CN117377687A - 抗癌组合疗法中的ltbr激动剂 - Google Patents

Abstract

本发明涉及包含Treg清除剂和LTBR激动剂的组合。这样的组合特别可用于治疗癌症。示例是小鼠拮抗剂CCR8VHH和CCR8VHH‑Fc融合体以及LTBR激动性单域抗体的产生。一种抗CCR8抗体VHH‑Fc和一种LTBR激动剂VHH已在MC38同系小鼠模型中进行了测试，并且显示25天后100％的测试小鼠存活，而结合LTBR的VHH的存活率为60％，且结合CCR8的VHH‑Fc的存活率为70％。还举例说明了抗CTLA4抗体和LTBR激动剂(VHH‑16)的组合对MC38同系小鼠模型中肿瘤生长的影响，导致产生协同作用和减少肿瘤负荷。

Description

抗癌组合疗法中的LTBR激动剂

技术领域

本发明涉及包含淋巴毒素β受体(LTBR)激动剂和调节性T细胞(Treg)清除剂(depletor)的组合，以及包含此类组合的组合物。本发明特别可用作治疗癌症的组合疗法。

背景技术

Treg细胞是适应性免疫系统的组成部分之一，它们有助于维持对自身抗原的耐受性并预防自身免疫性疾病。然而，还发现Treg细胞在多种不同癌症的肿瘤微环境中高度富集。在肿瘤微环境中，Treg细胞通过降低肿瘤相关抗原(TAA)特异性T细胞免疫而有助于免疫逃逸，从而阻止有效的抗肿瘤活性。因此，Treg细胞的高肿瘤浸润性通常与癌症患者的侵入性表型及不良预后相关。

由于认识到肿瘤浸润性Treg细胞的重要性及其在抑制抗肿瘤免疫中的潜在作用，人们提出了多种策略来调节肿瘤微环境中的Treg细胞。多项研究证明，清除Treg可增强肿瘤免疫并提供显著的治疗益处(参见，例如Tanaka和Sakaguchi 2019,Eur J Immuno 49:1140-1146)。

对于抗体介导的肿瘤Treg细胞杀伤，在肿瘤浸润性Treg细胞上表达的表面分子是很好的靶标，特别是如果它们在肿瘤浸润性Treg细胞上特异性地或以与其他T细胞相比高得多的水平表达。例如，CC趋化因子受体4(CCR4)在抑制性Treg细胞上高度表达。莫格利珠单抗(mogamulizumab)(KW-0761)是一种具有无岩藻糖基化Fc区以增加抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的抗CCR4抗体。通过CCR4与Treg的结合及其ADCC活性，莫格利珠单抗能够清除FoxP3⁺ CD4 Treg(Kurose等人,2015,J Thorac Oncol 10:74-83和Sugiyama等人,2013,PNAS110:17945-17650)。莫格利珠单抗已在日本和美国获得批准，并且正在使用莫格利珠单抗单一疗法或与抗PD-1或抗PD-L1抗体组合进行若干临床试验。

CD25是Treg细胞功能的关键表面特征，其表达受Foxp3调控。小鼠和人中的肿瘤浸润性Treg细胞高度表达CD25。已经证明具有增强ADCC活性的抗CD25抗体可有效清除肿瘤内Treg细胞，增加效应细胞(effector)与Treg细胞的比例，并改善对已形成的肿瘤的控制(Vargas等人,2017,Immunity46:577-586)。同一作者还观察到抗CD25抗体清除Treg与PD-1阻断具有协同作用。

作为另一个实例，已知G蛋白偶联的CC趋化因子受体蛋白CCR8(CKRL1/CMKBR8/CMKBRL2)及其天然配体CCL1与癌症，特别是肿瘤环境中的T细胞调节有关。Eruslanov等人(Clin Cancer Res 2013,17:1670-80)显示人癌症组织中CCR8表达的上调，并证明原发性人肿瘤产生大量天然CCR8配体CCL1。这表明CCL1/CCR8轴有助于免疫逃逸，并且提示阻断CCR8信号是对癌症治疗具有吸引力的策略。Hoelzinger等人(J Immunol 2010,184:8633-42)同样显示CCL1的阻断抑制了Treg抑制功能并增强肿瘤免疫而不影响Treg应答。Wang等人(PloSONE 2012,e30793)报道了CCR8在肿瘤浸润性FoxP3+T细胞上的表达增加，并且提示阻断CCR8可以导致抑制Treg迁移到肿瘤中。由于CCR8在肿瘤浸润性Treg上的高且相对特异性的表达，抗CCR8的单克隆抗体已经用于在癌症的治疗中调节和清除该Treg群体(例如，WO2018112032 A1和WO2019/157098 A1)。WO2018/181425 A1显示用抗CCR8 mAb清除Treg能够增强肿瘤免疫。通过将抗CCR8抗体清除Treg与抗PD-1抗体疗法组合来增强效果，这甚至可保护小鼠免受相同肿瘤类型的再次攻击(WO2018/181425 A1)。通过它们的中和活性，这些抗体抑制Treg迁移到肿瘤中，逆转Treg的抑制功能并清除肿瘤内Treg(WO2019/157098A1)。最近，Wang等人(Cancer Immunol Immonother 2020,https://doi.org/10.1007/s00262-020-02583-y)显示CCR8阻断可能会破坏肿瘤内Treg的稳定性，使其变成脆性表型，伴随抗肿瘤免疫的再激活并增加抗PD-1治疗益处。

CTLA-4是一种起免疫检查点作用的蛋白质受体。CTLA-4的重要功能是下调抗原呈递细胞中的CD80/86表达，从而抑制常规T细胞的激活。尽管CTLA-4在天然Treg上组成型表达，但其表达在肿瘤浸润性Treg细胞中上调。阻断CTLA-4对效应细胞和Treg细胞的抑制活性导致能够诱导肿瘤消退的抗肿瘤效应T细胞活性增强。已经表明，抗CLTA-4抗体对Treg细胞区室的活性是经由肿瘤浸润性Treg细胞的选择性清除介导的，需要表达Fcγ受体的巨噬细胞(Simpson等人,2013,J Exp Med 210:1695-1710)并且增强的ADCC活性增强了抗肿瘤应答(Selby等人,2013,Cancer Immunol Res 1:32-42)。

CD38由比CD38阴性Treg更具免疫抑制性的Treg群体表达。用具有ADCC、CDC和ADCP活性的抗CD38抗体来治疗患者清除了CD38阳性免疫抑制性Treg细胞(Krejcik等人,2016,Bood 128:384-394)。

TIGIT是Treg上的共抑制性受体，其促进Treg抑制子功能。具有ADCC活性的抗TIGIT抗体已显示在单一疗法中以及与抗PD-1组合中优先清除Treg并诱导抗肿瘤功效(Leroy等人,2018,CancerRes 78(13Suppl)Abstract LB-114)。

Treg上的ICOS表达在肿瘤微环境中比在血液或脾脏中更高，表明其可用于优先清除肿瘤内Treg，这在小鼠肿瘤中得到了证实(Sainson等人,2019,https://doi.org/10.1101/771493)。目前在临床试验中，以单一疗法或与抗PD-L1抗体的组合疗法中检测了具有ADCC活性的抗ICOS抗体(例如，MEDI-570和KY1044)。

OX-40、4-1BB和GITR是TNF受体超家族的成员，由Treg细胞组成型表达，并且在T细胞受体刺激后上调，而它们仅在T细胞受体刺激后在常规T细胞中被诱导。Bulliard等人(2014,Immunol Cell Biol 92:475-80)已经显示了抗OX-40抗体例如通过激活Fcγ受体清除Treg。

尽管肿瘤浸润性Treg细胞在癌症治疗中的清除已经在临床前和临床研究中显示出抗肿瘤功效，但是在治疗功效和持续时间方面仍需要进一步改善。

发明内容

本发明人现已令人惊讶地发现包含如权利要求中详述的Treg清除剂和LTBR激动剂的组合满足了上述需要。特别地，本发明人意外地发现，当使用如本发明的组合中所定义的Treg清除剂和LTBR激动剂时，观察到协同效应。因此，本发明的组合提供了改进的肿瘤疗法。

因此，本发明的目的是提供包含Treg清除剂和LTBR激动剂的组合。

在优选的实施方案中，Treg清除剂结合Treg的细胞表面标志物并具有细胞毒活性。

优选地，Treg的细胞表面标志物选自CCR8、CCR4、CTLA4、CD25、TIGIT、OX40、ICOS、CD38、GITR、4-1BB、NRP1和LAG-3。

在具体的实施方案中，Treg的细胞表面标志物选自CCR8、CLTA4、CCR4、CD25、TIGIT和ICOS；优选CCR8、CLTA4、CD25和CCR4；最优选CCR8或CTLA4。在另外的具体的实施方案中，Treg的细胞表面标志物选自CCR8、CCR4、CD25、TIGIT和ICOS；优选CCR8、CD25和CCR4；最优选CCR8。

在另一个优选的实施方案中，Treg清除剂的细胞毒活性归因于细胞毒性部分的存在，所述细胞毒性部分诱导抗体依赖性细胞毒性(ADCC)、诱导补体依赖性细胞毒性(CDC)、诱导抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)、结合并激活T细胞或包含细胞毒性有效负载。

在本发明的具体的实施方案中，细胞毒性部分包含可结晶片段(Fc)区部分，特别是Fc区部分经工程化例如通过无岩藻糖基化或通过包含ADCC、CDC和/或ADCP增加突变以增加ADCC、CDC和/或ADCP活性例如。

在其他实施方案中，Treg清除剂是结合Treg的细胞表面标志物并具有ADCC、CDC或ADCP活性的抗体。在其他实施方案中，Treg清除剂是具有ADCC、CDC或ADCP活性的CCR8结合抗体。

在本发明的另一个具体实施方案中，Treg清除剂包含(a)具有ADCC、CDC和/或ADCP活性的Fc区部分，以及(b)至少一个结合Treg细胞表面标志物的单域抗体部分。

在另外的具体的实施方案中，Treg清除剂是Treg的细胞表面标志物的非阻断结合剂。

本发明的另一个目的是提供组合物，其包含本发明的组合。

本发明的另一个目的是提供双特异性分子以及编码此类分子的核酸，所述双特异性结合分子包含LTBR激动部分和Treg清除部分，其中双特异性分子具有细胞毒活性。

本发明的另一个目的是提供包含Treg清除剂和LTBR激动剂的组合、包含此类组合的组合物以及包含LTBR激动部分和Treg清除部分的双特异性分子(其中双特异性分子具有细胞毒活性)，其用作药物。

本发明的另一个目的是提供包含Treg清除剂和LTBR激动剂的组合、包含此类组合的组合物以及包含Treg清除部分和LTBR激动部分的双特异性分子(其中双特异性分子具有细胞毒活性)，其用于治疗癌症。优选地，癌症选自乳腺癌、子宫癌、肺癌、胃癌、头颈部鳞状细胞癌、皮肤癌、结直肠癌和肾癌。

本发明的另一个目的是提供用于治疗癌症的LTBR激动剂，其中该治疗还包含Treg细胞清除疗法。

在具体的实施方案中，LTBR激动剂是LTBR激动性抗体；并且Treg细胞清除疗法包含施用具有ADCC、CDC和/或ADCP活性的CCR8结合抗体。

本发明的另一个目的是Treg清除剂，其用于治疗癌症，其中该治疗还包含施用LTBR激动剂。

除Treg清除剂和LTBR激动剂外，疗法还可包含其他活性成分。在其他实施方案中，另一种活性成分是检查点抑制剂。检查点抑制剂是阻断检查点蛋白与其伴侣蛋白结合从而激活免疫系统功能的化合物。优选地，检查点抑制剂阻断选自PD-1、PD-L1、B7-1和B7-2的蛋白质。更优选地，检查点抑制剂阻断PD-1或PD-L1。优选的实例包括抗PD-1和抗PD-L1抗体。用于本发明的优选的免疫检查点抑制剂选自纳武利尤单抗(nivolumab)、派姆单抗(pembrolizumab)、阿替利珠单抗(atezolizumab)、阿维单抗(avelumab)、度伐利尤单抗(durvalumab)、西米普利单抗(cemiplimab)、JTX-4014、斯巴达珠(spartalizumab)、卡瑞利珠单抗(camrelizumab)、信迪利单抗(sintilimab)、替雷利珠单抗(tiselizumab)、特瑞普利单抗(toripalimab)、多塔利单抗(dostarlimab)、INCMGA00012、AMP-224、AMP-514、KN035、AUNP12、CK-301、CA-170和BMS-986189。

合适地，根据本发明的Treg清除剂和检查点抑制剂可以包含在单个分子中，例如结合Treg的细胞表面标志物和免疫检查点的抗体。因此，在具体的实施方案中，本文所述的Treg清除剂是结合Treg的细胞表面标志物以及选自PD-1、PD-L1、B7-1和B7-2的蛋白质的双特异性抗体。合适地，本文所述的Treg清除剂可包含纳武利尤单抗、派姆单抗、阿替利珠单抗、阿维单抗、度伐利尤单抗、西米普利单抗、JTX-4014、斯巴达珠、卡瑞利珠单抗、信迪利单抗、替雷利珠单抗、特瑞普利单抗、多塔利单抗、INCMGA00012、AMP-224、AMP-514、KN035、AUNP12、CK-301、CA-170和BMS-986189的PD-1或PD-L1结合部分。

附图说明

图1示出了通过流式细胞术评估源自用小鼠CCR8免疫的美洲驼的两种VHH(VHH-01和VHH-06)与全长小鼠CCR8的结合以及与Hek293细胞中过表达的N末端缺失小鼠CCR8的结合。

图2示出了VHH-Fc-14在BW5147细胞中功能性抑制配体CCL1抗地塞米松诱导的细胞凋亡的保护活性的潜力的评价。

图3显示了VHH-Fc-43以及同型对照对瘤内Treg清除的影响，VHH-Fc-43是具有ADCC活性的CCR8 Fc融合体。

图4显示了VHH-Fc-43以及同型对照对循环Treg的影响。

图5显示了从接种肿瘤的第0天到第25天试验终点，在，与VHH-Fc-43和VHH-16的同型和组合疗法相比，VHH-FC-43和VHH-16单一疗法对MC38肿瘤中肿瘤生长的体内影响。

图6显示了同型、VHH-FC-43和VHH-16单一疗法以及VHH-Fc-43和VHH-16组合疗法治疗的肿瘤的卡普兰-迈耶(Kaplan-Meier)存活曲线。当动物的肿瘤达到2000mm³的伦理终点时处死动物。

图7描绘了在用同型(第21天)、VHH-FC-43和VHH-16单一疗法(第25天)以及VHH-Fc-43和VHH-16组合疗法(第25天)治疗的肿瘤中发现的HEV数量/肿瘤面积的定量。对每种情况下来自3只治疗小鼠的每一个肿瘤的切片进行分析，并使用Zen Blue软件程序通过勾勒DAPI阳性细胞核来计算总肿瘤面积。

图8显示了在用VHH-Fc-43和VHH-16组合疗法治疗的肿瘤中鉴定的“成熟”外观三级淋巴结构(TLS)。箭头显示围绕由大量B220阳性B细胞组成的有组织结构的MECA-79阳性HEV。

图9显示了从接种肿瘤的第0天到第25天试验终点，抗CTLA-4和VHH-16单一疗法与抗CTLA-4和VHH-16的同型和组合疗法对MC38肿瘤中肿瘤生长体内影响的对比。在这些实验中使用的抗CTLA-4是包含小鼠IgG2a的mAb，从而使得抗CTLA-4IgG能够清除Treg细胞。

具体实施方式

下面将参照具体实施方案并参照特定附图来描述本发明，但本发明不限于此。

除非本文另有定义，与本发明结合使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。此外，除非上下文另有要求，否则单数术语应包括复数，并且复数术语应包括单数。通常，与本文所述的分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白质和核酸化学相关使用的命名法和技术是本领域熟知和常用的那些。

如前所述，本发明提供了包含Treg清除剂和LTBR激动剂的组合。由于当本发明的组合中定义的Treg清除剂和LTBR激动剂作为癌症组合疗法施用时观察到的协同效应，此类组合特别有用。

