BR112021003089A2

BR112021003089A2 - anticorpos biespecíficos anti-pd-l1/anti-lag3 e seus usos

Info

Publication number: BR112021003089A2
Application number: BR112021003089-1A
Authority: BR
Inventors: Eunyoung PARK; Lei Fang; Wenqing Jiang; Yangsoon Lee; Uijung Jung; Youngkwang KIM; Yeun Ju Kim; Youngdon Pak; Sang Hoon Lee; Weon-Kyoo You; Jaeho Jung
Original assignee: Abl Bio Inc.
Priority date: 2018-08-21
Filing date: 2019-08-21
Publication date: 2021-05-11
Also published as: CN113248618A; CN113248618B; EP4249511A2; EP4249511A3; WO2020038397A1; CA3109999A1; JP7177543B2; JP2021536437A; KR20210049128A; US20220363763A1; EP3833693A4; EP3833693A1; AU2019326635A1

Abstract

ANTICORPOSBIESPECÍFICOSANTI-PD-L1/ANTI-LAG3ESEUSUSOS. É proporcionado um anticorpo biespecífico anti-PD-L1/anti-LAG3, capaz de bloquear efetivamente as interações entre o PD-L1 e o seu receptor PD-1 e entre LAG3 e o seu ligante (por exemplo, uma molécula de MHC de classe II e a FGL1). O anticorpo biespecífico pode ter alta afinidade de ligação para ambas de uma proteína PD-L1 (por exemplo, uma proteína PD-L1 humana) e uma proteína LAG3 (por exemplo, uma proteína LAG3 humana). Também são proporcionados anticorpos e fragmentos que têm especificidade para a proteína PD-L1 ou LAG3 sozinha, ou anticorpos e fragmentos tendo especificidade adicional para um ou mais outros antígenos.

Description

“ANTICORPOS BIESPECÍFICOS ANTI-PD-L1/ANTI-LAG3 E SEUS USOS”

[0001] A presente invenção reivindica a prioridade do PCT/CN2018/101547, depositado em 21 de agosto de 2018, e do PCT/CN2019/087943, depositado em 22 de maio de 2019, cujos conteúdos são incorporados neste documento por sua entidade. Campo da invenção

[0002] A presente invenção se refere ao campo de anticorpo, especificamente se refere aos anticorpos biespecíficos Anti-PD-L1/Anti-LAG3 e ao seu uso.

ANTECEDENTES

[0003] O ligante da morte programada 1 (“programmed death-ligand 1”) (PD-L1), também conhecido como aglomerado de diferenciação 274 (“cluster of differentiation 274”) (CD274) ou homólogo de B7 1 (B7-H1), é uma proteína transmembrana do tipo 1, de 40 kDa, que se acredita desempenhar um papel importante na supressão do sistema imunológico durante eventos particulares, como a gravidez, os aloenxertos de tecidos, a doença autoimune e outros estados de doença, como a hepatite. A ligação do PD- L1 à PD-1 ou B7.1 transmite um sinal inibitório, o qual reduz a proliferação de células T CD8+ nos linfonodos e, complementar a isso, a PD-1 também é capaz de controlar o acúmulo de células T específicas para o antígeno estranho nos linfonodos por meio da apoptose, que é ainda mediada por uma regulação inferior do gene Bcl-2.

[0004] Foi demonstrado que a regulação positiva do PD-L1 pode permitir que os cânceres escapem do sistema imunológico do hospedeiro. Uma análise de amostras de tumor de pacientes com carcinoma de células renais verificou que a alta expressão tumoral do PD-L1 estava associada a uma agressividade aumentada do tumor e um risco aumentado de morte. Muitos inibidores do PD-L1 estão em desenvolvimento como terapias imuno-oncológicas e estão mostrando bons resultados em ensaios clínicos.

[0005] Além do tratamento de cânceres, a inibição do PD-L1 também se mostrou promissora no tratamento de doenças infecciosas. Em um modelo de camundongo de infecção intracelular, a L. monocytogenes induziu a expressão da proteína PD-L1 em células T, células NK e macrófagos. O bloqueio do PD-L1 (por exemplo, utilizando anticorpos bloqueadores) resultou na mortalidade aumentada para os camundongos infectados. O bloqueio reduziu a produção de TNFα e óxido nítrico por macrófagos, reduziu a produção de granzima B pelas células NK e diminuiu a proliferação de células T CD8 específicas para o antígeno de L. monocytogenes (porém, não de células T CD4). Esta evidência sugere que o PD-L1 atua como uma molécula coestimuladora positiva na infecção intracelular.

[0006] O Gene de Ativação de Linfócitos 3 (“Lymphocyte Activation Gene-3”) (LAG-3) (também conhecido como CD223) é um membro da superfamília das imunoglobulinas (Ig), está intimamente relacionado ao CD4 e afeta variadamente a função das células T. O LAG-3 é expresso em células T ativadas, células T exauridas, células T infiltrantes no tumor e células T reguladoras (Tregs). Após a ligação com o complexo de histocompatibilidade principal 2 (MHC de classe II), a interação LAG-3/MHC de classe II resulta na regulação negativa da proliferação, da ativação e da homeostase das células T.

[0007] O LAG-3 representa um importante ponto de verificação imunológico no câncer, de forma semelhante ao antígeno de linfócitos T citotóxicos 4 (CTLA-4), ao ligante da morte celular programada 1 (PD-L1) e à morte celular programada 1 (PD-1). O LAG-3 não apenas se expressa nas células T efetoras ativadas/exauridas, como também nas células T reguladoras. O antagonismo do LAG3 não apenas pode promover a ativação das células T efetoras, como também bloquear a função supressora das células T reguladoras. Portanto, o LAG-3 representa um alvo promissor para a imunoterapia contra o câncer e a evidência pré- clínica sugere que um anticorpo anti-LAG-3 pode promover uma resposta antitumoral.

[0008] Em vista do acima mencionado, existe a necessidade de desenvolver novos agentes que modulem a atividade do LAG-3, de uma maneira que estimule uma resposta imune que iniba o crescimento de vários cânceres e células tumorais, além de serem úteis no tratamento de doenças autoimunes, inflamatórias ou virais.

SUMÁRIO

[0009] A presente divulgação proporciona um anticorpo biespecífico anti-PD-L1/anti-LAG3 capaz de bloquear efetivamente as interações entre o PD-L1 e o seu receptor PD-1 e entre o LAG3 e o seu ligante (por exemplo, uma molécula MHC de classe II). O anticorpo biespecífico pode ter alta afinidade de ligação por ambas, uma proteína PD-L1 (por exemplo, uma proteína PD-L1 humana) e uma proteína LAG3 (por exemplo, uma proteína LAG3 humana).

[0010] O anticorpo biespecífico anti-PD-L1/anti- LAG3 pode compreender um anticorpo anti-PD-L1 ou um fragmento de ligação ao antígeno dele como uma parte que alveja PD-L1, que é capaz de especificamente reconhecer e/ou se ligar a uma proteína PD-L1, e um anticorpo anti- LAG3 ou um fragmento de ligação ao antígeno dele como uma parte que alveja LAG3, que é capaz de especificamente reconhecer e/ou se ligar a uma proteína LAG3.

[0011] O anticorpo biespecífico anti-PD-L1/anti- LAG3 pode compreender um anticorpo anti-PD-L1 ou um fragmento de ligação ao antígeno dele como uma parte que alveja PD-L1.

[0012] Em uma modalidade, o anticorpo anti-PD-L1 ou o fragmento dele compreendido no anticorpo biespecífico pode se ligar especificamente a um domínio C da imunoglobulina (IgC) da proteína PD-L1 (por exemplo, PD-L1 humano). Em algumas modalidades, o domínio IgC consiste nos resíduos de aminoácidos 133-225 de uma proteína PD-L1 humana. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-PD-L1 ou o fragmento dele pode se ligar a pelo menos um dos resíduos de aminoácidos Y134, K162 e N183 de uma proteína PD-L1 humana. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-PD-L1 ou o fragmento dele não se liga a um domínio V da imunoglobulina (IgV) da proteína PD-L1 e, por exemplo, o domínio IgV consiste nos resíduos de aminoácidos 19-127 de uma proteína PD-L1 humana. Por exemplo, a proteína PD-L1 humana pode ser selecionada a partir do grupo que consiste em proteínas representadas pelo No. de Acesso do GenBank NP_001254635.1 NP_001300958.1, NP_054862.1 etc., porém não pode ser limitada elas. Estes anticorpos anti-PD-L1 podem ser úteis para fins terapêuticos, como o tratamento de vários tipos de câncer, infecções (inflamações) etc., e podem também ser utilizados para fins diagnósticos e prognósticos. Em uma modalidade, o anticorpo anti-PD-L1 ou o fragmento dele é capaz de especificidade para uma proteína PD-L1 humana.

[0013] O anticorpo anti-PD-L1 ou o fragmento dele pode compreender (1) uma CDR1 da VH tendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 61-67; (2) uma CDR2 da VH tendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 68-77 e 525-527; (3) uma CDR3 da VH tendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 78-90 e SEQ ID NO: 513-519; (4) uma CDR1 da VL tendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 91-92 e SEQ ID NO: 520-521; (5) uma CDR2 da VL tendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 93-105; e (6) uma CDR3 da VL tendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 106-111 e SEQ ID NO: 522-524. Por exemplo, o anticorpo anti-PD-L1 ou o fragmento dele pode compreender uma CDR1 da VH tendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1; uma CDR2 da VH tendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2; (3) uma CDR3 da VH tendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 ou 515; uma CDR1 da VL tendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4; uma CDR2 da VL tendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5; e uma CDR3 da VL tendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6.

[0014] O anticorpo biespecífico anti-PD-L1/anti-

LAG3 pode compreender um anticorpo anti-LAG3 ou um fragmento de ligação ao antígeno dele como uma parte que alveja LAG3. Em uma modalidade, o anticorpo anti-LAG3 ou o fragmento dele pode se ligar especificamente à proteína LAG3 (por exemplo, LAG3 humano); por exemplo, o anticorpo anti-LAG3 ou o fragmento dele pode se ligar a um domínio extracelular de LAG-3.

[0015] Por exemplo, o anticorpo anti-LAG3 ou o fragmento dele descrito neste documento pode inibir a ligação da proteína LAG-3 à Galectina-3 (LGALS3) e à proteína G de 4 membros da família do domínio da lectina tipo C (LSECtin), além de inibir a ligação às moléculas de MHC de classe II, o que é um efeito único e considerável do anticorpo anti-LAG3 ou do fragmento dele da presente divulgação, considerando que os anticorpos anti-LAG-3 existentes mostraram apenas efeito inibidor para a ligação às moléculas de MHC de classe II. Em algumas modalidades, os anticorpos e os fragmentos deles da presente divulgação são capazes de reverter o efeito inibitório das células T reguladoras (Tregs) sobre as células T efetoras (Teffs). Em algumas modalidades, os anticorpos e os fragmentos deles da presente divulgação são capazes de inibir a ligação entre o LAG3 e a Proteína 1 semelhante ao Fibrinogênio (“Fibrinogen-like Protein”) (FGL1).

[0016] Por exemplo, a proteína LAG3 humana pode ser selecionada a partir do grupo que consiste em proteínas representadas pelo No. de Acesso do GenBank NP_002277.4 etc., porém não pode ser limitada a elas. Estes anticorpos anti-LAG3 podem ser úteis para fins terapêuticos, como o tratamento de vários tipos de câncer, infecções

(inflamações) etc., e podem também ser utilizados para fins diagnósticos e prognósticos.

[0017] Em uma modalidade, o anticorpo anti-LAG3 ou o fragmento dele é capaz de especificidade para uma proteína LAG3 humana. O anticorpo anti-LAG3 ou o fragmento dele pode compreender (i) uma CDR1 da VH tendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOS: 116-117, 354 e 453-460; (ii) uma CDR2 da VH tendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOS: 118-119, 355 e 461-467; (iii) uma CDR3 da VH tendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 120-160, 356 e 468-475; (iv) uma CDR1 da VL tendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOS: 163-195, 229, 357 e 490; (v) uma CDR2 da VL tendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOS: 196-217, 358 e 476-483; e (vi) uma CDR3 da VL tendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOS: 218-228, 230-253, 359 e 484-489. Por exemplo, o anticorpo anti-LAG3 ou o fragmento dele pode compreender uma CDR1 da VH tendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 354; uma CDR2 da VH tendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 355 ou 461; uma CDR3 da VH tendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 356 ou 468; uma CDR1 da VL tendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 357 ou 490; uma CDR2 da VL tendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 358; e uma CDR3 da VL tendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 359 ou

488.

[0018] Também são proporcionados anticorpos e fragmentos que têm especificidade para a proteína PD-L1 ou LAG3 sozinha, ou anticorpos tendo especificidade adicional para um ou mais outros antígenos.

[0019] Em uma modalidade, é proporcionado um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno dele tendo especificidade para uma proteína PD-L1 humana, compreendendo: (1) uma CDR1 da VH compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1 e 61 -67; (2) uma CDR2 da VH compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 2, 68-77 e 525- 527; (3) uma CDR3 da VH compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 3, 78-90 e 513-519; (4) uma CDR1 da VL compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 4, 91-92 e 520- 521; (5) uma CDR2 da VL compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 5 e 93-105; e (6) uma CDR3 da VL compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 6, 106-111 e 522-524.

[0020] Em uma modalidade, é proporcionado um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno dele tendo especificidade para uma proteína LAG3 humana, compreendendo: (i) uma CDR1 da VH compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 116-117, 354 e 453-460; (ii) uma CDR2 da VH compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO:

118-119, 355 e 461-467; (iii) uma CDR3 da VH compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 120-160, 356 e 468-475; (iv) uma CDR1 da VL compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 163-195, 229, 357 e 490; (v) uma CDR2 da VL compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 196-217, 358 e 476-483; e (vi) uma CDR3 da VL compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 218-228, 230-253, 359 e 484-489.

[0021] Outra modalidade proporciona uma composição farmacêutica compreendendo o anticorpo biespecífico como descrito acima. A composição farmacêutica pode compreender ainda um veículo farmaceuticamente aceitável. A composição farmacêutica pode ser utilizada para tratar e/ou prevenir um câncer ou uma infecção.

[0022] Outra modalidade proporciona um método de tratar e/ou prevenir um câncer ou uma infecção em um paciente que necessita dele, compreendendo a administração ao paciente de uma quantidade farmaceuticamente eficaz do anticorpo biespecífico ou da composição farmacêutica. O método pode compreender ainda a etapa de identificação do paciente que necessita de tratar e/ou prevenir um câncer ou uma infecção, antes da etapa de administração.

[0023] Outra modalidade proporciona um uso do anticorpo biespecífico ou da composição farmacêutica no tratamento e/ou na prevenção de um câncer ou uma infecção. Outra modalidade proporciona um uso do anticorpo biespecífico na preparação de uma composição farmacêutica para tratar e/ou prevenir um câncer ou uma infecção.

[0024] Nas composições farmacêuticas, nos métodos e/ou nos usos proporcionados neste documento, o câncer pode ser um câncer sólido ou um câncer do sangue, de preferência um câncer sólido.

[0025] Outra modalidade proporciona uma composição para a detecção de PD-L1, LAG3 ou ambos simultaneamente, em uma amostra biológica, a composição compreendendo o anticorpo biespecífico. Outra modalidade proporciona um método de detecção de PD-L1, LAG3 ou ambos simultaneamente, em uma amostra biológica, o método compreendendo o contato da amostra biológica com o anticorpo biespecífico; e a detecção (medição) de uma reação (ligação) antígeno-anticorpo entre o anticorpo biespecífico e o PD-L1, o LAG3 ou ambos.

[0026] O método de detecção pode compreender ainda, após a etapa de detecção, a determinação que o PD- L1, o LAG3 ou ambos estão presentes na amostra biológica, quando for detectada uma reação antígeno-anticorpo, e/ou que o PD-L1, o LAG3 ou ambos estão ausentes (não estão presentes) na amostra biológica, quando não for detectada uma reação antígeno-anticorpo.

[0027] Outra modalidade proporciona uma composição farmacêutica para o diagnóstico de uma doença associada ao PD-L1, ao LAG3 ou a ambos, a composição compreendendo o anticorpo biespecífico. Em outra modalidade, é proporcionado o uso do anticorpo biespecífico para diagnosticar uma doença associada ao PD-L1, ao LAG3 ou a ambos.

[0028] Outra modalidade proporciona um método de diagnóstico de uma doença associada ao PD-L1, ao LAG3 ou a ambos, o método compreendendo o contato de uma amostra biológica, obtida de um paciente, com o anticorpo biespecífico e a detecção de uma reação antígeno-anticorpo ou a medição de um nível de uma reação antígeno-anticorpo na amostra biológica. Em algumas modalidades, o método pode compreender ainda o contato de uma amostra normal com o anticorpo biespecífico e a medição de um nível de uma reação antígeno-anticorpo na amostra normal. Além disso, o método pode compreender ainda a comparação do nível da reação antígeno-anticorpo na amostra biológica e na amostra normal, após a etapa de medição. Além disso, após a etapa de detecção ou a etapa de comparação, o método pode compreender ainda a determinação do paciente como um paciente com uma doença associada ao PD-L1, ao LAG3 ou a ambos, quando for detectada a reação antígeno-anticorpo na amostra biológica ou o nível da reação antígeno-anticorpo na amostra biológica for maior do que o da amostra normal.

[0029] A doença associada ao PD-L1, ao LAG3 ou a ambos pode ser uma associada à ativação (por exemplo, ativação anormal ou superativação) e/ou superprodução (superexpressão) de PD-L1, LAG3 ou ambos. Por exemplo, a doença pode ser um câncer ou uma infecção, conforme descrito acima.

[0030] Uma modalidade proporciona um polinucleotídeo que codifica o anticorpo biespecífico. Em particular, uma modalidade proporciona um polinucleotídeo que codifica uma cadeia pesada do anticorpo biespecífico em uma forma de IgG-scFv que compreende uma IgG de tamanho natural e um scFv ligado a uma extremidade de C e/ou extremidade de N da IgG de tamanho natural. Outra modalidade proporciona um polinucleotídeo que codifica uma cadeia leve do anticorpo biespecífico em uma forma de IgG- scFv. Outra modalidade proporciona um vetor recombinante compreendendo o polinucleotídeo que codifica uma cadeia pesada do anticorpo biespecífico, o polinucleotídeo que codifica uma cadeia leve do anticorpo biespecífico, ou ambos. Outra modalidade proporciona uma célula recombinante transfectada com o vetor recombinante.

[0031] Outra modalidade proporciona um método de preparação do anticorpo biespecífico, compreendendo a expressão do polinucleotídeo que codifica uma cadeia pesada do anticorpo biespecífico, do polinucleotídeo que codifica uma cadeia leve do anticorpo biespecífico em uma célula. A etapa de expressão do polinucleotídeo pode ser conduzida por cultura da célula que compreende o polinucleotídeo (por exemplo, em um vetor recombinante) sob uma condição que permita a expressão do polinucleotídeo. O método pode compreender ainda o isolamento e/ou a purificação do anticorpo biespecífico da cultura de células, após a etapa de expressão ou cultura.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0032] A FIG. 1 mostra que o HL1210-3 pode se ligar ao PD-L1 humano com alta afinidade.

[0033] A FIG. 2 mostra que o HL1210-3 pode inibir eficientemente a ligação do PD-L1 humano à PD1 humana.

[0034] A FIG. 3 mostra que o anticorpo HL1210-3 pode inibir de forma altamente eficiente a ligação da PD-1 em PD-L1 expresso em células de mamíferos.

[0035] A FIG. 4 mostra que os anticorpos anti- PD-L1 testados podem promover a resposta das células T humanas.

[0036] A FIG. 5 mostra a cinética de ligação do HL1210-3 ao PD-L1 recombinante.

[0037] As FIGS. 6A-6E mostram que todos os anticorpos humanizados testados tinham eficácia de ligação comparável ao PD-L1 humano em contato com o anticorpo quimérico.

[0038] As FIGS. 7A-7C mostram que todos os anticorpos humanizados testados podem se ligar com alta eficiência ao PD-L1 expresso em células de mamíferos, comparável ao anticorpo quimérico.

[0039] A FIG. 8 mostra que o anticorpo humanizado Hu1210-41 pode se ligar ao PD-L1 de rhesus com menor afinidade e não pode se ligar ao PD-L1 de rato e camundongo.

[0040] A FIG. 9 mostra que o anticorpo Hu1210-41 só pode especificamente se ligar ao B7-H1 (PD-L1), não a B7-DC, B7-1, B7-2, B7-H2, PD-1, CD28, CTLA4, ICOS e BTLA.

[0041] A FIG. 10 mostra que o Hu1210-41 pode inibir com eficiência a ligação do PD-L1 humano a PD1 e B7- 1 humanos.

[0042] A FIG. 11 mostra que Hu1210-41 pode inibir eficientemente a ligação do PD-L1 humano a PD1 e B7- 1 humanos.

[0043] A FIG. 12 mostra que os anticorpos humanizados Hu1210-8, Hu1210-9, Hu1210-16, Hu1210-17, Hu1210-21 e Hu1210-36 podem promover, de forma dependente da dose, a produção de IFNγ e IL-2 na reação de linfócitos mistos.

[0044] A FIG. 13 mostra que os anticorpos humanizados Hu1210-40, Hu1210-41 e Hu1210-17 podem promover, de forma dependente da dose, a produção de IFNγ no ensaio de lembrança do CMV.

[0045] A FIG. 14 mostra que o Hu1210-31 pode inibir o crescimento do tumor em 30%, a 5 mg/kg, no modelo de xenoenxerto de HCC827-NSG.

[0046] A FIG. 15 mostra que o anticorpo Hu1210- 41 pode inibir, de forma dependente da dose, o crescimento do tumor, no modelo de xenoenxerto de HCC827-NSG, ao mesmo tempo que o peso do tumor também foi suprimido, de forma dependente da dose, pelo anticorpo Hu1210-41.

[0047] A FIG. 16 representa graficamente, para cada mutante de PD-L1, o valor médio da ligação em função da expressão (reatividade do mAb anti-PD-L1 de controle).

[0048] A FIG. 17 ilustra as localizações de Y134, K162 e N183, os resíduos (esferas) envolvidos na ligação ao anticorpo anti-PD-L1 Hu1210-41.

[0049] A FIG. 18 mostra os resultados de um ensaio de ligação (ao PD-L1 humano) para os anticorpos derivados.

[0050] A FIG. 19 mostra que o anticorpo B6 se ligou de forma mais altamente eficiente ao PD-L1 expresso em células de mamíferos, em comparação com o anticorpo de origem e o Tecentriq® (atezolizumab).

[0051] A FIG. 20 mostra os efeitos dos anticorpos sobre a produção de IL2 nas células Jurkat, nas quais o B6 também exibiu maior potência.

[0052] A FIG. 21 mostra que os domínios D1-D2 são importantes para a função do LAG-3. Os fragmentos da proteína de fusão de LAG3 do tipo selvagem (WT) domínio extracelular (ECD) (LAG-3-ECD-huFc) podem se ligar às células Daudi, enquanto os fragmentos de LAG-3-ECD-huFc com D1-D2 truncados não conseguem se ligar às células Daudi.

[0053] As FIGS. 22A-22D mostram a ligação dos anticorpos anti-LAG3 humanos à proteína LAG3 derivada de várias espécies. Os anticorpos anti-LAG-3 foram avaliados quanto às suas propriedades de ligação ao LAG3 humano, de rato e de camundongo, por meio do ensaio imunológico por ligação com enzima (ELISA).

[0054] A FIG. 23 mostra a ligação dos anticorpos anti-LAG3 humanos ao antígeno LAG-3 da superfície celular nas células T CD4+ primárias humanas ativadas. Os anticorpos anti-LAG-3 foram avaliados quanto à ligação ao antígeno LAG-3 da superfície celular nas células T CD4+ primárias humanas ativadas em várias concentrações (10 μg/ml, 3,333 μg/ml, 1,111 μg/ml, 0,370 μg/ml, 0,123 μg/ml, 0,041 μg/ml, 0,014 μg/ml e 0,005 μg/ml).

[0055] A FIG. 24 mostra a inibição da ligação do LAG-3 solúvel (sLAG) ao MHC de classe II receptor pelo anticorpo anti-LAG-3. Os anticorpos anti-LAG-3 foram avaliados quanto à sua capacidade de bloquear a ligação do sLAG-3 ao MHC de classe II receptor em um ensaio de ligação in vitro, utilizando as proteínas de fusão de LAG-3-ECD- huFcLAG-3-Fc marcadas com biotina e as células Raji que expressam o MHC de classe II receptor.

[0056] A FIG. 25 mostra a estimulação da produção da IL-2 nas células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) pelos anticorpos anti-LAG-3. Os anticorpos anti-LAG-3 foram administrados às PBMCs estimuladas com a Enterotoxina Estafilocócica B (SEB) em várias concentrações, partindo de 20 μg/ml, em diluição em série de 1:3, para 6 doses. Três dias depois, a concentração de IL-2 no sobrenadante da cultura foi avaliada pelo ensaio imunológico por ligação com enzima (ELISA).

[0057] A FIG. 26 mostra a Reversão da função supressora das células T reguladoras (Tregs) nas células T efetoras (Teffs), utilizando os anticorpos anti-LAG-3. Para avaliar a capacidade dos anticorpos anti-LAG-3 de reverter o efeito supressor das Tregs sobre as Teffs, os anticorpos do Exemplo 2.1 foram utilizados em um ensaio de supressão das Tregs in vitro.

[0058] As FIGS. 27A-27C mostram os resultados do ELISA mostrando a EC50 do anticorpo para a ligação ao domínio extracelular completo do LAG3 (D1-D4 huFc), porém não ao LAG3 com D1-D2 removidos (△D1-D2 huFc), demonstrando que 122H, 147H e 170H são ligantes potentes e seletivos para o domínio D1 e D2 do LAG3 humano.

[0059] As FIGS. 28A-28C mostram que os anticorpos 122H, 147H e 170H inibiram, de forma dependente da dose, a ligação do LAG3 às suas moléculas de MHC de classe II receptoras.

[0060] A FIG. 29 mostra que os anticorpos monoclonais de camundongo 122H, 147H e 170H promoveram, de forma dependente da dose, a produção de IL2 pelas células T Jurkat.

[0061] A FIG. 30 mostra que o Anticorpo monoclonal humanizado 147H-13 promoveu, de forma dependente da dose, a produção de IL2 pelas células T Jurkat.

[0062] A FIG. 31 mostra as curvas de ligação dos anticorpos anti-LAG3 nas células Jurkat-LAG3 e nas células T CD4 ativadas.

[0063] A FIG. 32 ilustra esquematicamente um anticorpo biespecífico anti-PD-L1/anti-LAG3 de acordo com uma modalidade.

[0064] A FIG. 33 mostra gráficos que ilustram a ligação do anticorpo biespecífico anti-PD-L1/anti-LAG3 de acordo com uma modalidade ao PD-L1 humano e ao LAG3 humano, medida por ELISA.

[0065] A FIG. 34 mostra os resultados do ensaio das SEE para o anticorpo biespecífico anti-PD-L1/anti-LAG3 de acordo com uma modalidade. Ela também mostra gráficos que ilustram as atividades de promoção das células T do anticorpo biespecífico anti-PD-L1/anti-LAG3 de acordo com uma modalidade.

[0066] A FIG. 35 mostra um gráfico que ilustra o efeito de inibição do crescimento tumoral do anticorpo biespecífico anti-PD-L1/anti-LAG3 de acordo com uma modalidade.

[0067] A FIG. 36 mostra gráficos que ilustram as atividades de promoção das células T do anticorpo biespecífico anti-PD-L1/anti-LAG3 de acordo com uma modalidade.

[0068] A FIG. 37 mostra gráficos que ilustram as atividades de promoção das células T do anticorpo biespecífico anti-PD-L1/anti-LAG3 de acordo com uma modalidade. A FIG. 38 mostra a ligação do anticorpo monoclonal anti-LAG3 B3807 e dos anticorpos de controle à proteína LAG3 humana, através do ensaio imunológico por ligação com enzima (ELISA).

[0069] A FIG. 39 mostra o resultado da análise por Biacore para o B3807.

[0070] A FIG. 40 mostra as atividades de ligação do B3807 ao LAG3 humano nas células Jurkat e nas PBMCs.

[0071] A FIG. 41 mostra a inibição da ligação do LAG-3 solúvel (sLAG) ao MHC de classe II receptor pelo B3807.

[0072] A FIG. 42 mostra os efeitos do B3807 sobre a produção de IL2 nas células Jurkat.

[0073] A FIG. 43 mostra os efeitos do B3807, bem como em combinação com o anticorpo anti-PD-L1, sobre a produção de IL2 nas células T primárias.

[0074] A FIG. 44 mostra os resultados in vivo do B3807, sozinho ou em combinação com os anticorpos anti-PD-1 ou anti-PD-L1, na inibição do crescimento tumoral.

[0075] A FIG. 45 compara o B3807 e o B3807b na liberação da IL2 e nos ensaios de ligação com base em células e demonstra a sua similaridade de alto nível.

[0076] A FIG. 46 compara os resultados do ensaio do Biacore entre B3807 e B3807b.

[0077] A FIG. 47 demonstra que o B3807 inibiu efetivamente a ligação entre o LAG-3 solúvel e a FGL1.

DESCRIÇÃO DETALHADA Definições

[0078] Deve-se notar que o termo “um” ou “uma” entidade se refere a uma ou mais dessa entidade, por exemplo, “um anticorpo” é entendido como representando um ou mais anticorpos. Como tais, os termos “um” (ou “uma”),

“um ou mais” e “pelo menos um(a)” podem ser utilizados indistintamente neste documento.

[0079] Como utilizado neste documento, o termo “polipeptídeo” destina-se a abranger um “polipeptídeo” singular, bem como os “polipeptídeos” plural, e refere-se a uma molécula composta por monômeros (aminoácidos) linearmente ligados por ligações amida (também conhecidas como ligações peptídicas). O termo “polipeptídeo” refere-se a qualquer cadeia ou cadeias de dois ou mais aminoácidos e não se refere a um comprimento específico do produto. Assim, peptídeos, dipeptídeos, tripeptídeos, oligopeptídeos, “proteína”, “cadeia de aminoácidos” ou qualquer outro termo utilizado para se referir a uma cadeia ou cadeias de dois ou mais aminoácidos estão incluídos na definição de “polipeptídeo” e o termo “polipeptídeo” pode ser utilizado em vez, ou indistintamente com quaisquer, desses termos. O termo “polipeptídeo” também se destina a referir-se aos produtos de modificações pós-expressão do polipeptídeo, incluindo, sem limitação, a glicosilação, a acetilação, a fosforilação, a amidação, a derivatização por grupos de proteção/bloqueio conhecidos, a clivagem proteolítica ou a modificação por aminoácidos que não ocorrem naturalmente. Um polipeptídeo pode ser derivado de uma fonte biológica natural ou produzido por tecnologia recombinante, porém não é necessariamente traduzido de uma sequência de ácidos nucleicos designada. Ele pode ser gerado de qualquer maneira, inclusive por síntese química.

[0080] O termo “isolado(a)(s)”, como utilizado neste documento com relação às células, aos ácidos nucleicos, como o DNA ou o RNA, refere-se às moléculas separadas de outros DNAs ou RNAs, respectivamente, que estejam presentes na fonte natural da macromolécula. O termo “isolado(a)(s)”, como utilizado neste documento, também se refere a um ácido nucleico ou peptídeo que esteja substancialmente livre de material celular, material viral ou meio de cultura, quando produzido por técnicas de DNA recombinante ou precursores químicos, ou outros produtos químicos, quando sintetizado quimicamente. Além disso, um “ácido nucleico isolado” se destina a incluir os fragmentos de ácido nucleico que não estejam ocorrendo naturalmente como fragmentos e não seriam encontrados no estado natural. O termo “isolado(a)(s)” também é utilizado neste documento para se referir às células ou aos polipeptídeos que sejam isolados de outras proteínas ou tecidos celulares. Polipeptídeos isolados pretende abranger os polipeptídeos tanto purificados quanto recombinantes.

[0081] Como utilizado neste documento, o termo “recombinante”, conforme se referir aos polipeptídeos ou polinucleotídeos, se destina a uma forma do polipeptídeo ou polinucleotídeo que não existe naturalmente, cujo exemplo não limitativo pode ser criado por combinação de polinucleotídeos ou polipeptídeos que não ocorreriam normalmente juntos.

[0082] “Homologia” ou “identidade” ou “similaridade” refere-se à similaridade de sequência entre dois peptídeos ou entre duas moléculas de ácido nucleico. A homologia pode ser determinada comparando uma posição em cada sequência, a qual pode ser alinhada para fins de comparação. Quando uma posição na sequência comparada estiver ocupada pela mesma base ou aminoácido, então as moléculas são homólogas nessa posição. Um grau de homologia entre as sequências é uma função do número de posições correspondentes ou homólogas compartilhadas pelas sequências. Uma sequência “não relacionada” ou “não homóloga” compartilha menos de 40% de identidade, embora, de preferência, menos de 25% de identidade, com uma das sequências da presente divulgação.

[0083] Um polinucleotídeo ou região polinucleotídica (ou um polipeptídeo ou região polipeptídica) tem uma certa porcentagem (por exemplo, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% ou 99%) de “identidade de sequência” com outra sequência significa que, quando alinhada, essa porcentagem de bases (ou aminoácidos) é a mesma na comparação das duas sequências. Este alinhamento e a homologia percentual ou identidade de sequência podem ser determinados utilizando programas de software conhecidos na técnica, por exemplo, aqueles descritos em Ausubel et al. eds. (2007) Current Protocols in Molecular Biology. De preferência, são utilizados parâmetros padrão para o alinhamento. Um programa de alinhamento é o BLAST, que utiliza parâmetros padrão. Em particular, os programas são o BLASTN e o BLASTP, que utilizam os seguintes parâmetros padrão: Código genético = padrão; filtro = nenhum; fita = ambas; corte = 60; espera = 10; Matriz = BLOSUM62; Descrições = 50 sequências; classificar por = HIGH SCORE; Bancos de dados = não redundante, GenBank + EMBL + DDBJ + PDB + traduções de CDS do GenBank + SwissProtein + SPupdate + PIR. Os polinucleotídeos biologicamente equivalentes são aqueles que têm a homologia percentual especificada acima observada e que codificam um polipeptídeo tendo uma atividade biológica igual ou semelhante.

[0084] O termo “um ácido nucleico ou polinucleotídeo equivalente” refere-se a um ácido nucleico tendo uma sequência de nucleotídeos tendo um certo grau de homologia, ou identidade de sequência, com a sequência de nucleotídeos do ácido nucleico ou seu complemento. Um homólogo de um ácido nucleico de fita dupla destina-se a incluir os ácidos nucleicos tendo uma sequência de nucleótidos que tem um certo grau de homologia com ele ou com o seu complemento. Em um aspecto, os homólogos dos ácidos nucleicos são capazes de hibridizar com o ácido nucleico ou o complemento dele. Da mesma forma, “um polipeptídeo equivalente” refere-se a um polipeptídeo tendo um certo grau de homologia, ou identidade de sequência, com a sequência de aminoácidos de um polipeptídeo de referência. Em alguns aspectos, a identidade de sequência é pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99%. Em alguns aspectos, o polipeptídeo ou o polinucleotídeo equivalente tem uma, duas, três, quatro ou cinco adições, remoções, substituições e suas combinações em comparação com o polipeptídeo ou o polinucleotídeo de referência. Em alguns aspectos, a sequência equivalente conserva a atividade (por exemplo, ligação ao epítopo) ou a estrutura (por exemplo, ponte de sal) da sequência de referência.

[0085] As reações de hibridação podem ser realizadas sob condições de “severidade” diferente. Em geral, uma reação de hibridização de baixa severidade é realizada em torno de 40ºC, em cerca de 10xSSC ou uma solução de força iônica/temperatura equivalente. Uma hibridização de severidade moderada é tipicamente realizada em torno de 50ºC, em cerca de 6xSSC, e uma reação de hibridização de alta severidade é, em geral, realizada em torno de 60ºC, em cerca de 1xSSC. As reações de hibridação também podem ser realizadas sob “condições fisiológicas”, as quais são bem conhecidas por aqueles versados na técnica. Um exemplo não limitativo de uma condição fisiológica é a temperatura, a força iônica, o pH e a concentração de Mg2+ normalmente encontrados em uma célula.

[0086] Um polinucleotídeo é composto de uma sequência específica de quatro bases de nucleotídeo: adenina (A); citosina (C); guanina (G); timina (T); e uracila (U) para a timina quando o polinucleotídeo for o RNA. Assim, o termo “sequência polinucleotídica” é a representação alfabética de uma molécula polinucleotídica. Esta representação alfabética pode ser inserida nos bancos de dados em um computador que tenha uma unidade de processamento central e utilizada para aplicações de bioinformática, como a genômica funcional e a pesquisa de homologia. O termo “polimorfismo” refere-se à coexistência de mais de uma forma de um gene ou parte dele. Esta uma parte de um gene, na qual existem pelo menos duas formas diferentes, isto é, duas sequências de nucleotídeos diferentes, é referida como uma “região polimórfica de um gene”. Uma região polimórfica pode ser um único nucleotídeo, cuja identidade difere em diferentes alelos.

[0087] Os termos “polinucleotídeo” e

“oligonucleotídeo” são utilizados indistintamente e referem-se a uma forma polimérica de nucleotídeos de qualquer comprimento, sejam os desoxirribonucleotídeos ou os ribonucleotídeos ou os análogos deles.

Os polinucleotídeos podem ter qualquer estrutura tridimensional e podem desempenhar qualquer função, conhecida ou desconhecida.

Os que seguem são exemplos não limitativos de polinucleotídeos: um gene ou fragmento de gene (por exemplo, uma sonda, iniciador, marca de EST ou SAGE), exons, íntrons, RNA mensageiro (mRNA), RNA de transferência, RNA ribossômico, ribozimas, cDNA, dsRNA, siRNA, miRNA, polinucleotídeos recombinantes, polinucleotídeos ramificados, plasmídeos, vetores, DNA isolado de qualquer sequência, RNA isolado de qualquer sequência, sondas de ácido nucleico e iniciadores.

Um polinucleotídeo pode compreender nucleotídeos modificados, como os nucleotídeos metilados e os análogos de nucleotídeos.

Se presentes, as modificações na estrutura do nucleotídeo podem ser proporcionadas antes ou depois da montagem do polinucleotídeo.

A sequência de nucleotídeos pode ser interrompida por componentes não nucleotídeos.

Um polinucleotídeo pode ainda ser modificado após a polimerização, como por conjugação com um componente de marcação.

O termo também se refere a ambas as moléculas de fita simples e dupla.

A menos que especificado ou exigido de outra forma, qualquer modalidade desta divulgação que seja um polinucleotídeo engloba tanto a forma de fita dupla quanto cada uma das duas formas de fita simples complementares, conhecidas ou previstas para compor a forma de fita dupla.

[0088] O termo “codificar”, conforme for aplicado aos polinucleotídeos, refere-se a um polinucleotídeo que é dito “codificar” um polipeptídeo se, em seu estado nativo ou quando manipulado por métodos bem conhecidos pelos versados na técnica, ele puder ser transcrito e/ou traduzido para produzir o mRNA para o polipeptídeo e/ou um fragmento dele. A fita antissenso é o complemento de tal ácido nucleico e a sequência de codificação pode ser deduzida a partir dela.

[0089] Como utilizado neste documento, um “anticorpo” ou “polipeptídeo de ligação ao antígeno” refere-se a um polipeptídeo ou um complexo de polipeptídeo que especificamente reconhece e se liga a um antígeno. Um anticorpo pode ser um anticorpo inteiro e qualquer fragmento de ligação ao antígeno ou uma única cadeia deste. Assim, o termo “anticorpo” inclui qualquer proteína ou peptídeo contendo uma molécula que compreenda pelo menos uma parte de uma molécula de imunoglobulina tendo atividade biológica de ligação ao antígeno. Os seus exemplos incluem, porém não estão limitados a, uma região determinante de complementaridade (CDR) de uma cadeia pesada ou leve ou uma parte de ligação ao ligante dela, uma região variável da cadeia pesada ou da cadeia leve, uma região constante da cadeia pesada ou da cadeia leve, uma região de estrutura (FR), ou qualquer parte dela, ou pelo menos uma parte de uma proteína de ligação.

[0090] Os termos “fragmento de anticorpo” ou “fragmento de ligação ao antígeno”, como utilizados neste documento, são uma parte de um anticorpo, como F(ab’)2, F(ab)2, Fab’, Fab, Fv, scFv e semelhantes.

Independentemente da estrutura, um fragmento de anticorpo se liga ao mesmo antígeno que é reconhecido pelo anticorpo intacto. O termo “fragmento de anticorpo” inclui os aptâmeros, os spiegelmers e os diacorpos. O termo “fragmento de anticorpo” também inclui qualquer proteína sintética ou geneticamente modificada que atue como um anticorpo ligando-se a um antígeno específico para formar um complexo.

[0091] Um “fragmento variável de cadeia única” ou “scFv” refere-se a uma proteína de fusão das regiões variáveis das cadeias pesada (VH) e leve (VL) das imunoglobulinas. Em alguns aspectos, as regiões estão ligadas a um peptídeo ligador curto de dez a cerca de 25 aminoácidos. O ligador pode ser rico em glicina para a flexibilidade, bem como serina ou treonina para a solubilidade, e pode unir a extremidade de N da VH com a extremidade de C da VL, ou vice-versa. Esta proteína conserva a especificidade da imunoglobulina original, apesar da remoção das regiões constantes e da introdução do ligador. As moléculas de scFv são conhecidas na técnica e são descritas, por exemplo, na patente US 5.892.019.

[0092] O termo anticorpo abrange várias classes amplas de polipeptídeos que podem ser distinguidos bioquimicamente. Os versados na técnica apreciarão que as cadeias pesadas são classificadas como gama, mi, alfa, delta ou épsilon (γ, μ, α, δ, ε), com algumas subclasses entre elas (por exemplo, γl-γ4). É a natureza dessa cadeia que determina a “classe” do anticorpo como IgG, IgM, IgA IgG ou IgE, respectivamente. As subclasses da imunoglobulina (isótipos), por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3,

IgG4, IgG5 etc., são bem caracterizadas e são conhecidas por conferirem especialização funcional. As versões modificadas de cada uma dessas classes e isótipos são prontamente discerníveis para o versado na técnica em vista da presente divulgação e, consequentemente, estão dentro do escopo da presente divulgação. Todas as classes das imunoglobulinas estão claramente dentro do escopo da presente divulgação, a discussão a seguir será, em geral, direcionada à classe IgG das moléculas de imunoglobulina. No que diz respeito à IgG, uma molécula de imunoglobulina padrão compreende dois polipeptídeos de cadeia leve idênticos, de peso molecular aproximadamente 23.000 Daltons, e dois polipeptídeos de cadeia pesada idênticos, de peso molecular 53.000-70.000. As quatro cadeias são tipicamente unidas por ligações dissulfeto em uma configuração “Y”, em que as cadeias leves unem as cadeias pesadas começando na boca do “Y” e continuando através da região variável.

[0093] Os anticorpos, os polipeptídeos de ligação aos antígenos, as variantes ou os derivados deles da divulgação incluem, porém não estão limitados aos, anticorpos policlonais, monoclonais, multiespecíficos, humanos, humanizados, primatizados ou quiméricos, anticorpos de cadeia única, fragmentos de ligação ao epítopo, por exemplo, Fab, Fab’ e F(ab’)2, Fd, Fvs, Fvs de cadeia única (scFv), anticorpos de cadeia única, Fvs ligados ao dissulfeto (sdFv), fragmentos compreendendo um domínio VK ou VH, fragmentos produzidos por um biblioteca de expressão de Fab e anticorpos anti-idiotípicos (anti-Id) (incluindo, por exemplo, os anticorpos anti-Id para os anticorpos LIGHT divulgados neste documento). As moléculas de imunoglobulina ou anticorpo da divulgação podem ser de qualquer tipo (por exemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY), classe (por exemplo, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl e IgA2) ou subclasse da molécula de imunoglobulina.

[0094] As cadeias leves são classificadas como capa ou lambda (K, λ). Cada classe da cadeia pesada pode ser ligada a uma cadeia leve capa ou lambda. Em geral, as cadeias leves e pesadas são covalentemente ligadas entre si, e as partes da “cauda” das duas cadeias pesadas são ligadas entre si por ligações dissulfeto covalentes ou ligações não covalentes quando as imunoglobulinas forem geradas por hibridomas, células B ou células hospedeiras geneticamente modificadas. Na cadeia pesada, as sequências de aminoácidos estendem-se a partir de uma extremidade de N nas extremidades bifurcadas da configuração Y até a extremidade de C na parte inferior de cada cadeia.

[0095] Ambas as cadeias leve e pesada são divididas em regiões de homologia estrutural e funcional. Os termos “constante” e “variável” são utilizados funcionalmente. A este respeito, será apreciado que os domínios variáveis de ambas as partes das cadeias leve (VK) e pesada (VH) determinam o reconhecimento e a especificidade para um antígeno. Por outro lado, os domínios constantes da cadeia leve (CK) e da cadeia pesada (CH1, CH2 ou CH3) conferem propriedades biológicas importantes, como a secreção, a mobilidade transplacentária, a ligação ao receptor de Fc, a ligação ao complemento e semelhantes. Por convenção, a numeração dos domínios da região constante aumenta à medida que se tornam mais distais do sítio de ligação ao antígeno ou da extremidade amino do anticorpo. A parte de N terminal é uma região variável e na parte de C terminal está uma região constante; os domínios CH3 e CK na verdade compreendem a extremidade de carbóxi da cadeia pesada e leve, respectivamente.

[0096] Como indicado acima, a região variável permite que o anticorpo reconheça seletivamente e se ligue especificamente aos epítopos nos antígenos. Ou seja, o domínio VK e o domínio VH, ou o subconjunto das regiões determinantes de complementaridade (CDRs), de um anticorpo se combinam para formar a região variável que define um sítio de ligação ao antígeno tridimensional. Esta estrutura quaternária do anticorpo forma o sítio de ligação ao antígeno, presente no final de cada braço do Y. Mais especificamente, o sítio de ligação ao antígeno é definido por três CDRs sobre cada uma das cadeias VH e VK (ou seja, CDR-H1, CDR- H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3). Em alguns casos, por exemplo, certas moléculas de imunoglobulina derivadas de espécies de camelídeos ou modificadas com base nas imunoglobulinas de camelídeos, uma molécula de imunoglobulina completa pode consistir em apenas cadeias pesadas, sem cadeias leves. Ver, por exemplo, Hamers-Casterman et al., Nature 363: 446-448 (1993).

[0097] Nos anticorpos que ocorrem naturalmente, as seis “regiões determinantes de complementaridade” ou “CDRs”, presentes em cada domínio de ligação ao antígeno, são sequências de aminoácidos curtas e não contíguas, que estão especificamente posicionadas para formar o domínio de ligação ao antígeno, à medida que o anticorpo assume a sua configuração tridimensional em um ambiente aquoso. O restante dos aminoácidos nos domínios de ligação ao antígeno, referidos como regiões de “estrutura”, mostram menos variabilidade intermolecular. As regiões de estrutura adotam amplamente uma conformação de folha β e as CDRs formam loops que unem a, e, em alguns casos, formam parte da, estrutura de folha β. Assim, as regiões de estrutura atuam para formar uma armação que proporciona o posicionamento das CDRs na orientação correta, por interações não covalentes entre as cadeias. O domínio de ligação ao antígeno, formado pelas CDRs posicionadas, define uma superfície complementar ao epítopo sobre o antígeno imunorreativo. Esta superfície complementar promove a ligação não covalente do anticorpo ao seu epítopo cognato. Os aminoácidos que compreendem as CDRs e as regiões de estrutura, respectivamente, podem ser prontamente identificados quanto a qualquer região variável da cadeia pesada ou leve dada por um versado na técnica, uma vez que eles foram definidos com precisão (ver www.bioinf.org.uk: Dr. Andrew C.R. Martin’s Group; “Sequences of Proteins of Immunological Interest,” Kabat, E., et al., U.S. Department of Health and Human Services, (1983); e Chothia e Lesk, J. MoI. Biol., 196: 901-917 (1987)).

[0098] No caso onde existirem duas ou mais definições de um termo que seja utilizado e/ou aceito na técnica, a definição do termo conforme utilizado neste documento se destina a incluir todos os significados, a menos que explicitamente afirmado em contrário. Um exemplo específico é o uso do termo “região determinante de complementaridade” (“CDR”) para descrever os sítios não contíguos de combinação com os antígenos, encontrados dentro da região variável de polipeptídeos de cadeias tanto pesadas quanto leves.

Esta região particular foi descrita por Kabat et al., U.S.

Dept. of Health and Human Services, “Sequences of Proteins of Immunological Interest” (1983) e por Chothia et al., J.

MoI.

Biol. 196: 901-917 (1987), que são incorporados neste documento por referência nas suas totalidades.

As definições das CDRs de acordo com Kabat e Chothia incluem a sobreposição ou os subconjuntos de resíduos de aminoácidos quando comparados uns com os outros.

No entanto, a aplicação de uma ou outra definição para se referir a uma CDR de um anticorpo ou variantes dele pretende estar dentro do escopo do termo conforme definido e utilizado neste documento.

Os resíduos de aminoácidos apropriados que abrangem as CDRs conforme definidas por cada uma das referências citadas acima são apresentados na tabela abaixo como uma comparação.

Os números exatos de resíduos que abrangem uma CDR particular variarão, dependendo da sequência e do tamanho da CDR.

