CN113924118A - 在低ph下具有增强的结合特异性的伊匹单抗变体 - Google Patents

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Abstract

本公开文本提供了抗CTLA‑4抗体如伊匹单抗的变体形式，其在低pH下与CTLA‑4优先结合。此类抗体变体展现出在肿瘤微环境中的优先活性、抗肿瘤反应与副作用的增强的比率以及增强的治疗指数。

Description

在低PH下具有增强的结合特异性的伊匹单抗变体
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背景技术
免疫系统能够控制肿瘤发展并介导肿瘤消退。这需要产生和激活肿瘤抗原特异性T细胞。多种T细胞共刺激受体和T细胞负调节剂或共抑制受体协同作用以控制T细胞激活、增殖以及效应子功能的增加或损失。最早且最佳表征的T细胞共刺激和共抑制分子包括CD28和CTLA-4。Rudd等人(2009)Immunol.Rev.229:12。CD28通过与抗原呈递细胞上的B7-1和B7-2配体结合向T细胞受体接合提供共刺激信号，而CTLA-4提供下调T细胞增殖和功能的负信号。CTLA-4也结合B7-1(CD80)和B7-2(CD86)配体，但亲和力高于CD28，CTLA-4通过细胞自主(或内在)和细胞非自主(或外在)两种途径充当T细胞功能的负调节剂。CD8和CD4 T效应子(Teff)功能的内在控制是由CTLA-4的可诱导表面表达介导，这是由于通过对抗细胞上B7配体的多价接合所致的T细胞激活以及T细胞增殖和细胞因子增殖的抑制。Peggs等人(2008)Immunol.Rev.224:141。
抗CTLA-4抗体在交联时在体外抑制T细胞功能。Krummel和Allison(1995)J.Exp.Med.182:459；Walunas等人(1994)Immunity 1:405。组成性表达CTLA-4的调节性T细胞(Treg)以非细胞自主方式控制效应T细胞(Teff)的功能。缺乏CTLA-4的Treg具有受损的抑制能力(Wing等人(2008)Science 322:271)并且阻断CTLA-4与B7相互作用的抗体可以抑制Treg功能(Read等人(2000)J.Exp.Med.192:295；Quezada等人(2006)J.Clin.Invest.116:1935)。最近，还已显示出Teff通过外在途径控制T细胞功能(Corse和Allison(2012)J.Immunol.189:1123；Wang等人(2012)J.Immunol.189:1118)。Treg和Teff对T细胞功能的外在控制是通过CTLA-4阳性细胞的如下能力进行的：其去除抗原呈递细胞上的B7配体从而限制它们的共刺激潜力。Qureshi等人(2011)Science 332:600；Onishi等人(2008)Proc.Nat’l Acad.Sci.(USA)105:10113。抗体对CTLA-4/B7相互作用的阻断被认为通过干扰由CTLA-4接合传递的负信号来促进Teff激活；这种对T细胞激活和增殖的内在控制可以促进Teff和Treg二者增殖(Krummel和Allison(1995)J.Exp.Med.182:459；Quezada等人(2006)J.Clin.Invest.116:1935)。在使用动物模型的早期研究中，显示出抗体对CTLA-4的阻断加剧自身免疫。Perrin等人(1996)J.Immunol.157:1333；Hurwitz等人(1997)J.Neuroimmunol.73:57。通过扩展到肿瘤免疫，抗CTLA-4导致已建立的肿瘤的消退的能力提供了CTLA-4阻断的治疗潜力的引人注目的例子。Leach等人(1996)Science 271:1734。
伊匹单抗是一种人抗人CTLA-4单克隆抗体，最初被批准用于治疗转移性黑色素瘤，此后已被批准用于其他癌症，并正处于另外的癌症的临床试验中。Hoos等人(2010)Semin.Oncol.37:533；Hodi等人(2010)N.Engl.J.Med.363:711；Pardoll(2012)Nat.Immunol.13(12):1129。伊匹单抗具有人IgG1同种型，其与大多数人Fc受体结合最佳(Bruhns等人(2009)Blood 113:3716)并且被认为与鼠IgG2a在其结合的激活Fc受体的类型方面等同，但在抗体依赖性细胞毒性(ADCC)或其引发的其他效应子功能的程度方面不一定等同，其中人IgG1可引起的ADCC比IgG2a在小鼠中引起的ADCC小得多。由于IgG1与人NK细胞和单核细胞表达的激活受体CD16(FcγRIIIa)结合，因此伊匹单抗可以介导ADCC。IgG1同种型伊匹单抗最初直接从杂交瘤分离，但随后在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中克隆和表达。尽管考虑到介导ADCC和/或CDC的同种型可能是在寻求上调免疫应答的靶向T细胞上受体的抗体中不期望的，但仍保留了所述抗体的IgG1同种型，部分原因是其增强了食蟹猴中的疫苗反应并且认为具有功能。
已显示出伊匹单抗增加血液中激活T细胞的数量，如例如由以下所证明的：治疗后CD4+和CD8+细胞的表面上HLA-DR的表达的显著增加以及绝对淋巴细胞计数的增加(Ku等人(2010)Cancer 116:1767；Attia等人(2005)J.Clin.Oncol.23:6043；Maker等人(2005)J.Immunol.175:7746；Berman等人(2009)J.Clin.Oncol.27(suppl):15s.3020；Hamid等人(2009)J.Clin.Oncol.27(增刊):15s.9008)，从而表明在人的外周中未发生T细胞的耗尽。使用IL-2激活的PBMC作为效应细胞(未发表)，伊匹单抗仅显示出适度水平的激活T细胞的ADCC；然而，使用Treg作为靶标未进行测试。已观察到用伊匹单抗治疗的患者的血液中外周Treg频率的微小变化(Maker等人(2005)J.Immunol.175:7746)，但可获得伊匹单抗对瘤内Treg影响的很少信息。然而，已经描述了高CD8+与Treg比率与来自用伊匹单抗治疗的患者的转移性黑色素瘤病变的活检中的肿瘤坏死之间的正相关。Hodi等人(2008)Proc.Nat’lAcad.Sci.(USA)105:3005。另外，与来自未治疗的膀胱癌患者的肿瘤相比，来自伊匹单抗治疗的膀胱癌患者的肿瘤组织具有较低百分比的CD4+Foxp3+T细胞。Liakou等人(2008)Proc.Nat’l Acad.Sci.(USA)105:14987。这些结果与本文公开的数据一致，即伊匹单抗在肿瘤部位介导Treg减少。
相比之下，曲美木单抗是IgG2同种型，其不能有效地与除FcγRIIa变体H131以外的Fc受体结合。Bruhns等人(2009)Blood 113:3716。虽然曲美木单抗具有通过阻断CTLA-4与B7之间的抑制相互作用来增强T细胞应答的能力，但研究表明曲美木单抗可能在介导肿瘤处的Treg的耗尽方面受到限制，并且在此基础上，预计展现出与伊匹单抗相比降低的抗肿瘤活性。由于每种抗体的给药方案不同，因此难以直接比较这两种抗体的临床活性。参见例如，Ascierto等人(2011)J.Transl.Med.9:196)。曲美木单抗与伊匹单抗一样具有明显的抗肿瘤活性。Ribas(2010)Semin.Oncol.37(5):450。有趣的是，对曲美木单抗作用机制的研究显示，在通过免疫组织化学分析的有限数量的样品中，肿瘤浸润CD8 T细胞的增加作为治疗的结果发生，而Foxp3+细胞的数量在治疗后的肿瘤中没有变化。Comin-Anduix等人(2008)J.Transl.Med.6:22；Huang等人(2011)Clin.Cancer Res.17:4101。可替代地，可以通过阻断CTLA-4/B7相互作用来实现Treg功能的抑制。
针对人CTLA-4的人抗体伊匹单抗和曲美木单抗被选择用于抑制CTLA-4-B7相互作用(Keler等人(2003)J.Immunol.171:6251；Ribas等人(2007)Oncologist 12:873)并在多种恶性肿瘤的各种临床试验中进行测试。Hoos等人(2010)Semin.Oncol.37:533；Ascierto等人(2011)J.Transl.Med.9:196。经常观察到肿瘤消退和疾病稳定，并且用这些抗体治疗已经伴有能够影响各种器官系统的炎性浸润不良事件。在2011年，基于在先前治疗过的患有晚期黑色素瘤的患者的III期试验中总存活期的改善，具有IgG1恒定区的伊匹单抗在美国和欧盟被批准用于治疗不可切除或转移性黑色素瘤。Hodi等人(2010)N.Engl.J.Med.363:711。
尽管在治疗上有效，但伊匹单抗展现出剂量限制性毒性，这阻止可更有效地根除肿瘤的更高给药。需要展现出更大治疗指数的改善形式的伊匹单抗。这种改善形式的伊匹单抗将展现出增强的抗肿瘤活性、减少的副作用或二者。
发明内容
本发明提供了在可变结构域中具有突变的抗人CTLA-4抗体伊匹单抗的变体，与在中性pH(例如pH 7.4)下的结合相比，所述突变在低/酸性pH(例如pH 6.0)下增强了靶标结合。具体地，与伊匹单抗相比，本发明的伊匹单抗的变体展现出在低pH(如pH 5.8、6.0、6.2、6.4、6.6或6.8)相比于中性pH(如pH 7.0、7.2、7.4、7.5或7.6)下的优先结合。在一个实施方案中，低pH下的优先结合表示为“酸性pH结合偏好”(APBP)，其是pH 7.4下结合的解离平衡常数与pH 6.0下结合的解离平衡常数的比率，即KD-7.4/KD-6.0。在各个实施方案中，所述APBP大于或等于1.5、2、3、4、5、7、10、12、15、20、25、35、50、75和100。在另一个实施方案中，低pH下的优先结合表示为“比较性酸性pH结合偏好”(CAPBP)，其是变体形式在pH 7.4下结合的解离平衡常数与在pH 6.0下结合的解离平衡常数的比率除以对于伊匹单抗的等效值，即[(KD-7.4/KD-6.0)变体/(KD-7.4/KD-6.0)伊匹单抗]。在各个实施方案中，所述CLPBR大于或等于1.5、2、3、4、5、7、10、12、15、20、25、35、50、75和100。如本文所述，伊匹单抗的APBP基本上为1.0，意味着所述CAPBP基本上等于本文公开的伊匹单抗变体的APBP。
在各个实施方案中，本发明的抗CTLA-4抗体包含重链可变区，所述重链可变区在一个、两个、三个或更多个非组氨酸位置处具有组氨酸(H)取代或者在HCDR1、HCDR2和HCDR3中的两个或更多个中具有至少一个组氨酸残基。在其他实施方案中，本发明的抗CTLA-4抗体包含轻链可变区，所述轻链可变区包含LCDR1序列，所述LCDR1序列在一个、两个、三个或更多个先前非天冬氨酸或谷氨酸位置处具有酸性残基(天冬氨酸或谷氨酸；D/E)取代，或者在LCDR1中具有一个、两个、三个或更多个天冬氨酸或谷氨酸残基。在一些实施方案中，本发明的抗CTLA-4抗体包含前述句子的重链和轻链可变区二者。
在一些实施方案中，所述重链可变区中的一个、两个或三个组氨酸(H)取代位于成熟重链序列的残基31、56和99中的一个或多个处。在其他实施方案中，所述轻链可变区中的一个、两个或三个酸性(D/E)取代位于成熟轻链序列的残基28、31、32和33中的一个或多个处。在一些实施方案中，本发明的抗CTLA-4抗体包含前述句子的重链和轻链可变区二者。
在又其他实施方案中，本发明的改善的抗CTLA-4抗体包含伊匹单抗的重链可变区(例如SEQ ID NO:31所公开的)中的残基31、56和99中的一个或多个处或曲美木单抗的重链可变区(例如SEQ ID NO:43所公开的)中的残基30、31、52、53、54、56、101和103中的一个或多个处的一个、两个或三个组氨酸(H)取代。在其他实施方案中，本发明的改善的抗CTLA-4抗体包含伊匹单抗的轻链可变区(例如SEQ ID NO:32所公开的)中的残基28、31和33中的一个或多个处或曲美木单抗的轻链可变区(例如SEQ ID NO:44所公开的)中的残基28、30、31和32中的一个或多个处的一个、两个或三个酸性(D/E)取代。在一些实施方案中，本发明的抗CTLA-4抗体包含前述句子的重链和轻链可变区二者，如SEQ ID NO:31和32或SEQ ID NO:43和44，但是本发明的抗体不包含伊匹单抗(SEQ ID NO:9和10)或曲美木单抗(SEQ ID NO:39和40)的重链和轻链可变区二者。
在各个实施方案中，本发明的在低pH下优先结合的伊匹单抗变体包含以下提供的重链和轻链序列：SEQ ID NO:15和21(伊匹单抗1)；SEQ ID NO:16和21(伊匹单抗2)；SEQ IDNO:17和21(伊匹单抗3)；SEQ ID NO:18和21(伊匹单抗7)；SEQ ID NO:11和24(伊匹单抗17)；SEQ ID NO:11和25(伊匹单抗18)；SEQ ID NO:11和26(伊匹单抗20)；SEQ ID NO:11和29(伊匹单抗23)；SEQ ID NO:11和30(伊匹单抗24)；SEQ ID NO:11和22(伊匹单抗25)；SEQID NO:11和27(伊匹单抗26)；SEQ ID NO:12和21(伊匹单抗57)；SEQ ID NO:19和21(伊匹单抗59)；SEQ ID NO:12和22(伊匹单抗64)；SEQ ID NO:19和22(伊匹单抗66)；SEQ ID NO:13和21(伊匹单抗69)；SEQ ID NO:13和22(伊匹单抗71)；SEQ ID NO:20和21(伊匹单抗82)；SEQ ID NO:14和21(伊匹单抗84)；SEQ ID NO:20和22(伊匹单抗86)；SEQ ID NO:14和22(伊匹单抗88)；SEQ ID NO:20和23(伊匹单抗90)；SEQ ID NO:14和23(伊匹单抗92)；SEQ IDNO:11和23(伊匹单抗93)；SEQ ID NO:12和23(伊匹单抗94)；SEQ ID NO:13和23(伊匹单抗95)；SEQ ID NO:12和27(伊匹单抗100)；SEQ ID NO:13和27(伊匹单抗101)；SEQ ID NO:13和28(伊匹单抗105)；以及SEQ ID NO:14和28(伊匹单抗106)。在各个实施方案中，本发明的在低pH下优先结合的伊匹单抗变体包含上文提供的重链和轻链序列，其中在所述重链上添加了C末端赖氨酸(K)残基。
在一些实施方案中，本发明的在低pH下优先结合的伊匹单抗变体存在于具有减少的岩藻糖基化的抗体制剂、低岩藻糖基化的抗体制剂或非岩藻糖基化的抗体制剂中。在一些此类实施方案中，所述抗体制剂包含大于95％的去岩藻糖基化抗体重链。在其他实施方案中，所述抗体制剂包含80％至95％去岩藻糖基化抗体重链。在又其他实施方案中，所述抗体制剂展现出ADCC活性是通过常规手段在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中产生的相同抗体制剂的所述活性的至少两倍。在仍其他实施方案中，所述抗体制剂是在如下哺乳动物细胞系中产生的，所述哺乳动物细胞系缺乏参与产生GDP-岩藻糖或其前体的酶的活性，包括但不限于部分或完全缺乏α1,6-岩藻糖基转移酶活性的哺乳动物细胞系，如具有完全失活的FUT8基因的哺乳动物细胞系。
在其他方面，本发明提供了编码本发明的pH敏感性抗人CTLA-4抗体的重链和/或轻链的核酸、包含这些核酸的表达载体、包含这些表达载体的宿主细胞以及制备本发明的pH敏感性抗人CTLA-4抗体的方法，所述方法是通过在允许产生所述抗体的条件下培养所述宿主细胞并分离所述抗体来进行。本发明还提供了制备本发明的pH敏感性抗人CTLA-4抗体的方法，所述方法是通过在允许产生所述抗体的重链和轻链的条件下培养包含单独表达载体的宿主细胞并分离所述抗体来进行，所述表达载体分别包含编码所述抗体的重链和轻链序列的序列。
在另一方面，本发明提供了治疗方法，所述治疗方法包括向有需要的人受试者施用本发明的伊匹单抗变体。在一个实施方案中，所述治疗是治疗癌症，所述癌症包括但不限于不可切除的或转移性黑色素瘤。
在各个实施方案中，治疗与一种或多种其他抗肿瘤治疗剂组合，所述一种或多种其他抗肿瘤治疗剂包括其他免疫调节剂。在一些实施方案中，此类免疫调节剂是针对PD1或PD-L1的拮抗剂抗体。
在其他实施方案中，本发明的伊匹单抗变体是以比批准用于用伊匹单抗治疗相同适应症的剂量更低或更高的剂量施用。在一些实施方案中，所述伊匹单抗变体用于治疗不可切除的或转移性黑色素瘤并且是以大于3mg/kg，如10mg/kg、20mg/kg、50mg/kg或更高的剂量施用，例如经90分钟静脉内施用，q3w共四个剂量。
在其他实施方案中，所述伊匹单抗变体作为辅助剂用于患者，所述患者患有皮肤黑色素瘤且具有大于1mm的局部淋巴结的病理学受累，所述患者已经经历过完全切除术(包括全淋巴结清扫术)；并且是以大于10mg/kg，如20mg/kg、50mg/kg或更高的剂量施用，例如经90分钟静脉内施用，q3w共四个剂量，接着q12w持续长达三年或直到记录疾病复发或不可接受的毒性。
在其他实施方案中，所述伊匹单抗变体与纳武单抗组合用于治疗具有中等或低风险、患有先前未治疗的晚期肾细胞癌的患者，并且是以大于1mg/kg，如3mg/kg、10mg/kg、20mg/kg、50mg/kg或更高的剂量施用，例如经30分钟静脉内施用，q3w共四个剂量。
在仍其他实施方案中，所述伊匹单抗变体用于治疗患有高微卫星不稳定性(MSI-H)或错配修复缺陷(dMMR)转移性结直肠癌的12岁或更大的成人和儿童患者，所述患者在用氟嘧啶、奥沙利铂或伊立替康与纳武单抗组合治疗后已经进展；并且是以大于1mg/kg，如3mg/kg、10mg/kg、20mg/kg、50mg/kg或更高的剂量施用，例如q3w共四个剂量。
在本发明的单独实施方案中，所述pH敏感性抗CTLA-4抗体源自曲美木单抗。在各个实施方案中，所述抗体包含：含有SEQ ID NO:43的序列的重链可变区序列，其中组氨酸(H)存在于残基S30、S31、W52、Y53、D54、S56、N57、R101和A103中的一个或多个处；含有SEQID NO:44的序列的轻链可变区序列，其中天冬氨酸(D)或谷氨酸(E)存在于残基S28、N30、S31和Y32中的一个或多个处；或两者。
附图说明
图1显示了伊匹单抗的所有三个重链CDR(HCDR1、HCDR2和HCDR3)和第一轻链CDR(LCDR1)的残基编号。按照常规，氨基酸序列以单字母代码提供，从左到右为氨基末端到羧基末端。HCDR1、HCDR2、HCDR3和LCDR1的序列分别以SEQ ID NO:3-6提供。最上面一行数字代表如序列表中所用的严格顺序编号，除非另有说明，否则所述严格顺序编号用于描述说明书和权利要求中的序列变体。重链和轻链CDR的残基的编号分别根据SEQ ID NO:9和10。下面一行数字代表Kabat系统下的编号，除非另有说明，否则所述编号用于描述图中的序列变体。Kabat编号中省略的数字与所述顺序编号中的相同。Kabat编号系统被广泛使用以便于在可变结构域中具有不同氨基酸残基数量的抗体中的结构等效残基之间进行比较。图1提供的数字索引确保不会因对相同序列使用两种编号规则而产生歧义。
图2A显示了伊匹单抗的重链序列变体的先导文库中(从上到下)HCDR1、HCDR2和HCDR3的序列标识。参见实施例1。图2B显示了如实施例1所述对在pH 6.0下结合但在pH 7.4下不结合huCTLA-4的噬菌体进行三轮选择之后这些相同CDR的序列标识。HCDR1、HCDR2和HCDR3中的单个最优势序列分别是T33H、N56H和T95H(全部按照Kabat编号)。正如在本文的所有序列标识中一样，代表每个位置处氨基酸残基的字母的大小与该文库中该位置处该氨基酸残基的相对频率成比例。
图3A、图3B和图3C显示了与人CTLA-4结合的伊匹单抗的静电建模的结果。参见实施例1。图3A显示了pH 6下的电荷分布并且图3B显示了pH 7.5下的电荷分布，其中HCDR1标记为H1且LCDR1标记为L1。图3C显示了伊匹单抗的HCDR1(例如按照Kabat编号的残基T28、S30、S31和T33)与人CTLA-4(例如残基E48、D64和D65)之间的接触表面处的静电模型的增强视图。
图4A和图4B显示了伊匹单抗序列变体的预选择的(图4A)和选择的组合文库(图4B)二者中轻链CDR1(LCDR1)的序列标识。从图4A的起始序列组产生图4B的序列的选择方案在实施例2中进行了描述。在位置27a(S27aE)和30(S30E)处选择之后，观察到与其中原始伊匹单抗残基有利的其他位置相比远离天然伊匹单抗序列的显著变化。
图5A和图5B显示了在pH 7.4(图5A)和pH 6.0(图5B)下伊匹单抗25(LCDR1 S27aE/S30D)的示例性表面等离子体共振亲和力数据。参见实施例2。抗体伊匹单抗25在pH 6.0下与CTLA-4结合的紧密程度是在pH 7.4下的四至五倍，相比之下，伊匹单抗为1.0倍。参见表3(在实施例2中)。
图6A、图6B和图6C显示了本发明的选择的伊匹单抗序列变体，特别是抗体伊匹单抗25(LCDR1 S28E/S31D)、伊匹单抗57(HCDR1 S31H)和伊匹单抗64(LCDR1 S28E/S31D和HCDR1 S31H)在pH 6.0和pH 7.5下的结合参数。基本上如实施例3中所述来获得值。抗体伊匹单抗64组合了伊匹单抗25和伊匹单抗57的突变。与单独的重链和轻链突变相比，重链和轻链突变的组合使抗体具有在低pH下增强的结合偏好。针对伊匹单抗的比率(1.0)进行归一化的解离平衡结合常数(KD)的比率即CAPBP对于伊匹单抗25、伊匹单抗57和伊匹单抗64分别为6.3、5.5和27.2。
