CZ303703B6

CZ303703B6 - Monoklonální protilátka nebo její antigen-vázající fragment, farmaceutická kompozice obsahující tuto protilátku nebo fragment, bunecná linie produkující tuto protilátku nebo fragment, zpusob prípravy této protilátky, izolovaná nukleová kyselina kóduj

Info

Publication number: CZ303703B6
Application number: CZ20110342A
Authority: CZ
Inventors: Charles Hanson@Douglas; Joseph Neveu@Märk; Elliot Mueller@Eileen; Herbert Hanke@Jeffrey; Christopher Gilman@Steven; Geoffrey Davis@C.; Ramon Corvalan@Jose
Original assignee: Pfizer Inc.; Amgen Fremont Inc.
Priority date: 1998-12-23
Filing date: 1999-12-23
Publication date: 2013-03-20
Also published as: CN1328571A; CZ302706B6; CA2356215C; YU45501A; CN1328571B; OA11917A; HU229566B1; UA76936C2; SK9142001A3; LT2112166T; ID29991A; IS8950A; EP2112166A3; EP1141028A2; EP1141028B1; WO2000037504A9; PT1141028E; CZ20012349A3; EP3553085A1; CU23292B7

Abstract

Resení se týká monoklonální protilátky, která se váze na antigen 4 cytotoxických T lymfocytu, farmaceutické kompozice obsahující uvedenou protilátku nebo fragment, bunecné linie produkující uvedenou protilátku nebo fragment, zpusoby prípravy uvedené protilátky nebo fragmentu, izolované nukleové kyseliny kódující tezký a/nebo lehký retezec uvedené protilátky nebo fragmentu, hostitelské bunky obsahující uvedenou izolovanou nukleovou kyselinu nebo fragment, pouzití uvedené protilátky nebo fragmentu, prípadne v kombinaci s bunkami exprimujícími faktor stimulující kolonie granulocytu-makrofágu, pro prípravu léciva.

Description

CZ 303703 B6

Monoklonální protilátka nebo její antigen-vázající fragment, farmaceutická kompozice obsahující tuto protilátku nebo fragment, buněčná linie produkující tuto protilátku nebo fragment, způsob přípravy této protilátky, izolovaná nukleová kyselina kódující těžký a/ne-bo lehký řetězec této protilátky nebo fragmentu, hostitelská buňka obsahující tuto izolovanou nukleovou kyselinu a použití této protilátky nebo fragmentu případně s buňkami pro výrobu léčiva

Oblast techniky

Vynález se týká monoklonální protilátky, která se váže na antigen 4 cytotoxických T lymfocytů, farmaceutické kompozice obsahující uvedenou protilátkou nebo fragment, buněčné linie produkující uvedenou protilátku nebo fragment, způsoby přípravy uvedené protilátky nebo fragmentu, izolované nukleové kyseliny kódující těžký a/nebo lehký řetězec uvedené protilátky nebo fragmentu, hostitelské buňky obsahující uvedenou izolovanou nukleovou kyselinu nebo fragment, použití uvedené protilátky nebo fragmentu, případně v kombinaci s buňkami exprimujícími faktor stimulující kolonie granulocytů-makrofágů, pro přípravu léčiva.

Dosavadní stav techniky

Regulace imunitní reakce pacientů by poskytla žádoucí léčbu mnoha nemocí, která by mohla vést ke specifickému účinku, jehož lze zřídka dosáhnout použitím běžných léků. Bylo by možné dosáhnout aktivace i utlumení reakcí imunitního systému. Úlohy T a B lymfocytů byly obsáhle studovány a charakterizovány ve spojitosti s regulací imunitní reakce. Z těchto studií nezbytně vyplývá, že úloha T lymfocytů je v mnoha případech obzvláště důležitá při prevenci nemocí a léčbě. T lymfocyty mají velmi složitý systém kontroly svých interakcí. Pro interakce mezi T lymfocyty jsou používány početné receptory a rozpustné faktory. Tudíž účinek každého konkrétního signálu na imunitní reakci se většinou mění a závisí na konkrétních faktorech, receptorech a protirecepto-rech, které jsou zapojeny do metabolické dráhy. Metabolické dráhy pro utlumení reakcí jsou stejně důležité jako dráhy vyžadované pro aktivaci. Jeden mechanismus prevence imunitní reakce na konkrétní antigen je vyzrávání v thymu vedoucí k toleranci T lymfocytů. Jsou také známy další mechanismy, jako je například sekrece supresivních cytokinů.

Aktivace T lymfocytů nevyžaduje pouze stimulaci prostřednictvím ant i genového receptoru (T buněčný receptor (TCR)), ale další signály prostřednictvím kostimulačních (společně stimulujících) povrchových molekul, jako je například CD28. Ligandy pro CD28 jsou proteiny B71 (CD80) a B7-2 (CD86), které jsou exprimovány na buňkách prezentujících antigen jako jsou například dendritické buňky, aktivované B lymfocyty nebo monocyty, které interagují s CD28 nebo CTLA^l T lymfocytů nebo monocyty, které interagují s CD28 nebo CTLA-4 T lymfocytů pro zajištění kostimulačního signálu. Úloha kostimulačních signálů byla studována u experimentální alergické encefalomyelitidy (EAE) autory Perrinem et al. (Immunol. Res., 14, 189 až 99, 1995). EAE je autoimunitní porucha indukovaná buňkami Thl namířenými proti myelinovým ant i genům, která poskytuje in vivo model pro studium úlohy B7 zprostředkované kost imu láce v indukci patologické imunitní reakce. Použitím rozpustného fúzního proteinového ligandu po receptory B7, jakož i monoklonálních protilátek specifických buď pro CD80, nebo CD86, Perrin et al. prokázali, že B7 kostimulace má významnou úlohu pro určení klinického výsledku nemoci u EAE.

Interakce mezi B7 a CD28 je jedna z několika kostimulačních signálních drah, která se jeví postačující pro spuštění maturace a proliferace antigen-specifických T lymfocytů. Nedostatečná kostimulace a doprovodná nedostatečnost produkce IL-2 zabraňují následné proliferaci T lymfocytů a indukují stav nereaktivity nazývaný „anergie“. Aktivaci a proliferaci T lymfocytů může - 1 - CZ 303703 B6 blokovat celá řada virů a nádorů, což vede k nepostačující aktivitě nebo nereaktivitě hostitelského imunitního systému k infikovaným nebo transformovaným buňkám. Z celé řady možných poruch T lymfocytů může být anergie alespoň částečně zodpovědná za selhání hostitele zbavit se pato-genů nebo nádorových buněk.

Použití proteinu B7 ke zprostředkování protinádorové imunity bylo popsáno v práci Chen et al. (Cell, 71, 1093 až 1102, 1992) a Townsend a Allison (Science, 259, 368, 1993), Schwartz (Cell, 71, 1065, 1992) podává přehled úlohy CD28, CTLA-4, a B7 v produkci IL2 a imunoterapii. Harding et al. (Nátuře, 356, 607 až 609, 1994) dokazuje, že signály zprostředkované CD28 kostimulují myší T lymfocyty a zabraňují indukci anergie u klonů T lymfocytů. (viz také patenty Spojených států US 5 434 131, US 5 770 197, a US 5 773253, a mezinárodní patentové přihlášky č. WO 93/00 431, WO 95/01 994, WO 95/03 408, WO 95/24 217, a WO 95/33 770). Z výše uvedeného je jasné, že T lymfocyty vyžadují dva typy signálů od buněk prezentujících antigen (APC) pro aktivaci a následnou diferenciaci efektorové funkce. Zaprvé je zde antigen-specifický signál vznikající po interakcích mezi TCR na T lymfocytech a molekulách MHC prezentujících peptidy na APC. Za druhé je zde signál na antigenu nezávislý, který je zprostředkováván interakcí CD28 se členy rodiny B7 (B7--1 (CD80) nebo B7-2 (CDB6)). Zpočátku bylo nejasné, kam přesně do prostředí imunitní reaktivity CTLA-4 patří. Myší CTLA-4 byl poprvé identifikován a klonován autory Brunet et al. (Nátuře, 328, 267 až 270, 1987) jako součást hledání molekul, které jsou přednostně exprimovány na cytotoxických T lymfocytech. Lidský CTLA-4 byl identifikován a klonován krátce nebo autory Dariavach et al. (Eur. J. Immunol., 18, 1901 až 1905, 1988). Molekuly CTLA-4 myšího a lidského původu mají přibližně celkem ze 76 % homo-logní sekvence a blíží se k úplné identitě sekvencí svých cyto plazmatických domén (Dariavach et al., Eur. J. Immunol., 18, 1901 až 1905, 1988). CTLA-4 je člen imunoglobulinové (Ig) velké rodiny (,,superfamily“) proteinů. Rodina Ig je skupina proteinů, které sdílejí klíčové strukturní charakteristické vlastnosti buď variabilních (V), nebo konstantních (C) domén Ig molekul. Členové Ig rodiny, bez omezení, zahrnují samotné imunoglobuliny, molekuly hlavního histokompati-bilního komplexu (MHC) (tj. MHC třídy I a II) a molekuly TCR. V roce 1991, Linsley et al. (J. Exp. Med., 174, 561 až 569, 1991) navrhovali, že CTLA^l· je druhý receptor pro B7. Podobně Harper et al. (J. Immunol., 147, 1037 až 44, 1991) prokázali, že molekuly CTLA—4 a CD28 jsou blízce příbuzné u myši a člověka, co se týče sekvence, exprese RNA, genové struktury a lokalizace chromozomů. (Viz také Balzano et al., Int. J. Cancer Suppl., 7, 28 až 32, 1992). Další důkaz pro tuto úlohu byl získán funkčními studiemi. Například Lenschow et al. (Science, 257, 789 až 792, 1992) prokázal, že CTLA-4-Ig indukoval dlouhodobé přežívání štěpů pankreatických ostrůvků. Freeman et al. (Science, 262, 907 až 909, 1993) zkoumal úlohu CTLA^l u myší s deficitem B7. Zkoumání ligandů pro CTLA—4 je popsáno v práci Lenschow et al. (P.N.A.S., 90, 11054 až 11058, 1993). Linsley et al. (Science, 257, 792 až 795, 1992) popisuje imunosupresi in vivo prostřednictvím rozpustné formy CTLA—4. Linsley et al. (J. Exp. Med. 176, 1595 až 694, 1992) připravili protilátky, které váží CTLA-4 a které nereagují zkříženě s CD28 a uzavřeli, že CTLA^4 je exprimován společně (koexprimován) s CD28 na aktivovaných T lymfocytech a kooperativně reguluje adhezi T lymfocytů a aktivaci prostřednictvím B8. Kuchroo et al. (Cell, 80, 707 až 18, 1995) prokázali, že kostimulační molekuly B7-1 a B7-2 odlišně aktivovaly vývojové metabolické dráhy Thl/Th2. Yiqun et al. (Int. Immunol. 8, 37 až 444, 1996) prokázali, že existují odlišné požadavky na kostimulační signály od členů rodiny B7 pomocí klidových versus nově aktivovaných paměťových T lymfocytů vůči rozpustným upomínacím antigenům. (Viz také de Boer et al., Eur. J. Immunol., 23, 3120 až 5, 1993). Několik skupin vědců navrhovalo alternativní nebo rozdílné interakce receptor/ligand pro CTLA^l ve srovnání s CD28 a dokonce přemýšleli o třetím B-7 komplexu, který byl rozpoznáván prostřednictvím protilátky BB1. (Viz například Hathcock et al., Science, 262, 905 až 7, 1993, Freeman et al., Science, 262, 907 až 9, 1993, Freeman et al., J. Exp. Med., 178, 2185 až 92, 1993, Lenschow et al., Proč. Nati. Acad. Sci. U.S.A., 90, 11054 až 8, 1993, Razi-Wolf et al., Proč. Nati. Acad. Sci. U.S.A., 90, 11182 až 6, 1993 a Boussiotis et al., Proč. Nati. Acad. Sci. U.S.A., -2- CZ 303703 B6 90, 11059 až 63, 1993). Ale Freeman et al. (J. Immunol., 161, 2708 až 15, 1998) diskutovali zjištění, že protilátka BB1 váže molekulu, která je totožná s buněčnou povrchovou formou CD74, a tudíž BB1 mAB váže protein odlišný než je B7—1, a tento epitop se také vyskytuje na proteinu B7-1. Toto zjištění tedy vyžadovalo prostor pro opětné uvážení studií s použitím BB1 mAB v analýze exprese a funkce CD80.

Počínaje rokem 1993 s kulminací v roce 1995 začali vědci dále zpřesňovat úlohu CTLA-4 ve stimulaci T lymfocytů. Nejdříve s použitím monoklonálních protilátek proti CTLA-4 Walunas et al. (Immunity, 1, 405 až 13, 1994) poskytli důkaz, že CTLA^4 může působit jako negativní regulátor aktivace T lymfocytů. Potom Waterhouse et al. (Science, 270, 985 až 988, 1995) prokázali, že myši s deficitem CTLA^4 akumulovaly T lymfoblasty s aktivovanými aktivačními markéry ve svých lymfatických uzlinách a slezině. Blasty také infiltrovaly játra, srdce, plíce a pankreatickou tkáň, a množství sérových imunoglobulinů bylo zvýšeno a T lymfocyty prolife-rovaly silně a spontánně, když byly stimulovány prostřednictvím T buněčného receptoru, ale byly senzitivní k buněčné smrti indukované obsazením (zesítěním, ,,cross-linking“) receptorů Fas a zářením gama. Waterhouse et al. uzavřeli, že CTLA—4 působí jako negativní regulátor aktivace T lymfocytů a je životně důležitý pro kontrolu homeostázy lymfocytů. V komentáři ve stejném vydání Allison a Krummel Science, 270, 932 až 933, 1995) diskutovali práci Waterhouse et al. jako průkaznou, že CTLA—4 působí tak, že tlumí reaktivitu T lymfocytů nebo má inhibiční signální úlohu v aktivaci a vývoji T lymfocytů. Tivol et al. (Immunity, 3, 541 až 7, 1995) také vytvořili myši s deficitem CTLA^t a prokázali, že se u těchto myší rychle vyvíjejí lymfoprolifera-tivní choroby s multiorgánovou lymfocytámí infiltrací a tkáňovou destrukcí, s obzvláště závažnou myokarditidou a pankreatitidou. Uzavřeli, že CTLA-4 má klíčovou úlohu v tlumení aktivace T lymfocytů a udržování imunologické homeostázy. Krummel a Allison (J. Exp. Med., 182, 459 až 65, 1995) dále objasnili, že CD28 a CTLA-4 mají opačné účinky na reakci T lymfocytů na stimulaci. Vytvořili protilátku proti CTLA—4 a zkoumali účinky její vazby na CTLA-4 v systému používajícímu vysoce purifíkované T lymfocyty. Ve svém článku ukázali, že přítomnost nízkých hladin B7-2 na čerstvě explantované T lymfocyty může částečně inhibovat proliferaci T lymfocytů a tato inhibice byla zprostředkována interakcemi s CTLA^L Zkřížená vazba CTLA-4 spolu s TCR a CD28 silně inhibuje proliferaci a sekreci IL-2 T lymfocyty. Konečně výsledky ukázaly, že CD28 a CTLA-4 předávají opačné signály, které se zdají být sjednoceny T lymfocyty při určování reakce na antigen. Autoři tudíž uzavřeli, že výsledek stimulace receptoru T lymfocytů antigenem je regulován CD28 kostimulační signály, jakož i inhibičními signály pocházejícími od CTLA-4. (Viz také Krummel et al., Int. Immunol., 8, 519 až 23, 1996, a patent Spojených států US 5 811 097 a mezinárodní patentová přihláška WO 97/20 574).

Byla prováděna celá řada dalších pokusů pro další objasnění výše uvedené funkce CTLA—4. Například Wallunas et al. (J. Exp. Med., 183, 2541 až 50, 1996) prostřednictvím použití protilátek anti-CTLA-4 navrhovali, že signální dráha CTLA-4 nereguluje přežívání buněk nebo reaktivitu na IL—2, ale inhibuje produkci IL-2 závislou na CD28. Také Perrin et al. (J. Immunol., 157, 1333 až 6, 1996) prokázali, že protilátky encefalomyelitidy (EAE) exacerbovaly nemoc a zvýšily úmrtnost. Exacerbace nemoci byla spojena se zvýšenou produkcí encefalitogenních cytokinů TNF-alfa, IFN-gama a IL-2. Tito autoři tedy uzavřeli, že CTLA-4 reguluje intenzitu auto imunitní reakce u EAE, oslabuje produkci zánětlivých cytokinů a klinickou manifestaci nemoci. (Viz také Hurwitz et al., J. Neuroimmunol., 73, 57 až 62, 1997 a Cepero et al., J. Exp. Med., 188, 199 až 204, 1998) (anti-CTLA—4 „vlásenkový“ ribozym, který specificky ruší expresi CTLA^f po přenosu genu do myšího modelu T lymfocytů).

Kromě toho Blair et al. (J. Immunol., 160, 12-5, 1998) vyhodnotili působení panelu CTLA-4 monoklonálních protilátek (mAb) na klidové lidské CD4+ T lymfocyty. Jejich výsledky prokázaly, že některé CTLA-4 mAb inhibovaly proliferaci klidových buněk CD4+ a přechodné stadium buněčného cyklu od G0 do Gl. Inhibiční vliv CTLA-4 byl zjevný během 4 hodin, v době, kdy exprese buněčného povrchového CTLA—4 nebyla detekovatelná. Ale další CTLA—4 mAb neměly zjistitelný inhibiční účinek, což indikovalo, že vazba mAb na samotný CTLA^4 nebyla postačující pro zprostředkování útlumu reakcí T lymfocytů. Je zajímavé, že zatímco produkce IL-2 byla -3- CZ 303703 B6 zastavena, inhibiční anti-CTLA-4 mAb umožnily indukci a expresi genu přežívání buněk bcl-X(L). Ve shodě s tímto pozorován zůstávaly buňky životaschopné a po ligaci CTLA-4 nebyla zjišťována apoptóza. 5 Ve spojitosti s anergií Perez et al. (Immunity, 6, 411 až 7, 1997) prokázali, že indukci anergie T lymfocytů bylo zabráněno blokádou CTLA-4 a uzavřeli, že výsledek rozpoznávání antigenu T lymfocyty je určován interakcí CD28 nebo CTLA-4 na T lymfocytech s molekulami B7. Také Van Parijs et al. (J. Exp. Med., 186, 1119 až 28, 1997) zkoumali úlohu interleukinu 12 a kostimu-látorů u anergie T lymfocytů in vivo a nalezli, že prostřednictvím inhibice zapojení CTLA—4 io v průběhu indukce anergie byla blokována proliferace T lymfocytů a nebyla podněcována plná diferenciace Thl. Ale T lymfocyty vystavené antigenu vyvolávajícímu toleranci v přítomnosti jak IL—12, tak protilátky anti-CTLA-4 nebyly anergizovány a chovaly se identicky jako T lymfocyty, které potkaly imunogenní antigen. Tyto výsledky svědčí pro to, že k indukci anergie in vivo přispívají dva procesy: zapojení CTLA—4, které vede k blokádě schopnosti T lymfocytů prolife-15 rovat, a absence prototypového zánětlivého cytokinu, IL-12, který zabraňuje diferenciaci T lymfocytů na Thl efektorové buňky. Kombinace IL-12 a anti-CTLA—4 protilátky byla postačující ke konverzi normálně tolerovaného stimulu na imunogenní podnět.

Ve spojitosti s infekcemi prokázali McCoy et al. (J. Exp. Med., 186, 183 až 7, 1997), že anti-20 CTLA—4 protilátky značně zesílily a urychlily imunitní reakci T lymfocytů na Nippostrongylus brasiliemis, což mělo za následek vydatnou redukci počtu dospělých červů a časné ukončení produkce vajíček parazitem. (Viz také Murphy et al., J. Immunol., 161, 4153 až 4160, 1998) (Leishmania donovani). 25 Ve spojitosti s rakovinou zavedli Kwon et al. (PNAS USA, 94, 8099 až 103, 1997) syngenní myší model karcinomu prostaty a zkoumali dvě odlišné manipulace, o kterých se předpokládalo, že vyvolají reakci proti karcinomu prostaty prostřednictvím zvýšené kostimulace T lymfocytů: i) zabezpečení přímé kostimulace prostatickými rakovinnými buňkami transdukovanými tak, že exprimovaly ligand B7-1 a i i) in vivo blokáda CTLA—4 T lymfocytů zprostředkovaná protilát-30 kou, což zabraňovalo útlumu T lymfocytů. Bylo prokázáno, že in vivo blokáda CTLA-4 zprostředkovaná protilátkou zvýšila imunitní reakci proti karcinomu prostaty. Také Young et al. (Cancer Res., 57, 4036 až 41, 1997) studovali, zda blokáda funkce CTLA—4 vede k zesílení protinádorové odpovědi T lymfocytů v různých stadiích nádorového růstu. Na základě in vitro a in vivo výsledků zjistili, že blokáda CTLA—4 u jedinců s nádorem zvýšila kapacitu vytvářet 35 proti nádorovou odpověď T lymfocytů, ale exprese tohoto zesilujícího účinku v jejich modelu byla omezena na časná stadia růstu nádoru. Dále Hurwitz et al. (Proč. Nati. Acad. Sci. U.S.A., 95, 10067 až 71, 1998) zjistili, že vyvolání protinádorové reakce zprostředkované T lymfocyty závisí na zapojení receptoru T lymfocytů hlavním histokompatibilním komplexem/antigenem, jakož i ligace CD28 prostřednictvím B7. Určité nádory, jako například karcinom prsu SMI, byly 40 refraktemí na imunoterapii anti-CTLA—4. A tak díky použití kombinace blokády CTLA-4 a vak-cíny obsahující faktor stimulující granulocytové a makrofágové kolonie exprimovaný buňkami SMI byla pozorována regrese parenterálních SMI nádorů, navzdory neúčinnosti každé jednotlivé léčby použité samotné. Tato kombinační léčba měla za následek dlouhotrvající imunitu na SMI a závisela jak na CD4(+), tak na CD8(+) T lymfocytech. Zjištění svědčí pro to, že blokáda 45 CTLA-4 působí na úrovni buňky prezentující antigen pocházející z hostitele.

Ve spojitosti s diabetem Luhder et al. (J. Exp. Med., 187, 427 až 32, 1998) injikovali anti-CTLA-4 mAb do TCR transgenního myšího modelu diabetů v různých stadiích nemoci. Nalezli, že zapojení CTLA-4 v době, kdy jsou poprvé aktivovány potenciálně diabetogenní T lymfocyty, 50 je klíčový jev, je-li zapojení tolerováno, nastává invaze ostrůvků, ale zůstává po celé měsíce zcela neškodná. Jestliže zapojení tolerováno není, inzulitida je mnohem agresivnější a rychle vzniká diabetes.

Ve spojitosti s imunizací prostřednictvím vakcíny zjistili Horspool et al. (J. Immunol., 160, 2706 55 až 14, 1998), že intaktní anti-CTLA4 mAb, ale ne fragmenty Fab, tlumili primární humorální -4- CZ 303703 B6 odpověď na pCIA/beta gal bez ovlivnění upomínací reakce, což naznačuje, že aktivace CTLA4^ inhibovala produkci Ab, ale ne instruování (,,priming“) T lymfocytů. Blokáda ligandů pro CD2B a CTLA^4, CD80 (B7-1) a CD86 (B7-2), odhalila rozdílnou a nepřekrývající se funkci. Blokáda CD80 při iniciální imunizaci kompletně zrušila primární a sekundární Ab reakci, zatímco blokáda CD86 tlumila odpověď primární, ale ne sekundární. Současná blokáda CD80 + CD86 byla méně účinná v tlumení Ab reakcí, než blokáda každého z nich samotného. Zesílení kostimulace prostřednictvím společné injekce plazmidů exprimujících B7 zvýšilo CTL reakce, ale ne Ab odpovědi, a bez průkazu asymetrie Thl kTh2. Tato zjištění svědčí pro složité a rozdílné úlohy CD28, CTLA-4, CD80 a CD86 při kostimulaci T lymfocytů po vakcinaci nukleovou kyselinou.

Ve spojitosti s rejekcí štěpu zjistili Markess et al. (J. Clin. Invest., 101, 2446 až 55, 1998) v myším modelu rejekce kožního aloštěpu, že přijetí zpočátku záviselo na přítomnosti IFN-gama, CTLA^t, a CD4(+) T lymfocytů. Přidání anti-CTLA-4 nebo anti-IFn-gama mAb do laboratorního protokolu bylo spojeno s okamžitou rejekcí štěpu, zatímco anti-lL—4 mAb neměla žádný účinek.

Ve spojitosti s úlohou CTLA-4 ve vztahu k CD28, Fallarino et al. (J. Exp. Med., 188, 205 až 10, 1998) vytvořili transgenní myši TCR/s deficitem typu 2 aktivujícího rekombiuázu/ sCD28 divokým typem nebo s deficitem CD28, které byly imunizovány nádorem expritnujíeím antigen. Instruované T lymfocyty od obou typů myší produkovaly cytokiny a proliferovaly při reakci na stimulující buňky bez exprese B7. Avšak zatímco odpověď CD28+/+ T lymfocytů zesílena kostimulaci s B7-1, odpověď CD28-/- T lymfocytů byla silně inhibována. Tato inhibice byla zrušena monoklonální protilátkou proti B7—1 nebo CTLA-4. Tedy CTLA—4 mohou účinně inhi-bovat aktivaci T lymfocytů v nepřítomnosti CD28, což indikuje, že antagonismus signálu zprostředkovaného TCR je postačující pro vysvětlení inhibičního účinku CTLA-4. Také Lin et al. (J. Exp. Med., 188, 199 až 204, 1998) studovali rejekci srdečních aloštěpu u myší s deficitem CD28. H-2(q) srdce byla transplantována do myší s alogenním divokým typem nebo s deficitem CD28 (H-2(b)). Rejekce štěpu byla oddálena u myší s deficitem CD28 ve srovnání s myšmi s divokým typem. Ošetření příjemců s divokým typem s CTLA-4 imunoglobulinem (Ig) nebo s anti-B7-1 plus anti-B7-2 mAb významně prodloužilo přežívání aloštěpu. Na rozdíl od toho, ošetření myší s deficitem CD28 s CTLA^t-Ig, anti-B7-l plus anti-B7-2 mAb, nebo blokující anti-CTLA-4 mAb indukovalo akceleraci rejekce aloštěpu. Tato zvýšená rychlost rejekce štěpu byla spojena se závažnější infiltrací mononukleárními buňkami a zvýšenými hladinami transkriptů IFN-gama a 1L-6 v dárcovských srdcích neošetřeného divokého typu a myší s deficitem CD28 ošetřených CTLA^4-Ig- nebo anti-CTLA^4 mAb. Tudíž negativní regulační úloha CTLA^t se šíří za jeho potenciální schopnost zabránit aktivaci CD28 prostřednictvím kompetice o iigand. Dokonce i v nepřítomnosti CD28 má CTLA—4 inhibiční účinek v regulaci rejekce aloštěpu.

Byla také studována další charakterizace exprese CTLA^L Například Alegre et al. (J. Immunol., 157, 4762 až 70, 1996) navrhli, že povrchový CTLA-4 je rychle intemalizován, což může vysvětlit nízké hladiny exprese obecně zjišťované na povrchu buněk. Uzavřeli, že jak CD28, tak 1L-2 mají důležité úlohy v aktivaci exprese CTLA^l. Kromě toho se zdá, že akumulace CTLA-4 na buněčném povrchu je primárně regulována jeho rychlou endocytózou. Také Castan aj. (Immu-nology, 90, 265 až 71, 1997) na základě in šitu imunohistologických analýz exprese CTLA^4 naznačili že germinální centra T lymfocytů, která byla CTLA-4 pozitivní, mohou být důležitá pro imunitní regulaci.

Podle toho ve světle široké a ústřední úlohy, kterou, jak se ukazuje, CTLA-4 má v imunitní reaktivitě, by bylo žádoucí vytvořit protilátky k CTLA-4, které mohou být účinně používány v imunoterapii. Navíc by bylo žádoucí vytvořit protilátky proti CTLA-4, které mohou být používány u chronických nemocí, u kterých je vyžadováno opakované podávání protilátek.

Dokument WO 98/42 752 se týká peptidů včetně peptidů, které se váží v CTLA-4. Autoři toho dokumentu prezentují hypotézu, že by takové peptidy mohly být použity ke ko-stimulaci proliferace T-buněk. -5- CZ 303703 B6

Dokument WO 95/33 770 se vztahuje k izolovaným ligandům (například protilátky anti-CTLA-4), které indukují antigen-specifíckou apoptózu aktivovaných buněk Tak použití takových ligandů pro terapeutické účely.

Dokument WO 96/33 735 se týká způsobu produkce lidských protilátek v transgenickém živočichovi.

Publikace Jakobovits aj. Expert Opinion on Investigational Drugs 7(4): 607 až 614 (1998) se vztahuje k použití xenomyších kmenů upravených metodou genetického inženýrství pro produkci lidských protilátek.

Podstata vynálezu Předmětem vynálezu je monoklonální protilátka, která se váže na antigen 4 cytotoxických T lymfocytů (CTLA 4) nebo její antigen-vázající fragment, kde uvedená protilátka obsahuje variabilní úsek těžkého řetězce s alespoň 85% identitou s variabilním úsekem těžkého řetězce v Sekvenci ID Č. 63 a kde uvedená protilátka obsahuje variabilní úsek lehkého řetězce s alespoň 90% identitou s variabilním úsekem lehkého řetězce v SEKVENCI ID Č. 65., přičemž uvedená protilátka nebo fragment mají následující vlastnosti: (a) váží se k CTLA-4 s afinitou rovnou KD 10 9 M nebo vyšší a (b) inhibují vazbu mezi CTLA-4 a B7-2 s hodnotou ICso rovnou 100 nM nebo nižší. Výhodně uvedená protilátka obsahuje variabilní úsek těžkého řetězce s alespoň 90% identitou s variabilním úsekem těžkého řetězce v SEKVENCI ID Č. 63. Předmětem vynálezu je rovněž farmaceutická kompozice, jejíž podstata spočívá v tom, že obsahuje výše definovanou protilátku nebo fragment a farmaceuticky přijatelný nosič. Předmětem vynálezu je rovněž buněčná linie, která produkuje výše definovanou protilátku nebo fragment. Předmětem vynálezu je rovněž způsob přípravy výše definované protilátky, jehož podstata spočívá v tom, že se kultivuje výše definovaná buněčná linie. Předmětem vynálezu je rovněž izolovaná nukleová kyselina, která kóduje těžký řetězec nebo jeho antigen-vázající fragment a/nebo lehký řetězec nebo jeho antigen-vázající fragment výše definované protilátky nebo fragmentu. Předmětem vynálezu je rovněž hostitelská buňka obsahující výše definovanou izolovanou nukleovou kyselinu. Předmětem vynálezu je rovněž použití výše definované protilátky nebo fragmentu nebo výše definovaná farmaceutická kompozice pro výrobu léčiva pro léčení rakoviny. Předmětem vynálezu je dále použití výše definované protilátky nebo fragmentu nebo výše definované farmaceutické kompozice pro výrobu léčiva pro léčení melanomů. Předmětem vynálezu je konečně použití kombinace obsahující výše definovanou protilátku nebo fragment nebo výše definovanou farmaceutickou kompozici a buňky exprimující faktor stimulující kolonie granulocytů-makrofágů pro výrobu léčiva pro léčení nádorů. -6- CZ 303703 B6 Přehled obrázků na výkresech

Obrázek 1 popisuje řadu nukleotidových a aminokyselinových sekvencí těžkého řetězce a lehkého řetězce kapa (k) imunoglobulinových molekul podle vynálezu: 4.1.1 (obrázek ΙΑ), 4.8.1 (obrázek 1B), 4.14.3 (obrázek 1C), 6.1.1 (obrázek ID), 3.1.1 (obrázek 1E), 4.10.2 (obrázek 1F), 2.1.3 (obrázek 1G), 4.13.1 (obrázek 1H), 11.2.1 (obrázek 11), 11.6.1 (obrázek 1J), 11.7.1 (obrázek 1K), 12.3.1.1 (obrázek 1L) a 12.9.1.1 (obrázek 1M).

Obrázek 2 poskytuje srovnání sekvencí mezi predikovanými aminokyselinovými sekvencemi těžkého řetězce z klonů 4.1.1,4.8.1,4.14.3,6.1.1,3.1.1,4.10.2,4.13.1, 11.2.1, 11.6.1, 11.7.1, 12.3.1.1, a 12.9.1.1 a aminokyselinová sekvence zárodečné linie DP-50 (3-33). Rozdíly v aminokyselinové sekvenci zárodečné linie DP-50 a sekvencí v klonu jsou znázorněny tučně. Obrázek také ukazuje pozici sekvencí CDR1, CDR2 a CDR3, které jsou vystínovány.

Obrázek 3 ukazuje přiřazení sekvencí predikované aminokyselinové sekvence těžkého řetězce klonu 2.1.3 a zárodečné linie DP-6 (4-31). Rozdíly v aminokyselinové sekvenci zárodečné linie DP-65 a sekvencí v klonu jsou znázorněny tučně. Obrázek také ukazuje pozici sekvencí CDRl, CDR2 a CDR3, které jsou podtrženy.

Obrázek 4 ukazuje přiřazení predikované aminokyselinové sekvence lehkého řetězce kapa klonů 4.1.1, 4.8.1, 4.14.3, 6.1.1, 4.10.2 a 4.13.1 a zárodečné linie A27 aminokyselinové sekvence. Rozdíly v aminokyselinové sekvenci zárodečné linie A27 se sekvencí v klonu jsou znázorněny tučně. Obrázek také ukazuje pozici sekvencí CDRl, CDR2 a CDR3 protilátky, které jsou podtrženy. Zjevné delece v úseku CDRl klonů 4.8.1,4.14.3 a 6.1.1 jsou označeny symboly „0“

Obrázek 5 ukazuje přiřazení predikované aminokyselinové sekvence lehkého řetězce kapa klonu 3.1.1, 11.2.1, 11.6.1, a 11.7.1 a zárodečné linie 012. Rozdíly v aminokyselinové sekvenci zárodečné linie 012 a sekvencí v klonu jsou znázorněny tučně. Obrázek také ukazuje pozici sekvencí CDRl, CDR2 aCDR3 protilátky, které jsou podtrženy.

Obrázek 6 ukazuje přiřazení predikované aminokyselinové sekvence lehkého řetězce kapa klonu 2.1.3 a sekvencí zárodečné linie A10/A26. Rozdíly v aminokyselinové sekvenci zárodečné linie A10/A26 a sekvencí v klonu jsou znázorněny tučně. Obrázek také ukazuje pozici sekvencí CDRl, CDR2 a CDR3 protilátky, které jsou podtrženy.

Obrázek 7 ukazuje přiřazení predikované aminokyselinové sekvence lehkého řetězce kapa klonu 12.3.1 a sekvencí zárodečné linie AI7. Rozdíly v aminokyselinové sekvenci zárodečné linie AI7 a sekvencí v klonu jsou znázorněny tučně. Obrázek také ukazuje pozici sekvencí CDRl, CDR2 a CDR3 protilátky, které jsou podtrženy.

Obrázek 8 ukazuje přiřazení predikované aminokyselinové sekvence lehkého řetězce kapa klonu 12.9.1 a zárodečné linie A3/AI9. Rozdíly v aminokyselinové sekvenci zárodečné linie A3/A19 a sekvencí v klonu jsou znázorněny tučně. Obrázek také ukazuje pozici sekvencí CDRl, CDR2 a CDR3 protilátky, které jsou podtrženy.

Obrázek 9 ukazuje souhrn N—koncové aminokyselinové sekvence získaným přímým proteinovým sekvencováním těžkého a lehkého řetězce protilátek.

Obrázek 10 uvádí některé další charakteristiky některých protilátek podle vynálezu. Na obr. 10A jsou shrnuta data týkající se klonů 3.1.1, 4.1.1, 4.8.1, 4.10.2, 4.14.3 a 6.1.1. Data týkající se koncentrace, isoelektrického fokusingu (IEF), SDS-PAGE, vylučovací chromatografie, kapalinové chromatografie/hmotové spektroskopie (LCMS), hmotové spektroskopie (MALD1), N-koncové sekvence lehkého řetězce jsou uvedena. Další detailní údaje týkající se IEF jsou na obr. 10B, data týkající se SDS—PAGA na obr. 10C a SEC protilátky klonu 4.1.1 na obr. 10D. -7- CZ 303703 B6

Obrázek 11 ukazuje expresi B7-1 a B7-2 na buňkách Ráji užitím monoklonálních protilátek (mAb) anti-CDSO-PE a anti-CD86-PE.

Obrázek 12 ukazuje na koncentraci závislé zvýšení produkce IL-2 v testu L lymfoblastů/Raji 5 indukované blokujícími protilátkami anti-CTLA-^4 (BNI3,4.1.1,4.8.1 a 6.1.1).

Obrázek 13 ukazuje na koncentraci závislé zvýšení produkce IFN-γ v testu T lymfoblastů/Raji indukované blokujícími protilátkami anti-CDLA4 (BNI3, 4.1.1, 4.8.1 a 6.1.1) (shodné donorové T-buňky). 10

Obrázek 14 ukazuje průměrné zvýšení produkce IL-2 T-buňkami ze 6 donorů indukovaných blokujícími monoklonálními protilátkami anti-CTLA—4 testu T-buňky blast/Raji.

Obr. 15 ukazuje průměrné zvýšení produkce ÍFN-γ T-buňkami ze 6 donorů indukovaných bloku-15 jícími monoklonálními protilátkami anti-CTLA-4 testu T-buňky blast/Raji.

Obr. 16 ukazuje průměrné zvýšení produkce IL-2 v hPBMC z 5 donorů indukovaných blokujícími monoklonálními protilátkami anti-CTLA—4 testu T-buňky blast/Raji, měřeno 72 hodin po stimulaci SEA. 20

Obrázek 17 ukazuje průměrné zvýšení produkce IL-2 v celé krvi ze 3 donorů indukovaných blokujícími monoklonálními protilátkami anti-CTLA-4 testu T-buňky blast/Raji. měřeno 72 a 96 hodin po stimulaci SEA. 25 Obrázek 18 ukazuje inhibici růstu tumorů s protilátkou anti-myší CTLA^l na modelu myšího fibrosarkomu.

Obrázek 19 ukazuje zvýšení produkce IL-2 indukované protilátkami anti-CTLA4 (4.1.1 a 11.2.1) podle vynálezu v testu T blast/Raji a Superantigen po 72 hodinách (mononukleární buň-30 ky z celé krve a periferní krve ze 6 dárců).

Obrázek 20 ukazuje na dávce závislé zvýšení produkce IL-2 indukované protilátkami anti-CTLA4 (4.1.1 a 11.2.1) podle vynálezu v testu T blast/Raji a Superantigen po 72 hodinách. 35 Obrázek 21 ukazuje na dávce závislé zvýšení produkce IL-2 indukované protilátkami anti-CTLA4 (4.1.1 a 11.2.1) podle vynálezu v testu a Superantigenu po 72 hodinách, kde celá krev byla stimulovaná 100 ng/ml superantigenu.

Obr. 22 ukazuje sérii dalších nukleotidových a aminokyselinových sekvencí následujících řetězců 40 protilátek anti-CTLA-4; těžký řetězec 4.1.1 plné délky (cDNA 22(a), genomická sekvence 22(b), a aminokyselinová sekvence 22(c)), aglykosylovaný těžký řetězec plné 4.1.1 (cDNA 22(d) a aminokyselinová sekvence 22(e)), lehký řetězec 4.1.1 (cDNA 22(f) a aminokyselinová sekvence 22(g)), těžký řetězec 4.8.1 plné délky (cDNA 22(h) a aminokyselinová sekvence 22(i)), lehký řetězec 4.8.1 (cDNA 22(j) a aminokyselinové sekvence 22(k)), těžký řetězec 6.1.1 plné délky 45 (cDNA 22(1) a aminokyselinové sekvence 22(m)), lehký řetězec 6.1.1 (cDNA 22(n) a aminokyselinové sekvence 22(o)), těžký řetězec 11.2.1 plné délky (cDNA 22(p) a aminokyselinová sekvence 22(q)), a lehký řetězec 11.2.1 (cDNA 22(r) a aminokyselinová sekvence 22(s)).

Podrobný popis vynálezu 50 Předkládaný vynález poskytuje plně lidskou monoklonální protilátku proti lidskému CTLA^l. Vynález zejména poskytuje také nukleotidová sekvence kódující aminokyselinové sekvence obsahující těžký a lehký řetězec imunoglobulínových molekul, zejména sekvence odpovídající souvislým sekvencím těžkého a lehkého řetězce zFRl a CDR1 a CDR3 a FR4. Dále vynález 55 poskytuje protilátky mající podobné vazebné vlastnosti jako protilátky a protilátky (nebo jiné -8- CZ 303703 Β6 antagonisty) mající podobné funkce jako protilátky popsané ve vynálezu. Také poskytuje hybri-domy exprimující tyto imunoglobulinové molekuly a také monoklonální protilátky.

