JP2023532136A - 抗ｃｔｌａ－４結合タンパク質及びその使用方法 - Google Patents

抗ｃｔｌａ－４結合タンパク質及びその使用方法 Download PDF

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Abstract

本明細書では、ＣＴＬＡ－４並びにそのアイソフォーム及びホモログに選択的に結合する抗原結合タンパク質（ＡＢＰ）、並びにＡＢＰを含む組成物が提供される。治療及び診断方法などの、ＡＢＰを使用する方法も提供される。本明細書では、ＣＴＬＡ－４についての結合特異性を有する新規ＡＢＰ及びそのようなＡＢＰを使用する方法が提供される。ＡＢＰは、ヒトＣＴＬＡ－４（配列番号７００１）又はヒトＣＴＬＡ－４のフラグメントに特異的に結合する。

Description

１．関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年７月２日に出願された米国仮出願第６３／０４７，７８５号、及び２０２０年１０月２９日に出願された同第６３／１０７，３７６号に対する優先権の利益を主張し、これらの出願は参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。
２．配列表
本出願は、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介して提出された１２０８８配列を有する配列表を含み、ここに参照によってその全体が組み込まれる。２０２１年７月２日に作成された、当該ＡＳＣＩＩコピーは、「４９２２８ＷＯ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ」という名前が付けられ、サイズは１．８６メガバイトである。
３．技術分野
本明細書では、ＣＴＬＡ－４について結合特異性を有する抗原結合タンパク質（ＡＢＰ）、並びに薬学的組成物、診断組成物、及びキットを含む、そのようなＡＢＰを含む組成物が提供される。ＣＴＬＡ－４ ＡＢＰを作製する方法、並びにＣＴＬＡ－４ ＡＢＰを、例えば、治療目的、診断目的、及び研究目的で使用する方法も提供される。
４．背景技術
細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４及びＣＤ１５２（分化抗原群１５２）としても知られる、ＣＴＬＡ－４は、Ｔ細胞炎症活性を抑制する細胞表面受容体である。ＣＴＬＡ－４は、調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）によって構成的に発現され、刺激されたＴ細胞において上方調節される。樹状細胞（ＤＣ）などの抗原提示細胞（ＡＰＣ）においても発現される、ＣＤ８０及びＣＤ８６は、ＣＴＬＡ－４の一次リガンドである。ＣＴＬＡ－４とそのリガンドとの間の相互作用は、免疫応答を下方調節し、Ｔ細胞炎症活性を抑制することによって自己寛容を促進するために非常に重要である。この活性は、自己免疫疾患を予防するだけでなく、免疫系ががん細胞を殺滅するのを防止する。
ＣＴＬＡ－４は、活性化されたＴ細胞によって発現され、阻害性シグナルをＴ細胞に伝達する免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーである。ＣＴＬＡ－４は、ＣＤ２８よりも大きな親和性及び結合力でＣＤ８０及びＣＤ８６に結合し、よってそのリガンドについてＣＤ２８を打ち負かすことを可能にする。ＣＴＬＡ－４は、阻害性シグナルをＴ細胞に伝達するが、ＣＤ２８は、刺激性シグナルを伝達する。ＣＴＬＡ－４は、調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）にも見られ、それらの阻害機能に寄与する。Ｔ細胞受容体及びＣＤ２８を通したＴ細胞活性化は、ＣＴＬＡ－４の増加した発現をもたらす。ＣＴＬＡ－４がＴ細胞において作用するメカニズムには、いくらか議論の余地が残る。生化学的証拠は、ＣＴＬＡ－４がホスファターゼをＴ細胞受容体（ＴＣＲ）に動員し、よってシグナルを減衰させることを示した。この研究は、この最初の発表以来、文献では確認されないままである。より最近の研究は、ＣＴＬＡ－４が抗原提示細胞の膜からＢ７－１及びＢ７－２を捕捉及び除去し、よってこれらをＣＤ２８の誘発に利用不可能にすることによってインビボで機能し得ることを示した。
ＣＴＬＡ－４におけるバリアントは、インスリン依存的糖尿病、バセドウ病、橋本甲状腺炎、セリアック病、全身性エリテマトーデス、甲状腺関連眼窩障害、原発性胆汁性肝硬変、及び他の自己免疫疾患に関連している。ＣＤ８０及びＣＤ８６についてのＣＴＬＡ－４の比較的高い結合親和性は、それを自己免疫疾患の潜在的な療法としている。ＣＴＬＡ－４及び抗体の可溶性融合タンパク質（ＣＴＬＡ－４－Ｉｇ）は、リウマチ性関節炎の臨床試験で使用されている。
最近、ＣＴＬＡ－４抗体は、いくつかのタイプのがんを治療する効果がまちまちで使用されている。ＣＴＬＡ－４阻害剤は、ＣＴＬＡ－４のそのリガンドへの結合をアンタゴナイズし、それによって腫瘍を攻撃するように免疫系を活性化することが示されている。既知の抗ＣＴＬＡ－４療法の作用の現在のメカニズムは、チェックポイント阻害のためにＣＴＬＡ－４及びそのリガンド間の相互作用をブロックすることである。例えば、イピリムマブなどのＣＴＬＡ－４モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、当初、ＣＴＬＡ－４及びそのリガンド、Ｂ７タンパク質ＣＤ８０及びＣＤ８６との結合、すなわち、「チェックポイント阻害」をブロックすることが意図された。Ｂ７タンパク質へのＣＴＬＡ－４結合をブロックすることは、ＣＤ２８に結合し、Ｔ細胞共刺激及び活性化を誘発する、Ｂ７タンパク質を解放する。ＣＴＬＡ－４抗体はまた、腫瘍微小環境に特異的なＴｒｅｇの抗体依存的細胞媒介細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を誘発するために使用され、腫瘍に対する免疫寛容を低減する。よって、ＣＴＬＡ－４のそのＢ７リガンドとの相互作用をブロックすることに加えて、抗ＣＴＬＡ－４ ｍＡｂはまた、比較的高レベルの表面ＣＴＬＡ－４を発現する、腫瘍内ＦＯＸＰ３＋調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の抗体依存的細胞媒介細胞傷害性（ＡＤＣＣ）及び抗体依存的細胞食作用（ＡＤＣＰ）を誘発することができる。
よって、ＣＴＬＡ－４機能の阻害は、現在、様々な疾患についての最も有望な全身治療アプローチのうちの１つである。がん及び自己免疫疾患を含む、様々な疾患の治療、診断、及び研究に使用され得るＣＴＬＡ－４ ＡＢＰを開発する必要がある。
２０１９年１２月２７日に出願され、公開番号ＷＯ２０２０／１４００８４Ａ１として公開されたＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０６８８２０は、ＣＴＬＡ－４ ＡＢＰについて記載し、その出願は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
公開番号第２０２０／１４００８４号
５．発明の概要
本明細書では、ＣＴＬＡ－４についての結合特異性を有する新規ＡＢＰ及びそのようなＡＢＰを使用する方法が提供される。ＡＢＰは、ヒトＣＴＬＡ－４（配列番号７００１）又はヒトＣＴＬＡ－４のフラグメントに特異的に結合する。
特に、一態様では、本開示は、そのＣＤ８０／ＣＤ８６リガンドへのＣＴＬＡ－４結合をブロックする最小限の能力を有する新規ＣＴＬＡ－４モノクローナル抗体を提供するが、低減した毒性で優れた抗腫瘍活性を有する。抗ＣＴＬＡ４抗体は、ヒトＣＴＬＡ－４を発現するマウスモデルにおいて、より少ない末梢Ｔｒｅｇ増殖、及びより効率的な腫瘍内Ｔｒｅｇ枯渇を誘発することが示された。
本開示はまた、抗ＣＴＬＡ－４モノクローナル抗体が、他の既知の抗ＣＴＬＡ－４抗体（例えば、イピリムマブ）とは異なるエピトープでＣＴＬＡ－４に結合し、制限されたチェックポイント阻害剤活性を有し、よって弱いチェックポイント阻害剤であることを提供する。驚くべきことに、本明細書に提示される抗ＣＴＬＡ－４抗体の有効性は、腫瘍微小環境におけるＦｃＲ媒介Ｔｒｅｇ枯渇と関連していることが見出された。抗ＣＴＬＡ－４抗体はまた、より少ないＴｒｅｇ増殖を誘発し、インビトロＦｃＲシグナル伝達及び腫瘍内Ｔｒｅｇのインビボ枯渇を誘発する増加した能力を有する。本明細書に記載される実験結果は、弱いチェックポイント阻害剤の増強されたＦｃＲ活性が、その増強された抗腫瘍活性に寄与する可能性が高いことを示す。彼らはまた、弱いチェックポイント阻害がマウスモデルにおけるより低い毒性と関連していることを示す。
いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ－４に結合すると、ＡＢＰは、アミノ酸Ｋ１３０、Ｙ１３９、Ｌ１４１、Ｉ１４３と接触するが、ＣＴＬＡ－４のアミノ酸Ｒ７０とは接触しないか、若しくはＲ７０は、エネルギー的にＣＴＬＡ－４とＡＢＰとの間の相互作用への主要な寄与因子ではなく、かつ／又はＣＴＬＡ－４は、ＡＢＰに結合すると、ＣＤ８０／ＣＤ８６と会合することができ、かつ／又はＡＢＰとＣＴＬＡ－４のアミノ酸Ｌ７４Ａ及び／若しくはＥ６８との間の相互作用は、イピリムマブとＣＴＬＡ－４のアミノ酸Ｌ７４Ａとの間の相互作用より大きい。
いくつかの実施形態では、ＡＢＰは、配列番号１２０７８又は配列番号１０１４からなるＣＤＲ１－Ｌ、配列番号１２０７９又は配列番号２０１４からなるＣＤＲ２－Ｌ、配列番号１２０８０又は配列番号３０１４からなるＣＤＲ３－Ｌ、配列番号１２０７５又は配列番号４０１４からなるＣＤＲ１－Ｈ、配列番号１２０７６又は配列番号５０１４からなるＣＤＲ２－Ｈ、及び配列番号１２０７７又は配列番号６０１４からなるＣＤＲ３－Ｈを含む。いくつかの実施形態では、ＡＢＰは、配列番号１２００４からなるＣＤＲ１－Ｌ、配列番号１２０１４からなるＣＤＲ２－Ｌ、配列番号１２０２４からなるＣＤＲ３－Ｌ、配列番号１２０３９からなるＣＤＲ１－Ｈ、配列番号１２０４９からなるＣＤＲ２－Ｈ、及び配列番号１２０５９からなるＣＤＲ３－Ｈを含む。いくつかの実施形態では、ＡＢＰは、配列番号１２００５からなるＣＤＲ１－Ｌ、配列番号１２０１５からなるＣＤＲ２－Ｌ、配列番号１２０２５からなるＣＤＲ３－Ｌ、配列番号１２０４０からなるＣＤＲ１－Ｈ、配列番号１２０５０からなるＣＤＲ２－Ｈ、及び配列番号１２０６０からなるＣＤＲ３－Ｈを含む。いくつかの実施形態では、ＡＢＰは、配列番号１２００６からなるＣＤＲ１－Ｌ、配列番号１２０１６からなるＣＤＲ２－Ｌ、配列番号１２０２６からなるＣＤＲ３－Ｌ、配列番号１２０４１からなるＣＤＲ１－Ｈ、配列番号１２０５１からなるＣＤＲ２－Ｈ、及び配列番号１２０６１からなるＣＤＲ３－Ｈを含む。いくつかの実施形態では、ＡＢＰは、配列番号１２００７からなるＣＤＲ１－Ｌ、配列番号１２０１７からなるＣＤＲ２－Ｌ、配列番号１２０２７からなるＣＤＲ３－Ｌ、配列番号１２０４２からなるＣＤＲ１－Ｈ、配列番号１２０５２からなるＣＤＲ２－Ｈ、及び配列番号１２０６２からなるＣＤＲ３－Ｈを含む。いくつかの実施形態では、ＡＢＰは、配列番号１２００８からなるＣＤＲ１－Ｌ、配列番号１２０１８からなるＣＤＲ２－Ｌ、配列番号１２０２８からなるＣＤＲ３－Ｌ、配列番号１２０４３からなるＣＤＲ１－Ｈ、配列番号１２０５３からなるＣＤＲ２－Ｈ、及び配列番号１２０６３からなるＣＤＲ３－Ｈを含む。
いくつかの実施形態では、ＡＢＰは、配列番号１４と少なくとも９７％同一の配列を含む可変軽鎖（ＶＬ）、及び配列番号１１４と少なくとも９７％同一の配列を含む可変重鎖（ＶＨ）を含む。
いくつかの実施形態では、ＡＢＰは、ｓｃＦｖ又は完全長モノクローナル抗体を含む。いくつかの実施形態では、ＡＢＰは、免疫グロブリン定常領域を含む。
いくつかの実施形態では、ＡＢＰは、表面プラズモン共鳴によって測定された場合、５００ｎＭ未満のＫＤでヒトＣＴＬＡ－４に結合するか、又はＡＢＰは、表面プラズモン共鳴によって測定された場合、２００ｎＭ未満のＫＤでヒトＣＴＬＡ－４に結合するか、又はＡＢＰは、表面プラズモン共鳴によって測定された場合、２５ｎＭ未満のＫＤでヒトＣＴＬＡ－４に結合するか、又はＡＢＰは、２５ｎＭ未満のＫＤで細胞表面上のヒトＣＴＬＡ－４に結合する。
いくつかの実施形態では、ＡＢＰは、ＩｇＧ１ ＡＢＰである。いくつかの実施形態では、ＡＢＰは、ＩＧＨＧ１＊０１ヒト重鎖定常領域遺伝子セグメントを含む。いくつかの実施形態では、ＡＢＰは、ＩＭＧＴエキソンナンバリングによるアミノ酸位置９７（Ｒ９７）にリジンを含む。いくつかの実施形態では、ＡＢＰは、ＥＵナンバリングによるアミノ酸位置９７（Ｒ２１４）にリジンを含む。
いくつかの実施形態では、ＡＢＰは、低フコシル化Ｆｃ領域を含む。
いくつかの実施形態では、ＡＢＰは、細菌タンパク質ＲＭＤ（ＧＤＰ－６－デオキシ－Ｄ－リキソ－４－ヘキスロースレダクターゼ）又はその修飾を含む細胞から産生される。いくつかの実施形態では、細胞は、フコースの不在下で培養される。
いくつかの実施形態では、ＡＢＰは、Ｆｕｔ８の発現が欠如しているか、又は低減した細胞から産生される。いくつかの実施形態では、ＡＢＰは、フコシル化阻害剤、２－フルオロフコース（２ＦＦ）の存在下で培養された細胞から産生される。いくつかの実施形態では、ＡＢＰは、グリコシルトランスフェラーゼ（ＧｎＴＩＩＩ）を過剰発現する細胞から産生される。いくつかの実施形態では、ＡＢＰは、そのフコシル化状態に基づいて単離されている。
いくつかの実施形態では、ＡＢＰは、Ｆｃ部分のＮ－グリカンのコアフコシル化が欠如しているＦｃ領域を含む。いくつかの実施形態では、ＡＢＰは、低フコシル化モノクローナル抗体である。
本開示の態様はまた、本開示のＡＢＰ及び薬学的に許容される賦形剤を含む、薬学的組成物を含む。
いくつかの実施形態では、ＡＢＰの５０％未満がフコシル化されている。いくつかの実施形態では、ＡＢＰの４０％未満がフコシル化されている。いくつかの実施形態では、ＡＢＰの３０％未満がフコシル化されている。いくつかの実施形態では、ＡＢＰの２０％未満がフコシル化されている。いくつかの実施形態では、ＡＢＰの１０％未満がフコシル化されている。いくつかの実施形態では、ＡＢＰの３０％超がフコシル化されている。いくつかの実施形態では、ＡＢＰの４０％超がフコシル化されている。いくつかの実施形態では、ＡＢＰの５０％超がフコシル化されている。いくつかの実施形態では、ＡＢＰの６０％超がフコシル化されている。いくつかの実施形態では、ＡＢＰの７０％超がフコシル化されている。いくつかの実施形態では、ＡＢＰの８０％超がフコシル化されている。いくつかの実施形態では、ＡＢＰの９０％超がフコシル化されている。
いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、５．０～６．５のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、２０ｍＭのヒスチジン又はクエン酸塩緩衝液を含む。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、５０ｍＭのＮａＣｌを含む。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、１７０ｍＭ～２７０ｍＭの濃度でスクロースを含む。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、１７０ｍＭ又は２７０ｍＭのスクロースを含む。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、５ｍｇ／ｍＬ～２０ｍｇ／ｍＬのＡＢＰを含む。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、２０ｍｇ／ｍＬのＡＢＰを含む。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、５ｍｇ／ｍＬのＡＢＰを含む。
本開示の態様は、治療を必要とする対象に有効量の本開示のＡＢＰのいずれかのＡＢＰ又はその薬学的組成物を投与するステップを含む、疾患を治療する方法を提供する。
いくつかの実施形態では、疾患は、がん、ＡＩＤＳ、アルツハイマー病、及びウイルス又は細菌感染症からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、１つ以上の追加の治療剤を対象に投与するステップを更に含む。いくつかの実施形態では、追加の治療剤は、抗ＰＤ－Ｌ１、抗ＰＤ１、ＬＡＧ－３阻害剤、ＣＤ４７阻害剤、ＴＩＧＩＴ阻害剤、化学療法剤、免疫刺激剤、放射線、ＢＲＡＦ阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、ＰＩ３Ｋ阻害剤、サイトカイン、サイトカインをコードするポリヌクレオチド、サイトカインをコードする腫瘍溶解性ウイルス、及びそれらの組み合わせから選択される。
本開示の態様は、ＡＢＰをコードする単離されたポリヌクレオチドを含む。本開示の態様は、単離されたポリヌクレオチドを含むベクターを含む。本開示の態様は、本開示の単離されたポリヌクレオチド又はベクターを含む宿主細胞を提供する。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、細菌タンパク質ＲＭＤ（ＧＤＰ－６－デオキシ－Ｄ－リキソ－４－ヘキスロースレダクターゼ）を更に含む。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、フコースの不在下で培養される。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、Ｆｕｔ８の発現が欠如しているか、又は低減している。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、フコシル化阻害剤２－フルオロフコース（２ＦＦ）の存在下で培養される。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、グリコシルトランスフェラーゼ（ＧｎＴＩＩＩ）を過剰発現している。
本開示の態様は、ヒトＣＴＬＡ－４に特異的に結合する単離された抗原結合タンパク質（ＡＢＰ）を産生する方法であって、本開示の宿主細胞におけるＡＢＰの発現を誘発することと、ＡＢＰを単離することと、を含む、方法を提供する。
いくつかの実施形態では、ＡＢＰをそのフコシル化状態に基づいて単離するステップを更に含む。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、フコシル化阻害剤を含む培養培地中で培養される。いくつかの実施形態では、フコシル化阻害剤は、２－フルオロフコース（２ＦＦ）である。
有効用量のＡＢＰ又は薬学的組成物を投与することを含む、ＣＴＬＡ－４ＨＩ Ｔｒｅｇを、残りのＴｒｅｇの増殖が制限された対象において低減する方法が本開示に記載される。
いくつかの実施形態では、対象は、ヒト対象、任意に、ＲＣＣ（腎細胞がん）、ＮＳＣＬＣ（非小細胞肺がん）、メルケル細胞がん、ｃＳＣＣ、中皮腫、ＭＳＩ結腸直腸がん、卵巣がん、又は子宮頸がんを有するヒト対象である。
いくつかの実施形態では、１つ以上の追加の治療剤を対象に投与するステップを更に含む。いくつかの実施形態では、追加の治療剤は、抗ＰＤ－Ｌ１若しくは抗ＰＤ１又はそれらの組み合わせである。
別の態様では、本開示は、ヒト細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ－４）に特異的に結合する単離された抗原結合タンパク質（ＡＢＰ）を提供し、ＡＢＰは、（ａ）配列番号１２０７８からなるＣＤＲ１－Ｌ、配列番号１２０７９からなるＣＤＲ２－Ｌ、配列番号１２０８０からなるＣＤＲ３－Ｌ、配列番号１２０７５からなるＣＤＲ１－Ｈ、配列番号１２０７６からなるＣＤＲ２－Ｈ、及び配列番号１２０７７からなるＣＤＲ３－Ｈ、（ｂ）配列番号１０１４からなるＣＤＲ１－Ｌ、配列番号２０１４からなるＣＤＲ２－Ｌ、配列番号３０１４からなるＣＤＲ３－Ｌ、配列番号４０１４からなるＣＤＲ１－Ｈ、配列番号５０１４からなるＣＤＲ２－Ｈ、及び配列番号６０１４からなるＣＤＲ３－Ｈ、（ｃ）配列番号１２００４からなるＣＤＲ１－Ｌ、配列番号１２０１４からなるＣＤＲ２－Ｌ、配列番号１２０２４からなるＣＤＲ３－Ｌ、配列番号１２０３９からなるＣＤＲ１－Ｈ、配列番号１２０４９からなるＣＤＲ２－Ｈ、及び配列番号１２０５９からなるＣＤＲ３－Ｈ、（ｄ）配列番号１２００５からなるＣＤＲ１－Ｌ、配列番号１２０１５からなるＣＤＲ２－Ｌ、配列番号１２０２５からなるＣＤＲ３－Ｌ、配列番号１２０４０からなるＣＤＲ１－Ｈ、配列番号１２０５０からなるＣＤＲ２－Ｈ、及び配列番号１２０６０からなるＣＤＲ３－Ｈ、（ｅ）配列番号１２００６からなるＣＤＲ１－Ｌ、配列番号１２０１６からなるＣＤＲ２－Ｌ、配列番号１２０２６からなるＣＤＲ３－Ｌ、配列番号１２０４１からなるＣＤＲ１－Ｈ、配列番号１２０５１からなるＣＤＲ２－Ｈ、及び配列番号１２０６１からなるＣＤＲ３－Ｈ、（ｆ）配列番号１２００７からなるＣＤＲ１－Ｌ、配列番号１２０１７からなるＣＤＲ２－Ｌ、配列番号１２０２７からなるＣＤＲ３－Ｌ、配列番号１２０４２からなるＣＤＲ１－Ｈ、配列番号１２０５２からなるＣＤＲ２－Ｈ、及び配列番号１２０６２からなるＣＤＲ３－Ｈ、又は（ｇ）配列番号１２００８からなるＣＤＲ１－Ｌ、配列番号１２０１８からなるＣＤＲ２－Ｌ、配列番号１２０２８からなるＣＤＲ３－Ｌ、配列番号１２０４３からなるＣＤＲ１－Ｈ、配列番号１２０５３からなるＣＤＲ２－Ｈ、及び配列番号１２０６３からなるＣＤＲ３－Ｈを含む。
いくつかの実施形態では、ＡＢＰは、配列番号１４と少なくとも９７％同一の配列を含む可変軽鎖（ＶＬ）、及び配列番号１１４と少なくとも９７％同一の配列を含む可変重鎖（ＶＨ）を含む。
いくつかの実施形態では、ＡＢＰは、ｓｃＦｖ又は完全長モノクローナル抗体を含む。いくつかの実施形態では、ＡＢＰは、免疫グロブリン定常領域を含む。
いくつかの実施形態では、ＡＢＰは、表面プラズモン共鳴によって測定された場合、５００ｎＭ未満のＫＤでヒトＣＴＬＡ－４に結合するか、又はＡＢＰは、表面プラズモン共鳴によって測定された場合、２００ｎＭ未満のＫＤでヒトＣＴＬＡ－４に結合するか、又はＡＢＰは、表面プラズモン共鳴によって測定された場合、２５ｎＭ未満のＫＤでヒトＣＴＬＡ－４に結合するか、又はＡＢＰは、２５ｎＭ未満のＫＤで細胞表面上のヒトＣＴＬＡ－４に結合する。
いくつかの実施形態では、ＡＢＰは、ＩｇＧ１ ＡＢＰである。いくつかの実施形態では、ＡＢＰは、ＩＧＨＧ１＊０１ヒト重鎖定常領域遺伝子セグメントを含む。いくつかの実施形態では、ＡＢＰは、ＩＭＧＴエキソンナンバリングによるアミノ酸位置９７（Ｒ９７）にリジンを含む。いくつかの実施形態では、ＡＢＰは、ＥＵナンバリングによるアミノ酸位置９７（Ｒ２１４）にリジンを含む。
いくつかの実施形態では、ＡＢＰは、低フコシル化Ｆｃ領域を含む。
いくつかの実施形態では、ＡＢＰは、細菌タンパク質ＲＭＤ（ＧＤＰ－６－デオキシ－Ｄ－リキソ－４－ヘキスロースレダクターゼ）又はその修飾を含む細胞から産生される。いくつかの実施形態では、細胞は、フコースの不在下で培養される。いくつかの実施形態では、ＡＢＰは、Ｆｕｔ８の発現が欠如しているか、又は低減した細胞から産生される。いくつかの実施形態では、ＡＢＰは、フコシル化阻害剤、２－フルオロフコース（２ＦＦ）の存在下で培養された細胞から産生される。いくつかの実施形態では、ＡＢＰは、グリコシルトランスフェラーゼ（ＧｎＴＩＩＩ）を過剰発現する細胞から産生される。いくつかの実施形態では、ＡＢＰは、そのフコシル化状態に基づいて単離されている。
いくつかの実施形態では、ＡＢＰは、Ｆｃ部分のＮ－グリカンのコアフコシル化が欠如しているＦｃ領域を含む。いくつかの実施形態では、ＡＢＰは、低フコシル化モノクローナル抗体である。いくつかの実施形態では、低フコシル化Ｆｃ領域は、３０％未満のフコシル化を有し、３０％未満のフコシル化は、ＦｃｇＲＩＩＩ（Ｆｃガンマ受容体ＩＩＩ）シグナル伝達を増強する。いくつかの実施形態では、低フコシル化Ｆｃ領域は、３０％未満のフコシル化を有し、３０％未満のフコシル化は、ＦｃｇＲＩＩＩａ（Ｆｃガンマ受容体ＩＩＩａ）シグナル伝達を増強する。いくつかの実施形態では、低フコシル化Ｆｃ領域は、３０％未満のフコシル化を有し、３０％未満のフコシル化は、ＦｃｇＲ３ａによってコードされるタンパク質によってコードされるタンパク質を増強する。
本開示の態様は、本開示のＡＢＰ、及び薬学的に許容される賦形剤を含む、薬学的組成物を含む。
いくつかの実施形態では、ＡＢＰの５０％未満がフコシル化されている。いくつかの実施形態では、ＡＢＰの４０％未満がフコシル化されている。いくつかの実施形態では、ＡＢＰの３０％未満がフコシル化されている。いくつかの実施形態では、ＡＢＰの２０％未満がフコシル化されている。いくつかの実施形態では、ＡＢＰの１０％未満がフコシル化されている。いくつかの実施形態では、ＡＢＰの３０％超がフコシル化されている。いくつかの実施形態では、ＡＢＰの４０％超がフコシル化されている。いくつかの実施形態では、ＡＢＰの５０％超がフコシル化されている。いくつかの実施形態では、ＡＢＰの６０％超がフコシル化されている。いくつかの実施形態では、ＡＢＰの７０％超がフコシル化されている。いくつかの実施形態では、ＡＢＰの８０％超がフコシル化されている。いくつかの実施形態では、ＡＢＰの９０％超がフコシル化されている。
いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、５．０～６．５のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、２０ｍＭのヒスチジン又はクエン酸塩緩衝液を含む。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、５０ｍＭのＮａＣｌを含む。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、１７０ｍＭ～２７０ｍＭの濃度でスクロースを含む。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、１７０ｍＭ又は２７０ｍＭのスクロースを含む。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、５ｍｇ／ｍＬ～２０ｍｇ／ｍＬのＡＢＰを含む。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、２０ｍｇ／ｍＬのＡＢＰを含む。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、５ｍｇ／ｍＬのＡＢＰを含む。
本開示の態様は、治療を必要とする対象に有効量の本開示のＡＢＰのいずれかのＡＢＰ又はその薬学的組成物を投与するステップを含む、疾患を治療する方法を提供する。
いくつかの実施形態では、疾患は、がん、ＡＩＤＳ、アルツハイマー病、及びウイルス又は細菌感染症からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、１つ以上の追加の治療剤を対象に投与するステップを更に含む。いくつかの実施形態では、追加の治療剤は、抗ＰＤ－Ｌ１、抗ＰＤ１、ＬＡＧ－３阻害剤、ＣＤ４７阻害剤、ＴＩＧＩＴ阻害剤、化学療法剤、免疫刺激剤、放射線、ＢＲＡＦ阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、ＰＩ３Ｋ阻害剤、サイトカイン、サイトカインをコードするポリヌクレオチド、サイトカインをコードする腫瘍溶解性ウイルス、及びそれらの組み合わせから選択される。
本開示の態様は、ＡＢＰをコードする単離されたポリヌクレオチドを含む。本開示の態様は、単離されたポリヌクレオチドを含むベクターを含む。本開示の態様は、本開示の単離されたポリヌクレオチド又はベクターを含む宿主細胞を提供する。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、細菌タンパク質ＲＭＤ（ＧＤＰ－６－デオキシ－Ｄ－リキソ－４－ヘキスロースレダクターゼ）を更に含む。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、フコースの不在下で培養される。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、Ｆｕｔ８の発現が欠如しているか、又は低減している。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、フコシル化阻害剤２－フルオロフコース（２ＦＦ）の存在下で培養される。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、グリコシルトランスフェラーゼ（ＧｎＴＩＩＩ）を過剰発現している。
本開示の態様は、治療を必要とする対象に有効量の本開示のＡＢＰ又は薬学的組成物を投与するステップを含む、がんを治療する方法を提供する。いくつかの実施形態では、対象は、悪性腫瘍を有する。いくつかの実施形態では、投与されると、イピリムマブと比較して増加したＦｃ受容体（ＦｃＲ）シグナル伝達を含み、当該投与することは、対象におけるＣＴＬＡ－４ＨＩ Ｔｒｅｇの量を低減する。いくつかの実施形態では、当該投与することは、イピリムマブと比較して、対象における末梢Ｔｒｅｇの増殖を低減する。
いくつかの実施形態では、１つ以上の追加の治療剤を対象に投与するステップを更に含む。いくつかの実施形態では、追加の治療剤は、抗ＰＤ－Ｌ１、抗ＰＤ１、ＴＩＧＩＴ阻害剤、ＬＡＧ－３阻害剤、ＣＤ４７阻害剤、ＢＲＡＦ阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、ＰＩ３Ｋ阻害剤、化学療法剤、免疫刺激剤、放射線、サイトカイン、サイトカインをコードするポリヌクレオチド、サイトカインをコードする腫瘍溶解性ウイルス、及びそれらの組み合わせから選択される。
いくつかの実施形態では、ＡＢＰは、３０％未満のフコシル化を有する低フコシル化Ｆｃ領域を含み、３０％未満のフコシル化は、ＦｃｇＲＩＩＩシグナル伝達を増強する。いくつかの実施形態では、ＡＢＰは、３０％未満のフコシル化を有する低フコシル化Ｆｃ領域を含み、３０％未満のフコシル化は、ＦｃｇＲＩＩＩａシグナル伝達を増強する。いくつかの実施形態では、ＡＢＰは、７０％超のフコシル化を有するフコシル化Ｆｃ領域を含む。いくつかの実施形態では、低フコシル化Ｆｃ領域は、３０％未満のフコシル化を有し、３０％未満のフコシル化は、ＦｃｇＲ３ａによってコードされるタンパク質によってコードされるタンパク質を増強する。
本開示の態様は、ＡＢＰをコードする単離されたポリヌクレオチドを含む。本開示の態様は、単離されたポリヌクレオチドを含むベクターを含む。本開示の態様は、本開示の単離されたポリヌクレオチド又はベクターを含む宿主細胞を提供する。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、細菌タンパク質ＲＭＤ（ＧＤＰ－６－デオキシ－Ｄ－リキソ－４－ヘキスロースレダクターゼ）を更に含む。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、フコースの不在下で培養される。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、Ｆｕｔ８の発現が欠如しているか、又は低減している。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、フコシル化阻害剤２－フルオロフコース（２ＦＦ）の存在下で培養される。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、グリコシルトランスフェラーゼ（ＧｎＴＩＩＩ）を過剰発現している。
本開示の態様は、ヒトＣＴＬＡ－４に特異的に結合する単離された抗原結合タンパク質（ＡＢＰ）を産生する方法であって、本開示の宿主細胞におけるＡＢＰの発現を誘発することと、ＡＢＰを単離することと、を含み、ＡＢＰが、低フコシル化Ｆｃを含む、方法を提供する。
いくつかの実施形態では、ＡＢＰをそのフコシル化状態に基づいて単離するステップを更に含む。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、フコシル化阻害剤を含む培養培地中で培養される。いくつかの実施形態では、フコシル化阻害剤は、２－フルオロフコース（２ＦＦ）である。
別の態様では、本開示は、ＩＧＨＧ１＊０１ヒト重鎖定常領域遺伝子セグメントを含む、ヒト細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ－４）に特異的に結合する単離された抗原結合タンパク質（ＡＢＰ）を提供する。
いくつかの実施形態では、ＡＢＰは、（ａ）配列番号１２０７８からなるＣＤＲ１－Ｌ、配列番号１２０７９からなるＣＤＲ２－Ｌ、配列番号１２０８０からなるＣＤＲ３－Ｌ、配列番号１２０７５からなるＣＤＲ１－Ｈ、配列番号１２０７６からなるＣＤＲ２－Ｈ、及び配列番号１２０７７からなるＣＤＲ３－Ｈ、（ｂ）配列番号１０１４からなるＣＤＲ１－Ｌ、配列番号２０１４からなるＣＤＲ２－Ｌ、配列番号３０１４からなるＣＤＲ３－Ｌ、配列番号４０１４からなるＣＤＲ１－Ｈ、配列番号５０１４からなるＣＤＲ２－Ｈ、及び配列番号６０１４からなるＣＤＲ３－Ｈ、（ｃ）配列番号１２００４からなるＣＤＲ１－Ｌ、配列番号１２０１４からなるＣＤＲ２－Ｌ、配列番号１２０２４からなるＣＤＲ３－Ｌ、配列番号１２０３９からなるＣＤＲ１－Ｈ、配列番号１２０４９からなるＣＤＲ２－Ｈ、及び配列番号１２０５９からなるＣＤＲ３－Ｈ、（ｄ）配列番号１２００５からなるＣＤＲ１－Ｌ、配列番号１２０１５からなるＣＤＲ２－Ｌ、配列番号１２０２５からなるＣＤＲ３－Ｌ、配列番号１２０４０からなるＣＤＲ１－Ｈ、配列番号１２０５０からなるＣＤＲ２－Ｈ、及び配列番号１２０６０からなるＣＤＲ３－Ｈ、（ｅ）配列番号１２００６からなるＣＤＲ１－Ｌ、配列番号１２０１６からなるＣＤＲ２－Ｌ、配列番号１２０２６からなるＣＤＲ３－Ｌ、配列番号１２０４１からなるＣＤＲ１－Ｈ、配列番号１２０５１からなるＣＤＲ２－Ｈ、及び配列番号１２０６１からなるＣＤＲ３－Ｈ、（ｆ）配列番号１２００７からなるＣＤＲ１－Ｌ、配列番号１２０１７からなるＣＤＲ２－Ｌ、配列番号１２０２７からなるＣＤＲ３－Ｌ、配列番号１２０４２からなるＣＤＲ１－Ｈ、配列番号１２０５２からなるＣＤＲ２－Ｈ、及び配列番号１２０６２からなるＣＤＲ３－Ｈ、又は（ｇ）配列番号１２００８からなるＣＤＲ１－Ｌ、配列番号１２０１８からなるＣＤＲ２－Ｌ、配列番号１２０２８からなるＣＤＲ３－Ｌ、配列番号１２０４３からなるＣＤＲ１－Ｈ、配列番号１２０５３からなるＣＤＲ２－Ｈ、及び配列番号１２０６３からなるＣＤＲ３－Ｈを含む。いくつかの実施形態では、ＡＢＰは、配列番号１４と少なくとも９７％同一の配列を含む可変軽鎖（ＶＬ）、及び配列番号１１４と少なくとも９７％同一の配列を含む可変重鎖（ＶＨ）を含む。
いくつかの実施形態では、ＡＢＰは、（ａ）配列番号のいずれか１つからなるＣＤＲ１－Ｌ、配列番号１００１～１０２８のいずれか１つからなるＣＤＲ２－Ｌ、配列番号２００１～２０２８のいずれか１つからなるＣＤＲ３－Ｌ、配列番号のいずれか１つからなるＣＤＲ１－Ｈ、配列番号３００１～３０２８のいずれか１つからなるＣＤＲ２－Ｈを含む。いくつかの実施形態では、ＡＢＰは、配列番号１～２８のいずれか１つと少なくとも９７％同一の配列を含む可変軽鎖（ＶＬ）、及び配列番号１～１２８と少なくとも９７％同一の配列を含む可変重鎖（ＶＨ）を含む。
いくつかの実施形態では、ＡＢＰは、ＩＭＧＴエキソンナンバリングによるアミノ酸位置９７（Ｒ９７）にリジンを含む。いくつかの実施形態では、ＡＢＰは、ＥＵナンバリングによるアミノ酸位置９７（Ｒ２１４）にリジンを含む。いくつかの実施形態では、低フコシル化Ｆｃ領域を含む。いくつかの実施形態では、細菌タンパク質ＲＭＤ（ＧＤＰ－６－デオキシ－Ｄ－リキソ－４－ヘキスロースレダクターゼ）又はその修飾を含む細胞から産生される。いくつかの実施形態では、細胞は、フコースの不在下で培養される。いくつかの実施形態では、Ｆｕｔ８の発現が欠如しているか、又は低減した細胞から産生される。いくつかの実施形態では、フコシル化阻害剤、２－フルオロフコース（２ＦＦ）の存在下で培養された細胞から産生される。いくつかの実施形態では、グリコシルトランスフェラーゼ（ＧｎＴＩＩＩ）を過剰発現する細胞から産生される。いくつかの実施形態では、そのフコシル化状態に基づいて単離されている。いくつかの実施形態では、Ｆｃ部分のＮ－グリカンのコアフコシル化が欠如しているＦｃ領域を含む。いくつかの実施形態では、ＡＢＰは、低フコシル化モノクローナル抗体である。
本開示の態様は、本開示のＡＢＰ、及び薬学的に許容される賦形剤を含む、薬学的組成物を含む。
いくつかの実施形態では、ＡＢＰの５０％未満がフコシル化されている。いくつかの実施形態では、ＡＢＰの４０％未満がフコシル化されている。いくつかの実施形態では、ＡＢＰの３０％未満がフコシル化されている。いくつかの実施形態では、ＡＢＰの２０％未満がフコシル化されている。いくつかの実施形態では、ＡＢＰの１０％未満がフコシル化されている。いくつかの実施形態では、ＡＢＰの３０％超がフコシル化されている。いくつかの実施形態では、ＡＢＰの４０％超がフコシル化されている。いくつかの実施形態では、ＡＢＰの５０％超がフコシル化されている。いくつかの実施形態では、ＡＢＰの６０％超がフコシル化されている。いくつかの実施形態では、ＡＢＰの７０％超がフコシル化されている。いくつかの実施形態では、ＡＢＰの８０％超がフコシル化されている。いくつかの実施形態では、ＡＢＰの９０％超がフコシル化されている。
いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、５．０～６．５のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、２０ｍＭのヒスチジン又はクエン酸塩緩衝液を含む。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、５０ｍＭのＮａＣｌを含む。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、１７０ｍＭ～２７０ｍＭの濃度でスクロースを含む。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、１７０ｍＭ又は２７０ｍＭのスクロースを含む。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、５ｍｇ／ｍＬ～２０ｍｇ／ｍＬのＡＢＰを含む。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、２０ｍｇ／ｍＬのＡＢＰを含む。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、５ｍｇ／ｍＬのＡＢＰを含む。
本開示の態様は、治療を必要とする対象に有効量のＡＢＰ又は薬学的組成物を投与するステップを含む、疾患を治療する方法を提供する。
いくつかの実施形態では、疾患は、がん、ＡＩＤＳ、アルツハイマー病、及びウイルス又は細菌感染症からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、１つ以上の追加の治療剤を対象に投与するステップを更に含む。いくつかの実施形態では、追加の治療剤は、抗ＰＤ－Ｌ１、抗ＰＤ１、ＴＩＧＩＴ阻害剤、ＬＡＧ－３阻害剤、ＣＤ４７阻害剤、ＢＲＡＦ阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、ＰＩ３Ｋ阻害剤、化学療法剤、免疫刺激剤、放射線、サイトカイン、サイトカインをコードするポリヌクレオチド、サイトカインをコードする腫瘍溶解性ウイルス、及びそれらの組み合わせから選択される。
本開示の態様は、ＡＢＰをコードする単離されたポリヌクレオチドを含む。本開示の態様は、単離されたポリヌクレオチドを含むベクターを含む。本開示の態様は、本開示の単離されたポリヌクレオチド又はベクターを含む宿主細胞を提供する。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、細菌タンパク質ＲＭＤ（ＧＤＰ－６－デオキシ－Ｄ－リキソ－４－ヘキスロースレダクターゼ）を更に含む。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、フコースの不在下で培養される。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、Ｆｕｔ８の発現が欠如しているか、又は低減している。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、フコシル化阻害剤２－フルオロフコース（２ＦＦ）の存在下で培養される。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、グリコシルトランスフェラーゼ（ＧｎＴＩＩＩ）を過剰発現している。
本開示の態様は、ヒトＣＴＬＡ－４に特異的に結合する単離された抗原結合タンパク質（ＡＢＰ）を産生する方法であって、宿主細胞におけるＡＢＰの発現を誘発することと、ＡＢＰを単離することと、を含む、方法を提供する。
いくつかの実施形態では、ＡＢＰをそのフコシル化状態に基づいて単離するステップを更に含む。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、フコシル化阻害剤を含む培養培地中で培養される。いくつかの実施形態では、フコシル化阻害剤は、２－フルオロフコース（２ＦＦ）である。
本開示の態様は、有効用量のＡＢＰ又は薬学的組成物を投与することを含む、ＣＴＬＡ－４ＨＩ Ｔｒｅｇを、残りのＴｒｅｇの増殖が制限された対象において低減する方法を提供する。
いくつかの実施形態では、対象は、ヒト対象、任意に、黒色腫、ＲＣＣ（腎細胞がん）、ＮＳＣＬＣ（非小細胞肺がん）、メルケル細胞がん、ｃＳＣＣ、中皮腫、ＭＳＩ結腸直腸がん、卵巣がん、又は子宮頸がんを有するヒト対象である。いくつかの実施形態では、１つ以上の追加の治療剤を対象に投与するステップを更に含む。いくつかの実施形態では、追加の治療剤は、抗ＰＤ－Ｌ１若しくは抗ＰＤ１又はそれらの組み合わせである。いくつかの実施形態では、対象は、高レベルのＴｒｅｇ、高レベルのＣＴＬＡ－４、高レベルのＮＫ細胞、又は高レベルの活性化ＦｃＲを有する腫瘍を有する。
別の態様では、本開示は、ＩＧＨＧ１＊０１ヒト重鎖定常領域遺伝子セグメントを含む、抗原に特異的に結合する単離された抗原結合タンパク質（ＡＢＰ）を提供する。
いくつかの実施形態では、ＡＢＰは、ＩＭＧＴエキソンナンバリングによるアミノ酸位置９７（Ｒ９７）にリジンを含む。いくつかの実施形態では、ＡＢＰは、ＥＵナンバリングによるアミノ酸位置９７（Ｒ２１４）にリジンを含む。
いくつかの実施形態では、低フコシル化Ｆｃ領域を含む。いくつかの実施形態では、細菌タンパク質ＲＭＤ（ＧＤＰ－６－デオキシ－Ｄ－リキソ－４－ヘキスロースレダクターゼ）又はその修飾を含む細胞から産生される。いくつかの実施形態では、細胞は、フコースの不在下で培養される。いくつかの実施形態では、Ｆｕｔ８の発現が欠如しているか、又は低減した細胞から産生される。いくつかの実施形態では、フコシル化阻害剤、２－フルオロフコース（２ＦＦ）の存在下で培養された細胞から産生される。
いくつかの実施形態では、グリコシルトランスフェラーゼ（ＧｎＴＩＩＩ）を過剰発現する細胞から産生される。いくつかの実施形態では、そのフコシル化状態に基づいて単離されている。いくつかの実施形態では、Ｆｃ部分のＮ－グリカンのコアフコシル化が欠如しているＦｃ領域を含む。いくつかの実施形態では、ＡＢＰは、低フコシル化モノクローナル抗体である。
いくつかの実施形態では、ＡＢＰは、抗ＣＴＬＡ－４抗体又はその抗原結合フラグメント、抗ＰＤ－Ｌ１抗体又はその抗原結合フラグメント、抗ＰＤ１抗体又はその抗原結合フラグメント、ＴＩＧＩＴ抗体又はその抗原結合フラグメント、ＬＡＧ－３抗体又はその抗原結合フラグメント、ＣＤ４７抗体又はその抗原結合フラグメント、ＢＲＡＦ抗体又はその抗原結合フラグメント、ＭＥＫ抗体又はその抗原結合フラグメント、及びＰＩ３Ｋ抗体又はその抗原結合フラグメントから選択される。
いくつかの実施形態では、ＡＢＰは、（ａ）配列番号１２０７８からなるＣＤＲ１－Ｌ、配列番号１２０７９からなるＣＤＲ２－Ｌ、配列番号１２０８０からなるＣＤＲ３－Ｌ、配列番号１２０７５からなるＣＤＲ１－Ｈ、配列番号１２０７６からなるＣＤＲ２－Ｈ、及び配列番号１２０７７からなるＣＤＲ３－Ｈ、（ｂ）配列番号１０１４からなるＣＤＲ１－Ｌ、配列番号２０１４からなるＣＤＲ２－Ｌ、配列番号３０１４からなるＣＤＲ３－Ｌ、配列番号４０１４からなるＣＤＲ１－Ｈ、配列番号５０１４からなるＣＤＲ２－Ｈ、及び配列番号６０１４からなるＣＤＲ３－Ｈ、（ｃ）配列番号１２００４からなるＣＤＲ１－Ｌ、配列番号１２０１４からなるＣＤＲ２－Ｌ、配列番号１２０２４からなるＣＤＲ３－Ｌ、配列番号１２０３９からなるＣＤＲ１－Ｈ、配列番号１２０４９からなるＣＤＲ２－Ｈ、及び配列番号１２０５９からなるＣＤＲ３－Ｈ、（ｄ）配列番号１２００５からなるＣＤＲ１－Ｌ、配列番号１２０１５からなるＣＤＲ２－Ｌ、配列番号１２０２５からなるＣＤＲ３－Ｌ、配列番号１２０４０からなるＣＤＲ１－Ｈ、配列番号１２０５０からなるＣＤＲ２－Ｈ、及び配列番号１２０６０からなるＣＤＲ３－Ｈ、（ｅ）配列番号１２００６からなるＣＤＲ１－Ｌ、配列番号１２０１６からなるＣＤＲ２－Ｌ、配列番号１２０２６からなるＣＤＲ３－Ｌ、配列番号１２０４１からなるＣＤＲ１－Ｈ、配列番号１２０５１からなるＣＤＲ２－Ｈ、及び配列番号１２０６１からなるＣＤＲ３－Ｈ、（ｆ）配列番号１２００７からなるＣＤＲ１－Ｌ、配列番号１２０１７からなるＣＤＲ２－Ｌ、配列番号１２０２７からなるＣＤＲ３－Ｌ、配列番号１２０４２からなるＣＤＲ１－Ｈ、配列番号１２０５２からなるＣＤＲ２－Ｈ、及び配列番号１２０６２からなるＣＤＲ３－Ｈ、又は（ｇ）配列番号１２００８からなるＣＤＲ１－Ｌ、配列番号１２０１８からなるＣＤＲ２－Ｌ、配列番号１２０２８からなるＣＤＲ３－Ｌ、配列番号１２０４３からなるＣＤＲ１－Ｈ、配列番号１２０５３からなるＣＤＲ２－Ｈ、及び配列番号１２０６３からなるＣＤＲ３－Ｈを含む。
いくつかの実施形態では、ＡＢＰは、配列番号１４と少なくとも９７％同一の配列を含む可変軽鎖（ＶＬ）、及び配列番号１１４と少なくとも９７％同一の配列を含む可変重鎖（ＶＨ）を含む。
いくつかの実施形態では、ＡＢＰは、配列番号１２０８１のいずれか１つからなるＣＤＲ１－Ｌ、配列番号１２０８２からなるＣＤＲ２－Ｌ、配列番号１２０８３からなるＣＤＲ３－Ｌ、配列番号１２０８４からなるＣＤＲ１－Ｈ、配列番号１２０８５からなるＣＤＲ２－Ｈ、及び配列番号１２０８６からなるＣＤＲ３－Ｈを含む。
いくつかの実施形態では、ＡＢＰは、配列番号１２０８８と少なくとも９７％同一の配列を含む可変軽鎖（ＶＬ）、及び配列番号１２０８７と少なくとも９７％同一の配列を含む可変重鎖（ＶＨ）を含む。
いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、５．０～６．５のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、２０ｍＭのヒスチジン又はクエン酸塩緩衝液を含む。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、５０ｍＭのＮａＣｌを含む。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、１７０ｍＭ～２７０ｍＭの濃度でスクロースを含む。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、１７０ｍＭ又は２７０ｍＭのスクロースを含む。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、５ｍｇ／ｍＬ～２０ｍｇ／ｍＬのＡＢＰを含む。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、２０ｍｇ／ｍＬのＡＢＰを含む。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、５ｍｇ／ｍＬのＡＢＰを含む。
本開示の態様は、治療を必要とする対象に有効量のＡＢＰ又は薬学的組成物を投与するステップを含む、疾患を治療する方法を含む。
いくつかの実施形態では、疾患は、がん、ＡＩＤＳ、アルツハイマー病、及びウイルス又は細菌感染症からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、１つ以上の追加の治療剤を対象に投与するステップを更に含む。
いくつかの実施形態では、追加の治療剤は、化学療法剤、免疫刺激剤、放射線、サイトカイン、サイトカインをコードするポリヌクレオチド、サイトカインをコードする腫瘍溶解性ウイルス、及びそれらの組み合わせから選択される。
本開示の態様は、ＡＢＰをコードする単離されたポリヌクレオチドを含む。本開示の態様は、単離されたポリヌクレオチドを含むベクターを含む。本開示の態様は、本開示の単離されたポリヌクレオチド又はベクターを含む宿主細胞を提供する。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、細菌タンパク質ＲＭＤ（ＧＤＰ－６－デオキシ－Ｄ－リキソ－４－ヘキスロースレダクターゼ）を更に含む。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、フコースの不在下で培養される。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、Ｆｕｔ８の発現が欠如しているか、又は低減している。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、フコシル化阻害剤２－フルオロフコース（２ＦＦ）の存在下で培養される。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、グリコシルトランスフェラーゼ（ＧｎＴＩＩＩ）を過剰発現している。
本開示の態様は、ヒトＣＴＬＡ－４に特異的に結合する単離された抗原結合タンパク質（ＡＢＰ）を産生する方法であって、宿主細胞におけるＡＢＰの発現を誘発することと、ＡＢＰを単離することと、を含む、方法を提供する。
いくつかの実施形態では、ＡＢＰをそのフコシル化状態に基づいて単離するステップを更に含む。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、フコシル化阻害剤を含む培養培地中で培養される。いくつかの実施形態では、フコシル化阻害剤は、２－フルオロフコース（２ＦＦ）である。
本開示の態様は、有効用量のＡＢＰ又は薬学的組成物を投与することを含む、ＣＴＬＡ－４ＨＩ Ｔｒｅｇを、残りのＴｒｅｇの増殖が制限された対象において低減する方法を提供する。
いくつかの実施形態では、対象は、ヒト対象、任意に、黒色腫、ＲＣＣ（腎細胞がん）、ＮＳＣＬＣ（非小細胞肺がん）、メルケル細胞がん、ｃＳＣＣ、中皮腫、ＭＳＩ結腸直腸がん、卵巣がん、又は子宮頸がんを有するヒト対象である。
いくつかの実施形態では、１つ以上の追加の治療剤を対象に投与するステップを更に含む。いくつかの実施形態では、対象は、高レベルのＴｒｅｇ、高レベルのＣＴＬＡ－４、高レベルのＮＫ細胞、又は高レベルの活性化ＦｃＲを有する腫瘍を有する。
本開示の態様は、ＣＴＬＡ－４ＨＩ Ｔｒｅｇを、残りのＴｒｅｇの増殖が制限された対象において低減する方法であって、対象に有効用量のヒト細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ－４）に特異的に結合する抗原結合タンパク質（ＡＢＰ）を投与することを含む、方法を提供する。
いくつかの実施形態では、対象は、ヒト対象、任意に、黒色腫、ＲＣＣ（腎細胞がん）、ＮＳＣＬＣ（非小細胞肺がん）、メルケル細胞がん、ｃＳＣＣ、中皮腫、ＭＳＩ結腸直腸がん、卵巣がん、又は子宮頸がんを有するヒト対象である。
いくつかの実施形態では、１つ以上の追加の治療剤を対象に投与するステップを更に含む。
いくつかの実施形態では、ＡＢＰは、配列番号１４と少なくとも９７％同一の配列を含む可変軽鎖（ＶＬ）、及び配列番号１１４と少なくとも９７％同一の配列を含む可変重鎖（ＶＨ）を含む。
いくつかの実施形態では、ＡＢＰは、（ａ）配列番号のいずれか１つからなるＣＤＲ１－Ｌ、配列番号１００１～１０２８のいずれか１つからなるＣＤＲ２－Ｌ、配列番号３００１～３０２８のいずれか１つからなるＣＤＲ３－Ｌ、配列番号のいずれか１つからなるＣＤＲ１－Ｈ、配列番号３００１～３０２８のいずれか１つからなるＣＤＲ２－Ｈを含む。
いくつかの実施形態では、ＡＢＰは、配列番号１～２８のいずれか１つと少なくとも９７％同一の配列を含む可変軽鎖（ＶＬ）、及び配列番号１０１～１２８と少なくとも９７％同一の配列を含む可変重鎖（ＶＨ）を含む。
６．図面の簡単な説明
完全ヒトマウスから単離されたＢ細胞からｓｃＦｖライブラリーを生成し、抗原に対する親和性を有する抗体を発現するＢ細胞に由来する抗原に対する親和性を有するｓｃＦｖを発現する酵母を選択する方法を要約する。図１は、出現の順に、それぞれ、配列番号１１９７１～１１９９８を開示する。 ｓｃＦｖ増幅手順を示す。第一に、ＩｇＫ Ｃ領域、ＩｇＧ Ｃ領域、及び全てのＶ領域に対するプライマーの混合物は、ＩｇＫ及びＩｇＨを別々に増幅するために使用される。第二に、Ｖ－Ｈ及びＣ－Ｋプライマーは、ＩｇＫとＩｇＨとの間の融合産物であるオーバーラップ伸長アンプリコンの形成をもたらす相補性の領域を含む。相補性の領域は、Ｇｌｙ－ＳｅｒリッチｓｃＦｖリンカー配列をコードするＤＮＡ配列を含む。第三に、半ネステッドＰＣＲは、Ｉｌｌｕｍｉｎａシーケンシング又は酵母ディスプレイのためのアダプターを加えるために実施される。 それらのエピトープビンに選別されたモノクローナル抗体の概略図を含む。 ＰＢＳ又は抗ＣＴＬＡ－１ ＡＢＰで処理されたＭＣ３８腫瘍を有するｈＣＴＬＡ－４ ＫＩマウスの組織病理学的染色からのプロットを含む。プロットは、右腎臓からのＨ＆Ｅ（図４Ａ）、免疫グロブリン（Ｉｇ）（図４Ｂ及び図４Ｃ）、及びＣ３染色（図４Ｄ及び図４Ｅ）のスコアリングを示す。ｉｐｉは、イピリムマブであり、ＣＴＬＡ４．Ａ１４．２ａは、マウスＩｇＧ２ａバックボーンにクローニングされた抗体Ａ１４である。 同上。 同上。 同上。 同上。 ＭＣ３８腫瘍を有する処理されたｈＣＴＬＡ４ ＫＩマウスにおけるアルカリホスファターゼレベルを示すプロットを含む。ＩＰＩは、イピリムマブであり、ＣＴＬＡ４．Ａ１４．２ａは、マウスＩｇＧ２ａバックボーンにクローニングされた抗体Ａ１４である。Ｕ／Ｌは、１リットル当たりの単位である。 示された処理後の腫瘍内調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）細胞及び腫瘍内ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞のパーセンテージのプロットを含む。 示された処理を受けるｈＣＴＬＡ４マウスの体重における変化を示すプロットを含む。Ｉｐｉは、イピリムマブであり、ＣＴＬＡ４．Ａ１４．２ａは、マウスＩｇＧ２ａバックボーンにクローニングされた抗体Ａ１４である。エラーバーは、平均の＋／－標準誤差を表す。 ＣＤ３＋細胞（図８Ａ）、ＣＤ４＋細胞（図８Ｂ）、ＣＤ６９＋細胞（図８Ｃ）、ＩＣＯＳ＋細胞（図８Ｄ）、ＰＤ１＋細胞（図８Ｅ）、及びＦＯＸＰ３＋細胞（図８Ｆ）を含む、示された細胞集団のパーセンテージに対する対照、Ｉｐｉ、及び抗ＣＴＬＡ４処理の影響を示すプロットを含む。Ｉｐｉは、イピリムマブであり、ＣＴＬＡ４．Ａ１４．２ａは、マウスＩｇＧ２ａバックボーンにクローニングされた抗体Ａ１４である。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 ＣＤ８＋細胞（図９Ａ）、ＣＤ６９＋細胞（図９Ｂ）、ＩＣＯＳ＋細胞（図９Ｃ）、及びＰＤ１＋細胞（図９Ｄ）を含む、示された細胞集団のパーセンテージに対する対照、Ｉｐｉ、及び抗ＣＴＬＡ４処理の影響を示すプロットを含む。Ｉｐｉは、イピリムマブであり、ＣＴＬＡ４．Ａ１４．２ａは、マウスＩｇＧ２ａバックボーンにクローニングされた抗体Ａ１４である。 同上。 同上。 同上。 樹状細胞（ＤＣ）及び活性化された樹状細胞（ＣＤ８６＋）のパーセンテージに対する対照、Ｉｐｉ、及び抗ＣＴＬＡ４処理の影響を示すプロットを含む。Ｉｐｉは、イピリムマブであり、ＣＴＬＡ４．Ａ１４．２ａは、マウスＩｇＧ２ａバックボーンにクローニングされた抗体Ａ１４である。 ０．３ｍｇ／ｋｇの示された抗ＣＴＬＡ４での処理後の平均腫瘍体積を示すプロットを含む。 ＦｃＲエフェクター機能がマウスモデルにおけるイピリムマブの抗腫瘍有効性には必要であることを示す。図１２Ａ．プロットは、フローサイトメトリー（平均＋／－ＳＥＭ）によって決定されるＣＤ４４ＬｏＣＤ６２Ｌ＋である個々の対照（Ｃ５７ＢＬ／６）又はｈＣＴＬＡ４－ＫＩマウスのＬＮからのＣＤ４＋ＦＯＸＰ３－Ｔ細胞の頻度を示す。図１２Ｂ．ＭＣ３８腫瘍を担持するｈＣＴＬＡ－４ ＫＩマウスは、腫瘍が５０～１５１ｍｍ３（０日目）であるときに無作為し、５用量にわたって５ｍｇ／ｋｇの示された抗体で隔週で処理した。プロットは、示された抗体で処理された経時的なＭＣ３８腫瘍の腫瘍体積（平均±ＳＥＭ）を示す。３０００ｍｍ３を超える腫瘍負荷のために安楽死させたマウスからの腫瘍体積を繰り越した。細い縦線は、打ち切りデータを示す：細い灰色の縦線は、抗薬物抗体（ＡＤＡ）誘発過敏症のために投与後に失われた可能性が高い動物を示し、細い黒色の縦線は、腫瘍負荷のために安楽死させた動物を指し、これについてデータを繰り越した。Ｉｐｉアナログは、出願人によって産生及び精製されたイピリムマブｍＡｂを示し、Ｎ２９７Ｑは、抗体がＦｃエフェクター機能を無効にするために抗体のＦｃドメインにＮ２９７Ｑ変異を含むことを示す。アイソタイプ、ａＣＴＬＡ－４．２８、Ｉｐｉ－Ｎ２９７Ｑではｎ＝８であり、ｉｐｉアナログ及びａＣＴＬＡ－４．２８ではｎ＝７である。群間の腫瘍体積における変化について、Ｉｐｉアナログをアイソタイプと比較する場合はｐ＝０．０００４であり、ａＣＴＬＡ－４．２８をアイソタイプと比較する場合はｐ＝０．０００６である（線形混合効果モデル）。 同上。 ＧＩＧＡ－５６４がインビトロでＣＴＬＡ－４及びＣＤ８０／ＣＤ８６の相互作用をブロックする能力をほとんど有さないことを示す。図１３Ａ．ＣＤ８０又はＣＤ８６の結合をブロックするＣＴＬＡ－４ ｍＡｂの能力を、プレートベースのＥＬＩＳＡ方法を使用して測定した。ＣＴＬＡ－４を使用してプレートをコーティングし、その後抗体試料をインキュベートし、Ｈｉｓタグ付きＣＤ８０又はＣＤ８６を加え、ＣＴＬＡ－４に結合することができるリガンドの量を測定した。ＣＤ８０又はＣＤ８６がＣＴＬＡ－４に結合するのを防止するｍＡｂをブロックすることは、ＣＴＬＡ－４へのＣＤ８０又はＣＤ８６結合の欠如によって、吸光シグナルを低減する。弱ブロッキングｍＡｂは、ＣＤ８０又はＣＤ８６が結合するのを可能にし、全ての吸光シグナルの損失を防止する。図１３Ｂ．プロットは、（図１３Ａ）に記載されるようにＥＬＩＳＡによって評価されるように、イピリムマブ及びＣＴＬＡ－４．２８と比較して、ＣＴＬＡ－４とＢ７リガンドＣＤ８０及びＣＤ８６との間の相互作用をブロックするＧＩＧＡ－５６４の能力を示す。吸光度値は、抗ＰＤ－１対照（ペムブロリズマブ）に対して正規化され、２つの技術的複製の平均として示された。図１３Ｃ～１３Ｄ．ＣＴＬＡ－４結合を媒介する重要な残基は、ＣＴＬＡ－４のショットガン変異誘発、続いて結合の染色及びフローサイトメトリー評価によって、ＧＩＧＡ－５６４及びイピリムマブについて同定した。図１３Ｃ．イピリムマブとＧＩＧＡ－５６４との間で共有されるＣＴＬＡ－４エピトープ残基がオレンジに着色され、重要な差別化残基Ｒ７０が赤に着色（Ｐｙｍｏｌで可視化）された、ＣＤ８０（青色）とＣＴＬＡ－４（灰色）との間の複合体の結晶構造（タンパク質データベース［ＰＤＢ］１Ｉ８Ｌ）が示されている。加えて、Ｇ１４２は、ＧＩＧＡ－５６４ではなくイピリムマブのエピトープの二次残基として同定された。図１３Ｄ．これらのエピトープについて目的のＣＴＬＡ－４上の重要なアミノ酸、細胞ベースのアッセイにおいてＣＴＬＡ－４のＣＤ８０又はＣＤ８６への結合に重要であると変異分析によってわかったものを示す表は、それらのタンパク質のエピトープ残基を示すために灰色でマークされている。 同上。 同上。 同上。 ＧＩＧＡ－５６４がマウスモデルにおいて腫瘍成長を阻害することを示す。図１４Ａ．ＭＣ３８腫瘍を担持するｈＣＴＬＡ－４ ＫＩマウスは、腫瘍が５０～１５０ｍｍ３（０日目）であるときに無作為化し、５用量にわたって５ｍｇ／ｋｇの示された抗体で隔週で処理した。プロットは、示された抗体で処理された経時的なＭＣ３８腫瘍の腫瘍体積（平均±ＳＥＭ）を示す。３０００ｍｍ３を超える腫瘍負荷のために安楽死させたマウスからの腫瘍体積を繰り越した。細い灰色の縦線は、打ち切りデータ（ＡＤＡ誘発過敏症のために投与後に失われた可能性が高い動物）を示す。この実験は、図１２Ｂにも記載されている。ＧＩＧＡ－５６４ではｎ＝７であり、ビヒクル及び市販のイピリムマブではｎ＝６である。図１４Ｂ．ＲＭ－１腫瘍を担持するｈＣＴＬＡ－４ ＫＩマウスは、腫瘍が４０～１２５ｍｍ３（０日目）であるときに無作為化し、０、３、及び６日目に５ｍｇ／ｋｇの示された抗体で処理した。プロットは、示された抗体で処理された経時的なＲＭ－１腫瘍の腫瘍体積（平均±ＳＥＭ）を示す。３０００ｍｍ３を超える腫瘍負荷のために安楽死させたマウスからの腫瘍体積は、その群からのマウスが生存しなくなるまで繰り越した（細い黒色の縦線）。細い縦線は、打ち切りデータを示す。細い灰色の縦線は、イピリムマブ処理された群からの１匹のマウスを、腫瘍潰瘍のために安楽死させたことを示す。イピリムマブ及びＧＩＧＡ－５６４処理ではｎ＝１１であり、アイソタイプ処理ではｎ＝７である。図１４Ｃ（図１１にも示される）．ＭＣ３８腫瘍を担持するｈＣＴＬＡ－４ ＫＩマウスは、腫瘍が６５～１２５ｍｍ３（０日目）であるときに無作為化し、０、３、及び６日目に０．３ｍｇ／ｋｇの示された抗体で処理した。プロットは、示された抗体で処理された経時的なＭＣ３８腫瘍の腫瘍体積（平均±ＳＥＭ）を示す。３０００ｍｍ３を超える腫瘍負荷のために安楽死させたマウスからの腫瘍体積は、その群からのマウスが生存しなくなるまで繰り越した（細い黒色の縦線）。イピリムマブ及びＧＩＧＡ－５６４ではｎ＝１３であり、アイソタイプ処理動物ではｎ＝８である。Ｐ値は、縦方向に測定される腫瘍体積の変化における統計的に有意な差について示される（線形混合効果モデル）。 同上。 同上。 ＧＩＧＡ－５６４がより少ない末梢Ｔｒｅｇ増殖を誘発するが、腫瘍内Ｔｒｅｇの枯渇を強力に媒介することを示す。図１５Ａ．ｈＣＴＬＡ－４ ＫＩマウス（ｎ＝１２）を、０、３、及び６日目に５ｍｇ／ｋｇのｈＩｇＧ１アイソタイプ対照、イピリムマブ、又はＧＩＧＡ－５６４で処理し、７日目にフローサイトメトリー分析のために安楽死させた。ＧＩＧＡ－５６４群における２つの試料は、低い細胞数のために分析から除外された。Ｋｉ６７を発現する非流入領域（左前腋窩）リンパ節（ＬＮ）内のＣＤ８ Ｔ細胞（生、ＣＤ４５＋ＴＣＲβ＋ＣＤ８＋）、ＣＤ４ Ｔｃｏｎｖ（生、ＣＤ４５＋ＴＣＲβ＋ＣＤ４＋ＦＯＸＰ３－）、及びＴｒｅｇ（生、ＣＤ４５＋ＴＣＲβ＋ＣＤ４＋ＦＯＸＰ３＋）のパーセントを、フローサイトメトリーによって決定した（最初の３パネル）。右パネルは、イピリムマブ又はＧＩＧＡ－５６４処理マウスにおいてＫｉ６７を発現する各サブタイプの細胞のパーセントにおける倍率変化を、アイソタイプ対照処理群において発現するその細胞型の平均頻度と比較して示す。この右パネルでは、ｐ値は、多重ペアワイズ比較のために調整なしでマン－ホイットニー（ウィルコクソン）検定を使用して計算した。より少ない増殖Ｔｒｅｇは、患者においてイピリムマブと比較して有効性を更に増強し得る。図１５Ｂ～１５Ｅ．定着したＭＣ３８腫瘍を担持するｈＣＴＬＡ－４ ＫＩマウスを、無作為化し（ｎ＝６）、５ｍｇ／ｋｇのｈＩｇＧ１アイソタイプ対照、イピリムマブ、又はＧＩＧＡ－５６４で１回処理し、非流入領域ＬＮ及び腫瘍からの細胞を、翌日フローサイトメトリーによって分析した。図１５Ｂ．各処理群におけるＬＮ（左）及び腫瘍（右）中のＴｒｅｇ（ＣＤ４５＋細胞のパーセンテージとして）の頻度。図１５Ｃ．ＬＮ（左）及び腫瘍（右）中のＴｒｅｇにおけるＣＴＬＡ－４幾何平均蛍光強度（ＭＦＩ）。図１５Ｄ．各処理群におけるＣＤ４ Ｔ細胞の代表的な等高線プロット。Ｘ軸及びＹ軸は、それぞれ、ＦＯＸＰ３及びＣＴＬＡ－４に対応する。図１５Ｅ．ＬＮ（左）及び腫瘍（右）におけるＴｒｅｇに対するＣＤ８ Ｔ細胞の比。特に示されない限り、ｐ値は、ウィルコクソン順位和検定を使用して計算し、横線は、平均を示す。フローサイトメトリーは、ＧＩＧＡ－５６４が腫瘍微小環境におけるＣＴＬＡ－４＋ Ｔｒｅｇを枯渇させることにおいてイピリムマブよりも効率的であることを示した。図１５Ｄからのデータを図３２に再び示す。 同上。 同上。 同上。 同上。 ＧＩＧＡ－５６４がイピリムマブよりも多くのＦｃＲシグナル伝達を誘発することを示す。図１６Ａ～１６Ｄ．表面発現を増強するＹ２０１Ｇ変異を有するヒトＣＴＬＡ－４を発現する標的ＣＨＯ細胞を、イピリムマブ（黒色の四角）、ＧＩＧＡ－５６４（黒色の星）、又はＦｃγＲ結合を破壊するＬＡＬＡ－ＰＧ変異を有するＧＩＧＡ－５６４のバリアント（ＧＩＧＡ－５６４＿ＬＡＬＡ－ＰＧ、灰色の丸）の滴定系列とインキュベートした。次いで（図１６Ａ）マウスＦｃγＲＩＶ若しくはＦｃγＲＩＩＩ、（図１６Ｂ）ヒトＦｃγＲＩＩＩａ（高親和性Ｖ１５８若しくは低親和性Ｆ１５８バリアント）、（図１６Ｃ）ヒトＦｃγＲＩＩａ（高親和性Ｈ１３１若しくは低親和性Ｒ１３１バリアント）、又は（図１６Ｄ）ヒトＦｃγＲＩＩｂを有するＪｕｒｋａｔ／ＮＦＡＴ－Ｌｕｃエフェクター細胞を添加した。細胞を３７℃で６時間インキュベートし、次いでルシフェラーゼ活性を測定した。示されるデータは、エフェクター細胞から放射する相対発光量（ＲＬＵ）であり、２つの技術的複製の平均としてプロットされる。 同上。 同上。 同上。 ＧＩＧＡ－５６４がマウス腫瘍再チャレンジモデルにおいて保護を提供することを示す。図１７Ａ．ＭＣ３８腫瘍を担持するｈＣＴＬＡ－４ ＫＩマウスは、腫瘍が６０～１２０ｍｍ３であるとき（８日目）に無作為化し、次いで１ｍｇ／ｋｇの示された抗体で３用量にわたって３日毎に処理した。プロットは、示された抗体で処理された経時的なＭＣ３８腫瘍の腫瘍体積（平均±ＳＥＭ）を示す。３０００ｍｍ３を超える腫瘍負荷のために安楽死させたマウスからの腫瘍体積を繰り越した（細い縦の黒線）。アイソタイプ及び市販のイピリムマブではｎ＝８であり、ＧＩＧＡ－５６４ではｎ＝９である。図１７Ｂ．ＭＣ３８細胞は、ナイーブＣ５７ＢＬ／６マウス、及びイピリムマブ又はＧＩＧＡ－５６４で以前に処理され、４３日目に持続的な完全奏効（０ｍｍ３腫瘍体積）を有した（図１７Ａ）からのマウスの反対側の側腹部に移植した。プロットは、示された抗体で以前に処理されたか、又はナイーブマウス（ｎ＝５）であった経時的なＭＣ３８腫瘍の腫瘍体積（平均±ＳＥＭ）を示す。