CN108271359B - 结合ctla4的抗体治疗剂 - Google Patents

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Abstract

公开了与抗‑CTLA4抗体相关或源自抗‑CTLA4抗体的组合物和方法。更具体地，公开了结合CTLA4的全人抗体、这类抗体的CTLA4‑抗体结合片段和衍生物以及包含这类片段的CTLA4‑结合多肽。更进一步地，公开了编码这类抗体、抗体片段和衍生物及多肽的核酸，包含这类多肽的细胞，制备这类抗体、抗体片段和衍生物及多肽的方法，以及使用这类抗体、抗体片段和衍生物及多肽的方法，包括治疗需要免疫反应的刺激或抑制的疾病的方法。刺激使用阻断人CTLA4与人B7的结合的抗体实现，且适合于通过免疫反应延长的刺激或增强来治疗的疾病包括前列腺、肾、结肠、肺或乳腺的癌症；病原体感染；与CNS相关的疾病，例如成淀粉样疾病，包括阿尔兹海默病；和具有炎性或变应性成分的疾病。适合于治疗的疾病包括移植物抗宿主病、宿主抗移植物病、过敏症、自身免疫性疾病和其它炎性疾病。

Description

结合CTLA4的抗体治疗剂
相关申请
本申请要求2015年2月13日提交的美国临时申请No.62/116353的优先权，其全部内容通过引用整体并入本文中。
技术领域
本公开提供与抗-CTLA4抗体相关或源自抗-CTLA4抗体的组合物和方法。更具体地，本公开提供结合CTLA4的全人抗体、这类抗体的CTLA4-抗体结合片段和衍生物及包含这类片段的CTLA4-结合多肽。更进一步地，本公开提供编码这类抗体、抗体片段和衍生物及多肽的核酸，包含这类多肽的细胞，制备这类抗体、抗体片段和衍生物及多肽的方法，以及使用这类抗体、抗体片段和衍生物及多肽的方法，包括治疗需要免疫反应的刺激或抑制的疾病的方法。刺激使用阻断人CTLA4与人B7的结合的抗体实现，且适合于通过免疫反应延长的刺激或增强来治疗的疾病包括前列腺、肾、结肠、肺或乳腺的癌症；病原体感染；与CNS相关的疾病，例如成淀粉样疾病，包括阿尔兹海默病；和具有炎性或变应性成分的疾病。适合于治疗的疾病包括移植物抗宿主病、宿主抗移植物病、过敏症、自身免疫性疾病和其它炎性疾病。
背景技术
脊椎动物免疫系统需要多种信号来实现最佳免疫激活；参见，例如Janeway,ColdSpring Harbor Symp.Quant.Biol.54:1-14(1989)；Paul William E.,ed.Raven Press,N.Y.,Fundamental Immunology,4th edition(1998)，特别是第12和13章，411-478页。T淋巴细胞(T细胞)和抗原呈递细胞(APC)之间的相互作用是免疫反应所必需的。T细胞和APC上发现的许多粘附分子的水平在免疫反应期间提高(Springer等,A.Rev.Immunol.5:223-252(1987)；Shaw和Shimuzu,Current Opinion in Immunology,Eds.Kindt和Long,1:92-97(1988))；及Hemler,Immunology Today 9:109-113(1988))。这些分子的提高的水平可以帮助解释为什么激活的APC比静息APC更有效地刺激抗原特异性T细胞增殖(Kaiuchi等,J.Immunol.131:109-114(1983)；Kreiger等,J.Immunol.135:2937-2945(1985)；McKenzie,J.Immunol.141:2907-2911(1988)；及Hawrylowicz和Unanue,J.Immunol.141:4083-4088(1988))。
T细胞免疫反应是涉及到细胞-细胞相互作用(Springer等,A.Rev.Immunol.5:223-252(1987))，特别是T细胞和辅助细胞如APC之间，和可溶性免疫介质(细胞因子或淋巴因子)的产生(Dinarello(1987)New Engl.Jour.Med.317:940-945；Sallusto(1997)J.Exp.Med.179:1109-1118)的复杂过程。这一反应通过几种T-细胞表面受体调节，包括T-细胞受体复合物(Weiss(1986)Ann.Rev.Immunol.4:593-619)和其它“辅助”表面分子(Allison(1994)Curr.Opin.Immunol.6:414-419；Springer(1987)，同上)。这些辅助分子中的许多是由单克隆抗体在细胞表面上的反应性定义的天然存在的细胞表面分化(CD)抗原(McMichael,Ed.,Leukocyte Typing III,Oxford Univ.Press,Oxford,N.Y.(1987))。
CD28具有单一细胞外可变区(V)-样结构域(Aruffo和Seed，同上)。同源分子，CTLA4通过鼠溶细胞性-T细胞cDNA文库的差异筛选来鉴别(Brunet(1987)Nature 328:267-270)。
CTLA4是最初通过鼠溶细胞性-T细胞cDNA文库的差异筛选鉴别的T细胞表面分子(Brunet等,Nature 328:267-270(1987))。CTLA4也是免疫球蛋白(Ig)超家族的成员；CTLA4包含单一细胞外Ig结构域。CTLA4转录物在具有细胞毒性活性的T细胞群体中发现，表明CTLA4可能在溶细胞性反应中发挥功能(Brunet等，同上；Brunet等,Immunol.Rev.103-21-36(1988))。研究者已经报告了CTLA4的人对应物基因(Dariavach等,Eur.J.Immunol.18:1901-1905(1988))的克隆和映射到与CD28相同的染色体区域(2q33-34)(Lafage-Pochitaloff等,Immunogenetics 31:198-201(1990))。这种人CTLA4DNA和编码CD28蛋白质的DNA之间的序列比较揭示了序列的显著同源性，最大的同源性水平在近膜和胞质区域中(Brunet,1988同上；Dariavach等,1988，同上)。
一些研究已经表明CTLA4具有与次级辅助刺激因子相似的功能(Linsley等,J.Exp.Med.176:1595-1604(1992)；Wu等,J.Exp.Med.185:1327-1335(1997)及美国专利5,977,318、5,968,510、5,885,796和5,885,579)。但是，其它人报告CTLA4具有作为T细胞激活的缓冲剂(dampener)的相反作用(Krummel(1995)J.Exp.Med.182:459-465)；Krummel等,Int'l Immunol.8:519-523(1996)；Chambers等,Immunity.7:885-895(1997))。已经报告CTLA4缺陷小鼠遭受重度的淋巴细胞增殖(Chambers等，同上)。已经报告CTLA4阻滞在体外(Walunas等,Immunity.1:405-413(1994))和在体内(Kearney(1995)J.Immunol.155:1032-1036)增强T细胞反应，使抗肿瘤免疫恶化(Leach(1996)Science.271:1734-1736)和增强诱导的自身免疫性疾病(Luhder(1998)J Exp.Med.187:427-432)。还已经报告CTLA4对T细胞免疫反应的初始特征具有可选的和附加的影响(Chambers(1997)Curr.Opin.Immunol.9:396-404；Bluestone(1997)J.Immunol.158:1989-1993；Thompson(1997)Immunity 7:445-450)。这与一些自身免疫患者具有针对CTLA4的自身抗体的观察一致。有可能CTLA4阻断抗体在这些患者中具有病理作用(Matsui(1999)J.Immunol.162:4328-4335)。
非人CTLA4抗体已经用于各种研究中。但是，对于抗体在人体中的体内治疗和诊断应用的开发面对的主要阻碍之一是非人免疫球蛋白的固有免疫原性。例如，当具有免疫功能的人类患者施用治疗剂量的啮齿动物单克隆抗体时，患者产生抗啮齿动物免疫球蛋白序列的抗体；这些人抗-小鼠抗体(HAMA)中和治疗抗体并可引起急性毒性。之前抗体的这些和其它的缺陷通过由本公开提供抗CTLA4的全人抗体得以克服。
发明内容
本发明涉及能够结合CTLA4的结合蛋白，包括抗-CTLA4抗体及其抗原结合片段。
在一个方面中，本公开提供以至少10-6M的结合亲和力结合CTLA4表位的分离的IgG类的全人抗-CTLA4抗体，其具有与选自以下的氨基酸序列至少95％同一的重链可变域序列：SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.19、SEQ IDNO.21、SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.25、SEQ ID NO.27、SEQ ID NO.29、SEQ ID NO.31、SEQ IDNO.33、SEQ ID NO.35、SEQ ID NO.37、SEQ ID NO.39、SEQ ID NO.41和SEQ ID NO:43；和具有与选自以下的氨基酸序列至少95％同一的轻链可变域序列：SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.26、SEQ IDNO.28、SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.38、SEQ IDNO.40、SEQ ID NO.42和SEQ ID NO:44。在一个实施方式中，全人抗体具有重链和轻链两者，其中抗体具有选自以下的重链/轻链可变域序列：SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.2(本文中称为A1)、SEQ ID NO.3/SEQ ID NO.4(本文中称为A2)、SEQ ID NO.5/SEQ ID NO.6(本文中称为A4)、SEQ ID NO.7/SEQ ID NO.8(本文中称为A7)、SEQ ID NO.9/SEQ ID NO.10(本文中称为A12)、SEQ ID NO.11/SEQ ID NO.12(本文中称为B6)、SEQ ID NO.13/SEQ ID NO.14(本文中称为C2)、SEQ ID NO.15/SEQ ID NO.16(本文中称为D6)、SEQ ID NO.17/SEQ ID NO.18(本文中称为F1)、SEQ ID NO.19/SEQ ID NO.20(本文中称为F3)、SEQ ID NO.21/SEQ ID NO.22(本文中称为F5)、SEQ ID NO.23/SEQ ID NO.24(本文中称为F6)、SEQ ID NO.25/SEQ IDNO.26(本文中称为F7)、SEQ ID NO.27/SEQ ID NO.28(本文中称为G1)、SEQ ID NO.29/SEQID NO.30(本文中称为G2)、SEQ ID NO.31/SEQ ID NO.32(本文中称为G3)、SEQ ID NO.33/SEQ ID NO.34(本文中称为G5)、SEQ ID NO.35/SEQ ID NO.36(本文中称为G12)、SEQ IDNO.37/SEQ ID NO.38(本文中称为D5)、SEQ ID NO.39/SEQ ID NO.40(本文中称为E7)、SEQID NO.41/SEQ ID NO.42(本文中称为E8)和SEQ ID NO:43/SEQ ID NO:44(本文中称为CT1E1)。
在另一方面中，本公开提供抗-CTLA4Fab全人抗体片段，包含重链可变域和轻链可变域，该重链可变域包含与选自以下的氨基酸序列至少95％同一的序列：SEQ ID NO.1、SEQID NO.3、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.11、SEQ IDNO.13、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.23、SEQ IDNO.25、SEQ ID NO.27、SEQ ID NO.29、SEQ ID NO.31、SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.35、SEQ IDNO.37、SEQ ID NO.39、SEQ ID NO.41和SEQ ID NO:43，和该轻链可变域包含与选自以下的氨基酸序列至少95％同一的序列：SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.18、SEQ IDNO.20、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.30、SEQ IDNO.32、SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.40、SEQ ID NO.42和SEQID NO:44。在一个实施方式中，全人抗体Fab片段具有重链可变域区域和轻链可变域区域两者，其中抗体具有选自以下的重链/轻链可变域序列：SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.2、SEQ IDNO.3/SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5/SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7/SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9/SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11/SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13/SEQ ID NO.14、SEQ IDNO.15/SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17/SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.19/SEQ ID NO.20、SEQ IDNO.21/SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.23/SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.25/SEQ ID NO.26、SEQ IDNO.27/SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.29/SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.31/SEQ ID NO.32、SEQ IDNO.33/SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.35/SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.37/SEQ ID NO.38、SEQ IDNO.39/SEQ ID NO.40、SEQ ID NO.41/SEQ ID NO.42和SEQ ID NO:43/SEQ ID NO.44。
本公开进一步提供具有通过肽接头连接的重链可变域和轻链可变域的单链人抗体，其中重链可变域包含与选自以下的氨基酸序列至少95％同一的氨基酸序列：SEQ IDNO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9、SEQ IDNO.11、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.21、SEQ IDNO.23、SEQ ID NO.25、SEQ ID NO.27、SEQ ID NO.29、SEQ ID NO.31、SEQ ID NO.33、SEQ IDNO.35、SEQ ID NO.37、SEQ ID NO.39、SEQ ID NO.41和SEQ ID NO:43和其中轻链可变域包含与选自以下的氨基酸序列至少95％同一的氨基酸序列：SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQID NO.6、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16、SEQID NO.18、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.28、SEQID NO.30、SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.40、SEQID NO.42和SEQ ID NO:44。在某些实施方式中，全人单链抗体具有重链可变域区域和轻链可变域区域两者，其中单链全人抗体具有选自以下的重链/轻链可变域序列：SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3/SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5/SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7/SEQID NO.8、SEQ ID NO.9/SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11/SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13/SEQID NO.14、SEQ ID NO.15/SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17/SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.19/SEQID NO.20、SEQ ID NO.21/SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.23/SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.25/SEQID NO.26、SEQ ID NO.27/SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.29/SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.31/SEQID NO.32、SEQ ID NO.33/SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.35/SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.37/SEQID NO.38、SEQ ID NO.39/SEQ ID NO.40、SEQ ID NO.41/SEQ ID NO.42和SEQ ID NO.43/SEQ ID NO.44。
