TWI793129B - 細胞毒性t淋巴球相關蛋白4 (ctla-4) 之新穎單株抗體 - Google Patents
細胞毒性t淋巴球相關蛋白4 (ctla-4) 之新穎單株抗體 Download PDFInfo
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Abstract
本發明提供CTLA-4單株抗體,尤其以高親和力特異性結合於CTLA-4之人類化單株抗體。本發明亦提供與人類、食蟹獼猴及小鼠之CTLA-4交叉反應之功能性單株抗體。本發明另外提供本發明之該等抗體之胺基酸序列、選殖或表現載體、宿主細胞及用於表現或分離該等抗體之方法。該等抗體之抗原決定基已經鑑別。亦提供包含本發明之該等抗體之治療性組合物。本發明亦提供使用抗CTLA-4抗體治療癌症及其他疾病之方法。
Description
本發明大體上係關於抗CTLA-4之抗體及其組合物,以及在癌症、感染或其他人類疾病之治療中使用抗CTLA-4抗體之免疫療法。
癌症免疫療法已成為治療癌症之熱門研究領域。細胞毒性T淋巴細胞相關蛋白4 (CTLA-4)係免疫檢查點之經驗證之目標之一。在T細胞活化之後,CTLA-4快速地在該等T細胞上表現,通常在抗原與TCR接合之一小時內。CTLA-4可經由與CD28競爭來抑制T細胞信號傳導。CD28介導良好表徵T細胞共刺激信號中之一者:CD28在抗原呈現細胞上結合於其配位體CD80 (B7-1)及CD86 (B7-2),藉由誘導介白素-2及抗凋亡因子之產生而引起T細胞增殖。由於CTLA-4對CD80及CD86之結合之親和力比對CD28之結合之親和力高得多,在結合CD80及CD86方面CTLA-4可以勝過CD28,對T細胞活化造成抑制。除了在經活化T細胞上之誘導表現之外,CTLA-4還在調節性T細胞(Treg)之表面上組成性表現,表明可能需要CTLA-4用於接觸介導抑制且其與免疫抑制性細胞介素,諸如轉型生長因子β及介白素-10,產生Treg相關。
在多個臨床前及臨床研究中顯示,CTLA-4阻斷可引起腫瘤消退。兩種抗CTLA-4之抗體正處於臨床發展中。伊匹單抗(Ipilimumab)(MDX-010、BMS-734016),即一種IgG1-κ同型之完全人類抗CTLA-4單株抗體,係已作為治療晚期黑素瘤之單一療法審批通過之免疫調節劑。針對伊匹單抗所提出之作用機制係干擾CTLA-4之相互作用,其在經活化T細胞之一子集上表現,CD80/CD86分子在專職抗原呈現細胞上。由於阻斷了由CTLA-4與CD80/CD86相互作用促進之T細胞活化之抑制性調節,此引起T細胞增強。所引起之T細胞活化、增殖及淋巴球浸潤至腫瘤導致腫瘤細胞死亡。用於輸注用溶液,市售劑型為5 mg/mL濃縮物。伊匹單抗亦處於其他腫瘤類型,包括前列腺癌及肺癌,之臨床研究中。另一抗CTLA-4抗體曲美單抗經評估為黑素瘤及惡性間皮瘤中之單一療法。
本發明提供分離抗體,尤其單株抗體或人類化單株抗體。
在一個態樣中,本發明提供一種抗體或其抗原結合片段,其中抗體或抗原結合片段結合於人類、猴及小鼠CTLA-4。
前述抗體或抗原結合片段抑制CTLA-4結合於CD80或CD86。
在前述抗體或抗原結合片段中,抗體或抗原結合片段之結合性抗原決定基包含CTLA-4之N145或N145上之多醣。
在一個態樣中,本發明提供一種抗體或其抗原結合片段,其中抗體或抗原結合片段結合於人類、猴CTLA-4,其中抗體或抗原結合片段之結合性抗原決定基包含CTLA-4之P138。
在一個態樣中,本發明提供一種抗體或其抗原結合片段,其中抗體或抗原結合片段 a) 以4.77E-10 M或更低之KD
結合於人類CTLA-4;且 b) 以1.39E-09 M或更低之KD
結合於小鼠CTLA-4。
前述抗體,其中抗體或抗原結合片段展現以下至少一種特性: a) 以4.77E-10 M與2.08E-10 M之間之KD
結合於人類CTLA-4,且以1.39E-09 M與9.06E-10 M之間之KD
結合於小鼠CTLA-4; b) 促進受刺激之PBMC釋放介白素-2。 c) 不實質上結合於選自由以下組成之群之任何蛋白質:因子VIII、FGFR、PD-1、CD22、VEGF、CD3、HER3、OX40及4-1BB。
本發明提供一種抗體或其抗原結合片段,其包含與選自由以下組成之群之序列至少70%、80%、90%或95%同源之胺基酸序列:SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13及14,其中抗體或抗原結合片段特異性結合於CTLA-4。
本發明提供一種抗體或其抗原結合片段,其包含選自由以下組成之群之胺基酸序列:SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13及14, 其中抗體或抗原結合片段特異性結合於CTLA-4。
本發明提供一種抗體或其抗原結合片段,其包含: a) 具有與選自由以下組成之群之序列至少70%、80%、90%或95%同源之胺基酸序列的重鏈可變區:SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6及7;及 b) 具有與選自由以下組成之群之序列至少70%、80%、90%或95%同源之胺基酸序列的輕鏈可變區:SEQ ID NO:8、9、10、11、12、13及14, 其中抗體或抗原結合片段特異性結合於CTLA-4。
本發明提供一種抗體或其抗原結合片段,其包含: a) 具有選自由以下組成之群之胺基酸序列的重鏈可變區:SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6及7;及 b) 具有選自由以下組成之群之胺基酸序列的輕鏈可變區:SEQ ID NO:8、9、10、11、12、13及14, 其中抗體或抗原結合片段特異性結合於CTLA-4。
在各種實施例中,抗體或其抗原結合片段包含: a) 具有選自由SEQ ID NO:1組成之群之胺基酸序列的重鏈可變區;及 b) 具有選自由SEQ ID NO:8組成之群之胺基酸序列的輕鏈可變區, 其中抗體或抗原結合片段特異性結合於CTLA-4; 或抗體或其抗原結合片段包含: a) 具有選自由SEQ ID NO:2組成之群之胺基酸序列的重鏈可變區;及 b) 具有選自由SEQ ID NO:9組成之群之胺基酸序列的輕鏈可變區, 其中抗體或抗原結合片段特異性結合於CTLA-4; 或抗體或其抗原結合片段包含: a) 具有選自由SEQ ID NO:3組成之群之胺基酸序列的重鏈可變區;及 b) 具有選自由SEQ ID NO:10組成之群之胺基酸序列的輕鏈可變區, 其中抗體或抗原結合片段特異性結合於CTLA-4; 或抗體或其抗原結合片段包含: a) 具有選自由SEQ ID NO:4組成之群之胺基酸序列的重鏈可變區;及 b) 具有選自由SEQ ID NO:11組成之群之胺基酸序列的輕鏈可變區, 其中抗體或抗原結合片段特異性結合於CTLA-4; 或抗體或其抗原結合片段包含: a) 具有選自由SEQ ID NO:5組成之群之胺基酸序列的重鏈可變區;及 b) 具有選自由SEQ ID NO:12組成之群之胺基酸序列的輕鏈可變區, 其中抗體或抗原結合片段特異性結合於CTLA-4; 或抗體或其抗原結合片段包含: a) 具有選自由SEQ ID NO:6組成之群之胺基酸序列的重鏈可變區;及 b) 具有選自由SEQ ID NO:13組成之群之胺基酸序列的輕鏈可變區, 其中抗體或抗原結合片段特異性結合於CTLA-4; 或抗體或其抗原結合片段包含: a) 具有選自由SEQ ID NO:7組成之群之胺基酸序列的重鏈可變區;及 b) 具有選自由SEQ ID NO:14組成之群之胺基酸序列的輕鏈可變區, 其中抗體或抗原結合片段特異性結合於CTLA-4;
