CN116888156A - 非阻断性人ccr8结合剂 - Google Patents

Abstract

本发明涉及人CCR8(hCCR8)结合剂，其中所述hCCR8结合剂是一种非阻断性CCR8结合剂。此类结合剂尤其可用于肿瘤内调节性T细胞的清除和一般肿瘤的免疫疗法。

Description

非阻断性人CCR8结合剂

技术领域

本发明涉及人CCR8(hCCR8)结合剂，其中所述hCCR8结合剂是一种非阻断性CCR8结合剂。此类结合剂尤其可用于肿瘤内调节性T细胞的清除和一般的免疫疗法。

背景技术

调节性T(Treg)细胞是适应性免疫系统的组成部分之一，它们有助于维持对自身抗原的耐受性并预防自身免疫性疾病。然而，还发现Treg细胞在多种不同癌症的肿瘤微环境中高度富集(Colombo和Piconese，2007；Nishikawa和Sakaguchi，2014；Roychoudhuri等人，2015)。在肿瘤微环境中，Treg细胞通过降低肿瘤相关抗原(TAA)特异性T细胞免疫而有助于免疫逃逸，从而阻止有效的抗肿瘤活性。因此，Treg的高肿瘤浸润性通常与癌症患者的侵入性表型及不良预后相关(Shang等人，2015；Plitas等人，2016)。

由于认识到肿瘤浸润性Treg细胞的重要性及其在抑制抗肿瘤免疫中的潜在作用，人们提出了多种策略来调节肿瘤微环境中的Treg细胞。多项研究证明，调节Treg可提供显著的治疗益处(Elpek等人，2007)。

然而，与Treg调节相关的一个主要挑战是系统性去除或抑制Treg细胞可引发自身免疫。因此，为了预防自身免疫，特异性清除肿瘤浸润性Treg细胞同时保留肿瘤反应性效应T细胞和外周Treg细胞(例如，循环血液Treg细胞)至关重要。

已知G蛋白偶联的CC趋化因子受体蛋白CCR8(CKRL1/CMKBR8/CMKBRL2)及其天然配体CCL1与癌症，特别是肿瘤环境中的T细胞调节有关。Eruslanov等人(Clin CancerRes2013,17:1670-80)显示人癌症组织中CCR8表达的上调，并证明原发性人肿瘤产生大量天然CCR8配体CCL1。这表明CCL1/CCR8轴有助于免疫逃逸，并且提示阻断CCR8信号是对癌症治疗具有吸引力的策略。Hoelzinger等人(J Immunol 2010,184:8633-42)同样显示CCL1的阻断抑制了Treg抑制功能并增强肿瘤免疫而不影响Treg应答。Wang等人(PloSONE 2012,e30793)报道了CCR8在肿瘤浸润性FoxP3+T细胞上的表达增加，并且提示阻断CCR8可以导致抑制Treg迁移到肿瘤中。由于CCR8在肿瘤浸润性Treg上的高且相对特异性的表达，已经提示抗CCR8的中和性单克隆抗体用于在癌症治疗中调节和清除该Treg群体(EP3431105A1和WO2019/157098A1)。WO2018/181425表明，在小鼠中，中和性抗CCR8 mAb能够通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)清除肿瘤组织中的Treg细胞，从而增强肿瘤免疫。通过它们的中和活性，这些抗体抑制Treg迁移到肿瘤中、逆转Treg的抑制功能并清除肿瘤内Treg(WO2019/157098A1)。最近，Wang等人(Cancer Immunol Immonother 2020,https://doi.org/10.1007/s00262-020-02583-y)显示CCR8阻断可能会破坏肿瘤内Treg的稳定性，使其变成脆性表型，伴随抗肿瘤免疫的再激活并增加抗PD-1治疗益处。

与现有技术的一般教导一致，迄今为止已公开的CCR8治疗剂总是阻断人CCR8结合剂。例如，WO2013131010 A2公开了通过施用降低CCL1与CCR8的结合的CCR8拮抗剂来治疗实体瘤的方法，并且明确涉及WO2007044756 A2中描述的单克隆抗体。来自ICOS公司的本专利申请公开了阻断CCL1诱导的趋化性的抗人CCR8的抗体，包括目前可商购的优选抗体433H。类似地，WO2020138489 A1提供了用于癌症治疗的抗CCR8的抗体。其人源化抗体结合人CCR8并中和CC1诱导的钙内流。这表明与人CCR8的N末端区域结合是发挥中和活性的重要因素。

然而，仍然需要肿瘤内Treg调节的替代策略，特别是降低与人现有疗法相关的副作用风险的策略。

发明内容

本发明人现已令人惊讶地发现，如权利要求中详述的非阻断性人CCR8结合剂(hCCR8)满足上述需要。特别地，本发明人发现具有细胞毒活性的非阻断性CCR8结合剂允许有效清除肿瘤浸润调节性T细胞(Treg)。令人惊讶的是，现有技术中提示减少Treg浸润到肿瘤中以及抑制或恢复肿瘤内Treg的免疫抑制功能的功能性CCR8阻断的缺乏不降低治疗功效。因此，本发明的非阻断性hCCR8结合剂提供了有效肿瘤治疗的潜力，同时显示出改善的安全性特征。

因此，本发明的目的是提供非阻断性hCCR8结合剂。因此，在第一个实施方案中，本发明提供了一种hCCR8结合剂，其中所述hCCR8结合剂是非阻断性hCCR8结合剂。

优选地，hCCR8结合剂结合hCCR8的N末端胞外区。

在其他实施方案中，hCCR8结合剂包含结合hCCR8的单域抗体部分。

在另外的实施方案中，单域抗体部分包含三个互补决定区(CDR)，即CDR1、CDR2和CDR3，其中CDR3选自(a)AAGTTIGQYTY(SEQ ID NO:3)的氨基酸序列，(b)与SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少80％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，和(c)与SEQ ID NO:3的序列具有3、2或1个氨基酸序列差异的氨基酸序列。

优选地，CDR1选自(a)GRTFTNYKSNYK(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列，(b)与SEQ IDNO:1的氨基酸序列具有至少80％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，和(c)与SEQ ID NO:1的序列具有3、2或1个氨基酸序列差异的氨基酸序列，以及CDR2选自(a)TDWTGXSA(SEQ ID NO:2)的氨基酸序列，其中X选自N、S和K，(b)与SEQ ID NO:2具有至少80％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:2中的X选自N、S和K，以及(c)与SEQ ID NO:2具有3、2或1个氨基酸序列差异的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:2中的X选自N、S和K。

在另外的实施方案中，单域抗体部分还包含与SEQ ID NO:4至7具有至少50％、优选至少60％、更优选至少70％、还更优选至少80％、更优选至少85％序列同一性的四个框架区(FR)。优选地，其中SEQ ID NO:4中的X选自D和E，并且其中SEQ ID NO:6中的X选自D和G。

在另外的实施方案中，单域抗体部分包含SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9的氨基酸序列。

在又一个实施方案中，hCCR8结合剂抑制人CCR8的信号传导低于90％，优选低于80％，更优选低于70％，还更优选低于60％，最优选低于50％。

在另外的实施方案中，hCCR8结合剂包含结合人CCR8的单域抗体部分，并且还包含至少一个细胞毒性部分。

优选地，细胞毒性部分诱导抗体依赖性细胞毒性(ADCC)、诱导抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)、诱导补体依赖性细胞毒性(CDC)、结合并激活T细胞或包含细胞毒性有效负载。

本发明的另一个目的是提供编码hCCR8结合剂的核酸。

本发明的另一个目的是提供非阻断性hCCR8结合剂，其用作药物。

本发明的另一个目的是提供非阻断性hCCR8结合剂，其用于治疗肿瘤。优选地，肿瘤选自乳腺癌、子宫体癌、肺癌、胃癌、头颈癌、鳞状细胞癌、皮肤癌、结直肠癌、肾癌和T细胞淋巴瘤。

优选地，施用hCCR8结合剂导致肿瘤浸润性调节性T细胞(Treg)的清除。

在其他实施方案中，治疗还包含施用检查点抑制剂。检查点抑制剂是一种阻断检查点蛋白与其伴侣蛋白结合从而激活免疫系统功能的化合物。优选地，检查点抑制剂阻断选自PD-1、PD-L1、CTLA-4、TIGIT、TIM-3、LAG-3、VISTA、B7-1和B7-2的蛋白。更优选地，检查点抑制剂阻断PD-1或PD-L1。

附图说明

图1示出了通过流式细胞术评价源自用小鼠CCR8免疫的美洲驼的两种VHH(VHH-01和VHH-06)与全长小鼠CCR8的结合以及与Hek293细胞中过表达的N末端缺失小鼠CCR8的结合。

图2显示了VHH-Fc融合体VHH-Fc-14、VHH-Fc-25、VHH-Fc-41和VHH-Fc-43的示意图。

图3示出了VHH-Fc-14和VHH-Fc-25在BW5147细胞中功能性抑制配体CCL1抗地塞米松诱导的细胞凋亡的保护活性的潜力的评价。

图4显示了VHH-Fc-43(其是具有ADCC活性的mCCR8阻断性Fc融合体)和VHH-Fc-41(其缺乏ADCC活性)以及同型对照对肿瘤内Treg清除的影响。

图5显示了VHH-Fc-43和VHH-Fc-41以及同型对照对循环Treg的影响。

图6示出了VHH-Fc-43和VHH-Fc-41以及同型对照对肠道Treg水平的影响。

图7显示了与LLC-OVA肿瘤中的同型和VHH-Fc-14相比，VHH-Fc-25对肿瘤生长的体内影响。

图8显示了与MC38肿瘤中的同型和VHH-Fc-14相比，VHH-Fc-25对肿瘤生长的体内影响。

图9示出了通过流式细胞术评价源自用人CCR8免疫的美洲驼的一种VHH(VHH-69)与HEK293细胞中稳定转染的人CCR8的结合。

图10示出了VHH-69以及CCR8阻断性对照VHH(VHH-阻断)在稳定表达重组人CCR8的CHO-K1细胞中功能性抑制人CCL1配体对cAMP积累的作用的潜力的评价。

图11显示了与两种对照抗CCR8 mAb相比，三种VHH-Fc融合体VHH-Fc-218(SEQ IDNO:27)、VHH-Fc-219(SEQ ID NO:21)和VHH-Fc-220(SEQ ID NO:22)在稳定转染的HEK293细胞上与人CCR8结合的评价。

图12示出了与两种对照抗CCR8 mAb相比，通过流式细胞术评价VHH-Fc融合体VHH-Fc-218、VHH-Fc-219和VHH-Fc-220与在HEK239T细胞中瞬时表达的猕猴属CCR8的结合。

图13显示了VHH-Fc-219以及三种对照抗CCR8 mAb在稳定表达重组人CCR8的CHO-K1细胞中功能性抑制人CCL1配体对cAMP积累的作用的影响。

图14显示了VHH-69(SEQ ID NO:10)的氨基酸序列，其是非阻断性hCCR8结合剂。用IMGT方法鉴定的互补决定区(CDR)用下划线表示，而用Kabat方法鉴定的CDR用粗体表示。星号表示在人源化非阻断性hCCR8结合剂VHH-123(SEQ ID NO:8)和VHH-124(SEQ ID NO:9)中突变的氨基酸。

图15示出了与对照(VHH-69(E1D))相比，VHH-Fc融合体VHH-123(SEQ ID NO:8)和VHH-124(SEQ ID NO:9)与FLAG3标记的VHH-69(SEQ ID NO:10)竞争与HEK293细胞中稳定表达的人CCR8的结合的能力的评价。

图16显示了与同型相比，无岩藻糖基化(afucosylated)(AF)和非岩藻糖基化(non-afucosylated)形式的VHH-Fc-262(SEQ ID NO:29)和VHH-Fc-264(SEQ ID NO:26)对表达hCCR8的HEK292细胞上的PBMC介导的ADCC活性的评价。

具体实施方式

下面将参照具体的实施方案并参照特定附图来描述本发明，但本发明不限于此。

除非本文另有定义，与本发明结合使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。此外，除非上下文另有要求，否则单数术语应包括复数，并且复数术语应包括单数。通常，与本文所述的分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白质和核酸化学相关使用的命名法和技术是本领域熟知和常用的那些。

如前所述，本发明提供了一种人CCR8(hCCR8)结合剂，其中所述hCCR8结合剂是人非阻断性CCR8结合剂。此类化合物特别有用，因为它们能够结合细胞上表达的人CCR8，例如调节性T细胞，特别是肿瘤内调节性T细胞，并通过它们的细胞毒活性清除此类细胞。CCR8是β趋化因子受体家族的成员，其被预测为类似于G偶联受体的七跨膜蛋白。鉴定的CCR8配体包括其天然同源配体CCL1(I-309)。人CCR8在UniProt知识库(UniProt Knowledgebase)中的条目编号为P51685。

CCR8结合剂

如本文所述，术语特异性抗原的“结合剂”表示能够特异性结合所述抗原的分子。具体地，本文所用的人CCR8结合剂是指能够特异性结合hCCR8的分子。此类结合剂在本文中也称为“hCCR8结合剂”。

“特异性结合(specific binding)”、“特异性地结合(bind specifically)”和“特异性地结合(specifically bind)”特别理解为是指结合剂对目的抗原的解离常数(K_d)小于约10^-6M、10^-7M、10^-8M、10^-9M、10^-10M、10^-11M、10^-12M或10^-13M。在一个优选的实施方案中，解离常数小于10^-8M，例如范围为10^-9M、10^-10M、10^-11M、10^-12M或10^-13M。例如，可通过使用病毒样颗粒的基于表面等离振子共振的测定(例如，PCT申请公开号WO2005/012359中所述的BIAcore测定)、细胞酶联免疫吸附测定(ELISA)、以及荧光激活细胞分选(FACS)读出，来测定结合剂对膜靶标的亲和力。用于测定表观Kd或EC50值的优选方法是通过使用FACS在21℃使用过表达hCCR8的细胞。

如本领域技术人员将理解的，原则上与hCCR8结合的任何类型的结合剂都可以用于本发明，并且不同类型的结合剂对于本领域技术人员是容易获得的或可以使用本领域的典型知识产生。在具体的实施方案中，hCCR8结合剂的结合部分是蛋白质，更具体地是hCCR8结合多肽。在其他实施方案中，hCCR8结合剂的结合部分是基于抗体的或基于非抗体的，优选基于抗体的。基于非抗体的结合剂包括但不限于亲和体(affibody)、Kunitz结构域肽、monobody(adnectin)、anticalin、设计的锚蛋白重复结构域(DARPin)、centyrin、fynomer、avimer；affilin；affitin、肽等。在具体的实施方案中，本发明的hCCR8结合剂结合hCCR8的胞外部分，特别是调节性T细胞上表达的hCCR8的胞外部分，例如hCCR8的N-末端区域或细胞外环之一。在具体的实施方案中，本发明的hCCR8结合剂结合hCCR8的N-末端区域，尤其是N-末端氨基酸1-35，如1-30或1-25。

如本文所述，术语“抗体”、“抗体片段”和“活性抗体片段”是指包含免疫球蛋白(Ig)结构域或能够特异性结合抗原的抗原结合结构域的蛋白，在这种情况下为hCCR8蛋白。“抗体”还可以是来自天然来源或重组来源的完整免疫球蛋白，并且可以是完整免疫球蛋白的免疫反应性部分。抗体可以是免疫球蛋白分子的多聚体，例如四聚体。在一个优选的实施方案中，结合剂包含hCCR8结合部分，该hCCR8结合部分是抗体或活性抗体片段。在本发明的另一方面，结合剂是抗体。在本发明的另一方面，抗体是单克隆的。抗体可以另外地或可选地是人源化的或人的。在另一方面，抗体是人抗体，或者在任何情况下是具有允许其在人个体中使用和施用的形式和特征的抗体。抗体可以来自任何物种，包括但不限于小鼠、大鼠、鸡、兔、山羊、牛、非人灵长类动物、人、单峰驼、骆驼、美洲驼、羊驼和鲨鱼。

术语“抗原结合片段”是指所述完整多克隆或单克隆抗体的抗原结合部分，其保留了与靶抗原或其单链、包含抗体的融合蛋白以及包含抗原识别位点的免疫球蛋白分子的任何其他修饰构型特异性结合的能力。抗原结合片段包含但不限于Fab；Fab'；F(ab′)₂；Fc片段；单域抗体(sdAb或dAb)片段。这些片段通过使用本领域的常规方法衍生自完整抗体，例如通过用酶如木瓜蛋白酶进行蛋白水解切割以产生Fab片段或胃蛋白酶进行蛋白水解切割以产生F(ab′)₂片段。如本文所用，抗原结合片段还指包含重链和/或轻链可变区的融合蛋白，例如单链可变片段(scFv)。

如本文所用，术语“单克隆抗体”是指具有均一抗体群体的抗体组合物。应当理解，单克隆抗体针对单个抗原位点是高度特异性的。此外，与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的常规抗体(多克隆)制剂相反，每种单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。本发明的结合剂优选包含与hCCR8结合的单克隆抗体部分。

在本发明的一个方面，结合剂包含活性抗体片段。术语“活性抗体片段”是指任何抗体或抗体样结构的一部分，其本身对抗原决定簇或表位具有高亲和力，并含有一个或多个抗原结合位点，例如互补决定区(CDR)，从而解释了这种特异性。非限制性实例包括免疫球蛋白结构域、Fab、F(ab)’2、scFv、重链-轻链二聚体、免疫球蛋白单可变结构域、单域抗体(sdAb或dAb)、和单链结构(例如，完整轻链或完整重链)，以及已被工程化以结合抗原的抗体恒定结构域。根据本发明，对所述片段的“活性”的额外要求是所述片段能够结合hCCR8。术语“免疫球蛋白(Ig)结构域”或更具体地“免疫球蛋白可变结构域”(缩写为“IVD”)是指基本上由被互补决定区隔开的框架区组成的免疫球蛋白结构域。通常，免疫球蛋白结构域基本上由四个“框架区”组成，其在本领域中和下文中分别称为“框架区1”或“FR1”；“框架区2”或“FR2”；“框架区3”或“FR3”；以及“框架区4”或“FR4”；这些框架区被三个“互补决定区”或“CDR”隔开，其在本领域和下文中分别称为“互补决定区1”或“CDR1”；“互补决定区2”或“CDR2”；以及“互补决定区3”或“CDR3”。因此，免疫球蛋白可变结构域的一般结构或序列可以如下所示：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。免疫球蛋白可变结构域(IVD)通过携带抗原结合位点赋予了抗体对抗原的特异性。通常，在常规免疫球蛋白中，重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)相互作用形成抗原结合位点。在这种情况下，VH和VL的互补决定区(CDR)将有助于抗原结合位点，即，总共6个CDR将参与抗原结合位点的形成。鉴于上述定义，常规4链抗体(例如，IgG、IgM、IgA、IgD或IgE分子；本领域中已知)的抗原结合结构域或Fab片段、F(ab’)2片段、Fv片段(例如，二硫键连接的Fv或scFv片段)、或衍生自此类常规4链抗体的双链抗体(diabody)(均为本领域已知的)的抗原结合结构域，通过一对(缔合的)免疫球蛋白结构域如轻链和重链可变结构域，即通过免疫球蛋白结构域的VH-VL对与抗原的相应表位结合，所述免疫球蛋白结构域共同结合相应抗原的表位。本文所用的单域抗体(sdAb)是指具有包含4个框架区(FR)和3个根据形式FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4的互补决定区(CDR)的氨基酸序列的蛋白质。本发明的单域抗体等同于“免疫球蛋白单可变结构域”(缩写为“ISVD”)，并且是指其中抗原结合位点存在于单个免疫球蛋白结构域上并由其形成的分子。这将单域抗体与“常规”抗体或其片段分开，其中两个免疫球蛋白结构域，特别是两个可变结构域相互作用以形成抗原结合位点。单域抗体的结合位点由单个VH/VHH或VL结构域形成。因此，单域抗体的抗原结合位点由不超过3个CDR形成。因此，单个结构域可以是轻链可变结构域序列(例如，VL序列)或其合适的片段；或重链可变结构域序列(例如，VH序列或VHH序列)或其合适的片段；只要其能够形成单一抗原结合单位(即，基本上由单一可变结构域组成的功能性抗原结合单位，使得单一抗原结合结构域不需要与另一可变结构域相互作用以形成功能性抗原结合单位)。

