EA042725B1

EA042725B1 - Новые моноклональные антитела к белку 4, ассоциированному с цитотоксическими т-лимфоцитами, (ctla-4)

Info

Publication number: EA042725B1
Application number: EA201992755
Authority: EA
Inventors: Чжочжи ВАН; Цзин Ли; Геннадий ГОЛОЛОБОВ; Цзяньцин Сюй
Original assignee: Уси Байолоджикс (Шанхай) Ко. Лтд.
Filing date: 2017-05-19
Publication date: 2023-03-20

Description

Область техники

Изобретение относится в целом к антителам против CTLA-4 и их композициям, а также к иммунотерапии при лечении злокачественного новообразования, инфекций или других заболеваний человека с использованием антител против CTLA-4.

Уровень техники

Противоопухолевая иммунотерапия стала областью активных исследований лечения злокачественных новообразований. Белок 4, ассоциированный с цитотоксическими Т-лимфоцитами, (CTLA-4), является одной из проверенных мишеней иммунных контрольных точек. После активации Т-клеток, CTLA-4 быстро экспрессируется на этих Т-клетках, как правило, в течение 1 ч после рекрутирования антигена в TCR. CTLA-4 может ингибировать передачу сигналов Т-клеток посредством конкуренции с CD28. CD28 опосредует один из хорошо охарактеризованных костимулирующих сигналов Т-клеток: связывание CD28 со своими лигандами CD80 (В7-1) и CD86 (В7-2) на антигенпрезентирующих клетках приводит к пролиферации Т-клеток путем индукции продуцирования интерлейкина-2 и антиапоптотических факторов. Из-за гораздо более высокой аффинности связывания CTLA-4 с CD80 и CD86, чем у CD28, CTLA-4 может быть вне конкуренции по отношению к CD28 за связывание на CD80 и CD86, что приводит к подавлению активации Т-клеток. В дополнение к индуцированной экспрессии на активированных Тклетках CTLA-4 конститутивно экспрессируется на поверхности регуляторных Т-клеток (Treg), что позволяет предположить, что CTLA-4 может быть необходим для контактно-опосредованной супрессии и связан с продуцированием Treg иммуносупрессивных цитокинов, таких как трансформирующий фактор роста бета и интерлейкин-10.

Блокада CTLA-4 может вызвать регрессию опухоли, что продемонстрировано в ряде доклинических и клинических исследований. Два антитела против CTLA-4 находятся в клинической разработке. Ипилимумаб (MDX-010, BMS-734016), полностью человеческое моноклональное антитело против CTLA-4 изотипа IgG1-каппа, является иммуномодулирующим средством, которое было одобрено в качестве монотерапии для лечения прогрессирующей меланомы. Предполагаемый механизм действия для ипилимумаба заключается в интерференции взаимодействия CTLA-4, экспрессируемого на подгруппе активированных Т-клеток, с молекулами CD80/CD86 на профессиональных антигенпрезентирующих клетках. Это приводит к потенцированию Т-клеток благодаря блокаде ингибирующей модуляции активации Т-клеток, стимулируемой CTLA-4, и CD80/CD86 взаимодействию. В результате активация Тклеток, пролиферация и инфильтрация лимфоцитов в опухоли приводит к гибели опухолевых клеток.

Коммерческая лекарственная форма представляет собой концентрат 5 мг/мл инфузионного раствра. Ипилимумаб также находится в процессе клинических исследований для других типов опухолей, в том числе рака предстательной железы и легких. Другое антитело против CTLA-4, Тремелимумаб, было оценено как монотерапия при меланоме и злокачественной мезотелиоме.

Раскрытие изобретения

Настоящее изобретение относится к выделенным антителам, в частности моноклональным антителам или гуманизированным моноклональным антителам.

В одном аспекте настоящее изобретение относится к антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, где антитело или антигенсвязывающий фрагмент связывается с CTLA-4 человека, обезьяны и мыши.

Указанное антитело или антигенсвязывающий фрагмент ингибирует связывание CTLA-4 с CD80 или CD86.

В указанном антителе или антигенсвязывающем фрагменте связывающий эпитоп антитела или антигенсвязывающего фрагмента содержит N145 или полисахарид на N145 CTLA-4.

В одном аспекте настоящее изобретение относится к антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, где антитело или антигенсвязывающий фрагмент связывается с CTLA-4 человека, обезьяны, где связывающий эпитоп антитела или антигенсвязывающего фрагмента содержит Р138 CTLA-4.

В одном аспекте настоящее изобретение относится к антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, где антитело или антигенсвязывающий фрагмент:

a) связываются с CTLA-4 человека с KD 4,77Е-10 М или менее и

b) связываются с мышиным CTLA-4 с KD 1,39E-09 M или менее.

Указанное антитело, где антитело или антигенсвязывающий фрагмент проявляют по меньшей мере одно из следующих свойств:

a) связываются с CTLA-4 человека с KD от 4,77Е-10 М до 2,08Е-10 М и с CTLA-4 мыши с KD от 1,39Е-09 М до 9,06Е-10 М;

b) усиливают высвобождение интерлейкина-2 из стимулированных РВМС;

c) по существу не связываются с каким-либо белком, выбранным из группы, состоящей из фактора VIII, FGFR, PD-1, CD22, VEGF, CD3, HER3, ОХ40 и 4-1ВВ.

Настоящее изобретение относится к антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, содержащим аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70, 80, 90 или 95% гомологична последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 и 14, где антитело или антигенсвязывающий фрагмент специфически связываются с CTLA-4.

- 1 042725

Настоящее изобретение относится к антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, содержащим аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5,

6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 и 14, где антитело или антигенсвязывающий фрагмент специфически связываются с CTLA-4.

Настоящее изобретение относится к антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, содержащим:

a) вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70, 80, 90 или 95% гомологична последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5 6 и 7; и

b) вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70, 80, 90 или 95% гомологична последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 8, 9, 10, 11, 12 13 и 14, где антитело или антигенсвязывающий фрагмент специфически связываются с CTLA-4.

a) вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6 и 7; и

b) вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 8, 9, 10, 11, 12, 13 и 14, где антитело или антигенсвязывающий фрагмент специфически связываются с CTLA-4.

В различных вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержат:

a) вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1; и

b) вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 8, гд е антитело или антигенсвязывающий фрагмент специфически связываются с CTLA-4;

или антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержат:

a) вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2; и

b) вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 9, гд е антитело или антигенсвязывающий фрагмент специфически связываются с CTLA-4;

a) вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 3; и

b) вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 10, гд е антитело или антигенсвязывающий фрагмент специфически связываются с CTLA-4;

a) вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 4; и

b) вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 11, гд е антитело или антигенсвязывающий фрагмент специфически связываются с CTLA-4;

a) вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 5; и

b) вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 12, гд е антитело или антигенсвязывающий фрагмент специфически связываются с CTLA-4;

a) вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 6; и

b) вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 13, гд е антитело или антигенсвязывающий фрагмент специфически связываются с CTLA-4;

a) вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 7; и

b) вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 14, где антитело или антигенсвязывающий фрагмент специфически связываются с CTLA-4.

- 2 042725

Последовательность указанного антитела представлена в табл. 1 и в списке последовательностей.

Таблица 1

Выведенные аминокислотные последовательности антител

Клон ID	SEQ ГО NO	Аминокислотная последовательность
W3162-1.1 01.2	Тяжелая цепь	1	EEQLVESGGGLVQPGKSLKLSCSASGFTFRSSA MHWIRQPPGKGLDWVAFISSGGDTAYADAVK GRFIVSRDNAENTLFLQLNSLKSEDTAIYYCVR MERIPTWGQGVMVTVSS

	Легкая цепь	8	DIVLTQSPVLAVSLGQRATISCRASQSVSISSINL IHWYQQRPGQQPKLLIYRTSNLASGIPARFSGS GSGTDFTLSIDPVQADDVADYYCQQSRESPLTF GSGTKLEIK
W3162-1.	Тяжелая цепь	2	EVQLVESGGGLVQPGRSLKLSCAASDLTFSNY DMAWVRQTPTKGLEWVASISPNGGNTYYRDS VKGRFTVSRDNAKNSLYLQMDSLRSEDTATYY CARHLWFAYWGQGTLVTVSS
145.10	Легкая цепь	9	DIQMTQSPSSMSASLGDRVTISCQASQDIGSNLI WFQQKPGKSPRPMIYYATHLADGVPSRFSGSR SGSDYSLTISSLESEDVADYHCLQYKQYPRTFG GGTKLELK
W3162-1.1 46.19	Тяжелая цепь	3	EVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCSVTYHTITSGY DWTWIRKFPGNQMEWMGYISYSGNTNYNPSL KSRISITRDTSKNQFFLHLNSVTSEDTATYYCAS MMVPHYYVMDAWGQGASVTVSS
Легкая цепь	10	DVVLTQTPPTSSATIGQSVSISCRSSQSLLNSDG NTYLYWYLQRPSQSPQLLIYLVSKLGSGVPNRF SGSGSGTDFTLKISGVEAEDLGLYYCVQGTHDP WTFGGGTKLELK
W3162-1.1 54.8	Тяжелая цепь	4	EVQLQQSGPEAGRPGSSVKISCKASGYTFTNYF MNWVKQSPGQGLEWIGRVDPENGRADYAEKF KKKATLTADTTSNTAYIHLSSLTSEDTATYFCA RRAMDNYGFAYWGQGTLVTVSS
Легкая цепь	11	EIMLTQSPTIMAASLGEKITITCSANSSLSYMYW FQQKSGASPKLWVHGTSNLASGVPDRFSGSGS GTSYYLTINTMEAEDAATYFCHHWSNTQWTF GGGTKLELK
W3162-1.1 45.10-Z7	Тяжелая цепь	5	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASDLTFSNY DMAWVRQAPGKGLEWVASISPSGGNTYYRDS VKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYY CARHLWFAYWGQGTLVTVSS

- 3 042725

	Легкая цепь	12	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDIGSNLI WFQQKPGKAPKPMIYYATHLADGVPSRFSGSR SGTDYTLTISSLQPEDFATYYCLQYKQYPRTFG GGTKVEIK
W3162.1.14 6.-Z12	Тяжелая цепь	6	QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCSVTYHTITSGY DWTWIRKPPGKGMEWIGYISYSGNTNYNPSLK SRVTISRDTSKNQFFLKLSSVTAADTAVYYCAS ММ VPHYYVMD AWGQGTLVT VS S
Легкая цепь	13	DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCRSSQSLLNSDG NTYLYWYLQKPGQSPQLLIYLVSKLGSGVPNR FSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCVQGTH DPWTFGGGTKVEIK
W3162.1.15 4.8-z35	Тяжелая цепь	7	QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTNY FMNWVRQAPGQGLEWMGRVDPEQGRADYAE KFKKRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYY CARRAMDNYGFAYWGQGTLVTVSS
Легкая цепь	14	EIVLTQSPDFQSVTPKEKVTITCSANSALSYMY WYQQKPDQSPKLWVHGTSNLASGVPSRFSGSG SGTDFTLTINSLEAEDAATYYCHHWSNTQWTF GGGTKVEIK

В другом аспекте изобретение относится к антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, содержащим область, определяющую комплементарность, (CDR), имеющую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 15-41, где антитело или антигенсвязывающий фрагмент специфически связываются с CTLA-4.

В другом аспекте изобретение относится к антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, содержащим: вариабельную область тяжелой цепи, содержащую последовательности CDR1, CDR2 и CDR3; и вариабельную область легкой цепи, содержащую последовательности CDR1, CDR2 и CDR3, где последовательность CDR3 вариабельной области тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 15, 16, 17 и 18 и их консервативных модификаций, где антитело или антигенсвязывающий фрагмент специфически связываются с CTLA-4.

Предпочтительно, когда последовательность CDR3 вариабельной области легкой цепи вышеуказанного антитела или его антигенсвязывающего фрагмента содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 19, 20, 21 и 22 и их консервативных модификаций.

