NO330916B1

NO330916B1 - Fremstilling av rekombinante adenovirus og et kit som inneholder plasmider med avkortede adenovirusgenom.

Info

Publication number: NO330916B1
Application number: NO20021634A
Authority: NO
Inventors: Jean-Jacques Robert
Original assignee: Aventis Pharma Sa
Priority date: 1999-10-07
Filing date: 2002-04-05
Publication date: 2011-08-15
Also published as: IL148493A0; CA2383225A1; DE60033679T2; MXPA02003247A; DK1224310T3; EP1224310A1; KR20020057969A; EP1224310B1; FR2799472B1; HUP0203801A2; NZ518763A; US8263395B2; CZ20021215A3; DE60033679D1; HK1050211A1; CA2383225C; NO20021634D0; AU785431B2; AU7794700A; BR0014489B1

Description

Foreliggende oppfinnelse angår metoder for fremstilling av rekombinante adenovirus. De fremstilte adenovirus kan benyttes for overføring og/eller ekspresjon av gener inn i celler in vitro, ex vivo eller in vivo, eller også ved funksjonell "genomics". Foreliggende oppfinnelse omfatter også et kit som omfatter plasmider som omfatter avkortede adenovirus genom.

Adenovirus oppviser visse interessante egenskaper for overføring og/eller ekspresjon av gener i celler. Særlig har de et meget stort vertsspektrum, er i stand til og infektere hvilende celler, har en betydelig kloningskapasitet og integrerer seg ikke i genomet i den infekterte celle. Videre har de til i dag ikke vært forbundet med vesentlige patologier hos mennesker og har således vært benyttet for overføring av gener av interesse til forskjellige humane vev in vitro eller in vivo som muskelen (Ragot et al., "Nature", 361

(1993) 647), leveren (Jaffe et al, "Nature genetics", 1 (1992) 372), nervesystemet (Akli et al., "Nature genetics", 3 (1993) 224), tumorer, glatte muskler, og så videre. De samme egenskaper gjør den adenovirale vektor til et valgt verktøy for å utnytte genomiske data.

Den funksjonelle "genomics" angår som vitenskapelig felt å undersøke gener eller genomdata for forskjellige organismer for å gjøre disse funksjonelle. Tatt i betraktning egenskapene kan adenovirale vektorer som bærer en eksogen sekvens benyttes for å bestemme funksjonen til denne sekvens i forskjellige eksperimentelle modeller. Særlig kan de adenovirale vektorer benyttes for å studere et terapeutisk mål (i den betydning uttrykket benyttes i den farmasøytiske industri) i en cellulær modell in vitro eller in vivo i dyr. Når denne sekvens er kjent ogkarakterisert, kan de adenovirale vektorer tjene til funksjonell validering av dette mål. Mer spesielt og innenfor konteksten kalt funksjonell "genomics", kan den adenovirale vektor for overføring av gen utgjøre et nyttig verktøy for å identifisere funksjonen av en nukleinsekvens i en eukaryotisk forsøksmodell uten på forhånd å ha noen spesiell informasjon når det gjelder arten eller funksjonen til denne sekvens, derunder omfattet de situasjoner der tallrike sekvenser studeres i store mengder.

Imidlertid er den industrielle eksploatering, terapeutisk eller som funksjonell "genomics" for adenovirusene, ennu begrenset, særlig på grunn av de aktuelle metoder for fremstilling av disse rekombinante virus. Særlig tillater de i dag disponible metoder ikke å produsere på enkel, hurtig og klonende måte å fremstille adenoviruspopulasjoner som innarbeider heterologe nukleinsekvenser, særlig ikke de tallrike heterologe nukleinsekvenser som må studeres slik tilfellet er ved den funksjonelle "genomics". Foreliggende oppfinnelse gir nettopp en løsning på disse problemer. Foreliggende oppfinnelse beskriver således nye verktøy og nye metoder for konstruksjon av rekombinante adenovirus. Det beskrives særlig genetiske konstruksjoner (plasmider), celler og protokoller som gjør det mulig å fremstille adenovirus med hurtig og med god kvalitet. Dette gjør det også mulig å realisere adenovirale banker som omfatter et høyt antall heterologe nukleinsyrer.

