JP7177543B2 - 抗ｐｄ－ｌ１／抗ｌａｇ３二重特異性抗体およびその使用 - Google Patents

抗ｐｄ－ｌ１／抗ｌａｇ３二重特異性抗体およびその使用 Download PDF

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Description

プログラム細胞死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）は、分化のクラスター２７４（ＣＤ２７４）またはＢ７ホモログ１（Ｂ７－Ｈ１）としても公知であり、４０ｋＤａの１型膜貫通タンパク質であり、妊娠、組織同種移植、自己免疫疾患、肝炎などの他の病態などの特定のイベントで免疫系を抑制するのに主要な役割を果たすと考えられている。ＰＤ－Ｌ１のＰＤ－１またはＢ７．１への結合は、リンパ節でのＣＤ８＋ Ｔ細胞の増殖を減少させる阻害シグナルを伝達し、その補足として、ＰＤ－１は、アポトーシスを介してリンパ節で、Ｂｃｌ－２遺伝子のより低い調節によってさらに媒介され、外来抗原特異的Ｔ細胞の蓄積を制御し得る。
ＰＤ－Ｌ１の上方調節により、癌を宿主の免疫系から回避させ得ることが示されている。腎細胞癌患者の腫瘍標本の分析により、ＰＤ－Ｌ１の高い腫瘍発現は、腫瘍の攻撃性の増加と死亡リスクの増加に関連していることが見い出された。多くのＰＤ－Ｌ１阻害剤が免疫腫瘍学療法として開発中であり、臨床試験で良好な結果を示している。
癌の治療に加えて、ＰＤ－Ｌ１阻害は感染症の治療にも有望であることが示されている。細胞内感染のマウスモデルでは、リステリア・モノサイトゲネスがＴ細胞、ＮＫ細胞、マクロファージでＰＤ－Ｌ１タンパク質の発現を誘導した。 ＰＤ－Ｌ１遮断（例えば、遮断抗体の使用）は、感染したマウスの死亡率の増加をもたらした。遮断により、マクロファージによるＴＮＦαおよび一酸化窒素の産生が減少し、ＮＫ細胞によるグランザイムＢの産生が減少し、リステリア・モノサイトゲネスの抗原特異的ＣＤ８ Ｔ細胞（ＣＤ４ Ｔ細胞ではない）の増殖が減少した。この証拠は、ＰＤ－Ｌ１が細胞内感染において正の共刺激分子として作用することを示唆している。
リンパ球活性化遺伝子－３（ＬＡＧ－３）（ＣＤ２２３としても知られている）は免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリーのメンバーであり、ＣＤ４と密接に関連しており、Ｔ細胞機能にさまざまな影響を与える。ＬＡＧ－３は、活性化Ｔ細胞、枯渇Ｔ細胞、腫瘍浸潤Ｔ細胞、および制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）に発現する。主要組織適合遺伝子複合体２（ＭＨＣクラスＩＩ）と結合すると、ＬＡＧ－３／ＭＨＣクラスＩＩ相互作用により、Ｔ細胞の増殖、活性化、および恒常性が負に調節される。
ＬＡＧ－３は、細胞毒性Ｔリンパ球抗原－４（ＣＴＬＡ－４）、プログラム細胞死リガンド－１（ＰＤ－Ｌ１）、プログラム細胞死－１（ＰＤ－１）と同様に、癌における重要な免疫チェックポイントを表す。ＬＡＧ－３は、活性化／枯渇したエフェクターＴ細胞においてだけでなく、制御性Ｔ細胞においても発現する。ＬＡＧ３拮抗作用は、エフェクターＴ細胞の活性化を促進するだけでなく、制御性Ｔ細胞の抑制機能を阻害もし得る。したがって、ＬＡＧ－３は癌免疫療法の有望な標的であり、前臨床の証拠は、抗ＬＡＧ－３抗体が抗腫瘍反応を促進し得ることを示唆している。
上記を考慮して、様々な癌および腫瘍細胞の増殖を阻害する免疫応答を刺激する方法でＬＡＧ－３の活性を調節し、かつ、自己免疫、炎症性、またはウイルス性疾患の治療に有用である新規の剤を開発する必要性が存在する。
本開示は、ＰＤ－Ｌ１とその受容体ＰＤ－１との間、およびＬＡＧ３とそのリガンド（例えば、ＭＨＣクラスＩＩ分子）との間の相互作用を効果的に遮断することができる抗ＰＤ－Ｌ１／抗ＬＡＧ３二重特異性抗体を提供する。二重特異性抗体は、ＰＤ－Ｌ１タンパク質（例えば、ヒトＰＤ－Ｌ１タンパク質）およびＬＡＧ３タンパク質（例えば、ヒトＬＡＧ３タンパク質）の両方に対して高い結合親和性を有し得る。前記抗ＰＤ－Ｌ１／抗ＬＡＧ３二重特異性抗体は、ＰＤ－Ｌ１タンパク質に特異的に認識および／または結合し得るＰＤ－Ｌ１標的化部分として抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその抗原結合フラグメント、ならびに、ＬＡＧ３タンパク質に特異的に認識および／または結合し得るＬＡＧ３標的化部分として抗ＬＡＧ３抗体またはその抗原結合フラグメントを含み得る。
前記抗ＰＤ－Ｌ１ ／抗ＬＡＧ３二重特異性抗体は、抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその抗原結合フラグメントをＰＤ－Ｌ１標的化部分として含み得る。
一実施形態では、前記二重特異性抗体に含まれる前記抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはそのフラグメントは、ＰＤ－Ｌ１（例えば、ヒトＰＤ－Ｌ１）タンパク質の免疫グロブリンＣ（ＩｇＣ）ドメインに特異的に結合し得る。いくつかの実施形態では、前記ＩｇＣドメインは、ヒトＰＤ－Ｌ１タンパク質のアミノ酸残基１３３～２２５からなる。いくつかの実施形態では、前記抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはそのフラグメントは、ヒトＰＤ－Ｌ１タンパク質のアミノ酸残基Ｙ１３４、Ｋ１６２、およびＮ１８３のうちの少なくとも１つに結合し得る。いくつかの実施形態では、前記抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはそのフラグメントは、前記ＰＤ－Ｌ１タンパク質の免疫グロブリンＶ（ＩｇＶ）ドメインに結合せず、例えば、ＩｇＶドメインは、ヒトＰＤ－Ｌ１タンパク質のアミノ酸残基１９～１２７からなる。例えば、前記ヒトＰＤ－Ｌ１タンパク質は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００１２５４６３５．１ ＮＰ＿００１３００９５８．１、ＮＰ＿０５４８６２．１などで表されるタンパク質からなる群から選択し得るが、これらに限定され得ない。これらの抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、さまざまな種類の癌、感染症（炎症）などの治療などの治療目的に役立ち得て、診断および予後の目的にも使用され得る。一実施形態では、前記抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはそのフラグメントは、ヒトＰＤ－Ｌ１タンパク質に特異性を示し得る。
前記抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはそのフラグメントは、（１）配列番号１および６１～６７からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ１；（２）配列番号２、６８～７７、および５２５～５２７からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２；（３）配列番号３、７８～９０および５１３～５１９からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３；（４）配列番号４、配列番号９１～９２、および５２０～５２１からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１；（５）配列番号５および９３～１０５からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２；ならびに、（６）配列番号６、１０６～１１１、および５２２～５２４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ３を含み得る。例えば、前記抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはそのフラグメントは、配列番号１のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ１；配列番号２のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２；配列番号３または５１５のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３；配列番号４のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１； 配列番号５のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２；および配列番号６のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ３を含み得る。
前記抗ＰＤ－Ｌ１ ／抗ＬＡＧ３二重特異性抗体は、ＬＡＧ３標的化部分として抗ＬＡＧ３抗体またはその抗原結合フラグメントを含み得る。一実施形態では、前記抗ＬＡＧ３抗体またはそのフラグメントは、ＬＡＧ３（例えば、ヒトＬＡＧ３）タンパク質に特異的に結合し得て；例えば、前記抗ＬＡＧ３抗体またはそのフラグメントは、ＬＡＧ－３の細胞外ドメインに結合し得る。
例えば、本明細書に記載の抗ＬＡＧ３抗体またはそのフラグメントは、既存の抗ＬＡＧ－３抗体がＭＨＣクラスＩＩ分子への結合に対してのみ阻害効果を示したことを考慮すると、本開示の抗ＬＡＧ３抗体またはそのフラグメントに固有でかなりの効果のＭＨＣクラスＩＩ分子への結合を阻害することに加えて、前記ＬＡＧ－３タンパク質のガレクチン－３（ＬＧＡＬＳ３）およびＣ型レクチンドメインファミリー４メンバーＧ（ＬＳＥＣｔｉｎ）タンパク質への結合を阻害し得る。いくつかの実施形態では、本開示の抗体およびそのフラグメントは、エフェクターＴ細胞（Ｔｅｆｓ）に対する制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の阻害効果を逆転させ得る。いくつかの実施形態では、本開示の抗体およびそのフラグメントは、ＬＡＧ３フィブリノーゲン様タンパク質１（ＦＧＬ１）間の結合を阻害し得る。
例えば、前記ヒトＬＡＧ３タンパク質は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０２２７７．４などによって表されるタンパク質からなる群から選択され得るが、それに限定され得ない。これらの抗ＬＡＧ３抗体は、さまざまな種類の癌、感染症（炎症）などの治療などの治療目的に役立ち得て、診断および予後の目的にも使用され得る。
一実施形態では、前記抗ＬＡＧ３抗体またはそのフラグメントは、ヒトＬＡＧ３タンパク質に特異性を示し得る。前記抗ＬＡＧ３抗体またはそのフラグメントは、（ｉ）配列番号１１６～１１７、３５４、および４５３～４６０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ１；（ｉｉ）配列番号１１８～１１９、３５５、および４６１～４６７からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２；（ｉｉｉ）配列番号１２０～１６０、３５６、および４６８～４７５からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３；（ｉｖ）配列番号１６３～１９５、２２９、３５７、および４９０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１；（ｖ）配列番号１９６～２１７、３５８、および４７６～４８３からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２；ならびに、（ｖｉ）配列番号２１８～２２８、２３０～２５３、３５９、および４８４～４８９からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ３を含み得る。例えば、前記抗ＬＡＧ３抗体またはそのフラグメントは、配列番号３５４のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ１； 配列番号３５５または４６１のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２； 配列番号３５６または４６８のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３； 配列番号３５７または４９０のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１； 配列番号３５８のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２；および、配列番号３５９または４８８のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ３を含み得る。
前記ＰＤ－Ｌ１またはＬＡＧ３タンパク質のみに特異性を有する抗体およびフラグメント、または１つまたは複数の他の抗原に追加の特異性を有する抗体も提供される。
一実施形態では、（１）配列番号１および６１～６７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ１； （２）配列番号２、６８～７７、および５２５～５２７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ２； （３）配列番号３、７８～９０、および５１３～５１９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ３；（４）配列番号４、９１～９２、および５２０～５２１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ１； （５）配列番号５および９３～１０５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ２；ならびに、（６）配列番号６、１０６～１１１、および５２２～５２４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ３を含むヒトＰＤ－Ｌ１タンパク質に特異性を有する抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。
一実施形態では、（ｉ）配列番号１１６～１１７、３５４、および４５３～４６０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ１；（ｉｉ）配列番号１１８～１１９、３５５、および４６１～４６７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ２；（ｉｉｉ）配列番号１２０～１６０、３５６、および４６８～４７５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ３；（ｉｖ）配列番号１６３～１９５、２２９、３５７、および４９０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ１；（ｖ）配列番号１９６～２１７、３５８、および４７６～４８３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ２；ならびに、（ｖｉ）配列番号２１８～２２８、２３０～２５３、３５９、および４８４～４８９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ３を含むヒトＬＡＧ３タンパク質に特異性を有する抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。
他の実施形態は、上記のような二重特異性抗体を含む医薬組成物を提供する。前記医薬組成物は、薬学的に許容される担体をさらに含み得る。前記医薬組成物は、癌または感染症を治療および／または予防するために使用され得る。
他の実施形態は、それを必要とする対象における癌または感染症を治療および／または予防する方法を提供し、対象に薬学的に有効な量の二重特異性抗体または医薬組成物を投与することを含む。前記方法は、投与工程の前に、癌または感染症を治療および／または予防する必要がある対象を特定するさらなる工程であり得る。
他の実施形態は、癌または感染症を治療および／または予防する際の前記二重特異性抗体または医薬組成物の使用を提供する。他の実施形態は、癌または感染症を治療および／または予防するための医薬組成物を調製する際の前記二重特異性抗体の使用を提供する。
本明細書で提供される医薬組成物、方法および／または使用において、前記癌は、固形癌または血液癌、好ましくは固形癌であり得る。
他の実施形態は、生物学的サンプルにおいて、ＰＤ－Ｌ１、ＬＡＧ３、またはそれらの両方を同時に検出するための組成物を提供し、その組成物は、二重特異性抗体を含む。他の実施形態は、生物学的サンプルにおいて、ＰＤ－Ｌ１、ＬＡＧ３、またはそれらの両方を同時に検出する方法を提供し、その方法は、前記生物学的サンプルを二重特異性抗体と接触させること；および、前記二重特異性抗体と、ＰＤ－Ｌ１、ＬＡＧ３、またはその両方との間の抗原抗体反応（結合）を検出（測定）することを含む。
前記検出方法は、検出工程の後に、抗原抗体反応が検出される場合、ＰＤ－Ｌ１、ＬＡＧ３、またはそれらの両方が生物学的サンプル中に存在すること、および／または、抗原抗体反応が検出されない場合、ＰＤ－Ｌ１、ＬＡＧ３、またはその両方が生体サンプル中にない（存在しない）ことを特定することをさらに含み得る。
他の実施形態は、ＰＤ－Ｌ１、ＬＡＧ３、またはそれらの両方に関連する疾患を診断するための医薬組成物を提供し、その組成物は、二重特異性抗体を含む。他の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１、ＬＡＧ３、またはそれらの両方に関連する疾患を診断するための前記二重特異性抗体の使用が提供される。
他の実施形態は、ＰＤ－Ｌ１、ＬＡＧ３、またはそれらの両方に関連する疾患を診断する方法を提供し、この方法は、患者から得られた生物学的サンプルを前記二重特異性抗体と接触させ、前記抗原抗体反応を検出されるか、または生体サンプルにおける前記抗原抗体反応のレベルを測定することを含む。いくつかの実施形態では、前記方法は、正常なサンプルを二重特異性抗体と接触させること、および正常なサンプルにおける抗原抗体反応のレベルを測定することをさらに含み得る。さらに、前記方法は、測定工程の後に、生物学的サンプルおよび正常サンプルにおける抗原抗体反応のレベルを比較することをさらに含み得る。さらに、検出工程または比較工程の後、前記方法は、生物学的サンプルまたは生体サンプル中で前記抗原抗体反応が検出される場合か、前記抗原抗体反応のレベルが、正常なサンプルのレベルよりも高い場合、ＰＤ－Ｌ１、ＬＡＧ３、またはそれらの両方に関連する疾患を有する患者として患者を特定することをさらに含み得る。
前記ＰＤ－Ｌ１、ＬＡＧ３、またはそれらの両方に関連する疾患は、ＰＤ－Ｌ１、ＬＡＧ３、またはそれらの両方の活性化（例えば、異常な活性化または過剰活性化）および／または過剰産生（過剰発現）に関連する疾患であり得る。例えば、前記疾患は、上記のように、癌または感染症であり得る。
一実施形態は、前記二重特異性抗体をコードするポリヌクレオチドを提供する。特に、一実施形態は、全長ＩｇＧならびに全長ＩｇＧのＣ末端および／またはＮ末端に連結されたｓｃＦｖを含むＩｇＧ－ｓｃＦｖ形態の前記二重特異性抗体の重鎖をコードするポリヌクレオチドを提供する。他の実施形態は、ＩｇＧ－ｓｃＦｖ形態の前記二重特異性抗体の軽鎖をコードするポリヌクレオチドを提供する。他の実施形態は、前記二重特異性抗体の重鎖をコードするポリヌクレオチド、前記二重特異性抗体の軽鎖をコードするポリヌクレオチド、またはそれらの両方を含む組換えベクターを提供する。他の実施形態は、前記組換えベクターでトランスフェクトされた組換え細胞を提供する。
他の実施形態は、前記細胞内で二重特異性抗体の重鎖をコードするポリヌクレオチド、前記二重特異性抗体の軽鎖をコードするポリヌクレオチドを発現することを含む、前記二重特異性抗体を調製する方法を提供する。前記ポリヌクレオチドを発現する工程は、前記ポリヌクレオチドの発現させる条件下で（例えば、組換えベクターにおいて）、前記ポリヌクレオチドを含む細胞を培養することによって実施され得る。前記方法は、発現または培養の工程の後に、前記細胞培養物から前記二重特異性抗体を単離および／または精製することをさらに含み得る。
図１は、ＨＬ１２１０－３がヒトＰＤ－Ｌ１に高い親和性で結合し得ることを示している。 図２は、ＨＬ１２１０－３がヒトＰＤ－Ｌ１のヒトＰＤ１への結合を効率的に阻害し得ることを示している。 図３は、ＨＬ１２１０－３抗体が、哺乳動物細胞で発現されるＰＤ－Ｌ１とのＰＤ－１の結合を非常に効率的に阻害し得ることを示している。 図４は、試験された抗ＰＤ－Ｌ１抗体がヒトＴ細胞応答を促進し得ることを示している。 図５は、ＨＬ１２１０－３の組換えＰＤ－Ｌ１への結合動態を示している。 図６Ａ～図６Ｅは、試験されたすべてのヒト化抗体が、キメラ抗体と接触したヒトＰＤ－Ｌ１と同等の結合効果を有したことを示している。 図６Ａ～図６Ｅは、試験されたすべてのヒト化抗体が、キメラ抗体と接触したヒトＰＤ－Ｌ１と同等の結合効果を有したことを示している。 図６Ａ～図６Ｅは、試験されたすべてのヒト化抗体が、キメラ抗体と接触したヒトＰＤ－Ｌ１と同等の結合効果を有したことを示している。 図６Ａ～図６Ｅは、試験されたすべてのヒト化抗体が、キメラ抗体と接触したヒトＰＤ－Ｌ１と同等の結合効果を有したことを示している。 図６Ａ～図６Ｅは、試験されたすべてのヒト化抗体が、キメラ抗体と接触したヒトＰＤ－Ｌ１と同等の結合効果を有したことを示している。 図７Ａ～図７Ｃは、試験されたすべてのヒト化抗体が、キメラ抗体に匹敵する、哺乳動物細胞で発現されるＰＤ－Ｌ１に高効率で結合し得ることを示している。 図７Ａ～図７Ｃは、試験されたすべてのヒト化抗体が、キメラ抗体に匹敵する、哺乳動物細胞で発現されるＰＤ－Ｌ１に高効率で結合し得ることを示している。 図７Ａ～図７Ｃは、試験されたすべてのヒト化抗体が、キメラ抗体に匹敵する、哺乳動物細胞で発現されるＰＤ－Ｌ１に高効率で結合し得ることを示している。 図８は、ヒト化抗体Ｈｕ１２１０－４１がより低い親和性でアカゲザルＰＤ－Ｌ１に結合し得て、ラットおよびマウスＰＤ－Ｌ１に結合し得ないことを示している。 図９は、Ｈｕ１２１０－４１抗体がＢ７－Ｈ１（ＰＤ－Ｌ１）にのみ特異的に結合し得て、Ｂ７－ＤＣ、Ｂ７－１、Ｂ７－２、Ｂ７－Ｈ２、ＰＤ－１、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ４、ＩＣＯＳおよびＢＴＬＡには結合し得ないことを示している。 図１０は、Ｈｕ１２１０－４１がヒトＰＤ－Ｌ１のヒトＰＤ１およびＢ７－１への結合を効率的に阻害し得ることを示している。 図１１は、Ｈｕ１２１０－４１がヒトＰＤ－Ｌ１のヒトＰＤ１およびＢ７－１への結合を効率的に阻害し得ることを示している。 図１２は、Ｈｕ１２１０－８、Ｈｕ１２１０－９、Ｈｕ１２１０－１６、Ｈｕ１２１０－１７、Ｈｕ１２１０－２１およびＨｕ１２１０－３６ヒト化抗体が、混合リンパ球反応におけるＩＦＮγおよびＩＬ－２産生を用量依存的に促進し得ることを示している。 図１３は、Ｈｕ１２１０－４０、Ｈｕ１２１０－４１およびＨｕ１２１０－１７ヒト化抗体が、ＣＭＶリコールアッセイにおいて用量依存的にＩＦＮγ産生を促進し得ることを示している。 図１４は、Ｈｕ１２１０－３１が、ＨＣＣ８２７－ＮＳＧ－異種移植モデルにおいて５ｍｇ／ｋｇで３０％腫瘍増殖を阻害し得ることを示している。 図１５は、Ｈｕ１２１０－４１抗体がＨＣＣ８２７－ＮＳＧ－異種移植モデルにおいて腫瘍増殖を用量依存的に阻害し得る一方で、腫瘍重量もＨｕ１２１０－４１抗体によって用量依存的に抑制されたことを示している。 図１６は、各ＰＤ－Ｌ１変異体について、発現の関数としての平均結合値をプロットしている（コントロールの抗ＰＤ－Ｌ１ ｍＡｂ反応性）。 図１７は、抗ＰＤ－Ｌ１ Ｈｕ１２１０－４１抗体への結合に関与する残基（球）であるＹ１３４、Ｋ１６２、およびＮ１８３の位置を示している。 図１８は、誘導された抗体の（ヒトＰＤ－Ｌ１への）結合アッセイの結果を示している。 図１９は、親抗体およびＴｅｃｅｎｔｒｉｑＴＭ（アテゾリズマブ）と比較して、抗体Ｂ６が哺乳動物細胞で発現されたＰＤ－Ｌ１により効率的に結合することを示している。 図２０は、Ｂ６もより高い効力を示したジャーカット細胞におけるＩＬ２産生に対する抗体の効果を示している。 図２１は、Ｄ１－Ｄ２ドメインがＬＡＧ－３機能にとって重要であることを示している。 野生型（ＷＴ）ＬＡＧ３細胞外ドメイン（ＥＣＤ）融合タンパク質（ＬＡＧ－３－ＥＣＤ－ｈｕＦｃ）フラグメントはダウディ細胞に結合し得るが、Ｄ１－Ｄ２トランケートＬＡＧ－３－ＥＣＤ－ｈｕＦｃフラグメントはダウディ細胞に結合し得ない。 図２２Ａ～図２２Ｄは、様々な種に由来するＬＡＧ３タンパク質へのヒト抗ＬＡＧ３抗体の結合を示している。抗ＬＡＧ－３抗体は、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）を介して、ヒト、ラット、およびマウスのＬＡＧ３への結合特性について評価された。 図２２Ａ～図２２Ｄは、様々な種に由来するＬＡＧ３タンパク質へのヒト抗ＬＡＧ３抗体の結合を示している。抗ＬＡＧ－３抗体は、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）を介して、ヒト、ラット、およびマウスのＬＡＧ３への結合特性について評価された。 図２２Ａ～図２２Ｄは、様々な種に由来するＬＡＧ３タンパク質へのヒト抗ＬＡＧ３抗体の結合を示している。抗ＬＡＧ－３抗体は、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）を介して、ヒト、ラット、およびマウスのＬＡＧ３への結合特性について評価された。 図２２Ａ～図２２Ｄは、様々な種に由来するＬＡＧ３タンパク質へのヒト抗ＬＡＧ３抗体の結合を示している。抗ＬＡＧ－３抗体は、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）を介して、ヒト、ラット、およびマウスのＬＡＧ３への結合特性について評価された。 図２３は、活性化されたヒト初代ＣＤ４＋ Ｔ細胞上の細胞表面ＬＡＧ－３抗原へのヒト抗ＬＡＧ３抗体の結合を示している。抗ＬＡＧ－３抗体は、さまざまな濃度（１０μｇ／ｍｌ， ３．３３３μｇ／ｍｌ， １．１１１μｇ／ｍｌ， ０．３７０μｇ／ｍｌ， ０．１２３μｇ／ｍｌ， ０．０４１μｇ／ｍｌ， ０．０１４μｇ／ｍｌ ａｎｄ ０．００５μｇ／ｍｌ）で活性化されたヒト初代ＣＤ４＋ Ｔ細胞上の細胞表面ＬＡＧ－３抗原への結合について評価された。 図２４は、抗ＬＡＧ－３抗体によるＭＨＣクラスＩＩ受容体への可溶性ＬＡＧ－３（ｓＬＡＧ）結合の阻害を示している。抗ＬＡＧ－３抗体は、ＭＨＣクラスＩＩ受容体を発現する、ビオチン標識ＬＡＧ－３－ＥＣＤ－ｈｕＦｃＬＡＧ－３－Ｆｃ融合タンパク質およびＲａｊｉ細胞を使用したｉｎ ｖｉｔｒｏ結合アッセイで、ｓＬＡＧ－３のＭＨＣクラスＩＩ受容体への結合を阻害する能力について評価された。 図２５は、抗ＬＡＧ－３抗体による末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）におけるＩＬ－２産生の刺激を示している。抗ＬＡＧ－３抗体をブドウ球菌エンテロトキシンＢ（ＳＥＢ）で刺激したＰＢＭＣに、２０μｇ／ ｍｌから始まるさまざまな濃度で１：３段階希釈で６回投与した。３日後、培養上清中のＩＬ－２濃度を酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）で評価した。 図２６は、抗ＬＡＧ－３抗体を使用して、エフェクターＴ細胞（Ｔｅｆｓ）に対する制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の抑制機能を逆転させることを示している。Ｔｅｆｓに対するＴｒｅｇの抑制効果を逆転させる抗ＬＡＧ－３抗体の能力を評価するために、実施例２．１の抗体をｉｎ ｖｉｔｒｏのＴｒｅｇ抑制アッセイで使用した。 図２７Ａ～図２７Ｃは、ＬＡＧ３の完全な細胞外ドメイン（Ｄ１－Ｄ４ ｈｕＦｃ）に結合するが、Ｄ１－Ｄ２欠失ＬＡＧ３（△Ｄ１－Ｄ２ｈｕＦｃ）には結合しない抗体のＥＣ５０を示すＥＬＩＳＡ結果を示し、１２２Ｈ、１４７Ｈ、および１７０Ｈが、ヒトＬＡＧ３のＤ１およびＤ２ドメインに対する、強力で選択的結合剤であることを示している。 図２７Ａ～図２７Ｃは、ＬＡＧ３の完全な細胞外ドメイン（Ｄ１－Ｄ４ ｈｕＦｃ）に結合するが、Ｄ１－Ｄ２欠失ＬＡＧ３（△Ｄ１－Ｄ２ｈｕＦｃ）には結合しない抗体のＥＣ５０を示すＥＬＩＳＡ結果を示し、１２２Ｈ、１４７Ｈ、および１７０Ｈが、ヒトＬＡＧ３のＤ１およびＤ２ドメインに対する、強力で選択的結合剤であることを示している。 図２７Ａ～図２７Ｃは、ＬＡＧ３の完全な細胞外ドメイン（Ｄ１－Ｄ４ ｈｕＦｃ）に結合するが、Ｄ１－Ｄ２欠失ＬＡＧ３（△Ｄ１－Ｄ２ｈｕＦｃ）には結合しない抗体のＥＣ５０を示すＥＬＩＳＡ結果を示し、１２２Ｈ、１４７Ｈ、および１７０Ｈが、ヒトＬＡＧ３のＤ１およびＤ２ドメインに対する、強力で選択的結合剤であることを示している。 図２８Ａ～図２８Ｃは、１２２Ｈ、１４７Ｈおよび１７０Ｈ抗体が、ＬＡＧ３のその受容体ＭＨＣクラスＩＩ分子への結合を用量依存的に阻害したことを示している。 図２８Ａ～図２８Ｃは、１２２Ｈ、１４７Ｈおよび１７０Ｈ抗体が、ＬＡＧ３のその受容体ＭＨＣクラスＩＩ分子への結合を用量依存的に阻害したことを示している。 図２８Ａ～図２８Ｃは、１２２Ｈ、１４７Ｈおよび１７０Ｈ抗体が、ＬＡＧ３のその受容体ＭＨＣクラスＩＩ分子への結合を用量依存的に阻害したことを示している。 図２９は、１２２Ｈ、１４７Ｈおよび１７０Ｈマウスモノクローナル抗体が、ジャーカットＴ細胞によるＩＬ２産生を用量依存的に促進したことを示している。 図３０は、ヒト化モノクローナル抗体１４７Ｈ－１３が、ジャーカットＴ細胞によるＩＬ２産生を用量依存的に促進したことを示している。 図３１は、ジャーカットＬＡＧ３細胞および活性化ＣＤ４ Ｔ細胞に対する抗ＬＡＧ３抗体の結合曲線を示している。 図３２は、一実施形態による、抗ＰＤ－Ｌ１／抗ＬＡＧ３二重特異性抗体を概略的に示す。 図３３は、ＥＬＩＳＡによって測定された、一実施形態による抗ＰＤ－Ｌ１／抗ＬＡＧ３二重特異性抗体のヒトＰＤ－Ｌ１およびヒトＬＡＧ３への結合を示すグラフを示している。 図３４は、一実施形態による、抗ＰＤ－Ｌ１ ／抗ＬＡＧ３二重特異性抗体のＳＥＥアッセイ結果を示す。また、一実施形態による、抗ＰＤ－Ｌ１／抗ＬＡＧ３二重特異性抗体のＴ細胞促進活性を示すグラフを示している。 図３５は、一実施形態による、抗ＰＤ－Ｌ１／抗ＬＡＧ３二重特異性抗体の腫瘍増殖阻害効果を示すグラフを示している。 図３６は、一実施形態による、抗ＰＤ－Ｌ１／抗ＬＡＧ３二重特異性抗体のＴ細胞促進活性を示すグラフを示している。 図３７は、一実施形態による、抗ＰＤ－Ｌ１ ／抗ＬＡＧ３二重特異性抗体のＴ細胞促進活性を示すグラフを示している。 図３８は、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）による、抗ＬＡＧ３モノクローナル抗体Ｂ３８０７および対照抗体のヒトＬＡＧ３タンパク質への結合を示している。 図３９は、Ｂ３８０７のＢｉａｃｏｒｅ分析結果を示している。 図４０は、ジャーカットおよびＰＢＭＣ細胞上のヒトＬＡＧ３へのＢ３８０７の結合活性を示している。 図４１は、Ｂ３８０７によるＭＨＣクラスＩＩ受容体への可溶性ＬＡＧ－３（ｓＬＡＧ）結合の阻害を示している。 図４２は、ジャーカット細胞におけるＩＬ２産生に対するＢ３８０７の効果を示している。 図４３は、初代Ｔ細胞におけるＩＬ２産生に対する、Ｂ３８０７、ならびに抗ＰＤ－Ｌ１抗体との組み合わせの効果を示している。 図４４は、腫瘍増殖の阻害における、単独で、または抗ＰＤ－１または抗ＰＤ－Ｌ１抗体と組み合わせた、Ｂ３８０７のインビボ結果を示している。 図４５は、ＩＬ２放出および細胞ベースの結合アッセイにおけるＢ３８０７とＢ３８０７ｂを比較し、それらの高レベルの類似性を示している。 図４６は、Ｂ３８０７とＢ３８０７ｂのＢｉａｃｏｒｅアッセイ結果を比較している。 図４７は、Ｂ３８０７が可溶性ＬＡＧ－３とＦＧＬ１の間の結合を効果的に阻害したことを示している。
