CN101868241A - 表达生物治疗分子的治疗基因开关构建物和生物反应器以及它们的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及通过将控制一种或多种治疗产物表达的治疗基因开关引入对象细胞从而治疗、缓解或预防对象中疾病或病症的方法和组合物。

Description

表达生物治疗分子的治疗基因开关构建物和生物反应器以及它们的应用
发明背景
发明领域
本发明涉及通过将治疗基因开关构建物(therapeutic gene switch construct)引入某对象来治疗、缓解或预防该对象中疾病、病症或病状的方法和组合物，所述构建物控制一种或多种治疗产物的表达。在进一步的实施方式中，本发明涉及通过将“生物反应器”引入某对象来治疗、缓解或预防该对象中疾病、病症或病状的方法和组合物，所述“生物反应器”是由分泌治疗性蛋白质的一个或多个细胞构成的治疗性植入物。生物反应器可以通过包裹化而是免疫分离的，或是非免疫分离的。在具体的实施方式中，生物反应器包含治疗基因开关构建物。
发明背景
通过将编码治疗分子，例如治疗多肽或治疗多核苷酸的多核苷酸引入对象的细胞，或将分泌治疗分子的工程改造的修饰细胞引入对象来治疗或预防该对象中疾病的概念已存在了数年。该概念的几个实际问题阻碍了成功治疗的发展。将遗传材料直接引入待治疗对象的难点例如有：递送的安全性、在充足的时期内获得表达水平充足的治疗产物、治疗产物至所需细胞的表达有限和调节或刺激治疗产物表达的能力的保持，包括如果不再需要可关闭治疗产物表达的能力。基于细胞的治疗会通过对象的免疫反应而受排斥，因此，开发了免疫分离方案，例如细胞包裹化方法来增加所植入细胞的寿命并能利用异种细胞，即，不同物种的细胞。目前的包裹化或非包裹化细胞治疗经工程改造能组成型分泌治疗蛋白质。一旦植入，蛋白质分泌即不能调节。为提高直接或细胞介导的生物反应器治疗蛋白递送的安全性和临床应用，优选能关闭蛋白质产生或调节发生蛋白质产生的速度。
因此，本领域需要提供这些理想特征的新诊断方法和组合物。
发明概述
本发明涉及治疗、缓解或预防对象中疾病、病症或病状的方法和组合物。
在一个实施方式中，本发明提供治疗、缓解或预防对象中疾病、病症或病状的方法，包括：
(a)将以下多核苷酸引入所述对象：(1)编码基因开关(gene switch)的第一多核苷酸，所述基因开关包含至少一个与治疗开关启动子(therapeutic switchpromoter)操作性相连的转录因子序列，其中所述至少一个转录因子序列编码配体依赖性转录因子，其中所述治疗开关启动子是组成型活化的，和(2)与因子调节的启动子(factor-regulated promoter)操作性相连的编码治疗多肽或治疗多核苷酸的第二多核苷酸，该启动子由所述配体依赖性转录因子活化，其中，引入所述第一和第二多核苷酸从而使得它们在有配体存在下表达；和
(b)将配体给予该对象以诱导该治疗多肽或治疗多核苷酸表达。
本发明的进一步实施方式提供在对象中表达治疗多肽或治疗多核苷酸的方法，包括：
(a)将以下多核苷酸引入对象：(1)编码基因开关的第一多核苷酸，所述基因开关包含至少一个与治疗开关启动子操作性相连的转录因子序列，其中所述至少一个转录因子序列编码配体依赖性转录因子，其中所述治疗开关启动子在待治疗疾病、病症或病状相关的情况下活化，和(2)与因子调节的启动子操作性相连的编码治疗多肽或治疗多核苷酸的第二多核苷酸，该启动子由所述配体依赖性转录因子活化，其中，引入所述第一和第二多核苷酸从而使得它们在该疾病、病症或病状相关的情况下在该对象中表达；和
(b)将配体给予该对象以诱导该治疗多肽或治疗多核苷酸表达。
本发明的进一步实施方式提供在对象中表达治疗多肽或治疗多核苷酸的方法，包括：
(a)将以下多核苷酸引入对象：(1)编码基因开关的第一多核苷酸，所述基因开关包含至少一个与治疗开关启动子操作性相连的转录因子序列，其中所述至少一个转录因子序列编码配体依赖性转录因子，其中所述治疗开关启动子在可通过该治疗多肽或治疗多核苷酸治疗的疾病、病症或病状相关的情况下活化，和(2)与因子调节的启动子操作性相连的编码治疗多肽或治疗多核苷酸的第二多核苷酸，该启动子由所述配体依赖性转录因子活化，其中，引入所述第一和第二多核苷酸从而所述第一多核苷酸在该疾病、病症或病状相关的情况下表达；和
(b)将配体给予该对象以诱导该治疗多肽或治疗多核苷酸表达。
在上述方法中，在一个实施方式中，编码治疗基因开关的所述第一多核苷酸和与因子调节的启动子相连的编码治疗多肽或多核苷酸的所述第二多核苷酸是较大多核苷酸，例如载体的一部分。在另一实施方式中，编码治疗基因开关的所述第一多核苷酸和与因子调节的启动子相连的编码治疗多肽或多核苷酸的所述第二多核苷酸是不同的多核苷酸，二者可作为核酸组合物给予。
本发明还涉及可用于所述方法中的治疗基因开关构建物。
本发明还涉及包含本发明治疗基因开关构建物的载体。
本发明还提供在一个或多个修饰细胞中表达治疗多肽或治疗多核苷酸的方法，包括：
(a)将以下多核苷酸引入对象从而产生修饰的细胞：(1)编码基因开关的第一多核苷酸，所述基因开关包含至少一个与治疗开关启动子操作性相连的转录因子序列，其中所述至少一个转录因子序列编码配体依赖性转录因子，其中所述治疗开关启动子在疾病、病症或病状相关的情况下活化，和(2)与因子调节的启动子操作性相连的编码治疗多肽或治疗多核苷酸的第二多核苷酸，该启动子由所述配体依赖性转录因子活化，；和
(b)将配体给予修饰的细胞以诱导所述治疗多肽或治疗多核苷酸表达。
本发明还涉及包含本发明治疗基因开关构建物的修饰细胞。
本发明还涉及包含本发明修饰细胞的生物反应器器件，所述细胞未经包裹化或经包裹化从而保护细胞免受对象的免疫系统影响。这种生物反应器可采取诸如包被细胞、微囊化(microencapsulation)细胞或大包裹化(macroencapsulation)细胞等形式。
本发明还涉及实施本发明方法的试剂盒，其装有，例如基因开关构建物、载体、配体等。
附图简述
图1显示了本发明治疗基因开关的实施方式，其中编码配体依赖性转录因子复合物的两个不同部分的两个转录因子序列受单一启动子的控制。″AD″表示反式激活域；″HP″表示异二聚伴侣结构域(heterodimerization partnerdomain)。AD和HP结构域表达为融合蛋白，称为“共活化蛋白”或“CAP”。″DBD″表示DNA结合结构域；″LBD″表示配体结合结构域。DBD和LBD结构域表达为融合蛋白，称为“配体依赖性转录因子”或“LTF”。“转录接头”表示IRES(内部核糖体进入位点)或是从单一开放读框产生两个不同蛋白产物的手段。“治疗产物序列”表示编码治疗多肽或治疗多核苷酸的多核苷酸；“治疗产物”表示治疗多肽或治疗多核苷酸；“TSP-1”表示组成型治疗开关启动子、或在疾病、病症或病状相关条件下活化的治疗开关启动子。CAP和LTF组合形成配体依赖性转录因子复合物(LDTFC)，其与配体组合后活化因子调节的启动子(FRP)。
图2显示了本发明治疗基因开关的实施方式，其中编码配体依赖性转录因子复合物的两个不同部分的两个转录因子序列(CAP和LTF)受不同启动子的控制。术语AD、HP、CAP、DBD、LBD、LTF、″治疗产物序列″、″治疗产物″、TSP、LDTFC和FRP如图1中的图标所定义。“TSP-1”和“TSP-2”表示两种不同的治疗开关启动子，二者各自独立为组成型启动子、或在疾病、病症或病状相关条件下活化的启动子。在一个实施方式中，TSP-1是组成型启动子，TSP-2是在疾病、病症或病状相关条件下活化的启动子。CAP和LTF组合形成LDTFC，其与配体组合后活化FRP。
图3显示了本发明治疗基因开关的实施方式，其中可组合形成两个不同LDTFC的三个转录因子序列(CAP、LTF-1和LTF-2)受不同启动子的控制。术语AD、HP、CAP、DBD、LBD、LTF、″治疗产物序列″、″治疗产物″、TSP、LDTFC和FRP如图1中的图标所定义。DBD-A表示与LBD融合以形成LTF-1的第一DNA结合结构域；DBD-B表示与LBD融合以形成LTF-2的第二DNA结合结构域。“治疗产物A”表示第一治疗多肽或治疗多核苷酸；“治疗产物B”表示第二治疗多肽或治疗多核苷酸；TSP-1、TSP-2和TSP-3表示三种不同的治疗开关启动子，三者各自独立为组成型启动子、或在疾病、病症或病状相关条件下活化的启动子。在一个实施方式中，TSP-1是组成型治疗开关启动子，TSP-2和TSP-3各自是在疾病、病症或病状相关条件下独立活化的不同治疗开关启动子。CAP和LTF-1组合形成LDTFC-1，其与配体组合后活化FRP-1。CAP和LTF-2组合形成LDTFC-2，其与配体组合后活化FRP-2。
图4显示了本发明治疗基因开关的实施方式，其中编码CAP和配体依赖性转录因子复合物的两个不同LTF部分的三个转录因子序列不同启动子的控制。术语AD、HP、CAP、DBD、LBD、LTF、″治疗产物序列″、″治疗产物″、TSP、LDTFC和FRP如图1中的图标所定义。TSP-1、TSP-2和TSP-3表示三种不同的治疗开关启动子，三者各自独立为组成型启动子、或在疾病、病症或病状相关条件下活化的启动子。在一个实施方式中，TSP-1是组成型启动子，TSP-2和TSP-3各自是在疾病、病症或病状相关条件下独立活化的不同启动子。LTF-1或LTF-2可与CAP组合形成LDTFC-1或LDTFC-2。LDTFC-1或LDTFC-2与配体组合后活化FRP。
图5是在图1所示方案下构建的载体的示意图，其经工程改造从而能在缺氧，例如心肌缺血条件下表达胰岛素生长因子(IGF-1)。
图6是在图2所示方案下构建的载体的示意图，其经工程改造从而能在缺氧，例如心肌缺血条件下表达碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)。
图7是在图2所示方案下构建的载体的示意图，其经工程改造从而能在缺氧，例如心肌缺血条件下表达促红细胞生成素(EPO)。
图8是在图2所示方案下构建的载体的示意图，其经工程改造从而能在缺氧，例如心肌缺血条件下表达人B型利钠肽(BNP)。
图9是在图2所示方案下构建的载体的示意图，其经工程改造从而能在炎性，例如心肌缺血条件下表达组织纤维蛋白溶酶原激活剂(tPA)。
图10是在图3所示方案下构建的载体的示意图，其经工程改造从而能在炎性条件下表达松弛素和/或在缺氧的条件下表达肝细胞生长因子，两种条件均与心肌缺血有关。
图11是在图2所示方案下构建的载体的示意图，其经工程改造从而能在缺氧，例如心肌缺血条件下表达EPO，其中表达局限于心脏细胞。
图12是在图4所示方案下构建的载体的示意图，其经工程改造从而能在炎性条件或缺氧，例如心肌缺血条件下表达IGF-1，其中表达局限于心脏细胞。
图13是在图1所示方案下构建的载体的示意图，其经工程改造从而能在炎性条件，例如类风湿性关节炎的条件下表达肿瘤坏死因子结合蛋白2
Figure GPA00001141248200061
图14是在图4所示方案下构建的载体的示意图，其经工程改造从而能对TNFα表达起反应或在炎性条件下表达肿瘤坏死因子结合蛋白2
Figure GPA00001141248200062
两种条件均与类风湿性关节炎有关。
图15是在图3所示方案下构建的载体的示意图，其经工程改造从而能对在炎性条件下表达肿瘤坏死因子结合蛋白2
Figure GPA00001141248200063
和/或在HIF-驱动的缺氧的条件下表达EPO，两种条件均与类风湿性关节炎有关。
图16是在图1所示方案下构建的载体的示意图，其经工程改造从而能组成型表达人因子VIII：C。
图17是在图2所示方案下构建的载体的示意图，其经工程改造从而能在血友病相关缺氧条件下表达人因子VIII：C。
发明详述
本发明涉及利用基因开关在细胞中表达治疗多肽或治疗多核苷酸的方法和组合物。所述方法和组合物可在体外、离体或体内应用。本发明还利用基因开关控制治疗多肽或治疗多核苷酸表达以便治疗、缓解或预防对象中疾病、病症或病状的方法和组合物。本发明方法可离体(通过将基因开关引入对象的分离细胞或非自体细胞，并将该修饰细胞引入该对象或引入不同对象)或在体内(通过将基因开关直接引入对象的细胞)进行。本发明方法涉及利用配体依赖性转录因子的表达在一个或多个治疗开关启动子控制下的基因开关。所述方法还包括但不限于：应用基因开关技术将非包裹化和包裹化细胞治疗直接引入待治疗对象。本文所述方法和组合物提供高度特异性和严格调节的治疗技术，其中通过将配体给予包含该基因开关的细胞来控制治疗产物表达的水平和定时。
提供以下定义以帮助理解本发明的范围和实施。
出于本发明的目的，术语“分离的”指从其原始环境(其天然存在的环境)取出的生物学材料(细胞、核酸或蛋白质)。例如，存在于植物或动物的天然状态中的多核苷酸不是分离的，然而，与其天然存在的毗邻核酸相分离的同一多核苷酸认为是“分离的”。
适用于生物学材料的术语“纯化的”不要求该材料的存在形式显示绝对纯度，排除其它化合物的存在。其不过是一种相对的定义。
“核酸”、“核酸分子”、“寡核苷酸”和“多核苷酸”可互换使用，指单链形式或双链螺旋形式的核糖核苷(腺苷、鸟苷、尿苷或胞苷；“RNA分子”)或脱氧核苷(脱氧腺苷、脱氧鸟苷、脱氧胸苷或脱氧胞苷；“DNA分子”)的磷酸酯聚合形式，或它们的任何磷酸酯类似物，例如硫代磷酸酯和硫酯。双链DNA-DNA、DNA-RNA和RNA-RNA螺旋是可能的。术语核酸分子，特别是DNA或RNA分子仅指该分子的一级和二级结构，并不将其局限于任何具体的三级形式。因此，该术语包括在线形或环状DNA分子(例如，限制性片段)、质粒、超螺旋化DNA和染色体中发现的双链DNA，等等。讨论具体双链DNA分子的结构时，本文可根据沿DNA的非转录链(即，具有与mRNA同源的序列的链)仅以5’到3’方向给出序列的正常惯例描述序列。“重组DNA分子”是经过分子生物学操作的DNA分子。DNA包括但不限于：cDNA、基因组DNA、质粒DNA、合成DNA和半合成DNA。本发明的“核酸组合物”包含本文所述的一种或多种核酸。
应用于多核苷酸序列的术语“片段”指相对于参比核酸长度降低并在共同部分包含与参比核酸相同的核苷酸序列的核苷酸序列。本发明的这种核酸片段可以适当地包含在作为其成分的较大多核苷酸中。这种片段包含长度为至少6、8、9、10、12、15、18、20、21、22、23、24、25、30、39、40、42、45、48、50、51、54、57、60、63、66、70、75、78、80、90、100、105、120、135、150、200、300、500、720、900、1000、1500、2000、3000、4000、5000或更多个本发明核酸的连续核苷酸的寡核苷酸或由它们构成。
本文所用的“分离的核酸片段”指单链或双链RNA或DNA聚合物，任选含有合成、非天然或改变的核苷酸碱基。DNA聚合物形式的分离的核酸片段可包含cDNA、基因组DNA或合成DNA的一个或多个片段。
“基因”指包含编码功能分子的核苷酸的多核苷酸，包括仅通过转录产生(例如，生物活性RNA分子)或通过转录和翻译(例如，多肽)的功能分子。术语“基因”包括cDNA和基因组DNA核酸。“基因”还指表达特定RNA、蛋白质或多肽的核酸片段，其在编码序列之前(5’-非编码序列)和之后(3’-非编码序列)包含调控序列。“天然基因”指天然发现的包含其本身调控序列的基因。“嵌合型基因”指非天然基因的任何基因，其包含未在自然界中一起发现的调控和/或编码序列。因此，嵌合型基因可包含衍生自不同来源的调控序列和编码序列，或衍生自同一来源的调控序列和编码序列，但排列方式不同于天然发现的。嵌合型基因可包含衍生自不同来源的编码序列和/或衍生自不同来源的调控序列。“内源性基因”指在生物体的基因组中其天然位置发现的天然基因。“外来”基因或“异源”基因指不是宿主机体中正常发现的，而是通过基因传递引入该宿主机体的基因。外来基因可包含插入非天然机体中的天然基因，或嵌合型基因。“转基因”是通过转化方法引入基因组的基因。
“异源DNA”指不是天然位于细胞中，或细胞的染色体位点中的DNA。异源DNA可包括细胞的外来基因。
术语“基因组”包括染色体以及线粒体、叶绿体和病毒DNA或RNA。
当单链形式的核酸分子可在合适的温度和溶液离子强度的条件下与另一核酸分子退火时，称该核酸分子可与该另一核酸分子，例如cDNA、基因组DNA或RNA“杂交”。杂交和洗涤条件是本领域熟知的，例子见Sambrook等，刊于Molecular Cloning：ALaboratory Manual(分子克隆：实验室手册)，第二版，冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)，冷泉港(1989)，特别是其中的第11章和表格11.1(通过引用全文纳入本文)。温度和离子强度的条件决定了杂交的“严谨性”。
可调整严谨性条件以筛选适度相似的片段，例如远相关生物体的同源性序列，筛选高度相似片段，例如复制极其相关生物体的功能酶的基因。对于初步筛选同源性核酸，可采用对应于Tm为55℃的低严谨性杂交条件，例如，5XSSC、0.1％SDS、0.25％奶，无甲酰胺；或者30％甲酰胺、5X SSC、0.5％SDS。中等严谨性杂交条件对应于较高的Tm，例如，40％甲酰胺，和5X或6X SSC。高度严谨性杂交条件对应于最高Tm，例如50％甲酰胺，5X或6X SSC。
杂交要求两个核酸含有互补序列，虽然取决于杂交的严谨性，但碱基之间的错配是可能的。利用术语“互补”描述能彼此杂交的核苷酸碱基之间的关系。例如，对于DNA，腺嘌呤与胸腺嘧啶互补，胞嘧啶与鸟嘌呤互补。因此，本发明还包括与本文所公开或所用完整序列以及那些基本上相似的核酸序列互补的分离核酸片段。
在本发明的一个实施方式中，采用包括在Tm为55℃实施杂交步骤的杂交条件并利用上述条件检测多核苷酸。在其它实施方式中，Tm是60℃、63℃或65℃。
杂交后洗涤也决定了严谨性条件。一组条件采用一系列洗涤，开始为6XSSC、0.5％SDS，室温下15分钟(min)；然后替换为2X SSC、0.5％SDS、45℃，30分钟；然后是0.2X SSC、0.5％SDS，50℃，30分钟，重复两次。优选的一组严谨性条件利用较高的温度，其中洗涤与上述相同，除了在0.2XSSC、0.5％SDS中的最后两次30分钟洗涤的温度升高至60℃。优选的另一组高严谨性条件采用65℃，在0.1X SSC、0.1％SDS中进行最后两次洗涤。
杂交核酸的适度严谨性取决于本领域熟知的变量，即核酸长度和互补程度。两条核苷酸序列之间的相似性或同源性越高，具有那些序列的核酸杂交体的Tm值越高。核酸杂交的相对稳定性(对应于较高的Tm)按以下顺序降低：RNA：RNA、DNA：RNA、DNA：DNA。对于长度超过100个核苷酸的杂交体，已有计算Tm的方程(参见Sambrook等，同上，9.50-0.51)。对于与较短核酸，即寡核苷酸杂交，错配的位置更重要，寡核苷酸的长度决定其特异性(参见Sambrook等，同上，11.7-11.8)。
在本发明的一个实施方式中，采用杂交条件检测多核苷酸，所述杂交条件包括在低于500mM盐和至少37℃进行杂交步骤，在2X SSPE中，至少63温度进行洗涤步骤。在另一实施方式中，杂交条件包括在低于200mM盐和至少37℃进行杂交步骤。在进一步的实施方式中，杂交条件包括杂交和洗涤步骤均为2X SSPE和63℃。
在另一实施方式中，可杂交核酸的长度是至少约10个核苷酸。可杂交核酸的最低长度优选至少约15个核苷酸；例如至少约20个核苷酸；例如至少30个核苷酸。此外，技术人员应知道可根据诸如探针长度等因素，视需要调节温度和洗涤溶液盐浓度。
术语“探针”指可与互补的单链靶核酸碱基配对形成双链分子的单链核酸分子。
本文所用的术语“寡核苷酸”指可与基因组DNA分子、cDNA分子、质粒DNA或mRNA分子杂交的短核酸。寡核苷酸可以作标记，例如32p-核苷酸，或是已共价偶连了标记物，例如生物素的核苷酸。标记的寡核苷酸可用作探针来检测核酸的存在。寡核苷酸(其中一条和两条可作标记)可用作PCR引物，用于克隆全长核酸或其片段、用于DNA测序或用于检测核酸的存在。寡核苷酸还可用于和DNA分子形成三螺旋。通常合成制备寡核苷酸，优选用核酸合成仪。因此，可将寡核苷酸制备成含非天然产生的磷酸酯类似键，例如硫酯键等。
“引物”指与靶核酸序列杂交以形成双链核酸区域的寡核苷酸，该区域可用作合适条件下DNA合成的起点。这种引物可用于聚合酶链式反应或DNA测序中。
“聚合酶链式反应”缩写成PCR，指酶促扩增特定核酸序列的体外方法。PCR包括一系列重复的温度循环，其中每个循环包括3个阶段：模板核酸变性以分离靶分子诸链，单链PCR寡核苷酸引物与模板核酸退火，和DNA聚合酶使得退火引物延伸。PCR提供检测核酸的初始组合中靶分子是否存在，以及在定量或半定量条件下测定靶分子相对量的方法。
“逆转录-聚合酶链式反应”缩写成RT-PCR，指从一种或多种RNA分子酶促产生一种或多种cDNA靶分子，然后酶促扩增上述一种或多种cDNA靶分子内一种或多种特定核酸序列的体外方法。RT-PCR还提供检测核酸的初始组合中靶分子是否存在，以及在定量或半定量条件下测定靶分子相对量的方法。
DNA“编码序列”指编码多肽的双链DNA序列，当其置于合适调控序列的控制下，能在细胞中体内或体外转录和翻译成多肽。“合适的调控序列”指位于编码序列上游(5’非编码序列)、其中或下游(3’非编码序列)的核酸序列，其影响相关编码序列的转录、RNA加工或稳定性、或翻译。调控序列可包括启动子、翻译前导序列、内含子、聚腺苷酸化识别序列、RNA加工位点、效应子结合位点和茎环结构。编码序列的边界由5’(氨基)末端的起始密码子和3’(羧基)末端的翻译终止密码子决定。编码序列可包括但不限于：原核生物序列、mRNA的cDNA、基因组DNA序列和甚至是合成DNA序列。如果编码序列要在真核生物中表达，聚腺苷酸化信号和转录终止序列通常位于编码序列的3’。
“开放读框”缩写成ORF，指一定长度的核酸序列，可以是DNA、cDNA或RNA，其包含翻译起始信号或起始密码子，例如ATG或AUG和终止密码子，其有翻译成多肽序列的可能。
本文利用术语“头-对-头”描述两条多核苷酸序列相对彼此的取向。当一条多核苷酸的编码链的5’端毗连另一多核苷酸的编码链的5’端时，该两条多核苷酸以头-对-头取向布置，从而各多核苷酸的转录方向以远离另一多核苷酸的5’端的方向进行。术语“头-对-头”可缩写为(5’)-到-(5’)，还可以符号(←→)或(3’←5’5’→3’)表示。
本文利用术语“尾-对-尾”描述两条多核苷酸序列相对彼此的取向。当一条多核苷酸的编码链的3’端毗连另一多核苷酸的编码链的3’端时，该两条多核苷酸以尾-对-尾取向布置，从而各多核苷酸的转录方向朝另一多核苷酸进行。术语“尾-对-尾”可缩写为(3’)-到-(3’)，还可以符号(→←)或(5’→3’3’←5’)表示。
本文利用术语“头-对-尾”描述两条多核苷酸序列相对彼此的取向。当一条多核苷酸的编码链的5’端毗连另一多核苷酸的编码链的3’端时，该两条多核苷酸以头-对-尾取向布置，从而各多核苷酸的转录方向与另一多核苷酸的转录方向相同。术语“头-对-尾”可缩写为(5’)-到-(3’)，还可以符号(→→)或(5’→3’5’→3’)表示。
术语“下游”指相对参比核苷酸序列3’定位的核苷酸序列。具体地说，下游核苷酸序列通常涉及转录起点后的序列。例如，基因的翻译起始密码子位于转录起点的下游。
术语“上游”指相对参比核苷酸序列5’定位的核苷酸序列。具体地说，上游核苷酸序列通常涉及位于转录编码序列或起点的5’侧的序列。例如，大多数启动子位于转录起点的上游。
术语“限制性内切核酸酶”和“限制性酶”可互换使用，指能结合双链DNA内的特定核苷酸序列并在其中进行切割的酶。
“同源重组”指将外来DNA序列插入另一DNA分子，例如将载体插入染色体。载体优选靶向用于同源重组的特异性染色体位点。对于特异性同源重组，载体可含有足够长的染色体序列的同源性区域，从而载体能互补结合并掺入染色体。同源性区域越长，序列相似性越高可增加同源重组的效率。
可采用本领域已知的几种方法来扩增本发明的多核苷酸。一旦确立合适的宿主系统和生长条件，可大量扩增和制备重组表达载体。如本文所述，可用的表达载体包括但不限于以下载体或它们的衍生物：人或动物病毒，例如痘苗病毒或腺病毒；昆虫病毒，例如杆状病毒；酵母载体；噬菌体载体(例如，λ噬菌体)和质粒及粘粒DNA载体，等等。
“载体”指用于将核酸克隆和/或传递入宿主细胞的任何运载体。载体可以是可与另一DNA区段相连从而复制所连区段的复制子。“复制子”指用作DNA体内复制的自主单元，即能在其本身控制下复制的任何遗传元件(例如，质粒、噬菌体、粘粒、染色体、病毒)。术语“载体”包括用于在体外、离体或体内将核酸引入细胞的病毒和非病毒运载体。本领域已知的大量载体可用于操作核酸、将反应元件和启动子掺入基因，等等。可能的载体包括，例如质粒或修饰的病毒，包括，例如噬菌体，如λ衍生物，或质粒，如pBR322或pUC质粒衍生物，或Bluescript载体。可用于本发明的载体的另一例子是如通过引用纳入本文的WO 2007/038276所述的弗吉尼亚州布莱克斯堡的英特列克星敦公司(Intrexon Corp.，Blacksburg，VA)的UltraVectorTM产生系统。例如，可通过将合适DNA片段连接入具有互补粘性末端的所选载体实现将对应于反应元件和启动子的DNA片段插入合适载体。或者，可对DNA分子的两端作酶促修饰，或者可通过将核苷酸序列(接头)连接入DNA末端来产生任何位点。这种载体可经工程改造而含有可选择标记基因以供选择已将标记掺入细胞基因组的细胞。这种标记能鉴定和/或选择掺入标记并表达其所编码蛋白质的宿主细胞。
病毒载体，特别是逆转录病毒载体已用于细胞以及活的动物对象中的各种基因递送应用。可用的病毒载体包括但不限于：逆转录病毒、腺伴随病毒、痘病毒、杆状病毒、牛痘病毒、单纯疱疹病毒、E-B病毒、腺病毒、双粒病毒和花椰菜花叶病毒载体。非病毒载体包括质粒、脂质体、荷电脂质(细胞转染剂)、DNA-蛋白质复合物和生物聚合物。除核酸外，载体还可包含一个或多个调控区域和/或用于选择、检测和监测核酸传递结果(传递至何种组织、表达持续时间等)的可选择标记。
术语“质粒”指常携带基因的染色体外元件，其不是细胞中心代谢的一部分，通常是环状双链DNA分子的形式。这种元件可以是衍生自任何来源的单链或双链DNA或RNA，线形、环状或超螺旋的自发复制序列、基因组整合序列、噬菌体或核苷酸序列，其中许多核苷酸序列连接或重组入独特构建物中，该构建物能将所选基因产物的启动子片段和DNA序列连同合适的3’非翻译序列引入细胞。
“克隆载体”指“复制子”，其是单位长度的核酸，优选DNA，其顺序复制并包含复制起点，例如质粒、噬菌体或粘粒，另一核酸区段可与其相连从而能复制所连接的区段。克隆载体能在一类细胞中复制，在另一类中表达(穿梭载体)。克隆载体可包含一条或多条序列以便用于选择包含该载体的细胞和/或一个或多个多克隆位点以便插入感兴趣序列。
术语“表达载体”指载体、质粒或运载体，其设计成能在转化入宿主后表达所插入的核酸序列。克隆的基因，即，插入的核酸序列通常置于调控元件，例如启动子、最小启动子、增强子等的控制下。可用于驱动核酸在所需宿主细胞中表达的启动调控区或启动子多种多样，并为本领域技术人员所熟悉。基本上能驱动这些基因表达的任何启动子可用于表达载体，包括但不限于：病毒启动子、细菌启动子、动物启动子、哺乳动物启动子、合成启动子、组成型启动子、组织特异性启动子、病因或疾病相关启动子、发育特异性启动子、诱导型启动子、光调节启动子(light regulated promoter)；CYC1、HIS3、GAL1、GAL4、GAL10、ADH1、PGK、PHO5、GAPDH、ADC1、TRP1、URA3、LEU2、ENO、TPI、碱性磷酸酶启动子(用于在酵母(Saccharomyces)中表达)；AOX1启动子(用于在毕赤酵母(Pichia)中表达)；β-内酰胺酶、lac、ara、tet、trp、lPL、lPR、T7、tac、和trc启动子(用于在大肠杆菌(Escherichia coli)中表达)；光调节-、种子特异性-、花粉特异性-、子房特异性的、花椰菜花叶病毒35S、CMV 35S最低、木薯叶脉花叶病毒(CsVMV)、叶绿素a/b结合蛋白、核酮糖1，5-二磷酸羧化酶、枝条-特异性、根特异性、几丁质酶、应激诱导型、水稻东格鲁杆状病毒、植物超级启动子、马铃薯亮氨酸氨肽酶、硝酸盐还原酶、甘露碱合酶、胭脂碱合酶、泛素、玉米蛋白和花青甙启动子(可用于在植物细胞中表达)；本领域已知的动物和哺乳动物启动子，包括但不限于SV40早期(SV40e)启动子区域、劳斯肉瘤病毒(RSV)的3’长末端重复(LTR)中所含的启动子、腺病毒(Ad)的E1A或主要晚期启动子(MLP)基因的启动子、巨细胞病毒(CMV)早期启动子、单纯疱疹病毒(HSV胸苷激酶(TK)启动子、杆状病毒IE1启动子、延伸因子1α(EF1)启动子、磷酸甘油酸酯激酶(PGK)启动子、泛素(Ubc)启动子、白蛋白启动子、小鼠金属硫蛋白-L启动子的调控序列和转录调控区、遍在启动子(ubiquitouspromoter)(HPRT、波形蛋白、α-肌动蛋白、微管蛋白等)、中间丝的启动子(索蛋白、神经丝、角蛋白、GFAP等)、治疗基因的启动子(MDR、CFTR或VIII型因子等的)、病因或疾病相关启动子、和显示组织特异性并已用于转基因动物中的启动子，例如在胰腺腺泡细胞中有活性的弹性蛋白酶I基因调控区；在胰腺β细胞中有活性的胰岛素基因调控区、在淋巴细胞中有活性的免疫球蛋白基因调控区、在睾丸、乳腺、淋巴和肥大细胞中有活性的小鼠乳腺肿瘤病毒调控区；白蛋白基因、在肝中有活性的Apo AI和ApoAII调控区、在肝中有活性的α-胎蛋白基因调控区、在肝中有活性的α1-抗胰蛋白酶基因调控区、在骨髓细胞中有活性的β-球蛋白基因调控区、在大脑的少突胶质细胞中有活性的髓磷脂碱蛋白基因调控区、在骨骼肌中有活性的肌球蛋白轻链-2基因调控区、和在下丘脑中有活性的促性腺激素释放激素基因调控区、丙酮酸激酶启动子、绒毛蛋白启动子、脂肪酸结合肠蛋白的启动子、平滑肌细胞α-肌动蛋白的启动子，等等。此外，可通过加入增强子或调节序列等来修饰这些表达序列。
可通过本领域已知的方法，例如转染、电穿孔、显微注射、转导、细胞融合、DEAE葡聚糖、磷酸钙沉淀、脂质转染(脂质体融合)、利用基因枪或DNA载体运输蛋白将载体引入所需的宿主细胞(参见，例如Wu等，J.Biol.Chem.267：963(1992)；Wu等，J.Biol.Chem.263：14621(1988)；和Hartmut等，加拿大专利申请号2,012,311)。
还可通过脂质转染体内引入本发明的多核苷酸。在过去10年，利用脂质体在体外包装和转染核酸逐渐增多。可利用合成的阳离子脂质制备用于体内转染编码标记的基因的脂质体，该脂质设计成能减少脂质体介导转染遇到的困难和危险(Felgner等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.84：7413(1987)；Mackey等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：8027(1988)；和Ulmer等，Science 259：1745(1993))。使用阳离子脂质可促进包装带负电的核酸，还促进与带负电细胞膜融合(Felgner等，Science 337：387(1989))。WO95/18863、WO96/17823和U.S.5,459,127描述了传递核酸特别有用的脂质化合物和组合物。采用脂质转染将外源性基因体内引入特定生物体具有一定实际优点。脂质体分子靶向特定细胞代表了一类优点。直接转染特定细胞类型明显在具有细胞异质性的组织，例如胰腺、肝脏、肾脏和脑中特别理想。可为靶向目的将脂质与其它分子化学偶连(Mackey等，1988，同上)。可将靶向的肽，例如激素或神经递质和蛋白质，例如抗体，或非肽分子化学偶联于脂质体。
其它分子也可用于促进核酸的体内转染，例如阳离子寡肽(如WO95/21931)、衍生自DNA结合蛋白质的肽(如WO96/25508)或阳离子聚合物(如WO95/21931)。
还可能将载体作为裸DNA质粒体内引入(参见，美国专利号5,693,622、5,589,466和5,580,859)。还可采用受体介导的DNA递送方法(Curiel等，Hum.Gene Ther.3：147(1992)；和Wu等，J.Biol.Chem.262：4429(1987))。
术语“转染”指细胞摄取外源性或异源的RNA或DNA。当这种RNA或DNA被引入细胞，称该细胞被外源性或异源的RNA或DNA“转染”。当转染的RNA或DNA实现表型改变时，称细胞被外源性或异源RNA或DNA“转化”。转化RNA或DNA可以整合(共价相连)入构成细胞基因组的染色体DNA。
“转化”指将核酸片段传递入宿主生物体的基因组，从而导致遗传学稳定的遗传性。含有转化的核酸片段的宿主生物体称为“转基因”或“重组”或“转化”的生物体。
此外，包含本发明多核苷酸的重组载体可包含它们要在其中扩增或表达的细胞宿主的一个或多个复制起点，标记或可选择标记。
术语“可选择标记”指鉴定因子，通常是能基于标记基因的作用而选择的抗生素或化学耐受基因(即耐受抗生素、耐受除草剂)、比色标记、酶、荧光标记等，其中该作用用于示踪感兴趣核酸的遗传性和/或鉴定遗传了该感兴趣核酸的细胞或生物体。本领域已知并使用的可选择标记的例子包括：提供氨苄青霉素、链霉素、庆大霉素、卡那霉素、潮霉素、双丙氨酰膦除草剂、磺酰胺等耐受性的基因；和用作表型标记的基因，即，花青甙调节基因、异戊烯转移酶基因(isopentanyl transferase gene)等。
术语“报道基因”指编码能依据报道基因的作用而得到鉴定的鉴定因子的核酸，其中该作用用于示踪感兴趣核酸的遗传性，鉴定已遗传了感兴趣核酸的细胞或生物体，和/或检测基因表达诱导或转录。本领域已知并使用的报道基因的例子包括但不限于：萤光素酶(Luc)、绿色荧光蛋白(GFP)、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、β-半乳糖苷酶(LacZ)、β-葡糖醛酸糖苷酶(Gus)等。可选择标记基因也可视作报道基因。
“启动子”和“启动子序列”可互换使用，指能控制编码序列或功能RNA表达的DNA序列。编码序列通常位于启动子序列的3’端。启动子可以完全衍生自天然基因，或由衍生自天然发现的不同启动子的不同元件构成，或者甚至包含合成的DNA区段。本领域技术人员应知道不同启动子可在不同组织或细胞类型中，或在不同发育阶段，或对不同环境或生理条件起反应而指导基因表达。导致基因在大多数细胞类型中，在大部分时间内表达的启动子通常称为“组成型启动子”。导致基因在特定细胞类型中表达的启动子通常称为“细胞特异性启动子”或“组织特异性启动子”。导致基因在特定发育或细胞分化阶段表达的启动子通常称为“发育特异性启动子”或“细胞分化特异性启动子”。在用诱导启动子的药剂、生物分子、化学品、配体、光等接触或用这些物质处理细胞后得到诱导并导致基因表达的启动子通常称为“诱导型启动子”或“可调节启动子”。还应知道，由于在大多数情况中，调控序列的确切边界并未完全限定，不同长度的DNA片段可具有相同的启动子活性。
启动子序列在其3’末端通常结合有转录起始位点并向上延伸(5’方向)，从而包含在可检测背景水平启动转录所需的最少数量的碱基或元件。在启动子序列中可发现转录起始位点(通过，例如核酸酶S1作图不难限定)以及负责RNA聚合酶结合的蛋白质结合结构域(共有序列)。
“治疗开关启动子”(TSP)指控制基因开关组件表达的启动子。本文它处详细描述了基因开关和它们的各种组件。在某些实施方式中，TSP是组成型的，即组成型活化的。组成型TSP可以是组成型遍在的(即，在任何组织或细胞中广泛起作用，无需其它因子或调节剂)或组成型组织或细胞特异性的(即，在特定组织类型或细胞类型中广泛起作用，无需其它因子或调节剂)。在某些实施方式中，本发明的TSP在疾病、病症或病状相关条件下活化。在涉及两种或更多种TSP的本发明某些实施方式中，启动子可以是组成型或可活化启动子的组合。本文所用的“在疾病、病症或病状相关条件下活化的启动子”包括但不限于：疾病-特异性启动子、对特定生理、发育、分化或病理状况起反应的启动子、对特定生物分子起反应的启动子和对疾病、病症或病状相关的特定组织或细胞类型，例如肿瘤组织或恶性细胞起反应的启动子。TSP可包含天然产生启动子的序列、衍生自天然产生启动子的修饰序列或合成序列(例如，将反应元件插入最小启动子序列来改变启动子的反应性)。
当RNA聚合酶将编码序列转录成mRNA，然后经反式RNA剪接(如果编码序列含有内含子)并翻译成该编码序列所编码的蛋白质时，称编码序列受到细胞中转录和翻译调控序列的“控制”。
“转录和翻译调控序列”指在宿主细胞中表达编码序列的DNA调节序列，例如启动子、增强子、终止子等。在真核细胞中，聚腺苷酸化信号是调控序列。
术语“反应元件”(RE)指一个或多个顺式作用的DNA元件，其赋予受与转录因子的DNA结合结构域相互作用介导的启动子反应性。该DNA元件的序列可以是回文的(完美或不完美的)，或者其由被数量不同的核苷酸隔开的序列基序或半位点构成。半位点可以是相似或相同的，排列成正向或反向重复或排列成一个半位点或串联的毗连半位点的多聚体。依据要掺入反应元件的细胞或生物体的性质，反应元件可包含从不同生物体分离的最小启动子。有或没有配体存在下，转录因子的DNA结合结构域结合反应元件的DNA序列以启动或阻遏受该反应元件调节的下游基因转录。天然蜕皮素受体的反应元件的DNA序列的例子包括：RRGG/TTCANTGAC/ACYY(SEQ ID NO：1)(参见Cherbas等，Genes Dev.5：120(1991))；AGGTCAN(n)AGGTCA，其中N(n)可以是一个或多个间隔核苷酸(SEQ ID NO：2)(参见D′Avino等，Mol.Cell.Endocrinol.113：1(1995))；和GGGTTGAATGAATTT(SEQ ID NO：3)(参见Antoniewski等，Mol.Cell Biol.14：4465(1994))。
“因子调节的启动子”(FRP)指包含至少一个反应元件的启动子，该反应元件为本发明基因开关所编码的配体依赖性转录因子的DNA结合结构域所识别。
术语“操作性连接”、“操作性结合”、“通过操作性结合”等指核酸序列与一个核酸片段的结合，因此一个的功能受另一个的影响。例如，当启动子能影响编码序列的表达时(即，该编码序列受启动子的转录控制)，称该启动子操作性连接于该编码序列。编码序列可以有义或反义方向操作性连接于调节序列。
本文所用的术语“表达”指通过衍生自核酸或多核苷酸的有义(mRNA)或反义RNA的转录和稳定累积。表达还指将mRNA翻译成蛋白质或多肽。
术语“盒”、“表达盒”和“基因表达盒”指可插入核酸或多核苷酸特定位点的DNA区段，或通过同源重组获得。DNA区段包含编码感兴趣多肽的多核苷酸，并且将盒和限制性位点设计成能确保该盒插入合适的读框以供转录和翻译。“转化盒”指包含编码感兴趣多肽的多核苷酸，并且除该多核苷酸外，还具有有助于转化具体宿主细胞的元件的特定载体。本发明的盒、表达盒、基因表达盒和转化盒还可包含能增强编码感兴趣多肽的多核苷酸在宿主细胞中表达的元件。这些元件可包括但不限于：启动子、最小启动子、增强子、反应元件、终止序列、聚腺苷酸化序列等。
出于本发明的目的，术语“基因开关”指启动子相关反应元件和基于配体依赖性转录因子的系统的组合，有一种或多种配体存在时，其调节掺入反应元件和启动子的基因的表达。
对于基因开关，术语“基于蜕皮素的”指至少包含天然产生或合成蜕皮素受体配体结合结构域的功能部分的基因开关，其对结合蜕皮素受体配体结合结构域的配体起反应而调节基因表达。
本文所用的术语“生物反应器”或“生物反应器器件”包括要分泌治疗蛋白或治疗多核苷酸的一个或多个细胞。在某些非限制性实施方式中，生物反应器包含本文它处所述的修饰细胞。在某些，但不是所有实施方式中，生物反应器细胞可以是“免疫分离的”。当生物反应器细胞经处理从而该细胞在引入或植入对象后受保护而免遭该对象的免疫系统作用时，称该细胞与该对象是“免疫分离的”。例如，免疫分离的生物反应器细胞可以包含在屏障系统中，该系统能传播治疗蛋白或治疗多核苷酸，但能防止生物反应器细胞直接接触对象免疫系统的细胞。免疫分离的细胞可以是，例如包被或包裹化的。免疫分离方法包括但不限于：细胞的保形包被(conformal coating)，细胞悬浮在生物相容材料中并分隔成球形物质的微囊化，或细胞包封在用于包封细胞的天然或合成聚合物构成的器件中的大包裹化。
术语“调节”表示诱导、降低或抑制核酸或基因表达，从而分别导致蛋白质或多肽产生的诱导、降低或抑制。
本发明的多核苷酸或载体还可包含适合驱动基因在修饰细胞中表达的至少一个启动子。
可用于本发明实施方式中的增强子包括但不限于：SV40增强子、巨细胞病毒(CMV)增强子、延伸因子1(EF1)增强子、酵母增强子、病毒基因增强子等。
本文将“3’reg”定义为相对于基因或转录物编码区3’定位的表达调节元件。这种元件包括但不限于：初级转录物-编码剪接元件、加工转录物的UTR、聚腺苷酸化信号或DNA-编码转录终止结构域。
终止调控区，即终止子或聚腺苷酸化序列还可衍生自对优选宿主而言各种天然的基因。任选地，终止位点可不是必需的，但最好包含。在本发明的一个实施方式中，终止调控区可以由以下组分构成或衍生自它们：合成序列、合成聚腺苷酸化信号、SV40晚期聚腺苷酸化信号、SV40聚腺苷酸化信号、牛生长激素(BGH)聚腺苷酸化信号、病毒终止子序列等。
术语“3’非编码序列”或“3’非翻译区(UTR)”指位于编码序列下游(3’)的DNA序列，可包含聚腺苷酸化[poly(A)]识别序列和编码能影响mRNA加工或基因表达的调节信号的其它序列。聚腺苷酸化信号的特征通常在于在mRNA前体的3’端加上聚腺苷酸束。
“调控区”指调节第二核酸序列表达的核酸序列。调控区可包含天然负责特定核酸表达的序列(同源区域)，或者可包含负责表达不同蛋白质，甚至合成蛋白质的不同区域的序列(异源区域)。具体地说，所述序列可以是以特异性或非特异性方式并以诱导型或非诱导型方式刺激或阻遏基因转录的原核生物、真核生物或病毒基因的序列或衍生序列。调控区包含复制起点、RNA剪接位点、启动子、增强子、转录终止序列和引导多肽进入靶细胞的分泌途径的信号序列。
“异源来源”的调控区指不与所表达核酸天然结合的调控区。异源调控区包括不同物种的调控区、不同基因的调控区、杂交调节序列和天然不产生，而是由本领域普通技术人员设计的调节序列。
“RNA转录物”指RNA聚合酶催化DNA序列转录得到的产物。当RNA转录物是该DNA序列的完美互补拷贝时，其称为原始转录物，或者其可以是衍生自原始转录物的转录后加工的RNA序列并称为成熟RNA。“信使RNA(mRNA)”指没有内含子并可由细胞翻译成蛋白质的RNA。“cDNA”指与mRNA互补，并衍生自其的双链DNA。“有义”RNA指包括mRNA的RNA转录物，因此可由细胞翻译成蛋白质。“反义RNA”指与靶原始转录物或mRNA的全部或一部分互补并阻断靶基因表达的RNA转录物。反义RNA可以与特定基因转录物的任何部分互补，即，在5′非编码序列、3′非编码序列或编码序列处。“功能性RNA”指反义RNA、核酶RNA、或不被翻译但对细胞过程仍有影响的其它RNA。
“多肽”、“肽”和“蛋白质”可互换使用，指由共价连接的氨基酸残基构成的多聚化合物。
“分离的多肽”、“分离的肽”或“分离的蛋白质”指基本上不含天然状态下与其正常结合的那些组分(例如，其它蛋白质或多肽、核酸、碳水化合物、脂质)的多肽或蛋白质。“分离的”不表示排除含其它化合物，或存在杂质的人工或合成混合物，它们不干扰生物学活性，其存在可能是因为，例如纯化不完全、加入稳定剂或混入药学上可接受的制品。
“取代突变型多肽”或“取代突变体”应理解成表示与野生型或天然产生的多肽相比，在至少一个野生型或天然产生的氨基酸处包含不同氨基酸取代的突变型多肽。取代突变型多肽可仅包含一个野生型或天然产生的氨基酸取代，可称为“点突变型”或“单点突变型”多肽。或者，与野生型或天然产生的多肽相比，取代突变型多肽可包含用两个或更多个氨基酸取代两个或更多个野生型或天然产生的氨基酸。根据本发明，与野生型或天然产生的H组核受体配体结合结构域多肽相比，包含取代突变的H组核受体配体结合结构域多肽包含用不同氨基酸取代至少一个野生型或天然产生的氨基酸。
当取代突变型多肽包含两个或更多个野生型或天然产生氨基酸的取代时，该取代可包含相等数量的野生型或天然产生氨基酸缺失取代，即两个非野生型或天然产生的氨基酸替代两个野生型或天然产生的氨基酸，或者非相等数量的野生型氨基酸缺失取代，即一个非野生型氨基酸替代两个野生型氨基酸(取代+缺失突变)，或三个非野生型氨基酸替代两个野生型氨基酸(取代+插入突变)。
可利用缩写的术语体系描述取代突变体以表明参比多肽序列中被替代的氨基酸残基和编号以及新取代的氨基酸残基。例如，多肽的第20个氨基酸残基被取代的取代突变体可以缩写为“x20z”，其中“x”是待替代的氨基酸，“20”是该多肽中的氨基酸残基位置或编号，“z”是新取代的氨基酸。因此，可互换地缩写成“E20A”或“Glu20Ala”的取代突变体表示该突变体在多肽20位的谷氨酸(本领域中常缩写成“G”或“Glu”)位置包含丙氨酸残基(本领域中常缩写成“A”或“Ala”)。
可由本领域已知的任何诱变技术制作取代突变，所述技术包括但不限于：体外定点诱变(Hutchinson等，J.Biol.Chem.253：6551(1978)；Zoller等，DNA3：479(1984)；Oliphant等，Gene 44：177(1986)；Hutchinson等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83：710(1986))、利用法玛西亚公司(Pharmacia)的
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接头、限制性内切酶消化/片段缺失和取代、PCR-介导的/寡核苷酸-指导的诱变等。定点诱变优选基于PCR的技术(参见Higuchi，1989，″Using PCR toEngineer DNA(采用PCR工程改造DNA)″，刊于PCR Technology：PrinciplesandApplications for DNA Amplification(PCR技术：DNA扩增的原理和应用)，H.Erlich等，斯托克顿出版社(Stockton Press)，第6章，第61-70页)。
应用于多肽的术语“片段”指氨基酸序列短于参比多肽，并在这些参比多肽的完整部分上包含相同氨基酸序列的多肽。这种片段可以适当地包含在作为其一部分的较大多肽中。本发明多肽的这种片段的长度可以是至少2、3、4、5、6、8、10、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、25、26、30、35、40、45、50、100、200、240或300个或更多个氨基酸。
多肽或蛋白质的“变体”指衍生自多肽或蛋白质的任何类似物、片段、衍生物或突变体，其保留了该多肽或蛋白质的至少一种生物学特性。多肽或蛋白质可天然存在不同变体。这些变体可以是特征在于编码蛋白质的结构基因的核苷酸序列不同的等位基因变体，或者可包括差别剪接或翻译后修饰。技术人员可制备具有一个或多个氨基酸取代、缺失、添加或替代的变体。这些变体可包括：(a)其中一个或多个氨基酸残基被保守性或非保守性氨基酸取代的变体，(b)其中在多肽或蛋白质中加入一个或多个氨基酸的变体，(c)其中一个或多个氨基酸包含取代基的变体，和(d)其中多肽或蛋白质与另一多肽，例如血清白蛋白融合的变体。获得这些变体的技术是本领域普通技术人员已知的，包括遗传学(抑制、缺失、突变等)、化学和酶学技术。在一个实施方式中，变体多肽包含至少约14个氨基酸。
术语“同源性”指两个多核苷酸或两个多肽部分之间的相同性百分比。可通过本领域已知的技术测定一个部分的序列与另一部分的序列之间的对应性。例如，可通过比对序列信息并利用不难获得的计算机程序来直接比较两个多肽分子之间的序列信息从而测定同源性。或者，可通过在同源性区域之间能形成稳定双链体的条件下使得多核苷酸杂交，然后用单链特异性核酸酶消化并测定消化片段的大小来测定同源性。
本文所用的术语“同源性”的所有语法形式和拼写变化形式指具有“共同进化起源的”蛋白质之间的关系，包括来自超家族(例如，免疫球蛋白超家族)的蛋白质和不同物种的同源蛋白质(例如，肌球蛋白轻链等)(Reeck等，Cell50：667(1987))。高度序列相似性反映出这种蛋白质(和它们的编码基因)具有序列同源性。然而，在常规应用和本申请中，当术语“同源”用副词，例如“高度”修饰时，可指序列相似性而不指共同的进化起源。
因此，术语“序列相似性”的所有语法形式指可能具有或不具有共同进化起源的核酸和蛋白质的氨基酸序列之间的相同性或对应性程度(参见Reeck等，Cell 50：667(1987))。在一个实施方式中，当DNA序列的规定长度上有至少约50％(例如，至少约75％、90％或95％)的核苷酸匹配时，称两条DNA序列是“基本上同源的”或“基本上相似的”。可利用序列数据库中可得的标准软件，或在，例如特定体系所规定的严谨性条件下采用Southern杂交实验来比较序列，从而鉴定基本上同源的序列。本领域技术人员知道如何确定合适的杂交条件(参见例如，Sambrook等，1989，同上)。
本文所用的“基本上相似”指这样一种核酸片段，其中一个或多个核苷酸碱基中的改变导致一个或多个氨基酸取代，但不影响该DNA序列所编码蛋白质的功能特性。“基本上相似”还指这样一种核酸片段，其中一个或多个核苷酸碱基中的改变不影响该核酸片段通过反义或共-阻遏技术介导基因表达改变的能力。“基本上相似”还指本发明核酸片段的修饰物，例如缺失或插入不实质性影响所得转录物功能特性的一个或多个核苷酸碱基。因此，应该知道本发明包括多个具体的示范性序列。所提出的各种修饰是本领域的常规技术，与测定编码产物的生物学活性的保留程度一样。
此外，技术人员知道还可通过在严谨性条件下(0.1X SSC，0.1％SDS，65℃和用2X SSC，0.1％SDS，然后用0.1X SSC，0.1％SDS洗涤)与本文示例的序列杂交的能力来限定本发明所包括的基本上相似的序列。本发明的基本上相似的核酸片段是其DNA序列与本文报道的核酸片段的DNA序列有至少约70％、80％、90％或95％相同的那些核酸片段。
当大于约40％的氨基酸是相同的，或者大于60％是相似的(功能上相同)时，称两条氨基酸序列“基本上同源”或“基本上相似”。优选利用，例如GCG(Genetics Computer Group(遗传学计算机课题组)，ProgramManual for the GCG Package(GCG软件包的程序手册)，第7版，麦迪逊，威斯康星州)堆积程序，通过比对鉴定相似或同源的序列。
本文利用术语“对应于”指相似或同源序列，而无论检测相似性或同源性的分子的确切位置是相同还是不同。核酸或氨基酸序列比对可包括空格。因此，术语“对应于”指序列相似性，而不指氨基酸残基或核苷酸碱基的编号。
氨基酸或核苷酸序列的“实质性部分”包含足够的多肽氨基酸序列或基因核苷酸序列，从而可由本领域技术人员通过手工评估序列，或利用诸如BLAST(局部序列比对基本检索工具；Altschul等，J.Mol.Biol.215：403(1993))；可从ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/获得)等算法进行计算机自动序列比较和鉴定来推测性鉴定该多肽或基因。通常，10个或更多个毗连的氨基酸或30个或更多个核苷酸的序列是推测性鉴定与已知蛋白质或基因同源的多肽或核酸序列所需。此外，对于核苷酸序列，包含20-30个毗连核苷酸的基因特异性寡核苷酸探针可用于基因鉴定(例如，Southern杂交)和分离(例如，细菌菌落或噬菌体噬斑的原位杂交)的序列依赖性方法。另外，12-15个碱基的短寡核苷酸可在PCR中用作扩增引物以获得包含引物的特定核酸片段。因此，核苷酸序列的“实质性部分”包含足够的序列以特异性鉴定和/或分离包含该序列的核酸片段。
本领域已知的术语“相同性百分比”是通过比较序列测定的两条或更多条多肽序列或两条或更多条多核苷酸序列之间的关系。在本领域中，“相同性”还表示多肽或多核苷酸序列之间的序列关联性程度，例如通过这些序列诸链之间的匹配测定的。不难通过已知的方法计算“相同性”和“相似性”，所述方法包括但不限于以下描述的：Computational Molecular Biology(计算分子生物学)(Lesk，A.M.编)牛津大学出版社(Oxford University Press)，纽约(1988)；Biocomputing：Informatics and Genome Projects(生物计算：信息和基因组项目)(Smith，D.W.编)学术出版社(Academic Press)，纽约(1993)；ComputerAnalysis of Sequence Data(序列数据的计算机分析)，第I部分(Griffin，A.M.和Griffin，H.G.编)休玛娜出版社(Humana Press)，新泽西州(1994)；Sequence Analysis in Molecular Biology(分子生物学的序列分析)(von Heinje，G.编)学术出版社(1987)；和Sequence Analysis Primer(序列分析引物)(Gribskov，M.和Devereux，J.编)斯托克顿出版社，纽约(1991)。测定相同性的优选方法设计成能给出所测试序列之间的最佳匹配。测定相同性和相似性的方法编成公众可得的计算机程序。可利用序列分析软件，例如威斯康星州麦迪逊市DNA星公司的激光基因生物信息学计算套件的大型比对程序(Megalign program of the LASERGENE bioinformatics computing suite，DNASTAR Inc.，Madison，WI)进行序列比对和相容性百分比计算。可利用参数默认(GAP PENALTY＝10，GAP LENGTH PENALTY＝10)的群集比对方法(Clustal method of alignment)(Higgins等，CABIOS.5：151(1989))进行序列的多重比对。利用群集方法进行成对比对的默认参数可以选择为：KTUPLE1，GAP PENALTY＝3，WINDOW＝5和DIAGONALS SAVED＝5。
术语“序列分析软件”指可用于分析核苷酸或氨基酸序列的任何计算机算法或软件程序。“序列分析软件”可以商品化购得或独立开发的。典型的序列分析软件包括但不限于：GCG程序套件(威斯康星软件包(Wisconsin Package)9.0版，遗传学计算机课题组(GCG)，麦迪逊，威斯康星州)、BLASTP、BLASTN、BLASTX(Altschul等，J.Mol.Biol.215：403(1990))和DNASTAR(DNA星公司，圣帕克街1228号(S.Park St.)，麦迪逊，威斯康星州，53715美国)。在本申请的内容中，应该知道除非另有规定，利用序列分析软件进行分析时，分析的结果将依据引用的程序的“默认值”。本文所用的“默认值”表示首次启动时，软件原始加载的任何一组数值或参数。
与DNA序列相关的“化学合成”表示该组分核苷酸在体外装配。可采用已良好确立的方法手工化学合成DNA，或者利用多种可商品化购得的机器之一进行自动化学合成。因此，可依据反映宿主细胞的密码子偏爱的核苷酸序列优化来改进基因以便优化基因表达。技术人员应知道如果密码子选择偏向宿主所喜爱的那些密码子，则基因表达有成功的可能。可依据衍生自有序列信息可用的宿主细胞基因调查来测定优选的密码子。
如本文所用的，当有以下情况时，称两种或更多种可单独操作的基因调节系统是“正交的”：a)利用其各自配体在选择浓度调节各给定系统导致该系统的基因表达幅度中有可检测的改变，和b)该改变在统计学上显著不同于细胞、组织或生物体中可同时操作的所有其它系统的表达改变，而无论实际调节是同时或顺次进行的。各可单独操作的基因调节系统的调节在基因表达中实现的改变优选比在细胞、组织或是生物体中所有其它可操作系统的至少高2-倍，例如至少高5-倍、10-倍、100-倍、或500-倍。利用其各自配体在选择浓度调节各给定系统导致该系统的基因表达幅度有可检测的改变，而在细胞、组织或生物体中可操作的所有其它系统没有可检测的表达改变是理想的。在这种情况中，称多重诱导型基因调节系统是“完全正交的”。本发明可用于检索正交配体和基于受体的正交基因表达系统，例如通过引用全文纳入本文的US2002/0110861A1所述那些。
术语“外源性基因”表示对象的外来基因，即，通过转化方法引入对象的基因，内源性突变基因的未突变形式或内源性未突变基因的突变形式。转化方法不是本发明至关重要的，可以是本领域技术人员已知适合于对象的任何方法。外源性基因可以是以DNA或RNA形式引入对象的天然或合成基因，它们可通过DNA中间体，例如通过逆转录酶起作用。可将这些基因引入靶细胞，可通过直接引入对象，或通过将转化细胞传递入对象而间接引入。
本文所用的术语“治疗产物”和“治疗分子”指赋予待治疗对象有益功能的治疗多肽(“TP”，“治疗蛋白质序列”(“TPSQ”)所编码)或治疗多核苷酸。治疗多肽可包括但不限于：长度小3至个氨基酸的肽，单链或多链蛋白和融合蛋白。治疗多核苷酸可包括但不限于：反义寡核苷酸、小干扰性RNA、核酶和RNA外在引导序列。本文它处公开了治疗产物的非限制性例子。治疗产物可包含天然产生的序列、合成序列或天然和合成序列的组合。
术语“配体-依赖性转录因子复合物”或“LDTFC”指包含一个或多个蛋白质亚基的转录因子，该复合物能调节本文所述“因子调节的启动子”所驱动的基因表达。模型LDTFC是“蜕皮素受体复合物”，其通常指具有核受体家族的至少两个成员，蜕皮素受体(“EcR”)和超螺旋(ultraspiracle)(“USP”)蛋白的异源二聚蛋白质复合物(参见Yao等，Nature 366：476(1993))；Yao等，Cell 71：63(1992))。功能性LDTFC，例如EcR复合物还可包含其它蛋白质，例如亲免蛋白。称为转录因子的核受体家族蛋白的其它成员(例如，DHR38，βFTZ-1或其它昆虫同源物)也可以是EcR和/或USP的配体依赖性或非依赖性伴侣。LDTFC，例如EcR复合物还可以是EcR蛋白和超螺旋蛋白的脊椎动物同源物，视黄酸-X-受体(“RXR”)蛋白的异二聚体或USP和RXR的嵌合体。术语“LDTFC”和“EcR复合物”还包括EcR蛋白或USP的同质二聚复合物以及起到相同功能的单一多肽或三聚体、四聚体和其它多聚体。