Treg清除剂

如本文所用，术语“Treg清除剂”表示能够清除(消融)个体Treg的显著部分的分子。在一些实施方案中，个体中的大部分Treg细胞被消融。在一些实施方案中，个体中大于50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的Treg被消融。在具体的实施方案中，Treg清除剂与Treg细胞结合并清除。在另外的具体的实施方案中，Treg清除剂是能够结合Treg细胞的细胞表面标志物并通过其细胞毒活性诱导其清除的分子。在另外的具体的实施方案中，与其他Treg(例如，组织浸润Treg和循环血液Treg)相比，Treg清除剂更大程度地清除肿瘤内Treg。在另外的具体的实施方案中，与其他Treg相比，Treg清除剂更大程度清除肿瘤内Treg。在另外的具体的实施方案中，Treg清除剂清除肿瘤内Treg并增加肿瘤微环境中(优选肿瘤中)效应T细胞与Treg的比率。在具体的实施方案中，基本上如Pablos等人(BMCImmunology 2005,6:6doi:10.1186/1471-2172-6-6)所述，通过用化合物处理分离的人Treg或肿瘤浸润性淋巴细胞，如果需要，在效应细胞如NK细胞或PBMC存在下，分析处理后存活的Treg细胞的数目来测量Treg清除。可替代地，在一个互补的实施方案中，可通过将化合物加入到PBMC中并在4小时后测量存活Treg的水平来验证Treg清除。可替代地，基本上如Sugiyama等人(Proc Natl Acad Sci U S A 2013 Oct 29；110(44):17945-50.doi:10.1073/pnas.1316796110)所述，通过将PBMC与化合物一起孵育并使用磁珠捕获化合物结合的细胞，随后对未捕获的细胞进行FACS分析来验证Treg清除。用于确定Treg清除的合适的体内测定包含将Treg清除化合物施用于小鼠后对肿瘤浸润性免疫细胞进行FACS分析。

在其他实施方案中，Treg的细胞表面标志物是与另外的T细胞的细胞表面上标志物的表达相比在Treg的细胞表面上过表达的标志物。在更具体的实施方案中，Treg的细胞表面标志物是与其在外周Treg细胞上的表达相比在肿瘤浸润性Treg的细胞表面上过表达的标志物。

优选地，Treg的细胞表面标志物选自CCR8、CCR4、CTLA4、CD25、TIGIT、OX40、ICOS、CD38、GITR、4-1BB、NRP1和LAG-3。在具体的实施方案中，Treg的细胞表面标志物选自CCR8、CCR4、CD25、TIGIT和ICOS；优选CCR8、CD25和CCR4。

因此，在具体的实施方案中，Treg的细胞表面标志物是CC趋化因子受体4(CCR4)。具有细胞毒活性的CCR4结合抗体已公开于例如WO2013166500 A1、WO2016057488 A1和WO2016178779 A1中。在具体的实施方案中，用于本发明的Treg清除剂是莫格利珠单抗。

在另外的具体的实施方案中，Treg的细胞表面标志物是CTLA4，也称为CTLA-4或细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4。CTLA4结合抗体已公开于例如WO2013003761 A1和WO2017106372 A1中。在具体的实施方案中，用于本发明的Treg清除剂是伊匹木单抗(ipilimumab)或曲美木单抗(tremelimumab)。

在另外的具体的实施方案中，Treg的细胞表面标志物是CD25。白介素-2受体α链(也称为CD25)是人中由IL2RA基因编码的蛋白质。白细胞介素2(IL2)受体α(IL2RA)和β(IL2RB)链与共同的γ链(IL2RG)一起构成高亲和力IL2受体。合适的CD25结合抗体已经公开在例如WO2017174331 A1、WO2018167104 A1和WO2019175220 A1中，所有这些文献通过引用并入本文。在具体的实施方案中，用于本发明的CD25结合抗体是RG6292，也称为RO7296682。

在另外的具体的实施方案中，Treg的细胞表面标志物是TIGIT。TIGIT(也称为具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体)是存在于一些T细胞和自然杀伤细胞(NK)上的免疫受体。它也被标识为WUCAM和Vstm3。用于本发明的合适的TIGIT结合抗体公开于例如WO2015009856 A2、WO2016028656 A1、WO2016106302 A1、WO2017053748 A2、WO2017152088A1和WO2019023504 A1中。在又一个实施方案中，Treg清除剂是替瑞利尤单抗(tiragolumab)；抗体，其包含WO2019023504 A1的包含SEQ ID NO:221的氨基酸序列的重链可变结构域以及包含SEQ ID NO:222的氨基酸序列的轻链可变结构域；或抗体，其包含WO2019023504 A1的包含SEQ ID NO:219的氨基酸序列的重链可变结构域以及包含SEQ IDNO:220的氨基酸序列的轻链可变结构域。

在另外的具体的实施方案中，Treg的细胞表面标志物是OX40。OX40(也称为肿瘤坏死因子受体超家族，成员4(TNFRSF4)或CD134)是次级共刺激分子，用于本发明的合适的OX40结合抗体已公开于例如WO2018031400 A1、WO2007062245 A2、WO2018202649 A1、WO2016179517 A1和WO2018112346 A1中。在具体的实施方案中，Treg清除剂选自KHK4083、ATOR-1015、INCAGN01949和ABBV-368。在另外的具体的实施方案中，Treg清除剂是选自以下的抗体：

·包含重链可变区和轻链可变区的抗体，重链可变区包含来自WO2007062245 A2的SEQ ID NO:9的位置20至141的氨基酸的氨基酸序列，轻链可变区包含来自WO2007062245A2的SEQ ID NO:10的位置21至129的氨基酸的氨基酸序列；

·包含重链可变区和轻链可变区的抗体，重链可变区包含WO2018202649 A1的SEQID NO:91的氨基酸序列，轻链可变区包含WO2018202649 A1的SEQ ID NO:89的氨基酸序列；

·包含重链可变区和轻链可变区的抗体，重链可变区包含WO2016179517 A1的SEQID No:16的氨基酸序列，轻链可变区包含WO2016179517 A1的SEQ ID NO:15的氨基酸序列；以及

·WO2018112346 A1的抗体Hu3738。

在另外的具体的实施方案中，Treg的细胞表面标志物是ICOS。ICOS(也称为诱导型T细胞COS刺激剂或CD278)是由ICOS基因编码的免疫检查点蛋白。它是在激活的T细胞上表达的CD28超家族共刺激分子。用于本发明的合适的ICOS结合抗体已公开于例如WO2008137915 A2、WO2016154177 A2、WO2012131004 A2、WO2018029474 A2和WO2018187613A2中。在具体的实施方案中，Treg清除剂选自KY-11044、KY-1055、XmAb23104、伏派利单抗(vopratelimab)和MEDI-570。在另外的具体的实施方案中，Treg清除剂是选自以下的抗体：

·伏派利单抗；

·包含重链可变区和轻链可变区的抗体，重链可变区包含WO2018029474 A2的SEQID NO:408的氨基酸序列，轻链可变区包含WO2018029474 A2的SEQ ID NO:415的氨基酸序列；以及

·包含重链可变区和轻链可变区的抗体，重链可变区包含WO2008137915 A2的SEQID No:7的氨基酸序列，轻链可变区包含WO2008137915 A2的SEQ ID NO:2的氨基酸序列。

还在另外的具体的实施方案中，Treg的细胞表面标志物是CD38。CD38(分化簇38，也称为环状ADP核糖水解酶)是在许多免疫细胞(包括CD4+、CD8+、B淋巴细胞和天然杀伤细胞)的表面上发现的糖蛋白。CD38还在细胞粘附、信号转导和钙信号传导中发挥作用。例如在WO2016210223 A1、WO2012092616 A1、WO2008047242 A2和WO2015066450 A1中公开了用于本发明的合适的CD38结合抗体。在另外的具体的实施方案中，Treg清除剂是选自以下的抗体：

·达雷妥尤单抗(daratumumab)；

·伊沙妥昔单抗(isatuximab)；以及

·包含重链可变区和轻链可变区的抗体，重链可变区包含WO2012092616 A1的SEQID NO:9的氨基酸序列，轻链可变区包含WO2012092616 A1的SEQ ID NO:10的氨基酸序列。

在另外的具体的实施方案中，Treg的细胞表面标志物是GITR。GITR(糖皮质激素诱导的TNFR相关蛋白，也称为肿瘤坏死因子受体超家族成员18(TNFRSF18)或激活诱导型TNFR家族受体(AITR))也是一种共刺激免疫检查点分子，其在由CD25+/CD4+调节性T细胞维持的显性免疫自身耐受性中发挥关键作用。用于本发明的合适的GITR结合抗体已公开于例如WO2015187835 A2、WO2016054638 A1、WO2016081746 A2、WO2015184099 A1和WO2016057846A1中。在另外的具体的实施方案中，Treg清除剂是选自以下的抗体：

·具有WO2015187835 A2的抗体28F3.IgG1的重链和轻链可变区的抗体；

·包含重链可变区和轻链可变区的抗体，重链可变区包含WO2015184099 A1的SEQID NO:206的氨基酸序列，轻链可变区包含WO2015184099 A1的SEQ ID NO:208的氨基酸序列；

·包含重链可变区和轻链可变区的抗体，重链可变区包含WO2016057846 A1的SEQID NO:99的氨基酸序列，轻链可变区包含WO2016057846 99 A1的SEQ ID NO:7的氨基酸序列。

在另外的具体的实施方案中，Treg的细胞表面标志物是4-1BB。4-1BB(也称为肿瘤坏死因子受体超家族成员9(TNFRSF9)、CD137并由淋巴细胞激活(ILA)诱导)也是一种共刺激免疫检查点分子。合适的分子包括具有增加的细胞毒活性(特别是ADCC活性)的乌瑞芦单抗(urelumab)和乌托鲁单抗(utomilumab)及其衍生物。

在另外的具体的实施方案中，Treg的细胞表面标志物是NRP1。NRP1(也称为神经纤毛蛋白-1)是VEGF和脑信号蛋白(semaphorin)家族成员的酪氨酸激酶受体的膜结合共同受体。NRP1在血管生成、轴突导向、细胞存活、迁移和侵袭中发挥多种作用，并且在Treg上高度表达。用于本发明的合适分子包括在WO2007056470、WO2012006503 A1、WO2014058915 A2和WO2018119171 A1中公开的那些抗体，及其具有增加的细胞毒活性(尤其是ADCC活性)的衍生物。在具体的实施方案中，Treg清除剂是维森库单抗(vesencumab)。在另外的具体的实施方案中，Treg清除剂包含WO2018119171 A1的MAB12的重链和轻链可变区。

在另外的具体的实施方案中，Treg的细胞表面标志物是LAG3。LAG3(淋巴细胞激活基因3，也称为CD223)是一种免疫检查点受体。用于本发明的合适的LAG3结合抗体已经公开于例如WO2014140180 A1；WO2014008218 A1；US20160176965 A1；WO2016028672 A1；以及WO2010019570 A2中。在另外的具体的实施方案中，Treg清除剂是包含重链可变区和轻链可变区的抗体，重链可变区包含WO2014140180 A1的SEQ ID NO:9的氨基酸序列，轻链可变区包含WO2014140180 A1的SEQ ID NO:4的氨基酸序列。

更优选地，Treg的细胞表面标志物是CCR8。CCR8是β趋化因子受体家族的成员，其被预测为类似于G偶联受体的七跨膜蛋白。鉴定的CCR8配体包括其天然同源配体CCL1(I-309)。本发明人已经发现通过靶向CCR8的Treg调节允许特异性清除肿瘤浸润性Treg细胞，同时保留肿瘤反应性效应T细胞和外周Treg细胞(例如，循环血液Treg细胞)。

“特异性结合(specific binding)”、“特异性地结合(bind specifically)”和“特异性地结合(specificallybind)”特别理解为是指Treg清除剂对目的标志物/抗原的解离常数(K_d)小于约10^-6M、10^-7M、10^-8M、10^-9M、10^-10M、10^-11M、10^-12M或10^-13M。在一个优选的实施方案中，解离常数小于10^-8M，例如范围为10^-9M、10^-10M、10^-11M、10^-12M或10^-13M。例如，可通过使用病毒样颗粒的基于表面等离振子共振的测定(例如，PCT申请公开号WO2005/012359中所述的BIAcore测定)、细胞酶联免疫吸附测定(ELISA)、以及荧光激活细胞分选(FACS)读出，来测定Treg清除剂对膜靶标的亲和力。用于测定表观Kd或EC50值的优选方法是通过使用FACS在21℃使用过表达标志物(特别是过表达huCCR8)的细胞。

如本领域技术人员将理解的，原则上结合Treg的细胞表面标志物的任何类型的Treg清除剂都可以用于本发明，并且不同类型的Treg清除剂对于本领域技术人员是容易获得的或可以使用本领域的典型知识产生。在具体的实施方案中，Treg清除剂的结合部分是蛋白质，更具体地是Treg清除多肽。在其他实施方案中，Treg清除剂的结合部分是基于抗体的或基于非抗体的，优选基于抗体的。基于非抗体的Treg清除剂包括但不限于亲和体(affibody)、Kunitz结构域肽、monobody(adnectin)、anticalin、设计的锚蛋白重复结构域(DARPin)、centyrin、fynomer、avimer；affilin；affitin、肽等。

如本文所述，术语“抗体”、“抗体片段”和“活性抗体片段”是指包含免疫球蛋白(Ig)结构域或能够特异性结合抗原的抗原结合结构域的蛋白，特别是CCR8蛋白。“抗体”还可以是来自天然来源或重组来源的完整免疫球蛋白，并且可以是完整免疫球蛋白的免疫反应性部分。抗体可以是免疫球蛋白分子的多聚体，例如四聚体。在一个优选的实施方案中，Treg清除剂包含Treg清除剂部分，特别是CCR8结合部分，其为抗体或活性抗体片段。在本发明的另一方面，Treg清除剂是抗体。在本发明的另一方面，抗体是单克隆的。抗体可以另外地或可替代地是人源化的或人的。在另一方面，抗体是人抗体，或者在任何情况下是具有允许其在人个体中使用和施用的形式和特征的抗体。抗体可以来自任何物种，包括但不限于小鼠、大鼠、鸡、兔、山羊、牛、非人灵长类动物、人、单峰驼、骆驼、美洲驼、羊驼和鲨鱼。

术语“抗原结合片段”是指所述完整多克隆或单克隆抗体的抗原结合部分，其保留了与靶抗原或其单链、包含抗体的融合蛋白和包含抗原识别位点的免疫球蛋白分子的任何其他修饰构型特异性结合的能力。抗原结合片段包含但不限于Fab；Fab'；F(ab')₂；Fc片段；单域抗体(sdAb或dAb)片段。这些片段通过使用本领域的常规方法衍生自完整抗体，例如通过用酶如木瓜蛋白酶进行蛋白水解切割以产生Fab片段或胃蛋白酶进行蛋白水解切割以产生F(ab')₂片段。如本文所用，抗原结合片段还指包含重链和/或轻链可变区的融合蛋白，例如单链可变片段(scFv)。

如本文所用，术语“单克隆抗体”是指具有均一抗体群体的抗体组合物。应当理解，单克隆抗体针对单个抗原位点是高度特异性的。此外，与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的常规抗体(多克隆)制剂相反，每种单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。本发明的Treg清除剂优选包含与Treg(特别是CCR8或CTLA4，更特别是CCR8的细胞表面标志物)结合的单克隆抗体部分。

如本文所用，术语“人源化抗体”是指通过分子建模技术产生来确定人和非人(例如，小鼠或兔)抗体序列的最佳组合的抗体，即，这样的一种组合，其中抗体中人源成分最大化，同时很少或不造成归因于非人抗体的可变区的结合亲和力的损失。例如，人源化抗体也称为嵌合抗体，包含人框架区的和来自人抗体的恒定区的氨基酸序列，以“人源化”或使来自非人抗体的互补决定区(CDR)成为非免疫原性的。

如本文所用，术语“人抗体”是指具有对应于可由人产生和/或已使用本领域技术人员已知或本文公开的用于制备人抗体的任何技术制备的抗体的氨基酸序列的抗体。还应当理解，术语“人抗体”包括这样的抗体，该抗体包含至少一种人重链多肽或至少一种人轻链多肽。一个这样的实例是包含鼠轻链和人重链多肽的抗体。