腫瘍体積（ｍｍ３）は、反復された測定を説明するために、固定効果として処理群及び日並びに無作為効果として動物識別子（ＩＤ）を含む線形混合効果モデルを使用して分析した。最初のチャレンジモデルにおけるアイソタイプ対照群に対して、及び再チャレンジモデルにおけるナイーブ対照群に対して、ワルド検定を使用して統計的比較を行った。ナイーブ群と比較して、イピリムマブ（ｐ＝０．００８９）又はＧＩＧＡ－５６４（ｐ＝０．００８８）での以前の処理は、腫瘍成長を制限した。 同上。 ＧＩＧＡ－５６４とペムブロリズマブが、マウスモデルにおいてイピリムマブとペムブロリズマブよりも少ない毒性を誘発することを示す。４～５週齢のＢＡＬＢ／ｃバックグラウンド上のｈＣＴＬＡ－４／ｈＰＤ－１ダブルＫＩマウスを、ビヒクル、ペムブロリズマブ、ペムブロリズマブとイピリムマブ（Ｉｐｉ）、又はペムブロリズマブとＧＩＧＡ－５６４で３日毎に９用量にわたって処理した。最後の用量の１週間後、マウスを安楽死させ、組織を病理分析のために収集した。図１８Ａ．プロットは、示された療法で処理されたマウスにおける経時的な体重の変化パーセントを示す（平均±ＳＥＭ、ｎ＝１０）。ペムブロリズマブとイピリムマブ群からの４匹のマウスが１２日目に死亡し、ペムブロリズマブとＧＩＧＡ－５６４処理群からは３匹のマウスが１２日目に死亡し、１匹のマウスが１５日目に死亡し、全て投与後ＡＤＡ誘発過敏症に起因する可能性が高い。混合効果モデルでは、群間の体重変化パーセントに統計的な差は見られなかった。図１８Ｂ～１８Ｃ．プロットは、各処理レジメンによって誘発された皮膚炎症（図１８Ｂ）又は結腸上皮損傷（大腸炎、図１８Ｃ）スコア（平均±ＳＥＭ）を示す。横線は中央値を示す。調整されたｐ値は、多重比較を説明するベンジャミーニ－ホッホベルクステップダウン手順を使用して計算した。 同上。 同上。 イピリムマブ及びＧＩＧＡ－５６４作用メカニズムを表すモデルを示す。上パネル：イピリムマブは、ＣＤ８０／ＣＤ８６とのＣＴＬＡ－４相互作用をブロックし、抗原提示細胞（ＡＰＣ）が末梢Ｔｒｅｇを共刺激してそれらの増殖を増強することを可能にする。ＧＩＧＡ－５６４は、ＣＤ８０／ＣＤ８６とのＣＴＬＡ－４相互作用を弱くブロックし、よってより少ないＴｒｅｇ増殖を誘発する。下パネル：イピリムマブ及びＧＩＧＡ－５６４は、腫瘍内Ｔｒｅｇ上のＣＴＬＡ－４に結合し、エフェクター細胞上のＦｃ受容体（ＦｃＲ）との相互作用を介してＴｒｅｇ殺滅を誘発する。ＧＩＧＡ－５６４は、より強いＦｃＲシグナル伝達を誘発し、よってイピリムマブよりも腫瘍内Ｔｒｅｇを効率的に枯渇させる。 完全長抗体として再フォーマットされたｓｃＦｖのインビトロ特徴分析を示す。図２０Ａ．ＦＡＣＳ濃縮抗ＣＴＬＡ－４ ｓｃＦｖクローンについてのクローンクラスター分析。各節点は、ｓｃＦｖクローン（完全長ＩｇＫ＋ＩｇＨ）を表す。アミノ酸差の総数をｓｃＦｖ配列の各ペアワイズアラインメント間で計算した。エッジは、≦９アミノ酸差を有するペアワイズアラインメントを示す（クラスターグラムはＡｓｅｎｓｉｏ ｅｔ ａｌ．，２０１９の図７から修飾された）。比較のためにイピリムマブ（ｉｐｉ）のｓｃＦｖ配列を含めた。この研究で記載される完全長抗体のｓｃＦｖクローンにはＩＤ番号が付けられている。図２０Ｂ．可溶性ＣＴＬＡ－４に対する示された抗体の親和性は、ＳＰＲ（Ｃａｒｔｅｒｒａ）によって決定した。プロットは、５００ｎＭで開始する抗原の５倍希釈系列での会合及び解離シグナルを示す。図２０Ｃ．ＣＴＬＡ－４＋及びＣＤ２７＋（ＣＴＬＡ－４－）ＣＨＯ細胞の５０：５０混合物を１０μｇ／ｍｌの示された抗体で染色した。ＰＥにコンジュゲートされた抗ヒトＩｇＧ二次抗体を使用して、示された抗ＣＴＬＡ－４抗体で標識された細胞を検出し、抗ＣＤ２７－ＦＩＴＣは、ＣＤ２７＋ＣＨＯ細胞を特定した。ヒストグラムは、フローサイトメトリーによって決定される、示された抗体によるＣＴＬＡ－４＋（ＣＤ２７－ＦＩＴＣ－）又はＣＴＬＡ－４－（ＣＤ２７－ＦＩＴＣ＋）細胞の染色を示す。図２０Ｄ．細胞ベースのＣＴＬＡ－４ Ｂｌｏｃｋａｄｅ Ｂｉｏａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）は、ＣＴＬＡ－４発現Ｊｕｒｋａｔ細胞を、ＣＤ８０及びＣＤ８６を天然に発現するＲａｊｉ細胞と、示されたｍＡｂの存在下で共培養することを含んだ。ＣＴＬＡ－４に結合し、ＣＴＬＡ－４のＣＤ８０／ＣＤ８６と相互作用する能力をブロックするｍＡｂは、ＣＤ２８経路活性化ルシフェラーゼ発現をもたらす。プロットは、細胞が示された抗体の滴定系列で培養された場合に誘発されたルシフェラーゼ発現の量（相対ルシフェラーゼ単位、ＲＬＵ）を示す。各Ｐｒｏｍｅｇａバイオアッセイキットにおける試料サイズに対する制約のために、複数のプレートを使用してこのａＣＴＬＡ－４ ｍＡｂのセットを分析した。最大シグナルにおけるプレート間変動性について制御するために、イピリムマブアナログを各プレートで実行し、表２３におけるイピリムマブについてのＥＣ５０及び最大シグナルを計算するために代表的な試料を使用した。各抗体が試験されたプレートを表２３に示す。プレートＡ及びＢは、同時に実行されたが、プレートＣ及びプレートＤは、後で別々に実行された。Ｅ．抗体親和性と細胞ベースのアッセイ活性との間の相関。ＣＴＬＡ－４についての抗体親和性（ＫＤ）を、ブロッキングＥＣ５０及びＲＬＵ最大シグナルと比較し、データが線形回帰によって適合されたとき、いずれにも相関は見つからなかった。各データ点は、単一の抗体を表し、以下の抗体は、次のように区別される：イピリムマブアナログ（赤色の四角）、ＧＩＧＡ－５６４（逆三角）、及びａＣＴＬＡ－４．２８（星）。データは、（図２０Ｄ）及び表２３からのものである。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 細胞表面ＣＴＬＡ－４に結合するＮ２９７Ｑ変異体の検証を提供する。ヒトＣＴＬＡ－４発現あり及びなしのＣＨＯ細胞を、１０μｇ／ｍＬの示された抗体とインキュベートし、次いでＦＩＴＣにコンジュゲートした抗ヒトＩｇＧ二次抗体を、示されたＣＴＬＡ－４抗体によって結合した細胞を検出するために使用した。ヒストグラムは、フローサイトメトリーによって決定される、示された抗体によるＣＴＬＡ－４＋又はＣＴＬＡ－４－細胞の染色を示す。 共刺激がＴｒｅｇ増殖を増強することを示す。ヒストグラムは、図２２ＡのＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔシグナル（生ＣＤ３＋ＣＤ４＋細胞にゲートをかけた）を示す。Ｔｒｅｇ又は図２２Ｂ。ＣＤ８０あり及びなしで抗ＣＤ３抗体でコーティングされたＭ－４５０トシル活性化ビーズの存在下で培養されたＴｃｏｎｖ細胞、又は図２２Ｃ。Ｔｒｅｇ又は図２２Ｄ。ｒｈＣＴＬＡ－４（Ａｂａｔａｃｅｐｔ）及び／又は抗ＣＴＬＡ－４ ｍＡｂ（ａＣＴＬＡ－４．２８）の存在下で抗ＣＤ３抗体とＣＤ８０とでコーティングされたＭ－４５０トシル活性化ビーズで活性化されたＴｃｏｎｖ細胞。 同上。 同上。 同上。 抗ＣＴＬＡ－４がｈＣＴＬＡ－４ ＫＩマウスにおいて腫瘍内Ｔｒｅｇを枯渇させることを示す。ＣＴＬＡ－４ ｍＡｂを受けているＭＣ３８腫瘍担持ｈＣＴＬＡ－４ ＫＩマウスからの細胞のフローサイトメトリー分析。図２３Ａ及び２３Ｃ．群当たり６匹のマウスを０及び３日目に５ｍｇ／ｋｇのｈＩｇＧ１アイソタイプ対照、イピリムマブ、又はＧＩＧＡ－５６４で処理し、細胞を４日目に分析した。図２３Ｂ及び２３Ｄ．群当たり１２匹のマウスを０、３、及び６日目に５ｍｇ／ｋｇのｈＩｇＧ１アイソタイプ対照、イピリムマブ、又はＧＩＧＡ－５６４で処理し、細胞を７日目に分析した。ＧＩＧＡ－５６４群における２つのリンパ節試料は、低い細胞数のために分析から除外された。図２３Ａ～２３Ｂ．各処理群におけるリンパ節（左）及び腫瘍（右）中のＴｒｅｇ（生、ＣＤ４５＋ＴＣＲβ＋ＣＤ４＋ＦＯＸＰ３＋、ＣＤ４５＋細胞のパーセンテージとして）の頻度。図２３Ｃ～２３Ｄ．ＬＮ（左）及び腫瘍（右）中のＴｒｅｇにおける細胞内ＣＴＬＡ－４の幾何平均蛍光強度（ＭＦＩ）。Ｐ値は、ウィルコクソン順位和検定を使用して計算した。線は、平均＋／－ＳＥＭを表す。 同上。 同上。 同上。 ＧＩＧＡ－５６４がイピリムマブよりも多くのＦｃＲシグナル伝達を誘発することを示す。図２４Ａ．精製されたＣＴＬＡ－４抗体を、異なるｐＨ緩衝液中での８点５倍滴定系列のために５μｇ／ｍＬの開始濃度に希釈し、次いでｒｈＣＴＬＡ－４－Ｆｃでコーティングされたウェルに加えた。結合した抗体を抗定常カッパ－ＨＲＰで検出し、４５０ｎｍでの吸光度について測定した。図２４Ｂ．野生型ｈＣＴＬＡ－４を発現するＣＨＯ細胞を、３７℃でイピリムマブ又はＧＩＧＡ－５６４の滴定でインキュベートして、内在化を可能にした。次いで、表面上に残る抗体の量を、抗ヒトＩｇＧ Ｆｃで染色することによって決定した。図２４Ｃ～２４Ｄ．３つの異なる産生物からのＧＩＧＡ－５６４を、フコシル化レベル（棒グラフは各々単一データ点を表す）（図２４Ｃ）及びヒトＦｃγＲＩＩＩＡシグナル伝達（図２４Ｄ）について試験した。ＰＮ－２７５８．０１及びＰＮ－４０８８．０１は、ＥｘｐｉＣＨＯ細胞の一過性トランスフェクションから生成され、ＰＮ－４２６１．０１は、ＣＨＯＺＮクローンの安定発現プール（ＥＰ－１、濃縮プール１）から生成された。図２４Ｃ．ＵＰＬＣ分析によって決定される、フコシル化レベルを、各試料について示す。図２４Ｄ～２４Ｅ．グラフは、ＧＩＧＡ－５６４（図２４Ｄ）又はＧＩＧＡ－５６４及び示された量のフコシル化を有するイピリムマブ（図２４Ｅ）の示された３つの調製物についての細胞ベースのアッセイにおいて決定されるヒトＦｃγＲＩＩＩＡ（Ｖバリアント）シグナル伝達を示す。Ｆｃ受容体結合を破壊する変異を有する陰性対照タンパク質（ＧＩＧＡ－５６４＿ＬＡＬＡＰＧ）も、レポーターバイオアッセイで試験した。示されるデータは、エフェクター細胞から放出するＲＬＵである。 同上。 同上。 同上。 同上。 ＧＩＧＡ－５６４がマウスモデルにおいてイピリムマブよりも低い毒性をもたらすことを示す。図２５Ａ～２５Ｄ．４～５週齢のＢＡＬＢ／ｃバックグラウンド上のｈＣＴＬＡ－４／ｈＰＤ－１ダブルＫＩマウスを、ビヒクル、ペムブロリズマブ、ペムブロリズマブとイピリムマブ、又はペムブロリズマブとＧＩＧＡ－５６４で３日毎に９用量にわたって処理した。最後の用量の１週間後、マウスを安楽死させ、組織を病理分析のために収集した。グラフは、安楽死時の各群のマウスからの結腸長さ（図２５Ａ）又は脾臓重量（図２５Ｂ）を示す。無作為に選択されたＣＤ４５染色心臓ＦＦＰＥ切片上で計数されたＣＤ４５＋細胞／ｍｍ２の数（図２５Ｃ）又は病理学者によって決定される心臓病理学スコア（図２５Ｄ）が示されている。図２５Ｅ．ＭＣ３８腫瘍を担持するｈＣＴＬＡ－４ ＫＩマウスを、ビヒクル（ＰＢＳ）又は５ｍｇ／ｋｇのイピリムマブ又はＧＩＧＡ－５６４で週２回、５用量にわたって処理した（図１４Ａ）。処理の開始後２０日目に、マウスを安楽死させ、腎臓をホルマリン固定パラフィン包埋ブロック（ＦＦＰＥ）に処理した。ＦＦＰＥ切片は、抗マウス免疫グロブリン又はＣ３について染色され、研究から盲検化された委員会認定獣医病理学者によってスコア付けされた。糸球体における陽性染色は、毛細血管基底膜に沿っていた。グラフは、抗マウスＩｇＧ又はＣ３について陽性の糸球体のパーセント、及び陽性糸球体の相対強度を示し、４０ｘ／高倍率で各切片において少なくとも５つの糸球体を調査した。図２５Ｅからのデータはまた、図４Ａ～４Ｅに示される。線は、平均＋／－ＳＥＭを示す。調整されたｐ値は、多重比較を説明するベンジャミーニ－ホッホベルクステップダウン手順を使用して計算した。 同上。 同上。 同上。 同上。 チェックポイント阻害剤イピリムマブがヒト化ＣＴＬＡ－４を発現するマウスにおいて増殖Ｔｒｅｇのパーセンテージを増加させることを示す。図２６からのデータは、図１５Ａと同じ実験からのものである。 チェックポイント阻害ではなく、腫瘍内Ｔｒｅｇ枯渇が抗ＣＴＬＡ－４の作用メカニズムであることを示す。図２７（左）は、抗ＣＴＬＡ－４におけるＦｃエフェクター機能が堅牢な抗腫瘍応答に必要であることを示す。示されるように、腫瘍体積は、ＡＤＣＣ欠損イピリムマブ及びＡＤＣＣ欠損ＧＩＧＡ－５７７と比較して、イピリムマブ及びＧＩＧＡ－５７７で減少した。図２７からのデータは、図１２Ｂ及び１４Ａに示されるようなデータを含む。 ＧＩＧＡ－５６４抗ＣＴＬＡ－４抗体が弱いチェックポイント阻害剤活性を有するが、ＣＴＬＡ－４について強い親和性を有することを示す。従来のメカニズム対本出願に記載される現在の作用メカニズムを示す概略図を比較する。ＧＩＧＡ－５６４による処理後の腫瘍におけるＴｒｅｇの枯渇は、ＣＴＬＡ－４及びそのリガンドの相互作用ではなく、ＡＤＣＣ／ＡＤＣＰ結合によるものである。 ＧＩＧＡ－５６４が、イピリムマブと比較して、ＣＴＬＡ－４に対するＣＤ８０／ＣＤ８６結合相互作用を弱くブロックすることを示す。図２９は、図２０Ｄ（プレートＡ）に示されるデータを再び示し得る。 ＧＩＧＡ－５６４がイピリムマブと比較して優れた抗腫瘍活性を有することを示す。ＭＣ３８腫瘍を担持するヒト化ＣＴＬＡ－４ノックインマウス（ｎ＝８－１３）に、研究の０、３、及び６日目にＧＩＧＡ－５６４又はイピリムマブを０．３ｍｐｋで投与した。ＧＩＧＡ－５６４の投与後、ＭＣ３８腫瘍を有するＣＴＬＡ－４ノックインマウスは、イピリムマブ及びアイソタイプと比較して、低減した腫瘍体積及び増加した生存確率を示した。ＧＩＧＡ－５６４の優れた有効性は、ＧＩＧＡ－５６４の弱点が、チェックポイント阻害ができないことであることを確認する。図３０に記載される実験はまた、図１１及び１４Ｃに記載される。図３０からの腫瘍増殖データは、図１１及び１４Ｃに示されるデータを含む。 ＧＩＧＡ－５６４がイピリムマブよりも少ないＴｒｅｇ増殖を誘発することを示す。ＭＣ３８腫瘍を担持するヒトＣＴＬＡ－４ノックインマウスを、０、３、及び６日目に５ｍｐｋのイピリムマブ又はＧＩＧＡ－５６４で処理し、７日目に屠殺した。ＧＩＧＡ－５６４処理は、末梢により少ない増殖Ｔｒｅｇをもたらした。ここに記載される実験はまた、図１５Ａに記載された。図３１は、図１５Ａに以前示されたデータを含む。 各処理群におけるＣＤ４ Ｔ細胞の代表的な等高線プロットである。Ｘ軸及びＹ軸は、それぞれ、ＦＯＸＰ３及びＣＴＬＡ－４に対応する。図３２は、図１５Ｄからの結果を再び示す。 ｈＣＴＬＡ－４＋細胞と共培養される場合、ＧＩＧＡ－５６４がイピリムマブよりも多くのＦｃＲシグナル伝達を誘発することを示す。ＣｔＬＡ－４－Ｆｃ－ＦｃＲ相互作用を介した細胞シグナル伝達は、ヒトＣＴＬＡ－４＋細胞を用いてインビトロで評価した。ＧＩＧＡ－５６４は、イピリムマブよりも増加したＦｃＲシグナル伝達を示した。更なる実験は、違いがＦｃ－ＦｃＲ親和性又はＣＴＬＡ－４細胞表面サイクリングによるものであることを除外した。図３３は、図１６Ｂからのいくつかのデータを再び示し得る。 細胞表面上でカニクイザル（ｃｙｎｏ）ＣＴＬＡ－４を発現するＣＨＯ細胞の開発及び検証を提供する。フローヒストグラムは、ｃｙｎｏ ＣＴＬＡ－４及びｈＣＴＬＡ－４ ＣＨＯ細胞株が、抗ＣＴＬＡ－４クローンＬ３Ｄ１０又はＢＮＩ３によって結合した細胞表面上で抗原を発現することを示し、これは、それぞれ、これらの細胞株の表面上でのｃｙｎｏ又はヒトＣＴＬＡ－４の発現を検証する。 同上。 同上。 ＧＩＧＡ－５６４が、イピリムマブと比較して、表面に発現したｃｙｎｏ ＣＴＬＡ－４に結合する低減した能力を有することを示す。図３５は、ｃｙｎｏ又はヒトＣＴＬＡ－４＋ＣＨＯ細胞へのｍＡｂの結合のフローサイトメトリー分析を示す。データは、ＧＩＧＡ－５６４及びＩｐｉがｈＣＴＬＡ－４に結合する比較的類似した能力を有することを示すが、Ｉｐｉと比較して、ＧＩＧＡ－５６４は、細胞表面上に発現したｃｙｎｏ ＣＴＬＡ－４に結合する大幅に低減した能力を有する。アテゾ結合（陰性対照）からのデータは、参照のために複数のプロット上で再び示す。 同上。 同上。 同上。 ＧＩＧＡ－５６４が、ＥＬＩＳＡアッセイを用いて試験される場合、イピリムマブと比較して、ｃｙｎｏ ＣＴＬＡ－４のいくつかの提示への低減した結合を有することを示す。これらのＥＬＩＳＡでは、Ｆｃキメラ及びｈｉｓタグ付きフォーマットを含む、複数の製造業者から供給された様々なＣＴＬＡ－４タンパク質へのＧＩＧＡ－５６４の結合を試験した。ＧＩＧＡ－５６４のＦｃキメラＣＴＬＡ－４タンパク質への結合を試験するために、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ（９３３６－ＣＴ－２００、図３６Ａ）、Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ（９０２１３－Ｃ０２Ｈ、図３６Ｂ）、又はＡＣＲＯＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（ＣＴ４－Ｃ５２５６、図３６Ｃ）からのｒｃｍＣＴＬＡ－４－Ｆｃを、別々のＥＬＩＳＡプレートの一方の半分に１ｕｇ／ｍＬでコーティングした。Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（７２６８－ＣＴ－１００、図３６Ａ～３６Ｃ）からの組換えヒトＣＴＬＡ－４－Ｆｃ（ｒｈＣＴＬＡ－４）を、プレートの各々の他方の半分に、１ｕｇ／ｍＬでコーティングした。同様に、ＧＩＧＡ－５６４のｈｉｓタグ付きＣＴＬＡ－４への結合を試験するために、Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ（９０２１３－Ｃ０８Ｈ、図３６Ｄ）又はＡＣＲＯＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（ＣＴ４－Ｃ５２２７、図３６Ｅ）からのｒｃｍＣＴＬＡ－４－Ｈｉｓを、別々のＥＬＩＳＡプレートの一方の半分に１ｕｇ／ｍＬでコーティングした。ＲｈＣＴＬＡ－４－Ｆｃ（ＡＣＲＯＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＣＴ４－Ｈ５２２９、図３６Ｄ～Ｅ）を、これらのプレートの各々の他方の半分に、１ｕｇ／ｍＬでコーティングした。コーティング後、プレートを４℃で一晩インキュベートした。翌日、プレートを室温でプレートシェーカー上で１時間ＰＢＳＴ中の５％ミルクでブロックした。イピリムマブ、アテゾリズマブ（陰性対照）、及びＧＧ－５６４（５ｕｇ／ｍＬで開始）の一連の滴定をプレートに加え、室温で１時間プレートシェーカー上でインキュベートして、ｍＡｂ結合を可能にした。ＰＢＳＴで洗浄することによって、過剰な、結合していないｍＡｂを除去した。次いで、結合したｍＡｂを、ＨＲＰコンジュゲート抗カッパ軽鎖抗体（０．５ｕｇ／ｍｌ、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ ２０６０－５０）で検出した。室温で１時間プレートシェーカー上でインキュベーション及び洗浄後、プレートをＴＭＢ基質で展開した。十分なシグナルが達成された後、１Ｎ塩酸を加えて展開を停止した。Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ ｉ３ｘプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して、４５０ｎｍでの吸光度を読み取った。ＥＣ５０値を、Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ）を使用して吸光度対濃度の対数をプロットすることによって計算した。Ｉｐｉはヒト及びｃｙｎｏ ＣＴＬＡ－４への同様の結合を有するが、ほとんどの場合、ＧＩＧＡ－５６４はヒトＣＴＬＡ－４と比較してｃｙｎｏ ＣＴＬＡ－４に結合する低減した能力を有するため、結果は、Ｉｐｉ及びＧＩＧＡ－５６４エピトープが実際には異なることを示す。 同上。 同上。 同上。 同上。 ＧＩＧＡ－５６４の最適化された製剤を決定するために生成された応答プロットを提供する。応答プロットは、ＮａＣｌ及び緩衝液濃度が、それぞれ、１００ｍＭ及び３０ｍＭに固定される場合のｐＨ及びスクロース濃度の影響を示した。 示されるようにＧＩＧＡ－５６４抗体の製剤について最も高いＴｍをもたらすことが予想される緩衝液濃度及びＮａＣｌ量を決定するために生成された理論的応答プロットを示す。 どの変数がＧＩＧＡ－５６４の製剤に対して最も影響を与えるかを提供したパレート分析を示す。 ＧＩＧＡ－５６４の製剤の立体配座分析である。プロットは、高いＮａＣｌが立体配座にとって最も重要であり、ｐＨがいくらかの効果を有し、より低いｐＨがより良好であり、スクロースがいくらかの効果を有し、より高いほどより良好であることを示す。 ＧＩＧＡ－５６４の製剤の立体配座分析である。プロットは、高いＮａＣｌが立体配座にとって最も重要であり、ｐＨがいくらかの効果を有し、より低いｐＨがより良好であり、スクロースがいくらかの効果を有し、より高いほどより良好であることを示す。 ＧＩＧＡ－２３２８が、ＦｃγＲＩＩＩａシグナル伝達を増強する目的で、低いフコシル化を有するように設計されていることを示す。Ｐｒｏｍｅｇａ ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎからのヒトＦｃγＲＩＩＩａ、Ｖバリアント（Ｇ７０１１）のＡＤＣＣレポーターバイオアッセイを、製造業者の指示に従って実施した。簡潔には、細胞表面発現を増強するＹ２０１Ｇ変異を有するヒトＣＴＬＡ－４を安定して発現するＣＨＯ標的細胞を、示された抗体を含むＲＰＭＩ１６４０＋４％ＦＢＳ培地に懸濁し、３０分間３７℃でインキュベートした。ヒトＦｃγＲＩＩＩａ、Ｖバリアントを発現するＪｕｒｋａｔ／ＮＦＡＴ－Ｌｕｃエフェクター細胞を、５：１のエフェクター：標的比で各ウェルに添加し、３７℃で６時間インキュベートした。ルシフェラーゼ活性を、含まれるＢｉｏ－Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイ試薬とＳｐｅｃｔｒａＭａｘ ｉ３ｘリーダーを使用することによって測定した。相対発光量（ＲＬＵ）で測定されたルシフェラーゼ活性を、抗体の濃度に対してプロットした。 ＧＩＧＡ－５６４が、ＣＴＬＡ－４を発現する標的細胞株に対するヒトＰＢＭＣによる抗体依存的細胞傷害（ＡＤＣＣ）及び／又は抗体依存的細胞食作用（ＡＤＣＰ）を誘発することを示す。２人のドナーからの凍結保存されたヒトＰＢＭＣを解凍し、１００Ｕ／ｍＬのＩＬ－２及び１０％ＦＢＳを含有するＲＭＰＩ培地で一晩回復させた。細胞表面発現を増強するＹ２０１Ｇ変異を有するヒトＣＴＬＡ－４を安定に発現するＣＨＯ標的細胞を、ＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）で染色し、次いでＧＩＧＡ－５６４又はヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照のいずれかと示された濃度で３７℃で３０分間インキュベートした。次いで、ＰＭＢＣエフェクター細胞を２０：１のエフェクター対標的比で添加し、試料を４時間３７℃でインキュベートしてＡＤＣＣを可能にした。次いで、試料をＭＡＣＳ緩衝液で洗浄し、死細胞を標識する生存性色素７－アミノアクチノマイシンＤ（７－ＡＡＤ）で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。（図４２Ａ）ＡＤＣＣを決定する代表的なゲーティング戦略。試料は、まず標的細胞（ＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ＋）、次いで単細胞、次いで死細胞（７－ＡＡＤ＋）にゲートをかけた。（図４２Ｂ）ＧＩＧＡ－５６４及びヒトＩｇＧ１アイソタイプの各濃度での死細胞パーセントのプロット。ＧＩＧＡ－５６４は、アイソタイプ対照よりも高い死ＣＴＬＡ－４＋標的細胞パーセントをもたらす。 同上。 ＩｇＧ１アロタイプがＦｃγＲＩＩＩａ受容体を介したシグナル伝達に影響を与え得ることを示す。図４３Ａは、ＣＨ１ドメインにおいて１つのアミノ酸が異なる、ＩｇＧ１アロタイプＩＧＨＧ１＊０８及びＩＧＨＧ１＊０１の配列情報を示す。これらの２つのアロタイプ間の異なる残基が強調表示され、参照のために周囲の残基が提供される。位置は、ＩＭＧＴ及びＥＵナンバリングの両方で与える。図４３Ｂは、臨床イピリムマブ（Ｙｅｒｖｏｙ）がＩＧＨＧ１＊０８アロタイプを使用し、ＩＧＨＧ１＊０１を使用する、ＧｉｇａＧｅｎによって産生されたイピリムマブ及びＧＩＧＡ－５６４よりも低いＦｃγＲＩＩＩａシグナル伝達をもたらすことを示す。これらの結果は、アロタイプがＦｃγＲＩＩＩａシグナル伝達に影響を与え得ることを示す。ヒトＦｃγＲＩＩＩａ、Ｖバリアント（Ｇ７０１１）のＡＤＣＣレポーターバイオアッセイは、Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから購入した。アッセイは、製造業者の指示に従って実施した。簡潔には、細胞表面発現を増強するＹ２０１Ｇ変異を有するヒトＣＴＬＡ－４を安定して発現するＣＨＯ標的細胞を、示された抗体を含むＲＰＭＩ１６４０＋４％ＦＢＳ培地に懸濁し、３０分間３７℃でインキュベートした。ヒトＦｃγＲＩＩＩａ、Ｖバリアントを発現するＪｕｒｋａｔ／ＮＦＡＴ－Ｌｕｃエフェクター細胞を、５：１のエフェクター：標的比で各ウェルに添加し、３７℃で６時間インキュベートした。ルシフェラーゼ活性を、含まれるＢｉｏ－Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイ試薬とＳｐｅｃｔｒａＭａｘ ｉ３ｘリーダーを使用することによって測定した。相対発光量（ＲＬＵ）で測定されたルシフェラーゼ活性を、抗体の濃度に対してプロットした。 同上。
表２３．完全長抗体として再フォーマットされたｓｃＦｖのインビトロ特徴分析。可溶性ヒトＣＴＬＡ－４についての示されたＣＴＬＡ－４ ｍＡｂのｋｏｎ、ｋｏｆｆ、及びＫＤは、ＳＰＲ（Ｃａｒｔｅｒｒａ）によって決定した。二次ヒトＩｇＧ抗体及びフローサイトメトリーによって検出される、ＣＴＬＡ－４＋又はＣＤ２７＋ ＣＨＯ細胞に結合した示されたＣＴＬＡ－４ ｍＡｂの幾何学的ＭＦＩ。可溶性カニクイザルＣＴＬＡ－４ついての示されたＣＴＬＡ－４ ｍＡｂの親和性（ＫＤ）は、単一抗原濃度ＢＬＩ測定（Ｏｃｔｅｔ）によって決定した。ＣＤ８０／ＣＤ８６へのＣＴＬＡ－４結合をブロックする各ａＣＴＬＡ－４ ｍＡｂの能力を、細胞ベースのアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）によって決定した。各Ｐｒｏｍｅｇａバイオアッセイキットにおける試料サイズに対する制約のために、このａＣＴＬＡ－４ ｍＡｂのセットを複数のプレートを使用して分析した（プレート文字は図２０ＤにおけるプレートＡ～Ｄに対応する）。最大シグナルにおけるプレート間変動性について制御するために、イピリムマブアナログを各プレートで実行し、この表には代表的な試料を使用した。
表２４．ＧＩＧＡ－５６４は、ＣＤ８０又はＣＤ８６がＣＴＬＡ－４に結合するのをブロックする最小限の能力を有する。図１３ＢからのブロッキングＥＬＩＳＡデータの要約。検出されたＣＤ８０又はＣＤ８６からの吸光度値を、ペムブロリズマブとインキュベートされたＥＬＩＳＡプレートからのシグナルに対して正規化した。次いで、データを分析し、非線形回帰によって当てはめた。正規化された最大及び最小シグナル、並びにブロッキングのＩＣ５０が提供される。
表２５．ＧＩＧＡ－５６４及びイピリムマブのＦｃ受容体シグナル伝達。図１６からのＦｃＲバイオアッセイ結果の要約。バイオアッセイからの発光（ＲＬＵ）データを非線形回帰によって当てはめた。ＦｃＲシグナル伝達の最大シグナル及びＥＣ５０が提供される。
表２６．ＣＴＬＡ－４抗体配列。１４個の特徴付けられた完全長ＣＴＬＡ－４抗体のＩｇＫ及びＩｇＧ可変領域のアミノ酸配列が提供される。
表２７．免疫表現型検査用の試薬抗体。免疫表現型検査に使用される抗体クローン詳細を列挙する。
表３２－３３．異なるアルゴリズムによって同定されたＧＩＧＡ－５６４のＡ１４軽鎖ＣＤＲ配列及びＡ１４重鎖ＣＤＲ配列（抗体Ａ１４）：
７．発明を実施するための形態
７．１．定義
本明細書で特に定義されない限り、本開示に関連して使用される科学及び技術用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有するものとする。更に、文脈上によって特に要求されない限り、単数形の用語は複数形を含み、複数形の用語は単数形を含むものとする。一般に、本明細書に記載される細胞及び組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学並びにタンパク質及び核酸化学及びハイブリダイゼーションに関連して使用される命名法、及びその技術は、当該技術分野で周知であり、一般的に使用されているものである。本開示の方法及び技法は、一般に、当該技術分野で周知の従来の方法に従って、かつ特に指示されない限り、本明細書全体で引用及び議論される様々な一般的でより具体的な参考文献に記載されるように実施される。例えば、参照によって本明細書に組み込まれる、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）及びＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ（１９９２）、並びにＨａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９９０）を参照されたい。酵素反応及び精製技法は、当該技術分野で一般的に達成されるか、又は本明細書に記載されるように、製造業者の仕様書に従って実施される。本明細書に記載される分析化学、合成有機化学、及び医学的及び薬学的化学に関連して使用される用語、並びにそれらの実験手順及び技法は、当該技術分野で周知であり、一般的に使用されるものである。化学合成、化学分析、薬学的調製、製剤、及び送達、並びに患者の治療には、標準的な技法を使用することができる。
以下の用語は、特に指示されない限り、以下の意味を有すると理解されるものとする。
「ＣＴＬＡ－４」、「ＣＴＬＡ－４タンパク質」、及び「ＣＴＬＡ－４抗原」という用語は、細胞によって自然に発現されるか、又はｃｔｌａ４遺伝子でトランスフェクトされた細胞によって発現されるヒトＣＴＬＡ－４、又はヒトＣＴＬＡ－４の任意のバリアント（例えば、スプライスバリアント及び対立遺伝子バリアント）、アイソフォーム、及び種ホモログを指すために本明細書において交換可能に使用される。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ－４タンパク質は、霊長類（例えば、サル又はヒト）、齧歯類（例えば、マウス又はラット）、イヌ、ラクダ、ネコ、ウシ、ヤギ、ウマ、又はヒツジによって自然に発現されるＣＴＬＡ－４タンパク質である。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ－４タンパク質は、ヒトＣＴＬＡ－４（ｈＣＴＬＡ－４、配列番号７００１）である。
「免疫グロブリン」という用語は、一般的には２対のポリペプチド鎖：１対の軽（Ｌ）鎖及び１対の重（Ｈ）鎖を含む、構造的に関連するタンパク質のクラスを指す。「インタクトな免疫グロブリン」では、これらの鎖のうちの４つ全てがジスルフィド結合によって相互接続されている。免疫グロブリンの構造は、十分に特徴付けられている。例えば、Ｐａｕｌ，Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ７ｔｈ ｅｄ．，Ｃｈ．５（２０１３）Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡを参照されたい。簡潔には、各重鎖は、典型的には、重鎖可変領域（ＶＨ）及び重鎖定常領域（ＣＨ）を含む。重鎖定常領域は、典型的には、ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３と略される、３つのドメインを含む。各軽鎖は、典型的には、軽鎖可変領域（ＶＬ）及び軽鎖定常領域を含む。軽鎖定常領域は、典型的には、ＣＬと略される、１つのドメインを含む。
「抗原結合タンパク質」（ＡＢＰ）という用語は、抗原又はエピトープに特異的に結合する１つ以上の抗原結合ドメインを含むタンパク質を指す。いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、天然に存在する抗体と同様の特異性及び親和性で抗原又はエピトープに結合する。いくつかの実施形態では、ＡＢＰは、抗体を含む。いくつかの実施形態では、ＡＢＰは、抗体からなる。いくつかの実施形態では、ＡＢＰは、抗体から本質的になる。いくつかの実施形態では、ＡＢＰは、代替足場を含む。いくつかの実施形態では、ＡＢＰは、代替足場からなる。いくつかの実施形態では、ＡＢＰは、代替足場から本質的になる。いくつかの実施形態では、ＡＢＰは、抗体フラグメントを含む。いくつかの実施形態では、ＡＢＰは、抗体フラグメントからなる。いくつかの実施形態では、ＡＢＰは、抗体フラグメントから本質的になる。「ＣＴＬＡ－４ ＡＢＰ」、「抗ＣＴＬＡ－４ ＡＢＰ」、又は「ＣＴＬＡ－４特異的ＡＢＰ」は、抗原ＣＴＬＡ－４に特異的に結合する、本明細書で提供されるＡＢＰである。いくつかの実施形態では、ＡＢＰは、ＣＴＬＡ－４の細胞外ドメインに結合する。特定の実施形態では、本明細書で提供されるＣＴＬＡ－４ ＡＢＰは、異なる種からのＣＴＬＡ－４タンパク質間又はその中で保存されるＣＴＬＡ－４のエピトープに結合する。
「抗体」という用語は、本明細書ではその最も広い意味で使用され、抗原又はエピトープに特異的に結合する１つ以上の抗原結合ドメインを含む特定のタイプの免疫グロブリン分子を含む。抗体は、具体的には、インタクトな抗体（例えば、インタクトな免疫グロブリン）、抗体フラグメント、及び多重特異性抗体を含む。抗原結合ドメインの一例は、ＶＨ－ＶＬダイマーによって形成される抗原結合ドメインである。抗体は、ＡＢＰの１つのタイプである。
Ｆｃの文脈における「低フコシル化」又は「低フコシル化された」という用語は、Ｎ－グリコシル化部位、例えば、ＥＵインデックスに従って番号付けされた、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域のアミノ酸残基位置２９７（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１））、又は非ＩｇＧ１若しくは非ヒトＩｇＧ１免疫グロブリンにおける対応する残基に、直接又は間接的に共有結合したＮ－グリカンのコアフコシル化の実質的な欠如を指す。
フコシル化率が抗体を含む組成物の文脈で示される場合、その率は、組成物中の全抗体の中でのフコシル化抗体の割合を示す。例えば、７０％のフコシル化は、組成物中の抗体の７０％がフコシル化され、組成物中の抗体の３０％が低フコシル化されていることを示す。
「代替足場」という用語は、１つ以上の領域が抗原又はエピトープに特異的に結合する１つ以上の抗原結合ドメインを産生するために多様化され得る分子を指す。いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、天然に存在する抗体と同様の特異性及び親和性で抗原又はエピトープに結合する。例示的な代替足場としては、フィブロネクチン（例えば、Ａｄｎｅｃｔｉｎｓ（商標））、β－サンドイッチ（例えば、ｉＭａｂ）、リポカリン（例えば、Ａｎｔｉｃａｌｉｎｓ（登録商標））、ＥＥＴＩ－ＩＩ／ＡＧＲＰ、ＢＰＴＩ／ＬＡＣＩ－Ｄ１／ＩＴＩ－Ｄ２（例えば、Ｋｕｎｉｔｚドメイン）、チオレドキシンペプチドアプタマー、プロテインＡ（例えば、Ａｆｆｉｂｏｄｙ（登録商標））、アンキリンリピート（例えば、ＤＡＲＰｉｎｓ）、ガンマ－Ｂ－クリスタリン／ユビキチン（例えば、アフィリン）、ＣＴＬＤ３（例えば、テトラネクチン）、Ｆｙｎｏｍｅｒｓ、及び（ＬＤＬＲ－Ａモジュール）（例えば、アビマー）が挙げられる。代替足場についての追加情報は、Ｂｉｎｚ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２００５ ２３：１２５７－１２６８、Ｓｋｅｒｒａ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎ．ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ．，２００７ １８：２９５－３０４、及びＳｉｌａｃｃｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２０１４，２８９：１４３９２－１４３９８に提供され、その各々は、その全体が参照によって組み込まれる。代替足場は、ＡＢＰの１つのタイプである。
「抗原結合ドメイン」という用語は、抗原又はエピトープに特異的に結合することができるＡＢＰの部分を意味する。
「完全長抗体」、「インタクトな抗体」、及び「全抗体」という用語は、本明細書では交換可能に使用され、天然に存在する抗体構造に実質的に類似した構造を有し、Ｆｃ領域を含む重鎖を有する抗体を指す。
「Ｆｃ領域」という用語は、天然に存在する抗体において、Ｆｃ受容体及び補体系の特定のタンパク質と相互作用する、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を意味する。様々な免疫グロブリンのＦｃ領域の構造、及びそこに含まれるグリコシル化部位は、当該技術分野で知られている。その全体が参照によって組み込まれる、Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ ａｎｄ Ｃａｖａｃｉｎｉ，Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２０１０，１２５：Ｓ４１－５２を参照されたい。Ｆｃ領域は、天然に存在するＦｃ領域、又は本開示において他の箇所に記載されるように修飾されたＦｃ領域であり得る。
ＶＨ及びＶＬ領域は、より保存された領域が点在する超可変性の領域（「相補性決定領域」（ＣＤＲ）とも呼ばれる、「超可変領域（ＨＶＲ）」）に更に細分され得る。より保存された領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。各ＶＨ及びＶＬは、一般に、以下の順序（Ｎ末端からＣ末端）で配置される、３つのＣＤＲ及び４つのＦＲを含む：ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４。ＣＤＲは、抗原結合に関与し、抗体の抗原特異性及び結合親和性に影響を与える。その全体で参照によって組み込まれる、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ ５ｔｈ ｅｄ．（１９９１）Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤを参照されたい。
任意の脊椎動物種からの軽鎖は、その定常ドメインの配列に基づいて、カッパ（κ）及びラムダ（λ）と呼ばれる、２つのタイプのうちの１つに割り当てることができる。
任意の脊椎動物種からの重鎖は、５つの異なるクラス（又はアイソタイプ）：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭのうちの１つに割り当てることができる。これらのクラスはまた、それぞれ、α、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。ＩｇＧ及びＩｇＡクラスは、配列及び機能における違いに基づいてサブクラスに更に分ける。ヒトは、以下のサブクラス：ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２を発現する。
ＣＤＲのアミノ酸配列境界は、その各々が、その全体で参照によって組み込まれる、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．、前出（「Ｋａｂａｔ」ナンバリングスキーム）、Ａｌ－Ｌａｚｉｋａｎｉ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２７３：９２７－９４８（「Ｃｈｏｔｈｉａ」ナンバリングスキーム）、ＭａｃＣａｌｌｕｍ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６２：７３２－７４５（「Ｃｏｎｔａｃｔナンバリングスキーム）、Ｌｅｆｒａｎｃ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２００３，２７：５５－７７（「ＩＭＧＴ」ナンバリングスキーム）、及びＨｏｎｅｇｇｅ ａｎｄ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２００１，３０９：６５７－７０（「ＡＨｏ」ナンバリングスキーム）によって記載されるものを含む、多数の既知のナンバリングスキームのいずれかを使用して、当業者によって決定することができる。
表１は、Ｋａｂａｔ及びＣｈｏｔｈｉａスキームによって同定される、ＣＤＲ１－Ｌ（ＶＬのＣＤＲ１）、ＣＤＲ２－Ｌ（ＶＬのＣＤＲ２）、ＣＤＲ３－Ｌ（ＶＬのＣＤＲ３）、ＣＤＲ１－Ｈ（ＶＨのＣＤＲ１）、ＣＤＲ２－Ｈ（ＶＨのＣＤＲ２）、及びＣＤＲ３－Ｈ（ＶＨのＣＤＲ３）の位置を提供する。ＣＤＲ１－Ｈについて、Ｋａｂａｔ及びＣｈｏｔｈｉａナンバリングスキームの両方を使用して残基ナンバリングが提供される。
ＣＤＲは、例えば、ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆ．ｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｓ／ａｂｎｕｍ／で入手可能であり、その全体が参照によって組み込まれる、Ａｂｈｉｎａｎｄａｎ ａｎｄ Ｍａｒｔｉｎ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２００８，４５：３８３２－３８３９に記載される、Ａｂｎｕｍなどの、抗体ナンバリングソフトウェアを使用して割り当てられ得る。
「ＥＵナンバリングスキーム」は、一般に、（例えば、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．、前出で報告されるように）抗体重鎖定常領域中の残基を指す場合に使用される。
「抗体フラグメント」は、インタクトな抗体の抗原結合又は可変領域などの、インタクトな抗体の一部分を含む。抗体フラグメントには、例えば、Ｆｖフラグメント、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、ｓｃＦｖ（ｓＦｖ）フラグメント、及びｓｃＦｖ－Ｆｃフラグメントが含まれる。
「Ｆｖ」フラグメントは、１つの重鎖可変ドメイン及び１つの軽鎖可変ドメインの非共有結合ダイマーを含む。
「Ｆａｂ」フラグメントは、重鎖及び軽鎖可変ドメインに加えて、軽鎖の定常ドメイン及び重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）を含む。Ｆａｂフラグメントは、例えば、組換え方法によって又は完全長抗体のパパイン消化によって生成され得る。
「Ｆ（ａｂ’）２」フラグメントは、ジスルフィド結合によってヒンジ領域の近くで結合した２つのＦａｂ’フラグメントを含む。Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、例えば、組換え方法によって、又はインタクトな抗体のペプシン消化によって生成され得る。Ｆ（ａｂ’）フラグメントは、例えば、β－メルカプトエタノールでの処理によって解離することができる。
「単鎖Ｆｖ」又は「ｓＦｖ」又は「ｓｃＦｖ」抗体フラグメントは、単一のポリペプチド鎖中にＶＨドメイン及びＶＬドメインを含む。ＶＨ及びＶＬは、一般に、ペプチドリンカーによって結合している。Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ Ａ．（１９９４）を参照されたい。いくつかの実施形態では、リンカーは、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号１１９６８）である。いくつかの実施形態では、ｎ＝１、２、３、４、５、又は６である。その全体が参照によって組み込まれる、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｒｏｍ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ．Ｉｎ Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ Ｍ．＆Ｍｏｏｒｅ Ｇ．Ｐ．（Ｅｄｓ．），Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｖｏｌ．１１３（ｐｐ．２６９－３１５）．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照されたい。
「ｓｃＦｖ－Ｆｃ」フラグメントは、Ｆｃドメインに結合したｓｃＦｖを含む。例えば、Ｆｃドメインは、ｓｃＦｖのＣ末端に結合し得る。Ｆｃドメインは、ｓｃＦｖにおける可変ドメインの配向（すなわち、ＶＨ－ＶＬ又はＶＬ－ＶＨ）に応じて、ＶＨ又はＶＬに続き得る。当該技術分野で知られているか、又は本明細書に記載されている任意の好適なＦｃドメインが使用され得る。場合によっては、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ４ Ｆｃドメインを含む。
「単一ドメイン抗体」という用語は、抗体の１つの可変ドメインが他の可変ドメインの存在なしに抗原に特異的に結合する分子を指す。単一ドメイン抗体、及びそのフラグメントは、Ａｒａｂｉ Ｇｈａｈｒｏｕｄｉ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ，１９９８，４１４：５２１－５２６及びＭｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．，２００１，２６：２３０－２４５に記載されており、その各々はその全体が参照によって組み込まれる。
「単一特異性ＡＢＰ」は、単一のエピトープに特異的に結合する結合部位を含むＡＢＰである。単一特異性ＡＢＰの例は、二価であるが、各抗原結合ドメインで同じエピトープを認識する、天然に存在するＩｇＧ分子である。結合特異性は、任意の好適な原子価で存在し得る。
「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団からの抗体を指す。実質的に均一な抗体の集団は、モノクローナル抗体の産生中に通常生じ得るバリアントを除いて、実質的に類似し、同じエピトープに結合する抗体を含む。そのようなバリアントは、一般に少量のみ存在する。モノクローナル抗体は、典型的には、複数の抗体からの単一の抗体の選択を含むプロセスによって得られる。例えば、選択プロセスは、ハイブリドーマクローン、ファージクローン、酵母クローン、細菌クローン、又は他の組換えＤＮＡクローンのプールなどの、複数のクローンからの固有のクローンの選択であり得る。選択された抗体は、例えば、標的についての親和性を改善するため（「親和性成熟」）、抗体をヒト化するため、細胞培養におけるその産生を改善するため、かつ／又は対象におけるその免疫原性を低減するために、更に改変することができる。
「キメラ抗体」という用語は、重鎖及び／又は軽鎖の一部分が特定の供給源又は種に由来し、重鎖及び／又は軽鎖の残部が異なる供給源又は種に由来する抗体を指す。
非ヒト抗体の「ヒト化」形態は、非ヒト抗体由来の最小配列を含有するキメラ抗体である。ヒト化抗体は、一般に、１つ以上のＣＤＲからの残基が、非ヒト抗体（ドナー抗体）の１つ以上のＣＤＲからの残基によって置換されているヒト抗体（レシピエント抗体）である。ドナー抗体は、マウス、ラット、ウサギ、ニワトリ、又は所望の特異性、親和性、若しくは生物学的効果を有する非ヒト霊長類抗体などの、任意の好適な非ヒト抗体であり得る。場合によっては、レシピエント抗体の選択されたフレームワーク領域残基は、ドナー抗体からの対応するフレームワーク領域残基によって置換される。ヒト化抗体はまた、レシピエント抗体又はドナー抗体のいずれにも見られない残基を含み得る。そのような修飾は、抗体機能を更に改良するために行うことができる。更なる詳細については、その各々がその全体で参照によって組み込まれる、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９８６，３２１：５２２－５２５、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９８８，３３２：３２３－３２９、及びＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，１９９２，２：５９３－５９６を参照されたい。
「ヒト抗体」は、ヒト若しくはヒト細胞によって産生されるか、又はヒト抗体レパートリー若しくはヒト抗体コード配列（例えば、ヒト供給源から得られたか、又はデノボで設計された）を利用する非ヒト供給源から誘導される抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有するものである。ヒト抗体は、特にヒト化抗体を除外する。いくつかの実施形態では、齧歯類は、それらの齧歯類抗体配列をヒト抗体で置き換えるように遺伝子操作される。
「単離されたＡＢＰ」又は「単離された核酸」は、その自然環境の成分から分離及び／又は回収されたＡＢＰ又は核酸である。天然環境の成分は、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質性又は非タンパク質性材料を含み得る。いくつかの実施形態では、単離されたＡＢＰは、例えば、スピニングカップシーケネーターの使用によって、Ｎ末端又は内部アミノ酸配列の少なくとも１５残基を得るために十分な程度まで精製される。いくつかの実施形態では、単離されたＡＢＰは、還元又は非還元条件下でのゲル電気泳動（例えば、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）によって均質になるまで精製され、クーマシーブルー又は銀染色によって検出される。単離されたＡＢＰは、ＡＢＰの天然環境の少なくとも１つの成分が存在しないので、組換え細胞内のインサイチュのＡＢＰを含む。いくつかの実施形態では、単離されたＡＢＰ又は単離された核酸は、少なくとも１つの精製ステップによって調製される。いくつかの実施形態では、単離されたＡＢＰ又は単離された核酸は、重量で少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％まで精製される。いくつかの実施形態では、単離されたＡＢＰ又は単離された核酸は、体積で少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％まで精製される。いくつかの実施形態では、単離されたＡＢＰ又は単離された核酸は、重量で少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、９９％～１００％のＡＢＰ又は核酸を含む溶液として提供される。いくつかの実施形態では、単離されたＡＢＰ又は単離された核酸は、体積で少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、９９％～１００％のＡＢＰ又は核酸を含む溶液として提供される。
「親和性」は、分子の単一結合部位（例えば、ＡＢＰ）とその結合パートナー（例えば、抗原又はエピトープ）との間の非共有相互作用の合計の強度を指す。特に示されない限り、本明細書で使用される場合、「親和性」は、結合対のメンバー（例えば、ＡＢＰ及び抗原又はエピトープ）間の１：１相互作用を反映する、固有の結合親和性を指す。分子ＸのそのパートナーＹについての親和性は、解離平衡定数（ＫＤ）によって表すことができる。解離平衡定数に寄与する動的成分は、以下でより詳細に記載される。親和性は、本明細書に記載されるものを含む、当該技術分野で知られている一般的な方法によって測定することができる。親和性は、例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術（例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標））又はバイオレイヤー干渉法（例えば、ＦＯＲＴＥＢＩＯ（登録商標））を使用して決定することができる。
ＡＢＰの標的分子への結合に関して、特定の抗原（例えば、ポリペプチド標的）又は特定の抗原上のエピトープに「結合する」、「特異的結合」、「特異的に結合する」、「特異的」、「選択的に結合する」、及び「選択的」という用語は、（例えば、非標的分子との）非特異的又は非選択的相互作用とは測定可能な程度に異なる結合を意味する。特異的結合は、例えば、標的分子への結合を測定し、それを非標的分子への結合と比較することによって測定することができる。特異的結合はまた、標的分子上で認識されるエピトープを模倣する対照分子との競合によって決定することができる。その場合、ＡＢＰの標的分子への結合が対照分子によって競合的に阻害される場合、特異的結合が示される。いくつかの実施形態では、非標的分子についてのＣＴＬＡ－４ ＡＢＰの親和性は、ＣＴＬＡ－４についての親和性の約５０％未満である。いくつかの実施形態では、非標的分子についてのＣＴＬＡ－４ ＡＢＰの親和性は、ＣＴＬＡ－４についての親和性の約４０％未満である。いくつかの実施形態では、非標的分子についてのＣＴＬＡ－４ ＡＢＰの親和性は、ＣＴＬＡ－４についての親和性の約３０％未満である。いくつかの実施形態では、非標的分子についてのＣＴＬＡ－４ ＡＢＰの親和性は、ＣＴＬＡ－４についての親和性の約２０％未満である。いくつかの実施形態では、非標的分子についてのＣＴＬＡ－４ ＡＢＰの親和性は、ＣＴＬＡ－４についての親和性の約１０％未満である。いくつかの実施形態では、非標的分子についてのＣＴＬＡ－４ ＡＢＰの親和性は、ＣＴＬＡ－４についての親和性の約１％未満である。いくつかの実施形態では、非標的分子についてのＣＴＬＡ－４ ＡＢＰの親和性は、ＣＴＬＡ－４についての親和性の約０．１％未満である。
本明細書で使用される、「ｋｄ」（ｓｅｃ－１）という用語は、特定のＡＢＰ－抗原相互作用の解離速度定数を指す。この値はまた、ｋｏｆｆ値と称される。
本明細書で使用される、「ｋａ」（Ｍ－１×ｓｅｃ－１）という用語は、特定のＡＢＰ－抗原相互作用の会合速度定数を指す。この値はまた、ｋｏｎ値と称される。
本明細書で使用される、「ＫＤ」（Ｍ）という用語は、特定のＡＢＰ－抗原相互作用の解離平衡定数を指す。ＫＤ＝ｋｄ／ｋａ。
本明細書で使用される、「ＫＡ」（Ｍ－１）という用語は、特定のＡＢＰ－抗原相互作用の解離平衡定数を指す。ＫＡ＝ｋａ／ｋｄ。
「親和性成熟」ＡＢＰは、改変を有さない親ＡＢＰと比較して、ＡＢＰのその抗原についての親和性の改善をもたらす（例えば、１つ以上のＣＤＲ又はＦＲにおける）１つ以上の改変を有するものである。一実施形態では、親和性成熟ＡＢＰは、標的抗原についてナノモル又はピコモル親和性を有する。親和性成熟ＡＢＰは、当該技術分野で知られている様々な方法を使用して産生され得る。例えば、Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．（その全体が参照によって組み込まれる、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９２，１０：７７９－７８３）は、ＶＨ及びＶＬドメインシャッフリングによる親和性成熟を記載している。ＣＤＲ及び／又はフレームワーク残基の無作為変異誘発は、例えば、Ｂａｒｂａｓ ｅｔ ａｌ．（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，１９９４，９１：３８０９－３８１３）、Ｓｃｈｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ，１９９５，１６９：１４７－１５５、Ｙｅｌｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９５，１５５：１９９４－２００４、Ｊａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９５，１５４：３３１０－３３１９９、及びＨａｗｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９２，２２６：８８９－８９６によって記載され、その各々は、その全体が参照によって組み込まれる。
「免疫コンジュゲート」は、１つ以上の異種分子にコンジュゲートしたＡＢＰである。
「エフェクター機能」は、抗体のＦｃ領域によって媒介される生物学的活性を指し、その活性は抗体のアイソタイプに応じて変動し得る。抗体エフェクター機能の例は、補体依存的細胞傷害性（ＣＤＣ）を活性化するＣ１ｑ結合、抗体依存的細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を活性化するＦｃ受容体結合、及び抗体依存的細胞食作用（ＡＤＣＰ）を含む。
２つ以上のＡＢＰの文脈において本明細書で使用される場合、「競合する」又は「交差競合する」という用語は、２つ以上のＡＢＰが抗原（例えば、ＣＴＬＡ－４）への結合について競合することを示す。１つの例示的なアッセイでは、ＣＴＬＡ－４は、表面にコーティングされ、第１のＣＴＬＡ－４ ＡＢＰと接触され、その後第２のＣＴＬＡ－４ ＡＢＰが添加される。別の例示的なアッセイでは、第１のＣＴＬＡ－４ ＡＢＰは、表面にコーティングされ、ＣＴＬＡ－４と接触され、次いで第２のＣＴＬＡ－４ ＡＢＰが添加される。第１のＣＴＬＡ－４ ＡＢＰの存在が第２のＣＴＬＡ－４ ＡＢＰの結合を低減する場合、いずれのアッセイにおいても、ＡＢＰは競合する。「競合する」という用語は、１つのＡＢＰが別のＡＢＰの結合を低減するが、ＡＢＰが逆の順序で添加される場合に競合が観察されない、ＡＢＰの組み合わせも含む。しかしながら、いくつかの実施形態では、第１及び第２のＡＢＰは、それらが添加される順序に関係なく、互いの結合を阻害する。いくつかの実施形態では、１つのＡＢＰは、別のＡＢＰのその抗原への結合を、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％低減する。当業者は、競合アッセイで使用される抗体の濃度を、ＣＴＬＡ－４についてのＡＢＰの親和性及びＡＢＰの結合価に基づいて選択することができる。この定義で記載されるアッセイは例示であり、当業者は、抗体が互いに競合するかを決定するために任意の好適なアッセイを利用することができる。好適なアッセイは、例えば、Ｃｏｘ ｅｔ ａｌ．，“Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ，”ｉｎ Ａｓｓａｙ Ｇｕｉｄａｎｃｅ Ｍａｎｕａｌ［Ｉｎｔｅｒｎｅｔ］，Ｕｐｄａｔｅｄ Ｄｅｃｅｍｂｅｒ ２４，２０１４（ｗｗｗ（ｄｏｔ）ｎｃｂｉ（ｄｏｔ）ｎｌｍ（ｄｏｔ）ｎｉｈ（ｄｏｔ）ｇｏｖ／ｂｏｏｋｓ／ＮＢＫ９２４３４／；ａｃｃｅｓｓｅｄ Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ ２９，２０１５）、Ｓｉｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，２００１，４４：３０－３７、及びＦｉｎｃｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ａｎａｌ．，２０１１，５４：３５１－３５８に記載され、その各々は、その全体が参照によって組み込まれる。
「エピトープ」という用語は、ＡＢＰに特異的に結合する抗原の一部分を意味する。エピトープは、しばしば、表面にアクセス可能なアミノ酸残基及び／又は糖側鎖からなり、特定の三次元構造特徴、及び特定の電荷特徴を有し得る。立体構造及び非立体構造エピトープは、後者ではなく前者への結合が変性溶媒の存在下で失われ得るという点で区別される。エピトープは、結合に直接関与するアミノ酸残基、及び結合に直接関与しない他のアミノ酸残基を含み得る。ＡＢＰが結合するエピトープは、例えば、異なる点変異を有するＣＴＬＡ－４バリアント、又はキメラＣＴＬＡ－４バリアントへのＡＢＰ結合について試験することなどの、エピトープ決定のための既知の技法を使用して決定することができる。
ポリペプチド配列と参照配列との間の「同一性」パーセントは、最大配列同一性パーセントを達成するために、必要に応じて、配列をアラインさせ、ギャップを導入した後、参照配列中のアミノ酸残基と同一であるポリペプチド配列中のアミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。アミノ酸配列同一性パーセントを決定する目的でのアラインメントは、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮ、ＭＥＧＡＬＩＧＮ（ＤＮＡＳＴＡＲ）、ＣＬＵＳＴＡＬＷ、ＣＬＵＳＴＡＬ ＯＭＥＧＡ、又はＭＵＳＣＬＥソフトウェアなどの公的に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用して、当該技術分野の範囲内である様々な方法で達成することができる。当業者は、比較される配列の全長にわたって最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、配列をアラインさせるための適切なパラメータを決定することができる。
「保存的置換」又は「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸を化学的又は機能的に類似したアミノ酸での置換を指す。類似のアミノ酸を提供する保存的置換表は、当該技術分野で周知である。例として、表２～４に提供されるアミノ酸の群は、いくつかの実施形態では、互いの保存的置換とみなされる。
追加の保存的置換は、例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ２ｎｄ ｅｄ．（１９９３）Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹに見られ得る。親ＡＢＰにおけるアミノ酸残基の１つ以上の保存的置換を行うことによって生成されたＡＢＰは、「保存的に修飾されたバリアント」と称される。
「治療すること」という用語（及び「治療する」又は「治療」などのその変形）は、それを必要とする対象における疾患又は状態の自然経過を改変する試みにおける臨床的介入を指す。治療は、予防のため、及び臨床病理学の経過中の両方で行うことができる。治療の望ましい効果には、疾患の発生又は再発を防止すること、症状の軽減、疾患の任意の直接的又は間接的な病理学的結果の減少、転移を防止すること、疾患進行の速度の低下させること、疾患状態の改善又は緩和、及び寛解又は改善した予後が含まれる。
本明細書で使用される場合、「治療有効量」又は「有効量」という用語は、対象に投与されると、疾患又は障害を治療するために有効である、本明細書で提供されるＡＢＰ又は薬学的組成物の量を指す。
本明細書で使用される場合、「対象」という用語は、哺乳動物の対象を意味する。例示的な対象には、ヒト、サル、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ウシ、ウマ、ラクダ、ヤギ、ウサギ、及びヒツジが含まれる。特定の実施形態では、対象は、ヒトである。いくつかの実施形態では、対象は、本明細書で提供されるＡＢＰで治療することができる疾患又は状態を有する。いくつかの実施形態では、疾患又は状態は、がんである。いくつかの実施形態では、疾患又は状態は、ウイルス感染である。
「添付文書」という用語は、治療又は診断製品（例えば、キット）の商業包装に通例含まれる、そのような治療又は診断製品の使用に関する適応症、使用法、投与量、投与、併用療法、禁忌、及び／又は警告についての情報を含む、指示を指すために使用される。
本明細書で使用される、「細胞傷害性薬剤」という用語は、細胞機能を阻害若しくは防止するか、かつ／又は細胞死若しくは破壊を引き起こす物質を指す。
「化学療法剤」とは、がんの治療に有用な化合物を指す。化学療法剤には、がんの成長を促進することができるホルモンの効果を調節、低減、ブロック、又は阻害するように作用する「抗ホルモン剤」又は「内分泌療法剤」が含まれる。
「細胞増殖抑制剤」という用語は、インビトロ又はインビボのいずれかで細胞の成長を停止する化合物又は組成物を指す。いくつかの実施形態では、細胞増殖抑制剤は、Ｓ期における細胞のパーセンテージを低減する薬剤である。いくつかの実施形態では、細胞増殖抑制剤は、Ｓ期における細胞のパーセンテージを少なくとも約２０％、少なくとも約４０％、少なくとも約６０％、又は少なくとも約８０％低減する。
「腫瘍」という用語は、悪性又は良性にかかわらず、全ての新生物細胞成長及び増殖、並びに全ての前がん性及びがん性細胞及び組織を指す。「がん」、「がん性」、「細胞増殖性障害」、「増殖性障害」、及び「腫瘍」という用語は、本明細書で言及される場合、相互に排他的ではない。「細胞増殖性障害」及び「増殖性障害」という用語は、いくらかの程度の異常細胞増殖に関連する障害を指す。いくつかの実施形態では、細胞増殖性障害は、がんである。
「薬学的組成物」という用語は、その中に含まれる活性成分の生物学的活性が対象を治療することに有効であることを可能にするような形態であり、対象にとって許容されない程に毒性である追加の成分を含まない調製物を指す。
「調節する」及び「調節」という用語は、列挙された変数を低減すること若しくは阻害すること又は、あるいは、活性化すること若しくは増加することを指す。
「増加する」及び「活性化する」という用語は、列挙された変数における１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍以上の増加を指す。
「低減する」及び「阻害する」という用語は、列挙された変数における１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍以上の減少を指す。
「アゴナイズ」という用語は、受容体の活性化に関連する生物学的応答を誘発する受容体シグナル伝達の活性化を指す。「アゴニスト」は、受容体に結合し、それをアゴナイズする実体である。
「アンタゴナイズ」という用語は、受容体の活性化に関連する生物学的応答を阻害する受容体シグナル伝達の阻害を指す。「アンタゴニスト」は、受容体に結合し、それをアンタゴナイズする実体である。
「エフェクターＴ細胞」という用語には、Ｔヘルパー（すなわち、ＣＤ４＋）細胞及び細胞傷害性（すなわち、ＣＤ８＋）Ｔ細胞が含まれる。ＣＤ４＋エフェクターＴ細胞は、Ｂ細胞の形質細胞及びメモリーＢ細胞への成熟、並びに細胞傷害性Ｔ細胞及びマクロファージの活性化を含む、いくつかの免疫学的プロセスの発達に寄与する。ＣＤ８＋エフェクターＴ細胞は、ウイルス感染細胞及び腫瘍細胞を破壊する。エフェクターＴ細胞に関する追加の情報については、その全体が参照によって組み込まれる、Ｓｅｄｅｒ ａｎｄ Ａｈｍｅｄ，Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２００３，４：８３５－８４２を参照されたい。
「調節性Ｔ細胞」という用語は、例えば、エフェクターＴ細胞を抑制することによって、免疫寛容を調節する細胞を含む。いくつかの実施形態では、調節性Ｔ細胞は、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋表現型を有する。いくつかの実施形態では、調節性Ｔ細胞は、ＣＤ８＋ＣＤ２５＋表現型を有する。調節性Ｔ細胞に関する追加の情報については、その全体が参照によって組み込まれる、Ｎｏｃｅｎｔｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，２０１２，１６５：２０８９－２０９９を参照されたい。
