JP7177543B2 - 抗pd-l1/抗lag3二重特異性抗体およびその使用 - Google Patents

抗pd-l1/抗lag3二重特異性抗体およびその使用 Download PDF

Info

Publication number
JP7177543B2
JP7177543B2 JP2021510096A JP2021510096A JP7177543B2 JP 7177543 B2 JP7177543 B2 JP 7177543B2 JP 2021510096 A JP2021510096 A JP 2021510096A JP 2021510096 A JP2021510096 A JP 2021510096A JP 7177543 B2 JP7177543 B2 JP 7177543B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
antibody
lag3
amino acid
seq
human
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
JP2021510096A
Other languages
English (en)
Other versions
JP2021536437A (ja
Inventor
パク,ユンヨン
イ,ヤンソン
ジュン,ウィジュン
キム,ヨンクヮン
ジュ キム,ヨン
パク,ヨンドン
ホン イ,サン
ユ,ウォン-キョ
ジュン,ジェホ
ファン,レイ
ジャン,ウェンキン
Original Assignee
エービーエル バイオ インコーポレイテッド
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by エービーエル バイオ インコーポレイテッド filed Critical エービーエル バイオ インコーポレイテッド
Publication of JP2021536437A publication Critical patent/JP2021536437A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP7177543B2 publication Critical patent/JP7177543B2/ja
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K16/00Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2827Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against B7 molecules, e.g. CD80, CD86
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00Antineoplastic agents
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00Antineoplastic agents
    • A61P35/02Antineoplastic agents specific for leukemia
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K16/00Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K2317/00Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K2317/00Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K2317/00Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K2317/00Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K2317/00Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55Fab or Fab'
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K2317/00Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K2317/00Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565Complementarity determining region [CDR]
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K2317/00Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622Single chain antibody (scFv)
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K2317/00Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K2317/00Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K2317/00Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K2317/00Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Description

