CZ302706B6 - Lidská monoklonální protilátka, farmaceutická kompozice tuto protilátku obsahující, bunecná linie produkující tuto protilátku, izolovaná molekula kódující težký nebo lehký retezec uvedené protilátky, hostitelská bunka obsahující tuto izolovanou molek - Google Patents

Abstract

Rešení se týká lidské monoklonální protilátky, která se váže na antigen 4 cytotoxických T lymfocytu, farmaceutické kompozice, která tuto protilátku obsahuje, bunecné linie produkující tuto protilátku, izolované molekuly, která kóduje težký nebo lehký retezec uvedené protilátky, hostitelské bunky obsahující uvedenou izolovanou molekulu a použití uvedené protilátky pro výrobu léciva pro zvýšení tvorby cytokinu v T bunkách.

Description

Lidská monoklonální protilátka, farmaceutická kompozice tuto protilátku obsahující, buněčná linie produkující tuto protilátku, izolovaná molekula kódující těžký nebo lehký řetězec uvedené protilátky, hostitelská buňka obsahující tuto izolovanou molekulu a použití uvedené protilátky

Oblast techniky

Vynález se týká lidské monoklonální protilátky, která se váže na antigen 4 cytotoxických T lymfocytů, farmaceutické kompozice, která tuto protilátku obsahuje, buněčné linie produkující tuto protilátku, izolované molekuly, která kóduje těžký nebo lehký řetězec uvedené protilátky, hostitelské buňky obsahující uvedenou izolovanou molekulu a použití uvedené protilátky pro výrobu léčiva pro zvýšení tvorby cytokinů v T buňkách.

Dosavadní stav techniky

Regulace imunitní reakce pacientů by poskytla žádoucí léčbu mnoha lidských nemocí, která by mohla vést ke specifickému účinku, jehož lze zřídka dosáhnout použitím běžných léků. Bylo by možné dosáhnout aktivace i utlumení reakcí imunitního systému. Úlohy T a B lymfocytů byly obsáhle studovány a charakterizovány ve spojitosti s regulací imunitní reakce. Z těchto studií vyplývá, že úloha T lymfocytů je v mnoha případech obzvláště důležitá při prevenci nemocí a léčbě.

T lymfocyty mají velmi složitý systém kontroly svých interakcí. Pro interakce mezi T lymfocyty jsou používány početné receptory a rozpustné faktory. Tudíž účinek každého konkrétního signálu na imunitní reakci se většinou mění a závisí na konkrétních faktorech, receptorech a protireceptorech, které jsou zapojeny do metabolické dráhy. Metabolické dráhy pro utlumení reakcí jsou stejně důležité jako drahý vyžadované pro aktivaci. Jeden mechanismus prevence imunitní reakce na konkrétní antigen je vyzrávání v thymu vedoucí k toleranci T lymfocytů. Jsou také známy další mechanismy, jako je například sekrece supresivních cytokinů.

Aktivace T lymfocytů nevyžaduje pouze stimulaci prostřednictvím antigenového receptorů (T buněčný receptor (TCR)), ale další signály prostřednictvím kostimulačních (společně stimulujících) povrchových molekul, jako je například CD28. Ligandy pro CD28 jsou proteiny B71 (CD80) a B7-2 (CD86), které jsou exprimovány na buňkách prezentujících antigen jako jsou například dendritické buňky, aktivované B lymfocyty nebo monocyty, které interagují s CD28 nebo CTLA—4 T lymfocytů pro zajištění kostimulačního signálu. Úloha kostimulačních signálů byla studována u experimentální alergické encefalomyelitidy (EAE) autory Perrinem et al. (Immunol. Res., 14, 189-99, 1995). EAE je autoimunitní porucha indukovaná buňkami Thl namířenými proti myelinovým antigenům, která poskytuje in vivo model pro studium úlohy B7 zprostředkované kostimulace v indukci patologické imunitní reakce. Použitím rozpustného ťuzního proteinového ligandů pro receptory B7, jakož i monoklonálních protilátek specifických buď pro CD80 nebo CD86, Perrin et al. prokázali, že B7 kostimulace má významnou úlohu pro určení klinického výsledku nemoci u EAE.

Interakce mezi B7 a CD28 je jedna z několika kostimulačních signálních drah, která se jeví postačující pro spuštění maturace a proliferace antigen-specifických T lymfocytů. Nedostatečná kostimulace a doprovodná nedostatečnost produkce IL-2 zabraňují následné proliferaci T lymfocytů a indukují stav nereaktivity nazývaný „anergie“. Aktivaci a proliferaci T lymfocytů může blokovat celá řada virů a nádorů, což vede k nepostačující aktivitě nebo nereaktivitě hostitelského imunitního systému k infikovaným nebo transformovaným buňkám. Z celé řady možných poruch T lymfocytů může být anergie alespoň částečně zodpovědná za selhání hostitele zbavit se patogenů nebo nádorových buněk.

- 1 CZ 302706 Β6

Použití proteinu B7 ke zprostředkování protinádorové imunity bylo popsáno v práci Chen et al. (Cell, 71, 1093-1102, 1992) a Townsend a Allison (Science, 259, 368, 1993). Schwartz (Cell, 71, 1065, 1992) podává přehled úlohy CD28, CTLA—4, a B7 v produkci IL—2 a imunoterapíí. Harding et al. (Nátuře, 356, 607-609, 1994) dokazuje, že signály zprostředkované CD28 kostimulují myší T lymfocyty a zabraňují indukci anergie u klonů T lymfocytů. (viz také patenty Spojených Států 5 434 131, 5 770 197, a 5 773 253, a mezinárodní patentové přihlášky WO 93/00431. WO 95/01994, WO 95/03408, WO 95/24217, a WO 95/33770).

Z výše uvedeného je jasné, že T lymfocyty vyžadují dva typy signálů od buněk prezentujících antigen (APC) pro aktivaci a následnou diferenciaci efektorové funkce. Zaprvé je zde antigenspecifický signál vznikající pro interakcích mezi TCR naT lymfocytech a molekulách MHC prezentujících peptidy na APC. Za druhé zde je signál na antigenů nezávislý, který je zprostředkován interakcí CD28 se členy rodiny B7 (B7-I (CD80) nebo B7-2 (CDB6)). Zpočátku bylo nejasné, kam přesně do prostředí imunitní reaktivity CTLA-4 patří. Myší CTLA—4 byl poprvé identifikován a klonován autory Brunet et al. (Nátuře, 328, 267-270, 1987) jako součást hledání molekul, které jsou přednostně exprimovány na cytotoxických T lymfocytech. Lidský CTLA—4 byl identifikován a klonován krátce nato autory Dariavach et al. (Eur. J. Immunol., 18, 19011905, 1988). Molekuly Č I LA—4 myšího a lidského původu mají přibližně celkem ze 76 % homologní sekvence a blíží se k úplné identitě sekvencí svých cytoplazmatickýeh domén (Dariavach et al., Eur. J. Immunol., 18, 1901-1905, 1988). CTLA—4 je člen imunoglobulinové (Ig) velké rodiny („su perlám i ly“) proteinů. Rodina Ig je skupina proteinů, které sdílejí klíčové strukturní charakteristické vlastnosti buď variabilních (V) nebo konstantních (C) domén Ig molekul. Členové Ig rodiny, bez omezení, zahrnují samotné imunoglobuliny, molekuly hlavního histokompatibilního komplexu (MHC) (tj. MHC třídy I a II) a molekuly TCR.

V roce 1991, Einsley et al. (J. Exp. Med., 174, 561-569, 1991) navrhovali, že CTLA—4 je druhý receptor pro B7. Podobně Harperet al. (J. Immunol., 147, 1037 44. 1991) prokázali, že molekuly CTLA 4 a CD28 jsou blíže příbuzné u myši a člověka, co se týče sekvence, exprese RNA, genové struktury a lokalizace chromozomů. (Viz také Balzano et al., Int. J. Cancer Suppl., 7, 28-32, 1992). Další důkaz pro tuto úlohu byl získán funkčními studiemi. Například Lanschow et al. (Science, 257, 789-792, 1992) prokázal, že CTLA—44g indukoval dlouhodobé přežívání štěpů pankreatických ostrůvků. Freeman et al. (Science, 262, 907-909, 1993) zkoumal úlohu CTLA-4 u myší s deficitem B7. Zkoumání ligandů pro CTLA-4 je popsáno v práci Lenschow et al. (P.N.A.S., 90, 11054-11058, 1993) Linsley et al. (Science, 257, 792-795, 1992) popisuje imunosupresi in vivo prostřednictvím rozpustné formy CTLA—4. Linsley et al. (J. Exp, Med. 176, 1595604, 1992) připravili protilátky, které váží Č I LA—4 a které nereagují zkříženě s CD28 a uzavřeli, že ČI LA 4 je exprimován společně (koexprimován) sCD28 na aktivovaných T lymfocytech a kooperativně reguluje adhezi T lymfocytů a aktivaci prostřednictvím B7. Kuchroo et al. (Cell, 80, 707-18, 1995) prokázali, že kostimulační molekuly B7-I a B7-2 odlišně aktivovaly vývojové metabolické dráhy Thl/Th2. Yiqun et al. (Int. Immunol. 8, 37-44, 1996) prokázali, že existují odlišné požadavky na kostimulační signály od Členů rodiny B7 pomocí klidových versus nově aktivovaných paměťových T lymfocytů vůči rozpustným upomínacím antigenům. (Viz také de Boer et al., Eur. J. Immunol., 23, 3120-5, 1993).

Několik skupin vědců navrhovalo alternativní nebo rozdílné interakce receptor/ligand pro CTLA-4 ve srovnání sCD28 a dokonce přemýšleli o třetím B-7 komplexu, který byl rozpoznáván prostřednictvím protilátky BB1. (Viz například Hathcock et al., Science, 262, 905-7, 1993, Freeman et al., Science, 262, 907-9, 1993, Freeman et al., J. Exp. Med., 178, 2185-92, 1993, Lenschow et al., Proč. Nati. Acad. Sci. U.S.A., 90, 11054-8, 1993, Razi-Wolf et al,, Proč. Nati. Acad. Sci. U.S.A., 90, 11182-6, 1993 a Boussiotís et al„ Proč. Nati. Acad. Sci. U.S.A., 90, 1 1059-63, 1993). Ale Freeman et al. (J. Immunol., 161, 2708-15, 1998) diskutovali zjištění, že protilátka BB1 váže molekulu, která je totožná s buněčnou povrchovou formou CD74, a tudíž BB1 mAB váže protein odlišný než je B7-I, a tento epitop se také vyskytuje na proteinu B7-1. Toto zjištění tedy vyžadovalo prostor pro opětné uvážení studií s použitím BB1 mAB v analýze exprese a funkce CD80.

-2CZ 302706 Bó

Počínaje rokem 1993 s kulminací v roce 1995 začali vědci dále zpřesňovat úlohu CTLA-4 ve stimulaci T lymfocytů. Nejdříve s použitím monoklonálních protilátek proti CTLA-4 Walunas et al. (lmmunity, 1, 405-13, 1994) poskytli důkaz, že CTLA-4 může působit jako negativní regulátor aktivace T lymfocytů. Potom Waterhouse et al. (Science, 270, 985-988, 1995) prokázali, že myši s deficitem CTLAM akumulovaly T lymfoblasty s aktivovanými aktivačními markéry ve svých lymfatických uzlinách a slezině. Blasty tak infiltrovaly játra, srdce, plíce a pankreatickou tkáň, a množství sérových imunoglobulinů bylo zvýšeno a T lymfocyty proliferovaly silně a spontánně, když byly stimulovány prostřednictvím T buněčného receptoru, ale byly senzitivní k buněčné smrti indukované obsazením (zesítěním „cross-linking”) receptorů Fas a zářením gama. Waterhouse et al. uzavřeli, že CTLA-4 působí jako negativní regulátor aktivace T lymfocytů aje životně důležitý pro kontrolu homeostázy lymfocytů. V komentáři ve stejném vydání Allison a Krummel Science, 270, 932-933, 1995) diskutovali práci Waterhouse et al. jako průkaznou, že CTLA -4 působí tak, že tlumí reaktivitu T lymfocytů nebo má inhibiční signální úlohu v aktivaci a vývoji T lymfocytů. Tivol et al. (lmmunity, 3, 541-7, 1995) také vytvořili myši s deficitem CTL A—4 a prokázali, že se u těchto myší rychle vyvíjejí lymfoprol iterativní choroby s mu 1tiorgánovou lymfocytámí infiltrací a tkáňovou destrukcí, s obzvláště závažnou myokarditídou a pankreatitidou. Uzavřeli, že CTLA-4 má klíčovou úlohu v tlumení aktivace T lymfocytů a udržování imunologické homeostázy. Krummel a Allison (J. Exp. Med., 182, 45965, 1995) dále objasnili, že CD28 a CTLA-4 mají opačné účinky na reakci T lymfocytů na stimulaci. Vytvořili protilátku proti CTL A—4 a zkoumali účinky její vazby na CTLA-4 v systému používajícímu vysoce purifikované T lymfocyty. Ve svém článku ukázali, že přítomnost nízkých hladin B7-2 na čerstvě explantované T lymfocyty může částečně inhibovat proliferaci T lymfocytů a tato inhibice byla zprostředkována interakcemi s CTLA-4. Zkřížená vazba CTLA—4 spolu s TCR a CD28 silně inhibuje proliferaci a sekreci IL—2 T lymfocyty. Konečně výsledky ukázaly, že CD28 a CTLA—4 předávají opačné signály, které se zdají být sjednoceny T lymfocyty při určování reakce na antigen. Autoři tudíž uzavřeli, že výsledek stimulace receptoru T lymfocytů antigenem je regulován CD28 kostimulačními signály, jakož i inhibičními signály pocházejícími od CTLA—4. (Viz také Krummel et ak, Int. Immunol., 8, 519-23, 1996, a patent Spojených Států 5 811 097 a mezinárodní patentová přihláška WO 97/20574).

Byla prováděna celá řada dalších pokusů pro další objasnění výše uvedené funkce CTI.A—4. Například Walunas et ak (J. Exp. Med., 183, 2541-50, 1996) prostřednictvím použití protilátek anti-CTLA-4 navrhovali, že signální dráha CTLA-4 nereguluje přežívání buněk nebo reaktivitu na IL-2, ale inhibuje produkci IL—2 závislou na CD28. Také Perrin et ak (J. Immunol., 157, 1333-6, 1996) prokázali, že protilátky anti-CTLA-4 použité u experimentální alergické encefalomyelitidy (EAE) exacerbovaly nemoc a zvýšily úmrtnost. Exacerbace nemoci byla spojena se zvýšenou produkcí encefalitogenních cytokinů TNF-alfa, IFN-gama a IL-2. Tito autoři tedy uzavřeli, že CTLA^4 reguluje intenzitu auto imunitní reakce u EAE, oslabuje produkci zánětlivých cytokinů a klinickou manifestaci nemoci. (Viz také Hurwitz et ak, J. Neuroimmunok, 73, 57-62, 1997 a Cepero et ak, J. Exp. Med., 188, 199-204, 1998) (anti-CTLA-4 „vlásenkový” ribozym, který specificky ruší expresi Č I LA—4 po přenosu genu do myšího modelu T lymfocytů).

Kromě toho Blair et ak (J. Immunol., 160, 12-5, 1998) vyhodnotili působení panelu CTLA-4 monoklonálních protilátek (mAb) na klidové lidské CD4+ T lymfocyty. Jejich výsledky prokázaly, že některé CTLA-4 mAb inhibovaly proliferaci klidových buněk CD4+ a přechodné stádium buněčného cyklu od G0 do Gl. Inhibiční vliv CTLA-4 byl zjevný během 4 hodin, v době, kdy exprese buněčného povrchového CTLA-4 nebyla detekovatelná. Ale další CTLA-4 mAb neměly zjistitelný inhibiční účinek, což indikovalo, že vazba mAb na samotný CTLA—4 nebyla postačující pro zprostředkování útlumu reakcí T lymfocytů. Je zajímavé, že zatímco produkce IL-2 byla zastavena, inhibiční anti-CTLA—4 mAb umožnily indukci a expresi genu přežívání buněk bcl-X(L). Ve shodě s tímto pozorováním zůstávaly buňky životaschopné a po ligaci CTLA-4 nebyla zjišťována apoptóza.

Ve spojitosti sanergií Perez et al. (lmmunity, 6, 411-7, 1997) prokázali, že indukci anergie T lymfocytů bylo zabráněno blokádou CTLA-4 a uzavřeli, že výsledek rozpoznávání antigenu T lymfocyty je určován interakcí CD28 nebo CTLA—4 na T lymfocytech s molekulami B7. Také Van Parijs et al. (J. Exp. Med., 186, 1119-28, 1997) zkoumali úlohu interleukinu 12 a kostímulátorů u anergie T lymfocytů in vivo a nalezli, že prostřednictvím inhibice zapojení C I LA^l v průběhu indukce anergie byla blokována proliferace T lymfocytů a nebyla podněcována plná diferenciace Thl, Ale T lymfocyty vystavené antigenu vyvolávajícímu toleranci v přítomnosti jak IL—12, tak protilátky anti-CTLA-4 nebyly anergizovány a chovaly se identicky jako T lymfocyty, které potkaly imunogenní antigen. Tyto výsledky svědčí pro to, že k indukci anergie in vivo přispívají dva procesy; zapojení CTLA-4, které vede k blokádě schopnosti T lymfocytů proliferovat, a absence prototypového zánětlivého cytokinů, 1L-12. který zabraňuje diferenciaci T lymfocytů na Thl efektorové buňky. Kombinace IL-12 a anti-CTLA-4 protilátky byla postačující ke konverzi normálně tolerovaného stimulu na imunogenní podnět.

Ve spojitosti s infekcemi prokázali McCoy et al. (J. Exp. Med., 186, 183-7, 1997), že antiCTLA-4 protilátky značně zesílily a urychlily imunitní reakci T lymfocytů na Nippostrongylus brasiliensis, což mělo za následek vydatnou redukci počtu dospělých červů a časné ukončení produkce vajíček parazitem. (Viz také Murphy et al., J. Immunol., 161,4153-4160, 1998) (Leishmania donovani).

Ve spojitosti s rakovinou zavedli Kwon et al. (PNAS USA, 94, 8099-103, 1997) syngenní myší model karcinomu prostaty a zkoumali dvě odlišné manipulace, o kterých se předpokládalo, že vyvolají reakci proti karcinomu prostaty prostřednictvím zvýšené kostimulace T lymfocytů: i) zabezpečení přímé kostimulace prostatickými rakovinnými buňkami transdukovanými tak, že exprimovaly ligand B7-1 a ii) in vivo blokáda CTI. A ^4 T lymfocytů zprostředkovaná protilátkou, což zabraňovalo útlumu T lymfocytů. Bylo prokázáno, že in vivo blokáda CTLA—4 zprostředkovaná protilátkou zvýšila imunitní reakci proti karcinomu prostaty. Také Yang et al. (Cancer Res., 57, 4036-41, 1997) studovali, zda blokáda funkce CTLA—4 vede k zesílení protinádorové odpovědi T lymfocytů v různých stádiích nádorového růstu. Na základě in vitro a in vivo výsledků zjistili, že blokáda CTLA-4 u jedinců s nádorem zvýšila kapacitu vytvářet protinádorovou odpověď T lymfocytů, ale exprese tohoto zesilujícího účinku v jejich modelu byla omezena na časná stádia růstu nádoru. Dáie Hurwitz et al. (Proč. Nati. Acad. Sci. U.S.A., 95, 10067-71, 1998) zjistili, že vyvolání protinádorové reakce zprostředkované T lymfocyty závisí na zapojení receptoru T lymfocytů hlavním histokompatibilním komplexem/antigenem, jakož i ligace CD28 prostřednictvím B7. Určité nádory, jako například karcinom prsu SMI, byly refrakterní na imunoterapii anti -CTLA^4. A tak díky použití kombinace blokády CTLA-4 a vakcíny obsahující faktor stimulující granulocytové a makrofágové kolonie exprimovaný buňkami SMI byla pozorována regrese parenterálních SMI nádorů, navzdory neúčinnosti každé jednotlivé léčby použité samotné. Tato kombinační léčba měla za následek dlouhotrvající imunitu na SMI a závisela jak na CD4(+), tak na CD8(+) T lymfocytech. Zjištění svědčí pro to, že blokáda CTLA^4 působí na úrovni buňky prezentující antigen pocházející z hostitele.

Ve spojitosti s diabetem Luhder et al. (J. Exp. Med., 187, 427-32. 1998) injikovali anti-CTLA 4 mAb do TCR transgenního myšího modelu diabetů v různých stádiích nemoci. Nalezli, že zapojení CTLA-4 v době, kdy jsou poprvé aktivovány potenciálně diabetogenní T lymfocyty, je klíčový jev, je-li zapojení tolerováno, nastává invaze ostrůvků, ale zůstává po celé měsíce zcela neškodná. Jestliže zapojení tolerováno není, inzulttida je mnohem agresivnější a rychle vzniká diabetes.

Ve spojitosti s imunizací prostřednictvím vakcíny zjistili Horspool et al. (J. Immunol., 160, 2706-14, 1998), že intaktní anti-CTLA-4 mAb, ale ne fragmenty Fab, tlumili primární humorální odpověd¹ na pClA/beta gal bez ovlivněni upomínací reakce, což naznačuje, že aktivace CTLA4 inhibovala produkci Ab, ale ne instruování („priming) T lymfocytů. Blokáda ligandů pro CD28 a CTLA-4, CD80 (B7-I) a CD86 (B7-2), odhalila rozdílnou a nepřekrývající se funkci. Blokáda CD80 při iniciální imunizací kompletně zrušila primární a sekundární Ab reakci, zatím-4 CZ 302706 B6 co blokáda CD86 tlumila odpověď primární, ale ne sekundární. Současná blokáda CD80 + CD86 byla méně účinná v tlumení Ab reakcí, než blokáda každého z nich samotného. Zesílení kosti mu láce prostřednictvím společné injekce plazmidu exprimujících B7 zvýšilo CTL reakce, ale ne Ab odpovědi, a bez průkazu asymetrie Thl kTh2. Tato zjištění svědčí pro složité a rozdílné úlohy CD28, CTLA-4, CD80 a CD86 při kostimulaci T lymfocytů po vakcinaci nukleovou kyselinou.

Ve spojitosti s rejekci štěpu zjistili Markees et al. (J. Clin. Invest., 101, 2446-55, 1998) v myším modelu rejekce kožního aloštěpu, že přijetí zpočátku záviselo na přítomnosti IFN-gamma, CTLA-4, a CD4(+) T lymfocytů. Přidání anti-CTLA-4 neb anti-ÍFN-gama mAb do laboratorního protokolu bylo spojeno s okamžitou rejekci štěpu, zatímco anti-IL-4 mAb neměla žádný účinek.

Ve spojitostí s úlohou CTL A—4 ve vztahu kCD28, Fallarino et al. (J. Exp. Med., 188, 205-10, 1998) vytvořili transgenní myši TCR/s deficitem genu 2 aktivujícího rekombinázu/ s CD28 divokým typem nebo s deficitem CD28, které byly imunizovány nádorem exprimujícím antigen. Instruované T lymfocyty od obou typů myší produkovaly cytokiny a proliferovaly při reakci na stimulující buňky bez exprese B7. Avšak zatímco odpověď CD28+/+ T lymfocytů zesílena kostimulací s B7-1, odpověď CD28-/- T lymfocytů byla silně inhibována. Tato inhibice byla zrušena monoklonální protilátkou proti B7-1 nebo CTL A—4. Tedy CTLA-4 mohou účinně inhibovat aktivaci T lymfocytů v nepřítomnosti CD28, což indikuje, že antagonismus signálu zprostředkovaného TCR je postačující pro vysvětlení inhibičního účinku CTLA^L Také Lin et al. (J. Exp. Med., 188, 199-204, 1998) studovali rejekci srdečních aloštěpů u myší s deficitem CD28. H-2(q) srdce byla transplantována do myší s alogenním divokým typem nebo s deficitem CD28 (H-2(b). Rejekce štěpu byla oddálena u myší s deficitem CD28 ve srovnání s myšmi s divokým typem. Ošetření příjemců s divokým typem s CTLA-4 imunoglobulinem (Ig) nebo santi-B7-l plus anti-B7-2 mAb významně prodloužilo přežívání aloštěpu. Na rozdíl od toho, ošetření myší s deficitem CD28 s CTLA-4-Ig, anti-B7-l plus anti-B7-2 mAb, nebo blokující anti-CTLA-4 mAb indukovalo akceleraci rejekce aloštěpu. Tato zvýšená rychlost rejekce štěpu byla spojena se závažnější infiltrací mononukleámími buňkami a zvýšenými hladinami transkriptů IFN-gama a IL-6 v dárcovských srdcích neošetřeného divokého typu a myší s deficitem CD28 ošetřených CTLA—4--Ig- nebo anti-CTLA-4 mAb. Tudíž negativní regulační úloha CTLA- 4 se šíří za jeho potenciální schopnost zabránit aktivaci CD28 prostřednictvím kompetice o ligand. Dokonce i v nepřítomnosti CD28 má CTLA^4 inhibiční účinek v regulaci rejekce aloštěpu.

Byla také studována další charakterizace exprese CTLA-4. Například Alegre et al. (J. Immunol., 157, 4762-70, 1996) navrhli, že povrchový CTLA-4 je rychle intemalizován, což může vysvětlit nízké hladiny exprese obecně zjišťované na povrchu buněk. Uzavřeli, že jak CD28 tak IL-2 mají důležité úlohy v aktivaci exprese CTLA-4. Kromě toho se zdá, že akumulace CTLA-4 na buněčném povrchu je primárně regulována jeho rychlou endocytózou. Také Castan et al. (Immunology, 90, 265-71, 1997) na základě in šitu imunohistologických analýz exprese ČI LA—4 naznačili, že germinální centra T lymfocytů, která byla CTLA-4 pozitivní, mohou být důležitá pro imunitní regulaci.

Podle toho ve světle široké a ústřední úlohy, kterou jak se ukazuje, CTLA-4 má v imunní reaktivitě, by bylo žádoucí vytvořit protilátky k CTLA-4, které mohou být účinně používány v imunoterapii. Navíc by bylo žádoucí vytvořit protilátky proti CTLA-4, které mohou být používány u chronických nemocí, u kterých je vyžadováno opakované podávání protilátek.

Podstata vynálezu

Předmětem vynálezu je lidská monoklonální protilátka, která se váže na antigen 4 cytotoxických T lymfocytů (CTLA-4) nebo její antigen-vázající fragment, kde uvedená protilátka obsahuje aminokyselinové sekvence CDR1, CDR2 a CDR3 uvedené v SEKVENCI ID. Č. 70 a aminokyselinové sekvence CDRI, CDR2 a CDR3 uvedené v SEKVENCI ID. Č. 71.

- 5 CZ 302706 B6

Výhodně se jedná o výše definovanou protilátku nebo její antigen-vázající fragment, kde lehký řetězec uvedené protilátky obsahuje aminokyselinovou sekvenci SEKVENCE ID. Č. 71.

Výhodně se jedná o výše definovanou protilátku nebo její antigen-vázající fragment, kde těžký řetězec uvedené protilátky obsahuje aminokyselinovou sekvenci SEKVENCE ID. Č. 70.

Výhodně se jedná o výše definovanou protilátku nebo její antigen-vázající fragment, kde uvedená protilátka obsahuje aminokyselinovou sekvenci variabilního úseku těžkého řetězce v SEKio VENCI ID. Č. 70 a aminokyselinovou sekvenci variabilního úseku lehkého řetězce v SEKVENCI ID.Č. 71.

Výhodně se jedná o výše definovanou protilátku, která obsahuje aminokyselinovou sekvenci těžkého řetězce SEKVENCE ID. Č. 70 a aminokyselinovou sekvenci lehkého řetězce SEKVEN15 CE ID.Č. 71.

Výhodně se jedná o výše definovanou protilátku nebo její antigen-vázající fragment, kde uvedená protilátka nebo její antigen-vázající fragment má jednu nebo více vlastností zvolených ze skupiny sestávající z následujících vlastností:

a) kompetitivně inhibuje vazbu C1LA-4 s uvedenou protilátkou;

b) váže se na stejný epitop jako uvedená protilátka; a

e) váže se na CTLA4 se stejnou specifičností jako uvedená protilátka.

Výhodně se jedná o výše uvedenou protilátku nebo její antigen-vázající fragment, přičemž uvedená protilátka nebo její antigen-vázající fragment kompetitivně inhibuje vazbu CTLA-4 s protilátkou obsahující aminokyselinovou sekvenci těžkého řetězce SEKVENCE ID. Č. 70 a aminokyselinovou sekvenci lehkého řetězce SEKVENCE ID. Č. 71.

Výhodně se jedná o výše uvedenou monoklonální protilátku, která se váže na Č I LA—1. nebo její antigen-vázající fragment, přičemž uvedená protilátka obsahuje:

a) těžký řetězec obsahující aminokyselinovou sekvenci SEKVENCE ID. Č. 9 nebo aminokyselinovou sekvenci s ní alespoň z 90 % identickou; a

b) lehký řetězec obsahující aminokyselinovou sekvenci SEKVENCE ID. Č. 22 nebo aminokyselinovou sekvenci s ní alespoň z 90 % identickou.

přičemž uvedená protilátka nebo její antigen-vázající fragment má vazebnou afinitu pro CTLA-4 40 19⁹ M nebo vyšší, inhibuje vazbu mezi CTLA-4 a B7-I s IC50 100 nM nebo nižší a inhibuje vazbu mezi CTLA^l a B7-2 s IC_5tí 100 nM nebo nižší.

Výhodně se jedná o výše uvedenou protilátku nebo její antigen-vázající fragment, kde uvedená protilátka nebo fragment inhibuje vazbu lidského CTLA-4 na B7-1 s IC50 ΙΟΟηΜ nebo nižší a inhibuje vazbu lidského Č I LA 4 na B7-2 s IC50 100 nM nebo nižší, přičemž uvedená protilátka má alespoň jednou vlastnost zvolenou ze skupiny sestávající z následujících vlastností:

a) váže se na CTLA-4 s vazebnou afinitou ΙΟ⁹ M nebo vyšší;

b) zvyšuje produkci cytokinů v testu lidských T lymfocytů o 500 pg/ml nebo více;

5o c) zvyšuje produkci IL-2 v testu lidských T lymfocytů o 500 pg/ml nebo více,

d) zvyšuje produkci interferonu-γ v testu lidských T lymfocytů o 500 pg/ml nebo více,

e) naváže se na CTLA-4 myši, potkana nebo králíka a

-6 CZ 302706 Bó

f) váže se na CTLA-4 cynomologního makaka (Macaca fascicularis) a rhesus makaka (Macaca mullata).

Výhodně se jedná o výše uvedenou protilátku nebo její antigen-vázající fragment, kde uvedená protilátka ínhibuje vazbu lidského CTLA-4 na B7- 1 s IC_5O 0,50 nM nebo nižší a ínhibuje vazbu lidského CTLA-4 na B7-2 s IC₅₀ 0,38 nM nebo nižší.

Předmětem vynálezu je rovněž farmaceutická kompozice pro léčení rakoviny a zánčtlivých nebo autoimunitních onemocnění, jejíž podstata spočívá v tom, že obsahuje výše uvedenou protilátku nebo fragment a farmaceuticky přijatelný nosič.

Předmětem vynálezu je rovněž buněčná linie produkující výše uvedenou protilátku nebo fragment.

Předmětem vynálezu je rovněž izolovaná molekula nukleové kyseliny, která kóduje těžký řetězec nebo jeho antigen-vázající fragment nebo lehký řetězec nebo jeho antigen-vázající fragment výše uvedené protilátky.

Výhodně se jedná o izolovaná molekulu nukleové kyseliny, kteráje operativně spojená s kontrolní expresní sekvencí.

Předmětem vynálezu je rovněž hostitelská buňka obsahující uvedenou izolovanou molekulu nukleové kyseliny.

Předmětem vynálezu je rovněž použití výše uvedené protilátky nebo jejího fragmentu nebo výše uvedené farmaceutické kompozice pro výrobu léčiva pro zvýšení tvorby cytokinů v T buňkách nebo pro zesílení odezvy cytotoxických T buněk.

Výhodně se jedná o uvedené použití, kdy se protilátka nebo její fragment nepodílejí na cytotoxicitě závislé na komplementu.

Předmětem vynálezu je rovněž kombinace obsahující výše uvedenou protilátku nebo její fragment nebo výše uvedené farmaceutické kompozice a buněk exprimujících faktor stimulující kolonie granulocytů-makrofágů pro výrobu léčiva pro léčení nádoru u subjektu trpícího tímto nádorem.

Popis obrázků

Obrázek 1 popisuje řadu nukleotidových a aminokyselinových sekvencí těžkého řetězce a lehkého řetězce kapa (κ) imunoglobulinových molekul podle vynálezu: 4.14 (obrázek IA), 4,8.1 (obrázek 1B), 4.14.3 (obrázek IC), 6.1.1 (obrázek ID), 3.1.1 (obrázek 1E), 4.10.2 (obrázek 1F), 2.1.3 (obrázek IG), 4.13.1 (obrázek IH), 11.24 (obrázek 11), 11.6.1 (obrázek IJ), 11.74 (obrázek 1K), 12.344 (obrázek IL) a 12.944 (obrázek 1M).

Obrázek 2 poskytuje srovnání sekvencí mezi před i kovaný mi aminokyselinovými sekvencemi těžkého řetězce zklonů 444, 4.84, 444.3, 644, 344, 440.2, 4434, 11.24, 11.64, 11.74, 12.34 4, a 12.94 4 a aminokyselinová sekvence zárodečné linie DP-50 (3-33). Rozdíly v aminokyselinové sekvenci zárodečné linie DP-50 a sekvencí v klonu jsou znázorněny tučně. Obrázek také ukazuje pozici sekvencí CDR1. CDR2 a CDR3, které jsou vystínovány.

Obrázek 3 ukazuje přiřazení sekvencí predí kované aminokyselinové sekvence těžkého řetězce klonu 24.3 a zárodečné linie DP-65 (4-31). Rozdíly v aminokyselinové sekvenci zárodečné linie DP-65 a sekvencí v klonu jsou znázorněny tučně. Obrázek také ukazuje pozici sekvencí CDR1, CDR2 a CDR3, které jsou podtrženy.

-7 CZ 302706 B6

Obrázek 4 ukazuje přiřazení predikované aminokyselinové sekvence lehkého řetězce kapa klonil

4.1.1, 4.8.1, 4.14.3, 6.1.1, 4.10.2 a 4.13.1 a zárodečné linie Λ27 aminokyselinové sekvence. Rozdíly v aminokyselinové sekvenci zárodečné linie Λ27 a sekvencí v klonu jsou znázorněny lučně. Obrázek také ukazuje pozici sekvencí CDRt, CDR2 a CDR3 protilátky, které jsou podtrženy. Zjevné delece v úseku CDR1 klonů 4.8.1,4.14.3 a 6.1.1 jsou označeny symboly ,-Ο'“.

Obrázek 5 ukazuje přiřazení predikované aminokyselinové sekvence lehkého řetězce kapa klonů

3.1.1, 12.2.1, 1 1.6.1, a 1 1.7.1 a zárodečné linie 012. Rozdíly v aminokyselinové sekvenci zároKi dečné linie 012 a sekvencí v klonu jsou znázorněny tučně. Obrázek také ukazuje pozici sekvencí

ODŘI, CDR2 a CDR3 protilátky, které jsou podtrženy.

Obrázek 6 ukazuje přiřazení predikované aminokyselinové sekvence lehkého řetězce kapa klonu 2.1.3 a sekvencí zárodečné linie A10/A26. Rozdíly v aminokyselinové sekvenci zárodečné linie

A1O/A26 a sekvencí klonu jsou znázorněny tučně. Obrázek také ukazuje pozici sekvencí CDRI,

CDR2 a CDR3 protilátky, které jsou podtrženy.

Obrázek 7 ukazuje přiřazení predikované aminokyselinové sekvence lehkého řetězce kapa klonu

12.3.1 a sekvencí zárodečné linie A17. Rozdíly v aminokyselinové sekvenci zárodečné linie AI7 20 a sekvencí klonu jsou znázorněny tučně. Obrázek také ukazuje pozici sekvencí CDRI, CDR2 a CDR3 protilátky, které jsou podtrženy.

Obrázek 8 ukazuje přiřazení predikované aminokyselinové sekvence lehkého řetězce kapa klonu

12.9.1 a sekvencí zárodečné linie A3/AI9. Rozdíly v aminokyselinové sekvenci zárodečné linie

Λ3/Α19 a sekvencí klonu jsou znázorněny tučně. Obrázek také ukazuje pozici sekvencí CDRI,

CDR2 a CDR3 protilátky, které jsou podtrženy.

Obrázek 9 ukazuje souhrn N-koncové aminokyselinové sekvence získaný přímým proteinovým sekvencováním těžkého a lehkého řetězce protilátek,

Obrázek 10 uvádí některé další charakteristiky některých protilátek podle vynálezu. Na obr. 10A jsou shrnuta data týkající se klonů 3.1.1, 4.1.1, 4.8.1, 4.10.2, 4.14.3 a 6.1.1 Data týkající se koncentrace, isoelektrického ťokusingu (IEF), SDS-PAGE, vylučovací chromatografie, kapalinové chromatografie/hmotové spektroskopie (LCMS), hmotové spektroskopie (MALDI), N-koneové sekvence lehkého řetězce jsou uvedena. Další detailní údaje týkající se IEF jsou na obr. 10B, data týkající se SDS-PAGE na obr. i 0C a SEC protilátky klonu 4.1.1. na obr. 10D.

Obrázek I 1 ukazuje expresi B7-1 a B7-2 na buňkách Ráji užitím monoklonálních protilátek (mAb) anti-CD8O-PE a antiCD86-PH.

H)

Obrázek 12 ukazuje na koncentraci závislé zvýšení produkce IL-2 v testu T lymfoblastů/Raji indukované blokujícími protilátkami anti-GTLA-4 (BNI3, 4.1.1,4.8.1 a 6.1.1).

Obrázek 13 ukazuje na koncentraci závislé zvýšení produkce IFN-γ v testu ΐ lymfoblastů/Raji 45 indukované blokujícími protilátkami anti CTLA—1 (BNI3, 4.1.1., 4.8.1 a 6.1.1) (shodné donorové T-buňky).

Obrázek 14 ukazuje průměrné zvýšení produkce IL-2 T-buňkami ze 6 donorů indukovaných blokujícími monoklonálními protilátkami anti-CTLA-4 testu T-buňky blast/Raji.

Obr. 15 ukazuje průměrné zvýšení produkce IFN-γ T-buňkami ze 6 donorů indukovaných blokujícími monoklonálními protilátkami anti-CTLA-4 testu Ί-buňky blast/Raji.

-8CZ 302706 Β6

Obr. 16 ukazuje průměrné zvýšení produkce 1L 2 v hPBMC z 5 donorů indukovaných blokujícími monoklonálntmi protilátkami anti-CTLA-4 testu T-buňky blast/Raji, měřeno 72 hodin po stimulaci SEA.

Obr. 17 ukazuje průměrné zvýšení produkce IL-2 v celé krvi ze 3 donorů indukovaných blokujícími monoklonální mi protilátkami anti-CTLA—4 testu T-buňky blast/Raji, měřeno 72 a 96 hodin po stimulaci SEA.

Obrázek 18 ukazuje zvýšení produkce IL-2 indukované protilátkami anti-CTLA-4 (4,1.1 a 11.2.1) podle vynálezu v testu T blast/Raji a Superantigen po 72 hodinách (mononukleámí buňky z celé krve a periferní krve ze 6 dárců).

Obrázek 20 ukazuje na dávce závislé zvýšení produkce IL-2 indukované protilátkami antiCTLA-4 (4. L1 a 11.2.1) podle vynálezu v testu T blast/Raji a Superantigen po 72 hodinách.

Obrázek 21 ukazuje na dávce závislé zvýšení produkce IL-2 indukované protilátkami antiCTLA-4 (4.1.1 a 11.2.1) podle vynálezu v testu a Superantigenu po 72 hodinách, kde celá krev byla stimulovaná 100 ng/ml superantigenu.

Obr. 22 ukazuje sérii dalších nukleotidových a aminokyselinových sekvencí následujících řetězců protilátek anti-CTLA-4: těžký řetězec 4.1.1 plné délky (cDNA 22(a), genomická sekvence 22(b), a aminokyselinová sekvence 22(c)), aglykosylovaný těžký řetězec plné 4.1.1 (cDNA 22(d) a aminokyselinová sekvence 22(e)), lehký řetězec 4.1.1 (cDNA 22(f) a aminokyselinová sekvence 22(g)), těžký řetězec 4.8.1 plné délky (cDNA 22(h) a aminokyselinová sekvence 22(i)), lehký řetězec 4.8.1 (cDNA 22(j) a aminokyselinová sekvence 22(k)), těžký řetězec 6.1.1 plné délky (cDNA 22(1) a aminokyselinová sekvence 22(m)), lehký řetězec 6.L1 (cDNA 22(n) a aminokyselinová sekvence 22(o)), těžký řetězec 11.2.1 plné délky (cDNA 22(p) a aminokyselinová sekvence 22(q)), a lehký řetězec 11.2.1 (cDNA 22 (r) a aminokyselinová sekvence 22(s)). Podrobný popis vynálezu

Předkládaný vynález poskytuje plně lidskou monoklonální protilátku proti lidskému CTLA-4. Vynález zejména poskytuje také nukleotidová sekvence kódující aminokyselinové sekvence obsahující těžký a lehký řetězec imunoglobulinových molekul, zejména sekvence odpovídající souvislým sekvencím těžkého a lehkého řetězce zFRl a CDR1 a CDR3 a FR4. Dále vynález poskytuje protilátky mající podobné vazebné vlastnosti jako protilátky a protilátky (nebo jiné antagonisty) mající podobné funkce jako protilátky popsané ve vynálezu. Také poskytuje hybridomy exprimující tyto imunoglobulinové molekuly a také monoklonální protilátky.

Definice

Pokud není definováno jinak, vědecké a technické termíny jsou v předkládané přihlášce užívány v tom smyslu, jak jsou odborníkovi obecně srozumitelné. Pokud ze souvislosti nevyplývá opak, termíny použité v jednotném čísle zahrnují i množné číslo a termíny použité v množném čísle zahrnují i jednotné číslo. Obecně jsou názvosloví a metody použité v této přihlášce v souvislosti s buněčnými a tkáňovými kulturami, molekulární biologií, biochemií proteinů, oligonukleotidů a polynukleotidů a hybridizačním technikami obecně známé a odborníkovi srozumitelné. Pro rekombinantní DNA, syntézu oligonukleotidů, tkáňové kultury a transformace byly užity standardní postupy odborníkovi známé (jako je např. elektroforéza, lipofekce atd.). Enzymatické reakce a purifíkační metody se prováděly podle návodů výrobce, nebo obecně známými postupy a nebo jak je popsáno zde. Všechny zmíněné metody se prováděly odborníkovi známým způsobem, jak byly popsány v obecných příručkách, jako je např. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989, nebo ve specifických publikacích, kteréjsou dále v textu citovány, a tyto citace jsou formou odkazu do přihlášky zahrnuty. Názvosloví použité v přihlášce v souvislosti s laboratorními postupy z oboru

- 9 CZ 302706 B6 analytické chemie, organické sy ntetické chemie a lékařské a farmaceutické chemie jsou obecně užívané a odborníkovi známé. Pro chemické syntézy, chemické analýzy, přípravu a formulaci farmaceutických přípravků a podávání přípravků pacientům a léčení byly užity standardní postupy odborníkům známé.

Následující termíny užívané v přihlášce mají, pokud není specificky uvedeno jinak, následující význam:

Termín „izolovaný polynukleotid“ znamená podle vynálezu polynukleotid genomové DNA, cDNA nebo syntetického původu nebo jakoukoliv jejich kombinaci, který je „izolovaný“ tím, že l) není spojen ani s celým ani s části polynukleotidu, ve kterém se „izolovaný polynukleotid“ nalézá v přírodě, 2) je operativně spojený s polynukleotidem, se kterým není v přírodě spojen, nebo 3) v přírodě se nevyskytuje jako součást delší sekvence.

Termín „izolovaný protein“ znamená podle vynálezu protein vzniklý na základě cDNA, rekombinantní RNA nebo syntetickým způsobem nebo jakoukoliv jejich kombinací, který je „izolovaný“ vzhledem k původu nebo vzniku tím, že 1) není spojen s proteiny tak, jak se nachází v přírodě, 2) neobsahuje další proteiny ze stejného zdroje, např. neobsahuje žádné další proteiny z myši, a 3) je exprimován buňkami jiného biologického druhu, nebo 4) nevyskytuje se v přírodě.

Termín „polypeptid“ se užívá v popisu vynálezu jako generický termín a označuje nativní protein, fragmenty nebo analogy polypeptidové sekvence. Tudíž nativní protein, fragmenty nebo analogy jsou „druhy“ polypepťidového „rodu“. Výhodné polypeptidy podle předkládaného vynálezu jsou např. molekuly těžkého řetězce lidského imunoglobulinu a molekuly lehkého řetězce kapa lidského imunoglobulinu uvedené na obr. I, a také molekuly protilátek vytvořené jejich kombinací, obsahující molekuly těžkého řetězce s molekulami lehkého řetězce, např. lehkého řetězce kapa lidského imunoglobulinu, a také naopak, a také jejich fragmenty a analogy.

Termín „přirozeně se vyskytující“ nebo „vyskytující se v přírodě“ se v popisu vynálezu týká skutečnosti, že příslušný předmět lze nalézt v přírodě. Tak např. polypeptid nebo polynukleotidová sekvence, které jsou přítomny v organismu (včetně virů) a které z takové přírodního zdroje mohou být izolovány a nebyly přitom záměrně člověkem modifikovány, ať už v laboratoři nebo jinak, jsou „přirozeně se vyskytující.

Termín „operativně spojený“ v popisu vynálezu označuje to, že složky jsou v takové pozici, která jim umožňuje zamýšlenou funkci. Kontrolní sekvence operativně spojená škodující sekvencí je ligována s kódující sekvencí takovým způsobem, aby bylo dosaženo exprese kódující sekvence za podmínek vhodných pro funkci kontrolní sekvence.

Termín „kontrolní sekvence“ označuje v popisu vynález polynukleotidovou sekvenci, která je nutná k expresi a obecně k činnosti kódující sekvence, ke kteréje ligována (připojena). Kontrolní sekvence jsou různé povahy v závislosti na hostitelském organismu: u prokaryotických organismů obsahuje kontrolní sekvence obecně promotor, ribozomální vazebné místo a term i nač ní sekvenci transkripce, u eukaryotických organismů obsahuje kontrolní sekvence obecně promotor a terminační sekvenci transkripce. Termín „kontrolní sekvence“ zahrnuje jakožto minimum všechny složky, jejichž přítomnost je nezbytná pro expresi a „zpracování“ DNA, přitom může obsahovat ještě další složky, jejichž přítomnost je výhodná, např. vedoucí sekvenci („leader“) nebo partnerskou fúzní sekvenci.

Termín „polynukleotid“ podle předkládaného vynálezu znamená polymemí formu nukleotidů délky nejméně 10 baží, a to buďto ribonukleotidů nebo deoxyribonukleotidů nebo modifikované formy obou těchto typů nukleotidů. Termín přitom zahrnuje jak jednořetězcové tak dvouřetězcové formy DNA.

- 10CZ 302706 B6

Termín „oligonukleotid“ podle vynálezu označuje přirozeně se vyskytující i modifikované nukleotidy navázané oligonukleotidovými vazbami přirozeně se vyskytujícími nebo jinými než přirozeně se vyskytujícími. Oligonukleotidy jsou obecně podmnožinou polynukleotidu a obsahují přibližně 200 bází nebo méné. Výhodné oligonukleotidy obsahují 10 až 60 bází a nejvýhodněji 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 nebo 20 až 40 bází. Oligonukleotidy jsou obvykle jednořetězcové, např. oligonukleotidové sondy, ačkoliv mohou být i dvouřetězcové, např. pro konstrukci mutovaných genů. Oligonukleotidy podle vynálezu jsou buďto „sense“ nebo „antisense“ oligonukleotidy. Termín „přirozeně se vyskytující oligonukleotidy“ označuje jak ribonukleotidy tak i deoxyribonukleotidy. Termín „modifikované oligonukleotidy“ označuje v popisu vynálezu nukleotidy s modifikovanými nebo substituovanými cukernými skupinami a podobně. Termín „oligonukleotidové vazby“ označuje oligonukleotidové vazby jako je vazba fosforothioátová, fosforodithioátová, fosforoselenoátová, fosfordiselenoátová, fosfbroanilothoátová, fosforoaniladátová, fosforoamidátová a další. Viz např. publikace LaPlanche et al. Nucl. Acids Res. 14:9081 (1986); Stec etal. J. Am. Chem. Soc. 106:6077(1984); Stein et al. Nucl. Acids Res. 16:3209 (1988); Zon et al. Anti-Cancer Drug Design 6:539 (1991); Zon et al. Oligonucleotides and Analogues: A Practival Approach, pp. 87-108 (F. Eckstein, Ed., Oxford University Press, Oxford England (1991)); Stec et al. U.S. Patent 5,151,510; Uhlmann and Peyman Chemical Reviews 90:543 (1990), které jsou zahrnuty formou odkazu. Všechny oligonukleotidy mohou být pro detekci označeny, pokud je to třeba.