「樹状細胞」という用語は、ナイーブＴ細胞を活性化し、Ｂ細胞の増殖及び分化を刺激することができる専門的な抗原提示細胞を指す。
ポリペプチドの「バリアント」（例えば、抗体）は、天然ポリペプチド配列と比較して、１つ以上のアミノ酸残基がアミノ酸配列に挿入、それから欠失、及び／又はそれに置換されているアミノ酸配列を含み、天然ポリペプチドと同じ生物学的活性を本質的に保持する。ポリペプチドの生物学的活性は、当該技術分野における標準的な技法を使用して測定することができる（例えば、バリアントが抗体である場合、その活性は、本明細書に記載されるように、結合アッセイによって試験され得る）。本開示のバリアントには、フラグメント、アナログ、組換えポリペプチド、合成ポリペプチド、及び／又は融合タンパク質が含まれる。
ポリペプチドの「誘導体」は、例えば、ポリエチレングリコール、アルブミン（例えば、ヒト血清アルブミン）、リン酸化、及びグリコシル化などの、例えば、別の化学部分へのコンジュゲーションを介して、化学的に修飾されたポリペプチド（例えば、抗体）である。特に示されない限り、「抗体」という用語は、２つの完全長重鎖及び２つの完全長軽鎖を含む抗体に加えて、その誘導体、バリアント、フラグメント、及びムテインを含み、その例は、以下に記載されている。
調節配列がヌクレオチド配列の発現（例えば、発現のレベル、タイミング、又は位置）に影響を与える場合、ヌクレオチド配列は、調節配列に「作動可能に結合」している。「調節配列」は、作動可能に結合している核酸の発現（例えば、発現のレベル、タイミング、又は位置）に影響を与える核酸である。調節配列は、例えば、調節された核酸に対して直接、又は１つ以上の他の分子（例えば、調節配列及び／又は核酸に結合するポリペプチド）の作用を通して、その効果を発揮することができる。調節配列の例には、プロモーター、エンハンサー、及び他の発現制御要素（例えば、ポリアデニル化シグナル）が含まれる。調節配列の更なる例は、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ，１９９０，Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ及びＢａｒｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２３：３６０５－０６に記載されている。［００７８］
「宿主細胞」は、核酸、例えば、本開示の核酸を発現するために使用することができる細胞である。宿主細胞は、原核生物、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉであり得るか、又は真核生物、例えば、単細胞真核生物（例えば、酵母若しくは他の真菌）、植物細胞（例えば、タバコ若しくはトマト植物細胞）、動物細胞（例えば、ヒト細胞、サル細胞、ハムスター細胞、ラット細胞、マウス細胞、若しくは昆虫細胞）、若しくはハイブリドーマであり得る。宿主細胞の例には、ＣＳ－９細胞、サル腎臓細胞のＣＯＳ－７株（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）（Ｇｌｕｚｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９８１，Ｃｅｌｌ ２３：１７５を参照されたい）、Ｌ細胞、Ｃ１２７細胞、３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ １６３）、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株、若しくはそれらの誘導体、例えば、無血清培地で増殖するＶｅｇｇｉｅ ＣＨＯ及び関連細胞株（Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２８：３１を参照されたい）、ＨｅＬａ細胞、ＢＨＫ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １０）細胞株、アフリカミドリザル腎臓細胞株ＣＶ１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）に由来するＣＶ１／ＥＢＮＡ細胞株（ＭｃＭａｈａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９１，ＥＭＢＯ Ｊ．１０：２８２１を参照されたい）、ヒト胎児腎臓細胞、例えば、２９３、２９３ ＥＢＮＡ、若しくはＭＳＲ ２９３、ヒト表皮Ａ４３１細胞、ヒトＣｏｌｏ２０５細胞、他の形質転換された霊長類細胞株、正常二倍体細胞、一次組織、一次外植片、ＨＬ－６０、Ｕ９３７、ＨａＫ、若しくはＪｕｒｋａｔ細胞のインビトロ培養に由来する細胞株が含まれるが、これらに限定されない。典型的には、宿主細胞は、次いで宿主細胞において発現することができる、ポリペプチドコード核酸で形質転換又はトランスフェクトすることができる培養された細胞である。
「組換え宿主細胞」という語句は、発現される核酸で形質転換又はトランスフェクトされた宿主細胞を示すために使用することができる。宿主細胞はまた、核酸を含むが、調節配列が核酸と作動可能に結合するように宿主細胞に導入されない限り、それを所望のレベルで発現しない細胞であり得る。宿主細胞という用語は、特定の対象細胞だけでなく、そのような細胞の子孫又は潜在的な子孫を指すことが理解される。特定の修飾が、例えば、変異又は環境の影響によって、後続の世代で発生し得るため、そのような子孫は、実際には、親細胞と同一ではない場合があるが、依然として本明細書で使用される用語の範囲内に含まれる。
いくつかの実施形態では、宿主細胞は、対象へのＡＢＰの送達のための養子細胞療法において使用される。
７．２．他の解釈規則
本明細書に列挙される範囲は、列挙されたエンドポイントを含む、範囲内の値の全ての省略表現であると理解される。例えば、１～５０の範囲は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、及び５０からなる群からの任意の数、数の組み合わせ、又は部分範囲を含むと理解される。
特に示されない限り、１つ以上の立体中心を有する化合物への言及は、各立体異性体、及びそれらの立体異性体の全ての組み合わせを意図する。
７．３．抗原結合タンパク質
一態様では、本開示は、抗原結合タンパク質（例えば、抗体、抗体フラグメント、抗体誘導体、抗体ムテイン、及び抗体バリアント）を提供する。いくつかの実施形態では、ＡＢＰは、ＣＴＬＡ－４に結合する。特に、本開示は、イピリムマブとは異なるＣＴＬＡ－４のエピトープに結合するＡＢＰを提供する。いくつかの実施形態では、エピトープは、Ｋ１３０、Ｙ１３９、Ｌ１４１、及びＩ１４３を含むが、Ｒ７０を含まない。いくつかの実施形態では、ＡＢＰは、アミノ酸Ｋ１３０、Ｙ１３９、Ｌ１４１、Ｉ１４３と接触するが、ＣＴＬＡ－４のアミノ酸Ｒ７０とは接触しない。いくつかの実施形態では、ＡＢＰは、ＣＴＰＡ－４がＣＤ８０／ＣＤ８６と相互作用する間も、ＣＴＬＡ－４に結合することができる。いくつかの実施形態では、ＡＢＰとＣＴＬＡ－４のアミノ酸Ｌ７４Ａ及び／又はＥ６８との間の相互作用は、イピリムマブとＣＴＬＡ－４のアミノ酸Ｌ７４Ａとの間の相互作用よりも大きい。
いくつかの実施形態では、本開示は、Ａ１ＬＣ～Ａ２８ＬＣからなる群から選択される軽鎖可変領域又はＡ１ＨＣ～Ａ２８ＨＣからなる群から選択される重鎖可変領域を含む抗原結合タンパク質、並びにそのフラグメント、誘導体、ムテイン、及びバリアントを提供する。そのような抗原結合タンパク質は、命名法「ＬｘＨｙ」を使用して表すことができ、以下の配列において標識されるように、「ｘ」は、軽鎖可変領域の番号に対応し、「ｙ」は、重鎖可変領域の番号に対応する。すなわち、例えば、「Ａ１ＨＣ」は、配列番号１０１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を表し、「Ａ１ＬＣ」は、配列番号１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を表すなどである。より一般的に言えば、「Ｌ２Ｈ１」は、Ｌ２（配列番号２）のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域及びＨ１（配列番号１０１）のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を有する抗原結合タンパク質を指す。明確さのために、群の少なくとも２つのメンバーによって示される全ての範囲には、末端範囲メンバー間及びそれを含む群の全てのメンバーが含まれる。よって、群範囲Ａ１～Ａ２８には、メンバーＡ１～Ａ２８の全てのメンバー、並びにメンバーＡ１及びＡ２８自体が含まれる。群範囲Ａ４～Ａ６は、メンバーＡ４、Ａ５、及びＡ６などを含む。特定の実施形態では、ＡＢＰはＡ１４である。
いくつかの実施形態では、抗原結合タンパク質は、ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ－１２５５１２下で寄託された、ＣＴＬＡ－４結合クローンのライブラリー中のクローンのうちの１つと同一の重鎖及び軽鎖両方の配列の可変（Ｖ（Ｄ）Ｊ）領域を含む。いくつかの実施形態では、抗原結合タンパク質は、ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ－１２５５１２下で寄託された、ＣＴＬＡ－４結合クローンのライブラリー中のクローンのうちの１つと同一の重鎖又は軽鎖配列の可変（Ｖ（Ｄ）Ｊ）領域を含む。いくつかの実施形態では、抗原結合タンパク質は、ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ－１２５５１２下で寄託された、ＣＴＬＡ－４結合クローンのライブラリー中のクローンのうちの１つにおいて発現ベクターから発現される。
また以下には、抗原結合部位の一部を作製するＣＤＲ（下線）の位置が示され、フレームワーク領域（ＦＲ）は、これらの可変ドメイン配列の介在セグメントである。軽鎖可変領域及び重鎖可変領域の両方において、３つのＣＤＲ（ＣＤＲ１－３）及び４つのＦＲ（ＦＲ１－４）がある。各軽鎖及び重鎖のＣＤＲ領域はまた、抗体タイプ（Ａ１、Ａ２、Ａ３など）によって群化されている。本開示の抗原結合タンパク質には、例えば、Ｌ１Ｈ１（抗体Ａ１、本明細書では「ａＣＴＬＡ－４．９」として交換可能に使用される）、Ｌ２Ｈ２（抗体Ａ２、本明細書では「ａＣＴＬＡ－４．４」として交換可能に使用される）、Ｌ３Ｈ３（抗体Ａ３、本明細書では「ａＣＴＬＡ－４．２」として交換可能に使用される）、Ｌ４Ｈ４（抗体Ａ４、本明細書では「ａＣＴＬＡ－４．２９」として交換可能に使用される）、Ｌ５Ｈ５（抗体Ａ５、本明細書では「ａＣＴＬＡ－４．２８」として交換可能に使用される）、Ｌ６Ｈ６（抗体Ａ６、本明細書では「ａＣＴＬＡ－４．２６」として交換可能に使用される）、Ｌ７Ｈ７（抗体Ａ７、本明細書では「ａＣＴＬＡ－４．３」として交換可能に使用される）、Ｌ８Ｈ８（抗体Ａ８、本明細書では「ａＣＴＬＡ－４．１」として交換可能に使用される）、Ｌ９Ｈ９（抗体Ａ９、本明細書では「ａＣＴＬＡ－４．２４」として交換可能に使用される）、Ｌ１０Ｈ１０（抗体Ａ１０、本明細書では「ａＣＴＬＡ－４．２２」として交換可能に使用される）、Ｌ１１Ｈ１１（抗体Ａ１１、本明細書では「ａＣＴＬＡ－４．３１」として交換可能に使用される）、Ｌ１２Ｈ１２（抗体Ａ１２、本明細書では「ａＣＴＬＡ－４．１２」として交換可能に使用される）、Ｌ１３Ｈ１３（抗体Ａ１３、本明細書では「ａＣＴＬＡ－４．１４」として交換可能に使用される）、Ｌ１３Ｈ１３（抗体Ａ１３、本明細書では「ａＣＴＬＡ－４．１４」として交換可能に使用される）・・・及びＬ２８Ｈ２８（抗体Ａ２８）からなる組み合わせの群から選択される軽鎖及び重鎖可変ドメインの組み合わせを有する抗原結合タンパク質が含まれる。本開示の抗原結合タンパク質には、例えば、Ｌ１８Ｈ１８（抗体Ａ１８、本明細書では「ａＣＴＬＡ－４．１１」として交換可能に使用される）、Ｌ１５Ｈ１５（抗体Ａ１５、本明細書では「ａＣＴＬＡ－４．１８」として交換可能に使用される）、Ｌ１６Ｈ１６（抗体Ａ１６、本明細書では「ａＣＴＬＡ－４．５」として交換可能に使用される）、及びＬ１７Ｈ１７（抗体Ａ１７、本明細書では「ａＣＴＬＡ－４．１７」として交換可能に使用される）からなる群から選択される軽鎖及び重鎖可変ドメインを有する抗原結合タンパク質が含まれる。いくつかの実施形態では、本開示のＡＢＰは、Ｌ１４Ｈ１４（抗体Ａ１４、本明細書では「ａＣＴＬＡ－４．１５」又はＧＩＧＡ－５６４として交換可能に使用される）を含む。
本開示の抗原結合タンパク質には、例えば、Ｌ１９Ｈ１９（抗体Ａ１９、本明細書では「ａＣＴＬＡ－４．７」として交換可能に使用される）、Ｌ２０Ｈ２０（抗体Ａ２０、本明細書では「ａＣＴＬＡ－４．２５」として交換可能に使用される）、Ｌ２１Ｈ２１（抗体Ａ２１、本明細書では「ａＣＴＬＡ－４．１０」として交換可能に使用される）、Ｌ２２Ｈ２２（抗体Ａ２２、本明細書では「ａＣＴＬＡ－４．２１」として交換可能に使用される）、Ｌ２３Ｈ２３（抗体Ａ２３、本明細書では「ａＣＴＬＡ－４．２３」として交換可能に使用される）、Ｌ２４Ｈ２４（抗体Ａ２４、本明細書では「ａＣＴＬＡ－４．２７」として交換可能に使用される）、Ｌ２５Ｈ２５（抗体Ａ２５、本明細書では「ａＣＴＬＡ－４．３２」として交換可能に使用される）、Ｌ２６Ｈ２６（抗体Ａ２６、本明細書では「ａＣＴＬＡ－４．２０」として交換可能に使用される）、及びＬ２７Ｈ２７（抗体Ａ２７、本明細書では「ａＣＴＬＡ－４．８」として交換可能に使用される）からなる群から選択される軽鎖及び重鎖可変ドメインを有する抗原結合タンパク質が含まれる。いくつかの実施形態では、本開示のＡＢＰは、Ｌ１４Ｈ１４（抗体Ａ１４、本明細書では「ａＣＴＬＡ－４．１５」又はＧＩＧＡ－５６４として交換可能に使用される）の軽鎖及び重鎖可変ドメインを含む。
いくつかの実施形態では、抗原結合タンパク質は、ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ－１２５５１２下で寄託された、ＣＴＬＡ－４結合クローンのライブラリー中のクローンのうちの１つと同一の全ての６つのＣＤＲ配列（軽鎖の３つのＣＤＲ及び重鎖の３つのＣＤＲ）を含む。いくつかの実施形態では、抗原結合タンパク質は、ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ－１２５５１２下で寄託された、ＣＴＬＡ－４結合クローンのライブラリー中のクローンのうちの１つと同一の６つのＣＤＲ配列（軽鎖の３つのＣＤＲ又は重鎖の３つのＣＤＲ）のうちの３つを含む。いくつかの実施形態では、抗原結合タンパク質は、ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ－１２５５１２下で寄託された、ＣＴＬＡ－４結合クローンのライブラリー中のクローンのうちの１つと同一の６つのＣＤＲ配列のうちの１つ、２つ、３つ、４つ、又は５つを含む。
一実施形態では、本開示は、Ｌ１～Ｌ２８からなる群から選択される軽鎖可変ドメインの配列とは１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１個の残基のみで異なるアミノ酸の配列を含む軽鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質を提供し、各々そのような配列差は、独立して、１個のアミノ酸残基の欠失、挿入、又は置換のいずれかである。別の実施形態では、軽鎖可変ドメインは、Ｌ１～Ｌ２８からなる群から選択される軽鎖可変ドメインの配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸の配列を含む。別の実施形態では、軽鎖可変ドメインは、（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、Ｌ６、Ｌ７、Ｌ８、Ｌ９、Ｌ１０、Ｌ１１、Ｌ１２、Ｌ１３、Ｌ１４、・・・及びＬ２８を含む）Ｌ１～Ｌ２８からなる群から選択される軽鎖可変ドメインをコードするヌクレオチド配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸の配列を含む。別の実施形態では、軽鎖可変ドメインは、Ｌ１～Ｌ２８からなる群から選択される軽鎖可変ドメインをコードするポリヌクレオチドの補体に適度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸の配列を含む。別の実施形態では、軽鎖可変ドメインは、Ｌ１～Ｌ２８からなる群から選択される軽鎖可変ドメインをコードするポリヌクレオチドの補体に適度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸の配列を含む。別の実施形態では、軽鎖可変ドメインは、Ｌ１～Ｌ２８の軽鎖ポリヌクレオチドの補体に適度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸の配列を含む。
一実施形態では、本開示は、ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ－１２５５１２下で寄託された、ＣＴＬＡ－４結合クローンのライブラリーのクローンのうちの１つによってコードされる軽鎖可変ドメインの配列とは１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１個の残基のみで異なるアミノ酸の配列を含む軽鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質を提供し、各そのような配列差は、独立して、１個のアミノ酸残基の欠失、挿入、又は置換のいずれかである。別の実施形態では、軽鎖可変ドメインは、ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ－１２５５１２下で寄託された、ＣＴＬＡ－４結合クローンのライブラリーのクローンのうちの１つによってコードされる軽鎖可変ドメインの配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸の配列を含む。別の実施形態では、軽鎖可変ドメインは、ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ－１２５５１２下で寄託された、ＣＴＬＡ－４結合クローンのライブラリーのクローンのうちの１つのヌクレオチド配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸の配列を含む。
別の実施形態では、本開示は、Ｈ１～Ｈ２８からなる群から選択される重鎖可変ドメインの配列とは１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１個の残基のみで異なるアミノ酸の配列を含む重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質を提供し、各そのような配列差は、独立して、１個のアミノ酸残基の欠失、挿入、又は置換のいずれかである。別の実施形態では、重鎖可変ドメインは、Ｈ１～Ｈ２８からなる群から選択される重鎖可変ドメインの配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸の配列を含む。別の実施形態では、重鎖可変ドメインは、Ｈ１～Ｈ２８からなる群から選択される重鎖可変ドメインをコードするヌクレオチド配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸の配列を含む。別の実施形態では、重鎖可変ドメインは、Ｈ１～Ｈ２８からなる群から選択される重鎖可変ドメインをコードするポリヌクレオチドの補体に適度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸の配列を含む。別の実施形態では、重鎖可変ドメインは、Ｈ１～Ｈ２８からなる群から選択される重鎖可変ドメインをコードするポリヌクレオチドの補体に適度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸の配列を含む。別の実施形態では、重鎖可変ドメインは、本明細書に開示される重鎖ポリヌクレオチドの補体に適度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸の配列を含む。
一実施形態では、本開示は、ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ－１２５５１２下で寄託された、ＣＴＬＡ－４結合クローンのライブラリーのクローンのうちの１つによってコードされる重鎖可変ドメインの配列とは１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１個の残基のみで異なるアミノ酸の配列を含む重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質を提供し、各そのような配列差は、独立して、１個のアミノ酸残基の欠失、挿入、又は置換のいずれかである。別の実施形態では、重鎖可変ドメインは、ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ－１２５５１２下で寄託された、ＣＴＬＡ－４結合クローンのライブラリーのクローンのうちの１つによってコードされる重鎖可変ドメインの配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸の配列を含む。別の実施形態では、重鎖可変ドメインは、ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ－１２５５１２下で寄託された、ＣＴＬＡ－４結合クローンのライブラリーのクローンのうちの１つのヌクレオチド配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸の配列を含む。
本開示の抗原結合タンパク質の特定の実施形態は、本明細書で参照されるＣＤＲ及び／又はＦＲのうちの１つ以上のアミノ酸配列と同一である１つ以上のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、抗原結合タンパク質は、上に示された軽鎖ＣＤＲ１配列を含む。別の実施形態では、抗原結合タンパク質は、上に示された軽鎖ＣＤＲ２配列を含む。別の実施形態では、抗原結合タンパク質は、上に示された軽鎖ＣＤＲ３配列を含む。別の実施形態では、抗原結合タンパク質は、上に示された重鎖ＣＤＲ１配列を含む。別の実施形態では、抗原結合タンパク質は、上に示された重鎖ＣＤＲ２配列を含む。別の実施形態では、抗原結合タンパク質は、上に示された重鎖ＣＤＲ３配列を含む。
一実施形態では、本開示は、上に示されるＣＤＲ配列と５、４、３、２、又は１個のアミノ酸残基で異なる１つ以上のＣＤＲ配列を含む抗原結合タンパク質を提供する。
いくつかの実施形態では、抗原結合タンパク質のＣＤＲ１配列のうちの少なくとも１つは、表５に示されるように、Ａ１～Ａ２８、ＣＤＲ１－Ｌ１～２８、又はＣＤＲ１－Ｈ１～２８からのＣＤＲ１配列である。いくつかの実施形態では、抗原結合タンパク質のＣＤＲ２配列のうちの少なくとも１つは、表５に示されるように、Ａ１～Ａ２８、ＣＤＲ２－Ｌ１～２８、又はＣＤＲ２－Ｈ１～２８からのＣＤＲ２配列である。いくつかの実施形態では、抗原結合タンパク質のＣＤＲ３配列のうちの少なくとも１つは、表５に示されるように、Ａ１～Ａ２８、ＣＤＲ３－Ｌ１～２８、又はＣＤＲ３－Ｈ１～２８からのＣＤＲ３配列である。
別の実施形態では、抗原結合タンパク質の軽鎖ＣＤＲ３配列は、表５に示されるように、Ａ１～Ａ２８又はＣＤＲ３－Ｌ１～２８からの軽鎖ＣＤＲ３配列であり、抗原結合タンパク質の重鎖ＣＤＲ３配列は、表５に示されるように、Ａ１～Ａ２８又はＣＤＲ－Ｈ１～２８からの重鎖配列である。
いくつかの実施形態では、抗原結合タンパク質のＣＤＲ１配列のうちの少なくとも１つは、ＱＳＶＳＳＳＹＬＡ（配列番号１２０７８又は１０１４）の軽鎖ＣＤＲ１配列である。いくつかの実施形態では、抗原結合タンパク質のＣＤＲ２配列のうちの少なくとも１つは、ＧＡＳＳＲＡＴ（配列番号１２０７９又は２０１４）の軽鎖ＣＤＲ２配列である。いくつかの実施形態では、抗原結合タンパク質のＣＤＲ３配列のうちの少なくとも１つは、ＱＱＹＧＳＳＰＷＴ（配列番号１２０８０又は３０１４）の軽鎖ＣＤＲ３配列である。
いくつかの実施形態では、抗原結合タンパク質のＣＤＲ１配列のうちの少なくとも１つは、ＧＦＴＦＳＳＹ（配列番号１２０７５又は４０１４）の重鎖ＣＤＲ１配列である。いくつかの実施形態では、抗原結合タンパク質のＣＤＲ２配列のうちの少なくとも１つは、ＷＹＥＧＲＮの重鎖ＣＤＲ２配列（配列番号１２０７６又は５０１４）である。いくつかの実施形態では、抗原結合タンパク質のＣＤＲ３配列のうちの少なくとも１つは、ＡＧＤＬＧＡＦＤＩの重鎖ＣＤＲ３配列（配列番号１２０７７又は６０１４）である。
いくつかの実施形態では、ＡＢＰは、配列番号１２００４からなるＣＤＲ１－Ｌ、配列番号１２０１４からなるＣＤＲ２－Ｌ、配列番号１２０２４からなるＣＤＲ３－Ｌ、配列番号１２０３９からなるＣＤＲ１－Ｈ、配列番号１２０４９からなるＣＤＲ２－Ｈ、及び配列番号１２０５９からなるＣＤＲ３－Ｈを含む。いくつかの実施形態では、ＡＢＰは、配列番号１２００５からなるＣＤＲ１－Ｌ、配列番号１２０１５からなるＣＤＲ２－Ｌ、配列番号１２０２５からなるＣＤＲ３－Ｌ、配列番号１２０４０からなるＣＤＲ１－Ｈ、配列番号１２０５０からなるＣＤＲ２－Ｈ、及び配列番号１２０６０からなるＣＤＲ３－Ｈを含む。いくつかの実施形態では、ＡＢＰは、配列番号１２００６からなるＣＤＲ１－Ｌ、配列番号１２０１６からなるＣＤＲ２－Ｌ、配列番号１２０２６からなるＣＤＲ３－Ｌ、配列番号１２０４１からなるＣＤＲ１－Ｈ、配列番号１２０５１からなるＣＤＲ２－Ｈ、及び配列番号１２０６１からなるＣＤＲ３－Ｈを含む。いくつかの実施形態では、ＡＢＰは、配列番号１２００７からなるＣＤＲ１－Ｌ、配列番号１２０１７からなるＣＤＲ２－Ｌ、配列番号１２０２７からなるＣＤＲ３－Ｌ、配列番号１２０４２からなるＣＤＲ１－Ｈ、配列番号１２０５２からなるＣＤＲ２－Ｈ、及び配列番号１２０６２からなるＣＤＲ３－Ｈを含む。いくつかの実施形態では、ＡＢＰは、配列番号１２００８からなるＣＤＲ１－Ｌ、配列番号１２０１８からなるＣＤＲ２－Ｌ、配列番号１２０２８からなるＣＤＲ３－Ｌ、配列番号１２０４３からなるＣＤＲ１－Ｈ、配列番号１２０５３からなるＣＤＲ２－Ｈ、及び配列番号１２０６３からなるＣＤＲ３－Ｈを含む。
別の実施形態では、抗原結合タンパク質は、各々独立して、６、５、４、３、２、１、又は０個の単一アミノ酸付加、置換、及び／又はＡ１～Ａ２３のＣＤＲ配列からの欠失によって異なる１、２、３、４、又は５個のＣＤＲ配列を含み、抗原結合タンパク質は、各々独立して、６、５、４、３、２、１、又は０個の単一アミノ酸付加、置換、及び／又はＣＤＲ配列からの欠失によって異なる１、２、３、４、又は５個のＣＤＲ配列を更に含む。いくつかの実施形態では、抗原結合タンパク質は、各々Ａ１～Ａ２８のＣＤＲ配列に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有する１、２、３、４、又は５個のＣＤＲ配列を含む。
Ａ１～Ａ２８のヌクレオチド配列、又はＡ１～Ａ２８のアミノ酸配列は、例えば、無作為変異誘発によって又は部位特異的変異誘発（例えば、オリゴヌクレオチド特異的部位特異的変異誘発）によって改変して、非変異ポリヌクレオチドと比較して、１つ以上の特定のヌクレオチド置換、欠失、又は挿入を含む改変されたポリヌクレオチドを作製することができる。そのような改変を行うための技法の例は、Ｗａｌｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｇｅｎｅ ４２：１３３、Ｂａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．１９８５，Ｇｅｎｅ ３７：７３、Ｃｒａｉｋ，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｊａｎｕａｒｙ １９８５，１２－１９、Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，１９８１，Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ、並びに米国特許第４，５１８，５８４号及び同第４，７３７，４６２号に記載されている。これら及び他の方法を使用して、例えば、所望の特性、例えば、誘導体化されていない抗体と比較して、ＣＴＬＡ－４についての増加した親和性、結合力、若しくは特異性、インビボ若しくはインビトロでの増加した活性若しくは安定性、又は低減したインビボ副作用を有する抗ＣＴＬＡ－４抗体の誘導体を作製することができる。
本開示の範囲内の抗ＣＴＬＡ－４抗体の他の誘導体には、抗ＣＴＬＡ－４抗体ポリペプチドのＮ末端又はＣ末端に融合した異種ポリペプチドを含む組換え融合タンパク質の発現によるなど、抗ＣＴＬＡ－４抗体、又はそのフラグメントの、他のタンパク質又はポリペプチドとの共有結合又は凝集コンジュゲートが含まれる。例えば、コンジュゲートされたペプチドは、異種シグナル（又はリーダー）ポリペプチド、例えば、酵母アルファ因子リーダー、又はエピトープタグなどのペプチドであり得る。抗原結合タンパク質含有融合タンパク質は、抗原結合タンパク質（例えば、ポリ－Ｈｉｓ）の精製又は同定を促進するために添加されるペプチドを含むことができる。抗原結合タンパク質はまた、Ｈｏｐｐ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：１２０４，１９８８、及び米国特許第５，０１１，９１２号に記載されるＦＬＡＧペプチドＡｓｐ－Ｔｙｒ－Ｌｙｓ－Ａｓｐ－Ａｓｐ－Ａｓｐ－Ａｓｐ－Ｌｙｓ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ）（配列番号７００２）に結合し得る。ＦＬＡＧペプチドは、高抗原性であり、特定のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）によって可逆的に結合するエピトープを提供し、発現した組換えタンパク質の迅速なアッセイ及び容易な精製を可能にする。ＦＬＡＧペプチドが所与のポリペプチドに融合している融合タンパク質を調製するために有用な試薬は、市販されている（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）。
ＰＣＴ出願ＷＯ９３／１０１５１（参照によって本明細書に組み込まれる）に記載される、１つの好適なＦｃポリペプチドは、ヒトＩｇＧ１抗体のＦｃ領域のＮ末端ヒンジ領域から天然Ｃ末端まで延在する単鎖ポリペプチドである。別の有用なＦｃポリペプチドは、米国特許第５，４５７，０３５号及びＢａｕｍ ｅｔ ａｌ．，１９９４，ＥＭＢＯ Ｊ．１３：３９９２－４００１に記載されるＦｃムテインである。このムテインのアミノ酸配列は、アミノ酸１９がＬｅｕからＡｌａに変更され、アミノ酸２０がＬｅｕからＧｌｕに変更され、アミノ酸２２がＧｌｙからＡｌａに変更されたことを除いて、ＷＯ９３／１０１５１に提示される天然Ｆｃ配列のものと同一である。ムテインは、Ｆｃ受容体について低減した親和性を示す。
他の実施形態では、抗ＣＴＬＡ－４抗体の重鎖及び／又は軽鎖の可変部分は、抗体重鎖及び／又は軽鎖の可変部分に置換することができる。
１つ以上の抗原結合タンパク質を含有するオリゴマーは、ＣＴＬＡ－４アンタゴニスト又はアゴニストとして使用され得る。オリゴマーは、共有結合又は非共有結合ダイマー、トリマー、又はより高次のオリゴマーの形態であり得る。２つ以上の抗原結合タンパク質を含むオリゴマーは、使用について企図され、一例は、ホモダイマーである。他のオリゴマーには、ヘテロダイマー、ホモトリマー、ヘテロトリマー、ホモテトラマー、ヘテロテトラマーなどが含まれる。
一実施形態は、抗原結合タンパク質に融合したペプチド部分間の共有結合又は非共有相互作用を介して結合した複数の抗原結合タンパク質を含むオリゴマーを対象とする。そのようなペプチドは、ペプチドリンカー（スペーサー）、又はオリゴマー化を促進する特性を有するペプチドであり得る。ロイシンジッパー及び抗体から誘導される特定のポリペプチドは、以下でより詳細に記載されるように、それに結合した抗原結合タンパク質のオリゴマー化を促進することができるペプチドに含まれる。
特定の実施形態では、オリゴマーは、２～４個の抗原結合タンパク質を含む。オリゴマーの抗原結合タンパク質は、上記の形態のいずれか、例えば、バリアント又はフラグメントなどの、任意の形態であり得る。好ましくは、オリゴマーは、ＣＴＬＡ－４結合活性を有する抗原結合タンパク質を含む。
一実施形態では、オリゴマーは、免疫グロブリンに由来するポリペプチドを使用して調製される。抗体由来のポリペプチド（Ｆｃドメインを含む）の様々な部分に融合した特定の異種ポリペプチドを含む融合タンパク質の調製は、例えば、Ａｓｈｋｅｎａｚｉ ｅｔ ａｌ．，１９９１，ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８８：１０５３５、Ｂｙｒｎ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｎａｔｕｒｅ ３４４：６７７、及びＨｏｌｌｅｎｂａｕｇｈ ｅｔ ａｌ．，１９９２ Ｃｕｒｒ．Ｐｒｏｔｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，Ｓｕｐｐｌ．４，ｐａｇｅｓ １０．１９．１－１０．１９．１１によって記載されている。
本開示の一実施形態は、抗ＣＴＬＡ－４抗体のＣＴＬＡ－４結合フラグメントを抗体のＦｃ領域に融合することによって作製される２つの融合タンパク質を含むダイマーを対象とする。ダイマーは、例えば、融合タンパク質をコードする遺伝子融合体を適切な発現ベクターに挿入し、組換え発現ベクターで形質転換された宿主細胞において遺伝子融合体を発現させ、発現した融合タンパク質を抗体分子と同様に組み立てることを可能にすることによって作製することができ、その後鎖間ジスルフィド結合がＦｃ部分間に形成され、ダイマーをもたらす。
あるいは、オリゴマーは、ペプチドリンカー（スペーサーペプチド）を含む又は含まない、複数の抗原結合タンパク質を含む融合タンパク質である。好適なペプチドリンカーの中には、米国特許第４，７５１，１８０号及び第４，９３５，２３３号に記載されるものがある。
オリゴマー抗原結合タンパク質を調製するための別の方法は、ロイシンジッパーの使用を含む。ロイシンジッパードメインは、それらが見られるタンパク質のオリゴマー化を促進するペプチドである。ロイシンジッパーは、当初はいくつかのＤＮＡ結合タンパク質において同定され（Ｌａｎｄｓｃｈｕｌｚ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１７５９）、その後は様々な異なるタンパク質において発見された。既知のロイシンジッパーの中には、ダイマー化又はトリマー化する天然に存在するペプチド及びその誘導体がある。可溶性オリゴマータンパク質を産生するために好適なロイシンジッパードメインの例は、ＰＣＴ出願ＷＯ９４／１０３０８に記載されており、肺界面活性タンパク質Ｄ（ＳＰＤ）に由来するロイシンジッパーは、本明細書に参照によって組み込まれる、Ｈｏｐｐｅ ｅｔ ａｌ．，１９９４，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ３４４：１９１に記載されている。それに融合した異種タンパク質の安定なトリマー化を可能にする修飾されたロイシンジッパーの使用は、Ｆａｎｓｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｓｅｍｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：２６７－７８に記載されている。１つのアプローチでは、ロイシンジッパーペプチドに融合した抗ＣＴＬＡ－４抗体フラグメント又は誘導体を含む組換え融合タンパク質は、好適な宿主細胞において発現され、形成される可溶性オリゴマー抗ＣＴＬＡ－４抗体フラグメント又は誘導体は、培養上清から回収される。
一態様では、本開示は、ＣＴＬＡ－４のそのリガンドへの結合に干渉する抗原結合タンパク質を提供する。そのような抗原結合タンパク質は、ＣＴＬＡ－４、又はそのフラグメント、バリアント、若しくは誘導体に対して作製され、ＣＴＬＡ－４のそのリガンドへの結合に干渉する能力について従来のアッセイでスクリーニングされ得る。好適なアッセイの例は、ＣＴＬＡ－４を発現する細胞へのＣＴＬＡ－４リガンドの結合を阻害する能力について抗原結合タンパク質を試験するアッセイ、又はＣＴＬＡ－４リガンドの細胞表面ＣＴＬＡ－４への結合からもたらされる生体若しくは細胞応答を低減する能力について抗原結合タンパク質を試験するアッセイである。例えば、抗体は、固定化された抗体表面（ＣＴＬＡ－４）に結合する能力に従ってスクリーニングすることができる。ＣＴＬＡ－４のリガンドへの結合をブロックする抗原結合タンパク質は、がんを含むが、これに限定されない、任意のＣＴＬＡ－４関連状態の治療に使用することができる。一実施形態では、トランスジェニックマウスの免疫化を伴う手順によって生成されたヒト抗ＣＴＬＡ－４モノクローナル抗体が、そのような状態の治療に使用される。
本開示の抗原結合タンパク質の抗原結合フラグメントは、従来の技法によって産生することができる。そのようなフラグメントの例には、Ｆａｂ及びＦ（ａｂ’）２フラグメントが含まれるが、これらに限定されない。遺伝子操作技法によって産生された抗体フラグメント及び誘導体も企図される。
追加の実施形態には、キメラ抗体、例えば、非ヒト（例えば、マウス）モノクローナル抗体のヒト化バージョンが含まれる。そのようなヒト化抗体は、既知の技法によって調製され得、抗体がヒトに投与されると低減した免疫原性の利点を提供し得る。一実施形態では、ヒト化モノクローナル抗体は、マウス抗体の可変ドメイン（又はその抗原結合部位の全部若しくは一部）及びヒト抗体に由来する定常ドメインを含む。あるいは、ヒト化抗体フラグメントは、マウスモノクローナル抗体の抗原結合部位及びヒト抗体に由来する可変ドメインフラグメント（抗原結合部位が欠如している）を含み得る。キメラ及び更に操作されたモノクローナル抗体の産生のための手順には、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３、Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：３４３９、Ｌａｒｒｉｃｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７：９３４、及びＷｉｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９３，ＴＩＰＳ １４：１３９に記載されるものが含まれる。一実施形態では、キメラ抗体は、ＣＤＲグラフト化抗体である。抗体をヒト化するための技法は、例えば、米国特許第５，８６９，６１９号、同第５，２２５，５３９号、同第５，８２１，３３７号、同第５，８５９，２０５号、同第６，８８１，５５７号、Ｐａｄｌａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９５，ＦＡＳＥＢ Ｊ．９：１３３－３９、及びＴａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：１４３２－４１に議論されている。
非ヒト動物においてヒト抗体又は部分ヒト抗体を生成するために手順が開発されている。例えば、１つ以上の内因性免疫グロブリン遺伝子が様々な手段によって不活化されたマウスが調製されている。不活性化されたマウス遺伝子を置き換えるために、ヒト免疫グロブリン遺伝子がマウスに導入された。動物において産生される抗体は、動物に導入されたヒト遺伝材料によってコードされるヒト免疫グロブリンポリペプチド鎖を組み込む。一実施形態では、トランスジェニックマウスなどの、非ヒト動物は、ＣＴＬＡ－４ポリペプチドに対する抗体が動物において生成されるように、ＣＴＬＡ－４ポリペプチドで免疫化される。
好適な免疫原の一例は、以下の配列：配列番号７００１又はタンパク質の他の免疫原性フラグメントを有するタンパク質の細胞外ドメインを含むポリペプチドなどの、可溶性ヒトＣＴＬＡ－４である。ヒト又は部分的ヒト抗体の産生のためのトランスジェニック動物の産生及び使用のための技法の例は、米国特許第５，８１４，３１８号、同第５，５６９，８２５号、及び同第５，５４５，８０６号、Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｒｏｍ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｉｃｅ ｉｎ Ｌｏ，ｅｄ．Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，ＮＪ：１９１－２００、Ｋｅｌｌｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１３：５９３－９７、Ｒｕｓｓｅｌ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ．６８：１８２０－２６、Ｇａｌｌｏ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎ．３０：５３４－４０、Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｃａｎｃｅｒ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ Ｒｅｖ．１８：４２１－２５、Ｇｒｅｅｎ，１９９９，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２３１：１１－２３、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ，１９９８，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ３１：３３－４２、Ｇｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ．１８８：４８３－９５、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ Ａ，１９９８，Ｅｘｐ．Ｏｐｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｒｕｇｓ．７：６０７－１４、Ｔｓｕｄａ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．４２：４１３－２１、Ｍｅｎｄｅｚ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ．１５：１４６－５６、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ，１９９４，Ｃｕｒｒ Ｂｉｏｌ．４：７６１－６３、Ａｒｂｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．１：２４７－６０、Ｇｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ．７：１３－２１、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｎａｔｕｒｅ．３６２：２５５－５８、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．９０：２５５１－５５．Ｃｈｅｎ，Ｊ．，Ｍ．Ｔｒｏｕｎｓｔｉｎｅ，Ｆ．Ｗ．Ａｌｔ，Ｆ．Ｙｏｕｎｇ，Ｃ．Ｋｕｒａｈａｒａ，Ｊ．Ｌｏｒｉｎｇ，Ｄ．Ｈｕｓｚａｒ．Ｉｎｔｅｒ’ｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．５（１９９３）：６４７－６５６、Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ４：１１７－２３、Ｆｉｓｈｗｉｌｄ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１４：８４５－５１，Ｈａｒｄｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ａｎｎａｌｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｌｏｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｎａｔｕｒｅ ３６８：８５６－５９、Ｌｏｎｂｅｒｇ，１９９４，Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｔｏ Ｈｕｍａｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ １１３：４９－１０１、Ｌｏｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １３：６５－９３、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，１９９６，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４：８２６、Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０：６２８７－９５、Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｉｎｔｅｒ’ｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：５７９－９１、Ｔｏｍｉｚｕｋａ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １６：１３３－４３、Ｔｏｍｉｚｕｋａ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｐｒｏ．Ｎａｔ’ｌＡｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９７：７２２－２７、Ｔｕａｉｌｌｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｐｒｏ．Ｎａｔ’ｌＡｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：３７２０－２４、並びにＴｕａｉｌｌｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：２９１２－２０に記載されている。
本開示の抗原結合タンパク質（例えば、抗体、抗体フラグメント、及び抗体誘導体）は、当該技術分野で知られている任意の定常領域を含むことができる。軽鎖定常領域は、例えば、カッパ又はラムダ型軽鎖定常領域、例えば、ヒトカッパ又はラムダ型軽鎖定常領域であり得る。重鎖定常領域は、例えば、アルファ型、デルタ型、イプシロン型、ガンマ型、又はミュー型重鎖定常領域、例えば、ヒトアルファ型、デルタ型、イプシロン型、ガンマ型、又はミュー型重鎖定常領域であり得る。一実施形態では、軽鎖又は重鎖定常領域は、天然に存在する定常領域のフラグメント、誘導体、バリアント、又はムテインである。
目的の抗体から異なるサブクラス又はアイソタイプの抗体を誘導するための技法、すなわち、サブクラススイッチングが知られている。よって、ＩｇＧ抗体は、例えば、ＩｇＭ抗体から誘導され得、逆もまた同様である。そのような技法は、所与の抗体（親抗体）の抗原結合特性を有するが、親抗体のものとは異なる抗体アイソタイプ又はサブクラスに関連する生物学的特性も示す新しい抗体の調製を可能にする。組換えＤＮＡ技法が使用され得る。特定の抗体ポリペプチドをコードするクローニングされたＤＮＡ、例えば、所望のアイソタイプの抗体の定常ドメインをコードするＤＮＡは、そのような手順で使用され得る。Ｌａｎｔｔｏ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１７８：３０３－１６を参照されたい。
一実施形態では、本開示の抗原結合タンパク質は、Ａ１～Ａ２８（Ｈ１～Ｈ２８）のいずれかのＩｇＧ１重鎖ドメイン、又はＡ１～Ａ２８（Ｈ１～Ｈ２８）のいずれかのＩｇＧ１重鎖ドメインのフラグメントを含む。別の実施形態では、本開示の抗原結合タンパク質は、Ａ１～Ａ２８（Ｌ１～Ｌ２８）のカッパ軽鎖定常領域、又はＡ１～Ａ２８（Ｌ１～Ｌ２８）のカッパ軽鎖定常領域のフラグメントを含む。別の実施形態では、本開示の抗原結合タンパク質は、Ａ１～Ａ２８（Ｈ１～Ｈ２８）のＩｇＧ１重鎖ドメイン、又はそのフラグメント、及びＡ１～Ａ２８（Ｌ１～Ｌ２８）のカッパ軽鎖ドメイン、又はそのフラグメントの両方を含む。
別の実施形態では、本開示の抗原結合タンパク質は、Ａ１～Ａ２８（Ｈ１～Ｈ２８）の、ＩｇＧ１重鎖ドメイン又はそのフラグメントの両方を含む。いくつかの実施形態では、ＩｇＧ１重鎖ドメインは、ＩＭＧＴエキソンナンバリングシステムによるアミノ酸位置９７（Ｋ９７）にリジンを含む。別の実施形態では、ＩｇＧ１重鎖ドメインは、ＥＵナンバリングシステムによるアミノ酸位置２１４（Ｋ２１４）にリジンを含む。いくつかの実施形態では、ＩｇＧ１重鎖ドメインは、ＩＭＧＴエキソンナンバリングシステムによるアミノ酸位置９７（Ｒ９７）にアルギニンを含む。別の実施形態では、ＩｇＧ１重鎖ドメインは、ＥＵナンバリングシステムによるアミノ酸位置２１４（Ｒ２１４）にアルギニンを含む。
いくつかの実施形態では、本開示の抗原結合タンパク質は、Ａ１４（Ｈ１４）（配列番号１１４）のＩｇＧ１重鎖ドメイン又はＩｇＧ１重鎖ドメインのフラグメント、及びＡ１４（Ｈ１４）（配列番号１４）のＩｇＧ１軽鎖ドメイン又はＩｇＧ１軽鎖ドメインのフラグメントを含む。
したがって、本開示の抗原結合タンパク質には、例えば、可変ドメイン組み合わせＬ１Ｈ１、Ｌ２Ｈ２、Ｌ３Ｈ３、Ｌ４Ｈ４、Ｌ５Ｈ５、Ｌ６Ｈ６、Ｌ７Ｈ７、Ｌ８Ｈ８、Ｌ９Ｈ９、Ｌ１０Ｈ１０、Ｌ１１Ｈ１１、Ｌ１２Ｈ１２、Ｌ１３Ｈ１３、・・・及びＬ２８Ｈ２８を含むもの、所望のアイソタイプ（例えば、ＩｇＡ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＥ、及びＩｇＤ）及びそのＦａｂ又はＦ（ａｂ’）２フラグメントを有するものが含まれる。更に、ＩｇＧ４が望まれる場合、参照によって本明細書に組み込まれる、Ｂｌｏｏｍ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ６：４０７に記載されるようにヒンジ領域における点変異（ＣＰＳＣＰ（配列番号１１９６９）－＞ＣＰＰＣＰ（配列番号１１９７０））を導入して、ＩｇＧ４抗体における不均一性をもたらし得るＨ鎖内ジスルフィド結合を形成する傾向を緩和することも望まれ得る。
一実施形態では、抗原結合タンパク質は、１×１０－４ｓ－１以下のＫｏｆｆを有する。別の実施形態では、Ｋｏｆｆは、５×１０－５ｓ－１以下である。別の実施形態では、Ｋｏｆｆは、Ｌ１Ｈ１、Ｌ２Ｈ２、Ｌ３Ｈ３、Ｌ４Ｈ４、Ｌ５Ｈ５、Ｌ６Ｈ６、・・・及びＬ２８Ｈ２８からなる組み合わせの群から選択される軽鎖及び重鎖可変ドメイン配列の組み合わせを有する抗体と実質的に同じである。別の実施形態では、抗原結合タンパク質は、Ｌ１Ｈ１、Ｌ２Ｈ２、Ｌ３Ｈ３、Ｌ４Ｈ４、Ｌ５Ｈ５、Ｌ６Ｈ６、・・・及びＬ２３Ｈ２８からなる組み合わせの群から選択される軽鎖及び重鎖可変ドメイン配列の組み合わせを有する抗体からの１つ以上のＣＤＲを含む抗体と実質的に同じＫｏｆｆでＣＴＬＡ－４に結合する。別の実施形態では、抗原結合タンパク質は、上に示されたアミノ酸配列のうちの１つを含む抗体と実質的に同じＫｏｆｆでＣＴＬＡ－４に結合する。別の実施形態では、抗原結合タンパク質は、上に示されたアミノ酸配列のうちの１つを含む抗体からの１つ以上のＣＤＲを含む抗体と実質的に同じＫｏｆｆでＣＴＬＡ－４に結合する。
一態様では、本開示は、本開示の抗ＣＴＬＡ－４抗体の抗原結合フラグメントを提供する。そのようなフラグメントは、抗体由来の配列から完全に構成され得るか、又は追加の配列を含み得る。抗原結合フラグメントの例には、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、単鎖抗体、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、及びドメイン抗体が含まれる。他の例は、Ｌｕｎｄｅ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．３０：５００－０６に提供される。
単鎖抗体（ｓｃＦｖ）は、アミノ酸架橋（短いペプチドリンカー、例えば、アミノ酸残基の合成配列）を介して重鎖及び軽鎖可変ドメイン（Ｆｖ領域）フラグメントを結合し、単一のポリペプチド鎖をもたらすことによって形成され得る。そのような単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）は、２つの可変ドメインポリペプチド（ＶＬ及びＶＨ）をコードするＤＮＡ間のペプチドリンカーをコードするＤＮＡを融合することによって調製された。得られたポリペプチドは、２つの可変ドメイン間の柔軟なリンカーの長さに応じて、折り返して抗原結合モノマーを形成するか、又はマルチマー（例えば、ダイマー、トリマー、又はテトラマー）を形成することができる（Ｋｏｒｔｔ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．１０：４２３、Ｋｏｒｔｔ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｂｉｏｍｏｌ．Ｅｎｇ．１８：９５－１０８、Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３－２６、及びＨｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９－８３）。異なるＶＬ及びＶＨ含有ポリペプチドを組み合わせることによって、異なるエピトープに結合するマルチマーｓｃＦｖを形成することができる（Ｋｒｉａｎｇｋｕｍ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｂｉｏｍｏｌ．Ｅｎｇ．１８：３１－４０）。単鎖抗体の産生のために開発された技法には、米国特許第４，９４６，７７８号、Ｂｉｒｄ，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３、Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９、Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｎａｔｕｒｅ ３３４：５４４、ｄｅ Ｇｒａａｆ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．１７８：３７９－８７に記載されるものが含まれる。可変ドメインの組み合わせＬ１Ｈ１、Ｌ２Ｈ２、Ｌ３Ｈ３、Ｌ４Ｈ４、Ｌ５Ｈ５、Ｌ６Ｈ６、・・・、及びＬ２８Ｈ２８を含むｓｃＦｖは、本開示によって包含される。
本明細書で提供されるＡＢＰは、塩勾配を使用して、ヘパリンＨＰカラムを使用して宿主細胞培養液の濾過された上清を溶出することによって、抗体をコードする遺伝子によってトランスフェクトされた宿主細胞から精製された抗ＣＴＬＡ－４抗体であり得る。
いくつかの実施形態では、宿主細胞は、対象へのＡＢＰの送達のための養子細胞療法において使用される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法は、抗ＣＴＬＡ－４抗体をコードする遺伝子によってトランスフェクトされた宿主細胞を投与することができる。
抗原結合タンパク質は、例えば、天然に存在する免疫グロブリンの構造を有することができる。「免疫グロブリン」は、テトラマー分子である。天然に存在する免疫グロブリンでは、各テトラマーは、ポリペプチド鎖の２つの同一の対で構成され、各対は、１つの「軽」鎖（約２５ｋＤａ）及び１つの「重」鎖（約５０－７０ｋＤａ）を有する。各鎖のアミノ末端部分は、主に抗原認識に関与する約１００～１１０個以上のアミノ酸の可変領域を含む。各鎖のカルボキシ末端部分は、主にエフェクター機能に関与する定常領域を定義する。ヒト軽鎖は、カッパ及びラムダ軽鎖として分類される。重鎖は、ミュー、デルタ、ガンマ、アルファ、又はイプシロンとして分類され、抗体のアイソタイプを、それぞれ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、及びＩｇＥとして定義する。軽鎖及び重鎖内では、可変及び定常領域は、約１２個以上のアミノ酸の「Ｊ」領域によって結合し、重鎖は、約１０個以上のアミノ酸の「Ｄ」領域も含む。一般的には、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｃｈ．７（Ｐａｕｌ，Ｗ．，ｅｄ．，２ｎｄ ｅｄ．Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９））（全ての目的のためにその全体が参照によって組み込まれる）を参照されたい。各軽／重鎖対の可変領域は、インタクトな免疫グロブリンが２つの結合部位を有するように、抗体結合部位を形成する。
一態様では、本開示は、ＩＧＨＧ１＊０１のヒト重鎖定常領域遺伝子セグメントを含むＡＢＰを提供する。いくつかの実施形態では、ＩＧＨＧ１＊０１ Ｆｃ抗体は、ｓｃＦｖを含む。いくつかの実施形態では、ＡＢＰは、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＬＡＧ－３、ＣＤ４７、ＴＩＧＩＴ、又は他の抗原に特異的である。いくつかの実施形態では、ＡＢＰは、ＣＴＬＡ－４に特異的である。いくつかの実施形態では、ＡＢＰは、承認済み又は規制審査中の抗体治療薬の抗原結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＡＢＰは、イピリムマブ、トリパリマブ、アミバンタマブ、ドスタルリマブ、セミプリマブ、デュルバルマブ、アテゾリズマブ、又はペムブロリズマブの抗原結合ドメインを含む。
いくつかの実施形態では、ＡＢＰは、ＩＧＨＧ１＊０１のヒト重鎖定常領域遺伝子セグメントを含むことによって増強されたＦｃＲシグナル伝達又はＦｃエフェクター機能を有する。したがって、本開示は、ＩＧＨＧ１＊０１のヒト重鎖定常領域遺伝子セグメントを含むＡＢＰを投与するステップを含む、腫瘍微小環境においてＦｃＲ媒介Ｔｒｅｇ枯渇を誘発する方法を更に提供する。本開示はまた、ＩＧＨＧ１＊０１のヒト重鎖定常領域遺伝子セグメントをＡＢＰに導入することによって、ＡＢＰのＦｃＲシグナル伝達又はＦｃエフェクター機能を改善する方法を提供する。
一態様では、本開示による抗原結合タンパク質には、ＣＴＬＡ－４の生物学的活性を阻害する抗原結合タンパク質が含まれる。
いくつかの実施形態では、本開示による抗原結合タンパク質は、ＦｃＲシグナル伝達又はＦｃエフェクター機能を増強するＩＧＨＧ１＊０１ Ｆｃ抗ＣＴＬＡ－４抗体又はその抗原結合フラグメントを含む。いくつかの実施形態では、ＩＧＨＧ１＊０１ Ｆｃ抗ＣＴＬＡ－４抗体は、ｓｃＦｖを含む。
異なる抗原結合タンパク質は、ＣＴＬＡ－４の異なるドメインに結合し得るか、異なる作用メカニズムによって作用し得る。本明細書でとりわけ示されるように、ドメイン領域は、特に示されない限り、群を含むように指定される。例えば、アミノ酸４～１２は、９つのアミノ酸：位置４、及び１２のアミノ酸、並びに配列における７つの介在するアミノ酸を指す。他の例には、ＣＴＬＡ－４のそのリガンドへの結合を阻害する抗原結合タンパク質が含まれる。抗原結合タンパク質は、本開示において用途を見出すためにＣＴＬＡ－４誘発活性を完全に阻害する必要はなく、むしろ、ＣＴＬＡ－４の特定の活性を低減する抗原結合タンパク質も用途について企図される。（特定の疾患を治療することにおけるＣＴＬＡ－４結合抗原結合タンパク質の特定の作用メカニズムの本明細書における議論は、例示にすぎず、本明細書に提示される方法は、それによって拘束されない。）
Ｆａｂフラグメントは、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ、及びＣＨ１ドメインを有する一価フラグメントであり、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって結合した２つのＦａｂフラグメントを有する二価フラグメントであり、Ｆｄフラグメントは、ＶＨ及びＣＨ１ドメインを有し、Ｆｖフラグメントは、抗体の単一アームのＶＬ及びＶＨドメインを有し、ｄＡｂフラグメントは、ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、又はＶＨ若しくはＶＬドメインの抗原結合フラグメントを有する（米国特許第６，８４６，６３４号、同第６，６９６，２４５号、米国出願公開第０５／０２０２５１２号、同第０４／０２０２９９５号、同第０４／００３８２９１号、同第０４／０００９５０７号、同第０３／００３９９５８号、Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４－５４６，１９８９）。
特定の軽鎖及び重鎖可変ドメインのポリヌクレオチド及びポリペプチド配列は、以下に記載される。軽鎖及び重鎖を含む抗体は、軽鎖の名称及び重鎖可変ドメインの名称を組み合わせることによって指定される。例えば、「Ｌ４Ｈ７」は、Ｌ４の軽鎖可変ドメイン（配列番号４の配列を含む）及びＨ７の重鎖可変ドメイン（配列番号１０７の配列を含む）を含む抗体を示す。軽鎖可変配列は、配列番号１～２８で提供され、重鎖可変配列は、配列番号１０１～１２８で提供される。
他の実施形態では、抗体は、特定の重鎖又は軽鎖を含み得るが、相補的軽鎖又は重鎖可変ドメインは特定されないままである。特に、本明細書における特定の実施形態は、特定の軽鎖又は重鎖によって特定の抗原（ＣＴＬＡ－４など）に結合する抗体を含み、相補的な重鎖又は軽鎖は、無差別であるか、又は無関係でさえあり得るが、例えば、コンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることによって決定され得る。Ｐｏｒｔｏｌａｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｖ．１５０（３），ｐｐ．８８０－８８７（１９９３）、Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ｖ．３５２ ｐｐ．６２４－６２８（１９９１）、Ａｄｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａ ｎａｔｉｖｅｌｙ ｐａｉｒｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｌｉｂｒａｒｙ ｙｉｅｌｄｓ ｄｒｕｇ ｌｅａｄｓ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈｅｒ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｔｈａｎ ａ ｒａｎｄｏｍｌｙ ｐａｉｒｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｌｉｂｒａｒｙ，ＭＡｂｓ（２０１８））、Ａｄｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｒａｒｅ，ｈｉｇｈ－ａｆｆｉｎｉｔｙ ｍｏｕｓｅ ａｎｔｉ－ＣＴＬＡ－４ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｈａｔ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ ｂｌｏｃｋａｄｅ，ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｄ ｕｓｉｎｇ ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｇｅｎｏｍｉｃｓ，ＭＡｂｓ（２０１７）。
天然に存在する免疫グロブリン鎖は、相補性決定領域又はＣＤＲとも呼ばれる、３つの超可変領域によって結合した比較的保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）の同じ一般構造を示す。Ｎ末端からＣ末端まで、軽鎖及び重鎖の両方は、ドメインＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、及びＦＲ４を含む。各ドメインへのアミノ酸の割り当ては、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．ｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．，ＵＳ Ｄｅｐｔ．ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＰＨＳ，ＮＩＨ，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ｎｏ．９１－３２４２，１９９１に従う。
「完全ヒト抗体」とも称される「ヒト抗体」という用語は、ヒト免疫グロブリン配列に由来する１つ以上の可変領域及び定常領域を有する全ての抗体を含む。一実施形態では、可変ドメイン及び定常ドメインの全ては、ヒト免疫グロブリン配列（完全ヒト抗体）に由来する。これらの抗体は、ヒト重鎖及び／又は軽鎖コード遺伝子に由来する抗体を発現するように遺伝子修飾されたマウスの目的の抗原での免疫化を含む、様々な方法で調製され得、その例が以下に記載される。
ヒト化抗体は、１つ以上のアミノ酸置換、欠失、及び／又は付加によって非ヒト種に由来する抗体の配列とは異なる配列を有し、ヒト化抗体は、ヒト対象に投与されると、非ヒト種抗体と比較して、免疫応答を誘発する可能性が低く、かつ／又はあまり重度ではない免疫応答を誘発する。一実施形態では、非ヒト種抗体の重鎖及び／又は軽鎖のフレームワーク及び定常ドメイン中の特定のアミノ酸は、ヒト化抗体を産生するように変異される。別の実施形態では、ヒト抗体からの定常ドメインは、非ヒト種の可変ドメインに融合される。別の実施形態では、非ヒト抗体の１つ以上のＣＤＲ配列中の１つ以上のアミノ酸残基は、ヒト対象に投与されると、非ヒト抗体の免疫原性の可能性を低減するように変更され、変更されたアミノ酸残基は、抗体のその抗原への免疫特異的結合にとって重要ではないか、又は行われるアミノ酸配列への変更が保存的変更であるかのいずれかであり、ヒト化抗体の抗原への結合は、非ヒト抗体の抗原への結合よりも顕著に悪くはなかった。ヒト化抗体を作製する方法の例は、米国特許第６，０５４，２９７号、同第５，８８６，１５２号、及び同第５，８７７，２９３号に見出すことができる。