因此，在一个实施方案中，如上详述的hCCR8结合剂包含单域抗体部分。

特别地，单域抗体可以是(如本文所定义)或其合适的片段(注： 和/>是Ablynx公司(一家赛诺菲(Sanofi)公司)的注册商标)。对于/>的一般描述，参考下面的进一步描述，并在现有技术例如WO2008/020079中进行描述。“VHH结构域”，也称为VHH、VHH抗体片段和VHH抗体，最初被描述为“重链抗体”(即，“不含轻链的抗体”；参见，例如Hamers-Casterman等人,Nature 363:446-8(1993))的抗原结合免疫球蛋白(Ig)(可变)结构域。选择术语“VHH结构域”以区分这些可变结构域与存在于常规4链抗体中的重链可变结构域(本文称为“VH结构域”)以及存在于常规4链抗体中的轻链可变结构域(本文称为“VL结构域”)。对于VHH和/>的进一步描述，参考Muyldermans的综述文章(Reviews in Molecular Biotechnology 74:277-302,2001)，以及作为一般背景技术提及的下列专利申请：布鲁塞尔自由大学的WO 94/04678、WO95/04079和WO 96/34103；联合利华(Unilever)的WO 94/25591、WO 99/37681、WO 00/40968、WO 00/43507、WO 00/65057、WO 01/40310、WO 01/44301、EP 1134231和WO 02/48193；Vlaams生物技术研究所(VIB)的WO 97/49805、WO 01/21817、WO 03/035694、WO 03/054016和WO 03/055527；Algonomics公司和Ablynx公司的WO 03/050531；加拿大国家研究委员会的WO 01/90190；抗体研究所(Institute of Antibodies)的WO 03/025020(＝EP1433793)；以及Ablynx公司的WO 04/041867、WO 04/041862、WO 04/041865、WO 04/041863、WO 04/062551、WO 05/044858、WO 06/40153、WO 06/079372、WO 06/122786、WO 06/122787和WO 06/122825，以及Ablynx公司的进一步公开的专利申请。如这些文献中所描述的，(特别是VHH序列和部分人源化的/>)可以特别地表征为在一个或多个框架序列中存在一个或多个“标志(Hallmark)残基”。对/>的进一步描述，包括纳米抗体(Nanobody)的人源化和/或骆驼源化，以及其他修饰、部分或片段、衍生物或“纳米抗体融合体”、多价或多特异性构建体(包括接头序列的一些非限制性实例)以及用于增加及其制备物的半衰期的不同修饰可以在例如WO 08/101985和WO 08/142164中找到。VHH和/>是完全保留全长抗体的结合亲和力和特异性的最小抗原结合片段之一(参见，例如Greenberg等人,Nature 374:168-73(1995)；Hassanzadeh-Ghassabeh等人,Nanomedicine(Lond),8:1013-26(2013))。

本发明的结合剂可以是单特异性的、双特异性的或多特异性的。“多特异性结合剂”可以对一种靶抗原或多肽的不同表位具有特异性，或者可以含有对一种以上靶抗原或多肽具有特异性的抗原结合结构域(Kufer等人,Trends Biotechnol 22:238-44(2004))。

在本发明的一个方面，结合剂是单特异性结合剂。如下面进一步所讨论的，在一个替代方面，结合剂是双特异性结合剂。

如本文所用，“双特异性结合剂”是指这样的结合剂，其能够结合单一抗原或多肽上的两种不同表位、或者两种不同抗原或多肽上的两种不同表位。

如本文所讨论的本发明的双特异性结合剂可以通过以下方法产生：生物学方法，例如体细胞杂交；或基因方法，例如在细胞系或生物体中表达编码所需结合剂结构的非天然DNA序列；化学方法(例如，通过化学偶联、基因融合、非共价缔合或以其他方式结合至一个或多个分子实体(例如其片段的另一种结合剂))；或其组合。

允许产生单特异性或双特异性结合剂的技术和产品是本领域已知的，如在文献中广泛综述的，还涉及替代形式、结合剂-药物缀合物、结合剂设计方法、体外筛选方法、恒定区、翻译后和化学修饰、触发癌细胞死亡的改进特征(例如，Fc结构域工程化)(Tiller K和Tessier P,Annu Rev Biomed Eng.17:191-216(2015)；Speiss C等人,MolecularImmunology 67:95-106(2015)；Weiner G,Nat Rev Cancer,15:361-370(2015)；Fan G等人,J Hematol Oncol 8:130(2015))。

非阻断性结合剂

如上所述，现有技术中已经描述了具有细胞毒活性并导致肿瘤浸润调节性T细胞(Treg)清除的阻断性hCR8结合剂在现有技术中已有描述。然而，使用此类结合剂作为治疗剂可导致全身性副作用和自身免疫。本发明结合物的益处可以包括减少的副作用，例如减少对不是肿瘤浸润性Treg的表达CCR8的T细胞群，特别是表达CCR8的非肿瘤浸润性Treg细胞群(例如，肠和/或皮肤Treg群)的作用。此外，本发明的非阻断性结合剂可以包括树突细胞向淋巴结迁移的抑制的缺失或降低。

本发明人令人惊讶地发现，具有细胞毒活性的CCR8结合剂，其特征在于CCR8结合剂是非阻断性CCR8结合剂，但是可以特异性地清除肿瘤浸润的调节T细胞(Treg)，获得相同和更高的功效，同时减少不需要的全身副作用，如以下实施例所证明的。

hCCR8的“非阻断性”结合剂是指它不阻断或基本上不阻断hCCR8配体与hCCR8的结合，特别地，该结合剂不阻断选自hCCL1、hCCL8、hCCL16和hCCL18的至少一种配体与hCCR8的结合，特别地它不阻断hCCL1或hCCL18与hCCR8的结合，优选地它不阻断hCCL1与hCCR8的结合。可通过本领域已知的方法测定配体与hCCR8结合的阻断。其实例包括但不限于测量配体(例如，hCCL1)与hCCR8的结合、hCCR8表达细胞向配体(例如，hCCL1)迁移、hCCR8配体(例如，hCCL1)导致的细胞内Ca²⁺水平增加、配体(例如，hCCL1)对地塞米松诱导的细胞凋亡的拯救、以及对hCCR8配体刺激(例如，hCCL1刺激)敏感的基因表达的变化。提及“非阻断(non-blocking)”、“非配体阻断(non-ligand blocking)”、“不阻断(does not block)”或“无阻断(without blocking)”等(关于在hCCR8结合剂存在下hCCR8配体与hCCR8结合的非阻断)包括其中本发明的hCCR8结合剂不阻断或基本上不阻断hCCR8配体经由hCCR8的信号传导，特别是hCCL1经由hCCR8的信号传导的实施方案。即，与不存在结合剂的配体信号传导相比，hCCR8结合剂抑制小于50％的配体信号传导。在本文所述的本发明的具体的实施方案中，与不存在结合剂的配体信号传导相比，hCCR8结合剂抑制小于40％、35％、30％、优选小于约25％的配体信号传导。在具体的实施方案中，在hCR8结合剂摩尔浓度为hCR8结合剂与hCR8的结合EC50的至少10倍、特别是至少50倍、更特别是至少100倍时，测量配体信号传导的百分比。在另外的实施方案中，在hCCR8结合剂摩尔浓度为配体摩尔浓度的至少10倍、特别是至少50倍、更特别是至少100倍时，测量配体信号传导的百分比。非阻断性hCCR8结合剂允许hCCR8结合而不干扰至少一种配体与hCCR8的结合，或基本上不干扰至少一种配体与hCCR8的结合。通过hCCR8的配体信号传导(例如，hCCL1信号传导)可通过如实施例中讨论的和本领域已知的方法来测量。可以在相同或基本相同的条件下对存在和不存在hCCR8结合剂情况下的配体信号传导进行比较。

在一些实施方案中，hCCR8信号传导可通过测量cAMP释放来测定。具体而言，将稳定表达重组人CCR8受体的CHO-K1细胞(例如，购自EuroscreenFAST的FAST-065C)悬浮于KRH的测定缓冲液中：5mM KCl，1.25mM MgSO4，124mM NaCl，25mM HEPES，13.3mM葡萄糖，1.25mMKH2PO4，1.45mM CaCl2，0.5g/l BSA，补充有1mM IBMX。以100nM的浓度加入CCR8结合剂并在21℃孵育30分钟。加入5μM毛喉素和人CCL1在测定缓冲液中的混合物以达到5nM hCCL1的最终测定浓度。然后将测定混合物在21℃孵育30分钟。加入裂解缓冲液并孵育1小时后，测量cAMP的浓度。可以通过例如，利用制造商的测定条件、使用来自Cisbio的HTRF试剂盒(货号#62AM9PE)测定荧光水平来测量cAMP。与缺少结合剂的对照相比，非阻断性结合剂导致cAMP的量的变化小于50％。特别是小于40％，更特别是小于30％，例如小于20％。优选地，与对照相比，非阻断性结合剂导致cAMP的变化小于10％，更优选小于5％。

如本文所用，“表位”或“抗原决定簇”是指抗原上与结合剂(例如，抗体)结合的位点。如本领域所熟知的，表位可以由连续氨基酸(线性表位)或通过蛋白质的三级折叠并置的非连续氨基酸(构象表位)形成。由连续氨基酸形成的表位通常在暴露于变性溶剂时保留，而通过三级折叠形成的表位通常在用变性溶剂处理时丢失。表位通常以独特的空间构象包括至少3个、更通常至少5或8至10个氨基酸。确定表位空间构象的方法是本领域熟知的，包括例如X射线晶体学和2D核磁共振。参见，例如Methods in Molecular Biology,第66卷,Glenn E.Morris编著(1996)中的表位作图方案(Epitope Mapping Protocols)。

如本文所用，术语“序列同一性”是指两个多肽或多核苷酸序列在比较窗口上是相同的(即，分别以氨基酸对氨基酸、或以核苷酸对核苷酸为基础)。通过在比较窗口上比较两个最佳比对序列、确定两个序列中出现相同氨基酸或核酸碱基(任何相关的)位置的数目以产生匹配位置的数目、将匹配位置数目除以比较窗口中的位置总数(即，窗口大小)、将结果乘以100以得到序列同一性百分比，来计算“序列同一性百分比”。

如本文所用，术语“基本上相同(substantially identical)”或“基本同一性(substantial identity)”表示多肽或多核苷酸序列的特征，其中多肽或多核苷酸包含与参比序列相比具有至少80％序列同一性、优选至少85％序列同一性、更优选90％序列同一性、还更优选95％序列同一性、还更优选99％序列同一性的序列，其中通过将参比序列与多肽或多核苷酸序列进行比对来计算序列同一性百分比，可包括在比较窗口上占参比序列总量20％或更少的缺失或添加。参比序列可以是较大序列的子集。可以通过本领域普通技术人员已知的常规软件或方法进行序列的最佳比对。

如本文所用，术语“对应于(correspond to或corresponding to)”是指多肽或多核苷酸序列与参比多肽或多核苷酸序列的全部或部分相同或相似。相比之下，本文所用的与多肽或多核苷酸序列相关的术语“互补”是指互补序列与参比多肽或多核苷酸序列的全部或部分同源。为了说明，核苷酸序列“TATAC”对应于参比序列“TATAC”，并与参比序列“GTATA”互补。

在本发明的一个实施方案中，如上详述的hCC8结合剂包含单域抗体部分，该单域抗体部分包含如本文所述的单域抗体部分的至少一个互补决定区(CDR)、或与所述CDR序列具有至少80％氨基酸同一性的氨基酸序列、或与所述CDR序列具有3、2或1个氨基酸序列差异的氨基酸序列。应当理解，通过本领域普通技术人员已知的常规方法，例如但不限于KABAT系统(Kabat)、Chothia、AHo或国际免疫遗传学(ImMunoGeneTics)信息系统(IMGT)，可以容易地鉴定所述单域抗体部分序列中的CDR及其位置。确定CDR序列的优选方法是IMGT方法(Lefranc,M.-P.等人,2009,Nucleic Acids Research,D1006-1012,http://www.imgt.org)。

如以下实施例中所述，根据本发明的特异性且优选的hCCR8结合剂包含对应于SEQID NO:8、9或10的单域抗体部分。图14显示了SEQ ID NO:10的氨基酸序列的示意图，其中使用IMGT方法(下划线)或Kabat方法(粗体)鉴定CDR。

因此，使用IMGT方法，如上定义的在单域抗体部分内鉴定的CDR对应于：

SEQ ID NO:1(GRTFTNYKSNYK)

SEQ ID NO:2(TDWTGXSA)

SEQ ID NO:3(AAGTTIGQYTY)

其中X选自N、S和K。

此外，使用Kabat方法(Kabat E.A.等人,1991,Sequences of Proteins ofImmunological Interest,第五版,NIH出版社,No.91-3242)，如上定义的在单域抗体部分内鉴定的CDR对应于：

SEQ ID NO:33(NYKSNYKMA)

SEQ ID NO:12(RTDWTGXSAIIANSVKX)

SEQ ID NO:34(GTTIGQYTY)

其中SEQ ID NO:12中位置7处的X选自N、S和K，以及其中位置17处的X选自D和G。

因此，在具体的实施方案中，本文所指的单域抗体包含三个CDR，所述CDR包含SEQID NO:33、12和34的序列，其中SEQ ID NO:12中位置7处的X选自由N、S和K，以及其中位置17处的X选自D和G。

可选地，如上定义的在单域抗体部分内鉴定的CDR对应于：

SEQ ID NO:11(GRTFTNYKSNYKMA)

SEQ ID NO:12(RTDWTGXSAIIANSVKX)

SEQ ID NO:13(AAGTTIGQYTY)

其中SEQ ID NO:12中位置7处的X选自N、S和K，以及其中位置17处的X选自D和G。

因此，在具体的实施方案中，本文所指的单域抗体包含三个CDR，所述CDR包含SEQID NO:11、12和13的序列，其中SEQ ID NO:12中位置7处的X选自由N、S和K，以及其中位置17处的X选自D和G。

因此，如上详述的单域抗体部分包含至少一个、优选至少两个并且最优选三个选自SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:3的CDR，或者至少一个、优选至少两个并且最优选三个与所述CDR序列具有至少80％氨基酸同一性的氨基酸序列，或者至少一个、优选至少两个并且最优选三个与所述CDR序列具有3、2或1个氨基酸序列差异的氨基酸序列。

优选地，如上详述的单域抗体部分包含选自以下的CDR3：(a)AAGTTIGQYTY(SEQ IDNO:3)的氨基酸序列，(b)与SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少80％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，和(c)与SEQ ID NO:3的序列具有3、2或1个氨基酸序列差异的氨基酸序列。更优选地，CDR3对应于SEQ ID NO:3。

在一个优选的实施方案中，CDR1选自(a)GRTFTNYKSNYK(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列，(b)与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少80％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，和(c)与SEQ ID NO:1的序列具有3、2或1个氨基酸序列差异的氨基酸序列；和/或CDR2选自(a)TDWTGXSA(SEQ ID NO:2)的氨基酸序列，其中X选自N、S和K，(b)与SEQ ID NO:2具有至少80％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:2中的X选自N、S和K，以及(c)与SEQID NO:2具有3、2或1个氨基酸序列差异的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:2中的X选自N、S和K。

在另外的具体的实施方案中，本发明提供了一种hCCR8结合剂，其包含如本文所述的CDR1、CDR2和CDR3的组合，包括针对这些CDR区所述的容许变异。在另外的具体的实施方案中，本发明的结合剂包含如本文所述的单域抗体部分的至少一个CDR区。在其他实施方案中，本发明的结合剂包含具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的单域抗体部分的至少一个CDR区。在其他实施方案中，本发明的结合剂包含具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的单域抗体部分的三个CDR区。

在更优选的实施方案中，如上详述的单域抗体部分包含具有SEQ ID NO:1、2和3的序列的三个CDR，其中X选自N、S和K。

在本发明的另外的实施方案中，如上详述的单域抗体部分还包含与本文所述的单域抗体部分的至少一个框架区(FR)具有至少85％、90％、95％、98％或99％序列同一性的序列。在本发明的另外的实施方案中，如上详述的单域抗体部分还包含与本文所述的单域抗体部分的四个框架区(FR)具有至少85％、90％、95％、98％或99％序列同一性的序列。应当理解，用于确定所述单域抗体部分的FR的方法与用于鉴定CDR的方法相同。

因此，使用IMGT方法，如上定义的在单域抗体部分内鉴定的FR对应于：

SEQ ID NO:4(XVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTAS)

SEQ ID NO:5(MAWFRQAPGKARAFVGR)

SEQ ID NO:6(IIANSVKXRFTISRDNAKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYC)

SEQ ID NO:7(WGQGTLVTVSS)

其中SEQ ID NO:4中的X选自D和E，且其中SEQ ID NO:6中的X选自D和G。

因此，如上详述的单域抗体部分包含至少一个、优选至少两个、更优选至少三个并且最优选四个与选自SEQ ID NO:4至SEQ ID NO:7的序列具有至少85％、优选90％、更优选95％序列同一性的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:4中的X选自D和E并且其中SEQ ID NO:6中的X选自D和G。

优选地，如上详述的所述单域抗体部分包含根据FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4形式的四个框架区(FR)，其中FR1与SEQ ID NO:4的序列具有至少85％、优选90％、更优选95％序列同一性，其中X选自D和E，FR2与SEQ ID NO:5的序列具有至少85％、优选90％、更优选95％序列同一性，FR3与SEQ ID NO:6的序列具有至少85％、优选90％、更优选95％序列同一性，其中X选自D和G，以及FR4与SEQ ID NO:7的序列具有至少85％、优选90％、更优选95％序列同一性。

在另外的具体的实施方案中，本发明的结合剂包含抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列或者与其具有85％、90％或95％序列同一性的氨基酸序列，其中结合剂包含SEQ ID NO:1的CDR1、SEQ ID NO:2的CDR2，其中X为N、S和K，以及SEQ ID NO:3的CDR3。在其他实施方案中，SEQ ID NO:2中的X为N。

在具体的实施方案中，本发明的结合剂包含对应于SEQ ID NO:10的氨基酸序列。

人源化和序列优化的非阻断性CCR8结合剂

如本文所用，术语“人源化结合剂”是指通过分子建模技术产生来确定人和非人(例如，小鼠或兔)结合剂序列的最佳组合的结合剂，即，这样的一种组合，其中结合剂中人源成分最大化，同时很少或不造成归因于非人抗体的可变区的结合亲和力的损失。例如，人源化抗体也称为嵌合抗体，其包含人框架区以及来自人抗体的恒定区的氨基酸序列，以“人源化”或使来自非人抗体的互补决定区(CDR)成为非免疫原性的。

如本文所用，术语“人结合剂”是指具有氨基酸序列的结合剂，该氨基酸序列对应于可由人产生和/或使用本领域技术人员已知或本文公开的用于制备人抗体的任何技术来制备的结合剂的氨基酸序列。还应当理解，术语“人抗体”包括这样的抗体，该抗体包含至少一种人重链多肽或至少一种人轻链多肽。一个这样的实例是包含鼠轻链和人重链多肽的抗体。

对于完整大小的抗体，单个可变结构域(例如，VHH和)可进行序列优化，例如人源化(即，增加与最接近的人种系序列的序列同一性程度)和其他优化技术(例如，改善结合剂的物理化学或其他性质)。特别地，人源化免疫球蛋白单可变结构域(例如，VHH和/>)可以是单域抗体，其中存在至少一个单个氨基酸残基(特别是至少一个框架残基)，该氨基酸残基是人源化取代和/或对应于人源化取代(如本文进一步所定义)。