Os versados na técnica podem determinar rotineiramente quais resíduos compreendem uma CDR particular, dada a sequência de aminoácidos da região variável do anticorpo. [Tabela 1] Kabat Chothia CDR-H1 31-35 26-32 CDR-H2 50-65 52-58 CDR-H3 95-102 95-102

CDR-L1 24-34 26-32 CDR-L2 50-56 50-52 CDR-L3 89-97 91-96

[0099] Kabat et al. também definiram um sistema de numeração para as sequências do domínio variável que é aplicável a qualquer anticorpo. Um versado na técnica pode designar inequivocamente este sistema de “numeração de Kabat” para qualquer sequência do domínio variável, sem se valer de quaisquer dados experimentais além da própria sequência. Conforme utilizado neste documento, a “numeração de Kabat” refere-se ao sistema de numeração estabelecido por Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, “Sequence of Proteins of Immunological Interest” (1983).

[0100] Além da tabela acima, o sistema de números de Kabat descreve as regiões CDR da seguinte forma: A CDR-H1 começa aproximadamente no aminoácido 31 (ou seja, aproximadamente 9 resíduos após o primeiro resíduo de cisteína), inclui aproximadamente 5-7 aminoácidos e termina no próximo resíduo de triptofano. A CDR-H2 começa no décimo quinto resíduo após o final da CDR-H1, inclui aproximadamente 16-19 aminoácidos e termina no próximo resíduo de arginina ou lisina. A CDR-H3 começa aproximadamente no trigésimo terceiro resíduo de aminoácido após o final da CDR-H2; inclui 3-25 aminoácidos; e termina na sequência W-G-X-G, onde X é qualquer aminoácido. A CDR- L1 começa aproximadamente no resíduo 24 (isto é, após um resíduo de cisteína); inclui aproximadamente 10-17 resíduos; e termina no próximo resíduo de triptofano. A CDR-L2 começa aproximadamente no décimo sexto resíduo após o final da CDR-L1 e inclui aproximadamente 7 resíduos. A

CDR-L3 começa aproximadamente no trigésimo terceiro resíduo após o final da CDR-L2 (isto é, após um resíduo de cisteína); inclui aproximadamente 7-11 resíduos e termina na sequência F ou W-G-X-G, onde X é qualquer aminoácido.

[0101] Os anticorpos divulgados neste documento podem ser de qualquer origem animal, incluindo as aves e os mamíferos. De preferência, os anticorpos são anticorpos humanos, de ratos, burros, coelhos, cabras, porquinhos-da- índia, camelos, lhamas, cavalos ou galinhas. Em outra modalidade, a região variável pode ser de origem dos condríctios (por exemplo, a partir de tubarões).

[0102] Conforme utilizado neste documento, o termo “região constante da cadeia pesada” inclui as sequências de aminoácidos derivadas de uma cadeia pesada da imunoglobulina. Um polipeptídeo compreendendo uma região constante da cadeia pesada compreende pelo menos um de: um domínio CH1, um domínio de dobradiça (por exemplo, uma região de dobradiça superior, média e/ou inferior), um domínio CH2, um domínio CH3 ou uma variante ou fragmento dele. Por exemplo, um polipeptídeo de ligação ao antígeno para uso na divulgação pode compreender uma cadeia polipeptídica compreendendo um domínio CH1; uma cadeia polipeptídica compreendendo um domínio CH1, pelo menos uma parte de um domínio de dobradiça e um domínio CH2; uma cadeia polipeptídica compreendendo um domínio CH1 e um domínio CH3; uma cadeia polipeptídica compreendendo um domínio CH1, pelo menos uma parte de um domínio de dobradiça e um domínio CH3, ou uma cadeia polipeptídica compreendendo um domínio CH1, pelo menos uma parte de um domínio de dobradiça, um domínio CH2 e um domínio CH3. Em outra modalidade, um polipeptídeo da divulgação compreende uma cadeia polipeptídica compreendendo um domínio CH3. Além disso, um anticorpo para uso na divulgação pode não ter pelo menos uma parte de um domínio CH2 (por exemplo, todo ou parte de um domínio CH2). Conforme estabelecido acima, será entendido por um versado na técnica que a região constante da cadeia pesada pode ser modificada, de modo que varie na sequência de aminoácidos da molécula de imunoglobulina que ocorre naturalmente.

[0103] A região constante da cadeia pesada de um anticorpo divulgado neste documento pode ser derivada de diferentes moléculas de imunoglobulina. Por exemplo, uma região constante da cadeia pesada de um polipeptídeo pode compreender um domínio CH1 derivado de uma molécula de IgG1 e uma região de dobradiça derivada de uma molécula de IgG3. Em outro exemplo, uma região constante da cadeia pesada pode compreender uma região de dobradiça derivada, em parte, de uma molécula de IgG1 e, em parte, de uma molécula de IgG3. Em outro exemplo, uma parte da cadeia pesada pode compreender uma dobradiça quimérica derivada, em parte, de uma molécula de IgG1 e, em parte, de uma molécula de IgG4.

[0104] Conforme utilizado neste documento, o termo “região constante da cadeia leve” inclui as sequências de aminoácidos derivadas da cadeia leve do anticorpo. De preferência, a região constante da cadeia leve compreende pelo menos um de um domínio constante da capa ou domínio constante da lambda.

[0105] Um “par da cadeia leve-cadeia pesada” refere-se à coleção de uma cadeia leve e uma cadeia pesada que pode formar um dímero através de uma ligação dissulfeto entre o domínio CL da cadeia leve e o domínio CH1 da cadeia pesada.

[0106] Conforme indicado anteriormente, as estruturas de subunidades e a configuração tridimensional das regiões constantes das várias classes da imunoglobulina são bem conhecidas. Conforme utilizado neste documento, o termo “domínio VH” inclui o domínio variável amino terminal de uma cadeia pesada da imunoglobulina e o termo “domínio CH1” inclui o primeiro domínio da região constante (o mais amino terminal) de uma cadeia pesada da imunoglobulina. O domínio CH1 é adjacente ao domínio VH e é amino terminal à região de dobradiça de uma molécula da cadeia pesada de imunoglobulina.

[0107] Como utilizado neste documento, o termo “domínio CH2” inclui a parte de uma molécula da cadeia pesada que se estende, por exemplo, aproximadamente do resíduo 244 até o resíduo 360 de um anticorpo, utilizando os esquemas de numeração convencionais (resíduos 244 a 360, sistema de numeração de Kabat; e resíduos 231-340, sistema de numeração de EU; ver Kabat et al., US Dept. of Health and Human Services, “Sequences of Proteins of Immunological Interest” (1983). O domínio CH2 é único, visto que não está intimamente emparelhado com outro domínio. Mais exatamente, duas cadeias de carboidratos ramificadas ligadas ao N estão interpostas entre os dois domínios CH2 de uma molécula de IgG nativa intacta. Também está bem documentado que o domínio CH3 se estende a partir do domínio CH2 até o C terminal da molécula de IgG e compreende aproximadamente 108 resíduos.

[0108] Conforme utilizado neste documento, o termo “região de dobradiça” inclui a parte de uma molécula da cadeia pesada que une o domínio CH1 ao domínio CH2. Esta região de dobradiça compreende aproximadamente 25 resíduos e é flexível, permitindo, assim, que as duas regiões de ligação ao antígeno N terminais se movam independentemente. As regiões de dobradiça podem ser subdivididas em três domínios distintos: domínios de dobradiça superior, médio e inferior (Roux et al., J. Immunol 161: 4083 (1998)).

[0109] Conforme utilizado neste documento, o termo “ligação dissulfeto” inclui a ligação covalente formada entre dois átomos de enxofre. O aminoácido cisteína compreende um grupo tiol que pode formar uma ligação ou ponte dissulfeto com um segundo grupo tiol. Na maioria das moléculas de IgG que ocorrem naturalmente, as regiões CH1 e CK estão ligadas por uma ligação dissulfeto e as duas cadeias pesadas estão ligadas por duas ligações dissulfeto nas posições que correspondem a 239 e 242 utilizando o sistema de numeração de Kabat (posição 226 ou 229, sistema de numeração de EU)

[0110] Como utilizado neste documento, o termo “anticorpo quimérico” será considerado significar qualquer anticorpo em que a região ou sítio imunorreativo é obtido ou derivado de uma primeira espécie e a região constante (que pode ser intacta, parcial ou modificada de acordo com a presente divulgação) é obtida de uma segunda espécie. Em algumas modalidades, a região ou sítio de ligação ao alvo será de uma fonte não humana (por exemplo, camundongo ou primata) e a região constante é humana.

[0111] Como utilizado neste documento, a “porcentagem de humanização” é calculada determinando o número de diferenças de aminoácidos da estrutura (ou seja, diferença que não da CDR) entre o domínio humanizado e o domínio da linhagem germinativa, subtraindo esse número do número total de aminoácidos e, em seguida, dividindo isso pelo número total de aminoácidos e multiplicando por 100.

[0112] Por “especificamente se liga” ou “tem especificidade para”, em geral, significa que um anticorpo se liga a um epítopo por meio de seu domínio de ligação ao antígeno e que a ligação envolve alguma complementaridade entre o domínio de ligação ao antígeno e o epítopo. De acordo com esta definição, diz-se que um anticorpo “especificamente se liga” a um epítopo quando ele se ligar a esse epítopo, por meio de seu domínio de ligação ao antígeno, mais prontamente do que se ligaria a um epítopo aleatório, não relacionado. O termo “especificidade” é utilizado neste documento para qualificar a afinidade relativa pela qual um determinado anticorpo se liga a um determinado epítopo. Por exemplo, o anticorpo “A” pode ser considerado como tendo uma especificidade mais alta para um determinado epítopo do que o anticorpo “B”, ou pode-se dizer que o anticorpo “A” se liga ao epítopo “C” com uma especificidade mais alta do que tem para o epítopo relacionado “D”. De preferência, o anticorpo se liga a um antígeno (ou epítopo) com “alta afinidade”, a saber, com uma KD de 1 × 10-7 M ou menos, mais preferivelmente 5 × 10-8 M ou menos, mais preferivelmente 3 × 10- 8 M ou menos, mais preferivelmente 1 × 10-8 M ou menos, mais preferivelmente 25 × 10-9 M ou menos ou ainda mais preferivelmente 1 × 10-9 M ou menos.

[0113] Como utilizados neste documento, os termos “tratar” ou “tratamento” podem referir-se tanto ao tratamento terapêutico quanto às medidas profiláticas ou preventivas, em que o objetivo é prevenir ou retardar (diminuir) uma alteração ou distúrbio fisiológico indesejado, como a progressão do câncer. Os resultados clínicos benéficos ou desejados incluem, porém não estão limitados ao, alívio dos sintomas, diminuição da extensão da doença, estado da doença estabilizado (ou seja, sem agravamento), retardo ou desaceleração da progressão da doença, melhora ou paliação do estado da doença e remissão (seja parcial ou total), seja detectável ou indetectável. O “tratamento” também pode significar o prolongamento da sobrevida, em comparação com a sobrevida esperada se não receber tratamento. Aqueles que precisam de tratamento incluem aqueles já com a condição ou o distúrbio, bem como aqueles propensos a terem a condição ou o distúrbio ou aqueles nos quais a condição ou o distúrbio deve ser evitado.

[0114] Por “paciente” ou “indivíduo” ou “animal” ou “cobaia” ou “mamífero” pode se referir a qualquer paciente, particularmente um paciente mamífero, para o qual for desejado o diagnóstico, o prognóstico ou a terapia. Os pacientes mamíferos incluem os seres humanos, os animais domésticos, os animais de fazenda e os animais de zoológico, esporte ou estimação, como os cães, os gatos, os porquinhos-da-índia, os coelhos, os ratos, os camundongos, os cavalos, o gado domesticado, as vacas e assim por diante.

[0115] Como utilizadas neste documento, as frases, como “a um paciente que necessita de tratamento” ou

“um paciente que necessita de tratamento”, incluem os pacientes, como os pacientes mamíferos, que se beneficiariam da administração de um anticorpo ou composição da presente divulgação, utilizada, por exemplo, para a detecção, para um procedimento diagnóstico e/ou para um tratamento.

[0116] A presente divulgação proporciona um anticorpo biespecífico anti-PD-L1/anti-LAG3 capaz de bloquear efetivamente as interações entre o PD-L1 e o seu receptor PD-1 e entre o LAG3 e o seu ligante (por exemplo, uma molécula de MHC de classe II). O anticorpo biespecífico pode ter alta afinidade de ligação a ambas, uma proteína PD-L1 (por exemplo, uma proteína PD-L1 humana) e uma proteína LAG3 (por exemplo, uma proteína LAG3 humana).

[0117] O anticorpo biespecífico anti-PD-L1/anti- LAG3 pode compreender um anticorpo anti-PD-L1 ou um fragmento de ligação ao antígeno dele como uma parte que alveja PD-L1, que é capaz de especificamente reconhecer e/ou se ligar a uma proteína PD-L1, e um anticorpo anti- LAG3 ou um fragmento de ligação ao antígeno dele como uma parte que alveja LAG3, que é capaz de especificamente reconhecer e/ou se ligar a uma proteína LAG3. Anticorpo anti-PD-L1

[0118] O anticorpo biespecífico anti-PD-L1/anti- LAG3 pode compreender um anticorpo anti-PD-L1 ou um fragmento de ligação ao antígeno dele como uma parte que alveja PD-L1. O anticorpo anti-PD-L1 ou o fragmento de ligação ao antígeno dele pode exibir atividades de ligação potentes e inibitórias para PD-L1 e ser útil para usos terapêuticos e diagnósticos.

[0119] A proteína PD-L1 é uma proteína transmembrana do tipo 1, de 40 kDa. A proteína PD-L1 pode ser uma proteína PD-L1 humana, e a proteína PD-L1 humana pode ser selecionada a partir do grupo que consiste nas proteínas representadas pelo No. de Acesso do GenBank NP_001254635.1, NP_001300958.1, NP_054862.1 etc., porém não pode estar limitado a elas. A proteína PD-L1 humana inclui uma parte extracelular que inclui um domínio V da imunoglobulina (IgV) N terminal (aminoácidos 19-127) e um domínio C da imunoglobulina (IgC) C terminal (aminoácidos 133-225). Ao contrário dos anticorpos anti-PD-L1 pré- existentes, que se ligam ao domínio IgV do PD-L1, interrompendo, assim, a ligação entre a PD-1 e o PD-L1, o anticorpo anti-PD-L1 ou o fragmento dele compreendido no anticorpo biespecífico pode não se ligar a um domínio V da imunoglobulina (IgV) da proteína PD-L1, porém pode se ligar ao domínio IgC do PD-L1, para inibir efetivamente o PD-L1, melhorando, assim, os efeitos terapêuticos.

[0120] Em particular, o anticorpo anti-PD-L1 ou o fragmento dele compreendido no anticorpo biespecífico pode especificamente se ligar a um domínio C da imunoglobulina (IgC) da proteína PD-L1. No caso da proteína PD-L1 humana, o domínio Ig C compreende os, ou consiste essencialmente nos, resíduos de aminoácidos 133-225 de tamanho natural da proteína PD-L1 humana. Mais especificamente, o anticorpo anti-PD-L1 ou o fragmento dele pode se ligar a pelo menos um selecionado a partir dos resíduos de aminoácidos Y134, K162 e N183 da proteína PD-L1 humana. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-PD-L1 ou o fragmento dele pode se ligar a pelo menos dois selecionados a partir dos resíduos de aminoácidos Y134, K162 e N183 da proteína PD-L1 humana. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-PD-L1 ou o fragmento dele não se liga a um domínio V da imunoglobulina (IgV) da proteína PD-L1, em que o domínio IgV consiste nos resíduos de aminoácidos 19-127 da proteína PD-L1 humana.

[0121] Em uma modalidade, são proporcionados anticorpos e fragmentos deles que são capazes de ligação específica a uma proteína PD-L1 humana. Estes anticorpos podem ser úteis para fins terapêuticos, como o tratamento de vários tipos de câncer, infecções (inflamações) etc., e podem também ser utilizados para fins de diagnóstico e prognóstico.

[0122] O anticorpo anti-PD-L1 ou o fragmento dele pode compreender (1) uma CDR1 da VH tendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 61-67; (2) uma CDR2 da VH tendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 68-77 e 525-527; (3) uma CDR3 da VH tendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 78-90 e SEQ ID NO: 513-519; (4) uma CDR1 da VL tendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 91-92 e SEQ ID NO: 520-521; (5) uma CDR2 da VL tendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 93-105; e (6) uma CDR3 da VL tendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 106-111 e SEQ ID NO: 522-524.

[Tabela 2] CDRs dos anticorpos anti-PD-L1 Nome Sequência SEQ ID NO: CDR1 da VH SYDMS 1 TYDMS 61 CYDMS 62 SFDMS 63 SHDMS 64 SWDMS 65 SYDMT 66 SYDMC 67

CDR2 da VH TISDGGGYIYYSDSVKG 2

TISDGGAYIYYSDSVKG 68 TISDGGPYIYYSDSVKG 69 TISDGGGFIYYSDSVKG 70 TISDGGGHIYYSDSVKG 71 TISDGGGWIYYSDSVKG 72 TISDGGGYIYYSDTVKG 73 TISDGGGYIYYSDCVKG 74 TISDGGGYIYYSDSLKG 75 TISDGGGYIYYSDSIKG 76 TISDGGGYIYYSDSMKG 77 TISDAGGYIYYSDSVKG 525 TISDAGGYIYYRDSVKG 526 TISDGGGYIYYRDSVKG 527

CDR3 da VH EFGKRYALDY 3 QFGKRYALDY 78 DFGKRYALDY 79 NFGKRYALDY 80 EYGKRYALDY 81 EHGKRYALDY 82 EWGKRYALDY 83 EFAKRYALDY 84 EFPKRYALDY 85 EFGRRYALDY 86 EFGKKYALDY 87 EFGKRFALDY 88 EFGKRHALDY 89 EFGKRWALDY 90 EFGKRYALDS 513 EIFNRYALDY 514 ELPWRYALDY 515 ELHFRYALDY 516 ELYFRYALDY 517 ELLHRYALDY 518 ELRGRYALDY 519

CDR1 da VL KASQDVTPAVA 4 KATQDVTPAVA 91

KACQDVTPAVA 92 KAKQDVTPAVA 520 KASQDVWPAVA 521

CDR2 da VL STSSRYT 5 TTSSRYT 93 CTSSRYT 94 SSSSRYT 95 SMSSRYT 96 SVSSRYT 97 STTSRYT 98 STCSRYT 99 STSTRYT 100 STSCRYT 101 STSSKYT 102 STSSRFT 103 STSSRHT 104 STSSRWT 105

CDR3 da VL QQHYTTPLT 6 EQHYTTPLT 106 DQHYTTPLT 107 NQHYTTPLT 108 QEHYTTPLT 109 QDHYTTPLT 110

QNHYTTPLT 111 MQHYTTPLT 522 QQHSTTPLT 523 QQHSDAPLT 524

[0123] Em algumas modalidades, um anticorpo ou um fragmento dele inclui não mais do que uma, não mais do que duas ou não mais do que três das substituições acima mencionadas. Em algumas modalidades, o anticorpo ou o fragmento dele inclui uma CDR1 da VH de SEQ ID NO: 1 ou qualquer uma de SEQ ID NO: 61-67, uma CDR2 da VH de SEQ ID NO: 2, 525, 526 ou 527, uma CDR3 da VH de SEQ ID NO: 3, uma CDR1 da VL de SEQ ID NO: 4, uma CDR2 da VL de SEQ ID NO: 5 e uma CDR3 da VL de SEQ ID NO: 6.

[0124] Em algumas modalidades, o anticorpo ou o fragmento dele inclui uma CDR1 da VH de SEQ ID NO: 1, uma CDR2 da VH de SEQ ID NO: 2 ou qualquer uma de SEQ ID NO: 68-77, 525, 526 ou 527, uma CDR3 da VH de SEQ ID NO: 3, uma CDR1 da VL de SEQ ID NO: 4, uma CDR2 da VL de SEQ ID NO: 5 e uma CDR3 da VL de SEQ ID NO: 6.

[0125] Em algumas modalidades, o anticorpo ou o fragmento dele inclui uma CDR1 da VH de SEQ ID NO: 1, uma CDR2 da VH de SEQ ID NO: 2, 525, 526 ou 527, uma CDR3 da VH de SEQ ID NO: 3 ou qualquer uma de SEQ ID NO: 78-90 e 513- 519, uma CDR1 da VL de SEQ ID NO: 4, uma CDR2 da VL de SEQ ID NO: 5 e uma CDR3 da VL de SEQ ID NO: 6.

[0126] Em algumas modalidades, o anticorpo ou o fragmento dele inclui uma CDR1 da VH de SEQ ID NO: 1, uma CDR2 da VH de SEQ ID NO: 2, 525, 526 ou 527, uma CDR3 da VH de SEQ ID NO: 3, uma CDR1 da VL de SEQ ID NO: 4 ou qualquer uma de SEQ ID NO: 91-92 e 520-521, uma CDR2 da VL de SEQ ID NO: 5 e uma CDR3 da VL de SEQ ID NO: 6.

[0127] Em algumas modalidades, o anticorpo ou o fragmento dele inclui uma CDR1 da VH de SEQ ID NO: 1, uma CDR2 da VH de SEQ ID NO: 2, 525, 526 ou 527, uma CDR3 da VH de SEQ ID NO: 3, uma CDR1 da VL de SEQ ID NO: 4, uma CDR2 da VL de SEQ ID NO: 5 ou qualquer uma de SEQ ID NO: 93-105 e uma CDR3 da VL de SEQ ID NO: 6.

[0128] Em algumas modalidades, o anticorpo ou o fragmento dele inclui uma CDR1 da VH de SEQ ID NO: 1, uma CDR2 da VH de SEQ ID NO: 2, 525, 526 ou 527, uma CDR3 da VH de SEQ ID NO: 3, uma CDR1 da VL de SEQ ID NO: 4, uma CDR2 da VL de SEQ ID NO: 5 e uma CDR3 da VL de SEQ ID NO: 6 ou qualquer uma de SEQ ID NO: 106-111 e 522-524.

[0129] Por exemplo, o anticorpo anti-PD-L1 ou o fragmento dele pode compreender uma CDR1 da VH tendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1; uma CDR2 da VH tendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, 525, 526 ou 527; (3) uma CDR3 da VH tendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 ou 515; uma CDR1 da VL tendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4; uma CDR2 da VL tendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5; e uma CDR3 da VL tendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6.

[0130] Em algumas modalidades, é proporcionado um anticorpo anti-PD-L1 ou fragmento dele que compreende uma CDR1 da VH tendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1; uma CDR2 da VH tendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 525; uma CDR3 da VH tendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3; uma CDR1 da VL tendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4; uma CDR2 da VL tendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5; e uma CDR3 da VL tendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:

6.

[0131] Em algumas modalidades, é proporcionado um anticorpo anti-PD-L1 ou fragmento dele que compreende uma CDR1 da VH tendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1; uma CDR2 da VH tendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 526; uma CDR3 da VH tendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 515; uma CDR1 da VL tendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4; uma CDR2 da VL tendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5; e uma CDR3 da VL tendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:

6.

[0132] Os exemplos não limitativos da VH (região variável da cadeia pesada) são proporcionados nas SEQ ID NOS: 7-26, 113, 493, 495, 497, 499, 501, 503, 505, 507, 509 e 511, em que a SEQ ID NO: 113 é a VH do camundongo, as SEQ ID NOs: 7-26 são as humanizadas e as SEQ ID NO: 493, 495, 497, 499, 501, 503, 505, 507, 509 e 511 são as de afinidade maturada dos anticorpos humanizados. Além disso, entre as VHs humanizadas, as SEQ ID NO: 9-15, 17-21 e 23-26 incluem uma ou mais mutações reversas na versão de camundongo. Da mesma forma, os exemplos não limitativos da VL (VK; região variável da cadeia leve (tipo capa)) são proporcionados nas SEQ ID NOS: 27-33, 494, 496, 498, 500, 502, 504, 506, 508, 510, e 512. As SEQ ID NO: 28 e 30 são as sequências originalmente derivadas, enxertadas com CDR e humanizadas, como mostrado nos exemplos, e as SEQ ID NO: 29 e 31-33 são as VL humanizadas com mutações reversas.

[0133] As mutações reversas podem ser úteis para manter certas características dos anticorpos anti-PD-L1. Em algumas modalidades, os anticorpos anti-PD-L1 da presente divulgação, em particular os humanos ou humanizados, podem incluir uma ou mais das mutações reversas. Em algumas modalidades, a mutação reversa (isto é, aminoácido incluído na posição especificada) em uma região variável da cadeia pesada (VH) é uma ou mais selecionadas a partir de (a) Ser na posição 44, (b) Ala na posição 49, (c) Ala na posição 53, (d) Ile na posição 91, (e) Glu na posição 1, (f) Val na posição 37, (g) Thr na posição 40 (h) Val na posição 53, (i) Glu na posição 54, (j) Asn na posição 77, (k) Arg na posição 94 e (l) Thr na posição 108, da região variável da cadeia pesada, de acordo com a numeração de Kabat e suas combinações. Em algumas modalidades, as mutações reversas VH são selecionadas a partir de (a) Ser na posição 44, (b) Ala na posição 49, (c) Ala na posição 53 e/ou (d) Ile na posição 91, do pesado região variável da cadeia, de acordo com a numeração de Kabat, e suas combinações.

[0134] Em algumas modalidades, a mutação reversa em uma região variável da cadeia leve (VL) é uma ou mais selecionadas a partir de (a) Ser na posição 22, (b) Gln na posição 42, (c) Ser na posição 43, (d) Asp na posição 60 e (e) Thr na posição 63, da região variável da cadeia leve, de acordo com a numeração de Kabat, e suas combinações.

[0135] Em algumas modalidades, o anticorpo anti- PD-L1 da presente divulgação ou o fragmento dele pode compreender uma VH selecionada a partir de SEQ ID NO: 7-26, 113, 493, 495, 497, 499, 501, 503, 505, 507, 509 e 511, uma VL selecionada a partir de SEQ ID NO: 27-33, 494, 496, 498,

500, 502, 504, 506, 508, 510 e 512, ou seus respectivos equivalentes biológicos, conforme descrito acima. Um equivalente biológico da VH e/ou da VL pode ter uma sequência de aminoácidos que inclua os aminoácidos designados (por exemplo, as CDRs), ao mesmo tempo tendo uma identidade de sequência de pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99%. Um equivalente biológico de SEQ ID NO: 20, por exemplo, pode ser uma VH que tenha uma identidade de sequência geral de 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% com a SEQ ID NO: 20, porém conserve as CDRs (SEQ ID NO: 1-6 ou as suas variantes) e, opcionalmente, conserve uma ou mais ou todas as mutações reversas.

[0136] Os exemplos não limitativos do anticorpo ou do fragmento dele podem compreender uma região variável da cadeia pesada compreendendo a, ou consistindo essencialmente na, sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20 ou 501, ou um equivalente biológico dela, e uma região variável da cadeia leve compreendendo a, ou consistindo essencialmente na, sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 28 ou 502, ou um equivalente biológico dela.

[0137] Em algumas modalidades, o anticorpo anti- PD-L1 ou o fragmento dele compreende ainda uma região constante da cadeia pesada, uma região constante da cadeia leve, uma região Fc ou a combinação delas. Em algumas modalidades, a região constante da cadeia leve pode ser uma região constante da cadeia capa ou lambda. Em algumas modalidades, o anticorpo é de um isótipo de IgG, IgM, IgA, IgE ou IgD, por exemplo, a IgG humana, a IgM humana, a IgA humana, a IgE humana ou a IgD humana. Em algumas modalidades, o isótipo pode ser a IgG, por exemplo, a IgG humana, como a IgG1, a IgG2, a IgG3 ou a IgG4. Em algumas modalidades, o fragmento (fragmento de ligação ao antígeno do anticorpo anti-PD-L1) pode ser qualquer fragmento compreendendo as CDRs da cadeia pesada e/ou as CDRs da cadeia leve do anticorpo e, por exemplo, ele pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em Fab, Fab’, F(ab’)2, Fd (compreendendo uma região variável da cadeia pesada e um domínio CH1), Fv (uma região variável da cadeia pesada e/ou uma região variável da cadeia leve), Fv de cadeia única (scFv; compreendendo ou consistindo essencialmente em uma região variável da cadeia pesada e uma região variável da cadeia leve, em qualquer ordem, e um ligador peptídico entre a região variável da cadeia pesada e a região variável da cadeia leve), anticorpos de cadeia única, Fvs ligados ao dissulfeto (sdFv) e semelhantes.

[0138] Sem limitação, o anticorpo anti-PD-L1 ou o fragmento dele é um anticorpo quimérico, um anticorpo humanizado ou um anticorpo totalmente humano. Em um aspecto, o anticorpo ou o fragmento dele não ocorre naturalmente, nem é sintetizado química ou recombinantemente.

[0139] Dado que cada um desses anticorpos pode se ligar ao PD-L1, como o PD-L1 humano, as sequências da CDR ou as sequências da VH e da VL podem ser “misturadas e combinadas” para criar outras moléculas de ligação anti- LAG-3 da divulgação. De preferência, quando as sequências da CDR ou as cadeias da VH e da VL forem misturadas e combinadas, por exemplo, uma sequência da VH a partir de um emparelhamento de VH/VL particular é substituída por uma sequência da VH estruturalmente semelhante. Da mesma forma, de preferência, uma sequência da VL a partir de um emparelhamento de VH/VL particular é substituída por uma sequência da VL estruturalmente semelhante. Anticorpo anti-LAG3

[0140] O anticorpo biespecífico anti-PD-L1/anti- LAG3 pode compreender um anticorpo anti-LAG3 ou um fragmento de ligação ao antígeno dele como uma parte que alveja LAG3.

[0141] Em uma modalidade, são proporcionados anticorpos e fragmentos deles que podem especificamente se ligar à proteína LAG3 (por exemplo, a LAG3 humana); por exemplo, o anticorpo anti-LAG3 ou o fragmento dele pode se ligar a um domínio extracelular da LAG-3.

[0142] Por exemplo, a proteína LAG3 humana pode ser selecionada a partir do grupo que consiste nas proteínas representadas pelo No. de Acesso do GenBank NP_002277.4 etc., porém não pode ser limitada a elas. Estes anticorpos anti-LAG3 podem ser úteis para fins terapêuticos, como o tratamento de vários tipos de câncer, infecções (inflamações) etc., e podem também ser utilizados para fins de diagnóstico e prognóstico.

[0143] O termo “LAG-3” ou “LAG3” refere-se ao Gene de Ativação de Linfócitos 3. A proteína LAG3, que pertence à superfamília das imunoglobulinas (Ig), compreende uma proteína transmembrana do tipo I, de 503 aminoácidos, com quatro domínios extracelulares semelhantes à Ig (“Ig-like”), designados D1 a D4. Conforme descrito neste documento, o termo “LAG-3” inclui as variantes, as isoformas, os homólogos, os ortólogos e os parálogos. Por exemplo, os anticorpos específicos para uma proteína LAG-3 humana podem, em certos casos, reagir cruzado com uma proteína LAG-3 de uma espécie diferente da humana. Em outras modalidades, os anticorpos específicos para uma proteína LAG-3 humana podem ser completamente específicos para a proteína LAG-3 humana e podem não exibir espécies ou outros tipos de reatividade cruzada, ou podem reagir cruzado com o LAG-3 de algumas outras espécies, porém não todas as outras espécies (por exemplo, reagir cruzado com o LAG-3 de macaco, porém não com o LAG-3 de camundongo). O termo “LAG-3 humano” refere-se à sequência do LAG-3 humano, como a sequência de aminoácidos completa do LAG-3 humano com o No. de Acesso do GenBank NP 002277.4. O termo “LAG-3 de camundongo” refere-se à sequência do LAG-3 de camundongo, como a sequência de aminoácidos completa do LAG-3 de camundongo tendo o No. de Acesso do GenBank NP

032505. O LAG-3 também é conhecido na técnica como, por exemplo, CD223. A sequência do LAG-3 humano pode diferir do LAG-3 humano do No. de Acesso do GenBank NP 002277.4 por ter, por exemplo, mutações conservadas ou mutações em regiões não conservadas e o LAG-3 tem substancialmente a mesma função biológica que o LAG-3 humano do No. de Acesso do GenBank NP 002277.4. Por exemplo, uma função biológica do LAG-3 humano é ter um epítopo no domínio extracelular do LAG-3 que é especificamente ligado por um anticorpo da presente divulgação ou uma função biológica do LAG-3 humano é ligar-se às moléculas de MHC de Classe II.

[0144] Conforme demonstrado nos exemplos experimentais, alguns dos anticorpos anti-LAG-3 divulgados neste documento exibiram atividades não mostradas com os anticorpos anti-LAG-3 conhecidos. Por exemplo, os anticorpos presentemente divulgados podem inibir a ligação da proteína LAG-3 à Galectina-3 (LGALS3) e à proteína G de 4 membros da família do domínio da lectina do tipo C (LSECtin), além de se ligarem às moléculas de MHC de classe II. Em contraste, os anticorpos anti-LAG-3 conhecidos mostraram apenas efeito inibitório na ligação às moléculas de MHC de classe II. Em algumas modalidades, os anticorpos e os fragmentos deles da presente divulgação são capazes de reverter o efeito inibitório das células T reguladoras (Tregs) sobre as células T efetoras (Teffs). Em algumas modalidades, os anticorpos e os fragmentos deles da presente divulgação são capazes de inibir a ligação entre o LAG3 e a Proteína 1 semelhante ao Fibrinogênio (FGL1).

[0145] Estes anticorpos anti-LAG3 podem ser úteis para fins terapêuticos, como o tratamento de vários tipos de câncer, infecções (inflamações) etc., e podem também ser utilizados para fins de diagnóstico e prognóstico.

[0146] Em uma modalidade, é proporcionado um anticorpo ou um fragmento dele que é capaz de especificidade para uma proteína LAG3 humana. O anticorpo anti-LAG3 ou o fragmento dele pode compreender (i) uma CDR1 da VH tendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOS: 116-117, 354 e 453-460; (ii) uma CDR2 da VH tendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOS: 118-119, 355 e 461-467; (iii) uma CDR3 da VH tendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 120-160, 356 e 468-475; (iv) uma CDR1 da VL tendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOS: 163-195, 229, 357 e 490; (v) uma CDR2 da VL tendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOS: 196-217, 358 e 476-483; e (vi) uma CDR3 da VL tendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOS: 218-228, 230- 253, 359 e 484-489. Por exemplo, o anticorpo anti-LAG3 ou o fragmento dele pode compreender uma CDR1 da VH tendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 354; uma CDR2 da VH tendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 355 ou 461; uma CDR3 da VH tendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 356 ou 468; uma CDR1 da VL tendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 357 ou 490; uma CDR2 da VL tendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 358; e uma CDR3 da VL tendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 359 ou 488. [Tabela 3] CDRs dos anticorpos anti-LAG3 Nome Sequência SEQ ID NO: CDR1 da VH SYAIS 116 SYAMS 117 GYTFTNYWLG 354 GYTFENYWLG 453 GYMFTNYWLG 454 GYTFDNYWLG 455 GYTFGNYWLG 456 GYTFTNYWLW 457

GYLFTNYWLG 458 GYTFTNYWLS 459 GFTFTNYWLG 460

CDR2 da VH GIIPIFGTANYAQKFQG 118 AISGSGGSTYYADSVKG 119 DIYPGGDYINYNEKFKG 355 DIYPGGDYIVYNEKFKG 461 DIYPGGDIINYNEKFKG 462 DIYPGGDVINYNEKFKG 463 DIFPGGDYINYNEKFKG 464 DIYPGGDLINYNEKFKG 465 DIYPGGDHINYNEKFKG 466 EIYPGGDYITYNEKFKG 467

CDR3 da VH ARGSSWFDY 120 ASSYHGGGYHRY 121 TTSKYSGSALRY 122 ARDRTGAFDY 123 ARHETVAGSFDY 124 ARTGYYGGNSGAFDI 125 ARAGTGMDLVFNS 126 ARGLARGDLNFGY 127 TREPHFDY 128 TTAAPGSYYLVFHY 129

ARDAGPVGYYGMDV 130 AGDGLYGSGSFGY 131 AKDIRWFYGMDV 132 ARHESGIAGGHFDY 133 AKDIRWYYGMDV 134 AKGVRGTYQIGYYGMDV 135 ARQGTAMALDY 136 VRDLQDWNYGGAAY 137 ARDDYYYGQFDS 138 AREITGTSYTALDS 139 ARGHIDGQAAGDY 140 AASTLRVPNPPY 141 ARSGDRYDFWSGY 142 TRGQDSTWYSSFDY 143 AASTLRLPNPPY 144 ATTQTSFYSHGMDV 145 ARVRKTPFWGALDS 146 ARGFTYGDFIFDY 147 ARDVRGVTYLGMDV 148 ARVRKTPFWGTLDS 149 ARVRRTPFWGALDS 150 AKRKGLGSPTDYYYGMDV 151 VRPEYDTYYYGMDV 152 AKGGGSYDY 153 ARALNGMDV 154

TRPLQGIAAADSYYYYAMDV 155 ARLHSYLSEEFDP 156 AKLSAVNTYIDD 157 ARVTKTPFWGTLDY 158 ARVSQSPVWGYFDY 159 AKDGYYDFWSGYSDY 160 PNLPGDY 356 PNLPKDH 468 PDLPGDY 469 PGLPKDY 470 PNLPKDY 471 PNLPRDY 472 PGLPRDY 473 PGLPQDY 474 PDLPKDY 475

CDR1 da VL QANQDIHHYLN 161 KSSQSVLYSSSNKNYLA 162 KSSQSVLYSSNNKNYLA 163 RSSQNLLHSDGYNYLN 164 KSSQSVLYTSNNKNYLA 165 QASQDINRYLS 166 QASQDISNYLN 167 QASQDISNYLN 167

RASQTISSHLN 168 RASQGIAGWLA 169 RASQGVSSWLA 170 KSSQSLFYHSNNHNYLA 171 RASQGISSSLA 172 QASRDISNSLS 173 RASQSISRYLN 174 RASRSISNWLA 175 KSSQSVFYRSNQKNYLA 176 RASQSVSSYLA 177 RASRGISSWLA 178 RASQGISSWLA 179 RASQSISSYLN 180 RASQAISNLLA 181 RASQGISTWLA 182 RASQGIASNLA 183 RASQGVSSYLA 184 RASQSIYTYLN 185 RASQFVSDWLA 186 RASQTISTWLA 187 RASQGISSYLA 188 RASQSIGYWLA 189 RATQSISSWLA 190 RASQGVRNWLA 191 RASQSINNYLA 192

RASQDITSWLA 193 RASQGIYDYLA 194 RASEGISGWLA 195 RASQDIVNWLA 229 RSSKSLLHSNGITYLY 357 RSSKSLLHSQGITYLY 490

CDR2 da VL DASILQS 196 WASTRES 197 LGSNRAT 198 DASNLET 199 AASSLQS 200 AASTLQS 201 AAFSLQS 202 GASSRAT 203 GISSRAT 204 AVSTLQS 205 DISTLQN 206 GASTLQS 207 GASSLQS 208 AASTLES 209 DASSLQS 210 KASNLQS 211 TASTLQN 212 RASSLQS 213

AASHLQS 214 DASTLQS 215 AASNLER 216 AASSLET 217 QVSNLAS 358 QVSNLAR 476 QKSNLAS 477 QVSNLAV 478 QVSNLAL 479 QVDNLAS 480 QVSNLAT 481 HVSNLAS 482 QVSNRAS 483

CDR3 da VL QQADSFPIT 218 QQSYSTPWT 219 QQYYSTPWT 220 QQSFTTPWT 221 QQYDNLPPT 222 QQSYGSPVT 223 QQGNSFPFT 224 QQAKSFPLT 225 QQVKSFPLT 226 QQYYNTPWT 227 QQTKNFPLT 228

QQTKSFPLT 230 QQSYNTPRT 231 QQSYRAPWT 232 QQANNFPLT 233 QQGNSFPLT 234 QQSKNFPVT 235 QQANSFPLT 236 QQLESYPLT 237 QQYYSSPT 238 QQLKTFPLT 239 QQTNWFPLT 240 QQAQSFPIT 241 QQAHSFPLT 242 LQDYHFPLT 243 QQGHSFPLT 244 QQSYIFPLT 245 QQYDTYWT 246 QQLNSYPLFT 247 QQYSSYWT 248 LQHNTYPFT 249 QQGHSFPLT 250 QQAHSFPFT 251 QQANMFPLT 252 QQADSFPFT 253 AQNLELPWT 359

GQNLELPWT 484 AQNLEMPWT 485 GQNLEMPWT 486 AQYLEEPWT 487 AQYLELPWT 488 GQYLELPWT 489

[0147] Nos exemplos não limitativos, o anticorpo ou o fragmento tendo especificidade para LAG3 tem uma combinação de CDR1 da VH, CDR2 da VH, CDR3 da VH, CDR1 da VL, CDR2 da VL e CDR3 da VL, como mostrado em quaisquer dos anticorpos listados na Tabela 27. Por exemplo, as CDRs podem ser aquelas do 147H 3807, que incluem uma CDR1 da VH de SEQ ID NO:354, uma CDR2 da VH de SEQ ID NO:461, uma CDR3 da VH de SEQ ID NO:468, uma CDR1 da VL de SEQ ID NO:490, uma CDR2 da VL de SEQ ID NO:358 e uma CDR3 da VL de SEQ ID NO:488. As variantes desses anticorpos também são proporcionadas, como aquelas tendo pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 99,5% de identidade de sequência com as regiões variáveis da cadeia pesada/cadeia leve e conservando as respectivas sequências da CDR.

[0148] Em uma modalidade, por exemplo, é proporcionado um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno dele, tendo especificidade para uma proteína LAG3 humana e compreendendo: uma região variável da cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:443 ou um polipeptídeo tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:443 e tendo uma CDR1 da VH compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:354, uma CDR2 da VH compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:461 e uma CDR3 da VH compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:468, e uma região variável da cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:444 ou um polipeptídeo tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:444 e tendo uma CDR1 da VL compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:490, uma CDR2 da VL compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:358 e uma CDR3 da VL compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:488.

[0149] Nos exemplos não limitativos do anticorpo anti-LAG3 ou do fragmento dele, (1) a região variável da cadeia pesada pode compreender ou consistir essencialmente em um polipeptídeo tendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOS: 254-302, 352, 360-373, 375, 377, 379, 381, 383, 385, 387, 389, 391, 393, 395, 397, 399, 401, 403, 405, 407, 409, 411, 413, 415, 417, 419, 421, 423, 425, 427, 429, 431, 433, 435, 437, 439, 441, 443, 445, 447, 449, 451 e 491 ou um polipeptídeo tendo uma identidade de sequência de pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% com as sequências de aminoácidos descritas acima; e/ou (2) a região variável da cadeia leve pode compreender ou consistir essencialmente em um polipeptídeo tendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOS: 303-351, 353, 374, 376, 378, 380, 382, 384, 386, 388, 390, 392, 394, 396, 398, 400,

402, 404, 406, 408, 410, 412, 414, 416, 418, 420, 422, 424, 426, 428, 430, 432, 434, 436, 438, 440, 442, 444, 446, 448, 450, 452 e 492 ou um polipeptídeo tendo uma identidade de sequência de pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% com as sequências de aminoácidos descritas acima.

[0150] Os exemplos não limitativos do anticorpo anti-LAG3 ou do fragmento dele podem compreender uma região variável da cadeia pesada compreendendo a, ou consistindo essencialmente na, sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 352 ou 443 e uma região variável da cadeia leve compreendendo a, ou consistindo essencialmente na, sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 353 ou 444.

[0151] Para um anticorpo ou fragmento humanizado, podem ser incorporadas certas mutações reversas. Em algumas modalidades, a região variável da cadeia pesada compreende um ou mais resíduos de aminoácidos selecionados a partir do grupo que consiste em: (a) Ala (A) na posição 71, (b) Leu (L) na posição 69, (c) Lys (K) na posição 66, (d) Ala (A) na posição 67, (e) Ile (I) na posição 48, (f) Ile (I) na posição 37, (g) Lys (K) na posição 38, (h) Phe (F) na posição 91, e (i) Glu (E) na posição 1, de acordo com a numeração de Kabat, e suas combinações.

[0152] Em algumas modalidades, a região variável da cadeia pesada compreende Ala (A) na posição 71. Em algumas modalidades, a região variável da cadeia pesada compreende Leu (L) na posição 69. Em algumas modalidades, a região variável da cadeia pesada compreende Lys (K) na posição 66. Em algumas modalidades, a região variável da cadeia pesada compreende Ala (A) na posição 67. Em algumas modalidades, a região variável da cadeia pesada compreende Ile (I) na posição 48. Em algumas modalidades, a região variável da cadeia pesada compreende Ile (I) na posição 37. Em algumas modalidades, a região variável da cadeia pesada compreende Lys (K) na posição 38. Em algumas modalidades, a região variável da cadeia pesada compreende Phe (F) na posição 91. Em algumas modalidades, a região variável da cadeia pesada compreende Glu (E) na posição 1.

[0153] Em algumas modalidades, a região variável da cadeia pesada compreende um ou mais resíduos de aminoácidos selecionados a partir do grupo que consiste em (a) Ala (A) na posição 71, (b) Leu (L) na posição 69, (c) Lys (K) na posição 66, (d) Ala (A) na posição 67, (e) Ile (I) na posição 48, (f) Ile (I) na posição 37, e (g) Lys (K) na posição 38, de acordo com a numeração de Kabat, e suas combinações. Em algumas modalidades, a região variável da cadeia pesada compreende todos os resíduos descritos acima.

[0154] Os anticorpos da divulgação são caracterizados por características ou propriedades funcionais particulares dos anticorpos. Por exemplo, os anticorpos especificamente se ligam ao LAG-3 humano e podem se ligar ao LAG-3 de algumas outras espécies, por exemplo, o LAG-3 de macaco, por exemplo, o macaco cynomolgus, o macaco rhesus, porém podem não se ligar substancialmente ao LAG-3 de algumas outras espécies, por exemplo, o LAG-3 de camundongo. De preferência, um anticorpo da divulgação se liga ao LAG-3 humano com alta afinidade.

[0155] A capacidade do anticorpo de estimular uma resposta imune, como uma resposta das células T específica para um antígeno, pode ser indicada, por exemplo, pela capacidade do anticorpo de estimular a produção da interleucina-2 (IL-2) ou do interferon gama (IFN-gama) em uma resposta das células T específica para um antígeno. Em algumas modalidades, um anticorpo da divulgação se liga ao LAG-3 humano e exibe uma capacidade de estimular uma resposta das células T específica para um antígeno. Em outras modalidades, um anticorpo da divulgação se liga ao LAG-3 humano, porém não exibe uma capacidade de estimular uma resposta das células T específica para um antígeno. Os outros meios pelos quais avaliar a capacidade do anticorpo de estimular uma resposta imune incluem a capacidade do anticorpo de inibir o crescimento do tumor, como em um modelo de enxerto de tumor in vivo, ou a capacidade do anticorpo de estimular uma resposta autoimune, como a capacidade de promover o desenvolvimento de uma doença autoimune em um modelo autoimune, como a capacidade de promover o desenvolvimento de diabetes no modelo de camundongo NOD.

[0156] A ligação de um anticorpo da divulgação ao LAG-3 pode ser avaliada utilizando uma ou mais práticas bem estabelecidas na técnica. Por exemplo, em uma modalidade preferida, um anticorpo pode ser testado por um ensaio de citometria de fluxo, no qual o anticorpo é reagido com uma linhagem celular que expressa o LAG-3 humano, como as células CHO que tenham sido transfectadas para expressar o LAG-3, por exemplo, o LAG-3 humano ou o LAG-3 de macaco, por exemplo, o LAG-3 de macaco rhesus ou cynomolgus ou de rato, sobre a sua superfície celular. As outras células adequadas para uso nos ensaios de citometria de fluxo incluem as células T ativadas CD4+ estimuladas por anti-CD3, que expressam o LAG-3 nativo. Adicionalmente, ou alternativamente, a ligação do anticorpo, incluindo a cinética de ligação (por exemplo, o valor de KD), pode ser testada nos ensaios de ligação BIAcore. Ainda outros ensaios de ligação adequados incluem os ensaios ELISA, por exemplo, utilizando uma proteína LAG-3 recombinante. De preferência, um anticorpo da divulgação se liga a uma proteína LAG-3 com uma KD de 5 x 10-8 M ou menos, se liga a uma proteína LAG-3 com uma KD de 2 x 10-8 M ou menos, se liga a uma proteína LAG-3 com uma KD de 5 x 10-9 M ou menos, se liga a uma proteína LAG-3 com uma KD de 4 x 10-9 M ou menos, se liga a uma proteína LAG-3 com uma KD de 3 x 10-9 M ou menos, se liga a uma proteína LAG-3 com uma KD de 2 x 10-9 M ou menos, se liga a uma proteína LAG-3 com uma KD de 125 x 10-9 M ou menos, se liga a um proteína LAG-3 com uma KD de 5 x 10-10 M ou menos, ou se liga a uma proteína LAG-3 com uma KD de 1 x 10-10 M ou menos.

