ejemplo, una proteína que comprende un dominio extracelular de Fn14 fusionado a una región Fc de un anticuerpo. Después del lavado para eliminar la proteína unida no específica, la cantidad de etiqueta y, como consecuencia, la proteína unida se detecta. Por supuesto, la proteína de unión a Fn14 puede inmovilizarse y etiquetarse el antígeno. También se pueden usar, por ejemplo, ensayos de tipo selección, por ejemplo, como se describe o ejemplifica en el presente documento.

Ensayos de neutralización

Los ensayos para identificar proteínas de unión a Fn14 que neutralizan una o más actividades Tweak mediadas por Fn14 también serán evidentes para la persona experta.

Por ejemplo, un ensayo de neutralización comprende determinar una proteína de unión a Fn14 que reduce la señalización de NFkB inducida por Tweak en una célula que expresa Fn14. En un ejemplo, se produce u obtiene una célula que expresa Fn14 que se ha incorporado a ella, por ejemplo, en su genoma, un promotor unido operativamente a un gen indicador, en donde el promotor induce la expresión del promotor en respuesta a la unión por NFkB. La célula se pone en contacto con Tweak (o Tweak fusionado a una región Fc de un anticuerpo) en presencia o ausencia de la proteína de unión a Fn14. Un nivel reducido de expresión del gen indicador en presencia de la proteína de unión a Fn14 en comparación con la ausencia de la proteína de unión a Fn14 es indicativo de la reducción de la señalización de NFkB inducida por Tweak en una célula que expresa Fn14. En un ejemplo, la célula también se pone en contacto con la proteína de unión a Fn14 en ausencia de Tweak y se determina el nivel de expresión del gen indicador, que permite la identificación de una proteína de unión a Fn14 que no tiene actividad agonista. Al probar múltiples concentraciones de la proteína de unión a Fn14, se determina una CI50, es decir, una concentración a la que se produce el 50 % de la inhibición máxima de señalización de NFkB.

Otro medio para probar la reducción de la señalización de NF^kB inducida por Tweak en una célula que expresa Fn14 es probar el nivel de expresión de un gen cuya expresión es inducida por NFkB. Tales cambios en la expresión génica pueden medirse mediante ensayos de detección basados en ácidos nucleicos (por ejemplo, RT-PCR cuantitativa) o ensayos basados en proteínas (por ejemplo, como se describe en el presente documento). Los genes ejemplares inducidos por NFkB incluyen IL-2, lL-6, TNF, BCL2, VEGF y COX2.

Otro método para determinar la capacidad de una proteína de unión a Fn14 de la divulgación para neutralizar las actividades Tweak mediadas por Fn14 es un ensayo de unión a receptor. En dicho método, se inmoviliza un Fn14 o una forma soluble de la misma o una célula que la expresa. Luego Tweak etiquetado se pone en contacto con el receptor o la célula inmovilizada en presencia o ausencia de una proteína de unión a Fn14 de prueba y se detecta la cantidad de marcador unido. Una reducción de la cantidad de marcador unido en presencia de la proteína de unión a Fn14 en comparación con la ausencia de la proteína de unión a Fn14 indica que la proteína de unión a Fn14 reduce o evita la unión de Tweak a Fn14. Al probar múltiples concentraciones de la proteína de unión a Fn14, se determina una CI50, es decir, una concentración a la que se produce el 50 % de la inhibición máxima de la unión de Tweak a Fn14.

Un método adicional para determinar la neutralización de las actividades Tweak mediadas por Fn14 es la capacidad de una proteína de unión a Fn14 para reducir la muerte de las células Kym1 en presencia de Tweak. Las células Kym1 se ponen en contacto con Tweak (o Tweak fusionado a un dominio Fc de un anticuerpo) en presencia o ausencia de una proteína de unión a Fn14. Un nivel reducido de muerte celular (por ejemplo, evaluado por la absorción de yoduro de propidio) en presencia de la proteína de unión a Fn14 en comparación con la ausencia de la proteína de unión a Fn14 indica que la proteína de unión a Fn14 neutraliza las actividades Tweak mediadas por Fn14. En un ejemplo, las células Kym1 también se ponen en contacto con la proteína de unión a Fn14 en ausencia de Tweak y se determina el nivel de muerte celular, que permite la identificación de una proteína de unión a Fn14 que no tiene actividad agonista. Al probar múltiples concentraciones de la proteína de unión a Fn14, se determina una CI50, es decir, una concentración a la que se produce el 50 % de la inhibición máxima de la muerte celular de Kym 1.

Otro método para determinar la capacidad de una proteína de unión a Fn14 de la descripción para neutralizar las actividades Tweak mediadas por Fn14 es contactar las células tumorales con Tweak en presencia o ausencia de la proteína de unión a Fn14 y detectar la secreción de una citoquina, como, IL-6. Un nivel más bajo de la citoquina en presencia de la proteína de unión a Fn14 en comparación con la ausencia de la proteína de unión a Fn14 indica que la proteína de unión a Fn14 neutraliza las actividades Tweak mediadas por Fn14. En un ejemplo, las células también se ponen en contacto con la proteína de unión a Fn14 en ausencia de Tweak y se determina el nivel de secreción de citoquinas, que permite la identificación de una proteína de unión a Fn14 que no tiene actividad agonista. Al probar múltiples concentraciones de la proteína de unión a Fn14, se determina una CI50, es decir, una concentración a la que se produce el 50 % de la inhibición máxima de la secreción de citoquinas.

Otros ensayos para determinar la inhibición de las actividades Tweak mediadas por Fn14 incluyen la inhibición de la formación de tubos por las células endoteliales (por ejemplo, HUVEC) y/o la inhibición de la secreción de IL-8 inducida por Tweak por células de melanoma A375.

Ensayos de secreción de citoquinas

En otro ejemplo, la actividad de una proteína de la divulgación se determina poniendo en contacto una célula con una proteína de la divulgación y determinando la secreción de una citoquina (por ejemplo, IL-8) por la célula. En la técnica se conocen métodos para determinar la secreción de IL-8.

Ensayos de muerte celular

En otro ejemplo, la capacidad de una proteína de unión a Fn14 de la divulgación (por ejemplo, unida a un compuesto tóxico o una región constante) se evalúa determinando su capacidad para inducir la muerte de una célula. En el caso de una proteína de unión a Fn14 unida a una región constante, es deseable realizar dicho ensayo en presencia de células efectoras inmunes y/o complemento (por ejemplo, para facilitar ADCC/CDC).

Ensayos de eficacia terapéutica in vivo

También se puede probar una proteína de unión a Fn14 de la divulgación in vivo.

Por ejemplo, una proteína de unión a Fn14 puede probarse en un modelo animal de un trastorno de desgaste como se describe en el presente documento, por ejemplo, en que a un mamífero no humano se le administra una célula tumoral que expresa Fn14 en condiciones para que se desarrolle un trastorno de desgaste, luego se administra una proteína de unión a Fn14 de la divulgación y se evalúa el efecto en el trastorno de desgaste, por ejemplo, monitorizando los cambios de peso corporal. Una proteína de unión a Fn14 que reduce o previene la pérdida de peso corporal o induce un aumento de peso corporal se selecciona como un agente terapéutico potencial.

Una proteína de unión a Fn14 de la divulgación también se puede seleccionar en función de su capacidad para reducir o prevenir la invasividad de una célula tumoral. Por ejemplo, se implanta una célula tumoral en un sujeto, por ejemplo, en un músculo, y al sujeto se le administra una proteína de unión a Fn14 de ensayo (o para los controles, no se administra proteína de unión a Fn14). Una reducción en la invasión de tejido que rodea la célula tumoral (por ejemplo, evaluado mediante histopatología) en presencia de la proteína de unión a Fn14 en comparación con la ausencia de la proteína de unión a Fn14 indica que la proteína de unión a Fn14 reduce o previene la invasividad de una célula tumoral.

También se puede evaluar la eficacia terapéutica de una proteína de unión a Fn14 de la divulgación determinando su capacidad para retrasar o prevenir el desarrollo de un tumor en un modelo de xenoinjerto.

T a m b ié n s e p u e d e e v a lu a r la e f ic a c ia te ra p é u t ic a d e u n a p ro te ín a d e u n ió n a F n 14 d e la d iv u lg a c ió n d e te rm in a n d o su c a p a c id a d p a ra re d u c ir la c a n t id a d d e a n g io g é n e s is o v a s c u lo g é n e s is e n un tu m o r e n un m o d e lo d e x e n o in je r to . La eficacia terapéutica también se puede evaluar en modelos animales de artritis reumatoide, por ejemplo, una cepa SKG de ratón (Sakaguchi et al.), modelo de artritis de colágeno tipo II de rata, modelo de artritis de colágeno tipo II de ratón; un modelo de GVHD de ratón (por ejemplo, como se describe en Trenado (2002)) o un modelo de apoplejía isquémica, por ejemplo, oclusión de aorta/vena cava, torniquete o manguito externo del cuello, hemorragia o hipotensión, hipertensión intracraneal u oclusión de la arteria carótida común, oclusión de dos vasos e hipotensión, oclusión de cuatro vasos, oclusión unilateral de la arteria carótida común (solo en algunas especies), constricción de arterias y venas inducida por endotelina-1, oclusión de la arteria cerebral media, infarto cerebral espontáneo (en ratas espontáneamente hipertensas), embolización por macrosferas, embolización por coágulos sanguíneos o embolización por microesferas.

La eficacia terapéutica también se puede determinar mediante la administración de una proteína de unión a Fn14 a un modelo de diabetes, por ejemplo, diabetes tipo 1. Por ejemplo, el sujeto de ensayo es un ratón diabético no obeso (NOD) (un modelo de diabetes tipo I) o un ratón o rata al que se le ha administrado estreptozotocina (modelos de diabetes tipo I y/o tipo II).

Ensayos de unión competitiva

Los ensayos para determinar una proteína de unión a Fn14 que inhibe competitivamente la unión de un anticuerpo de la divulgación serán evidentes para el experto en la materia. Por ejemplo, el anticuerpo de la divulgación se conjuga a una etiqueta detectable, por ejemplo, una etiqueta fluorescente o una etiqueta radiactiva. El anticuerpo etiquetado y la proteína de unión a Fn14 de ensayo se mezclan y se ponen en contacto con Fn14 o un dominio extracelular del mismo fusionado a una región Fc de un anticuerpo o un péptido que comprende un epítopo del mismo. Luego se determina el nivel de anticuerpo etiquetado y se compara con el nivel determinado cuando el anticuerpo etiquetado se pone en contacto con la fusión de Fn14 o Fn14-Fc o un péptido que comprende un epítopo del mismo en ausencia de la proteína de unión a Fn14. Si el nivel de anticuerpo etiquetado se reduce en presencia de la proteína de unión a Fn14 de ensayo en comparación con la ausencia de la proteína de unión a Fn14, la proteína de unión a Fn14 inhibe competitivamente la unión del anticuerpo.

Opcionalmente, la proteína de unión a Fn14 de ensayo se conjuga con en una etiqueta diferente al anticuerpo. Esto permite la detección del nivel de unión de la proteína de unión a Fn14 de ensayo a la proteína o epítopo.

En otro ejemplo, se permite que la proteína de unión a Fn14 de ensayo se una a la fusión de Fn14 o Fn14-Fc o a un péptido que comprende un epítopo de la misma antes de ponen en contacto la fusión de Fn14 o Fn14-Fc o un péptido que comprende un epítopo del mismo con un anticuerpo descrito en el presente documento. Una reducción de la cantidad de anticuerpo unido en presencia de la proteína de unión a Fn14 en comparación con la ausencia de la proteína de unión a Fn14 indica que la proteína de unión a Fn14 inhibe competitivamente la unión del anticuerpo a Fn14. También se puede realizar un ensayo recíproco usando proteína de unión a Fn14 etiquetada y primero permitiendo que el anticuerpo se una a la fusión Fn14 o Fn14-Fc o un péptido que comprende un epítopo de la misma. En este caso, una cantidad reducida de proteína de unión a Fn14 etiquetada unida a la fusión de Fn14 o Fn14-Fc o un péptido que comprende un epítopo del mismo en presencia del anticuerpo en comparación con la ausencia de anticuerpo indica que la proteína de unión a Fn14 inhibe competitivamente la unión del anticuerpo a Fn14.

Ensayos de mapeo de epítopos

En otro ejemplo, se hacen mapas del epítopo unido por una proteína de unión a Fn14 descrita en el presente documento. Los métodos de mapeo de epítopos serán evidentes para el experto en la materia. Por ejemplo, una serie de péptidos superpuestos que abarcan la secuencia Fn14 o una región de la misma que comprende un epítopo de interés, por ejemplo, se producen péptidos que comprenden 10-15 aminoácidos. La proteína de unión a Fn14 luego se pone en contacto con cada péptido o una combinación de los mismos y se determinan los péptidos a los que se une. Esto permite la determinación del péptido(s) que comprende el epítopo al que se une la proteína de unión a Fn14. Si múltiples péptidos no contiguos están unidos por la proteína de unión a Fn14, la proteína de unión a Fn14 puede unirse a un epítopo conformacional.

En un ejemplo, los fragmentos aleatorios de Fn14 se expresan en la superficie del fago y el fago se pone en contacto con la proteína de unión a Fn14. Los fagos unidos por el anticuerpo pueden aislarse y la secuencia de aminoácidos del péptido expresado puede deducirse por el ácido nucleico codificador contenido en el fago. Al aislar una serie de fagos que tienen péptidos superpuestos, se identifica un péptido que comprende una región de Fn14 que comprende restos incluidos en un epítopo.

Como alternativa, o además, los restos de aminoácidos dentro de Fn14 están mutados, por ejemplo, mediante mutagénesis de barrido con alanina, y se determinan las mutaciones que reducen o evitan la unión a proteínas de unión a Fn14. Es probable que cualquier mutación que reduzca o evite la unión de la proteína de unión a Fn14 esté dentro del epítopo unido por la proteína de unión a Fn14.

Un método adicional implica unir Fn14 o una región del mismo a una proteína de unión a Fn14 inmovilizada de la presente divulgación y digerir el complejo resultante con proteasas. El péptido que permanece unido a la proteína de unión a Fn14 inmovilizada se aísla y analiza, por ejemplo, usando espectrometría de masas, para determinar su secuencia.

Un método adicional implica convertir hidrógenos en Fn14 o una región de los mismos en deutrones y unir la proteína resultante a una proteína de unión a Fn14 inmovilizada de la presente divulgación. Los deutrones se convierten de nuevo en hidrógeno, el Fn14 o región del mismo aislada, digerida con enzimas y analizada, por ejemplo, usando espectrometría de masas para identificar aquellas regiones que comprenden deutrones, que se habrían protegido de la conversión en hidrógeno mediante la unión de una proteína de unión a Fn14 descrita en el presente documento.

En los párrafos anteriores, la referencia a Fn14 abarca Fn14 recombinante, incluyendo el dominio extracelular del mismo.

Ensayos de afinidad

Opcionalmente, se determina la constante de disociación (Kd) o la constante de asociación (Ka) o la constante de unión (Kd, es decir, Ka/Kd) de una proteína de unión a Fn14 para Fn14 o un péptido que contiene epítopo de la misma. Estas constantes para una proteína de unión a Fn14 se miden en un ejemplo mediante un ensayo de unión a Fn14 radioetiquetado o etiquetado con fluorescencia. Este ensayo equilibra la proteína de unión a Fn14 con una concentración mínima de Fn14 etiquetado en presencia de una serie de valoración de Fn14 no etiquetado. Después del lavado para eliminar Fn14 sin unir, se determina la cantidad de etiqueta. Según otro ejemplo, las constantes se miden usando ensayos de resonancia de plasmones superficiales, por ejemplo, usando resonancia de plasmones superficiales BIAcore (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) con Fn14 inmovilizado o una región del mismo.

Composiciones farmacéuticas y métodos de tratamiento

Las proteínas de unión a Fn14 de la divulgación (sin. principios activos) son útiles para formulaciones en una composición farmacéutica para administración parenteral, tópica, oral o local, administración de aerosol o administración transdérmica, para tratamiento profiláctico o terapéutico. Las composiciones farmacéuticas se pueden administrar en una variedad de formas de dosificación unitaria en función del método de administración. Por ejemplo, las formas de dosificación unitaria adecuadas para la administración oral incluyen polvos, comprimidos, píldoras, cápsulas y pastillas para chupar.

Las composiciones farmacéuticas de esta divulgación son útiles para administración parenteral, como administración intravenosa o administración subcutánea o administración en una cavidad corporal o lumen de un órgano o articulación. Las composiciones para administración comprenderán comúnmente una solución de la proteína de unión a Fn14 de la divulgación disuelta en un vehículo farmacéuticamente aceptable, tal como un vehículo acuoso. Se puede usar una variedad de transportadores acuosos, por ejemplo, solución salina tamponada y similares. Las composiciones pueden contener vehículos farmacéuticamente aceptables según se requiera para aproximar condiciones fisiológicas tales como agentes de ajuste y tamponamiento del pH, agentes de ajuste de la toxicidad, y similares, por ejemplo, acetato de sodio, cloruro de sodio, cloruro de potasio, cloruro de calcio, lactato de sodio y similares. La concentración de proteínas de unión a Fn14 de la presente divulgación en estas formulaciones puede variar ampliamente, y se seleccionará principalmente en función de los volúmenes de fluido, en las viscosidades, peso corporal y similares de acuerdo con el modo particular de administración seleccionado y las necesidades del paciente. Los vehículos ejemplares incluyen agua, solución salina, solución de Ringer, solución de dextrosa, y albúmina sérica humana al 5 %. Los vehículos no acuosos tales como aceites mezclados y oleato de etilo también se pueden usar. También se pueden usar liposomas como vehículos. Los vehículos pueden contener pequeñas cantidades de aditivos que mejoran la isotonicidad y la estabilidad química, por ejemplo, tampones y conservantes. La proteína de unión a Fn14 de la divulgación puede formularse para administración parenteral, por ejemplo, formuladas para inyección por vía intravenosa, intramuscular, subcutánea, transdérmica u otras de estas rutas, incluyendo administración peristáltica e instilación directa en un tumor o sitio de la enfermedad (administración intracavitaria). Los expertos en la materia conocerán la preparación de una composición acuosa que contiene los compuestos de la presente divulgación como principio activo.

Las composiciones farmacéuticas adecuadas de acuerdo con la divulgación incluirán generalmente una cantidad de la proteína de unión a Fn14 de la presente divulgación mezclada con un vehículo farmacéutico aceptable, tal como una solución acuosa estéril, para proporcionar un intervalo de concentraciones finales, dependiendo del uso previsto. Las técnicas de preparación son generalmente conocidas en la técnica, como se ejemplifica en Pharmaceutical Sciences de Remington, 16a Ed. Mack Publishing Company, 1980.

Tras la formulación, los compuestos de la presente divulgación se administrarán de una manera compatible con la formulación de dosificación y en una cantidad que sea terapéutica/profilácticamente eficaz. Las dosis adecuadas de compuestos de la presente divulgación variarán dependiendo del compuesto específico, la afección a tratar y/o el sujeto a tratar. Está dentro de la capacidad de un médico experto el determinar una dosificación adecuada, por ejemplo, comenzando con una dosificación subóptima y modificando gradualmente la dosificación para determinar una dosificación óptima o útil.

Las dosificaciones y tiempos de administración ejemplares serán evidentes para el experto en la materia basándose en la divulgación en el presente documento.

En algunos ejemplos, una proteína de unión a Fn14 de la divulgación se administra con, antes o después del tratamiento de una afección, por ejemplo, cáncer. Los tratamientos ejemplares incluyen radioterapia, quimioterapia (por ejemplo, caboplatino, siplatino, ciclofosfamida, docetaxal, doxorrubicina, erlotinib, etopósido, fluorouracilo, irinotecán, metotrexato, paclitaxel, topotecán, vincristina o vinblastina) o la administración de otro fármaco para tratar una afección, por ejemplo, un producto biológico como rituximab, trastuzumab, bevacizumab, alemtuzumab, panitumumab, o cetuximab.