在本发明的一个方面，Treg清除剂包含活性抗体片段。术语“活性抗体片段”是指任何抗体或抗体样结构的一部分，其本身对抗原决定簇或表位具有高亲和力，并含有一个或多个抗原结合位点，例如互补决定区(CDR)，从而解释了这种特异性。非限制性实例包括免疫球蛋白结构域、Fab、F(ab)’2、scFv、重链-轻链二聚体、免疫球蛋白单可变结构域、单域抗体(sdAb或dAb)、和单链结构，例如完整轻链或完整重链，以及已被工程化以结合抗原的抗体恒定结构域。根据本发明，对所述片段的“活性”的额外要求是所述片段能够结合Treg(特别是CCR8)的细胞表面标志物。术语“免疫球蛋白(Ig)结构域”或更具体地“免疫球蛋白可变结构域”(缩写为“IVD”)是指基本上由被互补决定区隔开的框架区组成的免疫球蛋白结构域。通常，免疫球蛋白结构域基本上由四个“框架区”组成，其在本领域中和下文中分别称为“框架区1”或“FR1”；“框架区2”或“FR2”；“框架区3”或“FR3”；以及“框架区4”或“FR4”；这些框架区被三个“互补决定区”或“CDR”隔开，其在本领域和下文中分别称为“互补决定区1”或“CDR1”；“互补决定区2”或“CDR2”；以及“互补决定区3”或“CDR3”。因此，免疫球蛋白可变结构域的一般结构或序列可以如下所示：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。免疫球蛋白可变结构域(IVD)通过携带抗原结合位点赋予抗体对抗原的特异性。通常，在常规免疫球蛋白中，重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)相互作用形成抗原结合位点。在这种情况下，VH和VL的互补决定区(CDR)将有助于抗原结合位点，即，总共6个CDR将参与抗原结合位点的形成。鉴于上述定义，常规4链抗体(例如，IgG、IgM、IgA、IgD或IgE分子；本领域中已知)的抗原结合结构域或Fab片段、F(ab’)2片段、Fv片段(例如，二硫键连接的Fv或scFv片段)、或衍生自此类常规4链抗体的双链抗体(diabody)(均为本领域已知的)的抗原结合结构域，通过一对(缔合的)免疫球蛋白结构域如轻链和重链可变结构域，即通过免疫球蛋白结构域的VH-VL对与抗原的相应表位结合，所述免疫球蛋白结构域共同结合相应抗原的表位。本文所用的单域抗体(sdAb)是指具有包含4个框架区(FR)和3个根据形式FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4的互补决定区(CDR)的氨基酸序列的蛋白质。本发明的单域抗体等同于“免疫球蛋白单可变结构域”(缩写为“ISVD”)，并且是指其中抗原结合位点存在于单个免疫球蛋白结构域上并由其形成的分子。这将单域抗体与“常规”抗体或其片段分开，其中两个免疫球蛋白结构域、特别是两个可变结构域相互作用形成抗原结合位点。单域抗体的结合位点由单个VH/VHH或VL结构域形成。因此，单域抗体的抗原结合位点由不超过3个CDR形成。因此，单个结构域可以是轻链可变结构域序列(例如，VL序列)或其合适的片段；或重链可变结构域序列(例如，VH序列或VHH序列)或其合适的片段；只要其能够形成单一抗原结合单位(即，基本上由单一可变结构域组成的功能性抗原结合单位，使得单一抗原结合结构域不需要与另一可变结构域相互作用以形成功能性抗原结合单位)。

因此，在一个实施方案中，如上所述的结合Treg的细胞表面标志物并具有细胞毒活性的Treg清除剂包含至少一个单域抗体部分。优选地，结合Treg的细胞表面标志物并具有细胞毒活性的Treg清除剂包含至少两个单域抗体部分。

在本发明的另一个实施方案中，如上详述的Treg清除剂包含至少一个Fc区部分和至少两个结合Treg的细胞表面标志物(特别是CCR8)的单域抗体部分。优选地，Treg清除剂是基因工程化的多肽，其包含通过肽接头连接在一起的至少一个Fc区部分和至少两个结合Treg的细胞表面标志物(特别是CCR8)的单域抗体部分。Fc区部分和/或单域抗体部分区域的氨基酸序列可以被人源化以降低对人的免疫原性。

特别地，单域抗体可以是(如本文所定义)或其合适的片段(注： 和/>是Ablynx公司(一家赛诺菲(Sanofi)公司)的注册商标)。对于/>的一般描述，参考下面的进一步描述，并在现有技术例如WO2008/020079中进行描述。“VHH结构域”，也称为VHH、VHH抗体片段和VHH抗体，最初被描述为“重链抗体”(即，“不含轻链的抗体”；参见，例如Hamers-Casterman等人,Nature 363:446-8(1993))的抗原结合免疫球蛋白(Ig)(可变)结构域。选择术语“VHH结构域”以区分这些可变结构域与存在于常规4链抗体中的重链可变结构域(本文称为“VH结构域”)以及存在于常规4链抗体中的轻链可变结构域(本文称为“VL结构域”)。对于VHH和/>的进一步描述，参考Muyldermans的综述文章(Reviews in Molecular Biotechnology 74:277-302,2001)，以及作为一般背景技术提及的下列专利申请：布鲁塞尔自由大学的WO 94/04678、WO95/04079和WO 96/34103；联合利华(Unilever)的WO 94/25591、WO 99/37681、WO00/40968、WO 00/43507、WO 00/65057、WO 01/40310、WO 01/44301、EP 1134231和WO 02/48193；Vlaams生物技术研究所(VIB)的WO 97/49805、WO 01/21817、WO 03/035694、WO 03/054016和WO 03/055527；Algonomics公司和Ablynx公司的WO 03/050531；加拿大国家研究委员会的WO 01/90190；抗体研究所(Institute of Antibodies)的WO03/025020(＝EP 1433793)；以及Ablynx公司的WO 04/041867、WO 04/041862、WO 04/041865、WO 04/041863、WO 04/062551、WO 05/044858、WO 06/40153、WO 06/079372、WO 06/122786、WO 06/122787和WO06/122825以及Ablynx公司的进一步公开的专利申请。如这些文献中所描述的，/>(特别是VHH序列和部分人源化的/>)可以特别地表征为在一个或多个框架序列中存在一个或多个“标志(Hallmark)残基”。对/>的进一步描述，包括纳米抗体(Nanobody)的人源化和/或骆驼源化，以及其他修饰、部分或片段、衍生物或“纳米抗体融合体”、多价或多特异性构建体(包括接头序列的一些非限制性实例)以及用于增加/>及其制备的半衰期的不同修饰，可以在例如WO 08/101985和WO 08/142164中找到。VHH和/>是完全保留全长抗体的结合亲和力和特异性的最小抗原结合片段之一(参见，例如Greenberg等人,Nature 374:168-73(1995)；Hassanzadeh-Ghassabeh等人,Nanomedicine(Lond),8:1013-26(2013))。

此外，对于完整大小的抗体、单个可变结构域(例如，VHH和)可进行人源化，即增加与最接近的人种系序列的序列同一性程度。特别地，人源化免疫球蛋白单可变结构域(例如，VHH和/>)可以是单域抗体，其中存在至少一个单个氨基酸残基(特别是至少一个框架残基)，该氨基酸残基是人源化取代和/或对应于人源化取代(如本文进一步所定义)。通过将天然存在的VHH序列的框架区序列与一个或多个密切相关的人VH序列的相应框架序列进行比较，可以确定潜在有用的人源化取代，然后可以将由此确定的一个或多个潜在有用的人源化取代(或其组合)引入所述VHH序列中，并可以检测所得人源化VHH序列对靶标的亲和力、稳定性、表达的容易程度和水平和/或其他所需性质。由此，通过有限程度的反复试验，本领域技术人员可以确定其他合适的人源化取代(或其合适的组合)。

人源化单域抗体，特别是VHH和与相应的天然存在的VHH结构域相比，可以具有几个优点，例如免疫原性降低。人源化是指突变，使得在施用于人类患者时免疫原性较小或不存在。人源化取代的选择应使所得人源化氨基酸序列和/或VHH仍保留VHH的有利特性，例如抗原结合能力。基于本文提供的描述，技术人员将能够选择人源化取代或人源化取代的合适组合，其优化或实现一方面由人源化取代提供的有利特性与另一方面天然存在的VHH结构域的有利特性之间的期望或合适平衡。这些方法是本领域技术人员已知的。人共有序列可用作人源化的靶序列，但其他方法也是本领域已知的。一种替代方法包括本领域技术人员比对许多人种系等位基因的方法，例如但不限于比对IGHV3等位基因，以使用所述比对鉴定靶序列中适于人源化的残基。与靶序列最同源的人种系等位基因的子集也可以作为起始点进行比对以鉴定合适的人源化残基。可替代地，分析VHH以鉴定其在人等位基因中最接近的同源物，并用于人源化构建体设计。应用于骆驼科VHH的人源化技术也可以通过包含单独或组合替换特定氨基酸的方法进行。可以基于文献中已知的、来自已知的人源化工作、以及来自与天然VHH序列相比的人共有序列、或与关注的VHH序列最相似的人等位基因，来选择所述替换。从WO 08/020079的表A-5-A-8中给出的关于VHH熵和VHH变异性的数据可以看出，框架区中的一些氨基酸残基在人和骆驼科之间比其他氨基酸残基更保守。通常，尽管本发明在其最广泛的意义上不限于此，但优选在较不保守的位置进行任何取代、缺失或插入。此外，通常，氨基酸取代优于氨基酸缺失或插入。例如，类人骆驼科单域抗体含有通常在人来源或来自其他物种的常规抗体中发现的疏水性FR2残基，但通过在位置103处取代存在于来自双链抗体的VH中的保守色氨酸残基的其他取代来补偿这种亲水性损失。因此，属于这两类的肽显示出与人VH框架区高的氨基酸序列同源性，并且所述肽可以直接施用于人而不期望由此产生不希望的免疫应答，并且没有进一步人源化的负担。实际上，一些骆驼科VHH序列显示出与人VH框架区的高序列同源性，因此所述VHH可以直接施用于患者，而不期望由此产生的免疫应答，并且没有附加的人源化负担。

可以在人源化过程中引入合适的突变，特别是取代，以产生与预先存在的抗体结合减少的多肽(参见，例如WO 2012/175741和WO2015/173325)，例如以下位置中的至少一个：11、13、14、15、40、41、42、82、82a、82b、83、84、85、87、88、89、103或108。本发明的氨基酸序列和/或VHH可以在任何框架残基处，例如在一个或多个标志残基处(如下文所定义)或在一个或多个其他框架残基(即，非标志残基)处或其任何合适的组合处被适当地人源化。根据用于表达本发明的氨基酸序列、VHH或多肽的宿主生物体，此类缺失和/或取代也可以以除去一个或多个翻译后修饰位点(例如，一个或多个糖基化位点)的方式设计，这处于本领域技术人员的能力范围内。可替代地，可设计取代或插入以引入一个或多个用于连接官能团的位点(如本文所述)，例如以允许位点特异性聚乙二醇化。

在一些情况下，在位置37、44、45和/或47处具有亲水性特征的典型骆驼科标志残基中的至少一个被替换(参见WO2008/020079表A-03)。人源化的另一个实例包括以下残基的取代：在FR1中，例如位置1、5、11、14、16和/或28；在FR3中，例如位置73、74、75、76、78、79、82b、83、84、93和/或94；以及在FR4中，例如位置10、103、104、108和/或111(参见WO2008/020079的表A-05-A08；均根据Kabat进行编号)。

在本发明的一个方面，如本发明的组合中定义的Treg清除剂是单特异性的。如下面进一步讨论的，在另一个方面，本发明的Treg清除剂是双特异性的。

如本文所用，“双特异性”是指Treg清除剂具有结合单一抗原或多肽上或者两种不同抗原或多肽上的两种不同表位的能力。

如本文所讨论的本发明的双特异性Treg清除剂可以通过以下方法产生：生物方法，例如体细胞杂交；或基因方法，例如在细胞系或生物体中表达编码所需结构的非天然DNA序列；化学方法(例如，通过化学偶联、基因融合、非共价或以其他方式结合至一个或多个分子实体(例如，其片段的另一种结合剂))；或其组合。

允许产生单特异性或双特异性Treg清除剂的技术和产品是本领域已知的，如在文献中广泛综述的，还涉及替代形式、Treg清除剂-药物缀合物、Treg清除剂设计方法、体外筛选方法、恒定区、翻译后和化学修饰、触发癌细胞死亡的改进特征(例如，Fc结构域工程化)(TillerK和Tessier P,Annu Rev Biomed Eng.17:191-216(2015)；Speiss C等人,Molecular Immunology 67:95-106(2015)；Weiner G,Nat Rev Cancer,15:361-370(2015)；Fan G等人,J Hematol Oncol 8:130(2015))。

如本文所用，“表位”或“抗原决定簇”是指抗原上与Treg清除剂(例如，抗体)结合的位点。如本领域所熟知的，表位可以由连续的氨基酸(线性表位)或通过蛋白质的三级折叠并置的非连续氨基酸(构象表位)形成。由连续氨基酸形成的表位通常在暴露于变性溶剂时保留，而通过三级折叠形成的表位通常在用变性溶剂处理时丢失。表位通常在独特的空间构象中包括至少3个、更通常至少5或8-10个氨基酸。确定表位空间构象的方法是本领域熟知的，包括例如X射线晶体学和2D核磁共振。参见，例如Methods in Molecular Biology,第66卷,Glenn E.Morris编著(1996)中的表位作图方案(Epitope Mapping Protocols)。

进一步根据本发明，本发明组合中定义的Treg清除剂结合Treg细胞的细胞表面标志物并具有细胞毒活性。本文所用的“细胞毒性”或“细胞毒活性”是指Treg清除剂对其所结合的细胞具有毒性的能力。如技术人员从本发明的描述中所明了的，在本发明的上下文中可以使用任何类型的细胞毒性。重要的是本发明的Treg清除剂结合Treg细胞的细胞表面标志物(例如，CCR8)并对其所结合的细胞产生毒性的能力。细胞毒性可以是直接细胞毒性，其中Treg清除剂本身直接损伤细胞(例如，因为它包含化疗有效负载)，或者它可以是间接的，其中Treg清除剂诱导导致细胞损伤的细胞外机制(例如，诱导抗体依赖性细胞活性的抗体)。更具体地，本发明的Treg清除剂可以向免疫系统发出信号以破坏或消除其所结合的细胞，或者Treg清除剂可以携带细胞毒性有效负载以破坏其所结合的细胞。特别地，细胞毒活性归因于细胞毒性部分的存在。此类细胞毒性部分的实例包括诱导抗体依赖性细胞活性(ADCC)、诱导补体依赖性细胞毒性(CDC)、诱导抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)、结合并激活T细胞或包含细胞毒性有效负载的部分。最优选地，所述细胞毒性部分诱导抗体依赖性细胞活性(ADCC)。

抗体依赖性细胞毒性(ADCC)是指细胞介导的反应，其中表达Fc受体的非特异性细胞毒性细胞识别靶细胞上的Treg清除剂并随后导致靶细胞的裂解。表达Fc受体的非特异性细胞毒性细胞的实例包括天然杀伤细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞。

补体依赖性细胞毒性(CDC)是指在补体存在下靶标的裂解。补体激活途径通过补体系统的第一组分(C1q)与同族抗原复合的Treg清除剂的结合而启动。

抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)是指细胞介导的反应，其中表达Fc受体的吞噬细胞(例如，巨噬细胞)识别靶细胞上的Treg清除剂，从而导致靶细胞的吞噬作用。

可以使用本领域已知的测定来测量CDC、ADCC和ADCP(Vafa等人,Methods 2014年1月1日；65(1):114-26(2013))。

细胞毒活性也可归因于结合并激活细胞毒性T细胞或T辅助细胞的细胞毒性部分，例如因为细胞毒性部分结合细胞毒性T细胞或T辅助细胞标志物，该标志物不同于Treg的细胞表面标志物，优选不同于CCR8，并且该结合导致所述细胞毒性T细胞或T辅助细胞的激活。细胞毒性T细胞或T辅助细胞的激活诱导细胞毒性T细胞或T辅助细胞的Treg清除剂所结合的细胞的细胞毒活性。因此，在具体的实施方案中，本发明的Treg清除剂结合Treg的细胞表面标志物，优选结合CCR8，并结合和激活细胞毒性T细胞或T辅助细胞。例如，细胞毒性部分可以结合CD3。在其他实施方案中，细胞毒性部分包含与CD3结合的抗体或其抗原结合片段。因此，本发明的Treg清除剂可以结合Treg的细胞表面标志物，优选结合CCR8和CD3。此类Treg清除剂结合肿瘤内Treg并将T细胞的细胞毒活性引导至这些Treg，从而将它们从肿瘤环境中清除。在具体的实施方案中，本发明的Treg受体包含与Treg的细胞表面标志物(特别是CCR8)结合的部分以及与CD3结合的部分，其中至少一个部分是基于抗体的，特别是其中两个部分都是基于抗体的。因此，在具体的实施方案中，本发明提供了双特异性构建体，其包含特异性结合Treg的细胞表面标志物(优选CCR8)的抗体或其抗原结合片段、以及特异性结合CD3的抗体或其抗原结合片段。