可通过结合该复合物的蛋白质之一的活性蜕皮类固醇或非类固醇配体活化LDTFC，例如EcR复合物，包括EcR，但不排除该复合物的其它蛋白质。应用于基于LDTFC的基因开关，例如基于EcD复合物的基因开关的本文所用术语“配体”描述了小的可溶性分子，其具有活化基因开关以刺激其中所编码多肽表达的能力。配体的例子包括但不限于：蜕皮类固醇，例如蜕皮素、20-羟基蜕皮素、松甾酮A、米乐甾酮(muristerone A)等，9-顺式-视黄酸、视黄酸的合成类似物、N，N′-二酰基肼，例如美国专利号6,013,836；5,117,057；5,530,028；和5,378,726及美国申请公布号2005/0209283和2006/0020146公开的那些；美国申请公布号2004/0171651描述的噁二唑啉(oxadiazoline)；二苯甲酰基烷基氰基肼，例如欧洲申请号461,809公开的那些；N-烷基-N，N′-二芳酰基肼，例如美国专利号5,225,443公开的那些；N-酰基-N-烷基羰基肼，例如欧洲申请号234,994公开的那些；N-芳酰基-N-烷基-N′-芳酰基肼，例如美国专利号4,985,461描述的那些；酰氨基酮(amidoketone)，例如美国申请公布号2004/0049037描述的那些；这些文献各自通过引用纳入本文，和其它类似的材料，包括3，5-二-叔丁基-4-羟基-N-异丁基-苯甲酰胺、8-O-乙酰基哈帕苷、氧基类固醇、22(R)羟基胆固醇、24(S)羟基胆固醇、25-环氧胆固醇、T0901317、5-α-6-α-环氧胆固醇-3-硫酸酯(ECHS)、7-酮基胆固醇-3-硫酸酯、金合欢醇(fameso1)、胆汁酸、1，1-二膦酸酯、保幼激素III等。可用于本发明的二酰基肼配体的例子包括：RG-115819(3，5-二甲基-苯甲酸N-(1-乙基-2，2-二甲基-丙基)-N′-(2-甲基-3-甲氧基-苯甲酰基)-酰肼)、RG-115932((R)-3，5-二甲基-苯甲酸N-(1-叔丁基-丁基)-N′-(2-乙基-3-甲氧基-苯甲酰基)-酰肼)和RG-115830(3，5-二甲基-苯甲酸N-(1-叔丁基-丁基)-N′-(2-乙基-3-甲氧基-苯甲酰基)-酰肼)。参见，例如通过引用全文纳入本文的美国专利申请序列号12/155,111和PCT申请号PCT/US2008/006757。
LDTFC，例如EcR复合物包含作为核受体超家族成员的蛋白质，其中所有成员的特征在于存在包含氨基-末端反式激活域(″AD″、″TD″或″TA″，在本文可互换使用)、DNA结合结构域(“DBD”)和配体结合结构域(“LBD”)的一个或多个多肽亚基。AD可表示含“异二聚伴侣”或“HP”的融合体。本文将本发明的包含AD和HP的融合蛋白称为“共活化蛋白”或“CAP”。DBD和LBD可表达为融合蛋白，称为“配体诱导型转录因子”(“LTF”)。可通过接头，例如绞链区隔开融合伴侣。LTF家族的一些成员在LBD的羧基末端侧还可具有另一反式激活域。DBD的特征在于存在两个半胱氨酸锌指，在其间是两个氨基酸基序，P-盒和D-盒，其赋予蜕皮素反应元件的特异性。这些结构域可以是天然的、修饰的或是异源受体蛋白的不同结构域的嵌合体。
构成外源性基因、反应元件和LDTFC，例如EcR复合物的DNA序列可掺入古细菌、原核细胞，例如大肠杆菌、枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)，或其它肠细菌，或真核细胞，例如植物或动物细胞。然而，基因表达的许多蛋白质在细菌中加工不正确，因此优选真核细胞。细胞可以是单细胞或多细胞生物体的形式。外源性基因、反应元件和受体复合物的核苷酸序列也可作为RNA分子掺入，优选功能性病毒RNA的形式，例如烟草花叶病毒。真核细胞中优选脊椎动物细胞，因为它们天然缺乏对EcR的本发明配体起反应的分子。所以，它们对于本发明配体“基本上不敏感”。因此，可用于本发明的配体对转化细胞或整个生物体的生理学或其它影响可以忽略。因此，细胞可生长并表达所需产物，而基本上不受配体本身存在的影响。
术语“对象”表示完整的昆虫、植物或动物。还可预计，当对象是真菌或酵母菌时，配体可同等良好地起作用。当对象是完整的动物时，该动物优选脊椎动物，最优选哺乳动物。
当EcR配体与LDTFC，例如EcR复合物联用，EcR复合物进而结合与外源性基因(例如，报道基因)相连的反应元件时，为外在瞬时调节外源性基因表达提供了手段。各种组分彼此结合，即，配体与受体复合物以及受体复合物与反应元件结合的顺序不重要。通常，外源性基因表达的调节是对LDTFC，例如EcR复合物与特异性控制或调节性DNA元件结合的反应。与核受体家族的其它成员相似，EcR蛋白具有至少三个结构域：AD、DBD和LBD。与核受体家族的亚组相似，该受体还具有未良好确定的负责异二聚化特性的区域(本文称为“异二聚伴侣”或“HP”)。与包含，例如AD和/或HP(如USP或RXR蛋白)的CAP异二聚后，配体与LTF，例如EcR蛋白的配体结合结构域结合使得该异源二聚蛋白的DNA结合结构域能结合活性形式的反应元件，因此导致外源性基因的表达或阻遏。该机制不排除配体结合各亚基，例如LTF或CAP，如EcR或USP，以及导致活性同质二聚体复合物(例如EcR+EcR或USP+USP)形成的可能性。在一个实施方式中，可改变一个或多个受体结构域从而产生嵌合型基因开关。该三个结构域中的一个或多个通常可从与其它结构域来源不同的来源选择，从而能在所选宿主细胞或生物体内为反式激活活性、与配体互补结合和识别特异性反应元件而优化嵌合型受体。此外，可用其它DNA结合蛋白质结构域，例如酵母的GAL-4蛋白(参见Sadowski等，Nature 335：563(1988))或大肠杆菌的LexA蛋白(参见Brent等，Cell 43：729(1985))的反应元件修饰或取代反应元件本身来容纳嵌合型LDTFC，例如EcR复合物。嵌合型系统的另一优点是它们能根据所需的最终结果选用驱动外源性基因的启动子。这种双重控制在基因治疗领域尤其重要，特别是当产生细胞毒性蛋白时，因为既可控制表达的时机又可控制发生表达的细胞。当操作性连接于合适启动子的外源性基因引入对象的细胞时，该外源性基因的表达受到本发明配体存在的控制。启动子可以是组成型或诱导型调节的，或者可以是组织-特异性的(即，只在特定细胞类型中表达)或是生物体的某些发育阶段特异性的。
编码各种多肽的许多基因组和cDNA核酸序列，例如转录因子和报道基因是本领域熟知的。本领域技术人员可获得几乎所有已知基因的核酸序列信息，可从公共保藏机构(公布序列的研究机构)直接获得核酸分子，或采用常规方法制备该分子。
对于体内应用，本文所述配体可以吸收入药学上可接受的运载体，例如溶液、悬液、片剂、胶囊、软膏、酏剂和可注射组合物。药物组合物可含有0.01重量％到99重量％的配体。组合物可以是单剂量或多剂量形式。任何具体的药物组合物中配体的含量应取决于有效剂量，即，引发所需基因表达或阻遏的所需剂量。
给予药物制品的合适途径包括口服、直肠、局部(包括经皮肤、口腔含化和舌下)、经阴道、胃肠外(包括皮下、肌肉内、静脉内、真皮内、鞘内和硬膜外)和经鼻胃管。本领域技术人员应理解优选的给药途径取决于所治疗的病症，可能会因，例如受者的病症等因素而有所不同。
本发明的一个实施方式包括治疗、缓解或预防对象中疾病、病症或病状的方法，包括：
(a)将以下多核苷酸引入所述对象；(1)编码基因开关的多核苷酸，所述基因开关包含至少一个与治疗开关启动子操作性相连的转录因子序列，其中所述至少一个转录因子序列编码配体依赖性转录因子复合物，其中所述启动子在所述疾病、病症或病状期间活化，和(2)与某启动子相连的编码治疗多肽或治疗多核苷酸的第二多核苷酸，该启动子由所述配体依赖性转录因子复合物活化；和
(b)将配体给予所述对象以诱导所述治疗多肽或治疗多核苷酸表达；
其中所述治疗多肽或治疗多核苷酸的表达水平足以治疗、缓解或预防所述疾病、病症或病状。
本发明的一个实施方式包括治疗、缓解或预防对象中疾病、病症或病状的方法，包括：
(a)将以下多核苷酸引入对象；(1)编码基因开关的第一多核苷酸，所述基因开关包含至少一个与治疗开关启动子操作性相连的转录因子序列，其中所述至少一个转录因子序列编码配体依赖性转录因子复合物，和(2)与因子调节的启动子操作性相连的编码治疗多肽或治疗多核苷酸的第二多核苷酸，该启动子由所述配体依赖性转录因子复合物活化，其中，引入所述第一和第二多核苷酸从而使得它们在有所述配体依赖性转录因子复合物存在下表达；和
(b)将配体给予所述对象以诱导所述治疗多肽或治疗多核苷酸表达。
本发明的一个实施方式包括在对象中表达治疗多肽或治疗多核苷酸的方法，包括：
(a)将以下多核苷酸引入对象；(1)编码基因开关的第一多核苷酸，所述基因开关包含至少一个与治疗开关启动子操作性相连的转录因子序列，其中所述至少一个转录因子序列编码配体依赖性转录因子复合物，和(2)与因子调节的启动子操作性相连的编码所述治疗多肽或治疗多核苷酸的第二多核苷酸，该启动子由所述配体依赖性转录因子复合物活化，其中，引入所述第一和第二多核苷酸从而使得它们在有所述配体依赖性转录因子复合物存在下表达；和
(b)将配体给予所述对象以诱导所述治疗多肽或治疗多核苷酸表达。
在某些实施方式中，方法中所述的治疗开关启动子是组成型的。在某些实施方式中，治疗开关启动子在疾病、病症或病状相关条件下活化，例如，该启动子对疾病起反应、对特定生理、发育、分化或病理状况起反应和/或对一种或多种特定生物分子起反应而活化；和/或该启动子在特定组织或细胞类型中活化。在某些实施方式中，所述疾病、病症或病状对治疗多肽或多核苷酸起反应。例如，在某些非限制性实施方式中，治疗多核苷酸或多肽可用于治疗、预防、缓解、减轻症状、防止进展或治愈疾病、病症或病状，但无需达到这些事情中的任一项或全部。在某些实施方式中，引入所述第一和第二多核苷酸从而能在疾病、病症或病状相关条件下表达配体依赖性转录因子复合物。在一个实施方式中，实施治疗方法从而治疗多肽或治疗多核苷酸能表达，其在对象中的传播水平足以治疗、缓解或预防所述疾病、病症或病状。本文所用的“传播”表示多肽从修饰细胞中表达和释放足以在对象中具有作用或活性。传播可以是全身性、局部或其间的任何情况。例如，治疗多肽或治疗多核苷酸可以经血流或淋巴系统全身性散播。或者，治疗多肽或治疗多核苷酸可以在待治疗的组织或器官中局部散播。
在一个实施方式中，通过将本发明组合物，例如上述第一和第二多核苷酸直接给予待治疗对象来实施治疗方法，从而待治疗对象的细胞体内摄取该多核苷酸，在合适条件下那些细胞会表达一种或多种治疗多肽或多核苷酸，如本文它处所详述的。可以通过各种方法将多核苷酸直接递送至待治疗的对象，包括但不限于：病毒载体，例如逆转录病毒载体、腺伴随病毒载体、痘病毒载体，例如牛痘病毒载体，杆状病毒载体、疱疹病毒载体，例如单纯疱疹病毒载体或E-B病毒载体，腺病毒载体、双粒病毒载体或花椰菜花叶病毒载体；非病毒载体，例如可与例如脂质体形成复合物而递送的质粒、荷电脂质(细胞转染剂)、生物聚合物或DNA-蛋白质复合物。
在另一实施方式中，通过将包含在一个或多个修饰细胞的本发明组合物，例如上述第一和第二多核苷酸引入待治疗对象来实施治疗方法。给予修饰细胞后，修饰细胞在合适条件下表达一种或多种治疗多肽或多核苷酸，如本文它处所详述的。术语“修饰细胞”指至少插入了上述第一和第二多核苷酸的一个或多个细胞。因此，“修饰细胞”指含有所述第一和第二多核苷酸的细胞，其可以是或不是细胞形式，或与待治疗对象有关。这种细胞包括在本文所述“生物反应器”或“生物反应器器件”的定义中。然而，本文定义的“生物反应器”或“生物反应器器件”无需是修饰细胞，本文定义的生物反应器或生物反应器器件反而可以是要分泌治疗蛋白质或治疗多核苷酸的任何细胞或多种细胞，无论所述细胞是否是“修饰细胞”。
在一个实施方式中，通过将本发明组合物，例如上述第一和第二多核苷酸引入已从所述对象分离的细胞，即自体细胞，从而产生修饰细胞，将该修饰细胞重新引入所述对象来实施治疗方法。
或者，可通过将本发明组合物，例如上述第一和第二多核苷酸引入未从对象分离的细胞(即它们相对于该对象是非自体的)以产生修饰的非自体(MNA)细胞从而制备修饰细胞。这种MNA细胞相对于待治疗对象是同种异体的，即它们衍生自该对象同一物种的遗传上不同的成员。例如，在治疗人对象时，细胞将是人细胞，但不是直接衍生自待治疗的对象。或者，MNA细胞可以相对于待治疗对象是异种的，即它们衍生自不同于待治疗对象的物种。例如，在治疗人对象时，细胞可以是小鼠细胞、猴细胞或猪细胞。
适用于本发明的MNA细胞可以从任何数量的细胞类型产生，包括但不限于：固定化细胞、原代细胞和能终末分化的细胞。适合产生本发明的MNA修饰细胞的细胞的非限制性例子包括C2C12小鼠成肌细胞、HEK293人胚胎肾细胞、ARPE-19细胞、hMSC细胞、胰岛细胞、MDCK细胞、BHK细胞、杂交瘤细胞、CHO细胞、星形细胞衍生细胞、少突胶质细胞衍生细胞、成肌细胞衍生细胞、甲状旁腺衍生细胞。在利用胰岛细胞产生修饰细胞来治疗人对象的具体实施方式中，胰岛细胞可以是异种的，例如猪胰岛细胞，或同种异体的，例如从尸体获得的人胰岛细胞。
在一个实施方式中，治疗方法体内进行。
在一个实施方式中，连接于启动子的编码基因开关的多核苷酸和编码治疗多肽或治疗多核苷酸的多核苷酸是较大多核苷酸，例如载体的一部分。在另一实施方式中，连接于启动子的编码基因开关的多核苷酸和编码治疗多肽或治疗多核苷酸的多核苷酸是不同的多核苷酸，它们可以组合形成“核酸组合物”。
在某些实施方式中，本发明生物反应器包含在引入对象前围绕有屏障(例如，包裹化的)的修饰或非修饰细胞。这种生物反应器可用于任何对象，从而无需修饰每位个体的自体细胞。现已采用细胞包裹化方法来免疫分离细胞，从而能选择性或非选择性地释放所需生物材料。提供包裹化组合物及其制备方法，从而能提供改善的结构特征和/或免疫保护作用可能是理想的。这种组合物和方法可用于包裹化的细胞能耐受待治疗对象内的机械、化学或免疫破坏作用的场合，还使得营养素、离子、氧和维持组织和支持正常代谢功能所需的其它物质自由透过，但不透过细菌、淋巴细胞和负责免疫化学反应较大类蛋白质。适用于本发明的屏障能散播包含在屏障内的修饰或非修饰细胞表达的治疗蛋白或治疗多核苷酸，但防止这些细胞与对象免疫系统的细胞直接接触。屏障还起到防止非自体或自体修饰或非修饰细胞从引入部位逃脱(例如，如果进入循环可能对对象有害的劣种细胞(rogue cell))的作用。在一个实施方式中，屏障是选择性可透过屏障，例如可透过小分子，例如激素和小肽，但不透过较大多肽，例如抗体的屏障。例如，屏障不透过分子量大于约100,000、约50,000、约25,000、约10,000、约5,000或约1,000道尔顿的分子。
任何数量的屏障系统适用于本发明。在一个实施方式中，例如，屏障包括包入一个或多个细胞的保形包被。保形包被通常由聚合物材料，例如聚乙二醇或甲基丙烯酸羟乙酯-甲基丙烯酸甲酯(HEMA-MMA)制成。保形包被通常包封少量修饰细胞，例如1-10个细胞、1-20个细胞、1-30个细胞、1-50个细胞、1-70个细胞或1-90个细胞。参见，例如通过引用全文纳入本文的Shoichet MS，Winn SR.，Adv Drug Delivery Rev.42：81-102(2000)。
在其它实施方式中，适用于本发明的屏障系统包括含有包封细胞的生物反应器。本领域已知两种非限制性包封方法，微囊化和大包裹化。在微囊化中，细胞通常悬浮在生物相容的包裹化材料中，然后定型成珠样结构，而在大包裹化中，通常先制成该器件再加入细胞，该器件可由一种或多种合成膜构成。与保形包被相比，包含包裹化细胞的屏障系统在大小上更统一，孔径更均匀，从而能更好地控制蛋白质散播。对于包裹化，可在足够温和的条件下处理活细胞和其它敏感材料，从而使得细胞或生物材料基本上不受包裹化过程的影响，但仍能形成强度足够长期维持的胶囊。
活细胞可包裹化，通过将细胞在生物相容半透膜中包裹化，得到的包裹化细胞在体内长期维持。增加生物相容性的一种方法是加入生物相容带负电材料的外表面。本文所用的术语“生物相容”共同指完整的胶囊及其内含物。具体地说，其指植入的完整包裹化细胞避免身体各种保护系统，例如免疫系统或异物纤维变性反应的破坏作用和功能维持显著时间的能力。
包含适用于本发明的包裹化细胞的生物反应器对于将细胞给予动物特别有用，在该情况中要尽可能降低动物对细胞的免疫反应。还可给予产生抗体、酶和其它生物活性材料的细胞。本发明的所得包裹化细胞在对象内体积小有助于通过注射、植入或移植将微胶囊给予入对象。
可将活细胞包封在各种凝胶，例如藻酸盐中以形成可植入的珠样结构，例如微珠或微球，从而一旦植入待治疗的对象即可在物理上分离细胞。为防止较小分子量的物质，例如抗体和补体(分子量约150kDa)进入这些珠-样结构，可用能提供孔径受控外壳的，例如聚-L-赖氨酸、几丁质或PAN-PVC等材料包被它们，或者可通过，例如交联处理它们以控制它们的内部多孔性。有用材料的其它例子包括有天然或合成聚合物或共聚物制成的常规生物相容材料，例如聚-L-赖氨酸-藻酸盐、胶原、明胶、层粘连蛋白、甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸羟乙酯、MATRIGEL、VIRTOGEN、聚乙烯醇、琼脂糖、聚乙二醇、水凝胶、聚乳酸、聚乙醇酸、聚(丙交酯-共-乙交酯)、聚羟基丁酸酯-聚羟基戊酸酯共聚物、聚(丙交酯-共-己内酯)、聚酰胺酯、聚原酸酯、聚13-羟基丁酸、聚酐、聚对苯二甲酸乙酯、聚四氟乙烯、聚丙烯酸酯类(pllyacrylates)(包括丙烯酸共聚物)、聚偏乙烯、聚氯乙烯共聚物、聚氨基甲酸酯、聚苯乙烯、聚酰胺、醋酸纤维素、硝酸纤维素、聚砜(包括聚醚砜)、聚磷腈(polyphosphazenes)、聚丙烯腈和聚(acrylonitrile/covinyl chloride)。
一种形式的包裹化是微囊化，其涉及将细胞悬浮在液体或明胶状包裹化材料中，然后形成支持性颗粒基质，例如水凝胶基质以形成珠-样结构，其用作可植入器件的核心。该核心维持合适的细胞分布，提供强度并增强细胞活力、寿命和功能。该核心还可导致免疫分离。其还保护珠样结构中包含的内部细胞免遭可引发待治疗对象中不良免疫反应的直接细胞-细胞相互作用。
屏障系统可含有多层，例如各层用于不同目的(例如，支持、控制透过性)。屏障可包含对比剂或使得屏障可成像的其它特性(例如，通过x-射线、超声检查等)以确保植入细胞定位合适。可用于细胞植入的屏障系统的其它例子描述于美国专利号7,226,978、RE39,542(琼脂糖)、6,960,351、6,916,640、6,911,227(聚乙二醇)、6,818,018、6,808,705、6,783,964、6,762,959、6,727,322、6,610,668(聚-14-N-乙酰葡萄糖胺(p-GIcNAc)多糖)、6,558,665、RE38,027、6,495,161、6,368,612、6,365,385、6,337,008、6,306,454(聚亚烷基)、6,303,355、6,287,558(凝胶超级基质)、6,281,015、6,264,941、6,258,870、6,180,007、6,126,936(多胺酸)、6,123,700、6,083,523、6,020,200、5,916,790、5,912,005、5,908,623、5,902,745、5,858,746、5,846,530(多糖)、5,843,743、5,837,747、5,837,234、5,834,274、5,834,001、5,801,033、5,800,829、5,800,828、5,798,113、5,788,988、5,786,216、5,773,286、5,759,578、5,700,848、5,656,481、5,653,975、5,648,099、5,550,178、5,550,050、4,806,355、4,689,293、4,680,174、4,673,566、4,409,331、4,352,883、和美国专利申请公布2006/0263405(藻酸盐/聚合物)和2004/0005302(藻酸盐-聚-L-赖氨酸)，各自通过引用全文纳入本文。
在某些实施方式中，适用于本发明的屏障系统包含微囊化细胞。微囊化产生包含包裹化细胞的大致球形和相对均匀的珠-样结构，其中珠-样结构直径约100-700μm，例如直径约100、200、300、400、500、600或700μm。可利用上述各种包裹化材料制备本发明的微囊化细胞。在一个实施方式中，包裹化材料包含水凝胶。在另一实施方式中，包裹化材料包含聚合物。合适的聚合物包括但不限于纤维素，例如硫酸纤维素和藻酸盐。例如，本发明的一种微胶囊包含聚阴离子藻酸盐和聚阳离子聚合物，从而能相互作用并形成物理选择渗透性膜屏障。微囊化的其它方法包括形成聚(L-丙交酯)酸(PLLA)或聚-L-鸟氨酸(PLO)藻酸盐微球。参见，例如Darrabie，M.D.等.Biomaterials 26：6846-6852(2005)和Blasi，P.等.Int J Pharm.324：27-36(2006)。基于藻酸盐的微囊化材料还可包含也是生物可降解的超高粘度(UHV)聚合物。参见，例如Zimmermann，U.等.Ann NYAcadSci.944：199-215(2001)。
包含微囊化细胞的本发明生物反应器通常包含每个“珠”至少一个到最多约1000个细胞，例如要分泌本文所述所需治疗多肽或多核苷酸的修饰或非修饰细胞。例如，包含微囊化细胞的本发明生物反应器可包含每个“珠”至少50个、至少100个、至少200个、至少400个、至少500个、至少800个到约1000个或更多个细胞。
在某些实施方式中，适用于本发明的生物反应器包含包封在巨囊化(macroencapsulation)器件中的细胞。与包含微囊化细胞的生物反应器相比，包含大包裹化细胞的生物反应器通常更大，常是非球形包裹化细胞实体，并可由一种或多种合成膜，例如1、2、3、4、8、10或更多种膜构成，这些膜的组成可以相同或不同。如名称所示，大包裹化细胞器件的大小使得各实体易于操作。例如，典型的巨囊化器件可以是长椭圆形，长约3mm、4mm、5mm、6mm、7mm、8mm、9mm、10mm或更长，直径约1mm、2mm、3mm、4mm或5mm或更长。本发明的示范性而非示例性巨囊化器件约6mm长，直径约1mm。
在某些实施方式中，适用于本发明的巨囊化器件包含两种或更多种合成膜，其中合成膜的孔径不同从而能调节治疗分子经该器件的运输以及它们散播入环境。在某些实施方式中，本发明的巨囊化器件包含半透聚合物外膜和支持细胞的内部支架。在非限制性例子中，外膜包含约15nm的孔以交换治疗分子的营养物。内部支架可包含任何数量的材料。在一个非限制性例子中，支架包含聚对苯二甲酸乙二酯纱线(购自神经技术公司(Neurotech，www.neurotechusa.com))。
在另一非限制性例子中，适用于本发明的巨囊化器件包含聚合膜双层，其中该双层包含层叠在内部致密孔0.45uM PTFE免疫屏障层上的0.5μm聚(四氟乙烯)(PTFE)膜外层(购自特拉赛特公司(Theracyte，www.theracyte.com))。这种巨囊化器件还可在所述聚合膜双层外包含无纺聚合网层。在还有另一非限制性例子中，适用于本发明的巨囊化器件由聚醚砜(PES)中空纤维构成。参见，例如Li，Y.等，J.Membrane Sci.245：53-60(2004)。
适用于本发明的巨囊化器件可任选具有额外结构，从而能植入待治疗的对象并从中回收。例如，巨囊化器件可包含但不限于：缝合夹、装填端口、系线或便于使用的其它结构。
本发明巨囊化器件的内部空间通常适合包含至少1个到最多约至少105个细胞，例如要分泌所需治疗多肽或多核苷酸的修饰细胞。例如，本发明的巨囊化器件可包含至少500、至少1000、至少2000、至少4000、至少5000到约10,000个或更多个细胞。
要分泌所需治疗多肽或多核苷酸的一些本发明生物反应器器件，例如包裹化或包被的修饰或非修饰细胞还可在，例如屏障或胶囊内包含保护性细胞，该保护性细胞能为要分泌所需治疗多肽或多核苷酸的修饰或非修饰细胞提供保护作用。这种保护性细胞的非限制性例子包括修饰或非修饰的塞托利细胞和红细胞。此外，要分泌所需治疗多肽或多核苷酸的一些本发明生物反应器器件，例如包裹化或包被的修饰或非修饰细胞还可包含能产生更相容或保护性微环境的外涂层。可产生的示范性但非限制性微环境包括抗炎性微环境和促血管生成性微环境。
在还有其它实施方式中，本发明生物反应器器件可包括具有“安全-关闭”机制的修饰细胞。例如，生物反应器器件中所含的修饰细胞可包含编码致死多肽的调节自杀基因，当该基因活化后将诱导该修饰细胞本身的破坏作用。例如，如果修饰细胞脱离屏障系统，或者如果经历致癌转化，其可程序性死亡。下文更详细描述了适用于本发明的致死多肽的非限制性例子。
实施治疗方法的对象可以是需要治疗或预防的任何对象。例如，该对象可以是表现出疾病、病症或病状的一种或多种症状的对象。该对象还可以是易患疾病、病症或病状的对象，例如因为遗传学、家族史或环境接触的原因。该对象可以是普通公众的成员，例如人群中对疾病、病症或病状作预防性免疫接种的那部分。
待用本发明方法治疗或预防的疾病、病症或病状可以是有一种或多种治疗开关启动子可用的任何疾病、病症或病状。可通过本发明方法治疗或预防的疾病或病症的例子包括但不限于：超增殖性疾病、病症或病状(例如，癌症)，心血管疾病、病症或病状，神经疾病、病症或病状，自身免疫疾病、病症或病状，骨疾病、病症或病状，胃肠疾病、病症或病状，血液疾病、病症或病状，代谢疾病、病症或病状，炎性疾病、病症或病状和感染性疾病、病症或病状。
本发明的治疗开关启动子可以是可用于治疗、缓解或预防特定疾病、病症或病状的任何启动子。例子包括但不限于：只在特定疾病、病症或病状期间显示表达增加的基因的启动子和在特定细胞条件下(例如，增殖、凋亡、pH改变、氧化状态、氧水平)显示表达增加的基因的启动子。在基因开关包含多条转录因子序列的一些实施方式中，可通过组合疾病或病症-特异性启动子与组织或细胞类型特异性启动子以限制表达治疗产物的组织从而增加该治疗方法的特异性。因此，治疗开关启动子的定义包括组织-或细胞类型-特异性启动子。
作为疾病特异性启动子的例子，治疗癌症有用的启动子包括致癌基因的启动子。致癌基因类别的例子包括但不限于：生长因子、生长因子受体、蛋白激酶、程序性细胞死亡调节剂和转录因子。致癌基因的具体例子包括但不限于：sis、erb B、erb B-2、ras、abl、myc和bcl-2及TERT。其它癌症相关基因的例子包括肿瘤相关抗原基因和在肿瘤细胞中过表达的其它基因(例如，MAGE-1、癌胚抗原、酪氨酸酶、前列腺特异性抗原、前列腺特异性膜抗原、p53、MUC-1、MUC-2、MUC-4、HER-2/neu、T/Tn、MART-1、gp100、GM2、Tn、sTn和汤普森-弗莱德里系抗原(Thompson-Friedenreich antigen)(TF))。
表1和2所列参考文献公开了本领域已知并可用作本发明治疗开关启动子的启动子序列和其它调节元件(例如增强子)，以及各启动子相关的疾病/病症(表1)或组织特异性(表2)。这些参考文献中公开的启动子序列通过引用全文纳入本文。
表1
  启动子序列   疾病/病症   专利/申请公布号
  Her-2/neu(ERBB2/c-erbB-2)   癌症   5,518,885
  骨钙蛋白   钙化肿瘤   5,772,993
  溶基质素-1   癌症   5,824,794
  前列腺特异性抗原   前列腺癌   5,919,652
  人碘化钠共运输体   甲状腺癌   6,015,376
  H19，IF-1，IGF-2   癌症   6,306,833
  胸腺素β15   乳腺，胰腺，前列腺癌   6,489,463
  T细胞因子   癌症   6,608,037
  软骨衍生的视黄酸-敏感蛋白   软骨肉瘤，乳腺肿瘤   6,610,509
  胰岛素   胰腺癌   6,716,824
  PEG-3   癌症   6,737,523
  端粒酶逆转录酶   癌症   6,777,203
  黑色素瘤分化相关基因-7   癌症   6,841,362
  Prostasin(前列腺分泌的一种丝氨酸蛋白水解酶)   癌症   6,864,093
  端粒酶催化亚基细胞周期蛋白-A   癌症   6,936,595
  中期因子；c-erbB-2   癌症   7,030,099
  前列腺特异性膜抗原   前列腺癌   7,037,647
  p51   癌症   7,038,028
  端粒酶RNA   癌症   7,084,267
  启动子序列   疾病/病症   专利/申请公布号
  前列腺酸性磷酸酶   前列腺癌   7,094,533
  PCA3dd3   前列腺癌   7,138,235
  DF3/MUC1   癌症   7,247,297
  hex II   癌症   2001/0011128
  环加氧酶-2   癌症   2002/0107219
  超级PSA   前列腺癌   2003/0078224
  skp2   癌症   2003/0109481
  PRL-3   转移性结肠癌   2004/0126785
  CA125/M17S2   卵巢癌   2004/0126824
  IAI.3B   卵巢癌   2005/0031591
  CRG-L2   肝癌   2005/0124068
  TRPM4   前列腺癌   2006/0188990
  RTVP   神经胶质瘤   2006/0216731
  TARP   前列腺癌，乳腺癌   2007/0032439
  端粒酶逆转录酶   癌症   2007/0059287
  A4淀粉样蛋白   阿尔茨海默病   5,151,508
  淀粉样β-蛋白前体   阿尔茨海默病   5,643,726
  阿尔茨海默病A4淀粉样蛋白的前体   阿尔茨海默病   5,853,985
  神经肽FF   CNS病   6,320,038
  内质网应激元件   应激   7,049,132
  尿可汀II(urocortin II)   精神病   7,087,385
  酪氨酸羟化酶   神经病   7,195,910
  启动子序列   疾病/病症   专利/申请公布号
  补体因子3；血清淀粉样蛋白A3   炎症   5,851,822
  金属蛋白酶的组织抑制剂-3(TIMP-3)   风湿病，癌症，自身免疫疾病，炎症   5,854,019
  p75肿瘤坏死因子受体   自身免疫疾病   5,959,094
  肿瘤坏死因子-α   炎症   6,537,784
  过氧化物酶体增殖子活化的受体/IIA-1非胰腺分泌的磷脂酶A2   炎症   6,870,044
  SOCS-3   生长疾病，自身免疫疾病，炎症   2002/0174448
  SR-BI   脂质病   5,965,790
  Ob   肥胖症   5,698,389
  位点-1蛋白酶   肥胖症，糖尿病   7,045,294
  TIGR   青光眼   7,138,511
  VL30   缺氧   5,681,706
  兴奋性氨基酸运载体-2   神经系统缺血   2004/0171108
  MDTS9   肾衰竭   2006/0014931
  LIM，吡咯啉5-羧酸还原酶，SIM2   前列腺疾病   2006/0134688
  Bax   凋亡   5,744,310
  fas   凋亡   5,888,764
  bbc3   凋亡   7,202,024
  PINK-1   PI-3激酶/Akt途径疾病   2006/0228776
表2
启动子序列   组织特异性   专利/申请公布号
肌钙蛋白T   骨骼肌   5,266,488
myoD   肌肉   5,352,595
肌动蛋白   肌肉   5,374,544
平滑肌22α   动脉平滑肌   5,837,534
肌养相关蛋白   肌肉   5,972,609
肌肉生长抑制素(myostatin)   肌肉   6,284,882
平滑肌肌球蛋白重链   平滑肌   6,780,610
心脏锚蛋白重复蛋白   心肌   7,193,075
MLP   肌肉   2002/0042057
平滑肌蛋白   平滑肌   2003/0157494
MYBPC3   心肌细胞   2004/0175699
Tα1α-微管蛋白   神经元   5,661,032
细胞间粘附分子-4(ICAM-4)   神经元   5,753,502
γ-氨基丁酸A型受体β1亚基   海马   6,066,726
神经元烟碱乙酰胆碱受体β2-亚基   神经元   6,177,242
早老素-1   神经元   6,255,473
钙-钙调节蛋白依赖性激酶IIα   前脑   6,509,190
CRF2α受体   脑   7,071,323
  神经生长因子   神经元   2003/159159
  GLP-2受体   肠，脑   2002/0045173
  I型转谷氨酰胺酶   角质形成细胞   5,643,746
  K14   角质形成细胞   6,596,515
启动子序列   组织特异性   专利/申请公布号
  硬脂酰-CoA去饱和酶   皮肤   2002/0151018
  麦格星(megsin)   肾细胞   6,790,617
  催乳素   垂体   5,082,779
  GDF-9   卵巢，睾丸，下丘脑，垂体，胎盘   7,227,013
  PSP94   前列腺   2003/0110522
  NRL；NGAL   乳腺   5,773,290
  长乳清酸性蛋白   乳腺   5,831,141
  乳腺相关淀粉样蛋白A   乳腺管上皮细胞   2005/0107315
  内皮素-1   内皮细胞   5,288,846
  丝甘蛋白   造血细胞   5,340,739
  血小板-内皮细胞粘附分子-1(PECAM-1)   血小板，白细胞，内皮细胞   5,668,012
  Tie受体酪氨酸激酶   内皮细胞，骨髓   5,877,020
  KDR/flk-1   内皮细胞   5,888,765
  内皮糖蛋白   内皮细胞   6,103,527
  CCR5   骨髓和淋巴细胞   6,383,746
  CD11d   骨髓细胞   6,881,834
  血小板糖蛋白IIb   造血细胞   6,884,616
  前内皮素原-1   内皮细胞   7,067,649
  白介素-18结合蛋白   单核的细胞   2006/0239984
  CD34   造血干细胞   5,556,954
  Tec酪氨酸激酶   造血干细胞，肝脏   6,225,459
在特定疾病或病症期间显示表达水平改变，因此可提供用于本发明的启动子的其它基因包括但不限于表3所列的基因(连同相关的疾病/病症)。
表3
基因 疾病/病症   专利/申请公布号
 MLH1，MSH2，MSH6，PMS1，APC   结肠直肠癌   7,148,016
 LEF-1   结肠癌   2002/0169300
 F2受体   结肠癌   2002/0187502
 TGF-βII型受体   结肠癌   2004/0038284
 EYA4   结肠癌   2005/0003463
 PCA3   前列腺癌   7,138,235
 K2   前列腺癌   6,303,361
 PROST 03   转移性前列腺癌   2002/0009455
 PCAM-1   前列腺癌   2002/0042062
 PCADM-1   前列腺癌   2003/0100033
 PCA3dd3   前列腺癌   2003/0165850
 PCAV   前列腺癌   2006/0275747
 PAcP   雄激素不敏感的前列腺癌   2006/0294615
  通过引用纳入本文的专利5,866,329的SEQ ID NO：1   肝癌   5,866,329
  通过引用纳入本文的美国专利申请公布2002/0115094的SEQ ID NO：1，3   肝细胞癌   2002/0115094
  通过引用纳入本文的美国专利申请公布2005/0037372的SEQ ID NO：1   肝细胞癌   2005/0037372
基因 疾病/病症   专利/申请公布号
  ATB0   肝细胞癌   2006/0280725
  通过引用纳入本文的美国专利申请公布2007/0042420的SEQ ID NO：1，3   肝癌   2007/0042420
  CSA-1   软骨肉瘤   2001/0016649
  通过引用纳入本文的美国专利申请公布2001/0016651的SEQ ID NO：1-15   胰腺癌   2001/0016651
  通过引用纳入本文的美国专利申请公布2003/0212264的SEQ ID NO：1-15   胰腺癌   2003/0212264
  SYG972   乳腺癌   2002/0055107
  Urb-ctf   乳腺癌   2003/0143546
  BCU399   乳腺癌   2003/0180728
  TBX2   乳腺癌   2004/0029185
  Cyr61   乳腺癌   2004/0086504
  DIAPH3   乳腺癌   2005/0054826
  通过引用纳入本文的美国专利申请公布2007/0134669的SEQ ID NO：1-24   乳腺癌   2007/0134669
  人天冬氨酰(天冬酰胺酰)β-羟化酶   CNS癌症   2002/0102263
  BEHAB   CNS癌症   2003/0068661
  IL-8   卡波西肉瘤   2003/0096781
  通过引用纳入本文的美国专利申请公布2002/0198362的SEQ ID NO：1-278   血液学癌症   2002/0198362
  BLSA   B-细胞癌症   2003/0147887
  BP1   白血病   2003/0171273
基因 疾病/病症   专利/申请公布号
  DAP-激酶，HOXA9   非小细胞肺癌   2003/0224509
  ARP   透明细胞肾癌，炎性疾病   2004/0010119
  Nbk   肾癌   2005/0053931
  CD43   卵巢癌   2006/0216231
  通过引用纳入本文的美国专利申请公布2007/0054268的SEQ ID NO：1-84   卵巢癌   2007/0054268
  β7-hc G，β6-hCG，β6e-hCG，β5-hCG，β8-hcG，β3-hCG   子宫肿瘤   2006/0292567
  MTAls   激素不敏感性癌症   2006/0204957
  Old-35，Old-64   肿瘤增殖   2003/0099660
  LAGE-1   癌症   6,794,131
  CIF150/hTAFII150   癌症   6,174,679
  P65癌胚蛋白   癌症   5,773,215
  端粒酶   癌症   2002/0025518
  CYP1B1   癌症   2002/0052013
  14-3-3σ   癌症   2002/0102245
  NES1   癌症   2002/0106367
  CAR-1   癌症   2002/0119541
  HMGI，MAG   癌症   2002/0120120
  ELL2   癌症   2002/0132329
  肝配蛋白B2   癌症   2002/0136726
  WAF1   癌症   2002/0142442
基因 疾病/病症   专利/申请公布号
  CIF130   癌症   2002/0143154
  C35   癌症   2002/0155447
  BMP2   癌症   2002/0159986
  BUB3   癌症   2002/0160403
  聚合酶κ   癌症   2003/0017573
  EAG1，EAG2   癌症   2003/0040476
  通过引用纳入本文的美国专利申请公布2003/0044813的SEQ ID NO：18，20，22   癌症   2003/0044813
  HMGI   癌症   2003/0051260
  HLTF   癌症   2003/0082526
  Barx2   癌症   2003/0087243
  通过引用纳入本文的美国专利申请公布2003/0108920的SEQ ID NO：18，20，22，32，34，36   癌症   2003/0108920
  Cables   癌症   2003/0109443
  Pp 32r1   癌症   2003/0129631
  BMP4   癌症   2003/0134790
  TS10q23.3   癌症   2003/0139324
  核纺锤体相关蛋白   癌症   2003/0157072
  PFTAIRE   癌症   2003/0166217
  SEMA3B   癌症   2003/0166557
基因 疾病/病症   专利/申请公布号
  MOGp   癌症，多发性硬化症，炎性疾病   2003/0166898
  Fortilin(一种抗凋亡蛋白)   癌症   2003/0172388
  通过引用纳入本文的美国专利申请公布2003/0215833的SEQ ID NO：1   癌症   2003/0215833
  IGFBP-3   癌症   2004/0005294
  多同源异型(Polyhomeotic)2   癌症   2004/0006210
  PNQALRE   癌症   2004/0077009
  通过引用纳入本文的美国专利申请公布2004/0086916的SEQ ID NOS：1，3   癌症   2004/0086916
  SCN5A   癌症   2004/0146877
  miR15，miR16   癌症   2004/0152112
  Headpin   癌症   2004/0180371
  PAOh1/SMO   癌症   2004/0229241
  Hippo，Mst2   癌症   2005/0053592
  PSMA-样   癌症，神经性疾病   2005/0064504
  JAB1   癌症   2005/0069918
  NF-AT   癌症   2005/0079496
  P28ING5   癌症   2005/0097626
  MTG16   癌症   2005/0107313
  ErbB-2   癌症   2005/0123538
  HDAC9   癌症   2005/0130146
基因 疾病/病症   专利/申请公布号
  GPBP   癌症   2005/0130227
  MG20   癌症   2005/0153352
  KLF6   癌症   2005/0181374
  ARTS1   癌症   2005/0266443
  Dock 3   癌症   2006/0041111
  膜联蛋白8   癌症   2006/0052320
  MH15   癌症   2006/0068411
  DELTA-N p73   癌症   2006/0088825
  RapR6   癌症   2006/099676
  StarD10   癌症   2006/0148032
  Ciz1   癌症   2006/0155113
  HLJ1   癌症   2006/0194235
  RapR7   癌症   2006/0240021
  A34   癌症   2006/0292154
  Sef   癌症   2006/0293240
  Killin   癌症   2007/0072218
  SGA-1M   癌症   2007/0128593
  TGFβII型受体   癌症   2002/0064786
  GCA-相关基因   巨细胞动脉炎   6,743,903
  PRV-1   真性红细胞增多症   6,686,153
  通过引用纳入本文的美国专利5,948,637的SEQ ID NO：2，4   缺血   5,948,637
基因 疾病/病症   专利/申请公布号
  Vezf1   血管疾病   2002/0023277
  MLP   扩张性心肌病(Dilatativecardiomyopathy)   2002/0042057
  VEGI   病理性血管生成   2002/0111325
  PRO256   心血管疾病   2002/0123091
  AOP2   动脉粥样硬化   2002/0142417
  重塑蛋白(Remodelin)   动脉再狭窄，纤维化   2002/0161211
  磷酸二酯酶4D   中风   2003/0054531
  前列腺素受体亚型EP3   外周动脉阻塞疾病   2003/0157599
  CARP   心脏病   2004/0014706
  HOP   先天性心脏病   2004/0029158
  通过引用纳入本文的美国专利申请公布2004/0087784的SEQ ID NO：1-4   卒中   2004/0087784
  PLTP   动脉粥样硬化，血管疾病，高胆固醇血症，低α一脂蛋白血症，家族性HDL缺乏疾病   2006/0252787
  通过引用纳入本文的美国专利申请公布2007/0160996的SEQ ID NO：1，3-8，15，16   血栓形成   2007/0160996
  UCP-2   中风   2002/0172958
  FLJ11011   范康尼贫血   2006/0070134
  Codanin-1(新型红细胞分化因子)   贫血   2006/0154331
  通过引用纳入本文的美国专利5,763,591的SEQ ID NO：1，6，8   胰岛素依赖性糖尿病   5,763,591
基因 疾病/病症   专利/申请公布号
  抗性蛋白   II型糖尿病   2002/0161210
  Archipelin   糖尿病   2003/0202976
  通过引用纳入本文的美国专利申请公布2004/0053397的SEQ ID NO：2，7，16，27   糖尿病，高脂血症   2004/0053397
  Neuronatin   代谢病   2004/0259777
  Ncb5or   糖尿病   2005/0031605
  7B2   内分泌病症   2005/0086709
  PTHrP，PEX   代谢性骨疾病   2005/0113303
  KChIPl   II型糖尿病   2005/0196784
  SLIT-3   II型糖尿病   2006/0141462
  CX3CR1   II型糖尿病   2006/0160076
  SMAP-2   糖尿病   2006/0210974
  通过引用纳入本文的美国专利申请公布2006/0228706的SEQ ID NO：2，8，12，16，22，26，28，32   II型糖尿病   2006/0228706
  IC-RFX   糖尿病   2006/0264611
  E2IG4   糖尿病，胰岛素耐受，肥胖症   2007/0036787
 通过引用纳入本文的美国专利申请公布2007/0122802的SEQ ID NO：2，8，10，14，18，24，26，30，34，38，44，50，54，60，62，68，74，80，86，92，98，104，110   糖尿病   2007/0122802
 UCP2   体重紊乱   2002/0127600
 Ob受体   体重紊乱   2002/0182676
基因 疾病/病症   专利/申请公布号
 Ob   体重紊乱   2004/0214214
 Dp1   神经变性疾病   200I/0021771
 NRG-1   精神分裂症   2002/0045577
 突触蛋白III   精神分裂症   2002/0064811
 NRG1AG1   精神分裂症   2002/0094954
 AL-2   神经疾病   2002/0142444
 脯氨酸脱氢酶   双相性精神障碍，严重的抑郁性障碍，精神分裂症，强制性障碍   2002/0193581
 MNR2   慢性神经变性疾病   2002/0197678
 ATM   共济失调性毛细血管扩张症   2004/0029198
 Ho-1   痴呆性疾病   2004/0033563
 CON202   精神分裂症   2004/0091928
 失济蛋白-1   神经变性疾病   2004/0177388
 NR3B   运动神经元疾病   2005/0153287
 NIPA-1   遗传性痉挛性截瘫   2005/0164228
 DEPP，肾上腺髓质素，csdA   精神分裂症   2005/0227233
 Inf-20   神经变性疾病   2006/0079675
 EOPA   脑发育和变性疾病   2007/0031830
 SERT   孤独症   2007/0037194
 FRP-1   青光眼   2002/0049177
 血清淀粉样蛋白A   青光眼   2005/0153927
基因 疾病/病症   专利/申请公布号
 BMP2   骨质疏松症   2002/0072066
 BMPR1A   幼年性息肉病   2003/0072758
 ACLP   腹裂   2003/0084464
 抗性蛋白样分子β   家族性腺瘤性息肉病，糖尿病，胰岛素耐受，结肠癌，炎性肠病   2003/0138826
 Dlg5   炎性肠病   2006/0100132
  通过引用纳入本文的美国专利申请公布2002/0119452的SEQ ID NO：1-82   骨关节炎   2002/0119452
  TRANCE   免疫系统疾病   2003/0185820
  胞外基质蛋白-3   骨关节炎   2003/0203380
  Synoviolin   类风湿性关节炎   2004/0152871
  通过引用纳入本文的美国专利申请公布2007/0028314的SEQ ID NO：9，35   骨关节炎   2007/0028314
  HIV LTR   HIV感染   5,627,023
  SHIVA   HIV感染   2004/0197770
  EBI 1，EBI 2，EBI 3   E-B病毒感染   2002/0040133
  NM23家族   皮肤/肠道疾病   2002/0034741
  通过引用纳入本文的美国专利申请公布2002/0169127的SEQ ID NO：1   银屑病   2002/0169127
  Eps8   皮肤疾病，伤口愈合   2003/0180302
  β-10   甲状腺病   2002/0015981
  通过引用纳入本文的美国专利申请公布2003/0207403的SEQ ID NO：2   甲状腺病   2003/0207403
基因 疾病/病症   专利/申请公布号
  通过引用纳入本文的美国专利申请公布2007/0020275的SEQ ID NO：3   甲状腺疾病   2007/0020275
  发囊生长因子   脱发   2003/0036174
  角化粒(Corneodesmosin)   脱发   2003/0211065
  GCR9   哮喘，淋巴瘤，白血病   2003/0166150
  通过引用纳入本文的美国专利申请公布2004/0002084的SEQ ID NO：1-71   哮喘   2004/0002084
  Bg   切-东二氏综合征   2002/0115144
  通过引用纳入本文的美国专利申请公布2002/0127555的SEQ ID NO：1-16   子宫内膜异位   2002/0127555
  FGF23   血磷酸盐过少疾病   2005/0156014
  BBSR   巴-比二氏综合征   2003/0152963
  MIC-1   胎儿畸形，癌症，炎性疾病，流产，早产   2004/0053325
  MIA-2   肝脏损伤   2004/0076965
  IL-17B   软骨变性疾病   2004/0171109
  甲酰甘氨酸产生酶   多发性硫酸脂酶缺乏症   2004/0229250
  LPLA2   肺泡蛋白沉积症   2006/0008455
  CXCL1O   呼吸性疾病   2006/0040329
  通过引用纳入本文的美国专利申请公布2006/0140945的SEQ ID NO：1，2   肾病   2006/0140945
  HFE2A   铁代谢疾病   2007/0166711
一旦鉴定到表达模式在疾病、病症或病状期间受调节的基因，该基因的启动子可用于本发明的基因开关中。许多基因的序列，包括启动子区域是本领域已知的并可从公开数据库，例如GenBank获得。因此，一旦鉴定到合适的基因，则不难鉴定和获得启动子序列。本发明的另一方面涉及鉴定可分离其启动子并置于基因开关中的合适基因。因此，基因的身份对于本发明的具体实施方式不是至关重要的，只要该启动子能分离并可用于随后的配置和环境中。因此，本发明包括利用尚未鉴定的基因的启动子。一旦鉴定了合适的基因，那么测定启动子功能所需的遗传序列只是常规技术或实验的问题。实际上，有几种可商品化购得的方法协助测定感兴趣基因的启动子区域。例如，Ding等最近通过使得人Sprouty4基因的5′-侧接序列逐渐缺失而阐明了新型Sprouty4基因的启动子序列(Am.J.Physiol.Lung Cell.Mol.Physiol.287：L52(2004)，其通过引用纳入本文)。简言之，一旦测定了转录起始位点，则利用普通PCR引物产生PCR片段，从而以单向方式克隆5’-侧接区段的区段。将产生的区段克隆入萤光素酶受体载体，检测萤光素酶活性来测定人Sprouty4基因的启动子区域。
获取和验证基因启动子的另一示范性方法包括以下步骤：(1)获得组织类型相似/相同的患病和未患病细胞/组织样品；(2)分离该样品的总RNA或mRNA；(3)对患病和未患病RNA实施差别微阵列分析；(4)鉴定候选疾病-特异性转录物；(5)鉴定疾病特异性转录物相关的基因组序列；(6)获得或合成该疾病特异性DNA的预计转录起点上游和下游的DNA序列；(7)利用步骤6所得不同长度的DNA设计和产生启动子报道载体；和(8)检验患病和未患病细胞/组织以及无关细胞/组织中的启动子报道载体。
插入基因开关的启动子的来源可以是天然或合成的，启动子的来源应不限于本文所述的本发明范围。换言之，可从细胞直接克隆启动子，或者早已从不同来源克隆的启动子，或者可以合成启动子。
基因开关系统
基因开关可以是通过加入或除去特定配体而调节基因表达的任何基因开关。在一个实施方式中，基因开关是其中基因表达水平依赖于存在的配体水平的基因开关。可用于本发明基因开关中的配体依赖性转录因子复合物的例子包括但不限于：由其各自配体活化的核受体超家族的成员(例如，糖皮质激素、雌激素、妊娠素、类视黄醇、蜕皮素及其类似物和模拟物)和四环素活化的rTTA。在本发明的一方面。基因开关是基于EcR的基因开关。这种体系的例子包括但不限于：美国专利号6,258,603、7,045,315、美国专利申请公布号2006/0014711、2007/0161086和国际申请公布号WO 01/70816所述的系统。嵌合型蜕皮素受体系统的例子描述于美国专利号7,091,038、美国专利申请公布号2002/0110861、2004/0033600、2004/0096942、2005/0266457和2006/0100416和国际申请公布号WO 01/70816、WO 02/066612、WO02/066613、WO 02/066614、WO 02/066615、WO 02/29075和WO2005/108617，各自通过引用全文纳入本文。非类固醇蜕皮素激动剂-调节的系统的例子是马萨诸塞州伊普斯威奇市新英格兰生物实验室的
Figure GPA00001141248200471
哺乳动物诱导型表达系统(Mammalian InducibleExpression System，New England Biolabs，Ipswich，MA)。在本发明的另一方面，基因开关基于FK506结合蛋白(FKBP)与FBBP雷帕霉素相关蛋白(FRAP)的异二聚化，并通过雷帕霉素或其非免疫抑制性类似物调节。这种系统的例子包括但不限于：马萨诸塞州剑桥ARIAD药物公司的ARGENTTM转录技术(ARGENTTM Transcriptional Technology，ARIAD Pharmaceuticals，Cambridge，MA)和美国专利号6,015,709、6,117,680、6,479,653、6,187,757和6,649,595描述的系统。
在一个实施方式中，基因开关包含在治疗开关启动子控制下编码配体依赖性转录因子复合物的一条转录因子序列。该转录因子序列可编码天然产生的配体依赖性转录因子复合物或人工配体依赖性转录因子复合物。人工转录因子是其中转录因子的天然序列被改变，例如通过序列突变或通过组合不同转录因子的结构域获得的转录因子。在一个实施方式中，转录因子包含H组核受体配体结合结构域。在一个实施方式中，H组核受体配体结合结构域来自蜕皮素受体、遍在受体(UR)、孤儿受体1(OR-1)、类固醇激素核受体1(NER-1)、类视黄醇X受体相互作用蛋白-15(RIP-15)、肝X受体β(LXRβ)、类固醇激素受体样蛋白(RLD-1)、肝X受体(LXR)、肝脏X受体α(LXRα)、类法呢醇X受体(FXR)、受体相互作用蛋白14(RIP-14)、或法呢醇受体(HRR-1)。在另一实施方式中，H组核受体LBD来自蜕皮素受体。
A.基于蜕皮素的基因开关