En un ejemplo, una proteína de unión a Fn14 de la divulgación se administra con un estimulante del apetito (por ejemplo, un antagonista del receptor de melanocortina-4, un agonista del receptor de grelina, acetato de megestrol o un cannabinoide), un fármaco dirigido a una citoquina inflamatoria (por ejemplo, un antagonista del TNF (por ejemplo, etanercept, adalimumab, golimumab, infliximab), un anticuerpo anti-IL-6 (por ejemplo, CNTO-328, a LD-518), un antagonista de p-adrenorreceptores, un esteroide anabólico, miostatina, un inhibidor de ACE o ácido eicosapentaenoico).

Ensayos Diagnóstico/pronóstico

A partir de la descripción en el presente documento será evidente que la presente divulgación proporciona diversos métodos para diagnosticar/pronosticar afecciones asociadas con la expresión de Fn14.

Ensayos de detección de proteínas

Un ejemplo de la divulgación detecta la presencia de Fn14 o una célula que lo expresa. La cantidad, el nivel o la presencia de una proteína o célula se determina usando cualquiera de una variedad de técnicas conocidas por los expertos en la materia, tales como, por ejemplo, una técnica seleccionada entre el grupo que consiste en citometría de flujo, inmunohistoquímica, inmunofluorescencia, una inmunotransferencia, una transferencia de Western, una aplicación puntual, un ensayo de inmunoabsorción unida a enzimas unido a enzimas (ELISA), radioinmunoensayo (RIA), inmunoensayo enzimático, transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET), tiempo de vuelo de ionización/desorción láser asistido por matriz (MALDI-TOF), ionización por electropulverización (ESI), espectrometría de masas (incluyendo espectrometría de masas en tándem, por ejemplo, LC MS/MS), tecnología de biosensores, tecnología evanescente de fibra óptica o tecnología de chip de proteína.

En un ejemplo, el ensayo usado para determinar la cantidad o el nivel de una proteína es un ensayo semicuantitativo.

En otro ejemplo, el ensayo usado para determinar la cantidad o el nivel de una proteína es un ensayo cuantitativo. Por ejemplo, la proteína se detecta con un inmunoensayo, por ejemplo, usando un ensayo seleccionado entre el grupo que consiste en, inmunohistoquímica, inmunofluorescencia, ensayo de inmunoabsorción unida a enzimas (ELISA), ensayo inmunosorbente unido a fluorescencia (FLISA), transferencia Western, radioinmunoensayo (RIA), un ensayo de biosensor, un ensayo de chip de proteína y un ensayo de inmunotinción (por ejemplo, inmunofluorescencia).

Los formatos convencionales de ELISA o FLISA en fase sólida son particularmente útiles para determinar la concentración de una proteína de una variedad de muestras.

En una forma, un ELISA o FLISA comprende inmovilizar una proteína de unión a Fn14 de la divulgación o una proteína que se une a un epítopo diferente de Fn14 en una matriz sólida, como, por ejemplo, una membrana, un micropocillo de poliestireno o policarbonato, una tira reactiva de poliestireno o policarbonato o un soporte de vidrio. Una muestra se pone en relación física con la proteína inmovilizada, Fn14 se une o 'captura'. El Fn14 unido se detecta luego usando un segundo compuesto etiquetado que se une a un epítopo diferente de Fn14 (por ejemplo, la proteína de unión a Fn14 de la divulgación). Como alternativa, se puede usar un tercer anticuerpo etiquetado que se une al segundo anticuerpo (de detección).

Para la persona experta será evidente que los formatos de ensayo descritos en el presente documento son compatibles con formatos de alto rendimiento, como, por ejemplo automatización de procesos de identificación o un formato de micromatrices. Además, las variaciones del ensayo descrito anteriormente serán evidentes para los expertos en la materia, como, por ejemplo, un ELISA competitivo.

En un ejemplo alternativo, se detecta un polipéptido dentro o sobre una célula, usando métodos conocidos en la técnica, como, por ejemplo, inmunohistoquímica o inmunofluorescencia. Los métodos que usan inmunofluorescencia son ejemplares, ya que son cuantitativos o al menos semicuantitativos. Los métodos para cuantificar el grado de fluorescencia de una célula teñida son conocidos en la técnica y se describen, por ejemplo, en Cuello, 1984.

Los dispositivos biosensores generalmente emplean una superficie de electrodo en combinación con elementos de medición de corriente o impedancia para integrarse en un dispositivo en combinación con el sustrato de ensayo (como el descrito en US5567301). Se incorpora una proteína de unión a Fn14 de la divulgación sobre la superficie de un dispositivo biosensor y se pone en contacto una muestra biológica con dicho dispositivo. Un cambio en la corriente o impedancia detectada por el dispositivo biosensor indica la unión de proteínas a dicha proteína de unión a Fn14. Algunas formas de biosensores conocidos en la técnica también se basan en la resonancia de plasmones superficiales para detectar interacciones de proteínas, por lo que un cambio en la superficie de resonancia de plasmón de la superficie de reflexión es indicativo de una unión de proteínas a un ligando o anticuerpo (US5485277 y US5492840).

Los biosensores son de uso particular en el análisis de alto rendimiento debido a la facilidad de adaptar dichos sistemas a micro- o nano-escalas. Además, dichos sistemas están convenientemente adaptados para incorporar varios reactivos de detección, permitiendo la multiplexación de reactivos de diagnóstico en una sola unidad de biosensor. Esto permite la detección simultánea de varias proteínas o péptidos en una pequeña cantidad de fluidos corporales.

Métodos de formación de imágenes

Como será evidente para el experto en la materia a partir de lo anterior, la presente divulgación también contempla métodos de formación de imágenes que usan una proteína de unión a Fn14 de la divulgación. Para formación de imágenes, una proteína de unión a Fn14 generalmente se conjuga con una etiqueta detectable, que puede ser cualquier molécula o agente que pueda emitir una señal que sea detectable por imagen. Sin embargo, también se puede usar un compuesto etiquetado secundario que se une específicamente a una proteína de unión a Fn14 de la divulgación. Ejemplos de etiquetas detectables incluyen una proteína, un radioisótopo, un fluoróforo, un fluoróforo emisor de luz visible, fluoróforo emisor de luz infrarroja, un metal, una sustancia ferromagnética, una sustancia emisora electromagnética con una firma espectroscópica de resonancia magnética (MR) específica, una sustancia absorbente o reflectora de rayos X, o una sustancia que altera el sonido.

La proteína de unión a Fn14 de la divulgación (y, si se usa el compuesto secundario etiquetado) puede administrarse sistémica o localmente a un órgano, o tejido (o tumor, en el caso de un cáncer) para la formación de su imagen, antes del procedimiento de formación de imagen. Generalmente, la proteína de unión a Fn14 se administra en dosis eficaces para lograr la imagen óptica deseada de un tumor, tejido u órgano. Dichas dosis pueden variar ampliamente, dependiendo de la proteína de unión a Fn14 particular empleada, afección de la que se forma imagen, tejido u órgano sometido al procedimiento de formación de imagen, el equipo de formación de imágenes que se usa, y similares.

En algunos ejemplos de la divulgación, la proteína de unión a Fn14 se usa como agentes de imagen óptica in vivo de tejidos y órganos en diversas aplicaciones biomédicas que incluyen, pero no limitado a, imágenes de tumores, tomografía de órganos, monitorización de funciones orgánicas, angiografia coronaria, endoscopia de fluorescencia, cirugía guiada por láser, métodos fotoacústicos y de sonofluorescencia, y similares.

Ejemplos de métodos de formación de imagen incluyen resonancia magnética (MRI), espectroscopía MR, radiografía, tomografía computarizada (CT), ultrasonidos, imagen plana con cámara gamma, tomografía computarizada por emisión de fotón único (SPECT), tomografía de emisión de positrones (PET), otras imágenes basadas en medicina nuclear, imágenes ópticas usando luz visible, imagen óptica usando luciferasa, imagen óptica usando un fluoróforo, otras imágenes ópticas, imágenes usando luz infrarroja cercana, o imágenes usando luz infrarroja.

En algunos ejemplos, un agente de formación imagen se prueba usando un ensayo in vitro o in vivo antes de usar en humanos, por ejemplo, usando un modelo descrito en el presente documento.

Muestras

En la medida en que se realice el método de la presente divulgación in vitro, en una muestra de tejido aislada, en lugar de como una identificación in vivo, la referencia a "muestra" debe entenderse como una referencia a cualquier muestra de material biológico derivado de un animal como, pero no limitado a, un fluido corporal (por ejemplo, sangre o líquido sinovial o líquido cefalorraquídeo), material celular (por ejemplo, aspirado de tejido), muestras de biopsia de tejido o muestras quirúrgicas.

La muestra que se usa de acuerdo con el método de la presente divulgación puede usarse directamente o puede requerir alguna forma de tratamiento antes de su uso. Por ejemplo, una biopsia o muestra quirúrgica puede requerir h o m o g e n e iz a c ió n u o tra fo rm a d e d is p e rs ió n c e lu la r a n te s d e su u so . A d e m á s , e n la m e d id a e n q u e la m u e s tra b io ló g ic a n o e s té e n fo rm a líq u id a , (s i ta l fo rm a e s re q u e r id a o d e s e a b le ) p u e d e re q u e r ir la a d ic ió n d e un re a c tiv o , c o m o un ta m p ó n , p a ra m o v i liz a r la m u e s tra .

Como será evidente a partir de la descripción anterior, dicho ensayo puede requerir el uso de un control adecuado, por ejemplo, un individuo normal o saludable o una población típica, por ejemplo, para cuantificación.

Como se usa en el presente documento, se entenderá que el término "individuo normal" significa que el sujeto se selecciona basándose en que no tienen números anómalos de células que expresan Fn14 o niveles anómalos de Tweak.

Un "sujeto sano" es aquel que no ha sido diagnosticado con una afección, por ejemplo, una afección mediada por Fn14 y/o no está en riesgo de desarrollar la afección.

Como alternativa, o además, una muestra de control adecuada es un conjunto de datos de control que comprende mediciones del marcador que se analiza para una población típica de sujetos que se sabe que no padecen una afección.

En un ejemplo, una muestra de referencia no se incluye en un ensayo. En cambio, una muestra de referencia adecuada se deriva de un conjunto de datos establecido previamente generado a partir de una población típica. Los datos derivados del procesamiento, análisis y/o ensayo de una muestra de ensayo luego se comparan con los datos obtenidos para la población de la muestra.

Afecciones mediadas por Fn14

La presente divulgación abarca el uso de una proteína o anticuerpo de unión a Fn14 o composición descrita en el presente documento para tratar cualquier afección mediada por Fn14. Las afecciones ejemplares incluyen cáncer, metástasis, vascularización excesiva o angiogénesis, una enfermedad autoinmunitaria, una enfermedad inflamatoria, enfermedades neurodegenerativas, cicatrización queloide, enfermedad de injerto contra hospedador, rechazo a injerto o isquemia.

En un ejemplo, la afección autoinmune es esclerosis múltiple, neuritis, polimiositis, psoriasis, vitíligo, síndrome de Sjogren, artritis (como artritis reumatoide), diabetes tipo 1, pancreatitis autoinmune, enfermedades inflamatorias intestinales, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, enfermedad celíaca, glomerulonefritis, esclerodermia, sarcoidosis, enfermedades tiroideas autoinmunes, tiroiditis de Hashimoto, enfermedad de Grave, miastenia grave, enfermedad de Addison, uveorretinitis autoinmune, pénfigo vulgar, cirrosis biliar primaria, anemia perniciosa o lupus eritematoso sistémico (SLE). En un ejemplo, la afección es artritis reumatoide o SLE.

En un ejemplo, la afección es una enfermedad del tejido conectivo, como artritis reumatoide. En este sentido, Dharmapatni et al., (2011) han demostrado que Tweak/Fn14 desempeñan un papel en la artritis reumatoide.

En un ejemplo, la afección es esclerodermia (incluyendo esclerodermia sistémica).

En otro ejemplo, la afección es rechazo a injerto (por ejemplo, rechazo a aloinjerto) o enfermedad de injerto contra hospedador (incluyendo pérdida de peso asociada con la enfermedad de injerto contra hospedador). En este sentido, se ha demostrado que Tweak/Fn14 desempeñan un papel en la patogénesis de la enfermedad de injerto contra hospedador, por ejemplo, por Zhao et al., (2007).

En otro ejemplo, la afección es vasculopatía del aloinjerto cardiaco.

En un ejemplo, la afección es rechazo del engrosamiento íntimo asociado a injerto.

En otro ejemplo, la afección es infarto intramiocárdico o lesión por repurfusión isquémica. En este sentido, se ha demostrado que Tweak/Fn14 desempeñan un papel en la isquemia por, por ejemplo, Frauenknecht et al., (2010) e Inta et al., (2008).

En otro ejemplo, la afección se asocia con angiogénesis excesiva y/o neovascularización, por ejemplo, cáncer (incluyendo tumores sólidos, leucemias, linfoma, melanoma, glioma, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer gástrico, cáncer de esófago, cáncer de células renales, cáncer de ovario, cáncer cervical, cáncer carcinoide, cáncer de testículo, cáncer de próstata, cáncer de cabeza y cuello y carcinoma hepatocelular), metástasis de cáncer, n e o v a s c u la r iz a c ió n d e l c á n c e r, e n fe rm e d a d a u to in m u n e ( in c lu y e n d o p s o r ia s is ) , n e fro p a tía , re t in o p a tía , p re e c la m p s ia , h e p a tit is , s e p s is y d e g e n e ra c ió n m a c u la r .

En un ejemplo, la afección es cáncer o una metástasis del mismo. El término "cáncer" se refiere o describe la afección fisiológica en mamíferos que se caracteriza típicamente por el crecimiento/proliferación celular no regulada. Ejemplos de cáncer incluyen, pero no se limitan a, un adenocarcinoma, un carcinoma de células escamosas, un cáncer digestivo/gastrointestinal, un cáncer endocrino, un cáncer ocular, un cáncer musculoesquelético, un cáncer de mama, un cáncer neurológico, un cáncer genitourinario, un cáncer de células germinales, un cáncer de cabeza y cuello, un cáncer hematológico/sanguíneo, un cáncer respiratorio, un cáncer de piel, una neoplasia maligna relacionada con el SIDA o un cáncer ginelógico.

Un adenocarcinoma es un cáncer de un epitelio que se origina en el tejido glandular. Los adenocarcinomas ejemplares incluyen formas de cáncer colorrectal, cáncer de pulmón, cáncer cervical, cáncer de próstata, cáncer de uraco, cáncer de vulva, cáncer de mama, cáncer de esófago, cáncer de páncreas y cáncer gástrico.

Los cánceres digestivos/gastrointestinales incluyen cáncer anal; cáncer de las vías biliares; cáncer extrahepático de conductos biliares; cáncer de apéndice; tumores carcinoides, cáncer gastrointestinal; cáncer de colon; cáncer colorrectal, incluyendo cáncer colorrectal infantil; cáncer de esófago, incluyendo cáncer de esófago infantil; cáncer de vesícula biliar; cáncer gástrico (estómago) incluyendo cáncer gástrico (estómago) infantil; cáncer hepatocelular (hígado) incluyendo cáncer hepatocelular (hígado) infantil; cáncer de páncreas, incluyendo cáncer de páncreas infantil; sarcoma, rabdomiosarcoma; cáncer rectal; y cáncer de intestino delgado.

Los cánceres endocrinos incluyen carcinoma de células de los islotes (páncreas endocrino); carcinoma adrenocortical incluyendo carcinoma adrenocortical infantil; tumor carcinoide gastrointestinal; cáncer de paratiroides; feocromocitoma; tumor pituitario; cáncer de tiroides, incluyendo cáncer de tiroides infantil; síndrome de neoplasia endocrina múltiple infantil; y tumor carcinoide infantil.

Los cánceres oculares incluyen melanoma intraocular; y retinoblastoma.

Los cánceres musculoesqueléticos incluyen la familia de tumores de Ewing; osteosarcoma/histiocitoma fibroso maligno del hueso; rabdomiosarcoma incluyendo rabdomiosarcoma infantil; sarcoma de tejido blando, incluyendo sarcoma de tejido blando infantil; sarcoma de células claras de vainas tendinosas; y sarcoma uterino.

Los cánceres neurológicos incluyen glioma del tronco encefálico infantil; tumor cerebral; astrocitoma cerebeloso infantil; astrocitoma cerebral infantil/glioma maligno; ependimoma infantil; meduloblastoma infantil; tumores neuroectodérmicos primitivos pineales y supratentoriales infantiles; vía visual infantil y glioma hipotalámico; otros cánceres cerebrales infantiles; carcinoma adrenocortical; linfoma del sistema nervioso central, primario; astrocitoma cerebeloso infantil; neuroblastoma; craneofaringioma; tumores de la médula espinal; tumor teratoideo/rabdoideo atípico del sistema nervioso central; tumores embrionarios del sistema nervioso central; y tumores neuroectodérmicos primitivos supratentoriales incluyendo tumor infantil y pituitario.

Los cánceres genitourinarios incluyen cáncer de vejiga, incluyendo cáncer de vejiga infantil; cáncer de células renales (riñón); cáncer de ovario, incluyendo cáncer de ovario infantil; cáncer epitelial de ovario; tumor ovárico de bajo potencial maligno; cáncer de pene; cáncer de próstata; cáncer de células renales incluyendo cáncer de células renales infantil; pelvis renal y uréter, cáncer de células transicionales; cáncer testicular; cáncer de uretra; cáncer vaginal; cáncer vulvar; cáncer de cuello uterino; tumor de Wilms y otros tumores renales infantiles; cáncer endometrial; y tumor trofoblástico gestacional;

los cánceres de células germinales incluyen el tumor extracraneal de células germinales infantil; tumor extragonadal de células germinales; tumor de células germinales de ovario; y cáncer testicular.

Los cánceres de cabeza y cuello incluyen cáncer de labio y cavidad oral; cáncer oral infantil; cáncer de hipofaringe; cáncer de laringe, incluyendo cáncer de laringe infantil; cáncer de cuello escamoso metastásico con primario oculto; cáncer de boca; cáncer de cavidad nasal y seno paranasal; cáncer de nasofaringe incluyendo cáncer de nasofaringe infantil; cáncer orofaríngeo; cáncer de paratiroides; cáncer de faringe; cáncer de glándulas salivales incluyendo cáncer de glándulas salivales infantil; cáncer de garganta; y cáncer de tiroides.

Los cánceres hematológicos/de células sanguíneas incluyen leucemia (por ejemplo, leucemia linfoblástica aguda en adultos y niños; leucemia mieloide aguda, por ejemplo, en adultos y niños; leucemiaa linfocítica crónica; leucemia mielógena crónica; y leucemia de células pilosas); un linfoma (por ejemplo, linfoma relacionado con el SIDA; linfoma cutáneo de linfocitos T; linfoma de Hodgkin, incluyendo linfoma de Hodgkin en adultos y niños; linfoma de Hodgkin durante el embarazo; linfoma no Hodgkin, incluyendo linfoma no Hodgkin en adultos y niños; linfoma no Hodgkin durante el embarazo; micosis fungoide; síndrome de Sezary; macroglobulinemia de Waldenstrom; y linfoma primario del sistema nervioso central); y otros cánceres hematológicos (por ejemplo, trastornos mieloproliferativos crónicos); mieloma múltiple/neoplasia de células plasmáticas; síndromes mielodisplásicos; y trastornos mielodisplásicos/mieloproliferativos).

Los cánceres respiratorios incluyen cáncer de pulmón de células no pequeñas; cáncer de pulmón de células pequeñas; mesotelioma maligno, incluyendo mesotelioma maligno en adultos y niños; timoma maligno; timoma infantil; carcinoma tímico; adenomas/carcinoides bronquiales, incluyendo adenomas/carcinoides bronquiales infantiles; blastoma pleuropulmonar.

Los cánceres de piel incluyen sarcoma de Kaposi; carcinoma de células de Merkel; melanoma; carcinoma basocelular y cáncer de piel infantil.

En un ejemplo adicional, la afección es un trastorno de desgaste, tal como caquexia como se describe con más detalle en el presente documento.

En un ejemplo, el trastorno de desgaste está asociado con una afección, como, cáncer, acidosis metabólica, enfermedades infecciosas, diabetes, síndrome de inmunodeficiencia autoinmune (SIDA), trastornos autoinmunitarios, adicción a drogas, cirrosis hepática, trastornos inflamatorios crónicos, anorexia, insuficiencia cardiaca crónica, enfermedad renal crónica, osteoporosis, enfermedad del músculo esquelético, enfermedad de la neuronas motoras, esclerosis múltiple, atrofia muscular y enfermedad neurodegenerativa.