Definice

Pokud není definováno jinak, vědecké a technické termíny jsou v předkládané přihlášce užívány v tom smyslu, jak jsou odborníkovi obecně srozumitelné. Pokud ze souvislosti nevyplývá opak, termíny použité v jednotném čísle zahrnují i množné číslo a termíny použité v množném čísle zahrnují i jednotné číslo. Obecně jsou názvosloví a metody použité v této přihlášce v souvislosti s buněčnými a tkáňovými kulturami, molekulární biologií, biochemií proteinů, oligonukleotidů a polynukleotidů a hybridizačním technikami obecně známé a odborníkovi srozumitelné. Pro rekombinantní DNA, syntézu oligonukleotidů, tkáňové kultury a transformace byly užity standardní postupy odborníkovi známé (jako je např. elektroforéza, lipofekce atd.). Enzymatické reakce a purifikační metody se prováděly podle návodů výrobce, nebo obecně známými postupy a nebo jak je popsáno výše. Všechny zmíněné metody se prováděly odborníkovi známým způsobem, jak byly popsány v obecných příručkách, jako je např. Sambrook et al.al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989, nebo ve specifických publikacích, které jsou dále v textu citovány, a tyto citace jsou formou odkazu do přihlášky zahrnuty. Názvosloví použité v přihlášce v souvislosti s laboratorními postupy z oboru analytické chemie, organické syntetické chemie a lékařské a farmaceutické chemie jsou obecně užívané a odborníkovi známé. Pro chemické syntézy, chemické analýzy, přípravu a formulaci farmaceutických přípravků a podávání přípravků pacientům a léčení byly užity standardní postupy odborníkům známé. Následující termíny užívané v přihlášce mají, pokud není specificky uvedeno jinak, následující význam:

Termín „izolovaný polynukleotid44 znamená podle vynálezu polynukleotid genomové DNA, cDNA nebo syntetického původu nebo jakoukoliv jejich kombinaci, který je „izolovaný44 tím, že 1) není spojen ani s celým ani s částí polynukleotidu, ve kterém se „izolovaný polynukleotid44 nalézá v případě, 2) je operativně spojený s polynukleotidem, se kterým není v přírodě spojen, nebo 3) v přírodě se nevyskytuje jako součást další sekvence.

Termín „izolovaný protein44 znamená podle vynálezu protein vzniklý na základě cDNA, rekombinantní RNA nebo syntetickým způsobem nebo jakoukoliv jejich kombinací, který je „izolovaný44 vzhledem k původu nebo vzniku tím, že 1) není spojen s proteiny tak, jak se nachází v přírodě, 2) neobsahuje další proteiny ze stejného zdroje, např. neobsahuje žádné další proteiny z myši, a 3) je exprimován buňkami jiného biologického druhu, nebo 4) nevyskytuje se v přírodě.

Termín „polypeptid44 se užívá v popisu vynálezu jako generický termín a označuje nativní protein, fragmenty nebo analogy polypeptidové sekvence. Tudíž nativní protein, fragmenty nebo analogy jsou „druhy44 polypeptidového „rodu44. Výhodné polypeptidy podle předkládaného vynálezu jsou např. molekuly těžkého řetězce lidského imunoglobulinu a molekuly lehkého řetězce kapa lidského imunoglobulinu uvedené na obr. 1, a také molekuly protilátek vytvořené jejich kombinací, obsahující molekuly těžkého řetězce s molekulami lehkého řetězce, např. lehkého řetězce kapa lidského imunoglobulinu, a také naopak, a také jejich fragmenty a analogy.

Termín „přirozeně se vyskytující44 nebo „vyskytující se v přírodě44 se v popisu vynálezu týká skutečnosti, že příslušný předmět lze nalézt v přírodě. Tak např. polypeptid nebo polynukleotido-vá sekvence, které jsou přítomny v organismu (včetně virů) a které z takového přírodního zdroje mohou být izolovány a nebyly přitom záměrně člověkem modifikovány, ať už v laboratoři nebo jinak, jsou „přirozeně se vyskytující44.

Termín „operativně spojený44 v popisu vynálezu označuje to, že složky jsou v takové pozici, která jim umožňuje zamýšlenou funkci. Kontrolní sekvence operativně spojená škodující sekvencí je -9- CZ 303703 B6 ligována škodující sekvencí takovým způsobem, aby bylo dosaženo exprese kódující sekvence za podmínek vhodných pro funkci kontrolní sekvence.

Termín „kontrolní sekvence44 označuje v popisu vynález polynukleotidovou sekvenci, která je nutní k expresi a obecně k činnosti kódující sekvence, ke které je ligována (připojena). Kontrolní sekvence jsou různé povahy v závislosti na hostitelském organismu: u prokaryotických organismů obsahuje kontrolní sekvence obecně promotor, ribozomální vazebné místo a term i načni sekvenci transkripce, u eukaryotických organismů obsahuje kontrolní sekvence obecně promotor a terminační sekvenci transkripce. Termín „kontrolní sekvence44 zahrnuje jakožto minimum všechny složky, jejichž přítomnost je nezbytná pro expresi a „zpracování44 DNA, přitom může obsahovat ještě další složky, jejichž přítomnost je výhodná, např. vedoucí sekvenci („leader44) nebo partnerskou fúzní sekvenci.

Termín „polynukleotid44 podle předkládaného vynálezu znamená polymemí formu nukleotidů délky nejméně 10 bází, a to buďto ribonukleotidů, nebo deoxyribonukleotidů nebo modifikované formy obou těchto typů nukleotidů. Termín přitom zahrnuje jak jednořetězcové, tak dvouřetězco-vé formy DNA.

Termín „oligonukleotid44 podle vynálezu označuje přirozeně se vyskytující i modifikované nukleotidy navázané oligonukleotidovými vazbami přirozeně se vyskytujícími nebo jinými než přirozeně se vyskytujícími. Oligonukleotidy jsou obecně podmnožinou polynukleotidu a obsahují přibližně 200 bází nebo méně. Výhodné oligonukleotidy obsahují 10 až 60 bází a nejvýhodněji 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 nebo 20 až 40 bází. Oligonukleotidy jsou obvykle jednořetězcové, např. oligonukleotidové sondy, ačkoliv mohou být i dvouřetězcové, např. pro konstrukci mutovaných genů. Oligonukleotidy podle vynálezu jsou buďto „sense44, nebo „antisense44 oligonukleotidy. Termín „přirozeně se vyskytující oligonukleotidy44 označuje jak ribonukleotidy, tak i deoxy-ribonukleotidy. Termín „modifikované oligonukleotidy44 označuje v popisu vynálezu nukleotidy s modifikovanými nebo substituovanými cukernými skupinami a podobně. Termín „oligonukleo-tidové vazby44 označuje oligonukleotidové vazby jako je vazba fosforothioátová, fosforodithioá-tová, fosforoselenoátová, fosfordiselenoátová, fosforoanilothioátová, fosforoaniladátová, fosforoamidátová a další. Viz např. publikace LaPlanche et al. Nucl. Acids Res. 14:9081 (1986); Stec et al. J. Am. Chem. Soc. 106:6077 (1984); Stein et al. Nucl. Acids Res. 16:3209 (1988); Zon et al. Anti-Cancer Drug Design 6:539 (1991); Zon et al. Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, pp. 87 až 108 (F. Eckstein, Ed„ Oxford University Press, Oxford England (1991)); Stec et al. Patent US 5 151 510; Uhlmann and Peyman Chemical Reviews 90:543 (1990), které jsou zahrnuty formou odkazu. Všechny oligonukleotidy mohou být pro detekci označeny, pokud je to třeba.

Termín „selektivně hybridizovať4 znamená v popisu vynálezu detekovatelně a specificky se vázat. Polynukleotidy, oligonukleotidy a jejich fragmenty podle vynálezu selektivně hybridizují s řetězci nukleových kyselin za podmínek hybridizace a promývání, kdy je minimalizováno množství detekovatelně vazby nespecifických nukleových kyselin. Podmínky s vysokou stringen-cí se užívají k dosažení selektivní hybridizace, což je odborníkům známo a bude zde ještě diskutováno. Obecně homologie sekvencí nukleových kyselin mezi polynukleotidy, oligonukleotidy a fragmenty sekvencí nukleových kyselin podle vynálezu a požadovanými nukleovými kyselinami je nejméně 80 % a více, výhodně s rostoucí homologií alespoň 85, 90, 95, 99 a 100 %. Dvě aminokyselinové sekvence jsou homologní, pokud je zde částečná nebo úplná identita mezi jejich sekvencemi. Tak např. 85% homologie znamená, že 85 % aminokyselin je identických, když jsou dvě sekvence přiřazeny („alignmenť4) s dosažením maximální shody („matching44). Mezery (v jedné ze dvou přiřazených sekvencí) jsou povoleny, aby bylo dosaženo maximální shody, výhodné jsou mezery velikosti 5 nebo kratší, nejvýhodnější jsou mezery velikosti dvě nebo kratší. Alternativně a výhodně, dvě proteinové sekvence (nebo dvě polypeptidové sekvence z nich odvozené dlouhé alespoň 30 aminokyselin) jsou homologní, ve smyslu zde užívaného termínu, pokud mají skóre shody přiřazení vyšší než 5 (v jednotkách standardní odchylky) při užití programu ALIGN s mutační datovou maticí a sankcí za mezeru 6 nebo více. Viz Dayhoff, M. O., - 10- CZ 303703 B6 in Atlas of Protein: Sequence and Structure, str. 101 až 110 (Volume 5, National Biomedical Research Foundation (1972)), a Supplement 2 k tomuto dílu, str. 1 až 10. Dvě sekvence nebo jejich části jsou výhodně homologní, když jejich aminokyseliny jsou z 50 % a více identické při dosažení optimální shody přiřazení v programu ALIGN. Termín „odpovídá44 se v popisu vynálezu užívá ve významu, že polynukleotidová sekvence je homologní (tj. identická, nikoliv evolučně příbuzná) s celou nebo částí referenční polynukleotidové sekvence, nebo že polypeptidová sekvence je identická s referenční polypeptidovou sekvencí. Naproti tomu termín „komplementární44 znamená, že komplementární sekvence je homologní k části nebo celé polynukleotidové sekvence, ke které se srovnává. Tak pro ilustraci nukleotidová sekvence „TATAC44 odpovídá referenční sekvenci „TATAC44 a je komplementární k referenční sekvenci „GTATA44. Následující termíny se užívají k popisu vztahů mezi dvěma nebo více polynukleotidovými nebo aminokyselinovými sekvencemi: „referenční sekvence44, „srovnávací okno44, „sekvenční identita44, „procento sekvenční identity44 a „podstatná identita44. „Referenční sekvence44 je definována jako sekvence použitá jako základ pro srovnávání sekvencí, referenční sekvence může být podmnožina větší sekvence, např. segment cDNA plné délky nebo genové sekvence uvedené v seznamu sekvencí, nebo může obsahovat celou cDNA nebo genovou sekvenci. Obecně je referenční sekvence dlouhá alespoň 18 nukleotidů nebo 6 aminokyselin, často 24 nukleotidů nebo 8 aminokyselin, a častěji alespoň 48 nukleotidů nebo 16 aminokyselin. Jelikož v případě dvou polynukleolidů nebo aminokyselinových sekvencí každý/á z nich 1) může obsahovat sekvenci (tj. část úplné polynukleotidové nebo aminokyselinové sekvence), která je pro obě molekuly podobná a 2) dále může obsahovat sekvenci, která je pro obě molekuly odlišná, srovnávání dvou nebo více sekvencí se provádí obvykle pomocí tzv. „srovnávacího okna“ pro identifikaci a srovnání lokálních úseků sekvenční identity/podobnosti. Termín „srovnávací okno44 označuje myšlený segment alespoň 18 souvisle po sobě následujících nukleotidových pozic nebo 6 aminokyselin, kde polynukleotidová sekvence nebo aminokyselinová sekvence může být srovnána s referenční sekvencí alespoň 18 souvisle po sobě jdoucích nukleotidů nebo sekvencí 6 aminokyselin, přičemž úsek polynukleotidové sekvence ve srovnávacím okně může obsahovat adice, delece, substituce apod. (tj. mezery) z 20 % nebo méně ve srovnání s referenční sekvencí (která neobsahuje adice nebo delece) pro dosažení optimální shody přiřazení dvou sekvencí. Optimální přiřazení sekvencí při porovnávání srovnávacích oken může být prováděno algoritmem lokální homologie podle Smith a Waterman Adv. Appl. Math. 2:482 (1981), algoritmem homologního přiřazení podle Needleman and Wunsch J. Mol. Biol. 48:443 (1970), metodou vyhledávání podobnosti podle Pearson and Lipman Proč. Nati. Acad. Sci. (U.S.A.) 85:2444 (1988), počítačovou implementací těchto algoritmů (GAP, BESTFIT, FASTA a TFASTA v programovém balíku Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0 od Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.), nebo v programovém balíku Geneworks nebo MacVector), nebo prohlížením, a nejlepší přiřazení (které vede k nejvyššímu procentu homologie ve srovnávacím okně) získané různými metodami se vybere.

Termín „sekvenční identita44 znamená identitu dvou polynukleotidových nebo aminokyselinových sekvencí (tj. jsou identické na bázi nukleotid za nukleotidem nebo zbytek za zbytkem) ve srovnávacím okně. Termín „procento sekvenční identity44 označuje hodnotu, která se vypočte porovnáním dvou optimálně přiřazených sekvencí ve srovnávacím okně a určením počtu pozic, kde jsou identické báze (např. A, T, C, G, U nebo I) nebo aminokyselinové zbytky v obou sekvencích, čímž se získá počet shodných pozic, a tento počet shodných pozic se dělí celkovým počtem pozic ve srovnávacím okně (tj. velikostí okna) a výsledek se vynásobí 100, čímž se dostane hodnota procenta sekvenční identity. Termín „podstatná identita44 v přihlášce označuje vlastnosti polynukleotidové nebo aminokyselinové sekvence, kdy polynukleotidové nebo aminokyselinová sekvence obsahuje sekvenci, která má alespoň 85% sekvenční identitu, výhodně alespoň 90 až 95% sekvenční identitu, a nej výhodněji a nej obvykleji alespoň 99% sekvenční identitu při srovnání s referenční sekvencí ve srovnávacím okně velikosti alespoň 18 nukleotidů (6 aminokyselin), často velikosti alespoň 24 až 48 nukleotidů (8 až 16 aminokyselin), kdy procento sekvenční identity se vypočítává ze srovnání referenční sekvence se sekvencí, která může obsahovat delece nebo adice představující nejvýše 20 % celkové referenční sekvence ve srovnávacím okně. - 11 - CZ 303703 B6 V popisu vynálezu se po označení 20 esenciálních aminokyselin užívají konvenční zkratky, viz publikace Immunology - A Synthesis (2nd Edition, E. S. Golub and D. R. Gren, Eds., Sinauer Associates, Sunderland, Mass. 20 (1991)), která je vložena formou odkazu, Stereoizomery dvace-5 ti konvenčních aminokyselin (např. D-aminokyseliny), přírodně se nevyskytující aminokyseliny, jako např. α-, α-d i substituované aminokyseliny, N-alkylaminokyseliny, kyselina mléčná a další neobvyklé aminokyseliny mohou být také vhodné složky polypeptidů podle předkládaného vynálezu. K příkladům neobvyklých aminokyselin patří: 4-hydroxyprolin, γ-karboxyglutamát, ε-Ν,Ν,Ν-trimethyllysin, ε-N-acetyl lysin, O-fosfoserin, N-acetylserin, N-formylmethionin, 3-io methylhistidin, 5-hydroxy lysin, σ-N-methylarginin, a další podobné aminokyseliny (např. 4-hydroxyprolin). Při označování polypeptidů v popisu vynálezu je vlevo amino-koncová část a vpravo karboxy-koncová část polypeptidů v souladu s konvencí odborníkovi známou.

Obdobně, pokud není specifikováno jinak, levý konec jednořetězcové polynukleotidové sekvence (5 je 5'-konec a tudíž směr vlevo u dvouřetězcové polynukleotidové sekvence je označován jako 5'-směr. Směr od 5-konce do 3-konce, kterým vzniká RNA transkript je označován jako směr transkripce, úseky DNA řetězce mající stejnou sekvenci jako RNA, ležící 5-směrem od 5'-konce RNA transkriptu jsou označovány jako „upstream“ (tj. proti směru transkripce) sekvence, úseky DNA řetězce mající stejnou sekvenci jako RNA, ležící 3-směrem od 3'-konce RNA trans-20 kriptu jsou označovány jako „downstream“ (tj. po směru transkripce) sekvence. Při aplikaci na polypeptidy termín „podstatná identita14 znamená, že dvě peptidové sekvence, pokud jsou optimálně přiřazeny, jako např. v programu GAP nebo BESTFIt při použití předem nastavených hodnot váhy mezery, sdílejí alespoň 80% sekvenční identitu, výhodně alespoň 90% 25 sekvenční identitu, výhodněji 95% sekvenční identitu a nej výhodněji alespoň 99% sekvenční identitu. Výhodně aminokyselinové zbytky v pozicích, které nejsou identické, se liší konzervativní substitucí aminokyseliny. Konzervativní aminokyselinové substituce jsou vzájemné záměny takových aminokyselin, které mají podobné postranní řetězce, tak např. skupiny aminokyselin s alifatickým postranním řetězcem obsahuje glycin, alanin, valin, leucin a isoleucin, skupina 30 aminokyselin majících alifatický-hydroxylový postranní řetězec obsahuje serin a threonin, skupina aminokyselin s postranním řetězcem obsahujícím amidovou skupinu obsahuje asparagin aglutamin, skupina aminokyselin majících aromatické postranní řetězce obsahuje fenylalanin, tyrosin a tryptofan, skupina aminokyselin majících bazický postranní řetězec obsahuje lysin, arginin a histidin, a skupina aminokyselin majících postranní řetězec obsahující síru obsahuje 35 cystein a methionin. Výhodné skupiny aminokyselin pro konzervativní substituce jsou: valin-leucin-isoleucin, fenylalanin-tyrosin, lysin-arginin, alanin-valin, glutamát-aspartát a asparagin-glutamin.

Jak již bylo diskutováno, menší variace v aminokyselinové sekvenci protilátek nebo imunoglobu-40 línových molekul jsou zahrnuty v předkládaném vynálezu, za předpokladu, že variace udržují alespoň 75%, výhodněji alespoň 80%, 90% nebo 95% a nejvýhodněji 99% sekvenční identitu. Zejména sem patří konzervativní substituce aminokyselin. Konzervativní substituce jsou takové substituce, které se odehrávají v rámci rodiny aminokyselin, které jsou příbuzné svými postranními skupinami. Geneticky kódované aminokyselin se obecně dělí do rodin: (1) kyselé = aspartát, 45 glutamát (2) bazické = lysin, arginin, histidin, (3) nepolární = alanin, valin, leucin, isoleucin, prolin, fenylalanin, methionin, tryptofan, a (4) nenabité polární = glycin, asparagin, glutamin, cystein, serin, threonin, tyrosin. Výhodnější rodiny jsou: serin a threonin tvoří rodinu alifatickou-hydroxylovou, asparagin a glutamin tvoří rodinu obsahující amidovou skupinu, alanin, valin, leucin a isoleucin tvoří alifatickou rodinu, a fenylalanin, tryptofan a tyrosin tvoří aromatickou 50 rodinu. Tak např. je rozumné očekávat, že izolované nahrazení leucinu isoleucinem nebo vali-nem, aspartátu glutamátem, threoninu serinem nebo podobné náhrady aminokyselin strukturně příbuznými aminokyselinami, nebudou mít závažný vliv na vazebné nebo jiné vlastnosti výsledné molekuly, zejména pokud se náhrady nebudou týkat oblasti kostry. Zda záměna aminokyseliny vedla k funkčnímu peptidu lze okamžitě ověřit testováním specifické aktivity polypeptidového - 12- CZ 303703 B6 derivátu. Příslušné testy jsou v této přihlášce podrobně popsány. Fragmenty nebo analogy protilátek nebo imunoglobulinových molekul mohou být odborníkům snadno připraveny. Výhodné amino-konce nebo karboxy-konce fragmentů nebo analogů se vyskytují v blízkosti hranic funkčních domén. Strukturní a funkční domény mohou být identifikovány srovnáním nukleotidové a/nebo aminokyselinové sekvence s daty ve veřejných nebo soukromých databázích sekvenci. Výhodně se užívají počítačové metody k identifikaci sekvenčních motivů nebo predikci proteinových konformačních domén, které se vyskytují u jiných proteinů, jejichž struktura a/nebo funkce je známá. Metody k identifikaci proteinových sekvencí, které se skládají do známých trojrozměrných struktur, jsou odborníkům známy (viz např. Bowie et al. Science 253:164 (1991)). Čili předcházející příklady ukazují, že odborník je schopen rozeznat motivy a strukturní konformace, které lze užít pro definování strukturních a funkčních domén podle předkládaného vynálezu. Výhodné aminokyselinové substituce jsou takové, které: (1) redukují citlivost kproteolýze, (2) redukují citlivost k oxidaci, (3) mění vazebnou afinitu pro vytvářející se proteinové komplexy, (4) mění vazebné afinity a (5) poskytují nebo modifikují jiné fyzikálně-chemické nebo funkční vlastnosti takových analogů. Analogy mohou obsahovat různé muteiny sekvence odlišné od přirozeně se vyskytující peptidové sekvence. Tak např. jednoduchá nebo vícenásobná aminokyselinová substituce (výhodně konzervativní substituce aminokyselin) se může provést v přirozeně sc vyskytující sekvenci (výhodně v části polypeptidu mimo doménu/domény tvořící intermolckulár-ní spojení). Konzervativní aminokyselinové substituce by neměla podstatně změnit strukturní charakteristiky původní (parenterální) sekvence (např. náhrada aminokyseliny by neměla narušit šroubovicovou strukturu parenterální molekuly nebo narušit jiné typy sekundárních struktur charakteristických pro parenterální sekvenci). Příklady v oboru známých sekundárních a terciárních struktur polypeptidů byly popsány např. v publikacích Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton, Ed., W. H. Freeman and Company, New York (1984)), Introduction to Protein Structure (C. Branden and J. Tooze, eds., Garland Publishing, New York, N.Y. (1991)), a Thornton et al. Nátuře 354: 154 (1991), které jsou vloženy formou odkazu.

Termín „polypeptidový fragment" označuje v předkládané přihlášce polypeptid sdelecí amino-konce a/nebo karboxykonce, přičemž zbývající aminokyselinové sekvence je identická s odpovídajícími pozicemi přirozeně se vyskytující sekvence, dedukované např. na základě cDNA plné délky. Fragmenty jsou typicky dlouhé alespoň 5, 6, 8 nebo 10 aminokyselin, výhodně alespoň 14 aminokyselin a nejvýhodněji alespoň 20 aminokyselin, obvykle však alespoň 50 aminokyselin a ještě výhodněji alespoň 70 aminokyselin.

Termín „analog" v popisu vynálezu znamená polypeptid, který obsahuje segment alespoň 25 aminokyselin, který má podstatnou identitu s úsekem dedukované aminokyselinové sekvence a která má alespoň jednu z následujících vlastností: (1) specificky se váže k CTLA-4 za vhodných vazebných podmínek, (2) má schopnost blokovat vazbu CTLA^t s jeho receptorem, nebo (3) má schopnost inhibovat růst buněk exprimujících CTLA—4 in vitro nebo in vivo. Typicky polypeptidové analogy obsahují konzervativní aminokyselinové substituce (nebo adice nebo delece) vzhledem k přirozeně se vyskytující sekvenci. Analogy jsou typicky dlouhé alespoň 20 aminokyselin, výhodně alespoň 50 aminokyselin nebo delší, a často jsou dlouhé stejně jako přirozeně se vyskytující polypeptid plné délky.

Peptidové analogy jsou obecně ve farmaceutickém průmyslu užívány jako nepeptidové léčiva s vlastnostmi analogickými s původním (templátovým) peptidem. Tyto typy nepeptidových sloučenin se nazývají „peptidová mimetika" nebo také „peptidomimetika" (viz Fauchere, J. Adw Drug Res. 15:29 (1986); Veber and Freidinger TINS p.392 (1985); and Evans et al., J. Med. Chem. 30:1229 (1987)). Takové sloučeniny jsou obvykle vyvíjeny pomocí počítačového modelování molekul. Peptidomimetika strukturně podobná terapeuticky užitečným peptidům se mohou užít pro dosažení ekvivalentního terapeutického nebo profylaktického účinku. Obecně jsou peptidomimetika strukturně podobná „paradigmatickému" peptidu (tj. polypeptidu, který má požadované biochemické vlastnosti nebo farmakologickou aktivitu), jako jsou např. protilátky, ale má jednu nebo více peptidových vazeb nahrazených vazbou vybranou ze skupiny obsahující: - 13- CZ 303703 B6 -CH2NH -CH2S- -CH2-CH2- -CH=CH-(c/s a /raras), -COCH2- -GH(OH)CH2-a -CH2SO-, a sice metodami, které jsou odborníkům známy. Systematická substituce jedné nebo více aminokyselin kanonickou sekvencí D-aminokyselin stejného typu (tj. např. D-lysin místo L-lysinu) se může využít k přípravě stabilnějších peptidů. Kromě toho „nepřirozené*1 peptidy obsahující kanonickou sekvenci nebo v podstatě identickou variaci mohou být připraveny metodami, které jsou odborníkům známy (viz např. Rizo a Gierasch Ann. Rev. Biochem. 61:387 (1992)), např. přidáním vnitřních cysteinových zbytků schopných tvořit intramolekulámí disulfi-dické můstky, které cyklizují peptid.

Termíny „protilátka" nebo „protilátkový peptid" se týkají intaktní protilátky nebo jejího vazebného fragmentu, který kompetuje s intaktní protilátkou o specifickou vazbu. Vazebné fragmenty se připravují technikami rekombinantní DNA nebo enzymatickým nebo chemickým štěpením intaktních protilátek. K vazebným fragmentům patří fragmenty Fab, Fab', F(ab')2, Fv a jednoře-tězcové protilátky. Protilátky jiné než „bispecifické" nebo „bifunkční" jsou takové, které mají všechna svá vazebná místa identická. Protilátka podstatně inhibuje adhezi receptoru na „proti-receptor", když přístup protilátky snižuje množství receptoru vázaného na „protireceptor" alespoň o 20, 40, 60 nebo 80 %, obvykle alespoň o více než 85 % (měřeno kompetitivním vazebným testem in vitro).

Termín „epitop" označuje jakoukoliv proteinovou determinantu schopnou specificky se vázat na imunoglobulin nebo receptor T-buňky. Epitopové determinanty jsou obvykle tvořeny chemicky aktivním povrchovým seskupením molekul jako jsou aminokyseliny nebo cukerné postranní řetězce a obvykle mají specifické trojrozměrné strukturní vlastnosti a také specifické vlastnosti pokud jde o náboj. Protilátka se specificky váže na antigen, když disociační konstanta je menší nebo rovna 1 μΜ, výhodně menší nebo rovna 100 nM a nejvýhodněji je menší nebo rovna 10 nM.

Termín „činidlo" nebo „agens" označuje v přihlášce chemickou sloučeninu, směs chemických sloučenin, biologickou makromolekulu nebo extrakt připravený z biologických materiálů.

Termín „značka" a/nebo „značený" v popisu vynálezu znamená inkorporaci detekovatelného markéru, tj. např. vložení radioaktivně značené aminokyseliny nebo navázání biotinylových skupin k polypeptidu, které pak mohou být detekovány značeným avidinem (tj. streptavidinem obsahující fluorescenční markér nebo enzymatickou aktivitu, které mohou být detekovány optickými nebo kolorimetrickými metodami). Mohou být použity různé metody značení polypeptidů a glykoproteinů, které jsou odborníkům známé. K příkladům značek pro polypeptidy patří, aniž by výčet byl omezující, následující: radioisotopy nebo radionúklidy (např. 3H, 14C, l5N, 35S, 90Y, 99Tc, Inln, n\ 1311), fluorescenční značky (např. FITC, rhodamin, lanthanidfosfory), enzymatické značky (např. křenová peroxidáza, β-galaktosidáza, luciferáza, alkalická fosfatáza), chemi-luminiscenční značky, biotinylové skupiny, predeterminované polypeptidové epitopy rozpoznávané sekundární reportérovou molekulou (např. párové sekvence leucinového zipu, vazebná místa pro sekundární protilátku, domény vázající kov, epitopové značky). V některých provedeních vynálezu jsou značky navázány prostřednictvím oddělovacího ramínka (spaceru) různé délky, aby se redukovaly potenciální sterické zábrany.

Termíny „farmaceutické činidlo" nebo „farmaceutický přípravek" nebo „léčivo" se v popisu vynálezu užívají k označení chemických sloučenin, které jsou schopné vyvolat požadovaný terapeutický účinek, které jsou správně podávány pacientovi. Další chemické termíny jsou v předkládané přihlášce užívány ve smyslu, který je obvyklý a odborníkům známý, např. jak je uvedeno ve slovníku The McGraw-Hill Dictionaiy of Chemical Terms (Parker, S., Ed„ McGraw-Hill, San Francisco (1985)).

Termín „antineoplázické činidlo" označuje činidlo, které má takové funkční vlastnosti, že inhibuje vývoj nebo progresi neoplázií u člověka, zejména maligních (rakovinných) lézí, jako je např. - 14- CZ 303703 B6 karcinom, sarkom, lymfom nebo leukémie. Častou vlastností antineoplázického činidla je inhi-bice metastáz. „V podstatě čistým znamená v předkládané přihlášce, že předmětný druh je převládající přítomný 5 druh (tj. na molámí úrovni je hojnější než jakýkoliv jiný druh přítomný ve sloučenině), výhodně „v podstatě čistá“ frakce je přípravek, kde předmětný druh je zastoupen alespoň z 50 % (na molárním základě) mezi všemi přítomnými makromolekulami. Obecně v podstatě čistý přípravek obsahuje více než 80 % všech druhů makromolekul přítomných v přípravku, výhodněji více než 85, 90, 95 a 99 %. Nejvýhodněji je předmětný druh purifikován do nezbytné homogenity (kon-io venčními metodami nelze detekovat kontaminující druhy molekul), přičemž přípravek je v podstatě tvořen jediným druhem makromolekuly.

Struktura protilátky 15 Základní strukturní jednotka protilátky je, jak je známo, tvořena tetramerem. Každý tetramer je složen ze dvou identických dvojic polypeptidových řetězců, přičemž každý pár obsahuje jeden „lehký“ (přibližně 25 kDa) a jeden „těžký“ (přibližně 50 až 70 kDa) řetězec. Amino-koncová část každého řetězce obsahuje variabilní úsek složený přibližně ze i 00 až 110 nebo i více aminokyselin, primárně zodpovědný za rozpoznání anligenu. Karboxy-koncová část každého řetězce 20 definuje konstantní úsek primárně zodpovědný za efektorové funkce. Lidské lehké řetězce jsou klasifikovány jako kapa a lambda lehké řetězce. Lidské těžké řetězce jsou klasifikovány jako mí (μ), delta, gama, alfa a epsilon a definují isotyp protilátky označovaný jako IgM, IgD, IgG, IgA, a IgE, v uvedeném pořadí. Uvnitř těžkého a lehkého řetězce jsou variabilní a konstantní úsek spojeny úsekem „J“ velikosti 12 nebo více aminokyselin, přičemž těžký řetězec obsahuje navíc úsek 25 „D“ velikosti 10 a více aminokyselin (pro obecný přehled viz publikace Fundamentu! Immunolo- gy Ch. 7 (Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y. (1989)), která je celá zahrnuta formou odkazu. Variabilní úseky každé dvojice těžký/lehký řetězec vytvářejí vazebné místo protilátky.

Takže intaktní IgG má dvě vazebná místa. Až na bifunkční nebo bispecifické protilátky, tato 30 vazebná místa jsou shodná. Všechny řetězce mají stejnou obecnou strukturu relativně konzervativního úseku kostry (FR) spojeného třemi hypervariabilními úseky, které se nazývají úseky determinující komplementaritu, zkráceně CDR. Úseky CDR ze dvou řetězců z každého páru jsou spojeny úsekem kostry, což 35 umožňuje vazbu na specifický epitop. Ve směru od N-konce k C-konci, těžký a lehký řetězec obsahují domény FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 a FR4. Přiřazení aminokyselin ke každé doméně je v souladu s definicí podle Kabata: Seguences of Proteins of Immunological interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 and 1991)), nebo publikacemi Chothia & Lesk J. Mol Biol 196:901 až 917 (1987), Chothia et al. Nátuře 342:878 až 883 (1989). 40

Bispecifická nebo bifunkční protilátka je umělá hybridní protilátka obsahující dva různé páry těžký/lehký řetězec a dvě odlišná vazebná místa. Bispecifické protilátky mohou být připraveny řadou metod, např. fúzí hybridomů nebo spojením fragmentů Fab' (viz Songsivilai & Lachmann Clin. Exp. Immunol. 79: 315 až 321 (1990), Kostelny et al. J. Jmmunol 148:1547 1553 (1992)). 45 Kromě toho bispecifické protilátky mohou být tvořeny jako tzv. „diabodies“ (Hollinger et al. „'Diabodies': smáli bivalent and bispecific antibody fragments“ PNAS USA 90:6444 až 6448 (1993)) nebo „Janusiny“ (Traunecker et al. „Bispecific single chain molecules (Janusins) target cytotoxic lymphocytes on HIV infected cel!s“ EMBOJ 10:3655 až 3659 (1991), Traunecker et al. „Janusin: new molecular design for bispecific reagents“ Int J Cancer Suppll 7:51 až 52 (1992)). 50 Produkce bispecifických protilátek je proces relativně náročný na práci ve srovnání s produkcí konvenčních protilátek a výtěžky i stupeň čistoty, kterých se dosahuje, jsou obvykle nižší pro bispecifické protilátky. Bispecifické protilátky neexistují ve formě fragmentů majících jedno vazebné místo (jako jsou např. fragmenty Fab, Fab' a Fv). - 15- CZ 303703 B6

Lidské protilátky a humanizace protilátek Při použití lidských protilátek nedochází k některým problémům, které jsou spojeny s protilátkami, které obsahují variabilní a/nebo konstantní úseky z protilátek myši nebo potkana. Přítomnost proteinů pocházejících z myši nebo potkana vede ktomu, že se zvyšuje clearance a protilátka může vyvolat imunitní reakci u pacienta. Aby se zabránilo užívání protilátek pocházejících z myši nebo potkana, bylo navrženo vyvinout humanizované protilátky nebo připravit plně lidské protilátky tím, že se vnesou funkce lidských protilátek do hlodavce, který pak bude produkovat protilátky mající plně lidské sekvence.

Lidské protilátky

Schopnost klonování a rekonstrukce lidských lokusů velikosti megabází v YAC (umělých kvasinkových chromozómech a jejich vnesení do myších zárodečných buněk poskytují velmi účinné metody ke zjištění funkčních komponent velmi velkých nebo jen hrubě zmapovaných lokusů a k vytvoření užitečných modelů lidského nemocí. Kromě toho užití takové technologie k nahrazení myších lokusů jejich lidskými ekvivalenty poskytuje jedinečné informace o expresi a regulaci produktů lidských genů v průběhu vývoje, jejich komunikaci s jinými systémy a jejich účast v indukci a rozvoj nemoci. Důležitou praktickou aplikací takové strategie je „humanizace“ myšího humorálního imunitního systému. Vnesení lidských imunoglobulinových (Ig) lokusů do myši, jejíž endogenní Ig geny byly inaktivovány, nabízí možnost zkoumat mechanismus programované exprese a sestavování protilátek a také jejich roli ve vývoji B lymfocytů. Kromě toho tato strategie poskytuje ideální zdroj pro produkci monoklonálních plně lidských protilátek jakožto významný milník na cestě ke splnění příslibu protilátkových terapií lidských nemocí. Očekává se, že plně lidské protilátky minimalizují imunitní a alergické reakce, které jsou vlastní myším protilátkám nebo protilátkám z nich derivatizovaných, a tudíž zvýší bezpečnost a účinnost podávání protilátek. Podávání plně lidských protilátek bude zásadně výhodné pro léčení chronických a rekurentních nemocí, jako jsou zánětlivá a autoimunitní onemocnění a rakovina, kdy je třeba opakované podávání protilátek.

Jeden z přístupů k dosažení tohoto cíle je metodami genového inženýrství upravit myší kmeny defícientní v tvorbě protilátek pomocí velkých fragmentů lidských Ig lokusů s očekáváním, že takto modifikované myši budou tvořit velký repertoár lidských protilátek, aniž by tvořily myší protilátky. Velké fragmenty lidské Ig zachovají velkou genovou diverzitu a také správnou regulaci tvorby a exprese protilátek. Vzhledem k využití mechanismů myšího organismu pro diverzifikaci a selekci protilátek a nepřítomnosti imunologické tolerance k lidským proteinům, reprodukovaný repertoár lidských protilátek v těchto myších kmenech by mělo vést k vysokoafínitním protilátkám proti jakémukoliv požadovanému antigenu, včetně lidských antigenů. Užitím technologie hybridomů mohou být snadno připravovány a selektovány antigenně specifické monoklo-nální protilátky.

Tato obecná strategie byla poprvé demonstrována ve spojení s vytvořením prvních kmenů myší XenoMouse™, jak bylo publikováno v r. 1994 (viz Green et al. Nátuře Genetics 7:13 až 21 (1994)). Kmeny XenoMouse™ byly geneticky manipulovány pomocí umělých kvasinkových chromozómů (YAC) obsahujících fragmenty velikosti 245 a 190 kb se zárodečnou konfigurací lokusů pro lidský těžký řetězec, lidský lehký řetězec kapa, obsahující jádro sekvencí konstantního a variabilního úseku. YAC obsahující lidské Ig se ukázaly jako kompatibilní s myším systémem jak pro nové uspořádání, tak expresi protilátek a byly vhodné pro substituci inaktivovaných myších Ig genů. To bylo prokázáno jejich schopností indukovat vývoj B-lymfocytů, vytvářet dospělý repertoár plně lidských protilátek a vytvářet antigenně specifické lidské mní protilátky. Tyto výsledky také vedly k předpokladu, že vnesení velkých částí lidských Ig lokusů obsahujících velký počet V genů, další regulační elementy a lidské konstantní úseky, by mohlo v podstatě opa- - 16- CZ 303703 B6 kovat plný repertoár, který je charakteristický pro lidskou imunitní humorální reakci na infekci a imunizaci. Práce Greena et al. byla nedávno rozšířena o vnesení více než 80 % repertoáru lidských protilátek prostřednictvím fragmentů YAC velikosti megabází obsahujících zárodečnou konfiguraci lokusů pro lidský těžký řetězec a lidský lehký řetězec kapa do myší XenoMouse M 5 (viz např. Mendez et al. Nátuře Genetics 15:146 až 156 (1997), Green a Jakobits J. Exp. Med 188:483 až 495 (1998), mezinárodní patentová přihláška WO 1998/24893 podaná 3.12.1997, vložená formou odkazu).

Tento experimentální přístup byl dále diskutován a popsán v patentech US 5,939, 598 s prioritou io 30.6.1998; US 6 673 986 s prioritou 15.3.1993; US 6 657 103 s prioritou 4,9.1997; US 6 114 598 s prioritou 5.6.1995; US 6 075 181 s prioritou 7.6.1995; US 6 162 963 s prioritou 5.6.1995; US 6 150 584 s prioritou 2.10.1996; jakož i v mezinárodní patentové přihlášce WO 1998/24 893 s prioritou 3.12.1997. Vit také publikace Mendes a j. Nátuře Genetics 15:146 až 156 (1997) a Green a Jakobovits J. Exp. Med. 188:483 až 495 (1998). Viz dále také Evropský patent 15 EP 0 463 151 B 1, udělení zveřejněno 12.6. 1996, mezinárodní patentová přihláška WO 94/02 602, publikovaná 3.2.1994, mezinárodní patentová přihláška WO 96/34 096, publikovaná 31.10.1996, a mezinárodní patentová přihláška WO 98/24 893, publikovaná 11.6.1998. Vynálezy popsané ve výše citovaných patentech, přihláškách a publikacích jsou v úplnosti formou odkazu zahrnuly v předkládané přihlášce. 20

Alternativní přístup použitý dalšími, např. firmou GenPharm International, lne., využil tzv. „minilokusů“. Při této metodě je exogenní Ig lokus napodoben vložením kousků (jednotlivých genů) z lg lokusů. Takže se vytvoří konstrukt, obsahující jeden nebo více VH genů, jeden nebo více Dh genů, jeden nebo více JH genů, konstantní úsek μ a druhý konstantní úsek (výhodně kon-25 stantní úsek gama), vhodný pro inzerci do zvířete. Takové metody byly popsány v patentu US 5 545 807, Surani et al., a US 5 545 806, US 5 625 825, US 5 625 126, US 5 633 425, US 5 661 016, US 5 770 429, US 5 789 650, a US 5 814 318, všechny Lonberg a Kay, a US 5 591 669, Krimpenfort a Berns, US 5 612 205, US 5 721 367 a US 5 789 215, Berns et al., a US 5 643 763 Choi a Dunn, a patenty US 5 569 825 s prioritou 17.12.1991; US 5 789 650 30 s prioritou 18.3.1992; US 5 545 806 s prioritou 16.12.1992; US 5 661 016 s prioritou 26.4.1993; a US 5 814319 s prioritou 22.7.1993; jejichž úplné popisy jsou zahrnuty formou odkazu. Viz také Evropský patent EP 0 546 073 B 1, mezinárodní patentové přihlášky WO 92/03 918, WO 92/22 645, WO 92/22 647, WO 92/22 670, WO 93/12 227, WO 94/00 569, WO 94/25 585, WO 96/14 436, WO 97/13 852, a WO 98/24 884, jejichž úplné popisy jsou také zahrnuty formou 3? odkazu. Viz také publikace Taylor et al., 1992, Chen et al., 1993, Tuaillon et al., 1993, Choi et al., 1993, Lonberg et al., (1994), Taylor et al., (1994), a Tuaillon et al., (1995) a Fishwild et al., (1996), které jsou také plně zahrnuty formou odkazu. Původci Surani et al., ve výše citovaném vynálezu přihlašovatele Medical Research Counsel 40 (,,MRC“), připravily transgenní myši mající Ig lokus metodou minolokusů. Původci vynálezů fir my GenPharm International Lonberg a Kay navrhli inaktivaci endogenního myšího Ig lokusu spojenou s podstatnou duplikací práce Surani et al. Výhodou metody minilokusů je především rychlost, s jakou mohou být konstrukty obsahující 45 úseky lg lokusů vytvářeny a vkládány do zvířat. Avšak současně nevýhodou metody minilokusů je to, že vnesením malého počtu V, D, a J genů se vnese nedostatečná diverzita. A skutečně publikované práce potvrzují tyto obavy. Vývoj B—lymfocytů a tvorba protilátek u zvířat připravených metodou minilokusů jsou nedostatečné. Tudíž výzkum, který byl základem pro předkládaný vynález, byl zaměřen na vnesení velkých úseků Ig lokusů, aby bylo dosaženo velké diverzity 50 a aby byl rekonstituován celý imunitní repertoár.

