TW202313690A - 一種抗b7-h4抗體及其製備方法和應用 - Google Patents

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Abstract

本發明提供了一種抗B7-H4抗體，其包含VH；所述VH包含以下的CDR或其突變：如SEQ ID NO: 4或5的胺基酸序列所示的CDR1，如SEQ ID NO: 15的胺基酸序列所示的CDR2，和，如SEQ ID NO: 24或25的胺基酸序列所示的CDR3；其中所述突變為在所述CDR的胺基酸序列上具有3、2或1個胺基酸的插入、缺失或替換。本發明的抗體具有與人B7-H4和食蟹猴B7-H4結合的活性。將本發明的抗體製備成B7-H4×CD3雙特異性抗體時，其仍舊保留了與人B7-H4和食蟹猴B7-H4結合的活性，且對腫瘤細胞具有較強的毒殺效果，誘導的非特異性細胞因子例如IL-6和IFN-γ的表現很低；並且顯示出較強的體內抗腫瘤活性。

Description

一種抗B7-H4抗體及其製備方法和應用
本發明涉及生物醫藥領域，尤其涉及一種抗B7-H4抗體及其製備方法和應用，還涉及一種包含所述抗B7-H4抗體的雙特異性抗體。
乳腺癌、卵巢癌和子宮內膜瘤為女性常見的惡性腫瘤，其中乳腺癌發病居女性癌症發病的首位，2018年國際癌症研究機構IARC的數據顯示，乳腺癌在全球女性癌症中的發病率為24.2%。對於這些癌症的治療，免疫治療和標靶治療是目前的熱點。比如標靶Her2的赫賽汀在Her2陽性的乳腺癌上有很好的療效。對於三陰性乳腺癌(TNBC)，由於缺乏對應的標的，目前少有治療手段，主要以化療為主。2019年3月美國FDA批准PD-L1抑制劑Atezolizumab聯合白蛋白結合型紫杉醇用於轉移性三陰性乳腺癌(TNBC)的治療，但PD-L1在三陰性乳腺癌上的表現並不高。對卵巢癌和子宮內膜瘤的治療主要以手術和放化療輔助治療為主，對於復發或轉移性的腫瘤，除上述手段以外，其它可用的標的主要包括雌激素受體、HER2、VEGF以及PD1/PD-L1等，但治療效果有限。
B7-H4是比較新的B7家族成員，其蛋白在正常組織中的表現非常有限，僅在身體的部分導管上皮細胞上如乳房導管和小葉、輸卵管上皮、子宮內膜腺等組織有低位準表現。相反，B7-H4在多種腫瘤組織中大量表現，比如在乳腺癌特別是三陰性乳腺癌、卵巢癌和子宮內膜瘤等細胞上，有將近一半的腫瘤高表現B7-H4。從表現圖譜這一點上來講，B7-H4可以被認為是一個高特異性的腫瘤相關抗原。另一方面，B7-H4是一種新的免疫檢查點分子，體外實驗證明B7-H4透過與其未知的T細胞表面受體相互作用，抑制T細胞的增殖、活化以及細胞因子的產生。腫瘤細胞透過高表現B7-H4分子，以及腫瘤微環境裡高表現B7-H4分子的抑制性巨噬細胞，抑制T細胞的活化從而實現免疫逃避。B7-H4在腫瘤上的表現圖譜與PD-L1不重疊。透過抗體標靶B7-H4的治療，是一種有前景的治療B7-H4表現陽性腫瘤的手段。
目前有多家製藥公司在研發針對B7-H4的單株抗體，或與藥物偶聯物，或雙特異性抗體。Genentech、BMS、Jounce、江蘇豪森等都處於臨床前開發，目前進展最快的是FivePrime和Nextcure的抗B7-H4單株抗體，目前處在臨床I期，其機制主要透過ADCC以及阻斷免疫檢查點活化T細胞。建構包含抗腫瘤相關抗原與抗-CD3的雙特異性抗體被稱之為T細胞銜接器，具有很強的腫瘤相關抗原依賴的T細胞活化和毒殺腫瘤的作用，比普通單株抗體可能具有更強的療效。
本發明所要解決的技術問題是為了克服現有技術中抗B7-H4抗體的不足，提供了一種抗B7-H4抗體及其製備方法和應用，還提供了一種包含所述抗B7-H4抗體的雙特異性抗體。
為了解決上述技術問題，本發明第一方面提供了一種抗B7-H4抗體，其包含重鏈可變區(VH)；其中， 所述VH包含以下的互補決定區(CDR)或其突變：如SEQ ID NO: 4或5的胺基酸序列所示的CDR1，如SEQ ID NO: 15的胺基酸序列所示的CDR2，和，如SEQ ID NO: 24或25的胺基酸序列所示的CDR3； 其中所述突變為在所述CDR的胺基酸序列上具有3、2或1個胺基酸的插入、缺失或替換。
本申請中，在類似“具有3、2或1個胺基酸的插入、缺失或替換”中“胺基酸突變”是指相較於原胺基酸序列而言，變異體的序列存在胺基酸的突變，包括在原胺基酸序列的基礎上發生胺基酸的插入、缺失或替換。例示性的解釋是對CDR的突變可以包含3個、2個或1個胺基酸的突變，這些CDR之間可以任選地選擇相同或不同數目的胺基酸殘基進行突變，例如可以是對CDR1進行1個胺基酸的突變，對CDR2和CDR3不進行胺基酸突變。
本申請中，所述突變可以包括目前如本領域技術人員公知的突變，例如在抗體的生產或者應用過程中，可能會對抗體進行的一些突變，例如對可能存在的，特別是CDR區的轉錄後修飾(post-translational modifications，PTMs)的位點進行突變，包括抗體的聚集、天冬醯胺酸脫醯胺基(asparagine deamidation)敏感位點(NG、NS、NH等)、天冬胺酸異構(DG，DP)敏感位點、N醣基化(N-{P}S/T)敏感位點及氧化敏感位點等相關突變，或降低等電點進行的相關突變。
優選地，其在所述CDR2上的突變為在如SEQ ID NO: 15所示的胺基酸序列上具有G2P、S4G和S5R/D/E/T中的2或1個胺基酸替換；其胺基酸序列優選如SEQ ID NO: 11-14、SEQ ID NO: 16-18任一所示。
以上所述的G2P一般是指如SEQ ID NO: 15所示的胺基酸序列的第二位胺基酸G突變為P，其他的胺基酸替換例如S4G、S5R/D/E/T等等以此類推，本領域人員都應當理解其含義。
優選地，所述的抗B7-H4抗體包含重鏈可變區(VH)；其中，所述VH包含以下的互補決定區(CDR)或其突變：如SEQ ID NO: 4或5的胺基酸序列所示的CDR1，如SEQ ID NO: 11-18的胺基酸序列所示的CDR2，和，如SEQ ID NO: 24或25的胺基酸序列所示的CDR3。
在某一實施方案中，所述抗B7-H4抗體中的所述VH包含的CDR1、CDR2和CDR3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO: 4、11和24所示。
在某一實施方案中，所述抗B7-H4抗體中的所述VH包含的CDR1、CDR2和CDR3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO: 5、12和25所示。
在某一實施方案中，所述抗B7-H4抗體中的所述VH包含的CDR1、CDR2和CDR3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO: 4、17和24所示。
在某一實施方案中，所述抗B7-H4抗體中的所述VH包含的CDR1、CDR2和CDR3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO: 5、18和25所示。
在某一實施方案中，所述抗B7-H4抗體中的所述VH包含的CDR1、CDR2和CDR3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO: 4、13和24所示。
在某一實施方案中，所述抗B7-H4抗體中的所述VH包含的CDR1、CDR2和CDR3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO: 4、14和24所示。
在某一實施方案中，所述抗B7-H4抗體中的所述VH包含的CDR1、CDR2和CDR3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO: 4、15和24所示。
在某一實施方案中，所述抗B7-H4抗體中的所述VH包含的CDR1、CDR2和CDR3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO: 4、16和24所示。
優選地，所述VH的框架區為人VH的框架區。在某一實施方案中，所述人VH的框架區包括胺基酸序列如SEQ ID NO: 2所示的FWR1、胺基酸序列如SEQ ID NO: 7-9任一所示的FWR2、胺基酸序列如SEQ ID NO: 20-22任一所示的FWR3和胺基酸序列如SEQ ID NO: 26或27所示的FWR4。在某一實施方案中，所述VH包括如SEQ ID NO: 36-45任一所示的胺基酸序列或其突變；所述突變為所述VH的胺基酸序列上發生了一個或多個胺基酸殘基的缺失、取代或添加，且所述突變的胺基酸序列與所述VH的胺基酸序列具有至少85%序列同一性，並保持或改善了所述抗體與B7-H4的結合；所述至少85%序列同一性優選為至少90%序列同一性，更優選為至少95%序列同一性，最優選為至少99%序列同一性。
在某一較佳實施方案中，所述重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 36所示的胺基酸序列。在某一較佳實施方案中，所述重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 37所示的胺基酸序列。在某一較佳實施方案中，所述重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 44所示的胺基酸序列。在某一較佳實施方案中，所述重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 45所示的胺基酸序列。在某一較佳實施方案中，所述重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 38所示的胺基酸序列。在某一較佳實施方案中，所述重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 39所示的胺基酸序列。在某一較佳實施方案中，所述重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 40所示的胺基酸序列。在某一較佳實施方案中，所述重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 41所示的胺基酸序列。在某一較佳實施方案中，所述重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 42所示的胺基酸序列。在某一較佳實施方案中，所述重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 43所示的胺基酸序列。
在本申請中，所列CDR的胺基酸序列均是按照Chothia定義規則所示出的。但是，本領域人員公知，在本領域中可以透過多種方法來定義抗體的CDR，例如基於序列可變性的Kabat定義規則(參見Kabat等人，《免疫學的蛋白質序列》，第五版，美國國立衛生研究院，貝塞斯達，馬裡蘭州(1991))和基於結構環區域位置的Chothia定義規則(參見JMol Biol 273:927-48,1997)。在本發明的技術方案中，還可以使用包含了Kabat定義和Chothia定義的Combined定義規則來確定可變結構域序列中的胺基酸殘基。其中Combined定義規則即是將Kabat定義和Chothia定義的範圍相結合，基於此取了一個更大的範圍，詳見本申請中的表1-3。本領域技術人員應當理解的是，除非另有規定，否則術語給定抗體或其區(例如可變區)的“CDR”及“互補決定區”應瞭解為涵蓋如透過本發明描述的上述已知方案中的任何一種界定的互補決定區。雖然本發明中請求保護的範圍是基於Chothia定義規則所示出的序列，但是根據其他CDR的定義規則所對應的胺基酸序列也應當落在本發明的保護範圍中。
因此，在涉及用本發明定義的具體CDR序列限定抗體時，所述抗體的範圍還涵蓋了這樣的抗體，其可變區序列包含所述的具體CDR序列，但是由於應用了不同的方案(例如不同的指派系統規則或組合)而導致其所聲稱的CDR邊界與本發明所定義的具體CDR邊界不同。
優選地，所述的抗B7-H4抗體為全長抗體、Fab、Fab’、F(ab’) 2、Fv優選scFv、雙特異性抗體、多特異性抗體、重鏈抗體或單域抗體或者其他任何保留抗體特異性結合抗原的能力(可以是保留抗體的特異性結合抗原的部分能力)的抗體，或者由上述抗體製得的單株抗體或多株抗體。
優選地，所述的抗B7-H4抗體為重鏈抗體。在某一實施方案中，所述重鏈抗體包括如SEQ ID NO: 48-57任一所示的胺基酸序列或其突變。所述突變為所述胺基酸序列上發生了一個或多個胺基酸殘基的缺失、取代或添加，且所述突變的胺基酸序列與所述胺基酸序列具有至少85%序列同一性，並保持或改善了所述抗體與B7-H4的結合；所述至少85%序列同一性優選為至少90%序列同一性；更優選為至少95%序列同一性；最優選為至少99%序列同一性。在某一較佳實施方案中，所述重鏈抗體包括如SEQ ID NO: 48所示的胺基酸序列。在某一較佳實施方案中，所述重鏈抗體包括如SEQ ID NO: 49所示的胺基酸序列。在某一較佳實施方案中，所述重鏈抗體包括如SEQ ID NO: 56所示的胺基酸序列。在某一較佳實施方案中，所述重鏈抗體包括如SEQ ID NO: 57所示的胺基酸序列。在某一較佳實施方案中，所述重鏈抗體包括如SEQ ID NO: 50所示的胺基酸序列。在某一較佳實施方案中，所述重鏈抗體包括如SEQ ID NO: 51所示的胺基酸序列。在某一較佳實施方案中，所述重鏈抗體包括如SEQ ID NO: 52所示的胺基酸序列。在某一較佳實施方案中，所述重鏈抗體包括如SEQ ID NO: 53所示的胺基酸序列。在某一較佳實施方案中，所述重鏈抗體包括如SEQ ID NO: 54所示的胺基酸序列。在某一較佳實施方案中，所述重鏈抗體包括如SEQ ID NO: 55所示的胺基酸序列。
本申請中，所述的“Fab片段”由一條輕鏈和一條重鏈的CH1及可變區組成。Fab片段的重鏈不能與另一個重鏈分子形成二硫鍵。“Fc”區是含有抗體的CH2和CH3結構域的兩個重鏈片段。兩個重鏈片段由兩個或多個二硫鍵並透過CH3結構域的疏水作用保持在一起。所述的“Fab’片段”含有一條輕鏈和包含VH結構域、CH1結構域以及CH1和CH2結構域之間的區域，由此可在兩個Fab’片段的兩條重鏈之間形成鏈間二硫鍵以形成F(ab’) 2片段。所述的“F(ab’) 2片段”含有兩條輕鏈和兩條包含CH1和CH2結構域之間的恆定區的部分的重鏈，由此在兩條重鏈間形成鏈間二硫鍵。因此F(ab’) 2片段由透過兩條重鏈間的二硫鍵保持在一起的兩個Fab’片段組成。所述的術語“Fv”意指向抗體的單臂的VL和VH結構域組成的抗體片段，但缺少恆定區。
本申請中，所述的scFv(single chain antibody fragment，單鏈抗體)可為本領域常規的單鏈抗體，其包括重鏈可變區、輕鏈可變區和15~20個胺基酸的連接子短肽。其中VL和VH結構域透過使其能夠產生為單個多肽鏈的連接子配對形成單價分子[參見，例如，Bird等人，Science 242:423-426 (1988)和Huston等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883(1988)]。此類scFv分子可具有一般結構：NH 2-VL-連接子-VH-COOH或NH 2-VH-連接子-VL-COOH。合適的現有技術連接子由重複的G 4S胺基酸序列或其變異體組成。例如，可使用具有胺基酸序列(G 4S) 4（即SEQ ID NO: 88）或(G 4S) 3連接子，但也可使用其變異體。
本申請中，術語“多特異性抗體”按其最廣義使用，涵蓋具有多表位特異性的抗體。這些多特異性抗體包括但不限於：包含重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)的抗體，其中該VH-VL單元具有多表位特異性；具有兩個或多個VL和VH區的抗體，每個VH-VL單元與不同的標的或同一個標的的不同表位結合；具有兩個或更多個單可變區的抗體，每個單可變區與不同的標的或同一個標的的不同的表位結合；全長抗體、抗體片段、雙特異性抗體(diabodies)、三抗體(triabodies)、共價或非共價連接在一起的抗體片段等。
本申請中，所述的單株抗體或mAb或Ab，指由單一的選殖細胞株得到的標靶單一抗原表位的抗體，所述的細胞株不限於真核的、原核的或噬菌體的選殖細胞株。
本申請中，所述的單域抗體又稱為“奈米抗體”，指的是從重鏈抗體中選殖出來的VHH結構，是已知的可結合目標抗原的最小單位。
本申請中，所述的“重鏈抗體”指的是只包含一個重鏈可變區(VHH)和兩個常規的CH2與CH3結構域的抗體，又稱為HCAb。