在另一態樣中,本發明提供一種抗體或其抗原結合片段,其包含具有選自由以下組成之群之胺基酸序列的互補決定區(complementarity-determining region,CDR):SEQ ID NO:15至41, 其中抗體或抗原結合片段特異性結合於CTLA-4。
在另一態樣中,本發明提供一種抗體或其抗原結合片段,其包含:包含CDR1、CDR2及CDR3序列之重鏈可變區;及包含CDR1、CDR2及CDR3序列之輕鏈可變區, 其中重鏈可變區CDR3序列包含選自由以下組成之群之胺基酸序列:SEQ ID NO:15、16、17及18及其保守修飾, 其中抗體或抗原結合片段特異性結合於CTLA-4。
較佳地,其中前述抗體或其抗原結合片段之輕鏈可變區CDR3序列包含選自由以下組成之群之胺基酸序列:SEQ ID NO:19、20、21及22及其保守修飾。
較佳地,其中前述抗體或其抗原結合片段之重鏈可變區CDR2序列包含選自由以下胺基酸序列組成之群之胺基酸序列:SEQ ID NO:23、24、25、26、27及28及其保守修飾。
較佳地,其中前述抗體或其抗原結合片段之輕鏈可變區CDR2序列包含選自由以下胺基酸序列組成之群之胺基酸序列:SEQ ID NO:29、30、31及32及其保守修飾。
較佳地,其中前述抗體或其抗原結合片段之重鏈可變區CDR1序列包含選自由以下胺基酸序列組成之群之胺基酸序列:SEQ ID NO:33、34、35及36及其保守修飾。
較佳地,本發明之抗體,其中前述抗體或其抗原結合片段之輕鏈可變區CDR1序列包含選自由以下胺基酸序列組成之群之胺基酸序列:SEQ ID NO:37、38、39、40及41及其保守修飾。
在更佳實施例中,本發明提供抗體或其抗原結合片段,其中抗體或抗原結合片段特異性結合於CTLA-4且包含:包含CDR1、CDR2及CDR3序列之重鏈可變區;及包含CDR1、CDR2及CDR3序列之輕鏈可變區,其中: a) 重鏈可變區CDR1序列包含選自由以下胺基酸序列組成之群之胺基酸序列:SEQ ID NO:33、34、35及36,且CDR2序列包含選自由以下胺基酸序列組成之群之胺基酸序列:SEQ ID NO:23、24、25、26、27及28,CDR3序列包含選自由以下胺基酸序列組成之群之胺基酸序列:SEQ ID NO:15、16、17及18; b) 且輕鏈可變區CDR1序列包含選自由以下胺基酸序列組成之群之胺基酸序列:SEQ ID NO:37、38、39、40及41,且CDR2序列包含選自由以下胺基酸序列組成之群之胺基酸序列:SEQ ID NO:29、30、31及32,CDR3序列包含選自由以下胺基酸序列組成之群之胺基酸序列:SEQ ID NO:19、20、21及22, 其中抗體或抗原結合片段特異性結合於CTLA-4。
較佳抗體或其抗原結合片段包含: a) 包含SEQ ID NO:15之重鏈可變區CDR1; b) 包含SEQ ID NO:23之重鏈可變區CDR2; c) 包含SEQ ID NO:33之重鏈可變區CDR3; d) 包含SEQ ID NO:19之輕鏈可變區CDR1; e) 包含SEQ ID NO:29之輕鏈可變區CDR2; f) 包含SEQ ID NO:37之輕鏈可變區CDR3; 其中抗體或抗原結合片段特異性結合於CTLA-4。
另一較佳抗體或其抗原結合片段包含: a) 包含SEQ ID NO:16之重鏈可變區CDR1; b) 包含SEQ ID NO:24之重鏈可變區CDR2; c) 包含SEQ ID NO:34之重鏈可變區CDR3; d) 包含SEQ ID NO:20之輕鏈可變區CDR1; e) 包含SEQ ID NO:30之輕鏈可變區CDR2; f) 包含SEQ ID NO:38之輕鏈可變區CDR3; 其中抗體或抗原結合片段特異性結合於CTLA-4。
另一較佳抗體或其抗原結合片段包含: a) 包含SEQ ID NO:17之重鏈可變區CDR1; b) 包含SEQ ID NO:25之重鏈可變區CDR2; c) 包含SEQ ID NO:35之重鏈可變區CDR3; d) 包含SEQ ID NO:19之輕鏈可變區CDR1; e) 包含SEQ ID NO:31之輕鏈可變區CDR2; f) 包含SEQ ID NO:39之輕鏈可變區CDR3; 其中抗體或抗原結合片段特異性結合於CTLA-4。
另一較佳抗體或其抗原結合片段包含: a) 包含SEQ ID NO:18之重鏈可變區CDR1; b) 包含SEQ ID NO:26之重鏈可變區CDR2; c) 包含SEQ ID NO:36之重鏈可變區CDR3; d) 包含SEQ ID NO:22之輕鏈可變區CDR1; e) 包含SEQ ID NO:32之輕鏈可變區CDR2; f) 包含SEQ ID NO:40之輕鏈可變區CDR3; 其中抗體特異性結合於CTLA-4。
另一較佳抗體或其抗原結合片段包含: a) 包含SEQ ID NO:16之重鏈可變區CDR1; b) 包含SEQ ID NO:27之重鏈可變區CDR2; c) 包含SEQ ID NO:34之重鏈可變區CDR3; d) 包含SEQ ID NO:20之輕鏈可變區CDR1; e) 包含SEQ ID NO:30之輕鏈可變區CDR2; f) 包含SEQ ID NO:38之輕鏈可變區CDR3; 其中抗體或抗原結合片段特異性結合於CTLA-4。
另一較佳抗體或其抗原結合片段包含: a) 包含SEQ ID NO:17之重鏈可變區CDR1; b) 包含SEQ ID NO:25之重鏈可變區CDR2; c) 包含SEQ ID NO:35之重鏈可變區CDR3; d) 包含SEQ ID NO:21之輕鏈可變區CDR1; e) 包含SEQ ID NO:31之輕鏈可變區CDR2; f) 包含SEQ ID NO:39之輕鏈可變區CDR3; 其中抗體或抗原結合片段特異性結合於CTLA-4。
另一較佳抗體或其抗原結合片段包含: a) 包含SEQ ID NO:18之重鏈可變區CDR1; b) 包含SEQ ID NO:28之重鏈可變區CDR2; c) 包含SEQ ID NO:36之重鏈可變區CDR3; d) 包含SEQ ID NO:22之輕鏈可變區CDR1; e) 包含SEQ ID NO:32之輕鏈可變區CDR2; f) 包含SEQ ID NO:41之輕鏈可變區CDR3; 其中抗體或抗原結合片段特異性結合於CTLA-4。
本發明之抗體可為嵌合抗體。
本發明之抗體可為人類化抗體。
本發明之抗體可為完全人類抗體。
本發明之抗體可為大鼠抗體。
本發明之抗體或其抗原結合片段可展現以下至少一種特性: a) 以2.08E-09 M或更低之KD
結合於人類CTLA-4及/或以1.39E-09 M或更低之KD
結合於小鼠CTLA-4; b) 促進受刺激之PBMC釋放介白素-2;
在另一態樣中,本發明提供一種核酸分子,其編碼該抗體或其抗原結合片段。
本發明提供一種選殖或表現載體,其包含編碼該抗體或其抗原結合片段之核酸分子。
本發明亦提供一種宿主細胞,其包含一或多個選殖或表現載體。
在另一態樣中,本發明提供一種方法,其包含培養本發明之宿主細胞及分離抗體, 其中抗體經由在SD大鼠中免疫接種人類CTLA-4胞外域及小鼠CTLA-4胞外域來製備。
本發明提供一種基因轉殖動物(諸如大鼠),其包含人類免疫球蛋白重鏈及輕鏈轉殖基因,其中大鼠表現本發明之抗體。
本發明提供由本發明之大鼠製備之融合瘤,其中融合瘤產生該抗體。
在另一態樣中,本發明提供醫藥組合物,其包含本發明中之抗體或該抗體之抗原結合片段及一或多種醫藥學上可接受之賦形劑、稀釋劑或載劑。
本發明提供一種免疫結合物,其包含連接於治療劑之本發明中之該抗體或其抗原結合片段。
其中,本發明提供一種醫藥組合物,其包含該免疫結合物及一或多種醫藥學上可接受之賦形劑、稀釋劑或載劑。
