DE69518910T3

DE69518910T3 - Verfahren zur herstellung von viralen vektoren von mindestens 20kb durch intermolekulare homologe rekombination in einer prokaryotischen zelle

Info

Publication number: DE69518910T3
Application number: DE69518910T
Authority: DE
Inventors: Cecile Chartier; Eric Degryse
Original assignee: Transgene SA
Current assignee: Transgene SA
Priority date: 1994-12-01
Filing date: 1995-12-01
Publication date: 2006-07-13
Anticipated expiration: 2015-12-02
Also published as: JP3989541B2; EP0742834A1; DE69518910T2; AU4306896A; ES2150595T3; US20020090715A1; CA2182303A1; DE69518910D1; WO1996017070A1; JPH09509330A; EP0742834B9; CA2182303C; GR3035050T3; ATE196507T1; EP0742834B2; FR2727689A1; US6110735A; EP0742834B1; FR2727689B1; AU707208B2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines viralen Vektors in vitro in einer Prokaryotenzelle und seine Verwendung zur Herstellung eines viralen infektiösen Partikels, welcher zur therapeutischen Verwendung und insbesondere zur Gentherapie bestimmt ist.
Die Möglichkeit der Behandlung humaner Krankheiten durch Gentherapie hat sich innerhalb einiger Jahre vom Stadium der theoretischen Überlegungen zum Stadium der klinischen Anwendungen entwickelt. Die erste Anwendung am Menschen fand in den Vereinigten Staaten im September 1990 bei einem Patienten statt, der aufgrund einer Mutation des für die Adenindesaminase (ADA) kodierenden Gens genetisch immunodefizient war. Der relative Erfolg dieses ersten Experiments führte zur Entwicklung von neuen Gentherapien für verschiedene genetische oder erworbene Krankheiten (Infektionskrankheiten und insbesondere virale Erkrankungen, wie Aids oder Krebs). Die große Mehrzahl der bis heute beschriebenen Verfahren verwendet virale Vektoren zur Transferierung und Expremierung des therapeutischen Gens in den zu behandelnden Zellen.
Derzeit werden retrovirale Vektoren aufgrund der Einfachheit ihres Genoms am häufigsten verwendet. Jedoch haben sie neben ihrer beschränkten Klonierungsfähigkeit zwei Hauptnachteile, die ihre systematische Verwendung begrenzen: einerseits infizieren sie hauptsächlich in Teilung begriffene Zellen und andererseits ist aufgrund der zufälligen Integration in das Genom der Wirtszelle das Risiko einer Insertionsmutagenese nicht zu vernachlässigen. Aus diesem Grund widmeten sich eine Anzahl von wissenschaftlichen Gruppen der Entwicklung anderer Vektortypen, unter ihnen beispielsweise solche, die von Adenoviren abstammen, Viren, die mit Adenoviren assoziert sind (AAV), Pockenviren und Herpesviren. Im Allgemeinen sind ihre Organisation und ihr Infektionszyklus ausführlich in der dem Fachmann zugänglichen Literatur beschrieben.
In dieser Hinsicht erscheint die Verwendung von adenoviralen Vektoren als eine vielversprechende Alternative. Die Adenoviren treten bei einer Anzahl von Tierarten auf, besitzen ein breites Wirtsspektrum, sind wenig pathogen und weisen nicht die Nachteile der Retroviren auf, da sie sich in den ruhenden Zellen replizieren und nicht integrativ sind. Ihr Genom besteht aus einem linearen und doppelsträngigem DNA-Molekül von etwa 36 kb, welche mehr als 30 Gene aufweist, frühe Gene, welche für die virale Replikation notwendig sind (E1 bis E4) und späte Strukturgene (L1 bis L5) (siehe 1).
Im Allgemeinen werden die adenoviralen Vektoren durch Deletion wenigstens eines Bereichs der viralen Gene (insbesondere der Region E1, welche für die virale Replikation essentiell ist), welcher durch die therapeutischen Gene ersetzt wird, erhalten. Nachfolgend werden sie in einer Zelllinie, genannt Komplementation, welche in trans die deletierten viralen Funktionen liefert, vermehrt, um ein virales Vektorpartikel zu erzeugen, das nicht replizieren aber andere Wirtszellen infizieren kann. Es wird gewöhnlich die Linie 293, welche ausgehend von embryonalen humanen Nierenzellen etabliert wurde und die in der Funktion E1 defekten Adenoviren komplementiert, verwendet (Graham et al, 1977, J. Gen. Virol., 36, 59–72).
Die Techniken zur Herstellung von adenoviralen Vektoren sind ausführlich in der Literatur beschrieben (siehe insbesondere Graham und Prevec, Methods in Molecular Biology, Vol 7; Gene Transfer und Expression Protocols; Ed: E. J. Murray, 1991, The Human Press Inc., Clinton, NJ). Eine der am meisten angewendeten Methoden besteht in der Erzeugung des rekombinaten adenoviralen Vektors in den Komplementationszellen, die mit einem bakteriellen Plasmid transfiziert sind, welches das subklonierte Gen von Interesse in Mitten seines adenoviralen Insertionsbereich und des adenoviralen Genoms trägt. Im Allgemeinen wird die letztere durch ein geeignetes Restriktionsenzym gespalten, um die Infektiosität der parentalen viralen DNA herabzusetzen und die Isolierungseffizienz des rekombinanten Adenovirus zu erhöhen. Indessen wird trotzdem ein beträchtlicher Hintergrund von infektiösen viralen Partikeln parentalen Ursprungs beobachtet, was eine besonders schwere Analysenarbeit der erhaltenen Plaques erforderlich macht (hinsichtlich Zeit und Kosten, da jeder Plaque individuell amplifiziert und analysiert werden muss). Das ist problematisch, da das parentale Virus einen Selektionsvorteil gegenüber dem rekombinanten Adenovirus besitzt, beispielsweise da sich das letztere langsamer als das parentale Virus repliziert aufgrund der Insertion des Gens von Interesse mit großer Länge (Faktor VIII, Dystrophin), was ebenso die Wahrscheinlichkeit seines Erhalts reduziert.
Ebenso kann die Ligation zwischen zwei DNA-Fragmenten, die durch die klassischen Techniken der Molekularbiologie erhalten wurden und die jeweiligen 5'- und 3'-Bereiche des adenoviralen rekombinanten Vektors aufweisen, angewendet werden. Die Transfektion der Ligationsmischung in die Komplementationszellen ermöglicht theoretisch die Einkapselung des rekombinanten Virusgenoms zur Bildung eines infektiösen Partikels. Diese Technologie ist weniger effizient und ihre Anwendung auf die begrenzte Anzahl der geeigneten und gleichförmigen Restriktionsstellen begrenzt.
Es wurde jetzt gezeigt, dass es möglich ist, in Eschericha coli (E. coli) recBC sbcBC einen adenoviralen rekombinanten Vektor durch homologe intermolekulare Rekombination zwischen einem Plasmid, welches das Genom eines Adenovirus Typ 5 trägt, und einer Insertion, welche eine exogene DNA-Sequenz trägt, die von den adenoviralen Sequenzen A und B eingerahmt ist, zu erzeugen (2). Dieses Verfahren führt in dem adenoviralen Genom zum Ersatz der zwischen A und B gelegenen Zielregion durch die exogene Sequenz. Die Transfektion des so erzeugten rekombinaten adenoviralen Vektors in eine geeignete Komplementationslinie ergibt ein infektiöses virales Partikel, welches ohne vorherige Reinigungsstufe zur Infektion einer Wirtszelle verwendet werden kann. Der Hintergrund (Kontamination durch parentale virale Partikel) ist reduziert oder sogar supprimiert. Es stellte sich überraschenderweise heraus, dass die Verwendung der Stämme E. coli recBC sbcBC zur Unterstützung der intermolekularen Rekombination zwischen zwei beliebigen DNA-Fragmenten besonders vorteilhaft ist.
