DE60033679T2 - Herstellung von rekombinanten adenoviren und von adenovirus-genbanken - Google Patents

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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft Zusammensetzungen und Methoden zur Herstellung rekombinanter Adenoviren. Die hergestellten Adenoviren können zum Transfer und/oder Expression von Genen in Zellen in vitro, ex vivo oder in vivo, oder auch in der funktionellen Genomik verwendet werden. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung besonders effiziente Methoden zur Herstellung von Adenovirus-Genbanken und die Verwendung solcher Banken in der funktionellen Genomik. Sie betrifft ebenfalls Plasmide, die zur Konstruktion dieser Adenoviren verwendet werden, die Zellen, die diese Plasmide enthalten, und Kits, die diese Plasmide umfassen, Zellen und/oder Adenovirus-Banken.
  • Die Adenoviren weisen bestimmte interessante Eigenschaften für den Transfer und/oder die Expression von Genen in Zellen auf. Sie haben vor allem ein relativ großes Wirtsspektrum, sind in der Lage, ruhende Zellen zu infizieren, haben eine beträchtliche Klonierungskapazität und integrieren sich nicht in das Genom der infizierten Zelle. Ferner wurden sie bisher nicht mit für den Menschen bedeutsamen Pathologien assoziiert und wurden daher verwendet, um interessierende Gene in unterschiedliche menschliche Gewebe, in vitro oder in vivo zu übertragen, wie etwa Muskel (Ragot et al., Nature 361 (1993) 647), Leber (Jaffe et al., Nature genetics 1 (1992) 372), Nervensystem (Akli et al., Nature genetics 3 (1993) 224), Tumoren, glatte Muskeln usw. Genau diese Eigenschaften machen aus dem adenoviralen Vektor ein Werkzeug der Wahl, um die aus der Genomik stammenden Daten zu nutzen.
  • Die funktionelle Genomik versteht sich als das wissenschaftliche Gebiet, das sich damit beschäftigt, Genome oder Genomdaten von verschiedenen Organismen zu nutzen, um sie in Funktionsbegriffe zu übersetzen. In Anbetracht ihrer Eigenschaften können die adenoviralen Vektoren, die eine exogene Sequenz tragen, verwendet werden, um die Funktion dieser Sequenz in verschiedenen Versuchsmodellen zu bestimmen. Insbesondere können adenovirale Vektoren verwendet werden, um ein therapeutisches Ziel (in dem Sinn, in dem es von der pharmazeutischen Industrie verstanden wird) in einem zellulären Modell in vitro oder in vivo beim Tier zu untersuchen. Da diese Sequenz bekannt und charakterisiert ist, können die adenoviralen Vektoren der funktionellen Validierung dieses Ziels dienen. Umfassender könnte der adenovirale Gentransfervektor in dem Kontext, der funktionelle Genomik genannt wird, ein leistungsfähiges Werkzeug zur Identifikation der Funktion einer Nukleinsequenz in einem eukaryotischen Versuchmodell darstellen, ohne vorher spezielle Informationen zur Natur oder der Funktion dieser Sequenz zu haben, einschließlich in Situationen, in denen zahlreiche Sequenzen in großer Menge untersucht werden müssen.
  • Die Nutzung der Adenoviren in der Industrie, der Therapeutik und der funktionellen Genomik ist jedoch, vor allem durch die derzeitigen Methoden zur Herstellung dieser rekombinanten Viren, noch beschränkt. Insbesondere ermöglichen es die derzeit verfügbaren Methoden nicht, auf einfache, schnelle und klonale Weise Adenoviruspopulationen zu produzieren, die heterologe Nukleinsäuren inkorporieren, speziell, wenn zahlreiche heterologe Nukleinsäuren untersucht werden müssen, wie es in der funktionellen Genomik der Fall ist. Die vorliegende Erfindung liefert genau für diese Probleme eine Lösung. Die vorliegende Erfindung beschreibt nämlich neue Werkzeuge und neue Methoden zur Konstruktion rekombinanter Adenoviren. Die Erfindung beschreibt vor allem genetische Konstrukte (Plasmide), Zellen und Protokolle, die es ermöglichen, Adenoviren sehr schnell und mit hoher Qualität zu produzieren. Die Erfindung ermöglicht es insbesondere, adenovirale Banken zu realisieren, die eine große Anzahl heterologer Nukleinsäuren umfassen.
  • Die Erfindung bezieht sich ebenfalls auf Methoden und Werkzeuge, die die Herstellung solcher Adenoviren, insbesondere solcher Banken, vorteilhafterweise vor allem die gleichzeitige Konstruktion rekombinanter Adenoviren aus Nukleinsäurebanken ermöglichen.
  • Adenoviren sind Viren mit linearer doppelsträngiger DNA mit einer Größe von etwa 36 kb. Ihr Genom umfasst vor allem eine terminale invers wiederholte Sequenz (TIR) an jedem Ende, eine Enkapsidierungssequenz (Psi), frühe Gene und späte Gene. Die wichtigsten frühen Gene sind in den Regionen E1, E2, E3 und E4 enthalten. Unter diesen sind die Gene, die in der Region E1 enthalten sind, zur viralen Propagierung notwendig. Die Region E4 ist für die Regulierung der Replikation des adenoviralen Genoms ebenfalls wichtig. Die wichtigsten späten Gene sind in den Regionen L1 bis L5 enthalten. Das Genom des Adenovirus Ad5 wurde vollständig sequenziert und ist als Datenbestand zugänglich (vgl. vor allem Genebank M73260). Ebenso wurden Teile bzw. die Gesamtheit anderer humaner oder tierischer adenoviraler Genome (Ad2, Ad7, Ad12, CAV-2, usw.) sequenziert.
  • Außerdem wurden die Adenoviren, wie oben angegeben, bereits für den In-vivo-Transfer von Genen verwendet. Zu diesem Zweck wurden unterschiedliche, von Adenoviren abgeleite Adenoviren hergestellt, die unterschiedliche Gene (ss-gal, OTC, α-1AT, Cytokine, Enzyme, Wachstumsfaktoren usw.) inkorporieren. In jedem dieser Konstrukte wurde das Genom des Adenovirus modifiziert, um es nach Gentransfer unfähig zur autonomen Replikation und/oder Propagierung zu machen. Somit sind die auf dem Stand der Technik beschriebenen Konstrukte Adenoviren, bei denen eine oder mehrere Region(en), ausgewählt aus E1, E2, E3, E4, pIX, Iva2, usw., deletiert ist (sind). Speziellen Konstrukten fehlen zum Beispiel Region E1, die Regionen E1 und E3, die Regionen E1 und E4, die Regionen E1, E4 und E3, oder auch die Gesamtheit der kodierenden Regionen des Adenovirus (Gutless-Vektor). Diese Vektoren umfassen im Allgemeinen eine heterologe Nukleinsäure, deren Transfer in die Zellen oder deren Untersuchung gesucht ist. Diese Nukleinsäure kann an unterschiedlichen Stellen des rekombinanten Genoms inseriert werden, wobei sie die deletierten Regionen ersetzt, oder an anderen Positionen. Beispiele adenoviraler Vektoren werden vor allem in Levrero et al., Gene 101 (1991) 195; Gosh-Choudhury et al., Gene 50 (1986) 161, W094/12649, W094/28152, W094/28938, W095/34671, W096/10088, W095/02697, W095/27071, usw. beschrieben, die der vorliegenden Beschreibung als Bezugsdokumente beigefügt sind.
  • Die rekombinanten Adenoviren werden durch Transfektion der DNA des rekombinanten Virus in eine kompetente zelluläre Enkapsidierungslinie hergestellt. Es kann sich um eine einfache Transfektion handeln, wenn über ein Konstrukt verfügt wird, das das gesamte Genom des rekombinanten Virus trägt, oder, wie es am häufigsten der Fall ist, um eine Cotransfektion mehrerer DNA-Fragmente, die unterschiedliche Teile des rekombinanten viralen Genoms liefern. In diesem Fall impliziert das Verfahren einen oder mehrere Schritte homologer Rekombination zwischen den unterschiedlichen Konstrukten in der zellulären Enkapsidierungslinie, um die DNA des rekombinanten Virus zu erzeugen. Für den Einsatz einer dieser Methoden ist es daher notwendig, über geeignete Konstrukte zu verfügen, die das gesamte oder Teile des Genoms des rekombinanten Adenovirus tragen, der hergestellt werden soll.
  • Es existieren unterschiedliche Methoden zur Herstellung dieser Konstrukte in vitro, die auf dem Stand der Technik beschrieben sind. Die Technik, die am häufigsten verwendet wird, besteht darin, virale DNA zu isolieren, sie dann in vitro durch herkömmliche Methoden der Molekularbiologie (Digestion, Ligierung usw.) zu modifizieren. Die erhaltenen Konstrukte werden dann gereinigt und verwendet, um Enkapsidierungslinien zu transfizieren. Indessen beinhaltet diese Technik die Herstellung von Virusbeständen und die Reinigung viraler DNA für jedes Konstrukt oder für jede Manipulation der DNA des rekombinanten Virus, und ist daher nicht an die Herstellung von unterschiedlichen Beständen oder Banken angepasst. Um diesen Nachteilen abzuhelfen, wurde vorgeschlagen, prokaryotische Plasmide zu verwenden, um die viralen DNAs herzustellen, die für die Transfektion verwendbar sind. Insbesondere Bett et al. (PNAS 91 (1994) 8802) beschreibt die Konstruktion eines replikativen Plasmids aus E. coli, das ein modifiziertes adenovirales Genom (Plasmid pBHG10) umfasst. Genauer gesagt trägt dieses Plasmid ein adenovirales Genom, dessen Regionen E1, E3 und Psi deletiert sind, das durch Kopplung der TIR-Sequenzen zirkularisiert ist, und das, inseriert in Höhe der Region 188-1339 des Adenovirusgenoms, einen Teil des Plasmids pBR322 umfasst. Dieses Plasmid kann in E. Coli repliziert werden, das zur Insertion von interessierenden Genen manipuliert wurde, weist aber noch immer Nachteile auf. Seine Verwendung zur Herstellung von Virus beinhaltet vor allem eine Linearisierung der nebeneinander liegenden TIR und eine Rekombination, die in Anbetracht der Konstrukte zur Inkorporation von Regionen in das rekombinante adenovirale Genom führt, die aus dem prokaryotischen Plasmid stammen. Andere Plasmide dieses Typs, die die gleiche Art von Nachteilen aufweisen, wurden zum Beispiel von Graham (EMBOJ. 3 (12) (1984) 2917) beschrieben. Unlängst wurden neue Verfahren beschrieben, die insbesondere auf der homologen Rekombination von zwei Plasmiden basieren, die die künstlichen Chromosome von Hefe (YACs, Ketner et al., 1994) oder Bakterie (Chartier et al., 1996, Crouzet et al., 1997, He et al., 1998) verwenden. Diese Methoden sind, wenngleich leistungsfähiger als die vorherigen, gleichwohl komplexer. Das YAC-System erfordert die Kultur und die Manipulation von Hefen (Ketner et al., 1994). In den E.-Coli-Systemen folgen mehrere Schritte aufeinander (darunter einige kritische, Elektrotransformation, Saccharoseselektion). Es ist insbesondere festzuhalten, dass in allen Fällen, ein oder mehrere Schritte der Sichtung von Klonen erforderlich sind, um einen fertigen klonalen rekombinanten Vektor zu selektieren, der ein infektiöses adenovirales Genom trägt. Diese Verfahren sind jedoch, wenn sie es ermöglichen, auf klonale Weise, Bestände eines Adenovirus effektiv zu produzieren, die ein gegebenes therapeutisches Gen tragen, nicht auf zufrieden stellende Weise zur Herstellung rekombinanter Adenoviren in großer Menge, vor allem zur gleichzeitigen Herstellung mehrerer rekombinanter Adenoviren verwendbar, die unterschiedliche Nukleinsäuren inkorporieren.
  • Ein Hemmschuh für die Verwendung des adenoviralen Vektors als System zum Gentransfer- oder zur Genanalyse besteht also in der Komplexität und der Anzahl der Vorgänge, mit denen die Viren produziert werden müssen. Auf dem Stand der Technik existiert daher ein klarer Bedarf, über geeignete Plasmide zur Herstellung von rekombinanten adenoviralen Genomen verfügen zu können, die in vitro leicht manipulierbar und amplifizierbar sind. Es ist ebenfalls wichtig, dass die so produzierten Genome praktisch keine aus dem Plasmid stammenden Regionen haben, die imstande sind, (i) eine Immunantwort zu induzieren, (ii) für Resistenzproteine zu kodieren, und (iii) die Kapazität des Virus als Vektor zu reduzieren. Es existiert ebenfalls ein Bedarf an Methodologien, die es ermöglichen, auf vereinfachte Weise rekombinante Adenoviren auf klonale Weise, schnell und in großer Anzahl zu erzeugen.
  • Die vorliegende Erfindung ermöglicht es insbesondere, diese Nachteile zu beheben. Die vorliegende Erfindung beschreibt nämlich neuartige Zusammensetzungen und Methoden zur Herstellung rekombinanter Adenoviren, die diese Kriterien aufweisen. Die Zusammensetzungen und Methoden der Erfindung ermöglichen vor allem eine schnelle, effiziente klonale Herstellung rekombinanter Adenoviren in großer Menge, die therapeutisch oder zur Suche nach pharmazeutischen Zielen verwendbar sind.
  • Die vorliegende Erfindung beruht insbesondere auf der Verwendung von zwei (insbesondere prokaryotischen) Plasmiden, die in der Lage sind, in einem Schritt der homologen Rekombination in einer (insbesondere prokaryotischen) Wirtszelle, ein Plasmid zu erzeugen, das ein vollständiges adenovirales Genom umfasst, das leicht exzidierbar ist, um rekombinante Adenoviren herzustellen.
  • Allgemein umfasst das Verfahren der Erfindung daher:
    In einem ersten Schritt, die Konstruktion eines ersten, vorzugsweise prokaryotischen Plasmids (genannt „Fähre"), das ein erstes trunkiertes rekombinantes adenovirales Genom umfasst, das mindestens eine heterologe Nukleinsäure umfasst (Schritt der Klonierung). Vorzugsweise umfasst das erste trunkierte Genom eine TIR, eine heterologe Nukleinsäure, eine adenovirale Homologieregion und gegebenenfalls eine Enkapsidierungssequenz.
  • In einem zweiten Schritt wird dieses erste Plasmid mit einem zweiten Plasmid (genannt „Eltern") in Kontakt gebracht, das ein zweites trunkiertes adenovirales rekombinantes Genom umfasst, das komplementär zum ersten ist, das durch homologe Rekombination die Herstellung eines fertigen Plasmids ermöglicht, das ein vollständiges rekombinantes adenovirales Genom umfasst (Schritt der Rekombination). Das zweite trunkierte adenovirale Genom umfasst mindestens eine TIR, eine adenovirale Homologieregion, die identisch mit jener ist, die in dem ersten vorhanden ist, und eine Enkapsidierungssequenz (wenn diese nicht in dem ersten vorhanden ist). Dieses zweite trunkierte adenovirale Genom kann ferner auch eine andere interessierende Nukleinsäure umfassen.