為了解決上述技術問題，本發明第二方面提供了一種雙特異性抗體，其含有蛋白功能區A和蛋白功能區B；所述蛋白功能區A和所述蛋白功能區B標靶不同的抗原，其中所述蛋白功能區B標靶B7-H4，所述蛋白功能區A標靶非B7-H4；所述的雙特異性抗體選自如下a)或b)：
a) 所述蛋白功能區B選自如本發明第一方面所述的抗B7-H4抗體；或所述蛋白功能區B包含如SEQ ID NO: 72所示的HCDR1，SEQ ID NO: 74所示的HCDR2，SEQ ID NO: 76所示的HCDR3，SEQ ID NO: 78所示的LCDR1，SEQ ID NO: 80所示的LCDR2，SEQ ID NO: 82所示的LCDR3。
優選地，所述雙特異性抗體的結構包含多肽鏈1、多肽鏈2和多肽鏈3，所述多肽鏈1如式：N’-VL_A-CL- C’所示；所述多肽鏈2如式：N’-VH_A-CH1-鉸鍊區-CH2-CH3-C’所示；所述多肽鏈3如式：N’-VH_B1-連接子-VH_B2-鉸鍊區(也可為連接肽)-CH2-CH3-C’、或如式：N’-VH_B-鉸鍊區(也可為連接肽)-CH2-CH3-C’所示；其中，所述的VL_A和VH_A分別為所述蛋白功能區A的VL和VH，所述的VH_B1和VH_B2為所述蛋白功能區B的VH，且VH_B1和VH_B2的序列可以相同或者不同，VH_B1和VH_B2之間可以透過連接肽鏈接。其中，VH_A和VL_A分別為蛋白功能區A的重鏈可變區和輕鏈可變區，VH_B和VL_B為蛋白功能區B的重鏈可變區和輕鏈可變區；CL是輕鏈恆定區結構域；CH1、CH2和CH3分別是重鏈恆定區的第一、第二和第三結構域。
b) 所述蛋白功能區B包含如SEQ ID NO: 72所示的HCDR1，SEQ ID NO: 74所示的HCDR2，SEQ ID NO: 76所示的HCDR3，SEQ ID NO: 78所示的LCDR1，SEQ ID NO: 80所示的LCDR2，SEQ ID NO: 82所示的LCDR3；
優選地，所述雙特異性抗體的結構包含多肽鏈1、多肽鏈2和多肽鏈3，所述多肽鏈1如式：N’-VL_A-CL-C’所示；所述多肽鏈2如式：N’-VH_A-CH1-鉸鍊區-CH2-CH3-C’所示；所述多肽鏈3如式：N’-VL_B-連接子-VH_B-鉸鍊區-CH2-CH3-C’；其中，所述的VL_A和VH_A分別為所述蛋白功能區A的VL和VH，所述的VL_B和VH_B為所述蛋白功能區B的VL和VH。
在一些優選的實施例中，所述蛋白功能區A為抗CD3抗體，其包含重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)，所述VH含有胺基酸序列如SEQ ID NO: 3所示的VH CDR1、胺基酸序列如SEQ ID NO: 10所示的VH CDR2和胺基酸序列如SEQ ID NO: 23所示的VH CDR3，所述VL含有胺基酸序列如SEQ ID NO: 29所示的VL CDR1、胺基酸序列如SEQ ID NO: 31所示的VL CDR2和胺基酸序列如SEQ ID NO: 33所示的VL CDR3。在某一實施方案中，所述抗CD3抗體包含胺基酸序列如SEQ ID NO: 35所示的VH和胺基酸序列如SEQ ID NO: 46所示的VL。在某一實施方案中，所述抗CD3抗體包含胺基酸序列如SEQ ID NO: 47所示的重鏈和胺基酸序列如SEQ ID NO: 58所示的輕鏈。
在某一較佳實施方案中，所述蛋白功能區A包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，分別為SEQ ID NO: 29、31和33所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 3、10和23所示的胺基酸序列。所述蛋白功能區B包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 4、17和24所示的胺基酸序列。所列CDR的胺基酸序列按照Chothia定義規則所示。在某一較佳實施方案中，所述蛋白功能區A包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，分別為SEQ ID NO: 29、31和33所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 3、10和23所示的胺基酸序列。所述蛋白功能區B包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 5、18和25所示的胺基酸序列。所列CDR的胺基酸序列按照Chothia定義規則所示。在某一較佳實施方案中，所述蛋白功能區A包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，分別為SEQ ID NO: 29、31和33所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 3、10和23所示的胺基酸序列。所述蛋白功能區B包含第一重鏈可變區和第二重鏈可變區；所述第一重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 4、17和24所示的胺基酸序列；所述第二重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 5、18和25所示的胺基酸序列。所列CDR的胺基酸序列按照Chothia定義規則所示。在某一較佳實施方案中，所述蛋白功能區A包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，分別為SEQ ID NO: 29、31和33所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 3、10和23所示的胺基酸序列。所述蛋白功能區B包含重鏈可變區和輕鏈可變區；所述重鏈可變區VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分別為SEQ ID NO: 72、74和76所示的胺基酸序列；所述輕鏈可變區VL包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，分別為SEQ ID NO: 78、80和82所示的胺基酸序列。所列CDR的胺基酸序列按照Chothia定義規則所示。
在某一較佳實施方案中，所述蛋白功能區A包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包括如SEQ ID NO: 46所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 35所示的胺基酸序列。所述蛋白功能區B包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 44所示的胺基酸序列。在某一較佳實施方案中，所述蛋白功能區A包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包括如SEQ ID NO: 46所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 35所示的胺基酸序列。所述蛋白功能區B包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 45所示的胺基酸序列。在某一較佳實施方案中，所述蛋白功能區A包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包括如SEQ ID NO: 46所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 35所示的胺基酸序列。所述蛋白功能區B包含第一重鏈可變區和第二重鏈可變區；所述第一重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 44所示的胺基酸序列；所述第二重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 45所示的胺基酸序列。在某一較佳實施方案中，所述蛋白功能區A包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包括如SEQ ID NO: 46所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 35所示的胺基酸序列。所述蛋白功能區B包含重鏈可變區和輕鏈可變區；所述重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 84所示的胺基酸序列；所述第二重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO: 85所示的胺基酸序列。
在某一較佳實施方案中，所述的雙特異性抗體包括：胺基酸序列如SEQ ID NO:58所示的多肽鏈1，胺基酸序列如SEQ ID NO: 59所示的多肽鏈2，胺基酸序列如SEQ ID NO: 60所示的多肽鏈3。
在某一較佳實施方案中，所述的雙特異性抗體包括：胺基酸序列如SEQ ID NO: 58所示的多肽鏈1，胺基酸序列如SEQ ID NO: 59所示的多肽鏈2，胺基酸序列如SEQ ID NO:61所示的多肽鏈3。
在某一較佳實施方案中，所述的雙特異性抗體包括：胺基酸序列如SEQ ID NO: 58所示的多肽鏈1，胺基酸序列如SEQ ID NO: 59所示的多肽鏈2，胺基酸序列如SEQ ID NO:62所示的多肽鏈3。
在某一較佳實施方案中，所述的雙特異性抗體包括：胺基酸序列如SEQ ID NO: 58所示的多肽鏈1，胺基酸序列如SEQ ID NO: 59所示的多肽鏈2，胺基酸序列如SEQ ID NO:63所示的多肽鏈3。
在某一較佳實施方案中，所述的雙特異性抗體包括：胺基酸序列如SEQ ID NO: 58所示的多肽鏈1，胺基酸序列如SEQ ID NO: 59所示的多肽鏈2，胺基酸序列如SEQ ID NO:64所示的多肽鏈3。
在某一較佳實施方案中，所述的雙特異性抗體包括：胺基酸序列如SEQ ID NO: 58所示的多肽鏈1，胺基酸序列如SEQ ID NO: 59所示的多肽鏈2，胺基酸序列如SEQ ID NO:65所示的多肽鏈3。
在某一較佳實施方案中，所述的雙特異性抗體包括：胺基酸序列如SEQ ID NO: 58所示的多肽鏈1，胺基酸序列如SEQ ID NO: 59所示的多肽鏈2，胺基酸序列如SEQ ID NO:69所示的多肽鏈3。
在某一較佳實施方案中，所述的雙特異性抗體包括：胺基酸序列如SEQ ID NO: 58所示的多肽鏈1，胺基酸序列如SEQ ID NO: 59所示的多肽鏈2，胺基酸序列如SEQ ID NO:70所示的多肽鏈3。
在某一較佳實施方案中，所述的雙特異性抗體包括：胺基酸序列如SEQ ID NO: 58所示的多肽鏈1，胺基酸序列如SEQ ID NO: 59所示的多肽鏈2，胺基酸序列如SEQ ID NO:86所示的多肽鏈3。
為了解決上述技術問題，本發明第三方面提供了一種分離的核酸，其編碼如本發明第一方面所述的抗B7-H4抗體或如本發明第二方面所述的雙特異性抗體。
所述核酸的製備方法為本領域常規的製備方法，較佳地，包括以下的步驟：透過基因選殖技術獲得編碼上述抗體的核酸分子，或者透過人工全序列合成的方法得到編碼上述抗體的核酸分子。
本領域技術人員知曉，編碼上述抗體的胺基酸序列的鹼基序列可以適當引入替換、缺失、改變、插入或增加來提供一個多聚核苷酸的同系物。本發明中多聚核苷酸的同系物可以透過對編碼該抗體序列基因的一個或多個鹼基在保持抗體活性範圍內進行替換、缺失或增加來製得。
為了解決上述技術問題，本發明第四方面提供了一種重組表現載體，其包含如本發明第三方面所述的分離的核酸。
所述重組表現載體可透過本領域常規方法獲得，即：將本申請所述的核酸分子連接於各種表現載體上建構而成。所述的表現載體為本領域常規的各種載體，只要其能夠容載前述核酸分子即可。
優選地，所述表現載體包含真核細胞表現載體和/或原核細胞表現載體。
為了解決上述技術問題，本發明第五方面提供了一種轉形株，其包含如本發明第四方面所述的重組表現載體。
所述轉形株的製備方法可為本領域常規的製備方法，例如為：將上述重組表現載體轉形至宿主細胞中製得。所述轉形株的宿主細胞為本領域常規的各種宿主細胞，只要能滿足使上述重組表現載體穩定地自行複製，且所攜帶所述的核酸可被有效表現即可。優選地，所述宿主細胞為原核細胞和/或真核細胞，所述原核細胞優選 E. coli細胞如TG1、BL21(表現單鏈抗體或Fab抗體)，所述真核細胞優選HEK293細胞或CHO細胞(表現全長IgG抗體)。將前述重組表現質體轉形至宿主細胞中，即可得本發明優選的重組表現轉形株。其中所述轉形方法為本領域常規轉形方法，較佳地為化學轉形法、熱休克法或電穿孔法。
為了解決上述技術問題，本發明第六方面提供了一種嵌合抗原受體，其包含如本發明第一方面所述的抗B7-H4抗體或如本發明第二方面所述的雙特異性抗體。
為了解決上述技術問題，本發明第七方面提供了一種基因修飾的細胞，其特徵在於，其包含如本發明第六方面所述的嵌合抗原受體。
優選地，所述基因修飾的細胞為真核細胞，優選分離的人細胞；更優選免疫細胞如T細胞，或NK細胞。
為了解決上述技術問題，本發明第八方面提供了一種抗B7-H4抗體或雙特異性抗體的製備方法，所述製備方法包括以下步驟：培養如本發明第五方面所述的轉形株，從培養物中獲得抗B7-H4抗體或雙特異性抗體。
為了解決上述技術問題，本發明第九方面提供了一種抗體藥物偶聯物，包括抗體部分和偶聯部分，所述抗體部分包含如本發明第一方面所述的抗B7-H4抗體或如本發明第二方面所述的雙特異性抗體，所述偶聯部分包括可檢測標記物、藥物、毒素、細胞因子、放射性核種、酵素、或其組合，所述抗體部分和偶聯部分透過化學鍵或連接子進行偶聯。
為了解決上述技術問題，本發明第十方面提供了一種藥物組成物，其包含如本發明第一方面所述的抗B7-H4抗體、如本發明第二方面所述的雙特異性抗體、如本發明第六方面所述的嵌合抗原受體、如本發明第七方面所述的基因修飾的細胞和/或如本發明第九方面所述的抗體藥物偶聯物。
優選地，所述藥物組成物還包括藥學上可接受的載劑。
更優選地，所述的藥物組成物包括0.01~99.99%的上述蛋白質和/或上述的抗體藥物偶聯物，和0.01~99.99%的載劑，所述百分比為占所述藥物組成物的質量百分比。
本發明所述的藥物組成物的給藥途徑優選地為腸胃外施用、注射給藥或口服給藥。所述注射給藥優選地包括靜脈注射、肌肉注射、腹腔注射、皮內注射或皮下注射等途徑。所述的藥物組成物為本領域常規的各種劑型，較佳地為液體劑型、氣體劑型、固體劑型或半固體劑型的形式，即可以為水溶液、非水溶液或懸浮液，更佳的為片劑、膠囊、顆粒劑、注射劑或輸注劑等。更優選地為經由血管內、皮下、腹膜內或肌內施用。較佳地，所述藥物組成物還可以作為氣霧劑或噴霧劑施用，即經鼻施用；或者，鞘內、髓內或心室內施用。更優選地，所述的藥物組成物還可以口服給藥、注射給藥、經鼻給藥、經皮給藥或粘膜給藥。本發明的藥物組成物可根據需要製成各種劑型，並可由醫師根據患者種類、年齡、體重和大致疾病狀況、給藥方式等因素確定對病人有益的劑量進行施用。給藥方式例如可以採用注射或其它治療方式。
本發明所述的藥物組成物的給藥劑量位準可以根據達到所需診斷或治療結果的組合物量而調整。施用方案也可以為單次注射或多次注射，或進行調整。所選擇的劑量位準和方案依賴於包括所述藥物組成物的活性和穩定性(即，半衰期)、製劑、施用途徑、與其他藥物或治療的組合、待檢測和/或治療的疾病或病症、以及待治療的受試者的健康狀況和先前醫療史等各種因素而進行合理地調整。
優選地，所述藥物組成物還可包含組合治療劑以進行組合療法，所述的組合治療劑包括化學治療劑、放射治療劑、免疫抑制劑和/或細胞毒性藥物。對於組合療法，上述抗體、上述抗體藥物偶聯物和/或另外的治療或診斷劑可以各自作為單一藥劑，在適合於執行預期治療或診斷的任何時間範圍內進行使用。因此，這些單一藥劑可以基本上同時(即作為單一制劑或在數分鐘或數小時內)或以按順序連續施用。
關於製劑、劑量、施用方案和可測量的治療結果的另外指導，參見Berkow等人(2000)The Merck Manual of Medical Information(Merck醫學資訊手冊)和Merck&Co.Inc., Whitehouse Station, New Jersey; Ebadi (1998) CRC Desk Reference of Clinical Pharmacology(臨床藥理學手冊)等著作。