En un ejemplo, El trastorno de desgaste es caquexia o sarcopenia (por ejemplo, desgaste asociado con el envejecimiento).

En un ejemplo, el trastorno de desgaste es caquexia.

En un ejemplo, la caquexia está asociada con una enfermedad autoinmune. En un ejemplo, la caquexia está asociada con artritis reumatoide. En un ejemplo, la caquexia está asociada con la diabetes tipo 1.

En un ejemplo, la caquexia está asociada con la enfermedad cardiaca.

En un ejemplo, la caquexia está asociada con la enfermedad renal crónica.

En un ejemplo, la caquexia está asociada con inflamación pulmonar crónica.

En un ejemplo, la caquexia está asociada con inflamación instestinal.

En un ejemplo, la caquexia está asociada con la enfermedad inflamatoria intestinal.

En un ejemplo, la caquexia está asociada con el envejecimiento.

En un ejemplo, la caquexia está asociada con sepsis.

En un ejemplo, la caquexia está asociada con el SIDA.

En una forma ejemplar de la presente divulgación el trastorno de desgaste es caquexia asociada con el cáncer. anteriormente se han descrito cánceres ejemplares.

En un ejemplo, el método comprende además identificar un sujeto que padece caquexia. Tal sujeto se puede identificar, por ejemplo, basándose en la detección de pérdida de peso involuntaria después del diagnóstico de otra afección (por ejemplo, cáncer). Por ejemplo, el sujeto puede perder al menos el 5 % de su peso corporal después del diagnóstico de otra afección (por ejemplo, cáncer) o dentro de los 30 días anteriores.

Kits

La presente divulgación también proporciona kits terapéuticos/profilácticos/diagnósticos que comprenden compuestos de la presente divulgación para su uso en los métodos de detección/aislamiento/diagnóstico/pronóstico/tratamiento/profiláctico actuales. Tales kits generalmente contendrán, en un medio recipiente adecuado, una proteína de unión a Fn14 de la presente divulgación. Los kits también pueden contener otros compuestos, por ejemplo, para detección/aislamiento/diagnóstico/formación de imagen o terapia combinada. Por ejemplo, dichos kits pueden contener uno o más de una gama de fármacos antiinflamatorios y/o medicamentos quimioterapéuticos o radioterapéuticos; agentes antiangiogénicos; anticuerpos de células antitumorales; y/o vasculatura antitumoral o inmunotoxinas de estroma antitumoral o coaguligandos o vacunas. En un ejemplo, el kit es para detectar Fn14 y además comprende un reactivo para facilitar la detección (una etiqueta detectable y/o un sustrato de una etiqueta detectable). Dichos kits pueden comprender adicionalmente un control positivo.

En otro ejemplo, el kit es para aislar una célula o una población de células. En tales kits, una proteína de unión a Fn14 de la divulgación puede etiquetarse con una etiqueta detectable para facilitar FACS. La proteína de unión a Fn14 también puede etiquetarse con una partícula magnética o paramagnética para facilitar mAc S. La proteína de unión a Fn14 también puede inmovilizarse en un sustrato sólido o semisólido para facilitar el aislamiento.

En un ejemplo adicional, el kit es para el tratamiento o prevención de una afección. En tales kits, la proteína de unión a Fn14 puede proporcionarse en solución o en forma liofilizada, opcionalmente con una solución para resuspensión. La proteína de unión a Fn14 puede conjugarse con un compuesto terapéutico o el kit puede incluir un compuesto terapéutico para su conjugación. Como se ha analizado anteriormente, el kit también puede comprender compuestos terapéuticos o profilácticos adicionales.

Métodos de detección

Como será evidente para la persona experta basándose en la divulgación en el presente documento, la presente divulgación proporciona métodos para identificar un compuesto para el tratamiento de un trastorno de desgaste. Estos métodos pueden comprender etapas adicionales como se discute en los siguientes párrafos.

La presente divulgación también abarca la provisión de información relativa al compuesto identificado o aislado. Por tanto, los métodos de detección se modifican aún más mediante:

(i) opcionalmente, determinar la estructura del compuesto; y

(ii) proporcionar el compuesto o el nombre o estructura del compuesto tal como, por ejemplo, en forma de papel, formulario legible en máquina, o formulario legible en ordenador.

Naturalmente, para compuestos que se conocen, aunque no se hayan probado previamente, para su función usando una identificaciónproporcionada por la presente divulgación, la identificación del nombre y/o estructura del compuesto está implícita. Esto se debe a que el experto en la materia conocerá el nombre y/o la estructura del compuesto al momento de realizar la identificación.

Como se usa en el presente documento, se considerará que el término "proporcionar el compuesto" incluye cualquier medio químico o sintético recombinante para producir el compuesto o, alternativamente, la provisión de un compuesto que ha sido sintetizado previamente por cualquier persona como medio. Esto incluye claramente aislar el compuesto.

En un ejemplo, el compuesto o el nombre o estructura del compuesto se proporciona con una indicación de su uso, por ejemplo, según lo determinado por una identificación descrita en el presente documento.

Los ensayos de detección pueden modificarse aún más mediante:

(i) opcionalmente, determinar la estructura del compuesto;

(ii) opcionalmente, proporcionando el nombre o la estructura del compuesto como, por ejemplo, en forma de papel, formulario legible en máquina, o formulario legible en ordenador; y

(iii) proporcionar el compuesto.

En un ejemplo, el compuesto sintetizado/producido o el nombre o estructura del compuesto se proporciona con una indicación de su uso, por ejemplo, según lo determinado por una identificación descrita en el presente documento. En un ejemplo, el compuesto se proporciona en una biblioteca de compuestos, cada uno de los cuales o un subconjunto de los cuales puede estar separado de otros miembros (es decir, físicamente aislado). En dichos casos, un compuesto está aislado de la biblioteca por su identificación, que luego permite que una persona experta produzca ese compuesto de forma aislada, por ejemplo, en ausencia de otros miembros de la biblioteca.

La presente divulgación incluye los siguientes ejemplos no limitantes.

EJEMPLO 1: Generación y caracterización de anticuerpos monoclonales contra Fn14 humano

Métodos

Producción de células tumorales que expresan Fn14 y clonación sin señalización de Fn14 de constructos para modelo tumoral (Fn14 y Fn14-GPI)

El sistema de infección lentiviral inducible por 4-hidroxitamoxifeno (4-OHT) (Vince et al., 2007) se usó para todos los constructos. El ADNc de tipo silvestre de longitud completa para Fn14 humano (número de acceso en Genbank NM_016639) se clonó en el vector lentiviral pF_UAS_Neo en SamH I y Nhe I. El constructo de control que contiene el ADNc para la región extracelular de Fn14 humana (CGCGGATCCATGGCTCGGGGCTCGCTGCGC Directo (SEQ ID NO: 37) El GCTGGTGGTCATCCAAAGCAGCCGGAAGGGGGCAGG inverso (SEQ ID NO: 38)) fusionado a la región codificante de anclaje TrailR3 GPI de ratón (AF020502) se creó mediante PCR de solapamiento (Cebador directo CGGCTGCTTTGGATGACCACCAGCCCGGGGACTCCT (SEQ ID NO: 39), Cebador inverso CGCGCTAGCTTATCAAACAAACACAATCAGAAG (SEQ ID NO: 40)) para crear Fn14-GPI. Los constructos se confirmaron mediante secuenciación de ADN.

Creación de líneas celulares para modelo de tumor in vivo (Fn14 y Fn14-GPI)

Los fibroblastos embrionarios de ratón inmortalizados SV40 (MEF) de ratones C57BL/6 de tipo silvestre se transformaron con v12Hras humano mediante infección retroviral. Las células transformadas v12Hras se infectaron luego con lentivirus que portaban constructos de ADN para GEV16 expresado constitutivamente y hFn14 inducible por 4-hidroxitamoxifeno, hFn14-GPI inducible o que expresa hFn14 constitutivamente. Las células se seleccionaron con antibióticos apropiados durante un mínimo de 2 semanas antes de que se realizara el examen FACS para confirmar la expresión de proteínas. Para la inducción de la expresión de proteínas, se añadió 4-OHT a medios de crecimiento normales a una concentración de 100 nM durante un mínimo de 24 horas. Las células se recogieron y se realizó una tinción viva usando anticuerpos comerciales contra Fn14 humano (Abcam ab21359) y un anticuerpo anti ratón conjugado con R-ficoeritrina (R-PE; Chemicon 1030-09) o AlexaFluor 647 (Invitrogen N.° A21235). Se registró un mínimo de 10.000 eventos para cada muestra evaluada y los datos se analizaron posteriormente.

Vacunación de ratones

Para las inmunizaciones se usó una proteína recombinante purificada que comprende el dominio extracelular Fn14. Para la generación de anticuerpos anti-Fn14 CRCBT-06-001 y CRCBT-06-002, se inmunizaron ratones Balb/c hembra intraperitonealmente (IP) con 15 |jg de antígeno en PBS emulsionado en una proporción 1:1 en adyuvante completo de Freund (Sigma F 5881) para la inmunización primaria y adyuvante incompleto de Freund (Sigma F 5506) para los refuerzos posteriores. Para la generación de anticuerpos anti-Fn14 los ratones CRCBT-06-005-CRCBT-06-007 se inmunizaron con células HEK293T suspendidas en PBS y los refuerzos posteriores se realizaron con células en PBS, o las células se mezclaron 1:1 en adyuvante completo de Freund (Sigma F 5881) para la inmunización primaria y el adyuvante incompleto de Freund (Sigma F 5506) para los refuerzos posteriores. Para todos los ratones, los refuerzos se realizaron 4 semanalmente con una inyección final administrada en PBS por vía intraperitoneal 3 días antes de retirar los bazos y recoger las células del bazo. Las extracciones de sangre de ensayo se tomaron 5-7 días después del refuerzo y se usaron para detectar la presencia de una respuesta inmune a hFn14. La sangre extraída de los ratones se dejó coagular a 4 °C durante la noche. El coágulo se retiró por centrifugación y el suero se recogió y almacenó a -20 °C.

Producción de anticuerpos monoclonales

Las fusiones de hibridoma se realizaron usando el kit de hibridoma ClonaCell®-HY N.° 03800, Stemcell Technologies, Australia) básicamente de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En resumen, Las células del bazo se aislaron por perfusión del bazo antes de la fusión con mieloma de ratón SP2/O (proporción 1:5). Las etapas de selección y clonación se realizaron en semisólido de base de metilcelulosa en placas de 96 pocillos. Los sobrenadantes de cultivo se seleccionaron por ELISA para la producción de IgG y posteriormente por citometría de flujo para especificidad.

Detección con ELISA de sobrenadantes de hibridoma

Los sobrenadantes fueron seleccionados por ELISA para la producción de IgG. Brevemente, se recubrieron placas de 96 pocillos durante la noche a 4 °C con un anticuerpo policlonal contra IgG de ratón (Jackson Immuno Research, N.° 715-006-150 Australia) en tampón de recubrimiento de carbonato-bicarbonato al 0,05 % seguido de bloqueo con albúmina de suero bovino al 3 % (BSA) diluido en solución salina tamponada con fosfato (PBS) incubada durante 1 hora a temperatura ambiente (TA). Se añadieron el patrón y las muestras (100 jl/pocillo diluido a 1:50 en PBS) durante 60 minutos a temperatura ambiente. El anticuerpo monoclonal unido se detectó con IgG-peroxidasa de cabra anti ratón (Sigma, N.° A25554 Australia; 100 jl/pocillo y se usó a 1/50.000) incubado durante 60 minutos a temperatura ambiente seguido de incubación con sustrato de tetrametilbencidina (TMB) (100 jl/pocillo). El desarrollo del color se detuvo con 2 M de ácido sulfúrico y se leyó la absorbancia a 450 nm.

Detección con citometría de flujo de sobrenadantes de hibridoma

1x105 MEF v12Hras Fn14 /-(descrito anteriormente) inducido con 100 nM 4-OHT se usaron como población de células simples o mixtas (proporción 1:1) antes de la tinción. Las células se incubaron a 4 °C con muestras o controles durante 30 minutos en PBS, BSA al 2 %. Las células se lavaron e incubaron con anticuerpo secundario (IgG de cabra anti-ratón conjugada con AlexaFluor 647 a 1:100, Invitrogen N.° A21235, Australia) durante 30 minutos a 4 °C en la oscuridad. El BD FACSCanto II se usó para realizar citometría de flujo de acuerdo con el protocolo del fabricante y se realizó un análisis de datos. Los experimentos fueron representativos de al menos tres experimentos independientes. Los anticuerpos de control purificados incluyen IgG2b (BioLegend N.° 401212), IgG 1 (BioLegend N.° 401405), ITEM-1 (BioLegend N.° 314006) e ITEM-2 (eBioscience).

Purificación de anticuerpos monoclonales/eliminación de endotoxinas y ensayo de purificación de anticuerpos Se recogió aproximadamente 1 litro de medio acondicionado sin suero por anticuerpo durante 4,5 días de un Matraz Triple 4x de 500 cm2 (NUN132913 Thermofisher, Aus) de hibridomas cultivados en medios sin suero de hibridoma (12045-084, Invitrogen, Aus) suplementado con penicilina-estreptomicina (10.000 U/ml). El medio se filtró a través de un filtro de 0,45 pm antes de la purificación. Los anticuerpos se purificaron por cromatografía de afinidad con una columna de 5 ml de proteína A Sepharose HiTrap MabSelect Xtra (28-4082-60, GE Healthcare, Aus). La columna de proteína A se equilibró con tampón que contenía fosfato sódico 0,02 M, NaCl 250 mM, pH 6,85, y los anticuerpos se eluyeron con glicina 0,1 M/HCl, pH 3,0, seguido de neutralización con Tris 1 M/HCl pH 9,0. El eluato neutralizado se concentró y el tampón se intercambió con PBS usando una columna vivaspin 20 (VS2021, Sartorius, Aus). La endotoxina se eliminó de las muestras usando Detoxi-Gel (20339, Thermo Scientific, Aus) y se midió con kits de E-toxato (ET0100, Sigma, Aus) o usando el sistema de ensayo Protable Endosafe®-PTS (cartucho de intervalo 5-0,05 Eu/ml) y ambos métodos se realizaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los niveles de endotoxina de todas las preparaciones de anticuerpos finales usadas para experimentos in vivo estuvieron por debajo del nivel de detección del ensayo (menos de 0,05 EU/mg de anticuerpo).

Isotipado de anticuerpo

Los anticuerpos se isotiparon usando el kit de isotipado de inmunoglobulina de ratón BD Cytometric Bead Array (CBA) (N.° Catálogo 550026) esencialmente de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Ensayos de actividad in vitro Ensayo de GFP de HEK293T NF kB

Las células HEK293T que contenían un promotor NFkB integrado de forma estable seguido de un marco de lectura abierto GFP se usaron para analizar anticuerpos funcionalmente activos (Vince et al., 2007). Las células se incubaron durante 24 horas en presencia o ausencia de Tweak-Fc recombinante purificado a una concentración de 5-200 ng/ml. Además, el sobrenadante de hibridoma o los controles se añadieron a una dilución final de 1:10-1:100. Se recogieron las células y se midió la fluorescencia de GFP por citometría de flujo (BD FACS Canto II, software Diva). Se registraron un mínimo de 10.000 sucesos por muestra.

Como control de isotipo se usó un anticuerpo IgG2b anti-Citocromo C (BD Pharmingen 556433) en concentraciones equivalentes. El sobrenadante de hibridoma de un hibridoma no secretor de anticuerpos o un productor de IgG irrelevante se usó como control.

Ensayo de muerte de Kyml

Los ensayos de muerte celular de Kyml se realizaron esencialmente como se describe en Vince et al., (2007). Las células se incubaron durante 24 horas en presencia o ausencia de Tweak-Fc y sobrenadante de hibridoma, anticuerpos purificados o controles. Las células totales se cosecharon y analizaron por citometría de flujo en presencia de yoduro de propidio (PI; Sigma P4170) a una concentración de 50 pg/ml. Los datos se representaron como el porcentaje de muerte celular.

Ensayo de secreción de IL-8

Se sembraron células de melanoma humano A375 a 1x104 células por pocillo en una placa de fondo plano de 96 pocillos en medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con suero de ternera fetal al 10 % y penicilina/estreptomicina al 1 %. Se permitió que las células se unieran durante la noche en condiciones de cultivo celular estándar de 37 °C con CO2 al 5 %.

Las células se incubaron con Tweak-Fc (concentración final de 300 ng/ml) o con anticuerpos solos a las siguientes concentraciones: 10, 1, 0,1 y 0,01 pg/ml o con Tweak-Fc y anticuerpo a una concentración final de 300 ng/ml y 10 pg/ml respectivamente.

Después de la adición de reactivos, Las células se incubaron durante 24 horas en condiciones convencionales de cultivo de tejidos. Los sobrenadantes se recogieron y se centrifugaron a 700 g durante 5 minutos a 4 °C. El anticuerpo anti-Tweak (MTW-1), IgG1 de rata, ITEM-1, IgG2a, IgG2b, IgG1 se adquirieron en Biolegend, e ITEM-4 se adquirió en eBioscience.

ELISA de detección de IL-8

Tras 24 horas, los sobrenadantes de cultivo celular se evaluaron para determinar los niveles de IL-8 mediante ELISA (sistemas de R y D) esencialmente de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En resumen, las muestras y los patrones suministrados se incubaron durante 2 horas a temperatura ambiente. Después de varios lavados minuciosos (en el tampón de lavado suministrado) entre incubaciones, el conjugado de IL-8, seguido de una solución d e s u s tra to se a ñ a d ie ro n a to d a s la s m u e s tra s y s e in c u b a ro n a te m p e ra tu ra a m b ie n te d u ra n te 60 y 30 m in u to s , re s p e c t iv a m e n te . La a b s o rb a n c ia s e m id ió a 450 n m y 540 nm . L a le c tu ra a 540 n m s e re s tó d e la le c tu ra d e 450 p a ra te n e r en c u e n ta c u a lq u ie r v a r ia b il id a d d e la p la c a .

Secuenciación de ADN de regiones variables de anticuerpos

El ARNm se aisló de las células de hibridoma usando el kit midi RNeasy (Qiagen, 75144). La RT-PCR se realizó usando el kit RT PCR de una sola etapa (Qiagen, 210212) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En resumen, se usó 1 |jg de ARNm como molde para la síntesis de ADNc y las cadenas ligeras y pesadas variables de ratón se amplificaron con cebadores degenerados como se describe en Wang et al., 2000.

La cadena ligera se amplificó usando 10 pM de cebador directo 5'-GG GAG CTC GAY ATT GTG MTS ACM CAR WCT MCA-3 '(SEQ ID NO: 41) y 5'-GGT GCA TGC GGA TAC AGT TGG TGC AGC ATC-3 '(SEQ ID NO: 42) cebador inverso respectivamente. La cadena pesada se amplificó usando 10 pM de cebador directo (MH1: 5'-CTT CCG GAA TTC SAR GTN MAG CTG SAG SAG TC-3 '(SEQ ID NO: 43) o MH2: 5'-CTT CCG GAA TTC SAR GTN MAG CTG SAG SAG TCW GG -3 '(SEQ ID NO: 44)) y el cebador inverso específico (IgG1: 5'-gga aga tct ATA GAC AGA TGG GGG TGT CGT TTT GGC-3 '(SEQ ID NO: 45)). Los productos de RT-PCR se separaron en geles de agarosa al 1,5 %, las bandas se escindieron y el ADN se purificó usando Gel Wizard® SV y el sistema Clean-Up de PCR (Promega, A9282). Los fragmentos purificados se subclonaron en el vector pCR®2.1-TOPO® usando el kit TOPO TA Cloning® (Invitrogen, K4560-40) y los ligamientos se transformaron en One Shot® TOP10 Electrocomp™ E. coli de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La identificación azul-blanco de X-Gal permitió la selección de colonias blancas que se cultivaron para aislamiento de ADN usando el sistema de purificación de ADN Wizard® Plus SV Minipreps (Promega, A1460). Para cada mAb, varios clones independientes se enviaron para secuenciación usando cebadores M13 universales.