细胞毒性有效负载是指对与细胞毒性有效负载接触的细胞造成直接损伤作用的任何分子实体。细胞毒性有效负载是本领域技术人员已知的。在具体的实施方案中，细胞毒性有效负载是化学实体。此类细胞毒性有效负载的具体实例包括毒素、化疗剂和放射性同位素或放射性核素。在其他实施方案中，细胞毒性有效负载包含选自以下的药剂：烷化剂、蒽环霉素、细胞骨架破坏剂、埃坡霉素、组蛋白脱乙酰酶抑制剂、拓扑异构酶I抑制剂、拓扑异构酶II抑制剂、激酶抑制剂、核苷酸类似物和前体类似物、肽抗生素、基于铂的药剂、类视色素(retinoid)、长春花生物碱及衍生物、肽或小分子毒素和放射性同位素。可以使用本领域已知的技术将化学实体偶联至蛋白质类抑制剂，例如抗体或抗原结合片段。此类偶联可以是共价或非共价的，并且偶联可以是不稳定的或可逆的。

如本领域所熟知的，IgG抗体的Fc区与几种细胞Fcγ受体(FcγR)相互作用以刺激和调节下游效应物机制。存在五种激活受体，即FcγRI(CD64)、FcγRIIa(CD32a)、FcγRIIc(CD32c)、FcγRIIIa(CD16a)和FcγRIIIb(CD16b)以及一种抑制性受体FcγRIIb(CD32b)。IgG抗体与免疫系统的通讯由FcγR控制和介导，FcγR将抗体感测和收集的信息传递至免疫系统，提供先天性和适应性免疫系统之间的联系，特别是在生物治疗的情况下(Hayes J等人,2016.JInflamm Res 9:209-219)。

IgG亚类结合FcγR的能力不同，并且这种差异结合决定了它们引发一系列功能性应答的能力。例如，在人中，FcγRIIIa是参与抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)的激活的主要受体，并且IgG3与紧随其后的IgG1显示了对该受体的最高亲和力，反映了它们有效诱导ADCC的能力。虽然已显示IgG2对该受体的结合较弱，但也已发现具有人IgG2同型的Treg清除剂有效清除Treg。

在本发明的优选实施方案中，本发明的Treg清除剂诱导抗体效应功能，特别是人中的抗体效应功能。在具体的实施方案中，本发明的Treg清除剂以高亲和力结合FcγR，优选以高亲和力结合激活受体。优选地，Treg清除剂以高亲和力结合FcγRI和/或FcγRIIa和/或FcγRIIIa。特别优选地，Treg清除剂结合FcγRIIIa。在具体的实施方案中，Treg清除剂以小于约10^-6M、10^-7M、10^-8M、10^-9M、10^-10M、10^-11M、10^-12M或10^-13M的解离常数与至少一种激活的Fcγ受体结合。可以通过几种方式获得FcγR结合。例如，细胞毒性部分可包含可结晶片段(Fc)区部分或其可包含结合部分，例如特异性结合FcγR的抗体或其抗原结合部分。

因此，在一个实施方案中，细胞毒性部分包含可结晶片段(Fc)区部分。在本发明的上下文中，术语“可结晶片段(Fc)区部分”是指由重链恒定区组成的免疫球蛋白分子的可结晶片段，其负责与抗体Fc受体和补体系统的一些其他蛋白质结合，从而诱导ADCC、CDC和/或ADCP活性。

在一个实施方案中，Fc区部分已被工程化以增加ADCC、CDC和/或ADCP活性。

可以通过减少或消除Fc部分聚糖的岩藻糖部分的方法和/或通过在免疫球蛋白(例如，IgG1)的Fc区域上引入特异性突变(例如，S298A/E333/K334A、S239D/I332E/A330L或G236A/S239D/A330L/I332E)来增加ADCC(Lazar等人,Proc Natl Acad Sci USA 103:2005-2010(2006)；Smith等人,Proc Natl Acad Sci USA 209:6181-6(2012))。也可以通过在人IgG的Fc部分上引入特异性突变来增加ADCP(Richards等人,Mol Cancer Ther 7:2517-27(2008))。Saunders(Frontiers in Immunology 2019,1296)和Wang等人(Protein Cell2019,9:63-73)中描述了用于工程化结合剂以增加ADCC、CDC和ADCP活性的方法。

在本发明的具体实施方案中，优化包含Fc区部分的Treg清除剂以引发ADCC应答，即相对于包含Fc区部分的其他抗体，包括不抑制配体(特别是CCL1)与其受体(特别是CCR8)的结合的那些，以及例如未修饰的抗CCR8单克隆抗体，ADCC应答得到增强、增加或改善。在一个优选的实施方案中，Treg清除剂已经被工程化以引发增强的ADCC应答。

在本发明的优选实施方案中，优化包含Fc区部分的Treg清除剂以引发ADCP应答，即相对于包含Fc区部分的其他抗体，包括不抑制配体(特别是CCL1)与其受体(特别是CCR8)结合的那些，以及例如未修饰的抗CCR8单克隆抗体，ADCP应答得到增强、增加或改善。

在其他实施方案中，细胞毒性部分包含与Fcγ受体结合的部分。更特别地，结合并激活FcγR，特别是激活受体，例如FcγRI和/或FcγRIIa和/或FcγRIIIa，特别是FcγRIIIa。与FcγR结合的部分可以是基于抗体的或基于非抗体的，如上文所述。如果基于抗体，该部分可通过其可变区结合FcγR。

在具体的实施方案中，本发明的Treg清除剂是CCR8结合剂。如本文所述，术语特异性抗原的“结合剂”表示能够特异性结合所述抗原的分子。本文所用的CCR8结合剂是指能够特异性结合CCR8的分子。此类结合剂在本文中也称为“CCR8结合剂”。

因此，在具体的实施方案中，CCR8结合剂是具有ADCC活性的单克隆抗体。此类抗体是本领域已知的，例如WO2020138489 A1，其通过引用纳入本文。在具体的实施方案中，用于本发明的CCR8结合剂选自WO2020138489 A1中公开的抗体，特别是WO2020138489 A1的权利要求中呈现的抗体。在其他实施方案中，用于本发明的CCR8结合剂选自WO2020138489 A1中公开的人源化抗体，特别是WO2020138489 A1的权利要求中呈现的人源化抗体。在另外的具体的实施方案中，用于本发明的CCR8结合剂是来自WO2020138489 A1的抗体10A11、2C7或19D7或其人源化变体；特别地为10A11或其人源化变体；更特别地为人源化10A11抗体。在另外的具体的实施方案中，用于本发明的CCR8结合剂是19D7，更优选人源化19D7抗体。

在一个优选的实施方案中，用于本发明的CCR8结合剂是WO2020138489 A1的抗CCR8抗体，其包含：包含SEQ ID NO:59的轻链可变区和包含SEQ ID NO:41的重链可变区。在其他实施方案中，WO2020138489 A1中轻链恒定区包含SEQ ID NO:52且重链恒定区包含SEQID NO:53。

在具体的实施方案中，CCR8结合剂是抗CCR8抗体，其特别是IgG抗体，更特别是IgG1或IgG4。

在本发明的具体方面，Treg清除剂是非阻断性结合剂。益处可包括对肠和/或皮肤Treg群体的副作用降低，以及对树突细胞向淋巴结迁移的抑制缺乏或降低。此外，已观察到使用阻断性Treg清除剂(例如，非阻断性CCR8结合剂)，特别是与检查点抑制(例如，PD-1/PD-L1抑制剂)组合的Treg清除，增加了肿瘤微环境中的嗜中性粒细胞。在本发明的这一方面，非阻断性Treg清除剂(例如，非阻断性CCR8结合剂)对嗜中性粒细胞增加的影响较小，从而提供更大的抗肿瘤功效。

“非阻断性”结合剂是指它不阻断或基本上不阻断配体与细胞表面标志物的结合。例如，非阻断性CCR8结合剂不阻断CCR8配体与CCR8蛋白的结合。在其他实施方案中，Treg清除剂是不调节其所结合的细胞表面标志物的激活的结合剂。在此类实施方案中，Treg清除剂不是激动或拮抗结合剂。因此，在此类实施方案中，Treg清除剂不是激动或拮抗抗体。

优选地，非阻断性CCR8结合剂不阻断选自CCL1、CCL8、CCL16和CCL18的至少一种配体与CCR8的结合，特别是不阻断CCL1或CCL18与CCR8的结合，优选不阻断CCL1与CCR8的结合。

可通过本领域已知的方法测定配体与标志物(特别是CCR8结合)的阻断。其实例包括但不限于测量配体(例如，CCL1)与CCR8的结合、CCR8表达细胞向配体(例如，CCL1)迁移、CCR8配体(例如，CCL1)导致的细胞内Ca²⁺水平增加、配体(例如，CCL1)对地塞米松诱导的细胞凋亡的拯救、以及对CCR8配体刺激(例如，CCL1刺激)敏感的基因表达的变化。

提及“非阻断性”、“非配体阻断性”、“不阻断”或“未阻断”等包括其中本发明的非阻断性Treg清除剂不阻断或基本上不阻断配体经由Treg细胞表面标志物的信号传导的实施方案。也就是说，与不存在Treg清除剂时的配体信号传导相比，非阻断性Treg清除剂抑制少于50％的配体信号传导。在本文所述的本发明的具体实施方案中，与不存在Treg清除剂的配体信号传导相比，非阻断性Treg清除剂抑制少于40％、35％、30％、优选少于约25％的配体信号传导。在具体的实施方案中，在Treg清除剂摩尔浓度为Treg清除剂与细胞表面标志物的结合EC50的至少10倍、特别是至少50倍、更特别是至少100倍时，测量配体信号传导的百分比。在其他实施方案中，在Treg清除剂(例如，CCR8结合剂)摩尔浓度为配体摩尔浓度的至少10倍、特别是至少50倍、更特别是至少100倍时，测量配体信号传导的百分比。

非阻断性Treg清除剂，特别是非阻断性CCR8结合剂，允许细胞表面标志物，特别是CCR8的结合，而不干扰至少一种配体与细胞表面标志物(特别是CCR8)的结合，或基本上不干扰至少一种配体与标志物(特别是CCR8)的结合。通过标志物(例如，CCR8)的配体信号传导(例如，CCL1信号传导)可以通过实施例中讨论的和本领域已知的方法来测量。可以在相同或基本相同的条件下对存在和不存在Treg清除剂(特别是CCR8结合剂)情况下的配体信号传导进行比较。

在一些实施方案中，可通过测量cAMP释放来测定CCR8信号传导。具体而言，将稳定表达重组(人)CCR8受体的CHO-K1细胞(例如，购自EuroscreenFAST的FAST-065C)悬浮于KRH的测定缓冲液中：5mM KCl，1.25mM MgSO₄，124mM NaCl，25mM HEPES，13.3mM葡萄糖，1.25mMKH₂PO₄，1.45mM CaCl₂，0.5g/l BSA，补充有1mM IBMX。以100nM的浓度加入CCR8结合剂并在21℃孵育30分钟。加入5μM毛喉素和(人)CCL1在测定缓冲液中的混合物以达到5nM CCL1的最终测定浓度。然后将测定混合物在21℃孵育30分钟。加入裂解缓冲液并孵育1小时后，测量cAMP的浓度。可以通过例如，利用制造商的测定条件、使用来自Cisbio的HTRF试剂盒(货号#62AM9PE)测定荧光水平来测量cAMP。与缺乏结合剂的对照相比，非阻断性Treg清除剂导致cAMP量的变化小于50％，特别是小于40％，更特别是小于30％，例如小于20％。优选地，与对照相比，非阻断性Treg清除剂导致cAMP变化小于10％，更优选小于5％。

用于产生非阻断性Treg清除剂(包括但不限于非阻断性CCR8结合剂)的技术是本领域技术人员可获得的。作为非限制性实例，可以通过使用包含全长表面标志物或表面标志物片段的细胞表面标志抗原进行免疫来产生抗体，并且可以针对表面标志物阻断活性的缺乏来筛选所产生的抗体。在具体的实施方案中，使用不参与配体结合的表面标志物片段通过免疫产生抗体。非阻断性抗体可以通过用标志物片段(特别是CCR8片段)免疫获得，该标志物片段衍生自N末端区域，特别是不位于跨膜结构域之间的N末端胞外区。因此，在具体的实施方案中，本发明的Treg清除剂在标志物的N末端区域结合CCR8。在具体的实施方案中，Treg清除剂结合CCR8的N末端区域以及位于CCR8的跨膜结构域之间的一个或多个细胞外环。在其他实施方案中，Treg清除剂结合CCR8的N末端区域，而不结合位于CCR8跨膜结构域之间的胞外环。在另外的具体的实施方案中，Treg清除剂结合位于CCR8的跨膜结构域之间的一个或多个细胞外环。在另外的具体的实施方案中，Treg清除剂的表位位于所述N末端区域。在其他实施方案中，Treg清除剂的表位不位于跨膜结构域之间的胞外环中。

在其他实施方案中，本发明提供了编码本文定义的Treg清除剂的核酸分子。在一些实施方案中，此类提供的核酸分子可以含有密码子优化的核酸序列。在另外的实施方案中，核酸包括在合适的核酸载体内的表达盒中，用于在宿主细胞(例如，细菌、酵母、昆虫、鱼、鼠、猿或人细胞)中表达。在一些实施方案中，本发明提供了包含表达所需结合剂的异源核酸分子(例如，DNA载体)的宿主细胞。

在一些实施方案中，本发明提供了制备如上定义的分离的Treg清除剂的方法。在一些实施方案中，此类方法可以包含培养宿主细胞，该宿主细胞包含核酸(例如，可以包含和/或通过载体递送至宿主细胞的异源核酸)。优选地，宿主细胞(和/或异源核酸序列)被排列并构建为使得Treg清除剂从宿主细胞中分泌并从细胞培养物上清液分离。

LTBR激动剂

如本文所述，术语“LTBR激动剂”是指对受体LTBR具有特异性的配体，其为具有与受体结合的作用的化合物，因此特异性地刺激配体依赖性受体活性(与在不存在任何配体的情况下测定的基线水平不同)。这种作用也简单地称为受体刺激作用或受体激活作用。此外，作为“激动剂”、“激活剂”、“刺激剂”、“受体激活配体”的同义词。激动剂包括天然化合物、衍生自天然化合物的半合成化合物和合成化合物。LTBR激动剂是本领域已知的，它们参与高内皮囊泡(HEV)和三级淋巴细胞结构(TLS)的诱导。

LTBR也称为肿瘤坏死因子受体超家族成员3(TNFRSF3)，是一种参与细胞凋亡和细胞因子释放的淋巴毒素的细胞表面受体。它是肿瘤坏死因子受体超家族的成员。它在大多数细胞类型的表面表达，包括上皮和骨髓谱系的细胞，但不在T和B淋巴细胞上表达。该蛋白特异性结合淋巴毒素膜形式(淋巴毒素α和淋巴毒素β的复合物)。编码的蛋白及其配体在淋巴组织的发育和组织中发挥作用。

淋巴毒素α/β/β(淋巴毒素αββ)是由淋巴毒素α的一个亚基或拷贝与淋巴毒素β的两个亚基或拷贝组成的异源三聚体种类。淋巴毒素αββ结合淋巴毒素β受体(LTBR)。LTBR的激活引发导致趋化因子表达的信号事件，趋化因子包括但不限于CXCL12、CXCL13、CCL19和CCL21。这些趋化因子用于诱导树突细胞、T细胞和B细胞的迁移以建立生发中心。因此，淋巴毒素αββ是适用于本发明的LTBR激动剂和HEV诱导剂。

LIGHT也称为肿瘤坏死因子超家族成员14(TNFSF14)，是TNF超家族的成员，其受体已被鉴定为淋巴毒素β受体(LTBR)、疱疹病毒进入介质(HVEM)和诱饵受体3(DcR3)。LIGHT代表“与淋巴毒素同源、表现出可诱导的表达并与HSV糖蛋白D竞争结合疱疹病毒进入介质、在T淋巴细胞上表达的受体”。在分类术语集中，它被分类为CD258。该蛋白可作为淋巴细胞激活的共刺激因子。它是已知的LTBR激动剂和HEV诱导剂。

如本领域技术人员将理解的，原则上LTBR的任何类型的激动剂可用于本发明，并且不同类型的激动剂对于本领域技术人员是容易获得的或可使用本领域的典型知识产生，包括小分子和生物制剂或生物衍生的分子。在具体的实施方案中，LTBR激动剂的结合部分是蛋白质，更具体地是LTBR激动性多肽。在其他实施方案中，LTBR激动剂的结合部分是基于抗体的或基于非抗体的，优选基于抗体的。基于非抗体的激动剂包括但不限于亲和体(affibody)、Kunitz结构域肽、monobody(adnectin)、anticalin、设计的锚蛋白重复结构域(DARPin)、centyrin、fynomer、avimer；affilin；affitin、肽等。