［発明の詳細な説明］
定義
「ａ」または「ａｎ」実体という用語は、その実体のうちの１つまたは複数を指し、例えば、「抗体」は、１つまたは複数の抗体を表すと理解されることに留意されたい。したがって、「ａ」（または「ａｎ」）、「１つまたは複数」、および「少なくとも１つ」という用語は、本明細書では交換可能に使用され得る。
本明細書で使用される場合、「ポリペプチド」という用語は、単一の「ポリペプチド」ならびに複数の「ポリペプチド」を包含することを意図し、アミド結合（ペプチド結合としても知られる）によって直線的に連結されたモノマー（アミノ酸）から構成される分子を指す。「ポリペプチド」という用語は、２つ以上のアミノ酸の１つまたは複数の鎖のいずれかを指し、生成物の特定の長さを指すものではない。したがって、ペプチド、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド、「タンパク質」、「アミノ酸鎖」、または２つ以上のアミノ酸の１つまたは複数の鎖を指すために使用されるいずれかの他の用語は、「ポリペプチド」の定義に含まれ、かつ 「ポリペプチド」という用語は、これらの用語の代わりに、またはこれらの用語のいずれかと交換可能に使用され得る。「ポリペプチド」という用語はまた、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、既知の保護／遮断基による誘導体化、タンパク質分解切断、または非天然で発生するアミノ酸による修飾などの、これらに限定されない、ポリペプチドの発現後の修飾の、生成物を指すことを意図する。ポリペプチドは、天然の生物学的供給源に由来するか、または組換え技術によって産生され得るが、必ずしも指定された核酸配列から翻訳されるとは限らない。それは、化学合成を含むいずれかの方法で生成され得る。
細胞に関して本明細書で使用される「単離された」という用語は、ＤＮＡまたはＲＮＡなどの核酸が、それぞれ、高分子の天然の供給源に存在する他のＤＮＡまたはＲＮＡから分離された分子を指す。本明細書で使用される「単離された」という用語はまた、組換えＤＮＡ技術によって産生される場合、細胞物質、ウイルス物質、もしくは培養培地、または化学的に合成される場合、化学前駆体もしくは他の化学物質を実質的に含まない核酸またはペプチドを指す。さらに、「単離された核酸」は、フラグメントとして天然に存在せず、天然状態では見出されないであろう核酸フラグメントを含むことを意味する。「単離された」という用語はまた、他の細胞タンパク質または組織から単離された細胞またはポリペプチドを指すために本明細書で使用される。単離されたポリペプチドは、精製されたポリペプチドおよび組換えポリペプチドの両方を包含することを意味する。
本明細書で使用される場合、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドに関連する「組換え」という用語は、天然には存在しないポリペプチドまたはポリヌクレオチドの形態を意図し、その非限定的な例は、通常は一緒に発生しないポリヌクレオチドまたはポリペプチドを組み合わせることによって産生され得る。
「相同性」または「同一性」または「類似性」は、２つのペプチド間または２つの核酸分子間の配列類似性を指す。相同性は、比較の目的で整列され得る各配列の位置を比較することによって決定され得る。比較された配列の位置が同じ塩基またはアミノ酸で占められている場合、分子はその位置で相同である。配列間の相同性の程度は、配列によって共有される一致位置または相同位置の数の関数である。「非関連」または「非相同」配列は、本開示の配列の１つと、４０％未満の同一性、好ましくは２５％未満の同一性を共有する。
ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド領域（またはポリペプチドまたはポリペプチド領域）は、特定のパーセンテージ（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％）を有する。）の、他の配列に対する「配列同一性」の意味は、整列したときに、２つの配列を比較する際にその塩基（またはアミノ酸）のパーセンテージが同じであることを意味する。このアラインメントおよびパーセント相同性または配列同一性は、当技術分野で知られているソフトウェアプログラム、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら編 （２００７） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙに記載されているものを使用して決定され得る。好ましくは、デフォルトのパラメータが整列のために使用される。１つのアライメントプログラムは、デフォルトのパラメータを使用するＢＬＡＳＴである。特に、プログラムはＢＬＡＳＴＮとＢＬＡＳＴＰであり、次のデフォルトパラメータを使用する：Ｇｅｎｅｔｉｃ ｃｏｄｅ ＝ ｓｔａｎｄａｒｄ； ｆｉｌｔｅｒ ＝ ｎｏｎｅ； ｓｔｒａｎｄ ＝ ｂｏｔｈ； ｃｕｔｏｆｆ ＝ ６０； ｅｘｐｅｃｔ ＝ １０； Ｍａｔｒｉｘ ＝ ＢＬＯＳＵＭ６２； Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎｓ ＝ ５０ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ； ｓｏｒｔ ｂｙ ＝ ＨＩＧＨ ＳＣＯＲＥ； Ｄａｔａｂａｓｅｓ ＝ ｎｏｎ－ｒｅｄｕｎｄａｎｔ， ＧｅｎＢａｎｋ ＋ ＥＭＢＬ ＋ ＤＤＢＪ ＋ ＰＤＢ ＋ ＧｅｎＢａｎｋ ＣＤＳ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎｓ ＋ ＳｗｉｓｓＰｒｏｔｅｉｎ ＋ ＳＰｕｐｄａｔｅ ＋ ＰＩＲ。生物学的に同等のポリヌクレオチドは、上記の特定のパーセント相同性を有し、同一または類似の生物学的活性を有するポリペプチドをコードするものである。
「同等の核酸またはポリヌクレオチド」という用語は、核酸またはその相補体のヌクレオチド配列とある程度の相同性または配列同一性を有するヌクレオチド配列を有する核酸を指す。二本鎖核酸の相同体は、その相補体と、またはその相補体とある程度の相同性を有するヌクレオチド配列を有する核酸を含むことを意図している。一態様では、核酸の相同体は、前記核酸またはその補体にハイブリダイズし得る。同様に、「同等のポリペプチド」は、参照ポリペプチドのアミノ酸配列とある程度の相同性または配列同一性を有するポリペプチドを指す。いくつかの態様では、前記配列同一性は、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％である。いくつかの態様では、前記同等のポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、参照ポリペプチドまたはポリヌクレオチドと比較して、１つ、２つ、３つ、４つまたは５つの付加、欠失、置換、およびそれらのそれらの組み合わせを有する。いくつかの態様では、前記同等の配列は、参照配列の活性（例えば、エピトープ結合）または構造（例えば、塩橋）を保持する。
ハイブリダイゼーション反応は、異なる「ストリンジェンシー」の条件下で実行され得る。一般に、低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション反応は、約１０ｘＳＳＣまたは同等のイオン強度／温度の溶液中で約４０℃で実施される。中程度のストリンジェンシーハイブリダイゼーションは、通常、約６ｘＳＳＣで約５０℃で行われ、高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション反応は、一般に、約１ｘＳＳＣで約６０℃で行われる。ハイブリダイゼーション反応はまた、当業者によく知られている「生理学的条件下」で実施され得る。生理学的状態の非限定的な例は、細胞に通常見られる温度、イオン強度、ｐＨ、およびＭｇ２＋の濃度である。
ポリヌクレオチドは、４つのヌクレオチド塩基：シトシン（Ｃ）；グアニン（Ｇ）；チミン（Ｔ）；ポリヌクレオチドがＲＮＡの場合、チミンの代わりにウラシル（Ｕ）、の特定の配列で構成されている。したがって、「ポリヌクレオチド配列」という用語は、ポリヌクレオチド分子のアルファベット順の表現である。このアルファベット順の表現は、中央処理装置を備えたコンピューターのデータベースに入力され得て、機能ゲノミクスや相同性検索などのバイオインフォマティクスアプリケーションに使用され得る。「多型」という用語は、遺伝子またはその一部の複数の形態の共存を指す。少なくとも２つの異なる形態、すなわち２つの異なるヌクレオチド配列が存在する遺伝子の一部は、「遺伝子の多型領域」と呼ばれる。多型領域は単一のヌクレオチドであり得て、その同一性は対立遺伝子によって異なる。
「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」という用語は交換可能に使用され、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドまたはそれらの類似体のいずれかの任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。ポリヌクレオチドは、いずれかの三次元構造を有し得て、既知または未知のいずれかの機能を実行し得る。以下は、ポリヌクレオチドの非限定的な例である：遺伝子または遺伝子断片（例えば、プローブ、プライマー、ＥＳＴまたはＳＡＧＥタグ）、エキソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、いずれかの配列の単離されたＤＮＡ、いずれかの配列の単離されたＲＮＡ、核酸プローブおよびプライマー。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体などの修飾ヌクレオチドを含み得る。存在する場合、ヌクレオチド構造への修飾は、ポリヌクレオチドの集合の前または後に付与され得る。前記ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分によって中断され得る。ポリヌクレオチドは、標識成分との結合などによって、重合後にさらに修飾され得る。前記用語は、二本鎖分子および一本鎖分子の両方を指す。別段の指定または要求がない限り、ポリヌクレオチドである本開示のいずれかの実施形態は、前記二本鎖形態および、前記二本鎖形態を構成することが知られているまたは予測される２つの相補的な一本鎖形態のそれぞれの両方を包含する。
ポリヌクレオチドに適用される「コードする」という用語は、その天然状態で、または当業者に周知の方法によって操作された場合に、ｍＲＮＡを生成するためにポリペプチドおよび／またはそのフラグメントに転写および／または翻訳され得るポリペプチドを「コードする」と言われるポリヌクレオチドを指す。前記アンチセンス鎖はそのような核酸の相補体であり、それからコード配列を推定し得る。
本明細書で使用される場合、「抗体」または「抗原結合ポリペプチド」は、抗原を特異的に認識して結合するポリペプチドまたはポリペプチド複合体を指す。抗体は、抗体全体およびいずれかの抗原結合フラグメントまたはその一本鎖であり得る。したがって、「抗体」という用語は、抗原に結合する生物学的活性を有する免疫グロブリン分子の少なくとも一部を含むいずれかのタンパク質またはペプチド含有分子を含む。そのような例としては、重鎖または軽鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）もしくはそのリガンド結合部分、重鎖もしくは軽鎖可変領域、重鎖または軽鎖定常領域、フレームワーク（ＦＲ）領域、もしくはそのいずれかの部分、または結合タンパク質の少なくとも一部が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される「抗体フラグメント」または「抗原結合フラグメント」という用語は、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖなどの抗体の一部である。構造に関係なく、抗体フラグメントは、損傷のない抗体によって認識されるのと同じ抗原に結合する。「抗体フラグメント」という用語には、アプタマー、シュピーゲルマー、およびダイアボディが含まれる。「抗体フラグメント」という用語はまた、特定の抗原に結合して複合体を形成することによって抗体のように作用するいずれかの合成または遺伝子操作されたタンパク質を含む。
「一本鎖可変フラグメント」または「ｓｃＦｖ」は、免疫グロブリンの重鎖（ＶＨ）および軽鎖（ＶＬ）の可変領域の融合タンパク質を指す。いくつかの態様では、前記領域は、１０～約２５アミノ酸の短いリンカーペプチドに接続されている。前記リンカーは、柔軟性のためにグリシンが豊富であり、溶解性のためにセリンまたはスレオニンが豊富であり、ＶＨのＮ末端をＶＬのＣ末端に接続するか、またはその逆を行い得る。このタンパク質は、前記定常領域の除去と前記リンカーの導入にもかかわらず、元の免疫グロブリンの特異性を保持している。ＳｃＦｖ分子は当技術分野で知られており、例えば、米国特許第５，８９２，０１９号に記載されている。
抗体という用語は、生化学的に区別され得るさまざまな幅広いクラスのポリペプチドを含む。当業者は、重鎖がガンマ、ミュー、アルファ、デルタ、またはイプシロン（γ、μ、α、δ、ε）として分類され、それらの中にいくつかのサブクラス（例えば、γ１－γ４）があることを理解するであろう。この鎖の性質により、抗体の「クラス」をそれぞれＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＧ、またはＩｇＥとして決定する。前記免疫グロブリンサブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＧ５などは十分に特徴付けられており、機能的な特性を付与することが知られている。これらのクラスおよびアイソタイプのそれぞれの修正版は、本開示の観点から当業者には容易に識別可能であり、したがって、本開示の範囲内にある。すべての免疫グロブリンクラスは明らかに本開示の範囲内であり、以下の議論は一般に免疫グロブリン分子のＩｇＧクラスに向けられる。ＩｇＧに関して、標準的な免疫グロブリン分子は、分子量が約２３，０００ダルトンの２つの同一の軽鎖ポリペプチド、および分子量が５３，０００～７０，０００の２つの同一の重鎖ポリペプチドを含む。前記４つの鎖は通常、「Ｙ」構成のジスルフィド結合によって結合され、軽鎖は「Ｙ」の口から始まり可変領域まで続く重鎖を囲む。
本開示の抗体、抗原結合ポリペプチド、それらの変異体、または誘導体としては、ポリクローナル、モノクローナル、多重特異性、ヒト、ヒト化、霊長類化、またはキメラ抗体、一本鎖抗体、エピトープ結合フラグメント、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖｓ、一本鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）、一本鎖抗体、ジスルフィド結合Ｆｖｓ（ｓｄＦｖ）、ＶＫまたはＶＨドメインのいずれかを含むフラグメント、Ｆａｂ発現ライブラリー、ならびに抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体（例えば、本明細書に開示されるＬＩＧＨＴ抗体に対する抗Ｉｄ抗体など）が挙げられるがこれらに限定されない。本開示の免疫グロブリンまたは抗体分子は、いずれかのタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、およびＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡｌおよびＩｇＡ２）または免疫グロブリン分子のサブクラスであり得る。
軽鎖はカッパまたはラムダ（Κ、λ）のいずれかに分類される。各重鎖クラスは、カッパまたはラムダ軽鎖のいずれかに結合し得る。一般に、前記軽鎖および重鎖は互いに共有結合しており、免疫グロブリンがハイブリドーマＢ細胞または遺伝子操作された宿主細胞のいずれかによって生成される場合、前記２つの重鎖の「テール」部分は共有ジスルフィド結合または非共有結合によって互いに結合する。前記重鎖において、前記アミノ酸配列は、Ｙ配座の分岐した末端のＮ末端から各鎖の下部のＣ末端まで伸びている。
前記軽鎖および重鎖の両方が、構造的および機能的相同性の領域に分類される。「定数」および「可変」という用語は、機能的に使用される。これに関して、軽（ＶＫ）および重（ＶＨ）鎖部分の両方の可変ドメインが抗原認識および特異性を決定することが理解されるであろう。逆に、前記軽鎖（ＣＫ）および重鎖（ＣＨ１、ＣＨ２、またはＣＨ３）の定常ドメインは、分泌、経胎盤移動性、Ｆｃ受容体結合、補体結合などの重要な生物学的特性を付与する。慣習により、前記定常領域ドメインの番号付けは、それらが前記抗体の抗原結合部位またはアミノ末端からより遠位になるにつれて増加する。前記Ｎ末端部分は可変領域であり、前記Ｃ末端部分は定常領域である；前記ＣＨ３ドメインおよびＣＫドメインは、実際にはそれぞれ前記重鎖と軽鎖のカルボキシ末端を構成している。
上に示したように、前記可変領域は、前記抗体が抗原上のエピトープを選択的に認識し、特異的に結合させる。すなわち、前記抗体のＶＫドメインおよびＶＨドメイン、または相補性決定領域（ＣＤＲ）のサブセットが組み合わさって、３次元の抗原結合部位を定義する可変領域を形成する。この四次抗体構造は、前記Ｙの各アームの端に存在する前記抗原結合部位を形成する。より具体的には、前記抗原結合部位は、前記ＶＨ鎖およびＶＫ鎖のそれぞれ上の３つのＣＤＲ（すなわち、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｈ３、ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２およびＣＤＲ－Ｌ３）によって定義される。場合によっては、例えば、ラクダ種に由来する、またはラクダ免疫グロブリンに基づいて操作された特定の免疫グロブリン分子は、完全な免疫グロブリン分子が、軽鎖を含まず、重鎖のみからなり得る。Ｈａｍｅｒｓ－Ｃａｓｔｅｒｍａｎら， Ｎａｔｕｒｅ ３６３： ４４６－４４８ （１９９３）を参照のこと。
天然に存在する抗体では、各抗原結合ドメインに存在する６つの「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」は、前記抗体が水性環境におけるその三次元配座を想定して、抗原結合ドメインを形成するように、特異的に配置されたアミノ酸の短い非連続配列である。「フレームワーク」領域と呼ばれる、前記抗原結合ドメインの残りのアミノ酸は、分子間変動が少ないことを示している。前記フレームワーク領域は主にβシート配座を採用し、前記ＣＤＲはループを形成して接続し、場合によっては前記βシート構造の一部を形成する。したがって、前記フレームワーク領域は、鎖間相互作用、非共有相互作用によって前記ＣＤＲを正しい方向に配置するための骨格を形成するように機能する。前記配置されたＣＤＲによって形成される前記抗原結合ドメインは、前記免疫反応性抗原上のエピトープに相補的な表面を決定する。この相補的な表面は、前記抗体の同族エピトープへの非共有結合を促進する。前記ＣＤＲおよびフレームワーク領域をそれぞれ含むアミノ酸は、それらが正確に定義されているので、当業者によって、いずれかの所定の重鎖または軽鎖可変領域について容易に同定され得る（ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆ．ｏｒｇ．ｕｋ： Ｄｒ． Ａｎｄｒｅｗ Ｃ．Ｒ． Ｍａｒｔｉｎのグループ； “Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，” Ｋａｂａｔ， Ｅ．ら， Ｕ．Ｓ． Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ， （１９８３）；ならびに、ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ， Ｊ． ＭｏＩ． Ｂｉｏｌ．， １９６： ９０１－９１７ （１９８７）を参照のこと）。
当技術分野で使用および／または受け入れられる用語の２つ以上の定義がある場合、本明細書で使用される用語の定義は、特に反対に明示的に述べられていない限り、そのようなすべての意味を含むことを意図する。特定の例は、「相補性決定領域」（「ＣＤＲ」）という用語を使用して、前記重鎖および軽鎖ポリペプチドの両方の可変領域内に見られる前記非隣接抗原結合部位を説明する。この特定の領域はその全体が参照により本明細書に援用される、Ｋａｂａｔら， Ｕ．Ｓ． Ｄｅｐｔ． ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，“Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ”（１９８３）および Ｃｈｏｔｈｉａら， Ｊ． ＭｏＩ． Ｂｉｏｌ． １９６： ９０１－９１７ （１９８７）によって説明されている。ＫａｂａｔとＣｈｏｔｈｉａによる前記ＣＤＲの定義には、互いに比較した場合のアミノ酸残基の重複またはサブセットが含まれる。それにもかかわらず、前記抗体またはその変異体のＣＤＲを指すためのいずれかの定義の適用は、本明細書で定義および使用される用語の範囲内にあることが意図されている。上記の引用文献のそれぞれによって定義されるＣＤＲを包含する適切なアミノ酸残基は、比較として以下の表に記載されている。特定のＣＤＲを含む正確な残基番号は、前記ＣＤＲの配列およびサイズによって異なる。当業者は、前記抗体の前記可変領域アミノ酸配列が与えられると、どの残基が特定のＣＤＲを含むかを規定通りに決定し得る。
Figure 0007177543000001
Ｋａｂａｔらはまた、あらゆる抗体に適用可能な可変ドメイン配列の番号付けシステムを定義した。当業者は、配列自体を超えるいずれかの実験データに依存することなく、この「Ｋａｂａｔナンバリング」のシステムをいずれかの可変ドメイン配列に明確に割り当て得る。本明細書で使用される場合、「Ｋａｂａｔナンバリング」は、Ｋａｂａｔら， Ｕ．Ｓ． Ｄｅｐｔ． ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ， “Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ” （１９８３）によって規定されたナンバリングシステムを指す。
上記の表に加えて、前記Ｋａｂａｔ記数法は前記ＣＤＲ領域を以下のように表現する：ＣＤＲ－Ｈ１は、約アミノ酸３１（つまり、最初のシステイン残基の後の約９残基）において始まり、約５～７アミノ酸を含み、次のトリプトファン残基で終わる。ＣＤＲ－Ｈ２は、ＣＤＲ－Ｈ１の終わりの後の１５番目の残基で始まり、約１６～１９個のアミノ酸を含み、その次のアルギニンまたはリジン残基で終わる。ＣＤＲ－Ｈ３は、ＣＤＲ－Ｈ２の終了後約３３番目のアミノ酸残基から始まり；３～２５個のアミノ酸が含まれており；シーケンスＷ－Ｇ－Ｘ－Ｇで終了し、このＸはいずれかのアミノ酸である。ＣＤＲ－Ｌ１は約２４残基から始まり（つまり、システイン残基に続く）；約１０～１７残基が含まれており；かつ、次のトリプトファン残基で終わる。ＣＤＲ－Ｌ２は、ＣＤＲ－Ｌ１の終了後約１６残基において始まり、約７残基を含む。ＣＤＲ－Ｌ３は、ＣＤＲ－Ｌ２の終了後（つまり、システイン残基に続く）の約３３番目の残基において始まり；約７～１１残基を含み、配列ＦまたはＷ－Ｇ－Ｘ－Ｇで終了し、そのＸはいずれかのアミノ酸である。
本明細書に開示される抗体は、鳥および哺乳動物を含むいずれかの動物起源のものであり得る。 好ましくは、前記抗体は、ヒト、ネズミ、ロバ、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ラマ、ウマ、またはニワトリの抗体である。他の実施形態では、前記可変領域は、起源がコンドリクトイドであり得る（例えば、サメ由来）。
本明細書で使用される場合、「重鎖定常領域」という用語は、免疫グロブリン重鎖に由来するアミノ酸配列を含む。重鎖定常領域を含むポリペプチドは、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ（例えば、上部、中間、および／または下部ヒンジ領域）ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、またはそれらの変異体もしくは断片のうちの少なくとも１つを含む。例えば、本開示で使用するための抗原結合ポリペプチドは、ＣＨ１ドメインを含むポリペプチド鎖；ＣＨ１ドメイン、ヒンジドメインの少なくとも一部、およびＣＨ２ドメインを含むポリペプチド鎖；ＣＨ１ドメインおよびＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖； ＣＨ１ドメイン、ヒンジドメインの少なくとも一部、およびＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖、またはＣＨ１ドメイン、ヒンジドメインの少なくとも一部、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖を含み得る。他の実施形態では、本開示のポリペプチドは、ＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖を含む。さらに、本開示で使用するための抗体は、ＣＨ２ドメインの少なくとも一部（例えば、ＣＨ２ドメインの全部または一部）を欠き得る。上記のように、前記重鎖定常領域は、前記天然に存在する免疫グロブリン分子とはアミノ酸配列が異なるように修飾され得ることが当業者によって理解されるであろう。
本明細書に開示される抗体の重鎖定常領域は、異なる免疫グロブリン分子に由来し得る。例えば、ポリペプチドの重鎖定常領域は、ＩｇＧ１分子に由来するＣＨ１ドメインおよびＩｇＧ３分子に由来するヒンジ領域を含み得る。他の例では、重鎖定常領域は、一部はＩｇＧ１分子に由来し、一部はＩｇＧ３分子に由来するヒンジ領域を含み得る。他の例では、重鎖部分は、一部はＩｇＧ１分子に由来し、一部はＩｇＧ４分子に由来するキメラヒンジを含み得る。
本明細書で使用される場合、「軽鎖定常領域」という用語は、抗体軽鎖に由来するアミノ酸配列を含む。好ましくは、前記軽鎖定常領域は、一定のカッパドメインまたは一定のラムダドメインのうちの少なくとも１つを含む。
「軽鎖－重鎖ペア」とは、軽鎖のＣＬドメインと重鎖のＣＨ１ドメインとの間のジスルフィド結合を介して二量体を形成し得る軽鎖と重鎖の集合を指す。
前に示したように、様々な免疫グロブリンクラスの定常領域のサブユニット構造および三次元構成はよく知られている。本明細書で使用される場合、「ＶＨドメイン」という用語は、免疫グロブリン重鎖のアミノ末端可変ドメインを含み、「ＣＨ１ドメイン」という用語は、免疫グロブリン重鎖の第１の（最もアミノ末端の）定常領域ドメインを含む。前記ＣＨ１ドメインは前記ＶＨドメインに隣接しており、免疫グロブリン重鎖分子の前記ヒンジ領域のアミノ末端に存在する。
本明細書で使用される場合、「ＣＨ２ドメイン」という用語は、例えば、従来の番号付けスキーム（残基２４４～３６０、Ｋａｂａｔナンバリングシステム；および残基２３１～３４０、ＥＵナンバリングシステム；Ｋａｂａｔら， Ｕ．Ｓ． Ｄｅｐｔ． ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ， “Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ” （１９８３）を参照のこと）を使用して抗体の約残基２４４～残基３６０に広がる重鎖分子の部分を含む。前記ＣＨ２ドメインは、他のドメインと密接にペアになっていないという点で特有である。むしろ、２つのＮ－結合型分岐炭水化物鎖が、損傷のないネイティブＩｇＧ分子の前記２つのＣＨ２ドメインの間に挿入されている。また、前記ＣＨ３ドメインが前記ＣＨ２ドメインから前記ＩｇＧ分子のＣ末端まで伸びており、約１０８残基を含むことをも十分に立証されている。
本明細書で使用される場合、「ヒンジ領域」という用語は、前記ＣＨ１ドメインを前記ＣＨ２ドメインに結合する重鎖分子の部分を含む。このヒンジ領域は約２５残基を含み、柔軟性があるため、２つのＮ末端抗原結合領域を独立して動かす。ヒンジ領域は、上部、中間、下部のヒンジドメインの３つの異なるドメインに細分され得る（Ｒｏｕｘら， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ １６１： ４０８３ （１９９８））。
