CN118047871A - 一种靶向FRα的抗体或其抗原结合片段及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于抗体领域，具体地涉及一种FRα结合分子，特别是特异性识别FRα的抗体和其片段。此外，本发明还涉及包含此类抗体或其片段的核酸或宿主细胞，包含此类抗体或其片段的药物，以及应用这些抗体和片段的治疗和诊断方法或用途。
Description
技术领域
本发明属于抗体领域，具体地涉及一种FRα结合分子，特别是特异性识别FRα的抗体和其片段。此外，本发明还涉及包含此类抗体或其片段的核酸或宿主细胞，包含此类抗体或其片段的药物，以及应用这些抗体和片段的治疗和诊断方法或用途。
背景技术
叶酸受体α(Folate receptorα，FRα)是一种分子量大约40KD的细胞表面糖蛋白，最初是作为叶酸结合蛋白发现。FRα是叶酸受体(FRs)家族的一个成员，FRs家族还包括FRβ、FRγ和FRδ。叶酸-FRα复合物内吞入细胞进入内体小泡后，配体受体分离，FRα将再循环至细胞膜。膜型FRα会在酶切作用下脱落，形成可溶型FRα。FRα在实体瘤中有广泛高表达，比如间皮瘤(72-100％)，三阴性乳腺癌(35-68％)，卵巢癌(76-89％)，非小细胞肺癌(14-74％)；在非恶性组织中，支气管上皮细胞，脉络丛，甲状腺，唾液腺，乳腺，结肠，膀胱也有一定比例的FRα表达。叶酸受体参与肿瘤的浸润、转移、进展，成为肿瘤治疗有吸引力的靶点。
已经有公司例如ImmunoGen通过基于杂交瘤平台，筛选得到针对人FRα的单克隆抗体Mirvetuximab，继而通过可切割连接子连接一个细胞毒性药物DM4，开发了Mirvetuximabsoravtansine(IMGN853)。Morphotek(后被卫材收购)公司也开发针对人FRα的单克隆抗体Farletuzumab。
尽管已经开发了某些抗FRα抗体，但是对于在现有技术基础上进一步开发FRα抗体仍然存在需求，尤其是对于开发具有高特异性、高生物学活性、高内吞能力、更好的体内安全性，和/或可以用于制备ADC，CAR-T，CD3-engager的抗人FRα抗体，仍然存在需求。
发明内容
本发明公开了一种靶向FRα的抗体或其抗原结合片段及其应用。
本发明因此提供了一种新的结合FRα的抗体，以及其抗原结合片段。
在一些实施方案中，本发明的抗FRα抗体具有以下一个或多个或全部的特性：
(1)能够以高亲和力结合人或恒河猴FRα；
(2)能够以高亲和力结合细胞膜表面表达的人或恒河猴FRα；
(3)能够诱导FRα阳性细胞对抗体或其片段或包含所述抗体或其片段的分子的内吞作用，优选地具有相当于已知抗FRα抗体(例如MIRV)或优于已知抗FRα抗体(例如MIRV)的内吞效率；
(4)包含其的分子具有细胞(例如肿瘤细胞，例如FRα阳性细胞，例如FRα阳性肿瘤细胞)杀伤能力。
在一些实施方案中，本发明提供了编码本发明抗体或其片段的核酸，包含所述核酸的载体，包含所述载体的宿主细胞。
在一些实施方案中，本发明提供了制备本发明抗体或其片段的方法。
在一些实施方案中，本发明提供了包含本发明抗体的免疫缀合物、药物组合物和组合产品。
本发明还提供了利用本发明抗体在受试者中阻断FRα介导的信号通路的方法，以及预防或治疗FRα相关疾病，例如免疫系统疾病(例如自身免疫疾病或炎症)的方法。
本发明还涉及在样品中检测FRα的方法。
在下面的附图和具体实施方案中进一步说明本发明。然而，这些附图和具体实施方案不应被认为限制本发明的范围，并且本领域技术人员容易想到的改变将包括在本发明的精神和所附权利要求的保护范围内。
附图说明
图1显示了小鼠血清FRα抗体滴度(650nM处测量的吸光度)；
图2显示了FRα杂交瘤上清与人FRα-His结合的ELISA检测；
图3显示了杂交瘤上清与过表达hFRα的CHO细胞(CHO-hFOLR1)结合的FACS检测；
图4显示了杂交瘤上清与过表达cyno FRα的CHO细胞(CHO-cynoFOLR1)结合的FACS检测；
图5-图9显示了不同抗FRα嵌合抗体体外结合人FRα的能力，其中抗体编号-xiIgG(Sample ID-xiIgG)是指如实施例2.6所制备的具有IgG1的重链恒定区和κ亚类轻链恒定区的嵌合抗体，其可变区参见表1中对应“抗体编号(即Sample_ID)”的可变区；MIRV：Mirvecuximab，其作为阳性对照(PC)；NC：阴性对照，IgG1(序列见序列表SEQ ID NO:63和SEQ ID NO:64)。
图10-图13显示了不同抗FRα嵌合抗体与不同细胞的结合能力，其中抗体编号-xiIgG是指如实施例2.6所制备的具有IgG1的重链恒定区和κ亚类轻链恒定区的嵌合抗体，其可变区参见表1中对应“抗体编号”的可变区；MIRV：Mirvecuximab，其作为阳性对照(PC)；NC：阴性对照，IgG1。
图14-图21显示了不同的抗FRα嵌合抗体的ADC的体外细胞杀伤结果(RLU曲线和IC50值)，其中抗体编号-ADC是指如实施例2.6所制备的具有IgG1的重链恒定区和κ亚类轻链恒定区的嵌合抗体与vcMMAE的ADC，MIRV-ADC是指MIRV的ADC分子MIRV-vcMMAE,NC-ADC是指IgG1与vcMMAE的ADC。
图22-23显示了如实施例3.1所制备的人源化抗体hz2F22-H1L1、hz2F22-H1L0、hzPha3-H0L0、hzPha3-H1L2、hzPha3-H1L1、hzPha3-H0L1和hzPha3-H1L0以及嵌合抗体Pha3-xiIgG和2F22-xiIgG与人FRα的Octet评估的结合动力学结果。
图24-25显示了如实施例3.1所制备的人源化抗体hz45A3和hz45B1以及对照抗体MIRV与人FRα(hFOLR1)和恒河猴FRα(cynoFOLR1)的Biacore评估的结合动力学结果。
图26-27显示了如实施例3.1所制备的人源化抗体hz2F22-H1L1、hz2F22-H1L0、hzPha3-H0L0、hzPha3-H1L2、hzPha3-H1L1、hzPha3-H0L1和hzPha3-H1L0以及嵌合抗体Pha-xiIgG和2F22-xiIgG与FRα阳性细胞的结合能力，其中NC：阴性对照，IgG1；MIRV为阳性对照Mirvetuximab。
图28和29显示了如实施例3.1所制备的人源化抗体hz45A3和hz45B1与FRα阳性细胞的结合能力，其中NC：阴性对照，IgG1；MIRV为阳性对照Mirvetuximab。
图30-35显示了不同的人源化抗体hz2F22-H1L1、hz2F22-H1L0、hzPha3-H0L0、hzPha3-H1L2、hzPha3-H1L1、hzPha3-H0L1和hzPha3-H1L0以及hz45A3和hz45B1的ADC的体外细胞(图30-34：HEK293-FRα(HEK293-hFOLR1)细胞；图35：KB细胞)杀伤结果(RLU曲线和IC50值)，其中抗体编号-ADC是指如实施例3.1所制备的具有IgG1的重链恒定区和κ亚类轻链恒定区的人源化抗体与vcMMAE的ADC，MIRV-ADC是指MIRV与vcMMAE的ADC分子。
图36显示了不同抗体分子hz45A3和hz45B1和hzPha3-H1L2在体内的药代动力学，即随时间的浓度。
图37显示了hzPha3-H1L2-MMAE、hz45B1-MMAE、hz45A3-MMAE、Mirve-MMAE 1mg/Kg给药组对人宫颈癌KB皮下移植瘤生长的影响。
图38显示了hzPha3-H1L2-MMAE、hz45B1-MMAE、hz45A3-MMAE、Mirve-MMAE 3mg/Kg给药组对人宫颈癌KB皮下移植瘤生长的影响。
发明详述
I.定义
在下文详细描述本发明前，应理解本发明不限于本文中描述的特定方法学、方案和试剂，因为这些可以变化。还应理解本文中使用的术语仅为了描述具体实施方案，而并不意图限制本发明的范围，其仅会由所附权利要求书限制。除非另外定义，本文中使用的所有技术和科学术语与本发明所属领域中普通技术人员通常的理解具有相同的含义。
为了解释本说明书，将使用以下定义，并且只要适当，以单数形式使用的术语也可以包括复数，并且反之亦然。要理解，本文所用的术语仅是为了描述具体的实施方案，并且不意欲是限制性的。
术语“约”在与数字数值联合使用时意为涵盖具有比指定数字数值小5％的下限和比指定数字数值大5％的上限的范围内的数字数值。
如本文所用，术语“和/或”意指可选项中的任一项或可选项的两项或多项。
如本文所用，术语“包含”或“包括”意指包括所述的要素、整数或步骤，但是不排除任意其他要素、整数或步骤。在本文中，当使用术语“包含”或“包括”时，除非另有指明，否则也涵盖由所述及的要素、整数或步骤组合的情形。例如，当提及“包含”某个具体序列的抗体可变区时，也旨在涵盖由该具体序列组成的抗体可变区。
如本文所用，“FRα”、“叶酸受体α(FRα)”或“FOLR1”是指任何天然FRα多肽(例如人FRα多肽)或其变体。术语“FRα”涵盖“全长”未处理FRα多肽以及由细胞内的处理产生的任何形式的FRα多肽。所述术语还涵盖FRα的天然存在的变体，例如由剪切变体和等位基因变体编码的那些。本文所述的FRα多肽可从多种来源，诸如从人组织或从另一来源例如恒河猴分离，或通过重组或合成方法制备。在本发明的一个实施方案中，人FRα蛋白的-核苷酸序列在中如登录号NM_000802.3所示。在本发明的一个实施方案中，恒河猴FRα蛋白的核苷酸序列在/>中如登录号NM_001194647.3所示。
本文所用的术语“抗FRα抗体”、“抗FRα”、“FRα抗体”或“结合FRα的抗体”是指这样的抗体，所述抗体能够以足够的亲合力结合(灵长类动物，例如人或恒河猴)FRα或其片段。
术语“全抗体”或“全长抗体”在本文中可互换使用，是指具有天然免疫球蛋白分子结构的抗体分子。在常规四链IgG抗体的情况下，全长抗体包含由二硫键相互连接的两条重链(H)和两条轻链(L)。在仅具有重链而缺乏轻链的重链抗体情况下，全长抗体包含由二硫键相互连接的两条重链(H)。对于常规四链IgG抗体，全长抗体重链通常由重链可变区(本文中缩写为VH)和重链恒定区组成，其中重链恒定区至少包含3个结构域CH1、CH2和CH3。全长抗体轻链由轻链可变区(本文中缩写为VL)和轻链恒定区组成，其中轻链恒定区由一个结构域CL组成。每个重链可变区VH和每个轻链可变区都由三个CDR和4个FR组成，从氨基端到羧基端以如下顺序排列：FR1,CDR1,FR2,CDR2,FR3,CDR3,FR4。术语“抗体片段”包括完整抗体的一部分。在优选的实施方案中，抗体片段为抗原结合片段。
术语抗体的“抗原结合片段”是与全长抗体不同的分子，其包含全长抗体的一部分，但其能结合全长抗体的抗原或与全长抗体(即与抗原结合片段所来源的全长抗体)竞争结合抗原。可以通过重组DNA技术、或通过酶或化学切割完整的抗体制备抗原结合片段。抗原结合片段包括但不限于Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、单链Fv、双体抗体(diabody)、单域抗体(sdAb)、纳米抗体、sc(Fv)2。例如，通过木瓜蛋白酶消化全长抗体能够获得Fab片段。此外，通过胃蛋白酶在铰链区的二硫键下面消化完全抗体产生F(ab')2，其为Fab’的二聚体，是二价的抗体片段。F(ab')2可以在中性条件下通过破坏铰链区中的二硫键而被还原，由此将F(ab')2二聚体转化为Fab'单体。Fab'单体基本上是具有铰链区的Fab片段。Fv片段由抗体单臂的VL和VH结构域组成。Fv片段的两个结构域VL和VH可以由独立的基因编码，但是也可以使用重组方法，使用合成性连接肽连接这两个结构域以使其作为单条蛋白链产生，并且在所述单条蛋白链中VL区和VH区配对以形成单链Fv(scFv)。sc(Fv)2是小型抗体，其中两个VH和两个VL通过接头连接形成单链。
“Fab片段”或“Fab”在本文中可互换使用，用于指，由两条多肽链组成的、包含免疫球蛋白重链可变结构域VH、重链恒定结构域CH1、轻链可变结构域VL和轻链恒定结构域CL的免疫球蛋白片段，其中，一条多肽链从N端到C端包含VH和选自CH1和CL的一个恒定区，另一条多肽链从N端到C端包含VL和选自CL和CH1的另一恒定区，其中所述VH结构域和VL结构域配对形成抗原结合位点。在本文中，包含重链恒定区CH1的Fab多肽链也称作“Fab重链”；相应地，包含轻链恒定区CL的Fab多肽链也称作“Fab轻链”。
本文中的术语“Fc区”或“Fc结构域”用于定义含有至少一部分恒定区的免疫球蛋白重链的C端区域。所述术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。在一个实施方案中，人IgG重链Fc区从Cys226或Pro230延伸至重链的羧基末端。然而，Fc区的C末端赖氨酸(Lys447)或甘氨酸-赖氨酸(残基446-447)可能存在，也可能不存在。除非本文另有说明，Fc区或恒定区中氨基酸残基的编号是根据EU编号系统，也称为EU索引，如Kabat等人,Sequences ofProteinsof Immunological Interest,第5版Public Health Service,NationalInstitutes ofHealth,Bethesda,MD,1991中所述。
“双体抗体”是通过基因融合构建的二价小型抗体，例如其是由两个多肽链组成的二聚体。双体抗体的每一多肽链的VL和VH域通过接头结合，从而编码在同一多肽链中的VL和VH形成具有不同的单链可变区片段的二聚体。双体抗体一般具有两个抗原结合位点。
“互补决定区”或“CDR区”或“CDR”是抗体可变结构域中在序列上高变并且形成在结构上确定的环(“超变环”)和/或含有抗原接触残基(“抗原接触点”)的区域。CDR主要负责与抗原表位结合。重链和轻链的CDR通常被称作CDR1、CDR2和CDR3，从N-端开始顺序编号。位于抗体重链可变结构域内的CDR被称作HCDR1、HCDR2和HCDR3，而位于抗体轻链可变结构域内的CDR被称作LCDR1、LCDR2和LCDR3。在一个给定的轻链可变区或重链可变区氨基酸序列中，各CDR的精确氨基酸序列边界可以使用许多公知的抗体CDR指派方案的任一种或其组合确定，所述指派方案包括例如：基于抗体的三维结构和CDR环的拓扑学的Chothia(Chothia等人.(1989)Nature 342:877-883，Al-Lazikani等人,“Standard conformations for thecanonical structures of immunoglobulins”,Journal of Molecular Biology,273,927-948(1997))，基于抗体序列可变性的Kabat(Kabat等人,Sequences of Proteins ofImmunological Interest,第4版,U.S.Department of Health and Human Services,National Institutes of Health(1987)),AbM(University of Bath)，Contact(University College London)，国际ImMunoGeneTics database(IMGT)(在万维网上imgt.cines.fr/上)，以及基于利用大量晶体结构的近邻传播聚类(affinity propagationclustering)的North CDR定义。