本發明亦提供一種用於製備抗CTLA-4抗體或其抗原結合片段之方法,其包含: (a)提供: (i) 重鏈可變區抗體序列,其包含選自由以下組成之群之CDR1序列:SEQ ID NO:33至36;選自由以下組成之群之CDR2序列:SEQ ID NO:23至28;及選自由以下組成之群之CDR3序列:SEQ ID NO:15至18;及/或 (ii) 輕鏈可變區抗體序列,其包含選自由以下組成之群之CDR1序列:SEQ ID NO:37至41;選自由以下組成之群之CDR2序列:SEQ ID NO:29至32;及選自由以下組成之群之CDR3序列:SEQ ID NO:19至22;及 (b) 將經改變之抗體序列呈蛋白質表現。
本發明亦提供一種調節個體之免疫反應之方法,其包含向個體投與本發明中之抗體或該等抗體中之任一者之抗原結合片段。
本發明亦提供該抗體或其抗原結合片段之用途,其用於製造用於治療或防治免疫病症或癌症之藥劑。
本發明亦提供一種抑制個體之腫瘤細胞之生長之方法,其包含向個體投與治療有效量之該抗體或該抗原結合片段以抑制腫瘤細胞之生長。
其中,本發明提供該方法,其中腫瘤細胞屬於選自由以下組成之群之癌症:黑素瘤、腎癌、前列腺癌、乳癌、結腸癌、肺癌、骨癌、胰臟癌、皮膚癌、頭或頸部之癌症、皮膚或眼內惡性黑素瘤、子宮癌、卵巢癌及直腸癌。
其中,本發明提供該方法,其中該抗體係嵌合抗體、人類化抗體、人類抗體或大鼠抗體。
本發明之特性及優勢
本發明者已利用專用融合瘤技術製得抗CTLA-4人類化抗體,其中抗體抑制CTLA-4結合於其配位體CD80及CD86。本發明中所報導之抗體具有高結合親和力,其特異性結合於人類及猴CTLA-4蛋白;且強力調節免疫反應且增加介白素-2產生。
抗體中之一者不僅結合於人類及猴CTLA-4,且亦結合於鼠類CTLA-4,其可以大大促進其在小鼠腫瘤模型中之功效之臨床前驗證。
為使本發明可更易於理解,首先對某些術語進行定義。其他定義在整個實施方式中闡述。
術語「細胞毒性T淋巴球相關抗原4」、「蛋白CTLA-4」、「CTLA-4」、「CTLA4」、「CD152」可互換地使用且包括人類CTLA-4或其他物種之CTLA-4之變異體、同功異型物、物種同源物及具有至少一個常見的用於CTLA-4之抗原決定基的類似物。
如本文中所提及之術語「抗體」包括完整抗體及其任何抗原結合片段(亦即「抗原結合部分)」或單個鏈。「抗體」係指包含藉由二硫鍵互連之至少兩個重(H)鏈及兩個輕(L)鏈之蛋白或其抗原結合部分。各重鏈包含重鏈可變區(本文中縮寫為VH)及重鏈恆定區。重鏈恆定區包含三個域:CH1、CH2及CH3。各輕鏈包含輕鏈可變區(本文中縮寫為VL)及輕鏈恆定區。輕鏈恆定區包含一個域:CL。VH區及VL區可進一步再分為高變區,稱為互補決定區(complementarity determining region,CDR),其穿插有稱為框架區(framework region,FR)之更保守的區域。各VH及VL係由自胺基末端至羧基末端按以下順序排列之三個CDR及四個FR構成:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重鏈及輕鏈之可變區含有與抗原相互作用之結合域。
如本發明所使用,術語「抗體」係指免疫球蛋白或其片段或衍生物,且涵蓋包含抗原結合位點之任何多肽,無論其係活體外產生或活體內產生。該術語包括但不限於多株抗體、單株抗體、單特異性抗體、多特異性抗體、非特異性、人類化抗體、單鏈抗體、嵌合抗體、合成抗體、重組抗體、雜交抗體、突變抗體以及移植抗體。術語「抗體」亦包括抗體片段諸如Fab、F(ab')2、Fv、scFv、Fd、dAb及保留抗原結合功能,亦即特異性地結合CTLA-4之能力之其他抗體片段。通常,此類片段將包含抗原結合片段。
術語「抗原結合片段」、「抗原結合域」及「結合片段」係指抗體分子中包含負責抗體與抗原之間之特異性結合之胺基酸的一部分。在抗原較大之情況下,抗原結合片段可能僅結合於一部分抗原。負責與抗原結合片段之特異性相互作用之抗原分子之一部分稱為「抗原決定基」或「抗原決定子」。
抗原結合片段通常包含抗體輕鏈可變區(VL)及抗體重鏈可變區(VH),然而,未必必須包含兩者。舉例而言,所謂的Fd抗體片段僅由VH域組成,但仍保留完整抗體之一定抗原結合功能。
與以上術語「抗原決定基」一致地定義抗原決定子,其由如上文所定義之結合片段特異性結合/判別。結合片段可與構象或連續抗原決定基(其係專一針對目標結構,例如人類CTLA-4及鼠類CTLA-4)特異性結合/相互作用。針對多肽抗原之構象或非連續抗原決定基之特徵在於,存在兩個或更多個在一級序列中分離但當多肽摺疊成天然蛋白/抗原時則在分子之表面上聚集在一起的離散胺基酸殘基。構成抗原決定基之兩個或更多個離散胺基酸殘基存在於一或多個多肽鏈之獨立區域上。當多肽鏈摺疊成三維結構時,此等殘基在分子之表面上聚集在一起,構成抗原決定基。反之,連續或線性抗原決定基由存在於多肽鏈單個線性片段中之兩個或更多個離散胺基酸殘基組成。
術語「結合於CTLA-4之抗原決定基」係指抗體對CTLA-4之特定抗原決定基具有特異結合性,該等特定抗原決定基可由一部分CTLA-4多肽上之線性胺基酸序列或三級(亦即三維)構形界定。結合意謂對CTLA-4之部分之抗體親和力實質上高於其對其他相關多肽之親和力。術語「實質上更大親和力」意謂相比於對其他相關多肽之親和力,對CTLA-4之部分之親和力有增加到可量測之程度。較佳地,對CTLA-4之特定部分之親和力係對其他蛋白之親和力之至少1.5倍、2倍、5倍、10倍、100倍、103
倍、104
倍、105
倍、106
倍或更大。較佳地,結合親和力藉由酶聯免疫吸附測定(enzyme-linked immunoabsorbent assay,ELISA)或藉由螢光活化細胞分選(fluorescence-activated cell sorting,FACS)分析或表面電漿子共振(surface Plasmon resonance,SPR)測定。更佳地,結合特異性藉由螢光活化細胞分選(FACS)分析獲得。
術語「交叉反應性」係指本文中所描述之抗原片段結合於人類、猴及/或鼠類(小鼠或大鼠)中之相同目標分子。因此,「交叉反應性」應理解為對在不同物種中表現之相同分子X但不對除X以外之分子的種間反應性。單株抗體識別例如人類CTLA-4對猴及/或對鼠類(小鼠或大鼠) CTLA-4之跨物種特異性可例如藉由FACS分析測定。
如本文中所使用,術語「個體」包括任何人類或非人類動物。術語「非人類動物」包括所有脊椎動物,例如哺乳動物及非哺乳動物,諸如非人類靈長類動物、綿羊、狗、貓、馬、牛、雞、兩棲動物、爬行動物等。除非有所說明,否則術語「患者」或「個體」在本文中可互換地使用。
術語「治療」及「治療性方法」係指治療性治療及預防/防治性措施。需要治療之彼等可包括已經患有特定醫學病症之個體以及可能最終患上該病症之個體。
術語「保守修飾」亦即不顯著影響或改變由核苷酸序列編碼或含有胺基酸序列之抗體之結合特徵的核苷酸及胺基酸序列修飾。此類保守序列修飾包括核苷酸及胺基酸替代、添加及刪除。修飾可藉由此項技術中已知之標準技術,諸如定點誘變及PCR介導誘變引入序列中。保守胺基酸替代包括胺基酸殘基經替換為具有相似側鏈之胺基酸殘基的替代。此項技術中已定義具有相似側鏈之胺基酸殘基家族。此等家族包括具有鹼性側鏈(例如離胺酸、精胺酸、組胺酸)、酸性側鏈(例如天冬胺酸、麩胺酸)、不帶電極性側鏈(例如甘胺酸、天冬醯胺、麩醯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、半胱胺酸、色胺酸)、非極性側鏈(例如丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸)、β分支鏈側鏈(例如蘇胺酸、纈胺酸、異白胺酸)及芳族側鏈(例如酪胺酸、苯丙胺酸、色胺酸、組胺酸)之胺基酸。
除非另外規定,否則以下實例中之實驗方法為習知方法。
實例 實例 1 : 研究材料製備 1. 可溶性 CTLA-4 之表現及純化
將具有六組胺酸(6×His)-或Fc-標籤之人類及小鼠CTLA-4胞外域(ECD)基因選殖至表現載體中,且隨後用於使用Expi293表現系統套組轉染Expi293細胞。在以135 rpm旋轉之定軌振盪器平台上之含有具有8% CO2