Предпочтительно, когда последовательность CDR2 вариабельной области тяжелой цепи вышеуказанного антитела или его антигенсвязывающего фрагмента содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 23, 24, 25, 26, 27 и 28 и их консервативных модификаций.

Предпочтительно, когда последовательность CDR2 вариабельной области легкой цепи вышеуказанного антитела или его антигенсвязывающего фрагмента содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 29, 30, 31 и 32 и их консервативных модификаций.

Предпочтительно, когда последовательность CDR1 вариабельной области тяжелой цепи вышеуказанного антитела или его антигенсвязывающего фрагмента содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 33, 34, 35 и 36 и их консервативных модификаций.

Предпочтительно антитело по настоящему изобретению, где последовательность CDR1 вариабельной области легкой цепи вышеуказанного антитела или его антигенсвязывающего фрагмента содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 37, 38, 39, 40 и 41 и их консервативных модификаций.

В более предпочтительном варианте осуществления изобретение относится к антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, где антитело или антигенсвязывающий фрагмент специфически связываются с CTLA-4 и содержат: вариабельную область тяжелой цепи, которая содержит последовательности CDR1, CDR2 и CDR3; и вариабельную область легкой цепи, которая содержит последовательности CDR1, CDR2 и CDR3, где:

a) последовательность CDR1 вариабельной области тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 33, 34, 35 и 36, и последовательность CDR2 содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 23, 24, 25, 26, 27 и 28, последовательность CDR3 содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 15, 16, 17 и 18;

- 4 042725

b) и последовательность CDR1 вариабельной области легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 37, 38, 39, 40 и 41, и последовательность CDR2 содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группа, состоящей из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 29, 30, 31 и 32, последовательность CDR3 содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 19, 20, 21 и 22, где антитело или антигенсвязывающий фрагмент специфически связываются с CTLA-4.

Предпочтительное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержат:

a) CDR1 вариабельной области тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 15;

b) CDR2 вариабельной области тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 23;

c) CDR3 вариабельной области тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 33;

d) CDR1 вариабельной области легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 19;

e) CDR2 вариабельной области легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 29;

f) CDR3 вариабельной области легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 37; где антитело или антигенсвязывающий фрагмент специфически связываются с CTLA-4.

Другое предпочтительное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержат:

a) CDR1 вариабельной области тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 16;

b) CDR2 вариабельной области тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 24;

c) CDR3 вариабельной области тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 34;

d) CDR1 вариабельной области легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 20;

e) CDR2 вариабельной области легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 30;

f) CDR3 вариабельной области легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 38; где антитело или антигенсвязывающий фрагмент специфически связываются с CTLA-4.

a) CDR1 вариабельной области тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 17;

b) CDR2 вариабельной области тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 25;

c) CDR3 вариабельной области тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 35;

e) CDR2 вариабельной области легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 31;

f) CDR3 вариабельной области легкой цепи, содержаще. SEQ ID NO: 39; где антитело или антигенсвязывающий фрагмент специфически связываются с CTLA-4.

a) CDR1 вариабельной области тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 18;

b) CDR2 вариабельной области тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 26;

c) CDR3 вариабельной области тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 36;

d) CDR1 вариабельной области легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 22;

e) CDR2 вариабельной области легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 32;

f) CDR3 вариабельной области легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 40; где антитело специфически связывается с CTLA-4.

b) CDR2 вариабельной области тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 27;

d) CDR1 вариабельной области легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 21;

f) CDR3 вариабельной области легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 39; где антитело или антигенсвязывающий фрагмент специфически связываются с CTLA-4.

b) CDR2 вариабельной области тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 28;

f) CDR3 вариабельной области легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 41; где антитело или анти-

- 5 042725 генсвязывающий фрагмент специфически связываются с CTLA-4.

Последовательности CDR указанных антител представлены в табл. 2 и в списке последовательностей.

Таблица 2

Последовательности CDR антител

Клон ID.		SE Q ID NO	CDR1	SE Q ID NO	CDR2	SE Q ID NO	CDR3
W3162 -1.1 01.2	Тяжела я цепь	33	SSAMH	23	FISSGGDTAYAD AV KG	15	MERIPT
Легкая Цепь	37	RASQSVSISSINL IH	29	RTSNLAS	19	QQSRESP LT
W3162 -1.1 45.10	Тяжела я Цепь	34	NYDMA	24	SISPNGGNTYYR DSVKG	16	HLWFAY
Легкая Цепь	38	QASQDIGSNLI	30	YATHLAD	20	LQYKQY PRT
W3162 -1.1	Тяжела я	35	SGYDWT	25	YISYSGNTNYNPS LKS	17	MMVPHY YVMDA
46.19	Цепь
Легкая Цепь	39	RSSQSLLNSDGN TYLY	31	LVSKLGS	21	VQGTHD PWT
W3162 -1.1 54.8	Тяжела я Цепь	36	NYFMN	26	RVDPENGRADY AEKFKK	18	RAMDNY GFAY
Легкая Цепь	40	SANSSLSYMY	32	GTSNLAS	22	HHWSNT QWT
W3162 -1.1 45.10z7	Тяжела я Цепь	34	NYDMA	27	SISPSGGNTYYRD SVKG	16	HLWFAY
Легкая Цепь	38	QASQDIGSNLI	30	YATHLAD	20	LQYKQY PRT
W3162. 1.14 6.-Z12 W3162 -1.1 46.19	Тяжела я Цепь	35	SGYDWT	25	YISYSGNTNYNPS LKS	17	MMVPHY YVMDA
Тяжела я Цепь	35	SGYDWT	25	YISYSGNTNYNPS LKS	17	MMVPHY YVMDA
W3162. 1.15 4.8-z35	Тяжела я Цепь	36	NYFMN	28	RVDPEQGRADY AEKFKK	18	RAMDNY GFAY
Тяжела я Цепь	41	SANSALSYMY	32	GTSNLAS	22	HHWSNT QWT

Антитела по изобретению могут быть химерными антителами. Антитела по изобретению могут быть гуманизированными антителами. Антитела по изобретению могут быть полностью человеческими антителами. Антитела по изобретению могут быть антителами крысы.

Антитела или их антигенсвязывающие фрагменты по изобретению могут проявлять по меньшей мере одно из следующих свойств:

a) связываются с CTLA-4 человека с KD 2,08Е-09 М или менее и/или с CTLA-4 мыши с KD 1,39E09 M или менее;

b) усиливают высвобождение интерлейкина-2 из стимулированных РВМС.

В дополнительном аспекте изобретение относится к молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей антитело или его антигенсвязывающий фрагмент.

Изобретение относится к клонирующему или экспрессирующему вектору, содержащему молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент.

Изобретение также относится к клетке-хозяину, содержащей один или более клонирующих или экспрессирующих векторов.

Еще в одном аспекте изобретение относится к способу, включающему культивирование клеткихозяина по изобретению и выделение антитела, где антитело получают путем иммунизации крысы SD с помощью внеклеточного домена человеческого CTLA-4 и внеклеточного домена мышиного CTLA-4.

Изобретение относится к трансгенному животному, такому как крыса, содержащему трансгены тяжелой и легкой цепи человеческого иммуноглобулина, где крыса экспрессирует антитело по настоящему изобретению.

Изобретение относится к гибридоме, полученной с использованием крысы по настоящему изобретению, где гибридома продуцирует указанное антитело.

В дополнительном аспекте изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей антитело или антигенсвязывающий фрагмент указанного антитела по изобретению и один или более из фармацевтически приемлемых вспомогательных веществ, разбавителя или носителя.

Изобретение относится к иммуноконъюгату, содержащему указанное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению, связанным с терапевтическим агентом.

- 6 042725

При этом изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей указанный иммуноконъюгат и один или более фармацевтически приемлемых вспомогательных веществ, разбавителя или носителя.

Изобретение также относится к способу получения антитела против CTLA-4 или его антигенсвязывающего фрагмента, включающему:

(a) обеспечение:

(i) последовательности вариабельной области тяжелой цепи антитела, содержащей последовательность CDR1, которая выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NO: 33-36, последовательность CDR2, которая выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NO: 23-28; и последовательность CDR3, которая выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NO: 15-18; и/или (ii) последовательности вариабельной области легкой цепи антитела, содержащей последовательность CDR1, которая выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NO: 37-41, последовательность CDR2, которая выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NO: 29-32, и последовательность CDR3, которая выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NO: 19-22; и (b) экспрессию измененной последовательности антитела в виде белка.

Изобретение также относится к способу модулирования иммунного ответа у пациента, включающему введение пациенту антитела или антигенсвязывающего фрагмента любого из указанных антител по настоящему изобретению.

Изобретение также относится к применению указанного антитела или его антигенсвязывающего фрагмента в производстве лекарственного средства для лечения или профилактики иммунного расстройства или злокачественного новообразования.

Изобретение также относится к способу ингибирования роста опухолевых клеток у пациента, включающему введение пациенту терапевтически эффективного количества указанного антитела или указанного антигенсвязывающего фрагмента для ингибирования роста опухолевых клеток.

При этом изобретение относится к способу, отличающемуся тем, что опухолевые клетки представляют собой клетки злокачественного новообразования, выбранного из группы, состоящей из меланомы, рака почки, рака простаты, рака молочной железы, рака толстой кишки, рака легкого, рака кости, рака поджелудочной железы, рака кожи, рака головы или шеи, кожной или внутриглазной злокачественной меланомы, рака матки, рака яичников и рака прямой кишки.

При этом изобретение относится к способу, отличающемуся тем, что антитело представляет собой химерное антитело, гуманизированное антитело, антитело человека или антитело крысы.

Особенности и преимущества изобретения

Авторы изобретения создали гуманизированные антитела против CTLA-4 с использованием запатентованной технологии гибридомы, в которой антитела ингибировали связывание CTLA-4 с его лигандами CD80 и CD86. Антитела, описанные в настоящем изобретении, имеют высокую аффинность связывания, специфически связываясь с белком CTLA-4 человека и обезьяны; и сильные модулирующие иммунные ответы и увеличение продукции интерлейкина-2.

Одно из антител не только связывается с CTLA-4 человека и обезьяны, но также связывается с CTLA-4 мыши, что может значительно облегчить доклиническую проверку его эффективности на моделях опухолей у мышей.

Краткое описание чертежей

На фиг. 1 показаны графики связывания химерных антител с CTLA-4 человека в ИФА.

На фиг. 2 показаны графики связывания химерных антител с CTLA-4 яванской макаки в ИФА.

На фиг. 3 показаны графики связывания химерных антител с CTLA-4 мыши в ИФА.

На фиг. 4 показаны графики связывания химерных антител с CTLA-4 человека на клетках с помощью FACS.

На фиг. 5 показан результат связывания химерных антител на CTLA-4 человека с помощью SPR.

На фиг. 6 показан результат блокирования связывания лиганда химерными антителами.

На фиг. 7 показаны графики химерных Ab, ингибированных связыванием с CTLA-4, на клетках, экспрессирующих CD80 или CD86.

На фиг. 8 показаны результаты усиленного высвобождения цитокинов химерными антителами из стимулированных SEB РВМС.

На фиг. 9 показаны графики связывания гуманизированных антител с CTLA-4 человека, яванской макаки и мыши в ИФА.

На фиг. 10а показаны графики связывания гуманизированных антител с CTLA-4 на клетках (FACS).

На фиг. 10b показаны графики аффинности гуманизированных антител с использованием FACS.

На фиг. 11 показано с помощью ИФА, что гуманизированные антитела блокируют связывание лиганда.

На фиг. 12 показано с помощью FACS, что гуманизированные антитела блокируют связывание CTLA-4 с его лигандами.

На фиг. 13 показано в анализе SEB, что гуманизированные антитела усиливают высвобождение цитокинов.