Et aspekt ved oppfinnelsen ligger således i fremgangsmåte for anvendelse av rekombinante adenovirus for å bestemme den biologiske funksjon av en nukleinsyre eller et protein.

Det er også mulig å anvende adenovirus for konstruksjon av ekspresjonsbanker i det formålet analysere nukleinsyrene hva angår ukjent funksjon og/eller struktur.

Oppfinnelsen angår likeledes adenovirale ekspresjonsbibliotek, det vil si adenoviruspopulasjoner omfattende nukleinsyreinnskudd.

Oppfinnelsen angår likeledes metoder og verktøy som tillater fremstilling av slike adenovirus.

Adenovirus er virus med lineær dobbeltstreng DNA med en størrelse på rundt 36 kb. Dens genom omfatter særlig en repetert invers sekvens, ITR, ved hver ende, enkapsideringssekvens, Psi, tidlige gener og sene gener. De vesentlige tidlige gener inneholdes i områdene El, E2, E3 og E4. Blant disse er genene som inneholdes i området El nødvendige for den virale propagering. Området E4 er likeledes viktig når det gjelder regulering av replikasjonen for det adenovirale genom. De vesentlige sene gener inneholdes i områdene LI til L5. Genomet av adenovirusen Ad5 er helt og holdent sekvensert og tilgjengelig i databanker (se særlig Genbank M73260). På samme måte er deler og også totaliteten av andre adenovirale, humane eller animalske genomer (Ad2, Ad7, Adl2, CAV-2, etc.) sekvensert.

Som antydet ovenfor er adenovirus allerede benyttet for overføring av gener in vivo. I denne forbindelse er det fremstilt forskjellige vektorer avledet fra adenovirus og som innarbeider forskjellige gener (P-gal, OTC, a-1 AT, cytokiner, enzymer, vekstfaktorer, og så videre). I hver av disse konstruksjonene er genomet av adenovirusene modifisert for å gjøre den ute av stand til autonom replikering og/eller propagering efter gen-overføringen. Således er rekonstruksjoner som beskrives i den kjente teknikk adenovirus som er deletert i et eller flere områder valgt blant El, E2, E3, E4, pIX, Iva2, og så videre. Spesielle konstruksjoner er berøvet for området El, områdene El og E3, områdene El og E4, områdene El, E4 og E3, eller også totaliteten av områdene som koder for for eksempel adenoviruset ("vecteur gutless"). Disse vektorer omfatter generelt en heterolog nukleinsyre hvis overføring i cellen eller hvis studium er ønsket. Denne nukleinsyre kan innføres på forskjellige seter i det rekombinante genom som erstatning for deleterte områder eller på andre posisjoner. Eksempler på adenovirale vektorer er beskrevet særlig av Levrero et al. i "Gene", 101 (1991) 195; Gosh-Choudhury et al. i "Gene", 50, (1986) 161, WO 94/12649, WO 94/28152,

WO 94/28938, WO 95/23671, WO 96/10088, WO 95/02697, WO 95/27071, og så videre.

De rekombinante adenovirus produseres ved transfeksjon av DNA av den rekombinante virus i en kompetent enkapsideringscellelinje. Det kan dreie seg om en enkelt transfeksjon når man kan anbringe en konstruksjon som bærer helheten av genomet av den rekombinante virus eller, som tilfellet oftest er, å mene ko-transfeksjon av flere fragmenter av DNA som bærer de forskjellige deler av det rekombinante, virale genom. I dette tilfellet implikerer prosessen et eller flere trinn med homolog rekombinasjon mellom de forskjellige konstruksjoner i enkapsideringscellelinjen for å generere DNA av de rekombinante virus. For gjennomføring av den ene eller andre av disse metoder er det således nødvendig å disponere over egnede konstruksjoner som bærer helheten eller deler av genomet av den rekombinante adenovirus som man ønsker å produsere.