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung beruht auf der Ausnutzung der endogenen enzymatischen Aktivitäten der prokaryotischen Zellen, die in die homologe Rekombination verwickelt sind. Diese intermolekulare Rekombinationstechnik wurde bereits für die Klonierung kleiner Insertionen in bakterielle Vektoren beschrieben (Bubeck et al., 1993, Nucleic Acids Research, 21, 3601–3602) oder zur Erzeugung von Hybridgenen durch intramolekulare Rekombination (Calogero et al., 1992, FEMS Microbiology Letters, 97, 41–44; Caramori et al., 1991, Gene. 98, 37–44). Diese Rekombinationstechnik wurde jedoch niemals in prokaryotischen Zellen verwendet, um infektiöse virale Vektoren (die als infektiöse virale Partikel eingekapselt werden können) zu erzeugen.
Das erfindungsgemäße Verfahren hat gegenüber den bekannten Techniken den Vorteil, dass es schnell ist, insbesondere effizient und nur wenige Manipulationen in vitro erfordert. Außerdem kann es mit DNA-Fragmenten durchgeführt werden, die durch PCR (Polymerase-Kettenreaktion) erzeugt wurden, wodurch die Stufen der Subklonierung der exogenen DNA-Sequenz in die Insertionsregion des viralen Genoms vermieden wird. Schließlich bringt es eine vorteilhafte Lösung des Hintergrundproblems, welches deutlich in der Literatur beschrieben wird. Folglich erweist es sich besonders leistungsfähig für die Vektoren, die von großen Viren abstammen oder bei denen die Insertion in einer großen exogenen DNA-Sequenz gewünscht ist.
Somit stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten viralen Vektors von mindestens 20 kb in einer prokaryotischen Zelle zur Verfügung, wobei der Vektor von einem Stammvirus abgeleitet wird, dessen Genom durch intermolekulare Rekombination zwischen (i) einem ersten DNA-Fragment, welches das gesamte oder einen Teil des Genoms des Virus umfasst, und (ii) einem zweiten DNA-Fragment, welches die exogene DNA-Sequenz, die von den zu (i) homologen, flankierenden Sequenzen A und B eingerahmt wird, umfasst, eine exogene DNA-Sequenz eingefügt wird, dadurch gekennzeichnet, dass die prokaryotische Zelle von einem Escherichia coli recBC sbcBC-Stamm abgeleitet ist.
Bubeck et al., Nucleic Acids Research, Vol 21, Nr. 15, 25. Juli 1993, Seiten 3601–3602: "Rapid Cloning by Homologous Recombination in vivo" beschreibt Klonierungstechniken, die den Erhalt von rekombinanten Plasmiden (Klonierungsvektoren) erlauben, die in den Techniken der Molekularbiologie verwendet werden und insbesondere auf der Einführung von kleinen DNA-Fragmenten (0,3 bis 1,8 kb) in die Plasmide beruhen. Gleichzeitig publizierten Oliver et al., Nucleic Acids Research, Vol 21, 1993, Seiten 5192–5197 vergleichbare Arbeiten und beschrieben, dass die Klonierungseffizienz von DNA-Fragmenten, die aus der PCR herrühren, umgekehrt proportional zu der Größe dieser Fragmente ist.
Die vorliegende Erfindung erweist sich als besonders vorteilhaft, wenn es sich um die Herstellung eines rekombinanten viralen Vektors von wenigstens 20 kb handelt und insbesondere einen Vektor mit einem Genom, das eine Länge von 80 bis 120% des Genoms des entsprechenden Wildvirus, insbesondere 90 bis 110%, und bevorzugt 95 bis 105%, aufweist.
Erfindungsgemäß wird ein rekombinanter viraler Vektor ausgehend von einem Stammvirus erhalten, der derart modifiziert ist, dass er an einer geeigneten Stelle das virale Genom trägt und eine exogene DNA-Sequenz exprimiert. Bei den erfindungsgemäß verwendeten Viren kann es sich beispielsweise um Alphaviren, Retroviren, Pockenviren insbesondere Kuhpocken oder Canarypocken, Herpesviren, mit Adenoviren verwandte Viren (AAV) und insbesondere Adenoviren handeln.
Diesbezüglich ist die Auswahl an Adenostammviren sehr groß. Es kann sich um einen Adenovirus humanen Ursprungs, ein Hunde-, Vogel-, Rinder-, Maus-, Schaf-, Schweine- oder Affenvirus handeln oder auch um ein hybrides Adenovirus, welches adenovirale Genomfragmente verschiedenen Ursprungs enthält. Besonders bevorzugt ist ein humanes Adenovirus des Serotyps C, bevorzugt ein Adenovirus des Typs 2 oder 5, oder auch ein tierisches Adenovirus des Typs CAV-1 oder CAV-2 (Hund), DAV (Vogel) oder BAd (Rind). Die Viren und ihr Genom sind in der Literatur beschrieben (siehe beispielsweise Zakharchuk et al., 1993, Arch. Virol., 128, 171–176; Spibey et Cavanagh, 1989, J. Gen. Virol., 70, 165–172; Jouvenne et al., 1987, Gene, 60, 21–28; Mittal et al., 1995, J. Gen. Virol., 76, 93–102).
Das erfindungsgemäße Verfahren besteht in der Herstellung eines rekombinanten viralen Vektors für den Transfer und die Expression einer exogenen DNA-Sequenz in einer Wirtszelle. Unter "exogener DNA-Sequenz" wird eine Nukleinsäure verstanden, die kodierende Sequenzen und regulierende Sequenzen, welche die Expression der kodierenden Sequenzen ermöglichen, umfassen, wobei es sich bei den kodierenden Sequenzen um Sequenzen handelt, die normalerweise nicht in dem Genom des in der vorliegenden Erfindung verwendeten Stammvirus oder in einem anderen genomischen Kontext vorliegen. Erfindungsgemäß kann die exogene DNA-Sequenz aus einem oder mehreren Genen bestehen. Die regulierenden Sequenzen können beliebigen Ursprungs sein.
Bevorzugt kodiert die exogene DNA-Sequenz für eine Antisense-(Gegensinn-)RNA und/oder eine mRNA, welche anschließend in ein Protein von Interesse übersetzt wird. Es kann sich um genomische DNA handeln, komplementäre DNA (cDNA) oder gemischte DNA (Minigen, in dem wenigstens ein Intron deletiert ist). Sie kann für ein reifes Protein, einen Vorläufer für ein reifes Protein, insbesondere einen Vorläufer der zur Sekretion bestimmt ist und deshalb ein Peptidsignal aufweist, ein chimäres Protein, welches aus der Fusion von Sequenzen verschiedenen Ursprungs herrührt, oder eine Mutante eines natürlichen Proteins, welche verbesserte oder modifizierte biologische Eigenschaften aufweist, kodieren. Eine derartige Mutante kann durch Mutation, Deletion, Substitution und/oder Addition eines oder mehrerer Nukleotide des für das natürliche Protein kodierenden Gens erhalten werden.
