DE10126473A1

DE10126473A1 - Methode zur Diagnose und Therapie des Nierenzellkarzinoms

Info

Publication number: DE10126473A1
Application number: DE10126473A
Authority: DE
Inventors: Bernhard Gillissen
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2001-05-31
Filing date: 2001-05-31
Publication date: 2003-09-04
Also published as: EP1397163A2; WO2002096468A3; WO2002096468A2; US20050053931A1; AU2002319080A1

Abstract

Die Erfindung betrifft ein neues Mittel zur Diagnose und Therapie des Nierenzellkarzinoms sowie anderer Nierentumore, beispielsweise des Wilms-Tumors, oder anderer, nicht der Niere entstammender Tumore. Anwendungsgebiete der Erfindung sind die Medizin und die pharmazeutische Industrie. DOLLAR A Der Erfindung liegt die Aufgabe zu Grunde, die bei dem heutigen Bearbeitungsstand dringend erforderlichen neuen Behandlungsformen und auch neue diagnostische Mittel für Nierenzellkarzinome bereitzustellen. DOLLAR A Überraschenderweise wurde gefunden, daß das NBK-Protein, das im normalen Nierengewebe hoch exprimiert ist, im Tumorgewebe überhaupt nicht oder nur sehr schwach exprimiert ist. Die Proteinexpression und der Verlust von NBK wurde bei 80 Nierenzellkarzinom-Proben mittels Immunhistochemie und Mutationsanalytik untersucht. DOLLAR A Das erfindungsgemäße Verfahren zur Diagnose ist dadurch gekennzeichnet, daß die NBK-Protein-Konzentration bzw. die NBK-RNA-Menge im Gewebe bestimmt wird. DOLLAR A Das erfindungsgemäße Mittel zur Therapie des Nierenzellkarzinoms und anderer Nierentumore ist dadurch gekennzeichnet, daß es die NBK-Proteinkonzentration in Nierenzellen oder anderen Geweben erhöht und in diesen Zellen direkt den therapeutischen Effekt auslöst.