[0157] Em algumas modalidades, o anticorpo anti- LAG3 ou o fragmento dele compreende ainda uma região constante da cadeia pesada, uma região constante da cadeia leve, uma região Fc ou a combinação delas. Em algumas modalidades, a região constante da cadeia leve pode ser uma região constante da cadeia capa ou lambda. Em algumas modalidades, o anticorpo é de um isótipo de IgG, IgM, IgA, IgE ou IgD, por exemplo, a IgG humana, a IgM humana, a IgA humana, a IgE humana ou a IgD humana. Em algumas modalidades, o isótipo pode ser a IgG, por exemplo, a IgG humana, como a IgG1, a IgG2, a IgG3 ou a IgG4. Em algumas modalidades, o fragmento (fragmento de ligação ao antígeno do anticorpo anti-PD-L1) pode ser qualquer fragmento que compreenda as CDRs da cadeia pesada e/ou as CDRs da cadeia leve do anticorpo e, por exemplo, ele pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em Fab, Fab’, F(ab’)2, Fd (compreendendo uma região variável da cadeia pesada e um domínio CH1), Fv (uma região variável da cadeia pesada e/ou uma região variável da cadeia leve), Fv de cadeia única (scFv; compreendendo ou consistindo essencialmente em uma região variável da cadeia pesada e uma região variável da cadeia leve, em qualquer ordem, e um ligador peptídico entre a região variável da cadeia pesada e a região variável da cadeia leve), anticorpos de cadeia única, Fvs ligados ao dissulfeto (sdFv) e semelhantes.

[0158] Sem limitação, o anticorpo anti-LAG3 ou o fragmento dele é um anticorpo quimérico, um anticorpo humanizado ou um anticorpo totalmente humano. Em um aspecto, o anticorpo ou o fragmento dele não ocorre naturalmente, nem é sintetizado química ou recombinantemente.

[0159] Dado que cada um desses anticorpos pode se ligar ao LAG-3, como o LAG-3 humano, as sequências da

CDR ou as sequências da VH e da VL podem ser “misturadas e combinadas” para criar outras moléculas de ligação anti- LAG-3 da divulgação. De preferência, quando as sequências da CDR ou as cadeias da VH e da VL forem misturadas e combinadas, por exemplo, uma sequência da VH a partir de um emparelhamento de VH/VL particular é substituída por uma sequência da VH estruturalmente semelhante. Da mesma forma, de preferência, uma sequência da VL a partir de um emparelhamento de VH/VL particular é substituída por uma sequência da VL estruturalmente semelhante. Anticorpo biespecífico anti-PD-L1/anti-LAG3

[0160] No anticorpo biespecífico compreendendo a parte que alveja PD-L1 e a parte que alveja LAG3, uma da parte que alveja PD-L1 e da parte que alveja LAG3 pode ser um anticorpo de tamanho natural e a outra pode ser um fragmento de ligação ao antígeno (por exemplo, scFv) compreendendo as CDRs da cadeia pesada, as CDRs da cadeia leve ou uma combinação delas. O anticorpo de tamanho natural que alveja uma das proteínas PD-L1 e LAG3 e o fragmento de ligação ao antígeno que alveja a outra proteína pode ser quimicamente ligado (por exemplo, covalentemente ligado) diretamente ou por meio de um ligador peptídico. O fragmento de ligação ao antígeno (por exemplo, scFv) pode ser ligado diretamente, ou por meio de um ligador peptídico, à extremidade de N do anticorpo de tamanho natural (por exemplo, a extremidade de N de uma cadeia leve ou uma cadeia pesada do anticorpo de tamanho natural), à extremidade de C do anticorpo de tamanho natural (por exemplo, a extremidade de C de uma cadeia pesada (ou domínio Fc ou CH3) do anticorpo de tamanho natural), ou a ambas (ver FIG. 32).

[0161] Em uma modalidade, o anticorpo biespecífico pode compreender um anticorpo anti-PD-L1 de tamanho natural, um fragmento de ligação ao antígeno (por exemplo, o scFv) de um anticorpo anti-LAG3 e um ligador peptídico entre eles. Em outra modalidade, o anticorpo biespecífico pode compreender um anticorpo anti-LAG3 de tamanho natural, um fragmento de ligação ao antígeno (por exemplo, o scFv) de um anticorpo anti-PD-L1 e um ligador peptídico entre eles.

[0162] Em uma modalidade, o scFv contido no anticorpo biespecífico pode compreender uma região variável da cadeia pesada e uma região variável da cadeia leve em qualquer ordem. Por exemplo, o scFv contido no anticorpo biespecífico pode compreender uma região variável da cadeia pesada e uma variável da cadeia leve, em uma direção a partir da extremidade de N até a extremidade de C e, opcionalmente, um ligador peptídico entre elas ou, alternativamente, o scFv contido no anticorpo biespecífico pode compreender uma região variável da cadeia leve e uma variável da cadeia pesada, em uma direção a partir da extremidade de N até a extremidade de C e, opcionalmente, um ligador peptídico entre elas.

[0163] O uso de um ligador peptídico para o anticorpo biespecífico pode levar a uma alta pureza do anticorpo.

[0164] Como utilizado neste documento, o termo “ligador peptídico” pode ser os que incluem quaisquer aminoácidos de 1 a 100, particularmente 2 a 50, e quaisquer tipos de aminoácidos podem ser incluídos, sem quaisquer restrições.

O ligador peptídico pode incluir, por exemplo, os resíduos Gly, Asn e/ou Ser, e incluir também os aminoácidos neutros, como Thr e/ou Ala.

As sequências de aminoácidos adequadas para o ligador peptídico podem ser as conhecidas na técnica relevante.

Por outro lado, um comprimento do ligador peptídico pode ser determinado variadamente dentro de um tal limite que as funções da proteína de fusão não sejam afetadas.

Por exemplo, o ligador peptídico pode ser formado incluindo um total de cerca de 1 a cerca de 100, cerca de 2 a cerca de 50 ou cerca de 5 a cerca de 25 de um ou mais selecionados a partir do grupo que consiste em Gly, Asn, Ser, Thr e Ala.

Em uma modalidade, o ligador peptídico pode ser representado como (GmSl)n (m, l e n são, independentemente, um número inteiro de cerca de 1 a cerca de 10, particularmente um número inteiro de cerca de 2 a cerca de 5). Por exemplo, os exemplos dos ligadores peptídicos são resumidos da seguinte forma: Exemplos Ligador Função do Proteína de Ref.

Ligador Fusão Tipo Sequênciaa scFv flexível (GGGGS)3 [46] G-CSF-Tf flexível (GGGGS)3 [20] Aumentar a HBsAgpreS Estabilidade/Dup flexível (GGGGS)3 [85] 1 licação Myc-Est2p flexível (Gly)8 [30] albumina- flexível (Gly)6 [31]

ANF proteína de cobertura duro (EAAAK)3 [50] do vírus beta- glucanase- duro (EAAAK)n (n=1-3) [52] xilanase hGH-Tf e A(EAAAK)4ALEA(EAA duro [18] Aumentar a Tf-hGH AK)4A expressão G-CSF-Tf e A(EAAAK)4ALEA(EAA duro [18] Tf-G-CSF AK)4A G-CSF-Tf flexível (GGGGS)3 [20] A(EAAAK)4ALEA(EAA G-CSF-Tf duro [20] AK)4A A(EAAAK)4ALEA(EAA hGH-Tf duro [40] AK)4A HSA-IFN- flexível GGGGS [17] α2b Melhorar a HSA-IFN- duro PAPAP [17] atividade α2b biológica HSA-IFN- duro AEAAAKEAAAKA [17] α2b PGA-rTHS flexível (GGGGS)n (n=1, 2, 4) [55] interferon- - duro (Ala-Pro)n (10 - 34 aa) [54] gp120 GSF-S-S-Tf clivável dissulfeto [39] IFN-α2b- clivável dissulfeto [42]

HSA Capacitar o FIX- clivável VSQTSKLTR [59]

alvejamento albumina AETVFPDVb LAP-IFN- clivável PLG LWAc [64] RVL AEA; EDVVCC MazE-MazF clivável [68] SMSY; GGIEGR GSc TRHRQPR GWE; Imunotoxina clivável AGNRVRR SVG; [72] s RRRRRRR R Rd Imunotoxina clivável GFLGe [77] dipeptíd

LE eo Alterar a PK G-CSF-Tf e A(EAAAK)4ALEA(EAA duro [79] HGH-Tf AK)4A clivável Dissulfeto

[0165] Em outra modalidade, tanto a parte que alveja PD-L1 quanto a parte que alveja LAG3 podem ser um anticorpo de tamanho natural ou um fragmento de ligação ao antígeno compreendendo as CDRs da cadeia pesada, as CDRs da cadeia leve ou uma combinação delas.

[0166] Em outra modalidade, o anticorpo biespecífico pode estar em uma forma heterodimérica, que compreende um primeiro braço que inclui um par de uma primeira cadeia pesada e uma primeira cadeia leve que alveja um de PD-L1 e LAG3, e um segundo braço que inclui um par de uma segunda cadeia pesada e uma segunda cadeia leve que alveja o outro.

[0167] Em uma modalidade, o anticorpo de tamanho natural pode estar em uma forma de imunoglobulina de tamanho natural (por exemplo, IgG, IgM, IgA, IgE ou IgD, como a IgG humana, a IgM humana, a IgA humana, a IgE humana ou a IgD humana), e o fragmento de ligação ao antígeno pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em Fab, Fab’, F(ab’)2, Fd, Fv, scFv, anticorpos de cadeia única, sdFv e semelhantes, como descrito acima. Por exemplo, o anticorpo de tamanho natural pode estar em uma forma de IgG humana de tamanho natural (IgG1 humana, IgG2 humana, IgG3 humana ou IgG4 humana) e o fragmento de ligação ao antígeno pode ser o scFv.

[0168] Por exemplo, um anticorpo descrito neste documento pode compreender uma sequência do ligador flexível ou pode ser modificado para adicionar uma porção funcional (por exemplo, PEG, um medicamento, uma toxina ou uma marca).

[0169] Em algumas modalidades, é proporcionado um anticorpo bi- ou multiespecífico, o qual inclui o anticorpo anti-PD-L1 ou um fragmento de ligação ao antígeno dele e um anticorpo anti-LAG3 ou um fragmento de ligação ao antígeno dele, em que o anticorpo anti-PD-L1 ou o fragmento de ligação ao antígeno dele é capaz de especificamente se ligar a um domínio C da imunoglobulina (Ig C) de uma proteína de Ligante da morte programada 1 (PD-L1) humana, em que o domínio Ig C consiste nos resíduos de aminoácidos 133-225; e o anticorpo anti-LAG3 ou o fragmento de ligação ao antígeno dele é capaz de se ligar a uma molécula de MHC de classe II e/ou à FGL1.

[0170] Em algumas modalidades, o anticorpo anti- PD-L1 ou o fragmento de ligação ao antígeno dele inclui uma CDR1 da VH compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1 e 61-67; uma CDR2 da VH compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em

SEQ ID NO: 2, 68-77 e 525-527; uma CDR3 da VH compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 3, 78-90 e 513-519; uma CDR1 da VL compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 4, 91-92 e 520- 521; uma CDR2 da VL compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 5 e 93-105; e uma CDR3 da VL compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 6, 106-111 e 522-524, e o anticorpo anti-LAG3 ou o fragmento de ligação ao antígeno dele inclui uma CDR1 da VH compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 116-117, 354 e 453-460; uma CDR2 da VH compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 118-119, 355 e 461-467; uma CDR3 da VH compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 120-160, 356 e 468-475; uma CDR1 da VL compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 163-195, 229, 357 e 490; uma CDR2 da VL compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 196-217, 358 e 476-483; e uma CDR3 da VL compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 218-228, 230-253, 359 e 484-489.

[0171] Em algumas modalidades, o anticorpo anti- PD-L1 ou o fragmento de ligação ao antígeno dele inclui uma CDR1 da VH tendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1; uma CDR2 da VH tendo uma sequência de aminoácidos de SEQ

ID NO: 525; uma CDR3 da VH tendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3; uma CDR1 da VL tendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4; uma CDR2 da VL tendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5; e uma CDR3 da VL tendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, e o anticorpo anti-LAG3 ou o fragmento de ligação ao antígeno dele inclui uma CDR1 da VH compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:354, uma CDR2 da VH compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:461, uma CDR3 da VH compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:468, uma CDR1 da VL compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:490, uma CDR2 da VL compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:358 e uma CDR3 da VL compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:488.

[0172] Em algumas modalidades, o anticorpo anti- PD-L1 ou o fragmento de ligação ao antígeno dele inclui uma CDR1 da VH tendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1; uma CDR2 da VH tendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 526; uma CDR3 da VH tendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 515; uma CDR1 da VL tendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4; uma CDR2 da VL tendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5; e uma CDR3 da VL tendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, e o anticorpo anti-LAG3 ou o fragmento de ligação ao antígeno dele inclui uma CDR1 da VH compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:354, uma CDR2 da VH compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:461, uma CDR3 da VH compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:468, uma CDR1 da VL compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:490, uma CDR2 da VL compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:358 e uma CDR3 da VL compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:488. Os anticorpos ou as variantes descritas neste documentos podem compreender derivados que sejam modificados, por exemplo, pela ligação covalente de qualquer tipo de molécula ao anticorpo, de modo que a ligação covalente não impeça que o anticorpo se ligue ao antígeno (por exemplo, um epítopo). Por exemplo, porém não como limitação, os anticorpos podem ser modificados, por exemplo, por pelo menos uma selecionada a partir do grupo que consiste em glicosilação, acetilação, peguilação, fosforilação, fosforilação, amidação, derivatização por grupos de proteção/bloqueio conhecidos, clivagem proteolítica, ligação a um ligante celular ou outra proteína e semelhantes. Quaisquer das inúmeras modificações químicas podem ser realizadas por técnicas conhecidas, incluindo, porém não limitadas à, clivagem química específica, acetilação, formilação, síntese metabólica de tunicamicina etc. Além disso, os anticorpos podem conter um ou mais aminoácidos não clássicos.

[0173] Os anticorpos ou os fragmentos deles podem ser marcados de forma detectável por marcação (ligação) com um material de marcação convencional, selecionado a partir de compostos quimioluminescentes, compostos fluorescentes (por exemplo, metais emissores de fluorescência), radioisótopos, corantes etc. A presença dos anticorpos ou de seus fragmentos marcados pode ser detectado medindo um sinal que surge durante uma reação química entre o anticorpo (ou o fragmento dele) e o material de marcação. Os exemplos de material de marcação particularmente útil podem ser pelo menos um selecionado a partir do grupo que consiste em luminol, isoluminol, éster de acridínio teromático, imidazol, sal de acridínio, éster de oxalato, metais emissores de fluorescência e semelhantes. Por exemplo, os metais emissores de 152 fluorescência podem ser o Eu ou outros da série dos lantanídeos. Estes metais podem ser ligados ao anticorpo utilizando tais grupos quelantes de metais, como o ácido dietilenotriaminopentacético (DTPA) ou o ácido etilenodiaminotetracético (EDTA).

[0174] Em algumas modalidades, os anticorpos biespecíficos preparados não provocarão uma resposta imune deletéria no animal a ser tratado, por exemplo, em um ser humano. Em uma modalidade, o anticorpo biespecífico pode ser modificado para reduzir a sua imunogenicidade utilizando quaisquer técnicas convencionais. Por exemplo, o anticorpo biespecífico pode ser um anticorpo humanizado, primatizado, desimunizado ou quimérico. Estes tipos de anticorpos são derivados de um anticorpo não humano, tipicamente um anticorpo de rato ou primata, que conserva ou substancialmente conserva as propriedades de ligação ao antígeno do anticorpo de origem, porém que é menos imunogênico nos seres humanos. Isto pode ser obtido por vários métodos, incluindo (a) o enxerto de todos os domínios variáveis não humanos nas regiões constantes humanas, para gerar anticorpos quiméricos; (b) o enxerto de pelo menos uma parte de uma ou mais das regiões determinantes de complementaridade (CDRs) não humana em uma estrutura humana e nas regiões constantes, com ou sem a conservação dos resíduos críticos da estrutura; ou (c) o transplante de todos os domínios variáveis não humanos, porém “escondendo-os” com uma seção semelhante à humana por substituição dos resíduos da superfície.

[0175] A desimunização também pode ser utilizada para diminuir a imunogenicidade de um anticorpo. Como utilizado neste documento, o termo “desimunização” pode incluir a alteração de um anticorpo para modificar os epítopos das células T (ver, por exemplo, as Publicações de Pedidos Internacionais Nos.: WO/9852976 A1 e WO/0034317 A2). Por exemplo, as sequências variáveis da cadeia pesada e variáveis da cadeia leve do anticorpo de partida são analisadas e é criado um “mapa” de epítopos das células T humanas a partir de cada região V (variável), mostrando a localização dos epítopos em relação às regiões determinantes de complementaridade (CDRs) e a outros resíduos-chave dentro da sequência. Os epítopos das células T individuais a partir do mapa de epítopos das células T são analisados, a fim de identificar as substituições de aminoácidos alternativas com um baixo risco de alterar a atividade do anticorpo final. Uma gama de sequências alternativas das cadeias pesadas e das cadeias leves é projetada, compreendendo as combinações de substituições de aminoácidos, e estas sequências são subsequentemente incorporadas em uma gama de polipeptídeos de ligação. Tipicamente, entre 12 e 24 anticorpos variantes são gerados e testados quanto à ligação e/ou função. Os genes das cadeias pesadas e leves completos, compreendendo as regiões variáveis e constantes humanas modificadas, são então clonados em vetores de expressão e os plasmídeos subsequentes introduzidos em linhagens celulares para a produção do anticorpo completo. Os anticorpos são então comparados em ensaios bioquímicos e biológicos apropriados e a variante ideal é identificada.

[0176] A especificidade e/ou a afinidade de ligação do anticorpo biespecífico para cada proteína-alvo podem ser determinadas por qualquer ensaio convencional, por exemplo, os ensaios in vitro, como a imunoprecipitação, o radioimunoensaio (RIA) ou o ensaio imunológico por ligação com enzima (ELISA), porém não está limitado a eles.

[0177] Alternativamente, as técnicas descritas para a produção de unidades de cadeia única (Pat. U.S.

4.694.778 etc.) podem ser adaptadas para produzir as unidades de cadeia única da presente divulgação. As unidades de cadeia única são formadas ligando os fragmentos das cadeias pesadas e leves da região Fv por meio de uma ponte de aminoácidos (ligador peptídico), resultando em um peptídeo de fusão de cadeia única (scFv). Também podem ser utilizadas as técnicas para a montagem de fragmentos Fv funcionais em E. coli.

[0178] Os exemplos de técnicas que podem ser utilizadas para produzir os Fvs de cadeia única (scFvs) e os anticorpos incluem aquelas descritas nas Pats. U.S. Nos.

4.946.778, 5.258.498 etc.). Para alguns usos, incluindo o uso in vivo de anticorpos em seres humanos e os ensaios de detecção in vitro, pode ser preferível usar os anticorpos quiméricos, humanizados ou humanos. Um anticorpo quimérico é uma molécula na qual diferentes partes do anticorpo são derivadas de diferentes espécies animais, como os anticorpos que têm uma região variável derivada de um anticorpo monoclonal de rato e uma região constante da imunoglobulina humana. Os métodos para a produção de anticorpos quiméricos são conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, as Pats. U.S. Nos. 5.807.715, 4.816.567 e

4.816.397, que são incorporadas neste documento por referência na sua totalidade.

[0179] Os anticorpos humanizados são moléculas de anticorpos derivadas de um anticorpo de uma espécie não humana que ligam o antígeno desejado, tendo uma ou mais regiões determinantes de complementaridade (CDRs) da espécie não humana e regiões da estrutura de uma molécula de imunoglobulina humana. Frequentemente, os resíduos da estrutura nas regiões da estrutura humana serão substituídos pelo resíduo correspondente do anticorpo doador de CDR para alterar, de preferência melhorar, a ligação ao antígeno. Essas substituições na estrutura são identificadas por métodos bem conhecidos na técnica, por exemplo, por modelagem das interações dos resíduos da CDR e da estrutura para identificar os resíduos da estrutura importantes para a ligação ao antígeno e comparação das sequências para identificar os resíduos da estrutura incomuns em posições particulares (ver, por exemplo, Queen et al., Pat. U.S. 5.585.089, que é incorporada neste documento por referência na sua totalidade). Os anticorpos podem ser humanizados utilizando uma variedade de práticas conhecidas na técnica, incluindo, por exemplo, o enxerto de CDR (Pats. U.S. Nos. 5.225.539, 5.530.101, 5.585.089 etc., cada uma delas sendo incorporada por referência na sua totalidade), a remodelagem da superfície (“veneering” ou “resurfacing”) (EP 592.106; EP 519.596, cada uma delas sendo incorporada por referência na sua totalidade) e o embaralhamento das cadeias (“chain shuffling”) (Pat. U.S. No. 5.565.332, que é incorporada por referência na sua totalidade).

[0180] Os anticorpos totalmente humanos são particularmente desejáveis para o tratamento terapêutico de pacientes humanos. Os anticorpos humanos podem ser produzidos por uma variedade de métodos conhecidos na técnica, incluindo os métodos de exibição em fagos que utilizam as bibliotecas de anticorpos derivadas das sequências das imunoglobulinas humanas. Ver, também, as Pats. U.S. Nos. 4.444.887, 4.716.111 etc., cada uma delas sendo incorporada neste documento por referência em sua totalidade.

[0181] Os anticorpos humanos também podem ser produzidos utilizando camundongos transgênicos que sejam incapazes de expressar imunoglobulinas endógenas funcionais, porém que possam expressar os genes da imunoglobulina humanos. Por exemplo, os complexos de genes da imunoglobulina das cadeias pesada e leve humanos podem ser introduzidos, aleatoriamente ou por recombinação homóloga, nas células-tronco embrionárias de camundongos. Alternativamente, a região variável, a região constante e a região de diversidade humana podem ser introduzidas nas células-tronco embrionárias de camundongos, além dos genes das cadeias pesada e leve humanos. Os genes da imunoglobulina das cadeias pesada e leve de camundongos podem ser tornados não funcionais, separada ou simultaneamente com a introdução dos loci da imunoglobulina humana, por recombinação homóloga. Em particular, a remoção homozigótica da região JH impede a produção de anticorpos endógenos. As células-tronco embrionárias modificadas são expandidas e microinjetadas em blastocistos, para produzir camundongos quiméricos. Os camundongos quiméricos são então cruzados, para produzir filhotes homozigóticos que expressam os anticorpos humanos. Os camundongos transgênicos são imunizados, na maneira normal, com um antígeno selecionado, por exemplo, a totalidade ou uma parte de um polipeptídeo-alvo desejado. Os anticorpos monoclonais dirigidos contra o antígeno podem ser obtidos a partir dos camundongos transgênicos imunizados utilizando a tecnologia de hibridoma convencional. Os transgenes de imunoglobulina humana, abrigados pelos camundongos transgênicos, se reorganizam durante a diferenciação das células B e, subsequentemente, sofrem troca de classe e mutação somática. Assim, ao utilizar essa técnica, é possível produzir anticorpos IgG, IgA, IgM e IgE terapeuticamente úteis.

[0182] Anticorpos totalmente humanos que reconhecem um epítopo selecionado também podem ser gerados utilizando uma técnica referida como “seleção guiada”. Nesta abordagem, um anticorpo monoclonal não humano selecionado, por exemplo, um anticorpo de camundongo, é utilizado para guiar a seleção de um anticorpo totalmente humano que reconhela o mesmo epítopo.

[0183] Em outra modalidade, o DNA que codifica os anticorpos monoclonais desejados pode ser prontamente isolado e sequenciado utilizando procedimentos convencionais (por exemplo, utilizando as sondas de oligonucleotídeos que são capazes de se ligarem especificamente aos genes que codificam as cadeias pesada e leve dos anticorpos de ratos). As células de hibridoma isoladas e subclonadas servem como fonte preferida de tal DNA. Uma vez isolado, o DNA pode ser colocado em vetores de expressão, que são então transfectados em células hospedeiras procarióticas ou eucarióticas, como as células de E. coli, as células COS de símios, as células do Ovário de Hamster Chinês (CHO) ou as células de mieloma, que normalmente não produzem imunoglobulinas. Mais particularmente, o DNA isolado (que pode ser sintético, como descrito neste documento) pode ser utilizado para clonar as sequências das regiões constante e variável, para a fabricação dos anticorpos, conforme descrito em Newman et al., Pat. U.S. No. 5.658.570, que é incorporada neste documento por referência. Essencialmente, isso implica a extração do RNA das células selecionadas, a conversão em cDNA e a amplificação por PCR utilizando iniciadores específicos para a Ig. Os iniciadores adequados para este propósito também são descritos na Pat. U.S. No. 5.658.570. Como será discutido em mais detalhes abaixo, as células transformadas que expressam o anticorpo desejado podem ser desenvolvidas em quantidades relativamente grandes, para proporcionar suprimentos clínicos e comerciais da imunoglobulina.

[0184] Além disso, ao utilizar as técnicas de DNA recombinante de rotina, uma ou mais das CDRs do anticorpo biespecífico podem ser inseridas nas regiões de estrutura, por exemplo, nas regiões de estrutura humanas, para humanizar um anticorpo não humano. As regiões de estrutura podem ser regiões de estrutura que ocorrem naturalmente ou de consenso e, de preferência, regiões de estrutura humanas (ver, por exemplo, Chothia et al., J. Mol. Biol. 278: 457-479 (1998) quanto a uma listagem de regiões de estrutura humanas). Por exemplo, o polinucleotídeo gerado pela combinação das regiões de estrutura e as CDRs codifica um anticorpo que especificamente se liga a pelo menos um epítopo de um polipeptídeo desejado, por exemplo, o LIGHT. De preferência, uma ou mais substituições de aminoácidos podem ser feitas dentro das regiões de estrutura e, de preferência, as substituições de aminoácidos melhoram a ligação do anticorpo ao seu antígeno (ou epítopo). Além disso, tais métodos podem ser utilizados para efetuar substituições ou remoções de aminoácidos de um ou mais resíduos de cisteína da região variável que participam de uma ligação dissulfeto dentro das cadeias, para gerar moléculas de anticorpo que não tenham uma ou mais ligações dissulfeto dentro das cadeias. As outras alterações no polinucleotídeo são abrangidas pela presente divulgação e estão dentro da habilidade na técnica.

[0185] Além disso, podem ser utilizadas as técnicas desenvolvidas para a produção de “anticorpos quiméricos”, por emenda de genes de uma molécula de anticorpo de camundongo, de especificidade apropriada para um antígeno, juntamente com genes de uma molécula de anticorpo humana de atividade biológica apropriada. Conforme utilizado neste documento, um anticorpo quimérico é uma molécula na qual as partes diferentes são derivadas de espécies animais diferentes, como aquelas tendo uma região variável derivada de um anticorpo monoclonal de rato e uma região constante da imunoglobulina humana.

[0186] Alternativamente, as linhagens de células produtoras de anticorpos podem ser selecionadas e cultivadas utilizando práticas bem conhecidas do especialista na técnica. Essas práticas são descritas em uma variedade de manuais de laboratório e publicações primárias.

[0187] Além disso, podem ser utilizadas práticas padrão conhecidas pelos versados na técnica, para introduzir mutações na sequência de nucleotídeos que codifica um anticorpo da presente divulgação, incluindo, porém não limitadas à, mutagênese sítio-dirigida e mutagênese mediada por PCR, que resultam em substituições de aminoácidos. De preferência, as variantes (incluindo os derivados) codificam menos de 50 substituições de aminoácidos, menos de 40 substituições de aminoácidos, menos de 30 substituições de aminoácidos, menos de 25 substituições de aminoácidos, menos de 20 substituições de aminoácidos, menos de 15 substituições de aminoácidos, menos de 10 substituições de aminoácidos, menos de 5 substituições de aminoácidos, menos de 4 substituições de aminoácidos, menos de 3 substituições de aminoácidos ou menos de 2 substituições de aminoácidos, em relação à região variável da cadeia pesada, CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, região variável da cadeia leve, CDR-L1, CDR-L2 ou CDR-L3 de referência. Alternativamente, as mutações podem ser introduzidas aleatoriamente ao longo de toda ou parte da sequência de codificação, como por mutagênese de saturação, e os mutantes resultantes podem ser examinados quanto à atividade biológica para identificar os mutantes que conservam a atividade. Uso Terapêutico dos anticorpos

[0188] O anticorpo biespecífico proporcionado neste documento é capaz de bloquear simultaneamente as atividades do PD-L1 e do LAG3, exibindo, assim, efeitos melhorados nas imunoterapias e/ou terapias contra o câncer, por exemplo, por ativação da resposta imune (ver a FIG. 33). Dada a capacidade dos anticorpos biespecíficos da divulgação de inibir a ligação do LAG-3 às moléculas de MHC de Classe II e de estimular as respostas das células T específicas para um antígeno, a divulgação também proporciona uma composição ou métodos in vitro e in vivo de uso dos anticorpos da divulgação para estimular, aumentar ou regular positivamente as respostas das células T específicas para um antígeno.

[0189] Uma modalidade proporciona uma composição farmacêutica compreendendo o anticorpo biespecífico ou o anticorpo anti-PD-L1 ou anti-LAG3, conforme descrito acima. A composição farmacêutica pode compreender ainda um veículo farmaceuticamente aceitável. A composição farmacêutica pode ser utilizada para estimular uma resposta imune (por exemplo, uma resposta das células T específica para um antígeno) e/ou tratar e/ou prevenir uma doença associada ao PD-L1, ao LAG3 ou a ambos.

[0190] Outra modalidade proporciona um método de estimulação de uma resposta imune (por exemplo, uma resposta das células T específica para um antígeno) e/ou tratamento e/ou prevenção de uma doença associada ao PD-L1, ao LAG3 ou a ambos, em um paciente que necessita dele, compreendendo a administração ao paciente de uma quantidade farmaceuticamente eficaz do anticorpo biespecífico, do anticorpo anti-PD-L1 ou anti-LAG3 ou da composição farmacêutica. O método pode ser uma etapa adicional de identificação do paciente que necessita de tratamento e/ou prevenção de uma doença associada ao PD-L1, ao LAG3 ou a ambos, antes da etapa de administração.

[0191] A doença associada ao PD-L1, ao LAG3 ou a ambos pode ser selecionada a partir de cânceres (ou tumores), doenças infecciosas, reações autoimunes, distúrbios do sistema nervoso e semelhantes.

[0192] Em uma modalidade, o paciente pode ser selecionado a partir de mamíferos, incluindo os seres humanos, por exemplo, um mamífero (por exemplo, um ser humano) que sofra de um câncer e/ou infecção das células de mamífero. Em outra modalidade, o paciente pode ser uma célula separada (isolada) de um mamífero, por exemplo, um mamífero que sofre da doença selecionada a partir de cânceres, doenças infecciosas, reações autoimunes, distúrbios do sistema nervoso e semelhantes (por exemplo, uma célula cancerosa ou uma célula separada (isolada) de uma região infecciosa no mamífero, ou uma célula T, como um linfócito T infiltrante no tumor, uma célula T CD4+, uma célula T CD8+ ou a combinação delas).

[0193] Outra modalidade proporciona um uso do anticorpo biespecífico, do anticorpo anti-PD-L1 ou anti- LAG3 ou da composição farmacêutica no tratamento e/ou na prevenção de um câncer ou uma infecção. Outra modalidade proporciona o uso do anticorpo biespecífico, ou do anticorpo anti-PD-L1 ou anti-LAG3, na preparação de uma composição farmacêutica para tratar e/ou prevenir um câncer ou uma infecção.

[0194] Nas composições farmacêuticas, nos métodos e/ou nos usos proporcionados neste documento, a doença associada ao PD-L1, ao LAG3 ou a ambos pode ser uma associada à ativação (por exemplo, ativação anormal ou superativação) e/ou à superprodução (superexpressão) do PD- L1, do LAG3 ou de ambos. Por exemplo, a doença pode ser um câncer ou uma infecção.

[0195] O câncer pode ser um câncer sólido ou câncer do sangue, de preferência um câncer sólido. O câncer pode ser qualquer tumor que expresse a proteína PD-L1 e pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em câncer da bexiga, câncer do fígado, câncer do cólon, câncer retal, câncer endometrial, leucemia, linfoma, câncer pancreático, câncer do pulmão (por exemplo, câncer do pulmão de células pequenas, câncer do pulmão de células não pequenas etc.), câncer de mama, câncer uretral, câncer de cabeça e pescoço, câncer gastrointestinal, câncer do estômago, câncer esofágico, câncer ovariano, câncer renal, melanoma, câncer da próstata, câncer da tireoide e semelhantes, porém não pode ser limitado a eles. Em algumas modalidades, o câncer é selecionado a partir do grupo que consiste em câncer da bexiga, câncer do fígado, câncer pancreático, câncer do pulmão de células não pequenas, câncer de mama, câncer uretral, câncer colorretal, câncer de cabeça e pescoço, câncer de células escamosas, carcinoma de células de Merkel, câncer gastrointestinal, câncer do estômago, câncer esofágico, câncer ovariano, câncer renal, câncer do pulmão de células pequenas e semelhantes. O câncer pode ser um câncer primário ou metastático.

[0196] Um regime específico de dosagem e tratamento para qualquer paciente particular dependerá de uma variedade de fatores, incluindo os anticorpos específicos, a sua variante ou derivado utilizado, a idade, o peso corporal, a saúde geral, o sexo e a dieta do paciente, e o tempo de administração, a taxa de excreção, a combinação de medicamentos e a gravidade da doença particular que está sendo tratada. O julgamento de tais fatores pelos cuidadores médicos está dentro da habilidade comum na técnica. A quantidade dependerá também do paciente individual a ser tratado, da rota de administração, do tipo de formulação, das características do composto utilizado, da gravidade da doença e do efeito desejado. A quantidade utilizada pode ser determinada por princípios farmacológicos e farmacocinéticos bem conhecidos na técnica.

[0197] A administração do anticorpo biespecífico ou do anticorpo anti-PD-L1 ou anti-LAG3 pode ser conduzida através de pelo menos uma selecionada a partir do grupo que consiste em rotas intraperitoneal, intravenosa, subcutânea, intradérmica, intramuscular, intranasal, epidural e oral, porém não se limitar a elas. O anticorpo biespecífico ou o anticorpo anti-PD-L1 ou anti-LAG3 ou as composições podem ser administradas por qualquer rota conveniente, por exemplo, através de infusão ou injeção de bolo, por absorção através dos revestimentos epiteliais ou mucocutâneos (por exemplo, mucosa oral, mucosa retal e intestinal etc.) e podem ser administradas juntamente com outros agentes biologicamente ativos. Assim, as composições farmacêuticas contendo os polipeptídeos de ligação ao antígeno da divulgação podem ser administradas de forma oral, parenteral, intracistemal, intravaginal, intraperitoneal, retal, tópica (como por pós, unguentos, gotas ou emplastro transdérmico), bucal ou como um spray oral ou nasal.

[0198] O termo “parenteral”, como utilizado neste documento, refere-se aos modos de administração que incluam injeção e infusão intravenosas, intramusculares, intraperitoneais, intraesternais, subcutâneas e intra- articulares.

[0199] A administração pode ser sistêmica ou local. Além disso, pode ser desejável introduzir os anticorpos da divulgação no sistema nervoso central por qualquer rota adequada, incluindo a injeção intraventricular e intratecal; a injeção intraventricular pode ser facilitada por um cateter intraventricular, por exemplo, unido a um reservatório, como um reservatório de Ommaya. A administração pulmonar também pode ser empregada, por exemplo, pelo uso de um inalador ou nebulizador e formulação com um agente aerossolizador.

[0200] Pode ser desejável administrar os anticorpos biespecíficos, ou os anticorpos anti-PD-L1 ou anti-LAG3, ou as composições da divulgação localmente, à área que necessita de tratamento; isso pode ser obtido por meio de, por exemplo, e não a título de limitação, infusão local durante a cirurgia, aplicação tópica, por exemplo, em combinação com um curativo após a cirurgia, por injeção, por meio de um cateter, por meio de um supositório, ou por meio de um implante, sendo o referido implante de um material poroso, não poroso ou gelatinoso, incluindo as membranas, como as membranas de silástico ou as fibras. De preferência, ao administrar uma proteína, incluindo um anticorpo, da divulgação, deve-se ter cuidado ao usar materiais nos quais a proteína não seja absorvida.

[0201] Em outra modalidade, os anticorpos biespecíficos ou os anticorpos anti-PD-L1 ou anti-LAG3 ou a composição pode ser administrada em uma vesícula, em particular um lipossoma. Ainda em outra modalidade, os anticorpos biespecíficos ou os anticorpos anti-PD-L1 ou anti-LAG3 ou a composição pode ser administrada em um sistema de liberação controlada. Em uma modalidade, para o sistema de liberação controlada, quaisquer bombas farmaceuticamente aceitáveis e/ou materiais poliméricos podem ser utilizados.

[0202] A quantidade farmaceuticamente eficaz dos anticorpos biespecíficos ou dos anticorpos anti-PD-L1 ou anti-LAG3, para tratar, inibir, melhorar e/ou prevenir uma doença, distúrbio ou condição inflamatória, imunológica ou maligna, pode ser determinada por técnicas clínicas padrão. Além disso, os ensaios in vitro podem ser opcionalmente empregados para ajudar a identificar as faixas de dosagens ideais. A dose exata a ser empregada na formulação também dependerá da rota de administração e da gravidade da doença, distúrbio ou condição, e deve ser decidida de acordo com o julgamento do médico e as circunstâncias de cada paciente. As doses eficazes podem ser extrapoladas a partir de curvas de resposta à dose, derivadas de sistemas de teste in vitro ou em modelo de animal.

[0203] Os métodos de tratamento de uma doença (por exemplo, câncer), condição ou distúrbio infeccioso ou maligno, compreendendo a administração do anticorpo biespecífico ou do anticorpo anti-PD-L1 ou anti-LAG3, são tipicamente testados in vitro e, em seguida, in vivo em um modelo de animal aceitável, quanto à atividade terapêutica ou profilática desejada, antes do uso em seres humanos. Os modelos de animais adequados, incluindo os animais transgênicos, são bem conhecidos pelos versados na técnica. Por exemplo, os ensaios in vitro para demonstrar a utilidade terapêutica do anticorpo biespecífico ou do anticorpo anti-PD-L1 ou anti-LAG3 incluem o efeito do anticorpo biespecífico ou do anticorpo anti-PD-L1 ou anti- LAG3 sobre uma linhagem celular ou uma amostra de tecido do paciente. O efeito do anticorpo biespecífico ou do anticorpo anti-PD-L1 ou anti-LAG3 sobre a linhagem celular e/ou a amostra de tecido pode ser determinado utilizando práticas conhecidas pelos versados na técnica, como os ensaios divulgados em outro lugar neste documento. De acordo com a divulgação, os ensaios in vitro que podem ser utilizados para determinar se é indicada a administração do anticorpo biespecífico ou do anticorpo anti-PD-L1 ou anti- LAG3 incluem os ensaios de cultura de células in vitro, nos quais uma amostra de tecido do paciente é desenvolvida na cultura e exposta a, ou de outro maneira administrada a, um composto, e o efeito de tal composto sobre a amostra de tecido é observado.

[0204] Vários sistemas de administração são conhecidos e podem ser utilizados para administrar um anticorpo da divulgação ou um polinucleotídeo que codifica um anticorpo da divulgação, por exemplo, encapsulação em lipossomas, micropartículas, microcápsulas, células recombinantes capazes de expressar o composto, endocitose mediada por receptor, construção de um ácido nucleico como parte de um vetor retroviral ou outro vetor etc.

[0205] As composições farmacêuticas podem compreender uma quantidade eficaz do anticorpo biespecífico ou do anticorpo anti-PD-L1 ou anti-LAG3 e um veículo aceitável. Em algumas modalidades, a composição inclui ainda um segundo agente anticâncer (por exemplo, um inibidor do ponto de verificação imunológico).

[0206] Em uma modalidade específica, o termo “farmaceuticamente aceitável” pode referir-se a aprovado por uma agência reguladora do governo federal ou estadual ou listado na Farmacopeia dos EUA ou outra farmacopeia em geral reconhecida para uso em animais e mais particularmente em seres humanos. Além disso, um “veículo farmaceuticamente aceitável” será, em geral, uma carga não tóxica sólida, semissólida ou líquida, diluente, material encapsulante ou auxiliar de formulação de qualquer tipo.

[0207] O termo “veículo” pode referir-se a um diluente, adjuvante, excipiente ou transportador com o qual o agente terapêutico é administrado. Esses veículos farmacêuticos podem ser líquidos estéreis, como a água e os óleos, incluindo os de origem de petróleo, animal, vegetal ou sintética, como o óleo de amendoim, o óleo de soja, o óleo mineral, o óleo de gergelim e semelhantes. A água é um veículo preferido quando a composição farmacêutica for administrada intravenosamente. As soluções salinas e as soluções aquosas de dextrose e glicerol também podem ser empregadas como veículos líquidos, particularmente para soluções injetáveis. Os excipientes farmacêuticos adequados incluem o amido, a glicose, a lactose, a sacarose, a gelatina, o malte, o arroz, a farinha, o giz, a sílica gel, o estearato de sódio, o monoestearato de glicerol, o talco, o cloreto de sódio, o leite desnatado em pó, o glicerol, o propileno, o glicol, a água, o etanol e semelhantes.

A composição, se desejado, também pode conter pequenas quantidades de agentes molhantes ou emulsificantes, ou agentes de tamponamento de pH, como os acetatos, os citratos ou os fosfatos.

Os agentes antibacterianos, como o álcool benzílico ou os metil parabenos; os antioxidantes, como o ácido ascórbico ou o bissulfito de sódio; os agentes quelantes, como o ácido etilenodiaminotetracético; e os agentes para o ajuste da tonicidade, como o cloreto de sódio ou a dextrose, também são considerados.

Estas composições podem assumir a forma de soluções, suspensões, emulsões, comprimidos, pílulas, cápsulas, pós, formulações de liberação controlada e semelhantes.

A composição pode ser formulada como um supositório, com aglutinantes e veículos tradicionais, como os triglicerídeos.

A formulação oral pode incluir veículos padrão, como os graus farmacêuticos de manitol, lactose, amido, estearato de magnésio, sacarina sódica, celulose, carbonato de magnésio etc.

Os exemplos de veículos farmacêuticos adequados são descritos em Remington’s Pharmaceutical Sciences por E.

W.

Martin, incorporado neste documento por referência.

Tais composições conterão uma quantidade terapeuticamente eficaz do polipeptídeo de ligação ao antígeno, preferivelmente na forma purificada, juntamente com uma quantidade adequada de veículo, de modo a proporcionar a forma para a administração adequada ao paciente.

A formulação deve combinar com o modo de administração. A preparação parental pode ser inserida em ampolas, seringas descartáveis ou frascos pequenos de dose múltipla feitos de vidro ou plástico.

[0208] Em uma modalidade, a composição é formulada de acordo com procedimentos de rotina como uma composição farmacêutica adaptada para a administração intravenosa aos seres humanos. Tipicamente, as composições para a administração intravenosa são soluções em tampão aquoso isotônico estéril. Quando necessário, a composição também pode incluir um agente solubilizante e um anestésico local, como a lidocaína, para aliviar a dor no local da injeção. Em geral, os ingredientes são fornecidos separadamente ou misturados na forma de dosagem unitária, por exemplo, como um pó liofilizado seco ou um concentrado sem água em um recipiente hermeticamente fechado, como uma ampola ou sachê, indicando a quantidade de agente ativo. Quando a composição for para ser administrada por infusão, ela pode ser ministrada com um frasco de infusão contendo água ou solução salina estéril, de grau farmacêutico. Quando a composição for administrada por injeção, pode ser proporcionada uma ampola de água para injeção ou solução salina estéril, de modo que os ingredientes possam ser misturados antes da administração.

[0209] Os compostos da divulgação podem ser formulados como formas neutras ou de sal. Os sais farmaceuticamente aceitáveis incluem aqueles formados com ânions, como os derivados de ácidos clorídrico, fosfórico, acético, oxálico, tartárico etc., e aqueles formados com cátions, como os derivados de sódio, potássio, amônio,

cálcio, hidróxidos férricos, isopropilamina, trietilamina, 2-etilamino etanol, histidina, procaína etc. Uso Diagnóstico do anticorpo

[0210] A superexpressão e/ou superativação do PD-L1 e/ou do LAG3 são observadas em uma amostra biológica (por exemplo, células, tecidos, sangue, soro etc.) de um paciente que sofre de um determinado câncer e/ou infecção (por exemplo, célula ou tecido tumoral, sangue ou soro de um paciente infeccioso), e/ou os pacientes que tenham células que superexpressem o PD-L1 e/ou o LAG3 são provavelmente responsivos aos tratamentos com o anticorpo biespecífico ou o anticorpo anti-PD-L1 ou anti-LAG3. Por conseguinte, o anticorpo biespecífico ou o anticorpo anti- PD-L1 ou anti-LAG3 da presente divulgação também pode ser utilizado para fins de diagnóstico e prognóstico.

[0211] Uma modalidade proporciona uma composição farmacêutica para o diagnóstico de uma doença associada ao PD-L1, ao LAG3 ou a ambos, a composição compreendendo o anticorpo biespecífico ou o anticorpo anti-PD-L1 ou anti- LAG3. Em outra modalidade, é proporcionado um uso do anticorpo biespecífico ou do anticorpo anti-PD-L1 ou anti- LAG3 para o diagnóstico de uma doença associada ao PD-L1, ao LAG3 ou a ambos.

[0212] Outra modalidade proporciona um método de diagnóstico de uma doença associada ao PD-L1, ao LAG3 ou a ambos, o método compreendendo o contato de uma amostra biológica, obtida de um paciente, com o anticorpo biespecífico ou o anticorpo anti-PD-L1 ou anti-LAG3, e a detecção da reação antígeno-anticorpo ou a medição de um nível da reação antígeno-anticorpo na amostra biológica.

Neste método, quando a reação antígeno-anticorpo for detectada na amostra biológica ou o nível da reação antígeno-anticorpo na amostra biológica for maior do que o de uma amostra normal, o paciente de quem for obtida a amostra biológica pode ser determinado como um paciente com uma doença associada ao PD-L1, ao LAG3 ou a ambos. Portanto, em algumas modalidades, o método pode compreender ainda o contato de uma amostra normal com o anticorpo biespecífico ou o anticorpo anti-PD-L1 ou anti-LAG3 e a medição de um nível de uma reação antígeno-anticorpo na amostra normal. Além disso, o método pode compreender ainda a comparação do nível da reação antígeno-anticorpo na amostra biológica e na amostra normal, após a etapa de medição. Além disso, após a etapa de detecção ou a etapa de comparação, o método pode compreender ainda a determinação do paciente como um paciente com uma doença associada ao PD-L1, ao LAG3 ou a ambos, quando for detectada a reação antígeno-anticorpo na amostra biológica ou o nível da reação antígeno-anticorpo na amostra biológica for maior do que o da amostra normal.

[0213] A doença associada ao PD-L1, ao LAG3 ou a ambos pode ser uma associada à ativação (por exemplo, ativação anormal ou superativação) e/ou à superprodução (superexpressão) do PD-L1, do LAG3 ou de ambos. Por exemplo, a doença pode ser um câncer ou uma infecção, conforme descrito acima.

[0214] Na composição e no método de diagnóstico, a amostra biológica pode ser pelo menos uma selecionada a partir do grupo que consiste em uma célula, um tecido, fluido corporal (por exemplo, sangue, soro, linfa etc.) e semelhantes, obtida (separada) de um paciente a ser diagnosticado. A amostra normal pode ser pelo menos uma selecionada a partir do grupo que consiste em uma célula, um tecido, fluido corporal (por exemplo, sangue, soro, linfa, urina etc.) e semelhantes, obtida (separada) de um paciente não tendo uma doença associado ao PD-L1, ao LAG3 ou a ambos. O paciente pode ser selecionado a partir de um mamífero, como um ser humano. Após o pré-tratamento opcional da amostra, a amostra pode ser incubada com o anticorpo biespecífico ou o anticorpo anti-PD-L1 ou anti- LAG3 da presente divulgação, sob condições que permitam que anticorpo interaja com uma proteína PD-L1 e/ou LAG3 potencialmente presente na amostra.

[0215] A presença e/ou o nível (concentração) da proteína PD-L1 e/ou LAG3 na amostra podem ser utilizados para identificar um paciente que seja adequado para um tratamento com o anticorpo biespecífico ou o anticorpo anti-PD-L1 ou anti-LAG3, ou um paciente que seja responsivo ou suscetível ao tratamento com o anticorpo biespecífico ou o anticorpo anti-PD-L1 ou anti-LAG3.

[0216] Uma modalidade proporciona uma composição farmacêutica que identifica um paciente que seja adequado para um tratamento com o anticorpo biespecífico ou o anticorpo anti-PD-L1 ou anti-LAG3, ou um paciente que seja responsivo ou suscetível ao tratamento com o anticorpo biespecífico ou o anticorpo anti-PD-L1 ou anti-LAG3, a composição compreendendo o anticorpo biespecífico ou o anticorpo anti-PD-L1 ou anti-LAG3. Em outra modalidade, é proporcionado um uso do anticorpo biespecífico ou do anticorpo anti-PD-L1 ou anti-LAG3 para identificar um paciente que seja adequado para um tratamento com o anticorpo biespecífico ou o anticorpo anti-PD-L1 ou anti- LAG3, ou um paciente que seja responsivo ou suscetível ao tratamento com o anticorpo biespecífico ou o anticorpo anti-PD-L1 ou anti-LAG3. Outra modalidade proporciona um método de identificar um paciente que seja adequado para um tratamento com o anticorpo biespecífico ou o anticorpo anti-PD-L1 ou anti-LAG3, ou um paciente que seja responsivo ou suscetível ao tratamento com o anticorpo biespecífico ou o anticorpo anti-PD-L1 ou anti-LAG3, o método compreendendo o contato de uma amostra biológica, obtida de um paciente, com o anticorpo biespecífico ou o anticorpo anti-PD-L1 ou anti-LAG3 e a detecção da reação antígeno-anticorpo ou a medição de um nível da reação antígeno-anticorpo na amostra biológica.