Erfindungsgemäß können vorteilhaft verwendet werden:

– Gene, welche für Cytokine oder Lymphokine kodieren, wie die Interferone α, β und γ, die Interleukine, insbesondere IL-2, IL-6 oder IL-10, die Tumornekrosisfaktoren (TNF) und die Koloniestimulierenden Faktoren (CSF);
– Gene, die für zelluläre Rezeptoren kodieren, wie Rezeptoren, die von pathogenen Organismen (Viren, Bakterien oder Parasiten), bevorzugt von dem HIV-Virus (Virus der humanen Immunodefizienz) oder den Liganden der zellulären Rezeptoren erkannt werden;
– Gene, die für Wachstumshormone (HGF) kodieren;
– Gene, die für Koagulationsfaktoren, wie Faktor VIII und Faktor IX, kodieren;
– das Gen, welches für Dystrophin oder Minidystrophin kodiert;
– das Gen, welches für Insulin kodiert;
– Gene, die für Polypeptide kodieren, die direkt oder indirekt in die zellulären Ionenkanäle eintreten, wie das CFTR(Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator)-Protein;
– Gene, die für Antisense-RNA oder Proteine kodieren, die die Aktivität eines produzierten Proteins durch ein pathogenes Gen, welches im Genom eines pathogenen Organismus vorliegt, oder durch ein zelluläres Gen, dessen Expression dereguliert ist, beispielsweise ein Oncogen, inhibieren können;
– Gene, die für einen Protease-Inhibitor, wie das α1-Antitrypsin oder einen viralen Protease-Inhibitor kodieren;
– Gene, die für verschiedene pathogene Proteine kodieren, welche derart mutiert sind, dass ihre biologische Funktion verändert ist, wie beispielsweise die trans-dominanten Varianten des TAT-Proteins des HIV-Virus, welche mit dem natürlichen Protein um die Bindung der Zielsequenz kompetitieren können, wodurch die Replikation des HIV verhindert wird;
– Gene, die für antigene Epitope kodieren, um die Immunität der Wirtszelle zu steigern;
– Gene, die für Polypeptide kodieren, welche Antikrebseigenschaften aufweisen, insbesondere Tumorsuppressoren, wie das p53-Protein;
– Gene, die für die Proteine des Haupt-Histokompatibilitätskomplexes des Klassen I und II kodieren, sowie Gene, die für die Proteine kodieren, die die Expression dieser Gene regulieren;
– Gene, die für zelluläre Enzyme oder Produkte von pathogenen Organismen kodieren; und
– Zelltodgene. Insbesondere wird das Gen TK-HSV-1 genannt. Das virale TK-Enzym besitzt eine deutlich höhere Affinität im Vergleich zu dem zellulären TK-Enzym für bestimmmte Nukleosidanaloge (wie Acyclovir oder Gancyclovir). Es wandelt sie in monophosphatierte Moleküle um, welche selbst durch zelluläre Enzyme umwandelbar sind, in Nukleotidvorläufer, welche toxisch sind. Diese Nukleotidanalogen sind auf dem Weg der Synthese in das DNA-Molekül einbaubar, also prinzipiell in DNA von Zellen im Replikationsstadium. Dieser Einbau erlaubt die Zerstörung von speziell in Teilung begriffenen Zellen, wie Krebszellen.
– Gene, die für Antikörper, ein Antikörperfragment oder ein Immunotoxin kodieren;
– Reportergene, wie das Lac-Z-Gen, welches für die β-Galaktosidase kodiert oder das Luziferase-Gen.

Diese Liste ist nicht limitativ; es können andere Gene ebenso verwendet werden.
Des weiteren kann eine in der vorliegenden Erfindung verwendete DNA-Sequenz ein nicht therapeutisches Gen umfassen, beispielsweise ein Gen, welches für einen Selektionsmarker kodiert, der die Selektion oder Identifizierung von transfizierten Wirtszellen ermöglicht. Genannt sei das Gen neo (welches für die Neomycinphosphotransferase kodiert) und eine Resistenz gegen das Antibiotikum G418 verleiht, das Gen dhfr (Dihydrofolatreduktase), das CAT-Gen (Chloramphenicolacetyltransferase), das Pac-Gen (Puromycinacetyltransferase) oder das GPT-Gen (Xanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferase).
Ein in der vorliegenden Erfindung verwendetes Gen kann in einer Wirtszelle unter der Expressionskontrolle von geeigneten Elementen platziert werden. Unter "geeigneten Elementen" wird die Gesamtheit von Elementen verstanden, die für seine Transkription in RNA (Antisense-RNA oder mRNA) und die Übersetzung der mRNA in ein Protein notwendig sind. Unter den für die Transkription notwendigen Elementen ist der Promotor von besonderer Bedeutung. Es kann sich um einen konstitutiven Promotor oder einen regulierbaren Promotor handeln, und er kann aus irgendeinem Gen eukaryotischen oder sogar viralen Ursprungs isoliert sein. Alternativ kann es sich um den natürlichen Promotor des in Frage kommenden Gens handeln. Im Allgemeinen kann ein in der vorliegenden Erfindung verwendeter Promotor derart modifiziert sein, dass er regulative Sequenzen enthält. Als Beispiele für gewebespezifische Promotoren können die der Immunoglobulingene genannt werden, wenn die Expression in Lymphocyten-Wirtszellen und des α1-Antitrypsingens für leberspezifische Expression gewünscht ist. Ebenso seien die konstitutiven Promotoren des TK-HSV-1-Gens (Thymidinkinase des Herpesvirus Typ 1), des PGK-Gens (Phosphoglyceratkinase), murin oder human, der frühe Promotor des SV40-Virus (Simian Virus 40), eine retrovirale LTR oder der adenovirale Promotor MLP, insbesondere des humanen Adenovirus Typ 2, erwähnt.
Das erfindungsgemäße Verfahren verwendet einen Mechanismus der intermolekularen homologen Rekombination. Allgemein besteht er aus dem Austausch von homologen Sequenzen zwischen zwei DNA-Fragmenten. Diese Sequenzen können identisch oder im wesentlichen homolog sein. Mit anderen Worten kann der Homologiegrad der Sequenzen A und B mit dem entsprechenden Bereich des ersten DNA-Fragments variabel sein, muss jedoch ausreichen, um intermolekulare Rekombination zu erlauben. In der vorliegenden Erfindung ist er bevorzugt größer als 70%, vorteilhafterweise größer als 80%, bevorzugter größer als 90% und am bevorzugtesten etwa 100%. Ein kurzer Homologiebereich kann ausreichend sein (wenigstens 10 gemeinsame aufeinanderfolgende Nukleotide zwischen den Sequenzen A und B und ihren homologen Sequenzen in dem ersten DNA-Fragment). Erfindungsgemäß beträgt die Länge der Sequenzen A und B bevorzugt zwischen 10 bp und 10 kb, vorteilhafterweise 20 bp und 5 kb, bevorzugter 30 bp und 2 kb und am bevorzugtesten 40 bp und 1 kb.
In einer vorteilhaften Ausführung führt das erfindungsgemäße Verfahren zum Austausch des genetischen Materials, welches zwischen den Sequenzen des ersten DNA-Fragments lokalisiert und zu den Sequenzen A und B homolog ist, durch die exogene Sequenz. Dieser intermolekulare Austausch erlaubt die Erzeugung eines kreisförmigen rekombinanten viralen Vektors in Form eines prokaryotischen Vektors (Plasmid, Cosmid oder Phage), welcher seine Manipulation und/oder seine Vermehrung in einer prokaryotischen Zelle erlaubt. Eine Ausführungsart des erfindungsgemäßen Mechanismus ist in 2 dargestellt.
Obwohl der Insertionsbereich der exogenen Sequenz an jeder beliebigen Stelle des viralen Genoms liegen kann, werden bevorzugt die cis-wirkenden Bereiche, die für die Replikation notwendig sind, vermieden. Zu den letzten zählen insbesondere die 5'- und 3'-LTR's, sowie im Fall des Retrovirus das Einkapselungssignal und die 5'- und 3'-ITR's und der Einkapselungsbereich, wenn es sich um Adenoviren handelt. Es wird darauf hingewiesen, dass der Insertionsbereich in variierende Positionen in Abhängigkeit der ausgewählten homologen Sequenzen A und B dirigiert werden kann.
Wie zuvor erwähnt, enthält das erste DNA-Fragment das gesamte oder einen Teil des Genoms des verwendeten Stammvirus. Es kann sich um das Genom eines Wildvirus oder das Genom eines abgeleiteten Virus, welches durch Deletion, Addition und/oder Sustitution einer oder mehrerer Nukleotide modifiziert ist, handeln. Insbesondere können mehrere Gene gesamt oder teilweise deletiert sein.
