TW202144432A - 磷脂醯肌醇蛋白聚糖－２結合部分、嵌合抗原受體及其用途 - Google Patents

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湯逢源
楊帥
彭園園
唐安
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劉昀蕾
武術
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    • C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
    • C12N2502/30—Coculture with; Conditioned medium produced by tumour cells

Abstract

本申請提供了GPC2特異性抗體及其抗原結合片段。提供了一種特異性結合磷脂醯肌醇蛋白聚糖-2（GPC2）的嵌合抗原受體（CAR），該嵌合抗原受體包含GPC2特異性抗體、跨膜域和胞內信號傳導域。包含揭露的CAR構建體的Τ細胞可以用於癌症免疫療法。

Description

磷脂醯肌醇蛋白聚糖-2結合部分、嵌合抗原受體及其用途
本揭露關於對腫瘤抗原具有特異性的抗體和嵌合抗原受體，及其用於癌症免疫療法之用途。特別地，本揭露關於對磷脂醯肌醇蛋白聚糖-2（GPC2）具有特異性的抗體和嵌合抗原受體（CAR）及其用途。
2.
神經母細胞瘤（NBL）係由神經脊細胞引起之顱外癌，係繼白血病和腦瘤之後第三大最常見兒童癌症[1，2]。NBL占兒科癌症之8%-10%，並且90%的NBL患者確診年齡在五歲以下。每年在北美報導大約700例NBL，在歐洲報導1500例。亞太地區每百萬人口中大約有8-12個NBL發病[3]。由於快速侵襲和轉移，在目前治療方案下，具有高風險NBL的NBL患者之預後較差。相比I-II期患者之存活率90%，IV期患者之5年存活率係40%。從首次診斷開始，接受標準療法之患者中約有45%在14個月內復發，並且死亡率超過80% [1，2]。因此，對於安全且有效地治療神經母細胞瘤存在未滿足且迫切之需求。
已經表明，磷脂醯肌醇蛋白聚糖-2（GPC2）mRNA和蛋白在神經母細胞瘤中高度表現[4，5]。在小細胞肺癌、尤文氏肉瘤（Ewing sarcoma）、橫紋肌肉瘤、睾丸生殖細胞瘤和急性淋巴母細胞性白血病中也觀察到高水平GPC2表現（圖1）。GPC2係胞外糖基磷脂醯肌醇（GPI）錨定的蛋白聚糖信號傳導共受體。它屬於六員人磷脂醯肌醇蛋白聚糖蛋白家族（該等蛋白在生長因子信號傳導和癌細胞生長中起著不同的作用），並且是神經母細胞瘤細胞增殖所必需的[5]。GPC2的膜表現在小兒皮膚和食道中受限，而發現在成年睾丸和發育中的胎兒腦中具有低表現水平[5，6]。最近的數據表明，GPC2還可以藉由抑制成纖維細胞生長因子2誘導的祖細胞增殖來調節神經元祖細胞之增殖[7]。GPC2蛋白的消耗消除了NBL腫瘤細胞生長[4，5]，這表明它對NBL腫瘤細胞之生存必不可少。
嵌合抗原受體（CAR）由對抗原（例如腫瘤抗原）具有特異性的胞外結合域，與跨膜域和T細胞信號傳導部分融合組成。該等受體在T細胞表面表現時介導靶標結合並激活T細胞，最終誘導靶細胞裂解。CAR T細胞係經過基因工程化以產生人工T細胞受體（例如CAR）之T細胞，用於免疫療法。CAR T細胞正在成為治療多發性白血病的有前途之方法，但尚未充分探索其在治療實性瘤中之潛力。
本申請提供了特異性結合GPC2的抗體或抗原結合片段（例如抗GPC2單域抗體（sdAb）或其抗原結合片段）、包括一個或多個抗GPC2 sdAb或其抗原結合片段（例如VH H片段）的嵌合抗原受體（CAR）、工程化免疫效應細胞、以及其在癌症免疫療法中之使用方法。
本揭露提供了結合磷脂醯肌醇蛋白聚糖-2（GPC2）的結合部分（例如，抗體或其抗原結合片段），該結合部分包含第一可變域，該第一可變域包含具有選自由SEQ ID NO: 1-30組成之群組的胺基酸序列的互補決定區（CDR）1區、具有選自由SEQ ID NO: 31-61組成之群組的胺基酸序列的CDR2區、和具有選自由SEQ ID NO: 62-92組成之群組的胺基酸序列的CDR3區，或在CDR1、CDR2和CDR3中的每一個中包含獨立地多達三個胺基酸取代（例如，一個、兩個或三個胺基酸取代）的所述SEQ ID NO的一個或多個變體。
在一個方面，本揭露之抗體或其抗原結合片段可以包括選自由SEQ ID NO: 1-30組成之群組的CDR1、選自由SEQ ID NO: 31-61組成之群組的CDR2、和選自由SEQ ID NO: 62-92組成之群組的CDR3。
在一些實施方式中，本揭露之抗體或其抗原結合片段可以包括包含SEQ ID NO: 1的CDR1、包含SEQ ID NO: 31的CDR2、和包含SEQ ID NO: 62的CDR3，或包含SEQ ID NO: 2的CDR1、包含SEQ ID NO: 32的CDR2、和包含SEQ ID NO: 63的CDR3，或包含SEQ ID NO: 3的CDR1、包含SEQ ID NO: 33的CDR2、和包含SEQ ID NO: 64的CDR3，或包含SEQ ID NO: 4的CDR1、包含SEQ ID NO: 34的CDR2、和包含SEQ ID NO: 65的CDR3，或包含SEQ ID NO: 5的CDR1、包含SEQ ID NO: 35的CDR2、和包含SEQ ID NO: 66的CDR3，或包含SEQ ID NO: 6的CDR1、包含SEQ ID NO: 36的CDR2、和包含SEQ ID NO: 67的CDR3，或包含SEQ ID NO: 7的CDR1、包含SEQ ID NO: 37的CDR2、和包含SEQ ID NO: 68的CDR3，或包含SEQ ID NO: 8的CDR1、包含SEQ ID NO: 38的CDR2、和包含SEQ ID NO: 69的CDR3，或包含SEQ ID NO: 9的CDR1、包含SEQ ID NO: 39的CDR2、和包含SEQ ID NO: 70的CDR3，或包含SEQ ID NO: 10的CDR1、包含SEQ ID NO: 40的CDR2、和包含SEQ ID NO: 71的CDR3，或包含SEQ ID NO: 11的CDR1、包含SEQ ID NO: 41的CDR2、和包含SEQ ID NO: 72的CDR3，或包含SEQ ID NO: 12的CDR1、包含SEQ ID NO: 42的CDR2、和包含SEQ ID NO: 73的CDR3，或包含SEQ ID NO: 11的CDR1、包含SEQ ID NO: 43的CDR2、和包含SEQ ID NO: 74的CDR3，或包含SEQ ID NO: 13的CDR1、包含SEQ ID NO: 44的CDR2、和包含SEQ ID NO: 75的CDR3，或包含SEQ ID NO: 14的CDR1、包含SEQ ID NO: 45的CDR2、和包含SEQ ID NO: 76的CDR3，或包含SEQ ID NO: 15的CDR1、包含SEQ ID NO: 46的CDR2、和包含SEQ ID NO: 77的CDR3，或包含SEQ ID NO: 16的CDR1、包含SEQ ID NO: 47的CDR2、和包含SEQ ID NO: 78的CDR3，或包含SEQ ID NO: 17的CDR1、包含SEQ ID NO: 48的CDR2、和包含SEQ ID NO: 79的CDR3，或包含SEQ ID NO: 18的CDR1、包含SEQ ID NO: 49的CDR2、和包含SEQ ID NO: 80的CDR3，或包含SEQ ID NO: 19的CDR1、包含SEQ ID NO: 50的CDR2、和包含SEQ ID NO: 81的CDR3，或包含SEQ ID NO: 20的CDR1、包含SEQ ID NO: 51的CDR2、和包含SEQ ID NO: 82的CDR3，或包含SEQ ID NO: 21的CDR1、包含SEQ ID NO: 52的CDR2、和包含SEQ ID NO: 83的CDR3，或包含SEQ ID NO: 22的CDR1、包含SEQ ID NO: 53的CDR2、和包含SEQ ID NO: 84的CDR3，或包含SEQ ID NO: 23的CDR1、包含SEQ ID NO: 54的CDR2、和包含SEQ ID NO: 85的CDR3，或包含SEQ ID NO: 24的CDR1、包含SEQ ID NO: 55的CDR2、和包含SEQ ID NO: 86的CDR3，或包含SEQ ID NO: 25的CDR1、包含SEQ ID NO: 56的CDR2、和包含SEQ ID NO: 87的CDR3，或包含SEQ ID NO: 26的CDR1、包含SEQ ID NO: 57的CDR2、和包含SEQ ID NO: 88的CDR3，或包含SEQ ID NO: 27的CDR1、包含SEQ ID NO: 58的CDR2、和包含SEQ ID NO: 89的CDR3，或包含SEQ ID NO: 28的CDR1、包含SEQ ID NO: 59的CDR2、和包含SEQ ID NO: 90的CDR3，或包含SEQ ID NO: 29的CDR1、包含SEQ ID NO: 60的CDR2、和包含SEQ ID NO: 91的CDR3，或包含SEQ ID NO: 30的CDR1、包含SEQ ID NO: 61的CDR2、和包含SEQ ID NO: 92的CDR3，或其在CDR1、CDR2、和/或CDR3中獨立地包含一個、兩個或三個保守胺基酸取代的變體。
在一些實施方式中，本揭露之抗體或其抗原結合片段可以包括包含SEQ ID NO: 1的CDR1、包含SEQ ID NO: 31的CDR2、和包含SEQ ID NO: 62的CDR3，或包含SEQ ID NO: 2的CDR1、包含SEQ ID NO: 32的CDR2、和包含SEQ ID NO: 63的CDR3，或包含SEQ ID NO: 3的CDR1、包含SEQ ID NO: 33的CDR2、和包含SEQ ID NO: 64的CDR3，或包含SEQ ID NO: 4的CDR1、包含SEQ ID NO: 34的CDR2、和包含SEQ ID NO: 65的CDR3，或包含SEQ ID NO: 5的CDR1、包含SEQ ID NO: 35的CDR2、和包含SEQ ID NO: 66的CDR3，或包含SEQ ID NO: 6的CDR1、包含SEQ ID NO: 36的CDR2、和包含SEQ ID NO: 67的CDR3，或包含SEQ ID NO: 7的CDR1、包含SEQ ID NO: 37的CDR2、和包含SEQ ID NO: 68的CDR3，或包含SEQ ID NO: 8的CDR1、包含SEQ ID NO: 38的CDR2、和包含SEQ ID NO: 69的CDR3，或包含SEQ ID NO: 9的CDR1、包含SEQ ID NO: 39的CDR2、和包含SEQ ID NO: 70的CDR3，或包含SEQ ID NO: 10的CDR1、包含SEQ ID NO: 40的CDR2、和包含SEQ ID NO: 71的CDR3，或包含SEQ ID NO: 11的CDR1、包含SEQ ID NO: 41的CDR2、和包含SEQ ID NO: 72的CDR3，或包含SEQ ID NO: 12的CDR1、包含SEQ ID NO: 42的CDR2、和包含SEQ ID NO: 73的CDR3，或包含SEQ ID NO: 11的CDR1、包含SEQ ID NO: 43的CDR2、和包含SEQ ID NO: 74的CDR3，或包含SEQ ID NO: 13的CDR1、包含SEQ ID NO: 44的CDR2、和包含SEQ ID NO: 75的CDR3，或包含SEQ ID NO: 14的CDR1、包含SEQ ID NO: 45的CDR2、和包含SEQ ID NO: 76的CDR3，或包含SEQ ID NO: 15的CDR1、包含SEQ ID NO: 46的CDR2、和包含SEQ ID NO: 77的CDR3，或包含SEQ ID NO: 16的CDR1、包含SEQ ID NO: 47的CDR2、和包含SEQ ID NO: 78的CDR3，或包含SEQ ID NO: 17的CDR1、包含SEQ ID NO: 48的CDR2、和包含SEQ ID NO: 79的CDR3，或包含SEQ ID NO: 18的CDR1、包含SEQ ID NO: 49的CDR2、和包含SEQ ID NO: 80的CDR3，或包含SEQ ID NO: 19的CDR1、包含SEQ ID NO: 50的CDR2、和包含SEQ ID NO: 81的CDR3，或包含SEQ ID NO: 20的CDR1、包含SEQ ID NO: 51的CDR2、和包含SEQ ID NO: 82的CDR3，或包含SEQ ID NO: 21的CDR1、包含SEQ ID NO: 52的CDR2、和包含SEQ ID NO: 83的CDR3，或包含SEQ ID NO: 22的CDR1、包含SEQ ID NO: 53的CDR2、和包含SEQ ID NO: 84的CDR3，或包含SEQ ID NO: 23的CDR1、包含SEQ ID NO: 54的CDR2、和包含SEQ ID NO: 85的CDR3，或包含SEQ ID NO: 24的CDR1、包含SEQ ID NO: 55的CDR2、和包含SEQ ID NO: 86的CDR3，或包含SEQ ID NO: 25的CDR1、包含SEQ ID NO: 56的CDR2、和包含SEQ ID NO: 87的CDR3，或包含SEQ ID NO: 26的CDR1、包含SEQ ID NO: 57的CDR2、和包含SEQ ID NO: 88的CDR3，或包含SEQ ID NO: 27的CDR1、包含SEQ ID NO: 58的CDR2、和包含SEQ ID NO: 89的CDR3，或包含SEQ ID NO: 28的CDR1、包含SEQ ID NO: 59的CDR2、和包含SEQ ID NO: 90的CDR3，或包含SEQ ID NO: 29的CDR1、包含SEQ ID NO: 60的CDR2、和包含SEQ ID NO: 91的CDR3，或包含SEQ ID NO: 30的CDR1、包含SEQ ID NO: 61的CDR2、和包含SEQ ID NO: 92的CDR3。
在一些實施方式中，本揭露之抗體或其抗原結合片段可以包括第一可變域，該第一可變域與選自由SEQ ID NO: 93-142組成之群組的胺基酸序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列同一性。
在一些實施方式中，本揭露之抗體或其抗原結合片段可以包括第一可變域，該第一可變域具有選自由SEQ ID NO: 93-142組成之群組的胺基酸序列。
在另一個方面，以上所述之抗體或其抗原結合片段進一步包含第二可變域，該第二可變域包含選自由SEQ ID NO: 93-142組成之群組的胺基酸序列。
在一些實施方式中，本揭露之抗體或其抗原結合片段可以包括串聯抗體，該串聯抗體包含含有選自由SEQ ID NO: 93-142組成之群組的胺基酸序列的第一可變域和含有選自由SEQ ID NO: 93-142組成之群組的胺基酸序列的第二可變域。
在一些實施方式中，本揭露之串聯抗體可以具有與第二可變域相同的第一可變域，使得它們與相同的抗原結合，例如單價串聯抗體。
在一些實施方式中，本揭露之串聯抗體可以具有與第二可變域不同的第一可變域，使得它們與不同的抗原結合，例如多價串聯抗體。
在一些實施方式中，本揭露之串聯抗體可以包括（從N-末端至C-末端）包含SEQ ID NO: 126的第一可變域和包含SEQ ID NO: 128的第二可變域，或包含SEQ ID NO: 128的第一可變域和包含SEQ ID NO: 126的第二可變域，或包含SEQ ID NO: 124的第一可變域和包含SEQ ID NO: 127的第二可變域，或包含SEQ ID NO: 127的第一可變域和包含SEQ ID NO: 124的第二可變域，或包含SEQ ID NO: 124的第一可變域和包含SEQ ID NO: 124的第二可變域。
在一些實施方式中，本揭露之串聯抗體可以具有視需要經由連接子（linker）與第二可變域連接的第一可變域。在一些實施方式中，該連接子包含肽連接子，並且視需要該肽連接子係GS連接子。
在一些實施方式中，本揭露之串聯抗體可以與選自由SEQ ID NO: 143-147和244-245組成之群組的胺基酸序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列同一性。
在一些實施方式中，本揭露之串聯抗體可以具有選自由SEQ ID NO: 143-147和244-245組成之群組的胺基酸序列。
在一些實施方式中，本揭露之抗體或其抗原結合片段可以具有第一可變域或第二可變域，該可變域選自由以下組成之群組：單域抗體（sdAb）、僅重鏈抗體（HCAb）、抗原-結合片段（Fab）、Fab’、F(ab’)2 、抗原結合可變區片段（Fv）、單鏈Fv（scFv）、(scFv)2 、免疫球蛋白（Ig）G1抗體、IgG2抗體、IgG3抗體和IgG4抗體。
在一些實施方式中，本揭露之抗體或其抗原結合片段可以具有包含VH H域的單域抗體（sdAb）。
在一些實施方式中，本揭露之抗體或其抗原結合片段可以具有駱駝科、嵌合、人源化或人可變域的第一可變域和/或第二可變域。
在另一個方面，本揭露之實施方式可以包括特異性結合GPC2的嵌合抗原受體（CAR），該嵌合抗原受體包含：(a) 包含第一結合域的胞外抗原結合域，該第一結合域包含以上所述之抗體或其抗原結合片段；b) 跨膜域；和 (c) 胞內信號傳導域。
在另一個方面，本揭露之實施方式可以包括特異性結合GPC2的嵌合抗原受體（CAR），該嵌合抗原受體包含（從N-末端至C-末端）：(a) 包含第一結合域的胞外抗原結合域，該第一結合域包含選自由SEQ ID NO: 1-30組成之群組的CDR1、選自由SEQ ID NO: 31-61組成之群組的CDR2、和選自由SEQ ID NO: 62-92組成之群組的CDR3，或其在CDR1、CDR2、和/或CDR3中獨立地包含一個、兩個或三個胺基酸取代的變體，(b) 跨膜域；和 (c) 胞內信號傳導域。
在一些實施方式中，本揭露之CAR包含（從N-末端至C-末端）：(a) 包含第一結合域的胞外抗原結合域，該第一結合域包含選自由SEQ ID NO: 1-30組成之群組的CDR1、選自由SEQ ID NO: 31-61組成之群組的CDR2、和選自由SEQ ID NO: 62-92組成之群組的CDR3，(b) 跨膜域；和 (c) 胞內信號傳導域。
在一些實施方式中，本揭露之CAR可以與選自由SEQ ID NO: 189-238和248-252組成之群組的胺基酸序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列同一性。
在一些實施方式中，本揭露之CAR可以具有選自由SEQ ID NO: 189-238和248-252組成之群組的胺基酸序列。
在另一個方面，本揭露之CAR可以包括串聯CAR，該串聯CAR具有胞外抗原結合域，該胞外抗原結合域包括本揭露之CAR的第一結合域和如下第二結合域，該第二結合域包含選自由SEQ ID NO: 1-30組成之群組的CDR1、選自由SEQ ID NO: 31-61組成之群組的CDR2和選自由SEQ ID NO: 62-92組成之群組的CDR3，或其在CDR1、CDR2、和/或CDR3中獨立地包含一個、兩個或三個保守胺基酸取代的變體，其中該第一結合域視需要經由連接子與第二結合域融合。
在一些實施方式中，本揭露之CAR進一步包含第二結合域，該第二結合域包含選自由SEQ ID NO: 1-30組成之群組的CDR1、選自由SEQ ID NO: 31-61組成之群組的CDR2、和選自由SEQ ID NO: 62-92組成之群組的CDR3。在一些實施方式中，該第一結合域視需要經由連接子與第二結合域融合。在一些實施方式中，該連接子包含肽連接子，並且視需要該連接子係GS連接子。
在一些實施方式中，本揭露之串聯CAR可以與選自由SEQ ID NO: 239-243和246-247組成之群組的胺基酸序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列同一性。
在一些實施方式中，本揭露之串聯CAR可以具有選自由SEQ ID NO: 239-243和246-247組成之群組的胺基酸序列。
在一些實施方式中，本揭露之串聯CAR可以包括胞外抗原結合域，該胞外抗原結合域進一步包含與第二抗原結合的第二結合域，並且該第二抗原與GPC2不同。換句話說，條件係第一結合域不與第二抗原結合。
在一些實施方式中，本揭露之串聯CAR可以包括雙唾液酸神經節苷脂（GD2）或δ樣蛋白3（DLL3）的第二抗原。
在一些實施方式中，本揭露之CAR和串聯CAR可以進一步包括位於多肽的N-末端的訊息肽。
在一些實施方式中，本揭露之CAR和串聯CAR可以包括訊息肽，該訊息肽衍生自選自由以下組成之群組的分子：分化簇（CD）8 α鏈（CD8α）、粒細胞巨噬細胞群落刺激因子（GM-CSF）受體α和IgG1重鏈。
在一些實施方式中，本揭露之CAR和串聯CAR可以進一步包括位於胞外抗原結合域的C-末端和跨膜域的N-末端之間的鉸鏈域。
在一些實施方式中，本揭露之CAR和串聯CAR可以包括衍生自CD8α、CD28或IgG4片段可結晶區（Fc）的鉸鏈域。
在一些實施方式中，本揭露之CAR和串聯CAR可以包括跨膜域，該跨膜域衍生自選自由以下組成之群組的分子：CD8α、CD4、CD2、CD27、CD28、CD137、CD80、CD86、CTLA-4（CD152）、ICOS、OX40和計劃性細胞死亡蛋白1（PD-1）。
在一些實施方式中，本揭露之CAR和串聯CAR可以包括包含共刺激信號傳導域的胞內信號傳導域。
在一些實施方式中，本揭露之CAR和串聯CAR可以包括包含免疫效應細胞的初級胞內信號傳導域的胞內信號傳導域。
在一些實施方式中，本揭露之CAR和串聯CAR可以包括衍生自CD3ζ的初級胞內信號傳導域。
在一些實施方式中，本揭露之CAR和串聯CAR可以包括共刺激信號傳導域，該共刺激信號傳導域衍生自選自由以下組成之群組的共刺激分子：CD27、CD28、4-1BB（CD137）、TNF受體超家族成員4（OX40）、CD30、CD40、CD3、TNF受體超家族成員14（HVEM）、可誘導的T細胞共刺激因子（ICOS）、MYD88先天性免疫訊息傳遞銜接子（Myd88）、整合蛋白亞基α L（LFA-1）、CD2、CD7、TNF超家族成員14（LIGHT）、NKG2-C II型整合膜蛋白（NKG2C）、CD276分子（B7-H3）、CD83的配位基、及其組合。
在另一個方面，本揭露之實施方式可以包括雙CAR系統，其包含如上所述之第一CAR和如上所述之第二CAR。
在另一個方面，本揭露之實施方式可以包括雙CAR系統，其包括特異性結合GPC2的第一CAR和特異性結合GPC2的第二CAR或結合第二抗原的第二CAR，該第一CAR包含（從N-末端至C-末端）：(a) 包含第一結合域的第一胞外抗原結合域，該第一結合域包含選自由SEQ ID NO: 1-30組成之群組的CDR1、選自由SEQ ID NO: 31-61組成之群組的CDR2、和選自由SEQ ID NO: 62-92組成之群組的CDR3，或其在CDR1、CDR2、和/或CDR3中獨立地包含一個、兩個或三個保守胺基酸取代的變體，(b) 第一跨膜域；和 (c) 第一胞內信號傳導域，該特異性結合GPC2的第二CAR包含（從N-末端至C-末端）：(a) 包含第二結合域的第二胞外抗原結合域，該第二結合域包含選自由SEQ ID NO: 1-30組成之群組的CDR1、選自由SEQ ID NO: 31-61組成之群組的CDR2、和選自由SEQ ID NO: 62-92組成之群組的CDR3，或其在CDR1、CDR2、和/或CDR3中獨立地包含一個、兩個或三個保守胺基酸取代的變體，(b) 第二跨膜域；和 (c) 第二胞內信號傳導域，該與第二抗原結合的第二CAR包含（從N-末端至C-末端）：(a) 包含與第二抗原結合的第二結合域的第二胞外抗原結合域，條件係第一結合域不與第二抗原結合，(b) 第二跨膜域；和 (c) 第二胞內信號傳導域。
在一些實施方式中，本發明之雙CAR系統可以包括第一CAR和/或第二CAR，該第一CAR和/或第二CAR與選自由SEQ ID NO: 189-238和248-252組成之群組的胺基酸序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列同一性。
在一些實施方式中，本發明之雙CAR系統可以包括第一CAR和/或第二CAR，該第一CAR和/或第二CAR具有選自由SEQ ID NO: 189-238和248-252組成之群組的胺基酸序列。
在一些實施方式中，本發明之雙CAR系統可以包括第一CAR和/或第二CAR，該第一CAR和/或第二CAR進一步包含位於多肽的N-末端的訊息肽。
在一些實施方式中，本發明之雙CAR系統可以包括訊息肽，該訊息肽衍生自選自由以下組成之群組的分子：CD8α、GM-CSF受體α和IgG1重鏈。
在一些實施方式中，本發明之雙CAR系統可以包括第一CAR和/或第二CAR，該第一CAR和/或第二CAR進一步包含位於胞外抗原結合域的C-末端和跨膜域的N-末端之間的鉸鏈域。
在一些實施方式中，本發明之雙CAR系統可以包括衍生自CD8α、CD28或IgG4 Fc的鉸鏈域。
在一些實施方式中，本發明之雙CAR系統可以包括第一和第二跨膜域，其獨立地衍生自選自由以下組成之群組的分子：CD8α、CD4、CD2、CD27、CD28、CD137、CD80、CD86、CTLA-4（CD152）、ICOS、OX40和計劃性細胞死亡蛋白1（PD-1）。
在另一個方面，本發明之雙CAR系統可以包括第一和/或第二胞內信號傳導域，其各自獨立地包含共刺激信號傳導域。
在一些實施方式中，本發明之雙CAR系統可以包括共刺激信號傳導域，該共刺激信號傳導域衍生自選自由以下組成之群組的共刺激分子：CD27、CD28、CD137、OX40、CD30、CD40、CD3、HVEM、ICOS、Myd88、LFA-1、ICOS、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、CD83的配位基、及其組合。
在一些實施方式中，本發明之雙CAR系統可以包括第一和/或第二胞內信號傳導域，其各自獨立地進一步包含免疫效應細胞的初級胞內信號傳導域。
在一些實施方式中，本發明之雙CAR系統可以包括衍生自CD3ζ的初級胞內信號傳導域。
在一些實施方式中，本發明之雙CAR系統可以包括包含共刺激信號傳導域的第二CAR的胞內信號傳導域。在一些實施方式中，該共刺激信號傳導域衍生自選自由以下組成之群組的共刺激分子：CD27、CD28、CD137、OX40、CD30、CD40、CD3、HVEM、ICOS、Myd88、LFA-1、ICOS、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、CD83的配位基、及其組合。
在另一個方面，本揭露之實施方式可以包括分離的CAR系統（包括本揭露之雙CAR系統），其中第一胞內信號傳導域可以在結構上不同於第二胞內信號傳導域。
在一些實施方式中，本發明之分離的CAR系統可以包括包含免疫效應細胞的初級胞內信號傳導域的第一胞內信號傳導域和包含共刺激信號傳導域的第二胞內信號傳導域。
在一些實施方式中，本發明之分離的CAR系統可以包括由免疫效應細胞的初級胞內信號傳導域組成的第一胞內信號傳導域和由共刺激信號傳導域組成的第二胞內信號傳導域。
在一些實施方式中，本發明之分離的CAR系統可以包括衍生自CD3ζ的初級胞內信號傳導域。
在一些實施方式中，本發明之分離的CAR系統可以包括共刺激信號傳導域，該共刺激信號傳導域衍生自選自由以下組成之群組的共刺激分子：CD27、CD28、CD137、OX40、CD30、CD40、CD3、HVEM、ICOS、Myd88、LFA-1、ICOS、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、CD83的配位基、及其組合。
在另一個方面，本揭露之實施方式可以包括核酸分子，該等核酸分子編碼本揭露之抗體（包括單價抗體和串聯抗體）及其抗原結合片段、單CAR、串聯CAR、雙CAR系統和分離的CAR系統。
在一些實施方式中，該核酸分子可以選自由SEQ ID NO: 148-178組成之群組。
在一方面，本揭露之實施方式可以包括表現載體，該表現載體包含本揭露之核酸分子。
在另一個方面，該載體可以是病毒載體或非病毒載體。在一些實施方式中，病毒載體係慢病毒載體。
在一方面，本揭露之實施方式可以包括工程化免疫效應細胞，該工程化免疫效應細胞包含本揭露之載體，或包含本揭露之核酸。
在一些實施方式中，該工程化免疫效應細胞可以包括選自由以下組成之群組的免疫效應細胞：T細胞、NK細胞、外周血單核細胞（PBMC）、造血幹細胞、多能幹細胞、胚胎幹細胞、及其組合。
在一些實施方式中，該工程化免疫效應細胞可以包括選自由以下組成之群組的T細胞：細胞毒性T細胞、輔助T細胞、自然殺傷T細胞和γδ T細胞。
在另一個方面，該工程化免疫效應細胞可以進一步包含膜結合的介白素（IL）-15或膜結合的IL-7。
在一方面，本揭露之實施方式可以包括組成物，該組成物包含治療有效量的本揭露之工程化免疫效應細胞和藥學上可接受的載體。
在另一個方面，本揭露之組成物可以進一步包括免疫調節劑。
在另一個方面，該免疫調節劑可以選自由以下組成之群組：3-(4-胺基-1-側氧基-1,3-二氫-2H-異吲哚-2-基)哌啶-2,6-二酮、泊馬度胺（pomalidomide）、阿伐度胺（avadomide）、及其組合。
在一些實施方式中，該免疫調節劑可以包括3-(4-胺基-1-側氧基-1,3-二氫-2H-異吲哚-2-基)哌啶-2,6-二酮。
在一方面，本揭露之實施方式可以包括治療患有表現GPC2的癌症的患者之方法，該方法包括向患者施用本揭露之組成物。
在一些實施方式中，該工程化免疫效應細胞可以從患者獲得。
在一些實施方式中，該工程化免疫效應細胞可以從健康供體獲得。
在另一個方面，該癌症可以選自由以下組成之群組：急性淋巴母細胞性白血病細胞、尤文氏肉瘤細胞、神經母細胞瘤、胚胎性橫紋肌肉瘤、肺泡橫紋肌肉瘤、肺癌、腦癌、子宮癌、子宮頸癌、大腸直腸癌、胃癌、頭頸癌、乳癌、胰臟癌、卵巢癌、腎癌、食道癌、睾丸癌和皮膚癌。
另一個實施方式包括嵌合抗原受體（CAR），該嵌合抗原受體包含 (i) 包含至少一個與GPC2選擇性結合的單域抗體的外域（ectodomain）；(ii) 跨膜域；和 (iii) 包含一個或多個基於免疫受體酪胺酸的激活模體（ITAM）域的內域（endodomain）。在一些實施方式中，該外域可以是多聚體。多聚體可以藉由使用甘胺酸-絲胺酸連接子將兩個單域抗體配對成可稱為多價抗體的物質之方式來形成。在本揭露之一些實施方式中，甘胺酸-絲胺酸連接子係例如(GGGGS)n ，其中n係0至8的整數。在一些實施方式中，n係3，即GGGGSGGGGSGGGGS（SEQ ID NO: 181）。雙特異性抗體也可以藉由使用甘胺酸-絲胺酸連接子將一個單域抗體（例如VH H）與另一個單域抗體（例如VH H）或對不同抗原具有特異性的單鏈抗體（scFv）配對來形成。在一些實施方式中，CAR的鉸鏈部分包含一部分CD8α、一部分CD28或一部分IgG4 Fc，或由其組成。CAR的跨膜部分可以衍生自與柔性鉸鏈相同的分子。內域可以包含T-細胞受體的ζ鏈或其同源物中的任一個（例如 η鏈、δ鏈、γ鏈或ε鏈），MB1 鏈，B29，常見FcR γ（FCER1G），Fc γ RIIa，FcR β（Fc ε R1b），以及一個、兩個或更多個胞內信號傳導域（例如CD27、CD28、CD137（4-1BB或TNF受體超家族成員9）、CD40、DAP-10、DAP-12、CD2、ICOS、OX40/CD134、FcεRIγ、IL-2Rβ/CD122、IL 2Rα/CD132、和CD40）的組合，以增強CAR T細胞持久性和治療功效。
可以用本文所述之CAR靶向的腫瘤相關抗原的實例除了GPC2外還包括，例如雙唾液酸神經節苷脂（GD2）、癌抗原125（CA-125）、黏蛋白1（MUC-1）、δ樣3（DLL3）、癌胚抗原、甲胎蛋白、表皮生長因子受體（EGFR）、EGFR VIII、erb-b2受體酪胺酸激酶(Her)2、Her3、上皮腫瘤抗原、包含7A的C型凝集素域（Dectin-1）等。
在一些實施方式中，可以將CAR與膜結合的細胞介素共表現，例如以在當存在少量腫瘤相關抗原時改善持久性。例如，可以將CAR與膜結合的IL-15或膜結合的IL-7共表現。
在一些實施方式中，可以將CAR與趨化因子受體共表現，例如以改善T細胞運輸和腫瘤浸潤。例如，可以將CAR與C-X-C模體趨化因子受體（CXCR）1/2、CXCR3、CXCR4、CXCR5、C-C模體趨化因子受體（CCR）2或CCR7共表現。
在一些實施方式中，可以將CAR與顯性負性PD-1受體或顯性負性轉化生長因子（TGF）β受體（其包含完整的外域但缺乏胞內信號傳導域）共表現，以改善T細胞持久性和抗腫瘤功效。
在一些實施方式中，GPC2 CAR T細胞可以與3-(4-胺基-1-側氧基-1,3-二氫-2H -異吲哚-2-基)哌啶-2,6-二酮（示出為化合物A）組合使用，以改善CAR T擴增和抗腫瘤功能。
Figure 02_image001
（化合物A）
本文揭露了GPC2特異性駱駝科單域抗體，其特異性結合人細胞表面GPC2。本文揭露了呈單價或二價形式的人源化VH H單域抗體，其結合人細胞表面GPC2。本文還揭露了構建體，其包含GPC2單域抗體（例如嵌合抗原受體（CAR）T細胞），該等單域抗體能夠抑制GPC2陽性腫瘤細胞生長並有效殺死GPC2陽性腫瘤細胞。本揭露描述了使用基於GPC2特異性單域抗體的嵌合抗原受體T細胞來治療GPC2陽性腫瘤之方法。1. 定義
除非本文另外定義，否則，本發明中使用的技術和科學術語具有熟悉該項技術者所通常理解之含義。
「一個/種（a/an）」和「該」：如本文所用的冠詞係指一個或多於一個（即，至少一個）的該冠詞的語法賓語。藉由舉例，「抗體」意指一種抗體或多於一種的抗體。