Para confirmar la secuencia de CRCBT-06-002 la cadena ligera se amplificó usando 10 pM de cebador directo MKVP25'-ATG GAG WCA GAC ACA CTC CTG YTA TGG T-3 '(SEQ ID NO: 69) y cebador inverso 5'- TTT TAT CTC CAG CTT GGT GC-3 '(SEQ ID NO: 70; adaptado de Debat et al., 2001). Los productos de RT-PCR se separaron en geles de agarosa al 1,5 %, las bandas se escindieron y el ADN se purificó usando Gel Wizard® SV y el sistema Clean-Up de PCR (Promega, A9282). Los fragmentos purificados se subclonaron en el vector pGEM®T usando pGEM®T Vector System II (Promega, A3610) y los ligamientos se transformaron en células competentes JM109 de E. coli de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La identificación azul-blanco de X-Gal permitió la selección de colonias blancas que se cultivaron para aislamiento de ADN usando el sistema de purificación de ADN Wizard® Plus SV Minipreps (Promega, A1460). Se enviaron varios clones independientes para la secuenciación usando los cebadores universales T7 y SP6.

Validación de secuencias CDR/FR de anticuerpos por análisis de espectrometría de masas

Generación de Fab

Se generaron fragmentos de Fab a partir de CRCBT-06-002 usando el kit de preparación de Fab y F(ab')2 de IgG1 de ratón de Thermo Scientific Pierce (cat N.° 44980) de acuerdo con las instrucciones del fabricante con modificaciones menores. En resumen, se digirieron 4 mg de anticuerpo mediante 750 j l de Ficina inmovilizada en cisteína 25 mM a aproximadamente pH 5,6 durante 5 horas a 37 °C con mezcla constante. Después de la incubación, la resina de Ficina inmovilizada se centrifugó a 5.000 g durante 1 minuto y el sobrenadante se mantuvo en hielo. La resina de Ficina inmovilizada se lavó con 0,5 ml de PBS tres veces. Las fracciones de lavado se añadieron al anticuerpo digerido y se dializaron contra 20 ml de PBS usando un concentrador vivaspin20 de 30 KD de corte (Sartorius, cat N.° VS15T21) con una copa de diafiltración (Sartorius, cat N.° VSA005) y se concentraron a 0,5 ml. Los fragmentos de IgG y Fc no digeridos se eliminaron de los fragmentos Fab usando perlas de proteína G Sepharose de acuerdo con las instrucciones del fabricante (GE Healthcare, 17-0618-01).

Fab de CRCBT-06-001, CRCBT-06-003, CRCBT-06-004, CRCBT-06-005, CRCBT-06-006 y CRCBT-06-007 se generaron usando el Kit de preparación Fab Thermo Scientific Pierce (cat N.° 44985) de acuerdo con las instrucciones del fabricante con modificaciones menores. En resumen, se digirieron 5 mg de anticuerpo mediante 250 jl de papaína inmovilizada en cisteína 20 mM a aproximadamente pH 7 durante 3 horas a 37 °C con mezcla constante. Después de la incubación, la papaína inmovilizada se centrifugó a 5.000 g durante 1 minuto y el sobrenadante se mantuvo en hielo. La papaína inmovilizada se lavó con 0,5 ml de PBS tres veces. Las fracciones de lavado se añadieron al anticuerpo digerido. Los fragmentos de IgG y Fc no digeridos se eliminaron de los fragmentos Fab usando perlas de proteína G Sepharose de acuerdo con las instrucciones del fabricante (GE Healthcare, 17 0618-01).

Preparación de muestras para análisis de secuencia espectrométrica de masas

Los fragmentos de Fab generados a partir de anticuerpos monoclonales se disolvieron en Tris 50 mM pH 8,0 y se redujeron con DTT 10 mM durante la noche a temperatura ambiente, seguido de alquilación con IAA 50 mM a ^tA en la oscuridad durante 30 minutos. Cada muestra de Fab se digirió con 0,5 jg de tripsina de calidad para secuencia (Promega) o Quimotripsina (Promega) a 40 °C durante 2 horas. Adicionalmente, cada Fab se digirió primero y luego se redujo y se alquiló. La mezcla de péptidos se separó por RP-HPLC (Dionex, Ultímate 3000) antes del análisis directo por ESI-microTOF-Q-MS/MS o por aplicación puntual en una placa objeto de MALDI-MS para análisis posterior MALDI-tof/tof-MS (ambos instrumentos: Bruker Daltonics, Alemania).

Los espectros obtenidos por cualquiera de los instrumentos fueron anotados por DataAnalysis y los datos se transfirieron al programa Biotools (ambos programas: Bruker Daltonics, Alemania). El motor de búsqueda Mascot (Matrixscience, Reino Unido) se usó para buscar todos los datos en la base de datos SwissProt y se pudo confirmar la parte constante y la isoforma de los anticuerpos. Las secuencias de las regiones CDR se derivaron de la secuencia de ADN y esas secuencias se combinaron con los datos de espectrometría de masas usando una instalación disponible con el programa Biotools. La precisión de masa aplicada fue una ventana de masa de 50 ppm para los espectros de MS y se usó tolerancia de 0,8 Da en los espectros de MS/MS.

Determinación de la afinidad de anticuerpos para Fn14 usando Fn14-Fc

La interacción de los anticuerpos monoclonales IgG anti-Fn14 de ratón CRCBT-06-001 y CRCBT-06-002 con Fn14-Fc recombinante se midió usando el Bio-Rad ProteOn XPR36 básicamente como lo describe Nahshol et al., (2008). En resumen, se activó un chip sensor GLM ProteOn haciendo fluir una mezcla de 0,2 M EDC y 0,05 M sulfo-NHS sobre el chip (150 pl a 30 pl/min durante 5 minutos). La molécula completa de IgG de conejo anti-ratón (Sigma M-7023) se acopló luego al chip en orientación vertical haciendo fluir 150 pl de una solución de 50 pg/ml en tampón de acetato 10 mM (pH 4,5) a 30 pl/min. Los sitios de acoplamiento restantes se desactivaron haciendo fluir 150 pl de etanolamina-HCl 1 M (pH 8,5) a 30 pl/min. Los anticuerpos monoclonales IgG anti-Fn14 de ratón se unieron luego al anticuerpo IgG anti-ratón acoplado haciendo fluir 150 pl de IgG 100 pg/ml a 25 pl/min sobre un solo canal del chip sensor en la dirección horizontal. El Fn14-Fc recombinante diluido en PBS Tween 20 (0,005 %) se pasó luego sobre el chip sensor GLM (150 pl, 40 pl/min, tiempo de contacto 90 segundos y tiempo de disociación de 800 segundos) en dirección vertical en 5 canales a las siguientes concentraciones: 50 nM, 25 nM, 12,5 nM, 6,25 nM y 3,125 nM. PBS Tween 20 (0,005 %) solo se pasó sobre el canal restante. Los sensogramas de unión se recogieron y analizaron con el software ProteOn Manager 2.1 XPR36 usando los modelos cinéticos de analito Langmuir o bivalente para ajustar los datos y determinar la constante de afinidad Kd.

Determinación de la afinidad de anticuerpos para Fn14 usando Fn14

El análisis cinético de los anticuerpos monoclonales se realizó en un sistema ProteOn XPR36 Laboratorios (BioRad) básicamente de acuerdo con el protocolo de Nahshol et al., (2008). Los anticuerpos monoclonales contra hFn14 (50 pg/ml) se acoplaron covalentemente a un chip GMC. Los analitos fueron una dilución en serie de hFn14 etiquetado con histidina purificada y expresada en bacterias. Los sensogramas de unión se recogieron, procesaron y analizaron usando el software integrado ProteOn Manager (BioRad Laboratories). Las curvas de unión se ajustaron usando el modelo Langmuir que describe la estequiometría de unión 1:1.

Caracterización de la naturaleza del epítopo unido por CRCBT-06-001 Reducción y alquilación de Fn14

Para determinar si el epítopo de CRCBT-06-001 es conformacional, Fn14-Fc se redujo con Ditiotreitol (DTT) 10 mM en presencia de Guanidina-HCl 6 M pH 8,0 durante 45 minutos a 45 °C y se alquiló con yodoacetamida (IAA) 50 mM en Tris-HCl 1 M pH 8,0 durante 1 hora. La proteína se dializó ampliamente en PBS para eliminar el exceso de DTT e IAA. Se realizó un ELISA recubriendo los pocillos de una placa de microtitulación con el Fn14 nativo y R+An Fn14, se permitió que el anticuerpo anti-Fn14 se uniera, seguido de la detección con un conjugado de peroxidasa de rábano picante de caballo anti -ratón (HRP). Se usó el sustrato TMB (Sigma) y se detectó la absorbancia a 450 nm usando un lector de placa de microtitulación. Para garantizar la integridad del Fn14-Fc reducido y alquilado, la porción Fc de la proteína de fusión se detectó usando un anti-Fc-HRP.

Determinación de las regiones de unión mínima de Fn14 a las que se une el mAb

Se usó un enfoque de visualización de fagos para construir una biblioteca de fragmentos de genes por digestión del gen Fn14 humano y expresando los fragmentos en la superficie del bacteriófago. Esta es una técnica convencional que se ha usado con frecuencia para el mapeo de epítopos de epítopos conformacionales y lineales.

Preparación y selección de biblioteca de fragmentos de gen Fn14 humano

Una variación del método descrito en Coley et al. 2001 se usó para preparar una biblioteca de fragmentos de gen Fn14 humano expresados en el bacteriófago M13.

El vector fagémido pHENH6 (Hoogenboom et al., 1991) contiene una copia del gen III del bacteriófago M13, que codifica la proteína pIII en la superficie de las partículas de fago y un sitio de clonación múltiple entre la secuencia de direccionamiento periplásmico y la secuencia funcional del gen III. Este vector se usó para la expresión de fragmentos de hFn14 como una fusión con la proteína pIII. En resumen, se usaron cebadores oligonucleotídicos que flanquean la región codificante para Fn14 para amplificar el marco de lectura abierto completo mediante PCR usando ADN de hFn14 como molde. El producto de PCR se digirió con DNasa I y los fragmentos se purificaron y los extremos se hicieron romos usando ^aDⁿpolimerasa Vent. El vector fagémido pHENH6 se digirió usando PstI y posteriormente se hizo romo usando ADN polimerasa Vent. Los fragmentos de genes Fn14 romos generados por digestión aleatoria se ligaron luego en el vector pHENH6 preparado. Los productos ligados se transformaron purificados en células TG-1 competentes de E. coli por electroporación. El análisis de la biblioteca resultante indicó que la cobertura de la secuencia hFn14 era aleatoria.

Se realizaron cuatro rondas de selección recubriendo 10 pocillos de una placa de microtitulación (NUNC maxisorp) con 2 |jg/ml de CRCBT-06-001, los pocillos se bloquearon con leche desnatada en polvo al 5 % en PBS y se permitió que la biblioteca se uniera al anticuerpo. Después de 1 hora, la placa se lavó para eliminar el fago no unido, y el fago adherente se eluyó con glicina 0,1 M pH 2,2 y se neutralizó. Los fagos eluidos se reinfectaron en células TG1 de E. coli, se rescataron, se amplificaron y precipitaron con PEG para la siguiente ronda de selección como se describe en Coley et al. 2001. Los clones de la ronda 4 se secuenciaron con ADN para establecer la identidad de los fragmentos Fn14 que se unían al anticuerpo CRCBT-06-001.

Preparación de fragmentos de genes expresados en fagos

La estructura de solución de Fn14 ha sido descrita recientemente por He et al., 2009, además Brown et al., 2006 identificó restos críticos para la interacción del ligando Tweak. El dominio extracelular de Fn14 contiene 6 restos de cisteína y el apareamiento de disulfuro se describió en He et al. (2009). e produjeron fragmentos de Fn14 como se muestra en la Figura 13, se expresaron en fago y se usaron para caracterizar el epítopo unido por CRCBT-06-001. Clonación de constructos hFn14 para visualización en fago M13

Se diseñaron cebadores de oligonucleótidos, modificados con sitios de restricción XhoI y NotI, se sintetizaron (Geneworks) y se usaron para amplificar el dominio extracelular de longitud completa y los subdominios 1, 2 y 3 de la secuencia codificante de Fn14 de Homo sapiens por PCR, cuyos productos se modificaron posteriormente en A y se ligaron en el vector pGEMT (Promega). Se preparó el plásmido de un solo dominio extracelular de hFn14/clon SD1/2/3 -pGEMT y los insertos se digirieron del esqueleto del vector usando enzimas de restricción XhoI y NotI. Los insertos restringidos se purificaron y se ligaron en el vector fagémido pHEN-H6 (Hoogenboom et al., 1991). Para mutantes hFn14, la mutagénesis se logró usando el kit de mutagénesis dirigida al sitio de Phusion (Finnzymes) y el plásmido de dominio extracelular hFn14-pHEN-H6 como molde.

Mapeo de epítopos usando Fn14 expresado en fago-Método 1 Expresión y Purificación de Fago

Las reservas en glicerol de TG-1 E. coli transformadas con los constructos de fagémido se usaron para inocular 10 ml de medio YT que contenía ampicilina. Los cultivos iniciadores se hicieron crecer hasta la fase logarítmica antes de que se añadieran los fagos auxiliares M13K07 para infectar las células. Los cultivos infectados con fagos auxiliares se transfirieron luego a 200 ml de medio SB que contenía ampicilina y kanamicina. Los cultivos se cultivaron durante la noche a 30 °C. E. coli se recogieron posteriormente por centrifugación y se descartaron. Se añadió solución de PEG/NaCl al sobrenadante de cultivo, precipitando el fago, que posteriormente se cosechó por centrifugación, se resuspendió en solución salina tamponada con fosfato y se almacenó a -80 °C.

Ensayos de inmunoabsorción unidos a enzimas para determinar la unión del fago a anticuerpos

Los pocillos de las inmunoplacas Maxisorp (Nunc) se revistieron durante la noche a 4 °C con los anticuerpos monoclonales diana o Tweak-Fc recombinante a una concentración de 2 jg/ml en PBS. El MAb 5G8 se usó como control negativo para placas de ELISA recubiertas con anticuerpos probados. Se usó Fc recombinante solo como control negativo para placas de ELISA recubiertas con Tweak-Fc recombinante. Los pocillos de las placas de ELISA recubiertas se bloquearon posteriormente durante 2 horas con solución de leche desnatada al 10 % en PBS. Se prepararon diluciones en serie de fagos 10 veces usando solución de leche desnatada/PBS al 5 % en placas de microtitulación de 2 ml y se añadieron diluciones de fagos al recubrimiento, las placas de ELISA se bloquearon durante 1 hora, con agitación vigorosa a temperatura ambiente. Posteriormente se eliminaron los fagos de los pocillos y las placas de ELISA se lavaron 4 veces con PBS/Tween 20 al 0,05 %. Luego se añadió IgG policlonal anti-M13-fago conjugado con HRP diluido en PBS a los pocillos de las placas de ELISA durante 1 hora, con agitación vigorosa a temperatura ambiente. La solución de anticuerpo se retiró de los pocillos y las placas de ELISA se lavaron 5 veces con PBS/Tween 20 al 0,05 %. Los ELISA se desarrollaron usando sustrato t Mb y la reacción se detuvo usando una solución de H2SO42 M. La densidad óptica a 450 nm se cuantificó usando un espectrofotómetro de absorbancia Spectramax.

Mapeo de epítopos usando Fn14 expresado en fago - Método 2 Expresión y Purificación de Fago

Las colonias individuales de TG-1 E. coli transformadas con los constructos fagémidos se usaron para inocular 10 ml de medio 2YT que contenía ampicilina (100 jg/ml). Los cultivos iniciadores se cultivaron hasta la fase logarítmica antes de que se añadiera el fago auxiliar M13K07 para rescatar E. coli infectada con fago. Los cultivos infectados con fagos auxiliares se amplificaron en 200 ml de medio 2YT que contenía ampicilina y kanamicina (50 jg/ml). Los c u lt iv o s s e c u lt iv a ro n d u ra n te la n o c h e a 30 °C e n u n a in c u b a d o ra c o n a g ita c ió n . E l c u lt iv o s e c e n tr ifu g ó y e l fa g o ( fra c c ió n s o b re n a d a n te ) s e re c o g ió m e d ia n te p re c ip ita c ió n co n P E G /N a C l. L o s fa g o s s e s e d im e n ta ro n p o r c e n tr ifu g a c ió n y se re s u s p e n d ie ro n e n P B S y se a lm a c e n a ro n a -80 °C .

Ensayos de inmunoabsorción unidos a enzimas para medir la reactividad de mAbs con mutantes Fn14

Los pocillos de las inmunoplacas Maxisorp (Nunc) se revistieron durante la noche a 4 °C con los anticuerpos monoclonales diana o Tweak-Fc recombinante a una concentración de 1,5 pg/ml en PBS. El mAb 5G8 se usó como control negativo para placas de ELISA recubiertas con anticuerpos probados. Los pocillos de las placas de ELISA recubiertas se bloquearon posteriormente durante 2 horas con solución de leche descremada al 5 % en PBS. Se hicieron diluciones en serie de fagos 10 veces usando solución de PBS y se añadieron diluciones de fagos al recubrimiento, las placas de ELISA se bloquearon durante 1 hora, agitando a temperatura ambiente. Posteriormente el fago se eliminó de los pocillos y las placas de ELISA se lavaron tres veces con PBS/Tween 20 al 0,05 %.

Detección de fagos

Para detectar la unión de mutantes fagos se usaron dos métodos.

Método A: el anticuerpo anti-M13-fago conjugado con HRP (GE Healthcare) a una dilución 1/5000 en PBS se añadió luego a los pocillos de las placas de ELISA durante 1 hora, agitando a temperatura ambiente. La solución de anticuerpo se retiró de los pocillos y las placas de ELISA se lavaron cuatro veces con PBS/Tween 20 al 0,05 %. Método B: el anticuerpo anti-M13-fago conjugado con biotina (GE Healthcare) diluido en PBS se añadió luego a los pocillos de las placas de ELISA durante 1 hora de agitación a temperatura ambiente. La solución de anticuerpos se retiró de los pocillos y las placas de ELISA se lavaron tres veces con PBS/Tween 20 al 0,05 %. Luego se añadió estreptavidina conjugada con HRP diluida en PBS a los pocillos de las placas de ELISA durante 1 hora, agitando a temperatura ambiente. La solución se retiró de los pocillos y las placas de ELISA se lavaron tres veces con PBS/Tween 20 al 0,05 %. Los ELISA se desarrollaron usando sustrato TMB y la reacción se detuvo usando una solución de H2SO42 M. La densidad óptica a 450 nm se cuantificó usando un espectrofotómetro de absorbancia Spectramax.

Mapeo de epítopos de anticuerpo usando péptidos sintéticos

Los péptidos que representan subdominios 1p, 2 y 3 de hFn14 (Figura 20, Paneles B y C y Figura 14, Panel A) y para mutantes de pares de disulfuro (Cys3 y 6AS y Cys4 y 5AS; Figura 20 Paneles D y E) se sintetizaron en GLBiochem Ltd. (Shanghai, China) y los restos de cisteína para enlaces disulfuro fueron elegidos como se describe en la estructura de la solución por He et al., (2009). Se añadió un resto de lisina adicional al extremo C para unir un resto de biotina y permitir que los péptidos se unan a placas recubiertas de neutravidina (prebloqueadas; Pierce). Para estos experimentos, se usó un péptido de control con una biotina en el terminal C como control negativo y también se usaron anticuerpos de control de isotipo.

El ELISA se realizó esencialmente de acuerdo con sl protocolo recomendado por el fabricante (Pierce). En resumen, el péptido se revistió sobre los pocillos (por duplicado) a 1-10 pg/ml durante 2 horas a temperatura ambiente. Los pocillos se lavaron en PBS/Tween 20 al 0,05 %/BSA al 0,1 % 3 veces y se añadieron diluciones de cada anticuerpo en tampón de lavado durante 1 hora con agitación suave. Después de otros tres lavados, la HRP anti-ratón se conjugó con peroxidasa de rábano picante (HRP; Chemicon) se añadió a dilución 1/1000 durante 1 hora de agitación. Finalmente, después de 4 lavados adicionales, la placa se desarrolló usando sustrato TMB (3,3',5,5'-tetrametilbencidina) (Pierce), y la reacción se detuvo usando solución de H2SO42 M. La densidad óptica a 450 nM se cuantificó usando un espectrofotómetro de absorbancia Spectromax.