[0217] Uma modalidade proporciona uma composição para a detecção do PD-L1, do LAG3 ou de ambos simultaneamente, em uma amostra biológica, a composição compreendendo o anticorpo biespecífico ou o anticorpo anti- PD-L1 ou anti-LAG3. Outra modalidade proporciona um método de detecção do PD-L1, do LAG3 ou de ambos simultaneamente, em uma amostra biológica, o método compreendendo o contato da amostra biológica com o anticorpo biespecífico ou o anticorpo anti-PD-L1 ou anti-LAG3; e a detecção (medição) de uma reação (ligação) antígeno-anticorpo entre o anticorpo biespecífico ou o anticorpo anti-PD-L1 ou anti- LAG3 e o PD-L1, o LAG3 ou ambos.

[0218] Na composição de detecção e no método de detecção, o termo “detecção do PD-L1, do LAG3 ou de ambos” pode referir-se à, porém não se limitar à, detecção da presença (e/ou ausência) e/ou do nível do PD-L1, do LAG3 ou de ambos na amostra biológica.

[0219] No método de detecção, quando uma reação antígeno-anticorpo for detectada, pode ser determinado que o PD-L1, o LAG3 ou ambos estão presentes na amostra biológica e, quando uma reação antígeno-anticorpo não for detectada, pode ser determinado que o PD-L1, o LAG3 ou ambos estão ausentes (não estão presentes) na amostra biológica. Portanto, o método de detecção pode compreender ainda, após a etapa de detecção, a determinação que o PD- L1, o LAG3 ou ambos estão presentes na amostra biológica, quando for detectada uma reação antígeno-anticorpo, e/ou que o PD-L1, o LAG3 ou ambos estão ausentes (não estão presentes) na amostra biológica, quando não for detectada uma reação antígeno-anticorpo.

[0220] No método de detecção, o nível do PD-L1, do LAG3 ou de ambos pode ser determinado de acordo com o grau da reação antígeno-anticorpo (por exemplo, a quantidade de complexo de antígeno-anticorpo formado pela reação antígeno-anticorpo, a intensidade de qualquer sinal obtido pela reação antígeno-anticorpo e semelhantes, que podem ser medidos por qualquer meio convencional).

[0221] A amostra biológica pode compreender pelo menos uma selecionada a partir do grupo que consiste em uma célula (por exemplo, uma célula tumoral), um tecido (por exemplo, um tecido tumoral), fluido corporal (por exemplo, sangue, soro etc.) e semelhantes, obtida ou isolada de um mamífero, como um ser humano. As etapas do método de detecção podem ser conduzidas in vitro.

[0222] No método de diagnóstico e/ou no método de detecção, a etapa de detecção da reação antígeno- anticorpo ou medição de um nível da reação antígeno- anticorpo pode ser realizada por qualquer método geral conhecido na técnica relevante, como as reações enzimáticas gerais, as reações fluorescentes, as reações luminescentes e/ou a detecção de radiação. Por exemplo, a etapa pode ser realizada por um método selecionado a partir do, porém não limitado ao, grupo que consiste em imunocromatografia, imunoistoquímica (IHC), ensaio imunológico por ligação com enzima (ELISA), radioimunoensaio (RIA), imunoensaio enzimático (EIA), imunoensaio DE fluorescência (FIA), imunoensaio de luminescência (LIA), western blotting, microarranjo, citometria de fluxo, ressonância plasmônica de superfície (SPR) e semelhantes, porém não limitado a eles. Polinucleotídeos que Codificam os Anticorpos e Métodos de Preparação dos Anticorpos

[0223] Uma modalidade proporciona um polinucleotídeo que codifica o anticorpo biespecífico ou o anticorpo anti-PD-L1 ou anti-LAG3. Em particular, uma modalidade proporciona um polinucleotídeo que codifica uma cadeia pesada do anticorpo biespecífico em uma forma de IgG-scFv. Outra modalidade proporciona um polinucleotídeo que codifica uma cadeia leve do anticorpo biespecífico na forma de IgG-scFv. A forma de IgG-scFv pode referir-se a um tipo de um anticorpo biespecífico compreendendo um anticorpo IgG de tamanho natural que alveja (se liga a) uma das proteínas PD-L1 e LAG3 e um fragmento scFv que alveja (se liga a) à outra, em que o scFv está ligado a uma extremidade de C e/ou extremidade de N do anticorpo IgG de tamanho natural diretamente (sem um ligador peptídico) ou através de um ligador peptídico.

[0224] Em uma modalidade, quando o anticorpo biespecífico em uma forma de IgG-scFv compreender um anticorpo IgG de tamanho natural contra PD-L1 e um fragmento scFv contra LAG3, o polinucleotídeo que codifica uma cadeia pesada do anticorpo biespecífico pode codificar uma cadeia pesada do anticorpo IgG de tamanho natural contra PD-L1 e um fragmento scFv contra LAG3 que está ligado a uma extremidade de C e/ou extremidade de N do anticorpo IgG de tamanho natural diretamente ou através de um ligador peptídico; e o polinucleotídeo que codifica uma cadeia leve do anticorpo biespecífico pode codificar uma cadeia leve do anticorpo IgG de tamanho natural contra PD- L1.

[0225] Em outra modalidade, quando o anticorpo biespecífico em uma forma de IgG-scFv compreender um anticorpo IgG de tamanho natural contra LAG3 e um fragmento scFv contra PD-L1, o polinucleotídeo que codifica uma cadeia pesada do anticorpo biespecífico pode codificar uma cadeia pesada do anticorpo IgG de tamanho natural contra LAG3 e um fragmento scFv contra PD-L1 que está ligado a uma extremidade de C e/ou extremidade de N do anticorpo IgG de tamanho natural diretamente ou através de um ligador peptídico; e o polinucleotídeo que codifica uma cadeia leve do anticorpo biespecífico pode codificar uma cadeia leve do anticorpo IgG de tamanho natural contra LAG3.

[0226] Outra modalidade proporciona um vetor recombinante compreendendo o polinucleotídeo que codifica uma cadeia pesada do anticorpo biespecífico, o polinucleotídeo que codifica uma cadeia leve do anticorpo biespecífico, ou ambos. Outra modalidade proporciona uma célula recombinante transfectada com o vetor recombinante.

[0227] Outra modalidade proporciona um método de preparação do anticorpo biespecífico, compreendendo a expressão do polinucleotídeo que codifica uma cadeia pesada do anticorpo biespecífico, do polinucleotídeo que codifica uma cadeia leve do anticorpo biespecífico em uma célula. A etapa de expressão do polinucleotídeo pode ser conduzida por cultura da célula que compreende o polinucleotídeo (por exemplo, em um vetor recombinante), sob uma condição que permita a expressão do polinucleotídeo. O método pode compreender ainda o isolamento e/ou a purificação do anticorpo biespecífico da cultura de células, após a etapa de expressão ou cultura.

EXEMPLOS

[0228] A seguir, a presente invenção será descrita em detalhes por meio de exemplos.

[0229] Os exemplos a seguir são meramente para ilustrar a invenção e não são interpretados para restringir a invenção. Exemplo 1: Preparação dos anticorpos monoclonais anti-PD-L1

1.1. Preparação dos Anticorpos monoclonais de camundongo anti-PD-L1 humano e sua análise

[0230] Os anticorpos monoclonais de camundongo anti-PD-L1 humano foram gerados utilizando a tecnologia de hibridoma. Antígeno: proteína PD-L1-Fc humana e linhagem celular CHOK1 que expressa altamente o PD-L1 humano (linhagem celular PDL1-CHOK1).

[0231] Imunização: Para gerar os anticorpos monoclonais de camundongo para o PD-L1 humano, os camundongos BALB/c fêmeos de 6-8 semanas foram 7 primeiramente imunizados com 1,5x10 células PDL1-CHOK1. Dias 14 e 33 após a primeira imunização, os camundongos imunizados foram imunizados novamente com 1,5x107 células PDL1-CHOK1, respectivamente. Para selecionar os camundongos que produzem os anticorpos que ligam a proteína PD-L1, os soros dos camundongos imunizados foram testados por ELISA. Resumidamente, as placas de microtítulo foram revestidas com a proteína PD-L1 humana, a 1 μg/ml, em PBS, 100 μl/poço, na temperatura ambiente (TA), durante a noite, depois bloqueadas com 100 μl/poço de BSA a 5%. As diluições do plasma dos camundongos imunizados foram adicionadas a cada poço e incubadas por 1-2 horas, na TA. As placas foram lavadas com PBS/Tween e depois incubadas com o anticorpo IgG anti-camundongo conjugado com a Peroxidase de Raiz- Forte (HRP) durante 1 hora, na TA. Após a lavagem, as placas foram desenvolvidas com o substrato de ABTS e analisadas por espectrofotômetro, em DO 405 nm. Os camundongos com títulos suficientes de IgG anti-PDL1 foram reforçados com 50 μg da proteína PDL1-Fc humana no Dia 54 após a imunização. Os camundongos resultantes foram utilizados para as fusões. Os sobrenadantes de hibridoma foram testados quanto às IgGs anti-PD-L1 pelo ELISA.

[0232] As sequências de aminoácidos e polinucleotídeo das regiões variáveis do Hibridoma HL1210-3 são proporcionadas na Tabela 5 abaixo. [Tabela 5] Sequências das variáveis do HL1210-3 Nome Sequência SEQ ID

NO: VH do GAAGTGAAACTGGTGGAGTCTGGGGGAGACTTAGTGAAGC 112 HL1210-3 CTGGAGGGTCCCTGAAACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATT

CACTTTCAGTAGCTATGACATGTCTTGGGTTCGCCAGACT CCGGAGAAGAGTCTGGAGTGGGTCGCAACCATTAGTGATG GTGGTGGTTACATCTACTATTCAGACAGTGTGAAGGGGCG ATTTACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAACAACCTGTAC CTGCAAATGAGCAGTCTGAGGTCTGAGGACACGGCCTTGT ATATTTGTGCAAGAGAATTTGGTAAGCGCTATGCTTTGGA

CTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA VH do EVKLVESGGDLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYDMSWVRQT 113 HL1210-3 PEKSLEWVATISDGGGYIYYSDSVKGRFTISRDNAKNNLY

LQMSSLRSEDTALYICAREFGKRYALDYWGQGTSVT VL do GACATTGTGATGACCCAGTCTCACAAATTCATGTCCACAT 114 HL1210-3 CGGTAGGAGACAGGGTCAGCATCTCCTGCAAGGCCAGTCA

GGATGTGACTCCTGCTGTCGCCTGGTATCAACAGAAGCCA GGACAATCTCCTAAACTACTGATTTACTCCACATCCTCCC GGTACACTGGAGTCCCTGATCGCTTCACTGGCAGTGGATC TGGGACGGATTTCACTTTCACCATCAGCAGTGTGCAGGCT GAAGACCTGGCAGTTTATTACTGTCAGCAACATTATACTA CTCCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAA

A VL do DIVMTQSHKFMSTSVGDRVSISCKASQDVTPAVAWYQQKP 115 HL1210-3 GQSPKLLIYSTSSRYTGVPDRFTGSGSGTDFTFTISSVQA

EDLAVYYCQQHYTTPLTFGAGTKLELK

1.2. Atividades do mAb de camundongo HL1210-3

[0233] Para avaliar a atividade de ligação do clone de hibridoma HL1210-3, os mAb purificados deste clone foram submetido ao teste do ELISA. Resumidamente, as placas de microtítulo foram revestidas com a proteína PD-L1-Fc humana, a 0,1 μg/ml, em PBS, 100 μl/poço, a 4ºC, durante a noite, depois bloqueadas com 100 μl/poço de BSA a 5%. As diluições de três vezes dos anticorpos HL1210-3, partindo de 0,2 µg/ml, foram adicionadas a cada poço e incubadas por 1-2 horas, na TA. As placas foram lavadas com PBS/Tween e depois incubadas com anticorpo IgG anti-camundongo de cabra conjugado com a Peroxidase de Raiz-Forte (HRP), durante 1 hora, na TA. Após a lavagem, as placas foram desenvolvidas com substrato de TMB e analisadas por espectrofotômetro, em DO 450-630 nm. Como mostrado na FIG. 1, o HL1210-3 pode se ligar ao PD-L1 humano com alta atividade (EC50 = 5,539 ng/ml).

[0234] Para avaliar a atividade do mAb de camundongo HL1210-3 de bloquear a ligação do PD-L1 humano ao seu receptor PD-1, um ensaio de bloqueio do receptor foi realizado utilizando o PD-L1 humano recombinante.

[0235] Para avaliar o efeito de bloqueio do mAb de camundongo HL1210-3 sobre o PD-L1 humano recombinante de se ligar ao seu receptor PD-1, foi empregado o ensaio de bloqueio do receptor com base no ELISA. Resumidamente, as placas de microtítulo foram revestidas com a proteína PD- L1-Fc humana, a 1 µg/ml, em PBS, 100 µl/poço, a 4ºC, durante a noite, depois bloqueadas com 100 µl/poço de BSA a 5%. 50 µl da proteína PD-1-Fc humana marcada com biotina e as diluições de 3 vezes dos anticorpos HL1210-3, partindo de 2 µg/ml, a 50 µl, foram adicionados a cada poço e incubados por 1 hora, a 37ºC. As placas foram lavadas com PBS/Tween e, em seguida, incubadas com Estreptavidina-HRP por 1 hora, a 37ºC. Após a lavagem, as placas foram desenvolvidas com o substrato de TMB e analisadas por espectrofotômetro, em DO 450-630 nm. Como mostrado na FIG. 2, o HL1210-3 pode inibir eficientemente a ligação do PD-L1 humano à PD1 humana, em IC50 = 0,7835 nM.

[0236] Além disso, um ensaio de bloqueio do receptor também foi realizado utilizando o PD-L1 humano expresso em células de mamíferos.

[0237] Para avaliar o efeito de bloqueio do mAb de camundongo HL1210-3 sobre o PD-L1 humano expresso em células de mamíferos de se ligar ao seu receptor PD-1, foi utilizado o ensaio de bloqueio do receptor com base em FACS. Resumidamente, as células PDL1-CHOK1 foram incubadas primeiramente com o mAb de camundongo HL1210-3, diluído 3 vezes em série, partindo a 20 μg/ml, na TA, por 1 hora. Após lavagem com tampão de FACS (PBS com FBS a 2%), a huPD- 1 marcada com biotina foi adicionada a cada poço e incubada na TA, por 1 hora. Em seguida, a Estreptavidina-PE foi adicionada a cada poço, durante 0,5 hora, após lavar por duas vezes com tampão de FACS. A intensidade média de florescência (MFI) de PE foi avaliada por FACSAriaIII. Como mostrado na FIG. 3, o anticorpo HL1210-3 pode inibir de forma altamente eficiente a ligação da PD-1 sobre o PD-L1 expresso em células de mamíferos em IC50 de 2,56 nM com taxa de inibição superior de 92,6%.

MFI do composto de teste % de inibição  (1 − MFI do controle de veículo) × 100%

1.3. Efeitos do mAb de camundongo HL1210-3

[0238] Para avaliar o efeito do mAb de camundongo HL1210-3 de promover a resposta imune das células T humanas, a resposta das células T humanas foi avaliada em um ambiente de reação de linfócitos mistos. As DCs humanas foram diferenciadas de monócitos CD14+, na presença de GM-CSF e IL-4, por 7 dias. As células T CD4+ isoladas de outro doador foram então cocultivadas com as DCs e as diluições em série do anticorpo de bloqueio anti- PD-L1. No dia 5 após a inoculação, o sobrenadante da cultura foi testado quanto à produção de IFNγ. Os resultados indicaram que os anticorpos HL1210-3 podem promover a produção de IFNγ de um modo dependente da dose, sugerindo que o anticorpo anti-PD-L1 pode promover a resposta das células T humanas (FIG. 4).

1.4. Afinidade de ligação do mAb de camundongo HL1210-3

[0239] A ligação dos anticorpos HL1210-3 à proteína PD-L1 recombinante (PD-L1-marca de his humano) foi testada com o BIACORE®, utilizando um método de captura. O mAb de camundongo HL1210-3 foi capturado utilizando o anticorpo Fc anti-camundongo revestido sobre um chip CM5. Uma diluição em série da proteína PD-L1-marca de his humana foi injetada sobre o anticorpo capturado, por 3 minutos, em uma vazão de 25 μg/ml. O antígeno foi deixado se dissociar por 900 s. Todas as experiências foram realizadas em um Biacore T200. A análise dos dados foi realizada utilizando o software de avaliação Biacore T200. Os resultados são mostrados na FIG. 5 e na Tabela 6 abaixo. [Tabela 6] Cinética de ligação do HL1210-3 ao PD-L1 humano recombinante Anticorpo ka (1/Ms) kd (1/s) KD (M) HL1210-3 1,61E+05 4,69E-05 2,93E-10

1.5. Humanização do mAb de camundongo HL1210-3

[0240] Os genes da região variável do mAb HL1210-3 foram empregados para criar um MAb humanizado. Na primeira etapa deste processo, as sequências de aminoácidos da VH e da VK do MAb HL1210-3 foram comparadas com a base de dados disponível das sequências dos genes da Ig humana (IgG1), para encontrar as sequências dos genes da Ig da linhagem germinativa humanas gerais que mais correspondiam. Para a cadeia leve, a correspondência humana mais próxima foi o gene O18/Jk2 e KV1-39*01/KJ2*04 e, para a cadeia pesada, a correspondência humana mais próxima foi o gene VH3-21. Os genes VH3-11, VH3-23, VH3-7*01 e VH3-48 também foram selecionados devido às suas correspondências próximas.

[0241] As sequências do domínio variável humanizadas foram então projetadas, onde as CDR1 (SEQ ID NO. 4), 2 (SEQ ID NO. 5) e 3 (SEQ ID NO. 6) da cadeia leve do HL1210-3 foram enxertadas nas sequências da estrutura do gene O18/Jk2 e KV1-39*01/KJ2*04, e as sequências das CDR1 (SEQ ID NO. 1), 2 (SEQ ID NO. 2) e 3 (SEQ ID NO. 3) da VH do HL1210-3 foram enxertadas nas sequências da estrutura do gene VH3-21, VH3-11, VH3-23, VH3-48 ou VH3-7*01. Um modelo 3D foi então gerado, para determinar se havia quaisquer posições da estrutura onde a substituição do aminoácido de camundongo pelo aminoácido humano poderia afetar a ligação e/ou a conformação da CDR. No caso da cadeia leve, foram identificadas 22S, 43S, 60D, 63T e 42Q (numeração de Kabat,

ver a Tabela 7) na estrutura.

No caso da cadeia pesada, 1E, 37V, 40T, 44S, 49A, 77N, 91I, 94R e 108T, na estrutura, estavam envolvidas nas mutações reversas.

Tabela 7. Projeto de Humanização Projeto da VH I: VH3-21/JH6 Construção Mutação Hu1210 VH Quimera Hu1210 VH.1 enxertada com CDR Hu1210 VH.1a S49A Hu1210 VH.1b S49A, G44S, Y91I Projeto da VH II: VH3-11/JH6 Hu1210 VH.2 enxertada com CDR, Q1E Hu1210 VH.2a Q1E, S49A Hu1210 VH.2b Q1E, I37V, S49A, G44S, Y91I Projeto da VH III: VH3-23/JH6

Hu1210 VH.3 enxertada com CDR, K94R Hu1210 VH.3a G44S, S49A, Y91I, K94R Projeto da VH IV: VH3-48/JH6 Hu1210 VH.4 enxertada com CDR Hu1210 VH.4a S49A Hu1210 VH.4b S49A, G44S, Y91I Hu1210 VH.4c D52E, S49A, G44S, Y91I Hu1210 VH.4d G53A, S49A, G44S, Y91I Hu1210 VH.4e G53V, S49A, G44S, Y91I Projeto da VH V：VH3-7*01/ HJ1*01 Hu1210 VH.5 enxertada com CDR Hu1210 VH.5a H91I Hu1210 VH.5b H91I, H108T Hu1210 VH.5c H91I, H77N Hu1210 VH.5d H91I, H77N, H40T

Projeto da VK I: 018/Jk2 Construção Mutação Hu1210 Vk Quimera Hu1210 Vk.1 enxertada com CDR Hu1210 Vk.1a A43S Projeto da VK II: KV1-39*01/KJ2*04 Hu1210 Vk.2 enxertada com CDR Hu1210 Vk.2a L60D, L63T Hu1210 Vk.2b L60D, L63T, L42Q, L43S Hu1210 Vk.2c L60D, L63T, L42Q, L43S, T22S

[0242] As sequências de aminoácidos e nucleotídeos de alguns dos anticorpos humanizados estão listadas na Tabela 8 abaixo. [Tabela 8] Sequências dos anticorpos humanizados (o negrito indica a CDR) Nome Sequência de Aminoácidos SEQ ID NO: HL1210-VH EVKLVESGGDLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYDMSWV 7

RQTPEKSLEWVATISDGGGYIYYSDSVKGRFTISRDN AKNNLYLQMSSLRSEDTALYICAREFGKRYALDYWGQ

GTSVTVSS Hu1210 VH.1 EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYDMSWV 8

RQAPGKGLEWVSTISDGGGYIYYSDSVKGRFTISRDN AKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREFGKRYALDYWGQ

GTTVTVSS Hu1210 EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYDMSWV 9 VH.1a RQAPGKGLEWVATISDGGGYIYYSDSVKGRFTISRDN

AKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREFGKRYALDYWGQ GTTVTVSS

Hu1210 EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYDMSWV 10 VH.1b RQAPGKSLEWVATISDGGGYIYYSDSVKGRFTISRDN

AKNSLYLQMNSLRAEDTAVYICAREFGKRYALDYWGQ

GTTVTVSS Hu1210 VH.2 EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYDMSWI 11

RQAPGKGLEWVSTISDGGGYIYYSDSVKGRFTISRDN AKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREFGKRYALDYWGQ

GTTVTVSS Hu1210 EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYDMSWI 12 VH.2a RQAPGKGLEWVATISDGGGYIYYSDSVKGRFTISRDN

AKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREFGKRYALDYWGQ

GTTVTVSS Hu1210 EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYDMSWV 13 VH.2b RQAPGKSLEWVATISDGGGYIYYSDSVKGRFTISRDN

AKNSLYLQMNSLRAEDTAVYICAREFGKRYALDYWGQ

GTTVTVSS Hu1210 VH.3 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYDMSWV 14

RQAPGKGLEWVSTISDGGGYIYYSDSVKGRFTISRDN SKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREFGKRYALDYWGQ

GTTVTVSS Hu1210 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYDMSWV 15 VH.3a RQAPGKSLEWVATISDGGGYIYYSDSVKGRFTISRDN

SKNTLYLQMNSLRAEDTAVYICAREFGKRYALDYWGQ

GTTVTVSS Hu1210 VH.4 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYDMSWV 16

RQAPGKGLEWVSTISDGGGYIYYSDSVKGRFTISRDN AKNSLYLQMNSLRDEDTAVYYCAREFGKRYALDYWGQ GTTVTVSS

Hu1210 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYDMSWV 17 VH.4a RQAPGKGLEWVATISDGGGYIYYSDSVKGRFTISRDN

AKNSLYLQMNSLRDEDTAVYYCAREFGKRYALDYWGQ

GTTVTVSS Hu1210 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYDMSWV 18 VH.4b RQAPGKSLEWVATISDGGGYIYYSDSVKGRFTISRDN

AKNSLYLQMNSLRDEDTAVYICAREFGKRYALDYWGQ

GTTVTVSS Hu1210 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYDMSWV 19 VH.4c RQAPGKSLEWVATISEGGGYIYYSDSVKGRFTISRDN

AKNSLYLQMNSLRDEDTAVYICAREFGKRYALDYWGQ

GTTVTVSS Hu1210 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYDMSWV 20 VH.4d RQAPGKSLEWVATISDAGGYIYYSDSVKGRFTISRDN

AKNSLYLQMNSLRDEDTAVYICAREFGKRYALDYWGQ

GTTVTVSS Hu1210 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYDMSWV 21 VH.4e RQAPGKSLEWVATISDVGGYIYYSDSVKGRFTISRDN

AKNSLYLQMNSLRDEDTAVYICAREFGKRYALDYWGQ

GTTVTVSS Hu1210 VH.5 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYDMSWV 22

RQAPGKGLEWVATISDGGGYIYYSDSVKGRFTISRDN AKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREFGKRYALDYWGQ

GTLVTVSS HU1210 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYDMSWV 23 VH.5a RQAPGKGLEWVATISDGGGYIYYSDSVKGRFTISRDN

AKNSLYLQMNSLRAEDTAVYICAREFGKRYALDYWGQ GTLVTVSS

HU1210 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYDMSWV 24 VH.5b RQAPGKGLEWVATISDGGGYIYYSDSVKGRFTISRDN

AKNSLYLQMNSLRAEDTAVYICAREFGKRYALDYWGQ

GTTVTVSS HU1210 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYDMSWV 25 VH.5C RQAPGKGLEWVATISDGGGYIYYSDSVKGRFTISRDN

AKNNLYLQMNSLRAEDTAVYICAREFGKRYALDYWGQ

GTLVTVSS HU1210 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYDMSWV 26 VH.5d RQTPEKSLEWVATISDGGGYIYYSDSVKGRFTISRDN

AKNNLYLQMNSLRAEDTAVYICAREFGKRYALDYWGQ

GTLVTVSS HL1210-VK DIVMTQSHKFMSTSVGDRVSISCKASQDVTPAVAWYQ 27

QKPGQSPKLLIYSTSSRYTGVPDRFTGSGSGTDFTFT

ISSVQAEDLAVYYCQQHYTTPLTFGAGTKLELK Hu1210 VK.1 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVTPAVAWYQ 28

QKPGKAPKLLIYSTSSRYTGVPSRFSGSGSGTDFTFT

ISSLQPEDIATYYCQQHYTTPLTFGQGTKLEIK Hu1210 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVTPAVAWYQ 29 VK.1a QKPGKSPKLLIYSTSSRYTGVPSRFSGSGSGTDFTFT

ISSLQPEDIATYYCQQHYTTPLTFGQGTKLEIK Hu1210 Vk.2 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVTPAVAWYQ 30

QKPGKAPKLLIYSTSSRYTGVPSRFSGSGSGTDFTLT

ISSLQPEDFATYYCQQHYTTPLTFGQGTKLEIKR Hu1210 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVTPAVAWYQ 31 Vk.2a QKPGKAPKLLIYSTSSRYTGVPDRFTGSGSGTDFTLT

ISSLQPEDFATYYCQQHYTTPLTFGQGTKLEIKR Hu1210 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVTPAVAWYQ 32

Vk.2b QKPGQSPKLLIYSTSSRYTGVPDRFTGSGSGTDFTLT

ISSLQPEDFATYYCQQHYTTPLTFGQGTKLEIKR Hu1210 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTISCKASQDVTPAVAWYQ 33 Vk.2c QKPGQSPKLLIYSTSSRYTGVPDRFTGSGSGTDFTLT

ISSLQPEDFATYYCQQHYTTPLTFGQGTKLEIKR Nome Sequência de Ácidos Nucleicos SEQ ID NO: HL1210 VH GAGGTGAAGCTGGTGGAGAGCGGCGGAGATCTGGTGA

AGCCTGGCGGCAGCCTGAAGCTGAGCTGTGCCGCCAG CGGCTTCACCTTCAGCAGCTACGACATGAGCTGGGTG AGGCAGACCCCCGAGAAGAGCCTGGAGTGGGTGGCCA

CCATCAGCGATGGCGGCGGCTACATCTACTACAGCGA 34

CAGCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCAGCAGGGACAAC GCCAAGAACAACCTGTACCTGCAGATGAGCAGCCTGA GGAGCGAGGACACCGCCCTGTACATCTGCGCCAGGGA GTTCGGCAAGAGGTACGCCCTGGACTACTGGGGACAG

GGCACCAGCGTGACCGTGAGCAGC Hu1210 VH.1 GAGGTGCAGCTGGTGGAGAGCGGAGGAGGACTGGTGA

AGCCCGGAGGCAGCCTGAGACTGAGCTGCGCTGCCAG CGGCTTCACCTTCAGCAGCTACGACATGAGCTGGGTG AGACAGGCCCCTGGCAAAGGCCTGGAGTGGGTGAGCA

CCATCTCCGATGGCGGCGGCTACATCTATTACTCCGA 35

CAGCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCAGCAGGGACAAC GCCAAGAACAGCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGA GGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGGGA GTTCGGCAAAAGGTACGCCCTGGACTACTGGGGCCAG

GGCACAACCGTGACCGTGAGCAGC Hu1210 GAGGTGCAGCTGGTGGAGAGCGGAGGAGGACTGGTGA 36

VH.1a AGCCCGGAGGCAGCCTGAGACTGAGCTGCGCTGCCAG

CGGCTTCACCTTCAGCAGCTACGACATGAGCTGGGTG AGACAGGCCCCTGGCAAAGGCCTGGAGTGGGTGGCCA CCATCTCCGATGGCGGCGGCTACATCTATTACTCCGA CAGCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCAGCAGGGACAAC GCCAAGAACAGCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGA GGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGGGA GTTCGGCAAAAGGTACGCCCTGGACTACTGGGGCCAG

GGCACAACCGTGACCGTGAGCAGC Hu1210 GAGGTGCAGCTGGTGGAGAGCGGAGGAGGACTGGTGA VH.1b AGCCCGGAGGCAGCCTGAGACTGAGCTGCGCTGCCAG

CGGCTTCACCTTCAGCAGCTACGACATGAGCTGGGTG AGACAGGCCCCTGGCAAAAGCCTGGAGTGGGTGGCCA

CCATCTCCGATGGCGGCGGCTACATCTATTACTCCGA 37

CAGCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCAGCAGGGACAAC GCCAAGAACAGCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGA GGGCCGAGGACACCGCCGTGTACATCTGCGCCAGGGA GTTCGGCAAAAGGTACGCCCTGGACTACTGGGGCCAG

GGCACAACCGTGACCGTGAGCAGC Hu1210 VH.2 GAGGTGCAGCTGGTGGAGAGCGGAGGAGGACTGGTGA

AGCCCGGAGGCAGCCTGAGACTGAGCTGCGCTGCCAG CGGCTTCACCTTCAGCAGCTACGACATGAGCTGGATC AGACAGGCCCCTGGCAAAGGCCTGGAGTGGGTGAGCA

CCATCTCCGATGGCGGCGGCTACATCTATTACTCCGA 38

CAGCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCAGCAGGGACAAC GCCAAGAACAGCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGA GGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGGGA GTTCGGCAAAAGGTACGCCCTGGACTACTGGGGCCAG GGCACAACCGTGACCGTGAGCAGC

Hu1210 GAGGTGCAGCTGGTGGAGAGCGGAGGAGGACTGGTGA VH.2a AGCCCGGAGGCAGCCTGAGACTGAGCTGCGCTGCCAG

CGGCTTCACCTTCAGCAGCTACGACATGAGCTGGATC AGACAGGCCCCTGGCAAAGGCCTGGAGTGGGTGGCCA

CCATCTCCGATGGCGGCGGCTACATCTATTACTCCGA 39

GGCACAACCGTGACCGTGAGCAGC Hu1210 GAGGTGCAGCTGGTGGAGAGCGGAGGAGGACTGGTGA VH.2b AGCCCGGAGGCAGCCTGAGACTGAGCTGCGCTGCCAG

CGGCTTCACCTTCAGCAGCTACGACATGAGCTGGGTG AGACAGGCCCCTGGCAAAAGCCTGGAGTGGGTGGCCA

CCATCTCCGATGGCGGCGGCTACATCTATTACTCCGA 40

GGCACAACCGTGACCGTGAGCAGC Hu1210 VH.3 GAGGTGCAGCTGCTGGAGAGCGGAGGAGGACTGGTGC

AACCCGGAGGCAGCCTGAGACTGAGCTGCGCTGCCAG CGGCTTCACCTTCAGCAGCTACGACATGAGCTGGGTG

AGACAGGCCCCTGGCAAAGGCCTGGAGTGGGTGAGCA CCATCTCCGATGGCGGCGGCTACATCTATTACTCCGA 41

CAGCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCAGCAGGGACAAC AGCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGA GGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGGGA GTTCGGCAAAAGGTACGCCCTGGACTACTGGGGCCAG

GGCACAACCGTGACCGTGAGCAGC Hu1210 GAGGTGCAGCTGCTGGAGAGCGGAGGAGGACTGGTGC VH.3a AACCCGGAGGCAGCCTGAGACTGAGCTGCGCTGCCAG

CGGCTTCACCTTCAGCAGCTACGACATGAGCTGGGTG AGACAGGCCCCTGGCAAAAGCCTGGAGTGGGTGGCCA

CCATCTCCGATGGCGGCGGCTACATCTATTACTCCGA 42

CAGCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCAGCAGGGACAAC AGCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGA GGGCCGAGGACACCGCCGTGTACATCTGCGCCAGGGA GTTCGGCAAAAGGTACGCCCTGGACTACTGGGGCCAG

GGCACAACCGTGACCGTGAGCAGC Hu1210 VH.4 GAGGTGCAGCTGGTGGAGAGCGGAGGAGGACTGGTGC

AACCCGGAGGCAGCCTGAGACTGAGCTGCGCTGCCAG CGGCTTCACCTTCAGCAGCTACGACATGAGCTGGGTG AGACAGGCCCCTGGCAAAGGCCTGGAGTGGGTGAGCA

CCATCTCCGATGGCGGCGGCTACATCTATTACTCCGA 43

CAGCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCAGCAGGGACAAC GCCAAGAACAGCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGA GGGATGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGGGA GTTCGGCAAAAGGTACGCCCTGGACTACTGGGGCCAG

GGCACAACCGTGACCGTGAGCAGC Hu1210 GAGGTGCAGCTGGTGGAGAGCGGAGGAGGACTGGTGC VH.4a AACCCGGAGGCAGCCTGAGACTGAGCTGCGCTGCCAG

CGGCTTCACCTTCAGCAGCTACGACATGAGCTGGGTG

AGACAGGCCCCTGGCAAAGGCCTGGAGTGGGTGGCCA 44

CCATCTCCGATGGCGGCGGCTACATCTATTACTCCGA CAGCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCAGCAGGGACAAC GCCAAGAACAGCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGA GGGATGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGGGA GTTCGGCAAAAGGTACGCCCTGGACTACTGGGGCCAG

GGCACAACCGTGACCGTGAGCAGC Hu1210 GAGGTGCAGCTGGTGGAGAGCGGAGGAGGACTGGTGC VH.4b AACCCGGAGGCAGCCTGAGACTGAGCTGCGCTGCCAG

CGGCTTCACCTTCAGCAGCTACGACATGAGCTGGGTG AGACAGGCCCCTGGCAAAAGCCTGGAGTGGGTGGCCA

CCATCTCCGATGGCGGCGGCTACATCTATTACTCCGA 45

CAGCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCAGCAGGGACAAC GCCAAGAACAGCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGA GGGATGAGGACACCGCCGTGTACATCTGCGCCAGGGA GTTCGGCAAAAGGTACGCCCTGGACTACTGGGGCCAG

GGCACAACCGTGACCGTGAGCAGC Hu1210 GAGGTGCAGCTGGTGGAGAGCGGAGGAGGACTGGTGC VH.4c AACCCGGAGGCAGCCTGAGACTGAGCTGCGCTGCCAG

CGGCTTCACCTTCAGCAGCTACGACATGAGCTGGGTG AGACAGGCCCCTGGCAAAAGCCTGGAGTGGGTGGCCA

CCATCTCCGAAGGCGGCGGCTACATCTATTACTCCGA 46

GGCACAACCGTGACCGTGAGCAGC Hu1210_VH.4 GAGGTGCAGCTGGTGGAGAGCGGAGGAGGACTGGTGC d AACCCGGAGGCAGCCTGAGACTGAGCTGCGCTGCCAG

CGGCTTCACCTTCAGCAGCTACGACATGAGCTGGGTG AGACAGGCCCCTGGCAAAAGCCTGGAGTGGGTGGCCA 47

CCATCTCCGATGCGGGCGGCTACATCTATTACTCCGA CAGCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCAGCAGGGACAAC GCCAAGAACAGCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGA GGGATGAGGACACCGCCGTGTACATCTGCGCCAGGGA GTTCGGCAAAAGGTACGCCCTGGACTACTGGGGCCAG

GGCACAACCGTGACCGTGAGCAGC Hu1210_VH.4 GAGGTGCAGCTGGTGGAGAGCGGAGGAGGACTGGTGC e AACCCGGAGGCAGCCTGAGACTGAGCTGCGCTGCCAG

CGGCTTCACCTTCAGCAGCTACGACATGAGCTGGGTG AGACAGGCCCCTGGCAAAAGCCTGGAGTGGGTGGCCA

CCATCTCCGATGTTGGCGGCTACATCTATTACTCCGA 48

GGCACAACCGTGACCGTGAGCAGC Hu1210 VH.5 GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCCGGAGGAGGCCTGGTGC

AACCTGGAGGCTCCCTGAGGCTGTCCTGTGCCGCTTC CGGCTTCACCTTCAGCTCCTACGATATGAGCTGGGTG AGGCAGGCTCCTGGAAAGGGCCTGGAGTGGGTGGCCA

CCATCTCCGACGGAGGCGGCTACATCTACTACTCCGA 49

CTCCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCTCCCGGGACAAC GCCAAGAACTCCCTGTACCTGCAGATGAACTCTCTCA GGGCTGAGGACACCGCCGTGTATTACTGCGCCAGGGA GTTTGGCAAGAGGTACGCCCTGGATTACTGGGGCCAG

GGCACACTGGTGACAGTGAGCTCC Hu1210 GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCCGGAGGAGGCCTGGTGC VH.5a AACCTGGAGGCTCCCTGAGGCTGTCCTGTGCCGCTTC

CGGCTTCACCTTCAGCTCCTACGATATGAGCTGGGTG 50

AGGCAGGCTCCTGGAAAGGGCCTGGAGTGGGTGGCCA CCATCTCCGACGGAGGCGGCTACATCTACTACTCCGA CTCCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCTCCCGGGACAAC GCCAAGAACTCCCTGTACCTGCAGATGAACTCTCTCA GGGCTGAGGACACCGCCGTGTATATCTGCGCCAGGGA GTTTGGCAAGAGGTACGCCCTGGATTACTGGGGCCAG

GGCACACTGGTGACAGTGAGCTCC Hu1210 GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCCGGAGGAGGCCTGGTGC VH.5b AACCTGGAGGCTCCCTGAGGCTGTCCTGTGCCGCTTC

CGGCTTCACCTTCAGCTCCTACGATATGAGCTGGGTG AGGCAGGCTCCTGGAAAGGGCCTGGAGTGGGTGGCCA

CCATCTCCGACGGAGGCGGCTACATCTACTACTCCGA 51

CTCCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCTCCCGGGACAAC GCCAAGAACAACCTGTACCTGCAGATGAACTCTCTCA GGGCTGAGGACACCGCCGTGTATATCTGCGCCAGGGA GTTTGGCAAGAGGTACGCCCTGGATTACTGGGGCCAG

GGCACACTGGTGACAGTGAGCTCC Hu1210 GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCCGGAGGAGGCCTGGTGC VH.5c AACCTGGAGGCTCCCTGAGGCTGTCCTGTGCCGCTTC

CGGCTTCACCTTCAGCTCCTACGATATGAGCTGGGTG AGGCAGACCCCTGAGAAGAGCCTGGAGTGGGTGGCCA

CCATCTCCGACGGAGGCGGCTACATCTACTACTCCGA 52

GGCACACTGGTGACAGTGAGCTCC Hu1210_VH.5 GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCCGGAGGAGGCCTGGTGC d AACCTGGAGGCTCCCTGAGGCTGTCCTGTGCCGCTTC CGGCTTCACCTTCAGCTCCTACGATATGAGCTGGGTG 53

GGCACAACCGTGACAGTGAGCTCC HL1210 VK GACATCGTGATGACCCAGAGCCACAAGTTCATGAGCA

CCAGCGTGGGCGATAGGGTGAGCATCAGCTGCAAGGC CAGCCAGGATGTGACCCCTGCCGTGGCCTGGTACCAG

CAGAAGCCCGGCCAGAGCCCCAAGCTGCTGATCTACA GCACCAGCAGCAGGTACACCGGCGTGCCCGACAGGTT 54

CACAGGAAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCTTCACC ATCAGCAGCGTGCAGGCCGAGGACCTGGCCGTGTACT ACTGCCAGCAGCACTACACCACCCCTCTGACCTTCGG

CGCCGGCACCAAGCTGGAGCTGAAG Hu1210 VK.1 GACATCCAGATGACCCAGAGCCCTAGCAGCCTGAGCG

CTAGCGTGGGCGACAGGGTGACCATCACCTGCAAGGC CAGCCAGGATGTGACCCCTGCCGTGGCCTGGTACCAG

CAGAAGCCCGGCAAGGCCCCCAAGCTGCTGATCTACA GCACCAGCAGCAGGTACACCGGCGTGCCCAGCAGGTT 55

TAGCGGAAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCTTCACC ATCAGCAGCCTGCAGCCCGAGGACATCGCCACCTACT ACTGCCAGCAGCACTACACCACCCCTCTGACCTTCGG

CCAGGGCACCAAGCTGGAGATCAAG Hu1210 GACATCCAGATGACCCAGAGCCCTAGCAGCCTGAGCG VK.1a CTAGCGTGGGCGACAGGGTGACCATCACCTGCAAGGC

CAGCCAGGATGTGACCCCTGCCGTGGCCTGGTACCAG 56

CAGAAGCCCGGCAAGTCCCCCAAGCTGCTGATCTACA GCACCAGCAGCAGGTACACCGGCGTGCCCAGCAGGTT TAGCGGAAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCTTCACC ATCAGCAGCCTGCAGCCCGAGGACATCGCCACCTACT ACTGCCAGCAGCACTACACCACCCCTCTGACCTTCGG

CCAGGGCACCAAGCTGGAGATCAAG Hu1210 VK.2 GACATTCAGATGACCCAGTCCCCTAGCAGCCTGTCCG

CTTCCGTGGGCGACAGGGTGACCATCACCTGCAAGGC CAGCCAGGACGTGACACCTGCTGTGGCCTGGTATCAA

CAGAAGCCTGGCAAGGCTCCTAAGCTCCTGATCTACA GCACATCCTCCCGGTACACCGGAGTGCCCTCCAGGTT 57

TAGCGGCAGCGGCTCCGGCACCGATTTCACCCTGACC ATTTCCTCCCTGCAGCCCGAGGACTTCGCCACCTACT ACTGCCAGCAGCACTACACCACACCCCTGACCTTCGG

CCAGGGCACCAAGCTGGAGATCAAGCGG Hu1210 GACATTCAGATGACCCAGTCCCCTAGCAGCCTGTCCG VK.2a CTTCCGTGGGCGACAGGGTGACCATCACCTGCAAGGC

CAGCCAGGACGTGACACCTGCTGTGGCCTGGTATCAA

CAGAAGCCTGGCAAGGCTCCTAAGCTCCTGATCTACA GCACATCCTCCCGGTACACCGGAGTGCCCGACAGGTT 58

TACCGGCAGCGGCTCCGGCACCGATTTCACCCTGACC ATTTCCTCCCTGCAGCCCGAGGACTTCGCCACCTACT ACTGCCAGCAGCACTACACCACACCCCTGACCTTCGG

CCAGGGCACCAAGCTGGAGATCAAGCGG Hu1210 GACATTCAGATGACCCAGTCCCCTAGCAGCCTGTCCG VK.2b CTTCCGTGGGCGACAGGGTGACCATCACCTGCAAGGC

CAGCCAGGACGTGACACCTGCTGTGGCCTGGTATCAA

CAGAAGCCTGGCCAGAGCCCTAAGCTCCTGATCTACA 59

GCACATCCTCCCGGTACACCGGAGTGCCCGACAGGTT TACCGGCAGCGGCTCCGGCACCGATTTCACCCTGACC ATTTCCTCCCTGCAGCCCGAGGACTTCGCCACCTACT ACTGCCAGCAGCACTACACCACACCCCTGACCTTCGG

CCAGGGCACCAAGCTGGAGATCAAGCGG Hu1210 GACATTCAGATGACCCAGTCCCCTAGCAGCCTGTCCG VK.2c CTTCCGTGGGCGACAGGGTGACCATCAGCTGCAAGGC

CAGCCAGGACGTGACACCTGCTGTGGCCTGGTATCAA

CAGAAGCCTGGCCAGAGCCCTAAGCTCCTGATCTACA GCACATCCTCCCGGTACACCGGAGTGCCCGACAGGTT 60

TACCGGCAGCGGCTCCGGCACCGATTTCACCCTGACC ATTTCCTCCCTGCAGCCCGAGGACTTCGCCACCTACT ACTGCCAGCAGCACTACACCACACCCCTGACCTTCGG CCAGGGCACCAAGCTGGAGATCAAGCGG

[0243] Os genes da VH e da VK humanizados foram produzidos sinteticamente e então clonados, respectivamente, em vetores contendo os domínios constantes da gama 1 humana e da capa humana. O emparelhamento da VH humana e da VK humana criou os 40 anticorpos humanizados (ver a Tabela 9). [Tabela 9] Anticorpos humanizados com as suas regiões VH e

VL

VH Hu1210 Hu1210 Hu1210 Hu1210 Hu1210 Hu1210 Hu1210 Vk VH.1 VH.1a VH.1b VH.2 VH.2a VH 2.b VH Hu1210 Hu1210- Hu1210- Hu1210- Hu1210- Hu1210- Vk.1 1 2 3 4 5 Hu1210 Hu1210- Hu1210- Hu1210- Hu1210- Hu1210- Vk.1a 7 8 9 10 11 quimera Hu1210 de Vk H1210 VH Hu1210 Hu1210 Hu1210 Hu1210 Hu1210 Vk VH.3 VH.3a VH.4 VH.4a VH.4b Hu1210 Hu1210-13 Hu1210-14 Hu1210-15 Hu1210-16 Hu1210-17 Vk.1 Hu1210 Hu1210-18 Hu1210-19 Hu1210-20 Hu1210-21 Hu1210-22 Vk.1a VH Hu1210 HU1210 HU1210 HU1210 HU1210 VK VH.5 VH.5a VH.5b VH.5c VH.5d Hu1210 Hu1210-23 Hu1210-27 Hu1210-31 Hu1210-32 Hu1210-36 Vk.2 Hu1210 Hu1210-24 Hu1210-28 Hu1210-33 Hu1210-37 Vk.2a Hu1210 Hu1210-25 Hu1210-29 Hu1210-34 Hu1210-38 Vk.2b Hu1210 Hu1210-26 Hu1210-30 Hu1210-35 Hu1210-39 Vk.2c

VH Hu1210 VH.4c Hu1210 VH.4d Hu1210 VH.4e Vk Hu1210 Vk.1 Hu1210-40 Hu1210-41 Hu1210-42

1.6. Propriedades de ligação ao antígeno dos anticorpos para PD-L1 humanizados

[0244] Para avaliar a atividade de ligação ao antígeno, os anticorpos humanizados foram submetidos ao teste ELISA. Resumidamente, as placas de microtítulo foram revestidas com a proteína PD-L1-Fc humana, a 0,1 µg/ml, em PBS, 100 µl/poço, a 4ºC, durante a noite, depois bloqueadas com 100 µl/poço de BSA a 5%. As diluições de cinco vezes dos anticorpos humanizados, partindo de 10 μg/ml, foram adicionadas a cada poço e incubadas por 1-2 horas, na TA. As placas foram lavadas com PBS/Tween e depois incubadas com o anticorpo IgG anti-camundongo de cabra conjugado com a Peroxidase de Raiz-Forte (HRP), durante 1 hora, na TA. Após a lavagem, as placas foram desenvolvidas com o substrato de TMB e analisadas por espectrofotômetro, em DO 450-630 nm. Conforme mostrado nas FIGS. 6A-6E, todos os anticorpos humanizados mostram eficácia de ligação comparável ao PD-L1 humano em contato com o anticorpo quimérico.

[0245] Para avaliar a propriedade de ligação ao antígeno, os anticorpos humanizados foram analisados quanto à sua ligação ao PD-L1 expresso em mamífero, por FACS. Resumidamente, as células PDL1-CHOK1 foram primeiramente incubadas com os anticorpos humanizados diluídos 5 vezes em série, partindo a 2 μg/ml, na TA, por 1 hora. Após lavagem com o tampão de FACS (PBS com FBS a 2%), o alexa 488- anticorpo IgG anti-humano foi adicionado a cada poço e incubado na TA, por 1 hora. A MFI do Alexa 488 foi avaliada por FACSAriaIII. Conforme mostrado nas FIGS. 7A-7C, todos os anticorpos humanizados podem se ligar com alta eficiência ao PD-L1 expresso em células de mamíferos, o que era comparável com o anticorpo quimérico.