抗體：如本文所用，該術語係指藉由至少一個抗原識別位點識別並特異性地結合靶標如蛋白質、多肽、肽、碳水化合物、多核苷酸、脂質、或前述中任何的組合的免疫球蛋白分子，其中抗原結合位點通常位於免疫球蛋白分子之可變區內。如本文所用，該術語涵蓋完整多特異性抗體、完整單株抗體、單域抗體（sdAb；例如，駱駝科抗體，羊駝抗體）、單鏈Fv（scFv）抗體、重鏈抗體（HCAb）、輕鏈抗體（LCAb）、多特異性抗體、雙特異性抗體、單特異性抗體、單價抗體、包含抗體的抗原結合位點的融合蛋白、以及包含抗原結合位點的任何其他經修飾的免疫球蛋白分子（例如，雙可變域免疫球蛋白分子）（只要抗體表現出需要的生物學活性）。抗體還包括但不限於小鼠抗體、駱駝抗體、嵌合抗體、人源化抗體和人抗體。抗體可以是免疫球蛋白的五種主要類別中的任何一種：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，或其亞類（同種型）（例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2），基於其重鏈恒定域的同一性分別稱為α、δ、ε、γ和μ。不同類別的免疫球蛋白具有不同並且熟知的亞基結構和三維構型。抗體可以是裸的或與其他分子（包括但不限於毒素和放射性同位素）軛合。術語「免疫球蛋白」（Ig）與術語「抗體」在本文中可互換地使用。除非另外明確指出，否則如本文所用的，術語「抗體」包括完整抗體的「抗原結合片段」。
全長抗體：本文所用的該術語係指構成抗體的天然生物學形式的結構，包括可變區和恒定區。例如，在大多數哺乳動物（包括人和小鼠）中，IgG類的全長抗體係四聚體，並由相同的兩對（每對兩條）免疫球蛋白鏈組成，每對具有一條輕鏈和一條重鏈，每條輕鏈包含免疫球蛋白域VL和CL，並且每條重鏈包含免疫球蛋白域VH、CH1、CH2和CH3。在一些哺乳動物中，例如在駱駝和美洲駝中，IgG抗體僅由兩條重鏈組成（HCAb），每條重鏈均包含與Fc區附接的可變域（CH2和CH3域）。
化合價：如本文所用，該術語表示抗體分子中存在指定數目的結合位點。如此，術語「單價」、「二價」、「四價」和「六價」分別表示在抗體分子中存在一個結合位點、兩個結合位點、四個結合位點和六個結合位點。本文揭露的雙特異性抗體係「二價」。然而，單特異性二價抗體在本揭露之範圍內，其中兩個抗原結合位點結合相同的抗原。單特異性二價抗體的抗原結合位點可以結合抗原上的不同表位。
單特異性抗體：該術語係指抗體對抗原的特定表位的選擇性識別。例如，天然抗體係單特異性的。如本文所用，術語「單特異性」抗體表示具有一個或多個結合位點的抗體，每個結合位點結合相同抗原的相同表位。本揭露之對GPC2具有特異性的單特異性抗體可以是單價或多價的，例如 二價、四價或六價。
多特異性抗體 如本文所用，該術語可以包括多個免疫球蛋白可變域序列，其中該多個中的第一免疫球蛋白可變域序列對第一表位具有結合特異性並且該多個中的第二免疫球蛋白可變域序列對第二表位具有結合特異性。並且第一和第二表位在相同抗原（例如，多聚體蛋白的相同蛋白或亞單元）上或在不同抗原（例如，多聚體蛋白的不同蛋白或不同亞單元）上。多特異性抗體分子包含第三、第四或第五免疫球蛋白可變域。多特異性抗體分子係雙特異性抗體分子、三特異性抗體分子或四特異性抗體分子。
雙特異性抗體：該術語可以包括對第一表位具有結合特異性的重鏈可變域序列和輕鏈可變域序列以及對第二表位具有結合特異性的重鏈可變域序列和輕鏈可變域序列。雙特異性抗體分子可以具有對第一表位具有結合特異性的單域抗體（例如VH H或其片段）以及對第二表位具有結合特異性的單域抗體（例如VH H或其片段）。雙特異性抗體分子可以具有對第一表位具有結合特異性的scFv或其片段以及對第二表位具有結合特異性的scFv或其片段。並且第一和第二表位可以在相同抗原（例如，多聚體蛋白的相同蛋白或亞單元）上或在不同抗原（例如，多聚體蛋白的不同蛋白或不同亞單元）上。雙特異性抗體分子可以具有對第一表位具有結合特異性的半抗體或其片段以及對第二表位具有結合特異性的半抗體或其片段。
抗原結合片段：如與抗體結合使用的該術語係指完整抗體的一部分並且是指完整抗體的抗原決定可變區。抗體片段的實例包括但不限於Fab、Fab'、F(ab’)2 、Fv、線性抗體、單鏈抗體分子（例如scFv）、重鏈抗體（HCAb）、輕鏈抗體（LCAb）、二硫鍵連接的scFv（dsscFv）、雙抗體、三抗體、四抗體、微型抗體、雙可變域抗體（DVD）、單可變域抗體（sdAb；例如駱駝科抗體，羊駝抗體）、重鏈抗體的單可變域（VH H）、以及由抗體片段形成的多特異性抗體。
表位和抗原決定簇：這兩個術語在本文中可互換使用，係指與結合部分結合的靶分子表面上的位點，如抗原表面的局部區域。靶分子可以包含蛋白質、肽、核酸、碳水化合物或脂質。具有免疫原性活性的表位係引發動物中免疫反應的靶分子的一部分。如藉由本領域眾所周知的任何方法（包括例如藉由免疫測定法）所確定的，具有抗原活性的靶分子的表位係與抗體結合的靶分子的一部分。抗原表位不必一定係免疫原性的。表位通常由分子的化學活性表面基團（如胺基酸或糖側鏈）組成，並且具有特定的三維結構特徵以及特定的電荷特徵。術語「表位」包括線性表位和構象表位。構成表位的靶分子（例如多肽）的區域可以是多肽的連續胺基酸，或者表位可以一起來自靶分子的兩個或更多個非連續區域。表位可以是或可以不是靶分子的三維表面特徵。由連續胺基酸形成的表位（也稱為線性表位）典型地在蛋白質變性時保留，而由三級折疊形成的表位（也稱為構象表位）典型地在蛋白質變性時丟失。表位典型地包括至少3個，以及更通常地至少5、6、7或8-10個呈獨特的空間構象的胺基酸。
單域抗體：術語「單域抗體」、「單域抗體部分」、「sdAb」或「sdAb部分」係指具有三個互補決定區（CDR）的單抗原結合多肽，包括全長抗體（例如HCAb）及其抗原結合片段（例如VH H）。單獨的sdAb能夠與抗原結合而不與相應的包含CDR的多肽配對。在一些情況下，單域抗體從駱駝科HCAb進行工程化，並且其重鏈可變域在本文中稱為「VH H」。一些VH H也可能被稱為奈米抗體。駱駝科sdAb係已知最小的抗原結合抗體片段之一（參見，例如Hamers-Casterman等人, Nature 363:446-8 (1993)；Riechmann等人, Nature, 374:168-73 (1995)；Hassanzadeh-Ghassabeh等人, Nanomedicine (Lond), 8:1013-26 (2013)）。基本的VH H從N-末端至C-末端具有以下結構：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4，其中FR1至FR4分別是指框架區1至4，並且其中CDR1至CDR3係指互補決定區1至3。
實例包括但不限於重鏈抗體、天然缺乏輕鏈的抗體、衍生自常規4-鏈抗體的單域抗體、工程抗體和除衍生自抗體的那些以外的單域支架。單域抗體可以是任何本領域的抗體，或任何未來的單域抗體。單域抗體可以衍生自任何物種，包括但不限於小鼠、人、駱駝、美洲駝、魚、鯊魚、山羊、兔和牛。根據本揭露之另一個方面，單域抗體可以是天然存在的單域抗體，稱為缺乏輕鏈的重鏈抗體。例如在WO 9404678中揭露了這類單域抗體。這種可變域可以衍生自天然缺乏輕鏈的重鏈抗體，其在本文中稱為VH H或奈米抗體，以將其與四鏈免疫球蛋白的常規VH區分開。這種VH H分子可以源自駱駝科物種，例如駱駝、美洲駝、單峰駱駝、羊駝和原駝中產生的抗體。除駱駝科外的其他物種可產生天然缺乏輕鏈的重鏈抗體；此類VH H在本揭露之範圍內。
單株抗體：它係由淋巴細胞的單個殖株或由單個抗體的編碼序列已被轉染進其中的細胞產生的抗體。單株抗體藉由熟悉該項技術者已知之方法來產生。單株抗體包括人源化單株抗體。
嵌合抗體：該術語係指藉由將來自非人來源的遺傳物質與來自人類的遺傳物質組合來製備的抗體。或者更一般地，嵌合抗體係具有來自某種物種的遺傳物質與來自另一種物種的遺傳物質的抗體。
人源化抗體：它係包括人框架區以及來自非人（例如小鼠、兔、大鼠、鯊魚或合成的）免疫球蛋白的一個或多個CDR的免疫球蛋白。提供CDR的非人免疫球蛋白稱為「供體」，並且提供框架的人免疫球蛋白稱為「受體」。恒定區不需要存在，但如果它們存在，它們必須與人免疫球蛋白恒定區基本上相同，即至少約85%-90%，例如約95%或更多係相同的。因此，除了可能的CDR之外，人源化免疫球蛋白的所有部分基本上與天然人免疫球蛋白序列的相應部分相同。人源化抗體結合到與提供CDR的供體抗體相同的抗原上。人源化抗體或其他單株抗體可以具有另外的保守胺基酸取代，該等取代對抗原結合或其他免疫球蛋白的功能基本沒有影響。
駱駝科抗體：如本文所用，該術語旨在包括具有可變區的抗體，其中框架區及CDR區均源自駱駝科種系重鏈抗體序列。此外，如果抗體包含恒定區，則該恒定區也源自駱駝科種系重鏈抗體序列。本發明之駱駝科抗體可以包括不由駱駝科種系重鏈抗體序列所編碼的胺基酸殘基（例如，藉由體外隨機誘變或位點特異性誘變或藉由體內體細胞突變引入的突變）。然而，如本文所用的，術語「駱駝科抗體」不旨在包括這樣的抗體，其中，源自另一種哺乳動物物種的種系的CDR序列已移植到駱駝科框架序列上。
VH區和VL區：該術語可被進一步細分為散佈有稱為框架區（FR或FW）的更保守的區域的高變區（稱為「互補決定區」（CDR））。
框架區和CDR的範圍：已經藉由許多方法精確定義（參見Rabat, Ε. A.等人 (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH公開案號91-3242；Chothia, C.等人 (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917；以及由牛津分子AbM抗體建模軟體（Oxford Molecular’s AbM antibody modeling software）使用的AbM定義）。通常參見例如Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains. 在：Antibody Engineering Lab Manual（Ed.: Duebel, S.和Kontermann, R., Springer-Verlag, Heidelberg）中。
互補決定區（CDR）：如本文所用，其係指抗體可變區內賦予抗原特異性和結合親和力的胺基酸之序列。在一些實施方式中，每個重鏈可變區中存在三個CDR（HCDR1、HCDR2和HCDR3），並且每個輕鏈可變區中存在三個CDR（LCDR1、LCDR2和LCDR3）。
sdAb（例如VH H）的胺基酸殘基根據以下給出的VH 域的通用編號進行編號：Kabat等人（「Sequence of proteins of immunological interest」, US Public Health Services, NIH Bethesda, Md., 公開案號91），如在Riechmann和Muyldermans, J. Immunol. Methods 2000年6月23日; 240 (1-2): 185-195的文章中應用於來自駱駝科的VH H域。根據此編號，VH H的FR1包含位置1-30處的胺基酸殘基，VH H的CDR1包含位置31-35處的胺基酸殘基，VH H的FR2包含位置36-49處的胺基酸，VH H的CDR2包含位置50-65處的胺基酸殘基，VH H的FR3包含位置66-94處的胺基酸殘基，VH H的CDR3包含位置95-102處的胺基酸殘基，以及VH H的FR4包含位置103-113處的胺基酸殘基。在這方面，應該注意的是—如本領域中對於VH 域和VH H域所熟知的，每個CDR中的胺基酸殘基總數可以變化，並且可能不對應於藉由Kabat編號指示的胺基酸殘基總數（即，根據Kabat編號的一個或多個位置在實際序列中可能未被佔據，或者實際序列可以包含比藉由Kabat編號所允許的數目更多的胺基酸殘基）。
表述「如Kabat中的可變域殘基編號」或「如Kabat中的胺基酸位置編號」及其變體係指用於上文Kabat等人的抗體彙編的重鏈可變域或輕鏈可變域的編號系統。使用這個編號系統，實際直鏈胺基酸序列可以包含對應於可變域的FR或HVR的縮短或插入的更少的或另外的胺基酸。例如，重鏈可變域可以包含在H2的殘基52之後的單個胺基酸插入（根據Kabat的殘基52a）以及在重鏈FR殘基82之後的插入殘基（例如，根據Kabat的殘基82a、82b和82c等）。可以藉由在抗體序列與「標準」Kabat編號序列的同源性區域進行比對來確定給定抗體的殘基的Kabat編號。
框架區：在CDR之間插入的胺基酸序列。框架區包括可變輕框架區和可變重框架區。框架區用於將CDR保持在用於抗原結合的適當方向上。
取代：取代包含不是天然存在於抗原識別構建體的區域中的胺基酸。
取代修飾：本文所述之取代修飾包含不是天然存在於各自的CDR區的區域中的胺基酸。
胺基酸取代：該術語係指多肽序列中一個胺基酸殘基被另一個胺基酸殘基替代。「保守胺基酸取代」係其中一個胺基酸殘基被具有相似化學特性的側鏈的另一個胺基酸殘基取代。具有相似側鏈的胺基酸殘基的家族通常已在本領域中定義，包括鹼性側鏈（例如，離胺酸、精胺酸、組胺酸）、酸性側鏈（例如，天冬胺酸、麩胺酸）、不帶電的極性側鏈（例如，甘胺酸、天冬醯胺、麩醯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、半胱胺酸）、非極性側鏈（例如，丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸、色胺酸）、β-分支側鏈（例如，蘇胺酸、纈胺酸、異白胺酸）和芳香族側鏈（例如，酪胺酸、苯丙胺酸、色胺酸、組胺酸）。例如，用酪胺酸取代苯丙胺酸係保守取代。通常，本揭露之多肽、可溶性蛋白質和/或抗體的序列中的保守取代不會消除含有胺基酸序列的多肽、可溶性蛋白質或抗體與靶結合位點的結合。鑒定不消除結合的胺基酸保守取代之方法係本領域熟知的。
保守變體：「保守」胺基酸取代係基本上不影響或降低蛋白質（例如GPC2的抗體）的親和力的那些取代。作為一個實例，特異性結合GPC2的單株抗體可以包括至多約1個、至多約2個、至多約3個、至多約4個、至多約5個、至多約6個、至多約7個、至多約8個、至多約9個、至多約10個、至多約11個、至多約12個、至多約13個、至多約14、或至多約15個保守取代並特異性結合GPC2多肽。術語「保守變體」還包括使用取代的胺基酸代替未取代的親本胺基酸，條件係變體保持活性。非保守取代係降低蛋白質活性的那些。保守取代的非限制性實例可以在例如Creighton (1984) Proteins. W.H. Freeman and Company中找到，其內容藉由引用以其整體併入。
保守取代：它可能包括Dayhoff在「The Atlas of Protein Sequence and Structure.第5卷」, Natl. Biomedical Research中描述的那些，其內容藉由引用以其整體併入。例如，在一方面，屬於以下基團之一的胺基酸可以彼此交換，從而構成保守交換：第1組：丙胺酸（A）、脯胺酸（P）、甘胺酸（G）、天冬醯胺（N）、絲胺酸（S）、蘇胺酸（T）；第2組：半胱胺酸（C）、絲胺酸（S）、酪胺酸（Y）、蘇胺酸（T）；第3組：纈胺酸（V）、異白胺酸（I）、白胺酸（L）、甲硫胺酸（M）、丙胺酸（A）、苯丙胺酸（F）；第4組：離胺酸（K）、精胺酸（R）、組胺酸（H）；第5組：苯丙胺酸（F）、酪胺酸（Y）、色胺酸（W）、組胺酸（H）；和第6組：天冬胺酸（D）、麩胺酸（E）。在一方面，保守胺基酸取代可以選自以下：T→A、G→A、A→I、T→V、A→M、T→I、A→V、T→G、和/或T→S。在另一個方面，保守胺基酸取代可以包括胺基酸被相同類別的另一個胺基酸取代，例如 (1) 非極性：Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Met、Phe、Trp；(2) 不帶電的極性：Gly、Ser、Thr、Cys、Tyr、Asn、Gln；(3) 酸性：Asp、Glu；和 (4) 鹼性：Lys、Arg、His。其他保守的胺基酸取代還可以如以下組成：(1) 芳族：Phe、Tyr、His；(2) 質子供體：Asn、Gln、Lys、Arg、His、Trp；和 (3) 質子受體：Glu、Asp、Thr、Ser、Tyr、Asn、Gln（參見，例如美國專利案號10,106,805，其內容藉由引用以其整體併入）。在另一個方面，可以根據表A進行保守取代。用於預測對蛋白質修飾的耐受性之方法可以發現於例如Guo等人, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 101(25):9205-9210 (2004)，其內容藉由引用以其整體併入。在另一方面，保守取代可以是示於標題為「保守取代」的表B中的那些。如果此類取代導致生物活性的變化，那麼可以引入表B中稱為「示例性取代」的更多實質性變化，並且在需要時篩選產物。
[表A]
Figure 02_image003
[表B]
Figure 02_image005
序列同一性：胺基酸序列或核酸序列之間的相似性按照序列之間的相似性來表現，否則被稱為序列同一性。序列同一性經常按照同一性（或相似性或同源性）百分比來測量；百分比越高，兩個序列越相似。當使用標準方法比對時，多肽或核酸分子的同源物或變體將具有相對高程度的序列同一性。
特異性結合GPC2多肽的抗體的VL 或VH 或VH H或VNAR 的同源物和變體的典型特徵在於擁有至少約75%，例如至少約80%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性（使用NCBI Blast 2.0（空位blastp），經與抗體的胺基酸序列全長比對而計數出）。為了比較大於約30個胺基酸的胺基酸序列，利用Blast 2序列函數，其使用設置為預設參數的預設BLOSUM62矩陣（空位存在成本為11，每個殘基空位成本為1）。當比對短肽（少於約30個胺基酸）時，應該使用Blast 2序列函數採用設置為預設參數的ΡΑΜ30矩陣（開放空位9，擴展空位1罰分）進行比對。藉由這種方法評估時，與參考序列具有甚至更高相似性的蛋白質將顯示出同一性百分比增加，例如至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性。當比較少於整個序列的序列同一性時，同源物和變體典型地在10-20個胺基酸的短窗口上具有至少80%的序列同一性，並且可能具有至少85%或至少90%或95%的序列同一性，這取決於它們與參考序列的相似性。在這類短窗口上確定序列同一性之方法可在互聯網上的NCBI網站上找到。熟悉該項技術者理解提供該等序列同一性範圍僅用於指導；完全有可能可獲得超出所提供範圍的非常重要的同源物。
簡並變體：在本揭露之上下文中，「簡並變體」係指編碼GPC2多肽或結合GPC2的抗體的多核苷酸，該多核苷酸包含由於遺傳密碼而簡並的序列。有20種天然胺基酸，其中大多數由超過一個密碼子指定。因此，包括所有簡並的核苷酸序列，只要由核苷酸序列編碼的GPC2多肽或結合GPC2的抗體的胺基酸序列不變即可。
結合親和力：抗體對抗原的親和力。在一些實施方式中，親和力藉由修改由以下描述的斯卡查德（Scatchard）法來計算：Frankel等人Μol. Immunol., 16:101-106, 1979。在另一個實施方式中，結合親和力藉由抗原/抗體解離速率來測量。在另一個實施方式中，高結合親和力藉由競爭放射免疫測定來測量。在另一個實施方式中，結合親和力藉由ELISA來測量。在另一個實施方式中，抗體親和力藉由流動式細胞測量術來測量。「特異性結合」抗原（例如GPC2）的抗體係以高親和力結合抗原且不顯著結合其他不相關抗原的抗體。
標記：直接或間接軛合到另一個分子（例如抗體或蛋白質）的可檢測化合物或組成物，以促進該分子的檢測。標記的特定非限制性實例包括螢光標記、酶鍵和放射性同位素。在一個實例中，「標記的抗體」係指在抗體中摻入另一種分子。例如，標記係可檢測的標記物，例如摻入放射性標記的胺基酸或附著於生物素基部分的多肽（其可以藉由標記的親和素（例如包含螢光標誌物或可藉由光學或比色法檢測的酶活性的鏈黴親和素）檢測）。標記多肽和糖蛋白的各種方法係本領域已知的並且可以使用。多肽標記的實例包括但不限於以下：放射性同位素或放射性核苷酸（例如35 S、11 C、13 N、15 O、18 F、19 F、99 mTc、131 I、3 H、14 C、15 N、90 Y、99 Tc、11 In和125 I），螢光標記（例如異硫氰酸螢光素（FITC）、羅丹明、鑭系元素磷光體），酶標記（如辣根過氧化物酶、β-半乳糖苷酶、螢光素酶、鹼性磷酸酶），化學發光標記物，生物素基，由第二報導子識別的預定多肽表位（如白胺酸拉鍊對序列、第二抗體的結合位點、金屬結合域、表位標籤）或磁化劑（例如釓螯合物）。在一些實施方式中，標記藉由不同長度的間隔子臂附接，從而減小潛在空間位阻。
連接子：在一些情況下，連接子係抗體結合片段（例如Fv片段）內的肽，其用於將可變重鏈間接鍵合至可變輕鏈。「連接子」也可以指用於將靶向部分（例如抗體）與效應分子（例如細胞毒素或可檢測標記）連接的肽。連接子允許序列適當折疊以產生所需的三維構象和抗原結合譜。
軛合、結合、鍵合或連接：該等術語係指使兩個多肽成為一個連續的多肽分子，或將放射性核素或其他分子共價附接於多肽，例如scFv。在特定的上下文中，該等術語包括提及將配位基（例如抗體部分）結合至效應分子。連接可以藉由化學或重組手段進行。「化學手段」係指抗體部分和效應分子之間的反應，使得在兩個分子之間形成共價鍵以形成一個分子。
嵌合抗原受體（CAR）：包括一個或多個抗原結合部分（例如單域抗體或scFv）和信號傳導域（例如來自Τ細胞受體的信號傳導域（例如，CD3ζ））的嵌合分子。典型地，CAR由抗原結合部分、跨膜域和胞內域組成。胞內域典型地包括具有基於免疫受體酪胺酸的激活模體（ITAM）的信號傳導鏈，例如CD3ζ或FcεRIγ。在一些情況下，胞內域進一步包括至少一個另外的共刺激域（例如CD28、4-1ΒΒ（CD137）、ICOS、OX40（CD134）、CD27）和/或造血細胞訊息傳遞因子（DAP10））的胞內部分。在本申請的上下文中，該等術語「胞內域（cytoplasmic domain）」、「胞內域（intracellular domain）」和「胞內信號傳導域（intracellular signaling domain）」係可互換的。
單CAR：包括單抗原結合部分（例如單域抗體或scFv）和信號傳導域（例如來自Τ細胞受體的信號傳導域（例如，CD3ζ））的嵌合分子。典型地，單CAR可以包含單特異性抗原結合部分、跨膜域和胞內域。
串聯CAR：包括多於一個抗原結合部分（例如2、4或6個單域抗體或scFv）和信號傳導域（例如，來自Τ細胞受體的信號傳導域（例如CD3ζ））的嵌合分子。典型地，串聯CAR可以包含單特異性的二價抗原結合部分（例如，兩個相同的結合GPC2的VH H域）或多特異性（例如雙特異性）二價抗原結合部分（例如兩個不同的結合GPC2的VH H域，或一個結合GPC2的VH H域和另一個結合除了GPC2以外的其他分子（例如GD2和DLL3）的VH H域），跨膜域和胞內域。
雙CAR：兩個單獨的CAR（可以是雙特異性的），或兩個串聯CAR（每個CAR可以是單特異性或雙特異性的），或一個單CAR和一個串聯CAR（可以是單特異性或雙特異性的）。雙CAR可以具有第一CAR和第二CAR中的每個，其均具有共刺激域（例如CD28、4-1ΒΒ（CD137）、ICOS、OX40（CD134）、CD27和DAP10）和信號傳導域（例如，來自Τ細胞受體的信號傳導域（例如CD3ζ）。
分離的CAR：不同於雙CAR，在分離的CAR中，第一CAR可以包含共刺激域但缺乏來自Τ細胞受體的信號傳導域；而第二CAR可以包含來自Τ細胞受體的信號傳導域但缺乏共刺激域。
免疫反應：免疫系統的細胞（例如，Β細胞、Τ細胞或單核細胞）對刺激的反應。在一些實施方式中，反應對特定抗原（「抗原特異性反應」）具有特異性。在一些實施方式中，免疫反應係Τ細胞反應，例如CD4+反應或CD8+反應。在另一個實施方式中，反應係Β細胞反應，並且導致特異性抗體產生。
藥劑：在適當地向受試者或細胞施用時能夠誘導所希望的治療或預防作用的化學化合物或組成物。
藥學上可接受的載體：使用的藥學上可接受的載體係常規的。Remington’s Pharmaceutical Sciences（E.W. Martin, Mack Publishing Co., Easton, PA, 第15版, 1975）描述了適用於本文揭露的組成物的藥物遞送的組成物和配製物。
預防、治療或改善疾病：「預防」疾病係指抑制疾病完全發展。如本文使用的，「治療（treatment或treating）」係用於獲得有益的或所希望的結果（包括臨床結果）之方法。出於本發明之目的，有益的或所希望的臨床結果包括但不限於以下中的一種或多種：緩解由疾病引起的一種或多種症狀、減輕疾病的程度、穩定疾病（例如，預防或延遲疾病的惡化）、預防或延遲疾病的傳播（例如，轉移）、預防或延遲疾病的重現、延遲或減緩疾病的進展，改善疾病狀態、提供疾病的緩解（部分或全部）、減少治療疾病所需的一種或多種其他藥物的劑量、延遲疾病的進展、增強生活品質、和/或延長存活。「治療」還包括減少癌症的一個或多個病理後果。本申請之方法考慮了該等治療方面中的任何一個或多個。「改善」係指降低疾病（例如癌症）的體征或症狀的數量或嚴重性。
純化：術語「純化的」不需要絕對純度；更準確地說，它旨在作為一個相對術語。因此，例如，純化的肽製劑係肽或蛋白質比其在細胞內天然環境中更富集的肽製劑。在一些實施方式中，純化製劑，使得蛋白質或肽代表至少50%的製劑的總肽或蛋白質含量。基本上純化係指從其他蛋白質或細胞組分中純化。基本上純化的蛋白質係至少60%、70%、80%、90%、95%或98%純的。因此，在一個特定的非限制性實例中，基本上純化的蛋白質90%不含其他蛋白質或細胞組分。
分離的：「分離的」生物組分（例如核酸、蛋白質（包括抗體）或細胞器）已經基本上從該組分天然存在的環境（例如細胞）中的其他生物組分（即其他染色體和染色體外DNA和RNA、蛋白質和細胞器）分離或純化出來。已經「分離」的核酸和蛋白質包括藉由標準純化方法純化的核酸和蛋白質。該術語還涵蓋藉由在宿主細胞中重組表現所製備的核酸和蛋白質以及化學合成的核酸。
重組的：重組核酸係具有非天然存在的序列或具有由兩個以其他方式分離的序列片段的人工組合形成的序列的核酸。這種人工組合通常藉由化學合成或藉由人工作業分離的核酸片段，例如藉由基因工程技術來完成。
融合蛋白：包含至少一部分兩種不同（異源）蛋白質的蛋白質。
樣品（或生物樣品）：從受試者獲得的包含基因組DNA、RNA（包括mRNA）、蛋白質或其組合的生物樣本。實例包括但不限於外周血、組織、細胞、尿液、唾液、組織生檢、細針抽吸物、手術標本和屍檢材料。在一個實例中，樣品包括腫瘤生檢，例如腫瘤組織生檢。
受試者：活的多細胞脊椎動物生物體，包括人和動物受試者（包括人和非人哺乳動物）的一個類別。「受試者」、「個體」和「患者」在本文中可互換使用。在一些實施方式中，受試者係哺乳動物，包括但不限於人、牛、馬、貓、犬、齧齒動物或靈長類動物。在一些實施方式中，該受試者係人。
合成的：在實驗室中藉由人工手段產生，例如可以在實驗室中化學合成合成的核酸或蛋白質（例如抗體）。
治療有效量：本文使用的有效量係指足以治療指定障礙、病症或疾病（例如改善、減輕、減弱和/或延遲其症狀中的一種或多種）的試劑（例如抗GPC2構建體、工程化免疫細胞或其藥物組成物）之量。參考癌症時，有效量包括足以使一個腫瘤縮小和/或降低該腫瘤的生長速率（如壓制腫瘤生長）或防止或延遲其他不希望的細胞增殖之量。在一些實施方式中，有效量係足以延遲發展之量。在一些實施方式中，有效量係足以預防或延遲復發之量。有效劑量能夠以一次或多次給藥來施用。該藥物或組成物的有效量可以：(i) 減少癌細胞的數量；(ii) 減小腫瘤大小；(iii) 抑制、延遲、在一定程度上減慢並且較佳的是停止癌細胞浸潤到外周器官中；(iv) 抑制（即，在一定程度上減慢並且較佳的是停止）腫瘤轉移；(v) 抑制腫瘤生長；(vi) 預防或延遲腫瘤的發生和/或復發；和/或 (vii) 在一定程度上緩解與癌症相關的一種或多種症狀。
載體：導入宿主細胞的核酸分子，從而產生轉化的宿主細胞。載體可包括允許其在宿主細胞中複製的核酸序列，如複製起點。載體還可以包括一種或多種可選擇的標記基因和本領域已知的其他遺傳元件。
可操作地連接：當第一核酸序列與第二核酸序列處於功能關係時，第一核酸序列與第二核酸序列可操作地連接。例如，如果啟動子影響編碼序列的轉錄或表現，則啟動子與編碼序列可操作地連接。通常，可操作地連接的DNA序列係毗鄰的，且在需要時結合兩個蛋白編碼區，使其處在同一閱讀框中。
轉染：將裸核酸或純化的核酸引入細胞的過程。轉染可以使用磷酸鈣（即磷酸三鈣），藉由電穿孔，藉由細胞擠壓或藉由將陽離子脂質與物質混合以產生脂質體（該等脂質體與細胞膜融合並將其貨物存放在內部）來進行。
電穿孔：使用脈衝電場瞬時透過細胞膜，從而使大分子（例如DNA或RNA）進入到細胞中的過程。
轉導：藉由病毒或病毒載體將外源DNA引入到細胞中的過程。病毒可以是但不限於逆轉錄病毒、慢病毒、腺病毒或腺相關病毒。
瘤形成、惡性腫瘤、癌症或腫瘤：贅生物係由過度的細胞分裂導致的組織或細胞的異常生長。瘤性生長可產生腫瘤。個體中腫瘤的數量係「腫瘤負荷」，可以用腫瘤的數量、體積或重量來衡量。不轉移的腫瘤稱為「良性」。侵入周圍組織和/或可以轉移的腫瘤被稱為「惡性」。
GPC2陽性癌症：GPC2陽性癌症的實例包括但不限於：神經母細胞瘤、急性淋巴母細胞性白血病、胚胎性橫紋肌肉瘤、肺泡橫紋肌肉瘤、尤文氏肉瘤、促結締組織增生小圓細胞腫瘤和骨肉瘤。2. 抗 GPC2 抗體或抗原結合片段和 CAR
磷脂醯肌醇蛋白聚糖-2（GPC2）：硫酸乙醯肝素（HS）蛋白聚糖的六員磷脂醯肌醇蛋白聚糖家族的成員，其藉由GPI錨點附接至細胞表面（Filmus等人, Genome Biol 9:224, 2008）。GPC2在神經元發育期間瞬時表現（Stipp等人, J Cell Biol 124:149-160, 1994; Lugert S, Kremer T等人, Scientific Reports. 2017;7: 46543.），參與細胞黏附並被認為可調節軸突的生長和指導。此外，GPC2 mRNA在神經母細胞瘤和其他兒科癌症中高度表現（Orentas等人, Front Oncol 2:194, 2012）。GPC2也稱為腦聚糖蛋白聚糖（cerebroglycan proteoglycan）和磷脂醯肌醇蛋白聚糖蛋白聚糖2（glypican proteoglycan 2）。GPC2基因組mRNA和蛋白質序列係可公開獲得的（參見，例如NCBI Gene ID 221914）。2A ：抗 GPC2 抗體或抗原結合片段
僅重鏈抗體（ HCAb ）和可變域（ VH H ）
本揭露之抗體可以包括僅重鏈抗體（HCAb）。駱駝科（駱駝、單峰駱駝和美洲駝）除了正常的重鏈和輕鏈抗體（一個抗體中有2條輕鏈和2條重鏈）外，還包含單鏈抗體（僅包含重鏈）。HCAb（稱為VH H、奈米抗體或單域抗體（sdAb））的可變域代表最小的天然來源的抗原結合功能片段（約15 kDa）。包含天然VH H的抗體缺失了重鏈恒定區的整個CH1域。編碼CH1域的外顯子存在於基因組中，但由於在CH1外顯子的5'側缺失功能性剪接受體序列而被剪接出。結果，VDJ區被剪接到CH2外顯子上。當VH H重組到此類恒定區（CH2，CH3）上時，產生了充當單鏈抗體的抗體（即，沒有輕鏈相互作用的兩條重鏈的抗體）。抗原的結合不同於常規抗體中所見的結合，但是以相同的方式，即藉由可變區的超突變和表現此類高親和力抗體的細胞的選擇，可實現高親和力。該等VH H維持了與全尺寸mAb相當的親和力和抗原結合特異性。
抗 GPC2 VH H
本揭露之實施方式包括包含特異性結合GPC2的VH H域的抗體。在一些實施方式中，單域抗體（約15 kD）包含具有選自由SEQ ID NO: 1-30組成之群組的胺基酸序列的互補決定區（CDR）1、具有選自由SEQ ID NO: 31-61組成之群組的胺基酸序列的CDR2、和具有選自由SEQ ID NO: 62-92組成之群組的胺基酸序列的CDR3。例如，特異性結合GPC2的VH H單域抗體可以包含如表1中列出的CDR1、CDR2和CDR3。
本揭露之實施方式還可以包括包含VH H變體的抗體，該等變體在具有選自由SEQ ID NO: 1-30組成之群組的胺基酸序列的CDR1中包含一個、兩個或三個保守胺基酸取代，和/或在具有選自由SEQ ID NO: 31-61組成之群組的胺基酸序列的CDR2中包含一個、兩個或三個保守胺基酸取代，和/或在具有選自由SEQ ID NO: 62-92組成之群組的胺基酸序列的CDR3中包含一個、兩個或三個保守胺基酸取代。本揭露之實施方式還可以包括以下VH H變體，該等變體在具有選自由SEQ ID NO: 1-30組成之群組的胺基酸序列的CDR1中包含一個保守胺基酸取代，和/或在具有選自由SEQ ID NO: 31-61組成之群組的胺基酸序列的CDR2中包含一個保守胺基酸取代，和/或在具有選自由SEQ ID NO: 62-92組成之群組的胺基酸序列的CDR3中包含一個保守胺基酸取代。
在一些實施方式中，提供了抗GPC2 VH H，其包含：(a) 包含SEQ ID NO: 23的胺基酸序列的CDR1，或其在CDR1中包含多達約3（例如，1、2或3）個胺基酸取代的變體；(b) 包含SEQ ID NO: 54的胺基酸序列的CDR2，或其在CDR2中包含多達約3（例如，1、2或3）個胺基酸取代的變體；和 (c) 包含SEQ ID NO: 85的胺基酸序列的CDR3，或其在CDR3中包含多達約3（例如，1、2或3）個胺基酸取代的變體。在一些實施方式中，提供了抗GPC2 VH H，其包含：(a) 包含SEQ ID NO: 23的胺基酸序列的CDR1；(b) 包含SEQ ID NO: 54的胺基酸序列的CDR2；和 (c) 包含SEQ ID NO: 85的胺基酸序列的CDR3，或其在CDR中包含多達約5（例如，1、2、3、4或5）個胺基酸取代的變體。在一些實施方式中，提供了抗GPC2 VH H，其包含：(a) 包含SEQ ID NO: 23的胺基酸序列的CDR1；(b) 包含SEQ ID NO: 54的胺基酸序列的CDR2；和 (c) 包含SEQ ID NO: 85的胺基酸序列的CDR3。在一些實施方式中，提供了包含SEQ ID NO: 23、54和85的胺基酸序列的多肽。