Termín „selektivně hybridizovat“ znamená v popisu vynálezu detekovatelné a specificky se vázat. Póly nukleotidy, oligonukleotidy ajejich fragmenty podle vynálezu selektivně hybridizují s řetězci nukleových kyselin za podmínek hybridizace a promývání, kdy je minimalizováno množství detekovatelné vazby nespecifických nukleových kyselin. Podmínky s vysokou stringencí se užívají k dosažení selektivní hybridizace, což je odborníkům známo a bude zde ještě diskutováno. Obecně homologie sekvencí nukleových kyselin mezi polynukleotidy, oligonukleotidy a fragmenty sekvencí nukleových kyselin podle vynálezu a požadovanými nukleovými kyselinami je nejméně 80 % a více, výhodně s rostoucí homologii alespoň 85%, 90%, 95%, 99% a 100%. Dvě aminokyselinové sekvence jsou homologní, pokud je zde Částečná nebo úplná identita mezi jejich sekvencemi. Tak např. 85% homologie znamená, že 85 % aminokyselin je identických, když jsou dvě sekvence přiřazeny („alignment“) s dosažením maximální shody („matching“). Mezery (vjedné ze dvou přirazených sekvencí) jsou povoleny, aby bylo dosaženo maximální shody, výhodné jsou mezeiy velikosti 5 nebo kratší, nejvýhodnější jsou mezery velikosti dvě nebo kratší. Alternativně a výhodně, dvě proteinové sekvence (nebo dvě polypeptidové sekvence z nich odvozené dlouhé alespoň 30 aminokyselin) jsou homologní, ve smyslu zde užívaného termínu, pokud mají skóre shody přiřazení vyšší než 5 (v jednotkách standardní odchylky) při užití programu AL1GN s mutační datovou maticí a sankcí za mezeru 6 nebo více. Viz Dayhoff, M. O„ in Atlas of Protein: Sequence and Structure, str. 101-110 (Volume 5, National Biomedical Research Foundation (1972)), a Supplement 2 k tomuto dílu, str. 1-10. Dvě sekvence nebo jejich části jsou výhodně homologní, když jejich aminokyseliny jsou z 50% a více identické při dosažení optimální shody přiřazení v programu AL1GN. Termín „odpovídá“ se v popisu vynálezu užívá ve významu, že polynukleotidová sekvence je homologní (tj. identická, nikoliv evolučně příbuzná) s celou nebo částí referenční póly nukleotidové sekvence, nebo že polypeptidová sekvence je identická s referenční polypeptidovou sekvencí. Naproti tomu termín „komplementární“ znamená, že komplementární sekvence je homologní k části nebo celé polynukleotidové sekvence, ke které se srovnává. Tak pro ilustraci nukleotidová sekvence „TATAC“ odpovídá referenční sekvenci „TATAC“ a je komplementární k referenční sekvenci „GTATA“.

Následující termíny se užívají k popisu vztahů mezi dvěma nebo více polynukleotidovými nebo aminokyselinovými sekvencemi: „referenční sekvence“, „srovnávací okno“, „sekvenční identita“, „procento sekvenční identity“ a „podstatná identita“. „Referenční sekvence“ je definována jako sekvence použitá jako základ pro srovnávání sekvencí, referenční sekvence může být podmnožina vetší sekvence, např. segment cDNA plné délky nebo genové sekvence uvedené v seznamu sekvencí, nebo může obsahovat celou cDNA nebo genovou sekvenci. Obecně je referenční sekvence dlouhá alespoň 18 nukleotidů nebo 6 aminokyselin, často 24 nukleotidů nebo 8 amino- 11 C Z 302706 B6 kyselin, a častěji alespoň 48 nukleotidů nebo 16 aminokyselin. Jelikož v případě dvou polynukleolitlů nebo aminokyselinových sekvencí každý/á z nich I) může obsahovat sekvenci (tj. část úplné polynukleotidové nebo aminokyselinové sekvence), která je pro obč molekuly podobná a 2) dále může obsahoval sekvenci, která je pro obě molekuly odlišná, srovnávání dvou nebo více sekvencí se provádí obvykle pomocí tzv. „srovnávacího okna“ pro identifikaci a srovnání lokálních úseku sekvenční identity/podobnosti. Termín „srovnávací okno“ označuje myšlený segment alespoň 18 souvisle po sobě následujících nukleotidových pozic nebo 6 aminokyselin, kde polynukleotidová sekvence nebo aminokyselinová sekvence může být srovnána s referenční sekvencí alespoň 18 souvisle po sobě jdoucích nukleotidů nebo sekvencí 6 aminokyselin, přičemž úsek polynukleotidové sekvence ve srovnávacím okně může obsahovat adice, delece, substituce apod. (tj. mezery) z 20 % nebo méně ve srovnání s referenční sekvencí (která neobsahuje adice nebo delece) pro dosažení optimální shody přiřazení dvou sekvencí. Optimální přiřazení sekvencí při porovnávání srovnávacích oken může být prováděno algoritmem lokální homologie podle Smith a Waterman Adv. Appl. Math. 2:482 (1981), algoritmem homologního přiřazení podle Needleman and Wunsch J. Mol. Biol. 48:443 (1970), metodou vyhledávání podobnosti podle Perason and Lipman Proč. Natí Acad. Sci. (U.S.A.) 85:2444 (1988), počítačovou implementací těchto algoritmů (GAP, BESTFIT, FASTA, a TFASTA v programovém balíku Wísconsin Genetics Software Package Release 7.0 od Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.), nebo v programovém balíku Geneworsk nebo MacVector), nebo prohlížením, a nejlepší přiřazení (které vede k nej vyššímu procentu homologie ve srovnávacím okně) získané různými metodami se vybere.

Termín „sekvenční identita znamená identitu dvou polynukleotidových nebo aminokyselinových sekvencí (tj. jsou identické na bázi nukleotid za nukleotidem nebo zbytek za zbytkem) ve srovnávacím okně. Termín „procento sekvenční identity“ označuje hodnotu, která se vypočte porovnáním dvou optimálně přiřazených sekvencí ve srovnávacím okně a určením počtu pozic, kde jsou identické báze (např. A, T, C, G, U nebo I) nebo aminokyselinové zbytky v obou sekvencích, čímž se získá počet shodných pozic, a tento počet shodných pozic se dělí celkovým počtem pozic ve srovnávacím okně (tj. velikostí okna) a výsledek se vynásobí 100, čímž se dostane hodnota procenta sekvenční identity. Termín „podstatná identita“ v přihlášce označuje vlastnosti polynukleotidové nebo aminokyselinové sekvence, kdy polynukleotidová nebo aminokyselinová sekvence obsahuje sekvenci, která má alespoň 85% sekvenční identitu, výhodně alespoň 90 až 95% sekvenční identitu, a nejvýhodněji a nejobvykleji alespoň 99% sekvenční identitu při srovnání s referenční sekvencí ve srovnávacím okně velikosti alespoň 18 nukleotidů (6 aminokyselin), často velikosti alespoň 24 až 48 nukleotidů (8 až 16 aminokyselin), kdy procento sekvenční identity se vypočítává ze srovnání referenční sekvence se sekvencí, která může obsahovat delece nebo adice představující nejvýše 20 % celkové referenční sekvence ve srovnávacím okně.

V popisu vynálezu se pro označení 20 esenciálních aminokyselin užívají konvenční zkratky, viz publikace hntnunology - A Synthesis (2^,ui Edition, E. S. Golub and D. R. Gren, Eds., Sinauer Associates, Sunderland, Mass. 20 (1991)), která je vložena formou odkazu. Stereoisomery dvaceti konvenčních aminokyselin (např. D-aminokyseliny), přírodně se nevyskytující aminokyseliny, jako např. ct-, ad i substituované aminokyseliny, N-alkylaminokyseliny, kyselina mléčná a další neobvyklé aminokyseliny mohou být také vhodné složky polypeptidu podle předkládaného vynálezu. K příkladům neobvyklých aminokyselin patří: 4-hydroxyprolin, γ-karboxyglutamát ε-Ν,Ν,Ν-trimethyllysin, ε -N-acetyllysině, O-fosfoserin, N-aeetylserin, N-formylmethionin, 3-methylhistidin, 5-hydroxylysín, σ-N-methylargÍnin, a další podobné aminokyseliny (např. 4-hydroxyprolin). Při označování polypeptidu v popisu vynálezu je vlevo amino-koncová část a vpravo karboxy-koncová část polypeptidu v souladu s konvencí odborníkovi známou.

Obdobně, pokud není specifikováno jinak, levý konec jednořetězcové polynukleotidové sekvence je 5’ -konec a tudíž směr vlevo u dvouřetězcové polynukleotidové sekvence je označován jako

5'-směr. Směr od 5'-konce do 3' konce. kterým vzniká RNA transkript je označován jako směr transkripce, úseky DNA řetězce mající stejnou sekvenci jako RNA, ležící 5-směrem od 5'konce RNA transkriptu jsou označovány jako „upstream“ (tj, proti směru transkripce) sekvence.

- 12 CZ 302706 B6 úseky DNA řetězce mající stejnou sekvenci jako RNA, ležící 3'-směrem od 3'-konce RNA transkriptu jsou označovány jako „downstream“ (tj. po směru transkripce) sekvence.

Při aplikaci na póly peptidy termín „podstatná identita“ znamená, že dvě peptidové sekvence, s pokud jsou optimálně přiřazeny, jako např. v programu GAP nebo BESTFIt při použití předem nastavených hodnot váhy mezery, sdílejí alespoň 80% sekvenční identitu, výhodně alespoň 90% sekvenční identitu, výhodněji 95% sekvenční identitu a nejvýhodněji alespoň 99% sekvenční identitu. Výhodně aminokyselinové zbytky v pozicích, které nejsou identické, se liší konzervativní substitucí aminokyseliny. Konzervativní aminokyselinové substituce jsou vzájemně záměny io takových aminokyselin, které mají podobné postranní řetězce, tak např. skupiny aminokyselin s alifatickým postranním řetězcem obsahuje glycin, alanin, valin, leucin a isoleucin, skupina aminokyselin majících alifatický-hydroxylový postranní řetězec obsahuje serin athreonin, skupina aminokyselin s postranním řetězcem obsahujícím amidovou skupinu obsahuje asparagin a glutamin, skupina aminokyselin majících aromatické postranní řetězce obsahuje fenylalanin, is ty ros i n a tryptofan, skupina aminokyselin majících bazický postranní řetězec obsahuje lysin, arginin a histidin, a skupina aminokyselin majících postranní řetězec obsahující síru obsahuje cystein a methionin. Výhodné skupiny aminokyselin pro konzervativní substituce jsou: valin-leucinísoleucin, fenylalanín-tyrosin, lysin-arginin, alanin-valin, glutamát-aspartát a asparaginglutamin,

Jak již bylo diskutováno, menší variace v aminokyselinové sekvenci protilátek nebo imunoglobulinových molekul jsou zahrnuty v předkládaném vynálezu, za předpokladu, že variace udržují alespoň 75%, výhodněji alespoň 80%, 90% nebo 95% a nej výhodněji 99% sekvenční identitu. Zejména sem patří konzervativní substituce aminokyselin. Konzervativní substituce jsou takové substituce, které se odehrávají v rámci rodiny aminokyselin, kteréjsou příbuzné svými postranními skupinami. Geneticky kódované aminokyseliny se obecně dělí do rodin: (1) kyselé = aspartát, glutamát, (2) bazické = lysin, arginin, histidin, (3) nepolární = alanin, valin, leucin, isoleucin, prolin, fenylalanin, methionin, tryptofan, a (4) nenabité polární = glycin, asparagin, glutamin, cystein, serin, threonin, tyrosin. Výhodnější rodiny jsou: serin a threonin tvoří rodinu alifatickou3» hydroxylovou, asparagin a glutamin tvoří rodinu obsahující amidovou skupinu, alanin, valin, leucin a isoleucin tvoří alifatickou rodinu, a fenylalanin, tryptofan a tyrosin tvoří aromatickou rodinu. Tak např. je rozumné očekávat, že izolované nahrazení leucinu ísoleucinem nebo val i nem, aspartátu glutamátem, threoninu serinem nebo podobné náhrady aminokyselin strukturně příbuznými aminokyselinami, nebudou mít závažný vliv na vazebné nebo jiné vlastnosti výsledné molekuly, zejména pokud se náhrady nebudou týkat oblasti kostry. Zda záměna aminokyseliny vedla k funkčnímu peptidu lze okamžitě ověřit testováním specifické aktivity polypeptidového derivátu. Příslušné testy jsou v této přihlášce podrobně popsány. Fragmenty nebo analogy protilátek nebo imunoglobulinových molekul mohou být odborníkem snadno připraveny. Výhodné amino-konce nebo karboxy-konce fragmentů nebo analogů se vyskytují v blízkosti hranic

4o funkčních domén. Strukturní a funkční domény mohou být identifikovány srovnáním nukleotidové a/nebo aminokyselinové sekvence s daty ve veřejných nebo soukromých databázích sekvencí. Výhodně se užívají počítačové metody k identifikaci sekvenčních motivů nebo predikci proteinových konformačních domén, které se vyskytují u jiných proteinů, jejichž struktura a/nebo funkce je známá. Metody k identifikaci proteinových sekvencí, které se skládají do známých trojrozměr45 ných struktur, jsou odborníkům známy (viz např. Bowie et al. Science 253:164 (1991)). Čili předcházející příklady ukazují, že odborník je schopen rozeznat motivy a strukturní konformace, které lze užít pro definování strukturních a funkčních domén podle předkládaného vynálezu.

Výhodné aminokyselinové substituce jsou takové, které: (1) redukují citlivost k proteolýze, (2) redukují citlivost k oxidaci, (3) mění vazebnou afinitu pro vytvářející se proteinové komplexy, (4) mění vazebné afinity a (5) poskytují nebo modifikují jiné fyzikálně—chemické nebo funkční vlastnosti takových analogů. Analogy mohou obsahovat různé muteiny sekvence odlišné od přirozeně se vyskytující peptidové sekvence. Tak např. jednoduchá nebo vícenásobná aminokyselinová substituce (výhodně konzervativní substituce aminokyselin) se může provést v přirozené se vyskytující sekvenci (výhodně v části polypeptidu mimo doménu/domény tvořící intermolekulár- 13 CZ 302706 Β6 ni spojení). Konzervativní aminokyselinové substituce by neměla podstatně změnit strukturní charakteristiky původní (parenterální) sekvence (např. náhrada aminokyseliny by neměla narušit šroubovieovou strukturu parenterální molekuly nebo narušit jiné typy sekundárních struktur charakteristických pro parenterální sekvenci). Příklady v oboru známých sekundárních a terciárních struktur polypeptidu byly popsány např. v publikacích Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton, Fd.. W. H. Freeman and Company, New York (1984)), Introduction to Protein Structure (C. Brandeu and J. Tooze, eds„ Garland Publishing, New York, N. Y. (1991)), a l hornton et al.. Nátuře 354:105 (1991), které jsou vloženy formou odkazu.

Termín „polypeptidový fragment označuje v předkládané přihlášce polypeptid s delecí aminokonce a/nebo karboxykonee, přičemž zbývající aminokyselinová sekvence je identická s odpovídajícími pozicemi přirozeně se vyskytující sekvence, dedukované např. na základě cDNA plné délky. Fragmenty jsou typicky dlouhé alespoň 6, 8 nebo 10 aminokyselin, výhodně alespoň 14 aminokyselin a nejvýhodněji alespoň 20 aminokyselin, obvykle však alespoň 50 aminokyselin a ještě výhodněji alespoň 70 aminokyselin.

Termín „analog v popisu vynálezu znamená polypeptid, který obsahuje segment alespoň 25 aminokyselin, který má podstatnou identitu s úsekem dedukované aminokyselinové sekvence a která má alespoň jednu z následujících vlastností: (1) specificky se váže kČILA—1 za vhodných vazebných podmínek, (2) má schopnost blokovat vazbu CTLA-4 s jeho receptorem, nebo (3) má schopnost inhibovat růst buněk exprimujících CTLA-4 in vitro nebo in vivo. Typicky póly peptidové analogy obsahují konzervativní aminokyselinové substituce (nebo adice nebo dcíece) vzhledem k přirozeně se vyskytující sekvenci. Analogy jsou typicky dlouhé alespoň 20 aminokyselin, výhodně alespoň 50 aminokyselin nebo delší, a často jsou dlouhé stejně jako přirozeně se vyskytující polypeptid plné délky.

Peptidové analogy jsou obecně ve farmaceutickém průmyslu užívány jako nepeptidové léčiva s vlastnostmi analogickými s původním (templátovým) peptidem. Tyto typy nepeptidových sloučenin se nazývají „peptidová mímetíka nebo také „peptidomimetika (viz Fauchere, J. Adv. Drug Res. 15:29 (1986); Veber and Freidinger TINS p.392 (1985); and Evans et al., J. Med. Chem. 30:1229 (1987)). Takové sloučeniny jsou obvykle vyvíjeny pomocí počítačového modelování molekul. Peptidomimetika strukturně podobná terapeuticky užitečným peptidům se mohou užít pro dosažení ekvivalentního terapeutického nebo profylaktického účinku. Obecně jsou peptidomimetika strukturně podobná „paradigmatíckému“ peptidů (tj. polypeptidu, který má požadované biochemické vlastnosti nebo farmakologickou aktivitu), jako jsou např. protilátky, ale má jednu nebo více peptidových vazeb nahrazených vazbou vybranou ze skupiny obsahující: -CH₂NH- -CFFS-, -C1L-CH₂- -CH=CH- (cis a trans), -COCH₂- -CH(OH)CH₂a -CFFSO-, a sice metodami, kteréjsou odborníkům známy. Systematická substituce jedné nebo více aminokyselin kanonickou sekvencí D-aminokyselin stejného typu (tj. např. D-lysín místo l-lysinu) se může využít k přípravě stabilnějších peptidů. Kromě toho „nepřirozené“ peptidy obsahující kanonickou sekvenci nebo v podstatě identickou variaci mohou být připraveny metodami, které jsou odborníkům známy (viz např. Rizo a Gierasch Ann. Rev. Biochem. 61:387 (1992)), např. přidáním vnitřních cysteinových zbytků schopných tvořit intramolekulární dtsulfídické můstky, které cyklizují peptid.

Termín ..protilátka“ nebo „protilátkový peptid“ se týkají intaktní protilátky nebo jejího vazebného fragmentu, který kompetuje s intaktní protilátkou o specifickou vazbu. Vazebné fragmenty se připravují technikami rekombinantní DNA nebo enzymatickým nebo chemickým štěpením intaktních protilátek. K vazebným fragmentům patří fragmenty Fab, Fab', F(ab')₂, Év ajednořetězcové protilátky. Protilátky jiné než „bispecifické“ nebo „bifunkční“ jsou takové, které mají všechna svá vazebná místa identická. Protilátka podstatně inhibuje adhezi receptoru na „protireceptor“, když přístup protilátky snižuje množství receptoru vázaného na „protireceptor“ alespoň o 20 %, 40 %, 60 % nebo 80 %, obvykle alespoň o více než 85 % (měřeno kompetitivním vazebným testem in vitro).

- 14CZ 302706 B6

Termín „epitop“ označuje jakoukoliv proteinovou determinantu schopnou specificky se vázat na imunoglobulin nebo receptor T-buňky. Epitopové determinanty jsou obvykle tvořeny chemicky aktivním povrchovým seskupením molekul jako jsou aminokyseliny nebo cukerné postranní řetězce a obvykle mají specifické trojrozměrné strukturní vlastnosti a také specifické vlastnosti pokud jde o náboj. Protilátka se specificky váže na antigen, když disociační konstanta je menší nebo rovna 1 μΜ, výhodně menší nebo rovna lOOnM a nejvýhodněji je menší nebo rovna 10 nM.

Termín „činidlo“ nebo „agens“ označuje v přihlášce chemickou sloučeninu, směs chemických sloučenin, biologickou makromolekulu nebo extrakt připravený z biologických materiálů.

Termín „značka“ a/nebo „značený“ v popisu vynálezu znamená inkorporaci detekovatelného markéru, tj. např. vložením radioaktivně značené aminokyseliny nebo navázání biotinylováných skupin k polypeptidu, které pak mohou být detekovány značeným avidinem (tj. streptavidin obsahující fluorescenční markér nebo enzymatickou aktivitu, které mohou být detekovány optickými nebo kolorimetrickými metodami. Mohou být použity různé metody značení polypeptidů a glykoproteinů, které jsou odborníkům známé. K příkladům značek pro polypeptidy patří, aniž by výčet byl omezující, následující: radioisotopy nebo radionuklidy (např. ³H, ^!4C, ¹⁵N, ³⁵S, ⁹⁰Y, ⁹⁹Tc, ¹¹¹ In, '²⁵1, ¹³¹1), fluorescenční značky (např. FITC, rhodamin, lanthanidfosfory), enzymatické značky (např. křenová peroxidáza, β-galaktosidáza, luciferáza, alkalická fosfatáza), chemiluminiscenční značky, biotinylové skupiny, predeterminované polypeptidové epitopy rozpoznávané sekundární reportérovou molekulou (např. párové sekvence leucinového zipu, vazebná místa pro sekundární protilátku, domény vázající kov, epitopové značky). V některých provedeních vynálezu jsou značky navázány prostřednictvím oddělovacího ramínka (spaceru) různé délky, aby se redukovaly potenciální ster ické zábrany.

Termíny „farmaceutické činidlo“ nebo „farmaceutický přípravek“ nebo „léčivo“ se v popisu vynálezu užívají k označení chemických sloučenin, které jsou schopné vyvolat požadovaný terapeutický účinek, pokud jsou správně podávány pacientovi. Další chemické termíny jsou v předkládané přihlášce užívány ve smyslu, kterýje obvyklý a odborníkům známý, např. jak je uvedeno ve slovníku The McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (Parker, S„ Ed., McGraw-Hill, San Francisco (1985)).

Termín „antineoplázické činidlo“ označuje činidlo, které má takové funkční vlastnosti, že inhibuje vývoj nebo progresi neoplázií u člověka, zejména maligních (rakovinných) lézí, jako je např. karcinom, sarkom, lymfom nebo leukémie. Častou vlastností antineoplázického činidla je inhibice metastáz.

„V podstatě čistý“ v předkládané přihlášce znamená, že předmětný druh je převládající přítomný druh (tj. na molární úrovni je hojnější než jakýkoliv jiný druh přítomný ve sloučenině), výhodně „v podstatě čistá“ frakce je přípravek, kde předmětný druh je zastoupen alespoň z 50 % (na molámím základě) mezi všemi přítomnými makromolekulami. Obecně v podstatě čistý přípravek obsahuje více než 80 % všech druhů makromolekul přítomných v přípravku, výhodněji více než 85 %, 90 %, 95 % a 99 %. Mej výhodněji je předmětný druh purifikován do nezbytné homogenity (konvenčními metodami nelze detekovat kontaminující druhy molekul), přičemž přípravek je v podstatě tvořen jediným druhem makromolekuly.

Struktura protilátky

Základní strukturní jednotka protilátky je, jak je známo, tvořena tetramerem. Každý tetramer je složen ze dvou identických dvojic póly peptid ických řetězců, přičemž každý pár obsahuje jeden „lehký“ (přibližně 25 kDa) a jeden „těžký“ (přibližně 50 až 70 kDa) řetězec. Amino-koncová část každého řetězce obsahuje variabilní úsek složený přibližně ze 100 až 110 nebo i více aminokyselin, primárně zodpovědný za rozpoznání antigenu. Karboxy-koncová část každého řetězce definuje konstantní úsek primárně zodpovědný za efektorové funkce. Lidské lehké řetězce jsou

- 15 CZ 302706 B6 klasifikovány jako kapa a lambda lehké řetězce. Lidské těžké řetězce jsou klasifikovány jako mí (μ), delta, gama, alfa a epsilon a definují isotyp protilátky označovaný jako IgM, IgD, IgG, IgA, a Igb, v uvedeném pořadí. Uvnitř těžkého a lehkého řetězce jsou variabilní a konstantní úsek spojeny úsekem „J“ velikosti 12 nebo více aminokyselin, přičemž těžký řetězec obsahuje navíc ^s úsek „D“ velikosti 10 a více aminokyselin (pro obecný přehled viz publikace Fundamentu! lmmunology Ch. 7 (Paul, W.. ed., 2^d ed. Raen Press, N.Y. (1989)), která je celá zahrnuta formou odkazu. Variabilní úseky každé dvojice těžký/lehký řetězec vytvářejí vazebné místo protilátky.

Takže intaktní IgG má dvě vazebná místa. Až na b i funkční nebo b i specifické protilátky, tato io vazebná místa jsou shodná.

Všechny řetězce mají stejnou obecnou strukturu relativně konzervativního úseku kostry (PR) spojeného třemi hypervariabilními úseky, které se nazývají úseky determinující komplementaritu, zkráceně CDR. Úseky CDR ze dvou řetězců z každého páru jsou spojeny úsekem kostry, což is umožňuje vazbu na specifický epitop. Ve směru od N-konce k C-konci, těžký a lehký řetězec obsahují domény PRU CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 a FR4. Přiřazení aminokyselin ke každé doméně je v souladu s definicí podle Kabata: Sequences of Proteins of hnmunological Interest (National Institutes of I lealth, Bethesda, Md. (1987 a 1991)), nebo publikacemi Chothia & Lesk 7. Mol. Biol. 196:901-917 (1987), Chothia et a!. Nature 342:878-883 (1989).

B i specifická nebo b i funkční protilátka je umělá hybridní protilátka obsahující dva různé páry těžký/lehký řetězec a dvě odlišná vazebná místa. Bispeeifieké protilátky mohou být připraveny řadou metod, např. fúzí hybridomu nebo spojením fragmentů Fb' (viz Songsivilai & Lachmann Clin. Exp. Immunol. 79: 315-321 (1990), Kostelny et al. 7. Immunol. 148:1547 1553 (1992)).

Kromě toho bispeeifieké protilátky mohou být tvořeny jako tzv. „diabodies“ (Hollíger et al. ..'Diabodies': smáli bivalení and bispecific antibody fragments“ PNAS USA 90:6444-6448 (1993)) nebo „Janusiny“ (Traunecker et al., „Bispecific single chain molecules (Janusins) target cytotoxic lymphocytes on HIV infected cells“ EMBO 7 10:3655-3659 (1991), Traunecker et al. .Janusin: new molecular design for bispecific reagents“ Int J. Cancer Suppl 7:51-52 (1992)). ío Produkce bispecifiekých protilátek je proces relativně náročný na práci ve srovnání s produkcí konvenčních protilátek a výtěžky i stupeň čistoty, kterých se dosahuje, jsou obvykle nižší pro bispecifické protilátky. Bispeeifieké protilátky neexistují ve formě fragmentů majících jedno vazebné místo (jako jsou např. fragmenty Fab, Fab' a Fv).

Lidské protilátky a humanizace protilátek

Při použití lidských protilátek nedochází k některým problémům, které jsou spojeny s protilátkami, které obsahují variabilní a/nebo konstantní úseky z protilátek myší nebo potkana. Přítomnost proteinů pocházejících z myši nebo potkana vede k tomu, že se zvyšuje clearance a protilátka může vyvolat imunitní reakci u pacienta. Aby se zabránilo užívání protilátek pocházejících z myši nebo potkana, bylo navrženo vyvinout humanizované protilátky nebo připravit plně lidské protilátky tím, že se vnesou funkce lidských protilátek do hlodavce, který pak bude produkovat protilátky mající plně lidské sekvence.

Lidské protilátky

Schopnost klonování a rekonstrukce lidských lokusu velikosti megabází v YAC (umělých kvasinkových chromozómech a jejich vnesení do myších zárodečných buněk poskytují velmi účinné metody ke zjištění funkčních komponent velmi velkých nebo jen hrubě zmapovaných fokusů a k vytvoření užitečných modelů lidských nemocí. Kromě toho užití takové technologie k nahrazení myších lokusu jejich lidskými ekvivalenty poskytuje jedinečné informace o expresi a regulaci produktů lidských genů v průběhu vývoje, jejich komunikaci sjinými systémy ajejich účast v indukci a rozvoj nemoci.

- 16CZ 302706 B6

Důležitou praktickou aplikací takové strategie je „humanizace“ myšího humorálního imunitního systému. Vnesení lidských imunoglobulinových (Ig) lokusů do myši, jejíž endogenní Ig geny byly inaktivovány, nabízí možnost zkoumat mechanismus programované exprese a sestavování protilátek a také jejich roli ve vývoji B lymfocytů. Kromě toho tato strategie poskytuje ideální zdroj pro produkci monoklonálních plně lidských protilátek jakožto významný milník na cestě ke splnění příslibu proti látkových terapií lidských nemocí. Očekává se, že plně lidské protilátky minimalizují imunitní a alergické reakce, které jsou vlastní myším protilátkám nebo protilátkám žních derivatizovaných, a tudíž zvýší bezpečnost a účinnost podávání protilátek. Podávání plně lidských protilátek bude zásadně výhodné pro léčení chronických a rekurentních nemocí, jako jsou zánětlivá a autoimunitní onemocnění a rakovina, kdy je třeba opakované podávání protilátek.

Jeden z přístupů k dosažení tohoto cíle je metodami genového inženýrství upravit myší kmeny deficientní v tvorbě protilátek pomocí velkých fragmentů lidských Ig lokusů s očekáváním, že takto modifikované myši budou tvořit velký repertoár lidských protilátek aniž by tvořily myší protilátky. Velké fragmenty lidské Ig zachovají velkou genovou diverzítu a také správnou regulaci tvorby a exprese protilátek. Vzhledem k využití mechanismů myšího organismu pro diverzifikaci a selekci protilátek a nepřítomnosti imunologické tolerance k lidským proteinům, reprodukovaný repertoár lidských protilátek v těchto myších kmenech by mělo vest k vysokoafinitním protilátkám proti jakémukoliv požadovanému antigenů, včetně lidských antigenů. Užitím technologie hybridomu mohou být snadno připravovány a selektovány antígenně specifické monoklonální protilátky.

Tato obecná strategie byla poprvé demonstrována ve spojení s vytvořením prvních kmenů myší XenoMouse™, jak bylo publikováno v r. 1994 (viz Green et al. Nátuře Genetics 7:13-21 (1994)). Kmeny XenoMouse™ byly geneticky manipulovány pomocí umělých kvasinkových chromozómů (YAC) obsahujících fragmenty velikosti 245 a 190 kb se zárodečnou konfigurací lokusů pro lidský těžký řetězec a lidský lehký řetězec kapa, obsahující jádro sekvencí konstantního a variabilního úseku. YAC obsahující lidské Ig se ukázaly jako kompatibilní s myším systémem jak pro nové uspořádání tak expresi protilátek a byly vhodné pro substituci inaktivovaných myších Ig genů. To bylo prokázáno jejich schopností indukovat vývoj B-lymfocytů, vytvářet dospělý repertoár plně lidských protilátek a vytvářet dospělý repertoár plně lidských protilátek a vytvářet dospělý repertoár plně lidských protilátek a vytvářet antigenně specifické lidské monoklonální protilátky. Tyto výsledky také vedly k předpokladu, že vnesení velkých částí lidských Ig lokusů obsahujících velký počet V genů, další regulační elementy a lidské konstantní úseky, by mohlo v podstatě opakovat plný repertoár, kterýje charakteristický pro lidskou imunitní humorální reakci na infekci a imunizaci. Práce Greena et al. byla nedávno rozšířena o vnesení více než 80 % repertoáru lidských protilátek prostřednictvím fragmentů YAC velikosti megabází obsahujících zárodečnou konfiguraci lokusů pro lidský těžký řetězec a lidský lehký řetězec kapa do myší XenoMouse™ (viz např. Mendez et al. Nátuře Genetics 15:146—156 (1997), Green a Jakobovits J. Exp. Med. 188:483—495 (1998), patentová přihláška U.S. Seriál No. 08/759,620, podaná 3. 12. 1996, vložená formou odkazu).

Tento experimentální přístup byl dále diskutován a popsán v patentové přihlášce U.S. 07/466,008, podané 12.1. 1990, 07/610,515, podané 8.11. 1990, 07/919,297, podané

24.7. 1992, 07/922,649, podané 30. 7. 1992, 08/031,801, podané 15.3.1993,08/112,848, podané 27.8.1993, 08/234,145, podané 28. 4.1995, 08/376,279, podané 20.1.1995, 08/430,938, podané 27. 4. 1995, 081464,584, podané 5. 6. 1995, 08/464,582, podané 5. 6. 1995, 08/463,191, podané 5.6. 1995, 08/462,837, podané 5.6. 1995, 08/486.853, podané 5.6. 1995, 08/486,857, podané 5. 6. 1995, 08/486,859, podané 5. 6. 1996, 08/462,513, podané 5. 6.1995, 08/1724,752, podané 2. 10. 1996, a 08/759,620, podané 3. 12. 1996. Viz také publikace Mendez et al. Nátuře Genetics 15:146-156 (1997) a Green a Jakobovits J. Exp. Med. 188:483—495 (1998). Viz dále také Evropský patent EP 0 463 151 B 1, udělení zveřejněno 12. 6. 1996, mezinárodní patentová přihláška W094/02602, publikovaná 3. 2. 1994, mezinárodní patentová přihláška WO 96/34096, publikovaná 31. 10.1996, a mezinárodní patentová přihláška WO 98/24893, publikovaná

- 17CS. 302706 B6

11.6. 1998. Vynálezy popsané ve výše citovaných patentech, přihláškách a publikacích jsou v úplnosti formou odkazu zahrnuty v předkládané přihlášce.

Alternativní přístup použitý dalšími, např. firmou Gen Pharm International, lne., využil tzv.

„minilokusů“. Při této metodě je exogenní lg lokus napodoben vložením kousků (jednotlivých genů) z lg lokusů. Takže se vytvoří konstrukt, obsahující jeden nebo více V_N genů, jeden nebo více D_fj genů, jeden nebo více Ju genů, konstantní úsek μ a druhý konstantní úsek (výhodně konstantní úsek gama), vhodný pro inzerci do zvířete. lakové metody byly popsány v patentu U. S. 5,545,807, Surani et al., a U.S. 5,545,806, 5,625,825, 5,625,126, 5,633,425, 5,661,016, ío 5,770,429, 5,789,650, a 5,814,318, všechny Lonberg a Kay, a U.S. 5,591,669, Krimpenfort a Berns, U.S. 5,612,205. 5,721.367 a 5,789,215, Kerns et al., a U.S. ,643,763 Choi a Duím, a U.S. patentové přihlášky Gen Pharm International 07/574,748, podaná 29,8. 1990, 07/575,962, podaná

31.8. 1990, 07/810,279, podaná 17.12. 1991, 07/853,408, 18.3.1992, 07/904,068, podaná

23.6. 1992,07/990,860, podaná 16. 12. 1992. 08/053,13 1, podaná 26. 4. 1993,08/096,762, poda15 ná 22. 6. 1993, 08/155,301, podaná 18. ll. 1993, 08/161,739, podaná 3. 12. 1992, 08/165,699, podaná 10. 12. 1993, 08/209,741, podaná 9. 3. 1994, jejichž úplné popisy jsou zahrnuty formou odkazu. Viz také Evropský patent 0 546 073 Bl, mezinárodní patentové přihlášky WO 92/03918, WO 92/22645, WO 92/22647, WO 92/22670, WO 93/12227. WO 94/00569, WO 94/25585, WO 96/14436, WO 97/13852, a WO 98/24884, jejichž úplné popisy jsou také zahrnu20 ty formou odkazu. Viz také publikace Taylor et al., 1992, Chen et al., 1993, Tuaillon et al., 1993. Choi et al.. 1993, Lonberg et al., (1994), Taylor et al., (1994), and Tuaillon et al., (1995) a EishwhiId et al., (1996), kteréjsou také plně zahrnuty formou odkazu.

Původci Surani et al., ve výše citovaném vynálezu přihlašovatele Med i ca I Research Counsel („MRC“), připravily transgenní myši mající lg lokus metodou minilokusů. Původci vynálezů firmy Gen Pharm International Lonberg a Kay navrhli inaktivaci endogenního myšího lg lokusu spojenou s podstatnou duplikací práce Surani et al.

Výhodou metody minilokusů je především rychlost, sjakou mohou být konstrukty obsahující

5o úseky lg lokusů vytvářeny a vkládány do zvířat. Avšak současně nevýhodou metody minilokusů je to, že vnesením malého počtu V, D, a J genů se vnese nedostatečná diverzita. A skutečně publikované práce potvrzují tyto obavy. Vývoj B-lymfocytů a tvorba protilátek u zvířat připravených metodou minilokusů jsou nedostatečné. Tudíž výzkum, který byl základem pro předkládaný vynález, byl zaměřen na vnesení velkých úseků lg lokusů, aby bylo dosaženo velké diverzity a aby byl rekonstituován celý imunitní repertoár.

Lidská anti-myší proti látková reakce (HAMA) vedla průmysl k přípravě chimérických nebo jiným způsobem humanizovaných protilátek. Jelikož chimérické protilátky mají lidský konstantní úsek a myší variabilní úsek, očekává se, že bude pozorována určitá lidská antichimérická protilát4o ková reakce (HACA), zejména při chronickém nebo mnohodávkovém použití protilátky.

Je tudíž potřebné poskytnout plně lidské protilátky proti CTLA -L aby bylo možné odstranit obavy a také ovlivnit HAMA nebo HACA reakce.

Humanizace protilátek a metody displeje

Jak bylo již diskutováno výše ve spojitosti s tvorbou lidských protilátek, je výhodné připravovat protilátky se sníženou imunogenicitou. Toho lze do jisté míry dosáhnout metodami humanizace a displeje užitím vhodných knihoven. Je známo, že myší protilátky nebo protilátky z jiných druhů so mohou být humanizovány nebo pri mat izovány metodami, kteréjsou v oboru dobře známy, viz např. Winter a Harris Immunol Today 14:43-46 (1993) a Wright et al. Crit. Reviews in Immunol.

12125-168 (1992). Požadované protilátky lze připravit metodami rekombinantní DNA substitucí domén CHl, CH2, CH3, kloubové domény a/nebo domény kostry odpovídajícími lidskými doménami (viz WO 92/02190 a IJ.S. patenty 5,530,101, 5,585,089, 5,693,761, 5,693,792,

5.714.350, a 5,777,085). Také použití lg cDNA pro konstrukci chimérických lg genů je odborní- 18CZ 302706 B6 kům známo (viz např. Liu et al. P.N.A.S. 84:3439 (1987) a J. Immunol. 139:3521 (1987)). mRNA se izoluje z hybridomů nebo jiných buněk produkujících protilátku a užije se pro přípravu cDNA. Požadovaná cDNA se pak ampliflkuje např. polymerázovou řetězovou reakcí (PCR) užitím specifických primerů (viz U.S. patenty 4,683,195 a 4,683,202). Alternativně se připraví knihovna a provede se její sereening, čímž se izoluje požadovaná sekvence. DNA sekvence kódující variabilní úsek protilátky se pak fúzuje se sekvencí lidskou konstantní sekvencí. Sekvence lidských konstantních úseků lze najít v publikaci Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, N. 1. H. publication no. 91-3242. Lidské geny C úseků jsou okamžitě k dispozici ze známých klonů. Výběr isotypů se řídí požadovanými efektorovými funkcemi, jako je např. fixace komplementu, nebo aktivita v buněčné cytotoxic i tě závislé na protilátkách. Výhodné isotypy jsou IgGl, lgG2, IgG3 a ígG4. Zvláště výhodné isotypy protilátek podle předkládaného vynálezu jsou IgG2 a IgG4. Mohou být užity oba typy konstantních úseků lidského lehkého řetězce kapa i lambda. Chimérické humanizované protilátky se pak exprimují obvyklým způsobem.

Protilátkové fragmenty jako např. Fv, F(ab')2 a Fab se připraví štěpením intaktních proteinů, např. proteázami nebo chemicky. Alternativně se připraví zkrácené geny. Tak např. chimérický gen kódující část fragmentu F(ab')₂ by zahrnoval sekvence DNA kódující doménu CHI a kloubový úsek H řetězce, pak by následoval translační stop-kodon, aby vznikla zkrácená molekula.

V jedné metodě se užijí kanonické sekvence kódující J úseky těžkého a lehkého řetězce pro návrh sekvencí oligonukleotidových primerů, které se užijí pro vnesení vhodných restrikčních míst do J úseků pro následné spojení segmentů V úseku se segmenty lidského C úseku. cDNA C úseku může být modifikována místně cílenou mutagenezí, aby se umístila restrikční místa do analogických pozic v lidské sekvenci.

K expresním vektorům patří plazmidy. retrovirv. kosmidv, YAC. episomv odvozené z EBV, atd. Vhodným vektorem je takový, který kóduje funkčně kompletní CH nebo CL sekvenci lidského imunoglobulinu, s vhodně vloženými restrikčními místy, takže jakákoliv sekvence VH nebo VL může být snadno vložena a exprimována. V takových vektorech dochází k sestřihu zpravidla mezi donorovým sestříhovým místem ve vloženém J úseku a akceptorovým sestřihovým místem, které předchází lidský C úsek, a také v se stři ho vých úsecích, které se vyskytují v lidských CH exonech. Polyadenylace a terminace transkripce se uskutečňuje v přirozených chromozómových místech směrem „downstream“ od kódujícího úseku. Výsledná chimérická protilátka se může spojit s jakýmkoliv silným promotorem, včetně promotorů jako je retrovirový LTR, např. časný promotor SV—40 (Okayama et al. Mol. Cell. Bio. 3:280 (1983)), LTR viru Rousova sarkomu (Gorman et al. P.N.A.S. 79:6777 (1982)), a LTR Moloneyho myšího leukemického viru (Grosschedl et al. Cell 41:885 (1985)), nativní promotory Ig apod.

Kromě toho lidské protilátky nebo protilátky zjiných biologických druhů mohou být připraveny metodami typu displeje, např. displeje na fágu, retroviru, ribozomu apod., což jsou metody odborníkovi známé, a výsledné molekuly se podrobí dodatečné maturaci (zrání), jako je např. afinitní maturace, které jsou v oboru známy (viz např. Wright a Harris, viz výše, Hanes a Plucthau PNAS USA 94:4937—4942 (1997) (ribosomální display), Parmley a Smith Gene 73:305-318 (1988) (fágový displej), Scott TIBS 17:241-245 (1992), Cwirla et al. PNAS USA 87:6387-6382 (1990), Russel et al. Nucl. Acids Research 21:1081-1085 (1993), Hoganboom et al. Immunol. Reviews 130:43-68 (1992), Chiswell a McCafferty TIBTECH 10:80-84 (1992), a U.S. Patent 5,733,743.

Pokud se uvedené metody displeje užijí k produkci protilátek, které nejsou lidské, takové protilátky se pak mohou humanizovat, jak bylo již výše popsáno.

Užitím těchto postupů lze připravit protilátky k buňkám produkujícím CTL A—4, samotnému

CTLA^L formám CTLA-4 epitopů nebo peptidů a jejich expresním knihovnám (viz např.

U.S. Patent 5,703,057), které se pak mohou podrobit sereeningu na aktivity výše popsané.

- 19 C7 302706 B6

Další kritéria pro protilátková léčiva

Obecně řečeno není žádoucí usmrtit buňky exprimující CTLA 4. Spíše je potřebné jednoduše inhibovat vazbu CTLA-4 s ligandy, aby se zmírnila inaktivace T-lymfocytů. Jeden z hlavních mechanismů, kterým protilátky usmrcují buňky, je fixace komplementu a účast na CDC. Konstantní úsek protilátky hraje důležitou roli ve schopnosti protilátky fixovat komplement a podílet se na CDC. Takže obecně se vybere isotyp protilátky, který budJo umožňuje fixaci komplementu nebo ne. V předkládaném vynálezu není výhodné, jak již bylo zmíněno výše, užít takové protilátky, které vedou k usmrcení buněk. Existují četné isotypy protilátek, které jsou schopné fixovat komplement a CDC, patří k nim např. následující protilátky: myší IgM, myší Ig(i2a, myší lgG2b, myší IgG3, lidská IgM, lidská IgGl a lidská IgG3. nepatří sem však např. isotypy lidské lgG2 a lgG4.

Protilátky, které se připraví, nemusejí mít na počátku zvláštní požadovaný isotyp, ale mohou to být protilátky v podstatě jakéhokoliv isotypu a pak je isotyp ..přepnut užitím metod, které jsou odborníkovi známy. K takovým metodám patří např. metody přímé rekombinace (viz např. U.S. Patent 4,816,397), metody buněčné fůze (viz např. IJ.S. patentová přihláška 08/730,639, podání 11. 10. 1996).

Při metodě buněčných fúzí se připraví myelomová buněčná linie nebo jiná linie, která obsahuje těžký řetězec požadovaného isotypu a další myelomová buněčná linie nebo jiná linie, která obsahuje lehký řetězec. Tyto buňky jsou pak fúzovány a výsledná buněčná linie exprimující intaktní protilátku je izolována.

Jako příklad uvádíme, že většina CTLA-4 protilátek diskutovaných v předložené přihlášce jsou lidské anti-CTLA-4 lgG2 protilátky. Jelikož tyto protilátky mají požadovanou vazbu k molekule CTLA-4, kterákoliv z nich může být snadno isotypově „přepnuta“ a vytvořit např. lidský isotyp lgG4, přičemž si uchová stejný variabilní úsek (který definuje proti látkovou specificitu a také z části afinitu).

Tudíž se připraví kandidátní protilátky, které splňují „strukturní“ požadavky jak byly diskutovány výše, a které jsou vybaveny alespoň některými dalšími „funkčními“ vlastnostmi nutnými pro přepnutí isotypu.

Návrhy a tvorba dalších léčiv

Na základě aktivity protilátek k (711.A—4 popsaných a charakterizovaných zde lze v souladu s vynálezem snadno navrhovat další léčiva, včetně dalších protilátek, antagonistů nebo chemických sloučenin jiných než jsou protilátky. K takovým formám léčiv patří např. protilátky mající podobnou vazebnou aktivitu nebo funkcí, pokročilá protilátková léčiva, jako jsou např. bispecifické protilátky, imunotoxiny a radioaktivně značená léčiva, tvorba peptidových léčiv, genové terapie, „intrabodies“, antisense léčiva a malé molekuly. Kromě toho, jak již bylo diskutováno výše, efektorové funkce protilátek podle vynálezu mohou být změněny „přepnutím“ isotypu na IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgD, IgA, IgA nebo IgM pro různá terapeutická využití.

Ve spojení s přípravou pokročilých proti látkových léčiv, kde je požadovanou vlastností fixace komplementu, je možné závislost usmrcení buněk na komplementu obejít, tím že se užijí bispecifické protilátky, imunotoxiny nebo radioaktivní značky.

Mohou být připraveny takové bispeciflcké protilátky, které obsahují (I) dvě protilátky, kdy jedna má specificitu k CTLA-4 a druhá protilátka má specificitu k druhé molekule, které jsou společně konjugovány, (II) jednu protilátku, která má jeden řetězec specifický pro CTLA-4 a druhý řetězec specifický pro druhou molekulu, nebo (III) jednořetězcovou protilátku, která má specificitu k CTLA-4 a k druhé molekule. Takové bispeciflcké protilátky mohou být připraveny metodami, které jsou odborníkům známy, pro (I) a (II) viz např. Fanger et al. immunol Methods 4:72-81

-20CZ 302706 B6 (1994) a Wright a Harris. cit. výše, pro (III) viz např. Traunecker et al. Int. J. Cancer (Suppl.) 7:51-52(1992).

Kromě toho mohou být připraveny i tzv. „kappabodies“ (111 et al. „Design arid construction of a hybrid immunoglobulin domain with properties of both heavy and light chain variable regions Protein Eng 10:949-57 (1997)), „minibodies“ (Martin et al. „The affinity-selection of a minobody polypeptide inhibitor of human interleukin-6“ EMBO J 13:5303-9 (1994)), „diabodies“ (Holliger et al. „'Diabodies': smáli bivalent and bispecific antibody fragments“ PNAS USA 90:6444-6448 (1993)), nebo „Janusiny“ (Traunecker et al. „Bispecific single chain molecules (Janusins) target cytotoxic lymphocytes on HIV infected cells“ EMBO J 10:3655-3659 (1991) a Traunecker et al. „Janusin: new molecular design tor bispecific reagents“ Int J. Cancer Suppl 7:51-52 (1992)).

Pokud jde o imunotoxiny, protilátky mohou být modifikovány tak, aby působily jako imunotoxiny, a sice metodami, které jsou odborníkům známy. Viz např. Vitetta Immunol Today 14:252 (1993) a také U.S. Patent 5,194,594.

Pokud jde o přípravu radioaktivně značených protilátek, takto modifikované protilátky lze snadno připravit metodami, které jsou odborníkům známy. Viz např. Junghaus et al., Cancer Chemotherapy and Biotherapy 655-686 (2d edition, Chafner and Longo, eds., Lippincot Raven (1996)), U.S. Patenty 4,681,581, 4,735,210, 5,101,827, 5,102,990 (RE 35,500), 5,648,471 a 5,697,902. Každý z imunotoxinů nebo radioaktivně značených molekul pravděpodobně povede k usmrcení buněk exprimujících CTLA-4, zejména těch buněk, kde protilátky podle vynálezu jsou účinné.

Pokud jde o přípravu peptidových léčiv, užitím strukturních informací týkajících se CTLA—4 a protilátek k CTLA-4, např. protilátek podle vynálezu (jak bude ještě popsáno dále ve spojení s malými molekulami), nebo screeningem peptidových knihoven, je možné připravit terapeutické peptidy namířené proti CTLA-4. Návrh a screening peptidových léčiv byly např. popsány v publikacích Houghten et al. Biotechniques 13:412—421 (1992), Houghten PNAS USA 82:51315135 (1985), Pinalla et al. Biotechniques 13:901-905 (1992), Blake a Litzi-Davis BioConjugate Chem. 3:510-513 (1992). Imunotoxiny a radioaktivně značené protilátky mohou být připraveny podobným způsobem, jako peptidové části, jak bylo diskutováno výše pro protilátky.

Důležité informace týkající se vazby protilátky a antigenů mohou být získány experimenty s fágovou expozicí (fágový displej). Takové experimenty se obecně provádějí „rýžováním“ fágové knihovny exprimující náhodné peptidy na vazbu s protilátkou podle vynálezu, a pak určením, zda peptid, který se váže, může být izolován. Pokud je pokus úspěšný, z peptidu, který se váže, je možné získat určité informace o epitopů.