プログラム細胞死リガンド1(PD-L1)は、分化のクラスター274(CD274)またはB7ホモログ1(B7-H1)としても公知であり、40kDaの1型膜貫通タンパク質であり、妊娠、組織同種移植、自己免疫疾患、肝炎などの他の病態などの特定のイベントで免疫系を抑制するのに主要な役割を果たすと考えられている。PD-L1のPD-1またはB7.1への結合は、リンパ節でのCD8+ T細胞の増殖を減少させる阻害シグナルを伝達し、その補足として、PD-1は、アポトーシスを介してリンパ節で、Bcl-2遺伝子のより低い調節によってさらに媒介され、外来抗原特異的T細胞の蓄積を制御し得る。
PD-L1の上方調節により、癌を宿主の免疫系から回避させ得ることが示されている。腎細胞癌患者の腫瘍標本の分析により、PD-L1の高い腫瘍発現は、腫瘍の攻撃性の増加と死亡リスクの増加に関連していることが見い出された。多くのPD-L1阻害剤が免疫腫瘍学療法として開発中であり、臨床試験で良好な結果を示している。
癌の治療に加えて、PD-L1阻害は感染症の治療にも有望であることが示されている。細胞内感染のマウスモデルでは、リステリア・モノサイトゲネスがT細胞、NK細胞、マクロファージでPD-L1タンパク質の発現を誘導した。 PD-L1遮断(例えば、遮断抗体の使用)は、感染したマウスの死亡率の増加をもたらした。遮断により、マクロファージによるTNFαおよび一酸化窒素の産生が減少し、NK細胞によるグランザイムBの産生が減少し、リステリア・モノサイトゲネスの抗原特異的CD8 T細胞(CD4 T細胞ではない)の増殖が減少した。この証拠は、PD-L1が細胞内感染において正の共刺激分子として作用することを示唆している。
リンパ球活性化遺伝子-3(LAG-3)(CD223としても知られている)は免疫グロブリン(Ig)スーパーファミリーのメンバーであり、CD4と密接に関連しており、T細胞機能にさまざまな影響を与える。LAG-3は、活性化T細胞、枯渇T細胞、腫瘍浸潤T細胞、および制御性T細胞(Treg)に発現する。主要組織適合遺伝子複合体2(MHCクラスII)と結合すると、LAG-3/MHCクラスII相互作用により、T細胞の増殖、活性化、および恒常性が負に調節される。
LAG-3は、細胞毒性Tリンパ球抗原-4(CTLA-4)、プログラム細胞死リガンド-1(PD-L1)、プログラム細胞死-1(PD-1)と同様に、癌における重要な免疫チェックポイントを表す。LAG-3は、活性化/枯渇したエフェクターT細胞においてだけでなく、制御性T細胞においても発現する。LAG3拮抗作用は、エフェクターT細胞の活性化を促進するだけでなく、制御性T細胞の抑制機能を阻害もし得る。したがって、LAG-3は癌免疫療法の有望な標的であり、前臨床の証拠は、抗LAG-3抗体が抗腫瘍反応を促進し得ることを示唆している。
上記を考慮して、様々な癌および腫瘍細胞の増殖を阻害する免疫応答を刺激する方法でLAG-3の活性を調節し、かつ、自己免疫、炎症性、またはウイルス性疾患の治療に有用である新規の剤を開発する必要性が存在する。
本開示は、PD-L1とその受容体PD-1との間、およびLAG3とそのリガンド(例えば、MHCクラスII分子)との間の相互作用を効果的に遮断することができる抗PD-L1/抗LAG3二重特異性抗体を提供する。二重特異性抗体は、PD-L1タンパク質(例えば、ヒトPD-L1タンパク質)およびLAG3タンパク質(例えば、ヒトLAG3タンパク質)の両方に対して高い結合親和性を有し得る。前記抗PD-L1/抗LAG3二重特異性抗体は、PD-L1タンパク質に特異的に認識および/または結合し得るPD-L1標的化部分として抗PD-L1抗体またはその抗原結合フラグメント、ならびに、LAG3タンパク質に特異的に認識および/または結合し得るLAG3標的化部分として抗LAG3抗体またはその抗原結合フラグメントを含み得る。
前記抗PD-L1 /抗LAG3二重特異性抗体は、抗PD-L1抗体またはその抗原結合フラグメントをPD-L1標的化部分として含み得る。
一実施形態では、前記二重特異性抗体に含まれる前記抗PD-L1抗体またはそのフラグメントは、PD-L1(例えば、ヒトPD-L1)タンパク質の免疫グロブリンC(IgC)ドメインに特異的に結合し得る。いくつかの実施形態では、前記IgCドメインは、ヒトPD-L1タンパク質のアミノ酸残基133~225からなる。いくつかの実施形態では、前記抗PD-L1抗体またはそのフラグメントは、ヒトPD-L1タンパク質のアミノ酸残基Y134、K162、およびN183のうちの少なくとも1つに結合し得る。いくつかの実施形態では、前記抗PD-L1抗体またはそのフラグメントは、前記PD-L1タンパク質の免疫グロブリンV(IgV)ドメインに結合せず、例えば、IgVドメインは、ヒトPD-L1タンパク質のアミノ酸残基19~127からなる。例えば、前記ヒトPD-L1タンパク質は、GenBankアクセッション番号NP_001254635.1 NP_001300958.1、NP_054862.1などで表されるタンパク質からなる群から選択し得るが、これらに限定され得ない。これらの抗PD-L1抗体は、さまざまな種類の癌、感染症(炎症)などの治療などの治療目的に役立ち得て、診断および予後の目的にも使用され得る。一実施形態では、前記抗PD-L1抗体またはそのフラグメントは、ヒトPD-L1タンパク質に特異性を示し得る。
前記抗PD-L1抗体またはそのフラグメントは、(1)配列番号1および61~67からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR1;(2)配列番号2、68~77、および525~527からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR2;(3)配列番号3、78~90および513~519からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR3;(4)配列番号4、配列番号91~92、および520~521からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL CDR1;(5)配列番号5および93~105からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL CDR2;ならびに、(6)配列番号6、106~111、および522~524からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL CDR3を含み得る。例えば、前記抗PD-L1抗体またはそのフラグメントは、配列番号1のアミノ酸配列を有するVH CDR1;配列番号2のアミノ酸配列を有するVH CDR2;配列番号3または515のアミノ酸配列を有するVH CDR3;配列番号4のアミノ酸配列を有するVL CDR1; 配列番号5のアミノ酸配列を有するVL CDR2;および配列番号6のアミノ酸配列を有するVL CDR3を含み得る。
前記抗PD-L1 /抗LAG3二重特異性抗体は、LAG3標的化部分として抗LAG3抗体またはその抗原結合フラグメントを含み得る。一実施形態では、前記抗LAG3抗体またはそのフラグメントは、LAG3(例えば、ヒトLAG3)タンパク質に特異的に結合し得て;例えば、前記抗LAG3抗体またはそのフラグメントは、LAG-3の細胞外ドメインに結合し得る。
例えば、本明細書に記載の抗LAG3抗体またはそのフラグメントは、既存の抗LAG-3抗体がMHCクラスII分子への結合に対してのみ阻害効果を示したことを考慮すると、本開示の抗LAG3抗体またはそのフラグメントに固有でかなりの効果のMHCクラスII分子への結合を阻害することに加えて、前記LAG-3タンパク質のガレクチン-3(LGALS3)およびC型レクチンドメインファミリー4メンバーG(LSECtin)タンパク質への結合を阻害し得る。いくつかの実施形態では、本開示の抗体およびそのフラグメントは、エフェクターT細胞(Tefs)に対する制御性T細胞(Treg)の阻害効果を逆転させ得る。いくつかの実施形態では、本開示の抗体およびそのフラグメントは、LAG3フィブリノーゲン様タンパク質1(FGL1)間の結合を阻害し得る。
例えば、前記ヒトLAG3タンパク質は、GenBankアクセッション番号NP_02277.4などによって表されるタンパク質からなる群から選択され得るが、それに限定され得ない。これらの抗LAG3抗体は、さまざまな種類の癌、感染症(炎症)などの治療などの治療目的に役立ち得て、診断および予後の目的にも使用され得る。
一実施形態では、前記抗LAG3抗体またはそのフラグメントは、ヒトLAG3タンパク質に特異性を示し得る。前記抗LAG3抗体またはそのフラグメントは、(i)配列番号116~117、354、および453~460からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR1;(ii)配列番号118~119、355、および461~467からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR2;(iii)配列番号120~160、356、および468~475からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR3;(iv)配列番号163~195、229、357、および490からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL CDR1;(v)配列番号196~217、358、および476~483からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL CDR2;ならびに、(vi)配列番号218~228、230~253、359、および484~489からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL CDR3を含み得る。例えば、前記抗LAG3抗体またはそのフラグメントは、配列番号354のアミノ酸配列を有するVH CDR1; 配列番号355または461のアミノ酸配列を有するVH CDR2; 配列番号356または468のアミノ酸配列を有するVH CDR3; 配列番号357または490のアミノ酸配列を有するVL CDR1; 配列番号358のアミノ酸配列を有するVL CDR2;および、配列番号359または488のアミノ酸配列を有するVL CDR3を含み得る。
前記PD-L1またはLAG3タンパク質のみに特異性を有する抗体およびフラグメント、または1つまたは複数の他の抗原に追加の特異性を有する抗体も提供される。
一実施形態では、(1)配列番号1および61~67からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むVH CDR1; (2)配列番号2、68~77、および525~527からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むVH CDR2; (3)配列番号3、78~90、および513~519からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むVH CDR3;(4)配列番号4、91~92、および520~521からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むVL CDR1; (5)配列番号5および93~105からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むVL CDR2;ならびに、(6)配列番号6、106~111、および522~524からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むVL CDR3を含むヒトPD-L1タンパク質に特異性を有する抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。
一実施形態では、(i)配列番号116~117、354、および453~460からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むVH CDR1;(ii)配列番号118~119、355、および461~467からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むVH CDR2;(iii)配列番号120~160、356、および468~475からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むVH CDR3;(iv)配列番号163~195、229、357、および490からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むVL CDR1;(v)配列番号196~217、358、および476~483からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むVL CDR2;ならびに、(vi)配列番号218~228、230~253、359、および484~489からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むVL CDR3を含むヒトLAG3タンパク質に特異性を有する抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。
他の実施形態は、上記のような二重特異性抗体を含む医薬組成物を提供する。前記医薬組成物は、薬学的に許容される担体をさらに含み得る。前記医薬組成物は、癌または感染症を治療および/または予防するために使用され得る。
他の実施形態は、それを必要とする対象における癌または感染症を治療および/または予防する方法を提供し、対象に薬学的に有効な量の二重特異性抗体または医薬組成物を投与することを含む。前記方法は、投与工程の前に、癌または感染症を治療および/または予防する必要がある対象を特定するさらなる工程であり得る。
他の実施形態は、癌または感染症を治療および/または予防する際の前記二重特異性抗体または医薬組成物の使用を提供する。他の実施形態は、癌または感染症を治療および/または予防するための医薬組成物を調製する際の前記二重特異性抗体の使用を提供する。
本明細書で提供される医薬組成物、方法および/または使用において、前記癌は、固形癌または血液癌、好ましくは固形癌であり得る。
他の実施形態は、生物学的サンプルにおいて、PD-L1、LAG3、またはそれらの両方を同時に検出するための組成物を提供し、その組成物は、二重特異性抗体を含む。他の実施形態は、生物学的サンプルにおいて、PD-L1、LAG3、またはそれらの両方を同時に検出する方法を提供し、その方法は、前記生物学的サンプルを二重特異性抗体と接触させること;および、前記二重特異性抗体と、PD-L1、LAG3、またはその両方との間の抗原抗体反応(結合)を検出(測定)することを含む。
前記検出方法は、検出工程の後に、抗原抗体反応が検出される場合、PD-L1、LAG3、またはそれらの両方が生物学的サンプル中に存在すること、および/または、抗原抗体反応が検出されない場合、PD-L1、LAG3、またはその両方が生体サンプル中にない(存在しない)ことを特定することをさらに含み得る。
他の実施形態は、PD-L1、LAG3、またはそれらの両方に関連する疾患を診断するための医薬組成物を提供し、その組成物は、二重特異性抗体を含む。他の実施形態では、PD-L1、LAG3、またはそれらの両方に関連する疾患を診断するための前記二重特異性抗体の使用が提供される。
他の実施形態は、PD-L1、LAG3、またはそれらの両方に関連する疾患を診断する方法を提供し、この方法は、患者から得られた生物学的サンプルを前記二重特異性抗体と接触させ、前記抗原抗体反応を検出されるか、または生体サンプルにおける前記抗原抗体反応のレベルを測定することを含む。いくつかの実施形態では、前記方法は、正常なサンプルを二重特異性抗体と接触させること、および正常なサンプルにおける抗原抗体反応のレベルを測定することをさらに含み得る。さらに、前記方法は、測定工程の後に、生物学的サンプルおよび正常サンプルにおける抗原抗体反応のレベルを比較することをさらに含み得る。さらに、検出工程または比較工程の後、前記方法は、生物学的サンプルまたは生体サンプル中で前記抗原抗体反応が検出される場合か、前記抗原抗体反応のレベルが、正常なサンプルのレベルよりも高い場合、PD-L1、LAG3、またはそれらの両方に関連する疾患を有する患者として患者を特定することをさらに含み得る。
前記PD-L1、LAG3、またはそれらの両方に関連する疾患は、PD-L1、LAG3、またはそれらの両方の活性化(例えば、異常な活性化または過剰活性化)および/または過剰産生(過剰発現)に関連する疾患であり得る。例えば、前記疾患は、上記のように、癌または感染症であり得る。
一実施形態は、前記二重特異性抗体をコードするポリヌクレオチドを提供する。特に、一実施形態は、全長IgGならびに全長IgGのC末端および/またはN末端に連結されたscFvを含むIgG-scFv形態の前記二重特異性抗体の重鎖をコードするポリヌクレオチドを提供する。他の実施形態は、IgG-scFv形態の前記二重特異性抗体の軽鎖をコードするポリヌクレオチドを提供する。他の実施形態は、前記二重特異性抗体の重鎖をコードするポリヌクレオチド、前記二重特異性抗体の軽鎖をコードするポリヌクレオチド、またはそれらの両方を含む組換えベクターを提供する。他の実施形態は、前記組換えベクターでトランスフェクトされた組換え細胞を提供する。
他の実施形態は、前記細胞内で二重特異性抗体の重鎖をコードするポリヌクレオチド、前記二重特異性抗体の軽鎖をコードするポリヌクレオチドを発現することを含む、前記二重特異性抗体を調製する方法を提供する。前記ポリヌクレオチドを発現する工程は、前記ポリヌクレオチドの発現させる条件下で(例えば、組換えベクターにおいて)、前記ポリヌクレオチドを含む細胞を培養することによって実施され得る。前記方法は、発現または培養の工程の後に、前記細胞培養物から前記二重特異性抗体を単離および/または精製することをさらに含み得る。
図1は、HL1210-3がヒトPD-L1に高い親和性で結合し得ることを示している。 図2は、HL1210-3がヒトPD-L1のヒトPD1への結合を効率的に阻害し得ることを示している。 図3は、HL1210-3抗体が、哺乳動物細胞で発現されるPD-L1とのPD-1の結合を非常に効率的に阻害し得ることを示している。 図4は、試験された抗PD-L1抗体がヒトT細胞応答を促進し得ることを示している。 図5は、HL1210-3の組換えPD-L1への結合動態を示している。 図6A~図6Eは、試験されたすべてのヒト化抗体が、キメラ抗体と接触したヒトPD-L1と同等の結合効果を有したことを示している。 図6A~図6Eは、試験されたすべてのヒト化抗体が、キメラ抗体と接触したヒトPD-L1と同等の結合効果を有したことを示している。 図6A~図6Eは、試験されたすべてのヒト化抗体が、キメラ抗体と接触したヒトPD-L1と同等の結合効果を有したことを示している。 図6A~図6Eは、試験されたすべてのヒト化抗体が、キメラ抗体と接触したヒトPD-L1と同等の結合効果を有したことを示している。 図6A~図6Eは、試験されたすべてのヒト化抗体が、キメラ抗体と接触したヒトPD-L1と同等の結合効果を有したことを示している。 図7A~図7Cは、試験されたすべてのヒト化抗体が、キメラ抗体に匹敵する、哺乳動物細胞で発現されるPD-L1に高効率で結合し得ることを示している。 図7A~図7Cは、試験されたすべてのヒト化抗体が、キメラ抗体に匹敵する、哺乳動物細胞で発現されるPD-L1に高効率で結合し得ることを示している。 図7A~図7Cは、試験されたすべてのヒト化抗体が、キメラ抗体に匹敵する、哺乳動物細胞で発現されるPD-L1に高効率で結合し得ることを示している。 図8は、ヒト化抗体Hu1210-41がより低い親和性でアカゲザルPD-L1に結合し得て、ラットおよびマウスPD-L1に結合し得ないことを示している。 図9は、Hu1210-41抗体がB7-H1(PD-L1)にのみ特異的に結合し得て、B7-DC、B7-1、B7-2、B7-H2、PD-1、CD28、CTLA4、ICOSおよびBTLAには結合し得ないことを示している。 図10は、Hu1210-41がヒトPD-L1のヒトPD1およびB7-1への結合を効率的に阻害し得ることを示している。 図11は、Hu1210-41がヒトPD-L1のヒトPD1およびB7-1への結合を効率的に阻害し得ることを示している。 図12は、Hu1210-8、Hu1210-9、Hu1210-16、Hu1210-17、Hu1210-21およびHu1210-36ヒト化抗体が、混合リンパ球反応におけるIFNγおよびIL-2産生を用量依存的に促進し得ることを示している。 図13は、Hu1210-40、Hu1210-41およびHu1210-17ヒト化抗体が、CMVリコールアッセイにおいて用量依存的にIFNγ産生を促進し得ることを示している。 図14は、Hu1210-31が、HCC827-NSG-異種移植モデルにおいて5mg/kgで30%腫瘍増殖を阻害し得ることを示している。 図15は、Hu1210-41抗体がHCC827-NSG-異種移植モデルにおいて腫瘍増殖を用量依存的に阻害し得る一方で、腫瘍重量もHu1210-41抗体によって用量依存的に抑制されたことを示している。 図16は、各PD-L1変異体について、発現の関数としての平均結合値をプロットしている(コントロールの抗PD-L1 mAb反応性)。 図17は、抗PD-L1 Hu1210-41抗体への結合に関与する残基(球)であるY134、K162、およびN183の位置を示している。 図18は、誘導された抗体の(ヒトPD-L1への)結合アッセイの結果を示している。 図19は、親抗体およびTecentriqTM(アテゾリズマブ)と比較して、抗体B6が哺乳動物細胞で発現されたPD-L1により効率的に結合することを示している。 図20は、B6もより高い効力を示したジャーカット細胞におけるIL2産生に対する抗体の効果を示している。 図21は、D1-D2ドメインがLAG-3機能にとって重要であることを示している。 野生型(WT)LAG3細胞外ドメイン(ECD)融合タンパク質(LAG-3-ECD-huFc)フラグメントはダウディ細胞に結合し得るが、D1-D2トランケートLAG-3-ECD-huFcフラグメントはダウディ細胞に結合し得ない。 図22A~図22Dは、様々な種に由来するLAG3タンパク質へのヒト抗LAG3抗体の結合を示している。抗LAG-3抗体は、酵素免疫測定法(ELISA)を介して、ヒト、ラット、およびマウスのLAG3への結合特性について評価された。 図22A~図22Dは、様々な種に由来するLAG3タンパク質へのヒト抗LAG3抗体の結合を示している。抗LAG-3抗体は、酵素免疫測定法(ELISA)を介して、ヒト、ラット、およびマウスのLAG3への結合特性について評価された。 図22A~図22Dは、様々な種に由来するLAG3タンパク質へのヒト抗LAG3抗体の結合を示している。抗LAG-3抗体は、酵素免疫測定法(ELISA)を介して、ヒト、ラット、およびマウスのLAG3への結合特性について評価された。 図22A~図22Dは、様々な種に由来するLAG3タンパク質へのヒト抗LAG3抗体の結合を示している。抗LAG-3抗体は、酵素免疫測定法(ELISA)を介して、ヒト、ラット、およびマウスのLAG3への結合特性について評価された。 図23は、活性化されたヒト初代CD4+ T細胞上の細胞表面LAG-3抗原へのヒト抗LAG3抗体の結合を示している。抗LAG-3抗体は、さまざまな濃度(10μg/ml, 3.333μg/ml, 1.111μg/ml, 0.370μg/ml, 0.123μg/ml, 0.041μg/ml, 0.014μg/ml and 0.005μg/ml)で活性化されたヒト初代CD4+ T細胞上の細胞表面LAG-3抗原への結合について評価された。 図24は、抗LAG-3抗体によるMHCクラスII受容体への可溶性LAG-3(sLAG)結合の阻害を示している。抗LAG-3抗体は、MHCクラスII受容体を発現する、ビオチン標識LAG-3-ECD-huFcLAG-3-Fc融合タンパク質およびRaji細胞を使用したin vitro結合アッセイで、sLAG-3のMHCクラスII受容体への結合を阻害する能力について評価された。 図25は、抗LAG-3抗体による末梢血単核細胞(PBMC)におけるIL-2産生の刺激を示している。抗LAG-3抗体をブドウ球菌エンテロトキシンB(SEB)で刺激したPBMCに、20μg/ mlから始まるさまざまな濃度で1:3段階希釈で6回投与した。3日後、培養上清中のIL-2濃度を酵素免疫測定法(ELISA)で評価した。 図26は、抗LAG-3抗体を使用して、エフェクターT細胞(Tefs)に対する制御性T細胞(Treg)の抑制機能を逆転させることを示している。Tefsに対するTregの抑制効果を逆転させる抗LAG-3抗体の能力を評価するために、実施例2.1の抗体をin vitroのTreg抑制アッセイで使用した。 図27A~図27Cは、LAG3の完全な細胞外ドメイン(D1-D4 huFc)に結合するが、D1-D2欠失LAG3(△D1-D2huFc)には結合しない抗体のEC50を示すELISA結果を示し、122H、147H、および170Hが、ヒトLAG3のD1およびD2ドメインに対する、強力で選択的結合剤であることを示している。 図27A~図27Cは、LAG3の完全な細胞外ドメイン(D1-D4 huFc)に結合するが、D1-D2欠失LAG3(△D1-D2huFc)には結合しない抗体のEC50を示すELISA結果を示し、122H、147H、および170Hが、ヒトLAG3のD1およびD2ドメインに対する、強力で選択的結合剤であることを示している。 図27A~図27Cは、LAG3の完全な細胞外ドメイン(D1-D4 huFc)に結合するが、D1-D2欠失LAG3(△D1-D2huFc)には結合しない抗体のEC50を示すELISA結果を示し、122H、147H、および170Hが、ヒトLAG3のD1およびD2ドメインに対する、強力で選択的結合剤であることを示している。 図28A~図28Cは、122H、147Hおよび170H抗体が、LAG3のその受容体MHCクラスII分子への結合を用量依存的に阻害したことを示している。 図28A~図28Cは、122H、147Hおよび170H抗体が、LAG3のその受容体MHCクラスII分子への結合を用量依存的に阻害したことを示している。 図28A~図28Cは、122H、147Hおよび170H抗体が、LAG3のその受容体MHCクラスII分子への結合を用量依存的に阻害したことを示している。 図29は、122H、147Hおよび170Hマウスモノクローナル抗体が、ジャーカットT細胞によるIL2産生を用量依存的に促進したことを示している。 図30は、ヒト化モノクローナル抗体147H-13が、ジャーカットT細胞によるIL2産生を用量依存的に促進したことを示している。 図31は、ジャーカットLAG3細胞および活性化CD4 T細胞に対する抗LAG3抗体の結合曲線を示している。 図32は、一実施形態による、抗PD-L1/抗LAG3二重特異性抗体を概略的に示す。 図33は、ELISAによって測定された、一実施形態による抗PD-L1/抗LAG3二重特異性抗体のヒトPD-L1およびヒトLAG3への結合を示すグラフを示している。 図34は、一実施形態による、抗PD-L1 /抗LAG3二重特異性抗体のSEEアッセイ結果を示す。また、一実施形態による、抗PD-L1/抗LAG3二重特異性抗体のT細胞促進活性を示すグラフを示している。 図35は、一実施形態による、抗PD-L1/抗LAG3二重特異性抗体の腫瘍増殖阻害効果を示すグラフを示している。 図36は、一実施形態による、抗PD-L1/抗LAG3二重特異性抗体のT細胞促進活性を示すグラフを示している。 図37は、一実施形態による、抗PD-L1 /抗LAG3二重特異性抗体のT細胞促進活性を示すグラフを示している。 図38は、酵素結合免疫吸着検定法(ELISA)による、抗LAG3モノクローナル抗体B3807および対照抗体のヒトLAG3タンパク質への結合を示している。 図39は、B3807のBiacore分析結果を示している。 図40は、ジャーカットおよびPBMC細胞上のヒトLAG3へのB3807の結合活性を示している。 図41は、B3807によるMHCクラスII受容体への可溶性LAG-3(sLAG)結合の阻害を示している。 図42は、ジャーカット細胞におけるIL2産生に対するB3807の効果を示している。 図43は、初代T細胞におけるIL2産生に対する、B3807、ならびに抗PD-L1抗体との組み合わせの効果を示している。 図44は、腫瘍増殖の阻害における、単独で、または抗PD-1または抗PD-L1抗体と組み合わせた、B3807のインビボ結果を示している。 図45は、IL2放出および細胞ベースの結合アッセイにおけるB3807とB3807bを比較し、それらの高レベルの類似性を示している。 図46は、B3807とB3807bのBiacoreアッセイ結果を比較している。 図47は、B3807が可溶性LAG-3とFGL1の間の結合を効果的に阻害したことを示している。
[発明の詳細な説明]
定義
「a」または「an」実体という用語は、その実体のうちの1つまたは複数を指し、例えば、「抗体」は、1つまたは複数の抗体を表すと理解されることに留意されたい。したがって、「a」(または「an」)、「1つまたは複数」、および「少なくとも1つ」という用語は、本明細書では交換可能に使用され得る。
本明細書で使用される場合、「ポリペプチド」という用語は、単一の「ポリペプチド」ならびに複数の「ポリペプチド」を包含することを意図し、アミド結合(ペプチド結合としても知られる)によって直線的に連結されたモノマー(アミノ酸)から構成される分子を指す。「ポリペプチド」という用語は、2つ以上のアミノ酸の1つまたは複数の鎖のいずれかを指し、生成物の特定の長さを指すものではない。したがって、ペプチド、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド、「タンパク質」、「アミノ酸鎖」、または2つ以上のアミノ酸の1つまたは複数の鎖を指すために使用されるいずれかの他の用語は、「ポリペプチド」の定義に含まれ、かつ 「ポリペプチド」という用語は、これらの用語の代わりに、またはこれらの用語のいずれかと交換可能に使用され得る。「ポリペプチド」という用語はまた、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、既知の保護/遮断基による誘導体化、タンパク質分解切断、または非天然で発生するアミノ酸による修飾などの、これらに限定されない、ポリペプチドの発現後の修飾の、生成物を指すことを意図する。ポリペプチドは、天然の生物学的供給源に由来するか、または組換え技術によって産生され得るが、必ずしも指定された核酸配列から翻訳されるとは限らない。それは、化学合成を含むいずれかの方法で生成され得る。
細胞に関して本明細書で使用される「単離された」という用語は、DNAまたはRNAなどの核酸が、それぞれ、高分子の天然の供給源に存在する他のDNAまたはRNAから分離された分子を指す。本明細書で使用される「単離された」という用語はまた、組換えDNA技術によって産生される場合、細胞物質、ウイルス物質、もしくは培養培地、または化学的に合成される場合、化学前駆体もしくは他の化学物質を実質的に含まない核酸またはペプチドを指す。さらに、「単離された核酸」は、フラグメントとして天然に存在せず、天然状態では見出されないであろう核酸フラグメントを含むことを意味する。「単離された」という用語はまた、他の細胞タンパク質または組織から単離された細胞またはポリペプチドを指すために本明細書で使用される。単離されたポリペプチドは、精製されたポリペプチドおよび組換えポリペプチドの両方を包含することを意味する。
本明細書で使用される場合、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドに関連する「組換え」という用語は、天然には存在しないポリペプチドまたはポリヌクレオチドの形態を意図し、その非限定的な例は、通常は一緒に発生しないポリヌクレオチドまたはポリペプチドを組み合わせることによって産生され得る。
「相同性」または「同一性」または「類似性」は、2つのペプチド間または2つの核酸分子間の配列類似性を指す。相同性は、比較の目的で整列され得る各配列の位置を比較することによって決定され得る。比較された配列の位置が同じ塩基またはアミノ酸で占められている場合、分子はその位置で相同である。配列間の相同性の程度は、配列によって共有される一致位置または相同位置の数の関数である。「非関連」または「非相同」配列は、本開示の配列の1つと、40%未満の同一性、好ましくは25%未満の同一性を共有する。
ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド領域(またはポリペプチドまたはポリペプチド領域)は、特定のパーセンテージ(例えば、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%または99%)を有する。)の、他の配列に対する「配列同一性」の意味は、整列したときに、2つの配列を比較する際にその塩基(またはアミノ酸)のパーセンテージが同じであることを意味する。このアラインメントおよびパーセント相同性または配列同一性は、当技術分野で知られているソフトウェアプログラム、例えば、Ausubelら編 (2007) Current Protocols in Molecular Biologyに記載されているものを使用して決定され得る。好ましくは、デフォルトのパラメータが整列のために使用される。1つのアライメントプログラムは、デフォルトのパラメータを使用するBLASTである。特に、プログラムはBLASTNとBLASTPであり、次のデフォルトパラメータを使用する:Genetic code = standard; filter = none; strand = both; cutoff = 60; expect = 10; Matrix = BLOSUM62; Descriptions = 50 sequences; sort by = HIGH SCORE; Databases = non-redundant, GenBank + EMBL + DDBJ + PDB + GenBank CDS translations + SwissProtein + SPupdate + PIR。生物学的に同等のポリヌクレオチドは、上記の特定のパーセント相同性を有し、同一または類似の生物学的活性を有するポリペプチドをコードするものである。
「同等の核酸またはポリヌクレオチド」という用語は、核酸またはその相補体のヌクレオチド配列とある程度の相同性または配列同一性を有するヌクレオチド配列を有する核酸を指す。二本鎖核酸の相同体は、その相補体と、またはその相補体とある程度の相同性を有するヌクレオチド配列を有する核酸を含むことを意図している。一態様では、核酸の相同体は、前記核酸またはその補体にハイブリダイズし得る。同様に、「同等のポリペプチド」は、参照ポリペプチドのアミノ酸配列とある程度の相同性または配列同一性を有するポリペプチドを指す。いくつかの態様では、前記配列同一性は、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%である。いくつかの態様では、前記同等のポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、参照ポリペプチドまたはポリヌクレオチドと比較して、1つ、2つ、3つ、4つまたは5つの付加、欠失、置換、およびそれらのそれらの組み合わせを有する。いくつかの態様では、前記同等の配列は、参照配列の活性(例えば、エピトープ結合)または構造(例えば、塩橋)を保持する。
ハイブリダイゼーション反応は、異なる「ストリンジェンシー」の条件下で実行され得る。一般に、低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション反応は、約10xSSCまたは同等のイオン強度/温度の溶液中で約40℃で実施される。中程度のストリンジェンシーハイブリダイゼーションは、通常、約6xSSCで約50℃で行われ、高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション反応は、一般に、約1xSSCで約60℃で行われる。ハイブリダイゼーション反応はまた、当業者によく知られている「生理学的条件下」で実施され得る。生理学的状態の非限定的な例は、細胞に通常見られる温度、イオン強度、pH、およびMg2+の濃度である。
ポリヌクレオチドは、4つのヌクレオチド塩基:シトシン(C);グアニン(G);チミン(T);ポリヌクレオチドがRNAの場合、チミンの代わりにウラシル(U)、の特定の配列で構成されている。したがって、「ポリヌクレオチド配列」という用語は、ポリヌクレオチド分子のアルファベット順の表現である。このアルファベット順の表現は、中央処理装置を備えたコンピューターのデータベースに入力され得て、機能ゲノミクスや相同性検索などのバイオインフォマティクスアプリケーションに使用され得る。「多型」という用語は、遺伝子またはその一部の複数の形態の共存を指す。少なくとも2つの異なる形態、すなわち2つの異なるヌクレオチド配列が存在する遺伝子の一部は、「遺伝子の多型領域」と呼ばれる。多型領域は単一のヌクレオチドであり得て、その同一性は対立遺伝子によって異なる。