Mapeo de epítopos de anticuerpo usando proteína recombinante

Clonación de constructos hFn14 y mFn14 para expresión bacteriana

Los cebadores de oligonucleótido, diseñados con sitios de restricción Nde I y Bam HI, se diseñaron, sintetizaron (Geneworks) y usaron para amplificar el dominio extracelular de longitud completa del Fn14 de H. sapiens(hFn14), el dominio extracelular Fn14 de ratón (mFn14) y mutantes de hFn14 (R56P, R56A, R56K, R58K) por PCR. Los productos posteriores se ligaron en el vector pGEM-4Z (Promega) escindido con Sma I. Se prepararon plásmidos de un solo clon y los insertos se digirieron del vector. Los insertos restringidos se purificaron luego y se insertaron en pET-15b (Novagen) para expresión en E. coli.

Expresión y purificación de (Hisk-proteínas

Los vectores derivados de pET-15b se transformaron en Shuffle T7 Express E. coli (New England BioLabs). La expresión fue inducida por IPTG 1 mM a 30 °C durante cuatro horas. El lisado bacteriano se cargó en un 1 ml de Ni2+-ácido nitrilotriacético (Ni2+-NTA)-columna de agarosa (Qiagen) equilibrada con tampón de lisis (Tris-HCl 20 mM [pH 7,8], NaCl 300 mM, glicerol al 20 % [v/v], imidazol 18 mM, ^pM^sF 1 mM, inhibidores completos de proteasa de B o e h r in g e r) . L a c o lu m n a se la v ó p r im e ro c o n 20 m l d e ta m p ó n d e lis is y la s p ro te ín a s re c o m b in a n te s s e e lu y e ro n co n im id a z o l 300 m M . L a s p ro te ín a s re c o m b in a n te s s e d ia liz a ro n y s e c o n c e n tra ro n a 1 m g /m l e n H E P E S -K O H 25 m M (p H 7 ,4 ), N a C l 100 m M c o n un d is p o s it iv o d e f i lt ro c e n tr í fu g o C e n tr ic o n Y M -10 (M ill ip o re ) .

Cromatografía analítica de filtración en gel

(His)6- proteínas se purificaron adicionalmente por filtración en gel. Las muestras de proteínas (1 ml) se cargaron en una columna HiLoad 16/60 Superdex 75 pg (g E Healthcare) equilibrada con HEPES-KOH 25 mM (pH 7,4), NaCl 100 mM a temperatura ambiente y se cromatografió a una velocidad de flujo de 1,5 ml/min en un sistema AKTAxpress (GE Healthcare). Los perfiles de elución se detectaron a 280 nm y se recogieron 1,5 ml de fracción.

Detección por ELISA de anticuerpos monoclonales con (His)6-proteínas purificadas

Los pocillos de las inmunoplacas Maxisorp (Nunc) se revistieron durante la noche a 4 °C con diluciones en serie 2 veces de proteínas etiquetadas con histidina purificada (0,5 pg/ml a 4 ng/ml). Los sitios de unión a proteínas inespecíficos se bloquearon con leche al 1 % en solución salina tamponada con fosfato (PBS) durante 1 hora a 37 °C. Las placas se lavaron con PBST (PBS [fosfato sódico 10 mM y NaCl 150 mM], Tween 20 al 0,05 %). Se añadieron anticuerpos monoclonales diluidos a 1 pg/ml en PBST (PBS 0,005 % Tween 20, pH 7,4) 0,1 % de leche y se incubaron a 37 °C durante 2 horas en las placas recubiertas. Después de lavar con PBST, Se añadió una dilución 1:15.000 de IgG anti-ratón de cabra AffiniPure conjugada con peroxidasa (H+L) (Sigma) que contenía leche al 0,1 % durante 1 hora a 37 °C. Los ELISA se desarrollaron usando sustrato TMB y la reacción se detuvo usando una solución de H2SO42 M. La densidad óptica a 450 nm se cuantificó usando un espectrofotómetro de absorbancia Spectramax.

Resultados

Generación de Respuesta Inmune Específica de aFn14 en Ratones Usando Proteína Recombinante

Los ratones se inmunizaron usando una proteína recombinante que comprende el dominio extracelular Fn14 en presencia o ausencia de adyuvante y después de los refuerzos posteriores se hizo una pequeña sangría y se aislaron los sueros. Las muestras de suero se seleccionaron para detectar la presencia de anticuerpos IgG específicos para hFn14 mediante citometría de flujo en fibroblastos embrionarios de ratón inducibles por hFn14 vivos (MEF); Figura 1). Varios ratones mostraron una buena respuesta inmune a hFn14 como lo indica un aumento en la fluorescencia en las células inducidas similar a la del control positivo en comparación con la tinción de las células no inducidas (panel B).

Para confirmar este resultado, los sueros también se seleccionaron en la línea celular de glioma humano D645 que expresan naturalmente Fn14 cuando se cultivan en presencia de suero (Figura 2). Los mismos ratones que dieron positivo en células MEF inducidas por 4-OHT también mostraron tinción positiva en células D645, con el cambio general en la fluorescencia comparable al del control positivo (panel A.iii. comparado con el panel B) con una mínima tinción de fondo cuando las células se tiñeron con suero de ratones inmunizados con un antígeno no relacionado (panel A, vi. y vii).

Identificación de ratones que producen anticuerpos antagonistas anti-Fn14

El suero de ratones inmunizados se analizó para determinar la presencia de anticuerpos funcionalmente activos usando dos ensayos, el ensayo de indicador basado en células para la actividad de NFkB y la muerte celular de Kyml.

Los resultados del ensayo de indicador basado en células para la actividad de NFkB mostraron que Tweak-Fc exógeno indujo una fuerte activación de NFkB y que la activación de NFkB podría ser bloqueada por TweakR soluble o sueros de ratones que fueron positivos para la presencia de anticuerpos anti-hFn14. Por el contrario, los sueros de ratones inmunizados con un antígeno no relacionado o que no dieron positivo para anticuerpos anti-hFn14 no bloquearon la activación de NFkB.

Como el suero de algunos ratones era capaz de bloquear la activación de NFkB, luego se investigó la capacidad de estos anticuerpos para bloquear la muerte celular inducida por Tweak. Los resultados de este ensayo mostraron que el cultivo de células Kyml en presencia de Tweak-Fc condujo a una reducción dramática en la supervivencia celular, y que este efecto podría bloquearse con TweakR soluble o suero de los ratones inmunizados con hFn14 que redujeron la activación de NFkB inducida por Tweak, confirmando la presencia de anticuerpos antagonistas antihFn14.

Producción de anticuerpos monoclonales

Los bazos de ratones que muestran la presencia de anticuerpos específicos de Fn14 humanos y la capacidad de bloquear Tweak se usaron para la producción de anticuerpos monoclonales. Se realizaron fusiones de hibridoma y los clones posteriores se seleccionaron inicialmente mediante ELISA para la secreción de IgG. Los sobrenadantes de esos clones que producen IgG se evaluaron adicionalmente mediante tinción de células vivas (+/- hFn14; Figura 3). Se generó un gran número de clones que se unían específicamente a las células positivas para hFn14 pero no a las que carecen de hFn14. El panel B es representativo de varios clones seleccionados sin unión, unión moderada o alta a Fn14 mostrada. El panel C muestra cuatro anticuerpos denominados CRCBT-06-001, CRCBT-06-002, CRCBT-06-003 y CRCBT-06-004, que muestran claramente un alto nivel de unión a hFn14 expresado en la superficie celular.

Ensayo de NFkB para evaluar anticuerpos monoclonales para la actividad funcional

Los sobrenadantes de los anticuerpos CRCBT-06-001 y CRCBT-06-002 fueron evaluados para la actividad funcional en el ensayo NFkB descrito anteriormente. La fluorescencia de GFP sustancialmente aumentada es evidente en presencia de Tweak-Fc soluble pero no en presencia de sobrenadantes de una línea celular secretora de IgG o que secretan una IgG de control no relacionada (Figura 4, panel A). En presencia de CRCBT-06-001 y CRCBT-06-002 que contienen sobrenadantes, es evidente una fuerte inhibición de la activación de NFkB, mientras que en presencia de otros sobrenadantes no se puede ver ningún efecto visible en la activación (panel B).

Dada la especificidad y las capacidades de bloqueo de CRCBT-06-001 y CRCBT-06-002 estos hibridomas que producen los anticuerpos fueron elegidos para una caracterización adicional. Cada línea celular de hibridoma se clonó al menos una vez y se eligieron las líneas celulares posteriores. Todos los subclones elegidos mostraron las mismas características de unión y funcionales de las líneas celulares parentales.

Se realizó el isotipado de los anticuerpos monoclonales. Se descubrió que los anticuerpos CRCBT-06-001 y CRCBT-06-002 eran IgG2bK e IgG1, respectivamente. CRCBT-06-003 y CRC^bT-06-004 fueron encontrados como IgG2bK. El anticuerpo monoclonal CRCBT-06-001 fue purificado y evaluado por espectrometría de masas para asegurar un alto nivel de pureza. CRCBT-06-001 purificado se analizó luego para determinar el nivel de bloqueo detectable en el ensayo NFkB (Figura 4, panel C). A 50 ng/ml y superior, CRCBT-06-001 puede bloquear la acción de 5 o 50 ng/ml de Tweak-Fc en la activación de NFkB. El bloqueo completo de Tweak por CRCBT-06-001 se puede ver a una concentración de 1 pg/ml. Se observa con nivel menor de activación de Fn14 con concentraciones más altas de CRCBT-06-001, sin embargo esto no fue visto coherentemente. Sin embargo un control de isotipo de IgG2b purificado no mostró ningún efecto sobre la acción de Tweak cuando se añadió a 1 pg/ml (panel A, serie inferior). Células HEK293T transfectadas transitoriamente para la inmunización de ratones

Para generar anticuerpos hFn14 adicionales, se usó una estrategia de inmunización basada en células. Se optimizó la transfección transitoria de HEK293T con un constructo de sobreexpresión de hFn14. Los ratones se inmunizaron con células HEK293T transfectadas transitoriamente en presencia o ausencia de adyuvante. Después de 2 inmunizaciones de refuerzo posteriores, se hizo una pequeña sangría para detección. El suero de estos ratones se usó para teñir las células ^mE^f (+/hFn14) para la presencia de una respuesta inmune específica a hFn14 (Figura 5). En este experimento, las poblaciones de células positivas y negativas para Fn14 se mezclaron en una proporción de 1:1 antes de la tinción y el análisis por citometría de flujo. Un resultado negativo posterior estaría indicado por la presencia de un pico de fluorescencia que se superpone al de un control negativo, o un cambio en el pico completo. La aparición de un pico doble indicaría un resultado positivo (ver control positivo en el panel A.iii.). De forma interesante, solo aquellos ratones inmunizados con células vivas suspendidas en PBS fueron positivos para anticuerpos que reconocen la superficie celular expresada hFn14, mientras que los inmunizados con antígeno en adyuvante no muestran respuesta detectable (panel B). Los bazos de 2 de estos ratones anti-hFn14 positivos se usaron para la fusión de hibridoma para generar anticuerpos monoclonales. Esta fusión produjo 15 clones que reconocen la superficie celular expresada hFn14. Los anticuerpos de tres de estos clones se purificaron y se denominaron c Rc BT-06-005, CRCBT-06-006 e CRCBT-06-007. Se evaluó el isotipo de estos anticuerpos monoclonales y se encontró que CRCBT-06-005 y CRCBT-06-007 eran IgG2bK y CRCBT-06-006 era IgG2a.

Caracterización de anticuerpos monoclonales para Fn14 humano

Bloqueo de NFkB inducido por Tweak

Los anticuerpos CRCBT-06-001, CRCBT-06-002, CRCBT-06-003, CRCBT-06-004, CRCBT-06-005, CRCBT-06-006 y CRCBT-06-007 se purificaron y evaluaron la actividad funcional in vitro. Todos los anticuerpos purificados exhibieron actividad de bloqueo de NFkB inducida por Tweak como se esperaba. CRCBT-06-001 y CRCBT-06-002 pudieron bloquear completamente la activación a 100 ng/ml (Figura 6A). CRCBT-06-003 y CRC^bT-06-004 también demostraron una buena capacidad de bloqueo. CRCBT-06-005, CRCBT-06-006 y CRCBT-06-007 bloquearon eficazmente la activación de NFkB por 200 ng/ml de Tweak-Fc cuando se añade a una concentración de 1 pg/ml (Figura 7A). A la concentración más baja de anticuerpos de 100 ng/ml, también se observó bloqueo.

Los anticuerpos ITEM-1 e ITEM-2 también se evaluaron por su capacidad para activar NFkB o para bloquear NFkB inducido por Tweak en el ensayo del indicador (Figuras 7A y B). ITEM-1 no pudo activar NFkB, es decir, las células cultivadas en presencia de ITEM-1 no muestran diferencias en la activación de NFkB en comparación con las células solas. ITEM-1 tampoco tuvo efecto sobre la activación de NFkB por Tweak-Fc. En contraste con CRCBT-06-001, CRCBT-06-002, CRCBT-06-003, CRCBT-06-004, CRCBT-06-005, CRCBT-06-006, CRCBT-06-007 e ITEM-1, ITEM-2 indujo la activación constante de NFkB.

Actividad funcional de CRCBT-06-001 y CRCBT-06-002 en el ensayo de muerte celular de Kyml

CRCBT-06-001, CRCBT-06-002, CRCBT-06-003 y CRCBT-06-004 fueron evaluados por la capacidad de bloquear la muerte celular inducida por Tweak de las células Kyml in vitro. Las células solo muestran un pequeño grado de muerte celular y este porcentaje aumenta cuando las células se cultivaron en presencia de niveles crecientes de Tweak-Fc (Figura 8). Cuando las células se cocultivaron en presencia de TweakR-Fc, se bloqueó la muerte celular inducida por Tweak. De manera similar, cuando las células cultivadas en presencia de Tweak se cocultivaron en presencia de CRCBT-06-001 o CRCBT-06-002 (1 pg/ml) las células permanecen viables, lo que indica un bloqueo eficaz de la muerte celular inducida por Tweak-Fc. A una concentración más baja (100 ng/ml) de anticuerpo, la muerte celular inducida por Tweak se bloqueó a concentraciones más bajas de Tweak-Fc. CRCBT-06-003 y CRCBTG-06-004 también muestran un buen bloqueo de la muerte de células de Kyml inducida por Tweak, pero no al mismo nivel que para CRCBT-06-001 y CRCBT-06-002.

Ensayos de secreción de IL-8

Se evaluó la actividad funcional de los anticuerpos contra CRCBT en un ensayo de secreción de IL-8 in vitro. Las propiedades de los anticuerpos CRCBT se evaluaron en células A375 determinando si los anticuerpos CRCBT podrían desencadenar la secreción de IL-8 (agonista) o inhibir la secreción de IL-8 inducida por Tweak-Fc (antagonista).

Las células A375 se cultivaron en presencia o ausencia de anticuerpos en un intervalo de concentraciones (0, 0,01, 0,1, 1, 10 pg/ml; Figura 9). Las células solas no mostraron niveles de fondo detectables de IL-8. Se evaluaron una serie de controles de isotipo y no se mostró secreción de IL-8. Se observó una alta secreción de IL-8 en presencia de CRCBT-06-001 y CRCBT-06-006. Esta secreción de IL-8 fue específica a medida que los niveles aumentan de manera dependiente de la concentración de anticuerpos. Se observa una secreción débil de IL-8 en presencia de CRCBT-06-002, CRCBT-06-004, CRCBT-06-005, CRCBT-06-007, ITEM-1 e ITEM-4 (Figura 9).

Los anticuerpos (10 pg/ml) también se evaluaron en presencia de Tweak-Fc 300 ng/ml para determinar las propiedades antagonistas (Figura 10). Se observó una alta actividad antagonista para CRCBT-06-002, CRCBT-06-005, CRCBT-06-007, ITEM-4 comparable a un anticuerpo bloqueador anti-Tweak. Se observa una actividad antagonista débil para CRCBT-06-004 comparable a un anticuerpo de bloqueo anti-Tweak (Figura 10).

Se empleó una ecuación para estimar el nivel de actividad agonista de la siguiente manera: (a-c)/(b-c). Se usó un cálculo similar para estimar el grado de actividad antagonista: (b-d)/(b-a). Donde a = la cantidad de IL-8 secretada en presencia de 10 pg/ml de anticuerpo, b = la cantidad de IL-8 secretada en presencia de 300 ng/ml de Tweak-Fc, c = la cantidad de IL-8 secretada por las células en ausencia de anticuerpos o Tweak-Fc, d = la cantidad de IL-8 secretada en presencia de 10 pg/ml de anticuerpo y 300 ng/ml de Tweak-Fc. La Tabla 1 resume estos cálculos para todos los anticuerpos probados con excepción de la actividad antagonista para aquellos anticuerpos con fuertes propiedades agonistas, ya que el cálculo no es válido en esos casos.

Tabla 1 -Porcentae calculado de actividad a onista/anta onista en el ensa o de secreción de IL-8

Por lo tanto, estos datos junto con los de los ensayos para determinar la señalización de NFkB y/o la muerte celular kym1 indican que los anticuerpos tienen actividad agonista en algunos ensayos funcionales y actividad antagonista en otros ensayos.

Medición de afinidad de anticuerpos usando Fnl4-Fc

Se usó un Bio-Rad ProteOn XPR36 para determinar la afinidad de los anticuerpos monoclonales de ratón anti-Fn14 CRCBT-06-001 y CRCBT-06-002 a Fn14-Fc recombinante. Está claro que ambos anticuerpos probados muestran una alta tasa de activación y una baja tasa de desactivación. El software ProteOn se usó para ajustar una curva al sensograma basándose en un modelo matemático, permitiendo calcular la cinética de la interacción (ka, Kd y K^d) ^. Se pueden usar varios modelos para ajustar las curvas al sensograma, esencialmente se usaron los modelos usados para cada sensograma ya que proporcionaron el mejor ajuste, como es evidente por el bajo valor Chi2 obtenido para los restos. Los resultados se muestran en las Tablas 2 y 3.

- - -

T l : in i ni n R BT- - 2 r Fn14-F r m in n .

Medición de afinidad de anticuerpos usando Fn14

La cinética de unión de anticuerpos CRCBT-06-001 anti-Fn14, CRCBT-06-002, CRCBT-06-004, ITEM-1 e ITEM-4 se evaluaron como se describe en el presente documento y los resultados se exponen en la Tabla 4.

De la selección de anticuerpos anti-Fn14 probados en condiciones experimentales idénticas como agentes de captura, CRCBT-06-004, ITEM-1 e ITEM-4 mostraron una disociación mucho más rápida en comparación con CRCBT-06-001 y CRCBT-06-002 (Tabla 4).

T - e.

Secuenciación de ADN de cadenas pesadas y ligeras de anticuerpos antagonistas

Las cadenas ligera y pesada se secuenciaron para todos los anticuerpos que antagonizaban la señalización de NFkB (Figura 11). Los subgrupos de anticuerpos comparten un alto grado de homología dentro de sus cadenas pesadas y ligeras con una serie de diferencias presentes.

Los anticuerpos anti-hFn14 se unen a un epítopo conformacional

Para determinar si el epítopo unido por CRCBT-06-001 es conformacional, la proteína purificada Fn14-Fc se redujo y alquiló (R+A) para abolir la estructura del enlace disulfuro. Los resultados de ELISA usando CRCBT-06-001 demuestran claramente que cuando el antígeno está en el estado plegado nativo, el anticuerpo se une de una manera dependiente de la dosis. Sin embargo tras la reducción y alquilación, esta unión fue abolida (Figura 12Ai) demostrando una dependencia conformacional para la unión a c Rc b T-06-001. Fc antihumano reconoció la porción Fc de Fn14 indicando que se conserva la integridad de Fn14 R+A (Figura 12Aii). El análisis de transferencia Western también confirmó este hallazgo (Figura 12B).