Obecně fágové knihovny exprimující náhodné peptidy mohou být koupeny od firmy New England Biolabs (knihovny 7-merů a 12-merů, souprava Ph.D-7 Peptide 7-mer Library Kit a Ph.D.-12 Peptid představují valnou většinu, pokud ne všechny, z 2O⁷ = 1,28 x 10⁹ sekvencí 7merů. Knihovna 12-merů představuje diverzitu přibližně 1,9 x 10⁹ nezávislých klonů, které představují jen velmi malou část možných 20¹² = 4.1 x 10¹⁵ sekvencí 12-merů. Každá z knihoven 7-merů a 12-merů byla „rýžována“ nebo „screenována“ podle návodu výrobce, kde destičky byly potaženy protilátkou k zachycení vhodné protilátky (např. kozí anti-1 idský IgG Fc pro IgG protilátku) a pak opláchnuty. Navázaný fág byl eluován 0,2 M glycin-HCl, pH 2,2. Po třech opakováních cyklů selekce/amplifikace při konstantní stringenci (0,5% Tween) bylo možné pomocí sekvencování DNA charakterizovat klony z knihovny, které reagovaly s jednou nebo více protilátkami. Reaktivita peptidů se může určit pomocí ELISA. Pro další diskusi o epitopové analýze peptidů viz. např. také Scott, J. K. a Smith, G. P. Science 249:386-390 (1990); Cwirla et al. PNAS USA 87:63786382 (1990); Felici et al. J. Mol. Biol. 222:301-310 (1991), and Kuwabara et al. Nátuře Bioteehnology 15:74-78 (1997).

-21 CZ 302706 B6

Návrh a příprava genových léčiv a antisense léčiv konvenčními metodami jsou také usnadněny prostřednictvím předkládaného vynálezu. Tyto formy léčiv se mohou užít pro modulaci funkce CTLA-4. V této souvislosti protilátky podle vynálezu usnadňují návrh a použití funkčních testů. Návrh a příprava antisense léčiv byly podrobně diskutovány např. v mezinárodní patentové při5 hlášce WO 94/29444. Návrhy a strategie pro genovou terapii jsou odborníkům známy. Avšak ve specifickém případě použití metod užívajících Jntrabodies může být zvláště výhodné. Viz např. Chen et al. Human Gene Therapy 5:595-601 (1994) a Marasco Gene Therapy 4:11-15 (1997). Obecné návrhy a úvahy týkající se léčiv vhodných pro genové terapie lze najít např. také v mezinárodní patentové přihlášce WO 97/38137. Genetické materiály kódující protilátky podle vynáleni zu (jako např. 4.1.1,4.8.1 nebo 6.1.1, a další) se vloží do vhodného expresního systému (ve formě viru, atenuovaného viru, nevirové formě, „nahé formě nebo jiné) a podají sc příjemci, a pak se protilátky tvoří in vivo v příjemci/hostiteli.

Léčiva zvaná malé molekuly lze také připravovat užitím předkládaného vynálezu. Lze navrhnout i? taková léčiva, která budou modulovat aktivitu CTLA-4. Znalosti získané ze struktury CTLA—4 a interakce s jinými molekulami podle vynálezu, např. CD28, B7, B7-I, B7-2, a dalšími, se mohou využít k racionálnímu návrhu dalších forem léčiv. V tomto ohledu mohou být využity metody racionálních návrhů léčiv jako je rentgenová krystalografie, počítačové molekulové modelování (CAMM), kvantitativní nebo kvalitativní analýza vztahu struktura-aktivita (QSAR)

2o a podobné metody, k dalšímu upřesnění cílů při objevování nových léčiv. Metody racionálního navrhování dovolují před i kovat proteinové nebo syntetické struktury, které reagují s molekulou nebo její specifickou formou, a které mohou být užity k modifikaci nebo modulaci aktivity Č I LA 4. Takové struktury se mohou syntetizovat chemicky nebo exprimovat v biologických systémech. Tyto metody byly v přehledu uvedeny např. v Capsey et al. Genetically Engineered

2? Human Therapeutic Drugs (Stockton Press, NY (1988)). A skutečně racionální návrh molekul (peptidů. peptidomimetic, malých molekul apod.) založený na známém, nebo alespoň nastíněném. vztahu mezi strukturou a aktivitou s jinými molekulami (jako jsou např. protilátky podle vynálezu), se nyní obecně stává rutinním postupem. Viz např. Fry et al. „Specific, irreversible inactivation oťthe epidermal growth factor receptor and erbB2, by a new class of tyrosine kinase io inhibitor“ Proč Nati Acad Sci USA 95:12022-7 (1998); Hoffman et al. „A model of Cdc25 phosphatase catalytic domain and Cdk-internet i on surface based on the presence of a rhodanese homology domain“ J Mol Biol 282:195-208 (1998); Ginalski et al. „Modeiling of active forms of protein kinases: p38-a čase study“ Acta Biochim Pol 44:557-64 (1997); Jouko et al. „Identification of esk tyrosine phosphorylation sites and a tyrosine residue important for kinase domain structure“ Biochem J 322:927-35 (1997); Singh et al. „Structure-based design of a potent, selective, and irreversible inhibitor of the catalytic domain of the erbB receptor subfamily of protein tyrosine kinases“ J Med Chem 40:1130-5 (1997); Mandel et al. „ABGEN: a knowledgebased automated approach for antibody structure modeling“ Nat Bioteehnol 14:328-8 (1996); Monfardini et al. „Rational desig analysis, and potential utility of GM-CSF antagonists“ Proč

Assoc Am Physicians 108:420-31 (1996); Furet et al. „Modeiling study of protein kinase inhibitors: binding mode of staurosporine and origin of the selectivity of CGP 52411“ J Comput Aided Mol Des 9:465-72 (1995).

Jako další možnost se mohou připravit a syntetizovat kombinační knihovny a použít ve sereenin45 gových programech, jakojsou např. vysokovýkonné sereeningové programy.

Formulace léčiv ajejich podávání

Léčiva obsahující sloučeniny podle vynálezu se podávají formulována s vhodnými nosiči, exci50 pienty a dalšími činidly, která jsou součástí farmaceutického přípravku, aby se zlepšil přenos, příjem, tolerance apod. Existují mnohé vhodné lékové formy, jak je známo odborníkům v oboru farmaceutické chemie, a jak bylo popsáno např. v publikaci Remingtonů Pharmaceutical Sciences (I5^lh ed., Mack Publishing Company, Easton, PA (1975)), zejména kapitola 87: Blaug a Seymour. Takové přípravky obsahují např. prášky, pasty, masti, želé, vosky, oleje, tuky, vesi55 kuly (kationtové nebo aniontové) obsahující tuky (jako je např. Lipofectin ), DNA konjugáty,

-22 CZ 302706 B6 bezvodé absorpční pasty, emulze typu olej ve vodě nebo typu vody v oleji, emulzní karbovosky (polyethylenglykoly různých molekulových hmotností), polotuhé gely a polotuhé směsi obsahující karbovosky. Kterákoliv výše uvedená směs může být vhodná pro použití vynálezu za předpokladu, že účinná složka přípravku není i n aktivován a těmito pomocnými látkami pro formulaci přípravku a že přípravek je fyziologicky kompatibilní a tolerovatelný pri daném způsobu podávání. Pro další informace týkající se excipientů a nosičů, které jsou odborníkům ve farmaceutické chemii známy, viz také Powell et al. „Compendium of excipients for parenteral formulations“ PDA J Pharm Sci Technol. 52:238-311 (1998).

Příprava protilátek

Protilátky podle předkládaného vynálezu se výhodně připravují prostřednictvím transgenních myší, které obsahují vloženou podstatnou část lidského genomu produkujícího protilátky a naopak jsou deficientní v produkci endogenních myších protilátek. Takové myši jsou pak schopné produkovat molekuly lidského imunoglobulinu a protilátek ajsou deficientní v produkci myších imunoglobulinových molekul a protilátek. Postupy vhodné k dosažení tohoto cíle byly popsány v patentech, patentových přihláškách a dalších publikacích, které jsou uvedeny ve stavu techniky. Výhodné provedení transgenních myší a produkce protilátek je popsáno v U.S. patentové přihlášce 08/759,620, podané 3. 12. 1996, a dále také viz Mendez et al. Nátuře Genetics 15:146-156 (1997), což je plně zahrnuto formou odkazu.

Použitím těchto metod byly připraveny plně lidské monoklonální protilátky kcelé řadě různých antigenů. Podstata postupu spočívala v tom, že myši linií Xe no Mou se™ byly imunizovány požadovaným antigenem, z myši, která exprimovala požadované protilátky byly odebrány lymfatické buňky (jako např. B-lymfocyty), fúzovány s buňkami myeloidní linie, čímž se získaly imortalizované hybridomové linie a tyto hybridomové linie se pak podrobily screeningu a selekci, kdy byly identifikovány hybridomové buněčné linie produkující protilátku specifickou k požadovanému antigenu. V předkládaném vynálezu byly tyto metody použity pro přípravu protilátek specifických k CTLA^f. Popisuje se zde proto příprava mnoha hybridomových linií, které produkují protilátky specifické proti CTLA-M. Dále vynález poskytuje charakteristiky těchto protilátek, včetně analýz nukleotidových a aminokyselinových sekvencí těžkého a lehkého řetězce těchto protilátek.

Protilátky pocházející zvýše uvedených hybridomových linií byly označeny 3.1.1, 4.1.1, 4.8.1, 4.10.2, 4.13.1, 4.14.3, 6,1.1, 11.2.1, 11.6.1, 11.7.1, 12.3.1.1 a 12.9.1.1. Každá z těchto protilátek představuje plně lidský buďto lgG2 nebo IgG4 řetězec s lidským lehkým řetězcem kapa. Obecně řečeno protilátky podle vynálezu mají velmi vysokou afinitu, typicky mají hodnoty Kd od 10“⁹ do 10^_llM, když jsou měřeny v pevné nebo kapalné fázi.

Protilátky podle vynálezu mohou být exprimovány i v jiných buňkách či buněčných liniích než jen hybridomových.

Sekvence kódující cDNA nebo genomické klony určitých protilátek mohou být užity pro transformaci buněk vhodného hostitele, kterým je savec nebo organismus jiný než savec. K. transformaci lze užít jakoukoliv známou metodu pro vnesení polynukleotidu do hostitelské buňky, včetně metod jako je např. sbalení („pakážování“) polynukleotidu do viru (nebo do virového vektoru a transdukce hostitelské buňky virem (vektorem), nebo transfekcí, jak byly např. popsány v U.S. Patentech 4,399,216, 4,912,040, 4,740,461 a 4,959,455 (které jsou zahrnuty formou odkazu). Použitá metoda transformace závisí na hostiteli, který má být transformován. Metody pro vnášení heterologních polynukleotidů do savčích buněk jsou odborníkům známy a patří k nim, aniž by však tento výčet byl vyčerpávající, dextranem zprostředkovaná transfekce, precipitace s kalciumfosfátem, transfekce zprostředkovaná polybrenem, fúze protoplastů, eiektroporace, bombardování mikročásticemi, enkapsulace polynukleotidu do fiposomů, peptidové konjugáty, dendrimery a přímé mi kro injekce DNA do jádra.

-23 CZ 302706 B6

Linie savčích buněk vhodných jako hostitelské buňky pro expresi jsou odborníkům dobře známy a patří k nim mnoho imortilizovaných buněčných linií dostupných v Americké sbírce kultur a mikroorganismů (ATCC), jako jsou např. buňky vajecníků čínského křečka (CHO), buňky NSO₍₎, buňky HeLa, buňky BHK (křeččí fetální ledviny), COS buňky (opičích ledvin), buňky lidského bepatocelulárního karcinomu (např. Hep G2) a celá řada dalších buněčných linií. K vhodným buňkám, které nejsou ze savců, a které mohou být užity pro expresi rekombinantních protilátek patří, avšak výčet tím není omezen, např. bakteriální buňky, kvasinky, houby, hmyz a rostliny. Místně cílená mutageneze proti látkové domény CH2, která eliminuje glykosylaci, je výhodná ktomu, aby se zabránilo změnám v imunogenicitě, farmakokinetice a/nebo efektorových funkcích, které jsou výsledek glykosylace lišící se od lidského glykosylačního profilu. Metody exprese se vybírají na základě toho, že se stanoví, který systém produkuje nejvyšší expresní hladiny a tvoří protilátky s konstitutivními vazebnými vlastnostmi pro CTI.A 4.

Dále exprese protilátek podle vynálezu (nebo jiných sloučenin) v produkčních liniích může být zesílena řadou známých metod. Tak např. expresní systém glutaminsyntetázy a DHFR jsou známé systémy pro zvýšení exprese za jistých podmínek. Buněčné klony s vysokou expresí mohou být identifikovány konvenčními metodami, jako je např. klonování limitního ředění a nebo technika mikrokapky. Systém GS byl podrobně popsán a diskutován ve spojení s Evropskými patenty 0 216 846, 0 256 055 a 0 323 997 a evropskou patentovou přihláškou 5 89303964.4.

Protilátky podle vynálezu mohou být připraveny také transgenním způsobem, a sice vytvořením transgenniho zvířete nebo transgenní rostliny, které je transgenní na požadované sekvence těžkého a lehkého řetězce imunoglobulinu, a produkcí protilátek v izolovatelné formě. Pokud jde o transgenní savce, protilátky mohou být produkovány do mléka, ze kterého jsou pak izolovány, a sice u kozy, krávy a jiných savců (viz patenty U.S. 5,827,690, 5,756,687, 5,750,172, a 5,741,957.

Protilátky podle předkládaného vynálezu byly analyzovány strukturně i funkčně. Ve spojení se strukturami protilátek byly aminokyselinové sekvence těžkého a kapa lehkého řetězce predikovány na základě cDNA sekvencí získaných pomocí RT-PCR hybridomů. Viz příklady 3 a 4 a obrázky 1 až 8. Sekvencování A-konců protilátek bylo také provedeno pro potvrzení výsledků diskutovaných v příkladech 3 a 4. Viz také příklad 5 a obr. 9. Kinetické analýzy protilátek byly provedeny ke stanovení jejich afinit, viz příklad 2. Protilátky podle vynálezu (zejména 4.1.1, 4.8.1 a 6.1.1) mají vysoké afinity (4.1.1: 1,63 χ I0¹⁰ 1/M, 4.8.1: 3,54 χ IO¹⁰ 1/M; a 6.1.1: 7,2 x ΙΟ⁹ 1/M). Dále byly protilátky analyzovány izoelektrickým zaostřováním (IEF), redukující gelovou elektroforézou (SDS-PAGE), velikostní vylučovací chromatografií, kapalinovou chromatografií a hmotovou spektroskopií a vyhodnocením tvorby protilátek hybridomy. Viz příklad 6 a obr. 10.

Pokud jde o funkční analýzu protilátek podle vynálezu, tyto protilátky se ukázaly být silnými inhibitory Č I LA—4 a jeho vazby na ligandy z rodiny molekul B7. Tak např. bylo ukázáno, že protilátky podle vynálezu blokovaly vazbu CTLA-4 jak na B7-1 tak i B7-2. Viz příklad 7. Skutečně, mnoho protilátek podle vynálezu má hodnotu IC_5fl pro inhibicí vazby CTLA-4 na B71 nebo B7-2 řádu nanomolů a nižší. Kromě toho protilátky podle vynálezu mají vynikající selektivitu pro CTLA—4 ve srovnání např. s CD28, CD44, B7-2 nebo hlgGl. Viz příklad 8. Selektivita je poměr, který odráží stupeň preference vazby molekuly s prvním činidlem ve srovnání s druhým. a případně dalším, činidlem. V předkládaném popisu se termín selektivita týká stupně preference vazby protilátky podle vynálezu k CTLA—4 ve srovnání s vazbou protilátky sjinými molekulami, jako např. CD28, CD44, B7-2 nebo hlgGl. Hodnoty selektivity protilátek podle vynálezu vyšší než 500:1 jsou běžné. Bylo také ukázáno, že protilátky podle vynálezu indukují nebo zvyšují expresi některých cytokinů (jako např. IL-2 a IFN-γ) v kultuře T lymfocytů a v modelu T lymfoblastů. Viz příklady 9 a 10 a také obrázky 12 až 17. Lze také očekávat, že protilátky podle vynálezu budou inhibovat růst nádorů ve vhodných in vivo modelech nádorů. Návrh takových modelů je popsán a diskutován v příkladech 11 a 12.

-24 CZ 302706 B6

Výsledky popsané v předkládané přihlášce ukázaly, že protilátky podle vynálezu mají určité výhodné vlastnosti, pro které jsou vhodnější a účinnější než v současnosti užívané protilátky proti CTLA—4.

Zejména protilátky 4.1.1, 4.8.1 a 6.1.1 podle vynálezu mají výhodné vlastnosti. Jejich strukturní charakteristiky, funkce nebo aktivity poskytují měřítka, která usnadňují návrh a selekci dalších protilátek nebo jiných typů molekul, jak již bylo diskutováno výše. K těmto kritériím path jedno nebo více z následujících:

i o - schopnost kompetovat o vazbu k CTLA-4 s jednou nebo více protilátkami podle vynálezu, podobná vazebná specificita k CTLA—4 jako má jedna nebo více protilátek podle vynálezu,

- vazebná afinita k CTLA^l 10“⁹ nebo vyšší, výhodně 10~^ιθ nebo vyšší,

- nereaguje křížově s CTI.A—4 nižších savců, jako je např. myš, potkan, králík, výhodně nereaguje s CTLA—4 myši a potkana, is - reaguje křížově s CTLA—4 primátů, výhodně „cynomolgního“ makaka (Macaca fascicuiaris) a makaka „rhesus (Macaca mullata), selektivita pro CTLA^4 proti CD2B, B7-2, CD44 nebo hlgGl je alespoň 100:1 nebo vyšší, výhodně 300, 400 nebo 500:1 nebo vyšší,

1C_5O blokování CTLA^l· vazby na B7-2 je 100 nM nebo nižší, výhodně 5. 4, 3, 2, 1, 0,5

2o nebo 0,38 nM nebo nižší,

IC₅₀ blokování CTLA-4 vazby na B7-1 je 100 nm nebo nižší, výhodně 5, 4, 3, 2, 1, 0,5 nebo 0,50 nM nebo nižší,

- zvyšuje produkci cytokinů v jednom nebo více in vitro testech, např.

zvyšuje produkci IL-2 v testu T lymfoblasty/Raji buňky o 500 pg/ml nebo více, výhodně

750, 1000, 1500, 2000, 3000 nebo 3846 pg/ml, zvyšuje produkci IFN-γ v testu T lymfoblasty/Raji buňky o 500 pg/ml nebo více, výhodně 750, 1000 nebo 1233 pg/ml nebo více,

- zvyšuje produkci ÍL-2 v testu hPBMC nebo testu superantigenu celé krve o 500 pg/ml nebo více a výhodně 750, 1000, 1200 nebo 1511 pg/ml nebo více, vyjádřeno jinak produkce IL-2 je zvýšena o 30, 35, 40, 45, 50 procent a více při srovnání s kontrolním testem.

Očekává se, že protilátky podle vynálezu (nebo molekuly na jejich základě navržené nebo syntetizované), mající jednu nebo více z uvedených vlastností, budou mít také podobnou účinnost jako protilátky podle předkládaného vynálezu.

Požadované funkční vlastnosti popsané výše vedou k vazbě na CTLA-4 a inhibicí vazby CTLA4 molekulou (např. protilátkou, protilátkovým fragmentem, peptidem, malou molekulou) podobným způsobem jako se chová protilátka podle vynálezu (tj, vazbou na stejný nebo podobný epitop molekuly CTLA-4).

Molekula podle vynálezu se podává buďto přímo (tj. přímé podávání molekul pacientovi) nebo se může „podávat“ nepřímo (tj. např. podáváním peptidu nebo podobné molekuly, která vyvolá imunitní reakci u pacienta, podobně jako vakcína, a tato reakce zahrnuje tvorbu protilátek, které se váží na stejný nebo podobný epitop nebo protilátku nebo její fragment, které jsou produkovány po podání genetického materiálu, který kóduje takové protilátky nebo jejich fragmenty vázající se stejný nebo podobný epitop). Takže je jasné, že epitop na CTLA—4, ke kterému se váží protilátky podle vynálezu, je užitečný ve spojení s přípravou léčiv podle vynálezu. Při návrhu léčiv bývá stejně tak důležitá i negativní informace (tj. skutečnost, že protilátka, která se váže na CTLA-4, se neváže na epitop, který působí jako inhibitor CTLA-4, je užitečná). Takže epitop, na který se váží protilátky podle vynálezu, které nevedou k požadovaným funkcím, může být také velmi

CZ 302706 Ró důležitý. Tudíž do rozsahu předkládaného vynálezu spadají také molekuly (a zejména protilátky), které se váži na stejný nebo podobný epitop jako protilátky podle předkládaného vynálezu.

Kromě toho, že předmětem předkládaného vynálezu jsou protilátky a lze tudíž uvažovat i epito5 py, na které se váží, byly provedeny i předběžné studie mapování epitopů pro určité protilátky podle vynálezu, zejména protilátky 4.1.1 a 11.2.1

Jako první krok byly provedeny kompetiční studie BIAcore pro vytvoření hrubé mapy vazeb mezi protilátkami podle vynálezu také ve spojení sjejich schopností kompotovat o vazbu ío s CTLA-4. Pro tento účel byl CTLA-4 navázán na čip BIAcore a první protilátka, za saturujících podmínek, byla navázána na čip a pak byla měřena kompetiční vazba následné sekundární protilátky na CTLA-4. Tato metoda umožňuje vytvořené hrubé mapy, podle které lze klasifikovat rodiny protilátek.

Tímto způsobem bylo stanoveno, že protilátky podle vynálezu lze rozdělit do následujících epitopových kategorií.

Kategorie	Protilátka	Kompetice o vazbu CTLA-4
A	BO1M*	Plně křížově kompetují navzájem, křížově kompetují s kategorií B, do jisté míry kompetují s kategorií D
B02M*
B	4.1.1	Plně křížově kompetuj í navzájem, křížově kompetují s kategorií A, C a D
4.13.1
C	6.1.1	Plně kří žově kompetuj í navzáj em, kří žove kompetují s kategorií B a D
3.1.1
4.8.1
11.2.1
11.6.1
11.7.1
D	4.14.1	křížově kompetují s kategorií C a B, do jisté míry s kategorií A
E	4.9.1	BNI3 blokuje vazbu 4.9.1 na CTLA-4, ale ne naopak
BNI3***

(*) a (**)jsou dostupné od Biostride (***) jsou dostupné od Pharmingen

V dalším kroku se původci pokusili stanovit, zda protilátky podle vynálezu rozpoznávají lineární epitop na CTLA-4 za redukujících a neredukujících podmínek metodou westernového přenosu (western blot). Bylo pozorováno, že žádná z protilátek 4.1.1, 3.1.1, I1.7.L 1 L6.1 nebo 11.2.1 nerozpoznávala redukovanou formu CTLA-4 na westernovém přenosu. Tudíž se zdá, že všechny epitopy rozpoznávané příslušnými protilátkami nejsou lineární epitopy, ale spíše konformační epitop, jehož struktura je zrušena v redukujících podmínkách.

Tudíž bylo dále zkoumáno, zdaje možné něco zjistit o aminokyselinových zbytcích, které jsou důležité pro vazbu protilátek podle vynálezu. Jednou metodou bylo užití kinetické metody stanovení rychlostních konstant pro lidský CTLA- 4 a dva vysoce konzervativní CTLA-4 primátů

-26CZ 302706 B6 (makak, Macaca fascicularis a marmoset. Callithrix jacchuss). Studie pomocí techniky BIAcore ukázaly, že protilátka podle vynálezu 4.1.1 se váže na CTLA—4 člověka i obou primátů stejnou rychlostí. Avšak vzhledem ke kinetice se ukázalo, že protilátka 4.1.1 má nejvyšší afinitu (nejmenší rychlost rozpadu) pro lidský CTLA-4, rychlejší rozpad pro CTLA—4 makaka a ještě mnohem rychlejší pro marmoseta. Naproti tomu protilátka 11.2.1 se váže na CTLA-4 člověka i obou primátů se stejnou rychlostí, přitom má i stejné afinity (rychlosti rozpadu) pro všechny tri CTLA—4. Tato informace dále ukazuje, že protilátky 4.1.1 a 11.2.1 se váží na různé epitopy CTLA-4.

Pro další zkoumání epitopů, na které se váží protilátky kategorie B a C podle vynálezu byly provedeny studie s místně cílenou mutagenezí. CTLA-4 marmoseta má proti lidskému dva významné rozdíly, a sice ve zbytcích 105 a 106. Tyto rozdíly jsou změna leucinu na methioninu v pozici 105 a glycinu na serin v pozici 106. Tudíž byla mutována cDNA kódující lidský CTLA-4 tak, aby kódovala mutovaný CTLA—4 mající změny L105M a G106S. Homologní náhrada mutovaného CTLA-4 neovlivnila vazbu B7.2-IgGI fúzního proteinu. Avšak tato molekula byla významně inhibována ve schopnosti vázat se na protilátku 4.1.1 podle vynálezu (podobně marmoset). Dále byla mutována cDNA marmoseta kódující CTLA-4, čímž byla vytvořena mutanta CTLA—4 marmoseta obsahující záměnu S106G. Tato záměna vedla k obnovení původní stabilní vazby. Kromě toho byla připravena mutanta CTLA—4 marmoseta mající záměnu M105L. Tato záměna částečně obnovila vazbu mezi protilátkou 4.1.1 a mutovaným CTLA—4.

Každá z kategorií protilátek A až D podle vynálezu se zdá mít podobné funkční vlastnosti a má zřejmě potenciál působit jako silné terapeutické činidlo anti-CTLA—4. Dále každá z molekul vykazuje jistou křížovou kompetici ve vazbě k CTLA—4. Avšak jak již bylo výše diskutováno, každá z molekul různých kategorií se zjevně váže na samostatný konformační epitop CTLA-4.

Z předchozích údajů a diskusí vyplývá, že informace o epitopech diskutované výše ukazují, že protilátky (nebo jiné molekuly) podle vynálezu, které křížově kompetují s protilátkami, budou mít zřejmě značný terapeutický potenciál. Dále lze čekat, že protilátky (nebo jiné molekuly) podle vynálezu, které křížově kompetují s protilátkami podle vynálezu (tj. křížově kompetují s protilátkami skupin B, C a/nebo D, budou mít podle předkládaného vynálezu další terapeutický potenciál. A dále lze čekat, že protilátky (nebo jiné molekuly) podle vynálezu, které krizově kompetují s protilátkami podle vynálezu (tj. krizově kompetují s protilátkami skupin B, C a/nebo D) a I) nemají sníženou vazbu s CTLA-4 marmoseta (podobné protilátce 111.2.1) nebo II) mají sníženou vazbu s CTLA—4 marmoseta, budou mít podle předkládaného vynálezu další terapeutický potenciál. Také protilátky (nebo jiné molekuly) podle vynálezu, které křížově kompetují s protilátkami skupin A a E podle vynálezu mají určitý terapeutický potenciál.

Příklady provedení vynálezu

Následující příklady včetně provedených pokusů a dosažených výsledků jsou uvedeny pouze pro ilustrativní účely a předkládaný vynález nijak neomezují.

Příklad 1

Příprava hybridomů produkujících protilátku anti-CTLA—4

Protilátky podle vynálezu byly připraveny, selektovány a testovány podle popsaného příkladu.

-27CZ 302706 B6

Příprava antigenu:

Pro imunizaci myší XenoMouse''¹ byly připraveny tři rozdílné imunogeny: i) luzní protein > CTLA-4-|gG, ii) peptid CTLA-4 a iii) buňky myšího lymfomu 300,19 transfekované mutantou CTLA-4 (Y20I V), která je konstitutivně exprimována na buněčném povrchu, i) fúzní protein CTLA 4-1 gG io Konstrukce expresního vektoru:

cDNA kódující zralou extracelulámí doménu CTLA-4 byla ampliíikována pomocí PCR z cDNA knihovny lidského thymu (Clontech) s použitím primerú navržených podle publikované sekvence (Eur. J. Immunol·. 18, 1901-1905, 1988). Fragment byl směrově subklonován do pSR5, expres15 ního plazmidu viru Sindbis (InVitrogen), mezi domény CH1/CH2/CH3 signálního peptidů lidského onkostatinu M a lidského IgG gama 1 (IgG 1). Fúzní protein neobsahuje kloubovou doménu, ale obsahuje cystein 120 v extracelulámí doméně CTLA-4 za vzniku kovalentního dimeru. Výsledný vektor byl nazván CTLA-4-lgG/pSR5. Sekvence kompletní cDNA CTLA-4-lgGl ve vektoru byla potvrzena v obou vláknech. Aminokyselinová sekvence proteinu CTLA—4-lg je

2o ukázána níže. Zralá extracelulámí doména pro CD44 byla amplifikovana pomocí PCR z lidské lymfocytové knihovny (Clontech) a subklonována do pSínRepS za vzniku kontrolního proteinu s identickým koncem IgGl,

Fúzní protein OM-CTLA4-IgG I:

MGVLLT0RTLLSLVLALLFPSMASMAMHVAQPAWLA3SRGIASFVC

EYASPGKATEVRVTVLRQADSQVTEVCAATYMMGNELTFLDDSICT

GTSSGNQVNLTIQGLRAMDTGLYICKVELMYPPPYYLGIGNGTQIY

VIDPEPCPDSDLEGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPE

VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKE

YKCKVSNKALPTPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCL

VKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSR

WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

Podtrženo: signální peptid

Tučně: extracelulámí doména CTLA-4 cDNA pro zralou extracelulámí doménu CD28 byly amplífíkovány pomocí PCR z lidské lymfocytové knihovny (Clontech), a pak subklonovány do pCDM8 (J. Immunol., 151, 5261-71, 1993) za vzniku fúzního proteinu lidského IgGl obsahujícího oblast štěpení trombinem a kloubovou oblast. CTL A—4 z op i c Callithrix jacchuss, Macaca fascicularis a Macaca mullata byl klonován z mRNA izolované z PBMC stimulovaných PHA s použitím standardních technik degenerované PCR. Sekvencování prokázalo, že aminokyselinové sekvence opis rhesus a cynomologous byly totožné, se třemi odlišnostmi oproti zralé lidské extracelulámí doméně CTI.A—4 (S13N, I17T a L105M). U opic C. jacchuss bylo prokázáno deset aminokyselinových odchylek od zralé lidské extracelulámí domény CTLA-4 (V21A. V33I, A41T, A51G, 541, S71F, Q75K, T88M, L105M aG106S). Místně cílená mutageneze byla použita pro vytváření jednobodových mutací všech aminokyselin odlišných v marmoset CTLA-4 pro mapování aminokyselin důležitých pro interakci protilátek s lidským CTLA-4--IgG. Mutace lidského a marmoset CTLA-4- IgG pro epitopové mapování byly vytvářeny pomocí značkovací soupravy pro místně cílené mutageneze (Prome-28 CZ 302706 B6 ga). Fúzní proteiny IgG byly produkovány pomocí přechodné transfekce buněk Cos7 a purifikovány s použitím standardních technik Protein A. U mutovaných proteinů CTLA-4-IgG byla hodnocena vazba k protilátkám prostřednictvím imunopřenosu („imunoblotting“) a s použitím analýz BlAcore.

Exprese/purifikace rekombinantního proteinu

Rekombinantní virus Sindbis vznikal elektroporaci (Gibco) buněk z embryonálních ledvin křečka s SP6 in vitro transkribovanou mRNA CTLA—4—IgG/pSR5 a pomocnou mRNA DH-26S, jak popsáno firmou InVitrogen. Rekombinantní virus byl sklízen čtyřicet osm hodin později a titrován na optimální expresi proteinu v buňkách ovarií čínského křečka (CHO-Kl). Buňky CHO-Kl byly pěstovány v suspenzi DMEM/F12 (Gibco) obsahující 10% teplem inaktivované fetáiní bovinní sérum (Gibco), neesenciální aminokyseliny (Gibco), 4mM glutamin (Gibco), pěnici lin/streptomycin (Gibco), lOmM Hepes pH 7.5 (Gibco). Aby produkovaly CTLA-4-IgG, byly buňky CHO-Kl resuspendovány v množství lxlO⁷ buněk/ml vDMEM/F12 a inkubovány s virem Sindbis jednu hodinu při teplotě místnosti. Pak byly buňky naředěny na lxl0^ó/mI v DMEM/F12 obsahujícím 1% fetáiní bovinní sérum zbavené bovinního IgG s použitím Protein A Sepharose (Pharmacia), neesenciální aminokyseliny, 4mM glutamin, 12,5mM Hepes pH 7,5, a penicilin/streptomyein. Čtyřicet osm hodin po infekci byly buňky peletovány a kondicionovaná média byla sklizena a doplněna tabletami úplného inhibitoru proteáz (Boehringer Mannheim), pH bylo upraveno na 7,5, a média byla filtrována přes 0,2 filtr (Nalgene). FPLC (Pharmacia) byla použita pro afinitní purifikací fúzního proteinu s použitím 5ml kolony A HiTrap (Pharmacia) při rychlosti průtoku 10 ml/minutu. Kolona byla promyta PBS 30 objemy kolony a eluována 0,lM glycinem/HCI, pH 2,8, rychlostí 1 ml/minutu. Frakce (1 ml) byly okamžitě neutralizovány na pH 7,5 pomocí Tris pH 9. Frakce obsahující CTLA—4-lgGl byly identifikovány prostřednictvím SDSPAGE, a pak koncentrovány s použitím Centriplus 50 (Amicon) před aplikací na kolonu Sepharose 200 (Pharmacia) rychlostí 1 ml/minutu s použitím PBS jako rozpouštědla. Frakce obsahující CTLA—4-lgGl byly sloučeny, sterilizovány filtrací 0,2 (Millipore), rozděleny na poměrné části a zmraženy v -80 °C. CD44-IgGl byl exprimován a purifikován s použitím stejných metod, CD28-IgG byl purifikován z kondicionovaných médií od přechodně transfekovaných buněk Cos7.

Charakterizace CTLA-4-IgGl

Purifíkovaný CTLA-4-IgGl migroval jako jeden pás na SDS-PAGE při použití barvení koloidní modří Coomassie (Novex). Za neredukujících podmínek byl Č I LA—4-1 gGl dimer (lOOkD), který se redukoval na monomer o velikosti 50 kD, když byl ošetřen 50mM DTT. Sekvencování aminokyselin purifikovaného CTLA-4-IgGl v roztoku potvrdilo N-koncovou část CTLA 4 (MHVAQPAVVLAS) a to, že signální peptid onkostatinu M byl odštěpen ze zralého fúzního proteinu.

CTLA^4-IgGl se vázal na imobilizovaný B7.1-ígG způsobem závislým na koncentraci a vazba byla blokována křečci profilidskou anti-CTLAM protilátkou (BNI3, PharMingen). Sterilní CTLA^4-IgG byl bez endotoxinu a byl kvantifikován při OD280 s použitím 1,4 jako extinčního koeficientu. Výtěžek purifikovaného CTLA^4-IgG se pohyboval v rozmezí 0,5 až 3 mg/ml buněk CHO-KL (ii) CTLA 4 peptid

Následující peptid Č I LA-4 byl připraven tak, jak je popsáno dále:

NH_3: MHVAQPAVVLAS SRGI AS FVCEYASPGKATEVRVTVLRQADSQVT

EVCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGLRAMDTGLYICK

VELMYPPPYYLGIGNGTQIYVIDPEPC-CONH₂

- 29 CZ 302706 Β6

Zkratky/materiál:

NMP. N-melhylpyrrolidiiion; Tí E, 2,2,2-triťluoroethanol; DCM. dichlormethan; FMOC, fluorenylmethoxykarbonyl. Všechny reagencie byly dodávaný firmou Perkin Elmer s následujícími výjimkami: THE od firmy Aldrieh Chemical, FMOC-PAL-PEG pryskyřice od firmy Perseptive Biosystems. Pro ty aminokyseliny, které vyžadují ochranné skupiny postranních řetězců, byly použity: Emoc-Arg(PMC)-Ol 1, FMOC-Asn(Trt)-OH, FMOC-Asp(tBu)-()l 1, FMOC-Cys(Trt)OH, ' FMOC-Ghi(tBu)-OH, FMOC-Gln(Trt)-OI I, FMOC-His(Boc)-OH, I-MOCEys(B()C)OH, FM()C-Ser(tBu)-OH, FMOC-Thr(tBu)-OH a FMOC -Tyr(tBu)-OH.

Syntéza peptidů

Syntéza peptidů byla prováděna na přístroji Perkin—Elmer 431A dodatečně vybaveném monitorováním vazby prostřednictvím UV absorbance v 301 nm (Perkin-Elmer Model 759A detector). Sekvence peptidů byla syntetizována na pryskyřici FMOC-ΡΑΙ -PEG s použitím kondicionovanýeh dvojitých kondenzačních cyklů. Zesílené dvojité kondenzační reakce byly prováděny v cyklech 10, 11, 18, 19, 20 a 28 až 33. Pryskyřice byla promyta 50% směsí DCM a ΤΓΈ pri ukončení každého acy lačního cyklu, a potom následovalo „zakrytí“ nezreagovaných aminoskupin aeetanhydrídem v NMP. Pryskyřice byla odstraněna z reaktoru po ukončení cyklu 49 a zbytek pokračoval až do ukončení. Odštěpení peptidů z pryskyřice bylo prováděno s použitím Reagent K (King et al„ International Journal of Protein and Peptide Research, 36. 255-266, 1990) po dobu 6 hodin na 415 mg pryskyřice, která poskytla 186 mg hrubého peptidů CTLA-4.

Charakterizace peptidů

25mg alikvoty hrubého peptidů C'TLA-4 byly rozpuštěny v 5 ml 6M guanidin HCI/lOOmM K2PO3 při pH 6,4 a eluovány přes kolonu Pharmacia hi Load Superdex 75 16/60 (16 mm x 600 mm, 120 ml objem kolony) s 2M guanidin HCI/lOOmM K₂PO₃ při pH 6,4 rychlostí 2 ml/min po dobu 180 minut a při sběru 5ml frakcí. Frakce byly analyzovány nanesením 1,7 μΙ frakce na gel NuPAGE Laemeli s MES pufrem a vizualizaci prostřednictvím Daichiiova protokolu barvení stříbrem. Frakce mající molekulovou hmotnost 12 kD, jak usuzováno ze srovnání se standardy molekulové hmotnosti, byly sloučeny a uloženy ve 4 °C. Spojené frakce byly analyzovány pomoct UV a elektroforézy v gelu. Sek věncování aminokyselin bylo prováděno absorpcí vzorku o objemu 100 μΐ na zásobník ProSorb (absorpce na membránu PVDF) a promytím pro odstranění solí pufru. Sekvencování bylo prováděno na přístroji Applied Biosystems 420. Byla pozorována očekávaná N-koncová sekvence (Μ Η V A Q Ρ A V V L A). Imunopřenos prokázal, že peptid byl rozpoznáván CTLA-4 proti-lidskému BN13 (PharMingen). Pro odsolení byl alikvot obsahující 648 pg materiálu přenesen do dialyzačních trubiček 3500 D MWCO a byl dialyzován proti 0,1% TFA/H₂O ve 4 °C po dobu 9 dnů s mícháním. Veškerý obsah dialyzačntho váčku byl lyofilizován na prášek.

(iii) Buňky 300.19 transfekované CTLA-4 (Y201V)

Kompletní cDNA Č I LA 4 byla amplifikována pomocí PCR z cDNA knihovny lidského thymu (Stratagene) a subklonována do pIRESneo (Clontech). Byla zavedena mutace CTLA-4, která má za následek konstitutivní expresi na buněčném povrchu s použitím systému MatchMaker Mutagenesis (Promega). Mutace tyrosinu Y201 na valin inhibuje vazbu proteinu adaptinu AP50, který je zodpovědný za rychlou internalizaci CTLA-4 (Chuang et al., J. Immunol., 159. 144-151, 1997). Buňky 300.19 myšího lymfomu bez mykoplazmat byly pěstovány v RPM1-1640 obsahujícím 10% fetální telecí sérum, neesenciální aminokyseliny, penicilin/streptomycin, 2mM glutamin, I2,5mM Hepes pH 7,5, a 25 M beta-merkaptoethanol. Buňky byly transfekovány elektroporací (3xl0^b/0,4 ml RPMI bez séra) v Iml komůrce s 20 g CTLA—L Y201 V/pIRESneo s použitím 200V/1180uF (Gibco CellPorator). Buňky byly ponechány v klidu 10 minut, a pak bvlo přidáno 8 ml předem ohřátého kompletního média RPMI. Za 48 hodin byly buňky naředěny

- 30 CZ 302706 B6 na 0,5x10^ó/ml kompletním médiem RPMI obsahujícím 1 mg/ml G418 (Gibco). Rezistentní buňky se rozšířily a vykazovaly expresi CTLA—4 na buněčném povrchu pří použití protilátky BNI3 konjugované s iykoerythrinem (PharMingen). Buňky s vysokou hladinou exprese byly izolovány sterilním tříděním.

Imunizace a příprava hybridomu

Myši XenoMouse (staré 8 až 10 týdnů) byly imunizovány i) subkutánně do kořene ocasu s 1x10⁷ buněk 300.19, které byly transfekovány tak, aby exprimovaly CTLA-4. jak popsáno výše, a resuspendovány ve fyziologickém roztoku pufrovaném fosfáty (PBS) s kompletním Freundovým adjuvans, nebo ii) subkutánně do kořene ocasu s a) 10 g Č I LA—4 fúzního proteinu nebo b) 10 g peptidů CTLA-4 emulgovaného v kompletním Freundově adjuvans. V každém případě byla dávka opakována třikrát nebo čtyřikrát v nekompletním Freundově adjuvans. Čtyři dny před fúzí dostaly myši poslední injekci imunogenu nebo buněk v PBS. Lymfocyty ze sleziny a/nebo lymfatických uzlin z imunizovaných myší byly fúzovány s buněčnou linií myšího nesekrečního myelomu P3 a byly podrobeny selekci HAT tak, jak bylo popsáno dříve (Galfre, G. a Milstein, C., „Preparation of monoclonal antibodies, strategies and procedures.“, Methods Enzymol., 73, 3-46, 1981). Byl získán velký panel hybridomů, které všechny sekretovaly CTLA-4 specifické lidské IgG₂K nebo lgG₄K protilátky (jak odhaleno níže).

Test ELISA

ELISA pro zjišťování antigen-specifických protilátek v myším séru a v supematantech hybridomů byla prováděna tak, jak bylo popsáno (Coligan et al., oddíl 2.1, „Enzyme-linked immunosorbent assays,“, Current protocols in immunology, 1994) s použitím CTLA-4-Ig fúzního proteinu k záchytu protilátek. Zvířata, která byla imunizována fúzním proteinem CTLA—4-1 gG, původci navíc testovali na nespecifickou reaktivitu proti lidské Ig části fúzního proteinu. To bylo prováděno s použitím ELISA destiček potažených lidským Ig jako negativní kontrolou specifity.

Ve výhodném testu ELISA byly použity následující techniky:

ELISA destičky byly potahovány 100 μΙ/jamku potahovacím pufrem pro destičky s anti genem (0,lM uhličitanový pufr, pH 9,6 a NaHCO₃ (MW 84) 8,4 g/l). Potom byly destičky inkubovány přes noc ve 4 °C. Po inkubaci byl potahovací pufr odstraněn a destička byla blokována 200 pg/jamku blokovacího pufru (0,5% BSA, 0,1% Tween 20, 0,01% Thimerosal v 1 x PBS) a inkubována při teplotě místnosti 1 hodinu. Nebo byly destičky s blokovacím pufrem uloženy v lednici a utěsněny. Blokovací pufr byl odstraněn a bylo přidáno 50 μΙ/jamku supernatantu z hybridomu, séra nebo supernatantu z jiného hybridomu (pozitivní kontrola) a média HAT nebo blokovacího pufru (negativní kontrola). Destičky byly inkubovány 2 hodiny pri teplotě místnosti. Po inkubaci byly destičky promyty promývacím pufrem (lx PBS). Detekující protilátka (tj. myší proti-lidská IgG2-HRP (SB, #9070-05) pro protilátky IgG2 nebo myší proti-lidská IgG4-HRP (SB #9200-05) pro protilátky IgG4) byla přidána v množství 100 μΙ/jamku (myší proti—liská lgG2-HRP v ředění 1:2000 nebo myší proti-lidská IgG4-HRP v ředění 1:1000 (každá naředěna blokujícím pufrem). Destičky byly inkubovány při teplotě místnosti po dobu 1 hodiny, a pak promyty promývacím pufrem. Potom bylo do jamek přidáno 100 μΙ/jamku čerstvě připraveného vyvíjecího roztoku (10 ml substrátového pufru, 5 mg OPD (o-fenylendiamin, Sigma kat. č. P7288) a 10 μΐ 30% H₃O₂ (Sigma). Destičky se ponechaly vyvíjet 10 až 20 minut, dokud se neobjevilo slabé zabarvení v jamkách s negativními kontrolami. Potom bylo přidáno 100 μΙ/jamku stopovacího roztoku (2M H2SO4) a destičky byly odečítány na odečítacím zařízení pro destičky ELISA pri vlnové délce 490 nm.

-31 CZ 302706 B6

Zjišťování afinitních konstant plně lidských Mab pomocí zařízení BlAcore

Měření afinity puntíkovaných lidských monoklonálních protilátek, Fab fragmentů nebo supernatantů z hybrido mu prostřednictvím plazmonové rezonance bylo prováděno s použitím přístroje

BlAcore 2000, s použitím obecných postupu uvedených výrobcem.

Kinetická analýza protilátek byla prováděna s použitím antigenů i mobilizovaných s nízkou denzitou na povrchu senzoru. Na třech površích senzorického Čipu BlAcore byl imobilizován fúzní protein CTLA—4-lg v hustotě pohybující se od přibližně 390 až 900 při použití fúzního proteinu io CTLA-4-Ig v koncentraci 20 nebo 50 g/ml v lOmM acetátu sodném, pH 5,0, s použitím soupravy pro kondenzaci aminu dodávané výrobcem (BlAcore, lne.). Na čtvrtém povrchu senzorického čipu BlAcore byl imobilizován IgG 1 (900 RU) a byl použítjako negativní kontrolní povrch pro nespecifickou vazbu. Kinetická analýza byla prováděna při rychlosti průtoku 25 nebo 50 μΙ/minutu a byly určovány disociaění (kd nebo k_<wt) a asociační (ka nebo k„„) rychlosti s použitím i? software poskytnutého výrobcem (BIA evaluation 3.0), který umožnil celkové výpočty.

Příklad 2

Měření afinity anti-CTLA-4 protilátek

V následující tabulce jsou poskytnuty výsledky měření afinity některých z protilátek takto vybraných.

Tabulka I

	Pevná fáze i	pomocí BlAcore)
Hybridom	Rychlost asociace Ka (MXS'1 xlO6)	Rychlost disociace Kd (S_1 XlO’4)	Asociační konstanta KA (l/M)=ka/kd xlO10	Disociační konstanta KD (M) =kd/kaxlO*10	Povrchová denzita [RU]
MoabOl	0,68	1,01	0,67	1,48	878,7
	0,70	4,66	0,15	6,68	504,5
	0,77	6,49	0,19	8,41	457,2
	0,60	3,08	0,20	5,11	397, 8
4.1.1	1,85	0,72	2,58	0,39	878,7
	1,88	1,21	1,55	0,64	504,5
	1,73	1,54	1,13	0,88	457,2
	1,86	1,47	1,26	0,79	397,8
4.8.1	0,32	0,07	4,46	0,22	878,7
	0,31	0,23	1,33	0,75	504,5
	0,28	0,06	4,82	0,21	397,8
4.14.3	2,81	3,04	0,92	1,08	878,7
	2,88	3,97	0,73	1,38	504,5
	2,84	6,66	0,43	2,35	457,2
	3,17	5,03	0,63	1,58	397,8

- 32 CZ 302706 B6

6.1.1	0z43	0,35	1,21	0,83	878,7
	0,46	0,90	0,51	1,98	504,5
	0,31	0,51	0,61	1,63	457,2
	0,45	0,79	0,57	1,76	397,8
3.1.1	1,04	0,96	1,07	0,93	878,7
	0,95	1,72	0,55	1,82	504,5
	0,73	1,65	0,44	2,27	457,2
	0,91	2,07	0,44	2,28	397,8
4.9.1	1,55	13,80	0,11	8,94	878,7
	1/43	19,00	0,08	13,20	504,5
	1,35	20,50	0,07	15,20	397,8
4.10.2	1,00	2,53	0,39	2,54	878,7
	0,94	4,30	0,22	4,55	504,5
	0,70	5,05	0,14	7,21	457,2
	1,00	5,24	0,19	5,25	397,8
2.1.3	1,24	9,59	0,13	7,72	878,7
	1,17	13,10	0,09	11,20	504,5
	1,11	13,00	0,09	11,70	397,8
4.13.1	1,22	5,83	0,21	4,78	878,7
	1,29	6,65	0, 19	5,17	504,5
	1,23	7,25	0,17	5,88	397,8

Jak je z údajů vidět, protilátky připravené podle vynálezu mají vysoké afinity a vazebné konstantyPříklad 3

Struktury anti-CTLA-4 protilátek připravených podle vynálezu

V následující diskusi jsou poskytnuty strukturální informace týkající se protilátek připravených podle vynálezu.