Description

Die Erfindung betrifft ein neues Mittel zur Diagnose und Therapie des Nierenzellkarzinoms, sowie anderer Nierentumore, beispielsweise des Wilms-Tumors, oder anderer, nicht der Niere entstammender Tumore. Anwendungsgebiete der Erfindung sind die Medizin und die pharmazeutische Industrie.
Die operative Entfernung ist die bisher einzige Behandlungsmethode zur Heilung des nichtmetastasierten Nierenzellkarzinoms. Standardverfahren ist die radikale Tumor-Nephrektomie mit Entfernung der regionären Lymphknoten. Die 5-Jahres-Überlebensrate organbegrenzter Nierenzellkarzinome nach radikaler Tumornephrektomie beträgt, abhängig vom lokalen Tumorstadium 67-92%.
Die Prognose des metastasierten (N1 und höher, M1-Stadien nach der TNM-Klassifikation) ist wesentlich schlechter. Die mittlere Überlebenszeit bei Vorhandensein von Fermetastasen beträgt etwa ein halbes Jahr nach Diagnosestellung, die 1-Jahres-Überlebensrate 28%. Eine Heilung des metastasierten Nierenzellkarzinoms durch Chemo-, Strahlen-, oder Hormontherapie ist nicht möglich. Im Vergleich zu anderen Tumoren ist das Nierenzellkarzinom extrem therapieresistent und spricht schlecht auf die genannten Therapien an, was die schlechte Prognose der Patienten mit dieser Erkrankung erklärt. Begrenzte Therapieerfolge wurden mit Immuntherapien mit Interleukin-2 oder Interferonen erzielt (Komplette plus partielle Remissionen bei 10 bis 30% der Patienten). Aber auch diese Behandlungen können das Überleben der Patienten nicht wesentlich verlängern (Ostendorf und Seeber, Hämatologie und Onkologie, Urban und Schwarzenberg 1997).
Neue Behandlungsformen und auch neue diagnostische Mittel sind also dringend erforderlich.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zu Grunde, die bei dem heutigen Bearbeitungsstand dringend erforderlichen neuen Behandlungsformen und auch neue diagnostische Mittel für Nierenzellkarzinome bereitzustellen.
Gründe für die extreme Therapieresistenz des Nierenzellkarzinoms sind bisher nicht bekannt. Um dies zu untersuchen, wurde eine Reihe von Genen geprüft, für die bereits in der Vergangenheit ein Einfluß auf die Prognose anderer Tumorerkrankungen gezeigt worden ist. Rein willkürlich wurde zusätzlich auch das Gen und Protein NBK ausgewählt, für das eine solche prognostische Bedeutung noch nicht bekannt war.
Überraschenderweise wurde gefunden, daß das NBK-Protein, das im normalen Nierengewebe hoch exprimiert ist (Daniel et al. 1999 und Abb. 1), im Tumorgewebe überhaupt nicht oder nur sehr schwach exprimiert ist (Abb. 1). Die Proteinexpression und der Verlust von NBK wurde bei 80 Nierenzellkarzinom-Proben mittels Immunhistochemie (vgl. Abb. 1) und Mutationsanalytik (s. u.) untersucht.
Der Verlust dieses Zelltod-regulierenden Proteins in Nierenzellkarzinomen ist offensichtlich für die Resistenz von Nierenzellkarzinomen verantwortlich.
Um den Grund für den Expressionsverlust zu erforschen, wurden detaillierte Mutationsanalyse-Methoden angewandt. Die bekannten 5 Exons des NBK-Gens auf Chromsom 22q13 (Verma et al. 2000) wurden mittels SSCP-PCR in DNA-Proben der o. g. Patienten mit Nierenzellkarzinom untersucht. Bei 10 Patienten zeigte sich eine auffällige Bande in der konfromationsspezifischen PCR-Analyse. Diese auffälligen Proben (und zur Kontrolle auch mehrere Patienten ohne Auffälligkeiten in der SSCP-PCR) wurden mittels Sequenzierung der PCR-Produkte auf Veränderungen der genomischen DNA-Sequenz untersucht. Hierbei fanden sich, im Gegensatz zu früheren Untersuchungen bei kolorektalen Karzinomen (Abdel-Rahman et al. 2000), Punktmutationen. Weiterhin wurden genetische Veränderungen in intronischen Sequenzen gefunden, die das Spleißen der mRNA und die Expression des NBK-Proteins hemmen können.
