EA044486B1

EA044486B1 - Трехкомпонентные комбинированные препараты антител

Info

Publication number: EA044486B1
Application number: EA201992825
Authority: EA
Inventors: Спенсер Лян; Лин Леун; Сара Вилан; Майа Коттури; Артур Махленкин; Эран ОФИР; Зоя Альтебер; Мейр Азулай; Катрин Логронио; Сандип КУМАР; Радика Десай; Кристофер Чан
Original assignee: Компьюджен Лтд.
Priority date: 2017-06-01
Filing date: 2018-06-01
Publication date: 2023-08-30

Description

Перекрестная ссылка на родственные заявки

Заявка на данный патент заявляет приоритет в соответствии с 35 USC §119 по заявке на патент США № 62/513960, поданной 1 июня 2017 г., 62/515452, поданной 5 июня 2017 г., 62/538563, поданной 28 июля 2017 г., 62/547051, поданной 17 августа 2017 г., 62/582756, поданной 7 ноября 2017 г., и 62/618005, поданной 16 января 2018 г., все из которых явным образом включены в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.

I. Уровень техники

TIGIT представляет собой коингибирующий рецептор, который в высокой степени экспрессируется на эффекторных и регуляторных (Treg) CD4+ Т-клетках, эффекторных CD8+ Т-клетках и NK-клетках. Было продемонстрировано, что TIGIT ослабляет иммунный ответ посредством (1) прямого сигналинга, (2) индукции сигналинга лигандов и (3) конкуренции с нарушением сигналинга костимуляторным рецептором CD226 (также известным как DNAM-1). Сигналинг TIGIT был наиболее хорошо изучен в NKклетках, где было продемонстрировано, что взаимодействие с его родственным лигандом, рецептором полиовируса (PVR, также известным как CD155) напрямую подавляет цитотоксичность NK-клеток посредством его цитоплазматического домена ITIM. Было продемонстрировано, что нокаут гена TIGIT или блокада взаимодействия TIGIT/PVR антителами усиливают уничтожение NK-клеток in vitro, а также обостряют аутоиммунные заболевания in vivo. Помимо прямого воздействия на Т- и NK-клетки, TIGIT может индуцировать PVR-опосредованный сигналинг в дендритных или опухолевых клетках, приводя к увеличению продукции противовоспалительных цитокинов, таких как IL10. В Т-клетках TIGIT также может ингибировать ответы лимфоцитов, нарушая гомодимеризацию костимуляторного рецептора CD226 и конкурируя с ним за связывание с PVR.

TIGIT в высокой степени экспрессируется на лимфоцитах, включая инфильтрирующие опухоль лимфоциты (TIL) и Treg, которые проникают в различные типы опухолей. PVR также широко экспрессируется в опухолях, наталкивая на предположение, что сигнальная ось TIGIT-PVR может быть доминирующим механизмом ускользания от иммунного ответа при раке. Примечательно, что экспрессия TIGIT тесно коррелирует с экспрессией другого важного коингибирующего рецептора, PD1. TIGIT и PD1 совместно экспрессируются на TIL многочисленных опухолей человека и мыши. В отличие от TIGIT и CTLA4, ингибирование PD1 ответами Т-клеток не включает конкуренцию за связывание лиганда с костимуляторным рецептором.

Иммунная контрольная точка, содержащая домен иммуноглобулина, связанный с рецептором полиовируса (PVRIG, также известный как CD112R), представляет собой новый ингибирующий рецептор в семействе рецепторов TIGIT. PVRIG с высокой аффинностью связывается со своим родственным лигандом, связанным с рецептором полиовируса белком 2 (PVRL2, также известным как CD112 или нектин-2), чтобы доставлять ингибирующий сигнал через свой мотив ITIM в Т- и NK-клетках. Аффинность TIGIT к PVR и PVRIG к PVRL2 является выше, чем аффинность CD226 к PVR или PVRL2, наталкивая на предположение, что TIGIT и PVRIG могут превзойти PVR и PVRL2 из CD226, обеспечивая косвенный механизм, с помощью которого TIGIT и PVRIG могут снижать функцию лимфоцитов. Таким образом, два рецептора с одного и того же семейства, TIGIT и PVRIG, доставляют ингибирующие сигналы для ослабления ответов Т- и NK-клеток.

Соответственно, TIGIT и PVRIG представляют интерес для комбинаций трёхкомпонентной терапии с ингибиторами контрольной точки, включая антитела антu-PD-1.

II. Краткое изложение сущности изобретения

В данном изобретении предлагаются способы и композиции, содержащие комбинации антител TIGIT, как описано в данном документе и которые представлены в формуле изобретения, с антителами PVRIG и ингибиторами контрольной точки, включая антитела анти-PD-1. В данном изобретении также предлагаются нуклеиновые кислоты, кодирующие указанные антитела, и их композиции.

В данном изобретении предлагается способ лечения рака у указанного пациента, включающий: а) получения биоптата от указанного пациента, содержащего опухолевые клетки; б) измерение количества PD-L1-положительных опухолевых клеток или иммунных клеток в указанном биоптате; с) если указанное количество PD-L1-положительных опухолевых клеток или иммунных клеток превышает 1% по сравнению с окрашиванием тех же опухолевых клеток соответствующим антителом изотипического контроля, для применяемых антител, введение трехкомпонентного комбинированного препарата, содержащего антитело анти-TIGIT, антитело анти-PVRIG и антитело αнтu-PD-1; а также d) если указанное количество PD-L1-положительных опухолевых клеток или иммунных клеток составляет менее 1% по сравнению с окрашиванием тех же опухолевых клеток соответствующим антителом изотипического контроля, для применяемых антител, введение двухкомпонентного комбинированного препарата, содержащего антитело анти-TIGIT и антитело анти-PVRIG.

В некоторых вариантах осуществления указанного способа антитело анти-TIGIT представляет собой антитело, выбранное из по меньшей мере одного из следующих антител: СРА.9.083.Н4 (S241P), СРА.9.086.Н4 (S241P), СНА.9.547.7.Н4 (S241P) и CHA.9.547.13.H4 (S241P).

В некоторых вариантах осуществления указанного способа антитело анти-PVRIG представляет собой антитело, выбранное из по меньшей мере одного из следующих антител: СНА7.518.1.Н4 (S241P) и

- 1 044486

СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P).

В некоторых вариантах осуществления указанного способа антитело анти-PD-1 представляет собой антитело, выбранное из по меньшей мере одного из следующих антител: пембролизумаба, цемиплимаба и ниволумаба.

В некоторых вариантах осуществления указанного способа двухкомпонентную комбинированную терапию выбирают из введения СРА.9.083.Н4 (S241P) и СНА.7.518.1.Н4 (S241P); СРА.9.086.Н4 (S241P) и СНА.7.518.1.Н4 (S241P); СНА.9.547.7.Н4 (S241P) и СНА.7.518.1.Н4 (S241P); СНА.9.547.13.Н4 (S241P) и СНА.7.518.1.Н4 (S241P); СРА.9.083.Н4 (S241P) и СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P); СРА.9.086.Н4 (S241P) и СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P); СНА.9.547.7.Н4 (S241P) и СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P); а также СНА.9.547.13.Н4 (S241P) и СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P).

В некоторых вариантах осуществления указанного способа трехкомпонентную комбинированную терапию выбирают из введения СРА.9.083.Н4 (S241P), пембролизумаба и СНА.7.518.1.Н4 (S241P); СРА.9.086.Н4 (S241P), пембролизумаба и СНА.7.518.1.Н4 (S241P); СНА.9.547.7.Н4 (S241P), пембролизумаба и СНА.7.518.1.Н4 (S241P); СНА9.547.13.Н4 (S241P), пембролизумаба и СНА.7.518.1.Н4 (S241P); СРА.9.083.Н4 (S241P), пембролизумаба и СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P); СРА.9.086.Н4 (S241P), пембролизумаба и СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P); СНА.9.547.7.Н4 (S241P), пембролизумаба и СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P); СНА.9.547.13.Н4 (S241P), пембролизумаба и СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P); СРА.9.083.Н4 (S241P), ниволумаба и СНА.7.518.1.Н4 (S241P); СРА.9.086.Н4 (S241P), ниволумаба и СНА.7.518.1.Н4 (S241P); СНА.9.547.7.Н4 (S241P), ниволумаба и СНА.7.518.1.Н4 (S241P); СНА.9.547.13.Н4 (S241P), ниволумаба и СНА.7.518.1.Н4 (S241P); СРА.9.083.Н4 (S241P), ниволумаба и СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P); СРА.9.086.Н4 (S241P), ниволумаба и СНА7.538.1.2.Н4 (S241P); СНА.9.547.7.Н4 (S241P, ниволумаба и СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P); СНА.9.547.13.Н4 (S241P), ниволумаба и СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P); СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P); СРА.9.083.Н4 (S241P), емиплимаба и СНА.7.518.1.Н4 (S241P); СРА.9.086.Н4 (S241P), цемиплимаба и СНА.7.518.1.Н4 (S241P); СНА.9.547.7.Н4 (S241P), цемиплимаба и СНА.7.518.1.Н4 (S241P); СНА9.547.13.Н4 (S241P), цемиплимаба и СНА.7.518.1.Н4 (S241P); СРА.9.083.Н4 (S241P), цемиплимаба и СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P); СРА.9.086.Н4 (S241P), цемиплимаба и СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P); СНА9.547.7.Н4 (S241P), цемиплимаба и СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P); а также СНА.9.547.13.Н4 (S241P), цемиплимаба и CHA.7.538.1.2.H4 (S241P).

В некоторых вариантах осуществления указанного способа антитела вводят одновременно.

В некоторых вариантах осуществления указанного способа антитела вводят последовательно.

В некоторых вариантах осуществления указанного способа рак выбирают из группы, состоящей из рака предстательной железы, рака печени (ГЦК), колоректального рака, рака яичника, рака эндометрия, рака молочной железы, трижды негативного рака молочной железы, рака поджелудочной железы, рака желудка (желудочного рака), рака шейки матки, рака области головы и шеи, рака щитовидной железы, рака яичка, рак уротелия, рака легкого (мелкоклеточного рака легкого, немелкоклеточного рака легкого), меланомы, немеланомного рака кожи (плоскоклеточная и базально-клеточная карцинома), глиомы, рака почки (ПКК), лимфомы (НХЛ или ЛХ), острого миелобластного лейкоза (ОМЛ), острого лимф областного лейкоза Т-клеток (Т-ОЛЛ), диффузной В-крупноклеточной лимфомы, герминогенных опухолей яичка, мезотелиомы, рака пищевода, рака из клеток Меркеля, рака с высоким уровнем MSI, KRAS-мутантных опухолей, Т-клеточного лейкоза/лимфомы взрослых и миелодиспластических синдромов (МДС). В некоторых вариантах осуществления указанного способа рак выбирают из группы, состоящей из трижды негативного рака молочной железы, рака желудка (желудочного рака, рака легкого (мелкоклеточного рака легкого, немелкоклеточного рака легкого), рака из клеток Меркеля, рака с высоким уровнем MSI, KRASмутантных опухолей, Т-клеточного лейкоза/лимфомы взрослых и миелодиспластических синдромов (МДС). В некоторых вариантах осуществления указанного способа рак выбирают из группы, состоящей из трижды негативного рака молочной железы, рака желудка (желудочного рака, рака легкого (мелкоклеточного рака легкого, немелкоклеточного рака легкого), рака из клеток Меркеля, а также рака с высоким уровнем MSI.

В данном изобретении также предлагается способ лечения рака у указанного пациента, включающий введение трехкомпонентной комбинированной терапии, содержащей антитело анти-TIGIT, антитело анти-PVRIG и антитело анти-PD-1.

В некоторых вариантах осуществления указанного способа антитело анти-TIGIT представляет собой антитело, выбранное из по меньшей мере одного из следующих антител: СРА.9.083.Н4 (S241P), СРА.9.086.Н4 (S241P), СНА.9.547.7.Н4 (S241P) и СНА.9.547.13.Н4 (S241P).

В некоторых вариантах осуществления указанного способа антитело анти-PVRIG представляет собой антитело, выбранное из по меньшей мере одного из следующих антител: СНА7.518.1.Н4 (S241P) и СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P).

В некоторых вариантах осуществления указанного способа трехкомпонентная комбинированная терапия включает введение антитела анти-PD-1 в комбинации с двухкомпонентной комбинированной

- 2 044486 терапией, выбранной из введения СРА.9.083.Н4 (S241P) и СНА.7.518.1.Н4 (S241P); СРА.9.086.Н4 (S241P) и СНА.7.518.1.Н4 (S241P); СНА.9.547.7.Н4 (S241P) и СНА.7.518.1.Н4 (S241P); СНА.9.547.13.Н4 (S241P) и СНА.7.518.1.Н4 (S241P); СРА.9.083.Н4 (S241P) и СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P); СРА.9.086.Н4 (S241P) и СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P); СНА.9.547.7.Н4 (S241P) и СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P); а также СНА.9.547.13.Н4 (S241P) и СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P).

В некоторых вариантах осуществления указанного способа трехкомпонентную комбинированную терапию выбирают из введения СРА.9.083.Н4 (S241P), пембролизумаба и СНА.7.518.1.Н4 (S241P); СРА.9.086.Н4 (S241P), пембролизумаба и СНА.7.518.1.Н4 (S241P); СНА.9.547.7.Н4 (S241P), пембролизумаба и СНА.7.518.1.Н4 (S241P); СНА9.547.13.Н4 (S241P), пембролизумаба и СНА.7.518.1.Н4 (S241P); СРА.9.083.Н4 (S241P), пембролизумаба и СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P); СРА.9.086.Н4 (S241P), пембролизумаба и СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P); СНА.9.547.7.Н4 (S241P), пембролизумаба и СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P); СНА.9.547.13.Н4 (S241P), пембролизумаба и СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P); СРА.9.083.Н4 (S241P), ниволумаба и СНА.7.518.1.Н4 (S241P); СРА.9.086.Н4 (S241P), ниволумаба и СНА.7.518.1.Н4 (S241P); СНА.9.547.7.Н4 (S241P), ниволумаба и СНА.7.518.1.Н4 (S241P); СНА9.547.13.Н4 (S241P), ниволумаба и СНА.7.518.1.Н4 (S241P); СРА.9.083.Н4 (S241P), ниволумаба и СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P); СРА.9.086.Н4 (S241P), ниволумаба и СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P); СНА.9.547.7.Н4 (S241P, ниволумаба и СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P); СНА.9.547.13.Н4 (S241P), ниволумаба и СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P); СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P); СРА.9.083.Н4 (S241P), цемиплимаба и СНА.7.518.1.Н4 (S241P); СРА.9.086.Н4 (S241P), цемиплимаба и СНА.7.518.1.Н4 (S241P); СНА.9.547.7.Н4 (S241P), цемиплимаба и СНА.7.518.1.Н4 (S241P); СНА.9.547.13.Н4 (S241P), цемиплимаба и СНА.7.518.1.Н4 (S241P); СРА.9.083.Н4 (S241P), цемиплимаба и СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P); СРА.9.086.Н4 (S241P), цемиплимаба и СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P); СНА9.547.7.Н4 (S241P), цемиплимаба и СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P); а также СНА.9.547.13.Н4 (S241P), цемиплимаба и CHA.7.538.1.2.H4 (S241P).

В некоторых вариантах осуществления указанного способа рак для трехкомпонентной комбинированной терапии выбирают из группы, состоящей из рака предстательной железы, рака печени (ГЦК), колоректального рака, рака яичника, рака эндометрия, рака молочной железы, трижды негативного рака молочной железы, рака поджелудочной железы, рака желудка (желудочного рака), рака шейки матки, рака области головы и шеи, рака щитовидной железы, рака яичка, рак уротелия, рака легкого (мелкоклеточного рака легкого, немелкоклеточного рака легкого), меланомы, немеланомного рака кожи (плоскоклеточная и базально-клеточная карцинома), глиомы, рака почки (ПКК), лимфомы (НХЛ или ЛХ), острого миелобластного лейкоза (ОМЛ), острого лимфобластного лейкоза Т-клеток (Т-ОЛЛ), диффузной Вкрупноклеточной лимфомы, герминогенных опухолей яичка, мезотелиомы, рака пищевода, рака из клеток Меркеля, рака с высоким уровнем MSI, KRAS-мутантных опухолей, Т-клеточного лейкоза/лимфомы взрослых и миелодиспластических синдромов (МДС). В некоторых вариантах осуществления указанного способа рак выбирают из группы, состоящей из трижды негативного рака молочной железы, рака желудка (желудочного рака, рака легкого (мелкоклеточного рака легкого, немелкоклеточного рака легкого)), рака из клеток Меркеля, рака с высоким уровнем MSI, KRAS-мутантных опухолей, Т-клеточного лейкоза/лимфомы взрослых и миелодиспластических синдромов (МДС).

В данном изобретении также предлагается набор фармацевтических доз, содержащий: а) контейнер, содержащий стандартную дозу антитела анти-TIGIT; и b) контейнер, содержащий стандартную дозу антитела анти-PVRIG.

В данном изобретении также предлагается набор фармацевтических доз, содержащий: а) контейнер, содержащий стандартную дозу антитела анти-TIGIT; и b) контейнер, содержащий стандартную дозу антитела анти-PVRIG; и с) контейнер, содержащий антитело αнтu-PD-1.

В дополнительном аспекте данного изобретения предлагаются способы, включающие: а) получение популяции клеток из образца опухоли от пациента; b) окрашивание указанной популяции мечеными антителами, которые связывают: i) белок TIGIT; ii) белок PVRIG; iii) белок PVR; iv) белок PD-1; v) белок PD-L1; vi) PVRL2; и vi) соответствующий изотипический контроль для антител в i)-vi); с) проведение сортировки клеток с активированной флуоресценцией (FACS); d) для каждого из TIGIT, PVRIG, PVR, PD-1, PVRL2 и PD-L1, определение процента клеток в указанной популяции, которые экспрессируют белок относительно указанного антитела изотипического контроля; причем, если процент положительных клеток составляет > 1% либо для TIGIT, либо для PVR, а также либо для PVRIG, либо для PVRL2, а также либо для PD-1, либо для PD-L1, переход к этапу е); и е) введение антител к TIGIT, PVRIG и PD-1 указанному пациенту.

В дополнительном аспекте данного изобретения предлагаются способы, включающие: а) получение популяции клеток из образца опухоли от пациента; b) окрашивание указанной популяции мечеными антителами, которые связывают: i) белок TIGIT; ii) белок PVR; iii) белок PD-1; iv) белок PD-L1; и v) соответствующий изотипический контроль для антител в i)-iv); с) проведение сортировки клеток с активированной флуоресценцией (FACS); d) для каждого из TIGIT, PVR, PD-1 и PD-L1, определение процента клеток в указанной популяции, которые экспрессируют белок относительно указанного антитела изоти

- 3 044486 пического контроля; при этом, если процент положительных клеток составляет > 1% для всех 4 рецепторов, е) введение антител к TIGIT и PD-1 указанному пациенту.

В дополнительном аспекте данного изобретения предлагаются способы, включающие: а) получение популяции клеток из образца опухоли от пациента; b) окрашивание указанной популяции мечеными антителами, которые связывают: i) белок PVRIG; ii) белок PVRL2; iii) белок PD-1; iv) белок PD-L1; и v) соответствующий изотипический контроль для антител в i)-iv); с) проведение сортировки клеток с активированной флуоресценцией (FACS); d) для каждого из PVRIG, PVRL2, PD-1 и PD-L1, определение процента клеток в указанной популяции, которые экспрессируют белок относительно указанного антитела изотипического контроля; при этом, если процент положительных клеток составляет > 1% для всех 4 рецепторов, е) введение антител к PVRIG и PD-1 указанному пациенту.

В дополнительном аспекте данного изобретения предлагаются способы, включающие: а) получение популяции клеток из образца опухоли от пациента; b) окрашивание указанной популяции мечеными антителами, которые связывают: i) белок PVRIG; ii) белок PVRL2; iii) белок TIGIT; iv) белок PVR; и v) соответствующий изотипический контроль для антител в i)-iv); с) проведение сортировки клеток с активированной флуоресценцией (FACS); d) для каждого из PVRIG, PVRL2, TIGIT и PVR, определение процента клеток в указанной популяции, которые экспрессируют белок относительно указанного антитела изотипического контроля; при этом, если процент положительных клеток составляет > 1% для всех 4 рецепторов, е) введение антител к PVRIG и TIGIT указанному пациенту.

В дополнительном аспекте данного изобретения предлагаются способы, включающие: а) получение популяции клеток из образца опухоли от пациента; b) окрашивание указанной популяции мечеными антителами, которые связывают: i) белок PVRIG; ii) белок TIGIT; iii) белок PVRL2; iv) белок PD-1; v) белок PD-L1; и vi) соответствующий изотипический контроль для антител в i)-v); с) проведение сортировки клеток с активированной флуоресценцией (FACS); d) для каждого из PVRIG, TIGIT, PVRL2, PD-1 и PDL1, определение процента клеток в указанной популяции, которые экспрессируют белок относительно указанного антитела изотипического контроля; при этом, если процент положительных клеток составляет > 1% для всех 5 рецепторов, е) введение антител к PVRIG, TIGIT и PD-1 указанному пациенту.

В дополнительном аспекте данного изобретения предлагаются способы, включающие: а) получение популяции клеток из образца опухоли от пациента; b) окрашивание указанной популяции мечеными антителами, которые связывают: i) белок PVRIG; ii) белок PVRL2; iii) белок TIGIT; iv) белок PVR; v) PD-1; и vi) соответствующий изотипический контроль для антител в i)-v); с) проведение сортировки клеток с активированной флуоресценцией (FACS); d) для каждого из PVRIG, PVRL2, TIGIT и PVR, определение процента клеток в указанной популяции, которые экспрессируют белок относительно указанного антитела изотипического контроля; при этом, если процент положительных клеток составляет > 1% для всех 4 рецепторов, е) введение антител к PVRIG, TIGIT и PD-1 указанному пациенту.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения предлагается способ лечения рака у пациента, включающий: а) получения биоптата от указанного пациента, содержащего опухолевые клетки; б) измерение количества PD-L1-положительных опухолевых клеток или иммунных клеток в указанном биоптате; с) если указанное количество PD-L1-положительных опухолевых клеток или иммунных клеток превышает 1% по сравнению с окрашиванием тех же опухолевых клеток соответствующим антителом изотипического контроля, для применяемых антител, введение трехкомпонентного комбинированного препарата, содержащего антитело анти-TIGIT, антитело анти-PVRIG и антитело анти-PD-1; а также d) если указанное количество PD-L1-положительных опухолевых клеток или иммунных клеток составляет менее 1% по сравнению с окрашиванием тех же опухолевых клеток соответствующим антителом изотипического контроля, для применяемых антител, введение двухкомпонентного комбинированного препарата, содержащего антитело анти-TIGIT и антитело анти-PVRIG.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения антитело анти-TIGIT представляет собой антитело, выбранное из любого антитела анти-TIGIT, описанного в данном документе, включая любое из антител, описанных на фиг. 3.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения антитело анти-PVRIG представляет собой антитело, выбранное из любого антитела анти-PVRIG, описанного в данном документе, включая любое из антител, описанных на фиг. 5 и/или на фиг. 63.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения антитело анти-PD-1 представляет собой антитело, выбранное из любого антитела анти-PD-1, описанного в данном документе, включая любое из антител, описанных на фиг. 7.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения антитело анти-TIGIT представляет собой антитело, выбранное из по меньшей мере одного из следующих антител: СРА.9.083.Н4 (S241P), СРА.9.086.Н4 (S241P), СНА.9.547.7.Н4 (S241P) и CHA.9.547.13.H4 (S241P).

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения антитело анти-PVRIG представляет собой антитело, выбранное из по меньшей мере одного из следующих антител: СНА7.518.1.Н4 (S241P) и СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P).

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения антитело анти-PD-1 представляет со

- 4 044486 бой антитело, выбранное из по меньшей мере одного из следующих антител: пембролизумаба, цемиплимаба и ниволумаба.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения двухкомпонентную комбинированную терапию выбирают из введения СРА.9.083.Н4 (S241P) и СНА.7.518.1.Н4 (S241P); СРА.9.086.Н4 (S241P) и СНА.7.518.1.Н4 (S241P); СНА.9.547.7.Н4 (S241P) и СНА.7.518.1.Н4 (S241P); СНА.9.547.13.Н4 (S241P) и СНА.7.518.1.Н4 (S241P); СРА.9.083.Н4 (S241P) и СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P); СРА.9.086.Н4 (S241P) и СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P); СНА.9.547.7.Н4 (S241P) и СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P); а также СНА.9.547.13.Н4 (S241P) и СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P).

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения трехкомпонентную комбинированную терапию выбирают из введения СРА.9.083.Н4 (S241P), пембролизумаба и СНА.7.518.1.Н4 (S241P); СРА.9.086.Н4 (S241P), пембролизумаба и СНА.7.518.1.Н4 (S241P); СНА.9.547.7.Н4 (S241P), пембролизумаба и СНА.7.518.1.Н4 (S241P); СНА.9.547.13.Н4 (S241P), пембролизумаба и СНА.7.518.1.Н4 (S241P); СРА.9.083.Н4 (S241P), пембролизумаба и СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P); СРА.9.086.Н4 (S241P), пембролизумаба и СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P); СНА.9.547.7.Н4 (S241P), пембролизумаба и СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P); СНА.9.547.13.Н4 (S241P), пембролизумаба и СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P); СРА.9.083.Н4 (S241P), ниволумаба и СНА.7.518.1.Н4 (S241P); СРА.9.086.Н4 (S241P), ниволумаба и СНА7.518.1.Н4 (S241P); СНА.9.547.7.Н4 (S241P), ниволумаба и СНА.7.518.1.Н4 (S241P); СНА9.547.13.Н4 (S241P), ниволумаба и СНА.7.518.1.Н4 (S241P); СРА.9.083.Н4 (S241P), ниволумаба и СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P); СРА.9.086.Н4 (S241P), ниволумаба и СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P); СНА.9.547.7.Н4 (S241P, ниволумаба и СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P); СНА.9.547.13.Н4 (S241P), ниволумаба и СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P); СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P); СРА.9.083.Н4 (S241P), цемиплимаба и СНА.7.518.1.Н4 (S241P); СРА.9.086.Н4 (S241P), цемиплимаба и СНА.7.518.1.Н4 (S241P); СНА.9.547.7.Н4 (S241P), цемиплимаба и СНА.7.518.1.Н4 (S241P); СНА9.547.13.Н4 (S241P), цемиплимаба и СНА.7.518.1.Н4 (S241P); СРА.9.083.Н4 (S241P), цемиплимаба и СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P); СРА.9.086.Н4 (S241P), цемиплимаба и СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P); СНА9.547.7.Н4 (S241P), цемиплимаба и СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P); а также СНА.9.547.13.Н4 (S241P), цемиплимаба и CHA.7.538.1.2.H4 (S241P).

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения антитела вводят одновременно.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения антитела вводят последовательно.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения рак выбирают из группы, состоящей из рака предстательной железы, рака печени (ГЦК), колоректального рака, рака яичника, рака эндометрия, рака молочной железы, трижды негативного рака молочной железы, рака поджелудочной железы, рака желудка (желудочного рака), рака шейки матки, рака области головы и шеи, рака щитовидной железы, рака яичка, рак уротелия, рака легкого (мелкоклеточного рака легкого, немелкоклеточного рака легкого), меланомы, немеланомного рака кожи (плоскоклеточная и базально-клеточная карцинома), глиомы, рака почки (ПКК), лимфомы (НХЛ или ЛХ), острого миелобластного лейкоза (ОМЛ), острого лимфобластного лейкоза Т-клеток (Т-ОЛЛ), диффузной В-крупноклеточной лимфомы, герминогенных опухолей яичка, мезотелиомы, рака пищевода, рака из клеток Меркеля, рака с высоким уровнем MSI, KRAS-мутантных опухолей, Т-клеточного лейкоза/лимфомы взрослых и миелодиспластических синдромов (МДС).

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения рак выбирают из группы, состоящей из трижды негативного рака молочной железы, рака желудка (желудочного рака, рака легкого (мелкоклеточного рака легкого, немелкоклеточного рака легкого), а также рака из клеток Меркеля, рака с высоким уровнем MSI, KRAS-мутантных опухолей, Т-клеточного лейкоза/лимфомы взрослых и миелодиспластических синдромов (МДС).

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения предлагается способ лечения рака у пациента, включающий введение трехкомпонентной комбинированной терапии, содержащей антитело анти-TIGIT, антитело анти-PVRIG и антитело αнтu-PD-1.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения указанное антитело анти-PVRIG представляет собой антитело, выбранное из по меньшей мере одного из следующих антител: СНА.7.518.1.Н4 (S241P) и СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P).

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения антитело анти-PD-1 представляет собой антитело, выбранное из группы, состоящей из пембролизумаба, цемиплимаба и ниволумаба.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения трехкомпонентная комбинированная терапия включает введение антитела анти-PD-1 в комбинации с двухкомпонентной комбинированной терапией, выбранной из введения СРА.9.083.Н4 (S241P) и СНА.7.518.1.Н4 (S241P); СРА.9.086.Н4 (S241P) и СНА.7.518.1.Н4 (S241P); СНА.9.547.7.Н4 (S241P) и СНА.7.518.1.Н4 (S241P); СНА.9.547.13.Н4 (S241P) и СНА.7.518.1.Н4 (S241P); СРА.9.083.Н4 (S241P) и СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P); СРА.9.086.Н4 (S241P) и СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P); СНА.9.547.7.Н4 (S241P) и СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P); а также СНА.9.547.13.Н4 (S241P) и СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P).

В некоторых вариантах осуществления указанного способа трехкомпонентную комбинированную

- 5 044486 терапию выбирают из введения СРА.9.083.Н4 (S241P), пембролизумаба и СНА.7.518.1.Н4 (S241P); СРА.9.086.Н4 (S241P), пембролизумаба и СНА.7.518.1.Н4 (S241P); СНА.9.547.7.Н4 (S241P), пембролизумаба и СНА.7.518.1.Н4 (S241P); СНА9.547.13.Н4 (S241P), пембролизумаба и СНА.7.518.1.Н4 (S241P); СРА.9.083.Н4 (S241P), пембролизумаба и СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P); СРА.9.086.Н4 (S241P), пембролизумаба и СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P); СНА.9.547.7.Н4 (S241P), пембролизумаба и СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P); СНА.9.547.13.Н4 (S241P), пембролизумаба и СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P); CPA.9.083.H4 (S241P), ниволумаба и СНА.7.518.1.Н4 (S241P); СРА.9.086.Н4 (S241P), ниволумаба и СНА.7.518.1.Н4 (S241P); СНА.9.547.7.Н4 (S241P), ниволумаба и СНА.7.518.1.Н4 (S241P); СНА9.547.13.Н4 (S241P), ниволумаба и СНА.7.518.1.Н4 (S241P); СРА.9.083.Н4 (S241P), ниволумаба и СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P); СРА.9.086.Н4 (S241P), ниволумаба и СНА7.538.1.2.Н4 (S241P); СНА.9.547.7.Н4 (S24lP, ниволумаба и СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P); СНА.9.547.13.Н4 (S241P), ниволумаба и СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P); СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P); СРА.9.083.Н4 (S241P), цемиплимаба и СНА.7.518.1.Н4 (S241P); СРА.9.086.Н4 (S241P), цемиплимаба и СНА.7.518.1.Н4 (S241P); СНА.9.547.7.Н4 (S241P), цемиплимаба и СНА.7.518.1.Н4 (S241P); СНА9.547.13.Н4 (S241P), цемиплимаба и СНА.7.518.1.Н4 (S241P); СРА.9.083.Н4 (S241P), цемиплимаба и СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P); СРА.9.086.Н4 (S241P), цемиплимаба и СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P); СНА9.547.7.Н4 (S241P), цемиплимаба и СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P); а также СНА.9.547.13.Н4 (S241P), цемиплимаба и СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P).

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения рак выбирают из группы, состоящей из рака предстательной железы, рака печени (ГЦК), колоректального рака, рака яичника, рака эндометрия, рака молочной железы, трижды негативного рака молочной железы, рака поджелудочной железы, рака желудка (желудочного рака), рака шейки матки, рака области головы и шеи, рака щитовидной железы, рака яичка, рак уротелия, рака легкого (мелкоклеточного рака легкого, немелкоклеточного рака легкого), меланомы, немеланомного рака кожи (плоскоклеточная и базально-клеточная карцинома), глиомы, рака почки (ПКК), лимфомы (НХЛ или ЛХ), острого миелобластного лейкоза (ОМЛ), острого лимф областного лейкоза Т-клеток (Т-ОЛЛ), диффузной В-крупноклеточной лимфомы, герминогенных опухолей яичка, мезотелиомы, рака пищевода, рака из клеток Меркеля, рака с высоким уровнем MSI, KRAS-мутантных опухолей, Т-клеточного лейкоза/лимфомы взрослых и миелодиспластических синдромов (МДС).

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения предлагается набор фармацевтических доз, содержащий: а) контейнер, содержащий стандартную дозу антитела анти-TIGIT; и b) контейнер, содержащий стандартную дозу антитела анти-PVRIG.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения предлагается набор фармацевтических доз, содержащий: а) контейнер, содержащий стандартную дозу антитела анти-TIGIT; b) контейнер, содержащий стандартную дозу антитела анти-PVRIG; и с) контейнер, содержащий антитело анти-PD-l.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения антитело анти-PD-l представляет собой антитело, выбранное из любого антитела анти-PD-l, описанного в данном документе, включая любое из антител, описанных на фиг. 7.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения предлагается способ, включающий: а) получение популяции клеток из образца опухоли от пациента; b) окрашивание указанной популяции мечеными антителами, которые связывают: i) белок TIGIT; ii) белок PVRIG; iii) белок PVR; iv) белок PD-1; v) белок PD-L1; и vi) соответствующий изотипический контроль для антител в i)-v); с) проведение сортировки клеток с активированной флуоресценцией (FACS); d) для каждого из TIGIT, PVRIG, PVR, PD-1 и PD-L1 - определение процента клеток в указанной популяции, которые экспрессируют белок относительно указанного антитела изотипического контроля; при этом, если процент положительных клеток составляет > 1% для всех 5 рецепторов, е) введение антител к TIGIT, PVRIG и PD-1 указанному пациенту.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения антитело анти-PVRIG представляет

- 6 044486 собой антитело, выбранное из любого антитела анти-PVRIG, описанного в данном документе, включая любое из антител, описанных на фиг. 5 и/или на фиг. 63.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения антитело к TIGIT представляет собой СРА.9.086.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения антитело к PD-1 выбирают из пембролизумаба и ниволумаба.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения антитело к PVRIG представляет собой CHA.7.518.1.H4 (S241P).

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения предлагается способ, включающий: а) получение популяции клеток из образца опухоли от пациента; b) окрашивание указанной популяции мечеными антителами, которые связывают: i) белок PVRIG; ii) белок TIGIT; iii) белок PVRL2; iv) белок PD1; v) белок PD-L1; и vi) соответствующий изотипический контроль для антител в i)-v); с) проведение проточной цитометрии/сортировки клеток с активированной флуоресценцией (FACS); d) для каждого из PVRIG, TIGIT, PVRL2, PD-1 и PD-L1, определение процента клеток в указанной популяции, которые экспрессируют белок относительно указанного антитела изотипического контроля; при этом, если процент положительных клеток составляет > 1% для всех 5 рецепторов, е) введение антител к PVRIG и PD-1 указанному пациенту.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения антитело анти-PD-L1 представляет собой антитело, выбранное из любого антитела анти-PD-Ll, описанного в данном документе, включая любое из антител, описанных на фиг. 62.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения предлагается способ, включающий: а) получение популяции клеток из образца опухоли от пациента; b) окрашивание указанной популяции мечеными антителами, которые связывают: i) белок PVRIG; ii) белок PD-1; iii) белок PVRL2; iv) белок TIGIT; v) белок PVR; и vi) соответствующий изотипический контроль для антител в i)-v); с) проведение сортировки клеток с активированной флуоресценцией (FACS); d) для каждого из PVRIG, PVRL2, TIGIT и PVR, определение процента клеток в указанной популяции, которые экспрессируют белок относительно указанного антитела изотипического контроля; при этом, если процент положительных клеток составляет > 1% для всех 5 рецепторов, е) введение антител к PVRIG и TIGIT указанному пациенту.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения антитело к TIGIT представляет собой СРА9.086.

- 7 044486

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения предлагается способ лечения рака у пациента, включающий: а) получения биоптата от указанного пациента, содержащего опухолевые клетки; b) измерение количества PD-L1-положительных опухолевых клеток или иммунных клеток в указанном биоптате; с) если указанное количество PD-L1-положительных опухолевых клеток или иммунных клеток превышает 1% по сравнению с окрашиванием тех же опухолевых клеток соответствующим антителом изотипического контроля, для применяемых антител, введение трехкомпонентного комбинированного препарата, содержащего антитело анти-TIGIT, антитело анти-PVRIG и антитело αнтu-PD-L1; а также d) если указанное количество PD-L1-положительных опухолевых клеток или иммунных клеток составляет менее 1% по сравнению с окрашиванием тех же опухолевых клеток соответствующим антителом изотипического контроля, для применяемых антител, введение двухкомпонентного комбинированного препарата, содержащего антитело анти-TIGIT и антитело анти-PVRIG.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения антитело анти-PD-1 представляет собой антитело, выбранное из любого антитела анти-PD-L1, описанного в данном документе, включая любое из антител, описанных на фиг. 62.

58. Способ по любому из пп.52-57, отличающийся тем, что указанное антитело анти-PD-L1 представляет собой антитело, выбранное из по меньшей мере одного из следующих антител: атезолизумаба, авелумаба и дурвалумаба.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения трехкомпонентную комбинированную терапию выбирают из введения СРА.9.083.Н4 (S241P), атезолизумаба и СНА.7.518.1.Н4 (S241P); СРА.9.086.Н4 (S241P), атезолизумаба и СНА.7.518.1.Н4 (S241P); СНА.9.547.7.Н4 (S241P), атезолизумаба и СНА.7.518.1.Н4 (S241P); СНА.9.547.13.Н4 (S241P), атезолизумаба и СНА.7.518.1.Н4 (S241P); СРА.9.083.Н4 (S241P), атезолизумаба и СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P); СРА.9.086.Н4 (S241P), атезолизумаба и СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P); СНА9.547.7.Н4 (S241P), атезолизумаба и СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P); СНА.9.547.13.Н4 (S241P), атезолизумаба и СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P); СРА.9.083.Н4 (S241P), авелумаба и СНА.7.518.1.Н4 (S241P); СРА.9.086.Н4 (S241P), авелумаба и СНА.7.518.1.Н4 (S241P); СНА.9.547.7.Н4 (S241P), авелумаба и СНА.7.518.1.Н4 (S241P); СНА.9.547.13.Н4 (S241P), авелумаба и СНА.7.518.1.Н4 (S241P); СРА.9.083.Н4 (S241P), авелумаба и СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P); СРА.9.086.Н4 (S241P), авелумаба и СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P); СНА.9.547.7.Н4 (S241P, авелумаба и СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P); СНА.9.547.13.Н4 (S241P), авелумаба и СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P); СНА7.538.1.2.Н4 (S241P); СРА.9.083.Н4 (S241P), дурвалумаба и СНА.7.518.1.Н4 (S241P); СРА.9.086.Н4 (S241P), дурвалумаба и СНА.7.518.1.Н4 (S241P); СНА.9.547.7.Н4 (S241P), дурвалумаба и СНА.7.518.1.Н4 (S241P); СНА.9.547.13.Н4 (S241P), дурвалумаба и СНА.7.518.1.Н4 (S241P); СРА.9.083.Н4 (S241P), дурвалумаба и СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P); СРА.9.086.Н4 (S241P), дурвалумаба и СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P); СНА.9.547.7.Н4 (S241P), дурвалумаба и СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P); а также СНА.9.547.13.Н4 (S241P), дурвалумаба и СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P).

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения рак выбирают из группы, состоящей из рака предстательной железы, рака печени (ГЦК), колоректального рака, рака яичника, рака эндометрия, рака молочной железы, трижды негативного рака молочной железы, рака поджелудочной железы, рака желудка (желудочного рака), рака шейки матки, рака области головы и шеи, рака щитовидной железы, рака яичка, рак уротелия, рака легкого (мелкоклеточного рака легкого, немелкоклеточного рака легкого),

- 8 044486 меланомы, немеланомного рака кожи (плоскоклеточная и базально-клеточная карцинома), глиомы, рака почки (ПКК), лимфомы (НХЛ или ЛХ), острого миелобластного лейкоза (ОМЛ), острого лимф областного лейкоза Т-клеток (Т-ОЛЛ), диффузной В-крупноклеточной лимфомы, герминогенных опухолей яичка, мезотелиомы, рака пищевода, рака из клеток Меркеля, рака с высоким уровнем MSI, KRAS-мутантных опухолей, Т-клеточного лейкоза/лимфомы взрослых и миелодиспластических синдромов (МДС).

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения предлагается способ лечения рака у пациента, включающий введение трехкомпонентной комбинированной терапии, содержащей антитело анти-TIGIT, антитело анти-PVRIG и антитело αнтu-PD-L1.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения антитело анти-PD-L1 представляет собой антитело, выбранное из группы, состоящей из атезолизумаба, авелумаба и дурвалумаба.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения трехкомпонентная комбинированная терапия включает введение антитела анти-PD-L1 в комбинации с двухкомпонентной комбинированной терапией, выбранной из введения СРА.9.083.Н4 (S241P) и СНА.7.518.1.Н4 (S241P); СРА.9.086.Н4 (S241P) и СНА.7.518.1.Н4 (S241P); СНА.9.547.7.Н4 (S241P) и СНА.7.518.1.Н4 (S241P); СНА.9.547.13.Н4 (S241P) и СНА.7.518.1.Н4 (S241P); СРА.9.083.Н4 (S241P) и СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P); СРА.9.086.Н4 (S241P) и СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P); СНА.9.547.7.Н4 (S241P) и СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P); а также СНА.9.547.13.Н4 (S241P) и СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P).

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения трехкомпонентную комбинированную терапию выбирают из введения СРА.9.083.Н4 (S241P), атезолизумаба и СНА.7.518.1.Н4 (S241P); СРА.9.086.Н4 (S241P), атезолизумаба и СНА.7.518.1.Н4 (S241P); СНА.9.547.7.Н4 (S241P), атезолизумаба и СНА.7.518.1.Н4 (S241P); CHA.9.547.13.H4 (S241P), атезолизумаба и СНА.7.518.1.Н4 (S241P); СРА.9.083.Н4 (S241P), атезолизумаба и СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P); СРА.9.086.Н4 (S241P), атезолизумаба и СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P); СНА.9.547.7.Н4 (S241P), атезолизумаба и СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P); СНА.9.547.13.Н4 (S241P), атезолизумаба и СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P); СРА.9.083.Н4 (S241P), авелумаба и СНА.7.518.1.Н4 (S241P); СРА.9.086.Н4 (S241P), авелумаба и СНА.7.518.1.Н4 (S241P); СНА9.547.7.Н4 (S241P), авелумаба и СНА.7.518.1.Н4 (S241P); СНА.9.547.13.Н4 (S241P), авелумаба и СНА.7.518.1.Н4 (S241P); СРА.9.083.Н4 (S241P), авелумаба и СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P); СРА.9.086.Н4 (S241P), авелумаба и СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P); СНА.9.547.7.Н4 (S241P, авелумаба и СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P); СНА.9.547.13.Н4 (S241P), авелумаба и СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P); СНА7.538.1.2.Н4 (S241P); СРА.9.083.Н4 (S241P), дурвалумаба и СНА.7.518.1.Н4 (S241P); СРА.9.086.Н4 (S241P), дурвалумаба и СНА.7.518.1.Н4 (S241P); СНА.9.547.7.Н4 (S241P), дурвалумаба и СНА.7.518.1.Н4 (S241P); СНА.9.547.13.Н4 (S241P), дурвалумаба и СНА.7.518.1.Н4 (S241P); СРА.9.083.Н4 (S241P), дурвалумаба и СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P); СРА.9.086.Н4 (S241P), дурвалумаба и СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P); СНА.9.547.7.Н4 (S241P), дурвалумаба и СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P); а также СНА.9.547.13.Н4 (S241P), дурвалумаба и СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P).

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения рак выбирают из группы, состоящей из трижды негативного рака молочной железы, рака желудка (желудочного рака, рака легкого (мелкоклеточного рака легкого, немелкоклеточного рака легкого), а также рака из клеток Меркеля, рака с высоким уровнем MSI, KRAS-мутантных опухолей, Т-клеточного лейкоза/лимфомы взрослых и миелодиспласти

- 9 044486 ческих синдромов (МДС).

III. Краткое описание графических материалов

На фиг. 1А-1В продемонстрированы аминокислотные последовательности константных доменов IgG1 (с некоторыми пригодными аминокислотными заменами), IgG2, IgG3, IgG4, IgG4 человека с шарнирным вариантом, который находит конкретное применение в данном изобретении, и константных доменов легких цепей каппа и лямбда.

На фиг. 2 продемонстрирована последовательность белков TIGIT, PVRIG и PD-1 человека и яванского макака (обозначаемого супо)

На фиг. 3A-3SSSS продемонстрированы последовательности четырех антител анти-TIGIT, которые блокируют взаимодействие TIGIT и PVR, CPA.9.083.H4 (S241P), СРА.9.086.Н4 (S241P), СНА.9.547.7.Н4 (S241P) и СНА.9.547.13.Н4 (S241P), а также эталонных антител, ВМ26 и ВМ29, и многочисленных других антител анти-TIGIT.

На фиг. 4А-4С продемонстрированы результаты FACS FACS KD антител анти-TIGIT (СРА.9.083.Н4 (S241P), СРА.9.086.Н4 (S241P), СНА.9.547.7.Н4 (S241P) и СНА.9.547.13.Н4 (S241P), а также эталонных антител, ВМ26 и ВМ29, связывающихся с TIGIT-сверхэкспрессирующими клетками Expi293 HEK человека (А), яванского макака (В) и мыши (С).

На фиг. 5A-5F продемонстрированы последовательности двух антител анти-PVRIG, CHA.7.518.1.H4 (S241P) и СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P). Другие антитела к PVRIG представлены на фиг. 63.

На фиг. 6 продемонстрировано связывание СНА.7.518.1.Н4 (S241P) с PVRIG с помощью проточной цитометрии. (А) Связывание с PVRIG-сверхэкспрессирующими клетками HEK293. СНА.7.518.1.Н4 (S241P) связывает PVRIG-сверхэкспрессирующие клетки HEK293 человека и яванского макака, но не PVRIG-сверхэкспрессирующие клетки HEK293 мыши или родительские клетки HEK293. (В) Связывание СНА.7.518.1.Н4 (S241P) с клетками Jurkat. Специфическое связывание наблюдается для СНА.7.518.1.Н4 (S241P), но не для нерелевантного антитела изотипического контроля. Константа диссоциации (KD) относительно связывания СНА.7.518.1.Н4 (S241P) с мишенями, экспрессированными на клетках, приведена в таблице.

На фиг. 7A-7F продемонстрированы последовательности двух антител анти-PD-1.

На фиг. 8 продемонстрирована экспрессия PVRIG, TIGIT, PD1 на CMVpp65-реактивных Т-клетках, как описано в экспериментах по примеру 1. (А) Стратегия гейтирования для обнаружения CMV-CTL, окрашенных тетрамером. Продемонстрирована иерархия гейтирования и тетрамер-положительные клетки у трех доноров. Лимфоциты гейтировали в квадранте FS/SS (вверху слева) с последующим отбором синглетов и последующим удалением CD14-CD19-CD56- клеток, и последующим удалением CD3+ CD8+ положительных клеток. В CD3+ CD8+ положительной популяции, у отдельных доноров определяли процент клеток, связывающих каждый тетрамер. Продемонстрированы результаты окрашивания с применением тетрамера HLA-A*02:01 CMV. (В) Продемонстрирована экспрессия PVRIG, TIGIT и PD-1 на CMVpp65-реактивных Т-клетках, полученных от 3 доноров.

На фиг. 9 продемонстрирована кинетика экспрессии PVRIG, TIGIT и PD-1 на CCD8 + CMV+ Тклетках, как описано в экспериментах по примеру 1. (А) Продемонстрирован процент рр65-тетрамер положительных CD8 Т-клеток после 0, 72, 144, 216 и 288 ч стимуляции IL-2, IL-7 и CMV рр65 пептидамом. (В) TIGIT, (С) СНА.7.518.1.Н4 (S241P), (D) экспрессия PD-1 на CMVpp65-реактивных CD8 Т-клетках в различные моменты времени после стимуляции (n=3).

На фиг. 10 продемонстрирована экспрессия PVRL2, PVR, PDL1 и HLA-A2 на клетках Colo205 и Panc.04.05, оцененная с помощью проточной цитометрии, как описано в экспериментах по примеру 1. Число в верхнем правом углу обозначает процентное содержание лиганда (PVRL2, PVR, PDL1) или HLA-A2, экспрессированного на линиях опухолевых клеток, по сравнению с антителом изотипического контроля.

На фиг. 11А-1Ю продемонстрирован эффект блокады ингибирующего рецептора на CMVpp65реактивные CD8 Т -клетки в совместной культуре с линиями раковых клеток, как описано в экспериментах по примеру 1. CMVpp65-реактивные Т-клетки для 2 доноров (донор 4 и донор 156) совместно культивировали с 0,03 мкг/мл клеток Panc.04.05 или Colo205, нагруженных CMVpp65-пептидом, в течение 24 ч в присутствии 10 мкг/мл CHA.7.518.1.H4 (S241P), анти-TIGIT, анти-PD-1, или изотипического контроля, либо отдельно, либо в комбинации. (А) СНА.7.518.1.Н4 (S241P), антитела анти-TIGIT или анти-PD1, протестированные отдельно, в двухкомпонентной комбинации или в трехкомпонентной комбинации. (В) CHA.7.518.1.H4 (S241P) и антитела анти-TIGIT, протестированные отдельно или в комбинации. (С) СНА.7.518.1.Н4 (S241P) и антитела анти-PD1, протестированные отдельно или в комбинации. (D) Антитела анти-TIGIT и анти-PD1, протестированные отдельно или в комбинации. Кондиционированные среды анализировали на секрецию цитокинов. Гистограммы демонстрируют среднее значение + стандартное отклонение для IFN-γ, где каждая точка представляет собой технический повтор. Данные являются репрезентативными для n>2 экспериментов.

На фиг. 12 продемонстрирована экспрессия PVRIG на клетках из рассеченных опухолей, как описано в экспериментах по примеру 2. (А) Образцы группировали на основе типа опухоли, как определено в гистопатологическом заключении. Для каждого образца продемонстрирована экспрессия PVRIG на

- 10 044486

CD4+ Т-клетках, CD8+ Т-клетках, CD4-CD8- Т-клетках и на NK-клетках. Каждая точка в столбце представляет отдельный образец. Значение MFIr в образце выше 1 означает обнаружение экспрессии PVRIG. Медиана изображена срединной линией, а верхний и нижний квартили - серым пространством над и под срединной линией. (В) Во всех исследованных опухолевых образцах продемонстрирована экспрессия PVRIG на CD4+ Т-клетках, CD8+ Т-клетках, CD4-CD8- Т-клетках и на NK-клетках. Медиана изображена срединной линией, а верхний и нижний квартили - светло-серым и темно-серым пространством над и под срединной линией. Усы изображают 1,5-кратный межквартильный размах. (С) Для 4 подгрупп клеток, выделенных из опухоли легких и почек, продемонстрированы репрезентативные гистограммы FACS для PVRIG (синий) по сравнению с изотипическим контролем (красный).

На фиг. 13 продемонстрирован корреляционный анализ экспрессии PD1, TIGIT и PVRIG на CD4+ и CD8+ Т-клетках из рассеченных опухолей эндометрия, как описано в экспериментах по примеру 2. Для каждого образца эндометрия рассчитывали MFIr для PVRIG, PD1 и TIGIT на CD4 и CD8 Т-клетках. Проводили корреляционный анализ Спирмена и получали значения r2 и p.

На фиг. 14 продемонстрирован коэкспрессионный анализ экспрессии PD1, TIGIT и PVRIG на CD8+ Т - клетках из рассеченного образца рака легких и почки, как описано в экспериментах по примеру 2.

На фиг. 15 продемонстрировано сравнение экспрессии PVRIG на Т-клетках из рассеченных опухолей с соответствующими НСТ (нормальными соседними тканями), как описано в экспериментах по примеру 2. (А) Соответствующие опухолевые и нормальные соседние ткани из опухолей толстой кишки/желудка/прямой кишки, эндометрия/матки, почек, легких и яичников оценивали на экспрессию PVRIG на CD4 и CD8 Т-клетках. Каждая линия представляет соответствующего донора. Парный tкритерий Стьюдента применяли для всех образцов, сравнивая экспрессию PVRIG на CD4 и CD8 Тклетках в НСТ и в опухоли. (В) Изменение кратности PVRIG (в НСТ по сравнению с опухолью) нанесено на график в зависимости от кратного изменения PD1 для CD4 и CD8 Т-клеток. Проводили корреляционный анализ Спирмена, и получали значение r и значение р.

На фиг. 16 продемонстрирована экспрессия PVRL2 на иммунных и неиммунных подмножествах клеток из всех образцов рассеченных опухолей, как описано в экспериментах по примеру 2. Продемонстрирована экспрессия PVRL2 в различных подмножествах клеток, полученных из опухолей. Значения MFIr выше 1 означают обнаружение экспрессии PVRL2. Медиана изображена срединной линией, а верхний и нижний квартили - светло-серым и темно-серым пространством над и под срединной линией. Усы изображают 1,5-кратный межквартильный размах.

На фиг. 17 продемонстрирована экспрессия PVRL на неиммунных подмножествах клеток из рассеченных опухолей, как описано в экспериментах по примеру 2. Образцы группировали на основе типа опухоли, как определено в гистопатологическом заключении. Для каждого образца продемонстрирована экспрессия PVRL2 на CD45-неиммунных клетках. Каждая точка представляет отдельный образец. Медиана изображена срединной линией, а верхний и нижний квартили - серым пространством над и под срединной линией.

На фиг. 18 продемонстрирована экспрессия PVRL2 на подмножествах миелоидных клеток из рассеченных опухолей, как описано в экспериментах по примеру 2. Образцы группировали на основе типа опухоли, как определено в гистопатологическом заключении. Для каждого образца продемонстрирована экспрессия PVRL2 на миелоидных клетках, которые включают популяции моноцитов, mDC и pDC. Каждая точка представляет отдельный образец. Медиана изображена срединной линией, а верхний и нижний квартили - серым пространством над и под срединной линией.

На фиг. 19 продемонстрировано сравнение экспрессии PVRL2 на моноцитах и CD45^- опухолевых клетках из рассеченных опухолей и соответствующих НСТ, как описано в экспериментах по примеру 2. (А) Соответствующие опухолевые и нормальные соседние ткани из опухолей толстой кишки/желудка/прямой кишки, эндометрия/матки, почек, легких и яичников оценивали на экспрессию PVRL2 на CD45-клетках и на моноцитах. Каждая линия представляет соответствующего донора. Парный t-критерий Стьюдента применяли для всех образцов, сравнивая экспрессию PVRL2 на CD45-клетках и на клетках моноцитов в НСТ и в опухоли. (В) Изменение кратности PVRL2 (в НСТ по сравнению с опухолью) нанесено на график в зависимости от кратного изменения PD-L1 для CD45-клеток и для моноцитов. Проводили корреляционный анализ Спирмена, и получали значение r и значение р.

На фиг. 20 продемонстрирована совместная экспрессия PVRIG на Т-клетках с PVRL2 на моноцитах и CD45^- клетках в опухолевых тканях, как описано в экспериментах по примеру 2. На графике отображена экспрессия PVRIG на CD8 Т-клетках и PVRL2 на моноцитах или CD45-клетках из того же образца. Опухоли группировали по типах, при этом каждая точка представляет отдельную опухоль. Эталонные линии проведены при значении MFIr, составляющему 2.

На фиг. 21А-21В продемонстрирована экспрессия PVRL2 и PD-L1 при раке толстой кишки, кожи и молочной железы, как описано в экспериментах по примеру 3.

На фиг. 22 продемонстрирована экспрессия PVRL2 в PD-L1-отрицательных и PD-L1положительных опухолях, как описано в экспериментах по примеру 3. На основании окрашивания PD-L1 опухоли были классифицированы как PD-L1-отрицательные (окрашивания PD-L1 не наблюдалось в обоих дубликатных ядрах для каждой опухоли), либо PD-L1-положительные (положительное окрашивание

- 11 044486 наблюдалось в обоих дубликатных ядрах для каждой опухоли. А) Экспрессия PVRL2, проанализированная и продемонстрированная для каждого типа рака. В) Для PD-L1-отрицательных опухолей, продемонстрировано количество образцов, экспрессирующих PVRL2 (частично PVRL2-положительные или большее/общее количество образцов) для каждого типа рака.

На фиг. 23 продемонстрирована экспрессия PVRL2 и PD-L1 на инвазивной поверхности опухоли, как описано в экспериментах по примеру 3. А. В этом образце опухоли, PVRL2 экспрессировался как на иммунных клетках, так и на опухолевых клетках инвазивной поверхности опухоли, как показано синими и красными линиями. В) В этом образце опухоли, PD-L1 экспрессировался в иммунном компартменте.

На фиг. 24 продемонстрированы противоопухолевые ответы на воздействие моно-, двух- и трехкомпонентными комбинациями антител на модели опухоли СТ26, как описано в экспериментах по примеру 4. Группам из 10-15 мышей Balb/c подкожно вводили 5x105 клеток СТ26. Мыши получали назначенную комбинацию антител 2 раза в неделю в течение 3 недель, начиная со дня 7 после инокуляции. А) Объемы опухолей всех анализируемых групп измеряли 2 раза в неделю, включая группу положительного контроля (антитела анти-PDL-1 + анти-CTLA-4). Показатели TGI и р для группы трехкомпонентной комбинированной терапии по сравнению с указанными группами приведены в таблице. В) Относительный показатель выживания в определенных группах. С) Спайдер-диаграммы демонстрируют индивидуальный ответ в группах воздействия, тогда как PR указывает на частично ответивших на воздействие с размером опухоли, не превышающим 1000 мм³. Фиг. 25 изображает профили экспрессии для PVRIG и PVRL2, а также PD-L1 в различных опухолях человека, как описано в экспериментах по примерам 2 и 3.

На фиг. 26 продемонстрированы данные in vivo, касающиеся применения антитела анти-PVRIG у TIGIT-/- мышей или комбинации антител анти-PVRIG и анти-PD-1 у мышей Balb/c дикого типа для снижения темпов роста сингенной опухоли, как описано в экспериментах по примеру 4.

Фиг. 27 PVRIG в наивысшей степени экспрессируется в подмножествах цитотоксических лимфоцитов из образца рака человека. А) Продемонстрирована экспрессия PVRIG на подмножествах лейкоцитов из МКПК от 5-8 здоровых доноров. Экспрессия PVRIG определяется как отношение MFI PVRIG относительно MFI изотипического контроля. В) Продемонстрирована экспрессия PVRIG, TIGIT, CD96 и PD-1 на Treg периферической крови по сравнению с подмножествами CD8 Т-клеток из МКПК от 5 здоровых доноров. С) CMV рр65-специфичные Т-клетки от 3 здоровых доноров размножали in vitro с применением пептида рр65 (495-503), IL-2 и IL-7 в течение периода до 7 дней. Продемонстрирована экспрессия TIGIT (синий) и PVRIG (черный) на тетрамер-положительных клетках HLA-A2/pp65 (495-503). D) Продемонстрированы Т-клетки человека, культивированные с аллогенными DC, и экспрессия TIGIT и PVRIG на CD4+ Т-клетках в день 0, 1, 2 и 7 после активации. Е) Репрезентативные графики FACS, демонстрирующие экспрессию PVRIG (синий) по сравнению с изотипическим контролем (красный) на TIL (CD4 Тклетки, CD8 Т-клетки и NK-клетки) из репрезентативного рака легкого и почки. F) Продемонстрирована совместная экспрессия PVRIG, TIGIT и PD-1 на CD4 и CD8 TIL из образца рака легкого. G) Продемонстрирована экспрессия PVRIG на CD8+ и CD4+ TIL из рассеченных раковых опухолей человека различных типов. Каждая точка представляет отдельную опухоль от отдельного пациента. Н) Относительную экспрессию CD8 TIL оценивали по сравнению с Treg TIL для PVRIG, TIGIT и PD-1 из опухолей эндометрия, почек и легких. Для каждой опухоли кратность экспрессии на CD8 TIL нормализовали к кратности экспрессии на Treg TIL и наносили на график. Для А, В, С, G и Н, среднее значение ± СОС продемонстрировано с помощью планок погрешностей.

Фиг. 28А - Фиг. 28F. Экспрессия PVRL2 повышается в микроокружении опухоли. А) Экспрессию PVRL2 оценивали с помощью ИГХ на клетках опухолей легкого, яичника/эндометрия, молочной железы, толстой кишки и почек. Для каждой опухоли, 2 независимых наблюдателя оценивали 2 ядра. Репрезентативное окрашивание для каждого дескриптора продемонстрировано на фигуре В) Репрезентативная меланомная опухоль, демонстрирующая экспрессию PVRL2 на опухолевых клетках, а также в иммунных клетках в строме. С) Экспрессию PVRL2 из рассеченных опухолей исследовали с помощью FACS на подмножествах CD45^-, CD14+ и CD14’CD33^b“^c mDC клеток. Для каждого типа рака приведено среднее значение ± СОС. D) Продемонстрированы репрезентативные графики FACS для экспрессии PVRL2 (синий) по сравнению с IgG (красный) для рака легкого. Е) Для образцов опухолей, в которых мы смогли оценить экспрессию как PVRIG, так и PVRL2, экспрессия PVRIG на Т-клетках CD8 нанесена на график в сравнении с экспрессией PVRL2 на CD14+ ТАМ для каждой опухоли. Каждая точка представляет отдельный образец опухоли. Красная линия представляет 2-кратную экспрессию PVRIG или PVRL2 по сравнению с IgG.

Фиг. 29. Отчётливая регуляция PVRL2 и PD-L1 на опухолевых клетках. А) Экспрессию PD-L1 и PVRL2 оценивали с помощью ИГХ, на серийных срезах. Продемонстрирована экспрессия PVRL2 на PDL1-отрицательных (слева) и PD-L1-положительных (опухолях). Опухоли определяли как PD-L1отрицательные при отсутствии окрашивания на дубликатных ядрах для данной опухоли. PD-L1положительное окрашивание определяли как по меньшей мере частичное положительное окрашивание на обоих дубликатных ядрах для данной опухоли. Количество PVRL2-положительных опухолей из PDL1-положительных и PD-L1-отрицательных опухолей приведено в таблице (положительные/всего). В, С)

- 12 044486

Репрезентативная экспрессия PVRL2+PD-L1’ опухоли эндометрия (В) и PVRL2+PD-L1’ опухоли легкого (С). D) Незрелые BM-DC культивировали с указанными стимулами и оценивали экспрессию PVR, PVRL2, PD-L1 с помощью FACS на день 2 культивирования. Для каждого способа воздействия, экспрессию нормализовали к среде только контрольного воздействия. Е) Продемонстрирована экспрессия PVR, PVRL2 и PD-L1 на клетках НТ-29, обработанных только IFN-γ или средой. PD-L1 или PVRL2 показаны синим цветом, а окрашивание изотипического контроля IgG показано красным.

Фиг. 30. СНА.7.518.1.Н4 (S241P) представляет собой антитело с высокой аффинностью, которое усиливает активацию Т-клеток. А) Продемонстрировано связывание СНА.7.518.1.Н4 (S241P) или изотипического контроля IgG с родительскими клетками HEK293 PVRIG или HEK293 с помощью FACS. Значения KD FACS приведены для связывания СНА.7.518.1.Н4 (S241P) с клетками HEK293 hPVRIG, HEK293 cPVRIG и клетками Jurkat. В) СНА.7.518.1.Н4 (S241P) нарушает связывание PVRL2 Fc с клетками HEK293, эктопически экспрессирующими PVRIG. Приведено Среднее значение ± Ст Откл для значений трех повторов. С) СНА.7.518.1.Н4 (S241P) блокирует связывание PVRIG Fc с клетками HEK293, которые эндогенно экспрессируют PVRL2. D) CD4 Т-клетки человека совместно культивировали с клетками аАРС СНО, экспрессирующими связанное с клеточной поверхностью антитело анти-CD3 и hPVRL2, в присутствии 10 мкг/мл антитела анти-PVRIG и антител изотипического контроля IgG человека.

Продемонстрировано влияние анти-PVRIG Ab на пролиферацию CD4 Т-клеток, выделенных от 11 различных доноров. Планки погрешностей демонстрируют среднее значение ± СОС. Е) gp100специфические линии Т-клеток (TIL-209, TIL-463) совместно культивировали с клетками СНО, сконструированными для экспрессии HLA-A2 и PVRL2, вместе с 10 мкг/мл анти-PVRIG или антителом изотипического контроля IgG. Продукцию IFN-γ и TNF-α анализировали в момент времени 24 ч от начала совместного культивирования. Приведено Среднее значение + Ст Откл для значений трех повторов. Процентное изменение IFN-γ и TNF-α для каждого способа воздействия относительно изотипического контроля обозначено числом над каждой планкой. F) Продемонстрирована экспрессия PVR, PVRL2 и PD-L1 (красный) относительно IgG (синий) на клетках MEL624, Colo205 и Panc.05.04. Для Т-клеток продемонстрирована экспрессия PVRIG, TIGIT и PD-1 (красный) относительно IgG (синий) на TIL-209 и TIL-463 gp100-специфичных Т-клетках и на CMVpp65-специфических Т-клетках. Для размножения CMVpp65реактивных Т-клеток, МКПК культивировали с пептидом рр65 (495-503), IL-2 и IL-7 в течение 10 дней. Экспрессия PVRIG, TIGIT, PD-1 продемонстрирована на HLA-А2/рр65-тетрамер-положительных клетках. G) gp100-специфичные Т-клетки (TIL-209, TIL-463), размноженные из TIL, полученных из меланомных опухолей, культивировали совместно с клетками MEL624 в присутствии 10 мкг/мл указанных антител. Концентрацию IFN-γ в кондиционированных средах определяли через 24 ч. Н, I) Размноженные CMVpp65-специфичные Т-клетки совместно культивировали с клетками Colo205 и Panc.05.04, пептидом CMVpp65 и указанными антителами в концентрации 10 мкг/мл. Концентрацию IFN-γ в кондиционированных средах определяли через 24 ч. Для Е, G, Н, I приведено Среднее значение ± Ст Откл для трех повторов. Процентное изменение IFN-γ для каждого способа воздействия относительно изотипического контроля обозначено числом над каждой планкой.

Фиг. 31. Повышенная функция Т-клеток у мышей с дефицитом PVRIG. А) Оценка РНК экспрессии PVRIG, измеренной с помощью колРВ-ПЦР из очищенных подмножеств иммунных клеток мыши. Относительную экспрессию по отношению к конститутивному гену определяли с помощью метода ACt. В) pmel CD8⁺ TCR трансгенные Т-клетки активировались уровнями РНК-транскриптов gp100 (25-33), PVRIG и TIGIT оцененными с помощью колРВ-ПЦР в указанные моменты времени. График демонстрирует среднее значение ± СОС значение результатов 5 различных экспериментов. С) Селезенки собирали от однопометных мышей PVRIG’/’ и WT и анализировали с помощью проточной цитометрии на экспрессию PVRIG на NK, CD4+ и CD8+ Т-клетках (покоящиеся клетки). Кроме того, CD3+ Т-клетки выделяли из спленоцитов и активировали в течение 11 дней с применением гранул анти-CD3/анти-CD28. После активации, с помощью проточной цитометрии анализировали экспрессию PVRIG на CD4+ и CD8+ Тклетках (активированные клетки). Каждая точка представляет клетки, полученные от отдельной мыши. D) Спленоциты мышей WT и PVRIG’/’ помечали красителем для определения пролиферации клеток eFluor450 (Cell Proliferation Dye eFluor450) и культивировали в присутствии контрольного Fc (мышиный IgG2a) или мышиного PVRL2 Fc. Через 4 дня культивирования, деление клеток анализировали с помощью проточной цитометрии. Представлены репрезентативные графики FACS из эксперимента (слева) и сводные данные процентного ингибирования с применением PVRL2 Fc (определяемый как % пролиферации контрольного Fc, вычтенный из % пролиферации PVRL2 Fc) в 3 независимых экспериментах (справа). * указывает на значение р < 0,05, парный t-критерий Стьюдента для анализа изменения пролиферации в присутствии PVRL2-FC относительно пролиферации в присутствии белкового контроля у WT Т-клетках по сравнению с PVRIG’/’ Т-клетками. Е) pmel CD8⁺ Т-клетки, полученные от мышей pmel PVRIG’/’ или pmel PVRIG WT активировали в течение 11 дней их родственным пептидом и IL2. Затем активированные pmel CD8⁺ клетки совместно культивировали с клетками B16-Db/gp100 в течение 18 ч и после совместного культивирования оценивали экспрессию CD107 и продукцию цитокинов. Представ

- 13 044486 лены четыре независимых эксперимента, как обозначено каждой парной точкой. * указывает на значение р < 0,05, критерий Стьюдента, сравнивающий PVRIG^-/^- с WT.

Фиг. 32. Дефицит PVRIG приводит к снижению темпов роста опухоли и усилению механизма CD8 эффекторных Т-клеток. (А) Мышам C57BL/6 WT или PVRIG^-/^- подкожно вводили 5x105 клеток МС38. Объемы опухолей измеряли 2 раза в неделю. * указывает на значение р <0,05 для мышей WT по сравнению с мышами PVRIG^-/^- (ANOVA). (В) Продемонстрированы кривые роста отдельных опухолей. Продемонстрирован один репрезентативный эксперимент из 2 выполненных. (С) Мышам C57BL/6 WT или PVRIG^-/^- подкожно вводили 5x105 клеток МС38. В день 14 после инокуляции мышам вводили анти-PDL1, два раза в неделю в течение 2 недель. Объемы опухолей измеряли в 2 раза в неделю. Значение р = 0,052 для мышей WT по сравнению с мышами PVRIG^-/^-, которым вводили анти-PD-L1. (D) Продемонстрированы кривые роста отдельных опухолей. Продемонстрирован один репрезентативный эксперимент из 2 выполненных. (Е) Продемонстрировано количество CD8⁺ IFN-y⁺ TNF-a⁺ эффекторных клеток в дренирующих опухоль лимфатических узлах у мышей из 4 групп воздействия в день 18. (F) Продемонстрировано общее количество CD8+ IFN-γ + TNF-a+ эффекторных клеток на мг опухолевой ткани в день 18. (G-H) Суммарный балл TIL и балл цитотоксических Т-клеток относительно TIL, полученный в результате расширенного анализа nSolver 3.0 панели иммунного кодового набора множества раков мыши (mouse pan-cancer immune codeset panel) (Nanostring Technologies, Сиэтл, штат Вашингтон), проведенного на CD45⁺-обогащенных клетках из МС38 18-го дня TIL, выделенных от мышей 2 групп воздействия, мышей дикого типа и мышей с дефицитом PVRIG.

Фиг. 33. Антагонистические антитела анти-PVRIG синергически ингибируют опухоль, выращенную в комбинации с ингибиторами PD-1 или генетическим дефицитом TIGIT. А) Продемонстрировано связывание слитого белка mPVRL2 Fc с сконструированными клетками mPVRIG HEK293, которые были предварительно инкубированы с серийными разведениями анти-mPVRIG mAb или изотипического контроля IgG Ab. В) Мышам BALB/c подкожно вводили 5x105 клеток СТ26. В день 14 после инокуляции мышей умерщвляли и собирали селезенку, а также дренирующие лимфатические узлы и опухоли. Клетки анализировали с помощью проточной цитометрии на экспрессию PVRIG на CD3⁺ CD4+ Т-клетках, CD3+ CD8+ Т-клетках, CD3^-CD49b⁺ NK-клетках, CD11b⁺ Gr-1⁺ миелоид-производных-супрессорных клетках (MDSC) и CD11b⁺F4/80⁺ макрофагах. С, D) Мышам BALB/c подкожно вводили 5x105 клеток СТ26. В день 7 после инокуляции мышам вводили анти-PD-L1 и/или анти-PVRIG Ab, 2 раза в неделю в течение 3 недель (стрелки указывают на введение Ab). С) Продемонстрированы объемы опухолей. *** указывает на значение р < 0,001 (ANOVA) для группы, получавшей анти-PD-L1 + Rat IgG2b, по сравнению с группой, получавшей анти-PD-Ll + aPVRIG. Стрелки указывают период, когда вводили антитела. D. Анализ выживаемости мышей с полным ответом. * указывает на значение р < 0,05 (логарифмический ранговый критерий) для группы, получавшей анти-PD-L1 + Rat IgG2b, по сравнению с группой, получавшей антиPD-L1 + анти-PVRIG. Продемонстрировано одно репрезентативное исследование из 3 исследований. Е. Мышам C57BL/6 или TIGIT’^/’подкожно вводили 1x105 клеток B16/Db-hmgp100. Мыши получали 2 раза в неделю в течение 3 недель назначенное mAb, начиная со дня инокуляции (день 0). Е. Объемы опухолей измеряли 2 раза в неделю; приведено среднее значение ± СОС. Ингибирование роста опухоли, измеренное в указанные дни, сравнивали с контрольным WT + изотипическим контролем mIgG1. *** указывает на значение р < 0,001 для TIGIT^-/- + aPVRIG по сравнению с WT + изотипическим контролем mIgG1. Стрелки указывают период, когда вводили антитела. F. Продемонстрированы кривые роста отдельных опухолей для каждой мыши. Продемонстрирован один репрезентативный эксперимент из 2 выполненных.

Фиг. 34. PVRIG экспрессируется на Т- и NK-клетках TIL при раке человека. А) Продемонстрирована экспрессия PVRIG, TIGIT, CD96 и PD-1 на подмножествах CD4 Т-клеток из МКПК здоровых доноров. Приведено среднее значение ± СОС. В) Т-клетки человека совместно культивировали с аллогенными МКПК; продемонстрирована экспрессия белка PVRIG на CD4 и CD8 Т-клетках (вверху). С) Опухоли рассекали, и отдельные клетки активировали с применением анти-CD3 и анти-CD28. Экспрессию PVRIG (синий) относительно изотипического контроля IgG (красный) оценивали в день О (непосредственно ex vivo) и в день 5 после активации. D) Продемонстрирована экспрессия PVRIG на NK-клетках из рассеченных опухолей человека. Каждая точка представляет отдельную опухоль от отдельного пациента. Приведено среднее значение ± 95% доверительный интервал. D) Клетки из рассеченной опухоли активировали гранулами анти-CD3 и анти-CD28 в течение 5 дней. Экспрессия PVRIG (синий) относительно контрольного IgG (красный) на CD4 и CD8 Т-клетках в день 0 непосредственно ex vivo и в день 5 после активации продемонстрирована для 2 образцов рассеченной опухоли. Е) Экспрессию PVRIG оценивали на CD4 и CD8 Т-клетках из рассеченных опухолей и из рассеченной нормальной соседней ткани от соответствующего донора. Каждая линия представляет собой соответствующие ткани, полученные от отдельного пациента. Применяли парный t-критерий Стьюдента F) Продемонстрирован корреляционный анализ величины кратности экспрессии PVRIG, TIGIT и PD-1 относительно изотипического контроля IgG на CD4 и CD8 Т-клетках из опухолей. Каждая точка представляет отдельный образец опухоли. Приведен коэффициент корреляции Спирмена и значение р.

