UA76936C2

UA76936C2 - Human monoclonal antibody binding the antigen-4 of cytotoxic t-lymphocyte (ctla-4), nucleic acid, cell line, method of obtaining transgenic mammal, method to increase producing il-2 or ifn-? in the t-cells of a patient, method to treat and pharmaceutical composition used in treatment of cancer, inflammation or autoimmune disease, including the antibody

Info

Publication number: UA76936C2
Application number: UA2001075213A
Authority: UA
Original assignee: Pfizer; Abgenix Inc
Priority date: 1998-12-23
Filing date: 1999-12-23
Publication date: 2006-10-16
Also published as: HUP0104604A2; SI1141028T1; YU45501A; BG65899B1; ID29991A; SK288057B6; GEP20053594B; JP3793693B2; EA006972B1; NO20013147D0; KR20010099899A; NO337037B1; AP1590A; HU1300750D0; CZ303703B6; HRP20010551A2; OA11917A; EE05483B1; TR200200735T2; EP1141028B1

Description

Опис винаходу

У даній заявці декларується пріоритет попередньої (патентної заявки США. серійний Моб0/113647, 2 зареєстрованої 23 грудня 1998р.|, розкриття якої повністю включене тут як посилання.

Відповідно до даного винаходу тут пропонуються цілком людські моноклональні антитіла проти антигена 4 цитотоксичних Т-лимфоцитів людини (СТІ А-4). Пропонуються послідовності нуклеотидів, що кодують амінокислотні послідовності, що включають молекули важких і легких ланцюгів імуноглобулінів, зокрема, прилеглі послідовності важких і легких ланцюгів, охоплюючі райони, що визначають комплементарність (СОКЗ8), 70 особливо від ЕК1 і/або СОКІ до СОКЗ і/або в межах ЕК4. Додатково пропонуються антитіла, що мають схожі зв'язуючі властивості, і антитіла (або інші антагоністи), що мають функціональні властивості, схожі з розкритими тут антитілами.

Регуляція імунної відповіді у хворих повинна забезпечити бажане лікування багатьох захворювань людини, що може вести до специфічності дії, яка рідко зустрічається при застосуванні традиційних ліків. Повинна бути 72 можливою як позитивна, так і негативна регуляція імунної відповіді. У зв'язку з регуляцією імунної відповіді інтенсивно вивчається і характеризується роль Т-клітин і В-клітин. Внаслідок цих досліджень виявилося, що в багатьох випадках роль Т-клітин особливо важлива для профілактики і лікування захворювань.

Т-клітини володіють дуже складними системами контролю взаємодії між ними. Для процесу взаємодії між

Т-клітинами використовується множина рецепторів і розчинних факторів. Таким чином, ефект, який може надавати будь-який конкретний сигнал на імунну відповідь, залежить від конкретних факторів, рецепторів і зворотних рецепторів, які залучені до даного шляху. Шляхи негативної регуляції відповідей також важливі, як і шляхи, необхідні для активації. Навчання тимусу, яке веде до Т-клітинної толерантності, являє собою один з механізмів запобігання імунній відповіді на конкретний антиген. Відомі також інші механізми, такі як секреція цитокінів, що придушують імунну відповідь. с

Активація Т-клітин вимагає не тільки стимуляції через рецептор антигена (Т-клітинний рецептор (ТСК)), але (39 ії додаткового сигналу через костимуляторні молекули поверхні клітини, такі як СО28. Лігандами для СО28 є білки В7-1 (СО80) і В7-2 (СО86), які експресуються на антиген-представляючих клітинах, таких як дендритні клітини, активовані В-клітини або моноцити, які взаємодіють з СО28 або СТІ А-4 Т-клітин для надання костимуляторного сигналу. Роль костимуляторної сигналізації досліджена при експериментальному алергічному ее, енцефаломієліті (ЕАЕ) Г|Регїтіп еї аї., Ітіпипо! Кез 14: 189-99 (1995)). ЕАЕ являє собою аутоімунне порушення, со індуковане ТпІ-клітинами, направленими проти антигенів мієліну, що є моделлю для вивчення іп мімо ролі костимуляції, опосередкованої В7, в індукції патологічної імунної відповіді. За допомогою розчинного Ме. гібридного білкового ліганду рецепторів В7, а також моноклональних антитіл, специфічних у відношенні або «о

СО80, або СО86, Регїтіп еї аІ. показали, що костимуляція В7 грає важливу роль у визначенні клінічного виходу 3о захворювання при ЕАЕ. в

Взаємодія між В7 і СО28 є одним з декількох костимуляторних шляхів проведення сигналу, який, мабуть, істотний для ініціювання дозрівання і проліферації специфічних у відношенні антигена Т-клітин. Відсутність костимуляції при одночасній неадекватній продукції ІЛ-2 запобігає подальшій проліферації Т-клітин і спричиняє « стан відсутності реакції, який називається "анергією". Множина вірусів і пухлин можуть гальмувати активацію і З 50 проліферацію Т-клітин, що веде до недостатньої активності або відсутності реакції імунної системи господаря с по відношенню до інфікованих або трансформованих клітин. Серед ряду можливих порушень Т-клітин анергія з» може, щонайменше, частково відповідати за нездатність організму господаря видаляти патогенні або пухлинні клітини. Застосування білка В7 для опосередкування протипухлинної імунної відповіді було (описане в Спеп еї аіІ., Се! 71:1093-1102 (1992) і Томупвепа апа АЇйївоп, Зсіепсе 259:368 (19933). В огляді |(Зспжмагя СеїЇ 71: 1065 (1992)| розглядається роль СО28, СТІ А-4 і В7 в утворенні ІЛ-2 і імунотерапії. (Нагаїпуд еї аї. Майшге і 356:607-609 (1994)| демонструють, що опосередкована СО28 передача сигналу костимулює Т-клітини миші і

Ге») запобігає індукції анергії в клонах Т-клітин. Дивися також |(патенти США МоМо5434131, 5770197 і 5773-253), а також заявки на міжнародні патенти МоМоууО 93/00431, МУО 95/01994/ МО 95/03408, МО 95/24217 і МО о 95/33770). со 20 З вказаного вище ясно, що для активації і подальшої диференціації до ефекторної функції Т-клітинам потрібно два типи сигналів від антиген-представляючої клітини (АРС). По-перше, при взаємодіях між ТОК щи Т-клітин їі молекулами МНС, що представляють пептиди на АРС, виникає специфічний у відношенні антигена сигнал. По-друге, є незалежний від антигенна сигнал, який виникає при взаємодії СО28 з членами сімейства В7 (87-1 (СО80) або В7-2 (СО86)). Спочатку було неясно, на якому точно етапі імунної відповіді втручається 29 СТІ А-4. Мишачий СТІ А-4 був уперше ідентифікований і клонований (|Вгипеї еї аї!., Майиге 328: 267-270 (1987)) як

ГФ) один з результатів пошуку молекул, які переважно експресуються на цитотоксичних Т-лімфоцитах. Незабаром після цього був ідентифікований і клонований СТІ А-4 людини (|Оагіамасі еї аї!., Еиг. У. Іттипої. 18: 1901-1905 о (1988)). Молекули СТІ А-4 миші і людини мають приблизно 7695 спільної гомології послідовності і наближаються до повної ідентичності послідовності в своїх цитоплазматичних доменах |Оагіамаси еї аІ. Еицг. 9. Ітіашпої. 18: 60 1901-1905 (1988)). СТІ А-4 є членом імуноглобулінового (Ід) суперсімейства білків. Суперсімейство Ід являє собою групу білків, які виявляють ключові структурні особливості або варіабельного (М), або константного (С) домену молекул Ід. Члени суперсімейства Ід включають, але не обмежуються цим, власне імуноглобуліни, молекули класу головного комплексу гістосумісності (МНС) (тобто МНС класу І і ІЇ) і молекули ТОК.

ЇУ 1991 році І іІпзіеу еї аї!., У. Ехр. Мед. 174: 561-569 (1991)) передбачили, що СТІ А-4 є другим рецептором бо для В7. Схожим образом |Нагрег еї аї., 9. Іттипої. 147: 1037-44 (1991)) показали, що молекули СТІ А-4 і СО28 є близько родинними у миші і людини по послідовності, по експресії месенджера, по структурі гена і по хромосомній локалізації. |Дивися також ВаїЇгапо еї аї., Іпї у. Сапсег. Зиррі. 7: 28-32 (1992)). Подальший доказ цієї ролі отриманий завдяки функціональним дослідженням. (Наприклад, І епеспому еї а!., Зсіепсе 257: 789-792 (1992) показали, що СТІ А-4-Ід спричиняє довготривале виживання трансплантатів острівців підшлункової залози. (Егеетап еї аіЇ., Зсіепсе 262: 907-909 (1993)|) досліджували роль СТІ А-4 у мишей з дефіцитом В7. Визначення лігандів СТІ А-4 (описане І епеспом/ еї аі., Р.М.А.5. 90: 11054-11058 (1993)). (ЧпаІеу еї аі.,, Зсіепсе 257: 792-795 (1992)| описують імуносупресію іп мімо розчинною формою СТІ А-4. | іпвієу еї аї.,

У. Ехр. Мей. 176: 1595-604 (1992)| отримали антитіла, які зв'язували СТІ А-4 і які не реагували перехресно з /у/0 СО28, і дійшли висновку, що СТІ А-4 коекспресується з СО28 на активованих Т-лімфоцитах і кооперативно регулює адгезію Т-клітин і активацію під дією В7. |(Киспгоо еї аїЇ., Сей 80: 707-18 (19953)| показали, що костимуляторні молекули В7-1 і В7-2 диференційовано активують шляхи розвитку ТА1/Тп2. (Мі-Оцп еї аї., п.

Ітттипої. 8: 37-44 (1996)| показали, що для костимуляторних сигналів від членів сімейства В7 при їх додаванні до недавно активованих зберігаючих пам'ять Т-клітин є диференціальні вимоги відносно розчинних викликаних з /5 пам'яті антигенів. |Дивися також де Воег еї а!., Ешцг У. Іттипої. 23: 3120-5(1993)).

Декількома групами висловлене припущення про альтернативні або окремі рецептор/ліганд взаємодії для

СТІ А-4 в порівнянні з СО28 і навіть передбачено наявність третього В-7 комплексу, який впізнається антитілом

ВВІ. |Дивися, наприклад, НаїйсосК еї аїЇ.,, Зсіепсе 262: 905-7 (1993), Ргеетап еї аїЇ., Зсіепсе 262: 907-9 (1993), Ргеетап еї аіЇ., У. Ехр. Мей. 178: 2185-92 (1993), Іепзспом/ еї аї.,, Ргос. МаїіЇ. Асад. Зсі. ОБА 90: 11054-8 (1993), КагіУМоМй ек аї., Ргос. Май. Асай. Зсі. ОЗА 90: 11182-6 (1993) і Воизвіоїїв еї аї., Ргос.

Май. Асай. Зсі. ОБА 90: 11059-63 (1993)). Однак, (Бгеетап еї аїЇ.,, 9. ІттипоїЇї. 161: 2708-15 (1998), обговорюють дані про те, що антитіло ВВІ зв'язує молекулу, яка ідентична поверхово-клітинній формі СО74, і, отже, ВВ1 тАБб зв'язується з білком, відмінним від В7-1, і цей епітоп є також на білці В7-1. Таким чином, це спостереження вимагало перегляду робіт в даній області із застосуванням ВВІ1 тАбБ при аналізі експресії і сч ов функції СО 80.

Починаючи з 1993 року з кульмінацією в 1995 році, дослідники зробили подальше з'ясування ролі СТІ А-4 в і) стимуляції Т-клітин. По-перше, завдяки застосуванню моноклональних антитіл проти СТІ А-4 (М/аІшпавз еї аї.,

Іпттипйу 1: 4005-13 (1994) представили докази того, що СТІ А-4 може діяти як негативний регулювальник активації Т-клітин. Після цього УУайегпоизе еї аіЇ.. Зсіепсе 270:985-988 (1995) показали, що в лімфатичних Ге зо Вузлах і селезінці дефіцитних по СТІ А-4 мишей нагромаджуються Т-лімфобласти з підвищеним рівнем маркерів активації. Т-лімфобласти проникали також в печінкову тканину, тканину серця, легеневу і панкреатичну тканину, о кількість сироваткового імуноглобуліну була підвищеною, а після стимуляції через Т-клітинний рецептор їх Ге!

Т-клітини проліферували спонтанно і сильно, але вони були схильні до клітинної загибелі, індукованої перехресною зшивкою ЕРаз-рецептора і гама-опроміненням. У/агетоизе еї а!., дійшли висновку, що СТІ А-4 діє як ісе) негативний регулювальник активації Т-клітин і є життєво важливим для контролю гомеостазу лімфоцитів. У ї- коментарі в тому ж випуску (Аїзоп апа Кгиттеї!, Зсіепсе 270: 932-933 (1995)| обговорили роботу У/агегпоизе еї а!І., як таку, що демонструє те, що СТІ А-4 діє, знижуючи відповідь Т-клітин, або володіє гальмовою сигнальною функцією в активації і розвитку Т-клітин. (ТімоїЇ еї аЇ., Іттипйу З: 541-7 (19953| також створили дефіцитних по СТІ А-4 мишей і показали, що у таких мишей швидко розвивається лімфопроліферативне захворювання з « МуУультіорганною лімфоцитарною інфільтрацією і руйнуванням тканини, зокрема, з важким міокардитом і з с панкреатитом. Вони дійшли висновку, що СТІ А-4 грає ключову роль в негативній регуляції активації Т-клітин і . підтримці імунологічного гомеостазу. |Ктгитт. е! апа АЇївоп 9. Ехр. Мей. 182: 459-65 (1995)) пізніше и?» з'ясували, що СО28 і СТІ А-4 володіють протилежною дією на відповідь Т-клітин на стимуляцію. Вони створили антитіло проти СТІ А-4 і досліджували ефекти його скріплення з СТІ А-4 в системі з використанням високо очищених Т-клітин. У їх повідомленні було показано, що присутність низьких кількостей В7-2 на свіжоотриманих -І Т-клітинах може частково гальмувати проліферацію Т-клітин і це гальмування опосередковується взаємодіями з

СТІ А-4. Зщшиття СТІ А-4 разом з ТОК і СО28 сильно гальмує проліферацію і секрецію ІЛ-2 Т-клітинами. Нарешті,

Ме, ці результати показали, що СО28 і СТІ А-4 передають протилежні сигнали, які, мабуть, підсумовуються

Ге) Т-клітиною в формуванні відповіді на антиген. Таким чином, вони дійшли висновку, що результат стимуляції рецептора антигенна Т-клітини регулюється костимуляторними сигналами СО28, а також гальмовими сигналами, о що йдуть від СТІ А-4. |Дивися також Кгиттеї еї аї., Іпйї. Іттипої. 8: 519-23 (1996) і патент США Мо5811097 і

Ф заявку на міжнародний патент МОУУО 97/205741.

Була проведена множина додаткових експериментів для подальшого з'ясування згаданої вище функції

СТІ А-4. Наприклад, (ММаїшпаз еї аї., 9). Ехр. Мей. 183: 2541-50 (1996)) завдяки застосуванню антитіл проти

СТІ А-4 передбачили, що сигнали СТІ А-4 не регулюють виживаність клітин або відповідь на ІЛ-2, але насправді гальмують залежну від СО28 продукцію ІЛ-2. Також (|Регтіп еї аї., У. Іттипої. 157: 1333-6 (1996)) показали, що

Ф) антитіла проти СТІ А-4 при експериментальному алергічному енцефаломієліті (ЕАЕ) загострюють захворювання ка і підвищують смертність. Загострення захворювання було пов'язане з підвищеним утворенням енцефалітогенних цитокінів ТМЕ-аІрна, ІРМ-датта і ІЛ-2. Таким чином, вони дійшли висновку, що СТІ А-4 регулює інтенсивність бо аутоімунної відповіді при ЕАЕ, послаблюючи утворення запального цитокіну і клінічні вияви захворювання.

Дивися також Нигпмії» еї аіЇ., У Меийгоіїттипо! 73: 57-62 (1997) і Серего еї аїЇ.,, 9). Ехр. Мей. 188: 199-204 (1998)) (анти-СТІ А-4 шпильковий рибозим, який специфічно блокує експресію СТІ А-4 після трансфекції гена на моделі мишачих Т-клітин).

Крім того, |Віаїг еї аї., У. Іттипої. 160: 12-5 (1998)| оцінили функціональні впливи групи моноклональних 65 антитіл (тАбвв) на СТІ А-4 на СО4- клітинах, що покояться. їх результати показали, що деякі моноклональні антитіла до СТІ А-4 можуть гальмувати проліферативні відповіді СО4-- клітин, що покояться і перехід клітинного циклу з фази (ЗО в фазу С1. Інгібіторні ефекти СТІ А-4 були очевидними в межах 4год, в час, коли експресія

СТІ А-4 на поверхні клітини залишається такою, що не визначається. Однак інші СТІ А-4 тАбрв не мали інгібіторних ефектів, що вказує на те, що скріплення тАбз з СТІ А-4 саме по собі не досить для опосередкування негативної регуляції Т-клітинних відповідей. Цікаво, що поки продукція ІЛ-2 була вимкнена, |інгібіторні анти-СТІ А-4 тАбБв допускали індукцію і експресію гена виживання клітин рс1-Х(1). Відповідно до даного спостереження клітини залишалися життєздатними, і після скріплення СТІ А-4 апоптоз не визначався.

У зв'язку з анергією |Регел еї аїЇ.,, Іттипйу 6:411-7 (1997) показали, що індукція анергії Т-клітин запобігалася шляхом блокування СТІ А-4, і вони дійшли висновку, що вихід впізнавання антигена Т-клітинами /о визначається шляхом взаємодії СО28 або СТІ А-4 на Т-клітинах з молекулами В7. Також |Мап Рагіз еї аї.,..

Ехр. Меа. 186: 1119-28 (1997)| досліджували роль інтерлейкіну 12 і костимуляторів в анергії Т-клітин іп мімо і знайшли, що при інгібуванні скріплення СТІ А-4 при індукції анергії проліферація Т-клітин блокувалася, і не стимулювалася остаточне диференціювання Тп1. Однак Т-клітини, піддані дії толерогенного антигена в присутності як ІЛ-12, так і анти-СТІ А-4 антитіла, не ставали анергічними і поводилися ідентично Т-клітинам, 7/5 Які зустрічалися з імуногенним антигеном. Ці результати передбачали, що іп мімо в індукцію анергії вносять внесок два процеси: зустріч з СТІ А-4, яка веде до блокади здатності Т-клітин проліферувати і відсутність цитокіну запального типу, ІЛ-12, який запобігає диференціюванню Т-клітин в ТІ ефекторні клітини. Поєднання

ІЛ-12 їі анти-СТІ А-4 антитіла було достатнім для перетворення звичайно толерантного стимулу в імуногенний.

Відносно інфекцій |МсеСоу еї аіЇ., У. Ехр. Мей. 186: 183-7 (1997) показали, що анти-СТІ А-4 антитіла істотно збільшують і прискорюють Т-клітинну імунну відповідь на Міррозігопдуїз Бгазійепвії, що веде до значного зниження кількості дорослих особів і ранньому закінченню відкладення яєць паразитами. |Дивися також

Мигрпу еї аї/., У. Іттипої. 161: 4153-4160 (1998) (І еізптапіа допомапі)).

Відносно рака (Кмжоп еї аІ., РМАБ ОБА 94: 8099-103 (1997)| розробили модель сингенного рака простати мишей і вивчили два окремих впливи, призначених для з'ясування відповіді, направленої проти рака простати, сч об через посилену костимуляцію Т-клітин: (і) забезпечення прямої костимуляції клітинами рака простати з трансдукованою експресією ліганду В7.1 і (ії) опосередкована антитілом блокада іп мімо СТІ А-4 Т-клітин, яка і) запобігає негативній регуляції Т-клітин. Було показано, що опосередкована антитілом блокада іп мімо СТІ А-4 посилює імунні відповіді проти рака простати. Також |Моцпуд еї аЇ.,, Сапсег Кевз 57: 4036-41 (1997), досліджували, чи веде блокада функції СТІ А-4 до підвищення протиракових відповідей Т-клітин на різних Ге зо стадіях пухлинного зростання. На основі результатів, отриманих іп уйго і іп мімо, вони виявили, що блокада

СТІ А-4 в індивідуумів, хворих на рак, підвищує здатність генерувати протиракові ефекти Т-клітин, але о вираженість такої посилюючої дії була обмежена ранніми стадіями пухлинного зростання в їх моделі. Додатково Ге!

Нигмй» ег аїЇ., Ргос Май Асай сі ОБА 95: 10067-71 (1998) досліджували залежність генерації опосередкованого Т-клітинами протипухлинної відповіді від зустрічі рецептора Т-клітин з головним комплексом ісе) гістосумісності/антигеном, а також від скріплення СО28 з В7. Деякі пухлини, такі як карцинома молочної залози ї-

ЗМІ, не піддавалися антнН-СТІ А-4 імунотерапії. Так, завдяки застосуванню поєднання блокади СТІА-4 і вакцини, що складається з ЗМІ клітин, експресуючіх колонієстимулюючий фактор, гранулоцитів-макрофагів, спостерігалася регресія початкових пухлин 5М1, незважаючи на неефективність будь-якого лікування, що застосовується окремо. Ця спільна терапія приводила до тривалої імунної реакції по відношенню до ЗМІ і « залежала як від СО4(т), так і від СОВ(к) Т-клітин. Результати дозволили передбачити, що блокада СТІ А-4 діє на -плв) с рівні антиген-представляючих клітин господаря.

Відносно діабету | ипаег еї аї!., У. Ехр. Меа. 187: 427-32 (1998)| вводили тАБ проти СТІ А-4 трансгенним по з ТОК мишам, що моделюють діабет на різних стадіях захворювання. Вони виявили, що зустріч СТІ А-4 в момент, коли потенційно діабетогенні Т-клітини активуються уперше, є центральною подією; якщо зустріч

Забезпечується, то відбувається інвазія острівців, але вона залишається абсолютно нешкідливою протягом -І місяців. Якщо цього не відбувається, то інсульт стає набагато більш агресивним і швидко розвивається діабет.

У зв'язку з імунізацією вакциною (|Ногероої! еї аї., У. Іттипої. 160: 2706-14 (1998)| виявили, що інтактне

Ме, тАр проти СТІ А-4, але не Раб фрагменти, придушує первинну гуморальну відповідь на рсСіІА/Ьеїа даї, не

Ге) торкаючись відповідей, що викликаються з пам'яті, що вказує на те, що активація СТІ А-4 гальмує утворення антитіл, але не праймінг Т-клітин. Блокада лігандів для СО28 і СТІ А-4, СОв8О (87-1) і СО86 (87-2), виявила о окрему функцію, яка не перекривається. Блокада СОВ8О при початковій імунізації повністю блокувала первинні і

Ф повторні відповіді антитіл, тоді як блокада СО86 придушувала первинні, але не повторні відповіді. Одночасна блокада СО80-СО86 була менш ефективною при придушенні відповідей антитіл, ніж блокада будь-якого окремо.

Посилення костимуляції за допомогою спільного введення експресуючіх В7 плазмід збільшувало відповіді СТІ, ов але не відповіді антитіл, і не було отримано вказівок на зміщення ТИ! в бік Тп2. Ці дані дозволяють передбачати складні і окремі функції для СО28, СТІ А-4, СО8О і СО86 при костимуляції Т-клітин після вакцинації

Ф) нуклеїновою кислотою. ка У зв'язку з відторгненням алотрансплантату (МагКеез еї аї., 9 Сіїп Іпмеві 101: 2446-55 (1998)| виявили на мишачій моделі відторгнення шкіряного алотрансплантату, що приживаність початково залежить від присутності бо ЕМ-датта, СТІ А-4 ї СО4(т) Т-клітин. Додавання в схему протоколу тАБ проти СТІ А-4 або проти ІЕМ-датта було пов'язане з швидким відторгненням трансплантата, тоді як тАБ проти ІЛ-4 не надавали дії.

У зв'язку з вивченням ролі СТІ А-4 відносно СО28 (ІРаїЇагіпо еї аї., 9. Ехр. Мей. 188: 205-10 (1998), створили трансгенних мишей по ТОК з дефектним активуючим рекомбіназу геном 2 і 2028 дикого типу або дефектним СО28, яких імунізували експресуючою антигенною пухлиною. Праймовані Т-клітини мишей обох типів 65 продукували цитокіни і проліферували у відповідь на стимуляторні клітини, не експресуючі В7. Однак, в той час як відповідь СО28-/-- Т-клітин посилювався костимуляцією ВЩВ7-1, відповідь СЮО28-/- Т-клітин сильно гальмувалася.

Це гальмування знімалося моноклональними антитілами проти В7-1 або СТІ А-4. Таким чином, СТІ А-4 може значно гальмувати активацію Т-клітин у відсутність СО28, що вказує на те, що антагонізм опосередкованого ТСК сигналу достатній для пояснення гальмової дії СТІ А-4. Схожим образом, |іп еї а!., У. Ехр. Меа. 188: 199-204 (1998) вивчали відторгнення серцевих алотрансплантатів у мишей, дефектних по СО28. Серця Н-2(4а) трансплантували алогенним мишам дикого типу або дефектним по СО28 (Н-2(Б5)). Відторгнення трансплантата у дефектних по СО28 мишей відбувалося пізніше, ніж у мишей дикого типу. Обробка реципієнтів дикого типу

СТІ А-4-імуноглобуліном (4) або тАбБрз проти В7-1 плюс тАре5 проти В7-2 значно продовжувала виживання алотрансплантата. Навпаки, обробка дефектних по СО28 мишей СТІ А-4-Ід/ тАбрев проти В7-1 плюс тАбБз проти у/о0 ВТ або блокуючим тАбБ проти СТІ А-4 спричиняла прискорення відторгнення алотрансплантата. Ця підвищена швидкість відторгнення алотрансплантата була пов'язана з більш сильною інфільтрацією моноядерних клітин і підвищеним рівнем транскриптів ІЕМ-датта і ІЛ-6 в серцях донорів у необроблених мишей дикого типу і у дефектних по СЮО28 мишей, оброблених СТІ А-4-Ід або тАБ проти СТІ А-4. Таким чином, негативна регуляторна роль СТІ А-4 виходить за межі здатності запобігати активації СО28 за допомогою лігандної конкуренції. Навіть у 7/5 Відсутність СО28 СТІ А-4 грає інгібіторну роль в регуляції відторгнення алотрансплантату.

Досліджували також додаткові характеристики експресії СТІ А-4. Наприклад, |АІедге еї аї., 9. Іттипої. 157: 4762-70 (1996)| передбачили, що СТІ А-4 поверхні швидко інтерналізується, що може пояснити низький рівень експресії, що звичайно визначається на клітинній поверхні. Вони дійшли висновку, що СО28 і ІЛ-2 грають важливу роль в підвищенні експресії СТІ А-4. Крім того, акумуляція СТІ А-4 на клітинній поверхні, мабуть, регулюється головним чином за рахунок його швидкого ендоцитозу. Також (Савзіап еї аї., Іттипоіоду 90: 265-71 (1997)) на основі імуногістохімічного аналізу експресії СТІ А-4 іп зіш передбачили, що Т-клітини зародкового центра, які є СТІ А-4-позитивними, могли б бути важливими для імунної регуляції.

Відповідно, в світлі широкої і важливої ролі, яку СТІ А-4, мабуть, грають в імунній відповіді, було б бажано створити антитіла до СТІ А-4, які можуть бути ефективно застосовані в імунотерапії. Більш того було б сч бажано створити антитіла проти СТІ А-4, які можуть бути застосовані при хронічних захворюваннях, при яких потрібні повторні введення антитіл. і)

На Фіг.1 представлена серія нуклеотидних і амінокислотних послідовностей важкого ланцюга і легкого капа ланцюга імуноглобулінових молекул відповідно до винаходу: 4.1.1 (Фіг1А), 4.8.1 (Фіг.18), 4.14.3 (Фіг1С), 6.1.1 (Фіг10), 3.1.1 (ФігЛЕ), 410.2 (Фіг), 2.1.3 (Фіг1б), 413.1 (Фіг1Н), 11.2.1 (ФіглІ) 1161 «0 зо (Фіг.15), 11.7.1 (ФігЛК), 12.3.1.1 (Фіг.1у)) і 12.9.1.1 (Фіг.1М).

На Фіг.2 представлене порівняння послідовностей між передбаченими амінокислотними послідовностями і важкого ланцюга клонів 4.1.1, 4.8.1, 4.14.3, 6.1.1, 3.1.1, 4.10.2, 4.13.1, 11.21, 11.6.1, 11.7.1, 12.31.11 і Ге! 12.9.1.1 ї амінокислотною послідовністю батьківської лінії ОР-БО (3-33). Відмінності між послідовністю батьківської лінії ОР-50 і тією ж послідовністю в клонах позначені жирним шрифтом. На Фіг. також вказані ісе)

Зв положення послідовностей СОКІ, СОК2 і СОКЗ антитіл у вигляді затінень. ї-

На Фіг.3 представлене порівняння послідовностей між передбаченими амінокислотними послідовностями важкого ланцюга клону 2.1.3 Її амінокислотною послідовністю батьківської лінії ОР-65 (4-31). Відмінності між послідовністю батьківської лінії ОР-65 і тією ж послідовністю в клоні позначені жирним шрифтом. На Фіг. також вказані положення послідовностей СОК1, СОК2 і СОКЗ антитіла у вигляді підкреслення. «

На Фіг.4 представлене порівняння послідовностей між передбаченими амінокислотними послідовностями з с легкого капа ланцюга клонів 4.1.1, 4.8.1, 4.14.3, 6.1.1, 4.10.2 їі 4.13,1 і амінокислотною послідовністю батьківської лінії А27. Відмінності між послідовністю батьківської лінії А27 і тією ж послідовністю в клоні ;» позначені жирним шрифтом. На Фіг. також вказані положення послідовностей СОК1І, СОК2 і СОКЗ антитіла у вигляді підкреслення. Уявні делеції в СОК15 клонів 4.8.1, 4.14.3 і 6.1.1 позначені як "Ов".

На Фіг.5 представлене порівняння послідовностей між передбаченими амінокислотними послідовностями -І легкого капа ланцюга клонів 3.1.1, 11.2.1, 11.6.1 ії 11.7.1 ії амінокислотною послідовністю батьківської лінії 012. Відмінності між послідовністю батьківської лінії 012 і тією ж послідовністю в клоні позначені жирним ме) шрифтом. На Фіг. також вказані положення послідовностей СОК1, СОК2 і СОКЗ антитіла у вигляді підкреслення.