「キメラ抗体」という用語は、１つの抗体からの１つ以上の領域及び１つ以上の他の抗体からの１つ以上の領域を含む抗体を指す。一実施形態では、ＣＤＲのうちの１つ以上は、ヒト抗ＣＴＬＡ－４抗体に由来する。別の実施形態では、ＣＤＲの全ては、ヒト抗ＣＴＬＡ－４抗体に由来する。別の実施形態では、２つ以上のヒト抗ＣＴＬＡ－４抗体からのＣＤＲは、キメラ抗体において混合及び適合される。例えば、キメラ抗体は、第１のヒト抗ＣＴＬＡ－４抗体の軽鎖からのＣＤＲ１、第２のヒト抗ＣＴＬＡ－４抗体の軽鎖からのＣＤＲ２及びＣＤＲ３、並びに第３の抗ＣＴＬＡ－４抗体からの重鎖からのＣＤＲを含み得る。更に、フレームワーク領域は、同じ抗ＣＴＬＡ－４抗体のうちの１つ、ヒト抗体などの１つ以上の異なる抗体、又はヒト化抗体に由来し得る。キメラ抗体の一例では、重鎖及び／又は軽鎖の一部分は、特定の種からの、又は特定の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体と同一、相同であるか、又はそれに由来するが、鎖の残部は、別の種からの、又は別の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体と同一、相同であるか、又はそれに由来する。所望の生物学的活性（すなわち、ＣＴＬＡ－４に特異的に結合する能力）を示すそのような抗体のフラグメントも含まれる。
抗体のフラグメント又はアナログは、当業者によって、本明細書の教示に従い、当該技術分野で周知の技法を使用して容易に調製され得る。フラグメント又はアナログの好ましいアミノ末端及びカルボキシ末端は、機能ドメインの境界付近に発生する。構造及び機能ドメインは、ヌクレオチド及び／又はアミノ酸配列データの公開又は独自配列データベースとの比較によって同定することができる。コンピュータ化された比較方法は、既知の構造及び／又は機能の他のタンパク質において発生する配列モチーフ又は予測されたタンパク質立体配座ドメインを同定するために使用することができる。既知の三次元構造にフォールドするタンパク質配列を同定する方法が知られている。例えば、Ｂｏｗｉｅ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５３：１６４を参照されたい。
抗体に由来する抗原結合フラグメントは、例えば、抗体のタンパク質加水分解、例えば、従来の方法による全抗体のペプシン又はパパイン消化によって得ることができる。例として、抗体フラグメントは、Ｆ（ａｂ’）２と呼ばれる５Ｓフラグメントを提供するペプシンでの抗体の酵素的切断によって産生することができる。このフラグメントは、チオール還元剤を使用して更に切断して、３．５Ｓ Ｆａｂ’一価フラグメントを産生することができる。任意に、切断反応は、ジスルフィド結合の切断から生じるスルフヒドリル基のブロッキング基を使用して行うことができる。代替として、パパインを使用した酵素切断は、２つの一価Ｆａｂフラグメント及び１つのＦｃフラグメントを直接産生する。これらの方法は、例えば、Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ、米国特許第４，３３１，６４７号、Ｎｉｓｏｎｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．８９：２３０，１９６０、Ｐｏｒｔｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．７３：１１９，１９５９、Ｅｄｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １：４２２（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９６７）によって、及びＡｎｄｒｅｗｓ，Ｓ．Ｍ．ａｎｄ Ｔｉｔｕｓ，Ｊ．Ａ．ｉｎ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｃｏｌｉｇａｎ Ｊ．Ｅ．，ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ），Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（２００３），ｐａｇｅｓ ２．８．１ ２．８．１０ ａｎｄ ２．１０Ａ．１ ２．１０Ａ．５によって記載されている。フラグメントがインタクトな抗体によって認識される抗原に結合する限り、重鎖を分離して一価軽重鎖フラグメント（Ｆｄ）を形成すること、フラグメントの更なる切断、又は他の酵素的、化学的、若しくは遺伝的技法などの、抗体を切断するための他の方法も使用され得る。
抗体フラグメントはまた、任意の合成又は遺伝子操作されたタンパク質であり得る。例えば、抗体フラグメントには、軽鎖可変領域からなる単離されたフラグメント、重鎖及び軽鎖の可変領域からなる「Ｆｖ」フラグメント、軽及び重可変領域がペプチドリンカー（ｓｃＦｖタンパク質）によって接続されている組換え単鎖ポリペプチド分子が含まれる。
抗体フラグメントの別の形態は、抗体の１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むペプチドである。ＣＤＲ（「最小認識単位」又は「超可変領域」とも呼ばれる）は、それを抗原結合タンパク質にするために共有結合又は非共有結合のいずれかで分子に組み込むことができる。ＣＤＲは、目的のＣＤＲをコードするポリヌクレオチドを構築することによって得ることができる。そのようなポリヌクレオチドは、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応を使用して、抗体産生細胞のｍＲＮＡを鋳型として使用して可変領域を合成することによって調製される（例えば、Ｌａｒｒｉｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ａ Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２：１０６，１９９１、Ｃｏｕｒｔｅｎａｙ Ｌｕｃｋ，“Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，”ｉｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｒｉｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），ｐａｇｅ １６６（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ １９９５）、及びＷａｒｄ ｅｔ ａｌ．，“Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，”ｉｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｂｉｒｃｈ ｅｔ ａｌ．，（ｅｄｓ．），ｐａｇｅ １３７（Ｗｉｌｅｙ Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．１９９５）を参照されたい）。
よって、一実施形態では、結合剤は、本明細書に記載される少なくとも１つのＣＤＲを含む。結合剤は、本明細書に記載される少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、又は６つのＣＤＲを含み得る。結合剤は、本明細書に記載される抗体の少なくとも１つの可変領域ドメインを更に含み得る。可変領域ドメインは、任意のサイズ又はアミノ酸組成を有し得、一般に、ヒトＣＴＬＡ－４への結合に関与する少なくとも１つのＣＤＲ配列、例えば、本明細書に具体的に記載され、１つ以上のフレームワーク配列に隣接するか、又はそれとインフレームである、ＣＤＲ１－Ｈ、ＣＤＲ２－Ｈ、ＣＤＲ３－Ｈ、ＣＤＲ１－Ｌ、ＣＤＲ２－Ｌ、及びＣＤＲ３－Ｌを含むであろう。一般論として、可変（Ｖ）領域ドメインは、免疫グロブリン重（ＶＨ）及び／又は軽（ＶＬ）鎖可変ドメインの任意の好適な配置であり得る。よって、例えば、Ｖ領域ドメインは、モノマーであり、下に記載されるように少なくとも１×１０７Ｍ以下の親和性を有するヒトＣＴＬＡ－４に独立して結合することができる、ＶＨ又はＶＬドメインであり得る。あるいは、Ｖ領域ドメインは、ダイマーであり、ＶＨＶＨ、ＶＨＶＬ、又はＶＬＶＬダイマーを含み得る。Ｖ領域ダイマーは、非共有結合的に会合され得る少なくとも１つのＶＨ及び少なくとも１つのＶＬ鎖を含む（以下、ＦＶと称される）。所望に応じて、鎖は、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦＶ）を形成するために、直接、例えば、２つの可変ドメイン間のジスルフィド結合を介して、又はリンカー、例えば、ペプチドリンカーを介してのいずれかで共有結合され得る。
可変領域ドメインは、任意の天然に存在する可変ドメイン又はその操作されたバージョンであり得る。操作されたバージョンとは、組換えＤＮＡ操作技法を使用して作成された可変領域ドメインを意味する。そのような操作されたバージョンには、例えば、特定の抗体のアミノ酸配列における又はそれへの挿入、欠失、又は変更によって特定の抗体可変領域から作成されたものが含まれる。特定の例は、第１の抗体からの少なくとも１つのＣＤＲ及び任意に１つ以上のフレームワークアミノ酸並びに第２の抗体からの可変領域ドメインの残部を含む操作された可変領域ドメインを含む。
可変領域ドメインは、Ｃ末端アミノ酸で少なくとも１つの他の抗体ドメイン又はそのフラグメントに共有結合し得る。よって、例えば、可変領域ドメインに存在するＶＨドメインは、免疫グロブリンＣＨ１ドメイン、又はそのフラグメントに結合し得る。同様に、ＶＬドメインは、ＣＫドメイン又はそのフラグメントに結合し得る。このように、例えば、抗体は、抗原結合ドメインが、それぞれ、それらのＣ末端でＣＨ１及びＣＫドメインに共有結合した会合ＶＨ及びＶＬドメインを含むＦａｂフラグメントであり得る。ＣＨ１ドメインは、例えば、Ｆａｂ’フラグメントに見られるようなヒンジ領域若しくはヒンジ領域ドメインの一部分を提供するために、又は抗体ＣＨ２及びＣＨ３ドメインなどの更なるドメインを提供するために、更なるアミノ酸で伸長され得る。
いくつかの実施形態では、ＡＢＰは、Ｎグリカン上のフコース糖単位が欠如しているＦｃ領域を含む。
いくつかの実施形態では、ＡＢＰは、アミノ酸位置２０１にグリシンを含む。
いくつかの実施形態では、ＡＢＰは、細菌タンパク質ＲＭＤ（ＧＤＰ－６－デオキシ－Ｄ－リキソ－４－ヘキスロースレダクターゼ）又はその修飾を含む細胞から産生される。特定の実施形態では、細胞は、フコースの不在下で培養される。いくつかの実施形態では、ＡＢＰは、Ｆｕｔ８の発現が欠如しているか、又は低減した細胞から産生される。いくつかの実施形態では、ＡＢＰは、フコシル化阻害剤、２－フルオロフコース（２ＦＦ）の存在下で培養された細胞から産生される。
いくつかの実施形態では、ＡＢＰは、グリコシルトランスフェラーゼ（ＧｎＴＩＩＩ）を過剰発現する細胞から産生される。いくつかの実施形態では、ＡＢＰは、そのフコシル化状態に基づいて単離される。
いくつかの実施形態では、ＡＢＰは、低フコシル化モノクローナル抗体である。
本明細書に記載されるように、抗体は、これらのＣＤＲのうちの少なくとも１つを含む。例えば、１つ以上のＣＤＲは、既知の抗体フレームワーク領域（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２など）に組み込まれ得るか、又はその半減期を増強するために好適なビヒクルにコンジュゲートされ得る。好適なビヒクルには、Ｆｃ、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、アルブミン、トランスフェリンなどが含まれるが、これらに限定されない。これら及び他の好適なビヒクルは、当該技術分野で知られている。そのようなコンジュゲート型ＣＤＲペプチドは、モノマー、ダイマー、テトラマー、又は他の形態であり得る。一実施形態では、１つ以上の水溶性ポリマーは、結合剤の、１つ以上の特定の位置、例えば、アミノ末端で結合している。
別の例では、抗体（すなわち、ＣＴＬＡ－４抗体）からの個々のＶＬ又はＶＨ鎖を使用して、同じ特異性を有する、抗原結合フラグメント（又はＦａｂ）を形成することができる他のＶＨ又はＶＬ鎖を検索することができる。よって、ＶＨ鎖及びＶＬ鎖Ｉｇ遺伝子の無作為な組み合わせは、バクテリオファージライブラリー（ｆｄ又はラムダファージなど）において抗原結合フラグメントとして発現され得る。例えば、コンビナトリアルライブラリーは、それぞれ、抗原結合特異的ＶＬ又はＶＨ鎖ライブラリーと組み合わされた親ＶＬ又はＶＨ鎖ライブラリーを利用することによって生成され得る。次いで、コンビナトリアルライブラリーは、例えば、放射性標識されたプローブ（放射性標識されたＣＴＬＡ－４など）を使用することによって、従来の技法によってスクリーニングされ得る。例えば、Ｐｏｒｔｏｌａｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｖ．１５０（３）ｐｐ．８８０－８８７（１９９３）を参照されたい。
ダイアボディは、２つのポリペプチド鎖を含む二価抗体であり、各ポリペプチド鎖は、同じ鎖上の２つのドメイン間の対合を可能にするには短すぎるリンカーによって結合したＶＨ及びＶＬドメインを含み、よって各ドメインが別のポリペプチド鎖上の相補的ドメインと対合することを可能にする（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：６４４４－４８、及びＰｏｌｊａｋ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ２：１１２１－２３を参照されたい）。ダイアボディの２つのポリペプチド鎖が同一である場合、それらの対合から生じるダイアボディは、２つの同一の抗原結合部位を有するであろう。異なる配列を有するポリペプチド鎖を使用して、２つの異なる抗原結合部位を有するダイアボディを作製することができる。同様に、トリボディ及びテトラボディは、それぞれ、３つ及び４つのポリペプチド鎖を含み、それぞれ、同じであるか又は異なり得る、３つ及び４つの抗原結合部位を形成する抗体である。
フィブロネクチンポリペプチドモノボディを含む、抗体ポリペプチドも、米国特許第６，７０３，１９９号に開示されている。他の抗体ポリペプチドは、米国特許公開第２００５／０２３８６４６号に開示されており、これは、単鎖ポリペプチドである。
特定の実施形態では、抗体は、これらに限定されないが、ポリエチレングリコール、ポリオキシエチレングリコール、又はポリプロピレングリコールを含む、１つ以上の水溶性ポリマー結合を含む。例えば、米国特許第４，６４０，８３５号、同第４，４９６，６８９号、同第４，３０１，１４４号、同第４，６７０，４１７号、同第４，７９１，１９２号、及び同第４，１７９，３３７号を参照されたい。特定の実施形態では、誘導体結合剤は、モノメトキシ－ポリエチレングリコール、デキストラン、セルロース、又は他の炭水化物系ポリマー、ポリ－（Ｎ－ビニルピロリドン）－ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）、及びポリビニルアルコール、並びにそのようなポリマーの混合物のうちの１つ以上を含む。特定の実施形態では、１つ以上の水溶性ポリマーは、１つ以上の側鎖に無作為に結合している。特定の実施形態では、ＰＥＧは、抗体などの結合剤の治療能力を改善するように作用することができる。特定のそのような方法は、例えば、米国特許第６，１３３，４２６号で議論されており、これは、任意の目的のために参照によって本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、本開示のＡＢＰは、ＣＴＬＡ－４に結合するモノクローナル抗体である。本開示のモノクローナル抗体は、様々な既知の技法を使用して生成され得る。一般に、特定の抗原に結合するモノクローナル抗体は、当業者に知られている方法によって得ることができる（例えば、Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５，１９７５、Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１：２．５．１２．６．７（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ １９９１）、米国特許第ＲＥ ３２，０１１号、同第４，９０２，６１４号、同第４，５４３，４３９号、及び同第４，４１１，９９３号、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ：Ａ Ｎｅｗ Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｅｓ，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｋｅｎｎｅｔｔ，ＭｃＫｅａｒｎ，ａｎｄ Ｂｅｃｈｔｏｌ（ｅｄｓ．）（１９８０）、並びにＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ（ｅｄｓ．），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８８）、Ｐｉｃｋｓｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，“Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ Ｅ．ｃｏｌｉ，”ｉｎ ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２：Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｇｌｏｖｅｒ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），ｐａｇｅ ９３（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ １９９５）を参照されたい）。抗体フラグメントは、タンパク質分解消化などの任意の好適な標準技法を使用して、又は任意に、タンパク質分解消化（例えば、パパイン又はペプシンを使用する）、続いてジスルフィド結合の穏やかな還元及びアルキル化によってそれから誘導され得る。あるいは、そのようなフラグメントはまた、本明細書に記載される組換え遺伝子操作技法によって生成され得る。
モノクローナル抗体は、動物、例えば、当該技術分野で知られている、トランスジェニック又はノックアウトを含む、ラット、ハムスター、ウサギ、又は好ましくはマウスに、ヒトＣＴＬＡ－４［配列番号７００１の配列］又はそのフラグメントを含む免疫原を、当該技術分野で知られ、本明細書に記載される方法に従って注射することによって得ることができる。特異的抗体産生の存在は、初回注射後及び／又はブースター注射後に、血清試料を得て、ヒトＣＴＬＡ－４又はペプチドに結合する抗体の存在を、当該技術分野で知られ、本明細書に記載されるいくつかの免疫検出方法のうちのいずれか１つを使用して検出することによってモニターされ得る。所望の抗体を産生する動物から、リンパ球様細胞、脾臓又はリンパ節からの最も一般的な細胞を取り出して、Ｂリンパ球を得る。次いで、Ｂリンパ球を、薬物感作骨髄腫細胞融合パートナー、好ましくは、免疫化された動物と同系であり、任意に他の望ましい特性（例えば、内因性Ｉｇ遺伝子産物、例えば、Ｐ３Ｘ６３－Ａｇ ８．６５３（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＲＬ １５８０）、ＮＳＯ、ＳＰ２０を発現できないこと）を有するものと融合させて、不死真核細胞株である、ハイブリドーマを産生する。
リンパ球様（例えば、脾臓）細胞及び骨髄腫細胞は、ポリエチレングリコール又は非イオン性洗剤などの膜融合促進剤と数分間組み合わされ、次いで融合していない骨髄腫細胞ではなくハイブリドーマ細胞の成長を支持する選択培地上に低密度で播種され得る。好ましい選択培地は、ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）である。十分な時間、通常は約１～２週間後、細胞のコロニーが観察される。単一コロニーが単離され、細胞によって産生された抗体は、当該技術分野で知られ、本明細書に記載される多様なイムノアッセイのいずれか１つを使用して、ヒトＣＴＬＡ－４に対する結合活性について試験され得る。ハイブリドーマは、（例えば、限界希釈クローニング又は軟寒天プラーク単離によって）クローニングされ、ＣＴＬＡ－４に特異的な抗体を産生する陽性クローンが選択され、培養される。ハイブリドーマ培養物からのモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ培養物の上清から単離され得る。
マウスモノクローナル抗体の産生のための代替方法は、ハイブリドーマ細胞を同系マウス、例えば、モノクローナル抗体を含む腹水の形成を促進するように処理された（例えば、プリスタンプライミングされた）マウスの腹膜腔に注射することである。モノクローナル抗体は、様々な十分に確立された技法によって単離及び精製することができる。そのような単離技法には、プロテインＡセファロースによる親和性クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、及びイオン交換クロマトグラフィーが含まれる（例えば、Ｃｏｌｉｇａｎ ａｔ ｐａｇｅｓ ２．７．１－２．７．１２ ａｎｄ ｐａｇｅｓ ２．９．１－２．９．３、Ｂａｉｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，“Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｇ（ＩｇＧ），”ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１０，ｐａｇｅｓ ７９－１０４（Ｔｈｅ Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．１９９２）を参照されたい）。モノクローナル抗体は、抗体の特定の特性（例えば、重鎖又は軽鎖アイソタイプ、結合特異性など）に基づいて選択された適切なリガンドを使用する親和性クロマトグラフィーによって精製され得る。固体支持体上に固定化された、好適なリガンドの例には、プロテインＡ、プロテインＧ、抗定常領域（軽鎖又は重鎖）抗体、抗イディオタイプ抗体、及びＴＧＦ－ベータ結合タンパク質、又はそのフラグメント若しくはバリアントが含まれる。
モノクローナル抗体は、当該技術分野で知られている任意の技法を使用して、例えば、免疫化スケジュールの完了後にトランスジェニック動物から採取された脾臓細胞を不死化することによって産生され得る。脾臓細胞は、当該技術分野で知られている任意の技法を使用して、例えば、それらを骨髄腫細胞と融合させてハイブリドーマを産生することによって、不死化することができる。ＣＴＬＡ－４ポリペプチドに結合する抗体を産生するハイブリドーマ細胞株が同定される。そのようなハイブリドーマ細胞株、及びそれらによって産生される抗ＣＴＬＡ－４モノクローナル抗体は、本開示によって包含される。ハイブリドーマ産生融合手順における使用のための骨髄腫細胞は、好ましくは、抗体を産生せず、高い融合効率を有し、それらを所望の融合された細胞（ハイブリドーマ）のみの成長を支持する特定の選択培地で成長することができないようにする酵素欠損を有する。マウス融合における使用に好適な細胞株の例には、Ｓｐ－２０、Ｐ３－Ｘ６３／Ａｇ８、Ｐ３－Ｘ６３－Ａｇ８．６５３、ＮＳ１／１．Ａｇ ４ １、Ｓｐ２１０－Ａｇ１４、ＦＯ、ＮＳＯ／Ｕ、ＭＰＣ－１１、ＭＰＣ１１－Ｘ４５－ＧＴＧ １．７、及びＳ１９４／５ＸＸ０ Ｂｕｌが含まれ、ラット融合に使用される細胞株の例には、Ｒ２１０．ＲＣＹ３、Ｙ３－Ａｇ １．２．３、ＩＲ９８３Ｆ、及び４Ｂ２１０が含まれる。細胞融合に有用な他の細胞株は、Ｕ－２６６、ＧＭ１５００－ＧＲＧ２、ＬＩＣＲ－ＬＯＮ－ＨＭｙ２、及びＵＣ７２９－６である。ハイブリドーマ又はｍＡｂは、ＣＴＬＡ－４誘発活性をブロックする能力などの特定の特性を有するｍＡｂを同定するために更にスクリーニングされ得る。
本開示の抗体はまた、完全ヒトモノクローナル抗体であり得る。抗原結合タンパク質が、ヒト抗ＣＴＬＡ－４抗体の少なくとも１つのインビボ生物学的活性を有する、ＣＴＬＡ－４に特異的に結合する単離された完全ヒト抗体が提供される。
７．４．核酸
一態様では、本開示は、単離された核酸分子を提供する。核酸は、例えば、抗原結合タンパク質の全部若しくは一部、例えば、本開示の抗体の一方若しくは両方の鎖、又はそのフラグメント、誘導体、ムテイン、若しくはバリアントをコードするポリヌクレオチド、ハイブリダイゼーションプローブ、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを同定、分析、変異、若しくは増幅するためのＰＣＲプライマー若しくはシーケンシングプライマー、ポリヌクレオチドの発現を阻害するためのアンチセンス核酸、及び前述の相補的配列としての使用に十分なポリヌクレオチドを含む。核酸は、任意の長さであり得る。それらは、例えば、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、７５０、１，０００、１，５００、３，０００、５，０００以上のヌクレオチドの長さであり得、かつ／又は１つ以上の追加の配列、例えば、調節配列を含み得、かつ／又はより大きな核酸、例えば、ベクターの一部であり得る。核酸は、一本鎖又は二本鎖であり得、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡヌクレオチド、並びにその人工バリアント（例えば、ペプチド核酸）を含み得る。
抗体ポリペプチド（例えば、重鎖又は軽鎖、可変ドメインのみ、又は完全長）をコードする核酸は、ＣＴＬＡ－４で免疫化されたマウスのＢ細胞から単離することができる。核酸は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などの従来の手順によって単離することができる。
重鎖及び軽鎖可変領域の可変領域をコードする核酸配列が本明細書に示される。当業者は、遺伝コードの縮重のために、本明細書に開示されるポリペプチド配列の各々が多数の他の核酸配列によってコードされることを理解するであろう。本開示は、本開示の各抗原結合タンパク質をコードする各縮重ヌクレオチド配列を提供する。いくつかの実施形態では、核酸配列は、コドン最適化されている。いくつかの実施形態では、核酸配列は、哺乳動物細胞における発現のためにコドン最適化されている。
本開示は、特定のハイブリダイゼーション条件下で他の核酸（例えば、ＣＴＬＡ－４遺伝子のいずれかのヌクレオチド配列を含む核酸）にハイブリダイズする核酸を更に提供する。核酸をハイブリダイズするための方法は、当該技術分野で周知である。例えば、Ｃｕｒｒ．Ｐｒｏｔ．ｉｎ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９），６．３．１－６．３．６を参照されたい。本明細書で定義されるように、適度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、５ｘ塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）、０．５％ＳＤＳ、１．０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）を含有する予洗溶液、約５０％ホルムアミド、６Ｘ ＳＳＣのハイブリダイゼーション緩衝液、及び５５℃のハイブリダイゼーション温度（又は約５０％ホルムアミドを含有するものなどの、他の同様のハイブリダイゼーション溶液と４２℃のハイブリダイゼーション温度）、並びに０．５Ｘ ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、６０℃の洗浄条件を使用する。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、６Ｘ ＳＳＣ中、４５℃でハイブリダイズし、続いて０．１ｘ ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳ中、６８℃で１回以上洗浄する。更に、当業者は、互いに少なくとも６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９８、又は９９％同一であるヌクレオチド配列を含む核酸が、典型的には互いにハイブリダイズしたままであるように、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを増加又は減少させるようにハイブリダイゼーション及び／又は洗浄条件を操作することができる。ハイブリダイゼーション条件の選択に影響を与える基本的なパラメータ、及び好適な条件を考案するためのガイダンスは、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ，ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ（１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，ｃｈａｐｔｅｒｓ ９ ａｎｄ １１、及びＣｕｒｒ．Ｐｒｏｔ．ｉｎ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９５，Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ｓｅｃｔｉｏｎｓ ２．１０ ａｎｄ ６．３－６．４）によって記載されており、当業者によって、例えば、ＤＮＡの長さ及び／又は塩基組成に基づいて、容易に決定することができる。
変化は、変異によって核酸に導入することができ、それによって、コードするポリペプチド（例えば、抗原結合タンパク質）のアミノ酸配列における変化をもたらす。変異は、当該技術分野で知られている任意の技法を使用して導入することができる。一実施形態では、１つ以上の特定のアミノ酸残基は、例えば、部位特異的変異誘発プロトコルを使用して変化させる。別の実施形態では、１つ以上の無作為に選択された残基は、例えば、無作為変異誘発プロトコルを使用して変化させる。どのように作製されても、変異体ポリペプチドは、発現させ、所望の特性（例えば、ＣＴＬＡ－４への結合）についてスクリーニングすることができる。
変異は、コードするポリペプチドの生物学的活性を著しく改変することなく、核酸に導入することができる。例えば、非必須アミノ酸残基でアミノ酸置換をもたらすヌクレオチド置換を行うことができる。一実施形態では、ＣＴＬＡ－４、又はその所望のフラグメント、バリアント、若しくは誘導体について本明細書に提供されるヌクレオチド配列は、本明細書においてＣＴＬＡ－４について２つ以上の配列が異なる残基であると示されるアミノ酸残基の１つ以上の欠失又は置換を含むアミノ酸配列をコードするように変異される。あるいは、コードするポリペプチドの生物学的活性（例えば、ＣＴＬＡ－４の結合）を選択的に変化させる１つ以上の変異を核酸に導入することができる。例えば、変異は、生物学的活性を量的又は質的に変化させることができる。量的変化の例は、活性を増加させること、低減すること、又は排除することを含む。質的変化の例は、抗原結合タンパク質の抗原特異性を変化させることを含む。
別の態様では、本開示は、本開示の核酸配列の検出のためのプライマー又はハイブリダイゼーションプローブとしての使用に好適な核酸分子を提供する。本開示の核酸分子は、本開示の完全長ポリペプチドをコードする核酸配列の一部分、例えば、プローブ若しくはプライマーとして使用することができるフラグメント、又は本開示のポリペプチドの活性部分（例えば、ＣＴＬＡ－４結合部分）をコードするフラグメントのみを含むことができる。
本開示の核酸の配列に基づくプローブは、核酸又は類似の核酸、例えば、本開示のポリペプチドをコードする転写物を検出するために使用することができる。プローブは、標識基、例えば、放射性同位元素、蛍光化合物、酵素、又は酵素補因子を含むことができる。そのようなプローブは、ポリペプチドを発現する細胞を同定するために使用することができる
７．５．発現ベクター
本開示は、本開示のポリペプチド又はその一部分をコードする核酸を含むベクターを提供する。ベクターの例には、プラスミド、ウイルスベクター、非エピソーム哺乳動物ベクター、及び発現ベクター、例えば、組換え発現ベクターが含まれるが、これらに限定されない。
本開示の別の態様では、本開示の核酸分子及びポリヌクレオチドを含有する発現ベクターも提供され、そのようなベクターで形質転換された宿主細胞、及びポリペプチドを産生する方法も提供される。「発現ベクター」という用語は、ポリヌクレオチド配列からポリペプチドを発現する（又はその発現を誘発する）ためのプラスミド、ファージ、ウイルス、又はベクターを指す。ポリペプチドの発現のためのベクターは、ベクター増殖及びクローニングされたインサートの発現に必要な最小限の配列を含む。発現ベクターは、（１）遺伝子発現において調節的役割を有する１つ以上の遺伝要素、例えば、プロモーター又はエンハンサー、（２）ｍＲＮＡに転写され、タンパク質に翻訳されるポリペプチド及びタンパク質をコードする配列、並びに（３）適切な転写開始及び終結配列のアセンブリを含む転写単位を含む。これらの配列は、選択マーカーを更に含み得る。宿主細胞における発現に好適なベクターは、容易に入手可能であり、核酸分子は、標準的な組換えＤＮＡ技法を使用してベクターに挿入される。そのようなベクターには、特定の組織において機能するプロモーター、及び標的化されたヒト又は動物細胞におけるポリペプチドの発現のためのウイルスベクターが含まれ得る。
本開示の組換え発現ベクターは、宿主細胞における核酸の発現に好適な形態で本開示の核酸を含むことができる。したがって、一態様では、本開示は、本開示のＡＢＰをコードするポリヌクレオチド又はベクターを含む宿主細胞を提供する。宿主細胞は、エクスビボでＡＢＰを産生するために使用することができる。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、インビボでＡＢＰの発現を誘発するために対象に投与される。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、疾患の治療のための治療薬として使用される。
組換え発現ベクターは、発現に使用される宿主細胞に基づいて選択され、発現される核酸配列に作動可能に結合した１つ以上の調節配列を含む。調節配列には、多くのタイプの宿主細胞においてヌクレオチド配列の構成的発現を誘導するもの（例えば、ＳＶ４０初期遺伝子エンハンサー、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、及びサイトメガロウイルスプロモーター）、特定の宿主細胞においてのみヌクレオチド配列の発現を誘導するもの（例えば、組織特異的調節配列、参照によって本明細書にその全体が組み込まれる、Ｖｏｓｓ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．１１：２８７，Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３６：１２３７を参照されたい）、並びに特定の処理又は状態に応答したヌクレオチド配列の誘発性発現を誘導するもの（例えば、哺乳動物細胞におけるメタロチオニンプロモーター並びに原核及び真核系の両方におけるｔｅｔ－応答性及び／又はストレプトマイシン応答性プロモーター（同文献を参照されたい））が含まれる。発現ベクターの設計が形質転換される宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現のレベルなどのような因子に依存し得ることは、当業者によって理解されるであろう。本開示の発現ベクターは、宿主細胞に導入され、それによって本明細書に記載される核酸によってコードされる、融合タンパク質又はペプチドを含む、タンパク質又はペプチドを産生することができる。
いくつかの実施形態では、発現ベクターは、ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ－１２５５１２下で寄託されたＣＴＬＡ－４結合クローンのライブラリーのクローンのうちの１つから精製された発現ベクターである。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ－１２５５１２下で寄託されたＣＴＬＡ－４結合クローンのライブラリーから精製されたクローンのうちの１つにおける発現ベクターの１つの遺伝子修飾によって生成される。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ－１２５５１２下で寄託されたＣＴＬＡ－４結合クローンのライブラリーのクローンのうちの１つの重鎖及び軽鎖の可変領域配列を使用することによって生成される。
本開示は、ポリペプチドを作製する方法を更に提供する。様々な他の発現／宿主系が利用され得る。ベクターＤＮＡは、従来の形質転換又はトランスフェクション技法を介して原核又は真核系に導入することができる。これらの系には、組換えバクテリオファージ、プラスミド、又はコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）などの微生物、酵母発現ベクターで形質転換された酵母、ウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系、ウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ、タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）でトランスフェクトされた、若しくは細菌発現ベクター（例えば、Ｔｉ又はｐＢＲ３２２プラスミド）で形質転換された植物細胞系、又は動物細胞系が含まれるが、これらに限定されない。組換えタンパク質産生に有用な哺乳動物細胞には、ＶＥＲＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株、若しくはそれらの誘導体、例えば、無血清培地で増殖するＶｅｇｇｉｅ ＣＨＯ及び関連細胞株（Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２８：３１を参照されたい）、又はＤＨＦＲが欠損している、ＣＨＯ株ＤＸ－Ｂ１１（Ｕｒｌａｕｂ ｅｔ ａｌ．，１９８０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：４２１６－２０）ＣＯＳ細胞、例えば、サル腎臓細胞のＣＯＳ－７株（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）（Ｇｌｕｚｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９８１，Ｃｅｌｌ ２３：１７５を参照されたい）、Ｗ１３８、ＢＨＫ、ＨｅｐＧ２、３Ｔ３（ＡＴＣＣ ＣＣＬ １６３）、ＲＩＮ、ＭＤＣＫ、Ａ５４９、ＰＣ１２、Ｋ５６２、Ｌ細胞、Ｃ１２７細胞、ＢＨＫ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １０）細胞株、アフリカミドリザル腎臓細胞株ＣＶ１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）に由来するＣＶ１／ＥＢＮＡ細胞株（ＭｃＭａｈａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９１，ＥＭＢＯ Ｊ．１０：２８２１を参照されたい）、ヒト胎児腎臓細胞、例えば、２９３、２９３ ＥＢＮＡ、若しくはＭＳＲ ２９３、ヒト表皮Ａ４３１細胞、ヒトＣｏｌｏ２０５細胞、他の形質転換された霊長類細胞株、正常二倍体細胞、一次組織、一次外植片、ＨＬ－６０、Ｕ９３７、ＨａＫ、若しくはＪｕｒｋａｔ細胞のインビトロ培養に由来する細胞株が含まれるが、これらに限定されない。哺乳動物発現は、成長培地から回収され得る分泌型又は可溶性ポリペプチドの産生を可能にする。
いくつかの実施形態では、組換えタンパク質産生に使用される哺乳動物細胞は、（例えば、操作されていない細胞のコアフコシル化の量と比較して）低減した量のコアフコシル化を産生する操作された細胞を含む。いくつかの実施形態では、組換えタンパク質産生に使用される哺乳動物細胞は、（例えば、操作されていない細胞のフコースの量と比較して）低減した量のフコースを産生する操作された細胞を含む。いくつかの実施形態では、組換えタンパク質産生に使用される哺乳動物細胞は、ＣＨＯ細胞を含む。いくつかの実施形態では、哺乳動物細胞は、ＧｌｙｍａｘＸ（登録商標）細胞株である。特定の実施形態では、細胞株は、低フコシル化組換えタンパク質を産生する。特定の実施形態では、哺乳動物細胞は、例えば、哺乳動物細胞が低減した量のフコースを産生する場合、より少ない又は低減したフコシル化を有する。特定の実施形態では、細胞培養中、方法は、細胞を増殖させる培地にフコシル化阻害剤を添加することを含む。フコシル化阻害剤の非限定的な例は、フコシルトランスフェラーゼ（ＦＵＴ）阻害剤、２－フルオロ過アセチル化フコース（２ＦＦ）、２－フルオロフコース（ＳＧＮ－２ＦＦ）、フコトリムＩ（Ｐ－Ｄ－Ｒｈａ６Ｆ２－１Ｐ）、フコトリムＩＩ（Ｐ－Ｄ－Ｒｈａ６Ｆ３－１Ｐ）、Ａ２ＦＦ１Ｐ、及びＢ２ＦＦ１を含む。いくつかの実施形態では、組換えタンパク質産生に使用される哺乳動物細胞は、グリコシルトランスフェラーゼを過剰発現するように操作される。特定の実施形態では、グリコシルトランスフェラーゼは、ベータ－１，４－マンノシル－糖タンパク質４－ベータ－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼである。
いくつかの実施形態では、ＡＢＰは、低フコシル化Ｆｃ領域を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、低フコシル化されている（例えば、抗体のＦｃ領域のＮ－グリカンは、コアフコース糖単位を有さない）。
特定の実施形態では、グリコシルトランスフェラーゼは、ＦｕＴ８と競合する。いくつかの実施形態では、組換えタンパク質産生に使用される哺乳動物細胞株は、低減したフコシル化（例えば、７０％未満のフコシル化、６５％未満のフコシル化、６０％未満のフコシル化、５５％未満のフコシル化、５０％未満のフコシル化、４５％未満のフコシル化、４０％未満のフコシル化、３５％未満のフコシル化、３０％未満のフコシル化、２５％未満のフコシル化、２０％未満のフコシル化、１５％未満のフコシル化、１０％未満のフコシル化、５％未満のフコシル化、又は２．５％未満のフコシル化）を有するＡＢＰを産生する。
いくつかの実施形態では、組換えタンパク質産生に使用される哺乳動物細胞株は、増加したフコシル化（例えば、９９％超のフコシル化、９５％超のフコシル化、９０％超のフコシル化、８５％超のフコシル化、８０％超のフコシル化、７５％超のフコシル化、７０％超のフコシル化、６５％超のフコシル化、６０％超のフコシル化、５５％超のフコシル化、５０％超のフコシル化、４５％超のフコシル化、４０％超のフコシル化、３５％超のフコシル化、３０％超のフコシル化、２５％超のフコシル化、２０％超のフコシル化、１５％超のフコシル化、１０％超のフコシル化、５％超のフコシル化、又は２．５％超のフコシル化）を有するＡＢＰを産生する。
哺乳動物細胞の安定したトランスフェクションについて、使用される発現ベクター及びトランスフェクション技法に応じて、細胞の小さな画分のみが外来ＤＮＡをそれらのゲノムに組み込み得ることが知られている。これらの組込み体を同定及び選択するために、（例えば、抗生物質に対する耐性についての）選択可能なマーカーをコードする遺伝子は、一般に、目的の遺伝子とともに宿主細胞に導入される。そのような細胞が、選択可能なマーカー及び所望の発現カセットを含むベクターで形質転換されると、細胞は、例えば、選択培地に切り替えられる前に、濃縮された培地で増殖させることができる。選択可能なマーカーは、導入された配列を成功裏に発現する細胞の増殖及び回収を可能にするように設計されている。耐性のある安定に形質転換された細胞の塊は、使用される細胞株に適した組織培養技法を使用して増殖させることができる。組換えタンパク質の発現の概要は、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，ｖ．１８５，Ｇｏｅｄｄｅｌｌ，Ｄ．Ｖ．，ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９９０）に見られる。好ましい選択可能なマーカーには、Ｇ４１８、ハイグロマイシン、及びメトトレキセートなどの、薬物に対する耐性を付与するものが含まれる。導入された核酸で安定にトランスフェクトされた細胞は、他の方法の中でも、薬物選択（例えば、選択可能なマーカー遺伝子を組み込んだ細胞は生存するが、他の細胞は死滅する）によって同定することができる。
形質転換された細胞は、ポリペプチドの発現を促進する条件下で培養することができ、ポリペプチドは、従来のタンパク質精製手順（以上で定義される）によって回収することができる。１つのそのような精製手順は、例えば、それに結合したＣＴＬＡ－４の全部又は一部（例えば、細胞外ドメイン）を有するマトリックス上での、親和性クロマトグラフィーの使用を含む。本明細書での使用について企図されるポリペプチドは、汚染内因性材料を実質的に含まない、実質的に均質な組換え哺乳動物抗ＣＴＬＡ－４抗体ポリペプチドを含む。
原核生物系を使用した発現などの、いくつかの場合では、本開示の発現されたポリペプチドは、生物学的に活性であるために、適切な三次構造及び生成されたジスルフィド結合に「リフォールディング」及び酸化される必要があり得る。リフォールディングは、当該技術分野で周知の多数の手順を使用して達成することができる。そのような方法は、例えば、可溶化されたポリペプチドをカオトロピック剤の存在下で通常７を超えるｐＨに曝露することを含む。カオトロープの選択は、封入体可溶化に使用される選択と同様であるが、カオトロープは、典型的には、より低濃度で使用される。例示的なカオトロピック剤は、グアニジン及び尿素である。ほとんどの場合、リフォールディング／酸化溶液はまた、還元剤とその酸化形態を、システイン架橋の形成のためにジスルフィドシャッフリングが発生することを可能にする特定の酸化還元電位を生成する特定の比で含むであろう。いくつかの一般的に使用される酸化還元対には、システイン／シスタミン、グルタチオン／ジチオビスＧＳＨ、塩化第二銅、ジチオスレイトールＤＴＴ／ジチアンＤＴＴ、及び２－メルカプトエタノール（ｂＭＥ）／ジチオ－ｂＭＥが含まれる。多くの場合、共溶媒は、リフォールディングの効率を増加させるために使用され得る。一般的に使用される共溶媒には、グリセロール、様々な分子量のポリエチレングリコール、及びアルギニンが含まれる。
加えて、ポリペプチドは、従来の技法に従って、溶液中又は固体支持体上で合成することができる。様々な自動合成装置が市販されており、既知のプロトコルに従って使用することができる。例えば、Ｓｔｅｗａｒｔ ａｎｄ Ｙｏｕｎｇ，Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２ｄ．Ｅｄ．，Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（１９８４）、Ｔａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ，１０５：６４４２，（１９８３）、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３２：３４１－３４７（１９８６）、Ｂａｒａｎｙ ａｎｄ Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ｇｒｏｓｓ ａｎｄ Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ，ｅｄｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１－２８４、Ｂａｒａｎｙ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ Ｊ Ｐｅｐ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ，３０：７０５－７３９（１９８７）を参照されたい。
本開示のポリペプチド及びタンパク質は、当業者に周知のタンパク質精製技法に従って精製することができる。これらの技法は、あるレベルでは、タンパク質画分及び非タンパク質画分の粗分画を含む。ペプチドポリペプチドを他のタンパク質から分離し、目的のペプチド又はポリペプチドを、クロマトグラフィー及び電気泳動技法を使用して更に精製して、部分的又は完全な精製（若しくは均質までの精製）を達成することができる。本明細書で使用される「精製されたポリペプチド」という用語は、ポリペプチドがその天然に入手可能な状態に対して任意の程度まで精製されている、他の成分から単離可能な、組成物を指すことを意図する。したがって、精製されたポリペプチドは、それが天然に発生し得る環境から遊離しているポリペプチドも指す。一般に、「精製された」とは、様々な他の成分を除去するために分画に供されたポリペプチド組成物を指し、その組成物は、その発現された生物学的活性を実質的に保持する。「実質的に精製された」という用語が使用される場合、この指定は、ポリペプチド又はペプチドが組成物の主要成分を形成する、例えば、組成物中のタンパク質の約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約８５％、又は約９０％以上を構成するペプチド又はポリペプチド組成物を指すであろう。
精製における使用に好適な様々な技法は、当業者に周知である。これらには、例えば、硫酸アンモニウム、ＰＥＧ、抗体（免疫沈降）などでの沈降、又は熱変性、続いて遠心分離、クロマトグラフィー、例えば、親和性クロマトグラフィー（プロテインＡカラム）、イオン交換、ゲル濾過、逆相、ヒドロキシアパタイト、疎水性相互作用クロマトグラフィー、等電点電気泳動、ゲル電気泳動、及びこれらの技法の組み合わせが含まれる。当該技術分野で一般的に知られているように、様々な精製ステップを行う順序は変更され得、又は特定のステップは省略され、依然として実質的に精製されたポリペプチドの調製に好適な方法をもたらし得ると考えられている。例示的な精製ステップは、以下の実施例に提供される。
ポリペプチドの精製度を定量化するための様々な方法は、本開示に照らして当業者に知られるであろう。これらには、例えば、活性画分の特異的結合活性を決定すること、又はＳＤＳ／ＰＡＧＥ分析によって画分内のペプチド若しくはポリペプチドの量を評価することが含まれる。ポリペプチド画分の純度を評価するための好ましい方法は、画分の結合活性を計算し、それを初期抽出物の結合活性と比較し、よって本明細書では「倍精製数」によって評価される、精製度を計算することである。結合活性の量を表すために使用される実際の単位は、もちろん、精製後に選択される特定のアッセイ技法、及びポリペプチド又はペプチドが検出可能な結合活性を示すかどうかに依存するであろう。
７．６．抗体を生成する方法
完全ヒトモノクローナル抗体は、当業者が熟知しているであろう任意の数の技法によって生成され得る。そのような方法は、ヒト末梢血細胞（例えば、Ｂリンパ球を含む）のエプスタインバールウイルス（ＥＢＶ）形質転換、ヒトＢ細胞のインビトロ免疫化、挿入されたヒト免疫グロブリン遺伝子を有する免疫化されたトランスジェニックマウス由来の脾臓細胞の融合、ヒト免疫グロブリンＶ領域ファージライブラリーからの単離、又は当該技術分野で知られ、本明細書における開示に基づく他の手順を含むが、これらに限定されない。例えば、完全ヒトモノクローナル抗体は、抗原チャレンジに応答して特定のヒト抗体を産生するように操作されたトランスジェニックマウスから得られ得る。トランスジェニックマウスから完全ヒト抗体を得るための方法は、例えば、Ｇｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．７：１３，１９９４、Ｌｏｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３６８：８５６，１９９４、Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎ．６：５７９，１９９４、米国特許第５，８７７，３９７号、Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，１９９７ Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８：４５５－５８、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ ｅｔ ａｌ．，１９９５ Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７６４：５２５－３５によって記載されている。この技法では、ヒト重鎖及び軽鎖遺伝子座の要素が、内因性重鎖及び軽鎖遺伝子座の標的化された破壊を含む胚性幹細胞株から誘導されるマウスの株に導入される（Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８：４５５－５８（１９９７）も参照されたい）。例えば、ヒト免疫グロブリン導入遺伝子は、ミニ遺伝子構築物、又は酵母人工染色体上の転座であり得、これは、マウスリンパ球組織においてＢ細胞特異的ＤＮＡ再編成及び超変異を受ける。完全ヒトモノクローナル抗体は、トランスジェニックマウスを免疫化することによって得られ、これは次いでＣＴＬＡ－４に特異的なヒト抗体を産生し得る。免疫化されたトランスジェニックマウスのリンパ球細胞は、本明細書に記載される方法に従って、ヒト抗体分泌ハイブリドーマを産生するために使用することができる。完全ヒト抗体を含むポリクローナル血清はまた、免疫化された動物の血液から得られ得る。
本開示のヒト抗体を生成するための別の方法は、ＥＢＶ形質転換によるヒト末梢血細胞を不死化することを含む。例えば、米国特許第４，４６４，４５６号を参照されたい。ＣＴＬＡ－４に特異的に結合するモノクローナル抗体を産生するそのような不死化されたＢ細胞株（又はリンパ芽球様細胞株）は、本明細書で提供される免疫検出方法、例えば、ＥＬＩＳＡによって同定し、次いで標準的なクローニング技法によって単離することができる。抗ＣＴＬＡ－４抗体を産生するリンパ芽球様細胞株の安定性は、当該技術分野で知られている方法に従って、形質転換された細胞株をマウス骨髄腫と融合させてマウス－ヒトハイブリッド細胞株を作製することによって改善され得る（例えば、Ｇｌａｓｋｙ ｅｔ ａｌ．，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ８：３７７－８９（１９８９）を参照されたい）。ヒトモノクローナル抗体を生成する更に別の方法は、ヒト脾臓Ｂ細胞をヒトＣＴＬＡ－４でプライミングすること、続いてプライミングされたＢ細胞のヘテロハイブリッド融合パートナーとの融合を含む、インビトロ免疫化である。例えば、Ｂｏｅｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９１ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：８６－９５を参照されたい。
特定の実施形態では、抗ヒトＣＴＬＡ－４抗体を産生しているＢ細胞が選択され、軽鎖及び重鎖可変領域は、当該技術分野で知られている分子生物学技法に従ってＢ細胞からクローニングされ（ＷＯ９２／０２５５１、米国特許第５，６２７，０５２号、Ｂａｂｃｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：７８４３－４８（１９９６））、本明細書に記載されている。免疫化された動物からのＢ細胞は、ＣＴＬＡ－４に特異的に結合する抗体を産生している細胞を選択することによって、脾臓、リンパ節、又は末梢血試料から単離され得る。Ｂ細胞はまた、ヒトから、例えば、末梢血試料から単離され得る。
例えば、プラーク形成、蛍光活性化細胞選別、インビトロ刺激、続いて特異的抗体の検出、などによる、所望の特異性を有する抗体を産生している単Ｂ細胞を検出するための方法は、当該技術分野で周知である。特定の抗体産生Ｂ細胞の選択方法は、例えば、ヒトＣＴＬＡ－４を含有する軟寒天中のＢ細胞の単細胞懸濁液を調製することを含む。Ｂ細胞によって産生された特定の抗体の抗原への結合は、複合体の形成をもたらし、これは免疫沈降物として目に見える場合があり得る。
いくつかの実施形態では、特定の抗体産生Ｂ細胞は、天然に対合された抗体の同定を可能にする方法を使用することによって選択される。例えば、本明細書においてその全体が参照によって組み込まれる、Ａｄｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａ ｎａｔｉｖｅｌｙ ｐａｉｒｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｌｉｂｒａｒｙ ｙｉｅｌｄｓ ｄｒｕｇ ｌｅａｄｓ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈｅｒ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｔｈａｎ ａ ｒａｎｄｏｍｌｙ ｐａｉｒｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｌｉｂｒａｒｙ，ＭＡｂｓ（２０１８）に記載される方法を採用することができる。方法は、マイクロ流体技術、分子ゲノミクス、酵母単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）ディスプレイ、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）、及びＡｄｌｅｒ ｅｔ ａｌ．から採用された図１に要約されるディープシーケンシングを組み合わせる。手短に言えば、Ｂ細胞は、免疫化された動物から単離し、次いでプールすることができる。Ｂ細胞は、オリゴ－ｄＴビーズ及び溶解液で液滴にカプセル化され、ｍＲＮＡ結合ビーズは、液滴から精製され、次いで重鎖及び軽鎖Ｉｇの天然対合を有するｓｃＦｖをコードするＤＮＡアンプリコンを精製するＯＥ－ＲＴ－ＰＣＲ増幅ミックスを含む第２のエマルジョンに注射される。次いで、天然に対合されたアンプリコンのライブラリーは、ｓｃＦｖディスプレイのために酵母にエレクトロポレートされる。ＦＡＣＳは、高親和性ｓｃＦｖを同定するために使用される。最後に、ディープ抗体シーケンシングは、選別前及び後ｓｃＦｖライブラリーにおける全てのクローンを同定するために使用することができる。
所望の抗体を産生するＢ細胞が選択された後、特異的抗体遺伝子は、当該技術分野で知られ、本明細書に記載される方法に従ってＤＮＡ又はｍＲＮＡを単離及び増幅することによってクローニングされ得る。
本開示の抗体を得るための方法はまた、当該技術分野で知られている様々なファージディスプレイ技術を採用することができる。例えば、Ｗｉｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９４ Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２：４３３－５５、Ｂｕｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４ Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５７：１９１－２８０を参照されたい。ヒト又はマウス免疫グロブリン可変領域遺伝子コンビナトリアルライブラリーは、ＣＴＬＡ－４結合タンパク質又はそのバリアント若しくはフラグメントに特異的に結合するＩｇフラグメント（Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓＦｖ、又はそれらのマルチマー）を選択するためにスクリーニングすることができるファージベクターにおいて作製され得る。例えば、米国特許第５，２２３，４０９号、Ｈｕｓｅ ｅｔ ａｌ．，１９８９ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５－８１、Ｓａｓｔｒｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：５７２８－３２（１９８９）、Ａｌｔｉｎｇ－Ｍｅｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ３：１－９（１９９０）、Ｋａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９１ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：４３６３－６６、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ｅｔ ａｌ．，１９９２ Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２２７：３８１－３８８、Ｓｃｈｌｅｂｕｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，１９９７ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ １６：４７－５２、及びそこに引用される参考文献を参照されたい。例えば、Ｉｇ可変領域フラグメントをコードする複数のポリヌクレオチド配列を含むライブラリーは、Ｍ１３又はそのバリアントなどの、糸状バクテリオファージのゲノムに、ファージコートタンパク質をコードする配列とインフレームで挿入され得る。融合タンパク質は、軽鎖可変領域ドメインと及び／又は重鎖可変領域ドメインとコートタンパク質の融合体であり得る。特定の実施形態によれば、免疫グロブリンＦａｂフラグメントはまた、ファージ粒子上に示され得る（例えば、米国特許第５，６９８，４２６号を参照されたい）。
マイナーコートタンパク質などの、別のタンパク質に融合した抗体フラグメントはまた、抗原を有するファージを濃縮するために使用することができる。次いで、抗原（例えば、ＣＴＬＡ－４）に免疫のあるマウスからの再編成された重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）の無作為コンビナトリアルライブラリーを使用して、抗体フラグメントの多様なライブラリーがファージの表面上に示される。これらのライブラリーは、相補的可変ドメインについてスクリーニングすることができ、ドメインは、例えば、親和性カラムによって精製することができる。Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，Ｖ．３５２ ｐｐ．６２４－６２８（１９９１）を参照されたい。
重鎖及び軽鎖免疫グロブリンｃＤＮＡ発現ライブラリーはまた、例えば、λｌｍｍｕｎｏＺａｐ（商標）（Ｈ）及びλＩｍｍｕｎｏＺａｐ（商標）（Ｌ）ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を使用してラムダファージにおいて調製され得る。簡潔には、ｍＲＮＡは、Ｂ細胞集団から単離され、λＩｍｍｕｎｏＺａｐ（Ｈ）及びλＩｍｍｕｎｏＺａｐ（Ｌ）ベクターにおける重鎖及び軽鎖免疫グロブリンｃＤＮＡ発現ライブラリーを作製するために使用される。これらのベクターは、個別にスクリーニングされ得るか、又はＦａｂフラグメント若しくは抗体を形成するために共発現され得る（Ｈｕｓｅ ｅｔ ａｌ．、前出を参照、またＳａｓｔｒｙ ｅｔ ａｌ．、前出を参照されたい）。その後、陽性プラークは、Ｅ．ｃｏｌｉからのモノクローナル抗体フラグメントの高レベル発現を可能にする非溶解性プラスミドに変換され得る。
一実施形態では、ハイブリドーマにおいて、目的のモノクローナル抗体を発現する遺伝子の可変領域は、ヌクレオチドプライマーを使用して増幅される。これらのプライマーは、当業者によって合成され得るか、又は商業的に入手可能な供給源から購入され得る。（例えば、とりわけ、ＶＨａ、ＶＨｂ、ＶＨｃ、ＶＨｄ、ＣＨ１、ＶＬ、及びＣＬ領域のプライマーを含む、マウス及びヒト可変領域のプライマーを販売する、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を参照されたい。）これらのプライマーは、重鎖又は軽鎖可変領域を増幅するために使用され得、これらは次いで、それぞれ、ＩｍｍｕｎｏＺＡＰ（商標）Ｈ又はＩｍｍｕｎｏＺＡＰ（商標）Ｌ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）などのベクターに挿入され得る。次いで、これらのベクターは、発現のためにＥ．ｃｏｌｉ、酵母、又は哺乳動物ベースのシステムに導入され得る。ＶＨ及びＶＬドメインの融合体を含む多量の単鎖タンパク質は、これらの方法を用いて産生され得る（Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３－４２６，１９８８を参照されたい）。
本開示による抗体を産生する細胞が、上記の免疫化及び他の技法のいずれかを使用して得られると、特異的抗体遺伝子は、本明細書に記載される標準的な手順に従ってそこからＤＮＡ又はｍＲＮＡを単離及び増幅することによってクローニングされ得る。そこから産生された抗体は、配列決定され得、ＣＤＲは、同定され得、ＣＤＲについてコードするＤＮＡは、本開示に従って他の抗体を生成するように、以前に記載されるように操作され得る。
本開示のＣＴＬＡ－４結合剤は、好ましくは、本明細書に記載される細胞ベースアッセイ及び／若しくは本明細書に記載されるインビボアッセイにおいてＣＴＬＡ－４機能を調節し、かつ／又は本明細書に記載されるドメインのうちの１つ以上に結合し、かつ／又は本出願に記載される抗体のうちの１つの結合を交差ブロックし、かつ／又は本出願に記載される抗体のうちの１つによってＣＴＬＡ－４に結合することから交差ブロックされる。したがって、そのような結合剤は、本明細書に記載されるアッセイを使用して同定することができる。
特定の実施形態では、抗体は、本明細書で提供されるドメインのうちの１つ以上に結合し、かつ／又は本明細書に記載される細胞ベース及び／若しくはインビボアッセイにおいて中和し、かつ／又は本明細書に記載される抗体を交差ブロックし、かつ／又は本出願に記載される抗体のうちの１つによってＣＴＬＡ－４に結合することから交差ブロックされる、抗体をまず同定することによって生成される。次いで、これらの抗体からのＣＤＲ領域は、適切な生体適合性フレームワークに挿入して、ＣＴＬＡ－４結合剤を生成するために使用される。結合剤の非ＣＤＲ部分は、アミノ酸で構成され得るか、又は非タンパク質分子であり得る。本明細書に記載されるアッセイは、結合剤の特徴分析を可能にする。好ましくは、本開示の結合剤は、本明細書で定義される抗体である。