在一些實施方式中，提供了抗GPC2 VH H，其包含：(a) 包含SEQ ID NO: 27的胺基酸序列的CDR1，或其在CDR1中包含多達約3（例如，1、2或3）個胺基酸取代的變體；(b) 包含SEQ ID NO: 58的胺基酸序列的CDR2，或其在CDR2中包含多達約3（例如，1、2或3）個胺基酸取代的變體；和 (c) 包含SEQ ID NO: 89的胺基酸序列的CDR3，或其在CDR3中包含多達約3（例如，1、2或3）個胺基酸取代的變體。在一些實施方式中，提供了抗GPC2 VH H，其包含：(a) 包含SEQ ID NO: 27的胺基酸序列的CDR1；(b) 包含SEQ ID NO: 58的胺基酸序列的CDR2；和 (c) 包含SEQ ID NO: 89的胺基酸序列的CDR3，或其在CDR中包含多達約5（例如，1、2、3、4或5）個胺基酸取代的變體。在一些實施方式中，提供了抗GPC2 VH H，其包含：(a) 包含SEQ ID NO: 27的胺基酸序列的CDR1；(b) 包含SEQ ID NO: 58的胺基酸序列的CDR2；和 (c) 包含SEQ ID NO: 89的胺基酸序列的CDR3。在一些實施方式中，提供了包含SEQ ID NO: 27、58和89的胺基酸序列的多肽。
在一些實施方式中，提供了抗GPC2 VH H，其包含：(a) 包含SEQ ID NO: 3的胺基酸序列的CDR1，或其在CDR1中包含多達約3（例如，1、2或3）個胺基酸取代的變體；(b) 包含SEQ ID NO: 33的胺基酸序列的CDR2，或其在CDR2中包含多達約3（例如，1、2或3）個胺基酸取代的變體；和 (c) 包含SEQ ID NO: 64的胺基酸序列的CDR3，或其在CDR3中包含多達約3（例如，1、2或3）個胺基酸取代的變體。在一些實施方式中，提供了抗GPC2 VH H，其包含：(a) 包含SEQ ID NO: 3的胺基酸序列的CDR1；(b) 包含SEQ ID NO: 33的胺基酸序列的CDR2；和 (c) 包含SEQ ID NO: 64的胺基酸序列的CDR3，或其在CDR中包含多達約5（例如，1、2、3、4或5）個胺基酸取代的變體。在一些實施方式中，提供了抗GPC2 VH H，其包含：(a) 包含SEQ ID NO: 3的胺基酸序列的CDR1；(b) 包含SEQ ID NO: 33的胺基酸序列的CDR2；和 (c) 包含SEQ ID NO: 64的胺基酸序列的CDR3。在一些實施方式中，提供了包含SEQ ID NO: 3、33和64的胺基酸序列的多肽。
在一些實施方式中，提供了抗GPC2 VH H，其包含：(a) 包含SEQ ID NO: 5的胺基酸序列的CDR1，或其在CDR1中包含多達約3（例如，1、2或3）個胺基酸取代的變體；(b) 包含SEQ ID NO: 35的胺基酸序列的CDR2，或其在CDR2中包含多達約3（例如，1、2或3）個胺基酸取代的變體；和 (c) 包含SEQ ID NO: 66的胺基酸序列的CDR3，或其在CDR3中包含多達約3（例如，1、2或3）個胺基酸取代的變體。在一些實施方式中，提供了抗GPC2 VH H，其包含：(a) 包含SEQ ID NO: 5的胺基酸序列的CDR1；(b) 包含SEQ ID NO: 35的胺基酸序列的CDR2；和 (c) 包含SEQ ID NO: 66的胺基酸序列的CDR3，或其在CDR中包含多達約5（例如，1、2、3、4或5）個胺基酸取代的變體。在一些實施方式中，提供了抗GPC2 VH H，其包含：(a) 包含SEQ ID NO: 5的胺基酸序列的CDR1；(b) 包含SEQ ID NO: 35的胺基酸序列的CDR2；和 (c) 包含SEQ ID NO: 66的胺基酸序列的CDR3。在一些實施方式中，提供了包含SEQ ID NO: 5、35和66的胺基酸序列的多肽。
在一些實施方式中，提供了抗GPC2 VH H，其包含：(a) 包含SEQ ID NO: 11的胺基酸序列的CDR1，或其在CDR1中包含多達約3（例如，1、2或3）個胺基酸取代的變體；(b) 包含SEQ ID NO: 43的胺基酸序列的CDR2，或其在CDR2中包含多達約3（例如，1、2或3）個胺基酸取代的變體；和 (c) 包含SEQ ID NO: 74的胺基酸序列的CDR3，或其在CDR3中包含多達約3（例如，1、2或3）個胺基酸取代的變體。在一些實施方式中，提供了抗GPC2 VH H，其包含：(a) 包含SEQ ID NO: 11的胺基酸序列的CDR1；(b) 包含SEQ ID NO: 43的胺基酸序列的CDR2；和 (c) 包含SEQ ID NO: 74的胺基酸序列的CDR3，或其在CDR中包含多達約5（例如，1、2、3、4或5）個胺基酸取代的變體。在一些實施方式中，提供了抗GPC2 VH H，其包含：(a) 包含SEQ ID NO: 11的胺基酸序列的CDR1；(b) 包含SEQ ID NO: 43的胺基酸序列的CDR2；和 (c) 包含SEQ ID NO: 74的胺基酸序列的CDR3。在一些實施方式中，提供了包含SEQ ID NO: 11、43和74的胺基酸序列的多肽。
在一些實施方式中，包括以上所述之實施方式中任一項的抗GPC2 VH H（即包含特異性CDR1、CDR2和/或CDR3的抗GPC2 VH H）包含以下VH H域，該VH H域與SEQ ID NO: 93-142中任一個的胺基酸序列具有至少約85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%中任一的序列同一性。在一些實施方式中，具有至少約85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%中任一個的同一性的VH H序列相對於參考序列含有取代（例如，保守取代）、插入或缺失，但包含該序列的抗GPC2 VH H保持與GPC2結合的能力。在一些實施方式中，在SEQ ID NO: 93-142中任一個的胺基酸序列中，共計1至10個胺基酸已被取代、插入和/或缺失。在一些實施方式中，取代、插入或缺失發生在CDR以外的區域（即FR中）。在一些實施方式中，抗GPC2 VH H包含SEQ ID NO: 93-142中任一個的胺基酸序列，視需要包括該序列的翻譯後修飾。
在一些實施方式中，可以藉由組合的丙胺酸掃描來定位功能性表位。在此方法中，可以使用組合的丙胺酸掃描策略以鑒定GPC2蛋白中的對於與抗GPC2 sdAb相互作用係必需的胺基酸。在一些實施方式中，表位係構象的，並且結合至GPC2的抗GPC2 sdAb的晶體結構可以用於鑒定表位。
在一些實施方式中，本申請提供了抗體（例如VH H），其與本文所述之抗GPC2 VH H中的任一個競爭與GPC2的結合。在一些實施方式中，本申請提供了抗體（例如VH H），其與本文所提供的抗GPC2 VH H中的任一個競爭與GPC2上的表位的結合。在一些實施方式中，提供了抗GPC2抗體（例如VH H），其結合至與包含SEQ ID NO: 93-142中任一個的胺基酸序列的抗GPC2 VH H相同的表位上。在一些實施方式中，提供了GPC2抗體（例如VH H），其與包含SEQ ID NO:93-142中任一個的胺基酸序列的抗GPC2 VH H競爭結合GPC2。
在一些實施方式中，競爭測定可用於鑒定與本文所述之抗GPC2 VH H競爭與GPC2結合的單株抗體。競爭測定可用於藉由識別相同或空間重疊的表位來確定兩種抗體是否結合相同的表位，或者一種抗體競爭性地抑制另一種抗體與抗原的結合。在某些實施方式中，這種競爭性抗體與本文所述抗體所結合的相同表位結合。示例性競爭測定包括但不限於常規測定，例如在以下中提供的那些：Harlow和Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual ch.14（Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.）。Morris (1996) 「Epitope Mapping Protocols,」 Methods in Molecular Biology 第66卷（Humana Press, Totowa, N.J.）中提供了定位抗體所結合的表位的詳細示例性方法。在一些實施方式中，如果兩種抗體彼此阻斷50%或更多的結合，則認為兩種抗體與相同的表位結合。在一些實施方式中，與本文所述之抗GPC2 VH H競爭的抗體係駱駝科、嵌合、人源化或人抗體。在一些實施方式中，本申請提供了與如本文所述之駱駝科、嵌合、人源化、或人抗GPC2 VH H競爭的抗體。
在一些實施方式中，可將一個或多個胺基酸修飾引入本文提供的抗體的Fc區內，從而生成Fc區變體。Fc區變體可包含人Fc區序列（例如，人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc區），該序列包含在一個或多個胺基酸位置處的胺基酸修飾（例如，取代）。
在一些實施方式中，本申請考慮了具有一些（但非全部）效應子功能的抗體變體，這類功能使該抗體變體成為適合應用的理想候選物，在該應用中，抗體的體內半衰期很重要，但某些效應子功能（例如，補體和ADCC）係非必要或有害的。可以進行體外和/或體內細胞毒性測定確認CDC和/或ADCC活性的降低/消耗。例如，可以進行Fc受體（FcR）結合測定確保抗體沒有FcγR結合能力（因此可能缺乏ADCC活性），但可以保留FcRn結合能力。介導ADCC的主要細胞——NK細胞僅表現Fc(RIII，而單核細胞表現Fc(RI、Fc(RII和Fc(RIII。造血細胞上的FcR表現總結在Ravetch和Kinet，Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991) 的第464頁的表3中。在美國專利案號5,500,362（例如，參見Hellstrom, I.等人Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 83:7059-7063 (1986)和Hellstrom, I等人,Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 82:1499-1502 (1985)）；5,821,337（參見Bruggemann, M.等人,J. Exp. Med . 166:1351-1361 (1987)）中描述了用於評估目的分子的ADCC活性的體外測定的非限制性實例。可替代地，可以採用非放射性測定方法（例如，參見用於流動式細胞測量術的ACTI™非放射性細胞毒性測定（CellTechnology, Inc. Mountain View，CA；以及CYTOTOX 96® 非放射性細胞毒性測定（Promega，Madison，WI）。用於此類測定的有用的效應細胞包括外周血單核細胞（PBMC）和自然殺傷（NK）細胞。可替代地或另外地，可以在體內評估目的分子的ADCC活性，例如在動物模型中，如Clynes等人,Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 95:652-656 (1998)中揭露的。還可以進行C1q結合測定確認抗體不能結合C1q，並且因此缺乏CDC活性。例如，參見在WO 2006/029879和WO 2005/100402中的C1q和C3c結合ELISA。為了評估補體活化，可以進行CDC測定（參見,例如Gazzano-Santoro等人，J. Immunol. Methods 202:163 (1996)；Cragg, M.S.等人,Blood 101:1045-1052 (2003)；以及Cragg, M.S.和M.J. Glennie,Blood 103:2738-2743 (2004)）。也可以使用本領域已知之方法進行FcRn結合和體內清除/半衰期測定（參見，例如Petkova, S.B.等人,Int’l. Immunol . 18(12):1759-1769 (2006)）。
具有降低的效應子功能的抗體包括取代Fc區殘基238、265、269、270、297、327和329中的一個或多個的抗體（美國專利案號6,737,056）。此類Fc突變體包括取代胺基酸位置265、269、270、297和327中的兩個或更多個的Fc突變體，包括殘基265和297被丙胺酸取代的稱為「DANA」的Fc突變體（美國專利案號7,332,581）。
描述了與FcR結合提高或降低的某些抗體變體  （參見，例如美國專利案號6,737,056；WO 2004/056312，以及Shields等人,J. Biol. Chem . 9(2): 6591-6604 (2001)）。
在一些實施方式中，抗體變體包含具有一個或多個胺基酸取代的Fc區，該等取代（例如，Fc區內的位置298、333和/或334處的取代（殘基的EU編號））改善ADCC。
在一些實施方式中，Fc區內發生改變，導致C1q結合和/或補體依賴性細胞毒性（CDC）發生改變（即，提高或降低），例如，如美國專利案號6,194,551、WO 99/51642和Idusogie等人,J. Immunol . 164: 4178-4184 (2000)中所描述。
具有延長的半衰期和與新生兒Fc受體（FcRn）的結合改善的抗體（其負責將母體IgG轉移至胎兒（Guyer等人,J. Immunol . 117:587 (1976)和Kim等人,J. Immunol . 24:249 (1994)））描述於US 2005/0014934 A1中（Hinton等人）。那些抗體包含具有一個或多個胺基酸取代的Fc區，其中該等取代改善了Fc區與FcRn的結合。此類Fc變體包括在一個或多個Fc區殘基處具有取代的那些：238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424或434，例如取代Fc區殘基434（美國專利案號7,371,826）。
還參見Duncan & Winter,Nature 322:738-40 (1988)；美國專利案號5,648,260；美國專利案號5,624,821；以及關於Fc區變體的其他實例的WO 94/29351。
抗 GPC2 雙特異性二價抗體
本揭露之實施方式可以包括雙特異性抗體，其中兩個抗原結合域可以在單個雙特異性分子（即雙特異性二價抗GPC2抗體）中結合。本揭露之抗GPC2雙特異性二價抗體可以包含含有表1中列出CDR1、CDR2和CDR3的任何兩個不同的VH H單域。也就是說，兩個不同的VH H單域結合GPC2。例如，抗GPC2雙特異性二價抗體可以包含AS70549-AS70771、或AS70549-AS70950、或AS70549-AS71402、或AS70549-AS71529、或AS70549-AS71661等。本揭露之抗GPC2雙特異性二價抗體還可以包含表1中列出的第一VH H單域和與除了GPC2以外的分子（例如GD2或DLL3）結合的第二VH H單域。例如，抗GPC2雙特異性二價抗體可以包含與GPC2（AS70549）結合的第一VH H單域 - 與GD2結合的第二VH H單域，或與GPC2（AS70549）結合的第一VH H單域 - 與DLL3結合的第二VH H單域，或與GPC2（AS70771）結合的第一VH H單域 - 與GD2結合的第二VH H單域，或與GPC2（AS70771）結合的第一VH H單域 - 與DLL3結合的第二VH H單域等。本揭露之抗GPC2雙特異性二價抗體可以呈Fv片段（例如scFv）或HCAb或Fab的形式。抗GPC2雙特異性二價抗體可以視需要包括在兩個不同的VH H單域之間連接的連接子序列，例如GS連接子。例如，抗GPC2雙特異性二價抗體可以包含AS71529VH5-AS72052VH5、AS72052VH5-AS71529VH5、AS70950VH6-AS71529VH6、AS71529VH6-AS70950VH6、AS70950VH6-AS70950VH6、AS78117VH4-AS71529VH6或AS71529VH6-AS78117VH4。2B ：抗 GPC2 CAR
本申請的一個方面提供了嵌合抗原受體，其包含胞外域，該胞外域包含一個或多個抗GPC2 sdAb（例如VH H）、跨膜域和胞內信號傳導域。還提供了嵌合抗原受體系統，其包含：(a) 包含胞外域的第一嵌合抗原受體，該胞外域包含抗GPC2 sdAb（例如VH H）、跨膜域和胞內信號傳導域；和 (b) 包含胞外域的第二嵌合抗原受體，該胞外域包含特異性結合不同於GPC2的第二抗原或GPC2中的不同表位的結合部分。本文所述之抗GPC2抗體或抗原結合片段中的任一個均可在本文所述之嵌合受體或嵌合抗原受體系統中使用。嵌合受體和嵌合抗原受體系統的示例性結構在圖5中示出。單一抗 GPC2 CAR
本揭露之實施方式提供了具有胞外抗原結合域的單一抗GPC2 CAR，該胞外抗原結合域具有單GPC2結合域。在一些實施方式中，提供了靶向GPC2的嵌合抗原受體（本文也稱為「抗GPC2嵌合受體」或「抗GPC2 CAR」），其包含：(a) 包含單GPC2結合域的胞外域，該單GPC2結合域包含含有表1中列出的CDR1、CDR2和CDR3的抗GPC2 VH H域；(b) 跨膜域；和 (c) 胞內信號傳導域。鉸鏈域可以視需要用於在VH H單域和跨膜域之間連接。在一些實施方式中，跨膜域選自由以下組成之群組：CD8α、CD4、CD28、4-1BB、CD80、CD86、CD152、PD-1、CD2、CD27、ICOS和OX40。在一些實施方式中，胞內信號傳導域包含免疫效應細胞（例如T細胞）的初級胞內信號傳導序列。在一些實施方式中，初級胞內信號傳導序列衍生自CD3ζ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、常見FcR γ（FCER1G）、Fc γ RIIa、FcR β（Fc ε R1b）、CD5、CD22、CD79a、CD79b或CD66d。在一些實施方式中，初級胞內信號傳導序列衍生自CD3ζ。在一些實施方式中，胞內信號傳導域包含胞內共刺激序列。在一些實施方式中，胞內共刺激序列衍生自選自由以下組成之群組的共刺激分子：CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD40、PD-1、LFA-1、ICOS、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、TNFRSF9、TNFRSF4、TNFRSF8、CD40LG、ITGB2、KLRC2、TNFRSF18、TNFRSF14、HAVCR1、LGALS9、DAP10、DAP12、CD83、CD83的配位基、及其組合。本揭露之單一抗GPC2 CAR可以包括CAS70549-BBz、CAS70771-BBz、CAS70950-BBz、CAS71402-BBz、CAS71529-BBz、CAS71661-BBz、CAS72021-BBz、CAS72052-BBz、CAS72383-BBz、CAS72479-BBz、CAS72499-BBz、CAS72531-BBz、CAS72669-BBz、CAS72794-BBz、CAS72805-BBz、CAS72806-BBz、CAS72835-BBz、CAS77906-BBz、CAS77916-BBz、CAS77932-BBz、CAS77934-BBz、CAS77978-BBz、CAS77986-BBz、CAS78117-BBz、CAS78215-BBz、CAS78810-BBz、CAS79101-BBz、CAS79236-BBz、CAS79274-BBz、CAS79285-BBz、CAS79317-BBz、CAS70950VH6-BBz、CAS70950VH7-BBz、CAS71529VH5-BBz、CAS71529VH6-BBz、CAS72052VH5-BBz、CAS72052VH6-BBz、CAS72669VH6-BBz、CAS78117VH4-BBz、CAS78117VH5-BBz、CAS78117VH6-BBz、CAS78117VH7-BBz、CAS79236VH4-BBz、CAS79236VH5-BBz、CAS79236VH6-BBz、CAS77916VH6-BBz、CAS77916VH7-BBz、CAS77916VH8-BBz、CAS77916VH9-BBz、CAS77916VH10-BBz、GPC2-CD28z、GPC2-CD27z、GPC2-ICOSz、GPC2-CD2z和GPC2-OX40z，較佳的是CAS70950-BBz、CAS70950VH6-BBz、CAS71529-BBz、CAS71529VH6-BBz、CAS78117-BBz、CAS78117VH4-BBz、CAS79236-BBz、CAS79236VH6-BBz、GPC2-CD28z、GPC2-CD27z、GPC2-ICOSz、GPC2-CD2z、GPC2-OX40z、或其組合。
在一些實施方式中，提供了靶向GPC2的嵌合抗原受體，其包含：(a) 包含抗GPC2 VH H的胞外域，該抗GPC2 VH H包含含有SEQ ID NO: 3的胺基酸序列的CDR1、含有SEQ ID NO: 33的胺基酸序列的CDR2、和含有SEQ ID NO: 64的胺基酸序列的CDR3，或其在CDR中包含多達約5個胺基酸取代的變體；(b) 跨膜域；和 (c) 胞內信號傳導域。在一些實施方式中，抗GPC2 VH H部分包含含有SEQ ID NO: 95、124或125的胺基酸序列的VH H域，或其包含以下胺基酸序列的變體，該胺基酸序列與SEQ ID NO: 95、124或125的胺基酸序列具有至少約95%序列同一性。在一些實施方式中，初級胞內信號傳導序列衍生自CD3ζ。在一些實施方式中，胞內信號傳導域包含胞內共刺激序列。在一些實施方式中，胞內共刺激序列包含4-1BB、CD28z、CD27z、ICOSz、CD2z或OX40z。在一些實施方式中，抗GPC2嵌合抗原受體進一步包含位於胞外域的C-末端和跨膜域的N-末端之間的鉸鏈域（例如，CD8鉸鏈域）。在一些實施方式中，抗GPC2嵌合抗原受體進一步包含訊息肽（例如CD8訊息肽）。在一些實施方式中，抗GPC2嵌合抗原受體包含多肽，該多肽從N-末端至C-末端包含：CD8訊息肽、抗GPC2 VH H部分、CD8鉸鏈域、CD8跨膜域和胞內信號傳導域，該胞內信號傳導域包含衍生自4-1BB的胞內共刺激序列和CD3ζ胞內信號傳導序列。在一些實施方式中，抗GPC2嵌合抗原受體包含多肽，該多肽從N-末端至C-末端包含：CD8訊息肽、抗GPC2 VH H部分、CD28鉸鏈域、CD28跨膜域和胞內信號傳導域，該胞內信號傳導域包含衍生自4-1BB的胞內共刺激序列和CD3ζ胞內信號傳導序列。在一些實施方式中，抗GPC2嵌合抗原受體包含含有SEQ ID NO: 190、220或221的胺基酸序列的多肽，或其包含以下胺基酸序列的變體，該胺基酸序列與SEQ ID NO: 190、220或221的胺基酸序列具有至少約95%序列同一性。
在一些實施方式中，提供了靶向GPC2的嵌合抗原受體，其包含：(a) 包含抗GPC2 VH H的胞外域，該抗GPC2 VH H包含含有SEQ ID NO: 5的胺基酸序列的CDR1、含有SEQ ID NO: 35的胺基酸序列的CDR2、和含有SEQ ID NO: 66的胺基酸序列的CDR3，或其在CDR中包含多達約5個胺基酸取代的變體；(b) 跨膜域；和 (c) 胞內信號傳導域。在一些實施方式中，抗GPC2 VH H部分包含含有SEQ ID NO: 97、126或127的胺基酸序列的VH H域，或其包含以下胺基酸序列的變體，該胺基酸序列與SEQ ID NO: 97、126或127的胺基酸序列具有至少約95%序列同一性。在一些實施方式中，初級胞內信號傳導序列衍生自CD3ζ。在一些實施方式中，胞內信號傳導域包含胞內共刺激序列。在一些實施方式中，胞內共刺激序列包含4-1BB、CD28z、CD27z、ICOSz、CD2z或OX40z。在一些實施方式中，抗GPC2嵌合抗原受體進一步包含位於胞外域的C-末端和跨膜域的N-末端之間的鉸鏈域（例如，CD8鉸鏈域）。在一些實施方式中，抗GPC2嵌合抗原受體進一步包含訊息肽（例如CD8訊息肽）。在一些實施方式中，抗GPC2嵌合抗原受體包含多肽，該多肽從N-末端至C-末端包含：CD8訊息肽、抗GPC2 VH H部分、CD8鉸鏈域、CD8跨膜域和胞內信號傳導域，該胞內信號傳導域包含衍生自4-1BB的胞內共刺激序列和CD3ζ胞內信號傳導序列。在一些實施方式中，抗GPC2嵌合抗原受體包含多肽，該多肽從N-末端至C-末端包含：CD8訊息肽、抗GPC2 VH H部分、CD28鉸鏈域、CD28跨膜域和胞內信號傳導域，該胞內信號傳導域包含衍生自4-1BB的胞內共刺激序列和CD3ζ胞內信號傳導序列。在一些實施方式中，抗GPC2嵌合抗原受體包含含有SEQ ID NO: 193、222或223的胺基酸序列的多肽，或其包含以下胺基酸序列的變體，該胺基酸序列與SEQ ID NO: 193、222或223的胺基酸序列具有至少約95%序列同一性。
在一些實施方式中，提供了靶向GPC2的嵌合抗原受體，其包含：(a) 包含抗GPC2 VH H的胞外域，該抗GPC2 VH H包含含有SEQ ID NO: 8的胺基酸序列的CDR1、含有SEQ ID NO: 38的胺基酸序列的CDR2、和含有SEQ ID NO: 69的胺基酸序列的CDR3，或其在CDR中包含多達約5個胺基酸取代的變體；(b) 跨膜域；和 (c) 胞內信號傳導域。在一些實施方式中，抗GPC2 VH H部分包含含有SEQ ID NO: 100、128或129的胺基酸序列的VH H域，或其包含以下胺基酸序列的變體，該胺基酸序列與SEQ ID NO: 100、128或129的胺基酸序列具有至少約95%序列同一性。在一些實施方式中，初級胞內信號傳導序列衍生自CD3ζ。在一些實施方式中，胞內信號傳導域包含胞內共刺激序列。在一些實施方式中，胞內共刺激序列包含4-1BB、CD28z、CD27z、ICOSz、CD2z或OX40z。在一些實施方式中，抗GPC2嵌合抗原受體進一步包含位於胞外域的C-末端和跨膜域的N-末端之間的鉸鏈域（例如，CD8鉸鏈域）。在一些實施方式中，抗GPC2嵌合抗原受體進一步包含訊息肽（例如CD8訊息肽）。在一些實施方式中，抗GPC2嵌合抗原受體包含多肽，該多肽從N-末端至C-末端包含：CD8訊息肽、抗GPC2 VH H部分、CD8鉸鏈域、CD8跨膜域和胞內信號傳導域，該胞內信號傳導域包含衍生自4-1BB的胞內共刺激序列和CD3ζ胞內信號傳導序列。在一些實施方式中，抗GPC2嵌合抗原受體包含多肽，該多肽從N-末端至C-末端包含：CD8訊息肽、抗GPC2 VH H部分、CD28鉸鏈域、CD28跨膜域和胞內信號傳導域，該胞內信號傳導域包含衍生自4-1BB的胞內共刺激序列和CD3ζ胞內信號傳導序列。在一些實施方式中，抗GPC2嵌合抗原受體包含含有SEQ ID NO: 196、224或225的胺基酸序列的多肽，或其包含以下胺基酸序列的變體，該胺基酸序列與SEQ ID NO: 196、224或225的胺基酸序列具有至少約95%序列同一性。
在一些實施方式中，提供了靶向GPC2的嵌合抗原受體，其包含：(a) 包含抗GPC2 VH H的胞外域，該抗GPC2 VH H包含含有SEQ ID NO: 11的胺基酸序列的CDR1、含有SEQ ID NO: 43的胺基酸序列的CDR2、和含有SEQ ID NO: 74的胺基酸序列的CDR3，或其在CDR中包含多達約5個胺基酸取代的變體；(b) 跨膜域；和 (c) 胞內信號傳導域。在一些實施方式中，抗GPC2 VH H部分包含含有SEQ ID NO: 105或130的胺基酸序列的VH H域，或其包含以下胺基酸序列的變體，該胺基酸序列與SEQ ID NO: 105或130的胺基酸序列具有至少約95%序列同一性。在一些實施方式中，初級胞內信號傳導序列衍生自CD3ζ。在一些實施方式中，胞內信號傳導域包含胞內共刺激序列。在一些實施方式中，胞內共刺激序列包含4-1BB、CD28z、CD27z、ICOSz、CD2z或OX40z。在一些實施方式中，抗GPC2嵌合抗原受體進一步包含位於胞外域的C-末端和跨膜域的N-末端之間的鉸鏈域（例如，CD8鉸鏈域）。在一些實施方式中，抗GPC2嵌合抗原受體進一步包含訊息肽（例如CD8訊息肽）。在一些實施方式中，抗GPC2嵌合抗原受體包含多肽，該多肽從N-末端至C-末端包含：CD8訊息肽、抗GPC2 VH H部分、CD8鉸鏈域、CD8跨膜域和胞內信號傳導域，該胞內信號傳導域包含衍生自4-1BB的胞內共刺激序列和CD3ζ胞內信號傳導序列。在一些實施方式中，抗GPC2嵌合抗原受體包含多肽，該多肽從N-末端至C-末端包含：CD8訊息肽、抗GPC2 VH H部分、CD28鉸鏈域、CD28跨膜域和胞內信號傳導域，該胞內信號傳導域包含衍生自4-1BB的胞內共刺激序列和CD3ζ胞內信號傳導序列。在一些實施方式中，抗GPC2嵌合抗原受體包含含有SEQ ID NO: 196、224或225的胺基酸序列的多肽，或其包含以下胺基酸序列的變體，該胺基酸序列與SEQ ID NO: 201或226的胺基酸序列具有至少約95%序列同一性。
在一些實施方式中，提供了靶向GPC2的嵌合抗原受體，其包含：(a) 包含抗GPC2 VH H的胞外域，該抗GPC2 VH H包含含有SEQ ID NO: 23的胺基酸序列的CDR1、含有SEQ ID NO: 54的胺基酸序列的CDR2、和含有SEQ ID NO: 85的胺基酸序列的CDR3，或其在CDR中包含多達約5個胺基酸取代的變體；(b) 跨膜域；和 (c) 胞內信號傳導域。在一些實施方式中，抗GPC2 VH H部分包含含有SEQ ID NO: 116或131-134的胺基酸序列的VH H域，或其包含以下胺基酸序列的變體，該胺基酸序列與SEQ ID NO: 116或131-134的胺基酸序列具有至少約95%序列同一性。在一些實施方式中，初級胞內信號傳導序列衍生自CD3ζ。在一些實施方式中，胞內信號傳導域包含胞內共刺激序列。在一些實施方式中，胞內共刺激序列包含4-1BB、CD28z、CD27z、ICOSz、CD2z或OX40z。在一些實施方式中，抗GPC2嵌合抗原受體進一步包含位於胞外域的C-末端和跨膜域的N-末端之間的鉸鏈域（例如，CD8鉸鏈域）。在一些實施方式中，抗GPC2嵌合抗原受體進一步包含訊息肽（例如CD8訊息肽）。在一些實施方式中，抗GPC2嵌合抗原受體包含多肽，該多肽從N-末端至C-末端包含：CD8訊息肽、抗GPC2 VH H部分、CD8鉸鏈域、CD8跨膜域和胞內信號傳導域，該胞內信號傳導域包含衍生自4-1BB的胞內共刺激序列和CD3ζ胞內信號傳導序列。在一些實施方式中，抗GPC2嵌合抗原受體包含多肽，該多肽從N-末端至C-末端包含：CD8訊息肽、抗GPC2 VH H部分、CD28鉸鏈域、CD28跨膜域和胞內信號傳導域，該胞內信號傳導域包含衍生自4-1BB的胞內共刺激序列和CD3ζ胞內信號傳導序列。在一些實施方式中，抗GPC2嵌合抗原受體包含含有SEQ ID NO: 212或227-230的胺基酸序列的多肽，或其包含以下胺基酸序列的變體，該胺基酸序列與SEQ ID NO: 212或227-230的胺基酸序列具有至少約95%序列同一性。 在一些實施方式中，提供了靶向GPC2的嵌合抗原受體，其包含：(a) 包含抗GPC2 VH H的胞外域，該抗GPC2 VH H包含含有SEQ ID NO: 27的胺基酸序列的CDR1、含有SEQ ID NO: 58的胺基酸序列的CDR2、和含有SEQ ID NO: 89的胺基酸序列的CDR3，或其在CDR中包含多達約5個胺基酸取代的變體；(b) 跨膜域；和 (c) 胞內信號傳導域。在一些實施方式中，抗GPC2 VH H部分包含含有SEQ ID NO: 120或135-137的胺基酸序列的VH H域，或其包含以下胺基酸序列的變體，該胺基酸序列與SEQ ID NO: 120或135-137的胺基酸序列具有至少約95%序列同一性。在一些實施方式中，初級胞內信號傳導序列衍生自CD3ζ。在一些實施方式中，胞內信號傳導域包含胞內共刺激序列。在一些實施方式中，胞內共刺激序列包含4-1BB、CD28z、CD27z、ICOSz、CD2z或OX40z。在一些實施方式中，抗GPC2嵌合抗原受體進一步包含位於胞外域的C-末端和跨膜域的N-末端之間的鉸鏈域（例如，CD8鉸鏈域）。在一些實施方式中，抗GPC2嵌合抗原受體進一步包含訊息肽（例如CD8訊息肽）。在一些實施方式中，抗GPC2嵌合抗原受體包含多肽，該多肽從N-末端至C-末端包含：CD8訊息肽、抗GPC2 VH H部分、CD8鉸鏈域、CD8跨膜域和胞內信號傳導域，該胞內信號傳導域包含衍生自4-1BB的胞內共刺激序列和CD3ζ胞內信號傳導序列。在一些實施方式中，抗GPC2嵌合抗原受體包含多肽，該多肽從N-末端至C-末端包含：CD8訊息肽、抗GPC2 VH H部分、CD28鉸鏈域、CD28跨膜域和胞內信號傳導域，該胞內信號傳導域包含衍生自4-1BB的胞內共刺激序列和CD3ζ胞內信號傳導序列。在一些實施方式中，抗GPC2嵌合抗原受體包含含有SEQ ID NO: 216或231-233的胺基酸序列的多肽，或其包含以下胺基酸序列的變體，該胺基酸序列與SEQ ID NO: 216或231-233的胺基酸序列具有至少約95%序列同一性。串聯 CAR
本揭露之串聯CAR可以包括CAS70950VH6-AS70950VH6-BBz（SEQ ID NO: 243）。本揭露之串聯CAR還可以包括抗GPC2雙特異性二價CAR，包括CAS71529VH5-AS72052VH5-BBz（SEQ ID NO: 239）、CAS72052VH5-AS71529VH5-BBz（SEQ ID NO: 240）、CAS70950VH6-AS71529VH6-BBz（SEQ ID NO: 241）、CAS71529VH6-AS70950VH6-BBz（SEQ ID NO: 242）、CAS78117VH4-AS71529VH6-BBz（SEQ ID NO: 246）和CAS71529VH6-AS78117VH4-BBz（SEQ ID NO: 247）。