Ге) На Фіг.б6 представлене порівняння послідовностей між передбаченими амінокислотними послідовностями 5р легкого капа ланцюга клону 2.1.3 і амінокислотною послідовністю батьківської лінії АТО/А26. Відмінності між о послідовністю батьківської лінії АТ0/А26 і тією ж послідовністю в клоні позначені жирним шрифтом. На

Ф Фіг.також вказані положення послідовностей СОК1, СОК2 і СОКЗ антитіла у вигляді підкреслення.

На Фіг.7 представлене порівняння послідовностей між передбаченими амінокислотними послідовностями легкого капа ланцюга клону 12.3.1 і амінокислотною послідовністю батьківської лінії А17. Відмінності між дв послідовністю батьківської лінії А17 і тією ж послідовністю в клоні позначені жирним шрифтом. На Фіг. також вказані положення послідовностей СОК1, СОК2 і СОКЗ антитіла у вигляді підкреслення. (Ф) На Фіг.8 представлене порівняння послідовностей між передбаченими амінокислотними послідовностями ка легкого капа ланцюга клону 12.9.1 і амінокислотною послідовністю батьківської лінії АЗ/А 19. Відмінності між послідовністю батьківської лінії АЗ/А 19 і тією ж послідовністю в клоні позначені жирним шрифтом. На Фіг. бо також вказані положення послідовностей СОКІ, СОК2 і СОКЗ антитіла у вигляді підкреслення.

На Фіг.9 представлене узагальнення М-кінцевих амінокислотних послідовностей, отриманих за допомогою прямого білкового секвенування важкого і легкого ланцюгів антитіл.

На Фіг.10 представлена певна додаткова інформація, що характеризує деякі з антитіл відповідно до даного винаходу. На Фіг.10А підсумовані дані, що відносяться до клонів 3.1.1, 41.1.1, 4.8.1, 4.10.2, 4.14.3 і 6.1.1. 65 Представлені дані, що відносяться до концентрації, ізоелектричного фокусування (ЕФ), ДДОС-Ма-ПАГЕ, розмірно-ексклюзійної хроматографії (5ЕС), рідинної хромато/масс-спектроскопії (РХМС), мас-спектроскопії

(МАГО1), М-кінцевим послідовностям легких ланцюгів. Додаткова докладна інформація, що відноситься до ІЕФ, представлена на Фіг.10В; що відноситься до ДЦО-Ма-ПААГ, представлена на Фіг.10С; і ЕС антитіла 4.1.1 на

Фіг.100.

На Фіг.11 представлена експресія В7-1 і В7-2 на клітинах Каїї із застосуванням тАбБв проти СО-80-РЕ і

СО86-РЕ.

На Фіг.12 представлене залежне від концентрації збільшення продукції ІЛ-2 в тесті Т-лімфобластів/Каї), індуковане блокуючими антитілами проти СТІ А-4 (ВМІЗ, 4.1.1, 4.8.1 і 6.1.1).

На Фіг.13 представлене залежне від концентрації збільшення продукції ІЕМ-у в тесті Т-лімфобластів/Каїї, 70 індуковане блокуючими антитілами проти СТІ А-4 (ВМІЗ, 4.1.1, 4.8.1 і 6.1.1) (той же донор Т-клітин).

На Фіг.14 представлене середнє збільшення продукції ІЛ-2 Т-клітинами від 6 донорів, індуковане антитілами що блокують проти СТІ А-4, в тесті Т-лімфобластів/Каї).

На Фіг.15 представлене середнє збільшення продукції ІМЕ- у Т-клітинами від б донорів, індуковане блокуючими антитілами проти СТІ А-4, в тесті Т-лімфобластів/Каїї.

На Фіг.16 представлене збільшення продукції ІЛ-2 в ЯИРВМС від 5 донорів, індуковане блокуючими тАрз проти СТІ А-4, виміряне через 72 години після стимуляції 5ЕА.

На Фіг.17 представлене збільшення продукції ІЛ-2 в суцільній крові від З донорів, індуковане блокуючими тАбрз проти СТІ А-4, виміряне через 72 і 96 годин після стимуляції ЗЕА.

На Фіг.18 представлено гальмування зростання пухлини антитілами проти СТІ А-4 миші в мишачій пухлинній моделі фібросаркоми.

На Фіг.19 представлене збільшення продукції ІЛ-2, індуковане антитілами проти СТІ А-4 (4.1.1 ї 11.21) даного винаходу, Через 72 години в тестах Т-лімфобластів/Каїї і суперантигену (суцільна кров і моноядерні клітини периферичної крові від 6 донорів).

На Фіг.20 представлене дозозалежне збільшення продукції ІЛ-2, індуковане антитілами проти СТІ А-4(4.11і с 11.2.1) даного винаходу, через 72 години в тесті Т-лімфобластів/Ка) і.

На Фіг.21 представлене дозозалежне збільшення продукції ІЛ-2, індуковане антитілами проти СТІ А-4 (4.11 і і) 11.2.1) даного винаходу, Через 72 години в тесті суперантигену з суцільною кров'ю при стимуляції 1ООнг/мл суперантигену.

На Фіг.22 представлені серії додаткових нуклеотидних і амінокислотних послідовностей наступних ланцюгів Ге) антитіл проти СТІ А-4: повнорозмірний важкий ланцюг 4.1.1 (КДНК 22(а)), геномна ДНК 22(Б) і амінокислотна послідовність 22(с), повнорозмірний деглікозильований важкий ланцюг 4.1.1 (КДНК 22(4)), і амінокислотна о послідовність 22(е), легкий ланцюг 4.1.1 (КДНК 22(7)), і амінокислотна послідовність 22(9), повнорозмірний Ф) важкий ланцюг 4.8.1 (КДНК 22(Пп)), і амінокислотна послідовність 24(ї), легкий ланцюг 4.8.1 (КДНК 22), і амінокислотна послідовність 22(К), повнорозмірний важкий ланцюг 6.1.1 (КДНК 22(І)), і амінокислотна і-й 3Зз5 послідовність 22(т), легкий ланцюг 6.1.1 (КДНК 22(п)), і амінокислотна послідовність 22(про), повнорозмірний /- ча важкий ланцюг 11.2.1 (КДНК 22(р)), і амінокислотна послідовність 22(4) і легкий ланцюг 11.2.1 (КДНК 22(г)), і амінокислотна послідовність 22(8).

Відповідно до першого варіанту даного винаходу пропонується антитіло, яке здатне зв'язувати СТІ А-4, що « включає амінокислотну послідовність варіабельної області важкого ланцюга, яка включає прилеглу амінокислотну послідовність від послідовності ЕК1 до послідовності ЕКЗ включно, що кодується сімейством генів - с людини МнЗ-33, і яка включає, щонайменше, одну з амінокислотних замін в послідовностях СОМ, ц послідовностях СОМК2 або рамках послідовностей, представлених на Фіг2. В переважному здійсненні "» амінокислотна послідовність включає послідовність, яку вибирають з групи, що складається з ЗЕО ІЮО МО: 1, ЗЕО

ІО МО: 2, БЕО І МО: 3, ЗЕО ІЮ МО: 4, 5ЕО ІО МО: 5, 5ЕО ІЮ МО: 6, ЗЕО ІО МО: 8, 5ЕО ІЮ МО: 9, БЕО ІЮ МО: 10,

ЗБОЮ МО: 11, БЕО ІЮО МО: 12, 5ЕО ІЮ МО: 13, ЗЕО ІЮО МО: 63, ЗЕО І МО: 64, ЗЕО ІЮ МО: 66, ЗЕО ІЮО МО: 68 і -І ЗЕО ІЮО МО: 70. В іншому переважному здійсненні антитіло додатково включає амінокислотну послідовність варіабельної області легкого ланцюга, включаючи послідовність, яку вибирають з групи, що складається з б послідовності, що включає 5ЕО ІЮ МО: 14, 5ЕО ІЮО МО: 15, 5ЕО ІО МО: 16, 5ЕО ІЮ МО: 17, 5ЕО І МО: 18, 5ЕО ІЮ се МО: 19, БЕО ІЮ МО: 20, БЕО ІЮ МО: 21, БЕО ІЮО МО: 22, ЗЕО ІЮО МО: 23, ЗЕО ІО МО: 24, 5БЕО ІЮО МО: 25, 5ЕО ІЮ

МО: 26, ЗЕО ІЮО МО: 65, ЗЕО ІЮ МО: 67, 5ЕО ІЮ МО: 69 і ЗЕО ІЮ МО: 71.

Мамі Відповідно до другого варіанту даного винаходу пропонується антитіло, що включає амінокислотну

Я») послідовність важкого ланцюга, яка включає ЗЕО ІЮ МО: 1 і амінокислотну послідовність варіабельної частини легкого ланцюга, яка включає 5ЕО ІЮ МО: 14.

Відповідно до третього варіанту даного винаходу пропонується антитіло, що включає амінокислотну послідовність важкого ланцюга, яка включає ЗЕСО ІЮО МО: 2 і амінокислотну послідовність варіабельної частини легкого ланцюга, яка включає 5ЕО ІЮ МО: 15. і) Відповідно до четвертого варіанту даного винаходу пропонується антитіло, що включає амінокислотну ко послідовність важкого ланцюга, яка включає ЗЕО ІЮ МО: 4 і амінокислотну послідовність варіабельної частини легкого ланцюга, яка включає 5ЕО ІЮ МО: 17. 60 Відповідно до п'ятого варіанту даного винаходу пропонується виділене моноклональне антитіло людини, яке здатне взаємодіяти з СТІ А-4. У переважному здійсненні антитіло здатне конкурувати за скріплення з СТІ А-4 з антитілом, яке вибирають з групи, що складається з 3.1.1, 4.1.1, 4.8.1, 4.10.2, 4.13.1, 4.14.3, 6.1.1, 11.2.1, 11.6.1, 11.7.1, 12.3.1.1 ії 12.9.1.1. В іншому переважному здійсненні антитіло володіє по суті схожою специфічністю скріплення з СТІ А-4, що і антитіло, яке вибирають з групи, що складається з 3.1.1, 4.1.1, 65 4.8.1, 410.2, 4.13.1, 414.3, 6.1.1, 11.21, 11.6.1, 11.7.1, 12.3.1.1 їі 12.91.11. В іншому переважному здійсненні антитіло вибирають з групи, що складається з 3.1.1, 4.1.1, 4.8.1, 4.10.2, 4.13.1, 4.14.3, 6.1.1,

11.2.1, 11.6.1, 11.7.1, 12.3.1.1 ії 12.9.1.1. В іншому переважному здійсненні антитіло не реагує перехресно з

СТІ А-4 нижчих видів ссавців, переважно нижчі види ссавців включають мишу, пацюка і кролика і більш переважно мишу і пацюка. В іншому переважному здійсненні антитіло реагує перехресно з СТІ А-4 приматів, переважно примати включають довгохвостих макак і макак-резус. В іншому переважному здійсненні антитіло володіє вибірковістю у відношенні СТІ А-4 в порівнянні з СО28, В7-2, СО44 і пІдс1, більш ніж приблизно 100:1 і переважно приблизно 500:1 або більше. В іншому переважному здійсненні спорідненість скріплення антитіла становить приблизно 10М або вище і переважно приблизно 1079М або вище. В іншому переважному здійсненні антитіло гальмує скріплення між СТІ А-4 і В7-2 з ІС5о менше, ніж приблизно Т00НМ і переважно менше, ніж 70 приблизно 0,38нМ. В іншому переважному здійсненні антитіло гальмує скріплення між СТІ А-4 і В7-1 з ІС во менше, ніж приблизно 100НМ або вище і переважно менше, ніж приблизно О,5О0нМ. В іншому переважному здійсненні антитіло збільшує продукцію ІЛ-2 в тесті Т-лімфобластів/Каї на приблизно 5ООпг/мл або вище і переважно на приблизно 384бпг/мл або вище. В іншому переважному здійсненні антитіло збільшує продукцію

ІЕМ-у в тесті Т-лімфобластів/Ка|ї на приблизно 500пг/мл або вище і переважно на приблизно 123Зпг/мл або 75 вище. В іншому переважному здійсненні антитіло збільшує продукцію ІЛ-2 в тесті суперантигену в ПИРВМС або суцільній крові на приблизно 50Опг/мл або вище. В іншому переважному здійсненні антитіло збільшує продукцію

ІЛ-2 в тесті суперантигену в НИРВМС або суцільній крові на приблизно 50Опг/мл або переважно на 150Опг/мл або вище, або вище ніж на приблизно 3095 або переважно на 5095 по відношенню до контролю.

Відповідно до шостого варіанту даного винаходу пропонується гуманізоване (наближене до людського) антитіло, яке володіє по суті схожою специфічністю скріплення з СТІ А-4, що і антитіло, яке вибирають з групи, що складається з 3.1.1, 4.1.1, 4.8.1, 4.10.2, 4.13.1, 4.14.3, 6.1.1, 11.21, 11.6.1, 11.7.1, 12.31.11 і 12.9.1.1. У переважному здійсненні антитіло не реагує перехресно з СТІ А-4 нижчих видів ссавців, переважно нижчі види ссавців включають мишу, пацюка і кролика і переважно мишу і пацюка. В іншому переважному здійсненні антитіло реагує перехресно з СТІ А-4 приматів, переважно примати включають довгохвостих макакі су макак-резус. В іншому переважному здійсненні антитіло володіє вибірковістю по відношенню до СТІ А-4 в о порівнянні з СО28, В7-2, СО44 і пІдсІ, більш ніж приблизно 100:1 і переважно приблизно 500:1 або більше. В іншому переважному здійсненні спорідненість скріплення антитіла становить приблизно 10 УМ або вище і переважно приблизно 1079М або вище. В іншому переважному здійсненні антитіло гальмує скріплення між

СТІ А-4 і В7-2 з ІСвюо менше, ніж приблизно 100нНМ і переважно менше, ніж приблизно 0,38нМ. В іншому ре) переважному здійсненні антитіло гальмує скріплення між СТІ А-4 і В7-1 з ІСвкюо менше, ніж приблизно 100нНМ або со вище і переважно менше, ніж приблизно 0,50нНМ. В іншому переважному здійсненні антитіло збільшує продукцію

ІЛ-2 в тесті Т-лімфобластів/Каїі на приблизно 50Опг/мл або вище і переважно на приблизно 3846бпг/мл або вище. (22)

В іншому переважному здійсненні антитіло збільшує продукцію ІЕМ-у в тесті Т-лімфобластів/Каїї на приблизно «со 5О0Опг/мл або вище і переважно на приблизно 123Зпг/мл або вище. В іншому переважному здійсненні антитіло

Зо збільшує продукцію ІЛ-2 в тесті суперантигену в НИРВМС або суцільній крові на приблизно 50Опг/мл або вище. В - іншому переважному здійсненні антитіло збільшує продукцію ІЛ-2 в тесті суперантигену в НИРВМС або суцільній крові на приблизно 50О0пг/мл або переважно на 1500пг/мл або вище, або вище ніж на приблизно 3095 або переважно 5095 по відношенню до контролю. «

Відповідно до сьомого варіанту даного винаходу пропонується антитіло, яке взаємодіє з СТІ А-4, що включає амінокислотну послідовність важкого ланцюга, яка включає послідовності ЕКТ, ЕК2 і ЕКЗ людини, що кодується в) с сімейством генів людини Мн 3-33, оперативно пов'язану в рамці з послідовністю СОКІ, СОК2 і СОКЗ, причому "з послідовності СОК1!, СОК2 і СОКЗ незалежно вибирають з послідовностей СОК1, СОК2 і СОКЗ, представлених " на Фіг.2. В переважному здійсненні антитіло за п. 32 додатково включає будь-яку з соматичних мутацій в послідовностях ЕК1, ЕК2 і ЕКЗ, як продемонстровано на Фіг.2.

Відповідно до восьмого варіанту даного винаходу пропонується антитіло, яке взаємодіє з СТІ А-4, що

Ш- включає амінокислотну послідовність важкого ланцюга, яка включає послідовності ЕК1Т, ЕК2 і ЕКЗ людини, що

Ф кодується сімейством генів людини Мн 3-33, оперативно пов'язану в рамці з послідовністю СОКІ, СОК2 і СОКЗ, причому антитіло має наступні властивості: спорідненість скріплення по відношенню до СТІ А-4 приблизно 10 і, або вище; гальмування скріплення між СТІ А-4 і В7-1 з ІС 5о приблизно 100нНМ або менше; гальмування

Га 20 скріплення між СТІ А-4 і В7-2 з ІС о приблизно 100НМ або менше; і збільшення продукції цитокінів в тесті

Т-клітин людини на 50Опг/мл або вище. м, Відповідно до дев'ятого варіанту даного винаходу пропонується антитіло, яке взаємодіє з СТІ А-4, що включає амінокислотну послідовність важкого ланцюга, яка включає послідовності ЕК1, ЕК2 і ЕКЗ, оперативно пов'язану в рамці з послідовністю СОКІ, СОК2 і СОКЗ, яку незалежно вибирають з послідовностей СОКІ, СОК2 22 | СОВ3, представлених на фігурах 2 і 3, причому антитіло має наступні властивості: спорідненість скріплення

ГФ) по відношенню до СТІ А-4 приблизно 107 або вище; гальмування скріплення між СТІ А-4 і В7-1 з ІСво приблизно юю 100нНМ або менш; гальмування скріплення між СТІ А-4 і В7-2 з ІС о приблизно 100НМ або менш; і збільшення продукції цитокінів в тесті Т-клітин людини на 50Опг/мл або вище.

Відповідно до десятого варіанту даного винаходу пропонується система культур клітин для визначення 60 стимуляції Т-клітин, що включає культуру Т-лімфобластів людини, що співкультивується з клітинною лінією Каї).

У переважному здійсненні Т-лімфобласти промивають перед культивуванням з клітинною лінією Каї).

Відповідно до одинадцятого варіанту даного винаходу пропонується метод вимірювання стимуляції Т-клітин, що включає: надання культури Т-лімфобластів людини і клітинної лінії Каїї; контактування культури з агентом; і вимірювання продукції цитокінів культурою. бо Відповідно до дванадцятого варіанту даного винаходу пропонується функціональний метод скринінгу частини зі стимуляторною функцією відносно Т-клітин, що включає: надання культури Т-лімфобластів людини і клітинної лінії Каїї; контактування культури з даною частиною; і вимірювання продукції цитокінів культурою.

Відповідно до тринадцятого варіанту даного винаходу пропонується тест Т-клітинної стимуляції для оцінки інгібіторної функції СТІ А-4, що включає: контактування культури, що включає Т-лімфобласти людини і клітинну лінію Каїі, з агентом і визначення продукції цитокінів культурою.

Відповідно до чотирнадцятого варіанту даного винаходу пропонується спосіб скринінгу агента на стимуляторну активність відносно Т-клітин, що включає: контактування агента з клітинною культурою, що включає Т-лімфобласти людини і клітинну лінію Ка); і визначення продукції цитокінів культурою. 70 У кожному з варіантів з десятого по чотирнадцятий даного винаходу в переважному здійсненні

Т-лімфобласти промивають перед культивуванням з клітинною лінією Каїї. У іншому переважному здійсненні цитокін являє собою ІЛ-2 або ІЕМ-у. У переважному здійсненні агент являє собою антитіло і переважно взаємодіє з СТІ А-4.

Відповідно до п'ятнадцятого варіанту даного винаходу пропонується тест для вимірювання стимуляції 75 Т-клітин, що включає: надання популяції мононуклеарних клітин периферичної крові людини (ПРВМС) або суцільної крові людини, стимульованої ентеротоксином А стафілокока; контактування культури з агентом; і вимірювання продукції цитокінів популяцією клітин.

Відповідно до шістнадцятого варіанту даного винаходу пропонується функціональний тест для скринінгу частини зі стимуляторною функцією відносно Т-клітин, що включає: надання популяції мононуклеарних клітин го периферичної крові людини або суцільної крові людини, стимульованої ентеротоксином А стафілокока; контактування культури з даною частиною; і визначення продукції цитокінів популяцією клітин.

Відповідно до сімнадцятого варіанту даного винаходу пропонується тест Т-клітинної стимуляції для оцінки інгібіторної функції СТІ А-4, що включає контактування популяції мононуклеарних клітин периферичної крові людини або суцільної крові людини, стимульованої ентеротоксином А стафілокока, з агентом і визначення с продукції цитокінів популяцією клітин.

Відповідно до вісімнадцятого варіанту даного винаходу пропонується спосіб скринінгу агента на о стимуляторну активність відносно Т-клітин, що включає: контактування агента з популяцією мононуклеарних клітин периферичної крові людини або з суцільною кров'ю людини, стимульованих ентеротоксином А стафілокока; і визначення продукції цитокінів популяцією клітин. Ге)

У кожному з п'ятнадцятого по вісімнадцятий варіанти даного винаходу в переважному здійсненні цитокін являє собою ІЛ-2. У іншому переважному здійсненні продукцію цитокінів вимірюють в супернатанті, виділеному з і. культури. У переважному здійсненні агент являє собою антитіло і переважно взаємодіє з СТІ А-4. Ф

Відповідно до даного винаходу пропонуються повністю людські моноклональні антитіла проти СТІ А-4 людини. Пропонуються нуклеотидні послідовності, що кодують амінокислотні послідовності, що включають ікс, важкий і легкий ланцюги молекул імуноглобуліну, зокрема, послідовності, відповідні близьким ним ї- послідовностям важкого і легкого ланцюгів від ЕК1 і СОКІ до СОКЗ і ЕК4 включно. Далі пропонуються антитіла, що володіють схожими зв'язуючими властивостями, і антитіла (або інші антагоністи), що володіють функціями, схожими з функціями розкритих тут антитіл. Пропонуються також гібридоми, що експресують такі імуноглобулінові молекули і моноклональні антитіла. «

Визначення шщ с Якщо це не визначене тут інакше, наукові і технічні терміни, що застосовуються в зв'язку з даним й винаходом, повинні мати значення, які загальнозрозумілі для фахівців. Далі, якщо це не мається на увазі «» контекстом, окремі терміни повинні включати множини і множинні терміни повинні включати окремі. Загалом, використані тут номенклатури і способи, що застосовуються у відносинах з клітинною і тканинною культурою, Молекулярною біологією, а також білковою і оліго- або полінуклеотидною хімією і гібридизацією, добре відомі і -і загальноприйняті в техніці Для рекомбінантної ДНК, синтезу олігонуклеотидів, клітинної культури і трансформації застосовуються стандартні способи (наприклад, електропорація, ліпофекція). Ферментативні

Фо реакції і способи очищення здійснюють відповідно до вказівок виробника або як це звичайно виготовляється в

Те) техніці, або як тут описано. Вказані вище способи і процедури звичайно проводять відповідно до традиційних способів, добре відомих в техніці, і як описано в різних загальних і більш спеціальних посиланнях, які о цитуються і обговорюються в ході даного опису. Дивися, |наприклад, ЗатбгоокК еї а!., МоіІесшаг Сіопіпд: А 4) Іарогайгу Мапиа! (2794 ей. Со Зргіпд Нагрог Іарогаїгу Ргезв, Со Зргіпд Нагрог, М.М. (1989))), яка включена тут як посилання. Номенклатури, що використовуються тут і лабораторні процедури і способи, що застосовуються в зв'язку з аналітичною хімією, синтетичною органічною хімією і медичною і фармацевтичною хімією, добре відомі і загальноприйняті в техніці. Для хімічних синтезів, хімічних аналізів, отримання фармацевтичних препаратів, їх складання і доставки, а також лікування хворих застосовують стандартні о способи. ко Якщо це спеціально не вказане інакше, під наступними термінами, що застосовуються відповідно до даного розкриття, потрібно розуміти наступні значення: 60 Термін "виділений полінуклеотид", що застосовується тут буде означати полінуклеотид геномного, КДНК або синтетичного походження або їх певне поєднання, причому "виділений полінуклеотид" внаслідок свого походження (1) не пов'язаний з цілим або з частиною полінуклеотиду, в якому "виділений полінуклеотид" знаходиться в природних умовах, (2) операційно пов'язаний з полінуклеотидом, до якого він не приєднаний в природних умовах або (3) не існує в природі у вигляді частини більш довгої послідовності. 65 Термін "виділений білок", що застосовується тут означає білок, що кодується КкКДНК, рекомбінантною РНК, або синтетичного походження або що визначається їх певним поєднанням, причому "виділений білок" внаслідок свого походження або джерела походження (1) не пов'язаний з білками, виявленими в природі, (2) вільний від білків з того ж джерела, наприклад, вільний від білків миші, (3) експресується клітинами різних видів або (4) не існує в природі.

Термін "поліпептид", що застосовується тут як родове поняття відноситься до нативного білка, фрагментів або аналогів поліпептидної послідовності. Отже, нативний білок, фрагменти і аналоги є видами роду поліпептидів. Переважні поліпептиди відповідно до винаходу включають важкий ланцюг молекул імуноглобулінів людини і легкий капа ланцюг молекул імуноглобулінів людини, представлені на Фіг.1, а також молекули антитіл, що утворюються поєднаннями, що включають важкий ланцюг молекул імуноглобулінів і легкий ланцюг молекул 70 імуноглобулінів, такий як легкий капа ланцюг молекул імуноглобулінів, і навпаки, як і їх фрагменти і аналоги.

Термін "існуючий в природі", що застосовується тут відносно об'єкта відноситься до того факту, що об'єкт може бути виявлений в природі. Наприклад, поліпептидна або полінуклеотидна послідовність, присутня в організмі (включаючи віруси), яка може бути виділена з природного джерела і яка не була навмисно модифікована людиною в лабораторії або іншим способом, є "існуючою в природі".

Термін "операційно пов'язаний", що застосовується тут відноситься до положень компонентів, що описується таким чином, які дозволяють їм функціонувати властивим ним способом. Керуюча послідовність, "операційно пов'язана" з кодуючою послідовністю таким способом, що при умовах, сумісних з керуючими послідовностями, досягається експресія кодуючої послідовності.

Термін "керуюча послідовність", що застосовується тут відноситься до полінуклеотидних послідовностей, які необхідні для забезпечення експресії і процесінгу кодуючих послідовностей, до яких вони приєднані. Природа таких керуючих послідовностей розрізнюється в залежності від організму господаря; у прокаріот такі керуючі послідовності звичайно включають промотор, сайт скріплення з рібосомою і послідовність термінації транскрипції; в евкаріот керуючі послідовності звичайно включають промотори і послідовність термінації транскрипції. Термін "керуючі послідовності" призначений для включення, як мінімум, всіх компонентів, сч присутність яких необхідна для експресії і процесінгу, і може також включати додаткові компоненти, присутність яких корисна, наприклад, лідируючі послідовності і послідовності гібридного партнера. і)

Термін "полінуклеотид", що застосовується тут означає полімерну форму нуклеотидів довжиною, щонайменше, 10 основ, або рібонуклеотидів, або дезоксирібонуклеотидів, або модифікованої форми будь-якого типу нуклеотиду. Термін включає односпіральні і двоспіральні форми ДНК. Ге зо Термін "олігонуклеотид", що застосовується тут включає існуючі в природі і модифіковані нуклеотиди, пов'язані один з одним існуючими в природі і природно не існуючими олігонуклеотидними зв'язками. о

Олігонуклеотиди являють собою підгрупу полінуклеотидів, що звичайно має довжину в 200 основ або менш. Ге!

Переважно олігонуклеотиди мають довжину від 10 до 60 основ і більш переважно довжину від 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 або 20 до 40 основ. Олігонуклеотиди звичайно є односпіральними, наприклад, для проб; хоч ре) з5 Олігонуклеотиди можуть бути двоспіральними, наприклад, для застосування в конструкції мутантного гена. ча

Олігонуклеотиди винаходу можуть бути або смисловими, або антисмисловими олігонуклеотидами.

Термін "існуючі в природі нуклеотиди", що застосовується тут включає дезоксирібонуклеотиди і рібонуклеотиди. Термін "модифіковані нуклеотиди", що застосовується тут включає нуклеотиди з модифікованими або заміщеними групами цукрів і тому подібне. Термін "олігонуклеотидні зв'язки", що «

Застосовується тут включає такі олігонуклеотидні зв'язки, як фосфортіоатні, фосфордитіоатні, з с фосфорселеноатні, фосфордиселеноатні, фосфоранілтіоатні, фосфораніладатні, фосфорамідні і тому подібне.

Дивися, Інаприклад, І аРіапспе еї аїЇ., Мисі. Асідз Кевз. 14: 9081 (1986); (ес еї аіЇ., 9). Ат. Спет. 5ос. 106: ;» 6077 (1984); Зі(еїп еї аїЇ.,, МисіІ. Асідв Кевз. 16: 3209 (1988); 20оп еї аї., Апіі-Сапсег Огид ЮОевідп 6: 539 (1991); 2оп еї аї., Оіідописіеойдез апа Апаіодцев: А Ргасіїсаї Арргоасі, рр.87-108 (Р. ЕсКеїеіп, Еа., Охіога Мпімегайу Ргезв, Охіога Еподіапа (1991)); Зіес еї аі., патент США Мо.5151510; ОпІтапп апа Реутап Спетісаї -І Кеміємув 90:543 (1990)), відкриття яких включені тут як посилання. Якщо це бажане, олігонуклеотиди можуть включати мітку для їх визначення.

Ме, Термін "виборче гібридизований", що застосовується тут означає такий, що визначається і специфічно

Ге) пов'язаний. Полінуклеотиди, олігонуклеотиди і їх фрагменти відповідно до даного винаходу виборчо гібридизуються з ланцюгами нуклеїнових кислот в умовах гібридизації і промивки, які зводять до мінімуму о кількість неспецифічного скріплення, що визначається, яке піддається оцінці з нуклеїновими кислотами. Як

Ф відомо фахівцям в даній області і як тут обговорюється, можуть бути застосовані дуже суворі умови для досягнення умов виборчої гібридизації. Звичайно гомологія послідовностей нуклеотидів між полінуклеотидами, олігонуклеотидами і фрагментами даного винаходу і цікавлячою послідовністю нуклеотидів повинна бути, щонайменше, 8095 і більш типово гомологія, що переважно збільшується, щонайменше, до 8595, 9095, 9595, 9996 і 10095. Дві амінокислотні послідовності є гомологічними, якщо між цими послідовностями існує часткова або

Ф) повна ідентичність. Наприклад, 8595 гомологія означає, що 8595 амінокислот ідентичні, коли дві послідовності ка порівнюються на предмет максимального поєднання. Допускаються пропуски (в будь-якій з двох послідовностей, що порівнюються) для максимізації поєднання; причому переважні пропуски довжиною 5 або менш і більш бо переважні довжиною 2 або менш. В іншому варіанті переважно дві білкові послідовності (або поліпептидні послідовності, або ті, що беруть від них початок поліпептидні послідовності довжиною, щонайменше, 30 амінокислот) є гомологічними в значенні, що застосовується тут, якщо показник поєднання більше за 5 (в одиницях стандартного відхилення), що визначається за допомогою програми АГІСМ із застосуванням матриці даних по мутаціях і штрафними очками за пропуски 6-ти або більше. |Дивися Оауйоїї, М.О., іп АМаз ої Ргоїеіп 65 Зедцепсе апа Зігисіцге, рр.101-110 (Моїште 5, Майопа! Віотедіса! Кезеагспй Еошпаайоп (1972)) і БУрріетепі 2 до цього тому, рр.1-10Ї1. Дві послідовності або їх частини більш переважно є гомологічними, якщо їх амінокислоти ідентичні на 5095 або більш при оптимальному поєднанні із застосуванням програми АГІСМ. Термін "відповідає", що застосовується тут, означає, що послідовність нуклеотидів гомологічна (тобто є ідентичною, не маючи суворого загального еволюційного походження) всій полінуклеотидній послідовності порівняння або її частини, або що полінуклеотидна послідовність ідентична поліпептидній послідовності порівняння. На відміну від цього термін "комплементарна чомусь" застосовується тут для позначення того, що комплементарна послідовність гомологічна всій послідовності полінуклеотидів порівняння або її частини. Наприклад, нуклеотидна послідовність "ТАТАС" відповідає послідовності порівняння "ТАТАС" і комплементарна послідовності порівняння "СТАТА". 70 Наступні терміни застосовуються для опису взаємозв'язків послідовностей між двома або більш послідовностями полінуклеотидів або амінокислот: "послідовність порівняння", "вікно порівняння", "Ідентичність послідовностей", "процент ідентичності послідовностей" і "значна ідентичність". "Послідовність порівняння" являє собою певну послідовність, що застосовується як основа для порівняння послідовностей; послідовність порівняння може бути частиною більшої послідовності, наприклад, дільницею повнорозмірної КДНК або послідовності гена, даної в списку послідовностей, або може включати повну послідовність кКДНК або гена.