Das erste DNA-Fragment ist bevorzugt in einem konventionellen Vektor enthalten. Seine Auswahl ist sehr groß, es seien insbesondere der pBR322, der p polyII oder auch der p polyIII*I (Lathe et al., 1987, Gene, 57, 193–201) erwähnt. In einer vorteilhaften Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist das erste DNA-Fragment bevorzugt auf Höhe des Bereichs, in dem die Insertion eingefügt werden soll, linearisiert. Insbesondere kann es durch ein oder mehrere Restriktionsenzyme, deren Sites (Schnittstellen) zwischen den Sequenzen des ersten DNA-Fragments, welche zu den Sequenzen A und B homolog sind, oder ebenso auf Höhe dieser letzteren gespalten sein, auch wenn diese Ausführungsform nicht bevorzugt ist. Die Auswahl der verwendeten Restriktionsstellen sowie des Stammvirus liegt im Ermessen des Fachmanns. Vorteilhafterweise werden Stellen verwendet, die in dem ersten DNA-Fragment wenig vorhanden sind, insbesondere einzigartig sind. Außerdem können derartige Stellen ebenso durch klassische Techniken der gerichteten Mutagenese erzeugt werden.
Das zweite in der vorliegenden Erfindung verwendete DNA-Fragment trägt insbesondere die exogene DNA-Sequenz, welche von den Sequenzen A und B eingerahmt wird, die in der intermolekularen Kombination eine Rolle spielen. Es wird bevorzugt ein lineares DNA-Fragment verwendet. Es kann durch PCR erzeugt werden, aus irgendeinem Vektor ausgeschnitten oder auf synthetischem Weg oder durch eine in dem Fachgebiet übliche Methode hergestellt werden. Beispielsweise kann das in der vorliegenden Erfindung verwendete zweite DNA-Fragment durch Amplifikation der exogenen DNA-Sequenz ausgehend von einem Vektor des Standes der Technik oder einer genomischen Bank oder einer entsprechenden cDNA mit Hilfe von geeigneten Primern (Startermolekülen), welche an ihren 5'-Enden mit den Sequenzen A und B versehen sind, erhalten werden. Außerdem kann ein zweites DNA-Fragment ebenso plasmidische Sequenzen an seinen 5'- und 3'-Enden enthalten, die gegebenenfalls anstelle der Sequenzen A und B in dem Umfang, in dem sie zu den in dem ersten DNA-Fragment enthaltenden plasmidischen Sequenzen homolog sind, verwendet werden.
In einer besonderen Ausführungsform dient das erfindungsgemäße Verfahren der Herstellung eines viralen rekombinanten Vektors, der für die Replikation defektiv ist. Dieser Ausdruck bezeichnet einen Vektor, der unfähig ist, einen infektiösen Zyklus selbstständig in der Wirtszelle zu beenden. Im Allgemeinen fehlen dem Genom dieser defektiven Vektoren ein oder mehrere für die Replikation wesentliche Gene, frühe und/oder späte Gene. Sie können vollständig oder teilweise deletiert oder durch Mutation (Addition, Deletion und/oder Substitution eines oder mehrerer Nukleotide) funktionsunfähig gemacht sein. In dieser Hinsicht ermöglicht ein erfindungsgemäßes Verfahren die Herstellung eines rekombinanten adenoviralen Vektors, dem die gesamten oder ein Teil der Bereiche E1, E2, E3 und/oder E4 fehlen.
Es werden beispielhaft folgende Ausführungsformen aufgeführt. Wenn es sich um die Herstellung eines rekombinanten adenoviralen Vektors, der von einem humanen Adenovirus des Typs 5 (Ad5) abstammt in einer prokaryoten Zelle handelt, wobei die Insertion einer exogenen DNA-Sequenz anstelle des Bereichs E1 angestrebt wird, können verwendet werden: (i) ein Vektor, welcher das Genom des Ad5, gespalten durch das Enzym Cla1 enthält (Restriktionsstelle gelegen an Position 918 des Ad5-Genoms, wie in der Datenbank Genebank unter der Referenz M73260 veröffentlicht) und (ii) ein DNA-Fragment, welches eine zu dem adenoviralen Einkapselungsbereich homologe Sequenz A, die exogene DNA-Sequenz und eine Sequenz B, welche zu der für das Protein p1X kodierenden Sequenz homolog ist, umfasst. Außerdem erlaubt die Verwendung eines Vektors, welcher das adenovirale Genom gespalten durch das Enzym Spe1 (Position 27082 des Ad5-Genoms) und ein DNA-Fragment enthaltend eine zu dem 5'-Ende des Bereichs E2 homologe Sequenz A, die exogene DNA-Sequenz und eine zu dem 3'-Ende des Bereichs E4 homologe Sequenz B trägt, die Herstellung eines adenoviralen rekombinaten Vektors, in dem die exogene DNA-Sequenz anstelle des Bereichs E3 inseriert ist. Bei diesen besonderen Ausführungsformen handelt es sich jedoch nur um Beispiele. Schließlich kann das erfindungsgemäße Verfahren verwendet werden, um in eine bestimmte Region des viralen Genoms Deletionen, Mutationen und/oder Substitutionen einzuführen.
Gemäß einer anderen Ausführungsform kann das erfindungsgemäße Verfahren ebenso dazu verwendet werden, wenigstens zwei DNA-Fragmente in ein virales Genom einzufügen, durch intermolekulare Rekombination zwischen (i) einem ersten DNA-Fragment, welches das gesamte oder einen Teil des Genoms des Stammvirus umfasst, (ii) einem zweiten DNA-Fragment, welches einen ersten Teil der exogenen DNA-Sequenz, welche an ihrem 5'-Ende mit der flankierenden Sequenz A versehen ist, enthält, und (iii) einem dritten DNA-Fragment, welches einen zweiten Teil der exogenen DNA-Sequenz, welche an ihrem 3'-Ende mit der flankierenden Sequenz B versehen ist, enthält, wobei die zweiten und dritten DNA-Fragmente eine homologe Sequenz aufweisen, welche sich an ihren jeweiligen 3'- und 5'-Enden befinden. Diese homologen Sequenzen zwischen den zweiten und dritten DNA-Fragmenten genügen bevorzugt den gleichen Homologie- und Längenkriterien wie die Sequenzen A und B. Diese spezifische Ausführungsform ist besonders vorteilhaft für die Klonierung von großen exogenen Sequenzen.
Das erfindungsgemäße Verfahren wird in einem Bakterium, welches von einem Escherichia coli recBC sbcBC-Stamm abgeleitet ist, wie beispielsweise die Stämme CES200, CES201, W5449 und BJ5183 (Hanahan, 1983, J. Mol. Biol., 166, 557–580), durchgeführt.
Eine typische Vorgehensweise des erfindungsgemäßen Verfahrens umfasst folgende Stufen:

(a) Die Co-Einführung oder getrennte Einführung eines ersten DNA-Fragments und (ii) eines zweiten DNA-Fragments, wie zuvor ausführlich definiert, in eine Escherichia coli recBC sbcBC-Zelle,
(b) die Kultivierung der in Stufe (a) erhaltenen Escherichia coli recBC sbcBC-Zelle unter geeigneten Bedingungen zum Erhalt des rekombinanten viralen Vektors durch intermolekulare Rekombination und
(c) die Gewinnung des rekombinanten viralen Vektors.

In dem erfindungsgemäßen Verfahren können die Mengen an ersten und zweiten DNA-Fragmenten variieren. Bevorzugt wird die 10-fache Konzentration des zweiten Fragments gegenüber dem ersten verwendet. Die Einführung der DNA-Fragmente in die Escherichia coli recBC sbcBC-Zelle und die Gewinnung des Vektors aus diesen Zellen werden gemäß der allgemeinen Techniken der Genetik und der molekularen Klonierung, die im Maniatis et al. (1989, Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) beschrieben sind, durchgeführt.
Ein virales infektiöses Partikel, welches einen rekombinanten viralen Vektor enthält, kann durch Anwendung eines Verfahrens erhalten werden, in dem:

(a) der rekombinante virale Vektor in eine Säugetierzelle einführt wird, um eine transfizierte Säugetierzelle zu erzeugen,
(b) die transfizierte Säugetierzelle unter geeigneten Bedingungen kultiviert wird, um die Produktion des viralen Partikels zu ermöglichen, und
(c) das virale Partikel aus der in Stufe (b) erhaltenen Zellkultur gewonnen wird.