- 14 044486

Фиг. 35. Экспрессия PVRL2 усиливается при раке толстой кишки, кожи и молочной железы. А) Микрофотографии, иллюстрирующие связывание антитела против PVRL2 человека Sigma с FFPE срезами положительных клеток, CHO-S человека PVRL2 (справа) по сравнению с отрицательными клетками, CHO-S (слева), после извлечения антигена при рН 9. В) Антитело анти-PVRL2 анализировали на панели клеточных линий PVRL2+ (НТ29, MCF7, PC3, PANC1, RT4, NCI-H1573) и PVRL2 (Jurkat, 0PM2, Daudi, СА46). C-F) Типовая экспрессии PVRL2 в нормальной и раковой тканях легкого. С) Нормальная ткань, не демонстрирующая окрашивания. D) Аденокарцинома легкого с частичным положительным окрашиванием. Е) Аденокарцинома легкого, демонстрирующая положительное окрашивание. F) Аденокарцинома легкого с сильным положительным окрашиванием.

Фиг. 36. Повышение уровня экспрессии PVRL2 на ТАМ и CD45^- клетках опухоли по сравнению с нормальной соседней тканью. Продемонстрирована экспрессия PVRL2 на CD45^- клетках и ТАМ из донорной соответствующей опухоли и нормальной соседней ткани. Приведено значение р парного tкритерий Стьюдента.

Фиг. 37. PVRIG и PVRL2 совместно экспрессируются в одном и том же образце опухоли. Экспрессию PVRIG на CD4 Т-клетках (А) и NK-клетках (В) наносили на график по отношению к экспрессии PVRL2 на ТАМ для отдельной опухоли.

Фиг. 38. Активность СНА.7.518.1.Н4 (S241P) на Т-клетках человека. А) Экспрессия PVRIG на CD4 Т-клетках, активированных клетками СНО, экспрессирующими анти-CD3 и PVRL2, связанные с клеточной поверхностью. В) Продемонстрирована экспрессия HLA-A2, В-2m и PVRL2 на родительских и сконструированных клеточных линиях СНО-S. Кратность экспрессии относительно изотипа указана с помощью числа. С) СНО-клетки, эктопически экспрессирующие, связанные с клеточной поверхностью антиCD3 и PVRL2, совместно культивировали с очищенными CD8 Т-клетками в присутствии различных концентраций анти-PVRIG Ab или соответствующего контроля IgG. Приведен % пролиферации. Каждая точка представляет среднее из значений трех повторов. D) Клетки СНО с эктопической экспрессией HLA-A2/B2m и PVRL2 совместно культивировали с 2 gp100-специфическими линиями Т-клеток (TIL F4, TIL 209) в присутствии 1 мкг/мл gp100 и различных концентраций антитела анти-PVRIG или соответствующего контроля IgG. Концентрации TNF-α в день 3 совместного культивирования снижаются. Каждое значение представляет собой среднее из значений трех повторов.

Фиг. 39. Характеристика связывающих взаимодействий mPVRIG и суррогатного антитела антиmPVRIG. А, В) Связывание mPVRIG с mPVRL2 оценивали с помощью поверхностного плазмонного резонанса. С) Растворимый рецептор Fc или контрольные белки инкубировали в зависимости от дозы с иммобилизованным mPVRL2 HIS в формате ИФА. Продемонстрирован связанный рецептор Fc. D) Растворимый белок HRL PVRL2 инкубировали в зависимости от дозы на планшетах, покрытых PVRIG Fc или DNAM Fc. E) Продемонстрировано связывание mPVRIG Fc или контрольного Fc слитого белка с клеточной линией B16-F10, трансфицированной mPVRL2 siRNA, mPVRsRNA или скремблированной siRNA трансфекцией. F) Характеристика аффинности крысиного mAb против мышиного PVRIG проводили, исследуя связывание анти-mPVRIG с клетками HEK293, сверхэкспрессирующими mPVRIG. G) Характеристика аффинности крысиного mAb против мышиного PVRIG проводили, исследуя связывание анти-mPVRIG с линией клеток D10.G4.1, эндогенно экспрессирующей mPVRIG по сравнению с изотипическим контролем IgG крысы. Н) Связывание анти-mPVRIG с клетками D10.G4.1, трансфицированными PVRIG-siRNA мыши (зеленая гистограмма), по сравнению с scr siPHK (оранжевая гистограмма). I) Связывание mPVRIG Fc, предварительно инкубированного с анти-mPVRIG Ab, с клетками B16-F10, которые эндогенно экспрессируют PVRL2.

Фиг. 40. Генерация трансгенных мышей с нокаутом PVRIG и TIGIT. Линии мышей с условным нокаутом PVRIG и нокаутом Tigit генерировались Ozgene Pty Ltd (Bentley WA, Австралия). А) Целенаправленно воздействующую конструкцию, в которой PVRIG экзоны 1-4 были фланкированными loxPсайтами, электропорировали в клеточную линию ES C57BL/6, Bruce4 (Koentgen et al., Int Immunol 5: 957964, 1993). В) Целенаправленно воздействующую конструкцию, в которой кодирующая область экзона 1 Tigit (включая ATG) и экзонов 2 и 3 были заменены FR-фланкированной нео-кассетой, электропорировали в клеточную линию ES C57BL/6, Bruce4. Гомологичные рекомбинантные клоны ES-клеток идентифицировали посредством Саузерн-гибридизации и вводили в бластоцисты goGermline (Koentgen et al., Genesis 54: 326-333, 2016). Получали химерных самцов мышей и скрещивали с самками C57BL/6J, чтобы установить гетерозиготное потомство зародышевой линии на основе C57BL/6. Мышей зародышевой линии скрещивали с убиквитарной линией мышей FLP C57BL/6, чтобы удалить FRT-фланкированную селективную маркерную кассету и создать условные или нокаутные аллели (для PVRIG и Tigit соответственно). Для нокаута PVRIG, мышей дополнительно скрещивали с убиквитарной линией мышей Cre C57BL/6, чтобы удалить loxP-фланксированные экзоны и генерировать нокаутный аллель.

Фиг. 41. Мыши с нокаутом PVRIG являются иммуно-фенотипически сходными с мышами дикого типа. Мышей (n=5 на когорту дикого типа и когорту с нокаутом PVRIG) подвергали эвтаназии до забора венозной крови в пробирки с антикоагулянтным покрытием и забора органов. Из свежеотобранного костного мозга, тимуса, селезенки, кожных и брыжеечных лимфатических узлов извлекали отдельные клетки. Клетки окрашивали конъюгированными с флуорохромом поверхностными маркерными антите

- 15 044486 лами и анализировали на проточном цитометре BD LSR Fortessa. Панели иллюстрируют сопоставимые количества миелоидных клеток (А), дендритных клеток (В), В-клеток (С), Т-клеток (D), CD4 Т-клеток (Е), CD8 Т-клеток (F) и NK-клеток (G) по типам лимфоидной ткани. (H-I) Цельную венозную кровь анализировали в ветеринарной гематологической системе Hemavet 950 для сравнения дифференциальных показателей и количества подмножеств клеток крови у мышей дикого типа и мышей с дефицитом PVRIG.

Фиг. 42. Повышенная эффекторная функция Т-клеток у мышей PVRIG’/’ получавших αнтu-PDL1, по сравнению с мышами WT, получавшими анти-PD-Ll.

Опухоли МС38 инокулировали мышам WT или мышам PVRIG’/’, а затем вводили анти-PD-Ll или крысиный изотипический контроль IgG2b. В день 18, CD45+ лимфоциты, инфильтрирующие опухоль, очищали от опухолей, экстрагировали РНК и проводили профилирование транскриптов. Продемонстрированы несколько генов, связанных с Т-клетками, при этом каждая точка представляет отдельную мышь. Приведены значения р t-критерия Стьюдента.

Фиг. 43. Антитела анти-TIGIT и анти-PVRIG индуцируют уничтожение опухолевых клеток. Анализ совместного культивирования in vitro с размноженными CMV-специфичными CD8+ Т-клетками человека использовали для оценки влияния эталонных антител анти-TIGIT и СНА.7.518.1.Н4 (S241P) на уничтожение антиген-специфических опухолевых клеток. Применяемые в анализе линии клеток-мишеней HLA-A2+ представляли собой Ме1624 (А) и Panc.05.04 (В). Synagis hIgG4 представляет собой антителом изотипического контроля. Активность люциферазы в клетках-мишенях измеряли с применением субстрата люциферазы Bio-Glo. Репрезентативные данные (n > 2) демонстрируют процент специфического уничтожения (среднее значение +/-стандартное отклонение) клеток Ме1624 или Panc.05.04 после 16часового совместного культивирования с CMV-специфическими CD8+ Т-клетками человека от трех разных доноров.

Фиг. 44. Зависимое от дозы уничтожение опухолевых клеток антителами анти-TIGIT с СНА.7.518.1.Н4 (S241P). Анализ совместного культивирования in vitro с размноженными CMVспецифичными CD8+ Т-клетками человека использовали для оценки влияния двух разных антител антиTIGIT, ВМ26 и СРА.9.086, в комбинации с СНА.7.518.1.Н4 (S241P), на антигенспецифическое уничтожение клеток Mel624. Активность люциферазы в клетках-мишенях измеряли с применением субстрата люциферазы Bio-Glo. Репрезентативные данные (n>2) демонстрируют процент специфического уничтожения (среднее значение +/- стандартное отклонение) клеток Mel624 после 16-часового совместного культивирования с CMV-специфическими CD8+ Т-клетками человека от одного донора.

Фиг. 45. Последовательности CDR СРА.9.086, нумерация IMGT и Кабата.

Фиг. 46. Комбинация анти-TIGIT hIgG4 + CHA.7.518.1.H4 (S241P) индуцирует уничтожение опухолевых клеток. Совместное культивирование ЦМВ-реактивных CD8+ Т-клеток с Ме1624 PVR, PVRL2 и люциферазой ОЕ. Разовая доза 10 мкг/мл анти-TIGIT Ab и 10 мкг/мл СНА.7.518.1.Н4 (S241P) с CMVреактивным донором 4 при титровании дозы, начиная с 0,5 мкг/мл aTIGIT Ab и 10 мкг/мл СНА.7.518.1.Н4 (S241P) с ЦМВ-реактивным донором 156.

Фиг. 47. Антитела анти-TIGIT усиливают IFN-γ в комбинации с антителом анти-PD-1. Анализ совместного культивирования in vitro с размноженными CMV-специфичными CD8+ Т-клетками человека использовали для оценки влияния СРА.9.086 по сравнению с эталонными антителами ВМ26 и ВМ29 на секрецию антигенспецифических цитокинов в комбинации с антителом анти-PD-1, пембролизумабом. Линия клеток-мишеней, применяемая в анализе, представляла собой клетки аденокарциномы поджелудочной железы HLA-A2+, Panc.05.04, которые эндогенно экспрессируют PVR и PD-L1 человека. В клетки Panc.05.04 вводили пептид CMV рр65 в концентрации 0,01 мкг/мл при 37°C в течение 1 ч. Затем клетки промывали и высевали в концентрации 50000 клеток/лунку в 96-луночные круглодонные планшеты, обработанные тканевой культурой. Антитела анти-TIGIT человека или антитело изотипического контроля hIgG4 (анти-Synagis) добавляли в концентрации 0,1 мкг/мл в комбинации с антителом анти-PD-1 (заштрихованные столбцы) или антителом изотипического контроля hIgG4 в концентрации 10 мкг/мл (сплошные столбцы). CMV-специфичные CD8+ Т-клетки человека от одного донора размножали в соответствии с протоколом выше. В каждую лунку добавляли 50000 CD8+ Т-клеток человека. Совместные культуры инкубировали при 37 °C с 5% CO2 в течение 24 ч. Количество IFN-γ человека в супернатанте совместного культивирования измеряли с помощью проточной цитометрии с применением цитометрического анализа гранул (BD Biosciences).

На фиг. 48 изображено профилирование экспрессии оси PVRIG/TIGIT в опухолях; рак легкого и эндометрия характеризуются высокими показателями как для пути PVRIG-PVRL2, так и для пути TIGITPVR. (А, В) Экспрессию PVRIG и TIGIT анализировали на CD4+ и CD8+ Т-клетках из рассеченных опухолей человека с помощью FACS. Кратность экспрессии рассчитывали путем деления значения MFI для PVRIG или для TIGIT на значение MFI для контрольного IgG. Серая линия = экспрессия не обнаружена. Каждая оранжевая точка представляет собой отдельный образец опухоли, а медиана образцов показана синим столбцом. С, D) Экспрессия PVRIG на CD8+ Т-клетках по сравнению с экспрессией PVRL2 на CD45’ клетках, или экспрессия TIGIT на CD8+ Т-клетках по сравнению с экспрессией PVR на CD45’

- 16 044486 клетках из рассеченных опухолей нанесена на графики. Каждая точка представляет отдельный образец опухоли.

На фиг. 49 изображены данные экспрессии для PD-1, PVRIG и TIGIT на CD8 Т-клетках, которые демонстрируют, что PVRIG+TIGIT+PD-1+CD8+TIL широко распространены и имеют истощённый профиль. A) TIL из тканей рака человека окрашивали на предмет экспрессии PD1, PVRIG и TIGIT на CD8 Тклетках. Процент клеток, которые экспрессируют комбинации PD-1, PVRIG или TIGIT на CD8+ Тклетках, определяли с помощью булевого гейтирования. В) Продемонстрирована репрезентативная экспрессия PD-1, PVRIG и TIGIT на CD4+ и CD8+ Т-клетках из опухоли легкого. С) TIL из раковых опухолей человека окрашивали для выявления на клеточной поверхности PD1, PVRIG и TIGIT на CD8+ Тклетках, пермеабилизировали, и окрашивали для выявления Eomes и T-bet. В каждом подмножестве клеток приведен процент Eomes+ T-bet- клеток. Применяли парный t-критерий Стьюдента; приведены значения p. D) Продемонстрированы репрезентативные графики FACS, иллюстрирующие экспрессию Eomes и T-bet на CD8+ Т-клетках, экспрессирующих PD-1, PVRIG или TIGIT, из опухоли яичника и мочевого пузыря. Е) Определен процент клеток, экспрессирующих Eomes+ T-bet-, на основе экспрессии PD-1, PVRIG и TIGIT. Таким образом, экспрессия PVRIG коррелирует с экспрессией транскрипционного фактора Eomes+ T-bet-, фенотипа, о котором известно, что он ассоциирован с истощением Т-клеток. Трижды положительные PVRIG+ TIGIT+ PD-1+ клетки также имели высокий процент Eomes+ T-betклеток.

На фиг. 50 продемонстрировано, что PVRL2 индуцируется при раке и экспрессируется в PD-L1 опухолях. А) Экспрессию PVRL2 оценивали с помощью ИГХ на опухолях легкого, яичника/эндометрия, молочной железы, толстой кишки, почек и кожи. Планки погрешностей демонстрируют среднее значение ± СОС. Для каждой опухоли, патоморфологом оценивались 2 ядра и подсчитывался балл на основании распространенности и интенсивности мембранного окрашивания на опухолевых клетках. Для каждой опухоли приведен средний балл из 2 ядер. В) Экспрессию PD-L1 и PVRL2 оценивали с помощью ИГХ на серийных срезах. Опухоли группировали по типу ткани; продемонстрирована экспрессия PVRL2 на PD-L1-отрицательных и PD-L1-положительных опухолях. Опухоли определяли как PD-L1отрицательные при отсутствии мембранного окрашивания на опухолевых или иммунных клетках из любого дубликатного ядра для данной опухоли. PD-L1-положительное окрашивание определяли как мембранное окрашивание по меньшей мере на 1 ядре опухоли. Планки погрешностей демонстрируют среднее значение ± СОС для каждой группы. С) Репрезентативная экспрессия PVRL2 + PD-L1- карциномы эндометрия и PVRL2 + PD-L1- опухоли легкого.

На фиг. 51. продемонстрировано, что анти-PVRIG/TIGIT/PD-1 синергетически повышает функцию Т-клеток. (A) CMVpp65 CD8 Т-клетки окрашивали для выявления экспрессии TIGIT/PD-1/PVRIG, а линии опухолевых клеток окрашивали для выявления PD-L1, HLA-A2, PVR и PVRL2. Представлены репрезентативные гистограммы FACs. В) CMVpp65-специфичные Т-клетки совместно культивировали с клетками Panc0504 и Colo205, пептидом CMVpp65 и указанными антителами в концентрации 10 мкг/мл. Концентрации IFN-γ в кондиционированных средах определяли в момент времени 18 ч. Процент над столбцом представляет собой % увеличение секреции IFN-γ по сравнению с изотипом IgG.

На фиг. 52 продемонстрировано, что блокада взаимодействия PVRIG-PVRL2 индуцирует экспрессию PD-1 и TIGIT. CMVpp65-специфичные Т-клетки от 1-2 доноров совместно культивировали с Panc0504, пептидом CMVpp65 и указанными антителами в концентрации 10 мкг/мл в течение 18 ч. Затем клетки окрашивали на FAC; продемонстрирован процент клеток PD-1, TIGIT и LAG3 для каждого способа воздействия. Представлены гистограммы для каждого рецептора. Красный = Изотип, Синий = Целевая экспрессия. А) Экспрессия TIGIT индуцировалась под воздействием СНА7.518.1.Н4 (S241P) или анти-PD1. (В) Экспрессия PD-1 индуцировалась под воздействием СНА7.518.1.Н4 (S241P) и/или СРА.9.083.Н4 (S241P). (С) Экспрессия LAG-3 не индуцировалась под воздействием СНА7.518.1.Н4 (S241P), анти-TIGIT или анти-PD-1.

Фиг. 53. Опухоли, полученные в течение 24 ч после хирургической резекции, рассекали и очищали CD3+ TIL совместно культивировали с клетками MEL624, экспрессирующими поверхностно связанные анти-CD3, и с указанными антителами в концентрации 10 мкг/мл. Концентрацию IFN-γ в кондиционированных средах определяли в момент времени 72 часа. Продемонстрировано % изменение IFN-γ для каждого способа воздействия относительно hIgG4.

Фиг. 54. Блокада или дефицит антитела к PVRIG обуславливает снижение темпов роста опухоли. Блокада или дефицит антител PVRIG ингибируют рост опухоли. А) Мышам BALB/c подкожно вводили 5x105 клеток СТ26. В день 7 после инокуляции мышам вводили анти-PD-L1 и/или анти-PVRIG два раза в неделю в течение 3 недель. Продемонстрированы объемы опухолей. n=10 мышей на группу. Приведено среднее значение +/- СОС. *** указывает на значение р < 0,001 (ANOVA с повторными измерениями) для анти-PD-L1 ⁺ Rat IgG2b по сравнению с группами, получавшими анти-PD-L1⁺ анти-PVRIG. В) Мышам C57BL/6 WT или PVRIG^-/^- подкожно вводили 5x105 клеток МС38. n=10 мышей на группу. Приведено среднее значение +/- СОС. * указывает на значение р < 0,05 для мышей WT по сравнению с мышами PVRIG -/- (ANOVA с повторными измерениями). Также продемонстрированы кривые роста отдельных

- 17 044486 опухолей. Репрезентативные данные из n=2 экспериментов.

Фиг. 55. Экспрессионное профилирование оси PVRIG/TIGIT в опухолях человека. Рак легкого и эндометрия характеризуются высокими показателями как для пути PVRIG-PVRL2, так и для пути TIGITPVR. (А, В) Экспрессию PVRIG и TIGIT анализировали на CD4+ и CD8+ Т-клетках из рассеченных опухолей человека с помощью FACS. Кратность экспрессии рассчитывали путем деления значения MFI для PVRIG или для TIGIT на значение MFI для контрольного IgG. Серая линия = экспрессия не обнаружена. Каждая оранжевая точка представляет собой отдельный образец опухоли, а медиана образцов показана синим столбцом. С, D) Экспрессия PVRIG на CD8+ Т-клетках по сравнению с экспрессией PVRL2 на CD45^-клетках, или экспрессия TIGIT на CD8+ Т-клетках по сравнению с экспрессией PVR на CD45^- клетках из рассеченных опухолей человека нанесена на графики. Каждая точка представляет отдельный образец опухоли.

Фиг. 56. Клетки PVRIG+ TIGIT+ PD1+ характеризуются наибольшим % и наивысшим уровнем истощенности из CD8+ TIL. PVRIG+ TIGIT+ PD1+ CD8+ TIL являются широко распространенными и имеют истощенный фенотип. А) CD8⁺ TIL из тканей рака человека окрашивали на предмет экспрессии PD-1, PVRIG и TIGIT. Процент CD8⁺ TIL, которые экспрессируют комбинации PD-1, PVRIG или TIGIT на CD8+ Т-клетках, определяли с помощью булевого гейтирования. Каждая точка представляет отдельный образец опухоли. В) CD8⁺ TIL из раковых опухолей человека окрашивали для выявления на клеточной поверхности PD1, PVRIG и TIGIT, пермеабилизировали, и окрашивали для выявления внутриклеточных Eomes и T-bet. Приведен процент Eomes+ T-bet- CD8⁺ Т-клеток. Применяли парный t-критерий Стьюдента; приведены значения р. С) Процент Eomes⁺ T-bet-CD8⁺ Т-клеток, экспрессирующих PD-1, PVRIG и TIGIT, определяли при множестве раковых опухолях человека.

Фиг. 57. Относительная экспрессия разностей PVRL2 по сравнению с PVR в зависимости от типа рака. Относительная РНК- и экспрессия белка PVRL2 и PVR в разных опухолях человека. РНКэкспрессия PVRL2 и PVR из TCGA наносили на график как отношение PVRL2 к PVR при множестве раковых опухолях человека (левая панель). Опухоли с более высокой РНК-экспрессией PVRL2 по сравнению с PVR включают опухоли молочной железы, яичника, предстательной железы, эндометрия, мочевого пузыря, поджелудочной железы и легкого. Отношение экспрессии белка (gMFI) PVRL2 относительно PVR на CD45-опухолевых клетках из рассеченных опухолей человека представлено на графике (правая панель). Каждая точка представляет отдельный образец опухоли. Опухоли с более высокой экспрессией белка PVRL2 по сравнению с PVR включают опухоли яичника, молочной железы, эндометрия, легкого, предстательной железы, полости рта и желудка. Более высокая экспрессия РНК коррелирует с более высокими уровнями белка для PVRL2 в нескольких опухолях, включая рак молочной железы, яичника, эндометрия, предстательной железы и легких.

Фиг. 58. PVRL2+ PVR- опухолевые клетки и АРС присутствуют в опухолях человека. PVRL2+ PVR- опухолевые клетки и АРС присутствуют в опухолях человека. На график нанесена экспрессия PVRL2 и PVR из рассченных опухолей, определенных с помощью FACS на А) CD45-опухолевых клетках, и В) cDC2 (CD1c⁺CD14-HLA-DR^высLinCD141) и CD14+ ТАМ. PVRL2+ PVR- опухолевые клетки и АРС представлены на графике в виде красных точек в участках с положительным процентом. Продемонстрированы репрезентативные графики FACS для экспрессии PVRL2 и PVR (синий) по сравнению с изотипическим контролем IgG (красный) для опухолей яичника и эндометрия.

Фиг. 59 Комбинация СНА7.518.1.Н4 (S241P) + СРА.9.083.Н4 (S241P) характеризуется активностью > по сравнению с пембролизумабом на первичных CD3+ TIL. CHA7.518.1.H4 (S241P) и/или СРА.9.083.Н4 (S241P) обладают аналогичной или большей активностью, чем пембролизумаб, на свежевыделенных TIL человека. Опухоли человека, полученные в течение 24 ч после хирургической резекции, рассекали, и очищали CD3+ TIL. Выделенные CD3+ TIL культивировали совместно с модифицированной линией опухолевых клеток Mel-624, экспрессирующей поверхностно связанный анти-CD3, и с указанными антителами в концентрации 10 мкг/мл. Секрецию IFN-γ в кондиционированной среде измеряли в момент времени 72 ч. Продемонстрировано процентное изменение IFN-γ для каждого способа воздействия по сравнению с изотипическим контролем hIgG.

Фиг. 60. Блокада PVRIG/PVRL2 индуцирует индуцирует экспрессию PD-1 и TIGIT. Блокада PVRIG/PVRL2 индуцирует экспрессию PD-1 и TIGIT. CMVpp65^- специфические CD8⁺ Т-клетки от 2 доноров совместно культивировали с Panc.05.04, CMVpp65 пептидом, и указанными антителами в концентрации 10 мкг/мл в течение 18 ч. Клетки окрашивали; приведено процентное содержание A) TIGIT+, В) PD^- 1⁺ и С) LAG3⁺ CD8+ Т-клеток после каждого способа воздействия.

Фиг. 61А-61С. Трехкомпонентная комбинация демонстрирует улучшенную противоопухолевую эффективность. А) Кинетика роста опухолей СТ26 в модели минимального заболевания. Группам из 10 самок Balb/c инокулировали клетки СТ26 в правый фланк. В/бр введение антител начинали, когда опухоли достигали желаемого среднего объема (30-60 мм³). Мышам вводили анти-TIGIT mIgG1 или антиPVRIG mIgG1 в дозе 10 мг/кг, анти-PD-L1 mIgG1 в дозе 3 мг/кг и изотипический контроль в дозе 10 мг/кг в виде двухкомпонентной или трехкомпонентной комбинации, 3 раза в две недели, всего в течение двух недель 6 доз. TGI с анти-TIGIT mIgG1 в комбинации рассчитывали по % TGI = [1- (средний объем

- 18 044486 опухоли испытуемого изделия, деленный на средний объем опухоли контрольного изделия)* 100]. Звездочкой (***, ****) обозначено р < 0,001 или р < 0,0001, соответственно, для различий между двухкомпонентной или трехкомпонентной комбинацией и изотипическим контролем, по сравнению с двухкомпонентной или трехкомпонентной комбинацией, с применением двухфакторного анализа ANOVA. В) Спайдер-диаграммы объемов отдельных опухолей каждой мыши в трех группах воздействия измеряли до тех пор, пока не были достигнуты объемы опухолей > 1500 мм³ или 45 дней (основные оцениваемые параметры в исследовании). С) Кривые выживаемости Каплана-Мейера для мышей, получавших препараты в трех разных группах воздействия. Логарифмический ранговый критерий (критерий КоксаМантеля) выявил значение р < 0,0001, 90% выживаемость у мышей, получавших трехкомпонентную комбинацию антител, по сравнению с 40% выживаемостью у мышей, получавших двухкомпонентную комбинацию антител.

На фиг. 62A-62I продемонстрированы последовательности типовых антител анти-PD-L1.

На фиг. 63А-63АААА продемонстрированы последовательности многочисленных типовых антител к PVRIG.

IV. Подробное описание сущности изобретения

А. Введение.

Терапевтические антитела, направленные против ингибиторов иммунной контрольной точки, таких как PD-1, демонстрируют большие перспективы в лечении рака в клинической практике. Рак можно рассматривать как неспособность пациента распознавать и устранять раковые клетки. Во многих случаях эти трансформированные (например, раковые) клетки противодействуют иммунному надзору. Существуют естественные механизмы контроля, которые ограничивают активацию Т-клеток в организме для предотвращения безудержной активности Т-клеток, которые могут использоваться раковыми клетками для уклонения или подавления иммунного ответа. Цель иммунотерапии - восстанавить способность иммунных эффекторных клеток, особенно Т-клеток, распознавать и устранять рак. Область иммуноонкологии, которую иногда называют иммунотерапией, быстро развивается, и в последнее время одобрено несколько антител, ингибирующих Т-клетки, таких как Ервой (Yervoy®), Кейтруда (Keytruda®) и Оптидиво (Opdivo®). Эти антитела обычно называют ингибиторами контрольных точек, поскольку они блокируют обычно негативные регуляторы Т-клеточного иммунитета. Как правило, считается, что различные иммуномодулирующие сигналы, как костимулирующие, так и коингибирующие, могут применяться для получения оптимального антигенспецифического иммунного ответа.

Как правило, эти моноклональные антитела связываются с белками-ингибиторами контрольных точек, такими как CTLA-4 и PD-1, которые в нормальных условиях предотвращают или подавляют активацию цитотоксических Т-клеток (CTL). За счет ингибирования белка контрольной точки, например, в результате применения антител, которые связывают эти белки, может быть достигнут повышенный противоопухолевый ответ Т-клеток. То есть эти белки раковой контрольной точки подавляют иммунный ответ; когда белки блокируются, например, с помощью антител к белку контрольной точки, иммунная система активируется, что приводит к иммуностимуляции и возникает возможность лечить такие патологические состояния, как рак и инфекционные заболевания.

Данное изобретение направлено на композиции и способы применения нескольких ингибиторов против контрольной точки в комбинации с целью получения лучшим исходов у пациента. В частности, рассматриваются комбинации антител анти-TIGIT, анти-PVRIG и αнтu-PD-1. Кроме того, эти способы особенно пригодны в сочетании с оценкой уровней экспрессии PD-L1 в опухоли пациента. Если процент PD-L1-положительных опухолевых клеток или иммунных клеток превышает 1% (> 1%) по сравнению с теми же опухолевыми клетками, окрашенными антителом, соответствующим антителу изотипического контроля, для применяемых антител, то необходимо вводить трехкомпонентную комбинацию антител анти-TIGIT, анти-PVRIG и анти-PD-1. Тогда как пациентам, имеющим PD-L1-положительные опухолевые клетки или иммунные клетки в количестве ниже 1% (<1%) по сравнению с изотипическим контролем, следует вводить двухкомпонентную комбинацию антител анти-TIGIT и анти-PVRIG.

Как обсуждалось в данном документе, TIGIT представляет собой коингибирующий рецептор, который в высокой степени экспрессируется на эффекторных и регуляторных (Treg) CD4+ Т-клетках, эффекторных CD8+ Т-клетках и NK-клетках. Было продемонстрировано, что TIGIT ослабляет иммунный ответ посредством (1) прямого сигналинга, (2) индукции сигналинга лигандов и (3) конкуренции с нарушением сигналинга костимуляторным рецептором CD226 (также известным как DNAM-1).

Белок, содержащий домен иммуноглобулина, связанный с рецептором полиовируса человека, или PVRIG, экспрессируется на клеточной поверхности NK- и Т-клеток и имеет несколько сходств с другими известными иммунными контрольными точками. PVRIG был признан как ингибитор контрольной точки, см. USSN 62/118,208, 62/141,120, 62/235,823, 62/376,343, 15/048,967, 62/376,335, 62/417,217, и 62/477,974, все из которых явным образом включены в данный документ посредством ссылки в полном объеме и, в частности, для последовательностей антител, фигур и условных обозначений к фигурам. Как продемонстрировано в этих документах, PVRL2 был идентифицирован/подтвержден как аналог PVRIG. Были сгенерированы антитела, которые связываются с PVRIG, и затем было идентифицировано подмно

- 19 044486 жество антител, которые связываются с PVRIG и блокируют взаимодействие PVRIG и PVLR2. Когда PVRIG связан своим лигандом (PVRL2), вырабатывается ингибирующий сигнал, который действует для ослабления иммунного ответа NK- и Т-клеток против клетки-мишени (то есть аналогично PD-1/PDL1). Блокирование связывания PVRL2 с PVRIG отключает этот ингибирующий сигнал PVRIG и в результате модулирует иммунный ответ NK- и Т-клеток.

PD-1, или белок запрограммированной смерти клетки 1, является известным ингибитором контрольной точки. Существует два одобренных антитела αнтu-PD-1, пембролизумаб (Кейтруда®), цемиплимаб (REGN2810), и ниволумаб (Опдиво®), при этом многие другие находятся на этапе клинических исследований (включая, но не ограничиваясь этим, пидилизумаб, клоны ВАР049, как указано в WO 2015/112900 (последовательности которых явным образом включены в данное описание посредством ссылки), антитело 317-4В6, как указано в WO 2015/035606 (последовательность которого явным образом включена в данное описание посредством ссылки), антитело АРЕ2058, как указано в US 2016/0075783 (последовательность которого явным образом включена в данное описание посредством ссылки).

На этапе клинических исследований находятся три одобренных антитела анти-PD-L1: атезолизумаб (ТЕЦЕНТРИК (TECENTRIQ®)), авелумаб (БАВЕНСИО (BAVENCIO®)) и дурвалумаб, а также другие антитела анти-PD-L1.

Функциональные эффекты комбинаций этих антител на NK- и Т-клетки можно оценить in vitro (и в некоторых случаях in vivo, как более подробно описано ниже) путем измерения изменений следующих параметров: пролиферации, высвобождения цитокинов и маркеров клеточной поверхности. Соответственно, функциональные эффекты антител анти-TIGIT на NK-, эффекторные Т-клетки и Treg-клетки можно оценить in vitro (и в некоторых случаях in vivo, как более подробно описано ниже) путем измерения изменений следующих параметров: пролиферации, высвобождения цитокинов и маркеров клеточной поверхности. Для NK-клеток, увеличение пролиферации клеток, цитотоксичность (способность уничтожать клетки-мишени, измеряемая по увеличению экспрессии CD107а, гранзима и перфорина или путем непосредственного измерения уничтожения клеток-мишеней), продукция цитокинов (например, IFN-γ и TNF) и экспрессия рецептора клеточной поверхности (например, CD25) указывает на иммунную модуляцию, например, усиленное уничтожение раковых клеток. Для эффекторных Т- и Treg-клеток, увеличение пролиферации, повышение экспрессии рецепторов активации клеточной поверхности (например, CD25, CD69, CD137 и PD-1), цитотоксичность (способность уничтожать клетки-мишени, как упомянуто выше) и продукция цитокинов (например, IL-2, IL-4, IL-6, IFN-γ, TNF-α, IL-10, IL-17A) свидетельствует об иммунной модуляции, например, усиленном уничтожении раковых клеток. Соответственно, оценку лечения можно проводить с помощью анализов, которые оценивают один или большее количество из следующих механизмов: (i) повышение иммунного ответа, (ii) повышение активации αβ и/или γδ Тклеток, (iii) повышение активности цитотоксических Т-клеток, (iv) повышение активности NK- и/или NKT-клеток, (v) ослабление супрессии αβ и/или γδ Т-клеток, (vi) повышение секреции противовоспалительных цитокинов, (vii) повышение секреции IL-2; (viii) увеличение продукции интерферона-γ, (ix) повышение ответа Th1, (х) снижение ответа Th2, (xi) уменьшение количества или элиминация клеток и/или активности по меньшей мере одной из регуляторных Т-клеток.

В частности, любой из анализов, приведенных в примере 1, можно применять для измерения активации Т-клеток и/или подавления ингибирования Т-клеток.

Таким образом, в некоторых вариантах осуществления данного изобретения предлагается применение комбинированной терапии антител анти-TIGIT, анти-PVRIG и анти-PD-1 (или только антител антиTIGIT и анти-PVRIG в некоторых случаях, как описано в данном документе) для реализации в организме субъекта одного или большего количества из следующих механизмов: (а) активация противовоспалительных цитокинов; (b) увеличение пролиферации и/или размножения Т-клеток; (с) увеличение продукции интерферона или TNF-α Т-клетками; (d) увеличение секреции IL-2; (е) стимулирование ответов антител; (f) ингибирование роста раковых клеток; (g) стимулирование антигенного специфического Тклеточного иммунитета; (h) содействие активации CD4+ и/или CD8+ Т-клеток; (i) ослабление супрессии Treg-опосредованных клеток; (j) содействие активности NK-клеток; (k) содействие апоптозу или лизису раковых клеток; и/или (l) цитотоксическое или цитостатическое действие на раковые клетки.

Соответственно, в данном изобретении предлагаются антитела анти-TIGIT, анти-PVRIG и анти-PD1 для применения в комбинированной терапии и в сочетании с диагностическими анализами, измеряющими уровни экспрессии одного или большего количества из следующих белков: TIGIT, PVRIG и PD-1, и/или измеряющими уровней лигандов TIGIT (например, PVR), PVRIG (PVRL2) и PD-1 (PD-L1).

В. Определения.

С целью более полного понимания данной заявки, ниже приведены несколько определений. Такие определения предназначены для охвата грамматических эквивалентов.

В данном контексте под абляцией подразумевается снижение или устранение активности. В некоторых вариантах осуществления данного изобретения полезно удалить активность из константных доменов антител. Так, например, устранение связывания Fr/R означает, что аминокислотный вариант Fcобласти характеризуется менее 50% начального связывания по сравнению с Fc-областью, не содержащей

- 20 044486 специфического варианта, с потерей менее 70-80-90-95-98% активности, что является предпочтительным, и, как правило, активностью ниже уровня детектируемого связывания в анализе Biacore. Как продемонстрировано на фиг. 1, одним из вариантов абляции в константной области IgG1 является вариант N297A, который удаляет нативный сайт гликозилирования и значимо снижает связывание FcyRIIIa и, таким образом, снижает антитело-зависимую клеточную цитотоксичность (АЗКЦ).

Под антигенсвязывающим доменом или ABD в данном документе подразумевается набор из шести определяющих комплементарность областей (Complementary Determining Regions - CDR), которые, когда они присутствуют в качестве части полипептидной последовательности, специфически связывают целевой антиген, как обсуждается в данном документе. Таким образом, домен, связывающий антиген TIGIT связывает антиген TIGIT (последовательность которого приведена на фиг. 2), как указано в данном документе. Как известно в данной области техники, эти CDR, как правило, присутствуют в виде первого набора CDR вариабельной области тяжелой цепи (vhCDR или VhCDR) и второго набора CDR вариабельной области легкой цепи (vlCDR или VlCDR), каждый из которых содержит три CDR: vhCDR1, vhCDR2, vhCDR3 для тяжелой цепи и vlCDR1, vlCDR2 и vlCDR3 для легкой. CDR присутствуют в вариабельных доменах тяжелой цепи и вариабельных доменах легкой цепи соответственно и вместе образуют Fv-область. Таким образом, в некоторых случаях шесть CDR антигенсвязывающего домена образуются вариабельной тяжелой и вариабельной легкой цепью. В формате Fab, в набор из 6 CDR входят две разные полипептидные последовательности: вариабельный домен тяжелой цепи (vh или VH; содержащий vhCDR1, vhCDR2 и vhCDR3) и вариабельный домен легкой цепи (vl или V_L; содержащий vlCDR1, vlCDR2 и vlCDR3), при этом С-конец домена vh присоединен к N-концу домена CH1 тяжелой цепи, а С-конец домена vl присоединен к N-концу константного домена легкой цепи (и, таким образом, образуя легкую цепь).

В контексте данного документа под термином модификация подразумевается аминокислотная замена, вставка и/или делеция в полипептидной последовательности или изменение фрагмента, химически связанного с белком. Например, модификация может представлять собой измененную углеводную или ПЭГ-структуру, присоединенную к белку. В контексте данного документа под термином аминокислотная модификация подразумевается аминокислотная замена, вставка и/или делеция в полипептидной последовательности. Для ясности, если не указано иное, аминокислотная модификация всегда относится к аминокислоте, кодируемой ДНК, например, к 20 аминокислотам, которые имеют кодоны в ДНК и РНК.

В контексте данного документа под термином аминокислотная замена или замена подразумевается замена аминокислоты в конкретном положении в исходной полипептидной последовательности другой аминокислотой. В частности, в некоторых вариантах осуществления данного изобретения замена представляет собой аминокислоту, которая не встречается в природе в конкретном положении, либо не встречается в природе в организме, либо в любом организме. Например, замена N297A относится к варианту полипептида, в данном случае к Fc варианту, в котором аспарагин в положении 297 заменен аланином. Для ясности, белок, который был сконструирован для изменения последовательности, кодирующей нуклеиновую кислоту, но не для замены исходной аминокислоты (например, обмен CGG (кодирующего аргинин) на CGA (все еще кодирующего аргинин) для повышения уровня экспрессии в организме хозяина), не является аминокислотной заменой; то есть, несмотря на создание нового гена, кодирующего тот же белок, если белок имеет ту же аминокислоту в конкретной позиции, с которой он начинался, это не аминокислотная замена.

В контексте данного документа под термином вставка аминокислоты или вставка подразумевается добавление аминокислотной последовательности в конкретном положении в исходную полипептидную последовательность. Например, -233E или 233E обозначает вставку глутаминовой кислоты после положения 233 и перед положением 234. Кроме того, -233ADE или A233ADE обозначает вставку AlaAspGlu после положения 233 и перед положением 234.

В контексте данного документа под термином делеция аминокислоты или делеция подразумевается удаление аминокислотной последовательности в конкретном положении в исходной полипептидной последовательности. Например, Е233- или Е233#, E233() или E233del обозначает делецию глутаминовой кислоты в положении 233. Кроме того, EDA233- или EDA233# обозначает делецию последовательности GluAspAla, которая начинается в положении 233.

В контексте данного документа под термином вариантный белок или вариант белка или вариант подразумевается белок, который отличается от исходного белка за счет по меньшей мере модификации одной аминокислоты. Вариант белка может относиться к самому белку, композиции, содержащей белок, или к аминокислотной последовательности, которая его кодирует. Предпочтительно, вариант белка имеет по меньшей мере одну аминокислотную модификацию по сравнению с исходным белком, например, от около одной до около семидесяти аминокислотных модификаций, и предпочтительно от около одной до около пяти аминокислотных модификаций по сравнению с родительским белком. Как описано ниже, в некоторых вариантах осуществления данного изобретения родительский полипептид, например родительский полипептид Fc, представляет собой последовательность дикого типа человека, такую как Fc-область IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4, хотя последовательности человека с вариантами также могут служить в качестве родительских полипептидов. Вариант последовательности белка в данном

- 21 044486 документе предпочтительно будет обладать по меньшей мере около 80% идентичностью с последовательностью исходного белка, и наиболее предпочтительно по меньшей мере около 90% идентичностью, более предпочтительно по меньшей мере около 95-98-99% идентичностью. Вариант белка может относиться к самому варианту белка, композициям, содержащим вариант белка, или последовательности ДНК, которая его кодирует. Соответственно, под термином вариантом антитела или вариантным антителом в контексте данного документа подразумевается антитело, которое отличается от исходного антитела за счет по меньшей мере одной аминокислотной модификации, под термином вариант IgG или вариант IgG в контексте данного документа подразумевается антитело, которое отличается от родительского IgG (опять же, во многих случаях от последовательности IgG человека) за счет по меньшей мере одной аминокислотной модификации, а под термином вариант иммуноглобулина или иммуноглобулиновый вариант в контексте данного документа подразумевается последовательность иммуноглобулина, которая отличается из последовательности родительского иммуноглобулина за счет по меньшей мере одной аминокислотной модификации. В контексте данного документа под термином Fc-вариант или вариант Fc подразумевается белок, содержащий аминокислотную модификацию в Fc-домене. Варианты Fc по данному изобретению определены в соответствии с модификациями аминокислот, которые их составляют. Таким образом, например, S241P или S228P представляет собой шарнирный вариант с замещенным пролином в положении 228 относительно исходного шарнирного полипептида IgG4, при этом нумерация S228P соответствует индексу EU, a S241P соответствует нумерации по Кабату. Индекс EU или EU-индекс, как по Кабату или схема нумерации EU, относится к нумерации антител EU (Edelman et al., 1969, Proc Natl Acad Sci USA 63: 78-85, что включено в данный документ посредством ссылки в полном объеме). Модификация может представлять собой добавление, делецию или замену. Замены могут включать встречающиеся в природе аминокислоты и, в некоторых случаях, синтетические аминокислоты. Примеры включают патенты США № 6586207; WO 98/48032; WO 03/073238; US2004-0214988A1; WO 05/35727A2; WO 05/74524A2; J. W. Chin et al., (2002), Journal of the American Chemical Society 124:9026-9027; J. W. Chin, & P. G. Schultz, (2002), ChemBioChem 11:1135-1137; J. W. Chin, et al., (2002), PICAS United States of America 99:11020-11024; и L. Wang & PG Schultz (2002), Chem. 1-10, что включено в данный документ посредством ссылки в полном объеме.

В контексте данного документа под термином белок подразумевается по меньшей мере две ковалентно связанные аминокислоты, при этом указанный термин включает белки, полипептиды, олигопептиды и пептиды. Пептидильная группа может содержать встречающиеся в природе аминокислоты и пептидные связи или синтетические пептидомиметические структуры, то есть аналоги, такие как пептоиды (см. Simon et al., PNAS USA 89 (20): 9367 (1992), что включено в данный документ посредством ссылки в полном объеме). Аминокислоты могут быть либо встречающимися в природе, либо синтетическими (например, не быть аминокислотой, кодируемой ДНК); как будет оценено специалистами в данной области техники. Например, для целей изобретения гомофенилаланин, цитруллин, орнитин и норелейцин считаются синтетическими аминокислотами, а также могут применяться как D-, так и L- (R или S) сконфигурированные аминокислоты. Варианты данного изобретения могут содержать модификации, которые включают применение синтетических аминокислот, включенных с помощью, например, технологий, разработанных Schultz с коллегами, включая, но не ограничиваясь, способы, описанные в Cropp & Shultz, 2004, Trends Genet. 20 (12): 625-30, Anderson et al., 2004, Proc Natl Acad Sci USA 101 (2): 7566-71, Zhang et al., 2003, 303 (5656): 371-3 и Chin et al., 2003, Science 301 (5635): 964-7, все из которых включены в данный документ посредством ссылки в полном объеме. Кроме того, полипептиды могут включать синтетическую дериватизацию одной или большего количества боковых цепей или концов, гликозилирование, пегилирование, циклическую перестановку, циклизацию, связи с другими молекулами, слияние с белками или белковыми доменами и добавление пептидных тегов или меток.

В контексте данного документа под термином остаток подразумевается положение в белке и ассоциированную с ним идентичность аминокислот. Например, аспарагин 297 (также называемый Asn297 или N297) представляет собой остаток в положении 297 человеческого антитела IgG1.

В контексте данного документа под термином Fab или Fab-область подразумевается полипептид, который содержит домены иммуноглобулина VH, CH1, VL и CL. Fab может относиться к этой области в выделении, или может относиться к этой области в контексте полноразмерного антитела или фрагмента антитела.

В контексте данного документа под термином Fv, Fv-фрагмент или Fv-область подразумевается полипептид, который содержит домены VL и VH одного антитела. Как будет понятно специалистам в данной области техники, они обычно состоят из двух цепей.

В контексте данного документа под термином одноцепочечный Fv или scFv подразумевается вариабельный домен тяжелой цепи, ковалентно присоединенный к вариабельному домену легкой цепи, обычно с помощью линкера scFv, как описано в данном документе, для образования домена scFv или scFv. Домен scFv может иметь любую ориентацию от N- до С-конца (vh-линкер-vl или vl-линкер-vh). Как правило, линкер представляет собой линкер scFv, как это общеизвестно в данной области техники, причем линкерный пептид преимущественно включает следующие аминокислотные остатки: Gly, Ser, Ala или Thr. Линкерный пептид должен иметь длину, которая является достаточной для связывания двух

- 22 044486 молекул таким образом, чтобы они принимали правильную конформацию относительно друг друга, с целью сохранения необходимой активности. В одном варианте осуществления данного изобретения линкер состоит из около 1-50 аминокислот в длину, предпочтительно из около 1-30 аминокислот в длину. В одном варианте осуществления данного изобретения можно применять линкеры от 1 до 20 аминокислот в длину, при этом в некоторых вариантах осуществления данного изобретения находят применение линкеры от около 5 до около 10 аминокислот в длину. Пригодные линкеры включают в себя глицинсериновые полимеры, в том числе, например, (GS)n, (GSGGS)n, (GGGGS)n и (GGGS)n, где n представляет собой целое число из по меньшей мере одного (и, как правило, от 3 до 4), глицин-аланиновые полимеры, аланин-сериновые полимеры и другие гибкие линкеры. В альтернативном варианте различные непротеиновые полимеры, в том числе, но не ограничиваясь ими, полиэтиленгликоль (ПЭГ), полипропиленгликоль, полиоксиалкилены или сополимеры полиэтиленгликоля и полипропиленгликоля, могут найти применение в качестве линкеров, то есть, могут найти применение в качестве линкеров.

Под термином модификация подкласса IgG или модификация изотипа в данном контексте подразумевается аминокислотную модификацию, которая превращает одну аминокислоту одного изотипа IgG в соответствующую аминокислоту в другом выровненном изотипе IgG. Например, поскольку IgG1 содержит тирозин, a IgG2 фенилаланин в EU положении 296, замена F296Y в IgG2 считается модификацией подкласса IgG. Подобным образом, поскольку IgG1 имеет пролин в положении 241, a IgG4 имеет в этом положении серин, молекула IgG4 с S241P считается модификацией подкласса IgG. Следует обратить внимание, что модификации подкласса рассматриваются в данном документе как аминокислотные замены.

В контексте данного документа под термином не встречающаяся в природе модификация подразумевается аминокислотная модификация, которая не является изотипической. Например, поскольку ни один из IgG не содержит аспарагин в положении 297, замена N297A в IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4 (или в их гибридах) считается не встречающейся в природе модификацией.

В контексте данного документа под термином аминокислота и идентичность аминокислоты подразумевается одна из 20 встречающихся в природе аминокислот, которые кодируются ДНК и РНК.

В контексте данного документа под термином эффекторная функция подразумевается биохимическое явление, которое возникает в результате взаимодействия Fc-области антитела с Fc-рецептором или лигандом. Эффекторные функции включают, но не ограничиваются ими, АЗКЦ, АЗКФ и КЗЦ. Во многих случаях желательным является устранение большинства или всех эффекторных функций с помощью либо разных изотипов IgG (например, IgG4), либо аминокислотных замен в Fc-домене; однако является желательным сохранение связывания с рецептором FcRn, так как это способствует продлению периода полужизни антител в сыворотке человека.

В контексте данного документа под термином Fc-лиганд IgG подразумевается молекула, предпочтительно полипептид, из любого организма, который связывается с Fc-областью антитела IgG с образованием комплекса Fc/Fc-лиганд. Fc-лиганды включают, но не ограничиваются ими, FcyRI, FcyRIIs, FcyRIIIs, FcRn, C1q, C3, маннан-связывающий лектин, рецептор маннозы, стафилококковый белок А, стрептококковый белок G и вирусный FcyR. Fc-лиганды также включают гомологи Fc-рецепторов (FcRH), представляюх собой семейство Fc-рецепторов, которые являются гомологичными с FcyR (Davis et al., 2002, Immunological Reviews 190: 123-136, что включено в данный документ посредством ссылки в полном объеме). Fc-лиганды могут включать неизученные молекулы, которые связывают Fc. Конкретными Fc-лигандами IgG являются FcRn и Fc гамма-рецепторы. В контексте данного документа под термином Fc-лиганд подразумевается молекула, предпочтительно полипептид, из любого организма, который связывается с Fc-областью антитела с образованием комплекса Fc/Fc-лиганд.

В контексте данного документа под термином родительский полипептид подразумевается исходный полипептид, который впоследствии модифицируют для получения варианта. Родительский полипептид может представлять собой встречающийся в природе полипептид или вариант, или сконструированный вариант встречающегося в природе полипептида. Родительский полипептид может относиться к самому полипептиду, композициям, которые содержат родительский полипептид, или к аминокислотной последовательности, которая его кодирует. Соответственно, под термином родительский иммуноглобулин в контексте данного документа подразумевается немодифицированный полипептид иммуноглобулина, который модифицирован для получения варианта, а под термином родительское антитело в контексте данного документа подразумевается немодифицированное антитело, которое модифицировано для получения варианта антитела. Следует отметить, что термин родительское антитело включает в себя известные коммерческие, рекомбинантно продуцируемые антитела, как указано ниже.

В контексте данного документа под термином Fc или Fc-область или Fc-домен подразумевается полипептид, содержащий константную область антитела, исключая первый константный домен домена иммуноглобулина и, в некоторых случаях, часть шарнира. Таким образом, Fc относится к двум последним константным областям иммуноглобулиновых доменов IgA, IgD и IgG, к последним трем константным областям иммуноглобулиновых доменов IgE и IgM и гибкому шарнирному N-концу этих доменов. В IgA и IgM, Fc может включать J-цепь. В IgG, Fc- домен содержит иммуноглобулиновые домены

- 23 044486

Су2 и Су3 (Су2 и Су3) и область нижнюю шарнирную область между Cyl (Cy1) и Су2 (Су2). Хотя границы Fc-области могут варьироваться, Fc-область тяжелой цепи IgG человека обычно определяется как включающая остатки С226 или Р230 к ее карбоксильному концу, при этом нумерация соответствует EU индексу, как по Кабату. В некоторых вариантах осуществления данного изобретения, как более полно описано ниже, модификации аминокислот осуществляются в Fc-области, например, для изменения связывания с одним или большим количеством рецепторов FcyR или с рецептором FcRn.

В контексте данного документа под термином константная область тяжелой цепи подразумевается часть антитела СН1-шарнир-СН2-CH3.

В контексте данного документа под термином положение подразумевается местоположение в последовательности белка. Положения могут быть пронумерованы последовательно или в соответствии с установленным форматом, например, индексом EU для нумерации антител.

В контексте данного документа под термином антиген-мишень означает молекулу, которая специфически связана с вариабельной областью данного антитела. Представляющий интерес антигенмишень в контексте данного документа представляет собой TIGIT, обычно TIGIT человека и, необязательно, TIGIT яванского макака, последовательности которых приведены на фигурах.

В контексте данного документа под термином клетка-мишень подразумевается клетка, которая экспрессирует антиген-мишень.

В контексте данного документа под термином вариабельная область подразумевается область иммуноглобулина, которая содержит один или большее количество доменов Ig, по существу кодируемых любым из генов Vk (V.kappa), Vλ, (V.lamda) и/или VH, которые составляют генетические локусы каппа, лямбда и тяжелой цепи иммуноглобулина соответственно.

В контексте данного документа под термином дикий тип или WT подразумевается аминокислотная последовательность или нуклеотидная последовательность, которая встречается в природе, включая аллельные вариации. Белок WT имеет аминокислотную последовательность или нуклеотидную последовательность, которая не была намеренно модифицирована.

Антитела по данному изобретению обычно являются выделенными или рекомбинантными. Термин выделенный, при применении его для описания различных полипептидов, охарактеризованных в данном документе, означает полипептид, который был идентифицирован и отделен и/или выделен из клетки или клеточной культуры, из которой он был экспрессирован. Обычно выделенный полипептид будет получен по меньшей мере в результате одного этапа очистки. Термин выделенное антитело относится к антителу, которое по существу не содержит других антител, имеющих различные антигенные специфичности. Термин рекомбинантный означает, что антитела генерируются с помощью методов рекомбинантной нуклеиновой кислоты в экзогенных клетках-хозяевах.

Термин специфическое связывание или специфически связывается или специфично для конкретного антигена или эпитопа означает связывание, которое измеримо отличается от неспецифического взаимодействия. Специфическое связывание может быть измерено, например, путем определения связывания молекулы по сравнению со связыванием контрольной молекулы, которая обычно представляет собой молекулу сходной структуры, не обладая при этом активностью связывания. Например, специфическое связывание может быть определено путем конкуренции с контрольной молекулой, которая является сходной с мишенью.

Специфическое связывание для конкретного антигена или эпитопа может происходить, например, при наличии антитела, имеющего показатель KD для антигена или эпитопа, составляющий по меньшей мере около 10^-9 М, по меньшей мере около 10^-10 М, по меньшей мере около 10^-11 М, по меньшей мере около 10^-12 М, по меньшей мере около 10^-13 М, по меньшей мере около 10^-14 М, по меньшей мере около 10-¹⁵ М, где KD означает скорость диссоциации конкретного взаимодействия антитело-антиген. Как правило, антитело, которое специфически связывает антиген, будет иметь показатель KD, который в 20, 50, 100, 500, 1000, 5000, 10000 или более раз выше для контрольной молекулы относительно антигена или эпитопа.

Кроме того, специфическое связывание для конкретного антигена или эпитопа может происходить, например, при наличии антитела, имеющего показатель KA или Ka для антигена или эпитопа, являющийся по меньшей мере в 20-, 50-, 100-, 500-, 1000-, 5000 - в 10000 или более раз больше для эпитопа по сравнению с контролем, где KA или Ka означает скорость ассоциации конкретного взаимодействия антитело-антиген. Аффинность связывания обычно измеряют с помощью поверхностного плазмонного резонанса (например, анализа Biacore) и проточной цитометрии с антиген-экспрессирующими клетками.

V. Антитела

Как обсуждается ниже, термин антитело применяется в целом. Как правило, традиционные структурные единицы антитела содержат тетрамер. Как правило, каждый тетрамер состоит из двух идентичных пар полипептидных цепей, каждая пара имеет одну легкую (как правило, имеющую молекулярную массу около 25 кДа) и одну тяжелую цепь (как правило, имеющую молекулярную массу около 50-70 кДа). Легкие цепи человека классифицируются как легкие цепи каппа и лямбда. Данное изобретение направлено на антитела, которые в целом основаны на классе IgG, имеющем несколько подклассов, вклю

- 24 044486 чая, но не ограничиваясь этим, IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4. В целом, IgG1, IgG2 и IgG4 применяются чаще, чем IgG3. Следует отметить, что IgG1 имеет разные аллотипы с полиморфизмами в положении 356 (D или Е) и 358 (L или М). Последовательности, приведенные в данном документе, используют аллотип 356D/358M, однако другой аллотип также включен в данный документ. То есть любая последовательность, включающая Fc-домен IgG1, описанный в данном документе, может иметь 356E/358L, заменяющий аллотип 356D/358M.

Аминоконцевая часть каждой цепи включает вариабельную область от около 100 до 110 или более аминокислот, в первую очередь ответственную за распознавание антигена, обычно называемую в данной области техники и в данном документе Fv-доменом или Fv-областью. В вариабельной области три петли собираются для каждого из V-доменов тяжелой цепи и легкой цепи с образованием антигенсвязывающего сайта. Каждая из петель называется областью, определяющей комплементарность (далее называемой CDR), в которой изменение аминокислотной последовательности является наиболее значительным. Термин вариабельный относится к тому факту, что определенные сегменты вариабельной области сильно различаются по последовательности среди антител. Вариабельность в пределах вариабельной области распределена неравномерно. Напротив, V-области состоят из относительно инвариантных участков, называемых каркасными областями (FR) из 15-30 аминокислот, разделенных более короткими областями чрезмерной вариабельности, называемыми гипервариабельными областями, каждая из которых имеет длину 9-15 аминокислот или более.

Каждый VH и VL состоит из трех гипервариабельных областей (определяющих комплементарность областей, CDR) и четырех FR, расположенных от аминоконца до карбоксиконца в следующем порядке: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4.

Гипервариабельная область обычно охватывает аминокислотные остатки примерно из аминокислотных остатков 24-34 (LCDR1; L обозначает легкую цепь), 50-56 (LCDR2) и 89-97 (LCDR3) в вариабельной области легкой цепи и примерно из 31-35В (HCDR1; Н обозначает тяжелую цепь), 50-65 (HCDR2) и 95-102 (HCDR3) в вариабельной области тяжелой цепи; Kabat et al., SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991), и/или остатки, образующие гипервариабельную петлю (например, остатки 26-32 (LCDR1), 50-52 (LCDR2) и 91-96 (LCDR3) в вариабельной области легкой цепи и 26-32 (HCDR1), 53-55 (HCDR2) и 96-101 (HCDR3) в вариабельной области тяжелой цепи; Chothia and Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196: 901-917. Специфические CDR по данному изобретению описаны ниже.

Как будет понятно специалистам в данной области техники, точная нумерация и размещение CDR могут отличаться в разных системах нумерации. Однако следует понимать, что описание последовательности вариабельной области тяжелой цепи и/или вариабельной области легкой цепи включает в себя описание ассоциированных (присущих) CDR. Соответственно, описание каждой вариабельной области тяжелой цепи представляет собой описание vhCDR (например, vhCDR1, vhCDR2 и vhCDR3), а описание каждой вариабельной области легкой цепи представляет собой описание vlCDR (например, vlCDR1, vlCDR2 и vlCDR3). Полезное сравнение нумерации CDR приведено ниже, см. Lafranc et al., Dev. Сотр. Immunol. 27 (1): 55-77 (2003):___________________________________________________________

	Кабат + Чотиа	IMGT	Кабат	AbM	Чотиа	Contact
vhCDRl	26-35	27-38	31-35	26-35	26-32	30-35
vhCDR2	50-65	56-65	50-65	50-58	53-55	47-58
vhCDR3	95-102	105-117	95-102	95-102	96-101	93-101
vlCDRl	24-34	27-38	24-34	24-34	26-32	30-36
V1CDR2	50-56	56-65	50-56	50-56	50-52	46-55
V1CDR3	89-97	105-117	89-97	89-97	91-96	89-96

В данном описании система нумерации по Кабату обычно применяется для обозначения остатка в вариабельном домене (приблизительно, остатки 1-107 вариабельной области легкой цепи и остатки 1-113 вариабельной области тяжелой цепи) и шарнира, а система нумерации EU - для Fc-областей (например, Kabat et al., выше (1991)).

В данном изобретении предлагается большое количество различных наборов CDR. В этом случае полный набор CDR включает в себя три вариабельных CDR легкой цепи и три вариабельных CDR тяжелой цепи, например, vlCDR1, vlCDR2, vlCDR3, vhCDR1, vhCDR2 и vhCDR3. Соответственно, они могут быть частью большего вариабельного домена легкой или тяжелой цепи. Кроме того, как более полно указано в данном документе, вариабельные домены тяжелой цепи и вариабельные домены легкой цепи могут находиться на отдельных полипептидных цепях, когда применяется тяжелая и легкая цепь, или на одной полипептидной цепи в случае scFv-последовательностей.

CDR способствуют образованию антигенсвязывающего или, более конкретно, эпитопсвязывающего сайта антител. Термин эпитоп относится к детерминанте, которая взаимодействует со специфическим антигенсвязывающим сайтом в вариабельной области молекулы антитела, известной как паратоп. Эпитопы представляют собой группы молекул, таких как аминокислоты или боковые цепи сахаров, и обычно имеют специфические структурные характеристики, а также специфические характеристики заряда. Один антиген может иметь более одного эпитопа.

- 25 044486

Эпитоп может содержать аминокислотные остатки, непосредственно участвующие в связывании (также называемые иммунодоминантным компонентом эпитопа), и другие аминокислотные остатки, которые непосредственно не участвуют в связывании, такие как аминокислотные остатки, которые эффективно блокируются специфическим антигенсвязывающим пептидом; другими словами, аминокислотный остаток находится в зоне действия специфического антигенсвязывающего пептида.

Эпитопы могут быть конформационными или линейными. Конформационный эпитоп продуцируется пространственно сопоставленными аминокислотами из разных сегментов линейной полипептидной цепи. Линейный эпитоп представляет собой эпитоп, продуцируемый соседними аминокислотными остатками в полипептидной цепи. Конформационные и неконформационные эпитопы могут различаться тем, что в присутствии денатурирующих растворителей, связывание с первым, в отличие от второго, теряется.

Как правило, эпитоп включает по меньшей мере 3, а более характерно - по меньшей мере 5 или 8-10 аминокислот в уникальной пространственной конформации. Антитела, которые распознают один и тот же эпитоп, могут быть верифицированы с помощью простого иммуноанализа, демонстрирующего способность одного антитела блокировать связывание другого антитела с антигеном-мишенью, например бининг. Как указано ниже, данное изобретение включает не только перечисленные в данном документе антигенсвязывающие домены и антитела, но и те, которые конкурируют за связывание с эпитопами, связанными с перечисленными антигенсвязывающими доменами.

Карбоксиконцевая часть каждой цепи определяет константную область, в первую очередь ответственную за эффекторную функцию. Kabat et al. собрали многочисленные первичные последовательности вариабельных областей тяжелых цепей и легких цепей. На основании степени сохранения последовательностей, они классифицировали отдельные первичные последовательности на последовательности CDR и последовательности каркаса, а также составили их перечень (см. SEQUENCES OF IMMUNOLOGICAL INTEREST, 5th edition, NIH publication, No. 91-3242, E.A. Kabat et al., что включено в данный документ посредством ссылки в полном объеме).

В подклассе иммуноглобулинов IgG имеется несколько доменов иммуноглобулинов в тяжелой цепи. В контексте данного документа под термином домен иммуноглобулина (Ig) подразумевается область иммуноглобулина, имеющая отчетливую третичную структуру. В данном изобретении представляют интерес домены тяжелой цепи, в том числе константные домены тяжелой цепи (СН) и шарнирные домены. В контексте антител IgG каждый изотип IgG имеет три области СН. Соответственно, СНдомены в контексте IgG являются следующими: СН1 относится к положениям 118-220 в соответствии с индексом EU, как по Кабату. СН2 относится к положениям 237-340 в соответствии с индексом EU, как по Кабату, а CH3 относится к положениям 341-447 в соответствии с индексом EU, как по Кабату. Как продемонстрировано в данном документе и описано ниже, варианты pI могут находиться в одной или большем количестве областей СН, а также в шарнирной области, обсуждаемой ниже.

Другим типом домена Ig тяжелой цепи является шарнирная область. В контексте данного документа под термином шарнир или шарнирная область или шарнирная область антитела или шарнирная область иммуноглобулина подразумевается гибкий полипептид, содержащий аминокислоты между первым и вторым константными доменами антитела. Структурно домен CH1 IgG заканчивается в EUположении 220, а домен СН2 IgG начинается в EU-положении 237 остатка. Таким образом, для IgG, шарнир антитела в данном описании определен как включающий положения 221 (D221 в IgG1) -236 (G236 в IgG1), при этом нумерация соответствует индексу EU, как по K Кабату. В некоторых вариантах осуществления данного изобретения, например, в контексте Fc-области, включен нижний шарнир, при этом нижний шарнир обычно относится к положениям 226 или 230.

Легкая цепь обычно содержит два домена: вариабельный домен легкой цепи (содержащий CDR легкой цепи и вместе с вариабельными доменами тяжелой цепи образующий Fv-область) и константную область легкой цепи (часто называемую CL или Cλ).

Другой областью, представляющей интерес для дополнительных замен, описанной ниже, является Fc-область.

А. Химерные и гуманизированные антитела.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения антитела в данном изобретении могут быть получены из смеси разных видов, например, химерного антитела и/или гуманизированного антитела. Как правило, как химерные антитела, так и гуманизированные антитела относятся к антителам, которые объединяют области более чем одного вида. Например, химерные антитела традиционно включают вариабельную область (области) от мыши (или крысы, в некоторых случаях) и константную область (области) от человека. Гуманизированные антитела обычно относятся к нечеловеческим антителам, у которых каркасные области вариабельного домена были заменены на последовательности, обнаруженные в антителах человека. Как правило, в гуманизированном антителе все антитело, кроме CDR, кодируется полинуклеотидом человеческого происхождения или является идентичным такому антителу, за исключением его CDR. CDR, некоторые или все из которых кодируются нуклеиновыми кислотами, происходящими из нечеловеческого организма, прививаются в каркас бета-листа вариабельной области антитела человека для создания антитела, специфичность которого определяется привитыми CDR. Соз

- 26 044486 дание таких антител описано, например, в WO 92/11018, Jones, 1986, Nature 321: 522-525, Verhoeyen et al., 1988, Science 239: 1534-1536, все из которых включены в данный документ посредством ссылки в полном объеме. Обратная мутация выбранных акцепторных каркасных остатков в соответствующие донорные остатки часто требуется для восстанавления аффинности, которая теряется в исходной привитой конструкции (US 5530101; US 5585089; US 5693761; US 5693762; US 6180370; US 5859205; US 5821337; US 6054297; US 6407213, все из которых включены в данный документ посредством ссылки в полном объеме). Оптимально гуманизированное антитело также будет содержать по меньшей мере часть константной области иммуноглобулина, обычно области иммуноглобулина человека, и, таким образом, как правило, будет содержать Fc-область человека. Гуманизированные антитела также могут быть сгенерированы с использованием мышей с генетически сконструированной иммунной системой. Roque et al., 2004, Biotechnol. Prog. 20: 639-654, что включено в данный документ посредством ссылки в полном объеме. Разнообразные методы и способы гуманизации и изменения формы нечеловеческих антител хорошо известны в данной области техники (см. Tsurushita & Vasquez, 2004, Humanization of Monoclonal Antibodies, Molecular Biology of В Cells, 533-545, Elsevier Science (USA), и ссылки, цитируемые в том документе, включены в данный документ посредством ссылки в полном объеме). Способы гуманизации включают, но не ограничиваются ими, способы, описанные в Jones et al., 1986, Nature 321:522-525; Riechmann et al., 1988; Nature 332:323-329; Verhoeyen et al., 1988, Science, 239:1534-1536; Queen et al., 1989, Proc Natl Acad Sci, USA 86:10029-33; He et al., 1998, J. Immunol. 160: 1029-1035; Carter et al., 1992, Proc Natl Acad Sci USA 89:4285-9, Presta et al., 1997, Cancer Res. 57(20):4593-9; Gorman et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:4181-4185; O'Connor et al., 1998, Protein Eng 11:321-8, все из которых включены в данный документ посредством ссылки в полном объеме. Гуманизация или другие способы снижения иммуногенности вариабельных областей нечеловеческого антитела могут включать способы изменения поверхности, как описано, например, в Roguska et al., 1994, Proc. Natl. Акад. Sci. USA 91: 969-973, что включено в данный документ посредством ссылки в полном объеме.

В определенных вариантах осуществления данного изобретения антитела по данному изобретению содержат вариабельную область тяжелой цепи из конкретного гена тяжелой цепи иммуноглобулина зародышевой линии и/или вариабельную область легкой цепи из конкретного гена легкой цепи иммуноглобулина зародышевой линии (с необязательными мутациями, как в большинстве случаев описано в данном документе). Например, такие антитела могут содержать или состоять из антитела человека, содержащего вариабельные области тяжелой или легкой цепи, которые являются продуктом или получены из конкретной последовательности зародышевой линии. Антитело человека, которое является продуктом или полученным из последовательности иммуноглобулина зародышевой линии человека, можно идентифицировать как таковое путем сравнения аминокислотной последовательности антитела человека с аминокислотными последовательностями иммуноглобулинов зародышевой линии человека и выбора последовательности иммуноглобулина зародышевой линии человека, которая наиболее близка по последовательности (то есть имеет наибольший % идентичности) к последовательности антитела человека. Антитело человека, которое является продуктом или полученным из конкретной последовательности иммуноглобулина зародышевой линии человека, может содержать аминокислотные различия по сравнению с последовательностью зародышевой линии, например, из-за встречающихся в природе соматических мутаций или преднамеренного введения сайт-направленной мутации. Однако гуманизированное антитело, как правило, является по меньшей мере на 90% идентичным по аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью, кодируемой геном иммуноглобулина зародышевой линии человека, и содержит аминокислотные остатки, которые идентифицируют антитело как происходящее из последовательностей человека по сравнению с аминокислотными последовательностями иммуноглобулина зародышевой линии других видов (например, последовательностями зародышевой линии мыши) В определенных случаях гуманизированное антитело может быть по меньшей мере на 95, 96, 97, 98 или 99% или даже по меньшей мере на 96, 97, 98 или 99% идентичным по аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью, кодируемой геном иммуноглобулина зародышевой линии. Как правило, гуманизированное антитело, полученное из конкретной последовательности зародышевой линии человека, будет демонстрировать не более 10-20 аминокислотных отличий от аминокислотной последовательности, кодируемой геном иммуноглобулина зародышевой линии человека. В некоторых случаях гуманизированное антитело может демонстрировать не более 5 или даже не более 4, 3, 2 или 1 аминокислотных отличий с аминокислотной последовательностью, кодируемой геном иммуноглобулина зародышевой линии (опять же, до введения любого варианта, описанного в данном документе, то есть количество вариантов, как правило, является небольшим до введения вариантов по данному изобретению).

В одном варианте осуществления данного изобретения родительское антитело характеризуется зрелой аффинностью, как известно в данной области техники. Для гуманизации и созревания аффинности можно применять способы на основе структуры, например, как описано в USSN 11/004590. Для гуманизации и/или и созревания аффинности вариабельных областей антител можно применять способы на основе селекции, включая, но не ограничиваясь ими, способы, описанные в Wu et al., 1999, J. Mol. Biol. 294:151-162; Baca et al., 1997, J. Biol. Chem. 272(16): 10678-10684; Rosok et al., 1996, J. Biol. Chem.

- 27 044486

271(37): 22611-22618; Rader et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 8910-8915; Krauss et al., 2003, Protein Engineering 16(10):753-759, все из которых включены в данный документе посредством ссылки в полном объеме. Другие способы гуманизации могут включать прививание только частей CDR, включая, но не ограничиваясь ими, способы, описанные в USSN 09/810,510; Tan et al., 2002, J. Immunol. 169: 11191125; De Pascalis et al., 2002, J. Immunol. 169: 3076-3084, все из которых включены в данный документе посредством ссылки в полном объеме.

А. Специфические антитела анти-TIGIT.

В данном изобретении предлагаются антигенсвязывающие домены, включая полноразмерные антитела, которые содержат ряд специфических, перечисленных наборов из 6 CDR и определенных вариабельных областей тяжелой цепи (vh, VH или VH) и вариабельных областей легкой цепи (vl, VL или VL), которые связываются с TIGIT.

В одном варианте осуществления данного изобретения антитело анти-TIGIT представляет собой антитело, содержащее набор из шести CDR (vhCDR1, vhCDR2, vhCDR3, vlCDR1, vlCDR2 и vlCDR3) из СРА.9.083.Н4 (S241P), как продемонстрировано на фиг. 3. В одном варианте осуществления данного изобретения антитело анти-TIGIT представляет собой антитело, содержащее вариабельный домен тяжелой цепи (VH) и вариабельный домен легкой цепи (VL) из СРА.9.083.Н4 (S241P), как продемонстрировано на фиг. 3, связанные с константным доменом IgG IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 и IgG4 (S241P) человека. В одном варианте осуществления данного изобретения антитело анти-TIGIT представляет собой СРА.9.083.Н4 (S241P).

В одном варианте осуществления данного изобретения антитело анти-TIGIT представляет собой антитело, содержащее набор из шести CDR (vhCDR1, vhCDR2, vhCDR3, vlCDR1, vlCDR2 и vlCDR3) из СРА.9.086.Н4 (S241P), как продемонстрировано на фиг. 3. В одном варианте осуществления данного изобретения антитело анти-TIGIT представляет собой антитело, содержащее вариабельный домен тяжелой цепи (VH) и вариабельный домен легкой цепи (VL) из CPA.9.086.H4 (S241P), (VL) на фиг. З, связанные с константным доменом IgG IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 и IgG4 (S241P) человека. В одном варианте осуществления данного изобретения антитело анти-TIGIT представляет собой СРА.9.086.Н4 (S241P).