人源化单域抗体，特别是VHH和与相应的天然存在的VHH结构域相比，可以具有几个优点，例如免疫原性降低。人源化是指突变，使得在施用于人类患者时免疫原性较小或不存在。人源化取代的选择应使所得人源化氨基酸序列和/或VHH仍保留VHH的有利特性，例如抗原结合能力。

在具体的实施方案中，如上所述的非阻断性hCCR8结合剂是优化的非阻断性hCCR8结合剂。

优选地，优化的非阻断性hCCR8结合剂包含如上所述的单域抗体部分。更优选地，通过例如在SEQ ID NO:10的位置1、55和/或65的任一处引入突变，特别是取代，将单域抗体人源化。也在图14中用星号突出显示了这些残基。具体地，发现在SEQ ID NO:10的位置1处用天冬氨酸(D)取代谷氨酸残基(E)的突变增加了结合剂的化学稳定性。此外，如以下实施例中所示，发现在SEQ ID NO:10的位置55处用丝氨酸(S)或赖氨酸(K)取代天冬酰胺残基(N)避免了在40℃储存结合剂时的脱酰胺作用。此外，发现与对照VHH-69(E1D)相比，VHH-124中存在的N55K取代产生了2倍更有效的竞争IC50值(2.5×10^-10M)。因此，在具体的实施方案中，本发明提供了一种结合剂，其包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列，任选地包含取代E1D、N55S、N55K和G65D中的一个或多个。在其他实施方案中，包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的结合剂包含取代E1D、G65D和N55S或N55K。在其他实施方案中，包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的结合剂包含取代N55K。

在另外的实施方案中，本发明的结合剂包含具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的单域抗体部分的至少一个CDR区。在其他实施方案中，本发明的结合剂包含具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的单域抗体部分的三个CDR区。在另外的实施方案中，本发明的结合剂包含具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的单域抗体部分的至少一个CDR区。在其他实施方案中，本发明的结合剂包含具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的单域抗体部分的三个CDR区。

然而，可以在任何位置处，特别是在任何框架残基处，例如在一个或多个标志残基(如上所定义)处或者在一个或多个其他框架残基(即，非标志残基)处或其任何合适的组合，适当地人源化本发明的氨基酸序列和/或单域抗体。根据用于表达本发明的氨基酸序列、单域抗体或多肽的宿主生物体，此类缺失和/或取代也可以以除去一个或多个翻译后修饰的位点(例如，一个或多个糖基化位点)的方式设计，这处于本领域技术人员的能力范围内。可选地，可设计取代或插入以引入一个或多个用于连接官能团的位点(如本文所述)，例如以允许位点特异性聚乙二醇化。

在本发明的一个实施方案中，如上详述的人源化非阻断性hCC8结合剂包含单域抗体部分，该单域抗体部分包含如本文所述的单域抗体部分的至少一个互补决定区(CDR)、或与所述CDR序列具有至少80％氨基酸同一性的氨基酸序列、或与所述CDR序列具有3、2或1个氨基酸序列差异的氨基酸序列。应当理解，通过本领域普通技术人员已知的常规方法，例如但不限于KABAT系统(Kabat)、Chothia、AHo或国际免疫遗传学(ImMunoGeneTics)信息系统(IMGT)，可以容易地鉴定所述单域抗体部分序列中的CDR及其位置。确定CDR序列的优选方法是IMGT方法(Lefranc,M.-P.等人,2009,Nucleic Acids Research,D1006-1012,http://www.imgt.org)。

如以下实施例所述，本发明的两种特异性人源化hCCR8结合剂包含对应于SEQ IDNO:8或9的单域抗体部分。

因此，使用IMGT方法，如上定义的在单域抗体部分内鉴定的CDR对应于：

SEQ ID NO:1(GRTFTNYKSNYK)

SEQ ID NO:14(TDWTGSSA)或SEQ ID NO:15(TDWTGKSA)

SEQ ID NO:3(AAGTTIGQYTY)

此外，使用Kabat方法，如上定义的在单域抗体部分内鉴定的CDR对应于：

SEQ ID NO:33(NYKSNYKMA)

SEQ ID NO:16(RTDWTGSSAIIANSVKD)或SEQ ID NO:17(RTDWTGKSAIIANSVKD)

SEQ ID NO:34(GTTIGQYTY)

可选地，如上定义的在单域抗体部分内鉴定的CDR对应于：

SEQ ID NO:11(GRTFTNYKSNYKMA)

SEQ ID NO:16(RTDWTGSSAIIANSVKD)或SEQ ID NO:17(RTDWTGKSAIIANSVKD)

SEQ ID NO:13(AAGTTIGQYTY)

因此，如上详述的单域抗体部分包含至少一个、优选至少两个并且最优选三个选自SEQ ID NO:1、14、15和3的CDR，或者至少一个、优选至少两个并且最优选三个与所述CDR序列具有至少80％氨基酸同一性的氨基酸序列，或者至少一个、优选至少两个并且最优选三个与所述CDR序列具有3、2、1个氨基酸序列差异的氨基酸序列。

优选地，如上详述的单域抗体部分包含选自以下的CDR3：(a)AAGTTIGQYTY(SEQ IDNO:3)的氨基酸序列，(b)与SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少80％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，和(c)与SEQ ID NO:3的序列具有3、2或1个氨基酸序列差异的氨基酸序列。更优选地，CDR3对应于SEQ ID NO:3。

在一个优选的实施方案中，CDR1选自(a)GRTFTNYKSNYK(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列，(b)与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少80％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，和(c)与SEQ ID NO:1的序列具有3、2或1个氨基酸序列差异的氨基酸序列，以及CDR2选自(a)TDWTGSSA(SEQ ID NO:14)的氨基酸序列，(b)TDWTGSSA(SEQ ID NO:15)的氨基酸序列，(c)与SEQ ID NO:14或15具有至少80％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，和(c)与SEQ ID NO:14或15具有3、2或1个氨基酸序列差异的氨基酸序列。

在更优选的实施方案中，如上详述的单域抗体部分包含具有SEQ ID NO:1、14和3的序列或具有SEQ ID NO:1、15和3的序列的三个CDR。

在本发明的另外的实施方案中，如上详述的单域抗体部分还包含与本文所述的单域抗体部分的至少一个框架区(FR)具有至少85％、90％、95％、98％或99％序列同一性的序列。应当理解，用于确定所述单域抗体部分的FR的方法与用于鉴定CDR的方法相同。

因此，使用IMGT方法，如上定义的在单域抗体部分内鉴定的FR对应于：

SEQ ID NO:18(DVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTAS)

SEQ ID NO:5(MAWFRQAPGKARAFVGR)

SEQ ID NO:19(IIANSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYC)

SEQ ID NO:7(WGQGTLVTVSS)

因此，如上所述的单域抗体部分包含至少一个、优选至少两个、更优选至少三个并且最优选四个与选自SEQ ID NO:18、5、19和7的序列具有至少85％、优选90％、更优选95％序列同一性的氨基酸序列。

优选地，如上详述的所述单域抗体部分包含根据FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4形式的四个框架区(FR)，其中FR1与SEQ ID NO:18的序列具有至少85％、优选90％、更优选95％序列同一性，FR2与SEQ ID NO:5的序列具有至少85％、优选90％、更优选95％序列同一性，FR3与SEQ ID NO:19的序列具有至少85％、优选90％、更优选95％序列同一性，以及FR4与SEQ ID NO:7的序列具有至少85％、优选90％、更优选95％序列同一性。

更优选地，如上详述的所述单域抗体部分包含对应于SEQ ID NO:8或9的氨基酸序列。在具体的实施方案中，本发明的结合剂包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列。在另外的具体的实施方案中，本发明的结合剂包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列。

在另外的具体的实施方案中，本发明的结合剂包含抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列或者与其具有85％、90％或95％序列同一性的氨基酸序列，其中结合剂包含SEQ ID NO:1的CDR1、SEQ ID NO:14的CDR2和SEQ IDNO:3的CDR3。

在另外的具体的实施方案中，本发明的结合剂包含抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列或者与其具有85％、90％或95％序列同一性的氨基酸序列，其中结合剂包含SEQ ID NO:1的CDR1、SEQ ID NO:15的CDR2和SEQ IDNO:3的CDR3。

另一方面，本发明提供了一种结合剂，例如抗体或其抗原结合片段，其与本文所述的结合剂竞争与hCCR8的特异性结合。特别是与具有SEQ ID NO:8、9或10的氨基酸序列的hCCR8单域抗体部分竞争。因此，在具体的实施方案中，本发明提供了非阻断性hCCR8结合剂，其与具有SEQ ID NO:8、9或10的氨基酸序列的单域抗体竞争与hCCR8的特异性结合。使用本领域已知的常规方法，可以容易地确定结合剂是否与本文所述的结合剂竞争与hCCR8的特异性结合。例如，为了确定检测结合剂是否竞争，允许本发明的结合剂在饱和条件下结合hCCR8蛋白。接下来，评价检测结合剂的能力。如果检测结合剂不能与hCCR8蛋白结合，则可以推断检测抗体与本发明的结合剂竞争与hCCR8的特异性结合。

细胞毒性

本发明的另一方面是提供一种具有细胞毒活性的人CCR8结合剂。本文所用的“细胞毒性”或“细胞毒活性”是指结合剂对其所结合的细胞具有毒性的能力。如技术人员从本发明的描述中所明了的，在本发明的上下文中可以使用任何类型的细胞毒性。重要的是本发明的结合剂能够以非阻断方式结合hCCR8并对其所结合的细胞产生毒性。细胞毒性可以是直接细胞毒性，其中结合剂本身直接损伤细胞(例如，因为它包含化疗有效负载)，或者它可以是间接的，其中结合剂诱导导致细胞损伤的细胞外机制(例如，诱导抗体依赖性细胞活性的抗体)。更具体地，本发明的结合剂可向免疫系统发出信号以破坏或消除其所结合的细胞，或者结合剂可携带细胞毒性有效负载以破坏其所结合的细胞。特别地，细胞毒活性归因于细胞毒性部分的存在。此类细胞毒性部分的实例包括诱导抗体依赖性细胞活性(ADCC)、诱导抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)、诱导补体依赖性细胞毒性(CDC)、结合并激活T细胞或包含细胞毒性有效负载的部分。最优选地，所述细胞毒性部分诱导抗体依赖性细胞活性(ADCC)。

抗体依赖性细胞毒性(ADCC)是指细胞介导的反应，其中表达Fc受体的非特异性细胞毒性细胞识别靶细胞上的结合剂并随后导致靶细胞的裂解。表达Fc受体的非特异性细胞毒性细胞的实例包括天然杀伤细胞、嗜中性粒细胞、单核细胞和巨噬细胞。

补体依赖性细胞毒性(CDC)是指在补体存在下靶标的裂解。补体激活途径通过补体系统的第一组分(C1q)与同族抗原复合的结合剂的结合而启动。

抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)是指细胞介导的反应，其中表达Fc受体的吞噬细胞(例如，巨噬细胞)识别靶细胞上的结合剂，从而导致靶细胞的吞噬作用。

可以使用本领域已知的测定来测量CDC、ADCC和ADCP(Vafa等人,Methods2014.1.1；65(1):114-26(2013))。

结合并激活T细胞是指结合与hCCR8不同的T细胞标志物以及由此产生的所述T细胞的激活。T细胞的激活诱导T细胞对本发明的结合剂所结合的细胞的细胞毒活性。因此，在具体的实施方案中，本发明的结合剂结合hCCR8并结合和激活T细胞。例如，细胞毒性部分可结合hCD3。在其他实施方案中，细胞毒性部分包含与hCD3结合的抗体或其抗原结合片段。因此，本发明的结合剂可与hCCR8和hCD3结合。此类结合剂与肿瘤内Treg结合并将T细胞的细胞毒活性引导至这些Treg，从而将它们从肿瘤环境中清除。在具体的实施方案中，本发明的结合剂包含与hCCR8结合的部分以及与hCD3结合的部分，其中至少一个部分是基于抗体的，特别是其中两个部分都是基于抗体的。因此，在具体的实施方案中，本发明提供了一种双特异性构建体，其包含特异性结合hCCR8的抗体或其抗原结合片段以及特异性结合hCD3的抗体或其抗原结合片段。

细胞毒性有效负载是指对与细胞毒性有效负载接触的细胞造成直接损伤作用的任何分子实体。细胞毒性有效负载是本领域技术人员已知的。在具体的实施方案中，细胞毒性有效负载是化学实体。此类细胞毒性有效负载的具体实例包括毒素、化疗剂和放射性同位素或放射性核素。在其他实施方案中，细胞毒性有效负载包含选自以下的药剂：烷化剂、蒽环霉素、细胞骨架破坏剂、埃坡霉素、组蛋白脱乙酰酶抑制剂、拓扑异构酶I抑制剂、拓扑异构酶II抑制剂、激酶抑制剂、核苷酸类似物和前体类似物、肽抗生素、基于铂的药剂、类视色素(retinoid)、长春花生物碱及衍生物、肽或小分子毒素和放射性同位素。可以使用本领域已知的技术将化学实体偶联至蛋白质类抑制剂，例如抗体或抗原结合片段。此类偶联可以是共价或非共价的，并且偶联可以是不稳定的或可逆的。

如本领域所熟知的，IgG抗体的Fc区与几种细胞Fcγ受体(FcγR)相互作用以刺激和调节下游效应物机制。存在五种激活受体，即FcγRI(CD64)、FcγRIIa(CD32a)、FcγRIIc(CD32c)、FcγRIIIa(CD16a)和FcγRIIIb(CD16b)以及一种抑制性受体FcγRIIb(CD32b)。IgG抗体与免疫系统的通讯由FcγR控制和介导，FcγR将抗体感测和收集的信息传递至免疫系统，提供先天性和适应性免疫系统之间的联系，特别是在生物治疗的情况下(Hayes J等人,2016.JInflamm Res 9:209-219)。

IgG亚类结合FcγR的能力不同，并且这种差异结合决定了它们引发一系列功能性应答的能力。例如，在人中，FcγRIIIa是参与抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)的激活的主要受体，并且IgG3与紧随其后的IgG1显示了对该受体的最高亲和力，反映了它们有效诱导ADCC的能力。虽然已显示IgG2对该受体的结合较弱，但也已发现具有人IgG2同型的结合剂可有效清除Treg。

在本发明的优选实施方案中，本发明的结合剂诱导抗体效应功能，特别是人中的抗体效应功能。在具体的实施方案中，本发明的结合剂以高亲和力结合FcγR，优选以高亲和力结合激活受体。优选地，结合剂以高亲和力结合FcγRI和/或FcγRIIa和/或FcγRIIIa。特别优选地，结合剂结合FcγRIIIa。在具体的实施方案中，结合剂以小于约10^-6M、10^-7M、10^--8M、10^--9M、10^--10M、10^--11M、10^--12M或10^-13M的解离常数与至少一种激活的Fcγ受体结合。可以通过几种方式获得FcγR结合。例如，细胞毒性部分可包含可结晶片段(Fc)区部分或其可包含结合部分，例如特异性结合FcγR的抗体或其抗原结合部分。

在具体的实施方案中，细胞毒性部分包含可结晶片段(Fc)区部分。优选地，Fc区部分是来源于IgG1、IgG2、IgG3和IgG4抗体的IgG Fc结构域。更优选地，Fc区部分是来源于人IgG1抗体的IgG Fc结构域。更优选地，Fc区部分是来源于人IgG1抗体的短铰链变体的IgGFc结构域。在具体的实施方案中，Fc区部分包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列或具有至少80％序列同一性(例如，至少85％序列同一性或90％序列同一性)的氨基酸序列。在其他实施方案中，Fc区部分包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列或具有至少95％、96％、97％序列同一性、特别是至少98％序列同一性、更特别是至少99％序列同一性的氨基酸序列。

在一个实施方案中，Fc区部分已被工程化以增加ADCC、CDC和/或ADCP活性。

可以通过减少或消除Fc部分聚糖的岩藻糖部分的方法和/或通过在免疫球蛋白(例如，IgG1)的Fc区域上引入特异性突变(例如，S298A/E333/K334A、S239D/I332E/A330L或G236A/S239D/A330L/I332E)来增加ADCC(Lazar等人，Proc Natl Acad Sci USA 103:2005-2010(2006)；Smith等人，Proc Natl Acad Sci USA 209:6181-6(2012))。也可以通过在人IgG的Fc部分上引入特异性突变来增加ADCP(Richards等人,Mol Cancer Ther 7:2517-27(2008))。在Saunders(Frontiers in Immunology 2019,1296)和Wang等人(Protein Cell2019,9:63-73)中描述了用于工程化结合剂以增加ADCC、CDC和ADCP活性的方法。

在本发明的具体的实施方案中，优化包含Fc区部分的结合剂以引发ADCC应答，即，相对于包含Fc区部分的其他hCCR8结合剂，包括不抑制CCL1与CCR8结合的那些以及例如未修饰的抗CCR8单克隆抗体，ADCC应答得到增强、增加或改善。在一个优选的实施方案中，hCCR8结合剂已经被工程化以引发增强的ADCC应答。

在本发明的一个优选实施方案中，优化包含Fc区部分的结合剂以引发ADCP应答，即，相对于包含Fc区部分的其他hCCR8结合剂，包括不抑制hCCL1与hCCR8结合的那些以及例如未修饰的抗hCCR8单克隆抗体，ADCP应答得到增强、增加或改善。

在另外的实施方案中，细胞毒性部分包含与Fcγ受体结合的部分。更特别地，结合并激活FcγR，特别是激活受体，例如FcγRI和/或FcγRIIa和/或FcγRIIIa，特别是FcγRIIIa。与FcγR结合的部分可以是基于抗体的或基于非抗体的，如上文所述。如果基于抗体，该部分可通过其可变区结合FcγR。

在本发明的其他实施方案中，如上详述的hCCR8结合剂包含至少一个Fc区部分以及如上详述的结合hCCR8的单域抗体部分。

在本发明的一个实施方案中，hCCR8结合剂是经基因工程化的多肽，其包含至少一个Fc区部分以及结合hCCR8的单域抗体部分，两者通过直接键连接在一起。

在另外的实施方案中，hCCR8结合剂是经基因工程化的多肽，其包含至少一个Fc区部分以及结合hCCR8的单域抗体部分，两者通过直接键或接头连接在一起。优选地，接头是肽接头。优选地，接头是具有主要由甘氨酸(G)和丝氨酸(S)残基延伸段组成的氨基酸序列的柔性接头(即所谓的“GS”或“GlySer”接头)。在其他实施方案中，肽接头中至少80％、特别是至少85％、更特别是至少90％的氨基酸残基选自甘氨酸和丝氨酸。在一个优选的实施方案中，肽接头中至少95％的氨基酸残基选自甘氨酸和丝氨酸。在另外的具体的实施方案中，肽接头包含1至50个氨基酸，例如1至40个，特别是1至30个。在具体的实施方案中，5至25个氨基酸，优选8至22个氨基酸，例如10至20个氨基酸。此类GS接头的优选实例包含GGGGS(SEQID NO:20)的序列。在此类接头中，可以将SEQ ID NO:20的序列重复“n”次以优化GS接头的长度，从而实现结合剂的适当性质，使得接头的序列将是(SEQ ID NO:20)_n的序列。通常拷贝数“n”的范围为1至10、或2至4。Fc区部分和/或单域抗体部分区域的氨基酸序列可以被人源化以降低对人的免疫原性。

因此，在具体的实施方案中，本发明的hCCR8结合剂具有式B-L-C；其中B是指如本文所述的hCCR8结合部分，L是指如本文所述的接头，且C是指如本文所述的细胞毒性部分。从本文的公开内容可以理解，优选B包含结合hCCR8的单域抗体部分，L是直接键或具有序列(SEQ ID NO:20)_n，其中n是1至10的整数，且C是Fc区部分。