ELISA también se usó para determinar si los epítopos unidos por CRCBT-06-002, CRCBT-06-003, CRCBT-06-004, CRCBT-06-005, CRCBT-06-006 y CRCBT-06-007 es(son) conformacionalmente dependientes. Los anticuerpos se probaron a 1 pg/ml, y, como se muestra en la Figura 12C todos los anticuerpos se unen a una conformación dependiente de disulfuro de hFn14.

Generación de una biblioteca de fagos que expresa fragmentos aleatorios de Fn14

La región codificante para Fn14 se amplificó y se digirió con DNasa I. Las condiciones que produjeron fragmentos entre 50 y 400 pb se usaron para producir una mezcla de fragmentos del gen Fn14. Los fragmentos se clonaron en el vector fagémido pHENH6 para crear una biblioteca de fragmentos de genes con un tamaño de ~6x106 clones independientes. Se evaluaron varios clones seleccionados al azar y se demostró la amplia distribución de tamaños de la biblioteca.

Desplazamiento de la biblioteca de fragmentos de genes Fn14 con CRCBT-06-001

Se realizaron cuatro rondas de selección para seleccionar fragmentos de genes de Fn14 que se unían a CRCBT-06-001. Se realizó un ELISA y se observaron señales muy altas que demuestran el enriquecimiento en la unión de los fragmentos de genes mostrados en el fago a CRCBT-06-001 en las rondas 1-4.

Se seleccionaron clones individuales de la ronda 4 de selección, se realizó una PCR y se secuenciaron los fragmentos de ADN resultantes. La identidad de secuencia de los fragmentos del gen Fn14 seleccionados en la ronda 4 se muestra en la Figura 13, panel A. Los fragmentos se volvieron a evaluar mediante ELISA para determinar la capacidad de unión del anticuerpo anti-hFn14 (Figura 13, panel B). Aquellos fragmentos que se unían comprendían una porción de la región extracelular de Fn14 que contiene los 6 restos de cisteína que forman los 3 enlaces disulfuro conocidos (RW114-RW131). Los fragmentos que contienen esta región, pero también una parte del dominio transmembrana no parecían mostrar una unión específica en este experimento. Sin quedan llegado a la teoría o el modo de acción, estos datos pueden sugerir que la presencia de parte del dominio transmembrana altera la estructura o el plegamiento de estos fragmentos (RW95 y RW98). El fragmento Fn14 más corto identificado en los experimentos de selección de la biblioteca de fagos unidos por CRCBT-06-001 se indica en negrita (RW129).

Construcción de mutantes de dominio extracelular hFn14 y subdominios que se expresarán en fagos

Para caracterizar aún más los epítopos de los anticuerpos monoclonales anti-Fn14, se diseñó un panel de constructos hFn14 para ser exhibido en fagos. Estos incluyen: el Dominio extracelular Fn14 de H. Sapiens (hFn14); cuatro mutantes de dominio extracelular de hFn14 (D45A, K48A, M50A y D62E) conocidos por tener una afinidad disminuida por el ligando natural Tweak (Brown et al, 2006); y dos subdominios (1 y 2) delineados por enlaces disulfuro resueltos en la estructura de solución de RMN del dominio extracelular hFn14 (He et al., 2009). El subdominio 2 se trunca en el extremo C-terminal, debido a la selección de la biblioteca de fragmentos de genes hFn14 en CRCBT-06-001 enriquecido para un fragmento que carece de los 7 restos C-terminales del dominio extracelular, lo que sugiere que estos no fueron críticos para la unión de anticuerpos. Los constructos clonados y expresados en fagos se muestran en la Figura 12A. Los mutantes ilustrados en el contexto del modelo de homología de estructura hFn14 derivado por Brown et al., (2006) se muestran en la Figura 14B.

Los constructos de dominio extracelular hFn14 se expresan con éxito en la superficie del fago

Para evaluar adecuadamente las cantidades relativas de cada constructo hFn14 expresado en fago, se diseñó una etiqueta de epítopo c-myc entre la proteína de recubrimiento menor pIII del fago y el constructo hFn14 mostrado. La fuerte reactividad del anticuerpo monoclonal anti-c-myc 9E10 (MAb 9E10) con el dominio extracelular hFn14 de tipo silvestre y los mutantes indicaron que estos constructos se expresaron bien en el fago. Cuando se prueba simultáneamente en el mismo ELISA, no se observó una unión significativa de los constructos de fagos al control negativo MAb 5G8, mostrando que las preparaciones de fagos se unían específicamente al MAb 9E10.

Los mutantes de dominio extracelular humano exhibidos en fagos muestran una unión disminuida a Tweak-Fc recombinante

La concentración de cada preparación de fago se ajustó para lograr una reactividad aproximadamente igual con MAb 9E10. Esto se realizó para normalizar la cantidad de hFn14 mostrada en cada preparación de fagos para la comparación. Cuando se evaluó por ELISA, se demostró que cada preparación de fagos tenía una reactividad aproximadamente igual con MAb 9E10, indicando que las preparaciones se habían normalizado con éxito (Figura 15, Panel A). No se observó reactividad significativa al MAb 5G8 en el mismo ELISA, indicando que la unión era específicamente al MAb 9E10 (Figura 15, Panel B). Para evaluar la reactividad relativa de cada constructo hFn14 con Tweak-Fc recombinante, las preparaciones de fagos normalizadas se probaron para la unión al ligando mediante ELISA simultáneamente (Figura 15, Panel C). A diferencia del MAb 9E10, Tweak-Fc fue más reactivo con el dominio extracelular hFn14 de tipo silvestre y menos reactivo con los cuatro mutantes (Figura 15, Panel C). No se observó una unión significativa del subdominio 2 a Tweak-Fc, lo que sugiere que las regiones del dominio extracelular ausentes en este constructo contienen restos críticos para la unión de Tweak. No se observó una unión significativa de c-myc exhibido en fago solo a Tweak-Fc o hFn14 exhibido en fago a Fc recombinante solo, sugiriendo que los constructos de hFn14 se unían específicamente a Tweak en estos ensayos (Figura 15, Panel D). El panel de fagos muestra los constructos de dominio extracelular hFn14 se unen a MAbs anti-Fn14

La reactividad relativa de cada constructo de hFn14 mostrada en fago para anticuerpos monoclonales anti-Fn14 CRCBT-06-001, CRCBT-06-002 CRCBT-06-003 y CRCBT-06-004 también se evaluaron mediante ELISA realizados en paralelo (Figura 16A). En contraste con el patrón de reactividad observado con Tweak-Fc recombinante, todos los constructos mutantes hFn14, se unieron bien a los MAbs anti-Fn14 CRCBT-06-001, CRCBT-06-002, CRCBT-06-003 y CRCBT-06-004. Como se muestra en ensayos anteriores, no se observó una unión significativa de los constructos mostradas en fagos a MAb 5G8, indicando que los constructos de fagos se unían específicamente a los MAb anti-Fn14 (Figura 16B). Además, no se observó unión significativa de la etiqueta c-myc mostrada en fago sola a ninguno de los MAb anti-Fn14, sugiriendo que los anticuerpos se unían específicamente a Fn14 exhibido (Figura 17). La unión de ITEM-1 a los 4 mutantes fue comparable a la unión al dominio extracelular Fn14 de tipo silvestre (Figura 17).

Los anticuerpos monoclonales anti-Fn14 se unen al Subdominio 2, pero no al subdominio 1 del dominio extracelular hFn14

Para caracterizar aún más los epítopos unidos por anticuerpos monoclonales anti-Fn14, CRCBT-06-001, CRCBT-06-002, CRCBT-06-003, CRCBT-06-004, CRCBT-06-005, CRCBT-06-006, CRCBT-06-007, ITEM-1 e ITEM-2 se probaron para la unión al dominio extracelular, subdominio 1 y subdominio 2 de hFn14 exhibido en fago por ELISA (Figura 18a , Figura 19, Panel A). Los fagos se normalizaron de acuerdo con sus niveles de reactividad con MAb 9E10 evaluado en paralelo. De acuerdo con los datos anteriores de ELISA, CRC-BT-06-001 y CRCBT-06-002 reaccionaron bien tanto con el dominio extracelular de longitud completa como con el subdominio 2. Además, CRC-BT-06-003 a CRCBT-06-007, ITEM-1 e ITEM-2 se unieron bien a estos constructos de hFn14 mostrados en fagos. Ninguno de los MAb anti-Fn14 vinculados al subdominio 1 se mostró en fago, a pesar de que este constructo se unía bien al MAb 9E10 cuando se ensayó en paralelo. Como cabía esperar, ninguno de los constructos de fagos se unió al anticuerpo de control negativo MAb 5G8 (Figura 18B, Figura 19B).

Unión de anticuerpos a subdominios Fn14

Como se ha descrito anteriormente, se ha mostrado que los restos incluidos en el epítopo(s) de mAbs anti-hFn14 CRCBT-06-001, CRCBT-06-002, CRCBT-06-003, CRCBT-06-004, CRCBT-06-005, CRCBT-06-006 y CRCBT-06-007 se unen al subdominio 2 y no al subdominio 1 de hFn14 mediante la visualización de fagos. Los péptidos sintéticos correspondientes al subdominio 1p (una forma más larga del subdominio 1 expresada en el fago) y 2 y una región más pequeña de hFn14 (denominada subdominio 3) se produjeron para confirmar estos hallazgos (Figura 20).

CRCBT-06-001, CRCBT-06-002, CRCBT-06-003, CRCBT-06-004, CRCBT-06-005, CRCBT-06-006, CRCBT-06-007 e ITEM-1 no se unieron al subdominio 1p (Figura 21A) pero fueron reactivos con un péptido sintético que representa el subdominio 2 de Fn14 en comparación con un anticuerpo de control de isotipo (Figura 21A). El orden de reactividad de más fuerte a más débil fue CRCBT-06-002, CRCBT-06-001, CRCBT-06-005, CRCBT-06-007, ITEM-1 y CRCBT-06-006. La reactividad de CRCBT-06-001 y CRCBT-06-002 fue similar y a 5 ng/ml (Figura 21B). Este punto estaba en la parte lineal de cada curva y se usó para medir el porcentaje de disminución en la unión de los otros mAbs al subdominio 2. Hubo una disminución del 40 % en la unión de CRCBT-06-005, una disminución del 48 % en la unión de CRCBT-06-007, una disminución del 68 % en la unión de ITEM-1 y una disminución del 76 % en la unión de CRCBT-06-006 en comparación a CRCBT-06-001 y CRCBT-06-002 unidos al subdominio 2. Esto sugiere que la afinidad de CRCBT-06-001 y CRCBT-06-002 es mayor para este dominio, o que el epítopo podría variar ligeramente para CRCBT-06-005 a CRCBT-06-007 e ITEM-1.

La reactividad de CRCBT-06-001, CRCBT-06-002, CRCBT-06-003, CRCBT-06-004, CRCBT-06-005, CRCBT-06-006 y CRCBT-06-007 con subdominio 3 fue menor que para el subdominio 2, indicando que esta región puede ser un epítopo parcial para estos anticuerpos. Sin embargo, las diferencias en la unión a esta región podrían revelar variaciones sutiles en las regiones de contacto de los anticuerpos con hFn14. El orden de unión de más fuerte a más débil fue CRCBT-06-005, CRCBT-06-002, CRCBT-06-001, CRCBT-06-006, CRCBT-06-007 y ITEM-1. La unión relativa de cada anticuerpo al subdominio 3 en un único punto en la región lineal de las curvas se midió a 0,2 pg/ml (Figura 21C). Hubo una disminución del 43 % en la unión de CRCBT-06-002 en comparación con CRCBT-06-005 para la unión al subdominio 3, disminución del 60 % para CRCBT-06-001, disminución del 73 % para CRCBT-06-006 y CRCBT -06-007 y una disminución del 76 % en la unión del ITEM-1 al subdominio 3 en comparación con el mAb CRCBT-06-005. Esto podría indicar que el epítopo de ITEM-1 puede diferir ligeramente de los anticuerpos CRCBT en función de una interacción más débil con los restos expuestos a la superficie en el subdominio 3.

Los mutantes homólogos de Fn14 se unen a mAbs anti-Fn14

Se generó una serie de mutantes que representan mutaciones de aminoácidos individuales que cambian el residuo Fn14 humano al equivalente de ratón y/o rata. Estos fueron diseñados para la expresión en fagos. Los mutantes incluían T33N (SEQ ID NO: 49), A34S (SEQ ID NO: 50), R38S (SEQ ID NO: 51), R56P (SEQ ID NO: 52) y L77M (SEQ ID NO: 53). El ELISA evaluó la reactividad relativa de cada constructo Fn14 exhibido en fagos a los anticuerpos CRCBT-06-002 e ITEM-1. Todos los constructos de hFn14 se unieron bien a CRCBT-06-002. El mutante R56P aunque ligeramente reducido en CRCBT-06-002 no mostró unión al ITEM-1. Además, no se observó unión significativa de c-myc exhibido en fago solo a ninguno de los mAbs anti-Fn14, sugiriendo que los anticuerpos se unían específicamente al fago exhibido Fn14 (Figura 22).

C o m o s e m u e s tra e n e n s a y o s a n te r io re s , n o se o b s e rv ó u n a u n ió n s ig n if ic a t iv a d e lo s c o n s tru c to s m o s tra d a s en fa g o s a un m A b d e c o n tro l 5 G 8 (F ig u ra 22 ), lo q u e in d ic a q u e lo s c o n s tru c to s d e fa g o s s e u n ie ro n e s p e c íf ic a m e n te a C R C B T -06 -002 o IT E M -1 (F ig u ra 22 ).

Comparación de la unión de anticuerpos a Fn14 humano y de ratón y Fn14 humano mutante

Las regiones extracelulares de Fn14 humano y de ratón de tipo silvestre se clonaron como constructos de fusión etiquetados con His para expresión en bacterias. Las proteínas se expresaron y purificaron para producir proteína soluble plegada. La evaluación de la capacidad de cada anticuerpo para unirse al dominio extracelular Fn14 humano y de ratón se evaluó mediante ELISA (Figuras 23A, B y C). Se mostró que todos los anticuerpos en este formato de ensayo se unen bien al dominio extracelular Fn14 humano de tipo silvestre. La capacidad de los anticuerpos para unirse al ratón Fn14 reveló diferencias en la especificidad del anticuerpo. Los anticuerpos CRCBT-06-001, CRCBT-06-002, CRCBT-06-005, ITEM-2 e ITEM-4 se unieron bien al ratón Fn14 mientras que CRCBT-06-003 e ITEM-1 mostraron una unión reducida.

Dado que el mutante R56P no mostró unión a ITEM-1 cuando se expresó en el fago (Figura 22), este mutante se evaluó adicionalmente para la unión al conjunto de anticuerpos CRCBT junto con los anticuerpos comerciales ITEM-1, ITEM-2 y ITEM-4. Se generaron varios mutantes R56 para evaluar la importancia de este resto. Sus proteínas de fusión etiquetadas se generaron para la región extracelular de mutantes humanos Fn14 R56P, R56A (SEQ ID NO: 54) y R56k (SEQ ID NO: 55). Estos se expresaron en bacterias y se purificaron para producir proteína soluble plegada. La evaluación de la capacidad de cada anticuerpo para unirse a esta serie de restos R56 mutantes se evaluó mediante ELISA (los resultados se muestran en la Figura 24).

La unión del anticuerpo al mutante R56P se observó para todos los anticuerpos, aunque se redujo ligeramente para CRCBT-06-003 e ITEM-1 (Figuras 24A y B). Para garantizar la introducción de un resto de prolina no solo se estaba alterando el estado de plegamiento de la proteína, se evaluó un mutante similar donde el R56 se transformó en una alanina (R56A). La unión del anticuerpo a este mutante refleja la obtenida para el mutante R56P (Figuras 24C y D). Para evaluar mejor si la naturaleza cargada del resto de arginina de tipo silvestre era la razón por la que CRCBT-06-003 y el ITEM-1 muestran una reducción en la unión, se generó un mutante R56K. La unión de CRCB-06-003 e ITEM-1 se restableció principalmente, lo que sugiere que la carga es importante para la interacción antígenoanticuerpo en este resto (Figuras 24E y F).

En combinación, los datos generados para los mutantes R56 muestran que, aunque existe una unión reducida para CRCBT-06-003 en este mutante, todos los anticuerpos CRCBT se unen bien a mutantes de R56 y, por lo tanto, se puede concluir que no es un resto crítico en la interacción anticuerpo-antígeno.

También se generó una proteína recombinante para la mutación R58A (SEQ ID NO: 56) y se evaluó la unión de todos los anticuerpos. La proteína de fusión etiquetada con His se expresó en bacterias y se purificó para producir proteína soluble plegada. De forma interesante, este mutante segrega los anticuerpos en dos grupos, capaces de unión o sin unión (Figura 25). La unión de CRCBT-06-001, CRCBT-06-002, CRCBT-06-005 e iTe M-2 no se vio afectada por la presencia de esta mutación, mientras que la unión a CRCBT-06-003, ITEM-1 e ITEM-4 se suprime. Se realizó un análisis adicional del mutante R58A usando una versión del mutante expresado en fagos. La unión de los anticuerpos CRCBT-06-001 y CRCBT-06-002 no se ve afectada nuevamente. La unión de ITEM-1 e ITEM-4 se elimina como anteriormente y ^cR^cBT-06-004 adicionalmente no puede unirse (Figura 26).

Escaneo de alanina del subdominio 2

Para determinar restos específicos dentro del epítopo de Fn14 que son críticos para la unión de cada anticuerpo, se realizó una exploración de alanina en la mayoría de los restos del subdominio 2 (con la adición de algunos restos fuera de esta región). El conjunto de mutantes de alanina se generó como mutantes expresados en fagos de la región extracelular humana Fn14.

Los mutantes evaluados incluyeron W42A (SEQ ID NO: 57), L46A (SEQ ID NO: 58), D51A (SEQ ID NO: 59), S54A (SEQ ID NO: 60), A57G (SEQ ID NO: 61), R58A (SEQ ID NO: 56), P59A (SEQ ID NO: 62), H60A (SEQ ID NO: 63), S61A (SEQ ID NO: 64), D62A (SEQ ID NO: 65), F63A (SEQ ID NO: 66) y L65A (SEQ ID NO: 67). Cuando estaba presente un resto de alanina en el Fn14 (como en el caso de A57) se usó un resto de glicina para generar la mutación. La unión de CRCBT-06-001, CRCBT-06-002 y CRCBT-06-004 junto con ITEM-1, ITEM-4 y, en algunos casos, ITEM-2 se evaluó para la unión a cada uno de los mutantes (Figuras 27 y 28). Como cabía esperar, en todos los casos el anticuerpo de control 5G8 no mostró ninguna unión a las proteínas expresadas en fagos. Todos los anticuerpos anti-Fn14 evaluados se unieron bien al Fn14 humano de tipo silvestre (Figura 27A). La unión de anticuerpos no se realizó para ninguno de los anticuerpos en los mutantes W42A (Figura 27B), S54A (Figura 27C), A57G (Figura 27D), P59A (Figura 27E), S61A (Figura 27F), F63A (Figura 27G) y l65A (Figura 27H) sugierendo que estos no son restos importantes para la unión de antígeno-anticuerpo.

Todos los anticuerpos se unieron a los mutantes L46A (Figura 28A), D51A (Figura 28B) y D62A (Figura 28C), sin embargo, la unión de ITEM-4 se reduce parcialmente en cada caso.

Todos los anticuerpos pudieron unirse al mutante H60A; sin embargo, se observó una unión ligeramente reducida para CRCBT-06-004, ITEM-1 e ITEM-4 (Figura 29A). Este efecto no se observó para CRCBT-06-004 e ITEM-1 cuando la mutación se reemplazó con una lisina, sin embargo para ITEM-4 se abolió la unión (H60K; SEQ ID NO: 68; Figura 29B). La unión de ITEM-2 al mutante H60K varía de las del documento WO2009/140177 y puede justificar una investigación adicional.