「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」という用語は交換可能に使用され、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドまたはそれらの類似体のいずれかの任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。ポリヌクレオチドは、いずれかの三次元構造を有し得て、既知または未知のいずれかの機能を実行し得る。以下は、ポリヌクレオチドの非限定的な例である:遺伝子または遺伝子断片(例えば、プローブ、プライマー、ESTまたはSAGEタグ)、エキソン、イントロン、メッセンジャーRNA(mRNA)、トランスファーRNA、リボソームRNA、リボザイム、cDNA、dsRNA、siRNA、miRNA、組換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、いずれかの配列の単離されたDNA、いずれかの配列の単離されたRNA、核酸プローブおよびプライマー。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体などの修飾ヌクレオチドを含み得る。存在する場合、ヌクレオチド構造への修飾は、ポリヌクレオチドの集合の前または後に付与され得る。前記ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分によって中断され得る。ポリヌクレオチドは、標識成分との結合などによって、重合後にさらに修飾され得る。前記用語は、二本鎖分子および一本鎖分子の両方を指す。別段の指定または要求がない限り、ポリヌクレオチドである本開示のいずれかの実施形態は、前記二本鎖形態および、前記二本鎖形態を構成することが知られているまたは予測される2つの相補的な一本鎖形態のそれぞれの両方を包含する。
ポリヌクレオチドに適用される「コードする」という用語は、その天然状態で、または当業者に周知の方法によって操作された場合に、mRNAを生成するためにポリペプチドおよび/またはそのフラグメントに転写および/または翻訳され得るポリペプチドを「コードする」と言われるポリヌクレオチドを指す。前記アンチセンス鎖はそのような核酸の相補体であり、それからコード配列を推定し得る。
本明細書で使用される場合、「抗体」または「抗原結合ポリペプチド」は、抗原を特異的に認識して結合するポリペプチドまたはポリペプチド複合体を指す。抗体は、抗体全体およびいずれかの抗原結合フラグメントまたはその一本鎖であり得る。したがって、「抗体」という用語は、抗原に結合する生物学的活性を有する免疫グロブリン分子の少なくとも一部を含むいずれかのタンパク質またはペプチド含有分子を含む。そのような例としては、重鎖または軽鎖の相補性決定領域(CDR)もしくはそのリガンド結合部分、重鎖もしくは軽鎖可変領域、重鎖または軽鎖定常領域、フレームワーク(FR)領域、もしくはそのいずれかの部分、または結合タンパク質の少なくとも一部が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される「抗体フラグメント」または「抗原結合フラグメント」という用語は、F(ab’)、F(ab)、Fab’、Fab、Fv、scFvなどの抗体の一部である。構造に関係なく、抗体フラグメントは、損傷のない抗体によって認識されるのと同じ抗原に結合する。「抗体フラグメント」という用語には、アプタマー、シュピーゲルマー、およびダイアボディが含まれる。「抗体フラグメント」という用語はまた、特定の抗原に結合して複合体を形成することによって抗体のように作用するいずれかの合成または遺伝子操作されたタンパク質を含む。
「一本鎖可変フラグメント」または「scFv」は、免疫グロブリンの重鎖(VH)および軽鎖(VL)の可変領域の融合タンパク質を指す。いくつかの態様では、前記領域は、10~約25アミノ酸の短いリンカーペプチドに接続されている。前記リンカーは、柔軟性のためにグリシンが豊富であり、溶解性のためにセリンまたはスレオニンが豊富であり、VHのN末端をVLのC末端に接続するか、またはその逆を行い得る。このタンパク質は、前記定常領域の除去と前記リンカーの導入にもかかわらず、元の免疫グロブリンの特異性を保持している。ScFv分子は当技術分野で知られており、例えば、米国特許第5,892,019号に記載されている。
抗体という用語は、生化学的に区別され得るさまざまな幅広いクラスのポリペプチドを含む。当業者は、重鎖がガンマ、ミュー、アルファ、デルタ、またはイプシロン(γ、μ、α、δ、ε)として分類され、それらの中にいくつかのサブクラス(例えば、γ1-γ4)があることを理解するであろう。この鎖の性質により、抗体の「クラス」をそれぞれIgG、IgM、IgA、IgG、またはIgEとして決定する。前記免疫グロブリンサブクラス(アイソタイプ)、例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgG5などは十分に特徴付けられており、機能的な特性を付与することが知られている。これらのクラスおよびアイソタイプのそれぞれの修正版は、本開示の観点から当業者には容易に識別可能であり、したがって、本開示の範囲内にある。すべての免疫グロブリンクラスは明らかに本開示の範囲内であり、以下の議論は一般に免疫グロブリン分子のIgGクラスに向けられる。IgGに関して、標準的な免疫グロブリン分子は、分子量が約23,000ダルトンの2つの同一の軽鎖ポリペプチド、および分子量が53,000~70,000の2つの同一の重鎖ポリペプチドを含む。前記4つの鎖は通常、「Y」構成のジスルフィド結合によって結合され、軽鎖は「Y」の口から始まり可変領域まで続く重鎖を囲む。
本開示の抗体、抗原結合ポリペプチド、それらの変異体、または誘導体としては、ポリクローナル、モノクローナル、多重特異性、ヒト、ヒト化、霊長類化、またはキメラ抗体、一本鎖抗体、エピトープ結合フラグメント、例えば、Fab、Fab’およびF(ab’)、Fd、Fvs、一本鎖Fvs(scFv)、一本鎖抗体、ジスルフィド結合Fvs(sdFv)、VKまたはVHドメインのいずれかを含むフラグメント、Fab発現ライブラリー、ならびに抗イディオタイプ(抗Id)抗体(例えば、本明細書に開示されるLIGHT抗体に対する抗Id抗体など)が挙げられるがこれらに限定されない。本開示の免疫グロブリンまたは抗体分子は、いずれかのタイプ(例えば、IgG、IgE、IgM、IgD、IgA、およびIgY)、クラス(例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgAlおよびIgA2)または免疫グロブリン分子のサブクラスであり得る。
軽鎖はカッパまたはラムダ(Κ、λ)のいずれかに分類される。各重鎖クラスは、カッパまたはラムダ軽鎖のいずれかに結合し得る。一般に、前記軽鎖および重鎖は互いに共有結合しており、免疫グロブリンがハイブリドーマB細胞または遺伝子操作された宿主細胞のいずれかによって生成される場合、前記2つの重鎖の「テール」部分は共有ジスルフィド結合または非共有結合によって互いに結合する。前記重鎖において、前記アミノ酸配列は、Y配座の分岐した末端のN末端から各鎖の下部のC末端まで伸びている。
前記軽鎖および重鎖の両方が、構造的および機能的相同性の領域に分類される。「定数」および「可変」という用語は、機能的に使用される。これに関して、軽(VK)および重(VH)鎖部分の両方の可変ドメインが抗原認識および特異性を決定することが理解されるであろう。逆に、前記軽鎖(CK)および重鎖(CH1、CH2、またはCH3)の定常ドメインは、分泌、経胎盤移動性、Fc受容体結合、補体結合などの重要な生物学的特性を付与する。慣習により、前記定常領域ドメインの番号付けは、それらが前記抗体の抗原結合部位またはアミノ末端からより遠位になるにつれて増加する。前記N末端部分は可変領域であり、前記C末端部分は定常領域である;前記CH3ドメインおよびCKドメインは、実際にはそれぞれ前記重鎖と軽鎖のカルボキシ末端を構成している。
上に示したように、前記可変領域は、前記抗体が抗原上のエピトープを選択的に認識し、特異的に結合させる。すなわち、前記抗体のVKドメインおよびVHドメイン、または相補性決定領域(CDR)のサブセットが組み合わさって、3次元の抗原結合部位を定義する可変領域を形成する。この四次抗体構造は、前記Yの各アームの端に存在する前記抗原結合部位を形成する。より具体的には、前記抗原結合部位は、前記VH鎖およびVK鎖のそれぞれ上の3つのCDR(すなわち、CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2およびCDR-L3)によって定義される。場合によっては、例えば、ラクダ種に由来する、またはラクダ免疫グロブリンに基づいて操作された特定の免疫グロブリン分子は、完全な免疫グロブリン分子が、軽鎖を含まず、重鎖のみからなり得る。Hamers-Castermanら, Nature 363: 446-448 (1993)を参照のこと。
天然に存在する抗体では、各抗原結合ドメインに存在する6つの「相補性決定領域」または「CDR」は、前記抗体が水性環境におけるその三次元配座を想定して、抗原結合ドメインを形成するように、特異的に配置されたアミノ酸の短い非連続配列である。「フレームワーク」領域と呼ばれる、前記抗原結合ドメインの残りのアミノ酸は、分子間変動が少ないことを示している。前記フレームワーク領域は主にβシート配座を採用し、前記CDRはループを形成して接続し、場合によっては前記βシート構造の一部を形成する。したがって、前記フレームワーク領域は、鎖間相互作用、非共有相互作用によって前記CDRを正しい方向に配置するための骨格を形成するように機能する。前記配置されたCDRによって形成される前記抗原結合ドメインは、前記免疫反応性抗原上のエピトープに相補的な表面を決定する。この相補的な表面は、前記抗体の同族エピトープへの非共有結合を促進する。前記CDRおよびフレームワーク領域をそれぞれ含むアミノ酸は、それらが正確に定義されているので、当業者によって、いずれかの所定の重鎖または軽鎖可変領域について容易に同定され得る(www.bioinf.org.uk: Dr. Andrew C.R. Martinのグループ; “Sequences of Proteins of Immunological Interest,” Kabat, E.ら, U.S. Department of Health and Human Services, (1983);ならびに、ChothiaおよびLesk, J. MoI. Biol., 196: 901-917 (1987)を参照のこと)。
当技術分野で使用および/または受け入れられる用語の2つ以上の定義がある場合、本明細書で使用される用語の定義は、特に反対に明示的に述べられていない限り、そのようなすべての意味を含むことを意図する。特定の例は、「相補性決定領域」(「CDR」)という用語を使用して、前記重鎖および軽鎖ポリペプチドの両方の可変領域内に見られる前記非隣接抗原結合部位を説明する。この特定の領域はその全体が参照により本明細書に援用される、Kabatら, U.S. Dept. of Health and Human Services,“Sequences of Proteins of Immunological Interest”(1983)および Chothiaら, J. MoI. Biol. 196: 901-917 (1987)によって説明されている。KabatとChothiaによる前記CDRの定義には、互いに比較した場合のアミノ酸残基の重複またはサブセットが含まれる。それにもかかわらず、前記抗体またはその変異体のCDRを指すためのいずれかの定義の適用は、本明細書で定義および使用される用語の範囲内にあることが意図されている。上記の引用文献のそれぞれによって定義されるCDRを包含する適切なアミノ酸残基は、比較として以下の表に記載されている。特定のCDRを含む正確な残基番号は、前記CDRの配列およびサイズによって異なる。当業者は、前記抗体の前記可変領域アミノ酸配列が与えられると、どの残基が特定のCDRを含むかを規定通りに決定し得る。
Figure 0007177543000001
Kabatらはまた、あらゆる抗体に適用可能な可変ドメイン配列の番号付けシステムを定義した。当業者は、配列自体を超えるいずれかの実験データに依存することなく、この「Kabatナンバリング」のシステムをいずれかの可変ドメイン配列に明確に割り当て得る。本明細書で使用される場合、「Kabatナンバリング」は、Kabatら, U.S. Dept. of Health and Human Services, “Sequence of Proteins of Immunological Interest” (1983)によって規定されたナンバリングシステムを指す。
上記の表に加えて、前記Kabat記数法は前記CDR領域を以下のように表現する:CDR-H1は、約アミノ酸31(つまり、最初のシステイン残基の後の約9残基)において始まり、約5~7アミノ酸を含み、次のトリプトファン残基で終わる。CDR-H2は、CDR-H1の終わりの後の15番目の残基で始まり、約16~19個のアミノ酸を含み、その次のアルギニンまたはリジン残基で終わる。CDR-H3は、CDR-H2の終了後約33番目のアミノ酸残基から始まり;3~25個のアミノ酸が含まれており;シーケンスW-G-X-Gで終了し、このXはいずれかのアミノ酸である。CDR-L1は約24残基から始まり(つまり、システイン残基に続く);約10~17残基が含まれており;かつ、次のトリプトファン残基で終わる。CDR-L2は、CDR-L1の終了後約16残基において始まり、約7残基を含む。CDR-L3は、CDR-L2の終了後(つまり、システイン残基に続く)の約33番目の残基において始まり;約7~11残基を含み、配列FまたはW-G-X-Gで終了し、そのXはいずれかのアミノ酸である。
本明細書に開示される抗体は、鳥および哺乳動物を含むいずれかの動物起源のものであり得る。 好ましくは、前記抗体は、ヒト、ネズミ、ロバ、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ラマ、ウマ、またはニワトリの抗体である。他の実施形態では、前記可変領域は、起源がコンドリクトイドであり得る(例えば、サメ由来)。
本明細書で使用される場合、「重鎖定常領域」という用語は、免疫グロブリン重鎖に由来するアミノ酸配列を含む。重鎖定常領域を含むポリペプチドは、CH1ドメイン、ヒンジ(例えば、上部、中間、および/または下部ヒンジ領域)ドメイン、CH2ドメイン、CH3ドメイン、またはそれらの変異体もしくは断片のうちの少なくとも1つを含む。例えば、本開示で使用するための抗原結合ポリペプチドは、CH1ドメインを含むポリペプチド鎖;CH1ドメイン、ヒンジドメインの少なくとも一部、およびCH2ドメインを含むポリペプチド鎖;CH1ドメインおよびCH3ドメインを含むポリペプチド鎖; CH1ドメイン、ヒンジドメインの少なくとも一部、およびCH3ドメインを含むポリペプチド鎖、またはCH1ドメイン、ヒンジドメインの少なくとも一部、CH2ドメイン、およびCH3ドメインを含むポリペプチド鎖を含み得る。他の実施形態では、本開示のポリペプチドは、CH3ドメインを含むポリペプチド鎖を含む。さらに、本開示で使用するための抗体は、CH2ドメインの少なくとも一部(例えば、CH2ドメインの全部または一部)を欠き得る。上記のように、前記重鎖定常領域は、前記天然に存在する免疫グロブリン分子とはアミノ酸配列が異なるように修飾され得ることが当業者によって理解されるであろう。
本明細書に開示される抗体の重鎖定常領域は、異なる免疫グロブリン分子に由来し得る。例えば、ポリペプチドの重鎖定常領域は、IgG1分子に由来するCH1ドメインおよびIgG3分子に由来するヒンジ領域を含み得る。他の例では、重鎖定常領域は、一部はIgG1分子に由来し、一部はIgG3分子に由来するヒンジ領域を含み得る。他の例では、重鎖部分は、一部はIgG1分子に由来し、一部はIgG4分子に由来するキメラヒンジを含み得る。
本明細書で使用される場合、「軽鎖定常領域」という用語は、抗体軽鎖に由来するアミノ酸配列を含む。好ましくは、前記軽鎖定常領域は、一定のカッパドメインまたは一定のラムダドメインのうちの少なくとも1つを含む。
「軽鎖-重鎖ペア」とは、軽鎖のCLドメインと重鎖のCH1ドメインとの間のジスルフィド結合を介して二量体を形成し得る軽鎖と重鎖の集合を指す。
前に示したように、様々な免疫グロブリンクラスの定常領域のサブユニット構造および三次元構成はよく知られている。本明細書で使用される場合、「VHドメイン」という用語は、免疫グロブリン重鎖のアミノ末端可変ドメインを含み、「CH1ドメイン」という用語は、免疫グロブリン重鎖の第1の(最もアミノ末端の)定常領域ドメインを含む。前記CH1ドメインは前記VHドメインに隣接しており、免疫グロブリン重鎖分子の前記ヒンジ領域のアミノ末端に存在する。
本明細書で使用される場合、「CH2ドメイン」という用語は、例えば、従来の番号付けスキーム(残基244~360、Kabatナンバリングシステム;および残基231~340、EUナンバリングシステム;Kabatら, U.S. Dept. of Health and Human Services, “Sequences of Proteins of Immunological Interest” (1983)を参照のこと)を使用して抗体の約残基244~残基360に広がる重鎖分子の部分を含む。前記CH2ドメインは、他のドメインと密接にペアになっていないという点で特有である。むしろ、2つのN-結合型分岐炭水化物鎖が、損傷のないネイティブIgG分子の前記2つのCH2ドメインの間に挿入されている。また、前記CH3ドメインが前記CH2ドメインから前記IgG分子のC末端まで伸びており、約108残基を含むことをも十分に立証されている。
本明細書で使用される場合、「ヒンジ領域」という用語は、前記CH1ドメインを前記CH2ドメインに結合する重鎖分子の部分を含む。このヒンジ領域は約25残基を含み、柔軟性があるため、2つのN末端抗原結合領域を独立して動かす。ヒンジ領域は、上部、中間、下部のヒンジドメインの3つの異なるドメインに細分され得る(Rouxら, J. Immunol 161: 4083 (1998))。
本明細書で使用される場合、「ジスルフィド結合」という用語は、2つの硫黄原子の間に形成される共有結合を含む。 前記アミノ酸システインは、ジスルフィド結合を形成し得るか、または第2のチオール基と架橋し得るチオール基を含む。ほとんどの天然に存在するIgG分子では、前記CH1およびCK領域はジスルフィド結合によって結合され、前記2つの重鎖はKabatナンバリングシステム(226位または229位、EUナンバリングシステム)を使用して239および242に対応する位置で2つのジスルフィド結合によって結合される。
本明細書で使用される場合、「キメラ抗体」という用語は、前記免疫反応性領域または部位が第1の種および定常領域(本開示に従って損傷はないか、部分的であるか、または改変され得る)から得られるかまたは誘導されるいずれかの抗体が2番目の種から得られると意味すると解釈される。特定の実施形態では、前記標的結合領域または部位は、非ヒト供給源(例えば、マウスまたは霊長類)に由来し、かつ、前記定常領域はヒトである。
本明細書で使用される場合、「ヒト化パーセント」は、前記ヒト化ドメインと前記生殖系列ドメインとの間のフレームワークアミノ酸の差異(すなわち、非CDR差異)の数を決定し、アミノ酸の総数からその数を差し引き、次にアミノ酸の総数で除算して100を掛けることによって計算される。
「特異的に結合する」または「特異性を有する」とは、一般に、抗体がその抗原結合ドメインを介してエピトープに結合し、前記結合が前記抗原結合ドメインと前記エピトープとの間のある程度の相補性を伴うことを意味する。この定義によれば、抗体は、ランダムな無関係のエピトープに結合するよりも容易に、その抗原結合ドメインを介してそのエピトープに結合する場合に、エピトープに「特異的に結合する」と言われる。「特異性」という用語は、本明細書では、特定の抗体が特定のエピトープに結合するための相対的な親和性を限定するために使用される。例えば、抗体「A」は、抗体「B」よりも所与のエピトープに対して高い特異性を有すると見なされ得るか、または抗体「A」は、関連するエピトープ「D」に対するよりも高い特異性でエピトープ「C」に結合すると言われ得る。好ましくは、前記抗体は、「高親和性」、すなわち、1×10-7M以下、より好ましくは5×10-8M以下、より好ましくは3×10-8M以下、より好ましくは1×10-8M以下、より好ましくは25×10-9M以下、またはさらにより好ましくは1×10-9M以下のKDで抗原(またはエピトープ)に結合する。
本明細書で使用される場合、「治療する」または「治療」という用語は、治療的治療と予防的または予防的措置の両方を指し得て、その目的は、癌の進行などの望ましくない生理学的変化または障害を予防または減速(軽減)することである。有益なまたは望ましい臨床結果としては、検出可能か検出不可能かに関わらず、症状の緩和、疾患の程度の減少、疾患の安定した(すなわち、悪化しない)状態、疾患の進行の遅延または遅延、病状の改善または緩和、および寛解(部分的または全体的)が挙げられるが、これらに限定されない。「治療」はまた、治療を受けていない場合に予想される生存と比較して生存を延長することを意味し得る。治療が必要な人としては、すでに病状または障害を患っている人、および病状もしくは障害を患いやすい人、または病状もしくは障害を予防する必要がある人が挙げられる。
「対象」または「個体」または「動物」または「患者」または「哺乳動物」とは、診断、予後、または治療が望まれるいずれかの対象、特に哺乳動物対象を指し得る。哺乳類の対象としては、人間、家畜、家畜、動物園、スポーツ、または犬、猫、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、馬、畜牛、乳牛などのペット動物が挙げられる。
本明細書で使用される場合、「治療を必要とする患者へ」または「治療を必要とする対象」などの句は、例えば、検出用、診断手順用、および/または治療用に使用される本開示の抗体または組成物の投与から利益を得るであろう哺乳動物対象などの対象を含む。
本開示は、PD-L1とその受容体PD-1との間、およびLAG3とそのリガンド(例えば、MHCクラスII分子)との間の相互作用を効果的に遮断し得る抗PD-L1/抗LAG3二重特異性抗体を提供する。前記二重特異性抗体は、PD-L1タンパク質(例えば、ヒトPD-L1タンパク質)およびLAG3タンパク質(例えば、ヒトLAG3タンパク質)の両方に対して高い結合親和性を有し得る。
前記抗PD-L1/抗LAG3二重特異性抗体は、PD-L1タンパク質を特異的に認識および/または結合し得る、PD-L1標的化部分としての抗PD-L1抗体またはその抗原結合フラグメント、ならびにLAG3タンパク質を特異的に認識および/または結合し得るLAG3標的化部分としての抗LAG3抗体またはその抗原結合フラグメントを含み得る。
抗PD-L1抗体
前記抗PD-L1/抗LAG3二重特異性抗体は、抗PD-L1抗体またはその抗原結合フラグメントをPD-L1標的化部分として含み得る。前記PD-L1抗体またはその抗原結合フラグメントは、PD-L1に対して強力な結合および阻害活性を示し得て、治療および診断の用途に有用である。
前記PD-L1タンパク質は、40kDaの1型膜貫通タンパク質である。前記PD-L1タンパク質はヒトPD-L1タンパク質であり得て、前記ヒトPD-L1タンパク質は、GenBankアクセッション番号NP_001254635.1、NP_001300958.1、NP_054862.1などによって表されるタンパク質からなる群から選択され得るが、これに限定され得ない。前記ヒトPD-L1タンパク質には、N末端免疫グロブリンV(IgV)ドメイン(アミノ酸19~127)およびC末端免疫グロブリンC(IgC)ドメイン(アミノ酸133~225)などの細胞外部分が含まれる。PD-L1のIgVドメインに結合し、それによってPD-1とPD-L1との間の結合を破壊する既存の抗PD-L1抗体とは異なり、前記二重特異性抗体に含まれる前記抗PD-L1抗体またはそのフラグメントは前記PD-L1タンパク質の免疫グロブリンV(IgV)ドメインには結合しないが、PD-L1のIgCドメインに結合して、PD-L1を効果的に阻害し、それによって治療効果を向上させ得る。
特に、前記二重特異性抗体に含まれる前記抗PD-L1抗体またはそのフラグメントは、PD-L1タンパク質の免疫グロブリンC(IgC)ドメインに特異的に結合し得る。ヒトPD-L1タンパク質の場合、前記Ig Cドメインは、前記ヒトPD-L1タンパク質の全長のアミノ酸残基133~225を含むか、本質的にそれで構成される。より具体的には、前記抗PD-L1抗体またはそのフラグメントは、ヒトPD-L1タンパク質のアミノ酸残基Y134、K162、およびN183から選択される少なくとも1つに結合し得る。いくつかの実施形態では、前記抗PD-L1抗体またはそのフラグメントは、ヒトPD-L1タンパク質のアミノ酸残基Y134、K162、およびN183から選択される少なくとも2つに結合得る。いくつかの実施形態では、前記抗PD-L1抗体またはそのフラグメントは、前記PD-L1タンパク質の免疫グロブリンV(IgV)ドメインに結合せず、ここで、前記IgVドメインは、ヒトPD-L1タンパク質のアミノ酸残基19~127からなる。
一実施形態では、ヒトPD-L1タンパク質に特異的に結合し得る抗体およびそのフラグメントが提供される。これらの抗体は、さまざまな種類の癌、感染症(炎症)などの治療などの治療目的に役立ち得て、診断および予後の目的にも使用され得る。
前記抗PD-L1抗体またはそのフラグメントは、(1)配列番号1および61~67からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR1;(2)配列番号2、68~77、および525~527からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR2;(3)配列番号3、78~90および513~519からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR3;(4)配列番号4、91~92、および520~521からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL CDR1;(5)配列番号5および93~105からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL CDR2;ならびに、(6)配列番号6、106~111、および522~524からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL CDR3を含み得る。
Figure 0007177543000002
Figure 0007177543000003
Figure 0007177543000004
いくつかの実施形態では、前記抗体またはそのフラグメントとしては、上記の置換のうちの1つ以下、2つ以下、または3つ以下を含む。いくつかの実施形態では、前記抗体またはそのフラグメントは、配列番号1のVH CDR1または配列番号61~67のVH CDR1のいずれか、配列番号2、525、526または527のVH CDR2、配列番号3のVH CDR3、配列番号4のVL CDR1、配列番号5のVL CDR2、および配列番号6のVL CDR3が挙げられる。
いくつかの実施形態では、前記抗体またはそのフラグメントとしては、配列番号1のVH CDR1、配列番号2のVH CDR2、または配列番号68~77、525、526もしくは527のいずれかのVH CDR2、配列番号3のVH CDR3、配列番号4のVL CDR1、配列番号5のVL CDR2、および配列番号6のVL CDR3が挙げられる。
いくつかの実施形態では、前記抗体またはそのフラグメントとしては、配列番号1のVH CDR1、配列番号2、525、526または527のVH CDR2、配列番号3のVH CDR3、または配列番号78~90および513~519のいずれかのVH CDR3、配列番号4のVL CDR1、配列番号5のVL CDR2、ならびに配列番号6のVL CDR3が挙げられる。
いくつかの実施形態では、前記抗体またはそのフラグメントとしては、配列番号1のVH CDR1、配列番号2、525、526または527のVH CDR2、配列番号3のVH CDR3、 配列番号4のVL CDR1または配列番号91~92および520~521のいずれかのVL CDR1、配列番号5のVL CDR2、ならびに配列番号6のVL CDR3が挙げられる。
いくつかの実施形態では、前記抗体またはそのフラグメントとしては、配列番号1のVH CDR1、配列番号2、525、526または527のVH CDR2、配列番号3のVH CDR3、 配列番号4のVL CDR1、配列番号5のVL CDR2または配列番号93~105のいずれかのVL CDR2、および配列番号6のVL CDR3が挙げられる。
いくつかの実施形態では、前記抗体またはそのフラグメントとしては、配列番号1のVH CDR1、配列番号2、525、526または527のVH CDR2、配列番号3のVH CDR3、 配列番号4のVL CDR1、配列番号5のVL CDR2、ならびに配列番号6のVL CDR3、または配列番号106~111および522~524のいずれかのVL CDR3が挙げられる。
例えば、前記抗PD-L1抗体またはそのフラグメントは、配列番号1のアミノ酸配列を有するVH CDR1;配列番号2、525、526または527のアミノ酸配列を有するVH CDR2;(3)配列番号3または515のアミノ酸配列を有するVH CDR3;配列番号4のアミノ酸配列を有するVL CDR1;配列番号5のアミノ酸配列を有するVL CDR2;配列番号6のアミノ酸配列を有するVL CDR3が挙げられ得る。
いくつかの実施形態では、配列番号1のアミノ酸配列を有するVH CDR1;配列番号525のアミノ酸配列を有するVH CDR2;配列番号3のアミノ酸配列を有するVH CDR3;配列番号4のアミノ酸配列を有するVL CDR1;配列番号5のアミノ酸配列を有するVL CDR2;配列番号6のアミノ酸配列を有するVL CDR3を含む抗PD-L1抗体またはそのフラグメントが提供される。
いくつかの実施形態では、配列番号1のアミノ酸配列を有するVH CDR1;配列番号526のアミノ酸配列を有するVH CDR2;配列番号515のアミノ酸配列を有するVHCDR3;配列番号4のアミノ酸配列を有するVLCDR1;配列番号5のアミノ酸配列を有するVL CDR2;配列番号6のアミノ酸配列を有するVL CDR3を含む抗PD-L1抗体またはそのフラグメントが提供される。
VH(重鎖可変領域)の非限定的な例は、配列番号7~26、113、493、495、497、499、501、503、505、507、509、および511において提供され、ここで、配列番号113はマウスVHであり、配列番号7~26はヒト化VHであり、配列番号493、495、497、499、501、503、505、507、509、および511は親和性の成熟したヒト化抗体のVHである。さらに、ヒト化VHの中で、配列番号9~15、17~21および23~26は、マウスバージョンへの1つまたは複数の逆突然変異を含む。同様に、VL(VK;軽鎖(カッパ型)可変領域)の非限定的な例は、配列番号27~33、494、496、498、500、502、504、506、508、510、および512において提供される。配列番号28および30は、実施例に示されるように、最初に誘導され、CDRグラフト化され、ヒト化された配列であり、配列番号29および31~33は、逆突然変異を伴うヒト化VLである。
前記逆変異は、前記抗PD-L1抗体の特定の特性を保持するのに役立ち得る。いくつかの実施形態では、本開示の抗PD-L1抗体、特にヒトまたはヒト化抗体は、1つまたは複数の前記逆突然変異を含み得る。いくつかの実施形態では、前記重鎖可変領域(VH)における逆突然変異(すなわち、指定された位置に含まれるアミノ酸)は、前記重鎖可変領域の、Kabatナンバリングによる、(a)44位のSer、(b)49位のAla、(c)53位のAla、(d)91位のIle、(e)1位のGlu、(f)37位のVal、(g)40位のThr、(h)53位のVal、(i)54位のGlu、(j)77位のAsn、(k)94位のArg、および(l)108位のThrならびにそれらの組み合わせの1つまたは複数から選択される。いくつかの実施形態では、前記VH逆突然変異は、前記重鎖可変領域の、Kabatナンバリングによる、(a)44位のSer、(b)49位のAla、(c)53位のAla、および/または(d)91位のIleならびにそれらの組み合わせから選択される。
いくつかの実施形態では、軽鎖可変領域(VL)における逆突然変異は、軽鎖可変領域の、Kabatナンバリングによる、(a)22位のSer、(b)42位のGln、(c)43位のSer、(d)60位のAsp、および(e)63位のThr、ならびにそれらの組み合わせの1つまたは複数から選択される。
いくつかの実施形態では、本開示の抗PD-L1抗体またはそのフラグメントは、配列番号7~26、113、493、495、497、499、501、503、505、507、509、および511から選択されるVH、配列番号27~33、494、496、498、500、502、504、506、508、510、および512から選択されるVL、または上記のそれぞれの生物学的同等物を含み得る。前記VHおよび/またはVLの生物学的同等物は、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の配列同一性を有しながら指定されたアミノ酸(例えば、CDR)などのアミノ酸配列を有し得る。例えば、配列番号20の生物学的同等物は、配列番号20に対して全体的に80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%または99%の配列同一性を有するが、前記CDR(配列番号1~6またはそれらの変異体)を保持し、1つもしくは複数、またはすべての逆突然変異を保持していてもよいVHであり得る。
前記抗体またはそのフラグメントの非限定的な例は、配列番号20または501のアミノ酸配列、またはその生物学的同等物を含むか、または本質的にそれらからなる重鎖可変領域、および配列番号28または502のアミノ酸配列、またはそれらの生物学的同等物を含むか、または本質的にそれらからなる軽鎖可変領域を含み得る。
いくつかの実施形態では、前記抗PD-L1抗体またはそのフラグメントは、重鎖定常領域、軽鎖定常領域、Fc領域、またはそれらの組み合わせをさらに含む。いくつかの実施形態では、前記軽鎖定常領域は、カッパまたはラムダ鎖定常領域であり得る。いくつかの実施形態では、前記抗体は、IgG、IgM、IgA、IgEまたはIgDのアイソタイプ、例えば、ヒトIgG、ヒトIgM、ヒトIgA、ヒトIgE、またはヒトIgDのものである。いくつかの実施形態では、前記アイソタイプは、IgG、例えば、IgG1、IgG2、IgG3、またはIgG4などのヒトIgGであり得る。いくつかの実施形態では、前記フラグメント(抗PD-L1抗体の抗原結合フラグメント)は、前記抗体の重鎖CDRおよび/または軽鎖CDRを含むいずれかのフラグメントであり得て、例えばそれは、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fd(重鎖可変領域およびCH1ドメインを含む)、Fv(重鎖可変領域および/または 軽鎖可変領域)、一本鎖Fv(scFv;重鎖可変領域および軽鎖可変領域をいずれかの順序において、および重鎖可変領域と軽鎖可変領域との間のペプチドリンカーを含むかまたは本質的にそれらからなる)、一本鎖抗体、ジスルフィド結合Fv(sdFv)などからなる群から選択され得る。
限定されないが、前記抗PD-L1抗体またはそのフラグメントは、キメラ抗体、ヒト化抗体、または完全ヒト抗体である。一態様では、前記抗体またはそのフラグメントは、天然に存在するものでも、化学的または組換え的に合成されるものでもない。
これらの抗体のそれぞれがヒトPD-L1などのPD-L1に結合し得ることを考慮すると、前記CDR配列またはVHおよびVL配列を「混合および適合」させて、本開示の他の抗LAG-3結合分子を製造し得る。好ましくは、前記CDR配列またはVHおよびVL鎖が混合されて一致する場合、例えば、特定のVH/VL対からのVH配列は、構造的に類似したVH配列で置き換えられる。同様に、好ましくは、特定のVH/VL対からのVL配列は、構造的に類似したVL配列で置き換えられる。
抗LAG3抗体
前記抗PD-L1/抗LAG3二重特異性抗体は、LAG3標的化部分として抗LAG3抗体またはその抗原結合フラグメントを含み得る。
一実施形態では、LAG3(例えば、ヒトLAG3)タンパク質に特異的に結合し得る抗体およびそのフラグメントが提供され;例えば、前記抗LAG3抗体またはそのフラグメントは、LAG-3の細胞外ドメインに結合し得る。
例えば、前記ヒトLAG3タンパク質は、GenBankアクセッション番号NP_002277.4などによって表されるタンパク質からなる群から選択され得るが、それに限定され得ない。これらの抗LAG3抗体は、さまざまな種類の癌、感染症(炎症)などの治療などの治療目的に役立ち得て、診断および予後の目的にも使用され得る。