本明細書で使用される場合、「ジスルフィド結合」という用語は、２つの硫黄原子の間に形成される共有結合を含む。 前記アミノ酸システインは、ジスルフィド結合を形成し得るか、または第２のチオール基と架橋し得るチオール基を含む。ほとんどの天然に存在するＩｇＧ分子では、前記ＣＨ１およびＣＫ領域はジスルフィド結合によって結合され、前記２つの重鎖はＫａｂａｔナンバリングシステム（２２６位または２２９位、ＥＵナンバリングシステム）を使用して２３９および２４２に対応する位置で２つのジスルフィド結合によって結合される。
本明細書で使用される場合、「キメラ抗体」という用語は、前記免疫反応性領域または部位が第１の種および定常領域（本開示に従って損傷はないか、部分的であるか、または改変され得る）から得られるかまたは誘導されるいずれかの抗体が２番目の種から得られると意味すると解釈される。特定の実施形態では、前記標的結合領域または部位は、非ヒト供給源（例えば、マウスまたは霊長類）に由来し、かつ、前記定常領域はヒトである。
本明細書で使用される場合、「ヒト化パーセント」は、前記ヒト化ドメインと前記生殖系列ドメインとの間のフレームワークアミノ酸の差異（すなわち、非ＣＤＲ差異）の数を決定し、アミノ酸の総数からその数を差し引き、次にアミノ酸の総数で除算して１００を掛けることによって計算される。
「特異的に結合する」または「特異性を有する」とは、一般に、抗体がその抗原結合ドメインを介してエピトープに結合し、前記結合が前記抗原結合ドメインと前記エピトープとの間のある程度の相補性を伴うことを意味する。この定義によれば、抗体は、ランダムな無関係のエピトープに結合するよりも容易に、その抗原結合ドメインを介してそのエピトープに結合する場合に、エピトープに「特異的に結合する」と言われる。「特異性」という用語は、本明細書では、特定の抗体が特定のエピトープに結合するための相対的な親和性を限定するために使用される。例えば、抗体「Ａ」は、抗体「Ｂ」よりも所与のエピトープに対して高い特異性を有すると見なされ得るか、または抗体「Ａ」は、関連するエピトープ「Ｄ」に対するよりも高い特異性でエピトープ「Ｃ」に結合すると言われ得る。好ましくは、前記抗体は、「高親和性」、すなわち、１×１０－７Ｍ以下、より好ましくは５×１０－８Ｍ以下、より好ましくは３×１０－８Ｍ以下、より好ましくは１×１０－８Ｍ以下、より好ましくは２５×１０－９Ｍ以下、またはさらにより好ましくは１×１０－９Ｍ以下のＫＤで抗原（またはエピトープ）に結合する。
本明細書で使用される場合、「治療する」または「治療」という用語は、治療的治療と予防的または予防的措置の両方を指し得て、その目的は、癌の進行などの望ましくない生理学的変化または障害を予防または減速（軽減）することである。有益なまたは望ましい臨床結果としては、検出可能か検出不可能かに関わらず、症状の緩和、疾患の程度の減少、疾患の安定した（すなわち、悪化しない）状態、疾患の進行の遅延または遅延、病状の改善または緩和、および寛解（部分的または全体的）が挙げられるが、これらに限定されない。「治療」はまた、治療を受けていない場合に予想される生存と比較して生存を延長することを意味し得る。治療が必要な人としては、すでに病状または障害を患っている人、および病状もしくは障害を患いやすい人、または病状もしくは障害を予防する必要がある人が挙げられる。
「対象」または「個体」または「動物」または「患者」または「哺乳動物」とは、診断、予後、または治療が望まれるいずれかの対象、特に哺乳動物対象を指し得る。哺乳類の対象としては、人間、家畜、家畜、動物園、スポーツ、または犬、猫、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、馬、畜牛、乳牛などのペット動物が挙げられる。
本明細書で使用される場合、「治療を必要とする患者へ」または「治療を必要とする対象」などの句は、例えば、検出用、診断手順用、および／または治療用に使用される本開示の抗体または組成物の投与から利益を得るであろう哺乳動物対象などの対象を含む。
本開示は、ＰＤ－Ｌ１とその受容体ＰＤ－１との間、およびＬＡＧ３とそのリガンド（例えば、ＭＨＣクラスＩＩ分子）との間の相互作用を効果的に遮断し得る抗ＰＤ－Ｌ１／抗ＬＡＧ３二重特異性抗体を提供する。前記二重特異性抗体は、ＰＤ－Ｌ１タンパク質（例えば、ヒトＰＤ－Ｌ１タンパク質）およびＬＡＧ３タンパク質（例えば、ヒトＬＡＧ３タンパク質）の両方に対して高い結合親和性を有し得る。
前記抗ＰＤ－Ｌ１／抗ＬＡＧ３二重特異性抗体は、ＰＤ－Ｌ１タンパク質を特異的に認識および／または結合し得る、ＰＤ－Ｌ１標的化部分としての抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその抗原結合フラグメント、ならびにＬＡＧ３タンパク質を特異的に認識および／または結合し得るＬＡＧ３標的化部分としての抗ＬＡＧ３抗体またはその抗原結合フラグメントを含み得る。
抗ＰＤ－Ｌ１抗体
前記抗ＰＤ－Ｌ１／抗ＬＡＧ３二重特異性抗体は、抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその抗原結合フラグメントをＰＤ－Ｌ１標的化部分として含み得る。前記ＰＤ－Ｌ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＰＤ－Ｌ１に対して強力な結合および阻害活性を示し得て、治療および診断の用途に有用である。
前記ＰＤ－Ｌ１タンパク質は、４０ｋＤａの１型膜貫通タンパク質である。前記ＰＤ－Ｌ１タンパク質はヒトＰＤ－Ｌ１タンパク質であり得て、前記ヒトＰＤ－Ｌ１タンパク質は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００１２５４６３５．１、ＮＰ＿００１３００９５８．１、ＮＰ＿０５４８６２．１などによって表されるタンパク質からなる群から選択され得るが、これに限定され得ない。前記ヒトＰＤ－Ｌ１タンパク質には、Ｎ末端免疫グロブリンＶ（ＩｇＶ）ドメイン（アミノ酸１９～１２７）およびＣ末端免疫グロブリンＣ（ＩｇＣ）ドメイン（アミノ酸１３３～２２５）などの細胞外部分が含まれる。ＰＤ－Ｌ１のＩｇＶドメインに結合し、それによってＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との間の結合を破壊する既存の抗ＰＤ－Ｌ１抗体とは異なり、前記二重特異性抗体に含まれる前記抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはそのフラグメントは前記ＰＤ－Ｌ１タンパク質の免疫グロブリンＶ（ＩｇＶ）ドメインには結合しないが、ＰＤ－Ｌ１のＩｇＣドメインに結合して、ＰＤ－Ｌ１を効果的に阻害し、それによって治療効果を向上させ得る。
特に、前記二重特異性抗体に含まれる前記抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはそのフラグメントは、ＰＤ－Ｌ１タンパク質の免疫グロブリンＣ（ＩｇＣ）ドメインに特異的に結合し得る。ヒトＰＤ－Ｌ１タンパク質の場合、前記Ｉｇ Ｃドメインは、前記ヒトＰＤ－Ｌ１タンパク質の全長のアミノ酸残基１３３～２２５を含むか、本質的にそれで構成される。より具体的には、前記抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはそのフラグメントは、ヒトＰＤ－Ｌ１タンパク質のアミノ酸残基Ｙ１３４、Ｋ１６２、およびＮ１８３から選択される少なくとも１つに結合し得る。いくつかの実施形態では、前記抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはそのフラグメントは、ヒトＰＤ－Ｌ１タンパク質のアミノ酸残基Ｙ１３４、Ｋ１６２、およびＮ１８３から選択される少なくとも２つに結合得る。いくつかの実施形態では、前記抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはそのフラグメントは、前記ＰＤ－Ｌ１タンパク質の免疫グロブリンＶ（ＩｇＶ）ドメインに結合せず、ここで、前記ＩｇＶドメインは、ヒトＰＤ－Ｌ１タンパク質のアミノ酸残基１９～１２７からなる。
一実施形態では、ヒトＰＤ－Ｌ１タンパク質に特異的に結合し得る抗体およびそのフラグメントが提供される。これらの抗体は、さまざまな種類の癌、感染症（炎症）などの治療などの治療目的に役立ち得て、診断および予後の目的にも使用され得る。
前記抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはそのフラグメントは、（１）配列番号１および６１～６７からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ１；（２）配列番号２、６８～７７、および５２５～５２７からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２；（３）配列番号３、７８～９０および５１３～５１９からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３；（４）配列番号４、９１～９２、および５２０～５２１からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１；（５）配列番号５および９３～１０５からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２；ならびに、（６）配列番号６、１０６～１１１、および５２２～５２４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ３を含み得る。
Figure 0007177543000002
Figure 0007177543000003
Figure 0007177543000004
いくつかの実施形態では、前記抗体またはそのフラグメントとしては、上記の置換のうちの１つ以下、２つ以下、または３つ以下を含む。いくつかの実施形態では、前記抗体またはそのフラグメントは、配列番号１のＶＨ ＣＤＲ１または配列番号６１～６７のＶＨ ＣＤＲ１のいずれか、配列番号２、５２５、５２６または５２７のＶＨ ＣＤＲ２、配列番号３のＶＨ ＣＤＲ３、配列番号４のＶＬ ＣＤＲ１、配列番号５のＶＬ ＣＤＲ２、および配列番号６のＶＬ ＣＤＲ３が挙げられる。
いくつかの実施形態では、前記抗体またはそのフラグメントとしては、配列番号１のＶＨ ＣＤＲ１、配列番号２のＶＨ ＣＤＲ２、または配列番号６８～７７、５２５、５２６もしくは５２７のいずれかのＶＨ ＣＤＲ２、配列番号３のＶＨ ＣＤＲ３、配列番号４のＶＬ ＣＤＲ１、配列番号５のＶＬ ＣＤＲ２、および配列番号６のＶＬ ＣＤＲ３が挙げられる。
いくつかの実施形態では、前記抗体またはそのフラグメントとしては、配列番号１のＶＨ ＣＤＲ１、配列番号２、５２５、５２６または５２７のＶＨ ＣＤＲ２、配列番号３のＶＨ ＣＤＲ３、または配列番号７８～９０および５１３～５１９のいずれかのＶＨ ＣＤＲ３、配列番号４のＶＬ ＣＤＲ１、配列番号５のＶＬ ＣＤＲ２、ならびに配列番号６のＶＬ ＣＤＲ３が挙げられる。
いくつかの実施形態では、前記抗体またはそのフラグメントとしては、配列番号１のＶＨ ＣＤＲ１、配列番号２、５２５、５２６または５２７のＶＨ ＣＤＲ２、配列番号３のＶＨ ＣＤＲ３、 配列番号４のＶＬ ＣＤＲ１または配列番号９１～９２および５２０～５２１のいずれかのＶＬ ＣＤＲ１、配列番号５のＶＬ ＣＤＲ２、ならびに配列番号６のＶＬ ＣＤＲ３が挙げられる。
いくつかの実施形態では、前記抗体またはそのフラグメントとしては、配列番号１のＶＨ ＣＤＲ１、配列番号２、５２５、５２６または５２７のＶＨ ＣＤＲ２、配列番号３のＶＨ ＣＤＲ３、 配列番号４のＶＬ ＣＤＲ１、配列番号５のＶＬ ＣＤＲ２または配列番号９３～１０５のいずれかのＶＬ ＣＤＲ２、および配列番号６のＶＬ ＣＤＲ３が挙げられる。
いくつかの実施形態では、前記抗体またはそのフラグメントとしては、配列番号１のＶＨ ＣＤＲ１、配列番号２、５２５、５２６または５２７のＶＨ ＣＤＲ２、配列番号３のＶＨ ＣＤＲ３、 配列番号４のＶＬ ＣＤＲ１、配列番号５のＶＬ ＣＤＲ２、ならびに配列番号６のＶＬ ＣＤＲ３、または配列番号１０６～１１１および５２２～５２４のいずれかのＶＬ ＣＤＲ３が挙げられる。
例えば、前記抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはそのフラグメントは、配列番号１のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ１；配列番号２、５２５、５２６または５２７のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２；（３）配列番号３または５１５のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３；配列番号４のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１；配列番号５のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２；配列番号６のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ３が挙げられ得る。
いくつかの実施形態では、配列番号１のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ１；配列番号５２５のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２；配列番号３のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３；配列番号４のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１；配列番号５のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２；配列番号６のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ３を含む抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはそのフラグメントが提供される。
いくつかの実施形態では、配列番号１のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ１；配列番号５２６のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２；配列番号５１５のアミノ酸配列を有するＶＨＣＤＲ３；配列番号４のアミノ酸配列を有するＶＬＣＤＲ１；配列番号５のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２；配列番号６のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ３を含む抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはそのフラグメントが提供される。
ＶＨ（重鎖可変領域）の非限定的な例は、配列番号７～２６、１１３、４９３、４９５、４９７、４９９、５０１、５０３、５０５、５０７、５０９、および５１１において提供され、ここで、配列番号１１３はマウスＶＨであり、配列番号７～２６はヒト化ＶＨであり、配列番号４９３、４９５、４９７、４９９、５０１、５０３、５０５、５０７、５０９、および５１１は親和性の成熟したヒト化抗体のＶＨである。さらに、ヒト化ＶＨの中で、配列番号９～１５、１７～２１および２３～２６は、マウスバージョンへの１つまたは複数の逆突然変異を含む。同様に、ＶＬ（ＶＫ；軽鎖（カッパ型）可変領域）の非限定的な例は、配列番号２７～３３、４９４、４９６、４９８、５００、５０２、５０４、５０６、５０８、５１０、および５１２において提供される。配列番号２８および３０は、実施例に示されるように、最初に誘導され、ＣＤＲグラフト化され、ヒト化された配列であり、配列番号２９および３１～３３は、逆突然変異を伴うヒト化ＶＬである。
前記逆変異は、前記抗ＰＤ－Ｌ１抗体の特定の特性を保持するのに役立ち得る。いくつかの実施形態では、本開示の抗ＰＤ－Ｌ１抗体、特にヒトまたはヒト化抗体は、１つまたは複数の前記逆突然変異を含み得る。いくつかの実施形態では、前記重鎖可変領域（ＶＨ）における逆突然変異（すなわち、指定された位置に含まれるアミノ酸）は、前記重鎖可変領域の、Ｋａｂａｔナンバリングによる、（ａ）４４位のＳｅｒ、（ｂ）４９位のＡｌａ、（ｃ）５３位のＡｌａ、（ｄ）９１位のＩｌｅ、（ｅ）１位のＧｌｕ、（ｆ）３７位のＶａｌ、（ｇ）４０位のＴｈｒ、（ｈ）５３位のＶａｌ、（ｉ）５４位のＧｌｕ、（ｊ）７７位のＡｓｎ、（ｋ）９４位のＡｒｇ、および（ｌ）１０８位のＴｈｒならびにそれらの組み合わせの１つまたは複数から選択される。いくつかの実施形態では、前記ＶＨ逆突然変異は、前記重鎖可変領域の、Ｋａｂａｔナンバリングによる、（ａ）４４位のＳｅｒ、（ｂ）４９位のＡｌａ、（ｃ）５３位のＡｌａ、および／または（ｄ）９１位のＩｌｅならびにそれらの組み合わせから選択される。
いくつかの実施形態では、軽鎖可変領域（ＶＬ）における逆突然変異は、軽鎖可変領域の、Ｋａｂａｔナンバリングによる、（ａ）２２位のＳｅｒ、（ｂ）４２位のＧｌｎ、（ｃ）４３位のＳｅｒ、（ｄ）６０位のＡｓｐ、および（ｅ）６３位のＴｈｒ、ならびにそれらの組み合わせの１つまたは複数から選択される。
いくつかの実施形態では、本開示の抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはそのフラグメントは、配列番号７～２６、１１３、４９３、４９５、４９７、４９９、５０１、５０３、５０５、５０７、５０９、および５１１から選択されるＶＨ、配列番号２７～３３、４９４、４９６、４９８、５００、５０２、５０４、５０６、５０８、５１０、および５１２から選択されるＶＬ、または上記のそれぞれの生物学的同等物を含み得る。前記ＶＨおよび／またはＶＬの生物学的同等物は、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有しながら指定されたアミノ酸（例えば、ＣＤＲ）などのアミノ酸配列を有し得る。例えば、配列番号２０の生物学的同等物は、配列番号２０に対して全体的に８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有するが、前記ＣＤＲ（配列番号１～６またはそれらの変異体）を保持し、１つもしくは複数、またはすべての逆突然変異を保持していてもよいＶＨであり得る。
前記抗体またはそのフラグメントの非限定的な例は、配列番号２０または５０１のアミノ酸配列、またはその生物学的同等物を含むか、または本質的にそれらからなる重鎖可変領域、および配列番号２８または５０２のアミノ酸配列、またはそれらの生物学的同等物を含むか、または本質的にそれらからなる軽鎖可変領域を含み得る。
いくつかの実施形態では、前記抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはそのフラグメントは、重鎖定常領域、軽鎖定常領域、Ｆｃ領域、またはそれらの組み合わせをさらに含む。いくつかの実施形態では、前記軽鎖定常領域は、カッパまたはラムダ鎖定常領域であり得る。いくつかの実施形態では、前記抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥまたはＩｇＤのアイソタイプ、例えば、ヒトＩｇＧ、ヒトＩｇＭ、ヒトＩｇＡ、ヒトＩｇＥ、またはヒトＩｇＤのものである。いくつかの実施形態では、前記アイソタイプは、ＩｇＧ、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４などのヒトＩｇＧであり得る。いくつかの実施形態では、前記フラグメント（抗ＰＤ－Ｌ１抗体の抗原結合フラグメント）は、前記抗体の重鎖ＣＤＲおよび／または軽鎖ＣＤＲを含むいずれかのフラグメントであり得て、例えばそれは、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ（重鎖可変領域およびＣＨ１ドメインを含む）、Ｆｖ（重鎖可変領域および／または 軽鎖可変領域）、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ；重鎖可変領域および軽鎖可変領域をいずれかの順序において、および重鎖可変領域と軽鎖可変領域との間のペプチドリンカーを含むかまたは本質的にそれらからなる）、一本鎖抗体、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）などからなる群から選択され得る。
限定されないが、前記抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはそのフラグメントは、キメラ抗体、ヒト化抗体、または完全ヒト抗体である。一態様では、前記抗体またはそのフラグメントは、天然に存在するものでも、化学的または組換え的に合成されるものでもない。
これらの抗体のそれぞれがヒトＰＤ－Ｌ１などのＰＤ－Ｌ１に結合し得ることを考慮すると、前記ＣＤＲ配列またはＶＨおよびＶＬ配列を「混合および適合」させて、本開示の他の抗ＬＡＧ－３結合分子を製造し得る。好ましくは、前記ＣＤＲ配列またはＶＨおよびＶＬ鎖が混合されて一致する場合、例えば、特定のＶＨ／ＶＬ対からのＶＨ配列は、構造的に類似したＶＨ配列で置き換えられる。同様に、好ましくは、特定のＶＨ／ＶＬ対からのＶＬ配列は、構造的に類似したＶＬ配列で置き換えられる。
抗ＬＡＧ３抗体
前記抗ＰＤ－Ｌ１／抗ＬＡＧ３二重特異性抗体は、ＬＡＧ３標的化部分として抗ＬＡＧ３抗体またはその抗原結合フラグメントを含み得る。
一実施形態では、ＬＡＧ３（例えば、ヒトＬＡＧ３）タンパク質に特異的に結合し得る抗体およびそのフラグメントが提供され；例えば、前記抗ＬＡＧ３抗体またはそのフラグメントは、ＬＡＧ－３の細胞外ドメインに結合し得る。
例えば、前記ヒトＬＡＧ３タンパク質は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００２２７７．４などによって表されるタンパク質からなる群から選択され得るが、それに限定され得ない。これらの抗ＬＡＧ３抗体は、さまざまな種類の癌、感染症（炎症）などの治療などの治療目的に役立ち得て、診断および予後の目的にも使用され得る。
「ＬＡＧ－３」または「ＬＡＧ３」という用語は、リンパ球活性化遺伝子－３を指す。免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリーに属する前記ＬＡＧ３タンパク質は、Ｄ１～Ｄ４と呼ばれる４つの細胞外Ｉｇ様ドメインを有する５０３アミノ酸のＩ型膜貫通タンパク質を含む。本明細書に記載されるように、「ＬＡＧ－３」という用語は、変異体、アイソフォーム、ホモログ、オルソログ、およびパラログを含む。例えば、ヒトＬＡＧ－３タンパク質に特異的な抗体は、場合によっては、ヒト以外の種からのＬＡＧ－３タンパク質と交差反応し得る。他の実施形態では、ヒトＬＡＧ－３タンパク質に特異的な抗体は、ヒトＬＡＧ－３タンパク質に完全に特異的であり得、種または他のタイプの交差反応性を示し得ないか、または、他のすべての種ではなく、特定の他の種のＬＡＧ－３と交差反応し得る（例えば、サルＬＡＧ－３と交差反応するが、マウスＬＡＧ－３とは交差反応しない）。「ヒトＬＡＧ－３」という用語は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ ００２２７７．４を有するヒトＬＡＧ－３の完全なアミノ酸配列などのヒト配列ＬＡＧ－３を指す。「マウスＬＡＧ－３」という用語は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ ０３２５０５を有するマウスＬＡＧ－３の完全なアミノ酸配列などのマウス配列ＬＡＧ－３を指す。ＬＡＧ－３はまた、当技術分野では、例えば、ＣＤ２２３としても知られている。前記ヒトＬＡＧ－３配列は、例えば、保存された突然変異または非保存領域における突然変異を有することにより、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ ００２２７７．４のヒトＬＡＧ－３とは異なり得て、前記ＬＡＧ－３は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ００２２７７．４の前記ヒトＬＡＧ－３と実質的に同一の生物学的機能を有する。例えば、ヒトＬＡＧ－３の生物学的機能は、本開示の抗体によって特異的に結合されるＬＡＧ－３の細胞外ドメインにエピトープを有するか、またはヒトＬＡＧ－３の生物学的機能は、ＭＨＣクラスＩＩ分子に結合する。
実験例に示されるように、本明細書に開示される抗ＬＡＧ－３抗体のいくつかは、既知の抗ＬＡＧ－３抗体では示されない活性を示した。例えば、現在開示されている抗体は、ＭＨＣクラスＩＩ分子への結合に加えて、前記ＬＡＧ－３タンパク質のガレクチン－３（ＬＧＡＬＳ３）およびＣ型レクチンドメインファミリー４メンバーＧ（ＬＳＥＣｔｉｎ）タンパク質への結合を阻害し得る。対照的に、既知の抗ＬＡＧ－３抗体は、ＭＨＣクラスＩＩ分子への結合に対する阻害効果のみを示している。いくつかの実施形態では、本開示の抗体およびそのフラグメントは、エフェクターＴ細胞（Ｔｅｆｆｓ）に対する制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の阻害効果を逆転させ得る。いくつかの実施形態では、本開示の抗体およびそのフラグメントは、ＬＡＧ３とフィブリノーゲン様タンパク質１（ＦＧＬ１）との間の結合を阻害し得る。
これらの抗ＬＡＧ３抗体は、さまざまな種類の癌、感染症（炎症）などの治療などの治療目的に役立ち得て、診断および予後の目的にも使用され得る。
一実施形態では、ヒトＬＡＧ３タンパク質に特異性を有し得る抗体またはそのフラグメントが提供される。前記抗ＬＡＧ３抗体またはそのフラグメントは、（ｉ）配列番号１１６～１１７、３５４、および４５３～４６０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ１；（ｉｉ）配列番号１１８～１１９、３５５、および４６１～４６７からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２；（ｉｉｉ）配列番号１２０～１６０、３５６、および４６８～４７５からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３；（ｉｖ）配列番号１６３～１９５、２２９、３５７、および４９０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１；（ｖ）配列番号１９６～２１７、３５８、および４７６～４８３からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２；ならびに、（ｖｉ）配列番号２１８～２２８、２３０～２５３、３５９、および４８４～４８９からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ３を含み得る。例えば、前記抗ＬＡＧ３抗体またはそのフラグメントは、配列番号３５４のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ１；配列番号３５５または４６１のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２；配列番号３５６または４６８のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３；配列番号３５７または４９０のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１；配列番号３５８のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２；および配列番号３５９または４８８のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ３を含み得る。
Figure 0007177543000005
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非限定的な例において、ＬＡＧ３に特異性を有する抗体またはフラグメントは、表２７に列挙された抗体のいずれかに示されるように、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、およびＶＬ ＣＤＲ３の組み合わせを有する。例えば、前記ＣＤＲは、配列番号３５４のＶＨ ＣＤＲ１、配列番号４６１のＶＨ ＣＤＲ２、配列番号４６８のＶＨ ＣＤＲ３、配列番号４９０のＶＬ ＣＤＲ１、配列番号３５８のＶＬ ＣＤＲ２、および配列番号４８８のＶＬ ＣＤＲ３を含む１４７Ｈ ３８０７からのものであり得る。前記重鎖／軽鎖可変領域に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または９９．５％の配列同一性を有し、それぞれのＣＤＲ配列を保持するものなど、これらの抗体の変異体もまた提供される。
一実施形態では、例えば、提供されるのは、ヒトＬＡＧ３タンパク質に対する特異性を有し、配列番号４４３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、または配列番号４４３のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有し、配列番号３５４のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ１、配列番号４６１のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ２、および配列番号４６８のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ３を有するポリペプチド、ならびに、配列番号４４４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、または配列番号４４４のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有し、配列番号４９０のアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ１、配列番号３５８のアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ２、および配列番号４８８のアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ３を有するポリペプチドを含む抗体またはその抗原結合フラグメントである。