為了解決上述技術問題，本發明第十一方面提供了如本發明第一方面所述的抗B7-H4抗體、如本發明第二方面所述的雙特異性抗體、如本發明第六方面所述的嵌合抗原受體、如本發明第七方面所述的基因修飾的細胞、如本發明第九方面所述的抗體藥物偶聯物和/或如本發明第十方面所述的藥物組成物在製備治療和/或預防癌症的藥物、試劑盒和/或給藥裝置中的應用；或提供了如本發明第一方面所述的抗B7-H4抗體、如本發明第二方面所述的雙特異性抗體、如本發明第六方面所述的嵌合抗原受體、如本發明第七方面所述的基因修飾的細胞、如本發明第九方面所述的抗體藥物偶聯物和/或如本發明第十方面所述的藥物組成物在治療和/或預防癌症中的應用。
優選地，所述癌症選自肺癌、乳腺癌例如三陰性乳腺癌、卵巢癌、子宮內膜瘤、胃癌、小腸癌、結腸癌、直腸癌、胰腺癌、腎癌、膀胱癌、前列腺癌、膽管癌、食道癌和骨肉瘤等組成的組。
為了解決上述技術問題，本發明第十二方面提供了試劑盒，其包括如本發明第一方面所述的抗體、如本發明第二方面所述的雙特異性抗體、如本發明第六方面所述的嵌合抗原受體、如本發明第七方面所述的基因修飾的細胞、如本發明第九方面所述的抗體藥物偶聯物和/或如本發明第十方面所述的藥物組成物；以及任選地，說明書。
為了解決上述技術問題，本發明第十三方面提供了給藥裝置，所述給藥裝置包含：(1)用於對有需要的受試者施用如本發明第十方面所述的藥物組成物的輸注模組，以及(2)任選的藥效監控模組。
為了解決上述技術問題，本發明第十四方面提供了一種檢測B7-H4的方法，其包括使用如本發明第一方面所述的抗B7-H4抗體和/或如本發明第二方面所述的雙特異性抗體進行檢測的步驟。
優選地，所述方法為非診斷和/或治療目的。非診斷、治療目的例如在實驗室檢測樣品中所包含的B7-H4；或研發中利用B7-H4進行藥物篩選前對該B7-H4進行確認。
為解決上述技術問題，本發明還提供一種治療和/或預防腫瘤的方法，其包括向有需要的受試者施用治療有效劑量的如本發明第一方面所述的抗B7-H4抗體、如本發明第二方面所述的雙特異性抗體、如本發明第六方面所述的嵌合抗原受體、如本發明第七方面所述的基因修飾的細胞、如本發明第九方面所述的抗體藥物偶聯物和/或如本發明第十方面所述的藥物組成物。
對於本發明的所述藥物組成物的治療有效劑量可以最初在細胞培養實驗或動物模型例如齧齒類動物、兔、犬、豬和/或靈長類動物中進行估計。動物模型也可以用於測定合適的施用濃度範圍和途徑。隨後可以用於確定在人中施用的有用劑量和途徑。一般地，施用有效量或劑量的確定和調整以及何時和如何進行此類調整的評估為本領域技術人員已知。
為了解決上述問題，本發明還提供一種治療癌症的組合療法，所述組合療法包括向有需要的患者施用治療有效劑量的藥物組成物和組合治療劑；所述藥物組成物如本發明第十方面所述。
優選地，所述組合治療劑如本發明第十方面所述。
在本申請中，除非另有說明，否則本申請中使用的科學和技術名詞具有本領域技術人員所通常理解的含義。並且，本申請中所用的細胞培養、分子遺傳學、核酸化學、免疫學實驗室操作步驟均為對應領域內廣泛使用的常規步驟。同時，為了更好地理解本發明，下面提供相關術語的定義和解釋。
在本申請中，術語“可變”通常是指這樣的事實，即抗體的可變結構域的序列的某些部分變化強烈，它形成各種特定抗體對其特定抗原的結合和特異性。然而，變異性並非均勻地分佈在抗體的整個可變區中。它集中在輕鏈和重鏈可變區中的三個區段，被稱為互補決定區(CDR)或高變區(HVR)。可變域中更高度保守的部分被稱為框架(FWR)。天然重鏈和輕鏈的可變結構域各自包含四個FWR區，大部分採用β-折疊構型，透過三個CDR連接，形成環連接，並且在一些情況下形成β-折疊結構的一部分。每條鏈中的CDR透過FWR區緊密靠近在一起，並與來自另一條鏈的CDR一起形成抗體的抗原結合位點，恆定區不直接參與抗體與抗原的結合，但是它們表現出不同的效應功能，例如參與抗體的依賴於抗體的細胞毒性。
本申請所用胺基酸三字母代碼和單字母代碼如本領域技術人員知曉，或J. Biol. Chem, 243, p3558(1968)中所述。
如本文使用的，術語“包括”或“包含”旨在表示組合物和方法包括所述的元素但不排除其他元素，但根據上下文的理解，也包括“由……組成”的情況。
本申請中，所述的HCAb可以是由一種攜帶人免疫球蛋白免疫組庫的基因轉殖小鼠—Harbour HCAb小鼠(Harbour Antibodies BV，WO 2002/085945 A3)產生，僅含有“重鏈”的全人源抗體(Heavy Chain Only Antibody)，該抗體的大小只有傳統IgG抗體的一半，其通常僅具有人的抗體“重鏈”可變結構域和小鼠Fc恆定結構域。
本申請所述的術語“抗體”可以是包括免疫球蛋白，其是由兩條相同的重鏈和兩條相同的輕鏈透過鏈間二硫鍵連接而成的四肽鏈結構。免疫球蛋白重鏈恆定區的胺基酸組成和排列順序不同，故其抗原性也不同。據此，可將免疫球蛋白分為五類，或稱為免疫球蛋白的同種型，即IgM、IgD、IgG、IgA和IgE，其對應的重鏈分別為µ鏈、δ鏈、γ鏈、α鏈和ε鏈。同一類Ig根據其鉸鍊區胺基酸組成和重鏈二硫鍵的數目和位置的差別，又可分為不同的亞類，如IgG可分為IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。輕鏈透過恆定區的不同分為κ鏈或λ鏈。五類Ig中第每類Ig都可以有κ鏈或λ鏈。
在本申請中，本申請所述的抗體輕鏈可變區可進一步包含輕鏈恆定區，所述的輕鏈恆定區包含人源的κ、λ鏈或其變異體。在本申請中，本申請所述的抗體重鏈可變區可進一步包含重鏈恆定區，所述的重鏈恆定區包含人源的IgG1、2、3、4或其變異體。
在輕鏈和重鏈內，可變區和恆定區透過大約12或更多個胺基酸的“J”區連接，重鏈還包含大約3個或更多個胺基酸的“D”區。各重鏈由重鏈可變區(VH)和重鏈恆定區(CH)組成。重鏈恆定區由3個結構域(CH1、CH2和CH3)組成。各輕鏈由輕鏈可變區(VL)和輕鏈恆定區(CL)組成。輕鏈恆定區由一個結構域CL組成。抗體的恆定區可媒介免疫球蛋白與宿主組織或因子，包括免疫系統的各種細胞(例如，效應細胞)和典型補體系統的第一組分(C1q)的結合。抗體重鏈和輕鏈靠近N端的約110個胺基酸的序列變化很大，為可變區(V區)；靠近C端的其餘胺基酸序列相對穩定，為恆定區(C區)。可變區包括3個高變區(HVR)和4個序列相對保守的骨架區(FWR)。3個高變區決定抗體的特異性，又稱為互補性決定區(CDR)。每條輕鏈可變區(VL)和重鏈可變區(VH)由3個CDR區4個FWR區組成，從胺基端到羧基端依次排列的順序為：FWR1、CDR1、FWR2、CDR2、FWR3、CDR3、FWR4。輕鏈的3個CDR區指VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3；重鏈的3個CDR區指VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3。
術語“人源抗體”包括具有人種系免疫球蛋白序列的可變區和恆定區的抗體。本申請的人源抗體可包括不由人種系免疫球蛋白序列編碼的胺基酸殘基(如透過體外隨機或位點特異性誘變或透過體內體細胞突變所引入的突變)。然而，術語“人源抗體”不包括這樣的抗體，即其中已將衍生自另一種哺乳動物物種(諸如小鼠)種系的CDR序列移植到人骨架序列上(即“人源化抗體”)。
如本申請所用，關於抗體的術語“特異性”意指辨識特異性抗原但基本上不辨識或結合樣品中的其他分子的抗體。例如，特異性結合來自一個物種的抗原的抗體也可以結合來自一個或更多個物種的該抗原。但是，這種種間交叉反應性本身不改變抗體根據特異性的分類。在另一個實例中，特異性結合抗原的抗體也可以結合該抗原的不同等位基因形式。然而，這種交叉反應性本身不改變抗體根據特異性的分類。在一些情況下，術語“特異性”或“特異性結合”可用於指抗體、蛋白質或胜肽與第二化學物質的相互作用，意味著該相互作用取決於化學物質上特定結構(例如，抗原決定簇或表位)的存在；例如，抗體一般辨識並結合特定的蛋白質結構，而不是蛋白質。如果抗體對表位“A”具有特異性，則在含有經標記的“A”和抗體的反應中，含有表位A的分子(或游離的，未標記的A)的存在將減少結合於抗體的標記的A的量。
本申請中，術語“抗原結合片段”是指抗體的抗原結合片段及抗體類似物，其通常包括至少部分母體抗體(parental antibody)的抗原結合區或可變區(例如一個或多個CDR)。抗原結合片段保留母體抗體的至少某些結合特異性。通常，當基於莫耳來表示活性時，抗原結合片段保留至少10％的母體結合活性。優選地，抗原結合片段保留至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%或100%或更多的母體抗體對標的的結合親和力。抗原結合片段實例包括但不限於：Fab、Fab’、F(ab’) 2、Fv片段、線性抗體(linear antibody)、單鏈抗體、奈米抗體、單域抗體和多特異性抗體。抗原結合片段可為工程改造的抗體變異體。工程改造的抗體變異體綜述於Holliger和Hudson(2005)Nat. Biotechnol. 23: 1126-1136中。
本文中使用的術語“嵌合抗原受體”或“CAR”(Chimeric antigen receptor)指：包含能夠結合抗原的胞外域(胞外結合結構域)、鉸鍊結構域、跨膜結構域(跨膜區)和使胞質訊號傳到結構域的多肽(即胞內訊號域)。鉸鍊結構域可以被認為是用於向細胞外抗原結合區提供柔性的一部分。胞內訊號域指經由確定的訊號傳遞途徑透過產生第二信使而將訊息傳遞到細胞內以調節細胞活性的蛋白質、或透過對應於此類信使而作為效應子發揮作用的蛋白質，產生可以促進CAR的細胞(例如CART細胞)的免疫效應子功能的訊號。胞內訊號域包含訊號傳遞結構域，還可以包括源自共刺激分子的共刺激胞內結構域。
“同一性”、“突變”是指兩個多核苷酸序列之間或兩個多肽之間的序列相似性。當兩個比較序列中的位置均被相同鹼基或胺基酸單體次單元佔據時，例如如果兩個DNA分子的每一個位置都被腺嘌呤佔據時，那麼所述分子在該位置是同源的。兩個序列之間的同一性百分率是兩個序列共有的匹配或同源位置數除以比較的位置數×100的函數。例如，在序列最佳比對時，如果兩個序列中的10個位置有6個匹配或同源，那麼兩個序列為60%同源。一般而言，當比對兩個序列而得到最大的同一性百分率時進行比較。
術語“多肽”、“胜肽”和“蛋白質”(如果為單鏈)在本申請中互換地使用。術語“核酸”、“核酸序列”，“核苷酸序列”或“多核苷酸序列”和“多核苷酸”互換使用。
本文使用的術語“載體”是包含分離的核酸並可用於將分離的核酸遞送至細胞內部的組合物。在本領域中已知許多載體，包括但不限於線性多核苷酸、與離子或兩親化合物相關的多核苷酸、質體和病毒。因此，術語“載體”包括自主複製的質體或病毒。該術語還應被解釋為包括促進核酸轉移到細胞中的非質體和非病毒化合物，例如聚賴胺酸化合物、脂質體等。病毒載體的實例包括但不限於腺病毒載體、腺相關病毒載體、逆轉錄病毒載體等。
本申請使用的表述“細胞”、“細胞株”可互換使用，並且所有這類名稱都包括後代。術語“宿主細胞”是指，可用於導入載體的細胞，其包括但不限於，如大腸桿菌等原核細胞，如酵母細胞等的真菌細胞，或者如纖維原細胞、CHO細胞、COS細胞、NSO細胞、HeLa細胞、BHK細胞、HEK 293細胞或人細胞等的動物細胞。
術語“轉染”是指將外源核酸引入真核細胞。轉染可以透過本領域已知的各種手段來實現，包括磷酸鈣-DNA共沉澱、DEAE-葡聚糖媒介的轉染、聚凝胺媒介的轉染、電穿孔、顯微注射、脂質體融合、脂質轉染、原生質體融合、逆轉錄病毒感染和基因槍技術 (biolistics)。
術語“免疫細胞”指可以引發免疫反應的細胞，“免疫細胞”及其語法上的其他形式可以指任何來源的免疫細胞。“免疫細胞”包括例如衍生自在骨髓中產生的造血幹細胞(HSC)的白血球(白細胞)、淋巴細胞(T細胞、B細胞、自然殺手(NK)細胞和骨髓來源的細胞(嗜中性顆粒細胞、嗜酸性顆粒細胞、嗜鹼性顆粒細胞、單核細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞)。術語“免疫細胞”也可以是人或非人的。例如，免疫細胞可以是來自血液的，如自體的T細胞、異體T細胞、自體NK細胞、異體NK細胞，也可以來源自細胞株，如利用EBV病毒感染來製備NK細胞株，從胚胎幹細胞和iPSC誘導分化來的NK細胞以及NK92細胞株等。
如本申請使用的，術語“T細胞”是指在胸腺中成熟的一類淋巴細胞。T細胞在細胞媒介的免疫中起重要作用，並且與與其他淋巴細胞(例如B細胞)的不同點在於細胞表面上存在T細胞受體。“T細胞”包括表現CD3的所有類型的免疫細胞，包括T輔助細胞(CD4+細胞)、細胞毒性T細胞(CD8+細胞)、自然殺手T細胞、T調節細胞(Treg)和γ-δT細胞。“細胞毒性細胞”包括CD8+ T細胞、自然殺手(NK)細胞和嗜中性顆粒細胞，這些細胞能夠媒介細胞毒性反應。如本文使用的，術語“NK細胞”是指起源於骨髓並且在先天免疫系統中起重要作用的一類淋巴細胞。NK細胞提供針對病毒感染的細胞、腫瘤細胞或其他應激細胞的快速免疫反應，即使是細胞表面上不存在抗體和主要組織相容性複合體。
“任選”、“任一”、“任意”或“任一項”意味著隨後所描述地事件或環境可以但不必發生，該說明包括該事件或環境發生或不發生地場合。例如，“任選包含1個抗體重鏈可變區”意味著特定序列的抗體重鏈可變區可以但不必須存在。本發明所用，“一個”和“一種”在本發明中用來指的一個或多於一個的語法對象。除非內容明確提示，否則術語“或”在本發明中用來意指術語“和/或”並且與之互換使用。“約”和“大約”應當通常意指鑒於測量的性質或精度，所測量的量的可接受誤差程度。例示性誤差程度一般在其10%範圍內和更一般在其5%範圍內。本發明揭露的方法和組合物涵蓋這樣的多肽和核酸，它們具有指定的序列，變異序列或與其基本上相同或相似的序列，例如，與序列指定至少85%、90%、95%、99%或更多相同的序列。在胺基酸序列的情況下，術語“基本上相同”在本發明中用來指第一胺基酸序列。
如發明所用，術語“藥學上可接受的載劑”是指在藥理學和/或生理學上與受試者和活性成分相容的載劑，例如任意合適的生理學或藥學上可接受的藥物輔料，是本領域公知的(參見例如Remington's Pharmaceutical Sciences. Edited by Gennaro AR, 19th ed. Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1995)，並且包括但不限於：pH調節劑、賦形劑、填充劑、表面活性劑、佐劑、離子強度增強劑、稀釋劑、維持滲透壓的試劑、延遲吸收的試劑、防腐劑。例如，pH調節劑包括但不限於磷酸鹽緩衝液。表面活性劑包括但不限於陽離子，陰離子或者非離子型表面活性劑，例如Tween-80。離子強度增強劑包括但不限於氯化鈉。防腐劑包括但不限於各種抗細菌試劑和抗真菌試劑，例如對羥苯甲酸酯，三氯叔丁醇，苯酚，山梨酸等。維持滲透壓的試劑包括但不限於醣、NaCl及其類似物。延遲吸收的試劑包括但不限於單硬脂酸鹽和明膠。稀釋劑包括但不限於水，水性緩衝液(如緩衝鹽水)，醇和多元醇(如甘油)等。防腐劑包括但不限於各種抗細菌試劑和抗真菌試劑，例如硫柳汞，2-苯氧乙醇，對羥苯甲酸酯，三氯叔丁醇，苯酚，山梨酸等。穩定劑具有本領域技術人員通常理解的含義，其能夠穩定藥物中的活性成分的期望活性，包括但不限於谷胺酸鈉，明膠，SPGA，醣類(如山梨醇，甘露醇，澱粉，蔗糖，乳糖，葡聚糖，或葡萄糖)，胺基酸(如谷胺酸，甘胺酸），蛋白質(如乾燥乳清，白蛋白或酪蛋白)或其降解產物(如乳白蛋白水解物)等。本發明的藥學上可接受的載劑可為本領域常規的載劑，所述的藥物輔料為本領域常規的藥物輔料。
如本文中所使用的，術語EC 50是指半最大效應濃度(concentration for 50% of maximal effect)，即能引起50%最大效應的濃度。
如本發明所用，術語“癌”、“癌症”、“腫瘤”意在包括全部類型的癌性生長物或致瘤過程、轉移性組織或惡性轉形的細胞、組織或器官，無論組織病理學類型或侵襲力階段是什麼。例子包括但不限於固態腫瘤、血液學癌、軟組織腫瘤和轉移性病灶。
在符合本領域常識的基礎上，上述各優選條件，可任意組合，即得本發明各較佳實例。
本發明所用試劑和原料均市售可得。
本發明的積極進步效果在於：
1、本發明的抗體具有與人B7-H4和食蟹猴B7-H4結合的活性。在某一較佳實施例中，所述抗體可為一種全新的僅含“重鏈”的全人抗體，其大小只有傳統IgG抗體的一半，由於不含輕鏈的這一特點，使得該抗體可以用於雙特異性抗體，並解決了輕鏈錯誤配對和異源二聚化的問題。