Die Zellen können gemäß der Standardtechniken, die dem Fachmann gut bekannt sind transfiziert werden. Insbesondere seien die Calciumphosphat-Technik, die DEAE-Dextran-Technik, die Elektroporation, die Verfahren basierend auf osmotischem Schock, die Mikroinjektion oder die Methoden basierend auf der Verwendung von Liposomen genannt. In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei der Säugetierzelle um eine Komplementationszelle und insbesondere um die Zelle 293 im Rahmen eines von einem Adenovirus abstammenden Vektors. Die viralen Partikel können aus dem Überstand der Kultur gewonnen werden, jedoch ebenso aus den Zellen nach den üblichen Protokollen.
Ein infektiöses virales Partikel oder ein rekombinanter viraler Vektor, hergestellt nach dem erfindungsgemäßen Verfahren, können zur therapeutischen oder chirurgischen Behandlung des humanen Körpers und insbesondere zur Gentherapie verwendet werden. Die Behandlung ist insbesondere eine präventive oder kurative Behandlung von Krankheiten, wie genetischen Erkrankungen (Hämophilie, Thalassämien, Emphysem, Gaucher-Krankheit, Mukoviszidose, Duchène- oder Becker-Myopathie ...), Krebserkrankungen, viralen Erkrankungen (Aids, Herpesinfektionen oder Cytomegalovirus- oder Papillomavirus- Infektionen). Die Vektoren und viralen Partikel können entweder in vitro in eine Wirtszelle, die dem Patienten entnommen wurde, oder direkt in vivo in den zu behandelnden Organismus eingeführt werden. Bevorzugt handelt es sich bei der Wirtszelle um eine humane Zelle und bevorzugter um eine Lungenzelle, Fibroblastenzelle, Muskelzelle, Leberzelle, Lymphocytenzelle oder eine Zelle der hämatopoetischen Linie.
Eine pharmazeutische Zusammensetzung, welche eine therapeutisch wirksame Menge eines erfindungsgemäß hergestellten infektiösen viralen Partikels oder eines rekombinanten viralen Vektors enthält, kann zusammen mit einem aus pharmazeutischer Sicht geeigneten Träger hergestellt werden. Eine derartige pharmazeutische Zusammensetzung kann gemäß den gewöhnlich verwendeten Techniken hergestellt und auf jedem bekannten Weg verabreicht werden, beispielsweise systemisch (insbesondere intravenös, intratrachial, intraperitoneal, intramuskulös, subkutan, intratumoral oder intracranial) oder durch Aerosolisation oder intrapulmonare Instillation.
Ein nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestelltes infektiöses virales Partikel oder rekombinanter viraler Vektor können zur Expression einer interessierenden DNA-Sequenz in einem zellulären System verwendet werden.
Die vorliegende Erfindung wird anhand der folgenden Figuren und Beispiele genauer beschrieben.
1 ist eine schematische Darstellung des Genoms des humanen Adenovirus Typ 5 (dargestellt in willkürlich gewählten Einheiten von 0 bis 100), welches die Anordnung der verschiedenen Gene zeigt.
2 zeigt ein Verfahren der intermolekularen Rekombination zwischen zwei DNA-Fragmenten. Die plasmidischen Sequenzen werden durch eine dünne Linie dargestellt, die viralen Sequenzen durch eine fette Linie und die exogene Sequenz durch ein schraffiertes Kästchen.
3 ist eine schematische Darstellung des Vektors pTG3614, welcher dem p polyII entspricht, in den das Genom eines rekombinanten Adenovirus kloniert wurde, welches in dem Bereich E1 durch Insertion einer Expressionskassette des humanen FIX-Gens modifiziert ist.
4 ist eine schematische Darstellung des Vektors pTG4652, welcher dem p polyII entspricht, in den das Genom eines rekombinanten Adenovirus kloniert wurde, welches in den Bereichen E1, E3 und E4 durch Insertion einer Expressionskassette des humanen CF-Gens und durch partielle Deletionen modifiziert wurde.
BEISPIELE
Die folgenden Beispiele veranschaulichen lediglich eine mögliche Ausführungsform der vorliegenden Erfindung.
Die im Folgenden beschriebenen Konstruktionen werden nach den allgemeinen Methoden der Gentechnik und Molekularbiologie, welche detailliert im Maniatis et al. (1989, supra) beschrieben sind, realisiert. Die 5'-überstehenden Restriktionsstellen können durch das große Klenow-Fragment der E. coli-DNA-Polymerase in glatte Stellen überführt werden, die 3'-überstehenden Enden werden mit T4-Polymerase behandelt. Bezüglich der Amplifikationsstufen durch PCR wird das in "PCR Protokolls-A Guide to Methods and Applications (1990, ed Innis, Gelfand, Sninsky et White, Academic Press Inc.)" be schriebene Protokoll verwendet. Die Zellen werden durch die konventionellen Methoden transfiziert und gemäß den Empfehlungen des Lieferanten kultiviert. Die in die nachfolgend beschriebenen verschiedenen Konstruktionen eingeführten Fragmente werden genau gemäß ihrer Position in dem Ad5-Genom, so wie in der Datenbank Genebank unter der Referenz M73260 bekannt gemacht, angezeigt.
Beispiel 1: Konstruktion eines rekombinanten viralen Vektors, abgeleitet von einem humanen Adenovirus Typ 5, in Form eines bakteriellen Plasmids
A. Klonierung des Adenovirus 5(Ad5)-Genoms in p polyII
Es wird der linke Endbereich des Ad5-Genoms (Nukleotide 1 bis 935) durch PCR mit Hilfe der Starteroligonukleotide (Primer) oTG6597 (SEQ ID NO: 1) und oTG6598 (SEQ ID NO: 2) synthetisiert. Das erste hybridisiert mit den 21 ersten Nukleotiden der 5'-ITR und weist eine PacI-Site unmittelbar stromaufwärts der viralen Sequenzen und eine EcoRI-Site, welche für die Klonierung verwendet wird, auf. Der zweite Primer ermöglicht die Einführung von SalI- und BglII-Sites stromabwärts der viralen Sequenzen. Die in dieser Reaktion verwendete Matrize ist die genomische DNA von Ad5, die nach konventionellen Verfahren hergestellt wurde. Das so amplifizierte Fragment wird mit EcoRI und BglII verdaut und in das Plasmid p polyII (Lethe et al., 1987, supra) kloniert, welches zuvor durch die beiden gleichen Restriktionsenzyme gespalten wurde, wodurch pTG1692 erhalten wurde.
Das DNA-Fragment, welches dem rechten Randbereich des Ad5-Genoms entspricht (Nukleotide 35103 bis 35935) wird nach dem gleichen Prinzip hergestellt, wobei das Oligonukleotid paar oTG6599 (SEQ ID NO: 3) und oTG6597 (SEQ ID NO: 1) verwendet wird. Der Vektor pTG1693 wird konstruiert, indem das mit EcoRI und BglII verdaute, amplifizierte Fragment in die gleichen Sites von p polyII eingefügt wird. Aus pTG1693 wird ein BglII-BamHI-Fragment herausgeschnitten, welches die amplifizierten Sequenzen trägt, derart, dass in die BglII-Site von pTG1692 stromabwärts die adenoviralen 5'-Sequenzen eingeführt werden. Der so erhaltene pTG3601 wird zwischen den linken und rechten Endbereichen des Ad5-Genoms durch Verdau mit den Restriktionsenzymen BglII oder SalI linearisiert. Die so erzeugten Enden werden durch Wirkung des Klenow-Fragments der DNA-Polymerase von E. coli glatt gemacht. Die durch eine Calciumchlorid-Behandlung kompetent gemachten Bakterien BJ5183 (Hanahan, 1983 supra) werden mit der vorherigen Präparation und genomischer Ad5-DANN co-transformiert. Die erhaltenen Kolonien werden durch Restriktionskartografie analysiert. Es wird ein als pTG3602 bezeichneter Klon ausgewählt, der durch homologe intermolekulare Rekombination erhalten wurde, indem die adenoviralen Sequenzen (Nukleotide 936 bis 35102) zwischen die zwei durch PCR produzierrten Fragmente eingefügt wurden, derart, dass ein plasmidischer Vektor erzeugt wird, welcher das vollständige Ad5-pTG3602-Genom enthält und in den Bakterien C600 (Huynh et al., 1985 DNA Cloning, Volume 1, ed. Glover, IRL Press Limited: Oxford, England p56–110) produziert wird.