本发明中还包括分离的抗-CTLA4抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变域和轻链可变区，该重链可变域包含如选自以下的重链可变区氨基酸序列中所示的互补决定区(CDR)：SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ IDNO.9、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.19、SEQ IDNO.21、SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.25、SEQ ID NO.27、SEQ ID NO.29、SEQ ID NO.31、SEQ IDNO.33、SEQ ID NO.35、SEQ ID NO.37、SEQ ID NO.39和SEQ ID NO:43；和轻链可变区包含如选自以下的重链可变区氨基酸序列中所示的CDR：SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ IDNO.6、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16、SEQ IDNO.18、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.28、SEQ IDNO.30、SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.40和SEQID NO:44。
本公开进一步提供用于治疗需要免疫反应的刺激或抑制的疾病的方法，包括施用抗-CTLA4多肽，其中抗-CTLA4多肽选自结合CTLA4且包含重链可变域和轻链可变域的分离的IgG类的全人抗体；包含重链可变域和轻链可变域的抗-CTLA4全人抗体Fab片段；包含重链可变域和轻链可变域的单链人抗体，其中重链可变域和轻链可变域通过肽接头连接；其中重链可变域包含与选自以下的氨基酸序列至少95％同一的氨基酸序列：SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.11、SEQID NO.13、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.23、SEQID NO.25、SEQ ID NO.27、SEQ ID NO.29、SEQ ID NO.31、SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.35、SEQID NO.37、SEQ ID NO.39、SEQ ID NO.41和SEQ ID NO.43和其中轻链可变域包含与选自以下的氨基酸序列至少95％同一的氨基酸序列：SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.28、SEQ IDNO.30、SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.40、SEQ IDNO.42和SEQ ID NO.44。
在某些实施方式中，全人抗体或抗体片段具有重链和轻链两者，其中抗体或抗体片段包含选自以下的重链/轻链可变域序列：SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.2(本文中称为A1)、SEQ ID NO.3/SEQ ID NO.4(本文中称为A2)、SEQ ID NO.5/SEQ ID NO.6(本文中称为A4)、SEQ ID NO.7/SEQ ID NO.8(本文中称为A7)、SEQ ID NO.9/SEQ ID NO.10(本文中称为A12)、SEQ ID NO.11/SEQ ID NO.12(本文中称为B6)、SEQ ID NO.13/SEQ ID NO.14(本文中称为C2)、SEQ ID NO.15/SEQ ID NO.16(本文中称为D6)、SEQ ID NO.17/SEQ ID NO.18(本文中称为F1)、SEQ ID NO.19/SEQ ID NO.20(本文中称为F3)、SEQ ID NO.21/SEQ ID NO.22(本文中称为F5)、SEQ ID NO.23/SEQ ID NO.24(本文中称为F6)、SEQ ID NO.25/SEQ IDNO.26(本文中称为F7)、SEQ ID NO.27/SEQ ID NO.28(本文中称为G1)、SEQ ID NO.29/SEQID NO.30(本文中称为G2)、SEQ ID NO.31/SEQ ID NO.32(本文中称为G3)、SEQ ID NO.33/SEQ ID NO.34(本文中称为G5)、SEQ ID NO.35/SEQ ID NO.36(本文中称为G12)、SEQ IDNO.37/SEQ ID NO.38(本文中称为D5)、SEQ ID NO.39/SEQ ID NO.40(本文中称为E7)、SEQID NO.41/SEQ ID NO.42(本文中称为E8)和SEQ ID NO.43/SEQ ID NO.44(本文中称为CT1E1)。
在某些实施方式中，本发明的抗体或其抗原结合片段具有至少1x 10-6M的KD。在其它实施方式中，本发明的抗体或其抗原结合片段具有至少1x 10-7M的KD。在其它实施方式中，本发明的抗体或其抗原结合片段具有至少1x 10-8M的KD。
在某些实施方式中，抗体是IgG1同种型。在其它实施方式中，抗体是IgG4同种型。
在某些实施方式中，本文所述的抗体或抗原结合片段是重组体。
本发明还提供包含有效量的本文公开的抗-CTLA4抗体或片段和药学上可接受的载体的药物组合物。
在某些实施方式中，本发明特征在于治疗需要的人类受试者的癌症的方法，包括向受试者施用有效量的本文公开的抗-CTLA4抗体或其抗原结合片段，从而治疗癌症。
在优选的实施方式中，癌症与有害的CTLA4活性相关。这些类型的癌症的实例包括，但不限于膀胱癌、血癌、脑癌、乳腺癌、结肠癌、纤维肉瘤、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、黑素瘤、淋巴瘤、间皮瘤和浆细胞瘤。
在其它实施方式中，疾病选自前列腺、肾、结肠、肺或乳腺的癌症；病原体感染；与CNS相关的疾病，例如成淀粉样阿尔兹海默病；和具有炎性或变应性成分的疾病、移植物抗宿主病、宿主抗移植物病、过敏症、自身免疫性疾病和其它炎性疾病。
附图说明
图1显示所列的抗-CTLA4抗体增强T细胞激活的能力的功能活性。CD25表达的水平在其中添加抗-CTLA4抗体的培养物中较高。使用的对照抗体(对照Ig)是同种型匹配的非特异性(即，不结合CTLA4)的抗体。
图2显示，通过相对于培养基对照对数据进行标准化，显著的增强水平在接受抗-CTLA4抗体的培养物中检测到。使用的对照抗体(对照Ig)是同种型匹配的非特异性(即，不结合CTLA4)的抗体。
图3A和3B图示描绘了使用基于CD80(图3A)和CD86(图3B)的分析的抗体CT1E1的IC50特征，其与抗-CTLA4抗体伊匹单抗(Yervoy)相比。
图4图示描绘了测定抗-CTLA4抗体F7对低剂量超抗原葡萄球菌肠毒素B(SEB)的反应的作用的试验的结果。对照抗体(cIg)是同种型匹配的非特异性(即，不结合CTLA4)的抗体。
图5显示抗-CTLA4抗体E8的功能活性和其增强T细胞激活的能力。CD25表达的水平在其中添加E8的培养物中较高。使用的对照抗体(对照Ig)是同种型匹配的非特异性(即，不结合CTLA4)的抗体。标准化的数据在右侧。
具体实施方式
定义
术语"肽"、"多肽"和"蛋白质"各自指包含通过肽键彼此接合的两个或更多个氨基酸残基的分子。这些术语涵盖例如天然和人工蛋白质、蛋白质片段和蛋白质序列的多肽类似物(如突变蛋白、变体和融合蛋白)以及翻译后或者另外地共价或非共价地修饰的蛋白质。肽、多肽或蛋白质可以是单体或多聚的。
多肽的"变体"(例如，抗体的变体)包含其中相对于另一多肽序列，一个或多个氨基酸残基插入氨基酸序列、从氨基酸序列删除和/或置换到氨基酸序列中的氨基酸序列。公开的变体包括，例如，融合蛋白。
多肽的"衍生物"是已经化学修饰的多肽(例如，抗体)，例如，通过与另一化学部分(如，例如，聚乙二醇或白蛋白，例如，人血清白蛋白)偶联、磷酸化和糖基化。除非另外指示，术语"抗体"，除包含两个全长重链和两个全长轻链的抗体外，包括其衍生物、变体、片段和突变蛋白，其实例在下面描述。
"抗原结合蛋白"是包含与抗原结合的部分和任选地允许抗原结合部分采取促进的抗原结合蛋白与抗原的结合的构象的骨架或框架部分的蛋白质。抗原结合蛋白的实例包括抗体、抗体片段(例如，抗体的抗原结合部分)、抗体衍生物和抗体类似物。抗原结合蛋白可以包含，例如，具有移植的CDR或CDR衍生物的可选的蛋白质骨架或人工骨架。这些骨架包括，但不限于抗体衍生的骨架(包含引入以例如使抗原结合蛋白的三维结构稳定的突变)以及完全合成的骨架(包含，例如，生物相容性聚合物)。参见，例如，Korndorfer等人，2003，Proteins:Structure,Function,and Bioinformatics,Volume 53,Issue 1:121-129；Roque等人，2004，Biotechnol.Prog.20:639-654。此外，可以使用肽抗体模拟物(“PAM”)以及基于抗体模拟物的骨架(利用纤维连接蛋白组分作为骨架)。
抗原结合蛋白可以具有，例如，免疫球蛋白的结构。“免疫球蛋白”是四聚体分子，其由两个相同的多肽链对组成，每对具有一条“轻”链(约25kDa)和一条“重”链(约50-70kDa)。每条链的氨基端部分包括主要负责抗原识别的约100至110或更多个氨基酸的可变区。每条链的羧基端部分限定主要负责效应子功能的恒定区。人轻链分类为κ或λ轻链。重链分类为μ、δ、γ、α或ε，并分别定义抗体同种型为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。优选地，在一个实施方式中，本文公开的抗-CTLA4抗体特征在于重链(VH)和轻链(VL)氨基酸序列中的其可变域区域序列。在一个实施方式中，优选的抗体是作为κIgG抗体的A6。在轻链和重链内，可变区和恒定区通过约12或更多个氨基酸的“J”区连接，其中重链还包括约10个或更多个氨基酸的“D”区。通常参见，Fundamental Immunology，第7章(Paul,W.编辑，第二版，Raven出版社，N.Y.(1989))。每个轻/重链对的可变区形成抗体结合位点，使得完整的免疫球蛋白具有两个结合位点。
免疫球蛋白链的可变区表现出相同的总体结构：由通过三个高变区(也称为互补决定区或CDR)连接的相对保守的框架区(FR)。从N端至C端，轻链和重链都包含结构域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。每个结构域的氨基酸的指定按照Kabat等人在Sequencesof Proteins of Immunological Interest,第5版,US Dept.of Health and HumanServices,PHS,NIH,NIH出版号91-3242,1991中的定义命名。免疫球蛋白链中氨基酸的其它编号系统包括IMGTTM(国际ImMunoGeneTics信息系统；Lefranc等人，Dev.Comp.Immunol.29:185-203；2005)和AHo(Honegger和Pluckthun,J.Mol.Biol.309(3):657-670；2001)。
除非另有说明，“抗体”是指完整的免疫球蛋白或与完整抗体为特异性结合而竞争的其抗原结合部分。
在一个实施方式中，抗体包含重链可变域、轻链可变域、轻链恒定区(CL)和重链恒定区CH1、CH2和CH3。重链和轻链可变域序列可以选自本文SEQ ID No:1-44中所描述的那些。
可以通过重组DNA技术或通过完整抗体的酶促或化学切割产生抗体的抗原结合部分。抗原结合部分包括，特别是，Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、域抗体(dAb)和互补决定区(CDR)片段、单链抗体(scFv)、嵌合抗体、双抗体(diabodies)、三抗体(triabodies)、四抗体(tetrabodies)和含有至少足以对多肽赋予特异性抗原结合的免疫球蛋白的部分的多肽。
在某些实施方式中，抗体可以从含有具有变化的抗原特异性的免疫球蛋白的来源比如血清或血浆获得。如果将这样的抗体进行亲和纯化，它们可以针对特定的抗原特异性富集。通常由少于约10％的对特定抗原具有特异性结合活性的抗体制备这类富集的抗体制剂。使这些制剂经历若干轮亲和纯化可以提高对抗原具有特异性结合活性的抗体的比例。以这种方式制备的抗体通常称为“单特异性的”。
如本文中使用的术语“单特异性的”是指显示对于一种特定表位的亲和力的抗体。单特异性抗体制剂可以由约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或99.9％的对特定抗原具有特异性结合活性的抗体构成。
"抗体片段"或“抗体的抗原结合片段”包含完整抗体的部分且优选地包含抗体抗原结合或可变域。抗体片段的实例包括Fab、Fab'、F(ab')2、Fv片段和线性抗体。
Fab片段为具有VL、VH、CL和CH1结构域的单价片段；F(ab')2片段为具有通过在铰链区的二硫键连接的2个Fab片段的双价片段；Fd片段具有VH和CH1结构域；Fv片段具有抗体单臂的VL和VH结构域；并且dAb片段具有VH结构域、VL结构域或者VH或VL结构域的抗原结合片段(美国专利号6,846,634、6,696,245，美国专利申请公开号2002/02512、2004/0202995、2004/0038291、2004/0009507、2003/0039958和Ward等人，Nature 341:544-546,1989)。
单链抗体(scFv)为其中VL和VH区通过接头(例如，合成的氨基酸残基的序列)连接以形成连续的蛋白链的抗体，其中该接头足够长以允许蛋白链自身回折并形成单价抗原结合位点(参见，例如Bird等人，1988,Science 242:423-26和Huston等人，1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-83)。
双抗体为包含2条多肽链的二价抗体，其中每条多肽链包含由接头连接的VH和VL结构域，该接头太短而不允许相同链上的2个结构域之间配对，因此允许每个结构域与在另一多肽链上的互补结构域配对(参见，例如，Holliger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-48,1993和Poljak等人，Structure 2:1121-23,1994)。如果双抗体的两条多肽链是相同的，那么由其配对产生的双抗体将具有2个相同的抗原结合位点。具有不同序列的多肽链可以用于形成具有2个不同抗原结合位点的双抗体。类似地，三抗体和四抗体分别为包含3条和4条多肽链并分别形成3个和4个抗原结合位点(其可以相同的或不同)的抗体。
抗原结合蛋白如抗体可以具有一个或多个结合位点。如果存在多于一个结合位点，那么结合位点可以彼此相同或可以不同。例如，天然存在的人免疫球蛋白通常具有两个相同的结合位点，而“双特异性”或“双功能”抗体具有两个不同的结合位点。
术语“人抗体”包括具有源自人免疫球蛋白序列的一个或多个可变区和恒定区的所有抗体。在一个实施方式中，抗体的所有可变域和恒定域源自人免疫球蛋白序列(称为“全人抗体”)。这些抗体可以以多种方式制备，其实例如下文所述，包括通过用目标抗原对小鼠(其经遗传修饰以表达来源于人重链和/或轻链编码基因的抗体)进行免疫。在优选的实施方式中，全人抗体使用重组方法制备，使得抗体的糖基化模式不同于具有相同序列的抗体(如果它在自然界中存在)。
“人源化抗体”的序列与来源于非人物种的抗体的序列不同在于一个或多个氨基酸置换、删除和/或添加，以使得在施用于人类受试者时，人源化抗体与非人物种的抗体相比较少可能诱导免疫反应和/或诱导较不严重的免疫反应。在一个实施方式中，非人物种抗体的重链和/或轻链的框架和恒定域中的某些氨基酸被突变以产生人源化抗体。在另一实施方式中，来自人抗体的恒定域与非人物种的可变域融合。在另一实施方式中，改变非人抗体的一个或多个CDR序列中的一个或多个氨基酸残基以降低非人抗体在施用于人类受试者时可能的免疫原性，其中改变的氨基酸残基对于抗体与其抗原的免疫特异性结合不是关键的，或对氨基酸序列进行的改变是保守性改变，使得人源化抗体与抗原的结合不会比非人抗体与抗原的结合明显更差。如何制备人源化抗体的实例可以在美国专利号6,054,297、5,886,152和5,877,293中找到。
术语“嵌合抗体”指的是含有来自一个抗体的一个或多个区域和来自一个或多个其它抗体的一个或多个区域的抗体。在一个实施方式中，一个或多个CDR来源于人抗-CTLA4抗体。在另一实施方式中，所有的CDR来源于人抗-CTLA4抗体。在另一实施方式中，来自多于一个人抗-CTLA4抗体的CDR混合并在嵌合抗体中匹配。例如，嵌合抗体可以包含来自第一人抗-PAR-2抗体的轻链的CDR1，来自第二人抗-CTLA4抗体的轻链的CDR2和CDR3，以及来自第三抗-CTLA4抗体的重链的CDR。其它组合是可能的。
此外，框架区可以来源于相同抗-CTLA4抗体中的一个、来自一个或多个不同抗体(比如人抗体)或来自人源化抗体。在嵌合抗体的一个例子中，重链和/或轻链的一部分与来自特定物种或者属于特定抗体类别或子类的抗体相同、同源或来源于该抗体，而链的其余部分与来自另一物种或者属于另一抗体类别或子类的抗体相同、同源或来源于该抗体。也包括这些抗体的表现出所需生物活性(即，特异性结合CTLA4的能力)的片段。
“中和抗体”或“抑制性抗体”为抑制CTLA4活性的拮抗抗体，例如抑制CTLA4的蛋白水解激活。在一个实施方式中，使用例如本文实施例中描述的那些分析，CTLA4的蛋白水解激活在过量的抗-CTLA4抗体降低激活量至少约20％时测定。在各种实施方式中，抗原结合蛋白降低CTLA4的蛋白水解激活量至少30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％和99.9％。
“CDR移植抗体”是包含来源于特定物种或同种型的抗体的一个或多个CDR和相同或不同物种或同种型的另一抗体的框架的抗体。
“多特异性抗体”是识别在一个或多个抗原上的超过一个表位的抗体。这种类型的抗体的子类为“双特异性抗体”，其识别在相同或不同抗原上的2个不同的表位。
如果抗原结合蛋白以1纳摩尔或更小的解离常数结合抗原(例如，人CTLA4)，那么该抗原结合蛋白“特异性地结合”该抗原。
“抗原结合结构域”、“抗原结合区”或“抗原结合位点”为含有与抗原相互作用并造成抗原结合蛋白对抗原的特异性和亲和力的氨基酸残基(或其它部分)的抗原结合蛋白的部分。对于特异性地结合其抗原的抗体，这包括其CDR域中至少一个的至少一部分。
术语“Fc多肽”包括源自抗体Fc区的多肽的天然和突变蛋白形式。也包括含有促进二聚化的铰链区的这种多肽的截短形式。包含Fc部分的融合蛋白(以及由其形成的寡聚体)提供如下优势：易于通过在蛋白A或蛋白G柱上的亲和色谱纯化。
“表位”为分子的被抗原结合蛋白(例如，被抗体)结合的部分。表位可以包含分子的非连续部分(例如在多肽中，在多肽的一级序列中不连续但在多肽的三级和四级结构的情况下彼此足够接近从而被抗原结合蛋白结合的氨基酸残基)。
两条多核苷酸或两条多肽序列的“百分同一性”或“百分同源性”通过利用GAP计算机程序(GCG Wisconsin Package的部分，版本10.3(Accelrys，圣地亚哥，加利福尼亚州))使用其默认参数比较该序列来确定。
术语“多核苷酸”、“寡核苷酸”和“核酸”在全文中可互换地使用并包括DNA分子(例如，cDNA或基因组DNA)、RNA分子(例如，mRNA)、使用核苷酸类似物(例如，肽核酸和非天然存在的核苷酸类似物)产生的DNA或RNA的类似物及其杂合体。核酸分子可以为单链或双链的。在一个实施方式中，本发明的核酸分子包含编码抗体或其片段、衍生物、突变蛋白或变体的连续开放阅读框。
如果两个单链多核苷酸的序列可以按反平行定向对齐以使得一个多核苷酸中的每个核苷酸与另一多核苷酸中的其互补核苷酸相对而没有引入空位和在任一序列的5'或3'端没有未配对的核苷酸，那么这两个单链多核苷酸是彼此的“互补序列”。如果两个多核苷酸可以在中等严格条件下彼此杂交，那么一个多核苷酸与另一多核苷酸“互补”。因此，多核苷酸可以与另一多核苷酸互补而不是其互补序列。