Análisis de dependencia de unión de anticuerpos en enlaces disulfuro individuales

La región extracelular Fn14 contiene tres enlaces disulfuro (restos de cisteína denominados 1-6) de los cuales dos residen dentro del subdominio 2 (restos de cisteína 3-6; Figura 20 panel C). Como todos los anticuerpos CRCBT se unen bien al subdominio 2 en el contexto de un ensayo de unión a péptidos, la necesidad de los enlaces disulfuro se evaluó un par a la vez. Los restos de cisteína 3 y 6 se mutaron a restos de serina (Figura 20, Panel E) en un péptido y se evaluó la unión de anticuerpos anti-Fn14. Este enlace disulfuro demostró ser dispensable con todos los anticuerpos contra Fn14 probados mostrando unión (Figura 30A). Los restos de cisteína (4 y 5) que crean el segundo enlace disulfuro se mutaron a serina en un péptido del subdominio 2 (Figura 20, Panel F). Hubo una clara diferencia en la reactividad a este péptido con anticuerpos CRCBT-06-001, CRCBT-06-002 e ITEM-4 que muestran una buena unión, mientras que la unión a CRCBT-06-004, CRCBT-06-005 y el ITEM-1 se interrumpe (Figura 30B). EJEMPLO 2: Tratamiento de un trastorno de desgaste mediado por cáncer con anticuerpos anti-Fnl4 Muchos métodos usados en el presente Ejemplo se han descrito previamente en el Ejemplo 1. Algunos métodos nuevos se describen en el siguiente texto, junto con resultados de experimentos.

Detección de expresión de hFn14 en líneas celulares usadas para formación de tumores

Para evaluar el nivel de expresión de hFn14 en líneas celulares usadas para estudios de formación de tumores in vivo, las líneas celulares tumorales inducidas y no inducidas se tiñeron usando un anticuerpo específico anti-hFn14 y se evaluaron mediante citometría de flujo. Las células que contienen hFn14 inducible muestran un alto nivel de expresión inducible (Figura 31, panel A. 4-OHT). Aunque en el estado no inducido estas células no deben contener expresión de proteína diana, un pequeño nivel de hFn14 es claramente evidente (indicado por una flecha). La ausencia de esta tinción de bajo nivel en las otras líneas celulares evaluadas que no contienen hFn14 confirma la especificidad del anticuerpo, confirmando así la expresión en células no inducidas (Figura 31, paneles B y C).

Secreción de IL-6 por líneas celulares tumorales in vitro

Las líneas celulares tumorales MEF que contienen hFn14 o hFn14-GPI (inducidas o no inducidas para la expresión de proteínas) se cultivaron durante 48 horas en condiciones de crecimiento normales, Se recogieron los medios de las células y se evaluaron los niveles de IL-6 (Figura 32). Los niveles de IL-6 secretada aumentaron significativamente en las células que contienen hFn14 después de la inducción con 4-OHT (Figura 32).

Establecimiento del modelo de tumor hFn14 en ratones

Un modelo tumoral in vivo se creó en ratones C57BL/6 de tipo silvestre comprendiendo hFn14 inducible por 4-OHT. Para crear líneas celulares tumorales, las células MEF inmortalizadas con SV40 se transformaron con v12Hras humano y luego se infectaron de manera estable con un constructo inducible de hFn14 descrita en la Sección de Materiales y Métodos del Ejemplo 1.

Los ratones se inocularon por vía subcutánea con células (+/- hFn14 inducible). Los tumores comenzaron a formarse y fueron medibles el día 4 (Figura 33A, panel A). La tasa de crecimiento de estos tumores fue similar entre hFn14 y los controles, sin embargo, los tumores hFn14 se hicieron más grandes en momentos posteriores. Simultáneamente, desde el día 8, los ratones con tumores hFn14 sufrieron una rápida pérdida de peso y su salud general se deterioró (Figura 33 B), y los ratones desarrollaron caquexia. Todos los ratones de este grupo fueron sacrificados el día 10 debido a la presencia de estos síntomas. De forma interesante, los tumores en estos ratones todavía estaban en el estado no inducido, lo que indica que la expresión inducible en este sistema no estaba estrictamente regulada. En el análisis post mortem, Se observó un aumento de la vasculatura en los tumores hFn14 en comparación con los tumores de control no hFn14.

Creación de tumores de control de hFn14 sin señalización

Como los tumores de control usados en experimentos previos con este sistema simplemente carecían de expresión de la proteína diana, se creó un constructo de control más adecuada para su uso como control. Se creó una hFn14 'sin señalización' mediante la cual la región extracelular de hFn14 se fusionó con la región codificante del anclaje de glicosilfosfatidilinositol C-terminal (GPI) de TrailR3 para crear hFn14-GPI (Figura 34A). Cuando se expresa en células, esta proteína aparecería desde el exterior de la célula igual que el hFn14 tipo silvestre pero simplemente carecería de señalización funcional. Se generó una línea celular tumoral equivalente que alberga hFn14 anclada a GPI inducible por 4-OHT usando este constructo de hFn14-GPI. A los ratones se les inyectaron células tumorales el día 1 del experimento y se controló su peso corporal, aparición de tumores y para la salud general durante todo el experimento. La aparición de tumores fue evidente en todos los ratones en los días 4 (Figura 34B, panel i). Igual que los tumores no hFn14 en los experimentos previos, el hFn14-GPI tuvo una tasa de crecimiento ligeramente más baja el día 8 en comparación con los tumores hFn14. En ratones con tumor hFn14-GPI, no se observó pérdida de peso u otros signos de enfermedad física (es decir, caquexia) y para garantizar que estos ratones no desarrollen simplemente síntomas en un momento posterior, los ratones se observaron hasta 30 días. Los tumores hFn14-GPI crecieron grandes y no tuvieron ningún efecto sobre la salud general de los ratones en comparación con la observada para los tumores hFn14 (Figura 34B, panel ii). Tras la evaluación post mortem, La vascularización tumoral de control de hFn14-GPI se parecía mucho a los controles que no expresaban en los experimentos previos.

Tumores que expresan Fn14 constitutivo

Como el nivel de hFn14 en los tumores era bajo y, por lo tanto, difícil de detectar, y dada la característica inducible de este modelo no se estaba usando, se generó otro método para demostrar que el tipo salvaje hFn14 era responsable del aumento de la vasculatura y la aparición de síntomas físicos. Se generó una línea celular independiente con expresión constitutiva de hFn14. Se verificó la expresión de hFn14 en estas líneas celulares. Se realizó un experimento tumoral comparando estas células tumorales que expresan constitutivamente con los tumores hFn14 previos (Figura 35). Los tumores formados en ambos grupos, sin embargo, que expresaron constitutivamente los tumores hFn14 no mostraron signos de caquexia (es decir, pérdida de peso y enfermedad física) alrededor de los días 8-12 (como se vio en los tumores hFn14 anteriores). Estos ratones se observaron con el tiempo y eventualmente exhibieron síntomas de caquexia desde aproximadamente el día 18. Este resultado validó indirectamente la participación de hFn14 en la pérdida de peso y el deterioro de la salud que se observa cuando el tipo silvestre hFn14 está presente en los tumores.

Tratamiento con anticuerpos de tumores hFn14

El tratamiento de los tumores hFn14 con anticuerpos bloqueantes contra Fn14 se evaluó a continuación en el modelo de tumor inducible con expresión de Fn14 de bajo nivel. Los ratones se inocularon con células tumorales hFn14 o hFn14-GPI. El tamaño de los tumores, se evaluó diariamente el peso y la salud general de los ratones. Como la aparición y la gravedad de los síntomas de caquexia (es decir, pérdida de peso y deterioro de la salud general) es rápida en este modelo, los ratones se trataron primero con el anticuerpo de bloqueo CRCBT-06-001 (10 mg/kg) 2 días antes del inicio esperado de la pérdida de peso (Figura 36). Antes de esta administración inicial de anticuerpos, los grupos hFn14 y hFn14-GPI se segregaron aleatoriamente en grupos de tratamiento con /anticuerpo. El tratamiento se continuó dos veces por semana durante un total de 4 semanas. Los ratones control no recibieron tratamiento. El grupo tumoral hFn14-GPI se mantuvo sano como se predijo durante el transcurso del experimento, con el grupo tratado con anticuerpos manteniendo una buena salud general. Se observó una pequeña disminución en el peso promedio en el grupo tratado con anticuerpos, sin embargo, los ratones parecían sanos. Como cabía esperar, el grupo hFn14 no tratado mostró pérdida de peso y deterioro de la salud general desde el día 8. Todos los ratones fueron sacrificados el día 12. Los ratones hFn14 que recibieron tratamiento con anticuerpos no solo mantuvieron el peso corporal y la salud general durante el transcurso del tratamiento, sino que sobrevivieron un total de 15-25 días más que los ratones no tratados. Los resultados se representan en la Figura 36.

Evaluación y comparación de Eficacia de CRCBT-06-001, CRCBT-06-002, CRCBT-06-004 e ITEM-1

Los anticuerpos CRCBT-06-001, CRCBT-06-002, CRCBT-06-004 e ITEM-1 fueron in vivo en un experimento de administración de dosis única (Figura 37). Los tumores que expresan hFn14 se formaron en ratones y el día 7 cuando el inicio de la pérdida de peso fue en promedio aparente, se administró una dosis IP única de 5 mg/kg de anticuerpo a grupos de ratones. Un grupo de ratones con tumor hFn14 no recibió tratamiento. Como cabía esperar, CRCBT-06-001 pudo rescatar a la mayoría de los ratones del grupo. CRCBT-06-002 rescató a todos los ratones con una pronta reversión de la pérdida de peso fue evidente ya a las 48 horas después de la administración de anticuerpos. La administración de los anticuerpos CRCBT-06-001 y CRCBT-06-002 conduce a un mayor tiempo de supervivencia de 17,9 y 22,3 días, respectivamente (véase la Figura 37B; sin embargo, en ambos casos, al menos un ratón permaneció sano y mantuvo el peso corporal al finalizar el estudio en el día 27, lo que significa que el día recitado es probablemente una subestimación). Los ratones no tratados no mostraron ningún efecto sobre la progresión de la enfermedad y demostraron un tiempo de supervivencia de aproximadamente 10,3 días. Los ratones tratados con ITEM-1 o CRCBT-06-004 tuvieron un tiempo de supervivencia promedio de 11 días y 10 días, respectivamente. Estos datos demuestran que CRCBT-06-001 y CRCBT-06-002 proporcionan un beneficio superior en el tratamiento de los síntomas de caquexia y en la prolongación de la vida en este modelo de ratón.

Histopatología de los tumores

La histopatología se realizó en los tumores de ratones que portaban tumores hFn14 o hFn14-GPI, así como en un ratón sobreviviente tratado con anticuerpo CRCBT-06-002 tratado con tumor hFn14. El tumor que expresa hFn14-GPI formó una entidad discreta donde la interfaz músculo-tumor estaba claramente definida. Por el contrario, Las células tumorales que expresan hFn14 invadieron el músculo esquelético circundante y no se pudo identificar un límite claro entre las células tumorales y el músculo. En ratones con un tumor que expresa hFn14 que había sido tratado con el anticuerpo CRCBT-06-002 y posteriormente sobrevivió hasta el día 32, no fue aparente la invasión del músculo esquelético circundante por las células tumorales, con una clara interfaz tumor-músculo que es visible comparable a la observada para el tumor hFn14-GPI.

Respuesta a la dosis de CRCBT-06-001 y Tratamiento de rescate

Como el tratamiento dos veces por semana con CRCBT-06-001 en una dosis alta fue tan exitoso, a continuación, se trató a los ratones con una única inyección de anticuerpo en un rango de dosis (0-10 mg/kg) para evaluar la cantidad eficaz más pequeña de anticuerpo requerida para observar un efecto (Figura 38). Los ratones no tratados sufrieron nuevamente el destino esperado, sin embargo, en este caso, el inicio de la pérdida de peso (es decir, la caquexia) comenzó el día 7. Los ratones en el grupo de 10 mg/kg siguieron el mismo patrón que antes con un aumento dramático en la salud general y el mantenimiento del peso corporal en comparación con el grupo no tratado. El inicio de la pérdida de peso fue evidente en 2 ratones en este grupo en los días 14 y 16. El otro ratón sobrevivió sano hasta el final del experimento (23 días). En el grupo tratado con 5 mg/kg, todos los ratones permanecieron sanos y mantuvieron el peso durante el transcurso del experimento con una pequeña disminución en el peso que se hizo evidente alrededor del día 21-22, lo que sugiere la eliminación del anticuerpo del cuerpo. Esta dosis fue en general más efectiva que la dosis más alta de 10 mg/kg.

Todos los demás grupos tratados con anticuerpos (0.1, 0.5 y 1 mg/kg) mostraron cierto grado de mejora después del tratamiento, pero estas dosis más bajas solo retrasaron unos días la aparición de pérdida de peso (es decir, caquexia), con una disminución en el peso corporal visto entre los días 8-10. Para los ratones en estos grupos, cuando el inicio de los síntomas de caquexia fue definitivo (días 9 o 10), se administró una dosis única de anticuerpo de 10 mg/kg para evaluar el posible rescate de estos ratones de un mayor deterioro. Los grupos de 0,5 y 1 mg/kg se rescataron completamente de una mayor pérdida de peso y sorprendentemente mostraron una reversión total de la pérdida de peso dentro de aproximadamente 5 días después del tratamiento. Esta reversión se mantuvo durante el resto del experimento (hasta el día 23).

EJEMPLO 3: Tratamiento de un trastorno de desgaste mediado por cáncer con anticuerpos anti-Fnl4 Métodos

Animales experimentales

A los ratones hembra C57BL/6 (11 semanas de edad) se les administró una inyección subcutánea única de fibroblastos embrionarios de ratón (MEF s) transfectados de manera estable con Fn14 (MEF Fn14) o las células MEF Hras (Hras) no transfectadas (generación de línea celular descrita en los Materiales y Sección de Métodos del Ejemplo 1.). El día 6, a los ratones se les administró una única inyección intraperitoneal de anticuerpo de control de isotipo IgG2b (Hras+IgG2b, MEF Fn14+IgG2b, n = 8/grupo) o CRCBT-06-001 (MEF Fn14+001, n = 8). Los ratones fueron alojados en un ciclo de luz y oscuridad de 12:12 horas. Los ratones fueron evaluados diariamente para la salud general, masa corporal, tamaño del tumor, ingesta de alimentos y agua.

Ensayo de fuerza de agarre

La fuerza de todo el cuerpo se evaluó el día 11 por medio de un medidor de fuerza de agarre (Columbus Instruments, Columbus, OH), básicamente como se describe en Murphy et al., 2012.

Evaluación de las propiedades funcionales de los músculos tibiales anteriores in situ

El día 11, los ratones fueron anestesiados con pentobarbitona sódica (Nembutal; 60 mg/kg; Sigma-Aldrich) mediante inyección intraperitoneal (IP). Los métodos para evaluar las propiedades contráctiles del músculo tibial anterior (TA) de ratón in situ se han descrito previamente (Murphy et al., 2010). Después de determinar la fuerza tetánica máxima, los músculos fueron sometidos a un protocolo de estimulación intermitente de 4 minutos para inducir fatiga muscular. Los músculos fueron estimulados al máximo durante 1 segundo cada 4 segundos durante la duración del protocolo de fatiga. La fuerza tetánica máxima se evaluó a los 5 minutos y 10 minutos después del cese del protocolo de estimulación fatigante. Al finalizar las mediciones contráctiles in situ, los músculos Ta , extensor largo de los dedos (EDL), sóleo, plantaris, gastrocnemio y cuádriceps, así como la grasa epididimaria y el corazón, se extirparon cuidadosamente, se aplicaron en papel de filtro y se pesaron en una balanza analítica. Los ratones se sacrificaron como consecuencia de la escisión del corazón mientras aún estaban anestesiados profundamente.

Histología del músculo esquelético

Las secciones en serie (5 pm) se cortaron transversalmente a través del músculo TA usando un criostato refrigerado (-20 °C) (criostato CTI; IEC, Needham Heights, MA). Las secciones reaccionaron con: laminina (N.° L9393, Sigma-Aldrich) para la determinación del área transversal media de miofibras (CSA); succinato deshidrogenasa (SDH) para determinar la actividad de las enzimas oxidativas; y N2.261 (desarrollado por el Dr. Helen M. Blau, obtenido del Developmental Studies Hybridoma Bank desarrollado bajo los auspicios del NICHD y mantenido por la Universidad de Iowa, Departamento de biología, Iowa City, IA, USA) Para evaluar el porcentaje de isoformas de miosina IIa (Murphy et al., 2010). Se ha demostrado previamente que el músculo tA de ratón casi carece de fibras tipo I (Murphy et al., 2011), por lo que se supuso que todas las fibras que no reaccionan con N2.261 representan fibras de tipo IIx/b. La densidad óptica (d.o.) de SDH se determinó después de 6 minutos de reactividad para todas las muestras y las secciones se capturaron a todo color usando microscopía de luz de campo brillante y se analizaron, básicamente como se describe en Murphy et al., 2010. Se obtuvieron imágenes digitales usando un microscopio vertical con cámara (Axio Imager D1, Carl Zeiss, Wrek, Gottingen, Alemania), controlado y cuantificado por el software AxioVision AC (AxioVision AC Rel. 4.7.1, Carl Zeiss).

Resultados

La inyección con MEF Fn14 causó una pérdida de masa corporal, con ratones tratados con IgG2b que perdieron ~20 % de masa corporal durante el periodo experimental de 11 días en comparación con los ratones control que solo perdieron ~3 % de masa corporal (Figura 39). Sin embargo, el tratamiento con CRCBT-06-001 atenuó la pérdida de masa corporal con ratones tratados con MEF Fn14-001 que solo perdieron ~5,5 % de masa corporal (Figura 39). La masa y el volumen tumoral no fueron significativamente diferentes entre los grupos (Figura 40).

La inyección de MEF Fn14 causó una pérdida de masa muscular y grasa, con una disminución del 15-29 % en la masa de los músculos plantar y tibial anterior (TA) y una disminución del 60 % en la masa de grasa subescapular en comparación con los ratones control (Figura 41). La pérdida de masa muscular y grasa en ratones inyectados con MEF Fn14 se evitó por completo con una sola inyección de CRCBT-06-001 (Figura 41B).

Dada la corta duración del experimento, no hubo diferencias entre los grupos en las evaluaciones de la función muscular, con fuerza de agarre similar (Figura 42) y contracción máxima y fuerza tetánica de los músculos TA (Figuras 43A y 43B). Cuando se examinó la fuerza muscular TA en un intervalo de frecuencias de estimulación, hubo un efecto principal para la producción de menor fuerza tetánica en ratones tratados con MEF Fn14+IgG2b en comparación con los controles (Figura 43C). Durante un protocolo de estimulación fatigante intermitente de 4 minutos, los músculos TA de ratones tratados con MEF Fn14+IgG2b produjeron fuerzas más altas que los controles (Figura 43D).

Las secciones musculares de TA teñidas con hematoxilina y eosina y las secciones que reaccionaron con un anticuerpo anti-laminina revelaron que la inyección de MEF Fn14 causó una disminución en el área transversal de las fibras tipo IIa (-21 %) y las fibras tipo IIx/b (-13 %), y una disminución del 13 % en el área transversal promedio. Sin embargo, una sola inyección de CRCBT-06-001 evitó por completo la disminución del tamaño de la fibra muscular. No hubo diferencias entre los grupos en la proporción o capacidad enzimática oxidativa de las fibras tipo IIa y tipo IIx/b (Figura 44).

EJEMPLO 4: Tratamiento de un trastorno de desgaste mediado por cáncer de colon con anticuerpos anti-Fn14

Método

Los ratones machos CD2F1 (11 semanas de edad) o hembras Balb/c (9-10 semanas de edad) fueron inoculados subcutáneamente (s/c) con 1x106 células Colon-26 el día 1 (Cell Line Services; Alemania). Los ratones fueron evaluados diariamente para la salud general, masa corporal, ingesta de alimentos y agua. Los tumores se midieron diariamente y el volumen tumoral se calculó en función de (l*w2)/2 donde l = largo y w = ancho. Para los grupos alimentados por parejas, la alimentación se logró monitoreando la ingesta de alimentos del grupo tumoral no tratado cada 24 horas y luego proporcionando un grupo 'alimentado por parejas' no tumoral con esa cantidad de alimentos durante el siguiente periodo de 24 horas.

Resultados

Evaluación de anticuerpos en el modelo de cáncer de ratón de colon-26 de caquexia

El modelo de cáncer de colon-26 de caquexia es conocido en la bibliografía sobre caquexia (Murphy et al., 2012). Los ratones CD2F1 se inocularon con células Colon-26 para formar tumores sólidos subcutáneos. Estos tumores conducen a una pérdida de peso progresiva en ratones que incluye el desgaste del músculo esquelético.