以下为采用kabat、AbM、Chothia、Contact和IMGT方案定义的CDR的区域范围(http://www.bioinf.org.uk/abs/info.html)。
除非另有说明，否则在本发明中，术语“CDR”或“CDR序列”涵盖以上述任一种方式确定的CDR序列。CDR也可以基于与参考CDR序列(例如本发明示例性CDR之任一)具有相同的Kabat编号位置而确定。除非另有说明，否则在本发明中，当提及抗体可变区中的残基位置(包括重链可变区残基和轻链可变区残基)时，是指根据Kabat编号系统(Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991))的编号位置。
在一个实施方案中，本发明中抗体重链可变区的CDR是按照Chothia确定的。在一些实施方案中，本发明中抗体的重链可变区的CDR是按照Kabat确定的。在一些实施方案中，本发明中抗体的轻链可变区的CDR是按照Chothia和Kabat组合取最长后确定的(后文中显示为“Chothia&Kabat”)。
应该注意，基于不同的指派方案获得的同一抗体的可变区的CDR的边界可能有所差异。即不同指派方案下定义的同一抗体可变区的CDR序列有所不同。因此，在涉及用本发明定义的具体CDR序列限定抗体时，所述抗体的范围还涵盖了这样的抗体，其可变区序列包含所述的具体CDR序列，但是由于应用了不同的方案(例如不同的指派方案规则或组合)而导致其所声称的CDR边界与本发明所定义的具体CDR边界不同。
术语“嵌合抗体”是这样的抗体分子，其中(a)将恒定区或其部分改变、替换或交换，从而抗原结合位点与不同的或改变的类别、效应子功能和/或物种的恒定区或赋予嵌合抗体新性能的完全不同的分子(例如，酶、毒素、激素、生长因子、药物)等连接；或(b)将可变区或其部分用具有不同或改变的抗原特异性的可变区改变、替换或交换。例如，小鼠抗体可以通过将其恒定区更换为来自人免疫球蛋白的恒定区进行修饰。由于更换为人类恒定区，该嵌合抗体可以保留其在识别抗原方面的特异性，同时如与原始小鼠抗体相比，具有在人类中降低的免疫原性。
“人源化抗体”是一种保留非人类抗体(例如小鼠单克隆抗体)的抗原特异性反应性，同时作为治疗药对人施用时免疫原性较低的抗体。这可以例如通过保留非人类抗原结合位点并将抗体的剩余部分替换成它们的人类相应部分(即，将恒定区以及可变区中不参与结合的部分替换为人类抗体的相应部分)来实现。
如本文所用，术语“抗”、“结合”或“特异性结合”意指结合作用对靶标或抗原是选择性的并且可以与不想要的或非特异的相互作用区别。结合位点与特定靶标或抗原结合的能力可以通过流式细胞术或酶联免疫吸附测定法(ELISA)或本领域已知的常规结合测定法如通过放射性免疫测定(RIA)或生物膜薄层干涉测定法或MSD测定法或表面等离子体共振法(SPR)测定。
“免疫缀合物”是与一个或多个其他物质(例如大分子物质、放射性元素、细胞毒性剂等)缀合的抗体。
“个体”或“受试者”包括哺乳动物。哺乳动物包括但不限于，家养动物(例如，牛，羊，猫，狗和马)，灵长类动物(例如，人和非人灵长类动物如猴)，兔，以及啮齿类动物(例如，小鼠和大鼠)。在一些实施方案中，个体或受试者是人。
术语“有效量”指本发明的抗体或片段或组合物或组合的这样的量或剂量，其以单一或多次剂量施用患者后，在需要治疗或预防的患者中产生预期效果。
“治疗有效量”指以需要的剂量并持续需要的时间段，有效实现所需治疗结果的量。治疗有效量也是这样的一个量，其中抗体或抗体片段或组合物或组合的任何有毒或有害作用不及治疗有益作用。相对于未治疗的对象，“治疗有效量”优选地抑制可度量参数或改善可度量参数至少约40％、甚至更优选地至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％甚至100％。
“预防有效量”指以需要的剂量并持续需要的时间段，有效实现所需预防结果的量。通常，由于预防性剂量在对象中在疾病较早阶段之前或在疾病较早阶段使用，故预防有效量将小于治疗有效量。
术语“宿主细胞”指已经向其中引入外源多核苷酸的细胞，包括这类细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“转化的细胞”，这包括原代转化的细胞和从其衍生的后代，而不考虑传代的数目。后代在核酸内容上可能与亲本细胞不完全相同，而是可以包含突变。本文中包括在最初转化的细胞中筛选或选择的具有相同功能或生物学活性的突变体后代。宿主细胞是可以用来产生本发明抗体分子的任何类型的细胞系统，包括真核细胞，例如，哺乳动物细胞、昆虫细胞、酵母细胞；和原核细胞，例如，大肠杆菌细胞。宿主细胞包括培养的细胞，也包括转基因动物、转基因植物或培养的植物组织或动物组织内部的细胞。
本文所使用的术语“标记”是指被直接或间接缀合或融合至试剂(诸如多核苷酸探针或抗体)并且促进其所缀合或融合的试剂的检测的化合物或组合物。标记本身可以是可检测的(例如，放射性同位素标记或荧光标记)或在酶促标记的情况下可以催化可检测的底物化合物或组合物的化学改变。术语旨在涵盖通过将可检测物质偶联(即，物理连接)至探针或抗体来直接标记探针或抗体以及通过与直接标记的另一种试剂反应来间接标记探针或抗体。
“分离的”抗体或分子是这样的抗体或分子，其已经与其天然环境的组分分离。在一些实施方案中，将抗体或分子纯化至超过95％或99％纯度，如通过例如电泳(例如，SDS-PAGE，等电聚焦(IEF)，毛细管电泳)或层析(例如，离子交换或反相HPLC)确定的。
氨基酸序列的“同一性百分数(％)”是指将候选序列与本说明书中所示的具体氨基酸序列进行比对并且如有必要的话为达到最大序列同一性百分数而引入空位后，并且不考虑任何保守置换作为序列同一性的一部分时，候选序列中与本说明书中所示的具体氨基酸序列的氨基酸残基相同的氨基酸残基百分数。在一些实施方案中，本发明考虑本发明抗体分子的变体，所述变体相对于在本文中具体公开的抗体分子及其序列而言具有相当程度的同一性，例如同一性为至少80％,85％,90％,95％,97％,98％或99％或更高。所述变体可以包含保守性改变。
对于多肽序列，“保守性改变”包括对多肽序列的置换、缺失或添加，但不实质性改变多肽序列的期望功能活性。例如，保守性置换常常导致某个氨基酸置换为化学上相似的氨基酸。提供功能上相似氨基酸的保守性置换表是本领域熟知的。以下列出了8组含有互为保守替换的氨基酸：1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G)；2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；7)丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；和8)半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)。在一些实施方案中，术语“保守序列改变”用于指不显著影响或改变含有氨基酸序列的本发明抗体分子或结合蛋白分子的目的抗原结合特征的氨基酸修饰。例如保守修改变体相对于亲本抗体或结合蛋白保持对目的抗原至少80％,85％,90％,95％,98％,99％或更高，例如100-110％或更高的结合亲和力。
本文所述的术语“治疗剂”涵盖在预防或治疗肿瘤，例如癌症中有效的任何物质，包括化疗剂、细胞因子、细胞毒性剂、其它抗体、小分子药物或免疫调节剂(例如免疫抑制剂)。
术语“细胞毒性剂”用在本发明中指抑制或防止细胞功能和/或引起细胞死亡或破坏的物质。
“化疗剂”包括在治疗癌症或免疫系统疾病中有用的化学化合物。
术语“小分子药物”是指低分子量的能够调节生物过程的有机化合物。“小分子”被定义为分子量小于10kD、通常小于2kD和优选小于1kD的分子。小分子包括但不限于无机分子、有机分子、含无机组分的有机分子、含放射性原子的分子、合成分子、肽模拟物和抗体模拟物。作为治疗剂，小分子可以比大分子更能透过细胞、对降解更不易感和更不易于引发免疫应答。
本文使用的术语“免疫调节剂”指抑制或调节免疫应答的天然或合成活性剂或者药物。免疫应答可以是体液应答或细胞应答。免疫调节剂包含免疫抑制剂。在一些实施方案中，本发明的免疫调节剂包括免疫检查点抑制剂或免疫检查点激动剂。
术语“药用辅料”指与活性物质一起施用的稀释剂、佐剂(例如弗氏佐剂(完全和不完全的))、赋形剂、载体或稳定剂等。
术语“药物组合物”指这样的组合物，其以允许包含在其中的活性成分的生物学活性有效的形式存在，并且不包含对施用所述组合物的受试者具有不可接受的毒性的另外的成分。
术语“药物组合或组合产品”是指非固定组合产品或固定组合产品，包括但不限于药盒/试剂盒、药物组合物。术语“非固定组合”意指活性成分(例如，(i)本发明的抗体、以及(ii)其他治疗剂)以分开的实体被同时、无特定时间限制或以相同或不同的时间间隔、依次地施用于患者，其中这类施用在患者体内提供预防或治疗有效水平的两种或更多种活性剂。术语“固定组合”意指两种或更多种活性剂以单个实体的形式被同时施用于患者。优选对两种或更多种活性剂的剂量和/或时间间隔进行选择，从而使各部分的联合使用能够在治疗疾病或病症时产生大于单独使用任何一种成分所能达到的效果。各成分可以各自呈单独的制剂形式，其制剂形式可以相同也可以不同。
术语“组合疗法”是指施用两种或更多种治疗剂或治疗方式以治疗本文所述疾病。这种施用包括以基本上同时的方式共同施用这些治疗剂，例如以具有固定比例的活性成分的单一胶囊。或者，这种施用包括对于各个活性成分在多种或在分开的容器(例如片剂、胶囊、粉末和液体)中的共同施用。粉末和/或液体可以在施用前重构或稀释至所需剂量。此外，这种施用还包括以大致相同的时间或在不同的时间以顺序的方式使用每种类型的治疗剂。在任一情况下，治疗方案将提供药物组合在治疗本文所述的病症或病状中的有益作用。
用于本文时，“治疗”指减缓、中断、阻滞、缓解、停止、降低、或逆转疾病的症状、并发症、或生化指征的发作、缓解症状或阻止或抑制疾病、病状或病症的进一步发展。
用于本文时，“预防”包括对疾病或病症或特定疾病或病症的症状的发生或发展的抑制。
术语“载体”当在本文中使用时是指能够增殖与其相连的另一个核酸的核酸分子。该术语包括作为自我复制核酸结构的载体以及结合到已经引入其的宿主细胞的基因组中的载体。术语“表达载体”是指包含重组多核苷酸的载体，其包含有效连接要表达的核苷酸序列的表达控制序列。表达载体包含足够的用于表达的顺式作用元件；用于表达的其它元件可以由宿主细胞提供或在体外表达系统中。表达载体包括本领域已知的所有那些，包括被掺入重组多核苷酸的粘粒、质粒(例如，裸的或包含在脂质体中)和病毒(例如，慢病毒、逆转录病毒、腺病毒和腺伴随病毒)。
“受试者/患者/个体样品”指从患者或受试者得到的细胞或流体的集合。组织或细胞样品的来源可以是实体组织，像来自新鲜的、冷冻的和/或保存的器官或组织样品或活检样品或穿刺样品；血液或任何血液组分；体液，诸如泪液、玻璃体液、脑脊液、羊膜液(羊水)、腹膜液(腹水)、或间隙液；来自受试者的妊娠或发育任何时间的细胞。组织样品可能包含在自然界中天然不与组织混杂的化合物，诸如防腐剂、抗凝剂、缓冲剂、固定剂、营养物、抗生素、等等。
本文所提及的全部出版物、专利申请、专利和其他参考文献通过引用的方式完整地并入。上文以及整个本申请中所论述的任何或所有特征可以在本发明的各种实施方案中组合。此外，本文中所述的材料、方法和例子仅是说明性的并且不意在是限制性的。本发明的其他特征、目的和优点将从本说明书及附图并且从后附的权利要求书中显而易见。
II.抗体
在一些实施方案中，本发明的抗FRα抗体或其片段以高亲和力结合灵长类动物FRα(例如人FRα或恒河猴FRα)，例如，以以下平衡解离常数(KD)与FRα(例如人FRα)结合，所述KD小于约40nM、35nM、30nM、25nM、20nM、15nM、10nM、5nM、4nM、3nM、2nM、1nM、0.9nM、0.8nM、0.7nM、0.6nM、0.5nM、0.4nM、0.3nM、0.2nM、0.1nM、0.09nM或0.08nM，或在大约0.01nM或0.05nM至以上任一数值的范围内，或以上任一数值的范围内。
在一些实施方案中，本发明的抗体或其片段能够诱导FR诱阳性细胞对抗体或其片段或包含所述抗体或其片段的分子的内吞作用，优选地具有相当于已知抗FR细抗体(例如MIRV)或优于已知抗FR优抗体(例如MIRV)的内吞效率。
在一些实施方案中，包含本发明的抗体或其片段的分子具有细胞(例如肿瘤细胞，例如FR些阳性细胞，例如FR细阳性肿瘤细胞)杀伤能力。
在一些实施方案中，本发明的抗体或其片段(任选地与治疗方式和/或其它治疗剂，例如免疫调节剂组合)能够预防或治疗FRα相关疾病，例如肿瘤，例如实体肿瘤，例如上皮细胞癌，例如肺癌(例如非小细胞肺癌)、口腔癌(如口腔上皮癌)、卵巢癌、乳腺癌、间质瘤、子宫内膜癌。
在一些实施方案中，本发明的抗FRα抗体或其抗原结合片段包含3个来自重链可变区的互补决定区(HCDR)，HCDR1、HCDR2和HCDR3。
在一些实施方案中，本发明的抗FRα抗体或其抗原结合片段包含3个来自轻链可变区的互补决定区(LCDR)，LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在一些实施方案中，本发明的抗FRα抗体或其抗原结合片段包含3个来自重链可变区的互补决定区(HCDR)和3个来自轻链可变区的互补决定区(LCDR)。
在一些方面中，本发明的抗FRα抗体或其抗原结合片段包含重链可变区(VH)。在一些方面中，本发明的抗FRα抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区(VL)。在一些方面中，本发明的抗FRα抗体或其抗原结合片段包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)。在一些实施方案中，所述重链可变区包含3个来自重链可变区的互补决定区(HCDR)，HCDR1、HCDR2和HCDR3，例如通过Kabat和/或Chothia方案确定的HCDR1、HCDR2和HCDR3。在一些实施方案中，所述轻链可变区包含3个来自轻链可变区的互补决定区(LCDR)，LCDR1、LCDR2和LCDR3，例如通过Kabat和/或Chothia方案(例如Chothia&Kabat方案)确定的HCDR1、HCDR2和HCDR3。
在一些实施方案中，本发明的抗FRα抗体或其抗原结合片段还包含抗体重链恒定区。在一些实施方案中，本发明抗FRα抗体或其抗原结合片段还包含抗体轻链恒定区。在一些实施方案中，本发明抗FRα抗体或其抗原结合片段还包含重链恒定区和轻链恒定区。
在一些实施方案中，本发明的抗FRα抗体或其抗原结合片段包含抗体重链(HC)。在一些实施方案中，本发明抗FRα抗体或其抗原结合片段还包含抗体轻链(LC)。在一些实施方案中，本发明抗FRα抗体或其抗原结合片段包含重链和轻链。
在一些实施方案中，本发明的抗体重链包含抗体重链可变区和抗体重链恒定区。在一些实施方案中，本发明的抗体轻链包含抗体轻链可变区和抗体轻链恒定区。
在一些实施方案中，本发明的重链可变区