Lidská anti—myší protilátková reakce (HAMA) vedla průmysl k přípravě chimérických nebo jiným způsobem humanizovaných protilátek. Jelikož chimérické protilátky mají lidský konstantní úsek a myší variabilní úsek, očekává se, že bude pozorována určitá lidská antichimérická proti-55 látková reakce (HACA), zejména při chronickém nebo mnohodávkovém použití protilátky. - 17- CZ 303703 B6

Je tudíž potřebné poskytnout plně lidské protilátky proti CTLA—4, aby bylo možné odstranit obavy a také ovlivnit HAMA nebo HACA reakce. 5 Humanizace protilátek a metody displeje

Jak bylo již diskutováno výše ve spojitosti s tvorbou lidských protilátek, je výhodné připravovat protilátky se sníženou imunogenicitou. Toho lze do jisté míry dosáhnout metodami humanizace a displeje užitím vhodných knihoven. Je známo, že myší protilátky nebo protilátky z jiných druhů ío mohou být humanizovány nebo privatizovány metodami, které jsou v oboru dobře známy, viz např. Winter a Harris Immunol Today 14:43 až 46 (1993) a Wright et al. Crit. Reviews in Immu-nol. 12125 až 168 (1992). Požadované protilátky lze připravit metodami rekombinantní DNA substitucí domén CH1, CH2, CH3, kloubové domény a/nebo domény kostry odpovídajícími lidskými doménami (viz WO 92/02 190 a patenty US 5 530 101, US 5 585 089, US 5 693 761, 15 US 5 693 792, US 5 714 350, a US 5 777 085). Také použití Ig cDNA pro konstrukci chimérických Ig genů je odborníkům známo (viz např. Liu et al. P.N.A.S. 84:3439 (1987) a J. Immunol. 139:3521 (1987)). mRNA se izoluje zhybridomů nebo jiných buněk produkujících protilátku a užije se pro přípravu cDNA. Požadovaná cDNA se pak amplifikuje např. polymerá-zovou řetězovou reakcí (PCR) užitím specifických primerů (viz patenty US 4 683 195 20 a US 4 683 202). Alternativně se připraví knihovna a provede se její screening, čímž se izoluje požadovaná sekvence. DNA sekvence kódující variabilní úsek protilátky se pak fúzuje se sekvencí lidskou konstantní sekvencí. Sekvence lidských konstantních úseků lze najít v publikaci Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, N.I.H. publication no. 91-3242. Lidské geny C úseků jsou okamžitě k dispozici ze známých klonů. Výběr isotypů se řídí požado-25 vánými efektorovými funkcemi, jako je např. fixace komplementu, nebo aktivita v buněčné cytotoxicitě závislé na protilátkách. Výhodné isotypy jsou lgGl, lgG2, IgG3 a IgG4. Zvláště výhodné isotypy protilátek podle předkládaného vynálezu jsou IgG2 a IgG4. Mohou být užity oba typy konstantních úseků lidského lehkého řetězce kapa i lambda. Chimérické humanizované protilátky se pak exprimují obvyklým způsobem. 30

Protilátkové fragmenty jako např. Fv, F(ab')2 a Fab se připraví štěpením intaktních proteinů, např. proteázami nebo chemicky. Alternativně se připraví zkrácené geny. Tak např. chimérický gen kódující část fragmentu F(ab')2 by zahrnoval sekvence DNA kódující doménu CH1 a kloubový úsek H řetězce, pak by následoval translační stop-kodon, aby vznikla zkrácená molekula. 35 V jedné metodě se užijí kanonické sekvence kódující J úseky těžkého a lehkého řetězce pro návrh sekvencí oligonukleotidových primerů, které se užijí pro vnesení vhodných restrikčních míst do J úseků pro následné spojení segmentů V úseku se segmenty lidského C úseku. cDNA C úseku může být modifikována místně cílenou mutagenezí, aby se umístila restrikční místa do analogic-40 kých pozic v lidské sekvenci. K expresním vektorům patří plazmidy, retroviiy, kosmidy, YAC, episomy odvozené z EBV, atd. Vhodným vektorem je takový, který kóduje funkčně kompletní CH nebo CL sekvenci lidského imunoglobulinu, s vhodně vloženými restrikčními místy, takže jakákoliv sekvence VH nebo VL 45 může být snadno vložena a exprimována. V takových vektorech dochází k sestřihu zpravidla mezi donorovým sestřihovým místem ve vloženém J úseku a akceptorovým sestřihovým místem, které předchází lidský C úsek, a také v sestřihových úsecích, které se vyskytují v lidských CH exonech. Polyadenylace a terminace transkripce se uskutečňuje v přirozených chromozómových místech směrem „downstream“ od kódujícího úseku. Výsledná chimérická protilátka se může 50 spojit s jakýmkoliv silným promotorem, včetně promotorů jako je retrovirový LTR, např. časný promotor SV-40 (Okayama et al. Mol. Cell. Bio. 3:280 (1983)), LTR viru Rousova sarkomu (Gorman et al. P.N.A.S, 79:6777 (1982)), a LTR Moloneyho myšího leukemického viru (Gros-schedl et al. Cell 41:885 (1985)), nativní promotory Ig apod. - 18- CZ 303703 B6

Kromě toho lidské protilátky nebo protilátky z jiných biologických druhů mohou být připraveny metodami typu displeje, např. displeje na fágu, retroviru, ribozomu, apod., což jsou metody odborníkovi známé, a výsledné molekuly se podrobí dodatečné maturaci (zrání), jako je např. afínitní maturace, které jsou v oboru známy (viz např. afinitní maturace, které jsou v oboru zná-5 my (viz např. Wright a Harris, viz výše, Hanes a Plucthau PNAS USA 94:4937 až 4942 (1997) (ribosomální display), Parmley a Smith Gene 73:305 až 318 (1988) (fágový displej), Scott TIBS 17:241 až 245 (1992), Cwirla et al. PNAS USA 87:6378 až 6382 (1990), Russel et al. Nucl. Acids Research 21:1081 až 1085 (1993), Hoganboom et al. Immunol. Reviews 130:43 až 68 (1992), Chiswell a McCafferty TIBTECH 10:80 až 84 (1992), a patent US 5 733 743. 10

Pokud se uvedené metody displeje užijí k produkci protilátek, které nejsou lidské, takové protilátky se pak mohou humanizovat, jak bylo již výše popsáno. Užitím těchto postupů lze připravit protilátky k buňkám produkujícím CTLA—4, samotnému is CTLA^t, formám CTLA^l epitopů nebo peptidů a jejich expresním knihovnám (viz např. patent US 5 703 057), které se pak mohou podrobit screeningu na aktivity výše popsané.

Další kritéria pro proti látková léčiva 20 Obecně řečeno není žádoucí usmrtit buňky exprimující CTLA-4. Spíše je potřebné jednoduše inhibovat vazbu CTLA-4 s ligandy, aby se zmírnila ínaktivace T-Iymfocytů. Jeden z hlavních mechanismů, kletým protilátky usmrcujt buňky, je fixace komplementu a účast na CDC. Konstantní úsek protilátky hraje důležitou roli ve schopnosti protilátky fixovat komplement a podílet se na CDC. Takže obecně se vybere isotyp protilátky, který buďto umožňuje fixaci komplemen-25 tu, nebo ne. V předkládaném vynálezu není výhodné, jak již bylo zmíněno výše, užít takové protilátky, které vedou k usmrcení buněk. Existují četné isotypy protilátek, které jsou schopné fixovat komplement a CDC, patří k nim např. následující protilátky: myší IgM, myší ígG2a, myší IgG2b, myší IgG3, lidská IgM, lidská IgGl a lidská lgG3. Nepatří sem však např. isotypy lidské IgG2 a lgG4. 30

Protilátky, které se připraví, nemusejí mít na počátku zvláštní požadovaný isotyp, ale mohou to být protilátky v podstatě jakéhokoliv isotypu a pak je isotyp „přepnut44 užitím metod, které jsou odborníkovi známy. K takovým metodám patří např. metody přímé rekombinace (viz např. patent US 4 816 397), metody buněčné fúze (viz například patent US 5 916 771). 35 Při metodě buněčných fúzí se připraví myelomová buněčná linie nebo jiná linie, která obsahuje těžký řetězec požadovaného isotypu a další myelomová buněčná linie nebo jiná linie, která obsahuje lehký řetězec. Tyto buňky jsou pak fúzovány a výsledná buněčná linie exprimující intaktní protilátku je izolována. 40

Jako příklad uvádíme, že většina CTLA-4 protilátek diskutovaných v předložené přihlášce jsou lidské anti-CTLA^t IgG2 protilátky. Jelikož tyto protilátky mají požadovanou vazbu k molekule CTLA-4, kterákoliv z nich může být snadno isotypově „přepnuta44 a vytvořit např. lidský isotyp IgG4, přičemž si uchová stejný variabilní úsek (ktetý definuje protilátkovou specificitu a také 45 z části afinitu).

Tudíž se připraví kandidátní protilátky, které splňují „strukturní44 požadavky jak byly diskutovány výše, a které jsou vybaveny alespoň některými dalšími „funkčními44 vlastnostmi nutnými pro přepnutí isotypu. 50 Návrhy a tvorba dalších léčiv

Na základě aktivity protilátek k CTLA-4 popsaných a charakterizovaných zde lze v souladu s vynálezem snadno navrhovat další léčiva, včetně dalších protilátek, antagonistů nebo chemic-55 kých sloučenin jiných než jsou protilátky. K takovým formám léčiv patří např. protilátky mající -19- CZ 303703 B6 podobnou vazebnou aktivitu nebo funkci, pokročilá proti látková léčiva, jako jsou např. bispeci-fické protilátky, imunotoxiny a radioaktivně značená léčiva, tvorba peptidových léčiv, genové terapie, „intrabodies44, antisense léčiva a malé molekuly. Kromě toho, jak již bylo diskutováno výše, efektorové funkce protilátek podle vynálezu mohou být změněny „přepnutím44 isotypu na IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgD, IgA, IgA nebo IgM pro různá terapeutická využití.

Ve spojení s přípravou pokročilých proti látkových léčiv, kde je požadovanou vlastností fixace komplementu, je možné závislost usmrcení buněk na komplementu obejít, tím, že se užijí bispe-cifické protilátky, imunotoxiny nebo radioaktivní značky.

Mohou být připraveny takové bispecifické protilátky, které obsahují (I) dvě protilátky, kdy jedna má specificitu k CTLA-4 a druhá protilátka má specificitu k druhé molekule, které jsou společně konjugovány, (II) jednu protilátku, která má jeden řetězec specifický pro CTLA-4 a druhý řetězec specifický pro druhou molekulu, nebo (III) jednořetězcovou protilátku, která má specificitu k CTLA-4 a k druhé molekule. Takové bispecifické protilátky mohou být připraveny metodami, které jsou odborníkům známy, pro (I) a (II) viz např. Fanger et al. ImmimoL Methods 4:72 až 81 (1994) a Wright a Harris, cit. výše, pro (III) viz např. Traunecker et al. Int. J. Cancer (Suppi) 7:51 až 52 (1992).

Kromě toho mohou být připraveny i tzv. „kappabodies44 (111 et al. „Design arid construction of a hybrid immunoglobulin domain with properties of both heavy and light chain variable regions44 Protein Eng 10:949 až 57 (1997)), „minibodies44 (Martin et al. „The affinity-selection of a minobody polypeptide inhibitor of human interleukin-6“ EMBO J 13:5303 až 9 (1994)), „diabodies44 (Hollinger et al. „'Diabodies': smáli bivalent and bispecific antibody fragments44 PNAS USA 90:6444 až 6448 (1993)), nebo „Janusiny44 (Traunecker et al. „Bispecific single chain molecules (Janusins) target cytotoxic lymphocytes on HIV infected cells44 EMBO J 10:3655 až 3659 (1991) a Traunecker et al. „Janusin: new molecular design for bispecific reagents44 Int J Cancer Suppi 7:51 až 52 (1992)).

Pokud jde o imunotoxiny, protilátky mohou být modifikovány tak, aby působily jako imunotoxiny, a sice metodami, které jsou odborníkům známy. Viz např. Vitetta Immunol Today 14:252 (1993) a také patent US 5 194 594.

Pokud jde o přípravu radioaktivně značených protilátek, takto modifikované protilátky lze snadno připravit metodami, které jsou odborníkům známy. Viz např. Junghans et al., Cancer Chemo-iherapy and Biotherapy 655 až 686 (2d edition, Chafner and Longo, eds., Lippincott Raven (1996)), patenty US 4 681 581, US 4 735 210, US 5 101 827, US 5 102 990 (RE 35,500), US 5 648 471 a US 5 697 902. Každý z imunotoxinů nebo radioaktivně značených molekul pravděpodobně povede k usmrcení buněk exprimuj ících CTLA—4, zejména těch buněk, kde protilátky podle vynálezu jsou účinné.

Pokud jde o přípravu peptidových léčiv, užitím strukturních informací týkajících se CTLA—4 a protilátek k CTLA-4, např. protilátek podle vynálezu (jak bude ještě popsáno dále ve spojení s malými molekulami), nebo screeningem peptidových knihoven, je možné připravit terapeutické peptidy namířené proti CTLA^k Návrh a screening peptidových léčiv byly např. popsány v publikacích Houghten et al. Biotechniques 13:412 až 421 (1992), Houghton PNAS US 82:5131 až 5135 (1985), Pinalla et al. Biotechniques 13:901 až 905 (1992), Blake a Litzi-Davis BioConjugate Chem. 3:510 až 513 (1992). Imunotoxiny a radioaktivně značené protilátky mohou být připraveny podobným způsobem, jako peptidové části, jak bylo diskutováno výše pro protilátky. Důležité informace týkající se vazby protilátky a antigenu mohou být získány experimenty s fágovou expozicí (fágový displej). Takové experimenty se obecně provádějí „rýžováním44 fágové knihovny exprimující náhodné peptidy na vazbu s protilátkou podle vynálezu, a pak urče- -20- CZ 303703 B6 ním, zda peptid, který se váže, může být izolován. Pokud je pokus úspěšný, z peptidu, který se váže, je možné získat určité informace o epitopu.

Obecně fágové knihovny exprimující náhodné peptidy mohou být koupeny od firmy New England Biolabs (knihovny 7-merů a 12-merů, souprava Ph.D.-7 Peptide 7-mer Library Kit a Ph.D.-12 Peptid představují valnou většinu, pokud ne všechny, z 207 = 1,28 x 109 sekvencí 7-merů. Knihovna 12-merů představuje diverzitu přibližně 1,9 x 109 nezávislých klonů, které představují jen velmi malou část možných 2012 = 4.1 x 1015 sekvencí 12-merů.

Každá z knihoven 7-merů a 12-merů byla „rýžována“ nebo „screenována“ podle návodu výrobce, kde destičky byly potaženy protilátkou k zachycení vhodné protilátky (např. kozí anti-lidský IgG Fc pro IgG protilátku) a pak opláchnuty. Navázaný fág byl eluován 0,2 M glycin/HCl, pH 2,2. Po třech opakováních cyklů selekce/amplifikace při konstantní stringenci (0,5% Tween) bylo možné pomocí sekvencování DNA charakterizovat klony z knihovny, které reagovaly s jednou nebo více protilátkami. Reaktivita peptidů se může určit pomocí ELIS A. Pro další diskusi o epi-topové analýze peptidů viz např. také Scott, J. K. a Smith, G. P. Science 249:386 až 390 (1990); Cwirla et al. PNAS USA 87:63786382 (1990); Felici et al. J Mol. Bioi 222:301 až 310 (1991), and Kuwabara et al. Nátuře Biotechnology 15:74 až 78 (1997). Návrh a příprava genových léčiv a antisense léčiv konvenčními metodami jsou také usnadněny prostřednictvím předkládaného vynálezu. Tyto formy léčiv se mohou užít pro modulaci funkce CTLA-4. V této souvislosti protilátky podle vynálezu usnadňují návrh a použití funkčních testů. Návrh a příprava antisense léčiv byly podrobně diskutovány např. v mezinárodní patentové přihlášce WO 94/29 444. Návrhy a strategie pro genovou terapii jsou odborníkům známy. Avšak ve specifickém případě použití metod užívajících „intrabodies“ může být zvláště výhodné. Viz např. Chen et al. Human Gene Therapy 5:595 až 601 (1994) a Marasco Gene Therapy 4:11 až 15 (1997). Obecné návrhy a úvahy týkající se léčiv vhodných pro genové terapie lze najít např. Také mezinárodní patentové přihlášce WO 97/38 137. Genetické materiály kódující protilátky podle vynálezu (jako např. 4.1.1, 4.8.1 nebo 6.1.1 a další) se vloží do vhodného expresního systému (ve formě viru, atenuovaného viru, nevirové formě, „nahé“ formě nebo jiné) a podají se příjemci, a pak se protilátky tvoří in vivo v příjemci/hostiteli. Léčiva zvaná malé molekuly lze také připravovat užitím předkládaného vynálezu. Lze navrhnout taková léčiva, která budou modulovat aktivitu CTLA^l. Znalosti získané ze struktury CTLA-4 a interakce sjinými molekulami podle vynálezu, např. CD28, B7, B7-1, B7-2, a dalšími, se mohou využít k racionálnímu návrhu dalších forem léčiv. V tomto ohledu mohou být využity metody racionálních návrhů léčiv jako je rentgenová krystalografie, počítačové molekulové modelování (CAMM), kvantitativní nebo kvalitativní analýza vztahu struktura-aktivita (QSAR) a podobné metody, k dalšímu upřesnění cílů při objevování nových léčiv. Metody racionálního navrhování dovolují před i kovat proteinové nebo syntetické struktury, které reagují s molekulou nebo její specifickou formou, a které mohou být užity k modifikaci nebo modulaci aktivity CTLA^l. Takové struktury se mohou syntetizovat chemicky nebo exprimovat v biologických systémech. Tyto metody byly v přehledu uvedeny např. v Capsey et al. Genetically Engineered Human Therapeutic Drugs (Stockton Press, NY (1988)). A skutečně racionální návrh molekul (peptidů, peptidomimetic, malých molekul apod.) založený na známém, nebo alespoň nastíněném, vztahu mezi strukturou a aktivitou sjinými molekulami (jako jsou např. protilátky podle vynálezu), se nyní obecně stává rutinním postupem. Viz např. Fry et al. „Specific, irreversible inactivation of the epidermal growth factor receptor and erbB2, by a new class of tyrosine kinase inhibitor“ Proč Nati Acad Sci USA 95:12022-7 (1998); Hoffman et al. „A model of Cdc25 phosphatase catalytic domain and Cdk-interaction surface based on the presence of a rhodanese homology domain“ J Mol Bioi 282:195 až 208 (1998); Ginalski et al. „Moddeling of active forms of protein kinases: p38-a čase study“ Acta Biochim Pol 44:557 až 64 (1997); Jouko et al. „Identification of csk tyrosine phosphorylation sites and a tyrosine residue important for kinase domain structure“ Biochem J 322:927 až 35 (1997); Singh et al. „Structure-based design of a potent, selective, and irreversible inhibitor of the catalytic domain of the erbB receptor subfamily of pro- -21 - CZ 303703 B6 tein tyrosine kinases44 J Med Chem 40:1130 až 5 (1997); Mandel et al. „ABGEN: a knowledgebased automated approach for antibody structure modeling“ Nat Biotechnol 14:323 až 8 (1996); Monfardini et al. „Rational desig analysis, and potential utility of GM^CSF antago-nists44 Proč Assoc Am Physicians 108:420 až 31 (1996); Furet et al. „Modeling study of protein 5 kinase inhibitors: binding mode of staurosporine and origin of the selectivity of CGP 52411“ J Comput Aided Mol Des 9:465 až 72 (1995).

Jako další možnost se mohou připravit a syntetizovat kombinační knihovny a použít ve screenin-gových programech, jako jsou např. vysokovýkonné screeningové programy. 10

Formulace léčiv a jejich podávání Léčiva obsahující sloučeniny podle vynálezu se podávají formulována s vhodnými nosiči, exci-pienty a dalšími činidly, která jsou součástí farmaceutického přípravku, aby se zlepšil přenos, 15 příjem, tolerance apod. Existují mnohé vhodné lékové formy, jak je známo odborníkům v oboru farmaceutické chemie, a jak bylo popsáno např. v publikaci Remingtonů Pharmaceutical Sciences (15th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA (1975)), zejména kapitola 87: Blaug a Sey-mour. Takové přípravky obsahují např. prášky, pasty, masti, želé, vosky, oleje, tuky, vesikuly (kationtové nebo aniontové) obsahující tuky (jako je např. Lipofectin™), DNA konjugáty, bezvo-20 dé absorpční pasty, emulze typu olej ve vodě nebo typu vody v oleji, emulzní karbovosky (poly-ethylenglykoly různých molekulových hmotností), polotuhé gely a polotuhé směsi obsahující karbovosky. Kterákoliv výše uvedená směs může být vhodná pro použití vynálezu za předpokladu, že účinná složka přípravku není inaktivována těmito pomocnými látkami pro formulaci přípravku a že přípravek je fyziologicky kompatibilní a tolerovatelný při daném způsobu podává-25 ní. Pro další informace týkající se excipientů a nosičů, které jsou odborníkům ve farmaceutické chemii známy, viz také Powell et al. „Compendium of excipients for parenteral formulations“ PDAJPharm Sci Technolog. 52:238 až 331 (1998). Příprava protilátek 30

Protilátky podle předkládaného vynálezu se výhodně připravují prostřednictvím transgenních myší, které obsahují vloženou podstatnou část lidského genomu produkujícího protilátky a naopak jsou deficientní v produkci endogenních myších protilátek. Takové myši jsou pak schopné produkovat molekuly lidského imunoglobulinu a protilátek a jsou deficientní v produkci 35 myších imunoglobulinových molekul a protilátek. Postupy vhodné k dosažení tohoto cíle byly popsány v patentech, patentových přihláškách a dalších publikacích, které jsou uvedeny ve stavu techniky. Výhodné provedení transgenních myší a produkce protilátek je popsáno dále také viz Mendez et al. Nátuře Genetics 15:146 až 156 (1997), což je plně zahrnuto formou odkazu. 40 Použitím těchto metod byly připraveny plně lidské monoklonální protilátky k celé řadě různých antigenů. Podstata postupu spočívala v tom, že myši linií XenoMouše™ byly imunizovány požadovaným antigenem, z myši, která exprimovala požadované protilátky byly odebrány lymfatické buňky (jako např. B-lymfocyty), fúzovány s buňkami myeloidní linie, čímž se získaly imortali-zované hybridomové linie a tyto hybridomové linie se pak podrobily screeningu a selekci, kdy 45 byly identifikovány hybridomové buněčné linie produkující protilátku specifickou k požadovanému antigenů. V předkládaném vynálezu byly tyto metody použity pro přípravu protilátek specifických k CTLA^l. Popisuje se zde proto příprava mnoha hybr i domových linií, které produkují protilátky specifické proti CTLA^4. Dále vynález poskytuje charakteristiky těchto protilátek, včetně analýz nukleotidových a aminokyselinových sekvencí těžkého a lehkého řetězce těchto 50 protilátek.

Protilátky pocházející zvýše uvedených hybridomových linií byly označeny 3.1.1, 4.1.1, 4.8.1, 4.10.2, 4.13.1, 4.14.3, 6.1.1, 11.2.1, 11.6.1, 11.7.1, 12.3.1.1 a 12.9.1.1. Každá ztěchto protilátek představuje plně lidský buďto IgG2 nebo IgG4 řetězec s lidským lehkým řetězcem kapa. Obecně -22- CZ 303703 B6 řešeno protilátky podle vynálezu mají velmi vysokou afinitu, typicky mají hodnoty Kd od 10 9 do 10"I2M, když jsou měřeny v pevné nebo kapalné fázi.

Protilátky podle vynálezu mohou být exprimovány i v jiných buňkách či buněčných liniích než 5 jen hybridomových.

Sekvence kódující cDNA nebo genomické klony určitých protilátek mohou být užity pro transformaci buněk vhodného hostitele, kterým je savec nebo organismus jiná než savec. K transformaci lze užít jakoukoliv známou metodu pro vnesení polynukleotidů do hostitelské buňky, včetně io metod jako je např. sbalení (,,pakážování“) polynukleotidu do viru (nebo do virového vektoru a transdukce hostitelské buňky virem (vektorem), nebo transfekcí, jak byly např. popsány v U.S. Patentech č. 4,399,216, 4,912,040, 4,740,461 a 4,959,455 (které jsou zahrnuty formou odkazu). Použitá metody transformace závisí na hostiteli, který má být transformován. Metody pro vnášení heterologních polynukleotidů do savčích buněk jsou odborníkům známy a patří knim, aniž by 15 však tento výčet byl vyčerpávající, dextranem zprostředkovaná transfekce, precipitace s kalcium-fosfátem, transfekce zprostředkovaná polybrenem, fúze protoplastů, elektroporace, bombardování mikročásticemi, enkapsulace polynukleotidu do liposomů, peptidové konjugáty, dendrimery a přímé mikroinjekce DNA do jádra. 20 Linie savčích buněk vhodných jako hostitelské buňky pro expresi jsou odborníkům dobře známy a patří k nim mnoho imortalizovaných buněčných linií dostupných v Americké sbírce kultur a mikroorganismů (ATCC), jako jsou např. buňky vaječníků čínského křečka (CHO), buňky NSOo, buňky HeLa, buňky BHK (křeččí fetální ledviny), COS buňky (opičích ledvin), buňky lidského hepatocelulámího karcinomu (např. Hep G2) a celá řada dalších buněčných linií. 25 K vhodným buňkám, které nejsou ze savců, a které mohou být užity pro expresi rekombinantních protilátek patří, avšak výčet tím není omezen, např. bakteriální buňky, kvasinky, houby, hmyz a rostliny. Místně cílená mutageneze protilátkové domény CH2, která eliminuje glykosylaci, je výhodná k tomu, aby se zabránilo změnám v imunogenicitě, farmakokinetice a/nebo efektoro-vých funkcích, které jsou výsledek glykosyiace lišící se od lidského glykosylačního profilu. 30 Metody exprese se vybírají na základě toho, že se stanoví, který systém produkuje nejvyšší expresní hladiny a tvoří protilátky s konstitutivními vazebnými vlastnostmi pro CTLA-4. Dále exprese protilátek podle vynálezu (nebo jiných sloučenin) v produkčních liniích může být zesílena řadou známých metod. Tak např. expresní systém glutaminsyntetázy a DHFR jsou zná-35 mé systémy pro zvýšení exprese za jistých podmínek. Buněčné klony s vysokou expresí mohou být identifikovány konvenčními metodami, jako je např. klonování limitního ředění a nebo technika mikrokapky. Systém GS byl podrobně popsán a diskutován ve spojení s Evropskými patenty EP 0 216 846, EP 0 256 055 a EP 0 323 997 a patentem EP 03 388 441. 40 Protilátky podle vynálezu mohou být připraveny také transgenním způsobem, a sice vytvořením transgenního zvířete nebo transgenní rostliny, které jsou transgenní na požadované sekvence těžkého a lehkého řetězce imunoglobulinu, a produkcí protilátek v izolovatelné formě. Pokud jde o transgenní savce, protilátky mohou být produkovány do mléka, ze kterého jsou pak izolovány, a sice u kozy, krávy a jiných savců (viz patenty US 5 827 690, US 5 756 687, US 5 750 172, 45 a US 5 741 957.

Protilátky podle předkládaného vynálezu byly analyzovány strukturně i funkčně. Ve spojení se strukturami protilátek byly aminokyselinové sekvence těžkého a kapa lehkého řetězce prediková-ny na základě cDNA sekvencí získaných pomocí RT-PCR hybridomů. Viz příklady 3 a 4 50 a obrázky 1 až 8. Sekvencování A-konců protilátek bylo také provedeno pro potvrzení výsledků diskutovaných v příkladech 3 a 4. Viz také příklad 5 a obr. 9. Kinetické analýzy protilátek byly provedeny ke stanovení jejich afinit, viz příklad 2. Protilátky podle vynálezu (zejména 4.1.1, 4.8.1 a 6.1.1) mají vysoké afinity (4.1.1: 1,63 x 1010 l/M, 4.8.1: 3,54 x 1010 1/M; a 6.1.1; 7,2 x 10’ 1/M). Dále byly protilátky analyzovány izoelektrickým zaostřováním (IEF), redukující gelo-55 vou elektroforézou (SDS-PAGE), velikostní vylučovací chromatografíí, kapalinovou chromato- * 23 - CZ 303703 B6 grafu a hmotovou spektroskopií a vyhodnocením tvorby protilátek hybridomy. Viz příklad 6 a obr. 10.

Pokud jde o funkční analýzu protilátek podle vynálezu, tyto protilátky se ukázaly být silnými inhibitory CTLA-4 a jeho vazby na ligandy z rodiny molekul B. Tak např. bylo ukázáno, že protilátky podle vynálezu blokovaly vazbu CTLA—4 jak na B7—1 tak i B7—2. Viz příklad 7. Skutečně, mnoho protilátek podle vynálezu má hodnotu IC5o pro inhibici vazby CTLA-4 na B7-1 nebo B7-2 řádu nanomolů a nižší. Kromě toho protilátky podle vynálezu mají vynikající selektivitu pro CTLA^l ve srovnání např. sCD28, CD44, B7—2 nebo hlgGl. Viz příklad 8. Selektivita je poměr, který odráží stupeň preference vazby molekuly s prvním činidlem ve srovnání s druhým, a případně dalším činidlem. V předkládaném popisu se termín selektivita týká stupně preference vazby protilátky podle vynálezu k CTLA^l· ve srovnání s vazbou protilátky s jinými molekulami, jako např. CD28, CD44, B7-2 nebo hlgGl. Hodnoty selektivity protilátek podle vynálezu vyšší než 500:1 jsou běžné. Bylo také ukázáno, že protilátky podle vynálezu indukují nebo zvyšují expresi některých cytokinů (jako např. IL-2 a IFN-γ) v kultuře T lymfocytů a v modelu T lymfoblastů. Víz příklady 9 a 10 a také obrázky 12 až 17. Lze také očekávat, že protilátky podle vynálezu budou inhibovat růst nádorů ve vhodných in vivo modelech nádorů. Návrh takových modelů je popsán a diskutován v příkladech 11 a 12. Výsledky popsané v předkládané přihlášce ukázaly, že protilátky podle vynálezu mají určité výhodné vlastnosti, pro které jsou vhodnější a účinnější než v současnosti užívané protilátky proti CTLA-4.

Zejména protilátky 4.1.1, 4.8.1 a 6.1.1 podle vynálezu mají výhodné vlastnosti. Jejich strukturní charakteristiky, funkce nebo aktivity poskytují měřítka, které usnadňují návrh a selekci dalších protilátek nebo jiných typů molekul, jak již bylo diskutováno výše. K těmto kritériím patří jedno nebo více z následujících: schopnost kompetovat o vazbu k CTLA^l s jednou nebo více protilátkami podle vynálezu, - podobná vazebná specificita k CTLA-4 jako má jedna nebo více protilátek podle vynálezu, - vazebná afinita k CTLA-4 10 9 nebo vyšší, výhodně 1010 nebo vyšší, - nereaguje křížově s CTLA-4 nižších savců, jako je např. myš, potkan, králík, výhodně nereaguje s CTLA^l myši a potkana, - reaguje křížově s CTLA-4 primátů, výhodně „cynomolgního“ makaka (Macaca fascicula-ris) a makaka „rhesus“ {Macaca mullata), - selektivita pro CTLA—4 proti CD2B, B7-2, CD44 nebo hlgGl je alespoň 100:1 nebo vyšší, výhodně 300, 400 nebo 500:1 nebo vyšší, - íC5o blokování CTLA^4 vazby na B7-2 je 100 nM nebo nižší, výhodně 5, 4, 3, 2, 1, 0,5 nebo 0,38 nM nebo nižší, IC50 blokování CTLA-4 vazby na B7-1 je 100 nM nebo nižší, výhodně 5, 4, 3, 2, 1, 0,5 nebo 0,50 nM nebo nižší, - zvyšuje produkci cytokinů v jednom nebo více in vitro testech, např. - zvyšuje produkci 1L-2 v testu T lymfoblasty/Raji buňky o 500 pg/ml nebo více, výhodně 750, 1000, 1500, 2000, 3000 nebo 3846 pg/ml, -24- CZ 303703 B6 - zvyšuje produkci IFN-γ v testu T lymfoblasty/Raji buňky o 500 pg/ml nebo více, výhodně 750, 1000 nebo 1233 pg/ml nebo více, - zvyšuje produkci IL-2 v testu hPBMC nebo testu superantigenu celé krve o 500 pg/ml nebo více a výhodně 750, 1000, 1200 nebo 1511 pg/ml nebo více, vyjádřeno jinak produkce IL-2 je zvýšena o 30, 35, 40,45, 50 procent a více při srovnání s kontrolním testem. Očekává se, že protilátky podle vynálezu (nebo molekuly na jejich základě navržené nebo syntetizované), mající jednu nebo více z uvedených vlastností, budou mít také podobnou účinnost jako protilátky podle předkládaného vynálezu.

Požadované funkční vlastnosti popsané výše vedou k vazbě na CTLA-4 a inhibici vazby CTLA-4 molekulou (např. protilátkou, protilátkovým fragmentem, peptidem, malou molekulou) podobným způsobem jako se chová protilátka podle vynálezu (tj. vazbou na stejný nebo podobný epitop molekuly CTLA—4).

Molekula podle vynálezu se podává buďto přímo (tj. přímé podávání molekul pacientovi), nebo se může „podávat44 nepřímo (tj. např. podáváním peptidu nebo podobné molekuly), která vyvolá imunitní reakci u pacienta, podobně jako vakeína, a lato reakce zahrnuje tvorbu protilátek, které se váží na stejný nebo podobný epitop nebo protilátku nebo její fragment, které jsou produkovány po podání genetického materiálu, který kóduje takové protilátky, nebo jejich fragmenty vázající se stejný nebo podobný epitop). Takže je jasné, že epitop na CTLA-4, ke kterému se váží protilátky podle vynálezu, je užitečný ve spojení s přípravou léčiv podle vynálezu. Při návrhu léčiv bývá stejně tak důležitá i negativní informace (tj. skutečnost, že protilátka, která se váže na CTLA—4, se neváže na epitop, který působí jako inhibitor CTLA—4, je užitečná). Takže epitop, na který se váží protilátky podle vynálezu, které nevedou k požadovaným funkcím, může být také velmi důležitý. Tudíž do rozsahu předkládaného vynálezu spadají také molekuly (a zejména protilátky), které se váží na stejný nebo podobný epitop jako protilátky podle předkládaného vynálezu.

Kromě toho, že předmětem předkládaného vynálezu jsou protilátky, a lze tudíž uvažovat i epito-py, na které se váží, byly provedeny i předběžné studie mapování epitopů pro určité protilátky podle vynálezu, zejména protilátky 4.1.1 a 1L2.I

Jako první krok byly provedeny kom pěti ční studie BIAcore pro vytvoření hrubé mapy vazeb mezi protilátkami podle vynálezu také ve spojení sjejich schopností kompetovat o vazbu s CTLA—4. Pro tento účel byl CTLA—4 navázán na čip BIAcore a první protilátka, za saturujících podmínek, byla navázána na čip a pak byla měřena kompetiční vazba následné sekundární protilátky na CTLA-4. Tato metoda umožňuje vytvoření hrubé mapy, podle které lze klasifikovat rodiny protilátek. Tímto způsobem bylo stanoveno, že protilátky podle vynálezu lze rozdělit do následujících epitopových kategorií. -25 - CZ 303703 B6

Kategorie Protilátka Kompetice o vazbu CTLA-4 A BOIM* Plně křížově kompetují navzájem, křížově kompetují s kategorií B, do jisté míry kompetují s kategorií D B02M* B 4.1.1 Plně křížově kompetují navzájem, křížově kompetují s kategorií A, C a D 4.13.1 C 6.1.1 Plně křížově kompetují navzájem, křížově kompetují s kategorií B a D 3.1.1 4.8.1 11.2.1 11.6.1 11.7.1 D 4.14.1 křížově kompetují s kategorií C a B, do jisté míry s kategorií A E 4.9.1 BNI3 blokuje vazbu 4.9.1 na CTLA-4, ale ne naopak BNI3*** (*) a {**) jsou dostupné od Biostride (***) jsou dostupné od Pharmingen V dalším kroku se původci pokusili stanovit, zda protilátky podle vynálezu rozpoznávají lineární epitop na CTLA-4 za redukujících a neredukujících podmínek metodu westernového přenosu (western blot). Bylo pozorováno, že žádná z protilátek 4.1.1, 3.1.1, 11.7.1, 1 1.6.1 nebo 11.2.1 nerozpoznávala redukovanou formu CTLA-4 na westernovém přenosu. Tudíž se zdá, že všechny epitopy rozpoznávané příslušnými protilátkami nejsou lineární epitopy, ale spíše konformační epitop, jehož struktura je zrušena v redukujících podmínkách.

Tudíž bylo dále zkoumáno, zdaje možné něco zjistit o aminokyselinových zbytcích, které jsou důležité pro vazbu protilátek podle vynálezu. Jednou metodou bylo užití kinetické metody stanovení rychlostních konstant pro lidský CTLA-4 a dva vysoce konzervativní CTLA^4 primátů (makak, Macaca fascicularis a marmoset, Callithrix jacchuss). Studie pomocí techniky BIAcore ukázaly, že protilátka podle vynálezu 4.1.1 se váže na CTLA^t člověka i obou primátů stejnou rychlostí. Avšak vzhledem ke kinetice se ukázalo, že protilátka 4.1.1 má nejvyšší afinitu (nej-menší rychlost rozpadu) pro lidský CTLA-4, rychlejší rozpad pro CTLA^l makaka a ještě mnohem rychlejší pro marmoseta. Naproti tomu protilátka 11.2.1 se váže na CTLA-4 Člověka i obou primátů se stejnou rychlostí, přitom má i stejné afinity (rychlosti rozpadu) pro všechny tři CTLA^l. Tato informace dále ukazuje, že protilátky 4.1.1 a 11.2.1 se váží na různé epitopy CTLA-4.

Pro další zkoumání epitopů, na které se váží protilátky kategorie B a C podle vynálezu byly provedeny studie s místně cílenou mutagenezí. CTLA-4 marmoseta má proti lidskému dva významné rozdíly, a sice ve zbytcích 105 až 106. Tyto rozdíly jsou změna lučinu na methion v pozici 105 a glycinu na serin v pozici 106. Tudíž byla mutována cDNA kódující lidský CTLA—4 tak, aby kódovala mutovaný CTLA-4 mající záměny LI OSM a G106S. Homologní náhrada mutovaného CTLA-4 neovlivnila vazbu B7.2-IgGI fúzního proteinu. Avšak tato molekula byla významně inhibována ve schopnosti vázat se na protilátku 4.1.1 podle vynálezu (podobně marmoset). Dále byla mutována cDNA marmoseta kódující CTLA^4, čímž byla vytvořena mutanta CTLA-4 marmoseta obsahující záměnu S106G. Tato záměna vedla k obnovení původní stabilní vazby. -26- CZ 303703 B6

Kromě toho byla připravena mutanta CTLA^l marmoseta mající záměnu M105L. Tato záměna částečně obnovila vazbu mezi protilátku 4.1.1 a mutovaným CTLA-4.