「LAG-3」または「LAG3」という用語は、リンパ球活性化遺伝子-3を指す。免疫グロブリン(Ig)スーパーファミリーに属する前記LAG3タンパク質は、D1~D4と呼ばれる4つの細胞外Ig様ドメインを有する503アミノ酸のI型膜貫通タンパク質を含む。本明細書に記載されるように、「LAG-3」という用語は、変異体、アイソフォーム、ホモログ、オルソログ、およびパラログを含む。例えば、ヒトLAG-3タンパク質に特異的な抗体は、場合によっては、ヒト以外の種からのLAG-3タンパク質と交差反応し得る。他の実施形態では、ヒトLAG-3タンパク質に特異的な抗体は、ヒトLAG-3タンパク質に完全に特異的であり得、種または他のタイプの交差反応性を示し得ないか、または、他のすべての種ではなく、特定の他の種のLAG-3と交差反応し得る(例えば、サルLAG-3と交差反応するが、マウスLAG-3とは交差反応しない)。「ヒトLAG-3」という用語は、GenBankアクセッション番号NP 002277.4を有するヒトLAG-3の完全なアミノ酸配列などのヒト配列LAG-3を指す。「マウスLAG-3」という用語は、GenBankアクセッション番号NP 032505を有するマウスLAG-3の完全なアミノ酸配列などのマウス配列LAG-3を指す。LAG-3はまた、当技術分野では、例えば、CD223としても知られている。前記ヒトLAG-3配列は、例えば、保存された突然変異または非保存領域における突然変異を有することにより、GenBankアクセッション番号NP 002277.4のヒトLAG-3とは異なり得て、前記LAG-3は、GenBankアクセッション番号NP002277.4の前記ヒトLAG-3と実質的に同一の生物学的機能を有する。例えば、ヒトLAG-3の生物学的機能は、本開示の抗体によって特異的に結合されるLAG-3の細胞外ドメインにエピトープを有するか、またはヒトLAG-3の生物学的機能は、MHCクラスII分子に結合する。
実験例に示されるように、本明細書に開示される抗LAG-3抗体のいくつかは、既知の抗LAG-3抗体では示されない活性を示した。例えば、現在開示されている抗体は、MHCクラスII分子への結合に加えて、前記LAG-3タンパク質のガレクチン-3(LGALS3)およびC型レクチンドメインファミリー4メンバーG(LSECtin)タンパク質への結合を阻害し得る。対照的に、既知の抗LAG-3抗体は、MHCクラスII分子への結合に対する阻害効果のみを示している。いくつかの実施形態では、本開示の抗体およびそのフラグメントは、エフェクターT細胞(Teffs)に対する制御性T細胞(Treg)の阻害効果を逆転させ得る。いくつかの実施形態では、本開示の抗体およびそのフラグメントは、LAG3とフィブリノーゲン様タンパク質1(FGL1)との間の結合を阻害し得る。
これらの抗LAG3抗体は、さまざまな種類の癌、感染症(炎症)などの治療などの治療目的に役立ち得て、診断および予後の目的にも使用され得る。
一実施形態では、ヒトLAG3タンパク質に特異性を有し得る抗体またはそのフラグメントが提供される。前記抗LAG3抗体またはそのフラグメントは、(i)配列番号116~117、354、および453~460からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR1;(ii)配列番号118~119、355、および461~467からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR2;(iii)配列番号120~160、356、および468~475からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR3;(iv)配列番号163~195、229、357、および490からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL CDR1;(v)配列番号196~217、358、および476~483からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL CDR2;ならびに、(vi)配列番号218~228、230~253、359、および484~489からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL CDR3を含み得る。例えば、前記抗LAG3抗体またはそのフラグメントは、配列番号354のアミノ酸配列を有するVH CDR1;配列番号355または461のアミノ酸配列を有するVH CDR2;配列番号356または468のアミノ酸配列を有するVH CDR3;配列番号357または490のアミノ酸配列を有するVL CDR1;配列番号358のアミノ酸配列を有するVL CDR2;および配列番号359または488のアミノ酸配列を有するVL CDR3を含み得る。
Figure 0007177543000005
Figure 0007177543000006
Figure 0007177543000007
Figure 0007177543000008
Figure 0007177543000009
非限定的な例において、LAG3に特異性を有する抗体またはフラグメントは、表27に列挙された抗体のいずれかに示されるように、VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2、およびVL CDR3の組み合わせを有する。例えば、前記CDRは、配列番号354のVH CDR1、配列番号461のVH CDR2、配列番号468のVH CDR3、配列番号490のVL CDR1、配列番号358のVL CDR2、および配列番号488のVL CDR3を含む147H 3807からのものであり得る。前記重鎖/軽鎖可変領域に対して少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%または99.5%の配列同一性を有し、それぞれのCDR配列を保持するものなど、これらの抗体の変異体もまた提供される。
一実施形態では、例えば、提供されるのは、ヒトLAG3タンパク質に対する特異性を有し、配列番号443のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、または配列番号443のアミノ酸配列に対して少なくとも90%の配列同一性を有し、配列番号354のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号461のアミノ酸配列を含むVH CDR2、および配列番号468のアミノ酸配列を含むVH CDR3を有するポリペプチド、ならびに、配列番号444のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、または配列番号444のアミノ酸配列に対して少なくとも90%の配列同一性を有し、配列番号490のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号358のアミノ酸配列を含むVL CDR2、および配列番号488のアミノ酸配列を含むVL CDR3を有するポリペプチドを含む抗体またはその抗原結合フラグメントである。
前記抗LAG3抗体またはそのフラグメントの非限定的な例において、
(1)前記重鎖可変領域は、配列番号254~302、352、360~373、375、377、379、381、383、385、387、389、391、393、395、397、399、401、403、405、407、409、411、413、415、417、419、421、423、425、427、429、431、433、435、437、439、441、443、445、447、449、451、および491からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、または上記のアミノ酸配列対して少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の配列同一性を有するポリペプチドを含むか、または本質的にそれからなり得て;および/または、
(2)前記軽鎖可変領域は、配列番号303~351、353、374、376、378、380、382、384、386、388、390、392、394、396、398、400、402、404、406、408、410、412、414、416、418、420、422、424、426、428、430、432、434、436、438、440、442、444、446、448、450、452、および492からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、または上記のアミノ酸配列に対して少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の配列同一性を有するポリペプチドを含むか、または本質的にそれからなり得る。
前記抗LAG3抗体またはそのフラグメントの非限定的な例は、配列番号352もしくは443のアミノ酸配列を含むか、または本質的にそれからなる重鎖可変領域、および配列番号353もしくは444のアミノ酸配列を含むか、または本質的にそれからなる軽鎖可変領域を含み得る。
ヒト化抗体またはフラグメントの場合、特定の逆変異を組み込み得る。いくつかの実施形態では、前記重鎖可変領域は、以下からなる群から選択される1つまたは複数のアミノ酸残基を含む:Kabatナンバリングによる、
(a)71位のAla(A)、
(b)69位のLeu(L)、
(c)66位のLys(K)、
(d)67位のAla(A)、
(e)48位のIle(I)、
(f)37位のIle(I)、
(g)38位のLys(K)、
(h)91位のPhe(F)、および、
(i)1位のGlu(E)、ならびにそれらの組み合わせ。
いくつかの実施形態では、前記重鎖可変領域は、71位にAla(A)を含む。いくつかの実施形態では、前記重鎖可変領域は、69位にLeu(L)を含む。いくつかの実施形態では、前記重鎖可変領域は、66位にLys(K)を含む。いくつかの実施形態では、前記重鎖可変領域は、67位にAla(A)を含む。いくつかの実施形態では、前記重鎖可変領域は、48位にIle(I)を含む。いくつかの実施形態では、前記重鎖可変領域は、37位にIle(I)を含む。いくつかの実施形態では、前記重鎖可変領域は、38位にLys(K)を含む。いくつかの実施形態では、前記重鎖可変領域は、91位にPhe(F)を含む。いくつかの実施形態では、前記重鎖可変領域は、1位にGlu(E)を含む。
いくつかの実施形態では、前記重鎖可変領域は、以下からなる群から選択される1つまたは複数のアミノ酸残基を含む:Kabatナンバリングによる、
(a)71位のAla(A)、
(b)69位のLeu(L)、
(c)66位のLys(K)、
(d)67位のAla(A)、
(e)48位のIle(I)、
(f)37位のIle(I)、および
(g)38位のLys(K)、ならびにそれらの組み合わせ。いくつかの実施形態では、前記重鎖可変領域は、上記に列挙された残基のすべてを含む。
本開示の抗体は、前記抗体の特定の機能的特徴または特性によって特徴付けられる。例えば、前記抗体は、ヒトLAG-3に特異的に結合し、特定の他の種からのLAG-3、例えば、サルLAG-3、例えば、カニクイザル、アカゲザル、に結合し得るが、特定の他の種からのLAG-3、例えば、マウスLAG-3に実質的に結合し得ない。好ましくは、本開示の抗体は、高い親和性でヒトLAG-3に結合する。
抗原特異的T細胞応答などの免疫応答を刺激する抗体の能力は、例えば、インターロイキン-2(IL-2)、または抗原特異的T細胞応答におけるインターフェロンガンマ(IFN-ガンマ)産生を刺激する抗体の能力によって示され得る。特定の実施形態では、本開示の抗体は、ヒトLAG-3に結合し、抗原特異的T細胞応答を刺激する能力を示す。他の実施形態では、本開示の抗体は、ヒトLAG-3に結合するが、抗原特異的T細胞応答を刺激する能力を示さない。免疫応答を刺激する抗体の能力を評価する他の手段としては、invivo腫瘍移植モデルなどの腫瘍増殖を阻害する抗体の能力、または、NODマウスモデルで糖尿病の発症を促進する能力などの、自己免疫モデルで自己免疫疾患の発症を促進する能力などの、自己免疫応答を刺激する抗体の能力が挙げられる。
本開示の抗体のLAG-3への結合は、当技術分野で十分に確立された1つまたは複数の技術を使用して評価され得る。例えば、好ましい実施形態では、前記抗体は、前記抗体が、細胞表面にLAG-3、例えばヒトLAG-3、またはサルLAG-3、例えばアカゲザルもしくはカニクイザル、またはマウスLAG-3を発現するようにトランスフェクトされている、CHO細胞などのヒトLAG-3を発現する細胞株と反応するフローサイトメトリーアッセイによって試験され得る。フローサイトメトリーアッセイで使用するのに適した他の細胞としては、天然のLAG-3を発現する抗CD3刺激CD4+活性化T細胞が挙げられる。さらに、または代わりに、結合動態(例えば、KD値)などの、抗体の結合は、BIAcore結合アッセイで試験され得る。さらに他の適切な結合アッセイとしては、例えば組換えLAG-3タンパク質を使用するELISAアッセイが挙げられる。好ましくは、本開示の抗体は、5×10-8M以下のKDでLAG-3タンパク質に結合し、2×10-8M以下のKDでLAG-3タンパク質に結合し、5x10-9M以下のKDでLAG-3タンパク質に結合し、4x10-9M以下のKDでLAG-3タンパク質に結合し、3x10-9M以下のKDでLAG-3タンパク質に結合し、2x10-9M以下のKDでLAG-3タンパク質に結合し、125x10-9M以下のKDでLAG-3タンパク質に結合し、5x10-10M以下のKDでLAG-3タンパク質に結合し、または1x10-10M以下のKDでLAG-3タンパク質に結合する。
いくつかの実施形態では、前記抗LAG3抗体またはそのフラグメントは、重鎖定常領域、軽鎖定常領域、Fc領域、またはそれらの組み合わせをさらに含む。いくつかの実施形態では、前記軽鎖定常領域は、カッパまたはラムダ鎖定常領域であり得る。いくつかの実施形態では、前記抗体は、IgG、IgM、IgA、IgEまたはIgDのアイソタイプ、例えば、ヒトIgG、ヒトIgM、ヒトIgA、ヒトIgE、またはヒトIgDのものである。いくつかの実施形態では、前記アイソタイプは、IgG、例えば、IgG1、IgG2、IgG3、またはIgG4などのヒトIgGであり得る。いくつかの実施形態では、前記フラグメント(抗PD-L1抗体の抗原結合フラグメント)は、前記抗体の重鎖CDRおよび/または軽鎖CDRを含むいずれかのフラグメントであり得て、例えば、それは、Fab、Fab’、F(ab’)、Fd(重鎖可変領域およびCH1ドメインを含む)、Fv(重鎖可変領域および/または軽鎖可変領域を含む)、一本鎖Fv(scFv;重鎖可変領域および軽鎖可変領域をいずれかの順序で、重鎖可変領域と軽鎖可変領域との間のペプチドリンカー含むかまたは本質的にそれらからなる)、一本鎖抗体、ジスルフィド結合Fv(sdFv)などからなる群から選択され得る。
限定されないが、前記抗LAG3抗体またはそのフラグメントは、キメラ抗体、ヒト化抗体、または完全ヒト抗体である。一態様では、前記抗体またはそのフラグメントは、天然に存在するものでも、化学的または組換え的に合成されるものでもない。
これらの抗体のそれぞれがヒトLAG-3などのLAG-3に結合し得ることを考慮すると、前記CDR配列またはVHおよびVL配列を「混合および適合」させて、本開示の他の抗LAG-3結合分子を製造し得る。好ましくは、前記CDR配列またはVHおよびVL鎖が混合されて一致する場合、例えば、特定のVH/VL対からのVH配列は、構造的に類似したVH配列で置き換えられる。同様に、好ましくは、特定のVH/VL対からのVL配列は、構造的に類似したVL配列で置き換えられる。
抗PD-L1/抗LAG3二重特異性抗体
前記PD-L1標的部分およびLAG3標的部分を含む二重特異性抗体では、前記PD-L1標的部分およびLAG3標的部分の一方は完全長抗体であり、もう一方は重鎖CDR、軽鎖CDR、またはそれらの組み合わせを含む抗原結合フラグメント(scFvなど)であり得る。前記PD-L1およびLAG3タンパク質の1つを標的とする完全長抗体、および前記他のタンパク質を標的とする抗原結合フラグメントは、直接またはペプチドリンカーを介して化学的に結合(例えば、共有結合)し得る。前記抗原結合フラグメント(例えば、scFv)は、直接またはペプチドリンカーを介して、前記完全長抗体のN末端(例えば、軽鎖または全長抗体の重鎖のN末端)、完全長抗体のC末端(例えば、完全長抗体の重鎖(またはFcまたはCH3ドメイン)のC末端)、またはその両方に連結され得る(図32を参照のこと)。
一実施形態では、前記二重特異性抗体としては、全長抗PD-L1抗体、抗LAG3抗体の抗原結合フラグメント(例えば、scFv)、およびそれらの間のペプチドリンカーが挙げられ得る。他の実施形態では、前記二重特異性抗体としては、全長抗LAG3抗体、抗PD-L1抗体の抗原結合フラグメント(例えば、scFv)、およびそれらの間のペプチドリンカーが挙げられ得る。
一実施形態では、前記二重特異性抗体に含まれるscFvは、いずれかの順序で重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み得る。例えば、前記二重特異性抗体に含まれるscFvは、N末端からC末端への方向に重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み得て、この際それらの間のペプチドリンカーを含んでいてもよく、前記二重特異性抗体に含まれるscFvは、N末端からC末端への方向に軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含み得て、この際、それらの間のペプチドリンカーを含んでいてもよい。
二重特異性抗体にペプチドリンカーを使用すると、抗体の純度が高くなり得る。
本明細書で使用される場合、「ペプチドリンカー」という用語は、1~100、特に2~50のいずれかのアミノ酸を含むものであり得て、いずれかの種類のアミノ酸が制限なしに含まれ得る。前記ペプチドリンカーは、例えば、Gly、Asnおよび/またはSer残基を含み得て、さらに、Thrおよび/またはAlaなどの中性アミノ酸を含み得る。前記ペプチドリンカーに適したアミノ酸配列は、関連技術で知られているものであり得る。一方、前記ペプチドリンカーの長さは、前記融合タンパク質の機能が影響を受けないような制限内で様々に決定され得る。例えば、前記ペプチドリンカーは、合計約1~約100、約2~約50、または約5~約25の、Gly、Asn、Ser、Thr、およびAlaからなる群から選択される1つまたは複数を含むことによって形成され得る。一実施形態では、前記ペプチドリンカーは、(GmS1)nとして表され得る(m、l、およびnは、独立して、約1~約10の整数、特に約2~約5の整数である)。
例えば、前記ペプチドリンカーの例は次のように要約される:
Figure 0007177543000010
他の実施形態では、前記PD-L1標的化部分およびLAG3標的化部分の両方は、完全長抗体または重鎖CDR、軽鎖CDR、またはそれらの組み合わせを含む抗原結合フラグメントであり得る。
他の実施形態では、前記二重特異性抗体は、PD-L1およびLAG3のうちの1つを標的とする第1の重鎖および第1の軽鎖の対を含む第1のアーム、ならびに、もう1つを標的とする第2の重鎖と第2の軽鎖のペアを含む第2のアームを含むヘテロ二量体形態であり得る。一実施形態では、前記完全長抗体は、完全長免疫グロブリン形態(例えば、IgG、IgM、IgA、IgEまたはIgD、例えば、ヒトIgG、ヒトIgM、ヒトIgA、ヒトIgE、またはヒトIgD)であり得て、前記抗原結合フラグメントは、上記のように、Fab、Fab’、F(ab’)、Fd、Fv、scFv、一本鎖抗体、sdFvなどからなる群から選択され得る。例えば、前記完全長抗体は、完全長ヒトIgG(ヒトIgG1、ヒトIgG2、ヒトIgG3、またはヒトIgG4)形態であり得て、前記抗原結合フラグメントは、scFvであり得る。
例えば、本明細書に記載の抗体は、柔軟なリンカー配列を含み得るか、または機能的部分(例えば、PEG、薬物、毒素、または標識)を付加するように改変され得る。
いくつかの実施形態では、抗PD-L1抗体またはその抗原結合フラグメント、ならびに抗LAG3抗体またはその抗原結合フラグメントを含む、二重特異性または多重特異性抗体が提供され、ここで、前記抗PD-L1抗体またはその抗原結合フラグメントは、ヒトプログラム細胞死リガンド1(PD-L1)タンパク質の免疫グロブリンC(Ig C)ドメインに特異的に結合することができ、ここで、前記IgCドメインはアミノ酸残基133-225からなり;前記抗LAG3抗体またはその抗原結合フラグメントは、MHCクラスII分子および/またはFGL1に結合し得る。
いくつかの実施形態において、前記抗PD-L1抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号1および61~67からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むVH CDR1;配列番号2、68~77、および525~527からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むVH CDR2;配列番号3、78~90、および513~519からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むVH CDR3;配列番号4、91~92、および520~521からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むVL CDR1;配列番号5および93~105からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むVL CDR2;ならびに、配列番号6、106-111、および522-524からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むVL CDR3を含み、前記抗LAG3抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号116~117、354、および453~460からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むVH CDR1;配列番号118~119、355、および461~467からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むVH CDR2;配列番号120~160、356、および468~475からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むVH CDR3;配列番号163~195、229、357、および490からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むVL CDR1;配列番号196~217、358、および476~483からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むVL CDR2;ならびに、配列番号218~228、230~253、359、および484~489からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むVL CDR3を含む。
いくつかの実施形態では、前記抗PD-L1抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号1のアミノ酸配列を有するVH CDR1;配列番号525のアミノ酸配列を有するVH CDR2;配列番号3のアミノ酸配列を有するVH CDR3;配列番号4のアミノ酸配列を有するVL CDR1;配列番号5のアミノ酸配列を有するVL CDR2;および配列番号6のアミノ酸配列を有するVL CDR3を含み、前記抗LAG3抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号354のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号461のアミノ酸配列を含むVH CDR2、配列番号468のアミノ酸配列を含むVH CDR3、配列番号490のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号358のアミノ酸配列を含むVL CDR2、および配列番号488のアミノ酸配列を含むVL CDR3を含む。
いくつかの実施形態では、前記抗PD-L1抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号1のアミノ酸配列を有するVH CDR1;配列番号526のアミノ酸配列を有するVH CDR2;配列番号515のアミノ酸配列を有するVH CDR3; 配列番号4のアミノ酸配列を有するVL CDR1;配列番号5のアミノ酸配列を有するVL CDR2;配列番号6のアミノ酸配列を有するVL CDR3を含み、前記抗LAG3抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号354のアミノ酸配列を含むVH CDR1、配列番号461のアミノ酸配列を含むVH CDR2、配列番号468のアミノ酸配列を含むVH CDR3、配列番号490のアミノ酸配列を含むVL CDR1、配列番号358のアミノ酸配列を含むVL CDR2、および配列番号488のアミノ酸配列を含むVL CDR3を含む。本明細書に記載の抗体または変異体は、例えば、前記抗体へのいずれかのタイプの分子の共有結合によって、前記抗体が前記抗原(例えば、エピトープ)に結合するのを、共有結合が妨げないように修飾される誘導体を含み得る。例えば、限定的ではないが、前記抗体は、例えば、グリコシル化、アセチル化、ペグ化、リン酸化、リン酸化、アミド化、既知の保護/遮断基による誘導体化、タンパク質分解切断、細胞リガンドまたは他のタンパク質への結合などからなる群から選択される少なくとも1つによって修飾され得る。特定の化学的切断、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝合成などを含むがこれらに限定されない既知の技術によって、多数の化学修飾のいずれかを実施し得る。さらに、抗体は1つまたは複数の非古典的アミノ酸を含み得る。
前記抗体またはそのフラグメントは、化学発光化合物、蛍光化合物(例えば、蛍光発光金属)、放射性同位元素、色素などから選択される従来の標識材料でタグ付け(カップリング)することによって検出可能に標識され得る。タグ付けされた抗体またはそのフラグメントの存在は、抗体(またはそのフラグメント)と標識材料との間の化学反応中に生じるシグナルを測定することによって検出され得る。特に有用な標識材料の例は、ルミノール、イソルミノール、熱アクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩、シュウ酸塩エステル、蛍光発光金属などからなる群から選択される少なくとも1つであり得る。例えば、蛍光発光金属は、152Eu、またはランタニド系列の他のものであり得る。これらの金属は、ジエチレントリアミン五酢酸(DTPA)またはエチレンジアミン四酢酸(EDTA)などの金属キレート基を使用して抗体に結合させ得る。
特定の実施形態では、前記調製された二重特異性抗体は、治療される動物において、例えば、ヒトにおいて、有害な免疫応答を誘発しないであろう。一実施形態では、前記二重特異性抗体は、いずれかの従来の技術を使用してそれらの免疫原性を低下させるように改変され得る。例えば、前記二重特異性抗体は、ヒト化、霊長類化、脱免疫化、またはキメラ抗体であり得る。これらのタイプの抗体は、その親抗体の抗原結合特性を保持するか、または実質的に保持するが、ヒトでは免疫原性が低い非ヒト抗体、典型的にはマウスまたは霊長類の抗体に由来する。これは、以下を含む様々な方法によって達成され得る。(a)非ヒト可変ドメイン全体をヒト定常領域に移植してキメラ抗体を生成すること;(b)非ヒト相補性決定領域(CDR)の1つまたは複数の少なくとも一部を、重要なフレームワーク残基の保持の有無にかかわらず、ヒトフレームワークおよび定常領域に移植すること;または、(c)非ヒト可変ドメイン全体を移植するが、表面残基の置換によりヒト様セクションでそれらを「クローキング」すること。
免疫除去は、抗体の免疫原性を低下させるためにも使用され得る。本明細書で使用される場合、「脱免疫化」という用語は、T細胞エピトープを改変するための抗体の改変を含み得る(例えば、国際出願公開番号:WO/9852976 A1およびWO/0034317 A2を参照のこと)。例えば、開始抗体からの可変重鎖および可変軽鎖配列が分析され、配列内の相補性決定領域(CDR)および他の重要な残基に関連するエピトープの位置を示す各V(可変)領域からのヒトT細胞エピトープ「マップ」が作成される。最終抗体の活性を変化させるリスクが低い代替アミノ酸置換を特定するために、T細胞エピトープマップからの個々のT細胞エピトープを分析する。アミノ酸置換の組み合わせを含む一連の代替の可変重配列および可変軽配列が設計され、これらの配列はその後、一連の結合ポリペプチドに組み込まれる。通常、12~24の変異抗体が生成され、結合および/または機能について試験される。次に、改変された可変領域およびヒト定常領域を含む完全な重鎖および軽鎖遺伝子が発現ベクターにクローン化され、その後のプラスミドが全抗体の産生のために細胞株に導入される。次に、前記抗体は適切な生化学的および生物学的アッセイで比較され、最適な変異体が特定される。
各標的タンパク質に対する前記二重特異性抗体の結合特異性および/または親和性は、いずれかの従来のアッセイ、例えば、免疫沈降、ラジオイムノアッセイ(RIA)、または酵素結合免疫吸収アッセイ(ELISA)などのインビトロアッセイによって決定され得るが、それらに限定されない。
あるいは、一本鎖ユニット(米国特許第4,694,778号など)の製造について記載された技術を、本開示の一本鎖ユニットを製造するように適合させ得る。一本鎖ユニットは、アミノ酸架橋(ペプチドリンカー)を介してFv領域の重鎖および軽鎖フラグメントを結合することによって形成され、一本鎖融合ペプチド(scFv)をもたらす。大腸菌における機能的Fvフラグメントの集合のための技術もまた使用され得る。
一本鎖Fv(scFv)および抗体を産生するために使用され得る技術の例としては、米国特許第4,946,778号、5,258,498号などに記載されているものが挙げられる。ヒトにおける抗体のインビボ使用およびインビトロ検出アッセイを含むいくつかの用途については、キメラ、ヒト化、またはヒト抗体を使用することが好ましい場合がある。キメラ抗体は、マウスモノクローナル抗体に由来する可変領域、およびヒト免疫グロブリン定常領域を有する抗体など、前記抗体の異なる部分が異なる動物種に由来する分子である。キメラ抗体を産生するための方法は当技術分野で知られている。例えば、その全体が参照により本明細書に援用される、米国特許第5,807,715号、第4,816,567号、および第4,816,397号を参照のこと。
ヒト化抗体は、非ヒト種からの1つまたは複数の相補性決定領域(CDR)およびヒト免疫グロブリン分子からのフレームワーク領域を有する望ましい抗原に結合する非ヒト種抗体に由来する抗体分子である。多くの場合、前記ヒトフレームワーク領域のフレームワーク残基は、CDRドナー抗体からの対応する残基で置換されて、抗原結合を変更する、好ましくは改善する。これらのフレームワーク置換は、当技術分野で周知の方法によって、例えば、前記CDRとフレームワーク残基との相互作用をモデル化して抗原結合に重要なフレームワーク残基を特定し、配列比較して特定の位置にある異常なフレームワーク残基を特定することによって特定される(例えば、その全体が参照により本明細書に援用される、Queenら,米国特許第5,585,089号を参照のこと)。抗体は、例えば、CDR移植(それぞれ、その全体が参照により本明細書に援用される、米国特許第5,225,539号、5,530,101号、5,585,089号など)、ベニアリングまたはリサーフェシング(それぞれ、その全体が参照により援用される、EP 592,106;EP 519,596)、およびチェーンシャッフリング(参照によりその全体が援用される米国特許第5,565,332号)を含む当技術分野で知られている様々な技術を使用してヒト化し得る。
完全ヒト抗体は、ヒト患者の治療的治療にとって特に望ましい。ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン配列に由来する抗体ライブラリーを使用するファージディスプレイ法を含む、当技術分野で知られている様々な方法によって作製され得る。それぞれ、その全体が参照により本明細書に援用される、米国特許第4,444,887号、4,716,111号などをも参照のこと。
ヒト抗体は、機能的な内因性免疫グロブリンを発現し得ないが、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現し得るトランスジェニックマウスを使用して産生され得る。例えば、前記ヒトの重鎖および軽鎖免疫グロブリン遺伝子複合体は、ランダムに、または相同組換えによってマウス胚性幹細胞に導入され得る。あるいは、前記ヒトの重鎖および軽鎖遺伝子に加えて、前記ヒトの可変領域、定常領域、および多様性領域をマウス胚性幹細胞に導入し得る。前記マウスの重鎖および軽鎖免疫グロブリン遺伝子は、相同組換えによるヒト免疫グロブリン遺伝子座の導入とは別に、または同時に機能し得ない。特に、そのJH領域のホモ接合性欠失は内因性抗体産生を防ぐ。前記改変された胚性幹細胞は、増殖され、胚盤胞にマイクロインジェクションされて、キメラマウスを作製する。次に、前記キメラマウスを繁殖させて、ヒト抗体を発現するホモ接合性の子孫を作製する。前記トランスジェニックマウスは、選択された抗原、例えば、所望の標的ポリペプチドの全部または一部で通常の方法で免疫化される。抗原に対するモノクローナル抗体は、従来のハイブリドーマ技術を使用して、免疫化されたトランスジェニックマウスから得られ得る。前記トランスジェニックマウスが保有するヒト免疫グロブリン導入遺伝子は、B細胞の分化中に再配列し、その後、クラススイッチおよび体細胞変異を起こす。したがって、そのような技術を使用して、治療上有用なIgG、IgA、IgMおよびIgE抗体を産生し得る。
選択されたエピトープを認識する完全ヒト抗体は、「ガイド付き選択」と呼ばれる技術を使用してもまた産生し得る。このアプローチでは、選択された非ヒトモノクローナル抗体、例えばマウス抗体を使用して、同じエピトープを認識する完全ヒト抗体の選択をガイドする。
他の実施形態において、望ましいモノクローナル抗体をコードするDNAは、従来の手順を使用して、(例えば、前記マウス抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合し得るオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって)容易に単離および配列決定され得る。前記単離されサブクローン化されたハイブリドーマ細胞は、そのようなDNAの好ましい供給源として機能する。ひとたび単離されると、前記DNAは、発現ベクターに入れられ、その後、大腸菌細胞、シミアンCOS細胞、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、免疫グロブリンを産生しない骨髄腫細胞などの原核生物または真核生物の宿主細胞にトランスフェクトされる。より具体的には、前記単離されたDNA(本明細書に記載されるように合成され得る)は、その全体が参照により本明細書に援用される、ニューマンら,米国特許第5,658,570号に記載されるように、製造抗体のための定常および可変領域配列をクローン化するために使用され得る。基本的に、これには、選択した細胞からのRNAの抽出、cDNAへの変換、およびIg特異的プライマーを使用したPCRによる増幅が含まれる。この目的のための適切なプライマーはまた、米国特許第5,658,570号に記載されている。以下でより詳細に議論されるように、前記望ましい抗体を発現する形質転換細胞は、前記免疫グロブリンの臨床的および商業的供給を提供するために比較的大量に増殖され得る。
さらに、慣習の組換えDNA技術を使用して、前記二重特異性抗体のCDRの1つまたは複数を、フレームワーク領域内に、例えば、ヒトフレームワーク領域に挿入して、非ヒト抗体をヒト化し得る。前記フレームワーク領域は、自然発生またはコンセンサスフレームワーク領域、好ましくはヒトフレームワーク領域であり得る(例えば、ヒトフレームワーク領域の一覧として、Chothiaら, J. Mol. Biol. 278: 457-479 (1998)を参照のこと)。例えば、前記フレームワーク領域およびCDRの組み合わせによって生成されたポリヌクレオチドは、望ましいポリペプチドの少なくとも一つのエピトープ、例えば、LIGHTに特異的に結合する抗体をコードする。好ましくは、1つまたは複数のアミノ酸置換は、前記フレームワーク領域内で行われ得て、そして好ましくは、前記アミノ酸置換は、その抗原(またはエピトープ)への抗体の結合を改善する。さらに、そのような方法を使用して、鎖内ジスルフィド結合に関与する1つまたは複数の可変領域システイン残基のアミノ酸置換または欠失を行い、1つまたは複数の鎖内ジスルフィド結合を欠く抗体分子を生成し得る。前記ポリヌクレオチドに対する他の変更は、本開示に含まれ、当技術分野の技術の範囲内である。