图7A和图7B显示了在pH 7.4(图7A)和pH 6.0(图7B)下伊匹单抗3(按照Kabat编号的HCDR3 T95H)与CTLA-4结合的表面等离子体共振传感图数据。引入该突变以降低在pH7.5下伊匹单抗的亲和力。参见实施例4。
图8A、图8B和图8C提供了本发明的各种抗体在pH 6.0和pH 7.4下的结合的图。图8A和图8B显示了KD值，其较低的值代表增加的亲和力。在这些图中低于伊匹单抗的抗体在低pH(pH 6.0)下具有增强的结合。在象限基于伊匹单抗的位置的情况下，每个图中趋于右下象限的抗体具有在低pH(pH 6.0)下进一步增强的结合偏好，因为它们也具有在pH 7.4下降低的亲和力。图8B呈现了图8A的数据的扩展视图。图8C提供了本发明的抗体与CTLA-4的复合物的半衰期值，计算为ln2/koff。对于该图，左上象限中的抗体(再次参考伊匹单抗)展现出在pH 6.0下增强的稳定性以及在pH 7.4下降低的稳定性。参见实施例2。
图9显示了本发明的选择的伊匹单抗变体与CTLA-4的结合的pH依赖性。结合呈现为随着pH而变化的Req，它是表面等离子体共振中稳态结合的量度，其中呈现了在每个pH下抗体伊匹单抗64、伊匹单抗71、伊匹单抗92和伊匹单抗95的数据(从左到右)。伊匹单抗的数据以线的形式提供，如图例所示。与在所有测量的pH下类似地结合的伊匹单抗相比，对于所有伊匹单抗序列变体，亲和力随着pH的增加而降低。参见实施例2。
图10A和图10B显示了各种抗体以Fab片段的形式在pH 7.3(图10A)和pH 6.0(图10B)下与58α-β-CTLA-4/CD3ζ细胞的结合。参见实施例5。伊匹单抗(伊匹单抗fab野生型，●)在两种pH下类似地结合(EC50在pH 7.3下为5.4nM并且在pH 6.0下为7.1nM)，如通过任意荧光强度单位(GMFI)所测量；而伊匹单抗序列变体伊匹单抗64(伊匹单抗64突变体fab，▲)在pH 6.0下结合良好(3.3nM)，但在pH 7.3下结合很差(140nM)。参见实施例5。
图11A和图11B显示了类似于图10A和图10B所示的那些的结果，不同之处在于数据按抗体而不是按pH分组，并且提供了pH 5.6下的另外的数据。与图10A和图10B一样，与pH7.3(●)相比，伊匹单抗序列变体伊匹单抗64在pH 6.0(■)下的结合明显好得多，而伊匹单抗的结合是类似的。参见实施例5。
图12A、图12B和图12C显示了本发明的各种抗体以Fab片段的形式在pH 6.3(图12A)、pH 6.6(图12B)和pH 7.2(图12C)下与58α-β-CTLA-4/CD3ζ细胞的结合。像通常一样，伊匹单抗Fab(●)在所有pH下类似地结合，如通过任意荧光强度单位(GMFI)所测量；而伊匹单抗Fab序列变体伊匹单抗64(■)和伊匹单抗71(▲)展现出在低pH下的优先结合。参见实施例5。在图12C中伊匹单抗Fab序列变体的伊匹单抗64(■)和伊匹单抗71(▲)的曲线重叠。
图13A、图13B和图13C显示了与图12A、图12B和图12C中所示的那些类似的结果，不同之处在于数据是用全长IgG抗体而不是Fab片段获得的。正如预期的那样，二价抗体以比相应的Fab片段更高的亲合力结合。伊匹单抗(●)、伊匹单抗64(■)和伊匹单抗71(▲)的结合彼此无差别，并且在所有pH下具有相似的亲和力。参见实施例5。在该测定形式中抗体伊匹单抗92
Figure BDA0003396385390000101
和伊匹单抗95(◆)展现出在低pH下的优先结合，这与表4中其高KD 7.4/6(APBP)值(分别>59和99)一致。
图14A、图14B和图14C显示了如通过表面等离子体共振光谱术测量的本发明的选择的抗体与人CTLA-4的结合的pH滴定，分别提供了平衡结合常数KD、缔合(association/on)速率常数kon和解离(dissociation/off)速率常数koff。伊匹单抗(●)显示出对pH的相对较小依赖性，而伊匹单抗64(■)、伊匹单抗100(▲)、伊匹单抗101
Figure BDA0003396385390000102
伊匹单抗105(◆)和伊匹单抗106(○)全部展现出对pH的显著依赖性。参见实施例8。
图15A、图15B和图15C显示了如通过表面等离子体共振光谱术测量的本发明的选择的抗体与食蟹猴CTLA-4(来自食蟹猴(cynomolgus macaque Macaca fascicularis)的CTLA-4)的结合的pH滴定，分别提供了平衡结合常数KD、缔合(association/on)速率常数kon和解离(dissociation/off)速率常数koff。结果与如图14A-图14C所示用人CTLA-4获得的结果定性地相似，但亲和力较低。参见实施例8。
图16A、图16B和16C显示了与图13A、图13B和图13C所示的那些类似的结果，不同之处在于获得了本发明的另外的抗体的数据，并且所有抗体均为非岩藻糖基化的。参见实施例5。提供了伊匹单抗(○)、伊匹单抗64(■)、伊匹单抗100(▲)、伊匹单抗101
Figure BDA0003396385390000111
伊匹单抗106(●-实心六边形)和伊匹单抗105(◆)的数据。抗体伊匹单抗105和伊匹单抗106展现出在低pH下的优先结合。
图17A-图17F显示了与图16A-图16C所示的那些相似的结果，不同之处在于数据是用Fab片段而不是用非岩藻糖基化全长IgG1抗体获得的。参见实施例5。图17A和图17B显示了在两种不同放大倍数下对于pH 7.2的结果，其中图17B被扩大以更好地说明伊匹单抗106和伊匹单抗105的数据。图17C和图17D显示了对于pH 6.7的类似结果，并且图17E和17F显示了对于pH 6.2的类似结果。提供了伊匹单抗(○)、伊匹单抗100(■)、伊匹单抗101(▲)、伊匹单抗105
Figure BDA0003396385390000112
伊匹单抗106(◆)和同种型对照(●-实心六边形)的数据。抗体伊匹单抗100和伊匹单抗101的结合在pH 7.2下几乎与伊匹单抗一样，并且在pH 6.7和6.2下逐渐更好。在pH 7.2下抗体伊匹单抗105和伊匹单抗106的结合比伊匹单抗弱得多，但在pH 6.7和6.2下显示出显著改善的结合，其中在pH 6.2下伊匹单抗105接近伊匹单抗的亲和力。
图18A、图18B和图18C分别显示出表达为非岩藻糖基化IgG1的本发明的选择的抗体在pH 7.2、7.0和6.8下的58αβ-hCTLA/mCD3ζ:rhB7-1阻断测定的结果。提供了伊匹单抗(○)、伊匹单抗64(■)、伊匹单抗100(▲)、伊匹单抗101
Figure BDA0003396385390000113
伊匹单抗105(◆)、伊匹单抗106(●-实心六边形)、同种型对照
Figure BDA0003396385390000114
和无抗体(X)的数据。如IL-2分泌的抑制所反映，在所有pH下，抗体伊匹单抗64、伊匹单抗100和伊匹单抗101在阻断CTLA-4与B7-1的结合方面全部与伊匹单抗几乎一样有效，其中在较低pH下通常改善阻断。伊匹单抗105在pH 7.2下不如伊匹单抗有效，而在pH 6.8下展现出几乎等效的阻断。伊匹单抗106在pH 7.2下显示极小(如果存在)活性，而在pH 6.8下显示出中等活性。参见实施例9。
图19A-图19M显示了本发明的选择的pH敏感性抗CTLA-4抗体在MC38小鼠肿瘤模型中的作用，所述抗体各自表达为非岩藻糖基化IgG1。使用人CTLA-4敲入小鼠。参见实施例7。提供随着植入后天数而变化的肿瘤体积(mm3)，并且每条迹线代表每个实验的十只小鼠中的一只。图19A、图19B和图19C分别显示了以1mg/kg(mpk)、3mpk和10mpk给药的伊匹单抗的结果。图19D、图19E和图19F显示了伊匹单抗64的类似结果。图19G、图19H和图19I显示了伊匹单抗106的类似结果，并且图19J、图19K和图19L显示了伊匹单抗105的类似结果。图19M显示了用10mpk的同种型对照治疗的小鼠的类似结果。非岩藻糖基化伊匹单抗在1与10mpk之间以剂量依赖性方式有效地抑制肿瘤生长，并且在3和10mpk下完全抑制。伊匹单抗64、伊匹单抗106和伊匹单抗105以剂量依赖性方式类似地有效。
图20A和图20B显示了在用本发明的选择的pH敏感性抗CTLA-4抗体治疗的小鼠肿瘤模型中，分别在脾脏中和在肿瘤中的调节性T细胞的水平，所述水平表示为FoxP3+细胞占全部CD4+T细胞的百分比。参见实施例7。在两个图中，圆形(●)代表以1mpk给药，正方形(■)代表3mpk，并且三角形(▲)代表10mpk。向小鼠植入肿瘤细胞并用如参考图19A-图19M所述的本发明的选择的抗体治疗小鼠。获得来自脾脏和肿瘤的样品，并通过流式细胞术测定所有CD4+T细胞中FoxP3+细胞的百分比。与同种型对照相比，非岩藻糖基化伊匹单抗略微增加了脾脏中Treg的水平，而本发明的pH敏感性抗体(伊匹单抗64、伊匹单抗106和伊匹单抗105)更类似于同种型对照，因为它们几乎没有增加Treg的水平。图20A。相比之下，与同种型对照相比，非岩藻糖基化伊匹单抗显著降低肿瘤中Treg的水平，并且本发明的pH敏感性抗体具有相同作用。图20B。
图21A和图21B显示了在用如参考图20A和图20B所述的本发明的选择的pH敏感性抗CTLA-4抗体治疗的小鼠肿瘤模型的脾脏中，如由呈ICOS+的调节性T细胞的百分比所测量的T细胞激活以及如由呈Ki-67+的调节性T细胞的百分比所测量的增殖。参见实施例7。在两个图中，圆形(●)代表以1mpk给药，正方形(■)代表3mpk，并且三角形(▲)代表10mpk。与非岩藻糖基化伊匹单抗相比，非岩藻糖化pH敏感性伊匹单抗变体在脾脏中显示出降低的外周活性，如由激活和增殖标记物ICOS和Ki-67所展现，特别是在较高剂量下，其中非岩藻糖基化伊匹单抗的作用更明显。
具体实施方式
定义
为了更容易地理解本公开文本，首先定义某些术语。如本申请中所用，除非本文另外明确提供，否则以下术语中的每一个应当具有下文所阐述的含义。另外的定义贯穿本申请进行阐述。
“施用”是指使用本领域技术人员已知的多种方法和递送系统中的任何一种将包含治疗剂的组合物物理引入受试者。本发明的抗体的优选施用途径包括静脉内、腹膜内、肌内、皮下、脊髓或其他肠胃外施用途径例如通过注射或输注。如本文所用，短语“肠胃外施用”意指除了肠施用和局部施用之外，通常通过注射的施用模式，并且包括而不限于静脉内、腹膜内、肌内、动脉内、鞘内、淋巴管内、病灶内、囊内、眼眶内、心脏内、皮内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外以及胸骨内注射和输注以及体内电穿孔。可替代地，本发明的抗体可以是经由非肠胃外途径(如局部、表皮或粘膜施用途径)施用，例如鼻内、口服、阴道、直肠、舌下或局部施用。施用还可以例如进行一次、多次和/或经一个或多个延长的时间段。可以由一个或多个个体进行施用，包括但不限于医生、护士、其他医疗保健提供者或患者本人进行施用。
“抗体”(Ab)应包括但不限于糖蛋白免疫球蛋白(其与抗原特异性结合并包含通过二硫键相互连接的至少两个重(H)链和两个轻(L)链)或其抗原结合部分。每条H链包含重链可变区(本文缩写为VH)和重链恒定区。所述重链恒定区包含三个结构域即CH1、CH2和CH3。每条轻链包含轻链可变区(本文缩写为VL)和轻链恒定区。所述轻链恒定区由一个结构域CL构成。VH和VL区可以进一步细分为具有高变性的区域，称为互补决定区(CDR)，其散布有更保守的区域，称为框架区(FR)。每个VH和VL由三个CDR和四个FR组成，按照以下顺序从氨基末端到羧基末端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。
如本文所用且根据常规解释，被描述为包含“一个/种”重链和/或“一个/种”轻链的抗体是指包含所述重链和/或轻链中的“至少一个/种”的抗体，因此将包括具有两条或更多条重链和/或轻链的抗体。具体地，如此描述的抗体将包括具有两个基本相同的重链和两个基本相同的轻链的常规抗体。抗体链可以基本相同，但如果它们由于翻译后修饰(如赖氨酸残基的C末端切割、替代糖基化模式等)而不同，则不完全相同。
除非另有说明或从上下文明确看出，否则由其靶标特异性定义的抗体(例如“抗CTLA-4抗体”)是指可与其人靶标(例如人CTLA-4)结合的抗体。此类抗体可以与或可以不与来自其他物种的CTLA-4结合。
免疫球蛋白可以源自任何熟知的同种型，包括但不限于IgA、分泌型IgA、IgG和IgM。IgG同种型在某些物种中可以分为亚类：人中的IgG1、IgG2、IgG3和IgG4小鼠中的IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3。IgG抗体在本文中可以由符号gamma(γ)或简单的“G”来指代，例如IgG1可以表示为“γ1”或“G1”，如从上下文可以明确看出的。“同种型”是指由重链恒定区基因编码的抗体类别(例如，IgM或IgG1)。“抗体”包括天然存在的抗体和非天然存在的抗体二者；单克隆抗体和多克隆抗体；嵌合抗体和人源化抗体；人抗体或非人抗体；全合成抗体；和单链抗体。除非另有说明或从上下文明确看出，否则本文公开的抗体是人IgG1抗体。
“分离的抗体”是指基本上不含具有不同抗原特异性的其他抗体的抗体(例如，与CTLA-4特异性结合的分离的抗体基本上不含与CTLA-4以外的抗原特异性结合的抗体)。然而，与CTLA-4特异性结合的分离的抗体可能与其他抗原(如来自不同物种的CTLA-4分子)交叉反应。此外，分离的抗体可以基本上不含其他细胞材料和/或化学物质。相比之下，“分离的”核酸是指这样的物质的核酸组成，其与自然界中存在的核酸显著不同，即具有独特的化学特性、性质和实用性。例如，与天然DNA不同，分离的DNA是天然DNA的独立部分，而不是自然界中发现的更大结构复合物即染色体的组成部分。此外，与天然DNA不同，分离的DNA可以用作PCR引物或杂交探针，以用于测量基因表达和检测生物标记基因或突变以诊断疾病或预测治疗剂的功效等。还可以使用本领域熟知的标准技术纯化分离的核酸以使其基本上不含其他细胞组分或其他污染物，例如其他细胞核酸或蛋白质。
术语“单克隆抗体”(mAb)是指具有单一分子组成的抗体分子的制剂，即其一级序列基本上相同并且对特定表位展现出单一结合特异性和亲和力的抗体分子。单克隆抗体可以通过杂交瘤、重组、转基因或本领域技术人员已知的其他技术产生。
如本文所用，术语“去岩藻糖基化”是指其中N连接聚糖不含岩藻糖残基的单独抗体重链。如本文所用，术语“非岩藻糖基化”是指含有具有去岩藻糖基化重链的抗体的抗体制剂，并且除非另有说明，否则具有超过95％的去岩藻糖基化重链。此类抗体制剂可以用作治疗组合物。
“人”抗体(HuMAb)是指具有其中框架区和CDR区两者均源自人种系免疫球蛋白序列的可变区的抗体。此外，如果所述抗体含有恒定区，则所述恒定区也源自人种系免疫球蛋白序列。本发明的人抗体可以包含不是由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变引入的突变)。然而，如本文所用，术语“人抗体”并不旨在包括其中源自另一种哺乳动物物种(如小鼠)的种系的CDR序列已经被移植到人框架序列上的抗体。术语“人”抗体和“完全人”抗体同义使用。
“抗体片段”是指完整抗体的一部分，通常包括完整抗体的“抗原结合部分”(“抗原结合片段”)，其保留与由完整抗体结合的抗原特异性结合的能力；或保留FcR结合能力的抗体Fc区。示例性抗体片段包括Fab片段和单链可变结构域(scFv)片段。
如本文所用，“低pH”是指低于典型人受试者中的正常生理pH(如正常人血液或血清的pH，例如pH 7.4)的任何pH。在具体实施方案中，“低pH”是指有待于用本发明的抗体治疗的人受试者中的肿瘤内的肿瘤微环境中的pH，如pH 7.0、6.8、6.6、6.4、6.2、6.0或更低。除非另有说明或从上下文明确看出，否则正常或生理pH为pH 7.4，并且低pH为pH 6.0。所列举的pH值旨在包括确定相关样品中pH时的典型误差范围内的值。在一些实验中，7.3和7.5的pH值用作生理pH的替代值。选择7.4和6.0的pH值作为本文所述实验的示例性pH值用于选择本发明的改善的抗体，但此类改善的抗体可用于其中肿瘤微环境具有比非肿瘤组织低的pH的任何情形。本发明的抗体的使用决不限于在它们的选择中使用的任何特定pH值。
“酸性pH结合偏好”(APBP)是pH 7.4下结合的解离平衡常数与pH 6.0下结合的解离平衡常数的比率，即KD-7.4/KD-6.0。除非另有说明或从上下文明确看出，否则KD值通过表面等离子体共振(例如使用
Figure BDA0003396385390000151
表面等离子体共振设备(GE Healthcare，伊利诺伊州芝加哥))或等效方法来测定。较高的APBP代表对在低pH下结合的更大偏好，因此代表一种相对于具有较低APBP值的抗体的改善的抗体。高APBP可以是由于在酸性pH下增强的结合且在中性pH下减少的结合、在酸性pH下高度增强的结合且在中性pH下略微增强的结合、或在酸性pH下略微减少的结合且在中性pH下高度减少的结合。本发明的有用抗体可以在这些情况中任一种情况下产生。
本发明的抗体可以展现出任何大于伊匹单抗APBP的APBP。为了便于这种比较，可以将APBP值针对伊匹单抗的所述值归一化为“比较性酸性pH结合偏好”(CAPBP)。CAPBP是对于特定的伊匹单抗变体形式在pH 7.4下结合的解离平衡常数与在pH 6.0下结合的解离平衡常数的比率除以对于伊匹单抗的等效值，即[(KD-7.4/KD-6.0)变体/(KD-7.4/KD-6.0)伊匹单抗]。在各个实施方案中，所述CAPBP大于或等于1.5、2、3、4、5、7、10、12、15、20、25、35、50、75和100。
“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”(“ADCC”)是指体外或体内细胞介导的反应，其中表达FcR的非特异性细胞毒性细胞(例如，自然杀伤(NK)细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞和嗜酸性粒细胞)识别与靶细胞上的表面抗原结合的抗体，随后导致靶细胞的溶解。原则上，任何具有激活FcR的效应细胞都可以被触发以介导ADCC。
“癌症”是指一组广泛的不同疾病，其特征在于体内异常细胞的不受控制的生长。不受调节的细胞分裂和生长导致恶性肿瘤或细胞的形成，恶性肿瘤侵入邻近组织并且还可以通过淋巴系统或血流转移到身体的远端部分。
“细胞表面受体”是指能够接收信号并将这种信号传递穿过细胞的质膜的分子和分子复合物。
“效应细胞”是指表达一种或多种FcR并介导一种或多种效应子功能的免疫系统的细胞。优选地，所述细胞表达至少一种类型的激活Fc受体(例如像人FcγRIII)并执行ADCC效应子功能。介导ADCC的人白细胞的例子包括外周血单个核细胞(PBMC)、NK细胞、单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞和嗜酸性粒细胞。
“效应子功能”是指抗体Fc区与Fc受体或配体的相互作用或由此产生的生化事件。示例性的“效应子功能”包括Clq结合、补体依赖性细胞毒性(CDC)、Fc受体结合、FcγR介导的效应子功能(如ADCC和抗体依赖性细胞介导的吞噬作用(ADCP))和细胞表面受体(例如，B细胞受体；BCR)的下调。此类效应子功能通常需要Fc区与结合结构域(例如，抗体可变结构域)组合。
“Fc受体”或“FcR”是与免疫球蛋白的Fc区结合的受体。与IgG抗体结合的FcR包含FcγR家族的受体，包括这些受体的等位基因变体和可变剪接形式。FcγR家族由三种激活受体(小鼠中的FcγRI、FcγRIII和FcγRIV；人中的FcγRIA、FcγRIIA和FcγRIIIA)和一种抑制受体(FcγRIIB)组成。表1中总结了人FcγR的各种特性。大多数先天性效应细胞类型共表达一种或多种激活FcγR和抑制FcγRIIB，而自然杀伤(NK)细胞选择性地表达一种激活Fc受体(小鼠中的FcγRIII和人中的FcγRIIIA)，但是在小鼠和人中不表达抑制FcγRIIB。
“Fc区”(片段可结晶区)或“Fc结构域”或“Fc”是指抗体的重链的C末端区，其介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，包括与位于免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)上的Fc受体的结合或与经典补体系统的第一组分(C1q)的结合。因此，所述Fc区是包含除第一恒定区免疫球蛋白结构域之外的抗体恒定区的多肽。在IgG、IgA和IgD抗体同种型中，所述Fc区由两个相同的蛋白质片段构成，其源自抗体两条重链的第二(CH2)和第三(CH2)恒定结构域；IgM和IgE Fc区含有每个多肽链中的三个重链恒定结构域(CH结构域2-4)。对于IgG，所述Fc区包含免疫球蛋白结构域Cγ2和Cγ3以及Cγ1与Cγ2之间的铰链。尽管免疫球蛋白重链的Fc区的边界可能会发生变化，但是人IgG重链的Fc区通常定义为从位置C226或P230处的氨基酸残基延伸到重链的羧基末端，其中编号是根据如在Kabat中的EU索引进行的。人IgG Fc区的CH2结构域从约氨基酸231延伸到约氨基酸340，而CH3结构域位于Fc区中CH2结构域的C末端侧，即它从IgG的约氨基酸341延伸到约氨基酸447。如本文所用，所述Fc区可以是天然序列Fc或变体Fc。Fc也可以单独地或在包含Fc的蛋白质多肽(如“包含Fc区的结合蛋白”，也称为“Fc融合蛋白”(例如，抗体或免疫粘附素))的上下文中指代此区域。