[0246] Para explorar a cinética de ligação do anticorpo humanizado, este exemplo realizou a classificação da afinidade utilizando Octet Red 96. Como mostrado na Tabela 10, o hu1210-3, o hu1210-8, o hu1210-9, o hu1210-14, o hu1210-17, o hu1210-1 e o Hu1210-22 mostram melhor afinidade, o que é comparável com o anticorpo quimérico. [Tabela 10] Classificação da afinidade dos anticorpos humanizados Anti- KD Kon Kdis Anti- KD Kon Kdis corpo (M) (1/Ms) (1/s) corpo (M) (1/Ms) (1/s) Hu1210 7,16 3,94E+ 2,83E- Hu1210- 4,18 7,54E+ 3,15E- (mIgG) E-09 05 03 11 E-09 04 04 quimer 1,07 1,62E+ 1,73E- Hu1210- 4,36 8,38E+ 3,66E- a de E-09 05 04 13 E-09 04 04 H1210 Hu1210 4,25 7,10E+ 3,02E- Hu1210- 2,34 8,41E+ 1,97E- -1 E-09 04 04 14 E-09 04 04 Hu1210 3,23 7,78E+ 2,51E- Hu1210- 4,45 7,87E+ 3,50E- -2 E-09 04 04 15 E-09 04 04 Hu1210 2,64 8,62E+ 2,28E- Hu1210- 3,14 8,41E+ 2,64E- -3 E-09 04 04 16 E-09 04 04 Hu1210 7,68 7,12E+ 5,46E- Hu1210- 2,20 8,17E+ 1,80E- -4 E-09 04 04 17 E-09 04 04 Hu1210 4,83 7,93E+ 3,83E- Hu1210- 4,50 7,92E+ 3,57E- -5 E-09 04 04 18 E-09 04 04 Hu1210 4,78 8,45E+ 4,04E- Hu1210- 2,50 9,03E+ 2,25E- -7 E-09 04 04 19 E-09 04 04 Hu1210 1,64 7,72E+ 1,27E- Hu1210- 4,51 8,87E+ 4,00E- -8 E-09 04 04 20 E-09 04 04 Hu1210 2,33 8,37E+ 1,95E- Hu1210- 3,12 9,39E+ 2,93E- -9 E-09 04 04 21 E-09 04 04 Hu1210 7,03 8,59E+ 6,04E- Hu1210- 2,56 9,00E+ 2,30E-

-10 E-09 04 04 22 E-09 04 04

[0247] A ligação dos anticorpos humanizados à proteína PD-L1 recombinante (PD-L1-marca de his humano) foi testada por BIACORE®, utilizando um método de captura. O mAb de camundongo HL1210-3 foi capturado utilizando o anticorpo Fc anti-camundongo revestido sobre um chip CM5. Uma diluição em série da proteína PD-L1-marca de his humana foi injetada sobre o anticorpo capturado, por 3 minutos, em uma vazão de 25 μg/ml. O antígeno foi deixado se dissociar durante 900 s. Todas as experiências foram realizadas em um Biacore T200. A análise de dados foi realizada utilizando o software de avaliação Biacore T200 e é mostrada na Tabela 11 abaixo. [Tabela 11] Afinidade por Biacore Anticorpo ka (1/Ms) kd (1/s) KD (M) Hu1210-8 9,346E+4 7,169E-5 7,671E-10 Hu1210-9 9,856E+4 4,528E-5 4,594E-10 Hu1210-14 1,216E+5 5,293E-5 4,352E-10 Hu1210-16 9,978E+4 6,704E-5 6,720E-10 Hu1210-17 1,101E+5 2,128E-5 1,933E-10 Hu1210-28 1,289E+5 1,080E-4 8,378E-10 Hu1210-31 1,486E+5 1,168E-4 7,862E-10 Hu1210-36 1,461E+5 7,852E-5 5,376E-10 Hu1210-40 8,77E+04 1,31E-04 1,49E-09 Hu1210-41 9,17E+04 3,46E-05 3,78E-10 Hu1210-42 8,68E+04 7,53E-05 8,67E-10 Quimera de 1,236E+5 3,265E-5 2,642E-10 1210

1.7. Atividade cruzada das espécies

[0248] Para avaliar a ligação dos anticorpos humanizados ao huPD-L1, ao PD-L1 de Camundongo, ao PD-L1 de Rato, ao PD-L1 de Rhesus, os anticorpos foram efetuados para o teste pelo ELISA. Resumidamente, as placas de microtítulo foram revestidas com a proteína PD-L1-Fc humana, de camundongo, rato e rhesus, a 1 µg/ml, em PBS, 100 µl/poço, a 4ºC, durante a noite, depois bloqueadas com 100 µl/poço de BSA a 5%. As diluições de três vezes dos anticorpos humanizados, partindo de 1 µg/ml, foram adicionadas a cada poço e incubadas por 1-2 horas, na TA. As placas foram lavadas com PBS/Tween e depois incubadas com o anticorpo IgG anti-camundongo de cabra conjugado com a Peroxidase de Raiz-Forte (HRP), durante 1 hora, na TA. Após a lavagem, as placas foram desenvolvidas com o substrato de TMB e analisadas por espectrofotômetro, em DO 450-630 nm. O anticorpo Hu1210-41 pode se ligar ao PD-L1 de rhesus com menor afinidade e não pode se ligar ao PD-L1 de rato e camundongo (FIG. 8 e Tabela 12). [Tabela 12] Humano Rhesus Rato Camundongo EC50 0,215 nM 0,628 nM Sem ligação Sem ligação

[0249] Para avaliar a ligação do anticorpo anti- PD-L1 humanizado à família B7 humana e a outro ponto de verificação imunológico, o anticorpo foi avaliado quanto à sua ligação a B7-H1 (PD-L1), B7-DC, B7-1, B7-2, B7-H2, PD- 1, CD28, CTLA4, ICOS e BTLA, por ELISA. Como mostrado na FIG. 9, o anticorpo Hu1210-41 só pode especificamente se ligar ao B7-H1 (PD-L1).

1.8. Atividade dos anticorpos anti-PD-L1 humanizados de bloquear o PD-L1 humano para PD-1 Ensaio de bloqueio do receptor com base em células

[0250] Para avaliar o efeito de bloqueio dos anticorpos humanizados sobre o PD-L1 humano expresso em células de mamíferos de se ligar ao seu receptor PD-1, foi empregado o ensaio de bloqueio do receptor com base em FACS. Resumidamente, as células PDL1-CHOK1 foram primeiramente incubadas com o mAb de camundongo HL1210-3 diluído 3 vezes em série, começando a 20 μg/ml, na TA, por 1 hora. Após lavagem com o tampão de FACS (PBS com FBS a 2%), o huPD-1 marcado com biotina foi adicionado a cada poço e incubado na TA, por 1 hora. Em seguida, a Estreptavidina-PE foi adicionada a cada poço, durante 0,5 hora, após a lavagem por duas vezes com tampão de FACS. A intensidade média de florescência (MFI) do PE foi avaliada por FACSAriaIII.

[0251] Como mostrado na Tabela 13 abaixo, os anticorpos Hu1210-3, Hu1210-9, Hu1210-8, Hu1210-14, Hu1210- 17, Hu1210-19 e Hu1210-22 mostram eficácia comparável com o anticorpo quimérico de bloquearem a ligação do PD-L1 à PD-

1. [Tabela 13] Ensaio de bloqueio do receptor de PD-1 Bio-PD1(30 μg/ml) TOP EC50 quimera de H1210 87,16 3,961 Hu1210-8 86,35 4,194 Hu1210-9 85,7 4,038 Hu1210-16 88,02 5,436

Hu1210-17 80,88 4,424 Hu1210-3 84,28 3,693 Hu1210-14 79,56 3,572 Hu1210-19 87,45 4,52 Hu1210-22 85,83 4,505 Hu1210-27 103,9 11,48 Hu1210-31 92,91 6,179 Hu1210-36 91,75 8,175 Ensaio de bloqueio do receptor utilizando o PD-L1 humano recombinante

[0252] Existem dois receptores, isto é, PD-1 e B7-1, para o PD-L1 humano. Para explorar a propriedade de bloqueio do anticorpo para PD-L1 humanizado para essas duas proteínas, o ensaio de bloqueio do receptor com base em proteína foi empregado aqui. Resumidamente, as placas de microtítulo foram revestidas com a proteína PD-L1-Fc humana, a 1 µg/ml, em PBS, 100 µl/poço, a 4ºC, durante a noite, depois bloqueadas com 200 µl/poço de BSA a 5%, a 37º C, por 2 h. 50 µl da proteína PD-1-Fc ou B7-1 humana marcada com biotina e as diluições de 5 vezes dos anticorpos para PD-L1, partindo de 100 nM, a 50 µl, foram adicionados a cada poço e incubados por 1 hora, a 37ºC. As placas foram lavadas com PBS/Tween e, em seguida, incubadas com Estreptavidina-HRP, por 1 hora, a 37ºC. Após a lavagem, as placas foram desenvolvidas com o substrato de TMB e analisadas por espectrofotômetro, em DO 450 nm. Como mostrado nas FIGS. 10 e 11, o Hu1210-41 pode inibir eficientemente a ligação do PD-L1 humano a PD1 e B7-1 humanos.

1.9. Atividade do anticorpo anti-PD-L1 humanizado de promover a resposta imune das células T humanas Ensaio de Reação de Linfócitos Mistos

[0253] Para avaliar a função in vitro dos anticorpos humanizados, a resposta das células T humanas foi avaliada em um ambiente de reação de linfócitos mistos. As DCs humanas foram diferenciadas dos monócitos CD14+ na presença de GM-CSF e IL-4, por 7 dias. As células T CD4+ isoladas de outro doador foram então cocultivadas com as DCs e as diluições em série do anticorpo de bloqueio anti- PD-L1. No dia 5 após a inoculação, o sobrenadante da cultura foi testado quanto à produção de IL-2 e IFNy. Os resultados indicaram que os anticorpos Hu1210-8, Hu1210-9, Hu1210-16 e Hu1210-17 podem promover a produção de IL-2 e IFNγ de forma dependente da dose, sugerindo que os anticorpos anti-PD-L1 podem promover a resposta das células T humanas. Ensaio de lembrança do CMV

[0254] Para avaliar a função in vitro dos anticorpos humanizados, a resposta das células T humanas foi avaliada no ensaio de lembrança do CMV. As PBMCs humanas foram estimuladas com 1 μg/ml de antígeno de CMV, na presença dos anticorpos humanizados diluídos em série. Como mostrado nas FIGS. 12 e 13, o Hu1210-40, o Hu1210-41 e o Hu1210-17 podem promover, de forma dependente da dose, a produção de IFNγ.

1.10. Inibição do crescimento tumoral pelo mAb anti-PD-L1.

[0255] As células da linhagem celular de adenocarcinoma de pulmão humano HCC827 serão enxertadas nos camundongos NOD scid gama (NSG). Os camundongos NSG são deficientes em NOD scid gama e os camundongos mais imunodeficientes, tornando-os receptores ideais para as células tumorais humanas e o enxerto de PBMCs. 10 dias após o enxerto, as PBMCs humanas serão transplantadas nos camundongos com tumor. Aproximadamente 20 dias após o enxerto, assim que o volume do tumor tiver atingido 100-150 mm3, o anticorpo para PD-L1 será administrado aos camundongos a cada dois dias, a 5 mg/kg. O volume do tumor será monitorado a cada dois dias em conjunto com a administração dos anticorpos. Como mostrado na FIG. 14, o Hu1210-31 pode inibir o crescimento do tumor em 30%, a 5 mg/kg. O anticorpo Hu1210-41 pode inibir, de forma dependente da dose, o crescimento do tumor, ao mesmo tempo que o peso do tumor também foi suprimido, de forma dependente da dose, pelo anticorpo Hu1210-41 (FIG. 15).

1.11. Simulação em Computador da Variação e da Otimização Adicionais dos Anticorpos Humanizados

[0256] Foi contemplado que certos resíduos de aminoácidos, dentro das regiões CDR ou das regiões de estrutura, poderiam ser alterados para melhorar ou manter ainda mais a atividade e/ou a estabilidade dos anticorpos. As variantes foram testadas, com uma ferramenta computacional (VectorNTI, disponível em www. ebi. ac. uk/tools/msa/clustalo/), em relação às suas propriedades estruturais, conformacionais e funcionais, e aquelas (dentro das regiões CDR) que mostraram promessas estão listadas nas tabelas abaixo. [Tabela 14] CDRs da VH e da VL e suas variantes adequadas para a inclusão nos anticorpos humanizados

Nome Sequência SEQ ID NO: CDR1 da VH SYDMS 1 TYDMS 61 CYDMS 62 SFDMS 63 SHDMS 64 SWDMS 65 SYDMT 66 SYDMC 67

CDR2 da VH TISDGGGYIYYSDSVKG 2 TISDGGAYIYYSDSVKG 68 TISDGGPYIYYSDSVKG 69 TISDGGGFIYYSDSVKG 70 TISDGGGHIYYSDSVKG 71 TISDGGGWIYYSDSVKG 72 TISDGGGYIYYSDTVKG 73 TISDGGGYIYYSDCVKG 74 TISDGGGYIYYSDSLKG 75 TISDGGGYIYYSDSIKG 76 TISDGGGYIYYSDSMKG 77

CDR3 da VH EFGKRYALDY 3 QFGKRYALDY 78 DFGKRYALDY 79

NFGKRYALDY 80 EYGKRYALDY 81 EHGKRYALDY 82 EWGKRYALDY 83 EFAKRYALDY 84 EFPKRYALDY 85 EFGRRYALDY 86 EFGKKYALDY 87 EFGKRFALDY 88 EFGKRHALDY 89 EFGKRWALDY 90

CDR1 da VL KASQDVTPAVA 4 KATQDVTPAVA 91 KACQDVTPAVA 92

CDR2 da VL STSSRYT 5 TTSSRYT 93 CTSSRYT 94 SSSSRYT 95 SMSSRYT 96 SVSSRYT 97 STTSRYT 98 STCSRYT 99 STSTRYT 100

STSCRYT 101 STSSKYT 102 STSSRFT 103 STSSRHT 104 STSSRWT 105 CDR3 da VL QQHYTTPLT 6 EQHYTTPLT 106 DQHYTTPLT 107 NQHYTTPLT 108 QEHYTTPLT 109 QDHYTTPLT 110 QNHYTTPLT 111 (na Tabela 14, os resíduos de mutação de ponto de acesso e os seus substitutos estão sublinhados)

1.12. Identificação do epítopo de PD-L1

[0257] Este estudo foi realizado para identificar os resíduos de aminoácidos envolvidos na ligação do PD-L1 aos anticorpos da presente divulgação.

[0258] Foi construída uma biblioteca por varredura da alanina do PD-L1. Resumidamente, 217 clones mutantes do PD-L1 foram gerados na plataforma de engenharia de proteínas da Integral Molecular. A ligação do Fab Hu1210-41 a cada variante na biblioteca de mutações do PD- L1 foi determinada, em duplicata, por citometria de fluxo de alto rendimento. Cada ponto de dados brutos teve a fluorescência de fundo subtraída e foi normalizado para a reatividade com o PD-L1 do tipo selvagem (WT). Para cada variante do PD-L1, o valor médio da ligação foi representado graficamente em da expressão (reatividade do mAb anti-PD-L1 de controle). Para identificar os clones críticos preliminares (círculos com cruzes), foram aplicados limites (linhas tracejadas) de >70% de ligação do WT ao MAb de controle e <30% de reatividade do WT ao Fab Hu1210-41 (FIG. 16). Y134, K162 e N183 do PDL1 foram identificados como resíduos necessários para a ligação do Hu1210-41. A baixa reatividade do clone N183A com o Fab Hu1210-41 sugere que ele é o principal contribuidor energético para a ligação do Hu1210-41, com contribuições menores por Y134 e K162.

[0259] Os resíduos críticos (esferas) foram identificados em uma estrutura 3D do PD-L1, conforme ilustrado na FIG. 17. Estes resíduos, Y134, K162 e N183, portanto, constituem um epítopo do PD-L1, responsável pela ligação aos anticorpos de várias modalidades da presente divulgação.

[0260] É interessante observar que Y134, K162 e N183 estão todos localizados dentro do domínio IgC da proteína PD-L1. As partes extracelulares tanto da PD-1 quanto do PD-L1 têm um domínio IgV e um domínio IgC. É comumente conhecido que o PD-L1 se liga à PD-1 por meio de ligações entre seus domínios IgV. Ao contrário de tais anticorpos convencionais, no entanto, o Hu1210-41 se liga ao domínio IgC, o que teria sido esperado ser ineficaz na inibição da ligação entre PD-1/PD-L1. Este epítopo diferente do Hu1210-41, surpreendentemente, provavelmente contribui para as excelentes atividades do Hu1210-41.

1.13. Engenharia de anticorpo do anticorpo anti-PDL1

[0261] Os Exemplos 1.13-1.15 tentaram identificar outros anticorpos melhorados com base no Hu1210-41 utilizando a mutagênese.

[0262] Quatro sub-bibliotecas foram construídas para a engenharia de anticorpos do anticorpo monoclonal anti-PD-L1, utilizando quaisquer das estratégias a seguir. Na estratégia 1, a mutagênese da CDR3 da VH ou CDR3 da VL do domínio variável da cadeia pesada foi realizada por mutação altamente aleatória. Na estratégia 2, foram geradas duas bibliotecas de combinação de CDRs compostas por (CDR3 da VH, CDR3 da VL e CDR1 da VL) ou (CDR1 da VH, CDR2 da VH e CDR2 da VL), por deslocamento da CDR com taxas de mutação controladas.

[0263] Biosseleção: os métodos de seleção de fagos (“phage panning”) foram adaptados reduzindo o tempo de incubação/ligação antes da condição de lavagem severa. Resumidamente, 100 μl de esferas magnéticas de estreptavidina (Invitrogen, EUA) foram bloqueados com 1 ml de MPBS, por 1 hora, na temperatura ambiente. Em outro tubo, o fago da biblioteca foi pré-incubado (5 x 10^1~12 para cada rodada) com 100 μl de esferas magnéticas de estreptavidina, em 1 ml de MPBS, para remover os ligantes indesejados. O concentrador de partículas magnéticas foi utilizado para separar o fago e os glóbulos. A proteína PD- L1 biotinilada foi adicionada ao fago e incubada 2 h, na TA e suavemente misturada utilizando um agitador no alto. Os glóbulos contendo o fago da solução foram separados no concentrador de partículas magnéticas e o sobrenadante foi descartado. Os glóbulos foram lavados com tampão de lavagem novo, dez vezes com PBST e dez vezes com PBS (pH 7,4). 0,8 ml. A tripsina a 0,25% em PBS (Sigma, EUA) foi adicionada e incubada por 20 min, a 37ºC, para eluir o fago. O fago produto foi titulado e resgatado para a próxima rodada de seleção, diminuindo a concentração de antígeno rodada a rodada. Exame por ELISA e classificação da taxa de ativação/desativação

[0264] Os clones foram escolhidos e induzidos a partir do produto da seleção desejado; o ELISA do fago foi conduzido para o exame primário; os clones positivos foram analisados por sequenciamento; foram encontrados os pontos de acesso únicos. A Tabela 15 mostra as mutações identificadas. Como mostrado abaixo, os resíduos FGK na CDRH3 são resíduos de ponto de acesso que produzem anticorpos melhorados. [Tabela 15] Mutações nas CDRs CDR-H1 (SEQ No.) CDR-H2 (SEQ No.) CDR-H3 (SEQ No.) WT* SYDMS (1) TISDAGGYIYYRDSVKG EFGKRYALDY (3) (526) B3 SYDMS (1) TISDAGGYIYYRDSVKG EFGKRYALDY (3) (526) C4 SYDMS (1) TISDAGGYIYYRDSVKG EFGKRYALDS (513) (526) B1 SYDMS (1) TISDAGGYIYYRDSVKG EIFNRYALDY (514) (526) B6 SYDMS (1) TISDAGGYIYYRDSVKG ELPWRYALDY (515) (526) C3 SYDMS (1) TISDAGGYIYYRDSVKG ELHFRYALDY (516)

(526) C6 SYDMS (1) TISDAGGYIYYRDSVKG ELYFRYALDY (517) (526) A1 SYDMS (1) TISDAGGYIYYRDSVKG ELLHRYALDY (518) (526) A2 SYDMS (1) TISDAGGYIYYRDSVKG ELRGRYALDY (519) (526) A3 SYDMS (1) TISDAGGYIYYRDSVKG EFGKRYALDY (3) (526) CDR-L1 (SEQ No.) CDR-L2 (SEQ No.) CDR-L3 (SEQ No.) WT* KASQDVTPAVA (4) STSSRYT (5) QQHYTTPLT (6) B3 KAKQDVTPAVA STSSRYT (5) MQHYTTPLT (522) (520) C4 KASQDVWPAVA STSSRYT (5) QQHSTTPLT (523) (521) B1 KASQDVTPAVA (4) STSSRYT (5) QQHYTTPLT (6) B6 KASQDVTPAVA (4) STSSRYT (5) QQHYTTPLT (6) C3 KASQDVTPAVA (4) STSSRYT (5) QQHYTTPLT (6) C6 KASQDVTPAVA (4) STSSRYT (5) QQHYTTPLT (6) A1 KASQDVTPAVA (4) STSSRYT (5) QQHYTTPLT (6) A2 KASQDVTPAVA (4) STSSRYT (5) QQHYTTPLT (6) A3 KASQDVTPAVA (4) STSSRYT (5) QQHSDAPLT (524) (*WT difere de Hu1210-41 por uma substituição S60R (numeração de Kabat) na cadeia pesada para melhorar a afinidade.)

[0265] As sequências de aminoácidos das regiões variáveis destes anticorpos são apresentadas na Tabela 16 abaixo. [Tabela 16] Sequências dos anticorpos

Nome Sequência SEQ ID NO: WT-VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYDMSWVR 493

QAPGKSLEWVATISDAGGYIYYRDSVKGRFTISRDNAK NSLYLQMNSLRDEDTAVYICAREFGKRYALDYWGQGTT

VTVSS WT-Vk DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVTPAVAWYQQ 494

KPGKAPKLLIYSTSSRYTGVPSRFSGSGSGTDFTFTIS

SLQPEDIATYYCQQHYTTPLTFGQGTKLEIK B3-VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYDMSWVR 495

QAPGKSLEWVATISDAGGYIYYRDSVKGRFTISRDNAK NSLYLQMNSLRDEDTAVYICAREFGKRYALDYWGQGTT

VTVSS B3-Vk DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKAKQDVTPAVAWYQQ 496

KPGKAPKLLIYSTSSRYTGVPSRFSGSGSGTDFTFTIS

SLQPEDIATYYCMQHYTTPLTFGQGTKLEIK C4-VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYDMSWVR 497

QAPGKSLEWVATISDAGGYIYYRDSVKGRFTISRDNAK NSLYLQMNSLRDEDTAVYICAREFGKRYALDSWGQGTT

VTVSS C4-Vk DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVWPAVAWYQQ 498

KPGKAPKLLIYSTSSRYTGVPSRFSGSGSGTDFTFTIS

SLQPEDIATYYCQQHSTTPLTFGQGTKLEIK B1-VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYDMSWV 499

RQAPGKSLEWVATISDAGGYIYYRDSVKGRFTISRDN AKNSLYLQMNSLRDEDTAVYICAREIFNRYALDYWGQ

GTTVTVSS B1-Vk DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVTPAVAWYQ 500

QKPGKAPKLLIYSTSSRYTGVPSRFSGSGSGTDFTFT

ISSLQPEDIATYYCQQHYTTPLTFGQGTKLEIK B6-VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYDMSWV 501

RQAPGKSLEWVATISDAGGYIYYRDSVKGRFTISRDN AKNSLYLQMNSLRDEDTAVYICARELPWRYALDYWGQ

GTTVTVSS B6-Vk DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVTPAVAWYQ 502

QKPGKAPKLLIYSTSSRYTGVPSRFSGSGSGTDFTFT

ISSLQPEDIATYYCQQHYTTPLTFGQGTKLEIK C3-VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYDMSWV 503

RQAPGKSLEWVATISDAGGYIYYRDSVKGRFTISRDN AKNSLYLQMNSLRDEDTAVYICARELHFRYALDYWGQ

GTTVTVSS C3-Vk DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVTPAVAWYQ 504

QKPGKAPKLLIYSTSSRYTGVPSRFSGSGSGTDFTFT

ISSLQPEDIATYYCQQHYTTPLTFGQGTKLEIK C6-VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYDMSWV 505

RQAPGKSLEWVATISDAGGYIYYRDSVKGRFTISRDN AKNSLYLQMNSLRDEDTAVYICARELYFRYALDYWGQ

GTTVTVSS C6-Vk DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVTPAVAWYQ 506

QKPGKAPKLLIYSTSSRYTGVPSRFSGSGSGTDFTFT

ISSLQPEDIATYYCQQHYTTPLTFGQGTKLEIK A1-VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYDMSWV 507

RQAPGKSLEWVATISDAGGYIYYRDSVKGRFTISRDN AKNSLYLQMNSLRDEDTAVYICARELLHRYALDYWGQ

GTTVTVSS A1-Vk DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVTPAVAWYQ 508

QKPGKAPKLLIYSTSSRYTGVPSRFSGSGSGTDFTFT ISSLQPEDIATYYCQQHYTTPLTFGQGTKLEIK

A2-VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYDMSWV 509

RQAPGKSLEWVATISDAGGYIYYRDSVKGRFTISRDN AKNSLYLQMNSLRDEDTAVYICARELRGRYALDYWGQ

GTTVTVSS A2-Vk DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVTPAVAWYQ 510

QKPGKAPKLLIYSTSSRYTGVPSRFSGSGSGTDFTFT

ISSLQPEDIATYYCQQHYTTPLTFGQGTKLEIK A3-VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYDMSWV 511

RQAPGKSLEWVATISDAGGYIYYRDSVKGRFTISRDN AKNSLYLQMNSLRDEDTAVYICAREFGKRYALDYWGQ

GTTVTVSS A3-Vk DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVTPAVAWYQ 512

QKPGKAPKLLIYSTSSRYTGVPSRFSGSGSGTDFTFT ISSLQPEDIATYYCQQHSDAPLTFGQGTKLEIK

1.14. Propriedades de ligação ao antígeno dos anticorpos para PD-L1

[0266] Como mostrado nas Tabelas 15 e 16, no total, 9 clones únicos foram caracterizados e convertidos na IgG de tamanho natural. Propriedade de ligação ao PD-L1 humano recombinante

[0267] Para avaliar a atividade de ligação ao antígeno, os anticorpos foram submetidos ao teste ELISA. Resumidamente, as placas de microtítulo foram revestidas com a proteína PD-L1-Fc humana, a 2 μg/ml, em PBS, 100 μl/poço, a 4ºC, durante a noite, depois bloqueadas com 100 μl/poço de BSA a 5%. As diluições de 4 vezes dos anticorpos humanizados, partindo de 10 μg/ml, foram adicionadas a cada poço e incubadas por 1-2 horas, na TA. As placas foram lavadas com PBS/Tween e depois incubadas com o anticorpo IgG anti-camundongo de cabra conjugado com a Peroxidase de

Raiz-Forte (HRP), durante 1 hora, na TA. Após a lavagem, as placas foram desenvolvidas com o substrato de TMB e analisadas por espectrofotômetro, em DO 450-630 nm. Como mostrado na FIG. 18, todos os anticorpos humanizados mostraram excelente eficácia de ligação ao PD-L1 humano, e B6 e C3 se comportaram melhor do que o clone de origem WT. Propriedade de ligação ao PD-L1 humano expresso em mamíferos

[0268] Para avaliar a propriedade de ligação ao antígeno, os anticorpos foram analisados quanto à sua ligação ao PD-L1 expresso em mamífero por FACS. Resumidamente, as células PDL1-Raji foram incubadas primeiramente com os anticorpos humanizados diluídos 5 vezes em série, partindo a 2 g/ml, na TA, durante 1 hora. Após lavagem com o tampão de FACS (PBS com FBS a 2%), o Alexa 488-anticorpo IgG anti-humano foi adicionado a cada poço e incubado na TA, por 1 hora. O MFI do Alexa 488 foi avaliado por FACSAriaIII. Conforme mostrado na FIG. 19, o B6 se ligou de forma altamente eficiente ao PD-L1 expresso em células de mamíferos, o qual era mais potente do que o anticorpo de origem WT. Classificação da afinidade dos anticorpos humanizados por Biacore

[0269] Para explorar a cinética de ligação do anticorpo humanizado, este exemplo realizou a classificação da afinidade utilizando o Biacore. Como mostrado na Tabela 17, B6, C3, C6, A1 e A3 mostraram melhor afinidade do que o anticorpo de origem WT. [Tabela 17] Classificação da afinidade Anticorpo ka (1/Ms) kd (1/s) KD (M)

WT 1,77E+05 4,64E-04 2,63E-09 B3 1,19E+05 2,96E-04 2,49E-09 C4 1,13E+05 5,06E-04 4,50E-09 B1 1,63E+05 2,61E-04 1,60E-09 B6 2,42E+05 2,46E-04 1,02E-09 C3 2,18E+05 2,99E-04 1,37E-09 C6 2,06E+05 3,34E-04 1,63E-09 A1 2,03E+05 2,76E-04 1,36E-09 A2 1,87E+05 4,75E-04 2,55E-09 A3 2,18E+05 3,24E-04 1,49E-09

1.15. Função baseada na célula do anticorpo anti-PDL1

[0270] Para testar a capacidade dos anticorpos anti-PDL1 de estimular a resposta das células T, foram utilizadas as células Jurkat que expressam a hPD-1. Resumidamente, Jurkat é uma linhagem celular de leucemia de células T humanas que pode produzir a IL2 após estimulação com TCR. Neste ensaio, as células Jurkat, transfectadas com o gene de PD-1 humano pelo lentivírus, foram utilizadas como as células respondedoras. As células Raji-PDL1 foram utilizadas como as células apresentadoras de antígenos (APC). As Enterotoxinas Estafilocócicas (SE) são utilizadas para estimular o sinal de TCR. Neste sistema, o huPDL1 expresso ectopicamente pode suprimir a produção de IL-2 estimulada por SE pelas células Jurkat, enquanto os anticorpos anti-PDL1 podem reverter a produção de IL-2. Em resumo, as APCs (2,5 × 104) foram cocultivadas com as células T Jurkat que expressam a PD-1 (1 × 105), na presença da estimulação por SE. Os anticorpos anti-PDL1 (partindo de 100 nM e diluídos 1:4 em série para 8 doses) foram adicionados no início da cultura. 48 horas depois, o sobrenadante da cultura foi avaliado quanto à produção de IL2 por ELISA. Como mostrado na FIG. 20, o anticorpo monoclonal B6 era mais potente do que o anticorpo de origem WT. Exemplo 2. Preparação dos anticorpos monoclonais anti-LAG3

2.1. Exame dos anticorpos monoclonais humanos completos contra o LAG-3

[0271] Os anticorpos monoclonais humanos anti- LAG3 (mAbs α-LAG-3) foram gerados por exame das bibliotecas de exibição em fago do Fab humano completo. Os fragmentos de LAG-3-ECD-huFc do tipo selvagem podem se ligar às células Daudi, enquanto os fragmentos de LAG-3-ECD-huFc com D1-D2 truncados não conseguem se ligar às células Daudi (FIG. 21). Consequentemente, os domínios D1-D2 são críticos para a função do LAG-3.

[0272] Antígenos para a seleção da biblioteca de exibição em fago. O LAG-3 é uma proteína de membrana de passagem única do tipo I que pertence à superfamília das imunoglobulinas (Ig) e contém 4 domínios extracelulares semelhantes à Ig (ECD): domínio (D) 1, D2, D3 e D4. Uma proteína de fusão humana recombinante de LAG-3-ECD-IgG1 humana (LAG-3-huFc) ou uma proteína de fusão humana de LAG- 3-ECD-IgG1 humana com D1-D2 truncados (ΔD1D2-LAG-3-huFc) foi expressa em um Sistema de células 293T.

[0273] Biblioteca de Fago. Os segmentos de genes de Ig em mamíferos são organizados em grupos de exons variáveis (V), de diversidade (D), junção (J) e constantes (C). As bibliotecas de fagos do Fab humano foram construídas utilizando os vetores de fago, que consistem em: 1) todos os repertórios da capa variável humana (VK); e

2) a VH dos genes da linhagem germinativa VH3-23 e VH1-69, respectivamente, com as regiões CDR3 geneticamente randomizadas de pacientes humanos saudáveis.

[0274] Exame e geração de antígenos. Para selecionar os ligantes de fagos específicos para os domínios D1-D2, as bibliotecas de fagos foram submetidas à seleção com base em antígeno. I) Seleção da solução da biblioteca de fagos contra o LAG-

3.

[0275] As células 293F foram transfectadas com um plasmídeo contendo uma sequência do LAG-3 com D1-D2 removidos (△D1D2-LAG-3) com uma marca FLAG na extremidade de N. Aos 3 dias após a transfecção, as células △D1D2-LAG- 3 293F foram utilizadas para o exame da biblioteca de fagos. As bibliotecas de fagos realizaram os exames negativos sequenciais: glóbulos de estreptavidina, células 293F transfectadas com △D1D2-LAG-3 e proteína IgG1Fc humana marcada com biotina. A biblioteca resultante foi então incubada com a LAG-3-huFc LAG-3 biotinilada, por 2 horas, em movimento, seguido por incubação com 100 μL de glóbulos magnéticos de estreptavidina bloqueados com caseína por 15 min. Os fagos não ligados foram removidos por lavagem com PBS, 5-20 vezes. Os fagos ligados foram então eluídos com trietilamina (TEA) a 100 mM recentemente preparada e neutralizados com a adição de tampão de Tris- HCl. Os fagos resultantes foram rotulados como as bibliotecas de fagos Output-1. As bibliotecas de fagos Output-1 foram submetidas ao mesmo exame conforme descrito acima, para gerar as bibliotecas de fagos Output-2 e Output-3 subsequentes. Três rodadas do exame da biblioteca de fagos foram realizadas no total. II) Seleção em imunotubo da biblioteca de fagos contra o LAG-3

[0276] As bibliotecas de fagos foram utilizadas para realizar os exames sequenciais negativos: imunotubos revestidos com caseína, células 293F transfectadas com △D1D2-LAG-3 e proteína IgG1Fc humana. A biblioteca resultante foi então incubada nos imunotubos revestidos com LAG3-huFc, por 2 horas, em movimento. Os fagos não ligados foram removidos por lavagem com PBST, 5-20 vezes. Semelhante à seleção com base em células, foram realizadas três rodadas do exame da biblioteca de fagos no total.

[0277] As bibliotecas de fagos Output-3 foram diluídas e preparadas em placas para desenvolver, a 37ºC, por 8 h, e capturadas por filtros revestidos com anticorpo anti-capa, durante a noite, a 22ºC. A LAG-3-huFc biotinilada (50 nM) e o conjugado de NeutrAvidin-AP foram aplicados ao filtro, para detectar os fagos anti-LAG3 de ligação ao antígeno. As placas de fagos positivas foram selecionadas e eluídas em 100 μL de tampão de eluição de fago. Cerca de 10-15 μL de fagos eluídos foram então utilizados para infectar 1 mL de células competentes XL1- Blue para preparar um fago de alto título (HT) para o ELISA de ponto único (SPE) do fago (substrato imobilizado do ELISA revestido com 50 nM de cada proteína testada). 1x1010 unidades formadoras de placa (pfus) de cada acerto de fago foram utilizadas para a confirmação do SPE. Os clones positivos escolhidos a partir da elevação do filtro foram então testados quanto à ligação do antígeno LAG-3 com LAG- 3-huFc e ΔD1D2-LAG-3-huFc. Os ligantes específicos para D1-

D2 foram amplificados a partir dos fagos positivos para o antígeno por PCR e sequenciados. As sequências dos genes V da cadeia leve de Ig (VL) e VH foram analisados para identificar as sequências únicas e determinar a diversidade de sequências.

[0278] As sequências dos genes VL e VH de todos os acertos foram clonadas nos vetores de expressão pFUSE2ss-CLIg-hk (cadeia leve, InvivoGen Cat No. pfuse2ss- hclk) e pFUSEss-CHIg-hG1 (cadeia pesada, InvivoGen Cat No. pfusess-hchg1). Os anticorpos foram expressos nas células HEK293 e purificados utilizando Proteína A PLUS-Agarose. As sequências dos anticorpos e as suas regiões CDR são proporcionadas na tabela abaixo. [Tabela 18] regiões variáveis da cadeia pesada No. do Anticorpo VH SEQ ID NO: NLAG3-HDB169-T03 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKAS 254

GGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGG IIPIFGTANYAQKFQGRVTITADES TSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGS

SWFDYWGQGTLVTVSS NLAG3-HDB169-T05 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKAS 255

GGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGG IIPIFGTANYAQKFQGRVTITADES TSTAYMELSSLRSEDTAVYYCASSY

HGGGYHRYWGQGTLVTVSS NLAG3-HDB169-T06 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKAS 256

GGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGG IIPIFGTANYAQKFQGRVTITADES TSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTTSK YSGSALRYWGQGTLVTVSS

NLAG3-HDB169-T07 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKAS 257

GGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGG IIPIFGTANYAQKFQGRVTITADES TSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDR

TGAFDYWGQGTLVTVSS NLAG3-HDB169-T08 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKAS 258

GGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGG IIPIFGTANYAQKFQGRVTITADES TSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARHE

TVAGSFDYWGQGTLVTVSS NLAG3-HDB169-T10 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKAS 259

GGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGG IIPIFGTANYAQKFQGRVTITADES TSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARTG

YYGGNSGAFDIWGQGTMVTVSS NLAG3-HDB169-T13 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKAS 260

GGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGG IIPIFGTANYAQKFQGRVTITADES TSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARAG

TGMDLVFNSWGQGTLVTVSS NLAG3-HDB169-T23 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKAS 261

GGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGG IIPIFGTANYAQKFQGRVTITADES TSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGL

ARGDLNFGYWGQGTLVTVSS NLAG3-HDB169-S24 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKAS 262

GGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGG IIPIFGTANYAQKFQGRVTITADES TSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTREP

HFDYWGQGTLVTVSS NLAG3-HDB169-S27 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKAS 263

GGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGG IIPIFGTANYAQKFQGRVTITADES TSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTTAA

PGSYYLVFHYWGQGTLVTVSS NLAG3-HDB169-S31 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKAS 264

GGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGG IIPIFGTANYAQKFQGRVTITADES TSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDA

GPVGYYGMDVWGQGTTVTVSS NLAG3-HDB169-S32 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKAS 265

GGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGG IIPIFGTANYAQKFQGRVTITADES TSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAGDG

LYGSGSFGYWGQGTPVTVSS NLAG3-HDB169-S61 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKAS 266

GGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGG IIPIFGTANYAQKFQGRVTITADES

TSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAKDI RWFYGMDVWGQGTTVTVSSw NLAG3-HDB169-S64 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKAS 267

GGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGG IIPIFGTANYAQKFQGRVTITADES TSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARHE

SGIAGGHFDYWGQGTLVTVSS NLAG3-HDB169-S86 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKAS 268

GGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGG IIPIFGTANYAQKFQGRVTITADES TSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDA

GPVGYYGMDVWGQGTTVTVS NLAG3-HDB169-S87 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKAS 269

GGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGG IIPIFGTANYAQKFQGRVTITADES TSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAKDI

RWYYGMDVWGQGTTVTVSS NLAG3-HDB169-T94 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVFCKAS 270

GGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGG IIPIFGTANYAQKFQGRVTITADES TSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAKGV

RGTYQIGYYGMDVWGQGTTVTVSS NLAG3-HDB169-T97 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKAS 271

GGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGG IIPIFGTANYAQKFQGRVTITADES TSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARQG

TAMALDYWGQGTLVTVSS NLAG3-HDB169-T99 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKAS 272

GGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGG IIPIFGTANYAQKFQGRVTITADES TSTAYMELSSLRSEDTAVYYCVRDL

QDWNYGGAAYWGQGTLVTVSS NLAG3-HDB169-S103 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKAS 273

GGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGG IIPIFGTANYAQKFQGRVTITADES TSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDD

YYYGQFDSWGQGTLVTVSS NLAG3-HDB169-S107 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKAS 274

GGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGG IIPIFGTANYAQKFQGRVTITADES TSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAREI

TGTSYTALDSWGQGTLVTVSS NLAG3-HDB169-S109 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKAS 275

GGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGG IIPIFGTANYAQKFQGRVTITADES TSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGH

IDGQAAGDYWGQGTLVTVSS NLAG3-HDB169-S119 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKAS 276

GGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGG IIPIFGTANYAQKFQGRVTITADES TSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAAST

LRVPNPPYWGQGTLVTVSS NLAG3-HDB169-S120 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKAS 277

GGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGG IIPIFGTANYAQKFQGRVTITADES TSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSG

DRYDFWSGYWGQGTLVTVSS NLAG3-HDB169-S127 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKAS 278

GGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGG IIPIFGTANYAQKFQGRVTITADES TSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAAST

LRVPNPPYWGQGTLVTVSS NLAG3-HDB169-S128 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKAS 279

GGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGG IIPIFGTANYAQKFQGRVTITADES TSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDA

GPVGYYGMDVWGQGTMVTVSS NLAG3-HDB169-S136 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKAS 280

GGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGG IIPIFGTANYAQKFQGRVTITADES TSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTRGQ

DSTWYSSFDYWGQGTLVTVSS NLAG3-HDB169-S139 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKAS 281

GGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGG IIPIFGTANYAQKFQGRVTITADES TSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAAST

LRLPNPPYWGQGTLVTVSS NLAG3-HDB169-S150 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKAS 282

GGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGG IIPIFGTANYAQKFQGRVTITADES TSTAYMELSSLRSEDTAVYYCATTQ

TSFYSHGMDVWGQGTTVTVSS NLAG3-HDB169-S157 QLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGF 283

TFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAIS GSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKN TLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVRKT

PFWGALDSWGRGTLVTVSS NLAG3-HDB169-S164 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKAS 284

GGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGG IIPIFGTANYAQKFQGRVTITADES TSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGF

TYGDFIFDYWGQGTLVTVSS NLAG3-HDB169-S177 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKAS 285

GGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGG IIPIFGTANYAQKFQGRVTITADES TSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDV RGVTYLGMDVWGQGTTVTVSS

NLAG3-HDB323-S20 QLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGF 286

TFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAIS GSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKN TLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVRKT

PFWGTLDSWGRGTLVTVSS NLAG3-HDB323-S21 QLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGF 287

TFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAIS GSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKN TLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVRRT

PFWGALDSWGRGTLVTVSS NLAG3-HDB323-S32 QLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGF 288

TFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAIS GSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKN TLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVRKT

PFWGALDSWGRGTLVTVSS NLAG3-HDB323-S35 QLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGF 289

TFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAIS GSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKN TLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKRKGL

GSPTDYYYGMDVWGQGTTVTVSS NLAG3-HDB323-S52 QLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGF 290

TFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAIS GSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKN TLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVRKT

PFWGALDSWGRGTLVTVSS NLAG3-HDB323-S55 QLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGF 291

TFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAIS GSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKN TLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVRKT

PFWGTLDSWGRGSLVTVSS NLAG3-HDB323-T89 QLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGF 292

TFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAIS GSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKN TLYLQMNSLRAEDTAVYYCVRPEYD

TYYYGMDVWGQGTTVTVSS NLAG3-HDB323-T92 QLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGF 293

TFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAIS GSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKN TLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGGGS

YDYWGQGTLVTVSS NLAG3-HDB323-T94 QLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGF 294

TFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAIS GSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKN TLYLQMNSLRAEDTAVYYCARALNG

MDVWGQGTMVTVSS NLAG3-HDB323-S102 QLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGF 295

TFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAIS GSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKN TLYLQMNSLRAEDTAVYYCTRPLQG

IAAADSYYYYAMDVWGQGTTVTVSS NLAG3-HDB323-S103 QLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGF 296

TFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAIS GSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKN TLYLQMNSLRAEDTAVYYCARLHSY

LSEEFDPWGQGTLVTVSS NLAG3-HDB323-S107 QLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGF 297

TFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAIS GSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKN TLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVRKT

PFWGALDSWGRGTLVTVSS NLAG3-HDB323-S114 QLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGF 298

TFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAIS GSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKN TLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKLSAV

NTYIDDWGQGTLVTVSS NLAG3-HDB323-S135 QLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGF 299

TFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAIS GSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKN TLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVTKT

PFWGTLDYWGQGTLVTVSS NLAG3-HDB323-S143 QLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGF 300

TFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAIS GSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKN TLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVRRT

PFWGALDSWGRGTLVTVSS NLAG3-HDB323-S146 QLLESGGGLVQPGGSLRLSCAAS 301

GFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWV SAIS GSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKN TLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVSQS

PVWGYFDYWGQGMLVTVSS NLAG3-HDB323-S161 QLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGF 302

TFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAIS GSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKN TLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDGYY

DFWSGYSDYWGQGTLVTVSS [Tabela 19] CDRs da Cadeia Pesada

No. do CDR H1 SEQ ID CDR H2 SEQ ID CDR H3 SEQ ID Anticorpo NO: NO: NO: NLAG3- SYAIS 116 GIIPIF 118 ARGSSW 120 HDB169- GTANYA FDY T03 QKFQG NLAG3- SYAIS 116 GIIPIF 118 ASSYHG 121 HDB169- GTANYA GGYHRY T05 QKFQG NLAG3- SYAIS 116 GIIPIF 118 TTSKYS 122 HDB169- GTANYA GSALRY T06 QKFQG NLAG3- SYAIS 116 GIIPIF 118 ARDRTG 123 HDB169- GTANYA AFDY T07 QKFQG NLAG3- SYAIS 116 GIIPIF 118 ARHETV 124 HDB169- GTANYA AGSFDY T08 QKFQG NLAG3- SYAIS 116 GIIPIF 118 ARTGYY 125 HDB169- GTANYA GGNSGA T10 QKFQG FDI NLAG3- SYAIS 116 GIIPIF 118 ARAGTG 126 HDB169- GTANYA MDLVFN T13 QKFQG S NLAG3- SYAIS 116 GIIPIF 118 ARGLAR 127 HDB169- GTANYA GDLNFG T23 QKFQG Y NLAG3- SYAIS 116 GIIPIF 118 TREPHF 128 HDB169- GTANYA DY S24 QKFQG

NLAG3- SYAIS 116 GIIPIF 118 TTAAPG 129 HDB169- GTANYA SYYLVF S27 QKFQG HY NLAG3- SYAIS 116 GIIPIF 118 ARDAGP 130 HDB169- GTANYA VGYYGM S31 QKFQG DV NLAG3- SYAIS 116 GIIPIF 118 AGDGLY 131 HDB169- GTANYA GSGSFG S32 QKFQG Y NLAG3- SYAIS 116 GIIPIF 118 AKDIRW 132 HDB169- GTANYA FYGMDV S61 QKFQG NLAG3- SYAIS 116 GIIPIF 118 ARHESG 133 HDB169- GTANYA IAGGHF S64 QKFQG DY NLAG3- SYAIS 116 GIIPIF 118 ARDAGP 130 HDB169- GTANYA VGYYGM S86 QKFQG DV NLAG3- SYAIS 116 GIIPIF 118 AKDIRW 134 HDB169- GTANYA YYGMDV S87 QKFQG NLAG3- SYAIS 116 GIIPIF 118 AKGVRG 135 HDB169- GTANYA TYQIGY T94 QKFQG YGMDV NLAG3- SYAIS 116 GIIPIF 118 ARQGTA 136 HDB169- GTANYA MALDY T97 QKFQG NLAG3- SYAIS 116 GIIPIF 118 VRDLQD 137 HDB169- GTANYA WNYGGA

T99 QKFQG AY NLAG3- SYAIS 116 GIIPIF 118 ARDDYY 138 HDB169- GTANYA YGQFDS S103 QKFQG NLAG3- SYAIS 116 GIIPIF 118 AREITG 139 HDB169- GTANYA TSYTAL S107 QKFQG DS NLAG3- SYAIS 116 GIIPIF 118 ARGHID 140 HDB169- GTANYA GQAAGD S109 QKFQG Y NLAG3- SYAIS 116 GIIPIF 118 AASTLR 141 HDB169- GTANYA VPNPPY S119 QKFQG NLAG3- SYAIS 116 GIIPIF 118 ARSGDR 142 HDB169- GTANYA YDFWSG S120 QKFQG Y NLAG3- SYAIS 116 GIIPIF 118 AASTLR 141 HDB169- GTANYA VPNPPY S127 QKFQG NLAG3- SYAIS 116 GIIPIF 118 ARDAGP 130 HDB169- GTANYA VGYYGM S128 QKFQG DV NLAG3- SYAIS 116 GIIPIF 118 TRGQDS 143 HDB169- GTANYA TWYSSF S136 QKFQG DY NLAG3- SYAIS 116 GIIPIF 118 AASTLR 144 HDB169- GTANYA LPNPPY S139 QKFQG NLAG3- SYAIS 116 GIIPIF 118 ATTQTS 145

HDB169- GTANYA FYSHGM S150 QKFQG DV NLAG3- SYAIS 116 GIIPIF 118 ARVRKT 146 HDB169- GTANYA PFWGAL S157 QKFQG DS NLAG3- SYAIS 116 GIIPIF 118 ARGFTY 147 HDB169- GTANYA GDFIFD S164 QKFQG Y NLAG3- SYAIS 116 GIIPIF 118 ARDVRG 148 HDB169- GTANYA VTYLGM S177 QKFQG DV NLAG3- SYAMS 117 AISGSG 119 ARVRKT 149 HDB323- GSTYYA PFWGTL S20 DSVKG DS NLAG3- SYAMS 117 AISGSG 119 ARVRRT 150 HDB323- GSTYYA PFWGAL S21 DSVKG DS NLAG3- SYAMS 117 AISGSG 119 ARVRKT 146 HDB323- GSTYYA PFWGAL S32 DSVKG DS NLAG3- SYAMS 117 AISGSG 119 AKRKGL 151 HDB323- GSTYYA GSPTDY S35 DSVKG YYGMDV NLAG3- SYAMS 117 AISGSG 119 ARVRKT 146 HDB323- GSTYYA PFWGAL S52 DSVKG DS NLAG3- SYAMS 117 AISGSG 119 ARVRKT 149 HDB323- GSTYYA PFWGTL S55 DSVKG DS