之潮濕氛圍的37℃培育箱中的Expi293表現培養基中培養細胞。收集上清液用於蛋白純化。使用Ni-NTA管柱及純化六組胺酸標記蛋白且使用蛋白A管柱純化Fc標記蛋白。
2. 細胞株發展
將全長人類CTLA-4之基因選殖至表現載體中用於發展穩定細胞株。簡言之,使用Plasfect試劑用30 μg DNA轉染體積30 mL密度1×106
/mL之293F細胞。將經轉染細胞置於培育箱中,該培育箱設定為37℃、8% CO2
及100 rpm振盪速度。在轉染之後24至48小時,使用最終濃度4至6 μg/mL之殺稻瘟菌素(blasticidin)選擇穩定殖株。使用抗CTLA-4抗體藉由FACS測試所選擇之殖株。
為獲得表現食蟹獼猴CTLA-4之細胞,將全長食蟹獼猴CTLA-4之基因選殖至表現載體中用於發展細胞池。簡言之,使用Plasfect試劑(Life Technology)用30 μg DNA轉染體積30 mL密度1×106
/mL之293F細胞。將經轉染細胞置於培育箱中,該培育箱設定為37℃、8% CO2
及100 rpm振盪速度。在轉染之後24小時,使用最終濃度4 μg/mL之殺稻瘟菌素選擇細胞池。使用抗CTLA-4抗體藉由FACS測試所選擇之細胞池。
實例 2 :抗體融合瘤生成 1. 免疫接種
使用人類CTLA-4及鼠類CTLA-4來免疫接種SD大鼠。特定言之,將三隻SD大鼠用於佐劑中之人類及小鼠CTLA-4 ECD蛋白以30 微克/動物進行免疫接種。該佐劑包括Titer-Max、Adju-Phos及CpG-ODN。將大鼠一週一次由腳掌及皮下注射。每月一次藉由ELISA量測血清中之抗體效價。當抗體效價足夠高時,將具有最高效價之大鼠使用不含佐劑之於杜爾貝科氏磷酸鹽緩衝鹽水(Dulbecco's Phosphate Buffered Saline,DPBS)中之人類及小鼠CTLA-4 ECD蛋白給予最終加強。在若干天後,自大鼠取出脾及淋巴結,且分離淋巴球用於融合。
2. 細胞融合
如下進行細胞融合:在融合之前一週解凍骨髓瘤細胞SP2/0細胞,且每天以1:2分割直至融合之前一天以保持其成對數生長。用胰蛋白酶分別處理自經免疫接種大鼠之淋巴結分離之B淋巴球及骨髓瘤細胞且藉由添加FBS終止反應。將B淋巴球與骨髓瘤細胞以1:1比率組合。隨後洗滌細胞混合物且以2×106
個細胞/毫升再懸浮於含有0.3 M蔗糖、0.1 mM乙酸鎂及0.1 mM乙酸鈣之電融合溶液中。使用Btx電細胞操控器(Btx Electro Cell Manipulator)(Ecm 2001)遵照製造商之標準方案進行電細胞融合。隨後將來自融合室之細胞懸浮液立即轉移至含有新鮮培養基之無菌燒瓶中,且在37℃培育箱中培育2小時。隨後混合細胞懸浮液且轉移至96孔盤之60個孔中(1×104
個細胞/孔)。將96孔盤在37℃且5% CO2
下培養,且定期監測。當殖株足夠大時(7至10天之後),以180微升/孔移除上清液且隨後每孔添加200 μL新鮮培養基。在72小時之後,自組織培養盤轉移100 μL上清液至96孔分析盤中用於篩選。
3. 融合瘤篩選
在結合於人類、鼠類及猴CTLA-4蛋白以及工程化人類CTLA-4表現細胞上篩選大量融合瘤殖株。一旦經由第一及第二篩選檢驗出特異性CTLA-4結合及阻斷活性,則使用極限稀釋法將陽性融合瘤株次選殖至96孔盤。將盤在37℃、5% CO2
下培養直至進一步針對與配位體CD80及CD86競爭結合CTLA-4來篩選陽性殖株。收集所選擇之陽性殖株之培養上清液用於抗體純化及進一步表徵。選擇主導候選物用於VH及VL定序。
4. 自融合瘤測定 VH 及 VL 序列
藉由RT-PCR或5' RACE分離所選擇之融合瘤殖株之抗體之VH及VL基因。特定言之,藉由使用RNeasy Plus微型套組(Qiagen)自融合瘤細胞分離總RNA。使用寡dT反轉錄第一股cDNA。使用3'恆定區簡併引子及5'簡併引子組自cDNA擴增抗體之VH及VL基因。基於Ig可變序列之上游信號序列編碼區設計5'簡併引子。隨後將PCR產物接合至pMD18-T載體且10 μL接合產物轉型為前十(Top10)強細胞。將經轉型細胞接種在具有羧苄西林(carbenicillin) 2xYT盤上且在37℃下培育隔夜。隨機選取15個陽性群落用於藉由Biosune進行DNA定序。替代地,使用5' RACE鑑別所選擇之融合瘤殖株之VH及VL序列。首先,使用5'-RACE套組(Takara-28001488)將RNA首先反轉錄成cDNA,接著使用3'簡併引子及3'轉接器引子(ExTaq:Takara-RR001B)之PCR。將PCR片段嵌入pMD18-T載體(Takara-D101C)中且送至定序(Biosune,Shanghai)。
實例 3 : 嵌合抗體製備及表徵 1. 嵌合抗體製備
VH及VL之推導胺基酸序列列出於表3中。加下劃線之序列係由Kabat描繪系統定義之CDR。將此等大鼠抗體之可變區與人類抗體之恆定區融合,且自Expi293細胞表現嵌合抗體且使用蛋白A層析純化。 表3.大鼠抗CTLA-4抗體之可變區序列
2. 嵌合抗體之表徵
2.1結合於人類、猴及鼠類CTLA-4之抗體(ELISA、FACS及SPR) 自哺乳動物細胞表現具有大鼠可變區及人類恆定區之嵌合抗體且使用蛋白A親和層析來純化。
由CTLA-4結合ELISA測試抗體。如圖1、圖2及圖3中所示,所有四種抗體均以與伊匹單抗(WBP316-BMK1)相當之EC50
結合於人類及猴CTLA-4,但僅一個抗體W3162-1.146.19亦以0.01 nM之EC50
結合於鼠類CTLA-4。為確認抗體能夠在細胞表面上結合CTLA-4,在FACS分析中使用CTLA-4表現細胞株。此等抗體亦在細胞表面上結合CTLA-4 (圖4)且其EC50
在1.14 nM至9.42 nM範圍內。W3162-1.146.19以3.25 nM之EC50
在細胞表面上結合CTLA-4,且W3162-1.154.8以1.26 nM之EC50
在細胞表面上結合CTLA-4。
使用SPR來量測四種抗體之結合動力學。在固定化山羊抗人類Fc上捕獲抗體,且隨後依序注射不同濃度之人類CTLA-4 ECD。自測試感測圖譜減去用於參考通道及緩衝通道之感測圖譜。使用該資料擬合1:1結合分析。如圖5及表4中所示,所有四種抗體均以相比於伊匹單抗(WBP316-BMK1)之高親和力結合於人類CTLA-4 ECD域,且KD
範圍為2.08E-09 nM至6.80E-11 nM。 表4.抗體結合人類CTLA-4 ECD之動力學
2.2嵌合抗體與配位體之競爭 發現CTLA-4以比CD28高20至50倍之親和力結合CD80及CD86 [Krummel 1996]。因此,測試抗CTLA-4抗體是否能夠與CD80及CD86與CTLA-4之結合競爭。使用ELISA及FACS作為競爭分析。在基於ELISA之競爭分析中,將人類CTLA-4塗佈在盤上,且向盤中添加與經生物素標記之配位體混合之抗體。藉由HRP結合抗生蛋白鏈菌素(streptavidin)偵測所結合之配位體。如圖6a及圖6b中所示,在CTLA-4結合中,所有四種抗體均與配位體CD80 (B7-1、L1)及CD86 (B7-2、L2)競爭,且除W3162-1.101.2之外之其中三個具有與伊匹單抗(WBP316-BMK1)相當的EC50
。在FACS分析中,將抗體與經生物素標記之人類CTLA-4之混合物添加至CD80或CD86表現細胞中,且所結合之人類CTLA-4藉由PE結合抗生蛋白鏈菌素偵測。如圖7a (上圖)及圖7b (下圖)中所示,所有四種抗體均可有效阻斷CTLA-4結合在配位體表現細胞上。除W3162-1.154.8之外之三種抗體可完全阻斷CTLA-4結合在CD80細胞上,而伊匹單抗WBP316-BMK即使在200 nM (所使用之最高濃度)下僅可部分地阻斷此結合(圖7a)。在阻斷CTLA-4結合在CD86細胞上之FACS分析(圖7b)中,所有4種抗體均可完全阻斷CTLA-4結合在CD86細胞上,而伊匹單抗即使在200 nM (所使用之最高濃度)下僅可部分地阻斷此結合。W3162-1.101.2之動力學表現地不同:在低濃度下,該阻斷不及伊匹單抗有效,且在高濃度下比伊匹單抗更有效。在阻斷CTLA-4方面,其他三種抗體在所有試驗濃度下均比伊匹單抗更有效。