(i)包含与选自SEQ ID NO:1、14、26、35、41、53、65、75、88、100、109、117、13、33、34、74、99、115或116的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；或者
(ii)包含选自SEQ ID NO:1、14、26、35、41、53、65、75、88、100、109、117、13、33、34、74、99、115或116的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；或者
(iii)包含与选自SEQ ID NO:1、14、26、35、41、53、65、75、88、100、109、117、13、33、34、74、99、115或116的氨基酸序列相比具有1个或多个(优选不超过10个，更优选不超过5、4、3、2、1个)的氨基酸改变(优选氨基酸置换，更优选氨基酸保守置换)的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成，优选地，所述氨基酸改变不发生在CDR区中。
在一些实施方案中，本发明的轻链可变区
(i)包含与选自SEQ ID NO:2、15、27、36、42、54、66、76、89、101、110、118、24、25、39、40或51的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；或者
(ii)包含选自SEQ ID NO:2、15、27、36、42、54、66、76、89、101、110、118、24、25、39、40或51的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；或者
(iii)包含与选自SEQ ID NO:2、15、27、36、42、54、66、76、89、101、110、118、24、25、39、40或51的氨基酸序列相比具有1个或多个(优选不超过10个，更优选不超过5、4、3、2、1个)的氨基酸改变(优选氨基酸置换，更优选氨基酸保守置换)的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成，优选地，所述氨基酸改变不发生在CDR区中。
在一些实施方案中，本发明的3个来自重链可变区的互补决定区(HCDR)，HCDR1、HCDR2和HCDR3选自
(i)如SEQ ID NO:1、14、26、35、41、53、65、75、88、100、109、117、13、33、34、74、99、115或116所示的VH中所含的三个互补决定区域HCDR1、HCDR2和HCDR3，或
(iv)相对于(i)中任一项的序列，在所述三个HCDR区上共包含至少一个且不超过5、4、3、2或1个氨基酸改变(优选氨基酸置换，优选保守置换)的序列，优选地，所述HCDR根据Chothia或Kabat确定，或根据Chothia和Kabat(Chothia&Kabat)确定。
在一些实施方案中，本发明的3个来自轻链可变区的互补决定区(LCDR)，LCDR1、LCDR2和LCDR3选自
(i)如SEQ ID NO:2、15、27、36、42、54、66、76、89、101、110、118、24、25、39、40或51所示的VL中所含的三个互补决定区域LCDR1、LCDR2和LCDR3，
或
(iii)相对于(i)中任一项的序列，在所述三个LCDR区上共包含至少一个且不超过5、4、3、2或1个氨基酸改变(优选氨基酸置换，优选保守置换)的序列优选地，所述LCDR根据Chothia或Kabat确定，或根据Chothia和Kabat(Chothia&Kabat)确定。
在一些实施方案中，基于Chothia确定的HCDR1包含SEQ ID NO:3、16、28、43、55、77、90或119的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成，或者基于Chothia确定的HCDR1包含与SEQ ID NO:3、16、28、43、55、77、90或119的氨基酸序列相比具有一个、两个或三个改变(优选氨基酸置换，优选保守置换)的氨基酸序列。
在一些实施方案中，基于Kabat确定的HCDR1包含SEQ ID NO:6、19、30、46、58、80、93、122、或107的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成，或者基于Kabat确定的HCDR1包含与SEQ ID NO:6、19、30、46、58、80、93、122、或107的氨基酸序列相比具有一个、两个或三个改变(优选氨基酸置换，优选保守置换)的氨基酸序列。
在一些实施方案中，基于Chothia确定的HCDR2包含SEQ ID NO:4、17、44、56、67、78、91、120或85的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成，或者基于Chothia确定的HCDR2包含与SEQ ID NO:4、17、44、56、67、78、91、120或85的氨基酸序列相比具有一个、两个或三个改变(优选氨基酸置换，优选保守置换)的氨基酸序列。
在一些实施方案中，基于Kabat确定的HCDR2包含SEQ ID NO:7、20、31、37、47、59、69、81、94、103、111、123、98或108的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成，或者基于Kabat确定的HCDR2包含与SEQ ID NO:7、20、31、37、47、59、69、81、94、103、111、123、98或108的氨基酸序列相比具有一个、两个或三个改变(优选氨基酸置换，优选保守置换)的氨基酸序列。
在一些实施方案中，基于Chothia确定的HCDR3包含SEQ ID NO:5、18、29、45、57、68、79、92、102、121或86的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成，或者基于Chothia确定的HCDR3包含与SEQ IDN O:5、18、29、45、57、68、79、92、102、121或86的氨基酸序列相比具有一个、两个或三个改变(优选氨基酸置换，优选保守置换)的氨基酸序列。
在一些实施方案中，基于Kabat确定的HCDR3包含SEQ ID NO:5、18、29、45、57、68、79、92、102、121或86的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成，或者基于Kabat确定的HCDR3包含与SEQ ID NO:5、18、29、45、57、68、79、92、102、121或86的氨基酸序列相比具有一个、两个或三个改变(优选氨基酸置换，优选保守置换)的氨基酸序列。
在一些实施方案中，基于Chothia和Kabat(Chothia&Kabat)确定的LCDR1包含SEQID NO:9、21、48、60、70、82、95、104、112或124的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成，或者基于Chothia和Kabat(Chothia&Kabat)确定的LCDR1包含与SEQ ID NO:9、21、48、60、70、82、95、104、112或124的氨基酸序列相比具有一个、两个或三个改变(优选氨基酸置换，优选保守置换)的氨基酸序列。
在一些实施方案中，基于Chothia和Kabat(Chothia&Kabat)确定的LCDR2包含SEQID NO:10、22、49、61、71、83、96、105、113、125或52的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成，或者基于Chothia和Kabat(Chothia&Kabat)确定的LCDR2包含与SEQ ID NO:10、22、49、61、71、83、96、105、113、125或52的氨基酸序列相比具有一个、两个或三个改变(优选氨基酸置换，优选保守置换)的氨基酸序列。
在一些实施方案中，基于Chothia和Kabat(Chothia&Kabat)确定的LCDR3包含SEQID NO:11、23、32、38、50、62、72、84、97、106、114或12的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成，或者基于Chothia和Kabat(Chothia&Kabat)确定的LCDR3包含与SEQ ID NO:11、23、32、38、50、62、72、84、97、106、114或12的氨基酸序列相比具有一个、两个或三个改变(优选氨基酸置换，优选保守置换)的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明的抗体重链恒定区为IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的重链恒定区，优选的IgG1的重链恒定区。在一些实施方案中，本发明的抗体轻链恒定区为lambda或Kappa轻链恒定区，优选的Kappa轻链恒定区。在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段是IgG1形式的抗体或其抗原结合片段，并且包含人Kappa轻链恒定区。
在一些优选的实施方案中，本发明的抗体重链恒定区
(i)包含与选自SEQ ID NO:63的氨基酸序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；
(ii)包含选自SEQ ID NO:63的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；或者
(iii)包含与选自SEQ ID NO:63的氨基酸序列相比具有1个或多个(优选不超过20个或10个，更优选不超过5、4、3、2、1个)的氨基酸改变(优选氨基酸置换，更优选氨基酸保守置换)的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；或者
(iv)由下述核酸序列所编码，所述核酸序列
(a)包含与选自SEQ ID NO:73的氨基酸序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；
(b)包含选自SEQ ID NO:73的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；或者
(c)包含与选自SEQ ID NO:73的氨基酸序列相比具有1个或多个(优选不超过20个或10个，更优选不超过5、4、3、2、1个)的氨基酸改变(优选氨基酸置换，更优选氨基酸保守置换)的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成。
在一些实施方案中，所述氨基酸改变发生在Fc区。在一些实施方案中，本发明的Fc区(i)包含与选自SEQ ID NO:8的氨基酸序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；
(ii)包含选自SEQ ID NO:8的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；
(iii)包含与选自SEQ ID NO:8的氨基酸序列相比具有1个或多个(优选不超过20个或10个，更优选不超过5、4、3、2、1个)的氨基酸改变(优选氨基酸置换，更优选氨基酸保守置换)的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；或者
(iv)由下述核酸序列所编码，所述核酸序列
(a)包含与选自SEQ ID NO:87的氨基酸序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；
(b)包含选自SEQ ID NO:87的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；或者
(c)包含与选自SEQ ID NO:87的氨基酸序列相比具有1个或多个(优选不超过20个或10个，更优选不超过5、4、3、2、1个)的氨基酸改变(优选氨基酸置换，更优选氨基酸保守置换)的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成。
在一些实施方案中，本发明的抗体轻链恒定区
(i)包含与选自SEQ ID NO:64的氨基酸序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；
(ii)包含选自SEQ ID NO:64的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；或者
(iii)包含与选自SEQ ID NO:64的氨基酸序列相比具有1个或多个(优选不超过20个或10个，更优选不超过5、4、3、2、1个)的氨基酸改变(优选氨基酸置换，更优选氨基酸保守置换)的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成。
在本发明的一些具体实施方案中，本发明的抗FRα抗体或其抗原结合片段包含：
1)如SEQ ID NO:1或13所示的VH中所含的三个互补决定区域HCDR1、HCDR2和HCDR3，和如SEQ ID NO:2、24或25所示的VL中所含的三个互补决定区域LCDR1、LCDR2和LCDR3；
2)如SEQ ID NO:41、33或34所示的VH中所含的三个互补决定区域HCDR1、HCDR2和HCDR3，和如SEQ ID NO:42、39、40或51所示的VL中所含的三个互补决定区域LCDR1、LCDR2和LCDR3；
3)如SEQ ID NO:74、99、115或116所示的VH中所含的三个互补决定区域HCDR1、HCDR2和HCDR3，和如SEQ ID NO:42、39、40或51所示的VL中所含的三个互补决定区域LCDR1、LCDR2和LCDR3；
4)如SEQ ID NO:1所示的VH中所含的三个互补决定区域HCDR1、HCDR2和HCDR3，和如SEQ ID NO:2所示的VL中所含的三个互补决定区域LCDR1、LCDR2和LCDR3；
5)如SEQ ID NO:14所示的VH中所含的三个互补决定区域HCDR1、HCDR2和HCDR3，和如SEQ ID NO:15所示的VL中所含的三个互补决定区域LCDR1、LCDR2和LCDR3；
6)如SEQ ID NO:26所示的VH中所含的三个互补决定区域HCDR1、HCDR2和HCDR3，和如SEQ ID NO:27所示的VL中所含的三个互补决定区域LCDR1、LCDR2和LCDR3；
7)如SEQ ID NO:35所示的VH中所含的三个互补决定区域HCDR1、HCDR2和HCDR3，和如SEQ ID NO:36所示的VL中所含的三个互补决定区域LCDR1、LCDR2和LCDR3；