さらに、適切な抗原特異性のマウス抗体分子からの遺伝子を、適切な生物学的活性のヒト抗体分子からの遺伝子と一緒にスプライシングすることによって「キメラ抗体」を産生するために開発された技術を使用し得る。本明細書で使用される場合、キメラ抗体は、マウスモノクローナル抗体に由来する可変領域およびヒト免疫グロブリン定常領域を有するものなど、異なる部分が異なる動物種に由来する分子である。
あるいは、抗体産生細胞株は、当業者に公知の技術を使用して選択および培養され得る。 このような技術は、さまざまな実験マニュアルや主要な出版物に記載されている。
さらに、当業者に知られている標準的な技術を使用して、アミノ酸置換をもたらす部位特異的突然変異誘発およびPCR媒介突然変異誘発などの、これらに限定されない、本開示の抗体をコードするヌクレオチド配列に突然変異を導入し得る。好ましくは、前記変異体(誘導体を含む)は、前記参照可変重鎖領域、CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、可変軽鎖領域、CDR-L1、CDR-L2、またはCDR-L3と比較して50未満のアミノ酸置換、40未満のアミノ酸置換、30未満のアミノ酸置換、25未満のアミノ酸置換、20未満のアミノ酸置換、15未満のアミノ酸置換、10未満のアミノ酸置換、5未満のアミノ酸置換、4未満のアミノ酸置換、3未満のアミノ酸置換、2未満のアミノ酸置換をコードする。あるいは、飽和突然変異誘発などによって、突然変異をコード配列の全部または一部に沿ってランダムに導入し得て、得られた突然変異体を生物学的活性についてスクリーニングして、活性を保持する突然変異体を同定し得る。
抗体の治療的使用
本明細書で提供される二重特異性抗体は、PD-L1およびLAG3の活性を同時に遮断し得て、それにより、例えば免疫応答を活性化することにより、免疫療法および/または癌療法において改善された効果を示す(図33を参照のこと)。本開示の二重特異性抗体がLAG-3のMHCクラスII分子への結合を阻害し、抗原特異的T細胞応答を刺激する能力を考慮すると、本開示はまた、抗原特異的T細胞応答を刺激、増強または上方制御するために本開示の抗体を使用する組成物またはインビトロおよびインビボの方法を提供する。
一実施形態は、上記のような二重特異性抗体または抗PD-L1または抗LAG3抗体を含む医薬組成物を提供する。前記医薬組成物は、薬学的に許容される担体をさらに含み得る。前記医薬組成物は、免疫応答(例えば、抗原特異的T細胞応答)を刺激するため、および/またはPD-L1、LAG3、またはそれらの両方に関連する疾患を治療および/または予防するために使用され得る。
他の実施形態は、免疫応答(例えば、抗原特異的T細胞応答)を刺激する方法、および/または、医薬有効量の前記二重特異性抗体、抗PD-L1もしくは抗LAG3抗体、または医薬組成物を対象に投与することを含む、PD-L1、LAG3、またはそれらの両方に関連する疾患を、それを必要とする対象において、治療および/または予防する方法を提供する。この方法は、投与工程の前に、PD-L1、LAG3、またはそれらの両方に関連する疾患を治療および/または予防する必要がある対象を特定するさらなる工程であり得る。
前記PD-L1、LAG3、またはその両方に関連する疾患は、癌(または腫瘍)、感染症、自己免疫反応、神経系障害などから選択され得る。
一実施形態では、前記対象は、ヒトなどの哺乳動物、例えば、癌および/または感染哺乳動物細胞に罹患している哺乳動物(例えば、ヒト)から選択され得る。他の実施形態では、前記対象は、哺乳動物、例えば、癌感染症、自己免疫反応、神経系障害などから選択される疾患に罹患している哺乳動物から分離された(単離された)細胞(例えば、癌細胞または哺乳動物の感染領域から分離された(単離された)細胞、または腫瘍浸潤性Tリンパ球、CD4+ T細胞、CD8+ T細胞、またはそれらの組み合わせなどのT細胞)であり得る。
他の実施形態は、癌または感染症を治療および/または予防する際の二重特異性抗体、抗PD-L1または抗LAG3抗体、または医薬組成物の使用を提供する。他の実施形態は、癌または感染症を治療および/または予防するための医薬組成物を調製する際の二重特異性抗体、または抗PD-L1または抗LAG3抗体の使用を提供する。
本明細書で提供される医薬組成物、方法および/または使用において、PD-L1、LAG3、またはそれらの両方に関連する疾患は、PD-L1、LAG3、またはその両方の活性化(例えば、異常な活性化または過剰活性化)および/または過剰産生(過剰発現)に関連する疾患であり得る。例えば、病気は癌または感染症であり得る。
前記癌は、固形癌または血液癌、好ましくは固形癌であり得る。前記癌は、PD-L1タンパク質を発現するいずれかの腫瘍であり得て、膀胱癌、肝臓癌、結腸癌、直腸癌、子宮内膜癌、白血病、リンパ腫、膵臓癌、肺癌(例えば、小細胞肺癌、非小細胞肺癌など)、乳癌、尿道癌、頭頸部癌、胃腸癌、胃癌、食道癌、卵巣癌、腎癌、黒色腫、前立腺癌、甲状腺癌などからなる群から選択され得るが、これらに限定され得ない。いくつかの実施形態では、癌は、膀胱癌、肝臓癌、膵臓癌、非小細胞肺癌、乳癌、尿道癌、結腸直腸癌、頭頸部癌、扁平上皮癌、メルケル細胞癌、胃腸癌、胃癌、食道癌、卵巣癌、腎癌、小細胞肺癌などからなる群から選択される。前記癌は原発性または転移性の癌であり得る。
特定の患者に対する特定の投与量および治療計画は、特定の抗体、使用される変異体またはその派生物、患者の年齢、体重、一般的な健康状態、性別、食事、投与時間、排泄率、薬剤の組み合わせ、治療中の特定の疾患の重症度を含むさまざまな要因に依存する。医療介護者によるそのような要因の判断は、当業者の範囲内である。前記量はまた、治療される個々の患者、投与経路、製剤のタイプ、使用される化合物の特性、疾患の重症度、および望ましい効果に依存するであろう。前記使用される量は、当技術分野で公知の薬理学的および薬物動態学的原理によって決定され得る。
前記二重特異性抗体または抗PD-L1または抗LAG3抗体の投与は、腹腔内、静脈内、皮下、皮内、筋肉内、鼻腔内、硬膜外、および経口経路、からなる群から選択されるがこれらに限定されない少なくとも1つを介して実施され得る。前記二重特異性抗体または抗PD-L1または抗LAG3抗体または組成物は、いずれかの便利な経路、例えば注入またはボーラス注射、上皮または粘膜皮膚内層(例えば、口腔粘膜、直腸および腸粘膜など)を介した吸収によって投与され得て、他の生物学的に活性な剤と一緒に投与され得る。したがって、本開示の抗原結合ポリペプチドを含む医薬組成物は、経口的に、非経口的に、槽内、膣内、腹腔内、直腸、局所(粉末、軟膏、滴または経皮パッチなど)、頬側、または経口スプレーもしくは鼻スプレーとして投与され得る。
本明細書で使用される「非経口」という用語は、静脈内、筋肉内、腹腔内、胸骨内、皮下および関節内の注射および注入などの投与様式を指す。
管理は、全身的または局所的であり得る。さらに、脳室内および髄腔内注射などのいずれかの適切な経路によって、本開示の抗体を中枢神経系に導入することが望ましい場合がある;脳室内注射は、例えば、オマヤリザーバーなどのリザーバーに取り付けられた脳室内カテーテルによって促進され得る。肺投与はまた、例えば、吸入器またはネブライザーの使用、およびエアロゾル化剤との配合によって使用され得る。
本開示の二重特異性抗体、または抗PD-L1または抗LAG3抗体、または組成物を、治療を必要とする領域に局所的に投与することが望ましい場合がある;これは、例えば、限定的ではなく、手術中の局所注入によって、局所適用、例えば、手術後の創傷被覆材と組み合わせて、注射により、カテーテルにより、坐剤によって、またはインプラントによって、達成され得て、前記インプラントは、多孔質、非多孔質、またはゼラチン状の、シアラスティック膜などの膜、または繊維などの材料である。好ましくは、本開示の抗体を含むタンパク質を投与する場合、タンパク質が吸収しない材料を使用するように注意を払わなければならない。
他の実施形態では、前記二重特異性抗体または抗PD-L1もしくは抗LAG3抗体または組成物は、小胞、特にリポソームにおいて送達され得る。さらに他の実施形態では、前記二重特異性抗体または抗PD-L1もしくは抗LAG3抗体または組成物は、制御放出システムで送達され得る。一実施形態では、制御放出システムのために、いずれかの薬学的に許容されるポンプ、および/またはポリマー材料を使用し得る。
炎症性、免疫性または悪性の疾患、障害、または状態を治療、阻害、改善、および/または予防するための二重特異性抗体または抗PD-L1もしくは抗LAG3抗体の薬学的に有効な量は、標準的な臨床技術によって決定され得る。さらに、最適な投与量範囲を特定するために、invitroアッセイをオプションで使用し得る。前記製剤に使用される正確な用量は、投与経路、および疾患、障害、または状態の重症度にも依存し、開業医の判断および各患者の状況に応じて決定する必要がある。有効量は、invitroまたは動物モデル試験システムから得られた用量反応曲線から推定され得る。
前記二重特異性抗体または抗PD-L1もしくは抗LAG3抗体の投与を含む、感染性または悪性疾患(例えば、癌)、状態または障害を治療する方法は通常、ヒトで使用する前に、インビトロで、次に許容可能な動物モデルでインビボで、望ましい治療的または予防的活性について試験される。トランスジェニック動物などの適切な動物モデルは、当業者によく知られている。例えば、前記二重特異性抗体または抗PD-L1もしくは抗LAG3抗体の治療的有用性を実証するためのインビトロアッセイは、細胞株または患者の組織サンプルに対する二重特異性抗体または抗PD-L1もしくは抗LAG3抗体の効果を含む。前記細胞株および/または組織サンプルに対する二重特異性抗体または抗PD-L1もしくは抗LAG3抗体の効果は、本明細書の他の場所に開示されるアッセイなどの当業者に知られている技術を利用して決定され得る。本開示によれば、前記二重特異性抗体または抗PD-L1もしくは抗LAG3抗体の投与が示されるかどうかを決定するために使用し得るインビトロアッセイとしては、培地で患者の組織サンプルが成長し、化合物に曝露されるか、そうでなければ投与され、組織サンプルに対する前記化合物の効果が観察されるインビトロ細胞培養アッセイが挙げられる。
様々な送達システム、例えば、リポソーム、微粒子、マイクロカプセル、化合物を発現し得る組換え細胞、受容体媒介エンドサイトーシス、レトロウイルスまたは他のベクターの一部としての核酸の構築などへのカプセル化、が知られており、本開示の抗体または本開示の抗体をコードするポリヌクレオチドを投与するために使用され得る。
前記医薬組成物は、有効量の二重特異性抗体または抗PD-L1もしくは抗LAG3抗体、および許容可能な担体を含み得る。いくつかの実施形態では、前記組成物は、第2の抗癌剤(例えば、免疫チェックポイント阻害剤)をさらに含む。
特定の実施形態では、「薬学的に許容される」という用語は、連邦もしくは州政府の規制機関によって承認された、または動物、より具体的にはヒトで使用するために米国薬局方もしくは他の一般に認められた薬局方に記載されていることを指し得る。さらに、「薬学的に許容される担体」は、一般に、非毒性の固体、半固体または液体の充填剤、希釈剤、カプセル化材料、またはいずれかのタイプの製剤補助剤である。
「担体」という用語は、治療薬が投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤、またはビヒクルを指し得る。そのような医薬担体は、ピーナッツ油、大豆油、鉱油、ゴマ油などの石油、動物、植物または合成起源のものを含む、水および油などの無菌液体であり得る。前記医薬組成物を静脈内投与する場合、水が好ましい担体である。生理食塩水およびデキストロースおよびグリセロール水溶液もまた、特に注射可能な溶液の場合、液体担体として使用され得る。適切な医薬賦形剤としては、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどが挙げられる。前記組成物は、必要に応じて、少量の湿潤剤または乳化剤、あるいは酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩などのpH緩衝剤を含み得る。ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗菌剤;アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤;エチレンジアミン四酢酸などのキレート剤;および塩化ナトリウムまたはデキストロースなどの張性を調整するための薬剤もまた想定されている。これらの組成物は、溶液、懸濁液、乳濁液、錠剤、丸薬、カプセル、粉末、徐放性製剤などの形態をとり得る。前記組成物は、トリグリセリドなどの従来の結合剤および担体を用いて、坐剤として処方され得る。経口製剤は、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどの標準的な担体を含み得る。適切な医薬担体の例は、参照により本明細書に援用される、E.W.マーティンによるレミントンの医薬科学に記載されている。そのような組成物は、患者への適切な投与のための形態を提供するために、適切な量の担体と共に、好ましくは精製された形態で、治療有効量の抗原結合ポリペプチドを含むであろう。前記製剤は投与方法に適合している必要がある。非経口製剤は、アンプル、使い捨て注射器、またはガラスもしくはプラスチック製の複数回投与バイアルに入れ得る。
一実施形態では、前記組成物は、ヒトへの静脈内投与に適合した医薬組成物として通常の手順に従って処方される。通常は、静脈内投与用の組成物は、無菌の等張水性緩衝液中の溶液である。必要に応じて、前記組成物はまた、注射部位の痛みを和らげるために、可溶化剤およびリグノカインなどの局所麻酔薬を含み得る。一般に、前記成分は、別々に供給されるか、または単位剤形で一緒に混合されて、例えば、活性剤の量を示すアンプルまたはサシェットなどの密閉容器内の乾燥凍結乾燥粉末または水を含まない濃縮物として供給される。前記組成物が注入によって投与される場合、それは、無菌の医薬品グレードの水または生理食塩水を含む注入ボトルを省き得る。前記組成物が注射によって投与される場合、注射用の滅菌水のアンプルまたは生理食塩水を提供して、投与前に成分を混合し得る。
本開示の化合物は、中性または塩の形態として処方され得る。製薬上許容される塩としては、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などに由来する塩などの陰イオンで形成される塩、およびナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、2-エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどに由来する塩などの陽イオンで形成される塩が挙げられる。
抗体の診断的使用
PD-L1および/またはLAG3の過剰発現および/または過剰活性化は、特定の癌および/または感染症(例えば、感染性患者からの腫瘍細胞または組織、血液または血清)を患っている患者からの生物学的サンプル(例えば、細胞、組織、血液、血清など)において観察され、かつ/あるいは、PD-L1および/またはLAG3を過剰発現する細胞を有する患者は、二重特異性抗体または抗PD-L1または抗LAG3抗体による治療に反応し得る。したがって、本開示の二重特異性抗体または抗PD-L1または抗LAG3抗体はまた、診断および予後の目的のために使用され得る。
一実施形態は、PD-L1、LAG3、またはそれらの両方に関連する疾患を診断するための医薬組成物を提供し、前記組成物は、前記二重特異性抗体または抗PD-L1もしくは抗LAG3抗体を含む。他の実施形態では、前記PD-L1、LAG3、またはそれらの両方に関連する疾患を診断するための二重特異性抗体または抗PD-L1もしくは抗LAG3抗体の使用が提供される。
他の実施形態は、PD-L1、LAG3、またはそれらの両方に関連する疾患を診断する方法を提供し、前記方法は、患者から得られた生物学的サンプルを二重特異性抗体または抗PD-L1もしくは抗LAG3抗体と接触させることを含み、生体サンプル中の抗原抗体反応を検出または抗原抗体反応のレベルを測定する。この方法では、前記生体サンプルで前記抗原抗体反応が検出された場合、または前記生体サンプル中の前記抗原抗体反応のレベルが正常サンプルよりも高い場合、生物学的サンプルが得られる患者は、PD-L1、LAG3、またはその両方に関連する疾患を有する患者として決定され得る。したがって、いくつかの実施形態では、前記方法は、正常サンプルを前記二重特異性抗体または抗PD-L1もしくは抗LAG3抗体と接触させ、正常サンプル中の抗原抗体反応のレベルを測定することをさらに含み得る。さらに、前記方法は、測定工程の後に、生物学的サンプルおよび正常サンプルにおける抗原抗体反応のレベルを比較することをさらに含み得る。さらに、検出工程または比較工程の後、生体サンプル中の抗原抗体反応が検出された場合、または生体試料中の抗原抗体反応のレベルが正常サンプルよりも高い場合、前記方法は、前記患者を、PD-L1、LAG3、またはそれらの両方に関連する疾患を有する患者として決定することをさらに含み得る。
PD-L1、LAG3、またはその両方に関連する疾患は、PD-L1、LAG3、またはその両方の活性化(例えば、異常な活性化または過剰活性化)および/または過剰産生(過剰発現)に関連する疾患であり得る。例えば、前記疾患は、上記のように、癌または感染症であり得る。
前記診断組成物および診断方法において、前記生物学的サンプルは、細胞、組織、体液(例えば、血液、血清、リンパ液など)などからなる群から選択される少なくとも1つであり得て、診断される患者から得られ得る(分離され得る)。前記正常なサンプルは、細胞、組織、体液(例えば、血液、血清、リンパ、尿など)などからなる群から選択される少なくとも1つであり得て、PD-L1、LAG3、またはその両方に関連する疾患を持たない患者から得られ得る(分離され得る)。前記患者は、ヒトなどの哺乳動物から選択され得る。前記サンプルに対して施されていてもよい前処理の際に、前記サンプルは、前記抗体をサンプルに存在し得るPD-L1および/またはLAG3タンパク質と相互作用させる条件下で、本開示の二重特異性抗体または抗PD-L1もしくは抗LAG3抗体と共にインキュベートされ得る。
前記サンプル中のPD-L1および/またはLAG3タンパク質の存在および/またはレベル(濃度)は、二重特異性抗体もしくは抗PD-L1もしくは抗LAG3抗体による治療に適した患者、または二重特異性抗体もしくは抗PD-L1もしくは抗LAG3抗体による治療に反応もしくは感受性のある患者を特定するために使用され得る。
一実施形態は、前記二重特異性抗体もしくは抗PD-L1もしくは抗LAG3抗体による治療に適した患者、または前記二重特異性抗体もしくは抗PD-L1もしくは抗LAG3抗体による治療に反応または感受性のある患者を特定する医薬組成物を提供し、前記組成物は、前記二重特異性抗体または抗PD-L1もしくは抗LAG3抗体を含む。他の実施形態では、前記二重特異性抗体もしくは抗PD-L1もしくは抗LAG3抗体による治療に適した患者、または前記二重特異性抗体もしくは抗PD-L1もしくは抗LAG3抗体による治療に反応もしくは感受性のある患者を特定するための、前記二重特異性抗体または抗PD-L1もしくは抗LAG3抗体の使用が提供される。他の実施形態は、前記二重特異性抗体もしくは抗PD-L1もしくは抗LAG3抗体による治療に適した患者、または前記二重特異性抗体もしくは抗PD-L1もしくは抗LAG3抗体による治療に反応もしくは感受性のある患者を特定する方法を提供し、前記方法は、患者から得られた生体サンプルを前記二重特異性抗体または抗PD-L1もしくは抗LAG3抗体と接触させ、抗原抗体反応を検出するか、または生体サンプル中の抗原抗体反応のレベルを測定することを含む。
一実施形態は、生物学的サンプルにおいて、PD-L1、LAG3、またはそれらの両方を同時に検出するための組成物を提供し、前記組成物は、前記二重特異性抗体または抗PD-L1もしくは抗LAG3抗体を含む。他の実施形態は、生物学的サンプル中のPD-L1、LAG3、またはそれらの両方を同時に検出する方法を提供し、前記方法は、前記生物学的サンプルを前記二重特異性抗体または抗PD-L1もしくは抗LAG3抗体と接触させること;前記二重特異性抗体または抗PD-L1もしくは抗LAG3抗体とPD-L1、LAG3、またはその両方との間の抗原抗体反応(結合)を検出(測定)することを含む。
検出組成物および検出方法において、「PD-L1、LAG3、またはそれらの両方の検出」という用語は、生体サンプル中のPD-L1、LAG3、またはその両方の存在(および/または不在)および/またはレベルの検出を指し得るが、これらに限定されない。
検出方法において、抗原抗体反応が検出された場合、PD-L1、LAG3、またはその両方が生体試料中に存在すると判断し得て、抗原抗体反応が検出されない場合、PD-L1、LAG3、またはその両方が生体サンプルに存在しない(存在しない)と判断し得る。したがって、前記検出方法は、前記検出工程の後に、抗原抗体反応が検出された場合、PD-L1、LAG3、またはそれらの両方が生物学的サンプル中に存在すること、および/または抗原抗体反応が検出されない場合、PD-L1、LAG3、またはその両方が生体サンプルに存在しない(存在しない)ことを決定することをさらに含み得る。
前記検出方法において、PD-L1、LAG3、またはその両方のレベルは、前記抗原抗体反応の程度に応じて決定され得る(例えば、前記抗原抗体反応によって形成される抗原抗体複合体の量、抗原抗体反応によって得られるいずれかの信号の強度など、いずれかの従来の手段によって測定され得る)。
前記生物学的サンプルは、細胞(例えば、腫瘍細胞)、組織(例えば、腫瘍組織)、体液(例えば、血液、血清など)などからなる群から選択される少なくとも1つを含み得て、ヒトなどの哺乳動物から入手または単離され得る。前記検出方法の工程は、インビトロで実行され得る。
前記診断方法および/または検出方法において、一般的な酵素反応、蛍光反応、発光反応、および/または放射線の検出など、関連技術に知られているいずれかの一般的な方法により、抗原抗体反応を検出する、または抗原抗体反応のレベルを測定する工程を実施し得る。例えば、前記工程は、免疫クロマトグラフィー、免疫組織化学(IHC)、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)、ラジオイムノアッセイ(RIA)、酵素免疫測定法(EIA)、蛍光免疫測定法(FIA)、発光免疫測定法(LIA)、ウエスタンブロッティング、マイクロアレイ、フローサイトメトリー、表面プラズモン共鳴(SPR)などからなる群から選択されるがこれらに限定されない方法によって実施され得る。
抗体をコードするポリヌクレオチドおよび抗体を調製する方法
一実施形態は、前記二重特異性抗体または抗PD-L1もしくは抗LAG3抗体をコードするポリヌクレオチドを提供する。特に、一実施形態は、IgG-scFv形態の二重特異性抗体の重鎖をコードするポリヌクレオチドを提供する。他の実施形態は、IgG-scFv形態の二重特異性抗体の軽鎖をコードするポリヌクレオチドを提供する。前記IgG-scFv型は、PD-L1およびLAG3タンパク質の一方を標的とする(結合する)完全長IgG抗体と、もう一方を標的とする(結合する)scFvフラグメントを含む一種の二重特異性抗体を指し得て、ここで、scFvは完全長IgG抗体のC末端および/またはN末端に直接(ペプチドリンカーなしで)またはペプチドリンカーを介して連結されている。
一実施形態では、IgG-scFv形態の二重特異性抗体が、PD-L1に対する完全長IgG抗体およびLAG3に対するscFvフラグメントを含む場合、前記二重特異性抗体の重鎖をコードするポリヌクレオチドは、PD-L1に対する完全長IgG抗体の重鎖、および、完全長IgG抗体のC末端および/またはN末端に直接またはペプチドリンカーを介して結合しているLAG3に対するscFvフラグメントをコードし得て;二重特異性抗体の軽鎖をコードするポリヌクレオチドは、PD-L1に対する完全長IgG抗体の軽鎖をコードし得る。
他の実施形態において、IgG-scFv形態の二重特異性抗体が、LAG3に対する完全長IgG抗体およびPD-L1に対するscFvフラグメントを含む場合、二重特異性抗体の重鎖をコードするポリヌクレオチドは、LAG3に対する完全長IgG抗体の重鎖、および、完全長IgG抗体のC末端および/またはN末端に直接またはペプチドリンカーを介して結合しているPD-L1に対するscFvフラグメントをコードし得て;二重特異性抗体の軽鎖をコードするポリヌクレオチドは、LAG3に対する完全長IgG抗体の軽鎖をコードし得る。
他の実施形態は、二重特異性抗体の重鎖をコードするポリヌクレオチド、二重特異性抗体の軽鎖をコードするポリヌクレオチド、またはそれらの両方を含む組換えベクターを提供する。他の実施形態は、前記組換えベクターでトランスフェクトされた組換え細胞を提供する。
他の実施形態は、細胞内で前記二重特異性抗体の重鎖をコードするポリヌクレオチド、前記二重特異性抗体の軽鎖をコードするポリヌクレオチドを発現することを含む、二重特異性抗体を調製する方法を提供する。ポリヌクレオチドを発現する工程は、ポリヌクレオチドを発現させる条件下で(例えば、組換えベクターにおいて)ポリヌクレオチドを含む細胞を培養することによって実施され得る。前記方法は、発現または培養の工程の後に、前記細胞培養物から前記二重特異性抗体を単離および/または精製することをさらに含み得る。
以下、本発明を実施例により詳細に説明する。
以下の実施例は、単に本発明を説明することを意図しており、本発明を制限するものと解釈されるべきではない。
実施例1:抗PD-L1モノクローナル抗体の調製
1.1. 抗ヒトPD-L1マウスモノクローナル抗体の調製とその分析
抗ヒトPD-L1マウスモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ技術を使用して産生された。
抗原:ヒトPD-L1-Fcタンパク質およびヒトPD-L1高発現CHOK1細胞株(PDL1-CHOK1細胞株)。
免疫化:ヒトPD-L1に対するマウスモノクローナル抗体を生成するために、6~8週間の雌BALB/cマウスを最初に1.5×107PDL1-CHOK1細胞で免疫化した。最初の免疫後14日目と33日目に、免疫したマウスをそれぞれ1.5×107のPDL1-CHOK1細胞で再免疫化した。PD-L1タンパク質に結合する抗体を産生するマウスを選択するために、免疫化されたマウスの血清をELISAで試験した。簡潔に説明すると、マイクロタイタープレートをPBS中1μg/mlのヒトPD-L1タンパク質でコーティングし、室温(RT)で100μl/ウェルで一晩コーティングし、100μl/ウェルの5%BSAでブロックした。免疫化したマウスからの血漿の希釈液を各ウェルに加え、RTで1~2時間インキュベートした。プレートをPBS/Tweenで洗浄した後、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)と結合した抗マウスIgG抗体と室温で1時間インキュベートした。洗浄後、プレートをABTS基質で成長させ、OD 405nmで分光光度計で分析した。十分な力価の抗PDL1 IgGを有するマウスを、免疫後54日目に50μgのヒトPDL1-Fcタンパク質で追加免疫化した。得られたマウスを融合に使用した。ハイブリドーマ上清をELISAによって抗PD-L1IgGについて試験した。
ハイブリドーマHL1210-3の可変領域のアミノ酸およびポリヌクレオチド配列を以下の表5に提供する。
Figure 0007177543000011
Figure 0007177543000012
1.2. HL1210-3マウスmAbの活性
ハイブリドーマクローンHL1210-3の結合活性を評価するために、このクローンから精製したmAbをELISA試験に供した。簡単に説明すると、マイクロタイタープレートをPBS中0.1μg/mlのヒトPD-L1-Fcタンパク質、100μl/ウェル、4℃で一晩コーティングし、100μl/ウェルの5%BSAでブロックしました。0.2μg/mlから始まるHL1210-3抗体の3倍希釈液を各ウェルに添加し、室温で1~2時間インキュベートした。プレートをPBS/Tweenで洗浄した後、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)と結合したヤギ抗マウスIgG抗体と室温で1時間インキュベートした。洗浄後、プレートをTMB基質で成長させ、分光光度計でOD450-630nmで分析した。図1に示すように、HL1210-3は高活性(EC50=5.539ng/ml)でヒトPD-L1に結合し得る。
HL1210-3マウスmAbがその受容体PD-1に結合するヒトPD-L1をブロックする活性を評価するために、組換えヒトPD-L1を使用して受容体ブロックアッセイを実施した。
組換えヒトPD-L1がその受容体PD-1に結合することに対するHL1210-3マウスmAbのブロック効果を評価するために、ELISAベースの受容体遮断アッセイを採用した。簡単に説明すると、マイクロタイタープレートをPBS中1μg/mlのヒトPD-L1-Fcタンパク質でコーティングし、100μl/ウェルで4℃で一晩コーティングし、100μl/ウェルの5%BSAでブロックした。50μlのビオチン標識ヒトPD-1-Fcタンパク質および50μlで2μg/mlから始めてHL1210-3抗体を3倍希釈した溶液を各ウェルに添加し、37℃で1時間インキュベートした。プレートをPBS/Tweenで洗浄した後、ストレプトアビジン-HRPとともに37℃で1時間インキュベートした。洗浄後、プレートをTMB基質で成長させ、分光光度計でOD 450-630nmで分析した。図2に示すように、HL1210-3は、IC50=0.7835nMでヒトPD-L1のヒトPD1への結合を効率的に阻害し得る。
さらに、哺乳類細胞で発現させたヒトPD-L1を使用して受容体ブロッキングアッセイも実施した。
哺乳類細胞で発現して受容体PD-1に結合するヒトPD-L1に対するHL1210-3マウスmAbのブロック効果を評価するために、FACSベースの受容体遮断アッセイを使用した。簡単に説明すると、PDL1-CHOK1細胞を、最初に、20μg/mlから始めて厳密に3倍希釈したHL1210-3マウスmAbとともに、室温で1時間インキュベートした。FACSバッファー(2%FBSを含むPBS)で洗浄した後、ビオチン標識huPD-1を各ウェルに添加し、室温で1時間インキュベートした。次に、ストレプトアビジン-PEを各ウェルに0.5時間添加し、FACSバッファーで2回洗浄した。PEの平均蛍光強度(MFI)はFACSAriaIIIによって評価された。図3に示すように、HL1210-3抗体は、哺乳類細胞で発現したPD-L1へのPD-1の結合を2.56nMのIC50で92.6%の最高阻害率で非常に効率的に阻害し得る。
Figure 0007177543000013
1.3. HL1210-3マウスmAbの効果
HL1210-3マウスmAbがヒトT細胞の免疫応答を促進する効果を評価するために、混合リンパ球反応の設定でヒトT細胞の応答を評価した。ヒトDCは、GM-CSFおよびIL-4の存在下で7日間CD14+単球から分化した。次に、別のドナーから単離されたCD4+ T細胞を、DCおよび抗PD-L1ブロッキング抗体の段階希釈液と共培養した。接種後5日目に、培養上清をIFNγ産生についてアッセイした。結果は、HL1210-3抗体が用量依存的にIFNγ産生を促進し得ることを示し、抗PD-L1抗体がヒトT細胞応答を促進し得ることを示唆している(図4)。
1.4. HL1210-3マウスmAbの結合親和性
HL1210-3抗体の組換えPD-L1タンパク質(ヒトPD-L1-his taq)への結合は、キャプチャー法を使用してBIACORETMで試験された。HL1210-3マウスmAbは、CM5チップにコーティングされた抗マウスFc抗体を使用して捕捉された。ヒトPD-L1-histaqタンパク質の段階希釈液を、捕捉した抗体に25μg/mlの流速で3分間注入した。抗原を900秒間解離させた。すべての実験はBiacoreT200で実施された。データ分析は、BiacoreT200評価ソフトウェアを使用して実行された。結果を図5および以下の表6に示す。
Figure 0007177543000014
1.5. HL1210-3マウスmAbのヒト化
mAb HL1210-3可変領域遺伝子を使用して、ヒト化MAbを産生した。このプロセスの最初のステップでは、MAb HL1210-3のVHおよびVKのアミノ酸配列を、利用可能なヒトIg遺伝子(IgG1)配列のデータベースと比較して、全体的に最も一致するヒト生殖細胞系Ig遺伝子配列を見出した。軽鎖の場合、ヒトとの最も近い一致はO18/Jk2およびKV1-39*01/KJ2*04遺伝子であり、重鎖の場合、ヒトとの最も近い一致はVH3-21遺伝子であった。VH3-11、VH3-23、VH3-7*01およびVH3-48遺伝子も、それらの密接な一致のために選択された。
次に、HL1210-3軽鎖のCDR1(配列番号4)、CDR2(配列番号5)およびCDR3(配列番号6)が、O18/Jk2およびKV1-39*01/KJ2*04遺伝子のフレームワーク配列に移植され、かつ、HL1210-3 VHのCDR1(配列番号1)、CDR2(配列番号2)、およびCDR3(配列番号3)配列が、VH3-21、VH3-11、VH3-23、VH3-48またはVH3-7*01遺伝子のフレームワーク配列に移植されたヒト化可変ドメイン配列を設計した。次に、3Dモデルを生成して、マウスアミノ酸をヒトアミノ酸に置き換えると結合および/またはCDRコンフォメーションに影響を与え得るフレームワークの位置があるかどうかを判断した。軽鎖の場合、フレームワーク内の22S、43S、60D、63T、および42Q(Kabatナンバリング、表7を参照)が特定された。重鎖の場合、フレームワーク内の1E、37V、40T、44S、49A、77N、91I、94R、および108Tが逆変異に関与していた。
Figure 0007177543000015
Figure 0007177543000016
いくつかのヒト化抗体のアミノ酸およびヌクレオチド配列を以下の表8に示す。
Figure 0007177543000017
Figure 0007177543000018
Figure 0007177543000019
Figure 0007177543000020
Figure 0007177543000021
Figure 0007177543000022
Figure 0007177543000023
Figure 0007177543000024
Figure 0007177543000025
Figure 0007177543000026
Figure 0007177543000027
Figure 0007177543000028
Figure 0007177543000029
ヒト化されたVHおよびVK遺伝子は合成的に生成され、次にそれぞれヒトガンマ1およびヒトカッパ定常ドメインを含むベクターにクローン化された。ヒトVHおよびヒトVKのペアリングにより、40のヒト化抗体が産生された(表9を参照のこと)。
Figure 0007177543000030
Figure 0007177543000031
Figure 0007177543000032
Figure 0007177543000033
1.6. ヒト化PD-L1抗体の抗原結合特性
抗原結合活性を評価するために、ヒト化抗体をELISA試験にかけた。簡単に説明すると、マイクロタイタープレートをPBS中0.1μg/mlのヒトPD-L1-Fcタンパク質で、100μl/ウェルで4℃で一晩コーティングし、100μl/ウェルの5%BSAでブロックした。ヒト化抗体の10μg/mlから始めた5倍希釈液を各ウェルに添加し、室温で1~2時間インキュベートした。プレートをPBS/Tweenで洗浄した後、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)と結合したヤギ抗マウスIgG抗体とともに室温で1時間インキュベートした。洗浄後、プレートをTMB基質で成長させ、分光光度計でOD 450-630nmで分析した。図6A~6Eに示されるように、すべてのヒト化抗体は、キメラ抗体と接触しているヒトPD-L1と同等の結合効果を示す。
抗原結合特性を評価するために、ヒト化抗体を、FACSによって哺乳動物で発現されたPD-L1への結合について分析した。簡単に説明すると、PDL1-CHOK1細胞を、最初に2μg/ mlから初めて厳密に5倍希釈したヒト化抗体とともに室温で1時間インキュベートした。FACSバッファー(2%FBSを含むPBS)で洗浄した後、alexa 488-抗ヒトIgG抗体を各ウェルに添加し、室温で1時間インキュベートした。Alexa488のMFIはFACSAriaIIIによって評価された。図7A~7Cでは、すべてのヒト化抗体は、哺乳動物細胞で発現されたPD-L1に高効率で結合し得て、これは、キメラ抗体と同等であった。
ヒト化抗体の結合動態を調べるために、この例ではOctet Red 96を使用して親和性ランキングを実行した。表10に示すように、hu1210-3、hu1210-8、hu1210-9、hu1210-14、hu1210-17、hu1210-1およびHu1210-22は、キメラ抗体と同等より優れた親和性を示す。
Figure 0007177543000034