Звичайно довжина послідовності порівняння становить, щонайменше, 19 нуклеотидів або б амінокислот, частіше, щонайменше, 24 нуклеотида або 8 амінокислот і часто, щонайменше, 48 нуклеотидів або 16 амінокислот. Оскільки дві полінуклеотидні або амінокислотні послідовності можуть кожна (1) включати послідовність (тобто частина повної полінуклеотидної або амінокислотної послідовності), яка схожа у двох го молекул, ії (2) можуть додатково включати послідовність, яка розрізнюється у двох полінуклеотідних або амінокислотних послідовностей, порівняння послідовностей двох (або більш) молекул для ідентифікації і порівняння локальних районів схожості послідовностей звичайно виконують шляхом порівняння послідовностей двох молекул у "вікні порівняння". Термін "вікно порівняння", що застосовується тут відноситься до концептуальної дільниці з, щонайменше, 18 послідовних положень нуклеотидів або б амінокислот, в якому сч полінуклеотидна послідовність або амінокислотна послідовність можуть порівнюватися з послідовністю порівняння з 18 послідовних положень нуклеотидів або 6 амінокислотних послідовностей, і в якому частина (8) полінуклеотидної послідовності у вікні порівняння може включати до 20 процентів або менше за добавки, делецій, замін і тому подібне (тобто пропусків) при порівнянні з послідовністю порівняння (яка не включає добавки або делеції) для оптимального поєднання двох послідовностей. За допомогою різних способів Ге зо вибирають оптимальне поєднання послідовностей для поєднання вікна порівняння, яке може бути проведене за допомогою алгоритму локальної гомології Зтійй апа УУаїегптап, Аду. Аррі. Май. 2: 482 (1981), за допомогою о алгоритму гомологічного поєднання Меедіетап апа МУпеси 9. Мої. Віої. 48: 443 (1970), за допомогою способу Ге! пошуку схожості Реаггоп апа Гіртап Ргос. Маї). Асад. Зсі. (0.5.А.) 85: 2444 (1988), за допомогою комп'ютерних способів здійснення цих алгоритмів (ЗАР, ВЕЗТРІТ, РА5ЗТА і ТЕА5ЗТА в УУізсопвіп Сепеїйсв Зоїймжмаге Раскаде ісе)

Кеїєеазе 7.0, (Сепейсв Сотрийег Сгоцр, 575 Зсіепсе Ог., Медізоп, Муз.) Сепежогкв або МасМесіог зоїймаге ї- раскаде), або за допомогою перевірки і найкращого поєднання (тобто ведучого до найбільшого процента гомології у вікні порівняння).

Термін "ідентичність послідовностей" означає, що дві полінуклеотидні або амінокислотні послідовності ідентичні у вікні порівняння (тобто на основі збігу нуклеотиду з нуклеотидом або залишку із залишком). Термін « "процент ідентичності послідовностей" розраховують шляхом порівняння двох оптимально суміщених з с послідовностей у вікні порівняння, визначення числа положень, в яких в обох послідовностях знаходиться ідентична основа нуклеїнових кислот (наприклад, А, Т, С, б, У або І) або залишок для отримання числа парних з положень, розподілу числа парних положень на загальне число положень у вікні порівняння (тобто на розмір вікна) і множення результату на 100 для отримання процента ідентичності послідовностей. Термін "значна їдентичність що застосовується тут означає характеристику полінуклеотидної або амінокислотної -І послідовності, де полінуклеотидна або амінокислотна послідовність включає послідовність, в якій ідентичність послідовності становить, щонайменше, 85 процентів, переважно, щонайменше, від 90 до 95 процентів, більш

Ме, звичайно, щонайменше, 99 процентів при порівнянні з послідовністю порівняння у вікні порівняння з,

Ге) щонайменше, 18 нуклеотидних (б амінокислотних) положень, де процент ідентичності послідовностей 5о розраховують шляхом порівняння послідовності порівняння з послідовністю, яка може включати делеції або о добавки, які становлять сумарно 20 процентів або менше за послідовність порівняння у вікні порівняння.

Ф Послідовність порівняння може бути частиною більш великої послідовності.

Назви двадцяти амінокислот, що застосовуються тут і їх абревіатура відповідають традиційним. Дивися

Пттипоїоду - А Бупіпевзії, 2па Еаййоп, Е.5. СошбБ апа О.К. Огеп, Еадз., біпацег Авззойіафев, Зипаегіапа, в Мазв. (1991)), яка включена тут як посилання. Стереоізомери (наприклад, О-амінокислоти) двадцяти традиційних амінокислот, не природні амінокислоти, такі як оу-, 0-дизаміщені амінокислоти, М-алкіламінокислоти, молочна (Ф, кислота і інші нетрадиційні амінокислоти також можуть бути відповідними компонентами для поліпептидів даного ко винаходу. Приклади нетрадиційних амінокислот включають: 4-гідроксипролін, у-карбоксиглутамат,

Е-М,М,М-триметиллізин, Е-М-ацетиллізин, О-фосфосерин, М-ацетилсерин, М-формілметіонін, З-метилгістидин, 60 о-гідроксилізин, о-М-метиларгінін і інші схожі амінокислоти і імінокислоти (наприклад, 4-гідроксипролін). При записі послідовності поліпептиду, що застосовується тут напрям в ліву сторону є напрямом до аміно-кінця, а напрям в праву сторону є напрямом до карбокси-кінця відповідно до угоди і стандартного застосування.

Схожим образом, якщо не обумовлено інакше, лівий кінець одноланцюгових полінуклеотидних послідовностей є 5-кінцем; напрям в ліву сторону дволанцюгових полінуклеотидних послідовностей 65 позначається як 5-напрям. Напрям добавок зростаючих транскриптів РНК від 5" - до 3--кінця позначається як транскрипційний напрям; області послідовностей на ланцюги ДНК, які мають ту ж послідовність, що і РНК, і які є транскриптами РНК всередині 5'-кінця, позначаються як "вищележачі послідовності"; області послідовностей на ланцюги ДНК, які мають ту ж послідовність, що і РНК, і які є транскриптами РНК всередині 3'-кінця, позначаються як "нижчележачі послідовності".

У застосуванні до поліпептидів термін "істотна ідентичність" означає, що дві пептидні послідовності при оптимальному поєднанні, такому як за допомогою програм СЗАР або ВЕБТРІТ із застосуванням ваги негомологічних пропусків, мають послідовності, ідентичні щонайменше, на 80 процентів, переважно послідовності, ідентичні, щонайменше, на 90 процентів, більш переважно послідовності, ідентичні, щонайменше, на 95 процентів і найбільш переважно послідовності, ідентичні, щонайменше, на 99 процентів. Переважно 7/0 положення залишків, які не є ідентичними, відрізняються по консервативних замінах амінокислот. Під консервативними замінами амінокислот мається на увазі взаємозамінність залишків, що мають схожі бічні ланцюги. Наприклад, група амінокислот, що мають аліфатичні бічні ланцюги, являє собою гліцин, аланін, валін, лейцин і ізолейцин; група амінокислот, що мають аліфатичні-гідроксильні бічні ланцюги, являє собою серин і треонін; група амінокислот, що мають амід-утримуючі бічні ланцюги, являє собою аспарагін і глутамін; група /5 амінокислот, що мають ароматичні бічні ланцюги, являє собою фенілаланін, тирозин і триптофан; група амінокислот, що мають основні бічні ланцюги, являє собою лізин, аргінін і гістидін; і група амінокислот, що мають утримуючі сірку бічні ланцюги, являє собою цистеїн і метіонін. Переважні консервативні заміни груп амінокислот являють собою: валін-лейцин-ізолейцин, фенілаланін-тирозин, лізин-аргінін, аланін-валін, глутамінова-аспарагінова кислота і аспарагін-глутамін.

Як тут обговорюється, мінорні варіації амінокислотних послідовностей антитіл або молекул імуноглобулінів розглядаються як такі що охоплюються даним винаходом, з умовою, що при варіаціях в послідовності амінокислот зберігається, щонайменше, 7595, більш переважно, щонайменше, 8095, 9095, 9595 і найбільш переважно 9995 ідентичності. Зокрема, розглядаються консервативні заміни амінокислот. Консервативними замінами є такі, які мають місце всередині сімейства амінокислот, що мають схожі бічні ланцюги. Амінокислоти, сч об що кодуються генетично звичайно поділяють на сімейства: (1) кислі-аспартат, глутамат; (2) основні-лізин, аргінін, гістидін; (3) неполярні-аланін, валін, лейцин, ізолейцин, пролін, фенілаланін, метіонін, триптофан; (8) і (4) незаряджені полярні-тліцин, аспарагін, глутамін, цистеїн, серин, треонін, тирозин. Більш переважними сімействами є: сімейство серину і треоніну з аліфатичними-гідроксильними бічними ланцюгами; сімейство аспарагіну і глутаміну з амід-утримуючими бічними ланцюгами; сімейство аланіну, валіну, лейцину і ізолейцину Ге зо З аліфатичними бічними ланцюгами; і сімейство фенілаланіну, триптофану і тирозину з ароматичними бічними ланцюгами. Наприклад, логічно передбачити, що ізольована заміна лейцину на ізолейцин або валін, аспартату і, на глутамат, треоніну на серин або схожа заміна амінокислоти на структурно схожу амінокислоту не повинна ду мати істотного впливу на скріплення або властивості кінцевої молекули, особливо, якщо в заміну не залучена амінокислота, що знаходиться в місці рамки. Можна легко перевірити, чи буде заміна амінокислоти впливати на ісе) функцію пептиду, шляхом визначення специфічної активності похідного пептиду. Методи визначення тут ї- детально описані. Фрагменти або аналоги антитіл або молекул імуноглобулінів можуть бути легко отримані фахівцями в цій області. Переважно, щоб аміно- і карбокси-кінці фрагментів або аналогів знаходилися поблизу кордонів функціональних доменів. Структурні і функціональні домени можуть бути ідентифіковані шляхом порівняння даних послідовностей нуклеотидів і/або амінокислот з опублікованими або власними базами даних. «

Для ідентифікації мотивів послідовностей або передбаченої конформації доменів білків, які є в інших білках з з с відомою структурою і/або функцією, переважно застосовують комп'ютеризовані способи порівняння. Відомі . способи ідентифікації послідовностей білків, які формують відому трьохмірну структуру. |Воуле еї аї., Зсіепсе и?» 253: 164 (1991)). Таким чином, представлені вище приклади демонструють, що фахівець в даній області може дізнатися мотиви послідовностей і їх структурну конформацію, що може бути використано для визначення структурних і функціональних доменів відповідно до даного винаходу. -І Переважними амінокислотними замінами є ті, які: (1) знижують схильність протеолізу, (2) знижують схильність до окислення, (3) змінюють спорідненість скріплення для утворення білкових комплексів, (4)

Ме, змінюють спорідненість скріплення і (4) додають або модифікують інші фізико-хімічні і функціональні

Ге) властивості таких аналогів. Аналоги можуть включати різні мутеїни з послідовністю, відмінною від існуючої в 5о природі пептидної послідовності. Наприклад, в існуючій в природі послідовності (переважно в частині о поліпептиду, лежачій за межами домену (доменів), утворюючого міжмолекулярні контакти) можуть бути зроблені

Ф одиночні або множинні амінокислотні заміни (переважно консервативні амінокислотні заміни). Консервативна амінокислотна заміна не повинна істотно міняти структурні характеристики початкової послідовності (наприклад, замінююча амінокислота не повинна викликати тенденції до порушення спіралі, яка є в початковій послідовності, або руйнувати інші типи повторної структури, характерні для початкової послідовності). Приклади повторних і третинних структур поліпептидів, що розрізнюються в техніці описані (в Ргоїеіп5з, Зігисігез апа Моіесшаг

Ф) Ргіпсіріевз (Стеідпіоп, Еа., МУ. Н. Ргеетап апа Сотрапу, Мем/ МЖогк (1984)); Іпігодисіоп о Ргоївіп БігисіШге ка (3. Вгапдеп апа у. Тооге, едв., Сапапа Рибіївпіпо, Мем/ МогКк, ; і Тпогпіоп еї аїЇ., Маїшге 354: 105 (1991), які включені тут у вигляді посилання. во Термін "поліпептидний фрагмент", що використовується тут відноситься до поліпептиду, що має аміно-кінцеву або карбокси-кінцеву делецію, але в якому амінокислотна послідовність, що залишилася ідентична відповідним положенням існуючої в природі послідовності, визначеної, наприклад, з послідовності повнорозмірної КДНК. Фрагменти звичайно мають довжину, рівну, щонайменше, 5, 6, 8, або 10 амінокислотам, переважно, щонайменше, 14 амінокислотам, більш переважно, щонайменше, 20 амінокислотам, звичайно, 65 щонайменше, 50 амінокислотам, і навіть більш переважно, щонайменше, 70 амінокислотам. Термін "аналог", що застосовується тут відноситься до поліпептидів, що включає сегмент з, щонайменше, 25 амінокислот, який має значну ідентичність частини розрахованої амінокислотної послідовності і який володіє, щонайменше, однією з наступних властивостей: (1) специфічним скріпленням з СТІ А-4 при відповідних для скріплення умовах, (2) здатністю блокувати скріплення СТІ А-4 зі своїми рецепторами або (3) здатністю гальмувати зростання експресуючих СТІ А-4 клітин іп мйго або іп мімо. Звичайно поліпептидні аналоги включають консервативну амінокислотну заміну (або добавку або делецію) в порівнянні з існуючою в природі послідовністю. Аналоги звичайно мають довжину, рівну, щонайменше, 20 амінокислотам, переважно, щонайменше, 50 або більш амінокислотам, і часто можуть мати ту ж довжину, що і повнорозмірний існуючий в природі поліпептид.

Пептидні аналоги звичайно застосовують в фармацевтичній промисловості як непептидні ліки з /о властивостями, аналогічними властивостям пептиду-зразка. Ці типи непептидних сполук називають "пептидними міметиками" або "пептидоміметиками" (Раиспеге, У. Адм. Огид Кев. 15: 29 (1986); Мерег апа РЕгеїдіпдег, ТІМ5 р.392 (1985); і Емапз еї аї., У. Мей. Спет. 30: 1229 (1987)), які включені тут як посилання. Такі сполуки часто розробляються з метою комп'ютеризованого молекулярного моделювання. Пептидні міметики, які структурно схожі з терапевтично корисними пептидами, можуть бути використані для отримання еквівалентного /5 Терапевтичного або профілактичного ефекту. Звичайно пептидоміметики структурно схожі з пептидом-образом (тобто поліпептидом, який має біохімічну властивість або фармакологічну активність), таким як людське антитіло, але мають один або більше пептидних зв'язків, необов'язково заміщених зв'язком, який вибирають з групи, що складається з: --СН 2МН--, --СН»в--, --СНо-СНьо--, -СН:СН-- (цис і транс), -СОСН»--, - СН(ОН)СН»-- і -Сн.ьзо--, за допомогою способів, відомих в цій області. Для отримання більш стабільних пептидів може бути го використане систематичне заміщення однієї або більше амінокислоти консенсусної послідовності на

О-амінокислоту того ж типу (наприклад, О-лізин замість І -лізину). Крім того, за допомогою способів, відомих в цій області, можуть бути створені стислі пептиди, що включають консенсусну послідовність або по суті ідентичний варіант консенсусної послідовності (Кіго апа Сіегазп Апп. Кем. Віоспет. 61: 387 (1992), включений тут як посилання); наприклад, шляхом додавання внутрішніх цистеїнових залишків, здатних утворювати с ов ВНнутрішньомолекулярні дисульфідні містки, які перетворюють пептид в циклічну форму. "Антитіло" або "пептид(и) антитіла" відносяться до інтактного антитіла або його зв'язуючого фрагмента, і) який конкурує з інтактним антитілом за специфічне скріплення. Зв'язуючі фрагменти отримують за допомогою методу рекомбінантної ДНК або за допомогою ферментативного або хімічного розщеплення інтактних антитіл.

Зв'язуючі фрагменти включають Рар, Бар, Е(аб)», Ем і антитіла з одного ланцюга. Антитіло, відмінне від Ге зо "біспецифічного" або "біфункціонального" антитіла, розуміється як таке, що має ідентичні зв'язуючі центри.

Антитіло по суті гальмує взаємодію рецептора з протирецептором, коли надлишок антитіла знижує кількість о рецептора, пов'язаного з протирецептором, щонайменше, на приблизно 2095, 40905, 6095 або 8095 і частіше більш б ніж на 8595 (при вимірюванні в тесті конкурентного скріплення іп мі(го).

Термін "епітоп" включає будь-яку детермінанту білка, здатну зв'язуватися з імуноглобуліном або рецептором ісе)

Т-клітин. Епітопні детермінанти звичайно складаються з хімічно активних поверхневих угрупувань молекул, таких ї- як бічні ланцюги амінокислот або цукрів, і звичайно мають специфічні тримірні структурні характеристики, а також специфічні зарядні характеристики. Кажуть, що антитіло специфічно зв'язує антиген, коли константа дисоціації становить «1мМкМ, переважно «10О0ОНМ, і найбільш переважно «1ОнНМ.

Термін "агент" застосовується тут для позначення хімічної сполуки або суміші хімічних сполук, біологічної « макромолекули або екстракту, отриманого з біологічних матеріалів. в с Терміни "мітка" і "мічений", що застосовуються тут відносяться до включення маркера, що виявляється, наприклад, шляхом включення радіоактивної амінокислоти або приєднання до поліпептиду біотинільних частин, ;» які можуть бути виявлені за допомогою міченого авідину (наприклад, стрептавідину, що має флуоресцентний маркер або ферментативну активність, яка може бути визначена оптичними або колориметричними способами).

У певних ситуаціях мітка або маркер можуть бути також лікарськими. У техніці відомі і можуть бути застосовані -І різні способи мітки поліпептидів і глікопротеїнів. Приклади міток для поліпептидів включають, але не обмежуються цим, наступне: радіоізотопи і радіонукліди

Ф (наприклад, ЗН, МС, 79М, 3585, 90У, 99Тс, 1, 125), 191)), флуоресцентні мітки (наприклад, ФІТЦ, родамін, (Се) лантанід фосфору), ферментативні мітки (наприклад, пероксидаза хрону, В-галактозидаза, люцифераза, лужна с 50 фосфатаза), хемілюмінесцентні, біотининільні групи, заздалегідь визначені поліпептидні епітопи, які пізнаються повторним репортером (наприклад, парні послідовності лейцинової застібки, сайти скріплення для 4) повторних антитіл, домени скріплення, металу, епітопні ярлики). В деяких здійсненнях мітку приєднують за допомогою спейсерних груп різної довжини для зниження потенційного стеричного ускладнення).

Термін "фармацевтичний агент або ліки", що застосовується тут відноситься до хімічної сполуки або

Композиції, здатних викликати бажану терапевтичну дію при правильному введенні хворому. Інші хімічні терміни, що застосовуються тут використовуються відповідно до традиційного застосування в цій області, як це

ІФ) представлене |в Те МасОгам/-НІіЇЇ Оісбйопагу ої Спетіса! Тегтв, РагКег, 5., Еда., МасОгам/-НІіЇ, Зап Егапсізсо іме) (1985)), включеному тут як посилання.

Термін "антинеопластичний агент", що застосовується тут відноситься до агентів, які володіють 60 функціональною властивістю гальмувати розвиток або прогресію неоплазми у людини, особливо злоякісне (ракове) пошкодження, таке як карцинома, саркома, лімфома або лейкемія. Гальмування метастазів часто є властивістю антинеопластичних агентів.

Термін "в значній мірі чистий", що застосовується тут означає, що вид об'єкта є переважаючим присутнім видом (тобто на молярній основі його більше, ніж будь-якого іншого індивідуального виду в композиції) і 65 переважно в значній мірі очищена фракція являє собою композицію, в якій об'єкт виду становить, щонайменше, приблизно 50 процентів (на молярній основі) всіх присутніх макромолекулярних видів. Звичайно в значній мірі чиста композиція повинна включати більш ніж приблизно 80 процентів всіх макромолекулярних видів, присутніх в композиції, більш переважно, більш ніж приблизно 8595, 9095, 9595 і 9995. Найбільш переважно, щоб вид об'єкта був очищений до практично повної гомогенності (забруднюючі види не можуть бути визначені в композиції традиційними способами виявлення), коли композиція складається по суті з єдиного макромолекулярного виду.

Термін хворий включає людину і суб'єкти ветеринарії.

Структура антитіл

Відомо, що основна структурна одиниця антитіл включає тетрамер. Кожний тетрамер складається з двох ідентичних пар поліпептидних ланцюгів, причому кожна пара містить один "легкий" (приблизно 25кДа) і один 70 "важкий" ланцюг (приблизно 50-7ОкДа). Аміно-кінцева частина кожного ланцюга включає варіабельну область з приблизно від 100 до 110 або більше амінокислот, насамперед відповідальну за впізнавання антигенна.

Карбокси-кінцева частина кожного ланцюга визначає константну область, насамперед відповідальну за ефекторну функцію. Легкі ланцюги людини поділяються на капа і лямбда легкі ланцюги. Важкі ланцюги поділяються на мю, дельта, гамма, альфа або іпсилон і визначають ізотип антитіла як І9М, дО, до, ІЗА і є 7/5 Відповідно. У межах легкого і важкого ланцюгів варіабельні і константні області сполучаються областю ")" з приблизно 12 або більше амінокислот, причому важкий ланцюг включає також область Ю з приблизно 10 або більше амінокислот. Загалом, |дивися ЕРипдатепіа! Іттипоіоду Спи. 7, Раш, МУ., ед., 2пй ед. Камеп Ргезві|, (включений як посилання у всій повноті для всіх цілей). Варіабельні області кожної пари ланцюгів легкий/важкий утворять зв'язуючий сайт антитіла.

Таким чином, інтактне антитіло (ДО містить два зв'язуючих сайта. За винятком біфункціональних або біспецифічних антитіл, два зв'язуючих сайта є однаковими.

Всі ланцюги виявляють однакову загальну структуру з відносно консервативних рамкових областей (ЕК), сполучених трьома гіперваріабельними областями, які називають також областями, що визначають комплементарність або СОМ». СОКве з двох ланцюгів кожної пари розташовуються за рахунок рамкових сч областей, забезпечуючи скріплення зі специфічним епітопом. Від М-кінця до С-кінця як легкий, так і важкий ланцюги включають домени ЕК7Т, СОКІ1, ЕК2, СОК2, ЕКЗ, СОКЗ і ЕК4. Нумерація амінокислот в кожному домені (8) робиться у відповідності до визначень |Караї бедцепсез ої Ргоївіпз ої Іттипоіодіса! Іпіегевзі (Майопаї

Іпвійшіез ої Неакй, ВеїПпезаа, Ма. (1987 і 1991)) або Споїйіа 5: ЇЇ евк у). Мої. Віої. 196: 901-917 (1987); Споїпіа еї аї.. Майиге 342:878-883 (1989)|. «о зо Біспецифічне або біфункціональне антитіло являє собою штучне гібридне антитіло, що володіє двома різними парами важкий/легкий ланцюгів і двома різними зв'язуючими сайгами. Біспецифічні антитіла можуть бути о отримані множиною способів, включаючи злиття гібридом або з'єднання Рар' фрагментів. Дивися, Інаприклад, Ге!

Зоповзіміаі 5 Іасптапп Сіїпй. Ехр. Іттипої. 79: 315-321 (1990), КовієвІпу еї аїЇ., У. Іттипої. 148: 1547-1553 (1992))Ї. Крім того, біспецифічні антитіла можуть бути утворені як "діатіла" |Ноїйпдег ек аї., "Оіародіев': ісе) зтаї! Брімаіепі апа Брізресійс апіїбоду їадтепів" РМАБ БА 90: 6444-6448 (1993))| або "Янусини" |ТгапесКег еї ї- аІ., "Вівресіїс віпдіе спаійп тоіесшев (дЧапивіпв) (Фагдеї суїсіохіс ММтрпосуїез оп НІМ іпіесіей сейв" ЕМВО )/ 10: 3655-3659 (1991) і ТгтацпесКег еї аїЇ.,, "Уапивіп: пем/ тоіесціаг девзідп їог бБівресіїс геадепів" Іпбо 9.

Сапсег. Зиррі. 7: 51-52 (19923). Отримання біспецифічних антитіл може бути відносно трудомістким інтенсивним процесом в порівнянні з отриманням звичайних антитіл, а вихід і міра чистоти біспецифічних антитіл звичайно « нижче. Біспецифічні антитіла не існують в формі фрагментів, що містять один зв'язуючий сайт (наприклад, Бар, пт») с Еарб'ї гм).

Антитіла людини і наближення антитіл до людських з Антитіла людини не викликають проблем, пов'язаних з антитілами, які містять варіабельні і/або константні області миші або пацюка. Наявність таких, що беруть початок від миші або пацюка білків може вести до

Швидкого кліренсу антитіл і може вести до індукції імунної відповіді у хворого проти такого антитіла. Було -І постульовано, що для уникнення застосування антитіл, що беруть початок від миші або пацюка можна створити антитіла, наближені до людських (т.зв. "гуманізовані"), або створити повністю людські антитіла шляхом

Ме, введення функції антитіла людини гризуну, так щоб у гризуна утворювалися антитіла, що мають повністю

Ге) людські послідовності.

Антитіла людини о Можливість клонувати і реконструювати локуси людини розміром, що вимірюється мільйонами основ, в ХАС5

Ф і вводити їх в статеві клітини миші забезпечує потужний спосіб виявлення функціональних компонентів дуже великих або грубо картованих локусів, а також створення зручних моделей захворювань людини. Більш того застосування такої технології для заміни локусів миші їх людськими еквівалентами могло б дати унікальні в Відомості про експресію і регуляцію продуктів генів людини під час розвитку, їх зв'язку з іншими системами і їх залученні до індукції і прогресії захворювання.

Ф) Важливим практичним додатком такої стратегії є "гуманізація" гуморальної імунної системи миші. Введення ка миші, в якої ендогені гени Ід були інактивовані, локусів імуноглобуліну (Ід) людини дає сприятливу можливість вивчити механізми, лежачі в основі програмованої експресії і збирання антитіл, а також їх ролі в розвитку во В-клітин. Більш того така стратегія могла б забезпечити ідеальне джерело для отримання повністю людських моноклональних антитіл (Маре) - важливу віху в напрямі здійснення багатообіцяючої терапії захворювань людини антитілами. Очікується, що повністю людські антитіла зведуть до мінімуму імуногенні і алергічні відповіді, властиві мишачим або таким, що бере початок від миші Мабз», і тим самим підвищать ефективність і безпеку антитіл, що вводяться. Можна чекати, що застосування повністю людських антитіл забезпечить значну 65 перевагу в лікуванні хронічних і захворювань людини, що періодично поновлюються, таких як запалення, аутоімунність і рак, для якого потрібні повторювані введення антитіл.

Одним з підходів до даної мети було генно-інженерне створення ліній мишей з дефіцитом продукції антитіл миші, з великими фрагментами локусів Ід людини в очікуванні того, що такі миші повинні продукувати широкий репертуар антитіл людини у відсутність мишачих антитіл. Великі фрагменти Ід людини повинні зберігати велику різноманітність різних генів, так само як властиву ним регуляцію продукції і експресії антитіл. Завдяки розробці мишачої моделі для створення різноманітності антитіл і їх селекції, а також відсутності імунологічної толерантності до білків людини, виробництво набору антитіл людини такими лініями мишей повинне вести до отримання високоафінних антитіл проти будь-якого цікавлячого антигена, включаючи антигени людини. Антиген-специфічні Маре людини з бажаною специфічністю можна легко отримати і відібрати, /о застосовуючи технологію гібридом.

Ця загальна стратегія була продемонстрована в зв'язку з створенням заявниками перших ліній

ХепоМоизетм, як опубліковано в 1994 році. |Дивися Огееп еї аі.. Майиге Сепеїйсз 7: 13-21 (1994)). Лінії

ХепоМоизетм були створені генно-інженерним способом із застосуванням штучних хромосом дріжджів (УАсзв), що містять конфігураційні фрагменти локусу важкого ланцюга людини і локусу легкого капа ланцюга розміром, 75 245т.п.о. і 190т.п.о. відповідно, які містили каркас послідовностей варіабельного і константного районів (там же). Ід людини, що пропонуються, які містять ХАСв, є сумісними з мишачою системою, як для реконструкції, так і експресії антитіл і здатні заміняти інактивовані гени Ід миші. Це було продемонстроване по їх здатності індукувати вироблення В-клітин, продукувати набір повністю людських антитіл, подібний тому, тцо є у дорослої людини, і генерувати антиген-специфічні Маре людини. Ці результати також передбачали, що введення більш великих порцій локусів (Ід людини, що містять більше число М-генів, додаткових регуляторних елементів і константних районів Ід людини, повинно повторювати по суті повний набір, який характерний для гуморальної відповіді людини на інфекцію і імунізацію. Робота Сгееп еї аіІ. була недавно розширена до представлення набору антитіл людини, більшого, ніж 8095, шляхом введення зародкової конфігурації фрагментів МАС локусів важкого ланцюга людини і локусів легкого капа ланцюга розміру в мільйон основ, відповідно, для отримання мишей Ге!