在具体的实施方案中，LTBR激动剂选自淋巴毒素αββ、LIGHT或LTBR结合片段或其模拟物。在另外的实施方案中，LTBR激动剂包含淋巴毒素α或淋巴毒素β。在其他实施方案中，LTBR激动剂是融合肽，该融合肽包含淋巴毒素α和淋巴毒素β，特别是一个淋巴毒素α部分和两个淋巴毒素β部分。此类LTBR激动剂例如公开于WO2018119118 A1和WO9622788 A1中，其通过引用并入本文。在具体的实施方案中，LTBR激动剂包含WO2018119118 A1的SEQID NO:16、SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:18。

LIGHT和LIGHT模拟肽也是本领域已知的，例如由WO2018119118 A1已知。在某些实施方案中，LTBR激动剂包含LIGHT(例如，人LIGHT)或其片段。作为非限制性实例，LTBR结合部分可包含LIGHT的细胞外结构域或其片段。在某些实施方案中，LTBR激动剂包含LIGHT同三聚体(例如，单链LIGHT同三聚体)。例如，LTBR激动剂可包含人LIGHT的细胞外结构域，与人LIGHT的细胞外结构域具有至少80％序列同一性的其变体、或其片段。在某些实施方案中，LTBR激动剂可包含与WO2018119118 A1的SEQ ID NO:85具有至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约98％或100％序列同一性的多肽(例如，LIGHT同源三聚体)。在一些实施方案中，LTBR激动剂是单链多肽。在某些实施方案中，LTBR激动剂包含与WO2018119118 A1的SEQ ID NO:86具有至少约90％、至少约95％或至少约98％序列同一性的多肽。例如，LTBR激动剂可包含WO2018119118 A1的SEQ ID NO:86。在一些实施方案中，LTBR激动剂包含结合或激活HVEM的能力降低的突变体LIGHT同三聚体。

在具体的实施方案中，LTBR激动剂不具有细胞毒活性。在其他实施方案中，LTBR激动剂不具有ADCC、CDC或ADCP活性。在其他实施方案中，LTBR激动剂不会导致其所结合的细胞的裂解。在另外的具体的实施方案中，LTBR激动剂不清除其所结合的细胞。

在优选的实施方案中，激动剂包含LTBR激动部分，其为抗体或活性抗体片段。在本发明的另一方面，激动剂是抗体(“激动性抗体”)。特异性结合LTBR的激动性抗体是本领域已知的。例如，参见WO2006/114284 A2、WO2004/058191 A2和WO02/30986 A2，其各自通过引用并入本文。在本发明的另一方面，抗体是单克隆的。抗体可以另外地或可替代地是人源化的或人的。在另一方面，抗体是人的，或在任何情况下，抗体具有允许其在人个体中使用和施用的形式和特征。抗体可以来自任何物种，包括但不限于小鼠、大鼠、鸡、兔、山羊、牛、非人灵长类动物、人、单峰驼、骆驼、美洲驼、羊驼和鲨鱼。

在本发明的一个方面，LTBR激动剂包含活性抗体片段。

在另外的实施方案中，如上详述的LTBR激动剂包含至少一个单域抗体部分。优选地，LTBR激动剂包含至少两个单域抗体部分。

在本发明的其他实施方案中，如上所述，LTBR激动剂包含至少一个Fc区部分和至少两个结合LTBR的单域抗体部分。优选地，LTBR激动剂是基因工程化多肽，其包含至少一个Fc区部分和至少两个通过肽接头连接在一起的结合LTBR的单域抗体部分。Fc区部分和/或单域抗体部分区域的氨基酸序列可以被人源化以降低对人的免疫原性。

特别地，单域抗体可以是(如本文所定义)或其合适的片段(注： 和/>是Ablynx公司(一家赛诺菲(Sanofi)公司)的注册商标)。此外，对于完整大小的抗体，单个可变结构域(例如，VHH和/>)可进行人源化并产生人源化的单域抗体。在另外的具体的实施方案中，LTBR激动剂不包含Fc结构域。在其他具体实施方案中，LTBR激动剂包含一个或多个单域抗体部分且不包含Fc结构域。产生LTBR激动剂的技术是本领域技术人员可获得的。

在其他实施方案中，本发明提供了编码本文定义的LTBR激动剂的核酸分子。在一些实施方案中，此类提供的核酸分子可以含有密码子优化的核酸序列。在另外的实施方案中，核酸被包括在合适的核酸载体内的表达盒中，用于在宿主细胞(例如，细菌、酵母、昆虫、鱼、鼠、猿或人细胞)中表达。在一些实施方案中，本发明提供了包含表达所需结合剂的异源核酸分子(例如，DNA载体)的宿主细胞。

在一些实施方案中，本发明提供了制备如上定义的分离的LTBR激动剂的方法。在一些实施方案中，此类方法可以包含培养宿主细胞，该宿主细胞包含核酸(例如，可以包含和/或通过载体递送至宿主细胞的异源核酸)。优选地，宿主细胞(和/或异源核酸序列)被排列并构建使得LTBR激动剂从宿主细胞中分泌并从细胞培养物上清液中分离。

组合

如上所述，当使用本发明组合中所定义的Treg清除剂和LTBR激动剂时，发明人意外地观察到了协同效应。因此，本发明的一个目的是包含Treg清除剂和LTBR激动剂的组合。从本文的公开内容可以理解，本文所述的特定Treg清除剂和特定LTBR激动剂的组合是本发明的目的。此外，作为优选实施方案提及的Treg清除剂与作为优选实施方案提及的LTBR激动剂的组合构成关于所述组合、包含所述组合的组合物以及涉及此类组合的疗法的优选实施方案。

在优选的实施方案中，Treg清除剂结合Treg细胞的细胞表面标志物并具有细胞毒活性。

在另外的优选的实施方案中，Treg细胞的细胞表面标志物选自CCR8、CCR4、CTLA4、CD25、TIGIT、OX40、ICOS、CD38、GITR、4-1BB、NRP1和LAG-3。在具体的实施方案中，Treg的细胞表面标志物选自CCR8、CCR4、CD25、TIGIT和ICOS；优选CCR8、CD25和CCR4。

在更优选的实施方案中，Treg细胞的细胞表面标志物是CCR8。因此，在此类优选的实施方案中，Treg清除剂是CCR8结合剂。

还在另外的优选的实施方案中，Treg清除剂(特别是CCR8结合剂)的细胞毒活性归因于细胞毒性部分的存在，所述细胞毒性部分：诱导抗体依赖性细胞毒性(ADCC)、诱导补体依赖性细胞毒性(CDC)、诱导抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)、结合并激活T细胞或包含细胞毒性有效负载。

优选地，细胞毒性部分包含可结晶片段(Fc)区部分。

有利地，Fc区部分经工程化例如通过无岩藻糖基化或通过包含ADCC、CDC和/或ADCP增加突变以增加ADCC、CDC和/或ADCP活性例如。

还在另外的优选的实施方案中，Treg清除剂(特别是CCR8结合剂)包含至少一个结合Treg的细胞表面标志物(特别是CCR8)的单域抗体部分。

在具体的实施方案中，本发明的组合包含标志物结合抗体(在本文中也称为“Treg清除抗体”)，特别是具有ADCC、CDC和/或ADCP活性的CCR8结合抗体，以及LTBR激动性抗体。因此，在具体的实施方案中，Treg清除剂和LTBR激动剂都是抗体，特别是不同的抗体。在一个优选的实施方案中，Treg清除剂是结合CCR8、CCR4、CTLA4、CD25、TIGIT、OX40、ICOS、CD38、GITR、4-1BB、NRP1和LAG-3的抗体，LTBR激动剂是LTBR结合激动性抗体。在另外的具体的实施方案中，Treg清除剂是CCR8结合抗体，LTBR激动剂是LTBR结合激动性抗体。

在另外的实施方案中，本发明的组合还包含一种或多种其药学上可接受的载体或赋形剂。在一个实施方案中，所述一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂可以与Treg清除剂一起存在，特别是与CCR8结合剂和/或LTBR激动剂一起存在。因此，本发明的组合可以包含第一组合物，该第一组合物包含Treg清除剂(特别是CCR8结合剂)及其所述一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂和LTBR激动剂；或包含Treg清除剂(特别是CCR8结合剂)、以及包含LTBR激动剂及其所述一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂的第二组合物；或包含所述第一组合物和第二组合物(即，Treg清除剂(特别是CCR8结合剂))及其所述一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂，以及LTBR激动剂及其所述一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂。

本文所用的组合是指两种特征(Treg清除和LTBR激动)的组合。这些特征可以存在于单个分子中，例如包含Treg结合部分和LTBR激动部分的分子。尽管双特异性抗体是实施本发明的一种可能性，如下文所述，但在具体和优选的实施方案中，用于本发明的Treg清除剂和LTBR激动剂是不同的分子。在更具体的实施方案中，Treg清除剂是抗体，如本文所述的细胞毒性CCR8结合抗体、LTBR激动剂是不同的分子，优选LTBR激动性抗体。在其他优选的实施方案中，LTBR激动剂不包含本文定义的细胞毒性部分。

组合物

本发明的另一个目的是包含本发明的组合的组合物。因此，本发明的组合物包含与Treg(特别是CCR8)的细胞表面标志物结合并具有细胞毒活性的Treg清除剂(特别是CCR8结合剂)和LTBR激动剂。

在优选的实施方案中，本发明的组合物包含标志物结合抗体(在本文中也称为“Treg清除抗体”)，特别是具有ADCC、CDC和/或ADCP活性的CCR8结合抗体，以及LTBR激动性抗体。

在另外的优选的实施方案中，本发明的组合物还包含一种或多种其药学上可接受的载体或赋形剂。

双特异性分子

本发明的另一方面是双特异性分子，其包含Treg清除部分(特别是CCR8结合部分)和LTBR激动部分，其中所述双特异性分子具有细胞毒活性。

如本文所用，“双特异性”是指具有结合两种不同抗原或多肽上的两种不同表位的能力的分子，其中一种是LTBR抗原或多肽。

在优选的实施方案中，双特异性分子的细胞毒活性归因于Treg清除剂部分(特别是CCR8结合部分)，其诱导抗体依赖性细胞的细胞毒作用(ADCC)、诱导补体依赖性细胞毒作用(CDC)、诱导抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)、结合并激活T细胞，或包含细胞毒性有效负载。

在具体的实施方案中，Treg清除剂部分(特别是CCR8结合部分)是蛋白质，更特别是Treg清除多肽(即，标志物结合多肽)，特别是CCR8结合多肽。在其他实施方案中，Treg清除剂部分(特别是CCR8结合部分)是基于抗体的或基于非抗体的，优选基于抗体的。在优选的实施方案中，Treg清除剂部分(特别是CCR8结合部分)是抗体或活性抗体片段。

在另外的实施方案中，Treg清除剂部分(特别是CCR8结合部分)包含至少一个单域抗体部分。优选地，Treg清除剂部分(特别是CCR8结合部分)包含至少两个单域抗体部分。

在其他实施方案中，细胞毒性部分包含与CD3结合的抗体或其抗原结合片段。因此，Treg清除剂部分(特别是CCR8结合部分)可以结合Treg的细胞表面标志物，特别是CCR8和CD3。此类Treg清除剂结合肿瘤内Treg并将T细胞的细胞毒活性引导至这些Treg，从而将它们从肿瘤环境中清除。在具体的实施方案中，本发明的Treg清除剂包含结合Treg的细胞表面标志物(特别是CCR8)的部分以及结合CD3的部分，其中至少一个部分是基于抗体的，特别是其中两个部分都是基于抗体的。因此，在具体的实施方案中，本发明提供了双特异性构建体，其包含特异性结合Treg的细胞表面标志物(特别是CCR8)的抗体或其抗原结合片段，以及特异性结合CD3的抗体或其抗原结合片段。

在一个实施方案中，细胞毒性部分包含可结晶片段(Fc)区部分。在本发明的上下文中，术语“可结晶片段(Fc)区部分”是指由重链恒定区组成的免疫球蛋白分子的可结晶片段，其负责与抗体Fc受体和补体系统的一些其他蛋白质结合，从而诱导ADCC、CDC和/或ADCP活性。

在本发明的其他实施方案中，Treg清除剂部分(特别是CCR8结合部分)包含至少一个Fc区部分和至少两个结合Treg的细胞表面标志物(特别是CCR8)的单域抗体部分。优选地，Treg清除剂部分(特别是CCR8结合部分)是基因工程化的多肽，其包含至少一个Fc区部分和至少两个通过肽接头连接在一起的结合Treg的细胞表面标志物(特别是CCR8)的单域抗体部分。Fc区部分和/或单域抗体部分区域的氨基酸序列可以被人源化以降低对人的免疫原性。

在一个实施方案中，Fc区部分已被工程化以增加ADCC、CDC和/或ADCP活性。

在本发明的具体实施方案中，优化包含Fc区部分的Treg清除剂部分(特别是CCR8结合部分)以引发ADCC应答，即相对于包含Fc区部分的其他抗体，特别是其他CCR8结合剂，包括不抑制配体(特别是CCL1)与其Treg的细胞表面标志物(特别是CCR8)结合的那些，ADCC应答得到增强、增加或改善。

在优选的实施方案中，Treg清除剂(特别是CCR8结合剂)已被工程化以引发增强的ADCC应答。

在本发明的优选实施方案中，优化包含Fc区部分的Treg清除剂(特别是CCR8结合剂)以引发ADCP应答，即相对于包含Fc区部分的其他抗体，特别是其他CCR8结合剂，包括不抑制配体(特别是CCL1)与其受体(细胞表面标志物)(特别是CCR8)结合的那些，ADCP应答得到增强、增加或改善。

在另外的实施方案中，细胞毒性部分包含与Fcγ受体结合的部分。更特别地，结合并激活FcγR，特别是激活受体，例如FcγRI和/或FcγRIIa和/或FcγRIIIa，特别是FcγRIIIa。与FcγR结合的部分可以是基于抗体的或基于非抗体的，如上文所述。如果基于抗体，该部分可通过其可变区结合FcγR。

如本文所讨论的本发明的双特异性分子可以经由以下方法产生：生物方法，例如体细胞杂交；或基因方法，例如在细胞系或生物体中表达编码所需结合结构的非天然DNA序列；化学方法(例如，通过化学偶联、基因融合、非共价或以其他方式结合至一个或多个分子实体(例如，其片段的另一种结合剂))；或其组合。

允许产生双特异性Treg清除剂的技术和产品是本领域已知的，如在文献中广泛综述的，还关于替代形式、Treg清除剂-药物缀合物、Treg清除剂设计方法、体外筛选方法、恒定区、翻译后和化学修饰、触发癌细胞死亡的改善特征(例如，Fc结构域工程化)(TillerK和Tessier P,Annu Rev Biomed Eng.17:191-216(2015)；Speiss C等人,MolecularImmunology 67:95-106(2015)；Weiner G,Nat Rev Cancer,15:361-370(2015)；Fan G等人,J Hematol Oncol 8:130(2015))。

在其他实施方案中，本发明提供了一种编码本文定义的双特异性分子的核酸分子。在一些实施方案中，此类提供的核酸分子可以含有密码子优化的核酸序列。在另外的实施方案中，核酸包括在合适的核酸载体内的表达盒中，用于在宿主细胞(例如，例如细菌、酵母、昆虫、鱼、鼠、猿或人细胞)中表达。在一些实施方案中，本发明提供了包含表达所需结合剂的异源核酸分子(例如，DNA载体)的宿主细胞。

在具体的实施方案中，本发明的双特异性分子作为治疗性核酸施用。本文所用的术语“治疗性核酸”是指当引入真核生物(例如，哺乳动物如人)时具有治疗效果的任何核酸分子，并且包括编码本发明的结合剂的DNA和RNA分子。如本领域技术人员已知的，核酸可以包含诱导核酸的转录和/或翻译或增加核酸的体外和/或体内稳定性的元件。

治疗

本发明的另一个目的是具有本文所述特征的组合、包含此类组合的组合物、具有本文所述特征的双特异性分子、以及编码此类双特异性分子的核酸，其用作药物。

本发明的另一个目的是具有本文所述特征的组合、包含此类组合的组合物、具有本文所述特征的双特异性分子、以及编码此类双特异性分子的核酸，其用于治疗癌症。

本发明的另一个目的是具有本文所述特征的Treg清除剂(特别是CCR8结合剂)，其用于治疗癌症，其中该治疗还包含施用具有本文所述特征的LTBR激动剂。

优选地，Treg清除剂(特别是CCR8结合剂)是Treg清除抗体，特别是CCR8结合抗体，其结合Treg的细胞表面标志物，特别是CCR8，并且具有ADCC、CDC和/或ADCP活性；并且LTBR激动剂是LTBR激动性抗体。