- 7 042725

На фиг. 14 показан профиль SEC W3162-1.146.19-Z12 или W3162-1.154.8-Z35 при различных условиях.

На фиг. 15 показан результат эффективности in vivo антитела W3162-146.19-z12.

На фиг. 16 показано, что антитела W3162 специфически связываются с CTLA-4.

Фиг. 17. Связывающая активность антител против CTLA4 с мутантами CTLA-4/CTLA-4 человека. Антитела (А) ипилимумаб, (В) W3162-1.146.19-z 12 и (С) W3162-1.154.8-z35 были захвачены предварительно покрытым 2 мкг/мл козьим антителом против IgG Fc человека, а затем их инкубировали с разбавленным hCTLA4-His (WT) или его мутеинами (N113Q и N145Q), затем добавляли антитело HRP-антиHis с целью детектирования.

На фиг. 18 показаны остатки связывания или эпитопы, картированные на CTLA-4 человека: (А) сайты связывания CD80 (PDB: 1I8L), (В) CD86 (PDB: 1I85), (С) тремелимумаб (PDB: 5GGV), (D) ипилимумаб, (Е) W3162-1.146.19-z12 и (F) W3162-1.154.8-z35 соответственно. CTLA-4-структура IAH1 была использована для DF, чтобы показать структуру гликозилирования.

Подробное описание

Для того чтобы настоящее изобретение было более понятным, сначала дается определение некоторым терминам. Дополнительные определения приведены в подробном описании.

Термины антиген-4, ассоциированный с цитотоксическими Т-лимфоцитами, Белок CTLA-4, CTLA-4, CTLA4, CD152 используются взаимозаменяемо и включают варианты, изоформы, видовые гомологи человеческого CTLA-4 или CTLA-4 других видов, и аналоги, имеющие по меньшей мере один общий эпитоп с CTLA-4.

Термин антитело в контексте настоящего описания включает цельные антитела и любой антигенсвязывающий фрагмент (то есть антигенсвязывающую часть) или их отдельные цепи. Антитело относится к белку, содержащему по меньшей мере две тяжелые (Н) цепи и две легкие (L) цепи, связанные между собой дисульфидными связями, или их антигенсвязывающую часть. Каждая тяжелая цепь состоит из вариабельной области тяжелой цепи (сокращенно обозначенной в настоящем описании как VH) и константной области тяжелой цепи. Константная область тяжелой цепи обычно состоит из трех доменов, CH1, CH2 и СН3. Каждая легкая цепь состоит из вариабельной области легкой цепи (сокращенно обозначенной здесь как VL) и константной области легкой цепи. Константная область легкой цепи состоит из одного домена, CL. Области VH и VL могут быть далее подразделены на области гипервариабельности, называемые областями, определяющими комплементарность, (CDR), с вкраплениями областей, которые являются более консервативными, называемыми каркасными областями (FR). Каждая VH и VL состоит из трех CDR и четырех FR, расположенных от N-конца к С-концу в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Вариабельные области тяжелой и легкой цепей содержат связывающий домен, который взаимодействует с антигеном.

Термин антитело, используемый в настоящем описании, относится к иммуноглобулину или его фрагменту или его производному и охватывает любой полипептид, содержащий антигенсвязывающий сайт, независимо от того, получен ли он in vitro или in vivo. Этот термин включает, но не ограничивается ими, поликлональные, моноклональные, моноспецифичные, полиспецифичные, неспецифичные, гуманизированные, одноцепочечные, химерные, синтетические, рекомбинантные, гибридные, мутированные и трансплантированные антитела. Термин антитело также включает фрагменты антител, такие как Fab, F(ab')2, Fv, scFv, Fd, dAb и другие фрагменты антител, которые сохраняют антигенсвязывающую функцию, то есть способность специфически связываться с CTLA-4. Обычно такие фрагменты содержат антигенсвязывающий фрагмент.

Термины антигенсвязывающий фрагмент, антигенсвязывающий домен и связывающий фрагмент относятся к части молекулы антитела, которая содержит аминокислоты, ответственные за специфическое связывание между антителом и антигеном. В тех случаях, когда антиген является крупным, антигенсвязывающий фрагмент может связываться только с частью антигена. Часть молекулы антигена, которая отвечает за специфические взаимодействия с антигенсвязывающим фрагментом, называется эпитоп или антигенная детерминанта.

Антигенсвязывающий фрагмент обычно содержит вариабельную область легкой цепи антитела (VL) и вариабельную область тяжелой цепи антитела (VH), однако он необязательно должен включать их обе. Например, так называемый фрагмент Fd антитела состоит только из домена VH, но все еще сохраняет некоторую антигенсвязывающую функцию интактного антитела.

В соответствии с вышеизложенным термин эпитоп определяет антигенную детерминанту, которая специфически связывается/идентифицируется связывающим фрагментом, как определено выше. Связывающий фрагмент может специфически связываться/взаимодействовать с конформационными или непрерывными эпитопами, которые являются уникальными для структуры мишени, например CTLA-4 человека и CTLA-4 мыши. Конформационный или прерывистый эпитоп характеризуется для полипептидных антигенов наличием двух или более отдельных аминокислотных остатков, которые разделены в первичной последовательности, но собираются вместе на поверхности молекулы, когда полипептид складывается в нативный белок/антиген. Два или более отдельных аминокислотных остатка, вносящих вклад в эпитоп, присутствуют на отдельных участках одной или более полипептидных цепей. Эти остат- 8 042725 ки объединяются на поверхности молекулы, когда полипептидная цепь(цепи) складывается(складываются) в трехмерную структуру, образуя эпитоп. Напротив, непрерывный или линейный эпитоп состоит из двух или более отдельных аминокислотных остатков, которые присутствуют в одном линейном сегменте полипептидной цепи.

Термин связывается с эпитопом CTLA-4 относится к антителам, имеющим специфическое связывание с конкретным эпитопом CTLA-4, которое может быть определено линейной аминокислотной последовательностью или третичной, то есть трехмерной конформацией на части полипептида CTLA-4. Связывание означает, что аффинность антител к части CTLA-4 существенно больше, чем их аффинность к другим родственным полипептидам. Термин существенно большая аффинность означает, что наблюдается измеримое увеличение аффинности для части CTLA-4 по сравнению с аффинностью для других связанных полипептидов. Предпочтительно, аффинность по меньшей мере в 1,5 раза выше, в 2 раза, в 5 раз в 10 раз, 100 раз, в 103 раз, в 10⁴ раз, в 105 раз, в 10⁶ раз выше или более для конкретной части CTLA-4, чем для других белков. Предпочтительно аффинность связывания определяют с помощью иммуноферментного анализа (ИФА), или с помощью флуоресцентно-активированной сортировки клеток (FACS) или поверхностного плазмонного резонанса (SPR). Более предпочтительно, специфичность связывания получают с помощью анализа флуоресцентно-активированной сортировки клеток (FACS).

Термин перекрестная реактивность относится к связыванию фрагмента антигена, описанного в настоящем документе, с одной и той же молекулой-мишенью у человека, обезьяны и/или мыши (мыши или крысы). Таким образом, перекрестную реактивность следует понимать как межвидовую реактивность к одной и той же молекуле X, экспрессируемой у разных видов, но не к молекуле, отличной от X. Межвидовая специфичность моноклонального антитела, распознающего, например, человеческий CTLA-4, к обезьяньему и/или мышиному (мышиному или крысиному) CTLA-4 могут быть определены, например, с помощью анализа FACS.

Используемый в настоящем описании термин субъект включает любое животное, включая человека или отличное от него. Термин животное, отличное от человека включает в себя всех позвоночных животных, например млекопитающих и не млекопитающих, таких как приматы, отличные от человека, овцы, собаки, кошки, лошади, коровы, цыплята, земноводные, рептилии и т.д. За исключением оговоренных случаев, термин пациент или субъект используются взаимозаменяемо.

Термины лечение и терапевтический метод относятся как к терапевтическому лечению, так и к профилактическим/превентивным мерам. Те, кто нуждается в лечении, могут включать людей, уже имеющих определенное медицинское расстройство, а также тех, кто может в конечном итоге приобрести расстройство.

Термины консервативные модификации, то есть модификации нуклеотидной и аминокислотной последовательности, которые не оказывают существенного влияния или не изменяют характеристики связывания антитела, кодируемого нуклеотидной последовательностью или содержащего аминокислотную последовательность. Такие консервативные модификации последовательности включают замены, добавления и делеции нуклеотидов и аминокислот. Модификации могут быть введены в последовательность стандартными методами, известными в данной области, такими как сайт-направленный мутагенез и ПЦР-опосредованный мутагенез. Консервативные аминокислотные замены включают замены, в которых аминокислотный остаток заменен аминокислотным остатком, имеющим сходную боковую цепь. Семейства аминокислотных остатков, имеющих сходные боковые цепи, были определены в данной области. Эти семейства включают аминокислоты с боковыми цепями со свойствами оснований (например, лизин, аргинин, гистидин), боковыми цепями со свойствами кислот (например, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота), с незаряженными полярными боковыми цепями (например, глицин, аспарагин, глутамин, серин, треонин, тирозин, цистеин, триптофан), с неполярными боковыми цепями (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин), бетаразветвленными боковыми цепями (например, треонин, валин, изолейцин) и ароматическими боковыми цепями (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин).

Экспериментальные методы в следующих примерах являются обычными методами, если не указано иное.

Примеры

Пример 1. Приготовления материалов исследования.

1. Экспрессия и очистка растворимого CTLA-4.

Гены внеклеточного домена (ECD) человека и мыши CTLA-4 с гексагистидином (6xHis) или Fc-меткой клонировали в экспрессирующий вектор, а затем использовали для трансфекции клеток Expi293 с использованием набора Expi293 Expression System Kit. Клетки культивировали в среде Expi293 Expression Medium, на платформе орбитального шейкера, вращающейся со скоростью 135 об/мин, в инкубаторе при 37°С, содержащем увлажненную атмосферу с 8% СО₂. Собранный супернатант использовали для очистки белка. Белки, меченные гексагистидином, очищали с использованием колонки Ni-NTA, a белки, меченные Fc, очищали с использованием колонки с протеином А.

2. Разработка клеточных линий.

Ген полноразмерного человеческого CTLA-4 был клонирован в экспрессирующий вектор для получения стабильной клеточной линии. Вкратце, клетки 293F объемом 30 мл при плотности 1х10⁶/мл транс- 9 042725 фецировали 30 мкг ДНК с использованием реагента Plasfect. Трансфецированные клетки помещали в инкубатор при 37°С, 8% СО2 и скорости встряхивания 100 об/мин. Через 24-48 ч после трансфекции использовали бластицидин в конечной концентрации 4-6 мкг/мл для отбора стабильных клонов. Отобранные клоны тестировали с помощью FACS с использованием антитела против CTLA-4.

Чтобы получить клетки, экспрессирующие CTLA-4 яванской макаки, ген полноразмерного CTLA-4 яванской макаки клонировали в экспрессирующий вектор для получения пула клеток. Вкратце, объем 30 мл клеток 293F при плотности 1х10⁶/мл трансфецировали 30 мкг ДНК с использованием реагента Plasfect Reagent (Life Technology). Трансфецированные клетки помещали в инкубатор при 37°С, 8% СО₂и скорости встряхивания 100 об/мин. Через 24 ч после трансфекции использовали бластидин в конечной концентрации 4 мкг/мл для отбора пула клеток. Отобранные клеточные пулы тестировали с помощью FACS с использованием антитела против CTLA-4.

Пример 2. Генерация гибридомных антител.

1. Иммунизация.

Человеческий CTLA-4 и мышиный CTLA-4 использовали для иммунизации крыс SD.