8)如SEQ ID NO:41所示的VH中所含的三个互补决定区域HCDR1、HCDR2和HCDR3，和如SEQ ID NO:42所示的VL中所含的三个互补决定区域LCDR1、LCDR2和LCDR3；
9)如SEQ ID NO:53所示的VH中所含的三个互补决定区域HCDR1、HCDR2和HCDR3，和如SEQ ID NO:54所示的VL中所含的三个互补决定区域LCDR1、LCDR2和LCDR3；
10)如SEQ ID NO:65所示的VH中所含的三个互补决定区域HCDR1、HCDR2和HCDR3，和如SEQ ID NO:66所示的VL中所含的三个互补决定区域LCDR1、LCDR2和LCDR3；
11)如SEQ ID NO:75所示的VH中所含的三个互补决定区域HCDR1、HCDR2和HCDR3，和如SEQ ID NO:76所示的VL中所含的三个互补决定区域LCDR1、LCDR2和LCDR3；
12)如SEQ ID NO:88所示的VH中所含的三个互补决定区域HCDR1、HCDR2和HCDR3，和如SEQ ID NO:89所示的VL中所含的三个互补决定区域LCDR1、LCDR2和LCDR3；
13)如SEQ ID NO:100所示的VH中所含的三个互补决定区域HCDR1、HCDR2和HCDR3，和如SEQ ID NO:101所示的VL中所含的三个互补决定区域LCDR1、LCDR2和LCDR3；
14)如SEQ ID NO:109所示的VH中所含的三个互补决定区域HCDR1、HCDR2和HCDR3，和如SEQ ID NO:110所示的VL中所含的三个互补决定区域LCDR1、LCDR2和LCDR3；
15)如SEQ ID NO:117所示的VH中所含的三个互补决定区域HCDR1、HCDR2和HCDR3，和如SEQ ID NO:118所示的VL中所含的三个互补决定区域LCDR1、LCDR2和LCDR3；
16)如SEQ ID NO:74或99所示的VH中所含的三个互补决定区域HCDR1、HCDR2和HCDR3，和如SEQ ID NO：42所示的VL中所含的三个互补决定区域LCDR1、LCDR2和LCDR3；
17)如SEQ ID NO:13所示的VH中所含的三个互补决定区域HCDR1、HCDR2和HCDR3，和如SEQ ID NO:24或25所示的VL中所含的三个互补决定区域LCDR1、LCDR2和LCDR3；
18)如SEQ ID NO:33所示的VH中所含的三个互补决定区域HCDR1、HCDR2和HCDR3，和如SEQ ID NO:39、40或51所示的VL中所含的三个互补决定区域LCDR1、LCDR2和LCDR3；
19)如SEQ ID NO:34所示的VH中所含的三个互补决定区域HCDR1、HCDR2和HCDR3，和如SEQ ID NO:39、40或51所示的VL中所含的三个互补决定区域LCDR1、LCDR2和LCDR3；
20)如SEQ ID NO:115或116所示的VH中所含的三个互补决定区域HCDR1、HCDR2和HCDR3，和如SEQ ID NO:39、40或51所示的VL中所含的三个互补决定区域LCDR1、LCDR2和LCDR3；
21)如SEQ ID NO:115或116所示的VH中所含的三个互补决定区域HCDR1、HCDR2和HCDR3，和如SEQ ID NO:51所示的VL中所含的三个互补决定区域LCDR1、LCDR2和LCDR3；
优选地，其中所述HCDR和所述LCDR根据Chothia或Kabat确定，或根据Chothia和Kabat确定；
例如，所述HCDR根据Kabat方案确定，所述LCDR根据Kabat和Chothia组合方案(Chothia&Kabat)确定；
例如，所述HCDR根据Chothia方案确定，所述LCDR根据Kabat和Chothia组合方案(Chothia&Kabat)确定。
在本发明的一些具体实施方案中，本发明的抗FRα抗体或其抗原结合片段包含：互补决定区HCDR1、HCDR2和HCDR3，以及LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中所述HCDR1、HCDR2和HCDR3基于Chothia方案确定，其分别包含或由下表SEQ ID NO所示的氨基酸序列组成，且所述LCDR1、LCDR2和LCDR3基于Kabat和Chothia组合方案(Chothia&Kabat)，其分别包含或由下表SEQ ID NO所示的氨基酸序列组成：
或者其中所述HCDR1、HCDR2和HCDR3基于Kabat方案确定，其分别包含或由下表SEQID NO所示的氨基酸序列组成，且所述LCDR1、LCDR2和LCDR3基于Kabat和Chothia组合方案，其分别包含或由下表SEQ ID NO所示的氨基酸序列组成：
/>
在本发明的一些具体实施方案中，本发明的抗FRα抗体或其抗原结合片段包含VH和VL，其中VH和VL分别包含如下表中所列SEQ ID NO所示的氨基酸序列，或与下表中所列SEQ ID NO所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成：
/>
在优选的实施方案中，本发明提供抗FRα抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区和轻链可变区，其中所述抗体或其抗原结合片段包含的重链可变区和轻链可变区包含如下表SEQ ID NO所示的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成：
/>
在本发明的一个实施方案中，本文所述的氨基酸改变包括氨基酸的置换、插入或缺失。优选的，本文所述的氨基酸改变为氨基酸置换，优选地保守置换。
在优选的实施方案中，本发明所述的氨基酸改变发生在CDR外的区域(例如在FR中)。更优选地，本发明所述的氨基酸改变发生在重链可变区外和/或轻链可变区外的区域。
在一些实施方案中，置换为保守性置换。保守置换是指一个氨基酸经相同类别内的另一氨基酸置换，例如一个酸性氨基酸经另一酸性氨基酸置换，一个碱性氨基酸经另一碱性氨基酸置换，或一个中性氨基酸经另一中性氨基酸置换。
在某些实施方案中，置换发生在抗体的CDR区。通常，获得的变体相对于亲本抗体在某些生物学特性方面(例如，增加的亲和力)具有修饰(例如，改善)和/或将具有亲本抗体的基本上保留的某些生物学特性。例如，通过异构化位点进行置换来消除抗体的分子异构化的潜在风险，例如，可以将CDR，例如轻链CDR，例如轻链CDR2中的D突变，例如突变为E，例如，将第56位的D突变为E；例如，在本发明的抗体的Pha3-HZ2-D/EG-VK中，轻链的CDR2中的D突变为E，D56E(Kabat)。
在某些实施方案中，可能需要产生经半胱氨酸工程改造的抗体，例如“硫代MAb”，其中抗体的一或多个残基经半胱氨酸残基置换。
在某些实施方案中，本文中所提供的抗体可进一步经修饰为含有本领域中已知且轻易获得的其他非蛋白质部分。适合抗体衍生作用的部分包括，但不限于，水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性实例包括，但不限于，聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1,3-二烷、聚-1,3,6-三烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或无规共聚物)、及葡聚糖或聚(n-乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚环氧丙烷/氧化乙烯共聚物、聚氧乙基化多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇、及其混合物。
在一些实施方案中，本发明的抗体是人源化的。人源化可以通过如下方式实现：将非人源的天然抗体重链可变区和轻链可变区中的一个或多个氨基酸残基，尤其是构架区序列，置换成来自人的常规抗体的可变区相应位置的残基。人源化抗体的方法在本领域中是熟知的。典型地，人源化置换以保持抗体的有利结合性质的方式进行。本领域熟知用于确定人源化抗体的生物学性质，例如结合亲和力等的试验，以确定和选择适宜的人源化残基突变或突变组合。
在一些实施方案中，可以通过包括如下步骤的方法，获得本发明人源化的抗体：
①确定亲本抗体(例如来自杂交瘤制备的抗体)的CDR环结构；
②在人种系序列数据库(例如IMGT数据库)为每个V/J区域找到最接近的同源序列；
③筛选与重链最匹配的人种系以及最低量的回复突变，在一个实施方案中，人种系基因是IGVH/IGKV种系基因；将嵌合抗体的CDR区构建至人的构架区上；
④使用序列和结构特征，确定构架区中起到维持CDR功能的氨基酸位置；
⑤在确定为重要的序列位置进行回复突变(返回到输入氨基酸类型)，例如，轻链可变区可以包含Q79E和/或Y87F和/或F71Y，或在重链可变区可以包含A24G，例如在2F22-HZ1的轻链可变区Q79E和Y87F(Kabat编号)，Phage3-HZ1的重链可变区A24G(Kabat编号)和轻链可变区的F71 Y(Kabat编号)；
⑥优化风险位点的氨基酸，例如对异构化位点进行改变来消除异构化风险，例如可以将CDR，例如轻链CDR，例如轻链CDR2中的D突变，例如突变为E，例如，在本发明的抗体Phage3-HZ2-D/EG-VK的LCDR2的氨基酸D突变为E,，例如其中第56位氨基酸D突变为E(Kabat编号)；和
⑦获得人源化抗体，任选地测序抗体序列。
在一些实施方案中，本发明的抗FRα抗体或其抗原结合片段还包括具有以下一个或多个特性的抗体或抗原结合片段：
(i)显示与本发明抗体对FRα相同或相似的结合亲和力和/或特异性；
(ii)抑制(例如，竞争性抑制)本发明抗体与FRα的结合；
(iii)与本发明抗体结合相同或重叠的表位；
(iv)与本发明抗体竞争结合FRα；
(v)具有本发明抗体的一个或多个生物学特性。
如本文所述定义的，与参照抗体“结合相同或重叠表位的抗体”是指这样的抗体，其在竞争测定中阻断50％、60％、70％、80％、90％或95％以上的所述参照抗体与其抗原的结合，反言之，参照抗体在竞争测定中阻断50％、60％、70％、80％、90％或95％以上的该抗体与其抗原的结合。
如本文所述定义的，与参照抗体竞争结合其抗原的抗体是指这样的抗体，其在竞争测定中阻断50％、60％、70％、80％、90％或95％以上的所述参照抗体与其抗原的结合。反言之，参照抗体在竞争测定中阻断50％、60％、70％、80％、90％或95％以上的该抗体与其抗原的结合。众多类型的竞争性结合测定可用于确定一种抗体是否与另一种竞争，这些测定例如：固相直接或间接放射免疫测定(RIA)、固相直接或间接酶免疫测定(EIA)、夹心竞争测定、生物光干涉测定法(例如Fortebio)或表面等离子共振(Biacore)等。
如本文所述定义的，抑制(例如竞争性抑制)参照抗体与其抗原的结合的抗体是指这样的抗体，其抑制50％、60％、70％、80％、90％或95％以上的所述参照抗体与其抗原的结合。反言之，参照抗体抑制50％、60％、70％、80％、90％或95％以上的该抗体与其抗原的结合。抗体与其抗原的结合可以亲和力(例如平衡解离常数)衡量。测定亲和力的方法是本领域已知的。
与参照抗体显示相同或相似的结合亲和力和/或特异性的抗体是指这样的抗体，其能够具有参照抗体的至少50％、60％、70％、80％、90％或95％以上的结合亲和力和/或特异性。这可以通过本领域已知的任何测定结合亲和力和/或特异性的方法进行测定。
在一些实施方案中，本发明的抗FRα抗体是IgG1形式的抗体或IgG2形式的抗体或IgG3形式的抗体或IgG4形式的抗体。
在一些实施方案中，抗FRα抗体是单克隆抗体。
在一些实施方案中，抗FRα抗体是嵌合抗体或人源化抗体。
在一个实施方案中，本发明的抗FRα抗体还涵盖其抗体片段，优选地选自以下的抗体片段：抗原结合片段包括但不限于Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、单链Fv、双体抗体(diabody)、单域抗体(sdAb)、纳米抗体、sc(Fv)2。
在某些实施方案中，抗FRα抗体分子处于双特异性或多特异性抗体分子形式。在一个实施方案中，双特异性抗体可以结合FRα蛋白的两种不同的表位。在一个实施方案中，双特异性抗体可以结合FRα结合位点和另一种蛋白质。在一些实施方案中，所述抗FRα抗体是双特异性抗体或多特异性抗体。
III.本发明的核酸以及包含其的宿主细胞
在一方面，本发明提供了编码以上任何抗FRα抗体或其片段或其任一条链的核酸的核酸。
例如，本发明的核酸包含编码选自SEQ ID NO:1、2、14、15、26、27、35、36、41、42、53、54、65、66、75、76、88、89、100、101、109、110、117、118、13、24、25、33、34、39、40、51、74、99、115或116中任一项所示氨基酸序列的核酸，或编码与选自SEQ ID NO:1、2、14、15、26、27、35、36、41、42、53、54、65、66、75、76、88、89、100、101、109、110、117、118、13、24、25、33、34、39、40、51、74、99、115或116中任一项所示的氨基酸序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性的氨基酸序列的核酸。如本领域技术人员明了的，因为密码子简并性，每一个抗体或多肽氨基酸序列可以由多种核酸序列编码。编码本发明分子的核酸序列可以采用本领域熟知的方法，例如通过从头固相DNA合成，或通过PCR扩增而产生。
在一方面，本发明提供编码以上任何抗体或其片段或其任一条链的核酸。当从适宜的表达载体表达时，由所述核酸编码的多肽能够显示人(和/或恒河猴)FRα抗原结合能力。例如，在一些实施方案中，所述编码重链和/或轻链的可变区的核酸在读框中与编码重链和/或轻链的恒定区的核酸可操作连接，从而当从适宜的表达载体表达时，产生编码所述抗体重链和/或的核酸。
为了便于生产和纯化，可以在抗体的重链和/或轻链的N端融合分泌性信号肽，和/或利于纯化的标签肽。
在一个实施方案中，提供包含所述核酸的一个或多个载体。在一个实施方案中，载体是表达载体，例如真核表达载体。载体包括但不限于病毒、质粒、粘粒、λ噬菌体或酵母人工染色体(YAC)。在一个实施方案中，载体是pCDNA载体，例如pCDNA3.1。
在一个实施方案中，提供包含所述核酸或所述载体的宿主细胞。在一个实施方案中，宿主细胞是真核的。在另一个实施方案中，宿主细胞选自酵母细胞、哺乳动物细胞(例如CHO细胞(例如CHO-S或CHO-K)或293细胞(例如293F或HEK293细胞))或适用于制备抗体或其片段的其它细胞。在一个实施方案中，宿主细胞是原核的，例如是细菌，例如大肠杆菌。
在一个实施方案中，宿主细胞是真核的。在另一个实施方案中，宿主细胞选自酵母细胞、哺乳动物细胞或适用于制备抗体或其片段的其它细胞。例如，真核微生物诸如丝状真菌或酵母是关于编码抗体的载体的合适克隆或表达宿主。例如，糖基化途径已经进行“人源化”的真菌和酵母菌株导致产生具有部分或完全人糖基化模式的抗体。适于表达糖基化抗体的宿主细胞也衍生自多细胞生物体(无脊椎动物和脊椎动物)。也可以将脊椎动物细胞用作宿主。例如，可以使用被改造以适合于悬浮生长的哺乳动物细胞系。有用的哺乳动物宿主细胞系的其它实例是用SV40转化的猴肾CV1系(COS-7)；人胚肾系(HEK293、293F或293T细胞)等。其它有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括CHO-S细胞或CHO-K等；以及骨髓瘤细胞系如Y0，NS0和Sp2/0。本领域已知适合产生抗体的哺乳动物宿主细胞系。