  • In einem dritten Schritt wird das vollständige adenovirale Genom aus dem fertigen Plasmid exzidiert und in eine Enkapsidierungslinie eingeführt, um rekombinante Adenoviren herzustellen, die das vollständige rekombinante adenovirale Genom inkorporieren (Schritt der Herstellung der Adenoviren).
  • In einem vierten, fakultativen Schritt werden die rekombinanten Adenoviren verwendet, um zu infizieren:
    • – ein biologisches Material, das Zellen umfasst, mit dem Ziel in vitro die Eigenschaften der Nukleinsäure zu analysieren (Schritt der funktionellen Analyse);
    • – eine In-vitro- oder Ex-vivo-Zellkultur, mit dem Ziel ein Protein, Polypeptid oder Peptid herzustellen, das die heterologe Nukleinsäure kodiert.
  • Die vorliegende Erfindung ermöglicht es somit, in einem Schritt (homologe Rekombination), ein prokaryotisches Plasmid zu erhalten, das ein funktionelles (vollständiges) adenovirales Genom trägt, das durch ein oder mehrere geeignete Enzyme exzidierbar ist. Dieses fertige Plasmid resultiert somit aus der Integration eines ersten Plasmids (Fähre), das adenovirale Sequenzen (mindestens eine TIR- und eine Enkapsidierungssequenz) trägt und mit einer interessierenden heterologen Nukleinsäure ausgestattet ist, in ein zweites Plasmid (Eltern), das komplementäre adenovirale Sequenzen (mindestens eine zweite TIR-Sequenz) trägt, durch ein homologes Rekombinationsereignis über eine gemeinsame Sequenz der beiden Plasmide (adenovirale Homologiesequenz). Dieses homologe Rekombinationsereignis lässt über dieses Coaggregat ein funktionelles adenovirales Genom entstehen.
  • Einer der Vorteile des Verfahrens der Erfindung besteht in seiner Einfachheit, die dessen parallele Realisierung mit zahlreichen Fährenplasmiden ermöglicht. Somit umfasst der erste Schritt des Verfahrens vorteilhafterweise die Klonierung einer Nukleinsäurebank in den Fährenplasmiden, wodurch eine Bank von Fährenplasmiden erzeugt wird, die, abgesehen von Insertionen, die sie umfassen, eine identische Struktur aufweisen. Dieser Schritt der Klonierung wird vorteilhafterweise realisiert, indem jeder Klon einzeln, zum Beispiel in einer Vertiefung einer Mikrotiterplatte, konserviert wird. Ferner kann dieser Schritt automatisiert realisiert werden. Die erhaltene Bank der Fährenplasmide wird dann im Schritt der Rekombination verwendet, wobei jedes Fährenplasmid der Bank mit dem Elternplasmid in Kontakt gebracht wird. Dieses Verfahren führt somit zur parallelen und gleichzeitigen Herstellung mehrerer rekombinanter Adenoviren, die eine heterologe Nukleinsäure umfassen (d. h. eine adenovirale Expressionsbank). Diese Bank kann dann auf dem biologischen Material getestet werden (Schritt 4), um Klone zu identifizieren, die eine gesuchte biologische Aktivität aufweisen.
  • Die Erfindung kann mit jeder Art von Adenoviren, prokaryotischen Zellen verwendet werden, und aus unterschiedlichen Nukleinsäurebanken, wie im folgenden Text ausführlich illustriert wird.
  • Definitionen
  • Rekombinanter Adenovirus: Der Begriff rekombinanter Adenovirus bezeichnet im Sinne der Erfindung jeden Adenovirus, dessen Genom durch Deletion und/oder Insertion und/oder Substitution von Basen modifiziert wurde. Es handelt sich daher insbesondere um einen adenoviralen, im Allgemeinen infektiösen, Partikel, der ein rekombinantes adenovirales Genom umfasst. Je nach der oder den Modifikation(en), die dem Genom beigebracht wurden, kann der rekombinante Virus zur Replikation defektiv sein, das heißt nicht zur autonomen Replikation und/oder Propagierung in einer Zelle in der Lage sein. Der rekombinante Adenovirus kann aus jedem Adenovirus-Serotyp, vor allem aus menschlichen (zum Beispiel vom Typ C, wie etwa Ad5, Ad2, Ad7, Ad12 usw.) oder tierischen Adenoviren (wie etwa Hundeadenoviren, wie zum Beispiel CAV-2) hergestellt werden.
  • Adenovirales Genom: Der Begriff „adenovirales Genom" bezeichnet das DNA-Molekül, das in einem Adenovirus vorhanden ist, oder dessen Sequenz, Kopie oder Replikat. Ein rekombinantes adenovirales Genom ist eine Nukleinsäure, deren Sequenz der Sequenz eines Adenovirusgenoms entspricht, und eine oder mehrere Modifikationen umfasst. Die Modifikationen umfassen zum Beispiel Deletionen (zum Beispiel alle oder einen Teil der Regionen E1, E2, E3, E4 usw.), Insertionen (zum Beispiel einer oder mehrerer heterologer Nukleinsäuren) oder Veränderungen der Codonnutzung.
  • Das rekombinante adenovirale Genom, das durch die Zusammensetzungen und Methoden der Erfindung erzeugt wird, ist vorteilhafterweise ein „vollständiges" oder „funktionelles" Genom, das heißt, dass es keinen Beitrag anderer Regionen durch Rekombination oder Ligierung zur Herstellung von viralen Beständen in den ausgewählten Enkapsidierungslinien benötigt. Ein solches „vollständiges" Genom umfasst daher vorteilhafterweise mindestens eine Enkapsidierungssequenz und eine heterologe Nukleinsäure, die an jedem Ende von einer TIR-Sequenz flankiert ist. Ein anderes vorteilhaftes Kennzeichen der Plasmide gemäß der Erfindung stammt aus der Tatsache, dass das erhaltene vollständige rekombinante adenovirale Genom nicht durch Regionen des prokaryotischen Plasmids unterbrochen ist. Daher enthalten die hergestellten Genome im Wesentlichen keine Plasmidregionen, deren Nachteile weiter oben genannt wurden. Außerdem sind in den Plasmiden gemäß der Erfindung die TIR des adenoviralen Genoms nicht nebeneinander liegend, was es ermöglicht, lineare vollständige rekombinante virale Genome zu erhalten, die direkt zur Herstellung der rekombinanten Viren verwendbar sind.
  • Das rekombinante adenovirale Genom umfasst mindestens TIR-Sequenzen und eine Sequenz, die die Enkapsidierung ermöglicht. Die terminalen invers wiederholten Sequenzen (TIR) bilden den Replikationsstartpunkt der Adenoviren. Sie liegen an den Enden des viralen Genoms, wo sie gemäß herkömmlicher Techniken der Molekularbiologie, die dem Fachmann bekannt sind, mühelos isoliert werden können. Die Nukleotidsequenz der TIR-Sequenzen der humanen Adenoviren (insbesondere der Serotypen Ad2 und Ad5) sowie der Hundeadenoviren (vor allem CAV1 und CAV2) ist in der Literatur beschrieben. Zum Beispiel entspricht beim Adenovirus Ad5 die linke TIR-Sequenz der Region, die die Nukleotide 1 bis 103 des Genoms umfasst.
  • Die Enkapsidierungssequenz (auch als Psi-Sequenz bezeichnet) ist zur Enkapsidierung des viralen Genoms notwendig. Sie liegt im Genom wilder Adenoviren zwischen der linken TIR und der der Region E1. Sie kann mit herkömmlichen Techniken der Molekularbiologie künstlich isoliert oder synthetisiert werden. Die Nukleotidsequenz der Enkapsidierungssequenz der humanen Adenoviren (insbesondere der Serotypen Ad2 und Ad5) sowie der Hundeadenoviren (vor allem CAV1 und CAV2) ist in der Literatur beschrieben. Zum Beispiel liegt beim Adenovirus Ad5 eine funktionelle Enkapsidierungssequenz im Bereich zwischen den Nukleotiden 194 und 358 des Genoms.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung fehlt dem Genom des Adenovirus die gesamte oder ein Teil der Region E1. Die Region E1 ist tatsächlich wesentlich für die virale Replikation, und ihre Deaktivierung führt zur Bildung von für die Replikation defektiver Viren, das heißt, dass sie nicht in der Lage sind, sich nach Gentransfer in vivo autonom zu replizieren. Die Region E1 oder jede andere betrachtete virale Region kann durch jede Technik, die dem Fachmann bekannt ist, und vor allem durch vollständige Suppression, Substitution, teilweise Deletion, oder Zugabe einer oder mehrerer Basen zu dem oder den betrachteten Genen nicht-funktionell gemacht werden. Solche Modifikationen können direkt auf den Plasmiden der Erfindung leicht realisiert werden, zum Beispiel mittels gentechnologischer Verfahren. Vorteilhafterweise fehlt dem Genom des erzeugten Adenovirus ein Teil der Region E1 im Bereich zwischen den Nukleotiden 454 bis 3328 (Fragment PvuII-BgIII) oder 382 bis 3446 (Fragment HinfII-Sau3A).
  • Ein trunkiertes rekombinantes adenovirales Genom bezeichnet eine DNA, die der Sequenz eines terminalen Teils eines adenoviralen Genoms, das heißt, ab einem Ende (TIR) entspricht. Zwei trunkierte rekombinante Genome werden komplementär genannt, wenn sie jeweils einen komplementären Teil eines adenoviralen Genoms tragen, und wenn sie durch homologe Rekombination ein vollständiges rekombinantes adenovirales Genom rekonstituieren können.
  • Heterologe Nukleinsäure: Der Begriff „heterologe Nukleinsäure" bezeichnet jede in das rekombinante adenovirale Genom inserierte Nukleinsäure, deren Transfer, Expression oder funktionelle Untersuchung gesucht ist. Es handelt sich im Wesentlichen um eine Nukleinsäure, die anderen Ursprungs als der („heterologe") Adenovirus ist, die zum Beispiel aus einer humanen, tierischen, pflanzlichen, viralen (andere als dem als Vektor verwendeten Adenovirus), prokaryotischen, niedrigeren eukaryotischen Zelle stammt, oder synthetischen oder halbsynthetischen Ursprungs ist. Die Größe der heterologen Nukleinsäure kann in dem Maß variieren, in dem das rekombinante adenovirale Genom, das sie enthält, die maximale Größe nicht übersteigt, die dessen Enkapsidierung in einen adenoviralen Partikel (insgesamt weniger als 40 kb) ermöglicht. Somit kann es sich, wenn ausreichend Regionen des Adenovirus deletiert wurden, um eine Nukleinsäure mit einer Länge von mehr als 30 kb handeln. Diesbezüglich kann die Nukleinsäure eine Region umfassen, die für ein Protein, ein Polypeptid oder ein gegebenes Peptid, zum Beispiel eine cDNA, eine gDNA oder eine synthetische DNA kodiert. Es kann sich auch um eine Nukleinsäure mit einer unbekannten Struktur handeln, die zum Beispiel von einem Klon einer Nukleinsäurebank stammt. Außerdem kann das rekombinante adenovirale Genom mehrere heterologe Nukleinsäuren umfassen, die in verschiede Stellen des Genoms inseriert sind.
  • Beschreibung der Plasmide
  • Wie oben angegeben, beansprucht die vorliegende Erfindung zwei (prokaryotische) Plasmide, das Fährenplasmid und das Elternplasmid, die jeweils ein komplementäres Fragment eines rekombinanten adenoviralen Genoms umfassen. Mindestens eines dieser Plasmide besitzt eine heterologe Nukleinsäure (oder eine Insertionsstelle für eine solche Nukleinsäure), die zum Beispiel für die Gentherapie, die Herstellung eines rekombinante Proteins oder für einen Ansatz der funktionellen Genomik von Interesse ist. Vorteilhafterweise sind die Enden (TIR-Sequenzen) jedes der trunkierten Genome, die von jedem der Plasmide getragen werden (an 5' für die linke TIR und an 3' für die rechte TIR), von einer Stelle eingefasst, die in dem Genom nicht vorhanden ist, um nach der Rekombination die Exzision des vollständigen Genoms zu ermöglichen. Diese Plasmide tragen ein trunkiertes Genom des Adenovirus und können einzeln kein infektiöses adenovirales Genom erzeugen. Diese zwei Plasmide besitzen jeweils den zum anderen komplementären Teil, um durch Cointegration ein fertiges Plasmid zu erzeugen, dass dann das gesamte Adenovirusgenom besitzt, eingefasst von zwei TIR und von mindestens einer Restriktionsstelle, die in dem Genom nicht vorhanden ist. Das Fragment des rekombinanten Adenovirusgenoms, das in diesen Plasmiden vorhanden ist, ist ein unvollständiges Genom, das sich später nicht aus sich selbst heraus als infektiös erweisen kann. Dies ist besonders interessant, da nur das Cointegrat der beiden Plasmide in der Lage ist, ein funktionelles Genom zu erzeugen.
  • Solche Plasmide sind zum Beispiel in 1 dargestellt und werden im folgenden Text ausführlicher beschrieben. Diese Plasmide sind vorzugsweise prokaryotische Plasmide und umfassen im Allgemeinen eine plasmidische und eine adenovirale Region. Die plasmidische Region ermöglicht die Replikation und/oder Selektion des Plasmids in einer Wirtszelle, insbesondere in einer prokaryotischen Wirtszelle. Die adenovirale Region (trunkiertes Genom) liefert einen Teil des rekombinanten adenoviralen Genoms, das es, nach Rekombination mit der adenoviralen Region des komplementären (Eltern- oder Fähren-)Plasmids, ermöglicht, das vollständige rekombinante adenovirale Genom zu rekonstituieren.
  • Die Region, die die Replikation in den prokaryotischen Zellen ermöglicht, die in den Plasmiden der Erfindung verwendet werden, kann jeder funktionelle Replikationsstartpunkt in den ausgewählten Zellen sein. Es kann sich um einen Replikationsstartpunkt aus einem Plasmid der Inkompatibilitätsgruppe P (Beispiel = pRK290) handeln, der die Replikation in den Stämmen von E. Coli pol A ermöglicht. Allgemeiner kann es sich um jeden Replikationsstartpunkt aus einem Plasmid handeln, das sich in den prokaryotischen Zellen repliziert. Dieses Plasmid kann ein Derivat von pBR322 (Bolivar et al., 1977), ein Derivat von pUC (Viera et Messing, 1982), oder anderen Plasmiden sein, die von der gleichen Inkompatibilitätsgruppe abgeleitet sind, das heißt zum Beispiel von ColEl oder pMB1. Diese Plasmide können außerdem aus anderen Inkompatibilitätsgruppen ausgewählt werden, die sich in Escherichia coli replizieren. Es kann sich um Plasmide handeln, die von Plasmiden abgeleitet sind, die zum Beispiel zu den Inkompatibilitätsgruppen A, B, FI, FII, FIII, FIV, Hl, H11, I1, I2, J, K, L, N, OF, P, Q, T, U, W, X, Y, Z oder 9 gehören. Es können auch andere Plasmide verwendet werden, darunter jene Plasmide, die sich nicht in E. coli sondern in anderen Wirten, wie etwa B. subtilis, Streptomyces, P. putida, P. aeruginosa, Rhizobium meliloti, Agrobacterium tumefaciens, Staphylococcus aureus, Streptomyces pristinaespiralis, Enterococcus faecium oder Clostridium replizieren. Bevorzugt werden Replikationsstartpunkte aus Plasmiden verwendet, die sich in E. coli replizieren.