表1人FcγR的特性
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“免疫应答”是指脊椎动物内针对外来因子(agent)的生物反应，所述反应保护生物免受这些因子和由其引起的疾病的侵害。所述免疫应答是由免疫系统的细胞(例如，T淋巴细胞、B淋巴细胞、自然杀伤(NK)细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、树突细胞或嗜中性粒细胞)和通过这些细胞或肝脏中的任何一种产生的可溶性大分子(包括抗体、细胞因子和补体)的作用介导的，所述作用导致选择性靶向、结合、损伤、破坏和/或消除脊椎动物中侵入的病原体、感染病原体的细胞或组织、癌性或其他异常细胞，或者在自身免疫性或病理性炎症的情况下导致选择性靶向、结合、损伤、破坏和/或消除正常的人细胞或组织。
“免疫调节剂”(“immunomodulator”或“immunoregulator”)是指可以参与调节(modulating、regulating)或改变免疫应答的信号传导途径的组分。“调节”(“modulating”、“regulating”)或“改变”免疫应答是指免疫系统的细胞或这种细胞的活性的任何改变。这种调节包括对免疫系统的刺激或抑制，这可以通过各种细胞类型数量的增加或减少、这些细胞的活性的增加或降低或免疫系统内可能发生的任何其他变化来显示。已经鉴定了抑制和刺激免疫调节剂二者，其中一些在肿瘤微环境中可能具有增强的功能。在所公开的本发明的优选实施方案中，所述免疫调节剂位于T细胞的表面。“免疫调节靶标”(“immunomodulatory target”或“immunoregulatory target”)是这样的免疫调节剂，其被靶向用于与物质、药剂、部分、化合物或分子结合，并且所述免疫调节靶标的活性因物质、药剂、部分、化合物或分子的结合而改变。免疫调节靶标包括例如细胞表面上的受体(“免疫调节受体”)和受体配体(“免疫调节配体”)。
“免疫疗法”是指通过包括诱导、增强、抑制或以其他方式改变免疫应答的方法治疗患有疾病或者有感染疾病或遭受疾病复发风险的受试者。
“增强内源性免疫应答”意指增加受试者的现有免疫应答的有效性或效力。有效性和效力的这种增加可以例如通过以下方式来实现：克服抑制内源性宿主免疫应答的机制或者刺激增强内源性宿主免疫应答的机制。
“蛋白质”是指包含至少两个连续连接的氨基酸残基的链，所述链的长度没有上限。所述蛋白质中的一个或多个氨基酸残基可以含有修饰，例如但不限于糖基化、磷酸化或二硫键形成。术语“蛋白质”在本文中可与“多肽”互换使用。
“受试者”包括任何人或非人动物。术语“非人动物”包括但不限于脊椎动物，如非人灵长类、绵羊、狗、兔、啮齿动物(如小鼠、大鼠和豚鼠)、禽类物种(如鸡)、两栖动物和爬行动物。在优选的实施方案中，所述受试者是哺乳动物，如非人灵长类、绵羊、狗、猫、兔、雪貂或啮齿动物。在所公开的本发明的任何方面的更优选实施方案中，所述受试者是人。术语“受试者”和“患者”在本文可互换使用。
“治疗有效量”或“治疗有效剂量”的药物或治疗剂(如本发明的Fc融合蛋白)是当单独地或与另一种治疗剂组合使用时，促进通过疾病症状的严重程度的降低、无疾病症状时期的频率和持续时间的增加或由于疾病困扰引起的损伤或残疾的预防所证实的疾病消退的任何量的药物。药物的治疗有效量或剂量包括“预防有效量”或“预防有效剂量”，其是当单独地或与另一种治疗剂组合施用至有风险患上疾病或有风险遭受疾病复发的受试者时抑制所述疾病的发展或复发的任何量的药物。治疗剂促进疾病消退或抑制疾病发展或复发的能力可以使用熟练开业者已知的各种方法来评价，如在临床试验期间在人受试者中，在预测于人体中的功效的动物模型系统中，或者通过在体外测定中测定药剂的活性来评价。
举例来说，抗癌剂促进受试者中的癌症消退。在优选的实施方案中，治疗有效量的药物促进癌症消退至消除癌症的程度。“促进癌症消退”意指单独地或与抗肿瘤剂组合施用有效量的药物导致肿瘤生长或尺寸的减小、肿瘤坏死、至少一种疾病症状的严重程度降低、无疾病症状时期的频率和持续时间的增加、由于疾病困扰引起的损伤或伤残的预防、或者患者的疾病症状以其他方式的改善。另外，关于治疗的术语“有效的”和“有效性”包括药理学有效性和生理学安全性。药理学有效性是指药物促进患者的癌症消退的能力。生理学安全性是指由药物的施用引起的在细胞、器官和/或生物水平的毒性水平或其他不利生理效应(不利效应)。
对于肿瘤的治疗，举例来说，相对于未治疗的受试者，治疗有效量或剂量的药物优选抑制细胞生长或肿瘤生长至少约20％、更优选至少约40％、甚至更优选至少约60％、以及再更优选至少约80％。在最优选的实施方案中，治疗有效量或剂量的药物完全抑制细胞生长或肿瘤生长，即，优选100％抑制细胞生长或肿瘤生长。可以在动物模型系统中评价化合物抑制肿瘤生长的能力，所述动物模型系统如本文所述的CT26结肠腺癌、MC38结肠腺癌和Sa1N纤维肉瘤小鼠肿瘤模型，所述模型预测在人肿瘤中的功效。可替代地，可以通过检查化合物抑制细胞生长的能力来评价组合物的这种特性，可以通过熟练从业者已知的测定在体外测量这种抑制。在本发明的其他优选实施方案中，可以观察到肿瘤消退并且持续至少约20天、更优选地至少约40天或甚至更优选地至少约60天的时间。
受试者的“治疗”或“疗法”是指对受试者进行的任何类型的干预或处理，或者向受试者施用活性剂，目的是逆转、减轻、改善、抑制、减缓或预防症状、并发症、病症的发作、进展、发展、严重程度或复发或者与疾病相关的生化指标。
在低pH下具有增强的结合偏好的抗CTLA-4抗体
一方面，本发明提供了改善的抗CTLA-4抗体(如改善形式的伊匹单抗)，与正常组织中的7.2-7.4相比，其在低pH下(如在肿瘤微环境中，其可以具有在6.5与6.9之间的pH)具有增强的结合偏好。参见图14A-图14C。与伊匹单抗相比，预计此类抗体将展现出改善的治疗指数，即它们将具有抗肿瘤活性(要求在其他低pH区室的肿瘤微环境中结合)与副作用(通过在外周、非肿瘤组织中的结合介导的)的改善的比率。鉴于使用抗CTLA-4疗法、特别是在较高剂量下观察到的不良事件水平，副作用的减少可能代表显著优势。Ribas等人(2013)J.Clin.Oncology 31:616；Feng等人(2013)Clin.Cancer19:3977。
取决于在低pH和生理pH下的特定KD值，本发明的改善的抗体可以是以比伊匹单抗所用的剂量更高、更低或相等的剂量给药。本发明的抗体全都必须具有大于1.0的CAPBP，将所述抗体分为三类：在低pH和生理pH下均具有增强的亲和力(I型)；在低pH和生理pH下具有较低亲和力(II型)；以及在低pH下具有增强的亲和力，但在生理pH下具有较低亲和力(III型)。例如，I型抗体的剂量可以低于伊匹单抗，同时保持抗肿瘤功效。例如，III型抗体的剂量可以高于伊匹单抗，而不会增加副作用。例如，II型抗体的剂量可以低于、高于或等同于伊匹单抗，这分别取决于目标是使安全性最大化、功效最大化或在这两者之间取得平衡。然而，本发明的抗体可以是以提供所需功效和安全性的任何剂量施用，并且由于其增强的治疗指数，可能的剂量范围将比伊匹单抗的更宽。
其他抗体已被工程化为选择性地改变在低pH下的结合。托珠单抗(抗IL-6R)被修饰以选择性地降低在pH 6.0下的结合，以增强与酸性内体中结合的IL-6R的解离，从而释放抗体到血浆中以结合其他IL-6R。Igawa等人(2010)Nat.Biotechnol.28:1203。对于PCSK-9抗体(Chaparro-Riggers等人(2012)J.Biol.Chem.287:11090)、IL-6抗体(Devanaboyina等人(2013)mAbs 5:851)、抗补体C5 mAb(Fukuzawa等人(2017)Sci.Reports 7:1080)和抗TNFα抗体阿达木单抗(
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等人(2015)mAbs 7:138)使用了类似的方法。与本发明不同，这些情况中的每一种都涉及与中性/生理pH相比，降低在低pH下的相对亲和力，以增强抗体再循环。
如本文附图和实施例中所示，设计并选择与伊匹单抗相比，在低pH下具有优先结合亲和力的多种抗人CTLA-4抗体。简而言之，设计核酸文库以将氨基酸引入伊匹单抗的CDR中以增加其结合的pH敏感性，并选择具有在低pH下优先结合的所需特性的抗体。所述抗体的特性和序列在表4、表5、表6、表7中以及表8总结的序列表中提供。本发明的抗人CTLA-4抗体在低pH下结合的偏好可从图8A-图8C(其中抗体聚集在图中对应于低pH下优先结合的象限中)和图9明显看出，并且在图14A中最为清楚。所述抗体还展现出有利于低pH下与食蟹猴CTLA-4结合的相同趋势(图15A)，这表明食蟹猴将是良好的毒理学模型。
本发明的抗体显示出不仅在SPR实验中与huCTLA-4结合，而且在细胞表面上表达时与huCTLA-4结合(图10A-图10B、图11A-图11B、图12A-图12C、图13A-图13C、图16A-图16C、图17A-图17F和图18A-图18C)。当所有抗体都表达为非岩藻糖基化IgG1时，本发明的选择的抗体(伊匹单抗64、伊匹单抗106和伊匹单抗105)还显示出在使用huCTLA-4敲入小鼠的小鼠肿瘤模型中抑制肿瘤生长方面与伊匹单抗一样有效(图19A-图19M)。这些抗体还显示出与伊匹单抗一样降低肿瘤微环境中的Treg水平(图20B)，同时在外周中具有较小的增强作用(图20A)，表明它们可能在患者中引起较少的副作用，所述副作用已知是由外周T细胞激活导致的。这些相同的抗体还显示出在外周Treg中引起较少的激活(图21A)和增殖(图21B)，这与如下观点一致：本发明的pH敏感性抗huCTLA-4抗体(如伊匹单抗106和伊匹单抗105)无论是岩藻糖基化还是非岩藻糖基化都可以保留伊匹单抗的抗肿瘤功效且具有降低的外周毒性。此类改善的抗体可以是以比伊匹单抗(伊匹单抗的给药通常受毒性限制)更高的剂量施用以提供增强的功效，或者其剂量可以与伊匹单抗相同，其中功效等同但具有更高的安全性/耐受性。
靶向抗原结合
在各个实施方案中，本发明的抗体被修饰以选择性地阻断组织和环境中的抗原结合，在所述组织和环境中抗原结合将是有害的；但在抗原结合有益的情况下允许抗原结合。在一个实施方案中，产生了一种阻断肽“掩蔽剂”，其与所述抗体的抗原结合部分特异性地结合并干扰抗原结合，所述掩蔽剂通过肽酶可切割接头与所述抗体的每个结合臂连接。参见例如，授予CytomX的美国专利号8,518,404。还参见国际专利申请公开号WO 2018/085555。此类构建体可用于治疗癌症，其中与非肿瘤组织相比，肿瘤微环境中蛋白酶水平大大增加。肿瘤微环境中可切割接头的选择性切割允许所述掩蔽/阻断肽的解离，从而使抗原在肿瘤中选择性地结合，而在外周组织中不结合，在所述外周组织中抗原结合可能导致不希望的副作用。这种修饰将增强本发明的抗体的低pH偏好的益处，因为其将进一步增强与外周相比，伊匹单抗活性对具有低pH下和肿瘤特有蛋白酶的肿瘤部位的特异性。
可替代地，在相关实施方案中，开发了一种包含两个抗原结合结构域的二价结合化合物(“掩蔽配体”)，其与(二价)抗体的两个抗原结合表面均结合并干扰抗原结合，其中两个结合结构域掩蔽剂通过可切割接头(例如可被肽酶切割)彼此连接(但不是抗体)。参见例如，授予Tegopharm Corp的国际专利申请公开号WO 2010/077643。掩蔽配体可以包含或源自所述抗体旨在结合的抗原，或者可以独立地产生。此类掩蔽配体可用于治疗如下癌症，其中与非肿瘤组织相比，在肿瘤微环境中蛋白酶水平大大增加。肿瘤微环境中可切割接头的选择性切割使两个结合结构域彼此解离，从而降低了所述抗体的抗原结合表面的亲合力。所述掩蔽配体与所述抗体的解离使得抗原在肿瘤中选择性地结合，而在外周组织中不结合，在所述外周组织中抗原结合可能导致不希望的副作用。
编码本发明的抗体的核酸分子
本公开文本的另一方面涉及编码本发明的任何改善的抗CTLA-4抗体的分离的核酸分子。所述核酸可以存在于完整细胞、细胞溶解物中或以部分纯化的或基本上纯的形式存在。所述核酸可以是例如DNA或RNA，并且可以含有或可以不含有内含子序列。在某些实施方案中，所述DNA是基因组DNA、cDNA或合成DNA，即实验室合成的DNA，例如通过聚合酶链式反应或通过化学合成而合成的。
具有增强的效应子功能的pH敏感性抗CTLA-4抗体
已显示对抗体的Fc区的多种修饰可增强效应子功能。在小鼠中，与激活Fcγ受体的增强的结合和与Fcγ抑制受体的降低的结合遵循以下层次结构：mIgG2a>>mIgG2b>>mIgG1-D265A。该层次结构遵循由Nimmerjahn&Ravetch(2005)Science 310:1510定义的免疫球蛋白Fc区与激活Fc受体相比于抑制Fc受体的结合的活性比率(称为A/I比率)，并确定了对于介导ADCC功能的抗体的所述活性比率。
在某些方面，本发明的pH敏感性抗CTLA-4抗体是人IgG1抗体。本发明的抗CTLA-4抗体中的ADCC活性可以例如通过在Fc区中引入一个或多个氨基酸取代、改变N连接聚糖处的糖基化模式或这两种方式来增强。
增强效应子功能的Fc突变
在一些实施方案中，本发明的pH敏感性抗CTLA-4抗体的ADCC活性通过修饰Fc区的氨基酸序列来增加，例如，向天然存在的人IgG1序列添加突变以增强ADCC。关于ADCC活性，人IgG1≧IgG3＞＞IgG4≧IgG2，因此可以选择IgG1恒定结构域而不是IgG2或IgG4作为增强ADCC的起点。如本文所定义，如它以伊匹单抗的形式存在的未修饰的人IgG1不具有增强的ADCC。可以通过修饰以下位置处的一个或多个氨基酸来修饰Fc区以增加抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和/或增加对Fcγ受体(FcγR)的亲和力：234、235、236、238、239、240、241、243、244、245、247、248、249、252、254、255、256、258、262、263、264、265、267、268、269、270、272、276、278、280、283、285、286、289、290、292、293、294、295、296、298、299、301、303、305、307、309、312、313、315、320、322、324、325、326、327、329、330、331、332、333、334、335、337、338、340、360、373、376、378、382、388、389、398、414、416、419、430、433、434、435、436、437、438或439。参见WO 2012/142515；还参见WO 00/42072。示例性的单独取代包括236A、239D、239E、268D、267E、268E、268F、324T、332D和332E。示例性的变体簇包括239D/332E、236A/332E、236A/239D/332E、268F/324T、267E/268F、267E/324T和267E/268F/324T。例如，已显示包含G236A变体(其可以任选地与I332E组合)的人IgG1Fc可使FcγIIA/FcγIIB结合亲和力比率增加约15倍。Richards等人(2008)Mol.Cancer Therap.7:2517；Moore等人(2010)mAbs 2:181。用于增强FcyR和补体相互作用的其他修饰包括但不限于取代298A、333A、334A、326A、247I、339D、339Q、280H、290S、298D、298V、243L、292P、300L、396L、305I和396L。这些和其他修饰在Strohl(2009)Current Opinion in Biotechnology 20:685-691中进行了综述。具体地，ADCC和CDC两者均可以通过IgG1的位置E333处的变化(例如E333A)而增强。Shields等人(2001)J.Biol.Chem.276:6591。IgG1中P247I和A339D/Q突变用于增强效应子功能的用途披露于WO 2006/020114中，并且D280H、K290S±S298D/V披露于WO 2004/074455中。已显示K326A/W和E333A/S变体在人IgG1中可增加效应子功能，并且E333S在IgG2中可增加效应子功能。Idusogie等人(2001)J.Immunol.166:2571。其他实验已显示，G236A/S239D/A330L/I332E导致与FcRIIa和FcRIIIa的增强的结合。Smith等人(2012)Proc.Nat’l Acad.Sci.(USA)109:6181；Bournazos等人(2014)Cell158:1243。
除非另有说明或从上下文明确看出，否则抗体的Fc区中的氨基酸残基编号是根据EU编号规则(如在Kabat等人(1991)Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,National Institutes of Health,Bethesda,MD中的EU索引；还参见美国专利申请公开号2008/0248028的图3c-图3f)，当特别指代序列表中的序列中的残基时除外，在这种情况下编号必须是连续的。例如，关于Fc区中氨基酸取代作用的参考文献通常会使用EU编号，所述编号允许以相同的编号提及抗体Fc区中的任何给定残基，而与其附接的可变结构域的长度无关。在极少数情况下，可能有必要参考所引用的文件以证实所参考的确切Fc残基。
具体地，已经在人IgG1上定位了FcγR1、FcγRII、FcγRIII和FcRn的结合位点，并且已经描述了具有改善的结合的变体。Shields等人(2001)J.Biol.Chem.276:6591-6604。显示位置256、290、298、333、334和339处的特定突变可改善与FcγRIII的结合，所述特定突变包括组合突变体T256A/S298A、S298A/E333A、S298A/K224A和S298A/E333A/K334A(具有增强的FcγRIIIa结合和ADCC活性)。已鉴定与FcγRIIIa结合的大大增强的其他IgG1变体，包括具有S239D/I332E和S239D/I332E/A330L突变的变体，这些变体在食蟹猴中显示出对FcγRIIIa的亲和力的最大增加、FcγRIIb结合的减少、以及强细胞毒活性。Lazar等人(2006)Proc.Nat’l Acad.Sci.(USA)103:4005；Awan等人(2010)Blood 115:1204；Desjarlais和Lazar(2011)Exp.Cell Res.317:1278。将三重突变引入抗体如阿仑单抗(CD52特异性)、曲妥珠单抗(HER2/neu特异性)、利妥昔单抗(CD20特异性)和西妥昔单抗(EGFR特异性)中转化为体外极大增强的ADCC活性，并且S239D/I332E变体在食蟹猴中显示出增强的耗尽B细胞的能力。Lazar等人(2006)Proc.Nat’l Acad.Sci.(USA)103:4005。另外，已鉴定了在B细胞恶性肿瘤和乳腺癌模型中表达人FcγRIIIa的转基因小鼠中展现出与FcγRIIIa增强的结合和随之增强的ADCC活性的IgG1突变体，所述IgG1突变体含有L235V、F243L、R292P、Y300L、V305I和P396L突变。Stavenhagen等人(2007)Cancer Res.67:8882；美国专利号8,652,466；Nordstrom等人(2011)Breast Cancer Res.13:R123。
不同的IgG同种型也展现出不同的CDC活性(IgG3>IgG1>>IgG2≈IgG4)。Dangl等人(1988)EMBO J.7:1989。对于需要增强CDC的用途，也可以引入增加与C1q的结合的突变。可以通过IgG2中K326和/或E333处的突变(如K326W，其降低ADCC活性，以及E333S)来增强募集补体的能力(CDC)，以增加与C1q(即补体级联的第一成分)的结合。Idusogie等人(2001)J.Immunol.166:2571。将S267E/H268F/S324T(单独地或以任何组合的形式)引入人IgG1中增强了C1q结合。Moore等人(2010)mAbs 2:181。Natsume等人(2008)Cancer Res.68:3863(其中的图1)的IgG1/IgG3杂合同种型抗体“113F”的Fc区也赋予了增强的CDC。还参见Michaelsen等人(2009)Scand.J.Immunol.70:553和Redpath等人(1998)Immunology 93:595。
可增加或降低效应子功能的另外的突变公开在Dall’Acqua等人(2006)J.Immunol.177:1129中。还参见Carter(2006)Nat.Rev.Immunol.6:343；Presta(2008)Curr.Op.Immunol.20:460。
减少的岩藻糖基化、非岩藻糖基化和低岩藻糖基化