前記抗ＬＡＧ３抗体またはそのフラグメントの非限定的な例において、
（１）前記重鎖可変領域は、配列番号２５４～３０２、３５２、３６０～３７３、３７５、３７７、３７９、３８１、３８３、３８５、３８７、３８９、３９１、３９３、３９５、３９７、３９９、４０１、４０３、４０５、４０７、４０９、４１１、４１３、４１５、４１７、４１９、４２１、４２３、４２５、４２７、４２９、４３１、４３３、４３５、４３７、４３９、４４１、４４３、４４５、４４７、４４９、４５１、および４９１からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、または上記のアミノ酸配列対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するポリペプチドを含むか、または本質的にそれからなり得て；および／または、
（２）前記軽鎖可変領域は、配列番号３０３～３５１、３５３、３７４、３７６、３７８、３８０、３８２、３８４、３８６、３８８、３９０、３９２、３９４、３９６、３９８、４００、４０２、４０４、４０６、４０８、４１０、４１２、４１４、４１６、４１８、４２０、４２２、４２４、４２６、４２８、４３０、４３２、４３４、４３６、４３８、４４０、４４２、４４４、４４６、４４８、４５０、４５２、および４９２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、または上記のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するポリペプチドを含むか、または本質的にそれからなり得る。
前記抗ＬＡＧ３抗体またはそのフラグメントの非限定的な例は、配列番号３５２もしくは４４３のアミノ酸配列を含むか、または本質的にそれからなる重鎖可変領域、および配列番号３５３もしくは４４４のアミノ酸配列を含むか、または本質的にそれからなる軽鎖可変領域を含み得る。
ヒト化抗体またはフラグメントの場合、特定の逆変異を組み込み得る。いくつかの実施形態では、前記重鎖可変領域は、以下からなる群から選択される１つまたは複数のアミノ酸残基を含む：Ｋａｂａｔナンバリングによる、
（ａ）７１位のＡｌａ（Ａ）、
（ｂ）６９位のＬｅｕ（Ｌ）、
（ｃ）６６位のＬｙｓ（Ｋ）、
（ｄ）６７位のＡｌａ（Ａ）、
（ｅ）４８位のＩｌｅ（Ｉ）、
（ｆ）３７位のＩｌｅ（Ｉ）、
（ｇ）３８位のＬｙｓ（Ｋ）、
（ｈ）９１位のＰｈｅ（Ｆ）、および、
（ｉ）１位のＧｌｕ（Ｅ）、ならびにそれらの組み合わせ。
いくつかの実施形態では、前記重鎖可変領域は、７１位にＡｌａ（Ａ）を含む。いくつかの実施形態では、前記重鎖可変領域は、６９位にＬｅｕ（Ｌ）を含む。いくつかの実施形態では、前記重鎖可変領域は、６６位にＬｙｓ（Ｋ）を含む。いくつかの実施形態では、前記重鎖可変領域は、６７位にＡｌａ（Ａ）を含む。いくつかの実施形態では、前記重鎖可変領域は、４８位にＩｌｅ（Ｉ）を含む。いくつかの実施形態では、前記重鎖可変領域は、３７位にＩｌｅ（Ｉ）を含む。いくつかの実施形態では、前記重鎖可変領域は、３８位にＬｙｓ（Ｋ）を含む。いくつかの実施形態では、前記重鎖可変領域は、９１位にＰｈｅ（Ｆ）を含む。いくつかの実施形態では、前記重鎖可変領域は、１位にＧｌｕ（Ｅ）を含む。
いくつかの実施形態では、前記重鎖可変領域は、以下からなる群から選択される１つまたは複数のアミノ酸残基を含む：Ｋａｂａｔナンバリングによる、
（ａ）７１位のＡｌａ（Ａ）、
（ｂ）６９位のＬｅｕ（Ｌ）、
（ｃ）６６位のＬｙｓ（Ｋ）、
（ｄ）６７位のＡｌａ（Ａ）、
（ｅ）４８位のＩｌｅ（Ｉ）、
（ｆ）３７位のＩｌｅ（Ｉ）、および
（ｇ）３８位のＬｙｓ（Ｋ）、ならびにそれらの組み合わせ。いくつかの実施形態では、前記重鎖可変領域は、上記に列挙された残基のすべてを含む。
本開示の抗体は、前記抗体の特定の機能的特徴または特性によって特徴付けられる。例えば、前記抗体は、ヒトＬＡＧ－３に特異的に結合し、特定の他の種からのＬＡＧ－３、例えば、サルＬＡＧ－３、例えば、カニクイザル、アカゲザル、に結合し得るが、特定の他の種からのＬＡＧ－３、例えば、マウスＬＡＧ－３に実質的に結合し得ない。好ましくは、本開示の抗体は、高い親和性でヒトＬＡＧ－３に結合する。
抗原特異的Ｔ細胞応答などの免疫応答を刺激する抗体の能力は、例えば、インターロイキン－２（ＩＬ－２）、または抗原特異的Ｔ細胞応答におけるインターフェロンガンマ（ＩＦＮ－ガンマ）産生を刺激する抗体の能力によって示され得る。特定の実施形態では、本開示の抗体は、ヒトＬＡＧ－３に結合し、抗原特異的Ｔ細胞応答を刺激する能力を示す。他の実施形態では、本開示の抗体は、ヒトＬＡＧ－３に結合するが、抗原特異的Ｔ細胞応答を刺激する能力を示さない。免疫応答を刺激する抗体の能力を評価する他の手段としては、ｉｎｖｉｖｏ腫瘍移植モデルなどの腫瘍増殖を阻害する抗体の能力、または、ＮＯＤマウスモデルで糖尿病の発症を促進する能力などの、自己免疫モデルで自己免疫疾患の発症を促進する能力などの、自己免疫応答を刺激する抗体の能力が挙げられる。
本開示の抗体のＬＡＧ－３への結合は、当技術分野で十分に確立された１つまたは複数の技術を使用して評価され得る。例えば、好ましい実施形態では、前記抗体は、前記抗体が、細胞表面にＬＡＧ－３、例えばヒトＬＡＧ－３、またはサルＬＡＧ－３、例えばアカゲザルもしくはカニクイザル、またはマウスＬＡＧ－３を発現するようにトランスフェクトされている、ＣＨＯ細胞などのヒトＬＡＧ－３を発現する細胞株と反応するフローサイトメトリーアッセイによって試験され得る。フローサイトメトリーアッセイで使用するのに適した他の細胞としては、天然のＬＡＧ－３を発現する抗ＣＤ３刺激ＣＤ４＋活性化Ｔ細胞が挙げられる。さらに、または代わりに、結合動態（例えば、ＫＤ値）などの、抗体の結合は、ＢＩＡｃｏｒｅ結合アッセイで試験され得る。さらに他の適切な結合アッセイとしては、例えば組換えＬＡＧ－３タンパク質を使用するＥＬＩＳＡアッセイが挙げられる。好ましくは、本開示の抗体は、５×１０－８Ｍ以下のＫＤでＬＡＧ－３タンパク質に結合し、２×１０－８Ｍ以下のＫＤでＬＡＧ－３タンパク質に結合し、５ｘ１０－９Ｍ以下のＫＤでＬＡＧ－３タンパク質に結合し、４ｘ１０－９Ｍ以下のＫＤでＬＡＧ－３タンパク質に結合し、３ｘ１０－９Ｍ以下のＫＤでＬＡＧ－３タンパク質に結合し、２ｘ１０－９Ｍ以下のＫＤでＬＡＧ－３タンパク質に結合し、１２５ｘ１０－９Ｍ以下のＫＤでＬＡＧ－３タンパク質に結合し、５ｘ１０－１０Ｍ以下のＫＤでＬＡＧ－３タンパク質に結合し、または１ｘ１０－１０Ｍ以下のＫＤでＬＡＧ－３タンパク質に結合する。
いくつかの実施形態では、前記抗ＬＡＧ３抗体またはそのフラグメントは、重鎖定常領域、軽鎖定常領域、Ｆｃ領域、またはそれらの組み合わせをさらに含む。いくつかの実施形態では、前記軽鎖定常領域は、カッパまたはラムダ鎖定常領域であり得る。いくつかの実施形態では、前記抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥまたはＩｇＤのアイソタイプ、例えば、ヒトＩｇＧ、ヒトＩｇＭ、ヒトＩｇＡ、ヒトＩｇＥ、またはヒトＩｇＤのものである。いくつかの実施形態では、前記アイソタイプは、ＩｇＧ、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４などのヒトＩｇＧであり得る。いくつかの実施形態では、前記フラグメント（抗ＰＤ－Ｌ１抗体の抗原結合フラグメント）は、前記抗体の重鎖ＣＤＲおよび／または軽鎖ＣＤＲを含むいずれかのフラグメントであり得て、例えば、それは、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ（重鎖可変領域およびＣＨ１ドメインを含む）、Ｆｖ（重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域を含む）、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ；重鎖可変領域および軽鎖可変領域をいずれかの順序で、重鎖可変領域と軽鎖可変領域との間のペプチドリンカー含むかまたは本質的にそれらからなる）、一本鎖抗体、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）などからなる群から選択され得る。
限定されないが、前記抗ＬＡＧ３抗体またはそのフラグメントは、キメラ抗体、ヒト化抗体、または完全ヒト抗体である。一態様では、前記抗体またはそのフラグメントは、天然に存在するものでも、化学的または組換え的に合成されるものでもない。
これらの抗体のそれぞれがヒトＬＡＧ－３などのＬＡＧ－３に結合し得ることを考慮すると、前記ＣＤＲ配列またはＶＨおよびＶＬ配列を「混合および適合」させて、本開示の他の抗ＬＡＧ－３結合分子を製造し得る。好ましくは、前記ＣＤＲ配列またはＶＨおよびＶＬ鎖が混合されて一致する場合、例えば、特定のＶＨ／ＶＬ対からのＶＨ配列は、構造的に類似したＶＨ配列で置き換えられる。同様に、好ましくは、特定のＶＨ／ＶＬ対からのＶＬ配列は、構造的に類似したＶＬ配列で置き換えられる。
抗ＰＤ－Ｌ１／抗ＬＡＧ３二重特異性抗体
前記ＰＤ－Ｌ１標的部分およびＬＡＧ３標的部分を含む二重特異性抗体では、前記ＰＤ－Ｌ１標的部分およびＬＡＧ３標的部分の一方は完全長抗体であり、もう一方は重鎖ＣＤＲ、軽鎖ＣＤＲ、またはそれらの組み合わせを含む抗原結合フラグメント（ｓｃＦｖなど）であり得る。前記ＰＤ－Ｌ１およびＬＡＧ３タンパク質の１つを標的とする完全長抗体、および前記他のタンパク質を標的とする抗原結合フラグメントは、直接またはペプチドリンカーを介して化学的に結合（例えば、共有結合）し得る。前記抗原結合フラグメント（例えば、ｓｃＦｖ）は、直接またはペプチドリンカーを介して、前記完全長抗体のＮ末端（例えば、軽鎖または全長抗体の重鎖のＮ末端）、完全長抗体のＣ末端（例えば、完全長抗体の重鎖（またはＦｃまたはＣＨ３ドメイン）のＣ末端）、またはその両方に連結され得る（図３２を参照のこと）。
一実施形態では、前記二重特異性抗体としては、全長抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＬＡＧ３抗体の抗原結合フラグメント（例えば、ｓｃＦｖ）、およびそれらの間のペプチドリンカーが挙げられ得る。他の実施形態では、前記二重特異性抗体としては、全長抗ＬＡＧ３抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体の抗原結合フラグメント（例えば、ｓｃＦｖ）、およびそれらの間のペプチドリンカーが挙げられ得る。
一実施形態では、前記二重特異性抗体に含まれるｓｃＦｖは、いずれかの順序で重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み得る。例えば、前記二重特異性抗体に含まれるｓｃＦｖは、Ｎ末端からＣ末端への方向に重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み得て、この際それらの間のペプチドリンカーを含んでいてもよく、前記二重特異性抗体に含まれるｓｃＦｖは、Ｎ末端からＣ末端への方向に軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含み得て、この際、それらの間のペプチドリンカーを含んでいてもよい。
二重特異性抗体にペプチドリンカーを使用すると、抗体の純度が高くなり得る。
本明細書で使用される場合、「ペプチドリンカー」という用語は、１～１００、特に２～５０のいずれかのアミノ酸を含むものであり得て、いずれかの種類のアミノ酸が制限なしに含まれ得る。前記ペプチドリンカーは、例えば、Ｇｌｙ、Ａｓｎおよび／またはＳｅｒ残基を含み得て、さらに、Ｔｈｒおよび／またはＡｌａなどの中性アミノ酸を含み得る。前記ペプチドリンカーに適したアミノ酸配列は、関連技術で知られているものであり得る。一方、前記ペプチドリンカーの長さは、前記融合タンパク質の機能が影響を受けないような制限内で様々に決定され得る。例えば、前記ペプチドリンカーは、合計約１～約１００、約２～約５０、または約５～約２５の、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、およびＡｌａからなる群から選択される１つまたは複数を含むことによって形成され得る。一実施形態では、前記ペプチドリンカーは、（ＧｍＳ１）ｎとして表され得る（ｍ、ｌ、およびｎは、独立して、約１～約１０の整数、特に約２～約５の整数である）。
例えば、前記ペプチドリンカーの例は次のように要約される：
Figure 0007177543000010
他の実施形態では、前記ＰＤ－Ｌ１標的化部分およびＬＡＧ３標的化部分の両方は、完全長抗体または重鎖ＣＤＲ、軽鎖ＣＤＲ、またはそれらの組み合わせを含む抗原結合フラグメントであり得る。
他の実施形態では、前記二重特異性抗体は、ＰＤ－Ｌ１およびＬＡＧ３のうちの１つを標的とする第１の重鎖および第１の軽鎖の対を含む第１のアーム、ならびに、もう１つを標的とする第２の重鎖と第２の軽鎖のペアを含む第２のアームを含むヘテロ二量体形態であり得る。一実施形態では、前記完全長抗体は、完全長免疫グロブリン形態（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥまたはＩｇＤ、例えば、ヒトＩｇＧ、ヒトＩｇＭ、ヒトＩｇＡ、ヒトＩｇＥ、またはヒトＩｇＤ）であり得て、前記抗原結合フラグメントは、上記のように、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、一本鎖抗体、ｓｄＦｖなどからなる群から選択され得る。例えば、前記完全長抗体は、完全長ヒトＩｇＧ（ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２、ヒトＩｇＧ３、またはヒトＩｇＧ４）形態であり得て、前記抗原結合フラグメントは、ｓｃＦｖであり得る。
例えば、本明細書に記載の抗体は、柔軟なリンカー配列を含み得るか、または機能的部分（例えば、ＰＥＧ、薬物、毒素、または標識）を付加するように改変され得る。
いくつかの実施形態では、抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその抗原結合フラグメント、ならびに抗ＬＡＧ３抗体またはその抗原結合フラグメントを含む、二重特異性または多重特異性抗体が提供され、ここで、前記抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、ヒトプログラム細胞死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）タンパク質の免疫グロブリンＣ（Ｉｇ Ｃ）ドメインに特異的に結合することができ、ここで、前記ＩｇＣドメインはアミノ酸残基１３３－２２５からなり；前記抗ＬＡＧ３抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＭＨＣクラスＩＩ分子および／またはＦＧＬ１に結合し得る。
いくつかの実施形態において、前記抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１および６１～６７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ１；配列番号２、６８～７７、および５２５～５２７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ２；配列番号３、７８～９０、および５１３～５１９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ３；配列番号４、９１～９２、および５２０～５２１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ１；配列番号５および９３～１０５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ２；ならびに、配列番号６、１０６－１１１、および５２２－５２４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ３を含み、前記抗ＬＡＧ３抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１１６～１１７、３５４、および４５３～４６０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ１；配列番号１１８～１１９、３５５、および４６１～４６７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ２；配列番号１２０～１６０、３５６、および４６８～４７５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ３；配列番号１６３～１９５、２２９、３５７、および４９０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ１；配列番号１９６～２１７、３５８、および４７６～４８３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ２；ならびに、配列番号２１８～２２８、２３０～２５３、３５９、および４８４～４８９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ３を含む。
いくつかの実施形態では、前記抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ１；配列番号５２５のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２；配列番号３のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３；配列番号４のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１；配列番号５のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２；および配列番号６のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ３を含み、前記抗ＬＡＧ３抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号３５４のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ１、配列番号４６１のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ２、配列番号４６８のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ３、配列番号４９０のアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ１、配列番号３５８のアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ２、および配列番号４８８のアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ３を含む。
いくつかの実施形態では、前記抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ１；配列番号５２６のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２；配列番号５１５のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３； 配列番号４のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１；配列番号５のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２；配列番号６のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ３を含み、前記抗ＬＡＧ３抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号３５４のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ１、配列番号４６１のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ２、配列番号４６８のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ３、配列番号４９０のアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ１、配列番号３５８のアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ２、および配列番号４８８のアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ３を含む。本明細書に記載の抗体または変異体は、例えば、前記抗体へのいずれかのタイプの分子の共有結合によって、前記抗体が前記抗原（例えば、エピトープ）に結合するのを、共有結合が妨げないように修飾される誘導体を含み得る。例えば、限定的ではないが、前記抗体は、例えば、グリコシル化、アセチル化、ペグ化、リン酸化、リン酸化、アミド化、既知の保護／遮断基による誘導体化、タンパク質分解切断、細胞リガンドまたは他のタンパク質への結合などからなる群から選択される少なくとも１つによって修飾され得る。特定の化学的切断、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝合成などを含むがこれらに限定されない既知の技術によって、多数の化学修飾のいずれかを実施し得る。さらに、抗体は１つまたは複数の非古典的アミノ酸を含み得る。
前記抗体またはそのフラグメントは、化学発光化合物、蛍光化合物（例えば、蛍光発光金属）、放射性同位元素、色素などから選択される従来の標識材料でタグ付け（カップリング）することによって検出可能に標識され得る。タグ付けされた抗体またはそのフラグメントの存在は、抗体（またはそのフラグメント）と標識材料との間の化学反応中に生じるシグナルを測定することによって検出され得る。特に有用な標識材料の例は、ルミノール、イソルミノール、熱アクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩、シュウ酸塩エステル、蛍光発光金属などからなる群から選択される少なくとも１つであり得る。例えば、蛍光発光金属は、１５２Ｅｕ、またはランタニド系列の他のものであり得る。これらの金属は、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）またはエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）などの金属キレート基を使用して抗体に結合させ得る。
特定の実施形態では、前記調製された二重特異性抗体は、治療される動物において、例えば、ヒトにおいて、有害な免疫応答を誘発しないであろう。一実施形態では、前記二重特異性抗体は、いずれかの従来の技術を使用してそれらの免疫原性を低下させるように改変され得る。例えば、前記二重特異性抗体は、ヒト化、霊長類化、脱免疫化、またはキメラ抗体であり得る。これらのタイプの抗体は、その親抗体の抗原結合特性を保持するか、または実質的に保持するが、ヒトでは免疫原性が低い非ヒト抗体、典型的にはマウスまたは霊長類の抗体に由来する。これは、以下を含む様々な方法によって達成され得る。（ａ）非ヒト可変ドメイン全体をヒト定常領域に移植してキメラ抗体を生成すること；（ｂ）非ヒト相補性決定領域（ＣＤＲ）の１つまたは複数の少なくとも一部を、重要なフレームワーク残基の保持の有無にかかわらず、ヒトフレームワークおよび定常領域に移植すること；または、（ｃ）非ヒト可変ドメイン全体を移植するが、表面残基の置換によりヒト様セクションでそれらを「クローキング」すること。
免疫除去は、抗体の免疫原性を低下させるためにも使用され得る。本明細書で使用される場合、「脱免疫化」という用語は、Ｔ細胞エピトープを改変するための抗体の改変を含み得る（例えば、国際出願公開番号：ＷＯ／９８５２９７６ Ａ１およびＷＯ／００３４３１７ Ａ２を参照のこと）。例えば、開始抗体からの可変重鎖および可変軽鎖配列が分析され、配列内の相補性決定領域（ＣＤＲ）および他の重要な残基に関連するエピトープの位置を示す各Ｖ（可変）領域からのヒトＴ細胞エピトープ「マップ」が作成される。最終抗体の活性を変化させるリスクが低い代替アミノ酸置換を特定するために、Ｔ細胞エピトープマップからの個々のＴ細胞エピトープを分析する。アミノ酸置換の組み合わせを含む一連の代替の可変重配列および可変軽配列が設計され、これらの配列はその後、一連の結合ポリペプチドに組み込まれる。通常、１２～２４の変異抗体が生成され、結合および／または機能について試験される。次に、改変された可変領域およびヒト定常領域を含む完全な重鎖および軽鎖遺伝子が発現ベクターにクローン化され、その後のプラスミドが全抗体の産生のために細胞株に導入される。次に、前記抗体は適切な生化学的および生物学的アッセイで比較され、最適な変異体が特定される。
各標的タンパク質に対する前記二重特異性抗体の結合特異性および／または親和性は、いずれかの従来のアッセイ、例えば、免疫沈降、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、または酵素結合免疫吸収アッセイ（ＥＬＩＳＡ）などのインビトロアッセイによって決定され得るが、それらに限定されない。
あるいは、一本鎖ユニット（米国特許第４，６９４，７７８号など）の製造について記載された技術を、本開示の一本鎖ユニットを製造するように適合させ得る。一本鎖ユニットは、アミノ酸架橋（ペプチドリンカー）を介してＦｖ領域の重鎖および軽鎖フラグメントを結合することによって形成され、一本鎖融合ペプチド（ｓｃＦｖ）をもたらす。大腸菌における機能的Ｆｖフラグメントの集合のための技術もまた使用され得る。
一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）および抗体を産生するために使用され得る技術の例としては、米国特許第４，９４６，７７８号、５，２５８，４９８号などに記載されているものが挙げられる。ヒトにおける抗体のインビボ使用およびインビトロ検出アッセイを含むいくつかの用途については、キメラ、ヒト化、またはヒト抗体を使用することが好ましい場合がある。キメラ抗体は、マウスモノクローナル抗体に由来する可変領域、およびヒト免疫グロブリン定常領域を有する抗体など、前記抗体の異なる部分が異なる動物種に由来する分子である。キメラ抗体を産生するための方法は当技術分野で知られている。例えば、その全体が参照により本明細書に援用される、米国特許第５，８０７，７１５号、第４，８１６，５６７号、および第４，８１６，３９７号を参照のこと。
ヒト化抗体は、非ヒト種からの１つまたは複数の相補性決定領域（ＣＤＲ）およびヒト免疫グロブリン分子からのフレームワーク領域を有する望ましい抗原に結合する非ヒト種抗体に由来する抗体分子である。多くの場合、前記ヒトフレームワーク領域のフレームワーク残基は、ＣＤＲドナー抗体からの対応する残基で置換されて、抗原結合を変更する、好ましくは改善する。これらのフレームワーク置換は、当技術分野で周知の方法によって、例えば、前記ＣＤＲとフレームワーク残基との相互作用をモデル化して抗原結合に重要なフレームワーク残基を特定し、配列比較して特定の位置にある異常なフレームワーク残基を特定することによって特定される（例えば、その全体が参照により本明細書に援用される、Ｑｕｅｅｎら，米国特許第５，５８５，０８９号を参照のこと）。抗体は、例えば、ＣＤＲ移植（それぞれ、その全体が参照により本明細書に援用される、米国特許第５，２２５，５３９号、５，５３０，１０１号、５，５８５，０８９号など）、ベニアリングまたはリサーフェシング（それぞれ、その全体が参照により援用される、ＥＰ ５９２，１０６；ＥＰ ５１９，５９６）、およびチェーンシャッフリング（参照によりその全体が援用される米国特許第５，５６５，３３２号）を含む当技術分野で知られている様々な技術を使用してヒト化し得る。
完全ヒト抗体は、ヒト患者の治療的治療にとって特に望ましい。ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン配列に由来する抗体ライブラリーを使用するファージディスプレイ法を含む、当技術分野で知られている様々な方法によって作製され得る。それぞれ、その全体が参照により本明細書に援用される、米国特許第４，４４４，８８７号、４，７１６，１１１号などをも参照のこと。
ヒト抗体は、機能的な内因性免疫グロブリンを発現し得ないが、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現し得るトランスジェニックマウスを使用して産生され得る。例えば、前記ヒトの重鎖および軽鎖免疫グロブリン遺伝子複合体は、ランダムに、または相同組換えによってマウス胚性幹細胞に導入され得る。あるいは、前記ヒトの重鎖および軽鎖遺伝子に加えて、前記ヒトの可変領域、定常領域、および多様性領域をマウス胚性幹細胞に導入し得る。前記マウスの重鎖および軽鎖免疫グロブリン遺伝子は、相同組換えによるヒト免疫グロブリン遺伝子座の導入とは別に、または同時に機能し得ない。特に、そのＪＨ領域のホモ接合性欠失は内因性抗体産生を防ぐ。前記改変された胚性幹細胞は、増殖され、胚盤胞にマイクロインジェクションされて、キメラマウスを作製する。次に、前記キメラマウスを繁殖させて、ヒト抗体を発現するホモ接合性の子孫を作製する。前記トランスジェニックマウスは、選択された抗原、例えば、所望の標的ポリペプチドの全部または一部で通常の方法で免疫化される。抗原に対するモノクローナル抗体は、従来のハイブリドーマ技術を使用して、免疫化されたトランスジェニックマウスから得られ得る。前記トランスジェニックマウスが保有するヒト免疫グロブリン導入遺伝子は、Ｂ細胞の分化中に再配列し、その後、クラススイッチおよび体細胞変異を起こす。したがって、そのような技術を使用して、治療上有用なＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭおよびＩｇＥ抗体を産生し得る。