Um die biologische Bedeutung des NBK-Verlusts zu untersuchen und auch um eine mögliche Therapie im Sinne einer Genkomplementierung zu untersuchen, wurde ein adenoviraler Vektor für den Gentransfer des Wildtyp NBK Gens konstruiert. Hierbei traten erhebliche Schwierigkeiten auf, da die Vektor-produzierenden Zellen (293-Zellen; humane embyronale Nierenzell-Linie) bei Transfektion mit den Konstrukten für konstitutive NBK-Expression starben und trotz intensiver Bemühungen mittels dieser konventionellen Methode keine Viren hergestellt werden konnten.
Aus diesem Grund wurde eine technische Entwicklung erforderlich, die das Ziel hatte, einen Gentransfer und eine konditionalen Expression zu ermöglichen. Dies bedeutet, daß Viren konstruiert werden mußten, die während der Vektorherstellung NBK nicht exprimieren, also abgeschaltet sind, um die Produktion der Viren überhaupt erst zu ermöglichen. Weiterhin ermöglicht ein solches konditionales Expressionssystem nach viralen Gentransfer auch einen an- und abschaltbaren Expression, also eine bessere Kontrolle des theraputischen Transgens. Zu diesem Zweck wurde das Tet-off System in die E1- und die E3-Region eines adenoviralen Vektorsystems kloniert (s. u.).
Der Gentransfer von NBK in eine Auswahl von Nierenzellkarzinomlinien (Caki2, RCC-FG1, RCC-HS, RCC-KP, RCC-LR, RCC-MF, RCC-26) zeigte einen weiteren überraschenden Befund: diese Zellen starben rasch infolge der Aktivierung von Apoptose. Dies ist im Gegensatz zu früheren Befunden in T-Zellymphomzellen (Daniel et al. 1999) und anderen Zellinien (Daniel et al., unveröffentlichte Ergebnisse), in denen die konstitutive hohe Überexpression des NBK-Gens die Zellen für Apoptose sensbilisierte, aber nicht per se Zelltod auslöste. In Kontroll-Experimenten mit Tumorzellinien anderer Karzinome, in deren normalen Gegenstücken auch NBK-Expression nachgewiesen werden konnte (Verma et al. 2000), und zwar Tumorzellen des Gastrointestinaltrakts, Brustkrebs und Prostata, löste der adenovirale NBK-Gentransfer ebenfalls Apoptose aus, so daß der NBK-Gentransfer bzw. Aktivierung der NBK Genexpression ein breit anwendbares neues Therapieprinzip zur Abtötung von Tumorzellen darstellt.
Die Erfindung wird gemäß den Ansprüchen 1, 3 und 12 realisiert, die Unteransprüche sind Vorzugsvarianten.
Die Erfindung soll durch die folgenden Ausführungsbeispiele näher erläutert werden. Abkürzungen P_CMV: kompletter "immediate early" Promoter aus Cytomegalovirus, vermittelt effiziente Expression (Anderson et. al 1989)
P_miniCMV: minimaler "immediate early" Promoter aus Cytomegalovirus. Dieser Promotor besitzt nicht den starken CMV Enhancer und ist daher ohne die Bindung von tTA an das TRE-Element nicht aktiv
P_hCMC*: Kombinierter Promotor, das TRE-Element ist direkt vor dem P_miniCMV lokalisiert
TRE Tetracyclin-Responsive Element, eine regulatorische Sequenz bestehend aus sieben Kopien des tet-Operators (42-bp, cis-regulatorische DNA Sequenz aus dem bakteriellen tet-Operon, die der Bindungsstelle des Tet-Repressors entspricht)
tTA: Tetracycline-controlled transaktivator, ein Fusionsprotein bestehend aus dem TetR und der VP16 AD (Aktivierungsdomäne des Herpes Simplex Proteins VP16)
BGHpolyA: Bovine growth hormone polyadenylation signal (Goodwin and Rottman, 1992)
Amp^r Ampicillin resistance Gen (β-Lactamase)
ColE1ori: High-copy number origin of replication für E. coli