2.3 嵌合抗體在SEB分析中之功能 在經修飾之T細胞刺激分析(SEB分析)中測試具有不同濃度:1.34 nM、3.35 nM、8.71 nM、21.4 nM、53.6 nM、134 nM之抗CTLA-4抗體之功能。使用葡萄球菌腸毒素B (Staphylococcal enterotoxin B,SEB)作為人類T細胞活化之刺激物,CTLA-4報告被為人類T細胞活化之重要參與者。藉由IL-2之分泌量測T細胞活化。如圖8中所示,所有四種抗體均以劑量依賴型方式促進IL-2分泌,與伊匹單抗相當或優於伊匹單抗。
實例 4 : 人類化抗體之表徵 1. 人類化
使用「最佳擬合」方法來將抗體輕鏈及重鏈人類化。
使用CDR移植技術,選擇三種抗CTLA-4抗體(除了W3162-1.101.2,因為在ELISA及FACS中其結合活性相對低)用於人類化。抗體之可變區之CDR (在表5中加下劃線的)及FR使用Kabat系統定義。基於序列同源性及結構相似性,大鼠區FR1-3之基因經替換為人類化區FR1-3,而大鼠基因之區FR4經替換為結構最相似之衍生自JH及JK基因之人類化FR4區。對可變區之轉譯後修飾(post-translational modification,PTM)之熱點進行修飾以降低PTM風險。在檢驗模板序列及密碼子最佳化之後,合成重鏈可變區及輕鏈可變區且選殖至表現載體中,且隨後用於表現人類化抗體。使用蛋白A層析純化人類化抗體,且使用SPR方法來量測結合人類、猴及鼠類CTLA-4之動力學。 表5.人類化抗CTLA-4抗體之可變區序列
表6.人類化抗CTLA-4抗體之可變區
2. 人類化抗體之表徵
2.1結合於人類、猴及鼠類CTLA-4之抗體 2.1.1 CTLA-4結合ELISA 自哺乳動物細胞表現人類化抗體且使用蛋白A親和層析純化。伊匹單抗來自市售來源。同型對照抗體、具有不同標籤(hFc或6×His)之人類CTLA-4 ECD及鼠類CTLA-4.ECD-hFc由藥明生物(WuXi Biologics)製備。鼠類CTLA-4.ECD-6×His及食蟹獼猴CTLA-4 ECD-6×His購自Sino Biological。HRP-結合山羊抗人類IgG Fc購自Bethyl (目錄號:A80-304P)。
使用ELISA測試抗人類CTLA-4抗體與人類、鼠類及食蟹獼猴CTLA-4蛋白之結合。將96孔盤在4℃下塗佈CTLA-4.ECD-6×His (1.0 μg/mL)、食蟹獼猴CTLA-4.ECD-6×His (0.5 μg/mL)或小鼠CTLA-4.ECD-6×His (0.5 μg/mL) ,持續16至20小時。在使用2% BSA/DBPS阻斷1小時之後,向盤中添加試驗抗體以及陽性及陰性對照抗體且在室溫下培育1小時。藉由HRP-結合山羊抗人類IgG抗體(1:5000稀釋) 1小時培育來偵測抗體對盤之結合。藉由分配100 μL TMB基質顯影顏色8分鐘,且隨後藉由100 μL 2N HCl終止。使用微定量盤式分光光度計來量測在450 nM下之吸光度。
如圖9中所示,兩種抗體W3162-1.146.19-z12-IgGk及W3162-1.154.8-z35-IgGk分別以0.03 nM及0.04 nM之EC50
結合於人類CTLA-4,略微高於伊匹單抗(WBP316-BMK1)之0.01 nM之EC50
(圖9A)。兩種抗體亦以0.05 nM之EC50
結合於猴CTLA-4 (圖9B),但僅W3162-1.146.19-z12-IgGk以EC50
0.19 nM結合於鼠類CTLA-4。W3162-1.154.8-z35-IgGk或伊匹單抗皆不結合於鼠類CTLA-4 (圖9C)。
2.1.2 CTLA-4結合FACS 人類CTLA4表現293F細胞株由藥明生物發展。PE結合山羊抗人類IgG Fc片段購自Jackson (目錄號109-115-098)。向96孔盤之各孔中添加1×105
之數目之細胞/孔,且在4℃下以1500 rpm離心4分鐘,之後移除上清液。向再懸浮細胞中添加試驗抗體、陽性及陰性對照之連續稀釋液,且在4℃下培育1小時。將細胞用200 μL含有1% BSA之DPBS洗滌兩次。向細胞中添加在含有1% BSA之DPBS中稀釋之PE結合山羊抗人類IgG (1:100),且在4℃下培育1小時。用200 μL含有1% BSA之DPBS進行額外洗滌步驟兩次,接著在4℃下以1500 rpm離心4分鐘。最後,將細胞再懸浮在100 μL含有1% BSA之DPBS中,且藉由流式細胞測量術量測螢光值且藉由FlowJo分析。
在FACS分析中此等抗體亦能夠在細胞表面上結合人類CTLA-4。如圖11 (圖10a及圖10b)中所示,W3162-1.146.19-z12-IgGk、W3162-1.154.8-z35-IgGk及伊匹單抗具有略微不同之EC50
,分別為1.58 nM、0.66 nM及0.83 nM。
2.2此等抗體之結合動力學 2.2.1使用SPR量測此等抗體之結合動力學 實驗旨在基於SPR技術量測抗體與CTLA-4 ECD之結合速率常數(ka)及解離速率常數(kd)。因此測定親和力常數(KD
)。
Biacore T200、Series S感測器晶片CM5、胺偶合套組及10×HBS-EP購自GE Healthcare。山羊抗人類IgG Fc抗體購自Jackson ImmunoResearch Lab (目錄號109-005-098)。在固定化步驟中,在臨注射前藉由混合400 mM EDC與100 mM NHS製備活化緩衝液。用活化緩衝液將CM5感測器晶片活化420 s。隨後於10 mM NaAc (pH 4.5)中之30 μg/mL之山羊抗人類IgG Fcγ抗體以5 μL/min之流動速率經200 s注射至Fc1-Fc4通道中。藉由1 M乙醇胺-HCl (GE)去活化晶片。隨後在晶片上捕獲抗體。簡言之,於操作緩衝液(HBS-EP+)中之4 μg/mL抗體單獨地以10 μL/min之流動速率經30 s注射至Fc3通道。將八個不同濃度(20 nM、10 nM、5 nM、2.5 nM、1.25 nM、0.625 nM、0.3125 nM及0.15625 nM)之分析物CTLA-4 (WBP316.hCTLA-4.ECD-6×His)及空白操作緩衝液依序以30 μL/min之流動速率經120 s之締合期注射至Fc1至Fc4通道中,接著2400 s分解期。在每個分解期之後,將再生緩衝液(10 mM甘胺酸pH 1.5)以10 μL/min經30 s注射。
使用SPR量測此等抗體之結合動力學。在固定化抗人類Fc上捕獲抗體且依序注射不同濃度之CTLA-4-ECD。自測試感測圖譜減去用於參考通道及緩衝通道之感測圖譜。資料用於對人類、猴及小鼠CTLA-4.ECD-6×His之1:1結合分析。如表7中所示,人類化抗體W3162-1.146.19-Z12、W145及W3162-1.154.8-Z35分別以0.477 nM、1.84 nM及0.0968 nM之親和力結合人類CTLA-4-ECD域。相比於大鼠抗體,人類化抗體具有相當的親和力。W3162-1.146.19-Z12及W3162-1.154.8-Z35具有比伊匹單抗顯更著高的親和力(KD
=3.68 nM)。抗體W3162-1.146.19-Z12亦可結合於鼠類CTLA-4,且其在人類化之前及之後之親和力顯示於表9中。在人類化之後,其親和力為1.39 nM,略微低於其親本抗體之親和力0.906 nM。
W3162-1.146.19-Z12、W3162-1.145.10-z7及W3162-1.154.8-Z35結合食蟹獼猴CTLA-4-ECD之親和力分別為1.92 nM、0.598 nM、0.131 nM (表8)。 表7.抗體結合人類CTLA-4 ECD之動力學