在一些實施方式中，提供了靶向GPC2的串聯嵌合抗原受體，其包含：(a) 包含串聯抗GPC2 VH H的胞外域；(b) 跨膜域；和 (c) 胞內信號傳導域。在一些實施方式中，抗GPC2 VH H部分包含含有SEQ ID NO: 143-147、244或245的胺基酸序列的VH H域，或其包含以下胺基酸序列的變體，該胺基酸序列與SEQ ID NO: 143-147、244或245的胺基酸序列具有至少約95%序列同一性。在一些實施方式中，初級胞內信號傳導序列衍生自CD3ζ。在一些實施方式中，胞內信號信號傳導域包含胞內共刺激序列。在一些實施方式中，胞內共刺激序列包含4-1BB、CD28z、CD27z、ICOSz、CD2z或OX40z。在一些實施方式中，抗GPC2嵌合抗原受體進一步包含位於胞外域的C-末端和跨膜域的N-末端之間的鉸鏈域（例如，CD8鉸鏈域）。在一些實施方式中，抗GPC2嵌合抗原受體進一步包含訊息肽（例如CD8訊息肽）。在一些實施方式中，抗GPC2嵌合抗原受體包含多肽，該多肽從N-末端至C-末端包含：CD8訊息肽、抗GPC2 VH H部分、CD8鉸鏈域、CD8跨膜域和胞內信號傳導域，該胞內信號傳導域包含衍生自4-1BB的胞內共刺激序列和CD3ζ胞內信號傳導序列。在一些實施方式中，抗GPC2嵌合抗原受體包含多肽，該多肽從N-末端至C-末端包含：CD8訊息肽、抗GPC2 VH H部分、CD28鉸鏈域、CD28跨膜域和胞內信號傳導域，該胞內信號傳導域包含衍生自4-1BB的胞內共刺激序列和CD3ζ胞內信號傳導序列。在一些實施方式中，抗GPC2嵌合抗原受體包含含有SEQ ID NO: 243、239-242、246或247的胺基酸序列的多肽，或其包含以下胺基酸序列的變體，該胺基酸序列與SEQ ID NO: 243、239-242、246或247的胺基酸序列具有至少約95%序列同一性。
在一些實施方式中，本申請提供了多價（例如二價、三價或更高價）嵌合抗原受體，其包含：(a) 胞外域，其包含與GPC2的第一表位特異性結合的sdAb部分和與GPC2的第二表位特異性結合的第二結合部分（例如sdAb或scFv）；(b) 跨膜域；和 (c) 胞內信號傳導域，其中第一表位和第二表位係不同的。在一些實施方式中，第一抗GPC2 sdAb位於第二GPC2結合部分（例如，第二抗GPC2 sdAb）的N-末端。在一些實施方式中，第一抗GPC2 sdAb位於第二GPC2結合部分（例如，第二抗GPC2 sdAb）的C-末端。在一些實施方式中，多價嵌合抗原受體特異性結合GPC2上的兩個不同的表位。在一些實施方式中，多價嵌合抗原受體特異性結合GPC2上的三個或更多個不同的表位。
在一些實施方式中，結合部分例如sdAb（包括多個sdAb，或第一sdAb和/或第二sdAb）係駱駝科、嵌合、人或人源化的。在一些實施方式中，結合部分或sdAb經由肽鍵或肽連接子與彼此融合。在一些實施方式中，每個肽連接子長度不超過約50（例如不超過約35、25、20、15、10或5中任一個）個胺基酸。在一些實施方式中，跨膜域選自由以下組成之群組：CD8α、CD4、CD28、4-1BB、CD80、CD86、CD152、PD-1、CD2、CD27、ICOS和OX40。在一些實施方式中，胞內信號傳導域包含免疫效應細胞（例如T細胞）的初級胞內信號傳導序列。在一些實施方式中，初級胞內信號傳導序列衍生自CD3ζ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、常見FcR γ（FCER1G）、Fc γ RIIa、FcR β（Fc ε R1b）、CD5、CD22、CD79a、CD79b或CD66d。在一些實施方式中，初級胞內信號傳導序列衍生自CD3ζ。在一些實施方式中，胞內信號傳導域包含胞內共刺激序列。在一些實施方式中，胞內共刺激序列衍生自選自由以下組成之群組的共刺激分子：CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD40、PD-1、LFA-1、ICOS、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、TNFRSF9、TNFRSF4、TNFRSF8、CD40LG、ITGB2、KLRC2、TNFRSF18、TNFRSF14、HAVCR1、LGALS9、DAP10、DAP12、CD83、CD83的配位基、及其組合。在一些實施方式中，胞內共刺激序列衍生自CD28、4-1BB、CD2、CD27、ICOS和OX40。在一些實施方式中，多價嵌合抗原受體進一步包含位於胞外域的C-末端和跨膜域的N-末端之間的鉸鏈域（例如CD8鉸鏈域）。在一些實施方式中，多價嵌合抗原受體進一步包含訊息肽（例如CD8訊息肽）。在一些實施方式中，抗GPC2嵌合抗原受體包含多肽，該多肽從N-末端至C-末端包含：CD8訊息肽，胞外域，CD8或CD28鉸鏈域，CD8、CD28、CD2、CD27、ICOS或OX40跨膜域，和胞內信號傳導域，該胞內信號傳導域包含衍生自4-1BB、CD28、CD2、CD27、ICOS或OX40的胞內共刺激序列和CD3ζ胞內信號傳導序列。在一些實施方式中，多價嵌合抗原受體係單特異性的。在一些實施方式中，多價嵌合抗原受體係多特異性的，例如雙特異性的。
本文所述之多價嵌合受體可以特別適用於藉由不同抗原結合位點經由協同結合來靶向多聚體抗原，或用於增強與抗原的結合親和力或親合力。本文所述之任何抗GPC2 sdAb均可以用於本文所述之多價嵌合受體的胞外域。雙 CAR
雙CAR可以是任何兩個抗GPC2 CAR的組合，其中第一CAR和第二CAR中的每一個可以是單CAR或串聯CAR，即單CAR/單CAR、單CAR/串聯CAR、或串聯CAR/串聯CAR。雙CAR T細胞信號傳導的水平可以藉由操作每個第一和第二CAR的胞內域來調節。例如，第一CAR和第二CAR中的每個的胞內域可以包含共刺激域（例如CD28、4-1ΒΒ（CD137）、ICOS、OX40（CD134）、CD27和/或DAP10）和/或來自Τ細胞受體的信號傳導域（例如來自Τ細胞受體的信號傳導域（例如CD3ζ））。例如，本揭露之雙CAR可以包括第一CAR和第二CAR，其各自具有包含共刺激域和來自Τ細胞受體的信號傳導域的胞內域。因此，當雙CAR結合抗原（例如雙特異性的）時，T細胞信號可以藉由來自Τ細胞受體的兩個信號傳導域傳遞。
雙CAR可以是獨立地選自由以下組成之群組的任何兩個單一抗GPC2 CAR的組合：CAS70549-BBz、CAS70771-BBz、CAS70950-BBz、CAS71402-BBz、CAS71529-BBz、CAS71661-BBz、CAS72021-BBz、CAS72052-BBz、CAS72383-BBz、CAS72479-BBz、CAS72499-BBz、CAS72531-BBz、CAS72669-BBz、CAS72794-BBz、CAS72805-BBz、CAS72806-BBz、CAS72835-BBz、CAS77906-BBz、CAS77916-BBz、CAS77932-BBz、CAS77934-BBz、CAS77978-BBz、CAS77986-BBz、CAS78117-BBz、CAS78215-BBz、CAS78810-BBz、CAS79101-BBz、CAS79236-BBz、CAS79274-BBz、CAS79285-BBz、CAS79317-BBz、CAS70950VH6-BBz、CAS70950VH7-BBz、CAS71529VH5-BBz、CAS71529VH6-BBz、CAS72052VH5-BBz、CAS72052VH6-BBz、CAS72669VH6-BBz、CAS78117VH4-BBz、CAS78117VH5-BBz、CAS78117VH6-BBz、CAS78117VH7-BBz、CAS79236VH4-BBz、CAS79236VH5-BBz、CAS79236VH6-BBz、CAS77916VH6-BBz、CAS77916VH7-BBz、CAS77916VH8-BBz、CAS77916VH9-BBz、CAS77916VH10-BBz、GPC2-CD28z、C2-CD27z、GPC2-ICOSz、GPC2-CD2z和GPC2-OX40z，較佳的是CAS70950-BBz、CAS70950VH6-BBz、CAS71529-BBz、CAS71529VH6-BBz、CAS78117-BBz、CAS78117VH4-BBz、CAS79236-BBz、CAS79236VH6-BBz、GPC2-CD28z、GPC2-CD27z、GPC2-ICOSz、GPC2-CD2z、GPC2-OX40z、CAS71529VH5-AS72052VH5-BBz、CAS72052VH5-AS71529VH5-BBz、CAS70950VH6-AS71529VH6-BBz、CAS71529VH6-AS70950VH6-BBz、CAS70950VH6-AS70950VH6-BBz、CAS78117VH4-AS71529VH6-BBz和CAS71529VH6-AS78117VH4-BBz。
雙CAR可以是以下第一單一抗GPC2 CAR和第二CAR的組合，該第一單一抗GPC2 CAR選自由以下組成之群組：CAS70549-BBz、CAS70771-BBz、CAS70950-BBz、CAS71402-BBz、CAS71529-BBz、CAS71661-BBz、CAS72021-BBz、CAS72052-BBz、CAS72383-BBz、CAS72479-BBz、CAS72499-BBz、CAS72531-BBz、CAS72669-BBz、CAS72794-BBz、CAS72805-BBz、CAS72806-BBz、CAS72835-BBz、CAS77906-BBz、CAS77916-BBz、CAS77932-BBz、CAS77934-BBz、CAS77978-BBz、CAS77986-BBz、CAS78117-BBz、CAS78215-BBz、CAS78810-BBz、CAS79101-BBz、CAS79236-BBz、CAS79274-BBz、CAS79285-BBz、CAS79317-BBz、CAS70950VH6-BBz、CAS70950VH7-BBz、CAS71529VH5-BBz、CAS71529VH6-BBz、CAS72052VH5-BBz、CAS72052VH6-BBz、CAS72669VH6-BBz、CAS78117VH4-BBz、CAS78117VH5-BBz、CAS78117VH6-BBz、CAS78117VH7-BBz、CAS79236VH4-BBz、CAS79236VH5-BBz、CAS79236VH6-BBz、CAS77916VH6-BBz、CAS77916VH7-BBz、CAS77916VH8-BBz、CAS77916VH9-BBz、CAS77916VH10-BBz、GPC2-CD28z、GPC2-CD27z、GPC2-ICOSz、GPC2-CD2z、GPC2-OX40z、CAS71529VH5-AS72052VH5-BBz、CAS72052VH5-AS71529VH5-BBz、CAS70950VH6-AS71529VH6-BBz、CAS71529VH6-AS70950VH6-BBz、CAS70950VH6-AS70950VH6-BBz、CAS78117VH4-AS71529VH6-BBz和CAS71529VH6-AS78117VH4-BBz，較佳的是CAS70950-BBz、CAS70950VH6-BBz、CAS71529-BBz、CAS71529VH6-BBz、CAS78117-BBz、CAS78117VH4-BBz、CAS79236-BBz、CAS79236VH6-BBz、GPC2-CD28z、GPC2-CD27z、GPC2-ICOSz、GPC2-CD2z、GPC2-OX40z、CAS71529VH5-AS72052VH5-BBz、CAS72052VH5-AS71529VH5-BBz、CAS70950VH6-AS71529VH6-BBz、CAS71529VH6-AS70950VH6-BBz、CAS70950VH6-AS70950VH6-BBz、CAS78117VH4-AS71529VH6-BBz和CAS71529VH6-AS78117VH4-BBz，該第二CAR與除了GPC2以外的分子（例如GD2和DLL3）結合並包含共刺激域（例如CD28、4-1ΒΒ（CD137）、ICOS、OX40（CD134）、CD27、和/或DAP10）和來自Τ細胞受體的信號傳導域，例如來自Τ細胞受體的信號傳導域（例如CD3ζ）。
在一些實施方式中，提供了雙嵌合抗原受體系統，其包含：(a) 包含胞外域的第一嵌合抗原受體，該胞外域包含抗GPC2 sdAb（例如本文所述之抗GPC2 VH H中任一個）、跨膜域和胞內信號傳導域，該胞內信號傳導域包含衍生自4-1BB或CD28的胞內共刺激序列和CD3ζ胞內信號傳導序列；和 (b) 包含胞外域的第二嵌合抗原受體，該胞外域包含抗GD2或DLL3 sdAb或scFv、跨膜域和胞內信號傳導域，該胞內信號傳導域包含衍生自4-1BB或CD28的胞內共刺激序列和CD3ζ胞內信號傳導序列。在一些實施方式中，跨膜域選自由以下組成之群組：CD8α、CD4、CD28、4-1BB、CD80、CD86、CD152和PD-1。在一些實施方式中，初級胞內信號傳導序列衍生自CD3ζ。在一些實施方式中，胞內共刺激序列衍生自選自由以下組成之群組的共刺激分子：CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD40、PD-1、整合蛋白亞基α L（LFA-1）、ICOS、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、TNF受體超家族成員（TNFRSF）9、TNFRSF4、TNFRSF8、CD40配位基（CD40LG）、整合蛋白亞基β（ITGB）2、殺傷細胞凝集素樣受體（KLR）C2、TNFRSF18、TNFRSF14、A型肝炎病毒細胞受體（HAVCR）1、半乳凝素9（LGALS9）、造血細胞訊息傳遞因子（DAP10）、跨膜免疫信號傳導銜接子TYROBP（DAP12）、CD83、CD83的配位基及其組合。在一些實施方式中，第一嵌合抗原受體和/或第二嵌合抗原受體進一步包含位於胞外域的C-末端和跨膜域的N-末端之間的鉸鏈域（例如CD8鉸鏈域）。在一些實施方式中，第一嵌合抗原受體和/或第二嵌合抗原受體進一步包含訊息肽（例如CD8訊息肽）。任何合適的抗GD2或DLL3 sdAb或scFv均可以用於本文所述之雙嵌合抗原受體系統。分離的 CAR
分離的CAR不同於雙CAR，因為第一CAR可以包含共刺激域但不含來自Τ細胞受體的信號傳導域；而第二CAR可以包含來自Τ細胞受體的信號傳導域但不含共刺激域。因此，當分離的CAR結合抗原（例如雙特異性的）時，T細胞信號可以藉由第一CAR的共刺激域和來自第二CAR的Τ細胞受體的信號傳導域來傳遞。例如，本揭露之分離的CAR可以具有第一CAR和第二CAR，該第一CAR包含結合GPC2的具有選自SEQ ID NO: 93-142的胺基酸序列的VH H單結合域，該第二CAR包含結合除了GPC2以外的分子（例如，GD2和DLL3）的VH H單結合域。第一CAR還可以是單特異性或雙特異性二價串聯CAR。第一CAR可以具有來自Τ細胞受體的信號傳導域（例如CD3ζ），並且第二CAR可以具有共刺激域（例如CD28或4-1BB）並且反之亦然。
在一些實施方式中，提供了分離的嵌合抗原受體系統，其包含：(a) 包含胞外域的第一嵌合抗原受體，該胞外域包含抗GPC2 sdAb（例如本文所述之抗GPC2 VH H中任一個）、跨膜域和胞內信號傳導域，該胞內信號傳導域包含免疫效應細胞（例如T細胞）的初級胞內信號傳導序列，其中視需要該胞內信號傳導域不包含胞內共刺激序列；(b) 包含胞外域的第二嵌合抗原受體，該胞外域包含特異性結合第二抗原或表位的第二結合部分（例如，sdAb、scFv或受體的胞外域）、跨膜域和胞內信號傳導域，該胞內信號傳導域包含胞內共刺激序列，其中視需要該胞內信號傳導域不包含初級胞內信號傳導序列。在一些實施方式中，第二抗原係GD2或DLL3。
在一些實施方式中，跨膜域選自由以下組成之群組：CD8α、CD4、CD28、4-1BB、CD80、CD86、CD152和PD-1。在一些實施方式中，初級胞內信號傳導序列衍生自CD3ζ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、常見FcR γ（FCER1G）、Fc γ RIIa、FcR β（Fc ε R1b）、CD5、CD22、CD79a、CD79b或CD66d。在一些實施方式中，初級胞內信號傳導序列衍生自CD3ζ。在一些實施方式中，胞內共刺激序列衍生自選自由以下組成之群組的共刺激分子：CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD40、PD-1、LFA-1、ICOS、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、TNFRSF9、TNFRSF4、TNFRSF8、CD40LG、ITGB2、KLRC2、TNFRSF18、TNFRSF14、HAVCR1、LGALS9、DAP10、DAP12、CD83、CD83的配位基、及其組合。在一些實施方式中，胞內共刺激序列衍生自CD28或4-1BB。在一些實施方式中，第一嵌合抗原受體和/或第二嵌合抗原受體進一步包含位於胞外域的C-末端和跨膜域的N-末端之間的鉸鏈域（例如CD8鉸鏈域）。在一些實施方式中，第一嵌合抗原受體和/或第二嵌合抗原受體進一步包含訊息肽（例如CD8訊息肽）。在一些實施方式中，第一嵌合抗原受體包含多肽，該多肽從N-末端至C-末端包含：CD8訊息肽、抗GPC2 sdAb、CD8鉸鏈域、CD8跨膜域和胞內信號傳導域，該胞內信號傳導域包含CD3ζ胞內信號傳導序列。在一些實施方式中，第二嵌合抗原受體包含多肽，該多肽從N-末端至C-末端包含：CD8訊息肽、第二結合域、CD8鉸鏈域、CD8跨膜域和胞內信號傳導域，該胞內信號傳導域包含衍生自4-1BB或CD28的胞內共刺激序列。
在一些實施方式中，提供了分離的嵌合抗原受體系統，其包含：(a) 包含胞外域的第一嵌合抗原受體，該胞外域包含抗GPC2 sdAb（例如本文所述之抗GPC2 sdAb VH H中任一個）、跨膜域和胞內域，該胞內域包含含有胞內共刺激序列的胞內信號傳導域，其中視需要該胞內信號傳導域不包含初級胞內信號傳導序列；(b) 包含胞外域的第二嵌合抗原受體，該胞外域包含特異性結合第二抗原或表位的第二結合部分（例如，sdAb、scFv或受體的胞外域）、跨膜域和胞內信號傳導域，該胞內信號傳導域包含免疫效應細胞（例如T細胞）的初級胞內信號傳導序列，其中視需要該胞內信號傳導域不包含胞內共刺激序列。在一些實施方式中，第二抗原係GD2或DLL3。在一些實施方式中，跨膜域選自由以下組成之群組：CD8α、CD4、CD28、4-1BB、CD80、CD86、CD152和PD-1。在一些實施方式中，初級胞內信號傳導序列衍生自CD3ζ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、常見FcR γ（FCER1G）、Fc γ RIIa、FcR β（Fc ε R1b）、CD5、CD22、CD79a、CD79b或CD66d。在一些實施方式中，初級胞內信號傳導序列衍生自CD3ζ。在一些實施方式中，胞內共刺激序列衍生自選自由以下組成之群組的共刺激分子：CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD40、PD-1、LFA-1、ICOS、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、TNFRSF9、TNFRSF4、TNFRSF8、CD40LG、ITGB2、KLRC2、TNFRSF18、TNFRSF14、HAVCR1、LGALS9、DAP10、DAP12、CD83、CD83的配位基、及其組合。在一些實施方式中，胞內共刺激序列衍生自CD28或4-1BB。在一些實施方式中，第一嵌合抗原受體和/或第二嵌合抗原受體進一步包含位於胞外域的C-末端和跨膜域的N-末端之間的鉸鏈域（例如CD8鉸鏈域）。在一些實施方式中，第一嵌合抗原受體和/或第二嵌合抗原受體進一步包含訊息肽（例如CD8訊息肽）。在一些實施方式中，第一嵌合抗原受體包含多肽，該多肽從N-末端至C-末端包含：CD8訊息肽、抗GPC2 sdAb、CD8鉸鏈域、CD8跨膜域和胞內信號傳導域，該胞內信號傳導域包含衍生自4-1BB或CD28的胞內共刺激序列。在一些實施方式中，第二嵌合抗原受體包含多肽，該多肽從N-末端至C-末端包含：CD8訊息肽、第二結合域、CD8鉸鏈域、CD8跨膜域和胞內信號傳導域，該胞內信號傳導域包含CD3ζ胞內信號傳導序列。
免疫效應細胞（例如Τ細胞）通常可以使用如描述於例如以下中之方法進行活化或擴增：美國專利案號6,352,694；6,534,055；6,905,680；6,692,964；5,858,358；6,887,466；6,905,681；7,144,575；7,067,318；7,172,869；7,232,566；7,175,843；5,883,223；6,905,874；6,797,514；6,867,041；以及美國專利申請公開案號2006/0121005，其內容藉由引用以其整體特此併入本文。免疫效應細胞的實例包括Τ細胞，例如α/β Τ細胞和γ/δ Τ細胞、Β細胞、天然殺傷（ΝΚ）細胞、天然殺傷Τ（ΝΚΤ）細胞、肥大細胞、和骨髓衍生的吞噬細胞。在一些實施方式中，免疫細胞係T細胞，例如細胞毒性T細胞和/或輔助T細胞。在一些實施方式中，T細胞係CD4+ /CD8- 、CD4- /CD8+ 、CD4+ /CD8+ 、CD4- /CD8- 或其組合。在一些實施方式中，T細胞在表現CAR並與靶細胞（例如GPC2+ 腫瘤細胞）結合後產生IL-2、TFN和/或TNF。在一些實施方式中，CD8+ T細胞在表現CAR並與靶細胞結合後裂解抗原特異性靶細胞。在一些實施方式中，免疫細胞係γδ T細胞。
例如在US 2016/0185861中描述了形成表現CAR的細胞之方法，其內容藉由引用以其整體特此併入本文。治療方法
在一些實施方式中，提供了治療GPC2陽性疾病之方法，該GPC2陽性疾病由以下組成：急性淋巴母細胞性白血病細胞、尤文氏肉瘤細胞、神經母細胞瘤、胚胎性橫紋肌肉瘤、肺泡橫紋肌肉瘤、肺癌、腦癌、子宮癌、子宮頸癌、大腸直腸癌、胃癌、頭頸癌、乳癌、胰臟癌、卵巢癌、腎癌、食道癌、睾丸癌和皮膚癌。在一些實施方式中，提供了治療個體（例如人個體）的疾病（例如癌症，如神經母細胞瘤、小細胞肺癌和成神經管細胞瘤）之方法，該方法包括向個體施用有效量的包含工程化免疫細胞（例如T細胞）的藥物組成物，該工程化免疫細胞包含：抗GPC2嵌合抗原受體，該抗GPC2嵌合抗原受體包含：(a) 包含抗GPC2 VH H（例如本文所述之抗GPC2 VH H中任一個）的胞外域；(b) 跨膜域；和 (c) 胞內信號傳導域。在一些實施方式中，胞內信號傳導域包含免疫效應細胞（例如T細胞）的初級胞內信號傳導序列。在一些實施方式中，初級胞內信號傳導序列衍生自CD3ζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b或CD66d。在一些實施方式中，初級胞內信號傳導序列衍生自CD3ζ。在一些實施方式中，胞內信號傳導域包含胞內共刺激序列。在一些實施方式中，胞內共刺激序列衍生自選自由以下組成之群組的共刺激分子：CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD40、PD-1、LFA-1、ICOS、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、TNFRSF9、TNFRSF4、TNFRSF8、CD40LG、ITGB2、KLRC2、TNFRSF18、TNFRSF14、HAVCR1、LGALS9、DAP10、DAP12、CD83、CD83的配位基、及其組合。在一些實施方式中，胞內共刺激序列源自共刺激分子。在一些實施方式中，胞內共刺激序列包含4-1BB、CD28z、CD27z、ICOSz、CD2z或OX40z。在一些實施方式中，抗GPC2嵌合抗原受體包含：(a) 包含抗GPC2 VH H（例如本文所述之抗GPC2 VH H或串聯抗GPC2 VH H中任一個）的胞外域；(b) 跨膜域；和 (c) 包含CD3ζ胞內信號傳導序列和衍生自CD28或4-1BB的胞內共刺激序列的胞內信號傳導域。在一些實施方式中，抗GPC2 VH H包含以下中的任一個：(1) 包含SEQ ID NO: 1-30的胺基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO: 31-61的胺基酸序列的CDR2、和包含SEQ ID NO: 62-92的胺基酸序列的CDR3，或其在CDR中包含多達約5個胺基酸取代的變體；在一些實施方式中，抗GPC2 VH H包含含有SEQ ID NO: 93-142、143-147和244-245中任一個的胺基酸序列的VH H域，或其包含以下胺基酸序列的變體，該胺基酸序列與SEQ ID NO: 93-142、143-147和244-245中任一個的胺基酸序列具有至少約95%序列同一性。在一些實施方式中，抗GPC2嵌合抗原受體包含SEQ ID NO: 189-238和248-252中任一個的胺基酸序列，或其包含以下胺基酸序列的變體，該胺基酸序列與SEQ ID NO: 189-238和248-252中任一個的胺基酸序列具有至少約95%序列同一性。在一些實施方式中，GPC2嵌合抗原受體包含SEQ ID NO: 239-243和246-247的胺基酸序列。在一些實施方式中，工程化免疫細胞表現安全開關抗原或表位，例如CD52、EGFR或CD20。在一些實施方式中，該方法進一步包括隨後施用有效量的與安全開關抗原或表位特異性結合的治療性抗體。
在一些實施方式中，可以藉由向受試者施用試劑來治療和/或擾亂疾病或障礙以體內調節基因工程化細胞，例如以促進、增強或提高基因工程化細胞（例如向受試者施用的表現本揭露之CAR的T細胞）的擴增。在特定的實施方式中，該試劑係藥劑。在一些實施方式中，該試劑係治療劑。在一些實施方式中，該試劑係免疫調節劑。在一些實施方式中，該試劑係化療劑。在一些實施方式中，該試劑（例如免疫調節劑）能夠抑制或阻斷分子功能或涉及所述分子的信號傳導途徑。在一些實施方式中，該分子可以在免疫細胞上表現或可以是免疫突觸的一部分，例如在Τ細胞或抗原呈遞細胞或與免疫反應相關的其他細胞上表現。在一些這樣的方面中，該分子係免疫抑制分子或該分子係免疫檢查點分子。在一些實施方式中，免疫檢查點分子或途徑係PD-1、CD274分子（PD-L1）、計劃性細胞死亡1配位基2（PD-L2）、細胞毒性T淋巴細胞相關蛋白4（CTLA-4）、淋巴細胞活化基因3（LAG-3）、A型肝炎病毒細胞受體2（TIM3）、V-set免疫調節受體（VISTA）、腺苷2Α受體（A2AR）或腺苷或涉及任何前述物質的途徑。
示例性免疫檢查點抑制劑包括曲美木單抗（CTLA-4阻斷抗體，也稱為替西木單抗，CP-675,206）、抗OX40、PD-L1單株抗體（抗B7-Hl；MEDI4736，又稱度伐單抗）、MK-3475（PD-1阻斷劑）、納武單抗（抗PD-1抗體）、CT-011（抗PD-1抗體）、ΒΥ55單株抗體、ΑΜΡ224（抗PD-Ll抗體）、BMS-936559（抗PD-Ll抗體）、MPLDL3280A（抗PD-Ll抗體）、MSB0010718C（抗PD-Ll抗體）和伊匹單抗（抗CTLA-4抗體，也稱為Yervoy®，MDX-010和MDX-101）。免疫調節抗體的示例包括但不限於：達利珠單抗（賽尼哌）、貝伐單抗（AVASTIN®）、巴厘昔單抗、伊匹單抗、納武單抗、派姆單抗、MPDL3280A、皮地利珠單抗（CT-011）、MK-3475、BMS-936559、MPDL3280A（阿特珠單抗）、曲美木單抗、IMP321、BMS-986016、LAG525、烏瑞魯單抗、PF-05082566、TRX518、MK-4166、達塞妥珠單抗（SGN-40）、魯圖莫單抗（lucatumumab）（HCD122）、SEACD40、CP-870、CP-893、MEDI6469、MEDI6383、MOXR0916、AMP-224、MSB0010718C（阿維魯單抗）、MEDI4736（度伐單抗）、PDR001、rHIgM12B7、Ulocuplumab、ΒΚΤ140、Va rlilumab（CDX-1127）、ARGX-110、MGA271、立魯單抗（lirilumab）（BMS-986015，IPH2101）、IPH2201、ARGX-115、依米妥珠單抗（Emactuzumab）、CC-90002和MNRP1685A或其抗體結合片段。其他示例性免疫調節劑包括，例如阿夫土珠單抗（afutuzumab）；培非格司亭（pegfilgrastim）；3-(4-胺基-1-側氧基-1,3-二氫-2H -異吲哚-2-基)哌啶-2,6-二酮（CAS：191732-72-6）；沙利度胺、actimid（CC4047）；和IRX-2（包括介白素1、介白素2和干擾素γ的人細胞介素的混合物，CAS 951209-71-5，可購自IRX Therapeutics）。
在一些實施方式中，免疫調節劑係沙利度胺（2-(2,6-二側氧基哌啶-3-基)-1H -異吲哚-1,3(2H )-二酮）或沙利度胺的類似物或衍生物。在某些實施方式中，沙利度胺衍生物包括具有相似的生物活性的沙利度胺的結構變體。示例性沙利度胺衍生物包括但不限於3-(4-胺基-1-側氧基-1,3-二氫-2H -異吲哚-2-基)哌啶-2,6-二酮、泊馬度胺、CC-1088、CDC-501和CDC-801，以及在以下中揭露的化合物：美國專利案號5,712,291；7,320,991；和8,716,315；美國申請號2016/0313300；以及PCT公開案 號WO 2002/068414和WO 2008/154252；其內容藉由引用以其整體特此併入。
在一些實施方式中，該免疫調節劑係3-(4-胺基-1-側氧基-1,3-二氫-2H -異吲哚-2-基)哌啶-2,6-二酮，泊馬度胺，阿伐度胺，3-(4-胺基-1-側氧基-1,3-二氫-2H -異吲哚-2-基)哌啶-2,6-二酮、泊馬度胺、阿伐度胺的立體異構物，或其藥學上可接受的鹽、溶劑化物、水合物、共結晶、包合物或多晶型物。在一些實施方式中，該免疫調節化合物係3-(4-胺基-1-側氧基-1,3-二氫-2H -異吲哚-2-基)哌啶-2,6-二酮，3-(4-胺基-1-側氧基-1,3-二氫-2H -異吲哚-2-基)哌啶-2,6-二酮的立體異構物，或其藥學上可接受的鹽、溶劑化物、水合物、共結晶、包合物或多晶型物。在一些實施方式中，該免疫調節化合物係3-(4-胺基-1-側氧基-1,3-二氫-2H -異吲哚-2-基)哌啶-2,6-二酮。
在某些實施方式中，可以藉由向受試者施用化合物3-(4-胺基-1-側氧基-1,3-二氫-2H -異吲哚-2-基)哌啶-2,6-二酮和表現本揭露之CAR的T細胞來治療和/或擾亂疾病或障礙。CARS可以是選自由以下組成之群組的至少一個單價CAR：CAS70549-BBz、CAS70771-BBz、CAS70950-BBz、CAS71402-BBz、CAS71529-BBz、CAS71661-BBz、CAS72021-BBz、CAS72052-BBz、CAS72383-BBz、CAS72479-BBz、CAS72499-BBz、CAS72531-BBz、CAS72669-BBz、CAS72794-BBz、CAS72805-BBz、CAS72806-BBz、CAS72835-BBz、CAS77906-BBz、CAS77916-BBz、CAS77932-BBz、CAS77934-BBz、CAS77978-BBz、CAS77986-BBz、CAS78117-BBz、CAS78215-BBz、CAS78810-BBz、CAS79101-BBz、CAS79236-BBz、CAS79274-BBz、CAS79285-BBz、CAS79317-BBz、CAS70950VH6-BBz、CAS70950VH7-BBz、CAS71529VH5-BBz、CAS71529VH6-BBz、CAS72052VH5-BBz、CAS72052VH6-BBz、CAS72669VH6-BBz、CAS78117VH4-BBz、CAS78117VH5-BBz、CAS78117VH6-BBz、CAS78117VH7-BBz、CAS79236VH4-BBz、CAS79236VH5-BBz、CAS79236VH6-BBz、CAS77916VH6-BBz、CAS77916VH7-BBz、CAS77916VH8-BBz、CAS77916VH9-BBz和CAS77916VH10-BBz、GPC2-CD28z、C2-CD27z、GPC2-ICOSz、GPC2-CD2z和GPC2-OX40z，較佳的是CAS70950-BBz、CAS70950VH6-BBz、CAS71529-BBz、CAS71529VH6-BBz、CAS78117-BBz、CAS78117VH4-BBz、CAS79236-BBz、CAS79236VH6-BBz、GPC2-CD28z、GPC2-CD27z、GPC2-ICOSz、GPC2-CD2z和GPC2-OX40z，和/或包括CAS70950VH6-AS70950VH6-BBz的單價串聯CAR，和/或包括以下的多價串聯CAR：CAS71529VH5-AS72052VH5-BBz、CAS72052VH5-AS71529VH5-BBz、CAS70950VH6-AS71529VH6-BBz、CAS71529VH6-AS70950VH6-BBz、CAS78117VH4-AS71529VH6-BBz和CAS71529VH6-AS78117VH4-BBz，較佳的是CAS70950VH6-AS71529VH6-BBz、CAS71529VH6-AS70950VH6-BBz、CAS78117VH4-AS71529VH6-BBz和CAS71529VH6-AS78117VH4-BBz。