  • Die Region, die die Selektion von prokaryotischen Zellen ermöglicht, die die Plasmide der Erfindung enthalten, kann vor allem von jedem Gen gebildet sein, das Resistenz gegenüber einem Produkt, und vor allem gegenüber einem Antibiotikum verleiht. Somit können die Gene zitiert werden, die zum Beispiel Resistenz gegenüber Kanamycin (Kanr), gegenüber Ampicillin (Ampr), gegenüber Tetracyclin (tetr) oder gegenüber Spectinomycin verleihen, die häufig in der Molekularbiologie verwendet werden (Maniatis et al., 1989). Die Plasmidselektion kann durch andere Gene als die Gene erfolgen, die für die Antibiotikaresistenzmarker kodieren. Allgemein handelt es sich um ein Gen, dass der Bakterie eine Funktion gibt, die sie nicht mehr besitzt (dies kann einem Gen entsprechen, das auf dem Chromosom deletiert oder unwirksam gemacht wurde), wobei das Gen auf dem Plasmid diese Funktion wieder herstellt. Es kann sich beispielsweise um ein Gen mit einer transfer-RNA handeln, die eine defiziente Chromosomenfunktion wieder herstellt (Simoes et al., 1991).
  • Das Fährenplasmid und das Elternplasmid tragen einen unterschiedlichen Replikationsstartpunkt und/oder Marker, um die Selektion jedes Elements zu ermöglichen.
  • Die adenovirale Region, die in jedem der Plasmide enthalten ist, entspricht im Wesentlichen der Sequenz eines trunkierten adenoviralen Genoms. Diese trunkierten Genome, die von jedem der Plasmide getragen werden, sind komplementär, das heißt, in der Lage, nach homologer Rekombination ein vollständiges (und lineares) rekombinantes adenovirales Genom zu erzeugen. Ferner sind die trunkierten Genome, die von jedem der Plasmide getragen werden, vorzugsweise von einer oder mehreren Restriktionsstellen eingefasst, die in einem adenoviralen Genom nicht vorhanden sind, so dass das vollständige rekombinante adenovirale Genom, das durch Rekombination hergestellt wird, von solchen Stellen eingefasst ist.
  • Trunkiertes Genom, das in dem Fährenplasmid vorhanden ist
  • Wie oben angegeben, dient das Fährenplasmid dazu, die interessierende Nukleinsäure aufzunehmen, um sie in ein rekombinantes adenovirales Genom zu inkorporieren.
  • Die adenovirale Region des Fährenplasmids entspricht dem linken oder rechten Teil eines adenoviralen Genoms, ab dessen Ende (einer TIR-Sequenz), bis zu einer ausgewählten adenoviralen Homologieregion, die die homologe Rekombination zwischen den beiden Plasmiden ermöglichen wird. Ferner umfasst dieses adenovirale Genom eine oder mehrere genetische Modifikationen.
  • In einer ersten Ausführungsform entspricht das trunkierte Genom, das in dem Fährenplasmid vorhanden ist, dem linken Teil des fertigen rekombinanten adenoviralen Genoms. In dieser Ausführungsform umfasst es zum Beispiel eine Sequenz, die von der linken TIR bis zur Region reicht, die für das Protein pIX (und/oder Iva2) kodiert, wobei die heterologe Nukleinsäure als Substitution der gesamten oder eines Teils der Region E1 inseriert wird. In dieser besonderen Ausführungsform wird die adenovirale Homologieregion von der Region gebildet, die für das Protein pIX (und/oder Iva2) kodiert.
  • In einer anderen Ausführungsform entspricht das trunkierte Genom, das in dem Fährenplasmid vorhanden ist, dem rechten Teil des fertigen rekombinanten adenoviralen Genoms. In dieser Einsatzform umfasst es zum Beispiel die Sequenz, die von der rechten TIR bis zur Region reicht, die für das Protein pIX (und/oder Iva2) kodiert, wobei die heterologe Nukleinsäure zum Beispiel als Substitution der gesamten oder eines Teils der Region E4 oder E3 inseriert wird. In dieser besonderen Ausführungsform wird die adenovirale Homologieregion ebenfalls von der Region gebildet, die für das Protein pIX (und/oder Iva2) kodiert.
  • Außerdem wird in einer besonderen Einsatzform die Homologieregion von einer modifizierten adenoviralen Sequenz gebildet. Somit kann die Homologieregion zum Beispiel von einer Region des Adenovirus gebildet werden, die durch Veränderung der Codonnutzung modifiziert wird, indem die Degeneration des genetischen Codes verwendet wird. Solche Modifikationen wurden in der Patentanmeldung WO99/25861 beschrieben, die der vorliegenden Beschreibung als Bezugsdokument beigefügt ist. In einer besonderen Ausführungsform wird die adenovirale Homologieregion von einer Region gebildet, die für das degenerierte Protein pIX (und/oder Iva2) kodiert.
  • Es versteht sich, dass gemäß der ausgewählten Struktur des (nach Rekombination erzeugten) fertigen rekombinanten adenoviralen Genoms, die adenovirale Homologieregion unterschiedlichen Regionen des Genoms entsprechen kann. Tatsächlich kann sich die adenovirale Region des Elternplasmids von der linken TIR bis zur Region E3 erstrecken, und dann ist es diese Region, die die adenovirale Homologiezone bildet. Allgemeiner ist die adenovirale Homologieregion eine Sequenz, die jeder Region eines wilden oder modifizierten adenoviralen Genoms entspricht, die die Rekombination zwischen dem Fährenplasmid und dem Elternplasmid ermöglicht, um das fertige rekombinante adenovirale Genom zu erzeugen. Diese Homologieregion ist daher im Fährenplasmid und im Elternplasmid im Wesentlichen identisch. Sie kann, je nach dem verwendeten Konstruktionstyp, unterschiedlichen Teilen des Genoms eines Adenovirus entsprechen.
  • Eine besondere Ausführungsform der Erfindung besteht in einem Fährenplasmid, das ein trunkiertes Genom umfasst, das die linke TIR-Region, die Enkapsidierungssequenz, die heterologe Nukleinsäure und eine adenovirale Homologieregion umfasst, die von einer Region gebildet wird, die für das wilde oder degenerierte Protein pIX (und/oder Iva2) (vgl. zum Beispiel die Plasmide pJJl und pIG5) kodiert.
  • Außerdem ist in einer bevorzugten Form der Erfindung das trunkierte adenovirale Genom auf der Seite der TIR von einer Stelle, zum Beispiel PacI, eingefasst, die in dem adenoviralen Genom nicht vorhanden ist.
  • Trunkiertes Genom, das in dem Elternplasmid vorhanden ist
  • Wie oben angegeben, trägt das Elternplasmid ein trunkiertes adenovirales Genom, das in der Lage ist, durch Rekombination das trunkierte Genom, das in dem Fährenplasmid vorhanden ist, zu vervollständigen. Seine Struktur ist daher von der Struktur des Fährenplasmids abhängig. Außerdem kann das Elternplasmid auch eine andere Nukleinsäure enthalten, als die, die von dem Fährenplasmid getragen wird.
  • Somit entspricht, wenn die adenovirale Region des Fährenplasmids dem linken Teil eines adenoviralen Genoms entspricht, das trunkierte Genom, das in dem Elternplasmid vorhanden ist, dessen rechtem Teil, wobei es sich von der TIR bis zur adenoviralen Homologieregion erstreckt. Umgekehrt entspricht, wenn die adenovirale Region des Fährenplasmids dem rechten Teil eines adenoviralen Genoms entspricht, das trunkierte Genom, das in dem Elternplasmid vorhanden ist, dessen linkem Teil, wobei es sich von der TIR bis zur adenoviralen Homologieregion erstreckt.
  • In einer ersten Ausführungsform entspricht das trunkierte Genom, das in dem Elternplasmid vorhanden ist, dem rechten Teil des fertigen rekombinanten adenoviralen Genoms. In dieser Einsatzform umfasst es zum Beispiel die Sequenz, die von der rechten TIR bis zur Region reicht, die für das Protein pIX (und/oder Iva2) kodiert. Außerdem kann das Genom genetische Modifikationen umfassen, wie zum Beispiel Deletionen der gesamten oder eines Teils der Regionen E4 oder E3.
  • In einer anderen Ausführungsform entspricht das trunkierte Genom, das in dem Elternplasmid vorhanden ist, dem linken Teil des fertigen rekombinanten adenoviralen Genoms. In dieser Ausführungsform umfasst es zum Beispiel eine Sequenz, die von der linken TIR bis zu einer Sequenz nach der Region E4 reicht. Außerdem kann das Genom genetische Modifikationen umfassen, wie zum Beispiel Deletionen der gesamten oder eines Teils der Region E1.
  • Vorzugsweise trägt das Elternplasmid ein trunkiertes Genom, das dem rechten Teil des adenoviralen Genoms entspricht, und umfasst eine nicht-funktionelle Region E3. Stärker bevorzugt umfasst es eine nicht-funktionelle Region E4. Noch stärker bevorzugt umfasst es eine Deletion der gesamten oder eines Teils der Rahmen ORF3 und/oder ORF6 der Region E4. In einer anderen besonderen Ausführungsform trägt das Elternplasmid ein trunkiertes Genom, das dem rechten Teil des adenoviralen Genoms entspricht, und umfasst funktionelle Regionen E3 und E4.
  • Besondere Beispiele solcher Plasmide werden durch pOSE1, pOSE10-00, pOSE30-00, pOSE17-00 und pOSE37-00 dargestellt (vgl. 1 und 4).
  • In dieser Einsatzform trägt das Fährenplasmid ein trunkiertes Genom, das dem linken Teil des adenoviralen Genoms entspricht, und eine Deletion der gesamten oder eines Teils der Region E1 umfasst.
  • Zwei im Sinne der Erfindung besonders bevorzugte Plasmide sind das Plasmid pOSE17-00 und das Plasmid pIG5. pOSE17-00 (Elternplasmid) umfasst den Replikationsstartpunkt des Plasmids RK2, dem Tetracyclinresistenzgen, und besitzt ein Fragment des adenoviralen Genoms, das mit der Base 3520 von Ad5 beginnt und bis zur rechten TIR reicht, die von einer PacI-Stelle eingefasst ist. Dieses Genomfragment besitzt eine nicht-funktionelle Region E3 und eine in pIX und Iva2 modifizierte Sequenz, wie in der Patentanmeldung WO99/25861 beschrieben. Das Plasmid pIG5 (Fährenplasmid) besitzt einen Replikationsstartpunkt RK6 und kann sich in Stämmen von E. coli pir- nicht replizieren. pIG5 besitzt TIR- und Enkapsidierungsregionen, denen eine PacI-Stelle vorangeht, die gewünschte Expressionskassette und eine Region, die zu pOSE17-00 homolog ist (eine in pIX und Iva2 modifizierte Sequenz, wie in der Patentanmeldung WO99/25861 beschrieben). Das gewünschte Genom wird somit durch homologe Rekombination rekonstruiert, dank der Gegenwart der Homologieregion zwischen den beiden Plasmiden (d. h. der Sequenz, die in pIX und Iva2 modifiziert ist, wie in der Patentanmeldung WO99/25861 beschrieben).
  • Das Verfahren der Erfindung ermöglicht somit die Erzeugung eines vollständigen (infektiösen) rekombinanten Genoms aus zwei Plasmiden, die jeweils einen Teil des Genoms liefern (ein Plasmid, das die linke TIR-Sequenz trägt, der eine PacI-Stelle vorangeht, und einen Satz viraler oder nicht viraler Sequenzen und ein Plasmid, das die rechte TIR trägt, der virale oder nicht virale Sequenzen vorangehen, gefolgt von einer PacI-Stelle, wobei die Wahl der viralen oder nicht viralen Sequenzen von der Wahl der geplanten Konstruktion, dem rekombinanten Adenovirusvektor, der für alle oder einen Teil der viralen Gene deletiert ist, abhängt); die beiden Plasmide weisen gemeinsame Sequenzen auf, die für die Realisierung der homologen Rekombination ausreichen und eine Überlappung in einer Sequenz aufweisen, die das homologe Rekombinationsereignis ermöglicht. Insbesondere ermöglicht das Verfahren, in einem Schema, das mit dem vergleichbar ist, das für die Einführung von exogenen Sequenzen in die Region E1 präsentiert wird, mit Hilfe von geeigneten Plasmiden exogene Sequenzen in die Region E4 einzuführen. In diesem Fall findet die Rekombination zwischen einem Elternplasmid (das linke TIR- und Enkapsidierungsregionen besitzt, denen eine Restriktionsstelle für das Enzym PacI vorangeht, und ein trunkiertes adenovirales Genom in der Nähe der Region E4) und einem Fährenplasmid (das eine Sequenz nahe der Region E4 besitzt, die identisch mit dem Elternvektor ist – der am Rekombinationsereignis beteiligt ist – gefolgt von der Expressionskassette der interessierenden Sequenz, dann von der rechten TIR-Region und einer einmaligen PacI-Stelle) statt.
  • Gemäß einer besonders vorteilhaften Ausführungsform fehlt dem hergestellten Genom des Adenovirus ebenfalls die gesamte oder ein Teil der Region E3 und/oder E4 und/oder IVA2. Diese zusätzlichen Deletionen ermöglichen es, die Sicherheit des Vektors zu steigern, und seine Kapazität zu erhöhen. Vorzugsweise fehlt dem adenoviralen Genom ein Teil der Region E4, es umfasst jedoch mindestens die Rahmen ORF3 und ORF6. Das adenovirale Genom kann ebenfalls modifiziert sein, wie in der Patentanmeldung FR 9413355 beschrieben, die der vorliegenden Beschreibung als Bezugsdokument beigefügt ist, um Kontaminationsrisiken durch Replikationspartikel zu vermeiden. In einer besonderen Form ist das erhaltene vollständige rekombinante adenovirale Genom ein so genanntes Gutless-Genom, das heißt, ihm fehlt jede kodierende Region des Adenovirus. In dieser Ausführungsform umfasst das trunkierte Genom der Plasmide einerseits eine TIR und die Enkapsidierungsregion und andererseits eine TIR, wobei die Homologieregion von der heterologen Nukleinsäure selbst oder von einer künstlichen Sequenz gebildet werden kann, die in jedes Plasmid enthalten ist.