EcR和其它H组核受体是核受体超家族的成员，其中所有成员的特征通常在于存在任选融合于异二聚伴侣(HP)以形成共活化蛋白(CAP)的氨基-末端反式激活域(AD，也可互换称为TA或TD)，DNA结合结构域(DBD)和经绞链区融合于DBD的LBD从而形成配体依赖性转录因子(LTF)。本文所用的术语“DNA结合结构域”包括DNA结合蛋白的最小多肽序列，到最多DNA结合蛋白的全长，只要DNA结合结构域能起到结合特定反应元件的作用。核受体超家族的成员的特征还在于存在4或5个结构域：A/B、C、D、E，和在一些实施成员中的F(参见US 4,981,784和Evans，Science 240：889(1988))。“A/B”结构域对应于反式激活域，“C”对应于DNA结合结构域，“D”对应于绞链区，和“E”对应于配体结合结构域。该家族的一些成员还可在LBD的羧基末端侧具有对应于“F”的另一反式激活域。
以下多肽序列报道为蜕皮素受体(蜕皮类固醇受体)(20-羟基-蜕皮素受体)(20E受体)(EcRH)(核受体亚家族1H组成员1)的多肽序列，其Genbank登录号为P34021。
黑腹果蝇(果蝇)的蜕皮素受体(878aa)(SEQ ID NO：5)
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841smyanaqtam almgvalhsh qeqliggvav ksehstta
DBD的特征在于存在两个半胱氨酸锌指，在其间是两个氨基酸基序，P-盒和D-盒，其赋予反应元件的特异性。这些结构域可以是天然的、修饰的或是异源受体蛋白的不同结构域的嵌合体。与该核受体家族的亚组相似，EcR还具有未良好确定的负责异源二聚特性的区域。因为核受体的结构域在自然界中是模块，LBD、DBD和TD可互换。
在另一实施方式中，转录因子包含AD、识别与要调节其表达的治疗蛋白或治疗多核苷酸相关的反应元件的DBD和H组核受体LBD。在某些实施方式中，H组核受体LBD包含取代突变。
在另一实施方式中，基因开关包含在第一治疗开关启动子(TSP-1)控制下的第一转录因子序列，例如CAP和在第二治疗开关启动子(TSP-2)控制下的第二转录因子序列，例如LTF，其中所述第一转录因子序列和所述第二转录因子序列编码的蛋白质相互作用从而形成蛋白质复合物(LDTFC)，即，“双重开关”或“双杂交体”基因开关。第一和第二TSP可以相同或不同。在该实施方式中，基因开关中存在治疗分子表达所需的两种不同TSP提高了治疗方法的特异性(参见图2)。图2还证明通过插入合适的TSP能修饰治疗基因开关从而简单地治疗任何疾病、病症或病状。
在进一步的实施方式中，该第一和第二转录因子序列，例如CAP或LTF在一个治疗开关启动子(例如，图1中的TSP-1)的控制下。活化该启动子会产生含一个开放读框的CAP和LTF。利用转录接头，例如IRES(内部核糖体进入位点)可实现。在该实施方式中，配体依赖性转录因子复合物的两部分是TSP-1活化后合成的。TSP-1可以是组成型启动子或只在疾病、病症或病状相关条件下活化。
在进一步的实施方式中，一个转录因子序列，例如LTF在只在疾病、病症或病状相关条件下活化的治疗开关启动子(例如，图4中的TSP-2或TSP-3)的控制下，而另一转录因子序列，例如CAP在组成型治疗开关启动子(例如，图4中的TSP-1)的控制下。在该实施方式中，配体依赖性转录因子复合物的一部分是组成型存在的，而第二部分只在疾病、病症或病状相关条件下合成。
在另一实施方式中，一个转录因子序列，例如CAP在第一TSP(例如，图3中的TSP-1)的控制下，而两个或更多个不同的第二转录因子序列，例如LTF-1和LTF-2在不同TSP(例如，图3中的TSP-2和TSP-3)的控制下。在该实施方式中，LTF各自可具有识别不同因子调节的启动子序列的不同DBD(例如，DBD-A结合因子调节的启动子-1(FRP-1)相关反应元件，DBD-B结合因子调节的启动子-2(FRP-2)相关反应元件)。各因子调节的启动子可操作性连接于不同治疗基因。以此方式，可同时提供多种治疗。
在一个实施方式中，第一转录因子序列编码包含AD、识别与要调节其表达的治疗产物序列相关的反应元件的DBD和H组核受体LBD的多肽，第二转录因子序列编码包含核受体LBD的转录因子，所述LBD选自下组：脊椎动物类维生素A受体(RXR)、无脊椎动物RXR、超螺旋蛋白(USP)、或包含至少两个不同核受体配体结合结构域多肽片段的嵌合型核受体，其中所述片段选自：脊椎动物RXR、无脊椎动物RXR和USP(参见WO 01/70816A2和US 2004/0096942A1)。“伴侣”核受体配体结合结构域还可包含截短突变、缺失突变、取代突变或另一修饰。
在另一实施方式中，基因开关包含编码第一多肽的第一转录因子序列和编码第二多肽的第二转录因子序列，所述第一多肽包含核受体LBD和识别与要调节其表达的治疗产物序列相关的反应元件的DBD，而所述第二多肽包含AD和核受体LBD，其中核受体LBD之一是H组核受体LBD。在优选的实施方式中，所述第一多肽基本上不含AD，所述第二多肽基本上不含DBD。出于本发明的目的，“基本上不含”表示所述蛋白含有的所述结构域的序列不足以提供活化或结合活性。
在本发明的另一方面，第一转录因子序列编码包含异二聚伴侣和AD的蛋白(CAP)，第二转录因子序列编码包含DBD和LBD的蛋白(LTF)。
当只有一个核受体LBD是H组LBD，另一核受体LBD可以来自与H组LBD构成二聚体的任何其它核受体。例如，当H组核受体LBD是EcRLBD时，另一核受体LBD“伴侣”可以来自EcR、脊椎动物RXR、无脊椎动物RXR、超螺旋蛋白(USP)、或包含至少两个不同核受体LBD多肽片段的嵌合型核受体，所述片段选自：脊椎动物RXR、无脊椎动物RXR和USP(参见通过引用全文纳入本文的WO 01/70816A2，国际专利申请号PCT/US02/05235和US 2004/0096942A1)。“伴侣”核受体配体结合结构域还可包含截短突变、缺失突变、取代突变或另一修饰。
在一个实施方式中，脊椎动物RXR LBD来自智人(Homo sapiens)、小鼠(Mus musculus)、大鼠(Rattus norvegicus)、鸡(Gallus gallus)、家猪(Susscrofa domestica)、蛙(爪蟾(Xenopus laevis))、斑马鱼(zebrafish)(Danio rerio)、被囊动物海鞘(Polyandrocarpa misakiensis)、或水母(Tripedalia cysophora)RXR。
在一个实施方式中，无脊椎动物RXR配体结合结构域来自蝗虫(Locusta migratoria)超螺旋多肽(“LmUSP”)、硬蜱(美洲钝眼蜱(Amblyommaamericanum))RXR同源物1(“AmaRXR1”)、硬蜱(美洲钝眼蜱)RXR同源物2(“AmaRXR2”)、招潮蟹(Celuca pugilator)RXR同源物(“CpRXR”)、甲虫(黄粉甲虫(Tenebrio molitor))RXR同源物(“TmRXR”)、蜜蜂(Apis mellifera)RXR同源物(“AmRXR”)、蚜虫(Myzus persicae)RXR同源物(“MpRXR”)、或非-双翅类/非-鳞翅类RXR同源物。
在一个实施方式中，嵌合型RXR LBD包含至少两个选自下组的多肽片段：脊椎动物物种RXR多肽片段、无脊椎动物物种RXR多肽片段和非-双翅类/非-鳞翅类无脊椎动物物种RXR同源物多肽片段。本发明所用的嵌合型RXR配体结合结构域可包含至少两个不同物种的RXR多肽片段，或者当物种相同时，两个或更多个多肽片段可以来自该物种RXR多肽片段的两种或更多种不同的同种型。
在一个实施方式中，嵌合型RXR配体结合结构域包含至少一个脊椎动物物种的RXR多肽片段和一个无脊椎动物物种的RXR多肽片段。
在另一实施方式中，嵌合型RXR配体结合结构域包含至少一个脊椎动物物种的RXR多肽片段和一个非-双翅类/非-鳞翅类无脊椎动物物种的RXR同源物多肽片段。
当配体与核受体的LBD联用，受体进而结合与治疗产物序列相关FRP的反应元件时，其能外在瞬时调节治疗产物序列的表达。本发明各种组分彼此结合的结合机制或顺序，即，例如配体与LBD结合，DBD与反应元件结合、AD与启动子结合等不重要。
在具体的实例中，配体结合H组核受体的LBD及其核受体LBD伴侣使得治疗产物序列表达。该机制不排除配体结合H组核受体(GHNR)或其伴侣，以及导致活性同源二聚体复合物(例如GHNR+GHNR或伴侣+伴侣)形成的可能性。优选改变受体结构域中的一个或多个从而产生杂交基因开关。该三个结构域，DBD、LBD和AD中的一个或多个通常可从与其它结构域来源不同的来源选择，从而能在所选宿主细胞或生物体内为反式激活活性、与配体互补结合和识别特异性反应元件而优化杂交基因和得到的杂交蛋白。此外，可用其它DNA结合蛋白质结构域，例如酵母的GAL-4蛋白(参见Sadowski等，Nature 335：563(1988))或大肠杆菌的LexA蛋白(参见Brent等，Cell43：729(1985))的反应元件或与蛋白质靶向相互作用的特异性合成反应元件来修饰或取代反应元件本身来容纳杂交受体，所述蛋白质是为这种特异性相互作用而设计、修饰和选择的(参见，例如Kim等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，94：3616(1997))。双杂交系统的另一优点是它们能根据所需的最终结果选择用于驱动基因表达的启动子。这种双重控制在基因治疗领域尤其重要，特别是当产生细胞毒性蛋白时，因为既可控制表达的时机又可控制发生表达的细胞。当操作性连接于合适启动子的基因引入对象的细胞时，该外源性基因的表达受到本发明系统存在的控制。启动子可以是组成型或诱导型调节的，或者可以是组织-特异性的(即，只在特定细胞类型中表达)或是生物体的某些发育阶段特异性的。
有或没有配体存在下，第一杂交蛋白的DNA结合结构域结合反应元件的DNA序列以启动或阻遏该反应元件调节下的下游基因转录。
功能性LDTFC，例如EcR复合物还可包含其它蛋白质，例如亲免蛋白。称为转录因子的核受体家族蛋白的其它成员(例如，DHR38，βFTZ-1)也可以是EcR、USP和/或RXR的配体依赖性或非依赖性伴侣。此外，可能需要其它辅因子，例如通常称为辅助活化物(也称为衔接头或介导物)的蛋白质。这些蛋白质不序列特异性地结合DNA，也不涉及基础转录。它们可通过各种机制对转录活化施加其影响，包括刺激活化物的DNA-结合，通过影响染色质结构，或通过介导活化物启动复合物相互作用。这种辅助活化物的例子包括RIP140、TIF1、RAP46/Bag-1、ARA70、SRC-1/NCoA-1、TIF2/GRIP/NCoA-2、ACTR/AIB1/RAC3/pCIP以及泛宿主性共活化物C反应元件B结合蛋白，CBP/p300(综述参见Glass等，Curr.Opin.Cell Biol.9：222(1997))。蛋白质辅助活化物通常也称为辅阻遏物(也称为阻遏物、沉寂子或沉默介导物)，其可能是没有配体存在下有效抑制转录活化所需。这些辅阻遏物可与未结合配体(unliganded)的EcR相互作用以使得反应元件活性沉默。目前的证据提示配体结合改变了受体的构象，从而导致辅阻遏物释放和上述共活化物募集，藉此消除它们的沉默活性。辅阻遏物的例子包括N-CoR和SMRT(综述参见Horwitz等，Mol Endocrinol.10：1167(1996))。这些辅因子可以是细胞或生物体内源性的，或者可以是作为转基因而外源性加入从而以调节或未调节的方式表达。
B.基于雷帕霉素的基因开关
本发明还提供利用FK506结合蛋白作为配体依赖性转录因子复合物和利用雷帕霉素作为配体的基因开关系统。在一个实施方式中，编码基因开关的构建物包含：
(a)编码第一嵌合蛋白的第一多核苷酸，所述蛋白结合雷帕霉素或其类似物并包含至少一个FK506-结合蛋白(FKBP)结构域和至少一个与其异源的蛋白质结构域，其中FKBP结构域包含选自以下的肽序列：
(1)天然产生的FKBP
(2)天然产生的FKBP的变体，其中有最多10个氨基酸残基缺失、插入或被取代氨基酸替换，和
(3)DNA序列编码的FKBP，所述DNA序列与编码(1)或(2)所述FKBP的DNA序列选择性杂交；
(b)编码第二嵌合蛋白的第二多核苷酸，所述蛋白与(a)雷帕霉素或雷帕霉素类似物和(b)所述第一嵌合蛋白形成复合物，并包含至少一个FKBP：雷帕霉素结合(FRB)结构域和至少一个异源蛋白结构域，其中FRB结构域包含选自以下的肽序列：
(4)天然产生的FRB结构域，
(5)天然产生的FRB结构域的变体，其中有最多10个氨基酸残基缺失、插入或被取代氨基酸替换，和
(6)DNA序列编码的FRB结构域，所述DNA序列与编码(4)或(5)所述FRB的DNA序列选择性杂交。
在该基因开关系统中，第一多核苷酸和第二多核苷酸各自在一个或多个本文它处所述的治疗开关启动子的控制下。此外，在某些实施方式中，所述第一和第二嵌合蛋白质中FKBP和/或FRB结构域的至少一个异源蛋白结构域可以是一个或多个“作用”或“效应”结构域。效应结构域可以选自各种蛋白质结构域，包括DNA结合结构域、转录活化结构域、细胞定位结构域和信号转导结构域(即，能在群集或聚合后触发细胞生长、增殖、分化、凋亡、基因转录等的结构域)。
在某些实施方式中，一种融合蛋白含有至少一个DNA结合结构域(例如，GAL4或ZFHD1DNA-结合结构域)，另一融合蛋白含有至少一个转录活化结构域(例如，VP16或p65转录活化结构域)。配体介导的融合蛋白结合代表转录因子复合物的形成并启动与融合蛋白之一上的DNA结合结构域所识别(即，能与之结合)的DNA序列相连的靶基因转录。美国专利号6,187,757B1、6,649,595 B1、6,509,152 B1、6,479,653 B1和6,117,680 B1公开了基因表达系统以及配体的信息。
在其它实施方式中，本发明提供包含多核苷酸的基因开关系统，所述多核苷酸编码在没有配体存在下自我凝聚的两种融合蛋白，其中(a)所述第一融合蛋白包含结合所选配体的有条件凝聚结构域和转录活化结构域，(b)所述第二融合蛋白包含结合所选配体的有条件凝聚结构域和DNA结合结构域，和(c)没有配体存在下，细胞表达操作性连接于调控DNA的基因，所述调控DNA结合所述DNA结合结构域。有配体存在下，包含基因开关系统的修饰细胞的扩增量足以阻遏该基因。除去配体诱导造成细胞死亡的所编码蛋白质表达。编码两种融合蛋白的核酸在至少一个有条件启动子的控制下。美国申请号2002/0048792公开了利用有条件凝聚结构域的基因表达系统。
C.基于原核阻遏子/操纵子的基因开关系统
在一个实施方式中，本发明提供包含以下的基因开关系统：(a)编码反式激活融合蛋白的第一多核苷酸，该蛋白包含原核四环素(“tet”)阻遏子和真核转录激活蛋白结构域；和(b)编码治疗蛋白或治疗多肽的第二多核苷酸，其中所述第二多核苷酸操作性连接于最小启动子和至少一个tet操纵子序列。编码反式激活融合蛋白的第一多核苷酸可包含本文它处所述的治疗开关启动子。没有四环素存在下，致死性蛋白的表达上调(参见，例如Gossen等，(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.89：5547-5551；Gossen等，(1993)TIBS 18：471-475；Furth等，(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.91：9302-9306；和Shockett等，(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.92：6522-6526)。美国专利号5,464,758B1公开了TetO表达系统。
在另一实施方式中，基因开关系统包含大肠杆菌(Escherichia coli)的乳糖(“Lac”)阻遏子-操纵子系统。本发明的基因开关系统还可包含：(a)编码反式激活融合蛋白的第一多核苷酸，其包含原核lac I阻遏子和真核转录激活蛋白结构域；和(b)编码治疗蛋白或治疗多肽的第二多核苷酸，其中所述第二多核苷酸操作性连接于治疗开关启动子。在Lac系统中，没有乳糖或者合成类似物，例如异丙基-b-D-硫代半乳糖苷存在下lac操纵子是失活的。
其它基因开关系统包括以下文献所述的：US 7,091,038；WO2004078924；EP1266015；US20010044151；US20020110861；US20020119521；US20040033600；US20040197861；US20040235097；US20060020146；US20040049437；US20040096942；US20050228016；US20050266457；US20060100416；WO2001/70816；WO2002/29075；WO2002/066612；WO2002/066613；WO2002/066614；WO2002/066615；WO2005/108617；US 6,258,603；US20050209283；US20050228016；US20060020146；EP0965644；US 7,304,162；US 7,304,161；MX234742；KR10-0563143；AU765306；AU2002-248500；和AU2002-306550。
D.基因开关系统的组合
本发明提供包含两种或更多种含有不同配体依赖性转录因子复合物的基因开关系统的核酸组合物、修饰细胞和生物反应器，所述转录因子复合物被有效量的一种或多种配体激活，其中所述两种或更多种基因开关系统包含第一基因开关和第二基因开关，二者在结合一种或多种配体后选择性诱导一种或多种治疗多肽或治疗多核苷酸表达。任何数量和/或组合的基因开关系统属于本发明范围。
在一个实施方式中，本发明提供包含以下的核酸组合物：
a第一基因开关系统，其包含：
i.包含编码第一杂交多肽的多核苷酸的第一基因表达盒，其包含：
1.反式激活域，其激活操作性连接于编码治疗多肽或治疗多核苷酸的多核苷酸的因子调节的启动子；和
2.异二聚伴侣结构域，
ii.包含编码第二杂交多肽的多核苷酸的第二基因表达盒，其包含：
1.DNA-结合结构域，其识别操作性连接于编码治疗多肽或治疗多核苷酸的多核苷酸的因子调节的启动子；和
2.配体结合结构域；和
iii.包含编码治疗多肽或治疗多核苷酸的多核苷酸的第三基因表达盒，其包含：
1.由所述第二杂交多肽的反式激活域激活的因子调节的启动子；和
2.编码治疗多肽或治疗多核苷酸的多核苷酸，和
b.第二基因表达系统，其包含：
i.包含编码第一杂交多肽的多核苷酸的第一基因表达盒，其包含：
1.反式激活域，其激活操作性连接于编码治疗多肽或治疗多核苷酸的多核苷酸的因子调节的启动子；和
2.异二聚伴侣结构域，
ii.包含编码第二杂交多肽的多核苷酸的第二基因表达盒，其包含：
1.识别操作性连接于编码治疗多肽或治疗多核苷酸的多核苷酸的因子调节的启动子的DNA-结合结构域；和
2.配体结合结构域；和
iii.包含编码治疗多肽或治疗多核苷酸的多核苷酸的第三基因表达盒，其包含：
1.由所述第二杂交多肽的反式激活域激活的因子调节的启动子；和
2.编码治疗多肽或治疗多核苷酸的多核苷酸。
多种可诱导基因表达系统在不同疾病、病症或病状相关条件下表达给定的治疗多核苷酸或治疗多肽，或者在相同疾病、病症或病状相关的相同条件下或在不同疾病、病症或病状相关的不同条件下表达多种治疗多肽或治疗多核苷酸。
在某些实施方式中，两种或更多种基因开关系统的组合可以是(1)基于双-开关蜕皮素受体的表达系统和(2)基于单-开关蜕皮素受体的基因开关。在其它实施方式中，该组合可以是(1)基于单-或双-开关蜕皮素受体的基因开关和(2)基于雷帕霉素的基因开关。或者，基因开关系统的组合可以是上述两个相同的基于雷帕霉素的基因开关。本发明包括基因开关系统的任何可能的组合。
配体
本发明配体依赖性转录因子复合物的配体结合包含配体结合结构域、异二聚伴侣结构域、DNA结合结构域和反式激活域中一个或多个的蛋白质复合物。选择激活配体依赖性转录因子复合物的配体取决于所用基因开关的类型。
例如，可从任何合适的配体选择基于蜕皮素受体的基因开关的配体。天然产生的蜕皮素或蜕皮素类似物(例如，20-羟基蜕皮素、牵牛甾酮A(muristerone A)、松甾酮(ponasterone)A、松甾酮B、松甾酮C、26-碘代松甾酮A、牛膝甾酮或26-甲磺酰基牛膝甾酮)和非类固醇诱导物可用作本发明基因开关的配体。美国专利号6,379,945B1描述了从烟芽夜蛾(Heliothisvirescens)分离的昆虫类固醇受体(″HEcR″)，其可用作对类固醇和某些非类固醇诱导物起反应的基因开关。在该系统和对类固醇及非类固醇诱导物均起反应的许多其它系统中，非类固醇诱导物明显优于类固醇，原因众多，例如：生产成本较低、代谢稳定性、没有昆虫、植物或哺乳动物存在和环境上可接受。美国专利号描述了利用两种联苯甲酰肼、1，2-联苯甲酰基-1-叔丁基肼和虫酰肼(tebufenozide)(N-(4-乙基苯甲酰基)-N′-(3，5-二甲基苯甲酰基)-N′-叔丁基肼)作为基于蜕皮素的基因开关的配体。本发明还包括其它联苯甲酰肼作为配体，例如美国专利号5,117,057B 1所述的。美国专利号6,147,282还公开了利用虫酰肼作为黑腹果蝇的蜕皮素受体的化学配体。此外，蜕皮素配体的非限制性例子是3，5-二-叔丁基-4-羟基-N-异丁基-苯甲酰胺、8-O-乙酰基哈帕苷(harpagide)、1，2-二酰基肼、N′-取代的-N，N′-二取代的肼、联苯甲酰烷基氰基肼、N-取代的-N-烷基-N，N-二芳酰基肼、N-取代的-N-酰基-N-烷基，羰基肼或N-芳酰基-N′-烷基-N′-芳酰基肼(参见美国专利号6,723,531)。
在一个实施方式中，基于蜕皮素的基因开关系统的配体是二酰基肼配体或手性二酰基肼配体。基因开关系统中所用的配体可以是式I所示化合物或其药学上可接受的盐、水合物、结晶形式或无定形形式：
Figure GPA00001141248200571
式I
式中：
A是烷氧基、芳基烷基氧基或芳氧基；
B是任选取代的芳基或任选取代的杂芳基；和
R1和R2独立为任选取代的烷基、芳基烷基、羟基烷基、卤代烷基、任选取代的环烷基、任选取代的烯基、任选取代的炔基、任选取代的杂环基、任选取代的芳基或任选取代的杂芳基。
在另一实施方式中，配体可以是式II所示对映体富集的化合物或其药学上可接受的盐、水合物、结晶形式或无定形形式：
式II
式中：
A是烷氧基、芳基烷基氧基、芳氧基、芳基烷基、任选取代的芳基或任选取代的杂芳基；
B是任选取代的芳基或任选取代的杂芳基；和
R1和R2独立为任选取代的烷基、芳基烷基、羟基烷基、卤代烷基、任选取代的环烷基、任选取代的烯基、任选取代的炔基、任选取代的杂环基、任选取代的芳基或任选取代的杂芳基；
前提是R1不等于R2；
其中携带R1和R2的不对称碳原子处的绝对构型主要是S。
在某些实施方式中，配体可以是式III所示对映体富集的化合物或其药学上可接受的盐、水合物、结晶形式或无定形形式：
式III
式中：
A是烷氧基、芳基烷基氧基、芳氧基、芳基烷基、任选取代的芳基或任选取代的杂芳基；
B是任选取代的芳基或任选取代的杂芳基；和
R1和R2独立为任选取代的烷基、芳基烷基、羟基烷基、卤代烷基、任选取代的环烷基、任选取代的烯基、任选取代的炔基、任选取代的杂环基、任选取代的芳基或任选取代的杂芳基；
前提是R1不等于R2；
其中携带R1和R2的不对称碳原子处的绝对构型主要是R。
在一个实施方式中，配体可以是具有对映体过量为至少95％的(R)-3，5-二甲基-苯甲酸N-(1-叔丁基-丁基)-N′-(2-乙基-3-甲氧基-苯甲酰基)-肼或其药学上可接受的盐、水合物、结晶形式或无定形形式。
当与基于蜕皮素的基因开关系统联用时，式I所示二酰基肼配体和式II或III所示手性二酰基肼配体提供外部临时调节本发明治疗多肽或治疗多核苷酸表达的手段。
本发明所用的配体可形成盐。本文所用的术语“盐”表示用无机和/或有机酸和碱形成的酸性和/或碱性盐。此外，当式I、II或III所示化合物同时含有碱性部分和酸性部分时，可以形成两性离子(“内盐”)，其属于本文所用的术语“盐”。药学上可接受的(即，无毒、生理学上可接受的)盐可用于，例如制备期间可能采用的分离或纯化步骤中，但是其它盐也可用。可在介质中，通过，例如将化合物与一定量(例如相等量)的酸或碱反应来形成式I、II或II所示化合物的盐，所述介质可以是例如盐在其中沉淀的介质或在水性介质中然后冻干。
含有碱性部分的配体可与各种有机和无机酸形成盐。示范性酸加成盐包括乙酸盐(例如与乙酸或三卤代乙酸，如三氟乙酸形成的那些)、己二酸盐、藻酸盐、抗坏血酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、硫酸氢盐、硼酸盐、丁酸盐、柠檬酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、环戊烷丙酸盐、二葡糖酸盐、十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、延胡索酸盐、葡庚糖酸盐、甘油磷酸盐、半硫酸盐(hemisulfate)、庚酸盐、己酸盐、盐酸盐(与盐酸形成的)、氢溴酸盐(氢溴酸形成的)、氢碘化物、2-羟基乙磺酸盐、乳酸盐、马来酸盐(马来酸形成的)、甲磺酸盐(甲磺酸形成)、2-萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、草酸盐、果胶酯酸盐(pectinate)、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、磷酸盐、苦味酸盐、三甲基乙酸盐、丙酸盐、水杨酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐(例如，硫酸形成的)、磺酸盐(例如，本文所述那些)、酒石酸盐、硫氰酸盐、甲苯磺酸盐，例如甲磺酸盐，十一烷酸盐等。
含有酸性部分的配体可与各种有机和无机碱形成盐。示范性碱性盐包括铵盐、碱金属盐，例如钠、锂和钾盐，碱土金属盐，例如钙和镁盐，有机碱的盐(例如，有机胺)，例如苄星青霉素(benzathine)、二环己基胺、哈胺(hydrabamine)(与N，N-二(脱氢松香基(abietyl))乙二胺形成)、N-甲基-D-葡糖胺、N-甲基-D-葡糖酰胺(glucamides)、叔丁胺、和与氨基酸，例如精氨酸、赖氨酸等形成的盐。
利用FK506结合结构域的可诱导基因表达系统的配体的非限制性例子是FK506、环孢菌素A或雷帕霉素。美国专利号6,649,595B2和6,187,757公开了FK506、雷帕霉素和它们的类似物。也参见美国专利号7,276,498和7,273,874。
本文所述的配体可单独给予或作为包含药学上可接受的运载体的药物组合物的一部分给予。在一个实施方式中，药物组合物是溶液、混悬液、片剂、胶囊、软膏、酏剂或可注射组合物。
药物组合物
药学上可接受的运载体包括填充剂，例如糖，如乳糖或蔗糖、甘露醇或山梨醇，纤维素制品和/或磷酸钙，例如磷酸三钙或磷酸氢钙，以及粘合剂，例如利用诸如玉米淀粉、小麦淀粉、大米淀粉、马铃薯淀粉的淀粉浆液、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮。如果需要，可加入崩解剂，例如上述淀粉和羧甲基-淀粉、交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂或藻酸或其盐，例如藻酸钠。辅助剂是流动调节剂和润滑剂，例如二氧化硅、滑石粉、硬脂酸或其盐，例如硬脂酸镁或硬脂酸钙和/或聚乙二醇。在一个实施方式中，如果需要，给锭剂核心提供耐受胃液的合适包被。为该目的，可利用浓糖溶液，其可任选含有阿拉伯胶、滑石粉、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇和/或二氧化钛、漆溶液和合适的有机溶剂或溶剂混合物。为产生耐受胃液的包被，利用合适纤维素制品，例如邻苯二甲酸醋酸纤维素或邻苯二甲酸羟丙基甲基-纤维素的溶液。可将染料或色素加入片剂或锭剂核心包被，例如，为鉴定或为表征活性化合物剂量的组合。
可口服使用的其它药物制品包括明胶制成的推入式(push-fit)胶囊以及明胶和增塑剂，例如甘油或山梨醇制成的软密封胶囊。推入式胶囊可含有颗粒或纳米颗粒形式的活性化合物，可任选与填充剂，例如乳糖，粘合剂，例如淀粉和/或润滑剂，例如滑石粉或硬脂酸镁和任选的稳定剂混合。在一个实施方式中，溶解或悬浮于任选含稳定剂的合适液体，例如脂肪油或液体石蜡中。
脂肪油可含有单酸甘油酯、甘油二酯或甘油三酯。单酸甘油酯、甘油二酯或甘油三酯包括衍生自C6、C8、C10、C12、C14、C16、C18、C20和C22酸的那些。具体地说，示范性甘油二酯包括甘油二油酸酯、甘油二棕榈酸酯(dipalmitolein)和混合的辛酸甘油酯-癸酸甘油酯甘油二酯。甘油三酯包括植物油、鱼油、动物脂肪、氢化植物油、部分氢化植物油、合成甘油三酯、修饰甘油三酯、分馏甘油三酯、中链和长链甘油三酯、结构化甘油三酯和它们的混合物。示范性甘油三酯包括：杏仁油；巴西棕榈油(babassu oil)；琉璃苣油；黑醋栗籽油；芸苔油；蓖麻油；椰油；玉米油；棉籽油；月见草油；葡萄籽油；花生油；芥子油；橄榄油；棕榈油；棕榈仁油；花生油；菜籽油；红花油；芝麻油；鲨鱼肝油；大豆油；葵花子油；氢化蓖麻油；氢化椰油；氢化棕榈油；氢化大豆油；氢化植物油；氢化棉籽油和蓖麻油；部分氢化的大豆油；部分(氢化)的大豆和棉籽油；三己酸甘油酯；三辛酸甘油酯；三癸酸甘油酯；三十一烷酸甘油酯；三月桂酸甘油酯；三油酸甘油酯；三亚油酸甘油酯；三亚麻酸甘油酯；三辛酸/癸酸甘油酯；三辛酸/癸酸/月桂酸甘油酯；三辛酸/癸酸/亚油酸甘油酯；和三辛酸/癸酸/硬脂酸甘油酯。
在一个实施方式中，甘油三酯是以商品名拉巴法克(LABRAFAC CC)出售的中链甘油三酯。其它甘油三酯包括中性油，例如中性植物油，特别是分馏的椰油，例如已知以商品名MIGLYOL出售的，包括以下产物：MIGLYOL 810；MIGLYOL 812；MIGLYOL 818和CAPTEX 355。其它甘油三酯是辛酸-癸酸甘油三酯，例如以商品名MYRITOL出售的，包括以下产物MYRITOL 813。该类的其它甘油三酯是CAPMUL MCT、CAPTEX 200、CAPTEX 300、CAPTEX 800、NEOBEE M5和MAZOL 1400。
包含甘油三酯的药物组合物还可包含亲脂性和/或亲水性表面活性剂，用水性溶剂溶解后其可形成清澈溶液。一种这样的表面活性剂是生育酚基聚乙二醇1000琥珀酸酯(维生素E TPGS)。这种组合物的例子描述于美国专利号6,267,985。
在另一实施方式中，药学上可接受的运载体包括伽塔佛丝公司的拉巴索(LABRASOL，Gattefosse SA)，其是PEG-8辛酸/公司甘油酯。在另一实施方式中，药学上可接受的运载体包括PL90G、维生素E TPGS和Miglyol 812N。
可经直肠使用的可能药物制品包括，例如由一种或多种配体和栓剂基构成的栓剂。合适的栓剂基是，例如天然或合成的甘油三酯或石蜡烃类。此外，还可能利用由配体和基料组成的明胶直肠胶囊。可能的基料包括，例如液体甘油三酯、聚乙二醇或石蜡烃类。
胃肠外给药的合适制剂包括水溶形式配体的水性溶液，例如水溶性盐和碱性溶液。此外，可给予配体的悬液，例如合适的油性注射悬液。合适的亲脂性溶剂或载体包括脂肪油，例如芝麻油或合成的脂肪酸酯，例如油酸乙酯或甘油三酯或聚乙二醇-400。水性注射悬液可含有增加悬液粘度的物质，包括，例如羧甲基纤维素钠、山梨醇和/或葡聚糖。悬液还任选含有稳定剂。
可通过选择合适的运载体将局部制剂配制成油、乳膏、洗液、软膏等。合适的运载体包括植物或矿物油、白矿物脂(白软石蜡)、支链脂肪或油、动物脂肪和高分子量醇(高于C12)。如果需要，还可包括乳化剂、稳定剂、湿润剂和抗氧化剂以及赋予颜色或香味的试剂。此外，这些局部制剂中可利用经皮穿透增强剂。这种增强剂的例子可见美国专利号3,989,816和4,444,762。
可从矿物油、自乳化蜂蜡和水的混合物配制乳膏，在其中混合溶解于少量油，例如杏仁油中的配体。这种乳膏的典型例子包含约40份水、约20份蜂蜡、约40份矿物油和约1份杏仁油。
可通过混合配体的植物油，例如杏仁油悬液与温暖的软石蜡并使该混合物冷却来配制软膏。这种软膏的典型例子包含约30重量％杏仁油和约70重量％白软石蜡。
可在合适高分子量醇，例如丙二醇和聚乙二醇中制备配体悬液来方便地制备洗液。
可加入药物组合物的抗氧化剂的例子包括BHA和BHT。
在一个实施方式中，药物组合物在固体明胶胶囊中每毫升LABRASOL包含30mg配体。在另一实施方式中，胶囊含有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100mg配体。
药物组合物可含有0.01重量％-99重量％的配体。组合物可以是单一或多种剂型。任何具体药物组合物中配体的含量取决于有效剂量，即引发所需基因表达或阻遏所需的剂量。在一个实施方式中，将0.1-7.5mg/kg给予对象。在另一实施方式中，将0.1-3mg/kg给予对象。在另一实施方式中，给予0.1-3mg/kg。
给予药物组合物的合适途径包括口服、直肠、局部(包括真皮、口腔含化和舌下)、经阴道、胃肠外(包括皮下、肌肉内、静脉内、真皮内、鞘内、肿瘤内和硬膜外)和通过鼻-胃管。本领域技术人员应知道给药途径取决于所治疗的病症，可根据诸如受者的病症等因素而有所不同。可每日一次或多次给予药物组合物。
治疗分子
治疗分子，例如编码治疗多肽或治疗多核苷酸的多核苷酸可以是编码可用于治疗、缓解或预防疾病、病症或病状的多肽或多核苷酸的任何序列。治疗多肽可以是已知有效治疗、缓解或预防疾病、病症或病状的任何多肽。可用于本发明的治疗多肽类别的例子包括但不限于：细胞因子、趋化因子、激素、抗体、工程改造的免疫球蛋白-样分子、单链抗体、融合蛋白、酶、免疫共刺激分子、免疫调节分子、靶蛋白的反式显性负突变体、毒素、有条件的毒素(conditional toxin)、抗原、肿瘤阻遏蛋白、生长因子、膜蛋白、血管活性蛋白和肽、抗病毒蛋白或它们的变体。治疗多核苷酸包括但不限于：反义序列、小干扰RNA、核酶和RNA外在引导序列。治疗多核苷酸可靶向特定疾病、病症或病状相关并且优选降低或消除其表达的任何转录物。本领域已知疾病、病症或病状期间显示表达升高的许多基因，包括上表1-3所列的基因。
编码治疗多肽或治疗多核苷酸的多核苷酸操作性连接于或操作性结合包含至少一个反应元件的因子调节的启动子，该反应元件为基因开关编码的配体依赖性转录因子复合物的DBD所识别。在一个实施方式中，启动子包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多拷贝的反应元件。包含所需反应元件的启动子可以是天然产生的启动子或采用本领域熟知技术产生的人工启动子，例如操作性连接于最小启动子的将一个或多个反应元件。
可利用治疗基因开关表达的具体治疗多肽包括但不限于抗体，包括单克隆抗体、最小抗体，融合蛋白、内源性蛋白质模拟物、酶、激素、细胞因子、趋化因子、生长因子和片段，任何这种多肽的变体或衍生物。非限制性的代表性治疗分子如下所述。这些分子的所有参考文献，包括专利出版物、科学文献及多核苷酸和多肽序列登录号通过引用全文纳入本文。
单克隆抗体
可利用本发明的治疗基因开关构建物表达治疗性单克隆抗体，或其片段、变体或类似物(统称为“单克隆抗体”)。这种单克隆抗体可用于治疗疾病和病症，包括但不限于：癌症、自身免疫疾病(例如，MS、克罗恩病、类风湿性关节炎)、癌症、感染性疾病、炎性疾病、变态反应、心脏病和移植排异。用于本发明的抗体包括任何已知的治疗性单克隆抗体，包括但不限于以下所列的：结合与已知单克隆抗体相同的表位或靶标的单克隆抗体。适合通过治疗基因开关构建物表达的单克隆抗体构建物包括多特异性、人、人源化、灵长类化或嵌合型抗体、单链抗体、表位结合片段，例如Fab、Fab′和F(ab′)2，Fd、Fv、单链Fv(scFv)、单链抗体、二硫键连接的Fv(sdFv)和包含VL或VH结构域的片段。本领域已知scFv分子，其描述于，例如美国专利5,892,019。本发明免疫球蛋白或抗体分子可以是任何类型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、类别(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类的免疫球蛋白分子。包括单链抗体在内的抗体片段可单独包含可变区或与以下的全部或部分组合：绞链区、CH1、CH2和CH3结构域。本发明还包括抗原结合片段，其还包含可变区与绞链区、CH1、CH2和CH3结构域的任何组合。
在某些实施方式中，本发明包括编码针对抗原的单克隆抗体的治疗基因开关构建物，所述抗原包括但不限于：CTLA4、CD25、HER-2/neu(ErbB2)、CD20、TNFα、EGFR和VEGF。
本发明可用的抗-CTLA4抗体和产生它们的方法描述于：国际申请号PCT/US99/30895，2000年6月29日公布为WO 00/37504(例如，提犀利莫单抗(ticilimumab)，也称为11.2.1和CP-675,206)；欧洲专利申请号EP1262193A1，2002年4月12日公布；美国专利申请号09/472,087，现授权为美国专利号6,682,736；美国专利申请号09/948,939，现公布为美国专利申请公布号2002/0086014(例如，伊匹利莫单抗(ipilimumab)，也称为10D1和MDX-010，梅达莱克斯公司(Medarex)，普林斯顿，新泽西州)。
本发明可用的抗-CD25抗体包括但不限于达克珠单抗。参见，例如美国专利号5,530,101。达克珠单抗(商标名：
Figure GPA00001141248200651
由罗氏公司(Roche)投入市场)是针对CD25(IL-2受体)的人源化IgG1单克隆抗体。其用作IL-2受体拮抗剂，高亲和力地结合高亲和力IL-2受体复合物的Tac亚基。当与环孢菌素或糖皮质激素联用时，达克珠单抗适用于预防肾脏移植患者中的急性器官排异。
可用于本发明的抗-HER-2/neu(ErbB2)抗体包括但不限于曲妥单抗。参见，例如美国专利号5,677,171。曲妥单抗(商标名称：
Figure GPA00001141248200652
由基因技术公司(Genentech)投入市场)是针对c-erbB2/HER2/neu蛋白质的胞外结构域的人源化单克隆抗体，该蛋白质是在某些类型的乳腺癌中过表达的跨膜受体蛋白(与表皮生长因子受体结构相关)。作为抗体依赖性细胞毒性的介质，曲妥单抗优选对表达HER2的癌细胞有毒性。
可用于本发明的抗-CD20抗体包括但不限于利妥昔单抗(参见，例如美国专利号5,736,137)。利妥昔单抗(商标名：
Figure GPA00001141248200653
由BGI公司(BiogenIdec)和基因技术公司投入市场)是嵌合型(鼠/人)单克隆IgG1κ抗体。利妥昔单抗首先设计并批准用于治疗非霍奇金淋巴瘤，最近批准用于治疗抗-TNF难治类风湿性关节炎。
可用于本发明的抗-TNFα抗体包括但不限于阿达木单抗(参见，例如美国专利号7,223,394)和英夫利昔单抗(参见，例如美国专利号7138118)。阿达木单抗(商标名：
Figure GPA00001141248200654
由阿伯特公司(Abbott)投入市场)是特异性结合TNFα从而阻断TNFα与p55和p75表面TNF受体相互作用的重组人IgG1κ单克隆抗体。阿达木单抗批准用于类风湿性关节炎和青少年特发性关节炎。阿达木单抗的其它适应症包括克罗恩病、斑块状银屑病、银屑病关节炎和强直性脊柱炎。英夫利昔单抗(商标名：雷米卡德(Remicade)，由森托科公司(Centocor)投入市场)是特异性结合TNFα从而阻断TNFα与p55和p75表面TNF受体相互作用的重组嵌合型IgG1κ单克隆抗体。英夫利昔单抗批准用于克罗恩病。其它适应症包括类风湿性关节炎、银屑病关节炎、严重的慢性斑块状银屑病和强直性脊柱炎。
可用于本发明的抗EGFR(表皮生长因子受体)抗体包括但不限于西妥昔单抗(参见，例如美国专利号6,217,866)。西妥昔单抗(商标名：由伊姆克隆公司(Imclone)和布里斯托-美时施贵宝公司(Bristol-MeyersSquibb)(北美)和默克公司(Merck KgaA)(其它地区)投入市场)是特异性结合EGFR的嵌合型单克隆抗体。西妥昔单抗适用于转移性直肠结肠癌和头颈癌。
可用于本发明的抗-VEGF抗体包括但不限于贝伐单抗(参见，例如美国专利号6,383,486)。贝伐单抗(商标名：
Figure GPA00001141248200662
由基因技术公司投入市场)是抑制血管内皮生长因子(VEGF)功能，从而抑制肿瘤新血管生成的人单克隆抗体。贝伐单抗适于和其它抗癌症化疗剂联用作为治疗转移性结肠直肠癌患者的第一和第二线治疗剂和复发或转移性非鳞状细胞非小细胞肺癌(NSCLC)患者的第一线治疗剂。
融合蛋白
本发明的治疗基因开关构建物可用于表达治疗性融合蛋白，例如嵌合型TNFα结合蛋白2。通过蛋白水解过程从膜形式制备肿瘤坏死因子结合蛋白2(Enbrel)。Enbrel是由人IgGl分子的Fc片段相连的两个可溶性TNF受体构成的重组融合蛋白。其结合TNFα并阻断TNFα与其受体相互作用。Enbrel用于治疗中等到严重的类风湿性关节炎。编码Enbrel的氨基酸序列见公开数据库的登录号P20333。
Enbrel的多核苷酸序列见公开数据库的登录号DD292498和DD292499，其序列通过引用纳入本文。
酶
可利用本发明的治疗基因开关构建物表达治疗性酶，包括组织纤维蛋白溶酶原激活剂。组织纤维蛋白溶酶原激活剂，组织型同种型3前蛋白原(tPA)是分泌的丝氨酸蛋白酶，其将酶原-纤维蛋白溶酶原转化成纤溶酶-一种纤维蛋白溶解酶。该酶在细胞迁移和组织重塑中起作用。编码tPA的氨基酸序列可见公开数据库的登录号NP_127509和NP_000921(均是人)，其序列通过引用纳入本文。
编码tPA的多核苷酸序列见公开数据库的登录号NM_033011和NM_000930(均是人)，其序列通过引用纳入本文。
内源性蛋白模拟物
本发明的治疗基因开关构建物可用于表达内源性蛋白的治疗性模拟物，例如以下的：
当其将因子X转化成活化形式的因子Xa时，阿法耐特(Alphanate)(凝固因子III)连同钙和磷脂用作因子IXa的辅因子。阿法耐特是纯化的因子VIII(也称为抗血友病球蛋白因子)和血管假性血友病因子。阿法耐特批准用于预防和控制因子VIII缺陷型的A型血友病或获得性因子VIII缺陷型的患者出血。编码因子VIII的氨基酸序列见公开数据库的登录号AAA52485(人)；和AAA37385(小鼠)，其序列通过引用纳入本文。
编码因子VIII的多核苷酸序列见公开数据库的登录号M14113(人)；和L05573(小鼠)，其序列通过引用纳入本文。
阿拉斯特(Aralast)(α-1蛋白酶抑制剂)的氨基酸序列见公开数据库的登录号AAB59375(人α1-抗胰蛋白酶)；AAC28869(小鼠α-1蛋白酶抑制剂)；和AAA40788(大鼠α-1-抗胰蛋白酶)，其序列通过引用纳入本文。
编码α-1蛋白酶抑制剂的多核苷酸序列见公开数据库的登录号K01396(人)；M75721(小鼠)；和M32247(大鼠)，其序列通过引用纳入本文。
奈西立肽
Figure GPA00001141248200671
是已批准用于静脉内治疗急性代偿失调充血性心力衰竭(CHF)患者的重组形式人B-型利钠肽(hBNP)，这种患者在休息时或最低限度活动时呼吸困难。编码脑利钠肽的氨基酸序列见公开数据库的登录号NP_002512，其序列通过引用纳入本文。
编码脑利钠肽的多核苷酸序列见公开数据库的登录号NM_002521，其序列通过引用纳入本文。
编码人胰岛素的氨基酸序列见公开数据库的登录号AAH05255，其序列通过引用纳入本文。
编码人胰岛素的多核苷酸序列见公开数据库的登录号BC005255，其序列通过引用纳入本文。
粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)是用作血细胞生长因子的细胞因子，其刺激干细胞产生粒细胞(嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞)和单核细胞。编码粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的氨基酸序列见公开数据库的登录号AAA52122(人)；NP_034099(小鼠)；NP_001032749(大鼠Csf2ra)；和NP_598239(Csf2rb)，其序列通过引用纳入本文。
编码GM-CSF的多核苷酸序列见公开数据库的登录号M11734(人)；NM_009969(小鼠)；NM_001037660(大鼠Csf2ra)；和NM_133555(大鼠Csf2rb)，其序列通过引用纳入本文。
编码促红细胞生成素的氨基酸序列见公开数据库的登录号AAH93628(人)；AAI19266(小鼠)；和BAA01593(大鼠)，其序列通过引用纳入本文。
编码促红细胞生成素的多核苷酸序列见公开数据库的登录号BC093628(人)；BC119265(小鼠)；和D10763(大鼠)，其序列通过引用纳入本文。
编码生长激素的氨基酸序列见公开数据库的登录号AAA98618(人)；NP_032143(小鼠)；和NP_001030020(大鼠)，其序列通过引用纳入本文。
编码生长激素的多核苷酸序列见公开数据库的登录号M13438(人)；NM_008117(小鼠)；和NM_001034848(大鼠)，其序列通过引用纳入本文。
重组蛋白
本发明的治疗基因开关构建物可用于表达治疗性重组蛋白，例如肉毒杆菌毒素。肉毒杆菌毒素抑制神经递质乙酰胆碱在神经末稍的释放，以商品名BOTOX用于治疗张力障碍和颈张力障碍相关的斜视和眼睑痉挛。BOTOX还用于治疗偏侧颜面痉挛和特征在于肌肉收缩异常的许多其它神经学疾病。编码肉毒杆菌神经毒素A型前体(BoNT/A)(Bontoxilysin-A)(BOTOX)的氨基酸序列见公开数据库的登录号P10845。
心血管疾病的治疗
本发明还涉及治疗、缓解或预防心血管疾病的方法，包括给予需要这种治疗的对象在前述开关蛋白的控制下能缓解、预防或治疗心血管相关疾病的治疗基因产物。可将这种治疗直接递送给待治疗的对象，或者通过含有包裹化或非包裹化的非修饰或遗传修饰细胞的生物反应器而递送，所述细胞分泌本文它处所述的一种或多种治疗蛋白或治疗多肽。按照该实施方式，植入对象，例如植入心血管疾病患者的梗塞区域时，细胞会表达有效治疗心血管疾病的一种或多种治疗基因产物。下文更详细地描述了这种治疗基因产物的例子。在某些实施方式中，本发明的遗传修饰细胞组成型表达一种或多种治疗基因产物，即，细胞中一种或多种异源治疗基因产物持续表达。或者，细胞表达一种、两种、三种或更多种异源治疗基因产物受治疗基因开关的控制。在某些方面，治疗、缓解或预防心血管疾病的生物反应器包含包裹化的细胞，例如细胞包裹在基于藻酸盐的制剂中。本文它处详细描述了细胞包裹化的例子和方法以提供，例如与所治疗对象分开的物理或免疫学屏障。
本发明还提供通过操作性结合于启动子而可用于治疗、缓解或预防心血管疾病的，包含表达治疗基因产物，例如治疗多肽和/或治疗多核苷酸的一种或多种多核苷酸的核酸组合物。在某些实施方式中，通过配体依赖性转录因子复合物激活治疗基因产物的启动子控制性表达，其中转录因子的至少一部分是经操作性连接于一个或多个治疗开关启动子而表达的，其中所述治疗开关启动子的活性是组成型的和/或在组织类型相关或疾病、病症或病状相关条件下得到调节。在治疗、缓解或预防心血管疾病的实施方式中，治疗开关启动子可以是，例如心脏特异性启动子或在例如充血性心力衰竭、缺血性心脏病、高血压性心脏病、冠状动脉疾病、外周血管疾病和缺血性心脏事件，如心肌梗塞、心脏病发作、心力衰竭、心律失常、心肌破裂、心包炎和心源性休克等病症期间活化的启动子。示范性启动子见表1-3。本文在它处，例如实施例1-8中描述了其它启动子。通过本文所述的方法也不难鉴定其它启动子。
心脏细胞中调节基因开关表达可用的或在心脏疾病、病症或病状相关条件下可用的治疗开关启动子的例子包括但不限于：S100A6启动子，其是心肌细胞组织特异性的(Tsoporis等，J.Biol.Chem.(2008)(印刷前的电子版；PMID：18753141))；心房利钠肽因子(Atrial Naturetic Factor)(ANF)启动子、α-肌球蛋白重链启动子、c-fos启动子、BNP启动子或α肌动蛋白启动子，所有均是心肌细胞组织特异性的(Nelson等，J.Mol.Cell.Cardiol.39(3)：479(2005))；促红细胞生成素启动子，缺血性条件下其在心肌中活化(Su等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.99(14)：9480(2002))；αB-晶体蛋白(CRYAB)启动子，包括，例如BRG1-反应元件，其是脊椎动物眼睛晶状体组织特异性的(Duncan B.和Zhao K.DNA Cell.Biol.26(10)：745(2007))；具有顺式作用调节元件的αB-晶体蛋白(CRYAB)启动子，例如αBE-1、αBE-2、αBE-3和MRF，其是骨骼肌组织特异性的(Gopal-Srivastava等，J.Mol.Cell Biol.15(12)：7081(1995))；NCX1启动子，其是心肌细胞组织特异性的(Xu等，J.Biol.Chem.281(45)：34430(2006))；β肌球蛋白重链启动子，其是心肌细胞组织特异性的(Nelson等，J.Mol.Cell Cardiol.39(3)：479(2005)，Ross等，Development.122(6)：1799(1996)，和Lee等，Mol.Cell.Biol.14(2)：1220(1994))，肌球蛋白轻链-2心室启动子，包括HF-1a/HF-1b/MEF-2组合元件(Ross等，Development.122(6)：1799(1996))或HF-1a/HF-1b元件和HF-3调节元件(Lee等，Mol.Cell.Biol.14(2)：1220(1994))，其是心室组织特异性的；肌球蛋白轻链启动子，例如MLC 1F和MLC3F，它们在骨骼肌发育期间差别性活化(Kelly等，J.Cell.Biol.129(2)：383(1995))；肌球蛋白轻链2v(MLC-2v)启动子，其是心肌组织特异性的(Su等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.101(46)：16280(2004))；和心肌肌钙蛋白I(TnIc)启动子，其是心肌中组织特异性和发育阶段特异性的(Bhavsar等，J.Mol.Cell Cardiol.32(1)：95(2000))。
本发明还提供包含上述核酸组合物的一种或多种载体和包含这种载体的一种或多种遗传修饰的细胞。相对于待治疗的对象，这种细胞可以是同种异体的、自体的或异种的。本发明还提供一种或多种包裹化方法以供治疗、缓解或预防心血管疾病，包括上述修饰细胞，细胞经处理从而在引入对象后受保护而免遭该对象免疫系统的破坏。这种处理包括但不限于提供保形包被、微囊化或巨囊化。
心血管疾病包括但不限于：充血性心力衰竭、缺血性心脏病、高血压性心脏病、冠状动脉疾病、外周血管疾病和缺血性心脏事件，如心肌梗塞、心脏病发作、心力衰竭、心律失常、心肌破裂、心包炎和心源性休克。这种事件的诱因包括但不限于：血栓形成、栓塞、动脉粥样硬化和狭窄。敏感人群包括但不限于：吸烟者、患糖尿病、高血压或血脂障碍的人。
治疗、缓解或预防心血管疾病的合适治疗分子包括但不限于：促血管生成因子、心脏保护性因子和心脏再生因子。
可用于本发明以预防、治疗或缓解心血管疾病的治疗分子包括但不限于：心房利钠因子(ANF)、卡培立肽、脑钠素(BNP)、奈西立肽、松弛素、血管内皮生长因子(VEGF 165)、肝细胞生长因子(HGF)、血管生成素-1(Ang-1)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、成纤维细胞生长因子4(FGF-4)、胰岛素样生长因子1(IGF-1)、缺氧-诱导的因子1-α(HIF1-α)、促红细胞生成素、组织纤维蛋白溶酶原激活剂(tPA)、生长激素、间质-衍生的因子-1(SDF-1)、肌-内质网Ca2+-ATP酶(SERCA2a)、腺苷环化酶VI型(AC6)、S100A1、细小白蛋白、磷酸酶抑制剂2、和磷酸酶抑制剂1。已知这些分子通过各种机制，例如血液动力学、血管生成、心脏再生、抗-纤维变性和/或心脏修复对心脏组织施加作用。这些治疗分子可提供多种治疗作用，可彼此或与公众已知的其它分子联用。
在一个实施方式中，目前利用可用于促进新血管生成的治疗蛋白来实施治疗、缓解或预防心血管疾病的促血管生成基因治疗临床试验。这些蛋白包括但不限于：促血管生成因子，例如VEGF、HGF、bFGF、Ang-1、FGF-4、IGF-1和HIF1-α以及它们的片段、变体和衍生物。本领域普通技术人员能鉴定促进新血管生成的合适分子。这种促血管生成因子刺激新血管生成以便在梗塞区域内供应氧和营养物。这会限制梗塞区域增大并维持迁移入梗塞区域的任何心脏祖细胞。
实际上，已知促血管生成因子VEGF 165诱导新血管生成(Benest等，Microcirculation.13(6)：423(2006)；Riley等，Biomaterials.27(35)：5935(2006)；Shyu等，Life Sci.73(5)：563(2003)；Arsic等，Mol Ther.7(4)：450(2003)；Ye等，J.Heart Lung Transplant.24(9)：1393(2005)；Lubiatowski等，Plast.Reconstr.Surg.110(1)：149(2002)(错刊于：Plast.Reconstr.Surg.111(3)：1380(2003))；Kim等，Ann.Thorac.Surg.83(2)：640(2007)(注释在：Ann.Thorac.Surg.83(2)：646(2007))；Thurston G.，J.Anat.200(6)：575(2002)；Ryu等，Mol.Ther.13(4)：705(2006)；Chae等，Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol.20(12)：2573(2000)；和Chen等，Acta.Pharmacol.Sin.28(4)：493(2007))。治疗性新血管生成中早期临床试验的缺点部分归因于一次性给予高剂量的生长因子。参见，Zacchigna等，Hum.Gene Ther.18(6)：515(2007)和Yla-Herttuala等，J Am Coll Cardiol.49(10)：1015(2007)(注释在：JAm CollCardiol.50(2)：186(2007))。此后，VEGF表达和释放的临床前数据提示延长接触导致形成稳定的血管，而短期递送仅产生易于退化的渗漏血管。例如，产生VEGF-A的成肌细胞造成的局部高浓度导致血管渗漏和异常，而中等量的生长因子启动健康血管的生长。参见，Arsic等，Mol Ther.7(4)：450(2003)；Benest等，Microcirculation.13(6)：423(2006)；Yamauchi等，J GeneMed.5(11)：994(2003)；Jiang等，Acta Cardiol.61(2)：145(2006)；Ozawa等，JClin Invest.113(4)：516(2004)。此外，联用VEGF(启动血管生成)和Ang-1(血管的成熟)显示导致血管生长更稳定。参见，Thurston G.，J Anat.200(6)：575(2002)；Jiang等，Acta Cardiol.61(2)：145(2006)；Benest等，Microcirculation.13(6)：423(2006)；Zhou等，Gene Ther.12(3)：196(2005)(错刊于：Gene Ther.12(6)：552(2005)；Liu等，Scand Cardiovasc J.41(2)：95(2007)；Shyu等，LifeSci.73(5)：563(2003)；Yamauchi等，J Gene Med.5(11)：994(2003)；Arsic等，Mol Ther.7(4)：450(2003)；Ye等，J HeartLung Transplant.24(9)：1393(2005)；Ye等，Eur J Heart Fail.9(1)：15(2007)；Lubiatowski等，Plast Reconstr Surg.110(1)：149(2002)(错刊于：Plast Reconstr Surg.111(3)：1380(2003))；Ryu等，Mol Ther.13(4)：705(2006)；Chen等，Eur J Pharmacol.568(1-3)：222(2007)；Chae等，Arterioscler Thromb Vasc Biol.20(12)：2573(2000)；和Chen等，ActaPharmacol Sin.28(4)：493(2007)。