Para evaluar el efecto del anticuerpo anti-Fn14 en este modelo, los ratones con colon 26 se trataron con el anticuerpo IP CRCBT-06-002 (Colon-26 CRCBT-06-002) antes del inicio de la pérdida de peso. Se realizó una dosificación múltiple durante el transcurso del experimento como se indica en las Figuras 45A. Los grupos de control adicionales incluyeron un grupo no tumoral alimentado por pares (alimentados por pares), un grupo tumoral no tratado (colon-26 sin tratar) y un grupo no tumoral no tratado (control). La eficacia de CRCBT-06-002 se demostró con ratones tratados que mantienen la masa corporal y una buena salud general durante todo el experimento (el punto de tiempo más largo medido fue el día 27) en comparación con los ratones no tratados que alcanzaron la pérdida de peso máxima permitida (basándose en la aprobación de ética animal institucional para los días 14-18 (Figuras 45A y 45B). Nota, dos de los cinco ratones tratados con anticuerpos murieron el día 20 debido a que se alcanzó la masa máxima del tumor (según la aprobación institucional de ética animal) y no debido a la pérdida de peso u otros signos de enfermedad.

Evaluación de anticuerpos en ratones Balb/c con tumor de colon-26

Los tumores de colon-26 también se forman comúnmente en ratones Balb/c y dado el efecto de CRCBT-06-002 que se había observado en ratones CD2F1, se llevó a cabo un programa de tratamiento similar en ratones Balb/c con tumores de Colon-26. Los resultados se muestran en la Figura 46 y muestran que el tratamiento con CRCBT-06-002 reduce el tamaño del tumor.

Evaluación del anticuerpo CRCBT-06-001 en tumores de Colon-26 en ratones CD2F1

Dada la eficacia demostrada por CRCBT-06-002 en la caquexia por cáncer de colon-26, a continuación se evaluó el efecto de CRCBT-06-001 sobre la caquexia en este modelo. Los ratones CD2F1 se inocularon con células Colon-26 y los ratones se trataron con 10 mg/kg de anticuerpo IP CRCBT-06-001 los días 16 y 20 como se indica. Los ratones no tratados fueron inyectados con células Colon-26 pero no recibieron tratamiento con anticuerpos. Los ratones tratados con CRCBT-06-001 mostraron un inicio tardío de pérdida de peso en comparación con los controles no tratados, demostrando la eficacia del anticuerpo en la progresión de la caquexia en este modelo (Figura 47A). Esto también se puede ver en la evaluación de la supervivencia en el tiempo (Figura 47B). A pesar de la eficacia del anticuerpo para prevenir la pérdida de peso, no parecía tener un efecto significativo en el volumen tumoral (Figura 47C).

EJEMPLO 5: Tratamiento de un trastorno de desgaste mediado por cáncer de colon con anticuerpos anti-Fn14

Métodos

Animales experimentales

Ratones CD2F1 macho (12 semanas de edad) fueron inoculados por vía subcutánea (s/c) con 5x105 células Colon-26 (C-26) (amablemente donadas por Martha Belury, The Ohio State University, Columbus, OH) suspendidas en 100 |jl de PBS esterilizado. Los ratones fueron evaluados diariamente para la salud general, masa corporal, tamaño del tumor, ingesta de alimentos y agua. Todos los ratones se obtuvieron en el Animal Resources Centre (Canning Vale, Australia Occidental) y se alojaron en el Centro de Investigación Biológica de la Universidad de Melbourne en un ciclo de luz y oscuridad de 12:12 horas. El agua estaba disponible ad libitum y se proporcionó agua y comida de laboratorio convencional, se cambió y se monitorizó diariamente. La alimentación en parejas se logró al monitorizar la ingesta de alimentos del grupo no tratado cada 24 horas y luego proporcionar al grupo alimentado por parejas con esa cantidad de alimentos durante el siguiente periodo de 24 horas.

Ensayo de fuerza de agarre y rotarod

La fuerza de todo el cuerpo y la movilidad y coordinación de todo el cuerpo se evaluaron el día 21 por medio de un medidor de fuerza de agarre (Columbus Instruments, Columbus, OH) y ensayo de rendimiento de rotarod (Rotamex-5, Columbus Instruments) esencialmente como se describe en Murphy et al., 2012.

El día 22, los ratones fueron anestesiados con pentobarbitona sódica (Nembutal; 60 mg/kg; Sigma-Aldrich) mediante inyección intraperitoneal (IP). Los métodos para evaluar las propiedades contráctiles del músculo tibial anterior (TA) de ratón in situ han sido descritos en detalle anteriormente (Murphy et al., 2010). Después de determinar la fuerza tetánica máxima, los músculos fueron sometidos a un protocolo de estimulación intermitente de 4 minutos para inducir fatiga muscular. Los músculos fueron estimulados al máximo durante 1 segundo cada 4 segundos durante la duración del protocolo de fatiga. La fuerza tetánica máxima se evaluó a los 5 minutos y 10 minutos después del cese del protocolo de estimulación fatigante. Al finalizar las mediciones contráctiles in situ, los músculos TA, extensor largo de los dedos (EDL), sóleo, plantaris, gastrocnemio y cuádriceps, así como la grasa epididimaria y el corazón, se extirparon cuidadosamente, se aplicaron en papel de filtro y se pesaron en una balanza analítica. Los ratones se sacrificaron como consecuencia de la escisión del corazón mientras aún estaban anestesiados profundamente. Histología del músculo esquelético

La histología del músculo esquelético se evaluó sustancialmente como se describe en el Ejemplo 3.

Resultados

Para evaluar aún más el efecto del anticuerpo anti-Fn14 en el modelo Colon-26, los ratones fueron inoculados con células Colon-26 y antes del comienzo de la pérdida de peso, tratados con el anticuerpo CRCBT-06-002 (C-26 002). Se realizaron dosificaciones múltiples durante el transcurso del experimento como se indica. Los grupos de control incluyeron un grupo tumoral no tratado (C-26) y un grupo tumoral inyectado con anticuerpo IgG (C-26 IgG). Los grupos C-26 IgG y C-26 002 se alimentaron por pares al grupo tumoral no tratado.

La eficacia clara de CRCBT-06-002 se demuestra con ratones tratados que mantienen la masa corporal y una buena salud general durante todo el experimento (el punto de tiempo más largo medido fue el día 22) en comparación con los ratones no tratados y los ratones tratados con IgG (Figura 48A y B). Durante el periodo de 22 días, los ratones no tratados y tratados con IgG perdieron -29 % de masa corporal libre de tumor, mientras que los ratones con tumor tratado con CRCBT-06-002 solo perdieron ~4 % de masa corporal libre de tumor (Figura 48C). Los tumores se midieron con el tiempo (Figura 49A) y el volumen tumoral se calculó y se representaron para cada grupo (Figuras 49B y 49C).

La masa absoluta de los músculos extensor largo de los dedos (EDL), plantar, tibial anterior (TA), gastrocnemio y cuádriceps fueron 23-34 % más altos en los ratones con tumor tratados con CRCBT-06-002 en comparación con los ratones no tratados y tratados con IgG (Figura 50A). La grasa y la masa cardiaca también fueron mayores con el tratamiento con CRCBT-06-002 (Figura 50B).

La fuerza de agarre máxima fue 35 % y 26 % mayor en ratones con tumor tratado con CRCBT-06-002 en comparación con ratones no tratados y tratados con IgG, respectivamente (Figura 51A), mientras que la latencia hasta la caída durante el ensayo de rotarod no fue significativamente diferente entre los grupos (Figura 51B).

Los músculos TA de los ratones con tumor tratado con CRCBT-06-002 fueron más fuertes que los ratones no tratados y tratados con IgG, con mayor fuerza de contracción máxima y fuerza tetánica en un intervalo de frecuencias de estimulación (Figuras 52A, 52B y 52C). Durante un protocolo de estimulación fatigante intermitente de 4 minutos, los músculos TA de los ratones tratados con 002 fueron más fuertes que los ratones con tumor sin tratar y tratados con IgG (Figura 52D).

Las secciones musculares de TA teñidas con hematoxilina y eosina y las secciones que reaccionaron con un anticuerpo anti-laminina revelaron que los ratones tratados con CRCBT-06-002 tienen fibras musculares más grandes que los ratones no tratados y tratados con IgG. La proporción de fibras musculares tipo IIa parece similar entre los grupos, pero el área de las fibras tipo IIa es mayor en los ratones tratados con CRCBT-06-002. La capacidad oxidativa de la fibra muscular según la evaluación de la reacción SDH fue similar entre los grupos.

El análisis de las secciones musculares de TA teñidas con hematoxilina y eosina y las secciones que reaccionaron con un anticuerpo anti-laminina revelaron que el área transversal (CSA) de las fibras tipo IIa y tipo IIx/b, así como la CSA de fibra promedio, fue mayor en CRCBT-06-002 ratones tratados que ratones no tratados y tratados con IgG (Figura 53A). La proporción de fibras musculares tipo IIa y tipo IIx/b fue similar entre los grupos (Figura 53B). La capacidad enzimática oxidativa en las fibras tipo IIa y tipo IIx/b, así como la capacidad oxidativa promedio de la fibra evaluada por la reacción SDH, fue similar entre los grupos (Figura 53C). Estos datos indican que el tratamiento con CRCBT-06-002 aumentó el tamaño de las fibras musculares pero no cambió la constitución de los músculos en comparación con los controles.

EJEMPLO 6: Tratamiento de la diabetes y un trastorno de desgaste mediado por la diabetes con anticuerpos anti-Fnl4

Métodos

Se indujo diabetes en ratones machos C57B1/6 de 8 semanas de edad mediante la administración de múltiples dosis bajas de estreptozotocina (STZ) esencialmente como se describe en Chen et al., 2009 y/o Motyl et al., 2009. En resumen, los ratones recibieron una inyección IP de 45 mg/kg de STZ (Sigma S-0130) durante 5 días consecutivos (días 1-5). Los ratones de control fueron inyectados con vehículo (tampón de citrato sódico refrigerado 0,1 M, pH 4,5). Los ratones fueron evaluados para la salud general, masa corporal, ingesta diaria de alimentos y agua. El grupo alimentado por pares (PF) se alimentó de acuerdo con la ingesta diaria del grupo inyectado con STZ. Para el tratamiento con anticuerpos, a los ratones se les administró una dosis única de IP 20 mg/kg de CRCBT-06-002 dos días después de la inyección final de estreptozotocina (día 7). El día 28 todos los ratones fueron sacrificados y sangre, el músculo (tibial anterior, cuádriceps y corazón) y la grasa epididimaria se eliminaron para su análisis. Los niveles de glucosa en sangre no en ayunas se midieron usando un monitor de glucosa en sangre Accucheck.

Resultados

S e u só un m o d e lo d e ra tó n c o n d ia b e te s in d u c id a p o r S T Z p a ra e v a lu a r e l e fe c to d e l a n t ic u e rp o C R C B T -06 -002 en p é rd id a d e p e s o a s o c ia d a c o n d ia b e te s .

El anticuerpo se administró el día 7 a un grupo de ratones diabéticos inducidos por STZ. La masa corporal se evaluó diariamente y se estandarizó frente a la masa corporal inicial como 100 %. Se representaron los promedios de grupo estandarizados (Figura 54). La administración de anticuerpos después de la inducción de diabetes condujo a una caída inmediata en la masa corporal de este grupo, sin embargo, este peso se recuperó bien en 12-14 días. Luego se observó un aumento general de la masa corporal alrededor del día 18 en comparación con el grupo STZ solo.

En el transcurso del experimento de 28 días, la ingesta diaria de agua del grupo se midió y se representó como la ingesta acumulativa (Figura 55). La ingesta de agua de ratones STZ fue mayor debido al estado diabético, sin embargo, el grupo STZ posterior al tratamiento con anticuerpos muestra una tendencia de ingesta de agua a lo largo del tiempo más cercana a la ingesta de los grupos de control no diabéticos.

El día 28, los ratones fueron sacrificados y se evaluaron los niveles de glucosa en sangre (Figura 56). Cuando se obtuvo un nivel de glucosa en sangre fuera del rango del ensayo, se asignó el nivel máximo de detección (600 mg/dl). Este fue el caso de tres del grupo STZ y uno del grupo tratado con anticuerpos.

La grasa epididimaria, corazón, tibial anterior (TA) y cuádriceps se extirparon para análisis. Se calculó y se representó el peso medio del tejido del grupo (Figura 57A) estandarizado a la masa corporal final (día 28; Figura 57B) y contra la masa corporal inicial (día 1; Figura 57C). El tratamiento con anticuerpos atenuó la disminución en los cuádriceps y el corazón, y atenuó parcialmente la disminución en el músculo TA y en la grasa epididimaria.

Estos datos demuestran que el tratamiento con un anticuerpo anti-Fn14 (CRCBT-06-002) previene o trata la caquexia inducida por la diabetes y reduce los síntomas de la diabetes, como el aumento de la ingesta diaria de agua y los niveles de glucosa en sangre.

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Claims

REIVINDICACIONES

1. Una proteína de unión a Fn14 que comprende un dominio de unión a antígeno de un anticuerpo anti-Fn14 para uso en el tratamiento o prevención de caquexia que está asociada con otra afección, en donde la proteína de unión a Fn14 se une a un péptido que consiste en la secuencia establecida en SEQ ID NO: 56, reduce la señalización de NF^kB inducida por Tweak en una célula HEK293T que expresa Fn14, y en donde la proteína de unión a Fn14 comprende al menos una región variable de cadena pesada (Vh) y una región variable de cadena ligera (Vl), en donde Vh y Vl se unen para formar un Fv que comprende el dominio de unión a antígeno, y en donde el Fv comprende uno cualquiera de los siguientes:

(i) una Vh que comprende, según lo determinado de acuerdo con el sistema de numeración Kabat, las CDR 1, 2 y 3 de una Vh que comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 15 y una Vl que comprende, según lo determinado de acuerdo con el sistema de numeración Kabat, las CDR 1, 2 y 3 de una V^lque comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 22;

(ii) una Vh que comprende, según lo determinado de acuerdo con el sistema de numeración Kabat, las CDR 1, 2 y 3 de una Vh que comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 16 y una Vl que comprende, según lo determinado de acuerdo con el sistema de numeración Kabat, las CDR 1, 2 y 3 de una V^lque comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 23; y

2. La proteína de unión a Fn14 para uso de la reivindicación 1, en donde la caquexia está asociada con cáncer o diabetes, por ejemplo, la afección es caquexia por cáncer y el método comprende además seleccionar un sujeto que padece caquexia por cáncer, en donde el sujeto padece un cáncer que expresa Fn14.

3. La proteína de unión a Fn14 para uso de la reivindicación 2, en donde la proteína de unión a Fn14 también se usa para reducir el tamaño de un tumor en el sujeto.

4. La proteína de unión a Fn14 para uso de las reivindicaciones 1 a 3, en donde la proteína de unión a Fn14 es un anticuerpo anti-Fn14, el anticuerpo comprende uno cualquiera de los siguientes:

(i) una V^hque comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 15 o una versión humanizada, sinhumanizada o desinmunizada de la misma y una Vl que comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 22 o una versión humanizada, sinhumanizada o desinmunizada de la misma;

(ii) una Vh que comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 16 o una versión humanizada, sinhumanizada o desinmunizada de la misma y una V^lque comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 23 o una versión humanizada, sinhumanizada o desinmunizada de la misma; y

(iii) una Vh que comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 19 o una versión humanizada, sinhumanizada o desinmunizada de la misma y una VL que comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 26 o una versión humanizada, sinhumanizada o desinmunizada de la misma.

5. La proteína de unión a Fn14 para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde la proteína de unión a Fn14:

(i) se une a un epítopo conformacional dependiente de la formación de enlaces disulfuro dentro de Fn14, por ejemplo, se une al epítopo conformacional que no está presente en una proteína Fn14 que carece de enlaces disulfuro; y/o

(ii) se une a un péptido que consiste en la secuencia establecida en SEQ ID NO: 57 y/o SEQ ID NO: 68 que además comprende opcionalmente seis restos de histidina en un extremo a un nivel similar o sustancialmente igual al que se une a un dominio extracelular de Fn14.

6. Una proteína de unión a Fn14 que comprende un dominio de unión a antígeno de un anticuerpo anti-Fn14, en donde la proteína de unión a Fn14 se une a un péptido que consiste en la secuencia establecida en SEQ ID NO: 56 y en donde la proteína reduce la señalización de NF^kB inducida por Tweak en una célula HEK293T que expresa Fn14 y, en donde la proteína de unión a Fn14 comprende en menos una región variable de cadena pesada (V^h) y una región variable de la cadena ligera (Vl), en donde Vh y Vl se unen para formar un Fv que comprende el dominio de unión a antígeno, y en donde el Fv comprende uno cualquiera de los siguientes:

(i) una V^hque comprende, según lo determinado de acuerdo con el sistema de numeración Kabat, las CDR 1, 2 y 3 de una Vh que comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 15 y una Vl que comprende, según lo determinado de acuerdo con el sistema de numeración Kabat, las CDR 1, 2 y 3 de una VL que comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 22;

(ii) una V^hque comprende, según lo determinado de acuerdo con el sistema de numeración Kabat, las CDR 1, 2 y 3 de una V^hque comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 16 y una V^lque comprende, según lo determinado de acuerdo con el sistema de numeración Kabat, las CDR 1, 2 y 3 de una V^lque comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 23; y

7. La proteína de unión a Fn14 de la reivindicación 6, que no se une de manera detectable a un polipéptido que comprende un dominio extracelular de Fn14 fusionado a una región Fc de un anticuerpo, en donde el polipéptido se reduce o se reduce y alquila.

8. La proteína de unión a Fn14 de cualquiera de las reivindicaciones 6 o 7, en donde la Vh y la Vl están en una sola cadena polipeptídica y la proteína de unión a Fn14 es:

(i) un fragmento Fv de cadena sencilla (scFv);

(ii) un scFv dimérico (di-scFv);

(iii) al menos uno de (i) y/o (ii) unido a una región constante de cadena pesada o un Fc o un dominio constante de cadena pesada (Ch) 2 y/o Ch3; o

(iv) al menos uno de (i) y/o (ii) unido a una proteína que se une a una célula efectora inmune; o

en donde la Vl y Vh están en cadenas polipeptídicas separadas y la proteína de unión a Fn14 es:

(i) un diacuerpo;

(ii) un triacuerpo;

(iii) un tetracuerpo;

(iv) un Fab;

(v) un F(ab')2;

(vi) un Fv;

(vii) al menos uno de (i) a (vi) unido a una región constante de cadena pesada o un Fc o un dominio constante de cadena pesada (C^h) 2 y/o C^h3;

(viii) al menos uno de (i) a (vi) unido a una proteína que se une a una célula efectora inmune; o

(ix) un anticuerpo.

9. Un anticuerpo anti-Fn14, el anticuerpo comprende uno cualquiera de los siguientes:

(i) una V^hque comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 15 o una versión humanizada, sinhumanizada o desinmunizada de la misma y una V^lque comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 22 o una versión humanizada, sinhumanizada o desinmunizada de la misma;

(ii) una V^hque comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 16 o una versión humanizada, sinhumanizada o desinmunizada de la misma y una Vl que comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 23 o una versión humanizada, sinhumanizada o desinmunizada de la misma;

(iii) una Vh que comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 19 o una versión humanizada, sinhumanizada o desinmunizada de la misma y una V^lque comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 26 o una versión humanizada, sinhumanizada o desinmunizada de la misma;

(iv) una V^hque comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 20 o una versión humanizada, sinhumanizada o desinmunizada de la misma y una VL que comprende una secuencia establecida en SEQ ID NO: 27 o una versión humanizada, sinhumanizada o desinmunizada de la misma; o

10. La proteína de unión a Fn14 o el anticuerpo anti-Fn14 de cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9, en donde la proteína:

(ii) se une a un péptido que consiste en la secuencia establecida en SEQ ID NO: 68 que comprende adicionalmente seis restos de histidina en un terminal a un nivel similar o sustancialmente igual al que se une a un dominio extracelular de Fn14.