  • Diesbezüglich kann die Homologieregion, die in jedem Plasmid vorhanden ist, allgemein eine nicht virale, künstliche oder nicht künstliche Sequenz sein, die die homologe Rekombination ermöglicht.
  • Das rekombinante Genom kann ebenfalls Kassetten umfassen, die in vivo exzidierbar sind (WO97/47757) oder gentechnisch modifizierte Sequenzen (Fiber- oder Pentongene), die es ermöglichen, den Tropismus des Virus zu modifizieren. Ferner kann auch die genomische Organisation des Virus modifiziert werden, um die Sicherheit des hergestellten Virus zu verbessern (WO96/13596).
  • wie oben angegeben, ist das rekombinante Adenovirusgenom vorteilhafterweise von einer oder mehreren Restriktionsstellen eingefasst, die im genannten Genom fehlen. Die Stelle(n) ermöglichen es, auf einfache und effiziente Weise das rekombinante adenovirale Genom aus dem Plasmid zu exzidieren. Da die genomische Sequenz von Adenovirus bekannt und zugänglich ist, kann der Fachmann durch Routineversuche die Restriktionsstellen selektieren, die diesem Genom fehlen. Beispielsweise können die Stellen PacI, NspV und SwaI (für Ad5) oder SnabI (in Ad2) zitiert werden. Es ist ebenfalls möglich, bestimmte Stellen einmalig zu machen, indem die Sequenz des adenoviralen Genoms modifiziert wird. Somit können andere Enzyme verwendet werden, wenn die entsprechenden Restriktionsstellen in der adenoviralen Sequenz, die in E. coli konstruiert wird, supprimiert, modifiziert oder deletiert werden. Die Stellen können direkt neben den Enden des adenoviralen Genoms oder mit einem Abstand von einigen Basenpaaren positioniert sein.
  • Die Plasmide gemäß der Erfindung können unter Verwendung von Adenoviren verschiedenen Ursprungs konstruiert werden. Es wurden nämlich unterschiedliche Adenovirusserotypen, deren Struktur und Eigenschaften etwas variieren, charakterisiert. Unter diesen Serotypen ist im Rahmen der vorliegenden Erfindung die Verwendung von humanen Adenoviren vom Typ 2 oder 5 (Ad 2 oder Ad 5) oder von Adenoviren tierischen Ursprungs (vgl. Patentanmeldung WO 94/26914) bevorzugt. Unter den Adenoviren tierischen Ursprungs, die im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendbar sind, können Adenoviren von Hund, Rind, Maus (Beispiel: MavI, Beard et al., Virology 75 (1990) 81), Schaf, Schwein, Vogel oder auch Affe (Beispiel: SAV) zitiert werden. Der Adenovirus tierischen Ursprungs ist bevorzugt ein Hundeadenovirus, stärker bevorzugt ein CAV2-Adenovirus [zum Beispiel Manhattan-Stamm oder A26/61 (ATCC VR-800)]. Gemäß einer besonderen Ausführungsform der Erfindung ist der verwendete Adenovirus ein Adenovirus humanen Ursprungs. Gemäß einer anderen vorteilhaften Form ist der Adenovirus ein Adenovirus tierischen Ursprungs.
  • Homologe Rekombination und Herstellung von Viren
  • Der Schritt der homologen Rekombination (der die Rekonstruktion des vollständigen Genoms ermöglicht) kann gemäß der Techniken realisiert werden, die dem Fachmann bekannt sind, durch Transfektion (oder Cotransfektion) von Plasmiden in einer geeigneten Zelle, bevorzugt einer prokaryotischen Zelle. In einer besonderen Ausführungsform wird die homologe Rekombination in E. coli unter Verwendung eines Stamms polA durchgeführt, um die homologen Rekombinationsereignisse zu selektieren. Es ist offenkundig, dass diese Konstrukte auch in Abwesenheit von Systemen realisiert werden können, die es ermöglichen, Rekombinationsereignisse zu selektieren. Solche Rekombinationsereignisse können nämlich durch Minipreparation, Verlust oder Aufnahme eines Markers gesichtet werden, oder auch Sichtung mit Hilfe von radioaktiven Sonden, die für die erhaltenen oder verlorenen Kopplungen spezifisch sind. Zudem existieren andere Techniken, die es ermöglichen, homologe Rekombinationsereignisse in E. coli zu selektieren. Unter diesen kann die Verwendung von wärmesensitiven Plasmiden für ihre Replikation (Hamilton et al., 1989), die Verwendung von nicht replikativen zirkulären Molekülen (zum Beispiel beschrieben von Slater und Maurer, 1993), die Verwendung von Stämmen, in denen sich der verwendete Vektor nicht repliziert (Miller und Mekalanos, 1988, Zeef et al., 1994) usw., zitiert werden. Alle diese Systeme können anstelle von polA-Stämmen und einer Transformation mit einem Plasmid, das von pBR322 abgeleitet ist, oder dessen zahlreiche Derivaten, oder von anderen Plasmiden mit polA-abhängiger Replikation oder auch Plasmiden, die sich in Escherichia coli nicht replizieren, verwendet werden.
  • Eine andere Aufgabe der vorliegenden Patentanmeldung betrifft jede prokaryotische Zelle, die ein Plasmid, wie oben definiert, enthält. Es kann sich insbesondere um jede Bakterie handeln, für die ein Vektorsystem existiert, in das die rekombinante DNA eingeführt werden kann. Es können zum Beispiel Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Bacillus subtilis, Pseudomonas putida, Pseudomonas eruginosa, Agrobacterium tumefaciens, Rhizobium meliloti oder die Bakterien der Gattung Streptomyces zitiert werden. Diese Zellen werden vorteilhafterweise durch Transformation erhalten, gemäß Techniken, die dem Fachmann bekannt sind. Die Transformation kann vor allem mit der CaCl2-Transformationstechnik durchgeführt werden (Dagert et Ehrlich, 1979), oder jener, die von Hanahan et al. (1983) entwickelt wurde, oder jede Technik, die von dieser abgeleitet ist (Maniatis et al., 1989), sowie durch Elektrotransformation (Wirth et al., 1989). Vergleiche auch die nachstehenden allgemeinen Techniken der Molekularbiologie.
  • Eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in einem Verfahren zur Herstellung von rekombinanten Adenovirusgenomen. Gemäß diesem Verfahren werden prokaryotische Zellen, wie oben beschrieben, kultiviert, dann werden, in einem zweiten Schritt, die Plasmide wiedergewonnen. Vorteilhafterweise wird die Kultur in einem ausreichend langen Zeitraum realisiert, um geeignete Mengen an Plasmid herzustellen. Das Plasmid kann durch jede Technik wiedergewonnen werden, die dem Fachmann zur Herstellung plasmidischer DNA bekannt sind. Somit kann es durch Herstellung eines klaren Lysats, gefolgt von einer Zentrifugierung in einem Cäsiumchloridgradienten wiedergewonnen werden (Maniatis et al., 1989). Andere Techniken können verwendet werden, die auf andere Lysemethoden, zum Beispiel unter Verwendung von Triton X-100, zurückgreifen (Ausubel et al., 1987), oder auch eine Anionenaustauschsäule nach dem Lyseschritt und Separation der plasmidischen DNA vom Großteil der Chromosomen-DNA und den Proteinen. Die so wiedergewonnenen Plasmide können dann in Gegenwart des entsprechenden Restriktionsenzyms gereinigt und behandelt werden, das den Stellen entspricht, die das virale Genom einfassen. Dies ermöglicht es, in einem einzigen Schritt ein lineares Adenovirusgenom zu erzeugen, das direkt zur klonalen Herstellung rekombinanter Viren verwendbar ist.
  • Diesbezüglich besteht eine erste Methode zur Herstellung der rekombinanten Viren darin, das virale Genom, das aus den Plasmiden der Erfindung hergestellt wurde, in einer kompetenten zellulären Enkapsidierungslinie zu transfizieren, das heißt, die in trans alle Funktionen trägt, die zur Komplementierung des defektiven Virus notwendig sind. Diese Funktionen sind vorzugsweise in das Genom der Zelle integriert, was die Rekombinationsrisiken reduziert, und der zellulären Linie eine größere Stabilität verleiht.
  • Ein zweiter Ansatz besteht darin, das hergestellte rekombinante Genom, und die DNA eines oder mehrerer Viren oder Plasmidhelfer in einer geeigneten zellulären Linie zu cotransfizieren. Gemäß dieser Methode ist es nicht notwendig, über eine passende zelluläre Linie zu verfügen, die in der Lage ist, alle defektiven Funktionen des rekombinanten Adenovirus zu komplementieren. Ein Teil dieser Funktionen ist nämlich durch den oder die Virushelfer komlementiert. Dieser oder diese Virushelfer sind selbst defektiv.
  • Unter diesen verwendbaren zellulären Linien kann vor allem die Linie der humanen embryonalen Nierenzellen 293 (Graham et al., J. Gen. Virol. 36 (1977) 59) zitiert werden. Diese Linie enthält, integriert in ihr Genom, vor allem den linken Teil des Genoms des humanen Adenovirus Rd5 (12%). Die Transfektion kann vorteilhafterweise direkt mit dem Verdauungsprodukt des Plasmids realisiert werden, das gemäß dem oben beschriebenen Verfahren erhalten wurde, ohne einen Schritt der Reinigung des adenoviralen Genoms. Andere Linien sind zum Beispiel Linien, die aus embryonalen Retinazellen (HER), Leberzellen usw. hergestellt werden. Es kann sich um Linien handeln, die die Funktionen E1 (293, PERC-6-Zellen), E1 und E4 (IGRP2), E1 und E2, usw. komplementieren. Solche Linien wurden auf dem Stand der Technik beschrieben, und können vom Fachmann verwendet werden.
  • Sie so hergestellten Adenoviren können durch die Techniken, die dem Fachmann bekannt sind (Cäsiumchlorid, Chromatographie usw.), isoliert oder gereinigt werden. Sie können in unterschiedlichen Anwendungen, wie der Herstellung von therapeutischen oder prophylaktischen Produkten in vitro, ex vivo oder in vivo, oder auch zur funktionellen Analyse des Genoms (und zur Bildung von Banken) verwendet werden.
  • Die Vorteile der Verwendung des neuen Verfahrens sind folgende: Eine Vereinfachung und eine größere Schnelligkeit bei der Erzeugung des Rekombinanten, und die fehlende Notwendigkeit eines Sichtungsschritts, der mit mehrfachen Selektionssystemen verbunden ist, die dem Verfahren auferlegt sind, und der Struktur eines nicht-funktionellen Elternvektors.
  • Im Gegensatz zu den beschriebenen bekannten Verfahren basiert die Robustheit des Verfahrens auf der Gleichzeitigkeit der Selektionsdrücke, die in einem einzigen Schritt zur Selektion des einzigen fertigen Plasmids führen, das das funktionelle adenovirale Genom trägt. Die Erzeugung eines neuen rekombinanten Vektors in einem einzigen Schritt reduziert die notwendige Arbeitszeit im Vergleich zu den bekannten Verfahren beträchtlich. Jeder Schritt der Sichtung wird überflüssig, die notwendige Arbeitsmenge wird im Vergleich zu den bekannten Verfahren beträchtlich erleichtert. Zudem eröffnet die fehlende Notwendigkeit der Sichtung den Weg für die gleichzeitige Erzeugung zahlreicher rekombinanter adenoviraler Vektoren durch einen gleichen Bestandteil.
  • Ein anderer Vorteil des Verfahrens der Erfindung besteht in der nicht lebensfähigen Konstellation der beiden Plasmide, die zur Erzeugung des fertigen Plasmids, das das funktionelle Genom trägt, rekrutiert werden. Keines der beiden Ausgangsplasmide besitzt für sich allein den Satz an Funktionen, die es ihm ermöglichen, ein funktionelles adenovirales Genom zu erzeugen. Auch in dem extremen Fall eines Lecks bei den auferlegten Selektionen (Antibiotika), wenn zwei Typen von Konstrukten (das gewünschte Konstrukt und die Ausgangsplasmide) nach der Rekombination in dem Bakterienstamm coexistieren müssen, hätte dieses Ergebnis keine Auswirkung auf die Erzeugung des gewünschten rekombinanten Vektors, sobald diese Mischung in der eukaryotischen Produktionszelle transfiziert wird. Es ist nämlich nur das gewünschte Konstrukt lebensfähig, das aus der homologen Rekombination resultiert, und amplifiziert sich in der eukaryotischen Produktionszelle, während die Ausgangsplasmide nicht lebensfähig sind (Fehlen mindestens einer TIR-Region für jedes Plasmid).
  • Die weiter oben zitierten Charakteristika des Verfahrens der Erfindung tragen zu einer Vereinfachung der Konstruktion von adenoviralen Vektoren bei, und eröffnen die Möglichkeit, rekombinante Vektoren in großer Menge zu erzeugen. Es kann sich darum handeln, gleichzeitig rekombinante adenovirale Vektoren zu konstruieren, die bekannte Sequenzen tragen, deren Funktion validiert werden soll, oder einen Satz rekombinanter Vektoren, die Sequenzen unbekannter Natur tragen, deren Funktion herausgefunden werden soll. In diesem letzteren Fall spricht man von adenoviralen Expressionsbanken.
  • In einer gentherapeutischen Anwendung
  • Die Adenoviren können in therapeutischen Anwendungen verwendet werden. Mit diesem Ziel kann die heterologe Nukleinsäure ein oder mehrere therapeutische Gene und/oder ein oder mehrere Gene umfassen, die für antigene Peptide kodieren.
  • Die therapeutischen Gene, die so transferiert werden können, sind alle Gene, deren Transkription und gegebenenfalls Translation in die Zielzelle, Produkte erzeugen, die eine therapeutische Wirkung aufweisen. Es kann sich um ein gegenüber der Zielzelle homologes Produkt handeln, (das heißt, ein Produkt, das normalerweise in der Zielzelle exprimiert wird, wenn diese keinerlei Pathologie aufweist). In diesem Fall ermöglicht die Expression zum Beispiel die Beseitigung einer ungenügenden Expression in der Zelle oder der Expression eines inaktiven oder aufgrund einer Modifikation schwach aktiven Proteins, oder auch der Überexpression des genannten Proteins. Das therapeutische Gen kann auch für einen Mutanten eines zellulären Proteins kodieren, der eine erhöhte Stabilität, eine modifizierte Aktivität usw. aufweist. Das Produkt kann gegenüber der Zielzelle ebenfalls homolog sein. In diesem Fall kann ein exprimiertes Protein zum Beispiel eine defiziente Aktivität in der Zelle vervollständigen oder liefern, die es ihr ermöglicht, gegen eine Pathologie zu kämpfen.