Конкретно, трех SD-крыс иммунизировали 30 мкг/животного ECD-белка CTLA-4 человека и мыши в адъюванте. Адъювант включал Titer-Max, Adju-Phos и CpG-ODN. Крысам вводили инъекцию один раз в неделю как в лапку, так и подкожно. Титр антител в сыворотке измеряли с помощью ИФА каждый месяц. Когда уровень антител был достаточно высоким, крыса с наивысшим титром получала конечное бустерное введение с помощью белка ECD CTLA-4 человека и мыши в фосфатно-солевом буфере Дульбекко (DPBS) без адъюванта. Через несколько дней проводили забор селезенки и лимфатических узлов у крысы, и лимфоциты отделяли для слияния.

2. Слияние клеток.

Слияние клеток проводили следующим образом. Клетки миеломы SP2/0 оттаивали за неделю до слияния и разделяли по 1:2 каждый день до дня, предшествующего слиянию, чтобы сохранить их в логарифмическом росте. В-Лимфоциты, выделенные из лимфатического узла иммунизированных клеток крысы и миеломы, соответственно, обрабатывали трипсином и реакцию останавливали добавлением FBS. В-Лимфоциты объединяли с клетками миеломы в соотношении 1:1. Затем смесь клеток промывали и ресуспендировали при 2x106 клеток/мл в растворе для электрического слияния, содержащем 0,3 М сахарозы, 0,1 мМ ацетата магния и 0,1 мМ ацетата кальция. Электрическое слияние клеток проводили с использованием Btx Electro Cell Manipulator (Ecm 2001) в соответствии со стандартным протоколом производителя. Затем суспензию клеток из камеры слияния немедленно переносили в стерильную колбу, содержащую свежую среду, и инкубировали в течение 2 ч в инкубаторе при 37°С. Суспензию клеток затем смешивали и переносили в 60 96-луночных планшетов (1x10⁴ клеток/лунку). 96-луночные планшеты культивировали при 37°С и 5% СО₂ с периодическим мониторингом. Когда клоны были достаточно большими (через 7-10 дней), удаляли 180 мкл/лунку супернатанта и затем добавляли 200 мкл свежей среды на лунку. Через 72 ч 100 мкл супернатанта переносили из культуральных планшетов в 96-луночные аналитические планшеты для скрининга.

3. Скрининг гибридом.

Большое количество гибридомных клонов подвергали скринингу на связывание с белками CTLA-4 человека, мыши и обезьяны, а также сконструированными клетками, экспрессирующими CTLA-4 человека. После того, как специфическая связывающая и блокирующая активность CTLA-4 были проверены посредством первого и второго скрининга, положительные линии гибридомы субклонировали в 96-луночные планшеты с использованием лимитированного разведения. Планшеты культивировали при 37°С, 5% СО₂ до тех пор, пока положительные клоны не были подвергнуты дополнительному скринингу на предмет конкуренции с лигандами CD80 и CD86, связывающимися с CTLA-4. Культуральные супернатанты отобранных положительных клонов собирали для очистки антител и дальнейшей характеристики. Ведущие кандидаты были отобраны для секвенирования VH и VL.

4. Определение VH и VL последовательностей из гибридомы.

Гены VH и VL антител отобранных гибридомных клонов выделяли с помощью ОТ-ПЦР или 5'RACE. Конкретно, общую РНК выделяли из клеток гибридомы с использованием RNeasy Plus Mini Kit (Qiagen). кДНК первой цепи была подвергнута обратной транскрипции с использованием oligo dT. Гены VH и VL антител амплифицировали из кДНК с использованием вырожденного 3'-праймера константной области и наборов вырожденных 5'-праймеров. Вырожденные 5'-праймеры были сконструированы на основе области, кодирующей сигнальную последовательность в 5'-области вариабельных последовательностей Ig. Затем продукт ПНР лигировали в вектор pMD18-T и 10 мкл продукта лигирования трансформировали в компетентные клетки Тор10. Трансформированные клетки высевали на чашки 2xYT с карбенициллином и инкубировали в течение ночи при 37°С. Случайно отбирали 15 положительных колоний для секвенирования ДНК с помощью Biosune. Альтернативно, 5'-RACE использовали для идентификации последовательностей VH и VL отобранных гибридомных клонов. Сначала РНК подвергали обратной транскрипции в кДНК с использованием набора 5'-RACE (Takara-28001488), а затем проводили ПЦР с использованием 3'-вырожденных праймеров и 3'-адаптерных праймеров (ExTaq: Takara-RR001B). Фраг- 10 042725 менты ПНР вводили в вектор pMD18-T (Takara-D101C) и отправляли для секвенирования (Biosune,

Shanghai).

Пример 3. Получение и характеристика химерных антител.

1. Производство химерных антител.

Выведенные аминокислотные последовательности VH и VL перечислены в табл. 3.

Подчеркнутые последовательности представляют собой CDR, определенные системой картирования по Kabat. Вариабельные области этих крысиных антител были слиты с константной областью человеческого антитела, и химерные антитела были экспрессированы из клеток Expi293 и очищены с использованием хроматографии с протеином А.

Таблица 3

Последовательность вариабельной области антитела против CTLA-4 крысы

Клон ID	SEQ ID NO	Аминокислотная последовательность
W3162-1. 101.2	VH	1	EEOLVESGGGLVQPGKSLKLSCSASGFTFRSSAMHWIROPPGKGL DWVAFISSGGDTAYADAVKGRHVSRDNAENTLFLOLNSLKSED TAIYYCVRMERIPTWGOGVMVTVSS
VL	8	DIVLTOSPVLAVSLGORATISCRASOSVSISSINLIHWYOQRPGOO PKLLIYRTSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLSIDPVOADDVADYYCO QSRESPLTFGSGTKLEIK
W3162-1 .145.10	VH	2	EVOLVESGGGLVOPGRSLKLSCAASDLTFSNYDMAWVROTPTKG LEWVASISPNGGNTYYRDSVKGRFTVSRDNAKNSLYLQMDSLRS EDTATYYCARHLWFAYWGOGTLVTVSS
VL	9	DIOMTOSPSSMSASLGDRVTISCOASODIGSNLIWFOQKPGKSPRP MIYYATHLADGVPSRFSGSRSGSDYSLTISSLESEDVADYHCLQY KQYPRTFGGGTKLELK
W3162-1. 146.19	VH	3	_{EV0L0ESGPGLVKPS0SLSLTGSVTYHTITSGYDWTWIRKFPGN0}MEWMGYISYSGNTNYNPSLKSRISITRDTSKNQFFLHLNSVTSED TATYYCASMMVPHYYVMDAWGOGASVTVSS
VL	10	DVVLTOTPPTSSATIGOSVSISCRSSOSLLNSDGNTYLYWYLORPS QSPQLLIYLVSKLGSGVPNRFSGSGSGTDFTLKISGVEAEDLGLYY CVOGTHDPWTFGGGTKLELK
W3162-1. 154.8	VH	4	EVOLOOSGPEAGRPGSSVKISCKASGYTFTNYFMNWVKOSPGOG LEWIGRVOTENGRADYAEKFKKKATLTADTTSNTAYIHLSSLTS EDTATYFCARRAMDNYGFAYWGOGTLVTVSS
VL	11	EIMLTQSPTIMAASLGEKITITCSANSSLSYMYWFQQKSGASPKLW VHGTSNLASGVPDRFSGSGSGTSYYLTINTMEAEDAATYFCHIIW SNTQWTFGGGTKLELK

2. Характеристика химерных антител.

2.1. Антитела, связанные с CTLA-4 человека, обезьяны и мыши (ИФА, FACS и SPR). Химерные антитела с вариабельной областью крысы и константной областью человека экспрессировали из клеток млекопитающих и очищали с использованием аффинной хроматографии с протеином А.

Антитела тестировали на ИФА со связыванием CTLA-4. Как показано на фиг. 1-3, все четыре антитела, связывающиеся с CTLA-4 человека и обезьяны, с EC₅₀ сопоставимы с ипилимумабом (WBP316BMK1), но только одно антитело W3162-1.146.19 также связь с мышиным CTLA-4 с EC₅₀0,01 нМ. Чтобы подтвердить, что антитела способны связываться с CTLA-4 на клеточной поверхности, в анализах FACS использовали линию клеток, экспрессирующую CTLA-4. Эти антитела также связывались с CTLA-4 на клеточной поверхности (фиг. 4) с EC₅₀ в диапазоне от 1,14 до 9,42 нМ. W3162-1.146.19 связывается с CTLA-4 на клеточной поверхности с EC₅₀ 3,25 нМ и W3162-1.154.8 связывается с CTLA-4 на клеточной поверхности с EC₅₀ 1,26 нМ.

Кинетику связывания четырех антител измеряли с использованием SPR. Антитела захватывали на иммобилизованном козьем антителе против человеческого Fc, а затем в различных концентрациях упорядоченно вводили ECD CTLA-4 человека. Сенсограммы для эталонного канала и буферного канала вычитали из тестовых сенсограмм. Данные были использованы для анализа связывания 1:1. Как показано на фиг. 5 и в табл. 4, все четыре антитела связывались с ECD-доменом человеческого CTLA-4 с более высокой аффинностью, чем ипилимумаб (WBP316-BMK1), с диапазоном KD от 2,08 Е-09 до 6.80Е-11 нМ.

Таблица 4

Кинетика связывания антител с ECD CTLA-4 человека

Антитело	ka(l/Ms)	kd (1/s)	KD (M)
W3162-1.101.2 xAb.IgGl	6.95E+05	6.97E-05	1.00E-10
W3162-l.145.10xAb.IgGl	7.93E+06	1.65E-02	2.08E-09
W3162-1.146.19xAb.TgGl	7.09E+05	1.48E-04	2.08E-10
W3162-1.154.8 xAb.IgGl	1.85E+06	1.25E-04	6.8OE-11
WBP316 BMK1	9.42E+05	3.46E-03	3.68E-09

2.2. Конкуренция с лигандами химерных антител.

Было обнаружено, что CTLA-4 связывается как с CD80, так и с CD86 с аффинностю в 20-50 раз бо

- 11 042725 лее высокой, чем с CD28 [Krummel 1996]. Следовательно, антитела против CTLA-4 были протестированы на предмет их способности конкурировать со связыванием CD80 и CD86 с CTLA-4. В качестве конкурентных анализов использовали как ИФА, так и FACS. В конкурентном анализе на основе ИФА человеческие CTLA-4 наносили на планшеты, и антитела, смешанные с биотинилированными лигандами, добавляли в планшет. Связанные лиганды были обнаружены с помощью HRP конъюгированного стрептавидина. Как показано на фиг. 6а и 6b, все четыре антитела конкурировали с лигандами CD80 (В7-1, L1) и CD86 (В7-2, L2) в связывании CTLA-4, и три из них, за исключением W3162-1.101.2, имели сравнимую EC₅₀ с ипилимумабом (WBP316-BMK1). В анализе FACS смесь антител и биотинилированного человеческого CTLA-4 добавляли к клеткам, экспрессирующим CD80 или CD86, и связанный человеческий CTLA-4 детектировали с помощью РЕ-конъюгированного стрептавидина. Как показано на фиг. 7а (верхняя панель) и 7b (нижняя панель), все четыре антитела могут эффективно блокировать связывание CTLA-4 с клетками, экспрессирующими лиганд. Три антитела, за исключением W3162-1.154.8, могли полностью блокировать связывание CTLA-4 на клетках с CD80, тогда как ипилимумаб WBP316-BMK мог только частично блокировать это связывание даже при 200 нМ, самой высокой использованной концентрации (фиг. 7а). В анализе FACS блокирования связывания CTLA-4 на клетках с CD86 (фиг. 7b) все 4 антитела могли полностью блокировать связывание CTLA-4 на клетках с CD86, тогда как ипилимумаб мог лишь частично блокировать это связывание даже при 200 нМ, самой высокой использованной концентрации. Кинетика W3162-1.101.2 выглядела иначе: блокирование было менее эффективным, чем у ипилимумаба, при низкой концентрации, и более эффективным, чем ипилимумаба, в высокой концентрации. Другие три антитела были более эффективными, чем ипилимумаб, в блокировании CTLA-4 при всех протестированных концентрациях.

2.3. Функция в анализе SEB химерных антител.