Každá z kategorií protilátek A až D podle vynálezu se zdá mít podobné funkční vlastnosti a má 5 zřejmě potenciál působit jako silné terapeutické činidlo anti-CTLA^L Dále každá z molekul vykazuje jistou křížovou kompetici ve vazbě k CTLA-4. Avšak jak již bylo výše diskutováno, každá z molekul různých kategorií se zjevně váže na samostatný konformační epitop CTLA-4. Z předchozích údajů a diskusí vyplývá, že informace o epitopech diskutované výše ukazují, že ío protilátky (nebo jiné molekuly) podle vynálezu, které křížově kompetují s protilátkami, budou mít zřejmě značný terapeutický potenciál. Dále lze čekat, že protilátky (nebo jiné molekuly) podle vynálezu, které křížově kompetují s protilátkami podle vynálezu (tj. křížově kompetují s protilátkami skupin B, C a/nebo D, budou mít podle předkládaného vynálezu další terapeutický potenciál. A dále lze čekat, že protilátky (nebo jiné molekuly) podle vynálezu, které křížově 15 kompetují s protilátkami podle vynálezu (tj. křížově kompetují s protilátkami skupin B, C a/nebo D) a 1) nemají sníženou vazbu s CTLA-4 marmoseta (podobné protilátce 111.2.1) nebo II) mají sníženou vazbu s CTLA^t marmoseta, budou mít podle předkládaného vynálezu další terapeutický potenciál. Také protilátky (nebo jiné molekuly) podle vynálezu, které křížově kompetují s protilátkami skupin A a E podle vynálezu mají určitý terapeutický potenciál. 20 Příklady provedení vynálezu Následující příklady včetně provedených pokusů a dosažených výsledků jsou uvedeny pouze pro 25 ilustrativní účely a předkládaný vynález nijak neomezují. Příklad 1 30 Příprava hybridomů produkujících protilátku anti-CTLA^t

Protilátky podle vynálezu byly připraveny, selektovány a testovány podle popsaného příkladu. Příprava antigenu: 35

Pro imunizaci myší XenoMouse™ byly připraveny tři rozdílné imunogeny: i) fúzní protein CTLA^l-lgG, ii) peptid CTLA-4 a iii) buňky myšího lymfomu 300,19 transfekované mutantou CTLA-4 (Y201V), která je konstitutivně exprimovaná na buněčném povrchu.

40 i) fúzní protein CTLA-4-IgG

Konstrukce expresního vektoru: cDNA kódující zralou extracelulární doménu CTLA^t byla amplifíkována pomocí PCR z cDNA 45 knihovny lidského thymu (Clontech) s použitím primerů navržených podle publikované sekvence (Eur. J. Immunol., 18, 1901 až 1905, 1988). Fragment byl směrově subklonován do pSR5, expresního plazmidu viru Sindbis (InVitrogen), mezi domény CH1/CH2/CH3 signálního peptidu lidského onkostatinu M a lidského IgG gama 1 (IgGl). Fúzní protein neobsahuje kloubovou doménu, ale obsahuje cystein 120 v extracelulární doméně CTLA—4 za vzniku kovalentního 50 dimeru. Výsledný vektor byl nazván CTLA^MgG/pSR5. Sekvence kompletní cDNA CTLA-4-IgGl ve vektoru byla potvrzena v obou vláknech. Aminokyselinová sekvence proteinu CTLA^l-IgG je ukázána níže. Zralá extracelulární doména pro CD44 byla amplifíkována pomocí PCR z lidské lymfocytové knihovny (Clontech) a subklonována do pSinRep5 za vzniku kontrolního proteinu s identickým koncem IgG 1. -27- 55 CZ 303703 B6 Fúzní protein OM-CTLA-4-IgG 1:

MGVLLTORTLLSLVLALLFPSMASMAMHVAQPAWLASSRGIASFVC EYASPGKATEVRVTVLRQADSQVTEVCAATYMMGNELTFLDDSICT GTSSGNQVNI/TIQGIiRAMDTGLYICKVELMYPPPYYLGIGNGTQIY

VXDPEPCPDSDLEGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPE

VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKE

YKCKVSNKALPTPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCL

VKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSR

WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 5 Podtrženo: signální peptid

Tučně: extracelulámí doména CTLA-4 cDNA pro zralou extracelulámí doménu CD28 byly amplifi kovány pomocí PCR z lidské lymfo-cytové knihovny (Clontech), a pak subklonovány do pCDM8 (J. Immunol., 151, 5261 až 71, ío 1993) za vzniku fúzního proteinu lidského IgGl obsahujícího oblast štěpení trombinem a kloubovou oblast. CTLA—4 z opic Callithrix jacchuss, Macaca fascicularis a Macaca mullata byl klonován z mRNA izolované z PBMC stimulovaných PHA s použitím standardních technik degenerované PCR. Sekvencování prokázalo, že aminokyselinové sekvence opis rhesus a cynomologous byly totožné, se třemi odlišnostmi oproti zralé lidské extracelulámí doméně CTLA^t (S13N, 15 I17T a LI OSM). U opic C. jacchuss bylo prokázáno deset aminokyselinových odchylek od zralé lidské extracelulámí domény CTLA-^l· (V21A, V33I, A41T, A51G, 541, S71F, Q75K, T88M, LI OSM a G106S). Místně cílená mutageneze byla použita pro vytváření jednobodových mutací všech aminokyselin odlišných v marmoset CTLA-4 pro mapování aminokyselin důležitých pro interakci protilátek s lidským CTLA-4-lgG. Mutace lidského a marmoset CTLA—4-IgG pro 20 epitopové mapování byly vytvářeny pomocí značkovací soupravy pro místně cílené mutageneze (Promega). Fúzní proteiny IgG byly produkovány pomocí přechodné transfekce buněk Cos7 a purifikovány s použitím standardních technik Protein A. U mutovaných proteinů CTLA-4-IgG byla hodnocena vazba k protilátkám prostřednictvím imunopřenosu (,,imunoblotting“) a s použitím analýz BIAcore. 25

Exprese/puriíikace rekombinantního proteinu

Rekombinantní virus Sindbis vznikal elektroporací (Gibco) buněk z embryonálních ledvin křečka s SP6 in vitro transkribovanou mRNA CTLA-4-IgGl/pSR5 a pomocnou mRNA DH-26S, jak 30 popsáno firmou InVitrogen. Rekombinantní virus byl sklízen čtyřicet osm hodin později a titro-ván na optimální expresi proteinu v buňkách ovarií čínského křečka (CHO-K1). Buňky CHO-K1 byly pěstovány v suspenzi DMEM/F12 (Gibco) obsahující 10% teplem inaktivované fetální bovinní sérum (Gibco), neesenciální aminokyseliny (Gibco), 4mM glutamin (Gibco), penici-lin/streptomycin (Gibco), lOmM Hepes pH 7,5 (Gibco). Aby produkovaly CTLA-4-IgG, byly 35 buňky CHO-K1 resuspendovány v množství IxlO7 buněk/ml vDMEM/F12 a inkubovány s virem Sindbis jednu hodinu při teplotě místnosti. Pak byly buňky naředěny na lxl06/ml v DMEM/F12 obsahujícím 1% fetální bovinní sérum zbavené bovinního IgG s použitím Protein A Sepharose (Pharmacia), neesenciální aminokyseliny, 4mM glutamin, 12,5mM Hepes pH 7,5, a penicilin/streptomycin. Čtyřicet osm hodin po infekci byly buňky peletovány a kondicionovaná 40 média byla sklizena a doplněna tabletami úplného inhibitoru proteáz (Boehringer Mannheim), pH bylo upraveno na 7,5, a média byla filtrována přes 0,2 filtr (Nalgene). FPLC (Pharmacia) byla použita pro afínitní purifikaci fúzního proteinu s použitím 5ml kolony A HiTrap (Pharmacia) při rychlosti průtoku 10 ml/minutu. Kolona byla promyta PBS 30 objemy kolony a eluována 0,1 M glycinem/HCl, pH 2,8, rychlostí 1 ml/minutu. Frakce (1 ml) byly okamžitě neutralizovány na 28- CZ 303703 B6 pH 7,5 pomocí Tris pH 9. Frakce obsahující CTLA-4-IgGl byly identifikovány prostřednictvím SDS-PAGE, a pak koncentrovány s použitím Centriplus 50 (Amicon) před aplikací na kolonu Sepharose 200 (Pharmacia) rychlostí 1 ml/minutu s použitím PBS jako rozpouštědla. Frakce obsahující CTLA-4-IgGl byly sloučeny, sterilizovány filtrací 0,2 (Millipore), rozděleny na 5 poměrné části a zmraženy v -80 °C. CD44-IgGl byl exprimován a purifikován s použitím stejných metod. CD28-lgG byl purifikován z kondicionovaných médií od přechodně transfekova-ných buněk Cos7.

Charakterizace CTLA—4-IgGl 10

Purifikovaný CTLA—4-IgGl migroval jako jeden pás na SDS-PAGE při použití barvení koloidní modří Coomassie (Novex). Za neredukujících podmínek byl CTLA-4-IgGl dimer (lOOkD), který se redukoval na monomer o velikosti 50 kD, když byl ošetřen 50mM DTT. Sekvencování aminokyselin purifrkovaného CTLA-4-lgGl v roztoku potvrdilo N-koncovou část CTLA^l 15 (MHVAQPAVVLAS) a to, že signální peptid onkostatinu M byl odštěpen ze zralého fúzního proteinu. CTLA—4-IgGl se vázal na imobilizovaný B7.1-IgG způsobem závislým na koncentraci a vazba byla blokována křečci protilidskou anti-CTLA-4 protilátkou (BN13, PharMingcn). Sterilní 20 CTLA^í-lgG byl bez endotoxinu a byl kvantifikován při OD280 s použitím 1,4 jako extinkčníhó koeficientu. Výtěžek purifíkovaného CTLA—4-IgG se pohyboval v rozmezí 0,5 až 3 mg/1 buněk CHO-K1. (ii) CTLA^t peptid 25 Následující peptid CTLA-4 byl připraven tak, jak je popsáno dále: NH2: MHVAQPAVVLAS S RGI AS F V CE YAS PGKATEVRVTVLRQADSQVT E VCAATYMMGNELTFLDDSICTGTS SGNQVNLTIQGLRAMDTGLYICK VELMYPPPYYLGIGNGTQIYVIDPEPC-CONHs 30 Zkratky/materiál: NMP, N-methylpyrrolidinon; TFE, 2,2,2-trifluoroethanol; DCM, dichloromethan; FMOC, fluorenylmethoxykarbonyl. Všechny reagencie byly dodávány firmou Perkin Elmer s následujícími výjimkami: TFE od firmy Aldrich Chemical, FMOC-PAL-PEG pryskyřice od firmy Persepti-35 ve Biosystems. Pro ty aminokyseliny, které vyžadují ochranné skupiny postranních řetězců, byly použity: Fmoc-Arg(PMC)-OH, FMOC-Asn(Trt)-OH, FMOC-Asp(tBuK>H, FMOC-Cys(Trt)-OH, FMOC-Glu(tBu)-OH, FMOC-Gln(Trt)-OH, FMOC-His(BocK)H, FMOC-Lys(BOC)OH, FMOC-Ser(tBu)-OH, FMOC-Thr(tBu)-OH a FMOC-Tyr(tBu)-OH. 40 Syntéza peptidu

Syntéza peptidu byla prováděna na přístroji Perkin-Elmer 431A dodatečně vybaveném monitorováním vazby prostřednictvím UV absorbance v 301 nm (Perkin-Elmer Model 759A detector). Sekvence peptidu byla syntetizována na pryskyřici FMOC- PAL-PEG s použitím kon-45 dicionovaných dvojitých kondenzačních cyklů. Zesílené dvojité kondenzační reakce byly prováděny v cyklech 10, 11, 18, 19, 20 a 28 a 33. Pryskyřice byla promyta 50% směsí DCM a TFE při ukončení každého acylačního cyklu, a potom následovalo „zakrytí" nezreagovaných aminoskupin acetanhydridem v NMP. Pryskyřice byla odstraněna z reaktoru po ukončení cyklu 49 a zbytek pokračoval až do ukončení. Odštěpení peptidu z pryskyřice bylo prováděno s použi-50 tím Reagent K (King et al., International Journal of Protein and Peptide Research, 36, 255 až 266, 1990) po dobu 6 hodin na 415 mg pryskyřice, která poskytla 186 mg hrubého peptidu CTLA—4. -29- CZ 303703 B6

Charakterizace peptidu 25mg alikvoty hrubého peptidu CTLA-^1 byly rozpuštěny v 5 ml 6M guanidin HCl/lOOmM K2P03 při pH 6,4 a eluovány přes kolonu Pharmacia Hi Load Superdex 75 16/60 (16 mm x 5 600 mm, 120 ml objem kolony) s 2M guanidin HCI/lOmM K2PO3 při pH 6,4 lychlostí 2 ml/min po dobu 180 minut a při sběru 5ml frakcí. Frakce byly analyzovány nanesením 1,7 μΐ frakce na gel NuPAGE Laemeli s MES pufrem a vizualizací prostřednictvím Daichiiova protokolu barvení stříbrem. Frakce mající molekulovou hmotnost 12 kD, jak usuzováno ze srovnání se standardy molekulové hmotnosti, byly sloučeny a uloženy ve 4 °C. Spojené frakce byly analyzovány pomo-10 cí UV a elektroforézy v gelu. Sekvencování aminokyselin bylo prováděno absorpcí vzorku o objemu 100 μΐ na zásobník ProSorb (absorpce na membránu PVDF) a promytím pro odstranění solí pufru. Sekvencování bylo prováděno na přístroji Applied Biosystems 420. Byla pozorována očekávaná N-koncová sekvence (Μ Η V A Q P A V V L A). Imunopřenos prokázal, že peptid byl rozpoznáván CTLA^l proti-lidskou BNI3 (PharMingen). Pro odsolení byl alikvot obsahující 15 648 pg materiálu přenesen do dialyzačních trubiček 3500 D MWCO a byl dialyzován proti 0,1% TFA/H20 ve 4 °C po dobu 9 dnů s mícháním. Veškerý obsah dialyzačního váčku byl lyofilizován na prášek. (iii) Buňky 300.19 transfekované CTLA^t (Y201 V) 20

Kompletní cDNA CTLA^l byla amplifikována pomocí PCR zcDNA knihovny lidského thymu (Stratagene) a subklonována do plRESneo (Clontech). Byla zavedena mutace CTLA-4, která má za následek konstitutivní expresi na buněčném povrchu s použitím systému MatchMaker Muta-genesis (Promega). Mutace tyrosinu Y201 na valin inhibuje vazbu proteinu adaptinu AP50, který 25 je zodpovědný za rychlou internalizaci CTLA-4 (Chuang et al., J. Immunol., 159, 144 až 151, 1997). Buňky 300.19 myšího lymfomu bez mykoplazmat byly pěstovány v RPMI-1640 obsahujícím 10% fetální telecí sérum, neesenciální aminokyseliny, penicílin/streptomycin, 2mM gluta-min, 12,5mM Hepes pH 7,5 a 25 M beta-merkaptoethanol. Buňky byly transferovány elektropo-rací (3xl06/0,4 ml RPMI bez séra) v lml komůrce s 20 g CTLA-4-Y201 V/pIRESneo s použitím 30 200V/1180pF (Gibco CellPorator), Buňky byly ponechány v klidu 10 minut, a pak bylo přidáno 8 ml předem ohřátého kompletního média RPMI. Za 48 hodin byly buňky naředěny na 0,5xl06/ml kompletním médiem RPMI obsahujícím 1 mg/ml G418 (Gibco). Rezistentní buňky se rozšířily a vykazovaly expresi CTLA-4 na buněčném povrchu při použití protilátky BNI3 konju-gované s fykoerythrinem (PharMingen). Buňky s vysokou hladinou exprese byly izolovány 35 sterilním tříděním.

Imunizace a příprava hybridomu

Myši XenoMouse (staré 8 až 10 týdnů) byly imunizovány i) subkutánně do kořene ocasu 40 s lxl07 buněk 300.19, které byly transfekovány tak, aby exprimovaly CTLA-4, jak popsáno výše, a resuspendovány ve fyziologickém roztoku pufrovaném fosfáty (PBS) s kompletním Freundovým adjuvans, nebo ii) subkutánně do kořene ocasu s a) 10 g CTLA^4 fúzního proteinu nebo b) 10 g peptidu CTLA^l emulgovaného v kompletním Freundově adjuvans. V každém případě byla dávka opakována třikrát nebo čtyřikrát v nekompletním Freundově adjuvans. Čtyři 45 dny před fúzí dostaly myši poslední injekci imunogenu nebo buněk v PBS. Lymfocyty ze sleziny a/nebo lymfatických uzlin z imunizovaných myší byly fúzovány s buněčnou linií myšího nesek-rečního myelomu P3 a byly podrobeny selekci HAT tak, jak bylo popsáno dříve (Galfre, G. aMilstein, C., „Preparation of monoclonal antibodies, stratagies and procedures.“, Methods Enzymol., 73, 3 až 46, 1981). Byl získán velký panel hybridomu, které všechny sekretovaly 50 CTLA—4 specifické lidské IgG2A nebo IgG4A: protilátky (jak odhaleno níže).

Test ELISA ELISA pro zjišťování antigen-specifických protilátek v myším séru a v supematantech hybrido-55 mů byla prováděna tak, jak bylo popsáno (Coligan et al., oddíl 2.1, „Enzyme-linked immunosor- -30- CZ 303703 B6 bent assays,“, Current protocols in immunology, 1994) s použitím CTLA-4-Ig fúzního proteinu k záchytu protilátek. Zvířata, která byla imunizována fúzním proteinem CTLA-4-Ig, původci navíc testovali na nespecifickou reaktivitu proti lidské Ig části fúzního proteinu. To bylo prováděno s použitím ELISA destiček potažených lidským Ig jako negativní kontrolou specifity. 5

Ve výhodném testu ELISA byly použity následující techniky: ELISA destičky byly potahovány 100 pg/jamku potahovacím pufrem pro destičky s antigenem (0,1M uhličitanový pufr, pH 9,6 a NaHC03 (MW 84) 8,4 g/1). Potom byly destičky inkubovány io přes noc ve 4 °C. Po inkubaci byl potahovací pufr odstraněn a destička byla blokována 200 μΐ/jamku blokovacího pufru (0,5% BSA, 0,1% Tween 20, 0,01% Thimerosal v 1 x PBS) a inkubována při teplotě místnosti 1 hodinu. Nebo byly destičky s blokovacím pufrem uloženy v lednici a utěsněny. Blokovací pufr byl odstraněn a bylo přidáno 50 μ 1/jamku supematantu zhybridomu, séra nebo supematantu z jiného hybridomu (pozitivní kontrola) a média HAT nebo 15 blokovacího pufru (negativní kontrola). Destičky byly inkubovány 2 hodiny při teplotě místnosti. Po inkubaci byly destičky promyty promývacím pufrem (Ix PBS). Detekující protilátka (tj. myší proti-lidská IgG2-HRP (SB, #9070-05) pro protilátky IgG2 nebo myší proti—lidská IgG4-HRP (SB #9200-05) pro protilátky IgG4) byla přidána v množství 100 μΐ/jamku (myší proti-lidská IgG2-HRP v ředění 1:2000 nebo myší proti-lidská IgG4-HRP v ředění 1:1000 (každá naředěná 20 blokujícím pufrem). Destičky byly inkubovány při teplotě místnosti po dobu 1 hodiny, a pak promyty promývacím pufrem. Potom bylo do jamek přidáno 100 μΐ/jamku čerstvě připraveného vyvíjecího roztoku (10 ml substrátového pufru, 5 mg OPD (c^fenylendiamin, Sigma kat. č. P-7288) a 10 μΐ 30% H2O2 (Sigma). Destičky se ponechaly vyvíjet 10 až 20 minut, dokud se neobjevilo slabé zabarvení v jamkách s negativními kontrolami. Potom bylo přidáno 100 μΐ/jamku 25 stopovacího roztoku (2M H2SO4) a destičky byly odečítány na odečítacím zařízení pro destičky ELISA při vlnové délce 490 nm.

Zjišťování afinitních konstant plně lidských Mab pomocí zařízení BIAcore 30 Měření afinity purifikovaných lidských monoklonálních protilátek, Fab fragmentů nebo super-natantů z hybridomu prostřednictvím plazmonové rezonance bylo prováděno s použitím přístroje BIAcore 2000, s použitím obecných postupů uvedených výrobcem.

Kinetická analýza protilátek byla prováděna s použitím antigenů imobilizovaných s nízkou 35 denzitou na povrchu senzoru. Na třech površích senzorického čipu BIAcore byl imobilizován fúzní protein CTLA^4-Ig v hustotě pohybující se od přibližně 390 do 900 při použití fúzního proteinu CTLA^4-Ig v koncentraci 20 nebo 50 g/ml v lOmM acetátu sodném, pH 5,0, s použitím soupravy pro kondenzaci aminů dodávané výrobcem (BIAcore, lne.). Na čtvrtém povrchu senzorického čipu BIAcore byl imobilizován IgGl (900 RU) a byl použit jako negativní kontrolní 40 povrch pro nespecifickou vazbu, Kinetická analýza byla prováděna při rychlosti průtoku 25 nebo 50 μΙ/minutu a byly určovány disociační (kd nebo k<,ff) a asociační (ka nebo kon) rychlosti s použitím software poskytnutého výrobcem (BIA evaluation 3.0), který umožnil celkové výpočty. 45 Příklad 2 Měření afinity anti-CTLA-4 protilátek V následující tabulce jsou poskytnuty výsledky měření afinity některých z takto vybraných proti-50 látek. -31 - CZ 303703 B6

Tabulka I

Pevná fáze (pomocí BIAcore) Hybridom Rychlost asociace K* (M"1S’1 xlO6) Rychlost disociace Kd (S'1 xlO-4) Asociační konstanta KA (l/M) =ka/kd xlO10 Disociační konstanta KD (M) =kd/kaxlO"10 Povrchová denzita [RU] MoabOl 0,68 1, 01 0,67 1,48 878,7 0,70 4,66 0,15 6,68 504,5 0,77 6,49 0,19 8,41 457,2 0,60 3,08 0,20 5,11 397,8 4.1.1 1,85 0,72 2,58 0,39 878,7 1,88 1,21 1,55 0,64 504,5 1,73 1,54 1,13 0,88 457,2 1,86 1,47 1,26 0,79 397,8 4.8.1 0,32 0,07 4,46 0,22 878,7 0,31 0,23 1,33 0,75 504,5 0,28 0,06 4,82 0,21 397,8 4.14.3 2,81 3,04 0,92 1,08 878,7 2,88 3,97 0,73 1,38 504,5 2,84 6,66 0,43 2,35 457,2 3,17 5,03 0,63 1,58 397,8 6.1.1 0,43 0,35 1,21 0,83 878,7 0,46 0,90 0,51 1,98 504,5 0,31 0,51 0,61 1,63 457,2 0,45 0,79 0,57 1,76 397, 8 3.1.1 1,04 0,96 1,07 0,93 878,7 0,95 1,72 0,55 1,82 504,5 0,73 1,65 0,44 2,27 457,2 0,91 2,07 0,44 2,28 397,8 4.9.1 1,55 13,80 0,11 8,94 878,7 1,43 19,00 0,08 13,20 504,5 1,35 20,50 0,07 15,20 397,8 4.10.2 1,00 2,53 0,39 2,54 878,7 0,94 4,30 0,22 4,55 504,5 0,70 5,05 0,14 7,21 457,2 1,00 5,24 0,19 5,25 397,8 -32 - CZ 303703 B6 2.1.3 1,24 9,59 0,13 7,72 878,7 1,17 13,10 0, 09 11,20 504,5 1,11 13,00 0,09 11,70 397,8 4.13.1 1,22 5,83 0,21 4,78 878, 7 1,29 6,65 0,19 5,17 504,5 1,23 7,25 0,17 5,88 397,8

Jak je z údajů vidět, protilátky připravené podle vynálezu mají vysoké afinity a vazebné konstanty. Příklad 3

Struktury anti-CTLA—4 protilátek připravených podle vynálezu 10 V následující diskusi jsou poskytnuty strukturální informace týkající se protilátek připravených podle vynálezu.

Aby se analyzovaly struktury protilátek vytvořených podle vynálezu, vyklonovali původci geny 15 kódující fragmenty těžkého a lehkého řetězce z konkrétního hybridomu. Klonování genů a sekvencování bylo prováděno následovně:

Poly(A)+ mRNA byla izolována z přibližně 2x105 hybridomových buněk pocházejících z imunizovaných myší XenoMouse s použitím soupravy Fast-Track (Invitrogen). Po vytvoření cDNA 20 s náhodnými primery následovala PCR. Byly použity primery specifické pro variabilní oblasti rodin lidských VH nebo lidských V* (Marks et al., „Oligonucleotide primers for polymerase chain reaction amplification of human immunoglobulin variable genes and design of family-specific oligonucleotide probes.‘\ Eur. J. Immunol., 21, 985 až 991, 1991) ve spojení s primery specifickými pro konstantní oblast lidského C 2 (MG^40d, S^GCTGAGGGAGTAGAGTCCTGAGGA-25 3) nebo konstantní oblast Ck (h£P2, jak popsáno dříve v Green et al., 1994). Sekvence transkriptů lidských mAb pocházejících z těžkého řetězce a řetězce kappa z hybridomu byly získány přímým sekvencováním produktů PCR vzniklých z poly(A)+ RNA s použitím primerů popsaných výše. Produkty PCR byly také klonovány do pCRII s použitím TA klonovacího kitu (Invitrogen) a obě vlákna byla sekvencována s použitím souprav pro sekvencování s terminaění barevnou značkou 30 Prism a přístrojem pro sekvencování AB1 377. Všechny sekvence byly analyzovány pomocí srovnání s „V BASE sequence directory4" (Tomlinson et al., MRC Centre for Protein Enginee-ring, Cambridge, UK) s použitím programového software MacVector a Geneworks. Dále byla každá z protilátek 4.1.1,4.8.1, 11.2.1 a 6.1.1 podrobena sekvencování kompletní DNA. 35 Pro toto sekvencování byla izolována poly(A)1 mRNA z přibližně 4x106 hybridomových buněk s použitím soupravy mRNA Direct kit (Dynal). mRNA byla reverzně přepsána s použitím oligo-dT(18) a soupravy Advantage RT/PCR kit (Clontech). Byla použita databáze variabilních oblastí (V Base) pro navržení amplifikaěních primerů začínajících v počátečním místě ATG těžkého řetězce genu DP50: 40 5 -TATCTAAGCTTCTAGACTCGACCGCCACCATGGAGTTTGGGCTGAGCTG-3 a ke stop kodonu konstantní oblasti IgG2: 5 -TTCTCTGATCAGAATTCCTATCATTTACCCGGAGACAGGGAGAGCT-3. K počátečnímu místu ATG byla přidána 5 optimální Kozáková sekvence (ACCGCCACC). Stejná metoda byla použita pro návrh primerů k počátečnímu místu ATG řetězce kappa genu 45 A27: -33- CZ 303703 B6 5 -TCTTCAAGCTTGCCCGGGCCCGCCACCATGGAAACCCCAGCGCAG-3 a ke stop kodonu kappa konstantní oblasti: 5 -TTCTTTGATCAGAATTCTCACTAACACTCTCCCCTGTTGAAGC-3. 012 cDNA byla klonována s použitím primem k počátečnímu místu ATG: 5 -TCTTCAAGCTTGCCCGGGCCCGCCACCATGGCATGAGGGTCCCCGCT-3 a primem pro stop kodon kappa konstantní oblasti uvedeného výše. cDNA těžkého řetězce byly také klonovány jako genomové konstrukty místně cílenou mutagenezí přidáním místa Nhel na konec variabilní J domény a subklonováním fragmentu Nhel obsahujícím genomové oblasti IgG2 CH1 /kloubová oblast/CH2/CH3. Bodová mutace pro vznik místa Nhel nemění aminokyselinovou sekvenci proti sekvenci zárodečné linie. Páry primerů byly použity pro amplifikaci cDNA s použitím soupravy Advantage High Fidelity PCR Kit (Clontech). Sekvence z PCR byla získána přímým sek věncováním s použitím sekvenačních souprav s terminační barevnou značkou a přístrojem pro sekvencování AB1. Produkt PCR byl klonován do savčích expresních vektorů pEE-glutaminsyntetáza (Lonza) a tři klony byly sekvencovány pro potvrzení somatických mutací. U každého klonu byla sekvence verifikována na obou vláknech v přinejmenším třech reakcích. Neglykosylovaná protilátka 4.1.1 byla vytvořena místně cílenou mutagenezí N294Q v doméně CH2. Rekombinantní protilátky byly produkovány přechodnou transfekcí buněk Cos7 v FCS bez IgG a purifikovány s použitím standardních technik Protein A Sepharose. Stabilní transfektanty byly vytvářeny elektroporací myších buněk NSO a selekcí v médiu bez glutaminu. Rekombinantní 4.1.1 sglykosylací nebo bez ní projevovaly identickou specifitu a afinitu pro CTLA-4 v m vitro testech ELISA a BIAcore.

Analýza utilizace genu Následující tabulka uvádí utilizaci genu prokázanou vybranými hybridomovými klony protilátek podle vynálezu:

Tabulka II

Utilizace genů těžkého a lehkého řetězce

Klon Těžký řetězec Lehký řetězec kapa VH D JH VK JK 4.1.1 DP-50 DIR4 nebo DIR3 JH4 A27 JK1 4.S.1 DP-50 7-27 JH4 A27 JK4 4.14.3 DP-50 7-27 JH4 A2 7 JK3 6.1.1 DP-50 DIRS nebo DIR5rc JH4 A2 7 JK3 3.1.1 DP-5 0 3-3 JH6 012 JK3 4.10.2 DP-50 7-27 JH4 A2 7 JK3 2.1.3 DP-65 1-26 JH6 A10/A26 JK4 4.13.1 DP-50 7-27 JH4 A2 7 JK3 11.2.1 DP-50 Dl -2 6 JH6 012 JK3 11.6.1 DP-50 D2-2 nebo D4 0Ή6 012 JK3 11.7.1 DP-50 D3-22 nebo D21-9 JH4 012 JK3 12.3.1.1 DP-50 D3-3 nebo DXP4 JH6 AI 7 JK1 12.9.1.1 DP-50 D6-19 JH4 A3/A19 JK4 4.9.1 DP-47 5-24 a/nebo 6-19 JH4 L5 JK1 -34- CZ 303703 B6

Jak bylo pozorováno, protilátky podle předkládaného vynálezu byly vytvářeny se silnou tendencí k utilizaci variabilní oblasti těžkého řetězce DP-50. Gen DP-50 je také odkazován do rodiny genu VH 3-33. Pouze jedna protilátka, která byla selektována na základě vazby CTLA-4 a před-5 běžných in vitro funkčních testů vykázala utilizaci genu těžkého řetězce jiného než je DP-50. Tento klon, 2.1.3., používal variabilní oblast těžkého řetězce DP-6 a je izotypu IgG4. Gen DP-65 je také odkazován do rodiny genu VH 4-31. Na druhé straně klon 4.9.1, který má variabilní oblast těžkého řetězce DP-47, váže CTLA-4, ale neinhibuje vazbu k B7-1 nebo B7-2. U myší Xeno-Mouse je více než 30 odlišných funkčních variabilních genů těžkého řetězce, ke kterým se tvoří io protilátky. Tato tendence je tudíž ukazatel preferovaného vazebného motivu v interakci proti * látka-antigen s ohledem na kombinované vlastnosti vazby k antigenu a funkční aktivitu.

Mutační analýza 15 Jak bylo vyhodnoceno, analýza utilizace genů poskytuje pouze omezený přehled protilátkové struktury. Protože B lymfocyty myší XenoMouse náhodně vytvářej í transkripty V-D-J- těžkého řetězce nebo V-J kappa lehkého řetězce, je zde celá řada sekundárních procesů, které se objevují, včetně, ale bez omezení, somatické hypermutace, n-adicí a CDR3 extenzí. (Viz například Men-dez et al., Nátuře Genetics 15, 146 až 156, 1997, patentová přihláška Spojených států 20 č. 08/759 620, podaná 3. prosince, 1996. V souladu stím byly pro další zkoumání protilátkové struktury vytvářeny z cDNA získané z klonů predikované aminokyselinové sekvence protilátek. Navíc byly získány prostřednictvím sekvencování proteinů N-koncové aminokyselinové sekvence. 25 Obrázek 1 poskytuje nukleotidové a predikované aminokyselinové sekvence těžkých a kappa lehkých řetězců z klonů 4.1.1 (obrázek 1A), 4.8.1 (obrázek 1B), 4.14.3 (obrázek 1C), 6.1.1 (obrázek ID), 3.1.1 (obrázek 1E), 4.10.2 (obrázek 1F), 2.1.3 (obrázek 1G), 4.13.1 (obrázek 1H), 11.2.1 (obrázek II), 11.6.1 (obrázek 1J), 11.7.1 (obrázek 1K.), 12.3.1.1 (obrázek 1L) a 12.9.1.1 (obrázek 1M). Na obrázcích ΙΑ, 1B a ID jsou uvedené rozšířené sekvence protilátek 4.1.1, 4.8.1 30 a 6.1.1 získané klonováním kompletních cDNA, jak popsáno výše. Na těchto obrázcích jsou sekvence signálního peptidu (nebo báze kódující totéž) označeny tučně a sekvence používané pro 5 PCR reakce jsou podtrženy.

Obrázek 2 poskytuje srovnání sekvencí mezi predikovanými aminokyselinovými sekvencemi 35 těžkého řetězce zklonů 4.1.1, 4.8.1, 4.14.3, 6.1.1, 3.1.1, 4.10.2, 4.13.1, 11.2.1, 11.6.1, 11.7.1, 12.3.1.1 a 12.9.1.1 a aminokyselinovou sekvencí zárodečné linie DP-50 (3-33). Rozdíly mezi sekvencí zárodečné linie DP-50 a sekvencemi z klonů jsou označeny tučným písmem. Obrázek také ukazuje pozice sekvencí CDR1, CDR2 a CDR3 protilátek jako stínované. 40 Obrázek 3 poskytuje srovnání sekvencí mezi predikovanou aminokyselinovou sekvencí těžkého řetězce klonu 2.1.3 a aminokyselinovou sekvencí zárodečné linie DP-65 (4-31). Rozdíly mezi sekvencí zárodečné linie DP-6 a sekvencí z klonu jsou označeny tučným písmem. Obrázek také ukazuje pozice sekvencí CDR1, CDR2 a CDR3 protilátky jako podtržené. 45 Obrázek 4 poskytuje srovnání sekvencí mezi predikovanou aminokyselinovou sekvencí kappa lehkého řetězce zklonů 4.1.1, 4.8.1, 4.13.3, 6.1.1, 4.10.2 a 4.13.1 a aminokyselinovou sekvencí zárodečné linie A27. Rozdíly mezi sekvencí zárodečné linie A27 a sekvencemi z klonů jsou označeny tučným písmem. Obrázek také ukazuje pozice sekvencí CDR1, CDR2 a CDR3 protilátek jako podtržené. Zřejmě delece v CDR klonů 4.8.1,4.14.3 a 6.1.1 jsou označeny „0“ 50

Obrázek 5 poskytuje srovnání sekvencí mezi predikovanou aminokyselinovou sekvencí kappa lehkého řetězce zklonů 3.1.1, 11.2.1., 11.6.1 a 11.7.1 a aminokyselinovou sekvencí zárodečné linie 012. Rozdíly mezi sekvencí zárodečné linie 012 a sekvencí zklonů jsou označeny tučným písmem. Obrázek také ukazuje pozice sekvencí CDR1, CDR2 a CDR3 protilátek jako podtržené. -35 - 55 CZ 303703 B6

Obrázek 6 poskytuje srovnání sekvencí mezi predikovanou aminokyselinovou sekvencí kappa lehkého řetězce klonu 2.1.3 a aminokyselinovou sekvencí zárodečné linie A10/A26. Rozdíly mezi sekvencí zárodečné linie AI 0/A26 a sekvencí z klonu jsou označeny tučným písmem. Obrázek také ukazuje pozice sekvencí CDR1, CDR2 a CDR3 protilátek jako podtržené.

Obrázek 7 poskytuje srovnání sekvencí mezi predikovanou aminokyselinovou sekvencí kappa lehkého řetězce klonu 12.3.1 a aminokyselinovou sekvencí zárodečné linie AI7. Rozdíly mezi sekvencí zárodečné linie AI 7 a sekvencí z klonu jsou označeny tučným písmem. Obrázek také ukazuje pozice sekvencí CDR1, CDR2 a CDR3 protilátek jako podtržené.

Obrázek 8 poskytuje srovnání sekvencí mezi predikovanou aminokyselinovou sekvencí kappa lehkého řetězce klonu 12.9.1 a aminokyselinovou sekvencí zárodečné linie A3/A19. Rozdíly mezi sekvencí zárodečné linie A3/A19 a sekvencí z klonu jsou označeny tučným písmem. Obrázek také ukazuje pozice sekvencí CDR1, CDR2 a CDR3 protilátek jako podtržené.

Obrázek 22 poskytuje série dalších nukleotidových a aminokyselinových sekvencí následujících anti-CTLA—4 proti látkových řetězců: 4.1.1: kompletní 4.1.1 těžký řetězec (cDNA 22(a), genomová 22(b) a aminokyselinová 22(c)) kompletní neglykosylovaný 4.1.1 těžký řetězec (cDNA 22(d) a aminokyselinová 22(e)) 4.1.1 lehký řetězec (cDNA 22(f) a aminokyselinová 22(g)) 4.8,1: kompletní 4.8.1 těžký řetězec (cDNA 22(h) a aminokyselinová 22(i)) 4.8.1 lehký řetězec (cDNA 22(j) a aminokyselinová 22(k)) 6.1.1: kompletní 6.1.1 těžký řetězec (cDNA 22(1) a aminokyselinová 22(m)) 6.1.1 lehký řetězec (cDNA 22(n) a aminokyselinová 22(o)) 11.2.1: kompletní 11.2.1 těžký řetězec (cDNA 22(p) a aminokyselinová 22(q)) 11.2.1 lehký řetězec (cDNA 22(r) a aminokyselinová 22(s))

Sekvence signálního peptidu jsou označeny tučným písmem a velkým textem. Otevřené čtecí rámce kompletní sekvence 4.1.1 genomové DNA (obr. 22(b)) jsou podtržené. A mutace zavedené pro vytvoření neglykosylovaného 4.1.1 těžkého řetězce a výsledná změna (N294Q) jsou označeny podtržením a tučným textem (sekvence cDNA (obr. 22(b)) a aminokyselinová sekvence (obr. 22(c)). Příklad 4

Analýza aminokyselinových substitucí těžkého a lehkého řetězce

Na obrázku 2, který poskytuje srovnání sekvencí mezi predikovanými aminokyselinovými sekvencemi těžkého řetězce z klonů 4.1.1, 4.8.1, 4.14.3, 6.1.1, 3.1.1, 4.10.2, 4.13.1, 11.2.1, 11.6.1, 11.7.1, 12.3.1.1 a 12.9.1.1 a aminokyselinovou sekvencí zárodečné linie DP-50 (3-33), vyšel najevo zajímavý vzor. Navíc k faktu dispozice pro těžký řetězec DP-50 ve většině klonů, existuje relativně omezená hypermutace v protilátkách příbuzných s genem zárodečné linie DP-50. Například klony 3.1.1 a 11.2.1 neměly žádné mutace. Navíc mutace v dalších klonech jsou všeobecně konzervativní změny týkající se substitucí aminokyselin s podobnými vlastnostmi s aminokyselinovými v zárodečné linii. Mutace v mnoha sekvencích CDR1 a CDR2 jsou obzvláště konzervativní povahy. Tři těžké řetězce zobrazené na obrázku 2, 4.10.2, 4.13.1 a 4.14.3, jasně -36- CZ 303703 B6 pocházejí od jednoho rekombinantního jevu (tj. pocházejí z totožného germinálního centra) a mají téměř totožnou sekvenci. Jestliže jsou tyto tři považovány za jednu sekvenci, pak z 10 rozdílných protilátek obsahujících DP50 těžký řetězec, jsou v CDR1 a CDR2 3 pozice, ve kterých je nepolární zbytek nahrazen jiným nepolárním zbytkem, 12, kdy je polární nenabitý zbytek nahrazen jiným polárním nenabitým zbytkem a 1, ve které je polární nabitý zbytek nahrazen jiným polárním nabitým zbytkem. Navíc jsou dvě pozice, ve kterých jsou dva zbytky, které jsou velice podobné strukturálně, glycin a alanin, substituovány navzájem. Jediné mutace, které nejsou striktně konzervativní, se týkají 3 substitucí polárního nabitého zbytku polárním nenabitým zbytkem a jedné substituce nepolárního zbytku polárním zbytkem.

Lehké řetězce těchto protilátek pocházejí z 5 rozdílných genů Vk. Gen A27 je zastoupen nejvíce a je zdrojem 6 odlišných lehkých řetězců. Srovnání těchto 6 sekvencí odhalilo dvě pozoruhodné charakteristické stránky. Zaprvé tři z nich, 4.8.1, 4.14.3 a 6.1.1, obsahují delece jednoho nebo dvou zbytků v CDR1, což je vzácný jev. Za druhé, existuje silný důvod proti šeřinu v pozici šest v CDR3 zárodečné linie, a serin je v každé sekvenci nahrazen. To svědčí pro to, že serin v této pozici je nekompatibilní s vazbou CTLA^4.