“载体”为可以用于将与其连接的另一核酸引入细胞中的核酸。一种类型的载体为“质粒”，其指的是线性或环状双链DNA分子，可以将另外的核酸片段连接至该双链DNA分子中。另一类型的载体为病毒载体(例如，复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)，其中可将另外的DNA片段引入到病毒基因组中。某些载体能够在其所引入的宿主细胞中自主复制(例如，包含细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。其它载体(例如，非附加型哺乳动物载体)在引入宿主细胞中后被整合到宿主细胞的基因组中，且由此与宿主基因组一起复制。“表达载体”为可以指导选定多核苷酸的表达的载体类型。
如果调控序列影响核苷酸序列的表达(例如，表达的水平、时机或位置)，那么该核苷酸序列“可操作地连接”于调控序列。“调控序列”为影响其可操作地连接的核酸的表达(例如，表达的水平、时机或位置)的核酸。调控序列可以，例如，直接在所调节的核酸上，或通过一个或多个其它分子(例如，结合于该调控序列和/或该核酸的多肽)的作用施加其影响。调控序列的实例包括启动子、增强子和其它表达控制元件(例如，聚腺苷酸化信号)。调控序列的另外的实例在，例如，Goeddel,1990,Gene Expression Technology:Methods inEnzymology 185,Academic Press,San Diego,Calif.和Baron等人,1995,Nucleic AcidsRes.23:3605-06中描述。
“宿主细胞”为可以用于表达核酸(例如，本发明的核酸)的细胞。宿主细胞可以是原核细胞，例如，大肠杆菌，或其可以是真核细胞，例如，单细胞真核生物(例如，酵母或其它真菌)、植物细胞(例如，烟草或番茄植物细胞)、动物细胞(例如，人细胞、猴细胞、仓鼠细胞、大鼠细胞、小鼠细胞或昆虫细胞)或杂交瘤。宿主细胞的实例包括COS-7系猴肾细胞(ATCCCRL 1651)(参见Gluzman等人，1981,Cell23:175)、L细胞、C127细胞、3T3细胞(ATCC CCL163)、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或其衍生物如Veggie CHO和相关细胞系(其在无血清培养基中生长)(参见Rasmussen等人，1998,Cytotechnology 28:31)或CHO株DX-B11(其为DHFR缺陷的)(参见Urlaub等人，1980,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216-20)、HeLa细胞、BHK(ATCC CRL 10)细胞系、来源于非洲绿猴肾细胞系CV1的CV1/EBNA细胞系(ATCC CCL 70)(参见McMahan等人，1991,EMBO J.10:2821)、人胚肾细胞(比如293、293EBNA或MSR293)、人表皮A431细胞，人Colo205细胞、其它转化的灵长类细胞系、正常二倍体细胞、来源于原代组织、原代外植体的体外培养物的细胞株、HL-60、U937、HaK或Jurkat细胞。在一个实施方式中，宿主细胞是哺乳动物宿主细胞，但不是人宿主细胞。通常，宿主细胞是可用多肽编码核酸转化或转染的培养细胞，该多肽编码核酸随后可以在宿主细胞中表达。短语“重组宿主细胞”可以用于表示已经用待表达的核酸转化或转染的宿主细胞。宿主细胞也可以为包含核酸，但除非将调控序列引入到该宿主细胞中以使该调控序列可操作地与该核酸连接，该核酸不以所需的水平表达的细胞。应该理解，术语宿主细胞不仅仅指特定的受试细胞，还指这种细胞的后代或潜在的后代。因为在后续的世代中可能由于例如突变或环境影响而出现一些变化，因此实际上这类后代可能与亲代细胞不相同，但仍然包含在本文使用的术语的范围内。
术语"重组抗体"是指从用表达载体(或可能超过一种表达载体，通常两种表达载体)转染的细胞或细胞系表达的抗体，该表达载体包含抗体的编码序列，其中所述编码序列不是天然与该细胞相关。在一个实施方式中，重组抗体的糖基化模式不同于具有相同序列的抗体(如果其在自然界中存在)的糖基化模式。在一个实施方式中，重组抗体在不是人宿主细胞的哺乳动物宿主细胞中表达。值得注意地，单个哺乳动物宿主细胞具有独特的糖基化模式。
如本文中使用的术语“有效量”是指结合CTLA4的抗体或其抗原结合部分的量，其在施用于受试者时足以实现如本文中所述的与CTLA4依赖性信号传导相关的疾病的治疗、预后或诊断。本文提供的抗体在单独或组合使用时的治疗有效量根据抗体和组合的相对活性(例如，抑制细胞生长)和根据所治疗的受试者和疾病状况、受试者的体重和年龄、疾病状况的严重程度、施用方式等变化，这可以容易地通过本领域技术人员确定。
术语“分离的”是指基本上不含其它细胞物质和/或化学物质的蛋白质(例如，抗体)。在一个实施方式中，分离的抗体基本上不含来自相同物种的其它蛋白质。在一个实施方式中，分离的抗体通过来自不同物种的细胞表达且基本上不含来自不同物种的其它蛋白质。蛋白质可以使用本领域中公知的蛋白质纯化技术通过分离使得基本上不含天然相关的成分(或与用于产生抗体的细胞表达系统相关的成分)。在一个实施方式中，本发明的抗体或抗原结合片段是分离的。
CTLA4抗原结合蛋白
本发明涉及结合CTLA4的CTLA4结合蛋白，特别地抗-CTLA4抗体或其抗原结合部分，及其用途。本发明的各个方面涉及抗体和抗体片段、药物组合物、核酸、重组表达载体和用于产生这类抗体和片段的宿主细胞。使用本发明的抗体检测人CTLA4、抑制CTLA4活性(在体外或体内)和预防或治疗紊乱如癌症的方法也被本发明涵盖。
如以下表4中描述的，本发明中包括对于CTLA4特异性的新型重链和轻链可变区。在一个实施方式中，本发明提供抗-CTLA4抗体或其抗原结合片段，其包含具有含有如以下SEQ ID NO任一所示的氨基酸序列的可变域的重链：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41和43。在一个实施方式中，本发明提供抗-CTLA4抗体或其抗原结合片段，其包含具有含有如以下SEQ ID NO任一所示的氨基酸序列的可变域的轻链：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42和44。在一个实施方式中，本发明提供抗-CTLA4抗体或其抗原结合片段，其包含具有含有如以下SEQ ID NO任一所示的氨基酸序列的可变域的重链：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41和43；且包含具有含有如以下SEQ ID NO任一所示的氨基酸序列的可变域的轻链：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42和44。
互补决定区(CDR)已知为轻链和重链可变域两者中的超变区。可变域的更高保守的部分称为框架区(FR)。给定抗体的互补决定区(CDR)和框架区(FR)可以使用Kabat等，同上；Lefranc等，同上和/或Honegger和Pluckthun，同上描述的系统鉴别。还与本领域中类似的是Kabat等(1991,NIH Publication 91-3242,National Technical InformationService,Springfield,Va.)中描述的编号系统。在此方面，Kabat等定义了可应用于任何抗体的可变域序列的编号系统。本领域技术人员可以明确地将这一"Kabat编号"系统分配于可变域氨基酸序列而不依赖于超出序列本身的任何试验数据。可选的编号在Chothia等,J.Mol.Biol.196:901-917(1987)和MacCallum等,J.Mol.Biol.262:732-745(1996)中给出，虽然如在Kabat中，FR边界通过如上所述的相应CDR末端分隔。也参见Chothia等,Nature342,pp.877-883(1989)和S.Dubel,ed.,Handbook of Therapeutic antibodies,3rd ed.,WILEY-VCH Verlag GmbH and Co.(2007)，其中定义包括在彼此比较时氨基酸残基的重叠或子集。
在某些实施方式中，本发明提供如表4中所述的重链和轻链可变域(SEQ ID No:1-44)的CDR的抗-CTLA4抗体。例如，本发明提供包含具有如以下SEQ ID NO任一所示的氨基酸序列中所述的CDR的重链可变区的抗-CTLA4抗体或其抗原结合片段：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41和43。在一个实施方式中，本发明提供包含具有如以下SEQ ID NO任一所示的氨基酸序列中所述的CDR的轻链可变区的抗-CTLA4抗体或其抗原结合片段：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42和44。在一个实施方式中，本发明提供包含具有如以下SEQ ID NO任一所示的氨基酸序列中所述的CDR的轻链可变区的抗-CTLA4抗体或其抗原结合片段：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42和44；且包含具有如以下SEQ ID NO任一所示的氨基酸序列中所述的CDR的重链可变区：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41和43。
一个或多个CDR可以共价或非共价地并入分子中以使其形成抗原结合蛋白。
抗原结合蛋白可以作为大的多肽链的部分整合CDR，可以共价地将CDR连接于另一多肽链，或可以非共价地整合CDR。CDR允许抗原结合蛋白特异性地结合特定的目标抗原。
在一个实施方式中，本公开提供IgG类的分离的全人抗体，其结合CTLA4表位，具有与选自以下的氨基酸序列至少95％同一的重链可变域序列：SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.13、SEQID NO.15、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.25、SEQID NO.27、SEQ ID NO.29、SEQ ID NO.31、SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.35、SEQ ID NO.37、SEQID NO.39、SEQ ID NO.41、SEQ ID NO.43和具有与选自以下的氨基酸序列至少95％同一的轻链可变域序列：SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.20、SEQ IDNO.22、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.32、SEQ IDNO.34、SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.40、SEQ ID NO.42、SEQ ID NO.44。
在一个实施方式中，分离的全人抗体具有重链和轻链两者，其中抗体具有选自以下的重链/轻链可变域序列：SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.2(本文中称为A1)、SEQ ID NO.3/SEQID NO.4(本文中称为A2)、SEQ ID NO.5/SEQ ID NO.6(本文中称为A4)、SEQ ID NO.7/SEQID NO.8(本文中称为A7)、SEQ ID NO.9/SEQ ID NO.10(本文中称为A12)、SEQ ID NO.11/SEQ ID NO.12(本文中称为B6)、SEQ ID NO.13/SEQ ID NO.14(本文中称为C2)、SEQ IDNO.15/SEQ ID NO.16(本文中称为D6)、SEQ ID NO.17/SEQ ID NO.18(本文中称为F1)、SEQID NO.19/SEQ ID NO.20(本文中称为F3)、SEQ ID NO.21/SEQ ID NO.22(本文中称为F5)、SEQ ID NO.23/SEQ ID NO.24(本文中称为F6)、SEQ ID NO.25/SEQ ID NO.26(本文中称为F7)、SEQ ID NO.27/SEQ ID NO.28(本文中称为G1)、SEQ ID NO.29/SEQ ID NO.30(本文中称为G2)、SEQ ID NO.31/SEQ ID NO.32(本文中称为G3)、SEQ ID NO.33/SEQ ID NO.34(本文中称为G5)、SEQ ID NO.35/SEQ ID NO.36(本文中称为G12)、SEQ ID NO.37/SEQ IDNO.38(本文中称为D5)、SEQ ID NO.39/SEQ ID NO.40(本文中称为E7)、SEQ ID NO.41/SEQID NO.42(本文中称为E8)、SEQ ID NO.43/SEQ ID NO.44(本文中称为CT1E1)及其组合。
在一个实施方式中，本发明提供包含重链的抗-CTLA4抗体或其抗原结合片段，该重链包含如以下SEQ ID NO任一中所示的CDR3结构域：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41和43且包含含有与如以下SEQ ID NO任一中所示的序列至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一的氨基酸序列的可变域：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41和43。在一个实施方式中，本发明提供包含轻链的抗-CTLA4抗体或其抗原结合片段，该轻链包含如以下SEQ ID NO任一中所示的CDR3结构域的：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42和44且具有包含如以下SEQ ID NO任一中所示的序列至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一的氨基酸序列的轻链可变域：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42和44。因此，在某些实施方式中，CDR3结构域保持恒定，而变异性可以引入重链和/或轻链的其余CDR/或框架区中，同时抗体或其抗原结合片段保持结合CTLA4的能力且保持亲本抗体的功能特性，例如，结合亲和力。
在一个实施方式中，至少95％同一(或至少96％同一，或至少97％同一，或至少98％同一，或至少99％同一)的重链或轻链内进行的置换是保守氨基酸置换。"保守氨基酸置换"是其中氨基酸残基被具有化学特性(例如，电荷或疏水性)相似的侧链(R基团)的另一氨基酸残基置换。一般地，保守氨基酸置换实质上改变蛋白质的功能特性。在其中两个或更多个氨基酸序列彼此不同在于保守置换的情况中，百分序列同一性或相似性水平可以上调以改正置换的保守特性。用于进行这种调节的方式是本领域技术人员公知的。参见，例如，Pearson(1994)Methods Mol.Biol.24:307-331，通过引用并入本文。具有化学特性相似的侧链的氨基酸的组的实例包括(1)脂族侧链：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸：(2)脂族-羟基侧链：丝氨酸和苏氨酸：(3)含酰胺侧链：天冬酰胺和谷氨酰胺：(4)芳族侧链：苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸：(5)碱性侧链：赖氨酸、精氨酸和组氨酸：(6)酸性侧链：天冬氨酸和谷氨酸及(7)含硫侧链是半胱氨酸和甲硫氨酸。
在一个实施方式中，本发明涉及具有抗体A1的抗原结合区的抗体或其抗原结合片段。在一个实施方式中，本发明提供包含如SEQ ID NO:1中所示的重链可变域序列和如SEQID NO:2中所示的轻链可变域序列的抗体或其抗原结合片段。在一个实施方式中，本发明涉及具有包含SEQ ID NO:1的CDR的重链可变域和包含SEQ ID NO:2的CDR的轻链可变域的抗体。在一个实施方式中，本发明特征在于分离的人抗体或其抗原结合片段，其包含具有与SEQ ID NO:1中所示的序列至少95％同一、至少96％同一、至少97％同一、至少98％同一或至少99％同一的氨基酸序列的重链可变区和包含具有与SEQ ID NO:2中所示的序列至少95％同一、至少96％同一、至少97％同一、至少98％同一或至少99％同一的氨基酸序列的轻链可变区。抗体可以进一步是IgG1或IgG4同种型。
在一个实施方式中，本发明涉及具有抗体A2的抗原结合区的抗体或其抗原结合片段。在一个实施方式中，本发明提供包含如SEQ ID NO:3中所示的重链可变域序列和如SEQID NO:4中所示的轻链可变域序列的抗体或其抗原结合片段。在一个实施方式中，本发明涉及具有包含SEQ ID NO:3的CDR的重链可变域和包含SEQ ID NO:4的CDR的轻链可变域的抗体。在一个实施方式中，本发明特征在于分离的人抗体或其抗原结合片段，其包含具有与SEQ ID NO:3中所示的序列至少95％同一、至少96％同一、至少97％同一、至少98％同一或至少99％同一的氨基酸序列的重链可变区和包含具有与SEQ ID NO:4中所示的序列至少95％同一、至少96％同一、至少97％同一、至少98％同一或至少99％同一的氨基酸序列的轻链可变区。抗体可以进一步是IgG1或IgG4同种型。
在一个实施方式中，本发明涉及具有抗体A4的抗原结合区的抗体或其抗原结合片段。在一个实施方式中，本发明提供包含如SEQ ID NO:5中所示的重链可变域序列和如SEQID NO:6中所示的轻链可变域序列的抗体或其抗原结合片段。在一个实施方式中，本发明涉及具有包含SEQ ID NO:5的CDR的重链可变域和包含SEQ ID NO:6的CDR的轻链可变域的抗体。在一个实施方式中，本发明特征在于分离的人抗体或其抗原结合片段，其包含具有与SEQ ID NO:5中所示的序列至少95％同一、至少96％同一、至少97％同一、至少98％同一或至少99％同一的氨基酸序列的重链可变区和包含具有与SEQ ID NO:6中所示的序列至少95％同一、至少96％同一、至少97％同一、至少98％同一或至少99％同一的氨基酸序列的轻链可变区。抗体可以进一步是IgG1或IgG4同种型。
在一个实施方式中，本发明涉及具有抗体A7的抗原结合区的抗体或其抗原结合片段。在一个实施方式中，本发明提供包含如SEQ ID NO:7中所示的重链可变域序列和如SEQID NO:8中所示的轻链可变域序列的抗体或其抗原结合片段。在一个实施方式中，本发明涉及具有包含SEQ ID NO:7的CDR的重链可变域和包含SEQ ID NO:8的CDR的轻链可变域的抗体。在一个实施方式中，本发明特征在于分离的人抗体或其抗原结合片段，其包含具有与SEQ ID NO:7中所示的序列至少95％同一、至少96％同一、至少97％同一、至少98％同一或至少99％同一的氨基酸序列的重链可变区和包含具有与SEQ ID NO:8中所示的序列至少95％同一、至少96％同一、至少97％同一、至少98％同一或至少99％同一的氨基酸序列的轻链可变区。抗体可以进一步是IgG1或IgG4同种型。
在一个实施方式中，本发明涉及具有抗体A12的抗原结合区的抗体或其抗原结合片段。在一个实施方式中，本发明提供包含如SEQ ID NO:9中所示的重链可变域序列和如SEQ ID NO:10中所示的轻链可变域序列的抗体或其抗原结合片段。在一个实施方式中，本发明涉及具有包含SEQ ID NO:9的CDR的重链可变域和包含SEQ ID NO:10的CDR的轻链可变域的抗体。在一个实施方式中，本发明特征在于分离的人抗体或其抗原结合片段，其包含具有与SEQ ID NO:9中所示的序列至少95％同一、至少96％同一、至少97％同一、至少98％同一或至少99％同一的氨基酸序列的重链可变区和包含具有与SEQ ID NO:10中所示的序列至少95％同一、至少96％同一、至少97％同一、至少98％同一或至少99％同一的氨基酸序列的轻链可变区。抗体可以进一步是IgG1或IgG4同种型。