  • Unter den therapeutischen Produkten können insbesondere Enzyme, Blutderivate, Hormone und Lymphokine zitiert werden: Interleukine, Interferone, TNF usw. (WO93/19191), Wachstumsfaktoren, Neurotransmitter oder ihre Vorläufer oder Syntheseenzyme, trophische Faktoren: BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3, NT5 usw.; Apolipoproteine: ApoAI, ApoAIV, ApoE usw. (WO94/25073), Dystrophin oder Minidystrophin ( FR 9111947 ), Tumorsuppressionsgene: p53, Rb, Rap1A, DCC, k-rev usw. (WO9424297), Gene, die für Faktoren kodieren, die an der Koagulation beteiligt sind: Faktoren VII, VIII, IX, Suizidgene (TK usw.) usw.
  • Das therapeutische Gen kann auch ein Antisens-Gen oder eine Antisens-Sequenz sein, deren Expression in der Zielzelle es ermöglicht, die Expression von Genen oder die Transkription zellulärer mRNAs zu kontrollieren. Solche Sequenzen können zum Beispiel in der Zielzelle in komplementäre RNAs zellulärer mRNAs transkribiert werden und somit deren Translation in Protein blockieren, gemäß der Technik, die in der Patentschrift EP 140 308 beschrieben ist.
  • Wie weiter oben angegeben, kann die interessierende Nukleinsäure ebenfalls ein oder mehrere Gene umfassen, die für ein antigenes Peptid kodieren, das in der Lage ist, beim Menschen eine Immunantwort zu erzeugen. In dieser besonderen Einsatzform ermöglicht die Erfindung daher die Realisierung von Vakzinen, die es ermöglichen, den Menschen vor allem gegen Mikroorganismen oder Viren zu immunisieren. Es kann sich vor allem um antigene Peptide handeln, die spezifisch für den Epstein-Barr-Virus, den HIV-Virus, den Hepatitis-B-Virus ( EP 185 573 ), den Pseudorabies-Virus sind, oder auch um tumorspezifische Peptide ( EP 259 212 ).
  • Im Allgemeinen umfasst die interessierende Nukleinsäure auch Sequenzen, die die Expression des therapeutischen Gens und/oder des für das antigene Peptid kodierenden Gens in der infizierten Zelle ermöglichen. Es kann sich um Sequenzen handeln, die auf natürliche Weise für die Expression des betrachteten Gens verantwortlich sind, wenn diese Sequenzen imstande sind, in der infizierten Zelle zu funktionieren. Es kann sich ebenfalls um Sequenzen unterschiedlichen Ursprungs handeln (die für die Expression anderer Proteine verantwortlich sind, oder sogar synthetische Sequenzen). Es kann sich vor allem um Promotersequenzen eukaryotischer oder viraler Gene handeln. Es kann sich zum Beispiel um Promotersequenzen aus dem Genom der Zelle handeln, die infiziert werden soll. Ebenso kann es sich um Promotersequenzen aus dem Genom eines Virus, einschließlich des verwendeten Adenovirus, handeln. Diesbezüglich können zum Beispiel die Promoter der Gene ElA, MLP, CMV, RSV usw. zitiert werden. Ferner können diese Expressionssequenzen durch die Zugabe von Aktivierungssequenzen, Regulationssequenzen usw. modifiziert werden. Vorzugsweise könnten Promoter verwendet werden, die durch Tetracyclin vom Typ Tet on/off oder off/on regulierbar, oder durch Ecdyson oder Dexamethason induzierbar sind. Wenn das inserierte Gen keine Expressionssequenzen umfasst, kann es außerdem in das Genom des defektiven Virus stromabwärts einer solchen Sequenz inseriert werden. Schließlich kann die interessierende Nukleinsäure ebenfalls, insbesondere stromaufwärts des therapeutischen Gens, eine Signalsequenz umfassen, die das therapeutische Produkt lenkt, das in den Sekretionspfaden der Zielzelle synthetisiert wird. Diese Signalsequenz kann die natürliche Signalsequenz des therapeutischen Produkts sein, aber es kann sich auch um jede andere funktionelle Signalsequenz oder eine künstliche Signalsequenz handeln.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls jede pharmazeutische Zusammensetzung, die einen oder mehrere rekombinante Adenoviren umfasst, die gemäß diesem Verfahren hergestellt werden. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen der Erfindung können für einen topischen, oralen, parenteralen, intranasalen, intravenösen, intramuskulären, subkutanen, intraokularen, transdermalen usw. Administrationsweg formuliert sein.
  • Vorzugsweise enthält die pharmazeutische Zusammensetzung pharmazeutische Vehikel, die für eine injizierbare Formulierung unbedenklich sind. Es kann sich insbesondere um Salzlösungen (Mononatriumphosphat, Dinatriumphosphat, Natriumchlorid, Kalium, Calcium oder Magnesium usw., oder um Mischungen solcher Salze), sterile, isotonische oder um trockene, vor allem gefriergetrocknete Zusammensetzungen handeln, die gegebenenfalls durch die Zugabe von sterilisiertem Wasser oder physiologischer Salzlösung, die Bildung injizierbarer Lösungen ermöglichen.
  • Die für die Injektion verwendeten Virusdosen können in Abhängigkeit von unterschiedlichen Parametern, und vor allem in Abhängigkeit von der verwendeten Verabreichungsform, der betroffenen Pathologie, dem zu exprimierenden Gen, oder auch der gesuchten Behandlungsdauer angepasst werden. Allgemein werden die rekombinanten Adenoviren gemäß der Erfindung in Form von Dosen im Bereich zwischen 104 und 1014 pfu, und bevorzugt 106 bis 1010 pfu, formuliert und verabreicht. Der Begriff pfu ("plaque forming unit") entspricht der Infektionskraft einer Viruslösung, und wird durch Infektion einer geeigneten Zellkultur bestimmt, und misst, im Allgemeinen nach 15 Tagen, die Anzahl der Plaques mit infizierten Zellen. Die Techniken zur Bestimmung des pfu-Titers einer viralen Lösung sind in der Literatur gut dokumentiert.
  • Je nach der inserierten heterologen DNA-Sequenz können die Adenoviren der Erfindung zur Behandlung oder Prävention zahlreicher Pathologien verwendet werden, einschließlich genetischer Erkrankungen (Dystrophie, zystische Fibrose usw.), neurodegenerativer Erkrankungen (Alzheimer, Parkinson, ALS usw.), Krebsformen, Pathologien, die mit Störungen der Koagulation oder mit Dyslipoproteinämien verbunden sind, Pathologien, die mit viralen Infektionen verbunden sind (Hepatitisformen, AIDS usw.) usw.
  • In einer Anwendung zur Herstellung rekombinanter Proteine.
  • Das Verfahren der Erfindung ermöglicht es, adenovirale Vektoren zu erzeugen, die die Herstellung rekombinanter Proteine, insbesondere in humanen Zellen in Kultur ermöglichen können. Es kann sich um Proteine, wie etwa humanem Serumalbumin, humanen Interferonen, humanen Antikörpern, humanem Insulin, hämapoetischen Faktoren, Faktoren, wie etwa der Faktor IX oder VII, thrombolytische Faktoren, wie etwa der Gewebe-Plasminogen-Aktivator, verschiedene Wachstumsfaktoren, trophische Faktoren, Cytokine, Peptide des zentralen Nervensystems, Opiate, Enzyme, virale Antigene, aber auch Proteine anderer Organismen, wie Pflanzenproteine, handeln.
  • In einer Anwendung der funktionellen Genomik
  • Mit Hilfe der gleichen, weiter oben zitierten Werkzeuge zur Fertigung wird das Verfahren in einer Anwendung zur Validierung oder Entdeckung neuartiger Ziele, im von der pharmazeutischen Industrie gebrauchten Sinne, genutzt.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls jede Nutzung einer Zusammensetzung, die die beschriebene Methode verwendet. Insbesondere jede Zubereitung stromabwärts, die den Erhalt und die Integration von Nukleinsäuren, unabhängig von ihrer Natur, in einem ersten Fährenplasmid im Sinne der Erfindung ermöglicht, sowie die Verwendung der Plasmide, um einen oder mehrere rekombinante Adenoviren durch verschiedene Automatisierungsmethoden zu erzeugen. Diese rekombinanten Adenoviren können dann in zahlreichen Modellen in vitro und in vivo verwendet werden, um die Funktionalität der Sequenzen, die sie tragen, zu bewerten. Die Funktionalität der Sequenzen, die von den erzeugten rekombinanten Adenoviren getragen werden, kann durch einen der zahlreichen Funktionstests bewertet werden, über die der Fachmann verfügt.
  • Eine Aufgabe der Erfindung besteht daher auch in einem Verfahren zur Herstellung adenoviraler Expressionsbanken, das die folgenden Schritte umfasst:
    • – die Konstruktion einer primären Bank in einem Fährenvektor, wie oben beschrieben,
    • – die Transformation einer Bakterienkultur mit der primären Bank in Gegenwart eines Plasmids gemäß der Erfindung,
    • – die Einführung der erhaltenen Plasmide oder der vollständigen adenoviralen Genome nach Exzision durch enzymatische Verdauung in eine Adenovirusproduktionszelle.
    • – gegebenenfalls die Infektion eines biologischen Materials, das Zellen umfasst, um die Klone der Bank zu analysieren.
  • Dieses Verfahren umfasst daher einen ersten Schritt zur Herstellung einer primären Nukleinsäurebank in dem Fährenplasmid der Erfindung, bevor die Erfindung angewendet und die adenovirale Bank in einem Versuchsmodell verwendet wird. Die Bildung einer solchen primären Bank in dem Plasmid der Erfindung (Fährenplasmid) kann durch Methoden der Molekularbiologie realisiert werden, die dem Fachmann bekannt sind. Insbesondere kann die primäre Bank durch die Abfolge der folgenden Vorgänge konstruiert werden: a) Erhalt von mRNA (oder gesamter RNA) aus einer zellulären Population, b) Herstellung der komplementären DNA der isolierten mRNA-Population, c) gegebenenfalls die Herstellung einer Nukleinsäurebank in der die cDNAs unter die Kontrolle eines starken Promoters, oder insbesondere unter die Kontrolle eines regulierbaren Promoters, gestellt werden, d) Inkorporation der cDNAs (oder der Expressionskassette) in das Fährenplasmid der Erfindung.
  • Die vorliegende Erfindung hat daher auch eine in einem Vektor oder Fährenplasmid klonierte Nukleinsäurebank, wie zuvor beschrieben, zur Aufgabe.
  • Im zweiten Schritt ermöglicht die Cotransformation der primären Fährenplasmidbank mit einem Elternplasmid, die in der Erfindung beschrieben wird, den Erhalt einer Bank von Plasmiden, die funktionelle adenovirale Genome tragen. Dieser Schritt kann entweder durch gleichzeitige Cotransformation der Plasmide in den Bakterien, oder durch sequentielle Transfektionen realisiert werden. Somit kann das Elternplasmid zuerst in die Bakterien eingeführt werden, dann werden später die Fährenplasmide transfiziert.
  • In einem dritten Schritt werden die Plasmide (oder die exzidierten funktionellen rekombinanten Genome) in einer transkomplementierenden Zelle transfiziert, was es ermöglicht, eine Bank rekombinanter Adenoviren zu erzeugen. Vorzugsweise werden die erhaltenen Plasmide isoliert und/oder gereinigt, und die rekombinanten Genome werden durch Behandlung mit dem geeigneten Enzym (oder Enzymen) exzidiert, wobei das adenovirale Genom nicht geschnitten wird.
  • Im vierten Schritt ermöglicht die Infektion einer ausgewählten zellulären Population (oder eines biologischen Materials) mit Hilfe der Bank der rekombinanten Adenoviren, die biologischen oder funktionellen Eigenschaften der Klone der Bank zu analysieren. Hierfür kann die gewählte und infizierte zelluläre Population Bedingungen ausgesetzt werden, die die Expression der Nukleinsäure ermöglichen, und somit einen gesuchten Phänotyp durch die Untersuchung der zellulären Population zu identifizieren. Danach ist es möglich, bis zum induzierenden Vektor zurückzugehen und somit die DNA zu charakterisieren, die den gesuchten Phänotyp verleiht.
  • Um Untersuchungen der robusteren Funktionalität zu ermöglichen, werden die Klone vorteilhafterweise getrennt und nicht im Pool behandelt. Die Klone der primären Bank im Fährenplasmid werden somit einzeln in Mikrotiterplatten in der Bakterie transformiert, die bereits das trunkierte adenovirale Elternplasmid besitzt. Durch Wachsen in einer Mikrotiterplatte unter Selektionsdruck (Antibiotika) werden die hergestellten DNAs in der eukaryotischen Produktionszelle nach Exzision der Genome durch das gewählte Enzym (zum Beispiel PacI) gereinigt und transfiziert. Ein solches Verfahren wird in 2 schematisch dargestellt.
  • Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens zur Herstellung von adenoviralen Expressionsbanken der vorliegenden Erfindung kann die Klonierungstechnologie Gateway® verwendet werden, die von Life Technologies, Inc. (LTI, Rockville, MA, USA) entwickelt wurde, und vor allem ermöglicht, gleichzeitig einen Satz von Adenoviren zu erzeugen, die Inserts zum Beispiel aus einer komplementären DNA-Bank oder einer Gruppe von Sequenzen tragen, die durch unterschiedliche Methodologien, die dem Fachmann gut bekannt sind, charakterisiert und selektiert werden.
  • Die Klonierungstechnologie Gateway®, die unter anderem in der US-Patentschrift US 5,888,732 beschrieben ist, ermöglicht es zum Beispiel, Inserts zwischen zwei plasmidischen Vektoren zu transferieren, während einer In-vitro-Reaktion, aufgrund von Rekombinationsreaktionen in Höhe der spezifischen Stellen attL, attR, attB und attP des Lamda-Bakteriophagen (λ) von Escherichia coli. Die Insertion eines Gens erfordert nicht mehr die Gegenwart von geeigneten Restriktionsstellen innerhalb des Vektors, sondern nur noch die Gegenwart kurzer Rekombinationssequenzen, die att-Sequenzen genannt werden.
  • Das Klonierungssystem Gateway® besteht einerseits darin, eine Reaktion durchzuführen, die LR genannt wird, bei der sich ein Eingangsklon, der ein interessierendes Insert enthält, das von attL-Stellen eingerahmt ist, mit einem Zielklon, der attR-Stellen enthält, rekombiniert, um einen Expressions-Klon zu erzeugen. Das interessierende Insert, das von dem Eingangsklon getragen wird, wird somit in einen Expressionsvektor transferiert, der vom Zielklon stammt, der die attB-Stellen enthält. Das Gateway®-System besteht andererseits darin, eine Umkehrreaktion durchzuführen, die als BP-Reaktion bezeichnet wird, bei der der Expressionsklon, der ein interessierendes Insert enthält, das von Rekombinationsstellen attB eingerahmt ist, sich mit einem Gebervektor rekombiniert, der die Stellen attP enthält, um den Eingangsklon zu ergeben, der die Stellen attL enthält.