因此，促血管生成因子VEGF165已知能预防、治疗或缓解各种心血管疾病(Yamauchi等，J Gene Med.5(11)：994(2003)和Xu等，Cytotherapy.6(3)：204(2004)(注释在：Cytotherapy.7(1)：74(2005)))，包括但不限于：心肌梗塞(Zhou等，Gene Ther.12(3)：196(2005)(错刊于：Gene Ther.12(6)：552(2005)；Ye等，Circulation.116(11Suppl)：I 113(2007)；Liu等，Scand Cardiovasc J.41(2)：95(2007)；Ye等，Eur.J.Heart Fail.7(6)：945(2005)；Zhang等，CellTransplant.14(10)：787(2005)；Bonaros等，Interact.Cardiovasc.Thorac.Surg.7(2)：249(2008)；Shyu等，J.Biomed.Sci.13(1)：47(2006)；Ventura等，JBiolChem.282(19)：14243(2007)；Sugimoto等，Jpn.J.Thorac.Cardiovasc.Surg.51(5)：192(2003)；Yau等，Ann.Thorac.Surg.83(3)：1110(2007)(注释在：AnnThorac Surg.83(3)：1119(2007))；Rong等，Chin.Med.J.(Engl).121(4)：347(2008)；Yang等，Cardiology.107(1)：17(2007)；Wang等，J.Mol.Cell Cardiol.40(5)：736(2006)；Chen等，Eur J Clin Invest.35(11)：677(2005)；Suzuki等，Circulation.104(12Suppl 1)：I207(2001)；Ye等，Ann.Acad.Med.Singapore.32(5Suppl)：S21(2003)；和Haider等，J Mol Med.82(8)：539(2004)(注释在：JMol Med.82(8)：485(2004)))或缺血性或再灌注损伤(Becker等，Int JCardiol.113(3)：348(2006)；Gao等，Can.J.Cardiol.23(11)：891(2007)；Ye等Eur J Heart Fail.9(1)：15(2007)；Chen等，Eur.J.Pharmacol.568(1-3)：222(2007)；和Jiang等，Acta Cardiol.61(2)：145(2006))。
此外，本发明可利用提供多能作用的另一促血管生成因子HGF(人核苷酸序列登录号：M29145，人氨基酸序列登录号：NP_000592.3)。由c-Met受体介导的HGF通过以下机制提供促血管生成作用：对内皮细胞的有丝分裂促进活性，对心肌细胞的心脏保护性抗-凋亡作用，通过阻遏TGF-β1信号转导的抗纤维变性作用，HGF是通过将CD117(+)/c-Met(+)干细胞迁移入缺血心肌的I型胶原再生因子。参见Li等，Chin Med J(Engl)121(4)：336(2008)；Guo等，Arch.Med.Res.39(2)：179(2008)；Ventura等，J.Biol.Chem.282(19)：14243(2007)；Yang等，Gene Ther.13(22)：1564(2006)；Tambara等，Circulation.112(9增刊)：I129(2005)；Zhang等，Tissue Eng.A部分.14(6)：1025(2008)；和Sakaguchi等，Ann.Thorac.Surg.79(5)：1627(2005)。
类似地，bFGF(氨基酸序列登录号NP_001997)已显示通过促进血管生成、新血管生成和组织再生而有心脏保护的附加作用。(Doi等，Heart Vessels.22(2)：104(2007)；Fujita等，J.Surg.Res.126(1)：27(2005)；Fujita等，WoundRepair Regen.15(1)：58(2007)；Hosaka等，Circulation.110(21)：3322(2004)；Iwakura等，Heart Vessels.18(2)：93(2003)；Lai等，Tissue Eng.12(9)：2499(2006)；Nakajima等，J.Artif.Organs.7(2)：58(2004)；Perets等，J.Biomed.Mater.Res.A.65(4)：489(2003)；Pike等，Biomaterials.27(30)：5242(2006)；Sakakibara等，J Thorac Cardiovasc Surg.124(1)：50(2002)；Sakakibara等，Eur J Cardiothorac Surg.24(1)：105(2003)；Shao等，Circ J.70(4)：471(2006)；Tabata Y.和Ikada Y.，Biomaterials.20(22)：2169(1999)；Yamamoto等，Artif.Organs.27(2)：181(2003)；Yamamoto等，Jpn.Circ.J.65(5)：439(2001)；Yang等，Ophthalmic Res.32(1)：19(2000)；和Zhu等，Chin.Med.Sci.J.15(4)：210(2000))。在某些实施方式中，bFGF可用于预防、治疗或缓解骨关节炎。参见Inoue等，Arthritis Rheum.54(1)：264(2006)。
还已知IGF-1(人氨基酸序列登录号：NP_001104753.1)能施加保护心肌细胞免遭凋亡并增强新血管生成的多能作用(Su等，Am J Physiol HeartCirc Physiol.284(4)：H1429(2003)；Chao等，J.Gene Med.(4)：277(2003)；Rabinovsky E.D.和Draghia-Akli R.，Mol Ther.9(1)：46(2004)；和Barton等，Circulation.112(9增刊)：I46(2005))，其可用于本发明。
此外，FGF-4可用作治疗分子通过诱导心肌血管生成/动脉生成而预防、治疗或缓解慢性缺血性心脏病。(Kapur N.K.和Rade J.J.，Trends Cardiovasc.Med.18(4)：133(2008)；Henry等，J.Am.Coll.Cardiol.50(11)：1038(2007)；Grines等，Am.J.Cardiol.92(9B)：24N(2003)；(作者未列出)BioDrugs.16(1)：75(2002))。
此外，HIF1-α基因治疗，例如HIF1-α(aa 1-390)/VP16(aa 413-490)已知能通过增强BNP基因表达而治疗、预防或缓解缺血性疾病(Rajagopalan等，Circulation.115(10)：1234(2007)(注释在：Circulation.115(10)：1180(2007))；Wilhide M.E.和Jones W.K.，Mol Pharmacol.69(6)：1773(2006)(注释在：Mol Pharmacol.69(6)：1953(2006))；Luo等，Mol Pharmacol.69(6)：1953(2006)(注释在：Mol.Pharmacol.69(6)：1773(2006))或改善心肌梗塞中的血管生成(Shyu等，Cardiovasc Res.54(3)：576(2002)；Vincent等，Circulation.102(18)：2255(2000))。
在某些实施方式中，单独或与血管生成性因子和/或心脏再生因子组合提供治疗、缓解或预防心血管疾病的心脏保护性因子。心脏保护性分子提供抗-纤维变性、抗-凋亡信号以使心肌细胞驻留，限制梗塞区域大小并提供存活信号以使迁移干细胞。在某些实施方式中，心脏保护性因子是促红细胞生成素(EPO)(人氨基酸序列登录号CAA26095.1)，例如人促红细胞生成素α或安进公司(Amgen)生产的
Figure GPA00001141248200751
促红细胞生成素显示具有心脏保护、血管生成和神经保护作用(Ben-Dor等，Cardiovasc Drugs Ther.21(5)：339(2007)；Lin等，Circ J.71(1)：132(2007)；Prunier等，Am J.Physiol Heart CircPhysiol.292(1)：H522(2007))。
显示对实验性心肌缺血-再灌注损伤具有保护作用的其它心脏保护性激素包括但不限于：肾上腺髓质素，缓激肽，松弛素，ANF，也称为心房利钠肽(ANP，人核苷酸序列登录号：NM_006172，人氨基酸序列登录号：NP_006163)，BNP，也称为B-型利钠肽或GC-B(人氨基酸序列登录号：NP_002512.1；人核苷酸序列登录号：M25296)，C-型利钠肽(CNP)，卡培立肽，组织纤维蛋白溶酶原激活剂(tPA)和urocortin(一种促肾上腺皮质激素释放激素)。许多还显示能降低纤维变性或介导血液动力学。奈西立肽(商标名
Figure GPA00001141248200752
由西奥斯公司(Scios)投入市场)(重组形式的人B-型利钠肽)、ANF和卡培立肽用于治疗、缓解或预防急性代偿失调的心力衰竭，也可用于本发明(Burnett J.C.Jr.，J.Cardiol.48(5)：235(2006))。
已知对女性生殖系统有作用的松弛素(人氨基酸登录号NP_604390.1)还是涉及氧化氮作用机理的全身和冠状循环的强效舒张剂，其影响心脏搏动率。松弛素还已知是可预防、治疗或缓解缺血性心脏疾病(急性和慢性心肌梗塞)、心脏纤维变性和闭塞性外周动脉疾病并在细胞移植中恢复心脏功能的心血管药物。(Nistri等，Pharmacol.Res.57(1)：43(2008)；Samuel等，Adv.Exp.Med.Biol.612：88(2007)；Du XJ.，J.Cell Mol.Med.11(5)：1101(2007)；Formigli等，J.Cell Mol.Med.11(5)：1087(2007)；Bathgate等，Mol.CellEndocrinol.280(1-2)：30(2008)；Nistri等，Cardiovasc.Hematol.Agents Med.Chem.5(2)：101(2007)；Moore等，Endocrinology.148(4)：1582(2007)；Lekgabe等，Endocrinology.147(12)：5575(2006)；Samuel等，Pharmacol.Ther.112(2)：529(2006)；Zhang等，Peptides.26(9)：1632(2005)；Perna等，Ann.N.Y.Acad.Sci.1041：431(2005)；Perna等，FASEB J.19(11)：1525(2005)；Samuel等，Endocrinology.145(9)：4125(2004)；Masini等，Br J Pharmacol.137(3)：337(2002)；Ndisang等，Inflamm.Res.50增刊.2：S122-3(2001)；Dschietzig等，FASEB.J.15(12)：2187(2001)；Bani等，Am J Pathol.152(5)：1367(1998)；和Masini等，Inflamm.Res.45Suppl 1：S27(1996))。
在某些实施方式中，用于治疗、缓解或预防心血管疾病的本发明治疗蛋白具有多种治疗益处。例如，在心肌梗塞后的早期，据报道梗塞区的水平升高(SDF-1，人核苷酸序列登录号：U16752，人氨基酸序列登录号：NP_954637)。这为干细胞作为天然修复过程的一部分而从BM小环境(BMniches)迁移到受损部位提供了所需的刺激。SDF-1将骨髓造血干细胞(主要是CD31+、C-kit+和CD34+细胞)募集至梗塞心脏，从而导致新血管生成和心脏保护活性。此外，SDF-1通过G蛋白-偶联的失调CXCR4再生因子激活细胞存活因子蛋白激酶B(PKB/Akt)。也参见美国专利申请公布号20060111290A1；Elmadbouh等，J Mol Cell Cardiol.42(4)：792(2007)；Bonaros等，Interact Cardiovasc Thorac Surg.7(2)：249(2008)；Zhang等，JMol Cell Cardiol.44(2)：281(2008)；Ma等，Basic Res Cardiol.100(3)：217(2005)；和Zhang等，Tissue Eng.13(8)：2063(2007)。
此外，tPA(人氨基酸登录号28274638)，例如人组织纤维蛋白溶酶原激活剂或PDL生物医药公司(PDL BioPharma，Inc)生产的
Figure GPA00001141248200761
已知能通过抑制移植物动脉粥样硬化而预防、治疗或缓解心脏移植后并发症(Scholl等，J Heart Lung Transplant.20(3)：322(2001)；Dunn等，Circulation.93(7)：1439(1996)(注释在：Circulation.93(7)：1319(1996))；和Gong等，Gene Ther.14(21)：1537(2007))。此外，还知道生长激素能通过促进血管生成而预防、治疗或缓解心血管疾病，进而用于本发明(Isgaard J.和BerghC.H.，BioDrugs.12(4)：245(1999)；Fazio等，J.Clin.Endocrinol.Metab.92(11)：4218(2007)；Climent等，Curr Med Chem.14(13)：1399(2007)；Perez-Berbel等，Int J Cardiol.124(3)：393(2008)(注释在：Int J Cardiol.110(3)：313(2006))；和Le Corvoisier等，J Clin Endocrinol Metab.92(1)：180(2007))，并可减弱凋亡(Rong等，Chin MedJ(Engl).12l(4)：347(2008))。
在其它实施方式中，本发明包括能恢复心脏功能的治疗分子。心脏修复分子包括但不限于：SERCA2a、AC6、S100A1、细小白蛋白、磷酸酶抑制剂2和磷酸酶抑制剂1。例如，SERCA2a已知能在体内和体外改善心脏收缩性和心力衰竭中的心脏功能(Asahi等，Proc NatlAcadSci USA.101(25)：9199(2004)；Cavagna等，J Physiol.528Pt 1：53(2000)；Chaudhri等，Mol CellBiochem.251(1-2)：103(2003)；Davia等，J Mol Cell Cardiol.33(5)：1005(2001)；del Monte等，Circulation.100(23)：2308(1999)(注释在：Circulation.100(23)：2303(1999)；del Monte等，Circulation.104(12)：1424(2001)；Hajjar等，Circ Res.81(2)：145(1997)(注释在：Circ Res.88(4)：373(2001)和Circulation.101(7)：790(2000))；Kawase等，J AmCollCardiol.51(11)：1112(2008)；Maier等，Cardiovasc Res.67(4)：636(2005)(注释在：Cardiovasc Res.67(4)：581(2005)；Meyer M.和Dillmann W.H.，Cardiovasc Res.37(2)：360(1998)；Miyamoto等，Proc Natl Acad Sci U SA.97(2)：793(2000)；Muller等，Cardiovasc Res.59(2)：380(2003)；Sakata等，J Mol CellCardiol.42(4)：852(2007)；Sakata等，Am J Physiol Heart Circ Physiol.292(2)：H1204(2007)；Schmidt等，Circulation.101(7)：790(2000)(注释在：Circulation.101(7)：738(2000)，CircRes.81(2)：145(1997)，CircRes.83(9)：889(1998)，和Circulation.95(2)：423(1997))Suarez等，AmJPhysiol Heart Circ Physiol.287(5)：H2164(2004)；Terracciano等，CellCalcium.31(6)：299(2002)；Trost等，Diabetes.51(4)：1166(2002)；和Vetter等，FASEB J 16(12)：1657(2002))。
此外，已知AC6能恢复心肌病中SERCA2a对钙的亲合力以及肌质网的心脏钙摄入的最高速度(Gao等，Proc Natl Acad Sci U S A.95(3)：1038(1998)；Roth等，Circulation.99(24)：3099(1999)；Lai等，Circulation.102(19)：2396(2000)；Roth等，Circulation.105(16)：1989(2002)(注释在：Circulation.105(16)：1876(2002))；Gao等，CardiovascRes.56(2)：197(2002)(注释在：Cardiovasc Res.56(2)：181(2002))；Roth等，Basic Res Cardiol.98(6)：380(2003)；Roth等，Am J Physiol Heart Circ Physiol.287(1)：H 172(2004)；Gao等，JBiolChem.279(37)：38797(2004)；Tang等，AmJPhysiolHeart CircPhysiol.287(5)：H 1906(2004)；Lai等，Circulation.110(3)：330(2004)(注释在：Circulation.110(3)：242(2004)；Roth等，Hum Gene Ther.15(10)：989(2004)；Timofeyev等，JMol Cell Cardiol.41(1)：170(2006)(注释在：J Mol CellCardiol.41(3)：424(2006)；Takahashi等，Circulation.114(5)：388(2006)(错刊于：Circulation.114(11)：e497(2006)；注释在：Circulation.114(5)：365(2006)；Sastry等，J Am Coll Cardiol.48(3)：559(2006)；Rebolledo等，Hum Gene Ther.17(10)：1043(2006)；Hammond H.K.，Ann N YAcad Sci.1080：426(2006)；Phan等，Trends Cardiovasc Med.17(7)：215(2007)；Tang等，Circulation.117(1)：61(2008)；和Lai等，J Am Coll Cardiol.51(15)：1490(2008))。
在某些实施方式中，Ca2+-结合蛋白S100A1可恢复心脏功能，因此可用于本发明。S 100A1已知能体内增加心脏收缩并降低心肌梗塞后的心力衰竭可能性。(Most等，J Clin Invest.114(11)：1550(2004)；Most等，Circulation.114(12)：1258(2006)；Pleger等，Mol Ther.12(6)：1120(2005)；Pleger等，Eur JMed Res.11(10)：418(2006)；Remppis等，J Gene Med.6(4)：387(2004)；Most等，Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol.293(2)：R568(2007)；Remppis等，Basic Res Cardiol.97Suppl 1：I56(2002)；Pleger等，Circulation.115(19)：2506(2007)；和Most等，J Biol Chem.278(36)：33809(2003))。改善或恢复心脏功能的治疗分子的其它非限制性例子有：拟清蛋白(Hirsch等，Am J PhysiolHeart Circ Physiol.286(6)：H2314(2004)；Michele等，Mol Ther.10(2)：399(2004)；和Sakata等，J Mol Cell Cardiol.42(4)：852(2007))、磷酸酶抑制剂2(Yamada等，FASEB J.20(8)：1197(2006)；Gupta等，Mol Cell Biochem.269(1-2)：49(2005)；和Kirchhefer等，Cardiovasc Res.68(1)：98(2005))和磷酸酶抑制剂1(Gupta等，Mol Cell Biochem.269(1-2)：49(2005)和Gupta等，Am J Physiol Heart Circ Physiol.285(6)：H2373(2003))。
可用于本发明来预防、治疗或缓解疾病或病症的其它治疗分子包括但不限于：单克隆抗体(例如，
Figure GPA00001141248200781
-HC，
Figure GPA00001141248200782
-LC，
Figure GPA00001141248200783
-HC，
Figure GPA00001141248200784
-LC，-HC，
Figure GPA00001141248200786
-LC，
Figure GPA00001141248200787
-HC，
Figure GPA00001141248200788
-LC，
Figure GPA00001141248200789
-HC，
Figure GPA000011412482007810
-LC，
Figure GPA000011412482007811
-HC，
Figure GPA000011412482007812
-LC，
Figure GPA000011412482007813
-HC，
Figure GPA000011412482007814
-LC，
Figure GPA000011412482007815
-HC，和-LC)、重组酶(例如，
Figure GPA000011412482007818
-A链，
Figure GPA000011412482007819
-B链，
Figure GPA000011412482007820
前胰岛素原，
Figure GPA000011412482007821
和
Figure GPA000011412482007822
)、融合蛋白(例如，
Figure GPA000011412482007823
)或任何纯化蛋白(例如，
Figure GPA000011412482007824
和
Figure GPA000011412482007825
)。此外，本领域普通技术人员能鉴定合适的治疗分子以供预防、治疗或缓解特定疾病或病症。
载体和宿主细胞
利用载体将多核苷酸引入细胞。载体可以是，例如质粒载体或单链或双链RNA或DNA病毒载体。这种载体可以通过熟知技术引入细胞以便将DNA和RNA引入细胞。病毒载体可以是能复制的或复制缺陷型的。后一情况中，病毒通常只在互补的病毒感受态细胞中增殖。
因此，载体至少必须包含本发明多核苷酸。载体的其它组分可包括但不限于：可选择标记、染色质修饰结构域、驱动载体上还可能存在的其它多肽(例如，致死多肽)表达的其它启动子、基因组整合位点、重组位点和分子插入支点(molecular insertion pivot)。载体可在或不在该多核苷酸内包含任何数量的这些额外元件，从而该载体可为所需治疗方法的特定目标而作改进。
在本发明的一个实施方式中，引入细胞的载体还包含“可选择标记基因”，当其表达时，表示本发明的治疗基因开关构建物已整合入修饰细胞的基因组。在此方式中，选择者基因(selector gene)可以是基因组整合的正标记物。虽然对于本发明方法不是至关重要的，但选择者基因的存在使得实施者能选择载体构建物已整合入细胞基因组的活细胞群。因此，本发明的某些实施方式包括选择载体已成功整合的细胞。当本文所用的术语“选择”或其改变形式与细胞联用时，其应表示选择具有特定遗传组成或表型的细胞的标准熟知方法。典型的方法包括但不限于：有抗生素，例如G418、新霉素和氨苄青霉素存在下培养细胞。可选择标记基因的其它例子包括但不限于：赋予对二氢叶酸还原酶、潮霉素或霉酚酸耐受性的基因。选择的其它方法包括但不限于：允许利用胸苷激酶、次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶或腺嘌呤磷酸核糖转移酶作为选择剂的可选择标记基因。然后包含含有一种或多种抗生素耐受性基因的载体构建物的细胞能耐受培养基中的抗生素。类似地，不包含含有一种或多种抗生素耐受性基因的载体构建物的细胞不能耐受培养基中的抗生素。
本文所用的“染色质修饰结构域”(CMD)指与维持和/或改变染色质结构相关的各种蛋白质相互作用的核苷酸序列，例如但不限于DNA绝缘子。参见通过引用纳入本文的Ciavatta等，Proc.Nat’l Acad.Sci.U.S.A.，103：9958(2006)。CMD的例子包括但不限于：鸡β-球蛋白绝缘子和鸡超敏位点4(cHS4)。例如，利用在一个或多个基因程序(gene program)之间不同的CMD(即，启动子、编码序列和3’调控区)有助于联用差别CMD DNA序列作为“最小同源臂”与各种微生物或体外重组技术，从而在现有多基因和单基因穿梭载体之间“交流”基因程序。染色质修饰结构域的其它例子是本领域已知或者不难鉴定的。
本发明所用的具体载体是编码多肽或多核苷酸的表达载体。这种载体通常包含操作性连接于待表达多核苷酸的顺式-作用调控区以便在修饰细胞中有效表达。合适的反式作用因子由修饰细胞、互补载体(complementing vector)或在引入细胞后由载体本身提供。
可利用各种表达载体表达多肽或多核苷酸。这种载体包括染色体、附加体和病毒衍生的载体，例如衍生自细菌质粒、噬菌体、酵母附加体、酵母染色体元件、病毒，例如腺伴随病毒、慢病毒、杆状病毒、乳多空病毒，例如SV40、牛痘病毒、腺病毒、禽痘病毒、伪狂犬病病毒和逆转录病毒的载体，以及衍生自它们组合的载体，例如衍生自质粒和噬菌体遗传元件，例如粘粒和噬菌粒的那些载体。按照本发明的该方面，所有载体可用于表达。就此而言，适于在细胞中维持、增殖或表达多核苷酸或多肽的任何载体通常可用于表达。
表达载体中的多核苷酸序列操作性连接于合适的表达控制序列，包括例如指导mRNA转录的启动子。其它代表性启动子包括但不限于：组成型启动子和组织特异性或诱导型启动子。组成型真核生物启动子的例子包括但不限于：小鼠金属硫蛋白I基因的启动子(Hamer等，J.Mol.Appl.Gen.1：273(1982))；疱疹病毒的TK启动子(McKnight，Cell 31：355(1982))；SV40早期启动子(Benoist等，Nature 290：304(1981))；和牛痘病毒启动子。上述所有参考文献通过引用纳入本文。可用于驱动蛋白质或多核苷酸表达的启动子的其它例子包括但不限于组织特异性启动子和特定蛋白质的其它内源性启动子，例如白蛋白启动子(肝细胞)、胰岛素原启动子(胰腺β细胞)等。表达构建物通常含有转录、起始和终止位点以及在转录区域中用于翻译的核糖体结合位点。构建物表达的成熟转录物的编码部分可包含开始处的翻译起始AUG，和适当位于待翻译多肽末端的终止密码子(UAA、UGA或UAG)。
此外，构建物可含有调节以及引起表达的调控区。这些区域通常通过控制转录起作用，例如阻遏物结合位点和增强子等。
真核生物载体的例子包括但不限于：斯特拉塔基因公司(Stratagene)的pW-LNEO、pSV2CAT、pOG44、pXT 1和pSG；APB公司(Amersham PharmaciaBiotech)的pSVK3、pBPV、pMSG和pSVL；和克隆技术公司(Clontech)的pCMVDsRed2-表达、pIRES2-DsRed2、pDsRed2-Mito、pCMV-EGFP。许多其它载体是熟知且可商品化购得的。
包含分子插入支点以供快速插入和除去基因程序元件的尤其有用载体描述于：美国专利申请公布号2004/0185556、美国专利申请号11/233,246和国际申请公布号WO 2005/040336及WO 2005/116231，所有这些通过引用纳入本文。这种载体的例子是通过引用纳入本文的WO 2007/038276所述的弗吉尼亚州布莱克斯堡的英特列克星敦公司的UltraVectorTM产生系统。本文所用的“基因程序”是包含启动子(P)、表达序列(E)和3′调控序列(3)的遗传元件的组合，例如“PE3”是基因程序。该基因程序内的诸元件不难在侧接该基因程序各元件的分子支点之间交流。本文所用的分子支点定义为包含至少两个以线形方式排列的不可变罕有或稀有限制性位点的多核苷酸。在一个实施方式中，分子支点包含至少三个以线形方式排列的不可变罕有或稀有限制性位点。通常，任一分子支点不会包含同一基因程序中任何其它分子支点的罕有或稀有限制性位点。给定限制性酶在其上起作用的大于6个核苷酸的同源序列称为“罕有”限制性位点。然而，有的6bp限制性位点比统计学预计的更罕见，这些位点和切割它们的核酸内切酶称为“稀有”限制性位点。罕有或稀有限制性位点的例子包括但不限于：AsiS I、Pac I、Sbf I、Fse I、Asc I、Mlu I、SnaB I、Not I、Sal I、Swa I、Rsr II、BSiW I、Sfo I、Sgr AI、AflIII、Pvu I、Ngo MIV、Ase I、Flp I、Pme I、SdaI、SgfI、SrfI、和Sse8781I。
载体还可包含第二类限制性酶，称为归巢核酸内切酶(HE)的限制性位点。HE酶具有大的不对称限制性位点(12-40个碱基对)，它们的限制性位点是天然罕见的。例如，称为I-SceI的HE具有18bp的限制性位点(5′TAGGGATAACAGGGTAAT3′(SEQ ID NO：4))，预计在随机序列的每7x1010个碱基对中产生一个。这种发生率等于在哺乳动物基因组大小的20倍的基因组中只有一个位点。如果克隆载体质粒的适当位置包含HE位点，则HE位点的罕有特性极大增加了遗传工程师切割某基因程序而不破坏该基因程序完整性的可能性。
选择合适的载体和启动子在宿主细胞中表达是熟知的方法，载体构建和引入宿主及其在宿主中表达的必需技术是本领域的常规技术。
将多核苷酸引入细胞可以是瞬时转染、稳定转染，或者可以是基因座特异性插入载体。可通过磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、阳离子脂质-介导的转染、电穿孔、转导、感染或其它方法实现载体瞬时而稳定地转染入宿主细胞。通过引用纳入本文的许多标准实验室手册描述了这些方法，例如Davis等，Basic Methods in Molecular Biology(分子生物学基本方法)(1986)；Keown等，1990，Methods Enzymo1.185：527-37；Sambrook等，2001，Molecular Cloning，A Laboratory Manual(分子克隆-实验室手册)，第三版，冷泉港实验室出版社，纽约。这些稳定的转染方法导致载体随机插入细胞的基因组。此外，载体的拷贝数量和取向一般也是随机的。
在另一实施方式中，可通过重组酶位点特异性基因插入进行基因座特异性插入。简言之，细菌重组酶，例如但不限于PhiC31整合酶可作用于人基因组内的“伪”重组位点。这些伪重组位点可以是利用重组酶的基因座特异性插入的靶点。重组酶-位点特异性基因插入描述于通过引用纳入本文的Thyagarajan等，Mol.Cell Biol.21：3926(2001)。重组酶的其它例子和它们可用于重组酶-位点特异性基因插入的各位点包括但不限于丝氨酸重组酶，例如R4和TP901-1和通过引用纳入本文的WO 2006/083253描述的重组酶。
为将一个或多个基因表达系统稳定整合入修饰细胞，任何已知的整合方法可用于本发明的目的。在一个实施方式中，可通过重组酶位点特异性基因插入进行基因座特异性插入。简言之，细菌重组酶，例如但不限于PhiC31整合酶可作用于人基因组内的“伪”重组位点。参见美国公布号2004/0003420A1；Groth等，Proc.Natl.Acad.Science，97，5995-6000(2000)。这些伪重组位点可以是利用重组酶的基因座特异性插入的靶点。重组酶-位点特异性基因插入描述于Thyagarajan，B.等，Mol.Cell Biol.21(12)：3926-34(2001)。
在某些实施方式中，第一可诱导基因表达系统还包含整合酶，其将该第一基因开关系统稳定整合入靶向细胞基因组内的伪-位点。第二基因开关系统还可包含整合酶，其将该第二基因开关系统整合入靶向细胞基因组内的伪位点。该第一基因开关系统还可包含整合接受位点，其可将该第二可诱导基因开关系统整合在靶向细胞基因组内的预置接受位点。
以下多肽序列报道为编码链霉菌噬菌体PhiC31整合酶多肽序列的多肽序列，其在Genbank中的登录号为NP 047974。
链霉菌噬菌体phiC31整合酶(605aa)(SEQ ID NO：6)
  1mdtyagaydr qsrerenssa aspatqrsan edkaadlqre verdggrfrf vghfseapgt
 61safgtaerpe ferilnecra grlnmiivyd vsrfsrlkvm daipivsell algvtivstq
121egvfrqgnvm dlihlimrld ashkesslks akildtknlq relggyvggk apygfelvse
181tkeitrngrm vnvvinklah sttpltgpfe fepdvirwww reikthkhlp fkpgsqaaih
241pgsitglckr mdadavptrg etigkktass awdpatvmri lrdpriagfa aeviykkkpd
301gtpttkiegy riqrdpitlr pveldcgpii epaewyelqa wldgrgrgkg lsrgqailsa
361mdklycecga vmtskrgees ikdsyrcrrr kvvdpsapgq hegtcnvsma aldkfvaeri
421fnkirhaegd eetlallwea arrfgkltea peksgeranl vaeradalna leelyedraa
481gaydgpvgrk hfrkqqaalt lrqqgaeerl aeleaaeapk lpldqwfped adadptgpks
541wwgrasvddk rvfvglfvdk ivvtksttgr gqgtpiekra sitwakpptd ddeddaqdgt
601edvaa
可用于重组酶位点特异性基因插入的重组酶和它们的各自位点的其它例子包括但不限于：丝氨酸重组酶，例如R4和TP901-1。位点-特异性重组酶(SSR)，例如细菌噬菌体P1-衍生的Cre重组酶识别特异性DNA序列(″识别位点”″识别序列”或″整合酶接受位点″)并在两个识别位点之间催化重组。例如，Cre重组酶识别34碱基对(bp)的loxP基序(Austin等，Cell 25，729-736(1981))。如果两个位点以相同取向位于同一DNA分子上，重组酶从作为闭合环的亲代分子上切下间插DNA序列，从而在各反应产物上留下一个识别位点。如果两个位点是颠倒取向，侧接识别的区域通过重组酶介导的重组而颠倒。或者，如果两个识别位点位于不同分子上，重组酶介导的重组会导致环状分子整合或在两个线形分子之间的易位。
除了Cre，少数重组酶已在哺乳动物细胞中显示一定活性。最佳表征的例子是酵母衍生的FLP和Kw重组酶，其在30℃显示最佳活性，在37℃不稳定(Buchholz等，Nature Biotech.，16，657-662(1998)；Ringrose等，Eur.J.Biochem.，248，903-912)。在哺乳动物细胞中显示一定活性的其它重组酶包括噬菌体λ的突变型整合酶、噬菌体HK022的整合酶、突变型γδ-解离酶和β-重组酶(Lorbach等，J.Mol.Biol.，296，1175-81(2000)；Kolot等，Moi.Biol.Rep.26，207-213(1999)；Schwikardi等，FEBS Lett.，471，147-150(2000)；Diaz等，J.Biol.Chem.，274，6634-6640(1999))。此外，现已开发了改进形式的phiC31整合酶。该修饰的C31-Int(C31-Int(CNLS))携带C-末端核定位信号区(NLS)，其在哺乳动物细胞中展示明显强于野生型形式的重组效率并与Cre重组酶相当(EP 1205490；美国公布号2004/0003420A1)。这使得C31-Int成为哺乳动物基因组修饰的有价值工具。
在本发明的一个实施方式中，载体插入基因组的生物中立位点(bio-neutral site)。生物中立位点是基因组中多核苷酸的插入极少干扰(如果有的话)细胞正常功能的位点。可采用可得的生物信息学方法分析生物中立位点。许多生物中立位点是本领域已知的，例如ROSA-等价基因座。可采用本领域熟知的常规技术鉴定其它生物中立位点。采用本领域已知的方法表征基因组插入位点。为控制将载体引入细胞时多核苷酸的位置、拷贝数量和/或取向，可采用基因座特异性插入的方法。基因座特异性插入方法是本领域熟知的，包括但不限于：同源重组和重组酶介导的基因组插入。当然，如果本发明方法中要采用基因座特异性插入方法，载体可包含有助于这种基因座特异性插入，例如但不限于同源重组的元件。例如，载体可包含1、2、3、4或更多个基因组整合位点(GIS)。本文所用的“基因组整合位点”定义为载体序列的一部分，其核苷酸序列与允许载体插入基因组的细胞内的基因组诸部分相同或几乎相同。特别是，载体可包含至少侧接该多核苷酸的两个基因组插入位点。当然，GIS可侧接其它元件，甚至载体上存在的所有元件。
在进一步的实施方式中，载体可包含化学耐受性基因，例如多元抗药性基因mdr1、二氢叶酸还原酶或O6-烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶。化学耐受性基因可以在组成型(例如，CMV)或诱导型(例如，
Figure GPA00001141248200841
)启动子的控制下。在该实施方式中，如果需要治疗在对象的疾病而同时将修饰细胞维持在该对象中，临床医师可应用化疗剂来破坏患病细胞，而修饰细胞因表达合适的化学耐受性基因而免遭该化疗剂作用并且可继续用于治疗、缓解或预防疾病、病症或病状。将化学-耐受性基因置于诱导型启动子控制下，可避免该化学耐受性基因不必要的表达，但如果需要持续治疗，其仍可用。如果修饰细胞本身变得患病，也可通过诱导致死性多肽表达来破坏它们，如下所述。
通过将编码基因开关和治疗多肽或治疗多核苷酸的多核苷酸引入对象的细胞来实施本发明方法。可采用本领域已知的将多核苷酸引入细胞的任何已知方法，例如上述那些。
当要将多核苷酸离体引入细胞时，可通过本领域已知的任何技术获得对象的细胞，包括但不限于：活检、刮除术和外科组织取出。可以培养分离的细胞足够时间以使多核苷酸引入细胞，例如2、4、6、8、10、12、18、24、36、48小时或更长时间。短期培养原代细胞的方法是本领域熟知的。例如，可在平板(例如，微孔平板)中粘附或悬浮培养细胞。
对于离体治疗方法，从对象分离细胞并在适于将多核苷酸引入细胞的条件下培养。一旦多核苷酸引入细胞，将该细胞温育足够的时间以使配体依赖性转录因子复合物表达，例如0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、18、或24小时或更长时间。在多核苷酸引入细胞后的某时(配体依赖性转录因子复合物表达显著水平之前或之后)，将该细胞引回该对象。可通过本领域已知的任何方法实施重新引入，例如静脉内输注或直接注射入组织或体腔。在一个实施方式中，先测定细胞中是否存在多核苷酸，再将该细胞引回对象。在另一实施方式中，选择含有多核苷酸的细胞(例如，根据多核苷酸中可选择标记的存在)，只将含有该多核苷酸的那些细胞重新引入对象。细胞重新引入对象后，将配体给予对象以诱导治疗多肽或治疗多核苷酸表达。在其它实施方式中，甚至可在细胞重新引入对象前将配体给予细胞，从而能在重新引入细胞之前表达治疗多肽或治疗多核苷酸。可通过任何合适的方法，全身性(例如，口服、静脉内)或局部(例如，腹膜内、鞘内、心室内、直接注射入重新引入细胞的组织或器官)给予配体。可仅采用常规技术测定各类细胞和疾病、病症或病状的最佳配体给予时机。
在不同的实施方式中，可利用非自体细胞，例如对象的同种异体或异种细胞，而非对象的自体细胞实施离体治疗方法。可将多核苷酸离体引入非自体细胞以产生修饰细胞，然后将修饰细胞引入该对象。非自体细胞可以是移植后能存活的任何细胞，包括但不限于干细胞(例如胚胎干细胞或造血干细胞)和成纤维细胞。
本发明的体内治疗方法包括将多核苷酸直接体内引入对象的细胞。可将多核苷酸全身性或局部(例如，疾病、病症或病状的部位)引入对象。一旦多核苷酸引入对象，可给予配体以诱导治疗多肽或治疗多核苷酸的表达。可通过任何合适的方法，全身性(例如，口服、静脉内)或局部(例如，腹膜内、鞘内、心室内、直接注射入发生疾病、病症或病状的组织或器官)给予配体。可仅采用常规技术测定各类细胞和疾病、病症或病状的最佳配体给予时机。
在一个实施方式中，可将配体连续或间歇给予对象，可视需要根据疾病、病症或病状的状态改变配体给予的模式。可通过配体给予的时间表和配体的给予量调整治疗多肽或治疗多核苷酸的表达水平，从而能仔细控制治疗性治疗。
还可联用本发明治疗方法与诊断技术以提高诸如药物诊断学或治疗诊断学领域已知各种方法的治疗结果。例如，给予配体可与监测疾病、病症或病状的状态或进展向配合。在一个实施方式中，本发明多核苷酸与设计用于诊断或监测疾病、病症或病状的一种或多种多核苷酸一起引入细胞。在另一实施方式中，诊断多核苷酸存在于包含本发明多核苷酸的同一载体中。在该实施方式中，治疗性治疗和监测疗效的诊断检验在一个单位中一起给予，从而确保接受治疗的所有细胞也接受诊断检验。在一个实施方式中，诊断多核苷酸包含操作性连接于报道基因的诊断开关启动子(即，其活性在疾病、病症或病状期间受到调节的启动子)，而监测疾病、病症或病状的状态包括检测报道基因的表达水平。
在本发明的另一治疗实施方式中，通过检测报道基因的表达水平监测治疗多肽或治疗多核苷酸的表达水平，其中报道基因的表达水平与治疗多肽或治疗多核苷酸的表达水平直接相关。例如，可通过生物中立报道分子，例如人2型生长激素抑制素受体非侵入性地监测各种组织中治疗蛋白，例如白介素-12的表达水平，该受体可用放射性标记的生长激素抑制素类似物成像(参见，例如Zinn等，J.Nucl.Med41：887-895(2000))。报道基因可连接于与治疗多肽或多核苷酸相同的启动子，或者可置于受治疗多肽或多核苷酸调节的不同启动子控制下。
本发明的其它实施方式涉及在对象中表达治疗多肽或治疗多核苷酸的方法，包括：
(a)将以下多核苷酸引入所述对象的细胞从而产生修饰的细胞：(1)编码基因开关的多核苷酸，所述基因开关包含至少一个与治疗开关启动子操作性相连的转录因子序列，其中所述至少一个转录因子序列编码配体依赖性转录因子复合物，其中所述启动子在所述疾病、病症或病状期间活化，和(2)与启动子相连的编码治疗多肽或治疗多核苷酸的多核苷酸，该启动子由所述配体依赖性转录因子复合物活化；和
(b)将配体给予所述对象以诱导所述治疗多肽或治疗多核苷酸表达。
在一个实施方式中，可利用实验室动物(例如，小鼠、大鼠、猫、狗、猴)或农业动物(例如，猪、绵羊、奶牛)实施在对象中表达治疗多肽或治疗多核苷酸的方法。例如，可为研究或大规模生产治疗多肽或治疗多核苷酸的目的在动物中实施表达治疗产物的方法。
本发明的进一步实施方式涉及在细胞中表达治疗多肽或治疗多核苷酸的方法，包括：
(a)将以下多核苷酸引入所述细胞从而产生修饰的细胞：(1)编码基因开关的多核苷酸，所述基因开关包含至少一个与治疗开关启动子操作性相连的转录因子序列，其中所述至少一个转录因子序列编码配体依赖性转录因子复合物，其中所述启动子在所述疾病、病症或病状期间活化，和(2)与启动子相连的编码治疗多肽或治疗多核苷酸的多核苷酸，该启动子由所述配体依赖性转录因子复合物活化；和
(b)将配体给予所述修饰细胞以诱导所述治疗多肽或治疗多核苷酸表达。
本发明的另一实施方式是在一个或多个修饰细胞中表达治疗多肽或治疗多核苷酸的方法，包括：
(a)将以下多核苷酸引入细胞从而产生修饰细胞；(1)编码基因开关的第一多核苷酸，所述基因开关包含至少一个与治疗开关启动子操作性相连的转录因子序列，其中所述至少一个转录因子序列编码配体依赖性转录因子复合物，其中所述治疗开关启动子在疾病、病症或病状相关条件下活化，和(2)与因子调节的启动子操作性相连的编码治疗多肽或治疗多核苷酸的第二多核苷酸，该启动子由所述配体依赖性转录因子复合物活化；和
(b)将配体给予所述修饰细胞以诱导所述治疗多肽或治疗多核苷酸表达。
在一个实施方式中，可在体外，例如在培养细胞中实施在细胞中表达治疗多肽或治疗多核苷酸的方法。例如，可为研究或大规模生产治疗多肽或治疗多核苷酸的目的实施治疗产物的体外表达方法。
在本文所述的任何实施方式中，多核苷酸或含有多核苷酸的载体可包含编码致死性多肽的序列，开启该序列可表达杀伤含有该多核苷酸或载体的细胞的产物。致死性多肽表达可用于从对象中消除修饰细胞，因为不再需要治疗或者因为修饰细胞出了问题(例如，过度增殖或毒性)。本文所用的致死性多肽是在表达时对于表达该多肽的细胞有致死性的多肽，因为该多肽本身是致死性的或者该多肽产生致死性的化合物。本文所用的致死性多肽包括以任何方式诱导细胞死亡的多肽，包括但不限于：坏死、凋亡和细胞毒性。致死性多肽的例子包括但不限于：凋亡诱导型肿瘤阻遏基因，例如但不限于p53、Rb和BRCA-1，毒素，例如白喉毒素(DTA)、志贺菌神经毒素、肉毒杆菌毒素、破伤风毒素、霍乱毒素、CSE-V2和蝎子蛋白毒素的其它变体等等，自杀基因，例如胞嘧啶脱氨酶和胸苷激酶，以及细胞毒素基因，例如肿瘤坏死因子、干扰素-α。本发明不限于致死性多肽的身份，只要该多肽对表达其的细胞有致死性即可。如果修饰细胞是短寿细胞，例如寿命有限的细胞(例如，约10天或更短，如树突细胞)，可能无需在多核苷酸或载体中包含致死性多肽，因为该细胞自然会在短期内除去。
对于上述各方法，在一个实施方式中，连接于启动子的编码基因开关的多核苷酸和编码治疗多肽或治疗多核苷酸的多核苷酸是较大多核苷酸，例如载体的一部分。在另一实施方式中，与因子调节的启动子相连的编码治疗基因开关的多核苷酸和编码治疗多肽或多核苷酸的多核苷酸是不同的多核苷酸，二者可组合形成“核酸组合物”。
在一方面，本发明涉及可用于本发明方法的多核苷酸。在一个实施方式中，该多核苷酸编码基因开关，所述基因开关包含至少一个操作性连接于治疗开关启动子的转录因子序列，其中所述至少一个转录因子序列编码配体依赖性转录因子复合物，其中所述启动子的活性在所述疾病、病症或病状期间受到调节。在另一实施方式中，该多核苷酸还编码与因子调节的启动子相连的治疗多肽或治疗多核苷酸，该启动子由所述配体依赖性转录因子复合物活化。在一个实施方式中，基因开关是基于EcR的基因开关。在另一实施方式中，基因开关包含第一治疗开关启动子控制下的第一转录因子序列和第二治疗开关启动子控制下的第二转录因子序列，其中所述第一转录因子序列和所述第二转录因子序列编码的蛋白质相互作用从而形成起到配体依赖性转录因子复合物作用的蛋白质复合物。在一个实施方式中，所述第一治疗开关启动子和第二治疗开关启动子是不同的。在另一实施方式中，所述第一治疗开关启动子和第二治疗开关启动子是相同的。在另一实施方式中，所述第一转录因子序列编码包含异源二聚体伴侣和反式激活域的蛋白质，所述第二转录因子序列编码包含DNA结合结构域和配体结合结构域的蛋白质。在进一步的实施方式中，操作性连接于诱导型启动子的所述多核苷酸还编码致死性多肽。
本发明的另一方面涉及包含上述任何多核苷酸的载体。在一个实施方式中，所述载体是质粒载体或病毒载体。
在另一方面，本发明提供可与本发明方法联用的试剂盒。本发明该方面的试剂盒可装有一个或多个容器，其可包含一种或多种选自下组的组分：一种或多种核酸分子、限制性酶和一种或多种包含这种核酸分子的细胞。本发明试剂盒还可装有一个或多个含有适合支持培养本发明细胞的支持细胞的容器，一个或多个含有适于培养本发明细胞的细胞培养基的容器，一个或多个含有适合在本发明培养细胞中使用的抗生素的容器，一个或多个含有缓冲液的容器，一个或多个含有转染试剂的容器，一个或多个含有酶反应底物和/或基因开关活化的配体的容器。
本发明试剂盒可装有各种可用于本发明的核酸分子。本发明试剂盒中提供的核酸分子的例子包括含有以下的那些核酸分子：启动子、编码基因开关的序列、增强子、阻遏子、选择标记、转录信号、翻译信号、引物杂交位点(例如，用于测序或PCR)、重组位点、限制性位点和聚合接头、在有阻遏tRNA存在下阻止翻译终止的位点、阻遏tRNA编码序列、编码结构域和/或区域的序列，复制起点、端粒酶、着丝粒，等等。在一个实施方式中，试剂盒可装有包含基因开关而没有任何治疗开关启动子的多核苷酸，该多核苷酸适于插入任何感兴趣的治疗开关启动子。除上述多核苷酸外，本发明核酸分子可包含这些元件中的任一种或多种。
本发明试剂盒可装有包含一种或多种重组蛋白的容器。合适的重组蛋白包括但不限于：Cre、Int、IHF、Xis、Flp、Fis、Hin、Gin、Cin、Tn3解离酶、ΦC31、TndX、XerC和XerD。其它合适的重组位点和蛋白质是可从加利福尼亚州卡尔斯巴德市英杰公司(Invitrogen Corp.，Carlsbad，CA)购得的GATEWAYTM克隆技术相关的那些，并描述于通过引用全文纳入本文的GATEWAYTM克隆技术的产品文献中(E版，2003年9月22日)。
本发明的试剂盒还可提供引物。通常将这些引物设计成能与具有特异性核苷酸序列的分子退火。例如，可将这些引物设计成用于PCR中以扩增特定核酸分子。试剂盒还可提供测序引物。
本发明试剂盒可提供一种或多种缓冲剂(例如，1、2、3、4、5、8、10、15种)。这些缓冲剂可以工作浓度提供或以浓缩形式提供，随后稀释至工作浓度。这些缓冲剂常含有盐、金属离子、辅因子、金属离子螯合剂等以便增强缓冲剂本身或缓冲剂分子的活性或稳定性。此外，这些缓冲剂可以干燥或水性形式提供。当缓冲剂以干燥形式提供时，通常先将它们通常溶解于水中再使用。
实际上，本发明试剂盒可含有上述或本文它处所述组分的任何组合。本领域技术人员应知道可依据试剂盒所需的应用来改变本发明试剂盒提供的组分。因此，可将试剂盒设计成能执行本申请所述的各种功能，而这种试剂盒的组分也据此而变。
实施例
以下实施例进一步说明了本发明，但不应理解成以任何方式限制了本发明的范围。除非另有表述，本发明，包括以下实施例的实施将采用本领域技术人员已知的细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因技术、微生物和重组DNA的常规技术。以下文献完全解释了这些技术。参见，例如Molecular Cloning：A Laboratory Manual(分子克隆：实验室手册)(3-卷装)，J.Sambrook，D.W.Russell，冷泉港实验室出版社(2001)；Genes(基因)VIII，B.Lewin，Prentice Hall(2003)；PCR Primer(PCR引物)，C.W.Dieffenbach和G.S.Dveksler，CSHL出版社(2003)；DNA Cloning(DNA克隆)，D.N.Glover编，第I和II卷(1985)；Oligonucleotide Synthesis：Methods and Applications(Methods in Molecular Biology)(寡核苷酸合成：方法和应用(分子生物学方法))，P.Herdewijn(编)，休玛娜出版社(Humana Press)(2004)；Culture ofAnimal Cells：A Manual of Basic Technique(动物细胞培养：基础技术手册)，第4版，R.I.Freshney，Wiley-Liss(2000)；Oligonucleotide Synthesis(寡核苷酸合成)，M.J.Gait(编)，(1984)；Mullis等，美国专利号4,683,195；NucleicAcid Hybridization(核酸杂交)，B.D.Hames和S.J.Higgins编(1984)；Nucleic Acid Hybridization(核酸杂交)，M.L.M.Anderson，Springer(1999)；Animal Cell Culture and Technology(动物细胞培养和技术)，第2版，M.Butler，生物科学出版社(BIOS Scientific Publishers)(2004)；ImmobilizedCells and Enzymes：A Practical Approach(固定化细胞和酶：实用方法)(Practical Approach Series(实用方法丛书))，J.Woodward，IRL出版社(1992)；Transcription And Translation(转录和翻译)，B.D.Hames和S.J.Higgins(编)(1984)；Culture OfAnimal Cells(动物细胞培养)，R.I.Freshney，ARL公司(Alan R.Liss，Inc.)，(1987)；A Practical Guide To Molecular Cloning(分子克隆的实际指导)，第3版，B.Perbal，约翰威利父子公司(John Wiley&Sons Inc.)(1988)；Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells(哺乳动物细胞的基因转移载体)，J.H.Miller和M.P.Calos编，冷泉港实验室(1987)；Methods In Enzymology(酶学方法)，第154和155卷，Wu等(编)；Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology(细胞和分子生物学的免疫化学方法)，Mayer和Walker，(编)，学术出版社(Academic Press)，伦敦(1987)；和Ausubel等，Current Protocols in Molecular Biology(最新分子生物学方法)，约翰威利父子出版社，巴尔的摩，马里兰州(1989)。
实施例1
本实施例描述了通过促进血管生成而能用于治疗缺血性心脏疾病的基因治疗载体。胰岛素样生长因子1是可用于治疗缺血性心脏病的激素(IGF-1，GenBank登录号：NP_001104753.1，SEQ ID NO：20)。IGF-1在临床前模型中的应用与心脏功能、抗凋亡、新血管生成和心肌再生的改进有关(综述见Santini，M.P.等，Novartis Found Symp(诺华基金会论坛).274：228-38(2006)；讨论239-43，272-6；及Saetrum Opgaard，O.和Wang，P.H.Growth Horm IGFRes.15：89-94(2005))。为该目的，给出了对缺血和/或炎症起反应的诱导型IGF-1表达的实例。在缺血性组织中发生的缺氧的条件下，给予配体后表达IGF-1的诱导型表达系统示于图5。
SEQ ID NO：20：
MGKISSLPTQLFKCCFCDFLKVKMHTMSSSHLFYLALCLLTFTSSATAGPETLCGAELVDALQFVCGDRGFYFNKPTGYGSSSRRAPQTGIVDECCFRSCDLRRLEMYCAPLKPAKSARSVRAQRHTDMPKTQKYQPPSTNKNTKSQRRKGSTFEERK
图5所示构建物的完整核苷酸序列示于SEQ ID NO：7。该构建物的特征性元件(salient element)的核苷酸坐标(nucleotide coordinate)见表4。
表4
  标记物   方向   长度   起始   终止
  3′Reg(HSVTKpA)   反向   259   197   455
  Neo   反向   795   462   1256
  SV40早期启动子   反向   278   1446   1723
  3′Reg(SV40pA)   反向   221   1830   2050
  LTF[Gal4(DBD)：EcR(LBD)]   反向   1467   2057   3523
  TL(cMyc ires)   反向   408   3536   3943
  CAP[VP 16(AD)：RXR(HP)]   反向   975   3950   4924
  TSP-1(心脏缺血-诱导型)   反向   578   4958   5535
  FRP[6xGalRE：最小启动子]   正向   189   5946   6134
  胰岛素样生长因子(IGF-1)编码区   正向   477   6348   6824
  3′Reg(hGH PolyA)   正向   627   6897   7523
  复制起点   反向   589   7957   8545
 AmpR   反向  858   8920   9777
 bla启动子   反向  39   9811   9849
根据图1所示基因开关系统构建图5所示载体。在该系统下，利用内部核糖体进入位点(IRES)，通过操作性结合于单治疗开关启动子(TSP-1)表达配体依赖性转录因子复合物(LDTFC)的CAP亚基和LTF亚基。用于该系统中的启动子是UV-同形(UV-conformed)的合成缺氧-诱导型启动子。
治疗产物IGF-1的编码区操作性结合于有配体存在下，接触LDTFC后活化的因子-调节启动子(FRP)。
将图5所示构建物插入合适的载体系统，例如病毒载体以便向需要治疗缺血性心脏病的对象作递送。
可将载体全身性递送给对象，例如通过静脉内输注，或者可直接递送至心脏组织，例如通过血管成形术。全身性和/或局部给予基因治疗载体的方法是本领域熟知的。递送后，细胞，例如心脏细胞摄入载体，转录因子可在合适的生理条件下表达。载体编码的LTF将在，例如心肌缺血相关的缺氧条件下表达。将配体给予待治疗的对象，与表达的LDTFC组合从而在因子调节的启动子控制下驱动IGF-1表达。IGF-1表达进而促进缺血组织中的靶向血管生成。
实施例2
本实施例描述了通过促进血管生成和心脏保护作用而可用于治疗缺血性心血管疾病的生物反应器/细胞治疗载体。给予配体后，图6所示的载体在缺血组织中发生的缺氧条件下表达人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF，GenBank登录号：NP_001997，SEQ ID NO：21)。