Aby se analyzovaly struktury protilátek vytvořených podle vynálezu, vyklonovali původci geny kódující fragmenty těžkého a lehkého řetězce z konkrétního hybridomu. Klonování genů a sekvencování bylo prováděno následovně:

Poly(A)' mRNA byla izolována z přibližně 2x1 Cf hybridomových buněk pocházejících z imunizovaných myší XenoMouse s použitím soupravy Fast-Track (Invitrogen). Po vytvoření cDNA s náhodnými primery následovala PCR. Byly použity primery specifické pro variabilní oblasti rodin lidských V_H nebo lidských V_K (Marks et al., „Olígonucleotide primers for polymerase chain reaction amplification of human immunoglobulin variable genes and design of family-specific olígonucleotide probes.“, Eur. J. Immunol., 21, 985-991, 1991) ve spojení s primery specifickými pro konstantní oblast lidského C 2 (MG-40d, 5-GCTGAGGGAGTAGAGTCCTGAGGA-3) nebo konstantní oblast Ck (1ikP2, jak popsáno dříve v Green et al., 1994). Sekvence transkriptů lidských mAb pocházejících z těžkého řetězce a řetězce kappa z hybridomů byly získány přímým

-33 CZ 302706 B6 sekvencováním produktů PCR vzniklých z poly(A)¹ RNA s použitím primerú popsaných výše. Produkty PCR byly také klonovány do pCRII s použitím TA klonovacího kilu (Invitrogen) a obě vlákna byla sekvencována s použitím souprav pro sekvencování s terminační barevnou značkou Prism a přístrojem pro sekvencování ABI 377. Všechny sekvence byly analyzovány pomoci srovnání s „V BASE sequence directory“ (Tomlinson et al., MRC Centre for Protein Engineering, Cambridge, UK) s použitím programového software MacVector a Geneworks.

Dále byla každá z protilátek 4.1.1,4.8.1, 11.2.1 a 6.1.1 podrobena sekvencování kompletní DNA. Pro toto sekvencování byla izolována poly(A)' mRNA z přibližně 4xl0^(> hybridomových buněk s použitím soupravy mRNA Direct kit (Dynal). mRNA byla reverzně přepsána s použitím oligodT(18) a soupravy Advantage RT/PCR kit (Clonetech). Byla použita databáze variabilních oblastí (V Base) pro navržení amplifikačních primerů začínajících v počátečním místě ATG těžkého řetězce genu DP50:

5-TATCTAAGCTTCTAGACTCGACCGCCACCATGGAGTTTGGGCTGAGCTG-3 a ke stop kodonu konstantní oblasti IgG2:

5-TTCTCTGATCAGAATTCCTATCATTTACCCGGAGACAGGGAGAGCT-3.

K počátečnímu místu ATG byla přidána 5 optimální Kozáková sekvence (ACCGCCACC). Stejná metoda byla použita pro návrh primeru k počátečnímu místu ATG řetězce kappa genu A27:

5-TCTTCAAGCTTGCCCGGGCCCGCCACCATGGAAACCCCAGCGCAG-3 a ke stop kodonu kappa konstantní oblasti:

5-TTCTTTGATCAGAATTCTCACTAACACTCTCCCCTGTTGAAGC-3. 0,12 cDNA byla klonována s použitím primeru k počátečnímu místu ATG:

5-TCTTCAAGCTTGCCCGGGCCCGCCACCATGGCATGAGGGTCCCCGCT-3 a primeru pro stop kodon kappa konstantní oblasti uvedeného výše. cDNA těžkého řetězce byly také klonovány jako genomové konstrukty místně cílenou mutagenezí přidáním místa Nhel na konec variabilní J domény a subklonováním fragmentu Nhel obsahujícím genomové oblasti lgG2 CHl/kloubová oblast/CH2/CH3. Bodová mutace pro vznik místa Nhel nemění aminokyselinovou sekvenci proti sekvenci zárodečné linie. Páry primerů byly použity pro amplifikací cDNA s použitím soupravy Advantage High Fidelity PCR Kit (Clonetech). Sekvence z PCR byla získána přímým sekvencováním s použitím sekvenačních souprav s terminační barevnou značkou a přístrojem pro sekvencování ABL Produkt PCR byl klonován do savčích expresních vektorů pEE-glutaminsyntetáza (Lonza) a tři klony byly sekvencovány pro potvrzení somatických mutací. U každého klonu byla sekvence verifikována na obou vláknech v přinejmenším třech reakcích. Neglykosylovaná protilátka 4.1.1 byla vytvořena místně cílenou mutagenezí N294Q v doméně CH2. Rekombinantní protilátky byly produkovány přechodnou transfekci buněk Cos7 v FCS bez IgG a purifikovány s použitím standardních technik Protein A Sepharose. Stabilní transfektanty byly vytvářeny elektroporací myších buněk NSO a selekcí v médiu bez glutaminu. Rekombinantní 4.1.1 s gly kosy lácí nebo bez ní projevovaly identickou spec i fí tu a afinitu pro CTLA—4 v in vitro testech ELISA a BIAcore.

Analýza utilizace genu

Následující tabulka uvádí utilizací genu prokázanou vybranými hybridomovými klony protilátek podle vynálezu:

-34CZ 302706 B6

Tabulka II

Utilizace genů těžkého a lehkého řetězce

Klon	Těžký řetězec		Lehký řetězec kapa
VH	D	JH		VK	JK
4.1.1	DP-50	DIR4 nebo DIR3	JH4		A27	JK1
4.8.1	DP-50	7-27	JH4		A27	JK4
4.14.3	DP-50	7-27	JH4		A27	JK3
6.1.1	DP-50	DIR5 nebo DXRSrc	JH4		A27	JK3
3.1.1	DP-50	3-3	JH6		012	JK3
4.10.2	DP-50	7-27	JH4		A27	JK3
2.1.3	DP-65	1-26	JH6		A10/A26	JK4
4.13.1	DP-50	7-27	JH4		A27	JK3
11.2.1	DP-50	Dl-26	JH6		012	JK3
11.6.1	DP-50	D2-2 nebo D4	JH6		012	JK3
11.7.1	DP-50	D3-22 nebo D21-9	JH4		012	JK3
12.3.1.1	DP-50	D3-3 nebo DXP4	JH6		A17	JK1
12.9.1.1	DP-50	D6-19	JH4		A3/A19	JK4
,4.9.1	DP-47	5-24 a/nebo 6-19	JH4		L5	JK1

Jak bylo pozorováno, protilátky podle předkládaného vynálezu byly vytvářeny se silnou tendencí k utilizaci variabilní oblasti těžkého řetězce DP^IO. Gen DP-50 je také odkazován do rodiny genu V_H 3-33. Pouze jedna protilátka, která byla selektována na základě vazby CTLA-4 a předběžných in vitro funkčních testů vykázala utilizaci genu těžkého řetězce jiného než je DP50. Tento klon, 2.1.3., používal variabilní oblast těžkého řetězce DP-65 aje izotypu IgG4. Gen DP-65 je také odkazován do rodiny genu V_H 4-31. Na druhé straně klon 4.9.1, který má variabilní oblast těžkého řetězce DP-47, váže CTLA—4, ale ne inhibuje vazbu k B7-1 nebo B7-2. U myší XenoMouse je více než 30 odlišných funkčních variabilních genů těžkého řetězce, ke kterým se tvoří protilátky. Tato tendence je tudíž ukazatel preferovaného vazebného motivu v interakci protilátka-antigen s ohledem na kombinované vlastnosti vazby k antigenu a funkční aktivitu.

Mutační analýza

Jak bylo vyhodnoceno, analýza utilizace genů poskytuje pouze omezený přehled proti látkové struktury. Protože B lymfocyty myší XenoMouse náhodně vytvářejí transkripty V-D-J- těžkého řetězce nebo V-J kappa lehkého řetězce, je zde celá řada sekundárních procesů, které se objevují, včetně, ale bez omezení, somatické hypermutace, n-adicí a CDR3 extenzí. (Viz například Mendez et al., Nátuře Genetics, 15, 146-156, 1997, patentová přihláška Spojených Států 08/759 620, podaná 3. prosince, 1996. V souladu s tím byly pro další zkoumání protilátkové struktury vytvářeny z cDNA získané z klonů predikované aminokyselinové sekvence protilátek. Navíc byly získány prostřednictvím sekvencování proteinů N—koncové aminokyselinové sekvence.

Obrázek 1 poskytuje nukleotidové a predikované aminokyselinové sekvence těžkých a kappa lehkých řetězců z klonů 4.1.1 (obrázek IA), 4.8.1 (obrázek 1B), 4.14.3 (obrázek IC), 6.1.1 (obrázek ID), 3.1.1 (obrázek 1E), 4.10.2 (obrázek 1F), 2.1.3 (obrázek ÍG), 4.13.1 (obrázek IH), 11.2.1 (obrázek II), 11.6.1 (obrázek IJ), 11.7.1 (obrázek 1K), 12.3.1.1 (obrázek 1L) a 12.9.1.1 (obrázek

-35 CZ 302706 B6

1M). Na obrázcích 1 A, 1B a ID jsou uvedené rozšířené sekvence protilátek 4.1.1, 4.8.1 a 6,1.1 získané klonováním kompletních cDNA, jak popsáno výše. Na těchto obrázcích jsou sekvence signálního peptidu (nebo báze kódující totéž) označeny tučně a sekvence používané pro 5 PCR reakce jsou podtrženy.

s

Obrázek 2 poskytuje srovnání sekvencí mezí před i kovaný mí aminokyselinovými sekvencemi těžkého řetězce z klonů 4.1.1, 4.8.1, 4.14.3, 6.1.1, 3.1.1, 4.10.2. 4.13.1, 1 1.2.1, 11.6.1. 11.7.1,

12.3.1.1 a 12.9.1.1 a aminokyselinovou sekvencí zárodečné linie DP-50 (3-33). Rozdíly mezi sekvencí zárodečné linie DP-50 (3-33). Rozdíly mezi sekvencí zárodečné linie DP-50 a sekvenio cemi z klonů jsou označeny tučným písmem. Obrázek také ukazuje pozice sekvencí CDRI, CDR2 a CDR3 protilátek jako stínované.

Obrázek 3 poskytuje srovnání sekvencí mezi předikovanou aminokyselinovou sekvencí těžkého řetězce klonu 2.1.3 a aminokyselinovou sekvencí zárodečné linie DP-65 (4 -31). Rozdíly mezi i? sekvencí zárodečné linie DP-65 a sekvencí z klonu jsou označeny tučným písmem. Obrázek také ukazuje pozice sekvencí CDRI, CDR2 a CDR3 protilátky jako podtržené.

Obrázek 4 poskytuje srovnání sekvencí mezi předikovanou aminokyselinovou sekvencí kappa lehkého řetězce z klonů 4.1.1, 4.8.1, 4.14.3, 6.1.1, 4.10.2 a 4.13.1 a aminokyselinovou sekvencí zárodečné linie A27. Rozdíly mezi sekvencí zárodečné linie A27 a sekvencemi z klonů jsou označeny tučným písmem. Obrázek také ukazuje pozice sekvencí CDRI, CDR2 a CDR3 protilátek jako podtržené. Zřejmé delece v CDR klonů 4.8.1,4.14.3 a 6.1.1 jsou označeny „0“.

Obrázek 5 poskytuje srovnání sekvencí mezi předikovanou aminokyselinovou sekvencí kappa lehkého řetězce z klonů 3.1.1, 11.2.1, 11.6.1 a 11.7.1 a aminokyselinovou sekvencí zárodečné linie 012. Rozdíly mezi sekvencí zárodečné linie 012 a sekvencí z klonů jsou označeny tučným písmem. Obrázek také ukazuje pozice sekvencí CDRI, CDR2 a CDR3 protilátek jako podtržené.

Obrázek 6 poskytuje srovnání sekvencí mezi předikovanou aminokyselinovou sekvencí kappa κι lehkého řetězce z klonů 2.1.3 a aminokyselinovou sekvencí zárodečné linie A10/A26. Rozdíly mezi sekvencí zárodečné linie A10/A26 a sekvencí z klonu jsou označeny tučným písmem. Obrázek také ukazuje pozice sekvencí CDRI, CDR2 a CDR3 protilátek jako podtržené.

Obrázek 7 poskytuje srovnání sekvencí mezi předikovanou aminokyselinovou sekvencí kappa lehkého řetězce klonu 12.3.1 a aminokyselinovou sekvencí zárodečné linie A17. Rozdíly mezi sekvencí zárodečné linie AI7 a sekvencí z klonu jsou označeny tučným písmem. Obrázek také ukazuje pozice sekvencí CDRI, CDR2 a CDR3 protilátek jako podtržené.

Obrázek 8 poskytuje srovnání sekvencí mezi předikovanou aminokyselinovou sekvencí kappa lehkého řetězce klonu 12.9.1 a aminokyselinovou sekvencí zárodečné linie A3/A19. Rozdíly mezí sekvencí zárodečné linie A3/A19 a sekvencí z klonu jsou označeny tučným písmem. Obrázek také ukazuje pozice sekvencí CDRI, CDR2 a CDR3 protilátek jako podtržené.

Obrázek 22 poskytuje série dalších nukleotidových a aminokyselinových sekvencí následujících anti-CTLA-4 proti látkových řetězců:

4.1.1:

kompletní 4.1.1 těžký řetězec (cDNA 22(a), genomová 22(b) a aminokyselinová 22(c)) kompletní neglykosylovaný 4.1,1 těžký řetězec (cDNA 22(d) a aminokyselinová 22(e))

4.1.1 lehký řetězec (cDNA 22(f) a aminokyselinová 22(g)).

- 36 CZ 302706 B6

4.8.1:

kompletní 4.8.1 těžký řetězec (cDNA 22(h) a aminokyselinová 22(i))

4.8.1 lehký řetězec (cDNA 22(j) a aminokyselinová 22(k))

6.1.1:

kompletní 6.1.1 těžký řetězec (cDNA 22(1) a aminokyselinová 22(m))

6.1.1 lehký řetězec (cDNA 22(n) a aminokyselinová 22(o))

11.2.1:

kompletní 11.2.1 těžký řetězec (cDNA 22(p) a aminokyselinová 22(q))

11.2.1 lehký řetězec (cDNA 22(r) a aminokyselinová 22(s))

Sekvence signálního peptidu jsou označeny tučným písmem a velkým textem. Otevřené čtecí rámce kompletní sekvence 4.1.1 genomové DNA (obr. 22(b)) jsou podtržené. A mutace zavedené pro vytvoření neglykosylovaného 4.1.1 těžkého řetězce a výsledná změna (N294Q) jsou označeny podtržením a tučným textem (sekvence cDNA (obr. 22(b)) a aminokyselinová sekvence (obr. 22(c)).

Příklad 4

Analýza aminokyselinových substitucí těžkého a lehkého řetězce

Na obrázku 2, který poskytuje srovnání sekvencí mezi před i kovaný mi aminokyselinovými sekvencemi těžkého řetězce z klonů 4.1.1, 4.8.1, 4.14.3, 6.1.1, 3.1.1, 4.10.2, 4.13.1, 11.2.1, 11.6.1, 11.7.1, 12.3.1.1 a 12.9.1.1 a aminokyselinovou sekvencí zárodečné linie DP-50 (3-33), vyšel najevo zajímavý vzor. Navíc k faktu dispozice pro těžký řetězec DP-50 ve většině klonů, existuje relativně omezená hypermutace v protilátkách příbuzných s genem zárodečné linie DP50. Například klony 3.1.1 a 11.2.1 neměly žádné mutace. Navíc mutace v dalších klonech jsou všeobecně konzervativní změny týkající se substitucí aminokyselin s podobnými vlastnostmi s aminokyselinami v zárodečné linii. Mutace v mnoha sekvencích CDR.1 a CDR2 jsou obzvláště konzervativní povahy. Tři těžké řetězce zobrazené na obrázku 2, 4.10.2, 4.13.1 a 4.14.3, jasně pocházejí od jednoho rekombinantního jevu (tj. pocházejí z totožného germinálního centra) a mají téměř totožnou sekvenci. Jestliže jsou tyto tři považovány za jednu sekvenci, pak z 10 rozdílných protilátek obsahujících DP50 těžký řetězec, jsou v CDR1 a CDR2 3 pozice, ve kterých je nepolární zbytek nahrazen jiným nepolárním zbytkem, 12, kdy je polární nenabitý zbytek nahrazen jiným polárním nenabitým zbytkem a 1, ve které je polární nabitý zbytek nahrazen jiným polárním nabitým zbytkem. Navíc jsou dvě pozice, ve kterých jsou dva zbytky, které jsou velice podobné strukturálně, glycin a alanin, substituovány navzájem. Jediné mutace, které nejsou striktně konzervativní, se týkají 3 substitucí polárního nabitého zbytku polárním nenabitým zbytkem a jedné substituce nepolárního zbytku polárním zbytkem.

Lehké řetězce těchto protilátek pocházejí z 5 rozdílných genů Vk. Gen A27 je zastoupen nejvíce aje zdrojem 6 odlišných lehkých řetězců. Srovnání těchto 6 sekvencí odhalilo dvě pozoruhodné charakteristické stránky. Zaprvé tři z nich, 4.8.1, 4.14.3 a 6.1.1, obsahují delece jednoho nebo dvou zbytků v CDR1, což je vzácný jev. Za druhé, existuje silný důvod proti šeřinu v pozici šest v CDR3 zárodečné linie, a serin je v každé sekvenci nahrazen. To svědčí pro to, že šeřin v této pozici je nekompatibilní s vazbou CTLA-4.

- 37 CZ 302706 B6

Uznává se, že mnoho z výše identifikovaných aminokyselinových substitucí existuje v těsné blízkosti s CDR nebo v CDR. Zdá se, že tylo substituce mají určitý vliv na vazbu protilátky k molekule CTLA-4. Dále tyto substituce by mohyl mít významný účinek na afinitu protilátek.

Příklad 5

Analýza N-koncové aminokyselinové sekvence protilátek podle vynálezu

Aby se dále verifikovalo složení a struktura protilátek podle vynálezu identifikovaných výše, sekvencovali původci několik těchto protilátek s použitím sekvenačního přístroje Perkin-Elmer. Byly izolovány oba, těžký a kappa lehký řetězec protilátek, a purifikovány prostřednictvím preparativní gelové elektroforézy a elektropřenosu, a pak přímo sekvencovány, jak je popsáno v příkladu 6. Většina sekvencí těžkého řetězce byla blokována na svém amino-konci. Tyto protilátky byly tedy nejdříve ošetřeny pyroglutamátaminopeptidázou, a pak sekvencovány.

Výsledky tohoto pokusu jsou ukázány na obrázku 9. Obrázek 9 také poskytuje molekulovou hmotnost těžkého a lehkého řetězce, jak byly určeny hmotnostní spektroskopií (MALDI).

Příklad 6

Další charakterizace protilátek podle vynálezu

Obrázek 10 poskytuje některé další charakteristické informace o určitých protilátkách podle vynálezu. Na obrázku jsou sumarizována data týkající se klonů 3.1.1, 4.1.1, 4.8.1, 4.14.3 a 6.1.1. Jsou poskytnuta následující data: koncentrace, izoelektrické „zaostřování“ („focusin“) (IEF), SDS-PAGE, vylučování chromatografie, FACS, hmotnostní spektroskopie (MALDI) a Nkoncové sekvence lehkého řetězce.

Data všeobecně byla získávána následovně:

Materiál a metody:

Proteinová koncentrace byla zjišťována při 280 nm z UV skenu (200 až 350 nm), kdy 1,58 jednotky absorbance při 280 nm odpovídalo 1 mg/ml.

SDS-PAGE byla prováděna s použitím elektroforetického systému s 10% gelem NuPAGE a pracovním pufrem MES. Vzorky byly připraveny ředěním 3:1 s 4x pufrem NuPAGE pro vzorky (+/-), beta-merkaptoethanolem, zahřátím a na gel bylo naneseno -5 g proteinu. Gel byl pak obarven barvicím roztokem Brilliant Blue R (Sigma kat. č. B-6529) a molekulové hmotnosti byly vyhodnoceny srovnáním obarvených pásů se standardy „Perfect Protein Markers“ (Novagen kat. č. 69149-3).

Pro N-koncové sekvencování byly vzorky děleny tak, jak je uvedeno výše, na gelech NuPAGE, přeneseny na jmobilizační membránu Pro Blot (Applied Biosystems), a pak obarveny modří Coomassie Blue R-250. Obarvené proteinové pásy byly vyříznuty a podrobeny sekvenační analýze pomocí automatizované Ed man o vy degradace na sekvenačním přístroji Applied Biosystems 494 Procise HT Sequencer.

Izoelektrické zaostřování (IEF) bylo prováděno s použitím gelů Pharmacia IEF 3-9 pHast (kat. č. 17-0543-01). Vzorky byly naředěny 10% glycerolem na koncentraci -0,8 mg/ml a 1 μΙ byl nanesen na gel, a poté obarven. Hodnoty pl pak byly vyhodnoceny srovnáním obarvených pásů se standardy IEF pro široké rozmezí (pH 3 až 10) (Pharmacia, kat. č. 17-0471-01).

- 38CZ 302706 Β6

Vylučovací chromatografie (SEC) byla prováděna ve fyziologickém roztoku pufrovaném fosfáty (PBS) na systému SMART Pharmacia s použitím kolony Superdex 75 PC 3,2/30. Molekulové hmotnosti byly vyhodnoceny srovnáním retenčního času vrcholu s retenčním časem gelu.

Pro studie FACS byly připraveny lidské periferní T lymfocyty a 48 hodin stimulovány. T lymfocyty byly jednou promyty, resuspendovány ve FACS pufru v množství 1x10⁶ buněk/100 μΐ a barveny na povrchovou expresi CD3 s 10 μΐ anti-CD3-FITC (Immunotech, Marseille, Francie) po dobu 30 minut při teplotě místnosti. Buňky byly promyty dvakrát, pak fixovány, permeabilizovány (Fix and Perm, Caltag) a obarveny na intracelulámí expresi CTLA-4 s 10 μΐ anti-CD152-PE (Pharmingen). Průtoková cytometrie byla prováděna s použitím přístroje FACsort Becton Dickinson. Kvadranty byly ustanoveny analýzou relevantních izotypových kontrolních protilátek (Caltag).

Jak bylo diskutováno výše, bylo prokázáno, že anti-CTLA—4 protilátky mají spolehlivou silnou imunomodulační aktivitu. Následující pokusy byly prováděny proto, aby se určilo, jestli protilátky podle předkládaného vynálezu mají tuto aktivitu. Pokusy byly obecně navrženy pro stanovení schopnosti protilátek inhibovat interakci mezi molekulami CTLA-4 a B7, být selektivní pro molekuly CTLA-4, B7 a CD28 a podporovat produkci cytokinů T lymfocyty, včetně, ale bez omezení, exprese IL-2 a/nebo IFN-. Dále se vyšetřovala zkřížená reaktivita protilátek podle vynálezu s některými lidskými tkáněmi a molekulami CTLA—4 jiných živočišných druhů (např. myší a primátů).

Příklad 7

Kompetitivní ELISA: inhibice interakce CTLA—4/B7-1 nebo B7-2 protilátkami podle vynálezu

Byl prováděn in vitro test, aby se určilo, jestli byly protilátky podle předkládaného vynálezu schopné inhibice vazby CTLA-4 s B7-1 nebo B7-2. Jak bylo uznáno, očekává se, že protilátky podle vynálezu, které jsou schopné inhibovat vazbu CTLA-4 s molekulami B7, jsou kandidáty pro regulaci imunity prostřednictvím metabolické dráhy CTLA—4. V testu byly použity následující materiály a metody:

Materiály a metody

96-jamkové destičky MaxiSop byly potaženy 3 nM B7.1-Ig(Gl) nebo B7.2-Ig(Gl) (Repligen, lne. Needham, MA) v Dulbeccově PBS a inkubovány ve 4 °C přes noc. Druhý den byl B7-Ig odstraněn a destičky byly blokovány 1% BSA s 0,05% Tween-20 v D-PBS po dobu dvou hodin. Destičky byly promyty 3x promývacím pufrem (0,05% Tween-20 v D-PBS). Protilátky v příslušných testovaných koncentracích a CTLA—4-1 g(G4) (0,3 nM konečná koncentrace) (Repligen, lne. Needham, MA) byly předem míchány po dobu 15 minut a pak přidány na destičku potaženou B7-Ig (60 μΐ celkový objem) a inkubovány při teplotě místnosti 1,5 hodiny. Destičky byly promyty 3x a bylo přidáno 50 μΐ ředění 1 až 1000 myší protilidské protilátky IgG4 konjugované s HRP (Zymed, San Francisco, CA, ě. 05-3820) a destičky byly inkubovány 20 minut při teplotě místnosti, a pak bylo na destičku přidáno 50 μΐ IN FLSO4. Destičky byly odečítány ve 450 nm s použitím odečítacího zařízení pro destičky od Molecular Devices (Sunnyvale, CA). Všechny vzorky byly testovány v duplikátech. Maximální signál byl definován jako vazba CTLA—4 v nepřítomnosti testované protilátky. Nespecifická vazba byla definována jako absorbance v nepřítomnosti CTLA—4-1 g a testované protilátky.

Výsledky testu jsou uvedeny v tabulkách IIIA a ΙΠΒ. V tabulce ΠΙΑ jsou výsledky uvedeny pro celou řadu protilátek podle vynálezu. V tabulce IIIB jsou uvedeny výsledky srovnávající protilátku 4.1.1 podle vynálezu s protilátkou 11.2.1 podle vynálezu ze samostatného pokusu.

-39 C7. 302706 B6

Tabulka IIIA

Klon CTLA-4-Ig	Izotyp	CTLA-4/B7.2 komp. ELISA IC50 (nM)	CTLA-4/B7.1 komp. ELISA IC50 (nM)
CT3.1.1	IgG2	0,45±0,07 (n=3)	0,63±0,10 (n=2)
CT4.1.1	IgG2	0,38+0,06 (n=5)	0,50±0,05 (n=2)
CT4.8.1	IgG2	0,57+0,03 (n=3)	0,17±0,28 (n = 2)
CT4.9.1	IgG2	Nekompetitivní (n=3)	Nekompet i t i vní (n=2)
CT4.10.2	IgG2	1,5010,37 (n=3)	3,39+0,31 (n=2)
CT4.13.1	IgG2	0,49±0,05 (n=3)	0,98±0,ll (n=2)
CT4.14.3	IgG2	0,69±0,11 (n=3)	l,04±0,15 (n=2)
CTG.1.1	IgG2	0,39±0,06 (n=3)	0,67+0,07 (n=2)

Tabulka IIIB

Klon CTLA-4-Ig	Izotyp	CTLA-4/B7.2 komp, ELISA IC50 (nM)	CTLA-4/B7.1 komp. ELISA IC50 (nM)
CT4.1.1	IgG2	0,55+0,08 (n=4)	0,87+0,14 (n=2)
CT11.2.1	IgG2	0,56±0,05 (n=4)	0,81±0,24 (n=2)

Příklad 8

Poměr selektivity protilátek podle vynálezu k CTLA—4 ve srovnání s CD28 nebo B7-2

Byl prováděn další in vitro test, aby se určila selektivita protilátek podle vynálezu vzhledem k CTLA-4 buď proti CD28 nebo B7-2. V pokusech byly použity následující materiály a metody. ELISA na selektivitu CTLA-4: Materiály a metody

96—jamková destička FluroNUNC (Nunc kat. č. 475515) byla potažena čtyřmi antigeny: CTLA— 4/lg. CD44/Ig, CD28/Ig a B7.2/Ig (antigeny vytvořené ve vlastní laboratoři). Destička byla potahována přes noc ve 4 °C antigeny v koncentraci 1 g/ml v množství 100 μΙ/jamku v 0,lM pufru hydrogenuhličitanu sodném, pH 96. Destička pak byla promyta s PBST (PBS+0,1%

Tween-20) třikrát s použitím myčky destiček NUNC. Destička byla blokována s PPBST +0,5% BSA v množství 150 μΙ/jamku. Destička byla inkubována při teplotě místnosti po dobu 1 hodiny, a pak promyta třikrát s PBST. Pak byly naředěny anti-CTI.A4 protilátky podle vynálezu en bloc v 1 g/ml a byly přidány na destičku. Destička byla inkubována při teplotě místnosti po dobu i hodiny, a pak promyta třikrát s PBST. Jamky, které obsahovaly protilátky podle vynálezu, pak byly ošetřeny 100 μΙ/jamku proti-lidským IgG2-HRP (Souther Biotech kat. č. 9070-05) v ředění

1:4000 en bloc. Jedna řada byla také ošetřena proti-lidským IgG (Jackson kat. č. 209-035-088)

-40CZ 302706 B6 pro normalizaci potažení destiček, Tato protilátka byla nareděna 1:5000 en bloc a přidána v množství 100 μΙ/jamku. Jedna řada byla také ošetřena proti-lidským CTLA-4-HRP (Pharmingen, kat. ě. 345815/konjugováno s HRP na přání zákazníka) jako pozitivní kontrola. Tato protilátka byla použita v množství 0,05g/ml ředěná en bloc. Destička byla inkubována při teplotě místnosti po dobu 1 hodiny, a pak promyta třikrát s PBST. LBA chem i luminiscenční substrát (Pierce) byl přidán v množství 100 μΙ/jamku a destička byla inkubována na třepačce destiček 5 minut. Destička pak byla odečtena s použitím zobrazovacího zařízení luminiscence po 2 minutové expozici.

io Test selektivity vazby IGEN pro CTLA-4: materiály a metody

Perličky M^45O Dynabeads (Dynal A.S., Oslo, Norsko, č. 140.02) byly promyty 3x pufrem fosfátem sodným, pH 7,4, a resuspendovány v pufru fosfátu sodném. Ke 100μΙ perliček byl přidán 1,0 g CTLA-A-Ig(Gl), 1,0 g CD2 8-1 g(Gl) nebo 1,0 až 3,0 g B7.2-Ig(Gl) (Repligen, lne.

Needham, MA) a byly inkubovány přes noc na rotátoru ve 4 °C. Druhý den byly perličky promyty 3x v 1% BSA plus 0,05% Tween-20 v Dulbeccově PBS a blokovány 30 minut. Perličky byly naředěny 1 až 10 blokujícím pufrem a 25 μΐ potažených perliček bylo dáno do polypropylenových zkumavek 12x75 mm. Všechny vzorky byly testovány v duplikátu. Do zkumavek bylo přidáno 50 μΐ testované protilátky (konečná koncentrace 1 g/ml) nebo blokujícího pufru a inku20 bováno 30 minut na karuselovém pásu analyzátoru Origen 1,5 (IGEN International, Inc., Gaithersburg, MD) při teplotě místnosti, vortexováno 100 rpm. Do zkumavek bylo přidáno 25 μ) myší proti-lidské IgGl, IgG2 nebo IgG4 s rutheniem (Zymed, Inc., San Francisco, CA, č. 05-3300, 05-3500 a 05-3800) (konečná koncentrace 3 g/ml ve 100 μΐ celkového objemu). Zkumavky byly inkubovány 30 minut při teplotě místnosti na karuselovém pásu, vertexováno 100 rpm. Bylo přidáno 200 μΐ pufru testu Origen (IGEN International, Inc., Gaithersburg, MD, č. 402-050—03) do každé zkumavky, krátce vortexováno, a pak byly zkumavky odečítány na analyzátoru Origen a pro každou zkumavku byly určeny jednotky ECL (elektrochemiluminiscence). Byly zjištěny normalizační faktory pro opravu odchylek vazby fúzních proteinů na perličky Dynabeads a jednotky ECL byly korigovány na nespecifickou vazbu před výpočtem stupně selektivity.

Výsledky testů jsou uvedeny v tabulkách IVA a IVB.

-41 CZ 302706 B6

Tabulka IVA

Klon	Izotyp	CTLA4/CD28 ELISA	CTLA4/B7.2 ELISA	CTLA4/CD44 ELISA	CTLA4/CD28 IGEN	CTLA4/B7.2 IGEN
3.1.1	IgG2	>500:1 (n-3)	>500:1 (n-3)	>500:1 (n=3)	>500:1 (n-2)	>500:1 (n=l) 195:1 (n-1)
4.1.1	IgG2	>500:1 (n-3)	>500:1 (n=2) 485:1 (n=l)	>500:1 (n-3)	>500:1 (n-1) 261:1 (n-1)	>500:1 (n-1) 107:1 (n-1)
4.8.1	IgG2	>500:1 (n=3)	>500:1 (n-2) 190:1 (n-1)	>500:1 (n=3)	>500:1 (n=2)	>500:1 (n-2)
4.9.1	IgG2	>500:1 (n=2) 244:1 (n-1)	>500:1 (n=2) 33:1 (n-i)	>500:1 (n=3)	>500:1 (n-1)	>500:1 (n=l)
4.10.2	IgG2	>500:1 (n-3)	>500:1 (n=3)	>500:1 (n=3)	>500:1 (n=l)	>500:1 (n=l)
4.13,1	IgG2	>500:1 (n=2) 46:1 (n-1)	>500:1 (n=3)	>500:1 (n-3)	>500:1 (n=D 329:1 (n=l)	>500:1 (n-2)
4.14.3	IgG2	>500:1 (n=2) 80:1 (n=l)	>500:1 (n=2) 10:1 (n-1)	>500:1 (n-2) 126:1 (n-1)	>413:1 (n-1)	>234:1 (n-1)
6.1.1	IgG2	>500:1 (n=2) 52:1 (n=l>	>500:1 (n=3)	>500:1 (n=3)	>500:1 (n=2)	>500:1 (n-2)

Tabulka IVB

Klon	Izotyp	CTLA4/CD28 ELISA	CTLA4/B7.2 ELISA	CTLA4/hIgG ELISA
4.1.1	IgG2	>500:1 (n-3)	>500:1 (n=2)	>500:1 (n-3)
11.2.1	IgG2	>500:1 (n=3)	>500:1 (n-3)	>500:1 (n=3)

Příklad 9

Model buněčného signálu lidských T lymfocytů

Pro další vymezení aktivity protilátek podle vynálezu při působení jako regulátorů imunity, vyvinuli původci některé testy T lymfocytů, aby se kvantifikovalo zvýšení produkce IL-2 T lymfocyty při blokádě CTLA-4 signálu protilátkami. Při těchto pokusech byly použity následující materiály a metody:

Materiály a metody

Čerstvě izolované lidské T lymfocyty byly připraveny a použitím Histopaque (Sigma, St. Louis,

MO, č. A-70543) a T-kwik (Lympho-Kwik, One Lambda, Canoga Park, CA, č. LK-50-T)

-42 CZ 302706 B6 a stimulovány s PHA (1 g/ml) (puntíkovaný fytohemaglutinin, Murex Diagnostics Ltd., Dartford, England, č. HA 16) v médiu (RPMI 1640 obsahující L-glutamin, MEM neesenciální aminokyseliny, penicilín, streptomycin, 25 mM Hepes a 10% FBS) v koncentraci lxlO⁶ buněk/ml a inkubovány ve 37 °C po 2 dny. Buňky byly promyty a naředěny médiem na 2x10⁶ buněk/ml. Buňky Ráji (Burkittův lymfom, lidský, ATCC č.: CCL 86 Class II American Type Culture Collection, Rockville, MD) byly ošetřeny mitomycinem C (Sigma, St. Louis, MO, č, M-4287) (25 g/ml) jednu hodinu ve 37 °C. Buňky Ráji byly promyty 4x v PBS a resuspendovány v množství 2x10^Ď buněk/ml. Lidské T lymfoblasty (5xl0⁵/ml), buňky Ráji (5xl0⁵/ml) a anti-CTLA-4 protilátky nebo kontrolní protilátka souhlasného izotypu v různých koncentracích byly přidány na 96jamkové mikrotitrační destičky a destičky byly inkubovány ve 37 °C po 72 hodin. Celkový objem jamky byl 200 μΙ. 72 hodin po stimulaci byly destičky stočeny a supematant byl odstraněn a zamražen pro pozdější zjišťování IL-2 (Quantikine IL-2 ELISA kit, R&D Systems, MN, č. D 2050) a IFN(Quantikine IL-2 ELISA kit, R&D Systems). Zvýšení cytokinů bylo definováno jako rozdíl mezi hladinami cytokinů v tkáňových kulturách obsahujících anti-CTLA-4 blokující mAb proti kontrolní protilátce souhlasného izotypu. Pro experimenty s průtokovou cytometrií byly buňky Ráji promyty lx pufrem FACS (PBS obsahující 2% teplem inaktivované FCS, 0,025% azid sodný). Buněčné pelety byly resuspendovány v pufru FACS v množství lxlO⁶ buněk/100 μΐ a inkubovány s 10 μΐ anti-CD80-PE (Becton Dickinson, San Josse, CA) nebo anti-CD86-PE (Pharmingen, San Díego) po dobu 30 minut pri teplotě místnosti. Buňky byly promyty dvakrát a resuspendovány v 1 mí pufru FACS. Průtoková cytometrie byla prováděna s použitím přístroje Becton Dickinson FACSort. Histogramové markéry byly nastavené analýzou relevantních izotypových kontrolních protilátek (Caltag, Burlingame, CA).

Původci obecně vyvinuly test, který může být použit pro rychlé určení aktivace IL-2 T lymfocyty. Jak bylo uznáno, stimulace T lymfocytů je závislá na B7 a CD28. Navíc promyté T blasty netvořily zjistitelný IL-2 a buňky Ráji netvořily zjistitelný IL-2, dokonce ani když byly stimulovány LPS neb PWM. Ale, v kombinaci, T blasty společně pěstované s buňkami Ráji mohou modelovat signální jevy B7, CTLA-4 a CD28 a může na nich tedy být hodnocen účinek protilátek.

Obrázek 11 ukazuje expresi B7-1 a B7-2 na buňkách Ráji při použití anti-CD80-PE a antiCD86-Pe mAb a s použitím průtokové cytometrie (FACS), jak je popsáno v příkladu 6.

Obrázek 12 ukazuje na koncentraci závislé zvýšení produkce IL-2 v testu sT lymfoblasty/Raji indukované protilátkami blokujícími CTLA—4 (BNI3 (Pharmingen) a 4.1.1,4.8.6 a 6.1.1 protilátkami podle vynálezu).

Obrázek 13 ukazuje na koncentraci závislé zvýšení produkce IFN- v testu sT lymfoblasty/Raji indukované protilátkami blokujícími CTLA—4 (BNI3 (Pharmingen)a4.l.l,4.8.6a6.I.l protilátkami podle vynálezu) (stejné dárcovské T lymfocyty).

Obrázek 14 ukazuje průměrné zvýšení produkce IL-2 vT lymfocytech od 6 dárců indukované protilátkami blokujícími CTLA—4 v testu sT lymfoblasty/Raji. Je zajímavé zvážit, že mAb CT4.9.1 se váže na CTLA—4, ale neblokuje vazbu B7. Tedy pouhá vazba na CTLA-4 nepostačuje sama zajistit funkční protilátku podle vynálezu.

Obrázek 15 ukazuje průměrné zvýšení produkce IFN- vT lymfocytech od 6 dárců indukované protilátkami blokujícími CTLA-4 v testu s T lymfoblasty/Raji.

Obrázek 19 ukazuje srovnání mezi 4.1.1 a 11.2.1 protilátkami podle vynálezu v koncentraci 30 g/ml v 72 hodinovém testu s T lymfoblasty/Raji, jak bylo popsáno v tomto příkladu 9 a v testu se superantigenem popsaném v příkladu 10.

Obrázek 20 ukazuje na koncentraci závislé zvýšení produkce IL-2 v testu sT lymfoblasty/Raji indukované 4.1,1 a 11.2.1 CTLA-4 protilátkami podle vynálezu.

-43 CZ 302706 Β6

Následující tabulka 1VC poskytuje informaci týkající se průměrného zvýšení a rozsahu zvýšení cytokinové odpovědi v testech Kaji a SEA podle vynálezu. Každý z pokusů zahrnutých ve výsledcích je založen na protilátce v dávce 30 g/ml a měřen v 72 hodinách. Jsou uvedeny počty dárců zúčastněných v pokusech, jakož i odpovědi.

Tabulka IVC

Test	mAb	Cytokin	Průměrné zvýšení pg/ml	SEM	Rozsah zvýšení pg/ml	n	Reakce dárců
T lymfoblasty/ Ráji	4.1.1	IL-2	3329	408	0 až 8861	42	19 z 21
T lymfoblasty/ Ráji	4.1.1	IFří-	3630	980	600 až 13939	17	13 ze 13
T lymfoblasty/ Ráji	11.2.1	IL-2	3509	488	369 až 6424	18	14 ze 14
SEA (PBMC)	4.1.1	IL-2	2800	312	330 až 6699	42	17 ze 17
SEA (PBMC)	11.2.1	IL-2	2438	366	147 až 8360	25	15 z 15
SEA (plná krev)	4.1.1	IL-2	6089	665	-168 až 18417	46	15 ze 17
SEA (plná krev)	11.2.1	IL-2	6935	700	-111 až 11803	25	12 z 14

Příklad 10

Model signálu T lymfocytů u člověka

Původci vyvinuli druhý buněčný test, aby se kvantifikovalo zvýšení aktivace IL-2 T lymfocyty při blokádě signálu CTLA-4 protilátkami. Při těchto pokusech byly použity následující materiály a metody:

Materiály a metody

Lidské PBMC byly připraveny s použitím Accuspin. Mikrotitrační destičky byly předem potaženy santi-CD3 protilátkou (leu4, Becton Dickinson) (60 ng/ml) a inkubovány 2 hodiny ve 37 °C. Do jamek byly přidány hPBMC v množství 200 000 buněk na jamku. Do jamek byl přidán stafylokokový enterotoxin A (SEA) (Sigma) v koncentraci 100 ng/ml. Do jamek byly přidány protilátky, obvykle v koncentraci 30 g/ml. Pak byly buňky stimulovány 48, 72 nebo 96 hodin. Destičky byly stočeny v žádoucím časovém bodu a zjamek byl odstraněn supernatant. Potom byla v supematantu vyšetřována produkce IL-2 s použitím ELISA (R&D Systems).

Výsledky z těchto pokusů jsou ukázány na obrázcích 16, 17 a 21. Na obrázku 16 byla měřena indukce produkce IL-2 v hPBMC od 5 dárců 72 hodin po stimulaci. Na obrázku 17 jsou ukázány výsledky z měření plné krve rozebírající rozdíl v indukcí produkce IL-2 v krvi 3 dárců, jak byla měřena 72 a 96 hodin po stimulaci.

Na obrázku 21 je zvýšení produkce IL-2 v plné krvi 2 dárců, jak měřeno 72 hodin po stimulaci.

-44 CZ 302706 B6

Příklad 11

Model nádoru u zvířat

Původci nastolili podle nádoru u zvířat pro in vivo analýzu proti-myších CTLA-4 protilátek při inhibici nádorového růstu. V tomto modelu nádoru je pěstován myší fibosarkom a zvířata jsou ošetřována proti-myšími CTLA-4 protilátkami. Materiály a metody pro zavedení modelu jsou poskytnuty níže:

Materiály a metody

Samicím myší A/J (ve věku 6 až 8 týdnů) byly podány subkutánní injekce do dorzální strany krku s 0,2 ml nádorových buněk SalN (IxlO⁶) (Baskar 1995). Intraperitoneální injekcí byla podána proti--myší CTLA-4 nebo kontrolní protilátka souhlasného izotypu (Phramingen, San Diego, CA, 200 g/zvíre) ve dnech 0, 4, 7 a 14 po injekci nádorových buněk. Nádor byl měřen v průběhu 3 až 4 týdnů pokusů s použitím elektronického kaliperu Starret SPC Plus Athol, MA) a velikost nádoru byla vyjádřena jako povrchová oblast postižená růstem nádoru (mm²).

Obrázek 18 ukazuje inhibici nádorového růstu při proti-myší CTLA-4 protilátce v modelu nádoru myšího fibrosarkomu. Jak je ukázáno na obrázku 18, u zvířat ošetřených s anti-CTLA-4 nastala redukce nádorového růstu ve srovnání se zvířaty ošetřenými izotypovou kontrolní protilátkou. Podle toho jsou proti-myší CTLA-4 mAb schopné inhibovat růst fibrosarkomu v modelu myšího nádoru.

Lze očekávat, že protilátky, které reagují zkříženě s myším CTLA-4. se budou v tomto modelu chovat podobně. Ale žádná z protilátek podle vynálezu, u kterých byla zkoumána zkřížená reaktivita, nereaguje zkříženě s myším CTLA-4.

Příklad 12

Model nádoru u zvířat

Aby se dále zkoumala aktivita protilátek podle vynálezu, byl navržen model xenoimplantátu myší SC1D pro testování eradikace zjištěných nádorů ajejich metastáz. V tomto modelu jsou myším SCID podány jako štěp lidské T lymfocyty a myším jsou implantovány buňky pocházející z velkobuněčného plicního karcinomu (NSCL) nebo kolorektálního (CC) karcinomu pacientů. Implantace se provádí do tukových polštářků v gonádách myší SCID. Tumory se ponechají narůst, a pak se odstraní. U myší se rozvinuly nádorové metastázy jater podobné lidskému nádoru. Tento model je popsán v práci Bumpers et al., J. Surgical Res., 61, 282-288, 1996).

Očekává se, že protilátky podle vynálezu budou inhibovat růst nádorů tvořených u těchto myší.

SEZNAM SEKVENCÍ

Nukleotidové a aminokyselinové sekvence jsou uvedeny ve formě seznamu podle WIPO standardu 25.

Všechny uvedené sekvence jsou lidského původu, v popisném poli <213> angl. termín „human“ označuje zdroj sekvence Homo sapiens.

-45 CZ 302706 Ró <2I0> 1 <21 1> 463 <212> PRT <213> Human

Met

<4O0> Glu Phe

1 Gly

Leu

Ser

Trp

val

Phe

Leu

Val

Ala

Leu

Leu

Arg

Gly

1 Val

Gin

Cys

Gin

5 Val

Gin

Leu

Val

Glu

10 Ser

Gly

Gly

Gly

Val

15 Val

Gin

Pro

Gly

Arg

20 Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

25 Cys

Val

Ala

Ser

Gly

30 Phe

Thr

Phe

Ser

Ser

35 His

Gly

Met

Hle

Trp

40 Val

Arg

Gin

Ala

Pro

45 Gly

Lys

Gly

Leu

Glu

50 Trp

val

Ala

Val

Ile

55 Trp

Tyr

Asp

Gly

Arg

60 Asn

Lys

Tyr

Tyr

Ala

65 Asp

Ser

Val

Lys

Gly

70 Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

75 Arg

Asp

Asn

Ser

Lys

80 Asn

Thr

Leu

Phe

Leu

85 Gin

Met

Asn

Ser

Leu

90 Arg

Ala

Glu

Asp

Thr

95 Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

100 Ala

Arg

Gly Gly

His

105 Phe

Gly

Pro

Phe

Asp

110 Tyr

Trp

Gly

Gin

Gly

115 Thr

Leu

Val

Thr

Val

120 Ser

Ser

Ala

Ser

Thr

125 Lys

Gly

Pro

Ser

130 135 140

Val 145

Phe

Pro

Leu

Ala

Pro 150

Cys

Ser

Arg

Ser

Thr 155

Ser

Glu

Ser

Thr

Ala 160

Ala

Leu

Gly

Cys

Leu 165

Val

Lys

Asp

Tyr

Phe 170

Pro

Glu

Pro

Val

Thr 175

Val

Ser

Trp

Asn

Ser 180

Gly

Ala

Leu

Thr

Ser 185

Gly

Val

His

Thr

Phe 190

Pro

Ala

Val

Leu

Gin 195

Ser

Ser

Gly

Leu

Tyr 200

Ser

Leu

Ser

Ser

Val 205

Val

Thr

Val

Pro

Ser 210

Ser

Asn

Phe

Gly

Thr 215

Gin

Thr

Tyr

Thr

Cys 220

Asn

Val

Asp

His

Lys 225

Pro

Ser

Asn

Thr

Lys 230

Val

Asp

Lys

Thr

Val 235

Olu

Arg

Lys

Cys

cys 240

Val

Glu

Cys

Pro

Pro 245

Cys

Pro

Ala

Pro

Pro 250

Val

Ala

Gly

Pro

Ser 255

Val

Phe

Leu

Phe

Pro 260

Pro

Lys

Pro

Lys

Asp 265

Thr

Leu

Met

Ile

Ser 270

Arg

Thr

Pro

Glu

Val 275

Thr

Cys

Val

Val

val 280

Asp

Val

Ser

His

Glu 285

Asp

Pro

Glu

Val

Gin 290

Phe

Asn

Trp

Tyr

Val 295

Asp

Gly

Val

Glu

Val 300

His

Asn

Ala

Lys

Thr 305

Lys

Pro

Arg

Glu

Glu 310

Gin

Phe

Asn

Ser

Thr 315

Phe

Arg

Val

Val

Ser 320

Val

Leu

Thr

Val

Val 325

His

Gin

Asp

Trp

Leu 330

Asn.