B. Evaluierung des infektiösen Vermögens von pTG3602
Das virale Genom wird durch das Restriktionsenzym PacI freigesetzt. Die einschichtig kultivierten Zellen 293 werden mit dem Produkt dieses Verdaus durch Calciumphosphat-Präzipitation transfiziert. Es können gleichermaßen andere sensible Zellen verwendet werden, beispielsweise die Zellen A549 (ATCC CCL185). Die Zellen werden auf Agar 9 bis 14 Tage lang vermehrt, ein Zeitraum, in dem Lysisplaques auf dem Kontrollzellteppich durch die Herstellung von viralen infektiösen Partikeln und somit der Fähigkeit des aus dem pTG3602 hervorgegangenen Ad5-Genoms, sich zu replizieren, erscheinen.
C. Konstruktion eines defektiven rekombinanten adenoviralen Vektors, in dem der frühe Bereich E1 durch das exogene Gen ersetzt ist
Es wird ein Plasmid verwendet, in dem das Reportergen Lac Z, welches für die β-Galaktosidase kodiert, in einem viralen Kontext platziert ist; beispielsweise ein Plasmid, welches von pMLP-Adk7 abstammt (Stratford-Perricaudet und Perricaudet, 1991, Human Gene Transfer, 219, 51–61) und die 5'-Sequenzen von Ad5 (Nukleotide 1 bis 458), den Promotor MLP Ad2, das Lac-Z-Gen, das Polyadenylierungssignal des Virus SV40 und die Ad5-Sequenzen der Nukleotide 3329 bis 6241 enthält.
Die Expressionskassette des Lac-Z-Gens, umgeben von adenoviralen Sequenzen, wird durch die Restriktionsenzyme BsrGI (Position 192 auf dem Ad5-Genom) und PstI (Position 3788) herausgeschnitten und anschließend gereinigt. Der Vektor pTG3602 wird auf Höhe der ClaI-Site (Position 918) linearisiert und anschließend mit dem Klenow-Fragment behandelt. Die beiden erhaltenen Fragmente werden in die kompetenten Bakterien BJ5183 co-transformiert. Eine Rekombination auf Höhe der homologen adenoviralen Sequenzen führt zum Austausch des Bereichs E1 von Ad5 (Nukleotide 459 bis 3328) durch die Expressionskassette des Reportergens in dem Plasmid pTG3603.
Sein infektiöses Vermögen wird durch Transfektion eines Zellteppichs der Zellen 293, transfiziert mit zuvor durch PacI-verdautem pTG3603, verifiziert. Die gebildeten Lysispla ques werden gepickt und die viralen Partikel in Suspension gebracht und zur Infektion einer Schicht der 293-Zellen verwendet. Die Blaufärbung der Zellen nach Zugabe von X-Gal beweist die Expression des Lac-Z-Gens.
D. Konstruktion eines rekombinanten adenoviralen Vektors, in dem der frühe Bereich E3 durch das exogene Gen ersetzt ist
Eine Expressionskassette des Gens, welches für das gp19-Protein des Bereichs E3 von Ad5 kodiert (Nukleotide 28731 bis 29217) wird in dem Bakteriophagen M13mp18 (Gibco BRL) zusammengefügt, indem zwei PCR-Fragmente kloniert werden, wobei eines der 3'-LTR von RSV (Rous Sarcoma Virus) (Oligonukliotid-Primer oTG5892-SEQ ID NO: 4 und 5893-SEQ ID NO: 5) und das andere der für gp19 kodierenden Sequenz entspricht (oTG5455-SEQ ID NO: 6 und 5456-SEQ ID NO: 7). Es wird der Vektor M13TG1683 erhalten, aus dem durch XbaI-Verdau die Expressionskassette herausgeschnitten wird. Nach Behandlung mit dem Klenow-Fragment wird sie in die BsmI-Site (begradigt durch die Wirkung der DNA-Polymerase des Phagen T4) von pTG8519 eingeführt. Dieser stammt von dem Plasmid puc19 (Gibco BRL) ab, in das die adenoviralen Sequenzen zwischen der SpeI-Site und dem rechten Randbereich des Genoms (Nukleotide 27082 bis 35935) eingefügt wurden, wobei jedoch der Hauptteil des Bereichs E3 (Nukleotide 27871 bis 30758) fehlt. Es wird der pTG1695 erhalten, in dem das ScaI-SpeI-Fragment, welches die plasmidischen Sequenzen trägt, durch ein gereinigtes äquivalentes Fragment von pTG1659 ersetzt ist. Dies entspricht dem puc19, welcher die Sequenzen von Ad5 enthält, die sich über die Nukleotide 21562 bis 35826 erstrecken. Der so erhaltene pTG1697 weist adenovirale Sequenzen auf, die sich von der BamHI-Site (Position 21562) zu der 3'-ITR (Position 35935) erstrecken, in denen der Bereich E3 durch eine Expres sionskassette von gp19 unter Kontrolle des konstitutiven Promotors RSV ersetzt ist. Das Fragment DraI (Position 224444 und 35142 auf dem Ad5-Genom) wird gereinigt, und mit pTG3602, welcher mit SpeI linearisiert und mit dem Klenow-Fragment behandelt wurde, in kompetente Bakterien BJ-5183 co-eingeführt. Die rekombinaten Träger eines durch Rekombination erzeugten Plasmids werden auf Gegenwart des Promotors RSV geprüft. Der pTG3605, plasmidischer Vektor und Träger des Genoms von Adgp19+ wird somit offensichtlich.
Das infektiöse Vermögen des aus dem Plasmid pTG3605 ausgeschnittenen viralen Genoms wird gemäß dem zuvor beschriebenen Protokoll getestet. Die Produktion eines funktionellen Proteins gp19 wird durch die Co-Immunopräzipitation von Antigenen des Haupthistokompatibilitätskomplexes der Klasse I und des Proteins gezeigt (Burgert et Kvist, 1985, Cell, 41, 987–997).
E. Konstruktion eines defektiven rekombinanten adenoviralen Vektors, in dem die zwei frühen Bereiche E1 und E3 durch exogene Gene ersetzt sind
Die Zellen BJ-5183 werden mit dem oben erwähnten aus pTG1697 isolierten Fragment DraI und dem aus pTG3603 isolierten Fragment SpeI (Klenow) co-transformiert. Das resultierende Plasmid wird unter den gleichen Bedingungen wie zuvor untersucht.
F. Konstruktion eines rekombinanten adenoviralen Vektors, welcher das Gen FIX exprimiert
Die cDNA, welche für das humane FIX kodiert, wurde in Form eines BamHI-Fragments in das Plasmid pTG381 kloniert. In diesem wurde das nicht kodierende 5'-Ende des FIX-Gens derart modifiziert, dass es den Regeln von Kozak genügt. Das Plasmid pTG381 wird in der Patentveröffentlichung FR 2 600 334 beschrieben. Das FIX-Gen wird in die BamHI-Site von pTG6512 umkloniert, wodurch pTG4375 erhalten wird. pTG6512 stammt von dem Vektor pTG6511 nach Deletion des späten Hauptpromotors (MLP) von Ad2 und Ersetzen durch einen Polylinker, ab. Die Herstellung von pTG6511 ist detailliert in Beispiel 1 der internationalen Anmeldung WO 94/28152 beschrieben. Der murine Promotor PGK wird durch konventionelle Methoden, ausgehend von genomischer Maus-DNA gemäß Adra et al. isoliert (1987, Gene 60, 65–74) oder mit Hilfe von adäquaten Primern, die ausgehend von Sequenzdaten, veröffentlicht in der Datenbank Genebank unter der Referenz X15339, kreiert wurden. In den 5'-Enden der Primer befinden sich PstI-Restriktionsschnittstellen, um die späteren Klonierungsstufen zu vereinfachen. Das Fragment, welches den Promotor PGK trägt, wird mit T4-Polymerase behandelt und anschließend stromaufwärts des humanen FIX-Gens in die HpaI-Site von pTG4375 eingeführt, aus dem man durch MscI-Verdau ein "Ersatz"-Fragment, welches die FIX-Kassette umgeben von adenoviralen Sequenzen E1 trägt (185 bp in 5' und 2045 bp in 3'), herausgeschnitten hat.