Uznává se, že mnoho z výše identifikovaných aminokyselinových substitucí existuje v těsné blízkosti sCDR nebo v CDR. Zdá se, že tyto substituce mají určitý vliv na vazbu protilátky k molekule CTLA^L Dále tyto substituce by mohly mít významný účinek na afinitu protilátek. Příklad 5

Analýza N-koncové aminokyselinové sekvence protilátek podle vynálezu

Aby se dále verifikovalo složení a struktura protilátek podle vynálezu identifikovaných výše, sekvencovali původci několik těchto protilátek s použitím sekvenačního přístroje Perkin-Elmer. Byly izolovány oba, těžký a kappa lehký řetězec protilátek, a purifikovány prostřednictvím pre-parativní gelové elektroforézy a elektropřenosu, a pak přímo sekvencovány, jak je popsáno v příkladu 6. Většina sekvencí těžkého řetězce byla blokována na svém amino-koni. Tyto protilátky byly tedy nejdříve ošetřeny pyroglutamátaminopeptidázou, a pak sekvencovány. Výsledky tohoto pokusu jsou ukázány na obrázku 9. Obrázek 9 také poskytuje molekulovou hmotnost těžkého a lehkého řetězce, jak byly určeny hmotnostní spektroskopií (MALDI). Příklad 6

Další charakterizace protilátek podle vynálezu

Obrázek 10 poskytuje některé další charakteristické informace o určitých protilátkách podle vynálezu. Na obrázku jsou sumarizována data týkající se klonů 3.1.1, 4.1.1,4.8.1, 4.14.3 a 6.1.1. Jsou poskytnuta následující data: koncentrace, izoelektrické „zaostřování" („focusing") (IEF), SDS—PAGE, vylučovací chromatografíe, FACS, hmotnostní spektroskopie (MALDI) a N-koncové sekvence lehkého řetězce.

Data všeobecně byla získávána následovně:

Materiál a metody:

Proteinová koncentrace byla zjišťována při 280 nm z UV skenu (200 až 350 nm), kdy 1,58 jednotky absorbance při 280 nm odpovídalo 1 mg/ml. -37- CZ 303703 B6 SDS-PAGE byla prováděna s použitím elektroforetického systému s 10% gelem NuPAGE a pracovním pufrem MES. Vzorky byly připraveny ředěním 3:1 s 4x pufrem NuPAGE pro vzorky (+/-), beta merkaptoethanolem, zahřátím a na gel bylo naneseno -5 g proteinu. Gel byl pak obarven barvicím roztokem Brilliant Blue R (Sigma kat. č. B-6529) a molekulové hmotnosti byly vyhodnoceny srovnáním obarvených pásů se standardy „Perfect Protein Markers“ (Novagen kat. č. 69149-3).

Pro N-koncové sekvencování byly vzorky děleny tak, jak je uvedeno výše, na gelech NuPAGE, přeneseny na imobilizační membránu Pro Blot (Applied Biosystems), a pak obarveny modří Coomassie Blue R-250. Obarvené proteinové pásy byly vyříznuty a podrobeny sekvenační analýze pomocí automatizované Edmanovy degradace na sekvenačním přístroji Applied Biosystems 494 Procise HT Sequencer.

Izoelektrické zaostřování (IEF) bylo prováděno s použitím gelů Pharmacia IEF 3-9 pHast (kat. č. 17-0543-01). Vzorky byly naředěny 10% glycerolem na koncentraci ~0,8 mg/ml a 1 μΐ byl nanesen na gel, a poté obarven. Flodnoty pí pak byly vyhodnoceny srovnáním obarvených pásů se standardy IEF pro široké rozmezí (pH 3 až 10) (Pharmacia, kat. č. 17-0471-01).

Vylučovací chromatografie (SEC) byla prováděna ve fyziologickém roztoku pufrovaném fosfáty (PBS) na systému SMART Pharmacia s použitím kolony Superdex 75 PC 3.2/30. Molekulové hmotnosti byly vyhodnoceny srovnáním retenčního času vrcholu s retenčním časem gelu.

Pro studie FACS byly připraveny lidské periferní T lymfocyty a 48 hodin stimulovány. T lymfo-cyty byly jednou promyty, resuspendovány ve FACS pufru v množství lxlO6 buněk/ΙΟΟμΙ a barveny na povrchovou expresi CD3 s 10 μΐ anti^CD3-FITC (lmmunotech, Marseille, Francie) po dobu 30 minut při teplotě místnosti. Buňky byly promyty dvakrát, pak fixovány, permeabili-zovány (Fix and Perm, Caltag) a obarveny na intracelulámí expresi CTLA—4 s 10 μΐ anti-CD152-PE (Pharmingen). Průtoková cytometrie byla prováděna s použitím přístroje FACsort Becton Dickinson. Kvadranty byly ustanoveny analýzou relevantních izotypových kontrolních protilátek (Caltag).

Jak bylo diskutováno výše, bylo prokázáno, že anti-CTLA—4 protilátky mají spolehlivou silnou imunomodulační aktivitu. Následující pokusy byly prováděny proto, aby se určilo, jestli protilátky podle předkládaného vynálezu mají tuto aktivitu. Pokusy byly obecně navrženy pro stanovení schopnosti protilátek inhíbovat interakcí mezi molekulami CTLA—4 a B7, být selektivní pro molekuly CTLA-4, B7 a CD28 a podporovat produkci cytokinů T lymfocyty, včetně, ale bez omezení, exprese IL-2 a/nebo IFN-. Dále se vyšetřovala zkřížená reaktivita protilátek podle vynálezu s některými lidskými tkáněmi a molekulami CTLA-4 jiných živočišných druhů (např. myší a primátů). Příklad 7

Kompetitivní ELISA: inhibice interakce CTLA-4/B7-1 nebo B7-2 protilátkami podle vynálezu

Byl prováděn in vitro test, aby se určilo, jestli byly protilátky podle předkládaného vynálezu schopné inhibice vazby CTLA-4 s B7-1 nebo B7-2. Jak bylo uznáno, očekává se, že protilátky podle vynálezu, které jsou schopné inhíbovat vazbu CTLA-4 s molekulami B7, jsou kandidáty pro regulaci imunity prostřednictvím metabolické dráhy CTLA—4. V testu byly použity následující materiály a metody:

Materiály a metody 96-jamkové destičky MaxiSorp byly potaženy 3 nM B7.1-Ig(Gl) nebo B7.2-Ig(Gl) (Repligen, lne. Needham, MA) v Dulbeccově PBS a inkubovány ve 4 °C přes noc. Druhý den byl B7-Ig -38- CZ 303703 B6 odstraněn a destičky byly blokovány 1% BSA s 0,05% Tween-20 v D-PBS po dobu dvou hodin. Destičky byly promyty 3x promývacím pufrem (0,05% Tween-20 v D-PBS). Protilátky v příslušných testovaných koncentracích a CTLA^t-íg(G4) (0,3 nM konečná koncentrace) (Repligen, lne. Needham, MA) byly předem míchány po dobu 15 minut a pak přidány na destičku potaže-5 nou B7-Ig (60 μΐ celkový objem) a inkubovány při teplotě místnosti 1,5 hodiny. Destičky byly promyty 3x a bylo přidáno 50 μΐ ředění 1 až 1000 myší protilidské protilátky IgG4 konjugované s HRP (Zymed, San Francisco, CA, č. 05-3820) a destičky byly inkubovány 20 minut při teplotě místnosti, a pak bylo na destičku přidáno 50 μί 1N H2SO4. Destičky byly odečítány ve 450 nm s použitím odečítacího zařízení pro destičky od Molecular Devices (Sunnyvale, CA). Všechny 10 vzorky byly testovány v duplikátech. Maximální signál byl definován jako vazba CTLA^l v nepřítomnosti testované protilátky. Nespecifická vazba byla definována jako absorbance v nepřítomnosti CTLA—4-Ig a testované protilátky. Výsledky testu jsou uvedeny v tabulkách IIIA a 1IIB. V tabulce IIIA jsou výsledky uvedeny pro 15 celou řadu protilátek podle vynálezu. V tabulce IIIB jsou uvedeny výsledky srovnávající protilátku 4.1.1 podle vynálezu s protilátkou 11.2.1 podle vynálezu ze samostatného pokusu.

Tabulka 111A 20

Klon CTLA-4-Ig Izotyp CTLA-4/B7.2 komp. ELISA IC50 (nM) CTLA-4/B7.1 komp. ELISA IC50 (nM) CT3.1.1 IgG2 0,45+0,07 (n-3) 0,63±0,10 (n=2) CT4.1.1 IgG2 0,38+0,06 (n=5) 0,50+0,05 (n=2) CT4.8.1 IgG2 0,57+0,03 (n=3) 0,17+0,28 (n=2) CT4.9.1 IgG2 Nekompetitivní (n=3) Nekompetitivní (n=2) CT4.10.2 IgG2 1,50±0,3 7 (n=3) 3,39+0,31 (n=2) CT4.13.1 IgG2 0,4 9±0,05 (n=3) 0,98±0,11 (n=2) CT4.14.3 IgG2 0,69±0,11 (n=3) 1,04+0,15 (n=2) CT6.1.1 igG2 0,39+0,06 (n=3) 0,67+0,07 (n=2)

Tabulka IIIB 25

Klon CTLA-4-Ig Izotyp CTLA-4/B7.2 komp. ELISA IC5 0 (nM) CTLA-4/B7.1 komp. ELISA IC50 (nM) CT4.1.1 IgG2 0,55±0,08 (n=4) 0,87±0,14 (n=2) CT11.2.1 IgG2 0,56+0,05 (n=4) 0,81+0,24 (n=2) -39- CZ 303703 B6 Příklad 8

Poměr selektivity protilátek podle vynálezu k CTLA—4 ve srovnání s CD28 nebo B7-2

Byl prováděn další in vitro test, aby se určila selektivita protilátek podle vynálezu vzhledem k CTLA-4 buď proti CD28, nebo B7-2. V pokusech byly použity následující materiály a metody- ELISA na selektivitu CTLA-4: Materiály a metody 96-jamková destička FluroNUNC (Nunc kat. č. 475515) byla potažena čtyřmi antigeny: CTLA-4/Ig, CD44/Ig, CD28/Ig a B7.2/Ig (antigeny vytvořené ve vlastní laboratoři). Destička byla potahována přes noc ve 4 °C antigeny v koncentraci 1 g/ml v množství 100 μΐ/jamku v 0,1M pufru hydrogenuhličitanu sodném, pH 96. Destička pak byla promyta s PBST (PBS + 0,1% Tween-20) třikrát s použitím myčky destiček NUNC. Destička byla blokována s PPBST +0,5% BSA v množství 150 μΐ/jamku. Destička byla inkubována při teplotě místnosti po dobu 1 hodiny, a pak promyta třikrát s PBST. Pak byly naředěny anti-CTLA-4 protilátky podle vynálezu en bloc v 1 g/ml a byly přidány na destičku. Destička byla inkubována při teplotě místnosti po dobu 1 hodiny, a pak promyta třikrát s PBST. Jamky, které obsahovaly protilátky podle vynálezu, pak byly ošetřeny 100 μΐ/jarnku proti-lidským IgG2-HRP (Southern Biotech kat.č. 9070-05) v ředění 1:4000 en bloc. Jedna řada byla také ošetřena proti-lidským IgG (Jackson kat, č, 209-035-088) pro normalizaci potažení destiček. Tato protilátka byla naředěna 1:5000 en bloc a přidána v množství 100 μΐ/jamku. Jedna řada byla také ošetřena proti-lidským CTLA—4—HRP (Pharmin-gen, kat. č. 345815/konjugováno s HRP na přání zákazníka) jako pozitivní kontrola. Tato protilátka byla použita v množství 0,05 g/ml ředěná en bloc. Destička byla inkubována při teplotě místnosti po dobu 1 hodiny, a pak promyta třikrát s PBST. LBA chemiluminiscenční substrát (Pierce) byl přidán v množství 100 μΐ/jamku a destička byla inkubována na třepačce destiček 5 minut. Destička pak byla odečtena s použitím zobrazovacího zařízení luminiscence po 2 minutové expozici.

Test selektivity vazby IGEN pro CTLA—4: materiály a metody

Perličky M-450 Dynabeads (Dynal A.S., Oslo, Norsko č. 140.02) byly promyty 3x pufrem fosfátem sodným, pH 7,4, a resuspendovány v pufru fosfátu sodném. Ke 100 μΐ perliček byl přidán 1,0 g CTLA—4—1 g(G 1), 1,0 g CD28-Ig(G 1) nebo 1,0 až 3,0 g B7.2-Ig(G 1) (Repligen, lne. Needham, MA) a byly inkubovány přes noc na rotátoru ve 4 °C. Druhý den byly perličky promyty 3x v 1% BSA plus 0,05% Tween-20 v Dubleccově PBS a blokovány 30 minut. Perličky byly naředěny 1 až 10 blokujícím pufrem a 25 μΐ potažených perliček bylo dáno do polypropylenových zkumavek 12x75 mm. Všechny vzorky byly testovány v duplikátu. Do zkumavek bylo přidáno 50 μΐ testované protilátky (konečná koncentrace 1 g/ml) nebo blokujícího pufru a inku-bováno 30 minut na karuselovém pásu analyzátoru Origen 1,5 (IGEN International, lne., Gaithersburg, MD) při teplotě místnosti, vortexováno 100 rpm. Do zkumavek bylo přidáno 25 μΙ myší proti-lidské IgGl, IgG2 nebo IgG4 s rutheniem (Zymed, lne., San Francisco, CA, č. 05-3300, 05-3500 a 05-3800) (konečná koncentrace 3 g/ml ve 100 μΐ celkového objemu). Zkumavky byly inkubovány 30 minut při teplotě místnosti na karuselovém pásu, vortexováno 100 rpm. Bylo přidáno 200 μΐ pufru testu Origen (IGEN International, lne., Gaithersburg, MD, č. 402-050-03) do každé zkumavky, krátce vortexováno, a pak byly zkumavky odečítány na analyzátoru Origen a pro každou zkumavku byly určeny jednotky ECL (elektrochem i luminiscence). Byly zjištěny normalizační faktory pro opravu odchylek vazby fúzních proteinů na perličky Dynabeads a jednotky ECL byly korigovány na nespecifickou vazbu před výpočtem stupně selektivity. Výsledky testů jsou uvedeny v tabulkách IVA a IVB. -40- CZ 303703 B6

Tabulka IVA

Klon Izotyp CTLA4/CD28 ELISA CTLA4/B7.2 ELISA CTLA4/CD44 ELISA CTLA4/CD28 IGEN CTLA4/B7.2 IGEN 3.1.1 IgG2 >500:1 (n=3) >500:1 (n=3) >500:1 (n=3) >500:1 (n-2) >500:1 (n-1) 195:1 (n=l) 4.1.1 IgG2 >500:1 (n=3) >500:1 (n-2) 485:1 (n=l) >500:1 (n=3) >500:1 (n-1) 261:1 (n=l) >500:1 (n-1) 107:1 (n-1) 4.8.1 IgG2 >500:1 (n=3) >500:1 (n-2) 190:1 (n=l) >500:1 (n»3) >500:1 (n=2) >500:1 (n-2) 4.9.1 IgG2 >500:1 (n=2) 244:1 (n=l) >500:1 (n=2) 33:1 (n-1) >500:1 (n=3) >500:1 (n-l) >500:1 (n=l) 4.10=2 TgG2 >500:1 ín=3) >500:1 (n=3} >500:1 (n=3) >500:1 (n-1) >500:1 (n=l) 4.13.1 IgG2 >500:1 (n=2) 46:1 (nsl) >500:1 (n=3) >500:1 (n=3) >500:1 (n-1) 329:1 (n=l) >500:1 (n-2) 4.14.3 IgG2 >500:1 (n-2) 80:1 (n=l) >500:1 (n=2) 10:1 (n=i) >500:1 (n=2) 126:1 (tl=l) >413:1 (n-1) >234:1 (n-1) 6.1.1 IgG2 >500:1 (n=2) 52:1 (n=l) >500:1 (n=3) >500:1 (n=3) >500:1 (n=2) >500:1 (n-2) 5

Tabulka IVB

Klon Izotyp CTLA4/CD28 CTLA4/B7.2 CTLA4/hIgG ELISA ELISA ELISA 4.1.1 IgG2 >500:1 {n=3) >500:1 (n=2) >500:1 (n=3) 11.2.1 IgG2 >500:1 (n=3) >500:1 (n=3) >500:1 ín=3) io Příklad 9

Model buněčného signálu lidských T lymfocytů

Pro další vymezení aktivity protilátek podle vynálezu při působení jako regulátorů imunity, 15 vyvinuli původci některé testy T lymfocytů, aby se kvantifikovalo zvýšení produkce IL-2 T lymfocyty při blokádě CTLA-4 signálu protilátkami. Při těchto pokusech byly použity následující materiály a metody:

Materiály a metody 20 Čerstvě izolované lidské T lymfocyty byly připraveny a použitím Histopaque (Sigma, St. Louis, MO, ě. A-70543) a T-kwik (Lympho-Kwik, One Lambda, Canoga Park, CA, ě. LK-50-T) a stimulovány s PHA (1 g/ml) (purifikovaný fytohemaglutinin, Murex Diagnostics Ltd., Dartford, England, č. HA 16) v médiu (RPM1 1640, obsahující L-glutamin, MEM neesenciální aminokyse- -41 - CZ 303703 B6 liny, penicilín, streptomycin, 25 mM Hepes a 10% FBS) v koncentraci lxlO6 buněk/ml a inku-bovány ve 37 °C po 2 dny. Buňky byly promyty a naředěny médiem na 2x106 buněk/ml. Buňky Ráji (Burkittův lymfom, lidský, ATCC č.: CCL 86 Class II American Type Culture Collection, Rockville, MD) byly ošetřeny mitomycinem C (Sigma, St. Louis, MO, č. M-4287) (25 g/ml) jednu hodinu ve 37 °C. Buňky Ráji byly promyty 4x v PBS a resuspendovány v množství 2x106 buněk/ml. Lidské T lymfoblasty (5xl0s/ml), buňky Ráji (5xl05/ml) a anti-CTLA-4 protilátky nebo kontrolní protilátka souhlasného izotypu v různých koncentracích byly přidány na 96-jamkové mikrotitrační destičky a destičky byly inkubovány ve 37 °C po 72 hodin. Celkový objem jamky byl 200 μΐ. 72 hodin po stimulaci byly destičky stočeny a supematant byl odstraněn a zamražen pro pozdější zjišťování IL-2 (Quantikine IL-2 ELIS A kit, R&D Systems, MN, č. D 2050) a IFN- (Quantikine IL-2 ELISA kit, R&D Systems). Zvýšení cytokinů bylo definováno jako rozdíl mezi hladinami cytokinů v tkáňových kulturách obsahujících anti-CTLA—4 blokující mAb proti kontrolní protilátce souhlasného izotypu. Pro experimenty s průtokovou cytometrií byly buňky Ráji promyty Ix pufrem FACS (PBS obsahující 2% teplem inaktivované FCS, 0,025% azid sodný). Buněčné pelety byly resuspendovány v pufru FACS v množství 1x106 buněk/100 μΙ a inkubovány s 10 μΐ anti-CD80-PE (Becton Dickinson, San Jose, CA) nebo anti-CD86-PE (Pharmingen, San Diego) po dobu 30 minut při teplotě místnosti. Buňky byly promyty dvakrát a resuspendovány v 1 ml pufru FACS. Průtoková cytometrie byla prováděna s použitím přístroje Becton Dickinson FACSort. Histogramové markéry byly nastavené analýzou relevantních izotypových kontrolních protilátek (Caltag, Burlingame, CA). Původci obecně vyvinuly test, který může být použit pro rychlé určení aktivace IL-2 T lymfocy-ty. Jak bylo uznáno, stimulace T lymfocytů je závislá na B7 a CD28. Navíc promyté T blasty netvořily zjistitelný IL-2 a buňky Ráji netvořily zjistitelný IL-2, dokonce ani když byly stimulovány LPS nebo PWM. Ale, v kombinaci, T blasty společně pěstované s buňkami Ráji mohou modelovat signální jevy B7, CTLA^l a CD28 a může na nich tedy být hodnocen účinek protilátek.

Obrázek 11 ukazuje expresi B7-1 a B7-2 na buňkách Ráji při použití anti-CD80-PE a anti-CD86-Pe mAb a s použitím průtokové cytometrie (FACS), jak je popsáno v příkladu 6.

Obrázek 12 ukazuje na koncentraci závislé zvýšení produkce IL-2 v testu s T lymfoblasty/Raji indukované protilátkami blokujícími CTLA^4 (ΒΝΪ3 (Pharmingen) a 4.1.1, 4.8.6 a 6.1.1 protilátkami podle vynálezu).

Obrázek 13 ukazuje na koncentraci závislé zvýšení produkce IFN- v testu sT lymfoblasty/Raji indukované protilátkami blokujícími CTLA-4 (BNI3 (Pharmingen) a 4.1.1, 4.8.6 a 6.1.1 protilátkami podle vynálezu) (stejné dárcovské) T lymfocyty).

Obrázek 14 ukazuje průměrné zvýšení produkce IL-2 v T lymfocytech od 6 dárců indukované protilátkami blokujícími CTLA^l v testu sT lymfoblasty/Raji. Je zajímavé zvážit, že mAb CT4.9.1 se váže na CTLA^4, ale neblokuje vazbu B7. Tedy pouhá vazba na CTLA^4 nepostačuje sama zajistit funkční protilátku podle vynálezu.

Obrázek 15 ukazuje průměrné zvýšení produkce IFN- v T lymfocytech od 6 dárců indukované protilátkami blokujícími CTLA^l v testu s T lymfoblasty/Raji.

Obrázek 19 ukazuje srovnání mezi 4.1.1 a 11.2.1 protilátkami podle vynálezu v koncentraci 30 g/ml v 72 hodinovém testu s T lymfoblasty/Raji, jak bylo popsáno v tomto příkladu 9 a v testu se superantigenem popsaném v příkladu 10.

Obrázek 20 ukazuje na koncentraci závislé zvýšení produkce IL-2 v testu sT lymfoblasty/Raji indukované 4.1.1 a 11.2.1 CTLA-4 protilátkami podle vynálezu. -42- CZ 303703 B6 Následující tabulka IVC poskytuje informaci týkající se průměrného zvýšení a rozsahu zvýšení cytokinové odpovědi v testech Ráji a SEA podle vynálezu. Každý z pokusů zahrnutých ve výsledcích je založen na protilátce v dávce 30 g/ml a měřen v 72 hodinách. Jsou uvedeny počty dárců zúčastněných v pokusech, jakož i odpovědi. 5

Tabulka IVC

Test mAb Cytokin Průměrné zvýšení pg/ml SEM Rozsah zvýšení pg/ml n Reakce dárců T lymfoblasty/ Ráji 4.1.1 IL-2 3329 408 0 až 8861 42 19 z 21 T lymfoblasty/ Raj i 4.1.1 IFN- 3630 980 600 až 13939 17 13 ze 13 T lymfoblasty/ Raj i 11.2.1 IL-2 3503 488 363 až 6424 18 14 zc 14 SEA (PBMC) 4.1.1 IL-2 2800 312 330 až 6699 42 17 ze 17 SEA (PBMC) 11.2.1 IL-2 2438 366 147 až 8360 25 15 z 15 SEA (plná krev) 4.1.1 TL-2 6083 665 -168 až 18417 46 15 ze 17 SEA (plná krev) 11.2.1 IL-2 6935 700 -111 až 11803 25 12 z 14 Příklad 10

Model signálu T lymfocytů u člověka 15 Původci vyvinuli druhý buněčný test, aby se kvantifikovalo zvýšení aktivace 1L-2 T lymfocyty při blokádě signálu CTLA-4 protilátkami. Při těchto pokusech byly použity následující materiály a metody: 20 Materiály a metody

Lidské PBMC byly připraveny s použitím Accuspin. Mikrotitrační destičky byly předem potaženy s anti-CD3 protilátkou (leu4, Becton Dickinson) (60 ng/ml) a inkubovány 2 hodiny ve 37 °C. Do jamek byly přidány hPBMC v množství 200 000 buněk na jamku. Do jamek byl přidán 25 stafylokokový enterotoxin A (SEA) (Sigma) v koncentraci 100 ng/ml. Do jamek byly přidány protilátky, obvykle v koncentraci 30 g/ml. Pak byly buňky stimulovány 48, 72 nebo 96 hodin. Destičky byly stočeny v žádoucím časovém bodu a z jamek byl odstraněn supernatant. Potom byla v supematantu vyšetřována produkce IL-2 s použitím ELIS A (R&D Systems). 30 Výsledky z těchto pokusů jsou ukázány na obrázcích 16, 17 a 21. Na obrázku 16 byla měřena indukce produkce IL-2 v hPBMC od 5 dárců 72 hodin po stimulaci. Na obrázku 17 jsou ukázány výsledky z měření plné krve rozebírající rozdíl v indukci produkce IL-2 v krvi 3 dárců, jak byla měřena 72 a 96 hodin po stimulaci. 35 Na obrázku 21 je zvýšení produkce IL-2 v plné krvi 2 dárců, jak měřeno 72 hodin po stimulaci. -43 - CZ 303703 B6 Příklad 11

Model nádoru u zvířat 5 Původci nastolili model nádoru u zvířat pro in vivo analýzu proti-myších CTLA-4 protilátek při inhibici nádorového růstu. V tomto modelu nádoru je pěstován myší fibrosarkom a zvířata jsou ošetřována proti-myšími CTLA-4 protilátkami. Materiály a metody pro zavedení modelu jsou poskytnuty níže: 10

Materiály a metody

Samicím myší A/J (ve věku 6 až 8 týdnů) byly podány subkutánní injekce do dorzální strany krku s 0,2 ml nádorových buněk SalN (lxlO6) (Baskar 1995). Intraperitoneální injekcí byla podána 15 proti-myší CTLA^l nebo kontrolní protilátka souhlasného izotypu (Pharmingen, San Diego, CA, 200 g/zvíře) ve dnech 0, 4, 7 a 14 po injekci nádorových buněk. Nádor byl měřen v průběhu 3 až 4 týdnů pokusů s použitím elektronického kaliperu Starrett SPC Plus (Athol, MA) a velikost nádoru byla vyjádřena jako povrchová oblast postižená růstem nádoru (mm2). 20 Obrázek 18 ukazuje inhibici nádorového růstu při proti-myší CTLA^I protilátce v modelu nádoru myšího fibrosarkomu. Jak je ukázáno na obrázku 18, u zvířat ošetřených s anti42TLA-4 nastala redukce nádorového růstu ve srovnání se zvířaty ošetřenými izotypovou kontrolní protilátkou. Podle toho jsou proti-myší CTLA-4 mAb schopné inhibovat růst fibrosarkomu v modelu myšího nádoru. 25

Lze očekávat, že protilátky, které reagují zkříženě s myším CTLA^4, se budou v tomto modelu chovat podobně. Ale žádná z protilátek podle vynálezu, u kterých byla zkoumána zkřížená reaktivita, nereaguje zkříženě s myším CTLA^L 30 Příklad 12

Model nádoru u zvířat 35 Aby se dále zkoumala aktivita protilátek podle vynálezu, byl navržen model xenoimplantátu myší SCID pro testování eradikace zjištěných nádorů a jejich metastáz. V tomto modelu jsou myším SCID podány jako štěp lidské T lymfocyty a myším jsou implantovány buňky pocházející z velkobuněčného plicního karcinomu (NSCL) nebo kolorektálního (CC) karcinomu pacientů. Implantace se provádí do tukových polštářků v gonádách myší SCID. Tumory se ponechají 40 narůst, a pak se odstraní. U myší se rozvinuly nádorové metastázy jater podobné lidskému nádoru. Tento model je popsán v práci Bumpers et al., J. Surgical Res., 61, 282 až 288, 1996). Očekává se, že protilátky podle vynálezu budou inhibovat růst nádorů tvořených u těchto myší. -44- CZ 303703 B6 SEZNAM SEKVENCÍ

Nukleotidové a aminokyselinové sekvence jsou uvedeny ve formě seznamu podle WIPO 5 standardu 25. Všechny uvedené sekvence jsou lidského původu, v popisném poli <213> angl. termín „human“ označuje zdroj sekvence Homo sapiens. <210> 1 <211> 463 <212 > PRT <213> Human <4 00 > 1

Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Leu Leu Arg Gly 1 Val Gin Cys Gin 5 Val Gin Leu Val Glu 10 Ser Gly Gly Gly Val 15 Val Gin Pro Gly Arg 20 Ser Leu Arg Leu Ser 25 Cys Val Ala Ser Gly 30 Phe Thr Phe Ser Ser 35 His Gly Met His Trp 40 Val Arg Gin Ala Pro 45 Gly Lys Gly Leu Glu 50 Trp Val Ala 55 Val Ile Trp Tyr Asp Gly Arg 60 Asn Lys Tyr Tyr Ala 65 Asp Ser Val Lys 70 Gly Arg Phe Thr Ile Ser 75 Arg Asp Asn Ser Lys 80 Asn Thr Leu Phe Leu 85 Gin Met Asn Ser Leu 90 Arg Ala Glu Asp Thr 95 Ala Val Tyr Tyr Cys 100 Ala Arg Gly Gly His 105 Phe Gly Pro Phe Asp 110 Tyr Trp Gly Gin Gly 115 Thr Leu Val Thr Val 120 Ser Ser Ala Ser Thr 125 Lys Gly Pro Ser Val 130 Phe Pro Leu 135 Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr 14 0 Ser Glu Ser Thr Ala 145 Ala Leu Gly Cys 150 Leu Val Lys Asp Tyr Phe 155 Pro Glu Pro Val Thr 160 Val Ser Trp Asn Ser 165 Gly Ala Leu Thr Ser 170 Gly Val His Thr Phe 175 Pro Ala Val Leu Gin 180 Ser Ser Gly Leu Tyr 185 Ser Leu Ser Ser Val 190 Val Thr Val Pro Ser 195 Ser Asn Phe Gly Thr 200 Gin Thr Tyr Thr Cys 205 Asn Val Asp His Lys 210 Pro Ser Asn 215 Thr Lys Val Asp Lys Thr Val 220 Glu Arg Lys Cys Cys -45 CZ 303703 B6 225 230 235 240 Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val 245 250 255 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 260 265 270 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu 275 280 285 Val Gin Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 290 295 300 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser 305 310 315 320 Val Leu Thr Val Val His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 325 330 335 Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile 340 345 350 Ser Lys Thr Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro 355 360 365 Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu 370 375 380 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 385 390 395 400 Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu ASp Ser 405 410 415 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 420 425 430 Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 435 440 445 His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 450 455 460 <21G> 2 <211> 464 <212> PRT <213> Human <400> 2

Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Leu Leu Arg Gly 1 5 10 15 Val Gin Cys Gin Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gin 20 25 30 Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45 Ser Asn Tyr Gly Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Val Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys His Tyr Gly 65 70 75 80 Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ser Asp Asn Ser Lys Asn 85 90 95 Thr Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Glu Arg Leu Gly Ser Tyr Phe Asp Tyr Trp 115 120 125 Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro 130 135 140 Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr 145 150 155 160 Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr 165 170 175 Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro 180 185 190 Ala val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr 46- CZ 303703 B6

Val Pro 195 Ser Ser Asn Phe Gly 200 Thr Gin Thr Tyr Thr 205 Cys Asn Val Asp His 210 Lys Pro Ser Asn Thr 215 Lys Val Asp Lys Thr 220 Val Glu Arg Lys Cys 225 Cys Val Glu Cys Pro 230 Pro Cys Pro Ala Pro 235 Pro Val Ala Gly Pro 240 Ser Val Phe Leu Phe 245 Pro Pro Lys Pro Lys 250 Asp Thr Leu Met Ile 255 Ser Arg Thr Pro Glu 260 Val Thr Cys Val Val 265 Val Asp Val Ser His 270 Glu Asp Pro Glu Val 275 Gin. Phe Asn Trp Tyr 280 Val Asp Gly Val Glu 285 Val His Asn Ala Lys 290 Thr Lys Pro Arg Glu 295 Glu Gin Phe Asn Ser 300 Thr Phe Arg Val Val 305 Ser Val Leu Thr Val 310 Val His Gin Asp Trp 315 Leu Asn Gly Lys Glu 320 Tyr Lys Cys Lys Val 325 Ser Asn Lys Gly Leu 330 Pro Ala Pro Ile Glu 335 Lys Thr Ile Ser Lys 340 Thr Lys Gly Gin Pro 345 Arg Glu Pro Gin Val 350 Tyr Thr Leu Pro Pro 355 Ser Arg Glu Glu Met 360 Thr Lys Asn Gin Val 3 65 Ser Leu Thr Cys Leu 370 Val Lys Gly Phe Tyr 375 Pro Ser Asp Ile Ala 3 B0 Val Glu Trp Glu Ser 385 Asn Gly Gin Pro Glu 390 Asn Asn Tyr Lys Thr 395 Thr Pro Pro Met Leu 400 Asp Ser Asp Gly Ser 405 Phe Phe Leu Tyr Ser 410 Lys Leu Thr Val Asp 415 Lys Ser Arg Trp Gin 420 Gin Gly Asn Val Phe 425 Ser Cys Ser Val Met 430 His Glu Ala Leu His 435 Asn His Tyr Thr Gin 440 Lys Ser Leu Ser Leu 445 Ser Pro Gly Lys 450 455 460 <210> 3 <211> 163 <212> PRT <213> Human <400> 3

Pro 1 Gly Arg Ser Leu 5 Arg Leu Ser Cys Ala 10 Ala Ser Gly Phe Thr 15 Phe Ser Ser His Gly 20 Ile His Trp Val Arg 25 Gin Ala Pro Gly Lys 30 Gly Leu Glu Trp Val 35 Ala Val Ile Trp Tyr 40 Asp Gly Arg Asn Lys 45 Asp Tyr Ala Asp Ser 50 Val Lys Gly Arg Phe 55 Thr Ile Ser Arg Asp 60 Asn Ser Lys Lys Thr 65 Leu Tyr Leu Gin Met 70 Asn Ser Leu Arg Ala 75 Glu Asp Thr Ala Val 80 Tyr Tyr Cys Ala Arg 85 Val Ala Pro Leu Gly 90 Pro Leu Asp Tyr Trp 95 Gly Gin Gly Thr Leu 100 Val Thr Val Ser Ser 10S Ala Ser Thr Lys Gly 110 Pro Ser Val Phe Pro 115 Leu Ala Pro Cys Ser 12 0 Arg Ser Thr Ser Glu 125 Ser Thr Ala Ala Leu 130 Gly Cys Leu Val Lys 135 Asp Tyr Phe Pro Glu 140 Pro Val Thr Val Ser 145 Val Trp Leu Asn Gin Ser Gly Ala 150 Leu Thr Ser Gly Val 155 His Thr Phe Pro Ala 160 -47- CZ 303703 B6 <210> 4 <211> 463 <212> PRT <213> Human

Met <400> Glu Phe 4 Gly 1 Val Gin Cys Gin Pro Gly Arg 20 Ser Ser Ser 35 Tyr Gly Glu 50 Trp Val Ala 65 Asp Ser Ala Lys Thr Leu Tyr Leu Tyr Tyr Cys 100 Ala Gin Gly 115 Thr Leu val 130 Phe Pro Leu 145 Ala Leu Gly Cys Ser Trp Asn Ser Val Leu Gin 180 Ser Pro Ser 195 Ser Asn Lys 210 Pro Ser Asn 225 Val Glu Cys Pro Phe Leu Phe Pro Pro Glu Val 260 Thr Val Gin 275 Phe Asn Thr 290 Lys Pro Arg 305 Val Leu Thr Val Cys Lys Val Ser Ser Lys Thr 340 Lys Pro Ser 355 Arg Glu Val 370 Lys Gly Phe 385 Gly Gin. Pro Glu Asp Gly Ser Phe

Leu 5 Ser Trp Val Val Gin Leu Val Leu Arg Leu Ser 40 Met His Trp 55 Val Val Xle 70 Trp Tyr Gly 85 Arg Phe Thr Gin Met Asn Ser Arg Ala Glý Leu 120 Val Thr Val 135 Ser Ala Pro 150 Cys Ser Leu 165 Val Lys Asp Gly Ala Leu Thr Ser Gly Leu Tyr 200 Phe Gly Thr 215 Gin Thr Lys 230 Val Asp Pro 245 Cys Pro Ala Pro Lys Pro Lys Cys Val Val Val 280 Trp Tyr Val 295 Asp Glu Glu 310 Gin Phe Val 325 His Gin Asp Asn Lys Gly Leu Gly Gin Pro Arg 360 Glu Met Thr 375 Lys Tyr Pro 390 Ser Asp Asn 405 Asn Tyr Lys Phe Leu Tyr Ser

Phe Leu Val Ala Glu 10 Ser Gly Gly 25 Cys Thr Ala Ser Arg Gin Ala Pro Asp Gly Ser 60 Asn Ile Ser 75 Arg Asp Leu 90 Arg Ala Glu 105 Leu Gly Tyr Phe Ser Ala Ser Thr Arg Ser Thr 140 ser Tyr Phe 155 Pro Glu Ser 170 Gly Val His 185 Ser Leu Ser Ser Thr Tyr Thr Cys Lys Thr Val 220 Glu Pro Pro 235 Val Ala Asp 250 Thr Leu Met 265 Asp Val Ser His Gly Val Glu Val Asn Ser Thr 300 Phe Trp Leu 315 Asn Gly Pro 330 Ala Pro Ile 345 Glu Pro Gin Val Asn Gin val Ser Ile Ala Val 380 Glu Thr Thr 395 Pro Pro Lys 410 Leu Thr Val

Leu Leu Arg Gly Gly Val 15 Val Glu Gly 30 Phe Thr Phe 45 Gly Lys Gly Leu Lys His Tyr Ala Asn Ser Lys 80 Asn Asp Thr 95 Ala Val Asp 110 Tyr Trp Gly 125 Lys Gly Pro Ser Glu Ser Thr Ala Pro Val Thr 160 Val Thr Phe 175 Pro Ala Val 190 Val Thr Val 205 Asn Val Asp His Arg Lys Cys Cys Gly Pro Ser 240 Val Ile Ser 255 Arg Thr Glu 270 Asp Pro Glu 285 His Asn Ala Lys Arg Val Val Ser Lys Glu Tyr 320 Lys Glu Lys 335 Thr Ile Tyr 350 Thr Leu Pro 365 Leu Thr Cys Leu Trp Glu Ser Asn Met Leu Asp 400 Ser Asp Lys 415 Ser Arg -48 - CZ 303703 B6 420 Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser 435 440 His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser 450 455 <210> 5 <211> 169 <212> PRT <213> Human <400> 5 Gly Val Val Gin Pro Gly Arg Ser 1 5 Gly Phe Thr Phe Ser ser Tyr Gly 20 Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala 35 40 Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 50 55 Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 65 70 Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 Cys Met Asp Val Trp Gly Gin Gly 100 Ser Thr Lyá Gly Pro Ser Val Phe 115 120 Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu 130 135 Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 145 150 val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 165 <210> 6 <211> 167 <2l2> PRT <213> Human <400> 6 Gly Val Val Gin Pro Gly Arg Ser 1 5 Gly Phe Ile Phe Ser Ser His Gly 20 Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala 35 40 Lys Asp Tyr Ala Asp Ser Val Lys 50 55 Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 65 70 Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu 100 Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu 115 120 Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys 130 135 Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser 145 150 425 430

Cys Ser Val Met His 445 Glu Ala Leu Leu Ser Leu Ser 460 Pro Gly Lys

Leu Arg Leu Ser Cys * Ala Ala Ser 10 15 Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro 25 30 Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn 45 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp 60 Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu 75 80 Arg Gly Ala Arg Ile Ile Thr Pro 90 95 Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala 105 110 Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser 125 Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe 140 Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly 155 160 Gin

Leu Arg 10 Leu Ser Cys Val Ala 15 Ser Ile 25 His Trp Val Arg Gin 30 Ala Pro Val Ile Trp Tyr Asp 45 Gly Arg Asn Gly Arg Phe Thr 60 Ile Ser Arg Asp Gin Met Asn 75 Ser Leu Arg Ala Glu 80 Arg Val 90 Ala Pro Leu Gly Pro 95 Leu Val 105 Thr Val Ser Ser Ala 110 Ser Thr Ala Pro Cys Ser Arg 125 Ser Thr Ser Leu Val Lys Asp 140 Tyr Phe Pro Glu Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His 155 160 49 CZ 303703 B6

Thr Phe Pro

Ala Val Leu Gin 165 7 172

PRT

Human <210> <211> <212> <213> <400> 7

Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gin Ile Leu Ser Leu Thr Cys 1 5 10 15 Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly Gly His Tyr Trp Ser Trp 20 25 30 Ile Arg Gin His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr 35 40 45 Tyr Ile Gly Asn Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr 50 55 60 Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gin Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser 65 70 75 80 Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Ser Gly 85 90 95 Asp Tyr Tyr Gly Ile Asp Val Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr Val 100 105 110 Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys 115 120 125 Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys 130 135 14 0 Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu 145 150 155 160 Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin <210> <211> <212> <213> 6 153