本发明的另一个目的是具有本文所述特征的LTBR激动剂，其用于治疗癌症，其中治疗还包含施用具有本文所述特征的Treg清除剂，特别是CCR8结合剂。

在其他的实施方案中，本发明提供了治疗个体中的疾病的方法，包括施用本发明的组合、包含此类组合的组合物、本发明的双特异性分子、以及编码此类双特异性分子的核酸。优选地，疾病是癌症，特别是实体瘤的治疗。

在其他的实施方案中，本发明提供了用于治疗个体中的疾病的方法，该方法包含以下步骤：

-施用如本文所定义的Treg清除剂；以及

-施用如本文所定义的LTBR激动剂，

其中两种施用分开、同时或按顺序进行。

在另外的具体的实施方案中，本发明提供了通过Treg清除疗法治疗个体中的疾病的方法，该方法包含向所述个体施用LTRB激动剂。

优选地，疾病是癌症，特别是实体瘤的治疗。

在本发明的优选实施方案中，如本文所述的本发明的方面的个体是哺乳动物，优选猫、狗、马、驴、绵羊、猪、山羊、牛、仓鼠、小鼠、大鼠、兔或豚鼠，但最优选个体是人。因此，在本文所述的本发明的所有方面中，个体优选是人。

如本文所用，术语“癌症”、“癌性的”或“恶性的”是指或描述哺乳动物的通常表征为不受调节的细胞生长的生理状况。

如本文所用，术语“肿瘤”当应用于诊断患有或疑似患有癌症的个体时，是指任何大小的恶性或潜在恶性肿瘤或组织块，并且包括原发性肿瘤和继发性肿瘤。术语“癌症”、“恶性肿瘤”、“赘生物”、“肿瘤”和“癌瘤”在本文中也可互换使用，是指表现出异常生长表型的肿瘤和肿瘤细胞，该异常生长表型表征为细胞增殖控制的显著丧失。通常，用于治疗的目的细胞包括癌前(例如，良性)、恶性、转移前、转移和非转移细胞。本发明的教导可以与任何肿瘤及所有肿瘤相关。

肿瘤的实例包括但不限于癌瘤、淋巴瘤、白血病、胚细胞瘤和肉瘤。此类癌症的更具体实例包括鳞状细胞癌、骨髓瘤、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、神经胶质瘤、肝细胞癌(HCC)、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、急性骨髓性白血病(AML)、多发性骨髓瘤、胃肠(道)癌、肾癌、卵巢癌、肝癌、成淋巴细胞性白血病、淋巴细胞性白血病、结直肠癌、子宫内膜癌、肾癌、前列腺癌、甲状腺癌、黑色素瘤、软骨肉瘤、成神经细胞瘤、胰腺癌、多形性成胶质细胞瘤、宫颈癌、脑癌、胃癌、膀胱癌、肝细胞瘤、乳腺癌、结肠癌和头颈癌。

在一个方面，肿瘤涉及实体瘤。实体瘤的实例是肉瘤(包括由组织(例如，松质骨、软骨、脂肪、肌肉、血管、造血或纤维结缔组织)中的间充质来源的转化细胞产生的癌症)、癌瘤(包括由上皮细胞产生的肿瘤)、间皮瘤、成神经细胞瘤、成视网膜细胞瘤等。涉及实体瘤的肿瘤包括但不限于脑癌、肺癌、胃癌、十二指肠癌、食道癌、乳腺癌、结直肠癌、肾癌、膀胱癌、肾癌、胰腺癌、前列腺癌、卵巢癌、黑色素瘤、口腔癌、肉瘤、眼癌、甲状腺癌、尿道癌、阴道癌、颈癌、淋巴瘤等。

在另外的具体的实施方案中，肿瘤选自乳腺浸润性癌、结肠腺癌、头颈部鳞状细胞癌、胃腺癌、肺腺癌(NSCLC)、肺鳞状细胞癌(NSCLC)、肾透明细胞癌、皮肤黑色素瘤、食管癌、宫颈癌、肝细胞癌、默克尔细胞癌(Merkel cell carcinoma)、小细胞肺癌(SCLC)、经典霍奇金淋巴瘤(cHL)、尿道上皮癌、微卫星高度不稳定性(MSI-H)癌和错配修复缺陷型(dMMR)癌。

在其他实施方案中，肿瘤选自乳腺癌、子宫体癌、肺癌、胃癌、头颈部鳞状细胞癌、皮肤癌、结直肠癌和肾癌。在又一个实施方案中，肿瘤选自乳腺浸润性癌、结肠腺癌、头颈部鳞状细胞癌、胃腺癌、肺腺癌(NSCLC)、肺鳞状细胞癌(NSCLC)、肾透明细胞癌和皮肤黑色素瘤。在一个方面，癌症涉及表达CCR8的肿瘤，包括但不限于乳腺癌、子宫体癌、肺癌、胃癌、头颈部鳞状细胞癌、皮肤癌、结直肠癌和肾癌。在一个具体实施方案中，肿瘤选自乳腺癌、结肠腺癌和肺癌。

如本文所用，术语“施用”是指向生理系统(例如，个体或体内、体外或离体细胞、组织和器官)给予药物、前药、抗体或其他药剂或治疗性处理的行为。施用于人体的示例性途径可以是通过口(口服)、皮肤(透皮)、口腔粘膜(含服)、耳部、通过注射(例如，静脉内、皮下、瘤内、腹膜内等)等。术语本发明的Treg清除剂或LTBR激动剂的施用包括Treg清除剂或LTBR激动剂的直接施用以及通过施用编码Treg清除剂或LTBR激动剂的核酸的间接施用，使得Treg清除剂或LTBR激动剂由个体中的核酸产生。因此，施用Treg清除剂或LTBR激动剂包括导致体内产生Treg清除剂或LTBR激动剂的DNA和RNA治疗方法。

本文所用的“治疗(以及其各种词性)”肿瘤定义为实现至少一种治疗效果，例如肿瘤细胞数目减少、肿瘤大小减小、癌细胞浸润入周围器官的速率减小、或者肿瘤转移或肿瘤生长的速率减小。如本文所用，术语“调节”是指化合物影响(例如，促进或治疗)细胞功能的方面的活性，包括但不限于细胞生长、增殖、侵袭、血管生成、凋亡等。

可以通过多种方式测量癌症中的积极治疗效果(例如，Weber(2009)J Nucl Med50,1S-10S)。举例来说，相对于肿瘤生长抑制，根据国家癌症研究所(NCI)标准，T/C≤42％是抗肿瘤活性最低水平。T/C<10％被认为是高抗肿瘤活性水平，其中T/C(％)＝治疗的肿瘤体积中位数/对照的肿瘤体积中位数×100。在一些实施方案中，通过治疗有效量实现的治疗是无进展生存期(PFS)、无疾病生存期(DFS)或总生存期(OS)中的任一种。PFS也称为“肿瘤进展时间(Time to Tumour Progression)”，表示在治疗期间和治疗之后癌症不生长的时间长度，并且包括患者经历完全应答或部分应答的时间量，以及患者经历稳定疾病的时间量。DFS是指治疗期间和治疗之后患者保持无疾病的时间长度。OS是指与未处理的(naive)或未治疗的(untreated)个体或患者相比预期寿命的延长。

本文所用的“预防(prevention或prophylaxis)”是指延迟或预防癌症症状的发作。预防可以是绝对的(使得没有疾病发生)或可以仅在一些个体中或在有限的时间内有效。

在本发明的一个优选方面，个体患有已确立的肿瘤，即，个体已经患有例如被分类为实体肿瘤的肿瘤。因此，当个体已经患有肿瘤(例如，实体瘤)时，可以使用本文所述的本发明。因此，本发明提供了一种可用于治疗现有肿瘤的治疗选择。在本发明的一个方面，个体患有现有的实体瘤。本发明可以用于预防或优选治疗患有实体瘤的个体。在一个方面，本发明不用于预防或防止。

在一个方面，例如与其他癌症治疗(例如，用于给定癌症的护理标准治疗)相比，使用本文所述的本发明可增强肿瘤消退、可减弱或减少肿瘤生长、和/或可增加存活时间。

在本发明的一个方面，本文所述的治疗或预防肿瘤的方法还包含鉴定患有肿瘤的个体、优选鉴定患有实体瘤的个体的步骤。

有效治疗患有肿瘤的患者的本文所述疗法的剂量方案可根据例如患者的疾病状态、年龄和体重以及疗法在个体中引发抗癌应答的能力等因素而变化。适当剂量的选择将处于本领域技术人员的能力范围内。例如0.01、0.1、0.3、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40或50mg/kg。在一些实施方案中，此类数量是适合于根据给药方案施用的单位剂量(或其整个部分)，该给药方案已被确定为当施用于相关群体时与期望的或有益的结果相关(即，使用治疗性给药方案)。

如本文所述的根据本发明的任何方面的组合、组合物和双特异性分子可以是药物组合物的形式，其另外包含药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。如本文所用，术语“药学上可接受的载体”或“药学上可接受的赋形剂”包括当与活性成分组合时允许该成分保持生物活性的任何材料。药学上可接受的载体增强或稳定组合物或可用于促进组合物的制备。药学上可接受的载体包括溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等，它们是生理学上相容的，如本领域技术人员已知的(参见，例如，Remington'spharmaceutical sciences,第18版,Mack印刷公司,1990,第1289-1329页；Remington:TheScience andPractice of Pharmacy,第21版,英国医药出版社2011；及其后续版本)。所述药学上可接受的载体的非限制性实例包含任何标准药物载体，例如，磷酸盐缓冲盐水溶液、水、乳液如油/水乳液，以及各种类型的润湿剂。

这些组合物包括例如液体、半固体和固体剂型，例如液体溶液(例如，可注射和可输注溶液)、分散体或悬浮液、片剂、丸剂或脂质体。在一些实施方案中，优选的形式可取决于预期的施用模式和/或治疗应用。含有组合、组合物或双特异性分子的药物组合物可以通过本领域已知的任何合适的方法施用，包括但不限于口服、粘膜、吸入、局部、口腔、鼻、直肠或肠胃外(例如，静脉内、输注、瘤内、结节内、皮下、腹膜内、肌内、皮内、经皮或其他类型的施用，涉及个体组织的物理破坏以及通过组织中的破坏而施用药物组合物)。此类制剂可以是例如适于皮内、瘤内或皮下施用或静脉内输注的可注射或可输注溶液的形式。在具体的实施方案中，结合剂或核酸经静脉内施用。施用可以包括间歇给药。可替代地，施用可包括在至少选定的时间段内、与其他化合物同时或在其他化合物施用之间连续给药(例如，灌注)。

本发明的制剂通常包含治疗有效量的如本发明的组合中所定义的Treg清除剂，特别是CCR8结合剂和LTBR激动剂。“治疗水平”、“治疗有效量”或“治疗量”是指适于安全治疗病症以减少或预防病症症状的活性剂的施用量或浓度。

在一些实施方案中，如在本发明的组合中定义的Treg清除剂，特别是CCR8结合剂和LTBR激动剂，可以与保护其免于快速释放和/或降解的载体(例如，控释制剂如植入物、透皮贴剂和微囊化递送系统)一起制备。可以使用生物可降解的、生物相容的聚合物。

本领域技术人员将理解，例如，递送途径(例如，口服、静脉内、皮下、瘤内等)可影响剂量和/或所需剂量可影响递送途径。例如，当关注特定位点或位置(例如，肿瘤内)内的特别高的药剂浓度时，聚焦递送(例如，在该实例中，瘤内递送)可能是期望的和/或有用的。当针对给定治疗方案优化途径和/或给药方案时，要考虑的其他因素可包括例如所治疗的特定癌症(例如，类型、阶段、位置等)、个体的临床状况(例如，年龄、整体健康状况等)、存在或不存在组合疗法、以及执业医师已知的其他因素。在具体的实施方案中，静脉内施用Treg清除剂。在另外的具体的实施方案中，静脉内施用LTBR激动剂。在其他的具体的实施方案中，静脉内施用Treg清除剂和LTBR激动剂。

药物组合物通常应该是无菌的并且在制造和储存条件下是稳定的。组合物可以配制成溶液、微乳液、分散体、脂质体或其他适于高药物浓度的有序结构。可通过将所需量的结合剂与上文列举的成分中的一种或组合(视需要)一起掺入适当溶剂中，接着过滤灭菌，来制备无菌可注射溶液。用于肠胃外施用的制剂包括但不限于悬浮液、溶液、在油性或水性媒介物中的乳液、糊剂、以及如本文所讨论的可植入的持续释放或可生物降解的制剂。可使用无毒的肠胃外可接受的稀释剂或溶剂来制备无菌可注射制剂。根据本发明使用的每种药物组合物可以包括药学上可接受的分散剂、润湿剂、助悬剂、等渗剂、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、载体、赋形剂、盐或稳定剂，其在使用的剂量和浓度下对个体无毒。优选地，此类组合物还可以包含用于治疗癌症的药学上可接受的载体或赋形剂，其与给定的方法和/或施用部位相容，例如用于肠胃外(例如，皮下、皮内或静脉内注射)、瘤内或瘤周施用。

虽然根据本发明用于用途的治疗方法或组合物的实施方案不一定能有效地在每个个体中实现积极的治疗效果，但是它应该在使用药物组合物和给药方案中实现，其符合良好的医学实践并且具有通过本领域已知的任何统计学检验如Student t检验、X²检验、根据Mann和Whitney的U检验、Kruskal-Wallis检验(H检验)、Jonckheere-Terpstra检验和Wilcoxon检验确定的统计学显著的个体数量。

当在上文和随后提及肿瘤、肿瘤疾病、癌瘤或癌症时，无论肿瘤和/或转移的位置如何，也可替代地或附加地暗示位于原始器官或组织和/或任何其他位置中的转移。

在一些实施方案中，可以通过相同或不同的递送途径和/或根据不同的时间表将不同的抗癌药剂与本发明的组合、组合物或双特异性分子组合施用。可替代地或附加地，在一些实施方案中，第一活性剂的一个或多个剂量与一种或多种其他活性剂基本上同时施用，并且在一些实施方案中经由共同途径和/或作为与一种或多种其他活性剂的单一组合物的一部分施用。本领域技术人员还将理解，根据本发明提供的组合疗法的一些实施方案实现协同作用；在一些此类实施方案中，当在不同的治疗方案(例如，作为单一疗法和/或作为不同组合疗法的一部分)中使用药剂时，组合中使用的一种或多种药剂的剂量可以与标准的、优选的或必要的剂量实质上不同(例如，更低)和/或可以通过替代途径递送。

在一些实施方案中，当根据本发明使用两种或更多种活性剂时，此类活性剂可以同时或按顺序施用。在一些实施方案中，一种药剂的施用相对于另一种药剂的施用是特定定时的。例如，在一些实施方案中，施用第一药剂使得观察到特定作用(或预期观察到，例如基于显示给定给药方案与关注的特定作用之间的相关性的群体研究)。在一些实施方案中，组合施用的药剂的期望的相对给药方案可凭经验评估或确定，例如使用离体、体内和/或体外模型；在一些实施方案中，在体内、在患者群体中(例如，以便建立相关性)、或可替代地在关注的特定患者中进行的此类评估或经验确定。

“组合”施用另一疗法或包含施用另一疗法的治疗可以指在施用根据本发明的任何方面之前、同时或之后施用另外的疗法。因此，组合治疗可以同时、分开或按顺序施用。

在另外的实施方案中，本发明提供了包含上述组合、组合物和/或双特异性分子的试剂盒。在一些实施方案中，试剂盒还含有其药学上可接受的载体或赋形剂。在其他相关实施方案中，试剂盒中上述组合的任何组分以单位剂量存在，特别是如本文所述的剂量。还在其他实施方案中，试剂盒包括用于向个体施用任何组分或上述组合的说明书。在一个具体实施方案中，试剂盒包含如本文所述的Treg清除剂(特别是CCR8结合剂)和LTBR激动剂。Treg清除剂(特别是CCR8结合剂)和LTBR激动剂可存在于相同或不同的组合物中。

在一个具体实施方案中，本发明提供了包含如本文所述的组合、组合物和/或双特异性分子的包装，其中该包装还包含说明书，该说明书具有将该结合剂施用于同时接受免疫检查点抑制剂治疗的肿瘤患者的说明。