2、將本發明的抗體製備成B7-H4×CD3雙特異性抗體時，其仍舊保留了與人B7-H4和食蟹猴B7-H4結合的活性，且對腫瘤細胞具有較強的毒殺效果，誘導的非特異性細胞因子例如IL-6和IFN-γ的表現很低；並且顯示出較強的體內抗腫瘤活性。在某一較佳實施例中，所述雙特異性抗體帶有人Fc片段的雙特異性抗體結構，保留了Fc與FcRn的結合作用，從而具有較長的半衰期；同時優選突變的(AAA)Fc以降低與FcgR的結合，從而可降低因FcgR的交聯作用而引起的非特異性T細胞活化；B7-H4端可採用串聯的VHH形式，簡化了輕重鏈的錯誤配對，同時還保留了很好的穩定性和親水性；兩價串聯的VHH一方面增加了B7-H4的親和力，另一方面增加了對高表現B7-H4的腫瘤細胞的選擇性；優化了雙特異性抗體中CD3端的活性，採用中等強度的抗CD3抗體，保證藥效的前提下降低了毒性。
具體實施方式
下面透過實施例的方式進一步說明本發明，但並不因此將本發明限制在所述的實施例範圍之中。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，按照常規方法和條件，或按照商品說明書選擇。 實施例 1. 抗 B7-H4 HCAB 抗體分子的獲得
可以利用B7-H4抗原對實驗動物進行免疫以獲得針對B7-H4特異性結合的抗體分子，該實驗動物可以是小鼠、大鼠、兔、羊、駱駝等。通常，其得到的抗體分子是非人源的。在獲得非人源抗體後，需要對這些分子利用抗體工程技術進行人源化改造，以降低免疫原性並提高成藥性。然而，抗體的人源化過程有其技術複雜性，經過人源化改造的分子往往會降低對抗原的親和力。另一方面，基因轉殖技術的進步使得可以培育出基因工程化小鼠，其攜帶人免疫球蛋白免疫組庫並使其內源的鼠的免疫組庫缺失。這種基因轉殖小鼠產生的抗體具有全人源的序列，因而無需再進一步做人源化改造，大大提高了治療性抗體開發的效率。Harbour HCAb小鼠(Harbour Antibodies BV，WO 2002/085945 A3)是一種攜帶人免疫球蛋白免疫組庫的基因轉殖小鼠，能夠產生全新的僅“重鏈”抗體，該抗體的大小只有傳統IgG抗體的一半。其產生的抗體僅具有人的抗體“重鏈”可變結構域和小鼠Fc恆定結構域。由於不含輕鏈的這一特點，該抗體幾乎解決了輕鏈錯誤配對和異源二聚化的問題，使得這一技術平臺能夠開發出傳統抗體平臺難以實現的產品。 1.1 小鼠免疫
用過表現人B7-H4的HEK293T細胞(HEK293T/hu B7-H4，康源博創)免疫HCAB小鼠，每隻小鼠每次免疫5 × 10 6細胞，透過腹腔注射。在每一輪免疫中，每隻小鼠接受的總注射劑量是100微升。每輪增強免疫的間隔時間至少為兩周，通常為6到7輪增強免疫。免疫時間為第0、14、28、42、56、70、84、96天；並且在第49、77天，檢測小鼠血清抗體效價。在進行HCAB小鼠脾B細胞分離前5天進行最後一次增強免疫。 1.2 血清效價檢測
在特定的時間點，收取小鼠血清，用ELISA方法檢測血清中抗體結合B7-H4蛋白的效價以及用FACS方法檢測血清中抗體結合過表現B7-H4的細胞的效價。
在ELISA方法中，用1 µg/mL的hB7-H4-ECD-his蛋白(Sino Biological，# 10738-H08H)100µL/孔塗佈ELISA培養盤(corning, 9018)，4℃培育過夜；洗滌2次後，用含1% BSA的PBST在37℃阻斷2小時；加入100 µL/孔梯度稀釋的血清37℃培育1小時；洗滌3次後，加入100 µL/孔1:5000稀釋的anti-mouse-HRP(Bethyl, Cat# A90-231P)，37℃培育30分鐘。洗滌3次後，加入100 µL/孔TMB受質培育約10分鐘，加入50 µL/孔1N HCl終止顯色，讀450 nm的吸光度(Molecular Devices, Plus 384)。
在FACS方法中，梯度稀釋的鼠血清與HEK293T/hu B7-H4細胞4℃培育1小時；細胞洗2次後，加入二抗Goat Anti-Mouse IgG (H+L)(Jackson, Cat# 115-605-062)4℃培育1小時，洗2次後，重新懸浮細胞用流式細胞儀檢測(ACEA Novocyte3000)。HEK293T細胞作為背景對照。 1.3 噬菌體展示技術獲得 HCAb 單一選殖株和抗體序列a.噬菌體基因庫建構
從實施例1.1免疫後的小鼠中收集脾細胞，並從中分離出脾臟B細胞，然後用TRIZOl提取RNA後，參照產品說明書(Thermofisher, Cat.No.15596018)，進行RT-PCR參照產品說明書(Thermofisher, Cat.No.11756500)。以cDNA為模板，透過PCR擴增出VHH片段。
PCR擴增體系如下表所示：
總RNA-cDNA 1μl/1 μl H 2O 作為陰性對照
5xQ5反應緩衝液 10μl
2.5mM dNTP 4μl
正向引物(10μM) 2μl
反向引物(10μM) 2μl
Q5 DNA聚合酶 0.5μl
ddH 2O 30.5μl
總體積 50μl
Figure 02_image001
PCR擴增程序如下表所示：
98℃ 30s
98℃ 10s
64℃ 30s
72℃ 30s
72℃ 10min
將所得的連接產物轉形至SS320(Lucigen,Cat.No. 60512-1)；然後製備噬菌體基因庫。進行三輪生物淘選 (步驟如下所述)並用生物素化的B7-H4透過FACS進行篩選，將所有篩選出的候選物(hit)送去定序(步驟如下所述)並生產出特定的選殖株。 b. 生物淘選(Bio-Panning)
噬菌體基因庫(1E13噬菌體顆粒)用鏈黴親和素(SA)塗佈的珠子(Thermofisher, Cat.No.11206)去除非特異性結合的分子，然後在室溫下與SA-Bio-B7-H4珠（參照產品說明書）培育1小時；然後用1×PBST洗滌10次。洗滌後，用pH3.0檸檬酸緩衝液加入磁珠噬菌體混合物室溫培育10分鐘，再加入pH9.0 Tris-HCl中和緩衝液，然後在37℃感染SS320細胞，感染時間為45分鐘。然後在上述感染的細胞中加入50μl 2E12/ml的M13K07輔助噬菌體(NEB, Cat.No. N0315S)，最後加入新鮮2×YT(含有100μg/ml Amp，50 μg/ml Kan，1mM IPTG)，在30℃培育過夜。將過夜培養物離心，收集上清液，加入20%PEG6000/2.5M NaCl到上清液(1:5，體積比)中，然後在4℃，8000rpm離心20 min。將離心後所得的噬菌體沉澱重新懸浮於1 ml 1×PBS中。將所得上清液(噬菌體顆粒)轉移到新管中，並準備進行第2輪淘選。第2輪淘選和第3輪淘選的過程與前述步驟相同。 c. 初步篩選
將菌落挑選到含有YT/Amp培養基(Sangon Biotech, Cat.No.A507016-0250)的96孔盤中，並在37℃下生長3小時。加入IPTG至終濃度為1 mM，並在30℃下誘導過夜。然後將上清液離心沉澱後取上清液進行FACS試驗。對人和猴B7-H4結合較好的選殖株被挑選出來進行定序。 1.4 抗 B7-H4 H2L2 抗體分子的獲得
利用B7-H4重組蛋白或過表現B7-H4的細胞對實驗動物進行免疫以獲得針對B7-H4特異性結合的抗體分子，該實驗動物可以是小鼠、大鼠、兔、羊、駱駝等。通常，其得到的抗體分子是非人源的。在獲得非人源抗體後，需要對這些分子利用抗體工程技術進行人源化改造，以降低免疫原性並提高成藥性。然而，抗體的人源化過程有其技術複雜性，經過人源化改造的分子往往會降低對抗原的親和力。另一方面，基因轉殖技術的進步使得可以培育出基因工程化小鼠，其攜帶人免疫球蛋白免疫組庫並使其內源的鼠的免疫組庫缺失。Harbour H2L2小鼠(Harbour Antibodies BV)是一種攜帶人免疫球蛋白免疫組庫的基因轉殖小鼠，這種基因轉殖小鼠產生的抗體具有全人源的序列，因而無需再進一步做人源化改造，大大提高了治療性抗體開發的效率。
接著，透過B細胞體外選殖技術篩選抗B7-H4的抗體，具體如下： 將小鼠的脾臟取出，研磨後用200目濾網進行過濾，單細胞懸浮液按照小鼠記憶性B細胞分離篩選試劑盒(Miltenyi, #130-095-838) 進行分離篩選。分離篩選得到的細胞進行免疫螢光染色。
在流式細胞分離篩選儀S3e上對B200陽性(BioLegend, #103227)、IgM陰性(BioLegend, #406506)、B7-H4特異性陽性細胞(BioLegend, #405207)進行分離篩選。分離篩選獲得的細胞按照每孔5個細胞的密度培養在細胞培養96孔盤上，細胞培養盤上預先舖好輻射照過的EL4細胞作為飼養層細胞。
培養14天後收取培養上清液進行ELISA檢測，對於B7-H4蛋白有結合活性的孔，將細胞取出進行RT-PCR(SMART-Seq v4 Ultra Low Input RNA Kit for Sequencing(#634892), I-5™ 2×High-Fidelity Master Mix(#I5HM-5000)。擴增獲得的輕、重鏈透過overlap PCR拼接成scFv，在 E. coli中進行表現，表現上清液進行ELISA檢測，將陽性的選殖株進行定序。 1.5 抗 B7-H4 抗體的序列分析和序列優化
篩選獲得的陽性選殖株按照實施例1.6所述方法製備重組抗體PR006004和PR006008。在本實施例中，從免疫的Harbour HCAb小鼠得到的抗B7-H4單株抗體分子可變結構域的序列是人源抗體序列。表1-1列出其生殖系基因分析和翻譯後修飾位點(PTM)分析。
PR006004和PR006008在CDR2中含有一個可能的天門冬胺酸異構化位點(DG)，為了降低此潛在的翻譯後修飾位點(PTM)的風險，將其DG突變為DS，分別得到新分子PR007440和PR007441(表1-2)。
進一步地，為了降低PR006004的等電點，根據抗體序列分析，選擇CDR區域的鹼性胺基酸進行隨機突變。然後，使用FACS結合實驗進行篩選；篩選出的候選分子再表現純化及鑒定。表1-2列出了對抗體PR006004的序列進行胺基酸突變得到的新的抗體分子序列。 表1-1 初始抗體
選殖株號 VH 生殖系 V 基因 VH PTM 重組抗體 重組抗體亞型
R7004M1A2 VH3-74*01 DG (HCDR2) PR006004 IgG1
R7004M6D4 VH3-74*01 DG (HCDR2) PR006008 IgG1
表1-2PTM和電荷突變
初始抗體 變異體 可變區突變 重組抗體亞型
PR006004 PR007440 G55S IgG1
PR006008 PR007441 G55S IgG1
PR006004 PR007195 V46E, G55S, R56D, A61E IgG1
PR006004 PR007196 V46E, G55S, R56E IgG1
PR006004 PR007200 V46E, G55S, R56S IgG1
PR006004 PR007201 V46E, G55S, R56S, A61E IgG1
PR006004 PR007202 V46E, G55S, R56T IgG1
PR006004 PR007203 V46E, G55S, R56T, A61E IgG1
1.6 製備抗 B7-H4 全人重組抗體
將編碼抗體重鏈的質體轉染哺乳動物宿主細胞(如人胚腎細胞HEK293)，利用常規的重組蛋白表現和純化技術，可以得到純化的抗B7-H4重組重鏈抗體。具體說來，將HEK293細胞在FreeStyle™ F17 Expression Medium培養基(Thermo, A1383504)擴培。瞬時轉染開始之前，調節細胞濃度至6×10E+05細胞/ml，於37℃ 8% CO 2培養箱中培養24小時，細胞濃度在1.2×10E+06細胞/ml。準備30 ml培養的細胞，將上述編碼重鏈的質體30 µg質體溶解於1.5 ml Opti-MEM減血清培養基(Thermo,31985088)，再取1.5 ml Opti-MEM溶入1 mg/ml PEI(Polysciences, Inc, Cat# 23966-2)120 µl，靜置5分鐘。把PEI緩慢加入質體中，室溫培育10分鐘，邊搖晃培養瓶邊緩慢滴入質體PEI混合溶液，於37℃ 8% CO 2培養箱中培養5天。5天後觀測細胞存活率。收集培養物，以3300G轉速離心10分鐘後取上清液；然後將上清液高速離心去除雜質。用PBS(pH7.4)平衡含有MabSelect ™(GE Healthcare Life Science, Cat#71-5020-91 AE)的重力管柱(Bio-Rad, #7311550)，2-5倍管柱體積沖洗。將上清液樣品過管柱。用5-10倍管柱體積的PBS沖洗管柱。再用pH3.5的0.1M甘胺酸洗提目標蛋白，後用pH 8.0的Tris-HCl調節至中性，最後用超濾管(Millipore, UFC901024)濃縮換液至PBS緩衝液，得到純化的抗B7-H4重鏈抗體溶液。 1.7 利用 SEC-HPLC 分析蛋白純度和聚合體
本實施例使用分析型分子粒徑篩析層析法(SEC)來分析蛋白樣品的純度和聚合體形式。將分析型層析管柱TSKgel G3000SWxl (Tosoh Bioscience, #08541, 5 µm, 7.8 mm × 30 cm)連接到高壓液相層析儀HPLC (Agilent Technologies, Agilent 1260 Infinity II)，用PBS緩衝液室溫下平衡至少1小時。適量蛋白樣品(至少10 µg)用0.22 µm濾膜過濾後注射入系統，並設定HPLC程序：用PBS緩衝液將樣品以1.0 ml/分鐘的流速流過層析管柱，最長時間為25分鐘。HPLC將生成分析報告，報告出樣品內不同分子尺寸組份的滯留時間。 1.8 利用 HPLC-HIC 分析蛋白純度和疏水性
使用分析型疏水相互作用層析層析法(HIC)來分析蛋白樣品的純度和疏水性。將分析型層析管柱TSKge1 Buty1-NPR(Tosoh Bioscience, 14947, 4.6 mm × 3.5 cm)連接到高壓液相層析儀(HPLC)(型號：Agilent Technologies, Agilent 1260 Infinity II)，用PBS緩衝液室溫下平衡至少1小時。設定方法由16分鐘內從100%流動相A (20 mM 組胺酸，1.8 M硫酸銨，pH 6.0)至100%流動相B(20 mM 組胺酸，pH 6.0)的線性梯度，流速設定為0.7 ml/min，蛋白樣品濃度1 mg/ml，進樣體積20 µl，檢測波長280 nm。採集後用ChemStation軟體對層析圖進行積分並計算相關數據，生成分析報告，報告出樣品內不同分子尺寸組份的滯留時間。 1.9 利用 DSF 或 UNcle 測定蛋白分子的熱穩定性
差示掃描螢光法(Differential Scanning Fluorimetry, DSF)是一種常用的高通量的測定蛋白質熱穩定性的方法。它使用實時螢光定量PCR儀器透過監測與去折疊的蛋白分子結合的染料的螢光強度的變化，來反應蛋白質的變性的過程，從而反應出蛋白分子的熱穩定性。本實施例利用DSF方法來測定蛋白分子熱變性溫度(Tm)。10 μg蛋白加入96-孔PCR盤(Thermo, #AB-0700/W)，接著加入2 μl 100×稀釋的染料SYPROTM(Invitrogen, #2008138)，然後加入緩衝液使得終體積為40 μl每孔。將PCR盤密封，放置於實時螢光定量PCR儀器(Bio-Rad CFX96 PCR System)，先於25℃培育5分鐘，然後以0.2℃/0.2分鐘的梯度逐漸從25℃升溫至95℃，在測試結束時將溫度降至25℃。使用FRET掃描模式並使用Bio-Rad CFX Maestro軟體進行數據分析並計算出樣品的Tm。
Uncle (Unchained Labs)是一個多功能一站式的蛋白穩定性分析平臺，它透過全螢光，靜態光散射(SLS)和動態光散射(DLS)檢測方法來特徵鑑定蛋白質的穩定性。同一組樣品可同時得到熔解溫度(TM)，聚集溫度(Tagg)和粒徑(diameter)等參數。在本實施例中，選擇Uncle的“Tm & Tagg with optional DLS”應用程序進行操作，取9 µL樣品加入Uni管中，設置以0.3℃/分鐘的梯度逐漸從25℃升溫至95℃。進行初始和最終DLS測量四次採集，每次採集5秒。實驗運行結束後，Uncle分析軟體採用重心均值(BCM)公式來計算每個樣品的Tm值。
所得抗體的表現訊息和理化性質如表1-3所示。 表1-3 抗體的表現和理化性質
抗體 一步純化後產量 (mg/L) SEC-HPLC 純度 (%) HIC-HPLC 滯留時間 (min) 相對應硫酸銨濃度 (M) Tm 1 (℃) Tm測定方法 PI
PR006004 40.31 98.74 17.127 0.66 61.4 DSF 8.82
PR006008 51.7 100 16.193 0.78 59.4 DSF 7.69
PR007440 123.5 95.756 8.82
PR007441 16.4 100 7.69
PR007195 21.29 72.71 17.625 0.6 45.6 DSF 6.93