PRT

Human <400> 8

Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 1 5 10 15 ser Ser His Gly Ile His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu 20 25 30 Glu Trp Val Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Arg Asn Lys Asp Tyr Ala 35 40 45 Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn 50 55 60 Thr Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 65 70 75 80 Tyr Tyr Cys Ala Arg Val Ala Pro Leu Gly Pro Leu Asp Tyr Trp Gly 85 90 95 Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 100 105 110 Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala 115 12 0 125 Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 130 135 14 0 Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 145 150 <210> 9 <211> 167 -50- CZ 303703 B6 <212 > PRT <213> Human <220> <400> 9

Gly Val Val Gin Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser 1 5 10 15 Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro 20 25 30 Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn 35 40 45 Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp 50 55 60 Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu 65 70 75 80 Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Pro Arg Gly Ala Thr Leu 85 90 95 Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Arg Xaa Asp Val Trp Gly Gin Gly Thr Thr val 100 los 110 Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala 115 120 125 Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu 13 0 135 140 Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly 145 15 0 155 160 Ala Leu Thr Ser Gly Val His 165 <210 > 10 <211> 151 <212 > PRT <213 > Human <4 00> 10 Gly Val Val Gin Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser 1 5 10 15 Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro 20 25 30 Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser His 35 40 45 Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp 50 55 60 Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu 65 70 75 80 Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Ala Val Val Val Pro Ala 85 90 95 Ala Met Asp Val Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala 100 105 110 Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser 115 120 125 Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe 130 135 140 Pro Glu Pro Val Thr val Ser 145 <210> 11 150 <211> 146 <212> PRT <213 > Human -51 CZ 303703 B6 <220> <400> 11 Val Val Gin Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly 1 5 10 15 Phe Thr Phe Ser Ser Xaa Gly Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly 20 25 30 Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Val Ile Trp Ser Asp Gly Ser His Lys 35 40 45 Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn 50 55 60 Ser Lys Αεη Thr Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 65 70 75 80 Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Thr Met Ile Val Val Gly Thr 85 90 95 Leu Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser 100 105 110 Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr 115 120 125 Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro 130 135 140 Glu Pro 145 <210> 12 <211> 174 <212> PRT <213> Human <400> 12 Ser Gly Gly Gly Val Val Gin Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys 1 5 10 15 Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly Val His Trp Val Arg 20 25 30 Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Val Ile Trp Tyr Asp 35 40 45 Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile 50 55 60 Ser Arg Asp Asn Ser Lys Ser Thr Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu 65 70 75 80 Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Ser Tyr Tyr 85 90 95 Asp Phe Trp ser Gly Arg Gly Gly Met Asp Val Trp Gly Gin Gly Thr 100 105 110 Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu ser Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala val 165 170 <210> 13 <211> 163 <212> PRT <213;» Human <400> 13 Val Gin Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe 1 5 10 15 -52- CZ 303703 B6

Thr Phe Ser Asn 20 Tyr Ala Met Gly Leu Glu 35 Trp Val Val Val Tyr Ala 50 Glu Ser Val Lys Gly 55 Lys 65 Asn Thr Leu Tyr Leu 70 Gin Ala Val Tyr Tyr Cys 85 Ala Arg Phe Asp Phe Trp 100 Gly Gin Gly Thr Lys Gly 115 Pro Ser Val Phe ser Glu 130 Ser Thr Ala Ala Leu 135 Glu 145 His Pro Thr Val Phe Thr Val Ser 150 Trp

His Trp 25 Val Arg Gin Ala Pro 30 Gly Lys Ile 40 Trp His Asp Gly Asn 45 Asn Lys Tyr Arg Phe Thr Ile Ser 60 Arg Asp Asn Ser Met Asn Ser Leu 75 Arg Ala Glu Asp Thr 80 Asp Gin Gly 90 Thr Gly Trp Tyr Gly 9S Gly Thr Leu 105 Val Thr Val Ser Ser 110 Ala Ser Pro 120 Leu Ala Pro Cys Ser 125 Arg Ser Thr Gly Cys Leu val Lys 140 Asp Tyr Phe Pro Asn Ser Gly Ala 155 Leu Thr Ser Gly val 160

<210> 14 <211> 235 <212> PRT <213> Human <400> 14 Met Glu Thr Pro Ala Gin Leu 1 5 Asp Thr Thr Gly Glu Ile Val 20 Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala 35 Ile Ser Ser Ser Phe Leu Ala 50 55 Pro Arg Leu Leu Xle Tyr Gly 65 70 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly 85 Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp 100 Gly Thr Ser Pro Trp Thr Phe 115 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser 130 135 Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala 145 150 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val 165 Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser ISO Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr 195 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys 210 215 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn 225 230 <210> 15 <2ll> 233 <212> PRT

Leu Phe Leu 10 Leu Leu Leu Trp Leu 15 Pro Leu Thr 25 Gin Ser Pro Gly Thr 30 Leu Ser Thr 40 Leu Ser Cys Arg Ala 45 Ser Gin Ser Trp Tyr Gin Gin Arg 60 Pro Gly Gin Ala Ala Ser Ser Arg 75 Ala Thr Gly Ile Pro 80 Ser Gly Thr 90 Asp Phe Thr Leu Thr 95 Ile Phe Ala 105 Val Tyr Tyr Cys Gin 110 Gin Tyr Gly 120 Gin Gly Thr Lys Val 125 Glu ile Lys Val Phe Ile Phe Pro 140 Pro Ser Asp Glu Ser Val Val Cys 155 Leu Leu Asn Asn Phe 160 Gin Trp Lys 170 Val ASp Asn Ala Leu 175 Gin Val Thr 185 Glu Gin Asp Ser Lys 190 Asp Ser Leu 200 Thr Leu Ser Lys Ala 205 Asp Tyr Glu Glu Arg Val Gly Thr Glu His Cys 235 Gin. 220 Gly Leu Ser Ser -53- CZ 303703 B6 <213> Human <400> 15 Met Glu Thr Pro Ala Gin Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro 1 5 10 15 Asp Thr Thr Gly Glu Ile Val Leu Thr Gin Ser Pro Gly Thr Leu Ser 20 25 30 Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Thr Ser Val Ser 35 40 45 Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg 50 55 60 Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg 65 70 75 80 Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg es 90 95 Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Gly Ile 100 105 110 Ser Pro Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr 115 120 125 Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu 130 135 140 Lys Ser Gly Thr Ala Ser val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro 145 150 155 160 Arg Glu Ala Lys Val Gin Trp Lys val Asp Asn Ala Leu Gin Ser Gly 165 170 175 Asn Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr 180 185 190 Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His 195 200 205 Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro Val 210 215 220 Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 <210> 16 <211> 139 <212> PRT <213 > Human <4O0> 16 Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg 1 5 10 15 Ala Ser Gin Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro 20 25 30 Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr 35 40 45 Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 50 55 60 Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys 65 70 75 80 Gin Gin Tyr Gly Arg Ser Pro Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val 85 90 95 Asp Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro 100 105 110 Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu 115 120 125 Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys val Gin 130 135 <21Q> 17 <211> 234 -54- CZ 303703 B6 <212> PRT <213 > Human <4 00 > 17

Met GlU Thr Pro Ala Gin Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro 1 5 10 15 Asp Thr Thr Gly Glu Ile Val Leu Thr Gin Ser Pro Gly Thr Leu Ser 20 25 30 Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser 35 40 45 Val Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro 50 55 60 Arg Pro Leu ile Tyr Gly Val Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp 65 70 75 80 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 85 90 95 Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Gly 100 105 110 Ile Ser Pro Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys Arg 115 120 125 Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin 130 135 14 0 Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 145 150 155 160 Pro Arg Glu Ala Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin Ser 165 170 175 Gly Asn Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr 180 185 190 Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 195 200 205 His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu ser Ser Pro 210 215 220 Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 <210> 18 <211> 152 <212 > PRT <213 > Human <400 > 1Θ Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg val Thr Ile 1 5 10 15 Thr Cys Arg Ala Ser Gin Ser Ile Asn Thr Tyr Leu Ile Trp Tyr Gin 20 25 30 Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Asn Phe Leu Ile Ser Ala Thr Ser Ile 35 40 45 Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Arg Gly Ser Gly Ser Gly Thr 50 55 60 Asn Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu His Pro Glu Asp Phe Ala Thr 65 70 75 80 Tyr Tyr Cys Gin Gin Ser Tyr Ser Thr Pro Phe Thr Phe Gly Pro Gly 85 90 95 Thr Lys Val Asp Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile 100 105 110 Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val 115 120 125 Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gin Trp Lys 130 135 140 Val Asp Asn Ala Leu Gin Ser Gly 145 150 -55- CZ 303703 B6 <210> 19 <211> 142 <212> PRT <213> Human <400> 19

Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser 1 5 10 15 Cys Arg Ala Ser Gin Ser Ile Ser Ser Asn Phe Leu Ala Trp Tyr Gin 20 25 30 Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Arg Pro Ser Ser 35 40 45 Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Ser Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr 50 55 60 Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Leu 65 70 75 80 Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Gly Thr Ser Pro Phe Thr Phe Gly Pro Gly 85 90 95 Thr Lys Val Asp Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile 100 105 110 Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val 115 120 125 Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gin 130 135 140 <210> 20 <211> 155 <212> PRT <213> Human <400> 20 Ser Pro Asp Phe Gin Ser Val Thr Pro Lys Glu Lys val Thr Ile Thr 1 5 10 15 Cys Arg Ala Ser Gin Ser Ile Gly Ser Ser Leu His Trp Tyr Gin Gin 20 25 30 Lys Pro Asp Gin Ser Pro Lys Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Gin Ser 35 40 45

Phe Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp 50 55 60

Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr 65 70 75 80

Tyr Cys His Gin Ser Ser Ser Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile 85 Lys Arg Thr Val Ala 90 Ala Pro Ser Val Phe 95 Ile Phe Pro Pro Ser 100 Asp Glu Gin Leu Lys 105 Ser Gly Thr Ala Ser 110 Val Val Cys Leu Leu 115 Asn Asn Phe Tyr Pro 120 Arg Glu Ala Lys Val 125 Gin Trp Lys Val Asp 145 13 0 Asn Ala Leu Gin 135 Ser Gly 150 Asn Ser Gin Glu 155 140 <210> 21 <211> 146 <212 > PRT <213> Human <400> 21

Gin Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu 15 10 15 -56- CZ 303703 B6

Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin 20 25 30

Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ser 35 40 45

Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr 50 55 60

Asp 65 Phe Thr Leu Thr Ile Ser 70 Arg Leu Glu Pro 75 Glu Asp Phe Ala Val 80 Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Gly 85 Arg Ser Pro 90 Phe Thr Phe Gly Pro Gly 95 Thr Lys Val Asp 100 Ile Lys Arg Thr val 105 Ala Ala Pro Ser Val Phe 110 Ile Phe Pro Pro 115 Ser Asp Glu Gin Leu 120 Lys Ser Gly Thr Ala 125 Ser Val Val Cys Leu 130 Gly Gly 145 Leu Asn Asn Phe Tyr 135 Pro Arg Glu Ala Lys 140 Val Gin Trp Lys <21C> 22 <211> 139 <212> PRT <213> Human <400> 22

Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys 1 5 10 15 Arg Ala Ser Gin Ser Ile Asn Ser Tyr Leu Asp Trp Tyr Gin Gin Lys 20 25 30 Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gin 35 40 45 Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 50 55 60 Thr Leu Thr Ile Ser ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr 65 70 75 80 Cys Gin Gin Tyr Tyr Ser Thr Pro Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys 85 90 95 Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro 100 105 110 Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu 115 120 125 Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val 130 135 <210> 23 <211> 134 <212> PRT <213> Human <400> 23

Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr 1 5 10 15

Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gin Asn Ile Ser Arg Tyr Leu Asn Trp Tyr 20 25 30

Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Phe Leu Ile Tyr Val Ala Ser 35 40 45

Ile Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Gly Phe Ser Ala Ser Gly Ser Gly 50 55 60

Pro Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala 65 70 75 80

Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Ser Tyr Ser Thr Pro Phe Thr Phe Gly Pro -57- CZ 303703 B6 85 90 95 Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe 100 105 110 Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val 115 120 125 Val Cys Leu Leu Asn Asn 130 <210> 24 <211> 150 <212> PRT <213> Human <400> 24 Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr 1 5 10 15 Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gin Ser Ile Cys Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr 20 25 30 Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Arg Val Leu Ile Tyr Ala Ala Ser 35 40 45 Ser Leu Gin Gly Gly val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly 50 55 60 Ile Asp Cys Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala 65 70 75 80 Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Ser Tyr Ile Thr Pro Phe Thr Phe Gly Pro 85 90 95 Gly Thr Arg Val Asp Ile Glu Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe 100 105 110 Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser val 115 120 125 val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gin Trp 130 135 14 0 Lys Val Asp Asn Ala Tyr 145 150 <210> 25 <211> 139 <212> PRT <213> Human <400> 25 Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly Gin Pro Ala Ser Ile Ser Cys 1 5 10 15 Arg Ser Ser Gin Ser Leu Val Tyr Ser Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Asn 20 25 30 Trp Phe Gin Gin Arg Pro Gly Gin Ser Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Lys 35 40 45 Val Ser Asn Trp Asp Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp 65 70 75 80 Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gin Gly Ser His Trp Pro Pro Thr Phe 85 90 95 Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser 100 105 110 Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala 115 120 125 Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro 130 135 <210> 26 -58 - CZ 303703 B6 c211> 133 <212> PRT <213 > Human <400> 26 Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser 1 5 His Ser Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu 20 Gin Ser Pro Gin Leu Leu Ile Tyr 35 40 Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 Lys Leu Ser Arg Val Glu Ala Glu 65 70 Gin Ala Leu Gin Thr Pro Leu Thr 85 Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro 100 Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr 115 120 Asn Phe Tyr Pro Arg 130 <210> 27 <211> 3 64 <212> PRT <213> Human <400> 27 Met Gly val Leu Leu Thr Gin Arg 1 5 Leu Leu Phe Pro Ser Met Ala Ser 20 Ala Val Val Leu Ala Ser Ser Arg 35 40 Tyr Ala Ser Pro Gly Lys Ala Thr 50 55 Gin Ala Asp Ser Gin Val Thr Glu 65 70 Gly Asn Glu Leu Thr Phe Leu Asp 85 Ser Gly Asn Gin Val Asn Leu Thr 100 Thr Gly Leu Tyr Ile Cys Lys Val 115 120 Tyr Leu Gly Ile Gly Asn Gly Thr 130 135 Pro Cys Pro Asp Ser Asp Leu Glu 145 150 Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 165 Thr Cys val Val val Asp Val Ser 180 Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 195 200 Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr 210 215 Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn 225 230 Ser Asn Lys Ala Leu Pro Thr Pro

Cys Arg Ser Ser Gin Ser Leu Leu 10 15

Asp Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly 25 30

Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly 45

Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu 60

Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met 75 80

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu 90 95

Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser 105 110

Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn 125

Thr Leu Leu Ser Leu Val Leu Ala 10 15

Met Ala Met His Val Ala Gin Pro 25 30

Gly Ile Ala Ser Phe Val Cys Glu 45

Glu Val Arg Val Thr Val Leu Arg 60

Val Cys Ala Ala Thr Tyr Met Met 75 80

Asp Ser Ile Cys Thr Gly Thr Ser 90 95

Ile Gin Gly Leu Arg Ala Met Asp 105 110

Glu Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr 125

Gin Ile Tyr Val Ile Asp Pro Glu 140

Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe 155 160

Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val 170 175

His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe 185 190

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro 205

Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr 220

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val 235 240

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala -59- 245 CZ 303703 B6

Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin 260

Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin Val 275 280

Phe Tyr Pro Ser Asp IIe Ala Val 290 295

Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 305 310

Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr 325

Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 340

Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu 355 360 <210> 28 <211> 12 <212> PRT <213> Human <400> 28

Met His Val Ala Gin Pro Ala Val 1 5 <210> 29 <211> 120 <212> PRT <213> Human 250 255

Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg 265 270

Ser Leu Thr Cys Leu val Lys Gly 285

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro 300

Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser 315 320

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin 330 335

Met His Glu Ala Leu His Asn His 345 350

Ser Pro Gly Lys

Val Leu Ala Ser 10 <400> 29

Met His Val Ala Gin Pro Ala Val 1 5 Ala Ser Phe Val Cys Glu Tyr Ala 20 Arg Val Thr Val Leu Arg Gin Ala 35 40 Ala Ala Thr Tyr Met Met Gly Asn 50 55 Ile Cys Thr Gly Thr Ser Ser Gly 65 70 Gly Leu Arg Ala Met Asp Thr Gly 85 Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Tyr Leu 100 Tyr Val Ile Asp Pro Glu Pro Cys 115 120 <210> 30 <211> 11 <212> PRT <213> Human

Val Leu Ala Ser Ser Arg Gly Ile 10 15

Ser Pro Gly Lys Ala Thr Glu Val 25 30

Asp Ser Gin Val Thr Glu Val Cys 45

Glu Leu Thr Phe Leu Asp Asp Ser 60

Asn Gin Val Asn Leu Thr Ile Gin 75 80

Leu Tyr Ile Cys Lys Val Glu Leu 90 95

Gly Ile Gly Asn Gly Thr Gin Ile 105 110 <400> 30

Met His Val Ala Gin Pro Ala Val Val Leu Ala 15 10 <210> 31 <211> 89 <212> PRT <213> Human -60- CZ 303703 B6 <400> 31

Gly Val Val Gin Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser 1 5 10 15 Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro 20 25 30 Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn 35 40 45 Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp 50 55 60 Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu 65 70 75 80 Asp Thr Ala Val Tyr 85 Tyr Cys Ala Arg <210> 32 <211> 169 <212> PRT <213 > Human <400> 32

Gly Val Val Gin Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser 1 5 10 15 Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro 20 25 30 Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn 35 40 45 Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp 50 55 60 Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu 65 70 75 80 Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Ala Arg Ile Ile Thr Pro 85 90 95 Cys Met Asp Val Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala 100 105 110 Ser Thr Lys Gly Pro Ser val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser 115 120 125 Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe 130 135 140 Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly 145 150 155 160 Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin 165 <210> 33 <211> 167 <212> PRT <213 > Human <400> 33 Gly Val Val Gin Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser 1 5 10 15 Gly Phe Thr Phe Ser Ser His Gly Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro 20 25 30 Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Arg Asn 35 40 45 Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp 50 55 60 Asn Ser Lys Asn Thr Leu Phe Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu 65 7Ó 75 80 Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Gly His Phe Gly Pro Phe -61 - 85 Asp Tyr Trp Gly 100 Gin Gly Thr Lys Gly Pro 115 Ser Val Phe Pro Glu Ser 130 Thr Ala Ala Leu Gly 135 Pro 145 Val Thr Val Ser Trp 150 Asn Thr Phe Pro Ala Val 165 Leu Gin <210> ^211> <212> <213> CZ 303703 B6 90 95

Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr 105 110

Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser 120 125

Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Olu 140

Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His 155 160 34 166

PRT

Human <400> 34

Gly Val Val Gin Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser 1 5 10 15 Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Gly Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro 20 25 30 Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Val Ile Trp Tyr Αβρ Gly Ser Asn 35 40 45 Lys His Tyr Gly Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ser Asp 50 55 60 Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gin Met Asn ser Leu Arg Ala Glu 65 70 75 80 Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Glu Arg Leu Gly Sér Tyr 85 90 95 Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser 100 105 110 Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr 115 120 125 Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro 130 135 140 Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr ser Gly Val 145 150 155 160 His Thr Phe Pro Ala Val 165 <21Q> <211> <212> <213> 35 167

PRT

Human <400> 35

Gly 1 Val Val Gin Pro 5 Gly Arg Ser Leu Arg Leu 10 Ser Cys Val Ala Ser 15 Gly Phe Ile Phe 20 Ser Ser His Gly Ile His Trp 25 val Arg Gin 30 Ala Pro Gly Lys Gly 35 Leu Glu Trp Val Ala Val Ile Trp 40 Tyr Asp 45 Gly Arg Asn Lys Asp 50 Tyr Ala Asp Ser Val 55 Lys Gly Arg Phe Thr 60 Ile Ser Arg Asp Asn 65 Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 70 Leu Gin Met Asn 75 Ser Leu Arg Ala Glu 80 Asp Thr Ala Val Tyr 85 Tyr Cys Ala Arg Val Ala 90 Pro Leu Gly Pro Leu 95 Asp Tyr Trp Gly 100 Gin Gly Thr Leu Val Thr Val 105 ser Ser Ala 110 Ser Thr -62- CZ 303703 B6

Lys Gly PrO Ser Val Phe pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser 115 120 125 Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu 130 135 140 Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His 145 150 155 160 Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin 165 <210> 36 <211> 153 <212> PRT <213> Human <400> 36

Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 1 5 10 15 Ser Ser His Gly Ile His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu 20 25 30 Glu Trp Val Ala Val Ile Trp Tyr Aep Gly Arg Asn Lys Asp Tyr Ala 35 40 45 Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn 50 55 60 Thr Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 65 70 75 80 Tyr Tyr Cys Ala Arg Val Ala Pro Leu Gly Pro Leu Asp Tyr Trp Gly 85 90 95 Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 100 105 110 Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala 115 120 125 Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 130 135 140 Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 145 150 <210> 37 <211> 163 <212> PRT <213> Human <400> 37

Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 1 Ser Ser His Gly 5 Ile His Trp Val 10 Arg Gin Ala Pro Gly Lys 15 Gly Leu Glu Trp Val 20 Ala Val Ile Trp Tyr 25 Asp Gly Arg Asn Lys 30 Asp Tyr Ala Asp Ser 35 Val Lys Gly Arg Phe 40 Thr 45 Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Lys Thr 50 Leu Tyr Leu Gin Met 55 Asn Ser Leu Arg Ala 60 Glu Asp Thr Ala Val 65 Tyr Tyr Cys Ala 70 Arg Val Ala Pro Leu Gly 75 Pro Leu Asp 80 Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu 85 Val Thr Val Ser 90 Ser Ala Ser Thr Lys 95 Gly Pro Ser Val Phe Pro 100 Leu Ala Pro Cys Ser 105 Arg Ser Thr Ser Glu 110 Ser Thr Ala Ala Leu 115 Gly Cys Leu Val Lys 120 Asp Tyr Phe Pro 125 Glu Pro Val Thr Val Ser 130 Trp Asn Ser Gly Ala 135 Leu Thr Ser Gly Val 140 His Thr Phe Pro Ala -63 - 160 CZ 303703 B6 145 150 155

Val Leu Gin <210> 38 <211> 138 <212> PRT <213> Human <400> 38

Gly Gly Val Val Glu Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala 1 5 10 15 Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly Met His Trp Val Arg Gin Ala 20 25 30 Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser 35 40 45 Asn Lys His Tyr Ala Asp Ser Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg 50 55 60 Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala 65 70 75 80 Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ala Gly Leu Leu Gly Tyr 85 90 95 Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr val Ser Ser Ala Ser 100 105 110 Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr 115 120 125 Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu 130 135 <210> 39 <211> 167 <212> PRT <213> Human <220> <400> 39

Gly 1 Val Val Gin Pro 5 Gly Arg Ser Gly Phe Thr Phe 20 Ser Ser Tyr Gly Gly Lys Gly 35 Leu Glu Trp val Ala 40 Lys Tyr 50 Tyr Ala Asp Ser Val 55 Lys Asn 65 Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 70 Leu Asp Thr Ala Val Tyr 85 Tyr Cys Ala Tyr Tyr Tyr Tyr 100 Tyr Arg Xaa Asp Thr Val Ser 115 Ser Ala Ser Thr Lys 120 Pro Cys 130 Ser Arg Ser Thr Ser 135 Glu Val 145 Lys Asp Tyr Phe Pro Glu 15 0 Pro Ala Leu Thr Ser Gly 165 Val His <210> 40

Leu Arg 10 Leu Ser Cys Ala Ala 15 Ser Met His 25 Trp Val Arg Gin 30 Ala Pro Val Ile Trp Tyr Asp 45 Gly Ser Asn Gly Arg Phe Thr 60 Ile Ser Arg Asp Gin Met Asn 75 Ser Leu Arg Ala Glu 80 Arg Asp 90 Pro Arg Gly Ala Thr 95 Leu Val Trp Gly 105 Gin Gly Thr 110 Thr Val Gly Pro Ser Val Phe 125 Pro Leu Ala Ser Thr Ala Ala 140 Leu Gly Cys Leu Val Thr Val 155 Ser Trp Asn Ser Gly 160 -64- CZ 303703 B6 <211> 150 <212> PRT <213> Human <400> 40

Gly Val Val Gin Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser 1 5 10 15 Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro 20 25 30 Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser His 35 40 45 Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp 50 55 60 Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu 65 70 75 80 Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Ala Val Val Val Pro Ala 85 90 95 Ala Met Asp Val Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala 100 105 110 Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser 115 120 125 Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe 130 135 140 Pro Glu Pro Val Thr Val 145 150 <210> 41 <211> 146 <212> PRT <213> Human <400> 41

Val Val Gin Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly 1 5 10 15 Phe Thr Phe Ser Ser Cys Gly Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly 20 25 30 Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Val Ile Trp Ser Asp Gly Ser His Lys 35 40 45 Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn 50 55 60 Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 65 70 75 80 Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Thr Met Ile Val Val Gly Thr 85 90 95 Leu Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser 100 105 110 Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr 115 120 125 Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro 130 135 140 Glu Pro 145 <210> 42 <211> 171 <212> PRT <213 > Human <400> 42

Gly Val Val Gin Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser 15 io 15 -65- CZ 303703 B6

Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly Val His Trp Val Arg Gin Ala Pro 20 25 30 Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn 35 40 45 Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp 50 55 60 Asn Ser Lys Ser Thr Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu 65 70 75 80 Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Ser Tyr Tyr Asp Phe Trp 85 90 95 Ser Gly Arg Gly Gly Met Asp Val Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro 115 120 125 Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val 13 0 135 140 Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn. Ser Gly Ala 145 150 155 160 Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 <210> 43 <211> 163 <212> PRT <213> Huraan <400> 43 Val Gin Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe 1 5 10 15 Thr Phe Ser Asn Tyr Ala Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys 20 25 30 Gly Leu Glu Trp Val Val Val Ile Trp His Asp Gly Asn Asn Lys Tyr 35 40 45 Tyr Ala Glu Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser 50 55 60 Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr 65 70 75 80 Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Gin Gly Thr Gly Trp Tyr Gly Gly 85 90 95 Phe Asp Phe Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser 100 105 110 Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr 115 120 125 Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro 130 135 140 Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn. Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val 145 150 155 160 His Thr Phe <210> 44 <211> 76 <212> PRT <213> Human <400> 44 Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile 1 5 10 15 Arg Gin His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr 20 25 30 Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile -66 - CZ 303703 B6 35 40 45 Ser Val 50 Asp Thr Ser Lys Asn 55 Gin Phe Ser Leu Lys 60 Leu Ser Ser Val Thr 65 Ala Ala Asp Thr Ala 70 val Tyr Tyr Cys Ala 75 Arg <210 > 45 <211> 172 <212> PRT <213> Human <400> 45

Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gin Ile Leu Ser Leu Thr Cys 1 5 10 15 Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly Gly His Tyr Trp Ser Trp 20 25 30 Ile Arg Gin His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr 35 40 45 Tyr Ile Gly Asn Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr 50 55 60 Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gin Phe Ser Leu Lys Leu Ser ser 65 70 75 80 Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Ser Gly 85 90 95 Asp Tyr Tyr Gly Ile Asp Val Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr Val 100 105 110 Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys 115 120 125 Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys 130 135 140 Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu 145 150 155 160 Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin 165 170 <210> 46 <211> 96 <212> PRT <213> Human <400> 46

Glu 1 Ile Val Leu Thr Gin Ser 5 Pro Gly Thr 10 Leu Ser Leu Ser Pro Gly 15 Glu Arg Ala Thr 20 Leu Ser Cys Arg Ala 25 Ser Gin Ser Val Ser 30 Ser Ser Tyr Leu Ala 35 Trp Tyr Gin Gin Lys 40 Pro Gly Gin Ala Pro Arg 45 Leu Leu Ile Tyr 50 Gly Ala Ser Ser Arg Ala 55 Thr Gly Ile Pro Asp Arg 60 Phe Ser Gly 65 Ser Gly Ser Gly Thr Asp 70 Phe Thr Leu Thr 75 Ile Ser Arg Leu Glu 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr 85 Tyr Cys Gin 90 Gin Tyr Gly Ser Ser 95 Pro <210> 47 <211> 141 <212> PRT <213> Human <400> 47

Gin Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu -67- CZ 303703 B6 1 5 10 15 Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser Ile Ser Ser Ser Phe Leu Ala Trp Tyr 20 25 30 Gin Gin Arg Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser 35 40 45 Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly 50 55 60 Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro GlU Asp Phe Ala 65 70 75 80 Val Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Gly Thr Ser Pro Trp Thr Phe Gly Gin 85 90 95 Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe 100 105 110 Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val 115 120 125 Val cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys 13 0 135 140 <210> 48 <211> 141 <212> PRT <213> Human <400> 48 Gin Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu 1 5 10 15 Ser cys Arg Thr Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin 20 25 30 Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg 35 40 45 Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp 50 55 60 Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr 65 70 75 80 Tyr Cys Gin Gin Tyr Gly Ile Ser Pro Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr 85 90 95 Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe 100 105 110 Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys 115 120 125 Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gin 13 0 135 140 <210> 49 <211> 139 <212> PRT <213> Human <400> 49 Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg 1 5 10 15 Ala Ser Gin Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro 20 25 30 Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr 35 40 45 Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 50 SS 60 Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys 65 70 75 80 Gin Gin Tyr Gly Arg Ser Pro Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val 85 90 95 -68- CZ 303703 B6

Asp Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro 100 105 110

Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu 115 120 125

Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gin 130 135 <210> 50 <211> 142 <212> PRT <213> Human <400> 50

Gin Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu 15 10 15

Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin 20 25 30

Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Pro Leu Ile Tyr Gly Val Ser Ser 35 40 45

Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr 50 55 60

Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val 65 70 75 80

Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Gly Ile Ser Pro Phe Thr Phe Gly Pro Gly 85 90 95

Thr Lys Val Asp Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile 100 105 110

Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val 115 120 125

Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gin 130 135 140 <210> 51 <211> 142 <212> PRT <213> Human <400> 51 ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser 1 5 10 15 Cys Arg Ala Ser Gin Ser Ile Ser Ser Asn Phe Leu Ala Trp Tyr Gin 20 25 30 Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Arg Pro Ser Ser 35 40 45 Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Ser Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr 50 55 60 Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Leu 65 70 75 80 Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Gly Thr Ser Pro Phe Thr Phe Gly Pro Gly 85 90 95 Thr Lys Val Asp Ile Lys Arg Thr val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile 100 105 110 Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val 115 120 125 Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gin 130 135 140 <210> 52 <211> 146 <212> PRT <213> Human -69- CZ 303703 B6 <400> 52

Gin Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu 1 5 10 15 Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin 20 25 30 Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ser 35 40 45 Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr 50 55 60 Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu pro Glu Asp Phe Ala Val 65 70 75 80 Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Gly Arg Ser Pro Phe Thr Phe Gly Pro Gly 85 90 95 Thr Lys Val Asp ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser val Phe Ile 100 105 110 Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val 115 12 0 125 Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gin Trp Lys 130 135 140 Gly Gly 145 <210> 53 <211> 95 <212> PRT <213> Human <400> 53 Asp ile Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr ile Thr Cys Arg Ala Ser Gin Ser Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Ser Tyr Ser Thr Pro 85 90 95 <210> 54 <211> 152 <212> PRT <213> Human <400> 54 Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile 1 5 10 15 Thr Cys Arg Ala Ser Gin Ser Ile Asn Thr Tyr Leu Ile Trp Tyr Gin 20 25 30 Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Asn Phe Leu Ile Ser Ala Thr Ser Ile 35 40 45 Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Arg Gly Ser Gly Ser Gly Thr 50 55 60 Asn Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu His Pro Glu Asp Phe Ala Thr 65 70 75 80 Tyr Tyr Cys Gin Gin Ser Tyr Ser Thr Pro Phe Thr Phe Gly Pro Gly 85 90 95 Thr Lys Val Asp Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile -70- CZ 303703 B6 100 105 no

Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val 115 120 125

Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gin Trp Lys 130 135 140

Val Asp Asn Ala Leu Gin Ser Gly 145 150

<210> 55 <211> 139 <212> PRT <213> Human <400> 55 Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr lle Thr Cys 1 S 10 15 Arg Ala Ser Gin Ser lle Asn ser Tyr Leu Asp Trp Tyr Gin Gin Lys 20 25 30 Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lle Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gin 35 40 45 Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 50 55 60 Thr Leu Thr lle Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr 65 70 75 80 Cys Gin Gin Tyr Tyr Ser Thr Pro Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys 85 90 95 Val Glu lle Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe lle Phe Pro 100 105 110 Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu 115 120 125 Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val 130 135 <210> 56 <211> 134 <212> PRT <213> Human <400> 56 Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr 1 5 10 15 lle Thr Cys Arg Ala Ser Gin Asn lle Ser Arg Tyr Leu Asn Trp Tyr 20 25 30 Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Phe Leu lle Tyr Val Ala Ser 35 40 45 lle Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Gly Phe Ser Ala Ser Gly Ser Gly 50 55 60 Pro Asp Phe Thr Leu Thr lle Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala 65 70 75 80 Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Ser Tyr Ser Thr Pro Phe Thr Phe Gly Pro 85 90 95 Gly Thr Lys Val Asp lle Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe 100 105 110 lle Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val 115 120 125 Val Cys Leu Leu Asn Asn 130 <210> 57 <211> 150 <212 > PRT -71 - CZ 303703 B6 <213 > Human <400> 57 Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr 1 5 10 15 Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gin Ser Ile Cys Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr 20 25 30 Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Arg Val Leu Ile Tyr Ala Ala Ser 35 40 45 Ser Leu Gin Gly Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly 50 55 60 Ile Asp Cys Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro GlU Asp Phe Ala 65 70 75 80 Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Ser Tyr Ile Thr Pro Phe Thr Phe Gly Pro 85 90 95 Gly Thr Arg Val Asp Ile Glu Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe 100 105 110 Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser val 115 120 125 Val. Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gin Trp 130 135 140 Lys Val Asp Asn Ala Tyr 145 <210> 58 150 <211> 96 <212 > PRT <213 > Human <400> 58 Glu Ile Val Leu Thr Gin Ser Pro Asp Phe Gin Ser Val Thr Pro Lys 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gin Ser ile Gly ser Ser 20 25 30 Leu His Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Asp Gin Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Lys Tyr Ala Ser Gin Ser Phe Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala 65 70 75 80 Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gin Ser Ser Ser Leu Pro Gin 85 90 95 <210> 59 <211> 155 <212> PRT <213> Human <400> 59 Ser Pro Asp Phe Gin Ser val Thr Pro Lys Glu Lys Val Thr Ile Thr 1 5 10 15 Cys Arg Ala Ser Gin Ser Ile Gly Ser Ser Leu His Trp Tyr Gin Gin 20 25 30 Lys Pro Asp Gin Ser Pro Lys Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Gin Ser 35 40 45 Phe Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp 50 55 60 Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr 65 70 75 80 Tyr Cys His Gin Ser Ser Ser Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr 8S 90 95 -72- CZ 303703 B6

Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe 100 105 110 Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys 115 120 125 Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gin Trp Lys Val 130 135 140 Asp Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin Glu 145 150 155 <210> 60 <211> 100 <212> PRT <213> Human <400> 60 Asp Val Val Met Thr Gin Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly 1 5 10 15 Gin Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gin Ser Leu Val Tyr Ser 20 25 30 ASp Oly Asn Thr Tyr Leu Asn Trp Phe Gin Gin Arg Pro Gly Gin Ser 35 40 45 Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Asp Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Oly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gin Gly 85 90 95

Thr His Trp Pro 100 <210> 61 <211> 139 <212 > PRT <213> Human <400> 61

Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly Gin Pro Ala Ser Ile Ser Cys 1 5 10 15 Arg Ser Ser Gin Ser Leu Val Tyr Ser Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Asn 20 25 30 Trp Phe Gin Gin Arg Pro Gly Gin Ser Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Lys 35 40 45 Val Ser Asn Trp Asp Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp 65 70 75 80 Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gin Gly Ser His Trp Pro Pro Thr Phe 85 90 95 Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser 100 105 .110 Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala 115 120 125 Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro 130 135 <210> 62 <211> 100 <212> PRT <213 > Human <400> 62 -73- CZ 303703 B6

Asp Ile Val Met Thr Gin Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gin Ser Leu Leu His Ser 20 25 30 Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly Gin Ser 35 40 45 Pro Gin Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Axg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gin Ala 85 90 95 Leu Gin Thr Pro 100 <210> 63 <211> 133 <212> PRT <213> Human <400> 63

Pro Gly GlU Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gin Ser Leu Leu 1 5 10 15 His ser Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly 20 25 30 Gin Ser Pro Gin Leu Leu ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly 35 40 45 Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu 50 55 60 Lys Leu Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met 65 70 75 80 Gin Ala Leu Gin Thr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu 85 90 95 Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser 100 105 110 Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn 115 120 125 Asn Phe Tyr Pro Arg 130 <210> 64 <211> 20 <212> PRT <213> Human <400> 64

Asp Ile Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15

Asp Arg Val Thr 20 <210> 65 <211> 20 <212 > PRT <213 > Human <400> 65

Glu Ile Val Leu Thr Gin Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 15 10 15

Glu Arg Ala Thr 20 -74- CZ 303703 B6 <210?· 66 <211> 20 <212> PRT <213> Human <400> 66

Glu lle Val Leu Thr Gin Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 S 10 15

Glu Arg Ala Thr 20 <210> 67 <211> 20 <212> PRT <213> Human <400> 67

Asp lle Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15

Asp Arg Val Thr 20 <210> 68 <211> 20 <212> PRT <213> Human <400> 68

Thr Gly Glu Phe Val Leu Thr Gin Ser Pro Gly Thr Leu ser Leu Ser 1 5 10 15 Pro Gly Glu Arg 20 <210> 69 <211> 20 <212 > PRT <213? Human <400> 69 Glu Phe Val Leu Thr Gin Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr 20 <210> 70 <211> 20 <212> PRT <213> Human <400> 70

Glu lle Val Leu Thr Gin Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 15 10 15

Glu Arg Ala Thr 20 <210> 71 <211> 20 <212> PRT <213> Human -75- CZ 303703 B6 <400> 71 6lu Ile Val Leu Thr Gin Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr 20 <210> 72 <211> 20 <212> PRT <213> Human <400> 72 Glu Ile Val Leu Thr Gin Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr 20 <210> 73 <211> 20 <212> PRT <213> Human <400> 73 Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gin Pro Gly Arg Ser 1 5 10 15 Leu Arg Leu Ser 20 <210> 74 <211> 5 <212> PRT <213> Human <400> 74 Pro Glu Val Gin Phe 1 5 <210> 75 <211> 20 <212> PRT <213> Human <400> 75 Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gin Pro Gly Arg Ser 1 5 10 15 Leu Arg Leu Ser 20 <210> 76 <211> 10 <212> PRT <213> Human <400> 76 Pro Glu Val Gin Phe Asn Trp Tyr Val Asp 1 5 10 <210* 77 <211> 17 <212> PRT <213> Human -76- CZ 303703 B6 <400> 77

Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gin Pro Gly Arg Ser 15 10 15

Leu <21Q> 78 <211> 8 <212> PRT <213> Human <400> 78

Pro Glu Val Gin Phe Asn Trp Tyr 1 5 <210> 79 <211> 20 <212> PRT <213> Human <400> 79

Glu Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15

Ser Leu Arg Leu 20 <210> 80 <211;» 20 <212> PRT <213> Human <400> 80

Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gin Pro Gly Arg Ser 15 10 15

Leu Arg Leu Ser 20 <210> 81 <211> 10 <212> PRT <213> Human <400> 81

Pro Glu Val Gin Phe Asn Trp Tyr Val Asp 15 10 <210> 82 <211> 20 <212> PRT <213> Human <400> 82

Val Gin Leu Val Olu Ser Gly Gly Gly Val Val Gin Pro Gly Arg Ser 15 10 ís

Leu Arg Leu Ser 20

<210> 83 <211> 9 <212> PRT - 77 - CZ 303703 B6 <213> Human <400> 83

Pro Glu Val Gin Phe Asn Trp Tyr Val 1 5 <210> 84 <211> 20 <212> PRT <213> Human <400> 84

Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gin Pro Gly Arg Ser 15 10 15

Leu Arg Leu Ser 20 <210> 85 <211> 6 <212> PRT <213> Human <400> 85

Pro Glu Val Gin Phe Asn 1 5 <210> 86 <211> 20 <212> PRT <213> Human <400> 86

Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Glu Pro Gly Arg Ser 15 10 15

Leu Arg Leu Ser 20 <210> 87 <211> 10 <212> PRT <213> Human <400> 87

Pro Glu Val Gin Phe Asn Trp Tyr Val Asp 15 10 <210> 88 <211> 8 <212> PRT <213> Human <400> 88

Asp Ile Gin Met Thr Gin Ser Pro 1 5 <210> 89 <211> B <212 > PRT <213> Human <400> 89 - 78 - CZ 303703 B6

Glu Ile Val Leu Thr Gin Ser Pro 1 5 <210> 90 <211> 8 <212> PRT <213> Human <400> 90

Glu Ile Val Leu Thr Gin Ser Pro 1 5 <210> 91 <211> 10 <212> PRT <213> Human <400> 91

Thr Gly Glu Phe Val Leu Thr Gin Ser Pro 15 10 <210> 92 <211> 8 <212> PRT <213> Human <400> 92