В одном варианте осуществления данного изобретения антитело анти-TIGIT представляет собой антитело, содержащее набор из шести CDR (vhCDR1, vhCDR2, vhCDR3, vlCDR1, vlCDR2 и vlCDR3) из СНА.9.547.7.Н4 (S241P), как продемонстрировано на фиг. 3. В одном варианте осуществления данного изобретения антитело анти-TIGIT представляет собой антитело, содержащее вариабельный домен тяжелой цепи (VH) и вариабельный домен легкой цепи (VL) из СНА.9.547.7.Н4 (S241P), как продемонстрировано на фиг. 3, связанные с константным доменом IgG IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 и IgG4 (S241P) человека. В одном варианте осуществления данного изобретения антитело анти-TIGIT представляет собой СНА.9.547.7.Н4 (S241P).

В одном варианте осуществления данного изобретения антитело анти-TIGIT представляет собой антитело, содержащее набор из шести CDR (vhCDR1, vhCDR2, vhCDR3, vlCDR1, vlCDR2 и vlCDR3) из СНА.9.547.13.Н4 (S241P), как продемонстрировано на фиг. 3. В одном варианте осуществления данного изобретения антитело анти-TIGIT представляет собой антитело, содержащее вариабельный домен тяжелой цепи (VH) и вариабельный домен легкой цепи (VL) из CHA.9.547.13.H4 (S241P), как продемонстрировано на фиг. 3, связанные с константным доменом IgG IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 и IgG4 (S241P) человека. В одном варианте осуществления данного изобретения антитело анти-TIGIT представляет собой CHA.9.547.13.H4 (S241P).

Другие антитела анти-TIGIT, которые находят применение в комбинациях с антителами антиPVRIG, как указано в данном документе, представлены на фиг. 4 в публикации USSN 62/513916, озаглавленной Антитела анти-TIGIT и способы их применения, поданной 1 июня 2017 года правопреемником Compugen, а также те, которые включены в фиг. 3.

В. Дополнительные антитела анти-TIGIT для применения в комбинированной терапии.

Также включены дополнительные антитела анти-TIGIT, которые можно применять в комбинации с антителами анти-PVRIG и необязательно с антителами анти-PD-1, как указано в данном документе. Как более подробно обсуждается ниже, антитела анти-TIGIT проявляют особую эффективность в комбинации с антителами анти-PVRIG. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления данного изобретения альтернативные антитела анти-TIGIT применяются в комбинации с антителами анти-PVRIG, указанными в данном документе, и, в частности, либо с СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P), либо с СНА.7.518.1.Н4 (S241P).

Соответственно, в одном варианте осуществления данного изобретения антитела анти-TIGIT, описанные в патенте США № 9499596 (включенного в данное описание посредством ссылки в полном объеме и конкретно для SEQ ID NO: перечисленных ниже), можно комбинировать с СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P) или СНА.7.518.1.Н4 (S241P). В частности, антитело анти-TIGIT, имеющее последовательность легкой цепи SEQ ID NO: 21 и последовательность тяжелой цепи SEQ ID NO: 22 (из USP 9499596), можно комбинировать с СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P) или СНА.7.518.1.Н4 (S241P). Кроме того, антитело антиTIGIT, имеющее последовательность легкой цепи SEQ ID NO: 29 и последовательность тяжелой цепи SEQ ID NO: 30 (из USP 9499596), можно комбинировать с CHA.7.538.1.2.H4 (S241P) или CHA.7.518.1.H4

- 28 044486 (S241P).

Аналогично, в одном варианте осуществления данного изобретения антитела анти-TIGIT, описанные в публикации WO 2016/191643 (включенной в данное описание посредством ссылки в полном объеме и конкретно для SEQ ID NO: перечисленных ниже, и, в частности, для последовательностей антитела ОМР-313М32) можно комбинировать с СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P) или СНА.7.518.1.Н4 (S241P). В частности, антитело анти-TIGIT, имеющее последовательность легкой цепи SEQ ID NO: 72 и последовательность тяжелой цепи SEQ ID NO: 70 (из WO 2016/191643), можно комбинировать с CHA.7.538.1.2.H4 (S241P) или СНА.7.518.1.Н4 (S241P).

Соответственно, в одном варианте осуществления данного изобретения антитела анти-TIGIT, описанные в публикации WO 2017/053748 (включенной в данное описание посредством ссылки в полном объеме и конкретно для SEQ ID NO: перечисленных ниже), можно комбинировать с СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P) или СНА.7.518.1.Н4 (S241P). В частности, антитело анти-TIGIT, имеющее вариабельную последовательность легкой цепи SEQ ID NO: 36 и вариабельную последовательность тяжелой цепи SEQ ID NO: 34 (из WO 2017/053748), можно комбинировать с CHA.7.538.1.2.H4 (S241P) или СНА.7.518.1.Н4 (S241P). Кроме того, антитело анти-TIGIT, имеющее вариабельную последовательность легкой цепи SEQ ID NO: 36 и вариабельную последовательность тяжелой цепи SEQ ID NO: 35 (из WO 2017/053748), можно комбинировать с CHA.7.538.1.2.H4 (S241P) или СНА.7.518.1.Н4 (S241P). Кроме того, антитело антиTIGIT, имеющее вариабельную последовательность легкой цепи SEQ ID NO: 38 и вариабельную последовательность тяжелой цепи SEQ ID NO: 37 (из WO 2017/053748), можно комбинировать с CHA.7.538.1.2.H4 (S241P) или СНА.7.518.1.Н4 (S241P). Кроме того, антитело анти-TIGIT, имеющее вариабельную последовательность легкой цепи SEQ ID NO: 40 и вариабельную последовательность тяжелой цепи SEQ ID NO: 39 (из WO 2017/053748), можно комбинировать с CHA.7.538.1.2.H4 (S241P) или СНА.7.518.1.Н4 (S241P). В одном варианте осуществления данного изобретения антитела анти-TIGIT включают антитело Genentech, MTIG7192A, в данное время находящееся на этапе клинических исследований (см. во всемирной сети Интернет по адресу clintrials.gov/ct2/show/NCT02794571?term=MTIG7192A&rank=1). В одном варианте осуществления данного изобретения антитело анти-TIGIT MTIG7192A можно комбинировать с СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P) или СНА.7.518.1.Н4 (S241P).

Аналогично, в одном варианте осуществления антитела анти-TIGIT, описанные в публикации WO 2016/191643 (включенной в данное описание посредством ссылки в полном объеме и конкретно для SEQ ID NO: перечисленных ниже, и, в частности, для последовательностей антитела ОМР-313М32), можно комбинировать с СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P) или СНА.7.518.1.Н4 (S241P). В частности, антитело антиTIGIT, имеющее последовательность легкой цепи SEQ ID NO: 72 и последовательность тяжелой цепи SEQ ID NO: 70 (из WO 2016/191643), можно комбинировать с CHA.7.538.1.2.H4 (S241P) или СНА.7.518.1.Н4 (S241P). В одном варианте осуществления данного изобретения антитела анти-TIGIT включают антитело Oncomed, OMP-313M32, в данное время находящееся на этапе клинических исследований (см. во всемирной сети Интернет по адресу clintrials.gov/ct2/show/NCT03119428?term=OMP313M32&rank=1). В одном варианте осуществления данного изобретения антитело анти-TIGIT ОМР313М32 можно комбинировать с СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P) или СНА.7.518.1.Н4 (S241P).

Кроме того, в одном варианте осуществления данного изобретения антитела анти-TIGIT, описанные в публикации WO 2016/028656 (включенной в данное описание посредством ссылки в полном объеме и конкретно для SEQ ID NO: перечисленных ниже, и, в частности, для последовательностей антител МЕВ125.31С6.А1.205 VH4/VL1 (VH SEQ ID NO: 127, VL последовательности SEQ ID NO: 130 с константным доменом IgG1 человека), МЕВ 125.31С6.А1.205 VH5/VL4 (VH SEQ ID NO: 128, VL последовательности SEQ ID NO: 133 и константной области IgG1 человека) и МЕВ125.31.С6, А1.205 VH5/VL3 (VH последовательности SEQ ID NO: 128, VL последовательности SEQ ID NO: 132 и константной области IgG1 человека)), можно комбинировать с СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P) или СНА.7.518.1.Н4 (S241P). В частности, анти-TIGIT антитело МЕВ125.31С6.А1.205 VH4/VL1 (VH последовательности SEQ ID NO: 127, VL последовательности SEQ ID NO: 130 с константным доменом IgG1 человека) (из WO 2016/028656), можно комбинировать с СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P) или СНА.7.518.1.Н4 (S241P). В частности, анти-TIGIT антитело МЕВ 125.31С6.А1.205 VH5/VL4 (VH последовательности SEQ ID NO: 128, VL последовательности SEQ ID NO: 133 и константная область IgG1 человека (из WO 2016/028656), можно комбинировать с СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P) или СНА.7.518.1.Н4 (S241P). В частности, анти-TIGIT антитело МЕВ 125.31.C6.A1.2O5 VH5/VL3 (VH последовательности SEQ ID NO: 128, VL последовательности SEQ ID NO: 132 и константная область IgG1 человека (из WO 2016/028656), можно комбинировать с СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P) или СНА.7.518.1.Н4 (S241P). В частности, антитело анти-TIGIT, содержащее VH последовательности SEQ ID NO: 7, VL последовательности SEQ ID NO: 8 и константную область IgG1 человека (из WO 2016/028656), можно комбинировать с СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P) или СНА.7.518.1.Н4 (S241P). В частности, антитело анти-TIGIT, содержащее VH последовательности SEQ ID NO: 63, VL последовательности SEQ ID NO: 64 и константную область IgG1 человека (из WO 2016/028656), можно комбинировать с СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P) или СНА.7.518.1.Н4 (S241P). В частности, антитело анти-TIGIT, содержащее VH последовательности SEQ ID NO: 94, VL последовательности

- 29 044486

SEQ ID NO: 95 и константную область IgG1 человека (из WO 2016/028656), можно комбинировать с СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P) или СНА.7.518.1.Н4 (S241P). В частности, антитело анти-TIGIT, содержащее VH последовательности SEQ ID NO: 126, VL последовательности SEQ ID NO: 131 и константную область IgG1 человека (из WO 2016/028656), можно комбинировать с СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P) или СНА.7.518.1.Н4 (S241P). В частности, антитело анти-TIGIT, содержащее VH последовательности SEQ ID NO: 128, VL последовательности SEQ ID NO: 131 и константную область IgG1 человека (из WO 2016/028656), можно комбинировать с СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P) или СНА.7.518.1.Н4 (S241P). В частности, антитело анти-TIGIT, содержащее VH последовательности SEQ ID NO: 125, VL последовательности SEQ ID NO: 133 и константную область IgG1 человека (из WO 2016/028656), можно комбинировать с СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P) или СНА.7.518.1.Н4 (S241P). В частности, антитело анти-TIGIT, содержащее VH последовательности SEQ ID NO: 126, VL последовательности SEQ ID NO: 130 и константную область IgG1 человека (из WO 2016/028656), можно комбинировать с СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P) или СНА.7.518.1.Н4 (S241P). В частности, антитело анти-TIGIT, содержащее VH последовательности SEQ ID NO: 125, VL последовательности SEQ ID NO: 132 и константную область IgG1 человека (из WO 2016/028656), можно комбинировать с СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P) или СНА.7.518.1.Н4 (S241P). В частности, антитело анти-TIGIT, содержащее VH последовательности SEQ ID NO: 143, VL последовательности SEQ ID NO: 145 и константную область IgG1 человека (из WO 2016/028656), можно комбинировать с СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P) или СНА.7.518.1.Н4 (S241P). В частности, антитело анти-TIGIT, содержащее VH последовательности SEQ ID NO: 144, VL последовательности SEQ ID NO: 146 и константную область IgG1 человека (из WO 2016/028656), можно комбинировать с СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P) или СНА.7.518.1.Н4 (S241P). В частности, антитело анти-TIGIT, содержащее VH последовательности SEQ ID NO: 149, VL последовательности SEQ ID NO: 151 и константную область IgG1 человека (из WO 2016/028656), можно комбинировать с СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P) или СНА.7.518.1.Н4 (S241P). В частности, антитело анти-TIGIT, содержащее VH последовательности SEQ ID NO: 150, VL последовательности SEQ ID NO: 152 и константную область IgG1 человека (из WO 2016/028656), можно комбинировать с СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P) или СНА.7.518.1.Н4 (S241P).

Кроме того, в одном варианте осуществления данного изобретения антитела анти-TIGIT, описанные в публикации WO 2017/030823 (включенной в данное описание посредством ссылки в полном объеме и конкретно для SEQ ID NO: перечисленных ниже), можно комбинировать с СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P) или СНА.7.518.1.Н4 (S241P). В частности, антитело анти-TIGIT, имеющее вариабельную последовательность легкой цепи SEQ ID NO: 8 и вариабельную последовательность тяжелой цепи SEQ ID NO: 7 (из WO 2017/030823), можно комбинировать с CHA.7.538.1.2.H4 (S241P) или СНА.7.518.1.Н4 (S241P). В частности, антитело анти-TIGIT, имеющее вариабельную последовательность легкой цепи SEQ ID NO: 13 и вариабельную последовательность тяжелой цепи SEQ ID NO: 9 (из WO 2017/030823), можно комбинировать с CHA.7.538.1.2.H4 (S241P) или СНА.7.518.1.Н4 (S241P). В частности, антитело анти-TIGIT, имеющее вариабельную последовательность легкой цепи SEQ ID NO: 24 и вариабельную последовательность тяжелой цепи SEQ ID NO: 23 (из WO 2017/030823), можно комбинировать с CHA.7.538.1.2.H4 (S241P) или СНА.7.518.1.Н4 (S241P). В частности, антитело анти-TIGIT, имеющее вариабельную последовательность легкой цепи SEQ ID NO: 29 и вариабельную последовательность тяжелой цепи SEQ ID NO: 25 (из WO 2017/030823), можно комбинировать с CHA.7.538.1.2.H4 (S241P) или СНА.7.518.1.Н4 (S241P). В некоторых вариантах осуществления данного изобретения антитело анти-TIGIT, имеющее вариабельную последовательность легкой цепи, выбранную из последовательностей SEQ ID NO: 14, 15, 16, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 или 80, и вариабельную последовательность тяжелой цепи, выбранную из последовательностей SEQ ID NO: 10, 11, 12, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55 или 56 (из WO 2017/030823), можно комбинировать с СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P) или СНА.7.518.1.Н4 (S241P). В некоторых вариантах осуществления данного изобретения антитело анти-TIGIT, имеющее вариабельную последовательность легкой цепи, выбранную из последовательностей SEQ ID NO: 14, 15, 16, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 или 80, и вариабельную последовательность тяжелой цепи, выбранную из последовательностей SEQ ID NO: 10, 11, 12, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55 или 56 (из WO2017/030823), можно комбинировать с СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P) или СНА.7.518.1.Н4 (S241P). В некоторых вариантах осуществления данного изобретения антитело анти-TIGIT, имеющее вариабельную последовательность легкой цепи, выбранную из последовательностей SEQ ID NO: 30, 31 или 32, и вариабельную последовательность тяжелой цепи, выбранную из последовательностей SEQ ID NO: 26, 27, 28, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111 или 112 (из WO2017/030823), можно комбинировать с СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P) или СНА.7.518.1.Н4 (S241P). В одном варианте осуществления данного изобретения антитела анти-TIGIT включают антитело Merck, MK7684, в данное время находящееся на этапе клинических исследований (см. во всемирной сети Интернет по адресу clintrials.gov/ct2/show/NCT02964013?term=MK-7684&rank=1). В одном варианте осуществления данного изобретения антитело анти-TIGIT МК-7684 можно комбинировать с СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P) или СНА.7.518.1.Н4 (S241P).

Соответственно, в одном варианте осуществления данного изобретения антитела анти-TIGIT, как описано в патентной заявке США № 2016/0176963 (включенной в данное описание посредством ссылки

- 30 044486 в полном объеме и конкретно для SEQ ID NO: перечисленных ниже), можно комбинировать с СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P) или СНА.7.518.1.Н4 (S241P). В частности, антитело анти-TIGIT, имеющее вариабельную последовательность легкой цепи из SEQ ID NO: 6, 9, 11 или 13 и вариабельную последовательность тяжелой цепи из SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 7, 8, 10 или 12 (из US 2016/0176963), можно комбинировать с CHA.7.538.1.2.H4 (S241P) или СНА.7.518.1.Н4 (S241P). В частности, антитело анти-TIGIT, имеющее вариабельную последовательность легкой цепи из SEQ ID NO: 6 и вариабельную последовательность тяжелой цепи из SEQ ID NO: 2, 3, 4 или 5 (из US 2016/0176963), можно комбинировать с CHA.7.538.1.2.H4 (S241P) или СНА.7.518.1.Н4 (S241P). В частности, антитело анти-TIGIT, имеющее вариабельную последовательность легкой цепи из SEQ ID NO: 9 и вариабельную последовательность тяжелой цепи из SEQ ID NO: 7 или 8 (из US 2016/0176963), можно комбинировать с CHA.7.538.1.2.H4 (S241P) или СНА.7.518.1.Н4 (S241P). В частности, антитело анти-TIGIT, имеющее вариабельную последовательность легкой цепи из SEQ ID NO: 11 и вариабельную последовательность тяжелой цепи из SEQ ID NO: 10 (из US 2016/0176963), можно комбинировать с CHA.7.538.1.2.H4 (S241P) или СНА.7.518.1.Н4 (S241P). В частности, антитело анти-TIGIT, имеющее вариабельную последовательность легкой цепи из SEQ ID NO: 13 и вариабельную последовательность тяжелой цепи из SEQ ID NO: 12 (из US 2016/0176963), можно комбинировать с CHA.7.538.1.2.H4 (S241P) или СНА.7.518.1.Н4 (S241P). В одном варианте осуществления данного изобретения антитела анти-TIGIT включают антитело BMS, BMS98620, в данное время находящееся на этапе клинических исследований (см. во всемирной сети Интернет по адресу clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT02913313?term=BMS-986207&rank=1). В одном варианте осуществления данного изобретения антитело анти-TIGIT BMS-98620 можно комбинировать с СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P) или СНА.7.518.1.Н4 (S241P).

В одном варианте осуществления данного изобретения антитела анти-TIGIT включают антитело Arcus Bio, AB154. В одном варианте осуществления данного изобретения антитело анти-TIGIT АВ154 можно комбинировать с СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P) или СНА.7.518.1.Н4 (S241P).

Кроме того, в одном варианте осуществления данного изобретения антитела анти-TIGIT, описанные в публикации WO 2017/037707 (включенной в данное описание посредством ссылки в полном объеме и конкретно для SEQ ID NO: перечисленных ниже, и, в частности, для последовательностей из SEQ ID NO: перечисленных ниже, и, в частности, для антитела VSIG9#1 (SEQ ID NO: 7 VH и SEQ ID NO: 8 VL) и антитела 258-csl#4 (SEQ ID NO: 18 VH и SEQ ID NO: 19 VL). В частности, антитело анти-TIGIT VSIG9#1 (из WO 2017/037707; SEQ ID NO: 7 VH и SEQ ID NO: 8 VL) можно комбинировать с СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P) или СНА.7.518.1.Н4 (S241P). В частности, антитело анти-TIGIT 258-csl#4 (из WO 2017/037707; SEQ ID NO: 18 VH и SEQ ID NO: 19 VL) можно комбинировать с СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P) или СНА.7.518.1.Н4 (S241P).

Кроме того, в одном варианте осуществления данного изобретения антитела анти-TIGIT, описанные в публикации WO 2017/059095 (включенной в данное описание посредством ссылки в полном объеме и конкретно для SEQ ID NO: перечисленных ниже, и, в частности, для последовательностей, описанных в том документе. В частности, антитело анти-TIGIT, содержащее последовательность VH из SEQ ID NO: 13 и последовательность V_L из SEQ ID NO: 26 (из WO 2017/059095), можно комбинировать с СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P) или СНА.7.518.1.Н4 (S241P). В частности, антитело анти-TIGIT, содержащее последовательность V_H из SEQ ID NO: 12 и последовательность V_L из SEQ ID NO: 26 (из WO 2017/059095), можно комбинировать с СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P) или СНА.7.518.1.Н4 (S241P). В частности, антитело анти-TIGIT, содержащее последовательность V_H из SEQ ID NO: 14 и последовательность VL из SEQ ID NO: 26 (из wO 2017/059095), можно комбинировать с СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P) или СНА.7.518.1.Н4 (S241P). В частности, антитело анти-TIGIT, содержащее последовательность VH из SEQ ID NO: 15 и последовательность VL из SEQ ID NO: 26 (из WO 2017/059095), можно комбинировать с СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P) или СНА.7.518.1.Н4 (S241P). В частности, антитело анти-TIGIT, содержащее последовательность VH из SEQ ID NO: 9 и последовательность VL из SEQ ID NO: 26 (из WO 2017/059095), можно комбинировать с СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P) или СНА.7.518.1.Н4 (S241P). В частности, антитело анти-TIGIT, содержащее последовательность VH из SEQ ID NO: 10 и последовательность VL из SEQ ID NO: 26 (из wO 2017/059095), можно комбинировать с СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P) или СНА.7.518.1.Н4 (S241P). В частности, антитело анти-TIGIT, содержащее последовательность VH из SEQ ID NO: 11 и последовательность VL из SEQ ID NO: 26 (из WO 2017/059095), можно комбинировать с СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P) или СНА.7.518.1.Н4 (S241P). В частности, антитело анти-TIGIT, содержащее тяжелую цепь из SEQ ID NO: 99 и легкую цепь из SEQ ID NO: 92; или (it) тяжелую цепь из SEQ ID NO: 100 и легкую цепь из SEQ ID NO: 92 (из WO 2017/059095), можно комбинировать с СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P) или СНА.7.518.1.Н4 (S241P). В частности, антитело анти-TIGIT, содержащее тяжелую цепь из SEQ ID NO: 97 и легкую цепь из SEQ ID NO: 92; или (ii) тяжелую цепь из SEQ ID NO: 98 и легкую цепь из SEQ ID NO: 92 (из WO 2017/059095), можно комбинировать с СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P) или СНА.7.518.1.Н4 (S241P). В частности, антитело анти-TIGIT, содержащее тяжелую цепь из SEQ ID NO: 101 и легкую цепь из SEQ ID NO: 92; или (ii) тяжелую цепь из SEQ ID NO: 102 и легкую цепь мз SEQ ID NO: 92 (из WO 2017/059095), можно комбинировать с СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P) или СНА.7.518.1.Н4 (S241P). В частности, антитело анти-TIGIT, содержащее тяжелую цепь из SEQ ID NO: 103 и легкую цепь

- 31 044486 из SEQ ID NO: 92; или (ii) тяжелую цепь из SEQ ID NO: 104 и легкую цепь из SEQ ID NO: 92 (из WO 2017/059095), можно комбинировать с СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P) или СНА.7.518.1.Н4 (S241P). В частности, антитело анти-TIGIT, содержащее тяжелую цепь из SEQ ID NO: 90 и легкую цепь из SEQ ID NO: 92; или (ii) тяжелую цепь из SEQ ID NO: 91 и легкую цепь из SEQ ID NO: 92 (из WO 2017/059095), можно комбинировать с СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P) или СНА.7.518.1.Н4 (S241P). В частности, антитело антиTIGIT, содержащее тяжелую цепь из SEQ ID NO: 93 и легкую цепь из SEQ ID NO: 92; или (ii) тяжелую цепь из SEQ ID NO: 94 и легкую цепь из SEQ ID NO: 92 (из WO 2017/059095), можно комбинировать с СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P) или СНА.7.518.1.Н4 (S241P). В частности, антитело анти-TIGIT, содержащее тяжелую цепь из SEQ ID NO: 95 и легкую цепь из SEQ ID NO: 92; или (ii) тяжелую цепь из SEQ ID NO: 96 и легкую цепь из SEQ ID NO: 92 (из WO 2017/059095), можно комбинировать с СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P) или СНА.7.518.1.Н4 (S241P). Кроме того, в одном варианте осуществления данного изобретения антитела анти-TIGIT, как описано в публикации WO 2016/106302 (включенной в данное описание посредством ссылки в полном объеме и конкретно для SEQ ID NO: перечисленных ниже, и, в частности, для последовательностей конкретных последовательностей, описанных в той публикации. В частности, антитело анти-TIGIT, содержащее последовательность тяжелой цепи, выбранную из SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 7, 8, 10 или 12 (из WO 2016/106302), и последовательность легкой цепи из SEQ ID NO: 6, 9, 11 или 13 (из WO 2016/106302), можно комбинировать с СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P) или СНА.7.518.1.Н4 (S241P). В частности, антитело анти-TIGIT 22G2 (из WO 2016/106302) можно комбинировать с СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P) или СНА.7.518.1.Н4 (S241P). В частности, антитело анти-TIGIT 11G11 (из WO 2016/106302) можно комбинировать с СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P) или СНА.7.518.1.Н4 (S241P). В частности, антитело анти-TIGIT 15А6 (из WO 2016/106302) можно комбинировать с СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P) или СНА.7.518.1.Н4 (S241P).

Кроме того, в одном варианте осуществления данного изобретения антитела анти-TIGIT, описанные в публикации патента США № 2017281764 (включенной в данное описание посредством ссылки в полном объеме и конкретно для SEQ ID NO: перечисленных ниже, и, в частности, для последовательностей, описанных в той публикации. В частности, антитело анти-TIGIT, содержащее последовательность VH из SEQ ID NO: 10 и последовательность V_L из SEQ ID NO: 14 (из US 2017281764), можно комбинировать с СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P) или СНА.7.518.1.Н4 (S241P). В частности, антитело анти-TIGIT, содержащее последовательность V_H из SEQ ID NO: 18 и последовательность V_L из SEQ ID NO: 22 (из US 2017281764), можно комбинировать с СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P) или СНА.7.518.1.Н4 (S241P). В частности, антитело анти-TIGIT, содержащее последовательность VH из SEQ ID NO: 26 и последовательность V_L из SEQ ID NO: 30 (из US 2017281764), можно комбинировать с СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P) или СНА.7.518.1.Н4 (S241P). В частности, антитело анти-TIGIT, содержащее последовательность VH из SEQ ID NO: 35 и последовательность VL из SEQ ID NO: 37 (из US 2017281764), можно комбинировать с СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P) или СНА.7.518.1.Н4 (S241P). В частности, антитело анти-TIGIT, содержащее последовательность VH из SEQ ID NO: 34 и последовательность VL из SEQ ID NO: 36 (из US 2017281764), можно комбинировать с СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P) или СНА.7.518.1.Н4 (S241P).

В другом варианте осуществления данного изобретения антитела анти-TIGIT, описанные в международной публикации патента № WO 2015/009856(включенной в данное описание посредством ссылки в полном объеме и конкретно для SEQ ID NO: перечисленных ниже, и, в частности, для последовательностей, описанных в том документе (см. также международную публикацию патента № WO 2016/011264). В частности, антитело анти-TIGIT, содержащее последовательность VH из SEQ ID NO: 15 и последовательность V_L из SEQ ID NO: 13 (из WO 2015/009856), можно комбинировать с СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P) или СНА.7.518.1.Н4 (S241P). В частности, антитело анти-TIGIT, содержащее последовательность VH из SEQ ID NO: 16 и последовательность VL из SEQ ID NO: 14 (из WO 2015/009856), можно комбинировать с СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P) или CHA.7.518.1.H4 (S241P).

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения антитело анти-TIGIT представляет собой антитело, описанное в любом из следующих документов: заявка на патент США № 20170037133, международная публикация патента № WO 2017/048824; MBSA43 (коммерчески доступное от компании eBioscience), представляет собой антитело анти-TIGIT pab2197 или pab2196 (заявка на патент США № 2017/0081409), EOS084448, CASC-674 (доступное от компании Adimab LLC). В частности, антитело анти-TIGIT, как описано в заявке на патент США № 2017/0037133, можно комбинировать с СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P) или СНА.7.518.1.Н4 (S241P). В частности, антитело анти-TIGIT, как описано в международной публикации патента № WO 2017/048824, можно комбинировать с СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P) или СНА.7.518.1.Н4 (S241P). В частности, антитело анти-TIGIT MBSA43 можно комбинировать с СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P) или СНА.7.518.1.Н4 (S241P). В частности, антитело анти-TIGIT pab2197 можно комбинировать с СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P) или СНА.7.518.1.Н4 (S241P). В частности, антитело анти-TIGIT pab2196 можно комбинировать с СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P) или СНА.7.518.1.Н4 (S241P). В частности, антитело анти-TIGIT EOS084448 можно комбинировать с СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P) или СНА.7.518.1.Н4 (S241P). В частности, антитело анти-TIGIT CASC-674 можно комбинировать с СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P) или СНА.7.518.1.Н4 (S241P).

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения антитело анти-TIGIT представляет со

- 32 044486 бой антитело, описанное в патенте США № 9713364 (включен в данное описание посредством ссылки в полном объеме). В некоторых вариантах осуществления данного изобретения антитело анти-TIGIT представляет собой PTZ-201 (ASP8374). В частности, антитело анти-TIGIT PTZ-201 (ASP8374) можно комбинировать с СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P) или СНА.7.518.1.Н4 (S241P). В некоторых вариантах осуществления данного изобретения антитело анти-TIGIT представляет собой антитело, выбранное из группы, состоящей из mAb1, МАВ2, МАВЗ, МАВ4, МАВ5, МАВ6, МАВ7, МАВ8, МАВ9, МАВ10, МАВ11, МАВ12, МАВ13, МАВ14, МАВ15, МАВ16, МАВ17, МАВ18, 40 МАВ19, МАВ20 или МАВ21, как описано в патенте США № 9713364. В частности, антитело анти-TIGIT МАВ1 из патента США N 9713364 можно комбинировать с СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P) или СНА.7.518.1.Н4 (S241P). В частности, антитело антиTIGIT МАВ2 из патента США № 9713364 можно комбинировать с СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P) или СНА.7.518.1.Н4 (S241P). В частности, антитело анти-TIGIT МАВ3 из патента США № 9713364 можно комбинировать с СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P) или СНА.7.518.1.Н4 (S241P). В частности, антитело антиTIGIT МАВ4 из патента США № 9713364 можно комбинировать с СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P) или СНА.7.518.1.Н4 (S241P). В частности, антитело анти-TIGIT МАВ5 из патента США № 9713364 можно комбинировать с СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P) или СНА.7.518.1.Н4 (S241P). В частности, антитело антиTIGIT МАВ6 из патента США № 9713364 можно комбинировать с СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P) или СНА.7.518.1.Н4 (S241P). В частности, антитело анти-TIGIT МАВ7 из патента США № 9713364 можно комбинировать с СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P) или СНА.7.518.1.Н4 (S241P). В частности, антитело антиTIGIT МАВ8 из патента США № 9713364 можно комбинировать с СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P) или СНА.7.518.1.Н4 (S241P). В частности, антитело анти-TIGIT МАВ9 из патента США № 9713364 можно комбинировать с СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P) или СНА.7.518.1.Н4 (S241P). В частности, антитело антиTIGIT МАВ10 из патента США № 9713364 можно комбинировать с СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P) или СНА.7.518.1.Н4 (S241P). В частности, антитело анти-TIGIT МАВ11 из патента США № 9713364 можно комбинировать с СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P) или СНА.7.518.1.Н4 (S241P). В частности, антитело антиTIGIT МАВ12 из патента США № 9713364 можно комбинировать с СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P) или СНА.7.518.1.Н4 (S241P). В частности, антитело анти-TIGIT МАВ13 из патента США № 9713364 можно комбинировать с СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P) или СНА.7.518.1.Н4 (S241P). В частности, антитело антиTIGIT МАВ14 из патента США № 9713364 можно комбинировать с СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P) или СНА.7.518.1.Н4 (S241P). В частности, антитело анти-TIGIT МАВ15 из патента США № 9713364 можно комбинировать с СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P) или СНА.7.518.1.Н4 (S241P). В частности, антитело антиTIGIT МАВ16 из патента США № 9713364 можно комбинировать с СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P) или СНА.7.518.1.Н4 (S241P). В частности, антитело анти-TIGIT МАВ17 из патента США № 9713364 можно комбинировать с СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P) или СНА.7.518.1.Н4 (S241P). В частности, антитело антиTIGIT МАВ18 из патента США № 9713364 можно комбинировать с СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P) или СНА.7.518.1.Н4 (S241P). В частности, антитело анти-TIGIT МАВ19 из патента США № 9713364 можно комбинировать с СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P) или СНА.7.518.1.Н4 (S241P). В частности, антитело антиTIGIT МАВ20 из патента США № 9713364 можно комбинировать с СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P) или СНА.7.518.1.Н4 (S241P). В частности, антитело анти-TIGIT МАВ21 из патента США № 9713364 можно комбинировать с СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P) или СНА7.518.1.Н4 (S241P).

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения антитело анти-TIGIT представляет собой 10А7, 1F4, 14А6, 28Н5, 31С6, 15А6, 22G2, 11G11 и/или 10D7, содержание каждого из которых включено в данное описание посредством ссылки в полном объеме. В частности, антитело анти-TIGIT 10А7 можно комбинировать с СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P) или СНА.7.518.1.Н4 (S241P). В частности, антитело анти-TIGIT 1F4 можно комбинировать с СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P) или СНА.7.518.1.Н4 (S241P). В частности, антитело анти-TIGIT 14А6 можно комбинировать с СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P) или СНА.7.518.1.Н4 (S241P). В частности, антитело анти-TIGIT 28Н5 можно комбинировать с СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P) или СНА.7.518.1.Н4 (S241P). В частности, антитело анти-TIGIT 31С6 можно комбинировать с СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P) или СНА.7.518.1.Н4 (S241P). В частности, антитело анти-TIGIT 15А6 можно комбинировать с СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P) или СНА.7.518.1.Н4 (S241P). В частности, антитело антиTIGIT 22G2 можно комбинировать с СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P) или СНА.7.518.1.Н4 (S241P). В частности, антитело анти-TIGIT 11G11 можно комбинировать с СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P) или СНА.7.518.1.Н4 (S241P). В частности, антитело анти-TIGIT 10D7 можно комбинировать с СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P) или СНА7.518.1.Н4 (S241P).

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения антитело анти-TIGIT представляет собой одно из антител, описанных в международной публикации патента WO 2016/028656, в полном объеме включенной в данный документ. В частности, антитела анти-TIGIT, представленные в международной публикации патента № WO 2016/028656 (и воспроизведенные в данном документе на фиг. 3), можно комбинировать с СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P) или СНА. 7.518.1.Н4 (S241P).

Антитела анти-TIGIT, описанные в данном документе, могут найти применение в соответствии со способами трехкомпонентной комбинированной терапии по данному изобретению, которые помечены следующим образом. Такие антитела к TIGIT имеют ссылочные номера, например, СРА.9.086. Они представляют комбинацию вариабельных тяжелых цепей и вариабельных легких цепей, как продемонст

- 33 044486 рировано, например, на фиг. 3, при том понимании, что эти антитела включают две тяжелые цепи и две легкие цепи. CPA.9.086.VH относится к части вариабельной тяжелой цепи СРА.9.086, в то время как CPA.9.O86.VL представляет собой вариабельную легкую цепь. СРА.9.086.vhCDR1, CPA.9.086.vhCDR2, CPA.9.086.vhCDR3, CPA.9.086.vlCDR1, CPA. 9.086.vlCDR2 и

CPA.9.086.v1CDR3, относятся к указанным CDR. СРА.9.086.НС относится ко всей тяжелой цепи (например, вариабельный и константный домен) этой молекулы, а CPA.9.O86.LC относится ко всей легкой цепи (например, вариабельный и константный домен) одной и той же молекулы. В целом, легкая цепь каппа человека применяется в данном изобретении для константного домена каждого фагового антитела (или антитела гуманизированной гибридомы), хотя в некоторых вариантах осуществления применяется константный домен легкой цепи лямбда. СРА.9.086.Ш относится к полноразмерному антителу, содержащему вариабельные домены тяжелой и легкой цепи, в том числе константный домен IgG1 человека (следовательно, H1; IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4 последовательности приведены на фиг. 1, например). Соответственно, СРА.9.086.Н2 будет антителом, содержащим вариабельные домены СРА.9.086, связанные с IgG2 человека. СРА.9.О86.НЗ будет антителом, содержащим вариабельные домены СРА.9.086, связанные с IgG3 человека, а СРА.9.086.Н4 будет антителом, содержащим вариабельные домены СРА.9.086, связанные с IgG4 человека. Следует обратить внимание, что в некоторых случаях IgG человека могут иметь дополнительные мутации, такие как описаны ниже, и это может быть обозначено соответствующим образом. Например, во многих вариантах осуществления данного изобретения в IgG4 человека может быть мутация S241P, и это может быть обозначено, например, как СРА.9.086.Н4 (S241P). Последовательность IgG4 человека с этим шарнирным вариантом S241P приведена на фиг. 1. Другими потенциальными вариантами являются IgG1 (N297A) (или другие варианты, которые устраняют гликозилирование в этом сайте и, таким образом, многие эффекторные функции, связанные со связыванием FcYRIIIa), и IgG1 (D265A), который уменьшает связывание с рецепторами FcyR. Антитела анти-TIGIT для применения в данном изобретении могут содержать любую из последовательностей доменов антитела к TIGIT. Антитела анти-TIGIT для применения в данном изобретении могут содержать любой из доменов, связывающих антиген TIGIT.

В данном изобретении дополнительно предлагаются вариабельные домены тяжелой и легкой цепи, а также полноразмерные тяжелые и легкие цепи.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения предлагаются scFv, которые связываются с TIGIT, содержащие вариабельный домен тяжелой цепи и вариабельный домен легкой цепи, связанные с помощью линкера scFv, как описано выше. Домены VL и VH могут находиться в любой ориентации, например, от N- до С-конца VH-линкер-VL или VL-линкер VH. Они названы по их составных частях; например, scFv-CPA.9.086.VH-линкер-VL или scFv-CPA.9.086.VL-линkер-VH. Таким образом, scFv-CPA.9.086 может быть в любой ориентации. Антитела анти-TIGIT для применения в данном изобретении могут содержать любые scFv, которые связываются с TIGIT. Антитела анти-TIGIT для применения в данном изобретении могут содержать любые scFv, которые связываются с TIGIT. Антитела анти-TIGIT для применения в данном изобретении могут включать в себя любой элемент из следующих:

СРА.9.018, СРА.9.018.VH, CPA.9.018.VL, СРА.9.018.НС, CPA.9.018.LC,

СРА.9.018.Н1, СРА.9.018.Н2, СРА.9.018.НЗ, СРА.9.018.Н4; CPA.9.018.H4(S241P);

CPA.9.018.vhCDRl, CPA.9.018.vhCDR2, CPA.9.018.vhCDR3, CPA.9.018.vlCDRl,

CPA.9.018.V1CDR2, CPA.9.018.vlCDR3 и scFv-CPA.9.018;

CPA.9.027, CPA.9.027.VH, CPA.9.027.VL, CPA.9.027.HC, CPA.9.027.LC,

CPA.9.027.H1, CPA.9.027.H2, CPA.9.027.H3, CPA.9.027.H4; CPA.9.018.H4(S241P);

- 34 044486

CPA.9.027.vhCDRl, CPA.9.027.vhCDR2, CPA.9.027.vhCDR3, CPA.9.027.vlCDRl,

CPA.9.027.vlCDR2, CPA.9.027.vlCDR3 и scFv-CPA.9.027;

CPA.9.049, CPA.9.049.VH, CPA.9.049.VL, CPA.9.049.HC, CPA.9.049.LC,

CPA.9.049.H1, CPA.9.049.H2, CPA.9.049.H3; CPA.9.049.H4; CPA.9.049.H4(S241P);

CPA.9.049.vhCDRl, CPA.9.049.vhCDR2, CPA.9.049.vhCDR3, CPA.9.049.vlCDRl,

CPA.9.049.vlCDR2, CPA.9.049.vlCDR3 и scFv-CPA.9.049;

CPA.9.057, CPA.9.057.VH, CPA.9.057.VL, CPA.9.057.HC, CPA.9.057.LC,

CPA.9.057.H1, CPA.9.057.H2, CPA.9.057.H3; CPA.9.057.H4; CPA.9.057.H4(S241P);

CPA.9.057.vhCDRl, CPA.9.057.vhCDR2, CPA.9.057.vhCDR3, CPA.9.057.vlCDRl,

CPA.9.057.vlCDR2, CPA.9.057.vlCDR3 и scFv-CPA.9.057;

CPA.9.059, CPA.9.059.VH, CPA.9.059.VL, CPA.9.059.HC, CPA.9.059.LC,

CPA.9.059.H1, CPA.9.059.H2, CPA.9.059.H3; CPA.9.059.H4; CPA.9.059.H4(S241P);

CPA.9.059.vhCDRl, CPA.9.059.vhCDR2, CPA.9.059.vhCDR3, CPA.9.059.vlCDRl,

CPA.9.059.vlCDR2, CPA.9.059.vlCDR3 и scFv-CPA.9.059;

CPA.9.083, CPA.9.083.VH, CPA.9.083.VL, CPA.9.083.HC, CPA.9.083.LC,

CPA.9.083.H1, CPA.9.083.H2, CPA.9.083.H3; CPA.9.083.H4; CPA.9.083.H4(S241P);

CPA.9.083.vhCDRl, CPA.9.083 ,vhCDR2, CPA.9.083.vhCDR3, CPA.9.083 vlCDRl,

CPA.9.083. vlCDR2, CPA.9.083.vlCDR3 и scFv-CPA.9.083;

CPA.9.086, CPA.9.086.VH, CPA.9.086.VL, CPA.9.086.HC, CPA.9.086.LC,

CPA.9.086.H1, CPA.9.086.H2, CPA.9.086.H3; CPA.9.086.H4; CPA.9.086.H4(S241P);

CPA.9.086.vhCDRl, CPA.9.086.vhCDR2, CPA.9.086.vhCDR3, CPA.9.086.vlCDRl,

CPA.9.086.vlCDR2, CPA.9.086.vlCDR3 и scFv-CPA.9.086;

CPA.9.089, CPA.9.089.VH, CPA.9.089.VL, CPA.9.089.HC, CPA.9.089.LC,

CPA.9.089.H1, CPA.9.089.H2, CPA.9.089.H3; CPA.9.089.H4; CPA.9.089.H4(S241P);

CPA.9.089.vhCDRl, CPA.9.089.vhCDR2, CPA.9.089.vhCDR3, CPA.9.089.vlCDRl,

CPA.9.089.vlCDR2, CPA.9.089.vlCDR3 и scFv-CPA.9.089;

CPA.9.093, CPA.9.093. VH, CPA.9.093.VL, CPA.9.093.HC, CPA.9.093.LC,

CPA.9.093.H1, CPA.9.093.H2, CPA.9.093 H3; CPA.9.093.H4; CPA.9.093.H4(S241P);

CPA.9.093.vhCDRl, CPA.9.093 ,vhCDR2, CPA.9.093.vhCDR3, CPA.9.093 .vlCDRl,

CPA.9.093. vlCDR2, CPA.9.093 ,vlCDR3 и scFv-CPA.9.093;

CPA.9.101, CPA.9.101.VH, CPA.9.101.VL, CPA.9.101.HC, CPA.9.101.LC,

CPA.9.101.H1, CPA.9.101.H2, CPA.9.101.H3; CPA.9.101.H4; CPA.9.101.H4(S241P);

CPA.9.101.vhCDRl, CPA.9.101.vhCDR2, CPA.9.101.vhCDR3, CPA.9.101.vlCDRl,

CPA.9.101.V1CDR2, CPA.9.101.vlCDR3 и scFv-CPA.9.101; а также

CPA.9.103, CPA.9.103.VH, CPA.9.103.VL, CPA.9.103.HC, CPA.9.103.LC,

CPA.9.103.H1, CPA.9.103.H2, CPA.9.103 H3; CPA.9.103 H4;

CPA.9.103.H4(S241P); CPA.9.103.vhCDRl, CPA.9.103.vhCDR2, CPA.9.103.vhCDR3,

CPA.9.103.vlCDRl, CPA.9.103.vlCDR2, CPA.9.103.vlCDR3 и scFv-CPA.9.103.

Кроме того, в данном изобретении предлагается ряду антител к СНА, которые представляют собой мышиные антитела, полученные из гибридом. Как хорошо известно в данной области техники, шесть CDR являются пригодными, когда их помещают либо в каркасные вариабельные области тяжелой и легкой цепи человека, либо когда вариабельные области тяжелой и легкой цепи гуманизированы. Соответственно, в данном изобретении предлагаются антитела, обычно полноразмерные или домены scFv, которые содержат следующие наборы CDR, последовательности которых продемонстрированы на фиг. 3 и/или в перечне последовательностей:

-35 044486

CHA.9.536.1, CHA.9.536. l.VH, CHA.9.536.1. VL, CHA.9.536.1.НС, CHA.9.536.1.LC, CHA.9.536.1.Hl, CHA.9.536.1. H2, CHA.9.536.1. H3; CHA.9.536.1.H4,

CHA.9.536.1.H4(S241P), CHA.9.536.1.vhCDRl, CHA.9.536.1.vhCDR2,

CHA.9.536.1.vhCDR3, CHA.9.536.1.vlCDRl, CHA.9.536.1.vlCDR2 и CHA.9.536.1.vhCDR3;

CHA.9.536.3, CHA.9.536.3.VH, CHA.9.536.3.VL, CHA.9.536.3.HC, CHA.9.536.3.LC,

CHA.9.536.3.H1, CHA.9.536.3.H2, CHA.9.536.3.H3; CHA.9.536.3.H4,

CHA.9.536.3.H4(S241P); CHA.9.536.3.vhCDRl, CHA.9.536.3.vhCDR2,

CHA.9.536.3.vhCDR3, CHA.9.536.3.vlCDRl, CHA.9.536.3.vlCDR2 и CHA.9.536.3.vhCDR3;

CHA.9.536.4, CHA.9.536.4.VH, CHA.9.536.4.VL, CHA.9.536.4.HC, CHA.9.536.4.LC,

CHA.9.536.4.H1, CHA.9.536.4.H2, CHA.9.536.4.H3; CHA.9.536.4.H4,

CHA.9.536.4.H4(S241P), CHA.9.536.4.vhCDRl, CHA.9.536.4.vhCDR2,

CHA.9.536.4.vhCDR3, CHA.9.536.4.vlCDRl, CHA.9.536.4.vlCDR2 и CHA.9.536.4.vhCDR3;

CHA.9.536.5, CHA.9.536.5.VH, CHA.9.536.5.VL, CHA.9.536.5.HC, CHA.9.536.5.LC,

CHA.9.536.5.H1, CHA.9.536.5.H2, CHA.9.536.5.H3; CHA.9.536.5.H4,

CHA.9.536.5.H4(S241P), CHA.9.536.5.vhCDRl, CHA.9.536.5.vhCDR2,

CHA.9.536.5.vhCDR3, CHA.9.536.5.vlCDRl, CHA.9.536.5.vlCDR2 и CHA.9.536.5.vhCDR3;

CHA.9.536.6, CHA.9.536.6.VH, CHA.9.536.6.VL, CHA.9.536.6.HC, CHA.9.536.6.LC, CHA.9.536.6.H1, CHA.9.536.6.H2, CHA.9.536.6.H3; CHA.9.536.6.H4, CHA.9.536.6.vhCDRl, CHA.9.536.6.vhCDR2, CHA.9.536.6.vhCDR3, CHA.9.536.6.vlCDRl, CHA.9.536.6.vlCDR2 и CHA.9.536.6.vhCDR3;

CHA.9.536.7, CHA.9.536.7.VH, CHA.9.536.7.VL, CHA.9.536.7.HC, CHA.9.536.7.LC,

CHA.9.536.7.H1, CHA.9.536.7.H2, CHA.9.536.7.H3; CHA.9.536.7.H4,

CHA.9.536.5.H4(S241P); CHA.9.536.7.vhCDRl, CHA.9.536.7.vhCDR2,

CHA.9.536.7.vhCDR3, CHA.9.536.7.vlCDRl, CHA.9.536.7.vlCDR2 и CHA.9.536.7.vhCDR3;

- 36 044486

CHA.9.536.8, CHA.9.536.8.VH, CHA.9.536.8.VL, CHA.9.536.8.HC,

CHA.9.536.8.LC, CHA.9.536.8.H1, CHA.9.536.8.H2, CHA.9.536.8.H3; CHA.9.536.8.H4, CHA.9.536.8.H4(S241P), CHA.9.536.8.vhCDRl, CHA.9.536.8.vhCDR2,

HA.9.536.8.vhCDR3, CHA.9.536.8.vlCDRl, CHA.9.536.8.vlCDR2 и

CHA.9.536.8.vhCDR3; CHA.9.560.1, CHA. 9,560,1VH, CHA. 9.560. l.VL, CHA. 9.560. l.HC, CHA. 9.560.1.LC, СНА. 9.560.1.H1, СНА. 9.560.1.H2, СНА. 9.560.1.H3; CHA. 9.560.1.H4, CHA. 9.560.1.H4 (S241P), CHA. 9.560.l.vhCDRl, CHA. 9.560.l.vhCDR2, CHA. 9.560.l.vhCDR3, CHA. 9.560.l.vlCDRl, CHA. 9.560. LvlCDR2 и CHA. 9.560.l.vhCDR3;

CHA.9.560.3, CHA. 9.560. 3VH, CHA. 9.560. 3.VL, CHA. 9.560. 3.HC, CHA. 9.560. 3.LC, CHA. 9.560. 3.H1, CHA. 9.560. 3.H2, CHA. 9.560. З.НЗ; CHA.9.560.3.H4, CHA.9.560.3.H4 (S241P); CHA. 9.560. 3.vhCDRl, CHA. 9.560. 3.vhCDR2, CHA. 9.560. 3.vhCDR3, CHA. 9.560. 3.vlCDRl, CHA. 9.560. 3.vlCDR2 и CHA. 9.560. 3.vhCDR3;

CHA.9.560.4, CHA. 9.560. 4VH, CHA. 9.560. 4.VL, CHA. 9.560. 4.HC, CHA. 9.560. 4.LC, CHA. 9.560. 4.H1, CHA. 9.560. 4.H2, CHA. 9.560. 4.H3; CHA.9.560.4.H4, CHA.9.560.4.H4 (S241P), CHA. 9.560. 4.vhCDRl, CHA. 9.560. 4.vhCDR2, CHA. 9.560. 4.vhCDR3, CHA. 9.560. 4.vlCDRl, CHA. 9.560. 4.vlCDR2 и CHA. 9.560. 4.vhCDR3;

CHA.9.560.5, CHA. 9.560. 5VH, CHA. 9.560. 5.VL, CHA. 9.560. 5.HC, CHA. 9.560. 5.LC, CHA. 9.560. 5.H1, CHA. 9.560. 5.H2, CHA. 9.560. 5.H3; CHA. 9.560. 5.H4, CHA. 9.560. 5.vhCDRl, CHA. 9.560. 5.vhCDR2, CHA. 9.560. 5.vhCDR3, CHA. 9.560. 5.vlCDRl, CHA. 9.560. 5.V1CDR2 и CHA. 9.560. 5.vhCDR3;

CHA.9.560.6, CHA. 9.560. 6VH, CHA. 9.560. 6.VL, CHA. 9.560. 6.HC, CHA. 9.560. 6.LC, CHA. 9.560. 6.H1, CHA. 9.560. 6.H2, CHA. 9.560. 6.H3; CHA.9.560.6.H4, CHA.9.560.6.H4 (S241P), CHA. 9.560. 6.vhCDRl, CHA. 9.560. 6.vhCDR2, CHA. 9.560. 6.vhCDR3, CHA. 9.560. 6.vlCDRl, CHA. 9.560. 6.vlCDR2 и CHA. 9.560. 6.vhCDR3;

CHA.9.560.7, CHA. 9.560. 7VH, CHA. 9.560. 7.VL, CHA. 9.560. 7.HC, CHA. 9.560. 7.LC, CHA. 9.560. 7.H1, CHA. 9.560. 7.H2, CHA. 9.560. 7.H3; CHA.9.560.7.H4; CHA.9.560.7.H4 (S241P); CHA. 9.560. 7.vhCDRl, CHA. 9.560. 7.vhCDR2, CHA. 9.560. 7.vhCDR3, CHA. 9.560. 7.vlCDRl, CHA. 9.560. 7.vlCDR2 и CHA. 9.560. 7.vhCDR3;

CHA.9.560.8, CHA. 9.560. 8VH, CHA. 9.560. 8.VL, CHA. 9.560. 8.HC, CHA. 9.560. 8.LC, CHA. 9.560. 8.H1, CHA. 9.560. 8.H2, CHA. 9.560. 8.H3; CHA.9.560.8.H4, CHA.9.560.8.H4 (S241P); CHA. 9.560. 8.vhCDRl, CHA. 9.560. 8.vhCDR2, CHA. 9.560. 8.vhCDR3, CHA. 9.560. 8.vlCDRl, CHA. 9.560. 8.vlCDR2 и CHA. 9.560. 8.vhCDR3;

CHA.9.546.1, CHA. 9. 546,1VH, CHA. 9. 546.l.VL, CHA. 9. 546. l.HC, CHA. 9. 546.1.LC, CHA. 9. 546.1.Hl, CHA. 9. 546.1.H2, CHA. 9. 546.1.H3; CHA.9.546.1.H4,

- 37 044486

CHA.9.546.1.H4 (S241P), СНА. 9. 546.1.vhCDRl, СНА. 9. 546.l.vhCDR2, СНА.

9. 546.1.vhCDR3, СНА. 9. 546.1.vlCDRl, СНА. 9. 546.1.vlCDR2 и СНА. 9. 546.1.vhCDR3;

СНА.9.547.1, СНА. 9. 547,1VH, СНА. 9. 547.1.VL, СНА. 9. 547.1.НС, СНА. 9. 547.1.LC, СНА. 9. 547.1.Н1, СНА. 9. 547.1.Н2, СНА. 9. 547.1.НЗ; СНА.9.547.1.Н4, СНА.9.547.1.Н4 (S241P), СНА. 9. 547.1.vhCDRl, СНА. 9. 547.1.vhCDR2, СНА. 9. 547.1.vhCDR3, СНА. 9. 547.1.vlCDRl, СНА. 9. 547.1.vlCDR2 и СНА. 9. 547.1.vhCDR3;

СНА.9.547,2, СНА. 9. 547, 2VH, СНА. 9. 547, 2.VL, СНА. 9. 547, 2.НС, СНА. 9. 547, 2.LC, СНА. 9. 547. 2.Н1, СНА. 9. 547. 2.Н2, СНА. 9. 547. 2.НЗ; СНА.9.547.2.Н4, СНА.9.547.2.Н4 (S241P), СНА. 9. 547. 2,vhCDRl, СНА. 9. 547. 2.vhCDR2, СНА. 9. 547. 2.vhCDR3, СНА. 9. 547. 2.V1CDR1, СНА. 9. 547. 2.V1CDR2 и СНА. 9. 547. 2.vhCDR3;

СНА.9.547.3, СНА. 9. 547. 3VH, СНА. 9. 547. 3.VL, СНА. 9. 547. З.НС, СНА. 9. 547. 3.LC, СНА. 9. 547. З.Н1, СНА. 9. 547. З.Н2, СНА. 9. 547. З.НЗ; СНА.9.547.3.Н4, СНА.9.547.3.Н4 (S241P), СНА. 9. 547. 3.vhCDRl, СНА. 9.547. 3.vhCDR2, СНА. 9. 547. 3.vhCDR3, СНА. 9. 547. 3.V1CDR1, СНА. 9. 547. 3.V1CDR2 и СНА. 9. 547. 3.vhCDR3;

СНА.9.547.4, СНА. 9. 547. 4VH, СНА. 9. 547. 4.VL, СНА. 9. 547. 4.НС, СНА. 9.547. 4.LC, СНА. 9. 547. 4.Н1, СНА. 9. 547. 4.Н2, СНА. 9. 547. 4.НЗ; СНА.9.547.4.Н4, СНА.9.547.4.Н4 (S241P), СНА. 9. 547. 4.vhCDRl, СНА. 9. 547. 4.vhCDR2, СНА. 9. 547. 4.vhCDR3, СНА. 9. 547. 4.V1CDR1, СНА. 9. 547. 4.vlCDR2 и СНА. 9. 547. 4.vhCDR3;

СНА.9.547.6, СНА. 9. 547. 6 VH, СНА. 9. 547. 6.VL, СНА. 9. 547. 6.НС, СНА. 9. 547. 6.LC, СНА. 9. 547. 6.Н1, СНА. 9. 547. 6.Н2, СНА. 9. 547. 6.НЗ; СНА.9.547.6.Н4, СНА.9.547.6.Н4 (S241P), СНА. 9. 547. 6,vhCDRl, СНА. 9. 547. 6.vhCDR2, СНА. 9. 547. 6.vhCDR3, СНА. 9. 547. 6.V1CDR1, СНА. 9. 547. 6.V1CDR2 и СНА. 9. 547. 6.vhCDR3;

СНА.9.547.7, СНА. 9. 547. 7VH, СНА. 9. 547. 7.VL, СНА. 9. 547. 7.НС, СНА. 9. 547. 7.LC, СНА. 9. 547. 7.Н1, СНА. 9. 547. 7.Н2, СНА. 9. 547. 7.НЗ; СНА.9.547.7.Н4, СНА.9.547.7.Н4 (S241P), СНА. 9. 547. 7,vhCDRl, СНА. 9. 547. 7.vhCDR2, СНА. 9. 547. 7.vhCDR3, СНА. 9. 547. 7.V1CDR1, СНА. 9. 547. 7.V1CDR2 и СНА. 9. 547. 7.vhCDR3;

СНА.9.547.8, СНА. 9. 547. 8VH, СНА. 9. 547. 8.VL, СНА. 9. 547. 8.НС, CHA.9.547.8.LC, СНА. 9. 547. 8.Н1, СНА. 9. 547. 8.Н2, СНА. 9. 547. 8.НЗ; СНА.9.547.8.Н4, СНА.9.547.8.Н4 (S241P), СНА. 9. 547. 8,vhCDRl, СНА. 9. 547. 8.vhCDR2, СНА. 9. 547. 8.vhCDR3, СНА. 9. 547. 8.V1CDR1, СНА. 9. 547. 8.V1CDR2 и СНА. 9. 547. 8.vhCDR3;

СНА.9.547.9, СНА.9.547.9, СНА.9.547.9VH, CHA.9.547.9.VL, СНА.9. 547.9.НС, CHA.9.547.9.LC, СНА.9.547.9.Н1, СНА.9.547.9.Н2, СНА.9.547.9.НЗ; СНА.9.547.9.Н4, СНА.9.547.9.Н4, CHA.9.547.9.H4(S241P), CHA.9.547.9.H4(S241P), CHA.9.547.9.vhCDRl, СНА.9.547.9.vhCDR2, CHA.9.547.9.vhCDR3, CHA.9.547.9.vlCDRl, CHA.9.547.9.vlCDR2 и CHA.9.547.9.vhCDR3;

- 38 044486

CHA.9.547.13, CHA.9.547.13, CHA.9.547. 13VH, CHA.9. 547.13.VL,

CHA.9. 547.13.HC, CHA. 9.547.13.LC, СНА. 9.547.13.H1, CHA.9.547.13.H2, CHA.9.

47.13.H3; CHA.9.547.13.H4, CHA.9.547.13.H4, CHA.9.547.13.H4 (S241P),

CHA.9.547.13.H4 (S241P), CHA. 9. 547.13.vhCDRl, CHA.9.547.13. vhCDR2, CHA.9.547.

.vhCDR3, CHA. 9. 547.13.vlCDRl, CHA. 9. 547.13.vlCDR2 и CHA. 9. 547. 13.vhCDR3;

CHA.9.541.1, CHA. 9. 541.1.VH, CHA. 9. 541.1.VL, CHA. 9. 541.1.HC, CHA. 9.

1.1.LC, CHA. 9. 541.1.Hl, CHA. 9. 541.1.H2, CHA. 9. 541.1.H3; CHA.9.541.1.H4, CHA.9.541.1.H4 (S241P), CHA. 9. 541.1.vhCDRl, CHA. 9. 541.1.vhCDR2, CHA. 9.

1.1.vhCDR3, CHA. 9. 541.1.vlCDRl, CHA. 9. 541.1.vlCDR2 и CHA. 9.541.l.vhCDR3;

CHA.9.541.3, CHA. 9. 541. 3.VH, CHA. 9. 541. 3.VL, CHA. 9. 541. 3.HC, CHA. 9. 541.

.LC, CHA. 9. 541. 3.H1, CHA. 9. 541. 3.H2, CHA. 9. 541. 3.H3; CHA.9.541.3.H4, CHA.9.541.3.H4 (S241P), CHA. 9. 541. 3.vhCDRl, CHA. 9. 541. 3.vhCDR2, CHA. 9. 541.

.vhCDR3, CHA. 9. 541. 3.vlCDRl, CHA. 9. 541. 3.vlCDR2 и CHA. 9.541. 3.vhCDR3;

CHA.9.541.4, CHA. 9. 541.4.VH, CHA. 9. 541. 4.VL, CHA. 9. 541. 4.HC, CHA. 9. 541.

.LC, CHA. 9. 541. 4.H1, CHA. 9. 541. 4.H2, CHA. 9. 541. 4.H3; CHA.9.541.4.H4, CHA.9.541.4.H4 (S241P), CHA. 9. 541. 4.vhCDRl, CHA. 9. 541. 4.vhCDR2, CHA. 9. 541.

.vhCDR3, CHA. 9. 541. 4.vlCDRl, CHA. 9. 541. 4.vlCDR2 и CHA. 9.541. 4.vhCDR3;

CHA.9.541.5, CHA. 9. 541. 5.VH, CHA. 9. 541. 5.VL, CHA. 9. 541. 5.HC, CHA. 9. 541.

.LC, CHA. 9. 541. 5.H1, CHA. 9. 541. 5.H2, CHA. 9. 541. 5.H3; CHA.9.541.5.H4, CHA.9.541.5.H4 (S241P), CHA. 9. 541. 5.vhCDRl, CHA. 9. 541. 5.vhCDR2, CHA. 9. 541.

.vhCDR3, CHA. 9. 541. 5.vlCDRl, CHA. 9. 541. 5.vlCDR2 и CHA. 9.541. 5.vhCDR3;

CHA.9.541.6, CHA. 9. 541. 6.VH, CHA. 9. 541. 6.VL, CHA. 9. 541. 6.HC, CHA. 9. 541.

.LC, CHA. 9. 541. 6.H1, CHA. 9. 541. 6.H2, CHA. 9. 541.6.H3; CHA.9.541.6.H4, CHA.9.541.6.H4 (S241P), CHA. 9. 541. 6.vhCDRl, CHA. 9. 541. 6.vhCDR2, CHA. 9. 541.

.vhCDR3, CHA. 9. 541. 6.vlCDRl, CHA. 9. 541. 6.vlCDR2 и CHA. 9.541. 6.vhCDR3;

CHA.9.541.7, CHA. 9. 541. 7.VH, CHA. 9. 541. 7.VL, CHA. 9. 541. 7.HC, CHA. 9. 541.

.LC, CHA. 9. 541. 7.H1, CHA. 9. 541. 7.H2, CHA. 9. 541. 7.H3; CHA.9.541.7.H4, CHA.9.541.7.H4 (S241P), CHA. 9. 541. 7.vhCDRl, CHA. 9. 541. 7.vhCDR2, CHA. 9. 541.

.vhCDR3, CHA. 9. 541. 7.vlCDRl, CHA. 9. 541. 7.vlCDR2 и CHA. 9.541. 7.vhCDR3; и

CHA.9.541.8, CHA. 9. 541. 8.VH, CHA. 9. 541. 8.VL, CHA. 9. 541. 8.HC, CHA. 9. 541.

.LC, CHA. 9. 541. 8.H1, CHA. 9. 541. 8.H2, CHA. 9. 541. 8.H3; CHA.9.541.8.H4, CHA.9.541.8.H4 (S241P); CHA. 9. 541. 8vhCDRl, CHA. 9. 541. 8.vhCDR2, CHA. 9. 541.

.vhCDR3, CHA. 9. 541. 8.vlCDRl, CHA. 9. 541. 8.vlCDR2, а также CHA. 9.541. 8.vhCDR3.

В случае scFv, содержащих CDR вышеуказанных антител, они помечены как scFv, которые включают scFv, содержащий вариабельный домен тяжелой цепи с vhCDR, линкер и вариабельный домен легкой цепи с vlCDR, опять же, как указано выше в любой ориентации. Таким образом, изобретение включает применение scFv-CHA.9.536.3, scFv-CHA.9.536.4, scFv-CHA.9.536.5, scFv-CHA.9.536.7, scFvCHA.9.536.8, scFv-CHA.9.560.1, scFv-CHA.9.560.3, scFv-CHA.9.560.4, scFv-CHA.9.560.5, scFvCHA.9.560.6, scFv-CHA.9.560.7, scFv-CHA.9.560.8, scFv-CHA.9.546.1, scFv-CHA.9.547.1,scFvCHA.9.547.2, scFv-CHA.9.547.3, scFv-CHA.9.547.4, scFv-CHA.9.547.6, scFv-CHA.9.547.7,scFvCHA.9.547.8, scFv-CHA.9.547.9, scFv-CHA.9.547.13, scFv-CHA.9.541.1, scFv-CHA.9.541.3,scFvCHA.9.541.4, scFv-CHA.9.541.5, scFv-CHA.9.541.6, scFv-CHA.9.541.7 и scFv-CHA.9.541.8.

Кроме того, СНА.9.543 связывается с TIGIT, но не блокирует взаимодействие TIGIT-PVR.

Как описано в данном документе, в изобретении дополнительно предлагается применение вариантов вышеуказанных компонентов (СРА и СНА), включая варианты в CDR, как указано выше. Таким образом, в данном изобретении предлагаются антитела, содержащие набор из 6 CDR, как указано в данном документе, которые могут содержать одно, два или три аминокислотные различия в наборе CDR, при условии, что антитело все еще связывается с TIGIT. В данной области техники известны пригодные анализы, такие как анализы Biacore, для тестирования антитела анти-TIGIT, которое содержит мутации, по сравнению с последовательностями CDR, описанными в данном документе.

Кроме того, в данном изобретении дополнительно предлагается применение вариантов вышеуказанных вариабельных тяжелых и легких цепей. В этом случае вариабельные тяжелые цепи могут быть на

- 39 044486

80, 90, 95, 98 или 99% идентичными последовательностям VH в данном изобретении и/или содержать от 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 аминокислотных замен или более, когда применяются варианты Fc. Предлагаются вариабельные легкие цепи, которые могут быть на 80, 90, 95, 98 или 99% идентичны последовательностям VL в данном изобретении (и, в частности, СРА.9.086) и/или содержать от 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 аминокислотных замен или более, когда применяются варианты Fc. В этих вариантах осуществления данного изобретения антитела анти-TIGIT для применения в данном изобретении все еще связываются с TIGIT. В данной области техники известны пригодные анализы, такие как анализы Biacore, для тестирования антитела анти-TIGIT, которое содержит мутации, по сравнению с последовательностями CDR, описанными в данном документе.

Аналогичным образом, предлагаются тяжелые и легкие цепи, которые на 80, 90, 95, 98 или 99% идентичны полноразмерным последовательностям НС и LC в данном изобретении (и, в частности, СРА.9.086) и/или содержат от 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 аминокислотных замен или более, когда применяются варианты Fc. В эти варианты осуществления данного изобретения включены вышеуказанные варианты до тех пор, пока антитело анти-TIGIT все еще связывается с TIGIT. В данной области техники известны пригодные анализы, такие как анализы Biacore, для тестирования антитела анти-TIGIT, которое содержит мутации, по сравнению с последовательностями CDR, описанными в данном документе.

Кроме того, каркасные области вариабельных тяжелых и вариабельных легких цепей антител либо СРА, либо СНА в данном изобретении могут быть гуманизированы (или, в случае антител СНА, регуманизированы) в той степени, в которой могут быть выполнены альтернативные способы гуманизации), как известно в данной области техники (при необходимости в CDR генерируются случайные варианты), и, таким образом, могут быть созданы гуманизированные варианты цепей VH и VL, продемонстрированных на фиг. 23 (и, в частности, СРА.9.086). Кроме того, гуманизированные вариабельные домены тяжелой и легкой цепи затем могут быть слиты с константными областями человека, такими как константные области от IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4 (включая IgG4 (S241P)).

В частности, как известно в данной области техники, цепи VH и VL мыши могут быть гуманизированы, как известно в данной области техники, например, с помощью программы IgBLAST на сайте NCBI, как описано в публикации Ye et al. Nucleic Acids Res. 41: W34-W40 (2013), включенной в данный документ посредством ссылки в полном объеме для способов гуманизации. IgBLAST анализирует мышиную последовательность VH и/или VL мыши и сравнивает ее с библиотекой известных последовательностей зародышевой линии человека. Как продемонстрировано в данном документе, для гуманизированных последовательностей, сгенерированных в данном изобретении, в качестве баз данных применяли гены VH человека IMGT (F + ORF, 273 последовательности зародышевой линии) и гены каппа VL человека IMGT (F + ORF, 74 последовательности зародышевой линии). Были выбраны типовые пять последовательностей СНА: СНА.9.536, СНА9.560, СНА.9.546, СНА.9.547 и СНА.9.541 (см. Фиг. 3). Для этого варианта гуманизации, зародышевая линия IGHV1-46 человека (аллель 1) была выбрана для всех 5 в качестве акцепторной последовательности и области присоединения тяжелой цепи IGHJ4 (аллель 1) человека (ген J). Для трех из четырех (СНА.7.518, СНА.7.530, СНА.7.538_1 и СНА.7.538_2) зародышевая линия человека IGKV1-39 (аллель 1) была выбрана в качестве акцепторной последовательности и легкой цепи человека IGKJ2 (аллель 1) (ген J). Ген J был выбран из последовательностей области присоединения человека, собранных в IMGT®, международной информационной системе ImMunoGeneTics, по адресу www.imgt.org. CDR были определены в соответствии с определением AbM (см. www.bioinfo.org.uk/abs/). В некоторых вариантах осуществления данного изобретения антитела антиTIGIT для применения в данном изобретении включают TIGIT-связывающие участки или антигенсвязывающие домены, в которых последовательности V_H и V_L разных TIGIT-связывающих участков или антигенсвязывающих доменов могут быть смешаны и подобраны для создания других TIGIT-связывающих участков или антигенсвязывающих доменов. Связывание TIGIT с такими смешанными и подобранными антителами анти-TIGIT можно тестировать с помощью описанных выше анализов связывания, например, анализов ИФА или Biacore). В некоторых вариантах осуществления данного изобретения, когда цепи VH и VL являются смешанными и подобранными, последовательность VH из конкретного спаривания VH/VL заменяют структурно подобной последовательностью VH. Аналогично, в некоторых вариантах осуществления данного изобретения последовательность V_L из конкретного спаривания V_H/V_L заменяют структурно подобной последовательностью V_L. Например, последовательности V_H и V_L гомологичных антител являются особенно пригодными для смешивания и подбора.

Соответственно, антитела анти-TIGIT для применения в данном изобретении могут содержать аминокислотные последовательности CDR, выбранные из группы, состоящей из (а) последовательностей, перечисленных в данном документе; (b) последовательностей, которые отличаются от аминокислотных последовательностей CDR, указанных в (а), на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или большее количество аминокислотных замен; (с) аминокислотных последовательностей, имеющих 90% или более, 95% или более, 98% или более, или 99% или более идентичности с последовательностями, указанными в (а) или (b); (d) полипептида, имеющего аминокислотную последовательность, кодируемую полинуклеотидом, имеющим последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую аминокислоты, как указано в данном документе. В частности, антитело анти-TIGIT может содержать антигенсвязывающий домен из антитела

- 40 044486

СРА.9.086, которое может иметь последовательности, выбранные из (а), (b), (с) или (d).

Кроме того, в определение антител анти-TIGIT для применения в данном изобретении включены антитела, содержащие TIGIT-связывающие домены, которые имеют идентичность со связывающими доменам из TIGIT-антител, перечисленных в данном документе. То есть в определенных вариантах осуществления данного изобретения антитело анти-TIGIT по данному изобретению содержит вариабельные области тяжелой и легкой цепи, содержащие аминокислотные последовательности, которые идентичны всем или части связывающих доменов из аминокислотных последовательностей анти-TIGIT предпочтительных антител анти-TIGIT, соответственно, при этом указанные антитела сохраняют желаемые функциональные свойства родительских антител анти-TIGIT. Процент идентичности между двумя последовательностями является функцией количества идентичных положений, совместно используемых последовательностями (то есть % гомологии = количество идентичных положений/общее количество положений X 100), принимая во внимание количество гэпов и длину каждого гэпа, который необходимо ввести для оптимального выравнивания двух последовательностей. Сравнение последовательностей и определение процента идентичности между двумя последовательностями можно выполнить с помощью математического алгоритма, как описано в неограничивающих примерах ниже.

Процент идентичности между двумя аминокислотными последовательностями можно определить с помощью алгоритма Е. Meyers и W. Miller (Comput. Appl. Biosci., 4: 11-17 (1988)), который включен в программу ALIGN (версия 2.0), с применением таблицы веса остатков РАМ120, длины гэпа 12 и штрафа за гэп в последовательности 4. Кроме того, процент идентичности между двумя аминокислотными последовательностями можно определить с помощью алгоритма Needleman и Wunsch (J. Mol. Biol. 48: 444453 (1970)), который включен в программу GAP в пакете программного обеспечения GCG ( имеется в продаже), с применением либо матрицы Blossum 62, либо матрицы РАМ250, вес гэпа 16, 14, 12, 10, 8, 6 или 4, и штраф за удлинение гэпа 1, 2, 3, 4, 5 или 6.

В целом, процент идентичности для сравнения между TIGIT-связывающими доменами или антигенсвязывающими доменами составляет по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, при этом предпочтительным является процент идентичности по меньшей мере около 95, 96, 97, 98 или 99%. Процент идентичности может быть вдоль всей аминокислотной последовательности, например, всей тяжелой или легкой цепи или вдоль части цепей. Например, в определения антител анти-TIGIT для применения в данном изобретении включены антитела, TIGIT-связывающая часть или антигенсвязывающие домены которых имеют идентичность вдоль всей вариабельной области (например, когда идентичность составляет 95 или 98% идентичности вдоль вариабельных областей), или вдоль всей константной области, или вдоль только Fc-области. В частности, антитела анти-TIGIT для применения в данном изобретении включают антитела, которые имеют TIGIT-связывающую часть или антигенсвязывающие домены, имеющие процент идентичности с антителом СРА.9.086 по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, при этом предпочтительным является процент идентичности по меньшей мере около 95, 96, 97, 98 или 99%.