在一个实施方案中，本发明的hCCR8结合剂具有式B-L-C，其中B是对应于SEQ IDNO:8、9或10的单域抗体部分，L是对应于(SEQ ID NO:20)_n的接头，其中“n”的范围为1至10，且C是Fc区部分。

优选地，本发明的hCCR8结合剂具有式B-L-C，其中B是对应于SEQ ID NO:8、9或10的单域抗体部分，L是对应于(SEQ ID NO:20)_n的接头，其中“n”是2或4，且C是来源于人IgG1抗体的短铰链变体的IgG Fc结构域。

更优选地，如上详述的所述hCCR8结合剂包含对应于SEQ ID NO:21至26中任一个的氨基酸序列。

在其他实施方案中，本发明的hCCR8结合剂具有式B-C，其中B是对应于SEQ ID NO:8、9或10的单域抗体部分，且C是Fc区部分。

优选地，本发明的hCCR8结合剂具有式B-C，其中B是对应于SEQ ID NO:8、9或10的单域抗体部分，且C是来源于人IgG1抗体的短铰链变体的IgG Fc结构域。

更优选地，如上详述的所述hCCR8结合剂包含对应于SEQ ID NO:27至29中任一个的氨基酸序列。

在其他实施方案中，本发明提供了编码本文定义的hCCR8结合剂的核酸分子。在一些实施方案中，此类提供的核酸分子可以含有密码子优化的核酸序列。在另外的实施方案中，核酸被包括在合适的核酸载体内的表达盒中，用于在宿主细胞(例如，细菌、酵母、昆虫、鱼、鼠、猿或人细胞)中表达。在一些实施方案中，本发明提供了包含表达所需结合剂的异源核酸分子(例如，DNA载体)的宿主细胞。

在具体的实施方案中，本发明的结合剂作为治疗性核酸施用。本文所用的术语“治疗性核酸”是指当引入真核生物体(例如，哺乳动物如人)时具有治疗效果的任何核酸分子，并且包括编码本发明的结合剂的DNA和RNA分子。如本领域技术人员已知的，核酸可以包含诱导核酸的转录和/或翻译或增加核酸的体外和/或体内稳定性的元件。

在一些实施方案中，本发明提供了制备如上定义的分离的hCCR8结合剂的方法。在一些实施方案中，此类方法可以包含培养宿主细胞，该宿主细胞包含核酸(例如，可以包含和/或通过载体递送至宿主细胞的异源核酸)。优选地，宿主细胞(和/或异源核酸序列)被排列并构建，使得结合剂从宿主细胞中分泌并从细胞培养物上清液中分离。

治疗

具有本文所述特征的hCCR8结合剂代表本发明的另一个目的。hCCR8结合剂可用作药物。在其他实施方案中，本发明提供了一种治疗个体疾病的方法，其包含施用具有细胞毒活性的非阻断性hCCR8结合剂，特别是具有细胞毒活性的hCCR8结合剂，其不抑制hCCL1与hCCR8的结合或hCCL1经由hCCR8的信号传导。优选地，疾病是癌症，特别是实体瘤。

在本发明的一个优选实施方案中，本文所述的本发明的方面的个体是哺乳动物，优选猫、狗、马、驴、绵羊、猪、山羊、牛、仓鼠、小鼠、大鼠、兔或豚鼠，但最优选个体是人。因此，在本文所述的本发明的所有方面中，个体优选是人。

如本文所用，术语“癌症”、“癌性的”或“恶性的”是指或描述哺乳动物的通常表征为不受调节的细胞生长的生理状况。

如本文所用，术语“肿瘤”当应用于诊断患有或疑似患有癌症的个体时，是指任何大小的恶性或潜在恶性肿瘤或组织块，并且包括原发性肿瘤和继发性肿瘤。术语“癌症”、“恶性肿瘤”、“赘生物”、“肿瘤”和“癌”在本文中也可互换使用，是指表现出异常生长表型的肿瘤和肿瘤细胞，该异常生长表型表征为细胞增殖控制的显著丧失。通常，用于治疗的目的细胞包括癌前(例如，良性)、恶性、转移前、转移和非转移细胞。本发明的教导可以与任何肿瘤及所有肿瘤相关。

肿瘤的实例包括但不限于癌、淋巴瘤、白血病、胚细胞瘤和肉瘤。此类癌症的更具体实例包括鳞状细胞癌、骨髓瘤、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、神经胶质瘤、肝细胞癌(HCC)、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、急性骨髓性白血病(AML)、间变性大细胞淋巴瘤(ALCL)、皮肤T细胞淋巴瘤(CTCL)、成人T细胞白血病/淋巴瘤(ATLL)、多发性骨髓瘤、胃肠(道)癌、肾癌、卵巢癌、肝癌、成淋巴细胞性白血病、淋巴细胞性白血病、结直肠癌、子宫内膜癌、肾癌、前列腺癌、甲状腺癌、黑色素瘤、软骨肉瘤、成神经细胞瘤、胰腺癌、多形性成胶质细胞瘤、宫颈癌、脑癌、胃癌、膀胱癌、肝细胞瘤、乳腺癌、结肠癌和头颈癌。

在一个方面，肿瘤涉及实体瘤。实体瘤的实例是肉瘤(包括由组织(例如，松质骨、软骨、脂肪、肌肉、血管、造血或纤维结缔组织)中的间充质来源的转化细胞产生的癌症)、癌(包括由上皮细胞产生的肿瘤)、间皮瘤、成神经细胞瘤、成视网膜细胞瘤等。涉及实体瘤的肿瘤包括但不限于脑癌、肺癌、胃癌、十二指肠癌、食道癌、乳腺癌、结直肠癌、肾癌、膀胱癌、肾癌、胰腺癌、前列腺癌、卵巢癌、黑色素瘤、口腔癌、肉瘤、眼癌、甲状腺癌、尿道癌、阴道癌、颈癌、淋巴瘤等。

在另外的具体的实施方案中，肿瘤选自乳腺浸润性癌、结肠腺癌、头颈部鳞状细胞癌、胃腺癌、肺腺癌(NSCLC)、肺鳞状细胞癌(NSCLC)、肾透明细胞癌、皮肤黑色素瘤、食管癌、宫颈癌、肝细胞癌、默克尔细胞癌(Merkel cell carcinoma)、小细胞肺癌(SCLC)、经典霍奇金淋巴瘤(cHL)、尿道上皮癌、微卫星高度不稳定性(MSI-H)癌和错配修复缺陷型(dMMR)癌。

在其他实施方案中，肿瘤选自乳腺癌、子宫体癌、肺癌、胃癌、头颈部鳞状细胞癌、皮肤癌、结直肠癌和肾癌。在其他实施方案中，肿瘤选自乳腺浸润性癌、结肠腺癌、头颈部鳞状细胞癌、胃腺癌、肺腺癌(NSCLC)、肺鳞状细胞癌(NSCLC)、肾透明细胞癌和皮肤黑色素瘤。在一个方面，癌症涉及表达CCR8的肿瘤，包括但不限于乳腺癌、子宫体癌、肺癌、胃癌、头颈部鳞状细胞癌、皮肤癌、结直肠癌和肾癌。在具体的实施方案中，肿瘤选自乳腺癌、结肠腺癌和肺癌。

在具体的实施方案中，肿瘤是T细胞淋巴瘤，特别是表达CCR8的T细胞淋巴瘤，包括但不限于成人T细胞白血病/淋巴瘤(ATLL)、皮肤T细胞淋巴瘤(CTCL)和间变性大细胞淋巴瘤(ALCL)。

在其他实施方案中，肿瘤是携带涉及6p25.3上的DUSP22-IRF4基因座的复发性染色体重排(即所谓的DUSP22重排)的肿瘤。优选地，肿瘤是携带DUSP22重排的淋巴瘤。

如本文所用，术语“施用”是指向生理系统(例如，个体或体内、体外或离体细胞、组织和器官)给予药物、前药、抗体或其他药剂或治疗性处理的行为。施用于人体的示例性途径可以是通过口(口服)、皮肤(经皮)、口腔粘膜(含服)、耳部、通过注射(例如，静脉内、皮下、瘤内、腹膜内等)等。术语本发明的结合剂的施用包括结合剂的直接施用以及通过施用编码结合剂的核酸的间接施用，使得结合剂由个体中的核酸产生。因此，施用结合剂包括导致体内产生结合剂的DNA和RNA治疗方法。

本文所用的“治疗(以及其各种词性)”肿瘤定义为实现至少一种治疗效果，例如肿瘤细胞数目减少、肿瘤大小减小、癌细胞浸润入周围器官的速率减小、或者肿瘤转移或肿瘤生长的速率减小。如本文所用，术语“调节”是指化合物影响(例如，促进或治疗)细胞功能的方面的活性，包括但不限于细胞生长、增殖、侵袭、血管生成、凋亡等。

可以通过多种方式测量癌症的积极治疗效果(例如，Weber(2009)J Nucl Med 50,1S-10S)。举例来说，相对于肿瘤生长抑制，根据国家癌症研究所(NCI)标准，T/C≤42％是抗肿瘤活性的最低水平。T/C<10％被认为是高抗肿瘤活性水平，其中T/C(％)＝治疗的肿瘤体积中位数/对照的肿瘤体积中位数×100。在一些实施方案中，通过治疗有效量实现的治疗是无进展生存期(PFS)、无疾病生存期(DFS)或总生存期(OS)中的任一种。PFS也称为“肿瘤进展时间(Time to Tumour Progression)”，表示在治疗期间和治疗之后癌症不生长的时间长度，并且包括患者经历完全应答或部分应答的时间量，以及患者经历稳定疾病的时间量。DFS是指治疗期间和治疗之后患者保持无疾病的时间长度。OS是指与未处理的(naive)或未治疗的(untreated)个体或患者相比预期寿命的延长。

本文所用的“预防(prevention或prophylaxis)”是指延迟或预防癌症症状的发作。预防可以是绝对的(使得没有疾病发生)或可以仅在一些个体中或在有限的时间内有效。

在本发明的一个优选方面，个体患有已确立的肿瘤，即，个体已经患有例如被分类为实体肿瘤的肿瘤。因此，当个体已经患有肿瘤(例如，实体瘤)时，可以使用本文所述的本发明。因此，本发明提供了一种可用于治疗现有肿瘤的治疗选择。在本发明的一个方面，个体患有现有的实体瘤。本发明可以用于预防或优选治疗患有实体瘤的个体。在一个方面，本发明不用于预防或防止。

在一个方面，例如与其他癌症治疗(例如，用于给定癌症的护理标准治疗)相比，使用本文所述的本发明可增强肿瘤消退、可减弱或减少肿瘤生长、和/或可增加存活时间。

在本发明的一个方面，本文所述的治疗或预防肿瘤的方法还包含鉴定患有肿瘤的个体、优选鉴定患有实体瘤的个体的步骤。

有效治疗患有肿瘤的患者的本文所述疗法的剂量方案可根据例如患者的疾病状态、年龄和体重以及疗法在个体中引发抗癌应答的能力等因素而变化。适当剂量的选择将处于本领域技术人员的能力范围内。例如0.01、0.1、0.3、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40或50mg/kg。在一些实施方案中，此类数量是适合于根据给药方案施用的单位剂量(或其整个部分)，该给药方案已被确定为当施用于相关群体时与期望的或有益的结果相关(即，使用治疗性给药方案)。

如本文所述的根据本发明的任何方面的结合剂或编码其的核酸可以是药物组合物的形式，其另外包含药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。如本文所用，术语“药学上可接受的载体”或“药学上可接受的赋形剂”包括当与活性成分组合时允许该成分保持生物活性的任何材料。药学上可接受的载体增强或稳定组合物或可用于促进组合物的制备。药学上可接受的载体包括溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等，它们是生理学上相容的，如本领域技术人员已知的(参见，例如，Remington'sPharmaceutical Sciences,第18版,Mack印刷公司,1990,第1289-1329页；Remington:TheScience and Practice of Pharmacy,第21版,英国医药出版社2011；及其后续版本)。所述药学上可接受的载体的非限制性实例包含任何标准药物载体，例如，磷酸盐缓冲盐水溶液、水、乳液如油/水乳液，以及各种类型的润湿剂。因此，本发明还提供了本发明的结合剂在制备用于治疗肿瘤的药物中的用途。

这些组合物包括例如液体、半固体和固体剂型，例如液体溶液(例如，可注射和可输注溶液)、分散体或悬浮液、片剂、丸剂或脂质体。在一些实施方案中，优选的形式可取决于预期的施用模式和/或治疗应用。含有本发明的结合剂或核酸的药物组合物可以通过本领域已知的任何合适的方法施用，包括但不限于口服、粘膜、吸入、局部、口腔、鼻、直肠或肠胃外(例如，静脉内、输注、瘤内、结节内、皮下、腹膜内、肌内、皮内、经皮或其他类型的施用，涉及个体组织的物理破坏以及通过组织中的破坏而施用药物组合物)。此类制剂可以是例如适于皮内、瘤内或皮下施用或静脉内输注的可注射或可输注溶液的形式。在具体的实施方案中，结合剂或核酸经静脉内施用。施用可以包括间歇给药。可选地，施用可包括在至少选定的时间段内、与其他化合物同时或在其他化合物施用之间连续给药(例如，灌注)。

本发明的制剂通常包含治疗有效量的如本发明的结合剂。“治疗水平”、“治疗有效量”或“治疗量”是指适于安全治疗病症以减少或预防病症症状的活性剂的施用量或浓度。

在一些实施方案中，结合剂可以与保护其免于快速释放和/或降解的载体(例如，控释制剂如植入物、经皮贴剂和微囊化递送系统)一起制备。可以使用生物可降解的、生物相容的聚合物。

本领域技术人员将理解，例如，递送途径(例如，口服、静脉内、皮下、瘤内等)可影响剂量和/或所需剂量可影响递送途径。例如，当关注特定位点或位置(例如，肿瘤内)的特别高的药剂浓度时，聚焦递送(例如，在该实例中，瘤内递送)可能是期望的和/或有用的。当针对给定治疗方案优化途径和/或给药方案时，要考虑的其他因素可包括例如所治疗的特定癌症(例如，类型、阶段、位置等)、个体的临床状况(例如，年龄、整体健康状况等)、存在或不存在组合疗法、以及执业医师已知的其他因素。

药物组合物通常应该是无菌的并且在制造和储存条件下是稳定的。组合物可以配制成溶液、微乳液、分散体、脂质体或其他适于高药物浓度的有序结构。可通过将所需量的结合剂与上文列举的成分中的一种或组合(视需要)一起掺入适当溶剂中，接着过滤灭菌，来制备无菌可注射溶液。用于肠胃外施用的制剂包括但不限于悬浮液、溶液、在油性或水性媒介物中的乳液、糊剂、以及如本文所讨论的可植入的持续释放或可生物降解的制剂。可使用无毒的肠胃外可接受的稀释剂或溶剂来制备无菌可注射制剂。根据本发明使用的每种药物组合物可以包括药学上可接受的分散剂、润湿剂、助悬剂、等渗剂、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、载体、赋形剂、盐或稳定剂，其在使用的剂量和浓度下对个体无毒。优选地，此类组合物还可以包含用于治疗癌症的药学上可接受的载体或赋形剂，其与给定的方法和/或施用部位相容，例如用于肠胃外(例如，皮下、皮内或静脉内注射)、瘤内或瘤周施用。

虽然根据本发明用于用途的治疗方法或组合物的实施方案不一定能有效地在每个个体中实现积极的治疗效果，但是它应该在使用药物组合物和给药方案中实现，其符合良好的医学实践并且具有通过本领域已知的任何统计学检验如Student t检验、X²检验、根据Mann和Whitney的U检验、Kruskal-Wallis检验(H检验)、Jonckheere-Terpstra检验和Wilcoxon检验确定的统计学显著的个体数量。

当在上文和随后提及肿瘤、肿瘤疾病、癌或癌症时，无论肿瘤和/或转移的位置如何，也可选地或附加地暗示位于原始器官或组织和/或任何其他位置中的转移。

如本文所讨论的，本发明涉及清除调节性T细胞(Treg)。因此，在本发明的一个方面，用具有细胞毒活性的非阻断性CCR8结合剂进行治疗清除或减少了调节性T细胞，尤其是肿瘤浸润性调节性T细胞。在一个方面，经由ADCC进行清除。在另一方面，经由CDC进行清除。在另一方面，经由ADCP进行清除。

因此，本发明提供了一种用于清除个体肿瘤中的调节性T细胞的方法，其包含向所述个体施用具有细胞毒活性的非阻断性CCR8结合剂。在一个优选的实施方案中，Treg在实体瘤中被清除。“清除”是指相对于未施用具有细胞毒活性非阻断性CCR8结合剂时，Treg的数量、比例或百分比降低。在本文所述的本发明的具体的实施方案中，超过约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或99％的肿瘤浸润性调节性T细胞被清除。

如本文所用，“调节性T细胞”(“Treg”、“Treg细胞”或“Tregs”)是指专门控制自身免疫、变态反应和感染的CD4+T淋巴细胞谱系。通常，它们调节T细胞群的活性，但它们也可影响某些先天免疫系统细胞类型。通常通过生物标志物CD3、CD4、CD25和CD127或Foxp3的表达来鉴定Treg。天然存在的Treg细胞通常构成外周CD4+T淋巴细胞的约5-10％。然而，在肿瘤微环境(即，肿瘤浸润性Treg细胞)中，它们最高可以占总CD4+T淋巴细胞群的20-30％。

激活的人Treg细胞可通过穿孔素或颗粒酶B依赖性途径直接杀死靶细胞，例如效应T细胞和APC；细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA4+)Treg细胞通过APC诱导吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)表达，这些通过减少色氨酸进而抑制T细胞激活；Treg细胞可在体内释放白介素10(IL-10)和转化生长因子(TGFβ)，从而通过抑制MHC分子CD80、CD86和IL-12的表达，直接抑制T细胞激活并抑制APC功能。Treg细胞还可以通过表达高水平的CTLA4来抑制免疫，CTLA4可以结合抗原呈递细胞上的CD80和CD86并防止效应T细胞的适当激活。此外，已知Treg细胞表达高水平的CD25，从而与IL2竞争结合CD8并减少CD8诱导的增殖和存活。

在本发明的一个优选实施方案中，实体瘤中效应T细胞与调节性T细胞的比率在施用本发明的结合剂后增加。在一些实施方案中，实体瘤中效应T细胞与调节性T细胞的比率增加至5、10、15、20、40或80以上。

免疫效应细胞是指参与免疫应答的效应阶段的免疫细胞。示例性免疫细胞包括骨髓或淋巴来源的细胞，例如淋巴细胞(例如，B细胞和T细胞，包括溶细胞性T细胞(CTL))、杀伤细胞、天然杀伤细胞、巨噬细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞、嗜中性粒细胞、多形核细胞、粒细胞、肥大细胞和嗜碱性粒细胞。

参与免疫应答的效应期的免疫效应细胞表达特异性Fc受体并执行特异性免疫功能。效应细胞可诱导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)，例如能够诱导ADCC的嗜中性粒细胞。例如，表达FcaR的单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和淋巴细胞参与靶细胞的特异性杀伤以及将抗原呈递给免疫系统的其他组分，或与呈递抗原的细胞结合。效应细胞还可以吞噬靶抗原、靶细胞或微生物。如本文所述，本发明的抗体可针对诱导ADCC的能力进行优化。

在优选的实施方案中，用于清除Treg的方法和组合物对Treg是特异性的，对其他T细胞没有影响。在其他实施方案中，与其他Treg相比，本发明的方法和组合物更大程度地清除了肿瘤浸润性Treg。在其他实施方案中，与循环Treg相比，本发明的方法和组合物更大程度地清除了肿瘤浸润性Treg。在另外的实施方案中，与正常组织浸润性Treg(例如，肠道Treg)相比，本发明的方法和组合物更大程度地清除了肿瘤浸润性Treg。优选通过比较未治疗和已治疗的细胞群的减少百分比，来比较细胞群的清除程度，例如实施例中所示。