ХепоМоизетм, |Дивися Мепде? еї аЇ., Маїшге Сепеїйїсв 15: 146-156 (1997), Сгееп апа дакороміїв 9. Ехр. Меа. о 188: 483-495 (1998) і патентну заявку США Мо.08/759620, зареєстровану З грудня 1996 року), розкриття яких включені тут як посилання.

Такий підхід додатково обговорюється і (описується в патентних заявках США МоМо07/466008, зареєстрованої 12 січня 1990р., 07/610515, зареєстрованої 8 листопада 1990р., 07/919297, зареєстрованої 24 липня 1992р., (Се) 07/922649, зареєстрованої ЗО липня 1992р., зареєстрованої 08/031801, зареєстрованої 15 березня 1993р., с 08/112848, зареєстрованої 27 серпня 199Зр., 08/234145, зареєстрованої 28 квітня 1994р., 08/376279, зареєстрованої 20 січня 1995р., 08/430938, 27 квітня 1995р., 08/464584, зареєстрованої 5 червня 1995р., (о) 08/464582, зареєстрованої 5 червня 1995р., 08/463191, зареєстрованої 5 червня 1995р., 08/462837, со зареєстрованої 5 червня 1995р., 08/486853, зареєстрованої 5 червня 1995р., 08/486857, зареєстрованої 5 червня 1995р., 08/486859, зареєстрованої 5 червня 1995р., 08/462513, зареєстрованої 5 червня 1995р., 08/724752, - зареєстрованої 2 жовтня 1996бр., і 08/759620, зареєстрованої З грудня 1996бр. Дивися також Мепае? еї аї.,

Майте Сепеїйісв 15: 146-156 (1997) ії Сгееп апа дакороміїв, У Ехр. Мей. 138: 483-495 (1998). Дивися також

Європатент МОЕР 06 463 151 ВІ, рішення, опубліковане 12 червня 1996р., заявку на Міжнародний патент МОУУО « 94/02602, опубліковану З лютого 1994р., заявку на Міжнародний патент МоУУО 96/34096, опубліковану 31 жовтня 1996р., і УМО 98/24893, опубліковану 11 червня 1998р. Розкриття кожного з цитованих вище патентів, заявок і - с посилань включені тут як посилання у всій їх повноті. и В альтернативному підході інші, включаючи СепРіагт Іпіегпайопаї!, Іпс., застосовували "мінілокусний" є» підхід. У мінілокусному підході екзогенний локус Ід мімікрує завдяки включенню шматочків (індивідуальних генів) з локусу Ід. Таким чином, в конструкцію для вставки тварині включають один або більше генів МН, один або більше генів ОН, один або більше генів УН, константну область мю і другу константну область (переважно -і константну область гамма). Цей підхід (описаний в патенті США Мо5545807, що належить 5ийгапі еї аї., і патентах

ФУ США МоМо5545806, 5625825, 5625126, 5633425, 5661016, 5770429, 5789650 і 5814318, кожний з яких належить

Їопрегд апа Кау, патенті США Мо5591669, що належить Кгітрепіогі апа Вегп5, патентах США МоМо5612205, (се) 5721367, 5789215, що належать Вегпз еї аї., і патенті США Мо5643763, що належить Споїі апа Юшиппі, заявках на сю 50 патент США, що належать СепРНагт Іпіегпайопаї! з МоМо07/574748, зареєстрованої 29 серпня 1990Ор., 07/575962, зареєстрованої 31 серпня 1990Ор., 07/810279, зареєстрованої 17 грудня 1991р., 07/853408, зареєстрованої 18 4) березня 1992р., 07/904068, зареєстрованої 23 червня 1992р., 07/990860, зареєстрованої 16 грудня 1992р., 08/053131, зареєстрованої 26 квітня 1993Зр., 08/096762, зареєстрованої 22 липня 1993Зр., 08/155301, зареєстрованої 18 листопада 1993р., 08/161739, зареєстрованої З грудня 1993р., 08/165699, зареєстрованої 10 грудня 1993р., 08/209741, зареєстрованої 9 березня 1994р., розкриття яких включені тут як посилання. Дивися о також європейський патент Мо0546073 В1, міжнародні патентні заявки МоМоууО 92/03918, МО 92/22645, МО 92/22647, МО 92/22670, МО 93/12227, МО 94/00569, МО 94/25585, МО 96/14436, УМО 97/13852 і УМО 98/24884, їмо) розкриття яких включені тут як посилання у всій їх повноті. Дивися додатково Тауйог еї а!., 1992, СНеп еї аі.,, 1993, Тиайоп еї аїЇ., 1993, Спої еї аїЇ.,, 1993, Іопрегуд еї аї., (1994), Тауюг еї аїЇ.,, (1994) і Тциайоп бо егїаї., (1995), Різлм/йа еї а!., (1996)), розкриття яких включені тут як посилання у всій їх повноті.

Винахідники 5иєгапі еї аІ., процитовані вище, і представляючі Медіса! Кезеагспй Сошпвеї! ("МКС"), отримали трансгенну мишу, що містить локус Ід, за допомогою застосування мінілокусного підходу. Винахідники з

СепРіагт Іпіегпайопа! уогК, цитовані вище, Іопрегд апа Кау, слідуючи вказівкам вказаних заявників, запропонували інактивацію ендогенного Ід локусу миші, пов'язаного, по суті, з дублюванням роботи Зигапі еї аї. 65 Перевага мінілокусного підходу полягає в швидкості, з якою можуть бути отримані і введені тварині конструкції що включають частини локусу Ід. Відповідно, однак, істотний недолік мінілокусного підходу теоретично полягає в тому, що через включення малих кількостей генів М, ЮО і У вводиться недостатня різноманітність. Дійсно, опублікована робота, мабуть, підтримує це побоювання. Вироблення В-клітин і утворення антитіл тварин, отриманих за допомогою застосування мінілокусного підходу, представляється бумнівним. Отже, дослідження, близьке до даного винаходу, постійно було направлене на введення великих порцій локусу Ід для досягнення більшої різноманітності і для зусиль відтворення імунного репертуару тварин.

Відповіді антимишачого антитіла людини (НАМА.) привели до спроби отримати химерні або гуманізовані іншим образом антитіла. Хоч химерні антитіла містять константну область людини і варіабельну область миші, очікується, що повинні спостерігатися відповіді деякого антихимерного антитіла людини (НАСА), особливо при 7/0 тривалих або мультидозних застосуваннях антитіла. Таким чином, було б бажаним запропонувати повністю людські антитіла проти СТІ А-4 для того, щоб уникнути участі і/або ефектів відповіді НАМА або НАСА.

Гуманізація або дисплейна технологія

Як обговорювалося вище в зв'язку з отриманням антитіл людини, є переваги отримання антитіл зі зниженою імуногенністю. До деякої міри це може бути здійснене в зв'язку зі способами гуманізації і дисплейними /5 Методами за допомогою відповідних бібліотек. Потрібно розуміти, що антитіла миші або антитіла інших видів можуть бути наближені до людських або приматних за допомогою способів, добре відомих в даній області.

Дивися, Інаприклад, МУіпіег апа Наїтів, Іттипо! Тодау 14: 43-46 (1993) і МУпдні еї аїЇ., Сп Кеміемв іп

Іпипипої. 12: 125-168 (1992)). Цікавляче антитіло може бути сконструйоване за допомогою способів рекомбінантної ДНК для заміни СНІ, СН2, СНЗ, шарнірних доменів і/або рамкового домену відповідною послідовністю людини |дивися УУО 92/02190 і патенти США МоМо5530101, 5585089, 5693761, 5693792, 5714350 і 5777085). У даній області також відоме застосування кДНК Ід для конструювання генів химерних імуноглобулінів

Ши еї аї., Р.М.А.5. 84:3439 (1987) і 9. Іттипої. 139: 3521 (1987)) мРНК виділяють з гібридоми або інших клітин, що продукують антитіло, і застосовують для отримання кКДНК. Цікавляча кКДНК може бути ампліфікована полімеразною ланцюговою реакцією із застосуванням специфічних праймерів (пат. США МоМо4683195 і 46832021. с

В іншому варіанті створюють і піддають скринінгу бібліотеку для виділення цікавлячої послідовності.

Послідовність ДНК, що кодує варіабельну область антитіла, потім з'єднують з послідовностями константної (8) області людини. Послідовності генів константних областей людини можуть бути знайдені у Кабаї еї аї. (1991),

Зедцепсез ої Ргоїеіпз ої Іттипоіодіса! Іпіегеві, М.І.Н. рибіїсайоп Мо91-3242. Гени С-області людини легко доступні з відомих клонів. При виборі ізотипа потрібно керуватися бажаними ефекторними функціями, такими як Ге зо фіксація комплементу або активність в залежній від антитіла клітинній цитотоксичності. Переважними ізотипами є 1901, Ідс2, ДОЗ і Ідс4. Особливо переважними ізотипами для антитіл винаходу є Ідш2 і Ідс4. Може бути о використана будь-яка з константних областей легкого ланцюга людини капа або лямбда. Химерне гуманізоване зу антитіло потім експресують традиційними способами.

Фрагменти антитіла, такі як Ем, Е (аб). і Раб, можуть бути отримані розщепленням інтактного білка, ісе) з5 наприклад, за допомогою протеаз або хімічного розщеплення. В іншому варіанті конструюють укорочений ген. ча

Наприклад, химерний ген, що кодує частину фрагмента К(абБ)2, повинен включати послідовності ДНК, що кодують СНІ домен і шарнірну область ланцюга Н, що кінчається стоп-кодоном трансляції для отримання укороченої молекули.

В одному підході консенсусні послідовності, що кодують .) області важкого і легкого ланцюгів, можуть бути « застосовані для конструювання олігонуклеотидів для застосування в якості праймерів для введення відповідних з с сайтів рестрикції в / область для подальшого приєднання сегментів М області до сегментів С області людини.

КДНК С області може бути модифікована сайт-направленим мутагенезом для вміщення сайта рестрикції в з аналогічне положення послідовності людини.

Експресійні вектори включають плазміди, ретровіруси, косміди, МАСз, епісоми, похідні від ЕВМ, і тому подібне. Зручним вектором є такий, який кодує функціонально повну послідовність СН або Сі. імуноглобуліну з -І відповідними сайтами рестрикції, сконструйованими так, що будь-яка послідовність МН або МІ може бути легко вставлена і експресована. У таких векторах звичайно відбувається сплайсінг між донорним сайтом зрощення у

Ме, вставленій області У і акцепторним сайтом зрощення, попереднім С області людини, а також по областях

Ге) зрощення, що є в екзонах СН людини. Поліаденілювання і термінація транскрипції відбуваються по природним Хромосомним сайтам, розташованим нижче кодуючих областей. Отримане химерне антитіло може бути о приєднане до будь-якого сильного промотору, включаючи ІТК: ретровірусів, наприклад, ранньому промотору

Ф ЗМ-40 |ОКауата еї аІ. Мої. СеїІ. Віо. 3: 280 (1983)), ГТК вірусу саркоми, Рауса |Сегтап еї аїі., Р.М.А.5. 79: 6777 (1982)) і ГТК вірусу лейкозу мишей Моіопеу |Сгоззснеаі еї аї., СеїЇ. 41: 885 (1985)); нативні промотори

Ід і т.д..

Крім того, антитіла людини або антитіла інших видів можуть бути створені за допомогою технологій дисплейного типу, включаючи, але не обмежуючись цим, фаговий дисплей, ретровірусний дисплей, рибосомний (Ф) дисплей і інші способи із застосуванням методів, добре відомих в даній області, і отримані молекули можуть ка бути піддані додатковому дозріванню, такому як афінне дозрівання, оскільки такі способи добре відомі в даній області. МУгідчні апа Наїтіз, вище, Напез апа Ріисіпйа), РМАЗ БА 94: 4937-4942 (1997)| рибосомний дисплей, бо (Рапттіеу апа Зтйй, Сепе 73: 305-318 (1988) фаговий дисплей, |(Зсой, ТІВ 17: 241-245 (1992), Смжіпа еї аї.,

РМАБ БА 87: 6378-6382 (1990), Киззеї еї аі., Мисі. Асіадз Кезеагсп 21: 1081-1085 (1993), Нодапроот еї аї.,

Іттипої. Кеміемув 130: 43-68 (1992), СпізжмеїЇ апа МсСапПепу, ТІВТЕСН 10: 80-84 і патент США Мо.5733743). Якщо дисплейні технології застосовують для отримання антитіл, відмінних від людських, такі антитіла можуть бути гуманізовані як описано вище. 65 За допомогою цих способів можуть бути отримані антитіла до експресуючих СТІ А-4 клітин, самого СТІ А-4, формам СТІ А-4, його епітопам або пептидам і додатково експресійні бібліотеки |дивися, наприклад, патент США

Мо.5703057|, які можуть бути потім піддані скринінгу як описано вище на предмет описаної вище активності.

Додаткові критерії для лікування антитілами

Як повинно бути ясно, звичайно небажано викликати загибель експресуючих СТІ А-4 клітин. Навпаки, звичайно бажане просте інгібування скріплення СТІ А-4 з його лігандами для зниження негативної регуляції

Т-клітин. Один з основних механізмів, за допомогою яких антитіла викликають загибель клітин, є фіксація комплементу і участь в СОС. Константна область антитіла грає важливу роль в зв'язку зі здатністю антитіла до фіксації комплементу і участі в СОС. Таким чином, звичайно вибирають ізотип антитіла, який або забезпечує здібність до фіксації комплементу, або ні. У випадку даного винаходу звичайно, як згадувалося вище, /о застосування антитіла, що викликає загибель клітин, не є переважним. Існує ряд ізотипів антитіл, здібних до фіксації комплементу і СОС, включаючи, але не обмежуючись цим, наступні: ІОМ миші, ІЇІд02а миші, 9526 миші,

ДОЗ миші, (ОМ людини, Ідс1 людини і ІдЗ людини. Ці ізотипи не включають, але не обмежуючись цим, Ід02 людини і ЇдД54 людини.

Повинно бути ясним, що отримані антитіла не обов'язково повинні початково володіти бажаним ізотипом, а, /5 Навпаки, зроблене антитіло може володіти будь-яким ізотипом, і ізотип антитіла може бути перемкнутий пізніше за допомогою традиційних способів, добре відомих в даній області. Такі способи серед інших включають застосування способів прямої рекомбінації |дивися, наприклад, патент США Мо.4816397|, способів злиття клітин (дивися, наприклад, патентну заявку США Мо.08/730639, зареєстровану 11 жовтня 1996р.|.

У способі злиття клітин отримують лінію мієломи або інших клітин, яка містить важкий ланцюг будь-якого бажаного ізотипу, і отримують іншу лінію мієломи або інших клітин, яка містить легкий ланцюг. Такі клітини можуть надалі бути злиті, і може бути виділена клітинна лінія, що експресує інтактне антитіло.

Як приклад більшість антитіл, що обговорюються тут СТІ А-4 є Іде2 антитілами проти СТІ А-4. Оскільки такі антитіла володіють бажаним скріпленням з молекулою СТІ А-4, ізотип будь-якого з таких антитіл може бути легко перемкнутий на вироблення ізотипу Ід04 людини, наприклад, при збереженні тієї ж варіабельної області (яка сч об визначає специфічність антитіла і частину його спорідненості).

Відповідно, як тільки вироблені кандидаті антитіла, які відповідають "структурним" характеристикам, як (8) обговорювалося вище, вони звичайно можуть бути забезпечені щонайменше, певними додатковими "функціональними" характеристиками, які бажані при зміні ізотипу.

Конструювання і створення інших терапевтичних засобів Ге зо Відповідно до даного винаходу і засновуючись на активності антитіл, яка тут отримана і охарактеризована у відношенні СТІ А-4, полегшується конструювання інших засобів терапевтичного впливу, включаючи інші о антитіла, інші антагоністи або хімічні частини, відмінні від антитіл. Такі засоби включають, але не Ге! обмежуються цим, антитіла, що мають схожу зв'язуючу активність або функціональність, поліпшені терапевтичні засоби на основі антитіл, такі як біспецифічні антитіла, імунотоксини і радіоактивні терапевтичні засоби, ісе) з5 створення пептидних терапевтичних засобів, генна терапія, особливо на рівні організму, антисмислові ча терапевтичні засоби і малі молекули. Більш того як обговорювалося вище, ефекторна функція антитіл винаходу може бути змінена шляхом перемикання ізотипу на Ідс1, Ідс2, дез, Ідс4, дО, ІдДА, ЧЕ або І9ДМ для різних терапевтичних застосувань.

У зв'язку з створенням поліпшених терапевтичних засобів на основі антитіл, коли бажаною характеристикою є « фіксація комплементу, можливо, обійти залежність загибелі клітин від комплементу за допомогою застосування, з с наприклад, біспецифічних антитіл, імунотоксинів або радіоактивних міток.

У зв'язку з біспецифічними антитілами можуть бути створені біспецифічні антитіла, які включають (Її) два з антитіла, одне зі специфічністю у відношенні СТІ А-4, а інше відносно другої молекули, які сполучені разом, (ї) єдине антитіло, яке має один ланцюг, специфічний у відношенні СТІ А-4, і другий ланцюг, специфічний

Відносно другої молекули, або (ії) одноланцюгове антитіло, що володіє специфічністю у відношенні СТІ А-4 і -І іншої молекули. Такі біспецифічні антитіла можуть бути створені при застосуванні способів, які добре відомі, наприклад, в зв'язку з (ії) і (і) дивися, (наприклад, Рапдег еї аїЇ., ІттипоЇї. Меїйподв 4: 72-81 (1994) і

Ме, М тіднгага Наїгтіві, вище, і зв'язки з (ії) дивися, |наприклад, Тгашпескег еї аї., Іпі. У. Сапсег (Зиррі.) 7: 51-52 (1992)).

Ге) Додатково можуть бути також отримані "капатіла" (Ш ек аїЇ., "Оезідп апа сопзігасіоп ої а ВНубгіа во іттиподіорийй дотаїп м/йй ргорегієз ої роїй Ппеаму апа Пон спаіп мапаріе гедіопе" Ргоїеіп Епуо 10: 949-57 о (19973), "мінітіла" (Магіп ей аїЇ, "Те айіпійу-зеесіоп ої а тіпірорбру роїуреріїде іппірйог ої питап

Ф іпіепешкіп-6" ЕМВО 9) 13: 5303-9 (19943), "діатіла" |НоПдег сеї аїЇ., " Оіародіев7: звтаїй! бБімаіепі апа різресіїс апіроду їадтепів" РМАБ ОБА 90: 6444-6448 (1993)| або "янусини" ПгацпесКег еї аї., "Візреснс зіпдіе спаіп тоіесцієв (Чапивіпв) Фагдеї суїїохіс ММпрпосуїез оп НІМ іпіесіей сейв" ЕМВО 3 10: 3655-3659 дв (1991) Її Тгацпескег еї аїЇ., "Уапизіп: пем/ тоіесціаг девідп їог Брівресійс геадепів" Іпб У. Сапсег (Зиррі) 7: 51-52(1992)).

Ф) У відношенні імунотоксинів, антитіла можуть бути модифіковані до вияву активності імунотоксинів із ка застосуванням способів, добре відомих в цій області. Дивися, |наприклад, патент США Мо.5194594). Відносно отримання радіоактивних антитіл, такі модифіковані антитіла можуть бути також легко отримані із застосуванням во способів, добре відомих в цій області. Дивися, (наприклад, дипопапе еї аї., іп Сапсег СпетоїПегару апа

Віоїтегару, 655-686, 24 еайоп, Спаїпег апа Гоподо, еав., І Ірріпсой Камеп (1996)). Дивися також (патенти США

МоМо4681581, 4735210, 5101827, 5102990 (КЕЗ5500), 5648471 і 5697902). Кожний з імунотоксинів і радіоактивних молекул повинен бути відповідним для знищення клітин, експресуючих СТІ А-4, і особливо тих клітин, в яких антитіла даного винаходу є ефективними. 65 Відносно створення терапевтичних пептидів, терапевтичні пептиди, які направлені проти СТІ А-4, можуть бути створені шляхом використання інформації про структуру СТІ А-4 і антитіл до нього, такої як антитіла даного винаходу (як обговорюється нижче відносно малих молекул), або скринінгу пептидних бібліотек.

Конструювання і скринінг пептидних терапевтичних засобів обговорюється в зв'язку з роботою |Ноцойіеп еї аї.,

Віосїесппідцез 13: 412-421 (1992), Ноцдййеп РМАБ ОБА 82: 5131-5135 (1985), Ріпаїйіа еї аї, Віоїесппідцев 13: 901-905 (1992), Віаке апа Ійгі-Оаміз ВіоСопідабе Спет. 3: 510-513 (1992). Імунотоксини і радіоактивні молекули можуть бути також отримані схожим образом і з пептидними частинами, як обговорювалося вище відносно антитіл.

Важлива інформація відносно скріплення антитіла з антигеном може бути отримана в експериментах з фаговим дисплеєм. Такі експерименти звичайно виконуються шляхом перегляду бібліотеки фагів, експресуючих 70 випадкові пептиди, на скріплення їх з антитілами винаходу для визначення того, чи можуть бути виділені пептиди, які з ними зв'язуються. У разі успішного результату може бути отримана певна інформація про епітопи пептидів, які зв'язуються.

Загалом, бібліотеки фагів, експресуючі випадкові пептиди, можуть бути придбані від Мем Епдіапа Віоіарз (У-тег апа 12-тег Іргагіев, РА.О.-7 Реріїде 7-гаег Іібгагу КИ і РА.О.-12 Реріїде 12-тег Іібгагу Кі, 75 Відповідно) на основі системи М13 бактеріофага. 7-тег бібліотека являє собою множину з приблизно 2,0 х109 незалежних кланів, які представляють більшість, якщо не всі, з 20 7-1,28Х109 можливих 7-тег послідовностей. 12-тег бібліотека містить приблизно 1,9х10? незалежних клонів і представляє тільки дуже небагато зразків потенційного простору послідовностей 2012-4,1Х1015 12-тег послідовностей. Кожну з 7-тег і 12-тег бібліотек переглядають або проводять скринінг відповідно до рекомендацій виробника, при якому планшети покривали антитілом для скріплення з відповідним антитілом (наприклад, Ес Ід кози проти білків людини для антитіл Ід) з подальшим промиванням. Пов'язаний фаг елююють 0,2М гліцином-НСІ, рН2,2. Після 3 циклів селекції/ампліфікації при постійних умовах (0,595 Твін) за допомогою секвенування ДНК можна охарактеризувати клони з бібліотек, які взаємодіють з одним або більш антитілами. Реакційну здатність пептидів можна визначити з допомогою ЕЇГІЗ А. Для додаткового обговорення епітопного аналізу пептидів |дивися також 5соїй, У.К. апа с 22 тій, Зсієпсє, 249: 386-390 (1990); См/па еї а, РМАБЗ ОБА 87: 6378-6382 (1990); Реїїсі еї а. У. Мої. (3

Віої. 222: 301-310 (1991), і Кимабага еї а!., Майшге Віоїесппоіоду 15: 74-78 (1997)).

Реалізація генної і/або антисмислової терапії за допомогою традиційних способів також полегшується внаслідок даного винаходу. Такі засоби можуть бути використані для модуляції функцій СТІ А-4. У зв'язку з цим антитіла даного винаходу сприяють розробці і застосуванню пов'язаних з ними функціональних тестів. Розробка і ее, стратегія антисмислової терапії детально обговорюється |в міжнародній патентній заявці МоОУУО 94/29444). со

Розробка і стратегія генної терапії добре відомі. Однак, зокрема, застосування способів генної терапії з використанням антитіл повинно виявитися особливо вигідним. Дивися, (наприклад, Спеп еї аіЇ., Нитап Сепе Ме.

Тпегару 5: 595-601 (1994) і Магазсо Сепе ТПегару 4: 11-15 (1997)) Загальний задум і обговорення, що Ге) відноситься до генної терапії, обговорюються також |в міжнародній патентній заявці Мо.МУО 97/381371.

Генетичний матеріал, що кодує антитіло даного винаходу (такий як 4.1.1, 4.8.1 або 6.1.1 або інший), може бути в включений у відповідну експресійну систему (або вірусну, або ослаблену вірусну, невірусну, безоболонкову або іншу) і введений господареві для вироблення антитіл у господаря іп мімо.

Відповідно до даного винаходу можна також представити терапію із застосуванням малих молекул. На основі « даного винаходу можуть бути розроблені ліки для модуляції активності СТІ А-4. Знання, отримані при вивченні З структури молекули СТІ А-4 і її взаємодій з іншими молекулами відповідно до даного винаходу, такими як с антитіла винаходу, СО28, В7, В7-1, В7-2 і іншими, можуть бути використані для раціонального планування

Із» додаткових терапевтичних впливів. У цьому відношенні для концентрування зусиль на відкритті ліків може бути застосовані раціональні способи розробки ліків, такі як рентгеноструктурна кристалографія, молекулярне моделювання за допомогою (або при підтримці) комп'ютера (САММ), якісний або кількісний структурно-функціональний взаємозв'язок (ОЗАК) і схожі способи. Раціональна розробка дозволяє передбачити і білкові або синтетичні структури, які можуть взаємодіяти з молекулою або її специфічними формами, які можуть

Ге») бути використані для модифікації або модуляції активності СТІ А-4. Такі структури можуть бути синтезовані хімічно або експресовані в біологічних системах. Огляд цього підходу зроблений у Сарзеу еї аї!., Сепейса|Іу о Епдіпеегеа Нитап Тнегареціїс Огидз (ЗіосКіоп Ргезв, МУ (1988)). Дійсно, раціональне конструювання молекул со 20 (або пептидів, пептидоміметиків, малих молекул, або аналогічних), засноване на відомих або описаних структурно-функціональних взаємозв'язках з іншими молекулами (такими, як антитіла відповідно до даного щи винаходу), взагалі стає рутинним. Дивися, наприклад, Егу еї аї., "Зресіїіс, ігемегвіріеє іпасіїмайоп ої (пе ерідегта! дгоули Тасіог гесеріог апа егбВ2, Бу а пем/ сіазв ої (уговіпе Кіпазе іппірйог" Ргос Майї Асай зЗсі

ОБА 95: 12022-7 (1998); Нойтап еї аЇ.,, "А тоде!ї ої Сас25 рпозрпайазе сайамуіс дотаіїп апа Сак-іпіегасіоп 22 вупасе разейд оп (пе ргезепсе ої а гподапезе потоіоду дотаїп" У. Мої. Вісі. 282: 195-208 (1998); СіпаївКі еї

ГФ) а! "МодейЦпу ої асіме богте ої ргоївеіп Кіпазев: рЗ38 -- а савзе вішау», Ада Віоспіт. Рої. 44: 557-64 (1997); уЧоико еї аї., "Ідепійісайоп ої сек їуговіпе ріозрпогіацйоп овзійез апа а іуговіпе гевідце ітропапі о їТог Кіпаве дотаїп звігисіцге", Віоспет. 4. 322: 927-35 (1997); Біпуп еї аї., "Зігисійге-бразей дезідп ої а роїепі, зеїЇесіме, ап ігемегвібіе іппірйог ої їйе сайауєс дотаїп ої (Ше егрВ гесеріог зирепатіу ої 60 ргоїеіп їугозіпе Кіпазевз" ). Мед. Спет. 40: 1130-5 (1997); Мапавеї еї аІ., "АВОЕМ: а КпоумЛедде-разед ашотаїей арргоасі! їог апіїроду вігисійге тодеїйпуд" Маї. ВіобФесппоЇ. 14: 323-8 (1996); Мопгагаіїпі еї аї., "Кайопаї дезідп, апаїувів, апа роїепіа! шійу ої ОМ-С5БЕ апіадопівів" Ргос. Аввос. Ат. РпВПувзісіап5, 108: 420-31 (1996); Ригей еї аї., "МодеїІйпоу звіцау ої ргоїеіп Кіпазе іпрірйоге: Біпаіїпд тоде ої віайгозрогіпе апа огідіп ої пе зеїіесіїмну ої СОР 52411", 9. Сотриї. Аідед. Мої. Оев. 9: 465-72 (1995)). бо Далі, можуть бути створені і синтезовані комбінаторні бібліотекию, і вони можуть бути використані в програмах скринінгу, таких як досягнення скринінгу з високим виходом.

Терапевтичні склади і введення

Повинно бути зрозуміло, що введення терапевтичної основи відповідно до даного винаходу повинно бути проведене з відповідними носіями, наповнювачами і іншими агентами, які включають в склади для забезпечення поліпшеного перенесення, доставки, толерантності і тому подібне. Може бути знайдена множина відповідних складів в керівництві, відомому всім хімікам-фармацевтам: (Кетіпдіоп'є Рпагтасеціїса! Зсієпсев (157 єд, Маск

Рибіїзпіпда Сотрапу, Еавзіоп, РА (1975)), особливо в розділі 87, написаному Віаця, Зеутоиг|. Ці склади включають, наприклад, порошки, пасти, мазі, желе, віск, масла, ліпіди, що містять ліпіди (катіонні або 70 аніонні) везикули (такі як Ііроїесіїпй тм), кон'югати з ДНК, безводні абсорбуючі пасти, масляно-водні і водно-масляні емульсії, емульгований карбовакс (поліетиленгліколи різної молекулярної ваги), напівтверді гелі і напівтверді суміші, що містять карбовакс. Для лікування і терапії відповідно до даного винаходу може підходити будь-яка з перерахованих вище сумішей, що пропонується так, щоб активний інгредієнт в складі не інактивувався складом і склад був фізіологічно сумісним і підходив до способу введення. Дивися також |Роуеї 75 еї аї,, "Сотрепаїцт ої ехсіріепів їТог рагепієега! Тогптціайопв", РОА 3). РНапт. зЗсі. ТесппоїЇ. 52: 238-311 (1998)) і цитовані там посилання для додаткової інформації, що відноситься до наповнювачів і носіїв, добре відомих хімікам-фармацевтам.

Отримання антитіл

Антитіла відповідно до даного винаходу переважно отримують шляхом використання трансгенної миші, яка має істотну частку вбудованого геному, що продукує антитіла людини, але яка за рахунок цього дефіцитна відносно продукції ендогенних мишачих антитіл. Такі миші потім здатні продукувати молекули імуноглобулінів людини і антитіла, а також мають дефіцит продукції молекул імуноглобулінів і антитіла миші. Технології, що застосовуються для досягнення цієї мети, розкриті в патентах, заявках і посиланнях, розкритих тут у відомому рівні техніки. Особливо, однак, переважне здійснення отримання трансгенних мишей і продукції ними антитіл Ге розкрито |в патентній заявці США Мо.08/759620, зареєстрованої З грудня 1996р.), розкриття якої включене тут о як посилання. Дивися також |Мепае? еї аї., Майте Сепеїйісв 15: 146-156 (1997)), розкриття якої включене тут як посилання.