在一个实施方式中，本发明涉及具有抗体B6的抗原结合区的抗体或其抗原结合片段。在一个实施方式中，本发明提供包含如SEQ ID NO:11中所示的重链可变域序列和如SEQID NO:12中所示的轻链可变域序列的抗体或其抗原结合片段。在一个实施方式中，本发明涉及具有包含SEQ ID NO:11的CDR的重链可变域和包含SEQ ID NO:12的CDR的轻链可变域的抗体。在一个实施方式中，本发明特征在于分离的人抗体或其抗原结合片段，其包含具有与SEQ ID NO:11中所示的序列至少95％同一、至少96％同一、至少97％同一、至少98％同一或至少99％同一的氨基酸序列的重链可变区和包含具有与SEQ ID NO:12中所示的序列至少95％同一、至少96％同一、至少97％同一、至少98％同一或至少99％同一的氨基酸序列的轻链可变区。抗体可以进一步是IgG1或IgG4同种型。
在一个实施方式中，本发明涉及具有抗体C2的抗原结合区的抗体或其抗原结合片段。在一个实施方式中，本发明提供包含如SEQ ID NO:13中所示的重链可变域序列和如SEQID NO:14中所示的轻链可变域序列的抗体或其抗原结合片段。在一个实施方式中，本发明涉及具有包含SEQ ID NO:13的CDR的重链可变域和包含SEQ ID NO:14的CDR的轻链可变域的抗体。在一个实施方式中，本发明特征在于分离的人抗体或其抗原结合片段，其包含具有与SEQ ID NO:13中所示的序列至少95％同一、至少96％同一、至少97％同一、至少98％同一或至少99％同一的氨基酸序列的重链可变区和包含具有与SEQ ID NO:14中所示的序列至少95％同一、至少96％同一、至少97％同一、至少98％同一或至少99％同一的氨基酸序列的轻链可变区。抗体可以进一步是IgG1或IgG4同种型。
在一个实施方式中，本发明涉及具有抗体D6的抗原结合区的抗体或其抗原结合片段。在一个实施方式中，本发明提供包含如SEQ ID NO:15中所示的重链可变域序列和如SEQID NO:16中所示的轻链可变域序列的抗体或其抗原结合片段。在一个实施方式中，本发明涉及具有包含SEQ ID NO:15的CDR的重链可变域和包含SEQ ID NO:16的CDR的轻链可变域的抗体。应注意D6和A1抗体包含相同的重链和轻链可变序列。在一个实施方式中，本发明特征在于分离的人抗体或其抗原结合片段，其包含具有与SEQ ID NO:15中所示的序列至少95％同一、至少96％同一、至少97％同一、至少98％同一或至少99％同一的氨基酸序列的重链可变区和包含具有与SEQ ID NO:16中所示的序列至少95％同一、至少96％同一、至少97％同一、至少98％同一或至少99％同一的氨基酸序列的轻链可变区。抗体可以进一步是IgG1或IgG4同种型。
在一个实施方式中，本发明涉及具有抗体F1的抗原结合区的抗体或其抗原结合片段。在一个实施方式中，本发明提供包含如SEQ ID NO:17中所示的重链可变域序列和如SEQID NO:18中所示的轻链可变域序列的抗体或其抗原结合片段。在一个实施方式中，本发明涉及具有包含SEQ ID NO:17的CDR的重链可变域和包含SEQ ID NO:18的CDR的轻链可变域的抗体。在一个实施方式中，本发明特征在于分离的人抗体或其抗原结合片段，其包含具有与SEQ ID NO:17中所示的序列至少95％同一、至少96％同一、至少97％同一、至少98％同一或至少99％同一的氨基酸序列的重链可变区和包含具有与SEQ ID NO:18中所示的序列至少95％同一、至少96％同一、至少97％同一、至少98％同一或至少99％同一的氨基酸序列的轻链可变区。抗体可以进一步是IgG1或IgG4同种型。
在一个实施方式中，本发明涉及具有抗体F3的抗原结合区的抗体或其抗原结合片段。在一个实施方式中，本发明提供包含如SEQ ID NO:19中所示的重链可变域序列和如SEQID NO:20中所示的轻链可变域序列的抗体或其抗原结合片段。在一个实施方式中，本发明涉及具有包含SEQ ID NO:19的CDR的重链可变域和包含SEQ ID NO:20的CDR的轻链可变域的抗体。在一个实施方式中，本发明特征在于分离的人抗体或其抗原结合片段，其包含具有与SEQ ID NO:19中所示的序列至少95％同一、至少96％同一、至少97％同一、至少98％同一或至少99％同一的氨基酸序列的重链可变区和包含具有与SEQ ID NO:20中所示的序列至少95％同一、至少96％同一、至少97％同一、至少98％同一或至少99％同一的氨基酸序列的轻链可变区。抗体可以进一步是IgG1或IgG4同种型。
在一个实施方式中，本发明涉及具有抗体F5的抗原结合区的抗体或其抗原结合片段。在一个实施方式中，本发明提供包含如SEQ ID NO:21中所示的重链可变域序列和如SEQID NO:22中所示的轻链可变域序列的抗体或其抗原结合片段。在一个实施方式中，本发明涉及具有包含SEQ ID NO:21的CDR的重链可变域和包含SEQ ID NO:22的CDR的轻链可变域的抗体。在一个实施方式中，本发明特征在于分离的人抗体或其抗原结合片段，其包含具有与SEQ ID NO:21中所示的序列至少95％同一、至少96％同一、至少97％同一、至少98％同一或至少99％同一的氨基酸序列的重链可变区和包含具有与SEQ ID NO:22中所示的序列至少95％同一、至少96％同一、至少97％同一、至少98％同一或至少99％同一的氨基酸序列的轻链可变区。抗体可以进一步是IgG1或IgG4同种型。
在一个实施方式中，本发明涉及具有抗体F6的抗原结合区的抗体或其抗原结合片段。在一个实施方式中，本发明提供包含如SEQ ID NO:23中所示的重链可变域序列和如SEQID NO:24中所示的轻链可变域序列的抗体或其抗原结合片段。在一个实施方式中，本发明涉及具有包含SEQ ID NO:23的CDR的重链可变域和包含SEQ ID NO:24的CDR的轻链可变域的抗体。在一个实施方式中，本发明特征在于分离的人抗体或其抗原结合片段，其包含具有与SEQ ID NO:23中所示的序列至少95％同一、至少96％同一、至少97％同一、至少98％同一或至少99％同一的氨基酸序列的重链可变区和包含具有与SEQ ID NO:24中所示的序列至少95％同一、至少96％同一、至少97％同一、至少98％同一或至少99％同一的氨基酸序列的轻链可变区。抗体可以进一步是IgG1或IgG4同种型。
在一个实施方式中，本发明涉及具有抗体F7的抗原结合区的抗体或其抗原结合片段。在一个实施方式中，本发明提供包含如SEQ ID NO:25中所示的重链可变域序列和如SEQID NO:26中所示的轻链可变域序列的抗体或其抗原结合片段。在一个实施方式中，本发明涉及具有包含SEQ ID NO:25的CDR的重链可变域和包含SEQ ID NO:26的CDR的轻链可变域的抗体。在一个实施方式中，本发明特征在于分离的人抗体或其抗原结合片段，其包含具有与SEQ ID NO:25中所示的序列至少95％同一、至少96％同一、至少97％同一、至少98％同一或至少99％同一的氨基酸序列的重链可变区和包含具有与SEQ ID NO:26中所示的序列至少95％同一、至少96％同一、至少97％同一、至少98％同一或至少99％同一的氨基酸序列的轻链可变区。抗体可以进一步是IgG1或IgG4同种型。
在一个实施方式中，本发明涉及具有抗体G1的抗原结合区的抗体或其抗原结合片段。在一个实施方式中，本发明提供包含如SEQ ID NO:27中所示的重链可变域序列和如SEQID NO:28中所示的轻链可变域序列的抗体或其抗原结合片段。在一个实施方式中，本发明涉及具有包含SEQ ID NO:27的CDR的重链可变域和包含SEQ ID NO:28的CDR的轻链可变域的抗体。在一个实施方式中，本发明特征在于分离的人抗体或其抗原结合片段，其包含具有与SEQ ID NO:27中所示的序列至少95％同一、至少96％同一、至少97％同一、至少98％同一或至少99％同一的氨基酸序列的重链可变区和包含具有与SEQ ID NO:28中所示的序列至少95％同一、至少96％同一、至少97％同一、至少98％同一或至少99％同一的氨基酸序列的轻链可变区。抗体可以进一步是IgG1或IgG4同种型。
在一个实施方式中，本发明涉及具有抗体G2的抗原结合区的抗体或其抗原结合片段。在一个实施方式中，本发明提供包含如SEQ ID NO:29中所示的重链可变域序列和如SEQID NO:30中所示的轻链可变域序列的抗体或其抗原结合片段。在一个实施方式中，本发明涉及具有包含SEQ ID NO:29的CDR的重链可变域和包含SEQ ID NO:30的CDR的轻链可变域的抗体。在一个实施方式中，本发明特征在于分离的人抗体或其抗原结合片段，其包含具有与SEQ ID NO:29中所示的序列至少95％同一、至少96％同一、至少97％同一、至少98％同一或至少99％同一的氨基酸序列的重链可变区和包含具有与SEQ ID NO:30中所示的序列至少95％同一、至少96％同一、至少97％同一、至少98％同一或至少99％同一的氨基酸序列的轻链可变区。抗体可以进一步是IgG1或IgG4同种型。
在一个实施方式中，本发明涉及具有抗体G3的抗原结合区的抗体或其抗原结合片段。在一个实施方式中，本发明提供包含如SEQ ID NO:31中所示的重链可变域序列和如SEQID NO:32中所示的轻链可变域序列的抗体或其抗原结合片段。在一个实施方式中，本发明涉及具有包含SEQ ID NO:31的CDR的重链可变域和包含SEQ ID NO:32的CDR的轻链可变域的抗体。在一个实施方式中，本发明特征在于分离的人抗体或其抗原结合片段，其包含具有与SEQ ID NO:31中所示的序列至少95％同一、至少96％同一、至少97％同一、至少98％同一或至少99％同一的氨基酸序列的重链可变区和包含具有与SEQ ID NO:32中所示的序列至少95％同一、至少96％同一、至少97％同一、至少98％同一或至少99％同一的氨基酸序列的轻链可变区。抗体可以进一步是IgG1或IgG4同种型。
在一个实施方式中，本发明涉及具有抗体G5的抗原结合区的抗体或其抗原结合片段。在一个实施方式中，本发明提供包含如SEQ ID NO:33中所示的重链可变域序列和如SEQID NO:34中所示的轻链可变域序列的抗体或其抗原结合片段。在一个实施方式中，本发明涉及具有包含SEQ ID NO:33的CDR的重链可变域和包含SEQ ID NO:34的CDR的轻链可变域的抗体。在一个实施方式中，本发明特征在于分离的人抗体或其抗原结合片段，其包含具有与SEQ ID NO:33中所示的序列至少95％同一、至少96％同一、至少97％同一、至少98％同一或至少99％同一的氨基酸序列的重链可变区和包含具有与SEQ ID NO:34中所示的序列至少95％同一、至少96％同一、至少97％同一、至少98％同一或至少99％同一的氨基酸序列的轻链可变区。抗体可以进一步是IgG1或IgG4同种型。
在一个实施方式中，本发明涉及具有抗体G12的抗原结合区的抗体或其抗原结合片段。在一个实施方式中，本发明提供包含如SEQ ID NO:35中所示的重链可变域序列和如SEQ ID NO:36中所示的轻链可变域序列的抗体或其抗原结合片段。在一个实施方式中，本发明涉及具有包含SEQ ID NO:35的CDR的重链可变域和包含SEQ ID NO:36的CDR的轻链可变域的抗体。在一个实施方式中，本发明特征在于分离的人抗体或其抗原结合片段，其包含具有与SEQ ID NO:35中所示的序列至少95％同一、至少96％同一、至少97％同一、至少98％同一或至少99％同一的氨基酸序列的重链可变区和包含具有与SEQ ID NO:36中所示的序列至少95％同一、至少96％同一、至少97％同一、至少98％同一或至少99％同一的氨基酸序列的轻链可变区。抗体可以进一步是IgG1或IgG4同种型。
在一个实施方式中，本发明涉及具有抗体D5的抗原结合区的抗体或其抗原结合片段。在一个实施方式中，本发明提供包含如SEQ ID NO:37中所示的重链可变域序列和如SEQID NO:38中所示的轻链可变域序列的抗体或其抗原结合片段。在一个实施方式中，本发明涉及具有包含SEQ ID NO:37的CDR的重链可变域和包含SEQ ID NO:38的CDR的轻链可变域的抗体。在一个实施方式中，本发明特征在于分离的人抗体或其抗原结合片段，其包含具有与SEQ ID NO:37中所示的序列至少95％同一、至少96％同一、至少97％同一、至少98％同一或至少99％同一的氨基酸序列的重链可变区和包含具有与SEQ ID NO:38中所示的序列至少95％同一、至少96％同一、至少97％同一、至少98％同一或至少99％同一的氨基酸序列的轻链可变区。抗体可以进一步是IgG1或IgG4同种型。
在一个实施方式中，本发明涉及具有抗体E7的抗原结合区的抗体或其抗原结合片段。在一个实施方式中，本发明提供包含如SEQ ID NO:39中所示的重链可变域序列和如SEQID NO:40中所示的轻链可变域序列的抗体或其抗原结合片段。在一个实施方式中，本发明涉及具有包含SEQ ID NO:39的CDR的重链可变域和包含SEQ ID NO:40的CDR的轻链可变域的抗体。在一个实施方式中，本发明特征在于分离的人抗体或其抗原结合片段，其包含具有与SEQ ID NO:39中所示的序列至少95％同一、至少96％同一、至少97％同一、至少98％同一或至少99％同一的氨基酸序列的重链可变区和包含具有与SEQ ID NO:40中所示的序列至少95％同一、至少96％同一、至少97％同一、至少98％同一或至少99％同一的氨基酸序列的轻链可变区。抗体可以进一步是IgG1或IgG4同种型。
在一个实施方式中，本发明具有抗体E8的抗原结合区的抗体或其抗原结合片段。在一个实施方式中，本发明提供包含如SEQ ID NO:41中所示的重链可变域序列和如SEQ IDNO:42中所示的轻链可变域序列的抗体或其抗原结合片段。在一个实施方式中，本发明涉及具有包含SEQ ID NO:41的CDR的重链可变域和包含SEQ ID NO:42的CDR的轻链可变域的抗体。在一个实施方式中，本发明特征在于分离的人抗体或其抗原结合片段，其包含具有与SEQ ID NO:41中所示的序列至少95％同一、至少96％同一、至少97％同一、至少98％同一或至少99％同一的氨基酸序列的重链可变区和包含具有与SEQ ID NO:42中所示的序列至少95％同一、至少96％同一、至少97％同一、至少98％同一或至少99％同一的氨基酸序列的轻链可变区。抗体可以进一步是IgG1或IgG4同种型。
在一个实施方式中，本发明涉及具有抗体CT1E1的抗原结合区的抗体或其抗原结合片段。在一个实施方式中，本发明提供包含如SEQ ID NO:43中所示的重链可变域序列和如SEQ ID NO:44中所示的轻链可变域序列的抗体或其抗原结合片段。在一个实施方式中，本发明涉及具有包含SEQ ID NO:43的CDR的重链可变域和包含SEQ ID NO:44的CDR的轻链可变域的抗体。在一个实施方式中，本发明特征在于分离的人抗体或其抗原结合片段，其包含具有与SEQ ID NO:43中所示的序列至少95％同一、至少96％同一、至少97％同一、至少98％同一或至少99％同一的氨基酸序列的重链可变区和包含具有与SEQ ID NO:44中所示的序列至少95％同一、至少96％同一、至少97％同一、至少98％同一或至少99％同一的氨基酸序列的轻链可变区。抗体可以进一步是IgG1或IgG4同种型。
抗原结合蛋白(例如，抗体、抗体片段、抗体衍生物、抗体突变蛋白和抗体变体)是结合CTLA4的多肽。
本发明的抗原结合蛋白的抗原结合片段可以通过常规技术产生。这些片段的实例包括，但不限于Fab和F(ab')2片段。
单链抗体可以通过经由氨基酸桥(短肽接头)连接重链和轻链可变域(Fv区)片段而得到单多肽链来形成。这样的单链Fv(scFv)通过将编码肽接头的DNA融合在编码两个可变域多肽(VL和VH)的DNA之间制备。取决于在两个可变域之间的柔性接头的长度，得到的多肽可以本身回折以形成抗原结合单体，或它们可以形成多聚体(例如，二聚体、三聚体或四聚体)(Kortt等人,1997,Prot.Eng.10:423；Kortt等人,2001,Biomol.Eng.18:95-108)。通过将不同的包含VL和VH的多肽组合，可以形成结合不同表位的多聚scFv(Kriangkum等人,2001,Biomol.Eng.18:31-40)。为产生单链抗体而开发的技术包括在美国专利4,946,778；Bird,1988,Science 242:423；Huston等人,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879；Ward等人,1989,Nature 334:544和de Graaf等人,2002,Methods Mol.Biol.178:379-87中描述的那些技术。
在某些实施方式中，本公开提供Fab全人抗体片段，其具有来自重链的可变域区域和来自轻链的可变域区域，其中重链可变域序列与选自以下的氨基酸序列至少95％同一、至少96％同一、至少97％同一、至少98％同一或至少99％同一：SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.13、SEQID NO.15、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.25、SEQID NO.27、SEQ ID NO.29、SEQ ID NO.31、SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.35、SEQ ID NO.37、SEQID NO.39、SEQ ID NO.41、SEQ ID NO.43及其组合，且具有与由以下组成氨基酸序列至少95％同一、至少96％同一、至少97％同一、至少98％同一或至少99％同一的轻链可变域序列：SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.22、SEQ IDNO.24、SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.34、SEQ IDNO.36、SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.40、SEQ ID NO.42、SEQ ID NO.44及其组合。优选地，全人抗体Fab片段具有重链可变域区域和轻链可变域区域两者，其中抗体具有选自以下的重链/轻链可变域序列：SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3/SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5/SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7/SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9/SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11/SEQID NO.12、SEQ ID NO.13/SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15/SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17/SEQID NO.18、SEQ ID NO.19/SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.21/SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.23/SEQID NO.24、SEQ ID NO.25/SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.27/SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.29/SEQID NO.30、SEQ ID NO.31/SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.33/SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.35/SEQID NO.36、SEQ ID NO.37/SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.39/SEQ ID NO.40、SEQ ID NO.41/SEQID NO.42、SEQ ID NO.43/SEQ ID NO.44及其组合。