Функцию антител против CTLA-4 с различной концентрацией 1,34, 3,35, 8,71, 21,4, 53,6, 134 нМ тестировали в модифицированном анализе стимулирования Т-клеток (анализ SEB). Стафилококковый энтеротоксин В (SEB) использовали в качестве стимулятора активации Т-клеток человека, причем CTLA-4 был назван важным игроком. Активацию Т-клеток измеряли секрецией IL-2. Как показано на фиг. 8, все четыре антитела стимулируют секрецию IL-2 в зависимости от дозы, сравнимой или превосходящей дозу Ипилимумаба.

Пример 4. Характеристика гуманизированного антитела.

1. Гуманизация.

Подход наилучшего соответствия использовали для гуманизации легких и тяжелых цепей антител.

Три антитела против CTLA-4 (кроме W3162-1.101.2 из-за его относительно низкой активности связывания в ИФА и FACS) были отобраны для гуманизации с использованием техники трансплантации CDR. CDR (подчеркнуты в табл. 5) и FR вариабельные области антител определяли с использованием системы Kabat. В соответствии с гомологией последовательности и структурным сходством область гена крысы FR1-3 была заменена гуманизированной областью FR1-3, тогда как область FR4 гена крысы была заменена гуманизированной областью FR4, полученной из генов JH и JK, которые имели наиболее сходные структуры. Горячие точки пост-трансляционных модификаций (РТМ) вариабельных областей были модифицированы для снижения риска РТМ. После проверки последовательности матрицы и оптимизации кодонов вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи синтезировали и клонировали в экспрессирующий вектор, а затем использовали для экспрессии гуманизированных антител. Гуманизированные антитела очищали с использованием хроматографии на протеине А, а кинетику связывания CTLA-4 человека, обезьяны и мыши измеряли с использованием метода SPR.

- 12 042725

Таблица 5

Последовательность вариабельной области гуманизированных антител против CTLA-4

Клон ID	SEQ ID NO	Аминокислотная последовательность
W3162-1.1 45.10-Z7	VH	5	EVOLVES GGGLVOPGGSLRLSCAASDLTFSNYDMAWVROAPG KGLEWVASISPSGGNTYYRDSVKGRFTISRDNAKNSLYLOMNS LRAEDTAVYYCARHLWFAYWGOGTLVTVSS
VL	12	DIOMTOSPSSLSASVGDRVTITCOASODIGSNLIWFOQKPGKAP KPMIYYATHLADGVPSRFSGSRS GTD YTLTIS SLQPEDFATYYCL QYKQYPRTFGGGTKVEIK
W3162.1.14 6.19-Z12	VH	6	QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCSVTYHTITSGYDWTWIRKPPGK GMEWIGYISYSGNTNYNPSLKSRVTISRDTSKNQFFLKLSSVTA ADTAVYYCASMMVPHYYVMDAWGQGTLVTVSS
VL	13	DIVMTOTPLSLSVTPGOPASISCRSSOSLLNSDGNTYLYWYLQK PGOSPOLLIYLVSKLGSGVPNRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVG VYYCVQGTHDPWTFGGGTKVEIK
W3162.1.15 4.8-z35	VH	7	QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTNYFMNWVRQAP GOGLEWMGRVDPEQGRADYAEKFKKRVTITADKSTSTAYMEL SSLRSEDTAVYYCARRAMDNYGFAYWGQGTLVTVSS
VL	14	EIVLTOSPDFOSVTPKEKVTITCSANSALSYMYWYOOKPDQSP KLWVHGTSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTINSLEAEDAATYYC HHWSNTQWTFGGGTKVEIK

Таблица 6

Вариабельная область гуманизированных антител против CTLA-4

Клон ID	SEQ ID NO	Последовательность ДНК
W31621.145	VH	42	GAGGTGCAGCTGGTGGAGAGCGGCGGAGGACTGGTGCAA CCTGGCGGAAGCCTGAGACTGAGCTGCGCCGCCAGCGACC TGACCTTCAGCAACTACGACATGGCCTGGGTGAGACAGGC CCCTGGCAAGGGACTGGAGTGGGTGGCCAGCATCAGCCCC AGCGGCGGCAACACCTACTACAGGGACAGCGTGAAGGGC AGGTTCACCATCAGCAGGGACAACGCCAAGAACAGCCTGT ACCTGCAGATGAACAGCCTGAGGGCCGAGGACACCGCCG TGTACTACTGCGCCAGGCACCTGTGGTTCGCCTACTGGGG CCAGGGCACACTGGTGACCGTGAGCAGC
,10-z7	VL	45	GACATCCAGATGACCCAGAGCCCTAGCAGCCTGAGCGCCA GCGTGGGCGATAGGGTGACCATCACCTGCCAGGCCAGCCA GGACATCGGCAGCAACCTGATCTGGTTCCAGCAGAAGCCC GGCAAGGCCCCCAAGCCTATGATCTACTACGCCACCCACC TGGCCGATGGCGTGCCTAGCAGATTCAGCGGCAGCAGAAG CGGCACCGACTACACCCTGACCATCAGCAGCCTGCAGCCC GAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCTGCAGTACAAGCAGT ACCCCAGAACCTTCGGCGGCGGCACCAAGGTGGAGATCA AG
W31621.146 . 19-Ζ12	VH	43	CAGGTGCAGCTGCAGGAGAGCGGACCCGGACTGGTGAAG CCCTCCGAGACCCTGAGCCTGACCTGCAGCGTGACCTACC ACACCATCACCAGCGGCTACGACTGGACCTGGATCAGAAA GCCCCCCGGCAAAGGCATGGAGTGGATCGGCTACATCAGC TACAGCGGCAACACCAACTACAACCCCAGCCTGAAGAGC AGGGTGACCATCAGCAGGGACACCAGCAAGAACCAGTTC TTCCTGAAGCTGAGCAGCGTGACAGCCGCCGATACCGCCG

- 13 042725

W31621.154 .8-ζ35

TGTACTACTGCGCCAGCATGATGGTGCCCCACTACTACGT GATGGACGCCTGGGGACAGGGCACCCTGGTGACAGTGAG CAGCGACATCGTGATGACCCAGACCCCCCTGAGCCTGAGC GTGACACCTGGACAGCCCGCCAGCATCAGCTGCAGGTCCA GCCAGAGCCTGCTGAACAGCGACGGCAACACCTACCTGTA CTGGTACCTGCAGAAGCCTGGCCAGAGCCCCCAGCTGCTG ATCTACCTGGTGTCCAAGCTGGGCAGCGGCGTGCCTAACA GGTTTAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGATTTCACCCTGAA GATCAGCAGGGTGGAGGCCGAGGATGTGGGCGTGTACTA CTGCGTGCAGGGCACCCACGATCCTTGGACCTTCGGCGGC nrz Л Л Г'Г' Λ Λ Γ.Γ.ΤΓ.Γ. Λ η л τν Λ Λ η________________________________ CAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGAGCCGAGGTGAAGAAG CCCGGCAGCAGCGTGAAGGTGAGCTGCAAGGCCAGCGGC TACACCTTCACCAACTACTTCATGAACTGGGTGAGGCAGG CCCCTGGACAAGGCCTGGAGTGGATGGGCAGAGTGGATCC CGAGCAGGGCAGGGCCGACTACGCCGAGAAGTTCAAGAA GAGGGTGACCATCACCGCCGACAAGAGCACCAGCACCGC CTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGGAGCGAGGACACCGC CGTGTACTACTGCGCCAGGAGAGCCATGGACAACTACGGC TTCGCCTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTGACCGTGAGCA GC

GAGATCGTGCTGACCCAGAGCCCCGACTTCCAGAGCGTGA CCCCCAAGGAGAAGGTGACCATCACCTGCAGCGCCAACA GCGCCCTGAGCTACATGTACTGGTACCAGCAGAAGCCCGA CCAGAGCCCCAAGCTGTGGGTGCACGGCACCAGCAATCTG GCCAGCGGCGTGCCTAGCAGATTTAGCGGCAGCGGCAGCG GCACCGATTTCACCCTGACCATCAACAGCCTGGAGGCCGA GGACGCCGCTACCTACTACTGCCACCACTGGAGCAACACC CAGTGGACCTTCGGCGGCGGCACCAAGGTGGA GATCAAG

2. Характеристика гуманизированных антител.

2.1. Антитела, связанные с CTLA-4 человека, обезьяны и мыши.

2.1.1. CTLA-4-связывающий ИФА.

Гуманизированные антитела были экспрессированы из клеток млекопитающих и очищены с использованием аффинной хроматографии с протеином А. Ипилимумаб был из коммерческого источника. Антитело контроля изотипа, ECD CTLA-4 человека с различными метками (hFc или 6xHis) и мышиный CTLA-4.ECD-hFc были приготовлены WuXi Biologies. Мышиный CTLA-4.ECD-6xHis и CTLA-4.ECD6xHis яванской макаки были приобретены у Sino Biological. HRP-конъюгированное козье антитело против человеческого Fc IgG было приобретен у Bethyl (Cat: A80-304P).

ИФА использовали для тестирования связывания антител против человеческого CTLA-4 с белком CTLA-4 человека, мыши и яванской макаки. 96-луночный планшет был покрыт человеческим CTLA4.ECD-6xHis (1,0 мкг/мл), CTLA-4.ECD-6xHis яванской макаки (0,5 мкг/мл) или мышиным CTLA-4.ECD6xHis (0,5 мкг/мл) при 4°С в течение 16-20 ч. После 1 ч блокирования 2% BSA в DBPS добавляли в планшеты тестирующие антитела, а также антитела положительного и отрицательного контроля и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 ч. Связывание антител с планшетами детектировали с помощью HRP-конъюгированного козьего антитела против человеческого IgG (разведение 1:5000) с 1-часовой инкубацией. Цвет проявился путем распределения 100 мкл субстрата ТМВ в течение 8 мин, а затем реакцию останавливали 100 мкл 2 N HCl. Поглощение при 450 нМ измеряли с использованием спектрофотометра на микропланшете.

Как показано на фиг. 9, два антитела W3162-1.146.19-z12-IgGk и W3162-1.154.8-z35-IgGk связывались с CTLA-4 человека с ЕС₅₀ 0,03 нМ и 0,04 нМ, что, соответственно, немного выше, чем ЕС₅₀ Ипилимумаба (WBP316-BMK1) 0,01 нМ (фиг. 9А). Два антитела также связывались с CTLA-4 обезьяны с ЕС₅₀0,05 нМ (фиг. 9В), но только W3162-1.146.19-z12-IgGk связывались с мышиным CTLA-4 с ЕС₅₀ 0,19 нМ. Ни W3162-1.154.8-z35-IgGk, ни ипилимумаб не связывались с мышиным CTLA-4 (фиг. 9С).

2.1.2. CTLA-4-связывающий FACS.

Клеточная линия, экспрессирующая человеческий CTLA4, 293F, была разработана WuXi Biologies. РЕ-конъюгированное козье антитело против Fc-фрагмента IgG человека было приобретено у Jackson (номер по каталогу 109-115-098). В каждую лунку 96-луночного планшета добавляли 1х10⁵ клеток на лунку и центрифугировали при 1500 об/мин в течение 4 мин при 4°С перед удалением супернатанта. Последовательные разведения тестируемых антител, положительные и отрицательные контроли добавляли к ресуспендированным клеткам и инкубировали в течение 1 ч при 4°С. Клетки дважды промывали 200 мкл DPBS, содержащим 1% BSA. РЕ-конъюгированное козье антитело против человеческого IgG (1:100), разведенное в DPBS, содержащем 1% BSA, добавляли к клеткам и инкубировали при 4°С в течение 1 ч. Дополнительные стадии промывки проводили два раза с 200 мкл DPBS, содержащим 1% BSA, с последующим центрифугированием при 1500 об/мин в течение 4 мин при 4°С. Наконец, клетки ресуспендировали в 100 мкл DPBS, содержащим 1% BSA, и значения флуоресценции измеряли с помощью проточной цитометрии и анализировали с помощью Flow Jo.