За допомогою застосування такої технології заявники отримали повністю людські моноклональні антитіла до множини антигенов. Істотно, що заявники імунізували лінії ХепоМоцвзе тм мишей цікавлячим антигеном, (Се) витягували у мишей, які експресують антитіла лімфатичні клітини (такі як В-клітини), гібридизували такі с витягнуті клітини з клітинною лінією мієлоїдного типу для отримання іморталізованих гібридомних клітинних ліній і проводили скринінг і відбір таких гібридомних клітинних ліній для ідентифікації гібридомних клітинних Ге) ліній, які продукують антитіла, специфічні відносно цікавлячого антигена. Заявники застосовували такі с технології відповідно до даного винаходу для отримання антитіл, специфічних у відношенні СТІ А-4.. Тут заявники описують отримання множини гібридомних клітинних ліній, які продукують антитіла, специфічні у - відношенні СТІ А-4. Крім того, заявники представляють характеристику антитіл, що продукуються такими клітинними лініями, включаючи аналізи нуклеотидної і амінокислотної послідовностей важкого і легкого ланцюгів таких антитіл. «

Антитіла, що продукуються гібридомними, клітинними лініями, що обговорюються тут, позначені як 3.1.1, 4.1.1, 4.8.1, 44.10.29, 4.13.1, 6.1.1, 11.21, 11.6.1, 11.7.1, 12.3.1.1 їі 12.9.1.1. Кожне з антитіл, що - с продукується вказаними вище клітинними лініями, містить повністю людські ІД52 або ІдС4 важкі ланцюги з а людськими легкими капа ланцюгами. Загалом, антитіла відповідно до даного винаходу володіють дуже високою я спорідненістю, володіючи звичайно Ка від приблизно 109 до приблизно 19-7М при вимірюванні або за допомогою твердої фази, або рідкої фази.

Як повинне бути зрозуміло, антитіла відповідно до даного винаходу можуть експресуватися в клітинних - лініях, відмінних від гібридомних клітинних ліній. Послідовності, що кодують кКДНК або геномні клони для

ФО конкретних антитіл, можуть бути використані для трансформації відповідних клітин господаря-ссавця або нессавця. Трансформація може бути проведена за допомогою будь-якого відомого способу введення ре) полінуклеотидів в клітину господаря, включаючи, наприклад, введення полінуклеотида у вірус (або у вірусний с 20 вектор) і проведення трансдукції клітини господаря вірусом (або вектором) або за допомогою процедур трансфекції, відомих в даній області, приклади чого приводяться |в патентах США МоМо4399216, 4912040, 4» 4740461 і 4959455) (дані патенти включені тут як посилання). Процедура трансформації, що застосовується залежить від господаря, що піддається трансформації. Способи введення гетерологічних полінуклеотидів в клітини ссавців добре відомі в даній області і включають, але не обмежуються цим, трансфекцію, що 5о опосередковується декстраном, осадження фосфатом кальцію, трансфекцію, що опосередковується о полібреном, злиття протопластів, електропорацію, бомбардування частками, інкапсулювання полінуклеотидак(ів) в лілосоми, кон'югування пептидів, використання дендримерів і безпосередню мікроін'єкцію ДНК в ядра. де Клітинні лінії ссавців, придатні як господарі для експресії, добре відомі в даній області і включають багато які іморталізовані клітинні лінії що поставляються Атегісап Туре Сийиге СоІесіоп (АТСС), 60 включаючи, але не обмежуючись цим, клітини яєчників китайського хом'яка (СНО), МО), клітини Нега, клітини нирок діток хом'яка (ВНК), клітини нирок мавпи (СО5), клітини гепатоцелюлярної карциноми людини (наприклад,

Нер 02) і велику кількість інших клітинних ліній. Для експресії рекомбінантних антитіл можуть також використовуватися клітини нессавців, включаючи, але не обмежуючись цим, бактерій, дріжджів, комах і рослин.

Сайт-спрямований мутагенез СР2 домену антитіла для усунення глікозилювання може бути переважним для б5 того, щоб запобігти змінам або в імуногенності, фармакокінетиці і/або ефекторних функціях, виникаючих внаслідок глікозилювання, не властивого людським антитілам. Експресійні способи вибирають шляхом визначення того, яка система дає найбільш високі рівні експресії і продукує антитіла з конститутивними зв'язуючими властивостями СТІ А-4.

Крім того, експресія антитіл даного винаходу (або інших їх частин) клітинними лініями, що їх продукують,

Може бути збільшена за допомогою застосування великого числа відомих способів. Наприклад, системи експресії генів глутамінсинтетази і ОНЕК є звичайними для збільшення експресії в певних умовах. Клітинні клони з високим рівнем експресії можуть бути ідентифіковані із застосуванням традиційних способів, таких як клонування з обмеженим розведенням і технологія Місгтодгор. Система ЮО5 обговорюється частково або повністю в зв'язку || європейськими патентами МоМео0217846, 0256055 і 0323997 і європейською патентною заявкою 7/0 Мо.89303964.4).

Антитіла даного винаходу можуть також продукуватися трансгенно за допомогою створення ссавця або рослини, яка є трансгенною відносно цікавлячих послідовностей важкого і легкого ланцюгів імуноглобуліну і продукує антитіло в формі, що витягується з нього. Відносно трансгенної продукції у ссавців, у них можуть продукуватися антитіла і виявлятися в молоці кіз, корів або інших ссавців. Дивися, |наприклад, патенти США 75. МоМо5827690, 5756687, 5750172 і 5741957).

Антитіла відповідно до даного винаходу проаналізовані структурно і функціонально. Відносно структури антитіл, амінокислотні послідовності важкого і легкого капа ланцюгів передбачені на основі послідовностей

ДНК, отриманих з допомогою ОТ-ПЛР гібридом. Дивися приклади З і 4 і Фіг.1-8. для підтвердження результатів, що обговорюються в прикладах З і 4, було також проведено секвенування М-кінців антитіл. Дивися приклад 5 і фігуру 9. Для визначення спорідненості проводили кінетичний аналіз антитіл. Дивися приклад 2. Антітіла відповідно до даного винаходу (і особливо 4.1.1, 4.8.1 і 6.1.1 антитіла винаходу) мають високу спорідненість (4.1.11,63х1079 1/М; 4.8.1:3,54Х1079 1/М; і 6.1.1:7,2х109 1/М). Крім того, антитіла аналізували за допомогою ізоелектричного фокусування (ЕР), електрофорезу (ДДСО-ПАГЕ) у відновлюючих умовах, ексклюзійної хроматографії, рідинної хроматографії/мас-спектроскопії і мас-спектроскопії і визначали продукцію антитіл су гібридомами. Дивися приклад 6 і Фіг.10. о

Відносно функціонального аналізу антитіл відповідно до даного винаходу, такі антитіла, що пропонуються є сильними інгібіторами СТІ А-4 і їх скріплення зі своїми лігандами - молекулами сімейства В7. Наприклад, антитіла відповідно до даного винаходу, як показано, блокують скріплення СТІ А-4 або з В7-1, або з В7-2.

Дивися приклад 7. Зрозуміло, багато які з антитіл відповідно до даного винаходу володіють наномолярною або (се) субнаномолярною ІС 5о відносно гальмування скріплення СТІ А-4 з В7-1 і В7-2. Крім того, антитіла даного винаходу володіють прекрасною вибірковістю у відношенні СТІ А-4 в порівнянні з СО28, СО44, В7-2 або ПІдСІ. о

Дивися приклад 8. Вибірковість являє собою відношення, яке відображає міру переважного скріплення молекули Ге) з першим агентом в порівнянні зі скріпленням молекули з другим і необов'язково іншими молекулами. Тут вибірковість означає міру переважного скріплення антитіла винаходу з СТІ А-4 в порівнянні зі скріпленням шо антитіла з іншими молекулами, такими як СО28, СО44, В7-2 або піді. Рівень вибірковості антитіл винаходу че звичайно вище, ніж 500:1. Антитіла даного винаходу, як також було показано, індукують або збільшують експресію певних цитокінів (таких як ІЛ-2 і ІЄМ-у) при культивуванні Т-клітин в моделі Т-лімфобластів. Дивися приклади 9 і 10 і Фіг.12-17. Більш того очікується, що антитіла винаходу будуть гальмувати зростання пухлин у « відповідних моделях пухлин іп міго. Створення таких моделей обговорюється в прикладі 11 і 12.

Результати, отримані відповідно до даного винаходу, вказують на те, що антитіла даного винаходу володіють - с певними достоїнствами, що може зробити дані антитіла більш ефективними, ніж терапевтичні антитіла, що є в а цей час проти СТІ А-4. "» Зокрема, антитіла винаходу 4.1.1, 4.8.1 і 6.1.1 володіють бажаними властивостями у високій мірі. їх структурні характеристики, функції або активність є критеріями, які сприяють створенню або відбору додаткових антитіл або інших молекул, як обговорювалося вище. Такі критерії включають один або більш з наступного: -і Здатність конкурувати за скріплення з СТІ А-4 з одним або більш антитіл винаходу; Специфічність скріплення

ФУ з СТІ А-4, схожа з одним або більше антитіл винаходу; Зв'язуюча спорідненість у відношенні СТІ А-4 приблизно 1079 М або більш і переважно 10779 М або більш; ре) Відсутність перехресної реакції з СТІ А-4 нижчих ссавців, включаючи переважно мишу, пацюка або кролика і о 20 переважно СТІ А-4 миші;

Наявність перехресної реакції з СТІ А-4 приматів, включаючи переважно СТІ А-4 довгохвостих макак і макак ши резус;

Вибірковість у відношенні СТІ А-4 в порівнянні з СО28, В7-2, СО44 або пІдсСІ, щонайменше, біля 1001 або більш і переважно приблизно 300, 400 або 500:1 або більше; ІСво при гальмуванні скріплення СТІ А-4 з В7-2 2о приблизно 100НМ або нижче і переважно 5, 4, 3,2, 1, 0,5 або 0,38нНМ або менше; о ІСьо при гальмуванні скріплення СТІ А-4 з В7-1 приблизно 100НМ або нижче і переважно 5, 4, 3, 2, 1, 0,5 або О0,Б5ОнНМ або менше; ю Збільшення продукції цитокінів в одному або більше тестів іп міїго, наприклад:

Збільшення продукції ІЛ-2 в тесті Т-лімфобластів/Каї)ї на приблизно 50Опг/мл або вище і переважно на 750, 60 1000, 1500, 2000, 3000 або 3846бпг/мл або більше;

Збільшення продукції ІЕМ-у в тесті Т-лімфобластів/Каї|ї на приблизно 500пг/мл або більше і переважно на 750, 1000 або 123Зпг/мл або більше; або

Збільшення продукції ІЛ-2 в тесті суперантигену в ПРВМС або суцільній крові на приблизно 5О0Опг/мл або бо більше і переважно на 750, 1000, 1200 або 1511пг/мл або більше. При іншому вираженні величин бажано, щоб продукція ІЛ-2 збільшувалася на приблизно 30, 35, 40,45, 50 процентів або більше по відношенню до контролю тесту.

Очікується, що антитіла (або молекули, сконструйовані або синтезовані на їх основі), що мають одну або більше з даних властивостей, повинні володіти ефективністю, схожою з антитілами, описаними в даному винаході.

Бажані функціональні властивості, що обговорюються вище часто можуть бути результатом скріплення молекули (тобто антитіла, фрагмента антитіла, пептиду або малої молекули) з СТІ А-4 і гальмуванням його активності схожим чином, що і антитіло даного винаходу (тобто скріплення з тим же або схожим епітопом молекули СТІ А-4). Молекулу можна вводити або прямо (тобто пряме введення хворому таких молекул). Або, в 7/0 протилежному варіанті, молекулу можна вводити "посередньо" (тобто пептид або подібна йому сполука, яка викликає імунну відповідь у хворого (схожий з вакциною), де імунна відповідь включає вироблення антитіл, які взаємодіють з тим же самим або схожим епітопом, або антитіло або фрагмент, які продукуються іп зі після введення генетичних матеріалів, які кодують такі антитіла або їх фрагменти, які взаємодіють з тим же самим або схожим епітопом). Таким чином, повинне бути зрозуміло, що епітоп СТІ А-4, з яким взаємодіють антитіла /5 винаходу, може бути корисний в зв'язку з отриманням і/або схемою терапії відповідно до даного винаходу. При створенні ліків часто корисна також негативна інформація (тобто корисний той факт, що антитіло, яке взаємодіє з СТІ А-4, ймовірно, не взаємодіє з епітопом, який діє як інгібітор СТІ А-4). Таким чином, епітоп, з яким взаємодіють антитіла винаходу, що не веде до бажаних функціональних властивостей, може бути також дуже корисний. Отже, відповідно до даного винаходу розглядаються також молекули (і особливо антитіла), які 2о взаємодіють з тими ж самими або схожими епітопами, що і антитіла винаходу.

У доповнення до того факту, що антитіла винаходу і епітопи, з якими вони взаємодіють, розглядаються відповідно до даного винаходу, заявники провели деяку попередню роботу з картирування епітопів певних антитіл відповідно до даного винаходу і особливо антитіл 4.1.1 і 11.2.1 винаходу.

Як перший етап заявники провели конкурентний аналіз ВіОсоге для створення чорнової карти скріплення сч об певними антитілами винаходу по їх здатності конкурувати за скріплення з СТІ А-4. З цією метою СТІ А-4 був пов'язаний з чіпом ВіІОсоге і перше антитіло взаємодіяло з ним в насичуючих умовах, і вимірювали конкуренцію і) подальших других антитіл за скріплення з СТІ А-4. Цей спосіб дає можливість створити чорнову карту, по якій можуть бути класифіковані сімейства антитіл.

За допомогою цього способу заявники виявили, що певні антитіла відповідно до даного винаходу можуть Ге зо бути поділені на категорії, попадаючи в одну з перерахованих нижче категорій: со

Ф вогм" конкуренції з категорією Ю Ге) во радити 1 с (бл Вільна перехресна конкуренція одного з другим; перехресна конкуренція з категорією В і категорією Ю ч 40 - с і » 014143. Перекрена конуренця з категорею СІ; деякий ступінь перехресної конкуренція зкаторююх

Е (481 |ВМІЗ блокує скріплення 4.9.1 з СТІ А-4, але не навпаки и -- ашшшшш (3 (7) отримані від Віовігіае.

Ге) (7) отримані від Рпагтіпдеп. о На наступному етапі заявники спробували визначити чи впізнають антитіла винаходу лінійний епітоп на

Ге) 20 СТІАК при поновлюючих і непоновлюючих умовах при імуноблотінгу. Заявники виявили, що жодне з антитіл винаходу 4.1.1, 3.1.1, 11.7.1, 11.6.1 або 11.21, мабуть, не впізнає відновлену форму СТІА4 при щи імуноблотінгу. Отже, схоже, що епітоп, з яким кожне з цих антитіл зв'язується, не є лінійним епітопом, а швидше є конформаційним епітопом зі структурою, яка руйнується при поновлюючих умовах.

Таким чином, заявники вирішили визначити, що можна дізнатися про залишки в молекулі СТІ А4, які важливі 29 для скріплення антитіл винаходу. Один з способів, використаних заявниками, полягав в проведенні кінетичних (ФІ визначень зворотних швидкостей при порівнянні СТІ А4 людини з двома висококонсервативними молекулами

СТІ А4 приматів (СТІ А4 довгохвостих макак і мавп). Дослідження з допомогою ВіАсоге показало, що антитіло ді 4.1.1 винаходу зв'язується з СТІ А4 людини, довгохвостих мавп і мавп з однаковою швидкістю. Однак, відносно зворотних швидкостей (спорідненість) антитіло 4.1.1 володіло найбільшою спорідненістю (найбільш повільною 60 зворотною швидкістю) відносно СТІ А4 людини, більш високою зворотною швидкістю відносно СТІАй4 довгохвостої мавпи і найбільш високою зворотною швидкістю відносно СТІ А4 мавпи. Антитіло 11.2.1 винаходу, з іншого боку, зв'язується з СТІ А4 людини, довгохвостих мавп і мавп з приблизно однаковою швидкістю і володіє приблизно однаковою відносною зворотною швидкістю для кожного з трьох СТІ А4. Ця інформація додатково вказує на те, що антитіла винаходу 4.1.1 і 11.2.1 зв'язуються з різними епітопами СТІ А4. бо Для подальшого вивчення епітопа, з яким зв'язуються антитіла винаходу категорії В і С, заявники провели певне дослідження по сайт-направленому мутагенезу. У СТІ А4 мавпи міститься дві важливих заміни в залишках 105 і 106 по відношенню СТІ А4 людини. Такими відмінностями є заміна лейцину на метіонін в положенні 105 і гліцину на серин в положенні 106. Відповідно, заявники створювали мутацію кДНК, що кодує СТІ А4 людини, що кодує мутантний СТІ А4, із заміною /105М і 51065. Гомологічна заміна в мутантному СТІ А4 не впливала на скріплення гібридного білка В7.2-І9ОІ. Крім того, скріплення з антитілом винаходу 11.2.1 не змінювалося.

Однак здатність такої молекули зв'язуватися з антитілом винаходу 4.1.1 (схоже з мавпами) значно гальмувалася.

Далі, заявники викликали мутацію кКДНК, що кодує СТІ А4 мавпи, для створення мутантного СТІ А4 мавпи, що містить заміну 51060. Така заміна приводила до відновлення стабільного скріплення антитіла 4.1.1 і мутантного 7/0 СтІ.А4 мавпи. Крім того, заявники викликали мутацію кКДНК, що кодує СТІ А4 мавпи, для створення мутантного

СТІ А4 мавпи, що містить заміну М1О5І. Така заміна частково відновлювала скріплення антитіла 4.1.1 з мутантним СТІ А4.

Кожна з категорій від В до О антитіл винаходу, мабуть, володіє схожими функціональними властивостями і, очевидно, має можливість діяти як сильний терапевтичний агент, направлений проти СТІ А4. Більш того кожна з /5 молекул характеризується певною перехресною конкуренцією при скріпленні з СТІ А4. Однак, як повинне бути ясно з представленого вище обговорення, кожна з молекул різних категорій, очевидно, взаємодіє з окремими конформаційними епітопами СТІ А4.

З викладеного вище повинне бути зрозуміло, що інформація про епітопи, що обговорюється вище, вказує на те, що антитіла (або інші молекули, як обговорювалося вище), які перехресно конкурують з антитілами винаходу, повинні, ймовірно, мати певний терапевтичний потенціал відповідно до даного винаходу. Більш того очікується, що антитіла (або інші молекули, як обговорювалося вище), які перехресно конкурують з антитілами винаходу (тобто перехресно конкурують з категорією В, С і/або О антитіл), повинні, ймовірно, мати певний додатковий терапевтичний потенціал відповідно до даного винаходу. Крім того, очікується, що антитіла (або інші молекули, як обговорювалося вище), які перехресно конкурують з антитілами винаходу (тобто перехресно конкурують з с ов категорією В, С і/або О антитіл) і які () не характеризуються зниженим скріпленням з СТІ А4 мавп (подібно антитілу 11.2.1) або (ії) характеризуються зниженим скріпленням з СТІ А4 мавп (подібно антитілу 4.1.1), і) повинні, ймовірно, мати певний додатковий терапевтичний потенціал відповідно до даного винаходу. Антитіла (або інші молекули, як обговорювалося вище), які конкурують з категоріями А і Е можуть також мати певний терапевтичний потенціал. «о зо ПРИКЛАДИ

Наступні приклади, включаючи проведені експерименти і досягнуті результати, пропонуються лише для цілей і, ілюстрації і їх не треба тлумачити як такі, що обмежують даній винахід. Ге!

Приклад 1

Створення гібридом, що продукують антитіла проти СТІ А-4 ісе)

Антитіла винаходу отримували, відбирали і аналізували відповідно до даного прикладу. ї-

Отримання антигена: Для імунізації мишей ХепоМоцвзе тм отримували три різних імуногени: (і) гібридний білок СТІ А-4-ІдО, (її) пептид СТІ А-4 і (ії) лімфомні клітини 300.19 миші, трансфіковані мутантним СТІ А-4 (У201М), який конститутивно експресувався на клітинній поверхні. (і) гібридний білок СТІ А-4-ІдО:

Конструювання експресійного вектора: «

КДНК, що кодує зрілий позаклітинний домен СТІ А-4, ампліфіуцвали за допомогою ПЛР з бібліотеки КДНК /п-) с тимусу (Сіопіесі) із застосуванням праймерів, розроблених відповідно до опублікованої послідовності (Еишг. У. й Іттипої. 18: 1901-1905 (1988)). Фрагмент направлено субклонували в рек, експресійну плазміду вірусу Зіпабів «» (ІпмМігодеп), з локалізацією між сигнальним пептидом онкостатину М людини і доменами СНІ/СНо/СНьз до датта 1 (901) людини. Гібридний білок не містить шарнірного домену, але містить цистеїн-120 у позаклітинному домені СТІ А-4 для утворення ковалентного дим еру. Отриманий вектор був названий СТІ А-4-Іде1/рзк»5. -і Цілісність. КДНК СТІ А-4-ІД1 у векторі була підтверджена секвенуванням обох ланцюгів. Амінокислотна послідовність білка СТІ А4-Ід показана нижче. Зрілий позаклітинний домен для СО44 ампліфікували за

Фо допомогою ПЛР з бібліотеки лімфоцитів людини (Сіопіесп) і субклонували в рЗіпКерб5 для отримання

Те) контрольного білка з ідентичною ІдсіІ-кінцевою частиною. с 50 ОМ-СТІ А4-ІДОІ гібридний білок: пики евр ан век виткі нені. а Я и тк кн о в в нав дя й кі сни В все вия пе ява ау ЗД оту вве в сш: Модні ЕМ я и али НБН пелрвед і Вр: іде віраж верес ЕХ килетах тиражі: «ЛЕК: ДЕЦКЗНХА ЕЕ ЛЮЕУ нгоннивтя. нн: Мр ни ЕВ жу ЗД внозянтсяку непрекисвсЕтЕ: носі ТДВНЕ ек вседжнконя с 5 вс иПКу; з

Же нс; п нік Кв прос кт ай зору екол оп кид восвХси у весну пат ююс ху ррсюно и взути о рн вия. оті вра Се тов кон с тесть не коря еПпас сю с как а о квт я пор вве нн нав я Р ле Ек нсю Зеров пн о Сет с о кор ви дк со с нт кою сю с вІН ПЕ Кл в о ет Я В в щи ЗК Ко Ек ол юку а КН в тане Паро в м ков п з пес су рота о ві св кор в о ав й

Не

Підкреслено: сигнальний пептид Жирний шрифт: позаклітинний домен СТІ А4 кДНК зрілого позаклітинного домену СО28 ампліфікували за допомогою ПЛР з бібліотеки лімфоцитів людини (Сіопіесі) і потім субклонували в рСОМВ8 |У. Іттипої. 151: 5261-71 (1993)) для отримання гібридного білка ІдС1, що містить область розщеплення тромбіном і шарнірну область. СТІ А4 мавпи, довгохвостої макаки і макаки-резус клонували, виходячи з мРНК, виділеної з РНА, стимульованих РВМСз із застосуванням стандартних способів ПЛР з виродженими праймерами. Секвенування показало, що амінокислотна послідовність у макаки-резус і довгохвостої макаки ідентична зрілому позаклітинному домену СТІ А4 людини з трьома замінами (51З3М, І17Т і І105М), У мавпи виявлено десять амінокислотних замін в порівнянні зі зрілим позаклітинним доменом СТІ А4 людини (М21А, МУЗЗІ, 70 А41тТ, АБ10, 541, 571, О75К, Т88М, І105М і 51065). Для картирування амінокислот, важливих для взаємодії антитіл з СТІ А4-ІдДО людини застосовували сайт-направлений мутагенез для створення крапкових мутацій всіх амінокислот, відмінних у СТІ А4 мавпи. Мутації СТІ А-ДО людини і мавпи для епітопного картирування проводили шляхом встановлення відповідності сайт-направленого мутагенезу (Рготеда). Гібридні білки дос отримували імпульсною трансфекцією клітин Совз7 і очищали за допомогою стандартних способів із /5 застосуванням протешу А. Мутантні білки СТІ А4-ІдДО оцінювали по скріпленню з антитілами за допомогою імуноблотінгу і із застосуванням аналізів ВіАсоге.

Експресія/очищення рекомбинантного білка

Рекомбінантний вірус синдбіс отримували електропорацією (сірсо) клітин нирок новонароджених хом'яків з

ЗРб транскрибуванням іп міо мРНК СТІ А-4-ІдДе1/рак5 і хелперної МРНК ОН265 як описано в інструкції Іп Мігодеп. Через сорок вісім годин вірус збирали і титрували на оптимальну експресію білка в клітинах яєчників китайського хом'яка (СНО-К!Т). Клітини СНО-КІ культивували в суспензії в середовищі ОМЕМ/Е12 (модифікованого за Дульбекко середовища Ігла), утримуючому 1095 термо-інактивованої телячої плідної сироватки (бірсо), замінимі амінокислоти (бірсо), 4мм глутамін (бірсо), пеніцилін/стрептоміцин (бірсо), 10мММ

Нерез рН ,5 (Сірсо). Для отримання СТІ А-4-ІдД01 клітини СНО-К1 ресуспендували в концентрації 1 х107клітин/мл сч в середовищі ОМЕМ/Е12 і інкубували з вірусом синдбіс протягом однієї години при кімнатній температурі.

Клітини потім розводили до 1 хХ 10б/мл середовищем ЮОМЕМ/Е12, що містить 1906 телячої плідної сироватки, о виснажену відносно дО корови за допомогою протеїн А сефарози (РПагтасіа), замінимі амінокислоти, 4ММ глутамін, 12,5мММ Нерез рН7,5 і пеніцилін/стрептоміцин. Через сорок вісім годин після ін'єкції клітини осаджували, збирали кондиціоноване середовище, додавали таблетки повного протеазного інгібітору (Воегіпдег «ОО

Маппвеїт), доводили рН до 7,5 і фільтрували через фільтр 0,2мкм (МаЇдепе). Для афінного очищення гібридного білка використали ЕРІС (рідинну хроматографію швидкого розрізнення) (РПагтасіа) з швидкістю струму о 1б0мл/міна. Колонку промивали 30 об'ємами ЗФР і елюювали 0,1М гліцин/НсСІ рН2,8 з швидкістю Тмл/хв. Фракції с) (мл) негайно нейтралізували до рН7,5 за допомогою Ттгіз, рНеО. Фракції, що містять СТІ А-4-ІдС1 ідентифікували з допомогою ДДСОС-ПАГЕ і потім концентрували із застосуванням Сепігіріиз 50 (Атісоп) перед нанесенням на шо колонку сефарози 200 (РПагтасіа) з швидкістю імл/хв. з використанням як розчинника ЗФР. Утримуючі їч-

СТІ А-4-Ід1 фракції об'єднували, стерилізували фільтруванням через фільтр 0,2мкм (МійПіроге), ділили на аліквоти і заморожували при -802С. СО44-Ід01 експресували і очищали із застосуванням тих же способів.

СО28-90 очищали з кондиціонованого середовища від клітин Сов57, підданих імпульсної трансфекції. «

Характеристика СТІ А-4-ІЗДО1:

Очищений СТІ А-4-ІдД01 рухався у вигляді єдиної смуги при електрофорезі в ДДО-Ма-ПАГ при використанні - с для фарбування колоїдного кумасі (Момех). У невідновлюючих умовах СТІ А-4-ІдД1 знаходився в формі димеру и (100кДа), який відновлювався до мономера 5ОкДа після обробки 50мММ ОТ (дитіотреїтолу). Амінокислотне ,» секвенування очищеного СТІ А-4-Ід01 в розчині підтвердило наявність М-кінця СТІ А-4 (МНМАОРАММІ АБ), а також відщеплення сигнального пептиду онкостатину М від зрілого гібридного білка. СТІ А-4-ІДО1 зв'язувався з імобілізованим В7.11-ІдДО в залежності від концентрації і скріплення блокувалося антитілом хом'яка проти -і СТІ А-4 людини (ВМІЗ: Рпагміпдеп). Стерильний СТІ А-4-ІдД1 не містив ендотоксину і його кількісно визначали за

ФУ ОП280 із застосуванням коефіцієнта екстинкції 1,4. Вихід очищеного СТІ А-4-ІД01 варіював між приблизно 0,5 і

Змкг/л клітин СНО-КІ1. (Се) (ї) Пептид СТІ А-4: сю 50 Наступний пептид СТІ А-4 отримували як описано нижче:

Зв п та ее ях Ес с; о ко Скорочення/матеріали:

ММР, М-метилпіролідон; ТЕЕ, 2,2,2-трифторетанол; ОСМ, дихлорметан; ЕМОС, флуоренілметоксикарбоніл. бо Всі реактиви були поставлені Регкіп ЕІтег за наступними виключеннями: ТЕЕ, АЇагісн СпНетісаЇ, смола

ЕМОС-РАЇ -РЕбБ, Регзеріїме Віозузіетв. Для амінокислот, для яких були потрібні захисні групи бічних ланцюгів, застосовували Етос-Агу(РМО)-ОН, ЕМОС-Авп(Тт0О-ОН, ЕМОС-Авр(ІВи)-ОН, ЕМОС-Сув(ТтО-ОН,

ЕМОС-СІЩІВиц)-ОН, ЕМОС-СІпТО-ОН, ЕМОС-НІів(Вос)-ОН, ЕМОС-Гув(ВОС)-ОН, ЕМОС-ЗепіВи)-ОН,

ЕМОС-ТРигІВци)-ОН і ЕМОС-ТупІВи)-ОН. Синтез пептиду: 65 Пептидний синтез проводили в апараті Регкіп-ЕІтег 431А, забезпеченому системою зворотного моніторингу через поглинання в УФ при ЗО1НМ (детектор Регкіп-ЕІтег Моаде! 759А). Пептидну послідовність збирали на смолі

ЕМОС-РАЇ -РЕС із застосуванням кондиційних циклів з подвійним приєднанням. Примусові подвійні приєднання проводили в циклах 10, 11, 18, 19, 20 і з 28 по 33. Смолу промивали 5096 сумішшю ОСМ і ТЕРЕ по завершенні кожного циклу ацилирования з подальшим копіюванням аміногруп, що не прорегаували, оцтовим ангідридом в

ММР. Смолу видаляли з реактора після завершення циклу 49, а залишок залишали до завершення реакції.

Відділення пептиду від смоли проводили за допомогою реактиву К ЦКіпо еї аї.. ІпФЇегпайопа! дошгпаї! ої Ргоїевіп апа Рерііде Кезеагсп 36:255-266 (1990)| протягом 6 годин із застосуванням 415мг смоли, що дало 18бмг сирого пептиду СТІ А-4.