Gly

Lys

Glu

Tyr 335

Lys

Cys

Lys

Val

Ser 340

Asn

Lys

Gly

Leu

Pro 345

Ala

Pro

Ile

Glu

Lys 350

Thr

Ile

Ser

Lys

Thr 355

Lys

Gly

Gin

Pro

Arg 360

Glu

Pro

Gin

Val

Tyr 365

Thr

Leu

Pro

Pro

Ser 370

Arg

Glu

Glu

Met

Thr 375

Lys

Asn

Gin

Val

Ser 380

Leu

Thr

Cys

Leu

Val 385

Lys

Gly

Phe

Tyr

Pro 390

Ser

Asp

Ile

Ala

Val 395

Glu

Trp

Glu

Ser

Asn 400

Gly

Gin

Pro

Glu

Asn 405

Asn

Tyr

Lys

Thr

Thr 410

Pro

Pro

Met

Leu

Asp 415

Ser

Asp

Gly

Ser

Phe 420

Phe

Leu

Tyr

Ser

Lys 425

Leu

Thr

Val

Asp

Lys 430

Ser

Arg

Trp

Gin

Gin 435

Gly

Asn

Val

Phe

Ser 440

Cys

Ser

Val

Met

His 445

Glu

Ala

Leu

His

Asn 450

His

Tyr

Thr

Gin

Lys 455

Ser

Leu

Ser

Leu

Ser 460

Pro

Gly

Lys

-46CZ 302706 B6 <210>2 <211> 464 <212> PRT <213> Human <40O> 2

Met 1

Glu

Phe

Gly

Leu 5

Ser

Trp

Val

Phe

Leu 10

Val

Ala

Leu

Leu

Arg 15

Oly

Val

Gin

Cys

Gin 20

Val

Gin

Leu

Val

Glu 25

Ser

Gly Gly

Gly

Val 30

Val

Gin

Pro

Gly

Arg 35

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser 40

Cys

Thr

Ala

Ser

Gly 45

Phe

Thr

Phe

Ser

Asn 50

Tyr

Gly

Met

His

Trp 55

Val

Arg

Gin

Ala

Pro 60

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu 65

Trp

Val

Ala

Val

Ile 70

Trp

Tyr

Asp

Gly

Ser 75

Asn

Lys

His

Tyr

Gly 80

Asp

Ser

Val

Lys

Gly 85

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser 90

Ser

Asp

Asn

Ser

Lys 95

Asn

Thr

Leu

Tyr

Leu 100

Gin

Met

Asn

Ser

Leu 105

Arg

Ala

Glu

Asp

Thr 110

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys 115

Ala

Arg

Gly

Glu

Arg 120

Leu

Gly

Ser

Tyr

Phe 125

Asp

Tyr

Trp

Gly

Gin 130

Gly

Thr

Leu

Val

Thr 135

Val

Ser

Ser

Ala

Ser 140

Thr

Lys

Gly

Pro

Ser 145

Val

Phe

Pro

Leu

Ala 150

Pro

Cys

Ser

Arg

Ser 155

Thr

Ser-

Glu

Ser

Thr 160

Ala

Ala

Leu

Gly

Cys 165

Leu

Val

Lys

Asp

Tyr 170

Phe

Pro

Glu

Pro

Val 175

Thr

Val

Ser

Trp

Asn 180

Ser

Gly

Ala

Leu

Thr 185

Ser

Gly

Val

His

Thr 190

Phe

Pro

Ala

Val

Leu

Gin

Ser

Ser

Gly

Leu

Tyr

Ser

Leu

Ser

Ser

val

Val

Thr

195

200

205

Val

Pro 210

Ser

Ser

Asn

Phe

Gly 215

Thr

Gin

Thr

Tyr

Thr 220

Cys

Asn

Val

Asp

His 225

Lys

Pro

Ser

Asn

Thr 230

Lys

Val

Asp

Lys

Thr 235

Val

Glu

Arg

Lys

Cys 240

Cys

Val

Glu

Cys

Pro 245

Pro

Cys

Pro

Ala

Pro 250

Pro

Val

Ala

Gly

Pro 255

Ser

Val

Phe

Leu

Phe 260

Pro

Pro

Lys

Pro

Lys 265

Asp

Thr

Leu

Met

Ile 270

Ser

Arg

Thr

Pro

Glu 275

Val

Thr

Cys

Val

Val 280

Val

Asp

Val

Ser

His 285

Glu

Asp

Pro

Glu

Val 290

Gin

Phe

Asn

Trp

Tyr 295

Val

Asp

Gly

Val

Glu 300

Val

His

Asn

Ala

Lys 305

Thr

Lys

Pro

Arg

Glu 310

Glu

Gin

Phe

Asn

Ser 315

Thr

Phe

Arg

Val

Val 320

Ser

Val

Leu

Thr

Val 325

Val

His

Gin

Asp

Trp 330

Leu

Asn

Gly Lys

Glu 335

Tyr

Lys

Cys

Lys

Val 340

Ser

Asn

Lys

Gly

Leu 345

Pro

Ala

Pro

Ile

Glu 350

Lys

Thr

Ile

Ser

Lys 355

Thr

Lys

Gly

Gin

Pro 360

Arg

Glu

Pro

Gin

Val 365

Tyr

Thr

Leu

Pro

Pro 370

Ser

Arg

Glu

Glu

Met 375

Thr

Lys

Asn

Gin

Val 380

Ser

Leu

Thr

Cys

Leu 385

Val

Lys

Gly

Phe

Tyr 390

Pro

Ser

Asp

Ile

Ala 395

Val

Glu

Trp

Glu

Ser 400

Asn

Gly

Gin

Pro

Glu 405

Asn

Asn

Tyr

Lys

Thr 410

Thr

Pro

Pro

Met

Leu 415

Asp

Ser

Asp

Gly

Ser 420

Phe

Phe

Leu

Tyr

Ser 425

Lys

Leu

Thr

Val

Asp 430

Lys

Ser

Arg

Trp

Gin 435

Gin

Gly

Asn

Val

Phe 440

Ser

Cys

Ser

Val

Met 445

His

Glu

Ala

Leu

His 450

Asn

His

Tyr

Thr

Gin 455

Lys

Ser

Leu

Ser

Leu 460

Ser

Pro

Gly

Lys

-47 CZ 302706 Βή <2 1 ()> 3 <21 1> 163 <12> PRT <213> Human <40Q> 3

Pro

Gly

Arg

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser

Gly

Phe

Thr

Phe

1

5

10

15

Ser

Ser

His

Gly

lle

His

Trp

Val

Arg

Gin

Ala

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

20

25

30

Glu

Trp

Val

Ala

Val

lle

Trp

Tyr

Asp

Gly

Arg

Asn

Lys

Asp

Tyr

Ala

35

40

45

Asp

Ser

Val

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

lle

Ser

Arg

Asp

Asn

Ser

Lys

Lys

50

55

60

Thr

Leu

Tyr

Leu

Gin

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Ala

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

65

70

75

80

Tyr

Tyr

Cys

Ala

Arg

Val

Ala

Pro

Leu

Gly

Pro

Leu

Asp

Tyr

Trp

Gly

35

90

95

Gin

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

Ser

Ala

Ser

Thr

Lys

Gly

Pro

Ser

100

105

110

val

Phe

Pro

Leu

Ala

Pro

Cys

Ser

Arg

Ser

Thr

Ser

Glu

Ser

Thr

Ala

115

120

125

Ala

Leu

Gly

Cys

Leu

Val

Lys

Asp

Tyr

Phe

Pro

Glu

Pro

Val

Thr

Val

130

135

14 0

Ser

Trp

Asn

Ser

Gly

Ala

Leu

Thr

Ser

Gly

Val

His

Thr

Phe

Pro

Ala

14 5

150

155

160

Val

Leu

Gin

<21O> 4 io <21 1 > 463 <212> PRT <213> Human <400> 4

Met 1

Glu

Phe

Gly

Leu 5

Ser

Trp

Val

Phe

Leu 10

Val

Ala

Leu

Leu

Arg 15

Gly

Val

Gin

Cys

Gin 20

Val

Gin

Leu

Val

Glu 25

Ser

Gly Gly

Gly

Val 30

Val

Glu

Pro

Gly

Arg 35

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser 40

Cys

Thr

Ala

Ser

Gly 45

Phe

Thr

Phe

Ser

Ser 50

Tyr

Gly

Met

His

Trp 55

Val

Arg

Gin

Ala

Pro 60

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu 65

Trp

Val

Ala

Val

lle 70

Trp

Tyr

Asp

Gly

Ser 75

Asn

Lys

His

Tyr

Ala 80

Asp

Ser

Ala

Lys

Gly 85

Arg

Phe

Thr

lle

Ser 90

Arg

Asp

Asn

Ser

Lys 95

Asn

Thr

Leu

Tyr

Leu 100

Gin

Met

Asn

Ser

Leu 105

Arg

Ala

Glu

Asp

Thr 110

Ala

val

Tyr

Tyr

Cys 115

Ala

Arg

Ala

Gly

Leu 120

Leu

Gly

Tyr

Phe

Asp 125

Tyr

Trp

Gly

Gin

Gly 130

Thr

Leu

Val

Thr

Val 135

Ser

Ser

Ala

Ser

Thr 140

Lys

Gly

Pro

Ser

Val 145

Phe

Pro

Leu

Ala

Pro 150

Cys

Ser

Arg

Ser

Thr 155

Ser

Glu

Ser

Thr

Ala 160

Ala

Leu

Gly

Cys

Leu 165

Val

Lys

Asp

Tyr

Phe 170

Pro

Glu

Pro

Val

Thr 17S

Val

Ser

Trp

Asn

Ser 180

Gly

Ala

Leu

Thr

Ser 185

Gly

Val

His

Thr

Phe 190

Pro

Ala

Val

Leu

Gin 195

Ser

Ser

Gly

Leu

Tyr 200

Ser

Leu

Ser

Ser

Val 205

Val

Thr

Val

Pro

Ser

Ser

Asn

Phe

Gly

Thr

Gin

Thr

Tyr

Thr

Cys

Asn

Val

Asp

His

210 215 220

Lys

Pro

Ser

Asn

Thr

Lys

Val

Asp

Lys

Thr

Val

Glu

Arg

Lys

Cys

Cys

225 Val

Glu

Cys

Pro

Pro

230 Cys

Pro

Ala

Pro

Pro

235 Val

Ala

Gly

Pro

Ser

240 Val

Phe

Leu

Phe

Pro

245 Pro

Lys

Pro

Lys

Asp

250 Thr

Leu

Met

Ile

Ser

255 Arg

Thr

Pro

Glu

Val

260 Thr

Cys

Val

Val

Val

265 Asp

Val

Ser

His

Glu

270 Asp

Pro

Glu

val

Gin

275 Phe

Asn

Trp

Tyr

Val

280 Asp

Gly

Val

Glu

Val

285 His

Asn

Ala

Lys

Thr

290 Lys

Pro

Arg

Glu

Glu

2 95 Gin

Phe

Asn

Ser

Thr

3 00 Phe

Arg

Val

Val

Ser

305 Val

Leu

Thr

Val

Val

310 His

Gin

Asp

Trp

Leu

315 Asn

Gly

Lys

Glu

Tyr

320 Lys

Cys

Lys

Val

Ser

325 Asn

Lys

Gly

Leu

Pro

330 Ala

Pro

Ile

Glu

Lys

335 Thr

Ile

Ser

Lys

Thr

340 Lys

Gly

Gin

Pro

Arg

345 Glu

Pro

Gin

Val

Tyr

350 Thr

Leu

Pro

Pro

ser

35S Arg

Glu

Glu

Met

Thr

360 Lys

Asn

Gin

Val

Ser

365 Leu

Thr

Cys

Leu

Val

370 Lys

Gly

Phe

Tyr

Pro

375 Ser

Asp

Ile

Ala

Val

380 Glu

Trp

Glu

Ser

Asn

385 Gly

Gin

Pro

Glu

Asn

390 Asn

Tyr

Lys

Thr

Thr

395 Pro

Pro

Met

Leu

Asp

400 Ser

Asp

Gly

Ser

Phe

405 Phe

Leu

Tyr

Ser

Lys

410 Leu

Thr

val

Asp

Lys

415 Ser

Arg

Trp

Gin

Gin

420 Gly

Asn

Val

Phe

Ser

425 Cys

Ser

Val

Met

His

430 Glu

Ala

Leu

His

Asn

435 His

Tyr

Thr

Gin

Lys

440 Ser

Leu

Ser

Leu

Ser

445 Pro

Gly

Lys

450 455 460 <210>5 S <2ll>169 <212> PRT <213> Human

<400>

5

Gly

Val

Val

Gin

Pro

Gly

Arg

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

cys

Ala

Ala

Ser

1

5

10

15

Gly

Phe

Thr

phe

Ser

Ser

Tyr

Gly

Met

His

Trp

val

Arg

Gin

Ala

Pro

20

25

30

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

Val

Ala

Val

Ile

Trp

Tyr

Asp

Gly

Ser

Asn

35

40

45

Lys

Tyr

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

50

55

60

Asn

Ser

Lys

Asn

Thr

Leu

Tyr

Leu

Gin

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Ala

Glu

65

70

75

80

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

Ala

Arg

Gly

Ala

Arg

Ile

Ile

Thr

Pro

85

90

95

Cys

Met

Asp

Val

Trp

Gly

Gin

Gly

Thr

Thr

Val

Thr

Val

Ser

Ser

Ala

100

105

110

Ser

Thr

Lys

Gly

Pro

Ser

Val

Phe

Pro

Leu

Ala

Pro

Cys

Ser

Arg

Ser

115

120

125

Thr

Ser

Olu

Ser

Thr

Ala

Ala

Leu

Gly

Cys

Leu

Val

Lys

Asp

Tyr

Phe

130

135

140

Pro

Glu

Pro

Val

Thr

Val

Ser

Trp

Asn

Ser

Gly

Ala

Leu

Thr

Ser

Gly

145

150

155

160

Val

His

Thr

Phe

Pro

Ala

Val

Leu

Gin

165

<210> 6 <211> 167 <212> PRT

CZ 302706 R6 <213> Human <400> 6

Gly

Val

Val

Gin

Pro

Gly

Arg

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Val

Ala

Ser

1

5

10

15

Gly

Phe

Ile

Phe

Ser

Ser

His

Gly

Ile

His

Trp

val

Arg

Gin

Ala

Pro

20

25

30

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

Val

Ala

Val

Ile

Trp

Tyr

Asp

Gly

Arg

Asn

35

40

45

Lys

Asp

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

50

55

60

Asn

Ser

Lys

Asn

Thr

Leu

Tyr

Leu

Gin

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Ala

Glu

65

70

75

eo

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

Ala

Arg

Val

Ala

Pro

Leu

Gly

Pro

Leu

85

90

95

Asp

Tyr

Trp

Gly

Gin

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

Ser

Ala

Ser

Thr

100

105

110

Lys

Gly

Pro

Ser

Val

Phe

Pro

Leu

Ala

Pro

Cys

Ser

Arg

Ser

Thr

Ser

115

120

12S

Glu

Ser

Thr

Ala

Ala

Leu

Gly

Cys

Leu

Val

Lys

Asp

Tyr

Phe

Pro

Glu

130

135

140

Pro

Val

Thr

Val

Ser

Trp

Asn

Ser

Gly

Ala

Leu

Thr

Ser

Gly

Val

His

145

150

155

160

Thr

Phe

Pro

Ala

Val

Leu

Gin

165 <21 ()> 7 <211> 172 <212> PRT <213> Human <400> 7

Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gin Ile Leu Ser Leu Thr Cys 15 10 15

Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly Gly His Tyr Trp Ser Trp 20 25 30

Ile Arg Gin His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr 35 40 45

Tyr Ile Gly Asn Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr

55 60

Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gin Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser

70 75 80

Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Ser Gly

90 95

Asp Tyr Tyr Gly Ile Asp Val Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr Val

100 105 110

Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys

115 120 125

Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys

130 135 140

Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu 145 150 155 160

Thr Ser Gly val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin

165 170 <210> 8 <211> 153 <212>PRT <213> Human

-50CZ 302706 B6 <400> 8

Pro Gly

Arg Ser Leu Arg Leu

Ser

Cys Ala Ala Ser

Gly Phe Thr

Phe

1

5

10

15

Ser

Ser

His

Gly

Ile

Hle

Trp

Val

Arg

Gin

Ala

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

20

25

30

Glu

Trp

Val

Ala

Val

Ile

Trp

Tyr

Asp

Gly

Arg

Asn

Lys

Asp

Tyr

Ala

35

40

45

Asp

Ser

Val

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

Asn

Ser

Lys

Asn

50

55

60

Thr

Leu

Tyr

Leu

Gin

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Ala

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

65

70

75

80

Tyr

Tyr

Cys

Ala

Arg

val

Ala

Pro

Leu

Gly

Pro

Leu

Asp

Tyr

Trp

Gly

85

90

95

Gin

Gly

Thr

Leu

val

Thr

Val

Ser

Ser

Ala

Ser

Thr

Lys

Gly

Pro

Ser

100

105

110

Val

Phe

Pro

Leu

Ala

Pro

Cys

Ser

Arg

Ser

Thr

Ser

Glu

Ser

Thr

Ala

115

120

125

Ala

Leu

Gly

Cys

Leu

Val

Lys

Asp

Tyr

Phe

Pro

Glu

Pro

Val

Thr

Val

130

135

140

Ser

Trp

Asn

Ser

Gly

Ala

Leu

Thr

Ser

145 150 <210>9 <211> 167 s <212>PRT <213> Human <220>

Gly

<400> Val Val

9 Gin

Pro

Gly

Arg

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser

1 Gly

Phe

Thr

Phe

5 Ser

Ser

Tyr

Gly

Met

10 His

Trp

Val

Arg

Gin

15 Ala

Pro

Gly

Lys

Gly

20 Leu

Glu

Trp

Val

Ala

25 Val

Ile

Trp

Tyr Asp

30 Gly

Ser

Asn

Lys

Tyr

35 Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

40 Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

45 Ile

Ser

Arg

Asp

Asn

50 Ser

Lys

Asn

Thr

Leu

55 Tyr

Leu

Gin

Met

Asn

60 Ser

Leu

Arg

Ala

Glu

65 Asp

Thr

Ala

val

Tyr

70 Tyr

Cys

Ala

Arg

Asp

75 Pro

Arg

Gly

Ala

Thr

80 Leu

Tyr

Tyr

Tyr

Tyr

85 Tyr

Arg

Xaa

Asp

Val

90 Trp

Gly

Gin

Gly

Thr

95 Thr

Val

Thr

Val

Ser

100 Ser

Ala

Ser

Thr

Lys

105 Gly

Pro

Ser

Val

Phe

110 Pro

Leu

Ala

Pro

Cys

115 Ser

Arg

Ser

Thr

Ser

120 Glu

Ser

Thr

Ala

Ala

125 Leu

Gly

Cys

Leu

Val

130 Lys

Asp

Tyr

Phe

Pro

135 GlU

Pro

Val

Thr

Val

140 Ser

Trp

Asn

Ser

Gly

145 Ala

Leu

Thr

Ser

Gly

150 Val

His

155

160

io <210> 10 <211> 151 <212> PRT <213>Human

Gly

<400> Val Val

10 Gin

Pro

Gly

Arg

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser

1 Gly

Phe

Thr

Phe

5 Ser

Ser

Tyr

Gly

Met

10 His

Trp

Val

Arg

Gin

15 Ala

Pro

Gly

Lys

Gly

20 Leu

Glu

Trp

Val

Ala

25 val

Ile

Trp

Tyr

Asp

30 Gly

Ser

His

Lys

Tyr

35 Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

40 Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

45 Ile

Ser

Arg

Asp

Asn

50 Ser

Lys

Asn

Thr

Leu

55 Tyr

Leu

Gin

Met

Asn

60 Ser

Leu

Arg

Ala

Glu

65 Asp

Thr

Ala

val

Tyr

70 Tyr

Cys

Ala

Arg

Gly

75 Ala

Val

Val

Val

Pro

80 Ala

Ala

Met

Asp

Val

85 Trp

Gly

Gin

Gly

Thr

90 Thr

Val

Thr

Val

Ser

95 Ser

Ala

Ser

Thr

Lys

100 Gly

Pro

Ser

Val

Phe

105 Pro

Leu

Ala

Pro

Cys

110 Ser

Arg

Ser

Thr

Ser

115 Glu

Ser

Thr

Ala

Ala

120 Leu

Gly

Cys

Leu

Val

125 Lys

Asp

Tyr

Phe

Pro

130 Glu

Pro

Val

Thr

Val

135 Ser

140

145 150 <210> 11

<211> 146 <212> PRT <213> Human

<220> <400> Val Val Gin

11 Pro

Gly

Arg

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser

Gly

1 Phe

Thr

Phe

Ser

S Ser

Xaa

Gly

Met

His

10 Trp

Val

Arg

Gin

Ala

15 Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

20 Glu

Trp

val

Ala

Val

25 Ile

Trp

Ser

Asp

Gly

30 Ser

His

Lys

Tyr

Tyr

35 Ala

Asp

Ser

Val

Lys

40 Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

45 Ser

Arg

Asp

Asn

Ser

50 Lys

Asn

Thr

Leu

Tyr

55 Leu

Gin

Met

Asn

Ser

60 Leu

Arg

Ala

Glu

Asp

65 Thr

Ala

Val

Tyr

70 Tyr Cys

Ala

Arg

Gly

Thr

75 Met

Ile

Val

Val

Gly

80 Thr

Leu

Asp

Tyr

Trp

85 Gly

Gin

Gly

Thr

Leu

90 Val

Thr

Val

Ser

Ser

95 Ala

Ser

Thr

Lys

Gly

100 Pro

Ser

Val

Phe

Pro

105 Leu

Ala

Pro

Cys

Ser

110 Arg

Ser

Thr

Ser

Glu

115 Ser

Thr

Ala

Ala

Leu

120 Gly

Cys

Leu

Val

Lys

125 Asp

Tyr

Phe

Pro

130 135 140

Glu Pro 10 ¹⁴⁵ <210> 12 <211> 174 <212> PRT

J5 <213> Human <400> 12

Ser Gly Gly Gly Val	val	Gin Pro Gly Arg Ser	Leu	Arg Leu	Ser Cys
1 5		10			15
Ala Ala Ser Gly Phe	Thr	Phe Ser Ser Tyr Gly	Val	His Trp	Val Arg
20		25		30
Gin Ala Pro Gly Lys	Gly	Leu Glu Trp Val Ala	Val	Ile Trp	Tyr Asp
35		40		45
Gly Ser Asn Lys Tyr	Tyr	Ala Asp Ser Val Lys	Gly	Arg Phe	Thr Ile
50		55	60
Ser Arg Aep Asn Ser	Lys	Ser Thr Leu Tyr Leu	Gin	Met Asn	Ser Leu
65	70	75			80
Arg Ala Glu Asp Thr	Ala	Val Tyr Tyr Cys Ala	Arg Aep Ser	Tyr Tyr
85		90			95
Asp Phe Trp Ser Gly Arg	Gly Gly Met Asp Val	Trp	Gly Gin	Gly Thr
100		105		110
Thr Val Thr Val Ser	Ser	Ala Ser Thr Lys Gly	Pro	Ser Val	Phe Pro
115		120		125
Leu Ala Pro Cys Ser	Arg	Ser Thr Ser Glu Ser	Thr	Ala Ala	Leu Gly
130		135	140
Cys Leu Val Lys Asp	Tyr	Phe Pro Glu Pro Val	Thr	Val Ser	Trp Asn
145	150	155			160
Ser Gly Ala Leu Thr	Ser	Gly Val His Thr Phe	Pro	Ala Val

165 170 <210> 13 <211> 163 <212> PRT <213> Human

Val

<400> Gin Pro

13 Gly

Arg

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser

Gly

Phe

1 Thr

Phe

Ser

Asn

5 Tyr

Ala

Met

His

Trp

10 Val

Arg

Gin

Ala

Pro

15 Gly

Lys

Gly

Leu

Glu

20 Trp

Val

Val

Val

Ile

25 Trp

His

Asp

Gly

Asn

30 Asn

Lys

Tyr

Tyr

Ala

35 Glu

Ser

Val

Lys

Gly

40 Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

45 Arg

Asp

Asn

Ser

Lys

50 Asn

Thr

Leu

Tyr

Leu

55 Gin

Met

Asn

Ser

Leu

60 Arg

Ala

Glu

Asp

Thr

65 Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

70 Ala

Arg

Asp

Gin

Gly

75 Thr

Gly

Trp

Tyr

Gly

80 Gly

Phe

Asp

Phe

Trp

85 Gly

Gin

Gly

Thr

Leu

90 Val

Thr

Val

Ser

Ser

95 Ala

Ser

Thr

Lys

Gly

100 Pro

Ser

Val

Phe

Pro

105 Leu

Ala

Pro

Cys

Ser

110 Arg

Ser

Thr

Ser

Glu

115 Ser

Thr

Ala

Ala

Leu

12 0 Gly

Cys

Leu

val

Lys

125 Asp

Tyr

Phe

Pro

Glu

130 Pro

Val

Thr

val

Ser

135 Trp

Asn

Ser

Gly

Ala

14 0 Leu

Thr

Ser

Gly

Val

145

150

155

160

His Thr Phe <210> 14 <211> 235 <212> PRT <213> Human

CZ, 302706 B6

Met

<400> Glu Thr

14 Pro

Ala

□ln

Leu

Leu

Phe

Leu

Leu

Leu

Leu

Trp

Leu

Pro

1 ASp

Thr

Thr

Gly

5 Glu

Ile

Val

Leu

Thr

10 Gin

Ser

Pro

Gly

Thr

15 Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

20 Gly

Glu

Arg

Ala

Thr

25 Leu

Ser

Cys

Arg

Ala

30 Ser

Gin

Ser

Ile

Ser

35 Ser

Ser

Phe

Leu

Ala

40 Trp

Tyr

Gin

Gin

Arg

45 Pro

Gly

Gin

Ala

pro

50 Arg

Leu

Leu

Ile

Tyr

55 Gly

Ala

Ser

Ser

Arg

60 Ala

Thr

Gly

Ile

Pro

65 Asp

Arg

Phe

Ser

Gly

70 Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

75 Asp

Phe

Thr

Leu

Thr

80 Ile

Ser

Arg

Leu

Glu

05 Pro

Glu

Asp

Phe

Ala

90 Val

Tyr

Tyr

Cys

Gin

95 Gin

Tyr

Gly

Thr

Ser

100 Pro

Trp

Thr

Phe

Gly

105 Gin

Gly

Thr

Lys

Val

110 Glu

Ile

Lys

Arg

Thr

115 Val

Ala

Ala

Pro

Ser

120 Val

Phe

Ile

Phe

Pro

125 Pro

Ser

Asp

Glu

Gin

130 Leu

Lys

Ser

Gly

Thr

135 Ala

Ser

val

Val

Cys

140 Leu

Leu

Asn

Asn

Phe

145 Tyr

Pro

Arg

Glu

Ala

ISO Lys

Val

Gin

Trp

Lys

155 Val

Asp

Asn

Ala

Leu

160 Gin

Ser

Gly

Asn

ser

165 Gin

Glu

Ser

Val

Thr

170 Glu

Gin

Asp

Ser

Lya

175 Asp

Ser

Thr

Tyr

Ser

íao Leu

Ser

Ser

Thr

Leu

185 Thr

Leu

Ser

Lys

Ala

190 Asp

Tyr

Glu

Lys

His

195 Lys

Val

Tyr

Ala

Cys

200 Glu

Val

Thr

His

Gin

205 Gly

Leu

Ser

Ser

Pro 225

210 Val

Thr

Lys

Ser

Phe 230

215 Asn

Arg

Gly

Glu

Cys 235

220

<-2 ΙΟ 15 <21í> 233 <212> PRT <213> Human

	<400>	15
Met 1	Glu	Thr	Pro	Ala 5	Gin	Leu	Leu
Asp	Thr	Thr	Gly 20	Glu	Ile	Val	Leu
Leu	Ser	Pro 35	Gly	Glu	Arg	Ala	Thr 40
Ser	Ser 50	Tyr	Leu	Ala	Trp	Tyr 55	Gin
Leu 65	Leu	Ile	Tyr	Gly	Ala 70	Ser	ser
Phe	Ser	Gly	Ser	Gly 85	Ser	Gly	Thr
Leu	Glu	Pro	Glu 100	Asp	Phe	Ala	Val
Ser	Pro	Phe 115	Thr	Phe	Gly	Gly Gly 120
Val	Ala 130	Ala	Pro	Ser	Val	Phe 135	Ile
Lys 145	Ser	Gly	Thr	Ala	Ser 150	Val	Val
Arg	Glu	Ala	Lys	Val 165	Gin	Trp	Lys
Asn	Ser	Gin	Glu 180	Ser	Val	Thr	Glu
Ser	Leu	Ser 195	Ser	Thr	Leu	Thr	Leu 200
Lys	Val 210	Tyr	Ala	Cys	Glu	Val 215	Thr
Thr 225	Lys	Ser	Phe	Asn	Arg 230	Gly	Glu

Phe	Leu 10	Leu	Leu	Leu	Trp	Leu 15	Pro
Thr 25	Gin	Ser	Pro	Gly	Thr 30	Leu	Ser
Leu	Ser	Cys	Arg	Thr 45	Ser	Val	Ser
Gin	Lys	Pro	Gly Gin 60	Ala	Pro	Arg
Arg	Ala	Thr 75	Gly	Ile	Pro	Asp	Arg 80
Asp	Phe 90	Thr	Leu	Thr	Ile	Ser 95	Arg
Tyr 105	Tyr	Cys	□ln	Gin	Tyr 110	Gly	ile
Thr	Lys	Val	Glu	Ile 125	Lys	Arg	Thr
Phe	Pro	Pro	Ser 140	Asp	Glu	Gin	Leu
Cys	Leu	Leu 155	Asn	Asn	Phe	Tyr	Pro 160
Val	Asp 170	Asn	Ala	Leu	Gin	Ser 175	Gly
Gin 185	Asp	Ser	Lys	Asp	Ser 190	Thr	Tyr
Ser	Lys	Ala	Asp	Tyr 205	Glu	Lys	His
His Cys	Gin	Gly	Leu 220	Ser	Ser	Pro	Val

-54CZ 302706 Bó <210 16 <211> 139 <212> PRT <213> Human <4Q0> 16

Gly Thr Leu Ser 1

Leu 5

Ser Pro Gly

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg

10

15

Ala

Ser

Gin

Ser

Val

Ser

Ser

Tyr

Leu

Ala

Trp

Tyr

Gin

Gin

Lys

Pro

20

25

30

Gly

Gin

Ala

Pro

Arg

Leu

Leu

Ile

Tyr

Gly

Ala

ser

Ser

Arg

Ala

Thr

35

40

45

Gly

Tle

Pro

Asp

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

50

55

60

Leu

Thr

Ile

Ser

Arg

Leu

Glu

Pro

Glu

Asp

Phe

Ala

Val

Tyr

Tyr Cys

65

70

75

80

Gin

Gin

Tyr

Gly Arg

Ser

Pro

Phe

Thr

Phe

Gly

Pro

Gly

Thr

Lys

Val

05

90

95

Asp

Ile

Lys

Arg

Thr

Val

Ala

Ala

Pro

Ser

Val

Phe

Xle

Phe

Pro

Pro

100

105

110

Ser

Asp

Glu

Gin

Leu

Lys

Ser

Gly

Thr

Ala

Ser

Val

Val

Cys

Leu

Leu

115

120

125

Asn

Asn

Phe

Tyr

Pro

Arg

Glu

Ala

Lys

val

Gin

130

135

<210> 17 io <211> 234 <212> PRT <213> Human

<400>

17

Met

Glu

Thr

Pro

Ala

Gin

Leu

Leu

Phe

Leu

Leu

Leu

Leu

Trp

Leu

Pro

1

5

10

15

ASp

Thr

Thr

Gly

Glu

Ile

Val

Leu

Thr

Gin

Ser

Pro

Gly

Thr

Leu

Ser

20

25

30

Leu

Ser

Pro

Gly

Glu

Arg

Ala

Thr

Leu

Ser

Cys

Arg

Ala

Ser

Gin

Ser

35

40

45

val

Ser

Ser

Tyr

Leu

Ala

Trp

Tyr

Gin

Gin

Lys

Pro

Gly

Gin

Ala

Pro

50

55

60

Arg

Pro

Leu

Ile

Tyr

Gly

Val

Ser

Ser

Arg

Ala

Thr

Gly

Ile

Pro

Asp

65

70

75

00

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 05 90 95

Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Gly 100 105 110

Ile Ser Pro Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys Arg 11S 120 125

Thr

Val 13 0

Ala

Ala Pro Ser

Val Phe 135

Ile Phe Pro Pro 140

Ser Asp

Glu Gin

Leu

Lys

Ser

Gly

Thr

Ala

Ser

Val

Val

Cys

Leu

Leu

Asn

Asn

Phe

Tyr

145

150

155

160

Pro

Arg

Glu

Ala

Lys

Val

Gin

Trp

Lys

Val

Asp

Asn

Ala

Leu

Gin

Ser

165

170

175

Gly

Asn

Ser

Gin

Glu

Ser

Val

Thr

Glu

Gin

Asp

Ser

Lys

Asp

Ser

Thr

180

185

190

Tyr

Ser

Leu

Ser

Ser

Thr

Leu

Thr

Leu

Ser

Lys

Ala

Asp

Tyr

Glu

Lys

195

200

205

His

Lys

Val

Tyr

Ala

Cys

Glu

Val

Thr

His

Gin

Gly

Leu

Ser

Ser

Pro

210

215

220

Val

Thr

Lys

Ser

Phe

Asn

Arg

Gly

Glu

Cys

225

230

- 55 CZ 302706 B6 <210> 18 <21l> 152 <212>PRT <213> Human <400> 18

Gin

Ser

Pro

Ser

Ser

Leu

Ser

Ala

Ser

Val

Gly

Asp

Arg

Val

Thr

Ile

1

5

10

15

Thr

Cys

Arg

Ala

Ser

Gin

Ser

Ile

Asn

Thr

Tyr

Leu

Ile

Trp

Tyr

Gin

20

2S

30

Gin

Lys

Pro

Gly

Lya

Ala

Pro

Asn

Phe

Leu

Ile

Ser

Ala

Thr

Ser

Ile

35

40

45

Leu

Gin

Ser

Gly

Val

Pro

Ser

Arg

Phe

Arg

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

50

55

60

Asn

Phe

Thr

Leu

Thr

Ile

Asn

Ser

Leu

His

Pro

Glu

Asp

Phe

Ala

Thr

65

70

75

80

Tyr

Tyr

Cys

Gin

Gin

Ser

Tyr

Ser

Thr

Pro

Phe

Thr

Phe

Gly

Pro

Gly

85

90

95

Thr

Lys

Val

Asp

Ile

Lys

Arg

Thr

Val

Ala

Ala

Pro

Ser

Val

Phe

Ile

100

105

110

Phe

Pro

Pro

Ser

Asp

Glu

Gin

Leu

Lys

Ser

Gly

Thr

Ala

Ser

Val

Val

115

120

125

Cys

Leu

Leu

Asn

Asn

Phe

Tyr

Pro

Arg

Glu

Ala

Lys

Val

Gin

Trp

Lys

130

135

14 0

Val

Asp

Asn

Ala

Leu

Gin

Ser

Gly

145 ISO <210> 19 <211> 142 to <-212>HRT <213> Human

<400>

19

Ser Pro

Gly

Thr

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

Gly

Glu

Arg

Ala

Thr

Leu

Ser

1

5

10

15

Cys Arg

Ala

Ser

Gin

Ser

Ile

Ser

Ser

Asn

Phe

Leu

Ala

Trp

Tyr

Gin

20

25

30

Gin Lys

Pro

Gly

Gin

Ala

Pro

Arg

Leu

Leu

Ile

Tyr

Arg

Pro

Ser

Ser

35

40

45

Arg Ala

Thr

Gly

Ile

Pro

Asp

Ser

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

50

55

60

Asp Phe

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

Arg

Leu

Glu

Pro

Glu

Asp

Phe

Ala

Leu

65

70

75

80

Tyr Tyr

Cys

Gin

Gin

Tyr

Gly

Thr

Ser

Pro

Phe

Thr

Phe

Gly

Pro

Gly

85

90

95

Thr Lys

Val

Asp

Ile

Lys

Arg

Thr

Val

Ala

Ala

Pro

Ser

Val

Phe

Ile

100

105

110

Phe Pro

Pro

Ser

Asp

Glu

Gin

Leu

Lys

Ser

Gly

Thr

Ala

Ser

Val

val

115

120

125

Cys Leu

Leu

Asn

Asn

Phe

Tyr

Pro

Arg

Glu

Ala

Lys

Val

Gin

130

135

140

<210> 20

<211> 155

<212> PRT

<213> Human

-56CZ 302706 B6

Ser

<400> Pro Asp

20 Phe

Gin

Ser

Val

Thr

Pro

Lys

Glu

Lys

Val

Thr

Ile

Thr

1 Cys

Arg

Ala

Ser

5 Gin

Ser

Ile

Gly

ser

10 Ser

Leu

His

Trp

Tyr

15 Gin

Gin

Lys

Pro

Asp

20 Gin

Ser

Pro

Lys

Leu

25 Leu

Ile

Lys

Tyr

Ala

30 Ser

Gin

Ser

Phe

Ser

35 Gly

Val

Pro

Ser

Arg

40 Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

45 Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

50 Thr

Leu

Thr

Ile

Asn

55 Ser

Leu

Glu

Ala

Glu

60 Asp

Ala

Ala

Thr

Tyr

65 Tyr

Cys

His

Gin

Ser

70 Ser

Ser

Leu

Pro

Leu

75 Thr

Phe

Gly Gly Gly

80 Thr

Lys

val

Glu

Xie

85 Lys

Arg

Thr

Val

Ala

90 Ala

Pro

Ser

Val

Phe

95 Ile

Phe

Pro

Pro

Ser

100 Aep

Glu

Gin

Leu

Lye

105 Ser

Gly

Thr

Ala

Ser

110 Val

val

Cys

Leu

Leu

115 Asn

Asn

Phe

Tyr

Pro

120 Arg

Glu

Ala

Lys

Val

125 Gin

Trp

Lys

Val

Asp 145

130 Asn

Ala

Leu

Gin

Ser 150

135 Gly

Asn

Ser

Gin

Glu 155

140

<210> 21 <211> 146 <212> PRT <213> Human <400> 21

Gin Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu

1

5

10

15

Ser

cys

Arg

Ala 20

Ser

Gin

Ser

Val

Ser 25

Ser

Tyr

Leu

Ala

Trp 30

Tyr

Gin

Gin

Lys

Pro 35

Gly

Gin

Ala

Pro

Arg 40

Leu

Leu

Ile

Tyr

Gly 45

Ala

Ser

Ser

Arg

Ala 50

Thr

Gly

Ile

Pro

Asp 55

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser 60

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp 65

Phe

Thr

Leu

Thr

Ile 70

Ser

Arg

Leu

Glu

Pro 75

Glu

Asp

Phe

Ala

Val 80

Tyr

Tyr

Cys

Gin

Gin 85

Tyr

Gly

Arg

Ser

Pro 90

Phe

Thr

Phe

Gly

Pro 95

Gly

Thr

Lys

Val

Asp 100

Ile

Lys

Arg

Thr

val 105

Ala

Ala

Pro

Ser

Val 110

Phe

Ile

Phe

Pro

Pro 115

Ser

Asp

Glu

Gin

Leu 120

Lys

Ser

Gly

Thr

Ala 125

Ser

Val

Val

Cys

Leu 130

Leu

Asn

Asn

Phe

Tyr 135

Pro

Arg

Glu

Ala

Lys 14 0

Val

Gin

Trp

Lys

Gly Gly 145 <210> 22 <211> 139 <212> PRT <213> Human

- 57CZ 302706 B6

<400>

22

Pro Ser Ser

Leu

Ser

Ala

Ser

Val

Gly

Asp

Arg

Val

Thr

Ile

Thr

Cys

1

5

10

15

Arg Ala Ser

Gin

Ser

Ile

Asn

Ser

Tyr

Leu

Asp

Trp

Tyr

Gin

Gin

Lys

20

25

30

Pro Gly Lys

Ala

Pro

Lys

Leu

Leu

Ile

Tyr

Ala

Ala

Ser

Ser

Leu

Gin

35

40

45

Ser Gly Val

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

50

55

60

Thr Leu Thr

Ile

Ser

Ser

Leu

Gin

Pro

Glu

Asp

Phe

Ala

Thr

Tyr

Tyr

65

70

75

80

Cys Gin Gin

Tyr

Tyr

Ser

Thr

Pro

Phe

Thr

Phe

Gly

Pro

Gly

Thr

Lys

85

90

95

Val Glu Ile

Lys

Arg

Thr

Val

Ala

Ala

Pro

Ser

Val

Phe

Ile

Phe

Pro

100

105

110

Pro Ser Asp

Glu

Gin

Leu

Lys

Ser

Gly

Thr

Ala

Ser

Val

Val

Cys

Leu

115

120

125

Leu Asn Asn

Phe

Tyr

Pro

Arg

Glu

Ala

Lys

Val

130

135

<210> 23

<21 1> 134

<212> PRT

<213> Human

<400>

23

Thr Gin Ser

Pro

Ser

Ser

Leu

Ser

Ala

Ser

Val

Gly

Asp

Arg

Val

Thr

1

5

10

15

Ile Thr Cys

Arg

Ala

Ser

Gin

Asn

Ile

Ser

Arg

Tyr

Leu

Asn

Trp

Tyr

20

25

30

Gin Gin Lys

Pro

Gly

Lys

Ala

Pro

Lys

Phe

Leu

Ile

Tyr

Val

Ala

Ser

35

40

45

Ile Leu Gin

Ser

Gly

Val

Pro

Ser

Gly

Phe

Ser

Ala

Ser

Gly

Ser

Gly

50

55

60

Pro Asp Phe

Thr

Leu

Thr

ile

Ser

Ser

Leu

Gin

Pro

Glu

Asp

Phe

Ala

65

70

75

80

Thr Tyr Tyr

Cys

Gin

Gin

Ser

Tyr

Ser

Thr

Pro

Phe

Thr

Phe

Gly

Pro

85

90

95

Gly Thr Lys

Val

Asp

Ile

Lys

Arg

Thr

Val

Ala

Ala

Pro

Ser

Val

Phe

100

105

110

Ile Phe Pro

Pro

Ser

Asp

Glu

Gin

Leu

Lys

Ser

Gly

Thr

Ala

Ser

val

115

120

125

Val Cys Leu

Leu

Asn

Asn

130

<210> 24

<211> 150

<212> PRT

<213> Human

-58CZ 302706 B6

Thr	<400> Gin Ser	24 Pro	Ser	Ser	Leu	Ser
1 lle	Thr	Cys	Arg	5 Ala	Ser	Gin	Ser
Gin	Gin	Lys	20 Pro	Gly	Lys	Ala	Pro
Ser	Leu	35 Gin	Gly Gly	Val	Pro	40 Ser
lle	50 Asp	Cys	Thr	Leu	Thr	55 lle	Ser
65 Thr	Tyr	Tyr	Cys	Gin	70 Gin	Ser	Tyr
Gly	Thr	Arg	Val	85 Asp	lle	Glu	Arg
lle	Phe	Pro	100 Pro	Ser	Asp	Glu	Gin
Val	cys	115 Leu	Leu	Asn	Asn	Phe	120 Tyr
Lys 145	130 Val	Asp	Asn	Ala	Tyr ISO	135

Ala	Ser 10	Val	Gly	Asp	Arg	Val 15	Thr
lle 25	Cys	Asn	Tyr	Leu	Asn 30	Trp	Tyr
Arg	Val	Leu	lle	Tyr 45	Ala	Ala	Ser
Arg	Phe	Ser	Gly 60	Ser	Gly	Ser	Gly
Ser	Leu	Gin 75	Pro	Glu	Asp	Phe	Ala 80
lle	Thr 90	Pro	Phe	Thr	Phe	Gly 95	Pro
Thr 105	val	Ala	Ala	Pro	Ser 110	Val	Phe
Leu	Lys	Ser	Gly	Thr 125	Ala	Ser	Val
Pro	Arg	Glu	Ala 140	Lys	Val	Gin	Trp

<210> 25 <211> 139 <212> PRT <213> Human

	<400>	2S
Pro 1	Leu	Ser	Leu	Pro 5	Val	Thr	Leu
Arg	Ser	Ser	Gin 20	Ser	Leu	val	Tyr
Trp	Phe	Gin 35	Gin	Arg	Pro	Gly	Gin 40
Val	Ser 50	Asn	Trp	Asp	Ser	Gly 55	Val
Ser 6S	Gly	Thr	Asp	Phe	Thr 70	Leu	Lys
Val	Gly	Val	Tyr	Tyr 85	Cys	Met	Gin
Gly	Gin	Gly	Thr 100	Lys	Val	Glu	lle
Val	Phe	lle 115	Phe	Pro	Pro	Ser	Asp 120
Ser	Val 130	Val	Cys	Leu	Leu	Asn 135	Asn

Gly	Gin 10	Pro	Ala	Ser	lle	Ser 15	Cys
Ser 25	Asp	Gly	Asn	Thr	Tyr 30	Leu	Asn
Ser	Pro	Arg	Arg	Leu 45	lle	Tyr	Lys
Pro	Asp	Arg	Phe 60	Ser	Gly	Ser	Gly
lle	Ser	Arg 75	Val	Glu	Ala	Glu	Asp 80
Gly	Ser 90	His	Trp	Pro	Pro	Thr 95	Phe
Lys 105	Arg	Thr	Val	Ala	Ala 110	Pro	Ser
Glu Phe	Gin Tyr	Leu Pro	Lys	Ser 125	Gly	Thr	Ala

io <210>26 <211> 133 <212> PRT <213> Human

- 59 CZ 302706 B6

Pro

<40Q> Gly Glu

26 Pro

Ala

Ser

Ile

Ser

Cys

Arg

Ser

Ser

Gin

Ser

Leu

Leu

1 His

Ser

Asn

Gly

5 Tyr

Asn

Tyr

Leu

Asp

10 Trp

Tyr

Leu

Gin

Lys

15 Pro

Gly

Gin

Ser

Pro

20 Gin

Leu

Leu

Ile

Tyr

25 Leu

Gly

Ser

Asn

Arg

30 Ala

Ser

Gly

Val

Pro

35 Asp

Arg

Phe

Ser

Gly

40 Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

45 Asp

Phe

Thr

Leu

Lys

50 Leu

Ser

Arg

Val

Glu

55 Ala

Glu

Asp

Val

Gly

60 Val

Tyr

Tyr

Cys

Met

65

70

75

80

Gin Ala Leu Gin Thr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu

90 95

Ile

Lys

Arg Thr 100

Val

Ala

Ala Pro Ser 105

Val

Phe

Ile

Phe

Pro Pro Ser 110

Asp

Glu

Gin

Leu

Lys

Ser

Gly

Thr

Ala

Ser

Val

Val

Cys

Leu

Leu

Asn

115

120

125

Asn

Phe

Tyr

Pro

Arg

130

<2IO> 27 <211> 364 <212> PRT <213> Human

Met

<400> Gly Val

27 Leu

Leu

Thr

Gin

Arg

Thr

Leu

Leu

Ser

Leu

Val

Leu

Ala

1 Leu

Leu

Phe

Pro

5 Ser

Met

Ala

Ser

Met

10 Ala

Met

His

Val

Ala

15 Gin

Pro

Ala

Val

Val

20 Leu

Ala

Ser

Ser

Arg

25 Gly

Ile

Ala

Ser

Phe

30 Val

Cys

Glu

Tyr

Ala

35 Ser

Pro

Gly

Lys

Ala

40 Thr

Glu

Val

Arg

Val

4S Thr

Val

Leu

Arg

Gin

50 Ala

Asp

Ser

Gin

Val

55 Thr

Glu

Val

Cys

Ala

60 Ala

Thr

Tyr

Met:

Met

65 Gly

Asn

Glu

Leu

Thr

70 Phe

Leu

Asp

Asp

Ser

75 Ile

Cys

Thr

Gly

Thr

80 Ser

Ser

Gly

Asn

Gin

85 Val

Asn

Leu

Thr

Ile

90 Gin

Gly

Leu

Arg

Ala.