Det eksisterer forskjellige metoder beskrevet i den kjente teknikk for fremstilling av disse konstruksjoner in vitro. Den mest generelt benyttede teknikk består i å isolere virale DNA og derefter å modifisere dette in vitro ved klassiske molekylær biologi-metoder (kutting, ligering, og så videre). Konstruksjonene som oppnås blir derefter renset og benyttet for å transfektere enkapsideringslinjen. Denne teknikk implikerer videre produksjon av forråd av virus og rensing av virale DNA for hver konstruksjon eller for hver manipulering av DNA av den rekombinante virus og er således ikke til-passet fremstilling av forskjellige forråd eller banker. For å bøte på disse mangler, har det vært foreslått å benytte prokaryotiske plasmider for fremstilling av virale DNA som kan anvendes for transfeksjon. Særlig beskriver Bett et al. i "PNAS", 91 (1994) 8802) konstruksjonen av et replikativt plasmid hos E. coli som bærer et modifisert adenoviralt genom (plasmid pBHGlO). Mer spesielt bærer dette plasmid et adenoviralt genom som er deletert over området El, E3 og Psi, sirkularisert ved skjøting av ITR-sekvensen og som, innskutt i området 188-1339 av genomet av adenovirusen, en del av plasmidet pBR322. Dette plasmid kan replikere hos E. coli, manipulert for innføring av gener av interesse, men oppviser fremdeles visse mangler. Dets anvendelse ved fremstilling av virus implikerer særlig en linearisering av de skjøtende ITR og en rekombinering som, tatt i betraktning konstruksjonene, fører til innarbeiding av det rekombinante adenovirale genom av området som stammer fra det prokaryotiske plasmid. Andre plasmider av denne type og som oppviser den samme genre av mangler er beskrevet for eksempel av Graham, "EMBOJ.", 3(12) (1984) 2917.1 den senere tid er det beskrevet nye prosesser som særlig er basert på homolog rekombinasjon av to plasmider under anvendelse av kunstige kromosomer fra gjær (YACs, Ketner et al., 1994) eller bakterier (Chartier et al, 1996, Crouzet et al, 1997, He et al, 1998). Disse metoder er mer effektive enn de tidlige, men også mer komplekse. YAC-systemene nødvendiggjør dyrking og manipulering av gjær (Ketner et al, 1994). IE. coli-systemene følger flere trinn (hvorav visse er kritisk elektrotransformering, sukrose-seleksjon) efter hverandre. Man merker seg særlig at i ethvert tilfelle er et eller flere trinn ved screening av kloner nødvendige for å selektere en klonal endelige rekombinant vektor, som bærer et infektiøst adenoviralt genom. Denne prosess er, selv om den effektivt på klonal måte tillater å fremstille forråd av adenovirus som bærer et gitt terapeutisk gen, imidlertid ikke anvendelig på tilfredsstillende måte for fremstilling av rekombinante adenovirus i stor mengde, særlig på grunn av den samtidige produksjon av tallrike rekombinante adenovirus som inkorporerer forskjellige nukleinsyrer.

En bremse for anvendelsen av adenovirale vektorer som system for overføring eller analyse av gen ligger således i kompleksiteten og antallet operasjoner som tillater å fremstille disse virus. Det eksisterer således i denne teknikk et klart behov for å kunne disponere egnede plasmider som lett kan manipuleres og forsterkes in vitro for fremstilling av rekombinante, adenovirale genomer. Det er likeledes viktig at de således fremstilte genomer praktisk talt er berøvet for de områder som stammer fra plasmidet og som er i stand til

(i) å indusere en immunitær respons,

(ii) å kode for resistensproteinet og

(iii) å redusere evnen hos virusen som vektor.