Кроме того, также включены последовательности, которые могут иметь идентичные CDR, но в тоже время быть измененными в каркасных частях вариабельного домена (или всей тяжелой или легкой цепи). Например, антитела анти-TIGIT для применения в данном изобретении включают антитела с CDR, идентичные тем, которые продемонстрированы на фиг. 3, но идентичность которых вдоль вариабельной области может быть ниже, например, с процентом идентичности 95% или 98%. В частности, в данном изобретении предлагается применение антител анти-TIGIT, которые имеют TIGIT-связывающие части или антигенсвязывающие домены, CDR которых идентичны СРА.9.086, но каркасные области которых идентичны СРА.9.086 на 95 или 98%.

C. Антитела анти-TIGIT в комбинации с антителами αнтu-PD-1.

В другом варианте осуществления данного изобретения предлагаются комбинации антител антиTIGIT по данному изобретению и антител анти-PD-1. Существует два одобренных антитела анти-PD-1, пембролизумаб (Кейтруда (Keytruda®)) и ниволумаб (Опдиво (Opdivo®)) и многие другие, находящиеся на этапе клинических исследований, которые можно применять в комбинации с антителами анти-TIGIT по данному изобретению.

Соответственно, в данном изобретении предлагаются специфические комбинации: СРА.9.083.Н4 (S241P), как продемонстрировано на фиг. 3F, с пембролизумабом; СРА.9.083.Н4 (S241P), как продемонстрировано на фиг. 3F, с ниволумабом; СРА.9.086.Н4 (S241P), как продемонстрировано на фиг. 3G, с пембролизумабом; СРА.9.086.Н4 (S241P), как продемонстрировано на фиг. 3G, с ниволумабом; СНА.9.547.7Н4 (S241P), как продемонстрировано на фиг. 4НН, с пембролизумабом; СНА.9.547.7Н4 (S241P), как продемонстрировано на фиг. 3НН, с ниволумабом; СНА.9.547.13.Н4 (S241P), как продемонстрировано на фиг. 3VV, с пембролизумабом, и СНА.9.547.13.Н4 (S241P), как продемонстрировано на фиг. 3VV, с ниволумабом; все из фиг. 4 публикации USSN 62/513916, имеющей название Антитела анти-TIGIT и способы их применения, поданной 1 июня 2017 года правопреемником Compugen. Другие антитела анти-TIGIT, которые можно комбинировать с антителами анти PD-1, также представлены на фиг. 3.

- 41 044486

D. Специфические антитела анти-PVRIG.

В данном изобретении предлагаются антигенсвязывающие домены, включая полноразмерные антитела, которые содержат ряд специфических, перечисленных наборов из 6 CDR и определенных вариабельных областей тяжелой цепи (vh, VH или VH) и вариабельных областей легкой цепи (vl, VL или VL), которые связываются с PVRIG.

В одном варианте осуществления изобретения анти - PVRIG антитело представляет собой антитело, содержащее набор из шести CDR, (vhCDR1, vhCDR2, vhCDR3, vlCDR1, vlCDR2 и vlCDR3) от СНА.7.518.1.Н4 (S241P), как показано на фиг. 5. В одном варианте осуществления данного изобретения антитело анти-TIGIT представляет собой антитело, содержащее вариабельный домен тяжелой цепи (vh) и вариабельный домен легкой цепи (vl) из CHA.7.518.1.H4 (S241P), как продемонстрировано на фиг. 5, связанные с константным доменом IgG IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 и IgG4 (S241P) человека. В одном варианте осуществления данного изобретения антитело анти-TIGIT представляет собой CHA.7.518.1.H4 (S241P). В некоторых вариантах осуществления данного изобретения антитело анти-PVRIG представляет собой антитело анти-PVRIG, как продемонстрировано на фиг. 5 или на фиг. 63.

В частности, можно применять 2Н6 антитело анти-PVRIG согласно публикации Zhu et al., WO 2017/041004, специально включенной в данное описание посредством ссылки, которое имеет vhCDR1 SEQ ID NO: 6, vhCDR2 SEQ ID NO: 7, vhCDR3 SEQ ID NO: 8, vlCDR1 SEQ ID NO: 9, vlCDR2 SEQ ID NO: 10 и vhCDR3 SEQ ID NO: 11 из WO 2017/041004. 2H6 антитело анти-PVRIG согласно публикации Zhu et al., имеет вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий SEQ ID NO: 6, и вариабельный домен легкой цепи, содержащий SEQ ID NO: 3, который может быть связан с константным доменом IgG из IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 и IgG4 (S241P) человека. Все SEQ ID в этом параграфе взяты из WO 2017/041004 и также представлены на фиг. 5.

В частности, можно применять 334М5 антитело анти-PVRIG из публикации WO 20180/017864, специально включенной в данное описание посредством ссылки, которое имеет vhCDR1 SEQ ID NO: 31, vhCDR2 SEQ ID NO: 32, vhCDR3 SEQ ID NO: 33: vlCDR1 SEQ ID NO: 26, vlCDR2 SEQ ID NO: 27 и vhCDR3 SEQ ID NO: 28 из WO 2018/017864. 334M5 антитело анти-PVRIG из WO 2018/017864 имеет вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий SEQ ID NO: 30, и вариабельный домен легкой цепи, содержащий SEQ ID NO: 25, который может быть связан с константным доменом IgG из IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 и IgG4 (S241P) человека. Все SEQ ID в этом параграфе взяты из WO 2018/017864 и также представлены на фиг. 5.

Е. Дополнительные антитела анти-PVRIG.

Антитела к PVRIG, которые могут найти применение в соответствии с трехкомпонентными комбинациями по данному изобретению, обозначены следующим образом. Эти антитела анти-PVRIG, описанные в данном документе, обозначены следующим образом. Антитела к PVRIG имеют ссылочные номера, например СРА.7.013. Они представляют комбинацию вариабельных тяжелых цепей и вариабельных легких цепей, как продемонстрировано на фиг. 63, например.

CPA.7.013.VH относится к части вариабельной тяжелой цепи СРА.7.013, тогда как CPA.7.013.VL представляет собой вариабельную легкую цепь. CPA.7.013.vhCDR1, CPA.7.013.vhCDR2, CPA.7.013.vhCDR3, CPA.7.013.vlCDR1, CPA.7.013.vlCDR2 и

CPA.7.013.vlCDR3, относится к CDR, которые указаны. СРА.7.013.НС относится ко всей тяжелой цепи (например, вариабельный и константный домен) этой молекулы, a CPA.7.013.LC относится ко всей легкой цепи (например, вариабельный и константный домен) одной и той же молекулы. СРА.7.013.Н1 относится к полноразмерному антителу, содержащему вариабельные домены тяжелой и легкой цепи, в том числе константный домен IgG1 человека (следовательно, H1; IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4, как продемонстрировано на фиг. 1, например). Соответственно, СРА.7.013.Н2 будет антителом, содержащим вариабельные домены СРА.7.013, связанные с IgG2 человека. СРА.7.О13.НЗ будет антителом, содержащим вариабельные домены СРА.7.013, связанные с IgG3 человека, а СРА.7.013.Н4 будет антителом, содержащим вариабельные домены СРА.7.013, связанные с IgG4 человека.

Антитела к PVRIG, которые могут найти применение в соответствии с трехкомпонентными комбинациями по данному изобретению, обозначены следующим образом. Указанные антитела имеют ссылочные номера, например, СНА.7.518.1. Они представляют комбинацию вариабельных тяжелых цепей и вариабельных легких цепей, как продемонстрировано, например, на фиг. 5 и на фиг. 63, при том понимании, что эти антитела включают две тяжелые цепи и две легкие цепи. СРА. 7.518.1.VH относится к части вариабельной тяжелой цепи СРА. 7.518.1, в то время как CPA.7.518.1.VL представляет собой вариабельную легкую цепь. СРА. 7.518.1.vhCDR1, CPA.7.518.1.vhCDR2, СРА. 7.518.1.vhCDR3, СРА. 7.518.1.vlCDR1, СРА. 7.518.1.vlCDR2 и СРА. 7.518.1.vlCDR3, относятся к указанным CDR. СРА. 7.518.1.НС относится ко всей тяжелой цепи (например, вариабельный и константный домен) этой молекулы, а СРА. 7.518.1.LC относится ко всей легкой цепи (например, вариабельный и константный домен) одной и той же молекулы. В целом, легкая цепь каппа человека применяется в данном изобретении для константного домена каждого фагового антитела (или антитела гуманизированной гибридомы), хотя в некоторых вариантах осуществления данного изобретения применяется константный домен легкой цепи лямбда. СРА. 7.518.1.H1 относится к полноразмерному антителу, содержащему вариабельные

- 42 044486 домены тяжелой и легкой цепи, в том числе константный домен IgG1 человека (следовательно, H1; IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4, как продемонстрировано на фиг. 1, например). Соответственно, СРА. 7.518.1.Н2 будет антителом, содержащим вариабельные домены СРА. 7.518.1, связанные с IgG2 человека. СРА. 7.518.1.H3 будет антителом, содержащим вариабельные домены СРА.7.518.1, связанные с IgG3 человека, а СРА.7.518.1.Н4 будет антителом, содержащим вариабельные домены СРА. 7.518.1, связанные с IgG4 человека. Следует обратить внимание, что в некоторых случаях IgG человека могут иметь дополнительные мутации, такие как описаны ниже, и это может быть обозначено соответствующим образом. Например, во многих вариантах осуществления данного изобретения в IgG4 человека может быть мутация S241P, и это может быть обозначено как СРА. 7.518.1.Н4 (S241P), например. Последовательность IgG4 человека с этим шарнирным вариантом S241P приведена на фиг. 1. Другими потенциальными вариантами являются IgG1 (N297A) (или другие варианты, которые устраняют гликозилирование в этом сайте и, таким образом, многие эффекторные функции, связанные со связыванием FcYRIIIa), и IgG1 (D265A), который уменьшает связывание с рецепторами FcyR. Антитела анти-PVRIG для применения в данном изобретении могут содержать любую из последовательностей антитела к PVRIG. Антитела анти-PVRIG для применения в данном изобретении могут содержать любую из последовательностей домена, связывающего антиген PVRIG.

В данном изобретении дополнительно предлагаются вариабельные домены тяжелой и легкой цепи, а также полноразмерные тяжелые и легкие цепи, любые из которых можно применять в качестве части антител анти-PVRIG для применения в соответствии с данным изобретением.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения предлагаются scFv, которые связываются с PVRIG, содержащие вариабельный домен тяжелой цепи и вариабельный домен легкой цепи, связанные с помощью линкера scFv, как описано выше. Домены VL и VH могут находиться в любой ориентации, например, от N- до С-конца 'VH-линкер-VL или VL-линкер VH. Они названы по их составных частях; например, scFv-CHA.7.518.1VH-линкер-VL или scFv-CPA. 7.518.1.VL-линкер-VH. Таким образом, scFv-CPA. 7.518.1 может быть в любой ориентации. Антитела анти-PVRIG для применения в данном изобретении могут содержать scFv, который связывается с PVRIG.

В данном изобретении предлагаются антигенсвязывающие домены, включая полноразмерные антитела, которые содержат ряд специфических, перечисленных наборов из 6 CDR Антитела анти-PVRIG для применения в данном изобретении могут содержать любой из наборов 6 CDR из последовательностей антител к PVRIG, представленных в данном документе.

Во многих вариантах осуществления данного изобретения антитела анти-PVRIG для применения в данном изобретении являются антителами человека (полученными из фага) и блокируют связывание PVRIG и PVLR2. Антитела анти-PVRIG по данному изобретению могут содержать последовательность антитела к PVRIG и/или антигенсвязывающего домена, способную как связывать, так и блокировать взаимодействие рецептор-лиганд. Антитело анти-PVRIG может содержать CDR из последовательности антитела к PVRIG, способной как связывать, так и блокировать взаимодействие рецептор-лиганд. Антитела к СРА, а также последовательности CDR, которые связывают и блокируют взаимодействие рецепторлиганд, являются такими, как показано ниже, с указанием их компонентов, последовательности для которых приведены на фиг. 63:

СРА.7.001, CPA.7.001.VH, CPA.7.001.VL, СРА.7.001.НС, CPA.7.001.LC and

СРА.7.001.Н1, СРА.7.001. Н2, СРА.7.001.НЗ, СРА.7.001.Н4; СРА.7.001. vhCDRl, СРА.7.001.vhCDR2, CPA.7.001.vhCDR3, СРА.7.001.vlCDRl, СРА.7.001.vlCDR2 и CPA.7.001.V1CDR3;

СРА.7.003, СРА.7.003. VH, CPA.7.003.VL, СРА.7.003.НС, CPA.7.003.LC,

СРА.7.003.Н1, СРА.7.003.Н2, СРА.7.003 .НЗ, СРА.7.003.Н4; СРА.7.003 .vhCDRl, CPA.7.003.vhCDR2, СРА.7.003 ,vhCDR3, СРА.7.003 .vlCDRl, СРА.7.003 ,vlCDR2 и CPA.7.003.V1CDR3;

СРА.7.004, CPA.7.004.VH, CPA.7.004.VL, СРА.7.004.НС, CPA.7.004.LC,

СРА.7.004.Н1, СРА.7.004.Н2, СРА.7.004.НЗ СРА.7.004.Н4; CPA.7.004.vhCDRl,

CPA.7.004.vhCDR2, CPA.7.004.vhCDR3, CPA.7.004.vlCDRl, CPA.7.004.vlCDR2 и CPA.7.004.vlCDR3;

- 43 044486

CPA.7.006, CPA.7.006.VH, CPA.7.006.VL, CPA.7.006.HC, CPA.7.006.LC,

CPA.7.006.H1, CPA.7.006.H2, CPA.7.006.H3 CPA.7.006.H4; CPA.7.006.vhCDRl,

CPA.7.006.vhCDR2, CPA.7.006.vhCDR3, CPA.7.006.vlCDRl, CPA.7.006.vlCDR2 и CPA.7.006.V1CDR3;

CPA.7.008, CPA.7.008.VH, CPA.7.008.VL, CPA.7.008.HC, CPA.7.008.LC,

CPA.7.008.H1, CPA.7.008.H2, CPA.7.008.H3 CPA.7.008.H4; CPA.7.008.vhCDRl,

CPA.7.008.vhCDR2, CPA.7.008.vhCDR3, CPA.7.008.vlCDRl, CPA.7.008.vlCDR2 и CPA.7.008.V1CDR3;

CPA.7.009, CPA.7.009.VH, CPA.7.009.VL, CPA.7.009.HC, CPA.7.009.LC,

CPA.7.009.H1, CPA.7.009.H2, CPA.7.009.H3 CPA.7.009.H4; CPA.7.009.vhCDRl,

CPA.7.009.vhCDR2, CPA.7.009.vhCDR3, CPA.7.009.vlCDRl, CPA.7.009.vlCDR2 и CPA.7.009.vlCDR3;

CPA.7.010, CPA.7.010.VH, CPA.7.010.VL, CPA.7.010.HC,

CPA.7.010.LC, CPA.7.010.Hl, CPA.7.010.H2, CPA.7.010.H3 CPA.7.010.H4; CPA.7.010.vhCDRl, CPA.7.010.vhCDR2, CPA.7.010.vhCDR3, CPA.7.010.vlCDRl, CPA.7.010.V1CDR2 и CPA.7.010.vlCDR3;

CPA.7.011, CPA.7.01 l.VH, CPA.7.01 l.VL, CPA.7.011.HC, CPA.7.011.LC,

CPA.7.011.Hl, CPA.7.011.H2, CPA.7.011.H3 CPA.7.011.H4; CPA.7.01 l.vhCDRl,

CPA.7.01 l.vhCDR2, CPA.7.01 l.vhCDR3, CPA.7.01 l.vlCDRl, CPA.7.01 l.vlCDR2 и CPA.7.01 l.vlCDR3;

CPA.7.012, CPA.7.012.VH, CPA.7.012.VL, CPA.7.012.HC, CPA.7.012.LC,

CPA.7.012.H1, CPA.7.012.H2, CPA.7.012.H3 CPA.7.012.H4; CPA.7.012.vhCDRl,

CPA.7.012.vhCDR2, CPA.7.012.vhCDR3, CPA.7.012.vlCDRl, CPA.7.012.vlCDR2 и CPA.7.012.V1CDR3;

CPA.7.013, CPA.7.013.VH, CPA.7.013.VL, CPA.7.013.HC, CPA.7.013.LC,

CPA.7.013.H1, CPA.7.013.H2, CPA.7.013.H3 CPA.7.013.H4; CPA.7.013.vhCDRl,

CPA.7.013.vhCDR2, CPA.7.013.vhCDR3, CPA.7.013.vlCDRl, CPA.7.013.vlCDR2 и CPA.7.013.V1CDR3;

CPA.7.014, CPA.7.014.VH, CPA.7.014.VL, CPA.7.014.HC, CPA.7.014.LC,

CPA.7.014.H1, CPA.7.014.H2, CPA.7.014.H3 CPA.7.014.H4; CPA.7.014.vhCDRl,

CPA.7.014.vhCDR2, CPA.7.014.vhCDR3, CPA.7.014.vlCDRl, CPA.7.014.vlCDR2 и CPA.7.014.V1CDR3;

CPA.7.015, CPA.7.015.VH, CPA.7.015.VL, CPA.7.015.HC, CPA.7.015.LC,

CPA.7.015.H1, CPA.7.015.H2, CPA.7.015.H3 CPA.7.015.H4; CPA.7.015.vhCDRl,

CPA.7.015.vhCDR2, CPA.7.015.vhCDR3, CPA.7.015.vlCDRl, CPA.7.015.vlCDR2 и CPA.7.015.V1CDR3;

CPA.7.017, CPA.7.017.VH, CPA.7.017.VL, CPA.7.017.HC, CPA.7.017.LC,

CPA.7.017H1, CPA.7.017.H2, CPA.7.017.H3 CPA.7.017.H4; CPA.7.017.vhCDRl,

СР A.7.000171.vhCDR2, CPA.7.017.vhCDR3, CPA.7.017.vlCDRl, CPA.7.017.vlCDR2 и CPA.7.017.V1CDR3;

CPA.7.018, CPA.7.018.VH, CPA.7.018.VL, CPA.7.018.HC, CPA.7.018.LC,

CPA.7.018.H1, CPA.7.018.H2, CPA.7.018.H3 CPA.7.018.H4; CPA.7.017.vhCDRl,

CPA.7.017.vhCDR2, CPA.7.017.vhCDR3, CPA.7.017.vlCDRl, CPA.7.017.vlCDR2 и CPA.7.017.V1CDR3;

CPA.7.019, CPA.7.019.VH, CPA.7.019.VL, CPA.7.019.HC, CPA.7.019.LC,

CPA.7.019.H1, CPA.7.019.H2, CPA.7.019.H3 CPA.7.019.H4; CPA.7.019.vhCDRl,

CPA.7.019.vhCDR2, CPA.7.019.vhCDR3, CPA.7.019.vlCDRl, CPA.7.019.vlCDR2 и

- 44 044486

CPA.7.019.vlCDR3;

CPA.7.021, CPA.7.021.VH, CPA.7.021.VL, CPA.7.021.HC, CPA.7.021.LC,

CPA.7.021.Hl, CPA.7.021.H2, CPA.7.021.НЗ CPA.7.021.H4; CPA.7.021.vhCDRl, CPA.7.021. vhCDR2, CPA.7.021.vhCDR3, CPA.7.021. vlCDRl, CPA.7.021.vlCDR2 и

CPA.7.021.vlCDR3;

CPA.7.022, CPA.7.022.VH, CPA.7.022.VL, CPA.7.022.HC, CPA.7.022.LC,

CPA.7.022.H1, CPA.7.022.H2, CPA.7.022.H3 CPA.7.022.H4; CPA.7.022.vhCDRl,

CPA.7.022.vhCDR2, CPA.7.002201.vhCDR3, CPA.7.022.vlCDRl, CPA.7.022.vlCDR2 и CPA.7.022.V1CDR3;

CPA.7.023, CPA.7.023. VH, CPA.7.023. VL, CPA.7.023 HC, CPA.7.023.LC, CPA.7.023.H1, CPA.7.023.H2, CPA.7.023.H3 CPA.7.023.H4; CPA.7.023 .vhCDRl,

CPA.7.023.vhCDR2, CPA.7.023 vhCDR3, CPA.7.023 vlCDRl, CPA.7.023 vlCDR2 и CPA.7.023.V1CDR3;

CPA.7.024, CPA.7.024.VH, CPA.7.024.VL, CPA.7.024.HC, CPA.7.024.LC,

CPA.7.024.H1, CPA.7.024.H2, CPA.7.024.H3 CPA.7.024.H4; CPA.7.024.vhCDRl,

CPA.7.024.vhCDR2, CPA.7.024.vhCDR3, CPA.7.024.vlCDRl, CPA.7.024.vlCDR2 и CPA.7.024.V1CDR3;

CPA.7.033, CPA.7.033.VH, CPA.7.033.VL, CPA.7.033.HC, CPA.7.033.LC,

CPA.7.033.H1, CPA.7.033.H2, CPA.7.033.H3 CPA.7.033.H4; CPA.7.033.vhCDRl,

CPA.7.033.vhCDR2, CPA.7.033.vhCDR3, CPA.7.033.vlCDRl, CPA.7.033.vlCDR2 и CPA.7.033.vlCDR3;

CPA.7.034, CPA.7.034.VH, CPA.7.034.VL, CPA.7.034.HC, CPA.7.034.LC,

CPA.7.034.H1, CPA.7.034.H2, CPA.7.034.H3 CPA.7.034.H4; CPA.7.034.vhCDRl,

CPA.7.034.vhCDR2, CPA.7.034.vhCDR3, CPA.7.034.vlCDRl, CPA.7.034.vlCDR2 и CPA.7.034.V1CDR3;

CPA.7.036, CPA.7.036.VH, CPA.7.036.VL, CPA.7.036.HC, CPA.7.036.LC,

CPA.7.036.H1, CPA.7.036.H2, CPA.7.036.H3 CPA.7.036.H4; CPA.7.036.vhCDRl,

CPA.7.036.vhCDR2, CPA.7.036.vhCDR3, CPA.7.036.vlCDRl, CPA.7.036.vlCDR2 и CPA.7.036.V1CDR3;

CPA.7.040, CPA.7.040.VH, CPA.7.040.VL, CPA.7.040.HC, CPA.7.040.LC,

CPA.7.040.H1, CPA.7.040.H2, CPA.7.040.H3 и CPA.7.040. H4; CPA.7.040.vhCDRl, CPA.7.040.vhCDR2, CPA.7.040.vhCDR3, CPA.7.040.vlCDRl, CPA.7.040.vlCDR2 и CPA.7.040.V1CDR3;

CPA.7.046, CPA.7.046.VH, CPA.7.046.VL, CPA.7.046.HC, CPA.7.046.LC,

CPA.7.046.H1, CPA.7.046.H2, CPA.7.046.H3 CPA.7.046.H4; CPA.7.046.vhCDRl,

- 45 044486

CPA.7.046.vhCDR2, CPA.7.046.vhCDR3, CPA.7.046.vlCDRl, CPA.7.046.vlCDR2 и

CPA.7.046.vlCDR3;

CPA.7.047, CPA.7.047.VH, CPA.7.047.VL, CPA.7.047.HC, CPA.7.047.LC,

CPA.7.047.H1, CPA.7.047.H2, CPA.7.047.H3 CPA.7.047.H4; CPA.7.047.vhCDRl,

CPA.7.047.vhCDR2, CPA.7.047.vhCDR3, CPA.7.047.vlCDRl, CPA.7.004701.vlCDR2 и CPA.7.047.V1CDR3;

CPA.7.049, CPA.7.049.VH, CPA.7.049.VL, CPA.7.049.HC, CPA.7.049.LC,

CPA.7.049.H1, CPA.7.049.H2, CPA.7.049.H3 CPA.7.049.H4; CPA.7.049.vhCDRl,

CPA.7.049.vhCDR2, CPA.7.049.vhCDR3, CPA.7.049.vlCDRl, CPA.7.049.vlCDR2 и

CPA.7.049.vlCDR3; а также

CPA.7.050, CPA.7.050.VH, CPA.7.050.VL, CPA.7.050.HC, CPA.7.050.LC,

CPA.7.050.H1, CPA.7.050.H2, CPA.7.050.H3 CPA.7.050.H4, CPA.7.050.vhCDRl,

CPA.7.050. vhCDR2, CPA.7.050.vhCDR3, CPA.7.050.vlCDRl, CPA.7.050.vlCDR2 и

CPA.7.050.vlCDR3.

Кроме того, существует ряд антител к СРА, сгенерированных в данном изобретении, которые связываются с PVRIG, но не блокируют взаимодействие PVRIG и PVLR2. Антитела анти-PVRIG для применения в данном изобретении могут содержать последовательность антитела к PVRIG и/или антигенсвязывающего домена, способную как связывать, но не блокировать взаимодействие рецептор-лиганд. Антитело анти-PVRIG для применения в данном изобретении может содержать CDR из последовательности антитела к PVRIG, способной связывать, но не блокировать взаимодействие рецептор-лиганд. Антитела к СРА, а также последовательности CDR, которые связывают, но не блокируют взаимодействие рецептор-лиганд, являются такими, как показано ниже, с указанием их компонентов, последовательности для которых приведены на фиг. 63:

СРА.7.028, CPA.7.028.VH, CPA.7.028.VL, СРА.7.028.НС, CPA.7.028.LC,

СРА.7.028.Н1, СРА.7.028.Н2, СРА.7.028.НЗ и СРА.7.028. Н4; CPA.7.028.vhCDRl,

CPA.7.028.vhCDR2, CPA.7.028.vhCDR3, CPA.7.028.vlCDRl, CPA.7.028.vlCDR2 и

CPA.7.028. vlCDR3.

CPA.7.030, CPA.7.030.VH, CPA.7.030.VL, CPA.7.030.HC, CPA.7.030.LC,

CPA.7.030.H1, CPA.7.030.H2, CPA.7.030.H3 и CPA.7.030. H4; CPA.7.030.vhCDRl,

CPA.7.030.vhCDR2, CPA.7.030.vhCDR3, CPA.7.030.vlCDRl, CPA.7.030.vlCDR2 и

CPA.7.030. vlCDR3.

CPA.7.041, CPA.7.041.VH, CPA.7.041.VL, CPA.7.041.HC, CPA.7.041.LC,

CPA.7.041.Hl, CPA.7.041.H2, CPA.7.041.H3 и CPA.7.041. H4; CPA.7.041.vhCDRl,

CPA.7.041.vhCDR2, CPA.7.041.vhCDR3, CPA.7.041. vlCDRl, CPA.7.041.vlCDR2 и

- 46 044486

CPA.7.041.vlCDR3.

CPA.7.016, CPA.7.016.VH, CPA.7.016.VL, CPA.7.016.HC, CPA.7.016.LC,

CPA.7.016.Hl, CPA.7.016.H2, CPA.7.016.H3 и CPA.7.016. H4; CPA.7.016.vhCDRl, CPA.7.016.vhCDR2, CPA.7.016.vhCDR3, CPA.7.016.vlCDRl, CPA.7.016.vlCDR2 и CPA.7.016.V1CDR3.

CPA.7.020, CPA.7.020.VH, CPA.7.020.VL, CPA.7.020.HC, CPA.7.020.LC,

CPA.7.020.H1, CPA.7.020.H2, CPA.7.020.H3 и CPA.7.020. H4; CPA.7.020.vhCDRl, CPA.7.020.vhCDR2, CPA.7.020.vhCDR3, CPA.7.020.vlCDRl, CPA.7.020.vlCDR2 и CPA.7.020.V1CDR3.

CPA.7.038, CPA.7.038.VH, CPA.7.038.VL, CPA.7.038.HC, CPA.7.038.LC,

CPA.7.038.H1, CPA.7.038.H2, CPA.7.038.H3 и CPA.7.038. H4; CPA.7.038.vhCDRl, CPA.7.038.vhCDR2, CPA.7.038.vhCDR3, CPA.7.038.vlCDRl, CPA.7.038.vlCDR2 и CPA.7.038.V1CDR3.

CPA.7.044, CPA.7.044.VH, CPA.7.044.VL, CPA.7.044.HC, CPA.7.044.LC,

CPA.7.044.H1, CPA.7.044.H2, CPA.7.044.H3 и CPA.7.044. H4; CPA.7.044.vhCDRl, CPA.7.044.vhCDR2, CPA.7.044.vhCDR3, CPA.7.044.vlCDRl, CPA.7.044.vlCDR2 и

CPA.7.044.V1CDR3.

CPA.7.045, CPA.7.045.VH, CPA.7.045.VL, CPA.7.045.HC, CPA.7.045.LC,

CPA.7.045.H1, CPA.7.045.H2, CPA.7.045.H3 и CPA.7.045. H4; CPA.7.045.vhCDRl, CPA.7.045.vhCDR2, CPA.7.045.vhCDR3, CPA.7.045.vlCDRl, CPA.7.045.vlCDR2 и CPA.7.045.V1CDR3.

Как описано в данном документе, в изобретении дополнительно предлагаются варианты вышеуказанных компонентов, включая варианты в CDR, как указано выше. Кроме того, вариабельные тяжелые цепи могут быть на 80, 90, 95, 98 или 99% идентичными последовательностям VH в данном изобретении и/или содержать от 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 аминокислотных замен или более, когда применяются варианты Fc. Предлагаются вариабельные легкие цепи, которые могут быть на 80, 90, 95, 98 или 99% идентичны последовательностям VL в данном изобретении и/или содержать от 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 аминокислотных замен или более, когда применяются варианты Fc. Аналогичным образом, предлагаются тяжелые и легкие цепи, которые на 80, 90, 95, 98 или 99% идентичны последовательностям НС и LC в данном изобретении и/или содержат от 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 аминокислотных замен или более, когда применяются варианты Fc. Антитела анти-PVRIG для применения в данном изобретении могут содержать любую из этих последовательностей антитела к PVRIG и/или антигенсвязывающего домена.

Кроме того, в данном изобретении предлагается ряду антител к СНА, которые представляют собой мышиные антитела, полученные из гибридом. Как хорошо известно в данной области техники, шесть CDR являются пригодными, когда их помещают либо в каркасные вариабельные области тяжелой и легкой цепи человека, либо когда вариабельные области тяжелой и легкой цепи гуманизированы. См., например, фиг. 5 и 63.

Антитело анти-PVRIG для применения в данном изобретении может включать любой из следующих СНА наборов CDR из последовательностей антител к PVRIG. Соответственно, в данном изобретении предлагается применение антитела анти-PVRIG, которое содержат следующие СНА наборы CDR, последовательности которых продемонстрированы на фиг. 5 и/или на фиг. 63:

- 47 044486

CHA.7.502.vhCDRl, CHA.7.502.vhCDR2, CHA.7.502.vhCDR3, CHA.7.502. vlCDRl, CHA.7.502.V1CDR2 и CHA.7.502.vlCDR3.

CHA.7.503.vhCDRl, CHA.7.503.vhCDR2, CHA.7.503.vhCDR3, CHA.7.503 vlCDRl, CHA.7.503.vlCDR2 и CHA.7.503.vlCDR3.

CHA.7.506.vhCDRl, CHA.7.506.vhCDR2, CHA.7.506.vhCDR3, CHA.7.506.vlCDRl, CHA.7.506.vlCDR2 и CHA.7.506.vlCDR3.

CHA.7.5O8.vhCDRl, CHA.7.508.vhCDR2, CHA.7.508.vhCDR3, CHA.7.508.vlCDRl, CHA.7.508.vlCDR2 и CHA.7.508.vlCDR3.

CHA.7.510.vhCDRl, CHA.7.510.vhCDR2, CHA.7.510.vhCDR3, CHA.7.510.vlCDRl, CHA.7.510.V1CDR2 и CHA.7.510.vlCDR3.

CHA.7.512.vhCDRl, CHA.7.512.vhCDR2, CHA.7.512.vhCDR3, CHA.7.512.vlCDRl, CHA.7.512.V1CDR2 и CHA.7.512.vlCDR3.

CHA.7.514.vhCDRl, CHA.7.514.vhCDR2, CHA.7.514.vhCDR3, CHA.7.514.vlCDRl, CHA.7.514.V1CDR2 и CHA.7.514.vlCDR3.

CHA.7.516.vhCDRl, CHA.7.516.vhCDR2, CHA.7.516.vhCDR3, CHA.7.516.vlCDRl, CHA.7.516.V1CDR2 и CHA.7.516.vlCDR3.

CHA.7.518.vhCDRl, CHA.7.518.vhCDR2, CHA.7.518.vhCDR3, CHA.7.518.vlCDRl,

CHA.7.518.V1CDR2 и CHA.7.518.vlCDR3.

CHA.7.520_l .vhCDRl, CHA.7.520_l.vhCDR2, CHA.7.520_l.vhCDR3,

CHA.7.520_l.vlCDRl, CHA.7.520_l.vlCDR2 и CHA.7.520_l.vlCDR3.

CHA.7.520_2.vhCDRl, CHA.7.520_2.vhCDR2, CHA.7.520_2.vhCDR3,

CHA.7.520_2.vlCDRl, CHA.7.520_2.vlCDR2 и CHA.7.520_2.vlCDR3.

CHA.7.522.vhCDRl, CHA.7.522.vhCDR2, CHA.7.522.vhCDR3, CHA.7.522.vlCDRl, CHA.7.522.vlCDR2 и CHA.7.522.vlCDR3.

- 48 044486

CHA.7.524.vhCDRl,

CHA.7.524.vhCDR2, CHA.7.524.vhCDR3,

CHA.7.524.vlCDRl, CHA.7.524.vlCDR2 и CHA.7.524.vlCDR3

CHA.7.526.vhCDRl, CHA.7.526.vhCDR2, CHA.7.526.vhCDR3, CHA.7.526.vlCDRl,

CHA.7.526.V1CDR2 и CHA.7.526.vlCDR3.

CHA.7.527.vhCDRl, CHA.7.527.vhCDR2, CHA.7.527.vhCDR3, CHA.7.527.vlCDRl, CHA.7.527.V1CDR2 и CHA.7.527.vlCDR3.

CHA.7.528.vhCDRl, CHA.7.528.vhCDR2, CHA.7.528.vhCDR3, CHA.7.528.vlCDRl, CHA.7.528.V1CDR2 и CHA.7.528.vlCDR3.

CHA.7.530.vhCDRl, CHA.7.530.vhCDR2, CHA.7.530.vhCDR3, CHA.7.530.vlCDRl,

CHA.7.530.V1CDR2 и CHA.7.530.vlCDR3.

CHA.7.534.vhCDRl, CHA.7.534.vhCDR2, CHA.7.534.vhCDR3, CHA.7.534.vlCDRl,

CHA.7.534.V1CDR2 и CHA.7.534.vlCDR3.

CHA.7.535.vhCDRl, CHA.7.535.vhCDR2, CHA.7.535.vhCDR3, CHA.7.535.vlCDRl,

CHA.7.535.V1CDR2 и CHA.7.535.vlCDR3.

CHA.7.537.vhCDRl, CHA.7.537.vhCDR2,

CHA.7.537.vhCDR3, CHA.7.537.vlCDRl,

CHA.7.537.V1CDR2 и CHA.7.537.vlCDR3

CHA.7.538_l.vhCDRl, CHA.7.538_l.vhCDR2, CHA.7.538_l.vhCDR3,

CHA.7.538_l.vlCDRl, CHA.7.538_l.vlCDR2 и CHA.7.538_l.vlCDR3.

CHA.7.538_2.vhCDRl, CHA.7.538_2.vhCDR2, CHA.7.538_2.vhCDR3,

CHA.7.538 2.V1CDR1, CHA.7.538_2.vlCDR2 и CHA.7.538_2.vlCDR3.

CHA.7.543.vhCDRl, CHA.7.543.vhCDR2, CHA.7.543.vhCDR3, CHA.7.543.vlCDRl, CHA.7.543.V1CDR2 и CHA.7.543.vlCDR3.

CHA.7.544.vhCDRl, CHA.7.544.vhCDR2, CHA.7.544.vhCDR3, CHA.7.544.vlCDRl, CHA.7.544.V1CDR2 и CHA.7.544.vlCDR3.

CHA.7.545.vhCDRl, CHA.7.545.vhCDR2, CHA.7.545.vhCDR3, CHA.7.545.vlCDRl, CHA.7.545.V1CDR2 и CHA.7.545.vlCDR3.

CHA.7.546.vhCDRl, CHA.7.546.vhCDR2, CHA.7.546.vhCDR3, CHA.7.546.vlCDRl, CHA.7.546.V1CDR2 и CHA.7.546.vlCDR3.

CHA.7.547.vhCDRl, CHA.7.547.vhCDR2, CHA.7.547.vhCDR3, CHA.7.547.vlCDRl, CHA.7.547.V1CDR2 и CHA.7.547.vlCDR3.

CHA.7.548.vhCDRl, CHA.7.548.vhCDR2, CHA.7.548.vhCDR3, CHA.7.548.vlCDRl, CHA.7.548.V1CDR2 и CHA.7.548.vlCDR3.

CHA.7.549.vhCDRl, CHA.7.549.vhCDR2, CHA.7.549.vhCDR3, CHA.7.549.vlCDRl, CHA.7.549.V1CDR2 и CHA.7.549.vlCDR3.

CHA.7.550.vhCDRl, CHA.7.550.vhCDR2, CHA.7.550.vhCDR3, CHA.7.550.vlCDRl, CHA.7.550.V1CDR2 и CHA.7.550.vlCDR3.

Как указано выше, эти наборы CDR также могут представлять собой варианты аминокислот, как описано выше.

Кроме того, каркасные области вариабельных тяжелых и вариабельных легких цепей могут быть гуманизированы, как известно в данной области техники (при необходимости в CDR генерируются случайные варианты), и, таким образом, могут быть созданы гуманизированные варианты цепей VH и VL, продемонстрированных на фиг. 63. Кроме того, гуманизированные вариабельные домены тяжелой и легкой цепи затем могут быть слиты с константными областями человека, такими как константные области от IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4.

В частности, как известно в данной области техники, цепи VH и VL мыши могут быть гуманизированы, как известно в данной области техники, например, с помощью программы IgBLAST на сайте NCBI, как описано в публикации Ye et al. Nucleic Acids Res. 41: W34-W40 (2013), включенной в данный документ посредством ссылки в полном объеме для способов гуманизации. IgBLAST анализирует мышиную последовательность VH и/или VL мыши и сравнивает ее с библиотекой известных последовательностей зародышевой линии человека. Как продемонстрировано в данном документе, для гуманизированных последовательностей, сгенерированных в данном изобретении, в качестве баз данных применяли гены VH человека IMGT (F + ORF, 273 последовательности зародышевой линии) и гены каппа VL

- 49 044486 человека IMGT (F + ORF, 74 последовательности зародышевой линии). Были выбраны типовые пять последовательностей СНА: СНА.7.518, СНА.7.530, СНА.7.538_1, СНА.7.538_2 и СНА.7.524 (см. Фиг. 5 и Фиг. 63 для последовательностей VH и VL). Для этого варианта гуманизации, зародышевая линия IGHV1-46 человека (аллель 1) была выбрана для всех 5 в качестве акцепторной последовательности и области присоединения тяжелой цепи IGHJ4 (аллель 1) человека (ген J). Для трех из четырех (СНА.7.518, СНА.7.530, СНА.7.538_1 и СНА.7.5382) зародышевая линия человека IGKV1-39 (аллель 1) была выбрана в качестве акцепторной последовательности и легкой цепи человека IGKJ2 (аллель 1) (ген J). Ген J был выбран из последовательностей области присоединения человека, собранных в IMGT®, международной информационной системе ImMunoGeneTics, по адресу www.imgt.org. CDR были определены в соответствии с определением AbM (см. www.bioinfo.org.uk/abs/). Фиг. 63 также иллюстрирует гуманизированные последовательности, а также некоторые потенциальные изменения для оптимизации связывания с PVRIG. Антитела анти-PVRIG для применения в данном изобретении могут содержать любую из этих гуманизированных последовательностей антитела к PVRIG или антигенсвязывающего домена.

Конкретные гуманизированные антитела антител к СНА включают, например, те, которые продемонстрированы на фиг. 5 и на фиг. 63. Антитела анти-PVRIG для применения в данном изобретении могут содержать последовательности антитела СНА PVRIG, как продемонстрировано на фиг. 5 и на фиг. 63. Как будет понятно специалистам в данной области техники, каждая из гуманизированных последовательностей вариабельной тяжелой цепи (Гуманизированная тяжелая; НН) и вариабельной легкой цепи (Гуманизированная легкая, HL) может быть объединена с константными областями IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4 человека. То есть СНА.7.518.НН1 представляет собой первую гуманизированную вариабельную тяжелую цепь, а СНА.7.518.НН1.1 представляет собой полноразмерную тяжелую цепь, содержащую гуманизированную последовательность НН1 с константной областью IgG 1 (CHA.7.518.HH1.2 представляет собой СНА.7.518.НН1 с IgG2 и т.д.).

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения антитела анти-PVRIG для применения в данном изобретении включают антитела анти-PVRIG, при этом последовательности V_H и V_L различных антител анти-PVRIG могут быть смешаны и подобраны для создания других антител анти-PVRIG. Связывание PVRIG с такими смешанными и подобранными антителами можно тестировать с помощью анализов связывания, описанных выше, например, ИФА). В некоторых вариантах осуществления данного изобретения, когда цепи V_H и V_L являются смешанными и подобранными, последовательность V_H из конкретного спаривания V_H/V_L заменяют структурно подобной последовательностью V_H. Аналогично, в некоторых вариантах осуществления данного изобретения последовательность V_L из конкретного спаривания V_H/V_L заменяют структурно подобной последовательностью V_L. Например, последовательности V_H и VL гомологичных антител являются особенно пригодными для смешивания и подбора. Антитело анти-PVRIG для применения в данном изобретении может содержать последовательности PVRIG V_H и V_L из различных антител анти-PVRIG, которые были смешаны и подобраны.

Соответственно, указанные антитела по данному изобретению могут содержать аминокислотные последовательности CDR, выбранные из группы, состоящей из (а) последовательностей, перечисленных в данном документе; (b) последовательностей, которые отличаются от аминокислотных последовательностей CDR, указанных в (а), на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или большее количество аминокислотных замен; (с) аминокислотных последовательностей, имеющих 90% или более, 95% или более, 98% или более, или 99% или более идентичности с последовательностями, указанными в (а) или (b); (d) полипептида, имеющего аминокислотную последовательность, кодируемую полинуклеотидом, имеющим последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую аминокислоты, как указано в данном документе. Антитело анти-PVRIG для применения в данном изобретении может содержать последовательности CDR варианта PVRIG.

Кроме того, в определение антител к PVRIG включены антитела, которые имеют идентичность с антителами анти-PVRIG, перечисленными в данном документе. То есть в определенных вариантах осуществления данного изобретения антитело анти-PVRIG по данному изобретению содержит вариабельные области тяжелой и легкой цепи, содержащие аминокислотные последовательности, которые гомологичны выделенным аминокислотным последовательностям анти-PVRIG предпочтительных иммунных молекул анти-PVRIG, соответственно, при этом указанные антитела сохраняют желаемые функциональные свойства родительских антител анти-PVRIG. Процент идентичности между двумя последовательностями является функцией количества идентичных положений, совместно используемых последовательностями (например, % гомологии = количество идентичных положений/общее количество положений X 100), принимая во внимание количество гэпов и длину каждого гэпа, который необходимо ввести для оптимального выравнивания двух последовательностей. Сравнение последовательностей и определение процента идентичности между двумя последовательностями можно выполнить с помощью математического алгоритма, как описано в неограничивающих примерах ниже. Антитела анти-PVRIG для применения в данном изобретении могут содержать вариабельные области тяжелой и легкой цепи, содержащие аминокислотные последовательности, которые гомологичны выделенным аминокислотным последовательностям анти-PVRIG, как описано в данном документе.

Процент идентичности между двумя аминокислотными последовательностями можно определить с

- 50 044486 помощью алгоритма Е. Meyers и W. Miller (Comput. Appl. Biosci., 4:. 11-17 (1988)), который включен в программу ALIGN (версия 2.0), с применением таблицы веса остатков РАМ120, длины гэпа 12 и штрафа за гэп в последовательности 4. Кроме того, процент идентичности между двумя аминокислотными последовательностями можно определить с помощью алгоритма Needleman и Wunsch (J. Mol. Biol. 48: 444453 (1970)), который включен в программу GAP в пакете программного обеспечения GCG (имеется в продаже), с применением либо матрицы Blossum 62, либо матрицы РАМ250, вес гэпа 16, 14, 12, 10, 8, 6 или 4, и штраф за удлинение гэпа 1, 2, 3, 4, 5 или 6.

В целом, процент идентичности для сравнения между антителами к PVRIG составляет по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, при этом предпочтительным является процент идентичности по меньшей мере около 95, 96, 97, 98 или 99%. Процент идентичности может быть вдоль всей аминокислотной последовательности, например, всей тяжелой или легкой цепи или вдоль части цепей. Например, в определения антител анти-PVRIG по данному изобретению включены антитела, которые имеют идентичность вдоль всей вариабельной области (например, когда идентичность составляет 95% или 98% идентичности вдоль вариабельных областей), или вдоль всей константной области, или вдоль только Fc-области.

F. Антитела к TIGIT с противоопухолевыми антителами.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения антитела анти-TIGIT по данному изобретению вводят совместно с антителами, которые, в отличие от иммуноонкологических ингибиторов/ингибиторов контрольных точек, которые обычно воздействуют на иммунную систему для усиления нативного иммунного ответа пациента, вместо этого направлены против специфического опухолевого антигена-мишени (ТТА). Существует большое количество антител анти-ТТА, которые либо одобрены, либо находятся на этапе клинических исследований, и которые можно комбинировать с антителами к TIGIT по данному изобретению. Одобренные в данное время антитела включают, но не ограничиваются ими, цетуксимаб, панитумумаб, нимотузумаб (все антитела к EGFR), ритуксимаб (CD20), трастузумаб и пертузумаб (HER2), алемтузумаб (CD52), бевацизумаб (VEGF), офатумумаб (CD20), деносумаб (RANKлиганд), брентуксимаб (CD30), даратумумаб (CD38), ибритумомаб (CD20) и ипилимумаб (CTLA-4). Специфические целевые онкологические антитела в клинических исследованиях, которые можно комбинировать с антителами анти-TIGIT, включают, но не ограничиваются ими, анти-CTLA4 mAb, такие как ипилимумаб, тремелимумаб (см., например, публикацию патента США № 2017/0306025); анти-PD-1, такие как ниволумаб BMS-936558/ MDX-1106/ONO-4538, АМР224, СТ-011, MK-3475, антагонисты антиPD-L1, такие как атезолизумаб (IMpowerl33), BMS-936559/ MDX-1105, MEDI4736, RG7446/MPDL3280A, а также антитела, описанные в публикации патента США № 2017/0281764); антиLAG-3, такое как IMP-321, анти-TIM-3, анти-BTLA, анти-В7-Н4, анти-В7-И3, анти-VISTA; агонистические антитела, нацеленные на иммуностимулирующие белки, включая анти-CD40 mAb, такие как СР870,893, лукатумумаб, дацетузумаб; анти-CD137 mAb, такие как урелюмаб BMS-663513 (анти-4-1ВВ; см., например, патенты США № 7288638 и 8962804, в полном объеме включенные в данный документ посредством ссылки); PF-05082566 утомилумаб (см., например, патенты США № 8821867; 8337850; и 9468678, а также международную публикацию заявки на патент № W0 2012/032433, в полном объеме включенную в данный документ посредством ссылки); анти-ОХ40 mAb, такое как анти-ОХ40 (см., например, WO 2006/029879 или WO 2010096418, в полном объеме включенные в данный документ посредством ссылки); анти-GITR mAb, такое как TRX518 (см., например, патент США № 7812135, в полном объеме включенные в данный документ посредством ссылки); анти-CD27 mAb, такое как варлилумаб CDX-1127 (см., например, WO 2016/145085 и публикации патента США № US 2011/0274685 и US 2012/0213771, в полном объеме включенные в данный документ посредством ссылки); анти-ICOS mAb (например, MEDI-570, JTX-2011 и антитела анти-TIM3 (см., например, WO 2013/006490 или публикацию патента США № US 2016/0257758, в полном объеме включенные в данный документ посредством ссылки), а также моноклональные антитела к антигенам рака простаты, рака яичника, рака молочной железы, рака эндометрия, множественной миеломы, меланомы, лимфомы, рака легкого, включая мелкоклеточный рак легкого, рака почки, колоректального рака, рака поджелудочной железы, рака желудка, рака мозга (см. в целом www.clinicaltrials.gov).

G. Специфические антитела анти-PD-1.

В другом варианте осуществления данного изобретения предлагаются комбинации антител антиTIGIT по данному изобретению и антител анти-PD-1. Существует два одобренных антитела анти-PD-1, пембролизумаб (Кейтруда (Keytruda®); MK-3475-033), цемиплимаб (REGN2810; см. US 20170174779), и ниволумаб (Опдиво (Opdivo®); CheckMate078) и многие другие, находящиеся на этапе клинических исследований, которые можно применять в комбинации с антителами анти-TIGIT по данному изобретению. В других вариантах осуществления данного изобретения антитело анти-PD-1 может включать, например, SHR-1210 (CTR20160175 и CTR20170090), SHR-1210 (CTR20170299 и CTR20170322), JS-001 (CTR20160274), IBI308 (CTR20160735), BGB-A317 (CTR20160872) и/или антитело к PD-1, как указано в публикации патента США № 2017/0081409. Типовые последовательности антител анти-PD-1 продемонстрированы на фиг. 7, и любая из них может применяться в способах комбинированной терапии, описан

- 51 044486 ных в данном документе.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения антитела анти-TIGIT по данному изобретению комбинируют с антителами анти-PVRIG, как описано в данном документе, а также с антителами αнтu-PD-1, как описано в данном документе, или с другими антителами анти-PD-1, известными в данной области техники, в виде трехкомпонентной комбинированной терапии.

Н. Специфические антитела анти-PD-L1.

В другом варианте осуществления данного изобретения предлагаются комбинации антител антиTIGIT по данному изобретению и антител анти-PD-L1. На этапе клинических исследований находятся три одобренных антитела αнтu-PD-L1: атезолизумаб (ТЕЦЕНТРИК (TECENTRIQ®); MPDL3280A), авелумаб (БАВЕНСИО (BAVENCIO®); MSB001071 8С), и дурвалумаб (MEDI4736), а также другие антитела анти-PD-L1. Доступны многочисленные антитела анти-PD-1 и многие другие, находящиеся на этапе клинических исследований, которые можно применять в комбинации с антителами анти-TIGIT по данному изобретению. В вариантах осуществления данного изобретения, антитело к PD-L1 описано в публикации патента США № 2017/0281764, а также в международной публикации патента № WO 2013/079174 (авелумаб) и WO 2010/077634 (или в заявке на патент США № 20160222117 или патент США № 8217149; атезолизумаб). В некоторых вариантах осуществления данного изобретения антитело к PD-L1 содержит последовательность тяжелой цепи SEQ ID NO: 34 и последовательность легкой цепи SEQ ID NO: 36 (из US 2017/281764). В некоторых вариантах осуществления данного изобретения антитело к PD-L1 представляет собой атезолизумаб (ТЕЦЕНТРИК (TECENTRIQ®); MPDL3280A; IMpower110). В некоторых вариантах осуществления данного изобретения антитело к PD-L1 представляет собой авелумаб (БАВЕНСИО (BAVENCIO®); MSB001071 8С). В некоторых вариантах осуществления данного изобретения антитело к PD-L1 представляет собой дурвалумаб (MEDI4736). В некоторых вариантах осуществления данного изобретения антитело к PD-L1 включает, например, атезолизумаб (IMpower133), BMS-936559/MDX-1105 и/или RG-7446/MPDL3280A и/или YW243.55.S70, а также любое из антител, которые представлены в данном документе на фиг. 62.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения антитела анти-TIGIT по данному изобретению комбинируют с антителами анти-PVRIG, как описано в данном документе, а также с антителами αнтu-PD-L1, как описано в данном документе, или с другими антителами анти-PD-L1, известными в данной области техники, в виде трехкомпонентной комбинированной терапии.

I. Необязательное конструирование антител.

Антитела по данному изобретению могут быть модифицированы или сконструированы для изменения аминокислотных последовательностей путем аминокислотных замен. Как обсуждается в данном документе, аминокислотные замены могут быть осуществлены с целью изменения аффинности CDR к антигену (включая как увеличение, так и уменьшение связывания), а также с целью изменения дополнительных функциональных свойств антител. Например, антитела можно сконструировать так, чтобы они включали модификации в Fc-области, обычно для изменения одной или большего количества функциональных свойств антитела, таких как период полужизни в сыворотке, фиксация комплемента, связывание с рецептором Fc и/или антиген-зависимая клеточная цитотоксичность. Кроме того, антитело согласно по меньшей мере некоторым вариантам осуществления данного изобретения можно химически модифицировать (например, одну или большее количество химических групп можно присоединить к антителу) или можно модифицировать с целью изменения его гликозилирования, опять таки, чтобы изменить одно или большее количество функциональных свойств антитела. Такие варианты осуществления данного изобретения описаны ниже. Нумерация остатков в Fc-области соответствует индексу EU по Кабату.

В одном варианте осуществления данного изобретения шарнирная область C_H1 модифицирована таким образом, что количество остатков цистеина в шарнирной области изменяется, например, увеличивается или уменьшается. Этот подход описан дополнительно в патенте США № 5677425, Bodmer et al. Количество остатков цистеина в шарнирной области СН1 изменяют, например, для облегчения сборки легкой и тяжелой цепей или для увеличения или уменьшения стабильности антитела.

В еще одном варианте осуществления данного изобретения антитело может быть модифицировано для аннулирования обмена Fab-плеча in vivo, в частности, когда применяются константные домены IgG4. В частности, этот процесс включает обмен полумолекул IgG4 (одна тяжелая цепь плюс одна легкая цепь) между другими антителами IgG4, что приводит к эффективному образованию антител, которые являются функционально моновалентными. Мутации в шарнирной области и константных доменах тяжелой цепи могут аннулировать этот обмен (см. Aalberse, RC, Schuurman J., 2002, Immunology 105: 9-19). Как указано в данном документе, мутация, которая находит конкретное применение в данном изобретении, представляет собой S241P в контексте константного домена IgG4. IgG4 находит применение в данном изобретении, так как он не обладает значительной эффекторной функцией и, таким образом, применяется для блокирования связывания рецептор-лиганд без деплетирования клеток.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения аминокислотные замены можно осуществить в Fc-области, в основном, для изменения связывания с рецепторами FcyR. Под термином рецептор Fc гамма, FcyR или Fc гамма R в контексте данного описания подразумевается любой пред

- 52 044486 ставитель семейства белков, которые связывают Fc-область антитела IgG и кодируются геном FcyR. У людей это семейство включает, но не ограничивается ими, FcyRI (CD64), включая изоформы FcyRIa, FcyRIb и FcyRIc; FcyRII (CD32), включая изоформы FcyRIIa (включая аллотипы H131 и R131), FcyRIIb (включая FcyRIIb-1 и FcyRIIb-2) и FcyRIIc; и FcyRIII (CD16), включая изоформы FcyRIIIa (включая аллотипы V158 и F158) и FcyRIIIb (включая аллотипы FcyRIIIb-NA1 и FcyRIIIb-NA2) (Jefferis et al., 2002, Immunol Lett 82: 57-65, что в полном объеме включено в данный документ посредством ссылки) а также любые неизвестные изоформы или аллотипы FcyRs или FcyR человека. FcyR может происходить из любого организма, в том числе, но не ограничиваясь ими, организма людей, мышей, крыс, кроликов и обезьян. FcyR мыши включают, но не ограничиваются ими, FcyRI (CD64), FcyRII (CD32), FcyRIII-1 (CD16) и FcyRIII-2 (CD16-2), а также любые неизвестные изоформы или аллотипы FcyR или FcyR мыши.

Существует ряд пригодных замен Fc, которые можно осуществить для изменения связывания с одним или большим количеством рецепторов FcyR. Могут быть полезными замены, которые приводят к увеличению связывания, а также к уменьшению связывания. Например, известно, что увеличенное связывание с FcyRIIIa обычно приводит к увеличению АЗКЦ (антителозависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности; клеточно-опосредованной реакции, при которой неспецифические цитотоксические клетки, которые экспрессируют FcyR, распознают связанное антитело на клетке-мишени и впоследствии вызывают лизис клетки-мишени. Аналогичным образом, в некоторых случаях также может быть полезным уменьшение связывания с FcyRIIb (ингибирующий рецептор). Аминокислотные замены, которые находят применение в данном изобретении, включают замены, перечисленные в публикации US Ser. № 11/124620 (в частности, фиг. 41) и в публикации патента США № 6737056, обе из которых явным образом включены в данный документ посредством ссылки в полном объеме и конкретно для описанных в них вариантов.

В других вариантах осуществления данного изобретения Fc-область изменяют путем замены по меньшей мере одного аминокислотного остатка другим аминокислотным остатком для изменения эффекторных функций антитела. Например, одну или большее количество аминокислот, выбранных из аминокислотных остатков 234, 235, 236, 237, 297, 318, 320 и 322, можно заменить другим аминокислотным остатком, так что антитело будет иметь измененную аффинность к эффекторному лиганду, но сохранит антигенсвязывающую способность родительского антитела. Эффекторный лиганд, к которому изменяется аффинность, может быть, например, рецептором Fc или компонентом С1 комплемента. Этот подход более подробно описан в патентах США № 5624821 и 5648260, авторами которых являются Winter et al.

В другом примере, одну или большее количество аминокислот, выбранных из аминокислотных остатков 329, 331 и 322, можно заменить другим аминокислотным остатком, так что антитело будет характеризоваться измененным связыванием C1q и/или уменьшенной или аннулированной комплементзависимой цитотоксичностью (КЗЦ). Этот подход более подробно описан Idusogie et al. в патенте США № 6194551.

В другом примере, один или большее количество аминокислотных остатков в аминокислотных положениях 231 и 239 изменяют, чтобы тем самым изменить способность антитела фиксировать комплемент. Этот подход дополнительно описан Bodmer et al. в публикации РСТ WO 94/29351.

В еще одном примере Fc-область модифицируют для увеличения способности антитела опосредовать антитело-зависимую клеточную цитотоксичность (АЗКЦ) и/или для увеличения аффинности антитела к рецептору Fcy путем модификации одной или большего количества аминокислот в следующих положениях: 238, 239, 248, 249, 252, 254, 255, 256, 258, 265, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290 292, 293, 294, 295, 296, 298, 301, 303, 305, 307, 309, 312, 315, 320, 322, 324, 326, 327, 329, 330, 331, 333, 334, 335, 337, 338, 340, 360, 373, 376, 378, 382, 388, 389, 398, 414, 416, 419, 430, 434, 435, 437, 438 или 439. Этот подход дополнительно описан Presta в публикации РСТ WO 00/42072. Кроме того, сайты связывания на IgG1 человека для FcyRI, FcyRII, FcyRIII и FcRn картировали и описывали варианты с улучшенным связыванием (см. Shields, R. L. et al. (2001) J. Biol. Chem. 276:6591-6604). Продемонстрировано, что специфические мутации в положениях 256, 290, 298, 333, 334 и 339 улучшают связывание с FcyRIII. Кроме того, продемонстрировано, что следующие комбинации мутантов улучшают связывание FcyRIII: T256A/S298A, S298A/E333A, S298A/K224A и S298A/E333A/K334A. Кроме того, такие мутации, как M252Y/S254T/T256E или M428L/N434S, улучшают связывание с FcRn и увеличивают период полужизни циркулирующих антител (см. Chan CA и Carter PJ (2010) Nature Rev Immunol 10:301316).

Кроме того, антитела по данному изобретению модифицируют для увеличения их биологического периода полужизни. Существуют разные подходы. Например, можно ввести одну или большее количество из следующих мутаций: T252L, T254S, T256F, как описано в патенте США Ward № 6277375. В альтернативном варианте, для увеличения биологического периода полужизни, антитело можно изменить в области C_H1 или C_L таким образом, что оно будет содержать эпитоп связывания рецептора реутилизации, образованного из двух петель СН2-домена Fc-области IgG, как описано Presta et al. в патентах США № 5869046 и 6121022. Дополнительные мутации для увеличения периода полужизни в сыворотке описаны в

- 53 044486 патентах США № 8883973, 6737056 и 7371826 и включают 428L, 434А, 434S и 428L/434S.

В еще одном варианте осуществления данного изобретения модифицируют гликозилирование антитела. Например, может быть получено агликозилированное антитело (то есть антитело без гликозилирования). Гликозилирование может быть изменено, например, для увеличения аффинности антитела к антигену или снижения эффекторной функции, такой как АЗКЦ. Такие углеводные модификации могут быть осуществлены, например, путем изменения одного или большего количества сайтов гликозилирования в последовательности антитела, например N297. Например, можно осуществить одну или большее количество аминокислотных замен, которые приводят к удалению одного или большего количества сайтов гликозилирования каркаса вариабельной области, чтобы таким образом удалить гликозилирование в этом сайте с применением замены аланина в некоторых вариантах осуществления данного изобретения.

В дополнительном или альтернативном варианте можно создать антитело с измененным типом гликозилирования, такое как гипофукозилированное антитело с уменьшенным количеством остатков фукозила, или антитело с увеличенным количеством бисекционных структур GlcNac. Было продемонстрировано, что такие измененные характеристики гликозилирования повышают АЗКЦ-способность антител. Такие углеводные модификации могут быть осуществлены, например, путем экспрессии антитела в клетке-хозяине с измененным аппаратом гликозилирования. Клетки с измененным аппаратом гликозилирования были описаны в данной области техники и могут применяться в качестве клеток-хозяев, в которых экспрессируются рекомбинантные антитела согласно по меньшей мере некоторым вариантам осуществления данного изобретения, в результате чего получают антитело с измененным гликозилированием. Например, в клеточных линиях Ms704, Ms705 и Ms709 отсутствует ген фукозилтрансферазы, FUT8 (α (1,6) фукозилтрансфераза), так что в антителах, экспрессируемых в клеточных линиях Ms704, Ms705 и Ms709, отсутствует фукоза на их углеводах. Клеточные линии Fs8 Ms704, Ms705 и Ms709 создают путем целенаправленного разрушения гена FUT8 в клетках CHO/DG44 с помощью двух замещающих векторов (см. публикацию патента США № 20040110704 Yamane et al. И Yamane-Ohnuki et al. (2004) Biotechnol Bioeng 87: 614-22). В качестве другого примера, в публикации Hanai et al. EP 1176195 описана клеточная линия с функционально разрушенным геном FUT8, который кодирует фукозилтрансферазу, в результате чего антитела, экспрессируемые в такой клеточной линии, демонстрируют гипофукозилирование путем уменьшения активности или элиминации фермента, связанного с α 1,6-связью. Hanai et al. также описывают клеточные линии, которые обладают низкой ферментативной активностью при добавлении фукозы к N-ацетилглюкозамину, который связывается с Fc-областью антитела, или не обладают ферментативной активностью, например, клеточные линия клеток миеломы крысы YB2/0 (АТСС CRL 1662), В публикации РСТ WO 03/035835, Presta, описан вариант клеточной линии СНО, клетки Lec 13, с уменьшенной способностью присоединять фукозу к Asn(297)-связанным углеводам, что также приводит к гипофукозилированию антител, экспрессируемых в этой клетке-хозяине (см. также, Shields, R. L. et al. (2002) J. Biol. Chem. 277:26733-26740). В публикации РСТ WO 99/54342, Umana et al., описаны клеточные линии, сконструированные для экспрессии гликопротеин-модифицирующих гликозилтрансфераз (например, β (1,4)-Т-ацетилглюкозаминилтрансфераза III (GnTIII)) таким образом, что антитела, экспрессируемые в сконструированных клеточных линиях, демонстрируют повышение количества бисекционных структур GlcNac, что приводит к увеличению активности АЗКЦ антител (см. также Umana et al. (1999) Nat. Biotech. 17:176-180). В альтернативном варианте, остатки фукозы антитела можно отщепить с помощью фермента фукозидазы. Например, фукозидаза a-L-фукозидаза удаляет фукозильные остатки из антител (Tarentino, AL et al. (1975) Biochem. 14: 5516-23).

Другой модификацией антител в данном документе, которая предлагается в данном изобретении, является пегилирование или добавление других растворимых в воде фрагментов, обычно полимеров, например, для увеличения периода полужизни. Антитело может быть пегилировано, например, для увеличения биологического (например, сывороточного) периода полужизни определенного антитела. Для пегилирования антитела, антитело или его фрагмент обычно подвергают взаимодействию с полиэтиленгликолем (ПЭГ), таким как реакционноспособный сложный эфир или альдегидное производное ПЭГ, в условиях, когда одна или большее количество групп ПЭГ присоединяются к антителу или фрагменту антитела. Предпочтительно, пегилирование осуществляют посредством реакции ацилирования или реакции алкилирования с реакционноспособной молекулой ПЭГ (или аналогичным реакционноспособным водорастворимым полимером). В данном контексте под термином полиэтиленгликоль подразумевается любая форма ПЭГ, которая применялась для образования производных других белков, таких как моно (Ci-Cio) алкокси- или арилокси-полиэтиленгликоль или полиэтиленгликоль-малеимид. В некоторых вариантах осуществления данного изобретения антитело, подлежащее пегилированию, представляет собой агликозилированное антитело. Способы пегилирования белков известны в данной области техники и могут быть применены к антителам в соответствии по меньшей мере с некоторыми вариантами осуществления данного изобретения. См., например, публикацию ЕР 0 154 316, Nishimura et al., и публикацию ЕР 0401384, Ishikawa et al.

В дополнение к заменам, осуществленным для изменения аффинности связывания с FcyRs и/или FcRn, и/или для увеличения периода полужизни в сыворотке in vivo, можно осуществить дополнитель

- 54 044486 ные модификации антител, как более подробно описано ниже.

В некоторых случаях достигают созревания аффинности. Аминокислотные модификации в CDR иногда называют созреванием аффинности. Антитело с созревшей аффинностью представляет собой антитело, имеющее одно или большее количество изменений в одной или большем количестве CDR, что приводит к улучшению аффинности антитела к антигену по сравнению с родительским антителом, которое не обладает этими изменениями. В некоторых случаях может быть желательно уменьшить аффинность антитела к его антигену.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения одну или большее количество модификаций аминокислот вносят в одну или большее количество CDR антител по данному изобретению. Как правило, только 1, 2 или 3 аминокислоты замещают в любой отдельной CDR, и, как правило, не более чем из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 изменений вносятся в набор CDR. Однако следует понимать, что любая комбинация без замен, с 1, 2 или 3 заменами в любой CDR может независимо и необязательно сочетаться с любой другой заменой.

Созревание аффинности можно осуществлять для увеличения аффинности связывания антитела с антигеном по меньшей мере от около 10% до 50-100-150% или более или от 1 до 5 раз по сравнению с родительским антителом. Предпочтительные антитела с созревшей аффинностью будут иметь наномолярную или даже пикомолярную аффинность к антигену. Антитела с созревшей аффинностью получают с помощью известных способов. См., например, публикацию Marks et al., 1992, Biotechnology 10: 779783, в которой описано созревание аффинности с помощью перестановки доменов вариабельной тяжелой цепи (VH) и вариабельной легкой цепи (VL). Случайный мутагенез остатков CDR и/или каркаса описан в публикациях: Barbas, et al. 1994, Proc. Nat. Acad. Sci, USA 91:3809-3813; Shier et al., 1995, Gene 169:147155; Yelton et al., 1995, J. Immunol. 155: 1994-2004; Jackson et al., 1995, J. Immunol. 154 (7): 3310-9; и Hawkins et al., 1992, J. Mol. Biol. 226: 889-896, например.

В альтернативном варианте, аминокислотные модификации можно осуществить в одной или большем количестве CDR антител по данному изобретению, которые являются молчащими, например, которые существенно не изменяют аффинность антитела к антигену. Это может быть сделано по ряду причин, включая оптимизацию экспрессии (как это может быть осуществлено для нуклеиновых кислот, кодирующих антитела по данному изобретению).

Таким образом, в определение CDR и антител по данному изобретению включены варианты CDR и антител; то есть антитела по данному изобретению могут включать модификации аминокислот в одной или большем количестве CDR перечисленных антител по данному изобретению. Кроме того, как указано ниже, модификации аминокислот также могут быть независимо и необязательно осуществлены в любой области за пределами CDR, включая каркасные и константные области.

VI. Антитела анти-TIGIT в комбинированной терапии

Антитела к TIGIT и к PVRIG по данному изобретению находят конкретное применение при лечении рака при использовании в комбинации и, например, с ингибитором контрольной точки, таким как антитело анти-PD-1, как описано в данном документе. В целом, антитела по данному изобретению являются иммуномодулирующими, поскольку антитела ани-TIGIT и анти-PVRIG по данному изобретению, вместо того, чтобы непосредственно атаковать раковые клетки, стимулируют иммунную систему, как правило, ингибируя действие TIGIT и PVRIG, соответственно. Таким образом, в отличие от терапии, направленной на опухоль, которая основана на ингибировании молекулярных путей, имеющих решающее значение для роста и развития опухоли, и/или деплетирование опухолевых клеток, иммунотерапия рака направлена на стимулирование собственной иммунной системы пациента для устранения раковых клеток, обеспечивая продолжительное разрушение опухоли. Для иммунотерапии рака можно применять различные подходы, среди которых терапевтические противораковые вакцины для индукции опухолеспецифических Т-клеточных ответов и иммуностимулирующие антитела (то есть антагонисты ингибирующих рецепторов = иммунных контрольных точек) для удаления иммуносупрессивных путей.

Клинические ответы при таргетной терапии или традиционной противораковой терапии имеют тенденцию быть кратковременными, поскольку у раковых клеток развивается резистентность, и возникает рецидив опухоли. Тем не менее, клиническое применение противораковой иммунотерапии в последние несколько лет показало, что этот способ терапии может характеризоваться длительными клиническими ответами, что оказывает существенное влияние на долгосрочную выживаемость. Однако, хотя ответы носят долгосрочный характер, на иммунотерапию отвечает только небольшое количество пациентов (в отличие от обычной или таргетной терапии, когда большое количество пациентов отвечает, но ответы являются неустойчивыми).

К тому времени, когда опухоль обнаруживается клинически, она уже обошла иммунную систему защиты, приобретя иммунорезистентные и иммуносупрессивные свойства и создавая микросреду иммуносупрессивной опухоли с помощью различных механизмов и множества иммунных клеток.

Соответственно комбинации антител анти-TIGIT и анти-PVRIG по данному изобретению являются пригодными для лечения рака. Из-за природы иммуноонкологического механизма действия, TIGIT и/или PVRIG не обязательно должны сверхэкспрессироваться или коррелироваться с конкретным типом рака; то есть цель состоит в том, чтобы антитела анти-TIGIT подавляли активацию Т-клеток и NK-клеток та- 55 044486 ким образом, чтобы рак подвергался атаке иммунной системы.

VII. Композиции нуклеиновых кислот.

Также предлагаются композиции нуклеиновых кислот, кодирующие антитела анти-TIGIT, антиPVRIG и анти-PD-1 по данному изобретению, а также экспрессионные векторы, содержащие нуклеиновые кислоты и клетки-хозяева, трансформированные композициями нуклеиновых кислот и/или экспрессионными векторами. Как будет понятно специалистам в данной области техники, последовательности белка, описанные в данном документе, могут кодироваться любым количеством возможных последовательностей нуклеиновых кислот вследствие вырожденности генетического кода.

Композиции нуклеиновых кислот, которые кодируют антитела, будут зависеть от формата антитела. Традиционные тетрамерные антитела, содержащие две тяжелые цепи и две легкие цепи, кодируются двумя разными нуклеиновыми кислотами, одна кодирует тяжелую цепь, а другая кодирует легкую цепь. Их можно поместить в один экспрессионный вектор или в два экспрессионных вектора, как известно в данной области техники, трансформировать в клетки-хозяева, где они экспрессируются с образованием антител по данному изобретению. В некоторых вариантах осуществления данного изобретения, например, когда применяются конструкции scFv, обычно используют одну нуклеиновую кислоту, кодирующую комплекс вариабельная тяжелая цепь - линкер -вариабельная легкая цепь, которая может быть вставлена в экспрессионный вектор для трансформации в клетки-хозяева. Нуклеиновые кислоты могут быть введены в экспрессионные векторы, которые содержат соответствующие последовательности контроля транскрипции и трансляции, включая, но не ограничиваясь этим, сигнальные и секреторные последовательности, регуляторные последовательности, промоторы, источники репликации, селекционные гены и т.д.

Предпочтительные клетки-хозяева млекопитающих для экспрессии рекомбинантных антител по меньшей мере в некоторых вариантах осуществления данного изобретения включают клетки яичника китайского хомяка (клетки СНО), PER.C6, HEK293 и другие, как известно в данной области техники.

Нуклеиновые кислоты могут присутствовать в целых клетках, в клеточном лизате или в частично очищенной или по существу чистой форме. Нуклеиновая кислота является выделенной или выделенной по существу чистой, если она очищена от других клеточных компонентов или других контаминатов, например, других клеточных нуклеиновых кислот или белков с помощью стандартных способов, включая обработку щелочью/SDS, разделение в CsCl, хроматографию на колонке, электрофорез в агарозном геле и с помощью других, хорошо известных способов в данной области техники.

Для создания гена scFv, VH- и VL-кодирующие фрагменты ДНК функционально связывают с другим фрагментом, кодирующим гибкий линкер, например, кодирующим аминокислотную последовательность (Gly₄-Ser)₃, так чтобы последовательности V_H и V_L могли экспрессироваться в виде непрерывного одноцепочечного белка с областями V_L и VH, связанными гибким линкером (см., например, Bird et al. (1988) Science 242:423-426; Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; McCafferty et al., (1990) Nature 348:552-554).

VIII. Составы антител по данному изобретению.

Терапевтические композиции, применяемые при практическом осуществлении вышеуказанных способов, могут быть составлены в фармацевтические композиции, содержащие носитель, пригодный для необходимого способа доставки. Пригодные носители включают в себя любое вещество, которое в комбинации с терапевтической композицией сохраняет противоопухолевую функцию терапевтической композиции и, как правило, не вызывает реакции иммунной системы пациента. Примеры включают в себя, но не ограничиваются ими, любой из ряда стандартных фармацевтических носителей, такие как стерильные фосфатно-солевые буферные растворы, бактериостатическая вода и т.п. (см., в целом, Remington's Pharmaceutical Sciences 16th Edition, A. Osal., Ed., 1980). Приемлемые носители, вспомогательные вещества или стабилизаторы являются нетоксичными для реципиентов в применяемых дозах и концентрациях и могут включать буферы.

В предпочтительном варианте осуществления данного изобретения фармацевтическая композиция, которая содержит антитела по данному изобретению, может быть в водорастворимой форме, такой как присутствующая в виде фармацевтически приемлемых солей, которая должна включать как соль присоединения кислоты, так и соль присоединения основания. Термин фармацевтически приемлемая соль присоединения кислоты относится к тем солям, которые сохраняют биологическую эффективность свободных оснований и которые не являются биологически или иным образом нежелательными, образованными с неорганическими кислотами и тому подобным. Фармацевтически приемлемые соли присоединения основания включают соли, полученные из неорганических оснований и тому подобное.