組換えPD-L1タンパク質(ヒトPD-L1-his taq)へのヒト化抗体の結合は、キャプチャー法を使用してBIACORETMによって試験されました。HL1210-3マウスmAbは、CM5チップにコーティングされた抗マウスFc抗体を使用して捕捉された。ヒトPD-L1-histaqタンパク質の段階希釈液を、捕捉した抗体に25μg/mlの流速で3分間注入した。抗原を900秒間解離させた。すべての実験はBiacore T200で実施された。データ分析は、Biacore T200評価ソフトウェアを使用して実行され、以下の表11に示されている。
Figure 0007177543000035
1.7. 種間活性
ヒト化抗体のhuPD-L1、マウスPD-L1、ラットPD-L1、アカゲザルPD-L1への結合を評価するために、ELISA試験のために抗体を実施した。簡単に説明すると、マイクロタイタープレートをヒト、マウス、ラット、アカゲザルのPD-L1-Fcタンパク質でPBS中1μg/ml、100μl/ウェルで、4℃で一晩コーティングし、100μl/ウェルの5%BSAでブロックした。ヒト化抗体の1μg/mlから始めて3倍希釈液を各ウェルに添加し、室温で1~2時間インキュベートした。プレートをPBS/Tweenで洗浄した後、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)と結合したヤギ抗マウスIgG抗体とともに室温で1時間インキュベートした。洗浄後、プレートをTMB基質で成長させ、分光光度計でOD 450-630nmで分析した。Hu1210-41抗体は、アカゲザルPD-L1に低い親和性で結合し得て、ラットおよびマウスのPD-L1には結合し得ない(図8および表12)。
Figure 0007177543000036
ヒト化抗PD-L1抗体のヒトB7ファミリーおよびその他の免疫チェックポイントへの結合を評価するために、抗体をELISAによりB7-H1(PD-L1)、B7-DC、B7-1、B7-2、B7-H2、PD-1、CD28、CTLA4、ICOSおよびBTLAへの結合について評価した。図9に示すように、前記Hu1210-41抗体はB7-H1(PD-L1)にのみ特異的に結合し得る。
1.8. PD-1に対するヒトPD-L1をブロックするヒト化抗PD-L1抗体の活性
細胞ベースの受容体ブロッキングアッセイ
哺乳動物細胞で発現して受容体PD-1に結合するヒトPD-L1に対するヒト化抗体の遮断効果を評価するために、FACSベースの受容体遮断アッセイを採用した。簡単に説明すると、PDL1-CHOK1細胞を、最初に20μg/mlから始めて厳密に3倍希釈したHL1210-3マウスmAbとともに、室温で1時間インキュベートした。FACSバッファー(2%FBSを含むPBS)で洗浄した後、ビオチン標識huPD-1を各ウェルに添加し、室温で1時間インキュベートした。次に、ストレプトアビジン-PEを各ウェルに0.5時間添加し、FACSバッファーで2回洗浄した。PEの平均蛍光強度(MFI)はFACSAriaIIIによって評価された。
Figure 0007177543000037
以下の表13に示すように、Hu1210-3、Hu1210-9、Hu1210-8、Hu1210-14、Hu1210-17、Hu1210-19、およびHu1210-22抗体は、PD-L1のPD-1との結合をブロックするキメラ抗体と同等の効果を示す。
Figure 0007177543000038
組換えヒトPD-L1を使用した受容体ブロッキングアッセイ
ヒトPD-L1には2つの受容体、すなわちPD-1およびB7-1がある。これら2つのタンパク質に対するヒト化PD-L1抗体のブロッキング特性を調べるために、ここではタンパク質ベースの受容体ブロッキングアッセイを採用した。簡単に説明すると、マイクロタイタープレートをPBS中1μg/mlのヒトPD-L1-Fcタンパク質で、100μl/ウェル、4℃で一晩コーティングし、200μl/ウェルの5%BSAで、37℃で2時間ブロックした。50μlのビオチン標識ヒトPD-1-FcまたはB7-1タンパク質、およびPD-L1抗体の100nMから始めて5倍希釈液を各ウェルに50μlで添加し、37℃で1時間インキュベートした。プレートをPBS/Tweenで洗浄した後、ストレプトアビジン-HRPとともに37℃で1時間インキュベートした。洗浄後、プレートをTMB基質で成長させ、OD 450nmで分光光度計で分析した。図10および11に示されるように、Hu1210-41は、ヒトPD-L1のヒトPD1およびB7-1への結合を効率的に阻害し得る。
1.9. ヒトT細胞免疫応答を促進するためのヒト化抗PD-L1抗体の活性
混合リンパ球反応アッセイ
ヒト化抗体のinvitro機能を評価するために、混合リンパ球反応設定でヒトT細胞の応答を評価した。ヒトDCは、GM-CSFおよびIL-4の存在下で7日間CD14+単球から分化した。次に、別のドナーから単離されたCD4+ T細胞を、DCおよび抗PD-L1ブロッキング抗体の段階希釈液と共培養した。接種後5日目に、培養上清をIL-2およびIFNγ産生についてアッセイした。結果は、Hu1210-8、Hu1210-9、Hu1210-16、およびHu1210-17抗体が用量依存的にIL-2およびIFNγ産生を促進し得ることを示し、抗PD-L1抗体がヒトT細胞応答を促進し得ることを示唆している。
CMVリコールアッセイ
ヒト化抗体のinvitro機能を評価するために、CMVリコールアッセイでヒトT細胞の応答を評価した。ヒトPBMCは、厳密に希釈したヒト化抗体の存在下で1μg/mlCMV抗原で刺激された。図12および13に示すように、Hu1210-40、Hu1210-41およびHu1210-17は用量依存的にIFNγ産生を促進し得る。
1.10. 抗PD-L1mAbによる腫瘍増殖阻害。
ヒト肺腺癌細胞株HCC827の細胞は、NOD scid gamma(NSG)マウスに移植される。NSGマウスは、NOD scidガンマ欠損症であり、最も免疫不全のマウスであるため、ヒト腫瘍細胞およびPBMC移植の望ましいレシピエントとなる。移植後10日で、ヒトPBMCが担癌マウスに移植される。移植後約20日で、腫瘍体積が100~150mmに達したら、PD-L1抗体を5mg/kgで1日おきにマウスに投与する。腫瘍体積は、抗体投与と併せて隔日でモニターされる。図14に示すように、Hu1210-31は5mg/kgで腫瘍の成長を30%阻害し得る。Hu1210-41抗体は用量依存的に腫瘍増殖を阻害し得て、腫瘍重量もまたHu1210-41抗体によって用量依存的に抑制された(図15)。
1.11. ヒト化抗体のさらなる変異と最適化のコンピューターシミュレーション
CDR領域またはフレームワーク領域内の特定のアミノ酸残基を変更して、抗体の活性および/または安定性をさらに改善または保持し得ると考えられた。変異体は、計算ツール(VectorNTI,www.ebi.ac.uk/tools/msa/clustalo/で利用可能)を使用して、それらの構造的、コンフォメーション、および機能的特性、および(CDR領域内の)兆候を示したものは以下の表にリスト化されている。
Figure 0007177543000039
Figure 0007177543000040
Figure 0007177543000041
1.12. PD-L1エピトープの同定
この研究は、本開示の抗体へのPD-L1の結合に関与するアミノ酸残基を同定するために実施された。
PD-L1のアラニンスキャンライブラリが構築された。簡単に説明すると、PD-L1の217変異クローンが、IntegralMolecularのタンパク質エンジニアリングプラットフォームで生成されました。PD-L1変異ライブラリーの各変異体へのHu1210-41Fabの結合は、ハイスループットフローサイトメトリーによって重複して決定された。各生データポイントのバックグラウンド蛍光が差し引かれ、PD-L1野生型(WT)との反応性に対して正規化された。各PD-L1変異体について、平均結合値を発現の関数としてプロットした(コントロール抗PD-L1 mAb反応性)。予備的で重要なクローン(十字の付いた円)を特定するために、コントロールMAbへの>70%WT結合およびHu1210-41 Fabへの<30%WT反応性の閾値(破線)を適用した(図16)。PDL1のY134、K162、およびN183は、Hu1210-41結合に必要な残基として特定された。N183AクローンのHu1210-41Fabとの反応性が低いことは、それがHu1210-41結合の主要なエネルギー的寄与因子であり、Y134およびK162による寄与が少ないことを示唆している。
重要な残基(球)は、図17に示されるように、3D PD-L1構造上で同定された。したがって、これらの残基、Y134、K162、およびN183は、本開示の様々な実施形態の抗体への結合に関与するPD-L1のエピトープを構成する。
Y134、K162、およびN183はすべてPD-L1タンパク質のIgCドメイン内にあることは興味深い。PD-1およびPD-L1の両方の細胞外部分には、IgVドメインおよびIgCドメインが存在する。PD-L1はIgVドメイン間の結合を介してPD-1に結合することが通常に知られている。ただし、このような従来の抗体とは異なり、Hu1210-41はIgCドメインに結合し、このIgCドメインは、PD-1/PD-L1結合の阻害には効果がないと予想されていた。Hu1210-41のこの異なるエピトープは、驚くべきことに、Hu1210-41の優れた活性に寄与し得る。
1.13. 抗PDL1抗体の抗体工学
実施例1.13~1.15は、突然変異誘発を使用して、Hu1210-41に基づいてさらに改善された抗体を同定することを試みた。
以下の戦略のいずれかを使用して、抗PD-L1モノクローナル抗体の抗体工学のために4つのサブライブラリーを構築した。戦略1では、重鎖可変ドメインVH CDR3またはVL-CDR3の突然変異誘発は、高度にランダムな突然変異によって実行された。戦略2では、(VH-CDR3、VL-CDR3、およびVL-CDR1)または(VH-CDR1、VH-CDR2、およびVL-CDR2)で構成される2つのCDR組み合わせライブラリーが、制御された突然変異率でのCDRウォーキングによって生成された。
バイオパニング:ファージパニング法は、過酷な洗浄条件の前にインキュベーション/結合時間を短縮することによって適応された。簡単に説明すると、100μlの磁性ストレプトアビジンビーズ(Invitrogen、USA)を1mlのMPBSで室温で1時間ブロックした。別のチューブで、ライブラリーファージを1mlのMPBS中の100μlの磁性ストレプトアビジンビーズとプレインキュベートして(各ラウンドで5×10^11~12)、不要な結合剤を除去した。ファージとビーズとを分離するために、磁石粒子濃縮器が使用された。ビオチン化PD-L1タンパク質をファージに添加し、室温で2時間インキュベートし、オーバーヘッドシェーカーを使用して穏やかに混合した。溶液からファージを有するビーズを磁性粒子濃縮器で分離し、上澄みを廃棄した。ビーズを新しい洗浄バッファーで、PBSTで10回、PBS(pH7.4)で10回洗浄した。PBS(Sigma、USA)中の0.8ml、0.25%トリプシンを添加し、37℃で20分間インキュベートしてファージを溶出させた。出力ファージを滴定し、次のラウンドのパニングのためにレスキューし、抗原濃度をラウンドごとに減少させた。
ELISAスクリーニングとオン/オフ率ランキング
クローンを選択し、望ましいパニング出力から誘導した。一次スクリーニングのためにファージELISAを実施した。陽性クローンは配列決定により分析された。特有のホットスポットが見つかった。表15に特定された変異を示す。以下に示すように、前記CDRH3のFGK残基は、改良された抗体を生成するホットポット残基である。
Figure 0007177543000042
Figure 0007177543000043
これらの抗体の可変領域のアミノ酸配列を以下の表16に示す。
Figure 0007177543000044
Figure 0007177543000045
Figure 0007177543000046
1.14. PD-L1抗体の抗原結合特性
表15および表16に示すように、合計9つの固有のクローンが特徴づけられ、完全長IgGに変換された。
組換えヒトPD-L1への結合特性
抗原結合活性を評価するために、抗体をELISA試験にかけた。簡単に説明すると、マイクロタイタープレートをPBS中2μg/mlのヒトPD-L1-Fcタンパク質で、100μl/ウェル、4℃で一晩コーティングし、100μl/ウェルの5%BSAでブロックした。ヒト化抗体の10μg/mlから始めて4倍希釈液を各ウェルに添加し、室温で1~2時間インキュベートした。プレートをPBS/Tweenで洗浄した後、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)と結合したヤギ抗マウスIgG抗体と室温で1時間インキュベートした。洗浄後、プレートをTMB基質で成長させ、分光光度計でOD 450~630nmで分析した。図18に示すように、すべてのヒト化抗体は、ヒトPD-L1に対して優れた結合効果を示し、B6およびC3は親クローンWTよりも良好に機能した。
哺乳類で発現したヒトPD-L1への結合特性
抗原結合特性を評価するために、FACSによって哺乳動物で発現されたPD-L1への結合について抗体を分析した。簡単に説明すると、PDL1-Raji細胞を、最初に2μg/mlから始めて厳密に5倍希釈されたヒト化抗体とともに室温で1時間インキュベートした。FACSバッファー(2%FBSを含むPBS)で洗浄した後、Alexa 488-抗ヒトIgG抗体を各ウェルに添加し、室温で1時間インキュベートした。Alexa488のMFIはFACSAriaIIIによって評価された。図19に示されるように、B6は哺乳類細胞で発現したPD-L1に非常に効率的に結合し、これは親抗体WTよりも強力であった。
Biacoreによるヒト化抗体の親和性ランキング
ヒト化抗体の結合動態を調べるために、この例ではBiacoreを使用して親和性ランキングを実行した。表17に示すように、B6、C3、C6、A1、およびA3は、親抗体WTよりも優れた親和性を示した。
Figure 0007177543000047
1.15. 抗PDL1抗体の細胞ベースの機能
T細胞応答を刺激する抗PDL1抗体の能力を試験するために、hPD-1発現ジャーカット細胞を使用した。簡単に言えば、JurkatはTCR刺激時にIL2を産生し得るヒトT細胞白血病細胞株である。このアッセイでは、レンチウイルスによってヒトPD-1遺伝子をトランスフェクトされたJurkat細胞をレスポンダー細胞として使用した。Raji-PDL1細胞を抗原提示細胞(APC)として使用した。ブドウ球菌エンテロトキシン(SE)は、TCRシグナルを刺激するために使用される。このシステムでは、異所的に発現したhuPDL1は、Jurkat細胞によるSE刺激によるIL-2産生を抑制し得て、抗PDL1抗体はIL-2産生を逆転させ得る。要するに、APC(2.5×10)は、SE刺激の存在下でPD-1発現Jurkat T細胞(1×10)と共培養された。培養開始時に抗PDL1抗体(100nMから開始し、1:4を8回段階希釈)を添加した。48時間後、培養上清をELISAによってIL2産生について評価した。図20に示すように、B6モノクローナル抗体は親抗体WTよりも強力であった。
実施例2.抗LAG3モノクローナル抗体の調製
2.1. LAG-3に対する完全ヒトモノクローナル抗体のスクリーニング
抗LAG3ヒトモノクローナル抗体(α-LAG-3mAb)は、完全ヒトFabファージディスプレイライブラリーをスクリーニングすることによって産生された。野生型LAG-3-ECD-huFcフラグメントはダウディ細胞に結合し得るが、D1-D2トランケートされたLAG-3-ECD-huFcフラグメントはダウディ細胞に結合し得ない(図21)。したがって、D1-D2ドメインはLAG-3機能にとって重要である。
ファージディスプレイライブラリーパニング用の抗原。LAG-3は、免疫グロブリン(Ig)スーパーファミリーに属するシングルパスI型膜タンパク質であり、ドメイン(D)1、D2、D3、およびD4の4つの細胞外Ig様ドメイン(ECD)を含む。組換えヒトLAG-3-ECD-ヒトIgG1(LAG-3-huFc)融合タンパク質またはヒトD1-D2トランケートLAG-3-ECD-ヒトIgG1(ΔD1D2-LAG-3-huFc)融合タンパク質を 293T細胞システムで発現させた。
ファージライブラリー。哺乳類のIg遺伝子セグメントは、可変(V)、多様性(D)、結合(J)、および定数(C)のエクソンのグループに配置されている。ヒトFabファージライブラリーは、以下からなるファージベクターを使用して解釈された:1)すべてのヒト可変カッパ(VK)レパートリー;2)健康なヒト被験者からの遺伝的にランダム化されたCDR3領域を伴う、それぞれVH3-23およびVH1-69生殖細胞系遺伝子のVH。
抗原のスクリーニングと生成。D1-D2ドメイン特異的ファージ結合剤を選択するために、ファージライブラリーを抗原ベースのパニングにかけた。
I)LAG-3に対するファージライブラリー溶液のパニング。
293F細胞に、N末端にFLAGタグが付いたD1-D2欠失LAG-3(△D1D2-LAG-3)配列を含むプラスミドをトランスフェクトした。トランスフェクトの3日後、△D1D2-LAG-3293F細胞をファージライブラリーのスクリーニングに使用した。ファージライブラリーを順次ネガティブスクリーニングを行った:ストレプトアビジンビーズ、△D1D2-LAG-3トランスフェクト293F細胞およびビオチン標識ヒトIgG1Fcタンパク質。次に、得られたライブラリーを、ビオチン化LAG-3-huFc LAG-3と2時間、運動させながらインキュベートした後、100μLのカゼインブロックストレプトアビジン-磁気ビーズと15分間インキュベートした。PBSで5~20回洗浄することにより、結合していないファージを除去した。次に、結合したファージを、新たに調製した100mMトリエチルアミン(TEA)で溶出し、Tris-HClバッファーを添加して中和した。得られたファージは、アウトプット-1ファージライブラリーとして標識された。アウトプット-1ファージライブラリーを上記と同じスクリーニングに供して、アウトプット-2およびその後のアウトプット-3ファージライブラリーを生成した。合計3回のファージライブラリースクリーニングを実施した。
II)LAG-3に対するファージライブラリー免疫管パニング
ファージライブラリーを使用して、カゼインでコーティングされた免疫管、△D1D2-LAG-3でトランスフェクトされた293F細胞およびヒトIgG1Fcタンパク質の連続的なネガティブスクリーニングを実施した。次に、得られたライブラリーを、LAG3-huFcでコーティングされたイムノチューブ内で2時間動かしながらインキュベートした。PBSTで5~20回洗浄することにより、結合していないファージを除去した。 細胞ベースのパニングと同様に、合計3ラウンドのファージライブラリースクリーニングを実施した。
アウトプット-3ファージライブラリーを希釈し、プレートして37℃で8時間増殖させ、抗カッパ抗体でコーティングしたフィルターで22℃で一晩捕捉した。ビオチン化LAG-3-huFc(50nM)およびNeutrAvidin-APコンジュゲートをフィルターに適用して、抗原結合抗LAG3ファージを検出した。陽性のファージプラークを拾い上げ、100μLのファージ溶出バッファーに溶出した。次に、約10~15μLの溶出ファージを使用して1mLのXL1-Blueコンピテントセルに感染させ、ファージシングルポイントELISA(SPE)用の高力価(HT)ファージ(50nMの試験済みの各タンパク質でコーティングされたELISA固定化基質)を産生した。各ファージヒットの1×1010プラーク形成ユニット(pfus)をSPE確認に使用した。次に、フィルターリフトから選択された陽性クローンを、LAG-3-huFcおよびΔD1D2-LAG-3-huFcとのLAG-3抗原結合について試験した。D1-D2特異的結合剤は、PCRによって抗原陽性ファージから増幅され、配列決定された。Ig軽鎖V遺伝子(VL)とVH配列を分析して、固有の配列を特定し、配列の多様性を決定した。
すべてのヒットのVLおよびVH遺伝子配列を発現ベクターpFUSE2ss-CLIg-hk(軽鎖、InvivoGenカタログ番号pfuse2ss-hclk)およびpFUSEss-CHIg-hG1(重鎖、InvivoGenカタログ番号pfusess-hchg1)にクローニングした。抗体はHEK293細胞で発現され、プロテインAPLUS-アガロースを使用して精製された。抗体の配列およびそのCDR領域を以下の表に示す。
Figure 0007177543000048
Figure 0007177543000049
Figure 0007177543000050
Figure 0007177543000051
Figure 0007177543000052
Figure 0007177543000053
Figure 0007177543000054
Figure 0007177543000055
Figure 0007177543000056
Figure 0007177543000057
Figure 0007177543000058
Figure 0007177543000059
Figure 0007177543000060
Figure 0007177543000061
Figure 0007177543000062
Figure 0007177543000063
Figure 0007177543000064
Figure 0007177543000065
Figure 0007177543000066
Figure 0007177543000067
Figure 0007177543000068
2.2. 様々な種に由来するLAG3タンパク質へのヒト抗LAG3抗体の結合。
ヒト、ラット、およびマウスのLAG3に結合する抗LAG-3抗体の能力を評価するために、実施例2.1で同定された抗体を、ELISAを介してそれらの結合特性について評価した。ヒト、ラット、マウスのLAG3 ECD-Fcタンパク質を、100μl/ウェルで1μg/mlでELISAプレートにコーティングした。実施例1からの抗体は、ELISA希釈緩衝液で段階的に希釈された。次に、結合を評価するために、さまざまな濃度のLAG-3抗体(10μg/ml、3.333μg/ml、1.111μg/ml、0.370μg/ml、0.123μg/ml、0.041μg/ml、0.014μg/ml、0.005μg/ml、0.0015μg/ml、および0.0005μg/ml)をLAG3抗原コーティングプレートに1.5時間室温で添加した。得られたプレートを洗浄し、抗ヒトIgG(Fab)-HRP抗体で標識した。S31はヒトLAG3にのみ結合し得る。S27およびT99は、ヒトLAG3およびラット/マウスLAG3に低い効力で結合し得る。S119抗体は、ヒト、ラット、およびマウスのLAG3に高い効力で結合し得る(図22A~22D)。
2.3. 活性化されたヒト初代CD4+ T細胞上の細胞表面LAG-3抗原へのヒト抗LAG3抗体の結合。
LAG-3は、活性化または枯渇したT細胞に発現する。CD4+ T細胞は、CD4磁気ビーズを使用して分離された。精製したヒトCD4+ T細胞をDynabeads(登録商標)HumanT-ActivatorCD3/CD28で72時間刺激した。実施例2.1の抗体をFACS緩衝液で段階希釈した。次に、結合を評価するために、さまざまな濃度のLAG-3抗体(10μg/ml、3.333μg/ml、1.111μg/ml、0.370μg/ml、0.123μg/ml、0.041μg/ml、0.014μg/mlおよび0.005μg/ml)を、マウス抗ヒトLAG3 PE抗体(eBioscience、クローン:3DS223H)の存在下で、活性化されたヒトCD4T細胞に氷上で30分間添加した。標識した細胞をFACSバッファーで洗浄した後、氷上で30分間APC標識抗ヒトIgG抗体で標識した。得られた細胞をFACSバッファーで1回洗浄した。標識された細胞は、BDFACSCaliburTMでのフローサイトメトリーによって蛍光強度について評価された。図23に示すように、前記S27、S31、T99およびS119抗体は、活性化されたヒトCD4 T細胞に発現するLAG3に用量依存的に結合し得る。
2.4. MHCクラスII受容体に結合する可溶性LAG-3(sLAG)の抗LAG-3抗体阻害
sLAG-3のMHCクラスII受容体への結合をブロックする抗LAG-3抗体の能力を評価するために、ビオチン標識LAG-3-ECD-huFc融合タンパク質とMHCクラスII受容体を発現するRaji細胞を使用してinvitro結合アッセイを設計した。実施例1の抗体を、FACS緩衝液で20μg/mLから段階希釈し、6μg/mLのビオチン-LAG-3-ECD-huFccと共に室温で30分間プレインキュベートした。次に、抗体混合物をFcRでブロックされたRaji細胞に添加し、氷上で30分間インキュベートした。次に、細胞をFACS緩衝液で洗浄し、続いて氷上でストレプトアビジンPEで30分間染色し、続いてFACS緩衝液で1回洗浄した。標識された細胞を、BDFACSCaliburTMでのフローサイトメトリーによって蛍光強度について評価した。図24に示されるように、前記S27、S31、S119およびT99抗体は、LAG3のその受容体MHCクラスII分子への結合を用量依存的に阻害し得る。
2.5.抗LAG-3抗体による末梢血単核細胞(PBMC)でのIL-2産生の刺激
ブドウ球菌エンテロトキシンB(SEB)は、MHCクラスII抗原とT細胞受容体(TCR)に同時に結合し、T細胞の増殖とサイトカイン産生を誘導するようにそれらを結合するスーパー抗原である。20μg/mlから始めて6回1:3の段階希釈をした、様々な濃度における実施例1からの抗体の存在下で、2×10のPBMCをSEBで刺激した。3日後、培養上清中のIL-2濃度をELISAによって評価した。図25に示すように、PD-1抗体と同様に、抗LAG3抗体(S24、S27、S31、S87、S119、T99、およびS20)は、SEB刺激のみと比較して用量依存的にIL-2産生を増強し得る。
2.6. 抗LAG-3抗体の使用による、エフェクターT細胞(Teffs)に対する制御性T細胞(Tregs)の阻害の逆転。
LAG-3はTreg(CD4CD25hi)で高度に発現し、それらの抑制機能を仲介する(Journal of Immunology 184:6545-51,2010)。エフェクターT細胞(CD4CD25CD127hi)に対するTregの抑制効果を逆転させる抗LAG-3抗体の能力を評価するために、実施例1の抗体をインビトロ抑制アッセイで使用した。まず、BD FACSAria IIシステムを使用してTreg(CD4CD25hiCD127low)とTeffs(CD4CD25CD127hi)をFACSソートした。次に、Teffをカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル(CFSE)で標識し、プレート結合抗CD3抗体およびマイトマイシンC処理抗原提示細胞の存在下で1:1の比率でTregと共培養した。次に、抗LAG-3抗体を細胞培養に添加し、5日後にTeffs細胞の増殖を試験しました。
図26の結果は、TregをエフェクターT細胞と共培養すると、エフェクターT細胞の増殖およびサイトカイン産生が阻害されたことを示している。S119およびT99は、TregによるTeffの阻害を逆転させ得る。
2.7. LAG-3抗体BIACORE分析
S20、S24、S27、S31、S87、S119、S120、S128、S136、S161、およびT99抗体の組換えhisタグヒトLAG3-ECDタンパク質への結合を、キャプチャー法を使用してBiacore T200で調べた。抗LAG3抗体は、抗ヒトFc抗体を使用して捕捉された。抗ヒトFc抗体をチップ上にコーティングした。連続濃度のhisタグヒトLAG3-ECDタンパク質(0~4nM)を、キャプチャー抗体に30μl/分の流速で注入した。解離段階は900秒または550秒であった。結果を以下の表22に示す。抗LAG3抗体のBiacoreの結果は、これらの抗LAG3抗体がヒトLAG3に対する高親和性結合剤であることを示している。
Figure 0007177543000069
2.8. ヒトLAG3に対するマウスモノクローナル抗体の産生
この例は、ハイブリドーマ技術を使用して抗ヒトLAG3マウスモノクローナル抗体がどのように産生されたかを示している。
抗原:組換えヒトLAG-3融合タンパク質を免疫原として使用して、抗ヒトLAG-3抗体を産生させた。マウス免疫グロブリンFcドメイン(D1-D4mFc)に融合したヒトLAG-3の細胞外領域全体(ドメイン1~4)を含む融合タンパク質を免疫原として使用した。ELISA結合試験では、細胞外領域全体(ドメイン1~4)、またはヒトLAG-3のD1-D2ドメインを含まない細胞外領域を含む融合タンパク質はヒト免疫グロブリンFcドメイン(それぞれD1-D4huFcまたは△D1-D2huFc)に融合した。前記LAG-3融合タンパク質は、標準的な組換えDNA技術を使用して調製した。
免疫付与:
LAG-3融合タンパク質は、標準的な組換えDNA技術を使用して調製した。マウスを腹腔内(IP)および/または皮下(SC)で免疫化した。マウスは最初に50mgの免疫原をSC免疫化し、次に25μgの免疫原で隔週でIP免疫化した。免疫応答は、眼窩後出血によってモニターされた。血漿は、ELISAおよび細胞ベースの受容体ブロッキングアッセイ(以下に記載)によってスクリーニングされた。十分な力価の抗LAG-3D1-D2ドメイン免疫グロブリンおよび機能的LAG3ブロッカーを有するマウスを融合に使用した。脾臓を犠牲にして除去する前に、マウスを25μgの抗原で腹腔内に追加免疫し、続いて25μgの抗原で追加免疫した。脾臓を融合に使用した。ハイブリドーマ上清を、抗LAG-3 D1-D2ドメイン結合、および細胞ベースの受容体遮断アッセイによってその受容体へのLAG3の結合を遮断するその機能について試験した。
抗LAG3遮断抗体を産生するマウスの選択。
抗LAG3遮断抗体を産生するマウスを選択するために、免疫化されたマウスからの血清を、ELISAによってD1-D2ドメインへの結合について試験した。簡単に説明すると、血清のD1-D4 huFcへの結合を評価し、△D1-D2huFcへの結合をカウンタースクリーンとして使用した。端的には、D1-D4huFcまたは△D1-D2huFcを0.5μg/mlで一晩コーティングし、PBS中の5%BSAでブロックした。連続希釈した血清を、コーティングされた抗原とともに室温で1時間インキュベートした。得られたプレートをPBS/Tで洗浄し、ヤギ抗マウスIgG-HRPとともに室温で1時間インキュベートした。プレートをTMB基質で成長させ、OD 450~630nmで分光光度計によって分析した。並行して、実施例2.4に記載されているように、血清を、Raji細胞上に発現されたMHCII分子へのLAG3の結合を遮断するそれらの機能について評価した。LAG3 D1-D2ドメインに特異的で、LAG3のRaji細胞への結合をブロックする機能を有する高力価のマウスを、融合およびさらなるスクリーニングのために選択した。
ハイブリドーマクローン122H、147Hおよび170Hは、さらなる分析および配列決定のために選択された。
2.9. 抗LAG3マウスモノクローナル抗体の結合特性
この実施例では、LAG3タンパク質に対する抗LAG3マウス抗体の結合特性を試験した。
D1-D2固有の結合剤:
結合特異性を評価するために、精製された122H、147H、および170Hマウスモノクローナル抗体を、D1-D4huFcおよび△D1-D2huFc抗原のELISA結合試験に供した。簡単に説明すると、D1-D4huFcまたは△D1-D2huFcを0.5μg/mlで一晩コーティングし、PBS中の5%BSAでブロックした。連続希釈した抗体(1μg/mlから開始し1:3の10回の段階希釈)を、コーティングした抗原とともに室温で1時間インキュベートした。得られたプレートをPBS/Tで洗浄し、ヤギ抗マウスIgG-HRPとともに室温で1時間インキュベートした。プレートをTMB基質で成長させ、OD 450~630nmで分光光度計によって分析された。
ELISAの結果を図27A~27Cに要約し、これにより、LAG3の完全な細胞外ドメイン(D1-D4 huFc)に強い結合を示すが、LAG3が削除されたD1-D2(△D1-D2huFc)には強く結合しないことから、122H、147H、および170Hが、ヒトLAG3のD1およびD2ドメインに対する強力かつ選択的な結合剤であることを確認した。
2.10. 抗LAG3マウスモノクローナル抗体の機能特性
LAG3のその受容体への結合のブロック
sLAG-3のMHCクラスII受容体への結合をブロックする抗LAG-3抗体の能力を評価するために、ビオチン標識LAG-3-ECD-huFc融合タンパク質とMHCクラスII受容体を発現するRaji細胞を使用してinvitro結合アッセイを設計した。122H、147H、および170Hマウスモノクローナル抗体をFACSバッファーで20μg/ mLから段階希釈し(1:5で6回)、6μg/mLのビオチン-LAG-3-ECD-huFcとともに室温で30分間プレインキュベートした。次に、抗体混合物をFcRでブロックされたRaji細胞に添加し、氷上で30分間インキュベートした。次に、細胞をFACS緩衝液で洗浄し、続いて氷上でストレプトアビジンPEで30分間染色し、続いてFACS緩衝液で1回洗浄した。標識された細胞は、BD FACSCaliburTMでのフローサイトメトリーによって蛍光強度について評価された。図28A~28Cに示されるように、前記122H、147Hおよび170H抗体は、LAG3のその受容体MHCクラスII分子への結合を用量依存的に阻害し得る。
抗LAG3抗体によるヒトT細胞応答の刺激
刺激されたT細胞応答に対する抗LAG3抗体の能力を試験するために、JurkatT細胞刺激アッセイが使用された。Jurkatは、TCR刺激によりIL2を産生し得るヒトT細胞白血病細胞株である。このアッセイでは、レンチウイルスによってヒトLAG3遺伝子をトランスフェクトされたJurkat細胞をレスポンダー細胞として使用した。MHCIIを発現したRaji細胞を抗原提示細胞(APC)として使用した。ブドウ球菌エンテロトキシン(SE)はスーパー抗原であり、MHCII分子とT細胞受容体ベータ(TCRVβ)とを架橋し、T細胞応答を刺激し得る。このアッセイでは、SEを刺激剤として使用した。このシステムでは、異所的に発現したhuLAG3は、Jurkat細胞によるSE刺激によるIL-2産生を抑制し得て、抗LAG3抗体はIL-2産生を逆転させ得る。要するに、APC(2.5×10)は、SE刺激の存在下で、LAG3発現ジャーカットT細胞(1×10)と共培養された。培養開始時に抗LAG3抗体(20μg/mlから開始し、1:5で6回段階希釈)を添加した。48時間後、培養上清をELISAによってIL2産生について評価した。図29に示すように、122H、147H、および170Hマウスモノクローナル抗体は、Jurkat T細胞によるIL2産生を用量依存的に促進し得て、T細胞へのLAG3シグナルを抑制することによってTCR刺激を刺激し得ることを示唆している。
2.11. 147HマウスmAbヒト化設計
前記mAb 147H可変領域遺伝子を使用して、ヒト化mAbを産生した。このプロセスの最初の工程では、mAb 147HのVHおよびVκのアミノ酸配列を、利用可能なヒトIg遺伝子配列のデータベースと比較して、全体的に最も一致するヒト生殖細胞系Ig遺伝子配列を探した。軽鎖の場合、最も近いヒトの一致はA19/JK4遺伝子であり、重鎖の場合、ヒトとの最も近い一致はVH1-f/JH6遺伝子であった。次に、ヒト化可変ドメイン配列を設計し、147H軽鎖のCDR1(配列番号243)、CDR2(配列番号244)およびCDR3(配列番号245)をA19/JK4遺伝子のフレームワーク配列に移植し、147H VHのCDR1(配列番号240)、CDR2(配列番号241)、およびCDR3(配列番号242)配列を、VH1-f/JH6遺伝子のフレームワーク配列に移植した。次に、3Dモデルを生成して、マウスアミノ酸をヒトアミノ酸に置き換えると結合および/またはCDRコンフォメーションに影響を与え得るフレームワークの位置があるかどうかを判断した。重鎖の場合、ヒトフレームワークのR71、M69、R66、V67、M48、V37、R38、Y91、およびQ1(Kabatナンバリング)が特定され、マウスの対応するアミノ酸、すなわちR71A、 M69L、R66K、V67A、M48I、V37I、R38K、Y91FおよびQ1Eへの逆変異を受けた。
Figure 0007177543000070
ヒト化抗体のアミノ酸配列が記載されている:147H-1、147H-2、147H-3、147H-4、147H-5、147H-6、147H-7、147H-8、147H-9、147H-10、147H-11、147H-12、147H-13、および147H-14は、それぞれ異なる重鎖を有するが、すべて共通の軽鎖を共有している。
Figure 0007177543000071
Figure 0007177543000072
ヒト化されたVHおよびVK遺伝子は合成的に産生され、次にそれぞれヒトガンマ1およびヒトカッパ定常ドメインを含むベクターにクローン化された。ヒトVHおよびヒトVKのペアリングにより、40のヒト化抗体を産生した。
2.12. 抗LAG3 147Hヒト化モノクローナル抗体の結合特性
Octet(登録商標)RED96システムによるヒト化抗体の親和性ランキング
ヒト化抗体の結合動態を調べるために、この例ではOctet Red 96を使用して親和性ランキングを実行した。以下の表25に示すように、147H、147H-6、147H-7、147H-13、および147H-14はより優れた親和性を示す。
Figure 0007177543000073
Octet(登録商標)RED96システムによるヒト化抗体の完全な動的親和性
ヒト化抗体の結合動態を調べるために、この例では、Octet Red 96を使用してさまざまな用量の抗原(50nM、25nM、12.5nM、6.15nM、3.125nM)を実行することにより、完全な動態親和性試験をさらに実行した。Octet(登録商標)RED96システムのソフトウェアによって計算された。表26に示すように、147H-6、147H-7、147H-13、および147H-14は、147Hキメラ抗体と同等の親和性を示した。
Figure 0007177543000074
2.13. 抗LAG3マウスモノクローナル抗体の機能特性
抗LAG3抗体によるヒトT細胞応答の刺激
刺激されたT細胞応答に対する抗LAG3抗体の能力を試験するために、実施例12に記載されるように、Jurkat T細胞刺激アッセイを使用した。培養開始時に、抗LAG3抗体(30μg/mlから開始し、1:3を6回段階希釈)を添加した。48時間後、培養上清をELISAによってIL2産生について評価した。図30に示すように、147H-13ヒト化モノクローナル抗体は、Jurkat T細胞によるIL2産生を用量依存的に促進し得て、T細胞へのLAG3シグナルを抑制することによってTCR刺激を刺激し得ることを示唆している。
2.14. 抗LAG3147Hヒト化モノクローナル抗体の親和性成熟
抗原結合親和性を改善するために、この例では、ファージディスプレイ技術を使用して147H4-13の親和性成熟を実行した。戦略1:147H-13のCDRH3およびCDRL3は、コドンベースの突然変異誘発の対象であった。CDRH3およびCDRL3は、それぞれH95-H102とL89-L97(Kabatナンバリング)の位置でランダム化された。戦略2:各CDRは、CDRウォーキングアプローチを使用した単一コドンベースの突然変異誘発の対象となった。次に、CDRH1、CDRH2、CDRL1がライブラリー1に結合される。CDRH3、CDRL2、CDRL3がライブラリー2に結合される。
どちらの戦略でも、ライブラリーは、3ラウンドまたは4ラウンドの親和性ベースの液相ファージディスプレイ選択の対象となり、各ラウンドで抗原の濃度が減少した。最初のラウンドでは、比較的高い抗原濃度(10nM)を使用した。抗原濃度を、高親和性変異体を選択するために、後続の3ラウンドのそれぞれで10倍、または後続の2ラウンドのそれぞれで100倍減少させた。最終ラウンドからの個々の変異体を、ELISAスクリーニングによって抗原への陽性結合について試験した。個々の亜種のオフレートランキングは、Octet Red 96(Fortebio、USA)によって決定された。親和性が改善された変異を組み合わせて、新しいLAG3抗体を産生した。親和性はBiacoreによってさらに確認され、CDR H2のN58VがKoffを大幅に増加させ、CDRL3のN91YがKonを改善したことが示唆された。
Figure 0007177543000075
Figure 0007177543000076
Figure 0007177543000077
Figure 0007177543000078
Figure 0007177543000079
Figure 0007177543000080
Figure 0007177543000081
Figure 0007177543000082
Figure 0007177543000083
2.15. 親和性成熟抗LAG3 147Hヒト化モノクローナル抗体の結合特性
組換えhisタグヒトLAG3-ECDタンパク質に対する親和性成熟抗体の結合動態を、実施例2.7に記載されているように、BiacoreT200によって調べた。結果を以下の表に示した。Biacoreの結果は、これらの抗LAG3抗体が親147H-13よりも優れた親和性を有していることを示した。
Figure 0007177543000084
ヒトLAG3に結合する親和性成熟抗LAG-3抗体の能力を確認するために、親抗体147H-13とともに最も高い親和性を有する2つの抗体(B3807bおよびB3810)を、実施例2.2に記載のELISAを使用して評価した。B3807b、B3810のEC50と親抗体を下の表に示した。 B3807bおよびB3810の両方が、親抗体147H-13よりも優れた結合能力を示した。
Figure 0007177543000085
親和性成熟抗LAG-3抗体が細胞由来のヒトLAG3に結合し得ることをさらに確認するために、誘導性hLAG3発現Jurkat細胞および活性化PBMCの両方を使用して、B3807bとB3810の結合能力を試験した。簡単に説明すると、Jurkat細胞をFACSバッファーに再懸濁した。抗LAG3抗体およびアイソタイプコントロールは、20nMから30pMの範囲の用量でFACSバッファーで4倍段階希釈された。連続希釈した抗体を細胞懸濁液に加え、氷上で30分間インキュベートした。次に、結合していない抗体を除去した後、Alexa Fluor 633(Thermo、A21091)と結合した抗ヒトIgGで細胞を染色した。蛍光測定はFACSCelestaフローサイトメーターで取得し、Flowjoで分析して平均蛍光強度(MFI)を決定した。ネイティブヒトLAG3に結合する抗LAG3抗体の能力を試験するために、健常ドナーからのPBMCを、抗CD3(BD、555336)および抗CD28(BD、555725)で両方が1μg/mlの濃度において刺激した。3日間の刺激後、細胞を回収し、抗LAG3抗体とともに氷上で30分間インキュベートした。細胞を抗ヒトCD4および抗ヒトIgGで染色した。CD4+細胞に結合する抗体の分析は、FACSCelestaフローサイトメトリーで実施された。サイトメトリー分析の結果は、細胞由来のヒトLAG3に結合する抗体のEC50を示す以下の表に要約されている。図31は、抗LAG3抗体の結合曲線を示すグラフである。試験した抗体のEC50を以下に示した。
Figure 0007177543000086
2.16. モノクローナル抗体147H3807(B3807)の特性評価
A.B3807のLAG3タンパク質への結合
この例では、抗LAG-3抗体147H 3807(B3807)がヒトLAG3タンパク質に結合する能力を評価した。ストレプトアビジンをELISAプレートに2μg/ml、100μl/ウェルでコーティングした。続いて、1.0μg/mlの100μlのBio-LAG3をストレプトアビジンとともに室温で1時間インキュベートした。B3807は、ポジティブコントロール25F7およびネガティブコントロールIgGとともに、ELISA希釈バッファーで段階希釈した。結合を評価するために、さまざまな濃度の抗体をLAG3タンパク質でコーティングしたプレートに1.5時間室温で添加した。得られたプレートを洗浄し、抗ヒトIgG(Fab)-HRP抗体で標識した。
図38に示すように、B3807および25F7の両方が用量依存的にヒトLAG3に結合し、B3807はより高い効力およびより低いEC50を示した(25F7の0.22nMに対して0.06nM)。
B.ビアコア分析
組換えHisタグヒトLAG3-ECDタンパク質へのB3807の結合は、キャプチャー法を使用してBiacoreT200によって調べられた。B3807は、CM5センサーチップに固定化されたプロテインAを使用して補足された。連続濃度のhisタグヒトLAG3-ECDタンパク質(0~12nM)を、30μl/minの流速で捕捉抗体に注入した。解離段階は900秒または550秒であった。結果を図39に示し、これはB3807が高い親和性でヒトLAG3に結合していることを示す。
C.Jurkat細胞およびPBMCベースの結合アッセイ
B3807が細胞由来のヒトLAG3に結合し得ることをさらに確認するために、誘導性ヒトLAG3発現jurkat細胞および活性化PBMCの両方を使用して、B3807の結合能力を試験した。簡単に説明すると、Jurkat細胞をFACSバッファーに再懸濁した。B3807、25F7およびアイソタイプコントロールは、20nMから9pMの範囲の用量でFACSバッファーで3倍段階希釈された。連続希釈した抗体を細胞懸濁液に加え、氷上で30分間インキュベートした。次に、結合していない抗体を除去した後、Alexa Fluor 633(Thermo、A21091)と結合した抗ヒトIgGで細胞を染色した。蛍光測定はFACSCelestaフローサイトメーターで取得し、Flowjoで分析して平均蛍光強度(MFI)を決定した。ネイティブヒトLAG3に結合する抗体の能力を試験するために、健常ドナーからのPBMCを1μg/mlの濃度の抗CD3(BD、555336)および抗CD28(BD、555725)で刺激した。3日間の刺激後、細胞を回収し、抗LAG3抗体とともに氷上で30分間インキュベートした。細胞を抗ヒトCD4および抗ヒトIgGで染色した。CD4+細胞に結合する抗体の分析は、FACSCelestaフローサイトメトリーで実施された。
サイトメトリー分析の結果を図40に示す。試験した抗体のEC50もまた図に示されている。両方の試験において、B3807は対照抗体25F7よりも強い結合能力を示した。
D.MHCクラスIIへのLAG3結合のブロック
ヒトLAG3およびMHCIIの間の相互作用をブロックするB3807の能力を測定するために、LAG3とMHC II結合アッセイ(Cisbio、64ICP03PEG)を、キットの製造元が提供するプロトコルに従って、均一なTR-FRETテクノロジーを利用して実行した。B3807は、100nMから5pM(10ポイント)の範囲で3倍に希釈された。PerkinElmer Envisionプレートリーダーで蛍光データを取得し、4パラメーターの用量反応曲線をフィッティングして各抗体のIC50を取得した。B3807のIC50は0.41nMであり(図41)、強力なブロッキング活性を示している。
E.ヒトT細胞応答の刺激
T細胞応答を刺激する抗LAG3抗体の能力を試験するために、hLAG3発現Jurkat細胞を使用した。96ウェルプレートの各ウェルで、Jurkat細胞(1×10)を0.1ng/ml SEの存在下でRaji細胞(1×10)とインキュベートした。B3807を3倍に希釈し、100nM~50pmの範囲の最終濃度で細胞に添加した。48時間後、培地からのIL2を均一TR-FRETアッセイ(PerkinElmer、TRF1221M)を使用して測定した。図42は、IL2放出を刺激する際のB3807および25F7の曲線を示しており、B3807は、25F7を大幅に上回っていた。
F.初代T細胞におけるIL2放出
T細胞応答を刺激する抗体の能力は、hLAG3で発現した初代T細胞でも試験された。試験した4つの用量すべてで、B3807は25F7を上回った(図43、左パネル)。抗PD-L1抗体と一緒に使用した場合、IL2放出プロファイル(図43、右パネル)は、抗LAG3抗体B3807と抗PD-L1抗体との間の相乗効果を示した。
G.腫瘍退縮における抗PD1/抗PD-L1抗体との併用効果
ヒトLAG3の細胞外ドメインを発現するヒト化マウスを使用した。図44の左パネルに示すように、B3807および25F7は、抗PD-1抗体と組み合わせた場合に腫瘍増殖を阻害する効果を示した。
一方で、図44の右側のパネルでは、市販の抗PD-L1抗体であるTecentriqと併用した場合、B3807および25F7の両方が有意な相乗効果を示したことは明らかである。
H.B3807およびB3807bの比較
B3807およびB3807bの活性を、Jurkat細胞におけるIL2放出の促進(実施例2.16(E)の実験手順を参照のこと)およびJurkat細胞上のLAG3への結合(実施例2.16(C)の実験手順を参照のこと)におけるそれらの能力について比較した。
比較結果を図45に示す。両方の実験で、B3807およびB3807bは非常に類似した活性プロファイルを示し、これら2つの抗体間のCDRL1の配列の違いがそれらの活性に影響を与えなかったことを示している。
また、図46に示されるように、Biacoreデータ(実施例2.16(B)の実験手順を参照のこと)は、これらの2つの抗体間の大きな類似性をさらに実証している。 以下の例では、二重特異性抗体をさらに試験および調製するためにB3807を使用した。
実施例3.抗PD-L1/抗LAG3二重特異性抗体の調製
実施例1で調製された抗PD-L1クローンのうちの、Hu1210-41(Hu1210 VH.4dxHu1210 Vk.1、表8を参照のこと;以下、「H12」)およびB6(表16を参照のこと)クローン、ならびに実施例2で調製された抗LAG3クローンのうちの、147H(「147」とも呼ばれる、表23を参照のこと)および147H 3807(「147(H3807)」とも呼ばれる;表27を参照のこと)クローンを例示的に選択して、完全長IgGXscFv型の抗PD-L1/抗LAG3二重特異性抗体を調製した。PD-L1を完全IgG部分に配置する場合、ADCCが減少した変異骨格を有するIgG1(N297A変異、米国特許第7332581号、第8219149号など)を使用し、LAG3を完全IgG部分に配置する場合、S241P変異を有するIgG4(Angalら、Mol.Immunol.30:105-108)を使用した。
抗PD-L1/抗LAG3二重特異性抗体のIgG抗体の重鎖をコードするヌクレオチド配列を有するDNAセグメント1をpcDNA3.4(Invitrogen、A14697;プラスミド1)に挿入し、DNAセグメント2を有する 抗PD-L1/抗LAG3二重特異性抗体のIgG抗体の軽鎖をコードするヌクレオチド配列をpcDNA3.4(Invitrogen、A14697;プラスミド2)に挿入した。その後、プラスミド1に挿入されたIgG抗体のFc領域のc末端に対応するDNAセグメント1の一部に、二重特異性抗体の発現のためのベクターを構築するための(GGGGS)2からなる10アミノ酸長を有するリンカーペプチドをコードするDNAセグメント4を用いて、scFvをコードするDNAセグメント3を融合させた。
重鎖、軽鎖、scFvおよびDNAセグメントの配列を表32および表33に要約した。
Figure 0007177543000087
Figure 0007177543000088
Figure 0007177543000089
Figure 0007177543000090
Figure 0007177543000091
Figure 0007177543000092
Figure 0007177543000093
Figure 0007177543000094
Figure 0007177543000095
Figure 0007177543000096
Figure 0007177543000097
Figure 0007177543000098
Figure 0007177543000099
Figure 0007177543000100
Figure 0007177543000101
Figure 0007177543000102
Figure 0007177543000103
Figure 0007177543000104
Figure 0007177543000105
Figure 0007177543000106
Figure 0007177543000107
Figure 0007177543000108
Figure 0007177543000109
Figure 0007177543000110
構築されたベクターは、ExpiCHTM発現培地(Thermo、A29100-01)で、(ExpiFectamineTMCHOキット、Thermo、A29129)を使用して、30~37℃において条件下で回転式シェーカーを備えたCOインキュベーター内で7~15日間培養されたExpiCHO-STM細胞(Thermo Fisher、A29127)で一時的に発現された。プラスミドDNA(250μg)およびExpiFectamin CHO試薬(800μL)をOpti-MEM(R)I培地(最終容量20mL)と混合し、室温で5分間静置させた。混合溶液を、ExpiCHO発現培地で培養した6×10のExpiCHO細胞に添加し、空気中8%COの加湿雰囲気で37℃のシェーカーインキュベーター内で穏やかに混合した。トランスフェクションの18時間後に、1.5mLのExpiFectaminCHOトランスフェクションエンハンサー1および60mLのExpiFectaminCHOトランスフェクションフィードを各フラスコに添加した。
各BsAbは、組換えプロテインAアフィニティークロマトグラフィー(Hitrap Mabselect Sure、GE Healthcare、28-4082-55)およびHiLoad 26/200 Superdex200プレップグレードカラム(GE Healthcare、28-9893-36)を使用したゲルろ過クロマトグラフィーによって細胞培養上清から精製した。 SDS-PAGE(NuPage 4-12%Bis-Trisゲル、NP0321)およびSE-HPLCカラム(SWXL SE-HPLCカラム、TOSOH、G3000SWXL)を使用したサイズ排除HPLC(Agilent、1200シリーズ)分析を実行して、各BsAbのサイズと純度を検出および確定した。精製されたタンパク質を、Amicon Ultra 15 30Kデバイス(Merck、UFC903096)を使用した限外濾過によってPBSで濃縮し、タンパク質濃度はnanodrop(Thermo、Nanodrop One)を使用して評価した。2ベクトルシステムを適用する場合、軽鎖と重鎖の比率は重量で1:1~1:3になり得る。あるいは、1つの単一ベクトルに両方の鎖を含む1ベクトルシステムを使用し得る。
調製された抗PD-L1/抗LAG3二重特異性抗体は、それぞれH12x147、H12x147(H3807)、B6x147、およびB6x147(H3807)、147xH12、147(H3807)xH12、147xB6、および147(H3807)xB6と名付けられている。ここで、前者はIgG型のクローンを指し、後者はscFv型のクローンを指す。
実施例4.二重特異性抗体H12x147および147xH12の特徴づけ
4.1. 二重特異性抗体の結合
実施例3で調製した二重特異性抗体(BsAb; H12x147および147xH12)のPD-L1およびLAG3への結合活性を評価するために、BsAbをELISA試験に供した。簡単に説明すると、マイクロタイタープレートを、ヒトPD-L1-Fcタンパク質(Sinobio、10084-H02H)およびヒトLAG3-Hisタンパク質(Sinobio、16498-H08H)のそれぞれで、PBS中0.5μg/ml、100μl/ウェル、4℃で一晩コーティングし、次に100μl/ウェルの5%BSAでブロックした。各BsAbの、100nMから始めて4倍希釈液を各ウェルに添加し、室温で1~2時間インキュベートした。プレートをPBS/Tweenで洗浄した後、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)(Pierce、カタログ番号31413)と結合したヤギ抗ヒトIgG抗体とともに室温で1時間インキュベートした。洗浄後、プレートをTMB基質で成長させ、分光光度計でOD 450~630nmで分析した。結果を図33に示す。図33に示すように、試験されたすべてのBsAbは、高い活性でヒトPD-L1およびヒトLAG3タンパク質の両方に結合し得る。
4.2. 二重特異性抗体の結合親和性
実施例3で調製した二重特異性抗体(BsAb;147xH12、147H3807xB6およびB6x147H3807)の二重特異性抗体PD-L1およびLAG3のPD-L1タンパク質およびヒトLAG3タンパク質に対する結合親和性を、捕捉法を使用してBIACORETMで試験した。
結果を表34に示す。
Figure 0007177543000111
表34および図33に示されるように、試験された二重特異性抗体は、ヒトPD-L1およびヒトLAG3タンパク質の両方に対して比較的高い結合親和性を示す。
また、SEEアッセイを実施し、得られた結果を図34に示し、その結果は試験された二重特異性抗体がMHC IIとLAG3との間の結合を阻害し、それによりMHC IIおよびTCRによるT細胞活性を増加させることを示した。
4.3. ヒトT細胞免疫応答を促進する二重特異性抗体の活性
刺激されたT細胞応答に対する二重特異性抗体の能力を試験するために、Jurkat細胞活性化アッセイを使用した。レンチウイルスによってヒトLag3およびPd1でトランスフェクトされたJurkat細胞をレスポンダー細胞として使用した。PDL1を過剰発現したRaji細胞を抗原提示細胞(APC)として使用した。ブドウ球菌エンテロトキシンE(SEE)はスーパー抗原であり、このアッセイで刺激剤として使用された。このシステムでは、異所的に発現したhuLAG3およびhuPD-1は、Jurkat細胞によるSE刺激によるIL-2産生を抑制し得るが、抗LAG3および抗PD-L1抗体はIL-2産生を逆転し得る。要するに、Raji(1×10)は、スーパー抗原の存在下でJurkat T細胞(1×10)と共培養された。二重特異性抗体およびそれらの対応する単一抗体(100nMから開始し6回希釈された)を混合培養物に加えた。 48時間後、IL2産生のために上清を回収した。図34(上のパネル)に示すように、二重特異性抗体(147xH12(147-H12とラベル付け)およびH12X147(H12-147とラベル付け))は、Jurkat細胞によるIL2産生を用量依存的に促進し得る。
初代T細胞に対する二重特異性抗体のinvitro機能をさらに評価するために、混合リンパ球反応を実施した。ヒト樹状細胞(DC)は、GM-CSFおよびIL-4の存在下でCD14 +単球から7日間分化した。次に、別のドナーから単離されたCD4+ T細胞を、DCおよび段階希釈抗体と共培養した。混合培養の5日後、培養上清をIFNγ産生についてアッセイした。 図34(下のパネル)の結果は、二重特異性抗体(147XH12(A3L1とラベル付け)およびH12X147(L1A3とラベル付け)の両方がIFNγ産生を有意に促進し得ることを示した。
4.4. 二重特異性抗体の腫瘍増殖阻害(invivoアッセイ)
ヒトPD-1およびヒトLAG3の細胞外ドメインを発現する二重ヒト化マウスを使用した。マウス結腸腺癌細胞(MC38)は、ヒトPD-L1を発現するように設計されている。二重ヒト化マウス(hLAG3/hPD-1)に5×10 MC38-hPD-L1細胞を0日目に皮下移植した。10日目に、平均腫瘍体積が137 mmのマウスを選択し、4つの治療群(N=7/群)にランダム化した。マウスにアイソタイプコントロール(5mg/kg)、H12(抗PD-L1抗体、5mg/kg)、147H(抗LAG3抗体、5mg/kg)および147xH12(6.6mg/kg)を1日おきに10日目から開始して8回腹腔内投与した。腫瘍体積は、実験期間中(29日)、週に2回、キャリパー測定によってモニターされた。H12も147Hも5mg/kgで腫瘍抑制を示さなかった。対照的に、147xH12は、MC38腫瘍増殖の強力な阻害を示し、研究の終わりに67.7%のTGIを示した(図35)。
実施例5.二重特異性抗体147xH12および147(H3807)xH12の特徴づけ
5.1. 二重特異性抗体の結合
実施例3で調製した二重特異性抗体(BsAb;147xH12および147(H3807)xH12)のLAG3への結合活性を評価するために、BsAbをELISA試験に供した。簡単に説明すると、マイクロタイタープレートを、PBS中0.5μg/mlのヒトLAG3-Hisタンパク質(Sinobio、16498-H08H)で、100μl/ウェル、4℃で一晩コーティングし、100μl/ウェルの5%BSAでブロックした。各BsAbの100nMから始めて4倍希釈液を各ウェルに添加し、室温で1~2時間インキュベートした。プレートをPBS/Tweenで洗浄した後、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)(Pierce、カタログ番号31413)と結合したヤギ抗ヒトIgG抗体とともに室温で1時間インキュベートした。洗浄後、プレートをTMB基質で成長させ、分光光度計でOD 450~630nmで分析した。図33に示すように、BsAbs 147(H3807)xH12は、ヒトLAG3タンパク質への結合活性がさらに向上している。
5.2. ヒトT細胞免疫応答を促進する二重特異性抗体の活性
実施例3で調製された二重特異性抗体の効果は、健常なドナーからのPBMCを使用してさらに研究された。簡単に言えば、ヒトDCはCD14+単球から7日間分化した。別のドナーから単離された精製CD4+ T細胞は、抗CD3/CD28によって2日間刺激された。次に、段階希釈した抗体をスーパー抗原の存在下でDC細胞およびT細胞の共培養に加え、5日間インキュベートし、培地を収集してIL-2レベルを調べた。図36に示されるように、二重特異性抗体は、初代CD4+ T細胞におけるIL-2産生を有意に刺激し得て、これは、それらの対応する単一抗体の組み合わせよりも優れていた。データは、3つのウェルからの平均値±SDとして示されている。
さらに、実施例3で調製された二重特異性抗体の効果は、健常なドナーからのPBMCを使用して研究された。簡単に説明すると、ヒトDCをCD14+単球から5日間分化させた後、成熟させるためにLPS処理を行った。パンT細胞は別のドナーPBMCから分離された。次に、段階希釈した抗体を成熟DC細胞およびT細胞の共培養に加え、5日間インキュベートし、IFNγレベルについて培地を回収した。図37に示されるように、二重特異性抗体は、初代パンT細胞におけるIFNγ産生を有意に刺激し得て、これは、それらの対応する単一抗体の組み合わせよりも優れていた。 データは、重複ウェルからの平均値±SDとして示されている。
5.3. 二重特異性抗体の開発可能性
PD-L1およびLAG-3二重特異性抗体(BsAb; B6x147H3807および147(H3807)xB6)に対する物理化学的特性に関する開発可能性を評価した。BsAbsの品質属性は、いくつかの分析方法によって評価された。簡単に説明すると、純度はサイズ排除高速液体クロマトグラフィー(SE-HPLC)で測定され、両方のBsAbが99%を超える高純度を示した。蛍光標識リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)を用いたタンパク質サーマルシフト(PTS)による熱安定性を分析した。それらの溶融温度は67℃以上で観察され、試験品が安定した構造的完全性を有していることを示した。分子の溶解度を評価するために、限外濾過(Amicon Ultra-15スピンコンセントレーター)を使用してタンパク質を20 mg/mLに濃縮した。その結果、目視検査では可視粒子は観察されず、SE-HPLCでは凝集体の増加は確認されなかった。キャピラリー等電点電気泳動(cIEF)によって測定された各bsabの等電点(pI)は、それぞれ8.26および8.35であった。このpI範囲は、下流のプロセスおよび製剤開発を進めるのに適している。全体として、表19に示すように、試験したBsAbs(B6x147H3807および147(H3807)xB6)は、開発を成功させるための適切な物理化学的特性を備えていることが示された。
Figure 0007177543000112
実施例6.FGL1のLAG3への結合の阻害に対するB3807の効果。
この例では、LAG3およびフィブリノーゲン様タンパク質1(FGL1)の間の結合を阻害する抗LAG3抗体B3807の活性を試験した。
近年、フィブリノーゲン様タンパク質1(FGL1)が、MHC-IIとは別に、LAG3の別の機能的リガンドであることが報告された(Cell.2019;176:1-14)。FGL-1は肝臓から分泌され、癌細胞によって高度に産生される。FGL-1は抗原特異的T細胞の活性化を阻害し、逆にFGL-1の遮断は抗腫瘍反応を増強する。FGL-1とLAG3との間の相互作用は、免疫回避の別のメカニズムを表し得る。
組換えFGL-1を1μg/mlの濃度で96ウェルプレートにコーティングし、4℃で一晩インキュベートした。連続希釈した抗LAG3抗体B3807(10μg/mlから開始および1:3希釈)およびビオチン標識LAG3-ECD(2μg/ml)を、FGL-1でコーティングしたウェルと室温で2時間インキュベートした。洗浄バッファーで十分に洗浄した後、ストレプトアビジン-HRPを添加した。 図47に示すように、B3807は用量依存的にFGL-1のLAG3タンパク質への結合を阻害した。
***
本開示は、本開示の個々の態様の単一の例示として意図される記載された特定の実施形態によって範囲が限定されるべきではなく、機能的に同等であるいずれかの組成物または方法は、本開示の範囲内である。本開示の思想または範囲から逸脱することなく、本開示の方法および組成物において様々な修正および変形を行い得ることは当業者には明らかであろう。したがって、本開示は、添付の特許請求の範囲およびそれらの同等物の範囲内に入るという条件で、本開示の修正および変形に及ぶことが意図されている。
本明細書に記載されているすべての刊行物および特許出願は、個々の刊行物または特許出願が参照により援用されることが具体的かつ個別に示されている場合と同程度に、参照により本明細書に援用される。