Det foreligger likeledes et behov for metodologi som på enkel måte tillater å generere rekombinante adenovirus på en klonal, hurtig måte og i stort antall.

Foreliggende oppfinnelse tillater særlig å bøte på disse mangler. Foreliggende oppfinnelse beskriver således nye preparater og metoder for fremstilling av rekombinante adenovirus som tilfredsstiller disse krav. Preparatene og metodene ifølge oppfinnelsen tillater særlig en hurtig, effektiv klonal produksjon i stor mengde av rekombinante adenovirus som kan benyttes terapeutisk eller for ansøking av farmasøytiske mål.

Foreliggende oppfinnelse er basert særlig på anvendelsen av to plasmider (særlig prokaryoter) som er i stand til å generere et homologt rekombinasjonstrinn i vertscelle (særlig en prokaryot), et plasmid som omfatter et fullstendig, adenoviralt genom, som lett kan skjæres ut for å produsere de rekombinante adenovirus.

Rent generelt omfatter således oppfinnelsens fremgangsmåte:

I et første trinn konstruksjon av et første plasmid (kalt "skyttel"), fortrinnsvis prokaryotisk, omfattende et første avkorted, rekombinant, adenoviralt genom omfattende minst en heterolog nukleinsyre (kloningstrinn). Fortrinnsvis omfatter det første avkortede genom en ITR, en heterolog nukleinsyre, et adenoviralt homologiområde og eventuelt enkapsideringssekvens. I et andre trinn blir det første plasmid bragt i kontakt med et andre plasmid (kalt "opphav") omfattende et andre avkortet, rekombinant, adenoviralt genom, komplementært til det første, som ved homolog rekombinering tillater produksjon av et sluttplasmid omfattende et fullstendig, rekombinant, adenoviralt genom (rekombineringstrinn). Fortrinnsvis omfatter det andre, avkortede, adenovirale genom minst en ITR, et adenoviralt homologiområde, identisk med det som er til stede i den første, en enkapsideringssekvens (hvis denne ikke er til stede i det første). Dette andre avkortede, adenovirale genom kan i tillegg likeledes omfatte en annen nukleinsyrerest.

I et tredje trinn blir det fullstendige, rekombinante, adenovirale genom skåret ut av sluttplasmidet og innført i en enkapsideringslinje for å produsere rekombinante adenovirus som som innarbeidet det fullstendige, rekombinante, adenovirale genom (adenovirusproduksjonstrinn).

I et fjerde fakultativt trinn blir de rekombinante adenovirus benyttet for å infektere:

Et biologisk materiale omfattende celler i det forhold å analysere egenskapene hos

nukleinsyren (funksjonelt analysetrinn).

En cellulær kultur in vivo eller ex vivo, i det formål å fremstille et protein, polypeptid eller peptid kodet av den heterologe nukleinsyre.

En celle, et vev, et organ eller en organisme, i det formål in vivo å produsere et

protein, polypeptid eller peptid kodet av den heterologe nukleinsyre.

Foreliggende oppfinnelse tillater således i et trinn (homolog rekombinering) å oppnå et prokaryotisk plasmid som bærer et funksjonelt adenoviralt genom (komplett), som kan kuttes ut ved hjelp av et eller flere egnede enzymer. Dette sluttplasmid resulterer således i integrering av et første plasmid (skyttel) som bærer de adenovirale sekvenser (minimum en ITR-sekvens og en enkapsideringssekvens) og utstyrt med en heterolog nukleinsyre av interesse. I et andre plasmid (opphav) som bærer komplementære, adenovirale sekvenser (minimum en andre ITR-sekvens) ved et homologt rekombineringsevenement via en felles sekvens hos de to plasmider (adenoviral homologisekvens). Dette homologe rekombineringsevenement gir vis-å-vis koaggregat opphav til et funksjonelt, adenoviralt genom.