Konstruktion des konditionalen adenoviralen Vektorsystems zur regulierbaren Überexpression von mycNBK

Zur regulierbaren Expression des proapoptotischen Gens NBK in humanen Zellen mittels eines adenoviralen Vektorsystems wurde ein rekombinanter Adenovirus basierend auf dem Ad5 Genom hergestellt, bei dem die E3 Region durch eine Expressionskassette für tTA (Tetracycline-controlled transactivator) und die E1 Region durch eine Expressionskassette für mycNBK ersetzt wurde. Konstitutive Expression des tTA wird durch den CMV-Promotor gewährleistet. Bei Abwesenheit von Tetracyclin bzw Doxycyclin bindet das tTA Fusionsprotein über den Tet-Repressoranteil spezifisch an das Tet-Responsive Element (TRE) des Promotors P_hCMV*1 und aktiviert über den VP16AD Anteil (Herpes simplex virus VP16 protein activation domain) die Transkription von mycNBK.

Ausgangsplasmide zur Konstruktion von Adenoviren

pAd1-Del-E1/E3

pAd1-Del-E1/E3 enthält ein Adenovirus 5 Genom, in dem sowohl die E3 als auch die E1 Region deletiert wurden (siehe Abb. 2) Die E3 Deletion entspricht der von Bett et al. (1994) beschriebenen Deletion aus BHG10 und erstreckt sich von 78.3 bis 85.8 mu. Konstruiert durch homologe Rekombination in E. coli: Die PacI Schnittstelle von BHG10 wurde aufgefüllt und ein 8.7 kb HapI-NotI Fragment mit pTG3602 rekombiniert (Chartier et al., 1996). Die E1 Deletion erstreckt sich von 0,9-9.8 mu und wurde durch homologe Rekombination des 2,7 kb PacI-NotI Fragments aus pHVAd2 in pAd1 (ClaI linearisiert) eingeführt (siehe auch pHVAd2).

pHVAd2

Das Left-end shuttle Plasmid pAd2 dient zur Insertion von Genen in die E1-Region. Es enthält 2,6 kb des linken Endes des Adenovirus 5 mit einer 3,2 kb großen Deletion in der E1 Region. Diese größtmögliche E1 Deletion und die an dieser Stelle enthaltene Polycloning Region entsprechen der von Bett et. al (1994) für pΔE1sp1A beschriebenen Deletion.

pHV4d3

Das shuttle Plasmid pAd3 dient zur Insertion von Genen in die E3-Region. Es enthält ein 4,6 kb großes BglII Fragment aus BHG10 (Bett et. al 1994). Dies entspricht 2,9 kb stromabwärts und 1,7 kb stromaufwärts Sequenzen der von Bett et. al beschriebenen E3-Deletion.

Konstruktion von pAD-TreNBK-tTA

Zur Konstruktion von pAD-TreNBK-tTA wurde zuerst der Tetracyclin-regulierbare Promotor P_hCMV*1 als XhoI EcoRI Fragment (aus pTre, Clontech) in die entsprechenden Schnittstellen von pHVAd2 kloniert. Anschließend wurde in die HindIII und SalI Schnittstelle eine, am 5'Ende mit einem für einen myc-Tag codierenden ORF fusionierte, NBK-cDNA einschließlich des BGH polyA-Signals (aus pcDNA3, Invitrogene) integriert (s. Abb. 2).
Die so entstandene NBK-Expressionskassette (P_hCMV*1; mycNBK; BGH polyA) wurde mit den flankierenden adenoviralen DNA Sequenzen als PacI NotI Fragment isoliert und durch homologe Rekombination in den mit ClaI linearisierten pAd-DelE1/E3 eingefügt (s. Abb. 2). Um die Expressionskassette für den Tetracyclin-controlled-transactivator tTA in das so entstandene Plasmid pAd-TreNBK zu integrieren, wurde zuerst das entsprechende DNA Fragment, welches den P_CMV-Promotor, den Leserahmen für den tTA und ein SV40polyA- Signal umfasst, als XhoI-PvuII Fragment aus dem Plasmid pTet-Off (Clontech) isoliert und in die SalI und NruI Schnittstelle des Shuttlelplasmids pHVAd3 kloniert (Abb. 3).
Aus dem resultierenden Plasmid pAd3-tTA wurde die tTA Expressionskassette mit 5' und 3' flankierenden Ad5-Sequenzen als NheI-StuI Fragment herausgeschnitten und durch homologe Rekombination in das Plasmid pAd1-TreNBK integriert (Abb. 3)
Das so entstandene Plasmid pAD-TreNBK-tTA enthält somit ein vollständiges Ad5 Genom in dem die E1 Region durch die NBK-Expressionskassette und die E3 Region durch die tTA- Expressionskassette ersetzt sind (Abb. 4). Das rekombiniante Ad5 Genom läßt sich durch Spaltung mit PacI aus dem Plasmid herausschneiden und zur Transfektion von 293-Zellen verwenden in denen dann die Produktion der rekombinanten Adenoviren erfolgt.