  • Insbesondere kann gemäß einer ersten Strategie ein Fährenplasmid, zum Beispiel pJJl, wie zuvor beschrieben, modifiziert werden, um ein Plasmid zu erzeugen, das mit dem Gateway®-System kompatibel ist, das die geeigneten att-Stellen besitzt. gemäß diesem ersten Ansatz werden die att-Stellen bevorzugt zwischen dem Promoter (CMV) und der SV40-Polyadenylierungsstelle der Expressionskassette des Fährenplasmids eingeführt. Das so erhaltene Plasmid wird gemäß der Terminologie der Gateway®-Technologie als Zielplasmid bezeichnet, und kann danach mit den Eingangsklonen der Gateway®-Technologie in Reaktion treten. Folglich kann jedes Insert aus einer DNA-Bank oder einer Gruppe selektierter Sequenzen, das Klon in einem Vektor oder Eingangsklon ist, in das erfindungsgemäße Fährenplasmid transferiert werden, um ein Expressionsfährenplasmid zu ergeben, das in der Erfindung verwendbar ist, um den entsprechenden adenoviralen Vektor zu erzeugen.
  • Gemäß einer zweiten Strategie wird das vollständige adenovirale Plasmid modifiziert, um mit der Gateway®-Technologie kompatibel zu sein. Es handelt sich daher darum, geeignete att-Stellen in das Plasmid einzuführen, das ein adenovirales Genom trägt, um die Realisierung der Reaktionen zu ermöglichen, die im Gateway®-Klonierungssystem beschrieben sind. Bevorzugt werden die att-Stellen anstelle der Region E1 des adenoviralen Genoms zwischen einem Promoter und einer Polyadenylierungssequenz eingeführt. Diese Strategie ermöglicht es somit, Plasmide zu erzeugen, die adenovirale Genome tragen, die verschiedene Inserts umfassen, die ursprünglich in Eingangsklonen vorhanden waren. Es kann sich um Inserts aus der Fertigung von Banken komplementärer DNA, Inserts, die Gene einer gleichen Familie repräsentieren, oder jeden anderen Ursprungs, handeln. Es wird ein Plasmid erzeugt, das ein adenovirales Genom trägt, das modifiziert ist und att-Sequenzen besitzt, das ein Zielklon im Sinne der Gateway®-Technologie ist, und das als pAdDEST bezeichnet wird (Beispiel 6, 10). Der so erhaltene Zielklon, pAdDEST, kann mit jedem Eingangklon reagieren, um ein Expressionsplasmid zu erzeugen, das ein adenovirales Genom pAdExp trägt, wie nachfolgend in Beispiel 6 und in 11 beschrieben.
  • Die Erfindung stellt somit eine neuartige Methode zur Bestätigung oder Identifikation einer Sequenz dar, die mit einem physiologischen oder genetischen Effekt assoziiert ist, die einen charakteristischen Phänotyp induziert. Es kann sich insbesondere um ein Gen handeln, das einen genetischen Defekt hervorruft, oder um ein Gen, das anzeigend oder charakteristisch für eine genetische Anomalie sein könnte.
  • In einer Anwendung zur Validierung oder Bestimmung der Funktion einer oder mehrerer Sequenzen im Rahmen einer Aktivität der funktionellen Genomik können die Sequenzen von jeder Natur sein, insbesondere von solcher, die weiter oben zitiert wurde, sie können aber auch aus Populationen aller Sequenzen mit unbekannter oder multipler Natur stammen. Diese Sequenzen können in unterschiedlichen Kassetten nebeneinander liegen, um später in das gewünschte adenovirale Genom eingeführt zu werden.
  • Diese Sequenzen können aus jedem Zelltyp stammen, der lebt oder durch unterschiedliche Verfahren, wie der Denovo-Synthese, der Mutagenese, der Sequenzkombination usw. künstlich hergestellt wurde.
  • Ein große Anzahl von Banken kann als Quelle nukleotidischer Sequenzen im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendet werden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Banken genomischer DNA (insbesondere von Chromosomenregionen – die zum Beispiel in YACs oder BRCs enthalten sind), cDNA-Banken, Banken synthetischer DNA, egal ob diese Banken normalisiert sind oder nicht, und aus unterschiedlichen lebenden Geweben für die Sens- oder Antisens-Expression hergestellt, von zufällig erzeugten Sequenzen, die die Fähigkeit aufweisen, verschiedene Peptide zu erzeugen, von degenerierten Sequenzen aus einer bekannten Sequenz, von einer Mosaiksequenz von bekannten Sequenzen usw.
  • Insbesondere können zu untersuchende primäre Sequenzen Antisens oder Elemente genetischer Suppression erzeugen. Es handelt sich um Sequenzen, die, indem sie sich exprimieren, ein bestimmtes Gen in dem untersuchten biologischen System inaktivieren können. Es kann sich um Ribozym handeln.
  • Die Sequenzen, die verwendet werden, um die Bank zu bilden, können aus unterschiedlichen Syntheseprozessen stammen. Insbesondere die Simulation einer gelenkten molekularen Evolution, die die Rekombination verwendet, ermöglicht es, eine Vielfalt von Genen unter Verwendung von identifizierten Evolutionsmechanismen zu erzeugen (Curr. Op. in Biotech. 1997, 8: 724–733).
  • Die Sequenzen, die verwendet werden, um die Bank zu bilden, können auch aus der bioinformatischen Analyse von Datenbanken stammen, die die Daten des humanen Genoms erfassen. Sie können unter Verwendung der Genexpressionsanalyse selektiert werden, die durch unterschiedliche Methoden erhalten wird (EST, Microarrays, DNA-Chips, differential display) TIBtech 1996, 14 p294–298; Nature Biotechnology 1998,16, p27–31.
  • Insbesondere ermöglicht es das Verfahren, eine adenovirale Bank zur Expression von Sequenzen randomisierter Peptide zu erzeugen. Es ermöglicht somit die Selektion und Identifikation einer Sequenz aleatorischer Peptide, die in der Lage sind, sich an ein interessierendes Protein zu binden. Eine Bank von Oligonucleotiden mit aleatorischer Sequenz wird in eine Stelle (Polylinker) eingeführt, die einem flexiblen Ring eines natürlichen oder synthetischen Proteins entspricht, damit diese Peptide an der Oberfläche des Proteins präsentiert werden. Es kann sich darum handeln, diese Peptide intrazellulär zu präsentieren (Colas et al, 1996, Nature 380: 548–550) oder an der Oberfläche der Zelle (Tramonto et al., 1994, J. Mol. Recognit. 7: 9–24). Schließlich können die Peptide außerhalb der Zelle präsentiert werden, indem ein Sekretionssignal in die Expressionskassette inseriert wird (Rice et al., 1992, PNAS 89, 5467–5471).
  • Es können eine oder mehrere interessierende Sequenzen in den Vektor integriert werden.
  • Es kann sich darum handeln, am Ende eine Kombination von Sequenzen (Expressionskassette) zu bewerten oder die interessierende Sequenz mit einem anderen interessierenden Gen, zum Beispiel einem Markergen, zu coexprimieren. Es lässt sich somit entscheiden, ob polycistronische Sequenzen verwendet werden oder ob die zu exprimierenden Sequenz(en) an einem anderen Ort platziert wird (werden), als dem der interessierenden Sequenz im adenoviralen Genom. Es können verschiedene polycistronische Sequenzen verwendet werden. Die IRES-Elemente ermöglichen die effiziente Translation von zwei oder mehr offenen Leserahmen aus einer einzigen mRNA. Insbesondere kodiert ein Leserahmen für das interessierende Protein (das aus einer cDNA-Bank stammt) den anderen Leserahmen für einen Marker, wie GFP.
  • Der Verfahren ermöglicht es, Systeme zur Exzision/Integration zu verwenden, die mit einer enzymatischen Aktivität verbunden sind. Es kann sich um das CRE-Lox-System handeln (Baubonis et al., Nucl. Acids Res. 21: 2025–2029) das FLP-Recombinase-FRT-System (Dang et al., Dev. Gent. 13; 367–375) das System Piv de Moraxella lacunata (Lenic et al., 1994, J. Bacteriol. 176–4160) oder das System der Lamda-Integrase (Kwon et al., 1997, Science 276,126). Insbesondere wird eine Sequenz oder die Expressionskassette der cDNA mit einem replikativen episomalen Vektor verknüpft, wird durch das Cre-lox-System aus dem adenoviralen Genom exzidiert, und wird an infizierte Zellen übertragen, die sich teilen (WO97/47757).
  • Der Verfahren erleichtert den Nachweis von DNA-Protein-Interaktionen. Die Bank entspricht somit einer Population von Sequenzen, die in der Lage sind, sich mit der DNA zu verbinden. Es handelt sich um Polypeptide aus Proteinen, die auf natürliche Weise in der Lage sind, sich an die DNA oder an künstliche Polypeptide zu fixieren. Gesucht wird die spezifischste Sequenz einer gegebenen DNA-Sequenz.
  • Das Verfahren ermöglicht den Nachweis von Protein-Protein-Interaktionen. Die Kapazität zur Coinfektion des adenoviralen Vektors wird verwendet. Vorzugsweise wird der Komplementierungstest LacZ benutzt (PNAS 1997, 94, 8405–8410). Das zelluläre System wird durch das erste Konstrukt und die cDNA-Banken coinfiziert.
  • Die Funktionalitätstests, die eingesetzt werden können, um die adenovirale Expressionsbank der Erfindung zu analysieren, sind zahlreich und verschieden.
  • Es können zum Beispiel Komplementierungstests verwendet werden, die darin bestehen, die nukleotidische Sequenz aus der Bank zu identifizieren, deren Expression zu einem gesuchten zellulären Phänotyp führt. Insbesondere ermöglicht es die adenovirale Expressionsbank, eine defiziente humane Zelle für ein phänotypisches Merkmal zu infizieren. Analyse infizierter Zellen und Auffinden von Zellen, die nun das gesuchte phänotypische Merkmal tragen. Analyse der cDNA, die von dem Virus getragen wird, der für das Auftauchen des phänotypischen Merkmals verantwortlich ist. Es kann auch das Verschwinden eines phänotypischen Merkmals nach der Infektion gemessen werden, die in einer Antisens-Aktivität oder in einem funktionellen „Knock-out" resultiert.
  • Der Verfahren erleichtert die Untersuchung der Wirkungsweise eines chemischen Moleküls in einem biologischen System. Die adenovirale Expressionsbank dient dazu, die Zellen des biologischen Systems zu infizieren, das auf die Wirkung der Arznei antwortet.
  • Nach der Infektion kann der Effekt der Arznei nicht modifiziert, erhöht oder gehemmt sein. In den beiden letzteren Fällen erleichtert die Analyse der cDNAs, die von den viralen Genomen getragen werden, die Entdeckung von intrazellulären und/oder extrazellulären Pfaden, die am Effekt der chemischen Zusammensetzung beteiligt sind.
  • Der Verfahren der Erfindung kann somit eingesetzt werden zur
    • – Suche nach (Ziel-)Nukleinsäuren, die es ermöglichen, die Effekte von p53 in dem Verfahren des Wachstumsstillstands und der Apoptose zu umgehen,
    • – Identifikation von Cytokinen,
    • – Identifikation von synthetischen Peptiden, die auf zelluläre Verfahren einwirken,
    • – Suche nach Molekülen, die in der Lage sind, eine extrazelluläre Präsentation von Peptiden durchzuführen,
    • – Identifikation von Zielen für Tumorzellen, die keine spezifischen Tumorsuppressoren aufweisen,
    • – Identifikation von Genen, die am Metastasenprozess beteiligt sind.
  • Die Erfindung bezieht sich ebenfalls auf ein Kit, umfassend:
    • – ein Fährenplasmid, das ein erstes trunkiertes Adenovirusgenom umfasst, und
    • – ein Elternplasmid, das ein zweites trunkiertes Adenovirusgenom umfasst,
    wobei die zwei Plasmide in der Lage sind, durch homologe Rekombination zwischen den zwei trunkierten Adenovirusgenomen ein fertiges Plasmid herzustellen, das ein vollständiges lineares rekombinantes Adenovirusgenom umfasst, das durch ein oder mehrere Restriktionsstellen eingefasst ist, die in dem Genom nicht vorhanden sind.
  • Die vorliegende Erfindung wird mit Hilfe der folgenden Beispiele vollständiger beschrieben, die als illustrativ und nicht als beschränkend zu betrachten sind.
  • Beschriftung der Figuren
  • 1. Beschreibendes Schema des Prinzips der Erfindung. Ein Fährenplasmid pJJl und ein Elternplasmid pOSE1, die jeweils ein komplementäres Fragment besitzen, bilden ein Coaggregat durch homologe Rekombination in E. coli, wobei sie ein vollständiges rekombinantes Adenovirusgenom erzeugen, das eine exogene Sequenz trägt.
    KmR: Kanamycin-Resistenzgen. Tet R: Tetracyclin-Resistenzgen. RK2 Ori: Replikationsstartpunkt des Plasmids RK2. RK6 Ori: Replikationsstartpunkt des Plasmids RK6.
  • 2. Gleichzeitige Erzeugung von 96 rekombinanten Adenoviren, die cDNAs aus einer cDNA-Bank tragen, die in dem Fährenplasmid konstruiert wurde. Anwendung der Eigenschaften der OSEDRAG-Technologie.
  • 3. Erhalt des erfindungsgemäßen Elternplasmids, das eine Sequenz eines nicht vollständigen adenoviralen Genoms trägt, und daher für die EDRAG-Technologie nicht funktionell ist (Crouzet et al.). Karte der Plasmide pJJ301, pXL3215 und des Plasmids pOSE17-00.
  • 4. Karten von unterschiedlichen Versionen von Elternplasmiden, die in der Erfindung verwendbar sind, um unterschiedliche Versionen rekombinanter adenoviraler Vektoren zu erzeugen, insbesondere Vektoren, die für E1 und E3 (pOSE 10-00) deletiert sind, deletierte Vektoren für E1 und E3 und ausgestattet mit der Region pIX in ihrer Form syngen#2 (WO99/25861)-(pOSE17-00), deletierte Vektoren für E1, E3 und E4 (pOSE 30-00) und deletierte Vektoren für E1, E3 und E4 und ausgestattet mit der Region pIX in ihrer Form syngen#2 (pOSE37-00).
  • 5. Erhalt mit Hilfe des Verfahrens der Erfindung eines rekombinanten adenoviralen Genoms, das eine Expressionskassette des LacZ-Gens trägt. Karte des Fährenplasmids pIG5 und des Elternplasmids pOSE17-00 und des fertigen Plasmids pAd17-01. Karte der Plasmide pIG5, pOSE17-00 und pAd17-01.
  • 6. Erhalt mit Hilfe des Verfahrens der Erfindung von adenoviralen Genomen mit Hilfe von drei unterschiedlichen Fährenplasmiden (pIG5: Träger einer Expressionskassette des LacZ-Gens; Plasmid pIG18: Träger einer Expressionskassette des Luciferasegens und pIG7: ohne Expressionskassette). Enzymatische Verdauung der Klone, die aus der Cotransformation des Fährenplasmids und des Elternplasmids resultieren.