Характеристика пептиду: 70 25Мг Аліквоти сирого пептиду СТІ А-4 розчиняли в 5мл 6М гуанідин-НСІЛООмММ КоРО» при рнб.4 і елюювали з колонки Рпагтасіа Ні І ога Зирегаех 75 16/60 (1бммхбООмм, об'єм шару 120мл) 2М гуанідин-НСІЛО0мММ КоРО»з при рНб,4 з швидкістю 2мл/хв. протягом 180 хвилин при об'ємі фракцій, що збираються 5мл. Фракції аналізували нанесенням 1,7мкл фракцій на Ми-ПАГ для електрофорезу за І аетеїі, що проводиться із застосуванням буфера

МЕЗ5, з візуалізацією забарвленням сріблом згідно з описом ОЮаїспії. Фракції з молекулярною вагою 12кДа, 75 оціненою за стандартами молекулярної ваги, об'єднували і зберігали при 49С. Об'єднані фракції аналізували з допомогою УФ і електрофорезу в гелі. Амінокислотне секвенування проводили за допомогою абсорбції 100 мікролітрового зразка патроном РгозЗого (абсорбція мембраною РМОРГ) з промивкою для видалення солей буфера. Секвенування проводили на апараті Арріїй Віозузвіетвз 420. Виявлена очікувана М-кінцева послідовність (МНМАОРАМ/ А). З допомогою імуноблотінгу показано, що пептид впізнається ВМІЗ проти СТІ А-4 людини (Рпагміпдеп). Для видалення солі аліквоту, що містить 648мкг матеріалу, вміщували в діалізну трубку з500Оа ММУУСО і діалізували проти 0,195 ТФУ/НЬО при 492С протягом 9 днів при перемішуванні. Весь зміст діалізного мішечка ліофілізували до отримання порошку. (ії) Клітини 300.19, трансфіковані СТІ а-4 (201)

Повнорозмірну кКДНК СТІ А-4 ампліфікували за допомогою ПЛР з бібліотеки КДНК тимусу людини (Зігаїадепеї СУ і субклонували в рІКкКЕ5Зпео (Сіопіесп). Мутацію СТІ А-4, що приводить до конститутивної експресії на клітинній о поверхні, вводили з допомогою МаїспМаКег Миадепезіз Зувіет (Рготеда). Мутація, що викликає заміну тирозину У201 на валін, гальмує скріплення адаптинового білка АРБО, відповідального за швидку інтерналізацію

СТІ А-4 |Спцапод еї аї., 9. Іттипої. 159: 144-151 (1997)). Вільні від мікоплазми лімфомні клітини 300.19 миші культивували в середовищі КРМІ-1640, що містить 1095 плідної сироватки телят, замінимі амінокислоти, (Се) пеніцилін/стрептоміцин, 2мММ глутаміну, 12,5мММ Нерез рН7,5 і 25мМкМ бета-меркаптоетанолу. Клітини с електропорували (З3х105/0,4)мл безсироваткового середовища КРМІ) в ї-мл камері з 20мкг

СТІ А-4-У201М/рІРЕ:Е Зпео при 200 в/118Омкф (Сібсо СеїІРогайюг). Клітини залишали на 10 хвилин і потімдодавали (Ф)

Вмл заздалегідь нагрітого середовища ЕРМІ. Через 48 годин клітини розводили до концентрації 0,5х10б/мл. в со повному середовищі КРМІ, що містить їТмг/мл 05418 (Сібсо). За допомогою антитіла ВМІЗ, кон'югованого з

Зо фікоеритрином (Ріагміпдеп) було показано, що розмножені резистентні клітини експресують СТІ А-4 на клітинній - поверхні. Із застосуванням стерильного сортування були виділені клітини з високим рівнем експресії.

Імунізація і отримання гібридом: мишей ХепоМоизе (у віці від 8 до 10 тижнів) імунізували (ї) підшкірно в основу хвоста 1х10/ клітинами 300.19, які були трансфіковані як описано вище для експресії СТІ А-4, « ресуспендованими в забуференому фосфатом сольовому розчині (ЗФР) з повним ад'ювантом Фрейнда або (ії) З 50 підшкірно в основу хвоста (а) 1Омкг гібридного білка СТІ А-4 або (р) 10мкг білка СТІ А-4, емульгованого з с повним ад'ювантом Фрейнда. У кожному випадку введення дози повторювали три або чотири рази з неповним

Із» ад'ювантом Фрейнда. За чотири дні до проведення злиття мишам вводили останню ін'єкцію імуногену або клітин в ЗФР. Лімфоцити селезінки і/або лімфатичних вузлів імунізованих мишей зливали з лінією клітин РЗ несекретуючої мієломи мишей і піддавали селекції НАТ як описано раніше |Саїте, С. апа Міївівеїп, С, "Ргерагайоп ої топосіопа! апііродіев: зігаїедіев апа ргоседигез." Меїйодвз ЄЕплутої., 73: 3-46 (1981)). Був і виявлений широкий набір гібридом, всі з яких секретували специфічні у відношенні СТІ А-4 антитіла людини

Ге») ІДО2К або Ідс4К (як визначено нижче).

ЕПЗА аналіз: Твердофазний імуноферментний аналіз (ЕІ ІЗА аналіз) для визначення антитіл, специфічних у о відношенні антигенна, в сироватці мишей і супернатантах гібридом проводили як описано |Соїїдап еї аї!., Опії со 20 241, "Епгуте-Ійпкей іттипозогрепі аззаув" іп Сипепі ргоїосоЇїв іп іттипоіоду (19943| із застосуванням гібридного білка СТІ А-4-Ід для захоплення антитіл. У випадку тварин, імунізованих гібридним білком СТІ А-4-Ід щи заявники проводили додатковий скринінг на предмет неспецифічної реакції проти людської Ід частини гібридного білка. Це робили із застосуванням планшет для ЕГІЗА, покритих (901 людини, як негативний контроль на специфічність. 29 У переважному ЕГ ІЗА аналізі застосовували наступні методи:

ГФ) Планшети для ЕГІЗА покривають 100 ІдсСі/лунка антигену в буфері для покриття планшета (0,1М вуглекислий юю буфер, рН 9,6 ії Мансо» (м.в. 84) 8,4г/л). Потім планшети інкубують при 49С протягом ночі. Після інкубації буфер для покриття видаляють, планшет блокують 200 мкл/лунка блокуючого буферу (0,595 БСА, 0,190 твін-20, 0,0195 Тпітегоза! в їхЗФР) і інкубують при кімнатній температурі протягом 1 години. В іншому варіанті бо планшети зберігають в холодильнику з блокуючим буфером в герметичній упаковці планшета. Блокуючий буфер видаляють і додають 5Омкл/лунка супернатанту гібридоми, сироватки або іншого супернатанту гібридоми (позитивний контроль) і середовища НАТ або блокуючого буфера (негативний контроль). Планшети інкубують при кімнатній температурі протягом 2 годин. Після інкубації планшет промивають буфером для промивки в5 (1ХЗФР). Виявляюче антитіло (тобто, антитіло миші проти людського Ід(2-НАР (58, Мо9070-05) для антитіл 902 або антитіло миші проти людського Іде4-НКР (ЗВ, Мо9200-05) для антитіл 954) додають в кількості

10Омкл/лунка (антитіло миші проти людського ІД052-НКР 1:2000 або антитіло миші проти людського Ід4-НАР 1:1000 (кожне з яких розведено блокуючим буфером)). Планшети інкубують при кімнатній температурі протягом 1 години і потім промивають буфером для промивки. Після цього в лунку додають по 10Омкл/лунка свіжоприготованого виявляючого розчину (1Омл буфера для субстрату, мг ОРО (о-фенілендіамін, Зідта Саї

Мо.Р-7288) і 1Омкл 3095 НО» (Зідта)). Планшети залишають на 10-20 хвилин для розвитку забарвлення до моменту, коли в лунці негативного контролю ледве починає з'являтися забарвлення. Після цього додають 10Омкл/лунка зупиняючого розчину (2М Н»ЗО),) і прочитують показники за допомогою планшетного рідера для

ЕСІЗА при довжині хвилі 49ОНМ. 70 Визначення констант спорідненості суцільних Маре людини за допомогою ВіАсоге: Вимірювання спорідненості очищених моноклональних антитіл людини, Бар фрагментів або супернатантів гібридом за допомогою плазмонного резонансу, що проводиться із застосуванням апарату ВіАсоге 2000, слідуючи загальним процедурам, окресленим виробником.

Кінетичний аналіз антитіл проводили із застосуванням антигенів, імобілізованих на сенсорній поверхні при низькій щільності. Гібридний білок СТІ А-4-Ід імобілізували на трьох поверхнях сенсорних чіпів ВіАсоге при щільності, що варіює від приблизно 390 до 900, із застосуванням гібридного білка СТІ А-4-Ід в концентрації 20 або 5Омкг/мл в 10мММ ацетаті натрію при рН5,0 із застосуванням аміно-з'єднуючого набору, що поставляється виробником (ВіАсоге, Іпс.). На четвертій поверхні сенсорного чіпу ВіАсоге був імобілізований ІдС1 (900 КІ) і її застосовували в якості поверхні негативного контролю для неспецифічного скріплення. Кінетичний аналіз 2о проводили при швидкості струму 25 або 50 мікролітрів на хвилину, а швидкості дисоціації (Ка або Коня) і асоціації (Ка або Ку) визначали із застосуванням програми, що надається виробником (ВІА еуаїЇчайоп 3.0), яка забезпечує виконання загальнозастосовних розрахунків.

Приклад 2

Вимірювання спорідненості антитіл проти СТІ А-4 сч

У наступній таблиці представлені результати вимірювання спорідненості для деяких антитіл, вибраних цим способом і) 000000 тверда фазасавідюю.у//1111111111111111 со »

Ка (М'секх106) (секх10-7) (1/М)-Ка/ках 010 ІКО(М)-Ка/Ках10-10 щільність (КО) со мовної Ф

Ф зв тю 117з6000111000ю010 возив м « 181 2 с з ж 0117000600001100я860010о40 зв ни и т т ПУ Я ПО о ПО -

Ф в ну ни них ЗИ и т ЕХ І НН

Ф сг т о з 1702 69 213 я в0000вв000100пю01вмв 111 13,00 0,09 11,70 397,8 б5

9 Як буде розглянуто, антитіла, отримані відповідно до винаходу, володіють високою спорідненістю і константами скріплення.

Приклад З

Структура антитіл проти СТІ А-4. отриманих відповідно до винаходу 70 У наступному обговоренні пропонуються відомості про структуру антитіл, отриманих відповідно до винаходу.

Для аналізу структури антитіл, отриманих відповідно до винаходу, заявники клонували гени, що кодують фрагменти важкого і легкого ланцюга поза конкретної гібридоми. Клонування і секвенування генів проводили таким чином:

Полі(А)" мРНК виділяли з приблизно 2 х10? гібридомних клітин, отриманих від імунізованих мишей 7/5 ХепоМоизге із застосуванням набору Раві-Тгаск (Іпийгодеп). Отримання кДНК за допомогою випадкових затравок здійснювали за допомогою ПЛР. Специфічні у відношенні варіабельної області сімейств Мн людини або М, людини праймери |Магкз еї аї., "ОіІідописіеоїіде ргітеге ог роЇутегазе спаіїп геасіоп атрійісайоп ої питап іттиподіорийп о магіаріе депез апа девідп ої Татійу-зресіїс оїЇїдописіеойде ргобев." Еицг. 9). Іттипої. 21: 985-991 (1991)) або універсальний праймер Мн людини, МО-30 (САоОТОСАОСТОвАССАСТСІСС), го застосовували в поєднанні з праймерами, специфічними для константної області С у2 людини (Мо-40а; 5-ВСТОАОООАСТАСАСТССТОАООА-3), або константної області Ск (пКР2; як описано раніше |у Огееп еї аї., 19941). Послідовності транскриптів похідних Марз людини важкої і легкої капа ланцюгів гібридом отримували прямим секвенуванням продуктів ПЛР, отриманих з полі(А 7) РНК із застосуванням описаних вище праймерів.

Продукти ПЛР клонували також в рес! із застосуванням набору для клонування ТА (Іпмігодеп), і обидва с ланцюги секвенували із застосуванням наборів для секвенування Ргілт ауе-(егтіпайг і апарату для о секвенування АВІЗ77. Всі послідовності "аналізували шляхом порівняння з "М ВАБЕ зедицепсе даігесіогу" (Тотііпзоп еї аі., МКС Сепіге Тог Ргоївіп Епдіпеегіпд, Сатьгідде, ОК) із застосуванням комп'ютерних програм

МасмМесіог і Сепемогкзв.

Далі, кожне з антитіл 4.1.1, 4.8.1, 11.2.1 ії 6.1.1 піддавали повнорозмірному секвенуванню ДНК. Для (се) кожного секвенування виділяли полі(А)" мРНК з приблизно 4 Х 10 гібридомних клітин із застосуванням набору со тАМА Оігесі Кї (ОСупаЇ). мРНК піддавали зворотній транскрипції із застосуванням оліго-4Т(18) і набору

Адуапіаде КТУРСК Кії (Сіопедгесі). Для створення праймерів ампліфікації, починаючи зі стартового сайту АТО (о) гена ОРБО важкого ланцюга (5-ТАТСТААССТТСТАСАСТООАССОССАССАТОСАСТТТОООСТОАОСТО-3)) і с кінчаючи стоп-КкодономМ константної області Ід62 (5-ПСТСТОАТСАСААТТССТАТСАТТТАСССОСАСАСАСОСАСАССТ-3), використали банк даних для - варіабельної області (М Вазе). До 5-кінця стартового сайту АТО приєднували оптимальну послідовність Когак (АССОССАСС). Той же спосіб застосовували для створення праймера для стартового сайту АТО гена А27 капа ланцюга (5-ТСТТІСААОСТТОСССОООССсСОССАССАТОСАААССССАССОСАС-3) і стоп-кодону константної « області капа (5-ТПСТТТОАТСАСААТТСТСАСТААСАСТСТССССТОТТОА-3). кДНК о 012 клонували (із застосуванням праймера до стартовому сайту АТО т с (Е--СТТСААССТТОСССОООСССОССАССАТОСАСАТОАОООСТСССОСТ-3) і описаного вище праймеру до ч стоп-кодону константної області капа. КДНК важкого ланцюга клонували також у вигляді геномних конструкцій за » допомогою сайт-направленого мутагенезу для введення сайту Ме! в кінці варіабельного домену ./ і субклонування утримуючих фрагмент Мне! геномних областей ІдсС2 СНІ/Ніпде/СН 5/СНаз. Крапкова мутація для створення сайту Мпеі не порушує амінокислотної послідовності початкової лінії. Для ампліфікації кдНнКкК - застосовували пари праймерів з використанням набору Аймуапіаде Нідп ГРіаейшу РСК Кії (Сіопейесн). б Послідовність продукту ПЛР визначали прямим секвенуванням за допомогою наборів Юуе-іепгтіпаюг зедцепсіпа

Кіїз і апарату для секвенування АВІ. Продукт ПЛР клонували в експресійні вектори глутамінсинтази рЕЕ ссавців іс), (І оплга), і три клони секвенували для підтвердження соматичних мутацій. Для кожного клону послідовність бала о 50 перевірена для обох ланцюгів в, щонайменше, трьох реакціях. Неглікозильоване антитіло 4.1.1 було отримане сайт-направленим мутагенезом М2940) в домені СН». Рекомбінантні антитіла отримували скороминущою

І) трансфекцією клітин Со57 в позбавленій ІДС БС5 і очищали за допомогою стандартних способів із застосуванням протеїн А-сефарози. Стабільні трансфектанти отримували електропорацією мишачих клітин МО і селекцією в позбавленому глутаміну середовищі. Рекомбінантне антитіло 4.1.1 з глікозилюванням або без нього 22 виявляло однакові специфічність і спорідненість до СТІ А4 в тестах ЕГІ5А і ВіІАсоге іп міїго.

Ге! Аналіз використання гена

У наступній таблиці представлені дані по використанню гена, отримані для окремих клонів гібридоми ко відповідно до винаходу: во клон мії в Гн ж | ко б5 414.3 |ОР-БО 7-27 НА) А? Укз о

Як буде розглянуто нижче, антитіла відповідно до даного винаходу отримують з сильним зміщенням у бік 7/5 Використання варіабельної області важкого ланцюга ОР-50. Ген ОР-50 позначають також як ген сімейства М н 3-33. Лише у випадку одного антитіла, яке було відібране на основі скріплення СТІ А-4 і попередніх функціональних тестів іп міго, було показане використання гена важкого ланцюга, відмінного від ОР-50. У цьому клоні, 2.1.3, використовується варіабельна область важкого ланцюга ЮОР-65, і він відноситься до ізотипу

Ід094. Ген ОР-65 позначають також як ген сімейства М н 4-31. З іншого боку, клон 4.9.1, який містить варіабельну область важкого ланцюга ОР-47, зв'язується з СТІ А-4, але не гальмує скріплення з В7-1 або В7-2. У мишей ХепоМоизе є не більше за 30 різних функціональних варіабельних генів важкого ланцюга, за участю яких утворяться антитіла. Таким чином, зміщення служить показником переважного мотиву скріплення при взаємодії антитіло-антиген відносно об'єднаних властивостей скріплення з антигеном і функціональній активності.

Мутаційний аналіз с

Як буде розглянуто нижче, аналіз використання генів дає лише обмежене уявлення про структуру антитіл.

Оскільки В-клітини тварин ХепоМоизе стохастично проводять транскрипти важкого М-Ю0-У або легкого М-) капа о ланцюгів, є ряд повторних процесів, включаючи, але, не обмежуючись цим, соматичну гіпермутацію, п-добавки і розширення СОКЗ. |Дивися, наприклад, Мепаде? еї а). Майте Сепеїйїсв 15:146-156 (1997) і заявку на патент США

Мо08/759620, зареєстровану З грудня 1996р.)|. Відповідно, для подальшої оцінки структури антитіл отримували Ге)

Зо амінокислотні послідовності антитіл, що передбачаються на основі кДНК, отриманих з клонів. Крім того, шляхом секвенування білка отримували М-кінцеві амінокислотні послідовності. Ше

На Фіг.1 представлені нуклеотидні і передбачені амінокислотні послідовності важкого і легкого капа Ге»! ланцюгів клонів 4.1.1 (Фіг1А), 4.8.1 (Фіг.18), 4.14.3 (Фіг.1С), 6.1.1 (Фіг.10), 3.1.1 (Фіг), 4102 (Фіг), 2.1.3 (Фіг.1б), 4.13.1 (Фіг1Н), 11.2.1 (Фіг.1), 11.6.1 (Фіг.19), 11.7.1 (Фіг1К), 12.3.1.1 ікс, зв (Фіг!) ії 12.9.1.1 (Фіг!М). На Фіг1А, 18 і 10 розширені послідовності антитіл 4.1.1, 4.8.1 ії 6.1.1 були кю. отримані клонуванням повнорозмірних кКДНК, як описано вище. На цих фігурах сигнальні пептидні послідовності позначені жирним шрифтом, а послідовності, ті, що використовуються для 5'ПЛР-реакції підкреслені.

На Фіг.2 представлене порівняння послідовностей передбаченої амінокислотної послідовності важкого ланцюга клонів 4.1.1, 4.8.1, 4.14.3, 6.1.1, 3.1.1, 4.10.2, 4.13.1, 11.2.1, 11.6.1, 11.7.1, 12.35.11 і « 12.9.1.1 ії амінокислотною послідовністю батьківської лінії ОР-БО (3-33). Відмінності між послідовністю пев) с батьківської лінії ОР-50 і тією ж послідовністю в клонах позначені жирним шрифтом. На Фіг. також вказані й положення послідовностей СОКІ, СОК2 і СОКЗ антитіл у вигляді затінення. и? На Фіг.3 представлене порівняння послідовностей між передбаченими амінокислотними послідовностями важкого ланцюга клону 2.1.3 Її амінокислотною послідовністю батьківської лінії ОР-65 (4-31). Відмінності між послідовністю батьківської лінії ОР-65 і тією ж послідовністю в клоні позначені жирним шрифтом. На Фіг.також -І вказані положення послідовностей СОК1, СОК2 і СОКЗ антитіла у вигляді підкреслення.

На Фіг.4 представлене порівняння послідовностей між передбаченими амінокислотними послідовностями

Ме. легкого капа ланцюга клонів 4.1.1, 4.8.1, 4.14.3, 6.1.1, 4.10.2 їі 4.13,1 і амінокислотною послідовністю

Ге) батьківської лінії А27. Відмінності між послідовністю батьківської лінії А27 і тією ж послідовністю в клоні 5р позначені жирним шрифтом. На Фіг. також вказані положення послідовностей СОКІ, СОК2 і СОКЗ антитіла у о вигляді підкреслення. Уявні делеції в СОКІв клонів 4.8.1, 4.14.3 і 6.1.1 позначені як "Ов".

Ф На Фіг.5 представлене порівняння послідовностей між передбаченими амінокислотними послідовностями легкого капа ланцюга клонів 3.1.1, 11.2.1, 11.6.1 ії 11.7.1 ії амінокислотною послідовністю батьківської лінії 012. Відмінності між послідовністю батьківської лінії 012 і тією ж послідовністю в клоні позначені жирним шрифтом. На Фіг. також вказані положення послідовностей СОК1, СОК2 і СОКЗ антитіла у вигляді підкреслення.

На Фіг.б6 представлене порівняння послідовностей між передбаченими амінокислотними послідовностями

Ф) легкого капа ланцюга клону 2.1.3 і амінокислотною послідовністю батьківської лінії АТ0/А26. Відмінності між ко послідовністю батьківської лінії АТ0/А26 і тією ж послідовністю в клоні позначені жирним шрифтом. На Фіг. також вказані положення послідовностей СОК1, СОК2 і СОКЗ антитіла у вигляді підкреслення. во На Фіг.7 представлене порівняння послідовностей між передбаченими амінокислотними послідовностями легкого капа ланцюга клону 12.3.1 і амінокислотною послідовністю батьківської лінії А17. Відмінності між послідовністю батьківської лінії А17 і тією ж послідовністю в клоні позначені жирним шрифтом. На Фіг. також вказані положення послідовностей СОК1, СОК2 і СОКЗ антитіла у вигляді підкреслення.

На Фіг.8 представлене порівняння послідовностей між передбаченими амінокислотними послідовностями б5 легкого капа ланцюга клону 12.9.1 і амінокислотною послідовністю батьківської лінії АЗ/А 19. Відмінності між послідовністю батьківської лінії АЗ/А 19 і тією ж послідовністю в клоні позначені жирним шрифтом. На Фіг.

також вказані положення послідовностей СОК1, СОК2 і СОКЗ антитіла у вигляді підкреслення.

На Фіг.22 представлені серії додаткових нуклеотидних і амінокислотних послідовностей наступних ланцюгів антитіл проти СТІ А-4: 4.1.1: повнорозмірний важкий ланцюг 4.1.1 (КДНК 22 (а), геномна ДНК 22(Б) і амінокислотна послідовність 22(3)); повнорозмірний деглікозильований важкий ланцюг 4.1.1 (КДНК 22(4) і амінокислотна послідовність 22(е)); легкий ланцюг 4.1.1 (КДНК 227) і амінокислотна послідовність 22(9)); 4.8.1: 70 повнорозмірний важкий ланцюг 4.8.1 (КДНК 22(Н) і амінокислотна послідовність 22Ї)); легкий ланцюг 4.8.1 (КДНК 22 (|) і амінокислотна послідовність 22(к)); 6.1.1: повнорозмірний важкий ланцюг 6.1.1 (КДНК 221) і амінокислотна послідовність 22(т)); легкий ланцюг 6.1.1 (КДНК 22(п) і амінокислотна послідовність 22(0)); 11.21: повнорозмірний важкий ланцюг 11.2.1 (КДНК 22 (р) і амінокислотна послідовність 22(4)); і легкий ланцюг 11.2.1 (КДНК 22(г) і амінокислотна послідовність 22(5)).

Послідовності сигнальних пептидів позначені жирним і великим шрифтом. Відкриті рамки прочитання повнорозмірної послідовності геномної ДНК 4.1.1 (Фіг.22(5)) відмічені підкресленням. І, нарешті, мутації, го введені для отримання аглікозильованого важкого ланцюга 4.1.1, ії результуюча заміна (М2940)) відмічені подвійним підкресленням і жирним шрифтом (кДНК (Фіг.22(Б) і амінокислотна послідовність (Фіг.22(с)).

Приклад 4

Аналіз замін амінокислот важкого і легкого ланцюгів

На Фіг.2, де представлене порівняння послідовностей передбаченої амінокислотної послідовності важкого сч сов панцюга клонів 4.1.1, 4.8.1, 414.3, 6.1.1, 3.11, 410.2, 413.1, 11.21, 11.6.1, 11.71, 12311 і 12.9.1.1 ії амінокислотною послідовністю батьківської лінії ОР-50 (3-33), розкривається цікава особливість. У і) доповнення до факту зміщення в більшості клонів у бік важкого ланцюга ОР-50, є відносно обмежена гіпермутація антитіл в порівнянні з батьківським геном ЮР-50. Наприклад, в клонах 3.1.1 і 11.2.1 немає мутацій. Більш того мутації в інших клонах звичайно являють собою консервативні зміни, що включають заміни Ге зо амінокислот батьківської лінії на амінокислоти зі схожими властивостями. Особливо консервативні за своєю природою мутації в багатьох послідовностях СОКІ і СОК2. Три важкі ланцюги, представлені на Фіг.2, 4.10.2, о 4.13.1 ї 4.14.3, явно беруть початок від одиночної події рекомбінації (тобто, походять від ідентичного Ге! початкового центра) і майже ідентичні по послідовності. Якщо ці три послідовності розглядати як одну, то серед 10 різних антитіл, що містять важкий ланцюг ОР-50, в СОКІ і СОКО є З положення, в яких неполярний ісе) з5 ЗАЛИШОК замінений на інший неполярний залишок, 12 положень, в яких полярний незаряджений залишок ча замінений на інший полярний незаряджений залишок, і 1 положення, в якому полярний заряджений залишок замінений на інший полярний заряджений залишок. Більш того є два положення, в яких два залишки, структурно дуже схожих, гліцин і аланін, замінені один одним. Єдині не суворо консервативні мутації включають З заміни полярного зарядженого залишку на полярний незаряджений залишок і одну заміну неполярного залишку на « полярний залишок. в с Легкі ланцюги цих антитіл беруть початок від 5 різних генів МК. Ген А27 найбільш представлений і дає початок б різним легким ланцюгам. Порівняння цих б послідовностей дозволяє виявити дві примітних з особливості. По-перше, в трьох з них, 4.8.1, 4.14.3 і 6.1.1, є делеції одного або двох залишків в СОКІ, що є рідкою подією. По-друге, виникає підозра відносно серину батьківської лінії в положенні шість в СОКЗ в тому плані, що серин був замінений в кожній послідовності. Це дозволяє передбачати, що серин в даному положенні -І не сумісний зі скріпленням СТІ А4.

Потрібно усвідомлювати, що багато які із згаданих вище амінокислотних замін знаходяться в безпосередній ме) близькості до СОК або всередині СОМК. Схоже, що такі заміни могли б впливати певний чином на скріплення

Ге) антитіла з молекулою СТІ А-4. Більш того такі заміни могли б впливати істотний чином на спорідненість антитіл.

Приклад 5 і Аналіз М-кінцевої амінокислотної послідовності антитіл відповідно до винаходу Для подальшої перевірки

Ф складу і структури вказаних вище антитіл відповідно до винаходу, заявники секвенували деякі з антитіл із застосуванням секвенатору РегКіп-ЕІтег. Важкий і легкий капа ланцюги антитіл виділяли і очищали за допомогою методів препаративного електрофорезу в гелі і електроблотінгу, після чого піддавали прямому боб секвенуванню як описано в прикладі 6. Основна частина послідовностей важких ланцюгів була блокована по аміно-кінцю. Тому антитіла спочатку обробляли піроглутаматамінопептидазою і потім секвенували.

Ф) Результати цих експериментів показані на Фіг.9. На Фіг.9 також представлена молекулярна вага важкого і ка легкого ланцюгів, визначена мас-спектроскопією (МА! 01).

Приклад 6 во Додаткова характеристика антитіл відповідно до винаходу

На Фіг.10 представлена певна додаткова інформація за характеристикою деяких антитіл відповідно до винаходу. На Фіг. підсумовані дані у відношенні клонів 3.1.1, 4.1.1, 4.8.1, 4.10.2, 4.14,35 її 6.1.1.

Представлені наступні дані: концентрація, результати ізоелектрофокусування (ЕР), ДДСОС-Ма-ПАГЕ, розмірно-ексклюзійної хроматографії, ЕАС5, мас-спектроскопії (МА! 01) і М-кінцеві послідовності легких ланцюгів. 65 Загалом дані були отримані таким чином:

Матеріали і методи

Концентрацію білка визначали при 280нМ УФ-сканером (200-35ОНМ), коли 1,58 одиниць поглинання при 280нМ прирівнювали до мг/мл.

ДДО-Ма-ПАГЕ проводили із застосуванням електрофоретичної системи Момех МИРАСЕ з використанням 1090

Телю МиРАСЕ і буфера розділення МЕ5. Зразки готували розведенням 3:1 буфером для зразка 4 хХМиРАСЕ (ч/-) бета-меркаптоетанол, нагрівали і наносили "5мкг зразку на гель. Гель фарбували забарвлюючим розчином діамантового синього К (бЗідта са В8-6529), а визначення молекулярного розміру проводили шляхом порівняння забарвлених смуг з "Репесі Ргоївіп МагКегв" (Момадеп саїМоб9149-3).

Для М-кінцевого секвенування зразки піддавали електрофорезу в гелях МИРАСЕ як описано вище, 7/0 переносили на Рго Віої імобілізуючу мембрану (Арріїеї Віозувіетв) і забарвлювали кумасі синім К-250.

Забарвлені білкові смуги вирізали і піддавали секвенуючому аналізу за допомогою автоматизованої деградації за Едтап із застосуванням апарату Арріїей Віозузіетвзвз 494 Ргесізе НТ Зедпепсег".

Ізоелектричне фокусування (ЕР) проводили з допомогою ІЕЕ 3-9 рНаві деїв (саїж 17-0543-01). Зразки розводили в 1095 гліцерині до х0,8мг/мл і їмкл наносили на гель і потім забарвлювали сріблом. Визначення рі 7/5 проводили шляхом порівняння забарвлених смуг зі стандартами широкого діапазону (рНЗ-10) (Рпапгтасіа са? 17-0471-01).

Розмірно-ексклюзійну хроматографію (ЗЕС) проводили в забуференому фосфатом фізіологічному розчині (ЗФР) в системі Ріпагтасіа ЗМАКТ із застосуванням колонки Зирегаех 75 РО 3.2/30. Визначення розміру молекул проводили шляхом порівняння часу затримки на піку із часом затримки гелю.