Эти антитела были также способны связываться с человеческим CTLA-4 на клеточной поверхности в анализе FACS. Как показано на фиг. 11 (фиг. 10а и 10b), W3162-1.146.19-z12-IgGk, W3162-1.154.8-z35- 14 042725

IgGk и ипилимумаб имели слегка различающиеся значения ЕС₅₀, равные 1,58, 0,66 и 0,83 нМ соответственно.

2.2. Кинетика связывания этих антител.

2.2.1. Кинетику связывания этих антител измеряли с использованием SPR.

Эксперимент заключался в измерении константны ассоциации (ka) и константны диссоциации (kd) антител к ECD CTLA-4 на основе технологии SPR. Следовательно, определяли константу аффинности (KD).

Biacore T200, сенсорную микросхему серии S CM5, набор для соединения амина и 10 х HBS-EP были приобретены у GE Healthcare. Козье антитело против Fc IgG человека было приобретено в Jackson ImmunoResearch Lab (номер по каталогу 109-005-098). На стадии иммобилизации активационный буфер готовили путем смешивания 400 мМ EDC и 100 мМ NHS непосредственно перед инъекцией. Сенсорный чип СМ5 активировался в течение 420 с с помощью буфера активации. Затем 30 мкг/мл козьего антитела против Fcy IgG человека в 10 мМ NaAc (pH 4,5) инъецировали в каналы Fcl-Fc4 в течение 200 с при скорости потока 5 мкл/мин. Чип дезактивировали 1 М этаноламин-HCl (GE). Затем антитела захватывали на чипе. Вкратце, 4 мкг/мл антител в рабочем буфере (HBS-EP +) инъецировали индивидуально в канал Fc3 в течение 30 с при скорости потока 10 мкл/мин. Восемь различных концентраций (20, 10, 5, 2,5, 1,25, 0,625, 0,3125 и 0,15625 нМ) аналита CTLA-4 (WBP316.hCTLA-4.ECD-6xHis) и пустой рабочий буфер вводили последовательно в каналы Fc1-Fc4 при скорости потока 30 мкл/мин для фазы ассоциации 120 с, за которой следует фаза диссоциации 2400 с. Регенерирующий буфер (10 мМ глицин, рН 1,5) вводили со скоростью 10 мкл/мин в течение 30 с после каждой фазы диссоциации.

Кинетику связывания этих антител измеряли с помощью SPR. Антитела были захвачены на иммобилизованном антителе против человеческого Fc, и CTLA-4-ECD в различных концентрациях вводили упорядоченно. Сенсограммы для эталонного канала и канала буфера вычитали из тестовых сенсограмм. Данные были использованы для анализа связывания 1:1 на CTLA-4.ECD-6xHis человека, обезьяны и мыши. Как показано в табл. 7, гуманизированные антитела W3162-1.146.19-Z12, W145 и W3162-1.154.8Z35 связывались с доменом CTLA-4-ECD человека с аффинностью 0,477, 1,84 и 0,0968 нМ соответственно. По сравнению с антителами крысы гуманизированные антитела имели сравнимую аффинность. W3162-1.146.19-Z12 и W3162-1.154.8-Z35 имеют значительно более высокую аффинность, чем у ипилимумаба (KD=3,68 нМ). Антитело W3162-1.146.19-Z12 также может связываться с мышиным CTLA-4, и его аффинность до и после гуманизации показана в табл. 9. После гуманизации его аффинность 1,39 нМ немного ниже, чем аффинность 0,906 нМ его родительского антитела.

Аффинность связывания W3162-1.146.19-Z12, W3162-1.145.10-z7 и W3162-1.154.8-Z35 с CTLA-4ECD яванской макаки составила 1,92, 0,598, 0,131 нМ соответственно (табл. 8).

Таблица 7

Кинетика связывания антител на CTLA-4 ECD человека

Антитела ka (1/Мс) kd (1/с) KD (М)

W3162-1.146.19-zl2-uAb.IgGlK	2.06E+05	9.82E-05	4.77E-10
W3162-1.146.19 xAb.IgGl	7.09E+05	1.48E-04	2.08E-10
W3162_1.145.10-z7-uAb.IgGlK	7.37E+06	1.35E-02	1.84E-09
W3162-1.145.10 xAb.IgGl	7.93E+06	1.65E-02	2.08E-09
W3162-1.154.8-z35-uAb.IgGlK	1.23E+06	1.19E-04	9.68E-11
W3162-1.154.8 xAb.IgGl	1.85E+06	1.25E-04	6.80E-11
Ипилимумаб	9.42E+05	3.46E-03	3.68E-09 Таблица 8
Кинетика связывания антител на CTLA-4 ECD обезьяны
Антитела	ka (1/Mc)	kd (1/c)	KD (M)
W3162-1.146.19-zl2-uAb.IgGlK	1.73E+05	3.31E-04	1.92E-09
W3162-1.146.19 xAb.IgGl	2.91E+05	1.07E-04	3.69E-10
W3162-1.145.10-z7-uAb.IgGlK	4.52E+06	2.71E-03	5.98E-10
W3162-1.145.10 xAb.IgGl	1.06E+07	3.77E-03	3.55E-10
W3162-1.154.8-z35-uAb.IgGlK	9.32E+05	1.22E-04	1.31E-10
W3162-1.154.8 xAb.IgGl	1.25E+06	1.09E-04	8.72E-11 Таблица 9
Кинетика связывания антител на CTLA-4 ECD мыши
Антитела	ka (1/Mc)	kd (1/c)	KD (M)
W3162-1.146.19-z8-uAb.IgGlK	1.72E+05	2.39E-04	1.39E-09
W3162-1.146.19 xAb.IgGl	2.51E+05	2.28E-04	9.06E-10

2.2.2. Тест на аффинность с помощью FACS.

Конъюгированное с FITC козье антитело против человеческого Fc IgG было приобретено в Jackson Immunoresearch Lab (номер по каталогу 109-095-098), и BD CantoII использовали для этого анализа. Вкратце, клетки FIEK293, экспрессирующие человеческий CTLA-4, переносили в 96-луночные планшеты с U-образным дном (BD) при плотности 5х10⁴ клеток/лунку. Тестируемые антитела последовательно разводили в 1:2 в PBS с 1% BSA и инкубировали с клетками при 4°С в течение 1 ч. После центрифугирования при 1500 об/мин в течение 4 мин супернатант отбрасывали. Вторичное антитело, представляющее собой конъюгированное с FITC козье антитело против человеческого Fc IgG (3,2 FITC на IgG, Jackson Immunoresearch Lab), добавляли для повторного суспендирования клеток до конечной концентрации 14

- 15 042725 мкг/мл и инкубировали при 4°С в темноте в течение 30 мин. Затем клетки один раз промывали и повторно суспендировали в PBS с 1% BSA и анализировали с помощью проточной цитометрии (BD). Интенсивность флуоресценции была преобразована в связанные молекулы /на клетку на основе количественных гранул (QuantumTM MESF Kits, Bangs Laboratories). KD рассчитывали с использованием Graphpad

Prism5.

Аффинность связывания гуманизированных антител с клеточной поверхностью CTLA-4 измеряли методом проточной цитометрии, модифицированный по методу Бенедикта [Benedict 1997 JIM]. После измерения флуоресценции антител, связывающихся с клетками СНО, экспрессирующими CTLA-4, связанное антитело и свободное антитело анализировали и подставляли в уравнение, как показано на фиг. 5. На основании данных и формулы рассчитанная константа аффинности KD показана в табл. 10. Гуманизированные антитела W3162-1.146.19-Z12 и W3162-1.154.8-Z35 имели высокую аффинность при 5,05 и 0,35 нМ соответственно, тогда как аффинность ипилимумаба составляет 0,97 нМ.

Таблица 10

Тест на аффинность с помощью FACS

Образец	KD (М)	Вшах	R2
W3162-1.146.19-zl2-IgGlK	5.0Е-09	1.2Е-10	0.99
W3162-1.154.8-z35-IgGlK	3.5Е-10	1.2Е-10	0.98
Ипилимумаб	9.7Е-10	7.2Е-11	0.99

2.3. Конкуренция с лигандами.

Чтобы проверить, сохраняют ли гуманизированные антитела способность блокировать связывание CTLA-4 на CD80 и CD86, в анализе конкуренции использовали как ИФА, так и FACS. Два CTLA-4лиганда CD80 и CD86, были приобретены у Sino Biological (номера по каталогу 10698-Н08Н и 10699Н08Н). Биотинилированное антитело против His-метки было приобретено у Genscript (номер по каталогу А00613). HRP конъюгированный стрептавидин был приобретен у Invitrogen (номер по каталогу SNN1004).

2.3.1. Конкурентный анализ на основе ИФА.

ИФА использовали для проверки того, могут ли антитела ингибировать связывание человеческого CTLA-4 с его лигандами, человеческими CD80 и CD86. На планшеты наносили покрытие в виде человеческого CTLA-4.ECD.hFc (0,5 мкг/мл) при 4°С в течение 16-20 ч. После 1-часового блокирования с использованием 2% BSA в DBPS тестируемые антитела, а также антитела положительного и отрицательного контроля предварительно смешивали с 0,25 мкг/мл CD80-6xHis или CD86-6xHis, а затем добавляли в планшеты и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 ч. После трехкратного промывания PBS, содержащим 0,05% Tween 20, биотинилированное антитело против His-метки разбавляли 1:2000 и добавляли. Планшеты инкубировали при комнатной температуре в течение 1 ч. Связанные лиганды детектировали с помощью конъюгированного с HRP стрептавидина (1: 20000). Цвет проявляли путем распределения 100 мкл субстрата ТМВ в течение 8 мин, а затем реакцию останавливали 100 мкл 2 N HCl. Поглощение при 450 нМ измеряли с использованием спектрофотометра на микропланшете.

Как показано на фиг. 11, W3162-1.146.19-z12-IgGk и W3162-1.154.8-z35-IgGk имели эффект, аналогичный ипилимумабу, в блокировании связывания лигандов с покрытием CTLA-4, с IC₅₀ 0,87, 0,63 и 0,40 нМ для CD80 и 0,71, 0,50 и 0,42 нМ для CD86.

2.3.2. Анализ FACS.

Чтобы проверить, могут ли антитела блокировать связывание CTLA-4 с CD80 и CD86 на клеточной поверхности, использовали FACS для проверки этой конкуренции. Клеточные линии СНО, экспрессирующие CD80 и CD86, были разработаны WuXi Biologies. Биотинилированный CTLA-4.ECD.hFc был сделан WuXi Biologies. РЕ-конъюгированный стрептавидин был приобретен у eBioscience (номер по каталогу 12-4317).

Клетки, экспрессирующие CD80 или CD86, добавляли в каждую лунку 96-луночного планшета при 1х10⁵ на лунку и центрифугировали при 1500 об/мин в течение 4 мин при 4°С перед удалением супернатанта. Последовательные разведения тестируемых антител, положительного и отрицательного контролей смешивали с биотинилированным человеческим CTLA4.ECD.hFc. Из-за разной плотности лигандов на клеточной поверхности 0,02 мкг/мл hCTLA-4.ECD.hFc-биотин использовали для клеток с CD80 человека и 0,08 мкг/мл hCTLA-4.ECD.hFc-биотин для клеток с CD86 человека. Затем смеси антитела и CTLA-4 добавляли к клеткам и инкубировали в течение 1 ч при 4°С. Клетки промывали два раза с помощью 200 мкл буфера FACS (DPBS содержащего 1% BSA). Стрептавидин РЕ, разведенный от 1 до 333 раз в буфере FACS, добавляли к клеткам и инкубировали при 4°С в течение 1 ч. Дополнительные стадии промывки проводили два раза с 200 мкл FACS буфера с последующим центрифугированием при 1500 об/мин в течение 4 мин при 4°С. Наконец, клетки ресуспендировали в 100 мкл буфера FACS и значения флуоресценции измеряли с помощью проточной цитометрии и анализировали с помощью FlowJo.