Введение фармацевтической композиции, содержащей антитела по данному изобретению, предпочтительно в форме стерильного водного раствора, может осуществляться различными способами, включая, но не ограничиваясь, подкожно и внутривенно.

Количества доз и частоты введения в предпочтительном варианте осуществления данного изобретения выбирают так, чтобы они были терапевтически или профилактически эффективными. Как известно в данной области техники, может понадобиться коррекция на деградацию белка, системную и локальную доставку и скорость синтеза новой протеазы, а также возраст, массу тела, общее состояние здоровья, пол,

- 56 044486 рацион, время введения, взаимодействие с лекарственным средством и степень тяжести патологического состояния, при этом специалисты в данной области техники могут определить вышеуказанную коррекцию с помощью обычных экспериментов.

Для лечения пациента можно вводить терапевтически эффективную дозу варианта Fc по данному изобретению. Под термином терапевтически эффективная доза в данном документе подразумевается доза, которая вызывает эффекты, с целью которых она вводится. Точная доза будет зависеть от цели лечения и будет установлена специалистом в данной области техники с помощью известных методик.

А. Комбинированные составы.

Антитела по данному изобретению (либо в виде трехкомпонентной комбинации антител антиTIGIT, анти-PVRIG и анти-PD-1, либо в виде двухкомпонентной комбинации антител анти-TIGIT и антиPVRIG) могут быть получены с помощью различных способов, как известно специалистам в данной области техники. В некоторых случаях антитела вводят одновременно, например, в виде отдельных инфузий (например, каждый пакет для внутривенного вливания содержит одно антитело) или в виде одной инфузии смеси антител. В альтернативном варианте, антитела можно вводить последовательно, например, в течение нескольких часов или дней.

В некоторых случаях антитела предлагаются в наборе для введения, содержащим дозированные единицы каждого антитела, опять таки, упакованные либо отдельно в разные дозированные единицы, либо вместе в виде смеси антител в одной дозированной единице.

IX. Комбинированные способы терапии и их применение.

А. Способы терапии рака.

В данном контексте термин рак в широком смысле относится к любому опухолевому заболеванию (инвазивному или метастатическому), характеризующемуся аномальным и неконтролируемым делением клеток, вызывающим злокачественный рост или развитие опухоли (например, нерегулируемый рост клеток). Термин рак или раковый, применяемый в данном документе следует понимать как охватывающий любое опухолевое заболевание (будь то инвазивное, неинвазивное или метастатическое), которое характеризуется аномальным и неконтролируемым делением клеток, вызывающим злокачественный рост или развитие опухоли, неограничивающие примеры которых описаны в данном документе. Этот термин включает в себя любое физиологическое состояние у млекопитающих, которое обычно характеризуется нерегулируемым ростом клеток. Примеры рака приведены в рабочих примерах, а также описаны в данном описании.

Неограничивающие примеры рака, которые можно лечить с помощью антител анти-TIGIT, антител анти-PVRIG, а также комбинаций антител анти-TIGIT и других антител, таких как любое из антител анти-TIGIT, анти-PVRIG, анти-PD-1 и/или антител анти-PD-L1, приведены в данном документе. Такие раковые заболевания включают, но не ограничиваются ими, карциному, лимфому, бластому, саркому и лейкоз. Более конкретные примеры таких видов рака включают в себя плоскоклеточный рак, рак легкого (в том числе мелкоклеточный рак легкого, немелкоклеточный рак легкого, аденокарциному легкого и плоскоклеточный рак легкого), рак брюшины, гепатоцеллюлярный рак, рак желудка (в том числе рак желудочно-кишечного тракта), рак пищевода, меланому, мезотелиому, рак из клеток Меркеля, рак поджелудочной железы, глиобластому, рак шейки матки, рак яичников, рак печени, рак мочевого пузыря, гепатому, рак молочной железы, рак толстой кишки, колоректальный рак, рак эндометрия или матки, карциному слюнных желез, рак почки, рак предстательной железы, рак влагалища, рак щитовидной железы, карциному печени и различные типы рака головы и шеи, рак гортани, рак ротовой полости, уротелиальный рак, KRAS-мутантные опухоли, миелодиспластические синдромы (МДС), а также Вклеточные злокачественные опухоли, В-клеточную лимфому (в том числе низкодифференцированную/фолликулярную неходжкинскую лимфому (НХЛ), мелкоклеточную лимфоцитарную лимфому (МКЛ) НХЛ, среднедифференцированную/фолликулярную НХЛ, среднедифференцированную диффузную НХЛ, высокодифференцированную иммунобластную НХЛ, высокодифференцированную лимфобластную НХЛ, высокодифференцированную НХЛ из мелких нерасщепленных клеток, НХЛ с массивным поражением лимфатических узлов, лимфому мантийных клеток; лимфому, ассоциированную со СПИДом, и макроглобулинемию Вальденстрема); хронический лимфолейкоз (ХЛЛ); острый лимфобластный лейкоз (ОЛЛ); волосатоклеточный лейкоз; хронический миелобластный лейкоз; Т-клеточный лейкоз/лимф ому взрослых; миелому; множественную миелому и посттрансплантационное лимфопролиферативное нарушение (PTLD), лимфоидные злокачественные новообразования, аномальную сосудистую пролиферацию, ассоциированную с факоматозами, отек (например, ассоциированный с опухолями головного мозга) и синдром Мейгса, рак прямой кишки, почечно-клеточный рак, саркому мягких тканей, саркому Капоши, карциноидную карциному яичника в ранней или поздней стадии (в том числе метастатическую). Раковые состояния, поддающиеся лечению по данному изобретению, включают раковые заболевания, которые экспрессируют или не экспрессируют TIGIT, PVRIG, PVRL, PD-1 и/или PD-L1, и, кроме того, включают неметастатические или неинвазивные, а также инвазивные или метастатические раковые заболевания, при которых экспрессия TIGIT, PVRIG, PVRL, PD-1 и/или PD-L1 иммунными, стромальными или больными клетками подавляет противоопухолевые ответы и антиинвазивные иммунные ответы. Способ по данному изобретению является особенно пригодным для лечения васкуляризо

- 57 044486 ванных опухолей. В некоторых вариантах осуществления данного изобретения рак выбирают из группы, состоящей из рака предстательной железы, рака печени (ГЦК), колоректального рака, рака яичника, рака эндометрия, рака молочной железы, трижды негативного рака молочной железы, рака поджелудочной железы, рака желудка (желудочного рака), рака шейки матки, рака головы и шеи, рака щитовидной железы, рака яичка, уротелиального рака, рак легкого (мелкоклеточного рака легкого, немелкоклеточного рака легкого), меланомы, немеланомного рака кожи (плоскоклеточного и базально-клеточного рака), глиомы, рака почки (ПКК), лимфомы (НХЛ или ХЛ), острого миелоидного лейкоза (ОМЛ), Т-клеточного острого лимфобластного лейкоза (Т-ОЛЛ), диффузной В-крупноклеточной лимфомы, герминогенных опухолей яичка, мезотелиомы, рака пищевода, рака из клеток Меркеля, рака с высоким уровнем MSI, KRAS-мутантных опухолей, Т-клеточного лейкоза/лимфомы взрослых и миелодиспластических синдромов (МДС). В некоторых вариантах осуществления указанного способа рак выбирают из группы, состоящей из трижды негативного рака молочной железы, рака желудка (желудочного рака, рака легкого (мелкоклеточного рака легкого, немелкоклеточного рака легкого), рака из клеток Меркеля, рака с высоким уровнем MSI, KRAS-мутантных опухолей, Т-клеточного лейкоза/лимфомы взрослых и миелодиспластических синдромов (МДС).

Термин терапия рака в контексте данного документа относится к любому способу, с помощью которого предотвращают или лечат рак или ослабляет один или большее количество симптомов рака. Как правило, такие способы лечения включают введение иммуностимулирующих антител анти-TIGIT и антиPVRIG (включая антигенсвязывающие фрагменты) в сочетании с химиотерапией или лучевой терапией или другими биологическими средствами и для усиления их активности, то есть у индивидуумов, у которых экспрессия TIGIT и/или PVRIG подавляет противоопухолевые реакции и эффективность химиотерапии или лучевой терапии, или биологическую эффективность.

В данном изобретении предлагаются способы комбинированного лечения и применение антител анти-TIGIT и антител анти-PVRIG, иногда с добавлением антител анти-PD-1, для трехкомпонентной комбинированной терапии. В данном изобретении предлагаются способы комбинированного лечения и применение антител анти-TIGIT и антител анти-PVRIG, иногда с добавлением антител анти-PD-LL Любое из антител анти-PVRIG, перечисленных выше или на фигурах, можно применять для трехкомпонентной комбинированной терапии. Любое из антител анти-TIGIT, перечисленных выше или на фигурах, можно применять для трехкомпонентной комбинированной терапии. Любое из антител анти-PD-1, перечисленных выше или на фигурах, можно применять для трехкомпонентной комбинированной терапии. Любое из антител анти-PD-L1, перечисленных выше или на фигурах, можно применять для трехкомпонентной комбинированной терапии. В некоторых вариантах осуществления данного изобретения антитело анти-TIGIT представляет собой антитело, выбранное из любого антитела анти-TIGIT, описанного в данном документе, включая любое из антител, описанных на фиг. 3. В некоторых вариантах осуществления данного изобретения антитело анти-PVRIG представляет собой антитело, выбранное из любого антитела анти-PVRIG, описанного в данном документе, включая любое из антител, описанных на фиг. 5 и/или на фиг. 63. В некоторых вариантах осуществления данного изобретения антитело анти-PD-1 представляет собой антитело, выбранное из любого антитела анти-PD-1, описанного в данном документе, включая любое из антител, описанных на фиг. 7.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения антитело анти-PD-1 выбирают из пембролизумаба (Кейтруда (Keytruda®); MK-3475-033), ниволумаба (Опдиво (Opdivo®); CheckMate078), цемплимаба (REGN2810), SHR-1210 (CTR20160175 и CTR20170090), SHR-1210 (CTR20170299 и CTR20170322), JS-001 (CTR20160274), IBI308 (CTR20160735), BGB-A317 (CTR20160872) и/или антитела к PD-1, как указано в публикации патента США № 2017/0081409.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения, антитело анти-PD-L1 выбирают из антител, описанных в публикации патента США № 2017/0281764, а также в международной публикации патента № WO 2013/079174 (авелумаб) и WO 2010/077634 (или в заявке на патент США № 20160222117 или патент США № 8217149; атезолизумаб). В некоторых вариантах осуществления данного изобретения антитело к PD-L1 содержит последовательность тяжелой цепи SEQ ID NO: 34 и последовательность легкой цепи SEQ ID NO: 36 (из US 2017/281764). В некоторых вариантах осуществления данного изобретения антитело к PD-L1 представляет собой атезолизумаб (ТЕЦЕНТРИК (TECENTRIQ®); MPDL3280A; IMpower110). В некоторых вариантах осуществления данного изобретения антитело к PD-L1 представляет собой авелумаб (БАВЕНСИО (BAVENCIO®); MSB001071 8С). В некоторых вариантах осуществления данного изобретения антитело к PD-L1 представляет собой дурвалумаб (MEDI4736). В некоторых вариантах осуществления данного изобретения антитело к PD-L1 включает, например, атезолизумаб (IMpower133), BMS-936559/MDX-1105 и/или RG-7446/MPDL3280A и/или YW243.55.S70, а также любое из антител, которые представлены в данном документе на фиг. 62.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения антитело анти-PVRIG выбирают из антитела, последовательности которого продемонстрированы на фиг. 5 и/или на фиг. 63:

- 58 044486

CPA.7.001, CPA.7.001.VH, CPA.7.001.VL, CPA.7.001.HC, CPA.7.001.LC и CPA.7.001.H1, CPA.7.001.H2, CPA.7.001.H3, CPA.7.001.H4; CPA.7.001.vhCDRl,

CPA.7.001.vhCDR2, CPA.7.001.vhCDR3, CPA.7.001.vlCDRl, CPA.7.001.vlCDR2 и CPA.7.001.vlCDR3;

CPA.7.003, CPA.7.003.VH, CPA.7.003.VL, CPA.7.003.HC, CPA.7.003.LC,

CPA.7.003.H1, CPA.7.003.H2, CPA.7.003 H3, CPA.7.003.H4; CPA.7.003.vhCDRl,

CPA.7.003.vhCDR2, CPA.7.003.vhCDR3, CPA.7.003 .vlCDRl, CPA.7.003 ,vlCDR2 и

CPA.7.003.vlCDR3; CPA.7.004, CPA.7.004.VH, CPA.7.004.VL, CPA.7.004.HC, CPA.7.004.LC,

CPA.7.004.H1, CPA.7.004.H2, CPA.7.004.H3 CPA.7.004.H4; CPA.7.004.vhCDRl,

CPA. 7.004. vhCDR2, CPA.7.004.vhCDR3, CPA.7.004.vlCDRl, CPA.7.004.vlCDR2 и CPA. 7.004. vlCDR3; CPA.7.006, CPA.7.006.VH, CPA.7.006.VL, CPA.7.006.HC, CPA.7.006.LC,

CPA.7.006.H1, CPA.7.006.H2, CPA.7.006.H3 CPA.7.006.H4; CPA.7.006.vhCDRl,

CPA. 7.006. vhCDR2, CPA.7.006.vhCDR3, CPA.7.006.vlCDRl, CPA.7.006.vlCDR2 и CPA.7.006.V1CDR3; CPA.7.008, CPA.7.008.VH, CPA.7.008.VL, CPA.7.008.HC, CPA.7.008.LC,

CPA.7.008.H1, CPA.7.008.H2, CPA.7.008.H3 CPA.7.008.H4; CPA.7.008.vhCDRl,

CPA.7.008.vhCDR2, CPA.7.008.vhCDR3, CPA.7.008.vlCDRl, CPA.7.008.vlCDR2 и CPA.7.008.V1CDR3; CPA.7.009, CPA.7.009.VH, CPA.7.009.VL, CPA.7.009.HC, CPA.7.009.LC,

CPA.7.009.H1, CPA.7.009.H2, CPA.7.009.H3 CPA.7.009.H4; CPA.7.009.vhCDRl,

CPA.7.009.vhCDR2, CPA.7.009.vhCDR3, CPA.7.009.vlCDRl, CPA.7.009.vlCDR2 и CPA.7.009.V1CDR3; CPA.7.010, CPA.7.010.VH, CPA.7.010.VL, CPA.7.010.HC, CPA.7.010.LC,

CPA.7.010.H1, CPA.7.010.H2, CPA.7.010.H3 CPA.7.010.H4; CPA.7.010.vhCDRl,

CPA.7.010.vhCDR2, CPA.7.010.vhCDR3, CPA.7.010.vlCDRl, CPA.7.010.vlCDR2 и CPA.7.010.vlCDR3;

CPA.7.011, CPA.7.011.VH, CPA.7.011.VL, CPA.7.011.HC, CPA.7.011.LC,

CPA.7.011.Hl, CPA.7.011.H2, CPA.7.011.H3 CPA.7.011.H4; CPA.7.01 l.vhCDRl, CPA.7.011. vhCDR2, CPA.7.01 l.vhCDR3, CPA.7.011.vlCDRl, CPA.7.01 l.vlCDR2 и CPA.7.011.V1CDR3;

CPA.7.012, CPA.7.012.VH, CPA.7.012.VL, CPA.7.012.HC, CPA.7.012.LC,

CPA.7.012.H1, CPA.7.012.H2, CPA.7.012.H3 CPA.7.012.H4; CPA.7.012.vhCDRl,

CPA.7.013, CPA.7.013.VH, CPA.7.013.VL, CPA.7.013.HC, CPA.7.013.LC,

CPA.7.013.H1, CPA.7.013.H2, CPA.7.013.H3 CPA.7.013.H4; CPA.7.013.vhCDRl,

- 59 044486

CPA.7.014, CPA.7.014.VH, CPA.7.014.VL, CPA.7.014.HC, CPA.7.014.LC,

CPA.7.014.Hl, CPA.7.014.H2, CPA.7.014.H3 CPA.7.014.H4; CPA.7.014.vhCDRl, CPA.7.014.vhCDR2, CPA.7.014.vhCDR3, CPA.7.014.vlCDRl, CPA.7.014.vlCDR2 и CPA.7.014.vlCDR3;

CPA.7.015, CPA.7.015.VH, CPA.7.015.VL, CPA.7.015.HC, CPA.7.015.LC,

CPA.7.015.H1, CPA.7.015.H2, CPA.7.015.H3 CPA.7.015.H4; CPA.7.015.vhCDRl,

CPA.7.015.vhCDR2, CPA.7.015.vhCDR3, CPA.7.015.vlCDRl, CPA.7.015.vlCDR2 и CPA.7.015.vlCDR3;

CPA.7.017, CPA.7.017.VH, CPA.7.017.VL, CPA.7.017.HC, CPA.7.017.LC,

CPA.7.017H1, CPA.7.017.H2, CPA.7.017.H3 CPA.7.017.H4; CPA.7.017.vhCDRl,

CPA.7.000171.vhCDR2, CPA.7.017.vhCDR3, CPA.7.017.vlCDRl,

CPA.7.017.V1CDR2 и CPA.7.017.vlCDR3;

CPA.7.018, CPA. 7.018. VH, CPA.7.018.VL, CPA.7.018.HC, CPA.7.018.LC, CPA.7.018.Hl, CPA.7.018.H2, CPA.7.018.H3 CPA.7.018.H4; CPA.7.017.vhCDRl,

CPA.7.017.vhCDR2, CPA.7.017.vhCDR3, CPA.7.017.vlCDRl, CPA.7.017.vlCDR2 и CPA.7.017.vlCDR3;

CPA.7.019, CPA.7.019.VH, CPA.7.019.VL, CPA.7.019.HC, CPA.7.019.LC,

CPA.7.019.Hl, CPA.7.019.H2, CPA.7.019.H3 CPA.7.019.H4; CPA.7.019.vhCDRl,

CPA.7.019.vhCDR2, CPA.7.019.vhCDR3, CPA.7.019.vlCDRl, CPA.7.019.vlCDR2 и CPA.7.019.vlCDR3;

CPA.7.021, CPA.7.021.VH, CPA.7.021.VL, CPA.7.021.HC, CPA.7.021.LC, CPA.7.021.Hl, CPA.7.021.H2, CPA.7.021.H3 CPA.7.021. H4; CPA.7.021. vhCDRl, CPA.7.021. vhCDR2, CPA.7.021.vhCDR3, CPA.7.021.vlCDRl, CPA.7.021.vlCDR2 и CPA.7.021.vlCDR3;

CPA.7.022, CPA. 7.022. VH, CPA.7.022.VL, CPA.7.022.HC, CPA.7.022.LC, CPA.7.022.H1, CPA.7.022.H2, CPA.7.022.H3 CPA.7.022.H4; CPA.7.022.vhCDRl,

CPA.7.022.vhCDR2, CPA.7.002201.vhCDR3, CPA.7.022.vlCDRl, CPA.7.022.vlCDR2 и CPA.7.022.vlCDR3;

CPA.7.023, CPA. 7.023. VH, CPA.7.023.VL, CPA.7.023.HC, CPA.7.023 LC,

CPA.7.023.Hl, CPA.7.023.H2, CPA.7.023.H3 CPA.7.023.H4; CPA.7.023 vhCDRl,

CPA.7.023. vhCDR2, CPA.7.023 vhCDR3, CPA.7.023 vlCDRl, CPA.7.023 vlCDR2 и CPA.7.023.vlCDR3;

CPA.7.024, CPA.7.024.VH, CPA.7.024.VL, CPA.7.024.HC, CPA.7.024.LC,

CPA.7.024.H1, CPA.7.024.H2, CPA.7.024.H3 CPA.7.024.H4; CPA.7.024.vhCDRl,

CPA.7.024.vhCDR2, CPA.7.024.vhCDR3, CPA.7.024.vlCDRl, CPA.7.024.vlCDR2 и CPA.7.024. V1CDR3;

CPA.7.033, CPA. 7.033. VH, CPA.7.033.VL, CPA.7.033.HC, CPA.7.033.LC, CPA.7.033.H1, CPA.7.033.H2, CPA.7.033.H3 CPA.7.033.H4; CPA.7.033.vhCDRl,

CPA.7.033. vhCDR2, CPA.7.033.vhCDR3, CPA.7.033.vlCDRl, CPA.7.033.vlCDR2 и CPA.7.033.vlCDR3;

CPA.7.034, CPA.7.034.VH, CPA.7.034.VL, CPA.7.034.HC, CPA.7.034.LC,

CPA.7.034.H1, CPA.7.034.H2, CPA.7.034.H3 CPA.7.034.H4; CPA.7.034.vhCDRl,

CPA.7.034.vhCDR2, CPA.7.034.vhCDR3, CPA.7.034.vlCDRl, CPA.7.034.vlCDR2 и CPA.7.034.vlCDR3;

CPA.7.036, CPA.7.036.VH, CPA.7.036.VL, CPA.7.036.HC, CPA.7.036.LC,

- 60 044486

CPA.7.036.H1, CPA.7.036.H2, CPA.7.036.H3 CPA.7.036.H4;

CPA.7.036.vhCDRl, CPA.7.036.vhCDR2, CPA.7.036.vhCDR3, CPA.7.036.vlCDRl,

CPA.7.036.V1CDR2 и CPA.7.036.vlCDR3;

CPA.7.040, CPA.7.040.VH, CPA.7.040.VL, CPA.7.040.HC, CPA.7.040.LC,

CPA.7.046, CPA.7.046.VH, CPA.7.046.VL, CPA.7.046.HC, CPA.7.046.LC,

CPA.7.046.H1, CPA.7.046.H2, CPA.7.046.H3 CPA.7.046.H4; CPA.7.046.vhCDRl,

CPA.7.046.vhCDR2, CPA.7.046.vhCDR3, CPA.7.046.vlCDRl, CPA.7.046.vlCDR2 и CPA.7.046.V1CDR3;

CPA.7.047, CPA.7.047.VH, CPA.7.047.VL, CPA.7.047.HC, CPA.7.047.LC,

CPA.7.047.H1, CPA.7.047.H2, CPA.7.047.H3 CPA.7.047.H4; CPA.7.047.vhCDRl,

CPA.7.049, CPA.7.049.VH, CPA.7.049.VL, CPA.7.049.HC, CPA.7.049.LC,

CPA.7.049.H1, CPA.7.049.H2, CPA.7.049.H3 CPA.7.049.H4; CPA.7.049.vhCDRl,

CPA.7.049.vhCDR2, CPA.7.049.vhCDR3, CPA.7.049.vlCDRl, CPA.7.049.vlCDR2 и

CPA.7.049.vlCDR3; а также

CPA.7.050, CPA.7.050.VH, CPA.7.050.VL, CPA.7.050.HC, CPA.7.050.LC,

CPA.7.050.H1, CPA.7.050.H2, CPA.7.050.H3 CPA.7.050.H4, CPA.7.050.vhCDRl,

CPA.7.050.vhCDR2, CPA.7.050.vhCDR3, CPA.7.050.vlCDRl, CPA.7.050.vlCDR2 и CPA.7.050.V1CDR3.

CPA.7.028, CPA.7.028.VH, CPA.7.028.VL, CPA.7.028.HC, CPA.7.028.LC,

CPA.7.028.H1, CPA.7.028.H2, CPA.7.028.H3 и CPA.7.028. H4; CPA.7.028.vhCDRl, CPA.7.028.vhCDR2, CPA.7.028.vhCDR3, CPA.7.028.vlCDRl, CPA.7.028.vlCDR2 и CPA.7.028.V1CDR3.

CPA.7.030, CPA.7.030.VH, CPA.7.030.VL, CPA.7.030.HC, CPA.7.030.LC,

CPA.7.030.H1, CPA.7.030.H2, CPA.7.030.H3 и CPA.7.030. H4; CPA.7.030.vhCDRl, CPA.7.030.vhCDR2, CPA.7.030.vhCDR3, CPA.7.030.vlCDRl, CPA.7.030.vlCDR2 и CPA.7.030.V1CDR3.

CPA.7.041, CPA.7.041.VH, CPA.7.041.VL, CPA.7.041.HC, CPA.7.041.LC, CPA.7.041.H1, CPA.7.041.H2, CPA.7.041.НЗ и CPA.7.041. H4; CPA.7.041.vhCDRl, CPA.7.041. vhCDR2, CPA.7.041.vhCDR3, CPA.7.041. vlCDRl, CPA.7.041.vlCDR2 и CPA.7.041.vlCDR3.

- 61 044486

CPA.7.016, CPA.7.016.VH, CPA.7.016.VL, CPA.7.016.HC,

CPA.7.016.LC, CPA.7.016.Hl, CPA.7.016.H2, CPA.7.016.H3 и CPA.7.016. H4;

CPA.7.016.vhCDRl, CPA.7.016.vhCDR2, CPA.7.016.vhCDR3, CPA.7.016.vlCDRl, CPA.7.016.V1CDR2 и CPA.7.016.vlCDR3.

CPA.7.020, CPA.7.020.VH, CPA.7.020.VL, CPA.7.020.HC, CPA.7.020.LC,

CPA.7.020.H1, CPA.7.020.H2, CPA.7.020.H3 и CPA.7.020. H4; CPA.7.020.vhCDRl, CPA.7.020.vhCDR2, CPA.7.020.vhCDR3, CPA.7.020.vlCDRl, CPA.7.020.vlCDR2 и CPA.7.020.V1CDR3. CPA.7.038, CPA.7.038.VH, CPA.7.038.VL, CPA.7.038.HC, CPA.7.038.LC,

CPA.7.038.H1, CPA.7.038.H2, CPA.7.038.H3 и CPA.7.038. H4; CPA.7.038.vhCDRl, CPA.7.038.vhCDR2, CPA.7.038.vhCDR3, CPA.7.038.vlCDRl, CPA.7.038.vlCDR2 и CPA.7.038.V1CDR3. CPA.7.044, CPA.7.044.VH, CPA.7.044.VL, CPA.7.044.HC, CPA.7.044.LC,

CPA.7.044.H1, CPA.7.044.H2, CPA.7.044.H3 и CPA.7.044. H4; CPA.7.044.vhCDRl, CPA.7.044.vhCDR2, CPA.7.044.vhCDR3, CPA.7.044.vlCDRl, CPA.7.044.vlCDR2 и CPA.7.044.V1CDR3. CPA.7.045, CPA.7.045.VH, CPA.7.045.VL, CPA.7.045.HC, CPA.7.045.LC,

CPA.7.045.H1, CPA.7.045.H2, CPA.7.045.H3 и CPA.7.045. H4; CPA.7.045.vhCDRl, CPA.7.045.vhCDR2, CPA.7.045.vhCDR3, CPA.7.045.vlCDRl, CPA.7.045.vlCDR2 и CPA.7.045.vlCDR3.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения антитело анти-TIGIT выбирают из антитела, последовательности которого продемонстрированы на фиг. 3: СРА.9.018, CPA.9.018.VH, CPA.9.018.VL, СРА.9.018.НС, CPA.9.018.LC,

CPA.9.018.vhCDRl, CPA.9.018.vhCDR2, CPA.9.018.vhCDR3, CPA.9.018.vlCDRl,

CPA.9.018.V1CDR2, CPA.9.018.vlCDR3 и scFv-CPA.9.018;

CPA.9.027, CPA.9.027.VH, CPA.9.027.VL, CPA.9.027.HC, CPA.9.027.LC,

CPA.9.027.H1, CPA.9.027.H2, CPA.9.027.H3, CPA.9.027.H4; CPA.9.018.H4(S241P); CPA.9.027.vhCDRl, CPA.9.027.vhCDR2, CPA.9.027.vhCDR3, CPA.9.027.vlCDRl,

CPA.9.027.vlCDR2, CPA.9.027.vlCDR3 и scFv-CPA.9.027;

CPA.9.049, CPA.9.049.VH, CPA.9.049.VL, CPA.9.049.HC, CPA.9.049.LC,

CPA.9.049.H1, CPA.9.049.H2, CPA.9.049.H3; CPA.9.049.H4; CPA.9.049.H4(S241P); CPA.9.049.vhCDRl, CPA.9.049.vhCDR2, CPA.9.049.vhCDR3, CPA.9.049.vlCDRl,

CPA.9.049.V1CDR2, CPA.9.049.vlCDR3 и scFv-CPA.9.049;

CPA.9.057, CPA.9.057.VH, CPA.9.057.VL, CPA.9.057.HC, CPA.9.057.LC,

- 62 044486

CPA.9.057.H1, CPA.9.057.H2, CPA.9.057.H3; CPA.9.057.H4;

CPA.9.057.H4(S241P); CPA.9.057.vhCDRl, CPA.9.057.vhCDR2, CPA.9.057.vhCDR3,

CPA.9.057.vlCDRl, CPA.9.057.vlCDR2, CPA.9.057.vlCDR3 и scFv-CPA.9.057;

CPA.9.059, CPA.9.059.VH, CPA.9.059.VL, CPA.9.059.HC, CPA.9.059.LC,

CPA.9.059.H1, CPA.9.059.H2, CPA.9.059.H3; CPA.9.059.H4; CPA.9.059.H4(S241P); CPA.9.059.vhCDRl, CPA.9.059.vhCDR2, CPA.9.059.vhCDR3, CPA.9.059.vlCDRl,

CPA.9.059.vlCDR2, CPA.9.059.vlCDR3 и scFv-CPA.9.059;

CPA.9.083, CPA.9.083.VH, CPA.9.083.VL, CPA.9.083.HC, CPA.9.083.LC,

CPA.9.083.H1, CPA.9.083.H2, CPA.9.083.H3; CPA.9.083.H4; CPA.9.083.H4(S241P); CPA.9.083.vhCDRl, CPA.9.083.vhCDR2, CPA.9.083.vhCDR3, CPA.9.083 .vlCDRl, CPA.9.083.vlCDR2, CPA.9.083.vlCDR3 и scFv-CPA.9.083;

CPA.9.086, CPA.9.086.VH, CPA.9.086.VL, CPA.9.086.HC, CPA.9.086.LC,

CPA.9.086.H1, CPA.9.086.H2, CPA.9.086.H3; CPA.9.086.H4; CPA.9.086.H4(S241P); CPA.9.086.vhCDRl, CPA.9.086.vhCDR2, CPA.9.086.vhCDR3, CPA.9.086.vlCDRl,

CPA.9.086.V1CDR2, CPA.9.086.vlCDR3 и scFv-CPA.9.086;

CPA.9.089, CPA.9.089.VH, CPA.9.089.VL, CPA.9.089.HC, CPA.9.089.LC,

CPA.9.089.H1, CPA.9.089.H2, CPA.9.089.H3; CPA.9.089.H4; CPA.9.089.H4(S241P); CPA.9.089.vhCDRl, CPA.9.089.vhCDR2, CPA.9.089.vhCDR3, CPA.9.089.vlCDRl,

CPA.9.089.V1CDR2, CPA.9.089.vlCDR3 и scFv-CPA.9.089;

CPA.9.093, CPA.9.093. VH, CPA.9.093.VL, CPA.9.093.HC, CPA.9.093.LC, CPA.9.093.H1, CPA.9.093.H2, CPA.9.093 НЗ; CPA.9.093.H4; CPA.9.093.H4(S241P); CPA.9.093.vhCDRl, CPA.9.093.vhCDR2, CPA.9.093 ,vhCDR3, CPA.9.093 .vlCDRl, CPA.9.093.vlCDR2, CPA.9.093,vlCDR3 и scFv-CPA.9.093;

CPA.9.101, CPA.9.101.VH, CPA.9.101.VL, CPA.9.101.HC, CPA.9.101.LC,

CPA.9.101.H1, CPA.9.101.H2, CPA.9.101.H3; CPA.9.101.H4; CPA.9.101.H4(S241P); CPA.9.101.vhCDRl, CPA.9.101.vhCDR2, CPA.9.101.vhCDR3, CPA.9.101.vlCDRl, CPA.9.101.vlCDR2, CPA.9.101.vlCDR3 и scFv-CPA.9.101; а также

CPA.9.103, CPA.9.103.VH, CPA.9.103.VL, CPA.9.103.HC, CPA.9.103.LC,

CPA.9.103 .Hl, CPA.9.103.H2, CPA.9.103 НЗ; CPA.9.103.H4; CPA.9.103.H4(S241P); CPA.9.103.vhCDRl, CPA.9.103.vhCDR2, CPA.9.103.vhCDR3, CPA.9.103 .vlCDRl, CPA.9.103.V1CDR2, CPA.9.103.vlCDR3 и scFv-CPA.9.103.

CHA.9.536.1, CHA.9.536.1. VH, CHA.9.536.1. VL, CHA.9.536.1.HC, CHA.9.536.1.LC,

CHA.9.536.1.Hl, CHA.9.536.1. H2, CHA.9.536.1. H3; CHA.9.536.1.H4,

CHA.9.536.1.H4(S241P), CHA.9.536.1.vhCDRl, CHA.9.536.1. vhCDR2,

- 63 044486

CHA.9.536.3, CHA.9.536.3 VH, CHA.9.536.3.VL, CHA.9.536.3.HC,

CHA.9.536.3.LC, CHA.9.536.3.H1, CHA.9.536.3.H2, CHA.9.536.3.H3; CHA.9.536.3.H4, CHA.9.536.3.H4(S241P); CHA.9.536.3.vhCDRl, CHA.9.536.3.vhCDR2,

CHA.9.536.4, CHA.9.536.4.VH, CHA.9.536.4.VL, CHA.9.536.4.HC, CHA.9.536.4.LC,

CHA.9.536.4.H1, CHA.9.536.4.H2, CHA.9.536.4.H3; CHA.9.536.4.H4,

CHA.9.536.4.H4(S241P), CHA.9.536.4.vhCDRl, CHA.9.536.4.vhCDR2,

CHA.9.536.5, CHA.9.536.5.VH, CHA.9.536.5.VL, CHA.9.536.5.HC, CHA.9.536.5.LC,

CHA.9.536.5.H1, CHA.9.536.5.H2, CHA.9.536.5.H3; CHA.9.536.5.H4,

CHA.9.536.5.H4(S241P), CHA.9.536.5.vhCDRl, CHA.9.536.5.vhCDR2,

CHA.9.536.7, CHA.9.536.7.VH, CHA.9.536.7.VL, CHA.9.536.7.HC, CHA.9.536.7.LC,

CHA.9.536.7.H1, CHA.9.536.7.H2, CHA.9.536.7.H3; CHA.9.536.7.H4,

CHA.9.536.5.H4(S241P); CHA.9.536.7.vhCDRl, CHA.9.536.7.vhCDR2,

CHA.9.536.8, CHA.9.536.8.VH, CHA.9.536.8.VL, CHA.9.536.8.HC, CHA.9.536.8.LC,

CHA.9.536.8.H1, CHA.9.536.8.H2, CHA.9.536.8.H3; CHA.9.536.8.H4,

CHA.9.536.8.H4(S241P), CHA.9.536.8.vhCDRl, CHA.9.536.8.vhCDR2,

CHA.9.536.8.vhCDR3, CHA.9.536.8.vlCDRl, CHA.9.536.8.vlCDR2 и CHA.9.536.8.vhCDR3;

CHA.9.560.1, CHA. 9,560,1VH, CHA. 9.560. l.VL, CHA. 9.560. l.HC, CHA. 9.560.l.LC, CHA. 9.560.1.Hl, CHA. 9.560.1.H2, CHA. 9.560.1.H3; CHA. 9.560.1.H4, CHA. 9.560.1.H4 (S241P), CHA. 9.560.1.vhCDRl, CHA. 9.560.l.vhCDR2, CHA. 9.560.l.vhCDR3, CHA. 9.560.l.vlCDRl, CHA. 9.560.l.vlCDR2 и CHA. 9.560.1.vhCDR3;

CHA.9.560.4, CHA. 9.560. 4VH, CHA. 9.560. 4.VL, CHA. 9.560. 4.HC, CHA. 9.560. 4.LC, CHA. 9.560. 4.H1, CHA. 9.560. 4.H2, CHA. 9.560. 4.H3; CHA.9.560.4.H4, CHA.9.560.4.H4 (S241P), CHA. 9.560. 4.vhCDRl, CHA. 9.560. 4.vhCDR2, CHA. 9.560.

-64044486

4.vhCDR3, СНА. 9.560. 4.vlCDRl, СНА. 9.560. 4.vlCDR2 и СНА. 9.560. 4.vhCDR3;

СНА.9.560.5, СНА. 9.560. 5VH, СНА. 9.560. 5 VL, СНА. 9.560. 5.НС, СНА. 9.560. 5.LC, СНА. 9.560. 5.Н1, СНА. 9.560. 5.Н2, СНА. 9.560. 5.НЗ; СНА. 9.560. 5.Н4, СНА. 9.560. 5.vhCDRl, СНА. 9.560. 5.vhCDR2, СНА. 9.560. 5.vhCDR3, СНА. 9.560. 5.V1CDR1, СНА. 9.560. 5.V1CDR2 и СНА. 9.560. 5.vhCDR3;

СНА.9.560.6, СНА. 9.560. 6VH, СНА. 9.560. 6 VL, СНА. 9.560. 6.НС, СНА. 9.560. 6.LC, СНА. 9.560. 6.Н1, СНА. 9.560. 6.Н2, СНА. 9.560. 6.НЗ; СНА.9.560.6.Н4, СНА.9.560.6.Н4 (S241P), СНА. 9.560. 6.vhCDRl, СНА. 9.560. 6.vhCDR2, СНА. 9.560. 6.vhCDR3, СНА. 9.560. 6.V1CDR1, СНА. 9.560. 6.V1CDR2 и СНА. 9.560. 6.vhCDR3;

СНА.9.560.7, СНА. 9.560. 7VH, СНА. 9.560. 7.VL, СНА. 9.560. 7.НС, СНА. 9.560. 7.LC, СНА. 9.560. 7.Н1, СНА. 9.560. 7.Н2, СНА. 9.560. 7.НЗ; СНА.9.560.7.Н4; СНА.9.560.7.Н4 (S241P); СНА. 9.560. 7.vhCDRl, СНА. 9.560. 7.vhCDR2, СНА. 9.560. 7.vhCDR3, СНА. 9.560. 7.V1CDR1, СНА. 9.560. 7.V1CDR2 и СНА. 9.560. 7.vhCDR3;

СНА.9.560.8, СНА. 9.560. 8VH, СНА. 9.560. 8 VL, СНА. 9.560. 8.НС, СНА. 9.560. 8.LC, СНА. 9.560. 8.Н1, СНА. 9.560. 8.Н2, СНА. 9.560. 8.НЗ; СНА.9.560.8.Н4, СНА.9.560.8.Н4 (S241P); СНА. 9.560. 8.vhCDRl, СНА. 9.560. 8.vhCDR2, СНА. 9.560. 8.vhCDR3, СНА. 9.560. 8.V1CDR1, СНА. 9.560. 8.V1CDR2, а также СНА. 9.560. 8.vhCDR3;

СНА.9.546.1, СНА. 9. 546,1VH, СНА. 9. 546.1.VL, СНА. 9. 546.1.НС, СНА. 9. 546.1.LC, СНА. 9. 546.1.Н1, СНА. 9. 546.1.Н2, СНА. 9. 546.1.НЗ; СНА.9.546.1.Н4, СНА.9.546.1.Н4 (S241P), СНА. 9. 546.1.vhCDRl, СНА. 9. 546.1.vhCDR2, СНА. 9. 546.1.vhCDR3, СНА. 9. 546.1.vlCDRl, СНА. 9. 546.1.V1CDR2 и СНА. 9. 546.1.vhCDR3;

СНА.9.547.2, СНА. 9. 547. 2VH, СНА. 9. 547. 2.VL, СНА. 9. 547. 2.НС, СНА. 9. 547. 2.LC, СНА. 9. 547. 2.Н1, СНА. 9. 547. 2.Н2, СНА. 9. 547. 2.НЗ; СНА.9.547.2.Н4, СНА.9.547.2.Н4 (S241P), СНА. 9. 547. 2.vhCDRl, СНА. 9. 547. 2.vhCDR2, СНА. 9. 547. 2.vhCDR3, СНА. 9. 547. 2.V1CDR1, СНА. 9. 547. 2.V1CDR2 и СНА. 9. 547. 2.vhCDR3;

СНА.9.547.3, СНА. 9. 547. 3VH, СНА. 9. 547. 3 VL, СНА. 9. 547. З.НС, СНА. 9. 547. 3.LC, СНА. 9. 547. З.Н1, СНА. 9. 547. З.Н2, СНА. 9. 547. З.НЗ; СНА.9.547.3.Н4, СНА.9.547.3.Н4 (S241P), СНА. 9. 547. 3.vhCDRl, СНА. 9.547. 3.vhCDR2, СНА. 9. 547. 3.vhCDR3, СНА. 9. 547. 3.V1CDR1, СНА. 9. 547. 3.V1CDR2 и СНА. 9. 547. 3.vhCDR3;

СНА.9.547.4, СНА. 9. 547. 4VH, СНА. 9. 547. 4.VL, СНА. 9. 547. 4.НС, СНА. 9.547. 4.LC, СНА. 9. 547. 4.Н1, СНА. 9. 547. 4.Н2, СНА. 9. 547. 4.НЗ; СНА.9.547.4.Н4,

- 65 044486

CHA.9.547.4.H4 (S241P), СНА. 9. 547. 4.vhCDRl, СНА. 9. 547. 4.vhCDR2, СНА. 9. 547. 4.vhCDR3, СНА. 9. 547. 4.vlCDRl, СНА. 9. 547. 4.vlCDR2 и СНА. 9. 547. 4.vhCDR3;

СНА.9.547.6, СНА. 9. 547. 6 VH, СНА. 9. 547. 6.VL, СНА. 9. 547. 6.НС, СНА. 9. 547. 6.LC, СНА. 9. 547. 6.Н1, СНА. 9. 547. 6.Н2, СНА. 9. 547. 6.НЗ; СНА.9.547.6.Н4, СНА.9.547.6.Н4 (S241P), СНА. 9. 547. 6.vhCDRl, СНА. 9. 547. 6.vhCDR2, СНА. 9. 547. 6.vhCDR3, СНА. 9. 547. 6.vlCDRl, СНА. 9. 547. 6.V1CDR2 и СНА. 9. 547. 6.vhCDR3;

СНА.9.547.7, СНА. 9. 547. 7VH, СНА. 9. 547. 7.VL, СНА. 9. 547. 7.НС, СНА. 9. 547. 7.LC, СНА. 9. 547. 7.Н1, СНА. 9. 547. 7.Н2, СНА. 9. 547. 7.НЗ; СНА.9.547.7.Н4, СНА.9.547.7.Н4 (S241P), СНА. 9. 547. 7.vhCDRl, СНА. 9. 547. 7.vhCDR2, СНА. 9. 547. 7.vhCDR3, СНА. 9. 547. 7.vlCDRl, СНА. 9. 547. 7.V1CDR2 и СНА. 9. 547. 7.vhCDR3;

СНА.9.547.8, СНА. 9. 547. 8VH, СНА. 9. 547. 8.VL, СНА. 9. 547. 8.НС, CHA.9.547.8.LC, СНА. 9. 547. 8.Н1, СНА. 9. 547. 8.Н2, СНА. 9. 547. 8.НЗ; СНА.9.547.8.Н4, СНА.9.547.8.Н4 (S241P), СНА. 9. 547. 8.vhCDRl, СНА. 9. 547. 8.vhCDR2, СНА. 9. 547. 8.vhCDR3, СНА. 9. 547. 8.vlCDRl, СНА. 9. 547. 8.vlCDR2, а также СНА. 9. 547. 8.vhCDR3;

СНА.9.547.9, СНА.9.547.9, CHA.9.547.9VH, CHA.9.547.9.VL, СНА.9. 547.9.НС, CHA.9.547.9.LC, СНА.9.547.9.Н1, СНА.9.547.9.Н2, СНА.9.547.9.НЗ; СНА.9.547.9.Н4, СНА.9.547.9.Н4, CHA.9.547.9.H4(S241P), CHA.9.547.9.H4(S241P), СНА.9.547.9.vhCDRl, СНА.9.547.9.vhCDR2, CHA.9.547.9.vhCDR3, СНА.9.547.9. vlCDRl, СНА.9.547.9. vlCDR2 и СНА.9.547.9.vhCDR3;

СНА.9.547.13, СНА.9.547.13, СНА.9.547. 13VH, СНА.9. 547.13.VL, СНА.9. 547.13.НС, СНА. 9.547.13.LC, СНА. 9.547.13.Н1, СНА.9.547.13.Н2, СНА.9. 547.13.H3; СНА.9.547.13.Н4, СНА.9.547.13.Н4, СНА.9.547.13.Н4 (S241P), СНА.9.547.13.Н4 (S241P), СНА. 9. 547.13. vhCDRl, СНА.9.547.13. vhCDR2, СНА.9.547. 13.vhCDR3, СНА. 9. 547.13.vlCDRl, СНА. 9. 547.13.vlCDR2 и СНА. 9. 547. 13.vhCDR3;

СНА.9.541.1, СНА. 9. 541.1.VH, СНА. 9. 541.1.VL, СНА. 9. 541.1.НС, СНА. 9. 541.1.LC, СНА. 9. 541.1.Н1, СНА. 9. 541.1.Н2, СНА. 9. 541.1.НЗ; СНА.9.541.1.Н4, СНА.9.541.1.Н4 (S241P), СНА. 9. 541.1.vhCDRl, СНА. 9. 541.1.vhCDR2, СНА. 9. 541.1.vhCDR3, СНА. 9. 541.1.vlCDRl, СНА. 9. 541.1.vlCDR2 и СНА. 9.541.l.vhCDR3;

СНА.9.541.3, СНА. 9. 541. 3.VH, СНА. 9. 541. 3.VL, СНА. 9. 541. З.НС, СНА. 9. 541. 3.LC, СНА. 9. 541. З.Н1, СНА. 9. 541. З.Н2, СНА. 9. 541. З.НЗ; СНА.9.541.3.Н4, СНА.9.541.3.Н4 (S241P), СНА. 9. 541. 3.vhCDRl, СНА. 9. 541. 3.vhCDR2, СНА. 9. 541. 3.vhCDR3, СНА. 9. 541. 3.vlCDRl, СНА. 9. 541. 3.vlCDR2 и СНА. 9.541. 3.vhCDR3;

СНА.9.541.4, СНА. 9. 541.4.VH, СНА. 9. 541. 4.VL, СНА. 9. 541. 4.НС, СНА. 9. 541. 4.LC, СНА. 9. 541. 4.Н1, СНА. 9. 541. 4.Н2, СНА. 9. 541. 4.НЗ; СНА.9.541.4.Н4, СНА.9.541.4.Н4 (S241P), СНА. 9. 541. 4.vhCDRl, СНА. 9. 541. 4.vhCDR2, СНА. 9. 541.

- 66 044486 .vhCDR3, СНА. 9. 541. 4.vlCDRl, СНА. 9. 541. 4.vlCDR2 и СНА. 9.541. 4.vhCDR3;

СНА.9.541.5, СНА. 9. 541. 5.VH, СНА. 9. 541. 5.VL, СНА. 9. 541. 5.НС, СНА. 9. 541.

.LC, СНА. 9. 541. 5.Н1, СНА. 9. 541. 5.Н2, СНА. 9. 541. 5.НЗ; СНА.9.541.5.Н4, СНА.9.541.5.Н4 (S241P), СНА. 9. 541. 5.vhCDRl, СНА. 9. 541. 5.vhCDR2, СНА. 9. 541.

.vhCDR3, СНА. 9. 541. 5.vlCDRl, СНА. 9. 541. 5.vlCDR2 и СНА. 9.541. 5.vhCDR3;

СНА.9.541.6, СНА. 9. 541. 6.VH, СНА. 9. 541. 6.VL, СНА. 9. 541. 6.НС, СНА. 9. 541.

.LC, СНА. 9. 541. 6.Н1, СНА. 9. 541. 6.Н2, СНА. 9. 541.6.НЗ; СНА.9.541.6.Н4, СНА.9.541.6.Н4 (S241P), СНА. 9. 541. 6.vhCDRl, СНА. 9. 541. 6.vhCDR2, СНА. 9. 541.

.vhCDR3, СНА. 9. 541. 6.V1CDR1, СНА. 9. 541. 6.V1CDR2 и СНА. 9.541. 6.vhCDR3;

СНА.9.541.7, СНА. 9. 541. 7.VH, СНА. 9. 541. 7.VL, СНА. 9. 541. 7.НС, СНА. 9. 541.

.LC, СНА. 9. 541. 7.Н1, СНА. 9. 541. 7.Н2, СНА. 9. 541. 7.НЗ; СНА.9.541.7.Н4, СНА.9.541.7.Н4 (S241P), СНА. 9. 541. 7.vhCDRl, СНА. 9. 541. 7.vhCDR2, СНА. 9. 541.

.vhCDR3, СНА. 9. 541. 7.V1CDR1, СНА. 9. 541. 7.V1CDR2 и СНА. 9.541. 7.vhCDR3; и

СНА.9.541.8, СНА. 9. 541. 8.VH, СНА. 9. 541. 8.VL, СНА. 9. 541. 8.НС, СНА. 9. 541.

.LC, СНА. 9. 541. 8.Н1, СНА. 9. 541. 8.Н2, СНА. 9. 541. 8.НЗ; СНА.9.541.8.Н4, СНА.9.541.8.Н4 (S241P); СНА. 9. 541. 8vhCDRl, СНА. 9. 541. 8.vhCDR2, СНА. 9. 541.

.vhCDR3, СНА. 9. 541. 8.V1CDR1, СНА. 9. 541. 8.V1CDR2, а также СНА. 9.541. 8.vhCDR3.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения антитело анти-TIGIT представляет собой СРА.9.083.Н4 (S241P), антитело анти-PD-1 представляет собой пембролизумаб, а антитело антиPVRIG представляет собой одно из антител, указанных выше и/или на фиг. 5 или на фиг. 63.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения антитело анти-TIGIT представляет собой CPA.9.086.H4 (S241P), антитело анти-PD-1 представляет собой пембролизумаб, а антитело антиPVRIG представляет собой одно из антител, указанных выше и/или на фиг. 5 или на фиг. 63.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения антитело анти-TIGIT представляет собой CHA.9.547.7.H4 (S241P), антитело анти-PD-! представляет собой пембролизумаб, а антитело антиPVRIG представляет собой одно из антител, указанных выше и/или на фиг. 5 или на фиг. 63.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения антитело анти-TIGIT представляет собой CHA.9.547.13.H4 (S241P), антитело анти-PD-1 представляет собой пембролизумаб, а антитело антиPVRIG представляет собой одно из антител, указанных выше и/или на фиг. 5 или на фиг. 63.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения антитело анти-TIGIT представляет собой CPA.9.083.H4 (S241P), антитело анти-PD-1 представляет собой ниволумаб, а антитело анти-PVRIG представляет собой одно из антител, указанных выше и/или на фиг. 5 или на фиг. 63.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения антитело анти-TIGIT представляет собой CPA.9.086.H4 (S241P), антитело анти-PD-1 представляет собой ниволумаб, а антитело анти-PVRIG представляет собой одно из антител, указанных выше и/или на фиг. 5 или на фиг. 63.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения антитело анти-TIGIT представляет собой CHA.9.547.7.H4 (S241P), антитело анти-PD-1 представляет собой ниволумаб, а антитело анти-PVRIG представляет собой одно из антител, указанных выше и/или на фиг. 5 или на фиг. 63.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения антитело анти-TIGIT представляет собой CHA.9.547.13.H4 (S241P), антитело к PD-1 представляет собой ниволумаб, а антитело анти-PVRIG представляет собой одно из антител, указанных выше и/или на фиг. 5 или на фиг. 63.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения антитело анти-TIGIT представляет собой CPA.9.083.H4 (S241P), антитело анти-PD-1 представляет собой цемиплимаб, а антитело анти-PVRIG представляет собой одно из антител, указанных выше и/или на фиг. 5 или на фиг. 63.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения антитело анти-TIGIT представляет собой CPA.9.086.H4 (S241P), антитело анти-PD-1 представляет собой цемиплимаб, а антитело анти-PVRIG представляет собой одно из антител, указанных выше и/или на фиг. 5 или на фиг. 63.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения антитело анти-TIGIT представляет собой CHA.9.547.7.H4 (S241P), антитело анти-PD-1 представляет собой цемиплимаб, а антитело антиPVRIG представляет собой одно из антител, указанных выше и/или на фиг. 5 или на фиг. 63.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения антитело анти-TIGIT представляет собой CHA.9.547.13.H4 (S241P), антитело к PD-1 представляет собой цемиплимаб, а антитело анти-PVRIG представляет собой одно из антител, указанных выше и/или на фиг. 5 или на фиг. 63.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения антитело анти-PVRIG представляет собой CHA.7.518.1.H4 (S241P), антитело анти-PD-1 представляет собой пембролизумаб, а антитело антиTIGIT представляет собой одно из антител, указанных выше и/или на фиг. 3.

- 67 044486 собой CHA.7.538.1.2.H4 (S241P), антитело анти-PD-l представляет собой пембролизумаб, а антитело анти-TIGIT представляет собой одно из антител, указанных выше и/или на фиг. 3.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения антитело анти-PVRIG представляет собой CHA.7.518.1.H4 (S241P), антитело анти-PD-1 представляет собой ниволумаб, а антитело антиTIGIT представляет собой одно из антител, указанных выше и/или на фиг. 3.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения антитело анти-PVRIG представляет собой CHA.7.538.1.2.H4 (S241P), антитело анти-PD-1 представляет собой ниволумаб, а антитело антиTIGIT представляет собой одно из антител, указанных выше и/или на фиг. 3.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения антитело анти-PVRIG представляет собой CHA.7.518.1.H4 (S241P), антитело анти-PD-1 представляет собой цемиплимаб, а антитело антиTIGIT представляет собой одно из антител, указанных выше и/или на фиг. 3.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения антитело анти-PVRIG представляет собой CHA.7.538.1.2.H4 (S241P), антитело анти-PD-1 представляет собой цемиплимаб, а антитело антиTIGIT представляет собой одно из антител, указанных выше и/или на фиг. 3.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения антитело анти-TIGIT представляет собой СРА.9.083.Н4 (S241P), антитело анти-PVRIG представляет собой СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P), а антитело анти-PD-1 представляет собой пембролизумаб.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения антитело анти-TIGIT представляет собой СРА.9.083.Н4 (S241P), антитело анти-PVRIG представляет собой CHA.7.518.1.H4 (S241P), а антитело анти-PD-1 представляет собой пембролизумаб.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения антитело анти-TIGIT представляет собой CPA.9.086.H4 (S241P), антитело анти-PVRIG представляет собой CHA.7.538.1.2.H4 (S241P), а антитело анти-PD-1 представляет собой пембролизумаб.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения антитело анти-TIGIT представляет собой CPA.9.086.H4 (S241P), антитело анти-PVRIG представляет собой CHA.7.518.1.H4 (S241P), а антитело анти-PD-1 представляет собой пембролизумаб.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения антитело анти-TIGIT представляет собой CHA.9.547.7.H4 (S241P), антитело анти-PVRIG представляет собой CHA.7.538.1.2.H4 (S241P), а антитело анти-PD-1 представляет собой пембролизумаб.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения антитело анти-TIGIT представляет собой CHA.9.547.7.H4 (S241P), антитело анти-PVRIG представляет собой CHA.7.518.1.H4 (S241P), а антитело анти-PD-1 представляет собой пембролизумаб.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения антитело анти-TIGIT представляет собой CHA.9.547.13.H4 (S241P), антитело анти-PVRIG представляет собой CHA.7.538.1.2.H4 (S241P), а антитело анти-PD-1 представляет собой пембролизумаб.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения антитело анти-TIGIT представляет собой CHA.9.547.13.H4 (S241P), антитело анти-PVRIG представляет собой CHA.7.518.1.H4 (S241P), а антитело анти-PD-1 представляет собой пембролизумаб.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения антитело анти-TIGIT представляет собой СРА.9.083.Н4 (S241P), антитело анти-PVRIG представляет собой СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P), а антитело анти-PD-1 представляет собой SHR-1210.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения антитело анти-TIGIT представляет собой СРА.9.083.Н4 (S241P), антитело анти-PVRIG представляет собой CHA.7.518.1.H4 (S241P), а антитело анти-PD-1 представляет собой SHR-1210.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения антитело анти-TIGIT представляет собой CPA.9.086.H4 (S241P), антитело анти-PVRIG представляет собой CHA.7.538.1.2.H4 (S241P), а антитело анти-PD-1 представляет собой SHR-1210.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения антитело анти-TIGIT представляет собой CPA.9.086.H4 (S241P), антитело анти-PVRIG представляет собой CHA.7.518.1.H4 (S241P), а антитело анти-PD-1 представляет собой SHR-1210.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения антитело анти-TIGIT представляет собой CHA.9.547.7.H4 (S241P), антитело анти-PVRIG представляет собой CHA.7.538.1.2.H4 (S241P), а антитело анти-PD-1 представляет собой SHR-1210.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения антитело анти-TIGIT представляет собой CHA.9.547.7.H4 (S241P), антитело анти-PVRIG представляет собой CHA.7.518.1.H4 (S241P), а антитело анти-PD-1 представляет собой SHR-1210.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения антитело анти-TIGIT представляет собой CHA.9.547.13.H4 (S241P), антитело анти-PVRIG представляет собой CHA.7.538.1.2.H4 (S241P), а антитело анти-PD-1 представляет собой SHR-1210.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения антитело анти-TIGIT представляет собой CHA.9.547.13.H4 (S241P), антитело анти-PVRIG представляет собой CHA.7.518.1.H4 (S241P), а антитело анти-PD-1 представляет собой SHR-1210.

- 68 044486

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения антитело анти-TIGIT представляет собой СРА.9.083.Н4 (S241P), антитело анти-PVRIG представляет собой СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P), а антитело анти-PD-1 представляет собой IBI308.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения антитело анти-TIGIT представляет собой СРА.9.083.Н4 (S241P), антитело анти-PVRIG представляет собой CHA.7.518.1.H4 (S241P), а антитело анти-PD-1 представляет собой IBI308.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения антитело анти-TIGIT представляет собой CPA.9.086.H4 (S241P), антитело анти-PVRIG представляет собой CHA.7.538.1.2.H4 (S241P), а антитело анти-PD-1 представляет собой IBI308.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения антитело анти-TIGIT представляет собой CPA.9.086.H4 (S241P), антитело анти-PVRIG представляет собой CHA.7.518.1.H4 (S241P), а антитело анти-PD-1 представляет собой IBI308.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения антитело анти-TIGIT представляет собой CHA.9.547.7.H4 (S241P), антитело анти-PVRIG представляет собой CHA.7.538.1.2.H4 (S241P), а антитело анти-PD-1 представляет собой IBI308.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения антитело анти-TIGIT представляет собой CHA.9.547.7.H4 (S241P), антитело анти-PVRIG представляет собой CHA.7.518.1.H4 (S241P), а антитело анти-PD-1 представляет собой IBI308.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения антитело анти-TIGIT представляет собой CHA.9.547.13.H4 (S241P), антитело анти-PVRIG представляет собой CHA.7.538.1.2.H4 (S241P), а антитело анти-PD-1 представляет собой IBI308.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения антитело анти-TIGIT представляет собой CHA.9.547.13.H4 (S241P), антитело анти-PVRIG представляет собой CHA.7.518.1.H4 (S241P), а антитело анти-PD-1 представляет собой IBI308.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения антитело анти-TIGIT представляет собой СРА.9.083.Н4 (S241P), антитело анти-PVRIG представляет собой СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P), а антитело анти-PD-1 представляет собой BGB-A317.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения антитело анти-TIGIT представляет собой СРА.9.083.Н4 (S241P), антитело анти-PVRIG представляет собой CHA.7.518.1.H4 (S241P), а антитело анти-PD-1 представляет собой BGB-A317.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения антитело анти-TIGIT представляет собой CPA.9.086.H4 (S241P), антитело анти-PVRIG представляет собой CHA.7.538.1.2.H4 (S241P), а антитело анти-PD-1 представляет собой BGB-A317.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения антитело анти-TIGIT представляет собой CPA.9.086.H4 (S241P), антитело анти-PVRIG представляет собой CHA.7.518.1.H4 (S241P), а антитело анти-PD-1 представляет собой BGB-A317.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения антитело анти-TIGIT представляет собой CHA.9.547.7.H4 (S241P), антитело анти-PVRIG представляет собой CHA.7.538.1.2.h4 (S241P), а антитело анти-PD-1 представляет собой BGB-A317.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения антитело анти-TIGIT представляет собой CHA.9.547.7.H4 (S241P), антитело анти-PVRIG представляет собой CHA.7.518.1.H4 (S241P), а антитело анти-PD-1 представляет собой BGB-A317.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения антитело анти-TIGIT представляет собой CHA.9.547.13.H4 (S241P), антитело анти-PVRIG представляет собой CHA.7.538.1.2.H4 (S241P), а антитело анти-PD-1 представляет собой BGB-A317.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения антитело анти-TIGIT представляет собой CHA.9.547.13.H4 (S241P), антитело анти-PVRIG представляет собой CHA.7.518.1.H4 (S241P), а антитело анти-PD-1 представляет собой BGB-A317.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения антитело анти-TIGIT представляет собой СРА.9.083.Н4 (S241P), антитело анти-PVRIG представляет собой СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P), а антитело анти-PD-1 представляет собой антитело анти-PD-1, как указано в публикации патента США № 2017/0081409.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения антитело анти-TIGIT представляет собой СРА.9.083.Н4 (S241P), антитело анти-PVRIG представляет собой CHA.7.518.1.H4 (S241P), а антитело анти-PD-1 представляет собой антитело анти-PD-1, как указано в публикации патента США № 2017/0081409.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения антитело анти-TIGIT представляет собой CPA.9.086.H4 (S241P), антитело анти-PVRIG представляет собой СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P), а антитело анти-PD-1 представляет собой антитело анти-PD-1, как указано в публикации патента США № 2017/0081409.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения антитело анти-TIGIT представляет собой CPA.9.086.H4 (S241P), антитело анти-PVRIG представляет собой CHA.7.518.1.H4 (S241P), а антите

- 69 044486 ло анти-PD-l представляет собой антитело анти-PD-l, как указано в публикации патента США № 2017/0081409.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения антитело анти-TIGIT представляет собой CHA.9.547.7.H4 (S241P), антитело анти-PVRIG представляет собой СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P), а антитело анти-PD-1 представляет собой антитело αнтu-PD-1, как указано в публикации патента США № 2017/0081409.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения антитело анти-TIGIT представляет собой CHA.9.547.7.H4 (S241P), антитело анти-PVRIG представляет собой CHA.7.518.1.H4 (S241P), а антитело анти-PD-1 представляет собой антитело αнтu-PD-1, как указано в публикации патента США № 2017/0081409.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения антитело анти-TIGIT представляет собой CHA.9.547.13.H4 (S241P), антитело анти-PVRIG представляет собой СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P), а антитело анти-PD-1 представляет собой антитело анти-PD-1, как указано в публикации патента США № 2017/0081409.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения антитело анти-TIGIT представляет собой CHA.9.547.13.H4 (S241P), антитело анти-PVRIG представляет собой CHA.7.518.1.H4 (S241P), а антитело анти-PD-1 представляет собой антитело αнтu-PD-1, как указано в публикации патента США № 2017/0081409.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения антитело анти-TIGIT представляет собой СРА.9.083.Н4 (S241P), антитело анти-PVRIG представляет собой СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P), а антитело анти-PD-1 представляет собой цемиплимаб.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения антитело анти-TIGIT представляет собой СРА.9.083.Н4 (S241P), антитело анти-PVRIG представляет собой CHA.7.518.1.H4 (S241P), а антитело анти-PD-1 представляет собой цемиплимаб.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения антитело анти-TIGIT представляет собой CPA.9.086.H4 (S241P), антитело анти-PVRIG представляет собой CHA.7.538.1.2.H4 (S241P), а антитело анти-PD-1 представляет собой цемиплимаб.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения антитело анти-TIGIT представляет собой CPA.9.086.H4 (S241P), антитело анти-PVRIG представляет собой CHA.7.518.1.H4 (S241P), а антитело анти-PD-1 представляет собой цемиплимаб.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения антитело анти-TIGIT представляет собой CHA.9.547.7.H4 (S241P), антитело анти-PVRIG представляет собой CHA.7.538.1.2.H4 (S241P), а антитело анти-PD-1 представляет собой цемиплимаб.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения антитело анти-TIGIT представляет собой CHA.9.547.7.H4 (S241P), антитело анти-PVRIG представляет собой CHA.7.518.1.H4 (S241P), а антитело анти-PD-1 представляет собой цемиплимаб.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения антитело анти-TIGIT представляет собой CHA.9.547.13.h4 (S241P), антитело анти-PVRIG представляет собой CHA.7.538.1.2.H4 (S241P), а антитело анти-PD-1 представляет собой цемиплимаб.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения антитело анти-TIGIT представляет собой CHA.9.547.13.H4 (S241P), антитело анти-PVRIG представляет собой CHA.7.518.1.H4 (S241P), а антитело анти-PD-1 представляет собой цемиплимаб.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения антитело анти-TIGIT представляет собой CPA.9.083.H4 (S241P), антитело анти-PD-L1 представляет собой атезолизумаб, а антитело антиPVRIG представляет собой одно из антител, указанных выше и/или на фиг. 5 или на фиг. 63.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения антитело анти-TIGIT представляет собой CPA.9.086.H4 (S241P), антитело анти-PD-L1 представляет собой атезолизумаб, а антитело антиPVRIG представляет собой одно из антител, указанных выше и/или на фиг. 5 или на фиг. 63.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения антитело анти-TIGIT представляет собой CHA.9.547.7.H4 (S241P), антитело анти-PD-L1 представляет собой атезолизумаб, а антитело антиPVRIG представляет собой одно из антител, указанных выше и/или на фиг. 5 или на фиг. 63.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения антитело анти-TIGIT представляет собой CHA.9.547.13.H4 (S241P), антитело анти-PD-L1 представляет собой атезолизумаб, а антитело антиPVRIG представляет собой одно из антител, указанных выше и/или на фиг. 5 или на фиг. 63.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения антитело анти-TIGIT представляет собой CPA.9.083.H4 (S241P), антитело анти-PD-L1 представляет собой авелумаб, а антитело анти-PVRIG представляет собой одно из антител, указанных выше и/или на фиг. 5 или на фиг. 63.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения антитело анти-TIGIT представляет собой CPA.9.086.H4 (S241P), антитело анти-PD-L1 представляет собой авелумаб, а антитело анти-PVRIG представляет собой одно из антител, указанных выше и/или на фиг. 5 или на фиг. 63.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения антитело анти-TIGIT представляет собой CHA.9.547.7.H4 (S241P), антитело анти-PD-L1 представляет собой авелумаб, а антитело анти-PVRIG

- 70 044486 представляет собой одно из антител, указанных выше и/или на фиг. 5 или на фиг. 63.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения антитело анти-TIGIT представляет собой CHA.9.547.13.H4 (S241P), антитело анти-PD-L1 представляет собой авелумаб, а антитело антиPVRIG представляет собой одно из антител, указанных выше и/или на фиг. 5 или на фиг. 63.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения антитело анти-TIGIT представляет собой CPA.9.083.H4 (S241P), антитело анти-PD-L1 представляет собой дурвалумаб, а антитело анти-PVRIG представляет собой одно из антител, указанных выше и/или на фиг. 5 или на фиг. 63.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения антитело анти-TIGIT представляет собой CHA.9.547.7.H4 (S241P), антитело анти-PD-L1 представляет собой дурвалумаб, а антитело антиPVRIG представляет собой одно из антител, указанных выше и/или на фиг. 5 или на фиг. 63.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения антитело анти-TIGIT представляет собой CHA.9.547.13.H4 (S241P), антитело анти-PD-L1 представляет собой дурвалумаб, а антитело антиPVRIG представляет собой одно из антител, указанных выше и/или на фиг. 5 или на фиг. 63.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения антитело анти-PVRIG представляет собой CHA.7.518.1.H4 (S241P), антитело анти-PD-L1 представляет собой атезолизумаб, а антитело антиTIGIT представляет собой одно из антител, указанных выше и/или на фиг. 3.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения антитело анти-PVRIG представляет собой CHA.7.538.1.2.H4 (S241P), антитело анти-PD-L1 представляет собой атезолизумаб, а антитело анти-TIGIT представляет собой одно из антител, указанных выше и/или на фиг. 3.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения антитело анти-PVRIG представляет собой CHA.7.518.1.H4 (S241P), антитело анти-PD-L1 представляет собой авелумаб, а антитело антиTIGIT представляет собой одно из антител, указанных выше и/или на фиг. 3.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения антитело анти-PVRIG представляет собой CHA.7.538.1.2.H4 (S241P), антитело анти-PD-L1 представляет собой авелумаб, а антитело антиTIGIT представляет собой одно из антител, указанных выше и/или на фиг. 3.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения антитело анти-PVRIG представляет собой CHA.7.518.1.H4 (S241P), антитело анти-PD-L1 представляет собой дурвалумаб, а антитело антиTIGIT представляет собой одно из антител, указанных выше и/или на фиг. 3.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения антитело анти-PVRIG представляет собой CHA.7.538.1.2.H4 (S241P), антитело анти-PD-L1 представляет собой дурвалумаб, а антитело антиTIGIT представляет собой одно из антител, указанных выше и/или на фиг. 3.

В некоторых вариантах осуществления антитело против TIGIT представляет собой СРА.9.083.Н4 (S241P), антитело против PVRIG представляет собой СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P), а антитело против PD-L1 представляет собой атезолизумаб.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения антитело анти-TIGIT представляет собой СРА.9.083.Н4 (S241P), антитело анти-PVRIG представляет собой CHA.7.518.1.H4 (S241P), а антитело анти-PD-L1 представляет собой атезолизумаб.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения антитело анти-TIGIT представляет собой CPA.9.086.H4 (S241P), антитело анти-PVRIG представляет собой CHA.7.538.1.2.H4 (S241P), а антитело анти-PD-L1 представляет собой атезолизумаб.

- 71 044486 бой CPA.9.086.H4 (S241P), антитело анти-PVRIG представляет собой CHA.7.518.1.H4 (S241P), а антитело анти- PD-L1 представляет собой атезолизумаб.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения антитело анти-TIGIT представляет собой CHA.9.547.7.H4 (S241P), антитело анти-PVRIG представляет собой CHA.7.538.1.2.H4 (S241P), а антитело анти-PD-L1 представляет собой атезолизумаб.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения антитело анти-TIGIT представляет собой CHA.9.547.7.H4 (S241P), антитело анти-PVRIG представляет собой CHA.7.518.1.H4 (S241P), а антитело анти-PD-L1 представляет собой атезолизумаб.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения антитело анти-TIGIT представляет собой CHA.9.547.13.H4 (S241P), антитело анти-PVRIG представляет собой CHA.7.538.1.2.H4 (S241P), а антитело анти-PD-L1 представляет собой атезолизумаб.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения антитело анти-TIGIT представляет собой CHA.9.547.13.H4 (S241P), антитело анти-PVRIG представляет собой CHA.7.518.1.H4 (S241P), а антитело анти-PD-L1 представляет собой атезолизумаб.

В некоторых вариантах осуществления антитело против TIGIT представляет собой СРА.9.083.Н4 (S241P), антитело против PVRIG представляет собой СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P), а антитело против PD-L1 представляет собой авелумаб.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения антитело анти-TIGIT представляет собой СРА.9.083.Н4 (S241P), антитело анти-PVRIG представляет собой CHA.7.518.1.H4 (S241P), а антитело анти-PD-L1 представляет собой авелумаб.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения антитело анти-TIGIT представляет собой CPA.9.086.H4 (S241P), антитело анти-PVRIG представляет собой CHA.7.538.1.2.H4 (S241P), а антитело анти-PD-L1 представляет собой авелумаб.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения антитело анти-TIGIT представляет собой CPA.9.086.H4 (S241P), антитело анти-PVRIG представляет собой CHA.7.518.1.H4 (S241P), а антитело анти-PD-L1 представляет собой авелумаб.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения антитело анти-TIGIT представляет собой CHA.9.547.7.H4 (S241P), антитело анти-PVRIG представляет собой CHA.7.538.1.2.H4 (S241P), а антитело анти-PD-L1 представляет собой авелумаб.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения антитело анти-TIGIT представляет собой CHA.9.547.7.H4 (S241P), антитело анти-PVRIG представляет собой CHA.7.518.1.H4 (S241P), а антитело анти-PD-L1 представляет собой авелумаб.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения антитело анти-TIGIT представляет собой CHA.9.547.13.H4 (S241P), антитело анти-PVRIG представляет собой CHA.7.538.1.2.H4 (S241P), а антитело анти-PD-L1 представляет собой авелумаб.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения антитело анти-TIGIT представляет собой CHA.9.547.13.H4 (S241P), антитело анти-PVRIG представляет собой CHA.7.518.1.H4 (S241P), а антитело анти-PD-L1 представляет собой авелумаб.

В некоторых вариантах осуществления антитело против TIGIT представляет собой СРА.9.083.Н4 (S241P), антитело против PVRIG представляет собой СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P), а антитело против PD-L1 представляет собой дурвалумаб.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения антитело анти-TIGIT представляет собой СРА.9.083.Н4 (S241P), антитело анти-PVRIG представляет собой CHA.7.518.1.H4 (S241P), а антитело анти-PD-L1 представляет собой дурвалумаб.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения антитело анти-TIGIT представляет собой CPA.9.086.H4 (S241P), антитело анти-PVRIG представляет собой CHA.7.538.1.2.H4 (S241P), а антитело анти-PD-L1 представляет собой дурвалумаб.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения антитело анти-TIGIT представляет собой CPA.9.086.H4 (S241P), антитело анти-PVRIG представляет собой CHA.7.518.1.H4 (S241P), а антитело анти-PD-L1 представляет собой дурвалумаб.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения антитело анти-TIGIT представляет собой CHA.9.547.7.H4 (S241P), антитело анти-PVRIG представляет собой CHA.7.538.1.2.H4 (S241P), а антитело анти-PD-L1 представляет собой дурвалумаб.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения антитело анти-TIGIT представляет собой CHA.9.547.7.H4 (S241P), антитело анти-PVRIG представляет собой CHA.7.518.1.H4 (S241P), а антитело анти-PD-L1 представляет собой дурвалумаб.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения антитело анти-TIGIT представляет собой CHA.9.547.13.H4 (S241P), антитело анти-PVRIG представляет собой CHA.7.538.1.2.H4 (S241P), а антитело анти-PD-L1 представляет собой дурвалумаб.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения антитело анти-TIGIT представляет собой CHA.9.547.13.H4 (S241P), антитело анти-PVRIG представляет собой CHA.7.518.1.H4 (S241P), а антитело анти-PD-L1 представляет собой дурвалумаб.

- 72 044486

В. Анализ биомаркеров.