SEQ ID NO：21：
MVGVGGGDVEDVTPRPGGCQISGRGARGCNGIPGAAAWEAALPRRRPRRHPSVNPRSRAAGSPRTRGRRTEERPSGSRLGDRGRGRALPGGRLGGRGRGRAPERVGGRGRGRGTAAPRAAPAARGSRPGPAGTMAAGSITTLPALPEDGGSGAFPPGHFKDPKRLYCKNGGFFLRIHPDGRVDGVREKSDPHIKLQLQAEERGVVSIKGVCANRYLAMKEDGRLLASKCVTDECFFFERLESNNYNTYRSRKYTSWYVALKRTGQYKLGSKTGPGQKAILFLPMSAKS
图6所示构建物的完整核苷酸序列示于SEQ ID NO：8。该构建物的特征性元件的核苷酸坐标见表5。
表5
  标记物   方向   长度   起始   终止
  3′Reg(HSVTKpA)   反向   259   318   576
  Neo   反向   795   583   1377
  SV40早期启动子   反向   278   1567   1844
  3′Reg(合成PolyA)   反向   49   1963   2011
  CAP[VP16(AD)：RxR(HP)]   反向   975   2018   2992
  TSP-1(组成型)   反向   571   3026   3596
  3′Reg(SV40pA)   反向   221   3719   3939
  LTF[Gal4(DBD)：EcR(LBD)]   反向   1467   3946   5412
  TSP-2(缺氧-诱导型)   反向   870   5446   6315
  FRP[6x GalRE：最小启动子]   正向   189   6648   6836
  TSPq(bFGF)   正向   867   7050   7916
  3′Reg(hGH PolyA)   正向   627   7989   8615
  复制起点   反向   589   9049   9637
  标记物   方向   长度   起始   终止
  AmpR   反向   858   9882   10739
bla启动子 反向 39 10773 10811
根据图2所示基因开关系统构建图6所示载体。在该系统下，通过操作性结合于第一组成型治疗开关启动子TSP-1表达LDTFC的CAP亚基，通过操作性结合于第二诱导型治疗开关启动子(TSP-2)表达LDTFC的LTF亚基。用于该构建物中的启动子是缺氧-诱导型控制启动子-1。
治疗产物bFGF的编码区操作性结合于有配体存在下，接触LDTFC后活化的FRP。
可在适于引入细胞的载体中制备图6所示构建物，再引入待治疗的对象。细胞可以是取自待治疗对象的自体细胞或非自体的同种异体或异种细胞，可以是原代细胞或培养维持的细胞系。可通过任何标准方法，例如转染、转导、脂质转染或电穿孔将载体引入细胞，从而产生修饰的细胞。引入载体后，可任选处理修饰细胞以产生屏障系统，例如可将细胞包被或包裹化从而提供免疫分离作用。然后可将修饰细胞配制成生物反应器以便给予需要治疗缺血性心脏病的对象。
可将载体全身性递送给对象，例如通过静脉内输注，或者可直接递送至心脏组织，例如通过血管成形术。全身性和/或局部给予细胞治疗的方法是本领域熟知的。递送后，细胞，例如心脏细胞摄入载体，载体编码的LTF将在，例如心肌缺血相关的缺氧条件下表达。将配体给予待治疗的对象，与表达的LDTFC组合从而在FRP控制下驱动bFGF表达。bFGF表达进而促进缺血组织中的靶向血管生成和/或心脏保护作用。
实施例3
本实施例描述了通过促进心脏保护作用而可用于治疗缺血性心血管疾病的生物反应器/细胞治疗载体。给予配体后，图7所示的载体在缺血组织中发生的缺氧条件下表达促红细胞生成素(EPO，GenBank登录号：CAA26095.1，SEQ ID NO：22)。促红细胞生成素显示对缺血起反应而起到心脏保护和抗重塑的作用。
SEQ ID NO：22：
MGVHECPAWLWLLLSLLSLPLGLPVLGAPPRLICDSRVLQRYLLEAKEAENITTGCAEHCSLNENITVPDTKVNFYAWKRMEVGQQAVEVWQGLALLSEAVLRGQALLVNSSQPWEPLQLHVDKAVSGLRSLTTLLRALGAQKEAISPPDAASAAPLRTITADTFRKLFRVYSNFLRGKLKLYTGEACRTGDR
图7所示构建物的完整核苷酸序列示于SEQ ID NO：9。该构建物的特征性元件的核苷酸坐标见表6。
表6
  标记物   方向   长度   起始   终止
  3′Reg(HSVTKpA)   反向   259   318   576
  Neo   反向   795   583   1377
  SV40早期启动子   反向   278   1567   1844
3′Reg(合成PolyA) 反向 49 1963 2011
  CAP[VP16(AD)：RxR(HP)]   反向   975   2018   2992
  TSP-1(组成型)   反向   571   3026   3596
  3′Reg(SV40pA)   反向   221   3719   3939
  LTF[Gal4(DBD)：EcR(LBD)]   反向   1467   3946   5412
  TSP2(缺氧-诱导型)   反向   870   5446   6315
  FRP(6x GalRE：最小启动子)   正向   189   6648   6836
  TSPQ(Epo)   正向   582   7050   7631
  3′Reg(hGH PolyA)   正向   627   7704   8330
  复制起点   反向   589   8764   9352
  AmpR   反向   858   9597   10454
  bla启动子   反向   39   10488   10526
根据图2所示基因开关系统构建图7所示载体。在该系统下，通过操作性结合于第一组成型治疗开关启动子(TSP-1)表达LDTFC的CAP亚基，通过操作性结合于第二诱导型治疗开关启动子(TSP-2)表达LDTFC的LTF亚基。用于该载体中的启动子是缺氧-诱导型控制启动子-1。
治疗产物EPO的编码区操作性结合于有配体存在下，接触LDTFC后活化的FRP。
可在适于引入细胞的载体中制备图7所示构建物，再引入待治疗的对象。细胞可以是取自待治疗对象的自体细胞或非自体的同种异体或异种细胞，可以是原代细胞或培养维持的细胞系。可通过任何标准方法，例如转染、转导、脂质转染或电穿孔将载体引入细胞，从而产生修饰的细胞。引入载体后，可任选处理修饰细胞以产生屏障系统，例如可将细胞包被或包裹化从而提供免疫分离作用。然后可将修饰细胞配制成生物反应器以便给予需要治疗缺血性心脏病的对象。
可将载体全身性递送给对象，例如通过静脉内输注，或者可直接递送至心脏组织，例如通过血管成形术。全身性和/或局部给予细胞治疗的方法是本领域熟知的。递送后，细胞，例如心脏细胞摄入载体，载体编码的LTF将在，例如心肌缺血相关的缺氧条件下表达。将配体给予待治疗的对象，与表达的LDTFC组合从而在FRP控制下驱动EPO表达。EPO表达进而促进缺血组织中的心脏保护作用。
    实施例4
本实施例描述了通过促进血管生成和血液动力学而可用于治疗缺血性心血管疾病的生物反应器/细胞治疗载体。给予配体后，图8所示载体在缺血组织中发生的缺氧条件下表达人脑钠素(BNP，GenBank登录号：NP 002512，SEQID NO：23)。BNP以及其它利钠肽，例如松弛素、ANF、CNP和肾上腺调控蛋白(adrenomodulin)显示在心脏中起到心脏保护、血管舒张和抗重塑作用。为该目的，给出了对缺血起反应的BNP诱导型表达的实例。
SEQ ID NO：23：
MDPQTAPSRALLLLLFLHLAFLGGRSHPLGSPGSASDLETSGLQEQRNHLQGKLSELQVEQTSLEPLQESPRPTGVWKSREVATEGIRGHRKMVLYTLRAPRSPKMVQGSGCFGRKMDRISSSSGLGCKVLRRH
图8所示构建物的完整核苷酸序列示于SEQ ID NO：10。该构建物的特征性元件的核苷酸坐标见表7。
表7
  标记物   方向   长度   起始   终止
  3′Reg(HSVTKpA)   反向   259   318   576
  Neo   反向   795   583   1377
  SV40早期启动子   反向   278   1567   1844
  3′Reg(合成PolyA)   反向   49   1963   2011
  CAP[VP16(AD)：RxR(HP)]   反向   975   2018   2992
  TSP-1(组成型)   反向   571   3026   3596
  3′Reg(SV40pA)   反向   221   3719   3939
  LTF[GAL4(DBD)：EcR(LBD)]   反向   1467   3946   5412
  TSP-2(缺氧-诱导型)   反向   870   5446   6315
  FRP(6x GalRE：最小启动子)   正向   189   6648   6836
  标记物   方向   长度   起始   终止
  TSPQ(BNP)   正向   405   7050   7454
  3′Reg(hGH PolyA)   正向   627   7527   8153
  复制起点   反向   589   8587   9175
  AmpR   反向   858   9420   10277
  bla启动子   反向   39   10311   10349
根据图2所示基因开关系统构建图8所示载体。在该系统下，通过操作性结合于第一组成型治疗开关启动子(TSP-1)表达LDTFC的CAP亚基，通过操作性结合于第二诱导型治疗开关启动子(TSP-2)表达LDTFC的LTF亚基。用于该载体中的诱导型启动子是缺氧-诱导型控制启动子-1。
治疗产物BNP的编码区操作性结合于有配体存在下，接触LDTFC后活化的FRP。
可在适于引入细胞的载体中制备图8所示构建物，再引入待治疗的对象。细胞可以是取自待治疗对象的自体细胞或非自体的同种异体或异种细胞，可以是原代细胞或培养维持的细胞系。可通过任何标准方法，例如转染、转导、脂质转染或电穿孔将载体引入细胞，从而产生修饰的细胞。引入载体后，可任选处理修饰细胞以产生屏障系统，例如可将细胞包被或包裹化从而提供免疫分离作用。然后可将修饰细胞配制成生物反应器以便给予需要治疗缺血性心脏病的对象。
可将载体全身性递送给对象，例如通过静脉内输注，或者可直接递送至心脏组织，例如通过血管成形术。全身性和/或局部给予细胞治疗的方法是本领域熟知的。递送后，细胞，例如心脏细胞摄入载体，载体编码的LTF将在，例如心肌缺血相关的缺氧条件下表达。将配体给予待治疗的对象，与表达的LDTFC组合从而在FRP控制下驱动BNP表达。BNP表达进而促进缺血组织中的靶向心脏保护作用、舒张和抗重塑。
实施例5
本实施例描述了通过分解心脏中的纤维蛋白沉积而可用于治疗缺血性心血管疾病的生物反应器/细胞治疗载体。给予配体后，图9所示载体在缺血组织中发生的炎性条件下表达人组织纤维蛋白溶酶原激活剂(tPA，GenBank登录号：AAO34406，SEQ ID NO：24)。组织纤维蛋白溶酶原激活剂是催化纤维蛋白溶酶原成为降解纤维蛋白的活化纤溶酶的丝氨酸蛋白酶。利用重组tPA显示可作为有效的溶解血栓剂以便在诸如肺部栓塞、心肌梗塞和中风等疾病中分解纤维蛋白凝块。除了形成凝块，过量的纤维蛋白沉积在心脏和血管中还与胰岛素耐受性糖尿病、动脉粥样硬化和对炎症起反应的心肌梗塞相关。为该目的，给出了对缺血起反应的tPA诱导型表达的实例。
SEQ ID NO：24：
MDAMKRGLCCVLLLCGAVFVSPSQEIHARFRRGARSYQVICRDEKTQMIYQQHQSWLRPVLRSNRVEYCWCNSGRAQCHSVPVKSCSEPRCFNGGTCQQALYFSDFVCQCPEGFAGKCCEIDTRATCYEDQGISYRGTWSTAESGAECTNWNSSALAQKPYSGRRPDAIRLGLGNHNYCRNPDRDSKPWCYVFKAGKYSSEFCSTPACSEGNSDCYFGNGSAYRGTHSLTESGASCLPWNSMILIGNVYTAQNPSAQALGLGKHNYCRNPDGDAKPWCHVLKNRRLTWEYCDVPSCSTCGLRQYSQPQFRIKGGLFADIASHPWQAAIFAKHRRSPGERFLCGGILISSCWILSAAHCFQERFPPHHLTVILGRTYRVVPGEEEQKFEVEKYIVHKEFDDDTYDNDIALLQLKSDSSRCAQESSVVRTVCLPPADLQLPDWTECELSGYGKHEALSPFYSERLKEAHVRLYPSSRCTSQHLLNRTVTDNMLCAGDTRSGGPQANLHDACQGDSGGPLVCLNDGRMTLVGIISWGLGCGQKDVPGVYTKVTNYLDWIRDNMRP
图9所示构建物的完整核苷酸序列示于SEQ ID NO：11。该构建物的特征性元件的核苷酸坐标见表8。
表9
  标记物   方向   长度   起始   终止
  3′Reg(HSVTKpA)   反向   259   318   576
  Neo   反向   795   583   1377
  SV40早期启动子   反向   278   1567   1844
  3′Reg(合成PolyA)   反向   49   1963   2011
  CAP[VP16(AD)：RxR(HP)]   反向   975   2018   2992
  TSP-1(组成型)   反向   571   3026   3596
  3′Reg(SV40pA)   反向   221   3719   3939
  LTF[GAL4(DBD)：EcR(LBD)]   反向   1467   3946   5412
  TSP-2(缺氧诱导型)   反向   770   5446   6215
  FRP[6xGalRE：最小启动子]   正向   189   6548   6736
  TPSQ(瑞替普酶，tPA)   正向   1689   6950   8638
  3′Reg(hGH PolyA)   正向   627   8711   9337
  复制起点   反向   589   9771   10359
  AmpR   反向   858   10604   11461
bla启动子 反向 39 11495 11533
根据图2所示基因开关系统构建图9所示载体。在该系统下，通过操作性结合于第一组成型治疗开关启动子(TSP-1)表达LDTFC的CAP亚基，通过操作性结合于第二诱导型治疗开关启动子(TSP-2)表达LDTFC的LTF亚基。用于该载体中的诱导型治疗开关启动子是人丛蛋白D1启动子。
治疗产物tPA的编码区操作性结合于有配体存在下，接触LDTFC后活化的FRP。
可在适于引入细胞的载体中制备图9所示构建物，再引入待治疗的对象。细胞可以是取自待治疗对象的自体细胞或非自体的同种异体或异种细胞，可以是原代细胞或培养维持的细胞系。可通过任何标准方法，例如转染、转导、脂质转染或电穿孔将载体引入细胞，从而产生修饰的细胞。引入载体后，可任选处理修饰细胞以产生屏障系统，例如可将细胞包被或包裹化从而提供免疫分离作用。然后可将修饰细胞配制成生物反应器以便给予需要治疗缺血性心脏病的对象。
可将载体全身性递送给对象，例如通过静脉内输注，或者可直接递送至心脏组织，例如通过血管成形术。全身性和/或局部给予细胞治疗的方法是本领域熟知的。递送后，细胞，例如心脏细胞摄入载体，载体编码的LTF将在，例如心肌缺血相关的炎性反应事件中表达。将配体给予待治疗的对象，与表达的LDTFC组合从而在FRP控制下驱动tPA表达。tPA表达进而促进缺血组织中纤维蛋白沉积的靶向分解。
    实施例6
本实施例描述了通过促进心脏保护作用、血管生成和血液动力学而可用于治疗缺血性心血管疾病的生物反应器/细胞治疗载体。给予配体后，图10所示载体分别在缺血组织中发生的炎性条件和/或缺氧条件下表达两种治疗多肽，人松弛素(GenBank登录号：NP_604390.1，SEQ ID NO：25)和人肝细胞生长因子(HGF，GenBank登录号：NP_000592.3，SEQ ID NO：26)。松弛素是涉及氧化氮作用机理的全身和冠状循环的强效舒张剂，其影响心脏搏动率。HGF在心肌梗塞中提供促血管生成作用、抗-凋亡作用、抗-纤维变性作用，并且是I型胶原再生因子。为该目的，给出了对缺血起反应的松弛素和HGF的各自受控诱导型表达的实例。
SEQ ID NO：25：
MPRLFFFHLLGVCLLLNQFSRAVADSWMEEVIKLCGRELVRAQIAICGMSTWSKRSLSQEDAPQTPRPVAEIVPSFINKDTETINMMSEFVANLPQELKLTLSEMQPALPQLQQHVPVLKDSSLLFEEFKKLIRNRQSEAADSSPSELKYLGLDTHSRKKRQLYSALANKCCHVGCTKRSLARFC
SEQ ID NO：26：
MWVTKLLPALLLQHVLLHLLLLPIAIPYAEGQRKRRNTIHEFKKSAKTTLIKIDPALKIKTKKVNTADQCANRCTRNKGLPFTCKAFVFDKARKQCLWFPFNSMSSGVKKEFGHEFDLYENKDYIRNCIIGKGRSYKGTVSITKSGIKCQPWSSMIPHEHSFLPSSYRGKDLQENYCRNPRGEEGGPWCFTSNPEVRYEVCDIPQCSEVECMTCNGESYRGLMDHTESGKICQRWDHQTPHRHKFLPERYPDKGFDDNYCRNPDGQPRPWCYTLDPHTRWEYCAIKTCADNTMNDTDVPLETTECIQGQGEGYRGTVNTIWNGIPCQRWDSQYPHEHDMTPENFKCKDLRENYCRNPDGSESPWCFTTDPNIRVGYCSQIPNCDMSHGQDCYRGNGKNYMGNLSQTRSGLTCSMWDKNMEDLHRHIFWEPDASKLNENYCRNPDDDAHGPWCYTGNPLIPWDYCPISRCEGDTTPTIVNLDHPVISCAKTKQLRVVNGIPTRTNIGWMVSLRYRNKHICGGSLIKESWVLTARQCFPSRDLKDYEAWLGIHDVHGRGDEKCKQVLNVSQLVYGPEGSDLVLMKLARPAVLDDFVSTIDLPNYGCTIPEKTSCSVYGWGYTGLINYDGLLRVAHLYIMGNEKCSQHHRGKVTLNESEICAGAEKIGSGPCEGDYGGPLVCEQHKMRMVLGVIVPGRGCAIPNRPGIFVRVAYYAKWIHKIILTYKVPQS
图10所示构建物的完整核苷酸序列示于SEQ ID NO：13。该构建物的特征性元件的核苷酸坐标见表9。
表9
 标记物   方向   长度   起始   终止
 3′Reg(HSVTKpA)   反向   259   197   455
  NEO   反向   804   462   1265
  SV40e启动子   反向   280   1385   1664
  3′Reg(合成PolyA)   反向   49   1782   1830
  CAP[VP16(AD)：RxR(HP)]   反向   975   1837   2811
  TSP-1(遍在的)   反向   571   2845   3415
  3′Reg(SV40pA)   反向   221   3538   3758
  LTF-1[EcR(LBD)：Gal4(DBD)]   反向   1467   3765   5231
  TSP-2(炎性诱导型)   反向   770   5265   6034
  FRP-1[6x GalRE：最小启动子]   正向   189   6405   6593
  TPSQ-1(松弛素)   正向   558   6807   7364
  3′Reg(hGH PolyA)   正向   627   7437   8063
  FRP-2[8X LexA RE：最小启动子]   正向   216   8437   8652
  TPSQ-2(HGF)   正向   2187   8866   11052
  3′Reg(SV40早期pA)   正向   135   11112   11246
  TSP-3(缺氧-诱导型)   正向   870   11478   12347
  LTF-2[LexA(DBD)CfEcR-DEF(LBD)]   正向   1629   12381   14009
  EcR-LBD(DEF)   正向   1014   12996   14009
  3′Reg(人S100CABP)   正向   765   14016   14780
  复制起点   反向   589   15114   15702
 标记物   方向   长度   起始   终止
  AmpR   反向   858   16038   16895
  bla启动子   反向   39   16929   16967
根据图3所示基因开关系统构建图10所示载体。在该系统下，通过操作性结合于第一组成型治疗开关启动子(TSP-1)表达LDTFC的CAP亚基，通过操作性结合于第二诱导型治疗开关启动子(TSP-2)表达第一LTF(LTF-1)亚基，通过操作性结合于第三诱导型治疗开关启动子(TSP-3)表达第二LTF(LTF-2)亚基。该载体中的TSP-2是人丛蛋白D1启动子，该载体中的TSP-3是缺氧诱导型控制启动子。
第一治疗产物松弛素的编码区操作性结合于具有反应元件的第一FRP(FRP-1)，该反应元件识别LTF-1的第一DNA结合结构域DBD-A，第二治疗产物HGF的编码区操作性结合于具有反应元件的第二FRP(FRP-2)，该反应元件识别LTF-2的第二DNA结合结构域(DBD-B)。有配体存在下，接触各自的LDTFC后，两种FRP激活。
可在适于引入细胞的载体中制备图10所示构建物，再引入待治疗的对象。细胞可以是取自待治疗对象的自体细胞或非自体的同种异体或异种细胞，可以是原代细胞或培养维持的细胞系。可通过任何标准方法，例如转染、转导、脂质转染或电穿孔将载体引入细胞，从而产生修饰的细胞。引入载体后，可任选处理修饰细胞以产生屏障系统，例如可将细胞包被或包裹化从而提供免疫分离作用。然后可将修饰细胞配制成生物反应器以便给予需要治疗缺血性心脏病的对象。
可将载体全身性递送给对象，例如通过静脉内输注，或者可直接递送至心脏组织，例如通过血管成形术。全身性和/或局部给予细胞治疗的方法是本领域熟知的。递送后，细胞，例如心脏细胞摄入载体，LTF-1和/或LTF-2将在，例如心肌缺血相关的炎性反应和/或缺氧事件中表达。将一种或多种配体给予待治疗的对象，与表达的LDTFC组合从而在FRP控制下驱动松弛素和/或HGF表达。
实施例7
本实施例描述了通过促进心脏修复和保护作用而可用于治疗缺血性心血管疾病的生物反应器/细胞治疗载体。给予配体后，图11所示载体在缺血组织中发生的缺氧条件下表达人EPO(参见实施例3)。EPO显示对缺血起反应而在心脏保护和抗重塑中起作用。在本实施例中，EPO表达专门局限于心脏组织。
根据图2所示基因开关系统构建图11所示载体。在该系统下，通过操作性结合于心脏组织的特异性启动子(Nxc1心肌细胞-特异性启动子)表达CAP亚基，通过操作性结合于缺氧-诱导型控制启动子-1表达LTF亚基。
治疗产物EPO的编码区操作性结合于有配体存在下，接触LDTFC后活化的FRP。
图11所示构建物的完整核苷酸序列示于SEQ ID NO：12。该构建物的特征性元件的核苷酸坐标见表10。
表10
  标记物   方向   长度   起始   终止
  3′Reg(HSVTKpA)   反向   259   318   576
  Neo   反向   795   583   1377
  SV40早期启动子   反向   278   1567   1844
  3′Reg(合成PolyA)   反向   49   1963   2011
  CAP[VP16(AD)：RxR(HP)]   反向   975   2018   2992
  TSP-1(心脏特异性)   反向   240   3026   3265
  3′Reg(SV40pA)   反向   221   3388   3608
  LTF[Gal4(DBD)：EcR(LBD)]   反向   1467   3615   5081
  TSP-2(缺血，诱导型)   反向   870   5115   5984
  FRP[6x GalRE：最小启动子]   正向   189   6317   6505
  TPSQ(Epo)   正向   582   6719   7300
  3′Reg(hGH PolyA)   正向   627   7373   7999
  复制起点   反向   589   8433   9021
  AmpR   反向   858   9266   10123
  bla启动子   反向   39   10157   10195
将图11所示构建物插入合适载体系统，例如病毒载体以便递送给需要治疗缺血性心脏病的对象。
可将载体全身性递送给对象，例如通过静脉内输注，或者可直接递送至心脏组织，例如通过血管成形术。全身性和/或局部给予基因治疗载体的方法是本领域熟知的。递送后，细胞，例如心脏细胞摄入载体，LDTFC可在合适的生理条件下表达。载体编码的LDTFC将在，例如心肌缺血相关的缺氧条件下，在心肌细胞中特异性表达。将配体给予待治疗的对象，与表达的LDTFC组合从而在FRP控制下驱动EPO表达。EPO表达进而促进缺血组织中的靶向心脏保护。
实施例8
本实施例描述了通过促进心脏修复和血管生成而可用于治疗缺血性心脏疾病的基因治疗载体。给予配体后，图12所示载体在缺血组织中发生的缺氧条件下，在炎性反应中表达人IGF-1(参见实施例1)。为该目的，给出了对缺氧起反应和/或在炎性反应中的诱导型IGF-1表达的实例。在本实施例中，IGF-1的诱导型表达专门局限于心肌细胞。
根据图4所示基因开关系统构建图12所示载体。在该系统下，通过操作性结合于心脏组织的特异性启动子(Nxc1心肌细胞-特异性启动子)表达CAP亚基，通过两个诱导型TSP之一表达LDTFC的LTF亚基(LTF-1和LTF-2)，其中第一个操作性结合于缺氧-诱导型控制启动子-1，而第二个操作性结合于人丛蛋白D1启动子。
治疗产物IGF-1的编码区操作性结合于有配体存在下，接触LDTFC后活化的FRP。
图12所示构建物的完整核苷酸序列示于SEQ ID NO：14。该构建物的特征性元件的核苷酸坐标见表11。
表11
  标记物   方向   长度   起始   终止
  3′Reg(HSVTKpA)   反向   259   318   576
  Neo   反向   795   583   1377
  SV40早期启动子   反向   278   1567   1844
  3′Reg(合成PolyA)   反向   49   1963   2011
  CAP[VP 16(AD)：RxR(HP)]   反向   975   2018   2992
  反式激活域   反向   261   2732   2992
  TSP-1(心脏-特异性)   反向   240   3026   3265
  3′Reg(SV40pA)   反向   221   3388   3608
  LTF-1[Gal4(DBD)：EcR(LBD)]   反向   1467   3615   5081
  TSP-2(缺氧-诱导型)   反向   870   5115   5984
  FRP[6xGalRE：最小启动子]   正向   189   6317   6505
  最小启动子   正向   60   6446   6505
  TPSQ(IGF-1)   正向   477   6719   7195
  3′Reg(hGH PolyA)   正向   627   7268   7894
  标记物   方向   长度   起始   终止
  TSP-3(炎性诱导型)   正向   770   8040   8809
  LTF-2[Gal42(DBD)：EcR(LBD)]   正向   1467   8843   10309
  CfEcR-LBD(2)   正向   1014   9296   10309
  3′Reg(人S100钙结合蛋白pA)   正向   765   10316   11080
  复制起点   反向   589   11414   12002
  AmpR   反向  858  12247  13104
  bla启动子   反向  39  13138  13176
将图12所示构建物插入合适载体系统，例如病毒载体以便递送给需要治疗缺血性心脏病的对象。
可将载体全身性递送给对象，例如通过静脉内输注，或者可直接递送至心脏组织，例如通过血管成形术。全身性和/或局部给予基因治疗载体的方法是本领域熟知的。递送后，细胞，例如心脏细胞摄入载体，LDTFC可在合适的生理条件下表达。载体编码的LDTFC将在缺氧条件下，和/或在，例如心肌缺血相关的炎性反应事件中，在心肌细胞中特异性表达。将配体给予待治疗的对象，与表达的转录因子组合从而在FRP控制下驱动IGF-1表达。IGF-1表达进而促进缺血组织中的靶向血管生成。
实施例9
本实施例描述了可用于治疗类风湿性关节炎、活动性强直性脊柱炎或斑块状银屑病或用于抑制活动性关节炎所致结构破坏(“RA或相关疾病”)的基因治疗载体。RA及相关疾病的常规治疗包括传统的疾病改进性抗-风湿病药物(DMARD)以及生物DMARD，例如依那西普、英夫利昔单抗和阿达木单抗。例如，安进公司生产的依那西普
Figure GPA00001141248201061
是融合蛋白，其含有的人TNF-α受体2的两个胞外结构域通过绞链肽与Fc部分相融合。参见美国专利号7,276,477(通过引用全文纳入本文)。依那西普皮下一周给予一次或两次。因此，由于没有TNF激活存在下依那西普的任何产生受限制，利用炎性或细胞因子反应元件的依那西普基因开关系统可用于增加便利性和安全性。
图13所示构建物的完整核苷酸序列示于SEQ ID NO：16。该构建物的特征性元件的核苷酸坐标见表12。
表12
  标记物   方向   长度   起始   终止
  3′Reg(HSVTKpA)   反向   259   197   455
  Neo   反向   795   462   1256
  SV40早期启动子   反向   278   1446   1723
  3′Reg(SV40pA)   反向   221   1830   2050
  LTF[GAL4(DBD)：EcR(LBD)]   反向   1467   2057   3523
  TL(cMyc ires)   反向   408   3536   3943
  CAP[VP 16(AD)：RxR(HP)]   反向   975   3950   4924
  TSP-1(TNF-反应性炎性诱导型)   反向   800   4958   5757
  FRP[6x GalRE：最小启动子]   正向   189   6168   6356
  TPSQ(依那西普)   正向   1407   6570   7976
  3′Reg(hGH PolyA)   正向   627   8049   8675
  复制起点   反向   589   9109   9697
  AmpR   反向   858   10072   10929
  bla启动子   反向   39   10963   11001
根据图1所示基因开关系统构建图13所示载体。在该系统下，通过操作性结合于单TSP-1，利用内部核糖体进入位点(IRES)表达LDTFC的CAP亚基和LTF亚基。该系统所用的启动子是有TNF-α激活的血管细胞粘附分子(VCAM1)启动子。可用于本发明的TNF-α调节启动子的另一例子是对TNF-α或白介素(IL)-1β起反应的人正五聚蛋白3(PTX3)启动子。参见Basile等，J.Biol.Chem.272(13)：8172(1997)。
治疗产物依那西普的编码区操作性结合于有配体存在下，接触LDTFC后活化的FRP。
可在适于引入细胞的载体中制备图13所示构建物，再引入待治疗的对象。细胞可以是取自待治疗对象的自体细胞或非自体的同种异体或异种细胞，可以是原代细胞或培养维持的细胞系。可通过任何标准方法，例如转染、转导、脂质转染或电穿孔将载体引入细胞，从而产生修饰的细胞。引入载体后，可任选处理修饰细胞以产生屏障系统，例如可将细胞包被或包裹化从而提供免疫分离作用。然后可将修饰细胞配制成生物反应器以便给予需要治疗RA的对象。
可将细胞全身性递送给对象，例如通过静脉内输注，或者可直接递送至关节。全身性和/或局部给予基因治疗细胞是本领域熟知的。细胞递送后，LDTFC可在合适的生理条件下表达。载体编码的LDTFC将在，例如RA相关的TNF-α存在下表达。将配体给予待治疗的对象，与表达的LDTFC组合从而在TNF-α调节启动子控制下驱动依那西普表达。依那西普表达进而捕捉TNF-α并降低组织中的TNF-α浓度。
实施例10
本实施例描述了通过降低TNF-α水平而可用于治疗RA和相关疾病的生物反应器/细胞治疗载体。给予配体后，图14所示载体在RA或相关疾病中均发生的TNF-α和/或严重炎症存在下表达依那西普。为该目的，给出了对TNF-α起反应和/或在炎性反应中的诱导型依那西普表达的实例。
根据图4所示基因开关系统构建图14所示载体。在该系统下，通过操作性结合于组成型启动子(TSP-1)表达CAP亚基，通过两个诱导型转录盒之一表达LDTFC的LTF亚基，通过操作性结合于人纤维蛋白溶酶原激活剂抑制剂2-型(PAI2)启动子(TSP-2)表达第一(LTF-1)，通过操作性结合于人血清淀粉样蛋白A1(SAA1)启动子(TSP-3)表达第二(LTF-2)。人PAI2启动子在有TNF-α存在下激活。参见Mahony等，Eur.J.Biochem.263(3)(1999)和Matsuo等，Biochem.J.405：605(2007)。SAA1启动子不由致炎细胞因子，例如TNF-α，而由其它急性炎性信号，例如糖皮质激素直接上调。参见Kumon等，Scandinavian J.Immunol.56：504(2002)。
治疗产物依那西普的编码区操作性结合于有配体存在下，接触LDTFC后活化的FRP。
图14所示构建物的完整核苷酸序列示于SEQ ID NO：15。该构建物的特征性元件的核苷酸坐标见表13。
表13
  标记物   方向   长度   起始   终止
  3′Reg(HSVTKpA)   反向   259   318   576
  Neo   反向   795   583   1377
  SV40早期启动子   反向   278   1567   1844
  3′Reg(合成PolyA)   反向   49   1963   2011
  CAP[VP 16(AD)：RxR(HP)]   反向   975   2018   2992
  反式激活域   反向   261   2732   2992
  TSP-1(组成型)   反向   571   3026   3596
  3′Reg(SV40pA)   反向   221   3719   3939
  标记物   方向   长度   起始   终止
  LTF-1[Gal4(DBD)：EcR(LBD)]   反向   1467   3946   5412
  TSP-2(TNF-反应性炎性诱导型)   反向   252   5446   5697
  FRP[6x GalRE：最小启动子]   正向   189   6030   6218
  TPSQ(依那西普)   正向   1407   6432   7838
  3′Reg(hGH PolyA)   正向   627   7911   8537
  TSP-3(炎性诱导型)   正向   253   8683   8935
  LTF-2(Gal4(DBD)：CfEcR(LBD))   正向   1467   8969   10435
  EcRLBD(2)   正向   1014   9422   10435
  3′Reg(人S100CABP)   正向   765   10442   11206
  复制起点   反向   589   11540   12128
  AmpR   反向   858   12373   13230
  bla启动子   反向   39   13264   13302
可在适于引入细胞的载体中制备图14所示构建物，再引入待治疗的对象。细胞可以是取自待治疗对象的自体细胞或非自体的同种异体或异种细胞，可以是原代细胞或培养维持的细胞系。可通过任何标准方法，例如转染、转导、脂质转染或电穿孔将载体引入细胞，从而产生修饰的细胞。引入载体后，可任选处理修饰细胞以产生屏障系统，例如可将细胞包被或包裹化从而提供免疫分离作用。然后可将修饰细胞配制成生物反应器以便给予需要治疗RA的对象。
可将细胞全身性递送给对象，例如通过静脉内输注，或者可直接递送至关节。全身性和/或局部给予基因治疗细胞的方法是本领域熟知的。细胞递送后，LDTFC可在合适的生理条件下表达。载体编码的LDTFC将在TNF-α和/或严重炎症存在下专门在给予的细胞中表达。将配体给予待治疗的对象，与表达的LDTFC组合从而在FRP控制下驱动依那西普表达。依那西普表达进而捕捉TNF-α并降低组织中的TNF-α浓度。
实施例11
本实施例描述了可用于治疗RA的生物反应器/细胞治疗载体。给予配体后，载体在RA患者中均发生的TNF-α和/或炎性条件存在下表达两种治疗多肽，依那西普和人促红细胞生成素(EPO)。EPO在贫血RA患者中诱导红细胞生成。参见Mercuriali等.Transfusion 34(6)：501(2003)。为该目的，给出了对RA和贫血起反应的依那西普和EPO的分别受控诱导型表达的实例。
图15所示构建物的完整核苷酸序列示于SEQ ID NO：17。该构建物的特征性元件的核苷酸坐标见表14。
表14
  标记物   方向   长度   起始   终止
  3′Reg(HSVTKpA)   反向   259   197   455
  NEO   反向   804   462   1265
  SV40e启动子   反向   280   1385   1664
  3′Reg(合成PolyA)   反向   49   1782   1830
  CAP[VP 16(AD)：RxR(HP)]   反向   975   1837   2811
  TSP-1(组成型)   反向   571   2845   3415
  3′Reg(SV40pA)   反向   221   3538   3758
  LTF-1[Gal4(DBD)：EcR(LBD)]   反向   1467   3765   5231
  TSP-2(炎性-诱导型)   反向   253   5265   5517
  FRP-1[6x GalRE：最小启动子]   正向   189   5888   6076
  TPSQ-1(依那西普)   正向   1407   6290   7696
  3′Reg(hGH PolyA)   正向   627   7769   8395
  FRP-2[8X LexA：最小启动子]   正向   216   8769   8984
  TPSQ-2(Epo)   正向   582   9198   9779
  3′Reg(SV40早期pA)   正向   135   9839   9973
  TSP-3(缺氧-诱导型)   正向   870   10205   11074
  LTF2[LexA(DBD)：CfEcR-DEF(LBD)]   正向   1629   11108   12736
  3′Reg(人S100钙结合蛋白pA)   正向   765   12743   13507
  复制起点   反向   589   13841   14429
  标记物   方向   长度   起始   终止
  AmpR   反向   858   14765   15622
  bla启动子   反向   39   15656   15694
根据图3所示基因开关系统构建图15所示载体。在该系统下，通过操作性结合于第一组成型TSP-1表达LDTFC的CAP亚基，通过操作性结合于第二诱导型TSP-2表达LDTFC的第一LTF亚基(LTF-1)，通过操作性结合于第三诱导型TSP-3表达LDTFC的第二LTF亚基(LTF-2)。该载体中所用的第二诱导型TSP-2是人血清淀粉样蛋白A1(SAA1)启动子，该载体中所用的第三诱导型TSP-3是缺氧-诱导型控制启动子1。
第一治疗产物依那西普的编码区操作性结合于具有反应元件的第一FRP-1，该反应元件识别LTF-1结合的第一DNA结合结构域(DBD-A)，第二治疗产物EPO的编码区操作性结合于具有反应元件的第二FRP-2，该反应元件识别LTF-2结合的第二DNA结合结构域(DBD-B)。有配体存在下，接触各自的LDTFC后，两种因子-调节的启动子均激活。
可在适于引入细胞的载体中制备图15所示构建物，再引入待治疗的对象。细胞可以是取自待治疗对象的自体细胞或非自体的同种异体或异种细胞，可以是原代细胞或培养维持的细胞系。可通过任何标准方法，例如转染、转导、脂质转染或电穿孔将载体引入细胞，从而产生修饰的细胞。引入载体后，可任选处理修饰细胞以产生屏障系统，例如可将细胞包被或包裹化从而提供免疫分离作用。然后可将修饰细胞配制成生物反应器以便给予需要治疗RA的对象。
可将细胞全身性递送给对象，例如通过静脉内输注，或者可直接递送至关节。全身性和/或局部给予基因治疗细胞的方法是本领域熟知的。细胞递送后，LDTFC可在合适的条件下表达。将一种或多种配体给予待治疗的对象，与表达的LDTFC组合从而在FRP-1或FRP-2控制下驱动依那西普和/或EPO表达。依那西普表达进而捕捉TNF-α并降低组织中的TNF-α浓度，EPO表达诱导红细胞生成和改进贫血。
实施例12
本实施例描述了可用于治疗血友病的生物反应器/细胞治疗载体。血友病是缺乏因子VIII或因子IX所致。因子VIII缺陷型成为A型血友病，因子IX缺陷型成为B型血友病。可分别给予重组产生的因子VIII或IX来治疗A或B型血友病。参见Garcia-Martin等，J.Gene Med.4(2)：215(2002)。例如，可用于本发明的重组产生的因子VIII包括但不限于：全长因子VIII，例如(由巴克斯特公司(Baxter)投入市场)、
Figure GPA00001141248201112
(由阿方蒂斯公司(Aventis)投入市场)、
Figure GPA00001141248201113
(由拜耳公司(Bayer)投入市场)、
Figure GPA00001141248201114
(由阿方蒂斯公司投入市场)或
Figure GPA00001141248201115
(由巴克斯特公司投入市场)，B-结构域缺失的因子VIII，例如
Figure GPA00001141248201116
和
Figure GPA00001141248201117
(由遗传学研究所(Genetics Institute)和惠氏公司(Wyeth)投入市场)，或因子VIII和血管假性血友病因子复合物，例如
Figure GPA00001141248201121
(由格利弗生物公司公司(GrifolsBiologicals，Inc.)投入市场)。为该目的，图16显示了对给予配体起反应的诱导型
Figure GPA00001141248201122
表达以供生物反应器/细胞治疗的例子。利用生物反应器/细胞治疗改善了稳定性和连续输注的问题。参见Pipe S.W.，J.Thromb.Haemost.3(8)：1692(2005)。
图16所示构建物的完整核苷酸序列示于SEQ ID NO：18。该构建物的特征性元件的核苷酸坐标见表15。
表15
  标记物   方向   长度   起始   终止
  3′Reg(HSVTKpA)   反向   259   318   576
  Neo   反向   795   583   1377
  3′Reg(SV40早期启动子)   反向   278   1567   1844
  3′Reg(合成PolyA)   反向   49   1963   2011
  CAP[VP 16(AD)：RxR(HP)]   反向   975   2018   2992
  TSP-1(组成型)   反向   571   3026   3596
  3′Reg(SV40pA)   反向   221   3719   3939
  LTF[Gal4(DBD)：EcR(LBD)]   反向   1467   3946   5412
  TSP-2(组成型)   反向   1417   5446   6862
  FRP[6xGalRE：最小启动子]   正向   189   7195   7383
  TSPQ(人因子VIII)   正向   7002   7597   14598
  3′Reg(hGH PolyA)   正向   627   14671   15297
  复制起点   反向   589   15731   16319
  AmpR   反向   858   16564   17421
  bla启动子   反向   39   17455   17493
根据图2所示基因开关系统构建图16所示载体。在该系统下，通过操作性结合于第一组成型启动子(TSP-1)表达CAP亚基，通过操作性结合于第二组成型启动子(TSP-2)表达LDTFC的LTF亚基。用作第一组成型启动子的启动子是UbC(短)启动子，用作第二组成型启动子的启动子是UbB(短)启动子。
治疗产物，
Figure GPA00001141248201123
的编码区操作性结合于有配体存在下，接触LDTFC后活化的FRP。
可在适于引入细胞的载体中制备图16所示构建物，再引入待治疗的对象。细胞可以是取自待治疗对象的自体细胞或非自体的同种异体或异种细胞，可以是原代细胞或培养维持的细胞系。可通过任何标准方法，例如转染、转导、脂质转染或电穿孔将载体引入细胞，从而产生修饰的细胞。引入载体后，可任选处理修饰细胞以产生屏障系统，例如可将细胞包被或包裹化从而提供免疫分离作用。然后可将修饰细胞配制成生物反应器以便给予需要治疗血友病的对象。
可将细胞全身性递送给对象，例如通过静脉内输注。全身性和/或局部给予基因治疗细胞是本领域熟知的。细胞递送后，LDTFC可组成型表达。将配体给予待治疗的对象，与表达的LDTFC组合从而在因子调节的启动子控制下驱动
Figure GPA00001141248201131
表达。
Figure GPA00001141248201132
表达进而治疗血友病症状。
实施例13
本实施例描述了用于治疗血友病的生物反应器/细胞治疗载体。根据图1所示基因开关系统构建图17所示载体。在该系统下，通过操作性结合单组成型启动子(TSP-1)，利用内部核糖体进入位点(IRES)表达LDTFC的CAP亚基和LTF亚基。该组成型启动子是UbC(短)启动子。
治疗产物，
Figure GPA00001141248201133
的编码区操作性结合于有配体存在下，接触LDTFC后活化的FRP。
图17所示构建物的完整核苷酸序列示于SEQ ID NO：19。该构建物的特征性元件的核苷酸坐标见表16。
表16(MOD 8361)
  标记物   方向   长度   起始   终止
  3′Reg(HSVTKpA)   反向   259   197   455
  Neo   反向   795   462   1256
  SV40早期启动子   反向   278   1446   1723
  3′Reg(SV40pA)   反向   221   1830   2050
  LTF[Gal4(DBD)：EcR(LBD)]   反向   1467   2057   3523
  TL(cMyc ires)   反向   408   3536   3943
  CAP[VP16(AD)：RxR(HP)]   反向   975   3950   4924
  TSP-1(组成型)   反向   571   4958   5528
  FRP[6x GalRE：最小启动子]   正向   189   5939  6127
  TSPQ(人因子VIII)   正向   7002   6341  13342
  标记物   方向   长度   起始   终止
  3′Reg(hGH PolyA)   正向   627   13415  14041
  复制起点   反向   589   14475  15063
  AmpR   反向   858   15438  16295
  bla启动子   反向   39   16329  16367
可在适于引入细胞的载体中制备图17所示构建物，再引入待治疗的对象。细胞可以是取自待治疗对象的自体细胞或非自体的同种异体或异种细胞，可以是原代细胞或培养维持的细胞系。可通过任何标准方法，例如转染、转导、脂质转染或电穿孔将载体引入细胞，从而产生修饰的细胞。引入载体后，可任选处理修饰细胞以产生屏障系统，例如可将细胞包被或包裹化从而提供免疫分离作用。然后可将修饰细胞配制成生物反应器以便给予需要治疗血友病的对象。
可将细胞全身性递送给对象，例如通过静脉内输注。全身性和/或局部给予基因治疗细胞是本领域熟知的。细胞递送后，LDTFC可组成型表达。将配体给予待治疗的对象，与表达的LDTFC组合从而在因子调节的启动子控制下驱动
Figure GPA00001141248201141
表达。表达进而治疗血友病症状。
本发明的其它实施方式包括以下：
E1.一种治疗、缓解或预防对象中疾病或病症的方法，包括：
(a)将以下多核苷酸引入所述对象的细胞以产生修饰的细胞：(1)编码基因开关的多核苷酸，所述基因开关包含至少一个与治疗开关启动子操作性相连的转录因子序列，其中所述至少一个转录因子序列编码配体依赖性转录因子，其中所述启动子在所述疾病或病症期间活化，和(2)与某启动子相连的编码治疗多肽或治疗多核苷酸的多核苷酸，该启动子由所述配体依赖性转录因子活化；和
(b)将配体给予所述对象以诱导所述治疗多肽或治疗多核苷酸表达；
其中所述治疗多肽或治疗多核苷酸以足以治疗、缓解或预防所述疾病或病症的水平表达。
E2.一种在对象中表达治疗多肽或治疗多核苷酸的方法，包括：
(a)将以下多核苷酸引入所述对象的细胞以产生修饰的细胞：(1)编码基因开关的多核苷酸，所述基因开关包含至少一个与治疗开关启动子操作性相连的转录因子序列，其中所述至少一个转录因子序列编码配体依赖性转录因子，其中所述启动子在所述疾病或病症期间活化，和(2)与某启动子操作性相连的编码治疗多肽或治疗多核苷酸的多核苷酸，该启动子由所述配体依赖性转录因子活化；和
(b)将配体给予所述对象以诱导所述治疗多肽或治疗多核苷酸表达。
E3.如E1或E2所述的方法，其中，所述多核苷酸引入从所述对象分离的细胞以产生修饰细胞，并将所述修饰的细胞重新引入所述对象。
E4.如E1或E2所述的方法，其中，所述方法在体内进行。
E5.如E1或E2所述的方法，其中，所述基因开关是基于蜕皮素受体(EcR)的基因开关。
E6.如E5所述的方法，其中，所述配体结合EcR配体结合结构域。
E7.如E6所述的方法，其中，所述配体是二酰基肼。
E8.如E7所述的方法，其中，所述配体选自：RG-115819、RG-115932和RG-115830。
E9.如E6所述的方法，其中，所述配体是酰氨基酮或噁二唑啉。
E10.如E1或E2所述的方法，其中，所述基因开关包含第一治疗开关启动子控制下的第一转录因子序列和第二治疗开关启动子控制下的第二转录因子序列，其中所述第一转录因子序列和所述第二转录因子序列编码的蛋白质相互作用从而形成起到配体依赖性转录因子作用的蛋白质复合物。
E11.如E10所述的方法，其中所述第一治疗开关启动子和所述第二治疗开关启动子不同。
E12.如E10所述的方法，其中所述第一治疗开关启动子和所述第二治疗开关启动子相同。
E13.如E10所述的方法，其中所述第一转录因子序列编码包含异二聚体伴侣和反式激活域的蛋白质。
E14.如E10所述的方法，其中所述第二转录因子序列编码包含DNA结合结构域和配体结合结构域的蛋白质。
E15.如E1或E2所述的方法，其中操作性连接于诱导型启动子的所述多核苷酸之一还编码致死多肽。
E16.一种在细胞中表达治疗多肽或治疗多核苷酸的方法，包括：
(a)将以下多核苷酸引入所述细胞以产生修饰的细胞：(1)编码基因开关的多核苷酸，所述基因开关包含至少一个与治疗开关启动子操作性相连的转录因子序列，其中所述至少一个转录因子序列编码配体依赖性转录因子，其中所述启动子在所述疾病或病症期间活化，和(2)与某启动子相连的编码治疗多肽或治疗多核苷酸的多核苷酸，该启动子由所述配体依赖性转录因子活化；和
(b)将配体给予所述修饰的细胞以诱导所述治疗多肽或治疗多核苷酸表达。
E17.如E16所述的方法，其中，所述方法在体外进行。
E18.如E16所述的方法，其中，所述方法在已从对象分离的细胞中离体进行。
E19.如E16所述的方法，其中，所述方法在体内进行。
E20.如E16所述的方法，其中，所述基因开关是基于EcR的基因开关。
E21.如E20所述的方法，其中，所述配体结合EcR配体结合结构域。
E22.如E21所述的方法，其中，所述配体是二酰基肼。
E23.如E22所述的方法，其中，所述配体选自：RG-115819、RG-115932和RG-115830。
E24.如E21所述的方法，其中，所述配体是酰氨基酮或噁二唑啉。
E25.如E16所述的方法，其中，所述基因开关包含第一治疗开关启动子控制下的第一转录因子序列和第二治疗开关启动子控制下的第二转录因子序列，其中所述第一转录因子序列和所述第二转录因子序列编码的蛋白质相互作用从而形成起到配体依赖性转录因子作用的蛋白质复合物。
E26.如E25所述的方法，其中所述第一治疗开关启动子和所述第二治疗开关启动子不同。
E27.如E25所述的方法，其中所述第一治疗开关启动子和所述第二治疗开关启动子相同。
E28.如E25所述的方法，其中所述第一转录因子序列编码包含异二聚体伴侣和反式激活域的蛋白质。
E29.如E25所述的方法，其中所述第二转录因子序列编码包含DNA结合结构域和配体结合结构域的蛋白质。
E30.如E16所述的方法，其中操作性连接于诱导型启动子的所述多核苷酸之一还编码致死多肽。
E31.一种编码基因开关的多核苷酸，所述基因开关包含至少一个与治疗开关启动子操作性相连的转录因子序列，其中所述至少一个转录因子序列编码配体依赖性转录因子，其中所述启动子的活性在所述疾病或病症期间受到调节。
E32.如E31所述的多核苷酸，其还编码连接于由所述配体依赖性转录因子激活的启动子的报道基因。
E33.如E31所述的多核苷酸，其中，所述基因开关是基于EcR的基因开关。
E34.如E31所述的多核苷酸，其中，所述基因开关包含第一治疗开关启动子控制下的第一转录因子序列和第二治疗开关启动子控制下的第二转录因子序列，其中所述第一转录因子序列和所述第二转录因子序列编码的蛋白质相互作用从而形成起到配体依赖性转录因子作用的蛋白质复合物。
E35.如E34所述的多核苷酸，其中所述第一治疗开关启动子和所述第二治疗开关启动子不同。
E36.如E34所述的多核苷酸，其中所述第一治疗开关启动子和所述第二治疗开关启动子相同。
E37.如E34所述的多核苷酸，其中所述第一转录因子序列编码包含异二聚体伴侣和反式激活域的蛋白质。
E38.如E34所述的多核苷酸，其中所述第二转录因子序列编码包含DNA结合结构域和配体结合结构域的蛋白质。
E39.如E31所述的多核苷酸，其中操作性连接于诱导型启动子的所述多核苷酸之一还编码致死多肽。
E40.一种包含E31所述多核苷酸的载体。
E41.如E40所述的载体，其中所述载体是质粒载体。
E42.如E40所述的载体，其中所述载体是病毒载体。
E43.一种包含E31所述多核苷酸的试剂盒。
E44.一种包含E42所述载体的试剂盒。
本发明还涉及实施一种或多种本发明方法的使用说明书。这种使用说明书可指导用户适合实施本发明方法的条件。本发明的使用说明书可以是有形的，例如书面使用说明书(例如，打印在纸上)，或者可以是无形的，例如经由计算机磁盘或从因特网上获得。
应该知道无需提供实施本发明方法的或者当使用说明书包括在试剂盒中时，利用试剂盒的完整使用说明书。例如，本发明试剂盒未装有这种全长使用说明书的情况是所提供的指示告知试剂盒的用户从哪里可获得实施使用该试剂盒的方法的使用说明书。因此，可从因特网页，单独出售或分发的手册或其它产品文献等获得实施本发明方法的使用说明书。因此，本发明包括的试剂盒可指示试剂盒用户到一个或多个地点获得未随该试剂盒直接包装和/或分发的使用说明书。这种使用说明书可以是任何形式，包括但不限于电子或打印形式。
现在已完全描述了本发明，本领域普通技术人员应该知道可在广泛而等价的条件、制剂和其它参数中作出相同发明而不影响本发明或其任何实施方式的范围。本文引用的所有专利、专利申请和出版物通过引用全文纳入本文。
序列表
<110>英特瑞克斯顿股份有限公司(INTREXON CORPORATION)
     B.L.梅伦涅克(MERENICK，Bethany Lynn)
     R.P.比奇(BEECH，Robert P.)
     T.D.瑞德(REED，Thomas D.)
     A.P.特列季亚科夫(TRETIAKOVA，Anna P.)
     R.E.彼得森(PETERSON，Richard E.)
 