IV.本发明的抗体分子的生产和纯化
在一个实施方案中，本发明提供制备抗FRα抗体或其片段(优选的抗原结合片段)的方法，其中所述方法包括在适于表达编码所述抗体或其片段(优选的抗原结合片段)或其任一条或两条链的核酸的条件下培养所述宿主细胞，以及任选地分离所述抗体或其片段(优选地抗原结合片段)。在某个实施方案中，所述方法还包括从宿主细胞回收抗FRα抗体或其片段(优选地抗原结合片段)。
可以将编码本发明抗体的多肽链的多核苷酸插入一个或多个载体中以便进一步在宿主细胞中克隆和/或表达。可以使用本领域技术人员熟知的方法来构建表达载体。一旦已经制备了用于表达的包含本发明的一种或多种核酸分子的表达载体，则可以将表达载体转染或引入适宜的宿主细胞中。多种技术可以用来实现这个目的，例如，原生质体融合、磷酸钙沉淀、电穿孔、逆转录病毒的转导、病毒转染、基因枪、基于脂质体的转染或其他常规技术。
如本文所述制备的抗体可以通过已知的现有技术如高效液相色谱、离子交换层析、凝胶电泳、亲和层析例如Protein A、尺寸排阻层析等纯化。用来纯化特定蛋白质的实际条件还取决于净电荷、疏水性、亲水性等因素，并且这些对本领域技术人员是显而易见的。
可以通过多种熟知分析方法中的任一种方法确定本发明的抗体分子的纯度，所述熟知分析方法包括尺寸排阻层析、凝胶电泳、高效液相色谱等。
V.测定法
可以通过本领域中已知的多种测定法对本文中提供的抗FRα抗体鉴定，筛选，或表征其物理/化学特性和/或生物学活性。
一方面，对本发明的抗体测试其抗原结合活性，例如通过已知的方法诸如生物膜薄层干涉技术、ELISA，等来进行。可使用本领域已知方法来测定对FRα的结合，本文中公开了例示性方法。在一些实施方案中，使用放射性免疫测定(RIA)或生物膜薄层干涉测定法(BLI)或电化学发光(ECL)或表面等离子体共振法(SPR)或流式细胞术(FACS)测量。
本发明还提供了用于鉴定具有生物学活性的抗FRα抗体的测定法。生物学活性选自本发明的抗体的性质，可以包括例如结合FRα(例如结合人和/或恒河猴FRα)、细胞内吞活性或包含所述抗体的分子的杀伤活性等。
例如，对于本发明的抗体分子对FRα或表达FRα的细胞的结合活性，可以通过本领域已知的方法，例如Fortebio、流式细胞术、Octet或等离子共振(Biacore)等，或本文实施例公开的示例性方法测定。
例如，对于本发明的抗体分子的细胞(例如FRα阳性细胞)内吞活性，可以通过本领域已知的方法，例如流式细胞术，或本文实施例中公开的示例性方法测定。
例如，对于包含本发明的抗体分子的杀伤活性，可以通过本领域已知的方法，例如细胞杀伤实验，如体外细胞杀伤实验，或本文实施例中公开的示例性方法测定。
例如，对于本发明的抗体分子的药物动力学性质，可以通过本领域已知的方法，例如本文实施例公开的示例性方法测定。
供任何上述体外测定法使用的细胞包括天然表达FRα或经改造而表达FRα细胞系。此类细胞还包括表达FRα和并非正常情况下表达FRα的编码FRαDNA转染的细胞系。
可以理解的是，能够使用本发明的免疫缀合物替换或补充抗FRα抗体来进行任何上述测定法。
可以理解的是，能够使用抗FRα抗体和别的活性剂组合来进行任何上述测定法。
VI.免疫缀合物
在一些实施方案中，本发明提供了免疫缀合物，其包含本文中提供的任何抗FRα抗体和其它物质，例如治疗剂或标记。在一些实施方案中，治疗剂可以是适合与FRα形成免疫缀合物的治疗剂，例如免疫调节剂，例如抗炎剂或免疫抑制剂。在一些实施方案中，治疗剂选自化疗剂、细胞毒性剂、细胞因子、小分子药物、免疫调节剂(例如免疫抑制剂)或其他抗体。
在一些实施方案中，所述免疫缀合物用于预防或治疗FRα相关疾病，例如肿瘤或癌症。
VII.药物组合物和药物制剂
在一些实施方案中，本发明提供包含本文所述的任何抗FRα抗体或其片段(优选地其抗原结合片段)或其免疫缀合物的组合物，优选地组合物为药物组合物或药物制剂。在一个实施方案中，所述组合物还包含药用辅料。在一个实施方案中，组合物，例如，药物组合物，包含本发明的抗FRα抗体或其片段或其免疫缀合物，以及一种或多种其它治疗剂(例如如化疗剂、细胞因子、细胞毒性剂、其它抗体、疫苗、小分子药物或免疫调节剂(例如免疫抑制剂))的组合。本发明还包括包含编码抗FRα抗体的多核苷酸的组合物(包括药物组合物或药物制剂)。
在某些实施方案中，组合物包含一种或多种结合FRα的抗体或其片段，或一种或多种编码一种或多种抗FRα的抗体或其片段的多核苷酸。这些组合物还可以包含合适的药用辅料，如本领域中已知的药用载体、药用赋形剂，包括缓冲剂。
如本文所用，“药用载体”包括生理上相容的任何和全部溶剂、分散介质、等渗剂和吸收延迟剂等。
对于药用辅料的使用及其用途，亦参见“Handbook of PharmaceuticalExcipients”,第八版,R.C.Rowe,P.J.Seskey和S.C.Owen,Pharmaceutical Press,London,Chicago。
本发明的组合物可以处于多种形式。这些形式例如包括液体、半固体和固体剂型，如液态溶液剂(例如，可注射用溶液剂和可输注溶液剂)、散剂或混悬剂、脂质体剂和栓剂。优选的形式取决于预期的施用模式和治疗用途。
可以通过将具有所需纯度的本发明的抗体与一种或多种任选的药用辅料混合来制备包含本文所述的抗体的药物制剂，优选地以冻干制剂或水溶液的形式。
本发明的药物组合物或制剂还可以包含超过一种活性成分，所述活性成分是被治疗的特定适应证所需的，优选具有不会不利地彼此影响的互补活性的那些活性成分。例如，理想的是还提供其它治疗剂，例如如化疗剂、细胞因子、细胞毒性剂、其它抗体、小分子药物或免疫调节剂(例如免疫抑制剂)。所述活性成分以对于目的用途有效的量合适地组合存在。
VIII.药物组合和药盒
在一些实施方案中，本发明还提供了药物组合或药物组合产品，其包含本发明的抗FRα抗体或其片段(优选的抗原结合片段)，或其免疫缀合物，以及一种或多种其它治疗剂(例如如化疗剂、细胞因子、细胞毒性剂、其它抗体、疫苗、小分子药物或免疫调节剂(例如免疫抑制剂)。
本发明的另一个目的是提供一种成套药盒，其包含本发明的药物组合，优选地所述药盒为药物剂量单元形式。由此可以依据给药方案或药物施用间隔提供剂量单元。
在一个实施方案中，本发明的成套药盒在同一包装内包含：
-含有包含抗FRα抗体或其片段的药物组合物的第一容器；
-含有包含其它治疗剂如化疗剂、细胞因子、细胞毒性剂、其它抗体、疫苗、小分子药物或免疫调节剂(例如免疫抑制剂)的药物组合物的第二容器。
在一些实施方案中，所述组合产品用于预防或治疗FRα相关疾病，例如肿瘤或癌症。
IX.用途和方法
本发明一方面提供了在受试者中治疗FRα相关疾病的方法，包括向受试者施用有效量的本发明的抗FRα的抗体或其抗原结合片段、免疫缀合物、药物组合物或组合产品。
在一些实施方案中，本文所述的FRα相关疾病包括肿瘤，例如癌症。癌症可以处于早期、中期或晚期或是转移性癌。在一些实施方案中，癌症可以是实体肿瘤或血液肿瘤。在一些实施方案中，所述癌症是例如上皮细胞癌，例如肺癌(例如非小细胞肺癌)、口腔癌(如口腔上皮癌)、卵巢癌、乳腺癌、间质瘤、子宫内膜癌或宫颈癌。
在一个实施方案中，所述肿瘤是指在个体的肿瘤组织或肿瘤细胞中高表达FRα的肿瘤。在一个实施方案中，所述肿瘤是指在个体的肿瘤组织或肿瘤细胞中，例如与个体的相邻正常组织或正常细胞(例如组织中的正常细胞)或健康个体的相同组织或其中的细胞相比，FRα的蛋白质水平(例如表达)升高，或FRα的核酸水平升高。
在其他方面，本发明提供抗FRα抗体或其片段在生产或制备药物中的用途，所述药物用于治疗本文提及的相关疾病或病症。
在一些实施方案中，本发明的抗体或抗体片段或免疫缀合物或组合物或产品会延迟病症和/或与病症相关的症状的发作。
在一些实施方案中，本文所述的预防或治疗方法还包括向所述受试者或个体组合施用本文公开的抗体分子或药物组合物或免疫缀合物，以及一种或多种其它疗法，例如治疗方式和/或其它治疗剂。
在一些实施方案中，治疗方式包括外科手术、放射疗法(例如，外粒子束疗法，它涉及其中设计照射区域的三维适形放射疗法)、局部照射(例如，指向预选靶或器官的照射)或聚焦照射)等。
在一些实施方案中，治疗剂选自化疗剂、细胞因子、细胞毒性剂、其它抗体、疫苗、小分子药物或免疫调节剂(例如免疫抑制剂)等。
在一些实施方案中，本文中描述的抗体可以与其他抗体组合，用于分别施用，例如，分别作为单独的抗体分别施用，或连接时(例如作为双特异性或多特异性抗体分子)施用。
此类组合疗法涵盖组合施用(例如两种或更多种治疗剂包含在同一配制剂或分开的配制剂中)，和分开施用，在该情况中，可以在施用别的治疗剂和/或药剂之前，同时，和/或之后发生本发明的抗体的施用。
本发明的抗FRα抗体(以及包含其的免疫缀合物、组合物、药物组合物、制剂、组合产品等)可以通过任何合适的方法给药，包括肠胃外给药，并且，如果局部治疗需要，病灶内给药。肠胃外注射或输注包括肌内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下注射或输注。在一定程度上根据用药是短期或长期性而定，可通过任何适合途径，例如通过注射，例如静脉内或皮下注射用药。本文中涵盖各种用药时程，包括，但不限于，单次给药或在多个时间点多次给药、推注给药及脉冲输注。
为了预防或治疗疾病，本发明的抗FRα抗体或其片段(以及包含其的免疫缀合物、组合物、药物组合物、制剂、组合产品等)的合适剂量(当单独或与一种或多种其他的治疗剂组合使用时)将取决于待治疗疾病的类型、抗体的类型、疾病的严重性和进程、以预防目的施用还是以治疗目的施用、以前的治疗、患者的临床病史和对所述抗体的应答，施用模式；施用制剂的生物利用率特征；选择的给药方案；任何伴随疗法的使用和主治医师的判断力。所述抗体以一次治疗或经过一系列治疗合适地施用于患者。
在其他方面，本发明提供本发明的抗FRα抗体或其片段或包含其的免疫缀合物或组合物在生产或制备药物中的用途，所述药物用于本文所述的用途，例如用于预防或治疗本文提及的相关疾病或病症。
在一些实施方案中，抗FRα抗体或其片段(以及包含其的免疫缀合物、组合物、药物组合物、制剂等)还能与一种或多种其它疗法例如治疗方式和/或其它治疗剂组合施用，用于本文所述的用途，例如用于预防和/或治疗本文提及的相关疾病或病症。
X.用于诊断和检测的方法和组合物
在一个方面，本发明还涉及对本发明抗体或其抗原结合片段的用于诊断和检测的方法和包含其的用于诊断和检测的组合物。
在某些实施方案中，本文中提供的任何抗FRα抗体或其抗原结合片段可以用于检测FRα在生物样品中的存在。
术语“检测”用于本文中时，包括定量或定性检测，示例性的检测方法可以涉及免疫组织化学、免疫细胞化学、流式细胞术(例如，FACS)、抗体分子复合的磁珠、ELISA测定法、PCR-技术(例如，RT-PCR)。在某些实施方案中，生物样品是血、血清或生物来源的其他液体样品。在某些实施方案中，生物样品包含细胞或组织。在一些实施方案中，生物样品来自肿瘤组织或癌症组织。
在一个实施方案中，提供用于诊断或检测方法的抗FRα抗体。
在另一个方面中，提供检测FRα在生物样品中的存在的方法。在某些实施方案中，所述方法包含检测FRα蛋白在生物样品中的存在。在某些实施方案中，FRα是人FRα或恒河猴FRα。在某些实施方案中，所述方法包括将生物样品与如本文所述的抗FRα抗体在允许抗FRα抗体与FRα结合的条件下接触，并检测在抗FRα抗体和FRα之间是否形成复合物。复合物的形成表示存在FRα。该方法可以是体外或体内方法。在一个实施方案中，抗FRα抗体被用于选择适合利用抗FRα抗体的治疗的受试者，例如其中FRα是用于选择所述受试者的生物标记物。
在某些实施方案中，提供检测样品中FRα的方法，所述方法包括
(a)将样品与本发明的抗FRα抗体或其抗原结合片段接触；和
(b)检测抗FRα抗体或其抗原结合片段和FRα间的复合物的形成；任选地，抗FRα抗体是被可检测地标记的。
在某些实施方案中，提供标记的抗体或其片段。标记包括但不限于，被直接检测的标记或部分(如荧光标记、发色团标记、电子致密标记、化学发光标记和放射性标记)，以及被间接检测的部分，如酶或配体，例如，通过酶促反应或分子相互作用。
在本文中提供的一些实施方案中，样品是在用本发明的抗体或其片段治疗之前获得的。在一些实施方案中，样品是在用其他疗法之前获得的。在一些实施方案中，样品是在用其他疗法治疗过程中，或者用其他疗法治疗后获得的。
在一些实施方案中，在治疗之前，例如，在起始治疗之前或在治疗间隔后的某次治疗之前检测FRα。
在一些实施方案中，提供了一种治疗本发明疾病的方法，所述方法包括：对受试者(例如，样品)(例如，受试者样品)检验FRα的存在，因而确定FRα值，将FRα值与对照值(例如健康个体或正常组织中的值)比较，并且如果FRα值大于对照值，则向受试者施用治疗有效量的任选与一种或多种其他疗法组合的本发明所述的抗体或其片段，因而治疗所述疾病。
在一些实施方案中，提供了一种治疗本发明疾病的方法，所述方法包括：对受试者(例如，样品)(例如，受试者样品)检验FRα的存在，因而确定FRα值，将FRα值与对照值(例如正常个体中的值)比较，并且如果FRα值大于对照值，则向受试者施用治疗有效量的任选与一种或多种其他疗法组合的本发明所述的抗体或其片段或包含其的免疫缀合物、组合物、药物组合物、制剂、组合产品等，因而治疗所述疾病。
本发明的这些以及其它方面和实施方案在附图(附图简述紧随其后)和以下的发明详述中得到描述并且示例于以下实施例中。上文以及整个本申请中所论述的任何或所有特征可以在本发明的各种实施方案中组合。以下实施例进一步说明本发明，然而，应理解实施例以说明而非限定的方式来描述，并且本领域技术人员可以进行多种修改。
实施例：
实施例1：鼠源单克隆抗体的筛选
1.1骨髓瘤细胞培养
骨髓瘤细胞P3X63Ag8.653(南京科佰公司，货号CBP60876)使用含有20ug/mL 8-氮鸟嘌呤(Merck#134-58-7)的培养基连续传代，在5％CO2，37℃细胞培养箱中培养。
1.2小鼠免疫
使用商业化重组人FRα-his蛋白(近岸公司目录号C784)按照文献所述常规方法(Lonberg,N.,et al.,nature 368(1994)856-859；Fishwild,D.M.,et al.,Nat.Biotechnol.14(1996)845-851and WO 98/24884)对10只Balb/c小鼠进行免疫。对每只小鼠使用重组人FRα进行4次皮下(SC)免疫。对于第一次免疫，将100ul(75ug)的重组人FRα溶液与100ul的完全弗氏佐剂混合，对于其它免疫，使用100ul(75ug)的重组人FRα溶液与100ul不完全弗氏佐剂混合。
1.3抗原特异性ELISA检测小鼠血清滴度