Результаты представлены на фиг. 12. Два гуманизированных антитела могут более эффективно блокировать связывание CTLA-4/лиганд, чем ипилимумаб. При самой высокой использованной концентрации ипилимумаб блокировал только 32% связывание CTLA-4 с CD80 и 40% связывания CTLA-4 с

- 16 042725

CD86. Для сравнения, антитело W3162-1.146.19-Z12 блокировало 71% связывания CTLA-4 на CD80 и 73% связывания CTLA-4 на CD86, а антитело W3162-1.154.8-Z35 блокировало 89% связывания CTLA-4 на CD80 и 98% связывания CTLA-4 на CD86. IC50 ипилимумаба, W3162-1.146.19-Z12 и W3162-1.154.8Z35, направленных против CD80, составляли 3,23, 6,60 и 0,07 нМ соответственно. IC₅₀ ипилимумаба, W3162-1.146.19-Z12 и W3162-1.154.8-Z35, направленных против CD86, составляли 2,52, 5,15 и 0,28 нМ соответственно.

2.4. Высвобождение цитокинов РВМС, стимулированных SEB.

Тестировали, могут ли антитела против CTLA4 усиливать высвобождение цитокинов из РВМС человека после стимулирования SEB (из Второго военного медицинского университета). Была получена периферическая кровь от здоровых доноров, и клетки были выделены с помощью центрифугирования в градиенте плотности Ficoll GE Healthcare, 17-1440-02. После удаления плавучего слоя тромбоциты удаляли несколькими промывками со средой. В каждую лунку 96-луночного планшета добавляли 1x105 клеток РВМС человека. Последовательные разведения тестируемых антител, положительные и отрицательных контролей смешивали с SEB (10 нг/мл), а затем добавляют к осажденным клеткам и инкубировали в течение 3 дней при 37°С. Супернатанты собирали для измерения концентрации человеческого IL-2.

Для теста на человеческий IL-2 планшеты предварительно покрывали 1 мкг/мл человеческого антитела к IL-2 (R & D System MAB602) при 4° С в течение 16-20 ч. После 1 ч блокировки с помощью 2% BSA (BovoGen) в DBPS, супернатанты, содержащие IL-2, добавляли в планшеты и инкубировали при комнатной температуре в течение 2 ч. После трехкратной промывки PBST (содержащего 0,05% Tween 20) биотинилированное человеческое антитело к IL-2 (система R & D, BAF202) разбавляли и добавляли в концентрации 0,5 г/мл. Планшеты инкубировали при комнатной температуре в течение 1 ч. Связанное биотинилированное антитело детектировали с помощью HRP-конъюгированного стрептавидина 1:20000 (Invitrogen, SNN1004). После 1 ч инкубации цвет проявился путем дозирования 100 мкл субстрата ТМВ, а затем реакцию останавливали 100 мкл 2 М HCl. Поглощение при 450 и 540 нм измеряли с использованием спектрофотометра для микропланшетов.

В клеточном анализе тестировали гуманизированные антитела (8,60, 21,4, 53,6, 134, 335 нМ) на предмет того, могут ли они усиливать стимулируемые суперантигеном SEB РВМС человека. После 3-дневной стимуляции IL-2 из РВМС измеряли с помощью ИФА. По сравнению с антителом контроля изотипа оба гуманизированных антитела (W3162-1.146.19-Z12, W3162-1.154.8-Z35) и ипилимумаб могут усиливать высвобождение IL-2 из РВМС зависимым от дозы образом (фиг. 13).

2.5. Термостабильность.

Стабильность полученных антител тестировали при различной температуре. Вкратце, 100 мкл каждого образца антитела добавляли пипеткой в отдельные пробирки, и образцы инкубировали при 4°С или 37°С в течение 20 ч, или 45 или 50°С в течение 2 ч. Затем образцы центрифугировали при 12000 об/мин в течение 10 мин. Наблюдали, что эти образцы обнаруживают возможное осаждение, и образцы были проанализированы с помощью SEC-HPLC на чистоту и время элюирования.

Профиль SEC W3162-1.146.19-Z12 при различных условиях показан на фиг. 14 a-d. Ни время разбавления, ни процентное содержание основного пика (от 92,39 до 92,48%) при условиях высокой температуры существенно не изменялись по сравнению с аналогичными параметрами при низкой температуре (92,24%). Профиль SEC W3162-1.154.8-Z35 при различных условиях высокой температуры показан на фиг. 14 a-h. Ни время разбавления, ни процент основного пика (97,14-97,17%) существенно не изменились по сравнению с низкой температурой (96,84%). Этот набор данных указывает на то, что антитела были стабильны в испытанных условиях высокой температуры.

2.6. Неспецифическое связывание.

Оба теста, FACS и ИФА, были использованы для проверки, связываются ли антитела с другими мишенями. В анализе FACS различные клеточные линии (Ramos, Raji, MDA-MB-453, ВТ474, Jurkat, Hut78, A431, A204, CaLu-6, A375, HepG2, BxPC-3, HT29, FaDu, 293F, CHO-K1) доводили до 1x105 клеток на лунку. Тестируемые антитела и антитела контроля изотипа разводили до 10 мкг/мл в PBS, содержащем 1% BSA, и инкубировали с клетками при 4°С в течение 1 ч. Клетки дважды промывали 180 мкл PBS, содержащим 1% BSA. РЕ- конъюгированное козье антитело против человеческого Fc-фрагмента IgG (Jackson, номер по каталогу 109-115-098) разбавляли до конечной концентрации 5 мкг/мл в PBS с 1% BSA, затем добавляли для повторного суспендирования клеток и инкубировали при 4°С в темноте в течение 30 мин. Дополнительные стадии промывки проводили дважды с помощью 180 мкл PBS, содержащего 1% BSA с последующим центрифугированием при 1500 об/мин в течение 4 мин при 4°С. Наконец, клетки ресуспендировали в 100 мкл PBS, содержащего 1% BSA, и значения флуоресценции измеряли с помощью проточной цитометрии (BD CantoII) и анализировали с помощью FlowJo.

В анализе ИФА тестируемые антитела, антитела контроля изотипа тестировали на связывание с 10 различными антигенами-мишенями, включая фактор VIII, FGFR-ECD, PD-1, CTLA-4.ECD, VEGF, HER3. ECD, OX40.ECD, 4-1BB.ECD, CD22.ECD, CD3e.ECD. 96-луночный планшет покрывали отдельными антигенами (2 мкг/мл) при 4°С в течение ночи. После 1 ч блокировки с 2% BSA в PBS, промывали планшет 3 раза с помощью 300 мкл PBST. Тестируемые антитела, а также антитела контроля изотипа разбавляли

- 17 042725 до 10 мкг/мл в PBS, содержащем 2% BSA, затем добавляли в планшет и инкубировали при комнатной температуре в течение 2 ч. После трехкратного промывания 300 мкл PBST в планшет добавляли конъюгированное с HRP козье антитело против человеческого IgG (1:5000 разведенное в 2% BSA) и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 ч. Наконец, планшеты шесть раз промывали 300 мкл PBST. Цвет проявляли путем дозирования 100 мкл субстрата ТМВ в течение 12 мин, а затем реакцию останавливали 100 мкл 2 М HCl. Поглощение при 450 нМ измеряли с использованием спектрофотометра для микропланшетов.

В дополнение к CTLA-4 были использованы другие нерелевантные белки, чтобы проверить, способны ли антитела W3162-1.146.19-Z12 и W3162-1.154.8-Z35 связываться с этими антигенами. Как показано на фиг. 16, среди панели антигенов только CTLA-4 был обнаружен двумя антителами. Другие антигены не генерировали сигнал в этом анализе ИФА. Напротив, антитело против ОХ40 действительно связывалось с ОХ40, предполагая, что этот антиген был нанесен на планшет.

Специфичность двух антител также тестировали на панели с различными клеточными линиями в анализе FACS. Антитела не генерировали детектируемый сигнал ни к одной из этих клеточных линий (данные не показаны).

2.7. Эффективность in vivo.

Поскольку антитело W3162-1.146.19-Z12 перекрестно реагирует как на человеческий, так и на мышиный CTLA-4, противоопухолевая эффективность этого антитела была протестирована на моделях сингенных мышей. Мышиная опухолевая клеточная линия СТ26 была использована для создания мышиной модели с ксенотрансплантатом для тестирования антитела против CTLA-4 W3162-1.146.19-Z12.B качестве положительного контроля использовали антитело против мышиного CTLA-4, приобретенное у BioXCell (BioXCell-BE0131). Опухолевые клетки поддерживали in vitro в виде монослойной культуры в среде RPMI-1640 с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки, 100 Ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина при 37°С в атмосфере 5% СО₂. Опухолевые клетки обычно пересевали дважды в неделю после открепления клеток обработкой трипсином-ЭДТА. Клетки, выращенные до фазы экспоненциального роста, собирали и подсчитывали для инокуляции опухоли. Самки мышей Balb/C были приобретены у Beijing Vital River Laboratory Animal Co., Ltd. Мыши в возрасте 6-8 недель с весом приблизительно 18-22 г были использованы для исследования. Каждую мышь подкожно инокулировали в правые подмышечные впадины 1x106 опухолевых клеток в 0,1 мл PBS, смешанного с 50 мкл матригеля. Когда средний объем опухоли достигает 60-80 мм³, животных случайным образом группировали. Антитела против CTLA-4 и контроль изотипа использовали для обработки: внутривенно инъецировали мышам два раза в неделю. Размер опухоли измеряли два раза в неделю штангенциркулем, а объем опухоли рассчитывали по формуле а x b2 x π/6, где а - длина, b - ширина (а>b).

Когда средний объем опухоли достигал приблизительно 70 мм³, W3162-1.146.19-Z12 (1, 3, 10 мг/кг) и контрольные антитела (10 мг/кг) вводили два раза в неделю в течение двух недель. Животных наблюдали на предмет роста опухоли и массы тела с течением времени. Как показано на фиг. 15, W31621.146.19-Z12 значительно ингибирует рост опухоли в зависимости от дозы. При дозе 1 мг/кг W31621.146.19-Z12 ингибировал рост опухоли по сравнению с контрольной группой. При дозе 3 мг/кг W31621.146.19-Z12 ингибировал объем опухоли до 160 мм³ в день 19, тогда как 10 мг/кг W3162-1.146.19-Z12 вызывал регрессию опухоли в конце периода исследования.

2.8. Эпитопное картирование.

Сканирование аланином было использовано для идентификации эпитопа антител CTLA-4. В этом эксперименте остатки аланина на hCTLA4 мутировали в остатки глицина, а все остальные остатки мутировали в аланины. Для каждого остатка внеклеточного домена человеческого CTLA4 (ECD) были сделаны точечные аминокислотные замены были сделаны с использованием двух последовательных стадий ПЦР. В качестве матрицы была использована плазмида pcDNA3.3-hCTLA4_ECD.His, которая кодирует ECD человеческого CTLA4 и С-концевую His-метку, и набор мутагенных праймеров был использован для первой стадии ПЦР с использованием набора для набора мульти-сайт-направленного мутагенеза QuikChange lightning (Agilent technologies, Пало-Альто, Калифорния). Эндонуклеазу Dpn I использовали для расщепления родительской матрицы после реакции синтеза мутантной цепи. Во второй стадии ПЦР линейная экспрессирующая кассета ДНК, состоящая из промотора CMV, мутированного ECD CTLA4, His-tag и сайта полиаденилирования тимидинкиназы (ТК) вируса простого герпеса, была амплифицирована и транзиторно экспрессирована в клетках HEK293F (Life Technologies, Gaithersburg, MD). Кроме того, были сконструированы три плазмидных вектора для тестирования эпитопа гликанов: pcDNA3.3hCTLA4_ECD.His (N113Q), pcDNA3.3-hCTLA4_ECD.His (N145Q) и pcDNA3.3-hCTLA4_ECD.His (N113Q, N145Q). Эти три мутеина были транзиторно экспрессированы в клетках HEK293F (Life Technologies, Gaithersburg, MD).