3-(4-胺基-1-側氧基-1,3-二氫-2H -異吲哚-2-基)哌啶-2,6-二酮經FDA批准用於治療多發性骨髓瘤、與5q缺失有關的骨髓發育不良症候群以及最近用於治療復發性/難治性外膜細胞淋巴瘤（MCL）。3-(4-胺基-1-側氧基-1,3-二氫-2H -異吲哚-2-基)哌啶-2,6-二酮通常是沙利度胺的合成衍生物，並且目前被認為具有多種免疫調節作用，包括促進Τ細胞和抗原呈遞細胞（APC）之間免疫突觸形成。例如，在一些情況下，3-(4-胺基-1-側氧基-1,3-二氫-2H -異吲哚-2-基)哌啶-2,6-二酮調節T細胞反應並導致介白素（IL）-2在CD4+ 和CD8+ Τ細胞中的產生增加，誘導Τ輔助（Th）反應從Th2向Th1轉移，抑制Τ細胞調節子集（Tregs）的擴增，並改善濾泡性淋巴瘤和慢性淋巴細胞性白血病（CLL）中免疫突觸的功能（Otahal等人，Oncoimmunology (2016) 5(4):e1115940）。3-(4-胺基-1-側氧基-1,3-二氫-2H -異吲哚-2-基)哌啶-2,6-二酮在患有多發性骨髓瘤（MM）患者中也具有直接的殺腫瘤活性，並藉由影響支持性細胞（如在淋巴組織的微環境中發現的呵護樣（nurse-like）細胞）來直接和間接調節CLL腫瘤細胞的存活。3-(4-胺基-1-側氧基-1,3-二氫-2H -異吲哚-2-基)哌啶-2,6-二酮還可以響應於藉由CD3連接或樹突細胞介導的活化的T細胞活化來增強T細胞增殖和干擾素y產生。另外，認為3-(4-胺基-1-側氧基-1,3-二氫-2H -異吲哚-2-基)哌啶-2,6-二酮可藉由增強的ΝΚ細胞活化來減少促炎細胞介素（包括TNF-α、IL-1、IL-6和IL-12）的增殖並增強抗體依賴性細胞毒性（ADCC）。3-(4-胺基-1-側氧基-1,3-二氫-2H -異吲哚-2-基)哌啶-2,6-二酮還可以誘導惡性Β細胞表現更高水平的免疫刺激分子，例如CD80、CD86、HLA-DR、CD95和CD40（Fecteau等人，Blood (2014) 124(10): 1637-1644）。小腦蛋白（一種Ε3泛素連接酶）被鑒定係沙利度胺誘導的致畸作用的主要靶標（Ito等人，Τ, (2010) Science 327:1345-1350）。3-(4-胺基-1-側氧基-1,3-二氫-2H -異吲哚-2-基)哌啶-2,6-二酮也靶向小腦蛋白，並且已表明這導致c-Myc和IRF4表現降低同時還增加導致G1細胞週期停滯的p21的表現（Lopez-Girona等人，(2012) Leukemia 26: 2326-2335）。
在某些實施方式中，該藥劑係3-(4-胺基-1-側氧基-1,3-二氫-2H -異吲哚-2-基)哌啶-2,6-二酮或沙利度胺衍生物。在特定的實施方式中，該藥劑係3-(4-胺基-1-側氧基-1,3-二氫-2H -異吲哚-2-基)哌啶-2,6-二酮。在一些實施方式中，3-(4-胺基-1-側氧基-1,3-二氫-2H -異吲哚-2-基)哌啶-2,6-二酮或沙利度胺衍生物以從約0.1 µM至約10 mM、從約0.5 µM至約5 mM、從約1 µM至約2 mM、從約1 µM至約1 mM、從約1 µM至約500 µM、從約1 µM至約400 µM、從約1 µM至約300 µM、從約1 µM至約200 µM、從約1 µM至約100 µM、從約1 µM至約50 µM、從約1 µM至約40 µM、從約1 µM至約30 µM、從約1 µM至約20 µM、從約1 µM至約15 µM、從約1 µM至約10 µM、從約5 µM至約15 µM、或從約5 µM至約10 µM的劑量施用。在一些實施方式中，3-(4-胺基-1-側氧基-1,3-二氫-2H -異吲哚-2-基)哌啶-2,6-二酮或沙利度胺衍生物以從約1 mg至約20 mg，例如從約1 mg至約10 mg、從約2.5 mg至約7.5 mg、從約5 mg至約15 mg，例如約5 mg、10 mg、15 mg或20 mg的劑量施用。在一些實施方式中，3-(4-胺基-1-側氧基-1,3-二氫-2H -異吲哚-2-基)哌啶-2,6-二酮以從約10至5 mg/kg，例如約100 µg/kg至約2 mg/kg、約200 µg/kg至約1 mg/kg、約400 µg/kg至約600 µg/kg，例如約500 µg/kg的劑量施用。在特定的實施方式中，3-(4-胺基-1-側氧基-1,3-二氫-2H -異吲哚-2-基)哌啶-2,6-二酮的劑量係或係約10 mg。在某些實施方式中，藉由向受試者施用單劑量的3-(4-胺基-1-側氧基-1,3-二氫-2H -異吲哚-2-基)哌啶-2,6-二酮來治療和/或擾亂病變。在特定的實施方式中，藉由向受試者施用多劑量的3-(4-胺基-1-側氧基-1,3-二氫-2H -異吲哚-2-基)哌啶-2,6-二酮來治療和/或擾亂病變。在特定的實施方式中，在一個或多個治療週期中，施用多個劑量的3-(4-胺基-1-側氧基-1,3-二氫-2H -異吲哚-2-基)哌啶-2,6-二酮。在一些實施方式中，治療週期包含藥物假期。在某些實施方式中，在21天的治療週期中，每天施用一次3-(4-胺基-1-側氧基-1,3-二氫-2H -異吲哚-2-基)哌啶-2,6-二酮，持續14天。在某些實施方式中，在28天的治療週期中，每天施用一次3-(4-胺基-1-側氧基-1,3-二氫-2H -異吲哚-2-基)哌啶-2,6-二酮，持續21天。
能以任何常規方式施用抗GPC2構建體或其藥物組成物，包括藉由注射、攝取、輸血、植入或移植。可以向患者經動脈、皮下、真皮內、瘤內、結內、髓內、肌內、靜脈內或者腹膜內施用藥物組成物。在一些實施方式中，全身性施用藥物組成物。在一些實施方式中，藉由輸注（例如靜脈輸注）向個體施用藥物組成物。用於免疫療法的輸注技術係本領域已知的（參見，例如Rosenberg等人，New Eng. J. of Med. 319: 1676 (1988)）。在一些實施方式中，藉由真皮內或皮下注射向個體施用藥物組成物。在一些實施方式中，藉由靜脈內注射施用組成物。在一些實施方式中，將組成物直接注射到腫瘤或淋巴結中。在一些實施方式中，將藥物組成物局部施用到腫瘤部位，例如直接到腫瘤細胞或具有腫瘤細胞的組織中。
本申請的藥物組成物的劑量和希望的藥物濃度可根據預想的特定用途而變化。確定合適的劑量或給藥途徑完全在熟悉該項技術者的技能範圍內。動物實驗為確定用於人類療法的有效劑量提供了可靠的指導。可以按照Mordenti, J.和Chappell, W. 「The Use of Interspecies Scaling in Toxicokinetics,」 InToxicokinetics and New Drug Development , Yacobi等人, Eds, Pergamon Press, New York 1989, 第42-46頁規定的原則進行有效劑量的種間推算。在本申請的範圍內，不同的配製物對於不同的治療和不同的障礙將是有效的，並且旨在治療特定器官或組織的施用可能需要以與向另一器官或組織不同的方式遞送。
在一些實施方式中，其中該藥物組成物包含本文所述之抗GPC2構建體中任一個，該藥物組成物以每天按約10 ng/kg多達約100 mg/kg個體體重或更多的劑量施用，例如以約1 mg/kg/天至10 mg/kg/天的劑量施用，這取決於施用途徑。
在一些實施方式中，其中該藥物組成物包含本文所述之工程化免疫細胞中任一個，該藥物組成物以至少約104 、105 、106 、107 、108 、或109 個細胞/kg個體體重中任一的劑量施用。在一些實施方式中，該藥物組成物以約104 至約105 、約105 至約106 、約106 至約107 、約107 至約108 、約108 至約109 、約104 至約109 、約104 至約106 、約106 至約108 、或約105 至約107 個細胞/kg個體體重中任一的劑量施用。在一些實施方式中，該藥物組成物以至少約任何1 × 105 、2 × 105 、3 × 105 、4 × 105 、5 × 105 、6 × 105 、7 × 105 、8 × 105 、9 × 105 、1 × 106 、2 × 106 、3 × 106 、4 × 106 、5 × 106 、6 × 106 、7 × 106 、8 × 106 、9 × 106 、1 × 107 個細胞/kg或更多的劑量施用。
在一些實施方式中，施用一次藥物組成物。在一些實施方式中，施用多次（例如2、3、4、5、6、或更多次中的任一）藥物組成物。在一些實施方式中，每週施用一次至每年施用一次藥物組成物。在一些實施方式中，施用的間隔為約1週至1年。可以由醫藥領域技術人員藉由監測患者的疾病體征並且相應地調整治療，容易地確定用於具體患者的最佳劑量及治療方案。
而且，可以藉由一次或多次施用或藉由連續輸注來施用劑量。在一些實施方式中，以分次劑量施用藥物組成物，例如約2、3、4、5、或更多次劑量中任一個。在一些實施方式中，在約一週內施用分次劑量。在一些實施方式中，均分劑量。在一些實施方式中，分次劑量為總劑量的約20%、約30%和約50%。在一些實施方式中，連續分次劑量之間的間隔為約1天、2天、3天或更長。對於幾天或更長的重複施用，取決於病症，持續進行治療直至出現疾病症狀的所希望的遏制。然而，其他劑量方案可能是有用的。藉由常規技術和測定容易監測該療法的進展。
在一些實施方式中，藥物組成物的量可有效引起個體的客觀臨床反應。在一些實施方式中，藥物組成物的量可有效引起個體的疾病緩解（部分或完全）。在一些實施方式中，藥物組成物的量可有效預防個體癌症的復發或疾病進展。在一些實施方式中，藥物組成物的量可有效延長個體的存活期（例如無病存活期）。在一些實施方式中，藥物組成物可有效地改善個體的生活品質。
在一些實施方式中，藥物組成物的量可有效抑制實性瘤或淋巴瘤的生長或減小其尺寸。在一些實施方式中，實性瘤或淋巴瘤的尺寸減小至少約10%（包括例如至少約20%、30%、40%、60%、70%、80%、90%、或100%中任一）。在一些實施方式中，提供了抑制個體的實性瘤或淋巴瘤生長或減小其尺寸之方法。
在一些實施方式中，藥物組成物的量可有效抑制個體的腫瘤轉移。在一些實施方式中，抑制至少約10%（包括例如至少約20%、30%、40%、60%、70%、80%、90%、或100%中任一）轉移。在一些實施方式中，提供了抑制轉移至淋巴結之方法。在一些實施方式中，提供了抑制轉移至肺之方法。在一些實施方式中，提供了抑制轉移至肝之方法。轉移可以藉由本領域中任何已知之方法來評估，例如藉由血液測試、骨掃描、X射線掃描、CT掃描、PET掃描和生檢。 實例 以下實例僅是本發明之示例，因此不應視為以任何方式限制本發明。以下實例和詳細描述係作為說明而並不是作為限制而提供的。實例 1
動物免疫和滴定
1.1 動物免疫
使用重組人磷脂醯肌醇蛋白聚糖2蛋白（R&D Systems，#2304-GP）作為免疫原對兩隻駱駝進行免疫。對動物頸部皮下免疫六次。在初次免疫期間，將完全弗氏佐劑（SIGMA，#F5881）與200 μg/劑量免疫原組合使用。將不完全弗氏佐劑（SIGMA，#F5506）和200 μg/劑量免疫原用於加強免疫。以1至2週的間隔對動物進行免疫。一隻動物還在第4次和第5次免疫時接受了兩次轉基因HEK293T/hGPC2細胞（1 × 107 ，內部構建，參考實例3）注射，該細胞穩定表現hGPC2。在免疫前階段以及第3次和第5次免疫後收集外周血樣品。使用蛋白G和蛋白A樹脂從血清中分級分離IgG亞類，並藉由基於ELISA和基於細胞的測定驗證抗原特異性體液免疫反應（圖2A-圖2D），顯示出足夠的反應誘發，這與重鏈免疫球蛋白（HCAb）的存在相關。為了確認抗原特異性單域抗體（sdAb）的滴定度，在最後一次免疫後5天收集100 mL血液樣品。分離淋巴細胞和血液血清，並保存在-80°C。
1.2 IgG分級分離
根據GenScript標準操作程序進行IgG亞類分級分離。使用蛋白G和蛋白A樹脂從終末採血血清中分級分離IgG亞類。將1 mL血清樣品載入到1 mL HITRAP®蛋白G HP柱上，並用10 mL磷酸鹽緩衝液（20 mM，pH 7.0）洗滌該柱。用0.15M NaCl、0.58%乙酸（pH 3.5）洗脫IgG3（MW 100,000 Da）級分，並用1M Tris-HCl（pH 9.0）中和洗脫液至pH 7.4。隨後，用0.1 M甘胺酸-HCl（pH 2.7）洗脫IgG1（MW 170,000 Da）級分，並將洗脫液用1M Tris-HCl（pH 8.5）中和至pH 7.4。然後將HITRAP®蛋白G HP柱的流液（flow-through）載入到1 mL HITRAP®蛋白A HP柱上，並用20 mL磷酸鹽緩衝液（20 mM，pH 7.0）洗滌該柱。用0.15 M NaCl、0.58%乙酸（pH 4.5）洗脫IgG2（MW 100,000 Da）級分，並用1M Tris-HCl（pH 9.0）中和洗脫液至pH 7.4。藉由OD280確定純化的IgG1、IgG2和IgG3抗體的濃度，並藉由還原和非還原SDS-PAGE分析評估每種抗體的純度。
1.3 免疫反應測定
藉由ELISA評估駱駝的免疫反應，其中測定血清樣品和純化的IgG與固定化免疫原的結合。評估在免疫前、第3次和第5次免疫後以及終末採血時收集的血清。將抗原在包被緩衝液中稀釋。將微量滴定板在4°C下用稀釋的抗原包被過夜。然後將板用洗滌緩衝液洗滌3次，然後在室溫下封閉2小時。隨後將板用洗滌緩衝液洗滌4次。將一系列稀釋的血清或IgG添加至板中，並在室溫下孵育1.5小時。然後將板用洗滌緩衝液洗滌4次。將HRP軛合的抗美洲駝IgG第二抗體（NOVUS，#NB7242）添加至板中，並在室溫下孵育1小時。洗滌後，將TMB底物添加至每個孔中，並孵育10分鐘，然後用1M HCl停止反應。為了定量結合，使用光譜儀測量每個孔在450 nm處的吸光度。如圖2A和圖2C中所示，來自經免疫動物的免疫後血清比免疫前血清在更高的稀釋度下與重組GPC2蛋白結合，數據表明針對人GPC2具有陽性體液免疫反應。在圖2B和圖2D中，所有示例性抗GPC2 VH H-hIgG1Fc蛋白以劑量依賴性方式與重組GPC2蛋白結合，正如在450 nm處的吸光度與VH H-hIgG1Fc蛋白的濃度正相關。實例 2
VH H噬菌體展示文庫構建
2.1 RNA提取
使用淋巴細胞分離培養基（TBD，#LTS1076）從經免疫駱駝的外周血樣品中分離淋巴細胞。根據製造商的說明書，使用TRIzol®試劑（LIFE technologies，#15596-026）從每個樣品中分離總RNA。藉由凝膠電泳評估總RNA的數量和品質，並藉由測量OD260/280處的吸光度進行定量。
2.2 VH H擴增和噬菌體文庫構建
根據製造商的方案，使用PrimeScriptTM第1股cDNA合成套組（Takara，#6110A），針對每個血液樣品用寡聚(dT)20引物對RNA進行逆轉錄以生成cDNA文庫。使用特異性引物從cDNA文庫擴增編碼VH H的核苷酸序列。根據GenScript標準操作程序擴增VH H片段。使用聚合酶鏈反應（PCR）擴增重鏈免疫球蛋白的可變區。藉由瓊脂糖凝膠電泳分析DNA產物。隨後，VH H PCR片段從瓊脂糖凝膠中消化，並連接到噬菌粒載體中。將具有VH H基因片段的重組質體電轉移到大腸桿菌細胞中。將轉化的細胞稀釋，並鋪板在補充有100 µg/mL胺苄青黴素的2*YT板上。成功轉染的大腸桿菌帶有胺苄青黴素抗性基因，可使其在YT板上形成菌落。計算菌落數以估計展示文庫的大小。隨機選取單個殖株並定序以檢查文庫的品質。為了產生用於質體分離的細胞，將轉染的大腸桿菌細胞鋪板在補充有100 µg/mL胺苄青黴素和2%葡萄糖的YT板上。刮下菌落，在-80°C下將轉染的細胞的等分試樣儲存在甘油中，作為文庫質體分離的儲備液。實例 3
噬菌體展示淘選
3.1 淘選
使文庫儲備液生長至對數期，然後對文庫進行挽救並用PEG/NaCl沈澱，重懸於PBS中，並在-80°C下儲存。將構建的VH H噬菌體文庫針對重組人GPC2蛋白（R&D，#2304-GP）或HEK293T/hGPC2細胞系（內部參考實例3構建）進行淘選以獲得具有反選擇的人GPC1/GPC3（R&D，#4519-GP；R&D，#2119-GP）蛋白或HEK293T空白血球（ATCC，#CRL-1573）的輸出噬菌體。分析每個輸出的富集因子（相對於對照，洗脫液中存在的噬菌體#）、GPC2蛋白和細胞陽性殖株的多樣性和百分比（藉由ELISA & FACS）。
基於該等參數，將最佳輸出作為池亞選殖到可溶表現載體中用於高通量篩選。挑取菌落並在96深孔板（1 mL體積）中生長，並藉由添加IPTG（AMRESCO，#0487-100G）和0.05% Triton誘導上清液中單域抗體（sdAb）的表現。分析上清液與GPC2蛋白結合的能力（藉由ELISA），對陽性結合物進行定序，並選擇獨特的殖株進行進一步表徵。
3.2 噬菌體ELISA
進行噬菌體ELISA以鑒定對靶抗原具有特異性的殖株。使單個輸出噬菌體殖株在96深孔板中生長，並藉由M13K07輔助噬菌體（NEB，# N0315S）挽救過夜。為了鑒定與抗原蛋白結合的殖株，將96孔ELISA微量滴定板分別用重組人GPC2蛋白或對照蛋白（GPC1/GPC3）在包被緩衝液中於4°C包被過夜，然後將板用封閉緩衝液封閉。封閉後，將來自過夜細胞培養物的每孔大約50 μL噬菌體上清液添加到板中，在4°C下孵育1.5小時。將板洗滌四次，並將HRP軛合的抗M13單株抗體添加至板中，在4°C下孵育45分鐘。將板再次洗滌五次，並將底物溶液添加至孔中用於顯色。測量每個孔在450 nm處的吸收。淘選後，隨機選擇ELISA陽性噬菌體殖株，並使用質體提取套組（kit）從輸出噬菌體製備DNA。
3.3 噬菌體FACS
識別與表現GPC2的細胞結合的殖株。藉由用包含人GPC2（NM_152742.3）、食蟹獼猴（Macaca fascicularis）GPC2（NW_005092963.1）或馬來大狐蝠（Pteropus vampyrus）GPC2 ORF（NW_011888974.1）序列的plvx-EF1α-puro質體轉染HEK293 T細胞（ATCC，#CRL-1573）來製備穩定表現人GPC2、食蟹獼猴GPC2、馬來大狐蝠 GPC2的HEK293T殖株。將噬菌體上清液添加到表現GPC2的HEK293T穩定細胞和SH-SY5Y腫瘤細胞（ATCC，#CRL-2266）中，藉由M13噬菌體抗體（Sino biological，#11973-MM05T-H）檢測結合在細胞表面的殘留噬菌體。藉由流動式細胞測量術分析細胞。
表1示出了根據本揭露之一些實施方式的駱駝VH H中的CDR1、CDR2和CDR3。 [表1]
抗體 ID CDR1序列 ID CDR2序列 ID CDR3序列
AS70549 1 RYTGRSSC 31 IYSDDGVT 62 ATRTTYPGVCPDNAAWYDY
AS70771 2 GYTGK 32 IDDAGGT 63 AADTFRWFMRRSGPINGSDYAY
AS70950 3 EFTYKNTC 33 IDSDGNT 64 AAGAYCGRLLLWIGNYAY
AS71402 4 GYTYNRN 34 MYTGSGTT 65 AADTARRGGSWSGPFKYDY
AS71529 5 EYRYSSRYC 35 IDSNGSA 66 AADHLAYDCYSGATSVFRY
AS71661 6 GTTFAHYNM 36 ISKYGGTT 67 AIGVLPSSTAICAGAANY
AS72021 7 RNTYSSYC 37 IDNVKT 68 AAHLELCYYTDPMYQYEYNY
AS72052 8 GFRYASYC 38 IHSDGII 69 AAGAYCGADAILTLYDYAF
AS72383 9 GLTFDDSG 39 ITWNGRST 70 AAAFITKTGCSYE
AS72479 10 ETTDCRYV 40 ITSGGST 71 ESDPGWSGYHARRC
AS72499 11 RFTYSSYC 41 IEKDDST 72 AARIPGGNCGVVARMAY
AS72531 12 GLTFAHYNM 42 ISKYGGT 73 AIGVLSSTARGPGAANY
AS72669 11 RFTYSSYC 43 FYTGGGRT 74 VAGFYCSGGYWEGDFGY
AS72794 13 GFTFDDYA 44 ISASGTTT 75 AADRFRDYCSDSWSHLYNYEYMH
AS72805 14 RLRVSNNC 45 LGSDGRT 76 AAADFSSGGYCNIASVYHSYFPY
AS72806 15 GYTYMPPC 46 IYGRGGST 77 AADNLCYATGILRSAYDYSY
AS72835 16 GGYTSRTVC 47 IYRSGTT 78 AASPGYSDAACVSVPQANR
AS77906 17 GVVKCDVE 48 IEAGGHT 79 VAAPRYYTLSCPKDF
AS77916 18 GYTSSWNC 49 IANRGHST 80 ATDTWACVGISTDFEY
AS77932 19 GYWYSVAW 50 VLNGGGRR 81 AAGNGVGHPLGPSEYNY
AS77934 20 GYTYSSYS 51 FFYSGGPT 82 AARRSNTNDYCFYPTYTY
AS77978 21 GATSCRWR 52 IANGAT 83 AADPRVYTSRCDRTY
AS77986 22 ASGYTYSSDS 53 ISTGGRST 84 AADGPSMTAIQALGDLYPVDFAW
AS78117 23 RYTYATYS 54 LDSVGAT 85 VVDPASAKVTYGSWSTPSYAY
AS78215 24 RYTFSSNC 55 IASASGYT 86 AARAGPCWSWAQADLYNY
AS78810 25 GYTYYD 56 ISSSSST 87 AAGRYVGRKLEVYDYAY
AS79101 26 GDTYSNYC 57 IDSDGSR 88 ATDPKVACARVVEYGGGWYR
AS79236 27 GYTYSSYC 58 IDAGGRT 89 AVDVRTRCGGTWDGEAVYFPY
AS79274 28 KYAFCTYD 59 IDSRGNT 90 AAQIVGGALRCPRFAMY
AS79285 29 RYTVSNYC 60 ISTDGTT 91 AGVYGLIWYYKPCPAQREWALQRYGY
AS79317 30 GYSSSSVC 61 IYVTLGSI 92 AAGGCGYRGVADVPEFTY
AS70950VH6 3 EFTYKNTC 33 IDSDGNT 64 AAGAYCGRLLLWIGNYAY
AS70950VH7 3 EFTYKNTC 33 IDSDGNT 64 AAGAYCGRLLLWIGNYAY
AS71529VH5 5 EYRYSSRYC 35 IDSNGSA 66 AADHLAYDCYSGATSVFRY
AS71529VH6 5 EYRYSSRYC 35 IDSNGSA 66 AADHLAYDCYSGATSVFRY
AS72052VH5 8 GFRYASYC 38 IHSDGII 69 AAGAYCGADAILTLYDYAF
AS72052VH6 8 GFRYASYC 38 IHSDGII 69 AAGAYCGADAILTLYDYAF
AS72669VH6 11 RFTYSSYC 43 FYTGGGRT 74 VAGFYCSGGYWEGDFGY
AS78117VH4 23 RYTYATYS 54 LDSVGAT 85 VVDPASAKVTYGSWSTPSYAY
AS78117VH5 23 RYTYATYS 54 LDSVGAT 85 VVDPASAKVTYGSWSTPSYAY
AS78117VH6 23 RYTYATYS 54 LDSVGAT 85 VVDPASAKVTYGSWSTPSYAY
AS78117VH7 23 RYTYATYS 54 LDSVGAT 85 VVDPASAKVTYGSWSTPSYAY
AS79236VH4 27 GYTYSSYC 58 IDAGGRT 89 AVDVRTRCGGTWDGEAVYFPY
AS79236VH5 27 GYTYSSYC 58 IDAGGRT 89 AVDVRTRCGGTWDGEAVYFPY
AS79236VH6 27 GYTYSSYC 58 IDAGGRT 89 AVDVRTRCGGTWDGEAVYFPY
AS77916VH6 18 GYTSSWNC 49 IANRGHST 80 ATDTWACVGISTDFEY
AS77916VH7 18 GYTSSWNC 49 IANRGHST 80 ATDTWACVGISTDFEY
AS77916VH8 18 GYTSSWNC 49 IANRGHST 80 ATDTWACVGISTDFEY
AS77916VH9 18 GYTSSWNC 49 IANRGHST 80 ATDTWACVGISTDFEY
AS77916VH10 18 GYTSSWNC 49 IANRGHST 80 ATDTWACVGISTDFEY
根據本揭露之一些實施方式，駱駝VH H胺基酸序列可以包括AS70549（SEQ ID NO: 93）、AS70771（SEQ ID NO: 94）、AS70950（SEQ ID NO: 95）、AS71402（SEQ ID NO: 96）、AS71529（SEQ ID NO: 97）、AS71661（SEQ ID NO: 98）、AS72021（SEQ ID NO: 99）、AS72052（SEQ ID NO: 100）、AS72383（SEQ ID NO: 101）、AS72479（SEQ ID NO: 102）、AS72499（SEQ ID NO: 103）、AS72531（SEQ ID NO: 104）、AS72669（SEQ ID NO: 105）、AS72794（SEQ ID NO: 106）、AS72805（SEQ ID NO: 107）、AS72806（SEQ ID NO: 108）、AS72835（SEQ ID NO: 109）、AS77906（SEQ ID NO: 110）、AS77916（SEQ ID NO: 111）、AS77932（SEQ ID NO: 112）、AS77934（SEQ ID NO: 113）、AS77978（SEQ ID NO: 114）、AS77986（SEQ ID NO: 115）、AS78117（SEQ ID NO: 116）、AS78215（SEQ ID NO: 117）、AS78810（SEQ ID NO: 118）、AS79101（SEQ ID NO: 119）、AS79236（SEQ ID NO: 120）、AS79274（SEQ ID NO: 121）、AS79285（SEQ ID NO: 122）和AS79317（SEQ ID NO: 123）。
駱駝VH H核酸序列可以包括AS70549（SEQ ID NO: 148）、AS70771（SEQ ID NO: 149）、AS70950（SEQ ID NO: 150）、AS71402（SEQ ID NO: 151）、AS71529（SEQ ID NO: 152）、AS71661（SEQ ID NO: 153）、AS72021（SEQ ID NO: 154）、AS72052（SEQ ID NO: 155）、AS72383（SEQ ID NO: 156）、AS72479（SEQ ID NO: 157）、AS72499（SEQ ID NO: 158）、AS72531（SEQ ID NO: 159）、AS72669（SEQ ID NO: 160）、AS72794（SEQ ID NO: 161）、AS72805（SEQ ID NO: 162）、AS72806（SEQ ID NO: 163）、AS72835（SEQ ID NO:164）、AS77906（SEQ ID NO: 165）、AS77916（SEQ ID NO: 166）、AS77932（SEQ ID NO: 167）、AS77934（SEQ ID NO: 168）、AS77978（SEQ ID NO: 169）、AS77986（SEQ ID NO: 170）、AS78117（SEQ ID NO: 171）、AS78215（SEQ ID NO: 172）、AS78810（SEQ ID NO: 173）、AS79101（SEQ ID NO: 174）、AS79236（SEQ ID NO: 175）、AS79274（SEQ ID NO: 176）、AS79285（SEQ ID NO: 177）和AS79317（SEQ ID NO: 178）。實例 4
人源化和親和力測定
使用NCBI Ig-Blast（ncbi.nlm.nih.gov/projects/igblast/）在人種系數據庫中搜索親本抗體的可變域序列，以找到人受體（即與親本抗體具有高度同源性的人可變域）。人受體的CDR用其駱駝對應物代替，對抗原結合或抗體支架形成可能至關重要的殘基保持不變，從而產生一組人源化變體，在其名稱中用「VH」指示。
將親本和人源化變體的DNA序列選殖到pcDNA3.4載體中，然後將質體轉染到HEK293-6E細胞中，收集上清液，並使用Biacore T200藉由表面電漿共振（SPR）測試親和力等級。
根據本揭露之一些實施方式，人源化VH H胺基酸序列可以包括AS70950VH6（SEQ ID NO: 124）、AS70950VH7（SEQ ID NO: 125）、AS71529VH5（SEQ ID NO: 126）、AS71529VH6（SEQ ID NO: 127）、AS72052VH5（SEQ ID NO: 128）、AS72052VH6（SEQ ID NO: 129）、AS72669VH6（SEQ ID NO: 130）、AS78117VH4（SEQ ID NO: 131）、AS78117VH5（SEQ ID NO: 132）、AS78117VH6（SEQ ID NO: 133）、AS78117VH7（SEQ ID NO: 134）、AS79236VH4（SEQ ID NO: 135）、AS79236VH5（SEQ ID NO: 136）、AS79236VH6（SEQ ID NO: 137）、AS77916VH6（SEQ ID NO: 138）、AS77916VH7（SEQ ID NO: 139）、AS77916VH8（SEQ ID NO: 140）、AS77916VH9（SEQ ID NO: 141）、AS77916VH10（SEQ ID NO: 142）、AS71529VH5-AS72052VH5（SEQ ID NO: 143）、AS72052VH5-AS71529VH5（SEQ ID NO: 144）、AS70950VH6-AS71529VH6（SEQ ID NO: 145）、AS71529VH6-AS70950VH6（SEQ ID NO: 146）和AS70950VH6-AS70950VH6（SEQ ID NO: 147）。實例 5
抗GPC2 VH H的親和力和特異性
5.1 表面電漿共振（SPR）測定
將每個示例性抗GPC2 VH H序列選殖到包含人IgG1Fc片段（hlgG1Fc）序列的載體中，以促進抗GPC2 VH H-hlgG1Fc的重組表現。獲得重組蛋白並純化用於SPR測定。使用BIACORE® T200分析系統（GE Healthcare）藉由SPR確定每種抗GPC2 VH H-hIgG1Fc對GPC2的親和力。簡而言之，使用胺偶聯套組將重組人GPC2-His蛋白共價偶聯至一個或多個CM5感測器晶片。將示例性VH H-hIgG1Fc蛋白在運行緩衝液（10 mM HEPES、150 mM NaCl、3 mM EDTA、0.05% Tween-20，pH 7.4）中連續稀釋，並以100 μL/min的流速注射到晶片細胞中持續100秒，然後僅注射緩衝液持續300秒，以使抗體解離。使用BIACORE® T200評估軟體3.0版本（Langmuir結合，局部擬合，1 : 1結合模型）確定解離速率常數（KD）。六個VH H-hlgG1Fc的結合親和力示於表1中。
[表1]. 抗GPC2 VH H-hIgG1Fc與重組人GPC2-his蛋白的結合親和力
結合物 ka （ 1/Ms ） kd （ 1/s ） KD （ M ）
AS78117VH4-hIgG1Fc 2.0E+05 1.7E-04 8.2E-10
AS79236VH6-hIgG1Fc 5.3E+05 1.9E-04 3.7E-10
AS70950VH6-hIgG1Fc 3.90E+05 1.10E-04 2.70E-10
AS71529VH6-hIgG1Fc 8.50E+05 4.40E-03 5.10E-09
AS71529VH6-AS70950VH6-hIgG1Fc 3.20E+05 6.10E-05 1.90E-10
AS72669VH6-hIgG1Fc 5.20E+05 7.70E-05 1.50E-10
5.2 特異性結合測定
為評估人源化抗GPC2 VH H對重組人GPC2蛋白的特異性，進行基於ELISA的結合測定，以確定抗GPC2 VH H的差異靶蛋白結合。簡而言之，將微孔板用2 μg/mL重組人GPC1-His（RD System，目錄號4519-GP）、GPC2-His（RD System，目錄號2304-GP）、GPC3-His（ACRO，目錄號GP3-H5223）、GPC4-Fc（RD System，目錄號9195-GP）、GPC5-His（RD System，目錄號2607-G5/CF）、GPC6-His（RD System，目錄號2845-GP）或重組小鼠GPC2-His（RD System，目錄號2355-GP）蛋白包被。用脫脂乳封閉重組人蛋白包被的板。將連續稀釋的人源化VH H-hIgG1Fc重組抗體添加至板的每個孔中，並在4°C下孵育1.5 h。將樣品進一步用HRP軛合的山羊抗人IgG（H+L）第二抗體（Genescript，目錄號A00166-1）標記，並根據製造商的說明書用3,3′,5,5′-四甲基聯苯胺（TMB）底物產生信號。對於GPC4，而是將VH H-His重組抗體和抗His標籤第二抗體（Genescript，目錄號A00612）添加至GPC4-Fc包被的板中。用酶標儀測量在450 nm處的光密度。
如圖3A-圖3G中所示，所有人源化VH H-hIgG1Fc蛋白（AS78117VH4-hIgG1Fc、AS79236VH6-hIgG1Fc、AS70950VH6-hIgG1Fc和AS71529VH6-hIgG1Fc）均以高親和力與重組人GPC2蛋白結合。相比之下，人IgG1作為陰性對照，未顯示出與GPC家族蛋白結合，表明陽性信號係抗體特異性的。特別地，AS78117VH4-hIgG1Fc、AS79236VH6-hIgG1Fc和AS70950VH6-hIgG1Fc比已報導的D3-GPC2-IgG1顯示出對人GPC2蛋白更好的特異性 [5]，因為它們與其他重組人和鼠GPC家族蛋白沒有交叉反應性。總之，數據表明人源化VH H-hIgG1Fc蛋白可以特異性識別人GPC2蛋白。
5.3 重組VH H-His蛋白與靶細胞的結合