本開示による他の抗体は、本明細書に記載され、当該技術分野で知られている従来の免疫化及び細胞融合手順によって得られ得る。
抗体結合部位の中心にある相補性決定領域（ＣＤＲ）の分子進化はまた、Ｓｃｈｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６３：５５１によって記載されるように、増加した親和性を有する抗体、例えば、ｃ－ｅｒｂＢ－２についての増加した親和性を有する抗体を単離するために使用されてきた。したがって、そのような技法は、ＣＴＬＡ－４に対する抗体を調製することにおいて有用である。ＣＴＬＡ－４に対する抗原結合タンパク質は、例えば、インビトロ又はインビボのいずれかで、ＣＴＬＡ－４ポリペプチドの存在を検出するアッセイにおいて使用することができる。抗原結合タンパク質はまた、免疫親和性クロマトグラフィーによってＣＴＬＡ－４タンパク質を精製することにおいて使用され得る。
ヒト、部分ヒト、又はヒト化抗体は、多くの用途、特にヒト対象への抗体の投与を含むものに好適であるが、他のタイプの抗原結合タンパク質も特定の用途に適しているであろう。本開示の非ヒト抗体は、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ロバ、又は非ヒト霊長類（サル（例えば、カニクイザル又はアカゲザル）又は類人猿（例えば、チンパンジー）など）などの、任意の抗体産生動物から誘導することができる。特定の種からの抗体は、例えば、その種の動物を所望の免疫原（例えば、ＣＴＬＡ－４ポリペプチド）で免疫化するか、若しくはその種の抗体を生成するための人工システム（例えば、特定の種の抗体を生成するための細菌又はファージディスプレイベースのシステム）を使用することによって、又は、例えば、抗体の定常領域を他の種からの定常領域で置き換えることによって、１つの種からの抗体を別の種からの抗体に変換することによって、又は抗体の１つ以上のアミノ酸残基を、他の種からの抗体の配列により酷似するように置き換えることによって作製することができる。一実施形態では、抗体は、２つ以上の異なる種からの抗体に由来するアミノ酸配列を含むキメラ抗体である。
抗原結合タンパク質は、多数の従来技法のいずれかによって、調製され、所望の特性についてスクリーニングされ得る。特定の技法は、目的の抗原結合タンパク質（例えば、抗ＣＴＬＡ－４抗体）のポリペプチド鎖（又はその部分）をコードする核酸を単離し、組換えＤＮＡ技術によって核酸を操作することを含む。核酸は、目的の別の核酸に融合され得るか、又は例えば、１つ以上のアミノ酸残基を付加、欠失、若しくは置換するように（例えば、変異誘発又は他の従来技法によって）改変され得る。更に、抗原結合タンパク質は、それらを天然に発現する細胞から精製され得るか（例えば、抗体は、それを産生するハイブリドーマから精製することができ）、又は当該技術分野で知られる任意の技法を使用して、組換え発現システムにおいて産生され得る。例えば、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ：Ａ Ｎｅｗ Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｅｓ，Ｋｅｎｎｅｔ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８０）、及びＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｄ（ｅｄｓ．），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，（１９８８）を参照されたい。
当該技術分野で知られている任意の発現システムは、本開示の組換えポリペプチドを作製するために使用することができる。発現システムは、上で包括的に詳述されている。一般に、宿主細胞は、所望のポリペプチドをコードするＤＮＡを含む組換え発現ベクターで形質転換される。使用され得る宿主細胞の中には、原核生物、酵母、又は高等真核細胞がある。原核生物には、グラム陰性又はグラム陽性生物、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ又はＢａｃｉｌｌｉが含まれる。高等真核細胞には、昆虫細胞及び哺乳動物起源の確立された細胞株が含まれる。好適な哺乳動物宿主細胞株の例としては、サル腎臓細胞のＣＯＳ－７株（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）（Ｇｌｕｚｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９８１，Ｃｅｌｌ ２３：１７５）、Ｌ細胞、２９３細胞、Ｃ１２７細胞、３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ １６３）、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ＢＨＫ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １０）細胞株、及びＭｃＭａｈａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９１，ＥＭＢＯ Ｊ．１０：２８２１によって記載されるアフリカミドリザル腎臓細胞株ＣＶＩ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）に由来するＣＶＩ／ＥＢＮＡ細胞株が挙げられる。細菌、真菌、酵母、及び哺乳動物細胞宿主での使用のための適切なクローニング及び発現ベクターは、Ｐｏｕｗｅｌｓ ｅｔ ａｌ．（Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８５）によって記載されている。
抗体が結合特異性を保持するという条件で、本開示の抗体が少なくとも１つのアミノ酸置換を有し得ることが理解されるであろう。したがって、抗体構造への修飾は、本開示の範囲内に包含される。これらは、抗体のＣＴＬＡ－４結合能力を破壊しない保存的又は非保存的であり得る、アミノ酸置換を含み得る。保存的アミノ酸置換は、典型的には、生物学的システムにおける合成ではなく、化学的ペプチド合成によって組み込まれる、天然に存在しないアミノ酸残基を包含し得る。これらには、ペプチド模倣薬及びアミノ酸部分の他の逆転又は反転形態が含まれる。保存的アミノ酸置換はまた、その位置でのアミノ酸残基の極性又は電荷に対してほとんど又は全く効果がないように、天然アミノ酸残基の標準残基での置換を含み得る。
非保存的置換は、アミノ酸又はアミノ酸模倣体の１つのクラスのメンバーの、異なる物理的特性（例えば、サイズ、極性、疎水性、電荷）を有する別のクラスからのメンバーでの交換を含み得る。そのような置換された残基は、非ヒト抗体と相同であるヒト抗体の領域、又は分子の非相同領域に導入され得る。
更に、当業者は、各所望のアミノ酸残基での単一のアミノ酸置換を含む試験バリアントを生成し得る。次いで、バリアントは、当業者に知られている活性アッセイを使用してスクリーニングすることができる。そのようなバリアントは、好適なバリアントについての情報を収集するために使用され得る。例えば、特定のアミノ酸残基への変更が、破壊された、望ましくないほど低減した、又は不適切な活性をもたらしたことが発見された場合、そのような変更を有するバリアントは回避され得る。換言すれば、そのような日常的な実験から収集された情報に基づいて、当業者は、更なる置換が単独又は他の変異との組み合わせのいずれかで回避されるべきであるアミノ酸を容易に決定することができる。
当業者は、周知の技法を使用して、本明細書に記載されるポリペプチドの好適なバリアントを決定することができるであろう。特定の実施形態では、当業者は、活性にとって重要であるとは考えられない領域を標的とすることによって活性を破壊することなく変更され得る分子の好適な領域を同定し得る。特定の実施形態では、類似したポリペプチドの中で保存されている分子の残基及び部分を同定することができる。特定の実施形態では、生物学的活性又は構造にとって重要であり得る領域でさえ、生物学的活性を破壊することなく、又はポリペプチド構造に悪影響を与えることなく、保存的アミノ酸置換に供され得る。
加えて、当業者は、活性又は構造にとって重要な類似のポリペプチド中の残基を同定する構造機能研究を再検討することができる。そのような比較を考慮して、類似したタンパク質の活性又は構造に重要なアミノ酸残基に対応するタンパク質におけるアミノ酸残基の重要性を予測することができる。当業者は、そのような予測された重要なアミノ酸残基について化学的に類似したアミノ酸置換を選択し得る。
当業者はまた、類似のポリペプチドにおけるその構造に関連する三次元構造及びアミノ酸配列を分析することができる。そのような情報を考慮して、当業者は、その三次元構造に関して抗体のアミノ酸残基のアラインメントを予測し得る。特定の実施形態では、当業者は、そのような残基が他の分子との重要な相互作用に関与し得るため、タンパク質の表面上にあると予測されるアミノ酸残基に根本的な変更を行わないように選択し得る。
多くの科学出版物は、二次構造の予測を扱っている。Ｍｏｕｌｔ Ｊ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ．，７（４）：４２２－４２７（１９９６），Ｃｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１３（２）：２２２－２４５（１９７４）、Ｃｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１１３（２）：２１１－２２２（１９７４）、Ｃｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．Ｒｅｌａｔ．Ａｒｅａｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４７：４５－１４８（１９７８）、Ｃｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，４７：２５１－２７６、及びＣｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．，２６：３６７－３８４（１９７９）を参照されたい。更に、二次構造を予測することを支援するコンピュータプログラムが現在利用可能である。二次構造を予測する１つの方法は、相同性モデリングに基づいている。例えば、３０％よりも大きな配列同一性、又は４０％よりも大きな類似性を有する２つのポリペプチド又はタンパク質は、類似の構造トポロジーを有することが多い。タンパク質構造データベース（ＰＤＢ）の最近の増加は、ポリペプチドの又はタンパク質の構造内の潜在的なフォールドの数を含む、二次構造の増強された予測可能性を提供した。Ｈｏｌｍ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．，２７（１）：２４４－２４７（１９９９）を参照されたい。所与のポリペプチド又はタンパク質には限られた数のフォールドがあり、臨界数の構造が分解されると、構造予測は劇的により正確になることが提案されている（Ｂｒｅｎｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，７（３）：３６９－３７６（１９９７））。
二次構造を予測する追加の方法は、「スレッディング」（Ｊｏｎｅｓ，Ｄ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，７（３）：３７７－８７（１９９７）、Ｓｉｐｐｌ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，４（１）：１５－１９（１９９６））、「プロファイル分析」（Ｂｏｗｉｅ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５３：１６４－１７０（１９９１）、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．，１８３：１４６－１５９（１９９０）、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８４（１３）：４３５５－４３５８（１９８７））、及び「進化的結合」（Ｈｏｌｍ、前出（１９９９）、及びＢｒｅｎｎｅｒ、前出（１９９７）を参照されたい）を含む。
特定の実施形態では、抗体のバリアントには、グリコシル化部位の数及び／又はタイプが親ポリペプチドのアミノ酸配列と比較して改変されているグリコシル化バリアントが含まれる。特定の実施形態では、バリアントは、天然タンパク質より多い又は少ない数のＮ結合型グリコシル化部位を含む。Ｎ結合型グリコシル化部位は、配列：Ａｓｎ－Ｘ－Ｓｅｒ又はＡｓｎ－Ｘ－Ｔｈｒを特徴とし、Ｘとして示されるアミノ酸残基は、プロリン以外の任意のアミノ酸残基であり得る。この配列を作製するアミノ酸残基の置換は、Ｎ結合型糖鎖の付加のための潜在的な新しい部位を提供する。あるいは、この配列を除去する置換は、既存のＮ結合型炭水化物鎖を除去するであろう。１つ以上のＮ結合型グリコシル化部位（典型的には、天然に存在するもの）が除去され、１つ以上の新しいＮ結合型部位が作製される、Ｎ結合型炭水化物鎖の再編成も提供される。追加の好ましい抗体バリアントには、親アミノ酸配列と比較して、１つ以上のシステイン残基が別のアミノ酸（例えば、セリン）から欠失又はこれに置換されているシステインバリアントが含まれる。システインバリアントは、不溶性封入体の分離後などの、抗体を生物学的に活性な立体配座に再フォールドされる必要がある場合に有用であり得る。システインバリアントは、一般に、天然タンパク質よりも少ないシステイン残基を有し、対合していないシステインに起因する相互作用を最小限に抑えるために典型的には偶数を有する。
所望のアミノ酸置換（保存的又は非保存的）は、そのような置換が望まれる時点で当業者によって決定することができる。特定の実施形態では、アミノ酸置換は、ＣＴＬＡ－４に対する抗体の重要な残基を同定するか、又は本明細書に記載されるＣＴＬＡ－４に対する抗体の親和性を増加若しくは減少させるために使用することができる。
特定の実施形態によれば、好ましいアミノ酸置換は、（１）タンパク質分解に対する感受性を低減するもの、（２）酸化に対する感受性を低減するもの、（３）タンパク質複合体を形成するための結合親和性を改変するもの、（４）結合親和性を改変するもの、及び／又は（４）そのようなポリペプチドに対する他の物理化学的若しくは機能的特性を付与若しくは修飾するものである。特定の実施形態によれば、単一又は複数のアミノ酸置換（特定の実施形態では、保存的アミノ酸置換）は、天然に存在する配列において（特定の実施形態では、分子間接触を形成するドメインの外側のポリペプチドの部分において）行われ得る。特定の実施形態では、保存的アミノ酸置換は、典型的には、親配列の構造的特徴を実質的に変化させない場合がある（例えば、置換アミノ酸は、親配列において発生するヘリックスを破壊しないか、又は親配列を特徴付ける二次構造の他のタイプを破壊しない傾向があるべきである）。当該技術分野で認識されているポリペプチド二次及び三次構造の例は、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｅｄ．，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８４））、Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｃ．Ｂｒａｎｄｅｎ ａｎｄ Ｊ．Ｔｏｏｚｅ，ｅｄｓ．，Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（１９９１））、及びＴｈｏｒｎｔｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ３５４：１０５（１９９１）に記載されており、これらは各々参照によって本明細書に組み込まれる。
特定の実施形態では、本開示の抗体は、ポリマー、脂質、又は他の部分と化学的に結合され得る。
結合剤は、生体適合性フレームワーク構造に組み込まれた本明細書に記載されるＣＤＲのうちの少なくとも１つを含み得る。一例では、生体適合性フレームワーク構造は、局在化した表面領域において抗原（例えば、ＣＤＲ、可変領域など）に結合するアミノ酸配列の１つ以上の配列を表示することができる、立体構造的に安定な構造支持体、又はフレームワーク、又は足場を形成するために十分であるポリペプチド又はその部分を含む。そのような構造は、天然に存在するポリペプチド若しくはポリペプチド「フォールド」（構造モチーフ）であり得るか、又は天然に存在するポリペプチド若しくはフォールドと比較して、アミノ酸の付加、欠失、若しくは置換などの、１つ以上の修飾を有し得る。これらの足場は、ヒト、他の哺乳動物、他の脊椎動物、無脊椎動物、植物、細菌、又はウイルスなどの、任意の種の（又は複数の種の）ポリペプチドから誘導することができる。
典型的には、生体適合性フレームワーク構造は、免疫グロブリンドメイン以外のタンパク質足場又は骨格に基づいている。例えば、フィブロネクチン、アンキリン、リポカリン、ネオカルチノステイン、シトクロムｂ、ＣＰ１ジンクフィンガー、ＰＳＴ１、コイルドコイル、ＬＡＣＩ－Ｄ１、Ｚドメイン、及びテンダミスタットドメインに基づくものが使用され得る（例えば、Ｎｙｇｒｅｎ ａｎｄ Ｕｈｌｅｎ，１９９７，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．ｉｎ Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，７，４６３－４６９を参照されたい）。
ヒト化抗体は、当業者に知られている技法を使用して産生することができる（Ｚｈａｎｇ，Ｗ．，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．４２（１２）：１４４５－１４５１，２００５、Ｈｗａｎｇ Ｗ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ．３６（１）：３５－４２，２００５、Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ ＷＦ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６（１）：４３－６０，２００５、及びＣｌａｒｋ，Ｍ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ．２１（８）：３９７－４０２，２０００）。
加えて、当業者は、好適な結合剤が、本明細書に具体的に開示されるように、配列番号１００１～１０２８を有するＣＤＲ１－Ｌ１～２８、配列番号２００１～２０２８を有するＣＤＲ２－Ｌ１～２８、配列番号３００１～３０２８を有するＣＤＲ３－Ｌ１～２８、配列番号４００１～４０２８を有するＣＤＲ１－Ｈ１～２８、配列番号５００１～５０２８を有するＣＤＲ２－Ｈ１～２８、及び配列番号６００１～６０２８を有するＣＤＲ３－Ｈ１～２８のうちの１つ以上などの、これらの抗体の一部分を含むことを認識するであろう。ＣＤＲ領域の領域のうちの少なくとも１つは、抗体が非置換ＣＤＲの結合特異性を保持するという条件で、ここに提供される配列からの少なくとも１つのアミノ酸置換を有し得る。抗体の非ＣＤＲ部分は、非タンパク質分子であり得、結合剤は、本明細書に開示される抗体のＣＴＬＡ－４への結合を交差ブロックし、かつ／又はＣＴＬＡ－４を中和する。抗体の非ＣＤＲ部分は、非タンパク質分子であり得、抗体は、競合結合アッセイにおいてヒトＣＴＬＡ－４ペプチドに対して、抗体Ａ１～Ａ２８のうちの少なくとも１つによって示されるものと同様の結合パターンを示し、かつ／又はＣＴＬＡ－４を中和する。抗体の非ＣＤＲ部分は、アミノ酸で構成され得、抗体は、組換え結合タンパク質又は合成ペプチドであり、組換え結合タンパク質は、本明細書に開示される抗体のＣＴＬＡ－４への結合を交差ブロックし、かつ／又はＣＴＬＡ－４を中和する。抗体の非ＣＤＲ部分は、アミノ酸で構成され得、抗体は、組換え抗体であり、組換え抗体は、ヒトＣＴＬＡ－４ペプチドエピトープ競合結合アッセイ（以下に記載される）においてヒトＣＴＬＡ－４ペプチドに対して、抗体Ａ１～Ａ２８のうちの少なくとも１つによって示されるものと同様の結合パターンを示し、かつ／又はＣＴＬＡ－４を中和する。
抗体は、以上に記載されるＣＤＲ１－Ｈ、ＣＤＲ２－Ｈ、ＣＤＲ３－Ｈ、ＣＤＲ１－Ｌ、ＣＤＲ２－Ｌ、及びＣＤＲ３－Ｌのうちの１つ以上を含む場合、これらの配列をコードするＤＮＡを含む宿主細胞からの発現によって得られ得る。各ＣＤＲ配列についてコードするＤＮＡは、ＣＤＲのアミノ酸配列に基づいて決定され得、必要に応じてオリゴヌクレオチド合成技法、部位特異的変異誘発、及びポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技法を使用して、任意の所望の抗体可変領域フレームワーク及び定常領域ＤＮＡ配列と一緒に合成され得る。可変領域フレームワーク及び定常領域についてコードするＤＮＡは、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）などの遺伝子配列データベースから当業者に広く入手可能である。
合成されると、本開示の抗体又はそのフラグメントをコードするＤＮＡは、任意の数の既知の発現ベクターを使用して、核酸切除、ライゲーション、形質転換、及びトランスフェクションのための様々な周知の手順のいずれかに従って増殖及び発現され得る。よって、特定の実施形態では、抗体フラグメントの発現は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉなどの原核宿主において好ましい場合がある（例えば、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ ｅｔ ａｌ．，１９８９ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１７８：４９７－５１５を参照されたい）。特定の他の実施形態では、抗体又はそのフラグメントの発現は、酵母（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ、及びＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、動物細胞（哺乳動物細胞を含む）、又は植物細胞を含む、真核宿主細胞において好ましい場合がある。好適な動物細胞の例には、骨髄腫（マウスＮＳＯ株など）、ＣＯＳ、ＣＨＯ、又はハイブリドーマ細胞が含まれるが、これらに限定されない。植物細胞の例としては、タバコ、トウモロコシ、ダイズ、及びイネ細胞が挙げられる。
抗体可変及び／又は定常領域をコードするＤＮＡを含む１つ以上の複製可能な発現ベクターが調製され、適切な細胞株、例えば、マウスＮＳＯ株などの非産生骨髄腫細胞株又はＥ．ｃｏｌｉなどの細菌を形質転換するために使用され得、そこでは抗体の産生が起こるであろう。効率的な転写及び翻訳を得るために、各ベクターにおけるＤＮＡ配列は、適切な調節配列、特に可変ドメイン配列に作動可能に結合したプロモーター及びリーダー配列を含むべきである。このように抗体を産生するための特定の方法は、一般に周知であり、日常的に使用されている。例えば、基本的な分子生物学手順は、Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．によって記載されている（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９、Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ，３ｒｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，（２００１）も参照されたい）。ＤＮＡシーケンシングは、Ｓａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（ＰＮＡＳ ７４：５４６３，（１９７７））及びＡｍｅｒｓｈａｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｐｌｃ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｈａｎｄｂｏｏｋに記載されるように行うことができ、部位特異的変異誘発は、当該技術分野で知られる方法に従って行うことができる（Ｋｒａｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２：９４４１，（１９８４）、Ｋｕｎｋｅｌ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：４８８－９２（１９８５）、Ｋｕｎｋｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３６７－８２（１９８７）、ｔｈｅ Ａｎｇｌｉａｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｔｄ．ｈａｎｄｂｏｏｋ）。加えて、多数の出版物は、ＤＮＡの操作、発現ベクターの作製、並びに好適な細胞の形質転換及び培養による抗体の調製に適した技法を記載する（Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ａ ａｎｄ Ａｄａｉｒ，Ｊ Ｒ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｒｅｖｉｅｗｓ（ｅｄ．Ｔｏｍｂｓ，Ｍ Ｐ，１０，Ｃｈａｐｔｅｒ １，１９９２，Ｉｎｔｅｒｃｅｐｔ，Ａｎｄｏｖｅｒ，ＵＫ）、“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”，１９９９，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ（ｅｄ．），Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。
本開示による抗体の親和性を改善することが望ましい場合、上記ＣＤＲのうちの１つ以上を含むことは、ＣＤＲを維持すること（Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２５４，３９２－４０３，１９９５）、鎖シャッフリング（Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０，７７９－７８３，１９９２）、Ｅ．ｃｏｌｉ．の変異株の使用（Ｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２５０，３５０－３６８，１９９６）、ＤＮＡシャッフリング（Ｐａｔｔｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，８，７２４－７３３，１９９７）、ファージディスプレイ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２５６，７－８８，１９９６）、及び性的ＰＣＲ（Ｃｒａｍｅｒｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３９１，２８８－２９１，１９９８）を含む多数の親和性成熟プロトコルによって得ることができる。親和性成熟のこれらの方法の全ては、Ｖａｕｇｈａｎ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１６，５３５－５３９，１９９８）によって論じられている。
抗体などのいくつかのタンパク質が様々な翻訳後修飾を受け得ることは、当業者によって理解されるであろう。これらの修飾のタイプ及び程度は、多くの場合、タンパク質の発現に使用される宿主細胞株及び培養条件に依存する。そのような修飾には、グリコシル化、メチオニン酸化、ジケトピペリジン形成、アスパラギン酸塩異性化、及びアスパラギン脱アミド化におけるバリエーションが含まれ得る。頻繁な修飾は、（Ｈａｒｒｉｓ，Ｒ．Ｊ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ７０５：１２９－１３４，１９９５に記載されるような）カルボキシペプチダーゼの作用によるカルボキシ末端塩基性残基（リジン又はアルギニンなど）の喪失である。
７．７．配列
抗体Ａ１～Ａ２８は、重鎖及び軽鎖Ｖ（Ｊ）Ｄポリヌクレオチド（本明細書では、それぞれ、Ｌ１～Ｌ２８及びＨ１～Ｈ２８とも称される）を含む。抗体Ａ１～Ａ２８は、表５に列挙された配列を含む。例えば、抗体Ａ１は、軽鎖Ｌ１（配列番号１）及び重鎖Ｈ１（配列番号１０１）を含む。軽鎖（Ｌ１～Ｌ２８）及び重鎖（Ｈ１～Ｈ２８）におけるＣＤＲ配列はまた、特定の配列番号で提供される。例えば、Ｌ１の３つのＣＤＲ配列（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）は、それぞれ、ＣＤＲ１－Ｌ１（配列番号１００１）、ＣＤＲ２－Ｌ１（配列番号２００１）、及びＣＤＲ３－Ｌ１（配列番号３００１）であり、Ｈ１の３つのＣＤＲ配列（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）は、ＣＤＲ１－Ｈ１（配列番号４００１）、ＣＤＲ２－Ｈ１（配列番号５００１）、及びＣＤＲ３－Ｈ１（配列番号６００１）である。
７．８．薬学的組成物
本開示のタンパク質及びポリペプチドを含有する薬学的組成物も提供される。具体的には、本開示は、抗ＣＴＬＡ ＡＢＰを含む薬学的組成物を提供する。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、ＧＩＧＡ－５６４を含む。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、ＧＩＧＡ－２３２８を含む。そのような組成物は、治療上又は予防上有効な量のポリペプチド又はタンパク質を、薬学的に許容される材料、及び生理学的に許容される製剤材料と混合して含む。
薬学的組成物は、例えば、組成物のｐＨ、浸透圧、粘度、透明度、色、等張性、臭気、無菌性、安定性、溶解速度又は放出速度、吸着又は浸透を修飾、維持、又は保存するための製剤材料を含み得る。
好適な製剤材料には、アミノ酸（グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、又はリジンなど）；抗菌剤；酸化防止剤（アスコルビン酸、亜硫酸ナトリウム、又は亜硫酸水素ナトリウムなど）；緩衝液（ホウ酸塩、重炭酸塩、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、クエン酸塩、リン酸塩、他の有機酸など）；増量剤（マンニトール又はグリシンなど）、キレート剤（エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）など）；錯化剤（カフェイン、ポリビニルピロリドン、ベータ－シクロデキストリン、又はヒドロキシプロピル－ベータ－シクロデキストリンなど）；充填剤；単糖；二糖及び他の炭水化物（グルコース、マンノース、又はデキストリンなど）；タンパク質（血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリンなど）；着色；香料及び希釈剤；乳化剤；親水性ポリマー（ポリビニルピロリドンなど）；低分子量ポリペプチド；塩形成対イオン（ナトリウムなど）；防腐剤（塩化ベンザルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン、ソルビン酸、又は過酸化水素など）；溶媒（グリセリン、プロピレングリコール、又はポリエチレングリコールなど）；糖アルコール（マンニトール又はソルビトールなど）；懸濁剤；界面活性剤又は湿潤剤（プルロニック（登録商標）、ＰＥＧ、ソルビタンエステル、ポリソルベート、例えば、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、トリトン、トロメタミン、レシチン、コレステロール、チロキサパルなど）；安定性増強剤（スクロース又はソルビトール）；等張性増強剤（アルカリ金属ハロゲン化物（好ましくは塩化ナトリウム又は塩化カリウム、マンニトールソルビトール）など）；送達ビヒクル；希釈剤；賦形剤及び／又は薬学的補助剤が含まれるが、これらに限定されない。中性緩衝生理食塩水又は同種血清アルブミンと混合した生理食塩水は、適切な希釈剤の例である。適切な業界標準に従って、ベンジルアルコールなどの防腐剤も添加され得る。組成物は、希釈剤として適切な賦形剤溶液（例えば、スクロース）を使用して凍結乾燥物として製剤化され得る。好適な成分は、使用される投与量及び濃度でレシピエントに対して非毒性である。薬学的製剤に使用され得る成分の更なる例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１６ｔｈ Ｅｄ．（１９８０）ａｎｄ ２０ｔｈ Ｅｄ．（２０００），Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡに提示されている。
いくつかの実施形態では、薬学的組成物中のＡＢＰの５０％未満がフコシル化されている。いくつかの実施形態では、薬学的組成物中のＡＢＰの４０％未満がフコシル化されている。いくつかの実施形態では、薬学的組成物中のＡＢＰの３０％未満がフコシル化されている。いくつかの実施形態では、薬学的組成物中のＡＢＰの２０％未満がフコシル化されている。いくつかの実施形態では、薬学的組成物中のＡＢＰの１０％未満がフコシル化されている。
いくつかの実施形態では、薬学的組成物中のＡＢＰの９９％超がフコシル化されている。いくつかの実施形態では、薬学的組成物中のＡＢＰの９５％超がフコシル化されている。いくつかの実施形態では、薬学的組成物中のＡＢＰの９０％超がフコシル化されている。いくつかの実施形態では、薬学的組成物中のＡＢＰの８５％超がフコシル化されている。いくつかの実施形態では、薬学的組成物中のＡＢＰの８０％超がフコシル化されている。いくつかの実施形態では、薬学的組成物中のＡＢＰの７５％超がフコシル化されている。いくつかの実施形態では、薬学的組成物中のＡＢＰの７０％超がフコシル化されている。いくつかの実施形態では、薬学的組成物中のＡＢＰの６５％超がフコシル化されている。いくつかの実施形態では、薬学的組成物中のＡＢＰの６０％超がフコシル化されている。いくつかの実施形態では、薬学的組成物中のＡＢＰの５０％超がフコシル化されている。いくつかの実施形態では、薬学的組成物中のＡＢＰの４０％超がフコシル化されている。いくつかの実施形態では、薬学的組成物中のＡＢＰの３０％超がフコシル化されている。いくつかの実施形態では、薬学的組成物中のＡＢＰの２０％超がフコシル化されている。いくつかの実施形態では、薬学的組成物中のＡＢＰの１０％超がフコシル化されている。
いくつかの実施形態では、薬学的組成物中のＡＢＰの３０～７０％がフコシル化されている。いくつかの実施形態では、薬学的組成物中のＡＢＰの２０～５０％がフコシル化されている。いくつかの実施形態では、薬学的組成物中のＡＢＰの１０～４０％がフコシル化されている。いくつかの実施形態では、薬学的組成物中のＡＢＰの１０～３０％がフコシル化されている。いくつかの実施形態では、薬学的組成物中のＡＢＰの５～２０％がフコシル化されている。いくつかの実施形態では、薬学的組成物中のＡＢＰの１～１０％がフコシル化されている。
いくつかの実施形態では、薬学的製剤材料は、ヒスチジン緩衝液、クエン酸塩緩衝液、スクロース、塩化ナトリウム、コハク酸塩、ポリソルベート２０、及びポリソルベート－８０のうちの１つ以上を含む。特定の実施形態では、薬学的製剤は、１～２０ｍＭのヒスチジン又はクエン酸塩緩衝液を含む。特定の実施形態では、薬学的製剤は、１００～３５０ｍＭのスクロースを含む。特定の実施形態では、薬学的製剤は、０～７５ｍＭのスクロースを含む。特定の実施形態では、薬学的製剤は、０．００２～０．１重量％のポリソルベート－２０を含む。特定の実施形態では、薬学的製剤は、０．００２～０．１重量％のポリソルベート－８０を含む。特定の実施形態では、薬学的製剤材料は、２０ｍＭのクエン酸塩又はヒスチジン、１７０～２７０ｍＭのスクロース、０～５０ｍＭの塩化ナトリウム、及び０．０２重量％のポリソルベート－２０を含む。特定の実施形態では、薬学的製剤材料は、２０ｍＭのクエン酸塩又はヒスチジン、１７０～２７０ｍＭのスクロース、０～５０ｍＭの塩化ナトリウム、及び０．０２重量％のポリソルベート－８０を含む。
いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、５．０～６．５のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、５．５～６．５のｐＨを有する。
いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、２０ｍＭのヒスチジン又はクエン酸塩緩衝液を含む。
いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、５０ｍＭのＮａＣｌを含む。
いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、１７０ｍＭ～２７０ｍＭの濃度でスクロースを含む。
いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、１７０ｍＭ又は２７０ｍＭのスクロースを含む。
いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、２０ｍｇ／ｍＬのＡＢＰを含む。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、５ｍｇ／ｍＬのＡＢＰを含む。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、５ｍｇ／ｍＬ～２０ｍｇ／ｍＬのＡＢＰを含む。
いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、トレハロースを含む。
いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、約０．０４～３０ｍｇ／ｍｌのＡＢＰ、０．９％塩化ナトリウム注射、ＵＳＰ、又は５％デキストロース注射、ＵＳＰを含む。
いくつかの実施形態では、ＡＢＰは、１ｍｇ／ｍｌ～８０ｍｇ／ｍｌの濃度で製剤化される。特定の実施形態では、ＡＢＰは、５ｍｇ／ｍｌ～２０ｍｇ／ｍｌの濃度で製剤化される。
いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、約５～７のｐＨを含む。いくつかの実施形態では、薬学的製剤は、約５．０～６．５のｐＨを含む。いくつかの実施形態では、薬学的製剤は、約５．０、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、又は７のｐＨを含む。
任意に、組成物は、加えて、１つ以上の生理活性剤、例えば、抗血管新生物質、化学療法物質（カペシタビン、５－フルオロウラシル、又はドキソルビシンなど）、鎮痛物質などを含み、その非排他的な例が本明細書に提供される。様々な特定の実施形態では、組成物は、ＣＴＬＡ－４結合タンパク質に加えて、１、２、３、４、５、又は６つの生理活性剤を含む。
本開示の別の実施形態では、本明細書に開示される組成物は、中性又は塩形態で製剤化され得る。例示的な薬学的に許容される塩としては、（タンパク質の遊離アミノ基で形成された）酸付加塩を含み、これらは、例えば、塩酸若しくはリン酸などの無機酸、又は酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などのような有機酸で形成される。遊離カルボキシル基で形成された塩はまた、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、又は水酸化第二鉄などの無機塩基、及びイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどのような有機塩基から誘導することができる。製剤化後、溶液は、投与量製剤化に適合する方法で、治療上有効な量で投与されるであろう。
担体は、任意の全ての溶媒、分散媒、ビヒクル、コーティング、希釈剤、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤、緩衝液、担体溶液、懸濁液、コロイドなどを更に含むことができる。薬学的活性物質のためのそのような媒体及び薬剤の使用は、当該技術分野で周知である。任意の従来の媒体又は薬剤が活性成分と適合しない限りを除いて、治療組成物におけるその使用が企図される。補助活性成分も組成物に組み込むことができる。「薬学的に許容される」という語句は、ヒトに投与されるとアレルギー反応又は同様の有害反応をもたらさない分子実体及び組成物を指す。
最適な薬学的組成物は、例えば、意図した投与経路、送達形式、及び所望の投与量に応じて、当業者によって決定されるであろう。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、前出を参照されたい。そのような組成物は、ポリペプチドの物理的状態、安定性、インビボ放出速度、及びインビボクリアランス速度に影響を与え得る。例えば、好適な組成物は、注射用の水、非経口投与用の生理食塩水であり得る。
７．８．１．薬学的に活性な成分の含有量
典型的な実施形態では、活性成分（すなわち、本開示のタンパク質及びポリペプチド、ＡＢＰ）は、少なくとも０．０１ｍｇ／ｍｌ、少なくとも０．００５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも０．００４ｍｇ／ｍｌ、少なくとも０．０５ｍｇ／ｍｌ、０．０４ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌ、少なくとも０．５ｍｇ／ｍｌ、又は少なくとも１ｍｇ／ｍｌの濃度で薬学的組成物中に存在する。特定の実施形態では、活性成分は、少なくとも１ｍｇ／ｍｌ、２ｍｇ／ｍｌ、３ｍｇ／ｍｌ、４ｍｇ／ｍｌ、５ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、１５ｍｇ／ｍｌ、２０ｍｇ／ｍｌ、２５ｍｇ／ｍｌ、又は３０ｍｇ／ｍｌの濃度で薬学的組成物中に存在する。特定の実施形態では、活性成分は、少なくとも２０ｍｇ／ｍｌ、２５ｍｇ／ｍｌ、３０ｍｇ／ｍｌ、３５ｍｇ／ｍｌ、４０ｍｇ／ｍｌ、４５ｍｇ／ｍｌ、５０ｍｇ／ｍｌ、５５ｍｇ／ｍｌ、６０ｍｇ／ｍｌ、６５ｍｇ／ｍｌ、７０ｍｇ／ｍｌ、７５ｍｇ／ｍｌ、８０ｍｇ／ｍｌ、８５ｍｇ／ｍｌ、９０ｍｇ／ｍｌ、９５ｍｇ／ｍｌ、又は１００ｍｇ／ｍｌの濃度で薬学的組成物中に存在する。特定の実施形態では、活性成分は、１ｍｇ／ｍｌ～８０ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度で薬学的組成物中に存在する。特定の実施形態では、活性成分は、５ｍｇ／ｍｌ～２０ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度で薬学的組成物中に存在する。特定の実施形態では、活性成分は、０．０４ｍｇ／ｍｌ～３０ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度で薬学的組成物中に存在する。
いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、本開示のタンパク質又はポリペプチドに加えて、１つ以上の追加の活性成分を含む。１つ以上の追加の活性成分は、ＰＤ－１阻害剤（例えば、抗ＰＤ－１抗体）、ＰＤ－Ｌ１阻害剤、ＬＡＧ－３阻害剤、ＣＤ４７阻害剤、又はＴＩＧＩＴ阻害剤（例えば、抗ＴＩＧＩＴ抗体）などの、異なるチェックポイント受容体を標的とする薬物であり得る。
７．８．２．一般的な製剤化
薬学的組成物は、液体、油、エマルジョン、ゲル、コロイド、エアロゾル、又は固体を含む、ヒト又は獣医学に適した任意の形態であり得る。
薬学的組成物は、経腸及び非経口投与経路を含む、ヒト又は獣医学に適した任意の投与経路による投与用に製剤化することができる。
様々な実施形態では、薬学的組成物は、吸入による投与用に製剤化される。特定のこれらの実施形態では、薬学的組成物は、蒸気吸入器による投与用に製剤化される。特定のこれらの実施形態では、薬学的組成物は、ネブライザーによる投与用に製剤化される。特定のこれらの実施形態では、薬学的組成物は、エアロゾル発生器による投与用に製剤化される。
様々な実施形態では、薬学的組成物は、経口投与、頬側投与、又は舌下投与用に製剤化される。
いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、静脈内、筋肉内、又は皮下投与用に製剤化される。
いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、髄腔内又は脳室内投与用に製剤化される。
いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、注入用に製剤化される。
７．８．３．注射に適合した薬理学的組成物
静脈内、皮膚、若しくは皮下注射、又は罹患部位での注射について、活性成分は、パイロジェンフリーであり、好適なｐＨ、等張性、及び安定性を有する非経口的に許容される水性溶液の形態であろう。当業者は、例えば、塩化ナトリウム注射、リンゲル注射、乳酸リンゲル注射などの等張性ビヒクルを使用して好適な溶液を調製することが十分にできる。必要に応じて、防腐剤、安定剤、緩衝剤、酸化防止剤、及び／又は他の添加物を含めることができる。
様々な実施形態では、単位剤形は、バイアル、アンプル、ボトル、又はプレフィルドシリンジである。いくつかの実施形態では、単位剤形は、０．００５ｍｇ、０．０５ｍｇ、０．０１ｍｇ、０．１ｍｇ、０．５ｍｇ、１ｍｇ、２．５ｍｇ、５ｍｇ、１０ｍｇ、１２．５ｍｇ、２５ｍｇ、５０ｍｇ、７５ｍｇ、又は１００ｍｇの薬学的組成物を含有する。いくつかの実施形態では、単位剤形は、１２５ｍｇ、１５０ｍｇ、１７５ｍｇ、又は２００ｍｇの薬学的組成物を含有する。いくつかの実施形態では、単位剤形は、２５０ｍｇの薬学的組成物を含有する。
典型的な実施形態では、単位剤形中の薬学的組成物は、液体形態である。様々な実施形態では、単位剤形は、０．１ｍＬ～５０ｍｌの薬学的組成物を含有する。いくつかの実施形態では、単位剤形は、１ｍｌ、２．５ｍｌ、５ｍｌ、７．５ｍｌ、１０ｍｌ、２５ｍｌ、又は５０ｍｌの薬学的組成物を含有する。
特定の実施形態では、単位剤形は、０．０１ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌ、０．５ｍｇ／ｍｌ、又は１ｍｇ／ｍｌの濃度で１ｍｌの薬学的組成物を含有するバイアルである。いくつかの実施形態では、単位剤形は、０．０１ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌ、０．５ｍｇ／ｍｌ、又は１ｍｇ／ｍｌの濃度で２ｍｌの薬学的組成物を含有するバイアルである。いくつかの実施形態では、単位剤形は、０．０１ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌ、０．５ｍｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌ、２ｍｇ／ｍｌ、３ｍｇ／ｍｌ、４ｍｇ／ｍｌ、５ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、１５ｍｇ／ｍｌ、２０ｍｇ／ｍｌ、２５ｍｇ／ｍｌ、３０ｍｇ／ｍｌ、３５ｍｇ／ｍｌ、４０ｍｇ／ｍｌ、４５ｍｇ／ｍｌ、５０ｍｇ／ｍｌ、５５ｍｇ／ｍｌ、６０ｍｇ／ｍｌ、６５ｍｇ／ｍｌ、７０ｍｇ／ｍｌ、７５ｍｇ／ｍｌ、８０ｍｇ／ｍｌ、８５ｍｇ／ｍｌ、９０ｍｇ／ｍｌ、９５ｍｇ／ｍｌ、又は１００ｍｇ／ｍｌの濃度で１～１５０ｍｌの薬学的組成物を含有するバイアルである。いくつかの実施形態では、単位剤形は、０．０１～０．１ｍｇ／ｍｌ、０．１～０．５ｍｇ／ｍｌ、０．５～１ｍｇ／ｍｌ、１～１０ｍｇ／ｍｌ、１～５０ｍｇ／ｍｌ、１０～５０ｍｇ／ｍｌ、１０～１００ｍｇ／ｍｌ、５０～１００ｍｇ／ｍｌ、又は５０～２００ｍｇ／ｍｌの濃度で１～１５０ｍｌの薬学的組成物を含有するバイアルである。
いくつかの実施形態では、単位剤形における薬学的組成物は、可溶化に好適な、凍結乾燥物などの、固体形態である。
皮下、皮内、又は筋肉内投与に好適な単位剤形実施形態は、予め装填されたシリンジ、自動注射器、及び自動注射ペンを含み、各々が所定量の以上で記載される薬学的組成物を含有する。
様々な実施形態では、単位剤形は、シリンジ及び所定量の薬学的組成物を含む、予め装填されたシリンジである。特定の予め装填されたシリンジ実施形態では、シリンジは、皮下投与に適合される。特定の実施形態では、シリンジは、自己投与に好適である。特定の実施形態では、予め装填されたシリンジは、使い捨てシリンジである。
様々な実施形態では、予め装填されたシリンジは、約０．１ｍＬ～約０．５ｍＬの薬学的組成物を含有する。特定の実施形態では、シリンジは、約０．５ｍＬの薬学的組成物を含有する。特定の実施形態では、シリンジは、約１．０ｍＬの薬学的組成物を含有する。特定の実施形態では、シリンジは、約２．０ｍＬの薬学的組成物を含有する。
特定の実施形態では、単位剤形は、自動注射ペンである。自動注射ペンは、本明細書に記載される薬学的組成物を含有する自動注射ペンを含む。いくつかの実施形態では、自動注射ペンは、所定の体積の薬学的組成物を送達する。他の実施形態では、自動注射ペンは、使用者によって設定された体積の薬学的組成物を送達するように構成される。
様々な実施形態では、自動注射ペンは、約０．１ｍＬ～約５．０ｍＬの薬学的組成物を含有する。特定の実施形態では、自動注射ペンは、約０．５ｍＬの薬学的組成物を含有する。特定の実施形態では、自動注射ペンは、約１．０ｍＬの薬学的組成物を含有する。他の実施形態では、自動注射ペンは、約５．０ｍＬの薬学的組成物を含有する。
７．９．投与量レジメン
いくつかの実施形態では、ＡＢＰは、治療効果を生み出すのに十分な用量で投与される。
様々な実施形態では、ＡＢＰは、体重ベースの用量を使用して投与される。いくつかの実施形態では、ＡＢＰは、少なくとも０．０５ｍｇ／ｋｇの量で投与される。いくつかの実施形態では、ＡＢＰは、少なくとも０．０１ｍｇ／ｋｇの量で投与される。いくつかの実施形態では、ＡＢＰは、少なくとも０．１ｍｇ／ｋｇの量で投与される。いくつかの実施形態では、ＡＢＰは、少なくとも０．５ｍｇ／ｋｇの量で投与される。特定の実施形態では、ＡＢＰは、少なくとも１ｍｇ／ｋｇの量で経口投与される。特定の実施形態では、用量は、少なくとも２ｍｇ／ｋｇ、少なくとも３ｍｇ／ｋｇ、少なくとも４ｍｇ／ｋｇ、少なくとも５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも６ｍｇ／ｋｇ、少なくとも７ｍｇ／ｋｇ、少なくとも８ｍｇ／ｋｇ、少なくとも９ｍｇ／ｋｇ、又は少なくとも１０ｍｇ／ｋｇである。
様々な実施形態では、ＡＢＰの用量は、少なくとも１０ｍｇ／ｋｇである。特定の実施形態では、用量は、少なくとも１５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも２０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも２５ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも３５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも４０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも４５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも５０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも５５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも６０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも６５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも７０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも７５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも８０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも８５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも９０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも９５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも１００ｍｇ／ｋｇ、少なくとも１５０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも１７５ｍｇ／ｋｇ、又は少なくとも２００ｍｇ／ｋｇである。特定の実施形態では、用量は、２５０ｍｇ／ｋｇ、３００ｍｇ／ｋｇ、３５０ｍｇ／ｋｇ、４００ｍｇ／ｋｇ、４５０ｍｇ／ｋｇ、５００ｍｇ／ｋｇ、６００ｍｇ／ｋｇ、６５０ｍｇ／ｋｇ、７００ｍｇ／ｋｇ、７５０ｍｇ／ｋｇ、８００ｍｇ／ｋｇ、８５０ｍｇ／ｋｇ、９００ｍｇ／ｋｇ、９５０ｍｇ／ｋｇ、又は１０００ｍｇ／ｋｇである。特定の実施形態では、用量は、１日当たり０．５ｍｇ／ｋｇ～１００ｍｇ／ｋｇである。特定の実施形態では、用量は、１日当たり２ｍｇ／ｋｇ～１００ｍｇ／ｋｇである。特定の実施形態では、用量は、１日当たり２５ｍｇ／ｋｇ～１０００ｍｇ／ｋｇである。
７．１０．単位剤形
薬学的組成物は、便利に単位剤形で提示され得る。
単位剤形は、典型的には、薬学的組成物の１つ以上の特定の投与経路に適合されるであろう。
様々な実施形態では、単位剤形は、吸入による投与に適合される。特定のこれらの実施形態では、単位剤形は、蒸気吸入器による投与に適合される。特定のこれらの実施形態では、単位剤形は、ネブライザーによる投与に適合される。特定のこれらの実施形態では、単位剤形は、エアロゾル発生器による投与に適合される。
様々な実施形態では、単位剤形は、経口投与、頬側投与、又は舌下投与に適合される。
いくつかの実施形態では、単位剤形は、静脈内、筋肉内、又は皮下投与に適合される。
いくつかの実施形態では、単位剤形は、髄腔内又は脳室内投与に適合される。
いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、局所投与用に製剤化される。
単一剤形を産生するために担体材料と組み合わせることができる活性成分の量は、一般に、治療効果をもたらす化合物の量であろう。
７．１１．使用の方法
一態様では、インタクトなＣＴＬＡ－４に特異的に結合する治療用抗体が使用され得る。
インビボ及び／又はインビトロアッセイは、最適な投与量範囲を特定するのを助けるために任意に使用され得る。製剤に使用される正確な用量はまた、投与経路、及び状態の重症度に依存し、診療医の判断及び各対象の状況に従って決定されるべきである。有効用量は、インビトロ又は動物モデル試験システムから誘導される用量－応答曲線から外挿され得る。
オリゴペプチド又はポリペプチドは、本明細書で提供されるＣＤＲのうちの少なくとも１つと、及び／若しくは抗体Ａ１～Ａ２８のうちの少なくとも１つのＣＴＬＡ－４への結合を交差ブロックするＣＴＬＡ－４結合剤のＣＤＲと、少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％同一であるアミノ酸配列を有する場合、かつ／又は抗体Ａ１～Ａ２８のうちの少なくとも１つによってＣＴＬＡ－４への、及び／若しくは結合剤がＣＴＬＡ－４のそのリガンドへの結合をブロックすることができるＣＴＬＡ－４結合剤のＣＤＲへの、結合から交差ブロックされる場合、本開示の範囲内である。
ＣＴＬＡ－４結合剤ポリペプチド及び抗体は、抗体Ａ１～Ａ２８のうちの少なくとも１つの可変領域と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％同一であり、抗体Ａ１～Ａ２８のうちの少なくとも１つのＣＴＬＡ－４への結合を交差ブロックするアミノ酸配列を有する場合、かつ／又は抗体Ａ１～Ａ２８のうちの少なくとも１つによってＣＴＬＡ－４への結合から交差ブロックされる場合、かつ／又はＣＴＬＡ－４のそのリガンドに対する阻害効果をブロックすることができる場合、本開示の範囲内である。
本開示による抗体は、５ｘ１０－７Ｍ以下、１ｘ１０－７Ｍ以下、０．５ｘ１０－７Ｍ以下、１ｘ１０－８Ｍ以下、１ｘ１０－９Ｍ以下、１ｘ１０－１０Ｍ以下、１ｘ１０－１１Ｍ以下、又は１ｘ１０－１２Ｍ以下のヒトＣＴＬＡ－４についての結合親和性を有し得る。
抗体又は結合パートナーの親和性、及び抗体が結合を阻害する程度は、当業者によって従来の技法、例えば、Ｓｃａｔｃｈａｒｄ ｅｔ ａｌ．（Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．５１：６６０－６７２（１９４９））によって記載されるものを使用して、又は表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ、ＢＩＡｃｏｒｅ、Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）によって決定され得る。表面プラズモン共鳴について、標的分子は、固相上に固定され、フローセルに沿って移動する移動相でリガンドに曝露される。固定された標的へのリガンド結合が発生する場合、局所的な屈折率が変化し、ＳＰＲ角度の変化をもたらし、これは、反射光の強度の変化を検出することによってリアルタイムでモニターすることができる。ＳＰＲシグナルの変化率を分析して、結合反応の会合相及び解離相の見かけ速度定数を得ることができる。これらの値の比は、見かけ平衡定数（親和性）をもたらす（例えば、Ｗｏｌｆｆ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５３：２５６０－６５（１９９３）を参照されたい）。
本開示による抗体は、任意の免疫グロブリンクラス、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、又はＩｇＡに属し得る。それは、動物、例えば、家禽（例えば、ニワトリ）、及びマウス、ラット、ハムスター、ウサギ、又は他の齧歯類、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ラクダ、ヒト、又は他の霊長類を含むが、これらに限定されない、哺乳動物から得られるか、又はそれらに由来し得る。抗体は、内在化抗体であり得る。抗体の産生は、米国特許公開第２００４／０１４６８８８Ａ１号に一般的には開示されている。
特定のＡ１～Ａ２８ ＣＤＲの新しいフレームワーク及び／又は定常領域への操作を含む、本開示に従って抗体を生成する上に記載される方法では、所望の抗体を選択するために適切なアッセイが利用可能である（すなわち、ＣＴＬＡ－４に対する結合親和性を決定するためのアッセイ、交差ブロッキングアッセイ、Ｂｉａｃｏｒｅベースの競合結合アッセイ、インビボアッセイ）。
７．１１．１．ＣＴＬＡ－４阻害剤又は活性化剤に応答性である疾患を治療する方法
別の態様では、ＣＴＬＡ－４阻害剤又は活性化剤に応答性である疾患を有する対象を治療するための方法が提示される。疾患は、がん、自己免疫疾患、又はウイルス若しくは細菌感染症であり得る。
「治療」、「治療すること」などの用語は、一般に、所望の薬理学的及び／又は生理学的効果を得ることを意味するために本明細書で使用される。効果は、疾患、状態、若しくはそれらの症状を完全若しくは部分的に予防するという点で、予防的であり得るか、かつ／あるいは疾患若しくは状態、及び／又は疾患若しくは状態に起因する、症状などの、副作用の部分的若しくは完全な治癒という点で治療的であり得る。本明細書で使用される「治療」は、哺乳動物、特にヒトの疾患又は状態の任意の治療を包含し、（ａ）疾患若しくは状態を、疾患若しくは状態にかかりやすい場合があるが、まだそれを有すると診断されていない対象において発生することを予防すること、（ｂ）疾患若しくは状態を阻害すること（例えば、その発症を停止すること）、又は（ｃ）疾患若しくは状態を緩和すること（例えば、疾患若しくは状態の退行を引き起こし、１つ以上の症状における改善を提供すること）を含む。任意の状態における改善は、当該技術分野で知られている標準的な方法及び技法に従って容易に評価することができる。疾患の方法によって治療される対象の集団には、望ましくない状態又は疾患に罹患している対象、及び状態又は疾患の発症のリスクがある対象が含まれる。
「治療有効用量」又は「有効量」という用語は、それが投与される所望の効果をもたらす用量又は量を意味する。正確な用量又は量は、治療の目的に依存し、既知の技法を使用して当業者によって確認可能であろう（例えば、Ｌｌｏｙｄ（１９９９）Ｔｈｅ Ａｒｔ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｉｎｇを参照されたい）。
「十分な量」という用語は、所望の効果を生じるために十分な量を意味する。
「治療有効量」という用語は、疾患の症状を改善するために有効な量である。予防は療法とみなされ得るので、治療有効量は、「予防有効量」であり得る。
「改善すること」という用語は、疾患状態、例えば、神経変性疾患状態の治療における、その予防、重症度若しくは進行の軽減、寛解、又は治癒を含む、任意の治療的に有益な結果を指す。
投与された実際の量、並びに投与の速度及び時間経過は、治療されるタンパク質凝集疾患の性質及び重症度に依存するであろう。治療の処方、例えば、投与量などの決定は、総合診療医及び他の医師の責任の範囲内であり、典型的には、治療される障害、個々の患者の状態、送達の部位、投与の方法、及び診療医に知られている他の因子を考慮する。以上で言及される技法及びプロトコルの例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．（ｅｄ），１９８０において見出すことができる。
いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、吸入によって、経口的に、頬側投与によって、舌下投与によって、注射によって、又は局所適用によって投与される。
いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、ニューロンの生存又はドーパミン放出を調節するために十分な量で投与される。いくつかの実施形態では、主要なカンナビノイドは、用量当たり１ｇ未満、５００ｍｇ未満、１００ｍｇ未満、１０ｍｇ未満の量で投与される。
いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、１日１回、１日２～４回、１週間に２～４回、１週間に１回、又は２週間毎に１回投与される。
組成物は、単独又は他の治療と組み合わせて、治療される状態に応じて同時又は連続的のいずれかで投与することができる。例えば、薬学的組成物は、ＰＤ－１阻害剤（例えば、抗ＰＤ－１抗体）、ＰＤ－Ｌ１阻害剤、ＬＡＧ－３阻害剤、ＣＤ４７阻害剤、又はＴＩＧＩＴ阻害剤（例えば、抗ＴＩＧＩＴ抗体）などの、異なるチェックポイント受容体を標的とする１つ以上の薬物と組み合わせて投与することができる。
いくつかの実施形態では、疾患は、がん、ＡＩＤＳ、アルツハイマー病、及びウイルス又は細菌感染症からなる群から選択される。特定の実施形態では、疾患は、がんである。
特定の実施形態では、疾患は、がんである。特定の実施形態では、対象は、腫瘍を有する。治療され得るがんには、血管新生されていないか、又はまだ実質的に血管新生されていない腫瘍、及び血管新生された腫瘍が含まれる。本明細書に記載される薬学的組成物で治療されるがんのタイプには、がん腫、芽細胞腫、及び肉腫、並びに特定の白血病又はリンパ球様悪性腫瘍、良性及び悪性腫瘍、並びに悪性腫瘍、例えば、肉腫、がん腫、及び黒色腫が含まれるが、これらに限定されない。成人腫瘍／がん及び小児腫瘍／がんも含まれる。いくつかの実施形態では、がんは、ＲＣＣ（腎細胞がん）、ＮＳＣＬＣ（非小細胞肺がん）、メルケル細胞がん、ｃＳＣＣ、中皮腫、ＭＳＩ結腸直腸がん、卵巣がん、又は子宮頸がんである。いくつかの実施形態では、対象は、高レベルのＴｒｅｇ、高レベルのＣＴＬＡ－４、高レベルのＮＫ細胞、又は高レベルの活性化ＦｃＲを有する腫瘍を有する。
固形腫瘍は、通常は嚢胞又は液体領域を含まない組織の異常腫瘤である。固形腫瘍は、良性又は悪性であり得る。異なるタイプの固形腫瘍は、それらを形成する細胞のタイプ（肉腫、がん腫、及びリンパ腫など）に由来する。肉腫及びがん腫などの、固形腫瘍の例としては、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、及び他の肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸がん、リンパ系悪性腫瘍、膵臓がん、乳がん、肺がん、卵巣がん、前立腺がん、肝細胞がん、扁平上皮がん、基底細胞がん、腺がん、汗腺がん、甲状腺髄様がん、甲状腺乳頭がん、褐色細胞腫、皮脂腺がん、乳頭がん、乳頭腺がん、髄様がん、気管支原性がん、腎細胞がん、肝がん、胆管がん、絨毛がん、ウィルムス腫瘍、子宮頸がん、精巣腫瘍、セミノーマ、膀胱がん、黒色腫、及びＣＮＳ腫瘍（神経膠腫（脳幹神経膠腫及び混合神経膠腫）、膠芽腫（多形性膠芽腫としても知られる）、星細胞腫、ＣＮＳリンパ腫、胚細胞腫、髄芽腫、神経鞘腫頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、及び脳転移が挙げられる。いくつかの実施形態では、対象は、高レベルのＴｒｅｇ、高レベルのＣＴＬＡ－４、高レベルのＮＫ細胞、又は高レベルの活性化ＦｃＲを有する腫瘍を有する。
いくつかの実施形態では、対象は、結腸がん、乳がん、膵臓がん、卵巣がん、前立腺がん、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、扁平上皮がん、基底細胞がん、腺がん、汗腺がん、皮脂腺がん、乳頭がん、乳頭状腺がん、嚢胞腺がん、髄様がん、気管支原性がん、腎細胞がん、肝がん、胆管がん、絨毛がん、セミノーマ、胎児性がん、ウィルムス腫瘍、子宮頸がん、精巣腫瘍、肺がん、小細胞肺がん、膀胱がん、上皮がん、神経膠腫、星細胞腫、髄芽腫、メルケル細胞がん、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、急性リンパ球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性白血病、真性多血症、リンパ腫、多発性骨髄腫、ワルデンストレームマクログロブリン血症、重鎖疾患、及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるがんに罹患している。