在一个实施方式中，本公开提供具有来自重链的可变域区域和来自轻链的可变域区域及连接重链和轻链可变域区域的肽接头的单链人抗体，其中重链可变域序列与选自以下的氨基酸序列至少95％同一、至少96％同一、至少97％同一、至少98％同一或至少99％同一：SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.19、SEQ IDNO.21、SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.25、SEQ ID NO.27、SEQ ID NO.29、SEQ ID NO.31、SEQ IDNO.33、SEQ ID NO.35、SEQ ID NO.37、SEQ ID NO.39、SEQ ID NO.41、SEQ ID NO.43及其组合，且具有与选自以下的氨基酸序列至少95％同一的轻链可变域序列：SEQ ID NO.2、SEQID NO.4、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.14、SEQ IDNO.16、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.26、SEQ IDNO.28、SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.38、SEQ IDNO.40、SEQ ID NO.42、SEQ ID NO.44及其组合。优选地，全人单链抗体具有重链可变域区域和轻链可变域区域两者，其中单链全人抗体具有选自以下的重链/轻链可变域序列：SEQ IDNO.1/SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3/SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5/SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7/SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9/SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11/SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13/SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15/SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17/SEQ ID NO.18、SEQ IDNO.19/SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.21/SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.23/SEQ ID NO.24、SEQ IDNO.25/SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.27/SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.29/SEQ ID NO.30、SEQ IDNO.31/SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.33/SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.35/SEQ ID NO.36、SEQ IDNO.37/SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.39/SEQ ID NO.40、SEQ ID NO.41/SEQ ID NO.42、SEQ IDNO.43/SEQ ID NO.44及其组合。
已知用于从目标抗体衍生不同亚类或同种型的抗体(即，亚类转换)的技术。因此，例如，可以从IgM抗体衍生IgG抗体，反之亦然。这些技术允许制备具有给定抗体(亲本抗体)的抗原结合性质，但也展示与亲本抗体不同的抗体同种型或亚类相关的生物学性质的新抗体。可以采用重组DNA技术。在这些过程中可以采用编码特定抗体多肽的克隆DNA，例如，编码所需同种型的抗体的恒定结构域的DNA(Lantto等人,2002,Methods Mol.Biol.178:303-16)。此外，如果IgG4是需要的，那么在铰链区中引入点突变(CPSCP->CPPCP)(Bloom等人,1997,Protein Science 6:407)以减轻形成H链内二硫键(其可以导致IgG4抗体的异质性)的趋势也可能是理想的。因此，在一个实施方式中，本发明的抗体是人IgG1抗体。因此，在一个实施方式中，本发明的抗体是人IgG4抗体。
本公开提供了多种结构上特征为其可变域区域的氨基酸序列的抗体。但是，氨基酸序列可以发生一些改变而同时保留它们与其特异性靶标的高结合水平。更具体地，可变域区域中的许多氨基酸可以用保守置换进行改变，且可预期所得的抗体的结合特性与野生型抗体序列的结合特性没有不同。抗体可变域中具有许多不与抗原直接相互作用或影响抗原结合且对于确定抗体结构不关键的氨基酸。例如，任何所公开的抗体中预测的非关键氨基酸残基优选用来自相同类别的另一氨基酸残基替换。鉴别不消除抗原结合的氨基酸保守置换的方法是本领域中公知的(参见，例如，Brummell等,Biochem.32:1180-1187(1993)；Kobayashi等Protein Eng.12(10):879-884(1999)和Burks等Proc.Natl.Acad.Sci.USA94:412-417(1997))。Near等Mol.Immunol.30:369-377,1993解释了如何通过定点诱变影响或不影响结合。Near等仅突变他们认为具有改变抗原结合的高可能性的残基。大多数对结合亲和力(Near等，表3)和与不同形式的地高辛的结合(Near等，表2)具有适度的或负面的影响。因此，在某些实施方式中，本发明还包括与本文中公开的那些序列具有至少95％同一性的可变序列。
在某些实施方式中，本文提供的抗体或其抗原结合片段具有1x10-6M或更低，5x10-7M或更低，1x 10-7M或更低，5x 10-8M或更低，1x 10-8M或更低，5x 10-9M或更低或者1x 10-9M或更低的解离常数(KD)。在一个实施方式中，本发明的抗体或其抗原结合片段具有1x10-7M至1x 10-10M的KD。在一个实施方式中，本发明的抗体或其抗原结合片段具有1x 10-8M至1x 10-10M的KD。
本领域普通技术人员将理解已知用于测定抗体或其片段的Kd的标准方法。例如，在一个实施方式中，Kd通过放射标记抗原结合分析(RIA)测量。在一个实施方式中，RIA用目标抗体的Fab形式和其抗原进行。例如，Fab对抗原的溶液结合亲和力通过在滴定系列的未标记抗原的存在下用最小浓度的(125I)-标记抗原平衡Fab，然后用抗-Fab抗体涂布的平板捕获结合的抗原来测量(参见，例如，Chen等,J.Mol.Biol.293:865-881(1999))。
根据另一实施方式，Kd使用BIACORETM表面等离子体共振分析进行测量。如本文中使用的术语"表面等离子体共振"是指允许通过检测生物传感器矩阵内蛋白质浓度的改变来分析实时相互作用的光学现象，例如使用BIAcoreTM系统(Biacore Life Sciencesdivision of GE Healthcare,Piscataway,N.J.)。
在特别的实施方式中，本发明的抗原结合蛋白对于CTLA4具有至少106的结合亲和力(Ka)。在其它实施方式中，抗原结合蛋白表现出至少107、至少108、至少109或至少1010的Ka。在另一实施方式中，抗原结合蛋白表现出与实施例中本文所述的抗体基本上相同的Ka。
在另一实施方式中，本公开提供具有与CTLA4的低解离速率的抗原结合蛋白。在一个实施方式中，抗原结合蛋白具有1X 10-4至1X10-1或更低的Koff。在另一实施方式中，Koff是5X 10-5至5X 10-1或更低。在另一实施方式中，Koff基本上与本文所述的抗体相同。在另一实施方式中，抗原结合蛋白以与本文所述的抗体基本上相同的Koff结合CTLA4。
在另一方面中，本公开提供抑制CTLA4的活性的抗原结合蛋白，例如，抗-CTLA4抗体或其抗原结合片段。在一个实施方式中，抗原结合蛋白具有1000nM或更低的IC50。在另一实施方式中，IC50是100nM或更低；在另一实施方式中，IC50是10nM或更低。在另一实施方式中，IC50基本上与实施例中本文所述的抗体相同。在另一实施方式中，抗原结合蛋白,例如，抗-CTLA4抗体或其抗原结合部分，以与本文所述的抗体基本上相同的IC50抑制CTLA4的活性。在一个实施方式中，通过如本文中公开的抗体或其抗原结合片段抑制的CTLA4的活性是CTLA4与CD80和/或CD86的结合。在一个实施方式中，本发明的抗-CTLA4抗体或其抗原结合片段以1x 10-9或更低的IC50抑制CD80的CTLA4结合。在一个实施方式中，本发明的抗-CTLA4抗体或其抗原结合片段以5x 10-10或更低的IC50抑制CD80的CTLA4结合。在一个实施方式中，本发明的抗-CTLA4抗体或其抗原结合片段以1x 10-10或更低的IC50抑制CD80的CTLA4结合。在一个实施方式中，本发明的抗-CTLA4抗体或其抗原结合片段以1x 10-9或更低的IC50抑制CD86的CTLA4结合。在一个实施方式中，本发明的抗-CTLA4抗体或其抗原结合片段以5x 10-10或更低的IC50抑制CD86的CTLA4结合。在一个实施方式中，本发明的抗-CTLA4抗体或其抗原结合片段以1x 10-10或更低的IC50抑制CD86的CTLA4结合。可用于测试抗-CTLA4抗体抑制CD80或CD86的CTLA4的结合的能力的分析的实例是本领域中已知的且也描述于本文中提供的实施例中。
在另一方面中，本公开提供了结合在细胞表面上表达的CTLA4，且在如此结合时，抑制细胞中的CTLA4信号传导活性而不导致细胞表面上CTLA4量的显著下降的抗原结合蛋白。可以使用用于测定或估算细胞表面上和/或内部的CTLA4量的任何方法。在其它实施方式中，抗原结合蛋白与CTLA4表达细胞的结合导致少于约75％、50％、40％、30％、20％、15％、10％、5％、1％或0.1％的细胞表面CTLA4被内化。
在另一方面中，本公开提供了在体外或体内(例如，当施用于人类受试者时)具有至少一天的半衰期的抗原结合蛋白。在一个实施方式中，抗原结合蛋白的半衰期为至少三天。在另一实施方式中，抗原结合蛋白的半衰期为四天或更长。在另一实施方式中，该抗原结合蛋白的半衰期为八天或更长。在另一实施方式中，抗原结合蛋白被衍生化或修饰以使得其相比于未衍生化或未修饰的抗原结合蛋白具有更长的半衰期。在另一实施方式中，抗原结合蛋白含有一个或多个点突变以增加血清半衰期，比如在WO00/09560中所述的，该文献通过引入并入本文。
本公开进一步提供了多特异性抗原结合蛋白，例如，双特异性抗原结合蛋白，例如，通过两个不同的抗原结合位点或区域结合于CTLA4的两个不同表位，或结合于CTLA4的表位和另一分子的表位的抗原结合蛋白。此外，如本文公开的双特异性抗原结合蛋白可以包含来自本文描述的抗体之一的CTLA4结合位点和来自本文描述抗体中另一种(包括通过引用其它公开文献在本文中描述的那些)的第二CTLA4结合区。可选地，双特异性抗原结合蛋白可以包含来自本文描述的抗体之一的抗原结合位点和来自本领域已知的另一CTLA4抗体或来自通过已知的方法或本文描述的方法制备的抗体的第二抗原结合位点。
本领域已知许多用于制备双特异性抗体的方法。这些方法包括如Milstein等人,1983,Nature 305:537描述的杂种-杂交瘤的使用及抗体片段的化学偶联(Brennan等人,1985,Science 229:81；Glennie等人,1987,J.Immunol.139:2367；美国专利号6,010,902)。此外。可以通过重组手段产生双特性抗体，例如，通过利用亮氨酸拉链部分(即，来自Fos和Jun蛋白，其优先形成异源二聚体；Kostelny等人,1992,J.Immunol.148:1547)或如美国专利号5,582,996中描述的其它锁和钥相互作用的结构域结构。另外的有用技术包括美国专利号5,959,083和5,807,706中描述的那些技术。
在另一方面中，抗原结合蛋白包括抗体的衍生物。衍生化的抗体可以包含任何赋予抗体所需的性质(比如，在特定用途中增加的半衰期)的分子或物质。衍生化的抗体可以包含，例如，可检测(或标记)部分(例如，放射性的、比色的、抗原的或酶的分子)，可检测的珠(例如，磁珠或电子致密(例如，金)珠)或者结合另一分子的分子(例如，生物素或链霉亲和素)，治疗或诊断部分(例如，放射性的、细胞毒性的或药学活性的部分)，增加抗体对特定用途(例如，施用于受试者如人类受试者，或其它体内或体外用途)的适用性的分子。
可以用于抗体衍生化的分子的实例包括白蛋白(例如，人血清白蛋白)和聚乙二醇(PEG)。可以利用本领域公知的技术制备白蛋白连接的和聚乙二醇化的抗体衍生物。在一个实施方式中，抗体与转甲状腺素蛋白(TTR)或TTR变体缀合或以其他方式连接。TTR或TTR变体可以用例如选自以下的化学物质进行化学修饰：葡聚糖、聚(n-乙烯基吡咯烷酮)、聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙烯化多元醇和聚乙烯醇。
包含一个或多个抗原结合蛋白的寡聚体可以用作CTLA4拮抗剂。寡聚体可以是共价连接或非共价连接的二聚体、三聚体或更高阶寡聚体的形式。设想使用包含两个或更多个抗原结合蛋白的寡聚体，一个实例是同源二聚体。其它寡聚体包括异源二聚体、同源三聚体、异源三聚体、同源四聚体、异源四聚体等。
一个实施方式涉及包括通过在与抗原结合蛋白融合的肽部分之间的共价或非共价相互作用接合的多个抗原结合蛋白的寡聚体。这类肽可以是肽接头(间隔物)，或具有促进低聚化的性质的肽。亮氨酸拉链和来源于抗体的某些多肽属于能够促进与其连接的抗原结合蛋白的低聚化的肽，如下文更详细描述的。
在特别的实施方式中，寡聚体包含两个至四个抗原结合蛋白。寡聚体的抗原结合蛋白可以是任何形式的，如上述形式的任何一种，例如，变体或片段。优选地，寡聚体包含具有CTLA4结合活性的抗原结合蛋白。
在一个实施方式中，寡聚体使用源自免疫球蛋白的多肽制备。例如，Ashkenazi等人,1991,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:10535；Byrn等人,1990,Nature 344:677和Hollenbaugh等人,1992"Construction of Immunoglobulin Fusion Proteins",CurrentProtocols in Immunology,Suppl.4，第10.19.1-10.19.11页已经描述了包含与抗体来源的多肽的各个部分(包括Fc结构域)融合的某些异源多肽的融合蛋白的制备。
一个实施方式涉及包含通过将抗-CTLA4抗体的CTLA4结合片段与抗体的Fc区融合产生的两个融合蛋白的二聚体。可以通过例如，将编码融合蛋白的基因融合体插入合适的表达载体中，在用重组表达载体转化的宿主细胞中表达该基因融合体和使表达的融合蛋白非常像抗体分子一样组装，由此在Fc部分之间形成链间二硫键以产生二聚体来制备该二聚体。
用于制备低聚抗原结合蛋白的另一方法包括使用亮氨酸拉链。亮氨酸拉链结构域为促进其中存在亮氨酸拉链结构域的蛋白质的低聚化的肽。亮氨酸拉链最初在几种DNA结合蛋白中识别(Landschulz等人,1988,Science 240:1759)，并且此后在多种不同的蛋白质中发现。已知的亮氨酸拉链中有二聚化或三聚化的天然存在的肽及其衍生物。WO 94/10308描述了适于产生可溶性低聚蛋白的亮氨酸拉链结构域的实例，并且Hoppe等人,1994,FEBSLetters 344:191中描述了来源于肺表面活性蛋白D(SPD)的亮氨酸拉链。Fanslow等人,1994,Semin.Immunol.6:267-78中描述了修饰的亮氨酸拉链的使用，该修饰的亮氨酸拉链允许与其融合的异源蛋白质稳定地三聚化。在一种方法中，在合适的宿主细胞中表达包含与亮氨酸拉链肽融合的抗CTLA4抗体片段或衍生物的重组融合蛋白，并从培养物上清液回收形成的可溶性低聚化抗-CTLA4抗体片段或衍生物。
针对CTLA4的抗原结合蛋白可以用于，例如，在体外或体内检测CTLA4多肽的存在的分析中。抗原结合蛋白也可以用于通过免疫亲和色谱纯化CTLA4蛋白。阻断性抗原结合蛋白可以用于本文公开的方法中。可以使用作为CTLA4拮抗剂发挥作用的这些抗原结合蛋白治疗任何CTLA4诱导的病症，包括但不限于各种癌症。
抗原结合蛋白可以在体外过程中使用，或体内施用以抑制CTLA4诱导的生物活性。因此，可以治疗由CTLA4的蛋白水解活化(直接或间接地)引起或恶化的病症，本文提供了其实例。在一个实施方式中，本发明提供治疗方法，包括对需要的哺乳动物体内施用有效降低CTLA4诱导的生物活性的量的CTLA4阻断性抗原结合蛋白。
在某些实施方式中，本发明的抗原结合蛋白包括抑制CTLA4的生物活性的全人单克隆抗体。
可以通过许多常规技术的任何一种制备抗原结合蛋白。例如，它们可以从天然表达该抗原结合蛋白的细胞纯化(例如，抗体可以从产生抗体的杂交瘤纯化)，或利用本领域已知的任何技术在重组表达体系中产生。参见，例如，Monoclonal Antibodies,Hybridomas:A New Dimension in Biological Analyses,Kennet等人.(编辑),PlenumPress,New York(1980)和Antibodies:A Laboratory Manual,Harlow and Land(编辑),Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor,N.Y.,(1988)。
可以使用本领域已知的任何表达系统制备本发明的重组多肽。通常，用包含编码所需多肽的DNA的重组表达载体转化宿主细胞。可以采用的宿主细胞包括原核细胞、酵母或高等真核细胞。原核细胞包括革兰氏阴性或革兰氏阳性有机体，例如，大肠杆菌或芽孢杆菌。高等真核细胞包括昆虫细胞和哺乳动物来源的已建立细胞系。合适的哺乳动物宿主细胞系的实例包括COS-7系猴肾细胞(ATCC CRL1651)(Gluzman等人,1981,Cell 23:175)、L细胞、293细胞、C127细胞、3T3细胞(ATCC CCL 163)、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、HeLa细胞、BHK(ATCC CRL 10)细胞系和如McMahan等人，1991,EMBO J.10:2821所述的源自非洲绿猴肾细胞系CV1的CV1/EBNA细胞系(ATCC CCL 70)。Pouwels等人(Cloning Vectors:A LaboratoryManual,Elsevier,N.Y.,1985)描述了用于细菌、真菌、酵母和哺乳动物细胞宿主的合适的克隆和表达载体。