Claims (12)

  1. 抗PD-L1抗体またはその抗原結合フラグメント、および抗LAG3抗体またはその抗原結合フラグメントを含み、
    前記抗PD-L1抗体またはその抗原結合フラグメントが、ヒトのプログラム細胞死リガンド1(PD-L1)タンパク質の免疫グロブリンC(IgC)ドメインに特異的に結合することができ、ここで、前記IgCドメインはアミノ酸残基133~225から構成されており;かつ、
    前記抗LAG3抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号354アミノ酸配列を有するVH CDR1;配列番号355、および461からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR2;配列番号356、および468からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR3;配列番号357、および490からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL CDR1;配列番号358アミノ酸配列を有するVL CDR2;ならびに配列番号359、および488からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL CDR3を含む、抗PD-L1/抗LAG3二重特異性抗体。
  2. 前記抗PD-L1抗体またはその抗原結合フラグメントが、前記PD-L1タンパク質のアミノ酸残基Y134、K162、またはN183の少なくとも1つに結合し得る、請求項1に記載の抗PD-L1/抗LAG3二重特異性抗体。
  3. 前記抗PD-L1抗体またはその抗原結合フラグメントが、前記PD-L1タンパク質の免疫グロブリンV(IgV)ドメインに結合せず、ここで、前記IgVドメインはアミノ酸残基19~127から構成されている、請求項1または2に記載の抗PD-L1/抗LAG3二重特異性抗体。
  4. 抗PD-L1抗体またはその抗原結合フラグメント、および抗LAG3抗体またはその抗原結合フラグメントを含み、
    前記抗PD-L1抗体またはその抗原結合フラグメントが、
    (1)配列番号1および61~67からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR1;
    (2)配列番号2、68~77、および525~527からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR2;
    (3)配列番号3、78~90および513~519からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR3;
    (4)配列番号4、91~92、および520~521からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL CDR1;
    (5)配列番号5および93~105からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL CDR2;ならびに、
    (6)配列番号6、106~111、および522~524からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL CDR3、
    を含み、
    前記抗LAG3抗体またはその抗原結合フラグメントが、
    (i)配列番号354アミノ酸配列を有するVH CDR1;
    (ii)配列番号355、および461からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR2;
    (iii)配列番号356、および468からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR3;
    (iv)配列番号357、および490からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL CDR1;
    (v)配列番号358アミノ酸配列を有するVL CDR2;ならびに、
    (vi)配列番号359、および488からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL CDR3、
    を含む、抗PD-L1/抗LAG3二重特異性抗体。
  5. 前記抗PD-L1抗体またはその抗原結合フラグメントが、配列番号7~26、113、493、495、497、499、501、503、505、507、509、および511からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、または配列番号7~26、113、493、495、497、499、501、503、505、507、509、および511からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも90%の配列同一性を有するポリペプチドを含む、請求項4に記載の抗PD-L1/抗LAG3二重特異性抗体。
  6. 前記抗PD-L1抗体またはその抗原結合フラグメントが、配列番号27~33、494、496、498、500、502、504、506、508、510、および512からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、または配列番号27~33、494、496、498、500、502、504、506、508、510、および512からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも90%の配列同一性を有するペプチドを含む、請求項4または5に記載の抗PD-L1/抗LAG3二重特異性抗体。
  7. 前記抗LAG3抗体またはその抗原結合フラグメントが、配列番号352、360~373、375、391、393、395、397、399、401、403、405、417、421、429、433、435、437、443、445、および491からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、または配列番号352、360~373、375、391、393、395、397、399、401、403、405、417、421、429、433、435、437、443、445、および491からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも90%の配列同一性を有するポリペプチドを含む、請求項4~6のいずれか1項に記載の抗PD-L1/抗LAG3二重特異性抗体。
  8. 前記抗LAG3抗体またはその抗原結合フラグメントが、配列番号353、374、および444からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、または配列番号353、374、および444からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも90%の配列同一性を有するペプチドを含む、請求項4~7のいずれか1項に記載の抗PD-L1/抗LAG3二重特異性抗体。
  9. 請求項1~8のいずれか1項に記載の抗PD-L1/抗LAG3二重特異性抗体および薬学的に許容される担体を含む、PD-L1、LAG3、またはそれらの両方に関連する疾患を治療または予防するための医薬組成物。
  10. 前記PD-L1、LAG3、またはそれらの両方に関連する疾患が癌または感染症である、請求項9に記載の医薬組成物。
  11. 前記癌が固形腫瘍である、請求項10に記載の医薬組成物。
  12. 前記癌が、膀胱癌、肝臓癌、結腸癌、直腸癌、子宮内膜癌、白血病、リンパ腫、膵臓癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、乳癌、尿道癌、頭頸部癌、胃腸癌、胃癌、食道癌、卵巣癌、腎癌、黒色腫、前立腺癌、および甲状腺癌からなる群から選択される、請求項10に記載の医薬組成物。
JP2021510096A 2018-08-21 2019-08-21 抗pd-l1/抗lag3二重特異性抗体およびその使用 Active JP7177543B2 (ja)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CNPCT/CN2018/101547 2018-08-21
CN2018101547 2018-08-21
CN2019087943 2019-05-22
CNPCT/CN2019/087943 2019-05-22
PCT/CN2019/101747 WO2020038397A1 (en) 2018-08-21 2019-08-21 Anti-pd-l1/anti-lag3 bispecific antibodies and uses thereof