表8.抗體結合猴CTLA-4 ECD之動力學
表9.抗體結合鼠CTLA-4 ECD之動力學
2.2.2藉由FACS之親和力測試 FITC結合山羊抗人類IgG Fc購自Jackson Immunoresearch Lab (目錄號109-095-098),且使用BD CantoII用於此分析。簡言之,將表現人類CTLA-4之HEK293細胞以5×104
個細胞/孔之密度轉移至96孔U形底盤(BD)中。將試驗抗體在具有1% BSA之PBS中1:2倍連續稀釋且在4℃下與細胞一起培育1小時。在以1500 rpm離心4 min之後,棄去上清液。向再懸浮細胞中添加二級抗體、FITC結合山羊抗人類IgG Fc (每IgG 3.2 FITC,Jackson Immunoresearch Lab)至最終濃度14 μg/ml,且在4℃下在暗處培育30分鐘。隨後將細胞洗滌一次且再懸浮於具有1% BSA之PBS中,且藉由流式細胞測量術(BD)分析。基於定量珠粒(QuantumTM MESF套組,Bangs Laboratories)將螢光強度轉化為結合分子/細胞。使用Graphpad Prism5計算KD
。
人類化抗體結合細胞表面CTLA-4之親和力藉由自Benedict氏方法[Benedict 1997 JIM]修改之流式細胞測量術方法量測。在量測抗體結合CTLA-4表現CHO細胞之螢光之後,分析結合的抗體及游離抗體且擬合至等式中,如圖5中所示。基於資料及公式,計算得的親和力常數KD
顯示於表10中。人類化抗體W3162-1.146.19-Z12及W3162-1.154.8-Z35之親和力分別具有5.05 nM及0.35 nM之高親和力,而伊匹單抗之親和力為0.97 nM。 表10.藉由FACS之親和力測試
2.3與配位體之競爭 為測試人類化抗體是否保留其阻斷CTLA-4結合CD80及CD86之能力,在中競爭分析使用ELISA及FACS。兩種CTLA-4配位體CD80及CD86購自Sino Biological (目錄號10698-H08H及10699-H08H)。經生物素標記之抗His標籤抗體購自Genscript (目錄號A00613)。HRP結合抗生蛋白鏈菌素購自Invitrogen (目錄號SNN1004)。
2.3.1基於ELISA之競爭分析 使用ELISA測試抗體是否可以抑制人類CTLA-4與其配位體人類CD80及CD86之結合。將盤在4℃下塗佈人類CTLA-4.ECD.hFc (0.5 μg/mL)保持16至20小時。在用2% BSA/DBPS阻斷1小時之後,將試驗抗體以及陽性陰性對照抗體與0.25 μg/mL之CD80-6×His或CD86-6×His預混合,且隨後添加至盤中且在室溫下培育1小時。在用含有0.05%吐溫20 (Tween 20)之PBS洗滌三次之後,將經生物素標記之抗His標籤抗體1:2000稀釋且添加。將盤在室溫下培育1小時。藉由HRP結合抗生蛋白鏈菌素(1:20000)偵測結合之配位體。藉由分配100 μL TMB基質顯影顏色8分鐘,且隨後藉由100 μL 2N HCl終止。使用微定量盤式分光光度計來量測在450 nM下之吸光度。
如圖11中所示,在阻斷配位體與經塗佈之CTLA-4結合方面,W3162-1.146.19-z12-IgGk及W3162-1.154.8-z35-IgGk具有與伊匹單抗相似的效果,其針對CD80之IC50
為0.87 nM、0.63 nM及0.40 nM,且針對CD86之IC50
為0.71 nM、0.50 nM及0.42 nM。
2.3.2 FACS分析 為測試抗體是否可以阻斷CTLA-4在細胞表面上結合CD80及CD86,吾人使用FACS來測試此競爭。CD80及CD86表現CHO細胞株由藥明生物發展。經生物素標記之CTLA-4.ECD.hFc由藥明生物製備。PE結合抗生蛋白鏈菌素購自eBioscience (目錄號12-4317)。
向96孔盤之各孔中以每孔1×105
添加CD80或CD86表現細胞,且在4℃下以1500 rpm離心4分鐘,之後移除上清液。將試驗抗體、陽性及陰性對照之連續稀釋液與經生物素標記之人類CTLA4.ECD.hFc混合。由於在細胞表面上配位體密度不同,針對人類CD80細胞使用0.02 μg/mL之hCTLA-4.ECD.hFc生物素且針對人類CD86細胞使用0.08 μg/mL之hCTLA-4.ECD.hFc生物素。隨後向細胞中添加抗體與CTLA-4之混合物且在4℃下培育1小時。將細胞用200 μL FACS緩衝液洗滌兩次(含有1% BSA之DPBS)。向細胞中添加於FACS緩衝液中1比333稀釋之抗生蛋白鏈菌素PE且在4℃下培育1小時。用200 μL FACS緩衝液進行額外洗滌步驟兩次,接著在4℃下以1500 rpm離心4分鐘。最後,將細胞再懸浮在100 μL FACS緩衝液中,且藉由流式細胞測量術量測螢光值且藉由FlowJo分析。
結果顯示於圖12中。兩種人類化抗體可以比伊匹單抗更有效地阻斷CTLA-4/配位體結合。在最高使用濃度下伊匹單抗僅阻斷32%之CTLA-4與CD80結合及40%之CTLA-4與CD86結合。相比之下,抗體W3162-1.146.19-Z12阻斷71%之CTLA-4與CD80結合及73%之CTLA-4與CD86結合,且抗體W3162-1.154.8-Z35阻斷89%之CTLA-4與CD80結合及98%之CTLA-4與CD86結合。針對CD80之伊匹單抗、W3162-1.146.19-Z12及W3162-1.154.8-Z35之IC50
分別為3.23 nM、6.60 nM及0.07 nM。針對CD86之伊匹單抗、W3162-1.146.19-Z12及W3162-1.154.8-Z35之IC50
分別為2.52 nM、5.15 nM及0.28 nM。
2.4 SEB刺激之PBMC之細胞介素釋放 測試是否抗CTLA4抗體可以促進SEB (來自第二軍醫大學(The Second Military Medical University))刺激之後之人類PBMC之細胞介素釋放。獲得來自健康供體之外周血液且藉由Ficoll (GE Healthcare,17-1440-02)密度梯度離心分離細胞。在移除漂浮層之後,藉由用培養基洗滌幾次來移除血小板。向96孔盤之各孔中添加1×105
之數目之人類PBMC細胞。將試驗抗體、陽性及陰性對照之連續稀釋液與SEB (10 ng/mL)混合,且隨後添加至粒化細胞中且在37℃下培育3天。收集上清液以量測人類IL-2濃度。
對於人類IL-2測試,將盤在4℃下預塗佈1.0 μg/ml人類IL-2抗體(R&D System MAB602)保持16至20小時。在用於DBPS中之2% BSA (BovoGen)阻斷1小時之後,向盤中添加含有IL-2之上清液且在室溫下培育2小時。在用PBST (含有0.05%吐溫20)洗滌三次之後,稀釋經生物素標記之人類IL-2抗體(R&D system,BAF202)且以0.5 g/mL之濃度添加。將盤在室溫下培育1小時。藉由1:20000稀釋之抗生蛋白鏈菌素結合HRP (Invitrogen,SNN1004)偵測所結合之經生物素標記之抗體。在培育1小時之後,藉由分配100 μL TMB基質顯影顏色,且隨後藉由100 μL 2M HCl終止。使用微定量盤式分光光度計來量測在450 nm及540 nm下之吸光度。
在基於細胞之分析中,測試人類化抗體(8.60 nM、21.4 nM、53.6 nM、134 nM、335 nM)是否可以促進超抗原SEB刺激之人類PBMC。在刺激3天之後,使用ELISA量測來自PBMC之IL-2。相比於同型對照抗體,兩種人類化抗體(W3162-1.146.19-Z12、W3162-1.154.8-Z35)及伊匹單抗皆可以促進自PBMC以劑量依賴型方式釋放IL-2 (圖13)。