選択されたエピトープを認識する完全ヒト抗体は、「ガイド付き選択」と呼ばれる技術を使用してもまた産生し得る。このアプローチでは、選択された非ヒトモノクローナル抗体、例えばマウス抗体を使用して、同じエピトープを認識する完全ヒト抗体の選択をガイドする。
他の実施形態において、望ましいモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、従来の手順を使用して、（例えば、前記マウス抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合し得るオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）容易に単離および配列決定され得る。前記単離されサブクローン化されたハイブリドーマ細胞は、そのようなＤＮＡの好ましい供給源として機能する。ひとたび単離されると、前記ＤＮＡは、発現ベクターに入れられ、その後、大腸菌細胞、シミアンＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、免疫グロブリンを産生しない骨髄腫細胞などの原核生物または真核生物の宿主細胞にトランスフェクトされる。より具体的には、前記単離されたＤＮＡ（本明細書に記載されるように合成され得る）は、その全体が参照により本明細書に援用される、ニューマンら，米国特許第５，６５８，５７０号に記載されるように、製造抗体のための定常および可変領域配列をクローン化するために使用され得る。基本的に、これには、選択した細胞からのＲＮＡの抽出、ｃＤＮＡへの変換、およびＩｇ特異的プライマーを使用したＰＣＲによる増幅が含まれる。この目的のための適切なプライマーはまた、米国特許第５，６５８，５７０号に記載されている。以下でより詳細に議論されるように、前記望ましい抗体を発現する形質転換細胞は、前記免疫グロブリンの臨床的および商業的供給を提供するために比較的大量に増殖され得る。
さらに、慣習の組換えＤＮＡ技術を使用して、前記二重特異性抗体のＣＤＲの１つまたは複数を、フレームワーク領域内に、例えば、ヒトフレームワーク領域に挿入して、非ヒト抗体をヒト化し得る。前記フレームワーク領域は、自然発生またはコンセンサスフレームワーク領域、好ましくはヒトフレームワーク領域であり得る（例えば、ヒトフレームワーク領域の一覧として、Ｃｈｏｔｈｉａら， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２７８： ４５７－４７９ （１９９８）を参照のこと）。例えば、前記フレームワーク領域およびＣＤＲの組み合わせによって生成されたポリヌクレオチドは、望ましいポリペプチドの少なくとも一つのエピトープ、例えば、ＬＩＧＨＴに特異的に結合する抗体をコードする。好ましくは、１つまたは複数のアミノ酸置換は、前記フレームワーク領域内で行われ得て、そして好ましくは、前記アミノ酸置換は、その抗原（またはエピトープ）への抗体の結合を改善する。さらに、そのような方法を使用して、鎖内ジスルフィド結合に関与する１つまたは複数の可変領域システイン残基のアミノ酸置換または欠失を行い、１つまたは複数の鎖内ジスルフィド結合を欠く抗体分子を生成し得る。前記ポリヌクレオチドに対する他の変更は、本開示に含まれ、当技術分野の技術の範囲内である。
さらに、適切な抗原特異性のマウス抗体分子からの遺伝子を、適切な生物学的活性のヒト抗体分子からの遺伝子と一緒にスプライシングすることによって「キメラ抗体」を産生するために開発された技術を使用し得る。本明細書で使用される場合、キメラ抗体は、マウスモノクローナル抗体に由来する可変領域およびヒト免疫グロブリン定常領域を有するものなど、異なる部分が異なる動物種に由来する分子である。
あるいは、抗体産生細胞株は、当業者に公知の技術を使用して選択および培養され得る。 このような技術は、さまざまな実験マニュアルや主要な出版物に記載されている。
さらに、当業者に知られている標準的な技術を使用して、アミノ酸置換をもたらす部位特異的突然変異誘発およびＰＣＲ媒介突然変異誘発などの、これらに限定されない、本開示の抗体をコードするヌクレオチド配列に突然変異を導入し得る。好ましくは、前記変異体（誘導体を含む）は、前記参照可変重鎖領域、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｈ３、可変軽鎖領域、ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、またはＣＤＲ－Ｌ３と比較して５０未満のアミノ酸置換、４０未満のアミノ酸置換、３０未満のアミノ酸置換、２５未満のアミノ酸置換、２０未満のアミノ酸置換、１５未満のアミノ酸置換、１０未満のアミノ酸置換、５未満のアミノ酸置換、４未満のアミノ酸置換、３未満のアミノ酸置換、２未満のアミノ酸置換をコードする。あるいは、飽和突然変異誘発などによって、突然変異をコード配列の全部または一部に沿ってランダムに導入し得て、得られた突然変異体を生物学的活性についてスクリーニングして、活性を保持する突然変異体を同定し得る。
抗体の治療的使用
本明細書で提供される二重特異性抗体は、ＰＤ－Ｌ１およびＬＡＧ３の活性を同時に遮断し得て、それにより、例えば免疫応答を活性化することにより、免疫療法および／または癌療法において改善された効果を示す（図３３を参照のこと）。本開示の二重特異性抗体がＬＡＧ－３のＭＨＣクラスＩＩ分子への結合を阻害し、抗原特異的Ｔ細胞応答を刺激する能力を考慮すると、本開示はまた、抗原特異的Ｔ細胞応答を刺激、増強または上方制御するために本開示の抗体を使用する組成物またはインビトロおよびインビボの方法を提供する。
一実施形態は、上記のような二重特異性抗体または抗ＰＤ－Ｌ１または抗ＬＡＧ３抗体を含む医薬組成物を提供する。前記医薬組成物は、薬学的に許容される担体をさらに含み得る。前記医薬組成物は、免疫応答（例えば、抗原特異的Ｔ細胞応答）を刺激するため、および／またはＰＤ－Ｌ１、ＬＡＧ３、またはそれらの両方に関連する疾患を治療および／または予防するために使用され得る。
他の実施形態は、免疫応答（例えば、抗原特異的Ｔ細胞応答）を刺激する方法、および／または、医薬有効量の前記二重特異性抗体、抗ＰＤ－Ｌ１もしくは抗ＬＡＧ３抗体、または医薬組成物を対象に投与することを含む、ＰＤ－Ｌ１、ＬＡＧ３、またはそれらの両方に関連する疾患を、それを必要とする対象において、治療および／または予防する方法を提供する。この方法は、投与工程の前に、ＰＤ－Ｌ１、ＬＡＧ３、またはそれらの両方に関連する疾患を治療および／または予防する必要がある対象を特定するさらなる工程であり得る。
前記ＰＤ－Ｌ１、ＬＡＧ３、またはその両方に関連する疾患は、癌（または腫瘍）、感染症、自己免疫反応、神経系障害などから選択され得る。
一実施形態では、前記対象は、ヒトなどの哺乳動物、例えば、癌および／または感染哺乳動物細胞に罹患している哺乳動物（例えば、ヒト）から選択され得る。他の実施形態では、前記対象は、哺乳動物、例えば、癌感染症、自己免疫反応、神経系障害などから選択される疾患に罹患している哺乳動物から分離された（単離された）細胞（例えば、癌細胞または哺乳動物の感染領域から分離された（単離された）細胞、または腫瘍浸潤性Ｔリンパ球、ＣＤ４＋ Ｔ細胞、ＣＤ８＋ Ｔ細胞、またはそれらの組み合わせなどのＴ細胞）であり得る。
他の実施形態は、癌または感染症を治療および／または予防する際の二重特異性抗体、抗ＰＤ－Ｌ１または抗ＬＡＧ３抗体、または医薬組成物の使用を提供する。他の実施形態は、癌または感染症を治療および／または予防するための医薬組成物を調製する際の二重特異性抗体、または抗ＰＤ－Ｌ１または抗ＬＡＧ３抗体の使用を提供する。
本明細書で提供される医薬組成物、方法および／または使用において、ＰＤ－Ｌ１、ＬＡＧ３、またはそれらの両方に関連する疾患は、ＰＤ－Ｌ１、ＬＡＧ３、またはその両方の活性化（例えば、異常な活性化または過剰活性化）および／または過剰産生（過剰発現）に関連する疾患であり得る。例えば、病気は癌または感染症であり得る。
前記癌は、固形癌または血液癌、好ましくは固形癌であり得る。前記癌は、ＰＤ－Ｌ１タンパク質を発現するいずれかの腫瘍であり得て、膀胱癌、肝臓癌、結腸癌、直腸癌、子宮内膜癌、白血病、リンパ腫、膵臓癌、肺癌（例えば、小細胞肺癌、非小細胞肺癌など）、乳癌、尿道癌、頭頸部癌、胃腸癌、胃癌、食道癌、卵巣癌、腎癌、黒色腫、前立腺癌、甲状腺癌などからなる群から選択され得るが、これらに限定され得ない。いくつかの実施形態では、癌は、膀胱癌、肝臓癌、膵臓癌、非小細胞肺癌、乳癌、尿道癌、結腸直腸癌、頭頸部癌、扁平上皮癌、メルケル細胞癌、胃腸癌、胃癌、食道癌、卵巣癌、腎癌、小細胞肺癌などからなる群から選択される。前記癌は原発性または転移性の癌であり得る。
特定の患者に対する特定の投与量および治療計画は、特定の抗体、使用される変異体またはその派生物、患者の年齢、体重、一般的な健康状態、性別、食事、投与時間、排泄率、薬剤の組み合わせ、治療中の特定の疾患の重症度を含むさまざまな要因に依存する。医療介護者によるそのような要因の判断は、当業者の範囲内である。前記量はまた、治療される個々の患者、投与経路、製剤のタイプ、使用される化合物の特性、疾患の重症度、および望ましい効果に依存するであろう。前記使用される量は、当技術分野で公知の薬理学的および薬物動態学的原理によって決定され得る。
前記二重特異性抗体または抗ＰＤ－Ｌ１または抗ＬＡＧ３抗体の投与は、腹腔内、静脈内、皮下、皮内、筋肉内、鼻腔内、硬膜外、および経口経路、からなる群から選択されるがこれらに限定されない少なくとも１つを介して実施され得る。前記二重特異性抗体または抗ＰＤ－Ｌ１または抗ＬＡＧ３抗体または組成物は、いずれかの便利な経路、例えば注入またはボーラス注射、上皮または粘膜皮膚内層（例えば、口腔粘膜、直腸および腸粘膜など）を介した吸収によって投与され得て、他の生物学的に活性な剤と一緒に投与され得る。したがって、本開示の抗原結合ポリペプチドを含む医薬組成物は、経口的に、非経口的に、槽内、膣内、腹腔内、直腸、局所（粉末、軟膏、滴または経皮パッチなど）、頬側、または経口スプレーもしくは鼻スプレーとして投与され得る。
本明細書で使用される「非経口」という用語は、静脈内、筋肉内、腹腔内、胸骨内、皮下および関節内の注射および注入などの投与様式を指す。
管理は、全身的または局所的であり得る。さらに、脳室内および髄腔内注射などのいずれかの適切な経路によって、本開示の抗体を中枢神経系に導入することが望ましい場合がある；脳室内注射は、例えば、オマヤリザーバーなどのリザーバーに取り付けられた脳室内カテーテルによって促進され得る。肺投与はまた、例えば、吸入器またはネブライザーの使用、およびエアロゾル化剤との配合によって使用され得る。
本開示の二重特異性抗体、または抗ＰＤ－Ｌ１または抗ＬＡＧ３抗体、または組成物を、治療を必要とする領域に局所的に投与することが望ましい場合がある；これは、例えば、限定的ではなく、手術中の局所注入によって、局所適用、例えば、手術後の創傷被覆材と組み合わせて、注射により、カテーテルにより、坐剤によって、またはインプラントによって、達成され得て、前記インプラントは、多孔質、非多孔質、またはゼラチン状の、シアラスティック膜などの膜、または繊維などの材料である。好ましくは、本開示の抗体を含むタンパク質を投与する場合、タンパク質が吸収しない材料を使用するように注意を払わなければならない。
他の実施形態では、前記二重特異性抗体または抗ＰＤ－Ｌ１もしくは抗ＬＡＧ３抗体または組成物は、小胞、特にリポソームにおいて送達され得る。さらに他の実施形態では、前記二重特異性抗体または抗ＰＤ－Ｌ１もしくは抗ＬＡＧ３抗体または組成物は、制御放出システムで送達され得る。一実施形態では、制御放出システムのために、いずれかの薬学的に許容されるポンプ、および／またはポリマー材料を使用し得る。
炎症性、免疫性または悪性の疾患、障害、または状態を治療、阻害、改善、および／または予防するための二重特異性抗体または抗ＰＤ－Ｌ１もしくは抗ＬＡＧ３抗体の薬学的に有効な量は、標準的な臨床技術によって決定され得る。さらに、最適な投与量範囲を特定するために、ｉｎｖｉｔｒｏアッセイをオプションで使用し得る。前記製剤に使用される正確な用量は、投与経路、および疾患、障害、または状態の重症度にも依存し、開業医の判断および各患者の状況に応じて決定する必要がある。有効量は、ｉｎｖｉｔｒｏまたは動物モデル試験システムから得られた用量反応曲線から推定され得る。
前記二重特異性抗体または抗ＰＤ－Ｌ１もしくは抗ＬＡＧ３抗体の投与を含む、感染性または悪性疾患（例えば、癌）、状態または障害を治療する方法は通常、ヒトで使用する前に、インビトロで、次に許容可能な動物モデルでインビボで、望ましい治療的または予防的活性について試験される。トランスジェニック動物などの適切な動物モデルは、当業者によく知られている。例えば、前記二重特異性抗体または抗ＰＤ－Ｌ１もしくは抗ＬＡＧ３抗体の治療的有用性を実証するためのインビトロアッセイは、細胞株または患者の組織サンプルに対する二重特異性抗体または抗ＰＤ－Ｌ１もしくは抗ＬＡＧ３抗体の効果を含む。前記細胞株および／または組織サンプルに対する二重特異性抗体または抗ＰＤ－Ｌ１もしくは抗ＬＡＧ３抗体の効果は、本明細書の他の場所に開示されるアッセイなどの当業者に知られている技術を利用して決定され得る。本開示によれば、前記二重特異性抗体または抗ＰＤ－Ｌ１もしくは抗ＬＡＧ３抗体の投与が示されるかどうかを決定するために使用し得るインビトロアッセイとしては、培地で患者の組織サンプルが成長し、化合物に曝露されるか、そうでなければ投与され、組織サンプルに対する前記化合物の効果が観察されるインビトロ細胞培養アッセイが挙げられる。
様々な送達システム、例えば、リポソーム、微粒子、マイクロカプセル、化合物を発現し得る組換え細胞、受容体媒介エンドサイトーシス、レトロウイルスまたは他のベクターの一部としての核酸の構築などへのカプセル化、が知られており、本開示の抗体または本開示の抗体をコードするポリヌクレオチドを投与するために使用され得る。
前記医薬組成物は、有効量の二重特異性抗体または抗ＰＤ－Ｌ１もしくは抗ＬＡＧ３抗体、および許容可能な担体を含み得る。いくつかの実施形態では、前記組成物は、第２の抗癌剤（例えば、免疫チェックポイント阻害剤）をさらに含む。
特定の実施形態では、「薬学的に許容される」という用語は、連邦もしくは州政府の規制機関によって承認された、または動物、より具体的にはヒトで使用するために米国薬局方もしくは他の一般に認められた薬局方に記載されていることを指し得る。さらに、「薬学的に許容される担体」は、一般に、非毒性の固体、半固体または液体の充填剤、希釈剤、カプセル化材料、またはいずれかのタイプの製剤補助剤である。
「担体」という用語は、治療薬が投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤、またはビヒクルを指し得る。そのような医薬担体は、ピーナッツ油、大豆油、鉱油、ゴマ油などの石油、動物、植物または合成起源のものを含む、水および油などの無菌液体であり得る。前記医薬組成物を静脈内投与する場合、水が好ましい担体である。生理食塩水およびデキストロースおよびグリセロール水溶液もまた、特に注射可能な溶液の場合、液体担体として使用され得る。適切な医薬賦形剤としては、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどが挙げられる。前記組成物は、必要に応じて、少量の湿潤剤または乳化剤、あるいは酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩などのｐＨ緩衝剤を含み得る。ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗菌剤；アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸などのキレート剤；および塩化ナトリウムまたはデキストロースなどの張性を調整するための薬剤もまた想定されている。これらの組成物は、溶液、懸濁液、乳濁液、錠剤、丸薬、カプセル、粉末、徐放性製剤などの形態をとり得る。前記組成物は、トリグリセリドなどの従来の結合剤および担体を用いて、坐剤として処方され得る。経口製剤は、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどの標準的な担体を含み得る。適切な医薬担体の例は、参照により本明細書に援用される、Ｅ．Ｗ．マーティンによるレミントンの医薬科学に記載されている。そのような組成物は、患者への適切な投与のための形態を提供するために、適切な量の担体と共に、好ましくは精製された形態で、治療有効量の抗原結合ポリペプチドを含むであろう。前記製剤は投与方法に適合している必要がある。非経口製剤は、アンプル、使い捨て注射器、またはガラスもしくはプラスチック製の複数回投与バイアルに入れ得る。
一実施形態では、前記組成物は、ヒトへの静脈内投与に適合した医薬組成物として通常の手順に従って処方される。通常は、静脈内投与用の組成物は、無菌の等張水性緩衝液中の溶液である。必要に応じて、前記組成物はまた、注射部位の痛みを和らげるために、可溶化剤およびリグノカインなどの局所麻酔薬を含み得る。一般に、前記成分は、別々に供給されるか、または単位剤形で一緒に混合されて、例えば、活性剤の量を示すアンプルまたはサシェットなどの密閉容器内の乾燥凍結乾燥粉末または水を含まない濃縮物として供給される。前記組成物が注入によって投与される場合、それは、無菌の医薬品グレードの水または生理食塩水を含む注入ボトルを省き得る。前記組成物が注射によって投与される場合、注射用の滅菌水のアンプルまたは生理食塩水を提供して、投与前に成分を混合し得る。
本開示の化合物は、中性または塩の形態として処方され得る。製薬上許容される塩としては、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などに由来する塩などの陰イオンで形成される塩、およびナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２－エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどに由来する塩などの陽イオンで形成される塩が挙げられる。
抗体の診断的使用
ＰＤ－Ｌ１および／またはＬＡＧ３の過剰発現および／または過剰活性化は、特定の癌および／または感染症（例えば、感染性患者からの腫瘍細胞または組織、血液または血清）を患っている患者からの生物学的サンプル（例えば、細胞、組織、血液、血清など）において観察され、かつ／あるいは、ＰＤ－Ｌ１および／またはＬＡＧ３を過剰発現する細胞を有する患者は、二重特異性抗体または抗ＰＤ－Ｌ１または抗ＬＡＧ３抗体による治療に反応し得る。したがって、本開示の二重特異性抗体または抗ＰＤ－Ｌ１または抗ＬＡＧ３抗体はまた、診断および予後の目的のために使用され得る。
一実施形態は、ＰＤ－Ｌ１、ＬＡＧ３、またはそれらの両方に関連する疾患を診断するための医薬組成物を提供し、前記組成物は、前記二重特異性抗体または抗ＰＤ－Ｌ１もしくは抗ＬＡＧ３抗体を含む。他の実施形態では、前記ＰＤ－Ｌ１、ＬＡＧ３、またはそれらの両方に関連する疾患を診断するための二重特異性抗体または抗ＰＤ－Ｌ１もしくは抗ＬＡＧ３抗体の使用が提供される。
他の実施形態は、ＰＤ－Ｌ１、ＬＡＧ３、またはそれらの両方に関連する疾患を診断する方法を提供し、前記方法は、患者から得られた生物学的サンプルを二重特異性抗体または抗ＰＤ－Ｌ１もしくは抗ＬＡＧ３抗体と接触させることを含み、生体サンプル中の抗原抗体反応を検出または抗原抗体反応のレベルを測定する。この方法では、前記生体サンプルで前記抗原抗体反応が検出された場合、または前記生体サンプル中の前記抗原抗体反応のレベルが正常サンプルよりも高い場合、生物学的サンプルが得られる患者は、ＰＤ－Ｌ１、ＬＡＧ３、またはその両方に関連する疾患を有する患者として決定され得る。したがって、いくつかの実施形態では、前記方法は、正常サンプルを前記二重特異性抗体または抗ＰＤ－Ｌ１もしくは抗ＬＡＧ３抗体と接触させ、正常サンプル中の抗原抗体反応のレベルを測定することをさらに含み得る。さらに、前記方法は、測定工程の後に、生物学的サンプルおよび正常サンプルにおける抗原抗体反応のレベルを比較することをさらに含み得る。さらに、検出工程または比較工程の後、生体サンプル中の抗原抗体反応が検出された場合、または生体試料中の抗原抗体反応のレベルが正常サンプルよりも高い場合、前記方法は、前記患者を、ＰＤ－Ｌ１、ＬＡＧ３、またはそれらの両方に関連する疾患を有する患者として決定することをさらに含み得る。
ＰＤ－Ｌ１、ＬＡＧ３、またはその両方に関連する疾患は、ＰＤ－Ｌ１、ＬＡＧ３、またはその両方の活性化（例えば、異常な活性化または過剰活性化）および／または過剰産生（過剰発現）に関連する疾患であり得る。例えば、前記疾患は、上記のように、癌または感染症であり得る。
前記診断組成物および診断方法において、前記生物学的サンプルは、細胞、組織、体液（例えば、血液、血清、リンパ液など）などからなる群から選択される少なくとも１つであり得て、診断される患者から得られ得る（分離され得る）。前記正常なサンプルは、細胞、組織、体液（例えば、血液、血清、リンパ、尿など）などからなる群から選択される少なくとも１つであり得て、ＰＤ－Ｌ１、ＬＡＧ３、またはその両方に関連する疾患を持たない患者から得られ得る（分離され得る）。前記患者は、ヒトなどの哺乳動物から選択され得る。前記サンプルに対して施されていてもよい前処理の際に、前記サンプルは、前記抗体をサンプルに存在し得るＰＤ－Ｌ１および／またはＬＡＧ３タンパク質と相互作用させる条件下で、本開示の二重特異性抗体または抗ＰＤ－Ｌ１もしくは抗ＬＡＧ３抗体と共にインキュベートされ得る。
前記サンプル中のＰＤ－Ｌ１および／またはＬＡＧ３タンパク質の存在および／またはレベル（濃度）は、二重特異性抗体もしくは抗ＰＤ－Ｌ１もしくは抗ＬＡＧ３抗体による治療に適した患者、または二重特異性抗体もしくは抗ＰＤ－Ｌ１もしくは抗ＬＡＧ３抗体による治療に反応もしくは感受性のある患者を特定するために使用され得る。
一実施形態は、前記二重特異性抗体もしくは抗ＰＤ－Ｌ１もしくは抗ＬＡＧ３抗体による治療に適した患者、または前記二重特異性抗体もしくは抗ＰＤ－Ｌ１もしくは抗ＬＡＧ３抗体による治療に反応または感受性のある患者を特定する医薬組成物を提供し、前記組成物は、前記二重特異性抗体または抗ＰＤ－Ｌ１もしくは抗ＬＡＧ３抗体を含む。他の実施形態では、前記二重特異性抗体もしくは抗ＰＤ－Ｌ１もしくは抗ＬＡＧ３抗体による治療に適した患者、または前記二重特異性抗体もしくは抗ＰＤ－Ｌ１もしくは抗ＬＡＧ３抗体による治療に反応もしくは感受性のある患者を特定するための、前記二重特異性抗体または抗ＰＤ－Ｌ１もしくは抗ＬＡＧ３抗体の使用が提供される。他の実施形態は、前記二重特異性抗体もしくは抗ＰＤ－Ｌ１もしくは抗ＬＡＧ３抗体による治療に適した患者、または前記二重特異性抗体もしくは抗ＰＤ－Ｌ１もしくは抗ＬＡＧ３抗体による治療に反応もしくは感受性のある患者を特定する方法を提供し、前記方法は、患者から得られた生体サンプルを前記二重特異性抗体または抗ＰＤ－Ｌ１もしくは抗ＬＡＧ３抗体と接触させ、抗原抗体反応を検出するか、または生体サンプル中の抗原抗体反応のレベルを測定することを含む。
一実施形態は、生物学的サンプルにおいて、ＰＤ－Ｌ１、ＬＡＧ３、またはそれらの両方を同時に検出するための組成物を提供し、前記組成物は、前記二重特異性抗体または抗ＰＤ－Ｌ１もしくは抗ＬＡＧ３抗体を含む。他の実施形態は、生物学的サンプル中のＰＤ－Ｌ１、ＬＡＧ３、またはそれらの両方を同時に検出する方法を提供し、前記方法は、前記生物学的サンプルを前記二重特異性抗体または抗ＰＤ－Ｌ１もしくは抗ＬＡＧ３抗体と接触させること；前記二重特異性抗体または抗ＰＤ－Ｌ１もしくは抗ＬＡＧ３抗体とＰＤ－Ｌ１、ＬＡＧ３、またはその両方との間の抗原抗体反応（結合）を検出（測定）することを含む。
検出組成物および検出方法において、「ＰＤ－Ｌ１、ＬＡＧ３、またはそれらの両方の検出」という用語は、生体サンプル中のＰＤ－Ｌ１、ＬＡＧ３、またはその両方の存在（および／または不在）および／またはレベルの検出を指し得るが、これらに限定されない。
検出方法において、抗原抗体反応が検出された場合、ＰＤ－Ｌ１、ＬＡＧ３、またはその両方が生体試料中に存在すると判断し得て、抗原抗体反応が検出されない場合、ＰＤ－Ｌ１、ＬＡＧ３、またはその両方が生体サンプルに存在しない（存在しない）と判断し得る。したがって、前記検出方法は、前記検出工程の後に、抗原抗体反応が検出された場合、ＰＤ－Ｌ１、ＬＡＧ３、またはそれらの両方が生物学的サンプル中に存在すること、および／または抗原抗体反応が検出されない場合、ＰＤ－Ｌ１、ＬＡＧ３、またはその両方が生体サンプルに存在しない（存在しない）ことを決定することをさらに含み得る。
前記検出方法において、ＰＤ－Ｌ１、ＬＡＧ３、またはその両方のレベルは、前記抗原抗体反応の程度に応じて決定され得る（例えば、前記抗原抗体反応によって形成される抗原抗体複合体の量、抗原抗体反応によって得られるいずれかの信号の強度など、いずれかの従来の手段によって測定され得る）。
前記生物学的サンプルは、細胞（例えば、腫瘍細胞）、組織（例えば、腫瘍組織）、体液（例えば、血液、血清など）などからなる群から選択される少なくとも１つを含み得て、ヒトなどの哺乳動物から入手または単離され得る。前記検出方法の工程は、インビトロで実行され得る。
前記診断方法および／または検出方法において、一般的な酵素反応、蛍光反応、発光反応、および／または放射線の検出など、関連技術に知られているいずれかの一般的な方法により、抗原抗体反応を検出する、または抗原抗体反応のレベルを測定する工程を実施し得る。例えば、前記工程は、免疫クロマトグラフィー、免疫組織化学（ＩＨＣ）、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、発光免疫測定法（ＬＩＡ）、ウエスタンブロッティング、マイクロアレイ、フローサイトメトリー、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）などからなる群から選択されるがこれらに限定されない方法によって実施され得る。
抗体をコードするポリヌクレオチドおよび抗体を調製する方法
一実施形態は、前記二重特異性抗体または抗ＰＤ－Ｌ１もしくは抗ＬＡＧ３抗体をコードするポリヌクレオチドを提供する。特に、一実施形態は、ＩｇＧ－ｓｃＦｖ形態の二重特異性抗体の重鎖をコードするポリヌクレオチドを提供する。他の実施形態は、ＩｇＧ－ｓｃＦｖ形態の二重特異性抗体の軽鎖をコードするポリヌクレオチドを提供する。前記ＩｇＧ－ｓｃＦｖ型は、ＰＤ－Ｌ１およびＬＡＧ３タンパク質の一方を標的とする（結合する）完全長ＩｇＧ抗体と、もう一方を標的とする（結合する）ｓｃＦｖフラグメントを含む一種の二重特異性抗体を指し得て、ここで、ｓｃＦｖは完全長ＩｇＧ抗体のＣ末端および／またはＮ末端に直接（ペプチドリンカーなしで）またはペプチドリンカーを介して連結されている。
一実施形態では、ＩｇＧ－ｓｃＦｖ形態の二重特異性抗体が、ＰＤ－Ｌ１に対する完全長ＩｇＧ抗体およびＬＡＧ３に対するｓｃＦｖフラグメントを含む場合、前記二重特異性抗体の重鎖をコードするポリヌクレオチドは、ＰＤ－Ｌ１に対する完全長ＩｇＧ抗体の重鎖、および、完全長ＩｇＧ抗体のＣ末端および／またはＮ末端に直接またはペプチドリンカーを介して結合しているＬＡＧ３に対するｓｃＦｖフラグメントをコードし得て；二重特異性抗体の軽鎖をコードするポリヌクレオチドは、ＰＤ－Ｌ１に対する完全長ＩｇＧ抗体の軽鎖をコードし得る。
他の実施形態において、ＩｇＧ－ｓｃＦｖ形態の二重特異性抗体が、ＬＡＧ３に対する完全長ＩｇＧ抗体およびＰＤ－Ｌ１に対するｓｃＦｖフラグメントを含む場合、二重特異性抗体の重鎖をコードするポリヌクレオチドは、ＬＡＧ３に対する完全長ＩｇＧ抗体の重鎖、および、完全長ＩｇＧ抗体のＣ末端および／またはＮ末端に直接またはペプチドリンカーを介して結合しているＰＤ－Ｌ１に対するｓｃＦｖフラグメントをコードし得て；二重特異性抗体の軽鎖をコードするポリヌクレオチドは、ＬＡＧ３に対する完全長ＩｇＧ抗体の軽鎖をコードし得る。
他の実施形態は、二重特異性抗体の重鎖をコードするポリヌクレオチド、二重特異性抗体の軽鎖をコードするポリヌクレオチド、またはそれらの両方を含む組換えベクターを提供する。他の実施形態は、前記組換えベクターでトランスフェクトされた組換え細胞を提供する。
他の実施形態は、細胞内で前記二重特異性抗体の重鎖をコードするポリヌクレオチド、前記二重特異性抗体の軽鎖をコードするポリヌクレオチドを発現することを含む、二重特異性抗体を調製する方法を提供する。ポリヌクレオチドを発現する工程は、ポリヌクレオチドを発現させる条件下で（例えば、組換えベクターにおいて）ポリヌクレオチドを含む細胞を培養することによって実施され得る。前記方法は、発現または培養の工程の後に、前記細胞培養物から前記二重特異性抗体を単離および／または精製することをさらに含み得る。
以下、本発明を実施例により詳細に説明する。
以下の実施例は、単に本発明を説明することを意図しており、本発明を制限するものと解釈されるべきではない。
実施例１：抗ＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体の調製
１．１． 抗ヒトＰＤ－Ｌ１マウスモノクローナル抗体の調製とその分析
抗ヒトＰＤ－Ｌ１マウスモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ技術を使用して産生された。
抗原：ヒトＰＤ－Ｌ１－Ｆｃタンパク質およびヒトＰＤ－Ｌ１高発現ＣＨＯＫ１細胞株（ＰＤＬ１－ＣＨＯＫ１細胞株）。