Чтобы проверить, как мутации влияют на связывание антител, был проведен ИФА с захватом. Вкратце, ипилимумаб, моноклональные антитела W3162-1.146.19-z12 и W3162-1.154.8-z35 (2 мкг/мл) были захвачены с помощью планшетов, предварительно покрытых 2 мкг/мл козьим антитело против человеческого IgG Fc (Bethyl Laboratories, Montgomery, TX). После взаимодействия с супернатантом, кото- 18 042725 рый содержит количественные мутеины CTLA4, конъюгированное с HRP антитело против His (1:5000 ;

Rockland Immunochemicals, Pottstown, PA) добавляли в качестве детектирующего антитела. ТМВ использовали в качестве субстрата HRP. Абсорбция была нормализована в соответствии со средним уровнем контрольных мутантов. После установки дополнительного отсечения для изменения кратности связывания (<0,55) были определены окончательно определенные остатки эпитопа.

Определяли активности связывания антител W3162-1.146.19-z12, W3162-1.154.8-z35 и ипилимумаба (W316-BMK1) с CTLA4 человека, было обнаружено, что все три антитела связываются с CTLA4 человека (фиг. 17).

Протестированные точечные мутации, которые влияют на связывание антител с CTLA-4, показаны в табл. 11. Согласно кристаллическим структурам CTLA4 человека (код PDB 1AH1), некоторые аминокислотные остатки (например, Met38, Val40, Tyr60, Val71, Val73, Arg75, Val84, Cys85, Cys129, Ile149) вряд ли могли напрямую связываться с какими-либо антителами. Наблюдаемое снижение связывания, скорее всего, является результатом нестабильности или даже коллапса структуры CTLA4 после аланиновых замен. Окончательно определенные остатки эпитопа перечислены в табл. 12 и отмечены на фиг. 18.

Как показано на фиг. 18D и Е, эпитопы ипилимумаба и W3162-1.146.19-z12 перекрывают друг друга, за исключением нескольких остатков, таких как N145 и Р138. Для сравнения, W3162-1.15 4.8-z35 связан с меньшей областью CTLA-4 (фиг. 18F), чем два других антитела. Все три антитела связаны с лигандсвязывающим доменом CTLA-4 (фиг. 18А и В), которые включают мотив MYPPPY.

Перекрывающиеся эпитопы ипилимумаба и W3162-1.146.19-z12 не объясняют уникального межвидового связывания антитела W3162-1.146.19-z12. Поскольку мутация N145 на CTLA-4 влияла только на связывание W3162-1.146.19-z12 с CTLA-4, не затрагивая другие два антитела, мы далее рассматривали сайты N-гликозилирования как потенциальные эпитопы. Влияние мутаций в двух сайтах гликозилирования CTLA4 на активность связывания антител показано на фиг. 17. Связывание ипилимумаба или W3162-1.154.8-z35 с мутированным CTLA-4 существенно не изменялось (фиг. 17А и С). Напротив, связывание W3162-1.146.19-z12 с мутированным CTLA-4 N145Q значительно уменьшилось, тогда как связывание этого антитела с CTLA-4 с N113Q не изменилось. Этот набор данных указывает на то, что гликан (фиг. 18Е) на N145 CTLA-4 может быть эпитопом W3162-1.146.19-z12. Остаток N145 является консервативным в CTLA-4 яванской макаки и мыши.

Описание настоящего изобретения было сделано выше с помощью примеров. Однако специалистам в данной области техники понятно, что настоящее изобретение не ограничивается примерами. Изобретение может быть воплощено в других конкретных формах без отклонения от его сущности или существенных характеристик. Таким образом, объем изобретения обозначен прилагаемой формулой изобретения, а не предшествующим описанием, и все изменения, которые входят в значение и диапазон эквивалентности формулы изобретения, предназначены для включения в нее.

- 19 042725

Таблица 11

Влияние точечных мутаций CTLA4 на связывание антител

Ипилимумаб	W3162-l,146,19-zl2-IgGlK	W3162-l,154,8-z35-IgGlK
CTLA4	положе Кратн	SD	CTLA4	1 положе Кратн	SD	СТЕА4полож Кратно SD
Остатокние	ое		остато	ние	ое		Остато ение	е
		измене	к		измене	к		измене
		ние				ние				ние
Р	136	0,191	0,00	G	146	0,166	0,00	р	136	0,155	0,00
V	40	0,201	0,00	V	40	0,181	0,00	V	40	0,187	0,00
G	146	0,208	0,00	С	129	0,182	0,00	G	146	0,201	0,00
С	129	0,210	0,00	м	38	0,182	0,00	С	129	0,211	0,00
С	85	0,229	0,00	I	149	0,183	0,00	С	85	0,218	0,00
V	84	0,233	0,01	V	81	0,191	0,01	V	84	0,232	0,00
Y	60	0,236	0,04	N*	145	0,196	0,00	м	38	0,238	0,00
м	134	0,240	0,01	Q	76	0,200	0,00	γ	60	0,240	0,07
I	149	0,244	0,01	V	84	0,201	0,00	R	75	0,298	0,00
м	38	0,253	0,02	Y	60	0,223	0,05	I	149	0,319	0,00
V	81	0,268	0,03	Р	136	0,231	0,00	Р	138	0,339	0,00
R	75	0,273	0,00	м	134	0,254	0,00	V	71	0,347	0,10
I	143	0,278	0,00	I	128	0,256	0,00	к	65	0,351	0,00
I	128	0,286	0,00	с	85	0,256	0,03	г	88	0,433	0,02
V	71	0,335	0,08	I	143	0,264	0,00	м	134	0,455	0,00
к	130	0,364	0,00	R	75	0,278	0,00	Е	83	0,479	0,00
G	142	0,369	0,01	V	73	0,338	0,01	V	73	0,498	0,01
G	144	0,375	0,00	V	71	0,343	0,06	R	70	0,515	0,04
Т	88	0,377	0,06	к	130	0,348	0,00	А	66	0,519	0,02
R	70	0,378	0,10	А	66	0,395	0,02	L	74	0,520	0,00
V	73	0,380	0,00	L	74	0,398	0,00	Р	137	0,534	0,00
А	66	0,395	0,03	L	126	0,398	0,02	G	64	0,543	0,10
Е	83	0,396	0,02	Е	83	0,405	0,01	Н	39	0,549	0,01
А	86	0,401	0,03	Т	88	0,423	0,06
Р	137	0,407	0,00	Р	137	0,425	0,00
L	74	0,410	0,00		139	0,431	0,00
L	126	0,412	0,01	т	82	0,436	0,00
Н	39	0,420	0,01	Р	138	0,445	0,00
Y	139	0,434	0,00	Е	132	0,457	0,01
т	82	0,450	0,01	G	144	0,478	0,00
Е	132	0,470	0,04	Т	147	0,486	0,03
М	90	0,479	0,02	L	141	0,486	0,00
Т	147	0,508	0,03	М	90	0,492	0,00
Y	127	0,508	0,01	Q	148	0,500	0,02
Q	80	0,517	0,02	V	131	0,504	0,02
L	141	0,518	0,03	R	70	0,507	0,08
Е	68	0,529	0,00		89	0,512	0,05
Q	148	0,532	0,04		127	0,529	0,02
G	125	0,537	0,02	Н	39	0,529	0,00
Q	76	0,545	0,00	т	72	0,541	0,01
G	92	0,548	0,00	G	142	0,543	0,02
				С	103	0,544	0,03

Кратное изменение связывания является относительно связывания нескольких молчащих аланино вых замен.

Таблица 12

Идентифицированные эпитопы трех антител

Ипилимумаб	W3162-	1.146.19-	-Z12-	W3162-	1.154.8-z35-	-IgGl К
		IgGlK
CTLA	положен	распол CTLA4	положен распол	CTLA4	положе	располож
4	ие	ожени остато	ие	ожение	остаток	: ние	ение
остато		е к
к
н	39	А Н	39	А	Н	39	А
А	66	ВС А	66	ВС	G	64	ВС петля
		петля		петля
Е	68	С R	70	Q	К	65	ВС петля
R	70	С Т	72	С	А	66	ВС петля
L	74	С L	74	с	R	70	С
Q	76	С Q	76	с	L	74	С
Q	80	С V	81	с	Е	83	С
V	81	с т	82	с	Т	88	С
т	82	С Е	83	с	м	134	F
Е	83	С Т	88	с	Р	136	FG петля
А	86	С М	90	СС	Р	137	FG петля
				петля
Т	88	С G	92	С	Р	138	FG петля
м	90	С'С L	126	F	G	146	G
		петля
G	92	С 1	128	F
G	125	F К	130	F
L	126	F Е	132	F
I	128	F М	134	F
К	130	F Р	136	FG
				петля
Е	132	F Р	137	FG
				петля
М	134	F Р	138	FG
				петля
Р	136	FG Y	139	FG
		петля		петля
Р	137	FG L	141	G
		петля
γ	139	FG G	142	G
		петля
L	141	G I	143	G
G	142	G G	144	G
I	143	G N	145	G
G	144	G G	146	G
G	146	G Q	148	G
Q	148	G

Claims

1. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащие вариабельную область легкой цепи, содержащую область, определяющую комплементарность, 1 легкой цепи (LCDR1), содержащую SEQ ID NO: 41, LCDR2, содержащую SEQ ID NO: 32, и LCDR3, содержащую SEQ ID NO: 22, и вариабельную область тяжелой цепи, содержащую область, определяющую комплементарность, 1 тяжелой цепи (HCDR1), содержащую SEQ ID NO: 36, HCDR2, содержащую SEQ ID NO: 28, и HCDR3, содержащую SEQ ID NO: 18; и где антитело или антигенсвязывающий фрагмент связывается с CTLA-4.

2. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.1, содержащие аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90 или 95% гомологична SEQ ID NO: 7 или 14.

3. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.1 или 2, где вариабельная область легкой цепи имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14.

4. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.1 или 2, где вариабельная область тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7.

5. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.1 или 2, где вариабельная область легкой цепи имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14 и вариабельная область тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7.

6. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-5, где антитело ингибирует связывание CTLA-4 с CD80 или CD86.

7. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-6, где эпитоп связывания антитела или антигенсвязывающего фрагмента содержит N145 или полисахарид на N145 или Р138 CTLA-4.

8. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-7, где антитело или антигенсвязывающий фрагмент:

b) связываются с CTLA-4 мыши с KD 1,39E-09 M или менее.

9. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-8, где антитело является химерным, гуманизированным, полностью человеческим или крысиным антителом.

10. Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-9.

11. Вектор, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты по п.10.

12. Вектор по п.11, где указанный вектор представляет собой клонирующий или экспрессирующий вектор.

13. Клетка-хозяин, содержащая один или более экспрессирующих векторов по п.11 или 12.

14. Способ получения антитела по любому из пп.1-9, включающий культивирование клеткихозяина по п.13 и выделение антитела.

15. Фармацевтическая композиция, содержащая антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-9 и один или более из фармацевтически приемлемого вспомогательного вещества, разбавителя и носителя.

16. Иммуноконъюгат, содержащий антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-9, связанные с терапевтическим агентом.

17. Применение антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп.1-9 в производстве лекарственного средства для лечения иммунного расстройства или злокачественного новообразования.

18. Применение антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп.1-9 в производстве лекарственного средства для ингибирования роста опухолевых клеток.

19. Применение по п.18, где опухолевые клетки представляют собой клетки злокачественного новообразования, выбранного из группы, состоящей из меланомы, рака почки, рака простаты, рака молочной железы, рака толстой кишки, рака легкого, рака кости, рака поджелудочной железы, рака кожи, рака головы или шеи, кожной или внутриглазной злокачественной меланомы, рака матки, рака яичников и рака прямой кишки.