2.5熱穩定性 在不同溫度下測試主導抗體之穩定性。簡言之,將100 µL各抗體樣品吸入至單獨的管中,且將樣品在4℃或37℃下培育20小時,或在45℃或50℃下培育2小時。隨後將樣品以12,000 rpm離心10分鐘。觀測該等樣品以尋找可能沈澱,且藉由SEC-HPLC針對純度及洗脫時間來對樣品進行分析。
在不同條件下之W3162-1.146.19-Z12之SEC特徵顯示於圖14 a至d中。相比於低溫下之稀釋時間或主峰百分比(92.24%),高溫條件下之稀釋時間或主峰百分比(92.39%至92.48%)皆不顯著改變。不同高溫條件下之W3162-1.154.8-Z35之SEC特徵顯示於圖14 e至h中。相比於低溫下之稀釋時間或主峰百分比(96.84%),稀釋時間或主峰百分比(97.14%至97.17%)皆不顯著改變。此組資料表明,抗體在所測試之高溫條件下穩定。
2.6非特異性結合 使用FACS及ELISA兩種分析法測試抗體是否結合其他目標。在FACS分析中,將不同細胞株(Ramos、Raji、MDA-MB-453、BT474、Jurkat、Hut78、A431、A204、CaLu-6、A375、HepG2、BxPC-3、HT29、FaDu、293F、CHO-K1)調整為每孔1×105
細胞。將試驗抗體及同型對照抗體在含有1% BSA之PBS中稀釋至10 μg/ml,且在4℃下與細胞一起培育1小時。用180 μL含有1% BSA之PBS洗滌細胞兩次。將PE結合山羊抗人類IgG Fc片段(Jackson,目錄號109-115-098)在含有1% BSA之PBS中稀釋至最終濃度5 μg/mL,隨後添加至再懸浮細胞中且在4℃下於暗處培育30分鐘。用180 μL含有1% BSA之PBS再進行洗滌步驟兩次,接著在4℃下以1500 rpm離心4分鐘。最後,將細胞再懸浮在100 μL含有1% BSA之PBS中,且藉由流式細胞儀(BD CantoII)量測螢光值且藉由FlowJo分析。
在ELISA分析中,測試試驗抗體、同型對照抗體對包括以下之10種不同目標抗原之結合性:因子VIII、FGFR-ECD、PD-1、CTLA-4.ECD、VEGF、HER3.ECD、OX40.ECD、4-1BB.ECD、CD22.ECD、CD3e.ECD。在96孔盤上塗佈個別抗原(2 μg/mL),在4℃下一夜。使用含2% BSA之PBS阻斷1小時之後,用300 μL PBST洗滌分析盤3次。將試驗抗體以及同型對照抗體在含有2% BSA之PBS中稀釋至10 μg/mL,隨後添加至盤中且在室溫下培育2小時。使用300 μL PBST洗滌3次之後,向盤中添加HRP-結合山羊抗人類IgG抗體(於2% BSA中1:5000稀釋)且在室溫下培育1小時。最後,用300 μL PBST洗滌盤六次。藉由分配100 μL TMB基質,發展出顏色12 min,且隨後藉由100 μL 2M HCl終止。使用微定量盤式分光光度計來量測在450 nM下之吸光度。
除了CTLA-4之外,使用其他不相關蛋白質測試抗體W3162-1.146.19-Z12及W3162-1.154.8-Z35是否能夠結合此等抗原。如圖16中所示,在一組抗原中,僅CTLA-4被兩種抗體偵測到。在此ELISA分析中,其他抗原不會產生信號。反之,抗OX40抗體與OX40結合,表示此抗原塗佈在盤上。
亦在FACS分析中在一組不同細胞株上測試兩種抗體之特異性。對於此等細胞株中之任一者,該等抗體均未產生可偵測信號(資料未示出)。
2.7活體內功效 由於抗體W3162-1.146.19-Z12與人類CTLA-4及鼠類CTLA-4交叉反應,在同基因型小鼠模型中測試此抗體之抗腫瘤功效。使用小鼠癌細胞株CT26確立異種移植小鼠模型以測試抗CTLA-4抗體W3162-1.146.19-Z12。購自BioXCell之抗鼠類CTLA-4抗體用作陽性對照(BioXCell-BE0131)。在37℃下於5% CO2
之氛圍中,在補充有10%胎牛血清、100 U/mL青黴素(penicillin)及100 μg/mL鏈黴素(streptomycin)之RPMI-1640培養基中,將腫瘤細胞以單層培養物形式活體外保持。在藉由胰蛋白酶-EDTA處理分離細胞之後,將腫瘤細胞常規地每週兩次繼代培養。收集在指數生長期中生長之細胞。且計數以用於腫瘤接種。雌性Balb/C小鼠購自Beijing Vital River Laboratory Animal有限公司。使用年齡6至8週且重量約18至22 g的小鼠用於研究。將各小鼠在右腋處皮下接種於0.1 mL PBS中之混合有50 μL基質膠的1×105
腫瘤細胞。當平均腫瘤體積達到60至80 mm3
時,將動物隨機分組。使用抗CTLA-4抗體及同型對照來處理:一週兩次靜脈內注射至小鼠中。每週兩次藉由游標測徑規量測腫瘤尺寸,且藉由式a×b2
×π/6計算腫瘤體積,其中a為長度且b為寬度(a>b)。
當平均腫瘤體積達到約70 mm3
時,一週兩次注射W3162-1.146.19-Z12 (1 mg/kg、3 mg/kg、10 mg/kg)及對照抗體(10 mg/kg)持續兩週。針對隨時間推移之腫瘤生長及體重對動物進行監測。如圖15中所示,W3162-1.146.19-Z12以劑量依賴型方式顯著抑制腫瘤生長。相比於對照組,在1 mg/kg劑量下,W3162-1.146.19-Z12抑制腫瘤生長。在3 mg/kg劑量下,在第19天W3162-1.146.19-Z12抑制腫瘤體積至160 mm3
,而10 mg/kg下之W3162-1.146.19-Z12在研究階段結束時引起腫瘤消退。
2.8 抗原決定基定位 使用丙胺酸掃描鑑別抗體之CTLA-4抗原決定基。在此實驗中,hCTLA4上之丙胺酸殘基突變成甘胺酸殘基,且所有其他殘基突變成丙胺酸。對於人類CTLA4胞外域(ECD)之各殘基,使用兩個依序PCR步驟進行點胺基酸替代。使用QuikChange lightning多定點誘變套組(Agilent technologies,Palo Alto,CA),使用編碼人類CTLA4之ECD及C末端His標籤之pcDNA3.3-hCTLA4_ECD.His質體作為模板,且使用一組誘變引子用於第一步PCR。在突變股合成反應之後,使用Dpn I核酸內切酶分解親本模板。在第二步PCR中,將線性DNA表現卡匣,其由CMV啟動子、CTLA4之突變ECD、His標籤及單純疱疹病毒(herpes simplex virus)胸苷激酶(thymidine kinase,TK)多腺苷酸化構成,在HEK293F細胞(Life Technologies,Gaithersburg,MD)中擴增且暫時表現。此外,構築三種質體載體以測試聚糖之抗原決定基:pcDNA3.3-hCTLA4_ECD.His (N113Q)、pcDNA3.3-hCTLA4_ECD.His (N145Q)及pcDNA3.3-hCTLA4_ECD.His (N113Q、N145Q)。此等三種突變蛋白在HEK293F細胞(Life Technologies,Gaithersburg,MD)中暫時表現。
為測試突變如何影響抗體結合,進行捕獲ELISA。簡言之,藉由在盤中預塗佈2 μg/mL山羊抗人類IgG Fc (Bethyl Laboratories,Montgomery,TX)捕獲伊匹單抗、W3162-1.146.19-z12及W3162-1.154.8-z35 (2 μg/mL)單株抗體。在與含有定量CTLA4突變蛋白之上清液相互作用之後,添加HRP結合抗His抗體(1:5000;Rockland Immunochemicals,Pottstown,PA)作為偵測抗體。使用TMB作為HRP之物質。根據對照突變體之平均值正規化吸光度。在設定結合倍數變化之額外截斷(<0.55)之後,鑑別最終確定之抗原決定基殘基。