免疫化：ヒトＰＤ－Ｌ１に対するマウスモノクローナル抗体を生成するために、６～８週間の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスを最初に１．５×１０７ＰＤＬ１－ＣＨＯＫ１細胞で免疫化した。最初の免疫後１４日目と３３日目に、免疫したマウスをそれぞれ１．５×１０７のＰＤＬ１－ＣＨＯＫ１細胞で再免疫化した。ＰＤ－Ｌ１タンパク質に結合する抗体を産生するマウスを選択するために、免疫化されたマウスの血清をＥＬＩＳＡで試験した。簡潔に説明すると、マイクロタイタープレートをＰＢＳ中１μｇ／ｍｌのヒトＰＤ－Ｌ１タンパク質でコーティングし、室温（ＲＴ）で１００μｌ／ウェルで一晩コーティングし、１００μｌ／ウェルの５％ＢＳＡでブロックした。免疫化したマウスからの血漿の希釈液を各ウェルに加え、ＲＴで１～２時間インキュベートした。プレートをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎで洗浄した後、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）と結合した抗マウスＩｇＧ抗体と室温で１時間インキュベートした。洗浄後、プレートをＡＢＴＳ基質で成長させ、ＯＤ ４０５ｎｍで分光光度計で分析した。十分な力価の抗ＰＤＬ１ ＩｇＧを有するマウスを、免疫後５４日目に５０μｇのヒトＰＤＬ１－Ｆｃタンパク質で追加免疫化した。得られたマウスを融合に使用した。ハイブリドーマ上清をＥＬＩＳＡによって抗ＰＤ－Ｌ１ＩｇＧについて試験した。
ハイブリドーマＨＬ１２１０－３の可変領域のアミノ酸およびポリヌクレオチド配列を以下の表５に提供する。
Figure 0007177543000011
Figure 0007177543000012
１．２． ＨＬ１２１０－３マウスｍＡｂの活性
ハイブリドーマクローンＨＬ１２１０－３の結合活性を評価するために、このクローンから精製したｍＡｂをＥＬＩＳＡ試験に供した。簡単に説明すると、マイクロタイタープレートをＰＢＳ中０．１μｇ／ｍｌのヒトＰＤ－Ｌ１－Ｆｃタンパク質、１００μｌ／ウェル、４℃で一晩コーティングし、１００μｌ／ウェルの５％ＢＳＡでブロックしました。０．２μｇ／ｍｌから始まるＨＬ１２１０－３抗体の３倍希釈液を各ウェルに添加し、室温で１～２時間インキュベートした。プレートをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎで洗浄した後、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）と結合したヤギ抗マウスＩｇＧ抗体と室温で１時間インキュベートした。洗浄後、プレートをＴＭＢ基質で成長させ、分光光度計でＯＤ４５０－６３０ｎｍで分析した。図１に示すように、ＨＬ１２１０－３は高活性（ＥＣ５０＝５．５３９ｎｇ／ｍｌ）でヒトＰＤ－Ｌ１に結合し得る。
ＨＬ１２１０－３マウスｍＡｂがその受容体ＰＤ－１に結合するヒトＰＤ－Ｌ１をブロックする活性を評価するために、組換えヒトＰＤ－Ｌ１を使用して受容体ブロックアッセイを実施した。
組換えヒトＰＤ－Ｌ１がその受容体ＰＤ－１に結合することに対するＨＬ１２１０－３マウスｍＡｂのブロック効果を評価するために、ＥＬＩＳＡベースの受容体遮断アッセイを採用した。簡単に説明すると、マイクロタイタープレートをＰＢＳ中１μｇ／ｍｌのヒトＰＤ－Ｌ１－Ｆｃタンパク質でコーティングし、１００μｌ／ウェルで４℃で一晩コーティングし、１００μｌ／ウェルの５％ＢＳＡでブロックした。５０μｌのビオチン標識ヒトＰＤ－１－Ｆｃタンパク質および５０μｌで２μｇ／ｍｌから始めてＨＬ１２１０－３抗体を３倍希釈した溶液を各ウェルに添加し、３７℃で１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎで洗浄した後、ストレプトアビジン－ＨＲＰとともに３７℃で１時間インキュベートした。洗浄後、プレートをＴＭＢ基質で成長させ、分光光度計でＯＤ ４５０－６３０ｎｍで分析した。図２に示すように、ＨＬ１２１０－３は、ＩＣ５０＝０．７８３５ｎＭでヒトＰＤ－Ｌ１のヒトＰＤ１への結合を効率的に阻害し得る。
さらに、哺乳類細胞で発現させたヒトＰＤ－Ｌ１を使用して受容体ブロッキングアッセイも実施した。
哺乳類細胞で発現して受容体ＰＤ－１に結合するヒトＰＤ－Ｌ１に対するＨＬ１２１０－３マウスｍＡｂのブロック効果を評価するために、ＦＡＣＳベースの受容体遮断アッセイを使用した。簡単に説明すると、ＰＤＬ１－ＣＨＯＫ１細胞を、最初に、２０μｇ／ｍｌから始めて厳密に３倍希釈したＨＬ１２１０－３マウスｍＡｂとともに、室温で１時間インキュベートした。ＦＡＣＳバッファー（２％ＦＢＳを含むＰＢＳ）で洗浄した後、ビオチン標識ｈｕＰＤ－１を各ウェルに添加し、室温で１時間インキュベートした。次に、ストレプトアビジン－ＰＥを各ウェルに０．５時間添加し、ＦＡＣＳバッファーで２回洗浄した。ＰＥの平均蛍光強度（ＭＦＩ）はＦＡＣＳＡｒｉａＩＩＩによって評価された。図３に示すように、ＨＬ１２１０－３抗体は、哺乳類細胞で発現したＰＤ－Ｌ１へのＰＤ－１の結合を２．５６ｎＭのＩＣ５０で９２．６％の最高阻害率で非常に効率的に阻害し得る。
Figure 0007177543000013
１．３． ＨＬ１２１０－３マウスｍＡｂの効果
ＨＬ１２１０－３マウスｍＡｂがヒトＴ細胞の免疫応答を促進する効果を評価するために、混合リンパ球反応の設定でヒトＴ細胞の応答を評価した。ヒトＤＣは、ＧＭ－ＣＳＦおよびＩＬ－４の存在下で７日間ＣＤ１４＋単球から分化した。次に、別のドナーから単離されたＣＤ４＋ Ｔ細胞を、ＤＣおよび抗ＰＤ－Ｌ１ブロッキング抗体の段階希釈液と共培養した。接種後５日目に、培養上清をＩＦＮγ産生についてアッセイした。結果は、ＨＬ１２１０－３抗体が用量依存的にＩＦＮγ産生を促進し得ることを示し、抗ＰＤ－Ｌ１抗体がヒトＴ細胞応答を促進し得ることを示唆している（図４）。
１．４． ＨＬ１２１０－３マウスｍＡｂの結合親和性
ＨＬ１２１０－３抗体の組換えＰＤ－Ｌ１タンパク質（ヒトＰＤ－Ｌ１－ｈｉｓ ｔａｑ）への結合は、キャプチャー法を使用してＢＩＡＣＯＲＥＴＭで試験された。ＨＬ１２１０－３マウスｍＡｂは、ＣＭ５チップにコーティングされた抗マウスＦｃ抗体を使用して捕捉された。ヒトＰＤ－Ｌ１－ｈｉｓｔａｑタンパク質の段階希釈液を、捕捉した抗体に２５μｇ／ｍｌの流速で３分間注入した。抗原を９００秒間解離させた。すべての実験はＢｉａｃｏｒｅＴ２００で実施された。データ分析は、ＢｉａｃｏｒｅＴ２００評価ソフトウェアを使用して実行された。結果を図５および以下の表６に示す。
Figure 0007177543000014
１．５． ＨＬ１２１０－３マウスｍＡｂのヒト化
ｍＡｂ ＨＬ１２１０－３可変領域遺伝子を使用して、ヒト化ＭＡｂを産生した。このプロセスの最初のステップでは、ＭＡｂ ＨＬ１２１０－３のＶＨおよびＶＫのアミノ酸配列を、利用可能なヒトＩｇ遺伝子（ＩｇＧ１）配列のデータベースと比較して、全体的に最も一致するヒト生殖細胞系Ｉｇ遺伝子配列を見出した。軽鎖の場合、ヒトとの最も近い一致はＯ１８／Ｊｋ２およびＫＶ１－３９＊０１／ＫＪ２＊０４遺伝子であり、重鎖の場合、ヒトとの最も近い一致はＶＨ３－２１遺伝子であった。ＶＨ３－１１、ＶＨ３－２３、ＶＨ３－７＊０１およびＶＨ３－４８遺伝子も、それらの密接な一致のために選択された。
次に、ＨＬ１２１０－３軽鎖のＣＤＲ１（配列番号４）、ＣＤＲ２（配列番号５）およびＣＤＲ３（配列番号６）が、Ｏ１８／Ｊｋ２およびＫＶ１－３９＊０１／ＫＪ２＊０４遺伝子のフレームワーク配列に移植され、かつ、ＨＬ１２１０－３ ＶＨのＣＤＲ１（配列番号１）、ＣＤＲ２（配列番号２）、およびＣＤＲ３（配列番号３）配列が、ＶＨ３－２１、ＶＨ３－１１、ＶＨ３－２３、ＶＨ３－４８またはＶＨ３－７＊０１遺伝子のフレームワーク配列に移植されたヒト化可変ドメイン配列を設計した。次に、３Ｄモデルを生成して、マウスアミノ酸をヒトアミノ酸に置き換えると結合および／またはＣＤＲコンフォメーションに影響を与え得るフレームワークの位置があるかどうかを判断した。軽鎖の場合、フレームワーク内の２２Ｓ、４３Ｓ、６０Ｄ、６３Ｔ、および４２Ｑ（Ｋａｂａｔナンバリング、表７を参照）が特定された。重鎖の場合、フレームワーク内の１Ｅ、３７Ｖ、４０Ｔ、４４Ｓ、４９Ａ、７７Ｎ、９１Ｉ、９４Ｒ、および１０８Ｔが逆変異に関与していた。
Figure 0007177543000015
Figure 0007177543000016
いくつかのヒト化抗体のアミノ酸およびヌクレオチド配列を以下の表８に示す。
Figure 0007177543000017
Figure 0007177543000018
Figure 0007177543000019
Figure 0007177543000020
Figure 0007177543000021
Figure 0007177543000022
Figure 0007177543000023
Figure 0007177543000024
Figure 0007177543000025
Figure 0007177543000026
Figure 0007177543000027
Figure 0007177543000028
Figure 0007177543000029
ヒト化されたＶＨおよびＶＫ遺伝子は合成的に生成され、次にそれぞれヒトガンマ１およびヒトカッパ定常ドメインを含むベクターにクローン化された。ヒトＶＨおよびヒトＶＫのペアリングにより、４０のヒト化抗体が産生された（表９を参照のこと）。
Figure 0007177543000030
Figure 0007177543000031
Figure 0007177543000032
Figure 0007177543000033
１．６． ヒト化ＰＤ－Ｌ１抗体の抗原結合特性
抗原結合活性を評価するために、ヒト化抗体をＥＬＩＳＡ試験にかけた。簡単に説明すると、マイクロタイタープレートをＰＢＳ中０．１μｇ／ｍｌのヒトＰＤ－Ｌ１－Ｆｃタンパク質で、１００μｌ／ウェルで４℃で一晩コーティングし、１００μｌ／ウェルの５％ＢＳＡでブロックした。ヒト化抗体の１０μｇ／ｍｌから始めた５倍希釈液を各ウェルに添加し、室温で１～２時間インキュベートした。プレートをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎで洗浄した後、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）と結合したヤギ抗マウスＩｇＧ抗体とともに室温で１時間インキュベートした。洗浄後、プレートをＴＭＢ基質で成長させ、分光光度計でＯＤ ４５０－６３０ｎｍで分析した。図６Ａ～６Ｅに示されるように、すべてのヒト化抗体は、キメラ抗体と接触しているヒトＰＤ－Ｌ１と同等の結合効果を示す。
抗原結合特性を評価するために、ヒト化抗体を、ＦＡＣＳによって哺乳動物で発現されたＰＤ－Ｌ１への結合について分析した。簡単に説明すると、ＰＤＬ１－ＣＨＯＫ１細胞を、最初に２μｇ／ ｍｌから初めて厳密に５倍希釈したヒト化抗体とともに室温で１時間インキュベートした。ＦＡＣＳバッファー（２％ＦＢＳを含むＰＢＳ）で洗浄した後、ａｌｅｘａ ４８８－抗ヒトＩｇＧ抗体を各ウェルに添加し、室温で１時間インキュベートした。Ａｌｅｘａ４８８のＭＦＩはＦＡＣＳＡｒｉａＩＩＩによって評価された。図７Ａ～７Ｃでは、すべてのヒト化抗体は、哺乳動物細胞で発現されたＰＤ－Ｌ１に高効率で結合し得て、これは、キメラ抗体と同等であった。
ヒト化抗体の結合動態を調べるために、この例ではＯｃｔｅｔ Ｒｅｄ ９６を使用して親和性ランキングを実行した。表１０に示すように、ｈｕ１２１０－３、ｈｕ１２１０－８、ｈｕ１２１０－９、ｈｕ１２１０－１４、ｈｕ１２１０－１７、ｈｕ１２１０－１およびＨｕ１２１０－２２は、キメラ抗体と同等より優れた親和性を示す。
Figure 0007177543000034
組換えＰＤ－Ｌ１タンパク質（ヒトＰＤ－Ｌ１－ｈｉｓ ｔａｑ）へのヒト化抗体の結合は、キャプチャー法を使用してＢＩＡＣＯＲＥＴＭによって試験されました。ＨＬ１２１０－３マウスｍＡｂは、ＣＭ５チップにコーティングされた抗マウスＦｃ抗体を使用して捕捉された。ヒトＰＤ－Ｌ１－ｈｉｓｔａｑタンパク質の段階希釈液を、捕捉した抗体に２５μｇ／ｍｌの流速で３分間注入した。抗原を９００秒間解離させた。すべての実験はＢｉａｃｏｒｅ Ｔ２００で実施された。データ分析は、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００評価ソフトウェアを使用して実行され、以下の表１１に示されている。
Figure 0007177543000035
１．７． 種間活性
ヒト化抗体のｈｕＰＤ－Ｌ１、マウスＰＤ－Ｌ１、ラットＰＤ－Ｌ１、アカゲザルＰＤ－Ｌ１への結合を評価するために、ＥＬＩＳＡ試験のために抗体を実施した。簡単に説明すると、マイクロタイタープレートをヒト、マウス、ラット、アカゲザルのＰＤ－Ｌ１－Ｆｃタンパク質でＰＢＳ中１μｇ／ｍｌ、１００μｌ／ウェルで、４℃で一晩コーティングし、１００μｌ／ウェルの５％ＢＳＡでブロックした。ヒト化抗体の１μｇ／ｍｌから始めて３倍希釈液を各ウェルに添加し、室温で１～２時間インキュベートした。プレートをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎで洗浄した後、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）と結合したヤギ抗マウスＩｇＧ抗体とともに室温で１時間インキュベートした。洗浄後、プレートをＴＭＢ基質で成長させ、分光光度計でＯＤ ４５０－６３０ｎｍで分析した。Ｈｕ１２１０－４１抗体は、アカゲザルＰＤ－Ｌ１に低い親和性で結合し得て、ラットおよびマウスのＰＤ－Ｌ１には結合し得ない（図８および表１２）。
Figure 0007177543000036
ヒト化抗ＰＤ－Ｌ１抗体のヒトＢ７ファミリーおよびその他の免疫チェックポイントへの結合を評価するために、抗体をＥＬＩＳＡによりＢ７－Ｈ１（ＰＤ－Ｌ１）、Ｂ７－ＤＣ、Ｂ７－１、Ｂ７－２、Ｂ７－Ｈ２、ＰＤ－１、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ４、ＩＣＯＳおよびＢＴＬＡへの結合について評価した。図９に示すように、前記Ｈｕ１２１０－４１抗体はＢ７－Ｈ１（ＰＤ－Ｌ１）にのみ特異的に結合し得る。
１．８． ＰＤ－１に対するヒトＰＤ－Ｌ１をブロックするヒト化抗ＰＤ－Ｌ１抗体の活性
細胞ベースの受容体ブロッキングアッセイ
哺乳動物細胞で発現して受容体ＰＤ－１に結合するヒトＰＤ－Ｌ１に対するヒト化抗体の遮断効果を評価するために、ＦＡＣＳベースの受容体遮断アッセイを採用した。簡単に説明すると、ＰＤＬ１－ＣＨＯＫ１細胞を、最初に２０μｇ／ｍｌから始めて厳密に３倍希釈したＨＬ１２１０－３マウスｍＡｂとともに、室温で１時間インキュベートした。ＦＡＣＳバッファー（２％ＦＢＳを含むＰＢＳ）で洗浄した後、ビオチン標識ｈｕＰＤ－１を各ウェルに添加し、室温で１時間インキュベートした。次に、ストレプトアビジン－ＰＥを各ウェルに０．５時間添加し、ＦＡＣＳバッファーで２回洗浄した。ＰＥの平均蛍光強度（ＭＦＩ）はＦＡＣＳＡｒｉａＩＩＩによって評価された。
Figure 0007177543000037
以下の表１３に示すように、Ｈｕ１２１０－３、Ｈｕ１２１０－９、Ｈｕ１２１０－８、Ｈｕ１２１０－１４、Ｈｕ１２１０－１７、Ｈｕ１２１０－１９、およびＨｕ１２１０－２２抗体は、ＰＤ－Ｌ１のＰＤ－１との結合をブロックするキメラ抗体と同等の効果を示す。
Figure 0007177543000038
組換えヒトＰＤ－Ｌ１を使用した受容体ブロッキングアッセイ
ヒトＰＤ－Ｌ１には２つの受容体、すなわちＰＤ－１およびＢ７－１がある。これら２つのタンパク質に対するヒト化ＰＤ－Ｌ１抗体のブロッキング特性を調べるために、ここではタンパク質ベースの受容体ブロッキングアッセイを採用した。簡単に説明すると、マイクロタイタープレートをＰＢＳ中１μｇ／ｍｌのヒトＰＤ－Ｌ１－Ｆｃタンパク質で、１００μｌ／ウェル、４℃で一晩コーティングし、２００μｌ／ウェルの５％ＢＳＡで、３７℃で２時間ブロックした。５０μｌのビオチン標識ヒトＰＤ－１－ＦｃまたはＢ７－１タンパク質、およびＰＤ－Ｌ１抗体の１００ｎＭから始めて５倍希釈液を各ウェルに５０μｌで添加し、３７℃で１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎで洗浄した後、ストレプトアビジン－ＨＲＰとともに３７℃で１時間インキュベートした。洗浄後、プレートをＴＭＢ基質で成長させ、ＯＤ ４５０ｎｍで分光光度計で分析した。図１０および１１に示されるように、Ｈｕ１２１０－４１は、ヒトＰＤ－Ｌ１のヒトＰＤ１およびＢ７－１への結合を効率的に阻害し得る。
１．９． ヒトＴ細胞免疫応答を促進するためのヒト化抗ＰＤ－Ｌ１抗体の活性
混合リンパ球反応アッセイ
ヒト化抗体のｉｎｖｉｔｒｏ機能を評価するために、混合リンパ球反応設定でヒトＴ細胞の応答を評価した。ヒトＤＣは、ＧＭ－ＣＳＦおよびＩＬ－４の存在下で７日間ＣＤ１４＋単球から分化した。次に、別のドナーから単離されたＣＤ４＋ Ｔ細胞を、ＤＣおよび抗ＰＤ－Ｌ１ブロッキング抗体の段階希釈液と共培養した。接種後５日目に、培養上清をＩＬ－２およびＩＦＮγ産生についてアッセイした。結果は、Ｈｕ１２１０－８、Ｈｕ１２１０－９、Ｈｕ１２１０－１６、およびＨｕ１２１０－１７抗体が用量依存的にＩＬ－２およびＩＦＮγ産生を促進し得ることを示し、抗ＰＤ－Ｌ１抗体がヒトＴ細胞応答を促進し得ることを示唆している。
ＣＭＶリコールアッセイ
ヒト化抗体のｉｎｖｉｔｒｏ機能を評価するために、ＣＭＶリコールアッセイでヒトＴ細胞の応答を評価した。ヒトＰＢＭＣは、厳密に希釈したヒト化抗体の存在下で１μｇ／ｍｌＣＭＶ抗原で刺激された。図１２および１３に示すように、Ｈｕ１２１０－４０、Ｈｕ１２１０－４１およびＨｕ１２１０－１７は用量依存的にＩＦＮγ産生を促進し得る。
１．１０． 抗ＰＤ－Ｌ１ｍＡｂによる腫瘍増殖阻害。
ヒト肺腺癌細胞株ＨＣＣ８２７の細胞は、ＮＯＤ ｓｃｉｄ ｇａｍｍａ（ＮＳＧ）マウスに移植される。ＮＳＧマウスは、ＮＯＤ ｓｃｉｄガンマ欠損症であり、最も免疫不全のマウスであるため、ヒト腫瘍細胞およびＰＢＭＣ移植の望ましいレシピエントとなる。移植後１０日で、ヒトＰＢＭＣが担癌マウスに移植される。移植後約２０日で、腫瘍体積が１００～１５０ｍｍ３に達したら、ＰＤ－Ｌ１抗体を５ｍｇ／ｋｇで１日おきにマウスに投与する。腫瘍体積は、抗体投与と併せて隔日でモニターされる。図１４に示すように、Ｈｕ１２１０－３１は５ｍｇ／ｋｇで腫瘍の成長を３０％阻害し得る。Ｈｕ１２１０－４１抗体は用量依存的に腫瘍増殖を阻害し得て、腫瘍重量もまたＨｕ１２１０－４１抗体によって用量依存的に抑制された（図１５）。
１．１１． ヒト化抗体のさらなる変異と最適化のコンピューターシミュレーション
ＣＤＲ領域またはフレームワーク領域内の特定のアミノ酸残基を変更して、抗体の活性および／または安定性をさらに改善または保持し得ると考えられた。変異体は、計算ツール（ＶｅｃｔｏｒＮＴＩ，ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｔｏｏｌｓ／ｍｓａ／ｃｌｕｓｔａｌｏ／で利用可能）を使用して、それらの構造的、コンフォメーション、および機能的特性、および（ＣＤＲ領域内の）兆候を示したものは以下の表にリスト化されている。
Figure 0007177543000039
Figure 0007177543000040
Figure 0007177543000041
１．１２． ＰＤ－Ｌ１エピトープの同定
この研究は、本開示の抗体へのＰＤ－Ｌ１の結合に関与するアミノ酸残基を同定するために実施された。
ＰＤ－Ｌ１のアラニンスキャンライブラリが構築された。簡単に説明すると、ＰＤ－Ｌ１の２１７変異クローンが、ＩｎｔｅｇｒａｌＭｏｌｅｃｕｌａｒのタンパク質エンジニアリングプラットフォームで生成されました。ＰＤ－Ｌ１変異ライブラリーの各変異体へのＨｕ１２１０－４１Ｆａｂの結合は、ハイスループットフローサイトメトリーによって重複して決定された。各生データポイントのバックグラウンド蛍光が差し引かれ、ＰＤ－Ｌ１野生型（ＷＴ）との反応性に対して正規化された。各ＰＤ－Ｌ１変異体について、平均結合値を発現の関数としてプロットした（コントロール抗ＰＤ－Ｌ１ ｍＡｂ反応性）。予備的で重要なクローン（十字の付いた円）を特定するために、コントロールＭＡｂへの＞７０％ＷＴ結合およびＨｕ１２１０－４１ Ｆａｂへの＜３０％ＷＴ反応性の閾値（破線）を適用した（図１６）。ＰＤＬ１のＹ１３４、Ｋ１６２、およびＮ１８３は、Ｈｕ１２１０－４１結合に必要な残基として特定された。Ｎ１８３ＡクローンのＨｕ１２１０－４１Ｆａｂとの反応性が低いことは、それがＨｕ１２１０－４１結合の主要なエネルギー的寄与因子であり、Ｙ１３４およびＫ１６２による寄与が少ないことを示唆している。
重要な残基（球）は、図１７に示されるように、３Ｄ ＰＤ－Ｌ１構造上で同定された。したがって、これらの残基、Ｙ１３４、Ｋ１６２、およびＮ１８３は、本開示の様々な実施形態の抗体への結合に関与するＰＤ－Ｌ１のエピトープを構成する。
Ｙ１３４、Ｋ１６２、およびＮ１８３はすべてＰＤ－Ｌ１タンパク質のＩｇＣドメイン内にあることは興味深い。ＰＤ－１およびＰＤ－Ｌ１の両方の細胞外部分には、ＩｇＶドメインおよびＩｇＣドメインが存在する。ＰＤ－Ｌ１はＩｇＶドメイン間の結合を介してＰＤ－１に結合することが通常に知られている。ただし、このような従来の抗体とは異なり、Ｈｕ１２１０－４１はＩｇＣドメインに結合し、このＩｇＣドメインは、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１結合の阻害には効果がないと予想されていた。Ｈｕ１２１０－４１のこの異なるエピトープは、驚くべきことに、Ｈｕ１２１０－４１の優れた活性に寄与し得る。
１．１３． 抗ＰＤＬ１抗体の抗体工学
実施例１．１３～１．１５は、突然変異誘発を使用して、Ｈｕ１２１０－４１に基づいてさらに改善された抗体を同定することを試みた。
以下の戦略のいずれかを使用して、抗ＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体の抗体工学のために４つのサブライブラリーを構築した。戦略１では、重鎖可変ドメインＶＨ ＣＤＲ３またはＶＬ－ＣＤＲ３の突然変異誘発は、高度にランダムな突然変異によって実行された。戦略２では、（ＶＨ－ＣＤＲ３、ＶＬ－ＣＤＲ３、およびＶＬ－ＣＤＲ１）または（ＶＨ－ＣＤＲ１、ＶＨ－ＣＤＲ２、およびＶＬ－ＣＤＲ２）で構成される２つのＣＤＲ組み合わせライブラリーが、制御された突然変異率でのＣＤＲウォーキングによって生成された。
バイオパニング：ファージパニング法は、過酷な洗浄条件の前にインキュベーション／結合時間を短縮することによって適応された。簡単に説明すると、１００μｌの磁性ストレプトアビジンビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）を１ｍｌのＭＰＢＳで室温で１時間ブロックした。別のチューブで、ライブラリーファージを１ｍｌのＭＰＢＳ中の１００μｌの磁性ストレプトアビジンビーズとプレインキュベートして（各ラウンドで５×１０＾１１～１２）、不要な結合剤を除去した。ファージとビーズとを分離するために、磁石粒子濃縮器が使用された。ビオチン化ＰＤ－Ｌ１タンパク質をファージに添加し、室温で２時間インキュベートし、オーバーヘッドシェーカーを使用して穏やかに混合した。溶液からファージを有するビーズを磁性粒子濃縮器で分離し、上澄みを廃棄した。ビーズを新しい洗浄バッファーで、ＰＢＳＴで１０回、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で１０回洗浄した。ＰＢＳ（Ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ）中の０．８ｍｌ、０．２５％トリプシンを添加し、３７℃で２０分間インキュベートしてファージを溶出させた。出力ファージを滴定し、次のラウンドのパニングのためにレスキューし、抗原濃度をラウンドごとに減少させた。
ＥＬＩＳＡスクリーニングとオン／オフ率ランキング
クローンを選択し、望ましいパニング出力から誘導した。一次スクリーニングのためにファージＥＬＩＳＡを実施した。陽性クローンは配列決定により分析された。特有のホットスポットが見つかった。表１５に特定された変異を示す。以下に示すように、前記ＣＤＲＨ３のＦＧＫ残基は、改良された抗体を生成するホットポット残基である。
Figure 0007177543000042
Figure 0007177543000043
これらの抗体の可変領域のアミノ酸配列を以下の表１６に示す。
Figure 0007177543000044
Figure 0007177543000045
Figure 0007177543000046
１．１４． ＰＤ－Ｌ１抗体の抗原結合特性
表１５および表１６に示すように、合計９つの固有のクローンが特徴づけられ、完全長ＩｇＧに変換された。
組換えヒトＰＤ－Ｌ１への結合特性
抗原結合活性を評価するために、抗体をＥＬＩＳＡ試験にかけた。簡単に説明すると、マイクロタイタープレートをＰＢＳ中２μｇ／ｍｌのヒトＰＤ－Ｌ１－Ｆｃタンパク質で、１００μｌ／ウェル、４℃で一晩コーティングし、１００μｌ／ウェルの５％ＢＳＡでブロックした。ヒト化抗体の１０μｇ／ｍｌから始めて４倍希釈液を各ウェルに添加し、室温で１～２時間インキュベートした。プレートをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎで洗浄した後、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）と結合したヤギ抗マウスＩｇＧ抗体と室温で１時間インキュベートした。洗浄後、プレートをＴＭＢ基質で成長させ、分光光度計でＯＤ ４５０～６３０ｎｍで分析した。図１８に示すように、すべてのヒト化抗体は、ヒトＰＤ－Ｌ１に対して優れた結合効果を示し、Ｂ６およびＣ３は親クローンＷＴよりも良好に機能した。
哺乳類で発現したヒトＰＤ－Ｌ１への結合特性
抗原結合特性を評価するために、ＦＡＣＳによって哺乳動物で発現されたＰＤ－Ｌ１への結合について抗体を分析した。簡単に説明すると、ＰＤＬ１－Ｒａｊｉ細胞を、最初に２μｇ／ｍｌから始めて厳密に５倍希釈されたヒト化抗体とともに室温で１時間インキュベートした。ＦＡＣＳバッファー（２％ＦＢＳを含むＰＢＳ）で洗浄した後、Ａｌｅｘａ ４８８－抗ヒトＩｇＧ抗体を各ウェルに添加し、室温で１時間インキュベートした。Ａｌｅｘａ４８８のＭＦＩはＦＡＣＳＡｒｉａＩＩＩによって評価された。図１９に示されるように、Ｂ６は哺乳類細胞で発現したＰＤ－Ｌ１に非常に効率的に結合し、これは親抗体ＷＴよりも強力であった。
Ｂｉａｃｏｒｅによるヒト化抗体の親和性ランキング
ヒト化抗体の結合動態を調べるために、この例ではＢｉａｃｏｒｅを使用して親和性ランキングを実行した。表１７に示すように、Ｂ６、Ｃ３、Ｃ６、Ａ１、およびＡ３は、親抗体ＷＴよりも優れた親和性を示した。
Figure 0007177543000047
１．１５． 抗ＰＤＬ１抗体の細胞ベースの機能
Ｔ細胞応答を刺激する抗ＰＤＬ１抗体の能力を試験するために、ｈＰＤ－１発現ジャーカット細胞を使用した。簡単に言えば、ＪｕｒｋａｔはＴＣＲ刺激時にＩＬ２を産生し得るヒトＴ細胞白血病細胞株である。このアッセイでは、レンチウイルスによってヒトＰＤ－１遺伝子をトランスフェクトされたＪｕｒｋａｔ細胞をレスポンダー細胞として使用した。Ｒａｊｉ－ＰＤＬ１細胞を抗原提示細胞（ＡＰＣ）として使用した。ブドウ球菌エンテロトキシン（ＳＥ）は、ＴＣＲシグナルを刺激するために使用される。このシステムでは、異所的に発現したｈｕＰＤＬ１は、Ｊｕｒｋａｔ細胞によるＳＥ刺激によるＩＬ－２産生を抑制し得て、抗ＰＤＬ１抗体はＩＬ－２産生を逆転させ得る。要するに、ＡＰＣ（２．５×１０４）は、ＳＥ刺激の存在下でＰＤ－１発現Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞（１×１０５）と共培養された。培養開始時に抗ＰＤＬ１抗体（１００ｎＭから開始し、１：４を８回段階希釈）を添加した。４８時間後、培養上清をＥＬＩＳＡによってＩＬ２産生について評価した。図２０に示すように、Ｂ６モノクローナル抗体は親抗体ＷＴよりも強力であった。
実施例２．抗ＬＡＧ３モノクローナル抗体の調製
２．１． ＬＡＧ－３に対する完全ヒトモノクローナル抗体のスクリーニング
抗ＬＡＧ３ヒトモノクローナル抗体（α－ＬＡＧ－３ｍＡｂ）は、完全ヒトＦａｂファージディスプレイライブラリーをスクリーニングすることによって産生された。野生型ＬＡＧ－３－ＥＣＤ－ｈｕＦｃフラグメントはダウディ細胞に結合し得るが、Ｄ１－Ｄ２トランケートされたＬＡＧ－３－ＥＣＤ－ｈｕＦｃフラグメントはダウディ細胞に結合し得ない（図２１）。したがって、Ｄ１－Ｄ２ドメインはＬＡＧ－３機能にとって重要である。
ファージディスプレイライブラリーパニング用の抗原。ＬＡＧ－３は、免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリーに属するシングルパスＩ型膜タンパク質であり、ドメイン（Ｄ）１、Ｄ２、Ｄ３、およびＤ４の４つの細胞外Ｉｇ様ドメイン（ＥＣＤ）を含む。組換えヒトＬＡＧ－３－ＥＣＤ－ヒトＩｇＧ１（ＬＡＧ－３－ｈｕＦｃ）融合タンパク質またはヒトＤ１－Ｄ２トランケートＬＡＧ－３－ＥＣＤ－ヒトＩｇＧ１（ΔＤ１Ｄ２－ＬＡＧ－３－ｈｕＦｃ）融合タンパク質を ２９３Ｔ細胞システムで発現させた。
ファージライブラリー。哺乳類のＩｇ遺伝子セグメントは、可変（Ｖ）、多様性（Ｄ）、結合（Ｊ）、および定数（Ｃ）のエクソンのグループに配置されている。ヒトＦａｂファージライブラリーは、以下からなるファージベクターを使用して解釈された：１）すべてのヒト可変カッパ（ＶＫ）レパートリー；２）健康なヒト被験者からの遺伝的にランダム化されたＣＤＲ３領域を伴う、それぞれＶＨ３－２３およびＶＨ１－６９生殖細胞系遺伝子のＶＨ。
抗原のスクリーニングと生成。Ｄ１－Ｄ２ドメイン特異的ファージ結合剤を選択するために、ファージライブラリーを抗原ベースのパニングにかけた。
Ｉ）ＬＡＧ－３に対するファージライブラリー溶液のパニング。