Как продемонстрировано в данном документе, выбор комбинированной терапии для введения может быть осуществлен с применением оценки экспрессии конкретных биомаркеров из биоптата опухоли. То есть, взяв биопсию из образца опухоли пациента и проверив наличие и содержание определенных белков с помощью окрашивания и сортировки белка, можно выбрать подходящую терапию. Как продемонстрировано в примере 2, клетки опухолей можно подвергать скринингу для выявления популяций иммунных и неиммунных клеток, а затем оценивать популяции иммунных клеток на уровни ряда биомаркеров, включая PD-1, PD-L1, PVRIG, PVR, PVRL2 и TIGIT, в том числе путем анализа уровней как лиганда, так и антигена.

Таким образом, например, чтобы идентифицировать популяции иммунных клеток, антитела к одному или большему количеству из следующих маркеров: CD45, CD3, CD8, CD33, CD25, CD127, CD14, CD4 и CD56, можно оценить для классификации популяций клеток в образце опухоли, как продемонстрировано в табл. 1.

Таблица 1

Название	Гейтирующие маркеры
подмножества клеток CD4⁺ Т-клетки	CD45⁺ CD3⁺ CD14’ CD4⁺
CD8⁺ Т-клетки	CD45⁺CD3⁺CD14'CD8⁺
CD4 CD8 Т-клетки	CD45⁺ CD3⁺ CD14' CD4 CD8
NK клетки	CD45⁺ CD3' CD14’ CD56⁺
Моноциты	CD45⁺ CD3' CD14⁺
mDC	CD45⁺ CD3' CD14’ CD56'
pDC	CD33^BbIC CD45⁺ CD3' CD14’ CD56'
CD45 клетки	CD33^cpe«^H CD45'

Несколько из этих типов клеток затем оценивают на экспрессию одного или большего количества из следующих маркеров: PD-1, PD-L1, PVRIG, PVR, PVRL2 и TIGIT, как правило, с применением меченых антител, и подсчитывают. Если процент PD-L1-положительных опухолевых клеток или иммунных клеток превышает 1 % (> 1 %) по сравнению с теми же опухолевыми клетками, окрашенными антителом, соответствующим антителу изотипического контроля, для применяемых антител, то необходимо вводить трехкомпонентную комбинацию антител анти-TIGIT, анти-PVRIG и анти-PD-1. Тогда как пациентам, имеющим PD-L1-положительные опухолевые клетки или иммунные клетки в количестве ниже 1% (<1%) по сравнению с изотипическим контролем, следует вводить двухкомпонентную комбинацию антител анти-TIGIT и анти-PVRIG.

1. Комбинированная терапия антителами анти-TIGIT, анти-PVRIG и анти-PD-1 В некоторых вариантах осуществления данного изобретения, после того как иммунные клетки опухоли в необязательном порядке будут проанализированы на экспрессию по меньшей мере одного маркера клеточной поверхности, выбранного из PD-1, PD-L1, PVRIG, PVR, PVRL2 и TIGIT, могут приниматься решения относительно способа терапии. В случае, когда процент экспрессии PD-L1-положительных опухолевых клеток или иммунных клеток составляет > 1%, пациенту можно вводить трехкомпонентную комбинацию антител анти-TIGIT, анти-PVRIG и анти-PD-1, как описано в данном документе.

Соответственно, в одном варианте осуществления данного изобретения, антитела, содержащие наборы CDR из анти-TIGIT антитела СРА.9.083, комбинируют с антителами, содержащими наборы CDR из анти-PVRIG антитела СНА.7.518.1, и пембролизумабом. В конкретном варианте осуществления данного изобретения СРА.9.083.Н4 (S241P) комбинируют с СНА.7.518.1.Н4 (S241P) и пембролизумабом.

В одном варианте осуществления данного изобретения, антитела, содержащие наборы CDR из анти-TIGIT антитела СРА.9.083, комбинируют с антителами, содержащими наборы CDR из анти-PVRIG антитела СНА.7.538.1.2, и пембролизумабом. В конкретном варианте осуществления данного изобретения СРА.9.083.Н4 (S241P) комбинируют с CHA.7.538.1.2.H4 (S241P) и пембролизумабом.

В одном варианте осуществления данного изобретения, антитела, содержащие наборы CDR из анти-TIGIT антитела СРА.9.086, комбинируют с антителами, содержащими наборы CDR из анти-PVRIG антитела СНА.7.518.1, и пембролизумабом. В конкретном варианте осуществления данного изобретения CPA.9.086.H4 (S241P) комбинируют с CHA.7.518.1.H4 (S241P) и пембролизумабом.

В одном варианте осуществления данного изобретения, антитела, содержащие наборы CDR из анти-TIGIT антитела СРА.9.086, комбинируют с антителами, содержащими наборы CDR из анти-PVRIG антитела СНА.7.538.1.2, и пембролизумабом. В конкретном варианте осуществления данного изобретения CPA.9.086.H4 (S241P) комбинируют с CHA.7.538.1.2.H4 (S241P) и пембролизумабом.

В одном варианте осуществления данного изобретения, антитела, содержащие наборы CDR из анти-TIGIT антитела СНА.9.547.7, комбинируют с антителами, содержащими наборы CDR из анти-PVRIG антитела СНА.7.518.1, и пембролизумабом. В конкретном варианте осуществления данного изобретения CHA.9.547.7H4 (S241P) комбинируют с CHA.7.518.1.H4 (S241P) и пембролизумабом.

В одном варианте осуществления данного изобретения, антитела, содержащие наборы CDR из ан

- 73 044486 ти-TIGIT антитела СНА.9.547.7, комбинируют с антителами, содержащими наборы CDR из анти-PVRIG антитела СНА.7.538.1.2, и пембролизумабом. В конкретном варианте осуществления данного изобретения CHA.9.547.7.H4 (S241P) комбинируют с CHA.7.538.1.2.H4 (S241P) и пембролизумабом.

В одном варианте осуществления данного изобретения, антитела, содержащие наборы CDR из анти-TIGIT антитела СНА.9.547.13, комбинируют с антителами, содержащими наборы CDR из анти-PVRIG антитела СНА.7.518.1, и пембролизумабом. В конкретном варианте осуществления данного изобретения CHA.9.547.13.H4 (S241P) комбинируют с CHA.7.518.1.H4 (S241P) и пембролизумабом.

В одном варианте осуществления данного изобретения, антитела, содержащие наборы CDR из анти-TIGIT антитела СНА.9.547.13, комбинируют с антителами, содержащими наборы CDR из анти-PVRIG антитела СНА.7.538.1.2, и пембролизумабом. В конкретном варианте осуществления данного изобретения CHA.9.547.13.H4 (S241P) комбинируют с CHA.7.538.1.2.H4 (S241P) и пембролизумабом.

Соответственно, в одном варианте осуществления данного изобретения, антитела, содержащие наборы CDR из анти-TIGIT антитела СРА.9.083, комбинируют с антителами, содержащими наборы CDR из анти-PVRIG антитела СНА.7.518.1, и ниволумабом. В конкретном варианте осуществления данного изобретения СРА.9.083.Н4 (S241P) комбинируют с СНА.7.518.1.Н4 (S241P) и ниволумабом.

В одном варианте осуществления данного изобретения, антитела, содержащие наборы CDR из анти-TIGIT антитела СРА.9.083, комбинируют с антителами, содержащими наборы CDR из анти-PVRIG антитела СНА.7.538.1.2, и ниволумабом. В конкретном варианте осуществления данного изобретения СРА.9.083.Н4 (S241P) комбинируют с СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P) и ниволумабом.

В одном варианте осуществления данного изобретения, антитела, содержащие наборы CDR из анти-TIGIT антитела СРА.9.086, комбинируют с антителами, содержащими наборы CDR из анти-PVRIG антитела СНА.7.518.1, и ниволумабом. В конкретном варианте осуществления данного изобретения CPA.9.086.H4 (S241P) комбинируют с СНА.7.518.1.Н4 (S241P) и ниволумабом.

В одном варианте осуществления данного изобретения, антитела, содержащие наборы CDR из анти-TIGIT антитела СРА.9.086, комбинируют с антителами, содержащими наборы CDR из анти-PVRIG антитела СНА.7.538.1.2, и ниволумабом. В конкретном варианте осуществления данного изобретения CPA.9.086.H4 (S241P) комбинируют с СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P) и ниволумабом.

В одном варианте осуществления данного изобретения, антитела, содержащие наборы CDR из анти-TIGIT антитела СНА.9.547.7, комбинируют с антителами, содержащими наборы CDR из анти-PVRIG антитела СНА.7.518.1, и ниволумабом. В конкретном варианте осуществления данного изобретения CHA.9.547.7H4 (S241P) комбинируют с СНА.7.518.1.Н4 (S241P) и ниволумабом.

В одном варианте осуществления данного изобретения, антитела, содержащие наборы CDR из анти-TIGIT антитела СНА.9.547.7, комбинируют с антителами, содержащими наборы CDR из анти-PVRIG антитела СНА.7.538.1.2, и ниволумабом. В конкретном варианте осуществления данного изобретения CHA.9.547.7.H4 (S241P) комбинируют с СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P) и ниволумабом.

В одном варианте осуществления данного изобретения, антитела, содержащие наборы CDR из анти-TIGIT антитела СНА.9.547.13, комбинируют с антителами, содержащими наборы CDR из анти-PVRIG антитела СНА.7.518.1, и ниволумабом. В конкретном варианте осуществления данного изобретения CHA.9.547.13.H4 (S241P) комбинируют с CHA.7.518.1.H4 (S241P) и ниволумабом.

В одном варианте осуществления данного изобретения, антитела, содержащие наборы CDR из анти-TIGIT антитела СНА.9.547.13, комбинируют с антителами, содержащими наборы CDR из анти-PVRIG антитела СНА.7.538.1.2, и ниволумабом. В конкретном варианте осуществления данного изобретения CHA.9.547.13.H4 (S241P) комбинируют с CHA.7.538.1.2.H4 (S241P) и ниволумабом.

Соответственно, в одном варианте осуществления данного изобретения, антитела, содержащие наборы CDR из анти-TIGIT антитела СРА.9.083, комбинируют с антителами, содержащими наборы CDR из анти-PVRIG антитела СНА.7.518.1, и цемиплимабом. В конкретном варианте осуществления данного изобретения СРА.9.083.Н4 (S241P) комбинируют с СНА.7.518.1.Н4 (S241P) и цемиплимабом.

В одном варианте осуществления данного изобретения, антитела, содержащие наборы CDR из анти-TIGIT антитела СРА.9.083, комбинируют с антителами, содержащими наборы CDR из анти-PVRIG антитела СНА.7.538.1.2, и цемиплимабом. В конкретном варианте осуществления данного изобретения СРА.9.083.Н4 (S241P) комбинируют с CHA.7.538.1.2.H4 (S241P) и цемиплимабом.

В одном варианте осуществления данного изобретения, антитела, содержащие наборы CDR из анти-TIGIT антитела СРА.9.086, комбинируют с антителами, содержащими наборы CDR из анти-PVRIG антитела СНА.7.518.1, и цемиплимабом. В конкретном варианте осуществления данного изобретения CPA.9.086.H4 (S241P) комбинируют с CHA.7.518.1.H4 (S241P) и цемиплимабом.

В одном варианте осуществления данного изобретения, антитела, содержащие наборы CDR из анти-TIGIT антитела СРА.9.086, комбинируют с антителами, содержащими наборы CDR из анти-PVRIG антитела СНА.7.538.1.2, и цемиплимабом. В конкретном варианте осуществления данного изобретения CPA.9.086.H4 (S241P) комбинируют с CHA.7.538.1.2.H4 (S241P) и цемиплимабом.

В одном варианте осуществления данного изобретения, антитела, содержащие наборы CDR из анти-TIGIT антитела СНА.9.547.7, комбинируют с антителами, содержащими наборы CDR из анти-PVRIG антитела СНА.7.518.1, и цемиплимабом. В конкретном варианте осуществления данного изобретения

- 74 044486

CHA.9.547.7H4 (S241P) комбинируют с CHA.7.518.1.H4 (S241P) и цемиплимабом.

В одном варианте осуществления данного изобретения, антитела, содержащие наборы CDR из анти-TIGIT антитела СНА.9.547.7, комбинируют с антителами, содержащими наборы CDR из анти-PVRIG антитела СНА.7.538.1.2, и цемиплимабом. В конкретном варианте осуществления данного изобретения CHA.9.547.7.H4 (S241P) комбинируют с CHA.7.538.1.2.H4 (S241P) и цемиплимабом.

В одном варианте осуществления данного изобретения, антитела, содержащие наборы CDR из анти-TIGIT антитела СНА.9.547.13, комбинируют с антителами, содержащими наборы CDR из анти-PVRIG антитела СНА.7.518.1, и цемиплимабом. В конкретном варианте осуществления данного изобретения СНА.9.547.13.Н4 (S241P) комбинируют с СНА.7.518.1.Н4 (S241P) и цемиплимабом.

В одном варианте осуществления данного изобретения, антитела, содержащие наборы CDR из анти-TIGIT антитела СНА.9.547.13, комбинируют с антителами, содержащими наборы CDR из анти-PVRIG антитела СНА.7.538.1.2, и цемиплимабом. В конкретном варианте осуществления данного изобретения СНА.9.547.13.Н4 (S241P) комбинируют с СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P) и цемиплимабом.

2. Комбинированная терапия антителами анти-TIGIT и анти-PVRIG.

Аналогичным образом, после того как иммунные клетки опухоли будут проанализированы на экспрессию по меньшей мере одного маркера клеточной поверхности, выбранного из PD-1, PD-L1, PVRIG, PVR, PVRL2 и TIGIT, могут приниматься решения относительно способа терапии. В случае, когда процент экспрессии PD-L1-положительных опухолевых клеток или иммунных клеток составляет < 1%, пациенту можно вводить двухкомпонентную комбинацию антител анти-TIGIT и анти-PVRIG, как описано в данном документе.

Соответственно, в одном варианте осуществления данного изобретения, антитела, содержащие наборы CDR из анти-TIGIT антитела СРА.9.083, комбинируют с антителами, содержащими наборы CDR из анти-PVRIG антитела СНА.7.518.1. В конкретном варианте осуществления данного изобретения СРА.9.083.Н4 (S241P) комбинируют с CHA.7.518.1.H4 (S241P).

В одном варианте осуществления данного изобретения, антитела, содержащие наборы CDR из анти-TIGIT антитела СРА.9.083, комбинируют с антителами, содержащими наборы CDR из анти-PVRIG антитела СНА.7.538.1.2. В конкретном варианте осуществления данного изобретения СРА.9.083.Н4 (S241P) комбинируют с CHA.7.538.1.2.H4 (S241P).

В одном варианте осуществления данного изобретения, антитела, содержащие наборы CDR из анти-TIGIT антитела СРА.9.086, комбинируют с антителами, содержащими наборы CDR из анти-PVRIG антитела СНА.7.518.1. В конкретном варианте осуществления данного изобретения CPA.9.086.H4 (S241P) комбинируют с CHA.7.518.1.H4 (S241P).

В одном варианте осуществления данного изобретения, антитела, содержащие наборы CDR из анти-TIGIT антитела СРА.9.086, комбинируют с антителами, содержащими наборы CDR из анти-PVRIG антитела СНА.7.538.1.2. В конкретном варианте осуществления данного изобретения CPA.9.086.H4 (S241P) комбинируют с CHA.7.538.1.2.H4 (S241P).

В одном варианте осуществления данного изобретения, антитела, содержащие наборы CDR из анти-TIGIT антитела СНА.9.547.7, комбинируют с антителами, содержащими наборы CDR из анти-PVRIG антитела СНА.7.518.1. В конкретном варианте осуществления данного изобретения СНА.9.547.7Н4 (S241P) комбинируют с CHA.7.518.1.H4 (S241P).

В одном варианте осуществления данного изобретения, антитела, содержащие наборы CDR из анти-TIGIT антитела СНА.9.547.7, комбинируют с антителами, содержащими наборы CDR из анти-PVRIG антитела СНА.7.538.1.2. В конкретном варианте осуществления данного изобретения СНА.9.547.7.Н4 (S241P) комбинируют с CHA.7.538.1.2.H4 (S241P).

В одном варианте осуществления данного изобретения, антитела, содержащие наборы CDR из анти-TIGIT антитела СНА.9.547.13, комбинируют с антителами, содержащими наборы CDR из анти-PVRIG антитела СНА.7.518.1. В конкретном варианте осуществления данного изобретения СНА.9.547.13.Н4 (S241P) комбинируют с CHA.7.518.1.H4 (S241P).

В одном варианте осуществления данного изобретения, антитела, содержащие наборы CDR из анти-TIGIT антитела СНА.9.547.13, комбинируют с антителами, содержащими наборы CDR из анти-PVRIG антитела СНА.7.538.1.2. В конкретном варианте осуществления данного изобретения СНА.9.547.13.Н4 (S241P) комбинируют с CHA.7.538.1.2.H4 (S241P).

В одном варианте осуществления данного изобретения предлагаются комбинации антител антиTIGIT по данному изобретению и антител анти-PD-1. В одном варианте осуществления данного изобретения предлагаются комбинации антител анти-TIGIT по данному изобретению и антител анти-PD-L1.

В одном варианте осуществления данного изобретения биоптат получают из опухоли у пациента с раком и рассекают, как известно в данной области техники, для анализа FACS. Клетки окрашивают мечеными антителами к (1) TIGIT (например, с применением любых антител, описанных в данном документе, или других, известных в данной области техники, таких как MBSA43); (2) PD-1 (например, с применением известных в данной области техники антител, включая ЕН12.2Н7, Кейтруда (Keytruda®), Опдиво (Opdivo®), цемиплимаб и т.д.); (3) PD-L1 (например, с применением известных в данной области

- 75 044486 техники антител, таких как ВМ-1, атезолизумаб, авелумаб и дурвалумаб, описанных в данном документе) и (4) PVR (например, с применением известных в данной области техники антител, таких как SKII.4); и (5) соответствующему антителу изотипического контроля для применяемых антител. Выполняют анализ FACS, и для каждого рецептора рассчитывают процент клеток, экспрессирующих рецептор, относительно контрольного антитела. Если процент положительных клеток для TIGIT, PD-1, PD-1 и PVR составляет > 1% для всех 4 рецепторов, тогда пациента лечат антителами к TIGIT и PD-1, как описано в данном документе.

В одном варианте осуществления данного изобретения биоптат получают из опухоли у пациента с раком и рассекают, как известно в данной области техники, для анализа FACS. Клетки окрашивают мечеными антителами к (1) PVRIG (обычно с применением, например, СНА.7.518.Ш4 (S241P), хотя можно применять любое антитело, описанное в WO 2016/134333 (особенно включая любое антитело, которые связывает, даже если и не блокирует мишень), или любое антитело, описанное в WO 2017/041004); (2) PD-1 (например, с применением известных в данной области техники антител, включая ЕН12.2Н7, Кейтруда (Keytruda®), Опдиво (Opdivo®), цемиплимаб и т.д.); (3) PD-L1 (например, с применением известных в данной области техники антител, таких как ВМ-1, атезолизумаб, авелумаб и дурвалумаб, описанных в данном документе) и (4) PVRL2 (например, с применением известных в данной области техники антител, таких как ТХ11); и (5) соответствующему антителу изотипического контроля для применяемых антител. Выполняют анализ FACS, и для каждого рецептора рассчитывают процент клеток, экспрессирующих рецептор, относительно контрольного антитела. Если процент положительных клеток для PVRIG, PD-1, PD-1 и PVRL2 составляет > 1% для всех 4 рецепторов, тогда пациента лечат антителами к PVRIG и PD-1, как описано в данном документе.

В одном варианте осуществления данного изобретения биоптат получают из опухоли у пациента с раком и рассекают, как известно в данной области техники, для анализа FACS. Клетки окрашивают мечеными антителами к (1) PVRIG (обычно с применением, например, СНА.7.518.Ш4 (S241P), хотя можно применять любое антитело, описанное в WO 2016/134333 (особенно включая любое антитело, которые связывает, даже если и не блокирует мишень), или любое антитело, описанное в WO 2017/041004); (2) TIGIT (например, с применением любых описанных в данном документе или других, известных в данной области техники, антител, таких как MBSA43); (3) PVR (например, с применением любых известных в данной области техники антител, таких как SKII.4) и (4) PVRL2 (например, с применением известных в данной области техники антител, таких как ТХ11); и (5) соответствующему антителу изотипического контроля для применяемых антител. Выполняют анализ FACS, и для каждого рецептора рассчитывают процент клеток, экспрессирующих рецептор, относительно контрольного антитела. Если процент положительных клеток для PVRIG, TIGIT, PVR и PVRL2 составляет > 1% для всех 4 рецепторов, тогда пациента лечат антителами к PVRIG и TIGIT. Предпочтительными комбинациями в этом отношении являются СНА.7.518.1.Н4 (S241P) и СРА.9.086.

В одном варианте осуществления данного изобретения биоптат получают из опухоли у пациента с раком и рассекают, как известно в данной области техники, для анализа FACS. Клетки окрашивают мечеными антителами к (1) PVRIG (обычно с применением, например, СНА.7.518.Ш4 (S241P), хотя можно применять любое антитело, описанное в WO 2016/134333 (особенно включая любое антитело, которые связывает, даже если и не блокирует мишень), или любое антитело, описанное в WO 2017/041004); (2) TIGIT (например, с применением любых описанных в данном документе или других, известных в данной области техники, антител, таких как MBSA43); (3) PVR (например, с применением любых известных в данной области техники антител, таких как SKII.4) и (4) PVRL2 (например, с применением известных в данной области техники антител, таких как ТХ11); (5) PD-1 (например, с применением известных в данной области техники антител, включая ЕН12.2Н7, Кейтруда (Keytruda®), Опдиво (Opdivo®), цимиплимаб и т.д.); и (6) соответствующему антителу изотипического контроля для применяемых антител. Выполняют анализ FACS, и для каждого рецептора рассчитывают процент клеток, экспрессирующих рецептор, относительно контрольного антитела. Если процент положительных клеток для PVRIG, TIGIT, PVR, PVRL2 и PD-1 составляет > 1% для всех 5 рецепторов, тогда пациента лечат антителами к PVRIG, TIGIT и PD-1. Предпочтительными комбинациями в этом отношении являются CHA.7.518.1.H4 (S241P), СРА.9.086 и ЕН12.2Н7. Другими предпочтительными комбинациями в этом отношении являются СНА.7.518.1.Н4 (S241P), СРА.9.086 и Кейтруда (Keytruda®). Другими предпочтительными комбинациями в этом отношении являются СНА.7.518.1.Н4 (S241P), СРА.9.086 и Опдиво (Opdivo®).

В одном варианте осуществления данного изобретения биоптат получают из опухоли у пациента с раком и рассекают, как известно в данной области техники, для анализа FACS. Клетки окрашивают мечеными антителами к (1) PVRIG (обычно с применением, например, СНА.7.518.1Н4 (S241P), хотя можно применять любое антитело, описанное в WO 2016/134333 (особенно включая любое антитело, которые связывает, даже если и не блокирует мишень), или любое антитело, описанное в WO 2017/041004); (2) TIGIT (например, с применением любых описанных в данном документе или других, известных в данной области техники, антител, таких как MBSA43); (3) PD-L1 (например, с применением любых известных в данной области техники антител, таких как ВМ-1, атезолизумаб, авелумаб и дурвалумаб, описанных в

- 76 044486 данном документе) и (4) PVR (например, с применением известных в данной области техники антител, таких как SKII.4); (5) PD-1 (например, с применением известных в данной области техники антител, включая ЕН12.2Н7, Кейтруда (Keytruda®), Опдиво (Opdivo®), цимиплимаб и т.д.); и (6) соответствующему антителу изотипического контроля для применяемых антител. Выполняют анализ FACS, и для каждого рецептора рассчитывают процент клеток, экспрессирующих рецептор, относительно контрольного антитела. Если процент положительных клеток для PVRIG, TIGIT, PD-L1, PVR и PD-1 составляет > 1% для всех 5 рецепторов, тогда пациента лечат антителами к PVRIG, TIGIT и PD-1. Предпочтительными комбинациями в этом отношении являются CHA.7.518.1.H4 (S241P), СРА.9.086 и ЕН12.2Н7. Другими предпочтительными комбинациями в этом отношении являются СНА.7.518.1.Н4 (S241P), СРА.9.086 и Кейтруда (Keytruda®). Другими предпочтительными комбинациями в этом отношении являются СНА.7.518.1.Н4 (S241P), СРА.9.086 и Опдиво (Opdivo®).

3. Комбинированная терапия антителами анти-TIGIT и анти-PVRIG с антителами к PD-1 для пациентов с невосприимчивостью.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения лечение включает комбинацию антител анти-TIGIT, антител анти-PVRIG и антител анти-PD-1 для нацеливания на опухолевые клетки с высокой экспрессией PD-L1. В некоторых вариантах осуществления данного изобретения лечение включает комбинацию антител анти-TIGIT, антител анти-PVRIG и антител анти-PD-1 для применения у пациента, опухоли которого экспрессируют PD-L1. В некоторых вариантах осуществления данного изобретения лечение включает комбинацию антител анти-TIGIT, антител анти-PVRIG и антител анти-PD-1 для применения у пациента с раком, опухоль которого экспрессирует PD-L1, и/или который является невосприимчивым к препаратам антитела анти-PD-1. В некоторых вариантах осуществления лечение включает комбинацию анти-TIGIT-антител, анти-PVRIG-антител и анти-PD-1-антител для применения у пациента с раком, опухоль которого экспрессирует PD-L1, и который является невосприимчивым к препаратам антитела анти-PD-1.

Соответственно, в одном варианте осуществления данного изобретения, антитела, содержащие наборы CDR из анти-TIGIT антитела СРА.9.083, комбинируют с антителами, содержащими наборы CDR из анти-PVRIG антитела СНА.7.518.1, и пембролизумабом, для применения у пациента с раком, опухоль которого экспрессирует PD-L1, и/или который является невосприимчивым к препаратам антитела антиPD-1. В конкретном варианте осуществления данного изобретения СРА.9.083.Н4 (S241P) комбинируют с СНА.7.518.1.Н4 (S241P) и пембролизумабом, для применения у пациента с раком, опухоль которого экспрессирует PD-L1 и/или который является невосприимчивым к препаратам антитела анти-PD-1.

В одном варианте осуществления данного изобретения, антитела, содержащие наборы CDR из анти-TIGIT антитела СРА.9.083, комбинируют с антителами, содержащими наборы CDR из анти-PVRIG антитела СНА.7.538.1.2, и пембролизумабом, для применения у пациента с раком, опухоль которого экспрессирует PD-L1, и/или который является невосприимчивым к препаратам антитела анти-PD-1. В конкретном варианте осуществления данного изобретения СРА.9.083.Н4 (S241P) комбинируют с CHA.7.538.1.2.H4 (S241P) и пембролизумабом, для применения у пациента с раком, опухоль которого экспрессирует PD-L1, и/или который является невосприимчивым к препаратам антитела анти-PD-1.

В одном варианте осуществления данного изобретения, антитела, содержащие наборы CDR из анти-TIGIT антитела СРА.9.086, комбинируют с антителами, содержащими наборы CDR из анти-PVRIG антитела СНА.7.518.1, и пембролизумабом, для применения у пациента с раком, опухоль которого экспрессирует PD-L1, и/или который является невосприимчивым к препаратам антитела анти-PD-1. В конкретном варианте осуществления данного изобретения СРА.9.083.Н4 (S241P) комбинируют с СНА.7.518.1.Н4 (S241P) и пембролизумабом, для применения у пациента с раком, опухоль которого экспрессирует PD-L1, и/или который является невосприимчивым к препаратам антитела анти-PD-1.

В одном варианте осуществления данного изобретения, антитела, содержащие наборы CDR из анти-TIGIT антитела СРА.9.086, комбинируют с антителами, содержащими наборы CDR из анти-PVRIG антитела СНА.7.538.1.2, и пембролизумабом, для применения у пациента с раком, опухоль которого экспрессирует PD-L1, и/или который является невосприимчивым к препаратам антитела анти-PD-1. В конкретном варианте осуществления данного изобретения CPA.9.086.H4 (S241P) комбинируют с CHA.7.538.1.2.H4 (S241P) и пембролизумабом, для применения у пациента с раком, опухоль которого экспрессирует PD-L1, и/или который является невосприимчивым к препаратам антитела анти-PD-1.

В одном варианте осуществления данного изобретения, антитела, содержащие наборы CDR из анти-TIGIT антитела СНА.9.547.7, комбинируют с антителами, содержащими наборы CDR из анти-PVRIG антитела СНА.7.518.1, и пембролизумабом, для применения у пациента с раком, опухоль которого экспрессирует PD-L1, и/или который является невосприимчивым к препаратам антитела анти-PD-1. В конкретном варианте осуществления данного изобретения CHA.9.547.7H4 (S241P) комбинируют с CHA.7.518.1.H4 (S241P) и пембролизумабом, для применения у пациента с раком, опухоль которого экспрессирует PD-L1, и/или который является невосприимчивым к препаратам антитела анти-PD-1.

В одном варианте осуществления данного изобретения, антитела, содержащие наборы CDR из анти-TIGIT антитела СНА.9.547.7, комбинируют с антителами, содержащими наборы CDR из анти-PVRIG

- 77 044486 антитела СНА.7.538.1.2, и пембролизумабом, для применения у пациента с раком, опухоль которого экспрессирует PD-L1, и/или который является невосприимчивым к препаратам антитела антu-PD-1. В конкретном варианте осуществления данного изобретения CHA.9.547.7.H4 (S241P) комбинируют с CHA.7.538.1.2.H4 (S241P) и пембролизумабом, для применения у пациента с раком, опухоль которого экспрессирует PD-L1, и/или который является невосприимчивым к препаратам антитела анти-PD-1.

В одном варианте осуществления данного изобретения, антитела, содержащие наборы CDR из анти-TIGIT антитела СНА.9.547.13, комбинируют с антителами, содержащими наборы CDR из анти-PVRIG антитела СНА.7.518.1, и пембролизумабом, для применения у пациента с раком, опухоль которого экспрессирует PD-L1, и/или который является невосприимчивым к препаратам антитела αнтu-PD-1. В конкретном варианте осуществления данного изобретения CHA.9.547.13.H4 (S241P) комбинируют с CHA.7.518.1.H4 (S241P) и пембролизумабом, для применения у пациента с раком, опухоль которого экспрессирует PD-L1, и/или который является невосприимчивым к препаратам антитела анти-PD-1.

В одном варианте осуществления данного изобретения, антитела, содержащие наборы CDR из анти-TIGIT антитела СНА.9.547.13, комбинируют с антителами, содержащими наборы CDR из анти-PVRIG антитела СНА.7.538.1.2, и пембролизумабом, для применения у пациента с раком, опухоль которого экспрессирует PD-L1, и/или который является невосприимчивым к препаратам антитела αнтu-PD-1. В конкретном варианте осуществления данного изобретения CHA.9.547.13.H4 (S241P) комбинируют с CHA.7.538.1.2.H4 (S241P) и пембролизумабом, для применения у пациента с раком, опухоль которого экспрессирует PD-L1, и/или который является невосприимчивым к препаратам антитела анти-PD-1.

Соответственно, в одном варианте осуществления данного изобретения, антитела, содержащие наборы CDR из анти-TIGIT антитела СРА.9.083, комбинируют с антителами, содержащими наборы CDR из анти-PVRIG антитела СНА.7.518.1, и ниволумабом, для применения у пациента с раком, опухоль которого экспрессирует PD-L1, и/или который является невосприимчивым к препаратам антитела анти-PD-1. В конкретном варианте осуществления данного изобретения СРА.9.083.Н4 (S241P) комбинируют с СНА.7.518.1.Н4 (S241P) и ниволумабом, для применения у пациента с раком, опухоль которого экспрессирует PD-L1, и/или который является невосприимчивым к препаратам антитела анти-PD-1.

В одном варианте осуществления данного изобретения, антитела, содержащие наборы CDR из анти-TIGIT антитела СРА.9.083, комбинируют с антителами, содержащими наборы CDR из анти-PVRIG антитела СНА.7.538.1.2, и ниволумабом, для применения у пациента с раком, опухоль которого экспрессирует PD-L1, и/или который является невосприимчивым к препаратам антитела анти-PD-1. В конкретном варианте осуществления данного изобретения СРА.9.083.Н4 (S241P) комбинируют с CHA.7.538.1.2.H4 (S241P) и ниволумабом, для применения у пациента с раком, опухоль которого экспрессирует PD-L1, и/или который является невосприимчивым к препаратам антитела анти-PD-1.

В одном варианте осуществления данного изобретения, антитела, содержащие наборы CDR из анти-TIGIT антитела СРА.9.086, комбинируют с антителами, содержащими наборы CDR из анти-PVRIG антитела СНА.7.518.1, и ниволумабом, для применения у пациента с раком, опухоль которого экспрессирует PD-L1, и/или который является невосприимчивым к препаратам антитела анти-PD-1. В конкретном варианте осуществления данного изобретения CPA.9.086.H4 (S241P) комбинируют с СНА.7.518.1.Н4 (S241P) и ниволумабом, для применения у пациента с раком, опухоль которого экспрессирует PD-L1, и/или который является невосприимчивым к препаратам антитела αнтu-PD-1.

В одном варианте осуществления данного изобретения, антитела, содержащие наборы CDR из анти-TIGIT антитела СРА.9.086, комбинируют с антителами, содержащими наборы CDR из анти-PVRIG антитела СНА.7.538.1.2, и ниволумабом, для применения у пациента с раком, опухоль которого экспрессирует PD-L1, и/или который является невосприимчивым к препаратам антитела aнтu-PD-1. В конкретном варианте осуществления данного изобретения CPA.9.086.H4 (S241P) комбинируют с CHA.7.538.1.2.H4 (S241P) и ниволумабом, для применения у пациента с раком, опухоль которого экспрессирует PD-L1, и/или который является невосприимчивым к препаратам антитела анти-PD-1.

В одном варианте осуществления данного изобретения, антитела, содержащие наборы CDR из анти-TIGIT антитела СНА.9.547.7, комбинируют с антителами, содержащими наборы CDR из анти-PVRIG антитела СНА.7.518.1, и ниволумабом, для применения у пациента с раком, опухоль которого экспрессирует PD-L1, и/или который является невосприимчивым к препаратам антитела анти-PD-1. В конкретном варианте осуществления данного изобретения CHA.9.547.7H4 (S241P) комбинируют с CHA.7.518.1.H4 (S241P) и ниволумабом, для применения у пациента с раком, опухоль которого экспрессирует PD-L1, и/или который является невосприимчивым к препаратам антитела анти-PD-1.

В одном варианте осуществления данного изобретения, антитела, содержащие наборы CDR из анти-TIGIT антитела СНА.9.547.7, комбинируют с антителами, содержащими наборы CDR из анти-PVRIG антитела СНА.7.538.1.2, и ниволумабом, для применения у пациента с раком, опухоль которого экспрессирует PD-L1, и/или который является невосприимчивым к препаратам антитела анти-PD-1. В конкретном варианте осуществления данного изобретения CHA.9.547.7.H4 (S241P) комбинируют с CHA.7.538.1.2.H4 (S241P) и ниволумабом, для применения у пациента с раком, опухоль которого экспрессирует PD-L1, и/или который является невосприимчивым к препаратам антитела анти-PD-1.

- 78 044486 ти-TIGIT антитела СНА.9.547.13, комбинируют с антителами, содержащими наборы CDR из анти-PVRIG антитела СНА.7.518.1, и ниволумабом, для применения у пациента с раком, опухоль которого экспрессирует PD-L1, и/или который является невосприимчивым к препаратам антитела анти-PD-1. В конкретном варианте осуществления данного изобретения CHA.9.547.13.H4 (S241P) комбинируют с CHA.7.518.1.H4 (S241P) и ниволумабом, для применения у пациента с раком, опухоль которого экспрессирует PD-L1, и/или который является невосприимчивым к препаратам антитела анти-PD-1.

В одном варианте осуществления данного изобретения, антитела, содержащие наборы CDR из анти-TIGIT антитела СНА.9.547.13, комбинируют с антителами, содержащими наборы CDR из анти-PVRIG антитела СНА.7.538.1.2, и ниволумабом, для применения у пациента с раком, опухоль которого экспрессирует PD-L1, и/или который является невосприимчивым к препаратам антитела анти-PD-1. В конкретном варианте осуществления данного изобретения CHA.9.547.13.H4 (S241P) комбинируют с CHA.7.538.1.2.H4 (S241P) и ниволумабом, для применения у пациента с раком, опухоль которого экспрессирует PD-L1, и/или который является невосприимчивым к препаратам антитела анти-PD-1.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения антитело анти-TIGIT представляет собой антитело, выбранное из любого антитела анти-TIGIT, описанного в данном документе, включая любое из антител, описанных на фиг. 3. В некоторых вариантах осуществления данного изобретения антитело анти-PVRIG представляет собой антитело, выбранное из любого антитела анти-PVRIG, описанного в данном документе, включая любое из антител, описанных на фиг. 5 и/или на фиг. 63. В некоторых вариантах осуществления данного изобретения антитело анти-PD-1 представляет собой антитело, выбранное из любого антитела αнтu-PD-1, описанного в данном документе, включая любое из антител, описанных на фиг. 7.

4. Оценка лечения.

Как правило, антитела по данному изобретению, отдельно или в комбинации (PVRIG с PD-1, TIGIT с PD-1 или TIGIT с PVRIG и/или PVRIG с TIGIT и PD-1) вводят пациентам с раком, и их эффективность оценивают несколькими способами, как описано в данном документе. Таким образом, наряду с проведением стандартных анализов эффективности, таких как определение раковой нагрузки, размера опухоли, наличия или степени метастазирования и т.д., эффективность лечения с применением иммуноонкологических препаратов также можно оценивать на основе параметров иммунного статуса. Это можно осуществлять с помощью ряда способов, включая анализы как in vitro, так и in vivo. Например, с помощью оценки изменений в иммунном статусе (например, наличие ICOS+ CD4+ Т-клеток после лечения ipi) наряду с традиционными измерениями, такими как опухолевая нагрузка, размер опухоли, инвазивность, вовлечение ЛУ, метастазирование и т.д. Таким образом, можно оценить любой или все из следующих параметров: ингибирующие эффекты PVRIG на активацию или пролиферацию CD4+ T-клеток, активацию или пролиферацию CD8+ T (CTL) клеток, цитотоксическую активность, опосредованную CD8+ Тклетками, и/или CTL-опосредованное деплетирование клеток, активность NK-клеток и NKопосредованное деплетирование клеток, потенцирующие эффекты PVRIG на дифференцировку и пролиферацию Treg-клеток, и иммуносупрессию или иммунотолерантность, опосредованные Treg- или супрессорными клетками миелоидного происхождения (MDSC), и/или эффекты PVRIG на продукцию противовоспалительных цитокинов иммунными клетками, например, продукцию IL-2, IFN-γ или TNF-α Тклетками или другими иммунными клетками.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения оценку лечения проводят путем анализа пролиферации иммунных клеток, применяя, например, метод разведения CFSE, внутриклеточное окрашивание иммунных эффекторных клеток Ki67 и метод включения 3H-тимидина.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения оценку лечения проводят путем анализа повышения экспрессии генов или повышенных белковых уровней маркеров, ассоциированных с активацией, включая один или большее количество из следующих: CD25, CD69, CD137, ICOS, PD1, GITR, OX40, а также измерения дегрануляции клеток по поверхностной экспрессии CD1O7A.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения оценку лечения проводят путем анализа количества пролиферации Т-клеток без лечения, например, до введения антител по данному изобретению. Если после введения у пациента наблюдается повышение пролиферации Т-клеток, например, пролиферирует подмножество Т-клеток пациента, это указывает на то, что Т-клетки были активированы.

Аналогичным образом, оценку лечения антителами по данному изобретению можно проводить путем измерения уровней IFN-γ пациента до введения и после введения для оценки эффективности лечения. Это может быть осуществлено в пределах нескольких часов или дней.

Как правило, анализы экспрессии генов проводят, как известно в данной области техники. См., например, публикацию Goodkind et al., Computers and Chem. Eng. 29(3):589 (2005), Han et al., Bioinform. Biol. Insights 11/15/15 9(Suppl. 1):29-46, Campo et al., Nod. Pathol. 2013 Jan; 26 suppl. 1: S97-S110, методики измерения экспрессии генов в которой явным образом включены в данное описание посредством ссылки.

В общем, измерения экспрессии белка также проводят аналогично, как известно в данной области техники, см., например, публикацию Wang et al., в Recent Advances in Capillary Electrophoresis-Based Pro

- 79 044486 teomic Techniques for Biomarker Discovery, Methods. Mol. Biol. 2013:984:1-12; Taylor et al, BioMed Res. Volume 2014, Article ID 361590, 8 pages, Becerk et al., Mutat. Res 2011 June 17: 722 (2): 171-182, методики измерения экспрессии в которой явным образом включены в данное описание посредством ссылки.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения оценку лечения проводят путем анализа цитотоксической активности, измеренной путем определения жизнеспособности клеток-мишеней, посредством оценки многочисленных параметров клеток, таких как ферментная активность (включая активность протеазы), проницаемость клеточной мембраны, адгезия клеток, продукция АТФ, продукция кофермента и активность поглощения нуклеотидов. Конкретные примеры таких анализов включают в себя, но не ограничиваются ими, способ с окрашиванием трипановым синим или PI, способ с высвобождением ⁵¹Cr или ³⁵S, анализ активности ЛДГ, анализы МТТ и/или WST, анализ кальцеина-АМ, анализ на основе люминесценции и другие.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения оценку лечения проводят путем анализа активности Т-клеток, измеренную по продукции цитокинов, при этом в культуральной надосадочной жидкости исследуют внутриклеточную продукцию цитокинов, включая, но не ограничиваясь этим, IFNγ, TNF-α, GM-CSF, IL-2, IL-6, IL-4, IL-5, IL-10 и/или IL-13 с применением помощью хорошо известных методик.

Соответственно, оценку лечения можно проводить с помощью анализов, которые оценивают один или большее количество из следующих механизмов: (i) повышение иммунного ответа, (ii) повышение активации αβ и/или γδ Т-клеток, (iii) повышение активности цитотоксических Т-клеток, (iv) повышение активности NK- и/или NKT-клеток, (v) ослабление супрессии αβ и/или γδ Т-клеток, (vi) повышение секреции противовоспалительных цитокинов, (vii) повышение секреции IL-2; (viii) увеличение продукции интерферона-γ, (ix) повышение ответа Th1, (x) снижение ответа Th2, (xi) уменьшение количества или элиминация клеток и/или активности по меньшей мере одной из регуляторных Т-клеток (Treg).

Анализы для измерения эффективности.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения активацию Т-клеток оценивали с помощью анализа реакции смешанной культуры лимфоцитов (MLR), как описано в примерах. Повышение активности указывает на иммуностимулирующую активность. Соответствующие повышения активности описаны ниже.

В одном варианте осуществления данного изобретения с помощью анализа сигнального пути измеряют повышение или снижение иммунного ответа, что измеряется, например, по фосфорилированию или дефосфорилированию различных факторов или путем измерения других посттрансляционных модификаций. Повышение активности указывает на иммуностимулирующую активность. Соответствующие повышения активности описаны ниже.

В одном варианте осуществления данного изобретения с помощью анализа сигнального пути измеряют повышение или снижение активации αβ и/или γδ Т-клеток, что измеряется, например, по секреции цитокинов или по пролиферации, или по изменениям экспрессии маркеров активации, таких как, для примера, CD137, CD107a, PD1 и т.д. Повышение активности указывает на иммуностимулирующую активность. Соответствующие повышения активности описаны ниже.

В одном варианте осуществления данного изобретения с помощью анализа сигнального пути измеряют повышение или снижение активности цитотоксических Т-клеток, что измеряется, например, по непосредственному уничтожению клеток-мишеней, таких как, например, раковые клетки, или по секреции цитокинов, или по пролиферации, или по изменениям экспрессии маркеров активации, таких как, для примера, CD137, CD107a, PD1 и т.д. Повышение активности указывает на иммуностимулирующую активность. Соответствующие повышения активности описаны ниже.

В одном варианте осуществления данного изобретения с помощью анализа сигнального пути измеряют повышение или снижение активности NK и/или NKT-клеток, что измеряется, например, по непосредственному уничтожению клеток-мишеней, таких как, например, раковые клетки, или по секреции цитокинов, или по изменениям экспрессии маркеров активации, таких как, для примера, CD107а и т.д. Повышение активности указывает на иммуностимулирующую активность. Соответствующие повышения активности описаны ниже.

В одном варианте осуществления данного изобретения с помощью анализа сигнального пути измеряют повышение или снижение супрессии αβ и/или γδ Т-клеток, что измеряется, например, по секреции цитокинов или по пролиферации, или по изменениям экспрессии маркеров активации, как, для примера, CD137, CD107a, PD1 и т.д. Повышение активности указывает на иммуностимулирующую активность. Соответствующие повышения активности описаны ниже.

В одном варианте осуществления данного изобретения с помощью анализа сигнального пути измеряют увеличение или уменьшение секреции противовоспалительных цитокинов, что измеряется, например, с помощью ИФА, или с помощью методов на основе гранул Luminex или Multiplex, или с помощью внутриклеточного окрашивания и анализа FACS, или с помощью Alispot и т.д. Повышение активности указывает на иммуностимулирующую активность. Соответствующие повышения активности описаны ниже.

- 80 044486

В одном варианте осуществления данного изобретения с помощью анализа сигнального пути измеряют повышение или снижение секреции IL-2, что измеряется, например, с помощью ИФА, или с помощью методов на основе гранул Luminex или Multiplex, или с помощью внутриклеточного окрашивания и анализа FACS, или с помощью Alispot и т.д. Повышение активности указывает на иммуностимулирующую активность. Соответствующие повышения активности описаны ниже.

В одном варианте осуществления данного изобретения с помощью анализа сигнального пути измеряют увеличение или уменьшение продукции интерферона-γ, что измеряется, например, с помощью ИФА, или с помощью методов на основе гранул Luminex или Multiplex, или с помощью внутриклеточного окрашивания и анализа FACS, или с помощью Alispot и т.д. Повышение активности указывает на иммуностимулирующую активность. Соответствующие повышения активности описаны ниже.

В одном варианте осуществления данного изобретения с помощью анализа сигнального пути измеряют повышение или снижение ответа Th1, что измеряется, например, по секреции цитокинов или по изменениям экспрессии маркеров активации. Повышение активности указывает на иммуностимулирующую активность. Соответствующие повышения активности описаны ниже.

В одном варианте осуществления данного изобретения с помощью анализа сигнального пути измеряют повышение или снижение ответа Th2, что измеряется, например, по секреции цитокинов или по изменениям экспрессии маркеров активации. Повышение активности указывает на иммуностимулирующую активность. Соответствующие повышения активности описаны ниже.

В одном варианте осуществления данного изобретения с помощью анализа сигнального пути измеряют увеличение или уменьшение количества клеток и/или активности по меньшей мере одной из регуляторных Т-клеток (Treg), что измеряется, например, с помощью проточной цитометрии или ИГХ. Снижение ответа указывает на иммуностимулирующую активность. Соответствующие снижения являются такими же, как и для увеличений, описанных ниже.

В одном варианте осуществления данного изобретения с помощью анализа сигнального пути измеряют увеличение или уменьшение количества клеток макрофагов М2, что измеряется, например, с помощью проточной цитометрии или ИГХ. Снижение ответа указывает на иммуностимулирующую активность. Соответствующие снижения являются такими же, как и для увеличений, описанных ниже.

В одном варианте осуществления данного изобретения с помощью анализа сигнального пути измеряют повышение или снижение проонкогенной активности макрофагов М2, что измеряется, например, по секреции цитокинов или по изменениям экспрессии маркеров активации. Снижение ответа указывает на иммуностимулирующую активность. Соответствующие снижения являются такими же, как и для увеличений, описанных ниже.

В одном варианте осуществления данного изобретения с помощью анализа сигнального пути измеряют увеличение или уменьшение количества нейтрофилов N2, что измеряется, например, с помощью проточной цитометрии или ИГХ. Снижение ответа указывает на иммуностимулирующую активность. Соответствующие снижения являются такими же, как и для увеличений, описанных ниже.

В одном варианте осуществления данного изобретения с помощью анализа сигнального пути измеряют повышение или снижение проонкогенной активности нейтрофилов N2, что измеряется, например, по секреции цитокинов или по изменениям экспрессии маркеров активации. Снижение ответа указывает на иммуностимулирующую активность. Соответствующие снижения являются такими же, как и для увеличений, описанных ниже.

В одном варианте осуществления данного изобретения с помощью анализа сигнального пути измеряют повышение или снижение ингибирования активации Т-клеток, что измеряется, например, по секреции цитокинов или по пролиферации, или по изменениям экспрессии маркеров активации, как, для примера, CD137, CD107a, PD1 и т.д. Повышение активности указывает на иммуностимулирующую активность. Соответствующие повышения активности описаны ниже.

В одном варианте осуществления данного изобретения с помощью анализа сигнального пути измеряют повышение или снижение ингибирования активации CTL, что измеряется, например, по непосредственному уничтожению клеток-мишеней, таких как, например, раковые клетки, или по секреции цитокинов, или по пролиферации, или по изменениям экспрессии маркеров активации, таких как, для примера, CD137, CD107a, PD1 и т.д. Повышение активности указывает на иммуностимулирующую активность. Соответствующие повышения активности описаны ниже.

В одном варианте осуществления данного изобретения с помощью анализа сигнального пути измеряют повышение или снижение истощения αβ и/или γδ Т-клеток, что измеряется, например, по изменениям экспрессии маркеров активации. Снижение ответа указывает на иммуностимулирующую активность. Соответствующие снижения являются такими же, как и для увеличений, описанных ниже.

В одном варианте осуществления данного изобретения с помощью анализа сигнального пути измеряют повышение или снижение ответа αβ и/или γδ Т-клеток, что измеряется, например, по секреции цитокинов или по пролиферации, или по изменениям экспрессии маркеров активации, таких как, для примера, CD137, CD107a, PD1 и т.д.

Повышение активности указывает на иммуностимулирующую активность.

- 81 044486

Соответствующие повышения активности описаны ниже.

В одном варианте осуществления данного изобретения с помощью анализа сигнального пути измеряют повышение или снижение стимуляции антиген-специфических ответов памяти, что измеряется, например, по секреции цитокинов или по пролиферации, или по изменениям экспрессии маркеров активации, таких как, для примера, CD45RA, CCR7 и т.д. Повышение активности указывает на иммуностимулирующую активность. Соответствующие повышения активности описаны ниже.

В одном варианте осуществления данного изобретения с помощью анализа сигнального пути измеряют увеличение или уменьшение апоптоза или лизиса раковых клеток, что измеряется, например, с помощью анализов цитотоксичности, таких как, например, анализ МТТ, анализ высвобождения Cr, анализ кальцеина AM, или с помощью анализов на основе проточной цитометрии, как в примере разведения CFSE или окрашивания йодидом пропидия и т.д. Повышение активности указывает на иммуностимулирующую активность. Соответствующие повышения активности описаны ниже.

В одном варианте осуществления данного изобретения с помощью анализа сигнального пути измеряют повышение или снижение стимуляции цитотоксического или цитостатического эффекта на раковые клетки, что измеряется, например, с помощью анализов цитотоксичности, таких как, например, анализ МТТ, анализ высвобождения Cr, анализ кальцеина AM, или с помощью анализов на основе проточной цитометрии, как в примере разведения CFSE или окрашивания йодидом пропидия и т.д. Повышение активности указывает на иммуностимулирующую активность. Соответствующие повышения активности описаны ниже.

В одном варианте осуществления данного изобретения с помощью анализа сигнального пути измеряют увеличение или уменьшение непосредственного уничтожения раковых клеток, что измеряется, например, с помощью анализов цитотоксичности, таких как, например, анализ МТТ, анализ высвобождения Cr, анализ кальцеина AM, или с помощью анализов на основе проточной цитометрии, как в примере разведения CFSE или окрашивания йодидом пропидия и т.д. Повышение активности указывает на иммуностимулирующую активность. Соответствующие повышения активности описаны ниже.

В одном варианте осуществления данного изобретения с помощью анализа сигнального пути измеряют повышение или снижение активности Th17, что измеряется, например, по секреции цитокинов или по пролиферации или по изменениям экспрессии маркеров активации. Повышение активности указывает на иммуностимулирующую активность. Соответствующие повышения активности описаны ниже.

В одном варианте осуществления данного изобретения с помощью анализа сигнального пути измеряют повышение или снижение индукции комплемент-зависимой цитотоксичности и/или антителозависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности, что измеряется, например, с помощью анализов цитотоксичности, таких как, например, анализ МТТ, анализ высвобождения Cr, анализ кальцеина AM, или с помощью анализов на основе проточной цитометрии, как в примере разведения CFSE или окрашивания йодидом пропидия и т.д. Повышение активности указывает на иммуностимулирующую активность. Соответствующие повышения активности описаны ниже.

В одном варианте осуществления данного изобретения активацию Т-клеток измеряют, например, по непосредственному уничтожению клеток-мишеней, таких как, например, раковые клетки, или по секреции цитокинов, или по пролиферации, или по изменениям экспрессии маркеров активации, таких как, для примера, CD137, CD107a, PD1 и т.д. Для Т-клеток, повышение пролиферации, маркеры активации клеточной поверхности (например, CD25, CD69, CD137, PD1), цитотоксичность (способность уничтожать клетки-мишени) и продукция цитокинов (например, IL-2, IL-4, IL-6, IFNy, TNF-α, IL-10, IL-17A) будут указывать на иммунную модуляцию, которая согласуется с усиленным уничтожением раковых клеток.

В одном варианте осуществления данного изобретения активацию NK-клеток измеряют, например, по непосредственному уничтожению клеток-мишеней, таких как, например, раковые клетки, или по секреции цитокинов, или по изменениям экспрессии маркеров активации, таких как, для примера, CD107а и т.д. Для NK-клеток, увеличение пролиферации, цитотоксичности (способность уничтожать клеткимишени, и повышение экспрессии CD107а, гранзима и перфорина), продукция цитокинов (например, IFNy и TNF) и экспрессия рецепторов на клеточной поверхности (например, CD25) могут указывать на иммуномодуляцию, которая согласуется с усиленным уничтожением раковых клеток.

В одном варианте осуществления данного изобретения активацию γδ Т-клеток измеряют, например, по секреции цитокинов, или по пролиферации, или по изменениям экспрессии маркеров активации.

В одном варианте осуществления данного изобретения активацию Th1-клеток измеряют, например, по секреции цитокинов, или по изменениям экспрессии маркеров активации.

Соответствующими повышениями активности или ответа (или снижением, в зависимости от ситуации, как указано выше) являются повышения по меньшей мере на около 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% или 98 до 99% по сравнению с сигналом либо в эталонном образце, либо в контрольных образцах, например, в тестовых образцах, которые не содержат антитела анти-PVRIG по данному изобретению. Конкретные показатели повышения активности изображены на прилагаемых фигурах. Например, что касается повышения пролиферации Т-клеток, СНА.7.518.1.Н4 (S241P) демонстри

- 82 044486 рует повышение на около 60%, а СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P) демонстрирует повышение на 47%; соответствующие повышения, от около 10 до 70%, наблюдаются либо при пролиферации Т-клеток, либо IFN-γ, при этом показатели повышения от около 20 до 60% также находят применение.

Аналогичным образом, повышение по меньшей мере в 1, 2, 3, 4 или 5 раз по сравнению с эталонными или контрольными образцами указывает на эффективность.

X. Типовые варианты осуществления изобретения

1. Способ лечения рака у пациента, включающий:

a) получение биоптата от указанного пациента, содержащего опухолевые клетки;

b) измерение количества PD-L1-положительных опухолевых клеток или клеток иммунной системы в указанном биоптате;

c) если указанное количество PD-L1-положительных опухолевых клеток или иммунных клеток превышает 1% по сравнению с теми же опухолевыми клетками, окрашенными антителом, соответствующим антителу изотипического контроля, для применяемых антител, введение трехкомпонентной комбинированной терапии, включающей антитело анти-TIGIT антитело анти-PVRIG и антитело анти-PD-1; а также

d) если указанное количество PD-L1-положительных опухолевых клеток или иммунных клеток менее 1% по сравнению с теми же опухолевыми клетками, окрашенными антителом, соответствующим антителу изотипического контроля, для применяемых антител, введение двухкомпонентной комбинированной терапии, включающей антитело анти-TIGIT и антитело анти-PD-1.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанное антитело анти-TIGIT представляет собой антитело, выбранное из любого антитела анти-TIGIT, описанного в данном документе, включая любое из антител, описанных на фиг. 3.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанное антитело анти-PVRIG представляет собой антитело, выбранное из любого антитела анти-PVRIG, описанного в данном документе, включая любое из антител, описанных на фиг. 5 и/или на фиг. 63.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанное антитело анти-PD-1 представляет собой антитело, выбранное из любого антитела анти-PD-1, описанного в данном документе, включая любое из антител, описанных на фиг. 7.

5. Способ по любому из пп.1-4, отличающийся тем, что указанное антитело анти-TIGIT представляет собой антитело, выбранное из по меньшей мере одного из следующих антител: СРА.9.083.Н4 (S241P), СРА.9.086.Н4 (S241P), СНА.9.547.7.Н4 (S241P) и СНА.9.547.13.Н4 (S241P).

6. Способ по любому из пп.1-5, отличающийся тем, что указанное антитело анти-PVRIG представляет собой антитело, выбранное из по меньшей мере одного из следующих антител: СНА7.518.1.Н4 (S241P) и СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P).

Способ по любому из пп.1-6, отличающийся тем, что указанное антитело анти-PD-1 представляет собой антитело, выбранное из по меньшей мере одного из следующих антител: пембролизумаба, цемиплимаба и ниволумаба.

8. Способ по любому из пп.1-7, отличающийся тем, что указанную двухкомпонентную комбинированную терапию выбирают из введения СРА.9.083.Н4 (S241P) и СНА.7.518.1.Н4 (S241P); СРА.9.086.Н4 (S241P) и СНА.7.518.1.Н4 (S241P); СНА.9.547.7.Н4 (S241P) и СНА.7.518.1.Н4 (S241P); СНА.9.547.13.Н4 (S241P) и СНА.7.518.1.Н4 (S241P); СРА.9.083.Н4 (S241P) и СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P); СРА.9.086.Н4 (S241P) и СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P); СНА9.547.7.Н4 (S241P) и СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P); а также СНА.9.547.13.Н4 (S241P) и СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P).

9. Способ по любому из пп.1-8, отличающийся тем, что указанную двухкомпонентную комбинированную терапию выбирают из введения СРА.9.083.Н4 (S241P), пембролизумаба и СНА.7.518.1.Н4 (S241P); СРА.9.086.Н4 (S241P), пембролизумаба и СНА.7.518.1.Н4 (S241P); СНА.9.547.7.Н4 (S241P), пембролизумаба и СНА.7.518.1.Н4 (S241P); СНА.9.547.13.Н4 (S241P), пембролизумаба и СНА.7.518.1.Н4 (S241P); СРА.9.083.Н4 (S241P), пембролизумаба и СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P); СРА.9.086.Н4 (S241P), пембролизумаба и СНА7.538.1.2.Н4 (S241P); СНА.9.547.7.Н4 (S241P), пембролизумаба и СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P); СНА.9.547.13.Н4 (S241P), пембролизумаба и СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P); СРА.9.083.Н4 (S241P), ниволумаба и СНА.7.518.1.Н4 (S241P); СРА.9.086.Н4 (S241P), ниволумаба и СНА7.518.1.Н4 (S241P); СНА.9.547.7.Н4 (S241P), ниволумаба и СНА.7.518.1.Н4 (S241P); СНА.9.547.13.Н4 (S241P), ниволумаба и СНА.7.518.1.Н4 (S241P); СРА.9.083.Н4 (S241P), ниволумаба и СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P); СРА.9.086.Н4 (S241P), ниволумаба и СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P); СНА.9.547.7.Н4 (S241P, ниволумаба и СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P); а также СНА.9.547.13.Н4 (S241P), ниволумаба и СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P).

10. Способ по любому из пп.1-9, отличающийся тем, что указанные антитела вводят одновременно.

11. Способ по любому из пп.1-10, отличающийся тем, что указанные антитела вводят последовательно.

12. Способ по любому из пп.1-11, отличающийся тем, что указанный рак выбирают из группы, состоящей из рака предстательной железы, рака печени (ГЦК), колоректального рака, рака яичника, рака эндометрия, рака молочной железы, трижды негативного рака молочной железы, рака поджелудочной железы, рака желудка (желудочного рака), рака шейки матки, рака головы и шеи, рака щитовидной желе

- 83 044486 зы, рака яичка, уротелиального рака, рак легкого (мелкоклеточного рака легкого, немелкоклеточного рака легкого), меланомы, немеланомного рака кожи (плоскоклеточного и базально-клеточного рака), глиомы, рака почки (ПКК), лимфомы (НХЛ или ХЛ), острого миелоидного лейкоза (ОМЛ), Т-клеточного острого лимфобластного лейкоза (Т-ОЛЛ), диффузной В-крупноклеточной лимфомы, герминогенных опухолей яичка, мезотелиомы, рака пищевода, рака из клеток Меркеля, рака с высоким уровнем MSI, KRAS-мутантных опухолей, Т-клеточного лейкоза/лимфомы взрослых и миелодиспластических синдромов (МДС).

13. Способ по любому из пп.1-12, отличающийся тем, что указанный рак выбирают из группы, состоящей из трижды негативного рака молочной железы, рака желудка (желудочного рака, рака легкого (мелкоклеточного рака легкого, немелкоклеточного рака легкого), а также рака из клеток Меркеля, рака с высоким уровнем MSI, KRAS-мутантных опухолей, Т-клеточного лейкоза/лимфомы взрослых и миелодиспластических синдромов (МДС).

14. Способ лечения рака у пациента, включающий введение трехкомпонентной комбинированной терапии, содержащей антитело анти-TIGIT, антитело анти-PVRIG и антитело αнти-PD-1.

15. Способ по п.14, отличающийся тем, что указанное антитело анти-TIGIT представляет собой антитело, выбранное из по меньшей мере одного из следующих антител: СРА.9.083.Н4 (S241P), СРА.9.086.Н4 (S241P), СНА.9.547.7.Н4 (S241P) и CHA.9.547.13.H4 (S241P).

16. Способ по п.14 или 15, отличающийся тем, что указанное антитело анти-PVRIG представляет собой антитело, выбранное из по меньшей мере одного из следующих антител: СНА7.518.1.Н4 (S241P) и СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P).

17. Способ по любому из пп.14, 15 или 16, отличающийся тем, что указанное антитело анти-PD-1 представляет собой антитело, выбранное из группы, состоящей из пембролизумаба и ниволумаба.

18. Способ по любому из пп.14-17, отличающийся тем, что указанная трехкомпонентная комбинированная терапия включает введение антитела анти-PD-1 в комбинации с двухкомпонентной комбинированной терапией, выбранной из введения СРА.9.083.Н4 (S241P) и СНА.7.518.1.Н4 (S241P); СРА.9.086.Н4 (S241P) и СНА.7.518.1.Н4 (S241P); СНА.9.547.7.Н4 (S241P) и СНА.7.518.1.Н4 (S241P); СНА.9.547.13.Н4 (S241P) и СНА.7.518.1.Н4 (S241P); СРА.9.083.Н4 (S241P) и СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P); СРА.9.086.Н4 (S241P) и СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P); СНА.9.547.7.Н4 (S241P) и СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P); а также СНА.9.547.13.Н4 (S241P) и CHA.7.538.1.2.H4 (S241P).

19. Способ по любому из пп.14-18, отличающийся тем, что указанную трехкомпонентную комбинированную терапию выбирают из введения СРА.9.083.Н4 (S241P), пембролизумаба и СНА.7.518.1.Н4 (S241P); СРА.9.086.Н4 (S241P), пембролизумаба и СНА.7.518.1.Н4 (S241P); СНА.9.547.7.Н4 (S241P), пембролизумаба и СНА.7.518.1.Н4 (S241P); СНА.9.547.13.Н4 (S241P), пембролизумаба и СНА.7.518.1.Н4 (S241P); СРА.9.083.Н4 (S241P), пембролизумаба и СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P); СРА.9.086.Н4 (S241P), пембролизумаба и СНА7.538.1.2.Н4 (S241P); СНА.9.547.7.Н4 (S241P), пембролизумаба и СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P); СНА9.547.13.Н4 (S241P), пембролизумаба и СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P); СРА.9.083.Н4 (S241P), ниволумаба и СНА.7.518.1.Н4 (S241P); СРА.9.086.Н4 (S241P), ниволумаба и СНА7.518.1.Н4 (S241P); СНА.9.547.7.Н4 (S241P), ниволумаба и СНА.7.518.1.Н4 (S241P); СНА.9.547.13.Н4 (S241P), ниволумаба и СНА.7.518.1.Н4 (S241P); СРА.9.083.Н4 (S241P), ниволумаба и СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P); СРА.9.086.Н4 (S241P), ниволумаба и СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P); СНА.9.547.7.Н4 (S241P, ниволумаба и СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P); СНА.9.547.13.Н4 (S241P), ниволумаба и СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P); СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P); СРА.9.083.Н4 (S241P), цемиплимаба и СНА.7.518.1.Н4 (S241P); СРА.9.086.Н4 (S241P), цемиплимаба и СНА.7.518.1.Н4 (S241P); СНА.9.547.7.Н4 (S241P), цемиплимаба и СНА.7.518.1.Н4 (S241P); СНА.9.547.13.Н4 (S241P), цемиплимаба и

СНА.7.518.1.Н4 (S241P); СРА.9.083.Н4 (S241P), цемиплимаба и СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P); СРА.9.086.Н4 (S241P), цемиплимаба и СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P); СНА.9.547.7.Н4 (S241P), цемиплимаба и

СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P); а также СНА.9.547.13.Н4 (S241P), цемиплимаба и СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P).

20. Способ по любому из пп.14-19, отличающийся тем, что указанные антитела вводят одновременно.

21. Способ по любому из пп.14-20, отличающийся тем, что указанные антитела вводят последовательно.

22. Способ по любому из пп.14-21, отличающийся тем, что указанный рак выбирают из группы, состоящей из рака предстательной железы, рака печени (ГЦК), колоректального рака, рака яичника, рака эндометрия, рака молочной железы, трижды негативного рака молочной железы, рака поджелудочной железы, рака желудка (желудочного рака), рака шейки матки, рака головы и шеи, рака щитовидной железы, рака яичка, уротелиального рака, рак легкого (мелкоклеточного рака легкого, немелкоклеточного рака легкого), меланомы, немеланомного рака кожи (плоскоклеточного и базально-клеточного рака), глиомы, рака почки (ПКК), лимфомы (НХЛ или ХЛ), острого миелоидного лейкоза (ОМЛ), Т-клеточного острого лимфобластного лейкоза (Т-ОЛЛ), диффузной В-крупноклеточной лимфомы, герминогенных опухолей яичка, мезотелиомы, рака пищевода, рака из клеток Меркеля, рака с высоким уровнем MSI, KRAS-мутантных опухолей, Т-клеточного лейкоза/лимфомы взрослых и миелодиспластических синдромов (МДС).

- 84 044486

23. Способ по любому из пп.14-22, отличающийся тем, что указанный рак выбирают из группы, состоящей из трижды негативного рака молочной железы, рака желудка (желудочного рака, рака легкого (мелкоклеточного рака легкого, немелкоклеточного рака легкого), а также рака из клеток Меркеля, рака с высоким уровнем MSI, KRAS-мутантных опухолей, Т-клеточного лейкоза/лимфомы взрослых и миелодиспластических синдромов (МДС).

24. Набор фармацевтических доз, содержащий:

a) контейнер, содержащий стандартную дозу антитела анти-TIGIT; а также

b) контейнер, содержащий стандартную дозу антитела анти-PVRIG.

25. Набор фармацевтических доз, содержащий:

a) контейнер, содержащий стандартную дозу антитела анти-TIGIT;

b) контейнер, содержащий стандартную дозу антитела анти-PVRIG; а также

c) контейнер, содержащий антитело αнтu-PD-1.

26. Способ по п.24 или 25, отличающийся тем, что указанное антитело анти-TIGIT представляет собой антитело, выбранное из любого антитела анти-TIGIT, описанного в данном документе, включая любое из антител, описанных на фиг. 3.

27. Способ по п.24 или 25, отличающийся тем, что указанное антитело анти-PVRIG представляет собой антитело, выбранное из любого антитела анти-PVRIG, описанного в данном документе, включая любое из антител, описанных на фиг. 5 и/или на фиг. 63.

28. Способ по п.24 или 25, отличающийся тем, что указанное антитело анти-PD-1 представляет собой антитело, выбранное из любого антитела анти-PD-1, описанного в данном документе, включая любое из антител, описанных на фиг. 7.

29. Способ, включающий:

a) получение популяции клеток из образца опухоли от пациента;

b) окрашивание указанной популяции мечеными антителами, которые связывают:

i) белок TIGIT;

ii) белок PVRIG;

iii) белок PVR;

iv) белок PD-1;

v) белок PD-L1;

vi) PVRL2; а также vii) соответствующий изотипический контроль для антител в i)-vi);

c) проведение сортировки флуоресцентно-активированных клеток (FACS);

d) для каждого из TIGIT, PVRIG, PVR, PD-1, PVRL2 и PD-L1, определение процента клеток в указанной популяции, которые экспрессируют белок, относительно указанного антитела изотипического контроля;

при этом, если процент положительных клеток составляет > 1% для TIGIT или PVR, и для PVRIG или PVRL2, а также для PD-1 или PD-L1, переход к этапу е); а также е) введение антител к TIGIT, PVRIG и PD-1 указанному пациенту.

30. Способ по п.27, отличающийся тем, что указанное антитело анти-TIGIT представляет собой антитело, выбранное из любого антитела анти-TIGIT, описанного в данном документе, включая любое из антител, описанных на фиг. 3.

31. Способ по п.27, отличающийся тем, что указанное антитело анти-PVRIG представляет собой антитело, выбранное из любого антитела анти-PVRIG, описанного в данном документе, включая любое из антител, описанных на фиг. 5 и/или на фиг. 63.

32. Способ по п.27, отличающийся тем, что указанное антитело анти-PD-1 представляет собой антитело, выбранное из любого антитела анти-PD-1, описанного в данном документе, включая любое из антител, описанных на фиг. 7.

33. Способ по пп.29, 31 или 32, отличающийся тем, что указанное антитело к TIGIT представляет собой СРА.9.086.

34. Способ по пп.29, 30 или 31, отличающийся тем, что указанное антитело к PD-1 выбирают из пембролизумаба, цемлиплимаба и ниволумаба.

35. Способ по п.29, 30 или 32, отличающийся тем, что указанное антитело к PVRIG представляет собой СНА.7.518.1.Н4 (S241P).

36. Способ лечения рака у пациента, включающий:

c) если указанное количество PD-L1-положительных опухолевых клеток или иммунных клеток превышает 1% по сравнению с теми же опухолевыми клетками, окрашенными антителом, соответствующим антителу изотипического контроля, для применяемых антител, введение трехкомпонентной комбинированной терапии, включающей антитело анти-TIGIT антитело анти-PVRIG и антитело αнтu-PD-L1; а также

- 85 044486

d) если указанное количество PD-Ll-положительных опухолевых клеток или иммунных клеток менее 1% по сравнению с теми же опухолевыми клетками, окрашенными антителом, соответствующим антителу изотипического контроля, для применяемых антител, введение двухкомпонентной комбинированной терапии, включающей антитело анти-TIGIT и антитело анти-PVRIG.

37. Способ по п.36, отличающийся тем, что указанное антитело анти-TIGIT представляет собой антитело, выбранное из любого антитела анти-TIGIT, описанного в данном документе, включая любое из антител, описанных на фиг. 3.

38. Способ по п.36, отличающийся тем, что указанное антитело анти-PVRIG представляет собой антитело, выбранное из любого антитела анти-PVRIG, описанного в данном документе, включая любое из антител, описанных на фиг. 5 и/или на фиг. 63.

39. Способ по п.36, отличающийся тем, что указанное антитело анти-PD-1 представляет собой антитело, выбранное из любого антитела анти-PD-L1, описанного в данном документе, включая любое из антител, описанных на фиг. 62.

40. Способ по любому из пп.36-39, отличающийся тем, что указанное антитело анти-TIGIT представляет собой антитело, выбранное из по меньшей мере одного из следующих антител: СРА.9.083.Н4 (S241P), СРА.9.086.Н4 (S241P), СНА.9.547.7.Н4 (S241P) и СНА.9.547.13.Н4 (S241P).

41. Способ по любому из пп.36-39, отличающийся тем, что указанное антитело анти-PVRIG представляет собой антитело, выбранное из по меньшей мере одного из следующих антител: СНА.7.518.1.Н4 (S241P) и СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P).

42. Способ по любому из пп.36-41, отличающийся тем, что указанное антитело анти-PD-L1 представляет собой антитело, выбранное из по меньшей мере одного из следующих антител: атезолизумаба, авелумаба и дурвалумаба.

43. Способ по любому из пп.36-42, отличающийся тем, что указанную двухкомпонентную комбинированную терапию выбирают из введения СРА.9.083.Н4 (S241P) и СНА.7.518.1.Н4 (S241P); СРА.9.086.Н4 (S241P) и СНА.7.518.1.Н4 (S241P); СНА.9.547.7.Н4 (S241P) и СНА.7.518.1.Н4 (S241P); СНА.9.547.13.Н4 (S241P) и СНА.7.518.1.Н4 (S241P); СРА.9.083.Н4 (S241P) и СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P); СРА.9.086.Н4 (S241P) и СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P); СНА.9.547.7.Н4 (S241P) и СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P); а также СНА.9.547.13.Н4 (S241P) и CHA.7.538.1.2.H4 (S241P).

44. Способ по любому из пп.36-43, отличающийся тем, что указанную трехкомпонентную комбинированную терапию выбирают из введения СРА.9.083.Н4 (S241P), атезолизумаба и СНА.7.518.1.Н4 (S241P); СРА.9.086.Н4 (S241P), атезолизумаба и СНА.7.518.1.Н4 (S241P); СНА.9.547.7.Н4 (S241P), атезолизумаба и СНА.7.518.1.н4 (S241P); СНА.9.547.13.Н4 (S241P), атезолизумаба и СНА.7.518.1.Н4 (S241P); СРА.9.083.Н4 (S241P), атезолизумаба и СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P); СРА.9.086.Н4 (S241P), атезолизумаба и СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P); СНА.9.547.7.Н4 (S241P), атезолизумаба и СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P); СНА.9.547.13.Н4 (S241P), атезолизумаба и СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P); СРА.9.083.Н4 (S241P), авелумаба и СНА.7.518.1.Н4 (S241P); СРА.9.086.Н4 (S241P), авелумаба и СНА.7.518.1.Н4 (S241P); СНА9.547.7.Н4 (S241P), авелумаба и СНА.7.518.1.Н4 (S241P); СНА.9.547.13.Н4 (S241P), авелумаба и СНА.7.518.1.Н4 (S241P); СРА.9.083.Н4 (S241P), авелумаба и СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P); СРА.9.086.Н4 (S241P), авелумаба и СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P); СНА.9.547.7.Н4 (S241P, авелумаба и СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P); СНА.9.547.13.Н4 (S241P), авелумаба и СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P); СНА7.538.1.2.Н4 (S241P); СРА.9.083.Н4 (S241P), дурвалумаба и СНА.7.518.1.Н4 (S241P); СРА.9.086.Н4 (S241P), дурвалумаба и СНА.7.518.1.Н4 (S241P); СНА.9.547.7.Н4 (S241P), дурвалумаба и СНА.7.518.1.Н4 (S241P); СНА.9.547.13.Н4 (S241P), дурвалумаба и СНА.7.518.1.Н4 (S241P); СРА.9.083.Н4 (S241P), дурвалумаба и СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P); СРА.9.086.Н4 (S241P), дурвалумаба и СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P); СНА.9.547.7.Н4 (S241P), дурвалумаба и СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P); а также СНА.9.547.13.Н4 (S241P), дурвалумаба и СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P).