PR007196 60.82 97.45 7.2
PR007200 45.93 97.68 17.81 0.58 59.4 DSF 7.59
PR007201 43.47 92.1 17.662 0.6 52 DSF 7.2
PR007202 44.67 96.79 17.844 0.58 59.2 DSF 7.59
PR007203 50.53 90.74 17.65 0.6 52 DSF 7.2
PR007354 150 89.19 9.23
PR007355 202.9 95.93 9.11
PR006391 94.5 100 17.397 0.64 54.6 Uncle 9.34
PR006407 62.5 98.8 16.834 0.71 47.6 Uncle 9.14
PR006840 59.9 98.97 9.25
PR007077 33 93.984 17.9 0.59 57 Uncle 9.34
PR007078 34 68.496 17.3 0.65 56.1 Uncle 9.14
PR007168 43.8 99.077 9.25
PR005885 108.4 99.18 17.39 0.64 57 DSF 9.26
1.10 抗 B7-H4 抗體序列與編號
在本發明中，所列CDR的胺基酸序列均是按照Chothia定義規則所示出的。但是，本領域人員公知，在本領域中可以透過多種方法來定義抗體的CDR，例如基於序列可變性的Kabat定義規則(參見，Kabat等人，免疫學的蛋白質序列，第五版，美國國立衛生研究院，貝塞斯達，馬裡蘭州(1991))和基於結構環區域位置的Chothia定義規則(參見JMol Biol 273:927-48,1997)。在本發明的技術方案中，還可以使用包含了Kabat定義和Chothia定義的Combined定義規則來確定可變結構域序列中的胺基酸殘基。其中Combined定義規則即是將Kabat定義和Chothia定義的範圍相結合，基於此取了一個更大的範圍，詳見表4。本領域技術人員應當理解的是，除非另有規定，否則術語給定抗體或其區(例如可變區)的“CDR”及“互補決定區”應瞭解為涵蓋如透過本發明描述的上述已知方案中的任何一種界定的互補決定區。雖然本發明中請求保護的範圍是基於Chothia定義規則所示出的序列，但是根據其他CDR的定義規則所對應的胺基酸序列也應當落在本發明的保護範圍中。 表1-4本申請抗體CDR定義方法
Kabat Chothia Combined
HCDR1 H31--H35 H26--H32 H26-H35
HCDR2 H50--H65 H52--H56 H50-H65
HCDR3 H95--H102 H95--H102 H95-H102
其中，Haa-Hbb可以指從抗體重鏈的N端開始，第aa位(Chothia編碼規則)至第bb位(Chothia編碼規則)的胺基酸序列。例如，H26-H35可以指從抗體重鏈N端開始，按照Chothia編碼規則的從第26位至第35位的胺基酸序列。本領域技術人員應當知曉的是，在用Chothia編碼CDR時，有些位置會有插入位點的情況(可參見http://bioinf.org.uk/abs/)。
表1-5、表1-6、表1-7和表1-8列出了本發明的抗B7-H4抗體的序列所對應的序列編號。 表1-5
抗體編號 HCDR1 HCDR2 HCDR3
SEQ 胺基酸序列 SEQ 胺基酸序列 SEQ 胺基酸序列
PR006004 4 GFAFSNY 11 SGDGRS 24 DRFGDDYYYGMNV
PR006008 5 GFTFTDF 12 SPDGSS 25 FSTGWHRIEYFQH
PR007440 4 GFAFSNY 17 SGDSRS 24 DRFGDDYYYGMNV
PR007441 5 GFTFTDF 18 SPDSSS 25 FSTGWHRIEYFQH
PR007195 4 GFAFSNY 13 SGDSDS 24 DRFGDDYYYGMNV
PR007196 4 GFAFSNY 14 SGDSES 24 DRFGDDYYYGMNV
PR007200 4 GFAFSNY 15 SGDSSS 24 DRFGDDYYYGMNV
PR007201 4 GFAFSNY 15 SGDSSS 24 DRFGDDYYYGMNV
PR007202 4 GFAFSNY 16 SGDSTS 24 DRFGDDYYYGMNV
PR007203 4 GFAFSNY 16 SGDSTS 24 DRFGDDYYYGMNV
表1-6
抗體編號 重鏈 VH FWR1 FWR2 FWR3 FWR4
SEQ 胺基酸序列
PR006004 48 36 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFAFSNYWMHWARQVPGKGRVWISRISGDGRSTSYADSVKGRFTISRDNAKNMVYLQMNNLRAEDTAVYYCARDRFGDDYYYGMNVWGQGTTVTVSS 2 7 20 27
PR006008 49 37 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDFWMHWVRQVPGKGREWVSRISPDGSSTSYEDSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMHGLRAEDTAVYYCTRFSTGWHRIEYFQHWGQGTLVTVSS 2 8 21 26
PR007440 56 44 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFAFSNYWMHWARQVPGKGRVWISRISGDSRSTSYADSVKGRFTISRDNAKNMVYLQMNNLRAEDTAVYYCARDRFGDDYYYGMNVWGQGTTVTVSS 2 7 20 27
PR007441 57 45 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDFWMHWVRQVPGKGREWVSRISPDSSSTSYEDSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMHGLRAEDTAVYYCTRFSTGWHRIEYFQHWGQGTLVTVSS 2 8 21 26
PR007195 50 38 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFAFSNYWMHWARQVPGKGREWISRISGDSDSTSYEDSVKGRFTISRDNAKNMVYLQMNNLRAEDTAVYYCARDRFGDDYYYGMNVWGQGTTVTVSS 2 9 22 27
PR007196 51 39 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFAFSNYWMHWARQVPGKGREWISRISGDSESTSYADSVKGRFTISRDNAKNMVYLQMNNLRAEDTAVYYCARDRFGDDYYYGMNVWGQGTTVTVSS 2 9 20 27
PR007200 52 40 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFAFSNYWMHWARQVPGKGREWISRISGDSSSTSYADSVKGRFTISRDNAKNMVYLQMNNLRAEDTAVYYCARDRFGDDYYYGMNVWGQGTTVTVSS 2 9 20 27
PR007201 53 41 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFAFSNYWMHWARQVPGKGREWISRISGDSSSTSYEDSVKGRFTISRDNAKNMVYLQMNNLRAEDTAVYYCARDRFGDDYYYGMNVWGQGTTVTVSS 2 9 22 27
PR007202 54 42 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFAFSNYWMHWARQVPGKGREWISRISGDSTSTSYADSVKGRFTISRDNAKNMVYLQMNNLRAEDTAVYYCARDRFGDDYYYGMNVWGQGTTVTVSS 2 9 20 27
PR007203 55 43 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFAFSNYWMHWARQVPGKGREWISRISGDSTSTSYEDSVKGRFTISRDNAKNMVYLQMNNLRAEDTAVYYCARDRFGDDYYYGMNVWGQGTTVTVSS 2 9 22 27
表1-7
抗體編號 重鏈
SEQ 胺基酸序列
PR006004 48 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFAFSNYWMHWARQVPGKGRVWISRISGDGRSTSYADSVKGRFTISRDNAKNMVYLQMNNLRAEDTAVYYCARDRFGDDYYYGMNVWGQGTTVTVSSEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
PR006008 49 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDFWMHWVRQVPGKGREWVSRISPDGSSTSYEDSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMHGLRAEDTAVYYCTRFSTGWHRIEYFQHWGQGTLVTVSSEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
PR007440 56 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFAFSNYWMHWARQVPGKGRVWISRISGDSRSTSYADSVKGRFTISRDNAKNMVYLQMNNLRAEDTAVYYCARDRFGDDYYYGMNVWGQGTTVTVSSEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
PR007441 57 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDFWMHWVRQVPGKGREWVSRISPDSSSTSYEDSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMHGLRAEDTAVYYCTRFSTGWHRIEYFQHWGQGTLVTVSSEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
PR007195 50 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFAFSNYWMHWARQVPGKGREWISRISGDSDSTSYEDSVKGRFTISRDNAKNMVYLQMNNLRAEDTAVYYCARDRFGDDYYYGMNVWGQGTTVTVSSEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
PR007196 51 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFAFSNYWMHWARQVPGKGREWISRISGDSESTSYADSVKGRFTISRDNAKNMVYLQMNNLRAEDTAVYYCARDRFGDDYYYGMNVWGQGTTVTVSSEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
PR007200 52 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFAFSNYWMHWARQVPGKGREWISRISGDSSSTSYADSVKGRFTISRDNAKNMVYLQMNNLRAEDTAVYYCARDRFGDDYYYGMNVWGQGTTVTVSSEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
PR007201 53 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFAFSNYWMHWARQVPGKGREWISRISGDSSSTSYEDSVKGRFTISRDNAKNMVYLQMNNLRAEDTAVYYCARDRFGDDYYYGMNVWGQGTTVTVSSEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
PR007202 54 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFAFSNYWMHWARQVPGKGREWISRISGDSTSTSYADSVKGRFTISRDNAKNMVYLQMNNLRAEDTAVYYCARDRFGDDYYYGMNVWGQGTTVTVSSEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
PR007203 55 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFAFSNYWMHWARQVPGKGREWISRISGDSTSTSYEDSVKGRFTISRDNAKNMVYLQMNNLRAEDTAVYYCARDRFGDDYYYGMNVWGQGTTVTVSSEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
表1-8 抗B7-H4抗體PR003366的序列所對應的序列及序列編號
LCDR1 LCDR2 LCDR3 HCDR1 HCDR2 HCDR3
78 80 82 72 74 76
RASQSVSSNLA GASTRAT QQYKNWPFT EDTFSSY APIFGT GGPYFDY
HC VL VH
87 85 84
EIVMTQSPASLSVSPGERATLSCRASQSVSSNLAWYQQKPGQAPRLLIYGASTRATGIPARVSGGGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQYKNWPFTFGPGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGSSMRVSCKASEDTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGGTAPIFGTTNYAQKFQGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGGPYFDYWGQGTLVTVSSGGGASEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK EIVMTQSPASLSVSPGERATLSCRASQSVSSNLAWYQQKPGQAPRLLIYGASTRATGIPARVSGGGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQYKNWPFTFGPGTKLEIK QVQLVQSGAEVKKPGSSMRVSCKASEDTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGGTAPIFGTTNYAQKFQGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGGPYFDYWGQGTLVTVSS
實施例 2.FACS 檢測抗人 B7-H4 的 HCAb 單株抗體細胞位準的結合能力