本发明的抗体与FcγR的相互作用也可以通过修饰在N297残基处附接至每个Fc片段的聚糖部分来增强。特别地，核心岩藻糖残基的缺失经由改善IgG与激活FcγRIIIA的结合而不改变抗原结合或CDC而强烈增强ADCC。Natsume等人(2009)Drug Des.Devel.Ther.3:7。有令人信服的证据表明，去岩藻糖基化肿瘤特异性抗体在体内小鼠模型中导致增强的治疗活性。Nimmerjahn和Ravetch(2005)Science 310:1510；Mossner等人(2010)Blood 115:4393。
抗体糖基化的修饰可以通过例如在具有改变的糖基化机制的宿主细胞中表达所述抗体来实现。展现出增强的ADCC的具有减少或消除的岩藻糖基化的抗体可特别地用于本发明的方法中。本领域已经描述了具有改变的糖基化机制的细胞，并且可以将其用作表达本公开文本的重组抗体的宿主细胞，从而产生具有改变的糖基化的抗体。例如，细胞系Ms704、Ms705和Ms709缺乏岩藻糖基转移酶基因FUT8(α-(1,6)岩藻糖基转移酶)(参见美国专利申请公开号20040110704；Yamane-Ohnuki等人(2004)Biotechnol.Bioeng.87:614)，使得在这些细胞系中表达的抗体在其碳水化合物中缺乏岩藻糖。作为另一个例子，EP1176195也描述了具有功能破坏的FUT8基因的细胞系，以及具有很小或没有将岩藻糖添加至与抗体的Fc区结合的N-乙酰基葡糖胺的活性的细胞系，例如大鼠骨髓瘤细胞系YB2/0(ATCC CRL 1662)。PCT公开案WO 03/035835描述了变体CHO细胞系Lec13，其具有降低的将岩藻糖附接至Asn(297)连接的碳水化合物的能力，还导致了在该宿主细胞中表达的抗体的低岩藻糖基化。还参见Shields等人(2002)J.Biol.Chem.277:26733。如PCT公开号WO 2006/089231中所述，还可以在鸡蛋中产生具有修饰的糖基化特征的抗体。可替代地，可以在植物细胞(如浮萍属(Lemna))中产生具有修饰的糖基化特征的抗体。参见例如美国公开号2012/0276086。PCT公开号WO 99/54342描述了如下细胞系，其被工程化为表达修饰糖蛋白的糖基转移酶(例如，β(1,4)-N-乙酰基葡糖胺转移酶III(GnTIII))，使得在工程化细胞系中表达的抗体展现出增加的二等分GlcNac结构，这导致抗体的ADCC活性增加。还参见
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等人(1999)Nat.Biotech.17:176。可替代地，可以使用岩藻糖苷酶切割掉所述抗体的岩藻糖残基。例如，α-L-岩藻糖苷酶从所述抗体去除岩藻糖基残基。Tarentino等人(1975)Biochem.14:5516。还可以在含有编码使用GDP-6-脱氧-D-来苏-4-己糖(hexylose)作为底物的酶(如GDP-6-脱氧-D-来苏-4-己糖还原酶(RMD))的重组基因的细胞中产生具有减少的岩藻糖基化的抗体，如美国专利号8,642,292所述。可替代地，细胞可以在含有岩藻糖类似物的培养基中生长，所述岩藻糖类似物阻止岩藻糖残基添加至N连接聚糖或由在培养基中生长的细胞产生的糖蛋白，如抗体。美国专利号8,163,551；WO 09/135181。
因为与岩藻糖基化抗体相比，去岩藻糖基化抗体展现出大大增强的ADCC，因此抗体制剂不必完全不含岩藻糖基化重链即可用于本发明的方法中。岩藻糖基化重链的残留水平不会显著干扰基本上去岩藻糖基化重链的制剂的ADCC活性。然而，完全有能力将核心岩藻糖添加至N-聚糖中的常规CHO细胞中产生的抗体可能包含百分之几至15％的去岩藻糖基化抗体。去岩藻糖基化抗体可以展现出十倍更高的对CD16的亲和力，以及ADCC活性的多达30至100倍增强，因此即使去岩藻糖基化抗体的比例小的增加，也可以显著增加制剂的ADCC活性。任何包含比在培养中的正常CHO细胞中产生的更多的去岩藻糖基化抗体的制剂可以展现出一定水平的增强的ADCC。此类抗体制剂在本文中称为具有减少的岩藻糖基化的制剂。根据从正常CHO细胞获得的原始去岩藻糖基化水平，减少的岩藻糖基化的制剂可以包含少至50％、30％、20％、10％以及甚至5％的去岩藻糖基化抗体。减少的岩藻糖基化在功能上被定义为与在正常CHO细胞中制备的抗体相比，展现出ADCC的两倍或更多增强的制剂，而不是参考任何固定百分比的去岩藻糖基化种类。
在其他实施方案中，非岩藻糖基化的水平在结构上是确定的。如本文所用，非岩藻糖基化抗体制剂是包含大于95％(包括100％)去岩藻糖基化抗体重链的抗体制剂。低岩藻糖基化抗体制剂是包含小于或等于95％缺乏岩藻糖的重链的抗体制剂，例如其中在80％与95％之间(如在85％与95％之间和在90％与95％之间)的重链缺乏岩藻糖的抗体制剂。除非另有说明，否则低岩藻糖基化是指其中80％至95％的重链缺乏岩藻糖的抗体制剂，非岩藻糖基化是指其中超过95％的重链缺乏岩藻糖的抗体制剂，并且“低岩藻糖基化或非岩藻糖基化”是指其中80％或更多的重链缺乏岩藻糖。
在一些实施方案中，低岩藻糖基化或非岩藻糖基化抗体在缺乏岩藻糖基化所必需的酶(如由FUT8编码的α1,6-岩藻糖基转移酶)的细胞中(例如美国专利号7,214,775)，或在其中外源酶部分耗尽岩藻糖基化的代谢前体库的细胞中(例如美国专利号8,642,292)，或在参与岩藻糖基化的酶的小分子抑制剂的存在下培养的细胞中(例如WO 09/135181)产生。
抗体制剂中岩藻糖基化的水平可以通过本领域已知的任何方法测定，所述方法包括但不限于凝胶电泳、液相色谱法和质谱法。除非另有说明，否则出于本发明的目的，基本上如实施例3所述，抗体制剂中岩藻糖基化的水平通过亲水相互作用色谱法(或亲水相互作用液相色谱，HILIC)测定。为了测定抗体制剂的岩藻糖基化水平，将样品用PNGase F变性处理以切割N连接聚糖，然后分析岩藻糖含量。全长抗体链的LC/MS是检测抗体制剂的岩藻糖基化水平的替代方法，但质谱法本身的定量性较差。
药物组合物
本发明的改善的抗CTLA-4抗体可以构成组合物(例如药物组合物)，其含有结合蛋白(例如抗体或其片段)和药学上可接受的载体。如本文所用，“药学上可接受的载体”包括生理上相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣剂、抗细菌剂和抗真菌剂、等张剂和吸收延迟剂等。优选地，所述载体适用于静脉内、皮下、肌内、肠胃外、脊髓或表皮施用(例如，通过注射或输注)。本发明的药物组合物可以包含一种或多种药学上可接受的盐、抗氧化剂、水性和非水性载体、和/或佐剂，如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。
调整剂量方案以提供最佳的所需反应(例如治疗反应)和/或最小副作用。本发明的改善的抗体可以是以与伊匹单抗相同的剂量施用，但具有改善的安全性。可替代地，它们可以是以比伊匹单抗更高的剂量施用，例如如果所讨论的抗体在外周组织(其pH为约7.4)中展现出较低的亲和力(或较差的结合活性和/或活性)。对于转移性或不可切除的黑色素瘤，
Figure BDA0003396385390000281
(伊匹单抗)是每三周经90分钟以3mg/kg静脉内施用，共四个剂量。对于在黑色素瘤中的辅助用途，
Figure BDA0003396385390000282
(伊匹单抗)是以10mg/kg静脉内施用。对于与抗PD1抗体
Figure BDA0003396385390000283
(纳武单抗)组合用于晚期肾细胞癌或高微卫星不稳定性(MSI-H)或错配修复缺陷(dMMR)转移性结直肠癌，
Figure BDA0003396385390000284
(伊匹单抗)是以1mg/kg静脉内施用。
在一些实施方案中，例如当本发明的抗CTLA-4抗体伊匹单抗是I型抗体时，将其以低于对于伊匹单抗的批准剂量的剂量施用。当与使用未修饰的伊匹单抗的治疗相比时，这种较低的给药可以展现出等效或甚至增强的抗肿瘤功效而没有显著增强的副作用。在示例性实施方案中，它们是以小于3mg/kg(如2mg/kg、1mg/kg、0.5mg/kg或更低)施用以治疗不可切除的或转移性黑色素瘤。在其他实施方案中，它们是以小于10mg/kg(如5mg/kg、3mg/kg、1mg/kg、0.5mg/kg或更低)施用以用于患者的辅助治疗，所述患者患有皮肤黑色素瘤且具有大于1mm的局部淋巴结的病理学受累，所述患者已经经历过完全切除术(包括全淋巴结清扫术)。本发明的改善的伊匹单抗变体也可以用于至少任何组合疗法或双特异性试剂中，例如与PD1或PD-L1拮抗剂组合，其中使用伊匹单抗。
在一些实施方案中，例如当本发明的抗CTLA-4抗体伊匹单抗是III型抗体时，所述伊匹单抗变体用于治疗不可切除的或转移性黑色素瘤并且是以大于3mg/kg，如10mg/kg、20mg/kg、50mg/kg或更高的剂量施用。在其他实施方案中，所述III型伊匹单抗变体辅助剂至患者，所述患者患有皮肤黑色素瘤且具有大于1mm的局部淋巴结的病理学受累，所述患者已经经历过完全切除术(包括全淋巴结清扫术)，并且所述III型伊匹单抗变体是以大于10mg/kg，如20mg/kg、50mg/kg或更高的剂量施用。
在其他实施方案中，所述III型伊匹单抗变体与纳武单抗组合用于治疗具有中等或低风险、患有先前未治疗的晚期肾细胞癌的患者，并且是以大于1mg/kg，如3mg/kg、10mg/kg、20mg/kg、50mg/kg或更高的剂量施用，例如经30分钟静脉内施用，q3w共四个剂量。在仍其他实施方案中，所述III型伊匹单抗变体用于治疗患有高微卫星不稳定性(MSI-H)或错配修复缺陷(dMMR)转移性结直肠癌的12岁或更大的成人和儿童患者，所述患者在用氟嘧啶、奥沙利铂或伊立替康与纳武单抗组合治疗后已经进展；并且是以大于1mg/kg，如3mg/kg、10mg/kg、20mg/kg、50mg/kg或更高的剂量施用，例如q3w共四个剂量。
本发明的药物组合物中活性成分的实际剂量水平可以改变以便获得对于特定患者、组合物和施用方式有效实现所需治疗反应而不会对患者造成过度毒性的量的活性成分。所选的剂量水平将取决于多种药代动力学因素，包括所采用的本发明特定组合物的活性，施用途径，施用时间，所采用的特定化合物的排泄速率，治疗持续时间，与所采用的特定组合物组合使用的其他药物、化合物和/或材料，所治疗患者的年龄、性别、体重、病况、一般健康状况和既往病历，以及医学领域中熟知的类似因素。本领域普通技术人员将能够基于此类因素(如受试者的体型、受试者症状的严重程度以及所选择的施用的特定组合物或途径)来确定合适的剂量。可以使用本领域熟知的多种方法中的一种或多种，通过一种或多种施用途径来施用本发明的组合物。
本发明的治疗用途和方法
本公开文本提供了用于癌症免疫疗法的方法，例如增强患有癌症的受试者中的内源性免疫应答从而治疗所述受试者，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的本文所述的任何改善的抗CTLA-4抗体。
在本发明免疫治疗方法的优选实施方案中，所述受试者是人。
可以使用本公开文本的免疫治疗方法治疗的其他癌症的例子包括骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头颈癌、乳腺癌、肺癌、皮肤或眼内恶性黑色素瘤、肾癌、子宫癌、卵巢癌、结直肠癌、结肠癌、直肠癌、肛门区域癌症、胃癌、睾丸癌、子宫癌、输卵管癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、阴道癌、外阴癌、食道癌、小肠癌、内分泌系统癌症、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、血液系统恶性肿瘤、儿童实体瘤、淋巴细胞性淋巴瘤、膀胱癌、肾癌或输尿管癌、肾盂癌、中枢神经系统(CNS)肿瘤、原发性CNS淋巴瘤、肿瘤血管生成、脊髓轴肿瘤、脑干神经胶质瘤、垂体腺瘤、卡波西肉瘤、表皮样癌、鳞状细胞癌、环境诱发的癌症(包括由石棉诱发的癌症)、转移性癌症以及所述癌症的任何组合。在优选的实施方案中，所述癌症选自MEL、RCC、鳞状NSCLC、非鳞状NSCLC、CRC、CRPC、头颈部鳞状细胞癌以及食道癌、卵巢癌、胃肠道癌和乳腺癌。本发明方法也适用于治疗转移性癌症。
其他癌症包括血液系统恶性肿瘤，包括例如多发性骨髓瘤、B细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤/原发性纵隔B细胞淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、急性髓性淋巴瘤、慢性骨髓性白血病、慢性淋巴性白血病、滤泡性淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、免疫母细胞性大细胞淋巴瘤、前体B淋巴细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、急性淋巴母细胞性白血病、蕈样真菌病、间变性大细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤和前体T淋巴母细胞性淋巴瘤以及所述癌症的任何组合。
组合疗法
在这些用于治疗癌症患者的方法的某些实施方案中，本发明的改善的抗CTLA-4抗体是作为单一疗法施用至所述受试者，而在其他实施方案中，免疫调节靶标的刺激或阻断可以与包括化疗方案、放射、手术、激素剥夺和血管生成抑制剂的标准癌症治疗有效地组合。所述改善的抗CTLA-4抗体可以与抗肿瘤剂连接(作为免疫缀合物)或者可以与所述药剂分开施用。在后一种情况下(分开施用)，所述抗体可以是在所述药剂之前、之后或与所述药剂同时施用，或者可以是与其他已知的治疗剂共同施用。化疗药物包括多柔比星
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顺铂、卡铂、硫酸博来霉素、卡莫司汀、苯丁酸氮芥
Figure BDA0003396385390000312
环磷酰胺
Figure BDA0003396385390000313
来那度胺
Figure BDA0003396385390000314
硼替佐米
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地塞米松、米托蒽醌、依托泊苷、阿糖胞苷、苯达莫司汀
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利妥昔单抗
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异环磷酰胺、长春新碱
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氟达拉滨
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沙利度胺
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阿仑单抗
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奥法木单抗
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依维莫司
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和卡非佐米(KYPROLISTM)等。经由不同机制起作用的抗癌药剂的共同施用可以帮助克服耐药性的发展或肿瘤细胞的抗原性的变化。
本发明的改善的抗CTLA-4抗体也可以与其他免疫调节剂(如针对其他免疫调节受体或其配体的抗体)组合使用。已经鉴定了若干种其他调节T细胞应答的共刺激和抑制受体和配体。刺激受体的例子包括可诱导T细胞共刺激物(ICOS)、CD137(4-1BB)、CD134(OX40)、CD27、糖皮质激素诱导的TNFR相关蛋白(GITR)和疱疹病毒侵入介导物(HVEM)，而抑制受体的例子包括程序性死亡蛋白1(PD-1)、B和T淋巴细胞衰减子(BTLA)、T细胞免疫球蛋白和粘蛋白结构域3(TIM-3)、淋巴细胞激活基因3(LAG-3)、腺苷A2a受体(A2aR)、杀伤细胞凝集素样受体G1(KLRG-1)、自然杀伤细胞受体2B4(CD244)、CD160、具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体(TIGIT)以及T细胞激活的V结构域Ig抑制剂的受体(VISTA)。Mellman等人(2011)Nature 480:480；Pardoll(2012)Nat.Rev.Cancer 12:252；Baitsch等人(2012)PloS One7:e30852。抗PD-1抗体
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(纳武单抗)和
Figure BDA00033963853900003115
(派姆单抗)已被批准用于治疗癌症，并且可以与本发明的改善的抗CLTA-4抗体组合。这些受体及其配体为设计为刺激免疫应答或防止抑制免疫应答从而攻击肿瘤细胞的治疗剂提供了靶标。Weber(2010)Semin.Oncol.37:430；Flies等人(2011)Yale J.Biol.Med.84:409；Mellman等人(2011)Nature 480:480；Pardoll(2012)Nat.Rev.Cancer 12:252。激动剂靶向刺激受体或受体配体，而阻断剂靶向抑制受体或受体配体。用于增强免疫治疗抗肿瘤活性的最有希望的方法包括阻断所谓的“免疫检查点”，它是指过多抑制信号传导途径，其调节免疫系统并且对于维持自身耐受性和调节外周组织中生理免疫应答的持续时间和幅度以最小化附属组织损害是至关重要的。参见例如，Weber(2010)Semin.Oncol.37:430；Pardoll(2012)Nat.Rev.Cancer 12:252。由于许多免疫检查点是由配体-受体相互作用启动的，因此它们可以容易地被抗体阻断或由重组形式的配体或受体调节。
通过以下实施例进一步说明本发明，不应将所述实施例视为限制。本申请中引用的所有附图和所有参考文献、专利和公开的专利申请的内容通过引用明确地并入本文。
实施例1
具有增强的低pH结合偏好的伊匹单抗重链CDR序列变体的先导选择
为了测试用于选择pH优化的序列变体的过程，对于每条重链的总共三个氨基酸取代，在伊匹单抗重链的每个CDR中引入一个突变。CDR被修饰为在HCDR1的位置28、30、31、32和33处；在HCDR2中的位置52、52a、53、54、55和56；以及在HCDR3中的位置95、97、98处(所有编号均按照Kabat)具有组氨酸(H)。参见图1。轻链没有改变。
对在低/酸性pH下具有增强的结合偏好的序列变体的选择基本上如Hornsby等人(2015)Mol.Cell.Proteomics 14:2833中所述来进行。简而言之，将含有一个或多个序列改变的伊匹单抗轻链和重链可变结构域序列克隆至M13噬菌粒载体中，并产生噬菌体，使得克隆的scFv片段在噬菌体的表面上表达为外壳蛋白的融合物。因为编码伊匹单抗轻链和重链可变结构域的寡核苷酸包含选择的核酸残基处的简并改变(在这种情况下，在每个重链CDR处改变一个组氨酸密码子来代替一个天然残基)，所以所得噬菌体群体包含伊匹单抗scFv序列变体的文库。对编码该预选择文库中变体伊匹单抗轻链和重链可变结构域的核酸进行测序。序列变体文库中CDR序列的分布由图2A的序列标识表示。
该噬菌体文库分别针对在pH 6.0和pH 7.4下结合/非结合进行四轮选择/反选择。简而言之，生物素化人CTLA-4与磁性链霉亲和素珠结合。将噬菌体文库在pH 6.0下在轻柔混合下暴露于珠持续一小时，并使用磁性分离器将珠拉下(pull down)，将其在pH 6.0下洗涤，并在pH 7.4下洗脱。然后使在pH7.4下释放的噬菌体在细菌细胞中繁殖过夜。使从这些过夜细菌培养物获得的噬菌体再进行几轮类似于上述第一轮的选择，只是在每个下一轮选择中使链霉亲和素磁珠上的抗原(huCTLA-4)浓度系统性降低，以增加选择的严格性。
使用在四轮选择后得到的选择的噬菌体文库感染细菌，然后将所述细菌铺板以允许进行克隆选择。挑选单独菌落并对编码变体伊匹单抗轻链和重链可变结构域的核酸进行测序。CDR序列在所得序列变体的集合中的分布由图2B的序列标识表示，其中每个CDR的优势变体由最大字母表示，相比之下，序列变体的预选择文库中的最大字母示于图2A中。
然后用每个优势变体单独地(T33H、N56H和T95H，按照Kabat编号)以及用所有三个优势变体共同(T33H/N56H/T95H)产生伊匹单抗重链可变结构域(Fab构建体)，从而得到分别名为伊匹单抗1、伊匹单抗2、伊匹单抗3和伊匹单抗4的抗体。表2提供了这些抗体中的每一种与人CTLA-4的结合参数。如实施例3中所述，通过表面等离子体共振(SPR)来确定结合参数。
表2
选择的伊匹单抗重链可变结构域序列变体的结合
Figure BDA0003396385390000331
HCDR1和HCDR2中的突变使结合亲和力增强两到三倍(如通过减小的KD测量的)，而HCDR3中的突变显著降低了结合，并且所有三个突变的组合使KD改善了十倍。然而，所有这些结果在pH 6.0和pH 7.4下基本相同，这意味着虽然所述选择提供了具有增强的亲和力的抗体(即亲和力成熟抗体)，但所述抗体对在酸性pH下结合的偏好没有增强。
静电建模