いくつかの実施形態では、対象は、高レベルのＴｒｅｇ、高レベルのＣＴＬＡ－４、高レベルのＮＫ細胞、又は高レベルの活性化ＦｃＲを有する腫瘍を有する。
追加の実施形態では、がんは、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、及び他の肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸がん、リンパ系悪性腫瘍、膵臓がん、乳がん、肺がん、卵巣がん、前立腺がん、肝細胞がん、扁平上皮がん、基底細胞がん、腺がん、汗腺がん、甲状腺髄様がん、甲状腺乳頭がん、褐色細胞腫、皮脂腺がん、乳頭がん、乳頭腺がん、髄様がん、気管支原性がん、腎細胞がん、肝がん、胆管がん、絨毛がん、ウィルムス腫瘍、子宮頸がん、精巣腫瘍、セミノーマ、膀胱がん、黒色腫、及びＣＮＳ腫瘍（神経膠腫（脳幹神経膠腫及び混合神経膠腫）、膠芽腫（多形性膠芽腫としても知られる）、星細胞腫、ＣＮＳリンパ腫、胚細胞腫、髄芽腫、神経鞘腫頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、及び脳転移からなる群から選択される固形腫瘍である。
特定の実施形態では、がんは、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、及び他の肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸がん／結腸直腸がん、リンパ系悪性腫瘍、膵臓がん、乳がん、肺がん、卵巣がん、前立腺がん、肝細胞がん、扁平上皮がん、基底細胞がん、腺がん、汗腺がん、甲状腺髄様がん、甲状腺乳頭がん、褐色細胞腫、皮脂腺がん、乳頭がん、乳頭腺がん、髄様がん、気管支原性がん、腎細胞がん、肝がん、胆管がん、絨毛がん、ウィルムス腫瘍、子宮頸がん、精巣腫瘍、セミノーマ、膀胱がん、黒色腫、及びＣＮＳ腫瘍（神経膠腫（脳幹神経膠腫及び混合神経膠腫）、膠芽腫（多形性膠芽腫としても知られる）、星細胞腫、ＣＮＳリンパ腫、胚細胞腫、髄芽腫、神経鞘腫頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、及び脳転移からなる群から選択される固形腫瘍である。
別の態様では、本開示は、ＣＴＬＡ－４ＨＩ Ｔｒｅｇを、残りのＴｒｅｇの増殖が制限された対象において低減する方法であって、対象に有効用量の抗原結合タンパク質を投与することを含む、方法を提供する。
いくつかの実施形態では、対象は、ヒト対象であり、任意に、がんを有するヒト対象である。
いくつかの実施形態では、対象は、ヒト対象、任意に、黒色腫、ＲＣＣ（腎細胞がん）、ＮＳＣＬＣ（非小細胞肺がん）、メルケル細胞がん、ｃＳＣＣ、中皮腫、ＭＳＩ結腸直腸がん、卵巣がん、又は子宮頸がんを有するヒト対象である。
いくつかの実施形態では、方法は、１つ以上の追加の治療剤を対象に投与するステップを更に含む。
いくつかの実施形態では、対象は、高レベルのＴｒｅｇ、高レベルのＣＴＬＡ－４、高レベルのＮＫ細胞、又は高レベルの活性化ＦｃＲを有する腫瘍を有する。
いくつかの実施形態では、ＡＢＰは、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ１ ＴＩＧＩＴ、ＬＡＧ－３ ａ ＣＤ４７、ＢＲＡＦ、ＭＥＫ、ＰＩ３Ｋ、及び他の抗原から選択される抗原に結合する。いくつかの実施形態では、ＡＢＰは、ＣＴＬＡ－４又は他の抗原に特異的である。
いくつかの実施形態では、ＡＢＰは、抗ＣＴＬＡ－４抗体又はその抗原結合フラグメント、抗ＰＤ－Ｌ１抗体又はその抗原結合フラグメント、抗ＰＤ１抗体又はその抗原結合フラグメント、ＴＩＧＩＴ抗体又はその抗原結合フラグメント、ＬＡＧ－３抗体又はその抗原結合フラグメント、ＣＤ４７抗体又はその抗原結合フラグメント、ＢＲＡＦ抗体又はその抗原結合フラグメント、ＭＥＫ抗体又はその抗原結合フラグメント、及びＰＩ３Ｋ抗体又はその抗原結合フラグメントから選択される。
８．実施例
以下は、本開示を実施するための特定の実施形態の例である。例は、例示目的のみのために提供されており、決して本開示の範囲を限定することを意図するものではない。使用される数値（例えば、量、温度など）に関して正確性を確保するための努力がなされたが、もちろん、いくらかの実験誤差及び偏差は許容されるべきである。
本開示の実施は、特に指示されない限り、当該技術分野の範囲内のタンパク質化学、生化学、組換えＤＮＡ技法、及び薬理学の従来の方法を使用するであろう。そのような技法は、文献において完全に説明されている。例えば、Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９３）、Ａ．Ｌ．Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．，ｃｕｒｒｅｎｔ ａｄｄｉｔｉｏｎ）、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８９）、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｓ．Ｃｏｌｏｗｉｃｋ ａｎｄ Ｎ．Ｋａｐｌａｎ ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ：Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０）、Ｃａｒｅｙ ａｎｄ Ｓｕｎｄｂｅｒｇ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３ｒｄ Ｅｄ．（Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ）Ｖｏｌｓ Ａ ａｎｄ Ｂ（１９９２）を参照されたい。更に、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる、Ａｄｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａ ｎａｔｉｖｅｌｙ ｐａｉｒｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｌｉｂｒａｒｙ ｙｉｅｌｄｓ ｄｒｕｇ ｌｅａｄｓ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈｅｒ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｔｈａｎ ａ ｒａｎｄｏｍｌｙ ｐａｉｒｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｌｉｂｒａｒｙ，ＭＡｂｓ（２０１８））、Ａｄｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｒａｒｅ，ｈｉｇｈ－ａｆｆｉｎｉｔｙ ｍｏｕｓｅ ａｎｔｉ－ＣＴＬＡ－４ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｈａｔ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ ｂｌｏｃｋａｄｅ，ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｄ ｕｓｉｎｇ ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｇｅｎｏｍｉｃｓ，ＭＡｂｓ（２０１７）において説明される抗体を生成及び選択する方法を使用することができる。
８．１．実施例１：抗原結合タンパク質の生成
マウス免疫化及び試料調製：
まず、挿入されたヒト免疫グロブリン遺伝子を有するトランスジェニックマウスを、アジュバントとしてＴｉｔｅｒＭａｘを使用して、配列番号７００１の可溶性ＣＴＬＡ－４免疫原（すなわち、Ｈｉｓタグ付きＣＴＬＡ－４タンパク質（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ））で免疫化した。１μｇの免疫原を各飛節に注射し、３μｇの免疫原を、３日毎に１５日間、腹腔内投与した。力価は、１：２００希釈で開始して、各動物の血清の１：２希釈系列での酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって評価した。採取前に、アジュバントなしの２．５μｇ／飛節の最終静脈内ブーストを各動物に与えた。屠殺後、リンパ節（膝窩、鼠径部、腋窩、及び腸間膜）を外科的に除去した。各動物の単細胞懸濁液を、手動破壊、続いて７０μｍフィルター通過によって作製した。次に、ＥａｓｙＳｅｐ（商標）Ｍｏｕｓｅ Ｐａｎ－Ｂ Ｃｅｌｌ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）陰性選択キットを使用して、各試料からＢ細胞を単離した。リンパ節Ｂ細胞集団を、Ｃ－Ｃｈｉｐ血球計算盤（Ｉｎｃｙｔｏ）で計数することによって定量化し、トリパン ブルーを使用して生存率について評価した。次いで、細胞を、１２％ＯｐｔｉＰｒｅｐ（商標）密度勾配培地（Ｓｉｇｍａ）を含むリン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で５，０００～６，０００細胞／ｍＬに希釈した。この細胞混合物をマイクロ流体カプセル化に使用した。約１００万個のＢ細胞を、６匹の動物の各々から、エマルジョン液滴マイクロ流体力学プラットフォームを通して実行した。
対合した重及び軽鎖ライブラリーを生成する：
単細胞のＲＮＡからのｓｃＦｖをコードするＤＮＡライブラリーは、天然重－軽Ｉｇ対合がインタクトな状態で、エマルジョン液滴マイクロ流体力学プラットフォーム又はボルテックスエマルジョンを使用して生成した。ＤＮＡライブラリーを生成するための方法は、１）ポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡ捕捉、２）多重化オーバーラップ伸長逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＯＥ－ＲＴ－ＰＣＲ）、及び３）ディープシーケンシング又は酵母ディスプレイライブラリーのためにアーチファクトを除去し、アダプターを付加するネステッドＰＣＲに分けられた。ｓｃＦｖライブラリーは、陽性ＥＬＩＳＡ力価を達成した各動物からの約１００万個のＢ細胞から生成した。
ポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡ捕捉について、ガラスから製造された特注設計のコフローエマルジョン液滴マイクロ流体チップ（Ｄｏｌｏｍｉｔｅ）を使用した。マイクロ流体チップは、フルオロカーボン油用の２つの入力チャネル（Ｄｏｌｏｍｉｔｅ）、上に記載される細胞懸濁液ミックス用の１つの入力チャネル、及び細胞溶解緩衝液（２０ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ７．５、０．５ＭのＮａＣｌ、１ｍＭのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、０．５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－２０、及び２０ｍＭのジチオスレイトール）中の１．２５ｍｇ／ｍｌのオリゴ－ｄＴビーズ（ＮＥＢ）用の１つの入力チャネルを有する。入力チャネルは、チップの長さの大部分で５０μｍｘ１５０μｍにエッチングされ、液滴接合部で５５μｍまで狭く、疎水性のＰｉｃｏ－Ｇｌｉｄｅ（Ｄｏｌｏｍｉｔｅ）でコーティングされた。３つのＭｉｔｏｓ Ｐ－Ｐｕｍｐ圧力ポンプ（Ｄｏｌｏｍｉｔｅ）を使用して、液体をチップに送り込んだ。液滴サイズは、圧力に依存するが、典型的には、約４５ｍｍ直径の液滴は、最適に安定である。エマルジョンを、冷却した２ｍｌ微量遠心管に収集し、ｍＲＮＡ捕捉のために４０℃で１５分間インキュベートした。Ｐｉｃｏ－Ｂｒｅａｋ（Ｄｏｌｏｍｉｔｅ）を使用して液滴からビーズを抽出した。いくつかの実施形態では、ボルテックスを使用して同様の単細胞分配エマルジョンを作製した。
多重ＯＥ－ＲＴ－ＰＣＲについて、ガラスＴｅｌｏｓ液滴エマルジョンマイクロ流体チップを使用した（Ｄｏｌｏｍｉｔｅ）。ｍＲＮＡ結合ビーズをＯＥ－ＲＴ－ＰＣＲミックスに再懸濁し、２７μｍ液滴を生成する圧力で鉱物油ベースの界面活性剤ミックス（ＧｉｇａＧｅｎから市販されている）でマイクロ流体チップに注射した。ＯＥ－ＲＴ－ＰＣＲミックスは、２ｘワンステップＲＴ－ＰＣＲ緩衝液、２．０ｍＭのＭｇＳＯ４、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ逆転写酵素、及びＰｌａｔｉｎｕｍ Ｔａｑ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、並びにＩｇＫ Ｃ領域、ＩｇＧ Ｃ領域、及び全てのＶ領域に対するプライマーの混合物を含有する（図２）。オーバーラップ領域は、Ｇｌｙ－ＳｅｒリッチｓｃＦｖリンカー配列をコードするＤＮＡ配列であった。液滴破壊溶液（ＧｉｇａＧｅｎから市販されている）を使用して液滴からＤＮＡフラグメントを回収し、次いでＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製した。いくつかの実施形態では、ボルテックスを使用して同様のＯＥ－ＲＴ－ＰＣＲエマルジョンを作製した。
ネステッドＰＣＲ（図２）について、精製されたＯＥ－ＲＴ－ＰＣＲ産物をまず１．７％アガロースゲルで８０分間１５０Ｖで実行した。結合型産物に対応する１２００～１５００塩基対（ｂｐ）のバンドを、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｇｅｌ及びＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－ｕｐ Ｋｉｔ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ Ｎａｇｅｌ）を使用して切除し、精製した。次いでＰＣＲを実施して、Ｉｌｌｕｍｉｎａシーケンシング又は酵母ディスプレイ用のアダプターを付加し、シーケンシングについて、７ヌクレオチドのランダマーを付加して、後続の次世代シーケンシングステップにおけるベースコーリング精度を増加させる。ネステッドＰＣＲは、２ｘ ＮＥＢＮｅｘｔ Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ増幅ミックス（ＮＥＢ）で、Ｉｌｌｕｍｉｎａアダプター含有プライマー又は酵母発現ベクターにクローニングするためのプライマーのいずれかを使用して実施した。ネステッドＰＣＲ産物を、１．２％アガロースゲルで５０分間１５０Ｖで実行した。ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｇｅｌ及びＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－ｕｐ Ｋｉｔ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ Ｎａｇｅｌ）を使用して、８００～１１００ｂｐのバンドを切除し、精製した。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖライブラリーは、天然に対合されず、例えば、Ｂ細胞から単離されたＲＮＡから直接ｓｃＦｖを増幅することによって無作為に対合された。
８．２．実施例２：酵母ディスプレイによるＣＴＬＡ－４結合剤の単離
ライブラリースクリーニング：
ＥＺ－Ｌｉｎｋ Ｍｉｃｒｏ Ｓｕｌｆｏ－ＮＨＳ－ＬＣ－Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｉｏｎキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、ヒトＩｇＧ１－Ｆｃ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）及びＣＴＬＡ－４（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）タンパク質をビオチン化した。ビオチン化試薬を９ｍＭに再懸濁し、５０倍モル過剰でタンパク質に添加した。反応物を氷上で２時間インキュベートし、次いでビオチン化試薬をＺｅｂａ脱塩カラム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して除去した。最終タンパク質濃度は、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイで計算した。
次に、６つのＤＮＡライブラリーを酵母において表面ｓｃＦｖとして発現させた。ＧＡＬ１／１０プロモーター、Ａｇａ２細胞壁テザー、及びＣ末端ｃ－Ｍｙｃタグを含む酵母表面ディスプレイベクター（ｐＹＤ）を構築した。ＧＡＬ１／１０プロモーターは、ガラクトースを含む培地においてｓｃＦｖタンパク質の発現を誘発する。Ａｇａ２細胞壁テザーは、ｓｃＦｖを酵母細胞表面にシャトルし、ｓｃＦｖを細胞外空間にテザーするために必要であった。インフレームｓｃＦｖタンパク質を発現する酵母細胞を染色するために流動選別中にｃ－Ｍｙｃタグを使用した。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞（ＡＴＣＣ）は、インビトロでの相同組換えのために、ゲル精製されたネステッドＰＣＲ産物及び線形化されたｐＹＤベクターを用いてエレクトロポレートした（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ ＩＩ、０．５４ｋＶ、２５ｕＦ、無限大に設定された抵抗）。形質転換された細胞を増殖させ、ガラクトースで誘発して、酵母ｓｃＦｖディスプレイライブラリーを生成した。
増殖されたｓｃＦｖライブラリーからの２００万個の酵母細胞を、抗ｃ－Ｍｙｃ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａ２１２８１）及びＡＦ４８８コンジュゲート型二次抗体（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａ１１０３９）で染色した。ＣＴＬＡ－４に結合するｓｃＦｖ発現細胞を選択するために、ビオチン化ＣＴＬＡ－４抗原を、一次抗体インキュベーション中に酵母培養物（最終７ｎＭ）に添加し、次いでＰＥ－ストレプトアビジン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で染色した。酵母細胞を、二重陽性細胞（ＡＦ４８８Ｃ／ＰＥＣ）についてＢＤ Ｉｎｆｌｕｘ（Ｓｔａｎｆｏｒｄ Ｓｈａｒｅｄ ＦＡＣＳ Ｆａｃｉｌｉｔｙ）で流動選別し、回収されたクローンを、増殖のためにカナマイシン、ストレプトマイシン、及びペニシリン（Ｔｅｋｎｏｖａ）を含むＳＤ－ＣＡＡプレート上に播種した。次いで、増殖された第１ラウンドＦＡＣＳクローンを、同じモル濃度（最終７ｎＭ）で同じ抗原を用いてＦＡＣＳの第２ラウンドに供した。プラスミドミニプレップ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）は、最終ＦＡＣＳ選別から回収された酵母から調製した。テールエンドＰＣＲを使用して、Ｉｌｌｕｍｉｎａアダプターをディープシーケンシングのためにプラスミドライブラリーに付加した。
典型的なＦＡＣＳドットプロットでは、右上象限は、（Ｃ末端ｃ－Ｍｙｃタグによって特定された）抗原結合及びｓｃＦｖ発現の両方について染色する酵母を含む。左下象限は、抗原又はｓｃＦｖ発現のいずれについても染色しない酵母を含む。右下象限は、ｓｃＦｖを発現するが抗原に結合しない酵母を含む。各レパートリーにおける結合剤の頻度は、抗原及びｓｃＦｖ発現について二重染色する酵母の計数を、ｓｃＦｖを発現する酵母の計数によって割ることによって推定した。免疫化されたマウスから生成されたライブラリーは、最終抗原濃度７ｎＭで選別された場合、低いパーセンテージ（０．０８％～１．２８％の範囲）のｓｃＦｖ結合剤をもたらした。血清力価とレパートリーにおける結合剤の頻度との間に明確な関連はなかった。これらの選別された細胞の増殖後、スクリーンの特異性を増加させるために、７ｎＭの最終抗原濃度での第２ラウンドのＦＡＣＳを使用した。第２のＦＡＣＳにおける結合剤の頻度は、第１のＦＡＣＳよりも常にかなり高く、８．３９％～８４．４％の範囲であった。一般に、第１の選別における結合剤のより低い頻度は、第２の選別における結合剤のより低い頻度をもたらした。おそらく、これは、元のレパートリーにおいてより少ない本物の結合剤を有する試料についてのより低いゲーティング特異性のためである。
ディープレパートリーシーケンシング：
ＣＴＬＡ－４結合クローンを、ライブラリー（「ＣＴＬＡ－４結合クローンのライブラリー」）として回収し、ディープレパートリーシーケンシングに供した。ディープレパートリーシーケンシングは、重鎖及び軽鎖配列の両方の全ての対合された可変（Ｖ（Ｄ）Ｊ）領域の配列を決定する。ＣＴＬＡ－４結合クローンのライブラリーは、２０１８年１１月２０日のブダペスト条約に基づき、ＡＴＣＣアカウント番号１９７３６１（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ ２０１１０ ＵＳＡ）下、ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ－１２５５１２下で寄託された。ライブラリーにおける各クローンは、単一細胞に由来する重鎖及び軽鎖配列の両方の対合された可変（Ｖ（Ｄ）Ｊ）領域を含むｓｃＦｖを含有する。ディープレパートリーシーケンシングは、重鎖及び軽鎖配列の両方の全ての対合された可変（Ｖ（Ｄ）Ｊ）領域の配列を決定する。酵母ｓｃＦｖライブラリーを配列決定することから得られる重鎖及び軽鎖配列のいくつかは、配列番号１～２８及び配列番号１０１～１２８で提供される。酵母ｓｃＦｖライブラリーを配列決定することから得られる追加の配列は、配列番号８０００～８９９１で提供される。具体的には、それらの可変軽鎖（ＶＬ）配列は、配列番号８０００～８４９５を含む。それらの重鎖（ＶＨ）配列は、配列番号８４９６～８９９１を含む。
ディープ抗体シーケンシングライブラリーは、定量的ＰＣＲ Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＫＡＰＡ）を使用して定量化し、１７．５ｐＭに希釈した。ライブラリーは、ＭｉＳｅｑ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）で５００サイクルのＭｉＳｅｑ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ ｖ２を使用して、製造業者の指示に従って配列決定した。維持された重鎖及び軽鎖結合を有する高品質配列リードを得るために、シーケンシングは２回の別々のランで行った。第１のラン（「リンクしたラン」）では、ｓｃＦｖライブラリーを直接配列決定して、軽鎖Ｖ遺伝子及びＣＤＲ３についての３４０サイクルの順方向リード、並びに重鎖ＣＤＲ３及び重鎖Ｖ遺伝子の一部をカバーする１６２サイクルの逆方向リードを得た。第２のラン（「リンクしていないラン」）では、ｓｃＦｖライブラリーをまずＰＣＲのテンプレートとして使用して、重鎖及び軽鎖Ｖ遺伝子を別々に増幅した。次いで、重鎖及び軽鎖Ｉｇについての３４０サイクルの順方向リード及び１６２サイクルの逆方向リードを別々に得た。これは、ＣＤＲ３及びＶ遺伝子の一部で重複する順方向及び逆方向リードを産生し、ヌクレオチドコールにおける信頼性を増加させる。
ベースコールエラーを除去するために、リードの予想されたエラー数（Ｅ）をそのＰｈｒｅｄスコアから計算した。デフォルトによって、Ｅ＞１を有するリードを破棄し、ベースコールエラーの最確数がゼロであるリードを残した。追加の品質フィルターとして、２回以上見られた配列は正しい可能性が高いため、シングルトンヌクレオチドリードを破棄した。最後に、フィルタリングされた配列をマージすることによる高品質のリンクした抗体配列を、リンクしたラン及びリンクしていないランから生成した。簡潔には、リンクしていないランからの順方向及び逆方向リードをまずマージした一連のスクリプトをＰｙｔｈｏｎで書いた。ミスマッチを含んだ順方向及び逆方向配列のいずれの対も破棄した。次に、リンクしたランからのヌクレオチド配列を使用して、リンクしていないランにおけるマージされた配列を照会した。スクリプトからの最終出力は、天然重鎖及び軽鎖Ｉｇ対合を含む、一連の完全長、高品質可変（Ｖ（Ｄ）Ｊ）配列である。
リーディングフレーム及びＦＲ／ＣＤＲ接合部を特定するために、厳選された免疫グロブリン配列のデータベースをまず処理して、各ＦＲ／ＣＤＲ接合部の位置特異的配列マトリックス（ＰＳＳＭ）を生成した。これらのＰＳＳＭを使用して、上に記載されるプロセスを使用して生成されたマージされたヌクレオチド配列の各々についてのＦＲ／ＣＤＲ接合部を特定した。これは、ヌクレオチド配列の各々についてのタンパク質リーディングフレームを特定した。ＰＳＳＭに対して低い特定スコアを有するＣＤＲ配列は、感嘆符によって示される。次いで、Ｐｙｔｈｏｎスクリプトを使用して配列を翻訳した。リードは、有効な予測されたＣＤＲ３配列を有する必要があったため、例えば、Ｖ及びＪセグメント間のフレームシフトを有するリードを破棄した。次に、ｓｃＦｖヌクレオチド配列をクエリとして、並びにＩＭＧＴデータベースからのＶ及びＪ遺伝子配列を参照配列として使用して、ＵＢＬＡＳＴを実行した。最も低いＥ値を有するＵＢＬＡＳＴアラインメントを使用して、Ｖ及びＪ遺伝子ファミリーを割り当て、生殖細胞系列に対するＩＤ％を計算した。
各動物は、第２のＦＡＣＳ選択後に０．１％以上の頻度で存在する３８～５０個の固有のｓｃＦｖ配列をもたらし、合計２８個の固有のｓｃＦｖ候補結合剤（軽鎖では配列番号１～２８、重鎖では配列番号１０１～１２８）を含んだ。配列番号［ｎ］の配列を有する軽鎖及び配列番号［１００＋ｎ］の配列を有する重鎖は、単一細胞由来の同族対であり、単一ｓｃＦｖを形成する。例えば、配列番号１の軽鎖及び配列番号１０１の重鎖は、同族対であり、配列番号２８の軽鎖及び配列番号１２８の重鎖は、同族対である、などである。
この方法では、２ラウンドのＦＡＣＳは、ＣＴＬＡ－４結合ｓｃＦｖの濃縮をもたらした。加えて、多くのｓｃＦｖは、免疫化マウスからのＢ細胞の初期集団からのシーケンシングデータでは検出されず、選別前マウスレパートリーに存在するｓｃＦｖのほとんどは、ＦＡＣＳ後に除去された。したがって、この研究は、免疫化マウスのレパートリーに存在する抗体のほとんどが免疫原への強力な結合剤ではなく、この方法が免疫化マウスからのＢ細胞の初期集団から希少なｎＭ親和性結合剤について濃縮することができることを示す。
８．３．実施例３：抗原結合タンパク質の生物学的特徴
次いで、選別前ライブラリーでは低頻度で存在し、選別後ライブラリーでは高頻度になったｓｃＦｖ配列を、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞において完全長ｍＡｂとして合成した。これらのｍＡｂは、各動物についてＦＡＣＳの第２ラウンドで２～３つの最も豊富な配列を含む。
ＣＴＬＡ－４標的結合プロファイル
ＣＴＬＡ－４に対する各完全長抗体の結合特異性及び親和性は、バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）及び／又は表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を使用して決定した。抗ｃｙｎｏ ＣＴＬＡ－４及び抗マウスＣＴＬＡ－４親和性は、ＦｏｒｔｅＢｉｏ（ＢＬＩ）を使用して試験した。抗ヒトＣＴＬＡ－４親和性は、Ｃａｒｔｅｒｒａ（ＳＰＲ）を使用して測定した。
ＢＬＩについて、抗体を、Ｏｃｔｅｔ Ｒｅｄ９６システム（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を使用して抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ（ＡＨＣ）バイオセンサーに装填した。装填されたバイオセンサーを、３００ｎＭで開始する抗原希釈液に浸漬し、１：３で６段階希釈した。動力学分析は、１：１結合モデル及びグローバルフィッティングを使用して行った。
ＳＰＲについて、適度な密度（≫１，０００応答単位）の抗ヒトＩｇＧ－Ｆｃ試薬（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ ２０４７－０１）を、１００ｍＭのＭＥＳ ｐＨ５．５中の１３３ｍＭのＥＤＣ（Ｓｉｇｍａ）及び３３．３ｍＭのＳ－ＮＨＳ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）で活性化されたＸａｎｔｅｃ ＣＭＤ－５０Ｍチップ（官能基の５０ｎｍカルボキシメチルデキストラン媒体密度）にアミンカップリングさせた。次いで、ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ ２０４７－０１）を、１０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ４．５（Ｃａｒｔｅｒｒａ Ｉｎｃ．）中２５ｍｇ／ｍＬで１０分間カップリングさせた。次いで、表面を１ＭエタノールアミンｐＨ８．５（Ｃａｒｔｅｒｒａ Ｉｎｃ．）で不活性化した。ローン固定化に使用されるランニング緩衝液は、ＨＢＳ－ＥＰＣ（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０、ｐＨ７．４、Ｔｅｋｎｏｖａ）であった。
次いで、センサーチップをアレイ捕捉のために連続フローマイクロスポッター（ＣＦＭ、Ｃａｒｔｅｒｒａ Ｉｎｃ．）に移した。ｍＡｂ上清を、１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡを含むＨＢＳ－ＥＰＣに５０倍（最終濃度３～１０ｍｇ／ｍＬ）に希釈した。試料は、６５ｍＬ／分の流量を使用して、複数の密度を作製するために、それぞれ、第１及び第２のプリントでの１５分及び４分の捕捉ステップで各々２回捕捉した。ＣＦＭのランニング緩衝液はまた、ＨＢＳ－ＥＰＣであった。
次に、動力学分析のために、センサーチップをＳＰＲリーダー（ＭＸ－９６システム、Ｉｂｉｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に装填した。ＣＴＬＡ－４は、４倍希釈系列において５つの増加する濃度で、ランニング緩衝液（１．０ｍｇ／ｍＬのＢＳＡを含むＨＢＳ－ＥＰＣ）中の１．９５、７．８、３１．２５、１２５、及び５００ｎＭの濃度で注射した。ＣＴＬＡ－４注射は、５分であり、非再生動力学系列における８ｍＬ／秒での１５分の解離を伴った。７５ｍｇ／ｍＬでのヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ捕捉抗体の注射は、各ｍＡｂの捕捉レベルを検証するために系列の最後に注射した。結合データは、スポット間表面及びブランク注射を差し引くことによって二重参照し、Ｋｉｎｅｔｉｃ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ Ｔｏｏｌソフトウェア（Ｃａｒｔｅｒｒａ Ｉｎｃ．）を使用してｋａ（オンレート）、ｋｄ（オフレート）、及びＫＤ（親和性）について分析した。
細胞表面結合研究のために、安定したＣＴＬＡ－４発現Ｆｌｐ－Ｉｎ ＣＨＯ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）細胞を生成し、５０：５０比で混合した。１００万個の細胞を、２００μｌのＭＡＣＳ緩衝液（０．５％ウシ血清アルブミン及び２ｍＭ ＥＤＴＡを含むＤＰＢＳ）中の１μｇの開示された抗ＣＴＬＡ－４組換え抗体で、３０分間４℃で染色した。次いで、細胞を、抗ヒト無関係標的ＡＰＣ及び抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ－ＰＥ［Ｍ１３１０Ｇ０５］（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ ４１０７０）抗体で、４℃で３０分間共染色した。抗ヒトＣＴＬＡ－４－ＦＩＴＣ抗体をこれらの混合実験の対照として使用し、細胞生存率をＤＡＰＩで評価した。Ｓｔａｎｆｏｒｄ Ｓｈａｒｅｄ ＦＡＣＳ ＦａｃｉｌｉｔｙでＢＤ Ｉｎｆｌｕｘに対してフローサイトメトリー分析を実施し、ＦｌｏｗＪｏを使用してデータを分析した。
ＣＴＬＡ－４に特異的に結合する抗体を同定した。各抗体のＣＴＬＡ－４に対する親和性（ＫＤ）を表６に提供する。Ｐｒｏｍｅｇａアッセイ阻害％は、抗体Ａ５である、最も強い阻害剤と比較して計算した。ヒトＣＴＬＡ－４に対する各抗体の親和性、オン率、オフ率、及びＫＤを表７に示す。
ＣＴＬＡ－４リガンドブロッキングアッセイ：
ＣＴＬＡ－４／リガンド相互作用をブロックする抗体の能力の分析のために、ＣＴＬＡ－４ Ｂｌｏｃｋａｄｅ Ｂｉｏａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を製造業者の指示に従って使用した。アッセイの前日に、ＣＴＬＡ－４リガンドＣＤ８０及びＣＤ８６を発現するａＡＰＣ／Ｒａｊｉ細胞を、９０％Ｈａｍ’ｓ Ｆ－１２／１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）中に解凍し、２つの９６ウェルプレートの内側６０ウェル中に播種した。細胞を３７℃、５％ＣＯ２で一晩インキュベートした。アッセイの日に、抗体を９９％ＲＰＭＩ／１％ＦＢＳで希釈した。抗体希釈物を、ＣＴＬＡ－４リガンド発現ａＡＰＣ／Ｒａｊｉ細胞を含むウェルに添加し、続いて（９９％ＲＰＭＩ／１％ＦＢＳに解凍された）ＣＴＬＡ－４エフェクター細胞を添加した。細胞／抗体混合物を３７℃、５％ＣＯ２で６時間インキュベートし、その後、Ｂｉｏ－Ｇｌｏ試薬を添加し、Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ ｉ３ｘプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して発光を読み取った。誘発倍率を、［抗体を含むシグナル］／［抗体を含まないシグナル］の比を計算することによってプロットし、プロットを使用して、ＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用してＥＣ５０を計算した。インハウス産生されたイピリムマブを陽性対照として使用し、無関係な抗原に結合する抗体を陰性対照として使用した。
ＣＴＬＡ－４のそのリガンドへの結合は、Ｔ細胞シグナル伝達の阻害をもたらす。したがって、ＣＴＬＡ－４に結合し、ＣＴＬＡ－４／リガンド相互作用をアンタゴナイズする抗体は、この阻害を除去することができ、Ｔ細胞が活性化されることを可能にする。ＣＴＬＡ－４／リガンドチェックポイント遮断は、インビトロ細胞内活性化Ｔ細胞核因子（ＮＦＡＴ）ルシフェラーゼレポーターアッセイによって試験した。このアッセイでは、抗ＣＴＬＡ－４エピトープがリガンド結合ドメイン内にある抗体は、ＣＴＬＡ－４／リガンド相互作用をアンタゴナイズし、ＮＦＡＴ－ルシフェラーゼレポーターの増加をもたらす。ＣＨＯ細胞において発現したＣＴＬＡ－４に結合することができる完全長ｍＡｂ候補をアッセイした。各ｍＡｂのＥＣ５０値を生成するために、いくつかの濃度にわたって測定を行った。いくつかの完全長ｍＡｂは、表６に要約されるように用量依存的にチェックポイント遮断において機能的であることがわかった。
プレート結合ＣＴＬＡ４へのＣＤ８０又はＣＤ８６の結合を防止するＣＴＬＡ４抗体（表８に示される）の能力を、ＥＬＩＳＡを使用して評価した。各相互作用のＥＣ５０及び阻害パーセントを表８に示す。プレートを、ｒｈＣＴＬＡ４－Ｆｃでコーティングし、次いで５％ｗ／ｖ脱脂粉乳を含む１×ＰＢＳＴでブロックした。ブロッキング後、示された抗体の希釈系列をプレートに加えた。次いで、ＣＤ８０又はＣＤ８６が依然としてプレート結合ＣＴＬＡ４に結合することができた量を決定するために、プレートを洗浄した後、それぞれ、ｒｈＣＤ８０－Ｈｉｓ又はｒｈＣＤ８６－Ｈｉｓをプレートに加えた。結合していないＣＤ８０－Ｈｉｓ／ＣＤ８６－Ｈｉｓを洗い流し、マウス抗Ｈｉｓ－ＨＲＰを加えた。ＴＭＢを使用して、各抗体の存在下でプレート結合ＣＴＬＡ４に結合したＣＤ８０－Ｈｉｓ／ＣＤ８６－Ｈｉｓの量を決定した。
本開示のいくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ－４抗体は、抗体依存的細胞媒介細胞傷害性（ＡＤＣＣ）によって薬理学的に機能する。本開示のいくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ－４抗体療法に関連する免疫関連毒性は、ＡＤＣＣでは機能するが、チェックポイント遮断では機能しない抗体で抑止される。
エピトープビニング：
エピトープビニングは、修飾された古典的なサンドイッチアプローチでハイスループットアレイＳＰＲを使用して実施した。ＣＭＤ－２００Ｍチップタイプ（２００ｎｍカルボキシメチルデキストラン、Ｘａｎｔｅｃ）を使用し、ｍＡｂを５０ｍｇ／ｍＬでカップリングして、より高い結合能（約３，０００反応性単位固定化）を有する表面を作製したことを除いて、Ｃａｒｔｅｒｒａ ＣＦＭ及びＳＰＲ親和性研究と同様の方法を使用して、センサーチップを機能化した。上清中のｍＡｂの濃度に応じて、ｍＡｂ上清をランニング緩衝液中で１：１又は１：１０で希釈した。
センサーチップをＭＸ－９６装置に配置し、捕捉されたｍＡｂ（「リガンド」）を、水中０．８７ｍＭで１０分間注射された、二価アミン反応性リンカービス（スルホスクシンイミジル）スベレート（ＢＳ３、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して表面に架橋した。過剰な活性化されたＢＳ３を１ＭエタノールアミンｐＨ８．５で中和した。各ビニングサイクルについて、２５０ｍｇ／ｍＬのヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ ００９－０００－００３）の７分の注射を使用して、参照表面及び標的スポットの任意の残存容量をブロックした。
次に、２５０ｎＭのＣＴＬＡ－４タンパク質をセンサーチップ上に注射し、続いて希釈されたｍＡｂ上清（「分析物」）又は緩衝液ブランクを陰性対照として注射した。よって、分析物ｍＡｂは、リガンドｍＡｂと競合しない場合のみ、抗原に結合した。各サイクルの終わりに、１分の再生注射を、４部のＰｉｅｒｃｅ ＩｇＧ Ｅｌｕｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ＃２１００４）、１部の５Ｍ ＮａＣｌ（最終０．８３Ｍ）、及び１．２５部の０．８５％Ｈ３ＰＯ４（最終０．１７％）の溶液を使用して行った。
次いで、ネットワークコミュニティープロットアルゴリズムをＳＰＲエピトープデータ分析ソフトウェアパッケージ（Ｃａｒｔｅｒｒａ Ｉｎｃ．）で使用して、エピトープビンを決定した。クラスタリングアルゴリズムは、リガンド及び分析物両方のデータが入手可能なｍＡｂとは別に、分析物データのみが入手可能なｍＡｂを群化することに留意されたい。この現象は、不完全な競合マトリックスのアーチファクトである。リガンド及び分析物の両方のデータを有するｍＡｂは、より多くのｍＡｂ－ｍＡｂ測定値を有し、より多くのｍＡｂ－ｍＡｂ接続をもたらし、これは、コミュニティープロットにおいてより密接な関係につながった。
エピトープビニングは、全てのｍＡｂがイピリムマブとは異なるビンにあることを示した（図３）。
８．４．実施例４：腫瘍成長に対するＣＴＬＡ－４ ＡＢＰの影響
ヒトＣＴＬＡ－４を発現するトランスジェニックマウス（ｈＣＴＬＡ－４ ＫＩマウス）の右側腹部にＭＣ３８腫瘍細胞を皮下移植した。ｈＣＴＬＡ－４ ＫＩマウスを、移植後８、１１、及び１４日目に、１ｍｇ／ｋｇの示されたＣＴＬＡ－４抗体で処理した。具体的には、マウスを対照抗体（ｎ＝８）、イピルムマブ（ｎ＝８）、ＣＴＬＡ４．Ａ２抗体（ｎ＝８）、ＣＴＬＡ４．Ａ１４抗体（ｎ＝９）、ＣＴＬＡ４．Ａ１４．２ａ抗体（ｎ＝８）、ＣＴＬＡ４．Ａ７抗体（ｎ＝９）、ＣＴＬＡ４．Ａ７抗体（ｎ＝９）、及びＣＴＬＡ４．Ａ１２抗体（ｎ＝８）で処理した。ＣＴＬＡ－４．Ａ１４．２ａ抗体は、マウスＩｇＧ２ａバックグラウンドにクローニングされたＡ１４抗体であり、これは抗体依存的細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性を増強する。腫瘍体積を測定し、腫瘍成長阻害を、以下の式を使用して計算した：
平均阻害％＝（平均（Ｃ）－平均（Ｔ））／平均（Ｃ）＊１００％
Ｔ－現在の群の値
Ｃ－対照群の値
腫瘍は、腫瘍発生のために０．１ｍｌのＰＢＳ中のＭＣ３８腫瘍細胞（１×１０６）で右側腹領域に皮下移植した。指数増殖期の細胞を採取し、腫瘍移植前にセルカウンターによって定量した。腫瘍体積は、週２回キャリパーを使用して二次元で測定し、体積は、式：「Ｖ＝（ＬｘＷｘＷ）／２を使用してｍｍ３で表され、式中、Ｖは腫瘍体積であり、Ｌは腫瘍長さ（最長の腫瘍寸法）であり、Ｗは腫瘍幅（Ｌに垂直な最長の腫瘍寸法）である。投与並びに腫瘍及び体重測定は、Ｌａｍｉｎａｒ Ｆｌｏｗ Ｃａｂｉｎｅｔで行った。体重及び腫瘍体積は、ＳｔｕｄｙＤｉｒｅｃｔｏｒ（商標）ソフトウェア（バージョン３．１．３９９．１９）を使用して測定した。動物に、０．１ｍｇ／ｍｌの示されたタンパク質を含む滅菌生理食塩水中の示されたタンパク質をｉ．ｐ．（腹腔内）投与した。各マウスは、１ｍｇ／ｋｇの投与をもたらす、体重１グラム当たり１０マイクロリットルの示された溶液を受けた。無作為化後０、３、及び６日目に動物に投与した。
表９は、腫瘍が処理に対して完全奏効（ＣＲ）を有したマウスのパーセンテージを示す。処理開始後０ｍｍ３の少なくとも２回の連続した腫瘍測定値は、ＣＲとみなされる。
表１０は、ＣＲを有したが次いでその後５６日目までに再発した腫瘍を有するマウスのパーセンテージを示す。以前にＣＲを示したＣＴＬＡ４．Ａ１４．２ａで処理された群は、５６日目までに０％の再発を有し、ＡＤＣＣを増強することが抗腫瘍免疫を延長することができることを示した。
表１１は、ＭＣ３８腫瘍細胞が移植されたｈＣＴＬＡ－４ ＫＩマウスが１ｍｇ／ｋｇの対照又は１ｍｇ／ｋｇの示されたＣＴＬＡ－４抗体で処置した場合の経時的な腫瘍体積の平均阻害を示す。
８．５．実施例５：全身抗腫瘍免疫に対するＣＴＬＡ４ ＡＢＰの影響
ＭＣ３８腫瘍を担持するｈＣＴＬＡ４ ＫＩマウスは、上記で説明されるように、腫瘍細胞移植後８、１１、及び１４日目に示された抗ＣＴＬＡ４で処理した。腫瘍がＣＲを示したマウスを、反対の側腹部でのＭＣ３８細胞の移植で再チャレンジした。表１２は、研究の最終日（元の腫瘍細胞移植の７３日後及び再チャレンジ移植の３０日後）における元の又は再チャレンジ腫瘍の個々のマウス腫瘍体積（ｍｍ３）を示す。元の腫瘍がＣＲのままであったマウスにおいて、再チャレンジ腫瘍の成長はなかった。再チャレンジ腫瘍で見られた成長の３例は、元の腫瘍が再成長し始めたマウスであった（表１２を参照されたい）。結果はまた、ＣＴＬＡ４．Ａ２が、原発性腫瘍（元の腫瘍）が再発する場合でさえ、防御全身抗腫瘍免疫を誘発し得ることを示した（表１３を参照されたい）。
８．６．実施例６：ＣＬＴＡ－４ ＡＢＰの増加した用量の影響
抗ＣＴＬＡ－４で処理されたＭＣ３８腫瘍
ヒトＣＴＬＡ－４を発現するトランスジェニックマウス（ｈＣＴＬＡ－４ ＫＩマウス）の右側腹部にＭＣ３８腫瘍細胞を移植した。平均腫瘍サイズが９８．５ｍｍ２に達した場合に無作為化を開始した。ｈＣＴＬＡ－４ ＫＩマウスは、無作為化後０日目に開始して、隔週で５用量にわたって、５ｍｇ／ｋｇの示された抗ＣＴＬＡ４で処理した。投与された抗体を表１４に示す。ＣＴＬＡ４．Ａ１４．２ａは、ＡＤＣＣ活性を増強する、マウスＩｇＧ２ａバックボーンにクローニングされた抗体Ａ１４である。２９７接尾辞は、ｈＩｇＧ１ ＦｃがＮ２９７アミノ酸で変異して、グリコシル化、よってＡＤＣＣを含むＦｃエフェクター機能を排除したことを示す。
Ａ）腫瘍成長阻害
研究の経過にわたって、腫瘍成長阻害は、以下の式を使用して決定した：
平均阻害％＝（平均（Ｃ）－平均（Ｔ））／平均（Ｃ）＊１００％
Ｔ－現在の群の値
Ｃ－対照群の値
結果は、Ｆｃ活性を欠如する抗体が、全体的に低減した有効性を有したことを示した。これらの抗体は、依然としていくつかの動物において腫瘍退縮を誘発することができ、抗ＣＴＬＡ４がＦｃ依存的及びＦｃ非依存的の両方の作用メカニズムによって機能することを示し、ＡＤＣＣ及びＡＤＣＰを含む、Ｆｃ活性を欠如する抗ＣＴＬＡ４が抗腫瘍応答を誘発することができることを示す（表１４及び１５）。
Ｂ）組織病理学的分析：
ｈＣＴＬＡ－４マウスを安楽死させ、それらの右腎臓を組織病理学的分析のために採取した。組織をホルマリン固定及びパラフィン包埋し、５μｍ切片に切断し、それを標準的なヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色、並びに抗ＩｇＧ及び抗Ｃ３免疫組織化学（ＩＨＣ）染色のためにスライドガラス上に配置した。染色されたスライドは、デジタル画像として調製した。実験動物及び毒性病理学において経験を有する委員会認定の獣医病理学者が、Ｈ＆Ｅ画像を任意の所見について評価し、抗ＩｇＧ及びＣ３スライドを、陽性染色の位置、強度、及びパーセントについて評価した。Ｈ＆Ｅ画像における所見は、０～５のスケール（０＝正常範囲内、１＝最小限の所見又は識別可能な最小の変化、２＝軽度の所見、３＝中程度、４＝顕著、５＝重度又は可能な限り最大の程度）でスコア付けした。ＩＨＣ画像における所見は、強度について１～４のスケール（０＝陰性、１＝最小限又はわずかに陽性、４＝非常に暗い）で、及び糸球体中の陽性細胞のパーセントとして（少なくとも５つの糸球体を確認した後）スコア付けした。
Ｈ＆Ｅ、免疫グロブリン、又はＣ３染色画像は、盲検化された病理学者によってスコア付けされ、結果は、図４Ａ～４Ｃに示されている。主なＨ＆Ｅ所見は、腎間質における白血球が通常は糸球体に関与していないということであった。糸球体スコアリングにおけるＩｇ及びＣ３沈着も、図４Ａ～４Ｃに示されている。
Ｃ）アルカリホスファターゼ：
ｈＣＴＬＡ－４マウスはまた、アルカリホスファターゼレベルの変化について分析した。血清中のアルカリホスファターゼのレベルは、ＡＢＡＸＩＳ ＶｅｔＳｃａｎ ＶＳ２の包括的な診断ローターを使用して決定した。
研究は、イピリムマブ（ＩＰＩ）がアルカリホスファターゼレベルを上昇させることを見出し、これは免疫媒介肝炎の兆候であり得る。ＣＴＬＡ４抗体（例えば、ＣＴＬＡ４．Ａ１４．２Ａ）は、アルカリホスファターゼレベルの上昇における減少を示した（図５）。本開示のＣＴＬＡ４抗体によって誘発されるアルカリホスファターゼの上昇のこの減少は、それらがイピリムマブなどの処理よりも免疫媒介肝炎を誘発する可能性が低いことを示し得る。
８．７．実施例７：第２の腫瘍モデルに対するＣＴＬＡ－４ ＡＢＰの影響
抗ＣＴＬＡ－４で処理されたＲＭ１腫瘍
ヒトＣＴＬＡ－４を発現するトランスジェニックマウス（ｈＣＴＬＡ－４ ＫＩマウス）の右側腹部にＲＭ１腫瘍細胞を移植した。（ヒトＩｇＧ１アイソタイプ陰性対照ｎ＝７、アテゾリムマブｎ＝８、全ての他の群ではｎ＝１１）。ｈＣＴＬＡ４ ＫＩマウスは、表１６に示される抗体で処理した。ＣＴＬＡ４抗体は、無作為化後０、３、及び６日目に５ｍｇ／ｋｇで投与し、アテゾリズマブは、無作為化後０日目で開始して３週間にわたって隔週で５ｍｇ／ｋｇで投与した。ヒトＩｇＧ１アイソタイプ陰性対照は、無作為化後０、３、及び６日目に５ｍｇ／ｋｇで投与した。腫瘍成長の平均阻害は、以下の式を使用して、０、４、７、１１、１４、及び１８日目に決定した。
平均阻害％＝（平均（Ｃ）－平均（Ｔ））／平均（Ｃ）＊１００％
Ｔ－現在の群の値
Ｃ－対照群の値
表１６は、研究の経過にわたる対照、ＣＴＬＡ４抗体、及びアテゾリズマブ処理についての平均阻害値を示す。
８．８．実施例８：併用処理（ペムブロリズマブ及び抗ＣＴＬＡ４）
ヒトＣＴＬＡ－４及びＰＤ－１を発現するトランスジェニックマウス（ｈＣＴＬＡ４－ｈＰＤ１ノックイン（ＫＩ）マウス、処理群当たりｎ＝８）の右側腹部に１×１０６個のＭＣ３８腫瘍細胞を皮下移植した。ｈＣＴＬＡ４－ｈＰＤ１ ＫＩマウスを、対照（１ｘリン酸塩緩衝生理食塩水、又はＰＢＳ）、２ｍｇ／ｋｇのペムブロリズマブ（ペムブロ）、又は２ｍｇ／ｋｇのペムブロ＋５ｍｇ／ｋｇの抗ＣＴＬＡ４で処理し、表１７に示されるように動物当たり１０ｍｌ／ｋｇの用量体積で、無作為化後１日目に開始して３週間にわたって週２回ｉ．ｐ．投与した。対照処理と比較した各処理によって誘発された腫瘍成長の平均デルタ阻害（％）を、以下の式を使用して計算し、結果を表１７に示す。
平均Δ阻害％＝（（平均（Ｃ）－平均（Ｃ０））－（平均（Ｔ）－平均（Ｔ０）））／（平均（Ｃ）－平均（Ｃ０））＊１００％
Ｔ－現在の群の値
Ｔ０－現在の群の初期値
Ｃ－対照群の値
Ｃ０－対照群の初期値
研究は、ペムブロ単独で処理されたマウスが２４日目に腫瘍成長阻害を示さなかったが、示されたＣＴＬＡ４抗体の添加が研究の過程で腫瘍成長阻害を増加させたことを示した。
実験の最後に、選択された腫瘍を採取し、腫瘍内免疫細胞集団を調査するためにフローサイトメトリーを実施した。データは、抗ＣＴＬＡ４が腫瘍内Ｔｒｅｇ集団を減少させる一方で、腫瘍内ＮＫ細胞集団を増加させることを示す（図６）。
８．９．実施例９：免疫関連有害事象
ヒトＣＴＬＡ－４を発現するトランスジェニックマウス（ｈＣＴＬＡ－４ ＫＩマウス）の右側腹部にＭＣ３８腫瘍細胞を移植した。ｈＣＴＬＡ－４ ＫＩマウスを、移植後８、１１、及び１４日目に、１ｍｇ／ｋｇの示されたＣＴＬＡ－４抗体で処理した。移植後８、１１、１４、及び１７日目にマウスの体重を測定した。動物数は、イピリムマブについてｎ＝８、Ａ７についてｎ＝９、Ａ２についてｎ＝８、Ａ１４についてｎ＝９、及びＡ１４．２についてｎ＝８であった。示された抗ＣＴＬＡ４処理を受けるマウスの体重における変化パーセントを図７に示す。
ＣＴＬＡ４．Ａ７、ＣＴＬＡ４．Ａ１４、及びＣＴＬＡ４．Ａ１４．２ａで処理されたマウスは、抗ＣＴＬＡ４の最終用量後に体重減少を示さないようであった（図７）。免疫関連有害事象（ｉｒＡＥ）は、増強されたＡＤＣＣを有する抗ＣＴＬＡ４（例えば、ＣＴＬＡ．Ａ１４．２ａ）が投与されるとより大きくなると報告されているため、この発見は予想外であった。このデータは、低減したブロッキング活性を有する抗ＣＴＬＡ４が、ＡＤＣＣが増強される場合でも、ｉｒＡＥの誘発を制限し得ることを示す。
８．１０．実施例１０：末梢フローサイトメトリー
ヒトＣＴＬＡ－４を発現するトランスジェニックマウス（ｈＣＴＬＡ－４ ＫＩマウス）の右側腹部にＭＣ３８腫瘍細胞を移植した。ｈＣＴＬＡ－４ ＫＩマウスを、移植後８、１１、及び１４日目に、１ｍｇ／ｋｇの示されたＣＴＬＡ－４抗体で処理した。２７日目に末梢フローサイトメトリーを実施した。染色には１００μＬの血液を使用した。末梢血フローサイトメトリーからの所見を図８Ａ～８Ｆ、９Ａ～９Ｄ、及び１０に示す。
図８Ａに提供される結果は、ＣＴＬＡ４．Ａ２及びＣＴＬＡ４．Ａ１４が末梢Ｔ細胞（ＣＤ３＋）の上昇を減少させることを示した。ＣＴＬＡ４．Ａ１４．２ａでＡＤＣＣを増強することは、新たに活性化されたＴ細胞（ＣＤ６９＋）を増加させた。ＣＴＬＡ４．Ａ２及びＣＴＬＡ４．Ａ１４は、より少ない非従来型調節細胞（ＣＤ４＋ＰＤ１＋、ＣＤ４＋ＩＣＯＳ＋）をもたらした。（図８Ｄ及び８Ｅを参照されたい）。
結果はまた、ＣＴＬＡ４．Ａ２及びＣＴＬＡ４．Ａ１４がＣＤ８＋Ｔ細胞をより良好に増強することを示した（図９Ａ）。ＣＴＬＡ４．Ａ２は、新たに活性化されたＴ細胞（ＣＤ８＋ＣＤ６９＋）をより良好に増強し、イピリムマブと比較して減少したＴ細胞枯渇（ＣＤ８＋ＰＤ１＋）をもたらした。ＩＣＯＳは、抗ＣＴＬＡ４の薬力学的マーカーとして記載されている。ＣＴＬＡ４．Ａ１４．２ａでＡＤＣＣを増強することは、ＣＤ８＋ＩＣＯＳ＋細胞を更に上昇させるようであった（図９Ａ～９Ｄ）。結果はまた、樹状細胞（ＤＣ）及び活性化されたＤＣ（ＣＤ８６＋）の頻度によって判断されるように、ＣＴＬＡ４．Ａ２及びＣＴＬＡ４．Ａ１４．２ａがイピリムマブと比較して減少した末梢免疫活性化をもたらすことを示した。（図１０を参照されたい）。
８．１１．実施例１１：低用量ＣＴＬＡ－４での処理の研究
ヒトＣＴＬＡ－４を発現するトランスジェニックマウス（ｈＣＴＬＡ－４ ＫＩマウス）は、腫瘍発生のために０．１ｍｌのＰＢＳ中のＭＣ３８腫瘍細胞（１Ｅ６）で右側腹領域に皮下移植した。指数増殖期の細胞を採取し、腫瘍移植前にセルカウンターによって定量した。ｈＣＴＬＡ－４ ＫＩマウスは、平均腫瘍体積が９６．１５ｍｍ３であるときに無作為化し、０．３ｍｇ／ｋｇの示された抗ＣＴＬＡ４、イピリムマブ、又はヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照（アイソタイプ）で、無作為化後０、３、及び６日目に処理した。腫瘍体積及び阻害の平均％は、実施例４に記載されるように決定した。ＣＴＬＡ４．Ａ２及びＣＴＬＡ４．Ａ１４は、１８日の研究にわたって有意により高い腫瘍阻害をもたらした。研究の結果を表１８及び図１１に示す。
８．１２．
８．１３．実施例１２：ＣＴＬＡ－４のエピトープマッピング
市販の抗ＣＴＬＡ－４モノクローナル抗体イピリムマブ及び抗ＣＴＬＡ－４モノクローナル抗体ＧＩＧＡ－５６４（本明細書ではクローンＡ１４及びＣＴＬＡ４．Ａ１４とも記載される）のエピトープマッピングを行った。ＣＤＲ配列は、以下の表２１に記載されている：
簡潔には、包括的なアラニンスキャニング変異誘発をＣＴＬＡ－４タンパク質にわたって行った。変異体タンパク質をヒト細胞において発現させ、２つの抗体による結合を決定した。変異体タンパク質のタンパク質発現及びフォールディングを検証し、野生型ＣＴＬＡ－４への結合を使用してデータを正規化した。最も重要な残基のみを決定するために、例えば、ｐＨ又は塩修飾を使用してストリンジェンシーを増加させた。結果は、表２２に提示される。
結果は、抗体が共通のエピトープを共有することを示す。しかしながら、ＣＴＬＡ－４上のＲ７０は、ＧＩＧＡ－５６４結合ではなく、イピリムマブにとって重要な残基である。Ｒ７０はまた、ＣＴＬＡ－４へのＣＤ８０及びＣＤ８６結合に関与することが知られている（例えば、Ｌｉ，Ｄｏｎｇ ｅｔ ａｌ．“Ａ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｃｒｏｓｓ－ｒｅａｃｔｉｖｅ ｔｏ ｂｏｔｈ ｈｕｍａｎ ａｎｄ ｍｕｒｉｎｅ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ－ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ４ ｖｉａ ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｏ ａｎ Ｎ－ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｅｐｉｔｏｐｅ．”ｍＡｂｓ ｖｏｌ．１２，１（２０２０）：１７２５３６５及びＵｄｕｐｉ Ａ．ｅｔ ａｌ．“Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｂａｓｉｓ ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｂｙ ｔｈｅ ｆｉｒｓｔ－ｉｎ－ｃｌａｓｓ ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ．”ＰＮＡＳ Ｍａｙ ２０１７，１１４（２１）Ｅ４２２３－Ｅ４２３２を参照されたい）。Ｒ７０が、ＣＴＬＡ－４に結合したイピリムマブの結晶構造において重鎖ＣＤＲ２によって接触されることも知られており、２つの抗体の重鎖ＣＤＲ２配列は、類似しない。
加えて、データは、Ｌ７４Ａが両方の二次残基であり、イピリムマブよりもＧＩＧＡ ５６４結合に影響を与えることを示す。
共有されたエピトープ残基は、結晶構造において重鎖ＣＤＲ３及び軽鎖ＣＤＲ３によって接触されることが知られている。２つの抗体の軽鎖ＣＤＲ３配列は、同一である。
実験はまた、各抗体のＦａｂバージョンで実施した。データは、Ｅ６８がＧＩＧＡ－５６４結合にとって重要な残基でもあることを示す。
結論として、イピリムマブ及びＧＩＧＡ－５６４は、重複しているが異なるエピトープを有する。Ｒ７０は、ＧＩＧＡ－５６４ではなくイピリムマブの結合に重要である。ＧＩＧＡ－５６４が結合している場合、Ｒ７０は、ＣＤ８０／ＣＤ８６と会合するために利用可能である可能性が高い。Ｅ６８及びＬ７４は、モノクローナル抗体イピリムマブとモノクローナル抗体ＧＩＧＡ－５６４との間の考えられる差別化因子である。
８．１４．実施例１３：マウスモデルにおけるイピリムマブと比較したＧＩＧＡ－５６４の作用メカニズム
本開示の発明者らは、ヒトＣＴＬＡ－４を発現するマウスモデルにおいてイピリムマブと比較して、優れた抗腫瘍活性、同じ低減した毒性を有する、そのＣＤ８０／ＣＤ８６リガンドへのＣＴＬＡ－４結合をブロックする最小限の能力を有する新規ＣＴＬＡ－４モノクローナル抗体を開発した。
本明細書に記載される研究は、マウスモデルにおいてイピリムマブと比較してＧＩＧＡ－５６４ ＣＴＬＡ－４ 抗体の作用メカニズムを評価し、特徴付ける。加えて、イピリムマブを含む、従来の抗ＣＴＬＡ－４ ｍＡｂの抗腫瘍効果を、Ｆｃエフェクター機能の存在下及び不在下で調査した。
材料及び方法
以前に記載される方法のいくつかを以下に繰り返す。
抗体配列
完全長抗体として発現され、インビトロブロッキング活性について試験された、本明細書に記載される１４個の抗体のＩｇＫ及びＩｇＧ可変領域のアミノ酸配列を表２６に列挙する。
完全長抗体の生成及びＣＨＯ細胞における発現
完全ヒト可変領域を有する抗体を発現する５匹のＴｒｉａｎｎｉ Ｍｏｕｓｅ（登録商標）マウスを、他の箇所で記載されるように、Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ，ＵＳＡ）で免疫化した（４１）。簡潔には、マウスを可溶性Ｈｉｓタグ付きＣＴＬＡ－４（ＣＴ４－Ｈ５２２９、Ａｃｒｏ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｎｅｗａｒｋ，ＤＥ，ＵＳＡ）及びアレンドロネート（ＡＬＤ）／ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）アジュバントで週２回、４週間免疫化した。マウスを安楽死させ、鼠径及び膝窩リンパ節並びに脾臓を採取し、単細胞懸濁液中に処理した。全てのマウスからの細胞を組織型によってプールし、マウスＰａｎ－Ｂ陰性選択キット（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，ＢＣ，Ｃａｎａｄａ）を使用してリンパ節及び脾臓からＢ細胞を選択した。天然に対になった重鎖及び軽鎖ライブラリーの生成、ｓｃＦｖの酵母表面ディスプレイ及びＦＡＣＳ選別、並びに抗体レパートリー分析は、他の箇所に記載された。
この分析から、選別後の濃縮に基づいて完全長抗体発現のためにｓｃＦｖ配列を選択した。発現構築物は、ＧｅｎｅＢｌｏｃｋｓ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃｏｒａｌｖｉｌｅ，ＩＡ，ＵＳＡ）及びＮＥＢｕｉｌｄｅｒ ＨｉＦｉ ＤＮＡ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＮＥＢ、Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ，ＵＳＡ）を使用してＧｉｂｓｏｎアセンブリを行い、ＣＨＯ細胞における一過性発現に適したベクターに配列を組み込んだ。使用されるベクターは、ｐＣＤＮＡ５／ＦＲＴ哺乳動物発現ベクター（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）のバリアントであった。ベクターは、軽鎖を発現する伸長因子１アルファ（ＥＦ１α）プロモーター、続いてウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリＡ配列、及び重鎖を発現するサイトメガロ ウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、続いて第２のＢＧＨポリＡ配列を有する。全ての構築物は、元のレパートリーにおける所与の抗体のＩｇＧアイソタイプに関係なく、ヒトＩｇＧ１アイソタイプとして合成した。構築物を、増幅のためにＮＥＢ １０－ベータＥ．ｃｏｌｉに形質転換し、ＺｙｍｏＰＵＲＥ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍａｘｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）で精製した。次いで、精製されたプラスミドを、ＥｘｐｉＣＨＯシステム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）での一過性トランスフェクションに使用した。トランスフェクトされた細胞をＥｘｐｉＣＨＯ培地で７～９日間培養し、次いでＰｒｏｔｅｉｎ Ａカラム（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）を使用して濾過された上清から抗体を精製した。抗体純度及び適切なサイズは、クーマシー染色されたドデシル硫酸ナトリウム－ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）によって検証された。
一過性トランスフェクション及びｍＡｂタンパク質産生
大規模な発現のために、ＧＩＧＡ－５６４（Ａ１４、「ａＣＴＬＡ－４．１５」）の完全長カッパ鎖を、ＣＭＶプロモーターを使用して別のｐＳＦ発現ベクター（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）にクローニングした。免疫グロブリンカッパのみ及び二重遺伝子（免疫グロブリンカッパ及び免疫グロブリンガンマ）プラスミドを、ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）を使用して、２：１モル比でＥｘｐｉＣＨＯ細胞にトランスフェクトした。簡潔には、培養物の１００ｍＬ毎に、１００μｇの全プラスミドを４ｍＬのＯｐｔｉＰｒｏ無血清培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）中の３２０μｌのＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅと混合し、室温で５分間インキュベートし、次いで６×１０６細胞／ｍＬまで新たに継代された細胞に添加した。トランスフェクション後１日目及び５日目に１６ｍＬのＥｘｐｉＣＨＯフィードを細胞に与え、次いで８日目又は生存率が７５％を下回ったときに細胞を採取した。
採取された細胞培養液（ＨＣＣＦ）を、ＨｉＴｒａｐ ＭａｂＳｅｌｅｃｔ Ｐｒｉｓｍ Ａカラム（Ｃｙｔｉｖａ、Ｍａｒｌｂｏｒｏｕｇｈ，ＭＡ，ＵＳＡ）に装填し、高速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）装置（ＡＫＴＡ ｐｕｒｅ ２５、Ｃｙｔｉｖａ、Ｍａｒｌｂｏｒｏｕｇｈ，ＭＡ，ＵＳＡ）を使用してｐＨ７．０～７．４のＰＢＳで平衡化し、１００ｍＭのクエン酸塩ｐＨ３で溶出した。画分をプールして溶出された材料の９０％超を収集し、１ＭトリスｐＨ９を使用してｐＨ６．２に中和した。中和された溶出液を４０ｍＭヒスチジン＋２４０ｍＭスクロースｐＨ６．２に透析し、０．２％ｔｗｅｅｎ（登録商標）－２０を用いて製剤化した。濃度は、吸光度（ＮａｎｏＤｒｏｐ ８０００、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）によって決定し、エンドトキシンは、リムルスアメーバ様細胞溶解物アッセイ（ＮｅｘＧｅｎ ＰＴＳ、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ，ＵＳＡ）によって定量化した。日常的な生物物理学的特徴分析は、サイズ排除クロマトグラフィー高速液体クロマトグラフィー（ＳＥＣ－ＨＰＬＣ、７．８×３００ｍｍ、２．７μＭ、３００Ａカラム、Ａｇｉｌｅｎｔ、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（１２％トリス－グリシン、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）、及びキャピラリー電気泳動ドデシル硫酸ナトリウム（ＣＥ－ＳＤＳ、タンパク質２３０、ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ ２１００、Ａｇｉｌｅｎｔ、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を含んだ。
クローンクラスター分析及び可視化
ＵＳＥＡＲＣＨを使用して、ＦＡＣＳ選別されたｓｃＦｖ配列の各ペアワイズアラインメント間の総アミノ酸差を計算した。次いで、Ｒ ｐａｃｋａｇｅ ｉｇｒａｐｈ（バージョン１．２．６）を使用して、ペアワイズアラインメントのクラスタリング プロットを生成した。配列は、「ノード」として表され、「エッジ」は、ノード間のリンクであった。エッジは、≦９アミノ酸差を有するペアワイズアラインメントを示す。出力をフォーマットするために、ｌａｙｏｕｔ＿ｗｉｔｈ＿ｇｒａｐｈｏｐｔ（ｃｈａｒｇｅ＝０．０３、ｎｉｔｅｒ＝１０００）オプションを使用した。
親和性測定
ＣＨＯ発現からのＣＴＬＡ－４ ｍＡｂ ＨＣＣＦの動力学的分析は、Ｃａｒｔｅｒｒａ（Ｄｕｂｌｉｎ，ＣＡ，ＵＳＡ）によるＭＸ－９６装置（ＩＢＩＳ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｅｎｓｃｈｅｄｅ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）で実施した。９２５～１２００ＲＵの表面密度を有する抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ、Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬ，ＵＳＡ）で中密度捕捉チップを作製した。ＣＦＭプリンター（ＩＢＩＳ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｅｎｓｃｈｅｄｅ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）は、各試料についてｍＡｂ ＨＣＣＦの１つの１０分のプリントを印刷した。動力学分析のためのＨｉｓタグ付きヒトＣＴＬＡ－４抗原（ＣＴ４－Ｈ５２２９、Ａｃｒｏ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｎｅｗａｒｋ，ＤＥ，ＵＳＡ）注射は５分であり、解離は１０分であった。動力学分析は、５００ｎＭの抗原で開始する５つの５倍連続滴定で行い、１：１の一価モデルに適合した。