  • 7. Erhalt mit Hilfe des Verfahrens der Erfindung von adenoviralen Vektoren nach der Transfektion unterschiedlicher Klone des Plasmids pAD17-01 in der Produktionszelle 293. Enzymatische Verdauung der viralen DNAs, die in der Zelle 293 aus amplifizierten Viren auf gereinigt wurden.
  • 8. Erhalt mit Hilfe des Verfahrens der Erfindung einer Bank von adenoviralen Genomen, erzeugt durch eine primäre cDNA-Bank in dem Fährenplasmid pTA00. Die Bank der adenoviralen Genome wird dank des Elternplasmids pOSE37-10 erhalten, das ein von pOSE37-00 abgeleitetes Plasmid ist. Karte der Plasmide pTA00, pOSE37-10 und pAd37-10.
  • 9. Erhalt eines Expressionsplasmids pAdGWExpLacZ, das mit dem Gateway®-System (LTI, Rockville, MA, USA) kompatibel ist, durch homologe Rekombination der Plasmide pSHExpLacZ und PxI2689.
  • 10. Erhalt durch eine Reaktion, genannt BP, eines Zielplasmids pAdDEST, das ein vollständiges adenovirales Genom trägt, das Gen ccdB, das für E. Coli tödlich ist, eingerahmt von den Rekombinationsstellen attR1 und attR2.
  • 11. Erhalt des adenoviralen Plasmids, das ein interessierendes Insert pAdExp trägt, durch eine LR genannte Reaktion.
  • Allgemeine Techniken der Klonierung, der Molekularbiologie, der Zellbiologie
  • Die herkömmlichen Methoden der Molekularbiologie, wie etwa die Zentrifugierung von plasmidischer DNA in einem Gradienten aus Ethidium-Cäsiumbromidchlorid, Verdauungen durch Restriktionsenzyme, Gel-Elektrophorese, Transformation in E. coli, Präzipitation von Nukleinsäuren usw., sind in der Literatur beschrieben (Maniatis et al., 1989).
  • Die Enzyme wurden von New-England Biolabs (Beverly, MA) geliefert.
  • Für die Ligierungen werden die DNA-Fragmente nach ihrer Größe auf Agarosegelen von 0,8 bis 1,5% separiert, mit GeneClean gereinigt (BIO101, LaJolla CA) und über Nacht bei 14°C in einem Tris-HCl-Puffer, pH-Wert 7,4 50 mM, MgCl2 10 mM, DTT 10 mM, ATP 2 mM, in Gegenwart von DNA-Ligase des T4-Phagen inkubiert.
  • Die ligierten DNAs werden verwendet, um den kompetent gemachten Stamm E. coli TG1 [Δ(lac proA,B), supE. thi,hsdD5/F' traD36, proA+, B+, lacIq, lacZΔM15] (Maniatis et al., 1982), den Stamm E.-coli Top10 cells (TOP10 One Shot kit, Invitrogen, Niederlande) oder auch den Stamm E. coli polA SF800 (Heffron et al., 1977) zu transformieren. Die Amplifikation mit PCR, (Polymerase Chain Reaction), wurde ebenfalls gemäß Maniatis et al., 1989, mit folgenden Spezifikationen realisiert:
    • – Denaturierungstemperatur 95°C, Hybridierungstemperatur 55°C, Elongationstemperatur 72°C. Dieser Zyklus wurde 25 Mal in einem PTC-200 Peltier Thermal Cycler (MJ Research, Massachusetts, US) wiederholt.
  • Die Oligonucleotide wurden von der Firma GENSET (Evry, Frankreich) synthetisiert. Sie Sequenzierung wurde von der Firma GENSET (Evry, Frankreich) durchgeführt.
  • BEISPIELE
  • Beispiel 1: Konstruktion der Elternplasmide
  • Dieses Beispiel beschreibt den Erhalt eines adenoviralen Genoms, das an seinem 5'-Teil trunkiert und dessen E1- und E3-Regionen deletiert sind, humaner Adenovirus vom Typ 5, und von einer einmaligen Restriktionsstelle an seinem 3'-Teil eingefasst ist, in einem Plasmid der Inkompatibilitätsgruppe P, das sich in E coli repliziert.
  • Die Plasmide gemäß der vorliegenden Erfindung können auf unterschiedliche Weise konstruiert werden. gemäß einer bevorzugten Methode wird das Plasmid pOSE17-00 gemäß der EDRAG-Methodologie ( FR 2,730,504 ) mit Hilfe der Plasmide pXL3215 und pJJ301 konstruiert. Das Plasmid pXL3215 enthält das gesamte Genome des AD (abgesehen von zwei Deletionen in den Regionen E1 und E3), und besitzt eine Expressionskassette des LacZ-Gens, die von dem RSV-Promoter in der Region E1 gelenkt wird. Das Plasmid pXL3215 ist ein Derivat des Plasmids pXL2689 und enthält den Replikationsstartpunkt des Plasmids RK2, das Tetracyclinresistenzgen (J. Crouzet, PNAS, 1997).
  • Das Plasmid pJJ301 besitzt einen Replikationsstartpunkt RK6 und kann sich in Stämmen von E.coli pir- nicht replizieren. Das Plasmid pJJ301 besitzt das Kanamycinresistenzgen. Das Plasmid pJJ301 besitzt eine Homologieregion am Anfang des adenoviralen Genoms, das von pOSE17-00 getragen wird. Es handelt sich um eine besondere Version der Region pIX, genannt syngen#2, die in (WO99/25861) beschrieben ist. Stromaufwärts dieser Sequenz ist eine Sequenz inseriert, die homolog ist zur Region stromaufwärts des vollständigen adenoviralen Genoms in dem Plasmid pXL3215. Die doppelte Rekombination der Plasmide pXL3215 und pJJ301 lässt pOSE17-00 entstehen. Dieses Plasmid pOSE17-00 entspricht einem Elternplasmid im Sinne des Verfahrens der Erfindung und wird in 3 schematisch dargestellt.
  • Andere Elternplasmide (pOSE10-00, pOSE30-00, pOSE37-00) wurden mit dem gleichen Schema konstruiert, was es ermöglichte, adenovirale Genome zu erzeugen, die in der Region E1 und E3 deletiert sind (als Version Region pIX wild oder Version pIX degeneriert (WO99/25861)) oder adenovirale Genome, die in der Region E1, E3 und E4 deletiert sind (als Version Region pIX wild oder Version pIX degeneriert (4).
  • Beispiel 2: Konstruktion der Fährenplasmide
  • Diese Beispiel beschreibt den Erhalt eines Fährenplasmids, das die Region 5' des adenoviralen Genoms (TIR- und Enkapsidierungsregion) trägt, humaner Adenovirus vom Typ 5, der eine Restriktionsstelle PacI vorangeht.
  • Dieses Plasmid besitzt einen Replikationsstartpunkt RK6 und ist nicht in der Lage, sich in E coli zu replizieren, das für das Protein pir nicht transkomplementieren kann. Dieses Plasmid pIG5 enthält eine Expressionskassette LacZ, die einer Sequenz vorangeht, die homolog ist zu einer Sequenz, die in pOSE17-00 vorhanden ist (eine Sequenz, die einem Teil der Region pIX Iva2 entspricht). Dieses Plasmid wird im Sinne der Erfindung Fährenplasmid genannt, es besitzt ein Kanamycinresistenzgen (5).
  • Beispiel 3: Herstellung eines funktionellen rekombinanten adenoviralen Genoms
  • Diese Beispiel beschreibt den Erhalt eines funktionellen adenoviralen Genoms, dessen Regionen E1 und E3 deletiert sind, humaner Adenovirus vom Typ 5, und an seinen Enden von einer Restriktionsstelle PacI eingefasst ist, in einem Plasmid der Inkompatibilitätsgruppe P, das sich in E. coli repliziert und eine Expressionskassette des LacZ-Gens trägt.
  • Die gewählte Integrationsstrategie ist die homologe Rekombination im Stamm E. coli zwischen pOSE17-00 und PIG5. Das Plasmid pOSE17-00 wurde in Zellen des Stamms E. coli JM83 Rec+ lacZ eingeführt. Die Zellen aus einem tetracyclinresistenen Klon wurden ihrerseits kompetent gemacht, durch das Plasmid pIG5 transformiert, dann auf LB-Medium in Gegenwart von Tetracyclin und Kanamycin ausgebreitet. In Anbetracht dessen, dass sich das Plasmid pIG5 im Stamm JM83 nicht repliziert, kann der Erwerb der Tetracyclin- und Kanamycinresistenzen nur durch ein homologes Rekombinationsereignis zwischen den beiden Plasmiden hergestellt werden. Diese haben nämlich die Region pIX des Ad5-Genoms gemeinsam. Das resultierende Plasmid besitzt das vollständige Genom des rekombinanten adenoviralen Vektors, eingerahmt von einer PacI-Stelle. Verdauungen durch die Enzyme PacI und HindIII, EcoRI oder auch PacI und DraI, ermöglichen es, den Erhalt der erwarteten plasmidischen Struktur zu kontrollieren. Dieses fertige Plasmid, das ein funktionelles adenovirales Genom trägt, wurde pAd17-01 genannt (5).
  • Auf die gleiche Weise lassen das Plasmid pIG5 und das Plasmid pOSE37-00 ein Plasmid entstehen, das ein vollständiges adenovirales Genom trägt, dessen E1, E3, E4 deletiert sind, und das mit einer Region pIX in dessen Form syngen#2 ausgestattet ist (WO99/25861).
  • Außerdem ist es gemäß der gleichen Strategie möglich, andere rekombinante Genome der gleichen Familie zu konstruieren, die eine Expressionskassette tragen oder nicht. pIG7 und pIG18 werden verwendet und leiten von pIG5 ab: PIG7 hat keine Expressionskassette, pIG18 besitzt eine Expressionskassette des Luciferasegens. In dem Maße, in dem die Expressionskassette keine Sequenzhomologie mit der genomischen Sequenz des bakteriellen Chromosoms aufweist, wird erwartet, dass 100% der Klone positiv sind. Wie in 6 illustriert ist, stellte sich nämlich heraus, dass 100% der analysierten Klone am Ende dieses Versuchs die erwarteten nukleotidischen Strukturen aufwiesen (6).
  • pAd17-01 wurde von PacI verdaut, was das Genom des rekombinanten Adenovirus freisetzt. Das Produkt dieser Verdauung kann so wie es ist zur Transfektion von transkomplementierenden Säugetierzellen (Zellen 293) für die Funktionen E1 des Adenovirus verwendet werden.
  • Beispiel 4: Herstellung rekombinanter Adenoviren
  • Klone rekombinanter Adenoviren können in Escherichia coli konstruiert werden durch (i) Insertionen von Fragmenten, die ein oder mehrere Gene mit geeigneten Regulationssignalen enthalten, um diese Gene in den untersuchten Säugetierzellen zu exprimieren, oder (ii) durch Deletion bestimmter Fragmente des Adenovirusgenoms, oder auch durch die Kombination dieser beiden Ereignisse, dann danach, nach Transfektion der Produktionszellen, kann ein Bestand eines solchen rekombinanten Virus erhalten werden.
  • Das Plasmid pAd17-01 wird aus einer transformierten kompetenten E.-Coli-DH5-Zellkultur auf gereinigt. Das adenovirale Genom wird durch Verdauung in Gegenwart des Enzyms PacI freigesetzt. Das Verdauungsprodukt wird direkt verwendet, um die rekombinanten Adenoviren herzustellen. Hierfür werden Zellen der Linie 293 mit dem Verdauungsprodukt von pAd17-01 in Gegenwart von Effectene (Qiagen, Deutschland) transfiziert. Der rekombinante Adenovirus wird in der Zelllinie 293 amplifiziert, was zu einem Kulturüberstand führt, der den nicht gereinigten rekombinanten Adenovirus enthält, der einen Titer von etwa 1010 pfu/ml aufweist.
  • Die Konformität der viralen DNA wird durch enzymatische Verdauung nach Reinigung der DNA aus den amplifizierten Viren verifiziert (7).
  • Die viralen Partikel werden danach durch Zentrifugation auf einem Cäsiumchloridgradienten gemäß bekannter Techniken (vgl. vor allem Graham et al., Virology 52 (1973) 456), oder durch Chromatographie) gereinigt. Der Adenovirus kann bei –80°C in 20%-igen Glycerol konserviert werden.
  • Beispiel 5: Konstruktion adenoviraler Expressionsbanken
  • Es werden Fährenplasmide verwendet, die mit einem Replikationsstartpunkt RK6 ausgestattet sind, um eine primäre Bank von Fährenplasmiden zu erhalten, die über die homologe Rekombination dazu dienen werden, eine Bank rekombinanter Adenovirusgenome in dem Plasmid zu erhalten, das den Replikationsstartpunkt RK2 besitzt.
  • Diese Bank von Plasmiden rekombinanter Adenovirusgenome wird in der transkomplementierenden Produktionszelle transfiziert, um eine Bank rekombinanter Adenoviren zu erhalten.
  • Die Gesamtheit der Schritte wird in 2 schematisch dargestellt und die plasmidischen Strukturen, die den Erhalt der adenoviralen Expressionsbank ermöglichen, werden in 8 präsentiert.
  • Beispiel 5.1 Herstellung der cDNA-Bank in dem Fährenvektor
  • Für die Herstellung der Bank in dem Fährenvektor (ein Derivat von pIG5 oder dem LacZ-Gen wurde exzidiert und durch multiple Klonierungsstellen, insbesondere den Stellen XhoI und EcoRI ersetzt), werden 10–20 μg des Vektors, der mit einem Cäsiumgradienten gereinigt wurde, mit 5 U/μg der Enzyme XhoI und EcoRI 90 Min. lang bei 37°C verdaut. Die Verdauung wird auf einem Agarosegel (1% Seakem GTG) abgelagert, und der linearisierte Vektor wird durch Elektrophorese in TAE-Puffer separiert. Die Bande, die dem Vektor entspricht, wird nach Visualisierung auf einem UV-Tisch geschnitten. Der Vektor wird aus der Agarose eluiert (Qiaquick DNA Cleanup System, Quiagen, Deutschland) und durch Phenol/Chloroform-Extraktion gereinigt, gefolgt von einer Präzipitation in Ethanol. Dieser Vektor ermöglicht es, nach Ligierung eines Testinserts, das mit EcoRI und XhoI verdaut wurde, etwa 5 Millionen Klone/μg mit einem Hintergrundrauschen von weniger als 10% zu erhalten.
  • Herstellung der cDNAs: Die Synthese der cDNAs wird aus einer Population von RNA erhalten, die mit mRNA angereichert ist. Die Synthese des ersten Strands erfolgt gemäß herkömmlicher Protokolle unter Verwendung der Transkriptase Superscript II (Stratagene) mit Hilfe eines Primer oligo dT, der die Sequenz einer XhoI- Stelle an 5' besitzt. Die Synthese des zweiten Strangs wird mit dem Enzym DNA PolymeraseI von E. coli. in Gegenwart der RNAse H und der DNA-Ligase von E. coli durchgeführt. Die mit dem zweiten Strang erzeugten Enden werden durch die Wirkung der T4-DNA-Polymerase gefüllt.