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2021536437A JP2021536437A (ja) 2021-12-27
JP7177543B2 true JP7177543B2 (ja) 2022-11-24

Family

ID=69592807

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2021510096A Active JP7177543B2 (ja) 2018-08-21 2019-08-21 抗pd-l1/抗lag3二重特異性抗体およびその使用

Country Status (9)

Country Link
US (1) US20220363763A1 (ja)
EP (2) EP3833693A4 (ja)
JP (1) JP7177543B2 (ja)
KR (1) KR102666754B1 (ja)
CN (1) CN113248618B (ja)
AU (1) AU2019326635B2 (ja)
BR (1) BR112021003089A2 (ja)
CA (1) CA3109999A1 (ja)
WO (1) WO2020038397A1 (ja)

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PH12018502623A1 (en) * 2016-06-13 2019-10-07 I Mab Anti-pd-l1 antibodies and uses thereof
CN113563473A (zh) * 2020-04-29 2021-10-29 三生国健药业(上海)股份有限公司 四价双特异性抗体、其制备方法和用途
WO2022188801A1 (zh) * 2021-03-10 2022-09-15 北京拓界生物医药科技有限公司 Pd-1结合蛋白及其医药用途
CN117157323A (zh) * 2021-03-31 2023-12-01 美勒斯公司 新型多特异性抗体
EP4410835A1 (en) * 2021-09-29 2024-08-07 Akeso Biopharma, Inc. Anti-lag3 antibody, pharmaceutical composition and use
WO2023183317A2 (en) * 2022-03-21 2023-09-28 Ab Therapeutics, Inc. Multispecific antibodies and uses thereof
CN116063526A (zh) * 2022-12-31 2023-05-05 合肥天港免疫药物有限公司 抗pdl1的抗体及其用途
CN118496357A (zh) * 2023-02-15 2024-08-16 康源博创生物科技(北京)有限公司 一种多肽以及包含其作为轻链的抗体

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2017535528A (ja) 2014-10-03 2017-11-30 ノバルティス アーゲー 組み合わせ治療
WO2017215590A1 (en) 2016-06-13 2017-12-21 I-Mab Anti-pd-l1 antibodies and uses thereof

Family Cites Families (28)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4444887A (en) 1979-12-10 1984-04-24 Sloan-Kettering Institute Process for making human antibody producing B-lymphocytes
US4716111A (en) 1982-08-11 1987-12-29 Trustees Of Boston University Process for producing human antibodies
GB8308235D0 (en) 1983-03-25 1983-05-05 Celltech Ltd Polypeptides
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4694778A (en) 1984-05-04 1987-09-22 Anicon, Inc. Chemical vapor deposition wafer boat
US5807715A (en) 1984-08-27 1998-09-15 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods and transformed mammalian lymphocyte cells for producing functional antigen-binding protein including chimeric immunoglobulin
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
US5258498A (en) 1987-05-21 1993-11-02 Creative Biomolecules, Inc. Polypeptide linkers for production of biosynthetic proteins
US5892019A (en) 1987-07-15 1999-04-06 The United States Of America, As Represented By The Department Of Health And Human Services Production of a single-gene-encoded immunoglobulin
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
DE69233482T2 (de) 1991-05-17 2006-01-12 Merck & Co., Inc. Verfahren zur Verminderung der Immunogenität der variablen Antikörperdomänen
MX9204374A (es) 1991-07-25 1993-03-01 Idec Pharma Corp Anticuerpo recombinante y metodo para su produccion.
ES2136092T3 (es) 1991-09-23 1999-11-16 Medical Res Council Procedimientos para la produccion de anticuerpos humanizados.
US5639641A (en) 1992-09-09 1997-06-17 Immunogen Inc. Resurfacing of rodent antibodies
JP2002512624A (ja) 1997-05-21 2002-04-23 バイオベーション リミテッド 非免疫原性タンパク質の製造方法
EP1051432B1 (en) 1998-12-08 2007-01-24 Biovation Limited Method for reducing immunogenicity of proteins
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
NZ563193A (en) * 2005-05-09 2010-05-28 Ono Pharmaceutical Co Human monoclonal antibodies to programmed death 1(PD-1) and methods for treating cancer using anti-PD-1 antibodies alone or in combination with other immunotherapeutics
US8219149B2 (en) 2005-06-29 2012-07-10 Nokia Corporation Mobile communication terminal
GB0624500D0 (en) * 2006-12-07 2007-01-17 Istituto Superiore Di Sanito A novel passive vaccine for candida infections
AR072999A1 (es) * 2008-08-11 2010-10-06 Medarex Inc Anticuerpos humanos que se unen al gen 3 de activacion linfocitaria (lag-3) y los usos de estos
JO3663B1 (ar) * 2014-08-19 2020-08-27 Merck Sharp & Dohme الأجسام المضادة لمضاد lag3 وأجزاء ربط الأنتيجين
CR20170143A (es) * 2014-10-14 2017-06-19 Dana Farber Cancer Inst Inc Moléculas de anticuerpo que se unen a pd-l1 y usos de las mismas
CA2874083C (en) * 2014-12-05 2024-01-02 Universite Laval Tdp-43-binding polypeptides useful for the treatment of neurodegenerative diseases
JP6929951B2 (ja) * 2017-02-22 2021-09-01 アイ−エムエービー バイオファーマ (ハンジョウ) カンパニー リミテッド 抗lag−3抗体およびその使用
CN106986939B (zh) * 2017-03-27 2019-06-07 顺昊细胞生物技术(天津)股份有限公司 抗pd-1和tem-8双特异性抗体及其应用
KR102475106B1 (ko) * 2018-03-29 2022-12-08 아이-맵 항-pd-l1 항체 및 그것의 사용

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2017535528A (ja) 2014-10-03 2017-11-30 ノバルティス アーゲー 組み合わせ治療
WO2017215590A1 (en) 2016-06-13 2017-12-21 I-Mab Anti-pd-l1 antibodies and uses thereof

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Cancer Research,2017年,77(13_Suppl),5651

Also Published As

Publication number Publication date
EP4249511A3 (en) 2024-01-10
US20220363763A1 (en) 2022-11-17
KR20210049128A (ko) 2021-05-04
EP4249511A2 (en) 2023-09-27
EP3833693A1 (en) 2021-06-16
EP3833693A4 (en) 2023-06-07
KR102666754B1 (ko) 2024-05-17
JP2021536437A (ja) 2021-12-27
WO2020038397A1 (en) 2020-02-27
AU2019326635A1 (en) 2021-04-15
BR112021003089A2 (pt) 2021-05-11
AU2019326635B2 (en) 2024-05-23
CN113248618B (zh) 2022-03-18
CN113248618A (zh) 2021-08-13
CA3109999A1 (en) 2020-02-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7177543B2 (ja) 抗pd-l1/抗lag3二重特異性抗体およびその使用
KR102511268B1 (ko) Ig 및 itim 도메인을 갖는 t 세포 면역 수용체 (tigit)에 대한 항체 및 이것의 사용
US11634490B2 (en) Blocking antibodies against CD47 and methods of use thereof
TWI793129B (zh) 細胞毒性t淋巴球相關蛋白4 (ctla-4) 之新穎單株抗體
KR102536145B1 (ko) 항-pd-1 항체 및 이의 용도
CN110678484B (zh) 抗pd-l1/抗lag3双特异性抗体及其用途
AU2015384281B2 (en) Novel antibody binding to TFPI and composition comprising the same
US20210032350A1 (en) Antibodies to galectin-3 and methods of use thereof
US20220169726A1 (en) ANTI-SIRPalpha MONOCLONAL ANTIBODIES AND USES THEREOF
KR20230028708A (ko) 항-b7-h4/항-4-1bb 이중특이적 항체 및 이의 용도
KR20230015957A (ko) 이중특이적 항체 및 이의 용도
KR20240021162A (ko) Alpha 5 베타 1 인테그린 결합제 및 이의 용도
US20200190192A1 (en) Pd-1/tim-3 bi-specific antibodies, compositions thereof, and methods of making and using the same
WO2022127901A1 (en) BISPECIFIC ANTIBODIES TARGETING SIRPα AND PD-L1
TW202411252A (zh) 抗pd-1抗體及其用途

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20210419

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20210419

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20220419

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20220714

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20221025

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20221104

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Ref document number: 7177543

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150