本實施例是為了研究抗人B7-H4的HCAb單株抗體體外結合人B7-H4的活性，採用過表現人B7-H4的CHO-K1細胞株(CHO-K1/huB7-H4，和鉑醫藥)、HEK293細胞株(HEK293/huB7-H4，和鉑醫藥)，過表現食蟹猴B7-H4的CHO-K1細胞株(CHO-K1/cynoB7-H4，和鉑醫藥)，過表現小鼠B7-H4的CHO-K1細胞株(CHO-K1/mB7-H4，和鉑醫藥)以及內源性高表現B7-H4的MDA-MB-468乳腺癌細胞進行細胞層級上的抗體結合實驗。簡言之，消化酶處理細胞，並用含2%FBS的PBS重新懸浮，將細胞密度分別調整為1×10 6細胞/mL。以100 µL細胞/孔接種於96孔V底盤(Corning, Cat#: 3894)，隨後加入100 µL/孔，2倍於終濃度的3倍濃度梯度稀釋的待測抗體。將細胞放置於4℃，避光培育2小時。之後，加入100 µL/孔預冷PBS洗滌細胞兩次，於500 g、4℃下離心5分鐘，棄上清液。再加入100 µL/孔螢光二抗(Alexa Fluor 488-conjugated AffiniPure Goat Anti-Human IgG, Fcγ Fragment Specific, Jackson, Cat#:109-545-06, 1:500稀釋)，4℃，避光培育60分鐘。用100 µL/孔預冷PBS洗滌細胞兩次，於500 g、4℃下離心5分鐘，棄上清液。最後，200 µL/孔預冷PBS重新懸浮細胞，使用ACEA Novocyte3000讀取螢光發光訊號值。
抗體結合細胞表面的人B7-H4的結果見表2-1，2-2，2-3，圖1的A~E。結果顯示，PR006004與PR006008對人、食蟹猴B7-H4和腫瘤細胞MDA-MB-468都有較好的結合，其中PR006008有更強的細胞結合，且同小鼠B7-H4有交叉反應。PR006004的降等電點突變抗體對人B7-H4的結合相較PR006004本身有輕微的降低，其中PR007196的結合能力最弱。PR006004與PR006008的翻譯後修飾位點(PTM)突變體PR007440與PR007441的結合活性與母代相比沒有明顯變化。 表2-1
CHOK1/hu B7-H4
抗體 最大 MFI EC50 (nM)
PR006004 333458 4.863
PR006008 404722 1.072
表2-2
CHOK1/hu B7-H4
抗體 最大 MFI EC50 (nM)
PR006004 1632510 2.755
PR007195 1584634 5.65
PR007196 971497 3.717
PR007200 1477298 5.393
PR007201 1460146 5.496
PR007202 1508724 5.582
PR007203 1527268 5.405
表2-3
MDA-MB-468 CHO-K1/cyno B7-H4 CHO-K1/m B7-H4
抗體 最大 MFI EC50 (nM) 最大 MFI EC50 (nM) 最大 MFI EC50 (nM)
PR006004 182805 5.186 1573933 1.651 ~ ~
PR007440 184529 9.178 1588512 3.056 ~ ~
PR006008 149316 0.1616 1250247 0.432 399485 0.4026
PR007441 148378 0.2439 1260379 0.7209 400110 0.6168
實施例 3. 用 BLI 方法測定親和力
將10×動力學緩衝液(ForteBio，#18-1105)稀釋至1×，用於親和力測試以及抗原、抗體的稀釋。透過生物膜干涉(BLI)技術，使用Octet Red 96e(Fortebio)分子相互作用分析儀來進行抗原抗體之間的結合動力學分析。
測定抗原和抗體的親和力時，感測器轉動速度為1000 轉/分鐘。先將置於一列的AHC感測器(Fortebio，#18-5060)在測試緩衝液中平衡10分鐘，然後用AHC感測器捕捉B7-H4抗體，捕捉高度0.7 nm；AHC感測器在緩衝液中平衡120s後與2倍梯度稀釋的人或猴B7-H4(濃度為100-3.75 nM以及0 nM)結合180s，解離300s。最後將AHC感測器浸入10 mM甘胺酸-鹽酸pH 1.5溶液進行再生，以洗提結合在感測器上的蛋白。
使用Octet Data Analysis軟體(Fortebio，版本11.0)進行數據分析時，以0 nM為參照孔，扣除參照訊號(reference subtraction)，選擇“1:1 Global fitting”方法進行數據擬合，計算出抗原與抗原結合蛋白結合的動力學參數，得到k on(1/Ms)值、k dis(1/s)值和K D(M)值(見表3，圖2)，結果顯示，PR006004和PR006008在蛋白層級的親和力均較佳，其中PR006004在蛋白層級的親和力比PR006008略高。抗體經過胺基酸突變增加TM值以後，PR007077、PR007078與其相對應的母代PR006391，PR006407在B7-H4親和力方面沒有明顯改變。 表3
Ab Conc. (nM) KD (M) kon(1/Ms) kdis(1/s) Full R^2
human B7-H4 PR006004 60-3.75 1.89E-09 2.10E+05 3.96E-04 0.9965
PR006008 60-3.75 3.65E-09 3.12E+05 1.14E-03 0.9983
PR006391 100-6.25 3.75E-09 9.04E+04 3.39E-04 0.9983
PR006407 100-6.25 8.40E-09 1.50E+05 1.26E-03 0.999
PR007077 100-6.25 5.43E-09 1.09E+05 5.94E-04 0.9752
PR007078 100-6.25 1.03E-08 1.49E+05 1.54E-03 0.9965
PR007168 100-6.25 1.69E-10 1.83E+05 3.09E-05 0.9974
cyno B7-H4 PR007077 100-6.25 4.74E-08 1.72E+05 8.16E-03 0.9821
PR007078 100-6.25 6.78E-09 2.19E+05 1.49E-03 0.9966
PR007168 60-3.75 3.01E-10 2.94E+05 8.87E-05 0.9972
實施例 4. B7-H4×CD3 雙特異性抗體的結構和設計
B7-H4×CD3雙特異性抗體可以同時結合兩個標的，其中一端可以辨識腫瘤細胞表面特異表現的B7-H4，而另一端可以結合T細胞上的CD3分子。當B7-H4×CD3雙抗分子結合到腫瘤細胞表面後，可以召集並活化腫瘤細胞附近的T細胞，從而殺死腫瘤細胞。
本實施例利用實施例1所得到的抗B7-H4抗體和抗CD3抗體PR003886(來源於專利申請WO2021/063330，序列列於表4-1)來製備B7-H4×CD3雙特異抗體。所述雙特異抗體具有如圖3的A~C所示的結構。所述結構包含三個多肽鏈：多肽鏈1或第一多肽鏈，從胺基末端到羧基末端，其包含VL_A-CL；多肽鏈-2或第二多肽鏈，從胺基末端到羧基末端，VH_A-CH1-h-CH2-CH3；多肽鏈-3或第三多肽鏈，從胺基末端到羧基末端，其包含VH_B-L-VH_B-h-CH2-CH3或VH_B-h-CH2-CH3。其中，VH_A和VL_A分別為抗體A的重鏈可變區和輕鏈可變區，VH_B為重鏈抗體B的重鏈可變區；CL是輕鏈恆定區結構域；CH1、CH2和CH3分別是重鏈恆定區的第一、第二和第三結構域；L是連接肽，h是IgG抗體的鉸鍊區或衍生序列。
表4-2中的B7-H4×CD3雙抗分子RP007354、PR007355有相同的分子結構，多肽鏈1和多肽鏈-2的組成標靶CD3的Fab部分，多肽鏈-3包含一個標靶B7-H4的VH部分(VH_B)。
表4-2中的其它B7-H4×CD3雙抗分子(PR006391、PR006407、PR006840、PR007077、PR007078、PR007168)都有相同的分子結構，多肽鏈1和多肽鏈-2的組成標靶CD3的Fab部分，多肽鏈-3包含兩個標靶B7-H4的VH部分(VH_B)。其中，兩個VH_B的序列可以相同或者不同，且兩個VH_B之間透過連接肽GS_15(SEQ ID NO: 66)聯結。此外，PR005885為“1+1” Fab-Fc-scFv非對稱結構分子，結構涉及三條蛋白鏈，其分別包含對應抗B7-H4抗體的scFv多肽鏈，以及上述抗CD3抗體的重鏈及輕鏈。
為了防止由Fcγ受體結合引起的交聯和降低效應子功能，在多肽鏈-2和多肽鏈-3的重鏈恆定區引入“AA”雙突變(L234A和L235A)或者“AAA”三突變體(L234A，L235A和G237A)。而且，為了減少同源重鏈二聚體的產生，在兩條重鏈的恆定區分別引入了不同的胺基酸突變，使其攜帶“knob-hole”突變和改造的二硫鍵。標靶CD3的多肽鏈-2引入突變T366W和S354C；同時，標靶B7-H4的多肽鏈-3引入突變T366S、L368A、Y407V和Y349C。多肽鏈-2的Fc恆定區序列如SEQ ID NO: 68所示序列，多肽鏈-3的Fc恆定區序列如SEQ ID NO: 67所示序列。進一步地，為了提高抗體分子的熱穩定性，根據專利WO2012100343A1在抗B7-H4的VH結構域中引入一個額外的二硫鍵；具體的說，將抗B7-H4的VH結構域中Kabat編號為49和69位的兩個胺基酸變為Cys，使它們形成二硫鍵；即，各自引入突變S49C和I70C。表4-2列出了本發明的B7-H4×CD3雙抗分子及其CD3端的親代單株抗體和B7-H4端的親代單株抗體；表4-3列出了本發明的B7-H4×CD3雙特異抗體的多肽鏈序列所對應的序列編號。
利用實施例1.5所述方法，將編碼三條多肽鏈的表現載體共轉染至哺乳動物宿主細胞進行重組表現，並得到純化的抗體蛋白分子。
其穩定性Tm，溶解性HIC，一步純化後副產物分析等數據如表1-3所示。 表4-1 列出了本發明使用的抗CD3抗體PR003886的序列所對應的序列編號
VL VH LCDR1 LCDR2 LCDR3 HCDR1 HCDR2 HCDR3
46 35 29 31 33 3 10 23
QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAPRGLIGGTNKRAPWTPARFSGSLLGDKAALTLLGAQPEDEAEYFCALWYSNLWVFGGGTKLTVL EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFSTYAMNWVRQASGKGLEWVGRIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNSLKTEDTAVYYCTRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVS S RSSTGAVTTSNYAN GTNKRAP ALWYSNLWV GFTFSTY RSKYNNYA HGNFGNSYVSWFAY
輕鏈 重鏈
58 47
QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAPRGLIGGTNKRAPWTPARFSGSLLGDKAALTLLGAQPEDEAEYFCALWYSNLWVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFSTYAMNWVRQASGKGLEWVGRIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNSLKTEDTAVYYCTRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
表4-2 列出了本發明的B7-H4×CD3雙抗分子及其親代單株抗體
雙抗分子 CD3 抗體 B7-H4 抗體
PR007354 PR003886 一價PR007440
PR007355 PR003886 一價PR007441
PR006391 PR003886 二價PR007440
PR006407 PR003886 二價PR007441
PR006840 PR003886 PR007440和PR007441
PR007077 PR003886 二價PR007440, 增加(S49C,I70C)
PR007078 PR003886 二價PR007441, 增加(S49C,I70C)
PR007168 PR003886 PR007440和 PR007441, 各增加(S49C,I70C)
PR005885 PR003886 PR003366
表4-3列出了本發明的B7-H4×CD3雙特異抗體的多肽鏈序列所對應的序列編號
抗體編號 多肽鏈1 多肽鏈-2 多肽鏈-3
PR006391 58 QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAPRGLIGGTNKRAPWTPARFSGSLLGDKAALTLLGAQPEDEAEYFCALWYSNLWVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS 59 EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFSTYAMNWVRQASGKGLEWVGRIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNSLKTEDTAVYYCTRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 60 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFAFSNYWMHWARQVPGKGRVWISRISGDSRSTSYADSVKGRFTISRDNAKNMVYLQMNNLRAEDTAVYYCARDRFGDDYYYGMNVWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFAFSNYWMHWARQVPGKGRVWISRISGDSRSTSYADSVKGRFTISRDNAKNMVYLQMNNLRAEDTAVYYCARDRFGDDYYYGMNVWGQGTTVTVSSASEPKSSDKTHTCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
PR006407 58 59 61 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDFWMHWVRQVPGKGREWVSRISPDSSSTSYEDSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMHGLRAEDTAVYYCTRFSTGWHRIEYFQHWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDFWMHWVRQVPGKGREWVSRISPDSSSTSYEDSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMHGLRAEDTAVYYCTRFSTGWHRIEYFQHWGQGTLVTVSSASEPKSSDKTHTCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
PR006840 58 59 62 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFAFSNYWMHWARQVPGKGRVWISRISGDSRSTSYADSVKGRFTISRDNAKNMVYLQMNNLRAEDTAVYYCARDRFGDDYYYGMNVWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDFWMHWVRQVPGKGREWVSRISPDSSSTSYEDSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMHGLRAEDTAVYYCTRFSTGWHRIEYFQHWGQGTLVTVSSASEPKSSDKTHTCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
PR007077 58 59 63 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFAFSNYWMHWARQVPGKGRVWICRISGDSRSTSYADSVKGRFTCSRDNAKNMVYLQMNNLRAEDTAVYYCARDRFGDDYYYGMNVWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFAFSNYWMHWARQVPGKGRVWICRISGDSRSTSYADSVKGRFTCSRDNAKNMVYLQMNNLRAEDTAVYYCARDRFGDDYYYGMNVWGQGTTVTVSSASEPKSSDKTHTCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