在其他具体的实施方案中，本发明的方法和组合物降低了Treg与T细胞的比率，特别是肿瘤中Treg与T细胞的比率。在其他实施方案中，与肿瘤外Treg与T细胞的比率相比，本发明的方法和组合物更大程度地降低了肿瘤中Treg与T细胞的比率。在另外的实施方案中，与正常组织(特别是肠组织)中Treg与T细胞的比率相比，本发明的方法和组合物更大程度地降低了肿瘤中Treg与T细胞的比率。

在本发明的另一方面，用具有细胞毒活性的hCCR8结合剂或编码如本文所述的hCCR8结合剂的核酸进行治疗可清除或减少任何类型的表达hCCR8的细胞。优选地，细胞是表达hCCR8的肿瘤细胞。因此，本发明提供了一种用于清除个体中的细胞(优选肿瘤细胞)的方法，其包含向所述个体施用具有细胞毒活性的hCCR8结合剂或编码如本文所述的hCCR8结合剂的核酸。

在一些实施方案中，可以通过相同或不同的递送途径和/或根据不同的时间表将不同的抗癌药剂与本发明的结合剂组合施用。可选地或附加地，在一些实施方案中，第一活性剂的一个或多个剂量与一种或多种其他活性剂基本上同时施用，并且在一些实施方案中经由共同途径和/或作为与一种或多种其他活性剂的单一组合物的一部分施用。本领域技术人员还将理解，根据本发明提供的组合疗法的一些实施方案实现协同作用；在一些此类实施方案中，当在不同的治疗方案(例如，作为单一疗法和/或作为不同组合疗法的一部分)中使用药剂时，组合中使用的一种或多种药剂的剂量可以与标准的、优选的或必要的剂量实质上不同(例如，更低)和/或可以通过替代途径递送。

在一些实施方案中，当根据本发明使用两种或更多种活性剂时，此类活性剂可以同时或按顺序施用。在一些实施方案中，一种药剂的施用相对于另一种药剂的施用是特定定时的。例如，在一些实施方案中，施用第一药剂使得观察到特定作用(或预期观察到，例如基于显示给定给药方案与关注的特定作用之间的相关性的群体研究)。在一些实施方案中，组合施用的药剂的期望的相对给药方案可凭经验评估或确定，例如使用离体、体内和/或体外模型；在一些实施方案中，在体内、在患者群体中(例如，以便建立相关性)、或可选地在关注的特定患者中进行此类评估或经验确定。

在本发明的另一方面，当与免疫检查点抑制剂组合时，非阻断性hCCR8结合剂具有改善的治疗效果。具有非阻断性hCCR8结合剂和免疫检查点抑制剂的组合疗法可以在已确立的肿瘤的治疗中具有协同作用。因此，可以阻断PD-1受体与PD-L1配体之间的相互作用，导致“PD-1阻断”。在一个方面，例如与单独施用检查点抑制剂相比，使用如本文所述的本发明，该组合可导致增强的肿瘤消退、增强的肿瘤生长的损伤或减少和/或可增加存活时间。因此，在本发明的一个具体方面，本发明提供了本发明的hCCR8结合剂，其用于治疗肿瘤，其中治疗还包含施用免疫检查点抑制剂。

如本文所用，“免疫检查点”或“免疫检查点蛋白”是指属于免疫系统中的抑制性途径、特别是用于调节性T细胞应答的蛋白。在正常生理条件下，免疫检查点对于预防自身免疫至关重要，尤其是在对病原体的应答期间。癌细胞可以改变免疫检查点蛋白表达的调节以避免免疫监视。

免疫检查点蛋白的实例包括但不限于PD-1、CTLA-4、BTLA、KIR、CD155、B7H4、VISTA和TIM3，以及OX40、GITR、4-1BB和HVEM。免疫检查点蛋白还可以指结合其他免疫检查点蛋白的蛋白。此类蛋白包括PD-L1、PD-L2、CD80、CD86、HVEM、LLT1和GAL9。

“免疫检查点蛋白抑制剂”、“免疫检查点抑制剂”或“检查点抑制剂”是指可以干扰由免疫检查点蛋白介导的信号传导和/或蛋白-蛋白相互作用的任何分子。在本发明的一个方面，免疫检查点蛋白是PD-1或PD-L1。在本文所述的本发明的一个优选方面，免疫检查点抑制剂经由抗PD-1或抗PD-L1抗体干扰PD-1/PD-L1相互作用。

在另外的具体的实施方案中，免疫检查点是CTLA-4(也称为CTLA4、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4或CD152)，并且免疫检查点抑制剂是CTLA-4的抑制剂。在具体的实施方案中，本发明的结合剂用于治疗肿瘤，其中治疗还包含施用CTLA-4抑制剂，特别是抗CTLA-4抗体，特别是阻断性抗CTLA-4抗体。本发明的抗CTLA-4抗体可以结合人CTLA-4上的表位，以便抑制CTLA-4与人B7反受体(counter-receptor)相互作用。因为人CTLA-4与人B7的相互作用转导导致携带人CTLA-4受体的T细胞失活的信号，拮抗该相互作用有效地诱导、增强或延长了携带人CTLA-4受体的T细胞的激活，从而延长或增强了免疫应答。抗CTLA-4抗体描述于美国专利号5,811,097；5,855,887；6,051,227；PCT申请公开号WO 01/14424和WO 00/37504；以及美国专利公开号2002/0039581中。为了描述抗CTLA-4抗体的目的，将这些参考文献中的每一篇具体引入本文作为参考。示例性的临床抗CTLA-4抗体是人单克隆抗体10D1，如WO01/14424和美国专利申请序列号09/644,668所述；抗体10D1以单剂量和多剂量单独或与疫苗、化学疗法或白介素2组合施用于超过500名诊断患有转移性黑色素瘤、前列腺癌、淋巴瘤、肾细胞癌、乳腺癌、卵巢癌和HIV的患者。本发明方法包括的其他抗CTLA-4抗体包括例如以下文献中公开的那些：WO 98/42752；WO 00/37504；美国专利号6,207,156；Hurwitz等人,(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95(17):10067-10071；Camacho等人,(2004)J.Clin.Oncology 22(145):摘要编号2505(抗体CP-675206)；以及Mokyr等人,(1998)Cancer Res.58:5301-5304。在某些实施方案中，本发明的方法包含使用抗CTLA-4抗体，该抗体是人序列抗体，优选单克隆抗体，并且在另外的实施方案中是单克隆抗体10D1。在另外的具体的实施方案中，CTLA-4抑制剂是伊匹单抗(ipilimumab)或曲美木单抗(tremelimumab)。

PD-1(程序性细胞死亡蛋白1)也称为CD279，是在激活的T细胞和B细胞上表达的细胞表面受体。已经显示，与其配体的相互作用在体外和体内减弱了T细胞应答。PD-1结合两种配体，PD-L1和PD-L2。PD-1属于免疫球蛋白超家族。PD-1信号传导需要结合到与由主要组织相容性复合物(MHC)呈递的肽抗原非常接近的PD-1配体(Freeman,Proc Natl Acad SciUSA 105,10275-6(2008))。因此，防止PD-1和TCR在T细胞膜上共连接的蛋白、抗体或小分子是有用的PD-1拮抗剂。

在一个实施方案中，PD-1受体拮抗剂是抗PD-1抗体或其抗原结合片段，其特异性结合PD-1并阻断PD-L1与PD-1的结合。抗PD-1抗体可以是单克隆抗体。抗PD-1抗体可以是人或人源化抗体。抗PD-1抗体是能够特异性结合PD-1受体的抗体。本领域已知且适用于本发明的抗PD-1抗体包括纳武单抗、派姆单抗(pembrolizumab)、匹地利珠单抗(pidilizumab)、BMS-936559和托瑞普利单抗(toripalimab)。

本发明的PD-1拮抗剂还包括结合和/或阻断PD-1配体以干扰或抑制配体与PD-1受体结合、或直接结合并阻断PD-1受体而不诱导通过PD-1受体的抑制性信号转导的化合物或药剂。特别地，PD-1拮抗剂包括PD-1/PD-L1信号传导途径的小分子抑制剂。可选地，PD-1受体拮抗剂可直接结合PD-1受体而不触发抑制性信号转导，并且还结合PD-1受体的配体以减少或抑制配体触发通过PD-1受体的信号转导。通过减少与PD-1受体结合并触发抑制性信号转导的配体的数目和/或量，更少的细胞被PD-1信号转导递送的负信号衰减，并且可以实现更强健的免疫应答。

在一个实施方案中，PD-1受体拮抗剂是抗PD-L1抗体或其抗原结合片段，其特异性结合PD-L1并阻断PD-L1与PD-1的结合。抗PD-L1抗体可以是单克隆抗体。抗PD-L1抗体可以是人抗体或人源化抗体，例如阿替利珠单抗(atezolizumab)(MPDL3280A)或阿维单抗(avelumab)。

本文所述的本发明的任何方面可以与附加的治疗剂、特别是附加的癌症疗法组合进行。特别地，根据本发明的hCCR8结合剂以及任选地免疫检查点抑制剂可以与共刺激抗体、化学疗法和/或放射疗法(通过向身体外部施加辐射或通过施用放射性共轭化合物)、基于细胞因子的疗法、靶向疗法、单克隆抗体疗法或其任何组合组合施用。

本文所用的用于组合疗法的化疗实体是指对细胞具有破坏性的实体，即降低细胞活力的实体。化疗实体可以是细胞毒性药物。预期的化学治疗剂包括但不限于烷化剂、蒽环类、埃坡霉素、亚硝基脲、乙烯亚胺/甲基三聚氰胺、烷基磺酸酯、烷化剂、抗代谢物、嘧啶类似物、表鬼臼毒素类、酶(例如，L-天冬酰胺酶)；生物应答调节剂，例如IFN-γ、IL-2、IL-12和G-CSF；铂配位络合物(例如，顺铂、奥沙利铂和卡铂)、蒽二酮类、取代脲(例如，羟基脲)、甲基肼衍生物(包括N-甲基肼(MIH)和丙卡巴肼)、肾上腺皮质抑制剂(例如，米托坦(o,p'-DDD)和氨鲁米特；激素和拮抗剂，包括肾上腺糖皮质激素拮抗剂，例如泼尼松及等效物、地塞米松和氨鲁米特；孕激素，例如己酸羟孕酮、醋酸甲羟孕酮和醋酸甲地孕酮；雌激素，例如二乙基己烯雌酚和乙炔雌二醇等效物；抗雌激素药，例如他莫昔芬；雄激素，包括丙酸睾酮和氟甲睾酮/等效物；抗雄激素药，例如氟他胺、促性腺激素释放激素类似物和亮丙瑞林；以及非甾族抗雄激素药，例如氟他胺。

附加的癌症疗法可以是降低外周和肿瘤微环境内的免疫调节的其他抗体或小分子试剂，例如靶向TGFβ途径、IDO(吲哚胺脱氧酶)、精氨酸酶和/或CSF1R的分子。

“组合”施用另一疗法或包含施用另一疗法的治疗可以指在施用根据本发明的任何方面之前、同时或之后施用另外的疗法。因此，组合治疗可以同时、分开或按顺序施用。

在另外的实施方案中，本发明提供了一种试剂盒，其包含任何上述结合剂。在一些实施方案中，试剂盒还含有药学上可接受的载体或赋形剂。在其他相关实施方案中，试剂盒中的上述组合的任何组分以单位剂量存在，特别是如本文所述的剂量。还在其他实施方案中，试剂盒包括用于向个体施用任何组分或上述组合的说明书。在具体的实施方案中，试剂盒包含如本文所述的hCCR8结合剂和免疫检查点抑制剂，例如PD-1或PD-L1抑制剂。hCCR8结合剂和免疫检查点抑制剂可以存在于相同或不同的组合物中。

在一个具体的实施方案中，本发明提供了一种包装，其包含如本文所述的结合剂，其中该包装还包含说明书，该说明书具有将该结合剂施用于同时接受免疫检查点抑制剂治疗的肿瘤患者的说明。

诊断

本文所述的hCCR8结合剂还可用于预测、诊断、预后和/或监测个体的疾病或病症。在具体的实施方案中，本发明提供了一种用于监测表达hCCR8的细胞群的方法，该方法包含使细胞群与hCCR8结合剂接触，其不抑制hCCL1与hCCR8的结合或hCCL1经由hCCR8的信号传导，如本文所公开的。在其他实施方案中，本发明提供了如本文所述的非阻断性hCCR8结合剂作为伴侣诊断剂在用于治疗个体疾病的方法中的用途，所述方法包含向所述个体施用hCCL1。

如本文所用，术语“诊断及其各种词性形式(diagnosing或diagnosis)”通常是指基于症状和体征和/或由各种诊断程序的结果(例如，由知道所诊断的疾病或病症的一种或多种生物标志物特征的存在、不存在和/或量)识别、决定或推断个体中的疾病或病症的过程或行为。如本文所用，个体中的“疾病的诊断”可特别意指个体患有所述疾病，因此被诊断为患有所述疾病。如本文所教导的，个体可被诊断为不患有所述疾病，尽管显示了一种或多种其提醒的常规症状或体征。

如本文所用，术语“预后及其各种词性形式(prognosticating或prognosis)”通常是指对疾病或病症的进展和恢复的前景(例如，概率、持续时间和/或程度)的预期。疾病的良好预后通常可以包括优选在可接受的时间段内从所述疾病中令人满意的部分或完全恢复的预期，。所述疾病的良好预后更通常地可以包括优选在给定时间段内不进一步恶化或加重病症的预期。疾病的不良预后通常可以包括预期低于标准的恢复和/或不令人满意的缓慢恢复，或基本上没有恢复或甚至进一步恶化所述疾病。

在一个方面，本发明涉及根据本发明的非阻断性hCCR8结合剂，其用于诊断、预测和/或预后与人CCR8的表达和/或活性变化相关的疾病的方法中。换言之，本发明提供了一种用于诊断、预测和/或预后个体中与CCR8的表达和/或活性变化相关的疾病的(体外)方法，其中该方法包含测量来自个体的样品中CCR8的量。

在另一方面，本发明涉及根据本发明的非阻断性hCCR8结合剂，其用于诊断、预测和/或预后与人CCL1的表达和/或活性变化相关的疾病的方法中。换言之，本发明提供了一种用于诊断、预测和/或预后个体中与CLL1的表达和/或活性变化相关的疾病的(体外)方法，其中该方法包含测量来自个体的样品中CCR8的量。

根据另一方面，本发明涉及一种用于诊断、预测和/或预后与CCR8和/或CCL1的表达和/或活性变化相关的疾病的试剂盒，该试剂盒包含通过使用如本文所述的非阻断性hCCR8结合剂测量hCCR8的量的工具。根据一个优选的实施方案，所述试剂盒包含从未患有所述疾病的个体或具有所述疾病的已知诊断、预测和/或预后的个体获得的参考对照。

在一个实施方案中，如上所述的hCCR8结合剂可以有利地固定在固相或载体上。

所述试剂盒还可以包含已知量或浓度的hCCR8和/或其片段，例如用作对照、标准品和/或校准品。它还可以包含用于从个体收集样品的装置。

本发明的结合剂(特别是本文所述的缺乏细胞毒活性的结合剂)的优点是它们适于体内诊断用途。由于它们是非阻断性的并且在不存在细胞毒性部分的情况下，本发明的结合剂可以被施用于个体而不影响治疗性处理。例如，本文所述的单域抗体部分如上文和实施例中指定的VHH分子，可以在患者经受如抗癌药物治疗(例如，Treg清除疗法)时例如为了成像目的而施用。非阻断性和非细胞毒性结合剂可用于成像目的，例如用于监测有效表达CCR8的Treg清除。因此，在具体的实施方案中，本发明提供了一种CCR8结合剂，其包含本文所述的CCR8结合部分和可检测标记。可检测标记可以使用例如放射性、光学、磁共振和超声方法进行检测。在具体的实施方案中，可检测标记是荧光标记。在具体的实施方案中，本发明的CCR8结合剂(优选缺乏细胞毒性部分)用于监测非竞争性CCR8结合剂疗法。在另外的实施方案中，本发明的CCR8结合剂(优选缺乏细胞毒性部分)用于监测使用抗CCR8抗体的治疗，所述抗CCR8抗体是阻断性hCCR8结合剂。特别地，作为阻断性hCCR8结合剂的抗CCR8抗体是WO2020138489 A1中公开的抗体之一，更特别是WO2020138489 A1中公开的包含含有SEQID NO:59的轻链可变区和含有SEQ ID NO:41的重链可变区的抗CCR8抗体。在另外的实施方案中，是WO2020138489 A1中公开的包含含有SEQ ID NO:52的轻链恒定区和含有SEQ IDNO:53的重链恒定区的抗CCR8抗体。

实施例

提供以下实施例以证明和进一步说明本发明的某些优选实施方案和方面，并且不解释为限制其范围。

I.阻断性和非阻断性小鼠CCR8(mCCR8)结合剂的产生和功能表征

实施例1.mCCR8靶向单域抗体部分的产生

mCCR8 DNA免疫

用小鼠CCR8 DNA对美洲驼和羊驼的免疫基本上如Pardon E.等人(A generalprotocol for the generation of Nanobodies for structural biology,NatureProtocols,2014,9(3),674-693)以及Henry K.A.和MacKenzie C.R.编著(Single-DomainAntibodies:Biology,Engineering and Emerging Applications.Lausanne:FrontiersMedia)中所公开的进行。简言之，以两周的间隔用2mg插入到表达载体pVAX1(ThermoFisherScientific公司，V26020)中的编码小鼠CCR8的DNA免疫动物四次，然后采集血样。三个月后，所有动物接受2mg相同DNA的单次施用，然后采集血样。

噬菌体展示文库制备

如Pardon E.等人(A general protocol for the generation of Nanobodiesfor structural biology,Nature Protocols,2014,9(3),674-693)以及Henry K.A.和MacKenzie C.R.编著(Single-Domain Antibodies:Biology,Engineering and EmergingApplications.Lausanne:Frontiers Media)中所述制备并使用来源于外周血单核细胞(PBMC)的噬菌体展示文库。将VHH片段插入到含有MYC和His6标签的M13噬菌粒载体中。通过感染指数生长的大肠杆菌TG1[(F’traD36 proAB laclqZΔM15)supE thi-1Δ(lac-proAB)Δ(mcrB-hsdSM)5(rK-mK-)]细胞，随后用VCSM13辅助噬菌体进行重复感染(surinfection)来保存文库。

噬菌体展示文库在用插入到pVAX1中的小鼠CCR8瞬时转染的HEK293T细胞上进行两轮连续选择，然后在用插入到pVAX1中的小鼠CCR8瞬时转染的CHO-K1细胞上进行两轮连续选择。用来自第二轮选择的洗脱噬菌体感染的大肠杆菌TG1细胞制备多克隆噬菌粒DNA。通过PCR从这些样品中扩增VHH片段，并亚克隆到大肠杆菌表达载体中，所述载体具有符合读框的N端PelB信号肽以及C端FLAG3和His6标签。用所得VHH表达质粒连接混合物转化电感受态大肠杆菌TG1细胞，并在96深孔板中培养单个菌落。单克隆VHH的表达基本上如PardonE.等人(A general protocol for the generation of Nanobodies for structuralbiology,Nature Protocols,2014,9(3),674-693)所述。通过将细菌沉淀冷冻过夜，然后再悬浮于PBS中并离心除去细胞碎片，来制备含有VHH的粗周质提取物。