Для досліджень РГАС5 отримували Т-клітини периферичної крові людини і стимулювали протягом 48 годин.

Т-клітини одноразово промивали, ресуспендували в буфері БАСЗ при концентрації 1х1Обклітин/1О0Омкл і забарвлювали на поверхневу експресію СОЗ 10мкл анти-СОЗ-РІТС (Іттипоїесй, Магзеїйе, Ргапсе) протягом 30 хвилин при кімнатній температурі. Клітини двічі промивали, потім фіксували, спричиняли порушення проникності мембрани (Рїх апа Регт, Саї(ад) і забарвлювали на внутрішньоклітинну експресію СТІ А-4 за допомогою апі-СО су 152-РЕ (Рпагтіпдеп). Проточну цитометрію проводили за допомогою Весіоп Оіскіпвоп РАСзбогі. Квадранти о встановлювали за допомогою аналізу контрольних антитіл відповідного ізотипа (Саї(а89).

Як обговорювалося вище, було показано, що антитіла проти СТІ А-4 володіють певною значною імуномодуляторною активністю. Наступні експерименти проводили для з'ясування питання про те, чи володіють антитіла відповідно до даного винаходу такою активністю. Загалом експерименти були направлені на з'ясування (се) здатності антитіл гальмувати взаємодію між молекулами СТІ А-4 і В7, вибірковості між молекулами СТІ А-4, В7 і сО28 і здібності спричиняти утворення Т-клітинами цитокінів, включаючи, але, не обмежуючись цим, експресію о

ІЛ-2 і/або ІЄМ-у. Крім того, було зроблене вивчення перехресної взаємодії антитіл винаходу з деякими тканинами Ге) людини і молекулами СТІ А-4 інших видів (наприклад, миші і приматів). с

Приклад 7

Конкурентний ЕГІ5А: гальмування взаємодії СТІ А-4/87-1 або В7-2 антитілами відповідно до даного винаходу -

Аналіз іп міго проводили для з'ясування питання про те, чи здатні антитіла даного винаходу гальмувати скріплення СТІ А-4 з В7-1 або В7-2. Як буде розглянуто нижче, можна було б чекати, що антитіла винаходу, здатні гальмувати скріплення СТІ А-4 з молекулами В7, є кандидатами на імунну регуляцію через шлях СТІ А-4. «

При аналізі застосовували наступні матеріали і методи:

Матеріали і методи - с 9б-лункові планшети МахібЗогр (Мипс, ЮОептагк, 8439454) покривали ЗНМ В7.1-ІД(О1) або В7.2-Ід(1) и (Керіїдеп, Іпс. Меедпат, МА) в ЗФР за Дульбекко і інкубували при 42С протягом ночі. На 2 день В7-Ід видаляли, » і планшети блокували 1956 БСА плюс 0,0595 Твін-20 в Д-ЗФР протягом двох годин. Планшети промивали тричі буфером для промивки (0,0595 твін-20 в Д-ЗФР). Антитіло у відповідній для тестування концентрації і

СТІ А-4-Ід(54) (кінцева конц. 0,ЗнНМ) (Керіїдеп, Іпс. Меедпат, МА) заздалегідь змішували протягом 15 хвилин, - потім додавали в покритий В7-Ід планшет (сумарний об'єм бОмкл) і інкубували при кімн. темп, протягом 1,5 о годин. Планшети промивали тричі, додавали 5Омкл від 1 до 1000-кратно розведеного антитіла миші проти ІдДС4 людини, міченої НЕР, (7уїаед, Зап Егапсізсо, СА, 2505-3820) і інкубували при кімн. темп, протягом 1 години. се) Планшети промивали тричі, додавали 5Омкл субстрату пероксидази ТМВ Місго уеї! (Кігбедаага є Регту, сю 50 Сайнегериго, МО, 550-76-04) і інкубували при кімн. темп, протягом 20 хвилин, після чого в планшет додавали 5Омкл їн НьБЗО). Планшети прочитували при 450нМ з допомогою планшетного рідера Моїесціаг ЮОемісез 4; (Зиппумаіе, СА). Всі зразки аналізували в двох паралелях. Максимальний сигнал визначали по скріпленню

СТІ А-4-Ід у відсутність антитіла, що тестується. Неспецифічне скріплення визначали по поглинанню у відсутність СТІ А-4-|Ід і антитіла, що тестується.

Результати аналізу представлені в таблицях ША і ПІВ. У таблиці ША показані результати для множини о антитіл відповідно до винаходу. У таблиці ПІВ показані результати порівняння антитіла 4.1.1 винаходу з антитілом 11.2.1 винаходу в окремому експерименті. іме) зо бо стаАл102 Ідс2 1,50-0,37(п-3) 3,39-0,31(п-2)

ю

Приклад 8

Співвідношення вибірковості антитіл винаходу у відношенні СТІ А-4 в порівнянні з СО28 або В7-2

Інший аналіз іп міго проводили для визначення вибірковості антитіл винаходу у відношенні СТІ А-4 в 7/5 Порівнянні з СО28 або В7-2. У зв'язку з експериментами застосовували наступні матеріали і методи:

ЕПЗА вибірковості СТІ А-4: матеріали і методи 96-лунковий планшет РішоМОМе (МОМ Саї Мо.475515) покривали чотирма антигенами: СТІ А-4/Лдя, СО44Ла, сОр28лЛа і В7.2/Лд (антигени, отримані власними силами). Покриття планшета антигенами проводили протягом ночі при ї49С при концентрації мкг/мл, 1ООмкл/лунка в 0,1 М натрий-бікарбонатному буфері, рНе,6. Планшет потім промивали ЗФРТ (ЗФРО,1905 твін-20) тричі із застосуванням промивного пристрою для планшет МОМ.

Планшет блокували ЗФРТ-О,595 БСА в кількості 15О0мкл, лунка. Планшет інкубували при кімн. темп, протягом 1 години і потім промивали тричі ЗФРТ. Потім антитіла проти СТІ А-4 по винаходу розводили в один прийом до концентрації їмкг/мл і додавали в планшет. Планшет інкубували при кімн. темп, протягом 1 години і потім промивали тричі ЗФРТ. Лунки, що містили антитіла винаходу, обробляли потім 10О0мкл/лунка анти-ІдЯС2-НКР Га людини (Зоційегп Віоїесп Саї Мо.9070-05) при розведенні в один прийом 1:4000. Один ряд обробляли також антитілом проти дО людини (Часквоп Саї Мо.209-035-088) для нормування покриття планшет. Це антитіло і) розводили відразу 1:5000 і додавали в кількості 100мкл/лунка. Один ряд обробляли також антитілом з НКР проти

СТІ А-4 людини (РПапгтіпдеп Саї Мо.345815, Сивіот НКР сопішдаїе(й) як позитивний контроль. Антитіло застосовували в концентрації О,05мкг/мл після розведення в один прийом. Планшет інкубували при кімн. темп, Ге) протягом 1 години і потім промивали тричі ЗФРТ. Додавали хемілюмінесцентний субстрат І ВА (Ріегсе) в кількості 10Омкл/лунка і планшет інкубували на струшуванні протягом 5 хв. Потім знімали показники з планшета із о застосуванням люменометру при 2-хв. експозиції. Ге»)

Аналіз вибірковості скріплення СТІ А-4-Ід за допомогою ІСЕМ: матеріали і методи М-450 Бупабреадз (Рупаї

А.З, Ов8іо, Мопмау Мо140.02) тричі промивали Ма-фосфатним буфером, рН7,4, і ресуспендували в іш Ма-фосфатному буфері. До 100мкл кульок додавали 1,0мкг СТІ А-4-Ід(І), 1,0мкг СО28-ІД4(ОІ) або від 1,0 до

З,Омкг В7.2-І9(І) (Керіїдеп, Іпс. Меедпат. МА) і інкубували протягом ночі на ротаторі при 42С. На 2-й день кульки промивали тричі 195 БСА плюс 0,0590о твін-20 в ЗФР за Дульбекко і блокували протягом 30 хвилин. Кульки розводили 1-10-кратно блокуючим буфером і в поліпропіленові пробірки 12х75мм вносили по 25мкл покритих « кульок. Всі зразки тестували в двох паралелях. У пробірки додавали 5Омкл тестуючого антитіла (кінцева концентрація Тмкг/мл) або блокуючого буфера і інкубували протягом ЗО хвилин на карусельному Огідеп 1.5 - с Апаїулег (СЕМ Іпіегпайопаї!ї, Іпс., Саййегериго, МО) при кімн. темп, при перемішуванні з швидкістю и 100боб./хв. У пробірки додавали 25мкл оброблених рутенієм антитіл миші проти ІдсС1, Ід52 або ІдДб4 людини є» (7утед, Іпс. Зап Егапсізсо, СА Мо05-3300, 05-3500 і 05-3800) (кінцева концентрація Змкг/мл в сумарному об'ємі 10Омкл). Пробірки інкубували протягом 30 хвилин при кімн. темп, на карусельному перемішувачі зі швидкістю 100об./хв. Додавали 200мкл буферу для аналізу Огідеп (СЕМ Іпіегпайопаї, Іпс., зайпегериго, МО 5402-050-03) -і на пробірку, недовго перемішували, після чого пробірки використали для підрахунку в Огідеп Апаїугег і для бу кожної пробірки визначали значення ЕСІ. (електрохемілюмінесценції). Для поправок на відмінності в скріпленні гібридних білків з Оупареадз визначали фактори нормалізації, і перед розрахунками відносин вибірковості се) проводили корекцію значення ЕСІ на неспецифічне скріплення. Результати аналізів представлені в таблицях сю 50 МА мВ с 19511 (п-1) 41.1 | дс2 »500:1 (п-3) »500:1 (п-2) »Б500:1 (п-3) »500:1 (п-1) БОС (п-1) о ПОП ПМ ПО ан Пон Не НЕ анН з 180:1 (п-1) 60 2ААА (пет) 33:1 (п-1)

Ав (п-1) 329:1 (п-1) 4143 1962 | »5ОО1 (п-2) »500:1 (п-2) »500:1 (п-2) »413:1 (п-1) »23А:1 (п-1) 65 80:1 (п-1) 10:1 (п-1) 126:1 (п-1)

52:1 (п-1)

Приклад 9

Модель сигналізації Т-клітин людини

Для додаткового визначення активності антитіл відповідно до винаходу як імунних регулювальників заявники розробили ряд тестів для Т-клітин з метою кількісної оцінки підвищення утворення ІЛ-2 Т-клітинами після блокади сигналу СТІ А-4 антитілами. У зв'язку з експериментами застосовували наступні матеріали і методи:

Матеріали і методи

Свіжовиділені Т-клітини людини отримували з використанням Нівіорадце (бідта, 51. І оців, МО МоА-70543) і

Т-Кмік (Гутрпо-КмиікК, Опе Іатраа, Сапода Рагк, СА, Мої! К-50-Т) і стимулювали РНА (мкг/мл) (Ригійей

РПпуюпетадаішіпіп, Мигех Оіадповіїсв а. Оаппога, Епдіапа, ЯНА 16) в середовищі (КРМІ 1640, що містить

Ї-глутамін, замінимі амінокислоти МЕМ (мінімального підтримуючого середовища), пеніцилін, стрептоміцин, 25ММ Нерез і 1095 ЕВ5 (телячої плідної сироватки)) при концентрації 1 х1Обклітин/мл і інкубували при 372С протягом 2 днів. Клітини промивали і розводили в середовищі до концентрації 2 х1Обклітин/мл. Клітини Каїї (лімфома Беркітта людини, АТСС Мо. СС 86 Сіазз ІІ Атегісап Туре Сийиге СоПесіоп КоскКміе, МО) обробляли мітоміцином С (Зідта, 2Ї. Гоців, МО Мо М-4287) (25мкг/мл) протягом однієї години при 379. Клітини Каї дв промивали 4-кратно в ЗФР і ресуспендували при концентрації 2х1Обклітин/мл. Т-лімфобласти людини см (Бх10"/мл), клітини Каїї (5х105/мл) і антитіл проти СТІ А-4 або відповідні за ізотипом контрольні антитіла при о різних концентраціях додавали в 96-лункові мікропланшети, і планшети інкубували при 372С протягом 72 годин.

Сумарний об'єм на лунку становив 20Омкл. Через сімдесят дві години після стимуляції планшети центрифугували, супернатант відділяли і заморожували для подальшого визначення ІЛ-2 (Опцапіікіпе ІРМ-9 (Се) ЕЗА Кії, КО Зузіетв, Міппеароїїз, ММ, 202050) і ТЕМ-у (Оцапійкіпе ІРМ-9 ЕГІЗА Кі, КО Зувіетв). Підвищення со цитокінів визначали по різниці між рівнем цитокінів в культурах, що містять блокуюче тАбБ проти СТІ А-4 і контрольне антитіло відповідного ізотипа. Для експериментів з проточною цитометрією клітини Ка) промивали «3 однократно буфером РАС5З (ЗФР, що містить 2906 термоінактивовану телячу плідну сироватку і 0,02595 азид со натрію). Клітини ресуспендували в буфері ГАСУ в концентрації їх109 клітин/ЛООмкл і інкубували з 1Омкл анти-СБ8О-РЕ (Весіоп Оіскіпзоп, Зап дозе, СА) або анти-СВ86-РЕ (Рпагтіпдеп, Зап Оіедо, СА) протягом 30 в. хвилин при кімнатній температурі. Клітини промивали двічі і ресуспендували в їмл буфери РГАС5. Проточну цитометрію проводили за допомогою Весіоп Оіскіпвоп РАСбогі. Маркери гістограми встановлювали аналізом контрольних антитіл відповідного ізотипа (Саї(ад, Вигіпдате, СА). «

Загалом, заявники розробили спосіб аналізу, який може бути застосований для швидкого визначення позитивної регуляції ІЛ-2 в Т-клітинах. Як це буде ясне, стимуляція Т-клітин є В7- і СО28-залежною. Крім т с того, промиті Т-лімфобласти не проводять ІЛ-2 у вимірюваних кількостях, а клітини Каїї не проводять ІЛ-2 у ч вимірюваних кількостях навіть після стимуляції І/РЗ або РМУМ. Однак в поєднанні, Т-лімфобласти, що и? . о, . у ш . 2, культивуються спільно і клітини Каїі можуть моделювати сигнальні події з В7, СТІ А-4 і СО28, і дію на них антитіл може бути визначено.

На Фіг.11 представлена експресія В7-1 і В7-2 на клітинах Каїї із застосуванням тАбБв проти СО-80-РЕ і - СО86-РЕ із застосуванням проточної цитометрії (ГАСз) як описано в прикладі 6.

ФО На Фіг.12 представлене залежне від концентрації збільшення продукції ІЛ-2 в тесті Т-лімфобластів/клітина

Каїї, індуковане блокуючими антитілами проти СТІ А-4 (ВМІЗ, (Рпагміпдеп) і антитілами винаходу 4.1.1, 4.8.1 і ре) 6.1.1). с 20 На Фіг.13 представлене залежне від концентрації збільшення продукції ІЕМ-у в тесті Т-лімфобластів/клітина

Каїї, індуковане блокуючими антитілами проти СТІ А-4 (ВМІЗ, (Рпагміпдеп) і антитілами винаходу 4.1.1, 4.8.1 і м, 6.1.1) (той же донор Т-клітин).

На Фіг.14 представлене середнє збільшення продукції ІЛ-2 Т-клітинами від 6 донорів, індуковане блокуючими антитілами проти СТІ А-4, в тесті Т-лімфобластів/клітина Каїї. Цікаво зазначити, що тАБб СТ4.9.1 зв'язується з 22 СТІ А4, але не блокує скріплення В 7. Таким чином, просте скріплення з СТІ А-4 саме по собі є недостатнім для

Ф! отримання функціонального антитіла винаходу.

На Фіг.15 представлене середнє збільшення продукції ІМЕ- у Т-клітинами від б донорів, індуковане о блокуючими антитілами проти СТІ А-4, в тесті Т-лімфобластів/клітина Каїї,

На Фіг.19 представлене порівняння антитіл винаходу 4.1.1 і 11.2.1 при концентрації ЗОмкг/мл в 60 72-годинному тесті Т-лімфобластів/клітина Ра, як описано тут в прикладі 9, і в тесті суперантигену, як описано в прикладі 10.

На Фіг.20 представлене залежне від концентрації підвищення утворення ІЛ-2 в тесті Т-лімфобластів/клітина

Каї), індукованих антитілами винаходу 4.1.1 і 11.2.1 СТІ А4.

У наступній таблиці Мс представлена інформація, що стосується середнього збільшення і діапазону бо збільшення відповіді цитокіну в тестах Рай і ЗЕА винаходу. Кожний з включених в результати експериментів засновується на дозі антитіла ЗОмкг/мл і вимірюванні через 72 години. Показані кількість використаних в експериментах донорів і відповідей. й о 75 Приклад 10

Сигнальна модель Т-клітин людини

Заявники розробили другий клітинний тест для кількісного визначення підвищення освіти ІЛ-2 Т-клітинами внаслідок блокади сигналу СТІ А-4 антитілами. У зв'язку з експериментами застосовували наступні матеріали і методи:

Матеріали і методи

РВМС людини отримували з допомогою Ассизріп. Планшети для мікротитрування заздалегідь покривали антитілом проти СОЗ (Іец4, Весіоп Оіскіпзоп) (бОонг/мл) і інкубували протягом 2 годин при 372С. У лунки додавали

НРВМС в кількості 200000 клітин на лунку. У лунки додавали ентеротоксин А іарпуіососсивз (ЗЕА) (Зідта) в концентрації 10Онг/мл. У лунки додавали антитіла, звичайно в концентрації ЗОмкг/мл. Потім клітини стимулювали с ов протягом 48, 72 або 96 годин. Планшети центрифугували в бажаний час, і з лунок видаляли супернатант. Після цього супернатанти перевіряли на утворення ІЛ-2 за допомогою ЕГІЗА (КО Зувіетв). і)

Результати цих експериментів показані на фігурах 16, 17 і 21. На Фіг.16 індукцію утворення ІЛ-2 в ПИРВМС від 5 донорів вимірювали через 72 години після стимуляції. На Фіг.17 показані результати вимірювання на суцільній крові з аналізом різниці в індукції утворення ІЛ-2 в крові від З донорів, виміряного через 72 і 96 «я

Зо Годин після стимуляції.

На Фіг.21 показане підвищення утворення ІЛ-2 в суцільній крові від 2 донорів, виміряного через 72 години і, після стимуляції. б

Приклад 11

Модель пухлини тварини ікс,

Заявники створили модель пухлини тварини для іп мімо аналізу гальмування пухлинного зростання під дією М антитіл проти СТІ А-4 миші. У цій моделі вирощують мишачу фібросаркомну пухлину, і тварин обробляють антитілами проти СТІ А-4 миші. Матеріали і методи для створення моделі пропонуються нижче:

Матеріали і методи

Самицям миші лінії А/) (6-8-тижневі) вводили підшкірно у верхню частину шиї О,2мл пухлинних клітин заїМм « (1х105) (ВазКкаг 1995). Через 0, 4, 7 і 14 днів після введення пухлинних клітин вводили антитіло проти СТІ А-4 - с миші або контрольне антитіло відповідного ізотипа (РпагмМіпдеп, Зап Оіедо, СА, 200мкг/тварина). Вимірювання а пухлини проводили протягом 3-4 тижнів експерименту за допомогою електронного каверномеру Зіатек 5РС Різ я (АтоЇї, МА), і розмір пухлини виражали у вигляді площі поверхні, охопленої пухлинним зростанням (мм).

На Фіг.18 показано гальмування зростання пухлини під дією антитіла проти СТІ А-4 миші на моделі фібросаркомної пухлини миші. Як показано на Фіг.18, у тварин, оброблених антитілом проти СТІ А-4, відбувалося - зниження зростання пухлини в порівнянні з тваринами, обробленими контрольним антитілом відповідного о ізотипа. Отже, тАбБз проти СТІ А-4 миші здатні гальмувати зростання фібросаркоми на моделі пухлини миші.

Очікується, що антитіла, які перехресно реагують з СТІ А-4 миші, діють схоже в даній моделі. Однак серед се) антитіл винаходу, перевірених на перехресну реактивність, не було перехресно реагуючих з СТІ А-4 миші. сю 50 Приклад 12 Модель пухлини тварини

Для подальшого дослідження активності антитіл відповідно до винаходу була розроблена

І) ксенотрансплантантна модель на мишах ЗСІО для визначення придушення розвинених пухлин і виникаючих від них метастазів. У цій моделі мишам лінії 5ХСІЮ пересаджували Т-клітини людини і імплантували отримані від хворих недрібноклітинні клітини легенів (М5СІ) або клітини карциноми прямої кишки (СС). Імплантацію здійснюють в гонадальні жирові подушечки мишей ЗСІЮ. Пухлинам дають вирости і потім їх видаляють. У мишей о розвиваються схожа з людською пухлина і метастази в печінці. Така модель описана ІВитрегз еї аї!.). Зигаісаї

Кез. 61: 282-288 (1996). де Очікується, що антитіла винаходу повинні гальмувати зростання пухлин, утворених у таких мишей.

Включення за посиланням 6о0 Всі цитовані тут посилання, включаючи патенти, патентні заявки, статті, керівництва і ним подібне, і цитовані в них посилання в тій мірі, що вони не є прямими, включені тут як посилання у всій їх повноті. Крім того, наступні посилання також включені тут як посилання у всій їх повноті, включаючи посилання, цитовані в таких посиланнях:

Аїедге еї аї. 9. Іттипої! 157: 4762-70 (1996) 65 Аїйїзоп апа Кгиттеї! Зсіепсе 270: 932-933 (1995)

Ваїгапо еї аї. Іпї У Сапсег Зиррі 7: 28-32 (1992)

Віаїс еї а. 9. Іттипої 160: 12-5 (1998)

Віаке апа Гісі-Оаміз Віо Сопіпдаєе Спет. З: 510-513 (1992)

Воиззіоїіз еї а). Ргос Маїї Асаазсі ОБА 90: 11059-63 (1993)

Вом/іе еїг аї. Зсіепсе 253: 164 (1991)

Вгоддетанп ег ам. РМАЗ ОА 86: 6709-6713 (1989)

Вгоддетап, М. апа Мешибрегодсг, М.5. іп Ме(йодв: А сотрапіоп о Меїйподз іп Епгутоїіоду 2: 159-165 (І етсг еї аіІ., едз. Асадетіс Ргезз (1991))

Вгоддетапп еї аї!., "Нитап апіїбоду ргодисіоп іп ігапздепіс тісе: ехргезвіоп їот 100 КЬ ої (пе питап ІдЗн 7/0. юсив." Ецг. у. Іттипої. 21: 1323-1326 (1991)

Вгоддетапп, М. апа Меирегосг, М.5. "Бігайїедіев їТог ехргеззіпд питап апіїроду герегіоіїгев іп (гапздепіс тісе." ІттипоЇоду Тодау 17: 391-397 (1996)

Вгипеї! еї аї. Майшге 328: 267-270 (1987)

Витрегз еї а! 9. Зи,игдіса! Кев. 61: 282-288 (1996)

Сарзеу еї а). СепеїйісаПу Епдіпеегедй Нитап Тпегарешіс Югидзе (ЗіосКіюоп Ргевзв. МУ (1988))

Савіап еї а). Іттипоїоду 90: 265-71 (1997)

Серего еї аіІ..). Ехр Меа 188: 199-204 (1998)

Спеп еї аї. "Іттиподіобиїййп депе геагтапдетепі іп В-сеї| дейсіепі тісе депегагей Бу (агдегей аеїефоп ої (пе Он

Іосив" Іпіегпайопаї! Іттипоїіоду 5: 647-656(1993)

Спеп еї а. Сеї! 71: 1093-1102 (1992)

Спеп еї аі. Нитап Сепе ТПегару 5: 595-601 (1994)

СпівзжеїЇ апа МсСапегу ТІВТЕСН 10: 80-84 (1992)

Спої еї аї. "Тгтапвдепіс тісе сопіаіїпіпд а питап Пеаму спаійп іттиподіорийп депе їгадтепі сіопей іп а уеазі апійісіа! спготовзоте" Маїиге Сепеїйїісзв 4: 117-123 (1993) сч

Споїпіа 8. І езК.). Мої. Віо! 196: 901-917 (1987)

Споїпіа еї а). Масиге 342: 878-883 (1989) Спцапо еї аї. 9. Іттипої! 159: 144-151(1997) і)

Соїїдап еї аї., Опії 2.1, "Епгуте-іїпкей іттипозогрепі аззаув, " іп Ситепі ргоїосоїв іп іттипоіоду (1994)

Смігпа ег ам. РМА5 ОА 87: 6378-6382 (1990) Рагіамасні еї аІ. Еиг. 9. Іттипої! 18:1901-1905(1988) баупої, М.О., іп АМаз ої Ргоївіп Зедцепсе апа Зігосіиге, рр.101-110 (Моіште 5, Майопа! Віотедісаї «о зо Кезеагсп Рошйпаайоп (1972)) апа Зирріетепі 2 Юю (піз моїште, рр.1-10 де Воег еї а). Єиг У Іттипої! 23: 3120-5 (1993) о

Есквїеїіп, Ед., Охіога Опімегайу Ргезв, Охіога Епадіапа (1991)) Ге!

Емапз еї а). У. Мед. Спет. 30: 1229 (1987)

Раїіагіпо еї а. У.Ехр Меа 188: 205-10 (1998) ісе)

Еапдег еї аї. Іттипої! Меїподвз 4: 72-81 (1994) ї-

Еаимснеге, .). Аду. Огид Кезв. 15: 29 (1986)

ЕРівпм/йа оеї аїЇ., "Нідп-амідйу о питап ІдСту топосіопа! апіродіез їїот а поме! вігаійп оїтіпіосив5 ігапздепіс тісе." Майшге Віоїесн. 14: 845-851 (1996).

Егеетап еї аї. 9. ЕхрМеа 178: 2185-92 (1993) «

Егеетап еї аї. 9. Іттипої 161: 2708-15 (1998) з с Егеетап егаї. Зсіепсе 262: 907-9 (1993) ц Еопдатепіа! ІттипоїЇоду СИ. 7 (Раші, МУ., ед., 279 ед. Камеп Ргезв, и"? Сайтге, сб. апа Міївіеіїп, 3., "Ргерагайоп ої топосіопа! апііродіев: зігаїедіев апа ргоседигев." Меїповдв

Епгутої. 73: 3-46 (1981)

Сегтап еї аї. Р.М.А.5. 79:6777 (1982) -І Сгееп апа дакобоміїв.9У. Ехр. Меа. 188: 483-495 (1998)

Сгееп еї а). Майте Сепеїйісв 7: 13-21 (1994) б Сгоззепейді еї аї. СеїЇ 41: 885 (1985) (Се) Напез апа Ріисійа РМАЗ ЗА 94: 4937-4942 (1997)

Нагаїпо еї аї. Мате 356: 607-609 (1994) о Нагрег еї а). 9. дттипої 147: 1037-44 (1991)

ФО Наїйсоск еї аіІ. Зсіепсе 262: 905-7 (1993)

Нодапроот еї аї. Іттипої!. Кеміемув 130: 43-68 (1992)

Нагзрсоої! еї аї. 9. Іттипої 160: 2706-14 (1998)

Ноцоніеп еї аї. Віоїесппіднез 13: 412-421 (1992)

Ноцдлеп РМо45 БА 82: 5131-5135 (1985)

Ф, Нигміїг еї аІ. УМейгоіїттипої 73: 57-62 (1997) ко Нигміїг еї а. Ргос МаїЇ Асаазсі ОБА 95: 10067-71 (1998)

ІпттипоЇоду - А Бупіпевзів (279 Еайоп, Е.5. Соїшб апа О.К. Огеп, Еаз., Зіпацег Авззгосіафез, З(упаепапа, 60 Мазв. (1991))

Іпігодисіоп Юю Ргоїеіп бігисішге (3. Вгапаеп апа у. Тооге, едв., Сагпапа Рибіїзпіпд, Мем Могк,

Уакороміїв ег аї., "Септ-йпе // гапзітіввіоп апа ехргезвіоп ої а Питап-аегімей уеаві агпійісіаї-спготовоте." Майшге 362: 255-258 (1993)

Уакороміїв, А. еї аї.,, "Апаїувів оїпотогудоив тшапі епттегіс тісе: ЮОеїейоп ої (Ше іттиподіориїп 65 Ппеаму-спаіп |оїпіпд гедіоп Біоск5 В-сеїЇ демеюртепі апа апіїбоду ргодисіоп." Ргос. МаїЇ. Асад. Зсі. ОБА 90: 2551-2555 (1993)

Уакороміїв, А., "Нитапігіпд (пе тоизе депоте." Ситепі Віоіоду 4: 761-763 (1994)

Уакороміїв, А. "Ргодисіоп ої ЯШШУу Ппитап апіродіев ру (гапздепіс тісе" Ситепі Оріпіоп іп

Віоіесьпоіоду 6: 561-566 (1995)

Успуйапе еї а). іп Сапсег Спетоїпегару апа Віоїегару 655-686 (24 еаййіоп, Спапїйег апа Гопдо, евдФв.,

ПОрріпсоїї Камеп (1996))

Каваї еї аї. (1991) Зедшцепсез ої Ргоїеїпз ої Ітгаипоіодіса! Іпіегеві, М.І.Н. рибіїсайоп по. 91-3242

Кавраї Зедцепсев ої Ргоїеіпв ої Оттипоіодіса! Іпіегеві (Майопа! Іпвійшевз ої Неакй, Ве(пезаа, Ма. (1987 апа 1991)) 70 КозіеїІпу еї а. 9. Іттипо/!. 148: 1547-1553 (1992)

Кгиттеї! апа АЇЇїзоп у). Ехр Меа 182: 459-65 (1995)

Кгиттеї! еї аї. Іл Іттипої 8: 519-23 (1996)

Киснгоо еї а!. Сеї! 80: 707-18 (1995)

Куоп егаі. РМАБ ОА 94: 8099-103 (1997)

І аРіапсне еї аї. Мисі. Асідз Кез. 14: 9081 (1986)

Ї епзспому еї а). Ргос Маїї Асад5Зсі ОБА 90: 11054-8 (1993)

Ї епзспому еї а). Зсіепсе 257: 789-792 (1992)

Мп ега)ї. 9). Ехр Меа 188: 199-204 (1998)

Іавієу еї аї. 9. Ехр Меа 176: 1595-604 (1992)

Мавієу еїг аї. Ехр. Меа. 174: 561-569 (1991)

Мавієу еї а). Зсіепсе 257: 792-795 (1992)

Ми егаї. 9. Уттипої. 139: 3521 (1987)

ШОи егаї. Р.М.А.5. 84: 3439 (1987)

Їопрегд еї аїЇ., "Апіїдеп-зресіїйс питап апіродіев їот тісе сотргізвіпу їоцг о аівіпсі депеїйс сч дв тоайсайопег:" Маїцге 368: 856-859 (1994).