  • Die cDNAs werden gemäß der Größe durch Chromatographie durch Filtration auf Gel mit Hilfe von Biogel A50M fraktioniert, wie zuvor beschrieben (Soares et al., PNAS, 91: 9228–9232). Die gemäß der Größe fraktionierten cDNAs werden an kommerzielle Adapter EcoRI (Stratagene) ligiert, dann durch EcoRI verdaut, um Fragmente von cDNAs zu schaffen, die mit EcoRI-Enden (5') und XhoI (3') ausgestattet. Die nicht ligierten Adapter werden durch Chromatographie auf einer CL4B-Sepharosesäule (Pharmacia) entfernt. Die cDNAs, die die Adapter tragen, werden unter Verwendung der T4-Polynucleotidkinase phosphoryliert, und unter Verwendung der T4-DNA-Ligase in den Stellen EcoRI, XhoI des Fährenvektors, der wie weiter oben beschrieben, hergestellt wurde, ligiert, bei 16°C in einem Zeitraum, der bis zu 48 Std. dauert (600 ng Vektor +300 ng Insert in einem Volumen von 10–20 μl). Die Bank wird durch Elektroporation im Stamm pir.116+ amplifiziert, der die Replikation von Plasmiden ermöglicht, die mit einem Replikationsstartpunkt RK6 ausgestattet sind, dann auf 100 Schalen mit einem Durchmesser von 150 mm in Agar-LB-Medium plus Kanamycin ausgebreitet. Es wird eine Bank mit 5 Millionen Klonen erhalten. Die primäre cDNA-Bank in dem Fährenplasmid wird danach, gemäß dem von Soares et al., 1994, beschriebenen Protokoll, normalisiert. Ein Schritt der Selektion eines Subsatzes von Klonen kann realisiert werden, indem auf Technologien zurückgegriffen wird, die es ermöglichen, das Expressionsprofil der Klone zu bestimmen, wie zum Beispiel mittels DNA-Chips (Amersham, Molecular Dynamics, Affymetrix).
  • Die selektierten Klone aus der cDNA-Bank, die in dem Fährenplasmid normalisiert wurde, werden in Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen mit einem Klon je Vertiefung angeordnet. Diese Klone werden in flüssigem Medium (LB) in Gegenwart des angepassten Antibiotikums (Kanamycin) amplifiziert. Die Herstellung der DNA jedes Klons wird gleichzeitig für 96 Kulturproben mit Hilfe des Quiagen-Robot (Quiagen Biorobot 9600) und dem Kit Quiaprep 96 Turbo Biorobot (Quiagen, Deutschland) durchgeführt. Die DNAs werden in 50 μl TEx1 aufgenommen. 96 Proben plasmidischer DNA werden in einer so genannten primären Platte angeordnet.
  • Beispiel 5.2 Herstellung der plasmidischen Bank der funktionellen adenoviralen Genome, die die cDNAs tragen.
  • Das adenovirale Elterngenom, das von einem Plasmid RK2 getragen wird (pOSE37-00), wird durch herkömmliche Transformation in den Stamm JM83 eingeführt. Eine Kultur dieses Stamms, ausgestattet mit Plasmid (JM83xpOSE37-00), wird durch die Standardtechniken der aufeinander folgenden Wäschen in 100 mM Cacl2 kompetent gemacht.
  • Die kompetenten Zellen (JM83xpOSE37-00) werden mit 40 μl je Vertiefung in eine Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen verteilt. Die DNA jedes Fährenplasmids wird in diesem Stamm transformiert, um das homologe Rekombinationsereignis zu erhalten, das das funktionelle adenovirale Genom erzeugt. 5 μl DNA aus der so genannten Primärplatte werden dann zu 40 μl kompetenten Zellen zugefügt, wobei die Ordnung eingehalten wird. Die Platte wird 1 Min. lang auf 42°C erwärmt, dann 2 Min. lang auf Eis abgekühlt. 1 ml Medium (LB), das die beiden angepassten Antibiotika (Kanamycin, Tetracyclin) enthält, wird je Vertiefung zugefügt. Nach einem ersten Wachstum von 6 Std. dienen 50 μl dieses Wachstums dazu, eine neue Platte mit 96 Vertiefungen anzuimpfen, die mit 1 ml Medium (LB) ausgestattet ist, das die beiden angepassten Antibiotika (Kanamycin, Tetracyclin) enthält. Die Kultur wird 14 Std. lang erhalten.
  • Die plasmidische DNA, die aus diesem Wachstum resultiert, wird mit Hilfe des Quiagen-Robots (Quiagen Biorobot 9600) und des Kits R.E.A.L Prep 96 Biorobot gereinigt, der ein Schritt der Quiawell-Separation aus dem Qiawell 96 Ultra Biorobot Kit vor der Präzipitation in Isopropanol (Quiagen, Deutschland) folgt. Die DNA wird in 50 μl TEx1 aufgenommen.
  • 20 μl jeder DNA (etwa 0,4 μg) werden dann in eine Vertiefung einer neuen Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen, unter Einhaltung der Ordnung transportiert. Diese DNA wird mit dem Enzym PacI verdaut, um das virale Genom zu exzidieren. Je Vertiefung werden 10 μl der Reaktionsmischung (3 μl Nel-Puffer, 6 μl H2O, 1 μl (2, 5 U) PacI) zu 20 μl DNA zugefügt. Die Reaktion wird bei 37°C 1 Std. 30 Min. lang durchgeführt. Die Platte wird zentrifugiert und bis zum nächsten Schritt bei –20°C eingefroren.
  • Die virale DNA muss mit PacI verdaut werden, um das adenovirale Genom zu exzidieren, dann in den transkomplementierenden eukaryotischen Zellen transfiziert werden, um die virale Bank zu erzeugen.
  • Beispiel 5.3. Erhalt der adenoviralen Expressionsbank.
  • Die Platte mit 96 Vertiefungen, die die DNAs trägt, die mit PacI verdaut wurden, wird auf Umgebungstemperatur gebracht. Die 30 μl DNA jeder Vertiefung, die mit PacI verdaut sind, nehmen 2 μl Enhancer und 15 μl Effectene (Effectene Transfection Reagent, Quiagen, Deutschland) auf. Die transfizierende Mischung wird dann in die Vertiefungen einer Mikrotiterplatte mit 96 oder 48 Vertiefungen verteilt, in denen IGRP2-Zellen (WO96/22378) mit 105 Zellen je cm2 angeimpft wurden.
  • 14 Tage nach der Transfektion werden 50–75 μl/Vertiefung Kulturüberstand entnommen und dienen als Inokulum, um eine neue Platte mit frisch angeimpften transkomplementierenden Zellen zu infizieren. Dieser Schritt der Amplifikation wird 3–5 Mal erneuert, um eine Homogenität der viralen Titer zu gewährleisten, die in jeder Vertiefung erhalten werden. Der in jeder Vertiefung erhaltene Titer liegt im Bereich zwischen 5 × 108 und 5 × 109 viraler Teilchen je ml. Die Platte wird zentrifugiert und bei –20°C eingefroren.
  • Diese Viren können direkt in dem geeigneten biologischen System verwendet werden. Nach der Infektion des zellulären Modells durch die Bank wird eine funktionelle Analyse bestimmt und eingesetzt. Bevorzugt wird je nach dem verwendeten zellulären Modell eine pro-apoptotische, anti-angiogene oder anti-apoptotische Aktivität gesucht. Die Ordnung der Klone, dann der Viren, bei der Konstruktion der Bank, ermöglicht es, leicht zur nukleotidischen Sequenz zurückzukehren, die mit einer funktionellen Aktivität verbunden ist, und somit ein neues Ziel zu definieren.
  • Beispiel 6. Konstruktion eines Plasmids, das ein adenovirales Genom trägt, das mit dem Klonierungssystem Gateway® kompatibel ist, das von Life Technologies (LTI, Rockville, MA, USA) vertrieben wird.
  • Das Plasmid pSHExplacZ wird erzeugt, es besitzt den CMV-Promoter, die Stelle attB1, das LacZ-Gen, die Stelle attB2, und die SV40-Polyadenylierungsstelle in einem Fährenvektor vom Typ pIG5 (2). Um dieses Plasmid zu erhalten wird die cDNA des LacZ-Gens, das aus dem Plasmid pSV40-lacZ (Promega) stammt, mit HindIII und DraI verdaut und in die Stellen XmnI und EcoRV depENTR-1A inseriert, die von Life Technologies in ( US 5,888,732 ) beschrieben werden, was das Plasmid pENTR-LacZ ergibt. Eine Reaktion vom Typ LR (Gateway® cloning technology) zwischen pENTR-LacZ und pDest12.2 ergibt pExpLacZ (Bezeichnung der Gateway®-Technologie). Zwei Subklonierungsschritte haben den abschließenden Erhalt von pSHExpLacZ erleichtert: Das Fragment NcoI/AseI von pExpLacZ wird in AseI und NcoI von pCA350 (abgeleitet von depIG5) inseriert, wodurch das Plasmid pSExpLacZ erzeugt wird. Schließlich wird das Fragment PacI/SaII von pSExpLacZ in PacI/SaII des Plasmids pIG7 (abgeleitet von depIG5) inseriert. Am Ende befinden sich die Sequenzen: CMV-Promoter, Stelle attB1, LacZ-Gen, Stelle attB2 und SV40-Polyadenylierungsstelle anstelle der CMV-LacZ-Kassette des Fährenplasmids pIG5 (Beispiel 2). Das so erhaltene Plasmid wird als pSHExpLacZ bezeichnet und ist in 9 dargestellt.
  • Ein mit pAdGWExpLacZ bezeichnetes Plasmid, das mit dem Gateway®-System kompatibel ist, wird dann gemäß der EDRAG-Methodologie ( FR 2,730,504 ) mit Hilfe der Plasmide pSHExpLacZ und pXL2689 konstruiert.
  • Das Plasmid pXL2689, das von Crouzet et al. (PNAS 1997) beschrieben wird, besitzt den Plasmidstartpunkt RK2, das Tetracyclinresistenzgen und ein infektiöses adenovirales Genom, das Deletionen in E1 und E3 aufweist. Die Rekombination der Plasmide pXL2689 und pSHExpLacZ lassen ein Plasmid pAdGWExpLacZ entstehen, das das adenovirale Genom und das Insert trägt, das den CMV-Promoter, die attB1-Stelle, das LacZ-Gen, die attB2-Stelle und die SV40-Polyadenylierungsstelle umfasst (9).
  • Das so erhaltene Plasmid pAdGWExpLacZ umfasst ein interessierendes Gen, repräsentiert durch LacZ zwischen den beiden Rekombinationsstellen attB des Lamda-Phagen von E. Coli, und reagiert mit einem so genannten Gebervektor des Gateway®-Systems (pDONR201), der die Stellen attP, ein Kanamycinresistenzgen (KnR) und das Gen ccdB trägt, das für E. Coli tödlich ist. Das aus dieser Reaktion, die gemäß der Bezeichnung der Gateway®-Klonierungstechnologie BP genannt wird, resultierende Plasmid, wird als pAdDEST (Zielplasmid) bezeichnet und ist in 10 dargestellt.
  • Schließlich reagiert das Plasmid pAdDEST dank der Stellen attR1 und attR2 mit einem Klon, der Eingangsklon des Gateway®-Systems genannt wird, der ein interessierendes Insert trägt, das eingerahmt ist von den Rekombinationsstellen attL1 und attL2, durch eine LR genannte Reaktion. Das so erhaltene Plasmid wird als pAdExp bezeichnet, und trägt ein vollständiges adenovirales Genom sowie das interessierende Insert (11).
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Claims (4)

  1. Verfahren zur Herstellung von Adenovirus, umfassend: – a) die Konstruktion eines ersten, vorzugsweise prokaryotischen Plasmids (genannt „Fähre"), das ein erstes trunkiertes rekombinantes adenovirales Genom umfasst, das mindestens eine heterologe Nukleinsäure umfasst, – b) das Kontaktieren dieses ersten Plasmids mit einem zweiten Plasmid (genannt „Eltern"), das ein zweites trunkiertes rekombinantes adenovirales Genom umfasst, das komplementär zum ersten ist, wobei die beiden Plasmide eine zirkuläre Form aufweisen und durch homologe Rekombination die Herstellung eines fertigen Plasmids ermöglichen, das ein vollständiges rekombinantes adenovirales Genom umfasst, und – c) die Exzision des linearen vollständigen rekombinanten adenoviralen Genoms aus dem fertigen Plasmid und dessen Einführung in eine Enkapsidierungslinie, um die rekombinanten Adenoviren herzustellen, die das vollständige rekombinante adenovirale Genom inkorporieren, wobei beide, das „Fähren"-Plasmid und das „Eltern"-Plasmid, eine identische adenovirale Homologieregion umfassen, beide einen Replikationsstartpunkt und einen unterschiedlichen Selektionsmarker umfassen, um die Selektion jedes Elements zu ermöglichen, und beide eine TIR-Sequenz umfassen, die von einer Restriktionsstelle eingefasst ist, die in dem adenoviralen Genom nicht vorhanden ist, und eine von beiden eine Enkapsidierungssequenz umfasst.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, ferner umfassend: – die Infektion mittels der hergestellten rekombinanten Adenoviren: – eines biologischen Materials, das Zellen umfasst, mit dem Ziel in vitro die Eigenschaften der Nukleinsäure zu analysieren; – einer In-vitro- oder Ex-vivo-Zellkultur, mit dem Ziel ein Protein, Polypeptid oder Peptid herzustellen, das die heterologe Nukleinsäure kodiert.
  3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2 zur Herstellung adenoviraler Expressionsbanken.
  4. Kit, umfassend: – ein Fährenplasmid, das ein erstes trunkiertes Adenovirusgenom umfasst, das mindestens eine heterologe Nukleinsäure umfasst, und – ein Elternplasmid, das ein zweites trunkiertes Adenovirusgenom umfasst, und das mindestens eine heterologe Nukleinsäure umfasst, wobei die zwei Plasmide in der Lage sind, durch homologe Rekombination zwischen den zwei trunkierten Adenovirusgenomen ein fertiges Plasmid herzustellen, das ein vollständiges lineares rekombinantes Adenovirusgenom umfasst, das durch ein oder mehrere Restriktionsstellen eingefasst ist, die in dem Genom nicht vorhanden sind, wobei beide, das „Fähren"-Plasmid und das „Eltern"-Plasmid, eine identische adenovirale Homologieregion umfassen, beide einen Replikationsstartpunkt und einen unterschiedlichen Selektionsmarker umfassen, um die Selektion jedes Elements zu ermöglichen, und beide eine TIR-Sequenz umfassen, die von einer Restriktionsstelle eingefasst ist, die in dem adenoviralen Genom nicht vorhanden ist, und eine von beiden eine Enkapsidierungssequenz umfasst.
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