藉由將抗GPC2 VH H序列與N末端的小鼠Ig重鏈訊息肽序列（N' -MGWSWILLFLLSVTAGVHS-C；SEQ ID NO: 179）和C末端的6xHis-標籤（N' -HHHHHH-C'；SEQ ID NO: 180）融合來構建重組抗GPC2 VH H-His蛋白。進一步優化密碼子用於在哺乳動物工程化免疫效應細胞中實現最佳表現。然後將獲得的核苷酸序列選殖到哺乳動物表現載體pCDNA3.4中以提供表現質體。
使用流動式細胞測量術來確定人源化VH H蛋白AS70950VH6、AS71529VH6、AS72669VH6和AS71529VH6-AS70950VH6抗GPC2 VH H-HIS蛋白與表現人GPC2的細胞（SH-SY5Y和HEK293T/hGPC2）和表現食蟹獼猴GPC2的細胞（HEK293T/cynoGPC2）的結合親和力。簡而言之，將連續稀釋的抗GPC2 VH H-HIS蛋白與2 × 105 個靶細胞在4°C下孵育30分鐘。洗滌後，在4°C下，將細胞進一步用THE™ His標籤抗體（iFluor 647）（Genescript，#A01802）標記30分鐘。藉由流動式細胞測量術測量螢光強度。使用用於Windows 6.02版本的GraphPad Prism將四參數可變斜率曲線擬合到每個組。如圖4A-圖4C中所示，示例性的AS70950VH6、AS71529VH6、AS72669VH6和AS71529VH6-AS70950VH6以劑量依賴性方式與SH-SY5Y、HEK293T/hGPC2和HEK293T/cynoGPC2特異性結合。實例 6
單價GPC2特異性CAR T細胞的產生
6.1 CAR的產生
包含分離的抗GPC2 VH H抗體片段的基於VH H的單價CAR可以藉由將框內的編碼VH H的核酸序列選殖到CD8α鉸鏈的鉸鏈域和融合至4-1BB和CD3ζ胞內信號傳導域的跨膜域來構建（圖5）。將核酸序列選殖到帶有EF1α啟動子的慢病毒載體骨架中。
根據本揭露之一些實施方式，CAR的組分可以包括以下各項：
SEQ ID NO: CAR的組分 序列
181 連接子 GGGGSGGGGSGGGGS
182 CD8α訊息肽 MALPVTALLLPLALLLHAARP
183 CD8α鉸鏈 TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD
184 CD8α跨膜域 IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC
253 CD28跨膜域 FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV
254 CD27跨膜域 ILVIFSGMFLVFTLAGALFLH
255 ICOS跨膜域 FWLPIGCAAFVVVCILGCILI
256 CD2跨膜域 IYLIIGICGGGSLLMVFVALLVFYIT
257 OX40跨膜域 VAAILGLGLVLGLLGPLAILL
185 4-1BB胞內域 KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL
186 CD28胞內域 RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS
258 CD27胞內域 QRRKYRSNKGESPVEPAEPCHYSCPREEEGSTIPIQEDYRKPEPACSP
259 ICOS胞內域 CWLTKKKYSSSVHDPNGEYMFMRAVNTAKKSRLTDVTL
260 CD2胞內域 KRKKQRSRRNDEELETRAHRVATEERGRKPHQIPASTPQNPATSQHPPPPP GHRSQAPSHRPPPPGHRVQHQPQKRPPAPSGTQVHQQKGPPLPRPRVQP KPPHGAAENSLSPSSN
261 OX40胞內域 ALYLLRRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKI
187 CD3ζ胞內域 RVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKP RRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATK DTYDALHMQALPPR
188 P2A元件 GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP
根據本揭露之一些實施方式，包含駱駝VH H序列的基於VH H的示例性單價CAR可以包括CAS70549-BBz（SEQ ID NO: 189）、CAS70771-BBz（SEQ ID NO: 190）、CAS70950-BBz（SEQ ID NO: 191）、CAS71402-BBz（SEQ ID NO: 192）、CAS71529-BBz（SEQ ID NO: 193）、CAS71661-BBz（SEQ ID NO: 194）、CAS72021-BBz（SEQ ID NO: 195）、CAS72052-BBz（SEQ ID NO: 196）、CAS72383-BBz（SEQ ID NO: 197）、CAS72479-BBz（SEQ ID NO: 198）、CAS72499-BBz（SEQ ID NO: 199）、CAS72531-BBz（SEQ ID NO: 200）、CAS72669-BBz（SEQ ID NO: 201）、CAS72794-BBz（SEQ ID NO: 202）、CAS72805-BBz（SEQ ID NO: 203）、CAS72806-BBz（SEQ ID NO: 204）、CAS72835-BBz（SEQ ID NO: 205）、CAS77906-BBz（SEQ ID NO: 206）、CAS77916-BBz（SEQ ID NO: 207）、CAS77932-BBz（SEQ ID NO: 208）、CAS77934-BBz（SEQ ID NO: 209）、CAS77978-BBz（SEQ ID NO: 210）、CAS77986-BBz（SEQ ID NO: 211）、CAS78117-BBz（SEQ ID NO: 212）、CAS78215-BBz（SEQ ID NO: 213）、CAS78810-BBz（SEQ ID NO: 214）、CAS79101-BBz（SEQ ID NO: 215）、CAS79236-BBz（SEQ ID NO: 216）、CAS79274-BBz（SEQ ID NO: 217）、CAS79285-BBz（SEQ ID NO: 218）和CAS79317-BBz（SEQ ID NO: 219）。根據本揭露之一些實施方式，包含駱駝VH H序列的基於VH H的示例性單價CAR可以包括CAS70549-BBz（SEQ ID NO: 189）、CAS70771-BBz（SEQ ID NO: 190）、CAS70950-BBz（SEQ ID NO: 191）、CAS71402-BBz（SEQ ID NO: 192）、CAS71529-BBz（SEQ ID NO: 193）、CAS71661-BBz（SEQ ID NO: 194）、CAS72021-BBz（SEQ ID NO: 195）、CAS72052-BBz（SEQ ID NO: 196）、CAS72383-BBz（SEQ ID NO: 197）、CAS72479-BBz（SEQ ID NO: 198）、CAS72499-BBz（SEQ ID NO: 199）、CAS72531-BBz（SEQ ID NO: 200）、CAS72669-BBz（SEQ ID NO: 201）、CAS72794-BBz（SEQ ID NO: 202）、CAS72805-BBz（SEQ ID NO: 203）、CAS72806-BBz（SEQ ID NO: 204）、CAS72835-BBz（SEQ ID NO: 205）、CAS77906-BBz（SEQ ID NO: 206）、CAS77916-BBz（SEQ ID NO: 207）、CAS77932-BBz（SEQ ID NO: 208）、CAS77934-BBz（SEQ ID NO: 209）、CAS77978-BBz（SEQ ID NO: 210）、CAS77986-BBz（SEQ ID NO: 211）、CAS78117-BBz（SEQ ID NO: 212）、CAS78215-BBz（SEQ ID NO: 213）、CAS78810-BBz（SEQ ID NO: 214）、CAS79101-BBz（SEQ ID NO: 215）、CAS79236-BBz（SEQ ID NO: 216）、CAS79274-BBz（SEQ ID NO: 217）、CAS79285-BBz（SEQ ID NO: 218）和CAS79317-BBz（SEQ ID NO: 219）。
根據本揭露之一些實施方式，包含人源化駱駝VH H序列的基於VH H的示例性單價CAR可以包括CAS70950VH6-BBz、CAS70950VH7-BBz、CAS71529VH5-BBz、CAS71529VH6-BBz、CAS72052VH5-BBz、CAS72052VH6-BBz、CAS72669VH6-BBz、CAS78117VH4-BBz、CAS78117VH5-BBz、CAS78117VH6-BBz、CAS78117VH7-BBz、CAS79236VH4-BBz、CAS79236VH5-BBz、CAS79236VH6-BBz、CAS77916VH6-BBz、CAS77916VH7-BBz、CAS77916VH8-BBz、CAS77916VH9-BBz、CAS77916VH10-BBz、GPC2-CD28z、GPC2-CD27z、GPC2-ICOSz、GPC2-CD2z和GPC2-OX40z。
6.2 慢病毒產生、T細胞轉導和擴增
為產生病毒上清液，按照製造商的方案，以預先優化的比例用聚醚醯亞胺（PEI）將HEK-293T細胞用GPC2-CAR慢病毒載體psPAX2（Addgene#12260）和pMD2.G（Addgene#12259）共轉染。轉染後收集上清液過夜。將含病毒的上清液通過0.45 µm PES過濾器過濾，然後超速離心以濃縮慢病毒。將病毒等分試樣在-80°C下儲存。
人PBMC購自HemaCare Corporation，並使用Miltenyi人PanT細胞分離套組（Miltenyi，#130096535）分離原代人T細胞。使用Miltenyi抗CD3/CD28微珠（Miltenyi，#130091441）以2 : 1的細胞與珠的比率活化純化的T細胞（包含＞ 98% CD3+細胞）並擴增24-48小時，並以0.5 × 106 個細胞/mL懸浮在補充300 U/mL IL-2的生長培養基中。然後在8 μg/mL聚凝胺存在下，藉由在1000 g、32°C下離心1.5 h，用慢病毒原液轉導預活化的T細胞。然後將轉導的細胞轉移至細胞培養箱中以在合適的條件下進行轉基因表現。每隔一天對細胞計數，並每2-3天供應新鮮的生長培養基。
6.3 體外細胞毒性測定
在8 mg/mL聚凝胺和300 IU/mL IL-2存在下，用慢病毒原液轉導預活化的T細胞。將T細胞和慢病毒在1000 g、32°C下離心1 h，並放入濕潤的細胞培養箱中以在合適的條件下進行轉基因表現。在轉導後第5天或第7天或第10天，收穫轉導的T細胞，並在效應子（CAR T）與靶細胞比率為10 : 1或5 : 1或2 : 1或1 : 1或0.2 : 1下與腫瘤細胞共孵育20小時。靶細胞係人神經母細胞瘤細胞系SH-SY5Y（ATCC，#CRL-2266）、人神經母細胞瘤細胞系IMR-32細胞（ATCC，#CCL-127）、或人表皮樣癌細胞系A-431（ATCC，#CRL-1555）。為測定CAR T細胞對腫瘤細胞的細胞毒性，根據製造商的方案製備細胞毒性檢測套組（LDH）（Roche，#11644793001）測定試劑。將反應混合物添加到每個樣品的無細胞上清液中，以檢測從細胞釋放的LDH。藉由PHERStar酶標儀測量在OD492 nm和OD650 nm處的光密度。從總LDH量中減去在沒有效應細胞的情況下從靶細胞釋放的基線LDH和在沒有靶細胞的情況下從效應細胞釋放的基線LDH。在細胞毒性測定開始時，在不存在效應細胞的情況下藉由向靶細胞中添加終濃度為1%的Triton-X100來獲得靶標最大釋放。在沒有效應細胞的情況下，來自靶細胞的上清液用於獲得靶標最小釋放。藉由以下公式計算特異性細胞毒性：%靶細胞裂解 = 100*[(OD CAR T細胞+靶細胞)-(OD CAR T細胞)-(OD靶細胞) + (OD緩衝液背景)]/(OD靶標最大釋放-OD靶標最小釋放)。
選擇示例性的靶向GPC2的單價CAR T細胞，並在細胞毒性測定中進行測試。如圖6A中所示，測試第一組單價GPC2 CAR T細胞。CAS70950-BBz、CAS71402-BBz、CAS71529-BBz、CAS71661-BBz、CAS72021-BBz、CAS72052-BBz、CAS72383-BBz、CAS72479-BBz、CAS72499-BBz、CAS72531-BBz、CAS72669-BBz、CAS72805-BBz、CAS72835-BBz、CAS72794-BBz、CAS72806-BBz、CAS70549-BBz和CAS70771-BBz的CAR T細胞表現出針對神經母細胞瘤細胞系SH-SY5Y細胞的不同水平的細胞毒性和細胞介素釋放，其中超過50%的基於VH H的單價CAR T細胞顯示出針對SH-SY5Y的 ＞ 50%的細胞毒性。在顯示出針對SH-SY5Y超過50%細胞毒性且表現出相似細胞毒性的十一種示例性構建體（CAS70950-BBz、CAS71402-BBz、CAS71529-BBz、CAS71661-BBz、CAS72021-BBz、CAS72052-BBz、CAS72479-BBz、CAS72531-BBz、CAS72669-BBz、CAS72805-BBz和CAS70549-BBz）CAR T細胞中，選擇四種構建體（CAS70950-BBz、CAS71529-BBz、CAS72052-BBz和CAS72669-BBz）作為樣品用於進一步測試。
測試第二組單價GPC2 CAR T細胞，並與從第一組選擇的三種構建體（CAS70950-BBz、CAS72052-BBz和CAS72669-BBz）比較其針對SH-SY5Y的細胞毒性。如圖6C中所示，測試了CAS77906-BBz、CAS77916-BBz、CAS77932-BBz、CAS77934-BBz、CAS77978-BBz、CAS77986-BBz、CAS78117-BBz、CAS78215-BBz、CAS78810-BBz、CAS79101-BBz、CAS79236-BBz、CAS79274-BBz、CAS79285-BBz、CAS79317-BBz的CAR T細胞，和來自先前研究的顯示了有效抗腫瘤功效的三種CAR T細胞構建體。CAR T細胞表現出針對神經母細胞瘤細胞系SH-SY5Y細胞的不同水平的細胞毒性和細胞介素釋放，其中超過50%的基於VH H的單價CAR T細胞顯示出針對SH-SY5Y的超過50%的細胞毒性。選擇顯示出更好細胞毒性的並等同於CAS70950-BBz、CAS72052-BBz和CAS72669-BBz CAR T細胞的七種示例性構建體（CAS77916-BBz、CAS78117-BBz、CAS77932-BBz、CAS77986-BBz、CAS78810-BBz、CAS79101-BBz和CAS79236-BBz）CAR T細胞中的兩種（CAS78117-BBz和CAS79236-BBz）作為樣品用於進一步測試。
在首次人源化嘗試中，評估了一組示例性人源化單價GPC2 CAR T細胞之體外細胞毒性。如圖7A和圖7B中所示，將人源化構建體CAS70950VH6-BBz、CAS70950VH7-BBz、CAS71529VH5-BBz、CAS71529VH6-BBz、CAS72052VH5-BBz、CAS72052VH6-BBz和CAS72669VH6-BBz CAR T細胞與其親本構建體CAS70950-BBz、CAS72052-BBz和CAS72669-BBz CAR T細胞進行比較。CAR T細胞表現出針對神經母細胞瘤細胞系SH-SY5Y細胞的不同水平的細胞毒性和細胞介素釋放，其中超過70%的基於VH H的單價CAR T細胞顯示出針對SH-SY5Y的超過50%的細胞毒性。在顯示出針對SH-SY5Y超過50%的細胞毒性的六種示例性人源化構建體（CAS70950VH6-BBz、CAS70950VH7-BBz、CAS71529VH6-BBz、CAS72052VH5-BBz、CAS72052VH6-BBz和CAS72669VH6-BBz）CAR T細胞中，選擇三種構建體（CAS70950VH6-BBz、CAS71529VH6-BBz和CAS72669VH6-BBz）作為樣品用於進一步測試。
在第二次人源化嘗試中，評估了示例性人源化單價GPC2 CAR T細胞之體外細胞毒性。如圖7C和圖7D中所示，將CAS77916VH6-BBz、CAS77916VH7-BBz、CAS77916VH8-BBz、CAS77916VH9-BBz、CAS77916VH10-BBz、CAS78117VH4-BBz、CAS78117VH5-BBz、CAS78117VH6-BBz、CAS78117VH7-BBz、CAS79236VH4-BBz、CAS79236VH5-BBz、CAS79236VH6-BBz的人源化單價GPC2 CAR T細胞與其親本構建體CAS79236-BBz、CAS77916-BBz和CAS78117-BBz進行比較。超過50%的基於VH H的單價CAR T細胞顯示出針對SH-SY5Y超過50%的細胞毒性。在顯示出針對SH-SY5Y超過50%的細胞毒性並表現出與其親本構建體CAR T細胞相似的細胞毒性的六種示例性人源化構建體（CAS77916VH10-BBz、CAS78117VH4-BBz、CAS78117VH5-BBz、CAS78117VH6-BBz、CAS78117VH7-BBz、CAS79236VH6-BBz）中，選擇CAS78117VH4-BBz和CAS79236VH6-BBz作為樣品用於進一步測試。
在另一個實施方式中，在體外測定中比較從前兩次人源化中選擇的示例性人源化CAR T細胞構建體。與未轉導的對照T細胞（UnT）相比，藉由CAR T細胞治療，人源化基於VH H的（CAS70950VH6-BBz、CAS72669VH6-BBz、CAS78117VH4-BBz和CAS79236VH6-BBz）CAR T細胞針對多種GPC2陽性神經母細胞瘤細胞系SH-SY5Y（圖7E）和IMR-32（圖7F）表現出有效的細胞毒性，並在IMR-32殺滅方面增加至少7倍，在SH-SY5Y殺滅方面增加12倍。基於VH H的人源化CAR T細胞（CAS70950VH6-BBz、CAS72669VH6-BBz、CAS78117VH4-BBz和CAS79236VH6-BBz）的細胞毒性顯示出相當的針對GPC2陽性腫瘤細胞的細胞毒性水平。
在另一個實施方式中，選擇基於VH H的示例性人源化（CAS70950VH6-BBz、CAS72669VH6-BBz、CAS78117VH4-BBz和CAS79236VH6-BBz）CAR T細胞以研究CAR T細胞是否針對GPC2陰性腫瘤細胞具有非特異性細胞毒性。與UnT對照相似，圖7G顯示在CAS70950VH6-BBz、CAS72669VH6-BBz、CAS78117VH4-BBz和CAS79236VH6-BBz中未觀察到針對GPC2陰性人表皮樣癌細胞系A-431的細胞毒性。該觀察表明，構建體CAS70950VH6-BBz、CAS72669VH6-BBz、CAS78117VH4-BBz和CAS79236VH6-BBz針對GPC2陽性細胞具有靶特異性並且是有效的，而針對GPC2陰性A-431細胞無顯著毒性。
6.4 IFNγ釋放
除以上細胞毒性數據外，還收集了來自體外共培養測定的上清液，以評估CAR T細胞誘導的細胞介素釋放（例如干擾素γ（即IFNγ）的釋放）作為細胞毒性的另一種指標，將其按照製造商的說明書使用HTRF人IFNγ AlphaLISA套組（Perkin Elmer，#62HIFNGPEH）進行定量。如圖6B、圖6D、圖7B、圖7D和圖7H-圖7J中所示，在與GPC2陽性靶細胞SH-SY5Y和IMR-32共培養後，CAR T細胞釋放出高水平的IFNγ。沒有檢測到針對GPC2陰性細胞系A-431的明顯細胞介素釋放。在共培養中未轉導的T細胞（UnT）未誘導IFNγ的釋放。因此，細胞介素釋放數據與體外細胞毒性數據一致，這表明來自選定的CAR T細胞的細胞介素釋放具有GPC-2特異性。實例 7
示例性多價GPC2嵌合抗原受體的製備
如實例6中所述，將編碼藉由肽連接子軛合的多個不同VH H的核酸序列連接到包含CD8α鉸鏈的鉸鏈域和與4-1BB和CD3ζ胞內信號傳導域融合的跨膜域的CAR信號域主鏈載體中。將核酸序列選殖到帶有EF1α啟動子的慢病毒載體骨架中。
使用實例6中所述之方案，將攜帶CAR基因的慢病毒載體如所述進行包裝並滴定。使用Miltenyi人PanT細胞分離套組分離人T細胞，並使用Miltenyi抗CD3/CD28微珠活化。然後在8 µg/mL聚凝胺存在下，藉由在1000 g、32°C下離心1.5 h，用慢病毒原液轉導預活化的T細胞。然後將轉導的細胞轉移至細胞培養箱中以在合適的條件下進行轉基因表現。
根據本揭露之一些實施方式，包含多個不同的人源化VH H序列的基於多價和單價VH H的示例性串聯CAR可以包括CAS71529VH5-AS72052VH5-BBz（SEQ ID NO: 239）、CAS72052VH5-AS71529VH5-BBz（SEQ ID NO: 240）、CAS70950VH6-AS71529VH6-BBz（SEQ ID NO: 241）、CAS71529VH6-AS70950VH6-BBz（SEQ ID NO: 242）和CAS70950VH6-AS70950VH6-BBz（SEQ ID NO: 243）、CAS78117VH4-AS71529VH6-BBz（SEQ ID NO: 246）和CAS71529VH6-AS78117VH4-BBz（SEQ ID NO: 247）。
7.1 體外細胞毒性測定
在轉導後第5天或第8天或第10天，收穫轉導的T細胞，並在效應子（CAR T）與靶細胞比率為10 : 1或1 : 1或0.2 : 1下與腫瘤細胞共孵育20小時。為測定CAR T細胞對腫瘤細胞的細胞毒性，將細胞毒性檢測套組（LDH）（Roche，#11644793001）添加到培養上清液中，並如實例6中所述測量每種CAR T細胞構建體的特異性細胞毒性。
在一個實施方式中，將二價GPC2串聯CAR T細胞（CAS70950VH6-AS71529VH6-BBz、CAS71529VH6-AS70950VH6-BBz、CAS71529VH5-AS72052VH5-BBz、CAS72052VH5-AS71529VH5-BBz）和單價GPC2串聯CAR T細胞（CAS70950VH6-AS70950VH6-BBz）與其親本單價GPC2 CAR T細胞（CAS70950VH6-BBz、CAS71529VH5-BBz、CAS71529VH6-BBz、CAS72052VH5-BBz）針對SH-SY5Y細胞進行比較，其中效應子與靶標比率為10 : 1，持續20小時。如圖8A中所示，表現CAS70950VH6-AS71529VH6-BBz的CAR T細胞對GPC2串聯CAR T細胞的特異性裂解百分比係63.66 ± 8.02%，表現CAS71529VH6-AS70950VH6-BBz的CAR T細胞對GPC2串聯CAR T細胞的特異性裂解百分比係70.33 ± 4.93%，表現CAS70950VH6-AS70950VH6-BBz的CAR T細胞對GPC2串聯CAR T細胞的特異性裂解百分比係59.00 ± 6.08%，表現CAS71529VH5-AS72052VH5-BBz的CAR T細胞對GPC2串聯CAR T細胞的特異性裂解百分比係59.33 ± 4.72%，表現CAS72052VH5-AS71529VH5-BBz的CAR T細胞對GPC2串聯CAR T細胞的特異性裂解百分比係83.00 ± 4.58%，這與其親本單價CAR T細胞（CAS70950VH6-BBz、CAS71529VH5-BBz、CAS71529VH6-BBz和CAS72052VH5-BBz）相似。總之，數據表明二價CAR T細胞針對GPC2陽性細胞具有有效的抗腫瘤活性。
為了研究基於VH H的人源化CAR T細胞的細胞毒性是否具有GPC2靶標特異性，使用基於VH H的單價人源化CAR T細胞（CAS71529VH5-BBz、CAS71529VH6-BBz、CAS72052VH5-BBz、CAS70950VH6-BBz）和基於VH H的人源化二價GPC2 CAR T細胞（CAS70950VH6-AS71529VH6-BBz、CAS71529VH6-AS70950VH6-BBz、CAS71529VH5-AS72052VH5-BBz、CAS72052VH5-AS71529VH5-BBz）與GPC2陽性神經母細胞瘤細胞系（SH-SY5Y和IMR-32）和GPC2陰性表皮樣癌細胞系A-431共培養（效應子與靶標比率為1 : 1）來建立細胞溶解測定。
圖8B顯示單價和二價GPC2 CAR T細胞針對SH-SY5Y細胞和IMR-32細胞的細胞毒性大於40%，除了表現CAS71529VH5-BBz的CAR T針對SH-SY5Y和IMR-32細胞的裂解活性低於30%。單價GPC2 CAR T細胞和二價GPC2 CAR T細胞針對A-431的裂解活性低於10%，在用未轉導T細胞處理的SH-SY5Y、IMR-32和A-431細胞中觀察到最低細胞裂解（圖8B）。總的來說，數據表明，基於VH H的人源化二價和單價CAR T細胞可以以抗原特異性方式識別GPC2陽性腫瘤細胞，並表現出相當的針對GPC2陽性腫瘤細胞的細胞毒性。基於VH H的人源化二價和單價CAR T細胞顯示出針對GPC2陰性細胞的裂解活性最低或無活性。
已經確定了GPC2 CAR T細胞的靶特異性，進行研究以確定GPC2 CAR T細胞是否針對GPC2陽性腫瘤細胞具有劑量依賴性細胞毒性。使用基於VH H的人源化單價GPC2 CAR T細胞（CAS71529VH5-BBz、CAS71529VH6-BBz、CAS72052VH5-BBz、CAS70950VH6-BBz）和基於VH H的人源化二價GPC2 CAR T細胞（CAS70950VH6-AS71529VH6-BBz、CAS71529VH6-AS70950VH6-BBz、CAS71529VH5-AS72052VH5-BBz、CAS72052VH5-AS71529VH5-BBz）與GPC2陽性神經母細胞瘤IMR-32細胞共培養（效應子與靶標比率為0.2 : 1和1 : 1）來建立20小時的細胞溶解測定。如圖8C中所示，在E : T比率為1 : 1下，二價GPC2 CAR T細胞針對IMR-32細胞的裂解活性的範圍為從「49%至66%」，平均為58%，這高於單價GPC2 CAR T細胞的平均活性（37%）。相比之下，當在效應子與靶標比率為0.2 : 1下，當用單價和二價GPC2 CAR T細胞處理時，針對IMR-32細胞的平均細胞毒性小於10%。GPC2 CAR T細胞針對IMR-32的細胞毒性係劑量依賴性的。此外，在用未轉導的T細胞處理的IMR-32細胞中觀察到最低細胞裂解。所有基於VH H的單價和二價GPC2 CAR T細胞均顯示出相似的針對IMR-32的細胞毒性水平（圖8C）。總的來說，當與IMR-32細胞共培養時，二價CAR T細胞（CAS70950VH6-AS71529VH6-BBz、CAS71529VH6-AS70950VH6-BBz、CAS71529VH5-AS72052VH5-BBz、CAS72052VH5-AS71529VH5-BBz）表現出與單價CAR T細胞（CAS71529VH5-BBz、CAS71529VH6-BBz、CAS72052VH5-BBz、CAS70950VH6-BBz）相當的或比其更好的細胞溶解活性。
7.2 IFNγ釋放
如實例6中所述，收集來自體外共培養測定的上清液以評估CAR T細胞誘導的細胞介素釋放，例如干擾素γ（即IFNγ）釋放。如圖8D-圖8F中所示，當與GPC2陽性靶細胞SH-SY5Y和IMR-32共培養時，表現單價GPC2的CAR T細胞（CAS71529VH5-BBz、CAS71529VH6-BBz、CAS72052VH5-BBz、CAS70950VH6-BBz）和二價GPC2 CAR T細胞（CAS70950VH6-AS71529VH6-BBz、CAS71529VH6-AS70950VH6-BBz、CAS71529VH5-AS72052VH5-BBz、CAS72052VH5-AS71529VH5-BBz）均釋放出高水平的IFNγ。在GPC2陰性A-431細胞中未誘導出IFNγ。在共培養中未轉導的T細胞（UnT）未誘導IFNγ的釋放。數據表明，來自所選擇的CAR T細胞的細胞介素釋放具有GPC-2特異性。細胞介素釋放數據與體外細胞毒性數據一致。實例 8
GPC2 CAR T在腫瘤異種移植小鼠中的體內功效
為評估GPC2特異性CAR T細胞的體內抗腫瘤活性，對NCG小鼠（NOD-Prkdc Cd5 I12rg Cd /NjuCrl）皮下注射神經母細胞瘤SH-SY5Y細胞。在腫瘤接種後9天，向植入腫瘤的小鼠靜脈內施用單劑量的未轉導的T細胞（10 × 106 ）或CAR T細胞（5 × 106 ）（圖9A）。CAR T細胞處理後，每3-4天藉由卡尺測量腫瘤的長度（L）和寬度（W）。使用以下公式估算腫瘤體積：V = (W2 × L)/2。治療後十四天，與經未轉導的T細胞治療的組相比，用表現CAS70950VH6-BBz、CAS72669VH6-BBz和CAS70950VH6-AS71529VH6-BBz CAR的T細胞治療的NCG小鼠均顯示出腫瘤負荷降低（圖9A）。CAS70950VH6-BBz、CAS72669VH6-BBz和CAS70950VH6-AS71529VH6-BBz CAR T細胞的腫瘤消退比CAS71529VH6-BBz更明顯。在觀察結束時，100%的經單價CAR T細胞（CAS70950VH6-BBz、CAS72669VH6-BBz）治療的小鼠和80%的經多價CAR T細胞（CAS70950VH6-AS71529VH6-BBz）治療的小鼠仍然存活（圖9A）。在治療後第42天，用表現CAS72669VH6-BBz的CAR T細胞治療的2/5小鼠（40%）腫瘤消失，而用表現CAS70950VH6-AS71529VH6-BBz的CAR T細胞治療的3/5小鼠（60%）腫瘤消失且沒有復發。特別地，CAS70950VH6-BBz、CAS72669VH6-BBz和CAS70950VH6-AS71529VH6-BBz以比所報導的LH7 CAR T的CAR T劑量（每隻小鼠30 × 106 個CAR T細胞）低六倍的劑量下顯示出有效的抗腫瘤活性[4]。該數據突出了基於VH H的CAR T細胞在腫瘤消退和保護小鼠免受疾病進一步發展的困擾方面的優越性。值得注意的是，從接受靶向GPC2的CAR T細胞的NCG小鼠中未觀察到明顯的體重減輕，表明NCG小鼠對5 × 106 個靶向GPC2的CAR T細胞具有良好的耐受性（圖9B）。
此外，體內CAR T細胞的擴增和持久性也被認為係癌症患者持續的臨床腫瘤消退的重要預測指標[8]。為了瞭解所輸注的CAR T細胞的基本動力學，使用流式細胞儀評估NCG小鼠外周血中CAR T細胞的百分比。如圖9C中所示，從治療後第14天開始觀察到NCG小鼠外周血中CAR T細胞的百分比升高。在用5 × 106 個CAS70950VH6-AS71529VH6-BBz CAR T細胞治療的NCG小鼠的外周血中發現CAR T細胞平均為5.00 ± 6.42%，而在表現CAS70950VH6-BBz、CAS72669VH6-BBz和CAS71529VH6-BBz的CAR T組中檢測到CAR T細胞少於1%。在CAS70950VH6-AS71529VH6-BBz組中，CAR T細胞的擴增與腫瘤大小隨時間呈負相關。實例 9
3-(4-胺基-1-側氧基-1,3-二氫-2H -異吲哚-2-基)哌啶-2,6-二酮增強了CAR T細胞針對腫瘤細胞系的功能
3-(4-胺基-1-側氧基-1,3-二氫-2H -異吲哚-2-基)哌啶-2,6-二酮係批准用於治療多發性骨髓瘤（MM）的免疫調節藥物。其式如下：
Figure 02_image001
（化合物A）
已證明，在臨床前模型中，具有式I的分子與抗BCMA CAR T的組合療法改善了CAR T介導的多發性骨髓瘤的清除[9，10]。鑒於化合物A在組合治療中的優勢，在神經母細胞瘤腫瘤細胞共培養模型和異種移植腫瘤模型中進一步探索了化合物A對GPC2 CAR T功能的影響。
為評估化合物A是否對CAR T針對腫瘤細胞的細胞毒性產生影響，使用完全生長培養基將化合物A（CAS編號：191732-72-6，Sigma-Aldrich，St. Louis）儲備液連續稀釋至最終濃度為30、10、3.33、1.11、0.37、0.12和0.04 μM。在化合物A梯度存在下，將CAR T細胞與腫瘤細胞在效應子（CAR T）與靶細胞比率為0.2 : 1下共孵育20小時。將共培養的CAR T細胞和腫瘤細胞但不添加化合物A作為對照。如實例6所述，使用細胞毒性檢測套組（LDH）（Roche，#11644793001）估算CAR T細胞對腫瘤細胞的細胞毒性。圖10示出了單價GPC2 CAR T細胞（CAS70950VH6-BBz）針對SH-SY5Y細胞的細胞毒性未被不同濃度的化合物A損害。