PR007078 58 59 64 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDFWMHWVRQVPGKGREWVCRISPDSSSTSYEDSVKGRFTCSRDNAKNTVYLQMHGLRAEDTAVYYCTRFSTGWHRIEYFQHWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDFWMHWVRQVPGKGREWVCRISPDSSSTSYEDSVKGRFTCSRDNAKNTVYLQMHGLRAEDTAVYYCTRFSTGWHRIEYFQHWGQGTLVTVSSASEPKSSDKTHTCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
PR007168 58 59 65 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFAFSNYWMHWARQVPGKGRVWICRISGDSRSTSYADSVKGRFTCSRDNAKNMVYLQMNNLRAEDTAVYYCARDRFGDDYYYGMNVWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDFWMHWVRQVPGKGREWVCRISPDSSSTSYEDSVKGRFTCSRDNAKNTVYLQMHGLRAEDTAVYYCTRFSTGWHRIEYFQHWGQGTLVTVSSASEPKSSDKTHTCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
PR007354 58 59 69 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFAFSNYWMHWARQVPGKGRVWICRISGDSRSTSYADSVKGRFTCSRDNAKNMVYLQMNNLRAEDTAVYYCARDRFGDDYYYGMNVWGQGTTVTVSSASEPKSSDKTHTCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
PR007355 58 59 70 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDFWMHWVRQVPGKGREWVCRISPDSSSTSYEDSVKGRFTCSRDNAKNTVYLQMHGLRAEDTAVYYCTRFSTGWHRIEYFQHWGQGTLVTVSSASEPKSSDKTHTCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
PR005885 58 59 86 EIVMTQSPASLSVSPGERATLSCRASQSVSSNLAWYQQKPGQAPRLLIYGASTRATGIPARVSGGGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQYKNWPFTFGPGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGSSMRVSCKASEDTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGGTAPIFGTTNYAQKFQGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGGPYFDYWGQGTLVTVSSASEPKSSDKTHTCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
實施例 5.FACS 檢測 B7-H4 × CD3 雙特異性抗體在過表現人、食蟹猴和小鼠 B7-H4 的 CHO-K1 細胞株的體外結合
本實施例是為了研究B7-H4 的 CD3雙特異性抗體體外結合人、食蟹猴和小鼠B7-H4的活性。採用過表現人B7-H4的CHO-K1細胞株(CHO-K1/huB7-H4，和鉑醫藥)、過表現食蟹猴B7-H4的CHO-K1細胞株(CHO-K1/cynoB7-H4，和鉑醫藥)過表現小鼠B7-H4的CHO-K1細胞株(CHO-K1/mB7-H4，和鉑醫藥)進行細胞層級上的抗體結合實驗。簡言之，消化酶處理細胞，並用含2% FBS的PBS重新懸浮，將細胞密度分別調整為1×10 6細胞/mL。以100 µL細胞/孔接種於96孔V底盤(Corning, Cat#: 3894)，隨後加入100 µL/孔，2倍於終濃度的3倍濃度梯度稀釋的待測抗體。將細胞放置於4℃，避光培育2小時。之後，加入100 µL /孔預冷PBS洗滌細胞兩次，於500 g、4℃下離心5分鐘，棄上清液。再加入100 µL/孔螢光二抗(Alexa Fluor 488-conjugated AffiniPure Goat Anti-Human IgG, Fcγ Fragment Specific, Jackson, Cat#:109-545-06, 1:500稀釋)，4℃，避光培育60分鐘。用100 µL/孔預冷PBS洗滌細胞兩次，於500 g、4℃下離心5分鐘，棄上清液。最後，200 µL/孔預冷PBS重新懸浮細胞，使用ACEA Novocyte3000讀取螢光發光訊號值。
抗體結合細胞表面的人B7-H4、食蟹猴B7-H4和小鼠B7-H4的匯總見表5，圖4的A~E。結果顯示，雙抗分子PR006391、PR006407和PR005885與人、食蟹猴B7-H4的結合均較佳；其中，雙抗分子PR006407與人、食蟹猴B7-H4的結合與PR006391相比有更強的結合，這一結合趨勢與其母代B7-H4分子PR006008、PR006004的結合能力一致，而PR005885有更高的最大MFI值。PR006407與小鼠B7-H4有交叉反應，PR006391與小鼠B7-H4沒有結合，PR005885與小鼠B7-H4有較弱的交叉反應。其它抗體PR007354、PR007355、PR007077、PR007078、PR007168的結合趨勢也與其母代B7-H4分子PR006008、PR006004的結合能力一致。其中PR007355和PR007078與小鼠B7-H4有交叉反應。 表5
CHO-K1/hu B7-H4 CHO-K1/cyno B7-H4 CHO-K1/m B7-H4
抗體 最大MFI EC50 (nM) 最大MFI EC50 (nM) 最大MFI EC50 (nM)
PR006391 1892379 3.541 1668460 3.79 ~ ~
PR006407 2017672 0.5232 1882190 0.7934 905150 0.7021
PR007354 1381455 161.3 ~ ~
PR007355 1241666 0.8321 319200 3.332
PR007077 947650 8.587 ~ ~
PR007078 1032094 1.044 301560 14.58
PR007168 1180925 1.266 ~ ~
PR005885 3173877 4.785 2889346 5.919 904379 37.00
實施例 6.FACS 檢測 B7-H4 × CD3 雙特異性抗體在內源表現 B7-H4 的腫瘤細胞以及 T 細胞上的體外結合
採用內源表現B7-H4的腫瘤細胞或表現CD3的原代T細胞進行細胞層級上的抗體結合實驗。用含2% BSA的PBS重新懸浮MDA-MB-468細胞或人T細胞。將細胞密度分別調整為1 × 10 6細胞/mL。以100 µL細胞/孔接種於96孔V底盤(Corning, #3894)，隨後加入100 µL/孔，2倍於終濃度的3倍濃度梯度稀釋的待測抗體。將細胞放置於4℃，避光培育2小時。之後，加入100 µL/孔預冷含2%BSA的PBS洗滌細胞兩次，於500 g、4℃下離心5分鐘，棄上清液。再加入100 µL/孔螢光二抗(Alexa Fluor 488-conjugated AffiniPure Goat Anti-Human IgG, Fcγ Fragment Specific, Jackson, #109-545-098, 1：500稀釋)，4℃，避光培育1小時。用100 µL/孔預冷含2%BSA的PBS洗滌細胞兩次，於500 g、4℃下離心5分鐘，棄上清液。最後，200 µL/孔預冷含2%BSA的PBS重新懸浮細胞，使用ACEA Novocyte3000流式細胞儀讀取螢光發光訊號值。
結果見表6-1、6-2、6-3、圖5的A~F。結果顯示，這些雙抗分子均表現出與MDA-MB-468較佳的結合能力，其中雙抗分子PR006407與MDA-MB-468的結合比PR006391更強，結果與CHO-K1/hu B7-H4的結合趨勢一致；而PR006840有更高的最大MFI。抗體經過胺基酸突變增加Tm值以後，PR007077、PR007078、PR007168與其母代PR006391、PR006407、PR006840相比，與MDA-MB-468的結合能力保持一致。一價B7-H4的雙抗分子RP007354、PR007355與二價B7-H4的雙抗分子PR007077、PR007078在結合上沒有明顯差異。PR005885與MDA-MB-468的結合曲線與PR006391相似。由於抗CD3端採用了親和力較弱的抗CD3，這些抗體與T細胞的結合都比較弱，其中PR007354與其它抗體相比與T細胞的結合有所增強。 表6-1
MDA-MB-468
抗體 最大MFI EC50 (nM)
PR006391 257406 19.13
PR007077 279380 28.23
PR006407 185290 0.7753
PR007078 178616 0.9973
PR006840 356834 3.758
PR007168 346731 3.246
表6-2
MDA-MB-468
抗體 最大MFI EC50 (nM)
PR007354 305519 30.03
PR007355 186462 0.4732
PR007077 274432 28.83
PR007078 158199 0.7463
PR007168 336461 3.225
表6-3
MDA-MB-468
抗體 最大MFI EC50 (nM)
PR005885 412128 92.59
PR006391 235559 15.75
PR006407 195969 0.59
實施例 7.T 細胞毒殺實驗
本實驗採用人原代T細胞作為效應細胞，高表現B7-H4的細胞MDA-MB-468，B7-H4低表現的細胞OVCAR-3，B7-H4極低表現的細胞DLD-1或完全陰性的細胞MDA-MB-231作為標的細胞。使用ACEA公司的RTCA儀器檢測標的細胞的電導率反應毒殺效率。96孔盤e-plate先用50 μl完全培養基平衡。消化酶處理標的細胞，重新懸浮於含10%胎牛血清的RPM1640完全培養基中，稀釋至4 × 10 5/mL，平盤培養50 μl/孔於e-plate 96 盤中，即2 × 10 4/孔、37℃培養過夜。次日使用美天妮T細胞分離試劑盒(Miltenyi，# 130-096-535)按說明書的方法分離原代T細胞。每孔加入新鮮50 μl含2 × 10 5T細胞的培液，隨後加入50 μl 4×的濃度梯度稀釋的抗體，抗體最高終濃度為10 nM，每個抗體共8個濃度，設置兩個重複。實時檢測標的細胞的電導率，一般情況取24小時時間點的數據計算標的細胞毒殺效率 = (1- 樣品/ 空白對照) × 100%。24小時收上清液，ELISA方法檢測IFN-γ的濃度。ELISA檢測方法參照IFN gamma Human Uncoated ELISA Kit(Thermo，#88-7316-77)試劑盒操作說明。
結果見圖6的A~E、圖7的A~D和圖8的A~C。結果顯示，所有的雙抗分子均對表現B7-H4的腫瘤細胞有明顯的毒殺作用。其中，同樣的B7-H4二價的雙抗分子PR007077、PR007078或比一價的雙抗分子PR007354、PR007355有顯著增強的毒殺效果。雙抗分子PR006407與PR006391相比，在高表現B7-H4的MDA-MB-468細胞或中表現B7-H4的OVCAR-3細胞上具有較高的毒殺效果，較低的細胞因子IFN- gamma表現；在不表現B7-H4的MDA-MB-231細胞上沒有毒殺效果。與之類似，經過胺基酸突變增加TM值以後的雙抗分子PR007078比PR007077在MDA-MB-468和OVCAR-3細胞上具有較高的毒殺效果，較低的細胞因子IFN- gamma表現；在極低表現B7-H4的DLD-1細胞上沒有毒殺。PR006840雙抗同時具有較強的毒殺效果和細胞因子分泌。 實施例 8. 誘導非特異性細胞因子實驗
本實驗檢測雙抗分子在沒有標的細胞存在下誘導PBMC產生非特異性細胞因子的情況，以此可以初步判斷藥物的安全性。人PBMC重新懸浮於含10%胎牛血清的RPM1640完全培養基中，稀釋至2 × 10 6/mL，平盤培養100 μl/孔於96孔盤(Corning，3599)中，即2 × 10 5/孔，加入100ul 2×抗體，37℃培養過夜。24小時收上清液，ELISA方法檢測IL-6，TNF- α，IFN-γ的濃度。ELISA檢測方法參照TNF- α human Uncoated ELISA Kit (Thermo，#88-7346-88)試劑盒、IL-6 human Uncoated ELISA Kit(Thermo，#88-7066-88)試劑盒、IFN gamma Human Uncoated ELISA Kit(Thermo，#88-7316-77)試劑盒操作說明。
結果見圖9的A和B、圖10的A和B，以及圖11的A和B。結果顯示，雙抗分子PR007077、PR007078、PR007168誘導的IL-6和IFN-γ表現很低，但有一定的TNF- α的表現。不同的供體反應性差異較大。PR005885與其它分子相比具有最低的細胞因子表現，提示可能具有較低細胞因子風暴的風險。 實施例 9.NCG 小鼠重建人 PBMC 免疫系統的腫瘤模型的體內藥效實驗
在OVCAR-3模型中，細胞接種當天每隻NCG小鼠皮下接種5 × 10 6OVCAR3腫瘤細胞，細胞重新懸浮在PBS與Matrigel (1:1)混合液中(0.1 mL/隻)，皮下接種。當小鼠平均瘤體積在110 mm 3進行分組，18隻小鼠被分為3組，每隻小鼠靜脈接種5× 10 6人的PBMC，細胞重新懸浮在200 μl PBS中。次日開始給藥，給藥週期為一週一次，共進行了3次給藥，靜脈給藥。開始給藥後，每週稱量體重及瘤體積兩次，瘤體積計算方式為：腫瘤體積(mm 3)= 0.5 × 腫瘤長徑 × 腫瘤短徑 2。給藥後第23天結束實驗觀察，隨後所有小鼠進行安樂處理。
結果見圖12A。溶媒對照組小鼠在給藥後第23天平均腫瘤體積為1612 mm 3。測試藥PR006391(0.2 mg/kg)治療組在給藥後第23天平均腫瘤體積為1054 mm 3，相較溶媒對照組差異顯著(p值為0.04)，腫瘤抑制率TGI (%)為34.6%。測試藥PR006407(0.2 mg/kg)治療組在給藥後第23天平均腫瘤體積為770mm 3，相較溶媒對照組有顯著性差異(p值為0.001)，腫瘤抑制率TGI (%)為52.2%。測試藥PR005885(0.2 mg/kg)治療組在給藥後第23天平均腫瘤體積為681 mm 3，相較溶媒對照組差異顯著(p值為0.001)，腫瘤抑制率TGI (%)為57.77%。
在MDA-MB-468模型中，細胞接種當天每隻NCG小鼠皮下接種5 × 10 6MDA-MB-468腫瘤細胞，細胞重新懸浮在PBS與Matrigel (1:1)混合液中(0.1 mL/隻)，皮下接種。當小鼠平均瘤體積在150 mm 3進行分組，42隻小鼠被分為7組，每隻小鼠靜脈接種5× 10 6人的PBMC，細胞重新懸浮在200μl PBS中。次日開始給藥，給藥週期為一週一次，共進行了4次給藥，靜脈給藥。開始給藥後，每週稱量體重及瘤體積兩次，瘤體積計算方式為：腫瘤體積(mm 3)= 0.5 × 腫瘤長徑 × 腫瘤短徑 2。給藥後第23天結束實驗觀察，隨後所有小鼠進行安樂處理。
結果見圖12B。溶媒對照組小鼠在給藥後第23天平均腫瘤體積為893 mm 3。測試藥PR007077(0.1 mg/kg)治療組在給藥後第23天平均腫瘤體積為507mm 3，相較溶媒對照組差異顯著(p值為0.01)，腫瘤抑制率TGI(%)為43.16%。測試藥PR007077(0.5 mg/kg)治療組在給藥後第23天平均腫瘤體積為343mm 3，相較溶媒對照組有顯著性差異(p值為0.0009)，腫瘤抑制率TGI(%)為61.6%。測試藥PR007078(0.1 mg/kg)治療組在給藥後第23天平均腫瘤體積為464mm 3，相較溶媒對照組差異顯著(p值為0.0067)，腫瘤抑制率TGI (%)為47.9%。測試藥PR007078(0.5 mg/kg)治療組在給藥後第23天平均腫瘤體積為390mm 3，相較溶媒對照組有顯著性差異(p值為0.0022)，腫瘤抑制率TGI (%) 56.2%。測試藥PR007168(0.1 mg/kg)治療組在給藥後第23天平均腫瘤體積為446mm 3，相較溶媒對照組差異顯著(p值為0.0092)，腫瘤抑制率TGI (%)為50.1%。測試藥PR007168(0.5 mg/kg)治療組在給藥後第23天平均腫瘤體積為275mm 3，相較溶媒對照組有顯著性差異(p值為0.0009)，腫瘤抑制率TGI (%) 69.2%。