转化的细胞可以在促进多肽表达的条件下培养，并且多肽通过常规蛋白质纯化过程回收。一种这样的纯化过程包括使用亲和色谱，例如在CTLA4的全部或部分(例如，细胞外结构域)与其结合的基质上。本文考虑使用的多肽包括基本上没有污染的内源物质的基本上同源的重组哺乳动物抗-CTLA4抗体多肽。
可以通过许多已知技术中的任何一种制备抗原结合蛋白并针对所需的性质进行筛选。某些技术包括分离编码目标抗原结合蛋白(例如，抗-CTLA4抗体)的多肽链(或其部分)的核酸，和通过重组DNA技术操作该核酸。例如，核酸可以与另一目标核酸融合，或被改变(例如，通过诱突或其它常规技术)以添加、删除或置换一个或多个氨基酸残基。
可以利用本领域已知的任何标准方法产生本公开的多肽。在一个实例中，通过重组DNA方法将编码多肽的核酸序列(例如，cDNA)插入到重组表达载体中并且在促进表达的条件下表达DNA序列来产生该多肽。
可以化学合成编码本文公开的各种多肽中任何一种的核酸。可以选择密码子使用以改善在细胞中的表达。这类密码子使用取决于选择的细胞类型。已经开发了用于大肠杆菌和其它细菌以及哺乳动物细胞、植物细胞、酵母细胞和昆虫细胞的专用的密码子使用模式。参见，例如：Mayfield等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.2003，100(2):438-42；Sinclair等人，Protein Expr.Purif.2002(1):96-105；Connell N D.Curr.Opin.Biotechnol.2001，12(5):446-9；Makrides等人，Microbiol.Rev.1996，60(3):512-38和Sharp等人，Yeast.1991，7(7):657-78。
用于核酸操作的一般技术在，例如，Sambrook等人，Molecular Cloning:ALaboratory Manual,Vols.1-3,Cold Spring Harbor Laboratory Press,2ed.,1989或F.Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology(Green Publishing andWiley-Interscience:NewYork,1987)及其定期更新中描述，其通过引用并入本文中。编码多肽的DNA可操作地连接至源自哺乳动物、病毒或昆虫基因的合适的转录或翻译调控元件。这些调控元件包括转录启动子、任选的控制转录的操纵子序列、编码合适的mRNA核糖体结合位点的序列及控制转录和翻译的终止的序列。在宿主中复制的能力(通常由复制起点赋予)和帮助识别转化体的选择基因另外地并入。
重组DNA也可以包括可用于纯化蛋白质的任何类型的蛋白质标签序列。蛋白质标签的实例包括，但不限于组氨酸标签、FLAG标签、myc标签、HA标签或GST标签。用于细菌、真菌、酵母和哺乳动物细胞宿主的合适的克隆和表达载体可以在Cloning Vectors:ALaboratory Manual,(Elsevier,N.Y.,1985)中找到。
利用适合于宿主细胞的方法将表达构建体引入宿主细胞中。本领域已知将核酸引入宿主细胞中的多种方法，包括但不限于：电穿孔，采用氯化钙、氯化铷、磷酸钙、DEAE-葡聚糖或其它物质的转染，基因枪法，脂质转染和感染(其中载体是传染剂)。合适的宿主细胞包括原核细胞、酵母、哺乳动物细胞或细菌细胞。
合适的细菌包括革兰氏阴性或革兰氏阳性有机体，例如，大肠杆菌或芽孢杆菌属。酵母，优选来自酵母属物种，比如酿酒酵母，也可用于产生多肽。各种哺乳动物或昆虫细胞培养系统也可以用于表达重组蛋白。Luckow和Summers综述了用于在昆虫细胞中产生异源蛋白质的杆状病毒系统(Bio/Technology,6:47,1988)。合适的哺乳动物宿主细胞系的实例包括内皮细胞、COS-7猴肾细胞、CV-1、L细胞、C127、3T3、中国仓鼠卵巢(CHO)、人胚肾细胞、HeLa、293、293T和BHK细胞系。纯化的多肽通过培养合适的宿主/载体系统以表达重组蛋白来制备。对于许多应用，本文公开的许多多肽的小尺寸使得在大肠杆菌中表达成为优选的表达方法。然后从培养基或细胞提取物纯化蛋白质。
本文公开的蛋白质也可以使用细胞翻译系统产生。为了此类目的，必须修饰编码多肽的核酸以允许进行体外转录而产生mRNA并且允许利用在特定的无细胞系统(真核的，比如哺乳动物或酵母无细胞翻译系统，或原核的，比如，细菌无细胞翻译系统)中的mRNA无细胞翻译。
CTLA4-结合多肽也可以通过化学合成产生(例如，通过在Solid Phase PeptideSynthesis,2nd ed.,1984,The Pierce Chemical Co.,Rockford,111中描述的方法)。也可以通过化学合成产生对蛋白质的修饰。
本公开的多肽可以通过蛋白质化学领域公知的蛋白质分离/纯化方法进行纯化。非限制性例子包括萃取、重结晶、盐析(例如，用硫酸铵或硫酸钠)、离心、透析、超滤、吸附色谱、离子交换色谱、疏水性色谱、正相色谱、反相色谱、凝胶过滤、凝胶渗透色谱、亲和色谱、电泳、逆流分布或这些的任意组合。纯化后，可以通过本领域已知的多种方法中的任何一种，包括但不限于，过滤和透析，使多肽交换到不同的缓冲液中和/或浓缩。
纯化的多肽优选至少85％纯，更优选至少95％纯，并且最优选至少98％纯。无论纯度的确切数值如何，多肽都足够纯以用作药物产品。
在某些实施方式中，本公开提供了结合CTLA4的单克隆抗体。单克隆抗体可以利用本领域已知的任何技术产生，例如，通过使在完成免疫方案后从转基因动物中收集的脾细胞永生化。可以使用本领域已知的任何技术使脾细胞永生化，例如，通过使脾细胞与骨髓瘤细胞融合以产生杂交瘤。在产生杂交瘤的融合过程中使用的骨髓瘤细胞优选为不产生抗体的，具有高融合效率和酶缺陷的(这使得该骨髓瘤细胞不能在仅支持期望的融合细胞(杂交瘤)生长的某些选择培养基中生长)。在小鼠融合中使用的合适的细胞系的实例包括Sp-20、P3-X63/Ag8、P3-X63-Ag8.653、NS1/1.Ag 41、Sp210-Ag14、FO、NSO/U、MPC-11、MPC11-X45-GTG1.7和S194/5XX0Bul；在大鼠融合中使用的细胞系的实例包括R210.RCY3、Y3-Ag1.2.3、IR983F和48210。可用于细胞融合的其它细胞系为U-266、GM1500-GRG2、LICR-LON-HMy2和UC729-6。
本领域技术人员可以根据本说明书的教导并使用本领域已知技术容易地制备抗体的片段或类似物。片段或类似物的优选氨基端和羧基端存在于功能域的边界附近。可以通过将核苷酸和/或氨基酸序列数据与公共或专有序列数据库比较来识别结构域和功能域。计算机化的比较方法可用于识别在具有已知结构和/或功能的其它蛋白质中存在的序列基序或预测的蛋白质构象结构域。识别折叠成已知三维结构的蛋白质序列的方法是已知的。参见，Bowie等人,1991,Science 253:164。
多肽的翻译后修饰
在某些实施方式中，本发明的结合多肽可以进一步包括翻译后修饰。示例性的蛋白质翻译后修饰包括磷酸化、乙酰化、甲基化、ADP-核糖基化、泛素化、糖基化、羰基化、SUMO化、生物素化或者多肽侧链或疏水性基团的添加。结果，修饰的可溶性多肽可含有非氨基酸成分，例如脂质、多糖或单糖和磷酸类。糖基化的优选形式是唾液酸化，其将一个或多个唾液酸部分与多肽偶联。唾液酸部分改善溶解性和血清半衰期，同时还降低该蛋白质的可能的免疫原性。参见Raju等人，Biochemistry.2001，31；40(30):8868-76。
在一个实施方式中，所述可溶性多肽的修饰形式包括将所述可溶性多肽连接至非蛋白质性的聚合物。在一个实施方式中，聚合物为聚乙二醇("PEG")、聚丙二醇或聚氧化烯类，如美国专利号4,640,835、4,496,689、4,301,144、4,670,417、4,791,192或4,179,337中所述的方式。
PEG是可在市场上买到或可以根据本领域公知的方法通过乙二醇的开环聚合制备(Sandler和Karo,Polymer Synthesis,Academic Press,New York,Vol.3,138-161页)的水溶性聚合物。术语“PEG”广泛地用于涵盖任何聚乙二醇分子而无论大小或在PEG末端的修饰，并且可以由下式表示：X-O(CH2CH2O)n-CH2CH2OH(1)，其中n为20至2300，并且X为H或末端修饰，例如：C1-4烷基。在一个实施方式中，本发明的PEG在一端以羟基或甲氧基封端，即，X为H或CH3("甲氧基PEG")。PEG可以包含结合反应所需的进一步的化学基团，其由分子的化学合成产生，或者是使分子的部分具有最佳距离的间隔物。另外，这种PEG可以由一条或多条连接在一起的PEG侧链组成。具有多于一条PEG链的PEG被称为多臂或枝化PEG。枝化PEG可以通过，例如，将聚环氧乙烷添加到各种多元醇(包括甘油、季戊四醇和山梨糖醇)而制备。例如，四臂的枝化PEG可以由季戊四醇和环氧乙烷制备。例如，EP-A0473084和美国专利号5,932,462描述了枝化PEG。PEG的一种形式包括由赖氨酸的伯氨基基团连接的两个PEG侧链(PEG2)(Monfardini等人，Bioconjugate Chem.6(1995)62-69)。
对于未修饰的结合多肽的清除率，PEG修饰的多肽的血清清除率可以降低约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或甚至90％。PEG修饰的多肽的半衰期(t1/2)可以相对于未修饰蛋白质的半衰期增加。相对于未修饰的结合多肽的半衰期，PEG结合多肽的半衰期可以增加至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、125％、150％、175％、200％、250％、300％、400％或500％，或者甚至1000％。在一些实施方式中，在体外测定蛋白质半衰期，比如，在缓冲盐水溶液中或在血清中。在其它实施方式中，蛋白质半衰期是体内半衰期，比如在动物的血清或其它体液中的蛋白质半衰期。
治疗方法、制剂和施用方式
本公开进一步提供用于治疗需要免疫反应的刺激或抑制的疾病的方法，包括施用抗-CTLA4多肽。本文公开的任何抗体可以用于这样的方法中。例如，该方法可以使用抗-CTLA4多肽进行，该多肽选自以至少10-6M的结合亲和力结合CTLA4表位的IgG类的全人抗体、具有来自重链的可变域区域和来自轻链的可变域区域的Fab全人抗体片段、具有来自重链的可变域区域和来自轻链的可变域区域及连接重链和轻链可变域区域的肽接头的单链人抗体，其包括SEQ ID No.1-44(表4)中所述的重链和轻链可变区(及所述序列内的CDR)。
例如，在一个实施方式中，本文公开的方法包括使用全人抗体，其具有与选自以下的氨基酸序列至少95％同一、至少96％同一、至少97％同一、至少98％同一或至少99％同一的重链可变域序列：SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.25、SEQ ID NO.27、SEQ ID NO.29、SEQ IDNO.31、SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.35、SEQ ID NO.37、SEQ ID NO.39、SEQ ID NO.41和SEQID NO.43，和具有与选自以下的氨基酸序列至少95％同一、至少96％同一、至少97％同一、至少98％同一或至少99％同一的轻链可变域序列：SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ IDNO.6、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16、SEQ IDNO.18、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.28、SEQ IDNO.30、SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.40、SEQ IDNO.42和SEQ ID NO.44。
在一个实施方式中，本文所述的方法包括使用全人抗体Fab片段，其具有与选自以下的氨基酸序列至少95％同一、至少96％同一、至少97％同一、至少98％同一或至少99％同一的重链可变域序列：SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ IDNO.7、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.17、SEQ IDNO.19、SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.25、SEQ ID NO.27、SEQ ID NO.29、SEQ IDNO.31、SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.35、SEQ ID NO.37、SEQ ID NO.39、SEQ ID NO.41和SEQID NO.43，和具有与选自以下的氨基酸序列至少95％同一、至少96％同一、至少97％同一、至少98％同一或至少99％同一的轻链可变域序列：SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ IDNO.6、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16、SEQ IDNO.18、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.28、SEQ IDNO.30、SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.40、SEQ IDNO.42和SEQ ID NO.44。
在一个实施方式中，本文所述的方法包括使用单链人抗体，其包含与选自以下的氨基酸序列至少95％同一、至少96％同一、至少97％同一、至少98％同一或至少99％同一的重链可变域序列：SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.25、SEQ ID NO.27、SEQ ID NO.29、SEQ IDNO.31、SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.35、SEQ ID NO.37、SEQ ID NO.39、SEQ ID NO.41和SEQID NO.43，和包含与选自以下的氨基酸序列至少95％同一、至少96％同一、至少97％同一、至少98％同一或至少99％同一的轻链可变域序列：SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ IDNO.6、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16、SEQ IDNO.18、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.28、SEQ IDNO.30、SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.40、SEQ IDNO.42和SEQ ID NO.44。
在一个实施方式中，全人抗体具有重链和轻链两者，其中该抗体具有选自以下的重链/轻链可变域序列：SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3/SEQ ID NO.4、SEQ IDNO.5/SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7/SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9/SEQ ID NO.10、SEQ IDNO.11/SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13/SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15/SEQ ID NO.16、SEQ IDNO.17/SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.19/SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.21/SEQ ID NO.22、SEQ IDNO.23/SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.25/SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.27/SEQ ID NO.28、SEQ IDNO.29/SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.31/SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.33/SEQ ID NO.34、SEQ IDNO.35/SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.37/SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.39/SEQ ID NO.40、SEQ IDNO.41/SEQ ID NO.42和SEQ ID NO.43/SEQ ID NO.44。
在一个实施方式中，全人抗体Fab片段具有重链可变域区域和轻链可变域区域两者，其中该抗体具有选自以下的重链/轻链可变域序列：SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.2、SEQ IDNO.3/SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5/SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7/SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9/SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11/SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13/SEQ ID NO.14、SEQ IDNO.15/SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17/SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.19/SEQ ID NO.20、SEQ IDNO.21/SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.23/SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.25/SEQ ID NO.26、SEQ IDNO.27/SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.29/SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.31/SEQ ID NO.32、SEQ IDNO.33/SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.35/SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.37/SEQ ID NO.38、SEQ IDNO.39/SEQ ID NO.40、SEQ ID NO.41/SEQ ID NO.42和SEQ ID NO.43/SEQ ID NO.44。