使用分子操作环境(MOE)(Chemical Computing Group，加拿大蒙特利尔)对CTLA4的静电表面建模。结果示于图3A、图3B和图3C。CTLA4中存在由残基E48、D64和D65构成的电负性斑块，其靠近伊匹单抗的HCDR1。参见图3C。尽管在使用组合文库进行选择后，在HCDR1中富集了位置T33H，但我们观察到，T33H的单个取代在pH 6.0和pH 7.4下均同等地增强亲和力，而没有增强低pH特异性(表2)，因此不希望其在构建体中进一步开发。HCDR1中的其他残基针对组氨酸进行富集，所述其他残基如S31，其具有位于CTLA4中的电负性斑块附近的侧链。产生了S31H变体，从而产生伊匹单抗57，与pH 7.4相比，其展现出在pH 6.0下结合的偏好(表4)。该实验证明了如下原理：只有增强在pH 6.0下结合与在pH 7.4下结合的比率的序列变体才可用于本发明的方法中，而不仅仅是导致抗体亲和力成熟的任何突变。
实施例2
具有增强的低pH结合偏好的伊匹单抗CDR序列变体的组合文库
在先导重链可变筛选(实施例1)之后，设计了完整的组合方法来考虑所有六个CDR中的修饰。为了获得与在pH 7.4下的结合相比具有在pH 6.0下增强的结合偏好的伊匹单抗序列变体，将突变引入重链和轻链CDR中的选择的位置处。CDR在如下位置处进行修饰：HCDR1中的T28、S30、S31、Y32、T33；HCDR2中的F50、S52、Y52a、D53、G54、N55、N56、Y58；HCDR3中的T95、W97、L98；以及LCDR1中的Q27、S27a、S30、S31、Y32；LCDR2中的F52、S53、T56；LCDR3中的Q90、Y91、W96。LCDR1的每个位置都被H(His)以及D(Asp)或E(Glu)取代，其中每个CDR具有一到三个突变，每个链具有一到三个突变，每个scFv共有两到六个突变。所有残基编号均按照Kabat，如图1所示。
简而言之，将包含所需突变伊匹单抗重链和轻链CDR序列的寡核苷酸组合以产生每个CDR具有多达三个突变且在每个重链可变结构域中具有一到三个突变的scFv伊匹单抗变体。将这些寡核苷酸构建体克隆到M13噬菌粒载体中，使得克隆的scFv片段在噬菌体的表面上表达为外壳蛋白的融合物。
轻链结果
对选择前和选择后的噬菌体文库进行测序以确定轻链中优先富集的序列，而不顾重链。示例性结果以序列标识的形式提供于图4A和图4B，其中LCDR1中每个氨基酸残基的相对丰度由相应的单字母代码的大小表示。可以看出，预选择文库在突变位置处主要含有原始伊匹单抗残基，但选择后文库在特定位置处高度富集了不同的残基，如LCDR1突变S28E和S31E(或S31D)(顺序编号)。参见图4B。
使用
Figure BDA0003396385390000351
表面等离子体共振光谱仪(Biacore AB，瑞典乌普萨拉)，通过表面等离子体共振研究在位置28和31(27a和30，按照Kabat编号)处的选择的LCDR1变体，以测定pH 7.4和pH 6.0下的缔合和解离速率常数(以及平衡结合常数)。参见实施例3。抗体以单价Fab片段的形式进行测试以简化分析。伊匹单抗17(S28E)、伊匹单抗18(S31D)和伊匹单抗25(S28E/S31D)的结果提供于表3(上面几行)。伊匹单抗25的示例性传感图提供于图5A和图5B。进行单独的实验以测试在LCDR1位置28和31处的变体序列的所有成对组合(28E、28D:31E、31D；或27aE、27aD:30E、30D，按Kabat编号)。结果提供于表3(下面几行)。S28E和S31D的组合(伊匹单抗25)展现出与pH 7.4相比在pH 6.0下结合的最高偏好(KD-7.4/KD-6.0＝4.0)。
表3
选择的伊匹单抗LCDR1序列变体的结合
Figure BDA0003396385390000352
Figure BDA0003396385390000361
所有选择的抗体变体在pH 7.4下都是对于CTLA-4的较差结合物，其中缔合和解离速率常数二者均具有小于两倍的变化。然而，在pH 6.0下的结合展现出相似的ka值但较低的kd值(更紧密的结合)。在上述第一个实验中，对于伊匹单抗17、伊匹单抗18和伊匹单抗25的解离平衡结合常数(KD)的比率(针对相同实验的伊匹单抗的所述比率进行归一化)分别为1.4、3.2和4.0，并且在上述第二个实验中，对于伊匹单抗23、伊匹单抗24、伊匹单抗25和伊匹单抗26分别为5.1、4.1、6.3和4.3。
选择的变体的表征
基本上如实施例3中所述测定选择的变体与人CTLA-4的结合。结果提供于表4。这些抗体的命名和序列在表6和表7中以及表8总结的序列表中提供。
表4
本发明的选择的抗体的结合参数
Figure BDA0003396385390000362
Figure BDA0003396385390000371
选择的抗体的结合数据图提供于图8A-图8C。此类图提供了在pH 6.0和pH 7.4下的相对结合偏好的方便视觉评估。与pH 7.4相比，本发明的若干种抗体(如伊匹单抗64、伊匹单抗71、伊匹单抗92和伊匹单抗95)展现出在pH 6.0下显著增强的结合偏好。参见图9。所有这些抗体都包含LCDR1 S30D(按照Kabat编号)，尽管S30E在选择中有利但选择S30D(图4A和图4B)，因为对于在pH 6.0下相比于在7.4下的结合，轻链S27aE S30D具有5倍偏好(如由KD测量的)，而S27aE S30E仅具有3.4倍偏好。然而，在LCDR1中具有S30E突变而非S30D的伊匹单抗64、伊匹单抗71、伊匹单抗92和伊匹单抗95的变体分别作为伊匹单抗100、伊匹单抗101、伊匹单抗106和伊匹单抗105提供。在LCDR1中位置30(按照Kabat)处做出从D到E的逆转是为了消除导致不希望的异构化的序列(“DS”)。
实施例3
本发明的抗体的结合参数的表面等离子体共振(SPR)光谱测定
表面等离子体共振光谱术(SPR)用于基本上如下测定本发明的各种伊匹单抗序列变体与人CTLA-4的结合参数。除非另有说明，否则使用
Figure BDA0003396385390000381
SPR表面等离子体共振光谱仪(Biacore AB，瑞典乌普萨拉)进行实验。抗体以单价Fab片段的形式进行测试以简化分析。数据可以以传感图的形式提供，如在图5A、图5B、图7A和图7B中，或者概括为结合参数，如平衡解离结合常数(KD)、缔合(association/on)速率常数(ka，kon)、解离(dissociation/off)速率常数(kd，koff)和/或半衰期(t1/2)。
简而言之，本发明的伊匹单抗变体以Fab片段的形式产生并在具有固定化抗人κ多克隆捕获抗体的
Figure BDA0003396385390000382
CM4芯片上捕获。单体人CTLA-4作为分析物以多达2μM的最高浓度流动。在循环之间，将捕获表面用75mM磷酸再生。实验在37℃下在
Figure BDA0003396385390000383
T200仪器上运行。运行缓冲液对于pH 7.4实验为HEPES缓冲盐水并且对于较低pH实验为Bis-Tris缓冲盐水。所有缓冲液都补充有0.05％Tween-20和1g/L BSA。将双重参考传感图拟合到具有质量传输的1:1朗缪尔结合模型以测定平衡解离常数(KD)，以及在适当情况下测定缔合(ka)和解离(kd)速率常数。
实施例4
通常降低亲和力的突变
发现HCDR3中的T95H取代(按照Kabat编号)降低(通常减小)伊匹单抗对CTLA-4的亲和力，产生了抗体伊匹单抗3。示例性传感图提供于7A(pH 7.4)和图7B(pH 6.0)。从表2可以明显看出，T95H在pH 6.0和7.4下均使亲和力减小四倍(增加的KD)，导致几乎没有增强在低pH下的优先结合，其中KD-7.4/KD-6.0为0.9，相比之下，伊匹单抗为1.0。然而，这种突变与本发明的各种抗体中增加低pH下的结合偏好的其他突变组合(即伊匹单抗57、伊匹单抗69、伊匹单抗64、伊匹单抗71、伊匹单抗94、伊匹单抗95和伊匹单抗105变为伊匹单抗82、伊匹单抗84、伊匹单抗86、伊匹单抗88、伊匹单抗90、伊匹单抗92和伊匹单抗106)。参见表7。旨在不受理论的限制，假设T95H取代的并入可以减轻剂量限制性毒性(可能由pH 7.4下的结合驱动)，即使这种取代也影响低pH下(在肿瘤微环境中)的亲和力。
实施例5
本发明的抗体与细胞上的CTLA-4的结合
进行了另外的实验以证实本发明的选择的抗体在细胞的表面上结合，并且展现出在低pH下增强的结合偏好(并且不仅是在体外结合测定中)。简而言之，抗体伊匹单抗64表达为Fab片段和IgG，并在pH 6.3、6.6和7.2下的连续稀释液中与58α-β-CTLA-4/CD3ζ细胞结合。将细胞与抗体在4℃下孵育一小时，在相应的缓冲液中洗涤，并检测结合的抗体。结果提供于图10A(pH 7.3)和图10B(pH 6.0)。与伊匹单抗Fab相比，抗体伊匹单抗64在pH 7.3下大大降低结合，但在pH 6.0下增强结合。参见图11A和图11B。与伊匹单抗相比，这种伊匹单抗序列变体预计将展现出较低的外周结合，因此更小的毒副作用，同时在酸性肿瘤微环境中保持(或甚至改善)亲和力和活性。这种抗体可以是以与伊匹单抗相同的剂量(例如约3mg/kg)施用，期望提高安全性，或者可以是以达到剂量限制性毒性之前的更高(更有效)剂量(例如10mg/kg或更高)施用。已知伊匹单抗在10mg/kg下更有效，但由于毒性，在不可切除或转移性黑色素瘤环境中未以该水平给药(但对于黑色素瘤的辅助用途时其以10mg/kg施用)。
进行类似的实验以在pH 6.3、6.6和7.2下比较结合抗体伊匹单抗64和伊匹单抗71。使用抗体的Fab片段的结果提供于图12A、图12B和图12C，而使用全长IgG mAb的结果提供于图13A、图13B和图13C。
如图12A、图12B和图12C所示，当以单价形式如Fab片段研究pH优化的伊匹单抗变体时，变体伊匹单抗64和伊匹单抗71在低pH下的结合与伊匹单抗一样，但在较高pH下则不同。
相比之下，如图13A、图13B和图13C所示，当以二价形式如全长抗体(IgG)研究pH优化的伊匹单抗变体时，变体伊匹单抗64和伊匹单抗71在高pH下保持其高亲和力，没有任何pH偏好，而变体伊匹单抗95和伊匹单抗92(尤其是)在高pH下结合不佳。
进行另外的实验以测定伊匹单抗64、伊匹单抗100、伊匹单抗101、伊匹单抗106和伊匹单抗105的非岩藻糖基化IgG1形式与58αβ-CTLA4/mCD3ζ细胞的结合的pH依赖性。将抗体在pH特异性缓冲液中从100μg/mL以1:4稀释度跨12个点进行滴定，并孵育30-60分钟。缓冲液含有HBSS、2％FBSHI、0.02％叠氮化钠、2mM EDTA和磷酸钠缓冲液(pH 5.4)。添加磷酸钠缓冲液直至达到所需的pH(7.2、6.7、6.2)。对于每个细胞系测试约3e5个细胞/孔。在其各个pH特异性缓冲液中进行所有结合和洗涤步骤。用与Alexa647缀合并以1:2000稀释度使用的一价抗hκ二级纳米抗体进行检测。将细胞用BD固定溶液I固定30分钟，然后重悬于在pH特异性缓冲液中并在细胞仪(BD Fortessa)上读取。结果提供于图16A(pH 7.2)、图16B(pH 6.7)和图16C(pH 6.2)，并且EC50和Cmax值提供于表5。抗体伊匹单抗105和伊匹单抗106显示出随着pH减小结合增加。
表5
本发明的选择的抗体的结合参数
Figure BDA0003396385390000401
进行另外的实验以测定伊匹单抗100、伊匹单抗101、伊匹单抗106和伊匹单抗105的Fab形式与58αβ-CTLA4/mCD3ζ细胞的结合的pH依赖性。实验方案与用于获得图16A-图16C的数据的实验方案相同。结果提供于图17A和图17B(pH 7.2)、图17C和图17D(pH 6.7)以及图17E和图17F(pH 6.2)。与在其他结合测定中一样，伊匹单抗显示出非常相似的结合曲线，而不论pH如何。抗体伊匹单抗100和伊匹单抗101显示在较低pH下增强的结合，且亲和力通常接近或超过伊匹单抗的亲和力。抗体伊匹单抗105和伊匹单抗106也显示出在较低pH下增强的结合，但亲和力低于伊匹单抗的亲和力。
实施例6
本发明的伊匹单抗变体
在Sa1N纤维肉瘤肿瘤模型中的抗肿瘤活性
在免疫原性Sa1N纤维肉瘤肿瘤模型中评估本发明的在低pH下具有增强的结合偏好的伊匹单抗序列变体的抗肿瘤活性。向人CTLA-4敲入A/J小鼠皮下注射每个植入物中2x106个Sa1N肿瘤细胞。在七天之后，测量肿瘤并将小鼠随机分为治疗组以具有可比较的平均肿瘤体积(例如130-150mm3/2)。将本发明的伊匹单抗序列变体以及作为对照的伊匹单抗在第7、11和14天以每一剂量在200μl体积中200μg腹膜内(IP)施用。在第7天后以定期间隔测量肿瘤体积和外周抗CTLA-4活性的标记物，直至研究完成。小鼠肿瘤模型中的外周抗CTLA-4活性被视为人受试者中毒性的替代指标，因为这种外周活性在用抗CTLA-4抗体治疗的患者中造成剂量限制性副作用。
如下抗体是被开发为用于批准使用伊匹单抗或伊匹单抗以其他方式治疗有效的任何障碍的改善的人治疗剂的候选物，所述抗体i)至少与伊匹单抗大概一样减少肿瘤生长，并且ii)展现出比伊匹单抗更小的外周抗CTLA-4活性。
实施例7
本发明的伊匹单抗变体
在MC38肿瘤模型中的抗肿瘤活性
如下在MC38肿瘤模型中评估本发明的在低pH下具有增强的结合偏好的伊匹单抗序列变体的抗肿瘤活性。
肿瘤模型
简而言之，向十六至十八周龄雄性和雌性人CTLA-4敲入C57BL/6小鼠皮下注射1×106个MC38细胞。在肿瘤植入后八天，一旦肿瘤达到150mm3的平均体积就将小鼠随机分为治疗组。在植入后九天，将在PBS中配制的伊匹单抗和pH敏感性伊匹单抗抗体以每只小鼠20、60或200μg的单一剂量静脉内施用至各个治疗组。本实施例中施用的所有抗CTLA-4抗体都是非岩藻糖基化IgG1抗体。将对照小鼠用200μg具有人IgG1-NF同种型的抗钥孔血蓝蛋白抗体治疗。每2至5天测量一次肿瘤，并将患有溃疡性肿瘤和大于2000mm3的肿瘤的小鼠从研究移除。为了选择用于淋巴细胞染色分析的小鼠，在植入后十四天将治疗的小鼠进行随机化和安乐死。在两次或更多次连续测量期间未测量到肿瘤的小鼠被认为是无肿瘤的。
图19A-图19M显示出pH敏感性抗体伊匹单抗64、伊匹单抗106和伊匹单抗105在以剂量依赖性方式抑制肿瘤生长方面与伊匹单抗一样有效。
淋巴细胞染色分析
小鼠肿瘤模型中的外周抗CTLA-4活性被视为人受试者中毒性的替代指标，因为这种外周活性在用抗CTLA-4抗体治疗的患者中造成剂量限制性副作用。样品取自如上用选择的pH敏感性伊匹单抗抗体治疗的小鼠，取自肿瘤和脾脏，以评估所述抗体在两种环境中的相对活性，如下所示。
治疗后五天从小鼠收获肿瘤和脾脏。将肿瘤在具有补充有5％热灭活FBS(VWR，美国宾夕法尼亚州拉德诺)和5mM CaCl2(VWR)的HBSS中的250U/mL胶原酶IV(WorthingtonBiochemical，美国新泽西州雷克伍德)和100μg/mL DNase I(Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯)的gentleMACS C管(Miltenyi Biotec，德国贝尔吉施格拉德巴赫)中解离。将脾脏在gentleMACS C管(Miltenyi Biotec)中机械解离并用红细胞裂解缓冲液(Sigma-Aldrich)处理。使细胞通过70μm过滤器并重悬于完整的T细胞培养基(补充有10％热灭活FBS、50U/mL青霉素/链霉素、2mM L-谷氨酰胺、50μMβ-巯基乙醇、2mM丙酮酸钠和10mM HEPES的RPMI-1640)中。然后将细胞用Zombie NIR可固定活力试剂盒(Biolegend，美国加利福尼亚州圣地亚哥)染色，并用TruStain FcX(抗小鼠CD16/32)抗体(Biolegend)处理以阻断Fc受体结合。对于细胞表面染色，将细胞针对CD45(30-F11,BD Biosciences,美国加利福尼亚州圣何塞)、CD19(6D5,Biolegend)、CD4(GK1.5,BD Biosciences)、CD8(53-6.7,Biolegend)和ICOS(7E.17G9,BD Biosciences)在eBioscience流式细胞术染色缓冲液(ThermoFisher，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆)中进行染色。将所有细胞均用Foxp3/转录因子染色缓冲液组(ThermoFisher)固定和透性化处理，并针对FoxP3(FJK-16s,ThermoFisher)、Ki-67(16A8,Biolegend)和人CTLA4(BNI3,Biolegend,美国加利福尼亚州圣地亚哥)进行染色。在
Figure BDA0003396385390000431
流式细胞仪(BD Biosciences)上分析样品。使用
Figure BDA0003396385390000432
流式细胞术数据分析软件以及基于荧光减一对照的门控分析流动数据。
使用抗CTLA-4抗体阻断CTLA-4导致外周部位(如脾脏或淋巴结)中Treg的扩增，其充当毒性的替代指标。Selby等人(2013)Cancer Immunol.Res.1:32；Quezada等人(2006)J.Clin.Invest.116:1935。图20A和图20B证明pH敏感性抗体伊匹单抗64、伊匹单抗106和伊匹单抗105与伊匹单抗一样有效地降低肿瘤中的Treg水平(图20B)，但它们不像伊匹单抗提高外周(脾脏)中的Treg水平那样多(图20A，尤其是当以10mpk给药时)。另外，图21A和图21B显示，与伊匹单抗相比，这些相同的pH敏感性抗CTLA-4抗体在外周(脾脏)中诱导Treg的较少激活(如由ICOS表达所测量)以及较低增殖(如由Ki-67表达所测量)。分别参见图21A和图21B。
如下抗体是被开发为用于批准使用伊匹单抗或伊匹单抗以其他方式治疗有效的任何障碍的改善的人治疗剂的候选物，所述抗体i)至少与伊匹单抗大概一样减少肿瘤生长，并且ii)展现出比伊匹单抗更小的外周抗CTLA-4活性，如由Ki-67(Selby等人(2013)Cancer Immunol.Res.1:32)和ICOS(Liakou等人(2008)Proc.Nat’l Acad.Sci.(USA)105:14987)的表达所测量。抗体伊匹单抗64、伊匹单抗106和伊匹单抗105共同具有这些有利特性。
实施例8
本发明的伊匹单抗变体的结合参数的pH依赖性
本发明的选择的抗体与人CTLA-4和食蟹猴CTLA-4结合的pH依赖性通过表面等离子体共振(SPR)光谱术测量，基本上如实施例3中所述。简而言之，将抗体以单价Fab片段的形式进行研究。抗人κ多克隆捕获抗体(Southern Biotech，美国阿拉巴马州)被固定在Biacore T200表面等离子体共振系统中的乙二胺封闭的CM4传感器芯片上。然后在每个流动池上捕获本发明的选择的抗体的Fab片段。对于每种缓冲液条件，单体人CTLA4或食蟹猴CTLA-4作为分析物以2μM、400nM、80nM和16nM标称浓度流动。运行缓冲液为20mM BisTris、150mM NaCl、0.05％Tween-20、1g/L BSA，其pH范围为以0.1-0.2的pH单位间隔从5.5至7.4(共12个)。在循环之间将表面用1/200 H3PO4再生。使用Biacore T200评价软件对所有数据进行双重参考并拟合至具有传输限制的1:1朗缪尔结合模型。在需要时，通过基于捕获水平和来自对同一Fab的其他拟合的表观活性计算预期结合来确定Rmax。
人CTLA-4的结果提供于图14A(KD)、图14B(kon)和图14C(koff)。图14A显示了随着pH而变化的本发明的各种抗体的Fab片段的结合亲和力(KD)。正如预期的那样，伊匹单抗显示出随着pH的变化几乎没有改变。抗体伊匹单抗64、伊匹单抗100、伊匹单抗101、伊匹单抗105和伊匹单抗106在较高pH下全部显示出亲和力的系统降低。伊匹单抗105在pH 5.5与7.5之间显示出最大的亲和力差异，且亲和力通常高于伊匹单抗。伊匹单抗106随着pH也显示出几乎等同的亲和力变化，但在整个范围内亲和力低得多，且在高于pH 6.5时亲和力低于伊匹单抗。
图14B和图14C显示出随着pH而变化的相同Fab的缔合(association/on)速率和解离(dissociation/off)速率动力学常数(kon和koff)。与总体亲和力一样，伊匹单抗显示出随着pH的变化任一常数几乎没有差异。相比之下，本发明的抗体全部显示出随着pH增加kon的类似减小，但在koff对pH的依赖性方面基本不同，其中抗体伊匹单抗105以及特别是抗体伊匹单抗106显示出在较高pH下koff的显著增加。这些动力学结果表明，与伊匹单抗64、伊匹单抗100、伊匹单抗101相比，伊匹单抗105和伊匹单抗106的KD对pH的更大依赖性是由其增加的koff驱动的。
食蟹猴CTLA-4的类似结果提供于图15A(KD)、图15B(kon)和图15C(koff)。结果与用人CTLA-4观察到的结果定性地类似，但通常亲和力较低。图14A显示出随着pH而变化的本发明的各种抗体的Fab片段的结合亲和力(KD)，其主要是由增加的koff导致。与人和食蟹猴CTLA-4结合的类似pH依赖性证明食蟹猴是用于使用本发明的抗体进行毒理学和其他研究的良好动物。参见实施例10。
实施例9
在58αβ-hCTLA/mCD3ζ:rhB7-1阻断测定中
本发明的伊匹单抗变体的生物活性