还在另外的具体的实施方案中，本发明提供了LTBR激动剂在制备用于治疗本文所述疾病的药物中的用途，其中该治疗还包含施用本文所述的Treg清除剂。在另外的具体的实施方案中，本发明提供了本文所述的Treg清除剂在制备用于治疗本文所述疾病的药物中的用途，其中该治疗还包含施用LTBR激动剂。在另外的其他实施方案中，本发明提供了本文所述的LTRB激动剂和Treg清除剂在制备用于治疗本文所述疾病的药物中的用途。本发明还提供如本文所述的药物组合物，其用于治疗如本文所述的疾病，特别是癌症。

现在将参照附图通过以下实施例进一步描述本发明，这些实施例旨在帮助本领域普通技术人员实施本发明，而不是以任何方式限制本发明的范围。

实施例

提供以下实施例以证明和进一步说明本发明的某些优选实施方案和方面，并且不解释为限制其范围。

实施例1：LTBR报告基因测定

稳定的LTBR报告基因细胞系的产生

产生携带小鼠-人嵌合体LTBR编码序列的转基因构建体，其中小鼠直系同源基因的胞内部分被人对应物替代以确保在人细胞系背景中的功能信号传导。在37℃、5％CO₂的条件下，在补充有10％热灭活胎牛血清(FBS)和100U/mL青霉素和链霉素(Gibco)的Dulbecco的改良型Eagle培养基(DMEM，Gibco)中培养人NFκB荧光素酶报告基因HEK293稳定细胞系(Signosis，货号#SL-0012)。转染前，将细胞以7.5×10⁵个细胞/孔的密度接种于6孔板(Greiner)中并培养过夜。当达到大约40％汇合时，使用FUGENE HD转染试剂(Promega)，用携带小鼠-人嵌合体LTBR转基因的线性化pcDNA3.1转染细胞。6小时后，小心地取出细胞上清液并用新鲜的完全DMEM替换。48小时后，将培养基替换为包含500μg/mL G-418(Thermofisher Scientific)以选择携带表达盒的遗传霉素抗性转染子。每2-3天更换培养基，3周后，从每孔10³个细胞开始制备限制性1:2稀释液以获得单克隆系。使用藻红蛋白标记的小鼠抗小鼠LTBR mAb 5G11(Abcam，货号#ab65089)在流式细胞仪(Attune NxT，Thermofisher Scientific)中获取10⁴个细胞，从而鉴定出表达LTBR的单克隆系。

报告基因测定

将细胞以6.0×10⁴个细胞/孔的密度接种于聚-D-赖氨酸(PDL)包被的96孔板(Greiner)中，并在37℃、5％CO₂的条件下，在补充有10％热灭活胎牛血清(FBS)和100U/mL青霉素和链霉素(Gibco)的Dulbecco的改良型Eagle培养基(DMEM，Gibco)中培养过夜。将化合物(VHH和mAb)在不同浓度下孵育6小时以评价它们对LTBR的激动活性以诱导NFκB转录。在EnSightTM多模式酶标仪(PerkinElmer)上，根据制造商的说明书使用Steadylite plus报告基因测定系统(PerkinElmer，货号#6066756)测量荧光素酶的活性。通过滴定激动性抗小鼠LTBR mAb 5G11(Abcam，货号#ab65089)对稳定的报告细胞系进行最终QC，其以剂量依赖性方式激活报告基因。

实施例2：小鼠CCR8 VHH的产生

CCR8 DNA免疫

用CCR8 DNA对美洲驼和羊驼的免疫基本上如Pardon E.等人(A generalprotocol for the generation of Nanobodies for structural biology,NatureProtocols,2014,9(3),674-693)以及Henry K.A.和MacKenzie C.R.编著(Single-DomainAntibodies:Biology,Engineering and Emerging Applications.Lausanne:FrontiersMedia)中所公开的进行。简言之，以两周的间隔用插入到表达载体pVAX1(ThermoFisherScientific公司，V26020)中的2mg编码小鼠CCR8的DNA免疫动物四次，然后采集血样。三个月后，所有动物接受2mg相同DNA的单次施用，然后采集血样。

噬菌体展示文库制备

如Pardon E.等人(A general protocol for the generation of Nanobodiesfor structural biology,Nature Protocols,2014,9(3),674-693)以及Henry K.A.和MacKenzie C.R.编著(Single-Domain Antibodies:Biology,Engineering and EmergingApplications.Lausanne:Frontiers Media)中所述制备并使用来源于外周血单核细胞(PBMC)的噬菌体展示文库。将VHH片段插入到含有MYC和His6标签的M13噬菌粒载体中。通过感染指数生长的大肠杆菌TG1[(F’traD36 proAB laclqZΔM15)supE thi-1Δ(lac-proAB)Δ(mcrB-hsdSM)5(rK-mK-)]细胞，随后用VCSM13辅助噬菌体进行重复感染(surinfection)来保存文库。

噬菌体展示文库在用插入到pVAX1中的小鼠CCR8瞬时转染的HEK293T细胞上进行两轮连续选择，然后在用插入到pVAX1中的小鼠CCR8瞬时转染的CHO-K1细胞上进行两轮连续选择。用来自第二轮选择的洗脱噬菌体感染的大肠杆菌TG1细胞制备多克隆噬菌粒DNA。通过PCR从这些样品中扩增VHH片段，并亚克隆到大肠杆菌表达载体中，所述载体具有符合读框的N端PelB信号肽以及C端FLAG3和His6标签。用所得VHH表达质粒连接混合物转化电感受态大肠杆菌TG1细胞，并在96深孔板中培养单个菌落。单克隆VHH的表达基本上如PardonE.等人(A general protocol for the generation of Nanobodies for structuralbiology,Nature Protocols,2014,9(3),674-693)所述。通过将细菌沉淀冷冻过夜，然后再悬浮于PBS中并离心除去细胞碎片，来制备含有VHH的粗周质提取物。

CCR8选择输出的筛选

使用细胞解离的非酶溶液(Sigma Aldrich，C5914-100mL)回收表达CCR8的重组细胞，并在FACS缓冲液中重悬至1.0×10⁶个细胞/ml的终浓度。将含有VHH的粗周质提取物的稀释液(1:5的FACS缓冲液)与5μg/ml小鼠抗FLAG生物素化抗体(Sigma Aldrich，F9291-1MG)的FACS缓冲液孵育30分钟，并室温振荡。将细胞悬浮液分配到96孔v型底板中，并与VHH/抗体混合物一起在冰上振荡孵育1小时。用在FACS缓冲液中按1:400(0.18μg/ml)稀释的链霉亲和素R-PE(Invitrogen，SA10044)检测VHH与细胞的结合，在冰上振荡，避光孵育30分钟。通过2μg/ml的PE抗小鼠CCR8(Biolegend，150311)抗体证实mCCR8在瞬时转染的细胞系上的表面表达。

与模拟转染的对照细胞相比，通过流式细胞术筛选由小鼠CCR8免疫和选择活动产生的VHH克隆与预先用mCCR8或用N末端缺失小鼠CCR8(Δ16-3XHA)质粒DNA转染的HEK293细胞的结合。通过比较给定VHH克隆在三种细胞系中的结合(荧光强度中位数)信号，将所述克隆分类为N末端小鼠CCR8结合剂(即，结合mCCR8细胞，但不结合小鼠CCR8(δ16-3XHA)或对照细胞)或分类为细胞外环mCCR8结合剂(即，结合mCCR8细胞和小鼠CCR8(δ16-3XHA)，但不结合对照细胞)。

单价CCR8 VHH的纯化和评价

将编码CCR8结合VHH的合成DNA片段亚克隆到处于IPTG诱导型lac启动子控制下的大肠杆菌表达载体中，所述载体具有符合读框的用于周质区室靶向的N末端PelB信号肽以及C末端FLAG3和His6标签。转化电感受态大肠杆菌TG1细胞并对所得克隆进行测序。基本上如Pardon E.等人(A general protocol for the generation of Nanobodies forstructural biology,Nature Protocols,2014,9(3),674-693)所述，通过IMAC层析，随后脱盐，从这些克隆中纯化VHH蛋白。

与N末端缺失的mCCR8相比，选择由小鼠CCR8免疫接种活动获得的两种纯化的VHH(VHH-01和VHH-06，下文)，并通过流式细胞术评价它们与mCCR8的结合。图1中概述了该评估的结果。VHH-01结合全长和N末端缺失小鼠CCR8，而VHH-06仅结合全长小鼠CCR8。

单价CCR8 VHH的结合和功能表征

cAMP均相时间分辨荧光(HTRF)测定

在cAMP积累实验中评价了两种选择的单价VHH(VHH-01和VHH-06)在展示小鼠CCR8的CHO-K1细胞上功能性抑制小鼠CCL1信号传导的潜力。

在测试前，表达重组小鼠CCR8的CHO-K1细胞在不含抗生素的培养基中生长，通过用PBS-EDTA(5mM EDTA)冲洗而分离，通过离心回收并重悬于KHR缓冲液(5mM KCl，1.25mMMgSO₄，124mM NaCl，25mM HEPES，13.3mM葡萄糖，1.25mM KH₂PO₄，1.45mM CaCl₂，0.5g/lBSA，补充有1mM IBMX)中。将12微升细胞与6微升VHH(终浓度：1μM)一式三份混合并孵育30分钟。此后，加入6微升毛喉素和小鼠CCL1(R&D Systems，845-TC)的混合物，其终浓度对应于其EC80值。然后将板在室温孵育30分钟。加入裂解缓冲液并孵育1小时后，根据制造商的说明书用HTRF试剂盒(Cisbio，62AM9PE)测量荧光比。

1μM的VHH-01抑制CCL1对cAMP水平的作用，而VHH-06相对于对照(PBS)不改变cAMP水平。这些数据表明VHH-01是CCR8的阻断性结合剂，而VHH-06是非阻断性结合剂。

Ca²⁺释放测定

在Ca²⁺释放实验中进一步评价了VHH-01在展示mCCR8的CHO-K1细胞上功能性抑制小鼠CCL1信号传导的潜力。

使重组细胞(稳定表达小鼠CCR8的CHO-K1 mt-水母发光蛋白)在不含抗生素的培养基中生长18小时，并通过用PBSEDTA(5mM EDTA)冲洗而温和地分离，通过离心回收并重悬于测定缓冲液(具有HEPES+0.1％游离BSA蛋白酶的DMEM/HAM's F12)中。然后将细胞与腔肠素h(分子探针)在室温孵育至少4小时。在第一次注射100μl细胞和VHH的混合物(终浓度：1μM)后30分钟，以对应于其EC80值的最终浓度加入100μl小鼠CCL1(R&DSystems，845-TC)并注射到混合物中。使用功能性药物筛选系统6000(Functional Drug Screening System6000)(FDSS 6000，Hamamatsu)记录所得光谱发射。

VHH-01确实对94％的Ca²⁺释放产生了强烈抑制，证实了VHH-01是CCR8的阻断结合剂。

实施例3.CCR8 VHH-Fc融合体的产生

CCR8 VHH-Fc融合体的合成和纯化

通过将抗CCR8 VHH与小鼠IgG2a Fc结构域组合产生VHH-Fc-14，由柔性GlySer接头(10GS)隔开。除了两个VHH-06结合剂之外，VHH-Fc-14还含有两个VHH-01结合剂。将构建体克隆到pcDNA3.4哺乳动物表达载体中，所述载体具有符合读框的小鼠Ig重链V区102信号肽以将表达的重组蛋白引导至细胞外环境。通过Genscript(Genscript Biotech公司，荷兰莱顿市)进行DNA合成和克隆、细胞转染、Expi293F细胞中的蛋白生产和蛋白A纯化。

通过CCR8 VHH-Fc融合体证实CCR8结合

通过流式细胞术实验评价了多价VHH-Fc融合体VHH-Fc-14与BW5147细胞上内源性表达的小鼠CCR8结合的能力。将细胞与不同浓度的多价VHH-Fc融合体在4℃孵育30分钟，然后用FACS缓冲液洗涤两次，然后与AF488山羊抗小鼠IgG(Life Technologies，A11029)或AF488驴抗大鼠IgG(Life Technologies，A21208)在4℃孵育30分钟，然后进行两次洗涤步骤。使用TOPRO3(Thermo Fisher Scientific，T3605)对死细胞进行染色。VHH-Fc-14的结合的pEC50值为9.14±0.39M(n＝6)(平均值±标准偏差)。

通过CCR8 VHH-Fc融合体的功能性抑制

细胞凋亡测定

在细胞凋亡测定中检测VHH-Fc-14功能性抑制激动性配体CCL1的作用的能力。

地塞米松在内源性表达CCR8的小鼠淋巴瘤BW5147细胞中诱导细胞死亡。地塞米松诱导的细胞死亡可通过添加拮抗剂配体CCL1来逆转(vansnick等人,1996,Journal ofimmunology,157,2570-2576；Louahed等人,2003,European Journal of Immunology,33,494-501；Spinetti等人,2003,Journal of Leukocyte Biology,73,201-207；Denis等人,2012,PLOS One,7,e34199)。将50μl细胞(以2.75×10⁴个细胞/ml接种在Iscove-Dulbecco培养基+10％FBS，50μM 2-ME，1.25mM l-谷氨酰胺中)与30μl系列稀释的VHH-Fc融合体一起在37℃孵育30分钟。接着，加入地塞米松(Sigma-Aldrich，D4902)和人CCL1(Biolegend，582706)的20μl混合物至终浓度各为10nM。在37℃孵育48小时后，根据制造商的说明书(Perkin Elmer,6016736)使用ATPlite一步法试剂盒定量细胞活力。该评估的结果如图2所示。

VHH-Fc融合体VHH-Fc-14在测定中产生了较强的功能抑制，pIC50值为9.29±0.22M(n＝9)(平均值±标准偏差)。

cAMP测定

如实施例2所述在cAMP测定中检测VHH-Fc-14。VHH-Fc-14在50nM和更高浓度下对cAMP信号产生了100％抑制，pIC50值为8.54M，再次证实其为阻断性CCR8结合剂。

实施例4.CCR8 VHH-Fc融合体影响肠道Treg水平

为了研究细胞毒性CCR8结合剂对瘤内和其他Treg水平的影响，修饰VHH-Fc-14以获得具有增加的和消除的ADCC活性的VHH-Fc融合体。通过VHH-Fc-14(VHH-Fc-43)的α-岩藻糖基化获得增加的ADCC活性。可替代地，通过插入LALAPG Fc突变(VHH-Fc-41)在VHH-Fc-14中消除ADCC活性(Lo等人,2017,Journal of Biological Chemistry,292,3900-3908)。将构建体克隆到具有符合读框的分泌信号肽的哺乳动物表达载体pQMCF载体中，并转染到CHOEBNALT851E9细胞中，然后进行表达、蛋白A和凝胶过滤层析(Icosagen Cell Factory，爱沙尼亚塔尔图)。从携带GlymaxX技术的CHOEBNALT85细胞系(ProBioGen公司，德国柏林)(Icosagen Cell Factory，爱沙尼亚塔尔图)中表达获得在Fc部分的CH2结构域中具有α-岩藻糖基化N-聚糖的形式。蛋白质采用0.22mm无菌过滤。通过测量280nm处的吸光度确定蛋白质浓度，并通过SDS-PAGE和尺寸排阻层析确定纯度。通过LAL试验(Charles-RiverEndochrome)评估内毒素水平。对照mIgG2a同型购自BioXCell。VHH-Fc-41(pEC50值为9.33M(n＝1))和VHH-Fc-43(pEC50值为9.23±0.17M(n＝2))与BW5147细胞上的CCR8结合程度相当。另外，VHH-Fc-41(pIC50值为9.51±0.02M(n＝2))和VHH-Fc-43(pIC50值为9.39±0.11M(n＝4))(平均值±标准偏差)均在BW147细胞凋亡测定中有效抑制CCL1的作用。所有值均表示为平均值±标准偏差。

为了测试这些具有及不具有ADCC活性的阻断CCR8 VHH-Fc融合体的影响，将3×10⁶个细胞LLC-OVA细胞(200μl)皮下注射到雌性C57BL/6小鼠中(6-12周)。在第4天，每周一次(即，第4、11天)用200μg抗CCR8 VHH-Fc(VHH-Fc-41或VHH-Fc-43)或小鼠IgG2a(对照)治疗小鼠(n_小鼠/组＝5)。

在第16天处死小鼠，从每只小鼠收集肿瘤、血液和肠。

通过将组织切成小块，然后用10U ml^-1胶原酶I、400U ml^-1胶原酶IV和30U ml^{- 1}DNaseI(Worthington)在37℃处理25分钟，来获得肿瘤单细胞悬浮液。随后将组织挤压并过滤(70μm)。用红细胞裂解缓冲液(155mM NH4Cl，10mM KHCO3，500mM EDTA)除去所得细胞悬浮液中的红细胞，然后用RPMI中和。通过在红细胞裂解缓冲液中反复孵育5分钟来清除血液中的红细胞，直到仅剩余白细胞。