Glu Phe Val Leu Thr Gin Ser Pro 1 S <210> 93 <211> 8 <212> PRT <213> Human <400> 93

Glu Ile Val Leu Thr Gin Ser Pro 1 5 <210> 94 <211> 8 <212> PRT <2133· Human <400> 94

Glu Ile Val Leu Thr Gin Ser Pro 1 5 <210> 95 <211> 463 <212> PRT <213> Human <400> 95 Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Leu Leu Arg Gly 1 5 10 15 val Gin Cys Gin Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gin 20 25 30 Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys val Ala Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45 Ser Ser His Gly Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu -79- CZ 303703 B6 50 55 60

Glu Trp Val Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Arg Asn Lys 65 70 75

Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn 85 90

Thr Leu Phe Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 100 105

Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Gly His Phe Gly Pro Phe Asp 115 120 125

Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys 130 135 140

Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu 145 150 1SS

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro 165 170

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr 180 185

Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val 195 200 205

Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gin Thr Tyr Thr Cys Asn 210 215 220

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg 225 230 235

Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly 245 250

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 260 265

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 275 280 285

Val Gin Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 290 295 300

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Phe Asn Ser Thr Phe Arg 305 310 315

Val Leu Thr Val Val His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys 325 330

Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu 340 345

Ser Lys Thr Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr 355 360 365

Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu 370 375 380

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 385 390 395

Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met 405 410

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 420 425

Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 435 440 445

His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 450 455 460 <210> 96 <211> 463 <212> PRT <213 > Human <400> 96

Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Leu 15 10

Val Gin Cys Gin Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly

Tyr Tyr Ala 80 Ser Lys Asn 95 Thr Ala Val 110 Tyr Trp Gly Gly Pro Ser Ser Thr Ala 160 Val Thr Val 175 Phe Pro Ala 190 Val Thr Val Val Asp His Lys Cys Cys 240 Pro Ser Val 255 Ser Arg Thr 270 Asp Pro Glu Asn Ala Lys Val Val Ser 320 Glu Tyr Lys 335 Lys Thr Ile 350 Thr Leu Pro Thr Cys Leu Glu Ser Asn 400 Leu Asp Ser 415 Lys Ser Arg 430 Glu Ala Leu Gly Lys

Leu Arg Gly 15 Val Val Gin -80- CZ 303703 B6

Pro Gly Arg 20 Ser Leu Arg Leu Ser Ser Ser 35 His Gly Met His Trp 40 Val Glu 50 Trp Val Ala Val Ile 55 Trp Tyr 65 Asp Ser val Lys Gly 70 Arg Phe Thr Thr Leu Phe Leu 85 Gin Met Asn Ser Tyr Tyr Cys 100 Ala Arg Gly Gly His Gin Gly 115 Thr Leu Val Thr val 120 Ser Val 130 Phe Pro Leu Ala Pro 135 Cys Ser 145 Ala Leu Gly Cys Leu 150 Val Lys Asp Ser Trp Asn Ser 165 Gly Ala Leu Thr Val Leu Gin 180 Ser Ser Gly Leu Tyr Pro Ser 195 Ser Asn Phe Gly Thr 200 Gin Lys 210 Pro Ser Asn Thr Lys 215 Val Asp 225 Val Glu Cys Pro Pro 230 Cys Pro Ala Phe Leu Phe Pro 245 Pro Lys Pro Lys Pro Glu val 260 Thr Cys Val Val Val Val Gin 275 Phe Asn Trp Tyr Val 280 Asp Thr 290 Lys Pro Arg Glu Glu 295 Gin Phe 305 Val Leu Thr Val Val 310 His Gin Asp cys Lys val Ser 325 Asn Lys Gly Leu Ser Lys Thr 340 Lys Gly Gin Pro Arg Pro Ser 355 Arg Glu Glu Met Thr 360 Lys Val 370 Lys Gly Phe Tyr Pro 375 Ser Asp 385 Gly Gin Pro Glu Asn 390 Asn Tyr Lys Asp Gly Ser Phe 405 Phe Leu Tyr Ser Trp Gin Gin 420 Gly Asn val Phe Ser His Asn 435 His Tyr Thr Gin Lys 440 Ser 450 455 25 30 Cys val Ala Ser Gly Phe 45 Thr Phe Arg Gin Ala Pro Gly Lys 60 Gly Leu Asp Gly Arg 75 Asn Lys Tyr Tyr Ala 80 Ile Ser Arg 90 Asp Asn Ser Lys 95 Asn Leu 105 Arg Ala Glu Asp Thr 110 Ala Val Phe Gly Pro Phe Asp Tyr 125 Trp Gly Ser Ala Ser Thr Lys Gly 140 Pro Ser Arg Ser Thr 155 Ser Glu Ser Thr Ala 160 Tyr Phe Pro 170 Glu Pro Val Thr 175 Val Ser 185 Gly Val His Thr Phe 190 Pro Ala Ser Leu Ser Ser Val Val 205 Thr Val Thr Tyr Thr Cys Asn Val 220 Asp His Lys Thr Val 235 Glu Arg Lys Cys Cys 240 Pro Pro Val 250 Ala Gly Pro Ser 255 Val Asp 265 Thr Leu Met Ile Ser 270 Arg Thr Asp Val Ser His Glu Asp 285 Pro Glu Gly Val Glu Val His Asn 300 Ala Lys Gin Ser Thr 315 Phe Arg Val Val Ser 320 Trp Leu Asn 330 Gly Lys Glu Tyr 335 Lys Pro 345 Ala Pro Ile Glu Lys 350 Thr Ile Glu Pro Gin Val Tyr Thr 365 Leu Pro Asn Gin Val Ser Leu Thr 380 Cys Leu Ile Ala Val 395 Glu Trp Glu Ser Asn 400 Thr Thr Pro 410 pro Met Leu Asp 415 Ser Lys 425 Leu Thr Val Asp Lys 430 Ser Arg Cys Ser Val Met His Glu 445 Ala Leu Leu Ser Leu Ser Pro Gly 460 Lys <210> 97 <211> 235 <212> PRT <213> Human -81 CZ 303703 B6 <400> 97

Met Glu Thr Pro Ala Gin Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro 1 5 10 15 Asp Thr Thr Gly Glu Ile Val Leu Thr Gin Ser Pro Gly Thr Leu Ser 20 25 30 Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser 35 40 45 Ile ser Ser Ser Phe Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Arg Pro Gly Gin Ala 50 55 60 Pro Arg Leu Leu Xle Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro 65 70 75 80 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 85 90 95 Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala val Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr 100 105 110 Gly Thr Ser Pro Trp Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 115 120 125 Arg Thr Val Ala Ala Pro ser val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 130 135 140 Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 145 150 155 160 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin 165 170 175 Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser 180 185 190 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 195 200 205 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser 210 215 220 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 235 <210> 98 <211> 464 <212> PRT <213> Human <400> 98 Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Leu Leu Arg Gly 1 5 10 15 Val Gin Cys Gin Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gin 20 25 30 Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45 Ser Asn Tyr Gly Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Val Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys His Tyr Gly 65 70 75 80 Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ser Asp Asn Ser Lys Asn 85 90 95 Thr Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Glu Arg Leu Gly Ser Tyr Phe Asp Tyr Trp 115 120 125 Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro 13 0 135 140 Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr 145 150 155 160 Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr 165 170 175 Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro - 82 - CZ 303703 B6

Ala Val Leu 180 Gin Ser Ser Gly Leu 185 Tyr Ser Leu Ser Ser 190 Val Val Thr Val Pro 195 Ser Ser Asn Phe Gly 200 Thr Gin Thr 205 Tyr Thr Cys Asn Val Asp His 210 Lys Pro Ser Asn Thr 215 Lys Val Asp Lys Thr 220 Val Glu Arg Lys Cys 22S Cys Val Glu Cys Pro 230 Pro Cys Pro Ala Pro 235 Pro Val Ala Gly Pro 240 Ser Val Phe Leu Phe 245 Pro Pro Lys Pro Lys 250 Asp Thr Leu Met Ile 255 Ser Arg Thr Pro Glu 260 Val Thr Cys Val Val 265 Val Asp Val Ser His 270 Glu Asp Pro Glu Val 275 Gin Phe Asn Trp Tyr 280 Val Asp Gly Val 285 Glu Val His Asn Ala Lys 290 Thr Lys Pro Arg Glu 295 Glu Gin Phe Asn Ser 300 Thr Phe Arg Val Val 305 Ser Val Leu Thr Val 310 Val His Gin Asp Trp 315 Leu Asn Gly Lys Glu 320 Tyr Lys Cys Lys Val 325 Ser Asn Lys Gly Leu 330 Pro Ala Pro Ile Glu 335 Lys Thr Ile Ser Lys 340 Thr Lys Gly Gin Pro 345 Arg Glu Pro Gin Val 350 Tyr Thr Leu Pro Pro 355 Ser Arg Glu Glu Met 360 Thr Lys Asn Gin 365 Val Ser Leu Thr Cys Leu 370 Val Lys Gly Phe Tyr 375 Pro Ser Asp Ile Ala 380 Val Glu Trp Glu Ser 385 Asn Gly Gin Pro Glu 390 Asn Asn Tyr Lys Thr 395 Thr Pro Pro Met Leu 400 Asp Ser Asp Gly Ser 405 Phe Phe Leu Tyr Ser 410 Lys Leu Thr Val Asp 415 Lys Ser Arg Trp Gin 420 Gin Gly Asn Val Phe 425 Ser Cys Ser Val Met 430 His Glu Ala Leu His 435 Asn His Tyr Thr Gin 440 Lys Ser Leu Ser 445 Leu Ser Pro Gly Lys 450 455 460 <210> 99 <21l> 233 <212> PRT <213> Human <400> 99

Met Glu Thr Pro Ala Gin Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro 1 Asp Thr Thr Gly 5 Glu Ile Val Leu Thr 10 Gin Ser Pro Gly Thr 15 Leu Ser Leu Ser Pro 20 Gly Glu Arg Ala Thr 25 Leu Ser Cys Arg Thr 30 Ser Val Ser Ser Ser 35 Tyr Leu Ala Trp Tyr 40 Gin Gin Lys 45 Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu 50 Leu Ile Tyr Gly Ala 55 Ser Ser Arg Ala 60 Thr Gly Ile Pro Asp Arg 65 Phe Ser Gly Ser Gly 70 Ser Gly Thr Asp Phe 75 Thr Leu Thr Ile Ser 80 Arg Leu Glu Pro Glu 85 Asp Phe Ala Val Tyr 90 Tyr Cys Gin Gin Tyr 95 Gly Ile ser Pro Phe 100 Thr Phe Gly Gly Gly 105 Thr Lys Val Glu Ile 110 Lys Arg Thr val Ala 115 Ala Pro Ser Val Phe 120 Ile Phe Pro 125 Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys 130 Ser Gly Thr Ala Ser 135 Val Val Cys Leu 140 Leu Asn Asn Phe Tyr Pro 83 CZ 303703 B6

Val 150 Gin Trp Lys Val Asp 155 Asn Ala Leu Gin 160 Ser Gly 165 Ser Val Thr Glu Gin 170 Asp Ser Lys Asp Ser 175 Thr Tyr Thr Leu Thr Leu 185 Ser Lys Ala Asp Tyr 190 Glu Lys His Cys Glu Val 200 Thr His Gin Gly Leu 205 Ser Ser Pro Val Asn Arg 230 215 Gly Glu Cys 220 145

Arg Glu Ala Lys

Asn Ser Gin Glu

ISO

Ser Leu Ser Ser 195

Lys Val Tyr Ala 210

Thr Lys Ser Phe 225 <210> 100 <211> 463 <212> PRT <213> Human <400> 100

Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Leu Leu Arg Gly 1 5 10 15 Val Gin Cys Gin Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Glu 20 25 30 Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45 Ser Ser Tyr Gly Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Val Ala val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys His Tyr Ala 65 70 75 80 Asp Ser Ala Lys Gly Arg Phe Thr Xle Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn 85 90 95 Thr Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Ala Gly Leu Leu Gly Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly 115 120 125 Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 130 135 140 Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala 145 150 155 160 Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 165 170 175 Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 180 185 190 Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 195 200 205 Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gin Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His 210 215 220 Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr val Glu Arg Lys Cys Cys 225 230 235 240 Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro val Ala Gly Pro Ser Val 245 250 255 Phe Leu Phe Pro Pro LyS Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 260 265 270 Pro Glu val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu 275 280 285 Val Gin Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 290 295 300 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser 305 310 315 320 Val Leu Thr Val Val His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 325 330 335 Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile 84- CZ 303703 B6

Arg 345 Glu Pro 360 Lys Asn Gin Asp Ile Ala Lys Thr Thr Ser Lys 410 Leu Ser 425 Cys Ser 440 Ser Leu Ser 350 Thr Leu Pro Thr Cys Leu Glu Ser Asn Leu Asp 400 Ser Lys 415 Ser Arg 430 GlU Ala Leu Gly Lys

Gin Val Tyr 365 Val Ser 380 Leu Val 395 Glu Trp Pro Pro Met Thr val Asp Val Met His 445 Leu Ser 460 Pro 340

Gly Gin Pro Glu Met Thr 375 Tyr Pro 390 Ser Asn 405 Asn Tyr Phe Leu Tyr Asn Val Phe Thr Gin Lys 455

Ser Lys Thr Lys 355

Pro Ser Arg Glu 370

Val Lys Gly Phe 385

Gly Gin Pro Glu

Asp Gly Ser Phe 420

Trp Gin Gin Gly 435

His Asn His Tyr 450 <210> 101 <211> 234 <212> PRT <213> Human <400> 101

Met Glu Thr Pro Ala Gin Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro 1 5 10 15 Asp Thr Thr Gly Glu Ile Val Leu Thr Gin Ser Pro Gly Thr Leu Ser 20 25 30 Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser 35 40 45 Val Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro 50 55 60 Arg Pro Leu Ile Tyr Gly Val Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp 65 70 75 80 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 85 90 95 Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Gly 100 105 110 Ile Ser Pro Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys Arg 115 120 125 Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin 130 135 140 Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 145 150 155 160 Pro Arg Glu Ala Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin Ser 165 170 175 Gly Asn Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr 180 185 190 Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 195 200 205 HÍ3 Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro 210 215 220 Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 <210> 102 <211> 451 <212> PRT <213 > Human <400> 102

Gin Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gin Pro Gly Arg 15 10 15 85 CZ 303703 B6

Ser Leu Arg Leu Ser 20 Cys Ala Ala Ser 25 Gly Phe Thr Phe Ser 30 Ser Tyr Gly Met His 35 Trp Val Arg Gin Ala 40 Pro Gly Lys Gly Leu 45 Glu Trp Val Ala Val 50 Ile Trp Tyr Asp Gly 55 Ser Asn Lys Tyr Tyr 60 Ala Asp Ser Val Lys 65 Gly Arg Phe Thr Ile 70 Ser Arg Asp Asn Ser 75 Lys Asn Thr Leu Tyr 80 Leu Gin Met Asn Ser 85 Leu Arg Ala Glu Asp 90 Thr Ala Val Tyr Tyr 95 Cys Ala Arg Asp Pro Arg 100 Gly Ala Thr Leu 105 Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr 110 >Gly Met Asp Val Trp 115 Gly Gin Gly Thr Thr 120 Val Thr Val Ser Ser 125 Ala Ser Thr Lys Gly 130 Pro Ser Val Phe Pro 135 Leu Ala Pro Cys Ser 140 Arg Ser Thr Ser Glu 145 Ser Thr Ala Ala Leů 150 Gly Cys Leu Val Lys 155 Asp Tyr Phe Pro Glu 160 Pro val Thr Val Ser 165 Trp Asn Ser Gly Ala 170 Leu Thr Ser Gly Val 175 His Thr Pbe Pro Ala Val 180 Leu Gin Ser Ser 185 Gly Leu Tyr Ser Leu 190 Ser Ser Val Val Thr 195 Val Pro Ser Ser Asn 200 Phe Gly Thr Gin Thr 205 Tyr Thr Cys Asn Val 210 Asp His Lys Pro Ser 215 Asn Thr Lys Val Asp 220 Lys Thr Val Glu Arg 225 Lys Cys Cys Val Glu 230 Cys Pro Pro Cys Pro 235 Ala Pro Pro Val Ala 240 Gly Pro Ser Val Phe 245 Leu Phe Pro Pro Lys 250 Pro Lys Asp Thr Leu 255 Met Ile Ser Arg Thr Pro 260 Glu Val Thr Cys 265 Val Val Val Asp Val 270 Ser His Glu Asp Pro 275 Glu Val Gin Phe Asn 280 Trp Tyr Val Asp Gly 285 Val Glu Val His Asn 290 Ala Lys Thr Lys Pro 295 Arg Glu Glu Gin Phe 300 Asn Ser Thr Phe Arg 305 Val Val Ser Val Leu 310 Thr Val Val His Gin 315 Asp Trp Leu Asn Gly 320 Lys Glu Tyr Lys Cys 325 Lys Val Ser Asn Lys 330 Gly Leu Pro Ala Pro 335 Ile Glu Lys Thr Ile ser 340 Lys Thr Lys Gly 345 Gin Pro Arg Glu Pro 350 Gin Val Tyr Thr Leu 355 Pro Pro Ser Arg Glu 360 Glu Met Thr Lys Asn 365 Gin Val Ser Leu Thr 370 Cys Leu Val Lys Gly 375 Phe Tyr Pro Ser Asp 380 Ile Ala Val Glu Trp 385 Glu Ser Asn Gly Gin 390 Pro Glu Asn Asn Tyr 395 Lys Thr Thr Pro Pro 400 Met Leu Asp Ser Asp 405 Gly Ser Phe Phe Leu 410 Tyr Ser Lys Leu Thr 415 Val Asp Lys Ser Arg Trp 420 Gin Gin Gly Asn 425 Val Phe Ser Cys Ser 430 Val Met His Pro Glu Gly 450 Ala 435 Lys Leu His Asn His Tyr 440 Thr Gin Lys Ser Leu 445 Ser Leu Ser <210> 103 <211> 214 <212> PRT <213> Human 86- CZ 303703 B6 <4 00> 103 Asp 1 Ile Gin Met Thr 5 Gin Ser Pro Asp Arg Val Thr 20 Ile Thr Cys Arg Leu Asp Trp 35 Tyr Gin Gin Lys Pro 40 Tyr Ala 50 Ala Ser Ser Leu Gin Ser 55 Ser 65 Gly Ser Gly Thr Asp 70 Phe Thr Glu Asp Phe Ala Thr 85 Tyr Tyr Cys Thr Phe Gly Pro Gly 100 Thr Lys Val Pro Ser Val 115 Phe Ile Phe Pro Pro 12 0 Thr Ala 130 Ser Val Val Cys Leu Leu 135 Lys 145 Val Gin Trp Lys Val 150 Asp Asn Glu Ser Val Thr Glu 165 Gin Asp Ser Ser Thr Leu Thr 180 Leu Ser Lys Ala Ala Cys Glu 195 Val Thr His Gin Gly 200 Phe Asn 210 Arg Gly Glu Cys

Ser Ser 10 Leu Ser Ala Ser Val 15 Gly Ala 25 Ser Gin Ser Ile Asn 30 Ser Tyr Gly Lys Ala Pro Lys 45 Leu Leu Ile Gly Val Pro Ser 60 Arg Phe Ser Gly Leu Thr Ile 75 Ser Ser Leu Gin Pro 80 Gin Gin 90 Tyr Tyr Ser Thr Pro 95 Phe Glu 105 Ile Lys Arg Thr Val 110 Ala Ala Ser Asp Glu Gin Leu 125 Lys Ser Gly Asn Asn Phe Tyr 140 Pro Arg Glu Ala Ala Leu Gin 155 Ser Gly Asn Ser Gin 160 Lys Asp 170 Ser Thr Tyr Ser Leu 175 Ser Asp 185 Tyr Glu Lys His Lys 190 Val Tyr Leu Ser Ser Pro Val 205 Thr Lys Ser <210> 104 <211> 22 <212> DNA <213 > Human <4 00> 104 caggtgcagc tggagcagtc gg <210> 105 <211> 24 <212? DNA <213> Human <400> 105 gctgagggag tagagtcctg agga <210> 106 <211> 49 <212? DNA <213? Human <4 00> 106 tatctaagct tctagactcg accgccacca 22 24 tggagtttgg gctgagctg 49 <210> 107 <211? 46 <212> DNA <213> Human <4 00? 107 87 CZ 303703 B6 ttctctgatc agaattccta tcatttaccc <210> 108 <211> 9 <212> DNA <213> Human <400> 108 accgccacc <210> 109 <211> 45 <212> DNA <213> Human <400> 109 tcttcaagct tgcccgggcc cgccaccatg <21Q> 110 <211> 43 <212> DNA <213> Human <400> 110 ttctttgatc agaattctca ctaacactct <210> 111 <211> 48 <212> DNA <213> Human <400> 111 tcttcaagct tgcccgggcc cgccaccatg <210> 112 <211> 1392 <212> DNA <213> Human <400> 112 atggagtttg ggctgagctg ggttttcctc gtgeagctgg tggagtctgg gggaggcgtg tgtgtagcgt ctggattcac cttcagtagc ggcaaggggc tggagtgggt ggcagttata gactccgtga agggccgatt caccatctcc caaatgaaca gcctgagagc cgaggacacg ttcggtcctt ttgactactg gggccaggga aagggcccat cggtcttccc cctggcgccc gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc ggcgctctga ccagcggcgt gcacaccttc tccctcagea gcgtggtgac cgtgccctcc aacgtagatc acaagcccag caacaccaag gtcgagtgcc caccgtgccc agcaccacct ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc gacgtgagcc acgaagaccc cgaggtccag cataatgcca agacaaagcc acgggaggag gtcctcaccg ttgtgcacca ggactggctg aacaaaggcc tcccagcccc catcgagaaa gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc ctgacctgcc tggtcaaagg cttctacccc gggcagccgg agaacaacta caagaccaca ggagacaggg agagct 46 9 gaaaccccag cgcag cccctgttga agc gacatgaggg tccccgct gttgctcttt taagaggtgt ccagtgtcag gtccagcctg ggaggtccct gagactctcc catggcatgc actgggtccg ccaggctcca tggtatgatg gaagaaataa atactatgca agagacaatt ccaagaacac gctgtttctg gctgtgtatt actgtgcgag aggaggtcac accctggtca ccgtctcctc agcctccacc tgctccagga gcacctccga gagcacagcg cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca ccagctgtcc tacagtcctc aggactctac agcaacttcg gcacccagac ctacacctgc gtggacaaga cagttgagcg caaatgttgt gtggcaggac cgtcagtctt cctcttcccc cggacccctg aggtcacgtg cgtggtggtg ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg cagttcaaca gcacgttccg tgtggtcagc aacggcaagg agtacaagtg eaaggtctcc accatctcca aaaccaaagg gcagccccga cgggaggaga tgaccaagaa ccaggtcagc agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat cctcccatgc tggactccga cggctccttc 45 43 48 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 114 0 1200 1260 -88- CZ 303703 B6 ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca 1320 tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc agaagagcct ctccctgtct 1380 ccgggtaaat ga 1392 <210 > 113 <211> 708 <212 > DNA <213 > Human <400> 113 atggaaaccc cagcgcagct tctcttcctc ctgctactct ggctcccaga taccaccgga 60 gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 120 ctctcctgca gggccagtca gagtattagc agcagcttct tagcctggta ccagcagaga 180 cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca gcagggccac tggcatccca 240 gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 300 cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagtatggta cctcaccctg gacgttcggc 360 caagggacca aggtggaaat caaacgaact gtggctgcac catctgtctt catcttcccg 420 ccatctgatg agcagttgaa atctggaact gcctctgttg tgtgcctgct gaataacttc 480 tatcccagag aggccaaagt acagtggaag gtggataacg ccctccaate gggtaactcc 540 caggagagtg tcacagagca ggacagcaag gacagcacct acagcctcag cagcaccctg 600 acgctgagca aagcagacta cgagaaacac aaagtctacg cctgcgaagt cacccatcag 660 ggcctgagct cgcccgtcac aaagagcttc aacaggggag agtgttag 708 <210=> 114 <211> 1395 <212> DNA <213> Human <400> 114 atggagtttg ggctgagctg ggttttcctc gttgctcttt taagaggtgt ccagtgtcag 60 gtgcagctgg tggagtctgg gggaggcgtg gtccagcctg ggaggtccct gagactctcc 120 tgtacagcgt ctggattcac cttcagtaac tatggcatgc actgggtccg ccaggctcca 180 ggcaaggggc tggagtgggt ggcagttata tggtatgatg gaagtaataa acactatgga 240 gactccgtga agggccgatt caccatctcc agtgacaatt ccaagaacac gctgtatctg 300 caaatgaaca gcctgagagc cgaggacacg gctgtgtatt actgtgcgag aggagagaga 360 ctggggtcct actttgacta ctggggccag ggaaccctgg tcaccgtctc ctcagcctcc 420 accaagggcc catcggtctt ccccctggcg ccctgctcca ggagcacctc cgagagcaca 480 gcggccctgg gctgcctggt caaggactac ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac 540 tcaggcgctc tgaccagcgg cgtgcacacc ttcccagctg tcctacagtc ctcaggactc 600 tactccctca gcagcgtggt gaccgtgccc tccagcaact tcggcaccca gacctacacc 660 tgcaacgtag atcacaagcc cagcaacacc aaggtggaca agacagttga gcgcaaatgt 720 tgtgtcgagt gcccaccgtg cccagcacca cctgtggcag gaccgtcagt cttcctcttc 780 cccccaaaac ccaaggacac cctcatgatc tcccggaccc ctgaggtcac gtgcgtggtg 840 gtggacgtga gccacgaaga ccccgaggtc cagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag 900 gtgcataatg ccaagacaaa gccacgggag gagcagttca acagcacgtt ccgtgtggtc 960 agcgtcctca ccgttgtgca ccaggactgg ctgaacggca aggagtacaa gtgcaaggtc 1020 tccaacaaag gcctcccagc ccccatcgag aaaaccatct ccaaaaccaa agggcagccc 1080 cgagaaccac aggtgtacac cctgccccca tcccgggagg agatgaccaa gaaccaggtc 1140 agcctgacct gcctggtcaa aggcttctac cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc 1200 aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc acacctccca tgctggactc cgacggctcc 1260 ttettectet acagcaagct caccgtggac aagagcaggt ggcagcaggg gaacgtcttc 1320 tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcae aaCcactaca cgcagaagag cctctccctg 1380 tctccgggta aatga 1395 <210> 115 <211> 702 <212> DNA <213> Human <400> 115 atggaaaccc cagcgcagct tctcttcctc ctgctactct ggctcccaga taccaccgga 60 -89- CZ 303703 B6 gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctctcctgca ggaccagtgt tagcagcagt caggctccca ggctcctcat ctatggtgca ttcagtggca gtgggtctgg gacagacttc gattttgcag tetattactg tcagcagtat accaaggtgg agatcaagcg aactgtggct gatgagcagt tgaaatctgg aactgcctct agagaggcca aagtacagtg gaaggtggat agtgtcacag agcaggacag caaggacagc agcaaagcag actacgagaa acacaaagtc agctcgcccg tcacaaagag cttcaacagg <210> 116 <211> 489 <212> DNA <213 > Human <400> 116 cctgggaggt ccctgagact ctcctgtgca atccactggg tccgccaggc tccaggcaag gatggaagaa ataaagacta tgcagactcc aattccaaga agacgctgta tttgcaaatg tattactgtg cgagagtggc cccaetgggg gtcaccgtct cctcagcctc caccaagggc aggagcacct ccgagagcac agcggccctg ccggtgacgg tgtcgtggaa ctcaggcgct gtcctacag <210> 117 <211> 417 <212> DNA <213 > Human <400> 117 ggcaccctgt ctttgtctcc aggggaaaga gtcagcagct acttagcctg gtaccagcag tatggtgcat ccagcagggc cactggcatc acagacttca ctctcaccat cagcagactg cagcagtatg gtaggtcacc attcactttc actgtggctg caccatctgt cttcatcttc actgcctctg ttgtgtgcct gctgaataac <210> 118 <211> 1392 <212> DNA <213> Human <400> 118 atggagtttg ggctgagctg ggttttcctc gtgcagctgg tggagtctgg gggaggcgtg tgtacagcgt ctggattcac cttcagtagt ggcaaggggc tggagtgggt ggcagttata gactccgcga agggccgatt caccatctcc caaatgaaca gcctgagagc cgaggacacg ctgggteact ttgactactg gggccaggga aagggcccat cggtcttccc cctggcgccc gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc ggcgctctga ccagcggcgt gcacaccttc tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc aacgtagatc acaagcccag caacaccaag gtcgagtgcc caccgtgccc agcaccacct ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc tacttagcct ggtaccagca gaaacctggc tccagcaggg ccactggcat cccagacagg actctcacca tcagcagact ggagcctgaa ggcatctcac ccttcacttt cggcggaggg gcaccatctg tcttcatctt cccgccatct gttgtgtgcc tgctgaataa cttctatccc aacgccctcc aatcgggtaa ctcccaggag acctacagcc tcagcagcac cctgacgctg tacgcctgcg aagtcaccca tcagggcctg ggagagtgtt ag gcgtctggat tcaccttcag tagtcatggc gggctggagt gggtggcagt tatatggtat gtgaagggcc gattcaccat ctccagagac aacagcctga gagccgagga cacggctgtg ccacttgact actggggcca gggaaccctg ccatcggtct tccccctggc gccctgctcc ggctgcctgg tcaaggacta cttccccgaa ctgaccagcg gcgtgcacac cttcccagct gccaccctct cctgcagggc cagtcagagt aaacctggcc aggctcccag actcctcatc ccagacaggt tcagtggcag tgggtctggg gagcctgagg attttgcagt gtattactgt ggccctggga ccaaagtgga tatcaagcga ccgccatctg atgagcagtt gaaatctgga ttctatccca gagaggccaa agtacag gttgctcttt taagaggtgt ccagtgtcag gtcgagcctg ggaggtccct gagactctcc tatggcatgc actgggtccg ccaggctcca tggtatgatg gaagcaataa acactatgca agagacaatt ccaagaacac gctgtatctg gctgtgtatt actgtgcgag agccggactg accctggtca ccgtctcctc agcctccacc tgctccagga gcacctccga gagcacagcg cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca ccagctgtcc tacagtcctc aggactctac agcaacttcg gcacccagac ctacacctgc gtggacaaga cagttgagcg caaatgttgt gtggcaggac cgtcagtctt cctcttcccc 120 1B0 240 300 360 420 480 540 600 660 702 60 120 180 240 300 360 420 480 489 60 120 180 240 300 360 417 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 -90- CZ 303703 B6 ceaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg aggtcacgtg cgtggtggtg 840 gacgtgagcc acgaagaccc cgaggtccag ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg 900 cataatgcca agacaaagcc acgggaggag cagttcaaca gcacgttccg tgtggtcagc 9S0 gtcctcaccg ttgtgcacca ggactggctg aacggcaagg agtacaagtg caaggtctcc 1020 aacaaaggcc tcccagcccc catcgagaaa accatctcca aaaccaaagg gcagccccga 1080 gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgggaggaga tgaccaagaa ccaggtcagc 1140 ctgacctgcc tggtcaaagg cttctacccc agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat 1200 gggcagccgg agaacaacta caagaccaca cctcccatgc tggactccga cggctccttc 1260 ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca 1320 tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc agaagagcct ctccctgtct 1380 ccgggtaaat ga 1392 <210> 119 <211> 705 <212> DNA <213> Human <4 00> 119 atggaaaccc cagcgcagct tctcttcctc ctgctactct ggctcccaga taccaccgga 60 qaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 120 ctctcctgta gggccagtca aagtgttagc agctacttag cctggtacca acagaaacct 180 ggccaggctc ccaggcccct catctatggt gtatccagca gggccactgg catcccagac 240 aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac ttcactctca ccatcagcag actggagcct 300 gaagattttg cagtgtatta ctgtcagcag tatggtatct caccattcac tttcggccct 360 gggaccaaag tggatatcaa acgaactgtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 420 tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 480 cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 540 gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 600 ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 660 ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gttag 705 <210> 120 <211> 507 <212> DNA <213> Human <400> 120 ggcgtggtcc agcctgggag gtccctgaga ctctcctgtg cagcgtctgg attcaccttc 60 agtagetatg gcatgcactg ggtccgccag gctccaggca aggggctgga gtgggtggca 120 gttatatggt atgatggaag taataaatac tatgcagact ccgtgaaggg ccgattcacc 180 atctccagag acaattccaa gaacacgctg tatctgcaaa tgaacagcct gagagccgag 240 gacacggctg tgtattactg tgcgagaggg gcccgtataa taaccccttg tatggacgtc 300 tggggccaag ggaccacggt caccgtctcc tcagcctcca ccaagggccc. atcggtcttc 360 cccctggcgc cctgctceag gagcacctcc gagagcacag cggccctggg ctgcctggtc 420 aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg tcgtggaact caggcgctct gaccagcggc 480 gtgcacacct tcccagctgt cctacag 507 <210> 121 <211> 458 <212 > DNA <213 > Human <4 00> 121 cagtctccat cctccctgtc tgcatcfcgta ggagacagag tcaccatcac ttgccgggca 60 agtcagagca ttaacaccta tttaatttgg tatcagcaga aaccagggaa agcccctaac 120 ttcctgatct ctgctacatc cattttgcaa agtggggtcc catcaaggtt ccgtggcagt 180 ggctctggga caaatttcac tctcaccatc aacagtcttc atcctgaaga ttttgcaact 240 tactactgtc aacagagtta cagtacccca ttcactttcg gccctgggac caaagtggat 300 atcaaacgaa ctgtggctgc accatctgtc ttcatcttcc cgccatctga tgagcagttg 360 aaatctggaa ctgcctctgt tgtgtgcctg ctgaataact tctatcccag agaggccaaa 420 gtacagtgga aggtggataa cgccctccaa tcgggtaa 458 CZ 303703 B6 <210> 122 <211> 501 <212> DNA <213 > Human <400> 122 ggcgtggtcc agcctgggag gtccctgaga ctctcctgtg tagcgtctgg attcatcttc 60 agtagtcatg gcatccactg ggtccgccag gctccaggca aggggctgga gtgggtggca 120 gttatatggt atgatggaag aaataaagac tatgcagact ccgtgaaggg ccgattcacc 180 atctccagag acaattccaa gaacacgctg tatttgcaaa tgaacagcct gagagccgag 240 gacacggctg tgtattactg tgcgagagtg gccccactgg ggccacttga ctactggggc 300 cagggaacce tggtcaccgt ctcctcagcc tccaccaagg gcccatcggt cttccccctg 360 gcgccctgct ccaggagcac ctccgagagc acagcggccc tgggctgcct ggtcaaggac 420 tacttccccg aaccggtgac ggtgtcgtgg aactcaggcg ctctgaccag cggcgtgcac 480 accttcccag ctgtcctaca g 501 <21Q> 123 <211> 426 <212> DNA <213> Human <400> 123 tctccaggca ccctgtcttt gtctccaggg gaaagagcca ccctctcctg cagggccagt 60 cagagtatta gcagcaattt cttagcctgg taccagcaga aacctggcca ggctcccagg 120

ctcctcatct atcgtccatc cagcagggcc actggcatcc cagacagttt cagtggcagt ISO gggtctggga cagacttcac tctcaccatc agcagactgg agcctgagga ttttgcatta 240 tattactgtc agcagtatgg tacgtcaeca fctcactttcg gccctgggac caaagtggat 300 atcaagcgaa ctgtggctgc accatctgtc ttcatcttcc cgccatctga tgagcagttg 360 aaatctggaa ctgcctctgt tgtgtgcctg ctgaataact tctatcccag agaggccaaa 420 gtacag 426 <210> 124 <211> 516 <212> DNA <213> Human <400> 124 tcgggcccag gactggtgaa gccttcacag atcctgtccc tcacctgcac tgtctctggt 60 ggctccatca gcagtggtgg tcactactgg agctggatcc gccagcaccc agggaagggc 120