通过抗原特异性ELISA来确定免疫小鼠血清中的抗FRα效价。将浓度为1ug/ml的FRα溶液包被在96孔板中，每孔100ul，4℃过夜孵育。然后洗去包被液，使用封闭液(protein-free blocking buffer)加入每孔，室温静置孵育2小时。将小鼠血清在PBSA(含1％ BSA的PBS溶液)中预稀释100倍，并1:2连续稀释10个稀释梯度。洗去包被液后，将稀释的血清加入板孔中在室温孵育1个小时。用PBST洗涤96孔板后加入100ul/孔1/30000稀释的二抗(HRP标记的羊抗鼠IgG(Jackson#515-035-003))室温静置孵育45分钟，PBST洗涤三遍，加入室温平衡的TMB 20ul/孔，室温孵育10分钟，在650nm测量吸光度(图1)。
1.4小鼠的加强免疫
对抗FRα的血清效价大于1:100000的小鼠，在融合前4天，用溶于100ul PBS的100ug FRα溶液对小鼠进行另外的腹腔注射(IP)加强免疫一次。
实施例2抗人FRα抗体的制备和表征
2.1过表达人/猴FRα的HEK293细胞和CHO细胞株制备：
将人FRα的ORF(NCBI：NM_000802.3)和恒河猴FRα的ORF(NCBI：NM_001194647.3)分别构建插入pcDNA5/FRT载体(Invitrogen#V790-20)的多克隆位点中，依照Flp-In系统(Invitrogen，货号K6010)的操作说明，将构建好的重组质粒用lipofectamine3000试剂转染Flp-In HEK293细胞(Invitrogen公司#R758–07)和Flp-In CHO细胞(Invitrogen公司#R750–07)，转染48小时后，使用100μg/mL的Hygromycin进行筛选培养，10天后使用流式细胞仪将细胞进行单克隆分选，选择生长良好的单克隆使用特异性结合FRα的抗体进行鉴定并扩大培养，获得过表达hFRα的CHO细胞(命名为CHO-hFOLR1)、HEK293细胞(命名为HEK293-hFOLR1或HEK293-FRα)和过表达恒河猴FRα的CHO细胞(命名为CHO-cynoFOLR1)，用于细胞学实验。
2.2抗人FRα杂交瘤产生及检测
取实施例1获得的小鼠脾脏，将分离得到的脾细胞与骨髓瘤细胞P3X63Ag8.653使用电融合方法进行融合。将融合后的杂交瘤细胞接种于384孔板中，培养14天后，以人FRα-His重组蛋白(1ug/ml，pH9.6，0.1M NaHCO3)包被酶标板，4℃过夜孵育；用4％脱脂奶粉-PBS封闭，37℃，2小时孵育；用PBST(0.05％Tween20-PBS)洗三遍，加入杂交瘤克隆培养上清，37℃孵育1小时。经PBST(0.05％Tween20-PBS)洗三遍，加入HRP-羊抗小鼠IgG(Fcγ)(Jackson#515-035-071)，1:20000稀释，37℃孵育1小时；再经PBST(0.05％Tween20-PBS)洗五遍，加入TMB显色液，避光显色10min，酶标仪读A650光吸收值。(图2)
使用96孔板检测过表达hFRα的CHO细胞(CHO-hFOLR1)的流式结合能力，每个检测孔使用2×105个细胞，加入杂交瘤上清20ul。4℃孵育1小时后，用PBS清洗；加入稀释1000倍的FITC标记抗人抗体的二抗(Jackson#109-095-098)，100mL/孔重悬细胞，4℃孵育1小时后，用PBS清洗，在流式细胞分析仪上分析(图3)。以同样的方法，使用过表达cyno FRα的CHO细胞(CHO-cynoFOLR1)，对候选克隆的上清做流式分析筛选。经检测鉴定，共获得多个分泌阳性FRα抗体，同时识别猴FRα分子的杂交瘤克隆。(图4)
2.3亚克隆
将结合实验筛选得到的特异性识别人FRα的杂交瘤细胞克隆，通过有限稀释的方法单细胞化，两轮亚克隆之后得到的每个杂交瘤细胞克隆只分泌一个抗体。
2.4抗体轻链可变区IgG VL和重链可变区IgG VH序列的克隆
根据特异性结合实验结果，选择结合能力强的抗体克隆。杂交瘤细胞扩大培养后，按照RNAfast200试剂盒(上海飞捷生物技术有限公司)说明书步骤提取细胞总RNA；利用5×PrimeScript RT Master Mix(Takara)将杂交瘤细胞总RNA反转录成cDNA；使用简并引物(Anke Krebber.1997)和Extaq PCR试剂(Takara)扩增抗体轻链可变区VL和重链可变区VH序列；利用PCR clean-up Gel extraction试剂盒(Macherey-Nagel公司)纯化PCR扩增产物；按照pClone007 Simple Vector Kit试剂盒(擎科生物科技有限公司)说明书将扩增PCR产物连接至T载体并转化大肠杆菌感受态细胞，菌株扩增、抽提质粒后进行DNA测序获得单克隆抗体可变区序列。
2.5抗人FRα噬菌体展示文库的制备和抗体筛选
收集免疫小鼠骨髓B细胞。用Qiagen RNA提取试剂盒从B细胞中提取总RNA，用逆转录试剂盒(Takara#RR037A)利用随机引物逆转录得到cDNA，以该cDNA为模板，利用抗体可变区引物PCR扩增得到抗体重轻链可变区片段；经overlap PCR获得单链抗体scFv片段。Sfi I酶切后，克隆到自主构建的噬菌体质粒pBluescript SK/KS中。然后构建基于丝状噬菌体M13的小鼠scFv噬菌体展示文库，库容为6x108。
取10ug生物素化的人FRα重组蛋白，与SA磁珠4度孵育过夜。用PBS-吐温(0.5％v/v)和PBS进行5轮洗涤，加入到1ml噬菌体中，旋转混匀结合约10分钟。用PBS-吐温(0.5％v/v)和PBS进行15轮洗涤以除去未结合的噬菌体，洗涤后的磁珠用来感染对数期大肠杆菌TG1细菌，拯救以进行下一轮富集筛选。第二轮筛选将投入的抗原降为5ug，第三轮为2ug。经过三轮富集筛选后，各取每一轮的少量TG1大肠杆菌涂LB平板，37度过夜培养后挑取单克隆至96孔U型孔板中进行IPTG诱导表达，取上清进行ELISA检测筛选，ELISA阳性克隆经测序获得抗体可变区的序列。
2.6抗人FRα嵌合抗体的制备
将鼠源抗人FRα单克隆抗体的重链可变区编码核酸序列和公开发表的人单克隆抗体IgG1亚类的重链恒定区序列编码核酸序列(SEQ ID NO:73)拼接在一起，构建到哺乳动物细胞表达载体pcDNATM3.1(+)(Invitrogen#V790-20)中；将鼠源抗人FRα单克隆抗体的轻链可变区编码核酸序列和公开发表的人单克隆抗体κ亚类的轻链恒定区编码核酸序列(SEQID NO:87)拼接在一起，构建到哺乳动物细胞表达载体pcDNATM3.1(+)(Invitrogen#V790-20)中。构建好的抗人α嵌合抗体的重链载体和轻链载体配对混合，使用聚乙烯亚胺(PEI)转染HEK293细胞，约7天后收集细胞上清，使用ProteinA纯化得到抗人FRα嵌合抗体蛋白。
类似的构建对照抗体MIRV(US20200362029A1)。
获得的嵌合抗体的可变区序列和CDR序列的SEQ ID NO如下表1。
后文在提及这些嵌合抗体时，应用抗体编号或应用抗体编号-xiIgG，其均代表具有表1所示的抗体编号下的可变区和IgG1的重链恒定区和κ亚类轻链恒定区的嵌合抗体。
表1，具有如下编号的嵌合抗体的可变区和CDR序列。
2.7FRα嵌合抗体的体外亲和力的动力学研究
利用Fortebio(BLITZ pro1.1.0.28)仪器分析嵌合抗体与抗原人FRα(近岸蛋白#C784)的结合动力学参数。测定前先将AHC生物探针(AHC，Satorius#18-5064)浸泡于PBS中10分钟；然后将该探针置于含100nM的抗体中，固化高度在1nm，进一步将探针与100nM抗原进行结合反应，结合时间400秒；之后将探针转移至PBS中，进行解离反应，时间为600秒。实验完毕，扣除空白对照响应值，用软件进行1：1Langmuir结合模式拟合，计算抗原抗体结合的动力学常数，获得多个高亲和力嵌合抗体分子(图5-9；表2-6)。
表2抗FRα嵌合抗体体外结合能力
| Sensor Type | Antigen | Sample ID | Conc.(nM) | Response | KD(M) | kon(1/Ms) | kdis(1/s) | Full R^2 |
| AHC | hFOLR1 | 2F22 | 100 | 0.28 | 5.18E-10 | 1.41E+05 | 7.28E-05 | 0.998 |
| AHC | hFOLR1 | 8B23 | 100 | 0.2262 | 5.66E-09 | 1.11E+05 | 6.25E-04 | 0.999 |
| AHC | hFOLR1 | 11F9 | 100 | 0.3374 | <1.0E-12 | 1.94E+05 | <1.0E-07 | 0.999 |
| AHC | hFOLR1 | 14B16 | 100 | -0.0244 | 1.49E+07 | 2.22E+07 | 3.30E+14 | 0 |
| AHC | hFOLR1 | 15J13 | 100 | -0.0305 | 7.84E+12 | 1.79E+10 | 1.41E+23 | 0 |
| AHC | hFOLR1 | MIRV | 100 | 0.2462 | 1.57E-10 | 2.33E+05 | 3.65E-05 | 0.997 |
| AHC | hFOLR1 | NC | 100 | -0.043 | 1.38E+13 | 5.15E+09 | 7.12E+22 | 0 |
表3抗FRα嵌合抗体体外结合能力
| Sensor Type | Antigen | Sample ID | Conc.(nM) | Response | KD(M) | kon(1/Ms) | kdis(1/s) | Full R^2 |
| AHC | hFOLR1 | 19M21 | 100 | 0.025 | 1.06E-08 | 1.14E+06 | 1.20E-02 | 0.904 |
| AHC | hFOLR1 | 22J13 | 100 | -0.033 | 1.21E+08 | 3.18E+06 | 3.84E+14 | 0 |
| AHC | hFOLR1 | 25C8 | 100 | 0.0626 | 1.46E-08 | 8.28E+05 | 1.21E-02 | 0.919 |
| AHC | hFOLR1 | 25J13 | 100 | 0.235 | 2.43E-09 | 1.67E+05 | 4.05E-04 | 0.998 |
| AHC | hFOLR1 | MIRV | 100 | 0.2321 | 7.12E-10 | 2.85E+05 | 2.03E-04 | 0.997 |
| AHC | hFOLR1 | NC | 100 | -0.0497 | 2.09E+22 | 1.03E+04 | 2.15E+26 | 0 |
表4抗FRα嵌合抗体体外结合能力
| Sensor Type | Antigen | Sample ID | Conc.(nM) | Response | KD(M) | kon(1/Ms) | kdis(1/s) | Full R^2 |
| AHC | hFOLR1 | 10L17 | 100 | 0.1289 | 3.8E-08 | 315000 | 0.012 | 0.9771 |
| AHC | hFOLR1 | 13M15 | 100 | 0.1728 | 3.97E-08 | 232000 | 0.00921 | 0.9947 |
| AHC | hFOLR1 | 7G23 | 100 | 0.2891 | 1.23E-08 | 158000 | 0.00194 | 0.9989 |
| AHC | hFOLR1 | 5M21 | 100 | 0.2555 | 1.36E-08 | 113000 | 0.00153 | 0.9972 |
| AHC | hFOLR1 | MIRV | 100 | 0.3086 | 1.22E-09 | 220000 | 0.000269 | 0.9991 |
| AHC | hFOLR1 | NC | 100 | 0.0052 | <1.0E-12 | 23400 | <1.0E-07 | 0.5678 |
表5抗FRα嵌合抗体体外结合能力
| Sensor Type | Antigen | Sample ID | Conc.(nM) | Response | KD(M) | kon(1/Ms) | kdis(1/s) | Full R^2 |
| AHC | hFOLR1 | 12J4 | 100 | 0.1146 | 3.93E-08 | 101000 | 0.00396 | 0.9907 |
| AHC | hFOLR1 | 10O6 | 100 | 0.0739 | 1.48E-08 | 60800 | 0.000901 | 0.9848 |
| AHC | hFOLR1 | 8N3 | 100 | 0.0261 | 8.84E-09 | 554000 | 0.0049 | 0.8322 |
| AHC | hFOLR1 | pha3 | 100 | 0.3769 | 4.39E-09 | 191000 | 0.000835 | 0.9985 |
| AHC | hFOLR1 | MIRV | 100 | 0.2909 | 1.59E-09 | 196000 | 0.000312 | 0.9992 |
| AHC | hFOLR1 | NC | 100 | 0.0033 | <1.0E-12 | 11300 | <1.0E-07 | 0.3215 |
表6抗FRα嵌合抗体体外结合能力
| Sensor Type | Antigen | Sample ID | Conc.(nM) | Response | KD(M) | kon(1/Ms) | kdis(1/s) | Full R^2 |
| AHC | hFOLR | 45A3 | 50 | 0.3444 | 1.57E-10 | 8.07E+05 | 1.27E-04 | 0.9986 |
| AHC | hFOLR | 45B1 | 50 | 0.3645 | 1.98E-10 | 8.41E+05 | 1.66E-04 | 0.9988 |
| AHC | hFOLR | MIRV | 50 | 0.3337 | 5.13E-10 | 7.09E+05 | 3.64E-04 | 0.9987 |
| AHC | FOLR1 | NC | 50 | 0.0046 | -- | -- | -- | -- |
2.8FRα嵌合抗体的体外亲和力的流式细胞术评估
利用细胞膜表面表达FRα的人非小细胞肺癌细胞NCI-H2110(南京科佰#CBP60071)，人卵巢癌细胞SKOV3(南京科佰#CBP60291)等评估候选抗体的结合情况，每个待测抗体样品使用2×105个细胞，使用PBS清洗细胞两次。FRα待测抗体使用1％BSA稀释至高(0.4ug/mL)、中(0.1ug/mL)、低(0.01ug/mL)3个梯度点，使用稀释好的抗体重悬细胞；4℃孵育1小时后，PBS清洗；FITC标记的抗人抗体的二抗(Jackson#109-095-098)稀释1000倍使用(10ul抗体溶液，加入9.99mLPBS稀释为10mL工作液)，100mL/孔重悬细胞，4℃孵育1小时；PBS清洗后流式细胞分析仪(Satorius公司iQue Plus)进行分析(图10-13)。