Überexpression von mycNBK in Abhängigkeit von der Dox Konzentration

Infektion von humanen Zellinien mit dem rekombinanten Adenovirus Ad-TreNBK-tTA (Abb. 5A) induziert eine stake Überexpression von mycNBK in Abhängigkeit von der Dox Konzentration. Abb. 4B zeigt die Überexpression von mycNBK in DU145 Zellen 24 Stunden nach Infektion mit 25 MOI Ad-mycNBK-tTA. In Abwesenheit von Dox erfolgt eine starke Expression, die mit zunehmender Dox Konzentration abnimmt. Bei Konzentrationen über 10 ng/ml ist die mycNBK Expression fast vollständig repremiert (Abb 5B).
Bei Abwesenheit von Dox bzw. Tetracyclin konnte auch bei einer Reihe von weiteren Zellinien eine starke Überexpression von mycNBK 24 Stunden nach Infektion mit Ad- TreNBK-tTA festgestellt werden (s. u.).

Induktion von Apoptose durch Ad-TreNBK-tTA vermittelte Überexpression von mycNBK

Die Induktion von Apoptose durch adenoviral vermittelte Überexpression von mycNBK wurde bei Nierenzellkarzinomzellen und anderen Tumorzellinien untersucht.
Die Westernblot Analyse zeigt bei Abwesenheit von Dox eine starke Überexpression von mycNBK in den entsprechenden Zellinien 24 Stunden nach Infektion mit Ad-TreNBK-tTA (Abb. 6A). Die modifizierte Zellzyklus zeigt darüber hinaus bei den mycNBK exprimierenden Zellen einen starken Anstieg der Sub-G1 Fraktion, welche die apoptotischen Zellen repräsentiert (Abb. 6B). Überexpression von mycNBK führt somit zur Induktion von Apoptose in den untersuchten Nierenkarzinom- und anderen Zellinien. Neben den in Abb 5 gezeigten Zellinien wurde die Induktion der Apoptose in weiteren Nierenkarzinom-Zellinien (RCC-LR, RCC-FG1, RCC-MF, RCC-26 Caki2), Osteosarkomzellinien (U2OS, Saos2), Melanomzellinien (Mel-2A, MeWo) und in Mammakarzinomzellinie (MatuADR) untersucht. Infektion mit Ad-TreNBK-tTA führte auch bei diesen Zellinien bei Abwesenheit von Dox zur Überexpression von mycNBK und zur Induktion von Apoptose.

Rolle des endogenen NBK in NBK-exprimierenden Geweben

Da NBK ein Apoptose-förderndes, Gewebe-spezifisches Zelltod-förderndes Gen ist, wird aufgrund der oben geschilderten Befunde geschlossen, daß es eine physiologische Rolle beim Gewebsuntergang von Nierengewebe und -zellen ausüben kann. Die Überaktivität solcher Zelltodgene kann theoretisch, wie auch für andere Gene gezeigt, Gewebsuntergang und pathologische Zustände wie Nierengewebsdegeneration auslösen. Solche Phänomene sind beteiligt an erblichen, somatischen und durch exogene Schädigung, z. B. durch Toxine und Schwermetalle oder Immunreaktionen wie der infektiösen und nicht-infektiösen Nephritis oder Transplantatabstoßung ausgelöste Nierenschädigungen.
Basierend auf dieser Hypothese wird eine weitere Anwendungsmöglichkeit der Erfindung vorgeschlagen, mit der die Wirkung von NBK gehemmt wird, beispielsweise durch Hemmung des Moleküls selbst, seiner Wirkung in der nachgeschalteten Signalkette oder Herunterregulation des Signal-Moleküls selbst. Eine weitere Einsatzmöglichkeit der erfindungsgemäßen Erkenntnis besteht darin, in bestimmten Fällen von erblichen oder somatischen Nierenerkrankungen oder Nierengewebsdegeneration ausgelöst durch andere Ursachen, den Spiegel an NBK-Protein oder NBK-RNA zu senken. Dies stellt ein neuartiges Therapieprinzip für Nierenerkrankungen dar.