ctggagtgga ttgggtacat ctattacatt gggaacacct actacaaccc gtccctcaag ISO agtcgagtta ccatatcagt agacacgtct aagaaccagt tctccctgaa gctgagetct 240 gtgactgccg cggacacggc cgtgtattat tgtgcgagag atagtgggga ctactaeggt 300 atagacgtct ggggccaagg gaccacggtc accgtctcct cagcttccac caagggccca 360 tccgtcttcc ccctggcgcc ctgctccagg agcacctccg agagcacagc cgccctgggc 420 tgcctggtca aggactactt ccccgaaccg gtgacggtgt cgtggaactc aggcgccctg 480 accagcggcg tgcacacctt cccggctgtc ctacaa 516 <21Q> 125 <211> 465 <212> DNA <213> Human <400> 125 tctccagact ttcagtctgt gactccaaag gagaaagtca ccatcacctg ccgggccagt 50 cagagcattg gtagtagctt acattggtat cagcagaaac cagatcagtc tccaaagctc 120 ctcatcaagt atgcttccca gtccttctct ggggtcccct cgaggttcag tggcagtgga 180 tctgggacag atttcaccct caccatcaat agcctggaag ctgaagatgc tgcaacgtat 240 tactgtcatc agagtagtag tttaccgctc actttcggcg gagggaccaa ggtggagatc 300 aaacgaactg tggctgcacc atctgtcttc atcttcccgc catctgatga gcagttgaaa 360 tctggaactg cctctgttgt gtgcctgctg aataacttct atcccagaga ggccaaagta 420 -92- CZ 303703 B6 cagtggaagg tggataacgc cctccaatcg ggtaactccc aggag 465 <210> 126 <211> 459 <212 > DNA <213> Human <400> 126 cctgggaggt ccctgagact ctcctgtgca gcgtctggat tcaccttcag tagtcatggc 60 atccactggg tccgccaggc tccaggcaag gggctggagt gggtggcagt tatatggtat 120 gatggaagaa ataaagacta tgcagaetcc gtgaagggcc gattcaccat ctccagagac 180 aattccaaga acacgetgta tttgcaaatg aacagcctga gagccgagga cacggctgtg 240 tattactgtg cgagagtggc cccactgggg ccactcgact actggggcca gggaaccctg 300 gtcaccgtct cctcagcctc caccaagggc ccatcggtct tccccctggc gccctgctcc 360 aggagcacct ccgagagcac agcggccctg ggctgcctgg tcaaggacta cttccccgaa 420 ccggtgacgg tgtcgtggaa ctcaggcgct ctgaccagc 459 <210> 127 <211> 440 <212> DNA <213 > Humau <400> 127 cagtctccag gcaccctgtc tttgtctcca ggggaaagag ccaccctctc ctgcagggcc 60 agtcagagtg tcagcagcta cttagcctgg taccagcaga aacctggcca ggctcccagg 120 ctcctcatct atggtgcatc cagcagggcc actggcatcc eagacaggtt cagtggcagt 180 gggtctggga cagacttcac tctcaccatc agcagactgg agcctgagga ttttgcagtg 240 tattactgtc aacagtatgg taggteacca ttcactttcg gccctgggac caaagtagat 300 atcaagcgaa ctgtggctgc accatctgtc ttcatcttcc cgccatctga tgagcagttg 360 aaatctggaa ctgcctctgt tgtgtgcctg ctgaataact tctatcccag agaggccaaa 420 gtacagtgga aaggtggata 440 <210> 128 <211> 503 <212> DNA <213> Human <400> 128 ggcgtggtcc agcctgggag gtccctgaga ctctcctgtg cagcgtctgg attcaccttc 60 agtagctatg gcatgcactg ggtccgccag gctccaggca aggggctgga gtgggtggca 120 gttatatggt atgatggaag taataaatac tatgcagact ccgtgaaggg ccgattcacc 180 atctccagag acaattccaa gaacacgctg tatctgcaaa tgaacagcct gagagccgag 240 gacacggctg tgtattactg tgcgagagat ccgaggggag ctacccttta ctactactac 300 caccggtJcgg acgtctgggg ccaagggacc acggtcaccg tctcctcagc ctccaccaag 360 ggcccatcgg tcttccccct ggcgccctgc tccaggagca cctccgagag cacagcggcc 420 ctgggctgcc tggtcaagga ctacttcccc gaaccggtga cggtgtcgtg gaactcaggc 480 gctctgacca gcggegtgca cac 503 <210> 129 <211> 417 <212 > DNA <213 > Human <4 00> 129 ccatcctccc tgtctgcatc tgcaggagac agagtcacca tcacttgccg ggcaagtcag 60 agcattaaca gctatttaga ttggtatcag cagaaaccag ggaaagcccc taaactcctg 120 atctatgctg catccagttt gcaaagtggg gtcccatcaa ggttcagtgg cagtggatct 180 gggacagatt tcactctcac catcagcagt ctgcaacctg aagattttgc aacttactac 240 tgtcaacagt attacagtac tccattcact ttcggccctg ggaccaaagt ggaaatcaaa 300 cgaactgtgg ctgcaccatc tgtcttcatc ttcccgccat ctgatgagca gttgaaatct 360 ggaactgcct ctgttgtgtg cctgctgaat aacttctatc ccagagaggc caaagta 417 -93 - CZ 303703 B6 <210> 130 <211> 451 <212> DNA <213> Human <4O0> 130 ggcgtggtcc agcctgggag gtccctgaga ctctcctgtg cagcgtctgg attcaccttc 60 agtagctatg gcatgcactg ggtccgccag gctccaggca aggggctgga gtgggtggca 120 gttatatggt atgatggaag tcataaátac tatgcagact ccgtgaaggg ccgattcacc 180 atctccagag acaattccaa gaacacgctg tatctgcaaa tgaacagcct gagagccgag 240 gacacggctg tgtattactg tgcgagaggc gctgtagtag taccagctgc tatggacgtc 300 tggggccaag ggaccacggt caccgtctcc tcagcctcca ccaagggccc atcggtcttc 360 cccctggcgc cctgctccag gagcacctcc gagagcacag cggccctggg ctgcctggtc 420 aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg t 451 <210> 131 <211> 402 <212> DNA <213> Human <220> <400> 131 acccagtctc catcctccct gtctgcatct gtaggagaca gagtcaccat cacttgccgg 60 gcaagtcaga acattagcag gtatttaaat tggtatcaac agaaaccagg gaaagcccct 120 aagttcctga tctatgttgc atctattttg caaagtgggg tcccatcagg gttcagtgcc 180 agtggatctg ggccagattt cactctnacc atcagcagtc tgcaacctga agattttgca 240 acttactact gtcaacagag ttacagtacc ccattcactt tcggccctgg gaccaaagtg 300 gatatcaaac gaactgtggc tgcaccatct gtcttcatct tcccgccatc tgatgagcag 360 ttgaaatctg gaactgcctc tgttgtgtgc ctgctgaata ac 402 <210> 132 <211> 438 <212> DNA <213> Human <220> <400> 132 gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc tcctgtgcag cgtctggatt caccttcagt 60 agcngtggca tgcactgggt ccgccaggct ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt 120 atatggtctg atggaagtca taaatactat gcagactccg tgaagggccg attcaccatc 180 tccagagaca attccaagaa cacgctgtat ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac 240 acggctgtgt attactgtgc gagaggaact atgatagtag tgggtaccct tgactactgg 300 ggccagggaa ccctggtcac cgtctcctca gcctccacca agggcccatc ggtcttcccc 360 ctggcgccct gctccaggag cacctccgag agcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag 420 gactacttcc ccgaaccg 438 <210> 133 <211> 451 <212> DNA <213> Human <400> 133 acccagtctc catcctccct gtctgcatct gtaggagaca gagtcaccat cacttgccgg 60 gcaagtcaga gcatttgcaa ctatttaaat tggtatcagc agaaaccagg aaaagcccct 120 agggtcctga tctatgctgc atccagtttg caaggtgggg tcccgtcaag gttcagtggc 180 agtggatctg ggacagattg cactctcacc atcagcagtc tgcaacctga agattttgca 240 acttactact gtcaacagag ttacactacc ccattcactt tcggccctgg gaccagagtg 300 gatatcgaac gaactgtggc tgcaccatct gtcttcatct tcccgccatc tgatgagcag 360 -94- CZ 303703 B6 ttgaaatctg gaactgcctc tgttgtgtgc ctgctgaata acttctatcc cagagaggcc 420 aaagtacagt ggaaggtgga taacgcctat t 451 <210 > 134 <211> 562 <212> DNA <213> Human <4 00> 134 tcctgtgcag cgtctggatt caccttcagt tactatggcg tctgggggag gcgtggtcca 60 gcctgggagg tccctgagac tctcctgtgc agcgtctgga ttcaccttca gtagctatgg 120 cgtgcactgg gtccgccagg ctccaggcaa ggggctggag tgggtggcag ttatatggta 180 tgatggaagt aataaatact atgcagačtc cgtgaagggc cgattcacca tctccagaga 240 caattccaag agcacgctgt atctgcaaat gaacagcctg agagccgagg acacggctgt 300 gtattattgt gcgagagact cgtattacga tttttggagt ggtcggggcg gtatggacgt 360 ctggggccaa gggaccacgg tcaccgtctc ctcagcctcc accaagggcc catcggtctt 420 ccccctggcg ccctgctcca ggagcacctc cgagagcaca gcggccctgg gctgcctggt 480 caaggactac ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac tcaggcgctc tgaccagcgg 540 cgtgcacacc ttcccagctg tc 562 <210 > 135 <211> 419 <212> DNA <213? Human <400 > 135 ccactctccc tgcccgtcac ccttggacag ccggcctcca tctcctgcag gtctagtcaa 60 agcctcgtat acagtgatgg aaacacctac ttgaattggt ttcagcagag gccaggccaa 120 tctccaaggc gcctaattta taaggtttct aactgggact ctggggtccc agacagattc 180 agcggcagtg ggtcaggcac tgatttcaea ctgaaaatca gcagggtgga ggctgaggat 240 gttggggttt attactgcat gcaaggttca cactggcctc cgacgttcgg ccaagggacc 300 aaggtggaaa tcaaacgaac tgtggctgca ccatctgtct tcatcttccc gccatctgat 360 gagcagttga aatctggaac tgcctctgtt gtgtgcctgc tgaataactt ctatcccac 419 <210> 136 <211> 490 <212> DNA <213> Human <400? 136 gtccagcctg ggaggtccct gagactctcc tgtgcagcgt ctggattcac cttcagtaac 60 tatgccatgc actgggtccg ccaggctcca ggcaaggggc tggagtgggt ggtagttatt 120 tggcatgatg gaaataataa atactatgca gagtccgtga agggccgatt caceatctcc 180 agagacaatt ccaagaacac gctgtatctg caaatgaaca gcctgagagc cgaggacacg 240 gctgtatatt actgtgcgag agatcagggc actggctggt acggaggctt tgacttctgg 300 ggccagggaa ccctggtcac cgtctcctca gcctccacca agggcccatc ggtcttcccc 360 ctggcgccct gctccaggag cacctccgag agcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag 420 gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg tggaactcag gcgctctgac cagcggcgtg 480 cacaccttcc 490 <210> 137 <211> 419 <212> DNA <213> Human <400> 137 cctggagagc cggcttccat ctcttgcagg tctagtcaga gcctcctgca tagtaatgga 60 tacaactatt tggattggta cctgcagaag ccaggacagt ctccacagct cctgatctat 120 ttgggttcta atcgggcctc cggggtccct gacaggttca gtggcagtgg atcaggcaca 180 gattttacac tgaaactcag cagagtggag gctgaggatg ttggggttta ttactgcatg 240 caagctctac aaactcctct cactttcggc ggagggacca aggtggagat caaacgaact 300 -95 CZ 303703 B6 gtggctgcac catctgtctt catcttcccg ceatctgatg agcagttgaa atctggaact 360 gcctctgttg tgtgcctgct gaataacttc tatcccagar aggccaaagt acattccat 419 <210> 138 <211> 1392 <212 > DNA <213> Human <400 > 138 atggagtttg ggctgagctg ggttttcctc gttgctcttt taagaggtgt ccagtgtcag 60 gtgcagctgg tggagtctgg gggaggcgtg gtccagcctg ggaggtccct gagactctcc 120 tgtgtagcgt ctggatteac etteagtagc eatggcatgc actgggtccg ccaggctcea 180 ggcaaggggc tggagtgggt ggcagttata tggtatgatg gaagaaataa atactatgca 240 gactccgtga agggccgatt caccatctcc agagacaatt ccaagaacac gctgtttctg 300 caaatgaaca gcctgagagc cgaggacacg gctgtgtatt actgtgcgag aggaggtcac 360 ttcggtcctt ttgactactg gggccaggga accctggtca ccgtctcctc agcctccacc 420 aagggcccat cggtcttccc cctggcgccc tgctccagga gcacctccga gagcacagcg 480 gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca 540 ggcgctctga ccagcggcgt gcacaccttc ccagctgtcc tacagtcctc aggactctac 600 tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcaacttcg gcacccagac ctacacctgc 660 aacgtagatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga cagttgagcg caaatgttgt 720 gtcgagtgcc caccgtgccc agcaccacct gtggcaggac cgtcagtctt cctcttcccc 780 ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg aggtcacgtg cgtggtggtg 840 gacgtgagcc acgaagaccc cgaggtccag ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg 900 cataatgcca agacaaagcc acgggaggag cagttcaaca gcacgttccg tgtggtcagc 960 gtcctcaccg ttgtgcacca ggactggctg aacggcaagg agtacaagtg caaggtctcc 1020 aacaaaggcc tcccagcccc catcgagaaa accatctcca aaaccaaagg gcagocccga 1080 gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgggaggaga tgaccaagaa ccaggtcagc 1140 ctgacctgcc tggtcaaagg cttctacccc agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat 1200 gggcagccgg agaacaacta caagaccaca cctcccatgc tggactccga cggctccttc 1260 ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca 1320 tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc agaagagcct ctccctgtct 1380 ccgggtaaat ga 1392 <210> 139 <211> 1999 <212> DNA <213> Human <400 > 139 atggagtttg ggctgagctg ggttttcctc gttgctcttt taagaggtgt ccagtgtcag 60 gtgcagctgg tggagtctgg gggaggcgtg gtccagcctg ggaggtccct gagactctcc 120 tgtgtagcgt ctggattcac cttcagtagc eatggcatgc actgggtccg ecaggctcca 180 ggcaaggggc tggagtgggt ggcagttata tggtatgatg gaagaaataa atactatgca 240 gactccgtga agggccgatt caccatctcc agagacaatt ccaagaacac gctgtttctg 300 caaatgaaca gcctgagagc cgaggacacg gctgtgtatt actgtgcgag aggaggtcac 360 ttcggtcctt ttgactactg gggccaggga accctggtca ccgtctcctc agctagcacc 420 aagggcccat cggtcttccc cctggcgccc tgctccagga gcacctccga gagcacagcg 480 gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca 540 ggcgctctga ccagcggcgt gcacaccttc ccagctgtcc tacagtcctc aggactctac 600 tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcaacttcg gcacccagac ctacacctgc 660 aacgtagatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga cagttggtga gaggccagct 720 cagggaggga gggtgtctgc tggaagccag gctcagccct cctgcctgga cgcaccccgg 780 ctgtgcagcc ccagcccagg gcagcaaggc aggccccatc tgtctcctca cccggaggcc 840 tctgcccgcc ccactcatgc tcagggagag ggtcttctgg ctttttccac caggctccag 900 gcaggcacag gctgggtgcc cctaccccag gcccttcaca cacaggggca ggtgcttggc 960 tcagacctgc caaaagccat atccgggagg accctgcCcc tgacctaagc cgaccccaaa 1020 ggccaaactg tccactccct cagctcggac accttctctc ctcccagatc cgagtaactc 1090 ccaatcttct ctctgcagag cgcaaatgtt gtgtcgagtg cccaccgtgc ccaggtaagc 1140 cagcccaggc ctcgccctcc agctcaaggc gggacaggtg ccctagagta gcctgcatcc 1200 agggacaggc cccagctggg tgctgacacg tccacctcca tctcttcctc agcaccacct 1260 -96- CZ 303703 B6 gtggcaggac cgtcagtctt cctcttcccc ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc 1320 cggacccctg aggtcacgtg cgtggtggtg gacgtgagcc acgaagaccc cgaggtccag 1380 ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc acgggaggag 1440 cagttcaaca gcacgttccg tgtggtcagc gtcctcaccg ttgtgcacca ggactggctg 1500 aacggcaagg agtacaagtg caaggtctcc aacaaaggcc tcccagcccc catcgagaaa 1560 accatctcca aaaccaaagg tgggacccgc ggggtatgag ggecacatgg acagaggccg 1620 gctcggccca ccctctgccc tgggagtgac cgctgtgcca acctctgtcc ctacagggca 1680 gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg gaggagatga ccaagaacca 1740 ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctaccccagc gacatcgccg tggagtggga 1800 gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacacct cccatgctgg actccgacgg 1860 ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc aggtggcagc aggggaacgt 1920 cttctcatgc fcccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac tacacgcaga agagcctctc 1960 cctgtctccg ggtaaatga 1999 <210> 140 <211> 1392 <212> DNA <213> Human <400> 140 atggagtttg ggctgagctg ggttcccctc gctgcccttt taagaggtgt ccagtgtcag 60 gtgcagctgg tggagtctgg gggaggcgtg gtccagcctg ggaggtccct gagactctcc 120 tgtgtagcgt ctggattcac cttcagtagc catggcatgc actgggtccg ccaggctcca 180 ggcaaggggc tggagtgggt ggcagttata tggtatgatg gaagaaataa atactatgca 240 gactccgtga agggccgatt caccatctcc agagacaatt ccaagaacac gctgtttctg 300 caaatgaaca gcctgagagc cgaggacacg gctgtgtatt actgtgcgag aggaggtcac 360 ttcggtcctt ttgactactg gggccaggga accctggtca ccgtctectc agcctccacc 420 aagggcccat cggtcttccc cctggcgccc tgctccagga gcacctccga gagcacagcg 480 gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca 540 ggcgctctga ccagcggcgt gcacaccttc ccagctgtcc tacagtcctc aggactctac 600 tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcaacttcg gcacccagac ctacacctgc 660 aacgtagatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga cagttgagcg caaatgttgt 720 gtcgagtgcc caccgtgccc agcaccacct gtggcaggac cgtcagtctt cctcttcccc 780 ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg aggtcacgtg cgtggtggtg 840 gacgtgagcc acgaagaccc cgaggtccag ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg 900 cataatgcca agacaaagcc acgggaggag cagttccaaa gcacgttccg tgtggtcagc 960 gtcctcaccg ttgtgcacca ggactggctg aacggcaagg agtacaagtg caaggtctcc 1020 aacaaaggcc tcccagcccc catcgagaaa accatctcca aaaccaaagg gcagccccga 1080 gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgggaggaga tgaccaagaa ccaggtcagc 1140 ctgacctgcc tggtcaaagg cttctacccc agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat 1200 gggcagccgg agaacaacta caagaccaca cctcccatgc tggactccga cggctccttc 1260 ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca 1320 tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc agaagagcct ctccctgtct 1380 ccgggtaaat ga 1392 <210> 141 <211> 708 <212 > DNA <213> Human <400> 141 atggaaaccc cagcgcagct tctcttcctc ctgctactct ggctcccaga taccaccgga 60 gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 120 ctdtcctgca gggccagtca gagtattagc agcagcttct tagcctggta ccagcagaga 180 cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca gcagggccac tggcatccca 240 gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 300 cctgaagatt ttgeagtgta ttactgtcag cagtatggta cctcaccctg gacgttcggc 360 caagggacca aggtggaaat caaacgaact gtggctgcac catctgtctt catcttcccg 420 ccatctgatg agcagttgaa atctggaact gcctctgttg tgtgcctgct gaataacttc 480 tatcccagag aggccaaagt acagtggaag gtggataacg ccctccaatc gggtaactcc 540 caggagagtg tcacagagca ggacagcaag gacagcacct acagcctcag cagcaccctg 600 -97- CZ 303703 B6 acgctgagca aageagacta cgagaaacac aaagtctacg cctgcgaagt cacccatcag 660 ggcctgagct cgcccgtcac aaagagcttc aacaggggag agtgttag 708 <210s· 142 <211> 1395 <212 > DNA <213> Human <400> 142 atggagtttg ggctgagctg ggttttcctc gttgctcttt taagaggtgt ccagtgtcag 60 gtgcagctgg tggagtctgg gggaggcgtg gtccagcctg ggaggtccct gagactctcc 120 tgtacagcgt ctggattcac cttcagtaac tatggcatgc actgggtccg ccaggctcca 180 ggcaaggggc tggagtgggt ggcagttata tggtatgatg gaagtaataa acactatgga 240 gactccgtga agggccgatt caccatctcc agtgacaatt ccaagaacac gctgtatctg 300 caaatgaaca gcctgagagc cgaggacacg gctgtgtatt actgtgcgag aggagagaga 360 ctggggtcct actttgacta ctggggccag ggaaccctgg tcaeegtctc ctcagcctec 420 accaagggcc catcggtctt ccccctggcg ccctgctcca ggagcacctc cgagagcaca 480 gcggccctgg gctgcctggt caaggactac ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac 540 tcaggcgctc tgaccagcgg cgtgcacacc ttcccagctg tcctacagte ctcaggactc 600 tactccctca gcagcgtggt gaccgtgccc tccagcaact tcggcaccca gacctacacc 660 tgcaacgtag atcacaagcc cagcaacacc aaggtggaca agacagttga gcgcaaatgt 720 tgtgtcgagt gcccaccgtg cccagcacca cctgtggcag gaccgtcagt cttcctcttc 780 cccccaaaac ccaaggacac cctcatgatc tcccggaccc ctgaggtcac gtgcgtggtg 840 gtggacgtga gccacgaaga cccegaggtc cagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag 900 gtgcataatg ccaagacaaa gccacgggag gagcagttca acagcacgtt ccgtgtggtc 960 agcgtcctca ccgttgtgca ccaggactgg ctgaacggca aggagtacaa gtgcaaggtc 1020 tccaacaaag gcctcccagc ccccatcgag aaaaccatct ccaaaaccaa agggcagccc 1080 cgagaaccac aggtgtacac cctgccccca tcccgggagg agatgaccaa gaaccaggtc 1140 agcctgacct gcctggtcaa aggcttctac cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc 1200 aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc acacctccca tgctggactc cgacggctcc 1260 ttcttcctct acagcaagct caccgtggac aagagcaggt ggcagcaggg gaacgtcttc 1320 tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac aaccactaca cgcagaagag cctctccctg 1380 tctccgggta aatga 1395 <210> 143 <211> 702 <212> DNA <213> Human <40Q> 143 atggaaaccc cagcgcagct tctcttcctc ctgctactct ggctcccaga taccaccgga 60 gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 120 ctctcctgca ggaccagtgt tagcagcagt tacttagcct ggtaccagca gaaacctggc 180 caggctceca ggctcctcat ctatggtgca tccagcaggg ccactggcat cccagacagg 240 ttcagtggca gtgggtctgg gacagacttc actctcacca tcagcagact ggagcctgaa 300 gattttgcag tctattactg tcagcagtat ggcatctcac qcttcacttt cggcggaggg 360 accaaggtgg agatcaagcg aactgtggct gcaccatctg tcttcatctt cccgccatct 420 gatgagcagt tgaaatctgg aactgcctct gttgtgtgcc tgctgaataa cttctatccc 480 agagaggcca aagtacagtg gaaggtggat aacgccctcc aatcgggtaa ctcccaggag 540 agtgtcacag agcaggacag caaggacagc acctacagcc tcagcagcac cctgacgctg 600 agcaaagcag actacgagaa acacaaagtc tacgcctgcg aagtcaccca tcagggcctg 660 agctcgcccg tcacaaagag cttcaacagg ggagagtgtt ag 702 <210> 144 <211> 1392 <212> DNA <213 > Human <400 > 144 atggagtttg ggctgagctg ggttttcctc gttgctcttt taagaggtgt ccagtgtcag 60 gtgcagctgg tggagtctgg gggaggcgtg gtcgagcctg ggaggtccct gagactctcc 120 -98- CZ 303703 B6 tgtacagcgt ctggattcac cttcagtagt tatggcatgc actgggtccg ccaggctcca 180 ggcaaggggc tggagtgggt ggcagttata tggtatgatg gaagcaataa acactatgca 240 gactccgcga agggccgatt caccatctgc agagacaatt ccaagaacac gctgtatctg 300 caaatgaaca gcctgagagc cgaggacacg gctgtgtatt actgtgcgag agccggactg 360 ctgggttact tfcgactactg gggccaggga accctggtca ccgtctcctc agcctccacc 420 aagggcccat cggtcttccc cctggcgccc tgctccagga gcacctccga gagcacagcg 480 gecctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca 540 ggcgctctga ccagcggcgt gcacaccttc ccagctgtcc tacagtcctc aggactctac 600 tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcaacttcg gcacccagac ctacacctgc 660 aacgtagatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga cagttgagcg eaaatgttgt 72o gtcgagtgcc caccgtgccc agcaccacct gtggcaggac cgtcagtctt cctcttcccc 780 ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg aggtcacgtg cgtggtggtg 840 gacgtgagcc acgaagaccc cgaggtccag ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg 900 cataatgcca agacaaagcc acgggaggag cagttcaaca gcacgttccg tgtggtcagc 960 gtcctcaccg ttgtgcacca ggactggctg aacggcaagg agtacaagtg caaggtctcc 1020 aacaaaggcc tcccagcccc catcgagaaa accatctcca aaaccaaagg gcagccccga 1080 gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgggaggaga tgaccaagaa ccaggtcagc 1140 ctgacctgcc tggtcaaagg cttctacccc agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat 1200 gggcagccgg agaacaacta caagaccaca cctcccatgc tggactccga cggctccttc 1260 ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca 1320 tgctccgtga hacataaggc tctgcacaac cactacacgc agaagaacct ctccctatcť. 13S0 ccgggtaaat ga 1392 <210> 145 <2ll> 705 <212> DNA <213> Human <400 > 145 atggaaaccc cagcgcagct tctcttcctc ctgctactct ggctcccaga taccaccgga 60 gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 120 ctctcctgta gggccagtca aagtgttagc agctacttag cctggtacca acagaaacct 180 ggccaggctc ccaggcccct catctatggt gtatccagca gggccactgg catcccagac 240 aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac ttcactctca ccatcagcag actggagcct 300 gaagattttg cagtgtatta ctgtcagcag tatggtatct caccattcac tttcggccct 360 gggaccaaag tggatatcaa acgaactgtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 420 tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 480 cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 540 gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 600 cfcgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 660 ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gttag 705 <210> 146 <211> 1413 <212> DNA <213> Human <400> 146 atggagtttg ggctgagctg ggttttcctc gttgctcttt taagaggtgt ccagtgtcag 60 gtgcagctgg tggagtctgg gggaggcgtg gteeagcctg ggaggtccct gagactctcc 120 tgtgcagcgt ctggattcac cttcagtagc tatggcatgc actgggtccg ccaggctcca 180 ggcaaggggc tggagtgggt ggcagttata tggtatgatg gaagtaataa atactatgca 240 gactccgtga agggccgatt caccatctcc agagacaatt ccaagaacac gctgtatctg 300 caaatgaaca gcctgagagc cgaggacacg gctgtgtatt actgtgcgag agatccgagg 360 ggagctaccc tttactacta ctactacggt atggacgtct ggggccaagg gaccacggtc 420 accgtctcct cagcctccac caagggccca tcggtcttcc ccctggcgcc ctgctccagg 480 agcacctccg agagcacagc ggccctgggc tgcctggtca aggactactt ccccgaaccg 540 gtgacggtgt cgtggaactc aggcgctctg accagcggcg tgcacacctt cccagctgtc 600 ctacagtcct caggactcta ctccctcagc agcgtggtga ccgtgccctc cagcaacttc 660 ggcacccaga cctacacctg caacgtagat cacaagccca gcaacaccaa ggtggacaag 720 acagttgage geaaatgttg tgtcgagtgc ccaccgtgcc cagcaccacc tgtggcagga 780 -99- CZ 303703 B6 ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggaccccfc 840 gaggtcacgt gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ccgaggtcca gttcaactgg 900 tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cacgggagga gcagttcaac 960 agcacgttcc gtgtggtcag cgtcctcacc gttgtgcacc aggactggct gaacggcaag 1020 gagtacaagt gcaaggtctc caacaaaggc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 1080 aaaaccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggaggag 1140 atgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctaccc cagcgacatc 1200 gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac acctcccatg 1260 ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 1320 cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 1380 cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa tga 1413 <210> 147 <211> 714 <212> DNA <213> Human <400 > 147 atggacatga gggtccccgc tcagctcctg gggctcctgc tactctggct ccgaggtgcc 60 agatgtgaca tccagatgac ccagtctcca tcctccctgt ctgcatctgt aggagacaga 120 gtcaccatca cttgccgggc aagtcagagc attaacagct atttagattg gtatcagcag 180 aaaccaggga aagcccctaa actcctgatc tatgctgcat ccagtttgca aagtggggtc 240 ccatcaaggt tcagtggcag tggatctggg acagatttca ctctcaccat cagcagtctg 300 caacctgaag attttgcaac ttactactgt caacagtatt acagtactcc attcactttc 360 ggccctggga ccaaagtgga aatcaaacga actgtggctg caccatctgt cttcatcttc 420 ccgccatctg atgagcagtt gaaatctgga actgcctctg ttgtgtgcct gctgaataac 480 ttctatccca gagaggccaa agtacagtgg aaggtggata acgccctcca atcgggtaac 540 tcccaggaga gtgtcacaga gcaggacagc aaggacagca cctacagcct cagcagcacc 600 ctgacgctga gcaaagcaga ctacgagaaa cacaaagtct acgcctgcga agtcacccat 660 cagggcctga gctcgcccgt cacaaagagc ttcaacaggg gagagtgtta gtga 714 - 100- CZ 303703 B6

Seznam citované literatury Všechny publikace citované v přihlášce včetně patentů, patentových přihlášek, vědeckých 5 článků, příruček apod., a také publikace v nich citované, jsou zahrnuty v plném rozsahu formou odkazu. Kromě toho jsou plně zahrnuty i následující publikace, včetně publikací v nich citovaných.

Alegre et al. J Immunol 157:4762 až 70 (1996) 10

Allison and Krummel Science 270:932 až 933 (1995)

Balzano et al. Int. J Cancer Suppl 7:28 až 32 (1992) 15 Blair et al. J. Immunol 160:12 až 5 (1998)

Blake and Litzi-Davis BioConjugate Chem. 3:510 až 513 (1992)

Boussiotis et al. Proč NatiAcadSci USA 90:11059 až 63 (1993) 20

Bowie et al. Science 253:164 (1991)

Bruggeman et al. PNAS USA 86:6709 až 6713 (1989) 25 Bruggeman, M. and Neuberger, M. S. in Methods: A companion to Methods in Enzymology 2:159 až 165 (Lerner et al. eds. Academie Press(I991))

Bruggemann et al., „Human antibody production in transgenic mice: expression from 100 kb of the human lgH locus.·’1’ Eur. J. Immunol. 21:1323 až 1326 (1991) 30

Bruggemann, M. and Neuberger, N. S. „Strategies for expressing human antibody repertoires in transgenic mice.“‘ Immunology Today 17:391 až 397 (1996)

Brunet et al. Nátuře 328:267 až 270 (1987) 35

Bumpers et al J. Surgical Res. 61:282 až 288 (1996)

Capsey et al. Geneíically EngineeredHuman Therapeutic Drugs (Stockton Press, NY (1988)) 40 Castan et al. Immunology 90:265 až 71 (1997)

Cepero et al../ Exp Med 188:199 až 204 (1998)

Chen et al „Immunoglobulin gene rearrangement in B-cell deficient mice generated by targeted 45 deletion of the JH locus“ International Immunology 5:647 až 656 (1993)

Chen et al. Cell 71:1093 až 1102 (1992)

Chen et al. Human Gene Therapy 5:595 až 601 (1994) 50

Chiswell and McCafferty TIBTECH 10:80 až 84 (1992)

Choi et al. „Transgenic mice containing a human heavy chain immunoglobulin gene fragment cloned in a yeast artifícial chromosome“ Nátuře Genetics 4:117 až 123 (1993) - 101 - 55 CZ 303703 B6

Chothia& Lesk J. Mol. Biol 196:901 až917(1987)

Chothia et al. Nátuře 342:878 až 883 (1989) 5 Chuang et al. J. Immunol. 159:144 až 151 (1997)

Coligan et al., Unit 2.1, „Enzyme-linked immunosorbent assays,“ in Current protocols in immmology (1994) 10 Cwirla et al. PNAS USA 87:6378 až 6382 (1990)

Dariavach et al. Eur. J. Immunol 18:1901 až 1905 (1988)

Dayhoff, M.O., in Atlas of Protein Sequence and Structure, pp. 101-110 (Volume 5, National 15 Biomedical Research Foundation (1972)) and Supplement 2 to this volume, pp. 1 až 10 de Boer et al. Eur. JImmunol 23:3120 až 5 (1993)

Eckstein, Ed., Oxford University Press, Oxford England (1991)). 20

Evans et al. J. Med. Chem. 30:1229 (1987)

Fallarino et al. J Exp Med 188:205 až 10 (1998) 25 Fanger et al. Immunol Methods 4:72 až 81 (1994)

Fauchere, J. Ach. Drug. Res. 15:29 (1986)

Fishwild et al., „High-avidity human IgGy monoclonal antibodies from a novel strain of mini-30 locus transgenic mice.“ Nátuře Biotech. 14:845 až 851 (1996).

Freeman et al. J. Exp Med 178:185 až 92 (1993)

Freeman et al. JImmunol 161:2708 až 15 (1998) 35

Freeman et al. Science 262:907 až 9 (1993)

Fundamental Immunology Ch. 7 (Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y. (1989)) 40 Galfre, G. and Milstein, C., „Preparation of monoclonal antibodies: strategies and procedures.“ Methods Enzymol. 73:3 až 46 (1981)

Gorman et al. P.N.A.S. 79:6777 (1982) 45 Green and Jakobovits J. Exp. Med. 188:483 až 495 (1998)

Green et al. Nátuře Genetics 7:13 až 21 (1994)

Grosschedl et al. CW/41:885 (1985) 50

Hanes and Plucthau PNAS USA 94:4937 až 4942 (1997)

Harding et al. Nátuře 356:607 až 609 (1994) 55 Harper et al.J Immunol 147:1037 až 44 (1991) - 102- CZ 303703 B6

Hathcock et al. Science 262:905 až 7 (1993)

Hoganboom et al. Immunol. Reviews 130:43 až 68 (1992) 5

Horspool et al. J. Immunol 160:2706 až 14 (1998)

Houghten et al. J. Biotechniques 13:412 až 421 (1992) 10 Houghten PNAS USA 82:5131 až 5135 (1985)

Hurwitz et al. J. Neuroimmunol 73:57 až 62 (1997)

Hurwitz et al. Proč. NatiAcadSci USA 95:10067 až 71 (1998) 15

Immunology - A Synthesis (2nd Edition, E. S. Golub and D. R. Gren, Eds., Sinauer Associates, Sunderland, Mass. (1991))

Introduction toProtein Srtucture (C. Branden and J. Tooze, eds., Garland Publishing, New York, 20 N.Y. (1991))

Jakobovits et a!., „Green-line transmission and expression of a human-derived yeast artíficial— chromosome.“ Nátuře 362:255 až 258 (1993) 25 Jakobovits, A. et al., „Analysis of homozygous mutant chimeric mice: Deletion of the immuno-globulin heavy-chain joining region blocks Bečeli development and antibody production." Proč. Nati Acad. Sci. USA 90:2551 až 2555 (1993)

Jakobovits, A., „Humanizing the mouše genome." Current Biology 4:761 až 763 (1994) 30

Jakobovits, A., „Production of fully human antibodies by transgenic mice." Current Opinion in Bioiechnology 6:561 až 566(1995)

Junghans et al. in Cancer Chemitherapy and Biotherapy 655 až 686 (2d edition, Chafner and 35 Longo, eds., Lippincott Raven (1996))

Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, N.I.H. publication no. 91 až 3242 40 Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 and 1991))

Kostelny et al. J. Immunol. 148:1547 až 1553 (1992) 45 Krummel and Allison JExp Med 182:459 až 65 (1995)

Krummel et al. lni Immunol 8:519 až 23 (1996)

Kuchroo et al. Cell 80:707 až 18 (1995) 50

Kwon et al. PNAS USA 94:8099 až 103 (1997)

LaPlanche et al. Nucl. Acids Res. 14:9081 (1986) 55 Lenschow et al. Proč. Nati Acad Sci USA 90:11054 až 8 (1993) -103- CZ 303703 B6

Lenschow et al. Science 257:789 až 792 (1992)

Lin et al. JExp Med 188:199 až 204 (1998)

Linsley et al. JExp Med 176:1595 až 604 (1992)

Linsley et al. J. Exp. Med. 174:561 až 569 (1991)

Linsley et al. Science 257:792 až 795 (1992)

Liuetal. J. Immunol 139:3521 (1987)

Liu et al. P.N.A.S. 84:3439 (1987)

Lonberg et al., „Antigen-specific human antibodies from mice comprising four distinct genetic modificationsNátuře 368:856 až 859 (1994).

Luhder et al. JExp Med 187:427 až 32 (1998)

Marasco Gene Therapy 4:11 až 15 (1997)

Markees et al.JClin Invest 101:2446 až 55 (1998)

Marks et al., „Oligonucleotide primers for polymerase chain reaction amplification of human immunoglobulín variable genes and design of farníly-specific oligonucleotide probes.“ Eur. J. Immunol. 21:985 až 991 (1991)

McCoy et al. J. Exp Med 186:183 až 7 (1997)

Mendez et al. Nátuře Genetics 15:146 až 156 (1997)

Needleman and Wunsch J. Mol.Biol 48:443 (1970)

Okayama et al. Mol. Cell Bio. 3:280 (1983)

Parmley and Smith Gene 73:305 až 318 (1988)

Pearson and Lipman Proč. Nati Acad. Sci (U.S.A) 85:2444 (1988)

Perez et al. Immunity 6:411 až 7 (1997)

Perrin et al. Immunol Res 14:189 až 99 (1995)

Perrin et al.J Immunol 157:1333 až 6 (1996)

Pinalla et al. Biotechniques 13:901 až 905 (1992)

Proteins, Structures and Molecular Principles (Creíghton, Ed., W. H. Freeman and Company, New York (1984))

Razi-Wolf et al. Proč Nati Acad Sci USA 90:11182 až 6 (1993)

Remingtonů Pharmaceutical Sciences (15<h ed, Mack Publishing Company, Easton, PA (1975)), particularly Chapter 87 by Blaug, Seymour - 104- CZ 303703 B6

Rizo and Gierasch Ann. Rev. Biochem. 61:387 (1992)

Russel etal. Nud. Acids Research 21:1081 až 1085 (1993) 5

Schwartz Cell 71:1065 (1992)

Scott 7755 17:241 až 245 (1992) io Smith and Waterman Adv. Appl Math 2:482 (1981)

Songsívilai & Lachmann Clin. Exp. Immunol 79:315 až 321 (1990)

Stec et al. J. Am. Chem. Soc. 106:6077 (1984) 15

Stein et al. Nud. Acids Res. 16:3209 (1988)

Taylor et al., „A transgenie mouše that expresses a aiversity of human sequence heavy and iight ehain immunoglobulins.“ Nudeic Adds Research 20:6287 až 6295 (1992) 20

Taylor et al., „Human immunoglobulin transgenes undergo rearrangement, somatic mutation and class switchlng ín mice that lack endogenous IgM.“ International Immunology 6:579 až 591 (1994) 25 The McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (Parker, S., Ed., McGraw-Hill, San Francisco (1985))

Thomton et al. Nátuře 354:105 (1991) 30 Tivol et al. Immunity 3:541 až 7 (1995)

Townsend and Allison Science 259:368 (1993)

Traunecker et al. Int. J. Cancer (Suppl.) 7:51 až 52 (1992) 35

Tuaillon et al. „Analysis of direct and inverted DJM rearragnements in a human Ig heavy chain transgenie minilocus“./. Immunol. 154:6453 až 6465 (1995)

Tuaillon et al., „Human immunoglobulin heavy—chain minilocus recombination in transgenie 40 mice: gene-segment use in μ and γ transcripts.“ Proč. Nati Acad. Sci. USA 90:3720 až 3724 (1993)

Uhlmann and Peyman Chemical Reviews 90:543 (1990) 45 Van Parijs et al. JExp Med 186:1119 až 28 (1997)

Veber and Freidinger TINS p.392 (1985)

Vitetta Immunol Today 14:252 (1993) 50

Walunas et al. Immunity 1:405 až 13 (1994)

Walunas et al. JExp Med 183:2541 až 50 (1996) 55 Waterhouse et al. Science 27:985 až 988 (1995) -105- CZ 303703 B6

Winter and Harris fmmunol Today 14:43 až 46 (1993)

Wright et al. Crit. Reviews in Immunol. 12125 až 168 (1992)

Yang et al. Cancer Res 57:4036 až 41 (1997)

Yi-qun et al. Int Immunol 8:37 až 44 (1996)

Zon et al. Anti-Cancer Drug Design 6:539 (1991)

Zon et al. Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, pp. 87 až 108 (F. Eckstein, Ed„ Oxford University Press, Oxford England (1991))

Fry et al. „Specifíc, irreversible inactivation of the epidermal growth factor receptor and erbB2, by a new class of tyrosine kinase inhibitor^ Proč Nati AcadSci USA 95:12022 až 7 (1998)

Hoffman et al. „A model of Cdc25 phosphatase catalytic domain and Cdk-interaction surface based on the presence of a rhodanese homology domain“ J Mol Biol 282:195 až 208 (1998)

Ginalski et al. „Modelling of active forms of protein kinases: p38-a čase study“ Acta Biochim Pol 44:557 až 64 (1997)

Jouko et al. „Identification of csk tyrosine phosphoiylation sites and a tyrosine residue important for kinase domain structure“ BiochemJ322:927 až 35 (1997)

Singh et al. „Structure-based design of a potent, sele cti ve, and irreversible inhibitor of the catalytic domain of the erbB receptor subfamily of protein tyrosine kinases“ J Med Chem 40:1130 až 5 (1997)

Mandel et al. „ABGEN: a knowledge-based automated approach for antibody structure mode-ling“ Nat Biolechnol 14:323 až 8 (1996)

Monfardini et al. „Rational design, analysis, and potential utility of GM-CSF antagonists“ Proč Assoc Am Physicians 108:420 až 31 (1996)

Furet et al. „Modelling study of protein kinase inhibitors: binding mode of staurosporine and origin of the selectivity of CGP 5241 \“ JComput Aided Mol Des 9:465 až 72 (1995) 111 et al. „Design and construction of a hybrid immunoglobulin domain with properties of both heavy and light chain variable regions“ Protein Eng 10:949 až 57 (1997)

Martin et al. „The affínity-selection of a minobody polypeptide inhibitor of human interleukin-6“ EMBO J 13:5303-9 (1994)

Patenty USA:

Patent US No. 4 399 216 Patent US No. 4 681 581 Patent US No. 4 683 195 Patent US No. 4 683 202 Patent US No. 4 735 210 Patent US No. 4 740 461 - 106-

Claims

CZ 303703 B6 Patent US No. 4 816 397 Patent US No. 4 912 040 Patent US No. 4 959 455 Patent US No. 5 101 827 Patent US No. 5 102 990 (RE 35 500) Patent US No. 5 151 510 Patent US No. 5 194 594 Patent US No. 5 434 131 Patent US No. 5 530 101 Patent US No. 5 545 806 Patent US No. 5 545 807 Patent US No. 5 585 089 Patent US No. 5 591 669 Patent US No. 5 569 825 Patent US No. 5 789 650 Patent US No. 5 939 598 Patent US No. 5 545 806 Patent US No. 5 673 986 Patent US No. 5 661 016 Patent US No. 5 814 318 Patent US No. 6 150 584 Patent US No. 5 916 771 PATENTOVÉ NÁROKY 1. Monoklonální protilátka, která se váže na antigen 4 cytotoxických T lymfocytů (CTLA 4) nebo její antigen-vázající fragment, kde uvedená protilátka obsahuje variabilní úsek těžkého řetězce s alespoň 85% identitou s variabilním úsekem těžkého řetězce v Sekvenci ID Č. 63 a kde uvedená protilátka obsahuje variabilní úsek lehkého řetězce s alespoň 90% identitou s variabilním úsekem lehkého řetězce v SEKVENCI ID Č. 65, přičemž uvedená protilátka nebo fragment mají následující vlastnosti: (a) váží se k CTLA—4 s afinitou rovnou Kd 10 '9 M nebo vyšší a (b) inhibují vazbu mezi CTLA-4 a B7-2 s hodnotou IC50 rovnou 100 nM nebo nižší.
2. Protilátka nebo fragment podle nároku 1, kde uvedená protilátka obsahuje variabilní úsek těžkého řetězce s alespoň 90% identitou s variabilním úsekem těžkého řetězce v SEKVENCI ID Č. 63.
3. Farmaceutická kompozice, vyznačená tím, že obsahuje protilátku nebo fragment podle nároku 1 a farmaceuticky přijatelný nosič.
4. Buněčná linie, která produkuje protilátku nebo fragment podle nároku 1. - 107- CZ 303703 B6
5. Způsob přípravy protilátky podle nároku 1, vyznačený tím, že se kultivuje buněčná linie podle nároku 4.
6. Izolovaná nukleová kyselina, která kóduje těžký řetězec nebo jeho antigenvázající fragment 5 a/nebo lehký řetězec nebo jeho antigen-vázající fragment protilátky nebo fragmentu podle nároku I.
7. Hostitelská buňka obsahující izolovanou nukleovou kyselinu podle nároku 6. ίο
8. Použití protilátky nebo fragmentu podle nároku 1 nebo farmaceutická kompozice podle nároku 3 pro výrobu léčiva pro léčení rakoviny.
9. Použití protilátky nebo fragmentu podle nároku 1 nebo farmaceutické kompozice podle nároku 3 pro výrobu léčiva pro léčení melanomů. 15
10. Použití kombinace obsahující protilátku nebo fragment podle nároku 1 nebo farmaceutickou kompozici podle nároku 3 a buňky exprimující faktor stimulující kolonie granulocytů-makrofágů pro výrobu léčiva pro léčení nádorů. 20 48 výkresů - 108-