NLAG3- SYAMS 117 AISGSG 119 VRPEYD 152 HDB323- GSTYYA TYYYGM T89 DSVKG DV NLAG3- SYAMS 117 AISGSG 119 AKGGGS 153 HDB323- GSTYYA YDY T92 DSVKG NLAG3- SYAMS 117 AISGSG 119 ARALNG 154 HDB323- GSTYYA MDV T94 DSVKG NLAG3- SYAMS 117 AISGSG 119 TRPLQG 155 HDB323- GSTYYA IAAADS S102 DSVKG YYYYAM

DV NLAG3- SYAMS 117 AISGSG 119 ARLHSY 156 HDB323- GSTYYA LSEEFD S103 DSVKG P NLAG3- SYAMS 117 AISGSG 119 ARVRKT 146 HDB323- GSTYYA PFWGAL S107 DSVKG DS NLAG3- SYAMS 117 AISGSG 119 AKLSAV 157 HDB323- GSTYYA NTYIDD S114 DSVKG NLAG3- SYAMS 117 AISGSG 119 ARVTKT 158 HDB323- GSTYYA PFWGTL S135 DSVKG DY NLAG3- SYAMS 117 AISGSG 119 ARVRRT 150 HDB323- GSTYYA PFWGAL S143 DSVKG DS NLAG3- SYAMS 117 AISGSG 119 ARVSQS 159

HDB323- GSTYYA PVWGYF S146 DSVKG DY NLAG3- SYAMS 117 AISGSG 119 AKDGYY 160 HDB323- GSTYYA DFWSGY S161 DSVKG SDY [Tabela 20] Regiões variáveis da cadeia leve No. do Anticorpo VL SEQ ID NO: NLAG3-HDB169-T03 DIQLTQSPSSLSAFVGDRVTITCQANQ 303

DIHHYLNWYQQKPGKAPKLLIYD ASILQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISS LQPEDFATYFCQQADSFPITFGQ

GTRLEIKR NLAG3-HDB169-T05 EIVLTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQ 304

SVLYSSSNKNYLAWYQQKPGQPP KLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDF TLTISSLQPEDFATYYCQQSYST

PWTFGPGTKLEIKR NLAG3-HDB169-T06 DIQMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQ 305

SVLYSSNNKNYLAWYQQKPGHPP KLLVYWASTRESGVPARFSASGSGTDF TLAISNLQAEDVAVYYCQQYYST

PWTFGQGTKVEIKR NLAG3-HDB169-T07 EIVLTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQ 306

NLLHSDGYNYLNWYLQKPGQSPQ LLIYLGSNRATGVPDRFSGSGSGTDFT LTISSLQPEDFATYYCQQSYSTP

WTFGQGTKVEIKR NLAG3-HDB169-T08 DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQ 307

SVLYTSNNKNYLAWYQQKPGQPP KLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDF TLTISSLQAEDVAIYYCQQYYST

PWTFGQGTKLEIKR NLAG3-HDB169-T10 AIQLTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQ 308

SVLYSSNNKNYLAWYQQKPGQPP KLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDF TLTISSLQAEDSATYYCQQSFTT

PWTFGQGTKVEIKR NLAG3-HDB169-T13 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQ 309

DINRYLSWYQQKPGKAPKLLIYD ASNLETGVPSRFSGSASGTDFTFAISS LQPEDIATYYCQQYDNLPPTFGQ

GTRLEIKR NLAG3-HDB169-T23 EIVMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQ 310

DISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYA ASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISS LQPEDFASYYCQQSYGSPVTFGQ

GTKLEIKR NLAG3-HDB169-S24 EIVMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQ 311

DISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYD ASNLETGVPSRFSGSGSGTEFTLTISS LRPEDFATYFCQQADSFPITFGQ

GTRLEIKR NLAG3-HDB169-S27 DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQ 312

TISSHLNWYQQKPGKAPKVLIYA ASSLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISS LQPDDFATYYCQQGNSFPFTFGP GTKVEIKR

NLAG3-HDB169-S31 AIRMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQ 313

GIAGWLAWYQQKPGKAPKLLIYA ASSLQSGVPSRFSGSASGTDFTLTISN LQPEDFATYYCQQAKSFPLTFGG

GTKVEIKR NLAG3-HDB169-S32 DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQ 314

SVLYSSNNKNYLAWYQQKPGQPP KLLIYWASTRESGVPDRFSGTGSGTDF TLTISSLQAEDVAVYYCQQSYST

PWTFGQGTKLEIK NLAG3-HDB169-S61 DIVMTQSPSSVSAFVGDRVTITCRASQ 315

GVSSWLAWFQQKPGKAPKLLIYA ASTLQSGVPSRFSGRGYGTEFTLTISS LQPEDLATYYCQQVKSFPLTFGG

GTKVDIKR NLAG3-HDB169-S64 DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQ 316

SLFYHSNNHNYLAWYQQKPGQPP KLLIYWASTRQSGVPDRFTGSGSGTDF TLTISSLQAEDVAVYYCQQYYNT

PWTFGQGTKVEIKR NLAG3-HDB169-S86 AIRMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQ 317

GIAGWLAWYQQKPGKAPKLLIYA ASSLQSGVPSRFSGSASGTDFTLTISN LQPEDFATYYCQQAKSFPLTFGG

GTKVEIKR NLAG3-HDB169-S87 DIVMTQSPSSVSAFVGDRVTITCRASQ 318

GVSSWLAWFQQKPGKAPKLLIYA ASTLQSGVPSRFSGRGYGTEFTLTISS LQPEDLATYYCQQVKSFPLTFGG

GTKVDIKR NLAG3-HDB169-T94 DIVMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQ 319

GISSSLAWYQQKPGKAPNLLIYT ASTLQNGVPSRFSGSGSGTDFTLTISG LQPEDFATYYCQQTKNFPLTFGQ

GTRLEIKR NLAG3-HDB169-T97 EIVLTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQ 320

SVLYSSNNKNYLAWYQQRPGQPP KLLISWASTRESGVPDRFSGSGSGADF SLTISSLQAEDVAVYYCQQYYST

PWTFGQGTKLEIKR NLAG3-HDB169-T99 VIWMTQSPSSLSASVGDSVTITCQASR 321

DISNSLSWHQQKPGKAPKLLIYA ASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISS LQPEDFATYYCQQTKSFPLTFGG

GTKVEIKR NLAG3-HDB169-S103 EIVMTQSPSSLSASVGDRVTISCRASQ 322

SISRYLNWYQQKPGQAPKLLIYA AFSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISS LQPEDFATYYCQQSYNTPRTFGQ

GTKLEIKR NLAG3-HDB169-S107 DVVMTQSPSTVSASVGDRITITCRASR 323

SISNWLAWYQQKPGKAPKLLIYA ASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISS LQPEDFATYYCQQAKSFPLTFGG

GTKVEIK NLAG3-HDB169-S109 DIQLTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQ 324

SVFYRSNQKNYLAWYQQKPGQTP RLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDF TLTISSLQPEDFATYYCQQSYRA

PWTFGQGTKVEIKR NLAG3-HDB169-S119 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQ 325

SVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYG ISSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISS LQPEDFATYYCQQANNFPLTFGG

GTKLEIKR NLAG3-HDB169-S120 EIVLTQSPSSVSASVGDRVTITCRASR 326

GISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYA ASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISS LQPEDFATYYCQQAKSFPLTFGG

GTKVEIKR NLAG3-HDB169-S127 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQ 327

SVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYG ISSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISS LQPEDFATYYCQQANNFPLTFGG

GTKLEIKR NLAG3-HDB169-S128 AIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQ 328

GISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYA ASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISR LQPEDFATYYCQQAKSFPLTFGG

GTKVEIKR NLAG3-HDB169-S136 AIRMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQ 329

SISSYLNWYQQKPGKAPNLLIYA VSTLQSGVPSRFSGSGSGTVFTLTISS LQPEDFATYFCQQGNSFPLTFGG

GTKVEIKR NLAG3-HDB169-S139 DIQLTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQ 330

AISNLLAWYQQKPGKPPNLLIYD ISTLQNGVPSRFSGSGSGTDFTLTINS LQPEDFAIYYCQQSKNFPVTFGG

GTKVEIKR NLAG3-HDB169-S150 DIQLTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQ 331

GISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYG ASTLQSGVPSRFSGSGSGADYTLTISS LQPEDFATYYCQQANSFPLTFAG

GTKLEIKR NLAG3-HDB169-S157 DIQLTQSPSSLSASPGDRVTITCRASQ 332

GISTWLAWYQQKPGNAPKLLIYA ASSLQSGVPSRFSGSKSGTEYTLTISS LQPEDFATYYCQQLESYPLTFGG

GTKVEIKR NLAG3-HDB169-S164 AIRMTQSPDSLVVSLGERATINCKSSQ 333

SVLYSSNNKNYLAWYQQKPGQPP KLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDF TLSISSLQAEDVAVYYCQQYYSS

PTFGGGTKVEIKR NLAG3-HDB169-S177 DVVMTQSPFFLSASVGDRVTITCRASQ 334

GIASNLAWYQQKPGKAPKLLIYA ASTLQSGVPSRFTGSGSGTEFTLTVTS LQPEDFATYYCQQLKTFPLTFGG

GTKVEIKR NLAG3-HDB323-S20 VIWMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQ 335

GVSSYLAWYQQKPGKAPKLLIYA ASSLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISS LQPEDFATYYCQQTNWFPLTFGP

GTRLEIKR NLAG3-HDB323-S21 DIQMTQSPSSLSTSAGDTVTITCRASQ 336

SIYTYLNWYQQKPGKAPNLLIYG ASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISS LQPEDFATYYCQQAQSFPITFGQ

GTRLEIKR NLAG3-HDB323-S32 VIWMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQ 337

GISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYA ASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISS LQPEDFATYYCQQAHSFPLTFGG

GTKVEIKR NLAG3-HDB323-S35 AIQLTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQ 338

FVSDWLAWYQQKPGKAPKLLIYA ASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISS LQPEDLATYYCLQDYHFPLTFGG

GTKLEIKR NLAG3-HDB323-S52 DVVMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQ 339

DIVNWLAWYQQKPGKAPKLLIYA ASTLESGAPSRFSASGSGTDFTLTISS LQPDDFATYYCQQGHSFPLTFGP

GTKLEIKR NLAG3-HDB323-S55 DIVMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQ 340

SIYTYLNWYQQKPGKAPKLLIYD ASSLQSGVPSRFSGSGYGTEFTLTISG LQPEDFATYYCQQSYIFPLTFGR

GTKVEIKR NLAG3-HDB323-T89 AIRMTQSPSFVSASVGDRVTIACRASQ 341

TISTWLAWYQQKPGKAPKVLISK ASNLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISS LQPDDFATYYCQQYDTYWTFGQG TKVEIKR

NLAG3-HDB323-T92 AIRMTQSPSFVSASVGDRVTIACRASQ 342

TISTWLAWYQQKPGKAPKVLISK ASNLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISS LQPDDFATYYCQQYDTYWTFGQG

TKVEIKR NLAG3-HDB323-T94 DIVMTQSPSFVSASVGDTVTITCRASQ 343

GISSYLAWYQQKPGKAPKLLIYA ASTLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISS LQPEDFATYYCQQLNSYPLFTFG

PGTKVEIKR NLAG3-HDB323-S102 DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQ 344

SIGYWLAWYQQKPGKAPKLLIYR ASSLQSGVPSRFSGSGSATEFTLTITS LQPDDFATYFCQQYSSYWTFGQG

TKVEIKR NLAG3-HDB323-S103 EIVLTQSPSSLSASVGDTVTITCRATQ 345

SISSWLAWYQQKPGKAPQRLISG ASTLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISG LQPEDFATYYCLQHNTYPFTFGQ

GTKVEIKR NLAG3-HDB323-S107 DIVMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQ 346

GVRNWLAWYQQKPGKAPKLLIYA ASHLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISS LQTDDFATYYCQQGHSFPLTFGG

GTKVEIKR NLAG3-HDB323-S114 DIVMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQ 347

GVRNWLAWYQQKPGKAPKLLIYA ASHLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISS LQTDDFATYYCQQGHSFPLTFGG

GTKVEIKR NLAG3-HDB323-S135 VIWMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQ 348

SINNYLAWYQQKPGKAPKLLIYD ASTLQSGVPSRFSGGGSGTDFTLTINS LQPDDFASYYCQQAHSFPFTFGG

GTKLEIKR NLAG3-HDB323-S143 EIVMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQ 349

DITSWLAWYQQKPGKAPKLLIYA ASTLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTITG LQPEDFATYYCQQANMFPLTFGG

GTKVEIKR NLAG3-HDB323-S146 AIRMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQ 350

GIYDYLAWYQQKPGKAPSLLIYA ASNLERGVPSRFSGSGSGKYFILTISS LQPEDFATYYCQQANSFPLTFGG

GTKVEIKR NLAG3-HDB323-S161 AIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASE 351

GISGWLAWYQQIPGKAPKLLIYA ASSLETGVPSRFSGSGYGTDFTLTISS LQPEDFATYYCQQADSFPFTFGP

GTKVEIKR [Tabela 21] CDRs da Cadeia Leve No. do CDR L1 SEQ ID CDR L2 SEQ ID CDR L3 SEQ ID Anticorpo NO: NO: NO: NLAG3- QANQDI 161 DASILQ 196 QQADSF 218 HDB169-T03 HHYLN S PIT

NLAG3- KSSQSV 162 WASTRE 197 QQSYST 219 HDB169-T05 LYSSSN S PWT

KNYLA NLAG3- KSSQSV 163 WASTRE 197 QQYYST 220 HDB169-T06 LYSSNN S PWT

KNYLA NLAG3- RSSQNL 164 LGSNRA 198 QQSYST 219 HDB169-T07 LHSDGY T PWT

NYLN NLAG3- KSSQSV 165 WASTRE 197 QQYYST 220 HDB169-T08 LYTSNN S PWT

KNYLA NLAG3- KSSQSV 163 WASTRE 197 QQSFTT 221 HDB169-T10 LYSSNN S PWT

KNYLA NLAG3- QASQDI 166 DASNLE 199 QQYDNL 222 HDB169-T13 NRYLS T PPT NLAG3- QASQDI 167 AASSLQ 200 QQSYGS 223 HDB169-T23 SNYLN S PVT NLAG3- QASQDI 167 DASNLE 199 QQADSF 218 HDB169-S24 SNYLN T PIT NLAG3- RASQTI 168 AASSLQ 200 QQGNSF 224 HDB169-S27 SSHLN S PFT NLAG3- RASQGI 169 AASSLQ 200 QQAKSF 225 HDB169-S31 AGWLA S PLT NLAG3- KSSQSV 163 WASTRE 197 QQSYST 219 HDB169-S32 LYSSNN S PWT

KNYLA NLAG3- RASQGV 170 AASTLQ 201 QQVKSF 226

HDB169-S61 SSWLA S PLT NLAG3- KSSQSL 171 WASTRQ #N/A QQYYNT 227 HDB169-S64 FYHSNN S PWT

HNYLA NLAG3- RASQGI 169 AASSLQ 200 QQAKSF 225 HDB169-S86 AGWLA S PLT NLAG3- RASQGV 170 AASTLQ 201 QQVKSF 226 HDB169-S87 SSWLA S PLT NLAG3- RASQGI 172 TASTLQ 212 QQTKNF 228 HDB169-T94 SSSLA N PLT NLAG3- KSSQSV 163 WASTRE 197 QQYYST 220 HDB169-T97 LYSSNN S PWT

KNYLA NLAG3- QASRDI 173 AASSLQ 200 QQTKSF 230 HDB169-T99 SNSLS S PLT NLAG3- RASQSI 174 AAFSLQ 202 QQSYNT 231 HDB169- SRYLN S PRT S103 NLAG3- RASRSI 175 AASSLQ 200 QQAKSF 225 HDB169- SNWLA S PLT S107 NLAG3- KSSQSV 176 GASSRA 203 QQSYRA 232 HDB169- FYRSNQ T PWT S109 KNYLA NLAG3- RASQSV 177 GISSRA 204 QQANNF 233 HDB169- SSYLA T PLT S119 NLAG3- RASRGI 178 AASTLQ 201 QQAKSF 225 HDB169- SSWLA S PLT

S120 NLAG3- RASQSV 177 GISSRA 204 QQANNF 233 HDB169- SSYLA T PLT S127 NLAG3- RASQGI 179 AASSLQ 200 QQAKSF 225 HDB169- SSWLA S PLT S128 NLAG3- RASQSI 180 AVSTLQ 205 QQGNSF 234 HDB169- SSYLN S PLT S136 NLAG3- RASQAI 181 DISTLQ 206 QQSKNF 235 HDB169- SNLLA N PVT S139 NLAG3- RASQGI 179 GASTLQ 207 QQANSF 236 HDB169- SSWLA S PLT S150 NLAG3- RASQGI 182 AASSLQ 200 QQLESY 237 HDB169- STWLA S PLT S157 NLAG3- KSSQSV 163 WASTRE 197 QQYYSS 238 HDB169- LYSSNN S PT S164 KNYLA NLAG3- RASQGI 183 AASTLQ 201 QQLKTF 239 HDB169- ASNLA S PLT S177 NLAG3- RASQGV 184 AASSLQ 200 QQTNWF 240 HDB323-S20 SSYLA S PLT NLAG3- RASQSI 185 GASSLQ 208 QQAQSF 241 HDB323-S21 YTYLN S PIT

NLAG3- RASQGI 179 AASSLQ 200 QQAHSF 242 HDB323-S32 SSWLA S PLT NLAG3- RASQFV 186 AASTLQ 201 LQDYHF 243 HDB323-S35 SDWLA S PLT NLAG3- RASQDI 229 AASTLE 209 QQGHSF 244 HDB323-S52 VNWLA S PLT NLAG3- RASQSI 185 DASSLQ 210 QQSYIF 245 HDB323-S55 YTYLN S PLT NLAG3- RASQTI 187 KASNLQ 211 QQYDTY 246 HDB323-T89 STWLA S WT NLAG3- RASQTI 187 KASNLQ 211 QQYDTY 246 HDB323-T92 STWLA S WT NLAG3- RASQGI 188 AASTLQ 201 QQLNSY 247 HDB323-T94 SSYLA S PLFT NLAG3- RASQSI 189 RASSLQ 213 QQYSSY 248 HDB323- GYWLA S WT S102 NLAG3- RATQSI 190 GASTLQ 207 LQHNTY 249 HDB323- SSWLA S PFT S103 NLAG3- RASQGV 191 AASHLQ 214 QQGHSF 244 HDB323- RNWLA S PLT S107 NLAG3- RASQGV 191 AASHLQ 214 QQGHSF 250 HDB323- RNWLA S PLT S114 NLAG3- RASQSI 192 DASTLQ 215 QQAHSF 251 HDB323- NNYLA S PFT S135

NLAG3- RASQDI 193 AASTLE 209 QQANMF 252 HDB323- TSWLA S PLT S143 NLAG3- RASQGI 194 AASNLE 216 QQANSF 236 HDB323- YDYLA R PLT S146 NLAG3- RASEGI 195 AASSLE 217 QQADSF 253 HDB323- SGWLA T PFT S161

2.2. A ligação dos anticorpos anti-LAG3 humanos à proteína LAG3 derivada de várias espécies.

[0279] Para avaliar a capacidade dos anticorpos anti-LAG-3 de se ligarem ao LAG3 humano, de rato e de camundongo, os anticorpos identificados no Exemplo 2.1 foram avaliados quanto à sua propriedade de ligação através do ELISA. As proteínas LAG3 ECD-Fc humana, de rato e de camundongo foram revestidas na placa do ELISA, a 1 μg/ml, com 100 μl/poço. Os anticorpos do Exemplo 1 foram diluídos em série com o tampão diluente do ELISA. Para avaliar a ligação, os anticorpos para LAG-3 em várias concentrações (10 μg/ml, 3,333 μg/ml, 1,111 μg/ml, 0,370 μg/ml, 0,123 μg/ml, 0,041 μg/ml, 0,014 μg/ml, 0,005 μg/ml, 0,0015 μg/ml e 0,0005 μg/ml) foram então adicionados à placa revestida com o antígeno LAG3, por 1,5 h, TA. As placas resultantes foram lavadas e depois marcadas com o anticorpo IgG(Fab)- HRP anti-humano. O S31 só pode se ligar ao LAG3 humano. O S27 e o T99 podem se ligar ao LAG3 humano e ao LAG3 de rato/camundongo com menor potência. O anticorpo S119 pode se ligar ao LAG3 humano, de rato e de camundongo em alta potência (FIGS. 22A-22D).

2.3. A ligação dos anticorpos anti-LAG3 humanos ao antígeno LAG-3 da superfície celular nas células T CD4+ primárias humanas ativadas.

[0280] O LAG-3 é expresso nas células T ativadas ou exauridas. As células T CD4+ foram isoladas utilizando os glóbulos magnéticos de CD4. As células T CD4+ humanas purificadas foram estimuladas com o CD3/CD28 Ativador de T Humano Dynabeads® por 72 horas. Os anticorpos do Exemplo

2.1 foram diluídos em série com o tampão de FACS. Para avaliar a ligação, os anticorpos para LAG-3 em várias concentrações (10 μg/ml, 3,333 μg/ml, 1,111 μg/ml, 0,370 μg/ml, 0,123 μg/ml, 0,041 μg/ml, 0,014 μg/ml e 0,005 μg/ml) foram então adicionados às células T CD4 humanas ativadas, na presença de anticorpo anti-LAG3 PE humano de camundongo (eBioscience, clone: 3DS223H), por 30 min, em gelo. As células marcadas foram lavadas com tampão de FACS e subsequentemente marcadas com os anticorpos IgG anti- humanos conjugados com APC, por 30 min, em gelo. As células resultantes foram lavadas uma vez com tampão de FACS. As células marcadas foram avaliadas quanto à intensidade da fluorescência por citometria de fluxo, em um BD FACSCalibur®. Como mostrado na FIG. 23, os anticorpos S27, S31, T99 e S119 podem se ligar, de forma dependente da dose, ao LAG3 expresso nas células T CD4+ humanas ativadas.

2.4. Inibição pelo anticorpo anti-LAG-3 da ligação do LAG-3 solúvel (sLAG) ao MHC de classe II receptor

[0281] Para avaliar a capacidade dos anticorpos anti-LAG-3 de bloquear a ligação do sLAG-3 ao MHC de classe II receptor, um ensaio de ligação in vitro foi projetado, utilizando as proteínas de fusão de LAG-3-ECD-huFc marcadas com biotina e as células Raji que expressam o MHC de classe II receptor. Os anticorpos do Exemplo 1 foram diluídos em série, a partir de 20 μg/mL, com o tampão de FACS e pré- incubados com 6 μg/mL de biotina-LAG-3-ECD-huFcc, por 30 min, na temperatura ambiente. A mistura de anticorpos foi então adicionada às células Raji bloqueadas com FcR e incubada por 30 min, em gelo. As células foram então lavadas com tampão de FACS e subsequentemente tingidas com estreptavidina PE, por 30 min, em gelo, e subsequentemente lavadas uma vez com tampão de FACS. As células marcadas foram avaliadas quanto à intensidade da fluorescência por citometria de fluxo, em um BD FACSCalibur®. Como mostrado na FIG. 24, os anticorpos S27, S31, S119 e T99 podem inibir, de forma dependente da dose, a ligação do LAG3 às suas moléculas de MHC de classe II receptoras.

2.5. Estimulação da produção de IL-2 nas células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) pelos anticorpos anti-LAG-3.

[0282] A enterotoxina estafilocócica B (SEB) é um superantígeno que se liga simultaneamente aos antígenos MHC de classe II e receptores das células T (TCRs), reunindo-os de tal forma a induzir a proliferação das células T e a produção de citocinas. 2 × 105 PBMCs foram estimuladas com a SEB, na presença dos anticorpos do Exemplo 1 em várias concentrações, partindo de 20 μg/ml, em diluições 1:3 em série para 6 doses. Três dias depois, a concentração de IL-2 no sobrenadante da cultura foi avaliada por ELISA. Como mostrado na FIG. 25, semelhante ao anticorpo para PD-1, os anticorpos anti-LAG3 (S24, S27, S31, S87, S119, T99 e S20) podem aumentar a produção de IL-

2, de forma dependente da dose, em comparação com a estimulação com a SEB apenas.

2.6. Reversão da inibição das células T reguladoras (Tregs) sobre as células T efetoras (Teffs) utilizando os anticorpos anti-LAG-3.

[0283] O LAG-3 é altamente expresso nas Tregs (CD4+CD25hi) e medeia a sua função supressora (Journal of Immunology 184:6545-51, 2010). Para avaliar a capacidade dos anticorpos anti-LAG-3 em reverter o efeito supressor das Tregs sobre as células T efetoras (CD4+CD25-CD127hi), os anticorpos do Exemplo 1 foram utilizados em um ensaio de supressão in vitro. Primeiro, as Tregs (CD4+CD25hiCD127low) e as Teffs (CD4+CD25CD127hi) foram classificadas por FACS, utilizando um sistema BD FACSAria II. As Teffs foram então marcadas com o éster de carboxifluoresceína succinimidila (CFSE) e cocultivadas com as Tregs a uma razão de 1:1, na presença dos anticorpos anti-CD3 ligados à placa e das células apresentadoras de antígeno tratadas com mitomicina C. Os anticorpos anti-LAG-3 foram em seguida adicionados à cultura de células e a proliferação das células Teffs foi testada 5 dias depois. Os resultados na FIG. 26 indicam que, quando as Tregs foram cocultivadas com as células T efetoras, a proliferação das células T efetoras e a produção de citocinas foram inibidas. O S119 e o T99 podem reverter a inibição das Teffs pelas Tregs.

2.7. Análise por BIACORE do anticorpo para LAG-3

[0284] A ligação dos anticorpos S20, S24, S27, S31, S87, S119, S120, S128, S136, S161 e T99 à proteína LAG3-ECD humana com marca de his recombinante foi examinada por Biacore T200, utilizando um método de captura. Os anticorpos anti-LAG3 foram capturados utilizando o anticorpo Fc anti-humano. O anticorpo Fc anti-humano foi revestido sobre o chip. As concentrações em série da proteína LAG3-ECD humana com marca de his (0-4 nM) foram injetadas sobre os anticorpos de captura, na vazão de 30 μl/min. A fase de dissociação foi 900 s ou 550 s. Os resultados são mostrados na Tabela 22 abaixo. Os resultados do Biacore para os anticorpos anti-LAG3 mostraram que esses anticorpos anti-LAG3 são ligantes de alta afinidade para o LAG3 humano. [Tabela 22] Ka (M-1s-1) kd(s-1) KD (M) S20 1,65E+-5 7,33E-06 4,43E-11 S24 1,79E+06 1,20E-02 6,73E-09 S27 7,04E+06 1,10E-04 1,56E-11 S31 2,08E+06 6,25E-05 3,00E-11 S87 9,28E+05 2,33E-06 2,51E-12 S119 2,17E+07 1,49E-04 6,87E-12 S120 1,40E+06 2,64E-03 1,88E-09 S128 1,00E+06 8,17E-04 8,15E-10 S136 7,98E+05 8,27E-05 1,04E-10 S161 6,20E+05 5,53E-04 8,92E-10 T99 7,62E+06 1,70E-04 2,24E-11

2.8. Geração de anticorpos monoclonais de camundongo contra o LAG3 humano

[0285] Este exemplo mostra como os anticorpos monoclonais de camundongo anti-LAG3 humano foram gerados utilizando a tecnologia de hibridoma.

[0286] Antígeno: As proteínas de fusão de LAG-3 humanas recombinantes foram utilizadas como o imunógeno para aumentar os anticorpos anti-LAG-3 humano. Uma proteína de fusão compreendendo a região extracelular inteira (domínios 1-4) do LAG-3 humano fundida a um domínio Fc da imunoglobulina de camundongo (D1-D4 mFc) foi utilizada como o imunógeno. Para o teste de ligação ELISA, uma proteína de fusão compreendendo a região extracelular inteira (domínios 1-4) ou a região extracelular sem o domínio D1-D2 do LAG-3 humano fundida ao domínio Fc da imunoglobulina humana (D1- D4 huFc ou △D1-D2 huFc, respectivamente). As proteínas de fusão de LAG-3 foram preparadas utilizando as técnicas de DNA recombinante padrão. Imunizações:

[0287] As proteínas de fusão de LAG-3 foram preparadas utilizando as técnicas de DNA recombinante padrão. Os camundongos foram imunizados de modo intraperitoneal (IP) e/ou subcutâneo (SC). Os camundongos foram primeiramente imunizados SC com 50 mg de imunógeno e, em seguida, imunizados IP quinzenalmente com 25 μg de imunógeno. A resposta imune foi monitorada por sangramentos retro-orbitais. O plasma foi examinado por ELISA e ensaio de bloqueio do receptor com base em células (como descrito abaixo). Os camundongos com títulos suficientes de imunoglobulina anti-domínio D1-D2 do LAG-3 e bloqueador de LAG3 funcional foram utilizados para as fusões. Antes do sacrifício e da remoção dos baços, os camundongos foram reforçados de modo intraperitoneal com 25 μg de antígeno, seguido por um reforço subsequente com 25 μg de antígeno. Os baços foram utilizados para a fusão. O sobrenadante do hibridoma foi testado quanto à ligação anti-domínio D1-D2 do LAG-3 e à sua função de bloquear a ligação do LAG3 ao seu receptor pelo ensaio de bloqueio do receptor com base em células. Seleção dos camundongos que produzem os anticorpos bloqueadores anti-LAG3.

[0288] Para selecionar os camundongos que produzem os anticorpos bloqueadores anti-LAG3, os soros dos camundongos imunizados foram testados quanto à ligação ao domínio D1-D2 por ELISA. Resumidamente, os soros foram avaliados quanto à sua ligação ao D1-D4 huFc e a sua ligação ao △D1-D2 huFc serviu como um contraexame. Resumindo, D1-D4 huFc ou △D1-D2 huFc foi revestido a 0,5 ug/ml, durante a noite, e depois bloqueado por BSA a 5% em PBS. Os soros diluídos em série foram incubados com o antígeno revestido por 1 h, na temperatura ambiente. As placas resultantes foram lavadas com PBS/T e incubadas com IgG-HRP anti-camundongo de cabra, por 1 h, na temperatura ambiente. As placas foram desenvolvidas com o substrato de TMB e analisadas por espectrofotômetro, em DO 450-630 nm. Paralelamente, os soros foram avaliados quanto à sua função de bloquear a ligação do LAG3 às moléculas de MHCII expressas nas células Raji, conforme descrito no Exemplo

2.4. Os camundongos com títulos elevados específicos para o domínio D1-D2 do LAG3 e função de bloquear a ligação do LAG3 às células Raji foram selecionados para a fusão e uma triagem adicional.

[0289] Os clones de hibridoma 122H, 147H e 170H foram selecionados para análise adicional e sequenciamento.

2.9. Propriedades de ligação dos anticorpos monoclonais de camundongo anti-LAG3

[0290] Este exemplo testou as propriedades de ligação dos anticorpos de camundongo anti-LAG3 às proteínas LAG3. Ligantes específicos para D1-D2:

[0291] Para avaliar a especificidade de ligação, os anticorpos monoclonais de camundongo 122H, 147H e 170H purificados foram submetidos ao teste de ligação ELISA para os antígenos D1-D4 huFc e △D1-D2 huFc. Resumidamente, D1- D4 huFc ou △D1-D2 huFc foi revestido a 0,5 μg/ml, durante a noite e, em seguida, bloqueado por BSA a 5% em PBS. Os anticorpos diluídos em série (partindo de 1 μg/ml e diluição 1:3 em série para 10 doses) foram incubados com o antígeno revestido, por 1 h, na temperatura ambiente. As placas resultantes foram lavadas com PBS/T e incubadas com IgG-HRP anti-camundongo de cabra, por 1 h, na temperatura ambiente. As placas foram desenvolvidas com o substrato de TMB e analisadas por espectrofotômetro, em DO 450-630 nm.

[0292] Os resultados do ELISA estão resumidos nas FIGS. 27A-27C, que mostram uma forte ligação ao domínio extracelular completo do LAG3 (D1-D4 huFc), porém não ao LAG3 com D1-D2 removidos (△D1-D2 huFc), confirmam que 122H, 147H e 170H são ligantes potentes e seletivos para o domínio D1 e D2 do LAG3 humano.

2.10. Propriedades funcionais dos anticorpos monoclonais de camundongo anti-LAG3 Bloqueio da ligação do LAG3 ao seu receptor

[0293] Para avaliar a capacidade dos anticorpos anti-LAG-3 de bloquear a ligação do sLAG-3 ao MHC de classe II receptor, um ensaio de ligação in vitro foi projetado, utilizando as proteínas de fusão de LAG-3-ECD-huFc marcadas com biotina e as células Raji que expressam o MHC de classe

II receptor. Os anticorpos monoclonais de camundongo 122H, 147H e 170H foram diluídos em série (1:5 para 6 doses), a partir de 20 μg/mL, com tampão de FACS e pré-incubados com 6 ug/mL de biotina-LAG-3-ECD-huFc, por 30 min, na temperatura ambiente. A mistura de anticorpos foi então adicionada às células Raji bloqueadas com FcR e incubadas por 30 min, em gelo. As células foram então lavadas com tampão de FACS e subsequentemente tingidas com estreptavidina PE, por 30 min, em gelo, e subsequentemente lavadas uma vez com tampão de FACS. As células marcadas foram avaliadas quanto à intensidade da fluorescência por citometria de fluxo, em um BD FACSCalibur®. Conforme mostrado nas FIGS. 28A-28C, os anticorpos 122H, 147H e 170H podem inibir, de forma dependente da dose, a ligação do LAG3 às suas moléculas de MHC de classe II receptoras. Estimulação da resposta das células T humanas pelos anticorpos anti-LAG3

[0294] Para testar a capacidade dos anticorpos anti-LAG3 de estimular a resposta das células T, foi utilizado o ensaio de estimulação das células T Jurkat. Jurkat é uma linhagem de células de leucemia de células T humanas que pode produzir a IL2 após estimulação com o TCR. Neste ensaio, as células Jurkat transfectadas com o gene de LAG3 humano pelo lentivírus foram utilizadas como as células respondedoras. As células Raji que expressaram o MHCII foram utilizadas como as células apresentadoras de antígeno (APC). As Enterotoxinas Estafilocócicas (SE) são superantígenos, que podem reticular as moléculas de MHCII e o receptor beta das células T (TCRVβ) e estimular a resposta das células T. A SE foi utilizada como o estimulador neste ensaio. Neste sistema, o huLAG3 expresso ectopicamente pode suprimir a produção de IL-2 estimulada por SE pelas células Jurkat, enquanto os anticorpos anti- LAG3 podem reverter a produção de IL-2. Em resumo, as APCs (2,5×104) foram cocultivadas com as células T Jurkat que expressam o LAG3 (1×105), na presença de estimulação com SE. Os anticorpos anti-LAG3 (partindo de 20 μg/ml e diluídos 1:5 em série para 6 doses) foram adicionados no início da cultura. 48 horas depois, o sobrenadante da cultura foi avaliado quanto à produção de IL2 por ELISA. Como mostrado na FIG. 29, os anticorpos monoclonais de camundongo 122H, 147H e 170H podem promover, de forma dependente da dose, a produção de IL2 pelas células T Jurkat, sugerindo que eles podem estimular a estimulação pelo TCR por supressão do sinal do LAG3 para as células T.

2.11. Projeto de humanização do mAb de camundongo 147H

[0295] Os genes da região variável do mAb 147H foram empregados para criar um mAb humanizado. Na primeira etapa deste processo, as sequências de aminoácidos da VH e da Vκ do mAb 147H foram comparadas com a base de dados disponível das sequências dos genes da Ig humana, para encontrar as sequências dos genes da Ig da linhagem germinativa humanas gerais que mais correspondiam. Para a cadeia leve, a correspondência humana mais próxima foi o gene A19/JK4 e, para a cadeia pesada, a correspondência humana mais próxima foi o gene VH1-f/JH6. As sequências do domínio variável humanizadas foram então projetadas, onde as CDR1 (SEQ ID NO:243), 2 (SEQ ID NO:244) e 3 (SEQ ID NO:245) da cadeia leve do 147H foram enxertadas nas sequências da estrutura do gene A19/JK4, e as sequências das CDR1 (SEQ ID NO:240), 2 (SEQ ID NO:241) e 3 (SEQ ID NO:242) da VH do 147H foram enxertadas nas sequências da estrutura do gene VH1-f/JH6. Um modelo 3D foi então gerado, para determinar se havia quaisquer posições da estrutura onde a substituição do aminoácido de camundongo pelo aminoácido humano poderia afetar a ligação e/ou a conformação da CDR. No caso da cadeia pesada, R71, M69, R66, V67, M48, V37, R38, Y91 e Q1 (numeração de Kabat), na estrutura humana, foram identificadas e submetidas à mutação reversa em seu aminoácido original de camundongo, ou seja: R71A, M69L, R66K, V67A, M48I, V37I, R38K, Y91F e Q1E. [Tabela 23] Sequências dos anticorpos de camundongo Cadeia ou Sequências (os resíduos da CDR com a SEQ ID domínio do VH e a VL estão sublinhados) NO: anticorpo VH do 147H QVQLQQSGSELVRPGTSVKISCKASGYTFTNYWLGWI 352

KQRPGHGLEWIGDIYPGGDYINYNEKFKGKATLSADT SSSTAYMQLSSLTSEDSAVYFCARPNLPGDYWGQGTS

VTVSS VL do 147H DIVMTQAAFSNPVTLGTSASISCRSSKSLLHSNGITY 353

LYWYLQKPGQSPQLLIYQVSNLASGVPGRFSGSGSGT DFTLRISRVEAEDVGVYYCAQNLELPWTFGGGTKLEI

K CDRH1 GYTFTNYWLG 354 CDRH2 DIYPGGDYINYNEKFKG 355 CDRH3 PNLPGDY 356

CDRL1 RSSKSLLHSNGITYLY 357 CDRL2 QVSNLAS 358 CDRL3 AQNLELPWT 359

[0296] As sequências de aminoácidos dos anticorpos humanizados estão listadas: 147H-1, 147H-2, 147H-3, 147H-4, 147H-5, 147H-6, 147H-7, 147H-8, 147H-9, 147H-10, 147H-11, 147H-12, 147H-13 e 147H-14, cada um tendo uma cadeia pesada diferente, porém todos compartilham uma cadeia leve comum. [Tabela 24] Anticorpos humanizados e mutações reversas Cadeia do Sequências (CDR sublinhada; mutações SEQ anticorpo reversas em negrito e sublinhadas) ID NO: VH do 147H-1 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYWLGW

VRQAPGQGLEWMGDIYPGGDYINYNEKFKGRVTMTR 360

DTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARPNLPGDYWGQ

GTTVTVSS VH do 147H-2 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYWLGW

VRQAPGQGLEWMGDIYPGGDYINYNEKFKGRVTMTA 361

DTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARPNLPGDYWGQ

GTTVTVSS VH do 147H-3 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYWLGW

VRQAPGQGLEWMGDIYPGGDYINYNEKFKGRVTLTA 362

DTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARPNLPGDYWGQ

GTTVTVSS VH do 147H-4 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYWLGW 363

VRQAPGQGLEWMGDIYPGGDYINYNEKFKGKATLTA DTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARPNLPGDYWGQ

GTTVTVSS VH do 147H-5 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYWLGW

VRQAPGQGLEWIGDIYPGGDYINYNEKFKGKATLTA 364

DTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARPNLPGDYWGQ

GTTVTVSS VH do 147H-6 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYWLGW

IKQAPGQGLEWIGDIYPGGDYINYNEKFKGKATLTA 365

DTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARPNLPGDYWGQ

GTTVTVSS VH do 147H-7 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYWLGW

IKQAPGQGLEWIGDIYPGGDYINYNEKFKGKATLTA 366

DTSISTAYMELSRLRSDDTAVYFCARPNLPGDYWGQ

GTTVTVSS VH do 147H-8 EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYWLGW

VRQAPGQGLEWMGDIYPGGDYINYNEKFKGRVTMTR 367

DTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARPNLPGDYWGQ

GTTVTVSS VH do 147H-9 EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYWLGW

VRQAPGQGLEWMGDIYPGGDYINYNEKFKGRVTMTA 368

DTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARPNLPGDYWGQ

GTTVTVSS VH do 147H-10 EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYWLGW

VRQAPGQGLEWMGDIYPGGDYINYNEKFKGRVTLTA 369

DTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARPNLPGDYWGQ

GTTVTVSS VH do 147H-11 EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYWLGW 370

VRQAPGQGLEWMGDIYPGGDYINYNEKFKGKATLTA DTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARPNLPGDYWGQ

GTTVTVSS VH do 147H-12 EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYWLGW

VRQAPGQGLEWIGDIYPGGDYINYNEKFKGKATLTA 371

DTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARPNLPGDYWGQ

GTTVTVSS VH do 147H-13 EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYWLGW

IKQAPGQGLEWIGDIYPGGDYINYNEKFKGKATLTA 372

DTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARPNLPGDYWGQ

GTTVTVSS VH do 147H-14 EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYWLGW

IKQAPGQGLEWIGDIYPGGDYINYNEKFKGKATLTA 373

DTSISTAYMELSRLRSDDTAVYFCARPNLPGDYWGQ

GTTVTVSS VL do 147H DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSKSLLHSNGIT

YLYWYLQKPGQSPQLLIYQVSNLASGVPDRFSGSGS 374

GTDFTLKISRVEAEDVGVYYCAQNLELPWTFGGGTK VEIK

[0297] Os genes da VH e da VK humanizados foram produzidos sinteticamente e então clonados, respectivamente, em vetores contendo os domínios constantes da gama 1 humana e da capa humana. O emparelhamento da VH humana e da VK humana criou 40 anticorpos humanizados.

2.12. Propriedades de ligação dos anticorpos monoclonais humanizados anti-LAG3 147H Classificação da afinidade dos anticorpos humanizados pelo sistema Octet® RED96

[0298] Para explorar a cinética de ligação do anticorpo humanizado, este exemplo realizou a classificação da afinidade utilizando o Octet Red 96. Como mostrado na Tabela 25 abaixo, 147H, 147H-6, 147H-7, 147H-13 e 147H-14 mostram melhor afinidade. [Tabela 25] Anticorpo KD (M) kon (1/Ms) kdis (1/s) 147H-1 3,54E-08 1,09E+05 3,86E-03 147H-2 3,16E-08 9,93E+04 3,14E-03 147H-3 3,65E-08 9,25E+04 3,38E-03 147H-4 3,98E-08 8,62E+04 3,43E-03 147H-5 3,13E-08 9,58E+04 3,00E-03 147H-6 1,53E-08 1,20E+05 1,84E-03 147H-7 1,57E-08 1,52E+05 2,39E-03 147H-8 3,23E-08 1,65E+05 5,33E-03 147H-9 6,64E-08 6,74E+04 4,48E-03 147H-10 8,23E-08 4,91E+04 4,04E-03 147H-11 4,22E-08 1,07E+05 4,51E-03 147H-12 5,52E-08 6,23E+04 3,44E-03 147H-13 2,16E-08 1,08E+05 2,34E-03 147H-14 2,32E-08 1,08E+05 2,50E-03 Afinidade cinética total dos anticorpos humanizados pelo Sistema Octet® RED96

[0299] Para explorar a cinética de ligação do anticorpo humanizado, este exemplo realizou adicionalmente o teste da afinidade cinética total, executando várias doses de antígeno (50 nM, 25 nM, 12,5 nM, 6,15 nM, 3,125 nM), utilizando o Octet Red 96. A afinidade de ligação foi calculada por software, no Sistema Octet® RED96. Como mostrado na Tabela 26, 147H-6, 147H-7, 147H-13 e 147H-14 mostraram afinidade comparável com o anticorpo quimérico

147H. [Tabela 26] Anticorpo KD (M) kon (1/Ms) kdis (1/s) 147H quimérico 2,71E-08 8,01E+04 2,17E-03 147H-6 2,48E-08 1,05E+05 2,59E-03 147H-7 2,65E-08 1,18E+05 3,12E-03 147H-13 1,82E-08 1,04E+05 1,90E-03 147H-14 2,07E-08 9,87E+04 2,04E-03

2.13. Propriedades funcionais dos anticorpos monoclonais de camundongo anti-LAG3 Estimulação da resposta das células T humanas pelos anticorpos anti-LAG3

[0300] Para testar a capacidade dos anticorpos anti-LAG3 de estimular a resposta das células T, foi utilizado o ensaio de estimulação das células T Jurkat, conforme descrito no Exemplo 12. Os anticorpos anti-LAG3 (partindo de 30 μg/ml e diluídos 1:3 em série para 6 doses) foram adicionados no início da cultura. 48 h depois, o sobrenadante da cultura foi avaliado quanto à produção de IL2 por ELISA. Como mostrado na FIG. 30, os anticorpos monoclonais humanizados 147H-13 podem promover, de forma dependente da dose, a produção de IL2 pelas células T Jurkat, sugerindo que eles podem estimular a estimulação pelo TCR por supressão do sinal do LAG3 para as células T.

2.14. Maturação da afinidade dos anticorpos monoclonais humanizados anti-LAG3 147H

[0301] Para melhorar a afinidade de ligação ao antígeno, este exemplo realizou a maturação da afinidade do 147H4-13, utilizando a tecnologia de exibição em fagos. Estratégia 1: A CDRH3 e a CDRL3 do 147H-13 foram alvejadas para a mutagênese com base em códons. A CDRH3 e a CDRL3 foram randomizadas nas posições H95-H102 e L89-L97 (numeração de Kabat), respectivamente. Estratégia 2: Cada CDR foi alvejada para a mutagênese com base em códon único, utilizando a abordagem de deslocamento da CDR. Em seguida, a CDRH1, a CDRH2, a CDRL1 combinaram com a biblioteca 1. A CDRH3, a CDRL2, a CDRL3 combinaram com a biblioteca 2.

[0302] Em ambas as estratégias, as bibliotecas foram submetidas a três ou quatro rodadas de seleção por exibição em fagos da fase de solução, com base na afinidade, com concentração decrescente de antígeno em cada rodada. Uma concentração de antígeno relativamente alta (10 nM) foi utilizada para a primeira rodada. A concentração de antígeno foi diminuída 10 vezes em cada uma das três rodadas subsequentes ou 100 vezes em cada uma das duas rodadas subsequentes, para selecionar as variantes de alta afinidade. As variantes individuais da rodada final foram testadas quanto à ligação positiva ao antígeno através de exame por ELISA. A classificação da taxa de desativação das variantes individuais foi determinada pelo Octet Red 96 (Fortebio, EUA). As mutações com afinidade melhorada foram combinadas para gerar novos anticorpos para LAG3. A afinidade foi ainda confirmada por Biacore, que sugeriu que a N58V da CDR H2 aumentava significativamente a Koff, enquanto a N91Y da CDR L3 melhorava a Kon.