如前所述制备肠单细胞悬浮液(C.C.Bain,A.McI.Mowat,CD200 receptor andmacrophage function inthe intestine,Immunobiology 217,643–651(2012))。红细胞裂解后，将获得的单细胞悬浮液再悬浮于FACS缓冲液(富含2％FCS和2mM EDTA的PBS)中并计数。染色前，将所有单细胞悬浮液与大鼠抗小鼠CD16/CD32(2.4G2；BD Biosciences)或抗人Fc阻断试剂(Miltenyi)预孵育15分钟。洗涤后，将样品用可固定的活性染料eFluor506(eBioscience)(1:200)在4℃避光染色30分钟。随后，将样品洗涤并在4℃避光染色30分钟。细胞因子/趋化因子和转录因子的细胞内染色分别根据制造商的方案(货号554715；BDBiosciences)和(货号00-5523；Invitrogen)进行。使用BD FACSCantoII(BDBiosciences)获取FACS数据并使用FlowJo(TreeStar公司)分析。

如图3所示，Treg在肿瘤中被VHH-Fc-43清除，VHH-Fc-43是具有ADCC活性的CCR8阻断Fc融合体，而对于缺乏ADCC活性的VHH-Fc-41未观察到肿瘤内Treg清除。任一构建体的循环Treg的清除均未观察到(图4)。

实施例5：LTBR激动性单域抗体部分的产生

免疫

通过用重组蛋白免疫美洲驼和羊驼产生VHH，基本上如其他地方所述(Pardon等人,2014)(Henry和MacKenzie,2018)。简而言之，用50μg的重组小鼠LTBR-小鼠IgG2A Fc嵌合体蛋白(R&D Systems，货号#1008-LR)以一周的间隔免疫动物六次，之后采集血样。

噬菌体展示文库制备

制备来源于外周血单核细胞(PBLC)的噬菌体展示文库并如其他地方所述使用(Pardon等人,2014；Henry和MacKenzie,2018)。将VHH片段插入到含有MYC和His6标签的M13噬菌粒载体中。通过感染指数生长的大肠杆菌TG1[(F’traD36 proAB laclqZΔM15)supEthi-1Δ(lac-proAB)Δ(mcrB-hsdSM)5(rK-mK-)]细胞，随后用VCSM13辅助噬菌体进行重复感染来保存文库。在存在50倍过量的总小鼠IgG以消除Fc结合的VHH的情况下，在小鼠LTBR-小鼠IgG2A Fc嵌合蛋白(R&D Systems，货号#1008-LR)上对小鼠LTBR免疫的噬菌体文库进行两轮连续选择。在96深孔板中培养来自大肠杆菌TG1细胞的单个菌落，这些细胞用不同选择轮次洗脱的噬菌体感染。单克隆VHH基本上如前述表达(Pardon等人,2014)。通过将细菌沉淀冷冻过夜，然后再悬浮于PBS中并离心除去细胞碎片，来制备含有VHH的粗周质提取物。

LTBR选择输出的筛选

与未包被的对照相比，通过对小鼠LTBR的结合ELISA，筛选来自免疫和选择活动的VHH克隆作为粗周质提取物。通过生物层干涉测量法(Biolayer interferometry)证实结合。

ELISA

将1μg/ml稀释于pH 7.4的PBS中的mLTBR-mFc(R&D Systems，货号#1008-LR)包被在96孔微量滴定板上，随后用溶于PBS中的4％脱脂奶粉(Marvel)封闭。接着，加入来自单克隆VHH克隆的粗周质提取物的1:5稀释液，随后用1:1000抗c-myc抗体9E10(Merck，货号#11667203001)和1:5000稀释的抗小鼠IgG-HRP(Jackson Immuno Research，货号#715-035-150)检测，两者均溶于1％脱脂奶粉的PBS溶液中。在两次施加之间，用补充有Tween 0.05％pH 7.4的PBS洗涤板。使用100μl HRP底物TMB(Thermo Fisher，货号#00-4201-56)进行反应。通过加入100μl 0.5M H₂SO₄(Fisher Scientific，货号#J/8430/15)终止反应并在酶标仪上读取OD₄₅₀。克隆P002MP07G04与mLTBR-mFc的OD₄₅₀结合信号为4.458，而与未包被对照为0.042。

生物层干涉测量法(BLI)

生物层干涉测量法(BLI)是一种用于测量生物分子相互作用的无标记技术，其分析从生物传感器尖端上的固定蛋白质层和内部参考层两个表面反射的白光的干涉图案。结合到生物传感器尖端的分子数量的任何变化都会导致可实时测量的干涉图案的偏移。固定在生物传感器尖端表面上的配体与溶液中的分析物之间的结合使生物传感器尖端处的光学厚度增加，这导致波长偏移，这是生物层厚度变化的直接量度。在Octet RED96e机器(ForteBio)上根据制造商的方法测定动力学结合参数解离速率(k_off)和解离常数(K_D)并使用DataAnalysis 9.0软件(ForteBio)进行分析。在抗鼠IgG Fc捕获物(ForteBio，货号#18-5088)尖端捕获的小鼠LTBR-Fc(R&D Systems，货号#1008-LR)浸入1/5稀释的克隆P002MP07G04的周质提取物中，得到k_off值为1.8×10^-02S^-1。

报告基因测定

克隆P002MP07G04以多聚体形式展示在单克隆噬菌体颗粒的顶部，并在报告基因测定中筛选以评价其与不相关对照相比的激动潜力。因此评价了两种不同形式的单克隆噬菌体：(i)VCSM13保存的噬菌体，每个噬菌体颗粒展示一定范围(1至5个)的VHH片段，以及(ii)超噬菌体保存的噬菌体(Progen，货号#PRHYPE-XS)，每个噬菌体颗粒展示5个VHH片段。克隆P002MP07G04因此产生与不相关对照相比分别为4.7和3.2的报告基因测定信号比，表明P002MP07G04的多价展示能够激活小鼠LTBR。

单价LTBRVHH的生产、纯化和体外表征

将编码VHH的合成DNA片段排序并亚克隆到处于IPTG诱导型lac启动子控制下的大肠杆菌表达载体中，所述载体具有符合读框的N末端PelB信号肽(其将重组蛋白引导至周质区室)以及C末端FLAG3和HIS6标签。转化电感受态大肠杆菌TG1细胞并对所得克隆进行序列验证。通过IMAC层析从这些克隆中纯化VHH蛋白，然后根据成熟的方法脱盐(Pardon等人，2014)。

通过BLI测定纯化的单价P002MP07G04与抗鼠IgG Fc捕获物(ForteBio，#18-5088)尖端上捕获的小鼠LTBR-Fc(R&D Systems，货号#1008-LR)的结合KD为55nM。

100nM纯化的单价P002MP07G04通过其C末端HIS6标签与抗His标签mAb(Genscript，货号#A00186-100)以2:1的摩尔比交联。这种P002MP07G04的二聚体展示在报告基因测定中赋予LTBR激动作用，其中NFκB信号与背景之比为6.8。相反，100nM的非交联的单价P002MP07G04在报告基因测定中没有活性。

多价LTBRVHH的生产、纯化和体外表征

基本上如前所述产生VHH-16，一种结合三个P002MP07G04构建模块和一个抗血清白蛋白构建模块SA26h5(WO/2019/016237)的四价VHH，由20GS柔性GlySer接头隔开(Maussang等人,2013；De Tavernier等人,2016)。克隆多价构建体并在处于AOX1甲醇诱导型启动子的控制下的巴斯德毕赤氏酵母表达载体中进行序列验证，所述载体具有符合读框的将表达的重组蛋白引导至细胞外环境的N末端酿酒酵母α匹配因子信号肽。在巴斯德毕赤氏酵母中的转化和表达以及通过蛋白A纯化进行的纯化基本上如前所述(Lin-Cereghino等人,2005；Schotte等人,2016)。当在报告基因测定中检测时，VHH-16激活的小鼠LTBR，平均(±标准偏差)pEC50值为9.35±0.03(n＝3)。

实施例6：Treg清除剂与LTBR激动剂组合对MC38同系小鼠模型中肿瘤生长的影响

使用小鼠MC38肿瘤模型来测试使用VHH-Fc-43的抗CCR8和使用VHH-16的LTBR激动剂的单一疗法和组合疗法的功效。

在第0天，将5×10⁵个MC38细胞(0.1ml细胞悬浮液)皮下注射到8周龄雌性C57BL/6J小鼠的右胁腹中。在第7天，动物的平均肿瘤大小约125mm³，并分成4组，每组10只。每两周给小鼠注射200μg小鼠IgG2a、200μg P00500043、40μg VHH-16或200μg VHH-FC-43+40μgVHH-16的组合，持续3周。在3周试验期间，每两周测量一次体重和肿瘤负荷。用卡尺在两个维度上测量肿瘤以监测生长，并且当小鼠的肿瘤超过2000mm³的伦理终点时处死小鼠。

由下式计算肿瘤大小，单位为mm³：

肿瘤体积＝(w²×l)×0.52

其中w＝肿瘤的宽度，l＝肿瘤的长度，单位为mm

从第0天至第25天开始，四个队列中的平均肿瘤大小描绘于图5中。尽管两种单一疗法与同型对照相比在第14-25天有效控制了肿瘤生长，但与两种单一疗法相比，在第14天开始和第25天进入终末期，抗CCR8和LTBR激动剂组合治疗在减轻肿瘤负荷方面还产生了协同作用。这也反映在卡普兰-迈耶存活曲线中，其显示尽管所有同型治疗的动物(10/10)在第25天达到2000mm³的伦理终点，但只有3/10VHH-FC-43和4/10VHH-16单一疗法治疗的动物达到终末期。此外，用VHH-FC-43+VHH-16组合疗法治疗的小鼠(0/10)没有达到终末期(图6)。具有比较各种治疗组的混合效应模型的双向ANOVA表明，从第14天至第21天(当9/10小鼠由于高肿瘤负荷而被处死时)，单一疗法和组合疗法与同型对照之间存在统计学显著差异，并且组合疗法在统计学上优于第14-25天的VHH-16和第14天的VHH-FC-43。使用存活数据进行对数秩检验，结果表明在所有治疗组和同型对照之间，以及VHH-16单一疗法对组合疗法之间的存活率均有所增加(p值＝0.0297)。与VHH-FC-43相比，组合疗法的存活率有增加的趋势(p值＝0.0676)。图7显示了所有队列的同型和治疗的肿瘤中发现的高内皮小静脉(HEV)数量的定量以及HEV数量/肿瘤面积。在用外周节点地址素(addressin)抗体AF488抗MECA79(M79)染色的肿瘤上进行免疫荧光染色。当鉴定出推定的HEV时，使用AF568抗CD31评估血管染色。如果存在HEV，在CD31阳性血管的腔侧存在不连续的MECA79信号，其连续染色。对来自每个肿瘤的两个切片进行人工计数，并对每种条件下3-4只治疗的小鼠取平均值，使用Zen Blue软件程序由DAPI阳性核的面积计算肿瘤面积。结果显示，与每种单一疗法相比，组合治疗的肿瘤中HEV的诱导增加，并且在组合治疗的动物中，HEV的定位从VHH-16单一疗法治疗的小鼠中的肿瘤外周转移到肿瘤内深处(数据未显示)。此外，在4/6组合治疗的肿瘤中发现了“成熟”出现的三级淋巴样结构(TLS)，其由围绕由大量B220阳性B细胞组成的有组织结构的许多MECA-79阳性HEV(箭头)组成(图8)。此外，在组合治疗的肿瘤内深处的一些HEV被许多单个B细胞围绕。总之，组合治疗的动物中肿瘤负荷减轻、存活率增加的趋势以及HEV和TLS诱导增加，显示LTBR激动和Treg清除治疗的协同活性。

实施例7：Treg清除抗CTLA4与LTBR激动剂组合对MC38同系小鼠模型中肿瘤生长的影响

使用小鼠MC38肿瘤模型来测试具有Treg清除活性的抗CTLA4和使用VHH-16的LTBR激动剂的单一疗法和组合疗法的功效。在这些实验中使用的抗CTLA4抗体基于先前描述的抗mCTLA49D9抗体，但是其中鼠IgG2b已经被鼠IgG2a恒定区取代。选择鼠IgG2a是因为它在小鼠中提供了更强的ADCC活性(Selby MJ.等人,2013.Anti-CTLA-4 antibodies of IgG2aisotype enhance antitumor activity through reduction of intratumoralregulatory T cells.Cancer Immunol Res.1(1):32-42)。

在第0天，将5×10⁵个MC38细胞(100μL)皮下注射到雌性C57BL/6J小鼠(7-9周)中。在第7天，动物的平均肿瘤大小达到约116mm³，并分成4组，每组10只，即小鼠IgG2a(对照)、抗CTLA4单一疗法、CHH-16单一疗法以及抗CTLA4+VHH-16的组合。从第7天开始，每两周向小鼠腹膜内注射200μg小鼠IgG2a(对照)和40μg VHH-16，持续3周。从第10天开始，用200μg抗CTLA4治疗，并且小鼠每周给药一次，持续3周。在3周试验期间，每两周测量一次体重和肿瘤负荷。用卡尺在两个维度上测量肿瘤以监测生长。

由以下计算肿瘤大小，单位为mm³：

肿瘤体积＝(w²×l)×0.52

其中w＝肿瘤的宽度，l＝肿瘤的长度，单位为mm

从第0天至第25天开始，四个队列中的肿瘤大小中位数(单位为mm³)描绘于图9中。从第18天开始，用抗CTLA4和VHH-16作为单一疗法治疗的队列显示出与同型对照相比较小的肿瘤大小。另外，抗CTLA4 Treg清除和LTBR激动剂治疗的组合在减轻肿瘤负荷方面产生协同作用，并且甚至导致该治疗组中的大多数小鼠肿瘤停滞或消退。

Claims (15)

1.一种组合，其包含：

-淋巴毒素β受体(LTBR)激动剂；以及

-调节性T细胞(Treg)清除剂。

2.根据权利要求1所述的组合，其中所述Treg清除剂结合Treg的细胞表面标志物并具有细胞毒活性。

3.根据权利要求2所述的组合，其中所述Treg的所述细胞表面标志物选自CCR8、CCR4、CTLA4、CD25、TIGIT、OX40、ICOS、CD38、GITR、4-1BB、NRP1和LAG-3。

4.根据权利要求2或3所述的组合，其中所述Treg的所述细胞表面标志物是CCR8或CTLA4。

5.根据权利要求2至4中任一项所述的组合，其中所述Treg清除剂的所述细胞毒活性归因于细胞毒性部分的存在，所述细胞毒性部分：

-诱导抗体依赖性细胞毒性(ADCC)，

-诱导补体依赖性细胞毒性(CDC)，

-诱导抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)，

-结合并激活细胞毒性T细胞或T辅助细胞，或

-包含细胞毒性有效负载。

6.根据权利要求5所述的组合，其中所述细胞毒性部分包含可结晶片段(Fc)区部分，特别是经工程化以增加ADCC、CDC和/或ADCP活性的Fc区部分，例如通过无岩藻糖基化或通过包含ADCC、CDC和/或ADCP增加突变。

7.根据前述权利要求中任一项所述的组合，其中所述Treg清除剂是具有ADCC、CDC或ADCP活性的CCR8结合抗体。

8.一种组合物，其包含根据权利要求1至7中任一项所述的组合。

9.一种双特异性分子，其包含LTBR激动部分和Treg清除部分，其中所述双特异性分子具有细胞毒活性。

10.根据权利要求1至7中任一项所述的组合、根据权利要求8所述的组合物或根据权利要求9所述的双特异性分子，其用作药物。

11.根据权利要求1至7中任一项所述的组合、根据权利要求8所述的组合物或根据权利要求9所述的双特异性分子，其用于治疗癌症。

12.根据权利要求11所述用于用途的组合、组合物或双特异性分子，其中所述癌症选自乳腺癌、子宫体癌、肺癌、胃癌、头颈部鳞状细胞癌、皮肤癌、结直肠癌和肾癌。

13.一种LTBR激动剂，其用于治疗癌症，其中所述治疗还包含Treg清除疗法。

14.根据权利要求13所述用于用途的LTBR激动剂，

其中所述LTBR激动剂是LTBR激动性抗体；以及

其中所述Treg清除疗法包含施用具有ADCC、CDC和/或ADCP活性的CCR8结合抗体。

15.一种Treg清除剂，其用于治疗癌症，其中所述治疗还包含施用LTBR激动剂。