95 Met

Asp

Thr

Gly

Leu

100 Tyr

Ile

Cys

Lys

Val

105 Glu

Leu

Met

Tyr

Pro

110 Pro

Pro

Tyr

Tyr

Leu

115 Gly

Ile

Gly

Asn

Gly

120 Thr

Gin

Ile

Tyr

Val

125 Ile

ASp

Pro

Glu

Pro

130 Cys

Pro

Asp

Ser

Asp

135 Leu

Glu

Gly

Ala

Pro

140 Ser

Val

Phe

Leu

Phe

145 Pro

Pro

Lys

Pro

Lys

150 Asp

Thr

Leu

Met

Ile

155 Ser

Arg

Thr

Pro

Glu

160 Val

Thr

Cys

Val

Val

165 Val

Asp

Val

Ser

His

170 Glu

Asp

Pro

Glu

Val

175 Lys

Phe

Asn

Trp

Tyr

160 Val

Asp Gly

Val

Glu

185 Val

His

Asn

Ala

Lys

190 Thr

Lys

Pro

Arg

Glu

195 Glu

Gin

Tyr

Asn

Ser

200 Thr

Tyr

Arg

Val

Val

205 Ser

Val

Leu

Thr

Val

210 Leu

His

Gin

Asp

Trp

215 Leu

Asn

Gly

Lys

Glu

220 Tyr

Lys

Cys

Lys

Val

225 Ser

Asn

Lys

Ala

Leu

230 Pro

Thr

Pro

Ile

Glu

235 Lys

Thr

Ile

Ser

Lys

240 Ala

- 60 CZ 302706 B6

245

250

255

Lys Gly Gin

Pro

Arg

Glu

Pro

Gin

Val

Tyr

Thr

Leu

Pro

Pro

Ser

Arg

260

265

270

Asp Glu Leu

Thr

Lys

Asn

Gin

Val

Ser

Leu

Thr

Cys

Leu

Val

Lys

Gly

275

280

285

Phe Tyr Pro

Ser

Asp

lle

Ala

Val

Glu

Trp

Glu

Ser

Asn

Gly

Gin

Pro

290

295

300

Glu Asn Asn

Tyr

Lys

Thr

Thr

Pro

Pro

Val

Leu

Asp

Ser

Aep

Gly

Ser

305

310

315

320

Phe Phe Leu

Tyr

Ser

Lys

Leu

Thr

Val

Asp

Lys

Ser

Arg

Trp

Gin

Gin

325

330

335

Gly Asn Val

Phe

Ser

Cys

Ser

Val

Met

His

Glu

Ala

Leu

His

Asn

His

340

345

350

Tyr Thr Gin

Lys

Ser

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

Gly

Lys

355

360

<210> 28 <211> 12 <212> PRT <213> Human

<400>

28

Met His Val

Ala

Gin

Pro

Ala

Val

Val

Leu

Ala

Ser

1

s

10

<210> 29 <211> 120 <212> PRT <213> Human

<400>

29

Met His Val

Ala

Gin

Pro

Ala

Val

Val

Leu

Ala

Ser

Ser

Arg

Gly

lle

1

5

10

15

Ala Ser Phe

Val

Cys

Glu

Tyr

Ala

Ser

Pro

Gly

Lys

Ala

Thr

Glu

Val

20

25

30

Arg Val Thr

Val

Leu

Arg

Gin

Ala

Asp

Ser

Gin

Val

Thr

Glu

Val

Cys

35

40

45

Ala Ala Thr

Tyr

Met

Met

Gly

Asn

Glu

Leu

Thr

Phe

Leu

Asp

Asp

Ser

50

55

60

lle Cys Thr

Gly

Thr

Ser

Ser

Gly

Ásn

Gin

Val

Asn

Leu

Thr

lle

Gin

65

70

75

80

Gly Leu Arg

Ala

Met

ASp

Thr

Gly

Leu

Tyr

lle

Cys

Lys

Val

Glu

Leu

85

90

95

Met Tyr Pro

Pro

Pro

Tyr

Tyr

Leu

Gly

lle

Gly

Asn

Gly

Thr

Gin

lle

100

105

110

Tyr Val lle

ASp

Pro

Glu

Pro

Cys

115

120

<210> 30 <211> 11 <212> PRT <213> Human

<400>

30

Met His val

Ala

Gin

Pro

Ala

Val

Val

Leu

Ala

10 <210>31 <211> 89 <212> PRT

- 61 CZ 302706 B6

- 213> [ luman <400> 31

Gly

Val

Val

Gin

Pro

Gly

Arg

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser

1

5

10

15

Gly

Phe

Thr

Phe

Ser

Ser

Tyr

Gly

Met

His

Trp

Val

Arg

Gin

Ala

Pro

20

25

30

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

Val

Ala

Val

Ile

Trp

Tyr

Asp

Gly

Ser

Asn

35

40

45

Lys

Tyr

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

50

55

60

Asn

ser

Lys

Asn

Thr

Leu

Tyr

Leu

Gin

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Ala

Glu

65

70

75

80

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

Ala

Arg

S <2IO>32

<21l> 169 <212> PRT <213> Human

<400>

32

Gly

Val Val

Gin

Pro

Gly

Arg

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser

1

5

10

15

Gly

Phe Thr

Phe

Ser

Ser

Tyr

Gly

Met

His

Trp

Val

Arg

Gin

Ala

Pro

20

25

30

Gly

Lys Gly

Leu

Glu

Trp

Val

Ala

Val

Ile

Trp

Tyr

Asp

Gly

Ser

Asn

35

40

45

Lys

Tyr Tyr

Ala

Asp

ser

val

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

50

55

60

Asn

Ser Lys

Asn

Thr

Leu

Tyr

Leu

Gin

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Ala

Glu

65

70

75

80

Asp

Thr Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

Ala

Arg

Gly

Ala

Arg

Ile

Ile

Thr

Pro

85

90

95

Cys

Met Asp

Val

Trp

Gly

Gin

Gly

Thr

Thr

Val

Thr

Val

Ser

Ser

Ala

100

105

110

Ser

Thr Lys

Gly

Pro

Ser

Val

Phe

Pro

Leu

Ala

Pro

Cys

Ser

Arg

Ser

115

120

125

Thr

Ser Glu

Ser

Thr

Ala

Ala

Leu

Gly

Cys

Leu

Val

Lys

Asp

Tyr

Phe

130

135

140

Pro

Glu Pro

Val

Thr

Val

Ser

Trp

Asn

Ser

Gly

Ala

Leu

Thr

Ser

Gly

145

150

155

160

Val

His Thr

Phe

Pro

Ala

Val

Leu

Gin

165

<210> 33

<211

> 167

<212> PRT <213> Human

<400>

33

Gly

Val Val

Gin

Pro

Gly

Arg

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Val

Ala

Ser

1

5

10

15

Gly

Phe Thr

Phe

Ser

Ser

His

Gly

Met

His

Trp

Val

Arg

Gin

Ala

Pro

20

25

30

Gly

Lys Gly

Leu

Glu

Trp

Val

Ala

Val

Ile

Trp

Tyr

Asp

Gly

Arg

Asn

35

40

45

Lys

Tyr Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

50

55

60

Asn

Ser Lys

Asn

Thr

Leu

Phe

Leu

Gin

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Ala

Glu

65

70

75

80

Asp

Thr Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

Ala

Arg

Gly

Gly

His

Phe

Gly

Pro

Phe

-62 CZ 302706 B6 ίο

85

90

95

Asp Tyr Trp

Gly

Gin

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

ser

Ser

Ala

Ser

Thr

100

105

110

Lys Gly Pro

Ser

Val

Phe

Pro

Leu

Ala

Pro

Cys

Ser

Arg

Ser

Thr

Ser

115

120

125

Glu Ser Thr

Ala

Ala

Leu

Gly

Cys

Leu

Val

Lys

Asp

Tyr

Phe

Pro

Glu

130

135

140

Pro Val Thr

Val

Ser

Trp

Asn

Ser

Gly

Ala

Leu

Thr

Ser

Gly

Val

His

145

150

155

160

Thr Phe Pro

Ala

Val

Leu

Gin

165

<210> 34

<211> 166

<212> PRT

<213> Human

<400>

34

Gly Val Val

Gin

Pro

Gly Arg

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Thr

Ala

Ser

1

5

10

15

Gly Phe Thr

Phe

Ser

Asn

Tyr

Oly

Met

His

Trp

Val

Arg

Gin

Ala

Pro

20

25

30

Gly Lys Gly

Leu

Glu

Trp

val

Ala

Val

Ile

Trp

Tyr

Asp

Gly

Ser

Asn

35

40

45

Lys His Tyr

Gly

Asp

Ser

Val

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

ser

Ser

Asp

50

55

60

Asn Ser Lys

Asn

Thr

Leu

Tyr

Leu

Gin

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Ala

Glu

es

70

75

80

Asp Thr Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

Ala

Arg

Gly

Glu

Arg

Leu

Gly

Ser

Tyr

85

90

95

Phe Asp Tyr

Trp

Gly

Gin

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

Ser

Ala

Ser

100

105

110

Thr Lys Gly

Pro

Ser

Val

Phe

Pro

Leu

Ala

Pro

Cys

Ser

Arg

Ser

Thr

115

120

125

Ser Glu Ser

Thr

Ala

Ala

Leu

Gly

Cys

Leu

val

Lys

Asp

Tyr

Phe

Pro

130

135

140

Glu Pro Val

Thr

Val

Ser

Trp

Asn

Ser

Gly

Ala

Leu

Thr

Ser

Gly

Val

145

150

155

160

His Thr Phe

Pro

Ala

Val

165

<210> 35

<211> 167

<212> PRT

<213> Human

<400>

35

Gly Val Val

Gin

Pro

Gly

Arg

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Val

Ala

Ser

1

5

10

15

Gly Phe Ile

Phe

Ser

Ser

His

Gly

Ile

His

Trp

Val

Arg

Gin

Ala

Pro

20

25

30

Gly Lys Gly

Leu

Olu

Trp

Val

Ala

Val

Ile

Trp

Tyr

Asp

Gly

Arg

Asn

35

40

45

Lys Asp Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

50

55

60

Asn Ser Lys

Asn

Thr

Leu

Tyr

Leu

Gin

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Ala

Glu

65

70

75

80

Asp Thr Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

Ala

Arg

Val

Ala

Pro

Leu

Gly

Pro

Leu

85

90

95

Asp Tyr Trp

Gly

Gin

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

Ser

Ala

Ser

Thr

100 105 110

CZ, 302706 B6

Lys Gly Pro

Ser Val

Phe

Pro

Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser

115

120

125

Glu

Ser

Thr

Ala

Ala

Leu

Gly

Cys

Leu

Val

Lys

Asp

Tyr

Phe

Pro

Glu

130

135

140

Pro

Val

Thr

Val

Ser

Trp

Asn

Ser

Gly

Ala

Leu

Thr

Ser

Gly

Val

His

145

150

155

160

Thr

Phe

Pro

Ala

Val

Leu

Gin

165 <210> 36

<21l> 153 <212> PRT <213> Human

Pro

<400> Gly Arg

36 Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser

Gly

Phe

Thr

Phe

1 Ser

Ser

His

Gly

5 Ile

His

Trp

Val

Arg

10 Gin

Ala

Pro

Gly

Lys

15 Gly

Leu

Glu

Trp

Val

20 Ala

Val

Ile

Trp

Tyr

25 Asp

Gly

Arg

Asn

Lys

30 Asp

Tyr

Ala

Asp

Ser

35 Val

Lys

Gly

Arg

Phe

40 Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

45 Asn

Ser

Lys

Asn

Thr

50 Leu

Tyr

Leu

Gin

Met

55 Asn

Ser

Leu

Arg

Ala

60 Glu

Asp

Thr

Ala

Val

65 Tyr

Tyr

Cys

Ala

Arg

70 Val

Ala

Pro

Leu

Gly

75 Pro

Leu

Asp

Tyr

Trp

80 Gly

Gin

Gly

Thr

Leu

05 Val

Thr

Val

Ser

Ser

90 Ala

Ser

Thr

Lys

Gly

95 Pro

Ser

Val

Phe

Pro

100 Leu

Ala

Pro

Cys

Ser

105 Arg

Ser

Thr

Ser

Glu

110 Ser

Thr

Ala

Al a

Leu

115 Gly

Cys

Leu

Val

Lys

120 Asp

Tyr

Phe

Pro

Glu

125 Pro

Val

Thr

Val

130 135 140

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 145 150 io <21O>37 <211> 163 <212> PRT <213> Human

Pro

<400> Gly Arg

37 Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala

ser

Gly

Phe

Thr

Phe

1 Ser

Ser

His

Gly

5 Ile

His

Trp

Val

Arg

10 Gin

Ala

Pro

Gly

Lys

15 Gly

Leu

Glu

Trp

Val

20 Ala

Val

Ile

Trp

Tyr

25 Asp

Gly

Arg

Asn

Lys

30 Asp

Tyr

Ala

Asp

Ser

35 Val

Lys

Gly Arg

Phe

40 Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

45 Αβπ

Ser

Lys

Lys

Thr

50 Leu

Tyr

Leu

Gin

Met

55 Asn

Ser

Leu

Arg

Ala

60 Glu

Asp

Thr

Ala

Val

65 Tyr

Tyr

Cys

Ala

Arg

70 Val

Ala

Pro

Leu

Gly

75 Pro

Leu

Asp

Tyr

Trp

80 Gly

Gin

Gly

Thr

Leu

85 Val

Thr

Val

Ser

Ser

90 Ala

Ser

Thr

Lys

Gly

95 Pro

Ser

Val

Phe

Pro

100 Leu

Ala

Pro

Cys

Ser

105 Arg

Ser

Thr

Ser

Glu

110 Ser

Thr

Ala

Ala

Leu

115 Gly

Cys

Leu

Val

Lys

120 Asp

Tyr

Phe

Pro

Glu

125 Pro

Val

Thr

Val

Ser

130 Trp

Asn

Ser

Gly

Ala

135 Leu

Thr

Ser

Gly

Val

140 His

Thr

Phe

Pro

Ala

145 150 155 160

Val Leu Gin

-64CZ 302706 B6 <210> 38 <211> 138 <212>PRT <213>Human

Gly

<400> Gly Val

38 Val

Olu

Pro

Gly

Arg

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Thr

Ala

1 Ser

Gly

Phe

Thr

5 Phe

Ser

Ser

Tyr

Gly

10 Met

His

Trp

Val

Arg

15 Gin

Ala

Pro

Gly

Lys

20 Gly

Leu

Glu

Trp

Val

25 Ala

Val

Ile

Trp

Tyr

30 Asp

Gly

Ser

Asn

Lys

35 His

Tyr

Ala

Asp

Ser

40 Ala

Lys

Gly

Arg

Phe

45 Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

50 Asn

Ser

Lys

Asn

Thr

55 Leu

Tyr

Leu

Gin

Met

60 Asn

Ser

Leu

Arg

Ala

65 Glu

Asp

Thr

Ala

Val

70 Tyr

Tyr

Cys

Ala

Arg

75 Ala

Gly

Leu

Leu

Gly

80 Tyr

Phe

Asp

Tyr

Trp

85 Gly

Gin

Gly

Thr

Leu

90 Val

Thr

Val

Ser

Ser

95 Ala

Ser

Thr

Lys

Gly

100 Pro

Ser

Val

Phe

Pro

105 Leu

Ala

Pro

Cys

Ser

110 Arg

Ser

Thr

Ser

Glu

115 Ser

Thr

Ala

Ala

Leu

120 Gly

Cys

Leu

125

130 135 <210> 39 io <211> 167 <212> PRT <213> Human <220>

Gly

<400> Val Val

39 Gin

Pro

Gly

Arg

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser

1 Gly

Phe

Thr

Phe

5 Ser

Ser

Tyr

Gly

Met

10 His

Trp

Val

Arg

Gin

15 Ala

Pro

Gly

Lys

Gly

20 Leu

Glu

Trp

val

Ala

25 Val

Ile

Trp

Tyr

Asp

30 Gly

Ser

Asn

Lys

Tyr

35 Tyr

Ala

Asp

Ser

val

40 Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

45 Ile

Ser

Arg

Asp

Asn

50 Ser

Lys

Asn

Thr

Leu

55 Tyr

Leu

Gin

Met

Asn

60 Ser

Leu

Arg

Ala

Glu

65 Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

70 Tyr

Cys

Ala

Arg

Asp

75 Pro

Arg

Gly

Ala

Thr

80 Leu

Tyr

Tyr

Tyr

Tyr

85 Tyr

Arg

Xaa

Asp

Val

90 Trp

Gly

Gin

Gly

Thr

95 Thr

Val

Thr

Val

Ser

100 Ser

Ala

Ser

Thr

Lys

105 Gly

Pro

Ser

Val

Phe

110 Pro

Leu

Ala

Pro

Cys

115 Ser

Arg

Ser

Thr

Ser

120 Glu

Ser

Thr

Ala

Ala

125 Leu

Gly

Cys

Leu

val

130 Lys

Asp

Tyr

Phe

Pro

13 5 Glu

Pro

Val

Thr

Val

140 Ser

Trp

Asn

Ser

Gly

145 150 155 160

Ala Leu Thr Ser Gly Val His

165 <210> 40 <211> 150 <212>PRT <213> Human

Gly

<400> Val val

40 Gin

Pro

Gly

Arg

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser

1 Gly

Phe

Thr

Phe

5 Ser

Ser

Tyr

Gly

Met

10 His

Trp

Val

Arg

Gin

15 Ala

Pro

Gly

Lys

Gly

20 Leu

Glu

Trp

Val

Ala

25 Val

Ile

Trp

Tyr

Asp

30 Gly

Ser

His

Lys

Tyr

35 Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

40 Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

45 Ile

Ser

Arg

Asp

Asn

50 Ser

Lys

Asn

Thr

Leu

55 Tyr

Leu

Gin

Met

Asn

60 Ser

Leu

Arg

Ala

Glu

65 Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

70 Tyr

Cys

Ala

Arg

Gly

75 Ala

Val

Val

Val

Pro

80 Ala

Ala

Met

Asp

Val

85 Trp

Gly

Gin

Gly

Thr

90 Thr

Val

Thr

Val

Ser

95 Ser

Ala

Ser

Thr

Lys

100 Gly

Pro

Ser

Val

Phe

105 Pro

Leu

Ala

Pro

Cys

110 Ser

Arg

Ser

Thr

Ser

115 Glu

Ser

Thr

Ala

Ala

120 Leu

Gly

Cys

Leu

Val

125 Lys

Asp

Tyr

Phfe

Pro 145

130 Glu

Pro

Val

Thr

Val 150

135

14 0

<2Ι0>41 <211> 146 <212>PRT <213> Human <400> 41

Val Val Gin Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly 15 10 15

Phe Thr Phe Ser Ser Cys Gly Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly 20 25 30

Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Val Ile Trp Ser Asp Gly Ser His Lys 35 40 45

Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn 50 55 60

Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp

70 75 80

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Thr Met Ile Val Val Gly Thr

90 95

Leu Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser

100 105 110

Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr

115 120 125

Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro

130 135 140

Glu Pro 14S io <210> 42 <211> 171 <212> PRT <213> Human <400> 42

Gly Val Val Gin Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser 1 s 10 15

-66 CZ 302706 B6

Gly

Phe Thr

Phe Ser 20

Ser Tyr Gly Val His Trp Val Arg Gin Ala Pro

25

30

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

Val

Ala

Val

Ile

Trp

Tyr

Asp

Gly

Ser

Asn

35

40

45

Lys

Tyr

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

Lys

Gly Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

50

55

60

Asn

Ser

Lys

Ser

Thr

Leu

Tyr

Leu

Gin

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Ala

Glu

65

70

75

80

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

Ala

Arg

Asp

Ser

Tyr

Tyr

Asp

Phe

Trp

85

90

95

Ser

Gly

Arg

Gly

Gly

Met

Asp

Val

Trp

Gly

Gin

Gly

Thr

Thr

Val

Thr

100

105

110

Val

Ser

Ser

Ala

Ser

Thr

Lys

Gly

Pro

Ser

val

Phe

Pro

Leu

Ala

Pro

115

120

12S

Cys

Ser

Arg

Ser

Thr

Ser

Glu

Ser

Thr

Ala

Ala

Leu

Gly

Cys

Leu

Val

130

135

140

Lys

Asp

Tyr

Phe

Pro

Glu

Pro

Val

Thr

Val

Ser

Trp

Asn

Ser

Gly

Ala

145

150

155

160

Leu

Thr

Ser

Gly

Val

His

Thr

Phe

Pro

Ala

Val

165 170 <210> 43 <211> 163 <212> PRT <213> Human

Val

<400> Gin Pro

43 Gly

Arg

Ser

Leu

Arg

Leu

ser

Cys

Ala

Ala

Ser

Gly

Phe

1 Thr

Phe

Ser

Asn

5 Tyr

Ala

Met

His

Trp

10 Val

Arg

Gin

Ala

Pro

15 Gly

Lys

Gly

Leu

Glu

20 Trp

Val

Val

Val

Ile

25 Trp

His

Asp

Gly

Asn

30 Asn

Lys

Tyr

Tyr

Ala

35 Glu

Ser

Val

Lys

Gly

40 Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

45 Arg

Asp

Asn

Ser

Lys

50 Asn

Thr

Leu

Tyr

Leu

55 Gin

Met

Asn

Ser

Leu

60 Arg

Ala

Glu

Asp

Thr

65 Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

70 Ala

Arg

Asp

Gin

Gly

75 Thr

Gly

Trp

Tyr

Gly

80 Gly

Phe

Asp

Phe

Trp

85 Gly

Gin

Gly

Thr

Leu

90 Val

Thr

Val

Ser

Ser

95 Ala

Ser

Thr

Lys

Gly

100 Pro

Ser

Val

Phe

Pro

105 Leu

Ala

Pro

Cys

Ser

110 Arg

Ser

Thr

Ser

Glu

115 ser

Thr

Ala

Ala

Leu

120 Gly

Cys

Leu

Val

Lys

125 Asp

Tyr

Phe

Pro

Glu

13 0 Pro

val

Thr

Val

Ser

135 Trp

Asn

ser

Gly

Ala

140 Leu

Thr

Ser

Gly

Val

145

150

155

160

His Thr Phe

1tí <210> 44 <211> 76 <212> PRT <213> Human

<400>

44

Val

Ser

Gly

Gly

Ser

lle

Ser

Ser

Gly Gly

Tyr

Tyr Trp

Ser

Trp

Ile

1

5

10

15

Arg

Gin

His

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu Trp

Ile

Gly Tyr

Ile

Tyr

Tyr

20

25

30

Ser

Gly

Ser

Thr

Tyr

Tyr

Asn

Pro

Ser Leu

Lys

Ser Arg

Val

Thr

Ile

-67 15

40 45

Ser Val Asp

Thr

Ser

Lys

Asn

Gin

Phe

Ser

Leu

Lys

Leu

Ser

Ser

Val

50

55

60

Thr Ala Ala

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

Ala

Arg

65

70

75

<210> 45

<211> 172

<212> PRT

<213> Human

<400>

45

Ser Gly Pro

Gly

Leu

Val

Lys

Pro

Ser

Gin

Ile

Leu

Ser

Leu

Thr

Cys

1

5

10

15

Thr Val Ser

Gly

Gly

Ser

Ile

Ser

Ser

Gly

Gly

His

Tyr

Trp

Ser

Trp

20

25

30

Ile Arg Gin

His

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

Ile

Gly

Tyr

Ile

Tyr

35

40

45

Tyr Ile Gly

Asn

Thr

Tyr

Tyr

Asn

Pro

Ser

Leu

Lys

Ser

Arg

Val

Thr

50

55

60

Ile Ser Val

Asp

Thr

Ser

Lys

Asn

Gin

Phe

Ser

Leu

Lys

Leu

Ser

Ser

65

70

75

80

Val Thr Ala

Ala

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

Ala

Arg

Asp

Ser

Gly

85

90

9S

Asp Tyr Tyr

Gly

Ile

Asp

Val

Trp

Gly

Gin

Gly

Thr

Thr

Val

Thr

Val

100

105

110

Ser Ser Ala

Ser

Thr

Lys

Gly

Pro

Ser

Val

Phe

Pro

Leu

Ala

Pro

Cys

115

120

125

Ser Arg Ser

Thr

Ser

Glu

Ser

Thr

Ala

Ala

Leu

Gly

Cys

Leu

Val

Lys

130

135

14 0

Asp Tyr Phe

Pro

Glu

Pro

Val

Thr

val

Ser

Trp

Asn

Ser

Gly

Ala

Leu

145

150

155

160

Thr Ser Gly

Val

His

Thr

Phe

Pro

Ala

Val

Leu

Gin

165

170

<210> 46

<211> 96

<212> PRT

<213> Human

<400>

46

Glu Ile Val

Leu

Thr

Gin

Ser

Pro

Gly

Thr

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

Gly

1

5

10

15

Glu Arg Ala

Thr

Leu

Ser

Cys

Arg

Ala

Ser

Gin

Ser

Val

Ser

Ser

Ser

20

25

30

Tyr Leu Ala

Trp

Tyr

Gin

Gin

Lya

Pro

Gly

Gin

Ala

Pro

Arg

Leu

Leu

35

40

45

Ile Tyr Gly

Ala

Ser

Ser

Arg

Ala

Thr

Gly

Ile

Pro

Asp

Arg

Phe

Ser

50

55

60

Gly Ser Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

Arg

Leu

Glu

65

70

75

80

Pro Glu Asp

Phe

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

Gin

Gin

Tyr

Gly

Ser

Ser

Pro

90 95 <210> 47 <211> 141 <212> PRT <213>Human <4O0> 47

Gin Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu

- 68CZ 302706 86

1	5	10	15
Ser Cys	Arg Ala Ser Gin	Ser Ile Ser Ser Ser	Phe Leu Ala Trp Tyr
	20	25	30
Gin Gin	Arg Pro Gly Gin	Ala Pro Arg Leu Leu	Ile Tyr Gly Ala Ser
	35	40	45
Ser Arg	Ala Thr Gly Ile	Pro Asp Arg Phe Ser	Gly Ser Gly Ser Gly
50		55	60
Thr Asp	Phe Thr Leu Thr	Ile Ser Arg Leu Glu	Pro Glu Asp Phe Ala
65	70	75	80
Val Tyr	Tyr Cys Gin Gin	Tyr Gly Thr Ser Pro	Trp Thr Phe Gly Gin
	85	90	95
Gly Thr	Lys Val Glu Ile	Lys Arg Thr Val Ala	Ala Pro Ser Val Phe
	100	105	110
Ile Phe	Pro Pro Ser Asp	Glu Gin Leu Lys Ser	Gly Thr Ala Ser Val
	115	120	125
Val Cys	Leu Leu Asn Asn	Phe Tyr Pro Arg Glu	Ala Lys
130		135	140
<210 48
<211> 141
<212> PRT
<213> Human
<400> 48
Gin Ser	Pro Gly Thr Leu	Ser Leu Ser Pro Gly	Glu Arg Ala Thr Leu
1	5	10	15
Ser Cys	Arg Thr Ser Val	Ser Ser Ser Tyr Leu	Ala Trp Tyr Gin Gin
	20	25	30
Lys Pro	Gly Gin Ala Pro	Arg Leu Leu Ile Tyr	Gly Ala Ser Ser Arg
	35	40	45
Ala Thr	Gly Ile Pro Asp	Arg Phe Ser Gly Ser	Gly Ser Gly Thr Asp
50		55	60
Phe Thr	Leu Thr Ile Ser	Arg Leu Glu Pro Glu	Asp Phe Ala Val Tyr
65	70	75	80
Tyr Cys	Gin Gin Tyr Gly	Ile Ser Pro Phe Thr	Phe Gly Gly Gly Thr
	85	90	95
Lys Val	Glu Ile Lys Arg	Thr Val Ala Ala Pro	Ser Val Phe Ile Phe
	100	105	110
Pro Pro	Ser Asp Glu Gin	Leu Lys Ser Gly Thr	Ala Ser val Val Cys
	115	120	125
Leu Leu	Asn Asn Phe Tyr	Pro Arg Glu Ala Lys	Val Gin
130		135	140
<210 49
<211> 139
<212> PRT
<213> Human
<400> 49
Gly Thr	Leu Ser Leu Ser	Pro Gly Glu Arg Ala	Thr Leu Ser Cys Arg
1	5	10	15
Ala Ser	Gin Ser Val ser	Ser Tyr Leu Ala Trp	Tyr Gin Gin Lys Pro
	20	25	30
Gly Gin	Ala Pro Arg Leu	Leu Ile Tyr Gly Ala	Ser Ser Arg Ala Thr
	35	40	45
Gly Ile	Pro Asp Arg Phe	Ser Gly Ser Gly Ser	Gly Thr Asp Phe Thr
50		55	60
Leu Thr	Ile Ser Arg Leu	Glu Pro Glu Asp Phe	Ala Val Tyr Tyr Cys
65	70	75	80
Gin Gin	Tyr Gly Arg Ser	Pro Phe Thr Phe Gly	Pro Gly Thr Lys Val

90 95

-69 CZ 302706 B6

Asp

Xle

Lys

Arg 100

Thr Val

Ala

Ala Pro 105

Ser Val

Phe

Ile Phe Pro 110

Pro

Ser

Asp

Glu

Gin

Leu

Lys

Ser

Gly

Thr

Ala

Ser

Val

Val

Cys

Leu

Leu

115

120

125

Asn

Asn

Phe

Tyr

Pro

Arg

Glu

Ala

Lys

Val

Gin

130 135 <2I0> 50 <21l> 142 <212> PR I' <213> Human

<400>

50

Gin

Ser

Pro

Gly

Thr

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

Gly

Glu

Arg

Ala

Thr

Leu

1

5

10

15

Ser

Cys

Arg

Ala

Ser

Gin

Ser

Val

Ser

Ser

Tyr

Leu

Ala

Trp

Tyr

Gin

20

25

30

Gin

Lys

Pro

Gly

Gin

Ala

Pro

Arg

Pro

Leu

Ile

Tyr

Gly

Val

Ser

Ser

35

40

45

Arg

Ala

Thr

Gly

Ile

Pro

Asp

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

50

55

60

Asp

Phe

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

Arg

Leu

Glu

Pro

Glu

Asp

Phe

Ala

Val

65

70

75

80

Tyr

Tyr

Cys

Gin

Gin

Tyr

Gly

Ile

Ser

Pro

Phe

Thr

Phe

Gly

Pro

Gly

85

90

95

Thr

Lys

val

Asp

Ile

Lys

Arg

Thr

Val

Ala

Ala

Pro

Ser

Val

Phe

Ile

100

105

110

Phe

Pro

Pro

Ser

Asp

Glu

Gin

Leu

Lys

Ser

Gly

Thr

Ala

Ser

Val

Val

115

120

125

Cys

Leu

Leu

Asn

Asn

Phe

Tyr

Pro

Arg

Glu

Ala

Lys

Val

Gin

130

135

140

io <210> 51 <211> 142 <212> PRT <213> Human

<400> 51

Ser

Pro

Gly

Thr

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

Gly

Glu

Arg

Ala

Thr

Leu

Ser

1

5

10

15

Cys

Arg

Ala

Ser

Gin

Ser

Ile

Ser

Ser

Asn

Phe

Leu

Ala

Trp

Tyr

Gin

20

25

30

Gin

Lys

Pro

Gly

Gin

Ala

Pro

Arg

Leu

Leu

Ile

Tyr

Arg

Pro

Ser

Ser

35

40

45

Arg

Ala

Thr

Gly

Ile

Pro

Asp

Ser

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

50

55

60

Asp

Phe

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

Arg

Leu

Glu

Pro

Glu

Asp

Phe

Ala

Leu

65

70

75

80

Tyr

Tyr

Cys

Gin

Gin

Tyr

Gly

Thr

Ser

Pro

Phe

Thr

Phe

Gly

Pro

Gly

85

90

95

Thr

Lys

Val

Asp

Ile

Lys

Arg

Thr

Val

Ala

Ala

Pro

Ser

Val

Phe

Ile

100

105

110

Phe

Pro

Pro

Ser

Asp

Glu

Gin

Leu

Lys

Ser

Gly

Thr

Ala

Ser

Val

Val

115

120

125

Cys

Leu

Leu

Asn

Asn

Phe

Tyr

Pro

Arg

Glu

Ala

Lys

Val

Gin

130

135

140

<210> 52 <211> 146 <212> PRT <213> Human

-70CZ 302706 B6

<400>

52

Gin

Ser

Pro

Gly

Thr

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

Gly

Glu

Arg

Ala

Thr

Leu

1

5

10

15

Ser

Cys

Arg

Ala

Ser

Gin

Ser

Val

Ser

Ser

Tyr

Leu

Ala

Trp

Tyr

Gin

20

25

30

Gin

Lys

Pro

Gly

Gin

Ala

Pro

Arg

Leu

Leu

lle

Tyr

Gly

Ala

Ser

ser

35

40

45

Arg

Ala

Thr

Gly

lle

Pro

Asp

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

50

55

60

Asp

Phe

Thr

Leu

Thr

lle

Ser

Arg

Leu

Glu

Pro

Glu

Asp

Phe

Ala

val

65

70

75

80

Tyr

Tyr

Cys

Gin

Gin

Tyr

Gly

Arg

Ser

Pro

Phe

Thr

Phe

Gly

Pro

Gly

85

90

95

Thr

Lys

Val

Asp

lle

Lys

Arg

Thr

Val

Ala

Ala

Pro

Ser

Val

Phe

lle

100

105

110

Phe

Pro

Pro

Ser

Asp

Glu

Gin

Leu

Lys

Ser

Gly

Thr

Ala

Ser

Val

Val

115

120

125

Cys

Leu

Leu

Asn

Asn

Phe

Tyr

Pro

Arg

Glu

Ala

Lys

Val

Gin

Trp

Lys

130

135

14 0

Gly

Gly

145

<210> 53 <211> 95 s <212>PRT <2 í 3> Human <400> 53

Asp 1

lle Gin

Met Thr Gin 5

Ser Pro

Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

10

15

ASp

Arg

Val

Thr

xle

Thr

Cys

Arg

Ala

Ser

Gin

Ser

lle

Ser

Ser

Tyr

20

25

30

Leu

Asn

Trp

Tyr

Gin

Gin

Lys

Pro

Gly

Lys

Ala

Pro

Lys

Leu

Leu

lle

35

40

45

Tyr

Ala

Ala

Ser

Ser

Leu

Gin

Ser

Gly

Val

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser

Gly

50

55

60

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

Thr

lle

ser

Ser

Leu

Gin

Pro

65

70

75

80

Glu

Asp

Phe

Ala

Thr

Tyr

Tyr

Cys

Gin

Gin

Ser

Tyr

Ser

Thr

Pro

85

90

95

io <210>54 <211> 152 <212> PRT <213> Human

<400>

54

Gin

Ser

Pro

Ser

Ser

Leu

Ser

Ala

Ser

Val

Gly

Asp

Arg

Val

Thr

lle

1

5

10

15

Thr

Cys

Arg

Ala

Ser

Gin

Ser

lle

Asn

Thr

Tyr

Leu

lle

Trp

Tyr

Gin

20

25

30

Gin

Lys

Pro

Gly

Lys

Ala

Pro

Asn

Phe

Leu

lle

Ser

Ala

Thr

Ser

lle

35

40

45

Leu

Gin

Ser

Gly

Val

Pro

Ser

Arg

Phe

Arg

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

50

55

60

Asn

Phe

Thr

Leu

Thr

lle

Asn

Ser

Leu

His

Pro

Glu

Asp

Phe

Ala

Thr

65

70

75

80

Tyr

Tyr

Cys

Gin

Gin

Ser

Tyr

Ser

Thr

Pro

Phe

Thr

Phe

Gly

Pro

Gly

85

90

95

Thr

Lys

val

Asp

lle

Lys

Arg

Thr

Val

Ala

Ala

Pro

Ser

val

Phe

lle

-71 CZ 302706 B6

100

105

110

Phe Pro Pro

Ser

Asp

Glu

Gin

Leu

Lys

Ser

Gly

Thr

Ala

Ser

Val

Val

115

120

125

Cys Leu Leu

Asn

Asn

Phe

Tyr

Pro

Arg Glu

Ala

Lys

Val

Gin

Trp

Lys

130

135

140

Val Asp Asn

Ala

Leu

Gin

Ser

Gly

145

150

<210> 55

<211> 139

<212> PRT

<213> Ihiman

<400>

55

Pro Ser Ser

Leu

Ser

Ala

Ser

Val

Gly

Asp

Arg

Val

Thr

Ile

Thr

Cys

1

5

10

15

Arg Ala Ser

Gin

Ser

ile

Asn

Ser

Tyr

Leu

Asp

Trp

Tyr

Gin

Gin

Lys

20

25

30

Pro Gly Lys

Ala

Pro

Lys

Leu

Leu

Ile

Tyr

Ala

Ala

Ser

Ser

Leu

Gin

35

40

45

Ser Gly Val

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

50

55

60

Thr Leu Thr

Ile

Ser

Ser

Leu

Gin

Pro

Glu

Asp

Phe

Ala

Thr

Tyr

Tyr

65

70

75

80

Cys Gin Gin

Tyr

Tyr

Ser

Thr

Pro

Phe

Thr

Phe

Gly

Pro

Gly

Thr

Lys

85

90

95

Val Glu Ile

Lys

Arg

Thr

Val

Ala

Ala

Pro

Ser

Val

Phe

Ile

Phe

Pro

100

105

110

Pro Ser Asp

Glu

Gin

Leu

Lys

Ser

Gly

Thr

Ala

Ser

Val

Val

Cys

Leu

115

120

125

Leu Asn Asn

Phe

Tyr

Pro

Arg

Glu

Ala

Lys

Val

130

135

<210> 56

<211> 134

<212> PRT

<213> Human

<400>

56

Thr Gin Ser

Pro

Ser

Ser

Leu

Ser

Ala

Ser

Val

Gly

Asp

Arg

Val

Thr

1

5

10

15

Ile Thr Cys

Arg

Ala

Ser

Gin

Asn

Ile

Ser

Arg

Tyr

Leu

Asn

Trp

Tyr

20

25

30

Gin Gin Lys

Pro

Gly

Lys

Ala

Pro

Lys

Phe

Leu

Ile

Tyr

Val

Ala

Ser

35

40

45

Ile Leu Gin

Ser

Gly

Val

Pro

Ser

Gly

Phe

ser

Ala

Ser

Gly

Ser

Gly

50

55

60

Pro Asp Phe

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

Ser

Leu

Gin

Pro

Glu

Asp

Phe

Ala

65

70

75

80

Thr Tyr Tyr

Cys

Gin

Gin

Ser

Tyr

Ser

Thr

Pro

Phe

Thr

Phe

Gly

Pro

85

90

95

Gly Thr Lys

Val

Asp

Ile

Lys

Arg

Thr

Val

Ala

Ala

Pro

Ser

Val

Phe

100

105

110

Ile Phe Pro

Pro

Ser

Asp

Glu

Gin

Leu

Lys

Ser

Gly

Thr

Ala

Ser

val

115

120

125

Val Cys Leu Leu Asn Asn 15 ¹³⁰ <2IO> 57 <211> 150 <212> PRT <2l3>Human

- 72 CZ 302706 B6

Thr

<400> Gin Ser

57 Pro

Ser

Ser

Leu

Ser

Ala

Ser

Val

Gly

Asp

Arg

Val

Thr

1 Ile

Thr

Cys

Arg

5 Ala

ser

Gin

Ser

Ile

10 Cys

Asn

Tyr

Leu

Asn

15 Trp

Tyr

Gin

Gin

Lys

20 Pro

Gly

Lys

Ala

Pro

25 Arg

Val

Leu

Ile

Tyr

30 Ala

Ala

Ser

Ser

Leu

35 Gin

Gly

Gly

Val

Pro

40 Ser

Arg

Phe

Ser

Gly

45 Ser

Gly

Ser

Gly

Ile

50 Asp

Cys

Thr

Leu

Thr

55 Ile

Ser

Ser

Leu

Gin

60 Pro

Glu

Asp

Phe

Ala

85 Thr

Tyr

Tyr

Cys

Gin

70 Gin

Ser

Tyr

Ile

Thr

75 Pro

Phe

Thr

Phe

Gly

80 Pro

Gly

Thr

Arg

Val

85 Asp

Ile

Glu

Arg

Thr

90 Val

Ala

Ala

Pro

Ser

95 Val

Phe

Ile

Phe

Pro

100 Pro

Ser

Asp

Glu

Gin

105 Leu

Lys

Ser

Gly

Thr

110 Ala

Ser

Val

Val.

Cys

115 Leu

Leu

Asn

Asn

Phe

120 Tyr

Pro

Arg

Glu

Ala

125 Lys

Val

Gin

Trp

Lys

130 Val

Asp

Asn

Ala

Tyr

135

140

145 150 <210> 58

<211> 96 <212> PRT <213> Human

Glu

<400> Ile Val

58 Leu

Thr

Gin

Ser

Pro

Asp

Phe

Gin

Ser

Val

Thr

Pro

Lys

1 Glu

Lys

Val

Thr

5 Ile

Thr

Cys

Arg

Ala

10 Ser

Gin

Ser

Ile

Gly

15 ser

Ser

Leu

His

Trp

20 Tyr

Gin

Gin

Lys

Pro

25 ASp

Gin

Ser

Pro

Lys

30 Leu

Leu

ile

Lys

Tyr

35 Ala

Ser

Gin

Ser

Phe

40 Ser

Gly

Val

Pro

Ser

45 Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

50 Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

55 Phe

Thr

Leu

Thr

Ile

60 Asn

Ser

Leu

Glu

Ala

65 Glu

Asp

Ala

Ala

Thr

70 Tyr

Tyr

Cys

His

Gin

75 Ser

Ser

Ser

Leu

Pro

80 Gin

85

90

95

<210> 59 <211> 155 <212> PRT <213> Human

<400>

59

Ser Pro Asp

Phe

Gin

Ser

Val

Thr

Pro

Lys

Glu

Lys

Val

Thr

Ile

Thr

1

5

10

15

Cys Arg Ala

Ser

Gin

Ser

Ile

Gly

Ser

Ser

Leu

His

Trp

Tyr

Gin

Gin

20

25

30

Lys Pro Asp

Gin

Ser

Pro

Lys

Leu

Leu

Ile

Lys

Tyr

Ala

Ser

Gin

Ser

35

40

45

Phe Ser Gly

Val

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

50

55

60

Phe Thr Leu

Thr

Ile

Asn

Ser

Leu

Glu

Ala

Glu

Asp

Ala

Ala

Thr

Tyr

65

70

75

80

Tyr Cys His

Gin

Ser

Ser

Ser

Leu

Pro

Leu

Thr

Phe

Gly

Gly

Gly

Thr

90 95

- 73 CZ 302706 B6

Lys Val Glu

Ile

Lys

Arg

Thr

Val

Ala

Ala

Pro

Ser

Val

Phe

Ile

Phe

100

105

110

Pro Pro Ser

Asp

Glu

Gin

Leu

Lys

Ser

Gly

Thr

Ala

Ser

Val

Val

Cys

115

120

125

Leu Leu Asn

Asn

Phe

Tyr

Pro

Arg

Glu

Ala

Lys

Val

Gin

Trp

Lys

Val

130

135

140

Asp Asn Ala

Leu

Gin

Ser

Gly

Asn

Ser

Gin

Glu

145

150

155

<210> 60

<211> 100

<212> PRT

<213> Human

<400>

60

Asp Val Val

Met

Thr

Gin

Ser

Pro

Leu

Ser

Leu

Pro

Val

Thr

Leu

Gly

1

5

10

15

Gin Pro Ala

Ser

Ile

Ser

Cys

Arg

Ser

Ser

Gin

Ser

Leu

Val

Tyr

Ser

20

25

30

Asp Gly Asn

Thr

Tyr

Leu

Asn

Trp

Phe

Gin

Gin

Arg

Pro

Gly

Gin

Ser

35

40

45

Pro Arg Arg

Leu

Ile

Tyr

Lys

Val

Ser

Asn

Arg

Asp

Ser

Gly

Val

Pro

50

55

60

Asp Arg Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

Lys

Ile

65

70

75

80

Ser Arg Val

Glu

Ala

Glu

Asp

Val

Gly

Val

Tyr

Tyr

Cys

Met

Gin

Gly

85

90

95

Thr Hia Trp

Pro

100

<210> 61

<211> 139

<212> PRT

<213> Human

<400>

61

Pro Leu Ser

Leu

Pro

Val

Thr

Leu

Gly

Gin

Pro

Ala

Ser

Ile

Ser

Cys

1

S

10

15

Arg Ser Ser

Gin

Ser

Leu

Val

Tyr

Ser

Asp

Gly

Asn

Thr

Tyr

Leu

Asn

20

25

30

Trp Phe Gin

Gin

Arg

Pro

Gly

Gin

Ser

Pro

Arg

Arg

Leu

Ile

Tyr

Lys

35

40

45

Val Ser Asn

Trp

Asp

Ser

Gly

Val

Pro

Asp

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

50

55

60

Ser Gly Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

Lys

Ile

Ser

Arg

Val

Glu

Ala

Glu

Asp

65

70

75

60

Val Gly Val

Tyr

Tyr

Cys

Met

Gin

Gly

Ser

His

Trp

Pro

Pro

Thr

Phe

85

90

95

Gly Gin Gly

Thr

Lys

Val

Glu

Ile

Lys

Arg

Thr

Val

Ala

Ala

Pro

Ser

100

105

110

val Phe Ile

Phe

Pro

Pro

Ser

Asp

Glu

Gin

Leu

Lys

Ser

Gly

Thr

Ala

115

120

125

Ser Val Val

Cys

Leu

Leu

Asn

Asn

Phe

Tyr

Pro

130 135 <2 10> 62 <21 l> 100 <212> PRT io <213> Human

- 74CZ 302706 B6 <400? 62

Asp lle Val Met Thr Gin Ser Pro Leu Ser

Leu Pro Val Thr

Pro 15

Gly

1

5

10

Glu Pro Ala

Ser

lle

Ser

Cys

Arg

Ser

Ser

Gin

Ser

Leu

Leu

His

Ser

20

25

30

Asn Gly Tyr

Asn

Tyr

Leu

Asp

Trp

Tyr

Leu

Gin

Lys

Pro

Gly

Gin

Ser

35

40

45

Pro Gin Leu

Leu

lle

Tyr

Leu

Gly

Ser

Asn

Arg

Ala

Ser

Gly

Val

Pro

50

55

60

Asp Arg Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

Lys

lle

65

70

75

80

Ser Arg Val

Glu

Ala

Glu

Asp

Val

Gly

Val

Tyr

Tyr

Cys

Met

Gin

Ala

85

90

95

Leu Gin Thr

Pro

100

<210> 63 <211> 133 <212> PRT <213> Human

<400>

63

Pro Gly Glu

Pro

Ala

Ser

lle

Ser

Cys

Arg

Ser

Ser

Gin

Ser

Leu

Leu

1

5

10

15

His Ser Asn

Gly

Tyr

Asn

Tyr

Leu

Asp

Trp

Tyr

Leu

Gin

Lys

Pro

Gly

20

25

30

Gin Ser Pro

Gin

Leu

Leu

lle

Tyr

Leu

Gly

Ser

Asn

Arg

Ala

Ser

Gly

35

40

45

Val Pro Asp

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

ASp

Phe

Thr

Leu

50

55

60

Lys Leu Ser

Arg

Val

Glu

Ala

Glu

Asp

Val

Gly

Val

Tyr

Tyr

Cys

Met

65

70

75

80

Gin Ala Leu

Gin

Thr

Pro

Leu

Thr

Phe

Gly

Gly

Gly

Thr

Lys

Val

Glu

85

90

95

lle Lys Arg

Thr

Val

Ala

Ala

Pro

Ser

Val

Phe

lle

Phe

Pro

Pro

Ser

100

105

110

Asp Glu Gin

Leu

Lys

Ser

Gly

Thr

Ala

Ser

Val

Val

Cys

Leu

Leu

Asn

115

120

125

Asn Phe Tyr

Pro

Arg

130

<210> 64 <211> 20 <212> PRT <213> Human

<400>

64

Asp lle Gin

Met

Thr

Gin

Ser

Pro

Ser

Ser

Leu

Ser

Ala

Ser

Val

Gly

1 Asp Arg Val

Thr

5

10

15

20

<210> 65 <211> 20 <212> PRT <213> Human

<400>

65

Glu lle Val

Leu

Thr

Gin

Ser

Pro

Gly

Thr

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

Gly

S 10 15

Glu Arg Ala Thr

- 75 CZ 302706 B6 <2 1 ()> 66 <2 1 I > 20 <2 12> PRT <213> Human

	<400>	66
Glu	Ile	Val	Leu	Thr	Gin Ser Pro Gly Thr	Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1				5	10	15
Glu	Arg	Ala	Thr
			20

<210> 67 io <2Il>20 <212> PRT <213> Human

	<400>	67
Asp	Ile	Gin	Met	Thr Gin Ser	Pro Ser Ser Val	Ser Ala Ser Val
1				5	10	15
Asp	Arg	Val	Thr
			20

<210> 68 <21l>20 <2 12> PRT <2 13> Human <400> 68

Thr Gly Glu Phe Val Leu Thr Gin Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser 15 10 15

Pro Gly Glu Arg 20 <210> 69 <2 I i> 20 <212>PRT <213> Human <400> 69

Glu Phe Val Leu Thr Gin Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 15 10 15

Glu Arg Ala Thr 20 <210> 70 <21 l>20 <212> PRT <213> Human <400> 70

Glu Ile Val Leu Thr Gin Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 15 10 is

Glu Arg Ala Thr

20 <210> 71 <211> 20 <212> PRT

- 76 CZ 302706 B6 <213> Human <400> 71

Glu Ile Val Leu Thr Gin Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 15 10 15

Glu Arg Ala Thr 20 <210> 72 <211> 20 <212> PRT <213> Human

	<400>	72
Glu	Ile Val	Leu	Thr	Gin Ser Pro Oly Thr	Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1			5	10	15
Glu	Arg Ala	Thr
		20

<210> 73 <211> 20 <212> PRT <213> Human <40O> 73

Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gin Pro Gly Arg Ser 15 10 15

Leu Arg Leu Ser 20 <21O> 74 20 <211>5 <212> PRT <213> Human <400> 74

Pro Glu Val Gin Phe 1 5 <210> 75 <211> 20 <212> PRT <213> Human <400> 75 val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gin Pro Gly Arg Ser 15 10 15

Leu Arg Leu Ser 20 <210> 76 <211> 10 <212> PRT <213> Human <400> 76

Pro Glu Val Gin Phe Asn Trp Tyr Val Asp 15 10

- 77 CZ 302706 B6 <210> 77 <211> 17 <212> PRT <213> Human <400> 77

Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gin Pro Gly Arg Ser 15 10 15

Leu <210> 78 K) <211>8 <212> PRT <213> Human <400> 78

Pro Glu Val Gin Phe Asn Trp Tyr 1 5 <210> 79 <211> 20 <212> PRT <213> Human <400> 79

Glu Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15

Ser Leu Arg Leu 20 <210> 80 <21I> 20 <212>PRT <213> Human <400> 80

Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gin Pro Gly Arg Ser 15 10 15

Leu Arg Leu Ser 20 <210> 81 <211> 10 <212> PRT <213> Human <400> 81

Pro Glu Val Gin Phe Asn Trp Tyr Val Asp i 5 10 <210> 82 <211> 20 <212>PRT <213>Human

-78CZ 302706 Bó <400> 82

Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gin Pro Gly Arg Ser 15 10 15

Leu Arg Leu Ser <210> 83 <211>9 <212> PRT <213> Human <400> 83

Pro Glu Val Gin Phe Asn Trp Tyr Val 1 5 io <210>84 <211> 20 <212> PRT <213> Human <400> 84

Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gin Pro Gly Arg Ser 15 10 15

Leu Arg Leu Ser <210> 85

2117-6 <212> PRT <213> Human <400> as

Pro Glu Val Gin Phe Asn 1 5 <210> 86 25 <211>20 <212> PRT <213> Human

	<400>	86
Val	Gin Leu	Val	Glu	Ser Gly Gly Gly Val	Val Glu Pro Gly Arg
1			5	10	15
Leu	Arg Leu	Ser
		20

<210> 87 <211> 10 <212> PRT <213> Human <400> 87

Pro Glu Val Gin Phe Asn Trp Tyr Val Asp 15 10 <210> 88 <211>8

- 79 CZ 302706 B6 <212> PRT <213> Human <400> 88

Asp Ile Gin Met Thr Gin Ser Pro 1 5 <210> 89 <211>8 <212> PRT <213> Human <40O> 89

Glu Ile Val Leu Thr Gin. Ser Pro 1 5 <210> 90 <211> 8 <212> PRT <213> Human <400> 90

Glu Ile Val Leu Thr Gin Ser Pro l 5 <210>91 <211> 10 <212> PRT <213> Human <400> 91

Thr Gly Glu Phe val Leu Thr Gin Ser Pro 15 10 <210 92 <211>8 <212> PRT <213> Human <400> 92

Glu Phe Val Leu Thr Gin Ser Pro 1 s <210 93 <211> 8 <212> PRT <213> Human <400> 93