[Tabela 27] Maturação da afinidade do anticorpo No. Sequência (CDR sublinhada, mutação em negrito) VH (SEQ ID NO: 375) 147H 3421

EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYWLGWIKQAPGQGLE WIGDIYPGGDYINYNEKFKGKATLTADTSISTAYMELSRLRSDDTA

VYYCARPNLPKDHWGQGTTVTVSS VL (SEQ ID NO: 376)

DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSKSLLHSNAITYLYWYLQKPG QSPQLLIYQVSNLASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYY

CAQNLELPWTFGGGTKVEIK VH (SEQ ID NO: 377)

VYYCARPDLPGDYWGQGTTVTVSS 147H 3422 VL (SEQ ID NO: 378)

CAQNLELPWTFGGGTKVEIK VH (SEQ ID NO: 379)

VYYCARPGLPKDYWGQGTTVTVSS 147H 3423 VL (SEQ ID NO: 380)

CAQNLELPWTFGGGTKVEIK VH (SEQ ID NO: 381)

VYYCARPNLPKDYWGQGTTVTVSS 147H 3424 VL (SEQ ID NO: 382)

DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSKSLLHSNAITYLYWYLQKPG QSPQLLIYQVSNLASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYY CAQNLELPWTFGGGTKVEIK

VH (SEQ ID NO: 383)

VYYCARPNLPRDYWGQGTTVTVSS 147H 3425 VL (SEQ ID NO: 384)

CAQNLELPWTFGGGTKVEIK VH (SEQ ID NO: 385)

VYYCARPGLPRDYWGQGTTVTVSS 147H 3426 VL (SEQ ID NO: 386)

CAQNLELPWTFGGGTKVEIK VH (SEQ ID NO: 387)

VYYCARPGLPQDYWGQGTTVTVSS 147H 3427 VL (SEQ ID NO: 388)

CAQNLELPWTFGGGTKVEIK VH (SEQ ID NO: 389)

EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYWLGWIKQAPGQGLE

WIGDIYPGGDYINYNEKFKGKATLTADTSISTAYMELSRLRSDDTA 147H 3428

VYYCARPDLPKDYWGQGTTVTVSS VL (SEQ ID NO: 390)

CAQNLELPWTFGGGTKVEIK VH (SEQ ID NO: 391)

VYYCARPNLPGDYWGQGTTVTVSS 147H 3429 VL (SEQ ID NO: 392)

CGQNLELPWTFGGGTKVEIK VH (SEQ ID NO: 393)

VYYCARPNLPGDYWGQGTTVTVSS 147H 3430 VL (SEQ ID NO: 394)

CAQNLEMPWTFGGGTKVEIK VH (SEQ ID NO: 395)

VYYCARPNLPGDYWGQGTTVTVSS 147H 3431 VL (SEQ ID NO: 396)

CGQNLEMPWTFGGGTKVEIK VH (SEQ ID NO: 397)

EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYWLGWIKQAPGQGLE 147H 3432

WIGDIYPGGDYINYNEKFKGKATLTADTSISTAYMELSRLRSDDTA VYYCARPNLPGDYWGQGTTVTVSS

VL (SEQ ID NO: 398)

CAQYLEEPWTFGGGTKVEIK VH (SEQ ID NO: 399)

VYYCARPNLPGDYWGQGTTVTVSS 147H 3433 VL (SEQ ID NO: 400)

CAQYLELPWTFGGGTKVEIK VH (SEQ ID NO: 401)

VYYCARPNLPKDHWGQGTTVTVSS 147H 3508 VL (SEQ ID NO: 402)

CGQNLELPWTFGGGTKVEIK VH (SEQ ID NO: 403)

VYYCARPNLPKDHWGQGTTVTVSS 147H 3549 VL (SEQ ID NO: 404)

CAQYLEEPWTFGGGTKVEIK VH (SEQ ID NO: 405) 147H 3550

VYYCARPNLPKDHWGQGTTVTVSS VL (SEQ ID NO: 406)

CAQYLELPWTFGGGTKVEIK VH (SEQ ID NO: 407)

EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFENYWLGWIKQAPGQGLE WIGDIYPGGDYIVYNEKFKGKATLTADTSISTAYMELSRLRSDDTA

VYYCARPNLPGDYWGQGTTVTVSS 147H 3663 VL (SEQ ID NO: 408)

DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSKSLLHSNAITYLYWYLQKPG QSPQLLIYQVSNLARGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYY

CAQNLELPWTFGGGTKVEIK VH (SEQ ID NO: 409)

EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYMFTNYWLGWIKQAPGQGLE WIGDIYPGGDYINYNEKFKGKATLTADTSISTAYMELSRLRSDDTA

VYYCARPNLPGDYWGQGTTVTVSS 147H 3664 VL (SEQ ID NO: 410)

DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSKSLLHSNAITYLYWYLQKPG QSPQLLIYQKSNLASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYY

CAQNLELPWTFGGGTKVEIK VH (SEQ ID NO: 411)

EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFDNYWLGWIKQAPGQGLE WIGDIYPGGDIINYNEKFKGKATLTADTSISTAYMELSRLRSDDTA

VYYCARPNLPGDYWGQGTTVTVSS 147H 3665 VL (SEQ ID NO: 412)

DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSKSLLHSNAITYLYWYLQKPG QSPQLLIYQVSNLAVGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYY CAQNLELPWTFGGGTKVEIK

VH (SEQ ID NO: 413)

EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFGNYWLGWIKQAPGQGLE WIGDIYPGGDVINYNEKFKGKATLTADTSISTAYMELSRLRSDDTA

VYYCARPNLPGDYWGQGTTVTVSS 147H 3666 VL (SEQ ID NO: 414)

DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSKSLLHSNAITYLYWYLQKPG QSPQLLIYQVSNLALGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYY

CAQNLELPWTFGGGTKVEIK VH (SEQ ID NO: 415)

EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYWLWWIKQAPGQGLE WIGDIFPGGDYINYNEKFKGKATLTADTSISTAYMELSRLRSDDTA

VYYCARPNLPGDYWGQGTTVTVSS 147H 3667 VL (SEQ ID NO: 416)

DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSKSLLHSNAITYLYWYLQKPG QSPQLLIYQVDNLASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYY

CAQNLELPWTFGGGTKVEIK VH (SEQ ID NO: 417)

EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYWLGWIKQAPGQGLE WIGDIYPGGDYIVYNEKFKGKATLTADTSISTAYMELSRLRSDDTA

VYYCARPNLPGDYWGQGTTVTVSS 147H 3668 VL (SEQ ID NO: 418)

DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSKSLLHSNAITYLYWYLQKPG QSPQLLIYQVSNLATGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYY

CAQNLELPWTFGGGTKVEIK VH (SEQ ID NO: 419)

EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYLFTNYWLGWIKQAPGQGLE

WIGDIYPGGDYIVYNEKFKGKATLTADTSISTAYMELSRLRSDDTA 147H 3669

VYYCARPNLPGDYWGQGTTVTVSS VL (SEQ ID NO: 420)

CAQNLELPWTFGGGTKVEIK VH (SEQ ID NO: 421)

VYYCARPNLPGDYWGQGTTVTVSS 147H 3670 VL (SEQ ID NO: 422)

DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSKSLLHSNAITYLYWYLQKPG QSPQLLIYHVSNLASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYY

CAQNLELPWTFGGGTKVEIK VH (SEQ ID NO: 423)

EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYWLWWIKQAPGQGLE WIGDIYPGGDLINYNEKFKGKATLTADTSISTAYMELSRLRSDDTA

VYYCARPNLPGDYWGQGTTVTVSS 147H 3675 VL (SEQ ID NO: 424)

CAQNLELPWTFGGGTKVEIK VH (SEQ ID NO: 425)

EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYWLSWIKQAPGQGLE WIGDIYPGGDHINYNEKFKGKATLTADTSISTAYMELSRLRSDDTA

VYYCARPNLPGDYWGQGTTVTVSS 147H 3676 VL (SEQ ID NO: 426)

CAQNLELPWTFGGGTKVEIK VH (SEQ ID NO: 427)

EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYWLWWIKQAPGQGLE 147H 3677

WIGEIYPGGDYITYNEKFKGKATLTADTSISTAYMELSRLRSDDTA VYYCARPNLPGDYWGQGTTVTVSS

VL (SEQ ID NO: 428)

DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSKSLLHSNAITYLYWYLQKPG QSPQLLIYQVSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYY

CAQNLELPWTFGGGTKVEIK VH (SEQ ID NO: 429)

VYYCARPNLPGDYWGQGTTVTVSS 147H 3678 VL (SEQ ID NO: 430)

CAQNLELPWTFGGGTKVEIK VH (SEQ ID NO: 431)

EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGFTFTNYWLGWIKQAPGQGLE WIGDIYPGGDYIVYNEKFKGKATLTADTSISTAYMELSRLRSDDTA

VYYCARPNLPGDYWGQGTTVTVSS 147H 3679 VL (SEQ ID NO: 432)

CAQNLELPWTFGGGTKVEIK VH (SEQ ID NO: 433)

VYYCARPNLPKDHWGQGTTVTVSS 147H 3790 VL (SEQ ID NO: 434)

CAQNLELPWTFGGGTKVEIK VH (SEQ ID NO: 435) 147H 3791

VYYCARPNLPGDYWGQGTTVTVSS VL (SEQ ID NO: 436)

CGQNLELPWTFGGGTKVEIK VH (SEQ ID NO: 437)

VYYCARPNLPGDYWGQGTTVTVSS 147H 3792 VL (SEQ ID NO: 438)

CAQYLELPWTFGGGTKVEIK VH (SEQ ID NO: 439)

EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYLFTNYWLGWIKQAPGQGLE WIGDIYPGGDYIVYNEKFKGKATLTADTSISTAYMELSRLRSDDTA

VYYCARPNLPGDYWGQGTTVTVSS 147H 3793 VL (SEQ ID NO: 440)

CGQNLELPWTFGGGTKVEIK VH (SEQ ID NO: 441)

VYYCARPNLPGDYWGQGTTVTVSS 147H 3794 VL (SEQ ID NO: 442)

DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSKSLLHSNAITYLYWYLQKPG QSPQLLIYQVSNLASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYY CAQYLELPWTFGGGTKVEIK

VH (SEQ ID NO: 443)

VYYCARPNLPKDHWGQGTTVTVSS 147H 3807 VL (SEQ ID NO: 444)

DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSKSLLHSQGITYLYWYLQKPG QSPQLLIYQVSNLASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYY

CAQYLELPWTFGGGTKVEIK VH (SEQ ID NO: 491)

VYYCARPNLPKDHWGQGTTVTVSS 147H 3807b VL (SEQ ID NO: 492)

CAQYLELPWTFGGGTKVEIK VH (SEQ ID NO: 445)

VYYCARPNLPKDHWGQGTTVTVSS 147H 3808 VL (SEQ ID NO: 446)

CGQYLELPWTFGGGTKVEIK VH (SEQ ID NO: 447)

EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYLFTNYWLGWIKQAPGQGLE

WIGDIYPGGDYIVYNEKFKGKATLTADTSISTAYMELSRLRSDDTA 147H 3809

VYYCARPNLPKDHWGQGTTVTVSS VL (SEQ ID NO: 448)

CAQYLELPWTFGGGTKVEIK VH (SEQ ID NO: 449)

VYYCARPNLPKDHWGQGTTVTVSS 147H 3810 VL (SEQ ID NO: 450)

CAQYLELPWTFGGGTKVEIK VH (SEQ ID NO: 451)

VYYCARPNLPKDHWGQGTTVTVSS 147H 3811 VL (SEQ ID NO: 452)

CGQYLELPWTFGGGTKVEIK [Tabela 28] Resumo das mutações e das regiões CDR mutadas: Sequência Exemplo de Exemplo de sequências original substituiç mutadas (SEQ ID NO:__) ões (com (SEQ ID NO:__) base na numeração de kabat) CDRH1 GYTFTNYWLG (354) Y27: F GYTFENYWLG (453) T28: M, L GYMFTNYWLG (454) T30: E, D, GYTFDNYWLG (455) G GYTFGNYWLG (456)

527: W, S GYTFTNYWLW (457) GYLFTNYWLG (458) GYTFTNYWLS (459) GFTFTNYWLG (460) CDRH2 DIYPGGDYINYNEKFK D50: E DIYPGGDYIVYNEKFKG (461) G (355) Y52: F DIYPGGDIINYNEKFKG (462) Y56: I, V, DIYPGGDVINYNEKFKG (463) L, H DIFPGGDYINYNEKFKG (464) N58: V, T DIYPGGDLINYNEKFKG (465) DIYPGGDHINYNEKFKG (466) EIYPGGDYITYNEKFKG (467) CDRH3 PNLPGDY (356) N96: D, G PNLPKDH (468) G99: K, R, PDLPGDY (469) Q PGLPKDY (470) Y102: H PNLPKDY (471) PNLPRDY (472) PGLPRDY (473) PGLPQDY (474) PDLPKDY (475) CDRL1 RSSKSLLHSNGITYLY N28: Q RSSKSLLHSQGITYLY (490) (357) CDRL2 QVSNLAS (358) Q50: H QVSNLAR (476) V51: K QKSNLAS (477) S52: D QVSNLAV (478) L54: R QVSNLAL (479) S56: R, V, QVDNLAS (480) L, T QVSNLAT (481) HVSNLAS (482) QVSNRAS (483)

CDRL3 AQNLELPWT (359) A89: G GQNLELPWT (484) N91: Y AQNLEMPWT (485) L94: M, E GQNLEMPWT (486) AQYLEEPWT (487) AQYLELPWT (488) GQYLELPWT (489)

2.15. Propriedades de ligação dos anticorpos monoclonais humanizados anti-LAG3 147H com afinidade maturada

[0303] A cinética de ligação dos anticorpos com afinidade maturada à proteína LAG3-ECD humana com marca de his recombinante foi examinada por Biacore T200, como estabelecido no Exemplo 2.7. Os resultados foram apresentados na Tabela abaixo. Os resultados do Biacore mostraram que esses anticorpos anti-LAG3 tinham melhor afinidade do que o 147H-13 de origem. [Tabela 29] KD (M) kon (1/Ms) kdis (1/s) 147H-13 1,4E-08 2,2E+06 3,0E-02 147H 3421 8,1E-09 1,4E+06 1,2E-02 147H 3508 1,4E-09 2,9E+06 4,2E-03 147H 3549 9,2E-10 7,4E+06 6,8E-03 147H 3550 9,8E-10 8,7E+06 8,5E-03 147H 3663 6,8E-09 7,9E+05 5,4E-03 147H 3669 8,8E-09 7,2E+05 6,3E-03 147H 3790 5,9E-09 7,7E+05 4,5E-03 147H 3791 1,2E-09 2,1E+06 2,5E-03 147H 3792 5,9E-10 4,9E+06 2,9E-03 147H 3793 1,3E-09 1,8E+06 2,3E-03 147H 3794 7,2E-10 3,7E+06 2,7E-03

147H 3807b 5,1E-10 4,0E+06 2,0E-03 147H 3808 7,5E-10 4,3E+06 3,2E-03 147H 3809 4,7E-10 4,3E+06 2,0E-03 147H 3810 4,1E-10 4,7E+06 1,9E-03 147H 3811 5,9E-10 4,9E+06 2,9E-03

[0304] Para confirmar a capacidade de ligação do anticorpos anti-LAG-3 com afinidade maturada ao LAG3 humano, foram avaliados 2 anticorpos com a afinidade mais alta (B3807b e B3810), juntamente com o anticorpo de origem 147H-13, utilizando o ELISA, que foi descrito no Exemplo

2.2. A EC50 de B3807b, B3810, juntamente com o anticorpo de origem, foi mostrada na tabela abaixo. Tanto B3807b quanto B3810 mostraram capacidade de ligação superior do que o anticorpo de origem 147H-13. [Tabela 30] Nome EC50 （nM） 147H-13 6,5 147H 3807b 0,41 147H 3810 0,49

[0305] Para confirmar ainda mais que os anticorpos anti-LAG-3 com afinidade maturada podem se ligar ao LAG3 humano derivado de células, tanto as células Jurkat induzíveis que expressam o hLAG3 quanto as PBMCs ativadas foram utilizadas para testar a capacidade de ligação do B3807b e do B3810. Resumidamente, as células Jurkat foram suspensas novamente em tampão de FACS. Os anticorpos anti- LAG3 e o controle de isótipo foram diluídos 4 vezes em série em tampão de FACS, com uma dose variando de 20 nM a 30 pM. Os anticorpos diluídos em série foram adicionados à suspensão de células e incubados durante 30 minutos, em gelo. Em seguida, após a remoção dos anticorpos não ligados, as células foram tingidas com IgG anti-humano conjugado com Alexa Fluor 633 (Thermo, A21091). A medição da fluorescência foi adquirida no citômetro de fluxo FACSCelesta e analisada no Flowjo para determinar as intensidades médias de fluorescência (MFI). Para testar a capacidade dos anticorpos anti-LAG3 de se ligarem ao LAG3 humano nativo, as PBMCs de doador saudável foram estimuladas com anti-CD3 (BD, 555336) e anti-CD28 (BD, 555725), ambos a uma concentração de 1 ug/ml. Após estimulação de 3 dias, as células foram coletadas e incubadas com os anticorpos anti-LAG3, por 30 minutos, em gelo. As células foram tingidas com CD4 anti-humano e IgG anti-humano. As análises da ligação dos anticorpos às células CD4+ foram realizadas em citometria de fluxo FACSCelesta. Os resultados da análise por citometria foram resumidos na tabela abaixo, que mostrou a EC50 de ligação dos anticorpos ao LAG3 humano derivado de células. A FIG. 31 é um gráfico que mostra a curva de ligação dos anticorpos anti-LAG3. A EC50 dos anticorpos testados foi mostrada abaixo. [Tabela 31] Ensaio de ligação com EC50 (nM) base em células 147H-13 147H 3807b 147H 3810 Jurkat-LAG3 1,2 0,4 0,5 Células T CD4 ativadas 0,77 0,33 0,39

2.16. Caracterização do anticorpo monoclonal 147H 3807 (B3807) A. Ligação do B3807 à proteína LAG3

[0306] Este exemplo avaliou a capacidade do anticorpo anti-LAG-3 147H 3807 (B3807) de se ligar à proteína LAG3 humana. A estreptavidina foi revestida em uma placa do ELISA, a 2 μg/ml, com 100 μl/poço. 100 μl do Bio- LAG3, a 1,0 μg/ml, foram subsequentemente incubados com a estreptavidina, na TA, por 1 hora. O B3807, juntamente com um controle positivo 25F7 e um controle negativo IgG, foi diluído em série com o tampão diluente do ELISA. Para avaliar a ligação, os anticorpos em várias concentrações foram adicionados à placa revestida com a proteína LAG3, por 1,5 h, TA. As placas resultantes foram lavadas e depois marcadas com o anticorpo IgG(Fab)-HRP anti-humano.

[0307] Como mostrado na FIG. 38, tanto o B3807 quanto o 25F7 ligaram-se ao LAG3 humano de uma forma dependente da dose, com o B3807 mostrando uma potência mais alta e uma EC50 mais baixa (0,06 nM vs. 0,22 nM para o 25F7). B. Análise por Biacore

[0308] A ligação do B3807 à proteína LAG3-ECD humana com marca de His recombinante foi examinada por Biacore T200, utilizando um método de captura. O B3807 foi capturado utilizando a proteína A, que foi imobilizada sobre o chip sensor CM5. As concentrações em série da proteína LAG3-ECD humana com marca de his (0-12 nM) foram injetadas sobre os anticorpos de captura, na vazão de 30 μl/min. A fase de dissociação foi 900 s ou 550 s. Os resultados são mostrados na FIG. 39, demonstrando que o B3807 se liga ao LAG3 humano com alta afinidade C. Ensaios de ligação com base nas células Jurkat e PBMCs

[0309] Para confirmar adicionalmente que o B3807 pode se ligar ao LAG3 humano derivado de células, tanto as células Jurkat induzíveis que expressam o LAG3 humano quanto as PBMCs ativadas foram utilizadas para testar a capacidade de ligação do B3807. Em resumo, as células Jurkat foram suspensas novamente em tampão de FACS. O B3807, o 25F7 e o controle de isótipo foram diluídos em série 3 vezes, em tampão de FACS, com uma dose variando de 20 nM a 9 pM. Os anticorpos diluídos em série foram adicionados à suspensão de células e incubados durante 30 minutos, em gelo. Em seguida, após a remoção dos anticorpos não ligados, as células foram tingidas com IgG anti-humano conjugado com Alexa Fluor 633 (Thermo, A21091). A medição da fluorescência foi adquirida no citômetro de fluxo FACSCelesta e analisada no Flowjo, para determinar as intensidades médias de fluorescência (MFI). Para testar a capacidade dos anticorpos de se ligarem ao LAG3 humano nativo, as PBMCs de doador saudável foram estimuladas com anti-CD3 (BD, 555336) e anti-CD28 (BD, 555725), ambos a uma concentração de 1 μg/ml. Após estimulação de 3 dias, as células foram coletadas e incubadas com os anticorpos anti- LAG3, por 30 minutos, em gelo. As células foram tingidas com CD4 anti-humano e IgG anti-humano. As análises da ligação dos anticorpos às células CD4+ foram realizadas em citometria de fluxo FACSCelesta.

[0310] Os resultados da análise por citometria são apresentados na FIG. 40. A EC50 dos anticorpos testados também é mostrada na figura. Em ambos os testes, o B3807 exibiu uma capacidade de ligação mais forte do que o anticorpo de controle 25F7. D. Bloqueio da ligação do LAG3 ao MHC de classe II

[0311] Para medir a capacidade do B3807 de bloquear a interação entre o LAG3 humano e o MHCII, foi realizado o ensaio de ligação entre LAG3 e MHC II (Cisbio, 64ICP03PEG), utilizando a tecnologia de TR-FRET homogênea, seguindo o protocolo proporcionado pelo fabricante do kit. O B3807 foi diluído 3 vezes, variando de 100 nM a 5 pM (10 pontos). Os dados de fluorescência foram adquiridos em uma leitora de placas PerkinElmer Envision e uma curva de resposta à dose de quatro parâmetros foi ajustada para obter a IC50 de cada anticorpo. A IC50 do B3807 foi 0,41 nM (FIG. 41), demonstrando uma potente atividade de bloqueio. E. Estimulação da resposta das células T humanas

[0312] Para testar a capacidade dos anticorpos anti-LAG3 de estimularem a resposta das células T, foram utilizadas as células Jurkat que expressam o hLAG3. Em cada poço da placa de 96 poços, as células Jurkat (1 × 105) foram incubadas com as células Raji (1 × 104), na presença de 0,1 ng/ml de SE. O B3807 foi diluído 3 vezes e adicionado às células, em uma concentração final variando de 100 nM a 50 pm. 48 horas depois, a IL2 do meio de cultura foi medida utilizando um ensaio de TR-FRET homogênea (PerkinElmer, TRF1221M). A FIG. 42 mostra a curva do B3807 e do 25F7 na estimulação da liberação de IL2, em que o B3807 superou o 25F7 por uma grande margem. F. Liberação da IL2 nas células T primárias

[0313] A capacidade dos anticorpos de estimularem a resposta das células T também foi testada com as células T primárias que expressam o hLAG3. Em todas as quatro doses testadas, o B3807 superou o 25F7 (FIG. 43, painel esquerdo). Quando utilizado junto com um anticorpo anti-PD-L1, o perfil de liberação da IL2 (FIG. 43, painel direito) demonstrou o efeito sinergístico entre o anticorpo anti-LAG3 B3807 e o anticorpo anti-PD-L1. G. Efeitos combinatórios com os anticorpos anti-PD1/anti- PD-L1 na regressão tumoral

[0314] Foram utilizados camundongos humanizados que expressaram os domínios extracelulares do LAG3 humano. Como mostrado na FIG. 44, painel esquerdo, o B3807 e o 25F7 exibiram algum efeito na inibição do crescimento do tumor, quando combinados com o anticorpo anti-PD-1.

[0315] No painel direito da FIG. 44, no entanto, é evidente que tanto o B3807 quanto o 25F7 tiveram um efeito sinergístico significativo, quando utilizados juntos com o Tecentriq, um anticorpo anti-PD-L1 disponível comercialmente. H. Comparação do B3807 com o B3807b

[0316] As atividades do B3807 e do B3807b foram comparadas quanto à sua capacidade em promover a liberação da IL2 nas células Jurkat (ver o procedimento experimental no Exemplo 2.16(E)) e em se ligar ao LAG3 nas células Jurkat (ver o procedimento experimental no Exemplo

2.16(C)).

[0317] Os resultados da comparação são apresentados na FIG. 45. Em ambas as experiências, o B3807 e o B3807b exibiram perfis de atividade altamente semelhantes, demonstrando que a diferença na sequência na CDRL1 entre esses dois anticorpos não teve impacto sobre as suas atividades.

[0318] Além disso, como mostrado na FIG. 46, os dados do Biacore (ver procedimento experimental no Exemplo

2.16(B)) demonstram ainda a grande similaridade entre estes dois anticorpos. O B3807 foi utilizado nos exemplos a seguir, para testar ainda mais e preparar os anticorpos biespecíficos. Exemplo 3. Preparação dos anticorpos biespecíficos anti-PD- L1/anti-LAG3

[0319] Os clones Hu1210-41 (Hu1210 VH.4dxHu1210 Vk. 1, ver a Tabela 8; doravante, “H12”) e B6 (ver a Tabela 16), entre os clones anti-PD-L1 preparados no Exemplo 1, e os clones 147H (também chamado como “147”, ver a Tabela 23) e 147H 3807 (também chamado como “147(H3807)”; ver a Tabela 27), entre os clones anti-LAG3 preparados no Exemplo 2, foram selecionados ilustrativamente, para preparar os anticorpos biespecíficos anti-PD-L1/anti-LAG3 em uma forma de IgG de tamanho natural X scFv. Quando o PD-L1 foi colocado na parte da IgG completa, foi utilizada a IgG1 com a estrutura principal mutante com ADCC reduzida (mutação N297A; Patentes US Nos. 7332581, 8219149 etc.) e, quando o LAG3 foi colocado na parte da IgG completa, foi utilizada a IgG4 com a mutação S241P (Angal et al., Mol. Immunol. 30:105-108).

[0320] Um segmento de DNA 1, tendo uma sequência de nucleotídeos que codifica uma cadeia pesada de um anticorpo IgG do anticorpo biespecífico anti-PD-L1/anti- LAG3, foi inserido no pcDNA 3.4 (Invitrogen, A14697; plasmídeo 1), e um segmento de DNA 2, tendo uma sequência de nucleotídeos que codifica uma cadeia leve de um anticorpo IgG do anticorpo biespecífico anti-PD-L1/anti- LAG3, foi inserido no pcDNA 3.4 (Invitrogen, A14697; plasmídeo 2). Depois disso, um segmento de DNA 3, que codifica um scFv, foi fundido em uma parte do segmento de

DNA 1 que correspondia à extremidade de c da região Fc do anticorpo IgG inserido no plasmídeo 1, utilizando um segmento de DNA 4 que codifica um peptídeo ligador tendo 10 aminoácidos de comprimento que consistem em (GGGGS)2, para construir os vetores para a expressão dos anticorpos biespecíficos.

[0321] As sequências da cadeia pesada, da cadeia leve, do scFv e dos segmentos de DNA foram resumidas nas Tabelas 32 e 33: [Tabela 32] Anticorpo biespecífico compreendendo o clone anti-PD-L1 na forma de IgG e o clone anti-LAG3 na forma de scFv (PD-L1xLAG3) H12x147 (anticorpo biespecífico compreendendo o clone anti-PD-L1 H12 na forma de IgG e o clone anti-LAG3 147 na forma de scFv) Sequência de Sequência de aminoácidos (N’→C’) Nucleotídeos (5’→3’) Cadeia Cadeia EVQLVESGGGLVQPGGSLR GAGGTGCAGCTGGTGGAGAG Pesada pesada LSCAASGFTFSSYDMSWVR CGGAGGAGGACTGGTGCAAC do H12 QAPGKSLEWVATISDAGGY CCGGAGGCAGCCTGAGACTG

IYYSDSVKGRFTISRDNAK AGCTGCGCTGCCAGCGGCTT NSLYLQMNSLRDEDTAVYI CACCTTCAGCAGCTACGACA CAREFGKRYALDYWGQGTT TGAGCTGGGTGAGACAGGCC VTVSSASTKGPSVFPLAPS CCTGGCAAAAGCCTGGAGTG SKSTSGGTAALGCLVKDYF GGTGGCCACCATCTCCGATG PEPVTVSWNSGALTSGVHT CGGGCGGCTACATCTATTAC FPAVLQSSGLYSLSSVVTV TCCGACAGCGTGAAGGGCAG PSSSLGTQTYICNVNHKPS GTTCACCATCAGCAGGGACA NTKVDKKVEPKSCDKTHTC ACGCCAAGAACAGCCTGTAC PPCPAPELLGGPSVFLFPP CTGCAGATGAACAGCCTGAG KPKDTLMISRTPEVTCVVV GGATGAGGACACCGCCGTGT DVSHEDPEVKFNWYVDGVE ACATCTGCGCCAGGGAGTTC VHNAKTKPREEQYASTYRV GGCAAAAGGTACGCCCTGGA

VSVLTVLHQDWLNGKEYKC CTACTGGGGCCAGGGCACAA KVSNKALPAPIEKTISKAK CCGTGACCGTGAGCAGCgct GQPREPQVYTLPPSREEMT AgcAccAAgGGCCCCTCTGT

KNQVSLTCLVKGFYPSDIA GTTCCCTCTGGCCCCTTCCT VEWESNGQPENNYKTTPPV CTAAATCCACCTCTGGCGGA LDSDGSFFLYSKLTVDKSR ACCGCTGCTCTGGGCTGTCT WQQGNVFSCSVMHEALHNH GGTCAAGGACTACTTCCCTG

YTQKSLSLSPGK AGCCCGTGACCGTGTCTTGG (SEQ ID NO:528) AATTCTGGCGCTCTGACCAG

CGGAGTGCACACCTTTCCAG

CTGTGCTGCAGTCCTCCGGC Ligador GSGSGSGSGSGSGSGSGS CTGTACTCTCTGTCCTCTGT (SEQ ID NO:529) CGTGACAGTGCCTTCCAGCT

CTCTGGGCACCCAGACCTAC ATCTGCAACGTGAACCACAA GCCCTCCAACACCAAGGTGG ACAAGAAGGTGGAACCCAAG TCCTGCGACAAGACCCACAC CTGTCCTCCATGTCCTGCTC CAGAACTGCTGGGCGGACCC TCCGTGTTCCTGTTCCCTCC AAAGCCTAAGGACACCCTGA TGATCTCCCGGACCCCTGAA GTGACCTGCGTGGTGGTGGA TGTGTCCCACGAGGATCCCG AAGTGAAGTTCAATTGGTAC GTGGACGGCGTGGAAGTGCA

CAACGCCAAGACCAAGCCTA GAGAGGAACAGTACgccTCC

ACCTACCGGGTGGTGTCCGT GCTGACCGTTCTGCACCAGG ATTGGCTGAACGGCAAAGAG TACAAGTGCAAGGTGTCCAA CAAGGCCCTGCCTGCCCCTA TCGAAAAGACCATCTCTAAG GCCAAGGGCCAGCCCCGGGA ACCTCAAGTGTACACCTTGC CTCCCAGCCGGGAAGAGATG ACCAAGAACCAGGTGTCCCT GACCTGCCTGGTTAAGGGCT TCTACCCCTCCGATATCGCC GTGGAATGGGAGTCTAATGG CCAGCCTGAGAACAACTACA AGACCACACCTCCTGTGCTG GACTCCGACGGCTCATTCTT CCTGTACTCCAAGCTGACCG TGGACAAGTCCAGATGGCAG CAGGGCAACGTGTTCTCCTG CTCCGTGATGCACGAGGCCC TGCACAATCACTACACCCAG AAGTCCCTGTCTCTGTCCCC TGGCAAAGGCTCCGGATCTG GTTCTGGATCCGGAAGCGGT TCTGGCAGCGGCTCTGGATC TGACATCGTGATGACCCAGT CTCCACTGAGCCTGCCTGTG ACACCTGGCGAGCCTGCTTC CATCTCCTGCCGGTCCTCTA AGTCCCTGCTGCACTCTAAC GGCATCACCTACCTGTACTG GTATCTGCAGAAGCCCGGCC AGTCTCCTCAGCTGCTGATC TACCAGGTGTCCAACCTGGC TTCTGGCGTGCCCGATAGAT TCTCCGGTAGCGGATCTGGA ACCGACTTCACCCTGAAGAT CTCCAGAGTGGAAGCCGAGG ACGTGGGCGTGTACTACTGT GCCCAGAACCTGGAACTGCC CTGGACCTTTGGCTGTGGCA CCAAGGTGGAAATCAAGAGA GGCGGCGGAGGATCTGGCGG AGGTGGAAGCGGAGGCGGAG GAAGCGGTGGCGGCGGATCT GAAGTTCAGTTGGTTCAGTC TGGCGCCGAAGTGAAGAAAC CTGGCGCCTCTGTGAAGGTG TCCTGCAAGGCTTCCGGCTA CACCTTTACCAACTACTGGC TCGGCTGGATCAAGCAGGCC CCTGGACAGTGTCTGGAATG GATCGGCGACATCTACCCTG GCGGCGACTACATCAACTAC AACGAGAAGTTCAAGGGCAA AGCTACCCTGACCGCCGACA CCTCTATCTCCACCGCCTAC ATGGAACTGTCCCGGCTGAG ATCTGACGACACCGCCGTGT ACTATTGCGCCAGACCTAAC CTGCCTGGCGACTATTGGGG CCAGGGCACAACAGTGACCG

TGTCCTCTTAA (SEQ ID NO:533) scFv do VL DIVMTQSPLSL 147 PVTPGEPASIS

CRSSKSLLHSN GITYLYWYLQK PGQSPQLLIYQ VSNLASGVPDR FSGSGSGTDFT LKISRVEAEDV GVYYCAQNLEL PWTFGCGTKVE

IKR (SEQ ID NO:530) Ligador GGGGSGGGGSG

GGGSGGGGS (SEQ ID NO:531)

VH EVQLVQSGAEV KKPGASVKVSC KASGYTFTNYW LGWIKQAPGQC LEWIGDIYPGG DYINYNEKFKG KATLTADTSIS TAYMELSRLRS DDTAVYYCARP

NLPGDYWGQGT TVTVSS* (SEQ ID NO:532) Cadeia Cadeia DIQMTQSPSSLSASVGDRV GACATCCAGATGACCCAGAG leve leve do TITCKASQDVTPAVAWYQQ CCCTAGCAGCCTGAGCGCTA H12 KPGKAPKLLIYSTSSRYTG GCGTGGGCGACAGGGTGACC

VPSRFSGSGSGTDFTFTIS ATCACCTGCAAGGCCAGCCA SLQPEDIATYYCQQHYTTP GGATGTGACCCCTGCCGTGG LTFGQGTKLEIKRTVAAPS CCTGGTACCAGCAGAAGCCC VFIFPPSDEQLKSGTASVV GGCAAGGCCCCCAAGCTGCT CLLNNFYPREAKVQWKVDN GATCTACAGCACCAGCAGCA ALQSGNSQESVTEQDSKDS GGTACACCGGCGTGCCCAGC TYSLSSTLTLSKADYEKHK AGGTTTAGCGGAAGCGGCAG

VYACEVTHQGLSSPVTKSF CGGCACCGACTTCACCTTCA NRGEC* CCATCAGCAGCCTGCAGCCC (SEQ ID NO:534) GAGGACATCGCCACCTACTA

CTGCCAGCAGCACTACACCA CCCCTCTGACCTTCGGCCAG GGCACCAAGCTGGAGATCAA GAGAACCGTGGCCGCTCCCT CCGTGTTCATCTTCCCACCA TCTGACGAGCAGCTGAAGTC CGGCACCGCTTCTGTCGTGT GCCTGCTGAACAACTTCTAC CCTCGGGAAGCCAAGGTGCA GTGGAAGGTGGACAATGCCC TGCAGTCCGGCAACTCCCAA GAGTCTGTGACCGAGCAGGA CTCCAAGGACAGCACCTACT CCCTGTCCTCTACCCTGACC CTGTCCAAGGCCGACTACGA GAAGCACAAGGTGTACGCCT GCGAAGTGACCCACCAGGGA CTGTCTAGCCCCGTGACCAA GTCCTTCAACAGAGGCGAGT

GCTGA (SEQ ID NO:535) H12x147(H3807) (anticorpo biespecífico compreendendo o clone anti-PD-L1 H12 na forma de IgG e o clone anti-LAG3 147(H3807) na forma de scFv) Sequência de Sequência de aminoácidos (N’→C’) Nucleotídeos (5’→3’) Cadeia Cadeia EVQLVESGGGLVQPGGSLR GAGGTGCAGCTGGTGGAGAG Pesada pesada LSCAASGFTFSSYDMSWVR CGGAGGAGGACTGGTGCAAC do H12 QAPGKSLEWVATISDAGGY CCGGAGGCAGCCTGAGACTG

YTQKSLSLSPGK AGCCCGTGACCGTGTCTTGG (SEQ ID NO:528) AATTCTGGCGCTCTGACCAG Ligador GSGSGSGSGSGSGSGSGS CGGAGTGCACACCTTTCCAG (SEQ ID NO:529) CTGTGCTGCAGTCCTCCGGC

CTGTACTCTCTGTCCTCTGT CGTGACAGTGCCTTCCAGCT CTCTGGGCACCCAGACCTAC ATCTGCAACGTGAACCACAA GCCCTCCAACACCAAGGTGG ACAAGAAGGTGGAACCCAAG TCCTGCGACAAGACCCACAC CTGTCCTCCATGTCCTGCTC CAGAACTGCTGGGCGGACCC TCCGTGTTCCTGTTCCCTCC AAAGCCTAAGGACACCCTGA TGATCTCCCGGACCCCTGAA GTGACCTGCGTGGTGGTGGA TGTGTCCCACGAGGATCCCG AAGTGAAGTTCAATTGGTAC GTGGACGGCGTGGAAGTGCA

CAACGCCAAGACCAAGCCTA GAGAGGAACAGTACgccTCC

ACCTACCGGGTGGTGTCCGT GCTGACCGTTCTGCACCAGG ATTGGCTGAACGGCAAAGAG TACAAGTGCAAGGTGTCCAA CAAGGCCCTGCCTGCCCCTA TCGAAAAGACCATCTCTAAG GCCAAGGGCCAGCCCCGGGA ACCTCAAGTGTACACCTTGC CTCCCAGCCGGGAAGAGATG ACCAAGAACCAGGTGTCCCT GACCTGCCTGGTTAAGGGCT TCTACCCCTCCGATATCGCC GTGGAATGGGAGTCTAACGG CCAGCCCGAGAACAACTACA AGACCACCCCTCCTGTGCTG GACTCCGACGGCTCATTCTT CCTGTACTCCAAGCTGACCG TGGACAAGTCTCGGTGGCAG CAGGGCAACGTGTTCTCCTG CTCTGTGATGCACGAGGCCC TGCACAACCACTACACCCAG AAGTCCCTGTCCCTGTCTCC CGGCAAAGGCTCCGGATCTG GTTCTGGATCCGGAAGCGGT TCTGGCAGCGGCTCTGGATC TGACATTGTGATGACCCAGA GCCCCCTGAGCCTCCCCGTG ACCCCTGGAGAACCCGCCAG CATAAGCTGCAGATCCTCCA AAAGCCTGCTGCACTCCCAG GGAATAACCTACCTGTATTG GTACCTGCAGAAACCCGGCC AATCCCCCCAACTCCTGATA TACCAAGTGTCCAACCTGGC CTCCGGCGTGCCCGACAGAT TCTCCGGCTCCGGCAGCGGT ACCGACTTCACCCTCAAAAT CTCCAGAGTGGAAGCAGAAG ACGTCGGCGTGTACTACTGC

GCCCAGTACCTGGAACTGCC CTGGACCTTCGGCtgtGGCA

CCAAGGTGGAAATCAAGAGA GGCGGCGGAGGAAGCGGAGG CGGCGGTTCTGGTGGTGGCG GTAGCGGAGGTGGTGGATCT GAGGTGCAGCTGGTGCAGAG CGGAGCAGAGGTGAAGAAGC CAGGGGCCAGCGTGAAGGTG AGCTGTAAGGCTAGTGGGTA CACATTTACAAACTATTGGC

TGGGATGGATTAAGCAGGCC CCAGGCCAAtgcCTGGAGTG

GATAGGAGACATATACCCCG GAGGAGACTATATCGTGTAC AACGAGAAGTTCAAGGGCAA GGCCACACTCACCGCTGATA CAAGCATCAGCACCGCCTAC ATGGAGCTGAGCCGACTGAG AAGCGACGACACAGCAGTGT ATTACTGCGCCAGACCCAAC CTGCCCAAGGACCACTGGGG

ACAAGGCACCACCGTGACCG TGAGCAGCtga (SEQ ID NO:538) scFv do VL DIVMTQSPLSL 147(H380 PVTPGEPASIS 7) CRSSKSLLHSQ

GITYLYWYLQK PGQSPQLLIYQ VSNLASGVPDR FSGSGSGTDFT LKISRVEAEDV GVYYCAQYLEL PWTFGCGTKVE

IKR (SEQ ID NO:536) Ligador GGGGSGGGGSG

GGGSGGGGS (SEQ ID NO:531)

VH EVQLVQSGAEV KKPGASVKVSC KASGYTFTNYW LGWIKQAPGQC LEWIGDIYPGG DYIVYNEKFKG KATLTADTSIS TAYMELSRLRS DDTAVYYCARP

NLPKDHWGQGT TVTVSS* (SEQ ID NO:537) Cadeia Cadeia DIQMTQSPSSLSASVGDRV GACATCCAGATGACCCAGAG leve leve do TITCKASQDVTPAVAWYQQ CCCTAGCAGCCTGAGCGCTA H12 KPGKAPKLLIYSTSSRYTG GCGTGGGCGACAGGGTGACC

GCTGA (SEQ ID NO:535) B6x147 (anticorpo biespecífico compreendendo o clone anti-PD-L1 B6 na forma de IgG e o clone anti-LAG3 147 na forma de scFv) Sequência de Sequência de aminoácidos (N’→C’) Nucleotídeos (5’→3’) Cadeia Cadeia EVQLVESGGGLVQPGGSLR GAAGTGCAGCTGGTTGAATC Pesada pesada LSCAASGFTFSSYDMSWVR TGGCGGCGGATTGGTTCAGC do B6 QAPGKSLEWVATISDAGGY CTGGCGGATCTCTGAGACTG

IYYRDSVKGRFTISRDNAK TCTTGTGCCGCCTCCGGCTT NSLYLQMNSLRDEDTAVYI CACCTTCTCCAGCTACGATA CARELPWRYALDYWGQGTT TGTCCTGGGTCCGACAGGCC VTVSSASTKGPSVFPLAPS CCTGGCAAGTCTTTGGAATG SKSTSGGTAALGCLVKDYF GGTCGCCACCATCTCTGACG PEPVTVSWNSGALTSGVHT CTGGCGGCTACATCTACTAC FPAVLQSSGLYSLSSVVTV CGGGACTCTGTGAAGGGCAG PSSSLGTQTYICNVNHKPS ATTCACCATCAGCCGGGACA NTKVDKKVEPKSCDKTHTC ACGCCAAGAACTCCCTGTAC PPCPAPELLGGPSVFLFPP CTGCAGATGAACAGCCTGCG KPKDTLMISRTPEVTCVVV CGACGAGGATACCGCCGTGT DVSHEDPEVKFNWYVDGVE ACATCTGTGCTAGAGAGCTG VHNAKTKPREEQYASTYRV CCTTGGAGATACGCCCTGGA VSVLTVLHQDWLNGKEYKC TTATTGGGGCCAGGGCACCA KVSNKALPAPIEKTISKAK CAGTGACCGTGTCCTCTGCT GQPREPQVYTLPPSREEMT TCTACCAAGGGACCCAGCGT KNQVSLTCLVKGFYPSDIA GTTCCCTCTGGCTCCTTCCA VEWESNGQPENNYKTTPPV GCAAGTCTACCTCTGGCGGA LDSDGSFFLYSKLTVDKSR ACAGCTGCTCTGGGCTGCCT WQQGNVFSCSVMHEALHNH GGTCAAGGACTACTTTCCTG

YTQKSLSLSPGK AGCCTGTGACAGTGTCCTGG (SEQ ID NO:539) AACTCTGGCGCTCTGACATC Ligador GSGSGSGSGSGSGSGSGS TGGCGTGCACACCTTTCCAG (SEQ ID NO:529) CAGTGCTGCAGTCCTCCGGC

CTGTACTCTCTGTCCTCTGT CGTGACCGTGCCTTCCAGCT CTCTGGGCACCCAGACCTAC ATCTGCAACGTGAACCACAA GCCCTCCAACACCAAGGTGG ACAAGAAGGTGGAACCCAAG TCCTGCGACAAGACCCACAC CTGTCCTCCATGTCCTGCTC CAGAACTGCTGGGCGGACCC TCCGTGTTCCTGTTCCCTCC AAAGCCTAAGGACACCCTGA TGATCTCCCGGACCCCTGAA GTGACCTGCGTGGTGGTGGA TGTGTCCCACGAGGATCCCG AAGTGAAGTTCAATTGGTAC GTGGACGGCGTGGAAGTGCA

CAACGCCAAGACCAAGCCTA GAGAGGAACAGTACgccTCC

TGTCCTCTTAA (SEQ ID NO:540) scFv do VL DIVMTQSPLSL 147 PVTPGEPASIS

IKR (SEQ ID NO:530) Ligador GGGGSGGGGSG

GGGSGGGGS (SEQ ID NO:531)

NLPGDYWGQGT TVTVSS* (SEQ ID NO:532) Cadeia Cadeia DIQMTQSPSSLSASVGDRV GACATCCAGATGACCCAGAG leve leve do TITCKASQDVTPAVAWYQQ CCCTAGCAGCCTGAGCGCTA B6 KPGKAPKLLIYSTSSRYTG GCGTGGGCGACAGGGTGACC

GCTGA (SEQ ID NO:535) B6x147(H3807) (anticorpo biespecífico compreendendo o clone anti-PD-L1 B6 na forma de IgG e o clone anti-LAG3 147(H3807) na forma de scFv) Sequência de Sequência de aminoácidos (N’→C’) Nucleotídeos (5’→3’) Cadeia Cadeia EVQLVESGGGLVQPGGSLR GAAGTGCAGCTGGTTGAATC Pesada pesada LSCAASGFTFSSYDMSWVR TGGCGGCGGATTGGTTCAGC do B6 QAPGKSLEWVATISDAGGY CTGGCGGATCTCTGAGACTG

CAACGCCAAGACCAAGCCTA GAGAGGAACAGTACgccTCC

GCCCAGTACCTGGAACTGCC CTGGACCTTCGGCtgtGGCA

TGGGATGGATTAAGCAGGCC CCAGGCCAAtgcCTGGAGTG

ACAAGGCACCACCGTGACCG TGAGCAGCtga (SEQ ID NO:541) scFv do VL DIVMTQSPLSL 147(H380 PVTPGEPASIS 7) CRSSKSLLHSQ

IKR (SEQ ID NO:536) Ligador GGGGSGGGGSG

GGGSGGGGS (SEQ ID NO:531)

NLPKDHWGQGT TVTVSS* (SEQ ID NO:537) Cadeia Cadeia DIQMTQSPSSLSASVGDRV GACATCCAGATGACCCAGAG leve leve do TITCKASQDVTPAVAWYQQ CCCTAGCAGCCTGAGCGCTA B6 KPGKAPKLLIYSTSSRYTG GCGTGGGCGACAGGGTGACC

GCTGA (SEQ ID NO:535) [Tabela 33] Anticorpo biespecífico compreendendo o clone anti-LAG3 na forma de IgG e o clone anti-PD-L1 na forma de scFv (LAG3xPD-L1) 147xH12 (anticorpo biespecífico compreendendo o clone anti-LAG3 147 na forma de IgG e o clone anti-PD-L1 H12 na forma de scFv) Sequência de Sequência de aminoácidos Nucleotídeos (N’→C’) (5’→3’) Cadeia Cadeia EVQLVQSGAEVKKPGASV GAGGTGCAGCTGGTGCAG Pesada pesada do KVSCKASGYTFTNYWLGW AGCGGAGCAGAGGTGAAG 147 IKQAPGQGLEWIGDIYPG AAGCCAGGGGCCAGCGTG

GDYINYNEKFKGKATLTA AAGGTGAGCTGTAAGGCT DTSISTAYMELSRLRSDD AGTGGGTACACATTTACA TAVYYCARPNLPGDYWGQ AACTATTGGCTGGGATGG GTTVTVSSASTKGPSVFP ATTAAGCAGGCCCCAGGC LAPCSRSTSESTAALGCL CAAGGACTGGAGTGGATA VKDYFPEPVTVSWNSGAL GGAGACATATACCCCGGA TSGVHTFPAVLQSSGLYS GGAGACTATATCAATTAC LSSVVTVPSSSLGTKTYT AACGAGAAGTTCAAGGGC CNVDHKPSNTKVDKRVES AAGGCCACACTCACCGCT KYGPPCPPCPAPEFLGGP GATACAAGCATCAGCACC SVFLFPPKPKDTLMISRT GCCTACATGGAGCTGAGC PEVTCVVVDVSQEDPEVQ CGACTGAGAAGCGACGAC FNWYVDGVEVHNAKTKPR ACAGCAGTGTATTACTGC EEQFNSTYRVVSVLTVLH GCCAGACCCAACCTGCCC QDWLNGKEYKCKVSNKGL GGCGACTACTGGGGACAA

PSSIEKTISKAKGQPREP GGCACCACCGTGACCGTG QVYTLPPSQEEMTKNQVS TCTTCCgctAgcAccAAg LTCLVKGFYPSDIAVEWE ggcccctccgtgttccct SNGQPENNYKTTPPVLDS ctggccccAtgctcccgg DGSFFLYSRLTVDKSRWQ tccAcctccgAgtccAcc EGNVFSCSVMHEALHNHY gccgctctgggctgtctg TQKSLSLSLGK gtgAAggActActtccct (SEQ ID NO:542) gAgcccgtgAccgtgAgc Ligador GGGGSGGGGSGGGGS tggAActctggcgccctg (SEQ ID NO:543) AcctccggcgtgcAcAcc ttccctgccgtgctgcAg tcctccggcctgtActcc ctgtcctccgtggtgAcc gtgccttcctcctccctg ggcAccAAgAcctAcAcc tgcAAcgtggAccAcAAg ccttccAAcAccAAggtg gAcAAgcgggtggAgtcc AAgtAcggccctccttgc cctccctgccctgcccct gAgttcctgggcggAccc tccgtgttcctgttccct cctAAgcctAAggAcAcc ctgAtgAtctcccggAcc cctgAggtgAcctgcgtg gtggtggAcgtgtcccAg gAAgAtcctgAggtccAg ttcAAttggtAcgtggAt ggcgtggAggtgcAcAAc gccAAgAccAAgcctcgg gAggAAcAgttcAActcc AcctAccgggtggtgtct gtgctgAccgtgctgcAc cAggActggctgAAcggc AAggAAtAcAAgtgcAAg gtcAgcAAcAAgggcctg ccctcctccAtcgAgAAA AccAtctccAAggccAAg ggccAgcctcgcgAgcct cAggtgtAcAccctgcct cctAgccAggAAgAgAtg AccAagAAtcAggtgtcc ctgAcAtgcctggtgAAg ggcttctAcccttccgAt AtcgccgtggAgtgggAg AgcAAcggccAgccAgAg AAcAActAcAAgAccAcc cctcctgtgctggActcc gAcggctccttcttcctg tActccAggctgAccgtg gAcAAgtcccggtggcAg gAAggcAAcgtcttttcc tgctccgtgAtgcAcgAg gccctgcAcAAccActAc AcccAgAAgtccctgtcc ctgtctctgggcAAgGGT