Claims

1. Verfahren zur Diagnose des Nierenzellkarzinoms, anderer Nierentumore, beispielsweise des Wilms-Tumors oder andere, nicht der Niere entstammender Tumore, dadurch gekennzeichnet, daß die NBK-Protein-Konzentration bzw. die NBK- RNA-Menge im Gewebe bestimmt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß eine Analyse von Mutationen und Polymorphismen im NBK-Gen durchgeführt wird, bevorzugt durch DNA-Sequenz-Analyse und Messung veränderter NBK-mRNA- und NBK-Proteine.

3. Mittel zur Therapie des Nierenzellkarzinoms und anderer Nierentumore, beispielsweise des Wilms-Tumors, oder andere, nicht der Niere entstammender Tumore, dadurch gekennzeichnet, daß es die NBK-Proteinkonzentration in Nierenzellen oder anderen Geweben erhöht und in diesen Zellen direkt den therapeutischen Effekt auslöst.

4. Mittel nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß es die NBK-Proteinexpression durch Transfer von NBK-cDNA oder des NBK-Gens oder dessen Anteilen erhöht.

5. Mittel nach Anspruch 3 und 4, dadurch gekennzeichnet, daß es die NBK- Proteinexpression unter Verwendung viraler und nicht-viraler Expressionsvektoren erhöht.

6. Mittel nach Anspruch 3 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß es die NBK- Proteinexpression unter Verwendung eines konditionalen adenoviralen Expressionsvektors erhöht, bevorzugt mittels des in Abb. 4 dargestellten Vektors, konstruiert durch Klonierung der Expressionskassette in pAD3 wie in Abb. 3 dargestellt.

7. Mittel nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß es gewebespezifische Expression von NBK erzielt unter bevorzugter Verwendung gewebespezifischer Promotoren und anderer, beispielsweise hormoneller oder anderer pharmakologischer Regulatoren.

8. Mittel nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß es gewebespezifische Expression von NBK erzielt unter Konstruktion chimärer Moleküle, bestehend beispielsweise aus NBK und Transkriptionsfaktor-Anteilen oder Signalpeptiden auf der Ebene des NBK-Gens, der RNA oder des Proteins.

9. Mittel nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß herunterreguliertes endogenes NBK wieder zur Expression gebracht wird, beispielsweise mittels pharmakologischer Stimulation der NBK-Protein-Expression durch Aktivierung der Genexpression und aktivierender Regulation des NBK-Promotors.

10. Mittel nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß NBK-Proteinexpression erhöht wird durch Stabilisierung der NBK-Protein-Expression, beispielsweise durch Hemmung des NBK-Abbaus.

11. Mittel nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß NBK-Aktivität erhöht oder vermindert wird durch Aktivierung oder Hemmung regulatorischer Anteile des Proteins.

12. Mittel zur Therapie erblicher oder somatischer Nierenerkrankungen wie beispielsweise degenerativer Nierenerkrankungen, infektiöser und nichtinfektiöser entzündlicher oder toxischer Nierenschädigungen, in denen Zellen durch Apoptose absterben, gekennzeichnet dadurch, daß Hemmer der Expression oder der Aktivität des NBK-Proteins- oder der NBK-RNA in Nierenzellen eingebracht werden.

13. Mittel nach Anspruch 12, gekennzeichnet dadurch, daß die Aktivität des NBK- Proteins- oder der NBK-RNA vermindert wird durch Aktivierung oder Hemmung regulatorischer Anteile des NBK-Gens.

14. Mittel nach Anspruch 12, gekennzeichnet dadurch, daß die Aktivität des NBK- Proteins- oder der NBK-RNA vermindert wird durch Aktivierung oder Hemmung nachgeschalteter Signalwege.