Glu Ile Val Leu Thr Gin Ser Pro <210 94 <211>8 <212> PRT

4> <213> Human

-80CZ 302706 B6 <400> 94

Glu Ile Val Leu Thr Gin Ser Pro 1 5 <210> 95 <211> 463 <212> PRT <213> Human

<400>

95

Met

Glu

Phe

Gly

Leu

Ser

Trp

Val

Phe

Leu

Val

Ala

Leu

Leu

Arg

Gly

1

5

10

15

Val

Gin

Cys

Gin

Val

Gin

Leu

Val

Glu

Ser

Gly

Gly

Gly

Val

Val

Gin

20

25

30

Pro

Gly

Arg

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Val

Ala

Ser

Gly

Phe

Thr

Phe

35

40

45

Ser

Ser

His

Gly

Met

His

Trp

Val

Arg

Gin

Ala

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu

50 Trp

Val

Ala

Val

Ile

55 Trp

Tyr

Asp

Gly

Arg

60 Asn

Lys

Tyr

Tyr

Ala

65 Asp

Ser

Val

Lys

Gly

70 Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

75 Arg

Asp

Asn

Ser

Lys

80 Asn

Thr

Leu

Phe

Leu

85 Gin

Met

Asn

Ser

Leu

90 Arg

Ala

Glu

Asp

Thr

95 Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

100 Ala

Arg

Gly

Gly

His

105 Phe

Gly

Pro

Phe

Asp

110 Tyr

Trp

Gly

Gin

Gly

115 Thr

Leu

Val

Thr

Val

120 Ser

Ser

Ala

Ser

Thr

125 Lys

Gly

Pro

Ser

val

130 Phe

Pro

Leu

Ala

Pro

135 cys

Ser

Arg

Ser

Thr

140 Ser

Glu

Ser

Thr

Ala

145 Ala

Leu

Gly

Cys

Leu

150 Val

Lys

Asp

Tyr

Phe

155 Pro

Glu

Pro

Val

Thr

160 Val

Ser

Trp

Asn

Ser

165 Gly

Ala

Leu

Thr

Ser

170 Gly

Val

His

Thr

Phe

175 Pro

Ala

Val

Leu

Gin

180 Ser

Ser

Gly

Leu

Tyr

185 Ser

Leu

Ser

Ser

val

190 val

Thr

Val

Pro

Ser

195 Ser

Asn

Phe

Gly

Thr

200 Gin

Thr

Tyr

Thr

Cys

205 Asn

Val

Asp

His

Lys

210 Pro

Ser

Asn

Thr

Lys

215 Val

Asp

Lys

Thr

val

220 Glu

Arg

Lys

Cys

Cys

225 Val

Glu

Cys

Pro

Pro

230 Cys

Pro

Ala

Pro

Pro

235 Val

Ala

Gly

Pro

Ser

240 Val

Phe

Leu

Phe

Pro

245 Pro

Lys

Pro

Lys

Asp

250 Thr

Leu

Met

Ile

Ser

255 Arg

Thr

Pro

Glu

Val

260 Thr

Cys

Val

Val

Val

265 Asp

Val

Ser

His

Glu

270 Asp

Pro

Glu

Val

Gin

275 Phe

Asn

Trp

Tyr

Val

280 Asp

Gly

Val

Glu

Val

285 His

Asn

Ala

Lys

Thr

290 Lys

Pro

Arg

Olu

Glu

295 Gin

Phe

Asn

Ser

Thr

300 Phe

Arg

Val

Val

Ser

305 val

Leu

Thr

Val

Val

310 His

Gin

Asp

Trp

Leu

315 Asn

Gly

Lys

Glu

Tyr

320 Lys

Cys

Lys

Val

Ser

325 Asn

Lys

Gly

Leu

Pro

330 Ala

Pro

Ile

Glu

Lys

335 Thr

Ile

Ser

Lys

Thr

340 Lys

Gly

Gin

Pro

Arg

345 Glu

Pro

Gin

Val

Tyr

350 Thr

Leu

Pro

Pro

Ser

355 Arg

Glu

Glu

Met

Thr

360 Lys

Asn

Gin

Val

Ser

365 Leu

Thr

Cys

Leu

Val

370 Lys

Gly

Phe

Tyr

Pro

375 Ser

Asp

Ile

Ala

Val

380 Glu

Trp

Glu

Ser

Asn

385

390

395

400

-8! CZ 302706 B6

Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser 405 410 415

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 420 425 430

Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 435 440 445

His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 450 455 460

10> 96 1 1> 463 12> PRT <213> Human <400> 96

Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Leu Leu Arg Gly 15 10 15

Val Gin Cys Gin Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gin

Pro	Gly	Arg	20 Ser
Ser	Ser	35 His	Gly
Glu	50 Trp	Val	Ala
65 Asp	Ser	Val	Lys
Thr	Leu	Phe	Leu
Tyr	Tyr	Cys	100 Ala
Gin	Gly	115 Thr	Leu
Val	130 Phe	Pro	Leu
145 Ala	Leu	Gly	Cys
Ser	Trp	Asn	Ser
Val	Leu	Gin	180 Ser
Pro	Ser	195 Ser	Asn
Lys	210 Pro	Ser	Asn
225 Val	Glu	Cys	Pro
Phe	Leu	Phe	Pro
Pro	Glu	Val	260 Thr
Val	Gin	2*75 Phe	Asn
Thr	290 Lys	Pro	Arg
305 Val	Leu	Thr	val
Cys	Lys	val	Ser
Ser	Lys	Thr	340 Lys
Pro	Ser	355 Arg	Glu
	370

Leu	Arg	Leu	Ser 40
Met	His	Trp 55	Val
Val	Ile 70	Trp	Tyr
Gly Arg 85	Phe	Thr
Gin	Met	Asn	Ser
Arg	Gly	Gly	His 120
Val	Thr	Val 135	Ser
Ala	Pro 150	Cys	Ser
Leu 165	Val	Lys	Asp
Gly	Ala	Leu	Thr
Ser	Gly	Leu	Tyr 200
Phe	Gly	Thr 215	Gin
Thr	Lys 230	Val	Asp
Pro 245	Cys	Pro	Ala
Pro	Lys	Pro	Lys
Cys	Val	Val	Val 280
Trp	Tyr	Val 295	Asp
Glu	Glu 310	Gin	Phe
Val 325	His	Gin	Asp
Asn	Lys	Gly	Leu
Gly	Gin	Pro	Arg 360
Glu	Met	Thr 375	Lys

25 Cys	Val	Ala	Ser
Arg	Gin	Ala	Pro 60
Asp	Gly	Arg 75	Asn
Ile	Ser 90	Arg	Asp
Leu	Arg	Ala	Glu
105
Phe	Gly	Pro	Phe
Ser	Ala	Ser	Thr 140
Arg	Ser	Thr 155	Ser
Tyr	Phe 170	Pro	Glu
Ser	Gly	val	His
185
Ser	Leu	Ser	Ser
Thr	Tyr	Thr	Cys 220
Lys	Thr	Val 235	Glu
Pro	Pro 250	Val	Ala
Asp	Thr	Leu	Met
265
Asp	Val	Ser	HiS
Gly	Val	Glu	Val 300
Gin	Ser	Thr 315	Phe
Trp	Leu 330	Asn	Gly
Pro	Ala	Pro	Ile
345
Glu	Pro	Gin	Val
Asn	Gin	Val	Ser 380

Gly	30 Phe	Thr	Phe
45 Gly	Lys	Gly	Leu
Lys	Tyr	Tyr	Ala
Asn	Ser	Lys	80 Asn
Asp	Thr	95 Ala	Val
Asp	110 Tyr	Trp	Gly
125 Lys	Gly	Pro	Ser
Glu	Ser	Thr	Ala
Pro	Val	Thr	160 Val
Thr	Phe	175 Pro	Ala
Val	190 Val	Thr	Val
205 Asn	Val	Asp	His
Arg	Lys	Cys	Cys
Gly	Pro	Ser	240 Val
Ile	Ser	255 Arg	Thr
Glu	270 Asp	Pro	Glu
285 His	Asn	Ala	Lys
Arg	Val	Val	Ser
Lys	Glu	Tyr	320 Lys
Glu	Lys	335 Thr	Ile
Tyr	350 Thr	Leu	Pro
365 Leu	Thr	Cys	Leu

82CZ 302706 B6

Val

Lys

Gly

Phe

Tyr

Pro

ser

Asp

Ile

Ala

Val

Glu

Trp

Glu

Ser

Asn

385

390

395

400

Gly

Gin.

Pro

Glu

Asn

Asn

Tyr

Lys

Thr

Thr

Pro

Pro

Met

Leu

Asp

Ser

405

410

415

Asp

Gly

Ser

Phe

Phe

Len

Tyr

Ser

Lys

Leu

Thr

Val

Asp

Lys

Ser

Arg

420

425

430

Trp

Gin

Gin

Gly

Asn

Val

Phe

Ser

Cys

Ser

Val

Met

His

Glu

Ala

Leu

435

440

445

His

Asn

His

Tyr

Thr

Gin

Lys

Ser

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

Gly

Lys

450

455

460

<210> 97 <211> 235 <212> PRT <213> Human

Met

<400> Glu Thr

97 Pro

Ala

Gin

Leu

Leu

Phe

Leu

Leu

Leu

Leu

Trp

Leu

Pro

1 Asp

Thr

Thr

Gly

5 Glu

Ile

Val

Leu

Thr

10 Gin

Ser

Pro

Gly

Thr

15 Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

20 Gly

Glu

Arg

Ala

Thr

25 Leu

Ser

Cys

Arg

Ala

30 Ser

Gin

Ser

Ile

Ser

35 Ser

Ser

Phe

Leu

Ala

40 Trp

Tyr

Gin

Gin

Arg

45 Pro

Gly

Gin

Ala

Pro

50 Arg

Leu

Leu

Ile

Tyr

55 Gly

Ala

Ser

Ser

Arg

60 Ala

Thr

Gly

Ile

Pro

65 Asp

Arg

Phe

Ser

Gly

70 ser

Gly

Ser

Gly

Thr

75 Asp

Phe

Thr

Leu

Thr

80 Ile

Ser

Arg

Leu

Glu

85 Pro

Glu

Asp

Phe

Ala

90 Val

Tyr

Tyr

Cys

Gin

95 Gin

Tyr

Gly

Thr

Ser

100 Pro

Trp

Thr

Phe

Gly

105 Gin

Gly

Thr

Lys

Val

110 Glu

Ile

Lys

Arg

Thr

115 Val

Ala

Ala

Pro

Ser

120 Val

Phe

Ile

Phe

Pro

125 Pro

Ser

Asp

Glu

Gin

130 Leu

Lys

Ser

Gly

Thr

135 Ala

Ser

Val

Val

Cys

140 Leu

Leu

Asn

Asn

Phe

145 Tyr

Pro

Arg

GlU

Ala

ISO Lys

Val

Gin

Trp

Lys

155 Val

Asp

Asn

Ala

Leu

160 Gin

Ser

Gly

Asn

Ser

165 Gin

Glu

Ser

Val

Thr

170 Glu

Gin

Asp

Ser

Lys

175 Asp

Ser

Thr

Tyr

Ser

180 Leu

Ser

Ser

Thr

Leu

185 Thr

Leu

Ser

Lys

Ala

190 Asp

Tyr

Glu

Lys

His

195 Lys

Val

Tyr

Ala

Cys

200 Glu

Val

Thr

His

Gin

205 Gly

Leu

Ser

Ser

Pro 225

210 Val

Thr

Lys

Ser

Phe 230

215 Asn

Arg

Gly

Glu

Cys 235

220

io <210>98 <211> 464 <212> PRT <213> Human

Met

<400> Glu Phe

98 Gly

Leu

Ser

Trp

Val

Phe

Leu

Val

Ala

Leu

Leu

Arg

Gly

1 Val

Gin

Cys

Gin

5 Val

Gin

Leu

Val

Glu

10 Ser

Gly

Gly

Gly

Val

15 Val

Gin

Pro

Gly

Arg

20 Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

25 Cys

Thr

Ala

Ser

Gly

30 Phe

Thr

Phe

Ser

Asn

35 Tyr

Gly

Met

His

Trp

40 Val

Arg

Gin

Ala

Pro

45 Gly

Lys

Gly

Leu

Glu

SO Trp

Val

Ala

Val

Ile

55 Trp

Tyr

Asp

Gly

Ser

60 Asn

Lys

His

Tyr

Gly

65

70

75

80

- 83 15

Asp

Ser

Val

Lys

Gly 85

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser 90

Ser

Aďp

Asn

Ser

Lys 95

Asn

Thr

Leu

Tyr

Leu 100

Gin

Met

Asn

Ser

Leu 105

Arg

Ala

Glu

Asp

Thr 110

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys 115

Ala

Arg

Gly

Glu

Arg 120

Leu

Gly

Ser

Tyr

Phe 125

Asp

Tyr

Trp

Gly

Gin 130

Gly

Thr

Leu

Val

Thr 135

Val

Ser

Ser

Ala

Ser 140

Thr

Lys

Gly

Pro

Ser 145

val

Phe

Pro

Leu

Ala 150

Pro

Cys

Ser

Arg

Ser 155

Thr

Ser

Glu

Ser

Thr 160

Ala

Ala

Leu

Gly

Cys 165

Leu

Val

Lys

Asp

Tyr 170

Phe

Pro

Glu

Pro

Val 175

Thr

Val

Ser

Trp

Asn 180

Ser

Gly

Ala

Leu

Thr 185

Ser

Gly

Val

His

Thr 190

Phe

Pro

Ala

Val

Leu 195

Gin

Ser

Ser

Gly

Leu 200

Tyr

Ser

Leu

Ser

Ser 205

Val

Val

Thr

Val

Pro 210

Ser

Ser

Asn

Phe

Gly 215

Thr

Gin

Thr

Tyr

Thr 220

Cys

Asn

Val

Asp

His 225

Lys

Pro

Ser

Asn

Thr 230

Lys

Val

Asp

Lys

Thr 235

Val

Glu

Arg

Lys

Cys 240

Cys

Val

Glu

Cys

Pro 245

Pro

Cys

Pro

Ala

Pro 250

Pro

Val

Ala

Gly

Pro 255

Ser

Val

Phe

Leu

Phe 260

Pro

Pro

Lys

Pro

Lys 265

Asp

Thr

Leu

Met

Ile 270

Ser

Arg

Thr

Pro

Glu 27 5

Val

Thr

Cys

Val

Val 280

Val

Asp

Val

Ser

His 285

Glu

Asp

Pro

Glu

Val 290

Gin

Phe

Asn

Trp

Tyr 2 95

Val

Asp

Gly

Val

Glu 300

Val

His

Asn

Ala

Lys 305

Thr

Lys

Pro

Arg

Glu 310

Glu

Gin

Phe

Asn

Ser 315

Thr

Phe

Arg

Val

Val 320

Ser

Val

Leu

Thr

Val 325

Val

His

Gin

Asp

Trp 330

Leu

Asn

Gly

Lys

Glu 335

Tyr

Lys

Cys

Lys

Val 340

Ser

Asn

Lys

Gly

Leu 345

Pro

Ala

Pro

Ile

Glu 350

Lys

Thr

Ile

Ser

Lys 355

Thr

Lys

Gly

Gin

Pro 360

Arg

Glu

Pro

Gin

Val 365

Tyr

Thr

Leu

Pro

Pro 370

Ser

Arg

Glu

Glu

Met 375

Thr

Lys

Asn

Gin

val 380

Ser

Leu

Thr

Cys

Leu 385

val

Lys

Gly

Phe

Tyr 390

Pro

Ser

Asp

Ile

Ala 395

Val

Glu

Trp

Glu

Ser 400

Asn

Gly

Gin

Pro

Glu 405

Asn

Asn

Tyr

Lys

Thr 410

Thr

Pro

Pro

Met

Leu 415

Asp

Ser

Asp

Gly

Ser 420

Phe

Phe

Leu

Tyr

Ser 425

Lys

Leu

Thr

Val

Asp 430

Lys

Ser

Arg

Trp

Gin 435

Gin

Gly

Asn

Val

Phe 440

Ser

Cys

Ser

Val

Met 445

His

Glu

Ala

Leu

His 450

Asn

His

Tyr

Thr

Gin 455

Lys

Ser

Leu

Ser

Leu 460

Ser

Pro

Gly

Lys

<210> 99 5 <211>233 <212> PRT <213> Human

- 84 CZ 302706 B6 <400> 99

Met

GlU

Thr

Pro

Ala

Gin

Leu

Leu

Phe

Leu

Leu

Leu

Leu

Trp

Leu

Pro

1

5

10

IS

Asp

Thr

Thr

Gly

Glu

Ile

val

Leu

Thr

Gin

Ser

Pro

Gly

Thr

Leu

Ser

20

25

30

Leu

Ser

Pro

Gly

Glu

Arg

Ala

Thr

Leu

Ser

cys

Arg

Thr

Ser

Val

Ser

35

40

45

Ser

Ser

Tyr

Leu

Ala

Trp

Tyr

Gin

Gin

Lys

Pro

Gly

Gin

Ala

Pro

Arg

50

55

60

Leu

Leu

Ile

Tyr

Gly

Ala

Ser

Ser

Arg

Ala

Thr

Gly

Ile

Pro

Asp

Arg

65

70

75

80

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

Arg

85

90

95

Leu

Glu

Pro

Glu

ASp

Phe

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

Gin

Gin

Tyr Gly

Ile

100

105

110

Ser

Pro

Phe

Thr

Phe

Gly

Gly

Gly

Thr

Lys

Val

Glu

Ile

Lys

Arg

Thr

115

120

125

Val

Ala

Ala

Pro

Ser

Val

Phe

Ile

Phe

Pro

Pro

Ser

Asp

Glu

Gin

Leu

130

135

140

Lys

Ser

Gly

Thr

Ala

Ser

Val

Val

Cys

Leu

Leu

Asn

Asn

Phe

Tyr

Pro

145

150

155

160

Arg

Glu

Ala

Lye

Val

Gin

Trp

Lys

val

Asp

Asn

Ala

Leu

Gin

Ser

Gly

165

170

175

Asn

Ser

Gin

Glu

Ser

Val

Thr

Glu

Gin

Asp

Ser

Lys

Asp

Ser

Thr

Tyr

180

185

190

Ser

Leu

Ser

Ser

Thr

Leu

Thr

Leu

Ser

Lys

Ala

Asp

Tyr

Glu

Lys

His

195

200

205

Lys

Val

Tyr

Ala

Cys

Glu

Val

Thr

His

Gin

Gly

Leu

Ser

Ser

Pro

Val

210

215

220

Thr

Lys

Ser

Phe

Asn

Arg

Gly

Glu

Cys

225

230

<210> 100 5 <211>463 <212> PRT <213> Human <400> 100

Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Leu Leu Arg Gly i s 10 15

Val Gin Cys Gin Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Glu 20 25 30

Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45

Ser Ser Tyr Gly Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu

55 60

Glu Trp Val Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys His Tyr Ala

70 75 80

Asp Ser Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn

90 95

Thr Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val

100 105 110

Tyr Tyr Cys Ala Arg Ala Gly Leu Leu Gly Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly

115 120 125

Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

130 135 140

Val Phe Pro Leu Ala pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala

145 150 155 160

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

165 170 175

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

180 185 190

-85CZ 302706 B6

Val Leu Gin Ser

Ser

Gly

Leu

Tyr Ser Leu Ser Ser Val

Val

Thr

Val

195

200

205

Pro

Ser

Ser

Asn

Phe

Gly

Thr

Gin

Thr

Tyr

Thr

Cys

Asn

Val

Asp

His

210

215

220

Lys

Pro

Ser

Asn

Thr

Lys

Val

Asp

Lys

Thr

Val

Glu

Arg

Lys

Cys

Cys

225

230

235

240

Val

Glu

Cys

Pro

Pro

Cys

Pro

Ala

Pro

Pro

Val

Ala

Gly

Pro

Ser

Val

245

250

255

Phe

Leu

Phe

Pro

Pro

Lys

Pro

Lys

Asp

Thr

Leu

Met

Ile

Ser

Arg

Thr

260

265

270

Pro

Glu

Val

Thr

Cys

Val

Val

Val

Asp

Val

Ser

His

Glu

ASp

Pro

Glu

275

280

285

val

Gin

Phe

Asn

Trp

Tyr

Val

Asp

Gly

val

Glu

Val

His

Asn

Ala

Lys

290

295

300

Thr

Lys

Pro

Arg

Glu

Glu

Gin

Phe

Asn

Ser

Thr

Phe

Arg

Val

Val

Ser

305

310

315

320

Val

Leu

Thr

val

Val

His

Gin

Asp

Trp

Leu

Asn

Gly

Lys

Glu

Tyr

Lys

325

330

335

Cys

Lys

Val

Ser

Asn

Lys

Gly

Leu

Pro

Ala

Pro

Ile

Glu

Lys

Thr

Ile

340

345

350

ser

Lys

Thr

Lys

Gly

Gin

Pro

Arg

Glu

Pro

Gin

Val

Tyr

Thr

Leu

Pro

355

360

365

Pro

Ser

Arg

Glu

Glu

Met

Thr

Lys

Asn

Gin

Val

Ser

Leu

Thr

Cys

Leu

370

375

380

Val

Lys

Gly

Phe

Tyr

Pro

Ser

Asp

Ile

Ala

Val

Glu

Trp

Glu

Ser

Asn

385

390

395

400

Gly

Gin

Pro

Glu

Asn

Asn

Tyr

Lys

Thr

Thr

Pro

Pro

Met

Leu

Asp

Ser

405

410

415

Asp

Gly

Ser

Phe

Phe

Leu

Tyr

Ser

Lys

Leu

Thr

Val

Asp

Lys

Ser

Arg

420

425

430

Trp

Gin

Gin

Gly

Asn

Val

Phe

Ser

Cys

Ser

val

Met

His

Glu

Ala

Leu

435

440

445

His

Asn

His

Tyr

Thr

Gin

Lys

Ser

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

Gly

Lys

450

455

460

<210> 101 <211> 234 <212> PRT <213> Human

<400>

101

Met 1

Glu

Thr

Pro

Ala 5

Gin

Leu

Leu

Phe

Leu 10

Leu

Leu

Leu

Trp

Leu 15

Pro

Asp

Thr

Thr

Gly 20

Glu

Ile

val

Leu

Thr 25

Gin

Ser

Pro

Gly

Thr 30

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro 35

Gly

Glu

Arg

Ala

Thr 40

Leu

Ser

Cys

Arg

Ala 45

Ser

Gin

Ser

Val

Ser 50

ser

Tyr

Leu

Ala

Trp 55

Tyr

Gin

Gin

Lys

Pro 60

Gly

Gin

Ala

Pro

Arg 65

Pro

Leu

Ile

Tyr

Gly 70

Val

Ser

Ser

Arg

Ala 75

Thr

Gly

Ile

Pro

Asp 80

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser 85

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp 90

Phe

Thr

Leu

Thr

Ile 95

Ser

Arg

Leu

Glu

Pro 100

Glu

Asp

Phe

Ala

Val 105

Tyr

Tyr

Cys

Gin

Gin 110

Tyr

Gly

Ile

Ser

Pro 115

Phe

Thr

Phe

Gly

Pro 120

Gly

Thr

Lys

val

Asp 125

Ile

Lys

Arg

Thr

Val 130

Ala

Ala

Pro

Ser

Val 135

Phe

Ile

Phe

Pro

Pro 140

Ser

Asp

Glu

Gin

Leu 145

Lys

Ser

Gly

Thr

Ala 150

Ser

Val

Val

Cys

Leu 155

Leu

Asn

Asn

Phe

Tyr 160

Pro

Arg

Glu

Ala

Lys 165

Val

Gin

Trp

Lys

Val 170

Asp

Asn

Ala

Leu

Gin 175

Ser

-86CZ 302706 B6

Gly Asn Ser Gin

Glu Ser Val Thr

Glu Gin Asp Ser Lys Asp

Ser Thr

180

185

190

Tyr

Ser

Leu

Ser

Ser

Thr

Leu

Thr

Leu

Ser

Lys

Ala

Asp

Tyr

Glu

Lys

195

200

205

His

Lya

Val

Tyr

Ala

Cys

Glu

Val

Thr

His

Gin

Gly

Leu

Ser

Ser

Pro

210

215

220

Val

Thr

Lys

Ser

Phe

Asn

Arg Gly

Glu

Cys

225

230

<210> 102 <211> 451 <2I2>PRT <213> Human <400> 102

Gin Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gin Pro Gly Arg

1

1

5

10

15

Ser

Leu

Arg

Leu 20

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser 25

Gly

Phe

Thr

Phe

Ser 30

Ser

Tyr

Gly

Met

His 35

Trp

Val

Arg

Gin

Ala 40

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu 45

Glu

Trp

Val

Ala

Val 50

Ile

Trp

Tyr

Asp

Gly 55

Ser

Asn

Lys

Tyr

Tyr 60

Ala

Asp

Ser

Val

Lys 65

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile 70

Ser

Arg

Asp

Asn

Ser 75

Lys

Asn

Thr

Leu

Tyr 80

Leu

Gin

Met

Asn

Ser 85

Leu

Arg

Ala

Glu

Asp 90

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr 95

Cys

Ala

Arg

Asp

Pro 100

Arg

Gly

Ala

Thr

Leu 105

Tyr

Tyr

Tyr

Tyr

Tyr Gly 110

Met

Asp

Val

Trp 115

Gly

Gin

Gly

Thr

Thr 120

Val

Thr

Val

Ser

Ser 125

Ala

Ser

Thr

Lys

Gly 130

Pro

Ser

Val

Phe

Pro 135

Leu

Ala

Pro

cys

Ser 140

Arg

Ser

Thr

Ser

Glu 145

Ser

Thr

Ala

Ala

Leu 150

Gly

Cys

Leu

Val

Lys 155

Asp

Tyr

Phe

Pro

Glu 160

Pro

Val

Thr

Val

Ser 165

Trp

Asn

Ser

Gly

Ala 170

Leu

Thr

ser

Gly

Val 175

HÍS

Thr

Phe

Pro

Ala 180

val

Leu

Gin

Ser

Ser 185

Gly

Leu

Tyr

Ser

Leu 190

Ser

Ser

Val

Val

Thr 195

Val

Pro

Ser

Ser

Asn 200

Phe

Gly

Thr

Gin

Thr 205

Tyr

Thr

Cys

Asn

Val 210

Asp

His

Lys

Pro

Ser 215

Asn

Thr

Lys

Val

Asp 220

Lys

Thr

Val

Glu

Arg 225

Lys

Cys

Cys

Val

Glu 230

Cys

Pro

Pro

Cys

Pro 235

Ala

Pro

Pro

Val

Ala 240

Gly

Pro

Ser

Val

Phe 245

Leu

Phe

Pro

Pro

Lys 250

Pro

Lys

Asp

Thr

Leu 255

Met

Ile

Ser

Arg

Thr 260

Pro

Glu

Val

Thr

Cys 265

Val

Val

Val

Asp

Val 270

Ser

His

Glu

Asp

Pro 275

Glu

Val

Gin

Phe

Asn 280

Trp

Tyr

Val

ASp

Gly 285

Val

Glu

Val

His

Asn 290

Ala

Lys

Thr

Lys

Pro 295

Arg

Glu

Glu

Gin

Phe 300

Asn

Ser

Thr

Phe

Arg 305

Val

Val

Ser

Val

Leu 310

Thr

Val

Val

His

Gin 315

Asp

Trp

Leu

Asn

Gly 320

Lys

Glu

Tyr

Lys

Cys 325

Lys

Val

Ser

Asn

Lys 330

Gly

Leu

Pro

Ala

Pro 335

Ile

Glu

Lys

Thr

Ile 340

Ser

Lys

Thr

Lys

Gly 345

Gin

Pro

Arg

Glu

Pro 350

Gin

Val

Tyr

Thr

Leu 355

Pro

Pro

Ser

Arg

Glu 360

Glu

Met

Thr

Lys

Asn 365

Gin

Val

Ser

87CZ 302706 B6

Leu

Thr

Cys

Leu

Val

Lys

Gly

Phe

Tyr

Pro

Ser

Asp

lle

Ala

Val

Glu

370

375

380

Trp

Glu

Ser

Asn

Gly

Gin

Pro

Glu

Asn

Asn

Tyr

Lys

Thr

Thr

Pro

Pro

385

390

395

400

Met

Leu

Asp

Ser

Asp

Gly

Ser

Phe

Phe

Leu

Tyr

Ser

Lys

Leu

Thr

Val

405

410

415

Asp

Lys

Ser

Arg

Trp

Gin

Gin

Gly

Asn

Val

Phe

Ser

Cys

Ser

val

Met

420

425

430

His

Glu

Ala

Leu

His

Asn

His

Tyr

Thr

Gin

Lys

Ser

Leu

Ser

Leu

Ser

435

440

445

Pro

Gly

Lya

450 <210> 103

<211>214 <212> PRT <213> Human

Asp

<400> lle Gin

103 Met

Thr

Gin

Ser

Pro

Ser

Ser

Leu

Ser

Ala

Ser

Val

Gly

1 Asp

Arg

Val

Thr

5 lle

Thr

Cys

Arg

Ala

10 Ser

Gin

Ser

lle

Asn

15 Ser

Tyr

Leu

Asp

Trp

20 Tyr

Gin

Gin

Lys

Pro

25 Gly

Lys

Ala

Pro

Lys

30 Leu

Leu

lle

Tyr

Ala

35 Ala

Ser

Ser

Leu

Gin

40 Ser

Gly

Val

Pro

Ser

45 Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

50 Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

55 Phe

Thr

Leu

Thr

lle

60 Ser

Ser

Leu

Gin

Pro

65 Glu

Asp

Phe

Ala

Thr

70 Tyr

Tyr

Cys

Gin

Gin

75 Tyr

Tyr

Ser

Thr

Pro

80 Phe

Thr

Phe

Gly

Pro

85 Gly

Thr

Lys

Val

Glu

90 lle

Lys

Arg

Thr

Val

95 Ala

Ala

Pro

Ser

Val

100 Phe

lle

Phe

Pro

Pro

105 Ser

Asp

Glu

Gin

Leu

110 Lys

Ser

Gly

Thr

Ala

115 Ser

Val

Val

Cys

Leu

120 Leu

Asn

Asn

Phe

Tyr

125 Pro

Arg

Glu

Ala

Lys

130 Val

Gin

Trp

Lys

Val

135 Asp

Asn

Ala

Leu

Gin

140 Ser

Gly

Asn

Ser

Gin

145 Glu

Ser

Val

Thr

Glu

150 Gin

Asp

Ser

Lys

Asp

155 Ser

Thr

Tyr

Ser

Leu

160 Ser

Ser

Thr

Leu

Thr

165 Leu

Ser

Lys

Ala

Asp

170 Tyr

Glu

Lys

His

Lys

175 Val

Tyr

Ala

Cys

Glu

180 Val

Thr

His

Gin

Gly

185 Leu

Ser

Ser

Pro

Val

190 Thr

Lys

Ser

Phe

Asn

195 Arg

Gly

Glu

Cys

200

205

210 io <210> 104 <211> 22 <212> DNA <213> Human <400> 104 caggtgcagc tggagcagtc gg <210> 105 <211> 24 <212> DNA zn <213> Human

- 88 22 <400> 105 gctgagggag tagagtcctg agga 24 <210> 106 <211> 49 <212>DNA <213> Human <400> 106 tatctaagct tctagactcg accgccacca tggagtttgg gctgagctg 49 ío <210> 107 <211> 46 <212> DNA <213> Human <400> 107 ttctctgatc agaattccta tcatttaccc ggagacaggg agagct 46 <210> 108 <211> 9 <212>DNA <213> Human <400> 108 accgccacc 9 <210> 109 <211>45 <212» DNA <213> Human <400> 109 ₃₀ tcttcaagct tgcccgggcc cgccaccatg gaaaccccag cgcag 45 <210> 110 <211> 43 <212> DNA <213>Human <400> 110 ttctttgatc agaattctca ctaacactct cccctgttga agc 43 <210> 111 <211>48 <212>DNA <213> Human <400> 111 tcttcaagct tgcccgggcc cgccaccatg gacatgaggg tccccgct 48 <210> 112 <211> 1392 <212>DNA <213> Human

-SOCZ 302706 B6 <400> 112 atggagtttg ggctgagctg ggttttcctc gttgctcttt taagaggtgt ccagtgtcag 60 gtgcagctgg tggagtctgg gggaggcgtg gtccagcctg ggaggtccct gagactctcc 120 tgtgtagcgt ctggattcac cttcagtagc catggcatgc actgggtccg ccaggctcca 180 ggcaaggggc tggagtgggt ggcagttata tggtatgatg gaagaaataa atactatgca 240 gactccgtga agggccgatt caccatctcc agagacaatt ccaagaacac gctgtttctg 300 caaatgaaca gcctgagagc cgaggacacg gctgtgtatt actgtgcgag aggaggtcac 360 ttcggtcctt ttgactactg gggccaggga accctggtca ccgtctcctc agcctccacc 420 aagggcccat cggtcttccc cctggcgccc tgctccagga gcacctccga gagcacagcg 480 gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca 540 ggcgctctga ccagcggcgt gcacaccttc ccagctgtcc tacagtcctc aggactctac 600 tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcaacttcg gcacccagac ctacacctgc 660 aacgtagatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga cagttgagcg caaatgttgt 720 gtcgagtgcc caccgtgccc agcaccacct gtggcaggac cgtcagtctt cctcttcccc 780 ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg aggtcacgtg cgtggtggtg 840 gacgtgagcc acgaagaccc cgaggtccag ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg 900 cataatgcca agacaaagcc acgggaggag cagttcaaca gcacgttccg tgtggtcagc 960 gtcctcaccg ttgtgcacca ggactggctg aacggcaagg agtacaagtg caaggtctcc 1020 aacaaaggcc tcccagcccc catcgagaaa accatctcca aaaccaaagg gcagccccga 1080 gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgggaggaga tgaccaagaa ccaggtcagc 1140 ctgacctgcc tggtcaaagg cttctacccc agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat 1200 gggcagccgg agaacaacta caagaccaca cctcccatgc tggactccga cggctccttc 1260 ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca 1320 tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc agaagagcct ctccctgtct 1380 ccgggtaaat ga 1392 <210> 113 <21 1> 708 <212> DNA <213> Human <400> 113 atggaaaccc cagcgcagct tctcttcctc ctgctactct ggctcccaga taccaccgga 60 gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 120 ctctcctgca gggccagtca gagtattagc agcagcttct tagcctggta ccagcagaga 180 cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca gcagggccac tggcatccca 240 gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 300 cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagtatggta cctcaccctg gacgttcggc 360 caagggacca aggtggaaat caaacgaact gtggctgcac catctgtctt catcttcccg 420 ccatctgatg agcagttgaa atctggaact gcctctgttg tgtgcctgct gaataacttc 480 tatcccagag aggccaaagt acagtggaag gtggataacg ccctccaatc gggtaactcc 540 caggagagtg tcacagagca ggacagcaag gacagcacct acagcctcag cagcaccctg 600 acgctgagca aagcagacta cgagaaacac aaagtctacg cctgcgaagt cacccatcag 660 ggcctgagct cgcccgtcac aaagagcttc aacaggggag agtgttag 708 <210> 114 <211> 1395 <212> DNA <213>Human <400> 114 atggagtttg ggctgagctg ggttttcctc gttgctcttt taagaggtgt ccagtgtcag 60 gtgcagctgg tggagtctgg gggaggcgtg gtccagcctg ggaggtccct gagactctcc 120 tgtacagcgt ctggattcac cttcagtaac tatggcatgc actgggtccg ccaggctcca 180 ggcaaggggc tggagtgggt ggcagttata tggtatgatg gaagtaataa acactatgga 240 gactccgtga agggccgatt caccatctcc agtgacaatt ccaagaacac gctgtatctg 300 caaatgaaca gcctgagagc cgaggacacg gctgtgtatt actgtgcgag aggagagaga 360 ctggggtcct actttgacta ctggggccag ggaaccctgg tcaccgtctc ctcagcctcc 420 accaagggcc catcggtctt ccccctggcg ccctgctcca ggagcacctc cgagagcaca 480 gcggccctgg gctgcctggt caaggactac ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac 540

- 90CZ 302706 B6 tcaggcgctc tgaccagcgg cgtgcacacc ttcccagctg tcctacagtc ctcaggactc 600 tactccctca gcagcgtggt gaccgtgccc tccagcaact tcggcaccca gacctacacc 660 tgcaacgtag atcacaagcc cagcaacacc aaggtggaca agacagttga gcgcaaatgt 720 tgtgtcgagt gcccaccgtg cccagcacca cctgtggcag gaccgtcagt cttcctcttc 780 cccccaaaac ccaaggacac cctcatgatc tcccggaccc ctgaggtcac gtgcgtggtg 840 gtggacgtga gccacgaaga ccccgaggtc cagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag 900 gtgcataatg ccaagacaaa gccacgggag gagcagttca acagcacgtt ccgtgtggtc 960 agcgtcctca ccgttgtgca ccaggactgg ctgaacggca aggagtacaa gtgcaaggtc 1020 tccaacaaag gcctcccagc ccccatcgag aaaaccatct ccaaaaccaa agggcagccc 1080 cgagaaccac aggtgtacac cctgccccca tcccgggagg agatgaccaa gaaccaggtc 1140 agcctgacct gcctggtcaa aggcttctac cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc 1200 aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc acacctccca tgctggactc cgacggctcc 1260 ttcttcctct acagcaagct caccgtggac aagagcaggt ggcagcaggg gaacgtcttc 1320 tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac aaccactaca cgcagaagag cctctccctg 1380 tctccgggta aatga 1395 <210> 115 <211> 702 <212>DNA <213> Human <400> 115 atggaaaccc cagcgcagct tctcttcctc ctgctactct ggctcccaga taccaccgga 60 gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 120 ctctcctgca ggaccagtgt tagcagcagt tacttagcct ggtaccagca gaaacctggc 180 caggctccca ggctcctcat ctatggtgca tccagcaggg ccactggcat cccagacagg 240 ttcagtggca gtgggtctgg gacagacttc actctcacca tcagcagact ggagcctgaa 300 gattttgcag tctattactg tcagcagtat ggcatctcac ccttcacttt cggcggaggg 360 accaaggtgg agatcaagcg aactgtggct gcaccatctg tcttcatctt cccgccatct 420 gatgagcagt tgaaatctgg aactgcctct gttgtgtgcc tgctgaataa cttctatccc 480 agagaggcca aagtacagtg gaaggtggat aacgccctcc aatcgggtaa ctcccaggag 540 agtgtcacag ageaggacag caaggacagc acctacagcc tcagcagcac cctgacgctg 600 agcaaagcag actacgagaa acacaaagtc tacgcctgcg aagtcaccca tcagggcctg 660 agctcgcccg tcacaaagag cttcaacagg ggagagtgtt ag 702 <210> 116 <211> 489 <212> DNA <213> Human <400> 116 cctgggaggt ccctgagact ctcctgtgca gcgtctggat tcaccttcag tagtcatggc 60 atccactggg tccgccaggc tccaggcaag gggctggagt gggtggcagt tatatggtat 120 gatggaagaa ataaagacta tgcagactcc gtgaagggcc gattcaccat ctccagagac 180 aattccaaga agacgctgta tttgcaaatg aacagcctga gagccgagga cacggctgtg 240 tattactgtg cgagagtggc cccactgggg ccacttgact actggggcca gggaaccctg 300 gtcaccgtct cctcagcctc caccaagggc ccatcggtct tccccctggc gccctgctcc 360 aggagcacct ccgagagcac agcggccctg ggctgcctgg tcaaggacta cttccccgaa 420 ccggtgacgg tgtcgtggaa ctcaggcgct ctgaccagcg gcgtgcacac cttcccagct 480 gtcctacag 489 <210> 117 <211> 417 <212>DNA <213> Human

- oj CZ 302706 B6 <400> 117 ggcaccctgt ctttgtctcc aggggaaaga gccaccctct cctgcagggc cagtcagagt 60 gtcagcagct acttagcctg gtaccagcag aaacctggcc aggctcccag actcctcatc 120 tatggtgcat ccagcagggc cactggcatc ccagacaggt tcagtggcag tgggtctggg 180 acagacttca ctctcaccat cagcagactg gagcctgagg attttgcagt gtattactgt 240 cagcagtatg gtaggtcacc attcactttc ggccctggga ccaaagtgga tatcaagcga 300 actgtggctg caccatctgt cttcatcttc ccgccatctg atgagcagtt gaaatctgga 360 actgcctctg ttgtgtgcct gctgaataac ttctatccca gagaggccaa agtacag 417 <210> 1 18 <21 1> 1392 <212> DNA <213> Human <400> 118 atggagtttg ggctgagctg ggttttcctc gttgctcttt taagaggtgt ccagtgtcag 60 gtgcagctgg tggagtctgg gggaggcgtg gtcgagcctg ggaggtccct gagactctcc 120 tgtacagcgt ctggattcac čttcagtagt tatggcatgc actgggtccg ccaggctcca 180 ggcaaggggc tggagtgggt ggcagttata tggtatgatg gaagcaataa acactatgca 240 gactccgcga agggccgatt caccatctcc agagacaatt ccaagaacac gctgtatctg 300 caaatgaaca gcctgagagc cgaggacacg gctgtgtatt actgtgcgag agccggactg 360 ctgggttact ttgactactg gggccaggga accctggtca ccgtctcctc agcctccacc 420 ^aa999^cccat cggtcttccc cctggcgccc tgctccagga gcacctccga gagcacagcg 480 gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca 540 ggcgctctga ccagcggcgt gcacaccttc ccagctgtcc tacagtcctc aggactctac 600 tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcaacttcg gcacccagac ctacacctgc 660 aacgtagatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga cagttgagcg caaatgttgt 720 gtcgagtgcc caccgtgccc agcaccacct gtggcaggac cgtcagtctt cctcttcccc 780 ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg aggtcacgtg cgtggtggtg 840 gacgtgagcc acgaagaccc cgaggtccag ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg 900 cataatgcca agacaaagcc acgggaggag cagttcaaca gcacgttccg tgtggtcagc 960 gtcctcaccg ttgtgcaeca ggactggctg aacggcaagg agtacaagtg caaggtctcc 1020 aacaaaggcc tcccagcccc catcgagaaa accatctcca aaaccaaagg gcagccccga 1080 gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgggaggaga tgaccaagaa ccaggtcagc 1140 ctgacctgcc tggtcaaagg cttctacccc agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat 1200 gggcagccgg agaacaacta caagaccaca cctcccatgc tggactccga cggctccttc 1260 ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca 1320 tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc agaagagcct ctccctgtct 1380 ccgggtaaat ga 1392 <210> 119 <211> 705 <212> DNA <213> Human <400> 119 atggaaaccc cagcgcagct tctcttcctc ctgcfcactct ggctcccaga taccaccgga 60 gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 120 ctctcctgta gggccagtca aagtgttagc agctacttag cctggtacca acagaaacct 180 ggccaggctc ccaggcccct catctatggt gtatccagca gggccactgg catcccagac 240 aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac ttcactctca ccatcagcag actggagcct 300 gaagattttg cagtgtatta ctgtcagcag tatggtatct caccattcac tttcggccct 360 gggaccaaag tggatatcaa acgaactgtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 420 tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 480 cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 540 gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 600 ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 660 ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gttag 705 <210> 120 <21 1 > 507 <212> DNA

- 92 CZ 302706 B6 <213> Human <400> 120 ggcgtggtcc agcctgggag gtccctgaga ctctcctgtg cagcgtctgg attcaccttc 60 agtagctatg gcatgcactg ggtccgccag gctccaggca aggggctgga gtgggtggča 120 gttatatggt atgatggaag taataaatac tatgcagact ccgtgaaggg ccgattcacc ISO atctccagag acaattccaa gaacacgctg tatctgcaaa tgaacagcct gagagccgag 240 gacacggctg tgtattactg tgcgagaggg gcccgtataa taaccccttg tatggacgtc 300 tggggccaag ggaccacggt caccgtctcc tcagcctcca ccaagggccc atcggtcttc 360 cccctggcgc cctgctccag gagcacctcc gagagcacag cggccctggg ctgcctggtc 420 aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg tcgtggaact caggcgctct gaccagcggc 480 gtgeacacct tcccagctgt cctacag 507 <210 121 <211> 458 <212>DNA <213> Human <400? 121 cagtctccat cctccctgtc tgcatctgta ggagacagag tcaccatcac ttgccgggca 60 agtcagagca ttaacaccta tttaatttgg tatcagcaga aaccagggaa agcccctaac 120 ttcctgatct ctgctacatc cattttgcaa agtggggtcc catcaaggtt ccgtggcagt 180 ggctctggga caaatttcac tctcaccatc aacagtcttc atcctgaaga ttttgcaact 240 tactactgtc aacagagtta cagtacccca ttcactttcg gccctgggac caaagtggat 300 atcaaacgaa ctgtggctgc accatctgtc ttcatcttcc cgccatctga tgagcagttg 360 aaatctggaa ctgcctctgt tgtgtgcctg ctgaataact tctatcccag agaggccaaa 420 gtacagtgga aggtggataa cgccctccaa tcgggtaa 458 <210122 <211> 501 <212>DNA <213>Human <400> 122 ggcgtggtcc agcctgggag gtccctgaga ctctcctgtg tagcgtctgg attcatcttc 60 agtagtcatg gcatccactg ggtccgccag gctccaggca aggggctgga gtgggtggča 120 gttatatggt atgatggaag aaataaagac tatgcagact ccgtgaaggg ccgattcacc 180 atctccagag acaattccaa gaacacgctg tatttgcaaa tgaacagcct gagagccgag 240 gacacggctg tgtattactg tgcgagagtg gccccactgg ggccacttga ctactggggc 300 cagggaaccc tggtcaccgt ctcctcagcc tccaccaagg gcccatcggt cttccccctg 360 gcgccctgct ccaggagcac ctccgagagc acagcggccc tgggctgcct ggtcaaggac 420 tacttccccg aaccggtgac ggtgtcgtgg aactcaggcg ctctgaccag cggcgtgcac 480 accttcccag ctgtcctaca g 501 <210> 123 20 <211> 426 <212> DNA <213> Human <400> 123 tctccaggca ccctgtcttt gtctccaggg gaaagagcca ccctctcctg cagggccagt 60 cagagtatta gcagcaattt cttagcctgg taccagcaga aacctggcca ggcteccagg 120 ctcctcatct atcgtccatc cagcagggcc actggcatcc cagacagttt cagtggcagt 180 gggtctggga cagacttcac tctcaccatc agcagactgg agcctgagga ttttgcatta 240 tattactgtc agcagtatgg tacgtcacca ttcactttcg gccctgggac caaagtggat 300 atcaagcgaa ctgtggctgc accatctgtc ttcatcttcc cgccatctga tgagcagttg 360 aaatctggaa ctgcctctgt tgtgtgcctg ctgaataact tctatcccag agaggccaaa 420 gtacag 426 <210 124 <211> 516

- 93 CZ 302706 B6 <212> DNA <213> Human <400> 124 tCGGGCccag gactggtgaa gccttcacag atcctgtccc tcacctgcac tgtctctggt 60 ggctccatca gcagtggtgg tcactactgg agctggatcc gccagcaccc agggaagggc 120 ctggagtgga ttgggtacat ctattacatt gggaacacct actacaaccc gtccctCaag 190 agtcgagtta ccatatcagt agacacgtct aagaaccagt tctccctgaa gctgagctct 240 gtgactgccg cggacacggc cgtgtattat tgtgcgagag atagtgggga ctactacggt 300 atagacgtct ggggccaagg gaccacggtc accgtctcct cagcttccac caagggccca 360 tccgtcttcc ccctggcgcc ctgctccagg agcacctccg agagcacagc cgccctgggc 420 tgcctggtca aggactactt ccccgaaccg gtgacggtgt cgtggaactc aggcgccctg 480 accagcggcg tgcacacctt cccggctgtc ctacaa 516 <210> 125 <21 1> 465 <212> DNA <213> Human <400> 125 tctccagact ttcagtctgt gactccaaag gagaaagtca ccatcacctg ccgggccagt 60 cagagcattg gtagtagctt acattggtat cagcagaaac cagatcagtc tccaaagctc 120 ctcatcaagt atgcttccca gtccttctct ggggtcccct cgaggttcag tggcagtgga 180 tctgggacag atttcaccct caccatcaat agcctggaag ctgaagatgc tgcaacgtat 240 tactgtcatc agagtagtag tttaccgctc actttcggcg gagggaccaa ggtggagatc 300 aaacgaactg tggctgcacc atctgtcttc atcttcccgc catctgatga gcagttgaaa 360 tctggaactg cctctgttgt gtgcctgctg aataacttct atcccagaga ggccaaagta 420 cagtggaagg tggataacgc cctccaatcg ggtaactccc aggag 465 <210> 126 <21 l> 459 <212> DNA <213> Human <400> 126 cctgggaggt ccctgagact ctcctgtgca gcgtctggat tcaccttcag tagtcatggc 60 atccactggg tccgccaggc tccaggcaag gggctggagt gggtggcagt tatatggtat 120 gatggaagaa ataaagacta tgcagactcc gtgaagggcc gattcaccat ctccagagac 180 aattccaaga acacgctgta tttgcaaatg aacagcctga gagccgagga cacggctgtg 240 tattactgtg cgagagtggc cccactgggg ccacttgact actggggcca gggaaccctg 300 gtcaccgtct cctcagcctc caccaagggc ccatcggtct tccccctggc gccctgctcc 360 aggagcacct ccgagagcac agcggccctg ggctgcctgg tcaaggacta cttccccgaa 420 ccggtgacgg tgtcgtggaa ctcaggcgct ctgaccagc 459 <210> 127 <21 l> 440 <212> DNA <213> Human <400> 127 cagtctccag gcaccctgtc tttgtctcca ggggaaagag ccaccctctc ctgcagggcc 60 agtcagagtg tcagcagcta cttagcctgg taccagcaga aacctggcca ggctcccagg 120 ctcctcatct atggtgcatc cagcagggcc actggcatcc eagacaggtt cagtggcagt 180 gggtctggga cagacttcac tctcaccatc agcagactgg agcctgagga ttttgcagtg 240 tattactgtc aacagtatgg taggtcacca ttcactttcg gccctgggac caaagtagat 300 atcaagcgaa ctgtggctgc accatctgtc ttcatcttcc cgccatctga tgagcagttg 360 aaatctggaa ctgcctctgt tgtgtgcctg ctgaataact tctatcccag agaggccaaa 420 gtacagtgga aaggtggata 440