ＣＨＯ発現からのｍＡｂ ＨＣＣＦのＨｉｓタグ付きカニクイザルＣＴＬＡ－４（ＣＴ４－Ｃ５２２７、Ａｃｒｏ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｎｅｗａｒｋ，ＤＥ，ＵＳＡ）への親和性を決定する結合／解離実験は、ＣＲＯ（Ｂｉｏｎｏｖａ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ，ＵＳＡ）によってＯｃｔｅｔ Ｒｅｄ９６装置（ＦｏｒｔｅＢｉｏ、Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）で３０℃で行った。抗体を、８０ｎＭの抗原に浸漬させたプロテインＡバイオセンサーに５μｇ／ｍＬで装填し、動力学定数を、一価モデルを使用して計算した。
ｍＡｂのインビトロ特徴分析のためのフローサイトメトリー
ＣＴＬＡ－４ ｍＡｂが哺乳動物細胞の表面に発現した適切な抗原に結合したかを決定するために、ヒトＣＴＬＡ－４又は無関係な抗原（ＣＤ２７）を安定して発現するＣＨＯ細胞株を生成した。細胞（各細胞株０．５×１０６個）を合わせ、ＭＡＣＳ緩衝液（ダルベッコのリン酸塩緩衝生理食塩水［ＤＰＢＳ］、０．５％ウシ血清アルブミン［ＢＳＡ］、及び２ｍＭエチレンジアミン四酢酸［ＥＤＴＡ］を含む）で洗浄した。細胞を、４℃で３０分間１０μｇ／ｍＬの抗ＣＴＬＡ－４とインキュベートし、次いで、ＭＡＣＳ緩衝液で２回洗浄することによって、過剰な結合していないｍＡｂを除去した。次いで、細胞を、結合した抗ＣＴＬＡ－４を検出するＰＥコンジュゲート型抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ抗体（クローンＭ１３１０Ｇ０５、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ ４１０７２０、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）で、及び無関係な抗原を発現する細胞を区別するフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）コンジュゲート型抗ＣＤ２７（クローンＯ３２３、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ ３０２８０６、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）で染色した。細胞をＭＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、室温で２０分間４％パラホルムアルデヒド固定緩衝液（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ ４２０８０１、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）で固定し、ＭＡＣＳ緩衝液で更に２回洗浄した。イピリムマブアナログのＮ２９７Ｑバリアント及びＣＴＬＡ－４．２８の検証のために、ヒトＣＴＬＡ－４の発現が欠如しているＣＨＯ細胞をＣＤ２７発現細胞の代わりに使用し、２つの細胞株を別々に染色し、結合した抗ＣＴＬＡ－４を検出するためにＦＩＴＣコンジュゲート型抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ抗体（クローンＭ１３１０Ｇ０５、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ ４１０７１９、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用し、細胞を固定緩衝液で処理せず、代わりに細胞を４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）で染色し、サイトメーターで生（ＤＡＰＩ－）細胞についてゲートをかけたことを除き、同様の手順に従った。細胞表面上のＣＴＬＡ－４へのｍＡｂの結合は、ＬＳＲ ＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）又はＣｙｔｏＦＬＥＸ ＬＸ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｂｒｅａ，ＣＡ，ＵＳＡ）フローサイトメーターを使用して決定し、ＦｌｏｗＪｏ（ｖ１０．６．１、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して分析した。
細胞表面上の抗ＣＴＬＡ－４の蓄積を決定するために、野生型ヒトＣＴＬＡ－４を発現する懸濁ＣＨＯ細胞を、０．５％ＢＳＡ（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）及び０．５ＭのＥＤＴＡ（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）を含有するＤＰＢＳ（Ｌｏｎｚａ、Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）中で１×１０６細胞／ウェルで播種した。０～５０μｇ／ｍＬからのイピリムマブ又はＧＩＧＡ－５６４の滴定を細胞に添加し、プレートを３０分間３７℃でインキュベートして、内在化を発生させた。抗ヒトＩｇＧ Ｆｃアロフィコシアニン（ＡＰＣ）（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）を二次抗体として１０μｇ／ｍＬで添加し、プレートを３０分間４℃でインキュベートした。ＤＡＰＩ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）での生存率染色後、データをＣｙｔｏＦＬＥＸ ＬＸ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｂｒｅａ，ＣＡ，ＵＳＡ）で取得し、ＦｌｏｗＪｏ（ｖ１０．６．１、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して分析した。
細胞ベースのＣＴＬＡ－４ブロッキングアッセイ
ＣＴＬＡ－４ Ｂｌｏｃｋａｄｅ ＢｉｏａｓｓａｙをＰｒｏｍｅｇａ（ＪＡ３００１、Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）から購入し、製造業者の推奨に従って実施した。簡潔には、各抗体の段階希釈は、無菌９６ウェルプレートのアッセイ緩衝液（９０％ＲＰＭＩ １６４０／１０％ＦＢＳ、キットで供給）で生成した。ＣＴＬＡ－４エフェクター細胞（キットで提供）を解凍し、３．２ｍＬのアッセイ緩衝液に希釈し、２５μＬの細胞懸濁液を９６ウェルの白色平底プレートのインナー６０ウェルの各々に加えた。２５μＬの適切な抗体希釈液を、ＣＴＬＡ－４エフェクター細胞を含有するウェルに加えた。人工抗原提示（ａＡＰＣ）／Ｒａｊｉ細胞（キットで提供）を解凍し、７．２ｍＬのアッセイ緩衝液に希釈し、２５μＬの細胞懸濁液を、希釈された抗体及びＣＴＬＡ－４エフェクター細胞を含有するウェルに加えた。細胞及び抗体混合物を含有するウェルに７５μＬのＢｉｏ－Ｇｌｏ試薬を添加する前に、５％ＣＯ２を有する組織培養インキュベーターにおいて３７℃で６時間プレートをインキュベートした。プレートを室温で５～１５分間インキュベートし、発光をＳｐｅｃｔｒａｍａｘ ｉ３ｘプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）で測定した。データ分析は、Ｓｏｆｔｍａｘ Ｐｒｏ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）又はＰｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）ソフトウェアパッケージを使用して実施した。
ＣＤ８０／ＣＤ８６ブロッキングＥＬＩＳＡ
ＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ、ＭａｘｉＳｏｒｐ ＥＬＩＳＡプレート、平底、コーティングなし、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）を、４℃で一晩１μｇ／ｍＬの組換えヒトＣＴＬＡ－４－Ｆｃ（７２６８－ＣＴ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ，ＵＳＡ）でコーティングした。次いでプレートを、室温で１時間、ｔｗｅｅｎ ２０を含むリン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳＴ）中の５％ミルクでブロックした。次いで示されたｍＡｂの一連の滴定をプレートに添加し、次いでプレートを室温で１時間インキュベートして、ｍＡｂ結合を可能にした。ＰＢＳＴで洗浄することによって、過剰な、結合していないｍＡｂを除去した。次いで、組換えヒトＨｉｓタグ付きＣＤ８０（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ ９０５０－Ｂ１、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ，ＵＳＡ）又はＣＤ８６（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ ９０９０－Ｂ２、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ，ＵＳＡ）を１μｇ／ｍＬでプレートに加えた。室温で１時間インキュベーション後、プレートを洗浄して結合していないリガンドを除去した。結合したリガンドは、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲート型抗Ｈｉｓ抗体（６５２５０４、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）で検出された。室温で１時間インキュベーション及び洗浄後、プレートを３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジジン（ＴＭＢ）基質（３４０２８、Ｐｉｅｒｃｅ、Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）で展開した。十分なシグナルが達成された後、展開を１Ｎ塩酸の添加によって停止した。Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ ｉ３ｘプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して、４５０ｎｍでの吸光度を読み取った。Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して吸光度対濃度の対数をプロットすることによって、半最大阻害濃度（ＩＣ５０）値を計算した。
マウスモデル
マウス実験は、全ての関連する倫理規則に準拠して行われ、Ｃｒｏｗｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅの動物実験委員会によって承認された。完全長ｈＣＴＬＡ－４ノックインＨｕＧＥＭＭ（商標）マウス（Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｍｏｄｅｌ Ｏｒｇａｎｉｓｍｓ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｉｎｃ．）を使用した実験は、Ｃｒｏｗｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（Ｔａｉｃａｎｇ Ｊｉａｎｇｓｕ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ，Ｃｈｉｎａ）で実施された。完全長ｈＣＴＬＡ－４ノックインＨｕＧＥＭＭ（商標）マウスは、マウスＣｔｌａ４遺伝子座のエキソン１のポリＡ配列でヒトＣＴＬＡ４ ｃＤＮＡをノックインし、マウスＣｔｌａ４発現をヒトＣＴＬＡ４発現で置き換えることによって生成された。Ｃｒｏｗｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅは、ＦＤＣＣ（Ｔｈｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＩＢＳ）、Ｆｕｄａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ｃｈｉｎａ）からＭＣ３８細胞、及びＳＩＢＳ（Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｃｈｉｎａ）からＲＭ－１細胞を取得し、一塩基多型（ＳＮＰ）分析によって研究セルバンクの細胞株識別子を認証した。細胞株は、マイコプラズマ陰性であった。８～１２週齢、雌、完全長ｈＣＴＬＡ－４ノックインＨｕＧＥＭＭ（商標）マウスの右下側腹部に、腫瘍の発生について示されるようにＭＣ３８又はＲＭ－１細胞（１００μＬのＰＢＳ中に懸濁した１０６細胞）を皮下注射した。腫瘍体積が示されたサイズに達するまで、腫瘍を定着させた。次いで、マウスを無作為化し、各実験について記載される、投与を無作為化と同じ日に開始した。腫瘍体積及び体重は、盲検法で少なくとも週２回測定した。腫瘍体積は、式：Ｖ＝（Ｌ×Ｗ×Ｗ）／２を使用して計算し、式中、Ｖは腫瘍体積であり、Ｌは腫瘍長さ（最長の腫瘍寸法）であり、Ｗは腫瘍幅（Ｌに垂直な最長の腫瘍寸法）である。個々の動物は、それらの腫瘍体積の測定が３０００ｍｍ３を超えると、研究から除外された。示される場合、無作為化後３５日目に完全奏効有するマウスは、４３日目に再チャレンジされた。再チャレンジ実験のために、ＭＣ３８腫瘍細胞（１００μＬのＰＢＳ中１０６）を左下（反対側）側腹領域に皮下移植した。腫瘍細胞はまた、６～８週齢ナイーブ、ＷＴ Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｌｉｎｇｃｈａｎｇ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．（Ｓｈａｎｇｈａｉ，Ｃｈｉｎａ））において再チャレンジ時の腫瘍成長の陽性対照として移植した。マウス及び任意の腫瘍進行を更に３０日間観察した。これらの実験のうちのいくつかは、実施例４、５、６、７、及び１１において以前に記載されている。
マウス腫瘍解離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、Ｂｅｒｇｉｓｃｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）及び解離プログラム（３７＿ｃ＿ｍ＿ＴＤＫ＿１）に設定されたＧｅｎｔｌｅＭＡＣＳ（商標）Ｏｃｔｏ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｏｒ ｗｉｔｈ Ｈｅａｔｅｒｓを使用して、腫瘍からの単細胞懸濁液を調製した。リンパ節からの単細胞懸濁液を、５ｍＬシリンジからプランジャーを使用して７０μｍセルストレーナーに押し通した。次いで、単細胞懸濁液を室温で１×ＲＢＣ溶解緩衝液と９０秒間インキュベートした。次いで、ＲＢＣ溶解をクエンチし、洗浄し、７０μｍセルストレーナーを通して濾し、計数した。細胞染色のために、細胞をまず４°Ｃで１５分間１μｇ／ｍｌのＦｃ－Ｂｌｏｃｋ（マウスＦｃ Ｂｌｏｃｋ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）でブロックした。次いで、細胞を、暗所の氷上で３０分間示された表面抗体で染色した（表２７）。次いで、細胞を２回洗浄し、固定／透過処理作業溶液（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）で固定し、次いで１×透過処理緩衝液（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）で２回洗浄し、その後、細胞内染色を１×透過処理緩衝液中で実施した。細胞内染色後、細胞を１×透過処理緩衝液で２回洗浄し、フローサイトメーター（ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ Ｘ－２０、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用してデータを収集した。Ｋａｌｕｚａ又はＦｌｏｗＪｏ １０を使用してデータを分析した。
ＢＡＬＢ／ｃバックグラウンド（ＧｅｍＰｈａｒｍａｔｅｃｈ Ｃｏ．，Ｌｔｄ）上でｈＣＴＬＡ－４／ｈＰＤ－１ダブルノックインＨｕＧＥＭＭ（商標）マウスを使用した実験は、マウスＣｔｌａ４のエキソン２がヒトＣＴＬＡ４からのエキソン２で置換されたマウスを、マウスＰｄｃｄ１のエキソン２及び３がヒトＰＤＣＤ１のエキソン２及び３で置換されたマウスと交配することによって生成した。これらのマウスを使用したマウス毒性研究は、Ｃｒｏｗｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（Ｔａｉｃａｎｇ Ｊｉａｎｇｓｕ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ，Ｃｈｉｎａ）で実施した。雌マウスは、投与の開始時に４～５週齢であり、ＰＢＳ、ペムブロリズマブ（１５ｍｇ／ｋｇ）、イピリムマブ（１０ｍｇ／ｋｇ）とペムブロリズマブ、又はＧＩＧＡ－５６４（１０ｍｇ／ｋｇ）とペムブロリズマブで３週間毎に９用量にわたって処理し、投与の完了の１０日後にマウスを安楽死させ、組織病理学的分析のために組織を収集した。
エピトープマッピング
結合に関与する重要なエネルギー残基の同定は、Ｉｎｔｅｇｒａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ（Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ，ＵＳＡ）によって行った。内在化を低減する変異（Ｙ２０１Ｇ）を有する完全長ヒトＣＴＬＡ－４を一過性発現ベクターにクローニングし、各細胞外位置（３６－１６１）を個別にアラニンに変異させた（又はアラニンをセリンに変異させた）。変異体ライブラリーを３８４ウェルマイクロプレートに配列し、ＨＥＫ－２９３Ｔ細胞に一過性にトランスフェクトした。イピリムマブ、ＧＩＧＡ－５６４、及びＬ３Ｄ１０対照（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）の最適染色濃度は、野生型ＣＴＬＡ－４を使用して決定し、次いでＣＴＬＡ－４変異体ライブラリーに適用した。抗体結合は、ヤギ抗ヒトＩｇＧ－Ａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ－４８８又は抗ヒトＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）２－Ａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ－４８８（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ，ＵＳＡ）を使用して検出し、平均細胞蛍光は、フローサイトメトリー（Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔ ｉＱｕｅ、Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ，ＭＩ，ＵＳＡ）を使用して検出した。変異が対照抗体と比較して試験抗体への結合の顕著な喪失をもたらした場合、変異された残基は重要であるとみなされた。このエピトープマッピング実験は、実施例１２にも記載されている。
インビトロＴｒｅｇ活性化アッセイ
ＣＤ８０（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ ｒｈＣＤ８０－Ｆｃ、１０１０７－Ｂ１－１００、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ，ＵＳＡ）を含む及び含まない抗ＣＤ３（ＯＫＴ３、Ｕｌｔｒａ－ＬＥＡＦ精製、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）は、Ｍ－４５０ Ｔｏｓｙｌビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄ Ｍ－４５０、１４０１３０、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）の表面に製造業者のガイドラインに従って共有結合した。各ビーズタイプの表面が適切にコーティングされたことを確認するために、蛍光抗体を使用して、フローサイトメトリーを介してビーズ表面上のマウスＦｃ（抗ＣＤ３）又はＣＤ８０のいずれかを検出した。
ドナーがマッチしたヒトＴｒｅｇ及びＴｃｏｎｖ細胞（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、７００９６、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，ＢＣ，Ｃａｎａｄａ）を解凍し、ＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ（Ｃ３４５７１、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）で製造業者のプロトコルに従って染色した。次いで１０５個の細胞を、９６ウェルＵ底プレート（Ｆａｌｃｏｎ－Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｕ底組織培養プレート、ＶＷＲ、Ｒａｄｎｏｒ、ＰＡ、ＵＳＡ）における３７℃、５％ＣＯ２での非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、Ｇｌｕｔａｍａｘ、及び５％ヒト抗体血清を含む完全イスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）中で示されるように１０５個のビーズで培養した。ｒｈＣＤ８０－Ｆｃ（Ａｂａｔａｃｅｐｔ、ＢＭＳ、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，ＮＪ，ＵＳＡ）又はａＣＴＬＡ－４．２８が使用された条件では、これらを細胞に添加する前にまずビーズと混合した。ｒｈＣＤ８０－Ｆｃ及びａＣＴＬＡ－４．２８の両方を含む試験試料を混合し、ビーズ及び次いで細胞と混合する前に一緒にインキュベートした。４日のインキュベーション後、細胞を洗浄し、染色し、ＣｙｔｏＦＬＥＸ ＬＸ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して分析した。フローサイトメトリーデータは、ＦｌｏｗＪｏ ｖ１０．７．１（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）において分析した。
ＦｃＲエフェクター活性バイオアッセイ
ｍＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＳ１７７９Ｂ０８）、ｍＦｃγＲＩＶ（Ｍ１１５１）、ｈＦｃγＲＩＩｂ（ＣＳ１７８１Ｅ０２）、ｈＦｃγＲＩＩａ－Ｈバリアント（Ｇ９９８１）、ｈＦｃγＲＩＩａ－Ｒバリアント（ＣＳ１７８１Ｂ０８）、ｈＦｃγＲＩＩＩａ－Ｖバリアント（Ｇ７０１１）、及びｈＦｃγＲＩＩＩａ－Ｆバリアント（Ｇ９７９１）についてのＦｃエフェクター活性バイオアッセイは、Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）から購入した。アッセイは、製造業者の指示に従って実施した。簡潔には、細胞表面発現を増強するＹ２０１Ｇ変異を有するヒトＣＴＬＡ－４を安定して発現するＣＨＯ標的細胞を、ＧＩＧＡ－５６４、イピリムマブ、又はＦｃ機能を排除するＬＡＬＡ－ＰＧ変異を有するＧＩＧＡ－５６４を含むＲＰＭＩ１６４０＋４％ＦＢＳ培地に懸濁し、３０分間３７℃でインキュベートした。以下の開始濃度及び希釈係数を各アッセイに使用した：１μｇ／ｍＬ、２．５倍希釈系列（ｍＦｃγＲＩＩＩａ、ｈＦｃγＲＩＩＩａ－Ｖバリアント）、５００μｇ／ｍＬ、２．５倍（ｍＦｃγＲＩＶ）、３μｇ／ｍＬ、３倍（ｈＦｃγＲＩＩｂ、ｈＦｃγＲＩＩａ－Ｈ、及びＲバリアント）、又は１０μｇ／ｍＬ、２．５倍（ｈＦｃγＲＩＩＩａ－Ｆバリアント）。単独で１タイプのＦｃγＲを発現するＪｕｒｋａｔ／ＮＦＡＴ－Ｌｕｃエフェクター細胞を、各ウェルに添加し（エフェクター：標的比は５：１であった）、３７℃で６時間インキュベートした。ルシフェラーゼ活性を、含まれるＢｉｏ－Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイ試薬とＳｐｅｃｔｒａＭａｘ ｉ３ｘ又はｉＤ３プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用することによって測定した。相対発光量（ＲＬＵ）で測定されたルシフェラーゼ活性を、ＣＴＬＡ－４ ｍＡｂの濃度に対してプロットした。各ｍＡｂのＩＣ５０値は、Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用したロジスティック回帰によって計算した。
抗体のｐＨ感受性の決定
９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ、ＭａｘｉＳｏｒｐ、平底、コーティングなし、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ、４２３５０１）を、１×ＰＢＳ ｐＨ７．０で希釈された０．５μｇ／ｍＬのｒｈＣＴＬＡ－４－Ｆｃキメラ（７２６８－ＣＴ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ，ＵＳＡ）でコーティングし、２～８℃で一晩インキュベートした。プレートを１×ＰＢＳＴで洗浄し、ＰＢＳＴ＋１％ＢＳＡ（ＰＢＳＴＢ）でブロックした。精製されたＣＴＬＡ－４ ｍＡｂを、ｐＨ４．０、５．０、６．０、又は７．０に調節された１０ｍＭのリン酸ナトリウム＋１５０ｍＭのＮａＣｌ中で希釈し、１時間かけてプレートに添加した。結合していない抗体をＰＢＳＴで洗い流し、結合した抗体をＰＢＳＴＢ中で希釈された０．５μｇ／ｍＬのＨＲＰコンジュゲート型ヤギ抗ヒト定数カッパ（２０６０－０５、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬ，ＵＳＡ）で検出した。プレートをＰＢＳＴでもう一度洗浄し、次いでＴＭＢ基質（１－Ｓｔｅｐ（商標）Ｕｌｔｒａ ＴＭＢ－ＥＬＩＳＡ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）を加え、約１分間展開させた後、１Ｎ ＨＣｌで反応を停止させた。４５０ｎｍでの吸光度を、分光光度計（ｉ３ｘ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して測定し、Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用してプロットした。
ＧＩＧＡ－５６４を安定発現する細胞プールの生成
ＧＩＧＡ－５６４は、ｐＣＤＮＡ５／ＦＲＴ哺乳動物発現ベクター（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）のバリアントから発現させた。ベクターは、グルタミンシンセターゼ選択のためのプロモーターを有し、軽鎖発現を駆動するＥＦ１αプロモーター、続いてＢＧＨポリＡ配列及び重鎖の発現を駆動するＣＭＶプロモーター、続いて第２のＢＧＨポリＡ配列を使用する。抗体発現構築物は、ＧｅｎｅＢｌｏｃｋｓ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡ，ＵＳＡ）及びＮＥＢｕｉｌｄｅｒ（登録商標）ＨｉＦｉ ＤＮＡ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ，ＵＳＡ）を使用して構築した。構築物は、ＮＥＢ １０－ベータＥ．ｃｏｌｉにおいて増幅させ、ＺｙｍｏＰＵＲＥ（商標）Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍａｘｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）で精製した。次いで、１５０μｇのＤＮＡを３，０００単位のＰｖｕＩ－ＨＦ制限酵素（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ，ＵＳＡ）で消化することによってトランスフェクションのために線形化し、沈降させ、洗浄した。
Ｓｉｇｍａ ＡｌｄｒｉｃｈのＣＨＯＺＮ細胞は、６ｍＭのＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｇｉｂｃｏ、Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）で補足されたＥＸ－ＣＥＬＬ ＣＤ ＣＨＯ Ｆｕｓｉｏｎ培地（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ、Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ，ＵＳＡ）において、３７℃で振盪しながら、５％ＣＯ２、１２５ＲＰＭ（２５ｍｍスロー）でエレクトロポレーション前の７日間培養した。エレクトロポレーションの前日に、懸濁細胞を０．５×１０６生細胞／ｍＬ（ｖｃ／ｍＬ）で播種した。線形化されたプラスミドをトランスフェクトし、Ａｍａｘａ ４Ｄ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ上のＣＭ－１５０（Ｌｏｎｚａ、Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）及びＳＥ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ ４Ｄ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ Ｘキット（Ｌｏｎｚａ、Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用してパルスした。各キュベットは、４μｇのＤＮＡ及びＳＥ細胞溶液中で濃縮された１０７個のＣＨＯＺＮ細胞を有した。エレクトロポレーション後、トランスフェクトされた細胞を、２×１０６ｖｃ／ｍＬ密度でＴ－７５フラスコに移し、６ｍＭのＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｇｉｂｃｏ、Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）を含むＥＸ－ＣＥＬＬ ＣＤ ＣＨＯ融合培地（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ、Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ，ＵＳＡ）において１日回復させた。１日の回復後、トランスフェクトされた細胞をペレット化し、８０％ＥＸ－ＣＥＬＬ ＣＤ ＣＨＯクローニング培地（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ、Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ，ＵＳＡ）及び２０％ＥＸ－ＣＥＬＬ ＣＤ ＣＨＯ融合培地（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ、Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ，ＵＳＡ）に再懸濁させ、９６ウェルプレート（非ＴＣ処理、平底、Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｏｎｅ－Ｂｉｏ、Ｋｒｅｍｓｍｕｎｓｔｅｒ，Ａｕｓｔｒｉａ）にウェル当たり５，０００細胞で播種し、３７℃、湿度を有する５％ＣＯ２でインキュベートした。
４～５週間後、コンフルエントなトランスフェクトされたウェル（ミニプール）を、Ｇａｔｏｒバイオレイヤー干渉計システム及びプロテインＡバイオセンサー（ＧａｔｏｒＢｉｏ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して抗体濃度についてスクリーニングした。最も高い抗体力価を有するミニプールを、３７℃、湿度を有する５％ＣＯ２でインキュベートされた静的２４ウェルＴＣ処理プレートにおいてＥＸ－ＣＥＬＬ ＣＤ ＣＨＯ Ｆｕｓｉｏｎ培地を使用してスケールアップした。ミニプールは、増殖し続け、シェーカーは、１４５ＲＰＭ、３７℃、５％ＣＯ２、湿度で設定された１９ｍｍ振盪プラットフォーム上で６ウェルプレート（非ＴＣ処理、平底、Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｏｎｅ－Ｂｉｏ、Ｋｒｅｍｓｍｕｎｓｔｅｒ，Ａｕｓｔｒｉａ）を振盪することに適応した。高産生プールを特定するために、２４ウェルプレート（ＴＣ処理、平底、Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ，ＵＳＡ）における８日のターミナルバッチからの材料を、ミニプールをスクリーニングする第２の方法としてＧａｔｏｒシステムを使用してスクリーニングした。培養物を、３７℃、５％ＣＯ２、８０％湿度、２５ｍｍスローで２２５ＲＰＭで振盪しながらインキュベートされる振盪５０ｍＬコニカルチューブ（Ｍｉｄｓｃｉ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）中に増殖させた。上位ミニプールを組み合わせて、濃縮されたプール（ＥＰ）を生成した。
ＥＰは、振盪フラスコにおいて１２５ＲＰＭ、２５ｍｍスローで培養し、０．２～０．４×１０６生細胞密度（ＶＣＤ）／ｍＬで３～４日間播種した。次いで、ＥＰを、ＥＸ－ＣＥＬＬ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｆｅｄ Ｂａｔｃｈ培地に、０．４×１０６ＶＣＤ／ｍＬで、ベントキャップ及び２００ｍＬの作業体積を有する１Ｌ振盪フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ，ＵＳＡ）において接種した。インキュベーター条件は、フェドバッチ全体で３７℃、５％ＣＯ２、湿度８０％、及び１２５ＲＰＭ（２５ｍｍスロー）での振盪で一定に保持した。フェドバッチの開始３日目から採取まで、成長、生存率、及び代謝物濃度をオフラインで測定した。濃度が４ｇ／Ｌを下回った場合、４５％グルコースストック（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ，ＵＳＡ）を使用して６ｇ／Ｌまでグルコースを補足した。培養物には、３、５、７、９、及び１１日目に、ＥＸ－ＣＥＬＬ Ａｄｖａｎｃｅｄ ＣＨＯ Ｆｅｅｄ １（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ、Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ，ＵＳＡ）（作業培養体積の４％）及びＣｅｌｌＶｅｎｔｏ ４Ｆｅｅｄ ＣＯＭＰ（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ、Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ，ＵＳＡ）（作業培養体積の２％）を与えた。培養物を生存率が８０％を下回ったときに採取し、細胞培養上清を遠心分離によって清澄化し、濾過した。タンパク質は、１００ｍＭの酢酸塩ｐＨ３で溶出されたプロテインＡを使用して精製した。その後の分析に１つのＥＰを使用した（ＥＰ－１）。
グリカン分析
この分析は、ＣＲＯ Ｂｉｏｎｏｖａ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ，ＵＳＡ）によって行った。１５０μｇの抗体をＰＮＧａｓｅ Ｆ（Ｐｒｏｚｙｍｅ、Ｈａｙｗａｒｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）で消化して、グリカンを遊離させた。グリカンを単離し、ＧｌｙｋｏＰｒｅｐ ＩｎｓｔａｎｔＡＢ標識キット（Ｐｒｏｚｙｍｅ、Ｈａｙｗａｒｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）を製造業者の指示に従って使用して、蛍光分子で標識した。標識されたグリカンは、蛍光検出器を備えたＵＰＬＣ（Ｄｉｏｎｅｘ Ｕｌｔｉｍａｔｅ ３０００、Ｗａｔｅｒｓ、Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ，ＵＳＡ）上で３．５μｍ、２．１×１５０ｍｍ ＸＢｒｉｄｇｅ Ａｍｉｄｅカラム（Ｗａｔｅｒｓ、Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ，ＵＳＡ）に注射した。ピークは、Ｇｌｙｋｏ ＩｎｓｔａｎｔＡＢ二分岐及び高マンノース分割ライブラリー標準（Ｐｒｏｚｙｍｅ、Ｈａｙｗａｒｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）からの既知のグリカンに基づいて特定され、各グリコフォームの合計パーセントは、全てのピークのＡＵＣ（曲線下面積）の合計で割った特定されたピーク下の積分面積として報告された。
皮膚炎症、結腸上皮、及び心臓毒性スコアリング
ひげ領域付近からの皮膚のヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色切片を、次のようにスコア付けした１：切片当たり１～３個のリンパ球凝集体の小さな病巣、２：４～１０個の小さな病巣又は１～３個の中間の病巣、３：４個以上の中間又は大きな病巣の存在、４：柔組織における顕著な間質性線維症及びリンパ球凝集体の大きな病巣。
結腸上皮スコアは、Ｈ＆Ｅ染色結腸ロールの評価によって決定した。このスコアを決定するために、スライド全体を確認した後、損傷が最も深刻な４つの領域をスコアリングのために選択し、全ての４つの領域からのスコアを合計して累積スコアを決定した。個々の領域のスコアを決定するために、影響を受けた上皮構造及び損傷の一貫性の両方を考慮した。このため、上皮構造への損傷は、０：病変なし、１：粘膜損傷、２：粘膜下組織損傷、３：筋層／漿膜損傷としてスコア付けした。各領域における損傷の一貫性は、１：巣状、２：斑状、３：びまん性としてスコア付けした。次いで、両方のスコアを掛け合わせて領域スコアを決定した。
心臓病理学スコアでは、心膜、右又は左心房、大動脈基部、及び左又は右心室におけるＨ＆Ｅ染色された心臓切片上でのリンパ球浸潤は、各々１ポイントとしてカウントされる。ＣＤ４５＋細胞の数は、ＣＤ４５で染色された心臓ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）切片上で計数した。炎症細胞浸潤分析のための視野を無作為に選択し、各試料について３つの視野の平均スコアを決定した。
腎臓病理染色及びスコアリング
組織を収集し、１０％緩衝中性ホルマリンに入れ、次いでパラフィン包埋した。切片化、染色、及びスコアリングは、Ａｌｌｅｌｅ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）によって行った。簡潔には、ブロックを５μｍ切片に切断し、それを抗ＩｇＧ（ＵｌｔｒａＰｏｌｙｍｅｒヤギ抗マウス重及び軽鎖ＩｇＧ－ＨＲＰ、Ｃｅｌｌ ＩＤｘ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）又は抗Ｃ３（ＥＰＲ１９３９４、Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）免疫組織化学（ＩＨＣ）染色のためにガラススライド上に配置した。染色されたスライドは、デジタル画像として調製した。
研究に対して盲検化された、実験動物及び毒性病理学において経験を有する委員会認定の獣医病理学者が、抗ＩｇＧスライドを、陽性染色の位置、強度、及びパーセントについて評価した。所見は、強度について１～４のスケール（０：陰性、１：最小限又はわずかに陽性、４：非常に暗い）で、及び糸球体中の陽性細胞のパーセントとして（少なくとも５つの糸球体を確認した後）スコア付けした。この実験は、実施例６にも記載されている。
統計分析
複数の群において縦方向に測定された腫瘍体積における変化の比較は、反復された測定の依存を説明するために、固定効果として処理群及び日並びに無作為効果として動物識別子を含む線形混合効果モデルを使用して決定した。全ての試験は、タイプＩエラー率への調整なしに両側であった。これらの分析は、Ｒバージョン３．６．２を使用して実施した。
再チャレンジ研究について、腫瘍体積（ｍｍ３）は、反復された測定を説明するために、固定効果として処理群及び日並びに無作為効果として動物識別子を含む線形混合効果モデルを使用して分析した。最初のチャレンジのアイソタイプ対照群に対して、及び研究の再チャレンジ部分のナイーブ対照群に対して、ワルド検定を使用して統計的比較を行った。全ての試験は、０．０５のアルファレベルで両側であった。
皮膚炎症、結腸上皮損傷、心臓へのＣＤ４５＋細胞浸潤、心臓病理学スコア、結腸長さ、脾臓重量、及び腎臓Ｉｇ又はＣ３沈着の比較のための調整されたｐ値を、多重比較を説明するベンジャミーニ－ホッホベルクステップダウン手順を使用して計算した。分析は、Ｒバージョン３．６．２を使用して行った。対照と比較してペムブロリズマブ又はペムブロリズマブとＣＴＬＡ－４ ｍＡｂによって誘発された体重パーセントにおける任意の統計的な差があったかを決定するために、動物内での反復された測定を説明する、固定効果として日及び治療群並びに無作為効果として動物識別子を含む体重の変化に関する混合効果モデルを使用した。
フローサイトメトリーデータについては、ウィルコクソン順位和検定を使用して、統計的有意性を決定し、アルファレベルは０．０５であった。
結果
この研究は、チェックポイント阻害が抗ＣＴＬＡ－４抗体の有効性にとって主要な作用メカニズムではないという証拠を提示した。代わりに、有効性の主要なメカニズムは、腫瘍微小環境におけるＦｃＲ媒介Ｔｒｅｇ枯渇である。研究は、イピリムマブとわずか数アミノ酸だけ異なるが、限定されたチェックポイント阻害活性を有するエピトープでＣＴＬＡ－４に結合するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）（ＧＩＧＡ－５６４）を特定した。驚くべきことに、弱いチェックポイント阻害剤は、マウスモデルにおいてイピリムマブと比較して優れた抗腫瘍活性を有した。弱いチェックポイント阻害剤はまた、より少ないＴｒｅｇ増殖を誘発し、インビトロＦｃＲシグナル伝達及び腫瘍内Ｔｒｅｇのインビボ枯渇を誘発する増加した能力を有する。更なる実験結果は、弱いチェックポイント阻害剤の増強されたＦｃＲ活性が、その増強された抗腫瘍活性に寄与する可能性が高いことを示した。本研究の結果は、弱いチェックポイント阻害がマウスモデルにおいてより低い毒性と関連していることを示した。
本明細書における結果は、イピリムマブと比較して、抗ＣＴＬＡ－４抗体ＧＩＧＡ－５６４をブロックする弱いＢ７リガンドが、ヒトＣＴＬＡ４ノックインマウスモデルにおいてより少ない末梢Ｔｒｅｇ増殖、より効率的な腫瘍内Ｔｒｅｇ枯渇、優れた抗腫瘍有効性、及びより少ない毒性を誘発したことを示した。この研究は、がん患者の転帰を改善するための翻訳の道筋を示す。
研究の結果は、抗ＣＴＬＡ－４薬物の有効性が腫瘍微小環境におけるＴｒｅｇの枯渇によるものであることを示した。抗ＣＴＬＡ－４によるチェックポイント阻害は、必要なく、毒性を引き起こし得る。
発明者らは、驚くべきことに、ＧＩＧＡ－５６４が以下であることを見出した：
（１）限られたチェックポイント阻害活性を有する抗ＣＴＬＡ－４であり、ＧＩＧＡ－５６４は、マウスモデルにおいてイピリムマブに対して優れた有効性を有し、
（２）腫瘍担持マウスにおいてイピリムマブよりも少ないＴｒｅｇ増殖を誘発し、
（３）腫瘍微小環境において優れたＴｒｅｇ枯渇を有し、腫瘍内ＣＴＬＡ－４Ｈｉをより効率的に枯渇させ、
（４）ＣＴＬＡ－４結合ＧＩＧＡ－５６４とＦｃＲとの間の相互作用を介した細胞シグナル伝達を改善させ、
（５）ヒトＣＴＬＡ－４を発現するマウスモデルにおいてイピリムマブよりも少ない毒性を誘発した。
抗ＣＴＬＡ－４抗体の多様なパネルのインビトロ特徴分析
ＣＴＬＡ－４に特異的な天然に対合した単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）のライブラリーは、完全ヒト可変ドメイン及びマウス定常領域を有する抗体を産生する、Ｔｒｉａｎｎｉ Ｍｏｕｓｅ（登録商標）動物を免疫化することによって生成し、次いで、独自のマイクロ流体力学プラットフォーム及び酵母ｓｃＦｖディスプレイを使用して、ＣＴＬＡ－４結合剤を選択した。抗体のうちの１４個は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞において産生された、完全長ヒトＩｇＧ１抗体としてクローニングされ、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって、イピリムマブのそれと類似した、低ナノモル親和性（平均平衡解離定数、ＫＤ：８．７ｎＭ）で組換えヒトＣＴＬＡ－４に結合することが示された（図２０Ａ～２０Ｂ及び表２３）。
全ての１４個のｍＡｂは、無関係な標的ＣＤ２７を発現するＣＨＯ細胞へのオフターゲット結合なしに、ヒトＣＴＬＡ－４を安定して発現するＣＨＯ細胞に結合した（図２０Ｃ及び表２３）。次に、ＣＴＬＡ－４のその内因性リガンド（Ｂ７タンパク質ＣＤ８０及びＣＤ８６）との相互作用をブロックするこれらのｍＡｂの能力を、細胞ベースのアッセイによって評価した。ｍＡｂは、様々な半最大有効濃度（ＥＣ５０、μｇ／ｍＬ、平均：０．３４、範囲：０．１～２．１７）、及び広範囲の最大シグナル（平均：２４０、範囲：１３～５４８）を示し、より低い値は、より少ないブロッキングを示した（図２０Ｄ及び表２３）。親和性ＫＤとブロッキングＥＣ５０との間、又は親和性ＫＤとブロッキング最大シグナルとの間の相関は、有意ではなかった（線形回帰、それぞれ、Ｒ２＝０．０６及びＲ２＝０．１６、ｐ＞０．０５、図２０Ｅ）。この１４個の抗体のセットについて、Ｂ７リガンドブロッキングは、抗ＣＴＬＡ－４結合エピトープの機能であり、ＣＴＬＡ－４結合親和性ではないことが推測された。興味深いことに、その後ＧＩＧＡ－５６４と改名される、ａＣＴＬＡ－４．１５は、高い親和性及び低いブロッキング最大シグナルの組み合わせを示した。
ＦｃＲエフェクター機能はマウスモデルにおけるイピリムマブの抗腫瘍有効性に必要とされる
ＣＴＬＡ－４ ｍＡｂの有効性におけるＴｒｅｇ枯渇の役割には、議論の余地がある。加えて、イピリムマブの抗腫瘍有効性におけるＦｃエフェクター機能の役割は、報告されていない。よって、イピリムマブを含む、従来の抗ＣＴＬＡ－４ ｍＡｂの抗腫瘍効果を、Ｆｃエフェクター機能の存在下及び不在下で調査した。
まず、イピリムマブの野生型ヒトＩｇＧ１及びヒトＩｇＧ１ Ｎ２９７Ｑ変異体Ｆｃバリアント、並びに別の強力なブロッカー、ａＣＴＬＡ－４．２８（図２０及び表２３）を生成した。Ｎ２９７Ｑ変異は、Ｆｃグリコシル化及びＦｃＲに結合する能力を排除し、ＡＤＣＣなどのＦｃエフェクター機能を無効にする。Ｎ２９７Ｑ変異を有するＣＴＬＡ－４ ｍＡｂは、依然としてＣＴＬＡ－４＋ ＣＨＯ細胞に結合することができた（図２１）。イピリムマブはマウスＣＴＬＡ－４に結合しないため、ヒトＣＴＬＡ４コード領域がマウスＣｔｌａ４遺伝子座にノックインされているヒトＣＴＬＡ４ノックイン（ｈＣＴＬＡ－４ ＫＩ）マウスモデルをインビボ有効性研究に使用した。ｈＣＴＬＡ－４ ＫＩ及び野生型マウスのリンパ節におけるＣＤ４従来型Ｔ細胞（ＣＤ４＋ＦＯＸＰ３－）の大部分（それぞれ、８９．９％及び９１．５％）は、ナイーブ（ＣＤ４４ＬｏＣＤ６２Ｌ＋）であり（図１２Ａ）、ＣＴＬＡ－４がｈＣＴＬＡ－４ ＫＩマウスにおいて機能的であることを示した。野生型ヒトＩｇＧ１ Ｆｃを有するイピリムマブアナログ及びａＣＴＬＡ－４．２８の両方は、ｈＣＴＬＡ－４ ＫＩマウスにおけるＭＣ３８腫瘍（結腸がんモデル）の強力な退縮をもたらした（図１２Ｂ）。しかしながら、イピリムマブ＿Ｎ２９７Ｑ又はａＣＴＬＡ－４．２８＿Ｎ２９７で処理されたマウスでは、腫瘍成長は、アイソタイプ対照処理マウスとは有意に異ならなかった（図１２Ｂ）。これらのデータは、イピリムマブを含む、抗ＣＴＬＡ－４ ｍＡｂが、抗腫瘍活性のためにＦｃＲ結合を必要とすること、及びＢ７リガンドのＣＴＬＡ－４への結合をブロックすることが、抗ＣＴＬＡ－４ ｍＡｂの抗腫瘍活性にとって十分ではないことを示した。
ＧＩＧＡ－５６４はＣＴＬＡ－４がＣＤ８０／ＣＤ８６に結合するのをブロックする弱い能力を有する
ＧＩＧＡ－５６４のより弱いブロッキング能力を確認するために、ＥＬＩＳＡを行って、ＣＴＬＡ－４ ｍＡｂの存在下でＣＴＬＡ－４に結合するＣＤ８０又はＣＤ８６の能力を別々に決定した（図１３Ａ）。ｍＡｂのＣＴＬＡ－４への結合が、ＣＴＬＡ－４がリガンドに結合するのをブロックした場合、検出されるリガンドの量は、ｍＡｂ濃度を増加させながら減少する。ＧＩＧＡ－５６４は、曲線が右に強くシフトしたように、ＣＤ８０及びＣＤ８６の両方についてイピリムマブ又はａＣＴＬＡ－４．２８よりもはるかに弱いブロッキング効率を有た（図１３Ｂ及び表２４）。加えて、ＧＩＧＡ－５６４は、最も高い濃度であっても、いずれのリガンドも完全にブロックすることができなかった（図１３Ｂ）。これは、ＣＴＬＡ－４のＣＤ８０及びＣＤ８６への結合を強力にブロックするためにｍＡｂを必要とした、細胞ベースのシグナル伝達アッセイにおいて完全なＣＤ２８シグナル伝達を誘発することができないことと一致している（図２０Ｄ）。
ＧＩＧＡ－５６４及びイピリムマブのＣＴＬＡ－４エピトープにおける重要なアミノ酸は、ショットガン変異誘発エピトープマッピング法を使用して決定した。エピトープマッピングは、ＧＩＧＡ－５６４及びイピリムマブが重複しているが異なるエピトープを有することを明らかにした。特に、Ｋ１３０、Ｙ１３９、Ｌ１４１、及びＩ１４３は、ＧＩＧＡ－５６４及びイピリムマブの両方のエピトープの一部である重要なアミノ酸である（図１３Ｃ～１３Ｄ）。しかしながら、Ｒ７０は、ＧＩＧＡ－５６４ではなく、イピリムマブのエピトープにとって重要なアミノ酸である（図１３Ｃ～１３Ｄ）。重要なことに、Ｒ７０はまた、ＣＴＬＡ－４へのＣＤ８０及びＣＤ８６結合にとって重要である（図１３Ｄ）。イピリムマブと比較してＣＴＬＡ－４がＧＩＧＡ－５６４によって結合している場合、ＣＴＬＡ－４上のＲ７０は、ＣＤ８０及びＣＤ８６に結合するためにより入手可能であり得ると推測され、ＧＩＧＡ－５６４がＣＴＬＡ－４へのＣＤ８０／ＣＤ８６結合を最小限のみブロックする理由を説明した。
ＧＩＧＡ－５６４処理はマウスモデルにおいて抗腫瘍応答を誘発する
ＧＩＧＡ－５６４の抗腫瘍有効性を試験した。ＧＩＧＡ－５６４及び市販のイピリムマブの両方は、５ｍｇ／ｋｇで週２回投与された場合、ｈＣＴＬＡ－４ ＫＩマウスにおけるＭＣ３８腫瘍のほぼ完全な制御をもたらした（図１４Ａ）。同様に、抗ＣＴＬＡ－４に対してより耐性のある、ＲＭ－１腫瘍を担持するｈＣＴＬＡ－４ ＫＩマウス（前立腺がんモデル）では、ＧＩＧＡ－５６４は、５ｍｇ／ｋｇで０、３、及び６日目に投与されると、市販のイピリムマブと同様の腫瘍成長阻害をもたらした（図１４Ｂ）。よって、抗ＣＴＬＡ－４抗腫瘍活性は、複数の腫瘍モデルにおけるＣＴＬＡ－４ブロッキングを介したチェックポイント阻害とは無関係であることが見出された。
５ｍｇ／ｋｇの抗ＣＴＬＡ－４ ｍＡｂの非常に効率的な投与は、イピリムマブ及びＧＩＧＡ－５６４の抗腫瘍有効性における任意の潜在的な相違を特定することを困難にした。したがって、ｈＣＴＬＡ－４ ＫＩマウスにおけるＭＣ３８腫瘍の進行を制御する０．３ｍｇ／ｋｇのイピリムマブ又はＧＩＧＡ－５６４の能力を評価した。ＧＩＧＡ－５６４は、この低用量で市販のイピリムマブよりも腫瘍進行を制限することにおいてより有効であった（図１４Ｃ）。
ＧＩＧＡ－５６４はより少ない末梢Ｔｒｅｇ増殖を誘発し、腫瘍内Ｔｒｅｇを効率的に枯渇させる
ＣＤ３／ＣＤ８０を介して刺激されたＴｒｅｇは、単独のＣＤ３を介して刺激されたＴｒｅｇよりも多く増殖し、ＣＴＬＡ－４ブロックは、外因性ＣＴＬＡ－４－Ｆｃによる阻害を克服する（図２２）。これと一致して、ＣＴＬＡ－４のブロッキング又は急性喪失は、インビボでのＴｒｅｇ増殖を増強する。よって、ＧＩＧＡ－５６４は、イピリムマブよりも少ないＴｒｅｇ増殖を誘発するという仮説が立てられた。この可能性を試験するために、定着したＭＣ３８腫瘍を担持するｈＣＴＬＡ－４ ＫＩマウスを、０、３、及び６日目に５ｍｇ／ｋｇのｍＡｂで処理し、７日目に非流入領域リンパ節からの末梢Ｔ細胞サブセットの増殖状態を分析した（図１５Ａ）。この分析は、イピリムマブが、従来のＴ細胞（Ｔｃｏｎｖ）又はＣＤ８ Ｔ細胞の増殖を増加させるよりも、Ｔｒｅｇの増殖を増加させることを明らかにした（図１５Ａ）。更に、ＧＩＧＡ－５６４は、イピリムマブよりも有意に少ない末梢Ｔｒｅｇ増殖を誘発した（図１５Ａ、ウィルコクソン順位和検定、ｐ＝＜０．０５）。これらのデータは、ＧＩＧＡ－５６４がＣＴＬＡ－４のそのＢ７リガンドとの相互作用を弱くブロックするのみであることを示したインビトロデータと一致している（図１３Ｂ、図２０Ｄ、及び表２３）。
腫瘍内Ｔｒｅｇは、エフェクターＴ細胞又は末梢Ｔｒｅｇよりも多くの表面ＣＴＬＡ－４を発現する。よって、抗体のＦｃＲエフェクター機能活性は、細胞表面に結合する抗体の量に依存するため、ＣＴＬＡ－４ ｍＡｂは、腫瘍内Ｔｒｅｇを選択的に枯渇させる。更に、腫瘍微小環境（ＴＭＥ）におけるＣＴＬＡ－４Ｈｉ Ｔｒｅｇの抗体媒介枯渇は、抗体投与後の最初の２４時間以内に開始することが示された。よって、腫瘍内Ｔｒｅｇを枯渇させるＧＩＧＡ－５６４の能力を決定するために、定着したＭＣ３８腫瘍を担持するｈＣＴＬＡ－４ ＫＩマウスを５ｍｇ／ｋｇのアイソタイプ、イピリムマブ、又はＧＩＧＡ－５６４で処理し、次いで末梢及び腫瘍におけるＴｒｅｇ集団をフローサイトメトリーによって１日後に分析した。両方の抗ＣＴＬＡ－４抗体が腫瘍内Ｔｒｅｇを枯渇させたが（ウィルコクソン順位和検定、ｐ＜０．０５）、末梢Ｔｒｅｇを枯渇させなかった（図１５Ｂ、ウィルコクソン順位和検定、ｐ＞０．０５）ことが見出された。ＧＩＧＡ－５６４が投与された動物について、残りの腫瘍内Ｔｒｅｇの集団は、イピリムマブが投与された動物からの類似集団よりも低いＣＴＬＡ－４平均蛍光強度（ＭＦＩ）を有したことも見出された（図１５Ｃ～１５Ｄ、ウィルコクソン順位和検定、ｐ＜０．０５）。加えて、ＧＩＧＡ－５６４は、イピリムマブと比較して腫瘍内ＣＤ８／Ｔｒｅｇ比を弱く増強した（図１５Ｅ）。ＧＩＧＡ－５６４は、ＣＴＬＡ－４Ｈｉ腫瘍内Ｔｒｅｇを枯渇させることにおいてより効果的であり、これは、ＧＩＧＡ－５６４によって誘発される低減したＴｒｅｇ増殖に加えて、ＧＩＧＡ－５６４が低用量で腫瘍成長を制御することにおいてイピリムマブよりも優れている理由を説明し得る。結果は、ＧＩＧＡ－５６４が腫瘍内Ｔｒｅｇを除去することを示す。ＭＣ３８腫瘍を有するヒトＣＴＬＡ－４ノックインマウスを、５ｍｐｋのイピリムマブ又はＧＩＧＡ－５６４で処理し、１日後に屠殺した。フローサイトメトリーは、ＧＩＧＡ－５６４が腫瘍微小環境におけるＣＴＬＡ－４＋ Ｔｒｅｇを枯渇させることにおいてイピルマブよりも効率的であることを示した。
２又は３用量のＧＩＧＡ－５６４又はイピリムマブで処理された定着したＭＣ３８腫瘍を有するｈＣＴＬＡ－４ ＫＩマウスのＴＭＥ又は末梢リンパ節の追加のフロー分析を行った（それぞれ、４日目又は７日目に採取）。追加の処理を行っても、ＧＩＧＡ－５６４及びイピリムマブの両方は、腫瘍内Ｔｒｅｇを特異的に枯渇させることはできたが、末梢Ｔｒｅｇを枯渇させることはできなかった（図２３）。
ＧＩＧＡ－５６４はイピリムマブよりも多くのＦｃＲシグナル伝達を誘発する
イピリムマブと比較した低用量ＧＩＧＡ－５６４の増加した有効性（図１４Ｃ）は、部分的には、ＧＩＧＡ－５６４がＣＴＬＡ－４Ｈｉ腫瘍内Ｔｒｅｇを枯渇させる増強された能力に起因し得る（図１５Ｃ～１５Ｅ）。これを調査するために、マウスＦｃＲシグナル伝達を誘発するＧＩＧＡ－５６４及びイピリムマブの能力を比較した。ＣＴＬＡ－４を安定して発現するＣＨＯ細胞と共培養される場合、ＧＩＧＡ－５６４は、ＦｃγＲＩＩＩではなく、マウスＦｃγＲＩＶを発現するＪｕｒｋａｔエフェクター細胞においてイピリムマブよりも多くのＦｃＲシグナル伝達をもたらしたことが見出された（図１６Ａ及び表２５）。ＧＩＧＡ－５６４によって誘発されるこの増加したＦｃγＲＩＶシグナル伝達は、ＧＩＧＡ－５６４がイピリムマブよりも腫瘍内Ｔｒｅｇをより効率的に枯渇させる理由を説明し得る。
ＧＩＧＡ－５６４によって誘発される増加したマウスＦｃγＲＩＶシグナル伝達は、ｈＣＴＬＡ－４ ＫＩ ＭＣ３８腫瘍担持マウスにおいてＧＩＧＡ－５６４によって誘発される増強された腫瘍内Ｔｒｅｇの枯渇及び有効性に寄与し得るため、ＧＩＧＡ－５６４がまたより多くのヒトＦｃＲシグナル伝達を誘発するかを決定することは重要であった。ＧＩＧＡ－５６４は、イピリムマブよりも多くのヒトＦｃγＲＩＩＩａシグナル伝達を誘発したことがわかった（図１６Ｂ及び表２５）。しかしながら、ＧＩＧＡ－５６４によって誘発される増加したＦｃＲシグナル伝達は、ＦｃＲ特異的であった（図１６Ｃ～１６Ｄ及び表２５）。翻訳の観点から、ＧＩＧＡ－５６４は、特にＦｃγＲＩＩＩａの発現がバイオマーカーとして使用される場合、ＦｃＲシグナル伝達、及びよって患者におけるＦｃＲエフェクター機能を誘発する増加した能力を有し得る。
より低いｐＨで低減した結合を有するＣＴＬＡ－４ ｍＡｂは、初期エンドソームにおいてＣＴＬＡ－４から解離するため、Ｔｒｅｇの表面上に蓄積する増強された能力を有することが以前に示された。仮説は、低ｐＨでの低減した結合が、より多くのＣＴＬＡ－４再利用、及びよってより多くの合計ＣＴＬＡ－４表面発現を可能にするというものである。低ｐＨでの低減した結合を有するＣＴＬＡ－４ ｍＡｂは、ＴＭＥにおけるＣＴＬＡ－４に対して末梢におけるＣＴＬＡ－４に選択的に結合するであろう。この研究の目的は、腫瘍内Ｔｒｅｇを標的とするＣＴＬＡ－４ ｍＡｂを生成することであったため、いくつかのＣＴＬＡ－４ ｍＡｂのｐＨ感受性が決定され、ＧＩＧＡ－５６４が、しばしばＴＭＥに存在するより低いｐＨを含む、全ての試験されたｐＨでＣＴＬＡ－４に同様に結合したことがわかった（図２４Ａ）。
ＦｃＲシグナル伝達はまた、細胞表面上に蓄積する抗体の量及びＦｃＲに対するｍＡｂのＦｃ部分の親和性を含む、いくつかの他の因子によって影響され得る。イピリムマブよりもＧＩＧＡ－５６４がＣＴＬＡ－４＋細胞の表面上に蓄積するという証拠は見られなかった（図２４Ｂ）。ＦｃγＲＩＩＩａについてのＦｃの親和性は、低フコシル化が、ＦｃのＦｃγＲＩＩＩａ及びよってＡＤＣＣについての親和性を増強するため、Ｆｃグリコシル化、特にＦｃフコシル化によって部分的に制御される。ＥｘｐｉＣＨＯ細胞において一過性に発現したＧＩＧＡ－５６４は、イピリムマブよりもフコシル化されていないが、ＧＩＧＡ－５６４を安定して発現するＣＨＯ細胞プールは、９５％フコシル化された材料を産生したことがわかった（図２４Ｃ）。ヒトＦｃγＲＩＩＩａアッセイは、各調製物におけるＧＩＧＡ－５６４低フコシル化の量がＦｃγＲＩＩＩａシグナル伝達と相関したことが明らかになった（図２４Ｄ）。したがって、ＧＩＧＡ－２３２８の低フコシル化形態は、実施例１７に記載されるように生成された。
更なる調査は、ＧＩＧＡ－５６４が、減少した低フコシル化の文脈でも、イピリムマブよりも高いＦｃＲ活性を依然として示すことを明らかにした（図２４Ｅ）。ＧＩＧＡ－５６４の増加したＦｃＲ活性は、その増強された抗腫瘍有効性に寄与する可能性が高く、これは、ＧＩＧＡ－５６４がまた増強されたヒトＦｃγＲＩＩＩａシグナル伝達を誘発するため、十分に患者に翻訳され得る。
ＧＩＧＡ－５６４は持続的な抗腫瘍免疫応答を誘発する
第１世代抗ＣＴＬＡ－４は、持続的な抗腫瘍免疫をもたらしたが、最小限のブロッキング活性を有する抗ＣＴＬＡ－４の持続的な抗腫瘍免疫応答を誘発する能力についてはほとんど知られていない。この翻訳上重要な問題を調査するために、定着したＭＣ３８腫瘍を担持するｈＣＴＬＡ－４ ＫＩマウスを、０、３、及び６日目に、対照（アイソタイプ）、イピリムマブ、又はＧＩＧＡ－５６４で、約５０％の動物（５／８のイピリムマブ処理動物及び５／９のＧＩＧＡ－５６４処理動物）において持続的完全奏効を誘発したイピリムマブのＦＤＡ承認用量である、１ｍｇ／ｋｇで処理した（図６Ａ）。次いで、４３日目に完全奏効を有する動物を、元の腫瘍部位とは反対側の側腹部にＭＣ３８腫瘍細胞で再チャレンジした。市販のイピリムマブで以前に処理された群における全ての持続的完全レスポンダー、及びＧＩＧＡ－５６４で以前に処理された群における持続的完全レスポンダーの４／５は、再チャレンジ部位で腫瘍を発生させなかった（図１７Ｂ）。よって、ＧＩＧＡ－５６４、最小限のブロッキング活性を有する抗ＣＴＬＡ－４は、遠隔部位での腫瘍発生を防止することによって、持続的な抗腫瘍免疫をもたらす。
ＧＩＧＡ－５６４はマウスモデルにおいてイピリムマブよりも低い毒性を誘発する
クリニックでは、ＣＴＬＡ－４抗体は、最も頻繁にＰＤ－１抗体と組み合わせて使用されるが、この組み合わせは、重度の有害事象を比較的高頻度で誘発し得る。よって、増強された効力及び低減した毒性を有するＣＴＬＡ－４ ｍＡｂは、患者に有益であろう。いくつかの証拠は、従来のＣＴＬＡ－４ ｍＡｂによって誘発される毒性のかなりの部分が、ＣＤ８０及びＣＤ８６に結合することからＣＴＬＡ－４をブロックすることを通して生じる可能性が高いことを明らかにする。これは、最小限のブロッキング活性を有するＣＴＬＡ－４ ｍＡｂが、増強された抗腫瘍有効性を有するだけでなく、より低い毒性ももたらし得ることを示す。したがって、イピリムマブ及びＧＩＧＡ－５６４によって誘発される毒性を抗ＰＤ－１の存在下で比較した。
ＣＴＬＡ－４ ｍＡｂで処理されたｈＣＴＬＡ－４ ＫＩマウスは、患者においてＣＴＬＡ－４ ｍＡｂによって誘発された毒性のいくつかを反復することが示されており、ＢＡＬＢ／ｃマウスの抗マウスＣＴＬＡ－４抗体での繰り返された処理は、腸炎症を誘発することが示された。
よって、本研究では、ＢＡＬＢ／ｃバックグラウンド上のｈＣＴＬＡ－４／ｈＰＤ－１ダブルノックインマウスを、ビヒクル、ペムブロリズマブ、ペムブロリズマブとイピリムマブ、又はペムブロリズマブとＧＩＧＡ－５６４で３日毎に９用量にわたって処理した（図１８Ａ）。最後の用量の１週間後、マウスを安楽死させ、組織を病理分析のために採取した（図１８Ｂ～１８Ｃ及び図２５Ａ～２５Ｂ）。組織病理学的分析は、ペムブロリズマブとＧＩＧＡ－５６４ではなく、ペムブロリズマブとイピリムマブが、ビヒクル処理マウス又はペムブロリズマブ単独で処理されたマウスよりも多くの結腸上皮損傷及び皮膚炎症を誘発したことを明らかにしたが（図１８Ｂ～１８Ｃ）、両方の併用処理は、心臓への免疫細胞浸潤のわずかな増加をもたらした（図２５Ｃ～２５Ｄ）。ＣＴＬＡ－４ ｍＡｂは、Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンド上のｈＣＴＬＡ－４ ＫＩマウスにおいて腎臓沈着を誘発することが示されているため、ビヒクル、５ｍｇ／ｋｇのイピリムマブ、又は５ｍｇ／ｋｇのＧＩＧＡ－５６４で週に２回、５用量にわたって処理されたＭＣ３８腫瘍を有するｈＣＴＬＡ－４ ＫＩマウスからの処理の開始後２０日目に腎臓を採取した（図１４Ａ）。腎臓は、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）ブロック中に処理した。ＦＦＰＥ切片は、抗マウス免疫グロブリンについて染色し、研究から盲検化された委員会認定獣医病理学者によってスコアが付けられた。ＧＩＧＡ－５６４ではなく、イピリムマブは、マウスＩｇ沈着を伴う糸球体のパーセントを有意に増加させ（図２５Ｅ）、イピリムマブがｈＣＴＬＡ－４ ＫＩマウスにおいてＧＩＧＡ－５６４よりも多くの腎臓損傷を誘発することを示す。よって、ＧＩＧＡ－５６４は、これらのマウスモデルにおいてイピリムマブよりも低い毒性を誘発する。
結論として、ＧＩＧＡ－５６４は、複数のマウスモデル（図１９）において有効性が増強されたが、毒性が低減した最小限のＢ７リガンドブロッキング活性を有する新規ＣＴＬＡ－４ ｍＡｂであり、ＣＴＬＡ－４チェックポイント阻害を低減することが有効性及び安全性の両方について翻訳的に関連する利益をもたらすことを示す。
本明細書では、そのＣＤ８０／ＣＤ８６リガンドへのＣＴＬＡ－４結合をブロックする最小限の能力及び増強されたＦｃＲ活性を有する抗ＣＴＬＡ－４である、ＧＩＧＡ－５６４は、ヒトＣＴＬＡ－４を発現するマウスモデルにおいてイピリムマブと比較して優れた抗腫瘍活性及び低減した毒性を有したことが示された。ｈＣＴＬＡ－４ ＫＩマウスでは、イピリムマブが、ＣＤ４＋ＦＯＸＰ３－又はＣＤ８ Ｔ細胞の増殖よりもＴｒｅｇ増殖を増強したことがわかった。ＧＩＧＡ－５６４は、第１世代の抗ＣＴＬＡ－４ ｍＡｂイピリムマブと比較される場合、マウスモデルにおいてより少ないＴｒｅｇ増殖及び増加した抗腫瘍活性をもたらす。
腫瘍内Ｔｒｅｇの抗ＣＴＬＡ－４媒介枯渇は、一過性であり得ることが最近示され、抗ＣＴＬＡ－４療法後の全ての時点で腫瘍内Ｔｒｅｇ枯渇が明らかではない理由を説明している。よって、１つの可能性は、末梢Ｔｒｅｇの抗ＣＴＬＡ－４媒介増殖が、腫瘍内Ｔｒｅｇニッチを再播種するリザーバーを提供することである。加えて、ここで主に使用されるＭＣ３８モデルでは抗ＣＴＬＡ－４ ｍＡｂが腫瘍内Ｔｒｅｇの枯渇を効率的に誘発するが、患者において腫瘍内Ｔｒｅｇを枯渇させる抗ＣＴＬＡ－４の能力は、変動可能であると予想される。これは、腫瘍内ＴｒｅｇによるＣＴＬＡ－４の発現が、ＣＴＬＡ－４Ｈｉ Ｔｒｅｇの抗体依存的殺滅を媒介することができる、ＦｃＲの親和性と同様に、患者間及び患者内で変動するためである。更に、ＧＩＧＡ－５６４は、抗ＰＤ－１が誘発し得る腫瘍内Ｔｒｅｇを枯渇させることが期待されるため、抗ＰＤ－１と十分に相乗作用し得る。
いくつかの証拠は、ＣＤ８０／ＣＤ８６に結合するＣＴＬＡ－４の能力をブロックすることが、第一世代のＣＴＬＡ－４ ｍＡｂによって誘発される重度の有害事象に強く寄与し得ることを示す。まず、そのＢ７リガンドへのＣＴＬＡ－４の結合を減少させるヒトにおけるＣＴＬＡ４変異は、脳、胃腸管、及び肺への免疫浸潤に関連しており、下痢、大腸炎、リンパ球性間質性肺疾患、及び時には自己免疫性甲状腺炎を引き起こし得る。臨床的には、ＣＨＡＩ患者（自己免疫浸潤を伴うＣＴＬＡ－４ハプロ不全）の胃腸生検は、抗ＣＴＬＡ－４ブロッキング抗体で治療された患者を連想させることも報告されている。他の関連する臨床データは、Ｂ７タンパク質ＣＤ８０及びＣＤ８６に強く結合する、アバタセプト（ＣＴＬＡ－４－Ｉｇ）での治療後に報告されている。この研究は、ペムブロリズマブとＧＩＧＡ－５６４が、ＢＡＬＢ／ｃバックグラウンド上のヒトＣＴＬＡ－４／ＰＤ－１ダブルノックインマウスにおいてペムブロリズマブとイピリムマブよりも少ない結腸上皮損傷及び皮膚病理を誘発したことを見出した。患者における胃腸及び皮膚の有害事象は、イピリムマブ又はイピリムマブと抗ＰＤ－１の療法に関連する最も一般的な重度の有害事象に含まれる。