為評估3-(4-胺基-1-側氧基-1,3-二氫-2H -異吲哚-2-基)哌啶-2,6-二酮（化合物A）對CAR T細胞遞迴殺傷潛力、T細胞擴增和存活的影響，採用了體外重複激發測定[11]。在轉導後第11天，將示例性CAS70950VH6-BBz CAR T細胞與SH-SY5Y腫瘤細胞在效應子（CAR T）與靶細胞比率為1 : 2下共培養。在整個研究過程中，向共培養培養基中補充10 μM化合物A。每3天（第1輪、第2輪、第3輪和第4輪）將CAR T細胞用腫瘤細胞再次激發。將共培養的CAR T細胞和腫瘤細胞但不添加化合物A用作對照。藉由流式細胞儀分析CD3+ T細胞的百分比、CD3+ CAR+ T細胞的百分比。如實例6所述，使用HTRF人IFNγ AlphaLISA套組（Perkin Elmer，#62HIFNGPEH）定量共培養上清液中IFNγ之量。在該等實驗條件下，多次SH-SY5Y腫瘤細胞激發導致CAS70950VH6-BBz CAR T細胞的細胞毒性降低，這由總CD3+ T細胞和CD3+ CAR+ T細胞的百分比隨時間減少所示出（圖11A和圖11B）。相比之下，補充有10 μM化合物A的CAS70950VH6-BBz CAR T細胞在重複的腫瘤激發後仍保持其效應子活性並促進CD3+ CAR+ T細胞的存活和擴增（圖11A和圖11B）。與未處理的CAR T細胞相比，3-(4-胺基-1-側氧基-1,3-二氫-2H -異吲哚-2-基)哌啶-2,6-二酮（化合物A）處理還促進了更高量的IFNγ從CAS70950VH6-BBz CAR T細胞釋放。此外，用或不用10 μM化合物A處理的未轉導的T細胞（UnT）對照不能控制腫瘤細胞的生長，並且在第二輪腫瘤細胞激發後T細胞耗盡（圖11A）。數據表明，腫瘤細胞控制係CAR依賴性過程。
為評估化合物A與GPC2特異性CAR T細胞的組合的體內協同抗腫瘤作用，在CAR T輸注前，對NCG小鼠（NOD-Prkdc Cd5 I12rg Cd /NjuCrl）皮下注射神經母細胞瘤SH-SY5Y細胞持續13天。向腫瘤異種移植小鼠靜脈內施用單劑量未轉導的T細胞（6 × 106 個總T細胞/每隻小鼠）或CAR+ T細胞（CAS70950VH6-BBz，1.5 × 106 個CAR+ T細胞/小鼠），並以7.5 mg化合物A/kg體重每天一次腹膜內施用多劑量化合物A，持續21天。CAR T細胞處理後，每3-4天藉由卡尺測量腫瘤的長度（L）和寬度（W）。使用以下公式估算腫瘤體積：V = (W2 × L)/2。
治療後十二天，與經未轉導的T細胞治療的組相比，用CAS70950VH6-BBz CAR T細胞治療的NCG小鼠顯示出腫瘤生長延遲（圖12A）。儘管單獨的化合物A不能實現任何腫瘤抑制，但其與CAR-T細胞的組合卻導致更明顯的腫瘤消退。數據清楚地表明，化合物A顯著增強了CAR T細胞針對SH-SY5Y源神經母細胞瘤腫瘤的抗腫瘤功能。值得注意的是，從接受靶向GPC2的CAR T細胞及其與化合物A的組合的NCG小鼠中未觀察到明顯的體重減輕，表明NCG小鼠對兩種治療均具有良好的耐受性（圖12B）。如圖12C中所示，從治療後第14天開始觀察到NCG小鼠外周血中CAR T細胞的百分比升高。儘管從第14天到第21天持續觀察到CAR T細胞擴增，為約2.80%的CAR + T細胞，但是在治療後第21天，化合物A共施用顯著促進了CAR+ T細胞擴增，擴增了約6倍（16.78%）。值得注意的是，在單獨的CAR T細胞組及其與化合物A的組合的組之間，CAR+ T細胞的百分比與腫瘤生長呈正相關。實例 10
具有不同共刺激域的GPC2 CAR T的體外細胞毒性和CAR T持久性
按照實例6和實例7中所述之實驗程序，測試具有不同共刺激域的GPC2 CAR T針對NBL腫瘤細胞系SH-SY5Y的細胞毒性功效。將示例性GPC2 CAR T GPC2-BBz（GPC2 CAR T包含4-1BB和CD3ζ胞內信號傳導域）用作陽性對照，並與GPC2-CD28z（SEQ ID NO: 248，GPC2 CAR T包含CD28和CD3ζ胞內信號傳導域）、GPC2-CD27z（SEQ ID NO: 249，GPC2 CAR T包含CD27和CD3ζ胞內信號傳導域）、GPC2-CD2z（SEQ ID NO: 251，GPC2 CAR T包含CD2和CD3ζ胞內信號傳導域）、GPC2-ICOSz（SEQ ID NO: 250，GPC2 CAR T包含ICOS和CD3ζ胞內信號傳導域、和GPC2-OX40z（SEQ ID NO: 252，GPC2 CAR T包含OX40和CD3ζ胞內信號傳導域）進行比較。如圖13A中所示，所有測試的GPC2 CAR T均顯示出針對SH-SY5Y的有效細胞毒性。具有不同共刺激域的CAR T顯示出與陽性對照GPC2-BBz CAR T相當的細胞毒性水平。
此外，按照實例6和實例7中所述之實驗程序，對從細胞毒性測定產生的IFNγ的水平進行定量。與陰性對照（UnT）相比，所有測試的GPC2 CAR T細胞均顯示出針對SH-SY5Y的IFNγ產生水平升高（圖13B）。有趣的是，GPC2-CD28z CAR T比GPC2-BBz、GPC2-CD27z、GPC2-CD2z、GPC2-ICOSz和GPC2-OX40z產生的IFNγ水平更高（圖13B）。總之，數據表明，具有不同共刺激域的GPC2 CAR T針對GPC2陽性腫瘤細胞系均可發揮有效的細胞毒性並產生IFNγ。
為評估GPC2 CAR T細胞的持久性，選擇示例性CAR T細胞並在連續激發測定中進行測試。簡而言之，使用不含IL-2的新鮮生長培養基（E : T比率 = 1 : 3），將4 × 105 個SH-SY5Y細胞與用GPC2-BBz、GPC2-CD28z、GPC2-CD27z、GPC2-CD2z、GPC2-ICOSz或GPC2-OX40z慢病毒載體轉導的1.33 × 105 個CAR T細胞在12孔板中共培養。共培養三天後收穫細胞，並使用AOPI採集樣品進行細胞計數並藉由FAC定量T細胞。在不含IL-2的生長培養基中，將CAR T細胞與新鮮的SH-SY5Y細胞以1 : 2的E : T比率重新鋪板，以開始下一輪腫瘤共培養。在每次激發（每三天一次）結束時，採集樣品進行細胞計數並進行T細胞定量。GPC2-BBz作為陽性對照，而未轉導的T細胞（UnT）用作陰性對照。如圖14A中所示，用SH-SY5Y反復刺激CAR T細胞，並且當與UnT陰性對照相比時，所有GPC2 CAR T細胞均顯示出更好的持久性。GPC2-CD28z具有與陽性對照GPC2-BBz相當水平的長期持久性和CAR T細胞擴增（圖14A和圖14C）。儘管在GPC2-CD27z、GPC2-CD2z、GPC2-ICOSz和GPC2-OX40z CAR T細胞中觀察到CAR陽性T細胞百分比逐漸下降，但GPC2-BBz和GPC2-CD28z CAR T細胞卻擴增了並在靶細胞激發2輪後，CAR陽性T細胞百分比達到了峰值水平（圖14B）。在靶細胞激發4輪後，CD28共刺激域（相比其他共刺激域）説明CAR陽性T細胞維持更穩定的水平（圖14B）。
總的來說，數據表明4-1BB、CD28、CD27、CD2、ICOS和OX40共刺激信號傳導域均能夠支持GPC2 CAR T針對GPC2陽性靶細胞的細胞毒性功能。然而，與具有CD2、CD27、ICOS和OX40信號傳導域的GPC2 CAR T細胞相比，具有4-1BB或CD28共刺激域的GPC2 CAR T細胞在連續腫瘤細胞激發下具有更好的T細胞擴增和長期持久性。實例 11
GPC2 CAR T對神經母細胞瘤、小細胞肺癌（SCLC）和成神經管細胞瘤腫瘤細胞係有效的。
為測量GPC2表現水平，在補充有10% FBS的EMEM培養基中培養人神經母細胞瘤細胞系SH-SY5Y（ATCC，#CRL-2266）和人神經母細胞瘤細胞系IMR-32細胞（ATCC，#CCL-127）。在含有10% FBS的EMEM和Ham's F12（1 : 1比率）混合物培養基中培養人神經母細胞瘤細胞系LAN-1細胞（ECACC，#06041201）。在補充有10% FBS的DMEM培養基中培養人表皮樣癌細胞系A-431（ATCC，#CRL-1555）。在補充有10% FBS的RPMI-1640培養基中培養人SCLC腫瘤細胞系SHP-77（ATCC，#CRL-2195）和NCI-H526（ATCC，#CRL-5811）。在補充有10% FBS的EMEM培養基中培養人成神經管細胞瘤腫瘤細胞系D283 Med（ATCC，#HTB-185），並在補充有20% FBS的EMEM培養基中培養D341 Med（ATCC，#HTB-187）。藉由流動式細胞測量術分析GPC2的腫瘤細胞表面表現。如圖15中所示，神經母細胞瘤細胞系SH-SY5Y、IMR-32和LAN-1係GPC2陽性的。SCLC細胞系NCI-H526係GPC2陽性的並且SHP-77係GPC2低陽性（圖15）。成神經管細胞瘤細胞系D283 Med和D341 Med係GPC2陽性的（圖15）。A-431係GPC2陰性的（圖15）。選擇GPC2陽性腫瘤細胞系並在體外細胞毒性測定中進行測試。
為評估GPC2 CAR T針對腫瘤細胞的細胞毒性功效，將GPC2陽性NBL腫瘤細胞系SH-SY5Y用作陽性對照，並將GPC2陰性細胞系A-431用作陰性對照。如圖16和圖17中所示，所有GPC2 CAR T均顯示出針對SH-SY5Y的有效細胞毒性，但未對陰性對照A-431顯示出細胞毒性。數據表明，所有GPC2 CAR T針對GPC2陽性靶細胞均具有有效細胞毒性功效。此外，與未轉導的T細胞對照（UnT）相比，在測試的所有GPC2 CAR T中均觀察到針對SCLC細胞系NCI-H526和SHP-77呈劑量依賴性方式的細胞毒性水平升高（圖18和圖19）。還針對人成神經管細胞瘤腫瘤細胞測試了示例性的GPC2 CAR T（CAS70950VH6-BBz）。如圖20和圖21中所示，與UnT相比，CAS70950VH6-BBz CAR T針對D341 Med和D283 Med細胞系的細胞毒性水平升高。
本說明書中所引用的所有參考文獻在此藉由引用併入，如同每個參考文獻被明確地和單獨地指出藉由引用併入。任何參考文獻的引用皆為出於其在提交日期之前揭露，並且不應解釋為承認本揭露由於先前發明而沒有資格先於該文獻。
將理解，上述要素中的每個或兩個或更多個一起還可以在不同於上述類型的其他類型之方法中找到有用的應用。無需進一步分析，上文將如此全面地揭示本揭露之要點，以至於其他人可以藉由應用現有知識，容易地將其修改用於多種應用，而沒有省略從先前技術觀點來看清楚地構成在隨附申請專利範圍中闡述的本揭露之一般方面或具體方面的必要特徵之特徵。前述實施方式僅以實例的方式給出；本揭露之範圍僅由隨附申請專利範圍限制。序列表 胺基酸序列 AS70549 (SEQ ID NO: 93) QVRLVESGGGSVQAGGSLTLSCAYSRYTGRSSCMAWFRRPPGKKRERVASIYSDDGVTVYADSVKGRFTITQDSAQNTLYLQMNSLDPEDTAMYYCATRTTYPGVCPDNAAWYDYWGQGTQVTVSS AS70771 (SEQ ID NO: 94) QVQLVESGGGSVQAGGSLRLSCAASGYTGKMAWFRQAPGKEREGVAAIDDAGGTNYIDSVKGRFTISKDNAENTLYLRMNSLKPEDTAIYYCAADTFRWFMRRSGPINGSDYAYWGQGTQVTVSS AS70950 (SEQ ID NO: 95) QVQLVESGGGSAQSGGSLRLSCAISEFTYKNTCVGWFRQAPGKEREGVAAIDSDGNTNYVDSVKGRFTISQGNAKNTVYLQMNSLKPEDTAMYYCAAGAYCGRLLLWIGNYAYWGQGTQVTVSS AS71402 (SEQ ID NO: 96) QMQLVESGGGSVQAGGSLRLSCVVSGYTYNRNMAWFRQAPGKEREGVAAMYTGSGTTDYADSVKGRFTISHDNAKNTLYLQMNSLKPEDTATYYCAADTARRGGSWSGPFKYDYWGQGTQVTVSS AS71529 (SEQ ID NO: 97) EVQLVESGGGSVQAGGSLRLSCVVSEYRYSSRYCMGWFRQAPGKEREGVAAIDSNGSADYVDSVKGRFTISKDNAKNTLYLQINSVRPEDTAMYYCAADHLAYDCYSGATSVFRYWGQGTQVTVSS AS71661 (SEQ ID NO: 98) 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CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGAGGAGGCTCTGCCCAGAGCGGAGGCTCCCTGCGGCTGTCTTGCGCCATCAGCGAGTTCACCTACAAGAACACATGCGTGGGATGGTTTAGGCAGGCACCAGGCAAGGAGAGAGAGGGAGTGGCAGCAATCGACAGCGATGGAAACACCAATTACGTGGACTCCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCTCTCAGGGCAACGCCAAGAATACAGTGTATCTGCAGATGAACTCCCTGAAGCCTGAGGATACAGCCATGTACTATTGCGCAGCAGGAGCATATTGTGGCCGCCTGCTGCTGTGGATCGGCAATTACGCCTATTGGGGCCAGGGCACCCAGGTGACAGTGAGCTCC AS71402 (SEQ ID NO: 151) CAGATGCAGCTGGTGGAGTCCGGAGGAGGCTCTGTGCAGGCAGGAGGCAGCCTGCGGCTGTCCTGCGTGGTGTCTGGCTACACCTATAACAGGAATATGGCCTGGTTCAGGCAGGCACCAGGCAAGGAGAGGGAGGGAGTGGCAGCAATGTACACAGGCAGCGGCACCACAGACTATGCCGATTCCGTGAAGGGCAGGTTTACCATCTCTCACGACAACGCCAAGAATACACTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAAGCCCGAGGACACCGCCACATACTATTGTGCAGCAGATACCGCAAGGAGAGGAGGCTCTTGGAGCGGACCTTTCAAGTACGATTATTGGGGCCAGGGCACCCAGGTGACAGTGAGCTCC AS71529 (SEQ ID NO: 152) GAGGTGCAGCTGGTGGAGAGCGGAGGAGGCTCCGTGCAGGCAGGAGGCTCTCTGAGGCTGAGCTGCGTGGTGTCCGAGTACCGGTATAGCTCCAGATACTGTATGGGCTGGTTCAGGCAGGCACCAGGCAAGGAGAGGGAGGGAGTGGCAGCAATCGACTCCAACGGCTCTGCCGACTACGTGGATTCCGTGAAGGGCCGGTTTACCATCTCTAAGGACAACGCCAAGAATACACTGTATCTGCAGATCAATTCCGTGAGACCTGAGGATACCGCCATGTACTATTGCGCCGCCGACCACCTGGCCTACGATTGTTATTCTGGCGCCACAAGCGTGTTCAGATATTGGGGCCAGGGCACCCAGGTGACAGTGTCTAGC AS71661 (SEQ ID NO: 153) CAGGTGCAGCTGGTGGAGAGCGGAGGAGGACTGGTGCAGGCAGGAGGCTCCCTGCGGCTGTCCTGCTCTCCAAGCGGCACCACATTCGCCCACTACAACATGGTGGGCTGGTTTAGGCAGGCACCAGGCAAGGACAGGGAGGGCGTGTCCTGTATCTCTAAGTACGGCGGCACCACATACTATGCCGACTCTGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTATAGAGATAACGCCAAGAATACACTGTTTCTGCAGATGAACAGCCTGAAGCCCGAGGATACCGCCATGTACTATTGCGCCATCGGCGTGCTGCCTAGCTCCACAGCAATCTGTGCAGGAGCAGCAAATTATTGGGGACAGGGAACCCAGGTGACAGTGTCTAGC AS72021 (SEQ ID NO: 154) GAGGTGCAGCTGGCCGAGTCCGGAGGAGGCTCTGTGCAGGCAGGAGGCAGCCTGCGGCTGTCCTGCGTGGTGTCTAGAAACACCTACAGCTCCTATTGTATGTCCTGGTTCAGGCAGGCACCAGGCAAGGAGAGGGAGGGAGTGGCCGCCATCGACAATGTGAAGACAAGCTACGCCGATTCCGTGAAGGGCCGGTTTACCATCTCTAAGGACAACGCCAAGAATACACTGTATCTGCAGATGAACAGCCTGAAGCCCGAGGATACCGCCATGTACTATTGCGCCGCCCACCTGGAGCTGTGCTACTATACAGACCCTATGTACCAGTATGAGTACAATTATTGGGGCCAGGGCACCCAGGTGACAGTGTCTAGC AS72052 (SEQ ID NO: 155) CAGGTGCGGCTGGTGGAGTCTGGAGGAGGCAGCGTGCAGGCAGGAGGCTCCCTGCGGCTGTCTTGCGCCGTGAGCGGCTTCAGGTACGCCTCTTATTGTATGGGATGGTTTAGGCAGGCACCAGGCAAGGAGAGAGAGGGAGTGGCAGCAATCCACAGCGACGGAATCATCAGATACGCCGAGTCCGTGAAGGGCCGCTTCACCATCTCTAAGGACAACGCCAAGAATACACTGTATCTGCAGCTGAACAGCCTGAAGCCTGAGGATAATGCCATGTACTCCTGCGCAGCAGGAGCATATTGTGGAGCAGACGCCATCCTGACCCTGTACGATTATGCCTTTTGGGGCCAGGGCACCCAGGTGACAGTGAGCTCC AS72383 (SEQ ID NO: 156) CAGGTGCGGCTGGTGGAGTCCGGAGGAGGACTGGTGCAGGCAGGAGGCTCTCAGAGGCTGAGCTGCACCGCATCCGGACTGACATTCGACGATTCTGGAATGGGATGGTTTAGGCAGGCACCAGGCAAGGGAAGGGAGGGCGTGAGCTGTATCACCTGGAACGGCCGGTCCACATACTATGCCGACTCTGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCTAGAGATAACAGCAAGAATACACTGTATCTGCAGATGAACAGCCTGAAGCCTGAGGACACCGCCATGTACTATTGCGCCGCCGCCTTTATCACCAAGACAGGCTGTAGCTACGAGTATGATTACTCCGGCCAGGGCACCCAGGTGACAGTGAGCTCC AS72479 (SEQ ID NO: 157) CAGGTGAAGCTGGTGGAGAGCGGAGGAGGCTCCGTGCAGGCAGGAGGCTCTCTGCGGCTGAGCTGCGCCGCCTCCGAGACCACAGACTGTAGATACGTGTGGAGGTGGTATCGCGAGGACCCCGGCATGGAGAGGGAGTTCGTGAGCTCCATCACCTCCGGCGGCTCTACATGGTACGCCGACTCTGTGAAGGGCCGCTTTACCATCTCCCAGGATAACGCCAAGTCTACACTGTATCTGCAGATGAATAGCCTGAAGCCCGAGGACTCCGGCATGTACTATTGCGAGTCTGATCCTGGATGGAGCGGATACCACGCACGGAGATGTGAGGTGTATCGGGGCCAGGGCATCCAGGTGACCGTGTCTAGC AS72499 (SEQ ID NO: 158) CAGGTGAGGCTGGTGGAGTCCGGAGGAGGCTCTGTGCAGGCAGGAGGCAGCCTGCGGCTGTCCTGCGTGGTGTCTAGATTCACCTACAGCTCCTATTGTATGGGCTGGTTTAGGCAGGCACCAGGCAAGGAGAGGGAGGGAGTGGCCGGCATCGAGAAGGACGATAGCACATACTATGCCGACTCCGTGAAGGGCAGATTCACCATCTCTAAGGATAACGCCAAGAATACACTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAAGCCCGAGGACACCGCCATGTACTATTGCGCCGCCAGAATCCCCGGAGGAAATTGTGGAGTGGTGGCAAGAATGGCCTACTGGGATTATTGGGGCAAGGGCACCCTGGTGACAGTGTCTAGC AS72531 (SEQ ID NO: 159) CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGAGGAGGACTGGTGCAGGCAGGAGGCAGCCTGAGGCTGTCCTGCACCGCATCTGGACTGACATTCGCCCACTACAACATGGTGGGCTGGTTTAGGCAGGCACCAGGCAAGGACAGGGAGGGCGTGTCCTGTATCTCTAAGTATGGCGGCACCATCTACTATGCCGACAGCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCGATAGAAACAATGCCAAGAACACACTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAAGCCCGAGGATACCGCCATGTACTATTGCGCCATCGGCGTGCTGAGCTCCACAGCAAGGGGACCTGGAGCAGCAAATTATTGGGGACAGGGCACCCAGGTGACAGTGTCTAGC AS72669 (SEQ ID NO: 160) GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCCGGAGGAGGCTCTGTGCAGGCAGGAGGCAGCCTGAAGCTGTCCTGCGCCGCCTCTCGGTTCACCTACAGCTCCTATTGTATGGGCTGGATCAGACAGGCACCAGGCAAGGAGAGAGAGGGAGTGGCAATCTTCTACACCGGAGGAGGCAGGACATACTATGCCGACAGCGTGAAGGGCCGCTTTACCATCTCCCAGGATACCGCCAAGAACACACTGTATCTGCAGATGAACAGCCTGAAGCCTGAGGACACAGGCATCTACTATTGCGTGGCCGGCTTCTACTGTAGCGGCGGCTATTGGGAGGGCGATTTTGGCTACTGGGGCCAGGGCACCCAGGTGACAGTGTCTAGC AS72794 (SEQ ID NO: 161) CAGGTGCAGCTGGTGGAGAGCGGAGGAGGACTGGTGCAGGCAGGAGGCAGCCTGCGGCTGTCCTGCACAGCCTCTGGCTTCACCTTTGACGATTATGCAATGTCTTGGTTCAGGCAGGCACCAGGCAAGGAGAGGGAGGGCGTGTCCTGTATCTCCGCCTCTGGCACCACAACCTACTATGGCGATAGCGTGAAGGGCAGGTTTACAATCTCCCGCGACAACGCCAAGACAACCCTGATCCTGCAGATGAGCTCCCTGAAGCCTGAGGATACCGCCATGTACTATTGCGCCGCCGACCGGTTCAGAGATTACTGTAGCGACTCCTGGTCTCACCTGTACAATTATGAGTACATGCACTGGGGCCAGGGCACACAGGTGACCGTGTCTAGC AS72805 (SEQ ID NO: 162) CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCCGGAGGCGACTCTGTGCAGGCAGGAGGCAGCCTGACCCTGTCCTGCGTGGCATCTAGGCTGAGAGTGTCCAACAATTGTATGGGCTGGTTCAGGCAGGCACCAGGAAACGAGAGGGAGGGAGTGGCCACCCTGGGCTCTGACGGCCGGACAATCTATGCCGATTCTGTGAAGGGCAGGTTTACCATCAGCAAGGACAACGTGGCCAATACACTGTACCTGCAGATGAACGGCCTGAAGCTGGACGATACAGCCCTGTACTATTGCGCAGCAGCAGATTTCAGCTCCGGAGGATATTGTAATATCGCCAGCGTGTACCACTCCTATTTTCCTTACTGGGGCCAGGGCACCCAGGTGACAGTGTCTAGC AS72806 (SEQ ID NO: 163) CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGAGGAGGCAGCGTGCAGGCAGGAGGCTCCCTGAGGCTGTCTTGCGCAGCAAGCGGATACACCTATATGCCCCCTTGTATGGGATGGTTCAGGCAGGCACCAGGCAAGGAGAGAGAGGGAGTGGCAACCATCTATGGAAGGGGAGGCAGCACATACTATGCCGACTCCGTGAAGGGCCGCTTTACCATCTCTCAGGATAACGCCAAGAATACACTGTATCTGCAGATGAACAATCTGGAGCCCGAGGACACCGCCATGTACTATTGCGCCGCCGATAACCTGTGCTACGCCACAGGCATCCTGAGGTCCGCCTACGACTATTCTTACTGGGGCCAGGGCACCCAGGTGACAGTGAGCTCC AS72835 (SEQ ID NO:164) 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CAGGTGCACCTGATGGAGTCCGGAGGAGGCTCTGTGCAGGCAGGAGGCAGCCTGCGGCTGTCCTGCGCCACCTCTGGCTACACAAGCTCCTGGAACTGTATGGGATGGTTCAGGCAGCCACCTGGCAAGGAGAGAGAGGGAGTGGCCACCATCGCCAATAGGGGCCACAGCACATACTATGCCGACTCCGTGAAGGGCCGCTTTACCATCTCTCAGGGCAACGCCAAGAATACAGTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAAGCCCGAGGACACCGCCATGTACTATTGCGCCACCGATACATGGGCCTGCGTGGGCATCTCCACAGATTTCGAGTATTGGGGCCAGGGCACCCAGGTGACAGTGTCTAGC AS77932 (SEQ ID NO: 167) CAGGTGCAGCTGAAGGAGTCTGGAGGAGGCAGCGTGCAGGCAGGAGGCTCCCTGCGGCTGTCTTGCGCCGTGAGCGGCTACTGGTATTCTGTGGCCTGGATGGGCTGGTTCAGGCAGACCCCAGGCAAGGAGCGCGAGGGAGTGGCAGCCGTGCTGAACGGAGGAGGCCGGAGATACTATGCCGACAGCGTGAAGGGCAGGTTTACCATCTCCCAGGATAACTCTAAGAATACACTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAAGCCCGAGGACACAGCCATGTACTATTGTGCAGCAGGAAACGGAGTGGGACACCCACTGGGCCCTAGCGAGTACAATTATTGGGGCCAGGGCACCCAGGTGACAGTGAGCTCC AS77934 (SEQ ID NO: 168) GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCCGGAGGAGGCTCTGTGCAGGCAGGAGGCAGCCTGAGGCTGTCCTGCGCAGCATCTGGATACACCTATAGCTCCTACTCCATCGCATGGTTCAGGCAGGCACCAGGCAAGGAGAGGGAGGGAGTGGCCGGCTTCTTTTACTCTGGCGGCCCTACATGTTATGCCGACAGCGTGAAGGGCAGGTTTACCATCTCCCAGGATAACGCCAAGAATACACTGTATCTGCAGATGAACTCTCTGAAGCCAGAGGACACCGCCATGTACTATTGCGCCGCCCGGAGAAGCAACACAAATGATTACTGTTTCTATCCCACCTACACATATTGGGGCCAGGGCACCCAGGTGACAGTGTCTAGC AS77978 (SEQ ID NO: 169) CAGGTGCGGCTGGTGGAGAGCGGAGGAGGCTCCGTGCAGGCAGGAGGCTCTCTGCGGCTGAGCTGCGCCGCCTCCGGCGCCACCTCTTGTCGGTGGAGAATGTCTTGGTACAGGCAGGCACCAGGCAAGGAGAGAGAGTTCGTGAGCTCCATCGCCAACGGCGCCACAGAGTACGCCGATAGCGTGAAGGGCAGGTTTACCATCTCCCAGGACAACGCCCGCAATACAATGTATCTGCAGATGAACAGCCTGTCTCCCGAGGACACCGCCATGTACTATTGCGCCGCCGATCCTAGAGTGTACACCTCCAGGTGTGACCGCACATATCTGGGCCAGGGCACCCAGGTGACAGTGTCTAGC AS77986 (SEQ ID NO: 170) CAGGTGCAGCTGGTGGAGAGCGGAGGAGGCTCCGTGCAGGCAGGAGGCTCTCTGCGGCTGAGCTGCGCAGCATCCGCCTCTGGATACACCTATAGCTCCGACAGCATGGCATGGTTCAGGCAGGCACCAGGCAAGGAGAGAGAGGGAGTGGCAGGAATCTCCACCGGAGGCAGGTCTACATACTATGCCGACAGCGTGAAGGGCCGCTTTACAATCTCCCAGGATAACGCCAAGACCACAGTGTACCTGCACATGAACAGCCTGAAGCCCGAGGACACCGCCATGTACTATTGTGCCGCCGATGGCCCTTCCATGACAGCCATCCAGGCCCTGGGCGACCTGTATCCAGTGGATTTCGCATGGTGGGGACAGGGAACCCAGGTGACAGTGTCTAGC AS78117 (SEQ ID NO: 171) CAGGTGAAGCTGGTGGAGTCCGGAGGAGGCTCTGTGCAGGCAGGAGGCGCCCTGCGGCTGTCTTGCATCGTGCGGAGATACACCTATGCCACATACAGCATGGCCTGGTTCAGGCAGTCCCCAGGCAAGGAGCGCGAGGGAGTGGCAGGACTGGACAGCGTGGGAGCCACCGGCTACGCCGAGTCTGTGAAGGGCAGGTTTACAATCAGCAAGGATAACGCCAAGAATATCCTGTATCTGCAGATGAACTCCCTGAAGCCCGAGGACACCGCCATGTACTATTGCGTGGTGGACCCCGCATCCGCCAAGGTGACCTATGGCTCTTGGAGCACACCCTCTTACGCCTATTGGGGCCAGGGCACCCAGGTGACAGTGAGCTCC AS78215 (SEQ ID NO: 172) CAGGTGAAGCTGGTGGAGAGCGGAGGAGGCTCCGTGCAGGCAGGAGGCGCCCTGAGGCTGTCTTGCGCCGCCAGCCGCTACACCTTCAGCTCCAACTGTATGGGATGGTTTAGGCAGGCACCAGGCAAGGAGAGGGAGGGAGTGGCAACCATCGCATCCGCCTCTGGCTACACAGACTATCACGATTCCGTGAAGGGCCGGTTCGCCATCTCTAGAGACAACGCCAAGAATACAGTGTATCTGCAGATGAACAGCCTGAAGCCCGAGGATACCGCAACATACTATTGCGCAGCAAGGGCAGGACCTTGTTGGTCCTGGGCCCAGGCCGACCTGTACAATTATTGGGGCCAGGGCACCCAGGTGACAGTGTCTAGC AS78810 (SEQ ID NO: 173) CAGGTGCACCTGGTGGAGAGCGGAGGAGGCTCCGTGCAGGCAGGAGGCTCTCTGAGGCTGAGCTGCGCAGCATCCGGATATACCTACTATGACATGGGCTGGTTCAGGCTGGCACCAGGCAAGGAGAGGGAGGGCATCGCCGCCATCAGCTCCTCTAGCTCCACATACTATGCCGACAGCGTGAAGGGCAGGTTTACCATCTCCCGCGATTCTAACACACTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAAGCCTGAGGACACCGCCATGTATTCCTGTGCAGCAGGCCGGTACGTGGGAAGAAAGCTGGAGGTGTACGATTATGCCTACTGGGGCCAGGGCACCCAGGTGACAGTGTCTAGC AS79101 (SEQ ID NO: 174) CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCCGGAGGAGGCTCTGTGCAGGCAGGAGGCAGCCTGAGGCTGTCCTGCGCAGCATCTGGCGACACCTACTCTAACTATTGTATGGGCTGGTTCAGGCAGGCACCAGGCAAGGAGAGGGAGGAGGTGGCAGCAATCGACTCTGATGGCAGCCGGAGATACCCCGACAGCGTGAAGGGCAGATTCACAATCTCCAAGGATAACGCCAAGAAGATCCTGTACCTGCAGATGAATAGCCTGAAGCCCGAGGACACCGCCATGTATTTTTGCGCCACAGATCCTAAGGTGGCCTGTGCAAGGGTGGTGGAGTACGGAGGAGGATGGTATAGATGGGGACAGGGCACCCAGGTGACAGTGAGCTCC AS79236 (SEQ ID NO: 175) CAGGTGAAGCTGGTGGAGTCCGGAGGAGGCTCTGTGCAGGCAGGAGGCAGCCTGCGGCTGTCCTGCGCCGTGTCTGGCTACACCTATAGCTCCTACTGTATGGCATGGTTCAGGCAGGCACCAGGAGAGGAGAGGGAGGGAGTGGCCAGCATCGACGCAGGAGGAAGGACCACATACGTGGATTCCGTGAAGGGCAGGTTTACCATCAGCAAGGACAACGCCAAGACATCCCTGTATCTGCAGATGAACAGCCTGAAGCCCGAGGACACAGCCATGTACTATTGCGCCGTGGATGTGCGGACCAGATGTGGCGGCACATGGGATGGCGAGGCCGTGTACTTCCCTTATTGGGGCCAGGGCACCCAGGTGACAGTGTCTAGC AS79274 (SEQ ID NO: 176) CAGGTGCACCTGGTGGAGAGCGGAGGAGGCTCCGTGCAGGCAGGAGGCTCTCTGAGGCTGAGCTGCGCAGCATCCAAGTACGCCTTCTGTACCTATGACATGTCCTGGTTTAGGCAGGCACCAGGCAAGGAGAGGGAGGTGGTGAGCTCCATCGACTCTCGGGGCAACACAAATTACTCCGATTCTGTGAAGGGCAGGTTCACCATCTCTCAGGACCACGCCAAGAACACACTGTACCTGCAGATGAATAGCCTGAAGCCCGAGGATACCGCCATGTATACATGCGCAGCACAGATCGTGGGAGGCGCCCTGAGGTGTCCTAGATTTGCCATGTATTGGGGCCAGGGCACCCAGGTGACAGTGTCTAGC AS79285 (SEQ ID NO: 177) CAGGTGCGGCTGGTGGAGTCCGGAGGAGGCTCTGTGCAGGCAGGAGGCAGCCTGGCCCTGTCCTGCGAGACATCTAGGTACACCGTGTCTAACTATTGTATGGGCTGGTTCAGGCAGGTGAGCGGCAAGGAGGTGGAGGGAGTGGCCCTGATCTCCACAGACGGCACCACAACCTACGCCGATAGCGTGAAGGGCAGGTTCACAATCTCCAAGGACAACGCCAAGAATACCCTGTATCTGCAGATGAACAGCCTGAAGAGCGAGGATACCGCCATGTACTTTTGCGCCGGCGTGTATGGCCTGATCTGGTACTATAAGCCATGTCCTGCACAGAGGGAGTGGGCACTGCAGAGATACGGCTATTGGGGCCAGGGCACACAGGTGACCGTGAGCTCC AS79317 (SEQ ID NO: 178) GAGGTGCAGCTGGCAGAGAGCGGAGGAGGCTCCGTGCAGCCAGGAGGCTCTCTGAGGCTGAGCTGCGCAGCATCCGGATACAGCTCCTCTAGCGTGTGCATGGGATGGTTCAGGCAGGCACCAGGCAAGGAGAGGGAGGGAGTGGCCATCATCTACGTGACCCTGGGCTCTATCGCCTATGCCGACAGCGTGAAGGGCCGGTTTACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAATACACTGGATCTGGAGATGAACTCTCTGAAGCCCGACGATACCGCCCTGTACTATTGCGCAGCAGGAGGATGTGGATACAGGGGAGTGGCAGATGTGCCTGAGTTCACATATAGGGGCCAGGGCACCCAGGTGACAGTGTCCTCT參考文獻 1.  Basta NO, Halliday GC, Makin G, Birch J, Feltbower R, Bown N, Elliott M, Moreno L, Barone G, Pearson ADJ et al: Factors associated with recurrence and survival length following relapse in patients with neuroblastoma. 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無