進行抗體W3162-1.146.19-z12、W3162-1.154.8-z35及伊匹單抗(W316-BMK1)與人類CTLA4之結合活性,發現所有三種抗體均與人類CTLA4結合(圖17)。
所測試之影響抗體與CTLA-4結合之點突變顯示於表11中。根據人類CTLA4晶體結構(PDB代碼1AH1),一些胺基酸殘基(例如Met38、Val40、Tyr60、Val71、Val73、Arg75、Val84、Cys85、Cys129、Ile149)不大可能直接接觸任何抗體。觀測到之結合減少最可能係由於在丙胺酸替代之後CTLA4結構不穩定性或甚至塌陷。最終確定之抗原決定基殘基列出在表12中且在圖18上標記。
如圖18D及圖18E所示,伊匹單抗與W3162-1.146.19-z12之抗原決定基彼此重疊,幾個殘基除外,諸如N145及P138。相比之下,W3162-1.154.8-z35結合於CTLA-4之區域比其他兩種抗體小(圖18F)。所有三種抗體均結合於CTLA-4之配位體結合域(圖18A及圖18B),其涉及MYPPPY基元。
伊匹單抗與W3162-1.146.19-z12之抗原決定基重疊並不解釋抗體W3162-1.146.19-z12之獨特跨物種結合。因為CTLA-4上之N145突變僅影響W3162-1.146.19-z12與CTLA-4結合,不影響其他兩種抗體,吾人進一步將N-糖基化位點視作潛在抗原決定基。CTLA4之兩種糖基化位點上之突變對抗體結合活性之影響顯示在圖17上。伊匹單抗或W3162-1.154.8-z35在突變CTLA-4上之結合不顯著改變(圖17A及圖17C)。相比之下,W3162-1.146.19-z12在突變CTLA-4 N145Q上之結合顯著降低,而此抗體在具有N113Q之CTLA-4上之結合不改變。此組資料表明CTLA-4之N145上之聚糖(圖18E)可以為W3162-1.146.19-z12之抗原決定基。食蟹獼猴及小鼠之CTLA-4中之N145殘基為保守的。
圖1顯示在ELISA中結合於人類CTLA-4之嵌合抗體之圖。 圖2顯示在ELISA中結合於食蟹獼猴CTLA-4之嵌合抗體之圖。 圖3顯示在ELISA中結合於小鼠CTLA-4之嵌合抗體之圖。 圖4顯示藉由FACS之嵌合抗體在細胞上結合於人類CTLA-4之圖。 圖5顯示藉由SPR之嵌合抗體結合人類CTLA-4之結果。 圖6顯示嵌合抗體阻斷配位體結合之結果。 圖7顯示嵌合Ab抑制CTLA-4結合CD80或CD86表現細胞之圖。 圖8顯示嵌合抗體促進SEB刺激之PBMC釋放細胞介素之結果。 圖9顯示在ELISA中結合於人類CTLA-4、食蟹獼猴CTLA-4及小鼠CTLA-4之人類化抗體之圖。 圖10a顯示人類化抗體在細胞上結合於CTLA-4之圖(FACS)。 圖10b顯示藉由FACS之人類化抗體之親和力之圖。 圖11顯示藉由ELISA之人類化抗體阻斷配位體結合。 圖12顯示藉由FACS之人類化抗體阻斷CTLA-4結合於其配位體。 圖13顯示在SEB分析中人類化抗體促進細胞介素釋放。 圖14顯示W3162-1.146.19-Z12或W3162-1.154.8-Z35在不同條件下之SEC特徵。 圖15顯示抗體W3162-146.19-z12之活體內功效之結果。 圖16顯示W3162抗體特異性結合於CTLA-4。 圖17. 抗CTLA4抗體與人類CTLA-4/CTLA-4突變體之結合活性。用預塗佈之2 μg/ml山羊抗人類IgG Fc抗體捕獲(A)伊匹單抗、(B) W3162-1.146.19-z12及(C) W3162-1.154.8-z35抗體,且隨後與經稀釋之hCTLA4-His (WT)或其突變蛋白(N113Q及N145Q)一起培育,隨後添加HRP-抗His抗體用於偵測。 圖18分別顯示定位在人類CTLA-4上之結合殘基或抗原決定基:(A) CD80 (PDB:1I8L)、(B) CD86 (PDB:1I85)、(C)曲美單抗(tremelimumab)(PDB: 5GGV)、(D)伊匹單抗、(E) W3162-1.146.19-z12及(F) W3162-1.154.8-z35之結合位點。針對D至F使用IAH1之CTLA-4結構以顯示糖基化之結構。
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Claims (20)
- 一種抗體或其抗原結合片段,其包含:輕鏈可變區,其包含由SEQ ID NO:41所界定之輕鏈互補決定區1(LCDR1)、由SEQ ID NO:32所界定之LCDR2及由SEQ ID NO:22所界定之LCDR3,及重鏈可變區,其包含由SEQ ID NO:36所界定之重鏈互補決定區1(HCDR1)、由SEQ ID NO:28所界定之HCDR2及由SEQ ID NO:18所界定之HCDR3;及其中抗體或抗原結合片段特異性結合於CTLA-4。
- 如請求項1之抗體或其抗原結合片段,其中該輕鏈可變區具有SEQ ID NO:14之胺基酸序列。
- 如請求項1之抗體或其抗原結合片段,其中該重鏈可變區具有SEQ ID NO:7之胺基酸序列。
- 如請求項1之抗體或其抗原結合片段,其中該輕鏈可變區具有SEQ ID NO:14之胺基酸序列,且該重鏈可變區具有SEQ ID NO:7之胺基酸序列。
- 如請求項1至4中任一項之抗體或其抗原結合片段,其中該抗體或抗原結合片段抑制CTLA-4與CD80或CD86結合。
- 如請求項1至4中任一項之抗體或其抗原結合片段,其中抗體或抗原結合片段之結合性抗原決定基包含N145、N145上之多醣或CTLA-4之P138。
- 如請求項1至4中任一項之抗體或其抗原結合片段,其中該抗體或抗原結合片段a)以4.77E-10 M或更低之KD結合於人類CTLA-4;且b)以1.39E-09 M或更低之KD結合於小鼠CTLA-4。
- 如請求項1至4中任一項之抗體或其抗原結合片段,其中該抗體係嵌合、人類化、完全人類或大鼠抗體。
- 一種核酸分子,其編碼如請求項1至8中任一項之抗體或其抗原結合片段。
- 一種選殖或表現載體,其包含如請求項9之核酸分子。
- 一種宿主細胞,其包含一或多個如請求項10之選殖或表現載體。
- 一種製備如請求項1至8中任一項之抗體或其抗原結合片段之方法,其包含培養如請求項11之宿主細胞,及分離該抗體。
- 一種製備轉殖基因大鼠之方法,其包含以人類免疫球蛋白重鏈及輕鏈之轉殖基因轉染大鼠,其中該大鼠表現如請求項1至8中任一項之抗體或其抗原結合片段。
- 一種醫藥組合物,其包含如請求項1至8中任一項之抗體或其抗原結合片段,及一或多種醫藥學上可接受之賦形劑、稀釋劑及載劑。
- 一種免疫結合物,其包含連接於治療劑之如請求項1至8中任一項之抗體或其抗原結合片段。
- 一種製備抗CTLA-4抗體或其抗原結合片段之方法,其包含:(a)提供:(i)重鏈可變區抗體序列,其包含由SEQ ID NO:36所界定之重鏈互補決定區1(HCDR1)、由SEQ ID NO:28所界定之HCDR2及由SEQ ID NO:18所界定之HCDR3及(ii)輕鏈可變區抗體序列,其包含由SEQ ID NO:41所界定之輕鏈互補決定區1(LCDR1)、由SEQ ID NO:32所界定之LCDR2及由SEQ ID NO:22所界定之LCDR3;及(b)將經改變之抗體序列表現為蛋白質。
- 一種如請求項1至8中任一項之抗體或其抗原結合片段之用途,其係用於製造調節個體之免疫反應之藥劑。
- 一種如請求項1至8中任一項之抗體或其抗原結合片段之用途,其用於製造治療或預防免疫病症或癌症之藥劑。
- 一種如請求項1至8中任一項之抗體或其抗原結合片段之用途,其係用於製造抑制腫瘤細胞之生長之藥劑。
- 如請求項19之用途,其中該等腫瘤細胞為選自由以下組成之群之癌症之腫瘤細胞:黑素瘤、腎癌、前列腺癌、乳癌、結腸癌、肺癌、骨癌、胰臟癌、皮膚癌、頭或頸部之癌症、皮膚或眼內惡性黑素瘤、子宮癌、卵巢癌及直腸癌。
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