<120>表达生物治疗分子的治疗基因开关构建物和生物反应器以及它们的应用
 
<130>2584.014PC02
 
<140>PCT/US2008/011270
<141>2008-09-29
 
<150>US 60/047,899
<151>2008-04-25
 
<150>US 60/975,986
<151>2007-09-28
 
<160>26
 
<170>PatentIn版本3.3
 
<210>1
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成蜕皮素受体反应元件
 
<220>
<221>misc_feature
<222>(9)..(9)
<223>n是a，c，g，或t
 
<400>1
rrggttcant gacacyy                     17
 
<210>2
<211>13
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成蜕皮素受体反应元件
 
<220>
<221>misc_feature
<222>(7)..(7)
<223>n是一个或多个间隔核苷酸
 
<400>2
aggtcanagg tca                         13
<210>3
<211>15
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成蜕皮素受体反应元件
 
<400>3
gggttgaatg aattt                        15
 
<210>4
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成的I-SceI归巢核酸内切酶限制性位点
 
<400>4
tagggataac agggtaat                     18
 
<210>5
<211>878
<212>PRT
<213>黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)
 
<220>
<223>蜕皮素受体
 
<400>5
 
Met Lys Arg Arg Trp Ser Asn Asn Gly Gly Phe Met Arg Leu Pro Glu
1               5                   10                  15
Glu Ser Ser Ser Glu Val Thr Ser Ser Ser Asn Gly Leu Val Leu Pro
            20                  25                  30
Ser Gly Val Asn Met Ser Pro Ser Ser Leu Asp Ser His Asp Tyr Cys
        35                  40                  45
Asp Gln Asp Leu Trp Leu Cys Gly Asn Glu Ser Gly Ser Phe Gly Gly
    50                  55                  60
Ser Asn Gly His Gly Leu Ser Gln Gln Gln Gln Ser Val Ile Thr Leu
65                  70                  75                  80
Ala Met His Gly Cys Ser Ser Thr Leu Pro Ala Gln Thr Thr Ile Ile
                85                  90                  95
Pro Ile Asn Gly Asn Ala Asn Gly Asn Gly Gly Ser Thr Asn Gly Gln
            100                 105                 110
Tyr Val Pro Gly Ala Thr Asn Leu Gly Ala Leu Ala Asn Gly Met Leu
        115                 120                 125
Asn Gly Gly Phe Asn Gly Met Gln Gln Gln Ile Gln Asn Gly His Gly
    130                 135                 140
Leu Ile Asn Ser Thr Thr Pro Ser Thr Pro Thr Thr Pro Leu His Leu
145                 150                 155                 160
Gln Gln Asn Leu Gly Gly Ala Gly Gly Gly Gly Ile Gly Gly Met Gly
                165                 170                 175
Ile Leu His His Ala Asn Gly Thr Pro Asn Gly Leu Ile Gly Val Val
            180                 185                 190
Gly Gly Gly Gly Gly Val Gly Leu Gly Val Gly Gly Gly Gly Val Gly
        195                 200                 205
Gly Leu Gly Met Gln His Thr Pro Arg Ser Asp Ser Val Asn Ser Ile
    210                 215                 220
Ser Ser Gly Arg Asp Asp Leu Ser Pro Ser Ser Ser Leu Asn Gly Tyr
225                 230                 235                 240
Ser Ala Asn Glu Ser Cys Asp Ala Lys Lys Ser Lys Lys Gly Pro Ala
                245                 250                 255
Pro Arg Val Gln Glu Glu Leu Cys Leu Val Cys Gly Asp Arg Ala Ser
            260                 265                 270
Gly Tyr His Tyr Asn Ala Leu Thr Cys Glu Gly Cys Lys Gly Phe Phe
        275                 280                 285
Arg Arg Ser Val Thr Lys Ser Ala Val Tyr Cys Cys Lys Phe Gly Arg
    290                 295                 300
Ala Cys Glu Met Asp Met Tyr Met Arg Arg Lys Cys Gln Glu Cys Arg
305                 310                 315                 320
Leu Lys Lys Cys Leu Ala Val Gly Met Arg Pro Glu Cys Val Val Pro
                325                 330                 335
Glu Asn Gln Cys Ala Met Lys Arg Arg Glu Lys Lys Ala Gln Lys Glu
            340                 345                 350
Lys Asp Lys Met Thr Thr Ser Pro Ser Ser Gln His Gly Gly Asn Gly
        355                 360                 365
Ser Leu Ala Ser Gly Gly Gly Gln Asp Phe Val Lys Lys Glu Ile Leu
    370                 375                 380
Asp Leu Met Thr Cys Glu Pro Pro Gln His Ala Thr Ile Pro Leu Leu
385                 390                 395                 400
Pro Asp Glu Ile Leu Ala Lys Cys Gln Ala Arg Asn Ile Pro Ser Leu
                405                 410                 415
Thr Tyr Asn Gln Leu Ala Val Ile Tyr Lys Leu Ile Trp Tyr Gln Asp
            420                 425                 430
Gly Tyr Glu Gln Pro Ser Glu Glu Asp Leu Arg Arg Ile Met Ser Gln
        435                 440                 445
Pro Asp Glu Asn Glu Ser Gln Thr Asp Val Ser Phe Arg His Ile Thr
    450                 455                 460
Glu Ile Thr Ile Leu Thr Val Gln Leu Ile Val Glu Phe Ala Lys Gly
465                 470                 475                 480
Leu Pro Ala Phe Thr Lys Ile Pro Gln Glu Asp Gln Ile Thr Leu Leu
                485                 490                 495
Lys Ala Cys Ser Ser Glu Val Met Met Leu Arg Met Ala Arg Arg Tyr
            500                 505                 510
Asp His Ser Ser Asp Ser Ile Phe Phe Ala Asn Asn Arg Ser Tyr Thr
        515                 520                 525
Arg Asp Ser Tyr Lys Met Ala Gly Met Ala Asp Asn Ile Glu Asp Leu
    530                 535                 540
Leu His Phe Cys Arg Gln Met Phe Ser Met Lys Val Asp Asn Val Glu
545                 550                 555                 560
Tyr Ala Leu Leu Thr Ala Ile Val Ile Phe Ser Asp Arg Pro Gly Leu
                565                 570                 575
Glu Lys Ala Gln Leu Val Glu Ala Ile Gln Ser Tyr Tyr Ile Asp Thr
            580                 585                 590
Leu Arg Ile Tyr Ile Leu Asn Arg His Cys Gly Asp Ser Met Ser Leu
        595                 600                 605
Val Phe Tyr Ala Lys Leu Leu Ser Ile Leu Thr Glu Leu Arg Thr Leu
    610                 615                 620
Gly Asn Gln Asn Ala Glu Met Cys Phe Ser Leu Lys Leu Lys Asn Arg
625                 630                 635                 640
Lys Leu Pro Lys Phe Leu Glu Glu Ile Trp Asp Val His Ala Ile Pro
                645                 650                 655
Pro Ser Val Gln Ser His Leu Gln Ile Thr Gln Glu Glu Asn Glu Arg
            660                 665                 670
Leu Glu Arg Ala Glu Arg Met Arg Ala Ser Val Gly Gly Ala Ile Thr
        675                 680                 685
Ala Gly Ile Asp Cys Asp Ser Ala Ser Thr Ser Ala Ala Ala Ala Ala
    690                 695                 700
Ala Gln His Gln Pro Gln Pro Gln Pro Gln Pro Gln Pro Ser Ser Leu
705                 710                 715                 720
Thr Gln Asn Asp Ser Gln His Gln Thr Gln Pro Gln Leu Gln Pro Gln
                725                 730                 735
Leu Pro Pro Gln Leu Gln Gly Gln Leu Gln Pro Gln Leu Gln Pro Gln
            740                 745                 750
Leu Gln Thr Gln Leu Gln Pro Gln Ile Gln Pro Gln Pro Gln Leu Leu
        755                 760                 765
Pro Val Ser Ala Pro Val Pro Ala Ser Val Thr Ala Pro Gly Ser Leu
    770                 775                 780
Ser Ala Val Ser Thr Ser Ser Glu Tyr Met Gly Gly Ser Ala Ala Ile
785                 790                 795                 800
Gly Pro Ile Thr Pro Ala Thr Thr Ser Ser Ile Thr Ala Ala Val Thr
                805                 810                 815
Ala Ser Ser Thr Thr Ser Ala Val Pro Met Gly Asn Gly Val Gly Val
            820                 825                 830
Gly Val Gly Val Gly Gly Asn Val Ser Met Tyr Ala Asn Ala Gln Thr
        835                 840                 845
Ala Met Ala Leu Met Gly Val Ala Leu His Ser His Gln Glu Gln Leu
    850                 855                 860
Ile Gly Gly Val Ala Val Lys Ser Glu His Ser Thr Thr Ala
865                 870                 875
 
<210>6
<211>605
<212>PRT
<213>链霉菌(Streptomyces)
 
<220>
<223>链霉菌噬菌体phiC31整合酶
 
<400>6
 
Met Asp Thr Tyr Ala Gly Ala Tyr Asp Arg Gln Ser Arg Glu Arg Glu
1               5                   10                  15
Asn Ser Ser Ala Ala Ser Pro Ala Thr Gln Arg Ser Ala Asn Glu Asp
            20                  25                  30
Lys Ala Ala Asp Leu Gln Arg Glu Val Glu Arg Asp Gly Gly Arg Phe
        35                  40                  45
Arg Phe Val Gly His Phe Ser Glu Ala Pro Gly Thr Ser Ala Phe Gly
    50                  55                  60
Thr Ala Glu Arg Pro Glu Phe Glu Arg Ile Leu Asn Glu Cys Arg Ala
65                  70                  75                  80
Gly Arg Leu Asn Met Ile Ile Val Tyr Asp Val Ser Arg Phe Ser Arg
                85                  90                  95
Leu Lys Val Met Asp Ala Ile Pro Ile Val Ser Glu Leu Leu Ala Leu
            100                 105                 110
Gly Val Thr Ile Val Ser Thr Gln Glu Gly Val Phe Arg Gln Gly Asn
        115                 120                 125
Val Met Asp Leu Ile His Leu Ile Met Arg Leu Asp Ala Ser His Lys
    130                 135                 140
Glu Ser Ser Leu Lys Ser Ala Lys Ile Leu Asp Thr Lys Asn Leu Gln
145                 150                 155                 160
Arg Glu Leu Gly Gly Tyr Val Gly Gly Lys Ala Pro Tyr Gly Phe Glu
                165                 170                 175
Leu Val Ser Glu Thr Lys Glu Ile Thr Arg Asn Gly Arg Met Val Asn
            180                 185                 190
Val Val Ile Asn Lys Leu Ala His Ser Thr Thr Pro Leu Thr Gly Pro
        195                 200                 205
Phe Glu Phe Glu Pro Asp Val Ile Arg Trp Trp Trp Arg Glu Ile Lys
    210                 215                 220
Thr His Lys His Leu Pro Phe Lys Pro Gly Ser Gln Ala Ala Ile His
225                 230                 235                 240
Pro Gly Ser Ile Thr Gly Leu Cys Lys Arg Met Asp Ala Asp Ala Val
                245                 250                 255
Pro Thr Arg Gly Glu Thr Ile Gly Lys Lys Thr Ala Ser Ser Ala Trp
            260                 265                 270
Asp Pro Ala Thr Val Met Arg Ile Leu Arg Asp Pro Arg Ile Ala Gly
        275                 280                 285
Phe Ala Ala Glu Val Ile Tyr Lys Lys Lys Pro Asp Gly Thr Pro Thr
    290                 295                 300
Thr Lys Ile Glu Gly Tyr Arg Ile Gln Arg Asp Pro Ile Thr Leu Arg
305                 310                 315                 320
Pro Val Glu Leu Asp Cys Gly Pro Ile Ile Glu Pro Ala Glu Trp Tyr
                325                 330                 335
Glu Leu Gln Ala Trp Leu Asp Gly Arg Gly Arg Gly Lys Gly Leu Ser
            340                 345                 350
Arg Gly Gln Ala Ile Leu Ser Ala Met Asp Lys Leu Tyr Cys Glu Cys
        355                 360                 365
Gly Ala Val Met Thr Ser Lys Arg Gly Glu Glu Ser Ile Lys Asp Ser
    370                 375                 380
Tyr Arg Cys Arg Arg Arg Lys Val Val Asp Pro Ser Ala Pro Gly Gln
385                 390                 395                 400
His Glu Gly Thr Cys Asn Val Ser Met Ala Ala Leu Asp Lys Phe Val
                405                 410                 415
Ala Glu Arg Ile Phe Asn Lys Ile Arg His Ala Glu Gly Asp Glu Glu
            420                 425                 430
Thr Leu Ala Leu Leu Trp Glu Ala Ala Arg Arg Phe Gly Lys Leu Thr
        435                 440                 445
Glu Ala Pro Glu Lys Ser Gly Glu Arg Ala Asn Leu Val Ala Glu Arg
    450                 455                 460
Ala Asp Ala Leu Asn Ala Leu Glu Glu Leu Tyr Glu Asp Arg Ala Ala
465                 470                 475                 480
Gly Ala Tyr Asp Gly Pro Val Gly Arg Lys His Phe Arg Lys Gln Gln
                485                 490                 495
Ala Ala Leu Thr Leu Arg Gln Gln Gly Ala Glu Glu Arg Leu Ala Glu
            500                 505                 510
Leu Glu Ala Ala Glu Ala Pro Lys Leu Pro Leu Asp Gln Trp Phe Pro
        515                 520                 525
Glu Asp Ala Asp Ala Asp Pro Thr Gly Pro Lys Ser Trp Trp Gly Arg
    530                 535                 540
Ala Ser Val Asp Asp Lys Arg Val Phe Val Gly Leu Phe Val Asp Lys
545                 550                 555                 560
Ile Val Val Thr Lys Ser Thr Thr Gly Arg Gly Gln Gly Thr Pro Ile
                565                 570                 575
Glu Lys Arg Ala Ser Ile Thr Trp Ala Lys Pro Pro Thr Asp Asp Asp
            580                 585                 590
Glu Asp Asp Ala Gln Asp Gly Thr Glu Asp Val Ala Ala
        595                 600                 605
 
<210>7
<211>9861
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>表达IGF-1的合成缺氧诱导型基因开关构建物
 
<400>7
taaacaaata ggggttccgc gcacatttcc ccgaaaagtg ccacctgacg tactgaggac   60
gccagggttt tcccagtcac gacgttgtaa aacgacggcc agtagcagac aagcccgtca  120
gggcgcgtca gcgggtgttg gcgggtgtcg gggatttagg tgacactata ggctgagcgc  180
cgcacaggca tctagaggct atggcagggc ctgccgcccc gacgttggct gcgagccctg  240
ggccttcacc cgaacttggg gggtggggtg gggaaaagga agaaacgcgg gcgtattggc  300
cccaatgggg tctcggtggg gtatcgacag agtgccagcc ctgggaccga accccgcgtt  360
tatgaacaaa cgacccaaca ccgtgcgttt tattctgtct ttttattgcc gtcatagcgc  420
gggttccttc cggtattgtc tccttccgtg tttcaatcga ttcaaaagaa ctcgtccagc  480
agacggtaaa aagcaatgcg ttgagaatcc ggtgcagcaa tgccatacag caccagaaag  540
cgatcagccc attcaccgcc cagttcttca gcaatgtcac gggttgccag tgcgatgtcc     600
tgatagcgat cagccacgcc caggcgaccg cagtcgataa agccggagaa acggccgttt     660
tccaccataa tgtttggcag acaagcatcg ccgtgggtca caaccaggtc ctcgccatct     720
ggcatacgtg ctttcaggcg tgcgaacagt tctgccggtg ccagaccctg atgttcctcg     780
tccaggtcat cctgatcaac caggccagct tccatgcgag tgcgtgcgcg ctcgatacgg     840
tgtttagctt ggtgatcgaa tgggcaagta gctgggtcca gggtatgcag acggcgcata     900
gcatcagcca tgatggaaac cttttctgcc ggtgccagat gagaggacag cagatcctgg     960
cctggaacct cgcccagcag cagccagtcg cggccagcct cggtcacaac atccagcaca    1020
gctgcgcatg gaacgccggt agtagccagc caggacagac gagctgcttc atcttgcagt    1080
tcgttcagtg cgccggacag atcggtctta acaaacagca ccggacggcc ttgagcggac    1140
agacggaaca cagctgcgtc ggagcaaccg atagtctgtt gagcccagtc atagccaaac    1200
agacgttcca cccaagcagc cggagaacca gcgtgcagac cgtcttgttc aatcatggtg    1260
gcaattgggt gtctgagcga tgtggctcgg ctggcgacgc aaaagaagat gcggctgact    1320
gtcgaacagg aggagcagag agcgaagcgg gaggctgcgg gctcaatttg catgctttag    1380
ttcctcacct tgtcgtatta tactatgccg atatactatg ccgatgatta attgtcaacg    1440
tatacggaat agctctgagg ccgaggcagc ttcggcctct gcataaataa aaaaaattag    1500
tcagccatgg ggcggagaat gggcggaact gggcggagtt aggggcggga tgggcggagt    1560
taggggcggg actatggttg ctgactaatt gagatgcttg ctttgcatac ttctgcctgc    1620
tggggagcct ggggactttc cacacctggt tgctgactaa ttgagatgct tgctttgcat    1680
acttctgcct gctggggagc ctggggactt tccacaccct aacctcgagg ccatcgtggc    1740
acgccagggt tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgctct tctcccccgc    1800
gggaggtttt ataaatccga ctgtctagat accacatttg tagaggtttt acttgcttta    1860
aaaaacctcc cacatctccc cctgaacctg aaacataaaa tgaatgcaaa tgttttatta    1920
acttgtttat tgcagcttat aatggttaca aattaagcaa tagcatcaca aatttcacaa    1980
attaagcatt tttttcactg cattctagtt gtggtttgtc caaactcatc aatgtatctt    2040
atcatgtcta atcgattcac aggttggtgg ggctctccag gatggggggg ggctgggtgt    2100
ggctcatgtc ggccacgtcc caaatctcct ccaggaaggg gggcagcttc ctgttcttca    2160
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tgctcaggat cttgccgtag atcacgctgc tcctggcgct gccgctcagc tggttcagga    2280
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aacaaatgtt tgttcctgac aggaaaaacc ttgctgggta ccttcgttgc cggacacttc    6300
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attttaaaat aactatacca gcaggaggac gtccagacac agcataggct acctggccat    7440
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ccccgttcag cccgaccgct gcgccttatc cggtaactat cgtcttgagt ccaacccggt    8280
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tgaaatggat aaaaaaatac agcgtttttc atgtacaact atactagttg tagtgcctaa    8700
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gataactacg atacgggagg gcttaccatc tggccccagt gctgcaatga taccgcgaga    9060
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acccaactga tcttcagcat cttttacttt caccagcgtt tctgggtgag caaaaacagg  9720
aaggcaaaat gccgcaaaaa agggaataag ggcgacacgg aaatgttgaa tactcatacg  9780
cttccttttt caatagtatt gaagcattta tcagggttat tgtctcggga gcgaatacat  9840
atttgaatgt atttagaaaa a                                            9861
 
<210>8
<211>10823
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>表达bFGF的合成遍在和缺氧诱导型启动子基因开关构建物
 
<400>8
taaacaaata ggggttccgc gcacatttcc ccgaaaagtg ccacctgacg tactgaggac   60
gccagggttt tcccagtcac gacgttgtaa aacgacggcc agtagcagac aagcccgtca  120
gggcgcgtca gcgggtgttg gccctaggac gaaaggaggt cgtgaaatgg ataaaaaaat  180
acagcgtttt tcatgtacaa ctatactagt tgtagtgcct aaataatgct tttaaaactt  240
aaaaataatc aatgtcctca gcggggtgtc ggggatttag gtgacactat aggctgagcg  300
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catctcggtg atctgcctga agggggtgtc gctctcctcg ttctcgtcgt cggcctgctg    4620
ccaggtctgg gtgatccttt tcaggtcctc gtcgctgggc tgctcgtagc cgtcctgata    4680
ccagatcagc ctggcgatca ggaactgctg gttggcggtc agctggggga tgttcttctg    4740
cctgttggtc accagcagct tgtcgctcag gaacctgggc acgacctcgt gaatcctggc    4800
ggcctcgggg ggggggggct cgcactgcat gatggggggc atgtggtcat cgacggtggt    4860
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ggccctgacg tgcggcttcg tttgtcacgt cgcggacgtg cgggaaccca cgtgggggct    5880
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tggttttttg tgtgaatcca tagtactaac atacgctctc catcaaaaca aaacgaaaca    6540
aaacaaacta gcaaaatagg ctgtccccag tgcaagtcca ggtgccagaa catttctcta    6600
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tagagggtat ataatgggtg ccttagctgg tgtgtgacct catcttcctg tacgcccctg    6840
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tagataacta cgatacggga gggcttacca tctggcccca gtgctgcaat gataccgcga 10020
gacccacgct caccggctcc agatttatca gcaataaacc agccagccgg aagcgccgag 10080
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atcgtggtgt cacgctcgtc gtttggtatg gcttcattca gctccggttc ccaacgatca 10260
aggcgagtta catgatcccc catgttgtgc aaaaaagcgg ttagctcctt cggtcctccg 10320
atggttgtca gaagtaagtt ggccgcagtg ttatcactca tggttatggc agcactgcat 10380
aattctctta ctgtcatgcc atccgtaaga tgcttttctg tgactggtga gtattcaacc 10440
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cgcttccttt ttcaatagta ttgaagcatt tatcagggtt attgtctcgg gagcgaatac 10800
atatttgaat gtatttagaa aaa                                         10823
 
<210>9
<211>10538
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>表达EPO的合成遍在和缺氧诱导型启动子基因开关构建物
 
<400>9
taaacaaata ggggttccgc gcacatttcc ccgaaaagtg ccacctgacg tactgaggac   60
gccagggttt tcccagtcac gacgttgtaa aacgacggcc agtagcagac aagcccgtca  120
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aaaaataatc aatgtcctca gcggggtgtc ggggatttag gtgacactat aggctgagcg     300
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cacgtactcc gagtcccgca cgcactcagc gtcgctctgg ggccccacgt ccggccctga    6060
cgtgcggctt cgtttgtcac gtcgcggacg tgcgggaacc cacgtggggg ctccgtcacg    6120
tactccgagt cccgcacgca ctcagcgtcg ctctggggcc ccacgtccgg ccctgacgtg    6180
cggcttcgtt tgtcacgtcg cggacgtgcg ggaacccacg tgggggctcc gtcacgtact    6240
ccgagtcccg cacgcactca gcgtcgctct ggggccccac gtccggccct gacgtgcggc    6300
ttcgtttgtc acgtcctcga gtggtaatac aatggccggt tcccatggac ctgcatcgtg    6360
gtgtaactat aacggtccta aggtagcgac cgcggagact aggtgtattt atctaagcga    6420
tcgcttaatt aaggccggcc gccgcaataa aatatcttta ttttcattac atctgtgtgt    6480
tggttttttg tgtgaatcca tagtactaac atacgctctc catcaaaaca aaacgaaaca    6540
aaacaaacta gcaaaatagg ctgtccccag tgcaagtcca ggtgccagaa catttctcta    6600
tccataatgc aggggtaccg ggtgatgacg gtgaaaacct ccaattgcgg agtactgtcc    6660
tccgagcgga gtactgtcct ccgagcggag tactgtcctc cgagcggagt actgtcctcc    6720
gagcggagta ctgtcctccg agcggagtac tgtcctccga gcggagagtc cccggggacc    6780
tagagggtat ataatgggtg ccttagctgg tgtgtgacct catcttcctg tacgcccctg    6840
caggggcgcg ccacgcgtcg aagaaggtga gtaatcttaa catgctcttt tttttttttt    6900
ttgctaatcc cttttgtgtg ctgatgttag gatgacattt acaacaaatg tttgttcctg    6960
acaggaaaaa ccttgctggg taccttcgtt gccggacact tcttgtcctc tactttggaa    7020
aaaaggaatt gagagccgct agcgccacca tgggggtgca tgaatgtcct gcctggctgt    7080
ggcttctcct gtccctgctg tcgctccctc tgggcctccc agtcctgggc gctccaccac    7140
gcctcatctg tgacagccga gtcctggaga gatacctgtt ggaggccaag gaagccgaga    7200
atatcacgac gggctgtgct gaacactgct ccttgaatga gaatatcact gtcccagaca    7260
ccaaagttaa tttctatgcc tggaagcgga tggaggtcgg gcagcaggcc gtagaagtct    7320
ggcagggcct ggccctgctg tcggaagctg tcctgcgggg ccaggccctg ttggtcaaca    7380
gcagccagcc gtgggagccc ctgcaactgc atgtggataa agccgtcagt ggccttcgca    7440
gcctcaccac tctgcttcgg gctctgcgag cccagaagga agccatctcc cctccagatg    7500
cggccagcgc cgctccactc cgaacaatca ctgctgacac tttccgcaaa ctgttccgag    7560
tctactccaa tttcctccgg ggaaagctga agctgtacac aggggaggct tgcaggacag    7620
gggacagatg aatcgattgc gcaaagcttt cgcgataggc gagaccaatg ggtgtgtacg    7680
tagcggccgc gtcgacgata gcttgatggg tggcatccct gtgacccctc cccagtgcct    7740
ctcctggccc tggaagttgc cactccagtg cccaccagcc ttgtcctaat aaaattaagt    7800
tgcatcattt tgtctgacta ggtgtccttc tataatatta tggggtggag gggggtggta    7860
tggagcaagg ggcaagttgg gaagacaacc tgtagggcct gcggggtcta ttgggaacca    7920
agctggagtg cagtggcaca atcttggctc actgcaatct ccgcctcctg ggttcaagcg    7980
attctcctgc ctcagcctcc cgagttgttg ggattccagg catgcatgac caggctcagc    8040
taatttttgt ttttttggta gagacggggt ttcaccatat tggccaggct ggtctccaac    8100
tcctaatctc aggtgatcta cccaccttgg cctcccaaat tgctgggatt acaggcgtga    8160
accactgctc ccttccctgt ccttctgatt ttaaaataac tataccagca ggaggacgtc    8220
cagacacagc ataggctacc tggccatgcc caaccggtgg gacatttgag ttgcttgctt    8280
ggcactgtcc tctcatgcgt tgggtccact cagtagatgc ctgttgaatt ctgatttaaa    8340
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tcaaggacat catcccttta gtgagggtta attcacgcag tgggtacgga actaaaggca    8460
gcacacatcg tgtaatcatg gtcatagctg tttcctgtgt gaaattgtta tccgctacgt    8520
ctctcccccg cagtaagggc tagattaact cgtctcgtga atatccggaa ctccctttag    8580
tgagggttaa ttgcgttgcg ctcactgccc gctttccagt cgggaaacct gtcgtgccag    8640
cttaatcatg gtcatagctg tttcctgtgt gaaattgtta tccgctaccg gaaacgcttc    8700
cttcatgtga gcaaaaggcc agcaaaaggc caggaaccgt aaaaaggccg cgttgctggc    8760
gtttttccat aggctccgcc cccctgacga gcatcacaaa aatcgacgct caagtcagag    8820
gtggcgaaac ccgacaggac tataaagata ccaggcgttt ccccctggaa gctccctcgt    8880
gcgctctcct gttccgaccc tgccgcttac cggatacctg tccgcctttc tcccttcggg    8940
aagcgtggcg ctttctcata gctcacgctg taggtatctc agttcggtgt aggtcgttcg    9000
ctccaagctg ggctgtgtgc acgaaccccc cgttcagccc gaccgctgcg ccttatccgg    9060
taactatcgt cttgagtcca acccggtaag acacgactta tcgccactgg cagcagccac    9120
tggtaacagg attagcagag cgaggtatgt aggcggtgct acagagttct tgaagtggtg    9180
gcctaactac ggctacacta gaagaacagt atttggtatc tgcgctctgc tgaagccagt    9240
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tggttttttt gtttgcaagc agcagattac gcgcagaaaa aaaggatctc aagaagatcc    9360
tttgatcttt tctacggggt ctgacgctca gtggaacgaa aactcacgtt aagggatttt    9420
ggtcatgatc tatgtcgggt gcggagaaag aggtaatgaa atggcatacg agtaaacttg    9480
gtctgacacc gctgcatgag attatcaaaa aggatcttca cctagatcct tttaaattaa    9540
aaatgaagtt ttaaatcaat ctaaagtata tatgagtaaa cttggtctga cagttaccaa    9600
tgcttaatca gtgaggcacc tatctcagcg atctgtctat ttcgttcatc catagttgcc    9660
tgactccccg tcgtgtagat aactacgata cgggagggct taccatctgg ccccagtgct    9720
gcaatgatac cgcgagaccc acgctcaccg gctccagatt tatcagcaat aaaccagcca    9780
gccggaagcg ccgagcgcag aagtggtcct gcaactttat ccgcctccat ccagtctatt    9840
aactgttgcc gggaagctag agtaagtagt tcgccagtta atagtttgcg gagcgttgtt    9900
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ggttcccaac gatcaaggcg agttacatga tcccccatgt tgtgcaaaaa agcggttagc   10020
tccttcggtc ctccgatggt tgtcagaagt aagttggccg cagtgttatc actcatggtt   10080
atggcagcac tgcataattc tcttactgtc atgccatccg taagatgctt ttctgtgact   10140
ggtgagtatt caaccaagtc attctgagaa tagtgtatgc ggcgaccgag ttgctcttgc   10200
ccggcgtcaa tacgggataa taccgcgcca catagcagaa ctttaaaagt gctcatcatt   10260
gggaagcgtt cttcggggcg aaaactctca aggatcttac cgctgttgag atccagttcg   10320
atgtaaccca cacgagcacc caactgatct tcagcatctt ttactttcac cagcgtttct   10380
gggtgagcaa aaacaggaag gcaaaatgcc gcaaaaaagg gaataagggc gacacggaaa   10440
tgttgaatac tcatacgctt cctttttcaa tagtattgaa gcatttatca gggttattgt   10500
ctcgggagcg aatacatatt tgaatgtatt tagaaaaa                           10538
<210>10
<211>10361
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>表达BNP的合成遍在和缺氧诱导型启动子基因开关构建物
 
<400>10
taaacaaata ggggttccgc gcacatttcc ccgaaaagtg ccacctgacg tactgaggac   60
gccagggttt tcccagtcac gacgttgtaa aacgacggcc agtagcagac aagcccgtca  120
gggcgcgtca gcgggtgttg gccctaggac gaaaggaggt cgtgaaatgg ataaaaaaat  180
acagcgtttt tcatgtacaa ctatactagt tgtagtgcct aaataatgct tttaaaactt  240
aaaaataatc aatgtcctca gcggggtgtc ggggatttag gtgacactat aggctgagcg  300
ccgcacaggc atctagaggc tatggcaggg cctgccgccc cgacgttggc tgcgagccct  360
gggccttcac ccgaacttgg ggggtggggt ggggaaaagg aagaaacgcg ggcgtattgg  420
ccccaatggg gtctcggtgg ggtatcgaca gagtgccagc cctgggaccg aaccccgcgt  480
ttatgaacaa acgacccaac accgtgcgtt ttattctgtc tttttattgc cgtcatagcg  540
cgggttcctt ccggtattgt ctccttccgt gtttcaatcg attcaaaaga actcgtccag  600
cagacggtaa aaagcaatgc gttgagaatc cggtgcagca atgccataca gcaccagaaa  660
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ctgatagcga tcagccacgc ccaggcgacc gcagtcgata aagccggaga aacggccgtt  780
ttccaccata atgtttggca gacaagcatc gccgtgggtc acaaccaggt cctcgccatc  840
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gtccaggtca tcctgatcaa ccaggccagc ttccatgcga gtgcgtgcgc gctcgatacg  960
gtgtttagct tggtgatcga atgggcaagt agctgggtcc agggtatgca gacggcgcat 1020
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cagacggaac acagctgcgt cggagcaacc gatagtctgt tgagcccagt catagccaaa 1320
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cgggaggttt tataaatccg actgtctaga ttgttgttaa atcacacaaa aaaccaacac    1980
acagatgtaa tgaaaataaa gatattttat tatcgattca gctgtcgctg gggctctcca    2040
gcatctccat caggaaggtg tcgatgggca cgtcgccgat cagcctgaag aagaacaggt    2100
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cgtggggggt gaagccgggg ccggggctgt cgccgtcgcc cagcatgtcc aggtcgaagt    2880
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attgcccccc cccccccccg catgccgtct aacaaaaaag ccaaaaacgg ccagaattta    3060
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aaaggtgcct aaaaaacttc acaaaacaca ctcgccaacc ccgagcgcac gtacccagcc    3180
cagcagcccg ctactcacca agtgacgatc acagcgatcc acaaacaaga accgcgaccc    3240
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aacataaaat gaatgcaaat gttttattaa cttgtttatt gcagcttata atggttacaa    3840
attaagcaat agcatcacaa atttcacaaa ttaagcattt ttttcactgc attctagttg    3900
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gcgattctcc tgcctcagcc tcccgagttg ttgggattcc aggcatgcat gaccaggctc    7860
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aactcctaat ctcaggtgat ctacccacct tggcctccca aattgctggg attacaggcg    7980
tgaaccactg ctcccttccc tgtccttctg attttaaaat aactatacca gcaggaggac    8040
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cttggcactg tcctctcatg cgttgggtcc actcagtaga tgcctgttga attctgattt    8160
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tactcaagga catcatccct ttagtgaggg ttaattcacg cagtgggtac ggaactaaag    8280
gcagcacaca tcgtgtaatc atggtcatag ctgtttcctg tgtgaaattg ttatccgcta    8340
cgtctctccc ccgcagtaag ggctagatta actcgtctcg tgaatatccg gaactccctt    8400
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cagcttaatc atggtcatag ctgtttcctg tgtgaaattg ttatccgcta ccggaaacgc    8520
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gaggtggcga aacccgacag gactataaag ataccaggcg tttccccctg gaagctccct    8700
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gtggcctaac tacggctaca ctagaagaac agtatttggt atctgcgctc tgctgaagcc    9060
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cggtggtttt tttgtttgca agcagcagat tacgcgcaga aaaaaaggat ctcaagaaga    9180
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tttggtcatg atctatgtcg ggtgcggaga aagaggtaat gaaatggcat acgagtaaac    9300
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taaaaatgaa gttttaaatc aatctaaagt atatatgagt aaacttggtc tgacagttac    9420
caatgcttaa tcagtgaggc acctatctca gcgatctgtc tatttcgttc atccatagtt    9480
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gttatggcag cactgcataa ttctcttact gtcatgccat ccgtaagatg cttttctgtg    9960
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tgcccggcgt caatacggga taataccgcg ccacatagca gaactttaaa agtgctcatc   10080
attgggaagc gttcttcggg gcgaaaactc tcaaggatct taccgctgtt gagatccagt   10140
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tctgggtgag caaaaacagg aaggcaaaat gccgcaaaaa agggaataag ggcgacacgg 10260
aaatgttgaa tactcatacg cttccttttt caatagtatt gaagcattta tcagggttat 10320
tgtctcggga gcgaatacat atttgaatgt atttagaaaa a                     10361
 
<210>11
<211>11545
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>表达tPA的合成遍在和丛蛋白D1诱导型基因开关
 
<400>11
taaacaaata ggggttccgc gcacatttcc ccgaaaagtg ccacctgacg tactgaggac   60
gccagggttt tcccagtcac gacgttgtaa aacgacggcc agtagcagac aagcccgtca  120
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acagcgtttt tcatgtacaa ctatactagt tgtagtgcct aaataatgct tttaaaactt  240
aaaaataatc aatgtcctca gcggggtgtc ggggatttag gtgacactat aggctgagcg  300
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gggccttcac ccgaacttgg ggggtggggt ggggaaaagg aagaaacgcg ggcgtattgg  420
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acaggactat aaagatacca ggcgtttccc cctggaagct ccctcgtgcg ctctcctgtt    9900
ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc gcctttctcc cttcgggaag cgtggcgctt    9960
tctcatagct cacgctgtag gtatctcagt tcggtgtagg tcgttcgctc caagctgggc    10020
tgtgtgcacg aaccccccgt tcagcccgac cgctgcgcct tatccggtaa ctatcgtctt    10080
gagtccaacc cggtaagaca cgacttatcg ccactggcag cagccactgg taacaggatt    10140
agcagagcga ggtatgtagg cggtgctaca gagttcttga agtggtggcc taactacggc    10200
tacactagaa gaacagtatt tggtatctgc gctctgctga agccagttac cttcggaaaa    10260
agagttggta gctcttgatc cggcaaacaa accaccgctg gtagcggtgg tttttttgtt    10320
tgcaagcagc agattacgcg cagaaaaaaa ggatctcaag aagatccttt gatcttttct    10380
acggggtctg acgctcagtg gaacgaaaac tcacgttaag ggattttggt catgatctat    10440
gtcgggtgcg gagaaagagg taatgaaatg gcatacgagt aaacttggtc tgacaccgct    10500
gcatgagatt atcaaaaagg atcttcacct agatcctttt aaattaaaaa tgaagtttta    10560
aatcaatcta aagtatatat gagtaaactt ggtctgacag ttaccaatgc ttaatcagtg    10620
aggcacctat ctcagcgatc tgtctatttc gttcatccat agttgcctga ctccccgtcg    10680
tgtagataac tacgatacgg gagggcttac catctggccc cagtgctgca atgataccgc    10740
gagacccacg ctcaccggct ccagatttat cagcaataaa ccagccagcc ggaagcgccg    10800
agcgcagaag tggtcctgca actttatccg cctccatcca gtctattaac tgttgccggg    10860
aagctagagt aagtagttcg ccagttaata gtttgcggag cgttgttgcc attgctacag    10920
gcatcgtggt gtcacgctcg tcgtttggta tggcttcatt cagctccggt tcccaacgat    10980
caaggcgagt tacatgatcc cccatgttgt gcaaaaaagc ggttagctcc ttcggtcctc    11040
cgatggttgt cagaagtaag ttggccgcag tgttatcact catggttatg gcagcactgc    11100
ataattctct tactgtcatg ccatccgtaa gatgcttttc tgtgactggt gagtattcaa    11160
ccaagtcatt ctgagaatag tgtatgcggc gaccgagttg ctcttgcccg gcgtcaatac    11220
gggataatac cgcgccacat agcagaactt taaaagtgct catcattggg aagcgttctt    11280
cggggcgaaa actctcaagg atcttaccgc tgttgagatc cagttcgatg taacccacac    11340
gagcacccaa ctgatcttca gcatctttta ctttcaccag cgtttctggg tgagcaaaaa    11400
caggaaggca aaatgccgca aaaaagggaa taagggcgac acggaaatgt tgaatactca    11460
tacgcttcct ttttcaatag tattgaagca tttatcaggg ttattgtctc gggagcgaat    11520
acatatttga atgtatttag aaaaa                                          11545
 
<210>12
<211>10207
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>表达EPO的合成NxcI心肌细胞启动子缺氧诱导型基因开关
 
<400>12
taaacaaata ggggttccgc gcacatttcc ccgaaaagtg ccacctgacg tactgaggac   60
gccagggttt tcccagtcac gacgttgtaa aacgacggcc agtagcagac aagcccgtca  120
gggcgcgtca gcgggtgttg gccctaggac gaaaggaggt cgtgaaatgg ataaaaaaat  180
acagcgtttt tcatgtacaa ctatactagt tgtagtgcct aaataatgct tttaaaactt  240
aaaaataatc aatgtcctca gcggggtgtc ggggatttag gtgacactat aggctgagcg  300
ccgcacaggc atctagaggc tatggcaggg cctgccgccc cgacgttggc tgcgagccct  360
gggccttcac ccgaacttgg ggggtggggt ggggaaaagg aagaaacgcg ggcgtattgg  420
ccccaatggg gtctcggtgg ggtatcgaca gagtgccagc cctgggaccg aaccccgcgt  480
ttatgaacaa acgacccaac accgtgcgtt ttattctgtc tttttattgc cgtcatagcg  540
cgggttcctt ccggtattgt ctccttccgt gtttcaatcg attcaaaaga actcgtccag  600
cagacggtaa aaagcaatgc gttgagaatc cggtgcagca atgccataca gcaccagaaa  660
gcgatcagcc cattcaccgc ccagttcttc agcaatgtca cgggttgcca gtgcgatgtc  720
ctgatagcga tcagccacgc ccaggcgacc gcagtcgata aagccggaga aacggccgtt  780
ttccaccata atgtttggca gacaagcatc gccgtgggtc acaaccaggt cctcgccatc  840
tggcatacgt gctttcaggc gtgcgaacag ttctgccggt gccagaccct gatgttcctc  900
gtccaggtca tcctgatcaa ccaggccagc ttccatgcga gtgcgtgcgc gctcgatacg  960
gtgtttagct tggtgatcga atgggcaagt agctgggtcc agggtatgca gacggcgcat 1020
agcatcagcc atgatggaaa ccttttctgc cggtgccaga tgagaggaca gcagatcctg 1080
gcctggaacc tcgcccagca gcagccagtc gcggccagcc tcggtcacaa catccagcac 1140
agctgcgcat ggaacgccgg tagtagccag ccaggacaga cgagctgctt catcttgcag 1200
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cagacggaac acagctgcgt cggagcaacc gatagtctgt tgagcccagt catagccaaa 1320
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tgtcgaacag gaggagcaga gagcgaagcg ggaggctgcg ggctcaattt gcatgcttta 1500
gttcctcacc ttgtcgtatt atactatgcc gatatactat gccgatgatt aattgtcaac 1560
gtatacggaa tagctctgag gccgaggcag cttcggcctc tgcataaata aaaaaaatta 1620
gtcagccatg gggcggagaa tgggcggaac tgggcggagt taggggcggg atgggcggag    1680
ttaggggcgg gactatggtt gctgactaat tgagatgctt gctttgcata cttctgcctg    1740
ctggggagcc tggggacttt ccacacctgg ttgctgacta attgagatgc ttgctttgca    1800
tacttctgcc tgctggggag cctggggact ttccacaccc taacctcgag gccatcgtgg    1860
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cgggaggttt tataaatccg actgtctaga ttgttgttaa atcacacaaa aaaccaacac    1980
acagatgtaa tgaaaataaa gatattttat tatcgattca gctgtcgctg gggctctcca    2040
gcatctccat caggaaggtg tcgatgggca cgtcgccgat cagcctgaag aagaacaggt    2100
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cggtgaacat ctgctcgaac tcgaagtcgg ccatgtccag ggcgccgtag ggggcgctgt    2820
cgtggggggt gaagccgggg ccggggctgt cgccgtcgcc cagcatgtcc aggtcgaagt    2880
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attgcccccc cccccccccg catgccccag tatgatgcct tctctaaatt taccagaaag    3060
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ccaagctgtc gaaaagaagc tatctggcag ctctctgctt catccaacac atggatgata    3240
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tcttccaaaa atttaggtga cactataggg caccgctcgc acctgcgcac aggcccgcgg    3360
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ttgtttattg cagcttataa tggttacaaa ttaagcaata gcatcacaaa tttcacaaat    3540
taagcatttt tttcactgca ttctagttgt ggtttgtcca aactcatcaa tgtatcttat    3600
catgtctaat cgattcacag gttggtgggg ctctccagga tggggggggg ctgggtgtgg    3660
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aggccgggcc tgtcgctgaa gatcaccacg gcggtcagca gggcgtagtg gatgttgtcc    3960
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agaaaaa                                                             10207
 
<210>13
<211>16979
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>表达松弛素和HGF的合成遍在+h丛蛋白D1+缺氧诱导型基因开关构建物
 
<400>13
taaacaaata ggggttccgc gcacatttcc ccgaaaagtg ccacctgacg tactgaggac   60
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cgcacaggca tctagaggct atggcagggc ctgccgcccc gacgttggct gcgagccctg  240
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aaggactccc cctcgtggga agggtcgccg ctggcgaacc cctcctggct caacaacaca  12660
ttgagggaca ctatcaggtc gatcctagcc tctttaaacc caatgccgat ttcctcctga  12720
gggtgtccgg catgagcatg aaggatattg gaatcatgga cggagacctc ctggctgtgc  12780
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agcatttatc agggttattg tctcgggagc gaatacatat ttgaatgtat ttagaaaaa  16979
 
<210>14
<211>13188
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>编码IGF-1的合成心肌细胞+缺氧诱导型+h丛蛋白D1诱导型基因开关构建物
 