[圖1]示出了跨不同腫瘤數據庫之GPC2 mRNA表現水平。
[圖2A-2D]示出了經免疫的駱駝針對重組人GPC2蛋白之體液免疫反應。
[圖3A-3G]示出了人源化抗人GPC2單株VH H結合物與人GPC1、GPC2、GPC3、GPC4、GPC5、GPC6和小鼠GPC2之交叉反應性。
[圖4A-4C]示出了四種抗GPC2 VH H抗體對表現GPC2的細胞系的結合親和力。
[圖5]示出了示例性的基於VH H的具有一個或兩個VH H域的CAR之示意性結構。
[圖6A-6D]示出了單價抗GPC2 CAR T細胞在SH-SY5Y神經母細胞瘤細胞中之細胞毒性活性。
[圖7A-7J]示出了人源化單價抗GPC2 CAR T細胞在SH-SY5Y和IMR-32神經母細胞瘤細胞以及A-431表皮樣癌細胞中之細胞毒性活性。
[圖8A-8F]示出了人源化單價和多價抗GPC2 CAR T細胞在SH-SY5Y和IMR-32神經母細胞瘤細胞以及A-431表皮樣癌細胞中之細胞毒性活性。
[圖9A-9C]示出了藉由抗GPC2 CAR T細胞對神經母細胞瘤異種移植腫瘤生長之抑制。
[圖10]示出了化合物A對人源化CAS70950VH6-BBz CAR T細胞在SH-SY5Y神經母細胞瘤細胞中的細胞毒性活性之影響。
[圖11A-11C]示出了在化合物A存在下人源化CAS70950VH6-BBz CAR T細胞之體外重複激發測定。
[圖12A-12C]示出了藉由人源化CAS70950VH6-BBz CAR T細胞和化合物A的組合對神經母細胞瘤異種移植腫瘤生長之抑制。
[圖13A-13B]示出了具有4-1BB、CD28、CD27、CD2、ICOS或OX40共刺激域的GPC2 CAR T針對SH-SY5Y均可以發揮有效的細胞毒性並產生IFNγ。
[圖14A-14C]示出了具有4-1BB、CD28、CD27、CD2、ICOS或OX40共刺激域的GPC2 CAR T當受到SH-SY5Y連續激發時的長期持久性和CAR T細胞擴增倍數。
[圖15]示出了GPC2在人神經母細胞瘤、小細胞肺癌、成神經管細胞瘤和表皮樣癌腫瘤細胞系中之表現。
[圖16]示出了GPC2 CAR T針對神經母細胞瘤細胞系SH-SY5Y之體外細胞毒性。
[圖17]示出了GPC2 CAR T針對人表皮樣癌腫瘤細胞系A-431之體外細胞毒性。
[圖18]示出了GPC2 CAR T針對人小細胞肺癌細胞系NCI-H526之體外細胞毒性。
[圖19]示出了GPC2 CAR T針對人小細胞肺癌細胞系SHP-77之體外細胞毒性。
[圖20]示出了示例性GPC2 CAR T針對人成神經管細胞瘤細胞系D341 Med之體外細胞毒性。
[圖21]示出了示例性GPC2 CAR T針對人成神經管細胞瘤細胞系D283 Med之體外細胞毒性。
無
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Claims (62)

  1. 一種特異性結合磷脂醯肌醇蛋白聚糖-2（GPC2）的分離的抗體或其抗原結合片段，該抗體或其抗原結合片段包含重鏈域的第一單可變域（VH H），該第一單可變域包含含有選自由SEQ ID NO: 1-30組成之群組的胺基酸序列的互補決定區（CDR）1、含有選自由SEQ ID NO: 31-61組成之群組的胺基酸序列的CDR2、和含有選自由SEQ ID NO: 62-92組成之群組的胺基酸序列的CDR3，或其在該CDR1、該CDR2和/或該CDR3中包含一個、兩個或三個保守胺基酸取代的變體。
  2. 如請求項1所述之抗體或其抗原結合片段，其中： (i) 該CDR1包含SEQ ID NO: 1，該CDR2包含SEQ ID NO: 31，並且該CDR3包含SEQ ID NO: 62，或其在該CDR1、該CDR2和/或該CDR3中包含一個、兩個或三個保守胺基酸取代的變體；或 (ii) 該CDR1包含SEQ ID NO: 2，該CDR2包含SEQ ID NO: 32，並且該CDR3包含SEQ ID NO: 63，或其在該CDR1、該CDR2和/或該CDR3中包含一個、兩個或三個保守胺基酸取代的變體；或 (iii) 該CDR1包含SEQ ID NO: 3，該CDR2包含SEQ ID NO: 33，並且該CDR3包含SEQ ID NO: 64，或其在該CDR1、該CDR2和/或該CDR3中包含一個、兩個或三個保守胺基酸取代的變體；或 (iv) 該CDR1包含SEQ ID NO: 4，該CDR2包含SEQ ID NO: 34，並且該CDR3包含SEQ ID NO: 65，或其在該CDR1、該CDR2和/或該CDR3中包含一個、兩個或三個保守胺基酸取代的變體；或 (v) 該CDR1包含SEQ ID NO: 5，該CDR2包含SEQ ID NO: 35，並且該CDR3包含SEQ ID NO: 66，或其在該CDR1、該CDR2和/或該CDR3中包含一個、兩個或三個保守胺基酸取代的變體；或 (vi) 該CDR1包含SEQ ID NO: 6，該CDR2包含SEQ ID NO: 36，並且該CDR3包含SEQ ID NO: 67，或其在該CDR1、該CDR2和/或該CDR3中包含一個、兩個或三個保守胺基酸取代的變體；或 (vii) 該CDR1包含SEQ ID NO: 7，該CDR2包含SEQ ID NO: 37，並且該CDR3包含SEQ ID NO: 68，或其在該CDR1、該CDR2和/或該CDR3中包含一個、兩個或三個保守胺基酸取代的變體；或 (viii) 該CDR1包含SEQ ID NO: 8，該CDR2包含SEQ ID NO: 38，並且該CDR3包含SEQ ID NO: 69，或其在該CDR1、該CDR2和/或該CDR3中包含一個、兩個或三個保守胺基酸取代的變體；或 (ix) 該CDR1包含SEQ ID NO: 9，該CDR2包含SEQ ID NO: 39，並且該CDR3包含SEQ ID NO: 70，或其在該CDR1、該CDR2和/或該CDR3中包含一個、兩個或三個保守胺基酸取代的變體；或 (x) 該CDR1包含SEQ ID NO: 10，該CDR2包含SEQ ID NO: 40，並且該CDR3包含SEQ ID NO: 71，或其在該CDR1、該CDR2和/或該CDR3中包含一個、兩個或三個保守胺基酸取代的變體；或 (xi) 該CDR1包含SEQ ID NO: 11，該CDR2包含SEQ ID NO: 41，並且該CDR3包含SEQ ID NO: 72，或其在該CDR1、該CDR2和/或該CDR3中包含一個、兩個或三個保守胺基酸取代的變體；或 (xii) 該CDR1包含SEQ ID NO: 12，該CDR2包含SEQ ID NO: 42，並且該CDR3包含SEQ ID NO: 73，或其在該CDR1、該CDR2和/或該CDR3中包含一個、兩個或三個保守胺基酸取代的變體；或 (xiii) 該CDR1包含SEQ ID NO: 11，該CDR2包含SEQ ID NO: 43，並且該CDR3包含SEQ ID NO: 74，或其在該CDR1、該CDR2和/或該CDR3中包含一個、兩個或三個保守胺基酸取代的變體；或 (xiv) 該CDR1包含SEQ ID NO: 13，該CDR2包含SEQ ID NO: 44，並且該CDR3包含SEQ ID NO: 75，或其在該CDR1、該CDR2和/或該CDR3中包含一個、兩個或三個保守胺基酸取代的變體；或 (xv) 該CDR1包含SEQ ID NO: 14，該CDR2包含SEQ ID NO: 45，並且該CDR3包含SEQ ID NO: 76，或其在該CDR1、該CDR2和/或該CDR3中包含一個、兩個或三個保守胺基酸取代的變體；或 (xvi) 該CDR1包含SEQ ID NO: 15，該CDR2包含SEQ ID NO: 46，並且該CDR3包含SEQ ID NO: 77，或其在該CDR1、該CDR2和/或該CDR3中包含一個、兩個或三個保守胺基酸取代的變體；或 (xvii) 該CDR1包含SEQ ID NO: 16，該CDR2包含SEQ ID NO: 47，並且該CDR3包含SEQ ID NO: 78，或其在該CDR1、該CDR2和/或該CDR3中包含一個、兩個或三個保守胺基酸取代的變體；或 (xviii) 該CDR1包含SEQ ID NO: 17，該CDR2包含SEQ ID NO: 48，並且該CDR3包含SEQ ID NO: 79，或其在該CDR1、該CDR2和/或該CDR3中包含一個、兩個或三個保守胺基酸取代的變體；或 (xix) 該CDR1包含SEQ ID NO: 18，該CDR2包含SEQ ID NO: 49，並且該CDR3包含SEQ ID NO: 80，或其在該CDR1、該CDR2和/或該CDR3中包含一個、兩個或三個保守胺基酸取代的變體；或 (xx) 該CDR1包含SEQ ID NO: 19，該CDR2包含SEQ ID NO: 50，並且該CDR3包含SEQ ID NO: 81，或其在該CDR1、該CDR2和/或該CDR3中包含一個、兩個或三個保守胺基酸取代的變體；或 (xxi) 該CDR1包含SEQ ID NO: 20，該CDR2包含SEQ ID NO: 51，並且該CDR3包含SEQ ID NO: 82，或其在該CDR1、該CDR2和/或該CDR3中包含一個、兩個或三個保守胺基酸取代的變體；或 (xxii) 該CDR1包含SEQ ID NO: 21，該CDR2包含SEQ ID NO: 52，並且該CDR3包含SEQ ID NO: 83，或其在該CDR1、該CDR2和/或該CDR3中包含一個、兩個或三個保守胺基酸取代的變體；或 (xxiii) 該CDR1包含SEQ ID NO: 22，該CDR2包含SEQ ID NO: 53，並且該CDR3包含SEQ ID NO: 84，或其在該CDR1、該CDR2和/或該CDR3中包含一個、兩個或三個保守胺基酸取代的變體；或 (xxiv) 該CDR1包含SEQ ID NO: 23，該CDR2包含SEQ ID NO: 54，並且該CDR3包含SEQ ID NO: 85，或其在該CDR1、該CDR2和/或該CDR3中包含一個、兩個或三個保守胺基酸取代的變體；或 (xxv) 該CDR1包含SEQ ID NO: 24，該CDR2包含SEQ ID NO: 55，並且該CDR3包含SEQ ID NO: 86，或其在該CDR1、該CDR2和/或該CDR3中包含一個、兩個或三個保守胺基酸取代的變體；或 (xxvi) 該CDR1包含SEQ ID NO: 25，該CDR2包含SEQ ID NO: 56，並且該CDR3包含SEQ ID NO: 87，或其在該CDR1、該CDR2和/或該CDR3中包含一個、兩個或三個保守胺基酸取代的變體；或 (xxvii) 該CDR1包含SEQ ID NO: 26，該CDR2包含SEQ ID NO: 57，並且該CDR3包含SEQ ID NO: 88，或其在該CDR1、該CDR2和/或該CDR3中包含一個、兩個或三個保守胺基酸取代的變體；或 (xxviii) 該CDR1包含SEQ ID NO: 27，該CDR2包含SEQ ID NO: 58，並且該CDR3包含SEQ ID NO: 89，或其在該CDR1、該CDR2和/或該CDR3中包含一個、兩個或三個保守胺基酸取代的變體；或 (xxix) 該CDR1包含SEQ ID NO: 28，該CDR2包含SEQ ID NO: 59，並且該CDR3包含SEQ ID NO: 90，或其在該CDR1、該CDR2和/或該CDR3中包含一個、兩個或三個保守胺基酸取代的變體；或 (xxx) 該CDR1包含SEQ ID NO: 29，該CDR2包含SEQ ID NO: 60，並且該CDR3包含SEQ ID NO: 91，或其在該CDR1、該CDR2和/或該CDR3中包含一個、兩個或三個保守胺基酸取代的變體；或 (xxxi) 該CDR1包含SEQ ID NO: 30，該CDR2包含SEQ ID NO: 61，並且該CDR3包含SEQ ID NO: 92，或其在該CDR1、該CDR2和/或該CDR3中包含一個、兩個或三個保守胺基酸取代的變體。
  3. 如請求項1或2所述之抗體或其抗原結合片段，其中： (i) 該CDR1包含SEQ ID NO: 1，該CDR2包含SEQ ID NO: 31，並且該CDR3包含SEQ ID NO: 62；或 (ii) 該CDR1包含SEQ ID NO: 2，該CDR2包含SEQ ID NO: 32，並且該CDR3包含SEQ ID NO: 63，或 (iii) 該CDR1包含SEQ ID NO: 3，該CDR2包含SEQ ID NO: 33，並且該CDR3包含SEQ ID NO: 64，或 (iv) 該CDR1包含SEQ ID NO: 4，該CDR2包含SEQ ID NO: 34，並且該CDR3包含SEQ ID NO: 65，或 (v) 該CDR1包含SEQ ID NO: 5，該CDR2包含SEQ ID NO: 35，並且該CDR3包含SEQ ID NO: 66，或 (vi) 該CDR1包含SEQ ID NO: 6，該CDR2包含SEQ ID NO: 36，並且該CDR3包含SEQ ID NO: 67，或 (vii) 該CDR1包含SEQ ID NO: 7，該CDR2包含SEQ ID NO: 37，並且該CDR3包含SEQ ID NO: 68，或 (viii) 該CDR1包含SEQ ID NO: 8，該CDR2包含SEQ ID NO: 38，並且該CDR3包含SEQ ID NO: 69，或 (ix) 該CDR1包含SEQ ID NO: 9，該CDR2包含SEQ ID NO: 39，並且該CDR3包含SEQ ID NO: 70，或 (x) 該CDR1包含SEQ ID NO: 10，該CDR2包含SEQ ID NO: 40，並且該CDR3包含SEQ ID NO: 71，或 (xi) 該CDR1包含SEQ ID NO: 11，該CDR2包含SEQ ID NO: 41，並且該CDR3包含SEQ ID NO: 72，或 (xii) 該CDR1包含SEQ ID NO: 12，該CDR2包含SEQ ID NO: 42，並且該CDR3包含SEQ ID NO: 73，或 (xiii) 該CDR1包含SEQ ID NO: 11，該CDR2包含SEQ ID NO: 43，並且該CDR3包含SEQ ID NO: 74，或 (xiv) 該CDR1包含SEQ ID NO: 13，該CDR2包含SEQ ID NO: 44，並且該CDR3包含SEQ ID NO: 75，或 (xv) 該CDR1包含SEQ ID NO: 14，該CDR2包含SEQ ID NO: 45，並且該CDR3包含SEQ ID NO: 76，或 (xvi) 該CDR1包含SEQ ID NO: 15，該CDR2包含SEQ ID NO: 46，並且該CDR3包含SEQ ID NO: 77，或 (xvii) 該CDR1包含SEQ ID NO: 16，該CDR2包含SEQ ID NO: 47，並且該CDR3包含SEQ ID NO: 78，或 (xviii) 該CDR1包含SEQ ID NO: 17，該CDR2包含SEQ ID NO: 48，並且該CDR3包含SEQ ID NO: 79，或 (xix) 該CDR1包含SEQ ID NO: 18，該CDR2包含SEQ ID NO: 49，並且該CDR3包含SEQ ID NO: 80，或 (xx) 該CDR1包含SEQ ID NO: 19，該CDR2包含SEQ ID NO: 50，並且該CDR3包含SEQ ID NO: 81，或 (xxi) 該CDR1包含SEQ ID NO: 20，該CDR2包含SEQ ID NO: 51，並且該CDR3包含SEQ ID NO: 82，或 (xxii) 該CDR1包含SEQ ID NO: 21，該CDR2包含SEQ ID NO: 52，並且該CDR3包含SEQ ID NO: 83，或 (xxiii) 該CDR1包含SEQ ID NO: 22，該CDR2包含SEQ ID NO: 53，並且該CDR3包含SEQ ID NO: 84，或 (xxiv) 該CDR1包含SEQ ID NO: 23，該CDR2包含SEQ ID NO: 54，並且該CDR3包含SEQ ID NO: 85，或 (xxv) 該CDR1包含SEQ ID NO: 24，該CDR2包含SEQ ID NO: 55，並且該CDR3包含SEQ ID NO: 86，或 (xxvi) 該CDR1包含SEQ ID NO: 25，該CDR2包含SEQ ID NO: 56，並且該CDR3包含SEQ ID NO: 87，或 (xxvii) 該CDR1包含SEQ ID NO: 26，該CDR2包含SEQ ID NO: 57，並且該CDR3包含SEQ ID NO: 88，或 (xxviii) 該CDR1包含SEQ ID NO: 27，該CDR2包含SEQ ID NO: 58，並且該CDR3包含SEQ ID NO: 89，或 (xxix) 該CDR1包含SEQ ID NO: 28，該CDR2包含SEQ ID NO: 59，並且該CDR3包含SEQ ID NO: 90，或 (xxx) 該CDR1包含SEQ ID NO: 29，該CDR2包含SEQ ID NO: 60，並且該CDR3包含SEQ ID NO: 91，或 (xxxi) 該CDR1包含SEQ ID NO: 30，該CDR2包含SEQ ID NO: 61，並且該CDR3包含SEQ ID NO: 92。
  4. 如請求項1-3中任一項所述之抗體或其抗原結合片段，其中 該第一單可變域包含以下胺基酸序列，該胺基酸序列與選自由SEQ ID NO: 93-142組成之群組的胺基酸序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%序列同一性。
  5. 如請求項1-4中任一項所述之抗體或其抗原結合片段，其中 該第一單可變域包含選自由SEQ ID NO: 93-142組成之群組的胺基酸序列。
  6. 一種特異性結合GPC2的分離的抗體或其抗原結合片段，該抗體或其抗原結合片段與如請求項1-5中任一項所述之抗體或其抗原結合片段競爭結合GPC2。
  7. 如請求項1-6中任一項所述之抗體或其抗原結合片段，其中 該抗體或抗原結合片段係單域抗體（sdAb）或僅重鏈抗體（HCAb）。
  8. 如請求項1-7中任一項所述之抗體或其抗原結合片段，該抗體或其抗原結合片段包含Fc區。
  9. 如請求項8所述之抗體或其抗原結合片段，其中該Fc區選自由以下組成之群組：IgG1 Fc、IgG2 Fc、IgG3 Fc和IgG4 Fc。
  10. 如請求項1-9中任一項所述之抗體或其抗原結合片段，其中 該VH H域係駱駝科抗體、嵌合抗體、人源化抗體或人抗體可變域。
  11. 一種分離的多特異性抗體，其包含如請求項1-10中任一項所述之抗體或其抗原結合片段的至少兩個VH H域。
  12. 如請求項11所述之多特異性抗體，其中 該至少兩個VH H域係相同的。
  13. 如請求項11所述之多特異性抗體，其中 該至少兩個VH H域係不同的。
  14. 如請求項11所述之多特異性抗體，其 從N-末端至C-末端包含： (i) 包含SEQ ID NO: 126的第一VH H域和包含SEQ ID NO: 128的第二VH H域；或 (ii) 包含SEQ ID NO: 128的第一VH H域和包含SEQ ID NO: 126的第二VH H域，或 (iii) 包含SEQ ID NO: 124的第一VH H域和包含SEQ ID NO: 127的第二VH H域，或 (iv) 包含SEQ ID NO: 127的第一VH H域和包含SEQ ID NO: 124的第二VH H域，或 (v) 包含SEQ ID NO: 124的第一VH H域和包含SEQ ID NO: 124的第二VH H域，或 (vi) 包含SEQ ID NO: 131的第一VH H域和包含SEQ ID NO: 127的第二VH H域，或 (vii) 包含SEQ ID NO: 127的第一VH H域和包含SEQ ID NO: 131的第二VH H域。
  15. 如請求項14所述之多特異性抗體，其包含以下胺基酸序列，該胺基酸序列與選自由SEQ ID NO: 143-147和244-245組成之群組的胺基酸序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列同一性。
  16. 如請求項13或15所述之多特異性抗體，其包含 選自由SEQ ID NO: 143-147和244-245組成之群組的胺基酸序列。
  17. 一種特異性結合GPC2的嵌合抗原受體（CAR），其包含： (a) 包含第一結合域的胞外抗原結合域，該第一結合域包含如請求項1-10中任一項所述之抗體或其抗原結合片段或如請求項11-16中任一項所述之多特異性抗體； (b) 跨膜域；和 (c) 胞內信號傳導域。
  18. 如請求項17所述之CAR，其進一步包含 位於多肽N-末端的訊息肽。
  19. 如請求項18所述之CAR，其中 該訊息肽源自選自由以下組成之群組的分子：CD8α、GM-CSF受體α和IgG1重鏈。
  20. 如請求項17-19中任一項所述之CAR，其進一步包含 位於該胞外抗原結合域的C-末端和該跨膜域的N-末端之間的鉸鏈域。
  21. 如請求項20所述之CAR，其中 該鉸鏈域源自CD8α、CD28或IgG4 Fc。
  22. 如請求項17-21中任一項所述之CAR，其中 該跨膜域源自選自由以下組成之群組的分子：CD8α、CD4、CD2、CD27、CD28、CD137、CD80、CD86、CTLA-4（CD152）、ICOS、OX40和計劃性細胞死亡蛋白1（PD-1）。
  23. 如請求項17-22中任一項所述之CAR，其中 該胞內信號傳導域包含免疫效應細胞的初級胞內信號傳導序列。
  24. 如請求項23所述之CAR，其中 該初級胞內信號傳導序列源自CD3ζ。
  25. 如請求項23或24所述之CAR，其中 該胞內信號傳導域進一步包含胞內共刺激序列。
  26. 如請求項25所述之CAR，其中 該胞內共刺激序列源自選自由以下組成之群組的共刺激分子：CD27、CD28、CD137（4-1BB）、OX40、CD30、CD40、CD3、HVEM、ICOS、Myd88、LFA-1、ICOS、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、CD83的配位基、及其組合。
  27. 如請求項26所述之CAR，其中 該CAR包含多肽，該多肽從N-末端至C-末端包含：該胞外抗原結合域、該跨膜域和胞內信號傳導域，該胞內信號傳導域包含CD28或4-1BB的共刺激序列和CD3ζ的初級胞內信號傳導序列。
  28. 如請求項17-27中任一項所述之CAR，其中 該胞外抗原結合域包含特異性結合GPC2的單VH H域。
  29. 如請求項28所述之CAR，其中 該CAR包含以下胺基酸序列，該胺基酸序列與選自由SEQ ID NO: 189-238和248-252組成之群組的胺基酸序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列同一性。
  30. 如請求項28或29所述之CAR，其中 該CAR包含選自由SEQ ID NO: 189-238和248-252組成之群組的胺基酸序列。
  31. 如請求項17-27中任一項所述之CAR，其中 該胞外抗原結合域包含特異性結合GPC2的第一VH H域和第二VH H域。
  32. 如請求項31所述之CAR，其中 該第一VH H域經由肽連接子與該第二VH H域融合。
  33. 如請求項32所述之CAR，其中 該CAR包含以下胺基酸序列，該胺基酸序列與選自由SEQ ID NO: 239-243和246-247組成之群組的胺基酸序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列同一性。
  34. 如請求項33所述之CAR，其包含 選自由SEQ ID NO: 239-243和246-247組成之群組的胺基酸序列。
  35. 如請求項17-34中任一項所述之CAR，其中 該胞外抗原結合域進一步包含與第二抗原結合的第二結合域，並且該第二抗原不同於GPC2。
  36. 如請求項35所述之CAR，其中 該第二抗原係GD2或DLL3。
  37. 一種雙CAR系統，其包含 如請求項17-36中任一項所述之第一CAR，和 如請求項17-36中任一項所述之第二CAR。
  38. 如請求項37所述之雙CAR系統，其中 該第一CAR和/或該第二CAR包含以下胺基酸序列，該胺基酸序列與選自由SEQ ID NO: 189-238和248-252組成之群組的胺基酸序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列同一性。
  39. 如請求項38所述之雙CAR系統，其中 該第一CAR和/或該第二CAR包含選自由SEQ ID NO: 189-238和248-252組成之群組的胺基酸序列。
  40. 如請求項37-39中任一項所述之雙CAR系統，其中：(1) 該第二CAR的胞內信號傳導域由共刺激信號傳導域組成；(2) 該胞內信號傳導域由源自CD3ζ的初級胞內信號傳導域組成；或 (3) 該胞內信號傳導域由共刺激信號傳導域和源自CD3ζ的初級胞內信號傳導域組成。
  41. 如請求項40所述之雙CAR系統，其中 該共刺激信號傳導域源自選自由以下組成之群組的共刺激分子：CD27、CD28、CD137、OX40、CD30、CD40、CD3、HVEM、ICOS、Myd88、LFA-1、ICOS、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、CD83的配位基、及其組合。
  42. 一種分離的CAR系統，其包含如請求項37-41中任一項所述之雙CAR系統，其中 該第一CAR的胞內信號傳導域在結構上不同於該第二CAR。
  43. 如請求項42所述之分離的CAR系統，其中 該第一CAR的胞內信號傳導域包含免疫效應細胞的初級胞內信號傳導域，並且該第二CAR的胞內信號傳導域包含共刺激信號傳導域。
  44. 如請求項42或43所述之分離的CAR系統，其中 該初級胞內信號傳導域源自CD3ζ。
  45. 如請求項42-44中任一項所述之分離的CAR系統，其中 該共刺激信號傳導域源自選自由以下組成之群組的共刺激分子：CD27、CD28、CD137、OX40、CD30、CD40、CD3、HVEM、ICOS、Myd88、LFA-1、ICOS、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、CD83的配位基、及其組合。
  46. 一種核酸分子，其包含一個或多個核酸序列，該一個或多個核酸序列編碼如請求項1-16中任一項所述之抗體或抗原結合片段、如請求項17-36中任一項所述之CAR、如請求項37-41中任一項所述之雙CAR系統或如請求項42-45中任一項所述之分離的CAR系統。
  47. 如請求項46所述之核酸分子，其包含 選自由SEQ ID NO: 148-178組成之群組的核酸序列。
  48. 一種載體，其包含如請求項46或47所述之核酸分子。
  49. 如請求項48所述之載體，其中 該載體係病毒載體或非病毒載體。
  50. 一種工程化免疫效應細胞，其包含如請求項48或49所述之載體、或如請求項46或47所述之核酸分子。
  51. 如請求項50所述之免疫效應細胞，其中 該免疫效應細胞選自由以下組成之群組：T細胞、NK細胞、外周血單核細胞（PBMC）、造血幹細胞、多能幹細胞、胚胎幹細胞、及其組合。
  52. 如請求項50或51所述之免疫效應細胞，其中 該免疫效應細胞係T細胞，並且其中該T細胞選自由以下組成之群組：細胞毒性T細胞、輔助T細胞、自然殺傷T細胞和γδ T細胞。
  53. 如請求項50-52中任一項所述之免疫效應細胞，其進一步包含膜結合的IL-15或膜結合的IL-7。
  54. 一種藥物組成物，其包含有效量的如請求項50-53中任一項所述之免疫效應細胞、以及藥學上可接受的載體。
  55. 如請求項54所述之藥物組成物，其進一步包含 免疫調節劑。
  56. 如請求項55所述之藥物組成物，其中 該免疫調節劑選自由以下組成之群組：3-(4-胺基-1-側氧基-1,3-二氫-2H -異吲哚-2-基)哌啶-2,6-二酮、泊馬度胺、阿伐度胺、及其組合。
  57. 如請求項56所述之藥物組成物，其中 該免疫調節劑係3-(4-胺基-1-側氧基-1,3-二氫-2H- 異吲哚-2-基)哌啶-2,6-二酮。
  58. 一種治療受試者的GPC2陽性疾病之方法，該方法包括向該受試者施用有效量的如請求項1-10中任一項所述之抗體或其抗原結合片段、或如請求項11-16中任一項所述之多特異性抗體或其抗原結合片段、或如請求項54-57中任一項所述之藥物組成物。
  59. 如請求項58所述之方法，其中 該藥物組成物的免疫效應細胞係自體的或同種異體的。
  60. 如請求項59所述之方法，其中 該同種異體免疫效應細胞獲得自健康供體。
  61. 如請求項58-60中任一項所述之方法，其中 該GPC2陽性疾病係癌症。
  62. 如請求項61所述之方法，其中 該癌症選自由以下組成之群組：急性淋巴母細胞性白血病、尤文氏肉瘤、神經母細胞瘤、胚胎性橫紋肌肉瘤、肺泡橫紋肌肉瘤、肺癌、腦癌、子宮癌、子宮頸癌、大腸直腸癌、胃癌、頭頸癌、乳癌、胰臟癌、卵巢癌、腎癌、食道癌、睾丸癌和皮膚癌。
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