-94CZ 302706 B6 <210> 128 <211> 503 <212> DNA <213> Human <400> 128 ggcgtggtcc agcctgggag gtccctgaga ctctcctgtg cagcgtctgg attcaccttc 60 agtagctatg gcatgcactg ggtccgccag gctccaggca aggggctgga gtgggtggca 120 gttatatggt atgatggaag taataaatac tatgcagact ccgtgaaggg ccgattcacc 180 atctccagag acaattccaa gaacacgctg tatctgcaaa tgaacagcct gagagccgag 240 gacacggctg tgtattactg tgcgagagat ccgaggggag ctacccttta ctactactac 300 taccggtkgg acgtctgggg ccaagggacc acggtcaccg tctcctcagc ctccaccaag 360 ggcccatcgg tcttccccct ggcgccctgc tccaggagca cctccgagag cacagcggcc 420 ctgggctgcc tggtcaagga ctacttccce gaaccggtga cggtgtcgtg gaactcaggc 480 gctctgacca gcggcgtgca cac 503 <21O> 129 <211> 417 io <212> DNA <213> Human <400> 129 ccatcctccc tgtctgcatc tgtaggagac agagtcacca tcacttgccg ggcaagtcag 60 agcattaaca gctatttaga ttggtatcag cagaaaccag ggaaagcccc taaactcctg 120 atctatgctg catccagttt gcaaagtggg gtcccatcaa ggttcagtgg cagtggatct 180 gggacagatt tcactctcac catcagcagt ctgcaacctg aagattttgc aacttactac 240 tgtcaacagt attacagtac tccattcact ttcggccctg ggaccaaagt ggaaatcaaa 300 cgaactgtgg ctgcaccatc tgtcttcatc ttcccgccat ctgatgagca gttgaaatct 360 ggaactgcct ctgttgtgtg cctgctgaat aacttctatc ccagagaggc caaagta 417 is <210 130 <211> 451 <212>DNA <213> Human <400> 130 ggcgtggtcc agcctgggag gtccctgaga ctctcctgtg cagcgtctgg attcaccttc 60 agtagctatg gcatgcactg ggtccgccag gctccaggca aggggctgga gtgggtggca 120 gttatatggt atgatggaag tcataaátac tatgcagact ccgtgaaggg ccgattcacc 180 atctccagag acaattccaa gaacacgctg tatctgcaaa tgaacagcct gagagccgag 240 gacacggctg tgtattactg tgcgagaggc gctgtagtag taccagctgc tatggacgtc 300 tggggccaag ggaccacggt caccgtctcc tcagcctcca ccaagggccc atcggtcttc 360 cccctggcgc cctgctccag gagcacctcc gagagcacag cggccctggg ctgcctggtc 420 aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg t 451 <210 131 <211> 402 <212>DNA <213> Human <220 <400> 131 acccagtctc catcctccct gtctgcatct gtaggagaca gagtcaccat cacttgccgg 60 gcaagtcaga acattagcag gtatttaaat tggtatcaac agaaaccagg gaaagcccct 120 aagttcctga tctatgttgc atctattttg caaagtgggg tcccatcagg gttcagtgcc 180 agtggatctg ggccagattt cactctnacc atcagcagtc tgcaacctga agattttgca 240 acttactact gtcaacagag ttacagtacc ccattcactt tcggccctgg gaccaaagtg 300 gatatcaaac gaactgtggc tgcaccatct gtcttcatct tcccgccatc tgatgagcag 360 ttgaaatctg gaactgcctc tgttgtgtgc ctgctgaata ac 402 i

- 95 i <210> 132 <21 l> 438 <2I2> DNA <213> Human <22()>

<400> 132 gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc tcctgtgcag cgtctggatt caccttcagt 60 agcngtggca tgcactgggt ccgccaggct ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt 120 atatggtctg atggaagtca taaatactat gcagactccg tgaagggccg attcaccatc 180 tccagagaca attccaagaa cacgctgtat ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac 240 acggctgtgt attactgtgc gagaggaact atgatagtag tgggtaccct tgactactgg 300 ggccagggaa ccctggtcac cgtctcctca gcctccacca agggcceatc ggtcttcccc 360 ctggcgccct gctccaggag cacctccgag agcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag 420 gactacttcc ccgaaccg 438 o <21O> 133 <21 1> 451 <212> DNA <213> Human <400> 133 acccagtctc catcctccct gtctgcatct gtaggagaca gagtcaccat cacttgccgg 60 gcaagtcaga gcatttgcaa ctatttaaat tggtatcagc agaaaccagg aaaagcccct 120 agggtcctga tctatgctgc atccagtttg caaggtgggg tcccgtcaag gttcagtggc 180 agtggatctg ggacagattg cactctcacc atcagcagtc tgcaacctga agattttgca 240 acttactact gtcaacagag ttaeactacc ccattcactt tcggccctgg gaccagagtg 300 gatatcgaac gaactgtggc tgcaccatct gtcttcatct tcccgccatc tgatgagcag 360 ttgaaatctg gaactgcctc tgttgtgtgc ctgctgaata acttctatcc cagagaggcc 420 aaagtacagt ggaaggtgga taacgcctat t 451 <210> 134 <211> 562 o <212>DNA <213> Human <400> 134 tcctgtgcag cgtctggatt caccttcagt tactatggcg tctgggggag gcgtggtcca 60 gcctgggagg tccctgagac tctcctgtgc agcgtctgga ttcaccttca gtagctatgg 120 cgtgcactgg gtccgccagg ctccaggcaa ggggctggag tgggtggcag ttatatggta 180 tgatggaagt aataaatact atgcagactc cgtgaagggc cgattcacca tctccagaga 240 caattccaag agcacgctgt atctgcaaat gaacagcctg agagccgagg acacggctgt 300 gtattattgt gcgagagact cgtattacga tttttggagt ggtcggggcg gtatggacgt 360 ctggggccaa gggaccacgg tcaccgtctc ctcagcctcc accaagggcc catcggtctt 420 ccccctggcg ccctgctcca ggagcacctc cgagagcaca gcggccctgg gctgcctggt 480 caaggactac ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac tcaggcgctc tgaccagcgg 540 cgtgcacacc ttcccagctg tc 562 <210> 135 <211> 419 <212> DNA <213> Human

- 96CZ 302706 B6 <400> 135 ccactctccc tgcccgtcac ccttggacag ccggcctcca tctcctgcag gtctagtcaa agcctcgtat acagtgatgg aaacacctac ttgaattggt ttcagcagag gccaggccaa tctccaaggc gcctaattta taaggtttct aactgggact ctggggtccc agacagattc agcggcagtg ggtcaggcac tgatttcaca ctgaaaatca gcagggtgga ggctgaggat gttggggttt attactgcat gcaaggttca cactggcctc cgacgttcgg ccaagggacc aaggtggaaa tcaaacgaac tgtggctgca ccatctgtct tcatcttccc gccatctgat gagcagttga aatctggaac tgcctctgtt gtgtgcctgc tgaataactt ctatcccac <210> 136 <211> 490 <212>DNA <213> Human <40Ú> 136 gtccagcctg ggaggtccct gagactctcc tgtgcagcgt ctggattcac cttcagtaac tatgccatgc actgggtccg ccaggctcca ggcaaggggc tggagtgggt ggtagttatt tggcatgatg gaaataataa atactatgca gagtccgtga agggccgatt caccatctcc agagacaatt ccaagaacac gctgtatctg caaatgaaca gcctgagagc cgaggacacg gctgtatatt actgtgcgag agatcagggc actggctggt acggaggctt tgacttctgg ggccagggaa ccctggtcac cgtctcctca gcctccacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcgccct gctccaggag cacctccgag agcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg tggaactcag gcgctctgac cagcggcgtg cacaccttcc ιο <2I0> 137 <211> 419 <212> DNA <213> Human <400> 137 cctggagagc cggcttccat ctcttgcagg tctagtcaga gcctcctgca tagtaatgga tacaactatt tggattggta cctgcagaag ccaggacagt ctccacagct cctgatctat ttgggttcta atcgggcctc cggggtccct gacaggttca gtggcagtgg atcaggcaca gattttacac tgaaactcag cagagtggag gctgaggatg ttggggttta ttactgcatg caagctctac aaactcctct cactttcggc ggagggacca aggtggagat caaacgaact gtggctgcac catctgtctt catcttcccg ccatctgatg agcagttgaa atctggaact gcctctgttg tgtgcctgct gaataacttc tatcccagar aggccaaagt acattccat <210> 138 <211> 1392 ío <212>DNA <213> Human <400> 138 atggagtttg ggctgagctg ggttttcctc gttgctcttt taagaggtgt ccagtgtcag gtgcagctgg tggagtctgg gggaggcgtg gtccagcctg ggaggtccct gagactctcc tgtgtagcgt ctggattcac cttcagtagc catggcatgc actgggtccg ccaggctcca ggcaaggggc tggagtgggt ggcagttata tggtatgatg gaagaaataa atactatgca gactccgtga agggccgatt caccatctcc agagacaatt ccaagaacac gctgtttctg caaatgaaca gcctgagagc cgaggacacg gctgtgtatt actgtgcgag aggaggtcac ttcggtcctt ttgactactg gggccaggga accctggtca ccgtctcctc agcctccacc aagggcccat cggtcttccc cctggcgccc tgctccagga gcacctccga gagcacagcg gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca ggcgctctga ccagcggcgt gcacaccttc ccagctgtcc tacagtcctc aggactctac tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcaacttcg gcacccagac ctacacctgc aacgtagatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga cagttgagcg caaatgttgt gtcgagtgcc caccgtgccc agcaccacct gtggcaggac cgtcagtctt cctcttcccc ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg aggtcacgtg cgtggtggtg gacgtgagcc acgaagaccc cgaggtccag ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc acgggaggag cagttcaaca gcacgttccg tgtggtcagc

120

180

240

300

360

419

120

180

240

300

360

42Q

480

490

120

180

240

300

360

419

120

180

240

300

360

420

480

540

600

660

720

780

840

900

960 gtcctcaccg ttgtgcacca ggactggctg aacggcaagg agtacaagtg caaggtctcc 1020 aacaaaggcc tcccagcccc catcgagaaa accatctcca aaaccaaagg gcagccccga 1080 gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgggaggaga tgaccaagaa ccaggtcagc 1140 ctgacctgcc tggtcaaagg cttctacccc agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat 1200 gggcagccgg agaacaacta caagaccaca cctcccatgc tggactccga cggctccttc 1260 ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca 1320 tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc agaagagcct ctccctgtct 1380 ccgggtaaat ga 1392 <210> 139 <21 1> 1999 <212>DNA <213> Human <400> 139 atggagtttg ggctgagctg ggttttcctc gttgctcttt taagaggtgt ccagtgtcag 60 gtgcagctgg tggagtctgg gggaggcgtg gtccagcctg ggaggtccct gagactctcc 120 tgtgtagcgt ctggattcac cttcagtagc catggcatgc actgggtccg ecaggctcca 180 ggcaaggggc tggagtgggt ggcagttata tggtatgatg gaagaaataa atactatgca 240 gactccgtga agggccgatt caccatctcc agagacaatt ccaagaacac gctgtttctg 300 caaatgaaca gcctgagagc cgaggacacg gctgtgtatt actgtgcgag aggaggtcac 360 ttcggtcctt ttgactactg gggccaggga accctggtca ccgtctcctc agctagcacc 420 aagggcccat cggtcttccc cctggcgccc tgctccagga gcacctccga gagcacagcg 480 gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca 540 ggcgctctga ccagcggcgt gcacaccttc ccagctgtcc tacagtcctc aggactctac 600 tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcaacttcg gcacccagac ctacacctgc 660 aacgtagatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga cagttggtga gaggccagct 720 cagggaggga gggtgtctgc tggaagccag gctcagccct cctgcctgga cgcaccccgg 780 ctgtgcagcc ccagcccagg gcagcaaggc aggccccatc tgtctcctca cccggaggcc 640 tctgcccgcc ccactcatgc tcagggagag ggtcttctgg ctttttccac caggctccag 900 gcaggcacag gctgggtgcc cctaccccag gcccttcaca cacaggggca ggtgcttggc 960 tcagacctgc caaaagccat atccgggagg accctgcccc tgacctaagc cgaccccaaa 1020 ggccaaactg tccactccct cagctcggac accttctctc ctcccagatc cgagtaactc 1080 ccaatcttct ctctgcagag cgcaaatgtt gtgtcgagtg cccaccgtgc ccaggtaagc 1140 cagcccaggc ctcgccctcc agctcaaggc gggacaggtg ccctagagta gcctgcatcc 1200 agggacaggc cccagctggg tgctgacacg tccacctcca tctcttcctc agcaccacct 1260 gtggcaggac cgtcagtctt cctcttcccc ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc 1320 cggacccctg aggtcacgtg cgtggtggtg gacgtgagcc acgaagaccc cgaggtccag 1380 ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc acgggaggag 1440 cagttcaaca gcacgttccg tgtggtcagc gtcctcaccg ttgtgcacca ggactggctg 1500 aacggcaagg agtacaagtg caaggtctcc aacaaaggcc tcccagcccc catcgagaaa 1560 accatctcca aaaccaaagg tgggacccgc ggggtatgag ggccacatgg acagaggccg 1620 gctcggccca ccctctgccc tgggagtgac cgctgtgcca acctctgtcc ctacagggca 1680 gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg gaggagatga ccaagaacca 1740 ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctaccccagc gacatcgccg tggagtggga 1800 gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacacct cccatgctgg actccgacgg 1860 ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc aggtggcagc aggggaacgt 1920 cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac tacacgcaga agagcctctc 1980 cctgtctccg ggtaaatga 1999 <2 10> 140 <21 1> 1392 <212> DNA <213> Human

-98CZ 302706 B6 <400> 140 atggagtttg ggctgagctg ggttttcctc gttgctcttt taagaggtgt ccagtgtcag gtgcagctgg tggagtctgg gggaggcgtg gtccagcctg ggaggtccct gagactctcc tgtgtagcgt ctggattcac cttcagtagc catggcatgc actgggtccg ccaggctcca ggcaaggggc tggagtgggt ggcagttata tggtatgatg gaagaaataa atactatgca gactccgtga agggccgatt caccatctcc agagacaatt ccaagaacac gctgtttctg caaatgaaca gcctgagagc cgaggacacg gctgtgtatt actgtgcgag aggaggtcac ttcggtcctt ttgactactg gggccaggga accctggtca ccgtctcctc agcctccacc aagggcccat cggtcttccc cctggcgccc tgctccagga gcacctccga gagcacagcg gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca ggcgctctga ccagcggcgt gcacaccttc ccagctgtcc tacagtcctc aggactctac tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcaacttcg gcacccagac ctacacctgc aacgtagatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga cagttgagcg caaatgttgt gtcgagtgcc caccgtgccc agcaccacct gtggcaggac cgtcagtctt cctcttcccc ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg aggtcacgtg cgtggtggtg gacgtgagcc acgaagaccc cgaggtccag ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc acgggaggag cagttccaaa gcacgttccg tgtggtcagc gtcctcaccg ttgtgcacca ggactggctg aacggcaagg agtacaagtg caaggtctcc aacaaaggcc tccéagcccc catcgagaaa accatctcca aaaccaaagg gcagccccga gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgggaggaga tgaccaagaa ccaggtcagc ctgacctgcc tggtcaaagg cttctacccc agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat gggcagccgg agaacaacta caagaccaca cctcccatgc tggactccga cggctccttc ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc agaagagcct ctccctgtct ccgggtaaat ga <210> 141 <21l>708 <212> DNA <213> Human <400> 141 atggaaaccc cagcgcagct tctcttcctc ctgctactct ggctcccaga taccaccgga gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc ctctcctgca gggccagtca gagtattagc agcagcttct tagcctggta ccagcagaga cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca gcagggccac tggcatccca gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagtatggta cctcaccctg gacgttcggc caagggacca aggtggaaat caaacgaact gtggctgcac catctgtctt catcttcccg ccatctgatg agcagttgaa atctggaact gcctctgttg tgtgcctgct gaataacttc tatcccagag aggccaaagt acagtggaag gtggataácg ccctccaatc gggtaactcc caggagagtg tcacagagca ggacagcaag gacagcacct acagcctcag cagcaccctg acgctgagca aagcagacta cgagaaacac aaagtctacg cctgcgaagt cacccatcag ggcctgagct cgcccgtcac aaagagcttc aacaggggag agtgttag <210> 142 <211> 1395 <212> DNA <213> Human <400> 142 atggagtttg ggctgagctg ggttttcctc gttgctcttt taagaggtgt ccagtgtcag gtgcagctgg tggagtctgg gggaggcgtg gtccagcctg ggaggtccct gagactctcc tgtacagcgt ctggattcac cttcagtaac tatggcatgc actgggtccg ccaggctcca ggcaaggggc tggagtgggt ggcagttata tggtatgatg gaagtaataa acactatgga gactccgtga agggccgatt caccatctcc agtgacaatt ccaagaacac gctgtatctg caaatgaaca gcctgagagc cgaggacacg gctgtgtatt actgtgcgag aggagagaga ctggggtcct actttgacta ctggggccag ggaaccctgg tcaccgtctc ctcagcctcc accaagggcc catcggtctt ccccctggcg ccctgctcca ggagcacctc cgagagcaca gcggccctgg gctgcctggt caaggactac ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac tcaggcgctc tgaccagcgg cgtgcacacc ttcccagctg tcctacagtc ctcaggactc

120

180

240

300

360

420

480

540

600

660

720

780

840

900

960

1020

1080

1140

1200

1260

1320

1380

1392

120

180

240

300

360

420

480

540

600

660

708

120

180

240

300

360

420

480

540

600

-99 CZ 302706 B6 tactccctca gcagcgtggt gaccgtgccc tccagcaact tcggcaccca gacctacacc 660 tgcaacgtag atcacaagcc cagcaacacc aaggtggaca agacagttga gcgcaaatgt 720 tgtgtcgagt gcccaccgtg cccagcacca cctgtggcag gaccgtcagt cttcctcttc 780 cccccaaaac ccaaggacac cctcatgatc tcccggaccc ctgaggtcac gtgcgtggtg 840 gtggacgtga gccacgaaga ccccgaggtc cagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag 900 gtgcataatg ccaagacaaa gccacgggag gagcagttca acagcacgtt ccgtgtggtc 960 agcgtcctca ccgttgtgca ccaggactgg ctgaacggca aggagtacaa gtgcaaggtc 1020 tccaacaaag gcctcccagc ccccatcgag aaaaccatct ccaaaaccaa agggcagccc 1080 cgagaaccac aggtgtacac cctgccccca tcccgggagg agatgaccaa gaaccaggtc 1140 agcctgacct gcctggtcaa aggcttctac cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc 1200 aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc acacctccca tgctggactc cgacggctcc 1260 ttcttcctct acagcaagct caccgtggac aagagcaggt ggcagcaggg gaacgtcttc 1320 tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac aaccactaca cgcagaagag cctctccctg 1380 tctccgggta aatga 1395 <210> 143 <211> 702 <212> DNA <213> Human <400> 143 atggaaaccc cagcgcagct tctcttcctc ctgctactct ggctcccaga taccaccgga 60 gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 120 ctctcctgca ggaccagtgt tagcagcagt tacttagcct ggtaccagca gaaacctggc 180 caggctccca ggctcctcat ctatggtgca tccagcaggg ccactggcat cccagacagg 240 ttcagtggca gtgggtctgg gacagacttc actctcacca tcagcagact ggagcctgaa 300 gattttgcag tctattactg tcagcagtat ggcatctcac ccttcacttt cggcggaggg 360 accaaggtgg agatcaagcg aactgtggct gcaccatctg tcttcatctt cccgccatct 420 gatgagcagt tgaaatctgg aactgcctct gttgtgtgcc tgctgaataa cttctatccc 480 agagaggcca aagtacagtg gaaggtggat aacgccctcc aatcgggtaa ctcccaggag 540 agtgtcacag agcaggacag caaggacagc acctacagcc tcagcagcac cctgacgctg 600 agcaaagcag actacgagaa acacaaagtc tacgcctgcg aagtcaccca tcagggcctg 660 agctcgcccg tcacaaagag cttcaacagg ggagagtgtt ag 702 !() <210> 144 <211> 1392 <212> DNA <213> Human <400> 144 atggagtttg ggctgagctg ggttttcctc gttgctcttt taagaggtgt ccagtgtcag 60 gtgcagctgg tggagtctgg gggaggcgtg gtcgagcctg ggaggtccct gagactctcc 120 tgtacagcgt ctggattcac cttcagtagt tatggcatgc actgggtccg ccaggctcca 180 ggcaaggggc tggagtgggt ggcagttata tggtatgatg gaagcaataa acactatgca 240 gactccgcga agggccgatt caccatctcc agagacaatt ccaagaacac gctgtatctg 300 caaatgaaca gcctgagagc cgaggacacg gctgtgtatt actgtgcgag agccggactg 360 ctgggttact ttgactactg gggccaggga accctggtca ccgtctcctc agcctccacc 420 aagggcccat cggtcttccc cctggcgccc tgctccagga gcacctccga gagcacagcg 480 gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca 540 ggcgctctga ccagcggcgt gcacaccttc ccagctgtcc tacagtcctc aggactctac 600 tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcaacttcg gcacccagac ctacacctgc 660 aacgtagatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga cagttgagcg caaatgttgt 720 gtcgagtgcc caccgtgccc agcaccacct gtggcaggac cgtcagtctt cctcttcccc 780 ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg aggtcacgtg cgtggtggtg 840 gacgtgagcc acgaagaccc cgaggtccag ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg 900 cataatgcca agacaaagcc acgggaggag cagttcaaca gcacgttccg tgtggtcagc 960 gtcctcaccg ttgtgcacca ggactggctg aacggcaagg agtacaagtg caaggtctcc 1020 aacaaaggcc tcccagcccc catcgagaaa accatctcca aaaccaaagg gcagccccga 1080 gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgggaggaga tgaccaagaa ccaggtcagc 1140 ctgacctgcc tggtcaaagg cttctacccc agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat 1200

- 100 CZ 302706 B6 gggcagccgg agaacaacta caagaccaca cctcccatgc tggactccga cggctccttc 1260 ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca 1320 tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc agaagagcct ctccctgtct 1380 ccgggtaaat ga 1392 <210> 145 <211> 705 <212>DNA <213> Human <400> 145 atggaaaccc cagcgcagct tctcttcctc ctgctactct ggctcccaga taccaccgga 60 gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 120 ctctcctgta gggccagtca aagtgttagc agctacttag cctggtacca acagaaacct 1B0 ggccaggctc ccaggcccct catctatggt gtatccagca gggccactgg catcccagac 240 aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac ttcactctca ccatcagcag actggagcct 300 gaagattttg cagtgtatta ctgtcagcag tatggtatct caccattcac tttcggccct 360 gggaccaaag tggatatcaa acgaactgtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 420 tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 480 cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 540 gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 600 ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 660 ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gttag 705 io <210> 146 <211> 1413 <212> DNA <213> Human <400> 146 atggagtttg ggctgagctg ggttttcctc gttgctcttt taagaggtgt ccagtgtcag 60 gtgcagctgg tggagtctgg gggaggcgtg gtccagcctg ggaggtccct gagactctcc 120 tgtgcagcgt ctggattcac cttcagtagc tatggcatgc actgggtccg ccaggctcca 180 ggcaaggggc tggagtgggt ggcagttata tggtatgatg gaagtaataa atactatgca 240 gactccgtga agggccgatt caccatctcc agagacaatt ccaagaacac gctgtatctg 300 caaatgaaca gcctgagagc cgaggacacg gctgtgtatt actgtgcgag agatccgagg 360 ggagctaccc tttactacta ctactacggt atggacgtct ggggccaagg gaccacggtc 420 accgtctcct cagcctccac caagggccca tcggtcttcc ccctggcgcc ctgctccagg 480 agcacctccg agagcacagc ggccctgggc tgcctggtca aggactactt ccccgaaccg 540 gtgacggtgt cgtggaactc aggcgctctg accagcggcg tgcacacctt cccagctgtc 600 ctacagtcct caggactcta ctccctcagc agcgtggtga ccgtgccctc cagcaacttc 660 ggcacccaga cctacacctg caacgtagat cacaagccca gcaacaccaa ggtggacaag 720 acagttgagc gcaaatgttg tgtcgagtgc ccaccgtgcc cagcaccacc tgtggcagga 780 ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 840 gaggtcacgt gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ccgaggtcca gttcaactgg 900 tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cacgggagga gcagttcaac 960 agcacgttcc gtgtggtcag cgtcctcacc gttgtgcacc aggactggct gaacggcaag 1020 gagtacaagt gcaaggtctc caacaaaggc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 1080 aaaaccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggaggag 1140 atgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctaccc cagcgacatc 1200 gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac acctcccatg 1260 ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 1320 cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 1380 cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa tga 1413 <210> 147 <211> 714 <212>DNA <213> Human

- 101 CZ 302706 B6 <400 atggacatga agatgtgaca gtcaccatca aaaccaggga ccatcaaggt caacctgaag ggccctggga ccgccatctg ttctatccca tcccaggaga ctgacgctga cagggcctga ► 147 gggtccccgc tccagatgac cttgccgggc aagcccctaa tcagtggcag attttgcaac ccaaagtgga atgagcagtt gagaggccaa gtgtcacaga gcaaagcaga gctcgcccgt tcagctcctg ccagtctcca aagtcagagc actcctgatc tggatctggg ttactactgt aatcaaacga gaaatctgga agtacagtgg gcaggacagc ctacgagaaa cacaaagagc gggctcctgc tcctccctgt attaacagct tatgctgcat acagatttca caacagtatt actgtggctg actgcctctg aaggtggata aaggacagca cacaaagtct ttcaacaggg tactctggct ctgcatctgt atttagattg ccagtttgca ctctcaccat acagtactcc caccatctgt ttgtgtgcct acgccctcca cctacagcct acgcctgcga gagagtgtta ccgaggtgcc aggagacaga gtatcagcag aagtggggtc cagcagtctg attcactttc cttcatcttc gctgaataac atcgggtaac cagcagcacc agtcacccat gtga

120

1Θ0

240

300

360

420

480

540

600

660

714

Seznam citované literatury s Všechny publikace citované v přihlášce včetně patentů, patentových přihlášek, vědeckých článků, příruček apod., a také publikace v nich citované, jsou zahrnuty v plném rozsahu formou odkazu. Kromě toho jsou plně zahrnuty i následující publikace, včetně publikací v nich citovaných.

Alegre etal. J. Immunol 157: 4762-70(1996) io Allison and Krummel Science 270:932-933 (1995)

Balzano et al. lni J Cancer Suppl. 7:28-32 (1992)

Blaír et al.Immunol 160; 12-5 (1998)

Blake and Lítzí-Davis BioConjugate Chem. 3:510-5 13 (1992)

Boussiotís et al. Proč. Nati. Acad Sci USA 90:11059-63 (1993) is Bowie etal. Science 253:164 (1991)

Bruggeman et al. PNSA USA 86:6709-6713 (1989)

Bruggeman, M. and Neuberger, M. S. in Methods: A companion to Methods in Enzymology 2:159-165 (Lerner et al. eds. Academie Press (1991))

Bruggemann et al., „Human antibody production in trasgenie mice: expression from 100 kb of the human IgH locus.“ Eur. J. Immunol. 21:1323-1326(1991)

Bruggemann, M. and Neuberger, M. S. „Strategies for expressing human antibody repertoires in transgenic mice.“ Immunology Today 17:391-397 (1996)

Brunet et al. Nátuře 328:267-270 (1987)

Bumpers et al J. Surgical Res. 61:282-288 (1996)

Capsey et al. Genetically EngineeredHuman Therapeutic Drugs (Stockton Press, NY (1988)) Castan et al. Immunology 90:265-71 (1997)

Cepero et al. JExp. Med 188:199-204 (1998)

Chen et al. „Immunoglobulin gene rearrangement tn B-cell deficient mice generated by targeted deletion of the Jh locus“ International Immunology 5:647-656 (1993) .to Chen et al. Cell 71:1093-1102 (1992)

Chen et al. Human Gene Therapy 5:595-601 (1994)

Chiswell and McCafferty T1BTECH 10:80-84 (1992)

Choi et al. „Transgenic mice eontaining a human heavy chain immunoglobulin gene fragment cloned in a yeast artifical chromosome“ Nátuře Genetics 4:117-123 (1993

Chothia & Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)

- 102 CZ 302706 Β6

Chothiaet al. Nátuře 342:878-883 (1989)

Chuang et al. J. Immunol. 159:144-151 (1997)

Coligan et al., Unit 2.1, „Enzyme-linked immunosorbent assays,“ in Current protocols in immunology (1994)

Cwirla et al. PNAS USA 87:6378-6382 (1990)

Dariavach et al. Eur. J. Immunol. 18:1901-1905 (1988)

Dayhoff, M. O., in Atlas of Protein Sequence and Structure, pp. 101-110 (Volume 5, National Biomedical Research Foundation (1972)) and Supplement 2 to this volume, pp. 1-10 de Boer et al. Eur. J, Immunol 23:3120-5 (1993)

Eckstein, Ed., Oxford University Press, Oxford England (1991))

Evans et al. J. Med. Chem. 30:1229 (1987)

Fallarino et al., J. Exp Med 188:205-10 (1998)

Fanger et al. Immunol Methods 4:72-81 (1994)

Fauchere, J. Adv. Drug Res. 15:29 (1986)

Fishwild et al., „High-avidity human IgGy monoclonal antibodies from a novel strain of minilocus transgenic rnice. Nátuře Biotech. 14:845—851 (1996).

Freeman et al. J. Exp Med 178:2185-92 (1993)

Freeman etal. J. Immunol 161:2708-15 (1998)

Freeman et al. Science 262:907-9 (1993)

Fundamental Immunology Ch. 7 (Paul. W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y. (1989))

Galfre, G. and Milstein, C., „Preparation of monoclonal antibodies: strategies and procedures.“ Methods Enzymol. 73:3—46 (1981)

Gorman et al. P.N.A.S. 79-.6771 (1982)

Green and Jakobovits J. Exp. Med. 188:483-^195 (1998)

Green et al. Nátuře Genetics 7:13-21 (1994)

Grosschedl et al. Cell 41:885 (1985)

Hanes and Plucthau PNAS USA 94:4937-4942 (1997)

Harding et al. Nátuře 356:607-609 (1994)

Harper et al. J Immunol 147:103 7- 44 (1991)

Hathcock et al. Science 262:905-7 (1993)

Hoganboom et al. J Immunol. Reviews 130:43-68 (1992)

Horspool et al. J. Immunol. 160:2706—14 (1998)

Houghten et al. Biotechniques 13:412—421 (1992)

Houghten PNAS USA 82:5131-5135 (1985)

Hurwitz et al. J. Neuroimmunol 73:57-62 (1997)

Hurwitz et al. Proč. Nati Acad Sci US Λ 95:10067-71 (1998)

Immunology - A Synthesis (2^nd Edition, E. S. Golub and D. R. Gren, Eds., Sinauer Associates,

Sunderland, Mass. (1991))

- 103CZ 302706 B6

Inlroduclion to Protein Structure (C. Branděn and J. fooze, eds., Garland Hublishing, New York, N.Y.(199I))

Jakobovits et al., „Germ-line transmission and expression of a human-derived yeast artificial— chromosome.“ Nátuře 362:255-258 (1993) > Jakobovits, A ct al., „Analysis of homozygous mutant chimeric mice: Deletion of the immunoglobnlin heavy-chain joining region bloeks B-eell development and antibody production.“ Proč. Nati. Acad. Sci. USA 90:2551-2555 (1993)

Jakobovits, A„ „Human izing the mouše genome.“ Current Biology 4:761-763 (1994)

Jakobovits, A„ „Production of fully human antibodies by transgenic mice.“ Current Opinion in io Biotechnology 6:561-566 (1995)

Junghans et al. in Cancer Chemotherapy and Biotherapy 655-686 (2d edition, Chafner and Longo, eds., Lippincott Raven (1996))

Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of ImmunologicaI lnterest, N.I.H. publication no. 913242

Kabat Sequences of Proteins of Immunol ogical Interes (National Institutes of Health, Bethesda, Md.( 1987 and 1991))

Kostelny et al. J. Immunol. 148:1547-1553 (1992)

Krummel and Allison J Exp. Med 182:459-65 (1995)

Krummel et al. Int. Immunol 8:519-23 (1996) zo Kuchroo et al. Cell 80:707-18 (1995)

Kwon et al. PNAS USA 94:8099-103 (1997)

LaPlanche et al. Nud. Acids Res, 14:9081 (1986)

Lenschow et al. Proč. Nati. Acad Sci. USA 90:11054-8 (1993)

Lenschow et al. Science 257:789-792 (1992)

Lin et al., 7. Exp. Med. 188:199-204 (1998)

Linsley et al. 7. Exp. Med. 176:1595-604 (1992)

Linsley et al. J. Exp. Med. 174:561-569 (1991)

Linsley et al. Science 257:792-795 (1992)

L\u et a\. J. Immunol 139:3521 (1987)

Liu et al. P.N.A.S. 84:3439 (1987)

Lonberg et al., „Antigen-speciflc human antibodies from mice comprísing four distinct genetic modifications.“ Nátuře 368:856-859 (1994).

Luhder et al. J. Exp Med. 187:427-32(1998)

Marasco Gene Therapy 4\\ 1-15 (1997)

Markees et al. J. Clin Invest 101:2446-55 (1998)

Marks et al.. „Olígonucleotide primers for polymerase chain reaction amplification of human immunoglobulin variable genes and design of family-specific oligonukleotide probes.“ Eur. J. Immunol 21:985-991 (1991)

McCoy et al. 7 Exp Med 186:183-7 (1997)

Mendez et at. Nátuře Genetics 15:146-156(1997)

Needleman and Wunsch.7. Mol. Biol. 48:443 (1970)

- 104 CZ 302706 Β6

Okayama et al. Mol. Cell. Bio. 3:280 (1983)

Parmley and Smith Gene 73:305-318 (1988)

Pearson and Lipman Proč. Nati. Acad. Sci. (U.S.A.) 85:2444 (1988)

Perez et al. Immunity 6:411-7 (1997)

Perrin et al. Immunol Res 14:189-99 (1995)

Perrin et al. J. Immunol 157:1333-6 (1996)

PinallaetaL Biotechniques 13:901-905 (1992)

Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton, Ed., W. H. Freeman and Com pany, New York (1984))

Razi-Wolf et al. Proč. Nati Acad Sci U S A 90:11182-6 (1993)

Remingtonů Pharmaceutical Sciences (15^,h ed, Mack Publishing Company, Easton, PA (1975)), particularly Chapter 87 by Blaug, Seymour

Rizo and Gierasch Ann. Rev. Biochem. 61:387 (1992)

Russel et al. Nucl. Acids Research 21:1081-1085 (1993)

Schwart Cell 71:1065 (1992)

Scott TIBS 17:241-245 (1992)

Smith and Waterman Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)

Songsivilai & Lachmann Clin. Exp. Immunol 79:315-321 (1990)

Stec et al. J. Am. Chem. Soc. 106:3209 (1988)

Taylor et al„ ,.A transgenic mouše that express a diversity of human sequence heavy and light chain immunoglobulins.“ Nucleic Acids Research 20:6287-6295 (1992)

Taylor et al., „Human immunoglobulin transgenes undergo rearrangement, somatic mutation and class switching in mice that lack endogenous IgM.“ International Immunology 6:579-591 (1994)

The McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (Parker, S., Ed., McGraw-Hill, San Francisco (1985))

Thomton et al. Nátuře 354:105 (1991)

Tivol et al. Immunity 3:541-7 (1995)

Townsend and Allison Science 259:368 (1993)

Traunecker et al. Int. J. Cancer (Suppl.) 7:51-52 (1992)

Tuaillon et al. „Analysis of direct and inverted DJ_H rearrangements in a human lg heavy chain transgenic minilocus J. Immunol. 154:6453-6465 (1995)

Tuaillon et al., „Human immunoglobulin heavy-chain minilocus recombination in transgenic mice: gene-segment use in μ and γ transcripts.“ Proč. Nati. Acad. Sci. USA 90:3720-3724 (1993) (Jhlmann and Peyman Chemical Reviews 90:543 (1990)

Van Parijs et al. J. Exp. Med 186:1119-28 (1997)

Veber and Freidinger TINS p.392 (1985)

Vitetta Immunol Today 14:252 (1993)

Walunaset al. Immunity 1:405-13 (1994)

Walunas et al../. Exp. Med 183:2541-50 (1996)

Waterhouse et al. Science 270-985-988 (1995)

- 105 C7. 302706 B6

Winter and Harris Immunol Today 14:43- 46 (1993)

Wright et al· Crit Reviews in Immunol. 12:125-168 (1992)

Yang et al. Cancer Res 57:4036-41 (1997)

Υί-qun et al. Int. immunol. 8:37—44 {1996) ? Zon et al. Anti-Cancer Drug Design 6:539 (1991)

Zon et al. Oligonucleotides and Analogues: A Pracíical Approach, pp. 87-108 (F. Eckstein, Ed., Oxford University Press, Oxford England (1991)

Fry et ai. „Specific, irreversible inactivation of the epidermal growth factor receptor and erbB2, by a new class of tyrosine kinase inhibitor“ Proč Nati Acad Sci U SA 95:12022-7 (1998) ío Hoffman et al. „A model of Cdc25 phosphatase catalytic domain and Cdk-interaction surface based on the presence of a rhodanese homology domain“ J Mol Biol 282-195-208 (1998)

Ginalski et al. „Modelling of active forms of protein kinases: p38-a čase study“ Acta Biochem Pol 44:557-64(1997)

Jouko et al. „Identification of csk tyrosine phosphorylation sites and a tyrosine residue important i? for kinase domain structure“ Biochem J322:927-35 (1997)

Singh et al. „Structure-based design of a potent, selective, and irreversible inhibitor of the catalytic domain of the erbB receptor subťamily of protein tyrosine kinases“ J. Med Chem 40:1130-5 (1997)

Mandel et al. „ABGEN: a knowledge-based automatcd approach for antibody structure model ing“ Nat Biotechnol 14:323-8 (1996)

Monfardini et al. „Rational design, analysis, and potential utility of GM-CSF antagonists“ Proč. Assoc Am Physicžans 108:420-31 (1996)

Furet et al. „Modeling study of protein kinase inhibitors: binding mode of staurosporine and origin ofthe selectivity of CGP 52411“ JCompui AidedMol Des 9:465-72 (1995)

III et al. „Design and construction of a hybrid immunoglobulin domain with properties of both heavy and light chain variable regíons“ Protein Eng 10:949—57 (1997)

Martin et al. „The affinity-selection of a minobody polypeptide inhibitor of human interleukin6“ EMBO J 13:5303-9 (1994) so Přihlášky vynálezu USA:

U.S. Patent Application Seriál No U.S. Patent Application Seriál No, U.S. Patent Application Seriál No,

U.S. Patent Application Seriál No, U.S. Patent Application Seriál No. U.S. Patent Application Seriál No. U.S. Patent Application Seriál No, U.S. Patent Application Seriál No.

U.S. Patent Application Seriál No, U.S. Patent Application Seriál No. U.S. Patent Application Seriál No. U.S. Patent Application Seriál No. U.S. Patent Application Seriál No.

07/466,008, fi led January 12, 1990 07/574.748, filed August 29, 1900 07/575,962, filed August 31, 1990 07/610,515, filed November 8, 1990 07/810,279, filed December 17, 1991 07/853,408, filed March 18, 1992 07/904,068, filed June 23, 1992 07/919,297, filed July 24, 1992 07/922,649, filed July 30, 1992 07/990,860, filed December 16, 1992 08/031,801, filed March 15, 1993 08/053,131, filed Apríl 26, 1993 08/096.762, filed July 22, 1993

- 106 CZ 302706 B6

U.S. Patent Application Seriál No. 08/112,848, filed August 27, 1993 U.S. Patent Application Seriál No. 08/155,301, filed November 18, 1993 U.S. Patent Application Seriál No. 08/161,739, filed December 3, 1993 U.S. Patent Application Seriál No. 08/165,699, filed December 10, 1993 s U.S. Patent Application Seriál No. 08/209,741, filed March 9, 1994 U.S. Patent Application Seriál No. 08/234,145, filed Apríl 28, 1994 U.S. Patent Application Seriál No. 08/724,752, filed October 2, 1996 U.S. Patent Application Seriál No. 08/730,639, filed October 11, 1996 U.S. Patent Application Seriál No. 08/759,620, filed December 3, 1996 io U.S. Patent Application Seriál No. 08/759,672, filed December 3, 1996

Patenty USA:

U.S,

U.S,

U.S

U.S.

U.S.

U.S,

U.S.

U.S,

U.S

U.S,

IJ.S

U.S

U.S,

U.S,

U.S

U.S,

U.S,

U.S

U.S.

U.S.

U.S.

U.S.

U.S.

U.S.

U.S,

U.S.

U.S.

U.S

U.S

U.S.

Patent No: Patent No Patent No Patent No Patent No Patent No Patent No Patent No Patent No Patent No Patent No Patent No Patent No Patent No Patent No Patent No Patent No Patent No Patent No Patent No Patent No Patent No Patent No Patent No Patent No Patent No Patent No Patent No Patent No Patent No

4,399,216

4,681,581

4,683,195

4,683,202

4,735,210

4,740,461

4,816,397

4,912,040

4,959,455

5,101,827

5,102,990

5,151,510

5,194,594

5,434,131

5,530,101

5.545.806

5.545.807 5,585,089 5,591,669 5,612,205 5,625,126 5,625,825 5,633,425 5,643,763 5,648,471 5,661,016 5,693,761 5,693,792 5,697,902 5,703,057

107CZ 302706 B6

U.S

U.S

U.S

U.S

U.S U.S U.S U.S U.S o U.S

Patent No: Patent No: Patent No: Patent No Patent No: Patent No: Patent No: Patent No Patent No Patent No

5,714.350

5,721,367 5,733,743 5,770,197 5,770,429 5,773,253 5,777,085 5,789,215 5,789,650 5,81 1,097

Evropské patenty:

European Patent No. EP 0 546 073 Bl

European Patent No. EP0463 151, Bl, grant published June 12, 1996 Mezinárodní přihlášky PCT:

Internationa

Internationa

Internationa

Internationa

Internationa

Internationa

Internationa

Internationa

Patent Application No. WO 92/02190 Patent Application No. WO 92/0391 8 Patent Application No. WO 92/22645 Patent Application No. WO 92/22647 Patent Application No. WO 92/22670 Patent Application No. WO 93/0043 1 Patent Application No. WO 93/12227 Patent Application No. WO 94/00569

Internationa

Internationa

Internationa

Internationa

Internationa

Internationa

Internationa

Internationa

Patent Application No. WO 94/02602, published February 3, 1994

Patent Application No. WO 94/25585

Patent Application No. WO 94/29444

Patent Application No. WO 95/01994

Patent Application No. WO 95/03408

Patent Application No. WO 95/24217

Patent Application No. WO 95/33770

Patent Application No. WO 96/14436

Internationa

Internationa

Internationa

Internationa

Internationa

Internationa

Patent Application No. WO 96/34096, published October 31,1996

Patent Application No. WO 97/13852

Patent Application No. WO 97/20574

Patent Application No. WO 97/38137

Patent Application No. WO 98/24884

Patent Application No. WO 98/24893, published June 1 1, 1998

Ekvivalenty

- 108CZ 302706 B6

Popis vynálezu a příklady výhodných provedení uvádějí dle původců nej výhodnější provedení vynálezu. Je však zřejmé, že vynález lze realizovat různými ekvivalentními způsoby. Předmět vynálezu je definován následujícími patentovými nároky ajejich ekvivalenty.

Claims (19)

1. PATENTOVÉ NÁROKY io

   1. Lidská monoklonální protilátka, která se váže na antigen 4 cytotoxických T lymfocytů (CTLA—4) nebo její antigen-vázající fragment, kde uvedená protilátka obsahuje aminokyselinové sekvence CDRI, CDR2 a CDR3 uvedené v SEKVENCI ID. Č. 70 a aminokyselinové sekvence CDRI, CDR2 a CDR3 uvedené v SEKVENCI ID. Č. 71.
2. 2. Protilátka nebo její antigen-vázající fragment podle nároku 1, kde lehký řetězec uvedené protilátky obsahuje aminokyselinovou sekvenci SEKVENCE ID. Č. 71.
3. 3. Protilátka nebo její antigen-vázající fragment podle nároku I, kde těžký řetězec uvedené 20 protilátky obsahuje aminokyselinovou sekvenci SEKVENCE ID. Č. 70.
4. 4. Protilátka nebo její antigen-vázající fragment podle nároku 1, kde uvedená protilátka obsahuje aminokyselinovou sekvenci variabilního úseku těžkého řetězce v SEKVENCE ID. Č. 70 a aminokyselinovou sekvenci variabilního úseku lehkého řetězce v SEKVENCI ID. Č. 71.
5. 5. Protilátka podle nároku 1, kde protilátka obsahuje aminokyselinovou sekvenci těžkého řetězce SEKVENCE ID. Č. 70 a aminokyselinovou sekvenci lehkého řetězce SEKVENCE ID. Č. 71.
6. 6. Protilátka nebo její antigen-vázající fragment podle nároku 1, kde uvedená protilátka nebo io její antigen-vázající fragment má jednu nebo více vlastností zvolených ze skupiny sestávající z následujících vlastností:

   a) kompetitivně inhibuje vazbu CTLA-4 s protilátkou podle některého z nároků 4 nebo 5;

   b) váže se na stejný epitop jako uvedená protilátka podle některého z nároků 4 nebo 5; a

   35 c) váže se na CTLA-4 se stejnou specifičností jako protilátka podle některého z nároků 4 nebo 5.
7. 7. Protilátka nebo její antigen-vázající fragment podle nároku 1, přičemž uvedená protilátka nebo její antigen-vázající fragment kompetitivně inhibuje vazbu CTLA-4 s protilátkou obsahují40 cí aminokyselinovou sekvenci těžkého řetězce SEKVENCE ID. Č. 70 a aminokyselinovou sekvenci lehkého řetězce SEKVENCE ID. Č. 71.
8. 8. Monoklonální protilátka, která se váže na CTLA-4, nebo její antigen-vázající fragment, přičemž uvedená protilátka obsahuje:

   a) těžký řetězec obsahující aminokyselinovou sekvenci SEKVENCE ID. Č. 9 nebo aminokyselinovou sekvenci s ní alespoň z 90 % identickou; a

   b) lehký řetězec obsahující aminokyselinovou sekvenci SEKVENCE ID. Č. 22 nebo aminoky50 setinovou sekvenci s ní alespoň z 90 % identickou, přičemž uvedená protilátka nebo její antigen-vázající fragment má vazebnou afinitu pro CTLA 4

   19“⁹ M nebo vyšší, inhibuje vazbu mezi CTLA-4 a B7-1 s ICso 100 nM nebo nižší a inhibuje vazbu mezi CTLA-4 a B7-2 s IC₅₀ 100 nM nebo nižší.

   -109CZ 302706 B6
9. 9. Proti látka nebo její antigen-vázající fragment podle některého z nároku 1 až 8, kde uvedená protilátka nebo fragment inhibuje vazbu lidského C I LA 4 na B7-1 s IC™ 100 nM nebo nižší a inhibuje vazbu lidského CTLA-4 na B7-2 s ÍC™ lOOnM nebo nižší, přičemž uvedená

   5 protilátka má alespoň jednu vlastnost zvolenou ze skupiny sestávající z následujících vlastností:

   a) váže se na CTLA-4 s vazebnou afinitou
10. 10 ⁹ M nebo vyšší;

    b) zvyšuje produkci cytokinu v testu lidských T lymfocytů o 500 pg/ml nebo více; e) zvyšuje produkci IL—2 v testu lidských T lymfocytů o 500 pg/ml nebo více;

    io d) zvyšuje produkci interferonu-γ v testu lidských T lymfocytů o 500 pg/ml nebo více;

    e) naváže se na CTLA-4 myši, potkana nebo králíka a

    f) váže se na CTLA—4 cynomologního makaka (Meicaca jáscicularis) a rhesus makaka (Macaca muUata).

    15 10. Protilátka nebo její antigen-vázající fragment podle nároku 9, kde uvedená protilátka inhibuje vazbu lidského CTLA-4 na B7-1 s IC™ 0,50 nM nebo nižší a inhibuje vazbu lidského CTLA-4 na B7-2 s IC™ 0,38 nM nebo nižší.
11. 11. Farmaceutická kompozice pro léčení rakoviny a zánětlivých nebo autoimunitních onemoc30 nění, vyznačená tím, že obsahuje protilátku nebo fragment podle některého z nároků 1 až 10 a farmaceuticky přijatelný nosič.
12. 12. Buněčná linie produkující protilátku nebo fragment podle některého z nároků 1 až 10.

    25
13. 13. Izolovaná molekula nukleové kyseliny, která kóduje těžký řetězec nebo jeho antigen-vázající fragment nebo lehký řetězec nebo jeho antigen-vázající fragment protilátky podle některého z nároků 1 až 10.
14. 14. Izolovaná molekula nukleové kyseliny podle nároku 13 operativně spojená s kontrolní

    30 expresní sekvencí.
15. 15. Hostitelská buňka obsahující izolovanou molekulu nukleové kyseliny podle nároku 13 nebo 14.

    35
16. 16. Použití protilátky nebo jejího fragmentu podle některého z nároků 1 až 10 nebo farmaceutické kompozice podle nároku 11 pro výrobu léčiva pro zvýšení tvorby cytokinu v T buňkách.
17. 17. Použití protilátky nebo jejího fragmentu podle některého z nároků 1 až 10 nebo farmaceutické kompozice podle nároku 11 pro výrobu léčiva pro zesílení odezvy cytotoxických T buněk.
18. 18. Použití podle nároku 17, kdy se protilátka nebo její fragment nepodílejí na cytotoxicitě závislé na komplementu.
19. 19. Použití kombinace obsahující protilátku nebo jejího fragmentu podle některého z nároků 1

    45 až. 10 nebo farmaceutické kompozice podle nároku 11 a buněk exprimujících faktor stimulující kolonie granulocytů-makrofágu pro výrobu léčiva pro léčení nádoru u subjektu trpícího tímto nádorem.