І ипаег еї а. 9. Ехр Меа 187: 427-32 (1998) і)

Магазсо Сепе ТПегару 4: 11-15 (1997)

Магкеез еї а). У аїп Іпмеві 101: 2446-55 (1998)

Магке ег а. "Оіідописієойде ргітегз їТог роїутегазе спаїйп геасбоп атрійісабвоп ої о Ппитап (о зо іттиподіорийй магпаріє депез апа девідп ої Татіу-вресійс оіідописіеонае ргобев Ет. У. Уттипої. 21: 985-991 (1991) о

Мссоу еї а. У.Ехр Меа 186: 183-7 Ге! (1997) Мепае? еї а). Майшге Сепеїйісв 15: 146-156 (1997)

Мееаіетап апа УУцпзсп.. Мої. Віої. 48: 443 (1970) ісе)

ОкКкауата ег а. Мої. Сеї! Віо. 3: 280 (1983) ї-

Рагтіеу апа Зтійй Сепе 73: 305-318 (1988)

Реаггоп апа ІГіртап Ргос. Маї)!. Асад. Зсі. (0О.5.А.) 85: 2444 (1988)

Реге? еї аі. Іттипку 6: 411-7 (1997)

Регїтіп еї аї. Іттипої! Кез 14: 189-99 (1995) «

Регтіп ейа|!. ) Іттипої! 157: 1333-6 (1996) з с РіпаїІасіаІ. Віоїесппідцез 13: 901-905 (1992) . Ргоїеіпз, Зігисішгез апа Моіесціаг Ргіпсіріеєв (Стеідніюоп, Еа., МУ. Н. Ргеетап апа Сотрапу, Мем Хогк (1984)) и?» Калі-ЖМої еї а. Ргос Маїї Асад 5сі ОБА 90: 11182-6 (1993)

Кетіпдіоп'є РНаптасешіса! Зсіепсез (1501 ей. Маск Рибіїзпіпд Сотрапу, Еавіоп, РА (1975)), рапісшапу

СПарівг 87 Бу Віацо, Зеутоишг -І Кі2о апа Сіегазсп.Апп. Кеу. Віоспет. 61: 387 (1992)

Кизгзеї еї а). Мисі. Асідз Кезеагсі 21: 1081-1085 (1993)

Ме. Зспмагіг Сеї! 71: 1065 (1992) со сої ТІВ 17: 241-245 (1992)

Зтій апа УУагегтап Аду. Аррі. Май. 2: 482 (1981) о зЗопавіміїаі 5 І асптапп ап. Ехр. Іттипої. 79: 315-321 (1990)

Ф ес еї а). У. Ат. Спет. ос. 106: 6077 (1984)

Зіеїп еї аї. Мисі. Асіаз Кев. 16: 3209 (1988)

Тауюг еї аїЇ,, "А ігапздепіс тоцве (паї ехргеззез а дімегейу ої питап зедцепсе Пеаму апа днЕ снаїп дво іттиподіориїп8в." Мисіеїс Асіаз Кезеагсп 20: 6287-6295 (1992)

Тауюг ей аЇ,, "Нитап іттиподіорийп (гапздепез цпдегдо геагтапдетепі, зотайййс тиайоп апа сіазв

Ф) змйспіпу іп тісе (паї ІасК епдодепоиз ІДМ." Іпіегпайопаї! Іттипоіоду 6: 579-591 (1994) ка Тпе МсоОгам/-НІЇЇ Оіссопагу ої Спетіса! Тептз (Рагкег, 5., Ед., МеОгам-НІ), Зап Егапсізсо (1985))

Трогпіюп еї аї. Маїиге 354: 105 (1991) во Тімої еї а). Іттипйцу З: 541-7 (1995)

Том/пзепа апа АїЇїзоп Зсіепсе 259: 368 (1993)

Тгацпескег еї аї. Іл У. Сапсег (Зиррі.) 7: 51-52 (1992)

Тчайоп еї аї. "Апаїувів ої аігесїі апа іплмебей БуОнН геатапдетепів іп а питап Ід пеаму спаїп (гапздепіс тіпйосивУ). Іттипої. 154: 6453-6465 (1995) 65 Тчайоп оег а), "Нитап іттиподіобиіп Ппеаму-спаійпй птіпі осиз гесотбріпайоп іп (гапздепіс тісе: депе-зедтепі иве іп? апа? (гапзсгірів." Ргос. Маї). Асад. 5сі. ОБА 90: 3720-3724(1993)

ОпІтапп апа Реутап Спетіса! Кеміємуз 90: 543 (1990)

Мап Рагіз еї а). У.Ехр Меа 186: 1119-28 (1997)

Мебег апа Егеідіпдег ТІМ5 р.392 (1985)

Міена Іттипої! Тодау 14: 252 (1993)

УУаїІшпаз еї а. Ітптипйу 1: 405-13 (1994)

УУаїІшпаз еї а). У.Ехр Меа 183: 2541-50 (1996)

УУагегоизе еї аї. Зсіепсе 270: 985-988 (1995)

Міпіег апа Натз Іттипої! Тодау 14: 43-46 (1993) 70 Мідні еї а. Стії. Кеміемув іп Іттипої. 12125-168 (1992)

Уапа еї аї. Сапсег Кез 57: 4036-41 (1997)

Уі-дчп еї аї. ІС Іттипої 8: 37-44 (1996) 7оп еїг а). Апіі-Сапсег Огид Оевідп 6: 539 (1991) 7оп еї аї. Оіїдописіеойдез апа Апаіодцев: А Ргасіїсаї Арргоасі, рр.87-108 (Б. ЕсКвівеіп, Еа., Охіога 7/5 пімегайу Ргезв, Охіога Епдіапа (1991))

Егу еї аїЇ. "Зресіїс, ігемегвіріе іпасіїмайоп ої (Ше ерідепта! дгоули Тасіог гесеріог апа егвВ2, Бу а пем/ сіазз оПуговіпе Кіпазе іппіріюог" Ргос МайАсаазсі ОБА 95: 12022-7 (1998)

Нойтап еї аЇ. "А тоде! ої Сас25 рпозрпайазе саїауйс дотаїп апа Сак-іпіегасіоп зипасе разедй оп (Пе ргезепсе ої а гподапезе пото|іоду дотаїп" 9.Мої Віо! 282: 195-208 (1998)

Сіпаї»кКі еї а). "Модеїїйпо ої асіїме Тогітз ої ргоївіп Кіпазев: р38--а сазе зіцау" Асіа Віоспіт Рої 44: 557-64 (1997)

УоиКкоО еї аї. "Ідепійісайоп ої с8К (уговіпе рпозрпогуїайоп вйевз апа а (іугозіпе гевзідце ітрогпапі ог

Кіпазе дотаїп вігисіцге" Віоспет У 322: 927-35 (1997) зЗіпдй ег аїЇ. "Зігисійге-разей дезідп ої а роїепі, зеїЇесіїме, апа ігемегвіріе іпріБбйог ої (пе сайамйіс дотваїіп ої те егЬВ гесеріог зибтатіїу ої ргоїеіп (уговіпе Кіпазев" У.Мей Спет 40: 1130-5(1997). сч

Мападеі! ей а. "АВОЕМ: а Кпоуледде-разей ашцотайеай арргоасп їог апіїроду вігисішге тоаеїйпд" Маї

Віоіесппої! 14: 323-8 (1996) о

Моптагаїпі ей аї. "Кайопа! девзідп, апаїувзів, апа роїепіаІ! шу ої ОМ-С5Е апіадопівів" Ргос Авзвос Ат

РНузісіапз 108: 420-31 (1996)

ЕРигеї еї а). "Модеїйпо овішау ої ргоївіп Кіпаве іппірйоге: Біпдіпд тоде ої зіашгозрогіпе апа огідій ої «о їїйе зеіІесіїміу оїббоР 5241173 Сотриї Аїдей Мої Оез 9: 465-72 (1995)

Ш ек а). "Оевідп апа сопвігисіоп ої а Нургій іттиподіорийп дотаіїп м/йй ргорегіев ої рої Ппеаму апа і.

ДАЕ спаїп магіаріе гедіопе" Ргоївіп Епад 10: 949-57 (1997) Ф

Магпііп еї аїЇ., "Те айіпійу-зеіесіоп ої а тіпіроду роїуреріїде іппірйог ої питап іпіепеийКіп-6" ЕМВО / 13: 5303-9 (1994) ее,

Патентна заявка США, Мо.07/466008, зареєстрована 12 січня 1990 р. ї-

Патентна заявка США, Мо.07/574748, зареєстрована 29 серпня 1990 р.

Патентна заявка США, Мо.07/575962, зареєстрована 31 серпня 1990Ор.

Патентна заявка США, Мо.07/610515, зареєстрована 8 листопада 1990р.

Патентна заявка США, Мо.07/810279, зареєстрована 17 грудня 1991р. «

Патентна заявка США, Мо.07/853408, зареєстрована 18 березня 1992р. шщ с Патентна заявка США, Мо.07/904068, зареєстрована 23 червня 1992р. й Патентна заявка США, Мо.07/919297, зареєстрована 24 липня 1992р. «» Патентна заявка США, Мо.07/922649, зареєстрована 30 липня 1992р.

Патентна заявка США, Мо.07/990860, зареєстрована 16 грудня 1992р.

Патентна заявка США, Мо.08/031801, зареєстрована 15 березня 1993р. -і Патентна заявка США, Мо.08/053131, зареєстрована 26 квітня 1993р.

Патентна заявка США, Мо.08/096762, зареєстрована 22 липня 1993 р.

Фо Патентна заявка США, Мо.08/112848, зареєстрована 27 серпня 1993 р.

Те) Патентна заявка США, Мо.08/155301, зареєстрована 18 листопада 1993 р.

Патентна заявка США, Мо.08/161739, зареєстрована З грудня 1993р. о Патентна заявка США, Мо.08/165699, зареєстрована 10 грудня 1993р.

Ф Патентна заявка США, Мо.08/209741, зареєстрована 9 березня 1994р.

Патентна заявка США, Мо.08/234145, зареєстрована 28 квітня 1994р.

Патентна заявка США, Мо.08/724752, зареєстрована 2 жовтня 1996р.

Патентна заявка США, Мо.08/730639, зареєстрована 11 жовтня 1996р.

Патентна заявка США, Мо.08/759620, зареєстрована З грудня 1996р. іФ) Патентна, заявка США, Мо.08/759620, зареєстрована З грудня 1996р. ко Патент США Мо.4399216

Патент США Мо.4681581 во Патент США Мо.4683195

Патент США Мо.4683202

Патент США Мо.4735210

Патент США Мо.4740461

Патент США Мо.4816397 65 Патент США Мо.4912040

Патент США Мо.4959455

Патент США Мо.5101827

Патент США Мо.5102990 (КЕ 35500)

Патент США Мо.5151510

Патент США Мо.5194594

Патент США Мо.5434131

Патент США Мо.5530101

Патент США Мо.5545806

Патент США Мо.5545807 70 Патент США Мо.5585089

Патент США Мо.5591669

Патент США Мо.5612205

Патент США Мо.5625126

Патент США Мо.5625825

Патент США Мо.5633425

Патент США Мо.5643763

Патент США Мо.5648471

Патент США Мо.5661016

Патент США Мо.5693761

Патент США Мо.5693792

Патент США Мо.5697902

Патент США Мо.5703057

Патент США Мо.5714350

Патент США Мо.5721367 сч

Патент США Мо.5733743

Патент США Мо.5770197 і)

Патент США Мо.5770429

Патент США Мо.5773253

Патент США Мо.5777085 Ге зо Патент США Мо.5789215

Патент США Мо.5789650 Патент США Мо.5811097 ме)

Європейський патент Мо.ЕР 0 546 073 ВІ б

Європейський патент Мо.ЕР 0 463 151 ВІ, присудження опубліковане 12 червня 1996р.

Заявка на міжнародний патент Мо.МО 92/02190 ре)

Заявка на міжнародний патент Мо.МО 92/03918 ї-

Заявка на міжнародний патент Мо.МО 92/22645

Заявка на міжнародний патент Мо.МО 92/22647

Заявка на міжнародний патент Мо.МО 92/22670

Заявка на міжнародний патент Мо.М/О 93/00431 «

Заявка на міжнародний патент Мо.МО 93/12227 з с Заявка на міжнародний патент Мо.МО 94/00569 . Заявка на міжнародний патент Мо.МО 94/02602, опублікована З лютого 1994р. и? Заявка на міжнародний патент Мо.МО 94/25585

Заявка на міжнародний патент Мо.МО 94/29444

Заявка на міжнародний патент Мо.МО 95/01994 -І Заявка на міжнародний патент Мо.МО 95/03408

Заявка на міжнародний патент Мо.МО 95/24217 ме) Заявка на міжнародний патент Мо.МО 95/33770

Ге) Заявка на міжнародний патент Мо.МО 96/14436

Заявка на міжнародний патент Мо.М/О 96/34096, опублікована 31 жовтня 1996р. і Заявка на міжнародний патент Мо.МО 97/13852

Ф Заявка на міжнародний патент Мо.МО 97/20574

Заявка на міжнародний патент Мо.МО 97/38137

Заявка на міжнародний патент Мо.МО 98/24884

Заявка на міжнародний патент Мо.МО 98/24893, опублікована 11 червня 1998р.

Еквіваленти

Ф) У приведених вище описі і прикладах деталізуються деякі переважні здійснення винаходу і описуються ка найкращі з точки зору заявників способи. Потрібно розуміти, однак, що незалежно від того, як детально вищевикладене може виглядати в тексті, винахід може бути реалізований багатьма способами, і винахід во потрібно тлумачити відповідно до прикладеної формули винаходу і будь-яких її еквівалентів.

Claims

Формула винаходу 65 1. Моноклональне антитіло людини, яке зв'язує антиген-4 цитотоксичного Т-лімфоциту (СТІ А-4) або його антиген-зв'язуючий фрагмент, при цьому вказане антитіло або фрагмент інгібує зв'язування СТІ А-4 і В7-2 з

ІСьо, яка дорівнює приблизно 100 НМ або менше.
2. Антитіло або фрагмент за п. 1, де вказане антитіло або фрагмент інгібує зв'язування СТІ А-4 людини й В7-1 з ІСьо, яка дорівнює приблизно 100 нМ або менше, і інгібує зв'язування СТІ А-4 людини й В7-2 з ІС во, яка дорівнює приблизно 100 НМ або менше, і де вказане антитіло має щонайменше одну з властивостей, вибрану з групи, що складається з: а) зв'язує СТІ А-4 людини зі спорідненістю зв'язування приблизно 107 або більше; Б) збільшує продукування цитокінів у тесті Т-клітин людини на 500 пг/мл або більше; с) збільшує продукування ІЛ-2 у тесті Т-клітин людини на 500 пг/мл або більше; 70 а) збільшує продукування Г-інтерферону в тесті Т-клітин людини на 500 пг/мл або більше; е) не зв'язує СТІ А-4 миші, щура і кролика; 7) зв'язує СТІ А-4 довгохвостих макак і макак-резус.
3. Антитіло або фрагмент за п. 1 або 2, де вказане антитіло інгібує зв'язування між СТІ А-4 людини й В7-1 з ІСво, меншою ніж приблизно 50 НМ, і інгібує зв'язування між СТІ А-4 людини й В7-2 з ІСююо, меншою ніж приблизно 0,38 НМ.
4. Антитіло або фрагмент за п. 1, що включає амінокислотну послідовність легкого ланцюга, вибрану з групи, яка складається з: а) амінокислотної послідовності батьківської лінії гена А27 м людини або вказаної послідовності батьківської лінії, що містить щонайменше 1 мутацію; Б) амінокислотної послідовності батьківської лінії гена 012 м людини або вказаної послідовності батьківської лінії, що містить щонайменше 1 мутацію; с) амінокислотної послідовності батьківської лінії гена А1Т0/А26 м людини або вказаної послідовності батьківської лінії, що містить щонайменше 1 мутацію; а) амінокислотної послідовності батьківської лінії гена А17 м людини або вказаної послідовності Га батьківської лінії, що містить щонайменше 1 мутацію; е) амінокислотної послідовності батьківської лінії гена АЗ/АТ9 м, людини або вказаної послідовності о батьківської лінії, що містить щонайменше 1 мутацію.
5. Антитіло або фрагмент за п. 4, де вказана амінокислотна послідовність батьківської лінії гена А27 м. людини містить щонайменше 1 мутацію, вибрану з групи, яка складається з: (Те) а) щонайменше однієї амінокислоти в СОКІ, вилученої в порівнянні з амінокислотною послідовністю батьківської лінії гена А27 м людини; і. Б) залишку серину, заміщеного в положенні б у батьківській лінії СОКЗ, показаній на Фіг. 4, гена А27 мМ Ге»! людини; с) щонайменше одного консервативного або неконсервативного заміщення в СОКІ! в порівнянні з о амінокислотною послідовністю батьківської лінії гена А27 му людини. -
6. Антитіло або фрагмент за будь-яким з пп. 1-5, що включає послідовність СОКІ, СОК2 або СОКЗ легкого ланцюга, показану на одній з Фігур 4-8.
7. Антитіло або фрагмент за п. 6, де послідовність СОКІ, СОК2 або СОКЗ легкого ланцюга вибирається з « групи, яка складається з: а) амінокислотних послідовностей СОБІ, СОБ2 і СОКЗ антитіла 4.1.1, антитіла 4.8.1, антитіла 4.14.3, Й ЩЗ с антитіла 6.1.1, антитіла 4.10.2 або антитіла 4.13.1, показаних на Фіг. 4; ц Б) амінокислотних послідовностей СОКІ, СОК2 і СОКЗ антитіла 3.1.1, антитіла 11.21, антитіла 11.6.1 або и"? антитіла 11.7.1, показаних на Фіг. 5; с) амінокислотних послідовностей СОК1, СОК2 і СОКЗ антитіла 2.1.3, показаних на Фіг. 6; а) амінокислотних послідовностей СОКІ, СОК2 і СОКЗ антитіла 12.3.1, показаних на Фіг. 7; і -І е) амінокислотних послідовностей СОКІ, СОК2 і СОКЗ антитіла 12.91, показаних на Фіг. 8.
8. Антитіло або фрагмент за будь-яким з пп. 1-7, що включає амінокислотну послідовність легкого ланцюга, б яка включає послідовність, вибрану з групи, що складається з амінокислотних послідовностей, представлених у (се) 5ЕО ІЮО МО:14-26, 65, 67, 69 або 71.
9. Антитіло або фрагмент за будь-яким з пп. 1-84, що має важкий ланцюг, що включає амінокислотну о послідовність батьківської лінії гена МНЗ-33 (ОР-50) людини або вказану послідовність батьківської лінії, що ФО містить щонайменше 1 мутацію.
10. Антитіло або фрагмент за п. 1, що включає амінокислотну послідовність важкого ланцюга, вибрану з Групи, яка складається з: а) амінокислотної послідовності батьківської лінії гена МнНЗ-33 (ОР-50) людини або вказаної послідовності Ф, батьківської лінії, що містить щонайменше 1 мутацію; ко Б) амінокислотної послідовності батьківської лінії гена Мні-33 (ОР-65) людини або вказаної послідовності батьківської лінії, що містить щонайменше 1 мутацію; во с) амінокислотної послідовності батьківської лінії гена Мн (ОР-47) людини або вказаної послідовності батьківської лінії, що містить щонайменше 1 мутацію.
11. Антитіло або фрагмент за пп. 1 або 9, що включає амінокислотну послідовність СОКІ, СОК2 або СОКЗ важкого ланцюга, представлених на фігурі 2.
12. Антитіло або фрагмент за п. 1, де важкий ланцюг включає амінокислотні послідовності СОК1І, СОМ і 65 СОКЗ антитіла, представлені на фігурі 2.
13. Антитіло або фрагмент за будь-яким з пп. 1-12, що включає амінокислотну послідовність важкого -д41-

ланцюга, вибрану з групи, яка складається з амінокислотних послідовностей, представлених у ЗЕО ІЮ МО:1-8, 10-13, 63, 66, 68 або 70.
14. Антитіло або фрагмент за п. 1, де вказане антитіло або фрагмент вибраний із групи, яка складається з: а) антитіла або фрагмента, що включає варіабельну ділянку амінокислотної послідовності важкого ланцюга, представлену у ЗЕО ІЮ МО:63, і додатково включає амінокислотну послідовність варіабельної ділянки легкого ланцюга, представлену в ЗЕО ІЮ МО:65; р) антитіла або фрагмента, що включає варіабельну ділянку амінокислотної послідовності важкого ланцюга, представлену у ЗЕО ІЮ МО:66, і додатково включає амінокислотну послідовність варіабельної ділянки легкого /о ланцюга, представлену в ЗЕО ІЮ МО:67; с) антитіла або фрагмента, що включає варіабельну ділянку амінокислотної послідовності важкого ланцюга, представлену у ЗЕО ІЮ МО:68, і додатково включає амінокислотну послідовність варіабельної ділянки легкого ланцюга, представлену в ЗЕО ІЮ МО:69; і а) антитіла або фрагмента, що включає варіабельну ділянку амінокислотної послідовності важкого ланцюга, /5 представлену у ЗЕО ІЮ МО:70, і додатково включає амінокислотну послідовність варіабельної ділянки легкого ланцюга, представлену в ЗЕО ІЮ МО:71.
15. Антитіло або фрагмент за п. 14, яке включає: а) амінокислотну послідовність важкого ланцюга ЗЕО ІЮ МО:63 і амінокислотну послідовність легкого ланцюга ЗЕО ІЮ МО:65, де вказане антитіло не має сигнальних пептидів, представлених у вказаних послідовностях; р) амінокислотну послідовність важкого ланцюга 5ЕО ІЮ МО:66 і амінокислотну послідовність легкого ланцюга ЗЕО ІЮ МО:67, де вказане антитіло не має сигнальних пептидів, представлених у вказаних послідовностях; с) амінокислотну послідовність важкого ланцюга 5ЕО ІЮ МО:68 і амінокислотну послідовність легкого ланцюга ЗЕО ІЮ МО:69, де вказане антитіло не має сигнальних пептидів, представлених у вказаних послідовностях; і а) амінокислотну послідовність важкого ланцюга ЗЕО ІЮ МО:70 і амінокислотну послідовність легкого ланцюга сч ЗЕО ІЮ МО:71, де вказане антитіло не має сигнальних пептидів, представлених у вказаних послідовностях.
16. Антитіло або фрагмент за п. 1, що виявляє одну або більше властивостей, вибраних із групи, яка і) складається з: а) конкурентно інгібувати зв'язування СТІ А-4 з антитілом за п.14 або 15; р) зв'язувати такий же епітоп, як і антитіло за п.14 або 15; і Ге зо с) мати специфічність зв'язування по суті таку ж, як і в антитіла за п.14 або 15.
17. Антитіло або фрагмент за будь-яким з пп. 1-3, що включає щонайменше о одне з наступних: б а) послідовності ЕКТ, ЕК2 і ЕКЗ людини, які кодуються сімейством генів людини М н 3-33 або вказаним сімейством генів з консервативними замінами, одиничною неконсервативною заміною або з обома; або ісе) Б) послідовності ЕКІ, ЕК2 і ЕКЗ людини, які кодуються сімейством генів людини М Кк А27 або вказаним ї- сімейством генів з консервативними замінами, одиничною неконсервативною заміною або з обома.
18. Антитіло за п. 1, що включає варіабельну частину амінокислотної послідовності важкого ланцюга, представлену у БЕО ІЮ МО:70 і додатково включає амінокислотну послідовність варіабельної частини легкого ланцюга, представлену в ЗЕО ІЮ МО:71. «
19. Антитіло або фрагмент за п. 1, вибране з групи, яка складається з: з с а) антитіла або фрагмента, що включає варіабельну частину амінокислотної послідовності важкого ланцюга, представлену у ЕС ІО МО:З3, і амінокислотну послідовність варіабельної частини легкого ланцюга, з представлену в ЗЕО ІЮО МО:16; р) антитіла або фрагмента, що включає варіабельну частину амінокислотної послідовності важкого ланцюга, представлену у ЗЕСО І МО:8, і амінокислотну послідовність варіабельної частини легкого ланцюга, -І представлену в ЗЕО ІЮО МО:21; с) антитіла або фрагмента, що включає варіабельну частину амінокислотної послідовності важкого ланцюга, Ме, представлену у 5ЕО ІО МО:4, і амінокислотну послідовність варіабельної частини легкого ланцюга, со представлену в ЗЕО ІЮ МО:17; і а) антитіла або фрагмента, що включає варіабельну частину амінокислотної послідовності важкого ланцюга, о представлену у 5ЕО ІО МО:1, і амінокислотну послідовність варіабельної частини легкого ланцюга, Ф представлену в 5ЕО ІЮ МО:14.
20. Антитіло або фрагмент за п. 1, вибране з групи, яка складається з: а) амінокислотної послідовності важкого ланцюга, що містить ЕС ІЮО МО:3, і амінокислотної послідовності легкого ланцюга, що містить ЗЕО ІЮО МО: 16; Б) амінокислотної послідовності важкого ланцюга, що містить 5ЕО ІЮ МО:8, і амінокислотної послідовності (Ф) легкого ланцюга, що містить ЗЕО ІЮ МО: 21; ка с) амінокислотної послідовності важкого ланцюга, що містить ЗЕО ІЮО МО:4 без сигнальної пептидної послідовності, й амінокислотної послідовності легкого ланцюга, що містить ЗЕО ІЮО МО: 17 без сигнальної во пептидної послідовності; 4) амінокислотної послідовності важкого ланцюга, що містить ЗЕО ІЮО МО:1 без сигнальної пептидної послідовності, й амінокислотної послідовності легкого ланцюга, що містить ЗЕО ІЮО МО: 14 без сигнальної пептидної послідовності.
21. Антитіло або фрагмент за п. 1, вибране з групи, яка складається з: 65 а) антитіла або фрагмента, що включають амінокислотну послідовність важкого ланцюга, що містить послідовність СОКІ, СОК2 і СОКЗ антитіла 4.13.1, показану на фігурі 2, і амінокислотну послідовність легкого ланцюга, що містить послідовність СОКІ, СОК2 ії СОКЗ антитіла 4.13.1, показану на фігурі 4; Б) антитіла або фрагмента, що включають амінокислотну послідовність важкого ланцюга, що містить послідовність СОКІ, СОК2 і СОКЗ антитіла 4.14.3, показану на фігурі 2, і амінокислотну послідовність легкого ланцюга, що містить послідовність СОК1, СОК2 і СОКЗ антитіла 4.14.3, показану на фігурі 4; і с) антитіла або фрагмента, що включають амінокислотну послідовність важкого ланцюга, що містить послідовність СОКІ, СОК2 і СОКЗ антитіла 6.1.1, показану на фігурі 2, і амінокислотну послідовність легкого ланцюга, що містить послідовність СОКІ1, СОК2 і СОКЗ антитіла 6.1.1, показану на фігурі 4.
22. Антитіло або фрагмент за п. 1, яке включає амінокислотну послідовність важкого ланцюга, що містить 70 послідовність СОКІ, СОК2 і СОКЗ антитіла 11.2.1, показану на фігурі 2, і амінокислотну послідовність легкого ланцюга, що містить послідовність СОКІ, СОК2 ії СОКЗ антитіла 11.2.1, показану на фігурі 5.
23. Антитіло або фрагмент за п. 1, вибране з групи, яка складається з: а) антитіла або фрагмента, що включають амінокислотну послідовність від СОКІ! до СОКЗ важкого ланцюга антитіла 4.13.1, показану на фігурі 2, і амінокислотну послідовність від СОКІ до СОКЗ легкого ланцюга /5 антитіла 4.13.1, показану на фігурі 4; р) антитіла або фрагмента, що включають амінокислотну послідовність від СОКІ до СОКЗ важкого ланцюга антитіла 4.14.3, показану на фігурі 2, і амінокислотну послідовність від СОКІ до СОКЗ легкого ланцюга антитіла 4.14.3, показану на фігурі 4; с) антитіла або фрагмента, що включають амінокислотну послідовність від СОКІ! до СОКЗ важкого ланцюга 2о антитіла 6.1.1, показану на фігурі 2, і амінокислотну послідовність від СОКІТ до СОКЗ легкого ланцюга антитіла

6.1.1, показану на фігурі 5.
24. Антитіло або фрагмент за п. 1, що включають амінокислотну послідовність від СОКІ до СОКЗ важкого ланцюга антитіла 11.2.1, показану на фігурі 2, і амінокислотну послідовність від СОК1! до СОКЗ легкого ланцюга антитіла 11.2.1, показану на фігурі 5. сч
25. Антитіло або фрагмент за п. 1, які включають амінокислотну послідовність важкого ланцюга, що містить амінокислотні залишки 1-89 послідовності 5ЕС ІО МО:9, і додатково включають амінокислотну послідовність (8) легкого ланцюга, представлену в ЗЕО ІЮ МО:22.
26. Фармацевтична композиція, яка використовується при лікуванні раку, запалення або аутоїмунного захворювання, що включає антитіло або фрагмент за будь-яким з пп. 1-25 і фармацевтично прийнятний носій. Ге зо
27. Лінія клітин, що продукує антитіло або фрагмент за будь-яким з пп. 1-25.
28. Виділена нуклеїнова кислота, що кодує важкий і/або легкий ланцюг антитіла або фрагмента за будь-яким о з пп. 1-25. Ге!
29. Виділена нуклеїнова кислота за п. 28, операційно зв'язана з послідовністю, що керує експресією.
30. Спосіб одержання трансгенного ссавця, що не є людиною, або рослини, що включає стадію введення ісе) виділеної нуклеїнової кислоти за п. 28 або 29 в плюрипотентну клітину ссавця, що не є людиною, або рослини, ї- де вказаний трансгенний ссавець або рослина експресує вказану нуклеїнову кислоту.
31. Спосіб збільшення продукування 1-2 або ІЄМ-Г у Т-клітинах пацієнта, що включає стадію введення пацієнту антитіла або фрагмента за будь-яким з пп. 1-25 або фармацевтичної композиції за п. 26.
32. Спосіб збільшення цитотоксичної відповіді Т-клітин пацієнта, що включає стадію введення пацієнту « антитіла або фрагмента за будь-яким з пп. 1-25 або фармацевтичної композиції за п. 26. з с
33. Спосіб за п. 32, при якому вказане антитіло або фрагмент не опосередковують комплементзалежну цитотоксичність. ;»
34. Спосіб лікування пухлини у пацієнта, що включає стадії введення пацієнту комбінації, що включає антитіло або фрагмент за будь-яким з пп. 1-25 або фармацевтичну композицію за п. 26, і клітин, які експресують колонієстимулюючий фактор гранулоцитів-макрофагів. -І (22) се) о 50 42) Ф) іме) 60 б5