在一个实施方式中，全人单链抗体具有重链可变域区域和轻链可变域区域两者，其中该单链全人抗体具有选自以下的重链/轻链可变域序列：SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3/SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5/SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7/SEQ ID NO.8、SEQID NO.9/SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11/SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13/SEQ ID NO.14、SEQID NO.15/SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17/SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.19/SEQ ID NO.20、SEQID NO.21/SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.23/SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.25/SEQ ID NO.26、SEQID NO.27/SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.29/SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.31/SEQ ID NO.32、SEQID NO.33/SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.35/SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.37/SEQ ID NO.38、SEQID NO.39/SEQ ID NO.40、SEQ ID NO.41/SEQ ID NO.42和SEQ ID NO.43/SEQ ID NO.44。
在一个实施方式中，本发明的抗体和抗体片段用于治疗选自前列腺、肾、结肠、肺或乳腺的癌症；病原体感染；与CNS相关的疾病，成淀粉样阿尔兹海默病；和具有炎性或变应性成分的疾病、移植物抗宿主病、宿主抗移植物病、过敏症、自身免疫性疾病和其它炎性疾病的疾病。
本发明的抗体及其抗原结合片段可以用于治疗疾病如癌症。在一个实施方式中，本发明特征在于治疗作为CTLA4-相关癌症的癌症的方法。短语“CTLA4相关癌症”是指与异常CTLA4表达或活性，例如，提高的CTLA4表达或活性相关的癌症或恶性细胞转化。CTLA4相关癌症的实例包括，但不限于膀胱癌、血癌、脑癌、乳腺癌、结肠直肠癌、纤维肉瘤、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、黑素瘤、淋巴瘤、间皮瘤和浆细胞瘤(参见，例如，Grosso等,CancerImmun.2013；13:5；Postow等,JCO January 20,2015,Kvistborg等，ScienceTranslational Medicine17 Sep 2014:Vol.6,Issue 254,pp.254；Hersh等,J ClinOncol.2008；26:摘要9022)。在某些实施方式中，CTLA4相关癌症是其中与抗-CTLA-4临床活性相关的生物标志物被检测的个体中的任何癌症，例如绝对淋巴细胞计数的升高、T细胞上的持续的可诱导T细胞共刺激剂(ICOS)表达(Liakou等Proc Natl Acad Sci U S A.2008；105:14987-14992)或T细胞上的HLA-DR/CD45RO上调(Comin-Anduix B等.J TranslMed.2008；6:22)。
如本文公开的人CTLA4的全人抗体可以用于治疗需要免疫反应的刺激或抑制的疾病的方法。刺激使用阻断人CTLA4与人B7的结合的抗体实现，且适合于通过免疫反应延长的刺激或增强来治疗的疾病包括前列腺、肾、结肠、肺或乳腺的癌症；病原体感染；与CNS相关的疾病，例如成淀粉样疾病，包括阿尔兹海默病；和具有炎性或变应性成分的疾病。免疫抑制也可以使用人CTLA4的抗体实现，例如通过调节性T细胞的诱导(Coquerelle等,Gut2009；58:1363-1373)。适合于治疗的疾病包括移植物抗宿主病、宿主抗移植物病、过敏症、自身免疫性疾病和其它炎性疾病。
本公开的抗-CTLA4抗体(及其片段)也可用于治疗自身免疫性疾病及细胞、器官或组织移植物的排斥。在某些方面中，抗-CTLA4抗体(及其片段)可用于治疗选自类风湿性关节炎和幼年特发性关节炎的自身免疫性疾病。
本公开特征在于用于治疗或预防金黄色葡萄球菌(S.aureus)感染的方法，包括施用抗-CTLA4多肽。用于施用的技术和剂量根据特定多肽的类型和所治疗的特定病症而变化，但可以容易地由技术人员确定。一般地，管理机构要求用作治疗剂的蛋白质试剂经配制以具有可接受的低热原水平。因此，治疗制剂一般与其它制剂区别在于它们基本上是无热原的，或至少包含不超过可接受水平的热原，如由适当管理机构(例如，FDA)确定的。
本公开的治疗组合物可以在单位剂型中与药学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂一起施用。作为非限制性的实例，施用可以是肠胃外(例如，静脉内、皮下)、口服或局部。另外，可以使用任何基因治疗技术(其使用编码本发明的多肽的核酸)，如裸DNA递送、重组基因和载体、基于细胞的递送，包括患者细胞的活体外操作等等。
组合物可以是丸剂、片剂、胶囊、液体或用于口服施用的缓释片剂的形式；或者是用于静脉内、皮下或肠胃外施用的液体；凝胶；洗剂、油膏、霜剂或者用于局部施用的聚合物或其它缓释介质。
本领域中公知的用于制备制剂的方法在，例如，"Remington:The Science andPractice of Pharmacy"(20th ed.,ed.A.R.Gennaro A R.,2000,Lippincott Williams&Wilkins,Philadelphia,Pa.)中发现。用于肠胃外施用的制剂可以，例如，包含赋形剂、无菌水、盐水、聚烷撑二醇如聚乙二醇、植物源的油或氢化萘。生物相容的、生物降解丙交酯聚合物、丙交酯/乙交酯共聚物或聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物可以用于控制化合物的释放。纳米颗粒制剂(例如，生物降解纳米颗粒、固体液体纳米颗粒、脂质体)可以用于控制化合物的生物分布。其它潜在可用的肠胃外递送系统包括乙烯乙酸乙烯酯共聚物颗粒、蠕动泵、可植入输注系统和脂质体。制剂中的化合物浓度根据多种因素而变化，包括待施用的药物剂量和施用途径。
多肽可以任选地作为药学上可接受的盐施用，比如在制药工业中常用的无毒的酸加成盐或金属络合物。酸加成盐的实例包括有机酸，如乙酸、乳酸、扑酸、马来酸、柠檬酸、苹果酸、抗坏血酸、琥珀酸、苯甲酸、棕榈酸、辛二酸、水杨酸、酒石酸、甲磺酸、甲苯磺酸或三氟乙酸等；聚合酸，如单宁酸、羧甲基纤维素等；和无机酸，如盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸等。金属络合物包括锌、铁等等。在一个实例中，多肽在乙酸钠存在的情况下配制以提高热稳定性。
用于口服使用的制剂包括在与非毒性药学上可接受的赋形剂的混合物中包含活性成分的片剂。这些赋形剂可以是，例如，惰性稀释剂或填充剂(例如，蔗糖和山梨醇)、润滑剂、助流剂和抗粘剂(例如，硬脂酸镁、硬脂酸锌、硬脂酸、硅石、氢化植物油或滑石)。
用于口服用途的制剂也可以作为可咀嚼片剂，或作为硬明胶胶囊(其中活性成分与惰性固体稀释剂混合)或作为软明胶胶囊剂(其中活性成分与水或油介质混合)提供。
优选地，在某些实施方式中，公开的抗体通过吸入施用，但完全IgG抗体的雾化可能证明由于其分子大小(～150kDa)导致的限制。为使可商购的雾化装置最大化，较小的Fab片段可能是需要的。在这种情况下，我们也可能需要从亲本IgG分子生成Fab片段。因此，我们使用标准酶基消化方法进行初步研究以生成Fab片段，其然后与全IgG分子平行地表征。
治疗有效剂量是指产生用于施用目的的治疗效果的剂量。确切的剂量取决于待治疗的病症，并且本领域技术人员可以利用已知技术确定。通常，多肽以每天约0.01g/kg至约50mg/kg，优选每天0.01mg/kg至约30mg/kg，最优选每天0.1mg/kg至约20mg/kg施用。多肽可以每天(例如，每天一次、二次、三次或四次)或优选以较低频率(例如、每周、每两周、每三周、每月或每季度)给予。此外，如本领域已知的，根据年龄以及体重、一般健康状况、性别、饮食、给药时间、药物相互作用和疾病的严重程度做出调整可能是必要的，并且将由本领域技术人员通过常规实验确定。
如本文中公开的CTLA4结合多肽可单独或与一种或多种另外的治疗如化疗、放疗、免疫疗法、外科手术介入或这些方法的任何组合联合施用。如上所述的，长期治疗在其它治疗策略的情况下作为辅助疗法同样是可能的。
在这些方法的某些实施方式中，可以一起(同时地)或在不同时间(依次地)施用一种或多种多肽治疗剂。此外，多肽治疗剂可以与用于治疗癌症或用于抑制血管生成的另一类型的化合物一起施用。
在某些实施方式中，本发明的所述抗-CTLA4抗体剂可以单独使用。
在某些实施方式中，结合多肽或其片段可以标记或未标记以用于诊断目的。通常，诊断分析使得能够检测由结合多肽与CTLA4的结合导致的复合体的形成。结合多肽或片段可以直接地标记，与抗体类似。可以使用多种标记，包括但不限于，放射性核素、荧光剂、酶、酶底物、酶辅因子、酶抑制剂和配体(例如，生物素、半抗原)。本领域技术人员已知许多合适的免疫分析法(参见，例如，美国专利号3,817,827、3,850,752、3,901,654和4,098,876)。在未标记时，结合多肽可以用于分析中，比如凝集分析。未标记的结合多肽也可以与另外(一种或多种)合适的试剂结合使用，该试剂可以用于检测结合多肽，比如，与结合多肽反应的标记抗体或其它合适的试剂(例如，标记的蛋白A)。
在一个实施方式中，本发明的结合多肽可以用于酶免疫分析法中，其中所述多肽与酶偶联。当包含CTLA4蛋白的生物样品与所述结合多肽组合时，在结合多肽和CTLA4蛋白之间发生结合。在一个实施方式中，含有表达CTLA4蛋白的细胞(例如，内皮细胞)的样品与所述抗体组合，并且在结合多肽和携带被该结合多肽识别的CTLA4蛋白的细胞之间发生结合。这些结合的细胞可以与未结合的试剂分离并且可以测定特异地结合细胞的结合多肽-酶偶联物的存在，例如，通过将样品与酶的底物(其在受到酶的作用时产生颜色或其它可检测的变化)接触。在另一实施方式中，所述结合多肽可以是未标记的，并且可以加入识别所述结合多肽的第二标记多肽(例如，抗体)。
在某些方面，还可以制备用于检测生物样品中CTLA4蛋白的存在的试剂盒。这些试剂盒将包括与CTLA4蛋白或所述受体的部分结合的CTLA4结合多肽，以及一种或多种适于检测结合多肽和受体蛋白或其部分之间的复合体的存在的辅助试剂。本发明的多肽组合物可以单独地或与对于其它表位特异性的另外的抗体组合以冻干形式提供。结合多肽和/或抗体(其可以是标记或未标记的)可以与辅助成分(例如，缓冲剂如Tris、磷酸盐和碳酸盐，稳定剂，赋形剂，杀生物剂和/或惰性蛋白质，例如，牛血清白蛋白)一起包括在试剂盒中。例如，结合多肽和/或抗体可以作为与辅助成分的冻干混合物提供，或辅助成分可以单独地提供用于由使用者组合。一般地，这些辅助材料基于活性结合多肽或抗体的量以小于约5％重量存在，且通常基于多肽或抗体浓度以至少约0.001％重量的总量存在。当采用能够与结合多肽结合的第二抗体时，这种抗体可以在试剂盒中提供，例如在单独的小瓶或容器中。第二抗体(如果存在)通常是标记的，并且可以以与上文描述的抗体制剂相似的方式配制。
多肽序列使用标准的一字母或三字母的缩写表示。除非另有说明，每条多肽序列具有左侧的氨基端和右侧的羧基端；各单链核酸序列和各双链核酸序列的顶部链具有左铡的5'端和右铡的3'端。还可以通过解释特定多肽序列与参考序列如何不同来描述该特定多肽序列。
尽管现在详细描述了本发明，但本发明通过参照以下实施例更清楚地理解，该实施例仅为了说明的目的包括，而不是意图限制本发明。
实施例1
鉴别对于人CTLA4特异性的人抗体并针对治疗特性进行选择，包括对于CTLA4的特异性和对于CTLA4的高亲和力水平(例如，至少10-6M)。鉴别的抗体描述于表4中。
为确定抗-CTLA4抗体是否具有功能活性，测定它们增强T细胞激活的能力。使用生物素化的抗-CD14抗体接着与抗-生物素涂布的磁珠的反应耗竭单核细胞的外周血单核细胞(PBMC)，并使用磁性柱分离。收集从在磁场中保持的柱洗脱的细胞级分，从而产生包含<1％单核细胞的淋巴细胞群体。淋巴细胞添加到用固定的抗-CD3(5mg/ml)预涂布的孔。测试抗体以10mg/ml添加到这些孔。在培养3天后，细胞通过测量CD25的表达来分析细胞激活。具体地，在培养3天后，收获细胞并用抗-人CD25染色以作为细胞激活的量度。CD25表达的水平在其中已经添加抗-CTLA4抗体的培养物中较高(图1)。对照抗体是同种型匹配的非特异性(即，不结合CTLA4)的抗体。通过相对于培养基对照对数据进行标准化，明显的增强水平在接受抗-CTLA4抗体的培养物中检测到(图2)。
实施例2
本实施例测定本文中公开的示例性抗体(F7)的亲和动力学。表1显示抗体F7的亲和动力学。
表1：抗体F7的结合特性
mAb ka(1/Ms) kd(1/s) KD(M) Chi2
F7 2.94E5 2.17E-4 7.38E-10 0.805
本实施例阐明了本文公开的示例性抗-CTLA4抗体的结合亲和力。亲和力使用表面等离子体共振(Biacore)测定。简言之，抗-人Fc抗体(GE,BR-1008-39)使用标准NHS/EDC偶联方法固定在CM5传感芯片上达到大约1000RU。抗体(约10μg/ml)以10μl/min的流速捕获60s。重组人CTLA4/His在运行缓冲液(HBS-EP)中系列稀释。所有测量以30μL/min的流速进行。表面用3M MgCl2再生60s。1:1(Langmuir)结合模型用于拟合数据。
实施例3
以下实施例描述人抗-CTLA4抗体CT1E1的表征。CT1E1的可变重链和轻链的氨基酸序列分别提供在SEQ ID No:43和44中。
抗-CTLA4抗体CT1E1的交叉反应性研究揭示，CT1E1不仅对于人CTLA4是特异性的，而且与食蟹猴和鼠CTLA4两者交叉反应。使用96-孔Ni-NTA板，捕获1μg/mL的重组人CTLA4/His、食蟹猴CTLA4/His或小鼠CTLA4/His。平板在室温下温育30min，用PBS-Tween(PBST)洗涤3次，然后添加在酪蛋白中稀释的抗-CTLA4抗体(～1μg/mL)并伴随振摇温育30min。平板用PBST洗涤3次，添加辣根过氧化物酶(HRP)-偶联的山羊抗-人Fc(酪蛋白中1:500)，然后添加3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)作为底物，并显色约5min。2M H2SO4用于终止反应并在450nm下读取OD。
抗体CT1E1对于人CTLA4的亲和力也使用表面等离子体共振(BiaCore)测定。抗-人Fc抗体(GE,BR-1008-39)使用标准NHS/EDC偶联方法固定在CM5传感芯片上达到大约1000RU。抗体(约10μg/ml)以10μl/min的流速捕获60s。重组人PD-L1/His在运行缓冲液(HBS-EP)中系列稀释。所有测量以30μL/min的流速在HBS-EP缓冲液中进行。抗体适当地稀释以获得一系列浓度。1:1(Langmuir)结合模型用于拟合数据。Chi2(卡方)值用作拟合质量的指南。来自亲和力研究的结果提供在以下表2中。
表2：CT1E1结合特性
Figure BDA0001406393920000551
Figure BDA0001406393920000561
进行分析以确定抗体CT1E1抑制CD80和CD86活性的能力。96-孔Ni-NTA板在室温下用1μg/mL的具有六组氨酸标签的重组人CD80或CD86涂布1h。预混合30μL的系列3-倍稀释IgG(从25μg/mL开始)和30μL的0.006μL/mL重组人CTLA4(作为人Fc融合)并温育混合物30分钟，然后用PBS-Tween(PBST)洗涤平板3次。混合物转移50μL到ELISA平板并伴随振摇温育30min。平板用PBST洗涤3次，然后添加辣根过氧化物酶(HRP)-偶联的山羊抗-人Fc(酪蛋白中1:500)，接着添加3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)作为底物并显色30min。2M H2SO4用于终止反应并在450nm下读取OD。
来自研究的结果描述于图3A(CD80)和3B(CD86)中。CT1E1对于CD80的IC50值测定为约0.31x 10-9和对于CD86的IC50值测定为约0.32x 10-9。令人惊讶地，相对于对照抗体伊匹单抗(Yervoy)的计算的IC50，抗体CT1E1对于CD80和CD86具有较好的IC50值，对照抗体伊匹单抗是能够抑制CTLA4活性以使得细胞毒性T细胞可以例如破坏癌细胞的人抗-CTLA4抗体。伊匹单抗和CT1E1两者对于CD80和CD86的计算IC50值描述于图3A和3B中。
实施例4
本实施例描述了检验抗-CTLA4抗体F7对低剂量超抗原葡萄球菌肠毒素B(SEB)的反应的作用的实验。SEB用作刺激剂提供了研究响应于抗原的T细胞激活的手段。抗-CD3是多克隆T细胞激活剂，而SEB是寡克隆(oligiclonal)激活剂。
进行了其中抗-人CD25用作细胞激活的手段的实验。使用两种不同浓度的F7抗体(30μg和10μg)。也使用阴性对照，其是不结合CTLA4的同种型匹配的抗体。三天后，测量CD25细胞的百分激活。
如图4中所示，激活的CD25细胞的百分比在用两种浓度的抗-CTLA4F7抗体(30μg和10μg)处理的细胞中提高。通过相对于培养基对照对数据进行标准化，显著的激活水平在接受F7抗-CTLA4抗体的培养物中检测到(通过CD25细胞)(图4)。
实施例5
抗体E8进一步在另外的亲和力和功能研究中进行研究。抗体E8对于人CTLA4的亲和力使用表面等离子体共振(BiaCore)测定。研究的结果提供在以下表3中。
表3：抗体E8的Biacore研究
名称 ka(1/Ms) kd(1/s) KD(M) Rmax(RU) Chi2
E8 8.29E4 4.88E-3 5.89E-8 85 0.8
除亲和力研究外，图5提供了显示抗体E8的功能活性的结果。图5中描述的功能分析类似于实施例1的CD26分析中使用的方法。
表4：重链和轻链可变域氨基酸序列
重链可变域区域 轻链可变域区域
Figure BDA0001406393920000571
Figure BDA0001406393920000581
Figure BDA0001406393920000591
序列表
<110> SORRENTO THERAPEUTICS, INC.