实施例2.mCCR8选择输出的筛选

使用细胞解离的非酶溶液(Sigma Aldrich，C5914-100mL)回收表达mCCR8的重组细胞，并在FACS缓冲液中重悬至1.0×10⁶细胞/ml的终浓度。将含有VHH的粗周质提取物的稀释液(1:5的FACS缓冲液)与5μg/ml小鼠抗FLAG生物素化抗体(Sigma Aldrich，F9291-1MG)的FACS缓冲液孵育30分钟，并室温振荡。将细胞悬浮液分配到96孔v型底板中，并与VHH/抗体混合物一起在冰上振荡孵育1小时。用在FACS缓冲液中按1:400(0.18μg/ml)稀释的链霉亲和素R-PE(Invitrogen，SA10044)检测VHH与细胞的结合，在冰上振荡避光孵育30分钟。通过2μg/ml的PE抗小鼠CCR8(Biolegend，150311)抗体证实mCCR8在瞬时转染的细胞系上的表面表达。

与模拟转染的对照细胞相比，通过流式细胞术筛选由小鼠CCR8免疫和选择活动产生的VHH克隆与预先用mCCR8或用N末端缺失小鼠CCR8(Δ16-3XHA)质粒DNA转染的HEK293细胞的结合。通过比较给定VHH克隆在三种细胞系中的结合(荧光强度中位数)信号，将所述克隆分类为N末端小鼠CCR8结合剂(即，结合mCCR8细胞，但不结合小鼠CCR8(δ16-3XHA)或对照细胞)或分类为细胞外环mCCR8结合剂(即，结合mCCR8细胞和小鼠CCR8(δ16-3XHA)，但不结合对照细胞)。

实施例3.单价VHH的纯化和评价

将编码mCCR8结合的VHH的合成DNA片段亚克隆到处于IPTG诱导型lac启动子控制的大肠杆菌表达载体中，所述载体具有符合读框的用于周质区室靶向的N末端PelB信号肽以及C末端FLAG3和His6标签。转化电感受态大肠杆菌TG1细胞并对所得克隆进行测序。基本上如Pardon E.等人(A general protocol for the generation of Nanobodies forstructural biology,Nature Protocols,2014,9(3),674-693)中所述，通过IMAC层析，随后脱盐，由这些克隆纯化VHH蛋白。

与N末端缺失的mCCR8相比，选择从小鼠CCR8免疫接种活动获得的两种纯化的VHH(VHH-01和VHH-06，下文)，并通过流式细胞术评价它们与mCCR8的结合。图1中概述了该评估的结果。VHH-01结合全长和N末端缺失小鼠CCR8，而VHH-06仅结合全长小鼠CCR8。

实施例4.单价VHH的结合和功能表征

cAMP均相时间分辨荧光(HTRF)测定

在cAMP积累实验中评价了两种选择的单价VHH(VHH-01和VHH-06)在展示小鼠CCR8的CHO-K1细胞上功能性抑制小鼠CCL1信号传导的潜力。

在测试前，稳定表达重组小鼠CCR8的CHO-K1细胞在不含抗生素的培养基中生长，通过用PBS-EDTA(5mM EDTA)冲洗而分离，通过离心回收并重悬于KHR缓冲液(5mM KCl，1.25mM MgSO₄，124mM NaCl，25mM HEPES，13.3mM葡萄糖，1.25mM KH₂PO₄，1.45mM CaCl₂，0.5g/l BSA，补充有1mM IBMX)中。将12微升细胞与6微升VHH(终浓度：1μM)一式三份混合并孵育30分钟。此后，加入6微升毛喉素和小鼠CCL1(R&D Systems，845-TC)的混合物，其终浓度对应于其EC80值。然后将板在室温孵育30分钟。加入裂解缓冲液并孵育1小时后，根据制造商的说明书用HTRF试剂盒(Cisbio，62AM9PE)测量荧光比。

1μM的VHH-01抑制CCL1对cAMP水平的作用，而VHH-06相对于对照(PBS)不改变cAMP水平。这些数据表明VHH-01是阻断性CCR8结合剂，而VHH-06是非阻断性结合剂。

Ca²⁺释放测定

在Ca²⁺释放实验中进一步评价了VHH-01在展示mCCR8的CHO-K1细胞上功能性抑制小鼠CCL1信号传导的潜力。

使重组细胞(稳定表达小鼠CCR8的CHO-K1 mt-水母发光蛋白)在不含抗生素的培养基中生长18小时，并通过用PBSEDTA(5mM EDTA)冲洗而温和地分离，通过离心回收并重悬于测定缓冲液(具有HEPES+0.1％游离BSA蛋白酶的DMEM/HAM's F12)中。然后将细胞与腔肠素h(分子探针)在室温孵育至少4小时。在第一次注射100μl细胞和VHH的混合物(终浓度：1μM)后30分钟，以对应于其EC80值的最终浓度加入100μl小鼠CCL1(R&DSystems，845-TC)并注射到混合物中。使用功能性药物筛选系统6000(Functional Drug Screening System6000)(FDSS 6000，Hamamatsu)记录所得光谱发射。

VHH-01确实对94％的Ca²⁺释放产生了强烈抑制，证实了VHH-01是阻断性CCR8结合剂。

实施例5.阻断性和非阻断性VHH-Fc融合体的合成和纯化

为了比较非阻断性mCCR8结合剂与阻断性mCCR8结合剂的效果，通过将抗CCR8 VHH与小鼠IgG2a Fc结构域结合来产生两种VHH-Fc构建体(VHH-Fc-14和VHH-Fc-25)，由柔性GlySer接头(10GS，其是指SEQ ID NO:20的两个重复，因此具有10个氨基酸长度)分隔开。构建体VHH-Fc-25含有两个VHH-06结合剂，而VHH-Fc-14除了含有两个VHH-06结合剂之外，还含有两个VHH-01结合剂。图2提供了VHH-Fc-14和VHH-Fc-25构建体的示意图。因此，VHH-Fc-25是具有衍生自Fc结构域的细胞毒活性(ADCC)的非阻断性CCR8结合剂。除了另外的阻断性CCR8结构域之外，VHH-Fc-14与VHH-Fc-25相同。

将构建体克隆到pcDNA3.4哺乳动物表达载体中，所述载体具有符合读框的小鼠Ig重链V区102信号肽以将表达的重组蛋白引导至细胞外环境。通过Genscript(GenscriptBiotech公司，荷兰莱顿市)进行DNA合成和克隆、细胞转染、Expi293F细胞中的蛋白生产和蛋白A纯化。

实施例6.通过VHH-Fc融合体证实mCCR8结合

通过流式细胞术实验评价了多价VHH-Fc融合体VHH-Fc-14和VHH-Fc-25与BW5147细胞上内源性表达的小鼠CCR8结合的能力。将细胞与不同浓度的多价VHH-Fc融合体在4℃孵育30分钟，然后用FACS缓冲液洗涤两次，然后与AF488山羊抗小鼠IgG(LifeTechnologies，A11029)或AF488驴抗大鼠IgG(Life Technologies，A21208)在4℃孵育30分钟，然后进行两次洗涤步骤。使用TOPRO3(Thermo Fisher Scientific，T3605)对死细胞进行染色。

VHH-Fc-14和VHH-Fc-25与小鼠CCR8的结合高度相当，pEC50值分别为9.14±0.39M(n＝6)和9.49±0.17M(n＝3)(平均值±标准偏差)。

实施例7.通过阻断性和非阻断性VHH-Fc融合体的功能性抑制

细胞凋亡测定

在细胞凋亡测定中比较VHH-Fc-14和VHH-Fc-25融合体功能性抑制激动性配体mCCL1的作用的能力。

地塞米松在内源性表达CCR8的小鼠淋巴瘤BW5147细胞中诱导细胞死亡。地塞米松诱导的细胞死亡可通过添加拮抗剂配体CCL1来逆转(Van Snick等人,1996,Journal ofimmunology,157,2570-2576；Louahed等人,2003,European Journal of Immunology,33,494-501；Spinetti等人,2003,Journal of Leukocyte Biology,73,201-207；Denis等人,2012,PLOS One,7,e34199)。将50μl细胞(以2.75×10⁴个细胞/ml接种在Iscove-Dulbecco培养基+10％ FBS，50μM 2-ME，1.25mM l-谷氨酰胺中)与30μl系列稀释的VHH-Fc融合体一起在37℃孵育30分钟。接着，加入地塞米松(Sigma-Aldrich，D4902)和人CCL1(Biolegend，582706)的20μl混合物至终浓度各为10nM。在37℃孵育48小时后，根据制造商的说明书(Perkin Elmer,6016736)使用ATPlite一步法试剂盒定量细胞活力。该评估的结果如图3所示。

同时携带构建模块VHH-01(阻断性)和VHH-06(非阻断性)的VHH-Fc融合体VHH-Fc-14在测定中产生了较强的功能抑制，pIC50值为9.29±0.22M(n＝9)(平均值±标准偏差)。相比之下，携带构建模块VHH-06的两个拷贝的VHH-Fc融合体VHH-Fc-25不赋予功能抑制。这些数据证实VHH-Fc-25是非阻断性CCR8结合剂，而在VHH-Fc-14中添加阻断性VHH-01结构域引入了阻断活性。

cAMP测定

如实施例4所述在cAMP测定中测试VHH-Fc-14。VHH-Fc-14在50nM和更高浓度下对cAMP信号产生了100％抑制，pIC50值为8.54M，再次证实其为阻断性CCR8结合剂。

实施例8.阻断性VHH-Fc融合体影响肠道Treg水平

为了研究细胞毒性阻断性CCR8结合剂对瘤内和其他Treg水平的影响，修饰VHH-Fc-14以获得具有增加的和消除的ADCC活性的VHH-Fc融合体。通过VHH-Fc-14(VHH-Fc-43)的α-岩藻糖基化获得增加的ADCC活性。可选地，通过插入LALAPG Fc突变(VHH-Fc-41)在VHH-Fc-14中消除ADCC活性(Lo等人,2017,Journal of Biological Chemistry,292,3900-3908)。将构建体克隆到具有符合读框的分泌信号肽的哺乳动物表达载体pQMCF载体中，并转染到CHOEBNALT85 1E9细胞中，然后进行表达、蛋白A和凝胶过滤层析(Icosagen CellFactory，爱沙尼亚塔尔图)。从携带GlymaxX技术的CHOEBNALT85细胞系(ProBioGen公司，德国柏林)(Icosagen Cell Factory，爱沙尼亚塔尔图)中表达获得在Fc部分的CH2结构域中具有α-岩藻糖基化N-聚糖的形式。蛋白质采用0.22mm无菌过滤。通过测量280nm处的吸光度确定蛋白质浓度，并通过SDS-PAGE和尺寸排阻层析确定纯度。通过LAL试验(Charles-RiverEndochrome)评估内毒素水平。对照mIgG2a同型购自BioXCell。VHH-Fc-41(pEC50值为9.33M(n＝1))和VHH-Fc-43(pEC50值为9.23±0.17M(n＝2))与BW5147细胞上的CCR8结合程度相当。另外，VHH-Fc-41(pIC50值为9.51±0.02M(n＝2))和VHH-Fc-43(pIC50值为9.39±0.11M(n＝4))(平均值±标准偏差)均在BW147细胞凋亡测定中有效抑制CCL1的作用。所有值均表示为平均值±标准偏差。

为了测试这些具有及不具有ADCC活性的阻断mCCR8 VHH-Fc融合体的影响，将3×10⁶个细胞LLC-OVA细胞(200μl)皮下注射到雌性C57BL/6小鼠中(6-12周)。在第4天，每周一次(即，第4、11天)用200μg抗CCR8 VHH-Fc(VHH-Fc-41或VHH-Fc-43)或小鼠IgG2a(对照)治疗小鼠(n_小鼠/组＝5)。

在第16天处死小鼠，从每只小鼠收集肿瘤、血液和肠。

通过将组织切成小块，然后用10U ml^-1胶原酶I、400U ml^-1胶原酶IV和30U ml^{- 1}DNaseI(Worthington)在37℃处理25分钟，来获得肿瘤单细胞悬浮液。随后将组织挤压并过滤(70μm)。用红细胞裂解缓冲液(155mM NH4Cl，10mM KHCO3，500mM EDTA)除去所得细胞悬浮液中的红细胞，然后用RPMI中和。通过在红细胞裂解缓冲液中反复孵育5分钟来清除血液中的红细胞，直到仅剩余白细胞。如前所述制备肠单细胞悬浮液(C.C.Bain,A.McI.Mowat,CD200 receptor and macrophage function in the intestine,Immunobiology 217,643–651(2012))。红细胞裂解后，将获得的单细胞悬浮液再悬浮于FACS缓冲液(富含2％FCS和2mM EDTA的PBS)中并计数。染色前，将所有单细胞悬浮液与大鼠抗小鼠CD16/CD32(2.4G2；BD Biosciences)或抗人Fc阻断试剂(Miltenyi)预孵育15分钟。洗涤后，将样品用可固定的活性染料eFluor506(eBioscience)(1:200)在4℃避光染色30分钟。随后，将样品洗涤并在4℃避光染色30分钟。细胞因子/趋化因子和转录因子的细胞内染色分别根据制造商的方案(货号554715；BD Biosciences)和(货号00-5523；Invitrogen)进行。使用BD FACSCantoII(BDBiosciences)获取FACS数据并使用FlowJo(TreeStar公司)分析。

如图4所示，Treg在肿瘤中被VHH-Fc-43清除，VHH-Fc-43是具有ADCC活性的mCCR8阻断Fc融合体，而对于缺乏ADCC活性的VHH-Fc-41未观察到肿瘤内Treg清除。任一构建体的循环Treg的清除均未观察到(图5)。然而，在肠道中观察到两种VHH-Fc分子(具有ADCC和不具有ADCC功能性)的Treg水平均有所降低，表明在肠道中观察到的Treg水平的降低是由于功能性阻断mCCR8而不是mCCR8结合剂的细胞毒性作用(图6)。这表明具有细胞毒活性的非阻断性mCCR8结合剂是优选的并且避免了对肿瘤环境外的Treg群的副作用。

实施例9.细胞毒性非阻断性mCCR8结合剂对同系LLC-OVA小鼠模型中肿瘤生长的影响

为了证实细胞毒性非阻断性mCCR8结合剂用于肿瘤治疗的功效，使用同源小鼠LLC-OVA模型。

将3×10⁶个细胞LLC-OVA细胞(200μl)皮下注射到雌性C57BL/6小鼠(6-12周)中。在第4天，每周一次(即，第4、11天)用200μg抗CCR8 VHH-Fc(VHH-Fc-14或VHH-Fc-25)或小鼠IgG2a(对照)治疗小鼠(n_小鼠/组＝5)。用卡尺在两个维度上测量肿瘤以监测生长。

使用下式计算肿瘤大小(单位为mm³)：

肿瘤体积＝π(w²x l)/6

其中w＝肿瘤的宽度，l＝肿瘤的长度，单位为mm。

所有不同队列的肿瘤大小中位数(单位为mm³)描述于图7中。

从第11天开始，用VHH-Fc-14和VHH-Fc-25治疗的队列显示出与同型对照相比显著减小的肿瘤大小。非阻断性mCCR8结合剂VHH-Fc-25与阻断性mCCR8结合剂VHH-Fc-14相比显示出相同的功效。这些数据显示细胞毒性非阻断性mCCR8结合剂对于肿瘤治疗是有效的，同时具有比阻断性mCCR8 Treg清除剂更安全的特性。

实施例10.细胞毒性非阻断性mCCR8结合剂对MC38同系小鼠模型中肿瘤生长的影响为了证实细胞毒性非阻断性mCCR8结合剂用于肿瘤治疗的功效，使用小鼠MC38模型。

将5×10⁵个MC38细胞(100μl)皮下注射到雌性C57BL/6J小鼠(7-9周)中。在第7天(肿瘤平均大小＝118mm³)，将小鼠分成不同的组。不同的队列由每种病症的10只小鼠组成，并且每组小鼠每两周一次腹膜内注射200μg小鼠IgG2a(对照)、VHH-Fc-14或VHH-Fc-25，持续3周。每两周测量一次体重和肿瘤大小。

用卡尺在两个维度上测量肿瘤以监测生长。使用下式计算肿瘤大小(单位为mm³)：

肿瘤体积＝(w²x l)x0.52

其中w＝肿瘤的宽度，l＝肿瘤的长度，单位为mm。

所有不同队列的肿瘤大小中位数(单位为mm³)描述于图8中。从第18天开始，用VHH-Fc-14和VHH-Fc-25治疗的队列显示出与同型对照相比显著更小的肿瘤大小，导致用具有ADCC活性的mCCR8结合剂治疗的部分小鼠中肿瘤停滞或消退。

令人惊讶的是，尽管现有技术中表明mCCR8阻断对于肿瘤治疗是重要的，但与阻断性mCCR8结合剂VHH-Fc-14相比，非阻断性mCCR8结合剂VHH-Fc-25显示相同且甚至略高的功效。这些数据显示细胞毒性非阻断性mCCR8结合剂对于肿瘤治疗是有效的，同时具有比阻断性mCCR8 Treg清除剂更安全的特性。

II.阻断性和非阻断性人CCR8(hCCR8)结合剂的产生和功能表征

三种抗人CCR8阻断性单克隆抗体(人L263G8、ONCC8和ONCC10)用作下述实验的对照。通过将来自WO2020/0138489 A1的轻链可变区和重链可变区的序列(分别对应于WO2020/0138489 A1的SEQ ID NO:59和SEQ ID NO:41)克隆到人IgG1主链中，获得ONCC8的序列，而通过将来自WO2007/044756 A1的mAb 433H的重链可变区序列和轻链可变区序列克隆到人IgG1主链中，获得ONCC10的序列。这些抗体的产生在Icosagen的HEK293细胞(Icosagen，爱沙尼亚塔尔图)中或在Evitria的CHO细胞(Evitria，瑞士苏黎世)中进行。最后，人L263G8是一种商品化小鼠抗hCCR8/CD198 IgG2a单克隆抗体，其获自Biolegend(Biolegend，克隆号L263G8，360603)。

实施例11.hCCR8靶向单域抗体部分的产生

hCCR8 DNA免疫

用人CCR8 DNA对美洲驼和羊驼的免疫基本上如Pardon E.等人(A generalprotocol for the generation of Nanobodies for structural biology,NatureProtocols,2014,9(3),674-693)以及Henry K.A.和MacKenzie C.R.编著(Single-DomainAntibodies:Biology,Engineering and Emerging Applications.Lausanne:FrontiersMedia)中所公开的进行。简言之，以两周的间隔用2mg插入到表达载体pVAX1(ThermoFisherScientific公司，V26020)中的编码人CCR8的DNA免疫动物四次，然后采集血样。三个月后，所有动物接受三次2mg相同DNA的注射，然后采集血样。

噬菌体展示文库制备

如Pardon E.等人(A general protocol for the generation of Nanobodiesfor structural biology,Nature Protocols,2014,9(3),674-693)以及Henry K.A.和MacKenzie C.R.编著(Single-Domain Antibodies:Biology,Engineering and EmergingApplications.Lausanne:Frontiers Media)中所述制备并使用来源于外周血单核细胞(PBMC)的噬菌体展示文库。将VHH片段插入到含有MYC和His6标签的M13噬菌粒载体中。通过感染指数生长的大肠杆菌TG1[(F’traD36 proAB laclqZΔM15)supE thi-1Δ(lac-proAB)Δ(mcrB-hsdSM)5(rK-mK-)]细胞，随后用VCSM13辅助噬菌体进行重复感染来保存文库。

噬菌体展示文库在用插入到pcDNA3.1中的人CCR8瞬时转染的HEK293T细胞(ThermoFisher Scientific公司，V79020)上进行两轮连续选择，然后在用插入到pcDNA3.1中的人CCR8瞬时转染的CHO-K1细胞上进行两轮连续选择。用来自第二轮选择的洗脱噬菌体感染的大肠杆菌TG1细胞制备多克隆噬菌粒DNA。通过PCR从这些样品中扩增VHH片段，并亚克隆到大肠杆菌表达载体中，所述载体具有符合读框的N端PelB信号肽以及C端FLAG3和His6标签。用所得VHH表达质粒连接混合物转化电感受态大肠杆菌TG1细胞，并在96深孔板中培养单个菌落。单克隆VHH的表达基本上如Pardon E.等人(A general protocol forthe generation of Nanobodies for structural biology,Nature Protocols,2014,9(3),674-693)所述。通过将细菌沉淀冷冻过夜，然后再悬浮于PBS中并离心除去细胞碎片，来制备含有VHH的粗周质提取物。