２９３Ｆ細胞に、Ｎ末端にＦＬＡＧタグが付いたＤ１－Ｄ２欠失ＬＡＧ－３（△Ｄ１Ｄ２－ＬＡＧ－３）配列を含むプラスミドをトランスフェクトした。トランスフェクトの３日後、△Ｄ１Ｄ２－ＬＡＧ－３２９３Ｆ細胞をファージライブラリーのスクリーニングに使用した。ファージライブラリーを順次ネガティブスクリーニングを行った：ストレプトアビジンビーズ、△Ｄ１Ｄ２－ＬＡＧ－３トランスフェクト２９３Ｆ細胞およびビオチン標識ヒトＩｇＧ１Ｆｃタンパク質。次に、得られたライブラリーを、ビオチン化ＬＡＧ－３－ｈｕＦｃ ＬＡＧ－３と２時間、運動させながらインキュベートした後、１００μＬのカゼインブロックストレプトアビジン－磁気ビーズと１５分間インキュベートした。ＰＢＳで５～２０回洗浄することにより、結合していないファージを除去した。次に、結合したファージを、新たに調製した１００ｍＭトリエチルアミン（ＴＥＡ）で溶出し、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌバッファーを添加して中和した。得られたファージは、アウトプット－１ファージライブラリーとして標識された。アウトプット－１ファージライブラリーを上記と同じスクリーニングに供して、アウトプット－２およびその後のアウトプット－３ファージライブラリーを生成した。合計３回のファージライブラリースクリーニングを実施した。
ＩＩ）ＬＡＧ－３に対するファージライブラリー免疫管パニング
ファージライブラリーを使用して、カゼインでコーティングされた免疫管、△Ｄ１Ｄ２－ＬＡＧ－３でトランスフェクトされた２９３Ｆ細胞およびヒトＩｇＧ１Ｆｃタンパク質の連続的なネガティブスクリーニングを実施した。次に、得られたライブラリーを、ＬＡＧ３－ｈｕＦｃでコーティングされたイムノチューブ内で２時間動かしながらインキュベートした。ＰＢＳＴで５～２０回洗浄することにより、結合していないファージを除去した。 細胞ベースのパニングと同様に、合計３ラウンドのファージライブラリースクリーニングを実施した。
アウトプット－３ファージライブラリーを希釈し、プレートして３７℃で８時間増殖させ、抗カッパ抗体でコーティングしたフィルターで２２℃で一晩捕捉した。ビオチン化ＬＡＧ－３－ｈｕＦｃ（５０ｎＭ）およびＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎ－ＡＰコンジュゲートをフィルターに適用して、抗原結合抗ＬＡＧ３ファージを検出した。陽性のファージプラークを拾い上げ、１００μＬのファージ溶出バッファーに溶出した。次に、約１０～１５μＬの溶出ファージを使用して１ｍＬのＸＬ１－Ｂｌｕｅコンピテントセルに感染させ、ファージシングルポイントＥＬＩＳＡ（ＳＰＥ）用の高力価（ＨＴ）ファージ（５０ｎＭの試験済みの各タンパク質でコーティングされたＥＬＩＳＡ固定化基質）を産生した。各ファージヒットの１×１０１０プラーク形成ユニット（ｐｆｕｓ）をＳＰＥ確認に使用した。次に、フィルターリフトから選択された陽性クローンを、ＬＡＧ－３－ｈｕＦｃおよびΔＤ１Ｄ２－ＬＡＧ－３－ｈｕＦｃとのＬＡＧ－３抗原結合について試験した。Ｄ１－Ｄ２特異的結合剤は、ＰＣＲによって抗原陽性ファージから増幅され、配列決定された。Ｉｇ軽鎖Ｖ遺伝子（ＶＬ）とＶＨ配列を分析して、固有の配列を特定し、配列の多様性を決定した。
すべてのヒットのＶＬおよびＶＨ遺伝子配列を発現ベクターｐＦＵＳＥ２ｓｓ－ＣＬＩｇ－ｈｋ（軽鎖、ＩｎｖｉｖｏＧｅｎカタログ番号ｐｆｕｓｅ２ｓｓ－ｈｃｌｋ）およびｐＦＵＳＥｓｓ－ＣＨＩｇ－ｈＧ１（重鎖、ＩｎｖｉｖｏＧｅｎカタログ番号ｐｆｕｓｅｓｓ－ｈｃｈｇ１）にクローニングした。抗体はＨＥＫ２９３細胞で発現され、プロテインＡＰＬＵＳ－アガロースを使用して精製された。抗体の配列およびそのＣＤＲ領域を以下の表に示す。
Figure 0007177543000048
Figure 0007177543000049
Figure 0007177543000050
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Figure 0007177543000067
Figure 0007177543000068
２．２． 様々な種に由来するＬＡＧ３タンパク質へのヒト抗ＬＡＧ３抗体の結合。
ヒト、ラット、およびマウスのＬＡＧ３に結合する抗ＬＡＧ－３抗体の能力を評価するために、実施例２．１で同定された抗体を、ＥＬＩＳＡを介してそれらの結合特性について評価した。ヒト、ラット、マウスのＬＡＧ３ ＥＣＤ－Ｆｃタンパク質を、１００μｌ／ウェルで１μｇ／ｍｌでＥＬＩＳＡプレートにコーティングした。実施例１からの抗体は、ＥＬＩＳＡ希釈緩衝液で段階的に希釈された。次に、結合を評価するために、さまざまな濃度のＬＡＧ－３抗体（１０μｇ／ｍｌ、３．３３３μｇ／ｍｌ、１．１１１μｇ／ｍｌ、０．３７０μｇ／ｍｌ、０．１２３μｇ／ｍｌ、０．０４１μｇ／ｍｌ、０．０１４μｇ／ｍｌ、０．００５μｇ／ｍｌ、０．００１５μｇ／ｍｌ、および０．０００５μｇ／ｍｌ）をＬＡＧ３抗原コーティングプレートに１．５時間室温で添加した。得られたプレートを洗浄し、抗ヒトＩｇＧ（Ｆａｂ）－ＨＲＰ抗体で標識した。Ｓ３１はヒトＬＡＧ３にのみ結合し得る。Ｓ２７およびＴ９９は、ヒトＬＡＧ３およびラット／マウスＬＡＧ３に低い効力で結合し得る。Ｓ１１９抗体は、ヒト、ラット、およびマウスのＬＡＧ３に高い効力で結合し得る（図２２Ａ～２２Ｄ）。
２．３． 活性化されたヒト初代ＣＤ４＋ Ｔ細胞上の細胞表面ＬＡＧ－３抗原へのヒト抗ＬＡＧ３抗体の結合。
ＬＡＧ－３は、活性化または枯渇したＴ細胞に発現する。ＣＤ４＋ Ｔ細胞は、ＣＤ４磁気ビーズを使用して分離された。精製したヒトＣＤ４＋ Ｔ細胞をＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）ＨｕｍａｎＴ－ＡｃｔｉｖａｔｏｒＣＤ３／ＣＤ２８で７２時間刺激した。実施例２．１の抗体をＦＡＣＳ緩衝液で段階希釈した。次に、結合を評価するために、さまざまな濃度のＬＡＧ－３抗体（１０μｇ／ｍｌ、３．３３３μｇ／ｍｌ、１．１１１μｇ／ｍｌ、０．３７０μｇ／ｍｌ、０．１２３μｇ／ｍｌ、０．０４１μｇ／ｍｌ、０．０１４μｇ／ｍｌおよび０．００５μｇ／ｍｌ）を、マウス抗ヒトＬＡＧ３ ＰＥ抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、クローン：３ＤＳ２２３Ｈ）の存在下で、活性化されたヒトＣＤ４Ｔ細胞に氷上で３０分間添加した。標識した細胞をＦＡＣＳバッファーで洗浄した後、氷上で３０分間ＡＰＣ標識抗ヒトＩｇＧ抗体で標識した。得られた細胞をＦＡＣＳバッファーで１回洗浄した。標識された細胞は、ＢＤＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒＴＭでのフローサイトメトリーによって蛍光強度について評価された。図２３に示すように、前記Ｓ２７、Ｓ３１、Ｔ９９およびＳ１１９抗体は、活性化されたヒトＣＤ４＋ Ｔ細胞に発現するＬＡＧ３に用量依存的に結合し得る。
２．４． ＭＨＣクラスＩＩ受容体に結合する可溶性ＬＡＧ－３（ｓＬＡＧ）の抗ＬＡＧ－３抗体阻害
ｓＬＡＧ－３のＭＨＣクラスＩＩ受容体への結合をブロックする抗ＬＡＧ－３抗体の能力を評価するために、ビオチン標識ＬＡＧ－３－ＥＣＤ－ｈｕＦｃ融合タンパク質とＭＨＣクラスＩＩ受容体を発現するＲａｊｉ細胞を使用してｉｎｖｉｔｒｏ結合アッセイを設計した。実施例１の抗体を、ＦＡＣＳ緩衝液で２０μｇ／ｍＬから段階希釈し、６μｇ／ｍＬのビオチン－ＬＡＧ－３－ＥＣＤ－ｈｕＦｃｃと共に室温で３０分間プレインキュベートした。次に、抗体混合物をＦｃＲでブロックされたＲａｊｉ細胞に添加し、氷上で３０分間インキュベートした。次に、細胞をＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、続いて氷上でストレプトアビジンＰＥで３０分間染色し、続いてＦＡＣＳ緩衝液で１回洗浄した。標識された細胞を、ＢＤＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒＴＭでのフローサイトメトリーによって蛍光強度について評価した。図２４に示されるように、前記Ｓ２７、Ｓ３１、Ｓ１１９およびＴ９９抗体は、ＬＡＧ３のその受容体ＭＨＣクラスＩＩ分子への結合を用量依存的に阻害し得る。
２．５．抗ＬＡＧ－３抗体による末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）でのＩＬ－２産生の刺激
ブドウ球菌エンテロトキシンＢ（ＳＥＢ）は、ＭＨＣクラスＩＩ抗原とＴ細胞受容体（ＴＣＲ）に同時に結合し、Ｔ細胞の増殖とサイトカイン産生を誘導するようにそれらを結合するスーパー抗原である。２０μｇ／ｍｌから始めて６回１：３の段階希釈をした、様々な濃度における実施例１からの抗体の存在下で、２×１０５のＰＢＭＣをＳＥＢで刺激した。３日後、培養上清中のＩＬ－２濃度をＥＬＩＳＡによって評価した。図２５に示すように、ＰＤ－１抗体と同様に、抗ＬＡＧ３抗体（Ｓ２４、Ｓ２７、Ｓ３１、Ｓ８７、Ｓ１１９、Ｔ９９、およびＳ２０）は、ＳＥＢ刺激のみと比較して用量依存的にＩＬ－２産生を増強し得る。
２．６． 抗ＬＡＧ－３抗体の使用による、エフェクターＴ細胞（Ｔｅｆｆｓ）に対する制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇｓ）の阻害の逆転。
ＬＡＧ－３はＴｒｅｇ（ＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉ）で高度に発現し、それらの抑制機能を仲介する（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １８４：６５４５－５１，２０１０）。エフェクターＴ細胞（ＣＤ４＋ＣＤ２５－ＣＤ１２７ｈｉ）に対するＴｒｅｇの抑制効果を逆転させる抗ＬＡＧ－３抗体の能力を評価するために、実施例１の抗体をインビトロ抑制アッセイで使用した。まず、ＢＤ ＦＡＣＳＡｒｉａ ＩＩシステムを使用してＴｒｅｇ（ＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉＣＤ１２７ｌｏｗ）とＴｅｆｆｓ（ＣＤ４＋ＣＤ２５ＣＤ１２７ｈｉ）をＦＡＣＳソートした。次に、Ｔｅｆｆをカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）で標識し、プレート結合抗ＣＤ３抗体およびマイトマイシンＣ処理抗原提示細胞の存在下で１：１の比率でＴｒｅｇと共培養した。次に、抗ＬＡＧ－３抗体を細胞培養に添加し、５日後にＴｅｆｆｓ細胞の増殖を試験しました。
図２６の結果は、ＴｒｅｇをエフェクターＴ細胞と共培養すると、エフェクターＴ細胞の増殖およびサイトカイン産生が阻害されたことを示している。Ｓ１１９およびＴ９９は、ＴｒｅｇによるＴｅｆｆの阻害を逆転させ得る。
２．７． ＬＡＧ－３抗体ＢＩＡＣＯＲＥ分析
Ｓ２０、Ｓ２４、Ｓ２７、Ｓ３１、Ｓ８７、Ｓ１１９、Ｓ１２０、Ｓ１２８、Ｓ１３６、Ｓ１６１、およびＴ９９抗体の組換えｈｉｓタグヒトＬＡＧ３－ＥＣＤタンパク質への結合を、キャプチャー法を使用してＢｉａｃｏｒｅ Ｔ２００で調べた。抗ＬＡＧ３抗体は、抗ヒトＦｃ抗体を使用して捕捉された。抗ヒトＦｃ抗体をチップ上にコーティングした。連続濃度のｈｉｓタグヒトＬＡＧ３－ＥＣＤタンパク質（０～４ｎＭ）を、キャプチャー抗体に３０μｌ／分の流速で注入した。解離段階は９００秒または５５０秒であった。結果を以下の表２２に示す。抗ＬＡＧ３抗体のＢｉａｃｏｒｅの結果は、これらの抗ＬＡＧ３抗体がヒトＬＡＧ３に対する高親和性結合剤であることを示している。
Figure 0007177543000069
２．８． ヒトＬＡＧ３に対するマウスモノクローナル抗体の産生
この例は、ハイブリドーマ技術を使用して抗ヒトＬＡＧ３マウスモノクローナル抗体がどのように産生されたかを示している。
抗原：組換えヒトＬＡＧ－３融合タンパク質を免疫原として使用して、抗ヒトＬＡＧ－３抗体を産生させた。マウス免疫グロブリンＦｃドメイン（Ｄ１－Ｄ４ｍＦｃ）に融合したヒトＬＡＧ－３の細胞外領域全体（ドメイン１～４）を含む融合タンパク質を免疫原として使用した。ＥＬＩＳＡ結合試験では、細胞外領域全体（ドメイン１～４）、またはヒトＬＡＧ－３のＤ１－Ｄ２ドメインを含まない細胞外領域を含む融合タンパク質はヒト免疫グロブリンＦｃドメイン（それぞれＤ１－Ｄ４ｈｕＦｃまたは△Ｄ１－Ｄ２ｈｕＦｃ）に融合した。前記ＬＡＧ－３融合タンパク質は、標準的な組換えＤＮＡ技術を使用して調製した。
免疫付与：
ＬＡＧ－３融合タンパク質は、標準的な組換えＤＮＡ技術を使用して調製した。マウスを腹腔内（ＩＰ）および／または皮下（ＳＣ）で免疫化した。マウスは最初に５０ｍｇの免疫原をＳＣ免疫化し、次に２５μｇの免疫原で隔週でＩＰ免疫化した。免疫応答は、眼窩後出血によってモニターされた。血漿は、ＥＬＩＳＡおよび細胞ベースの受容体ブロッキングアッセイ（以下に記載）によってスクリーニングされた。十分な力価の抗ＬＡＧ－３Ｄ１－Ｄ２ドメイン免疫グロブリンおよび機能的ＬＡＧ３ブロッカーを有するマウスを融合に使用した。脾臓を犠牲にして除去する前に、マウスを２５μｇの抗原で腹腔内に追加免疫し、続いて２５μｇの抗原で追加免疫した。脾臓を融合に使用した。ハイブリドーマ上清を、抗ＬＡＧ－３ Ｄ１－Ｄ２ドメイン結合、および細胞ベースの受容体遮断アッセイによってその受容体へのＬＡＧ３の結合を遮断するその機能について試験した。
抗ＬＡＧ３遮断抗体を産生するマウスの選択。
抗ＬＡＧ３遮断抗体を産生するマウスを選択するために、免疫化されたマウスからの血清を、ＥＬＩＳＡによってＤ１－Ｄ２ドメインへの結合について試験した。簡単に説明すると、血清のＤ１－Ｄ４ ｈｕＦｃへの結合を評価し、△Ｄ１－Ｄ２ｈｕＦｃへの結合をカウンタースクリーンとして使用した。端的には、Ｄ１－Ｄ４ｈｕＦｃまたは△Ｄ１－Ｄ２ｈｕＦｃを０．５μｇ／ｍｌで一晩コーティングし、ＰＢＳ中の５％ＢＳＡでブロックした。連続希釈した血清を、コーティングされた抗原とともに室温で１時間インキュベートした。得られたプレートをＰＢＳ／Ｔで洗浄し、ヤギ抗マウスＩｇＧ－ＨＲＰとともに室温で１時間インキュベートした。プレートをＴＭＢ基質で成長させ、ＯＤ ４５０～６３０ｎｍで分光光度計によって分析した。並行して、実施例２．４に記載されているように、血清を、Ｒａｊｉ細胞上に発現されたＭＨＣＩＩ分子へのＬＡＧ３の結合を遮断するそれらの機能について評価した。ＬＡＧ３ Ｄ１－Ｄ２ドメインに特異的で、ＬＡＧ３のＲａｊｉ細胞への結合をブロックする機能を有する高力価のマウスを、融合およびさらなるスクリーニングのために選択した。
ハイブリドーマクローン１２２Ｈ、１４７Ｈおよび１７０Ｈは、さらなる分析および配列決定のために選択された。
２．９． 抗ＬＡＧ３マウスモノクローナル抗体の結合特性
この実施例では、ＬＡＧ３タンパク質に対する抗ＬＡＧ３マウス抗体の結合特性を試験した。
Ｄ１－Ｄ２固有の結合剤：
結合特異性を評価するために、精製された１２２Ｈ、１４７Ｈ、および１７０Ｈマウスモノクローナル抗体を、Ｄ１－Ｄ４ｈｕＦｃおよび△Ｄ１－Ｄ２ｈｕＦｃ抗原のＥＬＩＳＡ結合試験に供した。簡単に説明すると、Ｄ１－Ｄ４ｈｕＦｃまたは△Ｄ１－Ｄ２ｈｕＦｃを０．５μｇ／ｍｌで一晩コーティングし、ＰＢＳ中の５％ＢＳＡでブロックした。連続希釈した抗体（１μｇ／ｍｌから開始し１：３の１０回の段階希釈）を、コーティングした抗原とともに室温で１時間インキュベートした。得られたプレートをＰＢＳ／Ｔで洗浄し、ヤギ抗マウスＩｇＧ－ＨＲＰとともに室温で１時間インキュベートした。プレートをＴＭＢ基質で成長させ、ＯＤ ４５０～６３０ｎｍで分光光度計によって分析された。
ＥＬＩＳＡの結果を図２７Ａ～２７Ｃに要約し、これにより、ＬＡＧ３の完全な細胞外ドメイン（Ｄ１－Ｄ４ ｈｕＦｃ）に強い結合を示すが、ＬＡＧ３が削除されたＤ１－Ｄ２（△Ｄ１－Ｄ２ｈｕＦｃ）には強く結合しないことから、１２２Ｈ、１４７Ｈ、および１７０Ｈが、ヒトＬＡＧ３のＤ１およびＤ２ドメインに対する強力かつ選択的な結合剤であることを確認した。
２．１０． 抗ＬＡＧ３マウスモノクローナル抗体の機能特性
ＬＡＧ３のその受容体への結合のブロック
ｓＬＡＧ－３のＭＨＣクラスＩＩ受容体への結合をブロックする抗ＬＡＧ－３抗体の能力を評価するために、ビオチン標識ＬＡＧ－３－ＥＣＤ－ｈｕＦｃ融合タンパク質とＭＨＣクラスＩＩ受容体を発現するＲａｊｉ細胞を使用してｉｎｖｉｔｒｏ結合アッセイを設計した。１２２Ｈ、１４７Ｈ、および１７０Ｈマウスモノクローナル抗体をＦＡＣＳバッファーで２０μｇ／ ｍＬから段階希釈し（１：５で６回）、６μｇ／ｍＬのビオチン－ＬＡＧ－３－ＥＣＤ－ｈｕＦｃとともに室温で３０分間プレインキュベートした。次に、抗体混合物をＦｃＲでブロックされたＲａｊｉ細胞に添加し、氷上で３０分間インキュベートした。次に、細胞をＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、続いて氷上でストレプトアビジンＰＥで３０分間染色し、続いてＦＡＣＳ緩衝液で１回洗浄した。標識された細胞は、ＢＤ ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒTMでのフローサイトメトリーによって蛍光強度について評価された。図２８Ａ～２８Ｃに示されるように、前記１２２Ｈ、１４７Ｈおよび１７０Ｈ抗体は、ＬＡＧ３のその受容体ＭＨＣクラスＩＩ分子への結合を用量依存的に阻害し得る。
抗ＬＡＧ３抗体によるヒトＴ細胞応答の刺激
刺激されたＴ細胞応答に対する抗ＬＡＧ３抗体の能力を試験するために、ＪｕｒｋａｔＴ細胞刺激アッセイが使用された。Ｊｕｒｋａｔは、ＴＣＲ刺激によりＩＬ２を産生し得るヒトＴ細胞白血病細胞株である。このアッセイでは、レンチウイルスによってヒトＬＡＧ３遺伝子をトランスフェクトされたＪｕｒｋａｔ細胞をレスポンダー細胞として使用した。ＭＨＣＩＩを発現したＲａｊｉ細胞を抗原提示細胞（ＡＰＣ）として使用した。ブドウ球菌エンテロトキシン（ＳＥ）はスーパー抗原であり、ＭＨＣＩＩ分子とＴ細胞受容体ベータ（ＴＣＲＶβ）とを架橋し、Ｔ細胞応答を刺激し得る。このアッセイでは、ＳＥを刺激剤として使用した。このシステムでは、異所的に発現したｈｕＬＡＧ３は、Ｊｕｒｋａｔ細胞によるＳＥ刺激によるＩＬ－２産生を抑制し得て、抗ＬＡＧ３抗体はＩＬ－２産生を逆転させ得る。要するに、ＡＰＣ（２．５×１０４）は、ＳＥ刺激の存在下で、ＬＡＧ３発現ジャーカットＴ細胞（１×１０５）と共培養された。培養開始時に抗ＬＡＧ３抗体（２０μｇ／ｍｌから開始し、１：５で６回段階希釈）を添加した。４８時間後、培養上清をＥＬＩＳＡによってＩＬ２産生について評価した。図２９に示すように、１２２Ｈ、１４７Ｈ、および１７０Ｈマウスモノクローナル抗体は、Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞によるＩＬ２産生を用量依存的に促進し得て、Ｔ細胞へのＬＡＧ３シグナルを抑制することによってＴＣＲ刺激を刺激し得ることを示唆している。
２．１１． １４７ＨマウスｍＡｂヒト化設計
前記ｍＡｂ １４７Ｈ可変領域遺伝子を使用して、ヒト化ｍＡｂを産生した。このプロセスの最初の工程では、ｍＡｂ １４７ＨのＶＨおよびＶκのアミノ酸配列を、利用可能なヒトＩｇ遺伝子配列のデータベースと比較して、全体的に最も一致するヒト生殖細胞系Ｉｇ遺伝子配列を探した。軽鎖の場合、最も近いヒトの一致はＡ１９／ＪＫ４遺伝子であり、重鎖の場合、ヒトとの最も近い一致はＶＨ１－ｆ／ＪＨ６遺伝子であった。次に、ヒト化可変ドメイン配列を設計し、１４７Ｈ軽鎖のＣＤＲ１（配列番号２４３）、ＣＤＲ２（配列番号２４４）およびＣＤＲ３（配列番号２４５）をＡ１９／ＪＫ４遺伝子のフレームワーク配列に移植し、１４７Ｈ ＶＨのＣＤＲ１（配列番号２４０）、ＣＤＲ２（配列番号２４１）、およびＣＤＲ３（配列番号２４２）配列を、ＶＨ１－ｆ／ＪＨ６遺伝子のフレームワーク配列に移植した。次に、３Ｄモデルを生成して、マウスアミノ酸をヒトアミノ酸に置き換えると結合および／またはＣＤＲコンフォメーションに影響を与え得るフレームワークの位置があるかどうかを判断した。重鎖の場合、ヒトフレームワークのＲ７１、Ｍ６９、Ｒ６６、Ｖ６７、Ｍ４８、Ｖ３７、Ｒ３８、Ｙ９１、およびＱ１（Ｋａｂａｔナンバリング）が特定され、マウスの対応するアミノ酸、すなわちＲ７１Ａ、 Ｍ６９Ｌ、Ｒ６６Ｋ、Ｖ６７Ａ、Ｍ４８Ｉ、Ｖ３７Ｉ、Ｒ３８Ｋ、Ｙ９１ＦおよびＱ１Ｅへの逆変異を受けた。
Figure 0007177543000070
ヒト化抗体のアミノ酸配列が記載されている：１４７Ｈ－１、１４７Ｈ－２、１４７Ｈ－３、１４７Ｈ－４、１４７Ｈ－５、１４７Ｈ－６、１４７Ｈ－７、１４７Ｈ－８、１４７Ｈ－９、１４７Ｈ－１０、１４７Ｈ－１１、１４７Ｈ－１２、１４７Ｈ－１３、および１４７Ｈ－１４は、それぞれ異なる重鎖を有するが、すべて共通の軽鎖を共有している。
Figure 0007177543000071
Figure 0007177543000072
ヒト化されたＶＨおよびＶＫ遺伝子は合成的に産生され、次にそれぞれヒトガンマ１およびヒトカッパ定常ドメインを含むベクターにクローン化された。ヒトＶＨおよびヒトＶＫのペアリングにより、４０のヒト化抗体を産生した。
２．１２． 抗ＬＡＧ３ １４７Ｈヒト化モノクローナル抗体の結合特性
Ｏｃｔｅｔ（登録商標）ＲＥＤ９６システムによるヒト化抗体の親和性ランキング
ヒト化抗体の結合動態を調べるために、この例ではＯｃｔｅｔ Ｒｅｄ ９６を使用して親和性ランキングを実行した。以下の表２５に示すように、１４７Ｈ、１４７Ｈ－６、１４７Ｈ－７、１４７Ｈ－１３、および１４７Ｈ－１４はより優れた親和性を示す。
Figure 0007177543000073
Ｏｃｔｅｔ（登録商標）ＲＥＤ９６システムによるヒト化抗体の完全な動的親和性
ヒト化抗体の結合動態を調べるために、この例では、Ｏｃｔｅｔ Ｒｅｄ ９６を使用してさまざまな用量の抗原（５０ｎＭ、２５ｎＭ、１２．５ｎＭ、６．１５ｎＭ、３．１２５ｎＭ）を実行することにより、完全な動態親和性試験をさらに実行した。Ｏｃｔｅｔ（登録商標）ＲＥＤ９６システムのソフトウェアによって計算された。表２６に示すように、１４７Ｈ－６、１４７Ｈ－７、１４７Ｈ－１３、および１４７Ｈ－１４は、１４７Ｈキメラ抗体と同等の親和性を示した。
Figure 0007177543000074
２．１３． 抗ＬＡＧ３マウスモノクローナル抗体の機能特性
抗ＬＡＧ３抗体によるヒトＴ細胞応答の刺激
刺激されたＴ細胞応答に対する抗ＬＡＧ３抗体の能力を試験するために、実施例１２に記載されるように、Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞刺激アッセイを使用した。培養開始時に、抗ＬＡＧ３抗体（３０μｇ／ｍｌから開始し、１：３を６回段階希釈）を添加した。４８時間後、培養上清をＥＬＩＳＡによってＩＬ２産生について評価した。図３０に示すように、１４７Ｈ－１３ヒト化モノクローナル抗体は、Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞によるＩＬ２産生を用量依存的に促進し得て、Ｔ細胞へのＬＡＧ３シグナルを抑制することによってＴＣＲ刺激を刺激し得ることを示唆している。
２．１４． 抗ＬＡＧ３１４７Ｈヒト化モノクローナル抗体の親和性成熟
抗原結合親和性を改善するために、この例では、ファージディスプレイ技術を使用して１４７Ｈ４－１３の親和性成熟を実行した。戦略１：１４７Ｈ－１３のＣＤＲＨ３およびＣＤＲＬ３は、コドンベースの突然変異誘発の対象であった。ＣＤＲＨ３およびＣＤＲＬ３は、それぞれＨ９５－Ｈ１０２とＬ８９－Ｌ９７（Ｋａｂａｔナンバリング）の位置でランダム化された。戦略２：各ＣＤＲは、ＣＤＲウォーキングアプローチを使用した単一コドンベースの突然変異誘発の対象となった。次に、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＬ１がライブラリー１に結合される。ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３がライブラリー２に結合される。
どちらの戦略でも、ライブラリーは、３ラウンドまたは４ラウンドの親和性ベースの液相ファージディスプレイ選択の対象となり、各ラウンドで抗原の濃度が減少した。最初のラウンドでは、比較的高い抗原濃度（１０ｎＭ）を使用した。抗原濃度を、高親和性変異体を選択するために、後続の３ラウンドのそれぞれで１０倍、または後続の２ラウンドのそれぞれで１００倍減少させた。最終ラウンドからの個々の変異体を、ＥＬＩＳＡスクリーニングによって抗原への陽性結合について試験した。個々の亜種のオフレートランキングは、Ｏｃｔｅｔ Ｒｅｄ ９６（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ、ＵＳＡ）によって決定された。親和性が改善された変異を組み合わせて、新しいＬＡＧ３抗体を産生した。親和性はＢｉａｃｏｒｅによってさらに確認され、ＣＤＲ Ｈ２のＮ５８ＶがＫｏｆｆを大幅に増加させ、ＣＤＲＬ３のＮ９１ＹがＫｏｎを改善したことが示唆された。
Figure 0007177543000075
Figure 0007177543000076
Figure 0007177543000077
Figure 0007177543000078
Figure 0007177543000079
Figure 0007177543000080
Figure 0007177543000081
Figure 0007177543000082
Figure 0007177543000083
２．１５． 親和性成熟抗ＬＡＧ３ １４７Ｈヒト化モノクローナル抗体の結合特性
組換えｈｉｓタグヒトＬＡＧ３－ＥＣＤタンパク質に対する親和性成熟抗体の結合動態を、実施例２．７に記載されているように、ＢｉａｃｏｒｅＴ２００によって調べた。結果を以下の表に示した。Ｂｉａｃｏｒｅの結果は、これらの抗ＬＡＧ３抗体が親１４７Ｈ－１３よりも優れた親和性を有していることを示した。
Figure 0007177543000084
ヒトＬＡＧ３に結合する親和性成熟抗ＬＡＧ－３抗体の能力を確認するために、親抗体１４７Ｈ－１３とともに最も高い親和性を有する２つの抗体（Ｂ３８０７ｂおよびＢ３８１０）を、実施例２．２に記載のＥＬＩＳＡを使用して評価した。Ｂ３８０７ｂ、Ｂ３８１０のＥＣ５０と親抗体を下の表に示した。 Ｂ３８０７ｂおよびＢ３８１０の両方が、親抗体１４７Ｈ－１３よりも優れた結合能力を示した。
Figure 0007177543000085
親和性成熟抗ＬＡＧ－３抗体が細胞由来のヒトＬＡＧ３に結合し得ることをさらに確認するために、誘導性ｈＬＡＧ３発現Ｊｕｒｋａｔ細胞および活性化ＰＢＭＣの両方を使用して、Ｂ３８０７ｂとＢ３８１０の結合能力を試験した。簡単に説明すると、Ｊｕｒｋａｔ細胞をＦＡＣＳバッファーに再懸濁した。抗ＬＡＧ３抗体およびアイソタイプコントロールは、２０ｎＭから３０ｐＭの範囲の用量でＦＡＣＳバッファーで４倍段階希釈された。連続希釈した抗体を細胞懸濁液に加え、氷上で３０分間インキュベートした。次に、結合していない抗体を除去した後、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６３３（Ｔｈｅｒｍｏ、Ａ２１０９１）と結合した抗ヒトＩｇＧで細胞を染色した。蛍光測定はＦＡＣＳＣｅｌｅｓｔａフローサイトメーターで取得し、Ｆｌｏｗｊｏで分析して平均蛍光強度（ＭＦＩ）を決定した。ネイティブヒトＬＡＧ３に結合する抗ＬＡＧ３抗体の能力を試験するために、健常ドナーからのＰＢＭＣを、抗ＣＤ３（ＢＤ、５５５３３６）および抗ＣＤ２８（ＢＤ、５５５７２５）で両方が１μｇ／ｍｌの濃度において刺激した。３日間の刺激後、細胞を回収し、抗ＬＡＧ３抗体とともに氷上で３０分間インキュベートした。細胞を抗ヒトＣＤ４および抗ヒトＩｇＧで染色した。ＣＤ４＋細胞に結合する抗体の分析は、ＦＡＣＳＣｅｌｅｓｔａフローサイトメトリーで実施された。サイトメトリー分析の結果は、細胞由来のヒトＬＡＧ３に結合する抗体のＥＣ５０を示す以下の表に要約されている。図３１は、抗ＬＡＧ３抗体の結合曲線を示すグラフである。試験した抗体のＥＣ５０を以下に示した。
Figure 0007177543000086
２．１６． モノクローナル抗体１４７Ｈ３８０７（Ｂ３８０７）の特性評価
Ａ．Ｂ３８０７のＬＡＧ３タンパク質への結合
この例では、抗ＬＡＧ－３抗体１４７Ｈ ３８０７（Ｂ３８０７）がヒトＬＡＧ３タンパク質に結合する能力を評価した。ストレプトアビジンをＥＬＩＳＡプレートに２μｇ／ｍｌ、１００μｌ／ウェルでコーティングした。続いて、１．０μｇ／ｍｌの１００μｌのＢｉｏ－ＬＡＧ３をストレプトアビジンとともに室温で１時間インキュベートした。Ｂ３８０７は、ポジティブコントロール２５Ｆ７およびネガティブコントロールＩｇＧとともに、ＥＬＩＳＡ希釈バッファーで段階希釈した。結合を評価するために、さまざまな濃度の抗体をＬＡＧ３タンパク質でコーティングしたプレートに１．５時間室温で添加した。得られたプレートを洗浄し、抗ヒトＩｇＧ（Ｆａｂ）－ＨＲＰ抗体で標識した。
図３８に示すように、Ｂ３８０７および２５Ｆ７の両方が用量依存的にヒトＬＡＧ３に結合し、Ｂ３８０７はより高い効力およびより低いＥＣ５０を示した（２５Ｆ７の０．２２ｎＭに対して０．０６ｎＭ）。
Ｂ．ビアコア分析
組換えＨｉｓタグヒトＬＡＧ３－ＥＣＤタンパク質へのＢ３８０７の結合は、キャプチャー法を使用してＢｉａｃｏｒｅＴ２００によって調べられた。Ｂ３８０７は、ＣＭ５センサーチップに固定化されたプロテインＡを使用して補足された。連続濃度のｈｉｓタグヒトＬＡＧ３－ＥＣＤタンパク質（０～１２ｎＭ）を、３０μｌ／ｍｉｎの流速で捕捉抗体に注入した。解離段階は９００秒または５５０秒であった。結果を図３９に示し、これはＢ３８０７が高い親和性でヒトＬＡＧ３に結合していることを示す。
Ｃ．Ｊｕｒｋａｔ細胞およびＰＢＭＣベースの結合アッセイ
Ｂ３８０７が細胞由来のヒトＬＡＧ３に結合し得ることをさらに確認するために、誘導性ヒトＬＡＧ３発現ｊｕｒｋａｔ細胞および活性化ＰＢＭＣの両方を使用して、Ｂ３８０７の結合能力を試験した。簡単に説明すると、Ｊｕｒｋａｔ細胞をＦＡＣＳバッファーに再懸濁した。Ｂ３８０７、２５Ｆ７およびアイソタイプコントロールは、２０ｎＭから９ｐＭの範囲の用量でＦＡＣＳバッファーで３倍段階希釈された。連続希釈した抗体を細胞懸濁液に加え、氷上で３０分間インキュベートした。次に、結合していない抗体を除去した後、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６３３（Ｔｈｅｒｍｏ、Ａ２１０９１）と結合した抗ヒトＩｇＧで細胞を染色した。蛍光測定はＦＡＣＳＣｅｌｅｓｔａフローサイトメーターで取得し、Ｆｌｏｗｊｏで分析して平均蛍光強度（ＭＦＩ）を決定した。ネイティブヒトＬＡＧ３に結合する抗体の能力を試験するために、健常ドナーからのＰＢＭＣを１μｇ／ｍｌの濃度の抗ＣＤ３（ＢＤ、５５５３３６）および抗ＣＤ２８（ＢＤ、５５５７２５）で刺激した。３日間の刺激後、細胞を回収し、抗ＬＡＧ３抗体とともに氷上で３０分間インキュベートした。細胞を抗ヒトＣＤ４および抗ヒトＩｇＧで染色した。ＣＤ４＋細胞に結合する抗体の分析は、ＦＡＣＳＣｅｌｅｓｔａフローサイトメトリーで実施された。