在CT26-B7-H4模型中，細胞接種當天每隻BALB/c-hCD3EDG knock in小鼠皮下接種5 × 10 5CT26-B7-H4腫瘤細胞，細胞重新懸浮在PBS中(0.1 mL/隻)，皮下接種。當小鼠平均瘤體積在84 mm 3進行分組，24隻小鼠被分為4組，分組當天開始給藥，給藥週期為一週一次，共進行了3次給藥，靜脈給藥。開始給藥後，每週稱量體重及瘤體積兩次，瘤體積計算方式為：腫瘤體積(mm 3)= 0.5 × 腫瘤長徑 × 腫瘤短徑 2。給藥後第20天結束實驗觀察，隨後所有小鼠進行安樂處理。
結果見12C，溶媒對照組小鼠在給藥後第20天平均腫瘤體積為2043 mm 3。測試藥PR007077(0.5 mg/kg)治療組在給藥後第20天平均腫瘤體積為1007 mm 3，相較溶媒對照組差異顯著(p值為0.024)，腫瘤抑制率TGI (%)為50.4%。測試藥PR007078(0.5 mg/kg)治療組在給藥後第20天平均腫瘤體積為1069mm 3，相較溶媒對照組有顯著性差異(p值為0.031)，腫瘤抑制率TGI (%)為45.5%。測試藥PR007168(0.5 mg/kg)治療組在給藥後第20天平均腫瘤體積為1155mm 3，相較溶媒對照組有顯著性差異(p值為0.05)，腫瘤抑制率TGI (%)為39.9%。 實施例 10. 在 BALB/c nude 小鼠體內的藥代動力學
選取體重18~22克的雌性BALB/c nude小鼠6隻，按2.5 mg/kg的劑量透過尾靜脈注射給與藥物；一組3隻於給藥前以及給藥後5分鐘、24小時(1天)、第4天、和第10天採集全血，另一組3隻於只於給藥前以及給藥後5小時、第2天、第7天、和第14天採集全血。將全血靜置30分鐘使其凝固，隨後在4℃下以2,000 rpm離心5分鐘並將分離的血清樣品在-80℃下凍存直至分析。本實施例採用ELISA方法來定量測定小鼠血清中的藥物濃度。ELISA Fc端總體檢測方法，透過塗佈於96孔盤的山羊抗人Fc多株抗體來捕捉小鼠血清中的含有人Fc的融合蛋白，然後加入HRP標記的山羊抗人Fc第二抗體來檢測。ELISA B7-H4端結合檢測方法，透過塗佈於96孔盤的重組人B7-H4蛋白(Sino Biological, 10738-H08H)來捕捉小鼠血清中的B7-H4 x CD3雙抗，然後加入HRP標記的山羊抗人Fc第二抗體來檢測。
使用Phoenix WinNonlin軟體8.2版，選用非房室模型(NCA)對血藥濃度數據進行分析以評價其藥代動力學，結果見下表7。
結果表明，在Fc端總體檢測方法下，從前14天的數據計算，PR006407在小鼠體內的半衰期約為6天，PR007078在小鼠體內的半衰期約為8天。而在B7-H4端結合的檢測方法下，從前14天的數據計算，PR006407在小鼠體內的半衰期約只有1天，而PR007078在小鼠體內的半衰期約為12天。說明經過經過熱穩定性改造，引入二硫鍵的抗體可以提高抗體在小鼠體內的穩定性。 表7  PR006407以及經過熱穩定性改造，引入二硫鍵的對應抗體PR007078的藥代動力學參數
PK參數 PR006407 PR007078
檢測方法 總抗體 B7-H4結合的抗體 總抗體 B7-H4結合的抗體
CL (mL/hr/kg) 2.15 4.2 1.5 2.27
Vss (mL/kg) 290 92.1 236 508
Terminal t1/2 (hr) 144 24.5 183 278
AUClast (hr*μg/mL) 1010 592 1393 846
AUCINF (hr*μg/mL) 1161 595 1665 1103
MRTINF (hr) 135 21.9 157 224
C0 (μg/mL) 41.8 43.8 37.4 31.4
AUCINF_Free B7-H4/Total assay (%) 51.3 66.2
圖1的A~E為FACS檢測抗人B7-H4的HCAb單株抗體細胞位準的結合。
圖2為BLI方法測定親和力。
圖3的A~C為B7-H4 × CD3雙特異性抗體的結構。
圖4的A~E為FACS檢測B7-H4 × CD3雙特異性抗體在過表現人、食蟹猴和小鼠B7-H4的CHO-K1細胞株上的體外結合。
圖5的A~F為FACS檢測B7-H4 × CD3雙特異性抗體在內源表現B7-H4的腫瘤細胞以及T細胞上的體外結合。
圖6的A~E為T細胞毒殺MDA-MB-468細胞的結果圖。
圖7的A~D為T細胞毒殺OVCAR-3細胞的結果圖。
圖8的A~C為T細胞毒殺DLD-1、MDA-MB-231細胞的結果圖。
圖9的A和B為誘導非特異性細胞因子IL-6的結果圖。
圖10的A和B為誘導非特異性細胞因子TNF-α的結果圖。
圖11的A和B為誘導非特異性細胞因子IFN-γ的結果圖。
圖12的A~C為小鼠腫瘤模型的體內藥效實驗。
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Claims (20)

  1. 一種抗B7-H4抗體，其特徵在於，所述抗B7-H4抗體包含重鏈可變區(VH)；其中， 所述VH包含以下的互補決定區(CDR)或其突變：如SEQ ID NO: 4或5的胺基酸序列所示的CDR1，如SEQ ID NO: 15的胺基酸序列所示的CDR2，和，如SEQ ID NO: 24或25的胺基酸序列所示的CDR3； 其中所述突變為在所述CDR的胺基酸序列上具有3、2或1個胺基酸的插入、缺失或替換。
  2. 如請求項1所述的抗B7-H4抗體，其特徵在於，所述CDR2上的突變為在如SEQ ID NO: 15所示的胺基酸序列上具有G2P、S4G和S5R/D/E/T中的2或1個胺基酸替換；所述CDR2的胺基酸序列優選如SEQ ID NO: 11-14、SEQ ID NO: 16-18任一所示。
  3. 如請求項1或2所述的抗B7-H4抗體，其特徵在於，所述VH包含的CDR1、CDR2和CDR3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO: 4、11和24所示；或 所述VH包含的CDR1、CDR2和CDR3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO: 5、12和25所示；或 所述VH包含的CDR1、CDR2和CDR3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO: 4、17和24所示；或 所述VH包含的CDR1、CDR2和CDR3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO: 5、18和25所示；或 所述VH包含的CDR1、CDR2和CDR3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO: 4、13和24所示；或 所述VH包含的CDR1、CDR2和CDR3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO: 4、14和24所示；或 所述VH包含的CDR1、CDR2和CDR3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO: 4、15和24所示；或 所述VH包含的CDR1、CDR2和CDR3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO: 4、16和24所示。
  4. 如請求項1-3任一項所述的抗B7-H4抗體，其特徵在於，所述VH的框架區為人VH的框架區； 優選地，所述人VH的框架區包括胺基酸序列如SEQ ID NO: 2所示的FWR1、胺基酸序列如SEQ ID NO: 7-9任一所示的FWR2、胺基酸序列如SEQ ID NO: 20-22任一所示的FWR3和胺基酸序列如SEQ ID NO: 26或27所示的FWR4； 更優選地，所述VH包括如SEQ ID NO: 36-45任一所示的胺基酸序列。
  5. 如請求項1-4任一項所述的抗B7-H4抗體，其為全長抗體、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv優選scFv、雙特異性抗體、多特異性抗體、重鏈抗體或單域抗體；優選地，當所述抗B7-H4抗體為重鏈抗體時，所述重鏈抗體包括如SEQ ID NO: 48-57任一所示的胺基酸序列。
  6. 一種雙特異性抗體，其特徵在於，其含有蛋白功能區A和蛋白功能區B；其中所述蛋白功能區B標靶B7-H4，所述蛋白功能區A標靶非B7-H4；所述的雙特異性抗體選自如下a)或b)： a) 所述蛋白功能區B選自如請求項1-5任一項所述的抗B7-H4抗體； 優選地，所述雙特異性抗體的結構包含多肽鏈1、多肽鏈2和多肽鏈3，所述多肽鏈1如式：N’-VL_A-CL- C’所示；所述多肽鏈2如式：N’-VH_A-CH1-鉸鍊區-CH2-CH3-C’所示；所述多肽鏈3如式：N’-VH_B1-連接子-VH_B2-鉸鍊區-CH2-CH3-C’或如式：N’-VH_B-鉸鍊區-CH2-CH3-C’所示；其中，所述的VL_A和VH_A分別為所述蛋白功能區A的VL和VH，所述的VH_B1和VH_B2為所述蛋白功能區B的VH，且VH_B1和VH_B2可以相同或者不同； b) 所述蛋白功能區B包含如SEQ ID NO: 72所示的HCDR1，SEQ ID NO: 74所示的HCDR2，SEQ ID NO: 76所示的HCDR3，SEQ ID NO: 78所示的LCDR1，SEQ ID NO: 80所示的LCDR2，SEQ ID NO: 82所示的LCDR3； 優選地，所述雙特異性抗體的結構包含多肽鏈1、多肽鏈2和多肽鏈3，所述多肽鏈1如式：N’-VL_A-CL- C’所示；所述多肽鏈2如式：N’-VH_A-CH1-鉸鍊區-CH2-CH3-C’所示；所述多肽鏈3如式：N’-VL_B-連接子-VH_B-鉸鍊區-CH2-CH3-C’；其中，所述的VL_A和VH_A分別為所述蛋白功能區A的VL和VH，所述的VL_B和VH_B為所述蛋白功能區B的VL和VH。
  7. 如請求項6所述的雙特異性抗體，其特徵在於，所述蛋白功能區A為抗CD3抗體，其包含重鏈可變區（VH）和輕鏈可變區(VL)，所述VH含有胺基酸序列如SEQ ID NO: 3所示的VH CDR1、胺基酸序列如SEQ ID NO: 10所示的VH CDR2和胺基酸序列如SEQ ID NO: 23所示的VH CDR3，所述VL含有胺基酸序列如SEQ ID NO: 29所示的VL CDR1、胺基酸序列如SEQ ID NO: 31所示的VL CDR2和胺基酸序列如SEQ ID NO: 33所示的VL CDR3； 優選地，所述抗CD3抗體包含胺基酸序列如SEQ ID NO: 35所示的VH和胺基酸序列如SEQ ID NO: 46所示的VL； 更優選地，所述抗CD3抗體包含胺基酸序列如SEQ ID NO: 47所示的重鏈和胺基酸序列如SEQ ID NO: 58所示的輕鏈。
  8. 如請求項6或7所述的雙特異性抗體，其特徵在於，所述的雙特異性抗體包括： 胺基酸序列如SEQ ID NO: 58所示的多肽鏈1，胺基酸序列如SEQ ID NO: 59所示的多肽鏈2，胺基酸序列如SEQ ID NO: 60所示的多肽鏈3； 或，胺基酸序列如SEQ ID NO: 58所示的多肽鏈1，胺基酸序列如SEQ ID NO: 59所示的多肽鏈2，胺基酸序列如SEQ ID NO: 61所示的多肽鏈3； 或，胺基酸序列如SEQ ID NO: 58所示的多肽鏈1，胺基酸序列如SEQ ID NO: 59所示的多肽鏈2，胺基酸序列如SEQ ID NO: 62所示的多肽鏈3； 或，胺基酸序列如SEQ ID NO: 58所示的多肽鏈1，胺基酸序列如SEQ ID NO: 59所示的多肽鏈2，胺基酸序列如SEQ ID NO: 63所示的多肽鏈3； 或，胺基酸序列如SEQ ID NO: 58所示的多肽鏈1，胺基酸序列如SEQ ID NO: 59所示的多肽鏈2，胺基酸序列如SEQ ID NO: 64所示的多肽鏈3； 或，胺基酸序列如SEQ ID NO: 58所示的多肽鏈1，胺基酸序列如SEQ ID NO: 59所示的多肽鏈2，胺基酸序列如SEQ ID NO: 65所示的多肽鏈3； 或，胺基酸序列如SEQ ID NO: 58所示的多肽鏈1，胺基酸序列如SEQ ID NO: 59所示的多肽鏈2，胺基酸序列如SEQ ID NO: 69所示的多肽鏈3； 或，胺基酸序列如SEQ ID NO: 58所示的多肽鏈1，胺基酸序列如SEQ ID NO: 59所示的多肽鏈2，胺基酸序列如SEQ ID NO:70所示的多肽鏈3； 或，所述的雙特異性抗體包括：胺基酸序列如SEQ ID NO: 58所示的多肽鏈1，胺基酸序列如SEQ ID NO: 59所示的多肽鏈2，胺基酸序列如SEQ ID NO:86所示的多肽鏈3。
  9. 一種分離的核酸，其編碼如請求項1-5任一項所述的抗B7-H4抗體或如請求項6-8任一項所述的雙特異性抗體。
  10. 一種重組表現載體，其包含如請求項9所述的分離的核酸； 優選地，所述表現載體包含真核細胞表現載體和/或原核細胞表現載體。
  11. 一種轉形株，其包含如請求項10所述的重組表現載體； 優選地，所述轉形株的宿主細胞為原核細胞和/或真核細胞，所述原核細胞優選 E. coli細胞例如TG1、BL21細胞，所述真核細胞優選HEK293細胞或CHO細胞。
  12. 一種嵌合抗原受體，其包含如請求項1-5任一項所述的抗B7-H4抗體或如請求項6-8任一項所述的雙特異性抗體。
  13. 一種基因修飾的細胞，其特徵在於，其包含如請求項12所述的嵌合抗原受體； 優選地，所述基因修飾的細胞為真核細胞，優選分離的人細胞；更優選免疫細胞如T細胞，或NK細胞。
  14. 一種抗B7-H4抗體或雙特異性抗體的製備方法，所述製備方法包括以下步驟：培養如請求項11所述的轉形株，從培養物中獲得抗B7-H4抗體或雙特異性抗體。
  15. 一種抗體藥物偶聯物，包括抗體部分和偶聯部分，所述抗體部分包含如請求項1-5任一項所述的抗B7-H4抗體或如請求項6-8任一項所述的雙特異性抗體，所述偶聯部分包括可檢測標記物、藥物、毒素、細胞因子、放射性核種、酵素、或其組合，所述抗體部分和偶聯部分透過化學鍵或連接子進行偶聯。
  16. 一種藥物組成物，其包含如請求項1-5任一項所述的抗B7-H4抗體、如請求項6-8任一項所述的雙特異性抗體、如請求項12所述的嵌合抗原受體、如請求項13所述的基因修飾的細胞和/或如請求項15所述的抗體藥物偶聯物； 優選地，所述藥物組成物為液體劑型、氣體劑型、固體劑型和半固體劑型，和/或，所述藥物組成物可透過口服給藥、注射給藥、經鼻給藥、經皮給藥或粘膜給藥； 進一步優選地，所述的藥物組成物還包含組合治療劑，所述的組合治療劑包括化學治療劑、放射治療劑、免疫抑制劑和/或細胞毒性藥物。
  17. 如請求項1-5任一項所述的抗B7-H4抗體、如請求項6-8任一項所述的雙特異性抗體、如請求項12所述的嵌合抗原受體、如請求項13所述的基因修飾的細胞、如請求項15所述的抗體藥物偶聯物和/或如請求項16所述的藥物組成物在製備治療和/或預防癌症的藥物、試劑盒和/或給藥裝置中的應用； 優選地，所述癌症選自肺癌、乳腺癌例如三陰性乳腺癌、卵巢癌、子宮內膜瘤、胃癌、小腸癌、結腸癌、直腸癌、胰腺癌、腎癌、膀胱癌、前列腺癌、膽管癌、食道癌和骨肉瘤組成的組。
  18. 試劑盒，其包括如請求項1-5任一項所述的抗體、如請求項6-8任一項所述的雙特異性抗體、如請求項12所述的嵌合抗原受體、如請求項13所述的基因修飾的細胞、如請求項15所述的抗體藥物偶聯物和/或如請求項16所述的藥物組成物；以及任選地，說明書。
  19. 給藥裝置，其特徵在於，所述給藥裝置包含：(1)用於對有需要的受試者施用請求項16所述的藥物組成物的輸注模組，以及(2)任選的藥效監控模組。
  20. 一種檢測B7-H4的方法，其特徵在於，其包括使用如請求項1-5任一項所述的抗B7-H4抗體和/或如請求項6-8任一項所述的雙特異性抗體進行檢測的步驟；優選地，所述方法為非診斷和/或治療目的。
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