よって、本明細書に示されるデータは、ＧＩＧＡ－５６４の臨床翻訳が、従来のＣＴＬＡ－４ ｍＡｂに一般的に関連するこれらの有害事象の低減した割合をもたらし、よって患者に利益をもたらし得ることを示した。
驚くべきことに、ＧＩＧＡ－５６４は、インビトロ及びインビボで増強されたＦｃＲ活性を有することが見出された。増強されたＦｃＲ活性を有する次世代の抗ＣＴＬＡ－４は、改善された抗腫瘍有効性を有するため、ＧＩＧＡ－５６４の増強されたＦｃＲ活性は、このｍＡｂの改善された抗腫瘍有効性に寄与する可能性がある。本明細書に提示されるデータは、一過性に産生されたＧＩＧＡ－５６４の増強されたＦｃＲ機能が、この材料の部分的低フコシル化状態に起因し得ることを示すが、更なる調査は、ＧＩＧＡ－５６４が、減少した低フコシル化の文脈でも依然としてより高いヒトＦｃγＲＩＩＩａ活性を示したことを明らかにし、我々の結果が患者に翻訳されることを示す。注目すべきは、マウス毒性研究において使用されたＧＩＧＡ－５６４材料は、比較的高レベルの低フコシル化（８０．９％）及びＦｃエフェクター機能を有し、従来の抗ＣＴＬＡ－４ ｍＡｂによって誘発される有害事象の誘発におけるチェックポイント阻害の役割を更に強調した。
ＣＴＬＡ－４ ｍＡｂのＦｃＲ機能を増強することが報告されている別の戦略は、酸性ｐＨでＣＴＬＡ－４から解離するｍＡｂの選択であり、ＣＴＬＡ－４の増強された再利用及び細胞表面上での抗ＣＴＬＡ－４ ｍＡｂの蓄積をもたらす。しかしながら、腫瘍微小環境は、多くの場合酸性であり、よって中性ｐＨで優先的に結合する抗ＣＴＬＡ－４は、まさにＴｒｅｇを選択的に枯渇させることを目的とした、腫瘍微小環境においてＣＴＬＡ－４に結合することができなくなるであろう。重要なことに、ＧＩＧＡ－５６４は、低ｐＨで効率的にＣＴＬＡ－４に結合することができ、よって腫瘍内Ｔｒｅｇを標的とすることができる。
抗ＣＴＬＡ－４のＦｃＲ依存的活性は、免疫シナプスから離れてＣＴＬＡ－４保持するＦｃＲに起因し得、よってＣＴＬＡ－４／Ｂ７免疫チェックポイントを更に機能的に阻害する役割を果たすと主張されてきた。ＣＴＬＡ－４はＴｒｅｇによって最も高度に発現され、共刺激はまたＴｒｅｇ増殖に重要であるため、そのＢ７リガンドに結合するＣＴＬＡ－４の能力をブロックする抗ＣＴＬＡ－４は、顕著なＴｒｅｇ増殖を誘発する。よって、ＧＩＧＡ－５６４がそのＢ７リガンドに結合するＣＴＬＡ－４の能力を弱くブロックするのみであり、増強されたＦｃＲ活性を有するが、イピリムマブよりも少ないＴｒｅｇ増殖を誘発するという事実は、抗ＣＴＬＡ－４のＦｃ活性がそのＢ７リガンドに結合する抗ＣＴＬＡ－４の能力を阻害することにほとんど役割を果たさないことを示す。
結論として、本出願の発明者らは、弱いブロッキングＣＴＬＡ－４ ｍＡｂ ＧＩＧＡ－５６４が、末梢Ｔｒｅｇの増殖を低減し、腫瘍内ＣＴＬＡ－４Ｈｉをより効率的に枯渇させ、ヒトＣＴＬＡ－４を発現するマウスモデルにおいてイピリムマブよりも少ない毒性を誘発しながら優れた抗腫瘍活性を有したことを示した。
８．１５．実施例１４：細胞表面上でｃｙｎｏ ＣＴＬＡ－４を発現するＣＨＯ細胞の開発及び検証
細胞表面上でカニクイザルＣＴＬＡ－４に結合するＧＩＧＡ－５６４対イピリムマブ（Ｉｐｉ）の能力を決定するために、カニクイザルＣＴＬＡ－４（ｃｙｎｏ ＣＴＬＡ－４）又はヒトＣＴＬＡ－４（ｈＣＴＬＡ－４）を安定して発現するＣＨＯ細胞を生成した。
ｃｙｎｏ ＣＴＬＡ－４又はｈＣＴＬＡ－４＋ ＣＨＯ細胞に結合する、ＰＥ標識抗ＣＴＬＡ－４抗体、クローンＬ３Ｄ１０又はＢＮＩ３の能力を試験して、これらの細胞の表面上でのｃｙｎｏ ＣＴＬＡ－４又はｈＣＴＬＡ－４の発現を検証した。
この実験では、親ＣＨＯ細胞及びｃｙｎｏ ＣＴＬＡ－４ ＣＨＯ細胞又はｈＣＴＬＡ－４ ＣＨＯ細胞（各細胞株１Ｅ６細胞）をまずＭＡＣＳ緩衝液（ＤＰＢＳ＋０．５％ＢＳＡ＋２ｍＭのＥＤＴＡ）で洗浄し、次いでＰＥ標識抗ＣＴＬＡ－４クローンＬ３Ｄ１０又はＢＮＩ３のいずれかとインキュベートした。その後、細胞をＭＡＣＳ緩衝液で２回洗浄して、過剰な結合していない抗体を除去した。次いで、細胞表面上のｃｙｎｏ又はヒトＣＴＬＡ－４へのｍＡｂの結合をフローサイトメトリーによって分析した（図３４）。図３４のフローヒストグラムは、ｃｙｎｏ ＣＴＬＡ－４及びｈＣＴＬＡ－４ ＣＨＯ細胞株が、抗ＣＴＬＡ－４クローンＬ３Ｄ１０又はＢＮＩ３によって結合した細胞表面上で抗原を発現することを示し、これは、それぞれ、これらの細胞株の表面上でのｃｙｎｏ又はヒトＣＴＬＡ－４の発現を検証する。
８．１６．実施例１５：ＧＩＧＡ－５６４はイピリムマブと比較して低減したｃｙｎｏ ＣＴＬＡ－４に結合する能力を有する
哺乳動物細胞の表面上に発現したカニクイザル（ｃｙｎｏ）及びヒトＣＴＬＡ－４に結合するＧＩＧＡ－５６４の能力を決定するために、親ＣＨＯ細胞及びｃｙｎｏ ＣＴＬＡ－４ ＣＨＯ細胞又はｈＣＴＬＡ－４ ＣＨＯ細胞（各細胞株１Ｅ６細胞）をまずＭＡＣＳ緩衝液（ＤＰＢＳ＋０．５％ＢＳＡ＋２ｍＭのＥＤＴＡ）で洗浄し、次いで１０ｕｇ／ｍＬのイピリムマブ、アテゾリズマブ（陰性対照）、又はＧＧ－５６４と４℃でインキュベートした。
その後、細胞をＭＡＣＳ緩衝液で２回洗浄して、過剰な結合していない抗体を除去した。次いで、結合したヒト抗体を検出するために、細胞をＰＥ標識ラット抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ抗体で染色した。染色後、細胞をＭＡＣＳ緩衝液で２回洗浄して、過剰な結合していないＰＥコンジュゲート型抗ヒト抗体を除去した。次いで、ｃｙｎｏ又はヒトＣＴＬＡ－４＋ ＣＨＯ細胞へのｍＡｂの結合をフローサイトメトリーによって分析した。図３５は、ＧＩＧＡ－５６４及びイピリムマブ（Ｉｐｉ）がｈＣＴＬＡ－４に結合する比較的類似した能力を有することを示すが、Ｉｐｉと比較して、ＧＩＧＡ－５６４が細胞表面上に発現したｃｙｎｏ ＣＴＬＡ－４に結合する大幅に低減した能力を有する。結果は、Ｉｐｉ及びＧＩＧＡ－５６４が異なるＣＴＬＡ－４エピトープに結合することを示す。
次に、組換えカニクイザルＣＴＬＡ－４（ｒｃｍＣＴＬＡ－４）に結合するＧＩＧＡ－５６４の能力をＥＬＩＳＡによって試験した。
これらのＥＬＩＳＡでは、Ｆｃキメラ及びｈｉｓタグ付きフォーマットを含む、複数の製造業者から供給された様々なＣＴＬＡ－４タンパク質へのＧＩＧＡ－５６４の結合を試験した。ＧＩＧＡ－５６４のＦｃキメラＣＴＬＡ－４タンパク質への結合を試験するために、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ（９３３６－ＣＴ－２００、図３６Ａ）、Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ（９０２１３－Ｃ０２Ｈ、図３６Ｂ）、又はＡＣＲＯＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（ＣＴ４－Ｃ５２５６、図３６Ｃ）からのｒｃｍＣＴＬＡ－４－Ｆｃを、別々のＥＬＩＳＡプレートの一方の半分に１ｕｇ／ｍＬでコーティングした。Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（７２６８－ＣＴ－１００、図３６Ａ～３６Ｃ）からの組換えヒトＣＴＬＡ－４－Ｆｃ（ｒｈＣＴＬＡ－４）を、プレートの各々の他方の半分に、１ｕｇ／ｍＬでコーティングした。同様に、ＧＩＧＡ－５６４のｈｉｓタグ付きＣＴＬＡ－４への結合を試験するために、Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ（９０２１３－Ｃ０８Ｈ、図３６Ｄ）又はＡＣＲＯＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（ＣＴ４－Ｃ５２２７、図３６Ｅ）からのｒｃｍＣＴＬＡ－４－Ｈｉｓを、別々のＥＬＩＳＡプレートの一方の半分に１ｕｇ／ｍＬでコーティングした。ＲｈＣＴＬＡ－４－Ｆｃ（ＡＣＲＯＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＣＴ４－Ｈ５２２９、図３６Ｄ～Ｅ）を、これらのプレートの各々の他方の半分に、１ｕｇ／ｍＬでコーティングした。コーティング後、プレートを４℃で一晩インキュベートした。
翌日、プレートを室温でプレートシェーカー上で１時間ＰＢＳＴ中の５％ミルクでブロックした。イピリムマブ、アテゾリズマブ（陰性対照）、及びＧＧ－５６４（５ｕｇ／ｍＬで開始）の一連の滴定をプレートに加え、室温で１時間プレートシェーカー上でインキュベートして、ｍＡｂ結合を可能にした。ＰＢＳＴで洗浄することによって、過剰な、結合していないｍＡｂを除去した。次いで、結合したｍＡｂを、ＨＲＰコンジュゲート抗カッパ軽鎖抗体（０．５ｕｇ／ｍｌ、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ ２０６０－５０）で検出した。室温で１時間プレートシェーカー上でインキュベーション及び洗浄後、プレートをＴＭＢ基質で展開した。十分なシグナルが達成された後、１Ｎ塩酸を加えて展開を停止した。Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ ｉ３ｘプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して、４５０ｎｍでの吸光度を読み取った。ＥＣ５０値を、Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ）を使用して吸光度対濃度の対数をプロットすることによって計算した。Ｉｐｉは、ヒト及びｃｙｎｏ ＣＴＬＡ－４への同様の結合を有するため、ほとんどの場合、ＧＩＧＡ－５６４は、ヒトＣＴＬＡ－４と比較して低減したｃｙｎｏ ＣＴＬＡ－４に結合する能力を有した。これらの結果は、Ｉｐｉ及びＧＩＧＡ－５６４エピトープが実際には異なることを示す。
表２８は、ＥＬＩＳＡアッセイで試験される各抗体のＥＣ５０値及び倍率変化を示す。
８．１７．実施例１６：ＧＩＧＡ－５６４、ＧＩＧＡ－２３２８、及びイピリムマブのフコシル化分析
表３０は、操作されていないフコシル化で産生されたＧＩＧＡ－５６４及びイピリウムマブのフコシル化分析を示し、表３１は、低フコシル化を促進する条件で産生されたＧＩＧＡ－５６４及びイピリウムマブのフコシル化分析を示す。各抗体をＰＮＧａｓｅ Ｆで消化して、グリカンを遊離させた。グリカンを単離し、ＧｌｙｋｏＰｒｅｐ ＩｎｓｔａｎｔＡＢ標識キット（Ｐｒｏｚｙｍｅ）を製造業者の指示に従って使用して、蛍光分子で標識した。標識されたグリカンを、蛍光検出器を備えた超高速液体クロマトグラフィー（ＵＰＬＣ）システム上のＸＢｒｉｄｇｅ Ａｍｉｄｅカラムに注射した。ピークは、Ｇｌｙｋｏ ＩｎｓｔａｎｔＡＢ二分岐及び高マンノース分割ライブラリー標準（Ｐｒｏｚｙｍｅ）からの既知のグリカンに基づいて特定され、各グリコフォームの合計パーセントは、全てのピークの曲線下面積の合計で割った特定されたピーク下の積分面積として報告された。各値は、示されたロットの独立した測定値を表す。複数の測定が行われた場合、最小値、最大値、及び平均値も提供される。
ＧＩＧＡ－２３２８は、ＦｃγＲＩＩＩａシグナル伝達を増強する目的で低いフコシル化を有するように設計された。図４１に示されるように、Ｐｒｏｍｅｇａ ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎからのヒトＦｃγＲＩＩＩａ、Ｖバリアント（Ｇ７０１１）のＡＤＣＣレポーターバイオアッセイを、製造業者の指示に従って実施した。簡潔には、細胞表面発現を増強するＹ２０１Ｇ変異を有するヒトＣＴＬＡ－４を安定して発現するＣＨＯ標的細胞を、示された抗体を含むＲＰＭＩ１６４０＋４％ＦＢＳ培地に懸濁し、３０分間３７℃でインキュベートした。ヒトＦｃγＲＩＩＩａ、Ｖバリアントを発現するＪｕｒｋａｔ／ＮＦＡＴ－Ｌｕｃエフェクター細胞を、５：１のエフェクター：標的比で各ウェルに添加し、３７℃で６時間インキュベートした。ルシフェラーゼ活性を、含まれるＢｉｏ－Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイ試薬とＳｐｅｃｔｒａＭａｘ ｉ３ｘリーダーを使用することによって測定した。相対発光量（ＲＬＵ）で測定されたルシフェラーゼ活性を、抗体の濃度に対してプロットした。
各抗体をＰＮＧａｓｅ Ｆで消化して、グリカンを遊離させた。グリカンを単離し、ＧｌｙｋｏＰｒｅｐ ＩｎｓｔａｎｔＡＢ標識キット（Ｐｒｏｚｙｍｅ）を製造業者の指示に従って使用して、蛍光分子で標識した。標識されたグリカンを、蛍光検出器を備えた超高速液体クロマトグラフィー（ＵＰＬＣ）システムＵＰＬＣ上のＸＢｒｉｄｇｅ Ａｍｉｄｅカラムに注射した。ピークは、Ｇｌｙｋｏ ＩｎｓｔａｎｔＡＢ二分岐及び高マンノース分割ライブラリー標準（Ｐｒｏｚｙｍｅ）からの既知のグリカンに基づいて特定され、各グリコフォームの合計パーセントは、全てのピークの曲線下面積の合計で割った特定されたピーク下の積分面積として報告された。
図４２Ａ～４２Ｂ．ＧＩＧＡ－５６４は、ＣＴＬＡ－４を発現する標的細胞株に対するヒトＰＢＭＣによる抗体依存的細胞傷害（ＡＤＣＣ）及び／又は抗体依存的細胞食作用（ＡＤＣＰ）を誘発する。２人のドナーからの凍結保存されたヒトＰＢＭＣを解凍し、１００Ｕ／ｍＬのＩＬ－２及び１０％ＦＢＳを含有するＲＭＰＩ培地で一晩回復させた。細胞表面発現を増強するＹ２０１Ｇ変異を有するヒトＣＴＬＡ－４を安定に発現するＣＨＯ標的細胞を、ＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）で染色し、次いでＧＩＧＡ－５６４又はヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照のいずれかと示された濃度で３７℃で３０分間インキュベートした。次いで、ＰＭＢＣエフェクター細胞を２０：１のエフェクター対標的比で添加し、試料を４時間３７℃でインキュベートしてＡＤＣＣを可能にした。次いで、試料をＭＡＣＳ緩衝液で洗浄し、死細胞を標識する生存性色素７－アミノアクチノマイシンＤ（７－ＡＡＤ）で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。（図４２Ａ）ＡＤＣＣを決定する代表的なゲーティング戦略。試料は、まず標的細胞（ＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ＋）、次いで単細胞、次いで死細胞（７－ＡＡＤ＋）にゲートをかけた。（図４２Ｂ）ＧＩＧＡ－５６４及びヒトＩｇＧ１アイソタイプの各濃度での死細胞パーセントのプロット。ＧＩＧＡ－５６４は、アイソタイプ対照よりも高い死ＣＴＬＡ－４＋標的細胞パーセントをもたらす。
８．１８．実施例１７：ＦｃγＲＩＩＩａシグナル伝達に対する異なるＩｇＧ１アロタイプの効果
ＩｇＧ１アロタイプは、ＦｃγＲＩＩＩａ受容体を介したシグナル伝達に影響を与え得る。図４３Ａは、ＣＨ１ドメインにおいて１つのアミノ酸が異なる、ＩｇＧ１アロタイプＩＧＨＧ１＊０８及びＩＧＨＧ１＊０１の配列情報を示す。これらの２つのアロタイプ間の異なる残基が強調表示され、参照のために周囲の残基が提供される。位置は、ＩＭＧＴ及びＥＵナンバリングの両方で与える。
図４３Ｂは、臨床イピリムマブ（Ｙｅｒｖｏｙ）がＩＧＨＧ１＊０８アロタイプを使用し、ＩＧＨＧ１＊０１を使用する、ＧｉｇａＧｅｎによって産生されたイピリムマブ及びＧＩＧＡ－５６４よりも低いＦｃγＲＩＩＩａシグナル伝達をもたらすことを示す。これらの結果は、アロタイプがＦｃγＲＩＩＩａシグナル伝達に影響を与え得ることを示す。ヒトＦｃγＲＩＩＩａ、Ｖバリアント（Ｇ７０１１）のＡＤＣＣレポーターバイオアッセイは、Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから購入した。アッセイは、製造業者の指示に従って実施した。簡潔には、細胞表面発現を増強するＹ２０１Ｇ変異を有するヒトＣＴＬＡ－４を安定して発現するＣＨＯ標的細胞を、示された抗体を含むＲＰＭＩ１６４０＋４％ＦＢＳ培地に懸濁し、３０分間３７℃でインキュベートした。ヒトＦｃγＲＩＩＩａ、Ｖバリアントを発現するＪｕｒｋａｔ／ＮＦＡＴ－Ｌｕｃエフェクター細胞を、５：１のエフェクター：標的比で各ウェルに添加し、３７℃で６時間インキュベートした。ルシフェラーゼ活性を、含まれるＢｉｏ－Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイ試薬とＳｐｅｃｔｒａＭａｘ ｉ３ｘリーダーを使用することによって測定した。相対発光量（ＲＬＵ）で測定されたルシフェラーゼ活性を、抗体の濃度に対してプロットした。
８．１９．実施例１６：臨床使用のためのＡＢＰの製剤化
研究は、最適なタンパク質安定性及び投与の容易さを有する製剤を決定し、より簡単な投与のために等張性（ほぼ等張、２９０ｍＯｓｍ／ｋｇ）を有するために実施した。
ＧＩＧＡ－５６４は、様々な緩衝液中２０ｍｇ／ｍＬで製剤化し、次いで示差走査蛍光分析を使用して測定して、立体配座及びアンフォールディングを調べた。
●試験された製剤の範囲：ｐＨ５～ｐＨ７．６
●緩衝液：緩衝液はｐＨについて適した（変動する濃度の）クエン酸塩又はリン酸塩であった
●塩濃度：塩濃度は０～２００ｍＭのＮａＣｌの範囲であった
●スクロース：スクロースは０～１０％（重量対体積）の範囲で試験され、１０％は約２９０ｎＭである
試料は、２５～９５℃で示差走査蛍光分析を実行し、散乱は、ｍＡＵとして報告した。測定出力は、３５０ｎｍ対３３０ｎｍでの蛍光の比であった。３５０シグナルはあまり変化しないが、タンパク質がアンフォールドするにつれて、３３０シグナルは大幅に減少する（よりアクセスしやすくなるためトリプトファンによって駆動される）。
Ｔｏｎｓｅｔは、シグナルが増加し始める温度である。
Ｔｍ－１－２、－３などは、３５０／３３０データにおける変曲点及び一次導関数における極大値によって定義される、異なるドメインのアンフォールディング温度である。
抗体について、常に３つの異なるＴｍがあるわけではないが、一般的には：Ｔｍ１＝ＣＨ２、ＴＭ２＝ｆａｂ、Ｔｍ３＝ＣＨ３である。
Ｔａｇｇ＝散乱が増加する温度であり、粒子のサイズの増加を示す。
２５℃での３５０／３３０比は立体配座を示し、より低いほどよりフォールドされている。図３７は、ＮａＣｌ及び緩衝液濃度が、それぞれ、１００ｍＭ及び３０ｍＭで固定される場合のｐＨ及びスクロース濃度の影響を示す応答プロットを提供する。結果は、（ｉ）より高いＴｍ及びＴａｇｇがより良好であり、（ｉｉ）より高い［スクロース］が結果を改善し、（ｉｉｉ）最も良好なｐＨが中間（約６．３）であり、（ｉｖ）ｐＨがＴａｇｇにほとんど影響を与えないことを示す。
次に、製剤の最適条件を計算した。図３８に示されるような理論的応答プロットは、示されるように最も高いＴｍをもたらすことが予想される緩衝液濃度及びＮａＣｌ量を決定するために生成された。結果は、（ｉ）最も良好な緩衝液濃度が１０～５０ｍＭの範囲で変動し、（ｉｉ）全てのパラメータの計算された理想的な［ＮａＣｌ］が、８０～１００ｍＭと高いことを示す。次に、どの変数が製剤に最も影響を与えたかを決定するために、パレート分析を行った。図３９におけるデータは、（ｉ）全てについて、スクロース濃度が最も重要な変数であり、（ｉｉ）ｐＨがＴｍ－ｏｎｓｅｔ、ＴＭ－３にとって中程度に重要であったことを示した。加えて、図４０は、（ｉ）高いＮａＣｌが立体配座にとって最も重要であり、（ｉｉ）ｐＨがいくらかの効果を有し、より低いｐＨがより良好であり、（ｉｉｉ）スクロースがいくらかの効果を有し、より高いほどより良好であることを示す。
これらの所見に基づいて、以下の製剤が生成され、試験される。
８．１．実施例１７：ＡＢＰ、ＧＩＧＡ－５６４、及びＧＩＧＡ－２３２８の製造
ＧＩＧＡ－５６４は、ＣＨＯ細胞において作製することができる。いくつかのバリエーションでは、例えば、ＥｘｐｉＣＨＯ細胞、Ｅｘｐｉ２９３細胞、又は一過性トランスフェクションに一般的に使用される他の細胞株を使用して、一過性に発現させることができる。いくつかのバリエーションでは、ＤＧ４４、ＣＨＯＺＮ ＧＳなどのような、安定発現に一般的に使用される細胞株を使用して、ＧＩＧＡ－５６４の重鎖及び軽鎖配列を安定に発現するように修飾された細胞株から発現させることができる。安定発現構築物は、標的化組み込み、無作為組み込み、トランスポザーゼ媒介組み込み、レンチウイルス形質導入などのような方法を使用して組み込まれ得る。いくつかのバリエーションでは、エンハンサー要素、例えば、２Ｇ ＵＮｉｃ要素、ＵＣＯＥ要素などは、転写又は翻訳、よって力価を増強するために使用され得る。
ＧＩＧＡ－２３２８（低フコシル化を有するａＣＴＬＡ－４．１５）は、低減したコアフコシル化を有するタンパク質を産生するそれらの能力のために選択された細胞において産生される。いくつかのバリエーションでは、ＧＩＧＡ－２３２８は、ＵＤＰ－マンノースからのＵＤＰ－フコースの産生を防止する、細菌タンパク質ＲＭＤ（ＧＤＰ－６－デオキシ－Ｄ－リキソ－４－ヘキスロースレダクターゼ）を発現するＣＨＯ細胞において産生されるであろう。いくつかのバリエーションでは、フコシル化されたＧＩＧＡ－５６４はまた、フコースの外部供給源が細胞に与えられる場合、細菌タンパク質ＲＭＤ（ＧＤＰ－６－デオキシ－Ｄ－リキソ－４－ヘキスロースレダクターゼ）を発現する細胞を使用して産生することができる。いくつかのバリエーションでは、ＧＩＧＡ－２３２８は、Ｆｕｔ８の発現が欠如しているか、又は低減しているＣＨＯ細胞において産生され得る。いくつかのバリエーションでは、ＧＩＧＡ－２３２８は、細胞が増殖する培地にフコシル化阻害剤２－フルオロフコース（２ＦＦ）を添加することによって産生され得る。いくつかのバリエーションでは、ＧＩＧＡ－２３２８は、グリコシルトランスフェラーゼ（ＧｎＴＩＩＩ）を過剰発現する細胞において産生され得る。加えて、ＧＩＧＡ－２３２８は、低減したフコシル化レベルを有するように選択若しくは修飾された他のＣＨＯ細胞によって、又は低減したフコシル化を有するタンパク質を産生するその能力について選択された別の細胞株によって産生することができる。
ＧＩＧＡ－５６４を製造するために、細胞を液体窒素中での貯蔵から解凍し、生物産生用の容器（振盪フラスコ、ＴＰＰ、又はバイオリアクターにおけるバッチ、フェドバッチ、又は灌流培養を含むが、これらに限定されない）の接種のために十分な密度に達するまで増殖させる。１つのバリエーションでは、フェドバッチ培養は、必要に応じて、グルコース及びフィードを添加しながら約１４日間増殖させる。フェドバッチ培養が完了した後、培養物は、細胞沈降、遠心分離、及び／又は濾過を含み得る方法によって採取される。
ＧＩＧＡ－５６４は、いくつかのクロマトグラフィーステップのうちの１つ以上を使用して、採取された細胞培養液から精製させる。第１のステップは、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅ、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＰｒｉｓｍＡ、ＣａｐｔｉｖＡなどのような樹脂を使用した、プロテインＡ又は同様の親和性クロマトグラフィーである。親和性クロマトグラフィーステップに続いて、低ｐＨウイルス不活性化が行われ、続いてその後、ＰＯＲＯＳ ＸＳ、ＣａｐｔｏＳ ＩｍｐａＡｃｔなどのような樹脂を使用した、結合及び溶出モードのカチオン交換クロマトグラフィーが行われ得る。フロースルーモードでのアニオン交換濾過は、Ｎａｔｒｉｘ Ｑ、ＳａｒｔｏｂｉｎｄＱ、Ｍｕｓｔａｎｇ Ａｎｉｏｎｉｃ Ｅｘｃｈａｎｇｅ（Ｑ）などのようなフィルターを使用して行われ、ウイルス除去のためのナノ濾過は、Ｐｌａｎｏｖａ ＢｉｏＥＸ、Ｖｉｒｅｓｏｌｖｅ、Ｐｅｇａｓｕｓなどのようなフィルターを使用して行われる。最後に、ＧＩＧＡ－５６４は、濃縮し、最終製剤条件に緩衝液交換するために、限外濾過／ダイアフィルトレーションに供される。ＧＩＧＡ－２３２８の製造及び精製には、製造及び精製するための同様のアプローチを使用することができる。
９．参照による組み込み
本出願で引用された全ての刊行物、特許、特許出願、及び他の文献は、各個々の刊行物、特許、特許出願、又は他の文献が全ての目的のために参照によって組み込まれることが個別に示されているのと同じ程度に、全ての目的のために、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。
１０．同等物
様々な特定の実施形態が図示及び記載されてきたが、上記明細書は限定的なものではない。本開示の趣旨及び範囲から逸脱することなく、様々な変更を行うことができることが理解されるであろう。本明細書を検討すれば、当業者には多くのバリエーションが明らかとなるであろう。

Claims (198)

  1. ヒト細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ－４）に特異的に結合する単離された抗原結合タンパク質（ＡＢＰ）であって、
    前記ＡＢＰが、アミノ酸Ｋ１３０、Ｙ１３９、Ｌ１４１、Ｉ１４３と接触するが、前記ＣＴＬＡ－４のアミノ酸Ｒ７０と接触せず、かつ／又は
    前記ＣＴＬＡ－４が、前記ＡＢＰに結合すると、ＣＤ８０／ＣＤ８６と会合し得、かつ／又は
    前記ＡＢＰと前記ＣＴＬＡ－４のアミノ酸Ｌ７４Ａ及び／若しくはＥ６８との間の相互作用が、イピリムマブとＣＴＬＡ－４のアミノ酸Ｌ７４Ａとの間の相互作用よりも大きい、ＡＢＰ。
  2. 前記ＡＢＰが、配列番号１２０７８又は配列番号１０１４からなるＣＤＲ１－Ｌ、配列番号１２０７９又は配列番号２０１４からなるＣＤＲ２－Ｌ、配列番号１２０８０又は配列番号３０１４からなるＣＤＲ３－Ｌ、配列番号１２０７５又は配列番号４０１４からなるＣＤＲ１－Ｈ、配列番号１２０７６又は配列番号５０１４からなるＣＤＲ２－Ｈ、及び配列番号１２０７７又は配列番号６０１４からなるＣＤＲ３－Ｈを含む、請求項１に記載のＡＢＰ。
  3. 前記ＡＢＰが、配列番号１２００４からなるＣＤＲ１－Ｌ、配列番号１２０１４からなるＣＤＲ２－Ｌ、配列番号１２０２４からなるＣＤＲ３－Ｌ、配列番号１２０３９からなるＣＤＲ１－Ｈ、配列番号１２０４９からなるＣＤＲ２－Ｈ、及び配列番号１２０５９からなるＣＤＲ３－Ｈを含む、請求項１に記載のＡＢＰ。
  4. 前記ＡＢＰが、配列番号１２００５からなるＣＤＲ１－Ｌ、配列番号１２０１５からなるＣＤＲ２－Ｌ、配列番号１２０２５からなるＣＤＲ３－Ｌ、配列番号１２０４０からなるＣＤＲ１－Ｈ、配列番号１２０５０からなるＣＤＲ２－Ｈ、及び配列番号１２０６０からなるＣＤＲ３－Ｈを含む、請求項１に記載のＡＢＰ。
  5. 前記ＡＢＰが、配列番号１２００６からなるＣＤＲ１－Ｌ、配列番号１２０１６からなるＣＤＲ２－Ｌ、配列番号１２０２６からなるＣＤＲ３－Ｌ、配列番号１２０４１からなるＣＤＲ１－Ｈ、配列番号１２０５１からなるＣＤＲ２－Ｈ、及び配列番号１２０６１からなるＣＤＲ３－Ｈを含む、請求項１に記載のＡＢＰ。
  6. 前記ＡＢＰが、配列番号１２００７からなるＣＤＲ１－Ｌ、配列番号１２０１７からなるＣＤＲ２－Ｌ、配列番号１２０２７からなるＣＤＲ３－Ｌ、配列番号１２０４２からなるＣＤＲ１－Ｈ、配列番号１２０５２からなるＣＤＲ２－Ｈ、及び配列番号１２０６２からなるＣＤＲ３－Ｈを含む、請求項１に記載のＡＢＰ。
  7. 前記ＡＢＰが、配列番号１２００８からなるＣＤＲ１－Ｌ、配列番号１２０１８からなるＣＤＲ２－Ｌ、配列番号１２０２８からなるＣＤＲ３－Ｌ、配列番号１２０４３からなるＣＤＲ１－Ｈ、配列番号１２０５３からなるＣＤＲ２－Ｈ、及び配列番号１２０６３からなるＣＤＲ３－Ｈを含む、請求項１に記載のＡＢＰ。
  8. 前記ＡＢＰが、
    配列番号１４と少なくとも９７％同一の配列を含む可変軽鎖（ＶＬ）、及び配列番号１１４と少なくとも９７％同一の配列を含む可変重鎖（ＶＨ）を含む、請求項１又は２に記載のＡＢＰ。
  9. 前記ＡＢＰが、ｓｃＦｖ又は完全長モノクローナル抗体を含む、請求項１～８のいずれか一項に記載のＡＢＰ。
  10. 前記ＡＢＰが、免疫グロブリン定常領域を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載のＡＢＰ。
  11. 前記ＡＢＰが、表面プラズモン共鳴によって測定された場合、５００ｎＭ未満のＫＤでヒトＣＴＬＡ－４に結合するか、又は
    前記ＡＢＰが、表面プラズモン共鳴によって測定された場合、２００ｎＭ未満のＫＤでヒトＣＴＬＡ－４に結合するか、又は
    前記ＡＢＰが、表面プラズモン共鳴によって測定された場合、２５ｎＭ未満のＫＤでヒトＣＴＬＡ－４に結合するか、又は
    前記ＡＢＰが、２５ｎＭ未満のＫＤで細胞表面上のヒトＣＴＬＡ－４に結合する、請求項１～１０のいずれか一項に記載のＡＢＰ。
  12. 前記ＡＢＰが、ＩｇＧ１ ＡＢＰである、請求項１～１１のいずれか一項に記載のＡＢＰ。
  13. 前記ＡＢＰが、ＩＧＨＧ１＊０１ヒト重鎖定常領域遺伝子セグメントを含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載のＡＢＰ。
  14. 前記ＡＢＰが、ＩＭＧＴエキソンナンバリングによるアミノ酸位置９７（Ｒ９７）にリジンを含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載のＡＢＰ。
  15. 前記ＡＢＰが、ＥＵナンバリングによるアミノ酸位置９７（Ｒ２１４）にリジンを含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載のＡＢＰ。
  16. 低フコシル化Ｆｃ領域を含む、請求項１～１５のいずれか一項に記載のＡＢＰ。
  17. 細菌タンパク質ＲＭＤ（ＧＤＰ－６－デオキシ－Ｄ－リキソ－４－ヘキスロースレダクターゼ）又はその修飾を含む細胞から産生される、請求項１～１６のいずれか一項に記載のＡＢＰ。
  18. 前記細胞が、フコースの不在下で培養される、請求項１３に記載のＡＢＰ。
  19. Ｆｕｔ８の発現が欠如しているか、又は低減した細胞から産生される、請求項１～１８のいずれか一項に記載のＡＢＰ。
  20. フコシル化阻害剤、２－フルオロフコース（２ＦＦ）の存在下で培養された細胞から産生される、請求項１～１９のいずれか一項に記載のＡＢＰ。
  21. グリコシルトランスフェラーゼ（ＧｎＴＩＩＩ）を過剰発現する細胞から産生される、請求項１～２０のいずれか一項に記載のＡＢＰ。
  22. そのフコシル化状態に基づいて単離された、請求項１～２１のいずれか一項に記載のＡＢＰ。
  23. Ｆｃ部分のＮ－グリカンのコアフコシル化が欠如しているＦｃ領域を含む、請求項１～２２のいずれか一項に記載のＡＢＰ。
  24. 前記ＡＢＰが、低フコシル化モノクローナル抗体である、請求項１～２３のいずれか一項に記載のＡＢＰ。
  25. 請求項１～２４のいずれか一項に記載のＡＢＰ及び薬学的に許容される賦形剤を含む、薬学的組成物。
  26. 前記ＡＢＰの５０％未満が、フコシル化されている、請求項２５に記載の薬学的組成物。
  27. 前記ＡＢＰの４０％未満が、フコシル化されている、請求項２６に記載の薬学的組成物。
  28. 前記ＡＢＰの３０％未満が、フコシル化されている、請求項２７に記載の薬学的組成物。
  29. 前記ＡＢＰの２０％未満が、フコシル化されている、請求項２８に記載の薬学的組成物。
  30. 前記ＡＢＰの１０％未満が、フコシル化されている、請求項２９に記載の薬学的組成物。
  31. 前記ＡＢＰの３０％超が、フコシル化されている、請求項２５に記載の薬学的組成物。
  32. 前記ＡＢＰの４０％超が、フコシル化されている、請求項３１に記載の薬学的組成物。
  33. 前記ＡＢＰの５０％超が、フコシル化されている、請求項３２に記載の薬学的組成物。
  34. 前記ＡＢＰの６０％超が、フコシル化されている、請求項３３に記載の薬学的組成物。
  35. 前記ＡＢＰの７０％超が、フコシル化されている、請求項３４に記載の薬学的組成物。
  36. 前記ＡＢＰの８０％超が、フコシル化されている、請求項３５に記載の薬学的組成物。
  37. 前記ＡＢＰの９０％超が、フコシル化されている、請求項３６に記載の薬学的組成物。
  38. ５．０～６．５のｐＨを有する、請求項２５～３７のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
  39. ２０ｍＭのヒスチジン又はクエン酸塩緩衝液を含む、請求項２５～３８のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
  40. ５０ｍＭのＮａＣｌを含む、請求項２５～３９のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
  41. スクロースを１７０ｍＭ～２７０ｍＭの濃度で含む、請求項２５～４０のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
  42. １７０ｍＭ又は２７０ｍＭのスクロースを含む、請求項４１に記載の薬学的組成物。
  43. ５ｍｇ／ｍＬ～２０ｍｇ／ｍＬの前記ＡＢＰを含む、請求項２５～４２のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
  44. ２０ｍｇ／ｍＬの前記ＡＢＰを含む、請求項２６～４３のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
  45. ５ｍｇ／ｍＬの前記ＡＢＰを含む、請求項２６～４４のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
  46. 疾患を治療する方法であって、
    それを必要とする対象に、有効量の請求項１～２４のいずれかに記載のＡＢＰ又は請求項２５～４５のいずれか一項に記載の薬学的組成物を投与するステップを含む、方法。
  47. 前記疾患が、がん、ＡＩＤＳ、アルツハイマー病、及びウイルス又は細菌感染症からなる群から選択される、請求項４６に記載の方法。
  48. １つ以上の追加の治療剤を前記対象に投与するステップを更に含む、請求項４６又は４７に記載の方法。
  49. 前記追加の治療剤が、抗ＰＤ－Ｌ１、抗ＰＤ１、ＬＡＧ－３阻害剤、ＣＤ４７阻害剤、ＴＩＧＩＴ阻害剤、化学療法剤、免疫刺激剤、放射線、ＢＲＡＦ阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、ＰＩ３Ｋ阻害剤、サイトカイン、サイトカインをコードするポリヌクレオチド、サイトカインをコードする腫瘍溶解性ウイルス、及びそれらの組み合わせから選択される、請求項４８に記載の方法。
  50. 請求項１～２４のいずれかに記載のＡＢＰをコードする、単離されたポリヌクレオチド。
  51. 請求項５０に記載の単離されたポリヌクレオチドを含む、ベクター。
  52. 請求項５０に記載の単離されたポリヌクレオチド又は請求項５１に記載のベクターを含む、宿主細胞。
  53. 前記宿主細胞が、細菌タンパク質ＲＭＤ（ＧＤＰ－６－デオキシ－Ｄ－リキソ－４－ヘキスロースレダクターゼ）を更に含む、請求項５２に記載の宿主細胞。
  54. 前記宿主細胞が、フコースの不在下で培養される、請求項５２又は５３に記載の宿主細胞。
  55. Ｆｕｔ８の発現が欠如しているか、又は低減している、請求項５２～５４のいずれか一項に記載の宿主細胞。
  56. フコシル化阻害剤２－フルオロフコース（２ＦＦ）の存在下で培養された、請求項５２～５５のいずれか一項に記載の宿主細胞。
  57. グリコシルトランスフェラーゼ（ＧｎＴＩＩＩ）を過剰発現する、請求項５２～５６のいずれか一項に記載の宿主細胞。
  58. ヒトＣＴＬＡ－４に特異的に結合する単離された抗原結合タンパク質（ＡＢＰ）を産生する方法であって、請求項５２～５７のいずれか一項に記載の宿主細胞における前記ＡＢＰの発現を誘発することと、前記ＡＢＰを単離することと、を含む、方法。
  59. 前記ＡＢＰをそのフコシル化状態に基づいて単離するステップを更に含む、請求項５８に記載の方法。
  60. 前記宿主細胞が、フコシル化阻害剤を含む培養培地中で培養される、請求項５８又は５９に記載の方法。
  61. 前記フコシル化阻害剤が、２－フルオロフコース（２ＦＦ）である、請求項６０に記載の方法。
  62. ＣＴＬＡ－４ＨＩ Ｔｒｅｇを、残りのＴｒｅｇの増殖が制限された対象において低減する方法であって、有効用量の
    請求項１～２４のいずれか一項に記載のＡＢＰ又は請求項２５～４５のいずれか一項に記載の薬学的組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
  63. 前記対象が、ヒト対象、任意に、ＲＣＣ（腎細胞がん）、ＮＳＣＬＣ（非小細胞肺がん）、メルケル細胞がん、ｃＳＣＣ、中皮腫、ＭＳＩ結腸直腸がん、卵巣がん、又は子宮頸がんを有するヒト対象である、請求項６２に記載の方法。
  64. １つ以上の追加の治療剤を前記対象に投与するステップを更に含む、請求項６２又は６３に記載の方法。
  65. 前記追加の治療剤が、抗ＰＤ－Ｌ１若しくは抗ＰＤ１又はそれらの組み合わせである、請求項６４に記載の方法。
  66. ヒト細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ－４）に特異的に結合する単離された抗原結合タンパク質（ＡＢＰ）であって、前記ＡＢＰが、
    （ａ）配列番号１２０７８からなるＣＤＲ１－Ｌ、配列番号１２０７９からなるＣＤＲ２－Ｌ、配列番号１２０８０からなるＣＤＲ３－Ｌ、配列番号１２０７５からなるＣＤＲ１－Ｈ、配列番号１２０７６からなるＣＤＲ２－Ｈ、及び配列番号１２０７７からなるＣＤＲ３－Ｈ、
    （ｂ）配列番号１０１４からなるＣＤＲ１－Ｌ、配列番号２０１４からなるＣＤＲ２－Ｌ、配列番号３０１４からなるＣＤＲ３－Ｌ、配列番号４０１４からなるＣＤＲ１－Ｈ、配列番号５０１４からなるＣＤＲ２－Ｈ、及び配列番号６０１４からなるＣＤＲ３－Ｈ、
    （ｃ）配列番号１２００４からなるＣＤＲ１－Ｌ、配列番号１２０１４からなるＣＤＲ２－Ｌ、配列番号１２０２４からなるＣＤＲ３－Ｌ、配列番号１２０３９からなるＣＤＲ１－Ｈ、配列番号１２０４９からなるＣＤＲ２－Ｈ、及び配列番号１２０５９からなるＣＤＲ３－Ｈ、
    （ｄ）配列番号１２００５からなるＣＤＲ１－Ｌ、配列番号１２０１５からなるＣＤＲ２－Ｌ、配列番号１２０２５からなるＣＤＲ３－Ｌ、配列番号１２０４０からなるＣＤＲ１－Ｈ、配列番号１２０５０からなるＣＤＲ２－Ｈ、及び配列番号１２０６０からなるＣＤＲ３－Ｈ、
    （ｅ）配列番号１２００６からなるＣＤＲ１－Ｌ、配列番号１２０１６からなるＣＤＲ２－Ｌ、配列番号１２０２６からなるＣＤＲ３－Ｌ、配列番号１２０４１からなるＣＤＲ１－Ｈ、配列番号１２０５１からなるＣＤＲ２－Ｈ、及び配列番号１２０６１からなるＣＤＲ３－Ｈ、
    （ｆ）配列番号１２００７からなるＣＤＲ１－Ｌ、配列番号１２０１７からなるＣＤＲ２－Ｌ、配列番号１２０２７からなるＣＤＲ３－Ｌ、配列番号１２０４２からなるＣＤＲ１－Ｈ、配列番号１２０５２からなるＣＤＲ２－Ｈ、及び配列番号１２０６２からなるＣＤＲ３－Ｈ、又は
    （ｇ）配列番号１２００８からなるＣＤＲ１－Ｌ、配列番号１２０１８からなるＣＤＲ２－Ｌ、配列番号１２０２８からなるＣＤＲ３－Ｌ、配列番号１２０４３からなるＣＤＲ１－Ｈ、配列番号１２０５３からなるＣＤＲ２－Ｈ、及び配列番号１２０６３からなるＣＤＲ３－Ｈを含む、ＡＢＰ。
  67. 前記ＡＢＰが、
    配列番号１４と少なくとも９７％同一の配列を含む可変軽鎖（ＶＬ）、及び配列番号１１４と少なくとも９７％同一の配列を含む可変重鎖（ＶＨ）を含む、請求項６６に記載のＡＢＰ。
  68. 前記ＡＢＰが、ｓｃＦｖ又は完全長モノクローナル抗体を含む、請求項６６又は６７に記載のＡＢＰ。
  69. 前記ＡＢＰが、免疫グロブリン定常領域を含む、請求項６６～６８のいずれか一項に記載のＡＢＰ。
  70. 前記ＡＢＰが、表面プラズモン共鳴によって測定された場合、５００ｎＭ未満のＫＤでヒトＣＴＬＡ－４に結合するか、又は
    前記ＡＢＰが、表面プラズモン共鳴によって測定された場合、２００ｎＭ未満のＫＤでヒトＣＴＬＡ－４に結合するか、又は
    前記ＡＢＰが、表面プラズモン共鳴によって測定された場合、２５ｎＭ未満のＫＤでヒトＣＴＬＡ－４に結合するか、又は
    前記ＡＢＰが、２５ｎＭ未満のＫＤで細胞表面上のヒトＣＴＬＡ－４に結合する、請求項６６～６９のいずれか一項に記載のＡＢＰ。
  71. 前記ＡＢＰが、ＩｇＧ１ ＡＢＰである、請求項６６～７０のいずれか一項に記載のＡＢＰ。
  72. 前記ＡＢＰが、ＩＧＨＧ１＊０１ヒト重鎖定常領域遺伝子セグメントを含む、請求項６６～７１のいずれか一項に記載のＡＢＰ。
  73. 前記ＡＢＰが、ＩＭＧＴエキソンナンバリングによるアミノ酸位置９７（Ｒ９７）にリジンを含む、請求項６６～７２のいずれか一項に記載のＡＢＰ。
  74. 前記ＡＢＰが、ＥＵナンバリングによるアミノ酸位置９７（Ｒ２１４）にリジンを含む、請求項６６～７３のいずれか一項に記載のＡＢＰ。
  75. 低フコシル化Ｆｃ領域を含む、請求項６６～７４のいずれか一項に記載のＡＢＰ。
  76. 細菌タンパク質ＲＭＤ（ＧＤＰ－６－デオキシ－Ｄ－リキソ－４－ヘキスロースレダクターゼ）又はその修飾を含む細胞から産生される、請求項６６～７５のいずれか一項に記載のＡＢＰ。
  77. 前記細胞が、フコースの不在下で培養される、請求項７６に記載のＡＢＰ。
  78. Ｆｕｔ８の発現が欠如しているか、又は低減した細胞から産生される、請求項６６～７７のいずれか一項に記載のＡＢＰ。
  79. フコシル化阻害剤、２－フルオロフコース（２ＦＦ）の存在下で培養された細胞から産生される、請求項６６～７８のいずれか一項に記載のＡＢＰ。
  80. グリコシルトランスフェラーゼ（ＧｎＴＩＩＩ）を過剰発現する細胞から産生される、請求項６６～７９のいずれか一項に記載のＡＢＰ。
  81. そのフコシル化状態に基づいて単離された、請求項６６～８０のいずれか一項に記載のＡＢＰ。
  82. Ｆｃ部分のＮ－グリカンのコアフコシル化が欠如しているＦｃ領域を含む、請求項５８～８１のいずれか一項に記載のＡＢＰ。
  83. 前記ＡＢＰが、低フコシル化モノクローナル抗体である、請求項６６～８２のいずれか一項に記載のＡＢＰ。
  84. 前記低フコシル化Ｆｃ領域が、３０％未満のフコシル化を有し、３０％未満のフコシル化が、Ｆｃガンマ受容体ＩＩＩａ（ＦｃｇＲＩＩＩａ）シグナル伝達又はＦｃｇＲ３ａによってコードされるタンパク質によってコードされるタンパク質を増強する、請求項８３に記載のＡＢＰ。
  85. 請求項６６～８４のいずれか一項に記載のＡＢＰ、及び薬学的に許容される賦形剤を含む、薬学的組成物。
  86. 前記ＡＢＰの５０％未満が、フコシル化されている、請求項８５に記載の薬学的組成物。
  87. 前記ＡＢＰの４０％未満が、フコシル化されている、請求項８６に記載の薬学的組成物。
  88. 前記ＡＢＰの３０％未満が、フコシル化されている、請求項８７に記載の薬学的組成物。
  89. 前記ＡＢＰの２０％未満が、フコシル化されている、請求項８８に記載の薬学的組成物。
  90. 前記ＡＢＰの１０％未満が、フコシル化されている、請求項８９に記載の薬学的組成物。
  91. 前記ＡＢＰの３０％超が、フコシル化されている、請求項８５に記載の薬学的組成物。
  92. 前記ＡＢＰの４０％超が、フコシル化されている、請求項９１に記載の薬学的組成物。
  93. 前記ＡＢＰの５０％超が、フコシル化されている、請求項９２に記載の薬学的組成物。
  94. 前記ＡＢＰの６０％超が、フコシル化されている、請求項９３に記載の薬学的組成物。
  95. 前記ＡＢＰの７０％超が、フコシル化されている、請求項９４に記載の薬学的組成物。
  96. 前記ＡＢＰの８０％超が、フコシル化されている、請求項９５に記載の薬学的組成物。
  97. 前記ＡＢＰの９０％超が、フコシル化されている、請求項９６に記載の薬学的組成物。
  98. ５．０～６．５のｐＨを有する、請求項８５～９７のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
  99. ２０ｍＭのヒスチジン又はクエン酸塩緩衝液を含む、請求項８５～９８のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
  100. ５０ｍＭのＮａＣｌを含む、請求項８５～９９のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
  101. スクロースを１７０ｍＭ～２７０ｍＭの濃度で含む、請求項８５～１００のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
  102. １７０ｍＭ又は２７０ｍＭのスクロースを含む、請求項１０１に記載の薬学的組成物。
  103. ２０ｍｇ／ｍＬの前記ＡＢＰを含む、請求項８５～１０２のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
  104. ５ｍｇ／ｍＬの前記ＡＢＰを含む、請求項８５～１０３のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
  105. がんを治療する方法であって、
    それを必要とする対象に、有効量の請求項６６～８４のいずれかに記載のＡＢＰ又は請求項８５～１０４のいずれか一項に記載の薬学的組成物を投与するステップを含む、方法。
  106. 前記対象が、悪性腫瘍を有する、請求項１０５に記載の方法。
  107. 前記ＡＢＰが、投与されると、イピリムマブと比較して増加したＦｃ受容体（ＦｃＲ）シグナル伝達を含み、前記投与することが、前記対象におけるＣＴＬＡ－４ＨＩ Ｔｒｅｇの量を低減する、請求項１０５に記載の方法。
  108. 前記投与することが、イピリムマブと比較して、前記対象における末梢Ｔｒｅｇの増殖を低減する、請求項１０７に記載の方法。
  109. １つ以上の追加の治療剤を前記対象に投与するステップを更に含む、請求項１０５～１０８のいずれか一項に記載の方法。
  110. 前記追加の治療剤が、抗ＰＤ－Ｌ１、抗ＰＤ１、ＴＩＧＩＴ阻害剤、ＬＡＧ－３阻害剤、ＣＤ４７阻害剤、ＢＲＡＦ阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、ＰＩ３Ｋ阻害剤、化学療法剤、免疫刺激剤、放射線、サイトカイン、サイトカインをコードするポリヌクレオチド、サイトカインをコードする腫瘍溶解性ウイルス、及びそれらの組み合わせから選択される、請求項１０９に記載の方法。
  111. 前記ＡＢＰが、３０％未満のフコシル化を有する低フコシル化Ｆｃ領域を含み、３０％未満のフコシル化が、Ｆｃガンマ受容体ＩＩＩａ（ＦｃｇＲＩＩＩａ）シグナル伝達又はＦｃｇＲ３ａによってコードされるタンパク質によってコードされるタンパク質を増強する、請求項１０５～１１０のいずれか一項に記載の方法。
  112. 前記ＡＢＰが、７０％を超えるフコシル化を有するフコシル化Ｆｃ領域を含む、請求項１０５～１１０のいずれか一項に記載の方法。
  113. 請求項６６～８４のいずれかに記載のＡＢＰをコードする、単離されたポリヌクレオチド。
  114. 請求項１１３に記載の単離されたポリヌクレオチドを含む、ベクター。
  115. 請求項１１３に記載の単離されたポリヌクレオチド又は請求項１１４に記載のベクターを含む、宿主細胞。
  116. 前記宿主細胞が、操作されていない宿主細胞と比較して、フコシル化が低減するように操作されている、請求項１１５に記載の宿主細胞。
  117. 前記宿主細胞が、細菌タンパク質ＲＭＤ（ＧＤＰ－６－デオキシ－Ｄ－リキソ－４－ヘキスロースレダクターゼ）を更に含む、請求項１１６に記載の宿主細胞。
  118. 前記宿主細胞が、フコースの不在下で培養される、請求項１１５～１１７のいずれか一項に記載の宿主細胞。
  119. Ｆｕｔ８の発現が欠如しているか、又は低減している、請求項１１５～１１８のいずれか一項に記載の宿主細胞。
  120. フコシル化阻害剤２－フルオロフコース（２ＦＦ）の存在下で培養された、請求項１１５～１１９のいずれか一項に記載の宿主細胞。
  121. グリコシルトランスフェラーゼ（ＧｎＴＩＩＩ）を過剰発現する、請求項１１５～１２０のいずれか一項に記載の宿主細胞。
  122. ヒトＣＴＬＡ－４に特異的に結合する単離された抗原結合タンパク質（ＡＢＰ）を産生する方法であって、請求項１１５～１２１のいずれか一項に記載の宿主細胞における前記ＡＢＰの発現を誘発することと、前記ＡＢＰを単離することと、を含み、前記ＡＢＰが、低フコシル化Ｆｃを含む、方法。
  123. 前記ＡＢＰをそのフコシル化状態に基づいて単離するステップを更に含む、請求項１２２に記載の方法。
  124. 前記宿主細胞が、フコシル化阻害剤を含む培養培地中で培養される、請求項１１５～１２３のいずれか一項に記載の方法。
  125. 前記フコシル化阻害剤が、２－フルオロフコース（２ＦＦ）である、請求項１２４に記載の方法。
  126. ＩＧＨＧ１＊０１ヒト重鎖定常領域遺伝子セグメントを含む、抗原に特異的に結合する単離された抗原結合タンパク質（ＡＢＰ）であって、任意に、前記抗原が、ヒト細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ－４）である、ＡＢＰ。
  127. 前記ＡＢＰが、
    （ａ）配列番号１２０７８からなるＣＤＲ１－Ｌ、配列番号１２０７９からなるＣＤＲ２－Ｌ、配列番号１２０８０からなるＣＤＲ３－Ｌ、配列番号１２０７５からなるＣＤＲ１－Ｈ、配列番号１２０７６からなるＣＤＲ２－Ｈ、及び配列番号１２０７７からなるＣＤＲ３－Ｈ、
    （ｂ）配列番号１０１４からなるＣＤＲ１－Ｌ、配列番号２０１４からなるＣＤＲ２－Ｌ、配列番号３０１４からなるＣＤＲ３－Ｌ、配列番号４０１４からなるＣＤＲ１－Ｈ、配列番号５０１４からなるＣＤＲ２－Ｈ、及び配列番号６０１４からなるＣＤＲ３－Ｈ、
    （ｃ）配列番号１２００４からなるＣＤＲ１－Ｌ、配列番号１２０１４からなるＣＤＲ２－Ｌ、配列番号１２０２４からなるＣＤＲ３－Ｌ、配列番号１２０３９からなるＣＤＲ１－Ｈ、配列番号１２０４９からなるＣＤＲ２－Ｈ、及び配列番号１２０５９からなるＣＤＲ３－Ｈ、
    （ｄ）配列番号１２００５からなるＣＤＲ１－Ｌ、配列番号１２０１５からなるＣＤＲ２－Ｌ、配列番号１２０２５からなるＣＤＲ３－Ｌ、配列番号１２０４０からなるＣＤＲ１－Ｈ、配列番号１２０５０からなるＣＤＲ２－Ｈ、及び配列番号１２０６０からなるＣＤＲ３－Ｈ、
    （ｅ）配列番号１２００６からなるＣＤＲ１－Ｌ、配列番号１２０１６からなるＣＤＲ２－Ｌ、配列番号１２０２６からなるＣＤＲ３－Ｌ、配列番号１２０４１からなるＣＤＲ１－Ｈ、配列番号１２０５１からなるＣＤＲ２－Ｈ、及び配列番号１２０６１からなるＣＤＲ３－Ｈ、
    （ｆ）配列番号１２００７からなるＣＤＲ１－Ｌ、配列番号１２０１７からなるＣＤＲ２－Ｌ、配列番号１２０２７からなるＣＤＲ３－Ｌ、配列番号１２０４２からなるＣＤＲ１－Ｈ、配列番号１２０５２からなるＣＤＲ２－Ｈ、及び配列番号１２０６２からなるＣＤＲ３－Ｈ、又は
    （ｇ）配列番号１２００８からなるＣＤＲ１－Ｌ、配列番号１２０１８からなるＣＤＲ２－Ｌ、配列番号１２０２８からなるＣＤＲ３－Ｌ、配列番号１２０４３からなるＣＤＲ１－Ｈ、配列番号１２０５３からなるＣＤＲ２－Ｈ、及び配列番号１２０６３からなるＣＤＲ３－Ｈを含む、請求項１２６に記載のＡＢＰ。
  128. 前記ＡＢＰが、
    配列番号１４と少なくとも９７％同一の配列を含む可変軽鎖（ＶＬ）、及び配列番号１１４と少なくとも９７％同一の配列を含む可変重鎖（ＶＨ）を含む、請求項１２７に記載のＡＢＰ。
  129. 前記ＡＢＰが、
    （ａ）配列番号のいずれか１つからなるＣＤＲ１－Ｌ、配列番号１００１～１０２８のいずれか１つからなるＣＤＲ２－Ｌ、配列番号２００１～２０２８のいずれか１つからなるＣＤＲ３－Ｌ、配列番号のいずれか１つからなるＣＤＲ１－Ｈ、配列番号３００１～３０２８のいずれか１つからなるＣＤＲ２－Ｈを含む、請求項１２６に記載のＡＢＰ。
  130. 前記ＡＢＰが、
    配列番号１～２８のいずれか１つと少なくとも９７％同一の配列を含む可変軽鎖（ＶＬ）、及び配列番号１～１２８と少なくとも９７％同一の配列を含む可変重鎖（ＶＨ）を含む、請求項１２７に記載のＡＢＰ。
  131. 前記ＡＢＰが、ＩＭＧＴエキソンナンバリングによるアミノ酸位置９７（Ｒ９７）にリジンを含む、請求項１２６に記載のＡＢＰ。
  132. 前記ＡＢＰが、ＥＵナンバリングによるアミノ酸位置９７（Ｒ２１４）にリジンを含む、請求項１２６に記載のＡＢＰ。
  133. 低フコシル化Ｆｃ領域を含む、請求項１２６～１３２のいずれか一項に記載のＡＢＰ。
  134. 細菌タンパク質ＲＭＤ（ＧＤＰ－６－デオキシ－Ｄ－リキソ－４－ヘキスロースレダクターゼ）又はその修飾を含む細胞から産生される、請求項１２６～１３３のいずれか一項に記載のＡＢＰ。
  135. 前記細胞が、フコースの不在下で培養される、請求項１３４に記載のＡＢＰ。
  136. Ｆｕｔ８の発現が欠如しているか、又は低減した細胞から産生される、請求項１２６～１３５のいずれか一項に記載のＡＢＰ。
  137. フコシル化阻害剤、２－フルオロフコース（２ＦＦ）の存在下で培養された細胞から産生される、請求項１２６～１３６のいずれか一項に記載のＡＢＰ。
  138. グリコシルトランスフェラーゼ（ＧｎＴＩＩＩ）を過剰発現する細胞から産生される、請求項１２６～１３７のいずれか一項に記載のＡＢＰ。
  139. そのフコシル化状態に基づいて単離された、請求項１２６～１３８のいずれか一項に記載のＡＢＰ。
  140. Ｆｃ部分のＮ－グリカンのコアフコシル化が欠如しているＦｃ領域を含む、請求項１２６～１３９のいずれか一項に記載のＡＢＰ。
  141. 前記ＡＢＰが、低フコシル化モノクローナル抗体である、請求項１２６～１４０のいずれか一項に記載のＡＢＰ。
  142. 前記ＡＢＰが、抗ＣＴＬＡ－４抗体又はその抗原結合フラグメント、抗ＰＤ－Ｌ１抗体又はその抗原結合フラグメント、抗ＰＤ１抗体又はその抗原結合フラグメント、ＴＩＧＩＴ抗体又はその抗原結合フラグメント、ＬＡＧ－３抗体又はその抗原結合フラグメント、ＣＤ４７抗体又はその抗原結合フラグメント、ＢＲＡＦ抗体又はその抗原結合フラグメント、ＭＥＫ抗体又はその抗原結合フラグメント、及びＰＩ３Ｋ抗体又はその抗原結合フラグメントから選択される、請求項１３１～１４１のいずれか一項に記載のＡＢＰ。
  143. 前記ＡＢＰが、
    （ａ）配列番号１２０７８からなるＣＤＲ１－Ｌ、配列番号１２０７９からなるＣＤＲ２－Ｌ、配列番号１２０８０からなるＣＤＲ３－Ｌ、配列番号１２０７５からなるＣＤＲ１－Ｈ、配列番号１２０７６からなるＣＤＲ２－Ｈ、及び配列番号１２０７７からなるＣＤＲ３－Ｈ、
    （ｂ）配列番号１０１４からなるＣＤＲ１－Ｌ、配列番号２０１４からなるＣＤＲ２－Ｌ、配列番号３０１４からなるＣＤＲ３－Ｌ、配列番号４０１４からなるＣＤＲ１－Ｈ、配列番号５０１４からなるＣＤＲ２－Ｈ、及び配列番号６０１４からなるＣＤＲ３－Ｈ、
    （ｃ）配列番号１２００４からなるＣＤＲ１－Ｌ、配列番号１２０１４からなるＣＤＲ２－Ｌ、配列番号１２０２４からなるＣＤＲ３－Ｌ、配列番号１２０３９からなるＣＤＲ１－Ｈ、配列番号１２０４９からなるＣＤＲ２－Ｈ、及び配列番号１２０５９からなるＣＤＲ３－Ｈ、
    （ｄ）配列番号１２００５からなるＣＤＲ１－Ｌ、配列番号１２０１５からなるＣＤＲ２－Ｌ、配列番号１２０２５からなるＣＤＲ３－Ｌ、配列番号１２０４０からなるＣＤＲ１－Ｈ、配列番号１２０５０からなるＣＤＲ２－Ｈ、及び配列番号１２０６０からなるＣＤＲ３－Ｈ、
    （ｅ）配列番号１２００６からなるＣＤＲ１－Ｌ、配列番号１２０１６からなるＣＤＲ２－Ｌ、配列番号１２０２６からなるＣＤＲ３－Ｌ、配列番号１２０４１からなるＣＤＲ１－Ｈ、配列番号１２０５１からなるＣＤＲ２－Ｈ、及び配列番号１２０６１からなるＣＤＲ３－Ｈ、
    （ｆ）配列番号１２００７からなるＣＤＲ１－Ｌ、配列番号１２０１７からなるＣＤＲ２－Ｌ、配列番号１２０２７からなるＣＤＲ３－Ｌ、配列番号１２０４２からなるＣＤＲ１－Ｈ、配列番号１２０５２からなるＣＤＲ２－Ｈ、及び配列番号１２０６２からなるＣＤＲ３－Ｈ、又は
    （ｇ）配列番号１２００８からなるＣＤＲ１－Ｌ、配列番号１２０１８からなるＣＤＲ２－Ｌ、配列番号１２０２８からなるＣＤＲ３－Ｌ、配列番号１２０４３からなるＣＤＲ１－Ｈ、配列番号１２０５３からなるＣＤＲ２－Ｈ、及び配列番号１２０６３からなるＣＤＲ３－Ｈを含む、請求項１３１～１４１のいずれか一項に記載のＡＢＰ。
  144. 前記ＡＢＰが、
    配列番号１４と少なくとも９７％同一の配列を含む可変軽鎖（ＶＬ）、及び配列番号１１４と少なくとも９７％同一の配列を含む可変重鎖（ＶＨ）を含む、請求項１３１～１４１のいずれか一項に記載のＡＢＰ。
  145. 前記ＡＢＰが、
    （ａ）配列番号１２０８１のいずれか１つからなるＣＤＲ１－Ｌ、配列番号１２０８２からなるＣＤＲ２－Ｌ、配列番号１２０８３からなるＣＤＲ３－Ｌ、配列番号１２０８４からなるＣＤＲ１－Ｈ、配列番号１２０８５からなるＣＤＲ２－Ｈ、及び配列番号１２０８６からなるＣＤＲ３－Ｈを含む、請求項１３１～１４１のいずれか一項に記載のＡＢＰ。
  146. 前記ＡＢＰが、
    配列番号１２０８８と少なくとも９７％同一の配列を含む可変軽鎖（ＶＬ）、及び配列番号１２０８７と少なくとも９７％同一の配列を含む可変重鎖（ＶＨ）を含む、請求項１３１～１４１のいずれか一項に記載のＡＢＰ。
  147. 請求項１２６～１４６のいずれか一項に記載のＡＢＰ及び薬学的に許容される賦形剤を含む、薬学的組成物。
  148. 前記ＡＢＰの５０％未満が、フコシル化されている、請求項１４７に記載の薬学的組成物。
  149. 前記ＡＢＰの４０％未満が、フコシル化されている、請求項１４８に記載の薬学的組成物。
  150. 前記ＡＢＰの３０％未満が、フコシル化されている、請求項１４９に記載の薬学的組成物。
  151. 前記ＡＢＰの２０％未満が、フコシル化されている、請求項１５０に記載の薬学的組成物。
  152. 前記ＡＢＰの１０％未満が、フコシル化されている、請求項１５１に記載の薬学的組成物。
  153. 前記ＡＢＰの３０％超が、フコシル化されている、請求項１４７に記載の薬学的組成物。
  154. 前記ＡＢＰの４０％超が、フコシル化されている、請求項１５３に記載の薬学的組成物。
  155. 前記ＡＢＰの５０％超が、フコシル化されている、請求項１５４に記載の薬学的組成物。
  156. 前記ＡＢＰの６０％超が、フコシル化されている、請求項１５５に記載の薬学的組成物。
  157. 前記ＡＢＰの７０％超が、フコシル化されている、請求項１５６に記載の薬学的組成物。
  158. 前記ＡＢＰの８０％超が、フコシル化されている、請求項１５７に記載の薬学的組成物。
  159. 前記ＡＢＰの９０％超が、フコシル化されている、請求項１５８に記載の薬学的組成物。
  160. ５．０～６．５のｐＨを有する、請求項１４７～１５９のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
  161. ２０ｍＭのヒスチジン又はクエン酸塩緩衝液を含む、請求項１４７～１６０のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
  162. ５０ｍＭのＮａＣｌを含む、請求項１４７～１６１のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
  163. スクロースを１７０ｍＭ～２７０ｍＭの濃度で含む、請求項１６２～１６２のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
  164. １７０ｍＭ又は２７０ｍＭのスクロースを含む、請求項１６３に記載の薬学的組成物。
  165. ２０ｍｇ／ｍＬの前記ＡＢＰを含む、請求項１４７～１６４のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
  166. 疾患を治療する方法であって、
    それを必要とする対象に、有効量の請求項１２５～１４５のいずれかに記載のＡＢＰ又は請求項１４７～１６５のいずれか一項に記載の薬学的組成物を投与するステップを含む、方法。
  167. 前記疾患が、がん、ＡＩＤＳ、アルツハイマー病、及びウイルス又は細菌感染症からなる群から選択される、請求項１６６に記載の方法。
  168. １つ以上の追加の治療剤を前記対象に投与するステップを更に含む、請求項１６６又は１６７に記載の方法。
  169. 前記追加の治療剤が、抗ＰＤ－Ｌ１、抗ＰＤ１、ＴＩＧＩＴ阻害剤、ＬＡＧ－３阻害剤、ＣＤ４７阻害剤、ＢＲＡＦ阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、ＰＩ３Ｋ阻害剤、化学療法剤、免疫刺激剤、放射線、サイトカイン、サイトカインをコードするポリヌクレオチド、サイトカインをコードする腫瘍溶解性ウイルス、及びそれらの組み合わせから選択される、請求項１６８に記載の方法。
  170. 請求項１２６～１４６のいずれかに記載のＡＢＰをコードする、単離されたポリヌクレオチド。
  171. 請求項１７０に記載の単離されたポリヌクレオチドを含む、ベクター。
  172. 請求項１７０に記載の単離されたポリヌクレオチド又は請求項１７０に記載のベクターを含む、宿主細胞。
  173. 前記宿主細胞が、細菌タンパク質ＲＭＤ（ＧＤＰ－６－デオキシ－Ｄ－リキソ－４－ヘキスロースレダクターゼ）を更に含む、請求項１７２に記載の宿主細胞。
  174. 前記宿主細胞が、フコースの不在下で培養された、請求項１７２又は１７３に記載の宿主細胞。
  175. Ｆｕｔ８の発現が欠如しているか、又は低減している、請求項１７２～１７４のいずれか一項に記載の宿主細胞。
  176. フコシル化阻害剤２－フルオロフコース（２ＦＦ）の存在下で培養された、請求項１７２～１７５のいずれか一項に記載の宿主細胞。
  177. グリコシルトランスフェラーゼ（ＧｎＴＩＩＩ）を過剰発現する、請求項１７２～１７６のいずれか一項に記載の宿主細胞。
  178. ヒトＣＴＬＡ－４に特異的に結合する単離された抗原結合タンパク質（ＡＢＰ）を産生する方法であって、請求項１７１～１７７のいずれか一項に記載の宿主細胞における前記ＡＢＰの発現を誘発することと、前記ＡＢＰを単離することと、を含む、方法。
  179. 前記ＡＢＰをそのフコシル化状態に基づいて単離するステップを更に含む、請求項１７８に記載の方法。
  180. 前記宿主細胞が、フコシル化阻害剤を含む培養培地中で培養される、請求項１７８又は１７９に記載の方法。
  181. 前記フコシル化阻害剤が、２－フルオロフコース（２ＦＦ）である、請求項１８０に記載の方法。
  182. ＣＴＬＡ－４ＨＩ Ｔｒｅｇを、残りのＴｒｅｇの増殖が制限された対象において低減する方法であって、有効用量の
    請求項１２６～１４６のいずれか一項に記載のＡＢＰ、又は請求項１４１～１６４のいずれか一項に記載の薬学的組成物を投与することを含む、方法。
  183. 前記対象が、ヒト対象、任意に、黒色腫、ＲＣＣ（腎細胞がん）、ＮＳＣＬＣ（非小細胞肺がん）、メルケル細胞がん、ｃＳＣＣ、中皮腫、ＭＳＩ結腸直腸がん、卵巣がん、又は子宮頸がんを有するヒト対象である、請求項１８２に記載の方法。
  184. １つ以上の追加の治療剤を前記対象に投与するステップを更に含む、請求項１８２又は１８３に記載の方法。
  185. 前記追加の治療剤が、抗ＰＤ－Ｌ１若しくは抗ＰＤ１又はそれらの組み合わせである、請求項１８４に記載の方法。
  186. 前記対象が、高レベルのＴｒｅｇ、高レベルのＣＴＬＡ－４、高レベルのＮＫ細胞、又は高レベルの活性化ＦｃＲを有する腫瘍を有する、請求項１８２に記載の方法。
  187. ＣＴＬＡ－４ＨＩ Ｔｒｅｇを、残りのＴｒｅｇの増殖が制限された対象において低減する方法であって、有効用量の
    請求項１２６～１４６のいずれか一項に記載のＡＢＰ、又は請求項１４６～１６４のいずれか一項に記載の薬学的組成物を投与することを含む、方法。
  188. 前記対象が、ヒト対象、任意に、黒色腫、ＲＣＣ（腎細胞がん）、ＮＳＣＬＣ（非小細胞肺がん）、メルケル細胞がん、ｃＳＣＣ、中皮腫、ＭＳＩ結腸直腸がん、卵巣がん、又は子宮頸がんを有するヒト対象である、請求項１８７に記載の方法。
  189. １つ以上の追加の治療剤を前記対象に投与するステップを更に含む、請求項１８７又は１８８に記載の方法。
  190. 前記対象が、高レベルのＴｒｅｇ、高レベルのＣＴＬＡ－４、高レベルのＮＫ細胞、又は高レベルの活性化ＦｃＲを有する腫瘍を有する、請求項１８７に記載の方法。
  191. ＣＴＬＡ－４ＨＩ Ｔｒｅｇを、残りのＴｒｅｇの増殖が制限された対象において低減する方法であって、前記対象に、有効用量のヒト細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ－４）に特異的に結合する抗原結合タンパク質（ＡＢＰ）を投与することを含む、方法。
  192. 前記対象が、ヒト対象、任意に、黒色腫、ＲＣＣ（腎細胞がん）、ＮＳＣＬＣ（非小細胞肺がん）、メルケル細胞がん、ｃＳＣＣ、中皮腫、ＭＳＩ結腸直腸がん、卵巣がん、又は子宮頸がんを有するヒト対象である、請求項１９１に記載の方法。
  193. １つ以上の追加の治療剤を前記対象に投与するステップを更に含む、請求項１９１又は１９２に記載の方法。
  194. 前記ＡＢＰが、
    配列番号１４と少なくとも９７％同一の配列を含む可変軽鎖（ＶＬ）、及び配列番号１１４と少なくとも９７％同一の配列を含む可変重鎖（ＶＨ）を含む、請求項１９１に記載のＡＢＰ。
  195. 前記ＡＢＰが、
    （ａ）配列番号のいずれか１つからなるＣＤＲ１－Ｌ、配列番号１００１～１０２８のいずれか１つからなるＣＤＲ２－Ｌ、配列番号３００１～３０２８のいずれか１つからなるＣＤＲ３－Ｌ、配列番号のいずれか１つからなるＣＤＲ１－Ｈ、配列番号３００１～３０２８のいずれか１つからなるＣＤＲ２－Ｈを含む、請求項１９１に記載のＡＢＰ。
  196. 前記ＡＢＰが、
    配列番号１～２８のいずれか１つと少なくとも９７％同一の配列を含む可変軽鎖（ＶＬ）、及び配列番号１０１～１２８と少なくとも９７％同一の配列を含む可変重鎖（ＶＨ）を含む、請求項１９１に記載のＡＢＰ。
  197. 前記ＡＢＰが、
    （ａ）配列番号１２０８１のいずれか１つからなるＣＤＲ１－Ｌ、配列番号１２０８２からなるＣＤＲ２－Ｌ、配列番号１２０８３からなるＣＤＲ３－Ｌ、配列番号１２０８４からなるＣＤＲ１－Ｈ、配列番号１２０８５からなるＣＤＲ２－Ｈ、及び配列番号１２０８６からなるＣＤＲ３－Ｈを含む、請求項１９１に記載のＡＢＰ。
  198. 前記ＡＢＰが、
    配列番号１２０８８と少なくとも９７％同一の配列を含む可変軽鎖（ＶＬ）、及び配列番号１２０８７と少なくとも９７％同一の配列を含む可変重鎖（ＶＨ）を含む、請求項１９１に記載のＡＢＰ。
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