<120> 结合CTLA4的抗体治疗剂
<130> 126036-04320
<140> PCT/US2016/017713
<141> 2016-02-12
<150> 62/116,353
<151> 2015-02-13
<160> 46
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<221> PEPTIDE
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 1
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Arg Gly Ser Asn Phe Asn Phe Asp Asp Leu
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Phe Val Arg Ser Lys Ala Tyr Gly Glu Thr Thr Asp Tyr Val Ala
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Phe Ile
65 70 75 80
Ala Trp Leu Gln Met Asp Ser Leu Lys Thr Asp Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Thr Thr Phe Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
100 105 110
Ser Ser
<210> 2
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<221> PEPTIDE
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 2
Leu Pro Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Lys
1 5 10 15
Thr Ala Arg Ile Ser Cys Gly Gly Asn Asn Ile Ala Ser Glu Ala Val
20 25 30
His Trp Tyr Gln Lys Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr
35 40 45
Tyr Asp Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Arg Ile Ser Arg Val Asp Ala Gly
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Arg Thr Thr Asp Gln
85 90 95
Pro Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<221> PEPTIDE
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 3
Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Met Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Arg Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Ser Phe Thr Thr His
20 25 30
Phe Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Met Asn Pro Asn Thr Gly Asn Thr Gly Tyr Ala Glu Arg Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asn Pro Ala Glu Ser Gly Arg Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<221> PEPTIDE
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 4
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Ser Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Asn Asn Val Gly Gly Tyr
20 25 30
Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
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Met Ile Tyr Glu Val Thr Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Val Ser Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Gly Ser
85 90 95
Leu Asn Ala Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu
100 105 110
<210> 5
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<221> PEPTIDE
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 5
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Val Ser Asn Asn
20 25 30
Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Val Ile Tyr Arg Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Leu
85 90 95
Arg Glu Gly Gly Thr Ser Gly Asp Tyr Val Asn Asp Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 6
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<221> PEPTIDE
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 6
Gln Ser Val Val Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly
20 25 30
Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Gly Asn Lys Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ala Tyr Asp Ser Ser
85 90 95
Leu Ser Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 7
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<221> PEPTIDE
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 7
Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Ile Gly Ser Tyr Ser Ser Gly Trp Tyr Arg Ala Phe Asp
100 105 110
Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
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<210> 8
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<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<221> PEPTIDE
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 8
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Gln Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Asn Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Val Thr Glu Phe Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Leu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Arg Pro Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<221> PEPTIDE
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 9
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Thr Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Val Asn Tyr Asn Asp Gly Phe Gly Thr Phe Asn Gly Tyr Tyr Ala
50 55 60
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Ile Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn
65 70 75 80
Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Val Asp Asp Thr Ala Val
85 90 95
Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Ser Gly Val Ala Gly Pro Tyr Tyr Phe Asp
100 105 110
Asn Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 10
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<221> PEPTIDE
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 10
Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Ser Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 11
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<221> PEPTIDE
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 11
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Thr Val Lys Val Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Pro Phe Arg Asn Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Trp Ile Asp Ala Gly Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Ser Gln Thr Phe
50 55 60
His Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Leu Leu Trp Pro Tyr Leu Val Thr Ser Gly Gly Ala Phe
100 105 110
Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 12
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<221> PEPTIDE
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 12
Ser Tyr Glu Leu Met Gln Pro Pro Ser Thr Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser His
20 25 30
Ile Val Asn Trp Tyr Gln Gln Phe Pro Gly Ala Ala Pro Gln Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Asn Asp Asp Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Ala Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala His Tyr Tyr Cys Ser Ala Trp Asp Asp Ile Leu
85 90 95
Lys Gly Pro Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 13
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<221> PEPTIDE
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 13
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr His
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Ala Ile Ile Asn Pro Asn Asp Gly Val Lys Val Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Leu Thr Val Ala Ser Asp Thr Ser Ala Thr Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Asp Leu Ser Gly Leu Thr Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Gly Arg Glu Gln His Gly Gly His His Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
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<223> 人工序列的描述：合成多肽
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Gln Ala Gly Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr
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Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
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Met Ile Tyr Asp Val Thr Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu
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Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Lys Ser Tyr Thr Ser Ser
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Ser Thr Pro Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu
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Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Arg Gly Ser Asn Phe Asn Phe Asp Asp Leu
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Ser Ser
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<223> 人工序列的描述：合成多肽
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Leu Pro Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Lys
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Thr Ala Arg Ile Ser Cys Gly Gly Asn Asn Ile Ala Ser Glu Ala Val
20 25 30
His Trp Tyr Gln Lys Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr
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Tyr Asp Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
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Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Arg Ile Ser Arg Val Asp Ala Gly
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Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Arg Thr Thr Asp Gln
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Pro Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
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<220>
<221> PEPTIDE
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 17
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Ser Ala Tyr Asn Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Leu
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Val Gly Tyr Gly Gly Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 18
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<221> PEPTIDE
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 18
Ser Tyr Glu Leu Met Gln Pro Pro Ser Val Ser Lys Gly Leu Arg Gln
1 5 10 15
Thr Ala Thr Leu Thr Cys Thr Gly Asn Ser Asn Asn Val Gly Asn Gln
20 25 30
Gly Ala Asp Trp Leu Gln Gln His Gln Gly His Pro Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ser Tyr Arg Asn Asn Asp Arg Pro Ser Gly Ile Ser Glu Arg Phe Ser
50 55 60
Ala Ser Arg Ser Gly Ser Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Leu Gln
65 70 75 80
Pro Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Leu Ala Trp Asp Ser Ser Leu
85 90 95
Ser Ala Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu
100 105 110
<210> 19
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<221> PEPTIDE
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 19
Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Thr Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Ser
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Arg Leu Ile Pro Ser Ser Gly Tyr Thr Ile Phe Ser Gln Lys Leu
50 55 60
Gln Gly Arg Val Ser Met Thr Arg Asp Thr Ser Met Ser Thr His Tyr
65 70 75 80
Leu Thr Leu Ser His Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr Asp Gly Gly Asn Tyr Asn Leu Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 20
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<221> PEPTIDE
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 20
Gln Pro Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr
20 25 30
Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Met Ile Tyr Asp Val Ser Ser Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Asp Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Ser Ser
85 90 95
Ser Pro Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu
100 105 110
<210> 21
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<221> PEPTIDE
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 21
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Thr Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Ser Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Ile Pro Ile Leu Gly Ile Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Gly Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Ser Gly Ser Tyr Leu Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 22
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<221> PEPTIDE
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 22
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser
20 25 30
Pro Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Met Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Ala Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Ser Arg Ser Gly Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 23
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<221> PEPTIDE
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 23
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Phe Val Lys Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Gly Asp Tyr
20 25 30
Gly Met Ser Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Phe Ile Arg Ser Lys Ala Tyr Gly Gly Thr Thr Asp Tyr Ala Ala
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Phe
65 70 75 80
Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Thr Arg Gly His Tyr Ser Ala Ser Ile Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 24
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<221> PEPTIDE
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 24
Ser Tyr Glu Leu Met Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Lys
1 5 10 15
Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Asn Ile Gly Ser Lys Ser Val
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Asp Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr
35 40 45
Ser Asp Asn Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Ser Ser Gly His Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Val Trp Asp Ser Asn Lys Asn Glu
85 90 95
Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 25
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<221> PEPTIDE
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 25
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Asp Gly His
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Val Asp Pro His Ser Gly Ala Thr Asn Tyr Ala Gln Asn Phe
50 55 60
Gln Gly Gly Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Lys Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Phe Tyr Asp Thr Ser Ala Lys Ser Gly Ala Phe Asp Ile
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 26
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<221> PEPTIDE
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 26
Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Val Asn Ser Phe Pro Trp
85 90 95
Ala Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 27
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<221> PEPTIDE
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 27
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Thr Ser Gly Asn Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Met Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Lys Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Leu Phe Pro His Ile Tyr Gly Asn Tyr Tyr Gly Met Asp
100 105 110
Ile Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 28
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<221> PEPTIDE
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 28
Gln Ser Val Val Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Asn Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn
20 25 30
Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Asp Asn Asn Arg Arg Ala Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Thr Leu Gly Ile Thr Gly Leu Gln
65 70 75 80
Thr Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Arg Ser Leu
85 90 95
Thr Thr Asp Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 29
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<221> PEPTIDE
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 29
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser Ala
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Val Ile Tyr Arg Gly Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Arg
85 90 95
Gly Glu Gly Gly Asn Ser Gly Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 30
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<221> PEPTIDE
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 30
Asn Phe Met Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr
20 25 30
Asn Phe Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Met Ile Tyr Asp Val Ser Lys Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Ser Thr
85 90 95
Asn Thr Leu Asp Val Leu Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 31
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<221> PEPTIDE
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 31
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Gly Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Tyr Glu His Asp Tyr Asp Ser Ser Lys Ala Thr Thr Gly Tyr
100 105 110
Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 32
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<221> PEPTIDE
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 32
Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Ile Leu Tyr Arg
20 25 30
Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Ala Asp Arg Phe Pro Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 33
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<221> PEPTIDE
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 33
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser Asn
20 25 30
Ser Ala Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Gly Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Asp Tyr Ala
50 55 60
Val Ser Val Lys Ser Arg Ile Thr Ile Asn Pro Asp Thr Ser Lys Asn
65 70 75 80
Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val
85 90 95
Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Arg Trp Glu Leu Pro Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 34
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<221> PEPTIDE
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 34
Gln Ser Val Val Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Ser Gly Gln
1 5 10 15
Lys Val Ile Ile Ser Cys Ser Gly Ser Asn Ser Asn Ile Val Asn Asn
20 25 30
Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Ala Ala Pro Lys Val Leu
35 40 45
Ile Tyr Ala Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Phe Leu Ala Ile Thr Gly Leu Gln
65 70 75 80
Thr Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Gly Ser Leu
85 90 95
Asp Val Asp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 35
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<221> PEPTIDE
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 35
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Ser Ala Tyr Asn Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Leu
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Pro Gly Ile Leu Thr Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 36
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<221> PEPTIDE
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 36
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Asn Tyr His
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ala Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Thr Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asn Thr Tyr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 37
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<221> PEPTIDE
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 37
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser Asn
20 25 30
Ser Ala Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Gly Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Asp Tyr Ala
50 55 60
Val Ser Val Lys Ser Arg Ile Thr Ile Asn Pro Asp Thr Ser Lys Asn
65 70 75 80
Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val
85 90 95
Tyr Tyr Cys Ala Met His Ser Gly Tyr Arg Asn Tyr Gly Met Asp Val
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 38
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<221> PEPTIDE
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 38
Gln Ser Val Val Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly
20 25 30
Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Gly Asn Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Ser
85 90 95
Leu Ser Gly Ala Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 39
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<221> PEPTIDE
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 39
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Thr Val Lys Val Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Pro Phe Arg Asn Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Trp Ile Asp Ala Gly Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Ser Gln Thr Phe
50 55 60
His Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Leu Leu Trp Pro Tyr Leu Val Thr Ser Gly Gly Ala Phe
100 105 110
Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 40
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<221> PEPTIDE
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 40
Ser Tyr Glu Leu Met Gln Pro Pro Ser Thr Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser His
20 25 30
Ile Val Asn Gly Tyr Gln Gln Phe Pro Gly Ala Ala Pro Gln Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Asn Asp Asp Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Ala Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala His Tyr Tyr Cys Ser Ala Trp Asp Asp Ile Leu
85 90 95
Lys Gly Pro Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu
100 105 110
<210> 41
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<221> PEPTIDE
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 41
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Glu Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Leu Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Thr Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Ile Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Asp Cys Arg Gly Pro Ser Cys Tyr Phe Ala Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 42
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<221> PEPTIDE
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 42
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Pro Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asn Ser Phe Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys
100 105
<210> 43
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<221> PEPTIDE
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 43
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Arg Gly Ser Asn Phe Asn Phe Asp Asp Leu
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Phe Val Arg Ser Lys Ala Tyr Gly Glu Thr Thr Asp Tyr Val Ala
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Phe Ile
65 70 75 80
Ala Trp Leu Gln Met Asp Ser Leu Lys Thr Asp Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Thr Thr Phe Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
100 105 110
Ser Ser
<210> 44
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<221> PEPTIDE
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 44
Gln Pro Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Lys
1 5 10 15
Thr Ala Arg Ile Ser Cys Gly Gly Asn Asn Ile Ala Ser Glu Ala Val
20 25 30
His Trp Tyr Gln Lys Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr
35 40 45
Tyr Asp Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Arg Ile Ser Arg Val Asp Ala Gly
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Arg Thr Thr Asp Gln
85 90 95
Pro Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 45
<211> 4
<212> PRT
<213> 未知(Unknown)
<220>
<221> PEPTIDE
<223> 未知的描述：铰链区序列
<400> 45
Cys Pro Ser Cys
1
<210> 46
<211> 4
<212> PRT
<213> 未知(Unknown)
<220>
<221> PEPTIDE
<223> 未知的描述：铰链区序列
<400> 46
Cys Pro Pro Cys
1

Claims (10)

1.一种能够结合于CTLA4的结合蛋白或其抗原结合片段，包含：
重链互补决定区，所述重链互补决定区为氨基酸序列SEQ ID NO:43的重链可变域中的根据Kabat编号的互补决定区和
轻链互补决定区，所述轻链互补决定区为氨基酸序列SEQ ID NO:44的轻链可变域中的根据Kabat编号的互补决定区。
2.一种分离的全人抗-CTLA4抗体，其中所述抗体具有重链可变域序列SEQ ID NO:43和轻链可变域序列SEQ ID NO:44。
3.如权利要求1的结合蛋白或其抗原结合片段，其中所述结合蛋白或其抗原结合片段选自下组：分离的IgG类抗-CTLA4全人抗体，抗-CTLA4全人抗体Fab片段，和抗-CTLA4单链人抗体，并且其中所述结合蛋白或其抗原结合片段具有重链可变域序列SEQ ID NO:43和轻链可变域序列SEQ ID NO:44，并且其中所述抗-CTLA4单链人抗体的重链可变域和轻链可变域通过肽接头连接。
4.如权利要求1或3的结合蛋白或其抗原结合片段或如权利要求2的全人抗体，其中所述结合蛋白或抗体或其抗原结合片段具有至少1x10-6M的KD。
5.一种抗-CTLA4全人抗体Fab片段，包含：
具有氨基酸序列SEQ ID NO:43的重链可变域；和
具有氨基酸序列SEQ ID NO:44的轻链可变域。
6.如权利要求5的全人抗体Fab片段，其中所述抗体Fab片段具有至少1x10-6M的KD。
7.一种抗-CTLA4单链人抗体，包含通过肽接头连接的重链可变域和轻链可变域，其中所述重链可变域包含氨基酸序列SEQ ID NO:43；和所述轻链可变域包含氨基酸序列SEQ IDNO:44。
8.如权利要求7的单链人抗体，其中所述抗体具有至少1x10-6M的KD。
9.如前述权利要求中任一项的结合蛋白、抗体或其抗原结合片段在制备治疗癌症的药物中的用途，其中所述癌症选自膀胱癌、血癌、脑癌、乳腺癌、结肠癌、纤维肉瘤、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、黑素瘤、淋巴瘤、间皮瘤和浆细胞瘤。
10.一种药物组合物，包含如权利要求1-8中任一项的结合蛋白、抗-CTLA4抗体或其抗原结合片段和药学上可接受的载体。
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