Dieses wird in Gegenwart des Vektors pTG3602, welcher mit ClaI verdaut wurde (Position 918), co-transformiert. Die Transformanden werden auf Ampicillin selektioniert und durch Restriktionskartographie analysiert. Es wird der als pTG3614 bezeichnete Klon erhalten, der einem adenoviralen Vektor entspricht, welcher das therapeutische FIX-Gen anstelle des Bereichs E1 trägt (3). Eine virale Bank wird auf konventionelle Weise durch Transfektion des durch PacI-Verdau freigesetzten adenoviralen Genoms in die Linie 293 angelegt. Nach einer Amplifikationsstufe werden die Zellen lysiert und die viralen Partikel AdTG3614 durch Zentrifugation auf Cäsiumchlorid gereinigt.
Die Fähigkeit, das FIX-Gen zu überführen und zu exprimieren wird im Maustier-Modell bewertet. Dazu werden 1,5 × 10⁹ ufp in die Caudalvene von 5 bis 6 Wochen alten weiblichen C57-Black-6-Mäusen injiziert. Es werden regelmäßig Blutproben entnommen, bei denen die Menge an humanem FIX durch ELISA bestimmt wird (Kit Diagnostica Stago, Asnieres, France; Asserachirom^®IX: Ag 00564). Das FIX wird in dem Mausserum über mehrere Wochen mit einem Maximum bei 5 Tagen detektiert.
G. Konstruktion eines adenoviralen Vektors, der in dem Bereich E2 modifiziert ist
Im normalen viralen Zyklus wird die Expression der Gene der Region E2 durch die frühen Produkte von E1 und E4 induziert, und es wird eine reichliche Produktion der durch E2 kodierten Proteine und insbesondere des Proteins DBP (für DNA Binding Protein) beobachtet. Diese erhöhte Expression kann jedoch in vivo problematisch sein (Induktion von Entzündungsantworten oder Interferenz mit der Expression des Transgenen). Aus diesem Grund wurden die für die Funktion E2A defektiven adenoviralen Vektoren entweder durch Einführung einer thermosensiblen Mutation in E2A (Position 22795; C in T, was zu einem Ersatz von Pro durch Ser führt) oder durch eine partielle Deletion des DBP-Gens konstruiert.
Der Vektor pTG9551, welcher die thermosensible Mutation trägt, wird durch homologe Rekombination in BJ-Zellen zwischen pTG3601, verdaut mit BgII, und gereinigter genomischer DNA des Virus Ad5Hts 125 erzeugt (Ensinger und Ginsberg, 1972, J. Virol, 10, 328–339). Das so wiederhergestellte Genom wird durch PacI-Verdau freigesetzt und in die Zellen 293 transfiziert, welche bei 32°C zur Herstellung von viralen Partikeln inkubiert werden (die Toleranzgrenze für die Temperatur beträgt 39°C).
Die Fehlerhaftigkeit von E2A kann ebenso durch partielle Deletion von kodierenden Bereichen des DBP-Gens erzeugt werden, wobei Bereiche, die andere Leseraster abdecken, vermieden werden. Die Konstruktion wird durch die homologe Rekombination zwischen pTG3601 BglII und viraler DNA, hergestellt ausgehend von dem Virus H5dl802 (Rice und Klessig, 1985, J. Virol. 56, 767–778) bewirkt. Die Viren können in einer geeigneten Komplementationslinie, welche die Funktion DBP trans-komplementiert, beispielsweise der Linie 293, transfiziert mit einem Vektor, der die konstitutive oder regulierte Expression des DBP-Gens ermöglicht, produziert werden.
H. Konstruktion eines adenoviralen Vektors, welcher in der Region E4 modifiziert ist.
In einem ersten Schritt wird ein sogenannter "Ersatz"-Vektor konstruiert, welcher eine Expressionkassette des für das CFTR-Protein kodierenden Gens, platziert inmitten der adenoviralen Region E1, enthält. Dieser als pTG8585 bezeichnete Vektor enthält folgende Elemente, die alle in der Literatur beschrieben sind:

– 5'-ITP von Ad5 (Positionen 1 bis 458),
– den Promotor MLP Ad2,
– die humane CFTR-cDNA,
– das Polyadenylierungssignal des Kaninchen-β-Globingens,
– die 3'-LTR des Virus RSV (Rous Sarcoma Virus),
– die adenoviralen Sequenzen, welche für das Protein gp19 kodieren (Positionen 28731 bis 29217 von Ad5), und
– den 3'-Bereich der Region E1B (Position 3329 bis 6241).

Parallel dazu werden die adenoviralen Sequenzen, welche die Regionen E3 und E4 abdecken, in den Vektor p polyII subkloniert und durch klassische Techniken der Molekularbiologie deletiert. Es werden die Sequenzen E3 (Positionen 28592 bis 30470) durch XbaI-Verdau und die Sequenzen E4 (Positionen 32994 bis 34998) eliminiert. Das so modifizierte adenovirale Genom wird durch homologe Rekombination zwischen einem Ersatzfragment, welches diese Modifikationen trägt und aus dem vorhergehenden Vektor isoliert wurde, und pTG3603, verdaut mit SpeI, wiederhergestellt. Es wird pTG8595 erhalten, welcher ein rekombinantes adenovirales Genom trägt (Gen Lac Z anstelle der Region E1) und defektiv für die Funktionen E3 und E4 ist.
Die Expressionskassetten der oben aufgeführten Gene CFTR und gp19 werden in pTG8595 eingeführt, indem das Lac-Z-Gen durch Co-Transformation der Zellen BJ5183 durch das Fragment PacI-BstEII, isoliert aus pTG8585, und den durch ClaI linearisierten Vektor pTG8595, ersetzt wird. Es wird pTG4652 (4) erzeugt, der in einer Zelllinie vermehrt werden kann, welche die defektiven Funktionen E1 und E4 komplementiert, wie in der internationalen Anmeldung WO 94/28152 beschrieben.
Die viralen Partikel werden amplifiziert, die Zellen lysiert und die gesamten Zellextrakte durch Western Blot (SDS-PAGE-Gel, 8%) bezüglich der Expression des CFTR-Gens analysiert. Die Filter werden in Gegenwart einer 1/5000-Verdünnung des monoklonalen Antikörpers MAB 1104, welcher gegen ein synthetisches Peptid gerichtet ist, welches den Aminosäuren 722 bis 734 des humanen CFTR-Protein entspricht, inku biert. Die Detektion wird durch die ECL-Methode (Enhanced ChemiLuminescence; Kit Amersham) bewirkt. In den durch AdTG 4652 infizierten Zellextrakten wird eine ziemlich diffuse Bande starker Intensität beobachtet, welche einem Produkt mit erhöhtem Molekulargewicht, welches mit einem CFTR-Vergleich comigriert, entspricht. Diese Bande liegt in den Extrakten, die von dem Stammvirus pTG8595 stammen, welcher die Expressionkassette CFTR nicht enthält, nicht vor.