45. Способ по любому из пп.36-44, отличающийся тем, что указанные антитела вводят одновременно.

46. Способ по любому из пп.36-45, отличающийся тем, что указанные антитела вводят последовательно.

47. Способ по любому из пп.36-46, отличающийся тем, что указанный рак выбирают из группы, состоящей из рака предстательной железы, рака печени (ГЦК), колоректального рака, рака яичника, рака эндометрия, рака молочной железы, трижды негативного рака молочной железы, рака поджелудочной железы, рака желудка (желудочного рака), рака шейки матки, рака головы и шеи, рака щитовидной железы, рака яичка, уротелиального рака, рак легкого (мелкоклеточного рака легкого, немелкоклеточного рака легкого), меланомы, немеланомного рака кожи (плоскоклеточного и базально-клеточного рака), глиомы, рака почки (ПКК), лимфомы (НХЛ или ХЛ), острого миелоидного лейкоза (ОМЛ), Т-клеточного острого лимфобластного лейкоза (Т-ОЛЛ), диффузной В-крупноклеточной лимфомы, герминогенных опухолей яичка, мезотелиомы, рака пищевода, рака из клеток Меркеля, рака с высоким уровнем MSI, KRAS-мутантных опухолей, Т-клеточного лейкоза/лимфомы взрослых и миелодиспластических синдромов (МДС).

48. Способ по любому из пп.36-47, отличающийся тем, что указанный рак выбирают из группы, со

- 86 044486 стоящей из трижды негативного рака молочной железы, рака желудка (желудочного рака, рака легкого (мелкоклеточного рака легкого, немелкоклеточного рака легкого), а также рака из клеток Меркеля, рака с высоким уровнем MSI, KRAS-мутантных опухолей, Т-клеточного лейкоза/лимфомы взрослых и миелодиспластических синдромов (МДС).

49. Способ лечения рака у пациента, включающий введение трехкомпонентной комбинированной терапии, содержащей антитело анти-TIGIT, антитело анти-PVRIG и антитело αнтu-PD-L1.

50. Способ по п.49, отличающийся тем, что указанное антитело анти-TIGIT представляет собой антитело, выбранное из по меньшей мере одного из следующих антител: СРА.9.083.Н4 (S241P), СРА.9.086.Н4 (S241P), СНА.9.547.7.Н4 (S241P) и CHA.9.547.13.H4 (S241P).

51. Способ по п.49 или по 50, отличающийся тем, что указанное антитело анти-PVRIG представляет собой антитело, выбранное из по меньшей мере одного из следующих антител: СНА.7.518.1.Н4 (S241P) и СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P).

52. Способ по любому из пп.49, 50 или 51, отличающийся тем, что указанное антитело анти-PD-L1 представляет собой антитело, выбранное из группы, состоящей из атезолизумаба, авелумаба и дурвалумаба.

53. Способ по любому из пп.49 - 52, отличающийся тем, что указанная трехкомпонентная комбинированная терапия включает введение антитела анти-PD-L1 в комбинации с двухкомпонентной комбинированной терапией, выбранной из введения СРА.9.083.Н4 (S241P) и СНА.7.518.1.Н4 (S241P); СРА.9.086.Н4 (S241P) и СНА.7.518.1.Н4 (S241P); СНА.9.547.7.Н4 (S241P) и СНА.7.518.1.Н4 (S241P); СНА.9.547.13.Н4 (S241P) и СНА.7.518.1.Н4 (S241P); СРА.9.083.Н4 (S241P) и СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P); СРА.9.086.Н4 (S241P) и СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P); СНА.9.547.7.Н4 (S241P) и СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P); а также СНА.9.547.13.Н4 (S241P) и CHA.7.538.1.2.H4 (S241P).

54. Способ по любому из пп.49-53, отличающийся тем, что указанную трехкомпонентную комбинированную терапию выбирают из введения СРА.9.083.Н4 (S241P), атезолизумаба и СНА.7.518.1.Н4 (S241P); СРА.9.086.Н4 (S241P), атезолизумаба и СНА.7.518.1.Н4 (S241P); СНА.9.547.7.Н4 (S241P), атезолизумаба и СНА.7.518.1.Н4 (S241P); СНА.9.547.13.Н4 (S241P), атезолизумаба и СНА.7.518.1.Н4 (S241P); СРА.9.083.Н4 (S241P), атезолизумаба и СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P); СРА.9.086.Н4 (S241P), атезолизумаба и СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P); СНА.9.547.7.Н4 (S241P), атезолизумаба и СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P); СНА.9.547.13.Н4 (S241P), атезолизумаба и СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P); СРА.9.083.Н4 (S241P), авелумаба и СНА.7.518.1.Н4 (S241P); СРА.9.086.Н4 (S241P), авелумаба и СНА.7.518.1.Н4 (S241P); СНА.9.547.7.Н4 (S241P), авелумаба и СНА.7.518.1.Н4 (S241P); СНА.9.547.13.Н4 (S241P), авелумаба и СНА.7.518.1.Н4 (S241P); СРА.9.083.Н4 (S241P), авелумаба и СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P); СРА.9.086.Н4 (S241P), авелумаба и СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P); СНА.9.547.7.Н4 (S241P, авелумаба и СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P); СНА.9.547.13.Н4 (S241P), авелумаба и СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P); СНА7.538.1.2.Н4 (S241P); СРА.9.083.Н4 (S241P), дурвалумаба и СНА.7.518.1.Н4 (S241P); СРА.9.086.Н4 (S241P), дурвалумаба и СНА.7.518.1.Н4 (S241P); СНА.9.547.7.Н4 (S241P), дурвалумаба и СНА.7.518.1.Н4 (S241P); СНА.9.547.13.Н4 (S241P), дурвалумаба и СНА.7.518.1.Н4 (S241P); СРА.9.083.Н4 (S241P), дурвалумаба и СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P); СРА.9.086.Н4 (S241P), дурвалумаба и СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P); СНА.9.547.7.Н4 (S241P), дурвалумаба и СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P); а также СНА.9.547.13.Н4 (S241P), дурвалумаба и СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P).

55. Способ по любому из пп.49-54, отличающийся тем, что указанные антитела вводят одновременно.

56. Способ по любому из пп.49-54, отличающийся тем, что указанные антитела вводят последовательно.

57. Способ по любому из пп.49-56, отличающийся тем, что указанный рак выбирают из группы, состоящей из рака предстательной железы, рака печени (ГЦК), колоректального рака, рака яичника, рака эндометрия, рака молочной железы, трижды негативного рака молочной железы, рака поджелудочной железы, рака желудка (желудочного рака), рака шейки матки, рака головы и шеи, рака щитовидной железы, рака яичка, уротелиального рака, рак легкого (мелкоклеточного рака легкого, немелкоклеточного рака легкого), меланомы, немеланомного рака кожи (плоскоклеточного и базально-клеточного рака), глиомы, рака почки (ПКК), лимфомы (НХЛ или ХЛ), острого миелоидного лейкоза (ОМЛ), Т-клеточного острого лимфобластного лейкоза (Т-ОЛЛ), диффузной В-крупноклеточной лимфомы, герминогенных опухолей яичка, мезотелиомы, рака пищевода, рака из клеток Меркеля, рака с высоким уровнем MSI, KRAS-мутантных опухолей, Т-клеточного лейкоза/лимфомы взрослых и миелодиспластических синдромов (МДС).

58. Способ по любому из пп.49-57, отличающийся тем, что указанный рак выбирают из группы, состоящей из трижды негативного рака молочной железы, рака желудка (желудочного рака, рака легкого (мелкоклеточного рака легкого, немелкоклеточного рака легкого), а также рака из клеток Меркеля, рака с высоким уровнем MSI, KRAS-мутантных опухолей, Т-клеточного лейкоза/лимфомы взрослых и миелодиспластических синдромов (МДС).

- 87 044486

Примеры

Пример 1: функциональные тесты.

Цель этого исследования состояла в том, чтобы охарактеризовать функциональную активность СНА.7.518.1.Н4 (S241P) в отношении функции Т-клеток человека, либо отдельно, либо в комбинации с антителом анти-TIGIT и/или анти-PD-1 в первичных клеточных анализах in vitro. Авторы изобретения продемонстрировали, что СНА.7.518.1.Н4 (S241P) усиливает продукцию цитокинов вирусными антигенспецифическими CD8 Т-клетками, используемыми в качестве модельного суррогатного антигена для изучения ответов CD8 Т-клеток. Комбинация СНА.7.518.1.Н4 (S241P) с антителом анти-TIGIT приводит к дополнительному или, при некоторых условиях, синергетическому повышению функции Т-клеток. Авторы изобретения применяли трехкомпонентную комбинацию СНА.7.518.1.Н4 (S241P), анти-TIGIT и анти-PD-1 и наблюдали наибольшее увеличение функции Т-клеток, совместно культивированных с опухолевыми клетками-мишенями PD-L1выс, при применении трехкомпонентной комбинации CHA.7.518.1.H4 (S241P) по сравнению с двухкомпонентной комбинацией или отдельным антителом. В совместной культуре с опухолевыми клетками-мишенями PD-L1hu3k трехкомпонентная комбинация СНА.7.518.1.Н4 (S241P), анти-TIGIT, анти-PD-1 дополнительно не усиливала функцию Т-клеток по сравнению с двухкомпонентной комбинацией CHA.7.518.1.H4 (S241P) и анти-TIGIT, наталкивая на предположение о том, что лечение с применением СНА.7.518.1.Н4 (S241P) и анти-TIGIT может быть эффективным у пациентов с низкой или отрицательной экспрессией PD-L1. В совокупности, авторы продемонстрировали эффект СНА.7.518.1.Н4 (S241P) относительно усиления функции CD8+ Т-клеток человека, отдельно или в комбинации с анти-TIGIT или анти-PD-1.

В этом сообщении описывается характеристика СНА.7.518.1.Н4 (S241P), полностью гуманизированного антитела IgG4 анти-PVRIG, в клеточных анализах. СНА.7.518.1.Н4 (S241P) связывается с PVRIG с высокой аффинностью и специфичностью и блокирует взаимодействие PVRIG с PVRL2. Чтобы понять влияние СНА.7.518.1.Н4 (S241P) на функцию Т-клеток, авторы исследовали влияние СНА.7.518.1.Н4 (S241P) на продукцию цитокинов в анализе in vitro. Этот анализ был разработан на основе 2-сигнальной гипотезы активации Т-клеток: сигнал 1 исходит от активации рецептора Т-клеток; сигналом 2 являются иммуномодулирующие рецепторы, которые помогают усиливать или ингибировать ответы Т-клеток. Конструкция этих анализов состоит из совместного культивирования Т-клеток человека с линией клетокмишеней, в которую вводили антигенный пептидом, полученный из вирусного антигена (CMV). Этот сигнал обеспечивает сигнал 1 активации Т-клеток через рецептор Т-клеток. Эти линии клеток-мишеней экспрессируют эндогенный PVRL2, и в этом контексте PVRL2 обеспечивает сигнал 2 для Т-клетки.

CMV: анализ линии опухолевых клеток.

CMVpp65-реактивные Т-клетки размножали путем оттаивания CMV-реактивных донорных клеток в соответствии с протоколом CTL Оттаивание криоконсервированных МКПК, и 2е6 клеток/мл ресуспендировали в среде (Gibco) с добавлением 1% глутамакса (Gibco), 1% NEAA, пенициллина/стрептомицин (Gibco), 10% человеческой сыворотки АВ (Corning), 1 мкг/мл пептида CMV, 2 нг/мл IL2 (R&D) и 10 нг/мл IL-7 (R&D). МКПК культивировали в течение восьми дней с добавлением IL-2 и IL-7 - на третий и шестой день. В день 8 клетки собирали и реплицировали в низкой дозе IL-2 (100 Ед/мл) при 2е6/мл в полной среде RPMI в течение 5 дней. В девятый день клетки фенотипировали на предмет чистоты CD8+ Т-клеток и реакционной способности тетрамера CMV. Клетки окрашивали 0,25 мкл CD3 (клон: ОКТ)-аллофикоцианина семь (АРС-Су7; Biolegend), 0,25 мкл CD8 (клон: H1T8a)-Alexafluor 488 (AF488; Biolegend), 0,125 мкл CD14 (клон: HCD14), 0,5 мкл CD19 (клон: HIBCD14), 0,5 мкл CD56 (клон: HCD56)перидинин-хлорофиллового белка (PerCP; Biolegend), 1,25 мкл TIGIT (клон: MBSA43)-аллофикоцианина (АРС; е-Bioscience) или 1,25 мкл изотипического контроля IgG4 (внутрилабораторный) (АРС: Biolegend), 1,25 мкл СНА.7.518.1.Н4 (S241Р)-аллофикоцианина (внутрилабораторный) или 1,25 мкл изотипического контроля IgG4-APC (внутрилабораторный) и 0,5 мкл PD-1 (клон: ЕН12.2Н7)-бриллиантового фиолетового 421 (BV421; Biolegend) или 1,25 мкл IgG1 (клон: МОРС21)-бриллиантового фиолетового 421 (BV421; Biolegend). Для того, чтобы оценить количество тетрамер-реактивных CD8+ T - клеток, немеченые МКПК окрашивали после культивирования) с 10 мкл iTAg тетрамер-HLA-A*02:01 CMV рр65 (NLVPMVATV)-фикоэритрина (РЕ, MBL-BION) в течение 30 мин при комнатной температуре. Клетки промывали растовором PBS/BSA/азида и ресуспендировали в буфере). Данные получали с помощью Fortessa и анализировали с применением программ FlowJo (Treestar) и Prism (Graphpad).

Клетками-мишенями, применяемыми в анализе совместного культивирования, были клеточные линии Panc.05.4 и Colo205 (ATCC). Эти клеточные линии окрашивали 1,25 мкл PVR (SKII.4)-фикоэритрина (РЕ, Biolegend), 1,25 мкл PVRL2 (ТХ31)-перидинин-хлорофиллового белка (PerCP5,5; Biolegend), 2,5 мкл PD-L1 (29E.2A3)-бриллиантового фиолетового 785 (BV785; Biolegend) и 1,25 мкл HLA-A2 (ВВ7.2)аллофикоцианина (АРС; Biolegend). Также оценивали 1,25 мкл соответствующего изотипа для каждого флуорофора (МОРС-21).

Для проведения совместного культивирования опухолевые клеточные линии собирали из культуры, и в опухолевые клеточные линии вводиди пептид CMV (Anaspec) в течение 1 ч при 37°C с периодическим перемешиванием. После инкубации клетки-мишени тщательно промывали, подсчитывали и ресуспендировали в полной среде RPMI. Анализы проводили с соотношением Т-клеток (100000) к клеткам

- 88 044486 мишеням (100000) 1:1. Клетки-мишени, Т-клетки и 10 мкг/мл каждого антитела совместно добавляли на 96-луночный планшет с U-образным дном лунок (Costar) и инкубировали в течение 24 ч при 37°C. Обработки антителами включали СНА.7.518.1.Н4 (S241P) hIgG4, анти-TIGIT hIgG4 (Эталон 26, Compugen), анти-PD-1 hIgG4 (Эталон 3, Compugen) и изотипический контроль IgG4 человека (Compugen). С целью соответствия общей концентрации антител во всех отдельных и комбинированных группах, добавляли дополнительный изотипический контроль IgG4 человека в одиночную или двойную комбинацию до конечной общей концентрации антител 30 мкг/мл. После 24-часового периода инкубации супернатанты совместного культивирования анализировали на секретируемые цитокины, включая IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10, IL-13, IL-17A, IL -17F, IL-21, IL-22, TNF-α и/или IFN-γ, с помощью набора для цитометрического определения цитокинов человека Thl/Th2/Th17 с применением матрицы микросфер (СВА) (BD Biosciences) или с помощью набора для цитометрического определения цитокинов Th человека LEGENDplex™ (BioLegend). Данные получали с помощью Fortessa и анализировали с применением программ FlowJo (Treestar) и Prism (Graphpad).

1. Результаты и обсуждение.

а. Анализ CMV Т-клеток: CMVpp65 реактивные Т-клетки экспрессируют PVRIG, TIGIT и PD1.

Цитомегаловирус (CMV) человека - это широко распространенный персистирующий Ргерпесвирус, который поражает большой процент населения, с несколько меньшей серопревалентностью в Западной Европе и США (Cannon MJ et al. 2010). Иммунная система пациентов с хроническими вирусными инфекциями или раком часто функционально нарушается и не в состоянии обеспечить эффективный ответ против вируса или распознать и элиминировать злокачественные клетки. У этих пациентов увеличивается экспрессия ингибирующих рецепторов, и было обнаружено, что это ассоциировано с дисфункцией Т-клеток. Таким образом, активация негативных контрольных точек рецепторов может служить потенциальной мишенью для обратного развития истощения Т-клеток. CD8 Т-клетки, специфичные к белку CMV рр65, были хорошо охарактеризованы, и эти CMV-специфические Т-клетки можно применять для изучения роли модуляторных рецепторов на Т-клетках.

Стимуляция HLA-A2 + донорных МКПК с применением пептида CMV pp65, IL-2 и IL-7 приводила к сильному размножению CMV рр65-специфичных Т-клеток до степени чистоты в диапазоне от 50 до 90%, что определяется окрашиванием с применением тетрамера. На фиг. 8 А продемонстрирован процент CMV рр65-специфических Т-клеток от нескольких доноров после размножения. Поверхностную экспрессию PVRIG, TIGIT и PD-1 на Т-клетках оценивали от CMV+ доноров и сравнивали с соответствующим изотипом для экспрессии рецептора с помощью проточной цитометрии. CMV рр65специфичные Т-клетки экспрессировали PVRIG (медиана отношения gMFI: 7), TIGIT (медиана отношения gMFI: 37) и PD1 (медиана отношения gMFI: 2) на день 9 активации (на фиг. 8В).

Кроме того, авторы оценили кинетику экспрессии PVRIG, TIGIT и PD1 относительно размножения CMV рр65-специфичных Т-клеток с течением времени. Для каждого донора количество CMVpp65реактивных CD8+ Т-клеток наносили на график с течением времени (на фиг. 9А). Значимое увеличение количества CMVpp65-реактивных Т-клеток (диапазон: 50-97%) наблюдали у всех доноров, причем у донора 198 отмечалась первоначальное размножение на третий день (День 3 CMV + процент: 85,7%). Тем не менее, донор 198 характеризовался потерей экспрессии тетрамера CMV в день 6 (День 6 CMV + процент: 50,4%). Экспрессию PVRIG, TIGIT и PD-1 на CMV-специфичных CD8+ T - клетках оценивали с помощью проточной цитометрии в течение курса, составляющего двенадцать дней. У донора 4, донора 198 и донора 210 экспрессия TIGIT среди CMVpp65-специфичных CD8+ Т-клеток увеличивалась в течение двенадцатидневного периода размножения (среднее размножение gMFIr у трех доноров, экспрессия TIGIT у трех доноров, День 0 gMFIr: 1,2, День 12 gMFIr: 47) (на фиг. 9В). Экспрессия PVRIG на CMV+ Т-клетках также увеличивалась (среднее значение gMFI PVRIG для трех доноров, День 0 gMFIr: 0,92, День 12 gMFIr: 8,6) (фиг. 6С). Также оценивали экспрессию gMFI PVRIG, при этом авторы наблюдали минимальную индукцию экспрессии (среднее gMFIr PD-1, День 0 gMFI: 0,93, День 12 gMFI: 2) (на фиг. 9С).

b. Антитела СНА.7.518.1.Н4 (S241P), анти-TIGIT и анти-PD1 усиливали секрецию IFN-γ.

С учетом того, что усиление экспрессии TIGIT, PVRIG и PD-1 клетками CD8 CMV коррелирует с дисфункцией Т-клеток, авторы задались целью оценить влияние блокады PVRIG, TIGIT и PD-1 на способность продукции противовоспалительных цитокинов. CMVpp65-реактивные T-клетки от 2 доноров культивировали совместно с опухолевыми клеточными линиями PD-L1выс (Panc04.05) и PD-L1hu3k (Colo205), нагружеными CMV пептидом, перед анализом с помощью проточной цитометрии для оценки продукции цитокинов (на фиг. 10).

В совместной культуре Panc.04.05 (PD-L1выс) авторы наблюдали, что одиночная блокада антиTIGIT увеличивала продукцию IFN-γ по сравнению с контрольными mAb IgG, тогда как СНА.7.518.1.Н4 (S241P) или анти-PD-1 имели минимальный эффект (на фиг. 11). Двойная блокада с применением антиTIGIT и СНА.7.518.1.Н4 (S241P) синергетически и последовательно увеличивала продукцию цитокинов CD8+ Т-клетками по сравнению с блокадой с применением СНА.7.518.1.Н4 (S241P) или одного только анти-TIGIT. У донора 4, дополнительное увеличение продукции IFN-γ наблюдалось при применении

- 89 044486 трехкомпонентной комбинации СНА.7.518.1.Н4 (S241P), анти-TIGIT и αнтu-PD-1, что указывает на то, что когда PD-L1, PVR и PVRL2 экспрессируются в высоких уровнях на опухолевых клетках, наибольшее увеличение активации Т-клеток достигается при применении трехкомпонентной комбинации. В совместных культурах Colo205 (PD-L1hu3k) блокада с применением только анти-TIGIT увеличивала секрецию IFN-γ, тогда как СНА.7.518.1.Н4 (S241P) или антитело анти-PD1 оказывали минимальный эффект, аналогично результатам, полученным с совместной культурой Panc.04.05. Также подобно совместной культуре Panc.04.05, двойная блокада с применением анти-TIGIT и СНА.7.518.1.Н4 (S241P) также синергически увеличивала продукцию IFN-γ по сравнению с анти-TIGIT, анти-PD-1 или CHA.7.518.1.H4 (S241P), применяемыми отдельно, и с большей силой при примененени либо СНА.7.518.1.Н4 (S241P), либо антиTIGIT в комбинации с αнтu-PD-1. В отличие от Panc.04.05 (PD-L1hi), состояние трехкомпонентной комбинации для донора 4 было не лучше, чем двухкомпонентная комбинация СНА.7.518.1.Н4 (S241P) и анти-TIGIT в совместной культуре Colo205 (PD-Ынизк), наталкивая на предположение о том, что когда PVR и PVRL2 экспрессируются на опухолевых клетках в высоких уровнях, a PD-L1 экспрессируется в низких уровнях, двухкомпонентная комбинация СНА.7.518.1.Н4 (S241P) и анти-TIGIT приводит к наибольшему увеличению экспрессии IFN-γ. Эти результаты демонстрируют, что блокада TIGIT и PVRIG была достаточной для усиления ответов CD8+ Т-клеток в опухолях PD-L1^hu3k, и что трехкомпонентная комбинация приводила к наибольшему увеличению активации Т-клеток в опухолях PD-L1^b“^c.

с. Резюме.

Ответы анти-CMV Т-клеток человека используются в качестве антигенспецифического метода in vitro для оценки функциональной способности антитела-ингибитора контрольной точки. Авторы наблюдали, что совместная блокада TIGIT и СНА.7.518.1.Н4 (S241P) приводит к большему восстанавлению функции Т-клеток по сравнению с блокадой одним антителом, наталкивая на предположение о том, что нарушение пути TIGIT и PVRIG может быть более важным, чем нарушение пути PD1 в CD8-опухолевых клеточных культурах. Кроме того, авторы наблюдали, что тройная блокада с применением антител к PD1, TIGIT и PVRIG может привести к наибольшему увеличению продукции IFN-γ, когда PD-L1положительные опухолевые клетки или иммунные клетки составляют > 1%, что эквивалентно высоким уровням экспрессии PD-L1. Эти результаты демонстрируют, что блокада TIGIT и PVRIG была достаточной для усиления ответов CD8+ Т-клеток в опухолях PD-L1hu3k, и что трехкомпонентная комбинация приводила к наибольшему увеличению активации Т-клеток в опухолях PD-L1выс.

В данном изобретении предлагаются способы, включающие: а) получение популяции клеток из образца опухоли от пациента; b) окрашивание указанной популяции мечеными антителами, которые связывают: i) белок TIGIT; ii) белок PVRIG; iii) белок PVR; iv) белок PD-1; v) белок PD-L1; vi) PVRL2; и vii) соответствующий изотипический контроль для антител в i)-vi); с) проведение сортировки клеток с активированной флуоресценцией (FACS); d) для каждого из TIGIT, PVRIG, PVR, PD-1, PVRL2 и PD-L1, определение процента клеток в указанной популяции, которые экспрессируют белок относительно указанного антитела изотипического контроля; при этом, если процент положительных клеток составляет > 1% для TIGIT или PVR, и для PVRIG или PVRL2, а также для PD-1 или PD-L1, переход к этапу е); и е) введение антител к TIGIT, PVRIG и PD-1 указанному пациенту.

В данном изобретении предлагается способ, включающий: а) получение популяции клеток из образца опухоли от пациента; b) окрашивание указанной популяции мечеными антителами, которые связывают: i) белок TIGIT; ii) белок PVRIG; iii) белок PVR; iv) белок PD-1; v) белок PD-L1; vi) PVRL2; и vii) соответствующий изотипический контроль для антител в i)-vi); с) проведение сортировки клеток с активированной флуоресценцией (FACS); d) для каждого из TIGIT, PVRIG, PVR, PD-1, PVRL2 и PD-L1, определение процента клеток в указанной популяции, которые экспрессируют белок относительно указанного антитела изотипического контроля; при этом, если процент положительных клеток составляет > 1% для TIGIT или PVR, и для PVRIG или PVRL2, а также для PD-1 или PD-L1, переход к этапу е); и е) введение антител к TIGIT, PVRIG и PD-1 указанному пациенту.

В данном изобретении предлагается способ, включающий: а) получение популяции клеток из образца опухоли от пациента; b) окрашивание указанной популяции мечеными антителами, которые связывают: i) белок TIGIT; и ii) белок PVR; а также iii) соответствующий изотипический контроль для антител в i)-ii); с) проведение сортировки клеток с активированной флуоресценцией (FACS); d) для каждого из TIGIT и PVR, определение процента клеток в указанной популяции, которые экспрессируют белок относительно указанного антитела изотипического контроля; при этом, если процент положительных клеток составляет > 1% для TIGIT или PVR, переход к этапу е); и е) введение антител к TIGIT, PVRIG и PD-1 указанному пациенту.

В данном изобретении предлагается способ, включающий: а) получение популяции клеток из образца опухоли от пациента; b) окрашивание указанной популяции мечеными антителами, которые связывают: i) белок PVRIG; и ii) белок PVRL2; а также iii) соответствующий изотипический контроль для антител в i)-ii); с) проведение сортировки клеток с активированной флуоресценцией (FACS); d) для каждого из PVRIG и PVRL2, определение процента клеток в указанной популяции, которые экспрессируют белок относительно указанного антитела изотипического контроля; при этом, если процент положитель

- 90 044486 ных клеток составляет > 1% для PVRIG или PVRL2, переход к этапу е); и е) введение антител к TIGIT, PVRIG и PD-1 указанному пациенту.

В данном изобретении предлагается способ, включающий: а) получение популяции клеток из образца опухоли от пациента; b) окрашивание указанной популяции мечеными антителами, которые связывают: i) белок PD-1; и ii) белок PD-1; а также iii) соответствующий изотипический контроль для антител в i)-ii); с) проведение сортировки клеток с активированной флуоресценцией (FACS); d) для каждого из PD-1 и PD-L1, определение процента клеток в указанной популяции, которые экспрессируют белок относительно указанного антитела изотипического контроля; при этом, если процент положительных клеток составляет > 1% для PD-1 или PD-1, переход к этапу е); и е) введение антител к TIGIT, PVRIG и PD-1 указанному пациенту.

Пример 2: экспрессия PVRIG и PVRL2 в раковых и нормальных соседних тканях человека.

Целью данного исследования было изучение экспрессии PVRIG и PVRL2 в образцах опухоли человека и нормальных соседних тканей. Обнаружено, что PVRIG экспрессируется наиболее высоко на CD8+ Т-клетках, за которыми следуют NK-клетки, CD4-CD8-Т-клетки и CD4+ Т-клетки. На моноцитах, mDC, pDC или опухолевых клетках какой-либо экспрессии не наблюдалось. Из исследованных типов опухолей, опухоли эндометрия, легкого и почки экспрессировали самые высокие уровни PVRIG на лимфоцитах. Сравнение экспрессии PVRIG на CD4+ и CD8+ Т-клетках из нормальных соседних тканей по сравнению с опухолевыми тканями того же пациента продемонстрировало значимое увеличение PVRIG в опухолевых тканях. Корреляционный анализ уровня экспрессии PVRIG с уровнем экспрессии TIGIT или PD-1 продемонстрировал положительную и значимую корреляцию на CD4 и CD8 Т-клетках. Кроме того, анализ совместной экспрессии отдельных клеток PD-1, TIGIT и PVRIG продемонстрировал, что PVRIG совместно экспрессируется с PD-1 и TIGIT в подмножестве клеток. Эти данные подтверждают вывод о том, что комбинированная блокада PVRIG с TIGIT и/или PD-1 приведет к повышению уровня Тклеточных ответов. Лиганд для PVRIG, PVRL2, экспрессировался на миелоидных клетках (моноцитах, mDC, pDC) и на CD45- неиммунных клетках из множества опухолей, вероятно, состоящих из опухолевого эпителия и стромальных клеток. Сравнение PVRL2 на клетках, полученных из нормальной соседней ткани и опухолевой ткани, продемонстрировало значимое увеличение экспрессии PVRL2 на моноцитах и CD45- неиммунных клетках. Корреляционный анализ уровня экспрессии PVRL2 с уровнем экспрессии PD-L1 продемонстрировал положительную и значимую корреляцию с CD45- неиммунными клетками и моноцитами. В этих образцах авторы также оценили совместную экспрессию PVRIG и PVRL2 в том же образце, чтобы понять, какой тип опухоли характеризуется высоким уровнем совместной экспрессии как рецептора, так и лиганда. Среди исследованных типов опухолей, авторы наблюдали высокий уровень экспрессии как PVRIG, так и PVRL2 в большинстве образцов опухолей эндометрия, почки и легкого. Таким образом, эти данные демонстрируют, что PVRIG и PVRL2 экспрессируются на лейкоцитах и опухолевых клетках из микроокружения опухоли, и предполагают, что этот путь можно использовать для регуляции противоопухолевых ответов.

Авторы исследовали экспрессию PVRIG и PVRL2 с помощью проточной цитометрии на клетках из рассеченных опухолей человека и сопоставлял с и нормальными соседними тканями из множества различных тканей. Показатели экспрессии иммунных регуляторов в опухоли можно применять, чтобы спрогнозировать, какие типы опухолей или пациенты могут быть наиболее чувствительными к специфической терапии.

Мононуклеарные клетки периферической крови человека от здоровых доноров (МКПК) получали из Стэнфордского банка крови. Лейкоцитарные плёнки или продукты LRS разбавляли 1:1 в 1 х PBS + 2% FBS, и МКПК выделяли с помощью градиента фиколл-пак (Sigma). Очищенные МКПК промывали 2 раза PBS + 2% FBS и помещали в жидкий азот. Образцы опухолей и нормальных соседних тканей (НСТ) были предоставлены Объединенной сетью тканей человека, являющейся ресурсом, поддерживаемым Национальным институтом рака. Тип опухоли определяли на основании анализа отчета о гистопатологической характеристики для каждого образца. Количество образцов на тип опухоли, которые авторы исследовали на предмет экспрессии PVRIG и PVRL2, указано ниже.

Мишень	Талспя кишка, Мучная железа _пр„_Ш\|желудок	Эндометрий и матка	Голова и шея	Почки	Легкие	Простата	Яичники
PVRIG	J 15	24	J	14	5		5
PVRL2	: :1	22		1Е	и	ι:	К¹

1. Протокол рассечения опухоли.

Образцы опухоли и НСТ разрезали скальпелем на мелкие фрагменты и переносили в пробирки GentleMAC™ С (Miltenyi Biotec), содержащие смесь ферментов. Образцы рассекали на GentleMAC (Miltenyi Biotec) согласно протоколу производителя. После рассечения клетки фильтровали через фильтр 100 мкм до окрашивания FACS.

- 91 044486

2. Антитела и реагенты.

С целью идентификации иммунных и неиммунных клеточных популяций, следующие антитела применяли в рекомендованных производителем концентрациях.

Таблица 2

Продемонстрированы антитела, применяемые для идентификации подмножеств специфических клеток

Антитело	Флюорофор	Клон	Поставщик	Нойер no каталогу
СМ5	Ales Huor 700	ИЗО	Во Legend	ЭОКЕД
CD3	ДРССу7	огаз	BoLegend	317342
СЕ»	№ 785	RPAI8	BoLegend	300046
CD33	№711	WM53	EioLegend	30B424
CD25	№650	ВС96	BoLegend	30204
CD127	№605	401905	BoLegend	351334
CD14	BUV395	МоРЭ	EDPhamingen	50562
СЕН	BUV496	SK3	EDPharmngai	564651
CD56	PEtezde	KD56	BoLegend	31Я348

Следующие антитела применяли в концентрации 5 мкг/мл в коктейле изотипического контроля.

Таблица 3

Продемонстрированы антитела, применяемые в качестве изотипического контроля для мишеней, представляющих интерес

Антитело	Флюорофор	Клон	Поставщик	Номер по ___каталогу _
мда	ДР647	свой	Соггрисрп	свой
Иды	re	СВОЙ	Согтрисрп	свой
мда	ада	MOPZ21	Boie^nd	400158
мда	Р&СР 0/5-5	МОРС21	Boie^nd	40Q15D
мда	гео/7	могса	Bete^nd	400126
мда	тс	МОРС21	Boietpnd	лггтпл

Следующий коктейль применяли для окрашивания мишеней, представляющих интерес, в концентрации 5 мкг/мл.

Таблица 4

Продемонстрированы антитела, применяемые для анализа мишеней, представляющих интерес

Антитело	Флюорофор	Клон	Поставщик	Номер по каталогу
гад	ДР547	ВМ1(М1)	CorrpiKfn	свой
Pu4G	π	sasw	Bclecpnd	30000
ГО1	ада.	М2Э17(МЦ	Bcle^nd	32SSQD
Nt	RrCP 0/5-5	зал (ми		лзли2
FVR2	гео/7	1X31 (Ml)	Bcletpnd	337414
ΤΚΙΓ	HIT	ΝΕ9Μ3(Μΰ	еЙоэоятсЕ	11-900042

Все антитела изотипического контроля и целевые антитела применяли в конечной концентрации 5 мкг/мл.

3. Окрашивание FACS.

1х10⁶ клеток МКПК или клеток рассеченной опухоли высевали в 96-луночный планшет с Vобразным дном лунок для окрашивания. Образцы сначала окрашивали Aqua Live Dead (Thermo Scientific), чтобы отличить живые клетки от мертвых, и коктейлем анти-CD16 (Biolegend), анти-CD32 (Thermo Scientific), анти-CD64 (Biolegend) Ab для блокирования Fc-рецепторов. Образцы промывали дважды буфером FACS и окрашивали соответствующим изотипическим контролем для применяемых антител, или коктейлем целевых антител, описанных в разделе Антитела и реагенты. Все окрашивание проводили в течение 30 мин при 4°C. Затем образцы дважды промывали и собирали на проточном цитометре BD Fortessa. Анализ проводили с помощью FlowJo, осуществляя гейтирование на специфических популяциях, как указано в табл. 1 выше (все гейтирование осуществляли на живых клетках).

Из каждой популяции, содержащей не менее 100 клеток, экспортировали значения MFI, а отноше

- 92 044486 ние MFI (MFIr) рассчитывали путем деления MFI мишени на MFI соответствующего изотипического контроля. Значение MFIr больше единицы обозначает обнаруженную положительную экспрессию.

4. Результаты и обсуждение.

a. PVRIG экспрессируется на TILS из множества типов опухолей и совместно экспрессируется с TIGIT и PD1.

Для исследования экспрессии PVRIG на клетках, полученных из опухолей, с помощью проточной цитометрии, опухоли рассекали и окрашивали на предмет линейных маркеров иммунных клеток для идентификации подмножеств иммунных и неиммунных клеток, а также для PVRIG, TIGIT, PD1, PVRL2 и PVR с целью изучения экспрессии этих мишеней на этих подмножествах. Экспрессию PVRIG обнаруживали на CD4+ Т-клетках, CD8+ Т-клетках, CD4 CD8 Т-клетках и NK-клетках из опухолей молочной железы, толстой кишки/прямой кишки/желудка, эндометрия, головы и шеи, легкого, почки, предстательной железы и яичников (на фиг. 12А). Во всех исследованных опухолевых тканях PVRIG экспрессировался от наивысшего к наинизшему уровню, на CD8+ Т-клетках, NK-клетках, CD4 CD8 Т-клетках и CD4+ Т-клетках. На моноцитах, mDC, pDC или на неиммунных клетках какой-либо экспрессии PVRIG не наблюдали (фиг. 1В). Поскольку известно, что CD8+ Т-клетки и NK-клетки являются важными цитотоксическими лимфоцитами в иммунной системе, это предполагает, что PVRIG может непосредственно модулировать активность этих цитотоксических лимфоцитов.

Затем авторы исследовали уровень экспрессии PVRIG по отношению к уровню TIGIT и PD-1 на инфильтрирующих опухоль Т-клетках. Для этого анализа, авторы сфокусировались на образцах эндометрия, поскольку имелось достаточное количество образцов для проведения корреляционного анализа. Уровень экспрессии PVRIG значимо и прямо коррелировал с уровнем экспрессии TIGIT и PD1 как на CD4, так и на CD8 Т-клетках, что позволяет предположить, что эти молекулы совместно регулируются в пределах ТМЕ (на фиг. 13).

Кроме того, авторы исследовали совместную экспрессию PVRIG, TIGIT и PD1 на основе отдельных клеток на CD8 Т-клетках. Совместная экспрессия PVRIG с PD-1 и TIGIT наблюдалась на репрезентативных клетках рака легкого и почки (на фиг. 14).

b. Экспрессия PVRIG значимо повышалась на Т-клетках из опухоли по сравнению с нормальной соседней тканью.

Для подмножества клеток опухолей толстой кишки/прямой кишки/желудка, эндометрия, почки, легкого или яичника авторы смогли получить образцы соответствующей опухоли и нормальной соседней опухоли (НСТ) от одного и того же донора. Используя эти соответствующие образцы, авторы сравнивали экспрессию PVRIG и PD1 на клетках, полученных из образцов НСТ или опухоли, чтобы определить, есть ли модулированная экспрессия в опухоли по сравнению со здоровыми тканями (на фиг. 15). В целом, экспрессия PVRIG значимо повышалась на CD4 и CD8 Т клетках, полученных из опухолевой ткани, по сравнению с соответствующими нормальными соседними тканями (на фиг. 15А). Среди типов опухолей, экспрессия PVRIG повышалась по меньшей мере в 2 раза в 3 из 9 опухолей толстой кишки, в 1 из 2 опухолей эндометрия, в 4 из 11 опухолей почки, и в 4 из 5 опухолей легкого (на фиг. 15А). В тех же образцах авторы также оценивали экспрессию PD-1. Корреляционный анализ между кратностью изменения PVRIG (между НСТ и опухолью) и кратностью изменения PD-1 на CD4 и CD8 Т-клетках продемонстрировал положительную и значимую корреляцию в этих образцах, наталкивая на предположение о том, что эти молекулы могут совместно регулироваться сходным образом в опухоли.

c. PVRL2 экспрессируется на миелоидных и CD45- (неиммунных) клетках из множества опухолей.

В тех же самых образцах, из которых авторы исследовали экспрессию PVRIG, авторы также исследовали экспрессию PVRL2, лиганда PVRIG. Экспрессия PVRL2 была обнаружена на 2 основных подмножествах клеток: на миелоидных клетках, которые включают моноциты, mDC, и популяцию pDC, а также на CD45- неиммунных клетках, вероятно, состоящих из эпителиальных опухолевых клеток, стромальных клеток и эндотелиальных клеток (на фиг. 16).

Экспрессия PVRL2 на CD45- неиммунных клетках была обнаружена на клетках опухолей молочной железы, толстой кишки/прямой кишки/желудка, эндометрия, легкого, предстательной железы и яичника (на фиг. 17). Наивысшая медиана экспрессии PVRL2 была обнаружена на клетках опухолей эндометрия и яичника.

На иммунных клетках, PVRL2 экспрессировался на миелоидных клетках из ткани молочной железы, толстой кишки/прямой кишки/желудка, эндометрия/матки, головы и шеи, легкого, почки, предстательной железы и яичника (на фиг. 18).

Медиана экспрессии PVRL2 на миелоидных клетках (моноциты, mDC, pDC) была сопоставимой по типам опухолей.

При сравнении опухолевой ткани с нормальной соседней тканью, экспрессия PVRL2 была значимо повышена на CD45- клетках опухоли или на моноцитах из опухолевых тканей (на фиг. 19). Экспрессия PVRL2 на моноцитах или CD45-kлетках индуцировалась по меньшей мере в 2 раза выше в опухоли по сравнению с нормальной тканью: в 5 из 9 опухолей толстой кишки, в 1 из 2 опухолей эндометрия, в 5 из 11 опухолей почки, 4 из 5 опухоли легкого и 1 из 1 опухоли яичника. Эти данные подтверждают повышенную экспрессию PVLR2 на опухолевых клетках и на иммунных клетках в опухоли. Корреляционный

- 93 044486 анализ между кратностью изменения PVRL2 (между НСТ и опухолью) и кратностью изменения PD-L1 на CD45-клетках и моноцитах продемонстрировал положительную и значимую корреляцию в этих образцах, наталкивая на предположение о том, что эти молекулы могут совместно регулироваться сходным образом в опухоли.

d. PVRIG и PVRL2 совместно экспрессируются в одной и той же опухоли.

Далее авторы оценили, какие типы опухолей имеют высокую экспрессию как PVRIG на Т-клетках, так и PVRL2 на моноцитах и опухолевых клетках. В этом наборе образцов, опухоли из тканей матки, легкого и почки демонстрировали высокий уровень экспрессии как PVRIG на Т-клетках, так и PVRL2 либо на моноцитах, либо на CD45- клетках (на фиг. 20), наталкивая на предположение о том, что эти типы опухолей могут в большей степени отвечать на лечение с применением СНА.7.518.1.Н4 (S241P).

е. Заключение.

Результаты этих исследований демонстрируют, что PVRIG экспрессируется на эффекторных лимфоцитах, таких как CD8 Т-клетки и NK-клетки в микроокружении опухоли. Как PVRIG, так и PVRL2 экспрессировались во множестве образцов опухолей молочной железы, толстой кишки/прямой кишки/желудка, эндометрия, легкого, предстательной железы и яичника. Экспрессия PVRIG на Т-клетках была значимо выше в опухолевых тканях по сравнению с соответствующими нормальными соседними тканями. Кроме того, наблюдали значимую прямую корреляцию между экспрессией PVRIG и PD-1 и PVRIG и TIGIT на CD4 и CD8 Т-клетках из образцов ткани эндометрия. На основе анализа отдельных клеток, совместную экспрессию PVRIG с PD1 или с TIGIT наблюдали на CD8 Т-клетках. Лиганд для PVRIG, PVRL2, экспрессируется на антигенпрезентирующих клетках (моноцитах, mDC, pDC), а также на CD45-клетках (предположительно состоящих из эпителиальных, стромальных, эндотелиальных клеток) из множества опухолевых тканей. Индукцию экспрессии PVRL2 обнаруживали на клетках, полученных из опухоли, по сравнению с нормальными соседними тканями. Профиль клеточной экспрессии рецептора и лиганда наталкивает на предположение о роли этого пути в регуляции эффекторных ответов лимфоцитов при множестве типов опухолей.

Пример 3: экспрессия PVRL2 и PD-L1 в раковых и нормальных тканях человека, проанализированная с помощью ИГХ.

Целью данного исследования было изучение экспрессии PVRL2 и PD-L1 в здоровой и раковой ткани человека. Идентифицировали два антитела к PVRL2 для окрашивания PVRL2 в фиксированных в формалине и залитых парафином (FFPE) образцах. PD-L1 определяли с помощью коммерчески валидированного антитела. Применяя эти антитела, авторы исследовали экспрессию PVRL2 и PD-L1 в серийных срезах тканей опухолевой микроматрицы (ТМА), состоящей из тканей молочной железы, толстой кишки, легкого, яичника и кожи. Наблюдалось усиление экспрессии PVRL2 при раке молочной железы, толстой кишки, легкого, яичника и кожи по сравнению со здоровыми тканями. Подобное окрашивание наблюдали между двумя антителами к PVRL2, что содействует подтверждению полученных результатов. Также повышенной была экспрессия PD-L1 при раке молочной железы, толстой кишки, легкого, яичника и кожи по сравнению со здоровыми тканями. Экспрессию PVRL2 наблюдали в опухолевом эпителии, а также в инфильтрирующих иммунных клетках. В этих образцах опухоли отмечалась более высокая частота экспрессии PVRL2 по сравнению с экспрессией PD-L1. В дальнейшем отдельные образцы опухоли группировали по отрицательной и положительной экспрессии PD-L1, и проанализироли экспрессию PVRL2 в этих подгруппах. Все PD-L1-положительные опухоли также экспрессировали PVRL2, обеспечивая обоснование комбинированного лечения опухолей. В PD-L1-отрицательных опухолях экспрессию PVRL2 обнаруживали в подмножестве этих образцов, обеспечивая обоснование для нацеливания на путь PVRL2 в PD-L1-отрицательных опухолях. В своей совокупности, эти данные демонстрируют, что экспрессия PVRL2 была повышена в микроокружении опухоли при раке молочной железы, толстой кишки, легкого, яичника и кожи, и дают обоснование для монотерапии и комбинированного лечения с применением агентов, нацеленных на путь PVRL2.

Протоколы.

Антитела.

В этом исследовании применяли анти-PVRL2 (Abeam ab135246, Sigma HPA-012759) и анти-PDL1 (SpringBio Sp142). Антитело изотипического контроля (IgG кролика) применяли в качестве отрицательного контроля.

Окрашивание ИГХ.

Опухолевые микроматрицы получали из молочной железы, толстой кишки, легкого, яичников и кожи. Каждая микроматрица содержит здоровые ткани от 2-4 доноров и опухолевую ткань от 30-40 доноров, присутствующую в дубликатах в микропрепаратах. Ahtu-PVRL2 Abeam abl35246 окрашивание проводили в разведении 1:250 без термически индуцированного извлечения антигена (HTER). АнтиPVRL2 (Sigma HPA-012759) применяли в концентрации 0,1 мкг/мл с HTER при рН 9,5. Анти-PD-LI (SpringBio SP142) применяли в концентрации 1 мкг/мл с HTER при рН 6,2 согласно рекомендациям производителя. Соответствующий изотипический контроль IgG кролика применяли при каждом из подходящих условий. Два отдельных оператора качественно оценивали каждое ядро согласно следующей шкале: нет окрашивания (бал 0), частично положительный результат (бал 1), положительный результат

- 94 044486 (бал 2), сильно положительный результат (бал 3). В случае расхождений в баллах между двумя операторами образец повторно оценивали оба оператора для получения окончательного балла. Балл по 2 ядрам, полученным из одной и той же опухоли, усредняли, и для каждой опухоли получали один балл. Результаты наносили на график, и образцы группировали по данным гистопатологии, предоставленным поставщиком.

Результаты и обсуждение.

Экспрессия PVRL2 и PD-L1 повышается при раке молочной железы, толстой кишки, легкого, яичника и кожи

Два антитела анти-PVRL2 (ab135246, HPA-012759) тестировали на способность определять экспрессию PVRL2 в фиксированных в формалине и залитых парафином образцах ткани. Экспрессию PVRL2 и PD-L1 оценивали на серийных срезах с помощью опухолевой микроматрицы рака молочной железы, толстой кишки, легкого, яичника и кожи. Экспрессия PVRL2 и PD-L1 была повышенной при раке молочной железы, толстой кишки, легкого, яичника и кожи (фиг. 21).

PVRL2 экспрессируется в PD-L1-положительных и PD-L1-отрицательных опухолях.

Поскольку анализ экспрессии PVRL2 и PD-L1 проводили на последовательных срезах с помощью одной и той же ТМА, авторы смогли исследовать экспрессию PVRL2 и PD-L1 в каждой из этих опухолей из одной и той же части опухоли (фиг. 22). Подмножество PD-L1-отрицательных образцов опухолей, в частности опухолей легкого, яичника, молочной железы, экспрессировало PVRL2 (что определено по меньшей мере как частично положительный результат), что обнаружено с помощью обоих антител антиPVRL2. Эти данные демонстрируют, что PVRL2 может экспрессироваться в PD-L1-отрицательных опухолях. Напротив, все PD-L1-положительные опухоли экспрессировали PVRL2, что обнаружено с помощью обоих антител анти-PVRL2.

PVRL2 экспрессируется на эпителиальных клетках и на иммунном компартменте на инвазивной фронтальной поверхности.

Пространственная экспрессия иммунных контрольных точек на инвазивной фронтальной поверхности опухоли является важной для регуляции противоопухолевого ответа. Известные мишени контрольных точек, такие как PD-1 и PD-L1, характеризуются выраженную экспрессией на инвазивной фронтальной поверхности. Поскольку эти ТМА генерируются из материала прицельной биопсии и не содержат всей опухоли, авторы исследовали эти образцы на наличие иммунного инфильтрата на инвазивной фронтальной поверхности опухоли. Авторы идентифицировали 1 образец, в котором наблюдали экспрессию PVRL2 в иммунном инфильтрате и в эпителии опухоли (фиг. 23). Экспрессию PD-L1 наблюдали на иммунном инфильтрате, что дополнительно позволяет предположить, что это может быть инвазивная фронтальная поверхность опухоли.

Заключение.

Эти результаты демонстрируют, что экспрессия PVRL2 повышается в опухолях молочной железы, толстой кишки, легкого, яичника, кожи по сравнению со здоровой тканью из тех же органов. PVRL2 экспрессируется как на опухолевом эпителии, так и на инфильтрирующих лейкоцитах. Авторы также продемонстрировали, что все PD-L1-положительные опухоли экспрессируют PVRL2, и сделали предположение, что агенты, нацеленные на путь PVRL2, могут быть эффективными в комбинации с ингибиторами PD-1/PD-L1. Кроме того, экспрессия PVRL2 была обнаружена в PD-L1-отрицательных опухолях, что позволяет предположить, что агенты, нацеленные на путь PVRL2, могут быть эффективными при PD-L1отрицательных опухолях.

Пример 4: противоопухолевые ответы на лечение моно-, двух- и трехкомпонентной комбинацией антител в модели опухоли СТ26.

Обоснование и цели.

Цель - исследовать, может ли блокада антител PVRIG, TIGIT и PD-L1 усиливать ингибирование роста опухоли и повышать выживаемость в модели сингенной опухоли мыши по сравнению с применением моно- или двухкомпонентной комбинации антител.

Материалы и методы.

Модель опухоли in vivo.

Клетки карциномы толстой кишки СТ26 (АТСС) культивировали в RPMI 1640 с 10% FBS и 100 мкг/мл пенициллина/стрептомицина. Для имплантации опухоли, 5x105 клеток СТ26 подкожно вводили в правый фланк самкам мышей BALB/c 8-недельного возраста. После рандомизации опухоли, антитела вводили посредством внутрибрюшинной (в/бр) инъекции, начиная со дня 7 после инокуляции опухоли, когда опухоли достигли объема 60-90 мм³, и продолжали в течение 3 недель в общей сложности до 6 введений. Размер опухоли измеряли с помощью электронного штангенциркуля каждые 2-3 дня и регистрировали как 0,5 x W² x L мм³. Мышей умерщвляли либо в конце исследования, либо в моменты достижения клинических определяемых параметров в исследовании, включая объем опухоли > 3250 мм³, изъязвление опухоли, потерю массы тела > 20% или агонирующее состояние.

Антитела.

Химерное антитело против мышиного PVRIG (клон 407, изготовленное в своей лаборатории), при

- 95 044486 меняемое в этих исследованиях, было сконструировано как мышиное антитело IgG1 (mIgGI). Было продемонстрировано, что это антитело связывается с клетками 293HEK, сверхэкспрессирующими PVRIG мыши, и блокирует связывание лиганда, PVRL2 мыши. Антитело mIgG1 против мышиного PD-L1 (клон YW243.55.S70) генерировали в соответствии с описанием в WO/2010/077634. Антитело mIgG1 против мышиного TIGIT (клон 11A11) генерировали в соответствии с описанием в WO 2016/028656. Synagis IgG1 применяли в качестве изотипического контроля и производили в своей лаборатории. Антитела были составлены в стерильном PBS с низким содержанием эндотоксина (< 0,05 МЕ/мг). Антитело антиPVRIG вводили в дозе 10 мг/кг, анти-PD-L1 - 5 мг/кг и анти-TIGIT - 18 мг/кг.

Статистический анализ.

Двухфакторный анализ ANOVA с повторными измерениями с последующим двухфакторным анализом ANOVA с повторными измерениями для выбранных пар групп определяли с помощью программного обеспечения JUMP (Statistical Discoveries™). Анализы измерений роста опухоли проводили путем сравнения объемов опухоли, измеренных в последний день, в который все исследуемые животные были живы. Статистические различия в процентном отношении мышей без опухолей определяли с помощью логарифмического рангового критерия Мантеля-Кокса. Значения р < 0,05 считались значимыми. * р < 0,05; ** р < 0,01; *** р < 0,001.

Результаты.

Эффективность антител анти-TIGIT и анти-PVRIG в комбинации с антителом анти-PD-L1 in vivo

Эффективность комбинированной терапии для блокады PVRIG, TIGIT и PD-L1 мыши in vivo оценивали на модели сингенной эктопической подкожной опухоли CT26.WT мыши. Лечение мышей с опухолями антителом анти-PVRIG в комбинации с антителом αнтu-PD-L1 приводило к ингибированию роста опухоли (TGI) на 47% по сравнению с изотипическим контролем. Тем не менее, в этом исследовании не наблюдалось никаких преимуществ двухкомпонентной комбинации антител анти-PD-L1 и антиPVRIG по сравнению с лечением только антителом αнтu-PD-L1. Блокада TIGIT при применении трехкомпонентной комбинации (анти-PVRIG, анти-TIGIT и анти-PD-L1) приводила к значимому улучшению TGI по сравнению с другими двухкомпонентными комбинациями с антителом анти-TIGIT (анти-PDL-1 + анти-TIGIT, анти-PVRIG + анти-TIGIT, и анти-PDL-1 + анти-TIGIT, что соответствует 29%, 61% и 55% TGI соответственно) (фиг. 24А и С). Трехкомпонентная комбинация приводила к более высоким показателям ответа (55% против 40%) и способствовала длительной противоопухолевой активности с тенденцией к более высокой выживаемости до Дня 35 (фиг. 24В).

Пример 5: антагонизм PVRIG повышает эффекторную функцию Т-клеток и снижает темпы роста опухоли.

Резюме.

Несмотря на последние достижения, большинство пациентов не получают долгосрочного эффекта от применения ингибиторов контрольных точек. PVRIG является новым иммуносупрессивным рецептором семейства DNAM/TIGIT, и в данном примере авторы демонстрируют роль PVRIG в регуляции противоопухолевых ответов. PVRIG связывается с PVRL2 и демонстрирует значимо повышенную экспрессию в инфильтрирующих опухоль лимфоцитах по сравнению с лимфоцитами из нормальных тканей. Антагонизм PVRIG усиливает активацию Т-клеток человека, а комбинация ингибиторов PVRIG с PD-1 или TIGIT дополнительно синергически повышает функцию лимфоцитов. Затем авторы обратились к роли PVRIG в доклинических моделях опухоли. У мышей PVRIG^-/^- значимо повышалась активация Тклеток in vitro и снижался темп роста опухоли МС38, что было обусловлено повышенной эффекторной функцией CD8. Антагонистическое антитело анти-PVRIG значимо снижало темп роста опухоли в комбинации с анти-PD-L1 или при тестировании на мышах TIGIT^-/^-. Таким образом, авторы продемонстрировали, что путь PVRIG-PVRL2 индуцировался при раке человека и что антагонизм взаимодействий PVRIG-PVRL2 приводил к повышению функции Т-клеток и снижению темпа роста опухоли.

Состояние значимости.

Эти данные демонстрируют, что PVRIG является многообещающей мишенью для лечения рака, и дают обоснование для тестирования ингибитора PVRIG, CHA.7.518.1.H4 (S241P), в качестве нового средства противораковой иммунотерапии либо в виде монотерапии, либо в комбинации с блокадой TIGIT или PD1.

Введение.

Все больше данных свидетельствуют о том, что эндогенные иммунные ответы имеют решающее значение для формирования инициации, прогрессирования и подавления рака (1) (2). Иммунный статус пациентов, а также содержание инфильтрирующих опухоль лейкоцитов (TIL) в микроокружении опухоли (ТМЕ) являются ключевыми прогностическими показателями не только выживаемости рака, но и того, как пациенты будут отвечать на терапию (3) (4). Т-клетки являются ключевым компонентом TIL, которые могут вызывать противоопухолевый ответ, и большинство противоопухолевых иммунных ответов в конечном итоге зависят от функциональности эффекторных лимфоцитарных клеток. Обогащение CD8 Т-клеток в ТМЕ опухоли пациента, а также другие факторы, которые смещают иммунный ответ к эффективному ответу CD8 Т-клеток, такие как мутационная нагрузка и Th1-поляризованная ТМЕ, являются ключевыми прогностическими показателями для благоприятного противоопухолевого иммунного ответа

- 96 044486 (5) (6).

Ключевое наблюдение во многих твердых опухолях заключается в том, что эффекторные Т-клетки имеют активированный или истощенный фенотип в пределах ТМЕ (7). Это указывает на то, что, хотя Т-клетки в ТМЕ первоначально контактировали с родственным антигеном, были активированы и переправлены в опухоль, впоследствии они были не способны вызывать эффективный противоопухолевый ответ. Предварительно активированные или истощенные Т-клетки определяются по повышенной поверхностной экспрессии коингибирующих рецепторов, таких как PD-1 и CTLA-4 (8). Терапевтическое нацеливание антител на эти коингибирующие рецепторы, которые ингибируют взаимодействия с их родственными лигандами, продемонстрировало замечательную клиническую эффективность у пациентов с множественными распространенными формами рака (9). Механистически было продемонстрировано, что нацеливание на эти коингибирующие рецепторы приводит к размножению уже опухолевореактивных Т-клеток, которые уже существуют в ТМЕ, и к образованию пулов Т-клеток с расширенным разнообразием Т-клеточных рецепторов (10) (11) (12). Хотя ингибиторы контрольных точек, применяющиеся в данное время в клинической практике, произвели революцию в лечении рака и продемонстрировали силу иммунной системы в борьбе с раком, во многих пациентов по-прежнему отмечаются рецидивы и/или отсутствует ответ на лечение. Следовательно, более глубокое понимание иммунного ответа при раке и нацеливание на дополнительные иммунные пути будет способствовать дополнительным терапевтическим методам лечения.

Среди этих новых путей, группа рецепторов и лигандов в семействе нектинов и нектиноподобных агентов в данное время исследуется как потенциальная новая противоопухолевая иммунотерапия. Рецепторы в этом семействе включают DNAM-1 (CD226), CD96 (TACTILE), TIGIT и, совсем недавно открытый, PVRIG (CD112R) (13) (14) (15). Из этих молекул, DNAM представляет собой активирующий рецептор в пределах этого подсемейства, связывающийся с 2 лигандами, PVR (CD155) и PVRL2 (CD112), чтобы доставить сигнал активации к лимфоцитам (16). Было продемонстрировано, что два рецептора в этом семействе ингибируют функцию лимфоцитов человека, TIGIT, и, совсем недавно открытый, PVRIG (17) (18). Сообщается, что TIGIT обладает высокой аффинностью при взаимодействии с PVR, гораздо более слабой аффинностью к PVRL2, и было продемонстрировано, что он ингибирует ответы как Т-клеток, так и NK-клеток, доставляя ингибирующий сигнал в лимфоциты через свой мотив ITSM (19) (20). Совсем недавно было продемонстрировано, что PVRIG связывается с высокой аффинностью с PVRL2 и доставляет ингибирующий сигнал через свой мотив ITIM (15). В обоих случаях аффинность TIGIT к PVR и PVRIG к PVRL2 является выше, чем аффинность DNAM к PVR или PVRL2, наталкивая на предположение о том, что TIGIT и PVRIG могут вытеснять PVR и PVRL2 из DNAM, обеспечивая косвенный механизм, с помощью которого TIGIT и PVRIG могут ослаблять функцию Т-клеток. Среди этого семейства, PVR также является лигандом для CD96. Сообщалось, что функция CD96 ингибирует лимфоциты мыши (21), но активирует лимфоциты человека (22). Основываясь на этих данных, авторы предполагают, что 2 рецептора на лимфоцитах человека, TIGIT и PVRIG, связываются с высокой аффинностью с PVR и PVRL2, соответственно, чтобы доставлять ингибирующие сигналы для ослабления функции Т-клеток.

Хотя в одном недавнем сообщении было продемонстрировано, что PVRIG человека ингибирует ответ Т-клеток, в то же время роль PVRIG и PVRL2 в иммунном надзоре при раке до конца не изучена. В частности, не сообщалось о профиле экспрессии этого пути при раке и роли PVRIG в регуляции противоопухолевых ответов CD8 Т-клеток. Кроме того, не сообщалось о функциональных характеристиках гена PVRIG мыши и эффекте нарушения взаимодействия PVRIG-PVRL2 in vivo на доклинических моделях опухолей. В данном примере авторы выяснили роль PVRIG при раковых заболеваниях, охарактеризовав профиль экспрессии PVRIG и PVRL2 при раке и влияние антагонизма PVRIG в анализах совместного культивирования опухолевых клеток и в доклинических моделях опухолей. Авторы продемонстрировали, что PVRIG имеет дифференцированный профиль экспрессии на подмножествах Т-клеток по сравнению с TIGIT или CD96, и что экспрессия PVRIG и PVRL2 индуцировалась при раке по сравнению с нормальными соседними тканями. В множестве аналитических систем человека in vitro высокоаффинное антагонистическое моноклональное антитело к PVRIG (СНА.7.518.1.Н4 (S241P)) усиливает функцию Т-клеток, в частности, в комбинации с антителом анти-TIGIT или αнтu-PD1. Кроме того, авторы сообщили о новой характеристике PVRIG у мышей при применении антагонистических антител или у мышей с дефицитом PVRIG, и продемонстрировали, что ингибирование взаимодействия PVRIG-PVRL2 снижает темп роста опухоли с наиболее сильными эффектами в комбинации с ингибированием PD-1 или генетическим дефицитом TIGIT. В совокупности эти данные демонстрируют, что PVRIG является критически важным ингибиторным рецептором в регуляции противоопухолевых ответов Т-клеток и дают основания для изучения СНА.7.518.1.Н4 (S241P) в клинических испытаниях у пациентов с раком.

Материалы и методы.

Исследования периферической крови и опухолевой экспрессии у человека.

МКПК здорового донора человека получали из Стэнфордского университета в соответствии с Хельсинкской декларацией. Человеческие ткани были предоставлены Объединенной сетью тканей человека, являющейся ресурсом, поддерживаемым Национальным институтом рака. Ткань рака человека и соответствующие нормальные соседние ткани рассекали на отдельные клетки согласно протоколу про

- 97 044486 изводителя (Miltenyi Biotec). Полученные в результате рассечения клетки анализировали с помощью проточной цитометрии на экспрессию различных мишеней на разных подмножествах клеток. Для каждой целевой экспрессии в отдельном подмножестве клеток рассчитывали значение кратности экспрессии, путем деления значения MFI мишени на значение MFI изотипического контроля. Другие исследователи, возможно, получали образцы из материала этой же ткани. Тип опухоли определяли на основании анализа отчета о гистопатологической характеристике для каждого образца. Для исследований ИГХ, антитело анти-PVRL2 (НРА-012759, Sigma) и PD-L1 (Sp142, SpringBio) применяли для окрашивания опухолевых микроматриц (институт Biochain) в условиях, описанных в дополнительных методах. Оценку проводили два независимых специалиста на дубликатах ядер из той же опухоли.

Генерация и характеризация антител к PVRIG

Антитела против PVRIG человека и против PVRIG мыши получали, как подробно описано в дополнительных методах. Вкратце, специфичность и аффинность связывания антител оценивали с помощью селективного связывания с клетками со встроенным PVRIG, без детектируемого связывания с клетками, которые не экспрессируют ген. Антагонистическую активность этих антител анти-PVRIG определяли с помощью анализов на основе ИФА и FACS, в которых взаимодействие PVRIG с PVRL2 было нарушено. Для характеризации в клеточных анализах, антитела тестировали в нескольких системах анализа совместного культивирования Т-клетка - клетка-мишень, состоящих из клеток-мишеней, которые экспрессируют PVRL2, в культуре с МКПК или Т-клетками, полученными из опухолей. gp100 специфические Тклеточные линии размножали из меланомных опухолей, как описано ранее (23). CMVpp65-реактивные Т-клетки размножали из здоровых донорных МКПК (CTL иммуноспот) с CMVpp65 (495-503), IL-2 и IL-7 в течение 10 дней. Для комбинированных исследований применяли антитела к PD-1, TIGIT и PVRIG в концентрации 10 мкг/мл. Концентрации цитокинов в кондиционированных средах определяли цитометрически с помощью матрицы микросфер (СВА), а окрашивание FACS проводили, как описано в дополнительных методах.

Характеризация экспрессии и функции PVRIG мыши.

Связывающие взаимодействия PVRIG мыши с mPVRL2 и mPVR оценивали с помощью SPR и ИФА с применением рекомбинантных белков PVRIG, PVRL2 и PVR и с помощью FACS с применением эктопически сконструированных клеточных линий со сверхэкспрессией PVRIG и PVRL2 или клеточных линий, трансфицированных PVR или PVRL2 siRNA. Мышей с дефицитом PVRIG и TIGIT получали, как описано в дополнительных методах. Экспресс-анализ проводили для изучения экспрессии PVRIG в селезенке, лимфатическом узле и опухоли в различных подмножествах клеток. Функциональные клеточные анализы, демонстрирующие модуляторную активность Т-клеток для PVRIG мыши, проводили с применением WT- и PVRIG^-/^- Т-клеток и клеток-мишеней, эктопически экспрессируемых PVRL2 Fc или PVRL2, как подробно описано в дополнительных материалах и методах. Модели опухолей СТ26, МС38 и B16/Db-hmgp100 выполняли, как описано в дополнительных методах. Все исследования были одобрены Институциональным комитетом по уходу и использованию животных при Тель-Авивском университете (Тель-Авив, Израиль) или Университете Джона Хопкинса (Балтимор, США).

Результаты.

Экспрессия PVRIG является наиболее высокой на эффекторных Т-клетках периферической крови и опухолях.

Суперсемейство Ig (IgSF) состоит из сотен белков, но только некоторые из них являются рецепторами, ингибирующими Т-клетки. Белки IgSF имеют тенденцию быстро эволюционировать (24) и, следовательно, сходство последовательностей среди этих белков, как правило, низкое и не является оптимальным для идентификации новых иммунных рецепторов. С целью идентификации новых иммунных контрольных точек авторы разработали биоинформационные алгоритмы, основанные на общих геномных и протеомных характеристиках среди известных иммунных контрольных точек, таких как структура генов, белковые домены, прогнозируемая клеточная локализация и профиль экспрессии. Применяя эти алгоритмы, авторы определили PVRIG в качестве нового иммунного рецептора. В недавнем сообщении также было продемонстрировано, что PVRIG (CD112R) человека связывается с PVRL2 и ингибирует функцию Т-клеток (15). Тем не менее, о значении этого пути в регулировании иммунологического надзора над опухолью не сообщалось. В данном примере авторы оценили экспрессию и функцию PVRIG и PVRL2 в раковых опухолях человека и доклинических моделях опухоли. В периферической крови от здоровых доноров PVRIG экспрессировался исключительно на лимфоцитах, с наивысшим уровнем экспрессии на CD8 Т-клетках и NK-клетках (фиг. 27А). Дальнейший анализ подмножеств Т-клеток продемонстрировал наивысшую экспрессию PVRIG в подмножествах CD8 или CD4 Т-клеток памяти/эффекторных Т-клеток по сравнению с подмножеством Treg (фиг. 27В, фиг. 34А). Профиль экспрессии Т-клеток памяти преимущественно дифференцирует PVRIG от других рецепторов семейства (TIGIT, CD96), которые имеют тенденцию к одинаковой или более высокой экспрессии на Treg по сравнению с Т-клетками памяти/эффекторными Т-клетками. Авторы также сравнили кинетику экспрессии PVRIG и TIGIT после активации Т-клеток в двух системах анализа (вторичный ответ CMV, фиг. 27С, DC-MLR, фиг. 27D, фиг. 34В) и продемонстрировали, что PVRIG характеризуется замедленной кинетикой индукции и более продолжительной экспрессией в поздний момент времени по сравнению с TIGIT. Преиму

- 98 044486 щественная экспрессия PVRIG на клетках памяти/эффекторных клетках по сравнению с TIGIT наталкивает на предположение об уникальной роли PVRIG в регуляции Т-клеточных ответов.

Замедленная и продолжительная индукция экспрессии PVRIG на Т-клетках после активации позволяет предположить, что PVRIG может экспрессироваться в микроокружении опухоли. Затем авторы проанализировали экспрессию PVRIG на лейкоцитах из рассеченных опухолей человека непосредственно ex vivo с помощью FACS. Экспрессия PVRIG была обнаружена на CD8 Т-клетках, CD4 Т-клетках и NKклетках от нескольких типов опухолей (фиг. 27E-G, дополнительная Фиг. 27С). PVRIG коэкспрессировался с PD-1 и TIGIT на CD4 и CD8 Т-клетках (фиг. 27F). В среднем, более высокая экспрессия была обнаружена на CD4+ и CD8⁺ TIL из ткани опухолей молочной железы, эндометрия, головы и шеи, легкого, почки и яичника по сравнению с тканями опухолей мочевого пузыря, колоректальной области и предстательной железы. В образцах опухолей, в которых экспрессия PVRIG была низкой/отсутствовала ex vivo, активация с применением анти-CD3 и анти-CD28 усиливала экспрессию PVRIG, что позволяет предположить о том, что экспрессия PVRIG в TIL может дополнительно индуцироваться после повторной активации (фиг. 34D). Для опухолей толстой кишки, легкого, почки, эндометрия и яичников авторы смогли получить нормальную соседнюю ткань от одного и того же пациента и провести сравнение экспрессии PVRIG на лимфоцитах, выделенных из опухоли, в сравнении с нормальной тканью. TIL продемонстрировали значимую индукцию PVRIG на CD4 и CD8 Т-клетках по сравнению с клетками, выделенными из соответствующих нормальных соседних тканей (НСТ) (фиг. 34Е). Как и в случае с МКПК, авторы дополнительно сравнили экспрессию PVRIG, TIGIT и PD1 на Treg-клетках и CD8 Т-клетках из опухолей легкого, эндометрия и почки. На TIL, экспрессия TIGIT была выше на Treg по сравнению с CD8 Тклетками, тогда как для PVRIG и PD1, аналогичная или более высокая экспрессия наблюдалась на CD8 Т-клетках по сравнению с Treg (фиг. 27Е). Затем авторы проанализировали совместную регуляцию PVRIG, TIGIT и PD-1 в популяциях Т-клеток путем корреляционного анализа либо уровня экспрессии на TIL ex vivo, либо величины кратности изменения экспрессии между опухолью и НСТ. В обоих анализах CD4 и CD8 Т-клетки продемонстрировали положительную и значимую корреляцию между PVRIG и PD1 или TIGIT (фиг. 34F). В своей совокупности, эти данные демонстрируют, что PVRIG экспрессируется на Т-клетках и NK-клетках от множества раковых заболеваний человека, что делает PVRIG новой мишенью ингибирующего рецептора, которая может быть критически важной для регуляции функции Т-клеток в опухоли.

Экспрессия PVRL2 повышается в опухолевой ткани по сравнению с нормальной соседней тканью.

Поскольку было продемонстрировано, что экспрессия PD-L1 помогает спрогнозировать ответ на лечение ингибиторами PD-1, авторы исследовали, была ли экспрессия PVRL2 сопутствующей с экспрессией его родственного рецептора, PVRIG, в тканях рака человека. Применяя антитело к PVRL2, которое авторы валидировали для применения при ИГХ (фиг. 35А), авторы окрашивали опухолевые микроматрицы (ТМА), состоящие из тканей рака легкого, толстой кишки, кожи, молочной железы, яичника/эндометрия и почки. За исключением почки, экспрессия PVRL2 отсутствовала или отмечалась минимальной в большинстве нормальных тканей этих органов. В опухолевых тканях, PVRL2 индуцировался в значительном количестве образцов рака легкого, толстой кишки, кожи, молочной железы и яичника/эндометрия (фиг. 28А). Экспрессия PVRL2 была обнаружена на опухолевых клетках и на иммунных клетках инвазивной фронтальной поверхности опухоли (фиг. 28В). С целью определения подмножеств специфических иммунных клеток, экспрессирующих PVRL2, авторы провели проточную цитометрию на недавно рассеченных опухолях. В соответствии с профилем экспрессии при ИГХ, экспрессия PVRL2 была обнаружена на CD45+ иммунных клетках, в частности, миелоидных клетках (например, CD14+ ассоциированные с опухолью макрофаги (ТАМ) и миелоидные DC) и на CD45’неиммунных клетках из множества типов опухолей (фиг. 28С, D). На лимфоцитах какой-либо экспрессии PVRL2 обнаружено не было (данные не продемонстрированы). Сравнение экспрессии PVRL2 на CD45^- клетках и ТАМ, выделенных из опухолей толстой кишки, легкого, почки, эндометрия и яичника, продемонстрировало значимую индукцию PVRL2 на клетках, выделенных из опухоли, по сравнению с клетками, выделенными из соответствующих нормальных соседних тканей (НСТ) того же донора (фиг. 36D). Чтобы оценить, какие опухоли экспрессировали как PVRIG, так и PVRL2, авторы исследовали экспрессию PVRIG на лимфоцитах по сравнению с PVRL2 на миелоидных клетках и на CD45^- клетках из множества типов опухолей. Из проанализированных типов рака, рак эндометрия, легкого и почки характеризовался наивысшей частотой PVRIG^b“^c лимфоцитов и PVRL2^b“^c ТАМ или CD45^- неиммунных клеток (фиг. 28Е, фиг. 37). Эти данные демонстрируют, что путь PVRIG-PVRL2 может быть особенно важен для модулирования противоопухолевого ответа путем регулирования взаимодействия Т-клетка - ТАМ и взаимодействия Т-клетка - опухолевая клетка при раке эндометрия, легкого и почки.