从图中可知，本发明的抗体，特别是2F22、Pha3等在不同浓度下均与细胞结合，且显示与对照抗体MIRV(Mirvecuximab)相当的结合能力。
2.9FRα嵌合抗体的体外细胞内吞实验评估
FRα嵌合抗体的体外细胞内吞实验评估使用人非小细胞肺癌细胞NCI-H2110作为靶细胞进行实验。对待测抗体使用DOJINDO的LK01试剂盒进行FITC荧光标记，标记后的抗体使用1％BSA稀释至5μg/mL，NCI-H2110细胞培养至状态最佳，每个样品使用2×105个细胞，用PBS清洗细胞两次后重悬至2％BSA中；将细胞和待测抗体按1:1体积混匀，分为三份，分别放置于冰上两份，放置于37℃培养箱一份，孵育4.5小时。孵育完成后，将冰上的一份使用PBS清洗，另一份冰上孵育样本和37℃培养箱一份使用柠檬酸缓冲液，pH2.7缓冲液浸泡10分钟，将细胞表面未内吞的抗体清除。清洗后PBS重悬，流式仪读取MFI(表6)。
表7抗体分子诱导FRa+细胞内吞的活性检测
内吞效率计算公式为：内吞效率＝(37℃MFI－4℃MFI)÷4℃MFI(PBS)×100％
MIRV.:Mirvetuximab NC:IgG1，阴性对照
从上表可以看出，接受检测的抗体均表现出诱导内吞活性，其中2F22、Pha3、10L17等，均显示出优于或者相当于MIRV的活性。
2.10FRα嵌合抗体ADC的体外细胞杀伤实验评估
FRα嵌合抗体ADC的体外细胞杀伤实验评估使用HEK293-hFOLR1(HEK293-FRα)细胞和KB细胞(ATCC#CCL-17)进行。
ADC如下制备：
在pH为7.4的PBS中，2.0-2.6当量TECP还原抗体2小时后，6eq vcMMAE DMA溶液加入到还原后的抗体溶液中，2-8℃搅拌1小时后超滤换液除去DMA和小分子残留。紫外分光光度计测定偶联物在248nm～280nm处的吸光值，计算得到偶联物的浓度。样品分装到冻存管中-80℃保存。样品的DAR值由HPLC-HIC测定。
将细胞密度调整至5×104/mL，100μL/孔铺于96孔白板中。实验第二天，使用培养基(KB细胞培养基为EMEM+10％FBS；293细胞培养基为DMEM+10％ FBS)稀释待测抗体至10μg/mL，然后3倍稀释，设置10个梯度。按50μL/孔加入细胞培养板中，二氧化碳培养箱孵育96小时。孵育完毕后，按照100μL/孔加入配置好的Cell titer Glo(promega货号G7570)，裂解10分钟后，酶标仪读取荧光值。数据采用softmax pro7软件进行4参数拟合曲线(图14-21)。
上述抗体制备ADC后，显示出了对2种FRa+肿瘤细胞的杀伤活性，其中7G23、10L17、13M15在不同的细胞中显示出了优于或者相当于对标抗体ADC的细胞杀伤能力。
实施例3鼠源抗FRα抗体人源化及其表征
3.1鼠源抗人FRα抗体人源化
选择高亲和力，高阻断能力的分子，综合Kabat、Chothia的抗体编码方案，确定鼠源抗体的重链和轻链的6个抗原互补决定簇(CDR)的氨基酸序列区域及支撑抗体保守三维构象的框架区域(framework region)。随后通过分析搜索已知人源抗体序列，选择与鼠源抗体最为相似接近的人源抗体重链可变区序列，选择其抗体框架区序列作为模板，将鼠源抗体重链CDR与人源抗体框架区结合，最终生成人源化抗体重链可变区序列。同样过程，生成人源化抗体轻链可变区序列，并将框架区个别氨基酸从人源的改回鼠源的。确定回复突变位点，一是对照设计好的人源化抗体序列和原始的鼠源抗体序列，检查有哪些氨基酸的不同；二是检查这些氨基酸是否对支持抗体结构起重要作用或者对与抗原的结合起重要作用，同时需要检查是否有一些潜在的翻译后修饰位点，如N(天冬酰胺)糖基化位点、N脱酰胺化位点、D(天冬氨酸)异构化位点(例如，将Pha3的轻链CDR2上的DG突变为EG，从而消除抗体的分子异构化的潜在风险)等。获得2F22、Pha3、45B1和45A3的人源化抗体。
将工程改造后人源化抗体可变区重链基因构建到含人单克隆抗体IgG1亚类的重链恒定区基因(SEQ ID NO:73)的哺乳动物细胞表达载体pcDNATM3.1(+)(invitrogen#V790-20)中；轻链可变区基因构建到含人单克隆抗体κ亚类的轻链恒定区基因(SEQ ID NO:87)的哺乳动物细胞表达载体中。构建好的抗人FRα人源化抗体的重链载体和轻链载体配对混合，使用聚乙烯亚胺(PEI)转染HEK293细胞，约7天后收集细胞上清，使用ProteinA纯化得到抗人FRα人源化抗体蛋白。
人源化抗体序列参见下表8：
表8：人源化抗体的VH、VL和CDR序列。
3.2抗FRα人源化抗体的Octet评估
利用Fortebio(BLITZ pro1.1.0.28)仪器分析人源化抗体与抗原人FRα(hFOLR1，近岸蛋白#C784)的结合动力学参数。测定前先将AHC生物探针浸泡于PBS中10分钟；然后将该探针置于含100nM的抗体中，固化高度在1nm，进一步将探针与100nM抗原进行结合反应，结合时间400秒；之后将探针转移至PBS中，进行解离反应，时间为600秒。实验完毕，扣除空白对照响应值，用软件进行1：1Langmuir结合模式拟合，计算抗原抗体结合的动力学常数(图22,23；表9-10)。
表9：一组抗体和FRα分子之间的亲和力
表10一组抗体和FRα分子之间的亲和力
3.3抗FRα人源化抗体的Biacore评估
采用GE公司BIAcore仪器S200测定抗体抗原相互作用力。参考GE公司操作说明，首先在传感芯片CM5分析通道和对照样品通道都偶联抗人Fc抗体(GE公司Human AntibodyCapture Kit.Cat#BR-1008-39)，捕获人FRα抗体样品(100nM)，然后在分析通道和对照样品通道一起流过梯度稀释的人FRα抗原(Human FOLR1,近岸蛋白#C784)或恒河猴FRα(NCBI：NP_001181576.1)(起始浓度100nM，1:2梯度稀释)，测定抗体抗原结合后发生的光反应值。经仪器软件拟合分析(5个梯度稀释浓度点)，最终得到抗体的结合常数Kon和解离常数Koff，以及亲和力常数KD。结果参见图24和图25和表11-12。
表11：抗体与人FRα分子之间的亲和力
表12：抗体和cynoFRα的亲和力检测
如上可见，hz45A3和hz45B1分子与人和猴FRa的亲和力高于对照分子(MIRV,Mirvetuximab)。
3.4.FRα人源化抗体的体外亲和力的流式评估
使用过表达FRα的HEK293细胞HEK293-hFOLR1，口腔上皮癌细胞KB(ATCC#CCL-17)评估人源化抗体的结合情况，每个样品使用2×105个细胞，使用PBS清洗细胞两次。FRα待测抗体使用1％BSA稀释至高(10μg/mL)、中(1μg/mL)、低(0.1μg/mL)3个梯度点，使用稀释好的抗体重悬细胞；4℃孵育1小时后，PBS清洗；FITC标记的抗人抗体的二抗(Jackson#109-095-098)稀释1000倍使用，100mL/孔重悬细胞，4℃孵育1小时；PBS清洗后流式细胞分析仪进行分析(图26,27)。
可见，工程化改造过的分子表现出了不同的亲和力，其中2F22-H1L0、Pha3-H1L2等分子显示出了优于或者相当对标分子的FRa+细胞结合能力。
3.5.FRα人源化抗体的体外亲和力的流式评估
使用过表达FRα的HEK293细胞HEK293-hFOLR1(HEK293-hFRα)_，以及口腔上皮癌细胞KB(ATCC#CCL-17)评估人源化抗体的结合情况，每个样品使用2×105个细胞，使用PBS清洗细胞两次。FRα待测抗体使用含1％BSA的FBS溶液做1:4梯度稀释，将200ul抗体溶液，起始浓度为10ug/mL，依次加入到含有400uL FBS_1％BSA溶液的下一个稀释度试管，共得到7个稀释浓度。使用稀释好的抗体重悬细胞至100uL，4℃孵育1小时后PBS清洗；使用FBS_1％BSA稀释1000倍的FITC标记的抗人抗体的二抗(Jackson#109-095-098)，100uL/孔重悬细胞，4℃孵育1小时后PBS清洗。使用流式细胞分析仪进行分析(图28和29和表13、14)。
表13：抗体同过表达FRα的HEK293细胞的结合能力
| MIRV | Hz45A3 | Hz45B1 | |
| EC50(ug/mL) | 9.84E-01 | 9.41E-01 | 0.976 |
表14：抗体同过表达FRα的KB细胞的结合能力
| MIRV | Hz45A3 | Hz45B1 | |
| EC50(ug/mL) | 1.30E+00 | 1.01E+00 | 1.068 |
可见，hz45A3、hz45B1等分子显示出了优于对照分子(Mirv,Mirvetuximab)结合细胞表面FRa的能力。
3.6FRα人源化抗体的体外细胞内吞实验评估
使用人非小细胞肺癌细胞NCI-H2110作为靶细胞，进行FRα人源化抗体的体外细胞内吞能力评估。对待测抗体使用DOJINDO的LK01试剂盒进行FITC荧光标记，标记后的抗体用1％BSA稀释至5μg/mL，每个样品使用2E5个细胞，用PBS清洗细胞后重悬至2％BSA中；将细胞和待测抗体按1:1体积混匀后分为三份，放置于冰上两份，37℃培养箱一份，孵育4.5小时。孵育完成后，将冰上的一份使用PBS清洗，另一份和37℃培养箱一份使用酸洗10分钟，将细胞表面未内吞的抗体清除。清洗后PBS重悬流式仪读取MFI(表15)。
内吞效率计算公式为：内吞效率＝(37℃MFI－4℃MFI)÷4℃MFI(PBS)×100％
可见，在FRα+的细胞NCI-H2110中，工程化改造过的抗体分子表现出了诱导FRa+细胞内吞能力，其中2F22-H1L0、2F22-H1L1、Phage3-H1L2、Hz45A3和Hz45B1等分子都显示出了优于对照分子(MIRV，Mirvetuximab)的FRa+细胞内吞能力。
表15：抗体分子诱导FRa+细胞内吞的活性检测
3.7FRα人源化抗体ADC的体外细胞杀伤实验评估
人源化抗体ADC的制备：
在pH为7.4的PBS中，2.0-2.6当量TECP还原抗体2小时后，6eq vcMMAE DMA溶液加入到还原后的抗体溶液中，2-8℃搅拌1小时后超滤换液除去DMA和小分子残留。制备获得Pha-H0L0-ADC(也表示为hzPha-H0L0-MMAE)、Pha-H0L1-ADC(也表示为hzPha-H0L1-MMAE)、Pha-H1L2-ADC(也表示为hzPha-H1L2-MMAE)、2F22-H1L0-ADC(也表示为2F22-H1L0-MMAE)、2F22-H1L1-ADC(也表示为2F22-H1L1-MMAE)、hz45A3-ADC(也表示为hz45A3-MMAE)、hz45B1-ADC(也表示为hz45B1-MMAE)、MIRV-ADC(也表示为MIRV-MMAE或Mirve-MMAE)和NC-ADC(IgG1-MMAE)。紫外分光光度计测定偶联物在248nm～280nm处的吸光值，计算得到偶联物的浓度。样品分装到冻存管中-80℃保存。样品的DAR值由HPLC-HIC测定。
FRα人源化抗体ADC的体外细胞杀伤评估使用HEK293-FRα细胞和KB细胞(ATCC#CCL-17)进行。HEK293-FRα细胞和KB细胞密度分别调整至5×104/mL，100μL/孔铺于96孔白板中。实验第二天，使用培养基稀释待测抗体ADC分子至10μg/mL，然后3倍稀释，设置10个梯度。按50μL/孔加入细胞培养板中，二氧化碳培养箱孵育96小时。孵育完毕后，按照100μL/孔加入配置好的Cell titer Glo(promega货号G7570)，裂解10分钟后，酶标仪读取荧光值。数据采用softmax pro7软件进行4参数拟合曲线(图30-34：HEK293-FRα(HEK293-hFOLR1)细胞，图35：KB细胞)。
可见，工程化改造过的分子制备ADC，表现出了FRa+细胞杀伤能力，其中2F22-H1L1、Pha3-H1L2、Hz45A3和Hz45B1等的ADC分子显示出了和对照分子(MIRV Mirvetuximab)的ADC相当的FRa+细胞杀伤能力。
3.8FRα人源化抗体大鼠体内药代动力学研究
用0.9％氯化钠注射液稀释待测抗体(hzPha3H1L2、hz45B1、hz45A3、MIRV)至2mg/mL浓度，每个抗体使用5只雄性SD大鼠，按照10mg/Kg计算所需体积，尾静脉单次给药后，在1min、2h、8h、D2(24h)、D3(48h)、D5(96h)、D6(120h)、D8(168h)、D11(240h)、D15(336h)各时间点，颈静脉采血约0.2mL并分离血清；采用常规ELISA方法检测样本中受试抗体浓度，评价不同抗体分子在大鼠体内的药代动力学。结果见图36和表16。
表16：hzPha3H1L2、hz45B1、hz45A3、MIRV大鼠体内的药代动力学参数
可见，hzPha3H1L2、hz45B1、hz45A3分子在大鼠体内同对照分子(MIRV，Mirvetuximab)有相近的药代动力学特性。
3.9FRα人源化抗体小鼠体内药效研究
委托中国科学院上海药物研究所评价并比较hzPha3-H1L2-MMAE、hz45B1-MMAE、hz45A3-MMAE、Mirve-MMAE对人宫颈癌KB裸小鼠皮下移植瘤的疗效。
使用4周龄雌性BALB/c nu/nu裸小鼠，皮下接种KB细胞，待肿瘤长到100～150mm3后，根据肿瘤体积分为8组，将受试药物(hzPha3-H1L2-MMAE、hz45B1-MMAE、hz45A3-MMAE、Mirve-MMAE)用PBS配置为0.1mg/mL和0.3mg/mL，静脉注射(IV)药物，注射体积0.1mL/10g体重。分组和给药情况见表17。每周二次用游标卡尺测量肿瘤直径，肿瘤体积(V)，计算公式为
V＝1/2×a×b2，其中a、b分别表示长、宽。
评价并比较不同分子的ADC对人宫颈癌KB裸小鼠皮下移植瘤的疗效。评价指标为T/C％或肿瘤生长抑制率(TGI％)：
T/C(％)-(T-T0)/(C-C0)×100，其中T、C为实验结束时的肿瘤体积；T0、C0为实验开始时的肿瘤体积，C代表对照，T代表实验组肿瘤体积。
肿瘤生长抑制率％：(TGI％)＝100-T/C(％)。
当肿瘤出现消退时，肿瘤生长抑制率％：(TGI％)＝100-(T-T0)/T0×100
如果肿瘤比起始体积缩小，即T<T0或C<C0时，即定义为肿瘤部分消退(PR)；如果肿瘤完全消失，即定义为肿瘤完全消退(CR)。
实验结束，CO2麻醉处死动物，随后解剖取瘤并拍照。
结果见图37、38和表17。
如图37、38和表17所示，hzPha3-H1L2-MMAE(1、3mg/kg，IV，D0)剂量依赖性地显著抑制KB裸小鼠皮下移植瘤的生长，抑瘤率分别为64％和98％，3mg/kg剂量组有5/6小鼠肿瘤部分消退；hz45B1-MMAE(1、3mg/kg，IV，D0)对KB裸小鼠皮下移植瘤的抑瘤率分别为59％和128％，3mg/kg剂量组有6/6小鼠肿瘤部分消退；hz45A3-MMAE(1、3mg/kg，IV，D0)对KB裸小鼠皮下移植瘤的抑瘤率分别为58％和101％，3mg/kg剂量组有5/6小鼠肿瘤部分消退；Mirve-MMAE(1、3mg/kg，IV，D0)对KB裸小鼠皮下移植瘤的抑瘤率分别为69％和99％，3mg/kg剂量组有3/6小鼠肿瘤部分消退。
序列表