サイトメトリー分析の結果を図４０に示す。試験した抗体のＥＣ５０もまた図に示されている。両方の試験において、Ｂ３８０７は対照抗体２５Ｆ７よりも強い結合能力を示した。
Ｄ．ＭＨＣクラスＩＩへのＬＡＧ３結合のブロック
ヒトＬＡＧ３およびＭＨＣＩＩの間の相互作用をブロックするＢ３８０７の能力を測定するために、ＬＡＧ３とＭＨＣ ＩＩ結合アッセイ（Ｃｉｓｂｉｏ、６４ＩＣＰ０３ＰＥＧ）を、キットの製造元が提供するプロトコルに従って、均一なＴＲ－ＦＲＥＴテクノロジーを利用して実行した。Ｂ３８０７は、１００ｎＭから５ｐＭ（１０ポイント）の範囲で３倍に希釈された。ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｅｎｖｉｓｉｏｎプレートリーダーで蛍光データを取得し、４パラメーターの用量反応曲線をフィッティングして各抗体のＩＣ５０を取得した。Ｂ３８０７のＩＣ５０は０．４１ｎＭであり（図４１）、強力なブロッキング活性を示している。
Ｅ．ヒトＴ細胞応答の刺激
Ｔ細胞応答を刺激する抗ＬＡＧ３抗体の能力を試験するために、ｈＬＡＧ３発現Ｊｕｒｋａｔ細胞を使用した。９６ウェルプレートの各ウェルで、Ｊｕｒｋａｔ細胞（１×１０５）を０．１ｎｇ／ｍｌ ＳＥの存在下でＲａｊｉ細胞（１×１０４）とインキュベートした。Ｂ３８０７を３倍に希釈し、１００ｎＭ～５０ｐｍの範囲の最終濃度で細胞に添加した。４８時間後、培地からのＩＬ２を均一ＴＲ－ＦＲＥＴアッセイ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、ＴＲＦ１２２１Ｍ）を使用して測定した。図４２は、ＩＬ２放出を刺激する際のＢ３８０７および２５Ｆ７の曲線を示しており、Ｂ３８０７は、２５Ｆ７を大幅に上回っていた。
Ｆ．初代Ｔ細胞におけるＩＬ２放出
Ｔ細胞応答を刺激する抗体の能力は、ｈＬＡＧ３で発現した初代Ｔ細胞でも試験された。試験した４つの用量すべてで、Ｂ３８０７は２５Ｆ７を上回った（図４３、左パネル）。抗ＰＤ－Ｌ１抗体と一緒に使用した場合、ＩＬ２放出プロファイル（図４３、右パネル）は、抗ＬＡＧ３抗体Ｂ３８０７と抗ＰＤ－Ｌ１抗体との間の相乗効果を示した。
Ｇ．腫瘍退縮における抗ＰＤ１／抗ＰＤ－Ｌ１抗体との併用効果
ヒトＬＡＧ３の細胞外ドメインを発現するヒト化マウスを使用した。図４４の左パネルに示すように、Ｂ３８０７および２５Ｆ７は、抗ＰＤ－１抗体と組み合わせた場合に腫瘍増殖を阻害する効果を示した。
一方で、図４４の右側のパネルでは、市販の抗ＰＤ－Ｌ１抗体であるＴｅｃｅｎｔｒｉｑと併用した場合、Ｂ３８０７および２５Ｆ７の両方が有意な相乗効果を示したことは明らかである。
Ｈ．Ｂ３８０７およびＢ３８０７ｂの比較
Ｂ３８０７およびＢ３８０７ｂの活性を、Ｊｕｒｋａｔ細胞におけるＩＬ２放出の促進（実施例２．１６（Ｅ）の実験手順を参照のこと）およびＪｕｒｋａｔ細胞上のＬＡＧ３への結合（実施例２．１６（Ｃ）の実験手順を参照のこと）におけるそれらの能力について比較した。
比較結果を図４５に示す。両方の実験で、Ｂ３８０７およびＢ３８０７ｂは非常に類似した活性プロファイルを示し、これら２つの抗体間のＣＤＲＬ１の配列の違いがそれらの活性に影響を与えなかったことを示している。
また、図４６に示されるように、Ｂｉａｃｏｒｅデータ（実施例２．１６（Ｂ）の実験手順を参照のこと）は、これらの２つの抗体間の大きな類似性をさらに実証している。 以下の例では、二重特異性抗体をさらに試験および調製するためにＢ３８０７を使用した。
実施例３．抗ＰＤ－Ｌ１／抗ＬＡＧ３二重特異性抗体の調製
実施例１で調製された抗ＰＤ－Ｌ１クローンのうちの、Ｈｕ１２１０－４１（Ｈｕ１２１０ ＶＨ．４ｄｘＨｕ１２１０ Ｖｋ．１、表８を参照のこと；以下、「Ｈ１２」）およびＢ６（表１６を参照のこと）クローン、ならびに実施例２で調製された抗ＬＡＧ３クローンのうちの、１４７Ｈ（「１４７」とも呼ばれる、表２３を参照のこと）および１４７Ｈ ３８０７（「１４７（Ｈ３８０７）」とも呼ばれる；表２７を参照のこと）クローンを例示的に選択して、完全長ＩｇＧＸｓｃＦｖ型の抗ＰＤ－Ｌ１／抗ＬＡＧ３二重特異性抗体を調製した。ＰＤ－Ｌ１を完全ＩｇＧ部分に配置する場合、ＡＤＣＣが減少した変異骨格を有するＩｇＧ１（Ｎ２９７Ａ変異、米国特許第７３３２５８１号、第８２１９１４９号など）を使用し、ＬＡＧ３を完全ＩｇＧ部分に配置する場合、Ｓ２４１Ｐ変異を有するＩｇＧ４（Ａｎｇａｌら、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３０：１０５－１０８）を使用した。
抗ＰＤ－Ｌ１／抗ＬＡＧ３二重特異性抗体のＩｇＧ抗体の重鎖をコードするヌクレオチド配列を有するＤＮＡセグメント１をｐｃＤＮＡ３．４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ａ１４６９７；プラスミド１）に挿入し、ＤＮＡセグメント２を有する 抗ＰＤ－Ｌ１／抗ＬＡＧ３二重特異性抗体のＩｇＧ抗体の軽鎖をコードするヌクレオチド配列をｐｃＤＮＡ３．４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ａ１４６９７；プラスミド２）に挿入した。その後、プラスミド１に挿入されたＩｇＧ抗体のＦｃ領域のｃ末端に対応するＤＮＡセグメント１の一部に、二重特異性抗体の発現のためのベクターを構築するための（ＧＧＧＧＳ）２からなる１０アミノ酸長を有するリンカーペプチドをコードするＤＮＡセグメント４を用いて、ｓｃＦｖをコードするＤＮＡセグメント３を融合させた。
重鎖、軽鎖、ｓｃＦｖおよびＤＮＡセグメントの配列を表３２および表３３に要約した。
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構築されたベクターは、ＥｘｐｉＣＨＴＭ発現培地（Ｔｈｅｒｍｏ、Ａ２９１００－０１）で、（ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅＴＭＣＨＯキット、Ｔｈｅｒｍｏ、Ａ２９１２９）を使用して、３０～３７℃において条件下で回転式シェーカーを備えたＣＯ２インキュベーター内で７～１５日間培養されたＥｘｐｉＣＨＯ－ＳＴＭ細胞（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、Ａ２９１２７）で一時的に発現された。プラスミドＤＮＡ（２５０μｇ）およびＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎ ＣＨＯ試薬（８００μＬ）をＯｐｔｉ－ＭＥＭ(R)Ｉ培地（最終容量２０ｍＬ）と混合し、室温で５分間静置させた。混合溶液を、ＥｘｐｉＣＨＯ発現培地で培養した６×１０６のＥｘｐｉＣＨＯ細胞に添加し、空気中８％ＣＯ２の加湿雰囲気で３７℃のシェーカーインキュベーター内で穏やかに混合した。トランスフェクションの１８時間後に、１．５ｍＬのＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎＣＨＯトランスフェクションエンハンサー１および６０ｍＬのＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎＣＨＯトランスフェクションフィードを各フラスコに添加した。
各ＢｓＡｂは、組換えプロテインＡアフィニティークロマトグラフィー（Ｈｉｔｒａｐ Ｍａｂｓｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、２８－４０８２－５５）およびＨｉＬｏａｄ ２６／２００ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００プレップグレードカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、２８－９８９３－３６）を使用したゲルろ過クロマトグラフィーによって細胞培養上清から精製した。 ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（ＮｕＰａｇｅ ４－１２％Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓゲル、ＮＰ０３２１）およびＳＥ－ＨＰＬＣカラム（ＳＷＸＬ ＳＥ－ＨＰＬＣカラム、ＴＯＳＯＨ、Ｇ３０００ＳＷＸＬ）を使用したサイズ排除ＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ、１２００シリーズ）分析を実行して、各ＢｓＡｂのサイズと純度を検出および確定した。精製されたタンパク質を、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ １５ ３０Ｋデバイス（Ｍｅｒｃｋ、ＵＦＣ９０３０９６）を使用した限外濾過によってＰＢＳで濃縮し、タンパク質濃度はｎａｎｏｄｒｏｐ（Ｔｈｅｒｍｏ、Ｎａｎｏｄｒｏｐ Ｏｎｅ）を使用して評価した。２ベクトルシステムを適用する場合、軽鎖と重鎖の比率は重量で１：１～１：３になり得る。あるいは、１つの単一ベクトルに両方の鎖を含む１ベクトルシステムを使用し得る。
調製された抗ＰＤ－Ｌ１／抗ＬＡＧ３二重特異性抗体は、それぞれＨ１２ｘ１４７、Ｈ１２ｘ１４７（Ｈ３８０７）、Ｂ６ｘ１４７、およびＢ６ｘ１４７（Ｈ３８０７）、１４７ｘＨ１２、１４７（Ｈ３８０７）ｘＨ１２、１４７ｘＢ６、および１４７（Ｈ３８０７）ｘＢ６と名付けられている。ここで、前者はＩｇＧ型のクローンを指し、後者はｓｃＦｖ型のクローンを指す。
実施例４．二重特異性抗体Ｈ１２ｘ１４７および１４７ｘＨ１２の特徴づけ
４．１． 二重特異性抗体の結合
実施例３で調製した二重特異性抗体（ＢｓＡｂ； Ｈ１２ｘ１４７および１４７ｘＨ１２）のＰＤ－Ｌ１およびＬＡＧ３への結合活性を評価するために、ＢｓＡｂをＥＬＩＳＡ試験に供した。簡単に説明すると、マイクロタイタープレートを、ヒトＰＤ－Ｌ１－Ｆｃタンパク質（Ｓｉｎｏｂｉｏ、１００８４－Ｈ０２Ｈ）およびヒトＬＡＧ３－Ｈｉｓタンパク質（Ｓｉｎｏｂｉｏ、１６４９８－Ｈ０８Ｈ）のそれぞれで、ＰＢＳ中０．５μｇ／ｍｌ、１００μｌ／ウェル、４℃で一晩コーティングし、次に１００μｌ／ウェルの５％ＢＳＡでブロックした。各ＢｓＡｂの、１００ｎＭから始めて４倍希釈液を各ウェルに添加し、室温で１～２時間インキュベートした。プレートをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎで洗浄した後、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）（Ｐｉｅｒｃｅ、カタログ番号３１４１３）と結合したヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体とともに室温で１時間インキュベートした。洗浄後、プレートをＴＭＢ基質で成長させ、分光光度計でＯＤ ４５０～６３０ｎｍで分析した。結果を図３３に示す。図３３に示すように、試験されたすべてのＢｓＡｂは、高い活性でヒトＰＤ－Ｌ１およびヒトＬＡＧ３タンパク質の両方に結合し得る。
４．２． 二重特異性抗体の結合親和性
実施例３で調製した二重特異性抗体（ＢｓＡｂ；１４７ｘＨ１２、１４７Ｈ３８０７ｘＢ６およびＢ６ｘ１４７Ｈ３８０７）の二重特異性抗体ＰＤ－Ｌ１およびＬＡＧ３のＰＤ－Ｌ１タンパク質およびヒトＬＡＧ３タンパク質に対する結合親和性を、捕捉法を使用してＢＩＡＣＯＲＥＴＭで試験した。
結果を表３４に示す。
Figure 0007177543000111
表３４および図３３に示されるように、試験された二重特異性抗体は、ヒトＰＤ－Ｌ１およびヒトＬＡＧ３タンパク質の両方に対して比較的高い結合親和性を示す。
また、ＳＥＥアッセイを実施し、得られた結果を図３４に示し、その結果は試験された二重特異性抗体がＭＨＣ ＩＩとＬＡＧ３との間の結合を阻害し、それによりＭＨＣ ＩＩおよびＴＣＲによるＴ細胞活性を増加させることを示した。
４．３． ヒトＴ細胞免疫応答を促進する二重特異性抗体の活性
刺激されたＴ細胞応答に対する二重特異性抗体の能力を試験するために、Ｊｕｒｋａｔ細胞活性化アッセイを使用した。レンチウイルスによってヒトＬａｇ３およびＰｄ１でトランスフェクトされたＪｕｒｋａｔ細胞をレスポンダー細胞として使用した。ＰＤＬ１を過剰発現したＲａｊｉ細胞を抗原提示細胞（ＡＰＣ）として使用した。ブドウ球菌エンテロトキシンＥ（ＳＥＥ）はスーパー抗原であり、このアッセイで刺激剤として使用された。このシステムでは、異所的に発現したｈｕＬＡＧ３およびｈｕＰＤ－１は、Ｊｕｒｋａｔ細胞によるＳＥ刺激によるＩＬ－２産生を抑制し得るが、抗ＬＡＧ３および抗ＰＤ－Ｌ１抗体はＩＬ－２産生を逆転し得る。要するに、Ｒａｊｉ（１×１０４）は、スーパー抗原の存在下でＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞（１×１０５）と共培養された。二重特異性抗体およびそれらの対応する単一抗体（１００ｎＭから開始し６回希釈された）を混合培養物に加えた。 ４８時間後、ＩＬ２産生のために上清を回収した。図３４（上のパネル）に示すように、二重特異性抗体（１４７ｘＨ１２（１４７－Ｈ１２とラベル付け）およびＨ１２Ｘ１４７（Ｈ１２－１４７とラベル付け））は、Ｊｕｒｋａｔ細胞によるＩＬ２産生を用量依存的に促進し得る。
初代Ｔ細胞に対する二重特異性抗体のｉｎｖｉｔｒｏ機能をさらに評価するために、混合リンパ球反応を実施した。ヒト樹状細胞（ＤＣ）は、ＧＭ－ＣＳＦおよびＩＬ－４の存在下でＣＤ１４ ＋単球から７日間分化した。次に、別のドナーから単離されたＣＤ４＋ Ｔ細胞を、ＤＣおよび段階希釈抗体と共培養した。混合培養の５日後、培養上清をＩＦＮγ産生についてアッセイした。 図３４（下のパネル）の結果は、二重特異性抗体（１４７ＸＨ１２（Ａ３Ｌ１とラベル付け）およびＨ１２Ｘ１４７（Ｌ１Ａ３とラベル付け）の両方がＩＦＮγ産生を有意に促進し得ることを示した。
４．４． 二重特異性抗体の腫瘍増殖阻害（ｉｎｖｉｖｏアッセイ）
ヒトＰＤ－１およびヒトＬＡＧ３の細胞外ドメインを発現する二重ヒト化マウスを使用した。マウス結腸腺癌細胞（ＭＣ３８）は、ヒトＰＤ－Ｌ１を発現するように設計されている。二重ヒト化マウス（ｈＬＡＧ３／ｈＰＤ－１）に５×１０５ ＭＣ３８－ｈＰＤ－Ｌ１細胞を０日目に皮下移植した。１０日目に、平均腫瘍体積が１３７ ｍｍ３のマウスを選択し、４つの治療群（Ｎ＝７／群）にランダム化した。マウスにアイソタイプコントロール（５ｍｇ／ｋｇ）、Ｈ１２（抗ＰＤ－Ｌ１抗体、５ｍｇ／ｋｇ）、１４７Ｈ（抗ＬＡＧ３抗体、５ｍｇ／ｋｇ）および１４７ｘＨ１２（６．６ｍｇ／ｋｇ）を１日おきに１０日目から開始して８回腹腔内投与した。腫瘍体積は、実験期間中（２９日）、週に２回、キャリパー測定によってモニターされた。Ｈ１２も１４７Ｈも５ｍｇ／ｋｇで腫瘍抑制を示さなかった。対照的に、１４７ｘＨ１２は、ＭＣ３８腫瘍増殖の強力な阻害を示し、研究の終わりに６７．７％のＴＧＩを示した（図３５）。
実施例５．二重特異性抗体１４７ｘＨ１２および１４７（Ｈ３８０７）ｘＨ１２の特徴づけ
５．１． 二重特異性抗体の結合
実施例３で調製した二重特異性抗体（ＢｓＡｂ；１４７ｘＨ１２および１４７（Ｈ３８０７）ｘＨ１２）のＬＡＧ３への結合活性を評価するために、ＢｓＡｂをＥＬＩＳＡ試験に供した。簡単に説明すると、マイクロタイタープレートを、ＰＢＳ中０．５μｇ／ｍｌのヒトＬＡＧ３－Ｈｉｓタンパク質（Ｓｉｎｏｂｉｏ、１６４９８－Ｈ０８Ｈ）で、１００μｌ／ウェル、４℃で一晩コーティングし、１００μｌ／ウェルの５％ＢＳＡでブロックした。各ＢｓＡｂの１００ｎＭから始めて４倍希釈液を各ウェルに添加し、室温で１～２時間インキュベートした。プレートをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎで洗浄した後、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）（Ｐｉｅｒｃｅ、カタログ番号３１４１３）と結合したヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体とともに室温で１時間インキュベートした。洗浄後、プレートをＴＭＢ基質で成長させ、分光光度計でＯＤ ４５０～６３０ｎｍで分析した。図３３に示すように、ＢｓＡｂｓ １４７（Ｈ３８０７）ｘＨ１２は、ヒトＬＡＧ３タンパク質への結合活性がさらに向上している。
５．２． ヒトＴ細胞免疫応答を促進する二重特異性抗体の活性
実施例３で調製された二重特異性抗体の効果は、健常なドナーからのＰＢＭＣを使用してさらに研究された。簡単に言えば、ヒトＤＣはＣＤ１４＋単球から７日間分化した。別のドナーから単離された精製ＣＤ４＋ Ｔ細胞は、抗ＣＤ３／ＣＤ２８によって２日間刺激された。次に、段階希釈した抗体をスーパー抗原の存在下でＤＣ細胞およびＴ細胞の共培養に加え、５日間インキュベートし、培地を収集してＩＬ－２レベルを調べた。図３６に示されるように、二重特異性抗体は、初代ＣＤ４＋ Ｔ細胞におけるＩＬ－２産生を有意に刺激し得て、これは、それらの対応する単一抗体の組み合わせよりも優れていた。データは、３つのウェルからの平均値±ＳＤとして示されている。
さらに、実施例３で調製された二重特異性抗体の効果は、健常なドナーからのＰＢＭＣを使用して研究された。簡単に説明すると、ヒトＤＣをＣＤ１４＋単球から５日間分化させた後、成熟させるためにＬＰＳ処理を行った。パンＴ細胞は別のドナーＰＢＭＣから分離された。次に、段階希釈した抗体を成熟ＤＣ細胞およびＴ細胞の共培養に加え、５日間インキュベートし、ＩＦＮγレベルについて培地を回収した。図３７に示されるように、二重特異性抗体は、初代パンＴ細胞におけるＩＦＮγ産生を有意に刺激し得て、これは、それらの対応する単一抗体の組み合わせよりも優れていた。 データは、重複ウェルからの平均値±ＳＤとして示されている。
５．３． 二重特異性抗体の開発可能性
ＰＤ－Ｌ１およびＬＡＧ－３二重特異性抗体（ＢｓＡｂ； Ｂ６ｘ１４７Ｈ３８０７および１４７（Ｈ３８０７）ｘＢ６）に対する物理化学的特性に関する開発可能性を評価した。ＢｓＡｂｓの品質属性は、いくつかの分析方法によって評価された。簡単に説明すると、純度はサイズ排除高速液体クロマトグラフィー（ＳＥ－ＨＰＬＣ）で測定され、両方のＢｓＡｂが９９％を超える高純度を示した。蛍光標識リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）を用いたタンパク質サーマルシフト（ＰＴＳ）による熱安定性を分析した。それらの溶融温度は６７℃以上で観察され、試験品が安定した構造的完全性を有していることを示した。分子の溶解度を評価するために、限外濾過（Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－１５スピンコンセントレーター）を使用してタンパク質を２０ ｍｇ／ｍＬに濃縮した。その結果、目視検査では可視粒子は観察されず、ＳＥ－ＨＰＬＣでは凝集体の増加は確認されなかった。キャピラリー等電点電気泳動（ｃＩＥＦ）によって測定された各ｂｓａｂの等電点（ｐＩ）は、それぞれ８．２６および８．３５であった。このｐＩ範囲は、下流のプロセスおよび製剤開発を進めるのに適している。全体として、表１９に示すように、試験したＢｓＡｂｓ（Ｂ６ｘ１４７Ｈ３８０７および１４７（Ｈ３８０７）ｘＢ６）は、開発を成功させるための適切な物理化学的特性を備えていることが示された。
Figure 0007177543000112
実施例６．ＦＧＬ１のＬＡＧ３への結合の阻害に対するＢ３８０７の効果。
この例では、ＬＡＧ３およびフィブリノーゲン様タンパク質１（ＦＧＬ１）の間の結合を阻害する抗ＬＡＧ３抗体Ｂ３８０７の活性を試験した。
近年、フィブリノーゲン様タンパク質１（ＦＧＬ１）が、ＭＨＣ－ＩＩとは別に、ＬＡＧ３の別の機能的リガンドであることが報告された（Ｃｅｌｌ．２０１９；１７６：１－１４）。ＦＧＬ－１は肝臓から分泌され、癌細胞によって高度に産生される。ＦＧＬ－１は抗原特異的Ｔ細胞の活性化を阻害し、逆にＦＧＬ－１の遮断は抗腫瘍反応を増強する。ＦＧＬ－１とＬＡＧ３との間の相互作用は、免疫回避の別のメカニズムを表し得る。
組換えＦＧＬ－１を１μｇ／ｍｌの濃度で９６ウェルプレートにコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。連続希釈した抗ＬＡＧ３抗体Ｂ３８０７（１０μｇ／ｍｌから開始および１：３希釈）およびビオチン標識ＬＡＧ３－ＥＣＤ（２μｇ／ｍｌ）を、ＦＧＬ－１でコーティングしたウェルと室温で２時間インキュベートした。洗浄バッファーで十分に洗浄した後、ストレプトアビジン－ＨＲＰを添加した。 図４７に示すように、Ｂ３８０７は用量依存的にＦＧＬ－１のＬＡＧ３タンパク質への結合を阻害した。
＊＊＊
本開示は、本開示の個々の態様の単一の例示として意図される記載された特定の実施形態によって範囲が限定されるべきではなく、機能的に同等であるいずれかの組成物または方法は、本開示の範囲内である。本開示の思想または範囲から逸脱することなく、本開示の方法および組成物において様々な修正および変形を行い得ることは当業者には明らかであろう。したがって、本開示は、添付の特許請求の範囲およびそれらの同等物の範囲内に入るという条件で、本開示の修正および変形に及ぶことが意図されている。
本明細書に記載されているすべての刊行物および特許出願は、個々の刊行物または特許出願が参照により援用されることが具体的かつ個別に示されている場合と同程度に、参照により本明細書に援用される。

Claims (12)

  1. 抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその抗原結合フラグメント、および抗ＬＡＧ３抗体またはその抗原結合フラグメントを含み、
    前記抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその抗原結合フラグメントが、ヒトのプログラム細胞死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）タンパク質の免疫グロブリンＣ（ＩｇＣ）ドメインに特異的に結合することができ、ここで、前記ＩｇＣドメインはアミノ酸残基１３３～２２５から構成されており；かつ、
    前記抗ＬＡＧ３抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号３５４のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ１；配列番号３５５、および４６１からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２；配列番号３５６、および４６８からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３；配列番号３５７、および４９０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１；配列番号３５８のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２；ならびに配列番号３５９、および４８８からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ３を含む、抗ＰＤ－Ｌ１／抗ＬＡＧ３二重特異性抗体。
  2. 前記抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその抗原結合フラグメントが、前記ＰＤ－Ｌ１タンパク質のアミノ酸残基Ｙ１３４、Ｋ１６２、またはＮ１８３の少なくとも１つに結合し得る、請求項１に記載の抗ＰＤ－Ｌ１／抗ＬＡＧ３二重特異性抗体。
  3. 前記抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその抗原結合フラグメントが、前記ＰＤ－Ｌ１タンパク質の免疫グロブリンＶ（ＩｇＶ）ドメインに結合せず、ここで、前記ＩｇＶドメインはアミノ酸残基１９～１２７から構成されている、請求項１または２に記載の抗ＰＤ－Ｌ１／抗ＬＡＧ３二重特異性抗体。
  4. 抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその抗原結合フラグメント、および抗ＬＡＧ３抗体またはその抗原結合フラグメントを含み、
    前記抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその抗原結合フラグメントが、
    （１）配列番号１および６１～６７からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ１；
    （２）配列番号２、６８～７７、および５２５～５２７からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２；
    （３）配列番号３、７８～９０および５１３～５１９からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３；
    （４）配列番号４、９１～９２、および５２０～５２１からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１；
    （５）配列番号５および９３～１０５からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２；ならびに、
    （６）配列番号６、１０６～１１１、および５２２～５２４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ３、
    を含み、
    前記抗ＬＡＧ３抗体またはその抗原結合フラグメントが、
    （ｉ）配列番号３５４のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ１；
    （ｉｉ）配列番号３５５、および４６１からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２；
    （ｉｉｉ）配列番号３５６、および４６８からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３；
    （ｉｖ）配列番号３５７、および４９０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１；
    （ｖ）配列番号３５８のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２；ならびに、
    （ｖｉ）配列番号３５９、および４８８からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ３、
    を含む、抗ＰＤ－Ｌ１／抗ＬＡＧ３二重特異性抗体。
  5. 前記抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその抗原結合フラグメントが、配列番号７～２６、１１３、４９３、４９５、４９７、４９９、５０１、５０３、５０５、５０７、５０９、および５１１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、または配列番号７～２６、１１３、４９３、４９５、４９７、４９９、５０１、５０３、５０５、５０７、５０９、および５１１からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドを含む、請求項４に記載の抗ＰＤ－Ｌ１／抗ＬＡＧ３二重特異性抗体。
  6. 前記抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその抗原結合フラグメントが、配列番号２７～３３、４９４、４９６、４９８、５００、５０２、５０４、５０６、５０８、５１０、および５１２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、または配列番号２７～３３、４９４、４９６、４９８、５００、５０２、５０４、５０６、５０８、５１０、および５１２からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するペプチドを含む、請求項４または５に記載の抗ＰＤ－Ｌ１／抗ＬＡＧ３二重特異性抗体。
  7. 前記抗ＬＡＧ３抗体またはその抗原結合フラグメントが、配列番号３５２、３６０～３７３、３７５、３９１、３９３、３９５、３９７、３９９、４０１、４０３、４０５、４１７、４２１、４２９、４３３、４３５、４３７、４４３、４４５、および４９１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、または配列番号３５２、３６０～３７３、３７５、３９１、３９３、３９５、３９７、３９９、４０１、４０３、４０５、４１７、４２１、４２９、４３３、４３５、４３７、４４３、４４５、および４９１からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドを含む、請求項４～６のいずれか１項に記載の抗ＰＤ－Ｌ１／抗ＬＡＧ３二重特異性抗体。
  8. 前記抗ＬＡＧ３抗体またはその抗原結合フラグメントが、配列番号３５３、３７４、および４４４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、または配列番号３５３、３７４、および４４４からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するペプチドを含む、請求項４～７のいずれか１項に記載の抗ＰＤ－Ｌ１／抗ＬＡＧ３二重特異性抗体。
  9. 請求項１～８のいずれか１項に記載の抗ＰＤ－Ｌ１／抗ＬＡＧ３二重特異性抗体および薬学的に許容される担体を含む、ＰＤ－Ｌ１、ＬＡＧ３、またはそれらの両方に関連する疾患を治療または予防するための医薬組成物。
  10. 前記ＰＤ－Ｌ１、ＬＡＧ３、またはそれらの両方に関連する疾患が癌または感染症である、請求項９に記載の医薬組成物。
  11. 前記癌が固形腫瘍である、請求項１０に記載の医薬組成物。
  12. 前記癌が、膀胱癌、肝臓癌、結腸癌、直腸癌、子宮内膜癌、白血病、リンパ腫、膵臓癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、乳癌、尿道癌、頭頸部癌、胃腸癌、胃癌、食道癌、卵巣癌、腎癌、黒色腫、前立腺癌、および甲状腺癌からなる群から選択される、請求項１０に記載の医薬組成物。
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