По сравнению с PD-L1, экспрессия PVRL2 дифференциально регулируется и присутствует в PD-L1опухолях.

Поскольку PVRIG и PD-1 могут совместно экспрессироваться на инфильтрирующих опухоль лимфоцитах (TIL), авторы также исследовали совместную экспрессию PVRL2 и PD-L1 в одной и той же опухоли путем окрашивания серийных срезов одного и того же ТМА. Все PD-L1-положительные опухоли также экспрессировали PVRL2, что указывает на некоторое перекрывание в регуляции этих 2 путей и

- 99 044486 дает обоснование для комбинирования ингибитора PVRIG с ингибиторами PD-1/PD-L1 (фиг. 29А). В PDLl-отрицательных опухолях, PVRL2 обнаруживали в большинстве этих опухолей при различных типах рака (фиг. 29А). Это свидетельствует о том, что экспрессия PVRL2 была более распространенной по сравнению с PD-L1 в некоторых опухолях, и что нацеливание на этот путь может быть особенно эффективным при PD-L1-отрицательных опухолях. Поскольку сообщается, что PD-L1 индуцируется в опухоли с помощью IFN-гамма как часть адаптационной модели резистентности (25), авторы дополнительно оценили регуляцию экспрессии PVR, PVRL2 и PD-L1 различными воспалительными стимулами на дендритных клетках, происходящих из костного мозга, и на линиях опухолевых эпителиальных клеток (фиг. 29D). Воздействие на незрелые BM-DC противовоспалительными сигналами обычно приводит к повышению уровня экспрессии PVR, PVRL2 и PD-L1, демонстрируя, что экспрессия PVR, PVRL2 и PD-L1 повышается при созревании DC. Напротив, воздействие IFN-γ на эпителиальные клетки повышало экспрессию PD-L1, но не влияло на высокую исходную экспрессию PVRL2 (фиг. 29Е). Сообщалось, что для PVRL2, из-за геномного стресса, повреждения ДНК и генов-супрессоров опухолевого роста (26) (27) дополнительно поддерживается дифференциальная регуляция экспрессии PVRL2 по сравнению с PD-L1. Таким образом, эти данные указывают на то, что PD-L1 и PVRL2 могут совместно регулироваться на антигенпрезентирующих клетках, таких как DC, а также могут дифференциально регулироваться посредством IFN-γ на эпителиальных клетках. Присутствие PVRL2 в PD-L1-отрицательных опухолях наталкивает на предположение о том, что нацеливание на этот путь может иметь потенциальную пользу у пациентов, которые не отвечают на терапию ингибиторами PD-1.

СНА.7.518.1.Н4 (S241P) представляет собой высокоаффинное гуманизированное моноклональное антитело к PVRIG, которое нарушает взаимодействие PVRIG с PVRL2.

С целью изучения функциональных последствий антагонизма взаимодействий PVRIG-PVRL2 человека, авторы сгенерировали высокоаффинное антагонистическое антитело анти-PVRIG СНА.7.518.1.Н4 (S241P), которое блокирует взаимодействие PVRIG с PVRL2. Это антитело селективно связывало клетки HEK293, эктопически экспрессирующие PVRIG человека или PVRIG яванского макака, а также связывало клетки Jurkat, которые эндогенно экспрессируют PVRIG с субнаномолярной аффинностью (фиг. 30A). В биохимических анализах, СНА.7.518.1.Н4 (S241P) блокировало взаимодействие PVRIG Fc с PVRL2+ HEK293 клетками (фиг. 30B), а также блокировало связывание PVRL2 Fc с PVRIG+ HEK293 клетками (фиг. 30C). Применяя это антитело, авторы наблюдали функциональный эффект антагонистического антитела анти-PVRIG в нескольких анализах Т-клеток. Искусственные антигенпрезентирующие клетки (аАРС), эктопически экспрессирующие антитело анти-CD3 на клеточной поверхности и PVRL2 человека, генерировали и совместно культивировали с первичными CD4 Т-клетками человека, в присутствии либо анти-PVRIG (CHA.7.518.1.H4 (S241P)), либо изотипического контроля. Экспрессия PVRIG индуцировалась на пролиферирующих CD4 Т-клетках при совместном культивировании с СНО анти-CD3 аАРС (фиг. 38А). Антагонизм PVRIG с СНА.7.518.1.Н4 (S241P) усиливал пролиферацию CD4 Т-клеток от множества доноров (фиг. 30D). Авторы также проанализировали эффект анти-PVRIG на двух линиях gp100-реактивных CD8 Т-клеток человека, которые были получены из меланомных опухолей. Эти линии Т-клеток по отдельности совместно культивировали с ААР, экспрессирующими HLA-A2 и PVRL2 (фиг. 38В), в присутствии изотипического контроля IgG или антител анти-PVRIG. Как отмечено в обеих линиях, антитело анти-PVRIG увеличивало продукцию IFN-γ и TNF-α на ~ 20-50%. При оценке ответа на дозу, антитело СНА.7.518.1.Н4 (S241P) демонстрировало однозначные наномолярные значения ЕС₅₀ во множестве анализов (фиг. 38С, D). Эти данные в совокупности демонстрируют, что антагонизм взаимодействий PVRIG-PVRL2 с СНА.7.518.1.Н4 (S241P) приводил к повышенной активации Т-клеток.

СНА.7.518.1.Н4 (S241P) в комбинации с ингибиторами TIGIT или PD-1 приводят к синергетическому усилению функции Т-клеток.

Комбинированная блокада PVRIG и TIGIT синергически повышает функцию CD4 Т-клеток в анализе совместного культивирования Т-клеток и дендритных клеток (15), что указывает на роль этого пути в регуляции взаимодействий Т-клетка - АРС. Об эффектах блокады PVRIG и TIGIT на CD8 Т-клетках в условиях совместного культивирования опухолевых клеток не сообщалось. Поскольку профилирование экспрессии клеток опухоли, полученной авторами, продемонстрировало экспрессию PVRL2 на CD45иммунных клетках, авторы дополнительно исследовали эффект нацеливания этого пути в совместных культурах Т-клетка - опухолевая клетка с помощью двух систем анализа Т-клеток. Сначала авторы провели совместное культивирование 2 линий CD8 Т-клеток, gp100 специфичных к опухолевому антигену, с линией клеток меланомы, MEL624, в присутствии антител анти-PVRIG, анти-TIGIT или изотипического контроля, по отдельности или в комбинации. Клетки MEL624 экспрессировали как PVR, так и PVLR2, а TIL-209 и TIL-463 экспрессировали PVRIG, TIGIT и PD-1 (фиг. 30F). На TIL-209, авторы наблюдали, что анти-PVRIG или анти-TIGIT по отдельности не повышали продукцию IFN-γ, в тоже время комбинация анти-PVRIG и анти-TIGIT синергетически повышала продукцию IFN-γ (фиг. 30G). На TIL463, авторы наблюдали, что анти-PVRIG или анти-TIGIT незначительно повышали продукцию IFN-γ, в тоже время комбинация анти-PVRIG и анти-TIGIT аддитивно повышала продукцию IFN-γ (фиг. 30G). В дополнительной системе анализа авторы применяли CMVpp65-реактивные CD8 Т-клетки в качестве мо

- 100 044486 дельной системы для изучения ответов Т-клеток человека. HLA-A2+ CMVpp65 CD8 Т -клетки размножали в присутствии CMVpp65 (495-503), при этом экспрессия PVRIG, TIGIT и PD-1 наблюдалась в День 10 (фиг. 30F). PVRIG экспрессировался на CMVpp65-специфичных CD8 Т-клетках с уровнем, аналогичным тому, который наблюдался в образцах рака человека (фиг. 27). В качестве клеток-мишеней авторы идентифицировали линии раковых клеток PD-L1^b“^c (Panc05.04) и PD-L1^HUЗK (Colo205) HLA-A2+, обе из которых экспрессировали одинаковые количества PVR и PVRL2 (фиг. 30F). Затем авторы осуществили совместное культивирование CMVpp65-реактивных Т-клеток с линиями опухолевых клеток HLA-A2+, вводя пептид рр65 (495-503), в присутствии блокирующих антител к PVRIG, TIGIT и/или PD-1. Авторы наблюдали, что анти-PVRIG Ab повышало продукцию IFN-γ на ~ 50% в совместной культуре с клетками Panc05.04 и минимально повышало продукцию IFN-γ в совместной культуре с Colo205 (фиг. 30H). Комбинация анти-TIGIT с анти-PVRIG Ab синергетически повышала продукцию IFN-γ на обеих линиях клеток-мишеней, что приводило к большему повышению уровня IFN-γ по сравнению с применением антитела к PD-1 отдельно (фиг. 30H). Комбинация анти-PVRIG и анти-PD-1 также приводила к синергетическому повышению продукции IFN-γ по сравнению с антителом, применяемым отдельно (фиг. 30I). В своей совокупности, эти данные наталкивают на предположение о мощной синергии при комбинированной блокаде PVRIG и TIGIT или PVRIG и PD1 для усиления активации CD8 Т-клеток человека при взаимодействии с опухолевыми клетками.

Дефицит PVRIG приводил к увеличению пролиферации Т-клеток и снижению темпа роста опухоли.

Несмотря на то что сообщалось о последовательности для PVRIG мыши и его взаимодействии с PVRL2 мыши, профиль экспрессии и иммуномодулирующая активность PVRIG мыши изучены недостаточно. Сначала авторы проанализировали экспрессию и транскрипт mPVRIG РНК в NK-, NKT- и Тклетках (фиг. 31А). Активированные CD8 Т-клетки мыши имели повышенные уровни транскриптов PVRIG с замедленной кинетикой индукции по сравнению с TIGIT (фиг. 31В). Авторы подтвердили, что этот рекомбинантный mPVRIG, связанный с белком mPVRL2 с помощью поверхностного плазмонного резонанса (SPR) и ИФА, выполнялся в нескольких ориентациях анализа (фиг. 39A-D). Авторы также наблюдали взаимодействие между mPVRIG и mPVR, хотя аффинность была примерно в 10 раз меньше, чем взаимодействие с mPVRL2 (фиг. 39Е). Для того, чтобы определить, PVR или PVRL2 является доминирующим лигандом для mPVRIG, авторы протестировали связывание PVRIG Fc мыши с клетками B16F10, которые экспрессируют PVR и PVRL2 (данные не продемонстрированы). PVRIG Fc продемонстрировал дозозависимое связывание с клетками B16F10, которое полностью аннулировалось после нокдауна PVRL2 siRNA в клетках B16F10 (фиг. 39F). Для сравнения, связывание слитого белка PVRIG Fc было незначительным, но устойчиво уменьшалось после нокдауна PVR (фиг. 39Е), что указывает на очень слабое взаимодействие между mPVRIG и mPVR. В своей совокупности, эти результаты демонстрируют, что у мышей PVRL2 является основным лигандом для PVRIG, как это имеет место у человека.

Чтобы определить роль PVRIG в иммунных реакциях, авторы сгенерировали мышей с дефицитом PVRIG С/') (фиг. 40). Мыши PVRIG^-/^- родились с ожидаемым менделевским отношением, не демонстрировали явного фенотипа до 10-месячного возраста и в 8-недельном возрасте имели сходную насыщенность лейкоцитарными клетками (периферическая и лимфоидная ткань) по сравнению с мышами дикого типа (фиг. 41). CD8 Т-клетки дикого типа (WT) и NK-клетки экспрессируют PVRIG, а на клетках PVRIG^/- экспрессию PVRIG не обнаруживали (фиг. 31С). Чтобы исследовать роль PVRIG в регуляции ответов Т-клеток мыши, авторы исследовали пролиферацию WT и PVRIG^-/^- Т-клеток в двух аналитических системах. WT или PVRIG^-/^- Т-клетки активировали иммобилизованным анти-CD3 в присутствии растворимого PVRL2 Fc или контрольного белка Fc. Растворимый PVRL2 Fc значимо ингибировал пролиферацию WT CD4+ Т-клеток, в отличие от пролиферации PVRIG^-/^- CD4+ Т-клеток (фиг. 31D), что наталкивает на предположение о том, что PVRIG^-/^- клеткам не хватает ингибирующего сигнала. Для того, чтобы оценить роль PVRIG мыши во взаимодействии CD8⁺ T - клеток с опухолевыми клетками, из мышей PVRIG^-/генерировали pmel TCR-трансгенных мышей, которые экспрессируют трансгенный TCR, специфичный для gp100₂₅_₃₃ (28). Активированные PVRIG^-/^- - или Pmel CD8+ Т - клетки культивировали совместно с меланомными опухолевыми клетками B16-Db/gp100, которые эндогенно экспрессируют PVRL2 (данные не продемонстрированы) и оценивали активацию и эффекторную функцию. PVRIG^-/^- pmel CD8⁺ T клетки продемонстрировали повышенную дегрануляцию и продукцию эффекторных цитокинов (IFN-γ и TNF-α) по сравнению с клетками WT (фиг. 31Е). Эти данные указывают на то, что PVRIG мыши ингибирует активацию и эффекторную функцию опухолеспецифических Т-клеток при совместном культивировании с опухолевыми клетками-мишенями PVRL2+.

Затем авторы изучили влияние дефицита PVRIG на рост опухоли в сингенной модели МС38. PVRIG^-/--мыши демонстрировали достоверно более низкий темп роста опухоли по сравнению с мышами WT (фиг. 32А-В). Кроме того, PVRIG^-/--мыши демонстрировали дополнительные противоопухолевые ответы после блокады PD-L1, начиная со дня 14, что отражалось в значимом ингибировании (р = 0,052) роста опухоли по сравнению с WT- или PVRIG^-/^-- мышами, получавшими анти-PD-L1, которым вводили изотипический контроль (фиг. 32С, D). Сопоставимо со снижением темпа роста опухоли, у PVRIG^-/^-мышей, получавших анти-PD-L1, было выявлено значимое увеличение количества IFN-γ⁺TNF-α⁺ эффек

- 101 044486 торных CD8 Т-клеток при стимуляции ex vivo по сравнению с мышами дикого типа, получавшими антиPD-L1, а также мышами PVRIG’/’, которым вводили изотипический контроль (фиг. 32Е). Кроме того, PVRIG’^/’-мыши, получавшие анти-PD-Ll, также имели повышенное количество эффекторных цитокинпродуцирующих CD8⁺-лимфоцитов, инфильтрирующих опухоль (TIL), по сравнению с мышами дикого типа, получавшими анти-PD-Ll, а также PVRIG’^/’-мышами, получавшими изотипический контроль (фиг. 32F). Транскриптомное профилирование CD45+ иммунных клеток из опухолей, собранных в середине эксперимента (день 18; мыши получили 2 дозы анти-PD-Ll или изотипический контроль), продемонстрировало, что генные сигнатуры для количеств TIL и цитотоксических TIL значимо усиливались у PVRIG-дефицитных мышей, получавших анти-PD-Ll, относительно их эквивалентов дикого типа (фиг. 32G-H). Значимые изменения в генах, опосредованных Т-клетками (GRZB, IFN-γ), наблюдались в группе PVRIG’/’ + анти-PD-Ll по сравнению с другими группами (дополнительная фиг. 42). В своей совокупности, эти данные демонстрируют, что дефицит PVRIG, особенно в комбинации с блокадой PD-L1, приводит к повышению активации Т-клеток и снижению темпов роста опухоли in vivo.

Антитело анти-mPVRIG ингибировало рост опухоли в комбинации с антителом PD-1 или дефицитом TIGIT.

После демонстрации того, что генетический дефицит PVRIG приводил к снижению темпов роста опухоли, авторы впоследствии осуществили попытку продемонстрировать, что опосредованное антителами ингибирование взаимодействия PVRIG-PVRL2 может повысить противоопухолевый иммунитет, в частности, в комбинации с ингибиторами PD1 или TIGIT, как было продемонстрировано согласно данным от человека in vitro. Чтобы оценить это, авторы сгенерировали антагонистическое антитело антиmPVRIG с высокой аффинностью. Показатели аффинности анти-mPVRIG mAb, определенные с помощью FACS, продемонстрировали субнаномолярное значение Kd (0,33 нМ на HEK293 mPVRIG, 0,39 нМ на клетках D10.G4.1), аналогично антителу СНА.7.518.1.Н4 (S241P) (фиг. 39F-G). Специфичность этого антитела была дополнительно подтверждена, поскольку связывания с клетками D10.G4.1 преимущественно отмечалось после нокдауна mPVRIG (фиг. 39Н). Антитело анти-mPVRIG тестировали на нарушение взаимодействия mPVRIG-mPVRL2 по ингибированию связывания mPVRIG Fc с B16F10 и связывания mPVRL2 Fc с mPVRIG-сверхэкспрессирующими клетками HEK293 (фиг. 33A). Полное блокирование взаимодействия PVRIG-PVRL2 антителом анти-mPVRIG наблюдалось в обоих форматах анализа (фиг. 33A, фиг. 39I), демонстрируя антагонистическое антитело анти-mPVRIG. Далее, авторы протестировали эффективность блокады mPVRIG in vivo в подкожной модели сингенной опухоли толстой кишки СТ26. Экспрессия PVRIG была повышенной на NK- и Т-клетках в микроокружении опухоли по сравнению с соответствующими подгруппами селезеночных или дренирующих лимфатических узлов (фиг. 33В). Лечение мышей с опухолями с помощью монотерапии mAb, блокирующим mPVRIG, не приводило к снижению темпа роста опухоли (данные не продемонстрированы). Тем не менее, комбинация антиPVRIG и анти-PD-L1 mAb эффективно задерживала рост опухоли СТ26 (фиг. 33С) и значимо увеличивала выживаемость пролеченных мышей с частотой полного ответа на терапию - 40% (фиг. 33D). В соответствии с полученными авторами данными анализа Т-клеток человека, эти данные демонстрируют, что комбинация ингибиторов PD-1 и PVRIG может снизить темп роста опухоли.

Авторы также проанализировали эффект абляции сигналов PVRIG и TIGIT в регуляции противоопухолевых ответов. Для этих исследований авторы проанализировали эффективность антитела антиmPVRIG у мышей WT или TIGIT’/’, которым инокулировали клетки меланомы B16F10/Db-hmgp100. Введение мышам WT с опухолью антитела mAb, блокирующего mPVRIG, имело незначительный эффект по сравнению с применением изотипического контроля (17% TGI в день 11 и 8% TGI на момент оценки основных определяемых параметров в исследовании, день 18). Влияние делеции TIGIT на рост опухоли также было незначительным по сравнению с контрольной группой WT (17% TGI в день 11 и 13% TGI на момент оценки основных определяемых параметров в исследовании). Однако, когда делеция TIGIT сочеталась с применением анти-PVRIG mAb, наблюдалось значимое ингибирование роста опухоли (63% в день 11 и 49% TGI на момент оценки основных определяемых параметров в исследовании (фиг. 33E, F). В соответствии с ингибированием роста опухоли, мыши TIGIT’/’, получавшие анти-PVRIG mAb 407, демонстрировали повышенную выживаемость по сравнению с контрольной группой WT, однако статистическая значимость не была достигнута в этой модели агрессивной быстро растущей опухоли (данные не продемонстрированы). В своей совокупности, эти данные демонстрируют синергетическую активность ингибиторов PVRIG с ингибиторами PD1 или TIGIT и соответствуют полученным авторами функциональным данным человека, предоставляя обоснование для клинических исследований СНА.7.518.1.Н4 (S241P) с ингибиторами PD1 или TIGIT.

Обсуждение.

Несмотря на то что антитела, нацеленные на контрольные точки иммунных Т-клеток, такие как CTLA4 и PD-1, повышают выживаемость пациентов с раком, большинство пациентов с раком все еще не получают от таких препаратов клинической пользы. Одной из возможных причин этого является наличие дополнительных регуляторов Т-клеток, которые ингибируют противоопухолевый иммунитет Т-клеток. В этом примере авторы выясняли роль PVRIG в регуляции эффекторных функций Т-клеток и продемонстрировали, что антагонизм PVRIG повышает противоопухолевые ответы Т-клеток и снижает темпы роста

- 102 044486 опухолей.

PVRIG - это новый представитель семейства нектинов и нектиноподобных агентов, относящих его к ряду известных иммунорегуляторных рецепторов в этом семействе. Понимание взаимодействия рецепторов в этом семействе имеет решающее значение для понимания ценности и механизма действия PVRIG. Из этих рецепторов, DNAM, TIGIT и CD96 наиболее тесно связаны с PVRIG с точки зрения совместного взаимодействия с одними и теми же лигандами, PVR и PVRL2. DNAM связывается как с PVR, так и с PVRL2 и доставляет костимулирующий сигнал лимфоцитам. Сообщается, что TIGIT связывается с PVR и слабо связывается с PVRL2. Авторы не смогли обнаружить взаимодействие между TIGIT и PVRL2 с помощью ИФА или SPR (данные не продемонстрированы), что свидетельствует о том, что PVR является доминирующим лигандом для TIGIT. С помощью аналогичных методов, авторами самостоятельно и согласно недавнему отчету, было обнаружено взаимодействие с высокой аффинностью между PVRL2 и PVRIG, что наталкивает на предположение о том, что PVRIG является доминирующим ингибиторным рецептором для PVRL2. Эти данные позволяют предположить, что TIGIT и PVRIG содержат двойные сигнальные узлы на этой оси и что блокирование обоих белков необходимо для максимального повышения активации Т-клеток в этом семействе. Помимо взаимодействия с различными лигандами, авторы наблюдали, что PVRIG обладает самым высоким уровнем экспрессии на эффекторных Т-клетках или Т-клетках памяти, аналогично PD-1, тогда как TIGIT имеет самую высокую экспрессию на регуляторных Т-клетках. Кроме того, авторы наблюдали, что PVRIG проявлял позднюю индукцию после активации Т-клеток по сравнению с TIGIT. Эти данные позволяют предположить о том, что PVRIG играет уникальную роль в этом семействе, взаимодействуя с высокой аффинностью с PVRL2 и обладая дифференцированной экспрессией в клетках памяти и профилем поздней индукции для TIGIT.

В этом примере авторы также сообщают о новой роли PVRIG в регуляции противоопухолевых Тклеточных ответов с использованием мышей с дефицитом PVRIG и антагонистических антител антиPVRIG. Авторы демонстрируют, что PVRIG мыши экспрессировался на Т-клетках и NK-клетках, индуцируемых при активации лимфоцитов, и имел самый высокий уровень экспрессии в ТМЕ по сравнению с периферическими тканями. Кроме того, авторы демонстрируют, что дефицит PVRIG приводит к повышению функции Т-клеток in vitro и снижению темпов роста опухоли in vivo. Антагонистическое антитело к PVRIG снижало темпы роста опухоли в комбинации с αнтu-PD-L1 или генетическим дефицитом TIGIT, демонстрируя неотемлимую роль PVRIG в регуляции Т-клеточных ответов. Эти новые данные обеспечивают подтверждение концепции с применением доклинических моделей опухолей in vivo, в которых нацеливание на PVRIG в комбинации с антагонизмом PD1 или TIGIT является потенциальным новым способом лечения рака.

В этом примере авторы сообщают о высокоаффинном антителе против PVRIG человека, нарушающем взаимодействие PVRIG и PVRL2, которое авторы осуществляли для тестирования в клинических исследованиях. Чтобы определить потенциальные признаки рака, которые могли бы повлиять на отбор пациентов в клинических исследованиях, авторы проанализировали профиль экспрессии этой оси при раковых опухолях человека с помощью FACS и ИГХ. Для PVRIG, авторы наблюдали, что средний уровень экспрессии PVRIG на CD4 и CD8 Т-клетках, определенный с помощью FACS, был наиболее высоким при раке эндометрия, легкого, почки и яичника, хотя это различие не достигало статистической разницы с другими типами рака, что определяли посредством ANOVA с помощью критерия множественного сравнения Тьюки с рассматриваемым количеством образцов. Поскольку PVRIG индуцируется при активации Т-клеток и учитывая, что большинство инфильтрирующих опухоль Т-клеток являются коммитированными антигеном, очевидно, как и следовало ожидать, медиана экспрессии PVRIG была одинаковой в образцах опухоли и типах рака. Авторы наблюдали, что экспрессия PVRIG коррелировала с экспрессией PD-1 и TIGIT, наталкивая на предположение о том, что взаимодействие этих 3 ингибирующих рецепторов будет важным для регуляции противоопухолевого ответа. В этом сообщении авторы наблюдали более высокое синергетическое повышение функции Т-клеток при комбинации антител к PVRIG с антителами к TIGIT в совместной культуре опухолевых CD8 Т-клеток, по сравнению с комбинацией PD1 с ингибиторами PVRIG или TIGIT. Эти данные, наряду с предыдущим исследованием, демонстрирующим роль PVRIG и TIGIT в регуляции взаимодействий DC - Т-клетка, показывают, что этот путь может участвовать в регуляции взаимодействий Т-клетка - АРС и Т-клетка - опухолевая клетка, и предоставляют множество механизмов, с помощью которых нацеливание на PVRIG может повысить противоопухолевый иммунный ответ.

Поскольку экспрессия PD-L1 коррелировала с клиническим ответом на ингибиторы PD-1, авторы также проанализировали экспрессию PVRL2 в опухолях с помощью FACS и ИГХ, чтобы оценить, характеризуются ли определенные типы рака более высоким уровнем экспрессии. Оценивая клетки из рассеченной опухоли, авторы обнаружили, что средний уровень экспрессии PVRL2 на макрофагах из образцов опухолей эндометрия, головы и шеи, почки, легкого и яичника был выше по сравнению с другими типами опухолей. Средний уровень экспрессии PVRL2 на CD45^- неиммунных клетках был выше при раке молочной железы, колоректальной области, эндометрия, легкого, яичника и предстательной железы по сравнению с другими видами рака. На основании экспрессии PVRIG и PVRL2 авторы определили, что раковые опухоли эндометрия, головы и шеи, легкого, почки и яичника чаще характеризуются высокой

- 103 044486 экспрессией PVRIG и PVRL2, и что это потенциальные типы раковых опухолей, которые могут отвечать на терапию ингибиторами этого пути.

Авторы наблюдали, что экспрессия PVRL2 может модулироваться на антигенпродуцирующих клетках in vitro посредством медиаторов воспаления, тогда как экспрессия PVRL2 на раковых клетках не изменялась. Эти данные позволяют предположить, что экспрессия PVRL2 на антигенпрезентирующих клетках может регулироваться посредством воспаления и может быть индикатором воспаленной опухоли. Действительно, авторы наблюдали, что все PD-L1+ опухоли также экспрессируют PVRL2, как на опухолевых клетках, так и в иммунном компартменте. Экспрессия PVRL2 на миелоидных клетках может помочь спрогнозировать ответы на терапию ингибиторами PVRIG в комбинации с PD-1 или TIGIT для дополнительного усиления противоопухолевого эффекта. Представляет интерес тот факт, что часть PDL1-отрицательных опухолей также экспрессирует PVRL2, главным образом, на опухолевых клетках, а не на иммунных клетках. Сообщается, что экспрессия PVR и PVRL2 на эпителиальных клетках индуцируется в онкогенезе посредством xyz, а также в ответ на стресс и повреждение ДНК. Эти данные согласуются с выводами авторов in vitro, что регуляция экспрессии PVRL2 на опухолевых клетках не зависит от IFN-γ. Поскольку PD-L1 индуцируется в условиях адаптивной устойчивости в ответ на IFN-γ и является ассоциированным с воспалительным ответом, наличие экспрессии PVRL2 в отсутствие PD-L1 наталкивает на предположение, что экспрессия PVRL2 является более распространенной, чем PD-L1, и что PVRL2 экспрессируется в невоспаленных опухолях. Исходя из вышеизложенного, возможно, что присутствие PVR и PVRL2 способствуют подавлению иммунных ответов независимо от PD-L1, и что ингибиторы PVRIG и TIGIT могут иметь особое значение для пациентов, которые являются PD-L1отрицательными или не ответчиками/прогрессорами на терапию ингибиторами PD-1.

Таким образом, в этом сообщении представлено несколько новых идей о биологии PVRIG, включая характеристику экспрессии этой оси в раковых опухолях человека, с демонстрицией значимой роли PVRIG/TIGIT в регуляции взаимодействия CD8 с опухолевой клеткой, и показано, что антагонизм PVRIG в комбинации с ингибированием PD-1 или дефицитом TIGIT приводят к синергетическому снижению темпов роста опухоли. Эти данные расширяют существующее понимание биологии PVRIG и дают обоснование для клинических исследований СНА.7.518.1.Н4 (S241P), высокоаффинного антитела анти-PVRIG, у пациентов с раком.

Литература

1. Hanahan D, Weinberg RA. The hallmarks of cancer. Cell 2000; 100(1):57-70.

2. Hanahan D, Weinberg RA. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell

2011; 144(5):646-74 doi 10.1016/j.cell.2011.02.013.

3. Galon J, Mlecnik B, Bindea G, Angell HK, Berger A, Lagorce C, et al. Towards the introduction of the 'Immunoscore' in the classification of malignant tumours. J Pathol 2014;232(2): 199-209 doi 10.1002/path.4287.

4. Zitvogel L, Galluzzi L, Smyth MJ, Kroemer G. Mechanism of action of conventional and targeted anticancer therapies: reinstating immunosurveillance. Immunity 2013;39(l):74-88 doi 10.1016/j.immuni.2013.06.014.

5. Danilova L, Wang H, Sunshine J, Kaunitz GJ, Cottrell TR, Xu H, et al. Association of PD-l/PD-L axis expression with cytolytic activity, mutational load, and prognosis in melanoma and other solid tumors. Proc Natl Acad Sci U S A 2016; 113(48):E7769-E77 doi 10.1073/pnas. 1607836113.

6. Topalian SL, Taube JM, Anders RA, Pardoll DM. Mechanism-driven biomarkers to guide immune checkpoint blockade in cancer therapy. Nat Rev Cancer 2016; 16(5):275-87 doi 10.1038/nrc.2016.36.

7. Zarour HM. Reversing T-cell Dysfunction and Exhaustion in Cancer. Clin Cancer

Res 2016;22(8): 1856-64 doi 10.1158/1078-0432.CCR-15-1849.

8. Pardoll DM. The blockade of immune checkpoints in cancer immunotherapy. Nat

Rev Cancer 2012; 12(4):252-64 doi 10.1038/nrc3239.

9. Sharma P, Allison JP. Immune checkpoint targeting in cancer therapy: toward combination strategies with curative potential. Cell 2015; 161(2):205-14 doi

- 104 044486

10.1016/j.cell.2015.03.030.

10. Cha E, Klinger M, Hou Y, Cummings C, Ribas A, Faham M, et al. Improved survival with T cell clonotype stability after anti-CTLA-4 treatment in cancer patients. Sci Transl Med 2014;6(238):238ra70 doi 10.1126/scitranslmed.3008211.

11. Robert L, Tsoi J, Wang X, Emerson R, Hornet B, Chodon T, et al. CTLA4 blockade broadens the peripheral T-cell receptor repertoire. Clin Cancer Res 2014;20(9):2424-32 doi 10.1158/1078-0432.CCR-13-2648.

12. Tumeh PC, Harview CL, Yearley JH, Shintaku IP, Taylor EJ, Robert L, et al. PD1 blockade induces responses by inhibiting adaptive immune resistance. Nature 2014;515(7528):568-71 doi 10.1038/naturel3954.

13. Chan CJ, Andrews DM, Smyth MJ. Receptors that interact with nectin and nectinlike proteins in the immunosurveillance and immunotherapy of cancer. Curr Opin Immunol 2012;24(2):246-51 doi 10.1016/j.coi.2012.01.009.

14. Martinet L, Smyth MJ. Balancing natural killer cell activation through paired receptors. Nat Rev Immunol 2015;15(4):243-54 doi 10.1038/nri3799.

15. Zhu Y, Paniccia A, Schulick AC, Chen W, Koenig MR, Byers JT, et al. Identification of CD112R as a novel checkpoint for human T cells. J Exp Med 2016;213(2):16776 doi 10.1084/jem.20150785.

16. Bottino C, Castriconi R, Pende D, Rivera P, Nanni M, Camemolla B, et al. Identification of PVR (CD155) and Nectin-2 (CD112) as cell surface ligands for the human DNAM-1 (CD226) activating molecule. J Exp Med 2003; 198(4):557-67 doi 10.1084/jem.20030788.

17. Yu X, Harden K, Gonzalez LC, Francesco M, Chiang E, Irving B, et al. The surface protein TIGIT suppresses T cell activation by promoting the generation of mature immunoregulatory dendritic cells. Nat Immunol 2009; 10(1):48-57 doi 10.1038/ni.l674.

18. Stanietsky N, Simic H, Arapovic J, Toporik A, Levy O, Novik A, et al. The interaction of TIGIT with PVR and PVRL2 inhibits human NK cell cytotoxicity. Proc Natl Acad Sci U S A 2009;106(42): 17858-63 doi 10.1073/pnas.0903474106.

19. Johnston RJ, Comps-Agrar L, Hackney J, Yu X, Huseni M, Yang Y, et al. The immunoreceptor TIGIT regulates antitumor and antiviral CD8(+) T cell effector function. Cancer Cell 2014;26(6):923-37 doi 10.1016/j.ccell.2014.10.018.

20. Zhang B, Zhao W, Li H, Chen Y, Tian H, Li L, et al. Immunoreceptor TIGIT inhibits the cytotoxicity of human cytokine-induced killer cells by interacting with CD155. Cancer Immunol Immunother 2016;65(3):305-14 doi 10.1007/s00262-016-1799-4.

21. Chan CJ, Martinet L, Gilfillan S, Souza-Fonseca-Guimaraes F, Chow MT, Town

- 105 044486

L, et al. The receptors CD96 and CD226 oppose each other in the regulation of natural killer cell functions. Nat Immunol 2014;15(5):431-8 doi 10.1038/ni.2850.

22. Fuchs A, Celia M, Giurisato E, Shaw AS, Colonna M. Cutting edge: CD96 (tactile) promotes NK cell-target cell adhesion by interacting with the poliovirus receptor (CD155). J Immunol 2004; 172(7):3994-8.

23. Machienkin A, Uzana R, Frankenburg S, Eisenberg G, Eisenbach L, Pitcovski J, et al. Capture of tumor cell membranes by trogocytosis facilitates detection and isolation of tumor-specific functional CTLs. Cancer Res 2008;68(6):2006-13 doi 10.1158/0008-5472.CAN07-3119.

24. Ohtani H, Nakajima T, Akari H, Ishida T, Kimura A. Molecular evolution of immunoglobulin superfamily genes in primates. Immunogenetics 2011; 63 (7): 417-28 doi 10.1007/s00251-011-0519-7.

25. Taube JM, Anders RA, Young GD, Xu H, Sharma R, McMiller TL, et al. Colocalization of inflammatory response with B7-hl expression in human melanocytic lesions supports an adaptive resistance mechanism of immune escape. Sci Transl Med 2012;4(127):127ra37 doi 10.1126/scitranslmed.3003689.

26. Cerboni C, Fionda C, Soriani A, Zingoni A, Doria M, Cippitelli M, et al. The DNA Damage Response: A Common Pathway in the Regulation of NKG2D and DNAM-1 Ligand Expression in Normal, Infected, and Cancer Cells. Front Immunol 2014;4:508 doi 10.3389/fimmu. 2013.00508.

27. de Andrade LF, Smyth MJ, Martinet L. DNAM-1 control of natural killer cells functions through nectin and nectin-like proteins. Immunol Cell Biol 2014;92(3):237-44 doi 10.1038/icb.2013.95.

28. Overwijk WW, Tsung A, Irvine KR, Parkhurst MR, Goletz TJ, Tsung K, et al. gplOO/pmel 17 is a murine tumor rejection antigen: induction of self¹-reactive, tumoricidal T cells using high-affinity, altered peptide ligand. J Exp Med 1998; 188(2):277-86.

Пример 6: анализ уничтожения опухолевых клеток.

Влияние антитела против TIGIT человека и СНА.7.518.1.Н4 (S241P) на гибель опухолевых клеток, либо отдельно, либо в комбинации, оценивали с помощью анализа совместного культивирования in vitro с CMV-специфическим CD8+ Т-клетками человека. Линии клеток-мишеней HLA-A2+, использованные в анализе, представляли собой линию клеток меланомы, Mel624, которая стабильно экспрессирует PVR и PVRL2 человека, и линию клеток аденокарциномы поджелудочной железы, Panc05.04, которая экспрессирует эндогенные уровни PVR и PVRL2 человека. Обе линии опухолевых клеток стабильно трансдуцировали репортерным геном люциферазы посредством лентивирусной трансдукции (System Biosciences). В клетки Ме1624 и Panc05.04 вводили пептид CMV рр65 в концентрации 0,0033 мкг/мл или 0,01 мкг/мл при 37°C в течение 1 ч соответственно. Затем клетки промывали и высевали на планшеты в концентрации 20000 клеток/лунку. Эталонное антитело против TIGIT человека и СНА.7.518.1.Н4 (S241P) добавляли в культуру в комбинации, или с антителом изотипического контроля hIgG4 в концентрации 10 мкг/мл. CMV-специфичные CD8+ Т-клетки человека от трех разных доноров, указанных как Донор 4, Донор 72 и Донор 234, добавляли в концентрации 100000 клеток/лунку. Совместные культуры инкубировали при 37°C в течение 16 ч. После инкубации планшеты извлекали из инкубатора и оставляли уравновешиваться до комнатной температуры в течение 30 мин. В каждую лунку добавляли субстрат люциферазы Bio-Glo (Promega) и смесь уравновешивали в течение 10 мин при комнатной температуре в защищенном от света месте. Люминесцентные или относительные световые единицы (RLU) определяли количественно на мультимаркерном ридере En Vision (Perkin Elmer) со сверхчувствительным люминесцентным детектором. Процент специфического уничтожения рассчитывали как [(RLU для терапевтического антитела RLU только для среды)/RLU только для среды] х 100.

Результаты.

На фиг. 43А и В продемонстрирован эффект антитела анти-TIGIT и СНА.7.518.1.Н4 (S241P) на уничтожение клеток Ме1624 и Panc05.04, соответственно. При добавлении к одной только совместной культуре, как антитело анти-TIGIT, так и СНА.7.518.1.Н4 (S241P) индуцировали значимое уничтожение Т-клеток опухолевых клеточных линий по сравнению с антителом изотипического контроля. Для антитела анти-TIGIT процент специфического уничтожения варьировался от 19 до 41% для клеток Ме1624, и

- 106 044486 от 3 до 44% для клеток Panc05.04 у 3 различных протестированных CMV-реактивных доноров. Для СНА.7.518.1.Н4 (S241P) процент специфического уничтожения варьировался от 16 до 20% для клеток Ме1624, и от 0,21 до 29% для клеток Panc05.04. В некоторых случаях аддитивный эффект на уничтожение опухолевых клеток наблюдался при комбинированном воздействии антителом анти- TIGIT и СНА.7.518.1.Н4 (S241P).

Для того, чтобы определить, был ли эффект антитела анти-TIGIT и СНА.7.518.1.Н4 (S241P) на уничтожение опухолевых клеток дозозависимым, проводили анализ с серией 10-точечных, 2-кратных разведений для каждого антитела, начиная с 0,5 мкг/мл для антител анти-TIGIT и 10 мкг/мл для CHA.7.518.1.H4 (S241P) (фиг. 44). Уничтожение Ме1624 уменьшалось дозозависимым образом, когда либо антитело анти-TIGIT, ВМ26, либо СРА.9.086, комбинировали с CHA.7.518.1.H4 (S241P). Более сильное уничтожение наблюдалось при применении комбинации СРА.9.086 и CHA.7.518.1.H4 (S241P), со значением EC50, составляющем 0,40 ± 0,49 нМ, по сравнению с комбинацией ВМ26 и СНА.7.518.1.Н4 (S241P), со значением EC₅₀, составляющем 2,6 ± 1,7 нМ.

Пример 7: биофизическое измерение KD.

Эксперименты по равновесию KinExA проводили с помощью прибора KinExA 3200 (Sapidyne Instruments, Бойсе, штат Айдахо, США) при 22°C. Рекомбинантный His-меченый TIGIT человека получали от Sino Biologicals (Пекин, Китай) и восстанавливали в 1 X PBS. Все образцы антигенов и антител для анализов KinExA готовили в дегазированном буфере PBST (PBS с 0,05% твин-20) с 100 мкг/мл фильтрованного BSA и 0,02% азидом натрия. В качестве вторичного детектирующего антитела применяли козье антитело против IgG человека, меченное Alexa Flour 647 (H+L) (Jackson ImmunoResearch Laboratories), разведенное в 400-700 раз в буфере PBST (с BSA и азидом), как описано выше, из 0,5 мг/мл маточного раствора в 1 X PBS, рН 7,4. Для каждого эксперимента KinExA, ~ 20 мкг TIGIT человека разводили в 1 мл 50 мМ карбоната натрия, рН 9,2, который добавляли непосредственно к 50 мг гранул азлактона (Ultralink Support, Thermo Scientific, Рокфорд, штат Иллинойс, США) и встряхивали в течение ночи при 4°C. После встряхивания, гранулы промывали один раз 1 М буфером Трис, рН 8,5, содержащим 10 мг/мл BSA, и встряхивали в течение одного часа при комнатной температуре в том же буфере. Связанные гранулы добавляли в резервуар для гранул в приборе KinExA и разбавляли до ~ 30 мл 1 X HBS-N (0,01 М Hepes, 0,15 М NaCl, GE Healthcare), содержащим 0,02% азида натрия, который также являлся рабочим буфером для прибора KinExA. Все связанные с антигеном гарнулы применяли сразу после приготовления.

Для двух повторных измерений K_D для СРА.9.086 (табл. А), 14 концентраций TIGIT в диапазоне от 957 аМ до 212 пМ уравновешивали при комнатной температуре в течение ~ 72 ч с 2,5 пМ сайтов связывания СРА.9.086 и 1,8 пМ сайтов связывания СРА.9.086. Для СРА.9.083, 14 концентраций TIGIT в диапазоне от 478 аМ до 196 пМ уравновешивали в течение ~ 72 ч с 1,8 пМ сайтов связывания СРА.9.083. Для двойных измерений эталонного антитела, ВМ26 hIgG4, 14 концентраций TIGIT в диапазоне от 9,6 fM до 3,53 нМ уравновешивали в течение ~ 72 ч с помощью 20 пМ сайтов связывания ВМ26 и 8,0 пМ сайтов связывания ВМ26. Для СНА.9.547.13, 14 концентраций TIGIT в диапазоне от 10,5 fM до 2,2 нМ уравновешивали в течение ~ 72 ч с помощью 8 пМ сайтов связывания mAb СНА.9.547.13. Объем, протекающий через упаковку гранул для каждого уравновешенного образца для всех экспериментов, составлял от 4 мл до 11 мл при скорости потока 0,25 мл/мин. Данные подгоняли к модели связывания стандартное равновесие в соотношении 1:1 с помощью программного обеспечения KinExA Pro (версия 4.2.10; Sapidyne Instruments) для оценки KD и получения 95% доверительного интервала (ДИ) подгонки кривой.

Результаты.

Как СРА.9.083, так и СРА.9.086 связывались с TIGIT человека с фемтомолярной аффинностью связывания, тогда как СНА.9.547.13 и ВМ26 связывались с пикомолярной аффинностью связывания. Таким образом, СРА.9.083 и СРА.9.086 связываются с TIGIT человека с наибольшей аффинностью из четырех различных протестированных антител.

Таблица А

Измерения K_D для антител hIgG4 против TIGIT человека, определенные с помощью KinExA

Антитело	Kd ± 95% ДИ (n = 1)	Kd ± 95% ДИ (п = 2)
СНА.9.547.13	18,8 ±5,8 пМ	Не определено
СРА.9.083	694 ± 277 04	Не определено
СРА.9.086	553 ± 230 fM	665 ± 378 fM
ВМ26	8,2 ± 2,8 пМ	11,2±3,6пМ

Пример 8: исследование и функциональная характеристика СРА.9.086, нового терапевтического антитела, нацеливающегося на иммунную контрольную точку TIGIT.

Общие положения: TIGIT представляет собой коингибирующий рецептор, который в высокой степени экспрессируется в лимфоцитах, включая эффекторные и регуляторные CD4+ Т-клетки (Treg), эффекторные CD8+ Т-клетки и NK-клетки, которые проникают в различные типы опухолей. Взаимодейст

- 107 044486 вие TIGIT с его известными лигандами, рецептором полиовируса (PVR) и PVR-подобными белками (PVRL2 и PVRL3) непосредственно подавляет активацию лимфоцитов. PVR также широко экспрессируется в опухолях, наталкивая на предположение о том, что сигнальная ось TIGIT-PVR может быть доминирующим механизмом ускользания от иммунного ответа при раке. В данном примере авторы сообщают о биофизической и функциональной характеристике СРА.9.086, терапевтического антитела, нацеливающегося на TIGIT. Авторы также демонстрируют, что совместная блокада TIGIT и нового ингибитора контрольной точки, PVRIG, усиливает Т-клеточные ответы.

Материалы и методы. Для генерации терапевтических антител анти-TIGIT осуществлялись подходы по выявлению фагового дисплея человека и гибридомных антител мыши. Полученные антитела оценивали на их способность связываться с рекомбинантным и экспрессируемым на клеточной поверхности TIGIT человека с высокой аффинностью. Также исследовали перекрестную реактивность антител к TIGIT яванского макака и мыши. Подмножество антител, которые связываются с высокой аффинностью к TIGIT человека и перекрестно реагируют с TIGIT яванского макака, дополнительно характеризовали по их способности блокировать взаимодействие между TIGIT и PVR. Блокирующие антитела подвергали скринингу на их способность усиливать антиген-специфическую активацию Т-клеток in vitro либо отдельно, либо в комбинации с антителом анти-PVRIG, СНА.7.518.1.Н4 (S241P).

Результаты. Авторы идентифицировали основное антитело, СРА.9.086, которое связывается с TIGIT человека с высокой фемтомолярной аффинностью. Это антитело, связанное с TIGIT, эндогенно экспрессировалось на CD8+ Т-клетках человека с более высокой аффинностью, чем тестируемые эталонные антитела, и также перекрестно реагировало с TIGIT как яванского макака, так и мыши. При тестировании на активность in vitro, СРА.9.086 усиливало секрецию цитокинов и уничтожение опухолевых клеток CMV-специфическими CD8+ Т-клетками с превосходящей или эквивалентной эффективностью по сравнению с тестируемыми эталонными антителами. Комбинация СРА.9.086 с антителом анти-PD1 или СНА.7.518.1.Н4 (S241P) приводила к усилению активности CMV-специфичных CD8+ Т-клеток. Кроме того, авторы продемонстрировали, что TIGIT преимущественно экспрессируется на Treg и эффекторных CD8+ Т-клетках из твердых опухолей по сравнению с периферической кровью, наталкивая на предположение о том, что эти популяции, вероятно, будут преимущественной мишенью для СРА.9.086.

Заключение. Авторы описывают исследование антагонистического антитела к TIGIT с очень высокой аффинностью, СРА.9.086, которое в данное время находится на этапе доклинического исследования. Авторы теоретически допускают, что фемтомолярная аффинность СРА.9.086 может способствовать более низкой и менее частой дозировке у пациентов. СРА.9.086 может усиливать активацию Т-клеток человека отдельно или в комбинации с другими антителами контрольных точек. Таким образом, данные, полученные авторами, демонстрируют пользу нацеливания на TIGIT, PD1 и PVRIG для лечения рака.

Пример 9: анализ оси TIGIT/PVRIG при раке человека для подтверждения выбора показаний и биомаркеров для комбинированного лечения.

Общие положения: PVRIG и TIGIT идентифицировали с помощью платформы Predictive Discovery Compugen как иммуностимулирующие рецепторы, которые как сообщалось, ингибируют противоопухолевую активность. Авторы проводят клиническое исследование антагонистических антител к PVRIG (например, СНА7.518.1.Н4 (S241P)) и к TIGIT (например, СРА.9.083.Н4 (S241P)). В данном примере авторы проанализировали первичные раковые ткани и иммунные клетки человека, чтобы охарактеризовать экспрессию на оси TIGIT/PVRIG с целью подтверждения выбора показаний и стратегии комбинации для этих антител.

Методы: СНА7.518.1.Н4 (S241P) и СРА.9.083.Н4 (S241P) идентифицировали на основе способности блокировать взаимодействие PVRIG и TIGIT с их родственными лигандами (PVRL2 и PVR соответственно) и скринировали на их способность усиливать антиген-специфическая активацию CD8 Т-клеток в совместной культуре с линиями опухолевых клеток. Иммуногистохимию и проточную цитометрию проводили для оценки экспрессии рецептора/лиганда в рассеченных опухолях мочевого пузыря, молочной железы, колоректальной области, головы и шеи, легкого, почки, яичника, предстательной железы и желудка.

Результаты. Среди исследованных видов рака экспрессия PVRIG и PVRL2 была самой высокой при раке эндометрия, легкого, почки, яичника, а также головы и шеи по сравнению с нормальной соседней тканью. Из рассеченных опухолей, экспрессию PVRIG обнаруживали на Т- и NK- TIL, тогда как экспрессию PVRL2 обнаруживали на CD45 клетках и миелоидных клетках. Анализ совместной экспрессии PVRIG, TIGIT и PD1 продемонстрировал, что PVRIG коэкспрессировался как с TIGIT, так и с PD1, и что PVRIG+TIGIT+PD1+ клетки составляли основную долю CD8 TIL. По сравнению с PD-L1, экспрессия PVRL2 была более распространенной среди нескольких типов рака, b экспрессию PVRL2 обнаруживали в PD-L1-отрицательных образцах. In vitro, комбинация СНА7.518.1.Н4 (S241P) с ингибиторами PD1 или СРА.9.083.Н4 (S241P), усиливала продукцию CD8 цитокинов и цитотоксическую активность с трехкомпонентной комбинацией антител СНА7.518.1.Н4 (S241P), СРА.9.083.Н4 (S241P) и PD-1, обуславливающей наибольшее повышение функциональной активности. Несколько иммунных рецепторов индуцировались в ответ на блокаду PVRIG антителом СНА7.518.1.Н4 (S241P) на CD8 Т-клетках. В своей совокупности, эти данные подтверждают выбор показаний и стратегии комбинации для СНА7.518.1.Н4 (S241P)

- 108 044486 и СРА.9.083.Н4 (S241P) и потенциальных биомаркеров, которые могут быть индикаторами ответа на терапию.

Выводы. Таким образом, авторы продемонстрировали, что PVRIG и PVRL2 индуцируются в микроокружении опухоли при раке человека, и потенциал СНА7.518.1.Н4 (S241P) в качестве противоопухолевого терапевтического средства, либо в виде монотерапии, либо в виде двух- или трехкомпонентной комбинированной терапии с антителами, нацеленными на TIGIT и PD-1. Эти данные подчеркивают потенциал этого комбинированного подхода для расширения популяции пациентов с раком, которые будут отвечать на терапию ингибиторами контрольных точек, включая пациентов, которые не отвечает на терапию ингибиторами PD-1.

Пример 10: экспрессия PVRIG ассоциируется с истощением Т-клеток и синергизируется с TIGIT для ингибирования противоопухолевых реакций.

Резюме.

Используя уникальную вычислительную платформу для обнаружения, авторы определили новое семейство рецепторов контрольных точек, состоящее из 2 ингибирующих рецепторов в семействе нектинов, TIGIT и PVRIG. Как PVRIG, так и TIGIT экспрессируются при активации Т-клеток, но демонстрируют разницу в относительной экспрессии среди подмножеств Т-клеток и кинетике экспрессии. PVRIG связывается с PVRL2, тогда как TIGIT связывается с несколькими лигандами, среди которых авторы наблюдали, что PVR является доминирующим функциональным лигандом для TIGIT. Отличительный профиль экспрессии PVRIG и уникальное взаимодействие PVRIG-PVRL2 с высокой аффинностью позволяют предположить, что PVRIG играет уникальную роль в регуляции иммунитета. Используя новых мышей PVRIG’/’, авторы наблюдали, что генетический дефицит PVRIG приводил к повышению уровня Т-клеточных ответов и снижению темпов роста опухоли в доклинических моделях, демонстрируя потенциал нацеливания на этот путь при раке. С целью дополнительного определения клинической ниши антагониста PVRIG, авторы исследовали экспрессию осей TIGIT/PVRIG и PD-1 в образцах опухолей человека. Среди исследованных видов рака человека, экспрессия PVRIG и TIGIT на Т-клетках, полученных из опухолей, была наиболее высокой при раке эндометрия, легкого, почки и яичника. Анализ совместной экспрессии PVRIG, TIGIT и PD1 продемонстрировал, что PVRIG коррелировался и коэкспрессировался как с TIGIT, так и с PD1, и что PVRIG+TIGIT+PD1+ клетки составляли основную долю CD8 лимфоцитов, инфильтрирующих опухоль (TIL). Представляет интерес тот факт, что экспрессия PVRIG, а не TIGIT на CD8⁺ TIL ассоциировалась с истощенным фенотипом Eomes^высT-bet^низк. PVR, PVRL2 и PD-L1 также продемонстрировали тканеспецифические различия в относительном уровне экспрессии, при этом опухоли эндометрия и яичника имели более высоким коэффициентом экспрессии PVRL2 по отношению к PVR или PD-L1. Культура первичных TIL человека с антагонистическими антителами анти-PVRIG (СНА7.518.1.Н4 (S241P)) и анти-TIGIT (СРА.9.083.Н4 (S241P)) усиливала функцию Т-клеток до такой же или большей степени по сравнению с блокадой PD-1. См. фиг. с 54 по 60.

СНА7.518.1.Н4 (S241P) и СРА.9.083.Н4 (S241P) нацеливаются на PVRIG и TIGIT в семействе нектинов и нектиноподобных агентов: выводы PVRIG и TIGIT являются статически неопределимыми рецепторами контрольных точек и многообещающими мишенями для лечения рака.

В опухолях с более высоким уровнем PVRL2, чем PVR, взаимодействие PVRIG/PVRL2 может быть более доминирующим и требовать прямого нацеливания на PVRIG.

Пример 11: новые доклинические данные, демонстрирующие отличительные особенности пути PVRIG в иммуноонкологии и потенциал СНА7.518.1.Н4 (S241P) при лечении множественных твердых опухолей.

Данные дополнительно подтверждают обоснование Плана клинических исследований и стратегии биомаркеров для СНА7.518.1.Н4 (S241P).

СНА7.518.1.Н4 (S241P) является безопасным при применении в высоких дозах в исследовании токсичности GLP.

Приведены новые доклинические данные, демонстрирующие отличительные особенности пути PVRIG в иммунологической онкологии и потенциал СНА7.518.1.Н4 (S241P), первого в своем классе кандидата в терапевтические антитела, нацеленного на PVRIG при лечении множественных твердых опухолей. Данные, представленные на конференции Keystone Symposia Conference, A3: Т Cell Dysfunction, Cancer and Infection, которая состоялась 16-20 января 2018 года (приведены в примере 9 и на соответствующих фигурах), демонстрируют возможное доминирование оси PVRIG/TIGIT в иммуноонкологии и подтверждают обоснование Плана клинических исследований и стратегии биомаркеров для СНА7.518.1.Н4 (S241P) в качестве монотерапии и в комбинации с СРА.9.083.Н4 (S241P).

Постерный доклад под названием PVRIG Expression is Associated with T Cell Exhaustion and Synergizes with TIGIT to Inhibit Anti-Tumor Responses (постерный доклад № 2028) включает данные, демонстрирующие, что экспрессия PVRL2, лиганда PVRIG, является в большей степени доминирующим в некоторых типах опухолей, включая опухоли легкого, молочной железы, эндометрия и яичника, по сравнению с экспрессией PVR, лиганда для TIGIT. Эти результаты позволяют предположить, что PVRIG может быть доминирующей контрольной точкой в группах пациентов с опухолью, экспрессирующей повышенные уровни PVRL2, многие из которых не отвечают на терапию ингибиторами PD-1. Следовательно, эти

- 109 044486 пациенты могут иметь повышенную вероятность ответа на монотерапию антителом СНА7.518.1.Н4 (S241P).

Кроме того, исследования экспрессии демонстрируют, что PVRIG и TIGIT и их соответствующие лиганды обычно экспрессируются в типах опухолей, перечисленных выше, а также в клетках рака почки, а также головы и шеи, что указывает на то, что в группах пациентов, в которых активны два пути, блокада как TIGIT, так и PVRIG может быть необходимой для достаточной стимуляции противоопухолевого иммунного ответа. Кроме того, полученные данные также указывают на то, что истощенные TIL, обнаруженные при множественных типах опухолей, в значительной степени коэкспрессируют три тройные контрольные точки: TIGIT, PD-1 и PVRIG, что дополнительно подтверждает значимость тройной комбинации в таких группах пациентов.

Более полное понимание роли оси PVRIG-TIGIT и взаимодействия между различными компонентами оси также проливает свет на эволюцию пути PVRIG/PVRL2 при переходе от мыши к человеку, и выражается в меньшей активности указанного пути у мышей. Данные, полученные авторами, явно демонстрируют, что путем изучения биологии мыши относительно этого пути можно недооценить влияние, которое этот путь может оказать на противоопухолевый иммунитет человека, наталкивая на предположение о том, что СНА7.518.1.Н4 (S241P) может оказывать даже большее терапевтическое воздействие, чем наблюдаемое в доклинических исследованиях.

Потенциальное доминирование пути PVRIG и его взаимодействия с путями TIGIT и PD-1, продемонстрированное в наших доклинических исследованиях, в сочетании с профилями экспрессии, обеспечивает биологическое обоснование для подтверждения нашего клинического подхода к тестированию антитела СНА7.518.1.Н4 (S241P) при применении его в качестве монотерапии, а также в двух- и трехкомпонентной комбинации, поскольку авторы готовятся начать свое клиническое исследование Фазы 1b. При соблюдении дизайна исследования для всех пациентов, наша стратегия биомаркеров будет определяться этими профилями экспрессии, чтобы увеличить количество пациентов, наиболее склонных к ответу на терапию антителом СНА7.518.1.Н4 (S241P), -заявил Anat Cohen-Dayag, PhD, президент и генеральный директор компании Compugen. Мы также воодушевлены результатами исследования токсичности GLP для антитела СНА7.518.1.Н4 (S241P), которые продемонстрировали, что оно является безопасным при применении в высоких дозах. Наши данные позволяют нам предположить, что путь PVRIG и СНА7.518.1.Н4 (S241P), наше первое в своем классе терапевтическое антитело, могут иметь важное клиническое значение в качестве базиса для новой иммунотерапии рака с целью удовлетворения потребностей групп пациентов, нечувствительных или невосприимчивых к существующей терапии ингибиторами иммунных контрольных точек.

О СНА7.518.1.Н4 (S241P) и СРА.9.083.Н4 (S241P)

СНА7.518.1.Н4 (S241P) представляет собой гуманизированное гибридомное антитело, которое с высокой аффинностью связывается с PVRIG, новым кандидатом-мишенью В7/CD28-подобной иммунной контрольной точки, открытым компанией Compugen, что указывает на блокирование взаимодействия этой мишени с PVRL2. Блокада PVRIG с помощью СНА7.518.1.Н4 (S241P) продемонстрировала мощное воспроизводимое усиление активации Т-клеток, что согласуется с желаемым механизмом действия активации Т-клеток в микроокружении опухоли для генерации противоопухолевых иммунных ответов. Кроме того, антитело СНА7.518.1.Н4 (S241P) в комбинации с антагонистическими антителами антиPD-1 продемонстрировало синергетический эффект на стимуляцию Т-клеток человека, что указывает на потенциал этих комбинаций для дополнительного усиления иммунного ответа против опухолей.

СРА.9.083.Н4 (S241P), антитело от компании Compugen, нацеливающееся на TIGIT, было разработано для комбинированного применения с СНА7.518.1.Н4 (S241P). Доклинические данные убедительно подтверждают двойную блокаду двух отрицательных костимулирующих плеч оси: TIGIT и PVRIG, что приводит к более устойчивому ответу Т-клеток на антигенную стимуляцию и, следовательно, может обуславливать усиленный противоопухолевый иммунный ответ.

Пример 12: эффективность и выживаемость in vivo при применении трехкомпонентного комбинированного лечения.

Обоснование и цели.

Этот пример показывает, может ли комбинация блокады TIGIT, PVRIG и PD-L1 мыши значимо усилить ингибирование роста опухоли (TGI) и выживаемость в модели сингенной опухоли мыши.

Протоколы.

Животные.

Самки мышей 5-недельного возраста были приобретены в Charles River Laboratories. Мышей содержали в животноводческом комплексе Compugen USA с предоставлением пищи и воды ad libitum и акклиматизировали в течение минимум 6 дней до начала исследования. Все исследования были одобрены Институциональным комитетом по уходу и использованию животных в Compugen USA (Южный Сан-Франциско, штат Калифорния).

Модель сингенной опухоли мыши.

5x105 клеток карциномы толстой кишки СТ26 (АТСС) инокулировали подкожно (п/к) в правый фланк самок мышей Balb/c и выращивали в течение до 8 дней. Мыши с опухолями размером 30-60 мм³

- 110 044486 были рандомизированы (день рандомизации обозначен как день 0) на 3 группы по 10 мышей на группу. Животные получали внутрибрюшинную (в/бр) инъекцию 200 мкл либо антитела изотипического контроля IgG1 (mIgG1) мыши (обозначенного Synagis), либо двухкомпонентной комбинации антител антиTIGIT mIgG1 и анти-PVRIG mIgG1, либо трехкомпонентной комбинации антител анти-TIGIT mIgG1, анти-PVRIG mIgG1 и анти-PD-L1 mIgG1. Антитело анти-TIGIT mIgG1 представляет собой химерную версию СРА.9.086, которая содержит вариабельные тяжелые и легкие цепи СРА.9.086 и константную область mIgG1 человека. Антитела вводили в фиксированных дозах: 10 мг/кг анти-TIGIT, 10 мг/кг антиPVRIG и субоптимальная доза анти-PD-L1 3 мг/кг, начиная со дня 8, три раза в неделю в течение 2 недель. Рост опухоли определяли путем измерения штангенциркулем длины (L) и ширины (W); при этом размер опухоли рассчитывали по формуле (L х W2)/2. Размер опухоли не должен был превышать 2000 мм³, что было обозначено как основной определяемый параметр в исследовании, и мышей впоследствии подвергали эвтаназии.

Статистический анализ.

Двухфакторный анализ ANOVA с повторными измерениями с последующим двухфакторным анализом ANOVA с повторными измерениями для выбранных пар групп выполняли с помощью программного обеспечения prism. Анализы измерений роста опухоли проводили путем сравнения объемов опухоли, измеренных в последний день, в который все исследуемые животные были живы. Статистические различия в процентном отношении мышей без опухолей определяли с помощью логарифмического рангового критерия Мантеля-Кокса.

Результаты и резюме.

В этом исследовании изучалось влияние блокирования трех различных путей иммунных контрольных точек, TIGIT, PVRIG и PD-L1, на TGI и выживаемость у мышей. С помощью модели карциномы толстой кишки СТ26 мыши было продемонстрировано, что применение комбинации анти-TIGIT mIgGl с анти-PVRIG mIgGl обуславливало небольшое, но значимое TGI (20,7% TGI в день 25) по сравнению с мышами, которым вводили антитело изотипического контроля. При комбинировании трех антител, показатель TGI увеличился до 58,3% в день 25, что было статистически и значительно эффективнее по сравнению с двухкомпонентной комбинацией (р < 0,001 при двухфакторном анализе ANOVA в день 25). Хотя ни в одной из мышей к концу исследования (день 28) опухоль не исчезла (CR), повышенная эффективность при применении трехкомпонентной комбинации ассоциировалась с повышенной выживаемостью по сравнению с двухкомпонентной комбинацией. Тройная блокада продемонстрировала значимое повышение общей выживаемости с 90% выживанием на момент оценки основных определяемых параметров в исследовании (день 28). В дополнение к противоопухолевой эффективности, о которой сообщалось в данном документе, во всех наблюдаемых группах не отмечалось никаких значимых изменений массы тела (данные не продемонстрированы). В своей совокупности, эти данные демонстрируют, что трехкомпонентная комбинация хорошо переносилась и характеризовалась превосходным противоопухолевым эффектом при карциноме толстой кишки in vivo по сравнению с двухкомпонентной комбинацией блокаторов TIGIT и PVRIG. См. фиг. 61.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Применение трехкомпонентной комбинации, включающей антитело анти-TIGIT, антитело антиPVRIG и антитело анти-PD-1 для лечения рака.
2. Применение по п.1, отличающееся тем, что указанное антитело анти-TIGIT представляет собой антитело, выбранное из по меньшей мере одного из следующих антител: СРА.9.083.Н4 (S241P) (полноразмерная тяжелая цепь последовательности SEQ ID NO: 70; полноразмерная легкая цепь последовательности SEQ ID NO: 75), СРА.9.086.Н4 (S241P) (полноразмерная тяжелая цепь последовательности SEQ ID NO: 80; полноразмерная легкая цепь последовательности SEQ ID NO: 85), СНА.9.547.7.Н4 (S241P) (полноразмерная тяжелая цепь последовательности SEQ ID NO: 350; полноразмерная легкая цепь последовательности SEQ ID NO: 355) и СНА.9.547.13.Н4 (S241P) (полноразмерная тяжелая цепь последовательности SEQ ID NO: 480; полноразмерная легкая цепь последовательности SEQ ID NO: 485).
3. Применение по п.1 или 2, отличающееся тем, что указанное антитело анти-PVRIG представляет собой антитело, выбранное из по меньшей мере одного из следующих антител: СНА.7.518.1.Н4 (S241P) (полноразмерная тяжелая цепь последовательности SEQ ID NO: 1023; полноразмерная легкая цепь последовательности SEQ ID NO: 1028) и СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P) (полноразмерная тяжелая цепь последовательности SEQ ID NO: 1033; полноразмерная легкая цепь последовательности SEQ ID NO: 1038).
4. Применение по любому из пп.1-3, отличающееся тем, что указанное антитело анти-PD-1 представляет собой антитело, выбранное из по меньшей мере одного из пембролизумаба и ниволумаба.
5. Применение по любому из пп.1-4, отличающееся тем, что указанную трехкомпонентную комбинацию выбирают из

СРА.9.083.Н4 (S241P) (полноразмерная тяжелая цепь последовательности SEQ ID NO: 70; полноразмерная легкая цепь последовательности SEQ ID NO: 75), пембролизумаба и СНА.7.518.1.Н4 (S241P) (полноразмерная тяжелая цепь последовательности SEQ ID NO: 1023; полноразмерная легкая цепь по

- 111 044486 следовательности SEQ ID NO: 1028);

СРА.9.086.Н4 (S241P) (полноразмерная тяжелая цепь последовательности SEQ ID NO: 80; полноразмерная легкая цепь последовательности SEQ ID NO: 85), пембролизумаба и СНА.7.518.1.Н4 (S241P) (полноразмерная тяжелая цепь последовательности SEQ ID NO: 1023; полноразмерная легкая цепь последовательности SEQ ID NO: 1028);

СНА.9.547.7.Н4 (S241P) (полноразмерная тяжелая цепь последовательности SEQ ID NO: 350; полноразмерная легкая цепь последовательности SEQ ID NO: 355), пембролизумаба и СНА.7.518.1.Н4 (S241P) (полноразмерная тяжелая цепь последовательности SEQ ID NO: 1023; полноразмерная легкая цепь последовательности SEQ ID NO: 1028);

СНА.9.547.13.Н4 (S241P) (полноразмерная тяжелая цепь последовательности SEQ ID NO: 480; полноразмерная легкая цепь последовательности SEQ ID NO: 485), пембролизумаба и СНА.7.518.1.Н4 (S241P) (полноразмерная тяжелая цепь последовательности SEQ ID NO: 1023; полноразмерная легкая цепь последовательности SEQ ID NO: 1028);

СРА.9.083.Н4 (S241P) (полноразмерная тяжелая цепь последовательности SEQ ID NO: 70; полноразмерная легкая цепь последовательности SEQ ID NO: 75), пембролизумаба и СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P) (полноразмерная тяжелая цепь последовательности SEQ ID NO: 1033; полноразмерная легкая цепь последовательности SEQ ID NO: 1038);

СРА.9.086.Н4 (S241P) (полноразмерная тяжелая цепь последовательности SEQ ID NO: 80; полноразмерная легкая цепь последовательности SEQ ID NO: 85), пембролизумаба и СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P) (полноразмерная тяжелая цепь последовательности SEQ ID NO: 1033; полноразмерная легкая цепь последовательности SEQ ID NO: 1038);

СНА.9.547.7.Н4 (S241P) (полноразмерная тяжелая цепь последовательности SEQ ID NO: 350; полноразмерная легкая цепь последовательности SEQ ID NO: 355), пембролизумаба и СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P) (полноразмерная тяжелая цепь последовательности SEQ ID NO: 1033; полноразмерная легкая цепь последовательности SEQ ID NO: 1038);

СНА.9.547.13.Н4 (S241P) (полноразмерная тяжелая цепь последовательности SEQ ID NO: 480; полноразмерная легкая цепь последовательности SEQ ID NO: 485), пембролизумаба и СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P) (полноразмерная тяжелая цепь последовательности SEQ ID NO: 1033; полноразмерная легкая цепь последовательности SEQ ID NO: 1038);

СРА.9.083.Н4 (S241P) (полноразмерная тяжелая цепь последовательности SEQ ID NO: 70; полноразмерная легкая цепь последовательности SEQ ID NO: 75), ниволумаба и СНА.7.518.1.Н4 (S241P) (полноразмерная тяжелая цепь последовательности SEQ ID NO: 1023; полноразмерная легкая цепь последовательности SEQ ID NO: 1028);

СРА.9.086.Н4 (S241P) (полноразмерная тяжелая цепь последовательности SEQ ID NO: 80; полноразмерная легкая цепь последовательности SEQ ID NO: 85), ниволумаба и СНА.7.518.1.Н4 (S241P) (полноразмерная тяжелая цепь последовательности SEQ ID NO: 1023; полноразмерная легкая цепь последовательности SEQ ID NO: 1028);

СНА.9.547.7.Н4 (S241P) (полноразмерная тяжелая цепь последовательности SEQ ID NO: 350; полноразмерная легкая цепь последовательности SEQ ID NO: 355), ниволумаба и СНА.7.518.1.Н4 (S241P) (полноразмерная тяжелая цепь последовательности SEQ ID NO: 1023; полноразмерная легкая цепь последовательности SEQ ID NO: 1028);

СНА.9.547.13.Н4 (S241P) (полноразмерная тяжелая цепь последовательности SEQ ID NO: 480; полноразмерная легкая цепь последовательности SEQ ID NO: 485), ниволумаба и СНА.7.518.1.Н4 (S241P) (полноразмерная тяжелая цепь последовательности SEQ ID NO: 1023; полноразмерная легкая цепь последовательности SEQ ID NO: 1028);

СРА.9.083.Н4 (S241P) (полноразмерная тяжелая цепь последовательности SEQ ID NO: 70; полноразмерная легкая цепь последовательности SEQ ID NO: 75), ниволумаба и СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P) (полноразмерная тяжелая цепь последовательности SEQ ID NO: 1033; полноразмерная легкая цепь последовательности SEQ ID NO: 1038);

СРА.9.086.Н4 (S241P) (полноразмерная тяжелая цепь последовательности SEQ ID NO: 80; полноразмерная легкая цепь последовательности SEQ ID NO: 85), ниволумаба и СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P) (полноразмерная тяжелая цепь последовательности SEQ ID NO: 1033; полноразмерная легкая цепь последовательности SEQ ID NO: 1038);

СНА.9.547.7.Н4 (S241P) (полноразмерная тяжелая цепь последовательности SEQ ID NO: 350; полноразмерная легкая цепь последовательности SEQ ID NO: 355), ниволумаба и СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P) (полноразмерная тяжелая цепь последовательности SEQ ID NO: 1033; полноразмерная легкая цепь последовательности SEQ ID NO: 1038);

СНА.9.547.13.Н4 (S241P) (полноразмерная тяжелая цепь последовательности SEQ ID NO: 480; полноразмерная легкая цепь последовательности SEQ ID NO: 485), ниволумаба и СНА.7.538.1.2.Н4 (S241P) (полноразмерная тяжелая цепь последовательности SEQ ID NO: 1033; полноразмерная легкая цепь последовательности SEQ ID NO: 1038).
6. Применение по любому из пп.1-5, отличающееся тем, что указанные антитела вводят одновре

- 112 044486 менно.
7. Применение по п.6, отличающееся тем, что антитела вводят в виде отдельных инфузий или в виде одной инфузии смеси антител.
8. Применение по любому из пп.1-5, отличающееся тем, что указанные антитела вводят последовательно.
9. Применение по п.8, где антитела вводят последовательно в течение нескольких часов или дней.
10. Применение по любому из пп.1-9, отличающееся тем, что указанный рак выбирают из группы, состоящей из рака предстательной железы, рака печени (ГЦК), колоректального рака, рака яичника, рака эндометрия, рака молочной железы, трижды негативного рака молочной железы, рака поджелудочной железы, рака желудка (желудочного рака), рака шейки матки, рака головы и шеи, рака щитовидной железы, рака яичка, уротелиального рака, рака легкого (мелкоклеточного рака легкого, немелкоклеточного рака легкого), меланомы, немеланомного рака кожи (плоскоклеточного и базально-клеточного рака), глиомы, рака почки (ПКК), лимфомы (НХЛ или ХЛ), острого миелоидного лейкоза (ОМЛ), Т-клеточного острого лимфобластного лейкоза (Т-ОЛЛ), диффузной В-крупноклеточной лимфомы, герминогенных опухолей яичка, мезотелиомы, рака пищевода, рака из клеток Меркеля, рака с высоким уровнем MSI, KRAS-мутантных опухолей, Т-клеточного лейкоза/лимфомы взрослых и миелодиспластических синдромов (МДС).
11. Применение по любому из пп.1-10, отличающееся тем, что указанный рак выбирают из группы, состоящей из трижды негативного рака молочной железы, рака желудка (желудочного рака), рака легкого (мелкоклеточного рака легкого, немелкоклеточного рака легкого), рака из клеток Меркеля, рака с высоким уровнем микросателитов (MSI), KRAS-мутантных опухолей, Т-клеточного лейкоза/лимфомы взрослых и миелодиспластических синдромов (МДС).
12. Применение по любому из пп.1-11, отличающееся тем, что антитела обеспечиваются в наборе для введения с дозированными единицами каждого антитела, упакованными либо отдельно в разные дозированные единицы, либо вместе в виде смеси антител в одной дозированной единице.