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Claims (30)
1.结合FRα的抗体或其抗原结合片段，所述抗体包含
1)如SEQ ID NO:116、34或115所示的VH中所含的三个互补决定区域HCDR1、HCDR2和HCDR3，和如SEQ ID NO:51所示的VL中所含的三个互补决定区域LCDR1、LCDR2和LCDR3；
2)如SEQ ID NO:116所示的VH中所含的三个互补决定区域HCDR1、HCDR2和HCDR3，和如SEQ ID NO:51所示的VL中所含的三个互补决定区域LCDR1、LCDR2和LCDR3；
3)如SEQ ID NO:115或34所示的VH中所含的三个互补决定区域HCDR1、HCDR2和HCDR3，和如SEQ ID NO:51所示的VL中所含的三个互补决定区域LCDR1、LCDR2和LCDR3；
4)如SEQ ID NO:1或13所示的VH中所含的三个互补决定区域HCDR1、HCDR2和HCDR3，和如SEQ ID NO:2、24或25所示的VL中所含的三个互补决定区域LCDR1、LCDR2和LCDR3；
5)如SEQ ID NO:1所示的VH中所含的三个互补决定区域HCDR1、HCDR2和HCDR3，和如SEQID NO:2所示的VL中所含的三个互补决定区域LCDR1、LCDR2和LCDR3；
6)如SEQ ID NO:13所示的VH中所含的三个互补决定区域HCDR1、HCDR2和HCDR3，和如SEQ ID NO:24或25所示的VL中所含的三个互补决定区域LCDR1、LCDR2和LCDR3；
7)如SEQ ID NO:41、33或34所示的VH中所含的三个互补决定区域HCDR1、HCDR2和HCDR3，和如SEQ ID NO:42、39、40或51所示的VL中所含的三个互补决定区域LCDR1、LCDR2和LCDR3；
8)如SEQ ID NO:33所示的VH中所含的三个互补决定区域HCDR1、HCDR2和HCDR3，和如SEQ ID NO:39、40或51所示的VL中所含的三个互补决定区域LCDR1、LCDR2和LCDR3；
9)如SEQ ID NO:34所示的VH中所含的三个互补决定区域HCDR1、HCDR2和HCDR3，和如SEQ ID NO:39、40或51所示的VL中所含的三个互补决定区域LCDR1、LCDR2和LCDR3；
10)如SEQ ID NO:115或116所示的VH中所含的三个互补决定区域HCDR1、HCDR2和HCDR3，和如SEQ ID NO:39、40或51所示的VL中所含的三个互补决定区域LCDR1、LCDR2和LCDR3；
11)如SEQ ID NO:115或116所示的VH中所含的三个互补决定区域HCDR1、HCDR2和HCDR3，和如SEQ ID NO:51所示的VL中所含的三个互补决定区域LCDR1、LCDR2和LCDR3；
12)如SEQ ID NO:41所示的VH中所含的三个互补决定区域HCDR1、HCDR2和HCDR3，和如SEQ ID NO:42所示的VL中所含的三个互补决定区域LCDR1、LCDR2和LCDR3；
13)如SEQ ID NO:74、99、115或116所示的VH中所含的三个互补决定区域HCDR1、HCDR2和HCDR3，和如SEQ ID NO:42、39、40或51所示的VL中所含的三个互补决定区域LCDR1、LCDR2和LCDR3；
14)如SEQ ID NO:14所示的VH中所含的三个互补决定区域HCDR1、HCDR2和HCDR3，和如SEQ ID NO:15所示的VL中所含的三个互补决定区域LCDR1、LCDR2和LCDR3；
15)如SEQ ID NO:26所示的VH中所含的三个互补决定区域HCDR1、HCDR2和HCDR3，和如SEQ ID NO:27所示的VL中所含的三个互补决定区域LCDR1、LCDR2和LCDR3；
16)如SEQ ID NO:35所示的VH中所含的三个互补决定区域HCDR1、HCDR2和HCDR3，和如SEQ ID NO:36所示的VL中所含的三个互补决定区域LCDR1、LCDR2和LCDR3；
17)如SEQ ID NO:53所示的VH中所含的三个互补决定区域HCDR1、HCDR2和HCDR3，和如SEQ ID NO:54所示的VL中所含的三个互补决定区域LCDR1、LCDR2和LCDR3；
18)如SEQ ID NO:65所示的VH中所含的三个互补决定区域HCDR1、HCDR2和HCDR3，和如SEQ ID NO:66所示的VL中所含的三个互补决定区域LCDR1、LCDR2和LCDR3；
19)如SEQ ID NO:75所示的VH中所含的三个互补决定区域HCDR1、HCDR2和HCDR3，和如SEQ ID NO:76所示的VL中所含的三个互补决定区域LCDR1、LCDR2和LCDR3；
20)如SEQ ID NO:88所示的VH中所含的三个互补决定区域HCDR1、HCDR2和HCDR3，和如SEQ ID NO:89所示的VL中所含的三个互补决定区域LCDR1、LCDR2和LCDR3；
21)如SEQ ID NO:100所示的VH中所含的三个互补决定区域HCDR1、HCDR2和HCDR3，和如SEQ ID NO:101所示的VL中所含的三个互补决定区域LCDR1、LCDR2和LCDR3；
22)如SEQ ID NO:109所示的VH中所含的三个互补决定区域HCDR1、HCDR2和HCDR3，和如SEQ ID NO:110所示的VL中所含的三个互补决定区域LCDR1、LCDR2和LCDR3；
23)如SEQ ID NO:117所示的VH中所含的三个互补决定区域HCDR1、HCDR2和HCDR3，和如SEQ ID NO:118所示的VL中所含的三个互补决定区域LCDR1、LCDR2和LCDR3；
24)如SEQ ID NO:74或99所示的VH中所含的三个互补决定区域HCDR1、HCDR2和HCDR3，和如SEQ ID NO：42所示的VL中所含的三个互补决定区域LCDR1、LCDR2和LCDR3；
优选地，其中所述HCDR和所述LCDR根据Chothia或Kabat确定，或根据Chothia和Kabat确定；
例如，所述HCDR根据Kabat方案确定，所述LCDR根据Kabat和Chothia组合方案(Kabat&Chothia)确定；
例如，所述HCDR根据Chothia方案确定，所述LCDR根据Kabat和Chothia组合方案(Kabat&Chothia)确定。
2.结合FRα的抗体或其抗原结合片段，所述抗体包含重链可变区的3个互补决定区HCDR1、HCDR2和HCDR3，以及轻链可变区的3个互补决定区LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中所述HCDR1、HCDR2和HCDR3基于Chothia方案确定，其分别包含或由下表SEQ ID NO所示的氨基酸序列组成，且所述LCDR1、LCDR2和LCDR3基于Kabat和Chothia组合方案，其分别包含由下表SEQ ID NO所示的氨基酸序列组成：
或者其中所述HCDR1、HCDR2和HCDR3基于Kabat方案确定，其分别包含或由下表SEQ IDNO所示的氨基酸序列组成，且所述LCDR1、LCDR2和LCDR3基于Kabat和Chothia组合方案，其分别包含由下表SEQ ID NO所示的氨基酸序列组成：
3.如权利要求1或2所述的结合FRα的抗体或其抗原结合片段，所述抗体包含重链可变区，其中所述重链可变区包含与选自SEQ ID NO:1、14、26、35、41、53、65、75、88、100、109、117、13、33、34、74、99、115或116所示的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列，或由所述序列组成或包含选自SEQ ID NO:1、14、26、35、41、53、65、75、88、100、109、117、13、33、34、74、99、115或116所示的氨基酸序列，或由所述序列组成。
4.如权利要求1或2所述的结合FRα的抗体或其抗原结合片段，所述抗体包含轻链可变区，其中所述轻链可变区包含与选自SEQ ID NO:2、15、27、36、42、54、66、76、89、101、110、118、24、25、39、40或51所示的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列，或由所述序列组成或包含选自SEQ ID NO:2、15、27、36、42、54、66、76、89、101、110、118、24、25、39、40或51所示的氨基酸序列，或由所述序列组成。
5.如权利要求1或2所述的结合FRα的抗体或其抗原结合片段，所述抗体包含重链可变区和轻链可变区，其中所述抗体或其抗原结合片段包含的重链可变区和轻链可变区包含如下表SEQ ID NO所示的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成：
。
6.如权利要求1-5中任一项所述的结合FRα的抗体或其抗原结合片段，所述抗体包含重链恒定区，例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的重链恒定区，例如IgG1的重链恒定区，其
(i)包含与选自SEQ ID NO:63的氨基酸序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；
(ii)包含选自SEQ ID NO:63的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；或者
(iii)包含与选自SEQ ID NO:63的氨基酸序列相比具有1个或多个(优选不超过20个或10个，更优选不超过5、4、3、2、1个)的氨基酸改变(优选氨基酸置换，更优选氨基酸保守置换)的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成。
7.如权利要求1-6中任一项所述的结合FRα的抗体或其抗原结合片段，所述抗体包含轻链恒定区，例如所述轻链恒定区
(i)包含与选自SEQ ID NO:64的氨基酸序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；
(ii)包含选自SEQ ID NO:64的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；或者
(iii)包含与选自SEQ ID NO:64的氨基酸序列相比具有1个或多个(优选不超过20个或10个，更优选不超过5、4、3、2、1个)的氨基酸改变(优选氨基酸置换，更优选氨基酸保守置换)的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成。
8.如权利要求1-7中任一项所述的结合FRα的抗体或其抗原结合片段，所述抗体包含重链恒定区和轻链恒定区，其中
重链恒定区包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列或由其组成；和轻链恒定区包含SEQ IDNO:64的氨基酸序列或由其组成。
9.权利要求1或2所述的结合FRα的抗体或其抗原结合片段，其具有以下一个或多个特性：
(1)能够以高亲和力结合人或恒河猴FRα；
(2)能够以高亲和力结合细胞膜表面表达的人或恒河猴FRα；
(3)能够诱导FRα阳性细胞对抗体或其片段或包含所述抗体或其片段的分子的内吞作用，优选地具有相当于已知抗FRα抗体(例如MIRV)或优于已知抗FRα抗体(例如MIRV)的内吞效率；
(4)包含其的分子具有细胞(例如肿瘤细胞，例如FRα阳性细胞，例如FRα阳性肿瘤细胞)杀伤能力。
(5)显示与权利要求8所列的任一抗体对FRα相同或相似的结合亲和力和/或特异性；
(6)抑制权利要求8所列的任一抗体与FRα的结合；
(7)与权利要求8所示的任一抗体结合相同或重叠的表位；
(8)与权利要求8所示的任一抗体竞争结合FRα；或
(9)具有权利要求8所列的任一抗体分子的一个或多个生物学特性。
10.权利要求1-9中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4形式的抗体或其抗原结合片段。
11.权利要求1-10中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体是单克隆抗体。
12.权利要求1-11中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体是人源化的抗体或嵌合抗体。
13.权利要求1-12中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗原结合片段是选自以下的抗体片段：Fab、Fab’、Fab’-SH、Fv、单链抗体例如scFv、(Fab’)2片段、单结构域抗体、双抗体或线性抗体。
14.分离的核酸，其编码权利要求1至13中任一项的抗FRα抗体或其抗原结合片段。
15.包含权利要求14的核酸的表达载体。
16.包含权利要求14的核酸或权利要求15的表达载体的宿主细胞。
17.免疫缀合物，其包含权利要求1至13中任一项的抗体或其抗原结合片段和其它物质。
18.权利要求17所述的免疫缀合物，其中所述其它物质是细胞毒性剂。
19.药物组合物，其包含权利要求1至13中任一项的抗体或其抗原结合片段或者权利要求17或18的免疫缀合物，以及任选地药用辅料。
20.药物组合物，其包含权利要求1至13中任一项的抗体或其抗原结合片段或者权利要求17或18的免疫缀合物，以及其它治疗剂，以及任选地药用辅料。
21.权利要求20所述的药物组合物，其中所述其它治疗剂选自化疗剂、其它抗体、细胞毒性剂、疫苗、抗感染活性剂或免疫调节剂。
22.权利要求21所述的药物组合物，其中所述免疫调节剂是共刺激分子的激活剂或免疫检查点分子的抑制剂。
23.有效量的权利要求1至13中任一项的抗FRα抗体或其抗原结合片段、或者权利要求17或18的免疫缀合物、或权利要求20至22中任一项的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于在受试者中预防或治疗受试者或个体肿瘤。
24.权利要求23中任一项所述的用途，其中所述肿瘤是实体肿瘤。
25.权利要求23或24的用途，其中所述肿瘤是癌症。
26.权利要求25所述的用途，其中所述癌症是肺癌(例如非小细胞肺癌)、口腔癌(如口腔上皮癌)、卵巢癌、乳腺癌、间质瘤、子宫内膜癌或宫颈癌。
27.权利要求23-26中任一项所述的用途，其还包括向所述受试者联合施用一种或多种其它疗法。
28.权利要求27所述的用途，其中所述疗法包括治疗方式和/或其它治疗剂。
29.权利要求28所述的用途，其中所述其它治疗剂选自化疗剂、细胞因子、其它抗体、细胞毒性剂、疫苗、小分子药物或免疫调节剂，和/或所述治疗方式包括手术治疗和/或放射疗法。
30.权利要求29所述的用途，其中所述免疫调节剂是共刺激分子的激活剂或免疫检查点分子的抑制剂。
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