<400>14
taaacaaata ggggttccgc gcacatttcc ccgaaaagtg ccacctgacg tactgaggac   60
gccagggttt tcccagtcac gacgttgtaa aacgacggcc agtagcagac aagcccgtca  120
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gcgttgggtc cactcagtag atgcctgttg aattctgatt taaatcggtc cgcgtacggc    7920
gtggtaggtc cgaacgaatc catggattac cctgttatcc ctactcaagg acatcatccc    7980
tttagtgagg gttaattcac gcagtgccgc ggcgtgtaga aaatacctat cagctcgagg    8040
agcgaaggcc tggacagtgc ctgagaaagg tggtggaggg aggctgagtg tggaggggag    8100
acacagggtt cgggaaggca gagggagaag gaaaggggag ctcagaggga ccgagagagg    8160
gacggagggt ccgaggggga ggcagaggga gccacggaga gagggagcga gcgtcaggga    8220
cggaaaaacg gagcaggaga gagaaggaga ctagaaaggg ccgggggcgg ggctgccagg    8280
gactggagag cgaagcggag tcggagggag aaggagaagc agaggcagaa cccggagaag    8340
cgccacacgc gcggagtttg gggtggggac agaggcggag aggcgcagag accgagagac    8400
acagagagag ggagaggcgg ggtgggggag agggcggaaa agagaaaaca ggcgcgagcg    8460
aggcaggcca agcggccaag tgggaggaaa gagcgaggag agcgagcgac ggcggcggcg    8520
gctacgggga gggaccctgg ggccgcgggc gggtcctgga gggcgcgggc ggcgggaccc    8580
gcggacggcg gggcgtggcc cagggcggcc aggggcaggc gggggttccg ggggcgggcg    8640
gggccggggc ggggagtgag ggcgtgtccg cagcggagcc gcccccgccc cgcccccgga    8700
ctgcgcggcg aggctgatcc gggcccggac gccggggtcg ggggcggctg gcgcgggcag    8760
gaagcgcatc gtggcccgga cccgcccccc gcctcccgcc gcctccgggg catgcggggg    8820
gggggggggg caattggcca ccatgaagct cctgtccagc attgagcaag cctgtgacat    8880
ttgcaggctg aaaaagctca agtgtagcaa agagaaaccc aaatgcgcta agtgtctgaa    8940
aaacaactgg gaatgcagat actcccccaa aaccaaaaga tcccccctca ccagggccca    9000
tctgacagag gtcgagtcca gactcgaaag gctggaacag ctctttctcc tgattttccc    9060
tagagaagac ctcgacatga tcctcaagat ggactccctg caagacatta aggctctgct    9120
caccggactg tttgtgcaag acaatgtgaa taaggatgcc gtcaccgata gactcgcctc    9180
cgtggaaacc gatatgcctc tgacactgag gcagcataga attagcgcta cctccagctc    9240
cgaggaaagc tccaacaaag gccaaagaca actgacagtg tcccccgagt tccccgggat    9300
tagacctgag tgtgtggtcc ccgaaaccca atgcgctatg aaaagaaaag agaaaaaggc    9360
tcagaaagag aaagacaaac tgcctgtgtc caccacaacc gtcgatgatc acatgccccc    9420
tatcatgcag tgtgagcctc cccctcccga agccgctaga atccacgaag tcgtccccag    9480
gttcctctcc gataagctcc tggaaaccaa tagacaaaag aatatccctc aactcaccgc    9540
taaccaacag tttctgattg ccaggctgat ttggtatcag gatggctatg agcaaccctc    9600
cgacgaagac ctcaagagga tcacacagac atggcaacag gctgacgatg agaatgagga    9660
aagcgatacc cctttcaggc agattaccga aatgacaatc ctcaccgtcc agctcatcgt    9720
cgagtttgcc aaaggactcc ccggattcgc taagattagc caacccgatc agattaccct    9780
cctgaaagcc tgtagctccg aggtcatgat gctgagagtg gctagaaggt acgatgccgc    9840
ttccgatagc gtcctgtttg ccaataacca agcctatacc agggacaatt acaggaaggc    9900
tggcatggcc tatgtgattg aggatgtgct ccacttttgc agatgtatgt actccatggc    9960
tctcgataac attcactatg ccctcctgac agccgtcgtg attttctccg acaggcccgg   10020
actggaacag cctcaactcg tggaagaaat tcagaggtac tatctgaata ccctcagaat   10080
ttacattctg aatcagctct ccggcagcgc tagatccagc gtcatctatg gcaaaatcct   10140
ctccattctg tccgagctga gaacactggg aatgcaaaac tccaatatgt gcattagcct   10200
caagctcaag aatagaaaac tgcctccctt tctggaagaa atttgggatg tggctgacat   10260
gagccatacc caaccccctc ccattctgga aagccctacc aatctgtaaa tcgatagccg   10320
cctggctgag atggggtggg cagggcagag ctgatcaggg ccgagcagaa ccgcactctt   10380
cccaaataaa gcttcctcct tgaaacacaa atgtttctta cttacacccc atcctgattt  10440
cttttcttga gaccagagag tgggaaagct ctctcttgac ctgaggatgg atctgaaaat  10500
tatgagcccc ttgaggacag ggaatgttat tcatctttga attccgcagc atctagcacc  10560
aggtcttgta cagagcaggt gcccaataaa tggttgaatg aatatatgaa aagtagaggc  10620
agagggctgg gcacagtggc tcacgcctgt aatcctagca ctttgggagg ctgaggtggg  10680
tggatcactt gaggtcagga gttcgagacc agcttggcca acatggctaa acctcatctc  10740
tattaaaaat acaaaaatta gctgggctgg tgcctgtaat cccagctact caggaggctg  10800
aggcaggaga atcacttgaa cccaggagga ggagtttgca gtgagccgag atcgcaccat  10860
tgcactccag cctgggcgat aggagcaaaa ctccatctca aaaacaaaaa acaaaacaaa  10920
acaaaaagaa aaaagaaaag taggggcaga gatgtggggc aggagaggtg actcgggctc  10980
agctgcatgg tcctgctctg cttctttttt cttggagttt gtccgttgga tgacaatgat  11040
agtggtgaac aggtatggag ggcttactaa gtaccaggtg tctagacgag gacgctcggg  11100
cttggaccca tggcacatcg tgtaatcatg gtcatagctg tttcctgtgt gaaattgtta  11160
tccgctacgt ctctcccccg cagtaagggc tagattaact cgtctcgtga atatccggaa  11220
ctccctttag tgagggttaa ttgcgttgcg ctcactgccc gctttccagt cgggaaacct  11280
gtcgtgccag cttaatcatg gtcatagctg tttcctgtgt gaaattgtta tccgctaccg  11340
gaaacgcttc cttcatgtga gcaaaaggcc agcaaaaggc caggaaccgt aaaaaggccg  11400
cgttgctggc gtttttccat aggctccgcc cccctgacga gcatcacaaa aatcgacgct  11460
caagtcagag gtggcgaaac ccgacaggac tataaagata ccaggcgttt ccccctggaa  11520
gctccctcgt gcgctctcct gttccgaccc tgccgcttac cggatacctg tccgcctttc  11580
tcccttcggg aagcgtggcg ctttctcata gctcacgctg taggtatctc agttcggtgt  11640
aggtcgttcg ctccaagctg ggctgtgtgc acgaaccccc cgttcagccc gaccgctgcg  11700
ccttatccgg taactatcgt cttgagtcca acccggtaag acacgactta tcgccactgg  11760
cagcagccac tggtaacagg attagcagag cgaggtatgt aggcggtgct acagagttct  11820
tgaagtggtg gcctaactac ggctacacta gaagaacagt atttggtatc tgcgctctgc  11880
tgaagccagt taccttcgga aaaagagttg gtagctcttg atccggcaaa caaaccaccg  11940
ctggtagcgg tggttttttt gtttgcaagc agcagattac gcgcagaaaa aaaggatctc  12000
aagaagatcc tttgatcttt tctacggggt ctgacgctca gtggaacgaa aactcacgtt  12060
aagggatttt ggtcatgatc tatgtcgggt gcggagaaag aggtaatgaa atggcatacg  12120
agtaaacttg gtctgacacc gctgcatgag attatcaaaa aggatcttca cctagatcct 12180
tttaaattaa aaatgaagtt ttaaatcaat ctaaagtata tatgagtaaa cttggtctga 12240
cagttaccaa tgcttaatca gtgaggcacc tatctcagcg atctgtctat ttcgttcatc 12300
catagttgcc tgactccccg tcgtgtagat aactacgata cgggagggct taccatctgg 12360
ccccagtgct gcaatgatac cgcgagaccc acgctcaccg gctccagatt tatcagcaat 12420
aaaccagcca gccggaagcg ccgagcgcag aagtggtcct gcaactttat ccgcctccat 12480
ccagtctatt aactgttgcc gggaagctag agtaagtagt tcgccagtta atagtttgcg 12540
gagcgttgtt gccattgcta caggcatcgt ggtgtcacgc tcgtcgtttg gtatggcttc 12600
attcagctcc ggttcccaac gatcaaggcg agttacatga tcccccatgt tgtgcaaaaa 12660
agcggttagc tccttcggtc ctccgatggt tgtcagaagt aagttggccg cagtgttatc 12720
actcatggtt atggcagcac tgcataattc tcttactgtc atgccatccg taagatgctt 12780
ttctgtgact ggtgagtatt caaccaagtc attctgagaa tagtgtatgc ggcgaccgag 12840
ttgctcttgc ccggcgtcaa tacgggataa taccgcgcca catagcagaa ctttaaaagt 12900
gctcatcatt gggaagcgtt cttcggggcg aaaactctca aggatcttac cgctgttgag 12960
atccagttcg atgtaaccca cacgagcacc caactgatct tcagcatctt ttactttcac 13020
cagcgtttct gggtgagcaa aaacaggaag gcaaaatgcc gcaaaaaagg gaataagggc 13080
gacacggaaa tgttgaatac tcatacgctt cctttttcaa tagtattgaa gcatttatca 13140
gggttattgt ctcgggagcg aatacatatt tgaatgtatt tagaaaaa              13188
 
<210>15
<211>13314
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>编码依那西普的合成组成型+TNF+诱导型启动子基因开关
 
<400>15
taaacaaata ggggttccgc gcacatttcc ccgaaaagtg ccacctgacg tactgaggac   60
gccagggttt tcccagtcac gacgttgtaa aacgacggcc agtagcagac aagcccgtca  120
gggcgcgtca gcgggtgttg gccctaggac gaaaggaggt cgtgaaatgg ataaaaaaat  180
acagcgtttt tcatgtacaa ctatactagt tgtagtgcct aaataatgct tttaaaactt  240
aaaaataatc aatgtcctca gcggggtgtc ggggatttag gtgacactat aggctgagcg  300
ccgcacaggc atctagaggc tatggcaggg cctgccgccc cgacgttggc tgcgagccct  360
gggccttcac ccgaacttgg ggggtggggt ggggaaaagg aagaaacgcg ggcgtattgg     420
ccccaatggg gtctcggtgg ggtatcgaca gagtgccagc cctgggaccg aaccccgcgt     480
ttatgaacaa acgacccaac accgtgcgtt ttattctgtc tttttattgc cgtcatagcg     540
cgggttcctt ccggtattgt ctccttccgt gtttcaatcg attcaaaaga actcgtccag     600
cagacggtaa aaagcaatgc gttgagaatc cggtgcagca atgccataca gcaccagaaa     660
gcgatcagcc cattcaccgc ccagttcttc agcaatgtca cgggttgcca gtgcgatgtc     720
ctgatagcga tcagccacgc ccaggcgacc gcagtcgata aagccggaga aacggccgtt     780
ttccaccata atgtttggca gacaagcatc gccgtgggtc acaaccaggt cctcgccatc     840
tggcatacgt gctttcaggc gtgcgaacag ttctgccggt gccagaccct gatgttcctc     900
gtccaggtca tcctgatcaa ccaggccagc ttccatgcga gtgcgtgcgc gctcgatacg     960
gtgtttagct tggtgatcga atgggcaagt agctgggtcc agggtatgca gacggcgcat    1020
agcatcagcc atgatggaaa ccttttctgc cggtgccaga tgagaggaca gcagatcctg    1080
gcctggaacc tcgcccagca gcagccagtc gcggccagcc tcggtcacaa catccagcac    1140
agctgcgcat ggaacgccgg tagtagccag ccaggacaga cgagctgctt catcttgcag    1200
ttcgttcagt gcgccggaca gatcggtctt aacaaacagc accggacggc cttgagcgga    1260
cagacggaac acagctgcgt cggagcaacc gatagtctgt tgagcccagt catagccaaa    1320
cagacgttcc acccaagcag ccggagaacc agcgtgcaga ccgtcttgtt caatcatggt    1380
ggcaattggg tgtctgagcg atgtggctcg gctggcgacg caaaagaaga tgcggctgac    1440
tgtcgaacag gaggagcaga gagcgaagcg ggaggctgcg ggctcaattt gcatgcttta    1500
gttcctcacc ttgtcgtatt atactatgcc gatatactat gccgatgatt aattgtcaac    1560
gtatacggaa tagctctgag gccgaggcag cttcggcctc tgcataaata aaaaaaatta    1620
gtcagccatg gggcggagaa tgggcggaac tgggcggagt taggggcggg atgggcggag    1680
ttaggggcgg gactatggtt gctgactaat tgagatgctt gctttgcata cttctgcctg    1740
ctggggagcc tggggacttt ccacacctgg ttgctgacta attgagatgc ttgctttgca    1800
tacttctgcc tgctggggag cctggggact ttccacaccc taacctcgag gccatcgtgg    1860
cacgccaggg ttttcccagt cacgacgttg taaaacgacg gccagtgctc ttctcccccg    1920
cgggaggttt tataaatccg actgtctaga ttgttgttaa atcacacaaa aaaccaacac    1980
acagatgtaa tgaaaataaa gatattttat tatcgattca gctgtcgctg gggctctcca    2040
gcatctccat caggaaggtg tcgatgggca cgtcgccgat cagcctgaag aagaacaggt    2100
gctccaggca cttcaggccg atgctcctca ggctgggcag cctcagcagc agcttggcga    2160
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tctccctcag cagctccacc tcctgggcgc ttttcaggcc cctcacctcg gggttgaaca    2280
ggatgatggc cctcaggcag cccagctcgg tcttgtccat cctcatgtcc ctcatcttgc    2340
tcaccagctc ggtcagcacc ctgtcgaaga tggcgcccac tccggcgctg tgggcgctgt    2400
tcctatggac gtgcaggccg gtggccagca ggatgccgtc cctcacgtcg atgctcctgt    2460
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ccaggggcag gctgctgaag tggggaatcc tcttggccca ctccaccagg gtgaacagct    2580
gcttgtcggc ggcctggcag atgttggtca cggggtcgtt ggggctgctg ccgctgccgc    2640
cggttccgcc ggggccctcc acgccctggt cgcttttctg ctccacggcg agttcggcct    2700
ccagaatcct gtccacgggc atctccatat ggccgccgta ctcgtcgatg cccagggcgt    2760
cggtgaacat ctgctcgaac tcgaagtcgg ccatgtccag ggcgccgtag ggggcgctgt    2820
cgtggggggt gaagccgggg ccggggctgt cgccgtcgcc cagcatgtcc aggtcgaagt    2880
cgtccagggc gtcggcgtgg gccatggcca cgtcctcgcc gtccaggtgc agctcgtcgc    2940
ccaggctcac gtcggtgggg ggggccacct tccttttctt cttggggccc atggtggcca    3000
attgcccccc cccccccccg catgccgtct aacaaaaaag ccaaaaacgg ccagaattta    3060
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cagcagcccg ctactcacca agtgacgatc acagcgatcc acaaacaaga accgcgaccc    3240
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gcgttcaccg ccccacggag atccctccgc agaatcgccg agaagggact acttttcctc    3360
gcctgttccg ctctctggaa agaaaaccag tgccctagag tcacccaagt cccgtcctaa    3420
aatgtccttc tgctgatact ggggttctaa ggccgagtct tatgagcagc gggccgctgt    3480
cctgagcgtc cgggcggaag gatcaggacg ctcgctgcgc ccttcgtctg acgtggcagc    3540
gctcgccgtg aggagggggg cgcccgcggg aggcgccaaa acccggcgcg gaggccctcg    3600
agtaggcgag accaatgggt gcgccatggg ctcttccaaa aatttaggtg acactatagg    3660
gcaccgctcg cacctgcgca caggcccgcg gctacaaact acgaacgatc attctagata    3720
ccacatttgt agaggtttta cttgctttaa aaaacctccc acatctcccc ctgaacctga    3780
aacataaaat gaatgcaaat gttttattaa cttgtttatt gcagcttata atggttacaa    3840
attaagcaat agcatcacaa atttcacaaa ttaagcattt ttttcactgc attctagttg    3900
tggtttgtcc aaactcatca atgtatctta tcatgtctaa tcgattcaca ggttggtggg    3960
gctctccagg atgggggggg gctgggtgtg gctcatgtcg gccacgtccc aaatctcctc    4020
caggaagggg ggcagcttcc tgttcttcag cttcaggctg atacacatat tgctgttctg    4080
cattcccagg gtcctcagct cgctcaggat gctcaggatc ttgccgtaga tcacgctgct    4140
cctggcgctg ccgctcagct ggttcaggat gtagatcctc agggtgttca ggtagtacct    4200
ctggatctcc tccaccagct ggggctgctc caggccgggc ctgtcgctga agatcaccac    4260
ggcggtcagc agggcgtagt ggatgttgtc cagggccatg ctgtacatac atctgcagaa    4320
gtgcaggagg tcctcgatca cctcggccat gccagccttc ctgtagttgt ccctggtgta    4380
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catctcggtg atctgcctga agggggtgtc gctctcctcg ttctcgtcgt cggcctgctg    4620
ccaggtctgg gtgatccttt tcaggtcctc gtcgctgggc tgctcgtagc cgtcctgata    4680
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cctgttggtc accagcagct tgtcgctcag gaacctgggc acgacctcgt gaatcctggc    4800
ggcctcgggg ggggggggct cgcactgcat gatggggggc atgtggtcat cgacggtggt    4860
ggtgctcacg ggcagcttgt ccttctcctt ctgggccttc ttctccttcc ttttcatggc    4920
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cagctgcctc tggcccttgt tgctgctctc ctcgctgctg ctggtggcgc tgatcctgtg    5040
ctgcctcagg gtcaggggca tgtcggtctc cacgctggcc agcctgtcgg tcacggcgtc    5100
cttgttcacg ttgtcctgca cgaacaggcc ggtcagcagg gccttgatgt cttgcaggct    5160
gtccatcttc aggatcatgt ccaggtcctc cctggggaag atcagcagga acagctgctc    5220
cagcctctcc agcctgctct ccacctcggt caggtgggcc ctggtcaggg ggctcctctt    5280
ggtcttgggg ctgtatctgc actcccagtt gttcttcagg cacttggcgc acttgggctt    5340
ctccttgctg cacttcagct tcttcagcct gcagatgtcg caagcctgct cgatgctgct    5400
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tgctcctctg agagttgtta cagttcagac atggtaatga ctggttttat acagctttgc    5520
ccctcccaca tggcattttt ttttctccct ctgtcttttg atctgtgtcc tttgagtgat    5580
tcaacatttt actcaggaag acatcattag aatagaaata cttgtttgta aaggcatggt    5640
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gagtggtaat acaatggccg gttcccatgg acctgcatcg tggtgtaact ataacggtcc    5760
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ccgccgcaat aaaatatctt tattttcatt acatctgtgt gttggttttt tgtgtgaatc    5880
catagtacta acatacgctc tccatcaaaa caaaacgaaa caaaacaaac tagcaaaata    5940
ggctgtcccc agtgcaagtc caggtgccag aacatttctc tatccataat gcaggggtac    6000
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cgaagaaggt gagtaatctt aacatgctct tttttttttt ttttgctaat cccttttgtg    6300
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ggtaccttcg ttgccggaca cttcttgtcc tctactttgg aaaaaaggaa ttgagagccg    6420
ctagcgccac catgctgccc gcccaggtcg ccttcacccc ctacgccccc gagcccggca    6480
gcacctgtag actgagagag tattacgacc agaccgccca gatgtgctgc tccaagtgca    6540
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acgttgtgtg caagccctgt gcccccggca ccttcagcaa caccaccagc agcaccgaca    6900
tctgccgccc ccaccagatt tgcaacgtgg tggccatccc cggcaacgcc agcatggacg    6960
ccgtgtgtac cagcaccagc cccacccgca gcatggcccc cggcgctgtc cacctccccc    7020
agcccgtgag caccagaagc cagcacaccc agcccacccc cgagcccagc accgccccca    7080
gcaccagctt cctgctgcct atgggaccca gcccccccgc cgagggcagc accggcgacg    7140
agcccaagag ctgcgacaag acccacacct gtcccccctg ccccgccccc gagctgctgg    7200
gcggccccag cgtgttcctg ttccccccca agcccaagga caccctgatg atctccagaa    7260
cccccgaggt gacatgcgtg gtggtggacg tgagccacga ggacccccag gtgaagttca    7320
actggtacgt ggacggcgtg caagtgcata acgccaagac caagcccaga gagcagcagt    7380
acaacagcac ctacagagtg gtgagcgtgc tgaccgtgct gcaccagaac tggctggacg    7440
gcaaggagta caagtgcaag gtgtccaaca aggccctgcc cgcccccatc gagaaaacca    7500
tcagcaaggc caagggccag cccagagagc cccaggtgta caccctgccc cccagcagag    7560
aggagatgac caagaaccag gtgtccctga cctgtctggt gaagggcttc taccccagcg    7620
acatcgccgt ggagtgggag agcaacggcc agcccgagaa caactacaag accacccccc    7680
ccgtgctgga cagcgacggc agcttcttcc tgtacagcaa gctgaccgtg gacaagagca    7740
gatggcagca gggcaacgtg ttcagctgct ccgtgatgca cgaggccctg cacaaccact    7800
acacccagaa gtccctgagc ctgagccccg gcaagtgaat cgattgcgca aagctttcgc    7860
gataggcgag accaatgggt gtgtacgtag cggccgcgtc gacgatagct tgatgggtgg    7920
catccctgtg acccctcccc agtgcctctc ctggccctgg aagttgccac tccagtgccc    7980
accagccttg tcctaataaa attaagttgc atcattttgt ctgactaggt gtccttctat    8040
aatattatgg ggtggagggg ggtggtatgg agcaaggggc aagttgggaa gacaacctgt    8100
agggcctgcg gggtctattg ggaaccaagc tggagtgcag tggcacaatc ttggctcact    8160
gcaatctccg cctcctgggt tcaagcgatt ctcctgcctc agcctcccga gttgttggga    8220
ttccaggcat gcatgaccag gctcagctaa tttttgtttt tttggtagag acggggtttc    8280
accatattgg ccaggctggt ctccaactcc taatctcagg tgatctaccc accttggcct    8340
cccaaattgc tgggattaca ggcgtgaacc actgctccct tccctgtcct tctgatttta    8400
aaataactat accagcagga ggacgtccag acacagcata ggctacctgg ccatgcccaa    8460
ccggtgggac atttgagttg cttgcttggc actgtcctct catgcgttgg gtccactcag    8520
tagatgcctg ttgaattctg atttaaatcg gtccgcgtac ggcgtggtag gtccgaacga    8580
atccatggat taccctgtta tccctactca aggacatcat ccctttagtg agggttaatt    8640
cacgcagtgc cgcggcgtgt agaaaatacc tatcagctcg agcacggggc tcccactctc    8700
aactccgcag cctcagcccc ctcaatgctg aggagcagag ctggtctcct gccctgacag    8760
ctgccaggca catcttgttc cctcaggttg cacaactggg ataaatgacc cgggatgaag    8820
aaaccactgg catccaggaa cttgtcttag accgttttgt aggggaaatg acctgcaggg    8880
actttcccca gggaccacat ccagcttttc ttcgctccca agaaaccagc agggagcatg    8940
cggggggggg ggggggcaat tggccaccat gaagctcctg tccagcattg agcaagcctg    9000
tgacatttgc aggctgaaaa agctcaagtg tagcaaagag aaacccaaat gcgctaagtg    9060
tctgaaaaac aactgggaat gcagatactc ccccaaaacc aaaagatccc ccctcaccag    9120
ggcccatctg acagaggtcg agtccagact cgaaaggctg gaacagctct ttctcctgat    9180
tttccctaga gaagacctcg acatgatcct caagatggac tccctgcaag acattaaggc    9240
tctgctcacc ggactgtttg tgcaagacaa tgtgaataag gatgccgtca ccgatagact    9300
cgcctccgtg gaaaccgata tgcctctgac actgaggcag catagaatta gcgctacctc    9360
cagctccgag gaaagctcca acaaaggcca aagacaactg acagtgtccc ccgagttccc    9420
cgggattaga cctgagtgtg tggtccccga aacccaatgc gctatgaaaa gaaaagagaa    9480
aaaggctcag aaagagaaag acaaactgcc tgtgtccacc acaaccgtcg atgatcacat    9540
gccccctatc atgcagtgtg agcctccccc tcccgaagcc gctagaatcc acgaagtcgt    9600
ccccaggttc ctctccgata agctcctgga aaccaataga caaaagaata tccctcaact    9660
caccgctaac caacagtttc tgattgccag gctgatttgg tatcaggatg gctatgagca    9720
accctccgac gaagacctca agaggatcac acagacatgg caacaggctg acgatgagaa    9780
tgaggaaagc gatacccctt tcaggcagat taccgaaatg acaatcctca ccgtccagct    9840
catcgtcgag tttgccaaag gactccccgg attcgctaag attagccaac ccgatcagat    9900
taccctcctg aaagcctgta gctccgaggt catgatgctg agagtggcta gaaggtacga    9960
tgccgcttcc gatagcgtcc tgtttgccaa taaccaagcc tataccaggg acaattacag   10020
gaaggctggc atggcctatg tgattgagga tgtgctccac ttttgcagat gtatgtactc   10080
catggctctc gataacattc actatgccct cctgacagcc gtcgtgattt tctccgacag   10140
gcccggactg gaacagcctc aactcgtgga agaaattcag aggtactatc tgaataccct   10200
cagaatttac attctgaatc agctctccgg cagcgctaga tccagcgtca tctatggcaa   10260
aatcctctcc attctgtccg agctgagaac actgggaatg caaaactcca atatgtgcat   10320
tagcctcaag ctcaagaata gaaaactgcc tccctttctg gaagaaattt gggatgtggc   10380
tgacatgagc catacccaac cccctcccat tctggaaagc cctaccaatc tgtaaatcga   10440
tagccgcctg gctgagatgg ggtgggcagg gcagagctga tcagggccga gcagaaccgc   10500
actcttccca aataaagctt cctccttgaa acacaaatgt ttcttactta caccccatcc   10560
tgatttcttt tcttgagacc agagagtggg aaagctctct cttgacctga ggatggatct   10620
gaaaattatg agccccttga ggacagggaa tgttattcat ctttgaattc cgcagcatct   10680
agcaccaggt cttgtacaga gcaggtgccc aataaatggt tgaatgaata tatgaaaagt   10740
agaggcagag ggctgggcac agtggctcac gcctgtaatc ctagcacttt gggaggctga   10800
ggtgggtgga tcacttgagg tcaggagttc gagaccagct tggccaacat ggctaaacct  10860
catctctatt aaaaatacaa aaattagctg ggctggtgcc tgtaatccca gctactcagg  10920
aggctgaggc aggagaatca cttgaaccca ggaggaggag tttgcagtga gccgagatcg  10980
caccattgca ctccagcctg ggcgatagga gcaaaactcc atctcaaaaa caaaaaacaa  11040
aacaaaacaa aaagaaaaaa gaaaagtagg ggcagagatg tggggcagga gaggtgactc  11100
gggctcagct gcatggtcct gctctgcttc ttttttcttg gagtttgtcc gttggatgac  11160
aatgatagtg gtgaacaggt atggagggct tactaagtac caggtgtcta gacgaggacg  11220
ctcgggcttg gacccatggc acatcgtgta atcatggtca tagctgtttc ctgtgtgaaa  11280
ttgttatccg ctacgtctct cccccgcagt aagggctaga ttaactcgtc tcgtgaatat  11340
ccggaactcc ctttagtgag ggttaattgc gttgcgctca ctgcccgctt tccagtcggg  11400
aaacctgtcg tgccagctta atcatggtca tagctgtttc ctgtgtgaaa ttgttatccg  11460
ctaccggaaa cgcttccttc atgtgagcaa aaggccagca aaaggccagg aaccgtaaaa  11520
aggccgcgtt gctggcgttt ttccataggc tccgcccccc tgacgagcat cacaaaaatc  11580
gacgctcaag tcagaggtgg cgaaacccga caggactata aagataccag gcgtttcccc  11640
ctggaagctc cctcgtgcgc tctcctgttc cgaccctgcc gcttaccgga tacctgtccg  11700
cctttctccc ttcgggaagc gtggcgcttt ctcatagctc acgctgtagg tatctcagtt  11760
cggtgtaggt cgttcgctcc aagctgggct gtgtgcacga accccccgtt cagcccgacc  11820
gctgcgcctt atccggtaac tatcgtcttg agtccaaccc ggtaagacac gacttatcgc  11880
cactggcagc agccactggt aacaggatta gcagagcgag gtatgtaggc ggtgctacag  11940
agttcttgaa gtggtggcct aactacggct acactagaag aacagtattt ggtatctgcg  12000
ctctgctgaa gccagttacc ttcggaaaaa gagttggtag ctcttgatcc ggcaaacaaa  12060
ccaccgctgg tagcggtggt ttttttgttt gcaagcagca gattacgcgc agaaaaaaag  12120
gatctcaaga agatcctttg atcttttcta cggggtctga cgctcagtgg aacgaaaact  12180
cacgttaagg gattttggtc atgatctatg tcgggtgcgg agaaagaggt aatgaaatgg  12240
catacgagta aacttggtct gacaccgctg catgagatta tcaaaaagga tcttcaccta  12300
gatcctttta aattaaaaat gaagttttaa atcaatctaa agtatatatg agtaaacttg  12360
gtctgacagt taccaatgct taatcagtga ggcacctatc tcagcgatct gtctatttcg  12420
ttcatccata gttgcctgac tccccgtcgt gtagataact acgatacggg agggcttacc  12480
atctggcccc agtgctgcaa tgataccgcg agacccacgc tcaccggctc cagatttatc  12540
agcaataaac cagccagccg gaagcgccga gcgcagaagt ggtcctgcaa ctttatccgc 12600
ctccatccag tctattaact gttgccggga agctagagta agtagttcgc cagttaatag 12660
tttgcggagc gttgttgcca ttgctacagg catcgtggtg tcacgctcgt cgtttggtat 12720
ggcttcattc agctccggtt cccaacgatc aaggcgagtt acatgatccc ccatgttgtg 12780
caaaaaagcg gttagctcct tcggtcctcc gatggttgtc agaagtaagt tggccgcagt 12840
gttatcactc atggttatgg cagcactgca taattctctt actgtcatgc catccgtaag 12900
atgcttttct gtgactggtg agtattcaac caagtcattc tgagaatagt gtatgcggcg 12960
accgagttgc tcttgcccgg cgtcaatacg ggataatacc gcgccacata gcagaacttt 13020
aaaagtgctc atcattggga agcgttcttc ggggcgaaaa ctctcaagga tcttaccgct 13080
gttgagatcc agttcgatgt aacccacacg agcacccaac tgatcttcag catcttttac 13140
tttcaccagc gtttctgggt gagcaaaaac aggaaggcaa aatgccgcaa aaaagggaat 13200
aagggcgaca cggaaatgtt gaatactcat acgcttcctt tttcaatagt attgaagcat 13260
ttatcagggt tattgtctcg ggagcgaata catatttgaa tgtatttaga aaaa       13314
 
<210>16
<211>11013
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>表达依那西普的合成TNF诱导型启动子基因开关构建物
 
<400>16
taaacaaata ggggttccgc gcacatttcc ccgaaaagtg ccacctgacg tactgaggac   60
gccagggttt tcccagtcac gacgttgtaa aacgacggcc agtagcagac aagcccgtca  120
gggcgcgtca gcgggtgttg gcgggtgtcg gggatttagg tgacactata ggctgagcgc  180
cgcacaggca tctagaggct atggcagggc ctgccgcccc gacgttggct gcgagccctg  240
ggccttcacc cgaacttggg gggtggggtg gggaaaagga agaaacgcgg gcgtattggc  300
cccaatgggg tctcggtggg gtatcgacag agtgccagcc ctgggaccga accccgcgtt  360
tatgaacaaa cgacccaaca ccgtgcgttt tattctgtct ttttattgcc gtcatagcgc  420
gggttccttc cggtattgtc tccttccgtg tttcaatcga ttcaaaagaa ctcgtccagc  480
agacggtaaa aagcaatgcg ttgagaatcc ggtgcagcaa tgccatacag caccagaaag  540
cgatcagccc attcaccgcc cagttcttca gcaatgtcac gggttgccag tgcgatgtcc  600
tgatagcgat cagccacgcc caggcgaccg cagtcgataa agccggagaa acggccgttt  660
tccaccataa tgtttggcag acaagcatcg ccgtgggtca caaccaggtc ctcgccatct  720
ggcatacgtg ctttcaggcg tgcgaacagt tctgccggtg ccagaccctg atgttcctcg     780
tccaggtcat cctgatcaac caggccagct tccatgcgag tgcgtgcgcg ctcgatacgg     840
tgtttagctt ggtgatcgaa tgggcaagta gctgggtcca gggtatgcag acggcgcata     900
gcatcagcca tgatggaaac cttttctgcc ggtgccagat gagaggacag cagatcctgg     960
cctggaacct cgcccagcag cagccagtcg cggccagcct cggtcacaac atccagcaca    1020
gctgcgcatg gaacgccggt agtagccagc caggacagac gagctgcttc atcttgcagt    1080
tcgttcagtg cgccggacag atcggtctta acaaacagca ccggacggcc ttgagcggac    1140
agacggaaca cagctgcgtc ggagcaaccg atagtctgtt gagcccagtc atagccaaac    1200
agacgttcca cccaagcagc cggagaacca gcgtgcagac cgtcttgttc aatcatggtg    1260
gcaattgggt gtctgagcga tgtggctcgg ctggcgacgc aaaagaagat gcggctgact    1320
gtcgaacagg aggagcagag agcgaagcgg gaggctgcgg gctcaatttg catgctttag    1380
ttcctcacct tgtcgtatta tactatgccg atatactatg ccgatgatta attgtcaacg    1440
tatacggaat agctctgagg ccgaggcagc ttcggcctct gcataaataa aaaaaattag    1500
tcagccatgg ggcggagaat gggcggaact gggcggagtt aggggcggga tgggcggagt    1560
taggggcggg actatggttg ctgactaatt gagatgcttg ctttgcatac ttctgcctgc    1620
tggggagcct ggggactttc cacacctggt tgctgactaa ttgagatgct tgctttgcat    1680
acttctgcct gctggggagc ctggggactt tccacaccct aacctcgagg ccatcgtggc    1740
acgccagggt tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgctct tctcccccgc    1800
gggaggtttt ataaatccga ctgtctagat accacatttg tagaggtttt acttgcttta    1860
aaaaacctcc cacatctccc cctgaacctg aaacataaaa tgaatgcaaa tgttttatta    1920
acttgtttat tgcagcttat aatggttaca aattaagcaa tagcatcaca aatttcacaa    1980
attaagcatt tttttcactg cattctagtt gtggtttgtc caaactcatc aatgtatctt    2040
atcatgtcta atcgattcac aggttggtgg ggctctccag gatggggggg ggctgggtgt    2100
ggctcatgtc ggccacgtcc caaatctcct ccaggaaggg gggcagcttc ctgttcttca    2160
gcttcaggct gatacacata ttgctgttct gcattcccag ggtcctcagc tcgctcagga    2220
tgctcaggat cttgccgtag atcacgctgc tcctggcgct gccgctcagc tggttcagga    2280
tgtagatcct cagggtgttc aggtagtacc tctggatctc ctccaccagc tggggctgct    2340
ccaggccggg cctgtcgctg aagatcacca cggcggtcag cagggcgtag tggatgttgt    2400
ccagggccat gctgtacata catctgcaga agtgcaggag gtcctcgatc acctcggcca    2460
tgccagcctt cctgtagttg tccctggtgt aagcctggtt gttggcgaac aggatgctgt    2520
cgctggcggc gtcgtacctc ctggccaccc tcagcatcat cacctcgctg ctgcaagcct    2580
tcagcagggt gatctggtcg ggctggctga tcttggcgaa tccgggcagg cccttggcga    2640
actccacgat cagctgcacg gtcaggatgg tcatctcggt gatctgcctg aagggggtgt    2700
cgctctcctc gttctcgtcg tcggcctgct gccaggtctg ggtgatcctt ttcaggtcct    2760
cgtcgctggg ctgctcgtag ccgtcctgat accagatcag cctggcgatc aggaactgct    2820
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cctcgctgct gctggtggcg ctgatcctgt gctgcctcag ggtcaggggc atgtcggtct    3180
ccacgctggc cagcctgtcg gtcacggcgt ccttgttcac gttgtcctgc acgaacaggc    3240
cggtcagcag ggccttgatg tcttgcaggc tgtccatctt caggatcatg tccaggtcct    3300
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cgggaggctg ctggttttcc actacccgaa aaaaatccag cgtctaagca gctgcaagga    3600
gagcctttca gagaagcggg tcctggcagc ggcggggaag tgtccccaaa tgggcagaat    3660
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tgcccgcccg ctgctatggg caaagtttcg tggatgcggc tagggttgcg caccgctggc    3780
tgggggatca gcgggagggc tgggccagag gcgaagcccc ctattcgctc cggatctccc    3840
ttcccaggac gcccgcagcg cagctctgct cgccgggctc ctccacccta gcccgccgcc    3900
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tggggctctc cagcatctcc atcaggaagg tgtcgatggg cacgtcgccg atcagcctga    4020
agaagaacag gtgctccagg cacttcaggc cgatgctcct caggctgggc agcctcagca    4080
gcagcttggc gaatctgccg ggctcgtcgg ggtgggtggt cctggtgtac tcctccaggg    4140
cggcgtacac cttctccctc agcagctcca cctcctgggc gcttttcagg cccctcacct    4200
cggggttgaa caggatgatg gccctcaggc agcccagctc ggtcttgtcc atcctcatgt    4260
ccctcatctt gctcaccagc tcggtcagca ccctgtcgaa gatggcgccc actccggcgc    4320
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cgagttcggc ctccagaatc ctgtccacgg gcatctccat atggccgccg tactcgtcga    4680
tgcccagggc gtcggtgaac atctgctcga actcgaagtc ggccatgtcc agggcgccgt    4740
agggggcgct gtcgtggggg gtgaagccgg ggccggggct gtcgccgtcg cccagcatgt    4800
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gatgcagata ccgcggagtg aaatagaaag tctgtgcttt ataaagggtc ttgttgcaga    5040
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cgactccaaa aggctatctt tactggaaag ataaaggaca atgctgattg cagaatgaag    5280
ctttctgaat ccaatgtggg ttaagggggt ggggagagaa aaaatggaga cagagtagta    5340
aattctactc tggtttttga actggataaa taacgactat gccatgtgaa ttgattttct    5400
ccatcaagga aatatgtttg caattctaaa agagattaat ttttttctct tacaagagaa    5460
aggaaaaagt tatttctttt gatgagtcat tttttaaaaa agggacacca taacttctta    5520
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ggcaccgctc gcacctgcgc acaggcataa gccaaatgga actacgagac ctgcatcgtg    5880
gtgtaactat aacggtccta aggtagcgac cgcggagact aggtgtattt atctaagcga    5940
tcgcttaatt aaggccggcc gccgcaataa aatatcttta ttttcattac atctgtgtgt    6000
tggttttttg tgtgaatcca tagtactaac atacgctctc catcaaaaca aaacgaaaca    6060
aaacaaacta gcaaaatagg ctgtccccag tgcaagtcca ggtgccagaa catttctcta    6120
tccataatgc aggggtaccg ggtgatgacg gtgaaaacct ccaattgcgg agtactgtcc    6180
tccgagcgga gtactgtcct ccgagcggag tactgtcctc cgagcggagt actgtcctcc    6240
gagcggagta ctgtcctccg agcggagtac tgtcctccga gcggagagtc cccggggacc    6300
tagagggtat ataatgggtg ccttagctgg tgtgtgacct catcttcctg tacgcccctg    6360
caggggcgcg ccacgcgtcg aagaaggtga gtaatcttaa catgctcttt tttttttttt    6420
ttgctaatcc cttttgtgtg ctgatgttag gatgacattt acaacaaatg tttgttcctg    6480
acaggaaaaa ccttgctggg taccttcgtt gccggacact tcttgtcctc tactttggaa    6540
aaaaggaatt gagagccgct agcgccacca tgctgcccgc ccaggtcgcc ttcaccccct    6600
acgcccccga gcccggcagc acctgtagac tgagagagta ttacgaccag accgcccaga    6660
tgtgctgctc caagtgcagc cccggccagc acgccaaggt gttctgcacc aagaccagcg    6720
acaccgtctg cgacagctgc gaggacagca cctacaccca gctgtggaac tgggtgcccg    6780
agtgcctgag ctgcggcagc agatgtagca gcgaccaggt ggagacccag gcttgcacca    6840
gagagcagaa cagaatctgc acctgtagac ccggctggta ctgcgccctg agcaagcagg    6900
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cccccatcga gaaaaccatc agcaaggcca agggccagcc cagagagccc caggtgtaca    7680
ccctgccccc cagcagagag gagatgacca agaaccaggt gtccctgacc tgtctggtga    7740
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cctgtccttc tgattttaaa ataactatac cagcaggagg acgtccagac acagcatagg    8580
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cgtggtaggt ccgaacgaat ccatggatta ccctgttatc cctactcaag gacatcatcc    8760
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aggtaatgaa atggcaaatc aatgtcctca gcgaaatggc atacgagtaa acttggtctg   9960
acaccgctgc atgagattat caaaaaggat cttcacctag atccttttaa attaaaaatg  10020
aagttttaaa tcaatctaaa gtatatatga gtaaacttgg tctgacagtt accaatgctt  10080
aatcagtgag gcacctatct cagcgatctg tctatttcgt tcatccatag ttgcctgact  10140
ccccgtcgtg tagataacta cgatacggga gggcttacca tctggcccca gtgctgcaat  10200
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ttgccgggaa gctagagtaa gtagttcgcc agttaatagt ttgcggagcg ttgttgccat  10380
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ccaacgatca aggcgagtta catgatcccc catgttgtgc aaaaaagcgg ttagctcctt  10500
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agcactgcat aattctctta ctgtcatgcc atccgtaaga tgcttttctg tgactggtga  10620
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gtcaatacgg gataataccg cgccacatag cagaacttta aaagtgctca tcattgggaa  10740
gcgttcttcg gggcgaaaac tctcaaggat cttaccgctg ttgagatcca gttcgatgta  10800
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aatactcata cgcttccttt ttcaatagta ttgaagcatt tatcagggtt attgtctcgg  10980
gagcgaatac atatttgaat gtatttagaa aaa                               11013
 
<210>17
<211>15706
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>编码依那西普和EPO的合成双启动子炎症+缺氧诱导型基因开关构建物
 
<400>17
taaacaaata ggggttccgc gcacatttcc ccgaaaagtg ccacctgacg tactgaggac   60
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gagcgtgctg accgtgctgc accagaactg gctggacggc aaggagtaca agtgcaaggt    7320
gtccaacaag gccctgcccg cccccatcga gaaaaccatc agcaaggcca agggccagcc    7380
cagagagccc caggtgtaca ccctgccccc cagcagagag gagatgacca agaaccaggt    7440
gtccctgacc tgtctggtga agggcttcta ccccagcgac atcgccgtgg agtgggagag    7500
caacggccag cccgagaaca actacaagac cacccccccc gtgctggaca gcgacggcag    7560
cttcttcctg tacagcaagc tgaccgtgga caagagcaga tggcagcagg gcaacgtgtt    7620
cagctgctcc gtgatgcacg aggccctgca caaccactac acccagaagt ccctgagcct    7680
gagccccggc aagtgaatcg attgcgcaaa gctttcgcga taggcgagac caatgggtgt    7740
gtacgtagcg gccgcgtcga cgatagcttg atgggtggca tccctgtgac ccctccccag    7800
tgcctctcct ggccctggaa gttgccactc cagtgcccac cagccttgtc ctaataaaat    7860
taagttgcat cattttgtct gactaggtgt ccttctataa tattatgggg tggagggggg    7920
tggtatggag caaggggcaa gttgggaaga caacctgtag ggcctgcggg gtctattggg    7980
aaccaagctg gagtgcagtg gcacaatctt ggctcactgc aatctccgcc tcctgggttc    8040
aagcgattct cctgcctcag cctcccgagt tgttgggatt ccaggcatgc atgaccaggc    8100
tcagctaatt tttgtttttt tggtagagac ggggtttcac catattggcc aggctggtct    8160
ccaactccta atctcaggtg atctacccac cttggcctcc caaattgctg ggattacagg    8220
cgtgaaccac tgctcccttc cctgtccttc tgattttaaa ataactatac cagcaggagg    8280
acgtccagac acagcatagg ctacctggcc atgcccaacc ggtgggacat ttgagttgct    8340
tgcttggcac tgtcctctca tgcgttgggt ccactcagta gatgcctgtt gaattctgat    8400
ttaaatcggt ccgcgtacgg cgtggtaggt ccgaacgaat ccatggatta ccctgttatg    8460
tggtcctcca gggttgccgt tccttaacta taacggtcct aaggtagcga ccgcggagac    8520
taggtgtatt tatctaagcg atcgcttaat taaggccggc cgccgcaata aaatatcttt    8580
attttcatta catctgtgtg ttggtttttt gtgtgaatcc atagtactaa catacgctct    8640
ccatcaaaac aaaacgaaac aaaacaaact agcaaaatag gctgtcccca gtgcaagtcc    8700
aggtgccaga acatttctct atccataatg caggggtacc gggtgatgac ggtgaaaacc    8760
tccaattgtg ctgtatataa aaccagtggt tatatgtaca gtactgctgt atataaaacc    8820
agtggttata tgtacagtac gtcgactgct gtatataaaa ccagtggtta tatgtacagt    8880
actgctgtat ataaaaccag tggttatatg tacagtaccc cggggaccta gagggtatat    8940
aatgggtgcc ttagctggtg tgtgacctca tcttcctgta cgcccctgca ggggcgcgcc    9000
acgcgtcgaa gaaggtgagt aatcttaaca tgctcttttt tttttttttt gctaatccct    9060
tttgtgtgct gatgttagga tgacatttac aacaaatgtt tgttcctgac aggaaaaacc    9120
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tttacgcttg gaaaagaatg gaggtcggcc aacaggctgt ggaagtgtgg cagggactgg    9480
ctctgctgtc cgaagccgtc ctgaggggcc aagccctcct ggtcaactcc agccaaccct    9540
gggagcctct gcaactgcat gtggataagg ctgtgtccgg cctcagatcc ctgacaaccc    9600
tcctgagagc cctgggcgct cagaaagagg ctatctcccc ccctgacgct gcctccgccg    9660
ctcccctcag aacaatcaca gccgatacct ttagaaaact gtttagagtc tactccaact    9720
ttctgagggg caaactgaaa ctgtataccg gagaggcttg caggaccgga gacaggtaaa    9780
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gagaacttgt ttattgcagc ttataatggt tacaaataaa gcaatagcat cacaaatttc    9900
acaaataaag catttttttc actgcattct agttgtggtt tgtccaaact catcaatgta    9960
tcttatcatg tctcgtacgg cgtggtaggt ccgaacgaat ccatggatta ccctgttatc   10020
cctactcatc ttcgtcggac gcgccgttaa tatttgatca gccattctct gtatgagtac   10080
taacgaacgt gacgcggtgt tactggtaac tatgactctc ttaaggtagc caaatacatc   10140
atccctttag tgagggttaa ttcacgcagt gccgcggcgt gtagaaaata cctatcagct   10200
cgaggacgtg acaaacgaag ccgcacgtca gggccggacg tggggcccca gagcgacgct   10260
gagtgcgtgc gggactcgga gtacgtgacg gagcccccac gtgggttccc gcacgtccgc  10320
gacgtgacaa acgaagccgc acgtcagggc cggacgtggg gccccagagc gacgctgagt  10380
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tgacaaacga agccgcacgt cagggccgga cgtggggccc cagagcgacg ctgagtgcgt  10500
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tatctcccag acaggaatgc cccctaccag ggccgaaatc gctcagaggc tgggattcag  11220
gagccctaac gctgccgaag aacatctgaa agccctcgcc aggaagggag tgattgagat  11280
tgtgtccggc gcttccaggg gcattagact cctgcaagag gaggaagaag gactccccct  11340
cgtgggaagg gtcgccgctg gcgaacccct cctggctcaa caacacattg agggacacta  11400
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gagcatgaag gatattggaa tcatggacgg agacctcctg gctgtgcata agacacagga  11520
tgtgaggaac ggacaggtcg tggtcgccag gatcgacgac gaagtgacag tgaaaagact  11580
caagaaacag ggaaacaaag tggaactgct ccccgaaaac tccgagttta agcctatcgt  11640
cgtggatctg aggcagcaat cctttaccat tgagggactg gctgtgggag tgattagaaa  11700
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cgctatgaaa agaaaagaga aaaaggctca gaaagagaaa gacaaactgc ctgtgtccac  11820
cacaaccgtc gatgatcaca tgccccctat catgcagtgt gagcctcccc ctcccgaagc  11880
cgctagaatc cacgaagtcg tccccaggtt cctctccgat aagctcctgg aaaccaatag  11940
acaaaagaat atccctcaac tcaccgctaa ccaacagttt ctgattgcca ggctgatttg  12000
gtatcaggat ggctatgagc aaccctccga cgaagacctc aagaggatca cacagacatg  12060
gcaacaggct gacgatgaga atgaggaaag cgatacccct ttcaggcaga ttaccgaaat  12120
gacaatcctc accgtccagc tcatcgtcga gtttgccaaa ggactccccg gattcgctaa  12180
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ctataccagg gacaattaca ggaaggctgg catggcctat gtgattgagg atgtgctcca  12360
cttttgcaga tgtatgtact ccatggctct cgataacatt cactatgccc tcctgacagc  12420
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gcaaaactcc aatatgtgca ttagcctcaa gctcaagaat agaaaactgc ctccctttct  12660
ggaagaaatt tgggatgtgg ctgacatgag ccatacccaa ccccctccca ttctggaaag  12720
ccctaccaat ctgtaaatcg atagccgcct ggctgagatg gggtgggcag ggcagagctg  12780
atcagggccg agcagaaccg cactcttccc aaataaagct tcctccttga aacacaaatg  12840
tttcttactt acaccccatc ctgatttctt ttcttgagac cagagagtgg gaaagctctc  12900
tcttgacctg aggatggatc tgaaaattat gagccccttg aggacaggga atgttattca  12960
tctttgaatt ccgcagcatc tagcaccagg tcttgtacag agcaggtgcc caataaatgg  13020
ttgaatgaat atatgaaaag tagaggcaga gggctgggca cagtggctca cgcctgtaat  13080
cctagcactt tgggaggctg aggtgggtgg atcacttgag gtcaggagtt cgagaccagc  13140
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ctgtaatccc agctactcag gaggctgagg caggagaatc acttgaaccc aggaggagga  13260
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catctcaaaa acaaaaaaca aaacaaaaca aaaagaaaaa agaaaagtag gggcagagat  13380
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ccaggtgtct agacgaggac gctcgggctt ggacccatgg cacatcgtgt aatcatggtc  13560
atagctgttt cctgtgtgaa attgttatcc gctacgtctc tcccccgcag taagggctag  13620
attaactcgt ctcgtgaata tccggaactc cctttagtga gggttaattg cgttgcgctc  13680
actgcccgct ttccagtcgg gaaacctgtc gtgccagctt aatcatggtc atagctgttt  13740
cctgtgtgaa attgttatcc gctaccggaa acgcttcctt catgtgagca aaaggccagc  13800
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ctgacgagca tcacaaaaat cgacgctcaa gtcagaggtg gcgaaacccg acaggactat  13920
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cgcttaccgg atacctgtcc gcctttctcc cttcgggaag cgtggcgctt tctcatagct  14040
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ggtatgtagg cggtgctaca gagttcttga agtggtggcc taactacggc tacactagaa  14280
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gctcttgatc cggcaaacaa accaccgctg gtagcggtgg tttttttgtt tgcaagcagc  14400
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acgctcagtg gaacgaaaac tcacgttaag ggattttggt catgcctagg acgaaaggag  14520
gtcgtgaaat ggataaaaaa atacagcgtt tttcatgtac aactatacta gttgtagtgc  14580
ctaaataatg cttttaaaac ttaaaaatac gtttaaaccc tcagcgaaat ggcatacgag  14640
taaacttggt ctgacaccgc tgcatgagat tatcaaaaag gatcttcacc tagatccttt  14700
taaattaaaa atgaagtttt aaatcaatct aaagtatata tgagtaaact tggtctgaca  14760
gttaccaatg cttaatcagt gaggcaccta tctcagcgat ctgtctattt cgttcatcca  14820
tagttgcctg actccccgtc gtgtagataa ctacgatacg ggagggctta ccatctggcc  14880
ccagtgctgc aatgataccg cgagacccac gctcaccggc tccagattta tcagcaataa  14940
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agtctattaa ctgttgccgg gaagctagag taagtagttc gccagttaat agtttgcgga  15060
gcgttgttgc cattgctaca ggcatcgtgg tgtcacgctc gtcgtttggt atggcttcat  15120
tcagctccgg ttcccaacga tcaaggcgag ttacatgatc ccccatgttg tgcaaaaaag  15180
cggttagctc cttcggtcct ccgatggttg tcagaagtaa gttggccgca gtgttatcac  15240
tcatggttat ggcagcactg cataattctc ttactgtcat gccatccgta agatgctttt  15300
ctgtgactgg tgagtattca accaagtcat tctgagaata gtgtatgcgg cgaccgagtt  15360
gctcttgccc ggcgtcaata cgggataata ccgcgccaca tagcagaact ttaaaagtgc  15420
tcatcattgg gaagcgttct tcggggcgaa aactctcaag gatcttaccg ctgttgagat  15480
ccagttcgat gtaacccaca cgagcaccca actgatcttc agcatctttt actttcacca 15540
gcgtttctgg gtgagcaaaa acaggaaggc aaaatgccgc aaaaaaggga ataagggcga 15600
cacggaaatg ttgaatactc atacgcttcc tttttcaata gtattgaagc atttatcagg 15660
gttattgtct cgggagcgaa tacatatttg aatgtattta gaaaaa                15706
 
<210>18
<211>17505
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>编码人因子VIII：C的合成双启动子基因开关构建物
 