实施例12.稳定的hCCR8细胞系的产生

在37℃、5％ CO₂的条件下，在补充有10％热灭活胎牛血清(FBS)和100U/ml青霉素和链霉素(Gibco)的Dulbecco的改良型Eagle培养基(DMDM，Gibco)中，培养人胚肾细胞系HEK293(ATTC编号CRL-1573)。转染前，将细胞以7.5×10⁵个细胞/孔的密度接种于6孔板(Greiner)中并培养过夜。当达到大约40％汇合时，使用FUGENEHD转染试剂(Promega)，用编码人CCR8的线性化pcDNA3.1转染细胞。6小时后，小心取出细胞上清液并用新鲜的完全DMEM替换。48小时后，将培养基替换为包含500μg/ml G-418(ThermoFisher Scientific公司)以选择携带表达盒的庆大霉素抗性转染子。每2-3天更换培养基。3周后，从每孔10³个细胞开始，进行限制性1:2稀释以获得单克隆系。使用藻红蛋白标记的小鼠抗hCCR8/CD198IgG2a(Biolegend，克隆编号L263G8,360603)在流式细胞术(Attune NxT，ThermoFisherScientific公司)中获取10⁴个细胞，从而鉴定出表达hCCR8的单克隆系。

实施例13.hCCR8选择输出的筛选

使用细胞解离的非酶溶液(Sigma Aldrich，C5914-100mL)回收表达hCCR8的重组细胞，并在FACS缓冲液中重悬至1.0×10⁶个细胞/ml的终浓度。将含有VHH的粗周质提取物的稀释液(1:5的FACS缓冲液)与5μg/ml小鼠抗FLAG生物素化抗体(Sigma Aldrich，F9291-1MG)的FACS缓冲液孵育30分钟，并室温振荡。将细胞悬浮液分配到96孔v型底板中，并与VHH/抗体混合物一起在冰上振荡孵育1小时。用在FACS缓冲液中按1:400(0.18μg/ml)稀释的链霉亲和素R-PE(Invitrogen，SA10044)检测VHH与细胞的结合，在冰上振荡避光孵育30分钟。通过2μg/ml的PE抗人CCR8(Biolegend，360603)抗体证实人CCR8在瞬时转染的细胞系上的表面表达。

实施例14.单价VHH的纯化和评价

将编码hCCR8结合的VHH的合成DNA片段亚克隆到处于IPTG诱导型lac启动子控制下的大肠杆菌表达载体中，所述载体具有符合读框的用于周质区室靶向的N末端PelB信号肽以及C末端FLAG3和His6标签。转化电感受态大肠杆菌TG1细胞并对所得克隆进行测序。基本上如Pardon E.等人(A general protocol for the generation of Nanobodies forstructural biology,Nature Protocols,2014,9(3),674-693)所述，通过IMAC层析，随后脱盐，由这些克隆纯化VHH蛋白。

选择由人CCR8免疫接种活动获得的八种纯化的VHH，并通过流式细胞术评价它们与hCCR8的结合。纯化的VHH其中之一(下文称为VHH-69)显示出与人CCR8的有效结合(图9)，尽管这在Gi偶联受体的cAMP HTRF测定中不阻断CCL1对CCR8受体的作用。

实施例15.表位作图

与模拟转染的对照细胞相比，通过流式细胞术筛选由人CCR8免疫和选择活动产生的VHH克隆与稳定转染的HEK293细胞上的人CCR8(SEQ ID NO:31)的结合，或与预先用编码N末端缺失人CCR8的质粒DNA转染的HEK293细胞的结合(hCCR8的N-末端Met残基后18个氨基酸被三个连续HA标签的氨基酸序列SEQ ID NO:32取代，下文称为δ18-3XHA)。在三种细胞系中比较给定VHH克隆的结合(荧光强度中位数)信号能够将所述克隆分类为N末端人CCR8结合剂(即，结合在hCCR8细胞上，但不结合在人CCR8(δ18-3XHA)或对照细胞上)或分类为胞外环hCCR8结合剂(即，结合在hCCR8细胞和人CCR8(δ18-3XHA)上，但不结合在对照细胞上)。

这些实验将VHH-69分类为N末端人CCR8结合剂。

实施例16.单价VHH的结合和功能表征

在cAMP积累实验中评价了所选择的单价VHH-69在展示人CCR8的CHO-K1细胞上功能性抑制人CCL1信号传导的潜力。

在测试前，稳定表达重组人CCR8的CHO-K1细胞在不含抗生素的培养基中生长，并通过用PBS-EDTA(5mM EDTA)冲洗分离，通过离心回收并重悬于KHR缓冲液(5mM KCl，1.25mMMgSO₄，124mM NaCl，25mM HEPES，13.3mM葡萄糖，1.25mM KH₂PO₄，1.45mM CaCl₂，0.5g/lBSA，补充有1mM IBMX)中。将12微升细胞与6微升VHH(终浓度：1μM)一式三份混合并孵育30分钟。此后，加入6微升毛喉素和人CCL1(R&D Systems，845-TC或272-I)的混合物，其终浓度应于其EC80值。然后将板在室温孵育30分钟。加入裂解缓冲液并孵育1小时后，根据制造商的说明书用HTRF试剂盒(Cisbio，62AM9PE)测量荧光比。

1μM的VHH-69与对照(PBS)相比不改变cAMP水平，如图10所示。这些数据表明VHH-69是非阻断性hCCR8结合剂。

实施例17.阻断性和非阻断性VHH-Fc融合体的合成和纯化

为了比较非阻断性hCCR8结合剂与阻断性hCCR8结合剂的影响，通过直接融合(VHH-Fc-203和VHH-Fc-218)或通过柔性GlySer接头10GS(VHH-Fc-201和VHH-Fc-219)或20GS(VHH-Fc-202和VHH-Fc-220)(20GS是指SEQ ID NO:20的四个重复，因此具有20个氨基酸长度)隔开，将抗CCR8 VHH与人短铰链和IgG1 Fc结构域(SEQ ID NO:30)组合，产生了六种VHH-Fc构建体(VHH-Fc-201、VHH-Fc-202、VHH-Fc-203、VHH-Fc-218、VHH-Fc-219和VHH-Fc-220)。构建体VHH-Fc-201、VHH-Fc-202和VHH-Fc-203含有阻断性CCR8结合部分(VHH阻断)，而VHH-Fc-218、VHH-Fc-219和VHH-Fc-220含有VHH-69结合部分。因此，VHH-Fc-218、VHH-Fc-219和VHH-Fc-220是具有衍生自Fc结构域的细胞毒活性(ADCC)的非阻断性hCCR8结合剂。

将构建体克隆到pQMCF哺乳动物表达载体中，所述载体具有符合读框的分泌信号肽以将表达的重组蛋白引导至细胞外环境。通过Icosagen(Icosagen Cell Factory，爱沙尼亚塔尔图)进行克隆、CHOEBNALT854 1E9细胞中的细胞转染蛋白生产和蛋白A纯化。

实施例18.通过VHH-Fc融合体证实hCCR8结合

通过流式细胞术实验评价了六种多价VHH-Fc融合体在稳定转染的HEK293细胞上结合人CCR8的能力。将细胞与不同浓度的多价VHH-Fc融合体在4℃孵育30分钟，然后用FACS缓冲液洗涤两次，然后与R-藻红蛋白AffiniPure F(ab’)₂片段山羊抗人IgG(JacksonImmnoResearch，货号#109-116-098)在4℃孵育30分钟，然后进行两次洗涤使用TOPRO3(Thermo Fisher Scientific，T3605)对死细胞进行染色。

所有六种VHH-Fc融合体与人CCR8的结合高度相当，pEC50值范围为8.95-10.26M。图11显示了VHH-Fc-218、VHH-Fc-219和VHH-Fc-220与两种对照抗hCCR8 mAb(ONCC8和ONCC10)的结合曲线。

另一方面，发现VHH-Fc-218、VHH-Fc-219和VHH-Fc-220显示出较差的猕猴属交叉反应性，如图12所示。

实施例19.通过阻断性和非阻断性VHH-Fc融合体的功能性抑制

在Gi偶联受体的cAMP HTRF测定中比较VHH-Fc-201和VHH-Fc-219融合体功能性抑制激动性配体人CCL1的作用的能力。

在测定前，使稳定表达重组人CCR8受体的CHO-K1细胞在不含抗生素的培养基中生长，并通过用PBS-EDTA(5mM EDTA)温和冲洗来分离，通过离心回收并重悬于补充有1mMIBMX的KRH缓冲液(5mM KCl，1.25mM MgSO₄，124mM NaCl，25mM HEPES，13.3mM葡萄糖，1.25mM KH₂PO₄，1.45CaCl₂，0.5g/l BSA)。将12微升细胞与6μl的10个浓度的VHH-Fc-201、VHH-Fc-219或对照CCR8结合剂混合，一式两份，并孵育30分钟。然后，加入6μl毛喉素和人CCL1(R&D Systems，845-TC or 272-I)的混合物，其终浓度对应于其EC80值。然后将板在室温下孵育30分钟。加入裂解缓冲液并孵育1小时后，根据制造商的说明书用HTRF试剂盒(Cisbio，62AM9PE)测量荧光比。

VHH-Fc-201在50nM和更高的浓度下对cAMP信号产生了100％抑制，pIC50值为8.81M，证实它是阻断CCR8结合剂。另一方面，与其单价对应物一样，VHH-Fc-219不阻断CCL1对受体的作用，尽管其与人CCR8有效结合，但这与测试的三种对照mAb相反(图13)。

实施例20.VHH-Fc融合体的ADCC效力

ADCC报告基因测定

使用人CCR8 HEK293细胞系作为靶细胞，在ADCC报告基因检测试剂盒(Promega，G7010，G7018)中测试VHH-Fc融合体VHH-Fc-218、VHH-Fc-219和VHH-Fc-220激活人FcγRIIIa的能力。

在该测定中使用用V158 FcγRIIIa受体稳定转染的工程化Jurkat细胞以及作为效应细胞的NFAT(激活的T细胞的核因子)响应性萤火虫荧光素酶报告基因。将过表达人CCR8的HEK293细胞用作靶细胞。根据制造商的建议，通过将VHH-Fc融合体与靶细胞和效应细胞以2.5:1的效应细胞:靶细胞比率孵育时NFAT途径激活产生的荧光素酶发光信号来定量ADCC活性。

发现所有三种VHH-Fc融合体激活人FcγRIIIa，基于4种稀释度，pEC50值范围为约8.51-9.84M，该范围与两种对照抗人CCR8抗体ONCC8和ONCC10的范围相同。

使用人PBMC的ADCC测定

在ADCC测定中，使用来自三个独立健康供体的人PBMC，以40:1的效应细胞:靶细胞的比率测试了VHH-Fc融合体(VHH-Fc-218、VHH-Fc-219和VHH-Fc-220)以及对照单克隆抗体ONCC8和同型对照。简言之，用DiO标记表达人CCR8的HEK293细胞，并以每孔5×10³个细胞接种在96孔圆底板中。将结合剂一式两份进行8点滴定。标记的靶细胞用滴定结合剂调理，然后与效应细胞孵育3小时。通过PI活/死染色(PI live/dead stain)监测靶细胞上的特异性裂解。在NxT流式细胞仪(Attune)上采集样品。

基于使用来自不同健康供体的人PBMC的三次独立实验的平均值，所有三种VHH-Fc融合体显示出有效的ADCC活性，pEC50值范围为大约10.7-14.3M，该范围与ONCC8对照的范围相同。

实施例21.单价VHH的序列优化

对VHH-69进行序列优化，以试图最大限度地改进针对人IGHV3(SEQ ID NO:35,EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMHWVRQAPGKGLEWVSVISSDGSSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR)和JH(SES ID NO:36,WGQGTLVTVSS)种系共有序列的人源化方面以及化学和生物物理稳定性方面的序列。

生产、纯化和结合性质的评估

克隆到具有C末端His6(但没有LFAG3)标签的大肠杆菌表达载体中，如实施例14中所述进行标准大肠杆菌表达和固定化金属亲和层析(IMAC)步骤。

由此产生了多个His6标记的VHH-69变体，并通过流式细胞术评价了它们与FLAG3-His6标记的VHH-69竞争结合hCCR8的能力。首先将细胞与不携带FLAG3标签的不同浓度的单价序列优化变体在4℃孵育30分钟，然后与固定浓度的FLAG3标记的VHH-69在4℃孵育30分钟，然后洗涤，并通过小鼠M2抗-Flag mAb(Sigma Aldrich，货号#F-1804)随后通过R-藻红蛋白AffiniPure F(ab')₂片段山羊抗小鼠IgG(Jackson ImmunoResearch，货号#115-116-071)进行抗FLAG检测。选择保留结合能力的变体用于进一步的生物物理和化学稳定性分析。

生物物理稳定性

对所有VHH-69变体进行热稳定性和聚集测定，以了解它们的解链和聚集温度。

在Uncle仪(Unchained Labs，美国加利福尼亚州普莱森顿)中监测温度诱导的蛋白质解折叠时的内在色氨酸荧光。将10微升样品以1mg/ml加入到样品比色杯中，并以0.5℃/分钟的速率从25℃开始线性升温至95℃，预运行180秒。将重心平均值(BCM)和静态光散射(266nm和473nm处的SLS)信号对温度作图，以分别获得解链温度(T_m)和聚集温度(T_agg)。

当对VHH样品进行温度诱导的解折叠时，可以注意到解链温度(T_m)的明显差异，这通过266nm(较小的聚集体)和473nm(较大的聚集体)处的静态光散射测定的聚集温度(T_agg)得以很好地印证。

使用Uncle仪，通过将10μl样品以1mg/ml加入到样品比色杯中，进行动态光散射。激光和衰减器控制设置为自动，同时每个数据点运行10次采集，每次采集时间为10秒。

通过将120μl的1mg/ml样品加入到Agilent HPLC系统上的Superdex 200柱(GEhealthcare)上，进行与多角度激光散射(MALLS)偶联的尺寸排阻色谱(SEC)。柱的出口联接到UV检测器，然后联接到折射率(RI)检测器，最后联接到MALLS检测器。

VHH变体及其Fc-融合对应物的SEC-MALLS数据高度相关。对于大多数含有VHH-69实体的VHH-Fc融合体，在40℃储存一周不会导致任何可能观察到的可溶性(不溶性)(SEC-MALLS)聚集体的存在。

化学稳定性

选择从序列优化活动获得的两种纯化的VHH(VHH-123＝VHH-69(E1D，N55S，D65G)和VHH-124＝VHH-69(E1D，N55K，D65G)，下文)用于化学稳定性评估。

将样品在40℃储存4周，而将参考样品在-80℃储存。用过氧化氢补充强制氧化的样品(1mg/ml)直至终浓度为10mM，然后在37℃孵育3小时，最后根据制造商的说明，使用PDMiDiTrap G-25柱(GE-Healthcare，美国伊利诺伊州芝加哥)将缓冲液更换为磷酸盐缓冲盐水(PBS)。将样品储存在-80℃直到质谱肽作图(色谱研究所，比利时科特赖克)。肽作图包括用胰蛋白酶处理100μg样品蛋白质(在25℃过夜)并将样品注射到RPC柱(反相色谱；通过应用乙腈梯度洗脱)上，然后通过ESI-质谱仪，其中LC-MS和LC-MS/MS数据分别用于定量和鉴定。

与参考VHH-69(E1D)(N55的19％脱酰胺)相比，VHH-123和VHH-124在40℃下储存4周后未显示脱酰胺作用。还发现，与竞争流式细胞术中对照VHH-69(E1D)(4.9×10^-10M)和VHH-123(7.1×10^-10M)以及稳定转染的HEK293细胞中人CCR8的FLAG3标记的VHH-69相比，存在于VHH-124中的N55K取代导致竞争性IC50值(2.5×10^-10M)高出2倍(图15)。

VHH-123和VHH-124在储存4周后没有显示出任何实质性高温(40℃)依赖性问题，例如在40℃储存4周时Asn/Gln脱氨作用、Met/Trp氧化作用或Asp异构化。未发现其他问题。

实施例22.非阻断性优化的VHH-Fc融合体的合成和纯化

如实施例17中产生优化的VHH序列的Fc-融合体。因此，VHH-123直接与IgG1短铰链结构域融合(SEQ ID NO:28)或通过10GS接头融合(SEQ ID NO:23)或通过20GS接头融合(SEQ ID NO:24)。类似地，VHH-124直接与IgG1短铰链结构域融合(SEQ ID NO:29)或通过10GS接头融合(SEQ ID NO:25)或通过20GS接头融合(SEQ ID NO:26)。这些保留了结合能力的构建体最适于治疗本文提及的疾病。

实施例23.优化的VHH-Fc融合体的ADCC效力

在ADCC测定中，使用来自三个独立健康供体的人PBMC，以40:1的效应细胞与靶细胞的比率测试了实施例22中获得的优化序列的两种Fc-融合体(VHH-124，直接与IgG1短铰链结构域融合(SEQ ID NO:29，下文称为VHH-Fc-262)或通过20GS接头融合(SEQ ID NO:24，下文称为VHH-Fc-264))与同型对照。评估了VHH-Fc融合体的无岩藻糖基化和非岩藻糖基化形式的ADCC效力。

简言之，用DiO标记表达人CCR8的HEK293细胞，并以每孔5×10³个细胞接种在96孔圆底板中。将结合剂一式两份进行8点滴定。标记的靶细胞用滴定结合剂调理，然后与效应细胞孵育3小时。通过PI活/死染色监测靶细胞上的特异性裂解。在NxT流式细胞仪(Attune)上采集样品。

与同型对照相比，VHH-Fc融合体的无岩藻糖基化和非岩藻糖基化形式均显示出有效的ADCC活性(参见图16)。观察到的无岩藻糖基化形式的VHH-Fc融合体的ADCC活性显示最强的ADCC活性。这些数据显示，优化的VHH序列的Fc融合体显示有效的ADCC活性，而所述Fc融合体的无岩藻糖基化形式表现更好。

序列表

<110> Oncurious NV

<120> 人CCR8非阻断性结合剂

<130> PAT203910EP01

<160> 36

<170> PatentIn 3.5版

<210> 1

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR1-IMGT

<400> 1

Gly Arg Thr Phe Thr Asn Tyr Lys Ser Asn Tyr Lys

1 5 10

<210> 2

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR2-IMGT

<220>

<221> VARIANT

<222> (6)..(6)

<223> Xaa可以为任何天然存在的氨基酸

<400> 2

Thr Asp Trp Thr Gly Xaa Ser Ala

1 5

<210> 3

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR3-IMGT

<400> 3

Ala Ala Gly Thr Thr Ile Gly Gln Tyr Thr Tyr

1 5 10

<210> 4

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> FR1-IMGT

<220>

<221> VARIANT

<222> (1)..(1)

<223> Xaa可以为任何天然存在的氨基酸

<400> 4

Xaa Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser

20 25

<210> 5

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> FR2-IMGT

<400> 5

Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Ala Arg Ala Phe Val Gly

1 5 10 15

Arg

<210> 6

<211> 38

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> FR3-IMGT

<220>

<221> VARIANT

<222> (8)..(8)

<223> Xaa可以为任何天然存在的氨基酸

<400> 6

Ile Ile Ala Asn Ser Val Lys Xaa Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn

1 5 10 15

Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp

20 25 30

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

35

<210> 7

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> FR4-IMGT

<400> 7

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210> 8

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VHH-P123

<400> 8

Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Arg Thr Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Lys Ser Asn Tyr Lys Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Ala