Beispiel 2: Konstruktion eines rekombinanten viralen Vektors, abgeleitet vom Hunde-Andenovirus 2 (CAV2), in Form eines baktieriellen Plasmids
A. Klonierung des Genoms von CAV2 in p polyII
Das Genom von CAV2 wird in p polyII Sfil-NotI 14 (Lathe et al., 1987, supra) kloniert und zur Erzeugung der rekombinanten Vektoren modifiziert, indem die entsprechenden Sites verwendet und die gleichen Verfahren wie im Fall der Manipulation von Ad5 angewendet werden. Die linken Enden (Nukleotide 1 bis 810 gemäß der Nummerierung der Sequenz D04368 der Genebank) und rechten Enden (Nukleotide ca. 27600 bis zum Ende) werden durch PCR zwischen den Oligonukleotid-Primerpaaren oTG6974 (SEQ ID NO: 8) und oTG6975 (SEQ ID NO: 9) bzw. oTG6976 (SEQ ID NO: 10) und oTG6974 synthetisiert. Sie werden durch die Vermittlung der PstI-Site, welche bei der PCR eingeführt wurde, hinter den viralen Sequenzen, im Fall des linken Endes, und Kartografie bei ungefähr 1200 bp bis zum Ende des Genoms, im Fall des rechten Endes, zusammengefügt. Die kompetenten Bakterien BJ5183 werden mit dem so erhaltenen, durch PstI linearisierten Plasmid und der DNA von CAV2 co-transformiert. Die Einführung der fehlenden viralen Sequenzen (Nukleotide 811 bis 27600) wird durch homologe Re kombination bewirkt. Das Genom von CAV2, welches von dem entstandenen Plasmid getragen wird, wird durch Vermittlung der NotI-Sites, welche bei der PCR eingeführt wurden, herausgeschnitten und anschließend in eine Schicht von MDCK-Zellen (ATCC CCL34) transfiziert. Die folgenden Stufen sind in Beispiel 1 beschrieben.
B. Konstruktion eines rekombinanten adenoviralen Vektors caninen Ursprungs
Die genomische DNA des Virus CAV2 (Stamm Toronto A 26/61; ATCC VR-800) wird durch die klassische Technik (Amplifikation auf der Hundenieren-Linie MDCK GHK ..., Lyse der Zellen, Aufreinigung des Virus durch Zentrifugation auf Cäsiumchlorid, Behandlung mit Proteinase K und abschließende Phenol-/Chloroform-Extraktion) hergestellt. Das CAV2-Genom, welches ein Länge von 31 kb aufweist, wird durch homologe Rekombination in einen plasmidischen Vektor eingeführt. Dazu werden die linken und rechten Enden des CAV2-Genoms durch PCR und enzymatischen Verdau, wobei eine NotI-Site unmittelbar jenseits der 5'- und 3'-ITRs eingefügt wird, isoliert. Der Vektor pTG4457 wird durch Einführung des 5'-Bereichs des viralen Genoms bis zur BstBI-Site (Position 870), gefolgt von dem 3'-Bereich, ausgehend von der SalI-Site (Position 27800) in p polyII erhalten. Das komplette Genom kann durch Co-Transformation von genomischer DNA (100 bis 500 ng) und pTG4457, verdaut mit BstBI, (10 bis 100 ng) wiederhergestellt werden. Das virale Genom kann aus dem vorhergehenden Vektor pTG5406 durch NotI-Verdau herausgeschnitten werden. Durch Transfektion von 1 bis 5 μg in Hunde-MDCK- oder GHK-Zellen wird verifiziert, dass die DNA infektiös ist. Es wird die Produktion von Plaques beobachtet.
Der rekombinante Vektor wird folgendermaßen erhalten:
Das linke Ende von CAV2 wird subkloniert und derart modifiziert, dass die kodierenden Sequenzen E1A vollständig und E1B teilweise deletiert sind. Dies wird durch NarI-Verdau und anschließende Wiedereinführung eines durch PCR amplifizierten Fragments, welches die Einkapselungsregion, die Promotorregion E1A und die Initiationsstelle der Transkription abdeckt, bewirkt. Die Primer sind derart konstruiert, dass sie eine einzige Restriktionsschnittstelle XbaI enthalten. Es wird pTG5407 erhalten, in den auf Höhe der XbaI-Site das CAT- oder Lac-Z-Gen eingeführt wird (pTG 5408). Dieser letzte wird durch XhoI verdaut und es wird der 3'-Bereich des viralen Genoms in Form eines SalI-Fragments (Position 27800 bis zum Ende der 3'-ITR) eingefügt. Der so erhaltene Vektor pTG5409 wird mit SalI linearisiert und mit dem CAV2-Genom, verdaut mit SwaI, in E. coli BJ5183 co-transformiert. Es wird ein adenoviraler Vektor caninen Ursprungs erhalten, der das Reportergen CAT anstelle der Region E1 trägt.
Sequenzliste

Claims

Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten viralen Vektors von mindestens 20 kb in einer prokaryotischen Zelle, wobei der Vektor von einem Stammvirus abgeleitet wird, in dessen Genom durch intermolekulare Rekombination zwischen (i) einem ersten DNA-Fragment, welches das gesamte oder einen Teil des Genoms des Stammvirus umfasst, und (ii) einem zweiten DNA-Fragment, welches eine exogene DNA-Sequenz, die von den zu (i) homologen, flankierenden Sequenzen A und B eingerahmt wird, umfasst, eine exogene DNA-Sequenz eingefügt wird, dadurch gekennzeichnet, dass die prokaryotische Zelle von einem Escherichia coli recBC sbcBC-Stamm abgeleitet ist.
Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Stammvirus um ein Adenovirus, Retrovirus, ein mit dem Adenovirus verwandtes Virus, ein Pockenvirus oder ein Herpesvirus handelt.
Verfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Stammvirus um ein menschliches, ein Hunde-, Vogel-, Rinder-, Maus-, Schafs-, Schweine- oder Affenadenovirus oder ein hybrides Adenovirus handelt.
Verfahren gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Stammvirus ein Hundevirus des CAV-2-Typs ist.
Verfahren gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Stammvirus ein humanes Adenovirus des Serotyps C ist.
Verfahren gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Stammvirus ein humanes Adenovirus des Typs 5 ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die exogene DNA-Sequenz für ein Polypeptid von therapeutischem Interesse aus der Gruppe der Koagulationsfaktoren, Wachstumshormone, Zytokine, Lymphokine, tumorsuppressiven Polypeptide, zellulären Rezeptoren, zellulären Rezeptorliganden, Proteaseinhibitoren, Antikörper, Toxine, Immunotoxine, Dystrophine oder Polypeptide, die in die zellulären Ionenkanäle eingreifen, wie das CFTR-Protein, kodiert.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die homologen, flankierenden Sequenzen A und B eine Länge von 10 bp bis 10 kb, vorteilhafterweise von 20 bp bis 5 kb, bevorzugt von 30 bp bis 2 kb, und besonders bevorzugt von 40 bp bis 1 kb, aufweisen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass das erste DNA-Fragment auf Höhe des Insertionsbereichs der exogenen Sequenz linearisiert ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9 zur Herstellung eines rekombinanten viralen Vektors, der für die Replikation defektiv ist.
Verfahren gemäß Anspruch 10 zur Herstellung eines rekombinanten adenoviralen Vektors, dem die gesamte oder ein Teil wenigstens eines für die Replikation essentiellen Bereichs E1, E2 und/oder E4 fehlt.
Verfahren gemäß Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass dem rekombinanten adenoviralen Vektor außerdem ein Teil oder der gesamte Bereich E3 fehlt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12 zur Herstellung eines rekombinanten viralen Vektors von wenigstens 30 kb.
Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 13 durch intermolekulare Rekombination zwischen (i) einem ersten DNA-Fragment, welches das gesamte oder einen Teil des Genoms des Stammvirus umfasst, (ii) einem zweiten DNA-Fragment, welches einen ersten Teil der DNA-Sequenz von Interesse, welche an ihrem 5'-Ende mit der flankierenden Sequenz A versehen ist, enthält, und (iii) einem dritten DNA-Fragment, welches einen zweiten Teil der DNA-Sequenz von Interesse, welche an ihrem 3'-Ende mit der flankierenden Sequenz B versehen ist, enthält, wobei die zweiten und dritten DNA-Fragmente an ihren jeweiligen 3'- und 5'-Enden eine homologe Sequenz aufweisen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14 zum Einführen einer Modifikation durch Deletion, Mutation und/oder Substitution eines oder mehrerer Nukleotide oder einer exogenen DNA-Sequenz in ein virales Genom.
Verwendung eines E. coli recBC sbcBC-Stammes zur Klonierung von DNA-Fragmenten in einen Vektor gemäß Anspruch 1 durch intermolekulare homologe Rekombination.