<400>18
taaacaaata ggggttccgc gcacatttcc ccgaaaagtg ccacctgacg tactgaggac   60
gccagggttt tcccagtcac gacgttgtaa aacgacggcc agtagcagac aagcccgtca  120
gggcgcgtca gcgggtgttg gccctaggac gaaaggaggt cgtgaaatgg ataaaaaaat  180
acagcgtttt tcatgtacaa ctatactagt tgtagtgcct aaataatgct tttaaaactt  240
aaaaataatc aatgtcctca gcggggtgtc ggggatttag gtgacactat aggctgagcg  300
ccgcacaggc atctagaggc tatggcaggg cctgccgccc cgacgttggc tgcgagccct  360
gggccttcac ccgaacttgg ggggtggggt ggggaaaagg aagaaacgcg ggcgtattgg  420
ccccaatggg gtctcggtgg ggtatcgaca gagtgccagc cctgggaccg aaccccgcgt  480
ttatgaacaa acgacccaac accgtgcgtt ttattctgtc tttttattgc cgtcatagcg  540
cgggttcctt ccggtattgt ctccttccgt gtttcaatcg attcaaaaga actcgtccag  600
cagacggtaa aaagcaatgc gttgagaatc cggtgcagca atgccataca gcaccagaaa  660
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ttccaccata atgtttggca gacaagcatc gccgtgggtc acaaccaggt cctcgccatc  840
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cggttccgcc ggggccctcc acgccctggt cgcttttctg ctccacggcg agttcggcct    2700
ccagaatcct gtccacgggc atctccatat ggccgccgta ctcgtcgatg cccagggcgt    2760
cggtgaacat ctgctcgaac tcgaagtcgg ccatgtccag ggcgccgtag ggggcgctgt    2820
cgtggggggt gaagccgggg ccggggctgt cgccgtcgcc cagcatgtcc aggtcgaagt    2880
cgtccagggc gtcggcgtgg gccatggcca cgtcctcgcc gtccaggtgc agctcgtcgc    2940
ccaggctcac gtcggtgggg ggggccacct tccttttctt cttggggccc atggtggcca    3000
attgcccccc cccccccccg catgccgtct aacaaaaaag ccaaaaacgg ccagaattta    3060
gcggacaatt tactagtcta acactgaaaa ttacatattg acccaaatga ttacatttca    3120
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cagcagcccg ctactcacca agtgacgatc acagcgatcc acaaacaaga accgcgaccc    3240
aaatcccggc tgcgacggaa ctagctgtgc cacacccggc gcgtccttat ataatcatcg    3300
gcgttcaccg ccccacggag atccctccgc agaatcgccg agaagggact acttttcctc    3360
gcctgttccg ctctctggaa agaaaaccag tgccctagag tcacccaagt cccgtcctaa    3420
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gctcgccgtg aggagggggg cgcccgcggg aggcgccaaa acccggcgcg gaggccctcg    3600
agtaggcgag accaatgggt gcgccatggg ctcttccaaa aatttaggtg acactatagg    3660
gcaccgctcg cacctgcgca caggcccgcg gctacaaact acgaacgatc attctagata    3720
ccacatttgt agaggtttta cttgctttaa aaaacctccc acatctcccc ctgaacctga    3780
aacataaaat gaatgcaaat gttttattaa cttgtttatt gcagcttata atggttacaa    3840
attaagcaat agcatcacaa atttcacaaa ttaagcattt ttttcactgc attctagttg    3900
tggtttgtcc aaactcatca atgtatctta tcatgtctaa tcgattcaca ggttggtggg    3960
gctctccagg atgggggggg gctgggtgtg gctcatgtcg gccacgtccc aaatctcctc    4020
caggaagggg ggcagcttcc tgttcttcag cttcaggctg atacacatat tgctgttctg    4080
cattcccagg gtcctcagct cgctcaggat gctcaggatc ttgccgtaga tcacgctgct    4140
cctggcgctg ccgctcagct ggttcaggat gtagatcctc agggtgttca ggtagtacct    4200
ctggatctcc tccaccagct ggggctgctc caggccgggc ctgtcgctga agatcaccac    4260
ggcggtcagc agggcgtagt ggatgttgtc cagggccatg ctgtacatac atctgcagaa    4320
gtgcaggagg tcctcgatca cctcggccat gccagccttc ctgtagttgt ccctggtgta    4380
agcctggttg ttggcgaaca ggatgctgtc gctggcggcg tcgtacctcc tggccaccct    4440
cagcatcatc acctcgctgc tgcaagcctt cagcagggtg atctggtcgg gctggctgat    4500
cttggcgaat ccgggcaggc ccttggcgaa ctccacgatc agctgcacgg tcaggatggt    4560
catctcggtg atctgcctga agggggtgtc gctctcctcg ttctcgtcgt cggcctgctg    4620
ccaggtctgg gtgatccttt tcaggtcctc gtcgctgggc tgctcgtagc cgtcctgata    4680
ccagatcagc ctggcgatca ggaactgctg gttggcggtc agctggggga tgttcttctg    4740
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ggcctcgggg ggggggggct cgcactgcat gatggggggc atgtggtcat cgacggtggt    4860
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caccctagca caagacaaaa gcaattcaat gccacaacca ttcccgaaaa cgacatcgaa    9900
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aagatccttt gatcttttct acggggtctg acgctcagtg gaacgaaaac tcacgttaag  16380
ggattttggt catgatctat gtcgggtgcg gagaaagagg taatgaaatg gcatacgagt  16440
aaacttggtc tgacaccgct gcatgagatt atcaaaaagg atcttcacct agatcctttt  16500
aaattaaaaa tgaagtttta aatcaatcta aagtatatat gagtaaactt ggtctgacag  16560
ttaccaatgc ttaatcagtg aggcacctat ctcagcgatc tgtctatttc gttcatccat  16620
agttgcctga ctccccgtcg tgtagataac tacgatacgg gagggcttac catctggccc  16680
cagtgctgca atgataccgc gagacccacg ctcaccggct ccagatttat cagcaataaa  16740
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gtctattaac tgttgccggg aagctagagt aagtagttcg ccagttaata gtttgcggag  16860
cgttgttgcc attgctacag gcatcgtggt gtcacgctcg tcgtttggta tggcttcatt  16920
cagctccggt tcccaacgat caaggcgagt tacatgatcc cccatgttgt gcaaaaaagc 16980
ggttagctcc ttcggtcctc cgatggttgt cagaagtaag ttggccgcag tgttatcact 17040
catggttatg gcagcactgc ataattctct tactgtcatg ccatccgtaa gatgcttttc 17100
tgtgactggt gagtattcaa ccaagtcatt ctgagaatag tgtatgcggc gaccgagttg 17160
ctcttgcccg gcgtcaatac gggataatac cgcgccacat agcagaactt taaaagtgct 17220
catcattggg aagcgttctt cggggcgaaa actctcaagg atcttaccgc tgttgagatc 17280
cagttcgatg taacccacac gagcacccaa ctgatcttca gcatctttta ctttcaccag 17340
cgtttctggg tgagcaaaaa caggaaggca aaatgccgca aaaaagggaa taagggcgac 17400
acggaaatgt tgaatactca tacgcttcct ttttcaatag tattgaagca tttatcaggg 17460
ttattgtctc gggagcgaat acatatttga atgtatttag aaaaa                 17505
 
<210>19
<211>16379
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>编码人因子VIII：C的合成单启动子基因开关构建物
 
<400>19
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gccagggttt tcccagtcac gacgttgtaa aacgacggcc agtagcagac aagcccgtca  120
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ctgggacaat cactatggca cacagattcc caaagaggaa tggaaaagcc aagagaaaag  11100
ccctgagaaa accgctttca aaaagaaaga cacaatcctg agcctcaacg cttgcgaaag  11160
caatcacgct atcgctgcca ttaacgaagg ccaaaacaaa cccgaaatcg aagtgacatg  11220
ggccaagcag ggcaggaccg aaagactctg ctcccagaat ccccctgtgc tcaagaggca  11280
ccaaagagaa atcacaagaa caaccctcca gtccgaccaa gaggaaatcg actacgatga  11340
cacaatctcc gtggaaatga aaaaggagga ctttgacatt tacgatgagg atgagaatca  11400
gtcccccagg agctttcaga aaaagacaag acattacttt atcgctgccg tcgagaggct  11460
gtgggactat ggcatgagca gcagccctca cgtcctgagg aacagagccc agagcggaag  11520
cgtcccccaa ttcaaaaagg tcgtgtttca ggagttcaca gacggcagct tcacccaacc  11580
cctctacagg ggcgaactga atgagcatct gggactgctc ggcccttaca ttagagccga  11640
ggtggaggat aacattatgg tcacctttag aaatcaggcc agcaggccct atagctttta  11700
ctccagcctc atctcctacg aggaagatca gaggcaggga gccgaaccca ggaagaattt  11760
cgtcaagcct aacgaaacca aaacctattt ctggaaggtc cagcatcaca tggcccctac  11820
caaagacgaa tttgattgca aagcctgggc ctatttctcc gacgttgacc tggagaaaga  11880
cgtgcattcc ggcctcatcg gacccctcct ggtctgccat accaataccc tcaaccctgc  11940
ccacggcaga caggtgaccg tccaggagtt tgctctgttt ttcacaatct ttgacgaaac  12000
caaaagctgg tactttaccg aaaacatgga gaggaactgt agagccccct gtaacattca  12060
gatggaggac cccacattca aagagaatta caggttccat gccattaacg gatacattat  12120
ggataccctc cccggactgg tcatggctca ggatcagagg atcaggtggt atctgctgtc  12180
tatgggctcc aacgaaaaca ttcactccat ccatttctcc ggccatgtgt ttaccgtcag  12240
aaaaaaggag gagtataaga tggccctcta caatctgtat cccggagtgt ttgagacagt  12300
ggaaatgctc ccctccaagg ctggcatttg gagggtggaa tgcctcatcg gagagcatct  12360
gcacgccgga atgtccaccc tgtttctcgt gtatagcaat aagtgtcaga cacccctcgg  12420
catggcctcc ggccatatca gggactttca gattaccgcc agcggacagt atggccaatg  12480
ggctcccaaa ctggctagac tccactatag cggaagcatt aacgcttggt ccaccaaaga  12540
gcctttctcc tggattaagg tggacctcct ggctcccatg attatccacg gaatcaaaac  12600
ccaaggcgct agacaaaagt ttagctccct gtatatctcc cagtttatca ttatgtatag  12660
cctcgacgga aagaaatggc aaacctatag aggaaactcc accggaaccc tcatggtgtt  12720
ctttggcaat gtggatagct ccggcattaa gcataacatt ttcaatcccc ctatcattgc  12780
caggtacatt agactccacc ctacccatta ctccatcagg agcacactga ggatggaact  12840
gatgggctgt gacctcaact cctgctccat gcccctcggc atggaaagca aagccattag  12900
cgatgcccaa atcacagcct ccagctattt cacaaatatg ttcgctacct ggagccctag  12960
caaagccagg ctgcatctgc aaggcaggag caatgcctgg agacctcagg tcaacaatcc  13020
caaagagtgg ctgcaagtgg atttccaaaa gacaatgaaa gtgacaggcg tcaccacaca  13080
gggagtgaaa agcctcctga caagcatgta cgtcaaggag ttcctcatct ccagctccca  13140
ggatggccat cagtggaccc tgttctttca gaatggcaaa gtgaaagtgt ttcagggaaa  13200
ccaagactcc ttcacacccg tcgtgaatag cctcgaccct cccctcctga caagatacct  13260
gagaatccac ccccaaagct gggtgcatca gattgccctc agaatggagg tcctgggatg  13320
cgaagcccaa gacctctact aaatcgattg cgcaaagctt tcgcgatagg cgagaccaat  13380
gggtgtgtac gtagcggccg cgtcgacgat agcttgatgg gtggcatccc tgtgacccct  13440
ccccagtgcc tctcctggcc ctggaagttg ccactccagt gcccaccagc cttgtcctaa  13500
taaaattaag ttgcatcatt ttgtctgact aggtgtcctt ctataatatt atggggtgga  13560
ggggggtggt atggagcaag gggcaagttg ggaagacaac ctgtagggcc tgcggggtct  13620
attgggaacc aagctggagt gcagtggcac aatcttggct cactgcaatc tccgcctcct  13680
gggttcaagc gattctcctg cctcagcctc ccgagttgtt gggattccag gcatgcatga  13740
ccaggctcag ctaatttttg tttttttggt agagacgggg tttcaccata ttggccaggc  13800
tggtctccaa ctcctaatct caggtgatct acccaccttg gcctcccaaa ttgctgggat  13860
tacaggcgtg aaccactgct cccttccctg tccttctgat tttaaaataa ctataccagc  13920
aggaggacgt ccagacacag cataggctac ctggccatgc ccaaccggtg ggacatttga  13980
gttgcttgct tggcactgtc ctctcatgcg ttgggtccac tcagtagatg cctgttgaat  14040
tctgatttaa atcggtccgc gtacggcgtg gtaggtccga acgaatccat ggattaccct  14100
gttatcccta ctcaaggaca tcatcccttt agtgagggtt aattcacgca gtgggtacgg  14160
aactaaaggc agcacacatc gtgtaatcat ggtcatagct gtttcctgtg tgaaattgtt  14220
atccgctacg tctctccccc gcagtaaggg ctagattaac tcgtctcgtg aatatccgga  14280
actcccttta gtgagggtta attgcgttgc gctcactgcc cgctttccag tcgggaaacc  14340
tgtcgtgcca gcttaatcat ggtcatagct gtttcctgtg tgaaattgtt atccgctacc  14400
ggaaacgctt ccttcatgtg agcaaaaggc cagcaaaagg ccaggaaccg taaaaaggcc  14460
gcgttgctgg cgtttttcca taggctccgc ccccctgacg agcatcacaa aaatcgacgc  14520
tcaagtcaga ggtggcgaaa cccgacagga ctataaagat accaggcgtt tccccctgga  14580
agctccctcg tgcgctctcc tgttccgacc ctgccgctta ccggatacct gtccgccttt  14640
ctcccttcgg gaagcgtggc gctttctcat agctcacgct gtaggtatct cagttcggtg  14700
taggtcgttc gctccaagct gggctgtgtg cacgaacccc ccgttcagcc cgaccgctgc  14760
gccttatccg gtaactatcg tcttgagtcc aacccggtaa gacacgactt atcgccactg  14820
gcagcagcca ctggtaacag gattagcaga gcgaggtatg taggcggtgc tacagagttc  14880
ttgaagtggt ggcctaacta cggctacact agaagaacag tatttggtat ctgcgctctg  14940
ctgaagccag ttaccttcgg aaaaagagtt ggtagctctt gatccggcaa acaaaccacc  15000
gctggtagcg gtggtttttt tgtttgcaag cagcagatta cgcgcagaaa aaaaggatct  15060
caagaagatc ctttgatctt ttctacgggg tctgacgctc agtggaacga aaactcacgt  15120
taagggattt tggtcatgcc taggacgaaa ggaggtcgtg aaatggataa aaaaatacag  15180
cgtttttcat gtacaactat actagttgta gtgcctaaat aatgctttta aaacttaaaa  15240
ataatctatg tcgggtgcgg agaaagaggt aatgaaatgg caaatcaatg tcctcagcga  15300
aatggcatac gagtaaactt ggtctgacac cgctgcatga gattatcaaa aaggatcttc  15360
acctagatcc ttttaaatta aaaatgaagt tttaaatcaa tctaaagtat atatgagtaa  15420
acttggtctg acagttacca atgcttaatc agtgaggcac ctatctcagc gatctgtcta  15480
tttcgttcat ccatagttgc ctgactcccc gtcgtgtaga taactacgat acgggagggc  15540
ttaccatctg gccccagtgc tgcaatgata ccgcgagacc cacgctcacc ggctccagat  15600
ttatcagcaa taaaccagcc agccggaagc gccgagcgca gaagtggtcc tgcaacttta  15660
tccgcctcca tccagtctat taactgttgc cgggaagcta gagtaagtag ttcgccagtt  15720
aatagtttgc ggagcgttgt tgccattgct acaggcatcg tggtgtcacg ctcgtcgttt  15780
ggtatggctt cattcagctc cggttcccaa cgatcaaggc gagttacatg atcccccatg  15840
ttgtgcaaaa aagcggttag ctccttcggt cctccgatgg ttgtcagaag taagttggcc  15900
gcagtgttat cactcatggt tatggcagca ctgcataatt ctcttactgt catgccatcc  15960
gtaagatgct tttctgtgac tggtgagtat tcaaccaagt cattctgaga atagtgtatg  16020
cggcgaccga gttgctcttg cccggcgtca atacgggata ataccgcgcc acatagcaga  16080
actttaaaag tgctcatcat tgggaagcgt tcttcggggc gaaaactctc aaggatctta  16140
ccgctgttga gatccagttc gatgtaaccc acacgagcac ccaactgatc ttcagcatct  16200
tttactttca ccagcgtttc tgggtgagca aaaacaggaa ggcaaaatgc cgcaaaaaag  16260
ggaataaggg cgacacggaa atgttgaata ctcatacgct tcctttttca atagtattga  16320
agcatttatc agggttattg tctcgggagc gaatacatat ttgaatgtat ttagaaaaa   16379
 
<210>20
<211>158
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<220>
<223>人胰岛素样生长因子(IGF-1)
 
<400>20
 
Met Gly Lys Ile Ser Ser Leu Pro Thr Gln Leu Phe Lys Cys Cys Phe
1               5                   10                  15
Cys Asp Phe Leu Lys Val Lys Met His Thr Met Ser Ser Ser His Leu
            20                  25                  30
Phe Tyr Leu Ala Leu Cys Leu Leu Thr Phe Thr Ser Ser Ala Thr Ala
        35                  40                  45
Gly Pro Glu Thr Leu Cys Gly Ala Glu Leu Val Asp Ala Leu Gln Phe
    50                  55                  60
Val Cys Gly Asp Arg Gly Phe Tyr Phe Asn Lys Pro Thr Gly Tyr Gly
65                  70                  75                  80
Ser Ser Ser Arg Arg Ala Pro Gln Thr Gly Ile Val Asp Glu Cys Cys
                85                  90                  95
Phe Arg Ser Cys Asp Leu Arg Arg Leu Glu Met Tyr Cys Ala Pro Leu
            100                 105                 110
Lys Pro Ala Lys Ser Ala Arg Ser Val Arg Ala Gln Arg His Thr Asp
        115                 120                 125
Met Pro Lys Thr Gln Lys Tyr Gln Pro Pro Ser Thr Asn Lys Asn Thr
    130                 135                 140
Lys Ser Gln Arg Arg Lys Gly Ser Thr Phe Glu Glu Arg Lys
145                 150                 155
 
<210>21
<211>288
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
 
<220>
<223>人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)
 
<400>21
 
Met Val Gly Val Gly Gly Gly Asp Val Glu Asp Val Thr Pro Arg Pro
1               5                   10                  15
Gly Gly Cys Gln Ile Ser Gly Arg Gly Ala Arg Gly Cys Asn Gly Ile
            20                  25                  30
Pro Gly Ala Ala Ala Trp Glu Ala Ala Leu Pro Arg Arg Arg Pro Arg
        35                  40                  45
Arg His Pro Ser Val Asn Pro Arg Ser Arg Ala Ala Gly Ser Pro Arg
    50                  55                  60
Thr Arg Gly Arg Arg Thr Glu Glu Arg Pro Ser Gly Ser Arg Leu Gly
65                  70                  75                  80
Asp Arg Gly Arg Gly Arg Ala Leu Pro Gly Gly Arg Leu Gly Gly Arg
                85                  90                  95
Gly Arg Gly Arg Ala Pro Glu Arg Val Gly Gly Arg Gly Arg Gly Arg
            100                 105                 110
Gly Thr Ala Ala Pro Arg Ala Ala Pro Ala Ala Arg Gly Ser Arg Pro
        115                 120                 125
Gly Pro Ala Gly Thr Met Ala Ala Gly Ser Ile Thr Thr Leu Pro Ala
    130                 135                 140
Leu Pro Glu Asp Gly Gly Ser Gly Ala Phe Pro Pro Gly His Phe Lys
145                 150                 155                 160
Asp Pro Lys Arg Leu Tyr Cys Lys Asn Gly Gly Phe Phe Leu Arg Ile
                165                 170                 175
His Pro Asp Gly Arg Val Asp Gly Val Arg Glu Lys Ser Asp Pro His
            180                 185                 190
Ile Lys Leu Gln Leu Gln Ala Glu Glu Arg Gly Val Val Ser Ile Lys
        195                 200                 205
Gly Val Cys Ala Asn Arg Tyr Leu Ala Met Lys Glu Asp Gly Arg Leu
    210                 215                 220
Leu Ala Ser Lys Cys Val Thr Asp Glu Cys Phe Phe Phe Glu Arg Leu
225                 230                 235                 240
Glu Ser Asn Asn Tyr Asn Thr Tyr Arg Ser Arg Lys Tyr Thr Ser Trp
                245                 250                 255
Tyr Val Ala Leu Lys Arg Thr Gly Gln Tyr Lys Leu Gly Ser Lys Thr
            260                 265                 270
Gly Pro Gly Gln Lys Ala Ile Leu Phe Leu Pro Met Ser Ala Lys Ser
        275                 280                 285
 
<210>22
<211>193
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
 
<220>
<223>人促红细胞生成素
 
<400>22
 
Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu
1               5                   10                  15
Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu
            20                  25                  30
Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Gln Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu
        35                  40                  45
Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu
    50                  55                  60
Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg
65                  70                  75                  80
Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu
                85                  90                  95
Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser
            100                 105                 110
Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly
        115                 120                 125
Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu
    130                 135                 140
Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile
145                 150                 155                 160
Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu
                165                 170                 175
Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp
            180                 185                 190
Arg
 
<210>23
<211>134
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
 
<220>
<223>人BNP
 
<400>23
 
Met Asp Pro Gln Thr Ala Pro Ser Arg Ala Leu Leu Leu Leu Leu Phe
1               5                   10                  15
Leu His Leu Ala Phe Leu Gly Gly Arg Ser His Pro Leu Gly Ser Pro
            20                  25                  30
Gly Ser Ala Ser Asp Leu Glu Thr Ser Gly Leu Gln Glu Gln Arg Asn
        35                  40                  45
His Leu Gln Gly Lys Leu Ser Glu Leu Gln Val Glu Gln Thr Ser Leu
    50                  55                  60
Glu Pro Leu Gln Glu Ser Pro Arg Pro Thr Gly Val Trp Lys Ser Arg
65                  70                  75                  80
Glu Val Ala Thr Glu Gly Ile Arg Gly His Arg Lys Met Val Leu Tyr
                85                  90                  95
Thr Leu Arg Ala Pro Arg Ser Pro Lys Met Val Gln Gly Ser Gly Cys
            100                 105                 110
Phe Gly Arg Lys Met Asp Arg Ile Ser Ser Ser Ser Gly Leu Gly Cys
        115                 120                 125
Lys Val Leu Arg Arg His
    130
 
<210>24
<211>562
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
 
<220>
<223>人tPA
 
<400>24
 
Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly
1               5                   10                  15
Ala Val Phe Val Ser Pro Ser Gln Glu Ile His Ala Arg Phe Arg Arg
            20                  25                  30
Gly Ala Arg Ser Tyr Gln Val Ile Cys Arg Asp Glu Lys Thr Gln Met
        35                  40                  45
Ile Tyr Gln Gln His Gln Ser Trp Leu Arg Pro Val Leu Arg Ser Asn
    50                  55                  60
Arg Val Glu Tyr Cys Trp Cys Asn Ser Gly Arg Ala Gln Cys His Ser
65                  70                  75                  80
Val Pro Val Lys Ser Cys Ser Glu Pro Arg Cys Phe Asn Gly Gly Thr
                85                  90                  95
Cys Gln Gln Ala Leu Tyr Phe Ser Asp Phe Val Cys Gln Cys Pro Glu
            100                 105                 110
Gly Phe Ala Gly Lys Cys Cys Glu Ile Asp Thr Arg Ala Thr Cys Tyr
        115                 120                 125
Glu Asp Gln Gly Ile Ser Tyr Arg Gly Thr Trp Ser Thr Ala Glu Ser
    130                 135                 140
Gly Ala Glu Cys Thr Asn Trp Asn Ser Ser Ala Leu Ala Gln Lys Pro
145                 150                 155                 160
Tyr Ser Gly Arg Arg Pro Asp Ala Ile Arg Leu Gly Leu Gly Asn His
                165                 170                 175
Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Arg Asp Ser Lys Pro Trp Cys Tyr Val
            180                 185                 190
Phe Lys Ala Gly Lys Tyr Ser Ser Glu Phe Cys Ser Thr Pro Ala Cys
        195                 200                 205
Ser Glu Gly Asn Ser Asp Cys Tyr Phe Gly Asn Gly Ser Ala Tyr Arg
    210                 215                 220
Gly Thr His Ser Leu Thr Glu Ser Gly Ala Ser Cys Leu Pro Trp Asn
225                 230                 235                 240
Ser Met Ile Leu Ile Gly Asn Val Tyr Thr Ala Gln Asn Pro Ser Ala
                245                 250                 255
Gln Ala Leu Gly Leu Gly Lys His Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly
            260                 265                 270
Asp Ala Lys Pro Trp Cys His Val Leu Lys Asn Arg Arg Leu Thr Trp
        275                 280                 285
Glu Tyr Cys Asp Val Pro Ser Cys Ser Thr Cys Gly Leu Arg Gln Tyr
    290                 295                 300
Ser Gln Pro Gln Phe Arg Ile Lys Gly Gly Leu Phe Ala Asp Ile Ala
305                 310                 315                 320
Ser His Pro Trp Gln Ala Ala Ile Phe Ala Lys His Arg Arg Ser Pro
                325                 330                 335
Gly Glu Arg Phe Leu Cys Gly Gly Ile Leu Ile Ser Ser Cys Trp Ile
            340                 345                 350
Leu Ser Ala Ala His Cys Phe Gln Glu Arg Phe Pro Pro His His Leu
        355                 360                 365
Thr Val Ile Leu Gly Arg Thr Tyr Arg Val Val Pro Gly Glu Glu Glu
    370                 375                 380
Gln Lys Phe Glu Val Glu Lys Tyr Ile Val His Lys Glu Phe Asp Asp
385                 390                 395                 400
Asp Thr Tyr Asp Asn Asp Ile Ala Leu Leu Gln Leu Lys Ser Asp Ser
                405                 410                 415
Ser Arg Cys Ala Gln Glu Ser Ser Val Val Arg Thr Val Cys Leu Pro
            420                 425                 430
Pro Ala Asp Leu Gln Leu Pro Asp Trp Thr Glu Cys Glu Leu Ser Gly
        435                 440                 445
Tyr Gly Lys His Glu Ala Leu Ser Pro Phe Tyr Ser Glu Arg Leu Lys
    450                 455                 460
Glu Ala His Val Arg Leu Tyr Pro Ser Ser Arg Cys Thr Ser Gln His
465                 470                 475                 480
Leu Leu Asn Arg Thr Val Thr Asp Asn Met Leu Cys Ala Gly Asp Thr
                485                 490                 495
Arg Ser Gly Gly Pro Gln Ala Asn Leu His Asp Ala Cys Gln Gly Asp
            500                 505                 510
Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Leu Asn Asp Gly Arg Met Thr Leu Val
        515                 520                 525
Gly Ile Ile Ser Trp Gly Leu Gly Cys Gly Gln Lys Asp Val Pro Gly
    530                 535                 540
Val Tyr Thr Lys Val Thr Asn Tyr Leu Asp Trp Ile Arg Asp Asn Met
545                 550                 555                 560
Arg Pro
 
<210>25
<211>185
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
 
<220>
<223>人松弛素
 
<400>25
 
Met Pro Arg Leu Phe Phe Phe His Leu Leu Gly Val Cys Leu Leu Leu
1               5                   10                  15
Asn Gln Phe Ser Arg Ala Val Ala Asp Ser Trp Met Glu Glu Val Ile
            20                  25                  30
Lys Leu Cys Gly Arg Glu Leu Val Arg Ala Gln Ile Ala Ile Cys Gly
        35                  40                  45
Met Ser Thr Trp Ser Lys Arg Ser Leu Ser Gln Glu Asp Ala Pro Gln
    50                  55                  60
Thr Pro Arg Pro Val Ala Glu Ile Val Pro Ser Phe Ile Asn Lys Asp
65                  70                  75                  80
Thr Glu Thr Ile Asn Met Met Ser Glu Phe Val Ala Asn Leu Pro Gln
                85                  90                  95
Glu Leu Lys Leu Thr Leu Ser Glu Met Gln Pro Ala Leu Pro Gln Leu
            100                 105                 110
Gln Gln His Val Pro Val Leu Lys Asp Ser Ser Leu Leu Phe Glu Glu
        115                 120                 125
Phe Lys Lys Leu Ile Arg Asn Arg Gln Ser Glu Ala Ala Asp Ser Ser
    130                 135                 140
Pro Ser Glu Leu Lys Tyr Leu Gly Leu Asp Thr His Ser Arg Lys Lys
145                 150                 155                 160
Arg Gln Leu Tyr Ser Ala Leu Ala Asn Lys Cys Cys His Val Gly Cys
                165                 170                 175
Thr Lys Arg Ser Leu Ala Arg Phe Cys
            180                 185
 
<210>26
<211>728
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
 
<220>
<223>人肝细胞生长因子(HGF)
 
<400>26
 
Met Trp Val Thr Lys Leu Leu Pro Ala Leu Leu Leu Gln His Val Leu
1               5                   10                  15
Leu His Leu Leu Leu Leu Pro Ile Ala Ile Pro Tyr Ala Glu Gly Gln
            20                  25                  30
Arg Lys Arg Arg Asn Thr Ile His Glu Phe Lys Lys Ser Ala Lys Thr
        35                  40                  45
Thr Leu Ile Lys Ile Asp Pro Ala Leu Lys Ile Lys Thr Lys Lys Val
    50                  55                  60
Asn Thr Ala Asp Gln Cys Ala Asn Arg Cys Thr Arg Asn Lys Gly Leu
65                  70                  75                  80
Pro Phe Thr Cys Lys Ala Phe Val Phe Asp Lys Ala Arg Lys Gln Cys
                85                  90                  95
Leu Trp Phe Pro Phe Asn Ser Met Ser Ser Gly Val Lys Lys Glu Phe
            100                 105                 110
Gly His Glu Phe Asp Leu Tyr Glu Asn Lys Asp Tyr Ile Arg Asn Cys
        115                 120                 125
Ile Ile Gly Lys Gly Arg Ser Tyr Lys Gly Thr Val Ser Ile Thr Lys
    130                 135                 140
Ser Gly Ile Lys Cys Gln Pro Trp Ser Ser Met Ile Pro His Glu His
145                 150                 155                 160
Ser Phe Leu Pro Ser Ser Tyr Arg Gly Lys Asp Leu Gln Glu Asn Tyr
                165                 170                 175
Cys Arg Asn Pro Arg Gly Glu Glu Gly Gly Pro Trp Cys Phe Thr Ser
            180                 185                 190
Asn Pro Glu Val Arg Tyr Glu Val Cys Asp Ile Pro Gln Cys Ser Glu
        195                 200                 205
Val Glu Cys Met Thr Cys Asn Gly Glu Ser Tyr Arg Gly Leu Met Asp
    210                 215                 220
His Thr Glu Ser Gly Lys Ile Cys Gln Arg Trp Asp His Gln Thr Pro
225                 230                 235                 240
His Arg His Lys Phe Leu Pro Glu Arg Tyr Pro Asp Lys Gly Phe Asp
                245                 250                 255
Asp Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Gln Pro Arg Pro Trp Cys Tyr
            260                 265                 270
Thr Leu Asp Pro His Thr Arg Trp Glu Tyr Cys Ala Ile Lys Thr Cys
        275                 280                 285
Ala Asp Asn Thr Met Asn Asp Thr Asp Val Pro Leu Glu Thr Thr Glu
    290                 295                 300
Cys Ile Gln Gly Gln Gly Glu Gly Tyr Arg Gly Thr Val Asn Thr Ile
305                 310                 315                 320
Trp Asn Gly Ile Pro Cys Gln Arg Trp Asp Ser Gln Tyr Pro His Glu
                325                 330                 335
His Asp Met Thr Pro Glu Asn Phe Lys Cys Lys Asp Leu Arg Glu Asn
            340                 345                 350
Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Ser Glu Ser Pro Trp Cys Phe Thr Thr
        355                 360                 365
Asp Pro Asn Ile Arg Val Gly Tyr Cys Ser Gln Ile Pro Asn Cys Asp
    370                 375                 380
Met Ser His Gly Gln Asp Cys Tyr Arg Gly Asn Gly Lys Asn Tyr Met
385                 390                 395                 400
Gly Asn Leu Ser Gln Thr Arg Ser Gly Leu Thr Cys Ser Met Trp Asp
                405                 410                 415
Lys Asn Met Glu Asp Leu His Arg His Ile Phe Trp Glu Pro Asp Ala
            420                 425                 430
Ser Lys Leu Asn Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asp Asp Ala His
        435                 440                 445
Gly Pro Trp Cys Tyr Thr Gly Asn Pro Leu Ile Pro Trp Asp Tyr Cys
    450                 455                 460
Pro Ile Ser Arg Cys Glu Gly Asp Thr Thr Pro Thr Ile Val Asn Leu
465                 470                 475                 480
Asp His Pro Val Ile Ser Cys Ala Lys Thr Lys Gln Leu Arg Val Val
                485                 490                 495
Asn Gly Ile Pro Thr Arg Thr Asn Ile Gly Trp Met Val Ser Leu Arg
            500                 505                 510
Tyr Arg Asn Lys His Ile Cys Gly Gly Ser Leu Ile Lys Glu Ser Trp
        515                 520                 525
Val Leu Thr Ala Arg Gln Cys Phe Pro Ser Arg Asp Leu Lys Asp Tyr
    530                 535                 540
Glu Ala Trp Leu Gly Ile His Asp Val His Gly Arg Gly Asp Glu Lys
545                 550                 555                 560
Cys Lys Gln Val Leu Asn Val Ser Gln Leu Val Tyr Gly Pro Glu Gly
                565                 570                 575
Ser Asp Leu Val Leu Met Lys Leu Ala Arg Pro Ala Val Leu Asp Asp
            580                 585                 590
Phe Val Ser Thr Ile Asp Leu Pro Asn Tyr Gly Cys Thr Ile Pro Glu
        595                 600                 605
Lys Thr Ser Cys Ser Val Tyr Gly Trp Gly Tyr Thr Gly Leu Ile Asn
    610                 615                 620
Tyr Asp Gly Leu Leu Arg Val Ala His Leu Tyr Ile Met Gly Asn Glu
625                 630                 635                 640
Lys Cys Ser Gln His His Arg Gly Lys Val Thr Leu Asn Glu Ser Glu
                645                 650                 655
Ile Cys Ala Gly Ala Glu Lys Ile Gly Ser Gly Pro Cys Glu Gly Asp
            660                 665                 670
Tyr Gly Gly Pro Leu Val Cys Glu Gln His Lys Met Arg Met Val Leu
        675                 680                 685
Gly Val Ile Val Pro Gly Arg Gly Cys Ala Ile Pro Asn Arg Pro Gly
    690                 695                 700
Ile Phe Val Arg Val Ala Tyr Tyr Ala Lys Trp Ile His Lys Ile Ile
705                 710                 715                 720
Leu Thr Tyr Lys Val Pro Gln Ser
                725

Claims (142)

1.一种治疗、缓解或预防对象中疾病、病症或病状的方法，包括：
(a)将以下多核苷酸引入所述对象：(1)编码基因开关的第一多核苷酸，所述基因开关包含至少一个转录因子序列，其中所述至少一个转录因子序列通过与治疗开关启动子操作性结合而编码配体依赖性转录因子复合物(LDTFC)，和(2)与因子调节的启动子操作性结合的编码治疗多肽或治疗多核苷酸的第二多核苷酸，该启动子由所述配体依赖性转录因子复合物活化，其中，引入所述第一和第二多核苷酸以表达所述配体依赖性转录因子复合物；和
(b)将配体给予所述对象以诱导所述治疗多肽或治疗多核苷酸表达。
2.一种在对象中表达治疗多肽或治疗多核苷酸的方法，包括：
(a)将以下多核苷酸引入对象：(1)编码基因开关的第一多核苷酸，所述基因开关包含至少一个转录因子序列，其中所述至少一个转录因子序列通过与治疗开关启动子操作性结合而编码配体依赖性转录因子复合物，和(2)与因子调节的启动子操作性相连的编码治疗多肽或治疗多核苷酸的第二多核苷酸，该启动子由所述配体依赖性转录因子复合物活化，其中，引入所述第一和第二多核苷酸以表达所述配体依赖性转录因子复合物；和
(b)将配体给予所述对象以诱导所述治疗多肽或治疗多核苷酸表达。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述治疗开关启动子是组成型的。
4.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述治疗开关启动子在疾病、病症或病状相关条件下活化，从而在所述疾病、病症或病状相关条件下表达所述配体依赖性转录因子复合物。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述疾病、病症或病状对所述治疗多肽或治疗多核苷酸起反应。
6.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述治疗多肽或治疗多核苷酸的表达和传播水平足以治疗、缓解或预防所述疾病、病症或病状。
7.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述基因开关是基于蜕皮素受体(EcR)的基因开关。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述配体结合EcR配体结合结构域。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述配体是二酰基肼。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述配体选自：RG-115819、RG-115932和RG-115830。
11.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述配体是酰氨基酮或噁二唑啉。
12.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述基因开关包含第一治疗开关启动子控制下的第一转录因子序列和第二治疗开关启动子控制下的第二转录因子序列，其中所述第一转录因子序列和所述第二转录因子序列编码的蛋白质相互作用从而形成起到配体依赖性转录因子复合物作用的蛋白质复合物。
13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述第一治疗开关启动子和所述第二治疗开关启动子不同。
14.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述第一治疗开关启动子和所述第二治疗开关启动子相同。
15.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述第一转录因子序列编码包含异二聚体伴侣和反式激活域的蛋白质。
16.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述第二转录因子序列编码包含DNA结合结构域和配体结合结构域的蛋白质。
17.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，将所述第一和第二多核苷酸引入所述对象的一个或多个修饰细胞中。
18.如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述修饰细胞是通过将所述第一和第二多核苷酸引入已从所述对象分离的细胞制备的，从而产生修饰的自体细胞，然后重新引入所述对象。
19.如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述修饰细胞是其中掺入了所述第一和第二多核苷酸的修饰的非自体(MNA)细胞。
20.如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述MNA细胞是所述对象的自体细胞。
21.如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述MNA细胞是所述对象的异种细胞。
22.如权利要求19所述的方法，其特征在于，从选自下组的细胞类型产生所述MNA细胞：能终末分化的无限增殖细胞和原代细胞。
23.如权利要求22所述的方法，其特征在于，从选自下组的细胞类型产生所述MNA细胞：C2C12小鼠成肌细胞、HEK293人胚胎肾细胞、ARPE-19细胞、hMSC细胞、胰岛细胞、MDCK细胞、CHO细胞、星形细胞衍生细胞、少突胶质细胞衍生细胞和成肌细胞衍生细胞。
24.如权利要求23所述的方法，其特征在于，所述胰岛细胞是猪胰岛细胞。
25.如权利要求23所述的方法，其特征在于，所述胰岛细胞是获自尸体的人胰岛细胞。
26.如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述修饰细胞经处理，从而所述细胞在引入所述对象后免遭该对象的免疫系统破坏。
27.如权利要求26所述的方法，其特征在于，所述修饰细胞包含在允许所述治疗蛋白或治疗多核苷酸传播，但防止所述修饰细胞直接接触该对象的免疫系统细胞的屏障系统内。
28.如权利要求27所述的方法，其特征在于，所述屏障系统包含具有保形包被的修饰细胞。
29.如权利要求28所述的方法，其特征在于，所述保形包被包含聚合物。
30.如权利要求29所述的方法，其特征在于，所述聚合物选自：聚乙二醇和甲基丙烯酸羟乙酯-甲基丙烯酸甲酯(HEMA-MMA)。
31.如权利要求27所述的方法，其特征在于，所述屏障系统包含包裹化的修饰细胞。
32.如权利要求31所述的方法，其特征在于，所述修饰细胞包含在巨囊化器件中。
33.如权利要求32所述的方法，其特征在于，所述巨囊化器件包含一层或多层合成膜。
34.如权利要求33所述的方法，其特征在于，所述巨囊化器件包含两层或更多层合成膜，所述合成膜包含不同孔径从而调节经所述巨囊化器件的物质运输。
35.如权利要求32所述的方法，其特征在于，所述巨囊化器件包含半透聚合物外膜和支持细胞的内部支架。
36.如权利要求35所述的方法，其特征在于，所述巨囊化器件长约6mm，直径约1mm。
37.如权利要求35所述的方法，其特征在于，所述外膜包含约15nm的孔。
38.如权利要求35所述的方法，其特征在于，所述内部支架包含聚对苯二甲酸乙二酯纱线。
39.如权利要求32所述的方法，其特征在于，所述巨囊化器件的内部空间包含至少1个到约105个修饰细胞。
40.如权利要求32所述的方法，其特征在于，所述巨囊化器件包含聚合膜双层，所述双层包含层叠在内部致密孔0.45μM PFTE免疫屏障层上的5μmPTFE膜外层。
41.如权利要求40所述的方法，其特征在于，所述巨囊化器件在所述聚合膜双层外还包含无纺聚合网层。
42.如权利要求32所述的方法，其特征在于，所述巨囊化器件包含PES中空纤维器件。
43.如权利要求32所述的方法，其特征在于，所述巨囊化器件还包含缝合夹。
44.如权利要求32所述的方法，其特征在于，所述巨囊化器件是可植入和可收回的。
45.如权利要求31所述的方法，其特征在于，所述修饰细胞是微囊化的。
46.如权利要求45所述的方法，其特征在于，所述修饰细胞悬浮在生物相容包裹化材料中，然后制成珠-样结构。
47.如权利要求46所述的方法，其特征在于，所述包裹化材料包含水凝胶。
48.如权利要求46所述的方法，其特征在于，所述包裹化材料包含选自纤维素或藻酸盐的聚合物。
49.如权利要求48所述的方法，其特征在于，所述聚合物包含多聚阴离子藻酸盐和多聚阳离子聚合物，从而相互作用并形成物理透过选择性膜屏障。
50.如权利要求46所述的方法，其特征在于，所述珠-样结构各包含至少1个到约103个修饰细胞。
51.如权利要求46所述的方法，其特征在于，所述珠-样结构包含聚(L-丙交酯)酸(PLLA)藻酸盐微球。
52.如权利要求48所述的方法，其特征在于，所述珠-样结构还包含聚-L-鸟氨酸(PLO)藻酸盐包被。
53.如权利要求48所述的方法，其特征在于，所述包裹化材料包含基于藻酸盐的超高粘度(UHV)-生物聚合物。
54.如权利要求53所述的方法，其特征在于，所述基于藻酸盐的UHV-聚合物是生物可降解的。
55.如权利要求46所述的方法，其特征在于，所述珠-样结构是大致球形的，直径约500μm。
56.如权利要求27所述的方法，其特征在于，所述屏障系统还包含能为所述修饰细胞提供保护作用的保护细胞，其中所述保护细胞选自塞托利细胞和红细胞。
57.如权利要求27所述的方法，其特征在于，所述屏障系统还包含能产生保护性微环境的外层包被。
58.如权利要求57所述的方法，其特征在于，所述保护性微环境是抗炎性的。
59.如权利要求57所述的方法，其特征在于，所述保护性微环境是促血管生成性的。
60.如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述修饰细胞还包含调节型自杀基因，其在激活后诱导破坏所述修饰细胞。
61.如权利要求60所述的方法，其特征在于，所述自杀基因在逃离屏障系统或致癌转化事件中激活。
62.在一种或多种修饰细胞中表达治疗多肽或治疗多核苷酸的方法，包括：
(a)将以下多核苷酸引入细胞从而产生修饰的细胞：(1)编码基因开关的第一多核苷酸，所述基因开关包含至少一个转录因子序列，其中所述至少一个转录因子序列通过与治疗开关启动子操作性结合而编码配体依赖性转录因子复合物，和(2)与因子调节的启动子操作性结合的编码治疗多肽或治疗多核苷酸的第二多核苷酸，该启动子由所述配体依赖性转录因子复合物活化；和
(b)将配体给予所述修饰细胞以诱导所述治疗多肽或治疗多核苷酸表达。
63.如权利要求62所述的方法，其特征在于，所述治疗开关启动子是组成型的。
64.如权利要求62所述的方法，其特征在于，所述治疗开关启动子在疾病、病症或病状相关条件下活化，从而在所述疾病、病症或病状相关条件下表达所述配体依赖性转录因子复合物。
65.如权利要求62所述的方法，其特征在于，所述方法在体外进行。
66.如权利要求62所述的方法，其特征在于，所述方法在已从对象分离的细胞中离体进行。
67.如权利要求62所述的方法，其特征在于，所述方法在体内进行。
68.一种包含编码基因开关的第一多核苷酸的核酸组合物，所述基因开关包含至少一个转录因子序列，其中所述至少一个转录因子序列与治疗开关启动子操作性结合而编码配体依赖性转录因子复合物。
69.如权利要求68所述的核酸组合物，其特征在于，所述治疗开关启动子是组成型的。
70.如权利要求68所述的核酸组合物，其特征在于，所述治疗开关启动子在疾病、病症或病状相关条件下活化，从而在所述疾病、病症或病状相关条件下表达所述配体依赖性转录因子复合物。
71.如权利要求68所述的核酸组合物，其特征在于，还包含与启动子操作性结合的编码疾病、病症或病状相关的多肽或多核苷酸的第二多核苷酸，该启动子由所述配体依赖性转录因子复合物活化。
72.如权利要求71所述的核酸组合物，其特征在于，所述疾病、病症或病状相关多肽或多核苷酸包括能治疗、缓解或预防疾病、病症或病状的治疗多肽或治疗多核苷酸。
73.如权利要求68-72中任一项所述核酸组合物，其特征在于，所述基因开关是基于EcR的基因开关。
74.如权利要求73所述的核酸组合物，其特征在于，所述配体结合EcR配体结合结构域。
75.如权利要求74所述的核酸组合物，其特征在于，所述配体是二酰基肼。
76.如权利要求75所述的核酸组合物，其特征在于，所述配体选自：RG-115819、RG-115932和RG-115830。
77.如权利要求74所述的方法，其特征在于，所述配体是酰氨基酮或噁二唑啉。
78.如权利要求68-72中任一项所述的方法，其特征在于，所述基因开关包含第一治疗开关启动子控制下的第一转录因子序列和第二治疗开关启动子控制下的第二转录因子序列，其中所述第一转录因子序列和所述第二转录因子序列编码的蛋白质相互作用从而形成起到配体依赖性转录因子复合物作用的蛋白质复合物。
79.如权利要求78所述的多核苷酸，其特征在于，所述第一治疗开关启动子和所述第二治疗开关启动子不同。
80.如权利要求78所述的核酸组合物，其特征在于，所述第一治疗开关启动子和所述第二治疗开关启动子相同。
81.如权利要求78所述的核酸组合物，其特征在于，所述第一转录因子序列编码包含异二聚体伴侣和反式激活域的蛋白质。
82.如权利要求78所述的核酸组合物，其特征在于，所述第二转录因子序列编码包含DNA结合结构域和配体结合结构域的蛋白质。
83.如权利要求71所述的核酸组合物，其特征在于，还包含操作性连接于诱导型启动子，编码致死多肽的第三多核苷酸。
84.一种包含权利要求71所述核酸组合物的载体。
85.如权利要求84所述的载体，其特征在于，所述载体是质粒载体。
86.如权利要求84所述的载体，其特征在于，所述载体是病毒载体。
87.一种包含权利要求71所述核酸组合物的试剂盒。
88.一种包含权利要求84所述载体的试剂盒。
89.一种产生修饰细胞的方法，包括将权利要求71所述的核酸组合物引入细胞。
90.一种产生修饰细胞的方法，包括将权利要求84所述的载体引入细胞。
91.一种包含权利要求71所述的核酸组合物的修饰细胞。
92.一种包含权利要求84所述的载体的修饰细胞。
93.如权利要求91所述的修饰细胞，其特征在于，其是衍生自从需要所述多肽或多核苷酸的对象分离的细胞的修饰自体细胞，其中所述修饰细胞适于重新引入所述对象。
94.如权利要求91所述的修饰细胞，其特征在于，其衍生自选自下组的细胞类型：能终末分化的无限增殖细胞和原代细胞。
95.如权利要求94所述的修饰细胞，其特征在于，其衍生自选自下组的细胞类型：C2C12小鼠成肌细胞、HEK293人胚胎肾细胞、ARPE-19细胞、hMSC细胞、胰岛细胞、MDCK细胞、CHO细胞、星形细胞衍生细胞、少突胶质细胞衍生细胞和成肌细胞衍生细胞。
96.如权利要求95所述的修饰细胞，其特征在于，所述胰岛细胞是猪胰岛细胞。
97.如权利要求95所述的修饰细胞，其特征在于，所述胰岛细胞是获自尸体的人胰岛细胞。
98.如权利要求91所述的修饰细胞，其特征在于，所述修饰细胞还包含调节型自杀基因，其在激活后诱导破坏所述修饰细胞。
99.如权利要求98所述的修饰细胞，其特征在于，所述自杀基因在逃离屏障系统或致癌转化事件中激活。
100.一种包含一种或多种如权利要求91-99中任一项所述修饰细胞的生物反应器器件。
101.如权利要求100所述的生物反应器器件，其特征在于，所述修饰细胞经处理，从而所述细胞在引入对象后免遭该对象的免疫系统破坏。
102.如权利要求100所述的生物反应器器件，其特征在于，所述修饰细胞包含在允许所述多肽或多核苷酸传播，但防止所述修饰细胞直接接触该对象的免疫系统细胞的屏障系统内。
103.如权利要求102所述的生物反应器器件，其特征在于，所述屏障系统包含具有保形包被的修饰细胞。
104.如权利要求103所述的生物反应器器件，其特征在于，所述保形包被包含聚合物。
105.如权利要求104所述的生物反应器器件，其特征在于，所述聚合物选自：聚乙二醇和甲基丙烯酸羟乙酯-甲基丙烯酸甲酯(HEMA-MMA)。
106.如权利要求102所述的生物反应器器件，其特征在于，所述屏障系统包含包裹化的修饰细胞。
107.如权利要求106所述的生物反应器器件，其特征在于，所述修饰细胞包含在巨囊化器件中。
108.如权利要求107所述的生物反应器器件，其特征在于，所述巨囊化器件包含一层或多层合成膜。
109.如权利要求108所述的生物反应器器件，其特征在于，所述巨囊化器件包含两层或更多层合成膜，所述合成膜包含不同孔径从而调节经所述巨囊化器件的物质运输。
110.如权利要求107所述的生物反应器器件，其特征在于，所述巨囊化器件包含半透聚合物外膜和支持细胞的内部支架。
111.如权利要求110所述的生物反应器器件，其特征在于，所述巨囊化器件长约6mm，直径约1mm。
112.如权利要求110所述的生物反应器器件，其特征在于，所述外膜包含约15nm的孔。
113.如权利要求110所述的生物反应器器件，其特征在于，所述内部支架包含聚对苯二甲酸乙二酯纱线。
114.如权利要求107所述的生物反应器器件，其特征在于，所述巨囊化器件的内部空间包含至少1个到约105个修饰细胞。
115.如权利要求107所述的生物反应器器件，其特征在于，所述巨囊化器件包含聚合膜双层，所述双层包含层叠在内部致密孔0.45μM PFTE免疫屏障层上的5μm PTFE膜外层。
116.如权利要求115所述的生物反应器器件，其特征在于，所述巨囊化器件在所述聚合膜双层外还包含无纺聚合网层。
117.如权利要求107所述的生物反应器器件，其特征在于，所述巨囊化器件包含PES中空纤维器件。
118.如权利要求107所述的生物反应器器件，其特征在于，所述巨囊化器件还包含缝合夹。
119.如权利要求107所述的生物反应器器件，其特征在于，所述巨囊化器件是可植入和可收回的。
120.如权利要求106所述的生物反应器器件，其特征在于，所述修饰细胞是微囊化的。
121.如权利要求120所述的生物反应器器件，其特征在于，所述修饰细胞悬浮在生物相容包裹化材料中，然后制成珠-样结构。
122.如权利要求121所述的生物反应器器件，其特征在于，所述包裹化材料包含水凝胶。
123.如权利要求121所述的生物反应器器件，其特征在于，所述包裹化材料包含选自纤维素或藻酸盐的聚合物。
124.如权利要求123所述的生物反应器器件，其特征在于，所述聚合物包含多聚阴离子藻酸盐和多聚阳离子聚合物，从而相互作用并形成物理透过选择性膜屏障。
125.如权利要求121所述的生物反应器器件，其特征在于，所述珠-样结构各包含至少1个到约103个修饰细胞。
126.如权利要求121所述的生物反应器器件，其特征在于，所述珠-样结构包含聚(L-丙交酯)酸(PLLA)藻酸盐微球。
127.如权利要求121所述的生物反应器器件，其特征在于，所述珠-样结构还包含聚-L-鸟氨酸(PLO)藻酸盐包被。
128.如权利要求123所述的生物反应器器件，其特征在于，所述包裹化材料包含基于藻酸盐的超高粘度(UHV)-生物聚合物。
129.如权利要求128所述的生物反应器器件，其特征在于，所述基于藻酸盐的UHV-聚合物是生物可降解的。
130.如权利要求121所述的生物反应器器件，其特征在于，所述珠-样结构是大致球形的，直径约500μm。
131.如权利要求102所述的生物反应器器件，其特征在于，所述屏障系统还包含能为所述修饰细胞提供保护作用的保护细胞，其中所述保护细胞选自塞托利细胞和红细胞。
132.如权利要求102所述的生物反应器器件，其特征在于，所述屏障系统还包含能产生保护性微环境的外层包被。
133.如权利要求132所述的生物反应器器件，其特征在于，所述保护性微环境是抗炎性的。
134.如权利要求132所述的生物反应器器件，其特征在于，所述保护性微环境是促血管生成性的。
135.如权利要求68-83中任一项所述核酸组合物在治疗疾病、病症或病状中的应用。
136.如权利要求84-86中任一项所述载体在治疗疾病、病症或病状中的应用。
137.如权利要求91-99中任一项所述修饰细胞在治疗疾病、病症或病状中的应用。
138.如权利要求100-134中任一项所述生物反应器器件在治疗疾病、病症或病状中的应用。
139.如权利要求68-83中任一项所述核酸组合物在制备治疗疾病、病症或病状的药物中的应用，所述疾病、病症或病状选自下组：超增殖性疾病、病症或病状，心血管疾病、病症或病状，神经疾病、病症或病状，自身免疫疾病、病症或病状，骨疾病、病症或病状，胃肠疾病、病症或病状，血液疾病、病症或病状，代谢疾病、病症或病状，炎性疾病、病症或病状和感染性疾病、病症或病状。
140.如权利要求84-86中任一项所述载体在制备治疗疾病、病症或病状的药物中的应用，所述疾病、病症或病状选自下组：超增殖性疾病、病症或病状，心血管疾病、病症或病状，神经疾病、病症或病状，自身免疫疾病、病症或病状，骨疾病、病症或病状，胃肠疾病、病症或病状，血液疾病、病症或病状，代谢疾病、病症或病状，炎性疾病、病症或病状和感染性疾病、病症或病状。
141.如权利要求91-99中任一项所述修饰细胞在制备治疗疾病、病症或病状的药物中的应用，所述疾病、病症或病状选自下组：超增殖性疾病、病症或病状，心血管疾病、病症或病状，神经疾病、病症或病状，自身免疫疾病、病症或病状，骨疾病、病症或病状，胃肠疾病、病症或病状，血液疾病、病症或病状，代谢疾病、病症或病状，炎性疾病、病症或病状和感染性疾病、病症或病状。
142.如权利要求100-134中任一项所述生物反应器器件在制备治疗疾病、病症或病状的药物中的应用，所述疾病、病症或病状选自下组：超增殖性疾病、病症或病状，心血管疾病、病症或病状，神经疾病、病症或病状，自身免疫疾病、病症或病状，骨疾病、病症或病状，胃肠疾病、病症或病状，血液疾病、病症或病状，代谢疾病、病症或病状，炎性疾病、病症或病状和感染性疾病、病症或病状。
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