GGAGGTGGGTCTGGGGGT GGCGGGTCAGGTGGAGGA GGTTCAGACATCCAGATG ACCCAGAGCCCTAGCAGC CTGAGCGCTAGCGTGGGC GACAGGGTGACCATCACC TGCAAGGCCAGCCAGGAT GTGACCCCTGCCGTGGCC TGGTACCAGCAGAAGCCC GGCAAGGCCCCCAAGCTG CTGATCTACAGCACCAGC AGCAGGTACACCGGCGTG CCCAGCAGGTTTAGCGGA AGCGGCAGCGGCACCGAC TTCACCTTCACCATCAGC AGCCTGCAGCCCGAGGAC ATCGCCACCTACTACTGC

CAGCAGCACTACACCACC CCTCTGACCTTCGGCtgt

GGCACCAAGCTGGAGATC AAGAGAGGTGGAGGCGGC TCAGGGGGGGGTGGATCA GGGGGAGGAGGATCAGGG GGAGGCGGTAGTGAGGTG CAGCTGGTGGAGAGCGGA GGAGGACTGGTGCAACCC GGAGGCAGCCTGAGACTG AGCTGCGCTGCCAGCGGC TTCACCTTCAGCAGCTAC

GACATGAGCTGGGTGAGA CAGGCCCCTGGCAAAtgt

CTGGAGTGGGTGGCCACC ATCTCCGATGCGGGCGGC TACATCTATTACTCCGAC AGCGTGAAGGGCAGGTTC ACCATCAGCAGGGACAAC GCCAAGAACAGCCTGTAC CTGCAGATGAACAGCCTG AGGGATGAGGACACCGCC GTGTACATCTGCGCCAGG GAGTTCGGCAAAAGGTAC GCCCTGGACTACTGGGGC

CAGGGCACAACCGTGACC GTGAGCAGCtga (SEQ ID NO:546) scFv VL DIQMTQSPSSLSASVGDR do VTITCKASQDVTPAVAWY H12 QQKPGKAPKLLIYSTSSR

YTGVPSRFSGSGSGTDFT FTISSLQPEDIATYYCQQ

HYTTPLTFGCGTKLEIKR (SEQ ID NO:544) Liga GGGGSGGGGSGGGGSGGG dor GS (SEQ ID NO:531)

VH EVQLVESGGGLVQPGGSL RLSCAASGFTFSSYDMSW VRQAPGKCLEWVATISDA GGYIYYSDSVKGRFTISR DNAKNSLYLQMNSLRDED TAVYICAREFGKRYALDY

WGQGTTVTVSS (SEQ ID NO:545) Cadeia Cadeia DIVMTQSPLSLPVTPGEP GACATTGTGATGACCCAG leve leve do ASISCRSSKSLLHSNGIT AGCCCCCTGAGCCTCCCC 147 YLYWYLQKPGQSPQLLIY GTGACCCCTGGAGAACCC

QVSNLASGVPDRFSGSGS GCCAGCATAAGCTGCAGA GTDFTLKISRVEAEDVGV TCCTCCAAAAGCCTGCTG YYCAQNLELPWTFGGGTK CACTCCAACGGAATAACC VEIKRTVAAPSVFIFPPS TACCTGTATTGGTACCTG DEQLKSGTASVVCLLNNF CAGAAACCCGGCCAATCC YPREAKVQWKVDNALQSG CCCCAACTCCTGATATAC NSQESVTEQDSKDSTYSL CAAGTGTCCAACCTGGCC SSTLTLSKADYEKHKVYA TCCGGCGTGCCCGACAGA CEVTHQGLSSPVTKSFNR TTCTCCGGCTCCGGCAGC

GEC GGTACCGACTTCACCCTC (SEQ ID NO:547) AAAATCTCCAGAGTGGAA

GCAGAAGACGTCGGCGTG TACTACTGCGCCCAGAAT CTGGAACTGCCCTGGACC TTCGGCGGCGGCACCAAG GTGGAAATCAAGAGAACC GTGGCCGCTCCCTCCGTG TTCATCTTCCCACCATCT GACGAGCAGCTGAAGTCC GGCACCGCTTCTGTCGTG TGCCTGCTGAACAACTTC TACCCTCGGGAAGCCAAG GTGCAGTGGAAGGTGGAC AATGCCCTGCAGTCCGGC AACTCCCAAGAGTCTGTG ACCGAGCAGGACTCCAAG GACAGCACCTACTCCCTG TCCTCTACCCTGACCCTG TCCAAGGCCGACTACGAG AAGCACAAGGTGTACGCC TGCGAAGTGACCCACCAG GGACTGTCTAGCCCCGTG ACCAAGTCCTTCAACAGA

GGCGAGTGCTGA (SEQ ID NO:548) 147xB6 (anticorpo biespecífico compreendendo o clone anti-LAG3 147 na forma de IgG e o clone anti-PD-L1 B6 na forma de scFv) Sequência de Sequência de aminoácidos Nucleotídeos (N’→C’) (5’→3’) Cadeia Cadeia EVQLVQSGAEVKKPGASV GAGGTGCAGCTGGTGCAG Pesada pesada do KVSCKASGYTFTNYWLGW AGCGGAGCAGAGGTGAAG 147 IKQAPGQGLEWIGDIYPG AAGCCAGGGGCCAGCGTG

PSSIEKTISKAKGQPREP GGCACCACCGTGACCGTG QVYTLPPSQEEMTKNQVS TCTTCCgctAgcAccAAg LTCLVKGFYPSDIAVEWE ggcccctccgtgttccct SNGQPENNYKTTPPVLDS ctggccccAtgctcccgg DGSFFLYSRLTVDKSRWQ tccAcctccgAgtccAcc EGNVFSCSVMHEALHNHY gccgctctgggctgtctg TQKSLSLSLGK gtgAAggActActtccct (SEQ ID NO:542) gAgcccgtgAccgtgAgc Ligador GGGGSGGGGSGGGGS tggAActctggcgccctg (SEQ ID NO:543) AcctccggcgtgcAcAcc ttccctgccgtgctgcAg tcctccggcctgtActcc ctgtcctccgtggtgAcc gtgccttcctcctccctg ggcAccAAgAcctAcAcc tgcAAcgtggAccAcAAg ccttccAAcAccAAggtg gAcAAgcgggtggAgtcc AAgtAcggccctccttgc cctccctgccctgcccct gAgttcctgggcggAccc tccgtgttcctgttccct cctAAgcctAAggAcAcc ctgAtgAtctcccggAcc cctgAggtgAcctgcgtg gtggtggAcgtgtcccAg gAAgAtcctgAggtccAg ttcAAttggtAcgtggAt ggcgtggAggtgcAcAAc gccAAgAccAAgcctcgg gAggAAcAgttcAActcc AcctAccgggtggtgtct gtgctgAccgtgctgcAc cAggActggctgAAcggc AAggAAtAcAAgtgcAAg gtcAgcAAcAAgggcctg ccctcctccAtcgAgAAA AccAtctccAAggccAAg ggccAgcctcgcgAgcct cAggtgtAcAccctgcct cctAgccAggAAgAgAtg AccAagAAtcAggtgtcc ctgAcAtgcctggtgAAg ggcttctAcccttccgAt

ATCGCCGTGGAATGGGAG AGCAATGGCCAGCCTGAG AACAACTACAAGACAACC CCTCCTGTGCTGGACTCC GACGGCTCCTTCTTTCTG TACTCTCGCCTGACCGTG GACAAGTCCAGATGGCAA GAGGGCAACGTGTTCTCC TGCTCCGTGATGCACGAG GCCCTGCACAATCACTAC ACCCAGAAGTCCCTGTCT CTGTCCCTCGGAAAAGGC GGCGGAGGATCTGGCGGA GGCGGTAGCGGTGGTGGC GGATCTGATATTCAGATG ACCCAGTCTCCTTCCAGC CTGTCCGCTTCTGTGGGC GACAGAGTGACCATCACA TGCAAGGCCAGCCAGGAT GTGACCCCTGCTGTGGCT TGGTATCAGCAGAAGCCT GGCAAGGCCCCTAAGCTG CTGATCTACTCCACCTCC TCCAGATACACAGGCGTG CCCTCCAGATTCTCCGGC TCTGGCTCTGGCACCGAC TTTACCTTTACAATCTCC AGCCTGCAGCCTGAGGAC ATTGCCACCTACTACTGC CAGCAGCACTACACCACA CCTCTGACCTTTGGCTGC GGCACCAAGCTGGAAATC AAGAGAGGTGGCGGAGGA AGCGGAGGCGGCGGTTCA GGTGGCGGTGGTTCAGGC GGTGGTGGATCTGAAGTT CAGCTGGTGGAATCTGGC GGCGGATTGGTTCAACCA GGCGGCTCTCTGAGACTG TCTTGTGCCGCTTCCGGC TTCACCTTCTCCAGCTAC GACATGTCCTGGGTCCGA CAGGCCCCTGGAAAGTGT CTGGAATGGGTCGCCACC ATCTCTGACGCTGGCGGC TACATCTACTACCGGGAC TCTGTGAAGGGCAGATTC ACCATCAGCCGGGACAAT GCCAAGAACTCCCTGTAC CTGCAGATGAACAGTCTG CGCGACGAGGACACCGCC GTGTACATCTGTGCTAGA GAGCTGCCTTGGCGCTAC GCCCTGGATTATTGGGGC CAGGGCACAACAGTGACA

GTGTCCTCTTGA (SEQ ID NO:550) scFv do B6 VL DIQMTQSPSSLSAS

VGDRVTITCKASQD VTPAVAWYQQKPGK APKLLIYSTSSRYT GVPSRFSGSGSGTD FTFTISSLQPEDIA TYYCQQHYTTPLTF GCGTKLEIKR (SEQ ID

NO:544) Li GGGGSGGGGSGGGG ga SGGGGS do (SEQ ID r NO:531)

VH EVQLVESGGGLVQP GGSLRLSCAASGFT FSSYDMSWVRQAPG KCLEWVATISDAGG YIYYRDSVKGRFTI SRDNAKNSLYLQMN SLRDEDTAVYICAR

ELPWRYALDYWGQG TTVTVSS* (SEQ ID NO:549) Cadeia Cadeia DIVMTQSPLSLPVTPGEP GACATTGTGATGACCCAG leve leve do ASISCRSSKSLLHSNGIT AGCCCCCTGAGCCTCCCC 147 YLYWYLQKPGQSPQLLIY GTGACCCCTGGAGAACCC

GEC GGTACCGACTTCACCCTC (SEQ ID NO:547) AAAATCTCCAGAGTGGAA

GGCGAGTGCTGA (SEQ ID NO:548) 147(H3807)xH12 (anticorpo biespecífico compreendendo o clone anti-LAG3 147(H3807) na forma de IgG e o clone anti-PD-L1 H12 na forma de scFv) Sequência de Sequência de aminoácidos Nucleotídeos

(N’→C’) (5’→3’) Cadeia Cadeia EVQLVQSGAEVKKPGASV GAGGTGCAGCTGGTGCAG Pesada pesada do KVSCKASGYTFTNYWLGW AGCGGAGCAGAGGTGAAG 147(H3807) IKQAPGQGLEWIGDIYPG AAGCCAGGGGCCAGCGTG

GDYIVYNEKFKGKATLTA AAGGTGAGCTGTAAGGCT DTSISTAYMELSRLRSDD AGTGGGTACACATTTACA TAVYYCARPNLPKDHWGQ AACTATTGGCTGGGATGG GTTVTVSSASTKGPSVFP ATTAAGCAGGCCCCAGGC LAPCSRSTSESTAALGCL CAAGGACTGGAGTGGATA

VKDYFPEPVTVSWNSGAL GGAGACATATACCCCGGA TSGVHTFPAVLQSSGLYS GGAGACTATATCgtgTAC

LSSVVTVPSSSLGTKTYT AACGAGAAGTTCAAGGGC CNVDHKPSNTKVDKRVES AAGGCCACACTCACCGCT KYGPPCPPCPAPEFLGGP GATACAAGCATCAGCACC SVFLFPPKPKDTLMISRT GCCTACATGGAGCTGAGC PEVTCVVVDVSQEDPEVQ CGACTGAGAAGCGACGAC FNWYVDGVEVHNAKTKPR ACAGCAGTGTATTACTGC EEQFNSTYRVVSVLTVLH GCCAGACCCAACCTGCCC QDWLNGKEYKCKVSNKGL AAGGACCACTGGGGACAA

PSSIEKTISKAKGQPREP GGCACCACCGTGACCGTG QVYTLPPSQEEMTKNQVS TCTTCCgctAgcAccAAg LTCLVKGFYPSDIAVEWE ggcccctccgtgttccct SNGQPENNYKTTPPVLDS ctggccccAtgctcccgg DGSFFLYSRLTVDKSRWQ tccAcctccgAgtccAcc EGNVFSCSVMHEALHNHY gccgctctgggctgtctg TQKSLSLSLGK gtgAAggActActtccct (SEQ ID NO:551) gAgcccgtgAccgtgAgc Ligador GGGGSGGGGSGGGGS tggAActctggcgccctg (SEQ ID NO:543) AcctccggcgtgcAcAcc ttccctgccgtgctgcAg tcctccggcctgtActcc ctgtcctccgtggtgAcc gtgccttcctcctccctg ggcAccAAgAcctAcAcc tgcAAcgtggAccAcAAg ccttccAAcAccAAggtg gAcAAgcgggtggAgtcc AAgtAcggccctccttgc cctccctgccctgcccct gAgttcctgggcggAccc tccgtgttcctgttccct cctAAgcctAAggAcAcc ctgAtgAtctcccggAcc cctgAggtgAcctgcgtg gtggtggAcgtgtcccAg gAAgAtcctgAggtccAg ttcAAttggtAcgtggAt ggcgtggAggtgcAcAAc gccAAgAccAAgcctcgg gAggAAcAgttcAActcc AcctAccgggtggtgtct gtgctgAccgtgctgcAc cAggActggctgAAcggc AAggAAtAcAAgtgcAAg gtcAgcAAcAAgggcctg ccctcctccAtcgAgAAA AccAtctccAAggccAAg ggccAgcctcgcgAgcct cAggtgtAcAccctgcct cctAgccAggAAgAgAtg

AccAagAAtcAggtgtcc ctgAcAtgcctggtgAAg ggcttctAcccttccgAt AtcgccgtggAgtgggAg AgcAAcggccAgccAgAg AAcAActAcAAgAccAcc cctcctgtgctggActcc gAcggctccttcttcctg tActccAggctgAccgtg gAcAAgtcccggtggcAg gAAggcAAcgtcttttcc tgctccgtgAtgcAcgAg gccctgcAcAAccActAc AcccAgAAgtccctgtcc ctgtctctgggcAAgGGT

CAGCAGCACTACACCACC CCTCTGACCTTCGGCtgt

GACATGAGCTGGGTGAGA CAGGCCCCTGGCAAAtgt

CAGGGCACAACCGTGACC GTGAGCAGCtga (SEQ ID NO:552)

scFv do VL DIQMTQSPSSLSAS H12 VGDRVTITCKASQD

VTPAVAWYQQKPGK APKLLIYSTSSRYT GVPSRFSGSGSGTD FTFTISSLQPEDIA TYYCQQHYTTPLTF

GCGTKLEIKR (SEQ ID NO:544) Li GGGGSGGGGSGGGG ga SGGGGS do (SEQ ID r NO:531)

VH EVQLVESGGGLVQP GGSLRLSCAASGFT FSSYDMSWVRQAPG KCLEWVATISDAGG YIYYSDSVKGRFTI SRDNAKNSLYLQMN SLRDEDTAVYICAR EFGKRYALDYWGQG

TTVTVSS (SEQ ID NO:545) Cadeia Cadeia DIVMTQSPLSLPVTPGEP GACATTGTGATGACCCAG leve leve do ASISCRSSKSLLHSQGIT AGCCCCCTGAGCCTCCCC 147(H3807) YLYWYLQKPGQSPQLLIY GTGACCCCTGGAGAACCC

QVSNLASGVPDRFSGSGS GCCAGCATAAGCTGCAGA GTDFTLKISRVEAEDVGV TCCTCCAAAAGCCTGCTG

YYCAQYLELPWTFGGGTK CACTCCcagGGAATAACC

VEIKRTVAAPSVFIFPPS TACCTGTATTGGTACCTG DEQLKSGTASVVCLLNNF CAGAAACCCGGCCAATCC YPREAKVQWKVDNALQSG CCCCAACTCCTGATATAC NSQESVTEQDSKDSTYSL CAAGTGTCCAACCTGGCC SSTLTLSKADYEKHKVYA TCCGGCGTGCCCGACAGA

CEVTHQGLSSPVTKSFNR TTCTCCGGCTCCGGCAGC GEC* GGTACCGACTTCACCCTC (SEQ ID NO:553) AAAATCTCCAGAGTGGAA

GCAGAAGACGTCGGCGTG TACTACTGCGCCCAGtac

CTGGAACTGCCCTGGACC TTCGGCGGCGGCACCAAG GTGGAAATCAAGAGAACC GTGGCCGCTCCCTCCGTG TTCATCTTCCCACCATCT GACGAGCAGCTGAAGTCC GGCACCGCTTCTGTCGTG TGCCTGCTGAACAACTTC TACCCTCGGGAAGCCAAG GTGCAGTGGAAGGTGGAC AATGCCCTGCAGTCCGGC AACTCCCAAGAGTCTGTG ACCGAGCAGGACTCCAAG GACAGCACCTACTCCCTG TCCTCTACCCTGACCCTG TCCAAGGCCGACTACGAG AAGCACAAGGTGTACGCC TGCGAAGTGACCCACCAG GGACTGTCTAGCCCCGTG ACCAAGTCCTTCAACAGA

GGCGAGTGCTGA (SEQ ID NO:554) 147(H3807)xB6 (anticorpo biespecífico compreendendo o clone anti-LAG3 147(H3807) na forma de IgG e o clone anti-PD-L1 B6 na forma de scFv) Sequência de Sequência de aminoácidos Nucleotídeos (N’→C’) (5’→3’) Cadeia Cadeia EVQLVQSGAEVKKPGASV GAGGTGCAGCTGGTGCAG Pesada pesada do KVSCKASGYTFTNYWLGW AGCGGAGCAGAGGTGAAG 147(H3807) IKQAPGQGLEWIGDIYPG AAGCCAGGGGCCAGCGTG

VKDYFPEPVTVSWNSGAL GGAGACATATACCCCGGA TSGVHTFPAVLQSSGLYS GGAGACTATATCgtgTAC

PSSIEKTISKAKGQPREP GGCACCACCGTGACCGTG QVYTLPPSQEEMTKNQVS TCTTCCgctAgcAccAAg

LTCLVKGFYPSDIAVEWE ggcccctccgtgttccct SNGQPENNYKTTPPVLDS ctggccccAtgctcccgg DGSFFLYSRLTVDKSRWQ tccAcctccgAgtccAcc EGNVFSCSVMHEALHNHY gccgctctgggctgtctg TQKSLSLSLGK gtgAAggActActtccct (SEQ ID NO:551) gAgcccgtgAccgtgAgc Ligador GGGGSGGGGSGGGGS tggAActctggcgccctg (SEQ ID NO:543) AcctccggcgtgcAcAcc ttccctgccgtgctgcAg tcctccggcctgtActcc ctgtcctccgtggtgAcc gtgccttcctcctccctg ggcAccAAgAcctAcAcc tgcAAcgtggAccAcAAg ccttccAAcAccAAggtg gAcAAgcgggtggAgtcc AAgtAcggccctccttgc cctccctgccctgcccct gAgttcctgggcggAccc tccgtgttcctgttccct cctAAgcctAAggAcAcc ctgAtgAtctcccggAcc cctgAggtgAcctgcgtg gtggtggAcgtgtcccAg gAAgAtcctgAggtccAg ttcAAttggtAcgtggAt ggcgtggAggtgcAcAAc gccAAgAccAAgcctcgg gAggAAcAgttcAActcc AcctAccgggtggtgtct gtgctgAccgtgctgcAc cAggActggctgAAcggc AAggAAtAcAAgtgcAAg gtcAgcAAcAAgggcctg ccctcctccAtcgAgAAA AccAtctccAAggccAAg ggccAgcctcgcgAgcct cAggtgtAcAccctgcct cctAgccAggAAgAgAtg AccAagAAtcAggtgtcc ctgAcAtgcctggtgAAg ggcttctAcccttccgAt

GTGTCCTCTTGA (SEQ ID NO:555) scFv do B6 VL DIQMTQSPSSLSAS

VGDRVTITCKASQD VTPAVAWYQQKPGK APKLLIYSTSSRYT GVPSRFSGSGSGTD FTFTISSLQPEDIA TYYCQQHYTTPLTF

GCGTKLEIKR (SEQ ID NO:544) Li GGGGSGGGGSGGGG ga SGGGGS do (SEQ ID r NO:531)

ELPWRYALDYWGQG TTVTVSS* (SEQ ID NO:549) Cadeia Cadeia DIVMTQSPLSLPVTPGEP GACATTGTGATGACCCAG leve leve do ASISCRSSKSLLHSQGIT AGCCCCCTGAGCCTCCCC 147(H3807) YLYWYLQKPGQSPQLLIY GTGACCCCTGGAGAACCC

QVSNLASGVPDRFSGSGS GCCAGCATAAGCTGCAGA

GTDFTLKISRVEAEDVGV TCCTCCAAAAGCCTGCTG YYCAQYLELPWTFGGGTK CACTCCcagGGAATAACC

GCAGAAGACGTCGGCGTG TACTACTGCGCCCAGtac

GGCGAGTGCTGA (SEQ ID NO:554)

[0322] Os vetores construídos foram expressos temporariamente nas células ExpiCHO-S® (Thermo Fisher, A29127), utilizando o Kit ExpiFectamine®CHO (Thermo, A29129), cultivadas no Meio de expressão ExpiCHO® (Thermo, A29100-01), sob as condições de 30 a 37ºC, por 7 a 15 dias, em uma incubadora de CO2 equipada com agitador rotativo. O DNA de plasmídeo (250 μg) e o Reagente ExpiFectamin CHO (800 μL) foram misturados com o meio Opti-MEM® I (volume final de 20 mL) e deixados permanecer na temperatura ambiente, por 5 min. A solução mista foi adicionada a 6 x 106 células ExpiCHO cultivadas no Meio de Expressão ExpiCHO e suavemente misturada em uma incubadora de agitação, a 37º C, com uma atmosfera umidificada de 8% de CO2 em ar. Em 18 horas após a transfecção, 1,5 mL de ExpiFectamin CHO Transfection Enhancer 1 e 60 mL de ExpiFectamin CHO Transfection Feed foram adicionados a cada frasquinho.

[0323] Cada BsAb foi purificado do sobrenadante da cultura celular por meio de cromatografia por afinidade de Proteína A recombinante (Hitrap Mabselect Sure, GE Healthcare, 28-4082-55) e cromatografia de filtração em gel com uma coluna HiLoad 26/200 Superdex200 de grau preparatório (GE Healthcare, 28-9893 -36). As análises através de SDS-PAGE (NuPage 4-12% Bis-Tris gel, NP0321) e HPLC por exclusão de tamanho (Agilent, série 1200) com a coluna de SE-HPLC (coluna de SE-HPLC SWXL, TOSOH, G3000SWXL) foram realizadas para detectar e confirmar o tamanho e a pureza de cada BsAb. As proteínas purificadas foram concentradas em PBS, por ultrafiltração, utilizando um dispositivo Amicon Ultra 15 30K (Merck, UFC903096), e as concentrações das proteínas foram estimadas utilizando um nanodrop (Thermo, Nanodrop One). Quando um sistema de dois vetores for aplicado, a razão entre as cadeias leve e pesada pode ser 1:1 a 1:3 em peso. Alternativamente, um sistema de um vetor que contenha ambas as cadeias em um único vetor também pode ser utilizado.

[0324] Os anticorpos biespecíficos anti-PD- L1/anti-LAG3 preparados são designados como H12x147, H12x147(H3807), B6x147 e B6x147(H3807), 147xH12, 147(H3807)xH12, 147xB6 e 147(H3807)xB6, respectivamente, em que o primeiro se refere ao clone na forma de IgG e o último se refere ao clone na forma de scFv. Exemplo 4. Caracterização dos anticorpos biespecíficos H12x147 e 147xH12

4.1. Ligação dos anticorpos biespecíficos

[0325] Para avaliar a atividade de ligação ao PD-L1 e ao LAG3 dos anticorpos biespecíficos (BsAb; H12x147 e 147xH12) preparados no Exemplo 3, os BsAb foram submetidos ao teste ELISA. Resumidamente, as placas de microtítulo foram revestidas com cada uma da proteína PD- L1-Fc humana (Sinobio, 10084-H02H) e a proteína LAG3-His humana (Sinobio, 16498-H08H), a 0,5 µg/ml, em PBS, 100 µl/poço, a 4ºC, durante a noite, em seguida, bloqueadas com 100 µl/poço de BSA a 5%. As diluições de quatro vezes de cada um dos BsAbs, partindo de 100 nM, foram adicionadas a cada poço e incubadas por 1-2 horas, na TA. As placas foram lavadas com PBS/Tween e depois incubadas com o anticorpo IgG anti-humano de cabra conjugado com a Peroxidase de Raiz-Forte (HRP) (Pierce, cat. no. 31413), durante 1 hora, na TA. Após a lavagem, as placas foram desenvolvidas com o substrato de TMB e analisadas por espectrofotômetro, em DO 450-630 nm. Os resultados são mostrados na FIG. 33. Como mostrado na FIG. 33, todos os BsAbs testados podem se ligar a ambas as proteínas PD-L1 humana e LAG3 humana com atividades altas.

4.2. Afinidade de ligação dos anticorpos biespecíficos

[0326] As afinidades de ligação de anticorpos biespecíficos para PD-L1 e LAG3 dos anticorpos biespecíficos (BsAb; 147xH12, 147H3807xB6 e B6x147H3807) preparados no Exemplo 3 à proteína PD-L1 e à proteína LAG3 humana foram testadas com o BIACORE®, utilizando um método de captura.

[0327] Os resultados são mostrados na Tabela 34. [Tabela 34] Anticorpo PD-L1 Humano (KD (M)) LAG3 Humano (KD (M)) 147xH12 2,74E-08 1,35E-08 147H3807xB6 5,94E-09 1,63E-09 B6x147H3807 1,18E-09 8,87E-09

[0328] Conforme mostrado na Tabela 34 e na FIG.

33, o anticorpo biespecífico testado exibe afinidades de ligação relativamente altas para ambas as proteínas PD-L1 humana e LAG3 humana.

[0329] Além disso, o ensaio das SEE foi conduzido e os resultados obtidos são mostrados na FIG. 34, os resultados indicando que o anticorpo biespecífico testado inibe a ligação entre o MHC II e o LAG3, aumentando, assim, a atividade das células T pelo MHC II e pelo TCR.

4.3. Atividade dos anticorpos biespecíficos de promover a resposta imune das células T humanas

[0330] Para testar a capacidade dos anticorpos biespecíficos de estimular a resposta das células T, foi utilizado o ensaio de ativação das células Jurkat. As células Jurkat transfectadas com o Lag3 e a Pd1 humanos pelo lentivírus foram utilizadas como as células respondedoras. As células Raji que superexpressam o PDL1 foram utilizadas como as células apresentadoras de antígeno (APC). As enterotoxinas estafilocócicas E (SEE) são superantígenos, que foram utilizados como estimuladores neste ensaio. Neste sistema, o huLAG3 e a huPD-1 expressos ectopicamente podem suprimir a produção de IL-2 estimulada por SE pelas células Jurkat, enquanto os anticorpos anti- LAG3 e anti-PD-L1 podem reverter a produção de IL-2. Em resumo, as Raji (1×104) foram cocultivados com as células T Jurkat (1×105), na presença do superantígeno. Os anticorpos biespecíficos e os seus monoanticorpos correspondentes (partindo de 100 nM diluídos para 6 doses) foram adicionados à cultura mista. 48 h depois, o sobrenadante foi coletado para produção de IL2. Como mostrado na FIG. 34

(painel superior), os anticorpos biespecíficos (147xH12 (rotulado como 147-H12) e H12X147 (rotulado como H12-147)) podem promover a produção de IL2, de forma dependente da dose, pelas células Jurkat.

[0331] Para avaliar ainda mais a função in vitro dos anticorpos biespecíficos em relação às células T primárias, foi realizada uma reação de linfócitos mistos. As células dendríticas (DCs) humanas foram diferenciadas dos monócitos CD14+, na presença de GM-CSF e IL-4, por 7 dias. As células T CD4+ isoladas de outro doador foram então cocultivadas com as DCs e os anticorpos diluídos em série. 5 dias após a cultura mista, o sobrenadante da cultura foi testado quanto à produção de IFN. Os resultados na FIG. 34 (painel inferior) indicaram que ambos os anticorpos biespecíficos (147XH12 (rotulado como A3L1) e H12X147 (rotulado como L1A3) podem promover significativamente a produção de IFN.

4.4. Inibição do crescimento tumoral dos anticorpos biespecíficos (Ensaio in vivo)

[0332] Foram utilizados camundongos duplamente humanizados que expressam o domínio extracelular da PD-1 humana e do LAG3 humano. As células de adenocarcinoma do cólon de camundongo (MC38) foram engenheiradas para expressar o PD-L1 humano. Os camundongos duplamente humanizados (hLAG3/hPD-1) foram implantados de modo subcutâneo com 5x105 células MC38-hPD-L1, no dia 0. No dia 10, os camundongos com um volume médio de tumor de 137 mm3 foram selecionados e randomizados em quatro grupos de tratamento (N = 7/grupo). Os camundongos foram administrados de modo intraperitoneal com o controle de isótipo (5 mg/kg), o H12 (anticorpo anti-PD-L1, 5 mg/kg), o 147H (anticorpo anti-LAG3, 5 mg/kg) e o 147xH12 (6,6 mg/kg), em dias alternados, para 8 doses, partindo do dia

10. Os volumes dos tumores foram monitorados, por medição com calibrador duas vezes por semana durante o experimento (29 dias). Nem o H12 nem o 147H mostraram inibição do tumor a 5 mg/kg. Em contraste, o 147xH12 demonstrou inibição forte do crescimento do tumor MC38, com uma TGI de 67,7% no final do estudo (FIG. 35). Exemplo 5. Caracterização dos anticorpos biespecíficos 147xH12 e 147(H3807)xH12

5.1. Ligação dos anticorpos biespecíficos

[0333] Para avaliar a atividade de ligação ao LAG3 dos anticorpos biespecíficos (BsAb; 147xH12 e 147(H3807)xH12) preparados no Exemplo 3, os BsAbs foram submetidos ao teste ELISA. Resumidamente, as placas de microtítulo foram revestidas com a proteína LAG3-His humana (Sinobio, 16498-H08H), a 0,5 µg/ml, em PBS, 100 µl/poço, a 4ºC, durante a noite, depois bloqueadas com 100 µl/poço de BSA a 5%. As diluições de quatro vezes de cada um dos BsAbs, partindo de 100 nM, foram adicionadas a cada poço e incubadas por 1-2 horas, na TA. As placas foram lavadas com PBS/Tween e depois incubadas com o anticorpo IgG anti- humano de cabra conjugado com a Peroxidase de Raiz-Forte (HRP) (Pierce, cat. no. 31413), durante 1 hora, na TA. Após a lavagem, as placas foram desenvolvidas com o substrato de TMB e analisadas por espectrofotômetro, em DO 450-630 nm. Como mostrado na FIG. 33, os BsAbs 147(H3807)xH12 mostram mais atividade de ligação melhorada à proteína LAG3 humana.

5.2 Atividade dos anticorpos biespecíficos de promover a resposta imune das células T humanas

[0334] O efeito dos anticorpos biespecíficos preparados no Exemplo 3 foi adicionalmente estudado utilizando as PBMCs de doadores saudáveis. Em resumo, as DCs humanas foram diferenciadas dos monócitos CD14+ por 7 dias. As células T CD4+ purificadas, isoladas de outro doador, foram estimuladas pelo anti-CD3/CD28 por 2 dias. Os anticorpos diluídos em série foram então adicionados à cocultura de DCs e células T, na presença do superantígeno, e incubados por 5 dias e o meio de cultura foi coletado para o nível de IL-2. Como mostrado na FIG 36, os anticorpos biespecíficos podem estimular significativamente a produção de IL-2 nas células T CD4+ primárias, o que era superior à combinação de seus monoanticorpos correspondentes. Os dados são apresentados como valores médios de poços triplicados ± DP.

[0335] Além disso, o efeito dos anticorpos biespecíficos preparados no Exemplo 3 foi estudado, utilizando as PBMCs de doadores saudáveis. Em resumo, as DCs humanas foram diferenciadas dos monócitos CD14+ por 5 dias, seguido por tratamento com LPS para a maturação. As células T Pan foram isoladas de outra PBMC doadora. Os anticorpos diluídos em série foram então adicionados à cocultura de DCs e células T maduras e incubados por 5 dias e o meio de cultura foi coletado para o nível de IFNγ. Como mostrado na FIG 37, os anticorpos biespecíficos podem estimular significativamente a produção de IFNγ nas células T pan primárias, o que era superior à combinação de seus monoanticorpos correspondentes. Os dados são mostrados como valores médios de poços duplicados ± DP.

5.3. Capacidade de desenvolvimento dos anticorpos biespecíficos

[0336] Foi avaliada a capacidade de desenvolvimento em relação às propriedades físico-químicas para os anticorpos biespecíficos para PD-L1 e LAG-3 (BsAb; B6x147H3807 e 147(H3807)xB6). Os atributos de qualidade para os BsAbs foram avaliados por vários métodos analíticos. Resumidamente, a pureza foi medida através de cromatografia por exclusão de tamanho - líquida de alta eficiência (SE-HPLC) e ambos os BsAbs mostraram uma pureza alta acima de 99%. Foi analisada a estabilidade térmica por Deslocamento térmico da proteína (PTS) com a reação em cadeia por polimerase em tempo real marcada por fluorescência (RT-PCR). A sua temperatura de fusão foi observada acima de 67ºC, o que indicou que os artigos de teste têm integridade estrutural estável. Para avaliar a solubilidade das moléculas, as proteínas foram concentradas para 20 mg/mL, utilizando ultrafiltração (concentrador de rotação Amicon Ultra-15). Como resultado, as partículas visíveis não foram observadas por inspeção visual e nenhum incremento de agregados foi confirmado por SE-HPLC. O ponto Isoelétrico (pI) de cada bsab, medido por focagem isoelétrica capilar (cIEF,) foi 8,26 e 8,35, respectivamente. Esta faixa de pIs é apropriada para ocorrer o processo posterior e o desenvolvimento da formulação. No geral, como mostrado na Tabela 19, mostrou- se que os BsAbs testados (B6x147H3807 e 147(H3807)xB6) têm propriedades físico-químicas adequadas para o desenvolvimento com sucesso. [Tabela 35]

Sumário Método B6x147H3807 147(H3807)xB6 Pureza SEC 99,8 99,8 Estabilidade 61,8 62,0

PTS Térmica 77,7 71,6 Fácil de Fácil de Inspeção concentrar concentrar Solubilidade visual até 20 mg/mL, até 20 mg/mL, transparente transparente pI cIEF 8,56 7,65 Exemplo 6. O efeito do B3807 sobre a inibição da ligação da FGL1 ao LAG3

[0337] Este exemplo testou a atividade do anticorpo anti-LAG3 B3807 na inibição da ligação entre o LAG3 e a Proteína 1 semelhante ao Fibrinogênio (FGL1).

[0338] Foi relatado recentemente que a Proteína 1 semelhante a Fibrinogênio (FGL1) é outro ligante funcional do LAG3, além do MHC-II (Cell. 2019;176:1-14). A FGL-1 é secretada do fígado e altamente produzida por células cancerosas. A FGL-1 inibe a ativação das células T específicas para o antígeno e, inversamente, o bloqueio da FGL-1 potencializa a resposta antitumoral. A interação entre a FGL-1 e o LAG3 pode representar outro mecanismo para a evasão imunológica.

[0339] A FGL-1 recombinante foi revestida sobre uma placa de 96 poços, a uma concentração de 1 µg/ml, e incubada durante a noite, a 4ºC. O anticorpo anti-LAG3 B3807 diluído em série (partindo de 10 µg/ml e diluição 1:3) e o LAG3-ECD marcado com biotina (2 µg/ml) foram incubados com os poços revestidos com a FGL-1, na temperatura ambiente, por 2 horas. Após extensa lavagem com o tampão de lavagem, foi adicionada a estreptavidina-HRP. Como mostrado na FIG. 47, o B3807 inibiu, de forma dependente da dose, a ligação da FGL-1 à proteína LAG3. * * *

[0340] A presente divulgação não deve ser limitada no escopo pelas modalidades específicas descritas, as quais se destinam como ilustrações únicas de aspectos individuais da divulgação, e quaisquer composições ou métodos que sejam funcionalmente equivalentes estão dentro do escopo desta divulgação. Será evidente para os versados na técnica que várias modificações e variações podem ser feitas nos métodos e nas composições da presente divulgação, sem se afastar do espírito ou do escopo da divulgação. Assim, pretende-se que a presente divulgação inclua as modificações e as variações desta divulgação, desde que estejam dentro do escopo das reivindicações anexas e de seus equivalentes.

[0341] Todas as publicações e pedidos de patente mencionados neste relatório descritivo são incorporados neste documento por referência, na mesma medida como se cada publicação ou pedido de patente individual fosse específica e individualmente indicado para ser incorporado por referência.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Um anticorpo biespecífico anti-PD-L1/anti- LAG3, compreendendo um anticorpo anti-PD-L1 ou um fragmento de ligação ao antígeno dele e um anticorpo anti-LAG3 ou um fragmento de ligação ao antígeno dele, em que o anticorpo anti-PD-L1 ou o fragmento de ligação ao antígeno dele é capaz de especificamente se ligar a um domínio C da imunoglobulina (Ig C) de uma Proteína de ligante da morte programada 1 (PD-L1) humana, em que o domínio Ig C consiste nos resíduos de aminoácidos 133-225; e o anticorpo anti-LAG3 ou o fragmento de ligação ao antígeno dele compreende uma CDR1 da VH tendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOS: 116-117, 354 e 453-460; uma CDR2 da VH tendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOS: 118-119, 355 e 461-467; uma CDR3 da VH tendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 120-160, 356 e 468-475; uma CDR1 da VL tendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOS: 163-195, 229, 357 e 490; uma CDR2 da VL tendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOS: 196-217, 358 e 476-483; e uma CDR3 da VL tendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOS: 218-228, 230-253, 359 e 484-489.

2. O anticorpo biespecífico anti-PD-L1/anti-LAG3 da reivindicação 1, em que o anticorpo anti-PD-L1 ou o fragmento de ligação ao antígeno dele é capaz de se ligar a pelo menos um dos resíduos de aminoácidos Y134, K162 ou N183 da proteína PD-L1.

3. O anticorpo biespecífico anti-PD-L1/anti-LAG3 da reivindicação 2, em que o anticorpo anti-PD-L1 ou o fragmento de ligação ao antígeno dele é capaz de se ligar aos resíduos de aminoácidos Y134, K162 e N183 da proteína PD-L1.

4. O anticorpo biespecífico anti-PD-L1/anti-LAG3 de quaisquer das reivindicações 1-3, em que o anticorpo anti-PD-L1 ou o fragmento de ligação ao antígeno dele não se liga a um domínio V da imunoglobulina (Ig V) da proteína PD-L1, em que o domínio Ig V consiste nos resíduos de aminoácidos 19-127.

5. O anticorpo biespecífico anti-PD-L1/anti-LAG3 de quaisquer das reivindicações 1-4, em que cada um do anticorpo anti-PD-L1 ou o fragmento de ligação ao antígeno dele e do anticorpo anti-LAG3 ou o fragmento de ligação ao antígeno dele é independentemente um anticorpo quimérico, um anticorpo humanizado ou um anticorpo totalmente humano.

6. Um anticorpo biespecífico anti-PD-L1/anti- LAG3, compreendendo um anticorpo anti-PD-L1 ou um fragmento de ligação ao antígeno dele e um anticorpo anti-LAG3 ou um fragmento de ligação ao antígeno dele, em que o anticorpo anti-PD-L1 ou o fragmento de ligação ao antígeno dele compreende: (1) uma CDR1 da VH tendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 61-67; (2) uma CDR2 da VH tendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em

SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 68-77 e 525-527; (3) uma CDR3 da VH tendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 78-90 e SEQ ID NO: 513-519; (4) uma CDR1 da VL tendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 91-92 e SEQ ID NO: 520-521; (5) uma CDR2 da VL tendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 93-105; e (6) uma CDR3 da VL tendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 106-111 e SEQ ID NO: 522-524, o anticorpo anti-LAG3 ou o fragmento de ligação ao antígeno dele compreende: (i) uma CDR1 da VH tendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOS: 116-117, 354 e 453-460; (ii) uma CDR2 da VH tendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOS: 118-119, 355 e 461-467; (iii) uma CDR3 da VH tendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 120-160, 356 e 468-475; (iv) uma CDR1 da VL tendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOS: 163-195, 229, 357 e 490; (v) uma CDR2 da VL tendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOS: 196-217, 358 e 476-483; e

(vi) uma CDR3 da VL tendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOS: 218-228, 230-253, 359 e 484-489.

7. O anticorpo biespecífico anti-PD-L1/anti-LAG3 da reivindicação 6, em que cada um do anticorpo anti-PD-L1 ou o fragmento de ligação ao antígeno dele e do anticorpo anti-LAG3 ou o fragmento de ligação ao antígeno dele é independentemente um anticorpo quimérico, um anticorpo humanizado ou um anticorpo totalmente humano.

8. O anticorpo biespecífico anti-PD-L1/anti-LAG3 da reivindicação 8, em que o anticorpo anti-PD-L1 ou o fragmento de ligação ao antígeno dele e o anticorpo anti- LAG3 ou o fragmento de ligação ao antígeno dele são anticorpos humanizados.

9. O anticorpo biespecífico anti-PD-L1/anti-LAG3 de qualquer uma das reivindicações 6-8, em que o anticorpo anti-PD-L1 ou o fragmento de ligação ao antígeno dele compreende uma região variável da cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOS: 7-26, 113, 493, 495, 497, 499, 501, 503, 505, 507, 509 e 511, ou um polipeptídeo tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOS: 7-26, 113, 493, 495, 497, 499, 501, 503, 505, 507, 509 e 511.

10. O anticorpo biespecífico anti-PD-L1/anti-LAG3 de qualquer uma das reivindicações 6-9, em que o anticorpo anti-PD-L1 ou o fragmento de ligação ao antígeno dele compreende uma região variável da cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOS: 27-33, 494, 496, 498, 500, 502, 504, 506, 508, 510 e 512, ou um peptídeo tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOS: 27-33, 494, 496, 498, 500, 502, 504, 506, 508, 510 e 512.

11. O anticorpo biespecífico anti-PD-L1/anti-LAG3 de qualquer uma das reivindicações 6-10, em que o anticorpo anti-LAG3 ou o fragmento de ligação ao antígeno dele compreende uma região variável da cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOS: 254-302, 352, 360-373, 375, 377, 379, 381, 383, 385, 387, 389, 391, 393, 395, 397, 399, 401, 403, 405, 407, 409, 411, 413, 415, 417, 419, 421, 423, 425, 427, 429, 431, 433, 435, 437, 439, 441, 443, 445, 447, 449, 451 e 491, ou um polipeptídeo tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOS: 254-302, 352, 360-373, 375, 377, 379, 381, 383, 385, 387, 389, 391, 393, 395, 397, 399, 401, 403, 405, 407, 409, 411, 413, 415, 417, 419, 421, 423, 425, 427, 429, 431, 433, 435, 437, 439, 441, 443, 445, 447, 449, 451 e

491.

12. O anticorpo biespecífico anti-PD-L1/anti-LAG3 de qualquer uma das reivindicações 6-11, em que o anticorpo anti-LAG3 ou o fragmento de ligação ao antígeno dele compreende uma região variável da cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOS: 303-351, 353, 374, 376, 378, 380, 382, 384, 386, 388, 390, 392, 394, 396, 398, 400, 402,

404, 406, 408, 410, 412, 414, 416, 418, 420, 422, 424, 426, 428, 430, 432, 434, 436, 438, 440, 442, 444, 446, 448, 450, 452 e 492, ou um peptídeo tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOS: 303-351, 353, 374, 376, 378, 380, 382, 384, 386, 388, 390, 392, 394, 396, 398, 400, 402, 404, 406, 408, 410, 412, 414, 416, 418, 420, 422, 424, 426, 428, 430, 432, 434, 436, 438, 440, 442, 444, 446, 448, 450, 452 e 378.

13. O anticorpo biespecífico anti-PD-L1/anti-LAG3 de qualquer uma das reivindicações 1-12, o qual está na forma de forma de IgG-scFv.

14. Uma composição farmacêutica para tratar ou prevenir uma doença associada ao PD-L1, ao LAG3 ou a ambos, a composição compreendendo o anticorpo biespecífico anti- PD-L1/anti-LAG3 de qualquer uma das reivindicações 1-12 e um veículo farmaceuticamente aceitável.

15. A composição farmacêutica da reivindicação 14, em que a doença associada ao PD-L1, ao LAG3 ou a ambos é um câncer ou uma infecção.

16. A composição farmacêutica da reivindicação 15, em que o câncer é um tumor sólido.

17. A composição farmacêutica da reivindicação 15, em que o câncer é selecionado a partir do grupo que consiste em câncer da bexiga, câncer do fígado, câncer do cólon, câncer retal, câncer endometrial, leucemia, linfoma, câncer pancreático, câncer do pulmão de células pequenas, câncer do pulmão de células não pequenas, câncer de mama, câncer uretral, câncer de cabeça e pescoço, câncer gastrointestinal, câncer do estômago, câncer esofágico,

câncer ovariano, câncer renal, melanoma, câncer da próstata e câncer da tireoide.

18. Um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno dele, tendo especificidade para uma proteína PD-L1 humana e compreendendo: (1) uma CDR1 da VH compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1 e 61-67; (2) uma CDR2 da VH compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 2, 68-77 e 525-527; (3) uma CDR3 da VH compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 3, 78-90 e 513-519; (4) uma CDR1 da VL compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 4, 91-92 e 520-521; (5) uma CDR2 da VL compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 5 e 93-105; e (6) uma CDR3 da VL compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 6, 106-111 e 522-524.

19. Um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno dele, tendo especificidade para uma proteína LAG3 humana e compreendendo: (i) uma CDR1 da VH compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 116-117, 354 e 453-460; (ii) uma CDR2 da VH compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 118-119, 355 e 461-467; (iii) uma CDR3 da VH compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 120-160, 356 e 468-475; (iv) uma CDR1 da VL compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 163-195, 229, 357 e 490; (v) uma CDR2 da VL compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 196-217, 358 e 476-483; e (vi) uma CDR3 da VL compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 218-228, 230-253, 359 e 484-489.

20. O anticorpo ou o fragmento da reivindicação 19, em que a CDR1 da VH compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:354, a CDR2 da VH compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:461, a CDR3 da VH compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:468, a CDR1 da VL compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:490, a CDR2 da VL compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:358 e a CDR3 da VL compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:488.

21. O anticorpo ou o fragmento da reivindicação 20, o qual compreende uma região variável da cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:443, ou um polipeptídeo tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:443.

22. O anticorpo ou o fragmento da reivindicação 20 ou 21, o qual compreende uma região variável da cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:444, ou um polipeptídeo tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:444.

23. O anticorpo ou o fragmento de qualquer uma das reivindicações 19-22, o qual é capaz de inibir a ligação de uma proteína LAG humana a uma molécula de MHC de classe II ou à Proteína 1 semelhante ao Fibrinogênio (FGL1).

24. Um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno dele, tendo especificidade para uma proteína LAG3 humana e compreendendo: uma região variável da cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:443, ou um polipeptídeo tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:443 e tendo uma CDR1 da VH compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:354, uma CDR2 da VH compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:461 e uma CDR3 da VH compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:468, e uma região variável da cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:444, ou um polipeptídeo tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:444 e tendo uma CDR1 da VL compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:490, uma CDR2 da VL compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:358 e uma CDR3 da VL compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:488.

25. O anticorpo ou o fragmento de qualquer uma das reivindicações 18-24, o qual é humanizado.

26. Um ou mais polinucleotídeos que codificam o anticorpo ou o fragmento de qualquer uma das reivindicações 18-24.

27. Uma composição farmacêutica para tratar ou prevenir o câncer, compreendendo o anticorpo ou o fragmento de qualquer uma das reivindicações 18-24 e um veículo farmaceuticamente aceitável.

28. A composição farmacêutica da reivindicação 27, em que o câncer é selecionado a partir do grupo que consiste em câncer da bexiga, câncer do fígado, câncer do cólon, câncer retal, câncer endometrial, leucemia, linfoma, câncer pancreático, câncer do pulmão de células pequenas, câncer do pulmão de células não pequenas, câncer de mama, câncer uretral, câncer de cabeça e pescoço, câncer gastrointestinal, câncer do estômago, câncer esofágico, câncer ovariano, câncer renal, melanoma, câncer da próstata e câncer da tireoide.