35 40 45

Arg Ala Phe Val Gly Arg Thr Asp Trp Thr Gly Ser Ser Ala Ile Ile

50 55 60

Ala Asn Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys

65 70 75 80

Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala

85 90 95

Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Gly Thr Thr Ile Gly Gln Tyr Thr Tyr Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 9

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VHH-P124

<400> 9

Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Arg Thr Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Lys Ser Asn Tyr Lys Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Ala

35 40 45

Arg Ala Phe Val Gly Arg Thr Asp Trp Thr Gly Lys Ser Ala Ile Ile

50 55 60

Ala Asn Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys

65 70 75 80

Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala

85 90 95

Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Gly Thr Thr Ile Gly Gln Tyr Thr Tyr Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 10

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VHH-69

<400> 10

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Arg Thr Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Lys Ser Asn Tyr Lys Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Ala

35 40 45

Arg Ala Phe Val Gly Arg Thr Asp Trp Thr Gly Asn Ser Ala Ile Ile

50 55 60

Ala Asn Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys

65 70 75 80

Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala

85 90 95

Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Gly Thr Thr Ile Gly Gln Tyr Thr Tyr Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 11

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 11

Gly Arg Thr Phe Thr Asn Tyr Lys Ser Asn Tyr Lys Met Ala

1 5 10

<210> 12

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR2-Kabat

<220>

<221> VARIANT

<222> (7)..(7)

<223> Xaa可以为任何天然存在的氨基酸

<220>

<221> VARIANT

<222> (17)..(17)

<223> Xaa可以为任何天然存在的氨基酸

<400> 12

Arg Thr Asp Trp Thr Gly Xaa Ser Ala Ile Ile Ala Asn Ser Val Lys

1 5 10 15

Xaa

<210> 13

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR3-Kabat

<400> 13

Ala Ala Gly Thr Thr Ile Gly Gln Tyr Thr Tyr

1 5 10

<210> 14

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CRD2-IMGT-P123

<400> 14

Thr Asp Trp Thr Gly Ser Ser Ala

1 5

<210> 15

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR2-IMGT-P124

<400> 15

Thr Asp Trp Thr Gly Lys Ser Ala

1 5

<210> 16

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR2-Kabat-P123

<400> 16

Arg Thr Asp Trp Thr Gly Ser Ser Ala Ile Ile Ala Asn Ser Val Lys

1 5 10 15

Asp

<210> 17

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR2-Kabat-P124

<400> 17

Arg Thr Asp Trp Thr Gly Lys Ser Ala Ile Ile Ala Asn Ser Val Lys

1 5 10 15

Asp

<210> 18

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> FR1-IMGT-P123/P124

<400> 18

Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser

20 25

<210> 19

<211> 38

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> FR3-IMGT-P123/P124

<400> 19

Ile Ile Ala Asn Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn

1 5 10 15

Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp

20 25 30

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

35

<210> 20

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> GS接头

<400> 20

Gly Gly Gly Gly Ser

1 5

<210> 21

<211> 358

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> P69-10GS-Fc

<400> 21

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Arg Thr Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Lys Ser Asn Tyr Lys Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Ala

35 40 45

Arg Ala Phe Val Gly Arg Thr Asp Trp Thr Gly Asn Ser Ala Ile Ile

50 55 60

Ala Asn Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys

65 70 75 80

Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala

85 90 95

Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Gly Thr Thr Ile Gly Gln Tyr Thr Tyr Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

115 120 125

Gly Gly Gly Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro

130 135 140

Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys

145 150 155 160

Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val

165 170 175

Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp

180 185 190

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr

195 200 205

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp

210 215 220

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu

225 230 235 240

Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg

245 250 255

Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys

260 265 270

Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

275 280 285

Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys

290 295 300

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser

305 310 315 320

Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser

325 330 335

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser

340 345 350

Leu Ser Leu Ser Pro Gly

355

<210> 22

<211> 368

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> P69-20GS-Fc

<400> 22

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Arg Thr Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Lys Ser Asn Tyr Lys Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Ala

35 40 45

Arg Ala Phe Val Gly Arg Thr Asp Trp Thr Gly Asn Ser Ala Ile Ile

50 55 60

Ala Asn Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys

65 70 75 80

Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala

85 90 95

Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Gly Thr Thr Ile Gly Gln Tyr Thr Tyr Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

115 120 125

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Lys

130 135 140

Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro

145 150 155 160

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

165 170 175

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp

180 185 190

Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

195 200 205

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val

210 215 220

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

225 230 235 240

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys

245 250 255

Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr

260 265 270

Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr

275 280 285

Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

290 295 300

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu

305 310 315 320

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys

325 330 335

Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

340 345 350

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

355 360 365

<210> 23

<211> 358

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> P123-10GS-Fc

<400> 23

Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Arg Thr Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Lys Ser Asn Tyr Lys Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Ala

35 40 45

Arg Ala Phe Val Gly Arg Thr Asp Trp Thr Gly Ser Ser Ala Ile Ile

50 55 60

Ala Asn Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys

65 70 75 80

Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala

85 90 95

Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Gly Thr Thr Ile Gly Gln Tyr Thr Tyr Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

115 120 125

Gly Gly Gly Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro

130 135 140

Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys

145 150 155 160

Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val

165 170 175

Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp

180 185 190

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr

195 200 205

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp

210 215 220

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu

225 230 235 240

Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg

245 250 255

Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys

260 265 270

Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

275 280 285

Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys

290 295 300

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser

305 310 315 320

Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser

325 330 335

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser

340 345 350

Leu Ser Leu Ser Pro Gly

355

<210> 24

<211> 368

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> P123-20GS-Fc

<400> 24

Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Arg Thr Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Lys Ser Asn Tyr Lys Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Ala

35 40 45

Arg Ala Phe Val Gly Arg Thr Asp Trp Thr Gly Ser Ser Ala Ile Ile

50 55 60

Ala Asn Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys

65 70 75 80

Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala

85 90 95

Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Gly Thr Thr Ile Gly Gln Tyr Thr Tyr Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

115 120 125

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Lys

130 135 140

Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro

145 150 155 160

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

165 170 175

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp

180 185 190

Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

195 200 205

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val

210 215 220

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

225 230 235 240

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys

245 250 255

Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr

260 265 270

Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr

275 280 285

Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

290 295 300

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu

305 310 315 320

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys

325 330 335

Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

340 345 350

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

355 360 365

<210> 25

<211> 358

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> P124-10GS-Fc

<400> 25

Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Arg Thr Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Lys Ser Asn Tyr Lys Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Ala

35 40 45

Arg Ala Phe Val Gly Arg Thr Asp Trp Thr Gly Lys Ser Ala Ile Ile

50 55 60

Ala Asn Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys

65 70 75 80

Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala

85 90 95

Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Gly Thr Thr Ile Gly Gln Tyr Thr Tyr Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

115 120 125

Gly Gly Gly Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro

130 135 140

Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys

145 150 155 160

Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val

165 170 175

Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp

180 185 190

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr

195 200 205

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp

210 215 220

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu

225 230 235 240

Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg

245 250 255

Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys

260 265 270

Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

275 280 285

Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys

290 295 300

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser

305 310 315 320

Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser

325 330 335

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser

340 345 350

Leu Ser Leu Ser Pro Gly

355

<210> 26

<211> 368

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> P124-20GS-Fc

<400> 26

Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Arg Thr Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Lys Ser Asn Tyr Lys Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Ala

35 40 45

Arg Ala Phe Val Gly Arg Thr Asp Trp Thr Gly Lys Ser Ala Ile Ile

50 55 60

Ala Asn Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys

65 70 75 80

Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala

85 90 95

Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Gly Thr Thr Ile Gly Gln Tyr Thr Tyr Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

115 120 125

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Lys

130 135 140

Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro

145 150 155 160

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

165 170 175

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp

180 185 190

Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

195 200 205

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val

210 215 220

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

225 230 235 240

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys

245 250 255

Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr

260 265 270

Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr

275 280 285

Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

290 295 300

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu

305 310 315 320

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys

325 330 335

Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

340 345 350

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

355 360 365

<210> 27

<211> 348

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> P69-Fc

<400> 27

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Arg Thr Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Lys Ser Asn Tyr Lys Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Ala

35 40 45

Arg Ala Phe Val Gly Arg Thr Asp Trp Thr Gly Asn Ser Ala Ile Ile

50 55 60

Ala Asn Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys

65 70 75 80

Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala

85 90 95

Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Gly Thr Thr Ile Gly Gln Tyr Thr Tyr Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys

115 120 125

Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu

130 135 140

Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu

145 150 155 160

Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys

165 170 175

Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys

180 185 190

Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu

195 200 205

Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys

210 215 220

Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys

225 230 235 240

Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser

245 250 255

Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys

260 265 270

Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln

275 280 285

Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly

290 295 300

Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln

305 310 315 320

Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn

325 330 335

His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

340 345

<210> 28

<211> 348

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> P123-Fc

<400> 28

Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Arg Thr Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Lys Ser Asn Tyr Lys Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Ala

35 40 45

Arg Ala Phe Val Gly Arg Thr Asp Trp Thr Gly Ser Ser Ala Ile Ile

50 55 60

Ala Asn Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys

65 70 75 80

Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala

85 90 95

Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Gly Thr Thr Ile Gly Gln Tyr Thr Tyr Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys

115 120 125

Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu

130 135 140

Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu

145 150 155 160

Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys

165 170 175

Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys

180 185 190

Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu

195 200 205

Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys

210 215 220

Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys

225 230 235 240

Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser

245 250 255

Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys

260 265 270

Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln

275 280 285

Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly

290 295 300

Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln

305 310 315 320

Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn

325 330 335

His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

340 345

<210> 29

<211> 348

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> P124-Fc

<400> 29

Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Arg Thr Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Lys Ser Asn Tyr Lys Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Ala

35 40 45

Arg Ala Phe Val Gly Arg Thr Asp Trp Thr Gly Lys Ser Ala Ile Ile

50 55 60

Ala Asn Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys

65 70 75 80

Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala

85 90 95

Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Gly Thr Thr Ile Gly Gln Tyr Thr Tyr Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys

115 120 125

Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu

130 135 140

Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu

145 150 155 160

Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys

165 170 175

Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys

180 185 190

Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu

195 200 205

Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys

210 215 220

Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys

225 230 235 240

Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser

245 250 255

Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys

260 265 270

Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln

275 280 285

Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly

290 295 300

Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln

305 310 315 320

Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn

325 330 335

His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

340 345

<210> 30

<211> 226

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> IgG1短铰链

<400> 30

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly

1 5 10 15

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

20 25 30

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

35 40 45

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

50 55 60

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

65 70 75 80

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

85 90 95

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

100 105 110

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

115 120 125

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

130 135 140

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

145 150 155 160

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

165 170 175

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

180 185 190

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

195 200 205

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

210 215 220

Pro Gly

225

<210> 31

<211> 355

<212> PRT

<213> 智人

<400> 31

Met Asp Tyr Thr Leu Asp Leu Ser Val Thr Thr Val Thr Asp Tyr Tyr

1 5 10 15

Tyr Pro Asp Ile Phe Ser Ser Pro Cys Asp Ala Glu Leu Ile Gln Thr

20 25 30

Asn Gly Lys Leu Leu Leu Ala Val Phe Tyr Cys Leu Leu Phe Val Phe

35 40 45

Ser Leu Leu Gly Asn Ser Leu Val Ile Leu Val Leu Val Val Cys Lys

50 55 60

Lys Leu Arg Ser Ile Thr Asp Val Tyr Leu Leu Asn Leu Ala Leu Ser

65 70 75 80

Asp Leu Leu Phe Val Phe Ser Phe Pro Phe Gln Thr Tyr Tyr Leu Leu

85 90 95

Asp Gln Trp Val Phe Gly Thr Val Met Cys Lys Val Val Ser Gly Phe

100 105 110

Tyr Tyr Ile Gly Phe Tyr Ser Ser Met Phe Phe Ile Thr Leu Met Ser

115 120 125

Val Asp Arg Tyr Leu Ala Val Val His Ala Val Tyr Ala Leu Lys Val

130 135 140

Arg Thr Ile Arg Met Gly Thr Thr Leu Cys Leu Ala Val Trp Leu Thr

145 150 155 160

Ala Ile Met Ala Thr Ile Pro Leu Leu Val Phe Tyr Gln Val Ala Ser

165 170 175

Glu Asp Gly Val Leu Gln Cys Tyr Ser Phe Tyr Asn Gln Gln Thr Leu

180 185 190

Lys Trp Lys Ile Phe Thr Asn Phe Lys Met Asn Ile Leu Gly Leu Leu

195 200 205

Ile Pro Phe Thr Ile Phe Met Phe Cys Tyr Ile Lys Ile Leu His Gln

210 215 220

Leu Lys Arg Cys Gln Asn His Asn Lys Thr Lys Ala Ile Arg Leu Val

225 230 235 240

Leu Ile Val Val Ile Ala Ser Leu Leu Phe Trp Val Pro Phe Asn Val

245 250 255

Val Leu Phe Leu Thr Ser Leu His Ser Met His Ile Leu Asp Gly Cys

260 265 270

Ser Ile Ser Gln Gln Leu Thr Tyr Ala Thr His Val Thr Glu Ile Ile

275 280 285

Ser Phe Thr His Cys Cys Val Asn Pro Val Ile Tyr Ala Phe Val Gly

290 295 300

Glu Lys Phe Lys Lys His Leu Ser Glu Ile Phe Gln Lys Ser Cys Ser

305 310 315 320

Gln Ile Phe Asn Tyr Leu Gly Arg Gln Met Pro Arg Glu Ser Cys Glu

325 330 335

Lys Ser Ser Ser Cys Gln Gln His Ser Ser Arg Ser Ser Ser Val Asp

340 345 350

Tyr Ile Leu

355

<210> 32

<211> 366

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> hCCR8-Δ18-3XHA

<400> 32

Met Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Ala Tyr Pro Tyr Asp Val

1 5 10 15

Pro Asp Tyr Ala Gly Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Ile Phe

20 25 30

Ser Ser Pro Cys Asp Ala Glu Leu Ile Gln Thr Asn Gly Lys Leu Leu

35 40 45

Leu Ala Val Phe Tyr Cys Leu Leu Phe Val Phe Ser Leu Leu Gly Asn

50 55 60

Ser Leu Val Ile Leu Val Leu Val Val Cys Lys Lys Leu Arg Ser Ile

65 70 75 80

Thr Asp Val Tyr Leu Leu Asn Leu Ala Leu Ser Asp Leu Leu Phe Val

85 90 95

Phe Ser Phe Pro Phe Gln Thr Tyr Tyr Leu Leu Asp Gln Trp Val Phe

100 105 110

Gly Thr Val Met Cys Lys Val Val Ser Gly Phe Tyr Tyr Ile Gly Phe

115 120 125

Tyr Ser Ser Met Phe Phe Ile Thr Leu Met Ser Val Asp Arg Tyr Leu

130 135 140

Ala Val Val His Ala Val Tyr Ala Leu Lys Val Arg Thr Ile Arg Met

145 150 155 160

Gly Thr Thr Leu Cys Leu Ala Val Trp Leu Thr Ala Ile Met Ala Thr

165 170 175

Ile Pro Leu Leu Val Phe Tyr Gln Val Ala Ser Glu Asp Gly Val Leu

180 185 190

Gln Cys Tyr Ser Phe Tyr Asn Gln Gln Thr Leu Lys Trp Lys Ile Phe

195 200 205

Thr Asn Phe Lys Met Asn Ile Leu Gly Leu Leu Ile Pro Phe Thr Ile

210 215 220

Phe Met Phe Cys Tyr Ile Lys Ile Leu His Gln Leu Lys Arg Cys Gln

225 230 235 240

Asn His Asn Lys Thr Lys Ala Ile Arg Leu Val Leu Ile Val Val Ile

245 250 255

Ala Ser Leu Leu Phe Trp Val Pro Phe Asn Val Val Leu Phe Leu Thr

260 265 270

Ser Leu His Ser Met His Ile Leu Asp Gly Cys Ser Ile Ser Gln Gln

275 280 285

Leu Thr Tyr Ala Thr His Val Thr Glu Ile Ile Ser Phe Thr His Cys

290 295 300

Cys Val Asn Pro Val Ile Tyr Ala Phe Val Gly Glu Lys Phe Lys Lys

305 310 315 320

His Leu Ser Glu Ile Phe Gln Lys Ser Cys Ser Gln Ile Phe Asn Tyr

325 330 335

Leu Gly Arg Gln Met Pro Arg Glu Ser Cys Glu Lys Ser Ser Ser Cys

340 345 350

Gln Gln His Ser Ser Arg Ser Ser Ser Val Asp Tyr Ile Leu

355 360 365

<210> 33

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR1-Kabat

<400> 33

Asn Tyr Lys Ser Asn Tyr Lys Met Ala

1 5

<210> 34

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR3-Kabat

<400> 34

Gly Thr Thr Ile Gly Gln Tyr Thr Tyr

1 5

<210> 35

<211> 98

<212> PRT

<213> 智人

<400> 35

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Val Ile Ser Ser Asp Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg

<210> 36

<211> 11

<212> PRT

<213> 智人

<400> 36

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

1 5 10

Claims (15)

1.一种人CCR8(hCCR8)结合剂，其中所述结合剂是非阻断性hCCR8结合剂。

2.根据权利要求1所述的结合剂，其中所述结合剂结合hCCR8的N末端胞外区。

3.根据前述权利要求1或2所述的结合剂，包含结合hCCR8的单域抗体部分。

4.根据权利要求3所述的结合剂，其中所述单域抗体部分包含三个互补决定区(CDR)，即CDR1、CDR2和CDR3，其中CDR3选自：

a)AAGTTIGQYTY(SEQ ID NO:3)的氨基酸序列；

b)与SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少80％氨基酸同一性的氨基酸序列；和

c)与SEQ ID NO:3的序列具有3、2或1个氨基酸序列差异的氨基酸序列。

5.根据权利要求4所述的结合剂，其中

CDR1选自：

a)GRTFTNYKSNYK(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列；

b)与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少80％氨基酸同一性的氨基酸序列；和

c)与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有3、2、1个氨基酸差异的氨基酸序列；

以及

CDR2选自：

d)TDWTGXSA(SEQ ID NO:2)的氨基酸序列，其中X选自N、S和K；

e)与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少80％氨基酸同一性的氨基酸序列，其中X选自N、S和K；

f)与SEQ ID NO:2的氨基酸序列有3、2、1个氨基酸差异的氨基酸序列，其中X选自N、S和K。

6.根据权利要求4或权利要求5所述的结合剂，其中所述单域抗体部分还包含与SEQ IDNO:4-7具有至少85％序列同一性的四个框架区(FR)。

7.根据权利要求3至6的结合剂，其中所述单域抗体部分包含SEQ ID NO:8或SEQ IDNO:9的氨基酸序列。

8.根据前述权利要求中任一项所述的结合剂，其中所述结合剂抑制人CCR8的信号传导少于50％。

9.根据前述权利要求中任一项所述的结合剂，其中所述结合剂包含结合人CCR8的单域抗体部分并且包含至少一个细胞毒性部分。

10.根据权利要求9所述的结合剂，其中所述细胞毒性部分

-诱导抗体依赖性细胞毒性(ADCC)，

-诱导补体依赖性细胞毒性(CDC)，

-诱导抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)，

-结合并激活T细胞，或者

-包含细胞毒性有效负载。

11.一种核酸，其编码根据前述权利要求中任一项所述的结合剂。

12.根据权利要求1至10中任一项所述的结合剂或根据权利要求11所述的核酸，其用作药物。

13.根据权利要求1至10中任一项所述的结合剂或根据权利要求11所述的核酸，其用于治疗肿瘤。

14.根据权利要求13所述的用于用途的结合剂或核酸，其中所述肿瘤选自乳腺癌、子宫体癌、肺癌、胃癌、头颈部鳞状细胞癌、皮肤癌、结直肠癌、肾癌和T细胞淋巴瘤。

15.根据权利要求13或14中任一项所述用于用途的结合剂或核酸，其中所述治疗还包含施用检查点抑制剂，例如阻断PD-1或PD-L1的抑制剂。