如下在58αβ-hCTLA/mCD3ζ:rhB7-1阻断测定中评估本发明的选择的pH敏感性伊匹单抗变体的生物活性。在运行所述测定的前一天，将rhB7-1在1 X PBS中稀释，并在1.2μg/mL下以50μL/孔铺板于96孔平底板中，并在4℃下孵育过夜。伊匹单抗pH变体(伊匹单抗64、伊匹单抗100、伊匹单抗101、伊匹单抗105、伊匹单抗106)表达为IgG1-NF变体，并针对58αβ-hCTLA4/mCD3ζ细胞和板结合的rhB7-1的阻断进行测试。将伊匹单抗-pH变体在pH特异性介质中针对最终最高浓度为15μg/mL以1:4稀释度跨8个点进行滴定。介质含有RPMI-1640、10％FBSHI、碳酸氢钠和磷酸钠缓冲液(pH 5.4)。添加磷酸钠缓冲液直至达到所需的pH(7.2、7.0、6.8)。将1e6个细胞/mL的120μL细胞和60μL抗体滴定液合并在96孔圆底板中，并在37℃、8％CO2下孵育20分钟以平衡pH。用PBS洗涤包被的板，并将150μL细胞/抗体混合物转移到板上。将板在37℃、8％CO2下孵育18小时，并且移取上清液并通过ELISA(BD)测试mIL-2的产生。结果提供于图18A-图18C。
实施例10
食蟹猴中的毒性评价
按照美国食品和药品管理局的非临床实验室研究的优良实验室工作规范(GoodLaboratory Practice Regulations for nonclinical Laboratory Studies of the USFood and Drug Administration，21 C.F.R.第58部分)、USDA动物福利法案(9C.F.R.，第1、2、3部分)以及美国国立卫生研究院的实验室动物护理和使用指南(Guide for the Careand Use of Laboratory Animals of the National Institutes of Health，ILAR出版，1996)，在食蟹猴中进行为期4周的研究以评价本发明的pH敏感性伊匹单抗变体与伊匹单抗相比的毒性。
三十只目的繁殖的食蟹猴(cynomolgus monkey)(食蟹猴(Macacafascicularis)；5只/性别/组)通过分层随机化方案分配成三个组，所述方案被设计为实现相似的组平均体重，并且这些组被随机分配以进行治疗。向各组静脉内(IV)给予1)盐水对照、2)50mg/kg伊匹单抗、或3)本发明的pH敏感性伊匹单抗变体50mg/kg，每周一次(第1、8、15和22天)，总共四个剂量。评价动物的临床体征和体重的变化，并进行心血管评估。Selby等人(2016)PLoS One 11:e0167251。
表6
在酸性pH下具有潜在优先结合的伊匹单抗变体*
Figure BDA0003396385390000461
Figure BDA0003396385390000471
*-分别包含伊匹单抗HC(SEQ ID NO:11)和LC变体9(SEQ ID NO:29)或LC变体10(SEQ ID NO:30)的另外的变体伊匹单抗23和伊匹单抗24出于空间原因不包括在表6中，而是包括在表7中。
表7
Figure BDA0003396385390000472
表8
序列表总结
Figure BDA0003396385390000481
Figure BDA0003396385390000491
关于抗体序列，序列表提供了重链和轻链的成熟可变区的序列，即所述序列不包括信号肽。适用于所用生产细胞系的任何信号序列均可以用于产生本发明的抗体。提供了没有C末端赖氨酸残基的重链氨基酸序列，但在一些实施方案中，这种残基在所述抗体的核酸构建体中编码。说明书和附图中的编号通常是根据Kabat编号系统，因此可能与序列表中的编号不对应，但任何歧义都可以通过参考图1来解决。
等同物：
本领域的技术人员仅使用常规实验就将认识到或能够确定本文所公开的具体实施方案的许多等同方案。此类等同物旨在被以下权利要求所涵盖。
序列表
<110> 百时美施贵宝公司
<120> 在低PH下具有增强的结合特异性的伊匹单抗变体
<130> 13177-WO-PCT
<150> 62/835,794
<151> 2019-04-18
<160> 44
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 223
<212> PRT
<213> 智人 (Homo sapiens)
<400> 1
Met Ala Cys Leu Gly Phe Gln Arg His Lys Ala Gln Leu Asn Leu Ala
1 5 10 15
Thr Arg Thr Trp Pro Cys Thr Leu Leu Phe Phe Leu Leu Phe Ile Pro
20 25 30
Val Phe Cys Lys Ala Met His Val Ala Gln Pro Ala Val Val Leu Ala
35 40 45
Ser Ser Arg Gly Ile Ala Ser Phe Val Cys Glu Tyr Ala Ser Pro Gly
50 55 60
Lys Ala Thr Glu Val Arg Val Thr Val Leu Arg Gln Ala Asp Ser Gln
65 70 75 80
Val Thr Glu Val Cys Ala Ala Thr Tyr Met Met Gly Asn Glu Leu Thr
85 90 95
Phe Leu Asp Asp Ser Ile Cys Thr Gly Thr Ser Ser Gly Asn Gln Val
100 105 110
Asn Leu Thr Ile Gln Gly Leu Arg Ala Met Asp Thr Gly Leu Tyr Ile
115 120 125
Cys Lys Val Glu Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Tyr Leu Gly Ile Gly
130 135 140
Asn Gly Thr Gln Ile Tyr Val Ile Asp Pro Glu Pro Cys Pro Asp Ser
145 150 155 160
Asp Phe Leu Leu Trp Ile Leu Ala Ala Val Ser Ser Gly Leu Phe Phe
165 170 175
Tyr Ser Phe Leu Leu Thr Ala Val Ser Leu Ser Lys Met Leu Lys Lys
180 185 190
Arg Ser Pro Leu Thr Thr Gly Val Tyr Val Lys Met Pro Pro Thr Glu
195 200 205
Pro Glu Cys Glu Lys Gln Phe Gln Pro Tyr Phe Ile Pro Ile Asn
210 215 220
<210> 2
<211> 220
<212> PRT
<213> 智人 (Homo sapiens)
<400> 2
Met Leu Arg Leu Leu Leu Ala Leu Asn Leu Phe Pro Ser Ile Gln Val
1 5 10 15
Thr Gly Asn Lys Ile Leu Val Lys Gln Ser Pro Met Leu Val Ala Tyr
20 25 30
Asp Asn Ala Val Asn Leu Ser Cys Lys Tyr Ser Tyr Asn Leu Phe Ser
35 40 45
Arg Glu Phe Arg Ala Ser Leu His Lys Gly Leu Asp Ser Ala Val Glu
50 55 60
Val Cys Val Val Tyr Gly Asn Tyr Ser Gln Gln Leu Gln Val Tyr Ser
65 70 75 80
Lys Thr Gly Phe Asn Cys Asp Gly Lys Leu Gly Asn Glu Ser Val Thr
85 90 95
Phe Tyr Leu Gln Asn Leu Tyr Val Asn Gln Thr Asp Ile Tyr Phe Cys
100 105 110
Lys Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser
115 120 125
Asn Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro
130 135 140
Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly
145 150 155 160
Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile
165 170 175
Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met
180 185 190
Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro
195 200 205
Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
210 215 220
<210> 3
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人 (Homo sapiens)
<400> 3
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Thr Met His
1 5 10
<210> 4
<211> 17
<212> PRT
<213> 智人 (Homo sapiens)
<400> 4
Phe Ile Ser Tyr Asp Gly Asn Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 5
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人 (Homo sapiens)
<400> 5
Thr Gly Trp Leu Gly Pro Phe Asp Tyr
1 5
<210> 6
<211> 12
<212> PRT
<213> 智人 (Homo sapiens)
<400> 6
Arg Ala Ser Gln Ser Val Gly Ser Ser Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 7
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人 (Homo sapiens)
<400> 7
Gly Ala Phe Ser Arg Ala Thr
1 5
<210> 8
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人 (Homo sapiens)
<400> 8
Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Trp Thr
1 5
<210> 9
<211> 118
<212> PRT
<213> 智人 (Homo sapiens)
<400> 9
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Thr Phe Ile Ser Tyr Asp Gly Asn Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Thr Gly Trp Leu Gly Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 10
<211> 108
<212> PRT
<213> 智人 (Homo sapiens)
<400> 10
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Gly Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Phe Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro
85 90 95
Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 11
<211> 447
<212> PRT
<213> 智人 (Homo sapiens)
<400> 11
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Thr Phe Ile Ser Tyr Asp Gly Asn Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Thr Gly Trp Leu Gly Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210 215 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
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65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg His Gly Trp Leu Gly Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210 215 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
<210> 21
<211> 215
<212> PRT
<213> 智人 (Homo sapiens)
<400> 21
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Gly Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Phe Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro
85 90 95
Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala
100 105 110
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
115 120 125
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
130 135 140
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
145 150 155 160
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
165 170 175
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
180 185 190
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
195 200 205
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 22
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 伊匹单抗LC的S28E / S31D变体
<400> 22
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Glu Val Gly Asp Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Phe Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro
85 90 95
Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala
100 105 110
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
115 120 125
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
130 135 140
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
145 150 155 160
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
165 170 175
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
180 185 190
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
195 200 205
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 23
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 伊匹单抗LC的S28E / S31D / Y33E变体
<400> 23
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Glu Val Gly Asp Ser
20 25 30
Glu Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Phe Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro
85 90 95
Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala
100 105 110
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
115 120 125
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
130 135 140
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
145 150 155 160
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
165 170 175
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
180 185 190
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
195 200 205
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 24
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 伊匹单抗LC的S28E变体
<400> 24
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Glu Val Gly Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Phe Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro
85 90 95
Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala
100 105 110
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
115 120 125
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
130 135 140
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
145 150 155 160
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
165 170 175
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
180 185 190
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
195 200 205
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 25
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 伊匹单抗LC的S31D变体
<400> 25
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Gly Asp Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Phe Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro
85 90 95
Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala
100 105 110
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
115 120 125
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
130 135 140
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
145 150 155 160
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
165 170 175
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
180 185 190
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
195 200 205
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 26
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 伊匹单抗LC的Y33E变体
<400> 26
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Gly Ser Ser
20 25 30
Glu Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Phe Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro
85 90 95
Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala
100 105 110
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
115 120 125
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
130 135 140
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
145 150 155 160
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
165 170 175
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
180 185 190
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
195 200 205
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 27
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 伊匹单抗LC的S28E / S31E变体
<400> 27
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Glu Val Gly Glu Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Phe Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro
85 90 95
Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala
100 105 110
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
115 120 125
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
130 135 140
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
145 150 155 160
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
165 170 175
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
180 185 190
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
195 200 205
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 28
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 伊匹单抗LC的S28E / S31E / Y33E变体
<400> 28
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Glu Val Gly Glu Ser
20 25 30
Glu Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Phe Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro
85 90 95
Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala
100 105 110
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
115 120 125
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
130 135 140
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
145 150 155 160
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
165 170 175
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
180 185 190
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
195 200 205
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 29
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 伊匹单抗LC的S28D / S31D变体
<400> 29
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Gly Asp Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Phe Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro
85 90 95
Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala
100 105 110
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
115 120 125
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
130 135 140
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
145 150 155 160
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
165 170 175
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
180 185 190
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
195 200 205
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 30
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 伊匹单抗LC的S28D / S31E变体
<400> 30
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Gly Glu Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Phe Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro
85 90 95
Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala
100 105 110
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
115 120 125
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
130 135 140
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
145 150 155 160
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
165 170 175
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
180 185 190
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
195 200 205
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 31
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有多达三个修饰的伊匹单抗 (人序列)
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (31)..(31)
<223> Xaa是S或H
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (56)..(56)
<223> Xaa是N或H
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (99)..(99)
<223> Xaa是T或H
<400> 31
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Xaa Tyr
20 25 30
Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Thr Phe Ile Ser Tyr Asp Gly Xaa Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Xaa Gly Trp Leu Gly Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 32
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有多达三个修饰的伊匹单抗 (人序列)
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (28)..(28)
<223> Xaa是S, D或E
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (31)..(31)
<223> Xaa是S, D或E
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (33)..(33)
<223> Xaa是Y, D或E
<400> 32
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Xaa Val Gly Xaa Ser
20 25 30
Xaa Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Phe Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro
85 90 95
Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 33
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人 (Homo sapiens)
<400> 33
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly Met His
1 5 10
<210> 34
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人 (Homo sapiens)
<400> 34
Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
1 5 10 15
<210> 35
<211> 16
<212> PRT
<213> 智人 (Homo sapiens)
<400> 35
Asp Pro Arg Gly Ala Thr Leu Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val
1 5 10 15
<210> 36
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人 (Homo sapiens)
<400> 36
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Asn Ser Tyr Leu Asp
1 5 10
<210> 37
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人 (Homo sapiens)
<400> 37
Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser
1 5
<210> 38
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人 (Homo sapiens)
<400> 38
Gln Gln Tyr Tyr Ser Thr Pro Phe Thr
1 5
<210> 39
<211> 125
<212> PRT
<213> 智人 (Homo sapiens)
<400> 39
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Pro Arg Gly Ala Thr Leu Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met
100 105 110
Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 40
<211> 107
<212> PRT
<213> 智人 (Homo sapiens)
<400> 40
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Asn Ser Tyr
20 25 30
Leu Asp Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ser Thr Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 41
<211> 450
<212> PRT
<213> 智人 (Homo sapiens)
<400> 41
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Pro Arg Gly Ala Thr Leu Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met
100 105 110
Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr
115 120 125
Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser
130 135 140
Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu
145 150 155 160
Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His
165 170 175
Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser
180 185 190
Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys
195 200 205
Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu
210 215 220
Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly
450
<210> 42
<211> 214
<212> PRT
<213> 智人 (Homo sapiens)
<400> 42
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Asn Ser Tyr
20 25 30
Leu Asp Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ser Thr Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 43
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有一个或多个His修饰的人序列
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (30)..(30)
<223> Xaa是S或H
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (31)..(31)
<223> Xaa是S或H
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (52)..(52)
<223> Xaa是W或H
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (53)..(53)
<223> Xaa是Y或H
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (54)..(54)
<223> Xaa是D或H
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (56)..(56)
<223> Xaa是S或H
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (57)..(57)
<223> Xaa是N或H
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (101)..(101)
<223> Xaa是R或H
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (103)..(103)
<223> Xaa是A或H
<400> 43
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Xaa Xaa Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Xaa Xaa Xaa Gly Xaa Xaa Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Pro Xaa Gly Xaa Thr Leu Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met
100 105 110
Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 44
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有一个或多个Asp或Glu修饰的人序列
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (28)..(28)
<223> Xaa是S, D或E
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (30)..(30)
<223> Xaa是N, D或E
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (31)..(31)
<223> Xaa是S, D或E
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (32)..(32)
<223> Xaa是Y, D或E
<400> 44
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Xaa Ile Xaa Xaa Xaa
20 25 30
Leu Asp Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ser Thr Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105

Claims (30)

1.一种抗人CTLA-4抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段对于在酸性pH下结合相比于在中性pH下结合具有大于或等于1.5、1.5、2、3、4、5、7、10、12、15、20、25、35、50、75或100的酸性pH结合偏好(APBP)。
2.根据权利要求1所述的抗人CTLA-4抗体或片段，其中所述酸性pH为5.8、6.0、6.2、6.4、6.6或6.8并且所述中性pH为7.0、7.2、7.4、7.5或7.6。
3.根据权利要求2所述的抗人CTLA-4抗体或片段，其中所述酸性pH为6.0并且所述中性pH为7.4。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的抗人CTLA-4抗体或片段，所述抗体或片段包含含有HCDR1、HCDR2和HCDR3序列的重链可变区序列，其中：
a.HCDR1包含至少两个组氨酸(H)残基；
b.HCDR2包含至少一个组氨酸(H)残基；和/或
c.HCDR3包含至少一个组氨酸(H)残基。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的抗人CTLA-4抗体或片段，所述抗体或片段包含轻链可变区序列，所述轻链可变区序列包含含有一个、两个或三个酸性残基的LCDR1序列，每个所述酸性残基选自天冬氨酸(D)和谷氨酸(E)。
6.根据权利要求4-5中任一项所述的抗人CTLA-4抗体或片段，所述抗体或片段包含重链可变区序列，所述重链可变区序列包含选自31H、55H和95H(按照Kabat的编号)的一个或多个残基。
7.根据权利要求4-6中任一项所述的抗人CTLA-4抗体或片段，所述抗体或片段包含轻链可变区序列，所述轻链可变区序列包含选自27aD、27aE、30D、30E、31D、31E、32D和32E(按照Kabat的编号)的一个或多个残基。
8.根据权利要求1-3中任一项所述的抗人CTLA-4抗体或片段，所述抗体或片段包含含有SEQ ID NO:31的序列的重链可变区序列，其中组氨酸(H)存在于残基31、56和99中的一个或多个处。
9.根据权利要求1-3和8中任一项所述的抗人CTLA-4抗体或片段，所述抗体或片段包含含有SEQ ID NO:32的序列的轻链可变区序列，其中天冬氨酸(D)或谷氨酸(E)存在于残基28、31和33中的一个或多个处。
10.根据权利要求8-9中任一项所述的抗人CTLA-4抗体或片段，所述抗体或片段包含含有SEQ ID NO:31的序列的重链可变区序列，其中组氨酸(H)存在于残基31、56和99中的两个或更多个处。
11.根据权利要求8-10中任一项所述的抗人CTLA-4抗体或片段，所述抗体或片段包含含有SEQ ID NO:32的序列的轻链可变区序列，其中天冬氨酸(D)或谷氨酸(E)存在于28、31和33中的两个或更多个处。
12.根据权利要求8-11中任一项所述的抗人CTLA-4抗体或片段，所述抗体或片段包含含有SEQ ID NO:32的序列的轻链可变区序列，其中天冬氨酸(D)或谷氨酸(E)存在于28、31和33中的每一个处。
13.根据权利要求8-12中任一项所述的抗人CTLA-4抗体或片段，所述抗体或片段包含含有SEQ ID NO:14的序列的重链可变区序列。
14.根据权利要求1-3中任一项所述的抗人CTLA-4抗体或片段，所述抗体或片段包含选自以下的重链可变区序列和轻链可变区序列对：
a)SEQ ID NO:15的残基1-118和SEQ ID NO:21的残基1-108(伊匹单抗1)；
b)SEQ ID NO:16的残基1-118和SEQ ID NO:21的残基1-108(伊匹单抗2)；
c)SEQ ID NO:17的残基1-118和SEQ ID NO:21的残基1-108(伊匹单抗3)；
d)SEQ ID NO:18的残基1-118和SEQ ID NO:21的残基1-108(伊匹单抗7)；
e)SEQ ID NO:11的残基1-118和SEQ ID NO:24的残基1-108(伊匹单抗17)；
f)SEQ ID NO:11的残基1-118和SEQ ID NO:25的残基1-108(伊匹单抗18)；
g)SEQ ID NO:11的残基1-118和SEQ ID NO:26的残基1-108(伊匹单抗20)；
h)SEQ ID NO:11的残基1-118和SEQ ID NO:29的残基1-108(伊匹单抗23)；
i)SEQ ID NO:11的残基1-118和SEQ ID NO:30的残基1-108(伊匹单抗24)；
j)SEQ ID NO:11的残基1-118和SEQ ID NO:22的残基1-108(伊匹单抗25)；
k)SEQ ID NO:11的残基1-118和SEQ ID NO:27的残基1-108(伊匹单抗26)；
l)SEQ ID NO:12的残基1-118和SEQ ID NO:21的残基1-108(伊匹单抗57)；
m)SEQ ID NO:19的残基1-118和SEQ ID NO:21的残基1-108(伊匹单抗59)；
n)SEQ ID NO:12的残基1-118和SEQ ID NO:22的残基1-108(伊匹单抗64)；
o)SEQ ID NO:19的残基1-118和SEQ ID NO:22的残基1-108(伊匹单抗66)；
p)SEQ ID NO:13的残基1-118和SEQ ID NO:21的残基1-108(伊匹单抗69)；
q)SEQ ID NO:13的残基1-118和SEQ ID NO:22的残基1-108(伊匹单抗71)；
r)SEQ ID NO:20的残基1-118和SEQ ID NO:21的残基1-108(伊匹单抗82)；
s)SEQ ID NO:14的残基1-118和SEQ ID NO:21的残基1-108(伊匹单抗84)；
t)SEQ ID NO:20的残基1-118和SEQ ID NO:22的残基1-108(伊匹单抗86)；
u)ID NO:14的残基1-118和SEQ ID NO:22的残基1-108(伊匹单抗88)；
v)SEQ ID NO:20的残基1-118和SEQ ID NO:23的残基1-108(伊匹单抗90)；
w)SEQ ID NO:14的残基1-118和SEQ ID NO:23的残基1-108(伊匹单抗92)；
x)SEQ ID NO:11的残基1-118和SEQ ID NO:23的残基1-108(伊匹单抗93)；
y)SEQ ID NO:12的残基1-118和SEQ ID NO:23的残基1-108(伊匹单抗94)；
z)SEQ ID NO:13的残基1-118和SEQ ID NO:23的残基1-108(伊匹单抗95)；
aa)SEQ ID NO:12的残基1-118和SEQ ID NO:27的残基1-108(伊匹单抗100)；
bb)SEQ ID NO:13的残基1-118和SEQ ID NO:27的残基1-108(伊匹单抗101)；
cc)SEQ ID NO:13的残基1-118和SEQ ID NO:28的残基1-108(伊匹单抗105)；以及
dd)SEQ ID NO:14的残基1-118和SEQ ID NO:28的残基1-108(伊匹单抗106)。
15.根据权利要求14所述的抗人CTLA-4抗体，所述抗体包含选自以下的重链序列和轻链序列对：
a)SEQ ID NO:15和21(伊匹单抗1)；
b)SEQ ID NO:16和21(伊匹单抗2)；
c)SEQ ID NO:17和21(伊匹单抗3)；
d)SEQ ID NO:18和21(伊匹单抗7)；
e)SEQ ID NO:11和24(伊匹单抗17)；
f)SEQ ID NO:11和25(伊匹单抗18)；
g)SEQ ID NO:11和26(伊匹单抗20)；
h)SEQ ID NO:11和29(伊匹单抗23)；
i)SEQ ID NO:11和30(伊匹单抗24)；
j)SEQ ID NO:11和22(伊匹单抗25)；
k)SEQ ID NO:11和27(伊匹单抗26)；
l)SEQ ID NO:12和21(伊匹单抗57)；
m)SEQ ID NO:19和21(伊匹单抗59)；
n)SEQ ID NO:12和22(伊匹单抗64)；
o)SEQ ID NO:19和22(伊匹单抗66)；
p)SEQ ID NO:13和21(伊匹单抗69)；
q)SEQ ID NO:13和22(伊匹单抗71)；
r)SEQ ID NO:20和21(伊匹单抗82)；
s)SEQ ID NO:14和21(伊匹单抗84)；
t)SEQ ID NO:20和22(伊匹单抗86)；
u)SEQ ID NO:14和22(伊匹单抗88)；
v)SEQ ID NO:20和23(伊匹单抗90)；
w)SEQ ID NO:14和23(伊匹单抗92)；
x)SEQ ID NO:11和23(伊匹单抗93)；
y)SEQ ID NO:12和23(伊匹单抗94)；
z)SEQ ID NO:13和23(伊匹单抗95)；
aa)SEQ ID NO:12和27(伊匹单抗100)；
bb)SEQ ID NO:13和27(伊匹单抗101)；
cc)SEQ ID NO:13和28(伊匹单抗105)；以及
dd)SEQ ID NO:14和28(伊匹单抗106)。
16.根据权利要求15所述的抗人CTLA-4抗体或片段，所述抗体或片段包含SEQ ID NO:13和28(伊匹单抗105)的重链序列和轻链序列。
17.根据权利要求15所述的抗人CTLA-4抗体或片段，所述抗体或片段包含SEQ ID NO:14和28(伊匹单抗106)的重链序列和轻链序列。
18.一种根据前述权利要求中任一项所述的抗人CTLA-4抗体的制剂，其中所述制剂具有减少的岩藻糖基化、是低岩藻糖基化的或非岩藻糖基化的。
19.根据权利要求18所述的抗人CTLA-4抗体的制剂，其中所述抗体是在缺乏α-1,6-岩藻糖基转移酶活性的哺乳动物细胞系中产生的。
20.一种编码根据权利要求1-17中任一项所述的抗人CTLA-4抗体或片段的重链和/或轻链的核酸。
21.一种包含根据权利要求20所述的核酸的表达载体。
22.一种包含根据权利要求21所述的表达载体的宿主细胞。
23.一种制备抗人CTLA-4抗体的方法，所述方法包括在允许产生所述抗人CTLA-4抗体的条件下培养根据权利要求22所述的宿主细胞和分离所述抗人CTLA-4抗体。
24.一种治疗人受试者中的疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗量的根据权利要求1-19中任一项所述的抗体或其片段或抗人CTLA-4抗体的制剂。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述疾病是癌症。
26.根据权利要求24-25中任一项所述的方法，其中所述治疗(treatment)或治疗(treating)是与结合PD1或PD-L1的拮抗剂抗体或其片段组合进行的。
27.根据权利要求25-26中任一项所述的方法，其中所述癌症是不可切除的或转移性黑色素瘤。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述抗体是以大于3mg/kg，如10mg/kg、20mg/kg、50mg/kg或更高的剂量施用。
29.根据权利要求25-26中任一项所述的方法，其中所述癌症是黑色素瘤，并且所述抗体是作为辅助剂施用至患者，所述患者患有皮肤黑色素瘤且具有大于1mm的局部淋巴结的病理学受累，所述患者已经经历过完全切除术，包括全淋巴结清扫术。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述抗体是以大于10mg/kg，如20mg/kg、50mg/kg或更高的剂量施用。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2024056049A1 (zh) * 2022-09-16 2024-03-21 同润生物医药(上海)有限公司 具有pH依赖性的抗CTLA4抗体或抗原结合片段

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3625255A4 (en) 2017-05-19 2021-02-24 Wuxi Biologics (Shanghai) Co. Ltd. NOVEL MONOCLONAL ANTIBODIES AGAINST CYTOTOXIC T-LYMPHOCYTE ASSOCIATED PROTEIN 4 (CTLA-4)
EP4082572A4 (en) * 2019-12-25 2024-03-06 Bio-Thera Solutions, Ltd. ANTI-CTLA-4 MONOCLONAL ANTIBODY, PREPARATION METHOD AND ITS APPLICATION
WO2022036079A1 (en) 2020-08-13 2022-02-17 Bristol-Myers Squibb Company Methods of redirecting of il-2 to target cells of interest
WO2023168404A1 (en) 2022-03-04 2023-09-07 Bristol-Myers Squibb Company Methods of treating a tumor
WO2023196987A1 (en) 2022-04-07 2023-10-12 Bristol-Myers Squibb Company Methods of treating tumor

Family Cites Families (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK2180007T4 (da) 1998-04-20 2017-11-27 Roche Glycart Ag Glycosyleringsteknik for antistoffer til forbedring af antistofafhængig cellecytotoxicitet
KR101077001B1 (ko) 1999-01-15 2011-10-26 제넨테크, 인크. 효과기 기능이 변화된 폴리펩티드 변이체
ES2571230T3 (es) 1999-04-09 2016-05-24 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd Procedimiento para controlar la actividad de una molécula inmunofuncional
HUP0600342A3 (en) 2001-10-25 2011-03-28 Genentech Inc Glycoprotein compositions
US20040002587A1 (en) 2002-02-20 2004-01-01 Watkins Jeffry D. Fc region variants
CA2481657A1 (en) 2002-04-09 2003-10-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cells of which genome is modified
EP2053062A1 (en) 2004-03-24 2009-04-29 Xencor, Inc. Immunoglobin variants outside the Fc region
EP2213683B1 (en) 2004-08-04 2013-06-05 Mentrik Biotech, LLC Variant Fc regions
JP5249587B2 (ja) 2005-02-18 2013-07-31 メダレックス， インク． フコシル残基を欠く前立腺特異的膜抗原（ｐｓｍａ）に対するモノクローナル抗体
WO2007084672A2 (en) 2006-01-17 2007-07-26 Medarex, Inc. Monoclonal antibodies against cd30 lacking in fucosyl and xylosyl residues
WO2008140603A2 (en) 2006-12-08 2008-11-20 Macrogenics, Inc. METHODS FOR THE TREATMENT OF DISEASE USING IMMUNOGLOBULINS HAVING FC REGIONS WITH ALTERED AFFINITIES FOR FCγR ACTIVATING AND FCγR INHIBITING
WO2009025846A2 (en) 2007-08-22 2009-02-26 The Regents Of The University Of California Activatable binding polypeptides and methods of identification and use thereof
AU2009242453B2 (en) 2008-05-02 2014-12-04 Seagen Inc. Methods and compositions for making antibodies and antibody derivatives with reduced core fucosylation
WO2010077643A1 (en) 2008-12-08 2010-07-08 Tegopharm Corporation Masking ligands for reversible inhibition of multivalent compounds
US8642292B2 (en) 2009-09-22 2014-02-04 Probiogen Ag Process for producing molecules containing specialized glycan structures
HUE033008T2 (hu) 2011-04-13 2017-11-28 Bristol Myers Squibb Co FC fúziós proteinek, amelyek tartalmaznak új linkereket
WO2020092155A1 (en) * 2018-10-31 2020-05-07 Bioatla, Llc Anti-ctla4 antibodies, antibody fragments, their immunoconjugates and uses thereof
CA3042679A1 (en) 2016-11-03 2018-05-11 Bristol-Myers Squibb Company Activatable anti-ctla-4 antibodies and uses thereof
WO2018218076A1 (en) * 2017-05-26 2018-11-29 Janux Therapeutics, Inc. Modified antibodies
AU2019214865A1 (en) * 2018-02-02 2020-09-17 OncoC4, Inc. Mutant anti-CTLA-4 antibodies with improved immunotherapeutic effect but attenuated adverse effects

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2024056049A1 (zh) * 2022-09-16 2024-03-21 同润生物医药(上海)有限公司 具有pH依赖性的抗CTLA4抗体或抗原结合片段

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