En av fordelene ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen ligger i enkelheten som tillater realisering i parallell med tallrike skyttelplasmider. Således omfatter det første trinn av prosessen fortrinnsvis kloning av en nukleinsyrebank i skyttelplasmidet for derved å generere en sluttplasmidbank som bærer et funksjonelt, adenoviralt genom, med identisk struktur, bortsett fra innskuddene de omfatter. Dette kloningstrinn realiseres fortrinnsvis ved å bevare hver individualiserte klon, for eksempel i en mikrotitrerings-brønnplate. Videre kan dette trinn realiseres automatisert. Skyttelplasmidbanken som oppnås benyttes derefter i rekombineringstrinnet, idet hvert skyttelplasmid i banken bringes i kontakt med plasmidopphavet. Denne prosess fører så til produksjon, i parallell og samtidig, i tallrike rekombinante adenovirus som omfatter en heterolog nukleinsyre (det vil si en adenoviral ekspresjonsbank). Denne bank kan så testes på biologisk materiell (trinn 4) for å identifisere kloner som oppviser en tilsiktet, biologisk aktivitet.

Foreliggende oppfinnelse kan benyttes med enhver type adenovirus, prokaryotiske celler og fra forskjellige nukleinsyrebanker slik det skal illustreres i større detalj i det følgende.

Foreliggende oppfinnelse omfatter fremgangsmåte for fremstilling av adenovirus, kjennetegnet ved at den omfatter:

(a) konstruksjon av et første plasmid (kalt "skyttel" plasmid), fortrinnsvis et prokaryotisk plasmid, omfattende et første avkortet, rekombinant adenoviralt genom som inneholder minst en heterolog nukleinsyre, (b) å bringe det første plasmidet i kontakt et andre plasmid (kalt "foreldre" plasmid) omfattende et andre avkortet, rekombinant adenoviralt genom, komplementært til det første genomet, hvor begge plasmidene er i sirkulær form og gjør det mulig, ved homolog rekombinasjon, å produsere et sluttplasmid som omfatter et fullstendig rekombinant adenoviralt genom, og (c) å kutte det lineære, komplette, rekombinante adenovirale genomet fra sluttplasmidet og innføre dette i en enkapsideringscellelinje for å fremstille de rekombinante adenovirus som inkorporerer det komplette, rekombinante, adenovirale genom, hvor nevnte "skyttel" plasmid og nevnte "foreldre plasmid" begge omfatter en identisk homolog adenoviral region, hvor begge omfatter et origo for replikasjon og en forskjellig seleksjonsmarkør for å selektere hvert element og begge omfatter en ITR sekvens grensende til et restriksjonssete som ikke er tilstede i det adenovirale genom og en eller annen som omfatter en enkapsideringssekvens.

Foreliggende oppfinnelse omfatter også et kit, kjenntegnet ved at det at det omfatter

et skyttel plasmid som omfatter et første avkortet adenoviralt genom som omfatter minst en heterolog nukleinsyre og en foreldre plasmid som omfatter et andre avkortet, adenoviralt genom og som omfatter minst en heterolog nukleinsyre, hvor de to plasmidene gjør det mulig, ved homolog rekombinasjon, mellom de to avkortede adenovirus genomene, å produsere et sluttplasmid som omfatter et fullstendig lineært rekombinant adenovirus genom som er flankert av ett eller flere restriksjonsseter som ikke er tilstede i nevnte genom, hvor nevnte "skyttel" plasmid og nevnte "foreldre plasmid" begge omfatter en identisk homolog adenoviral region, hvor begge omfatter et origo for replikasjon og en forskjellig seleksjonsmarkør for å selektere hvert element og begge omfatter en ITR sekvens grensende til et restriksjonssete som ikke er tilstede i det adenovirale genomet og en eller annen som omfatter en enkapsideringssekvens.

Definisjoner

Rekombinant adenovirus: Uttrykket rekombinant adenovirus angir i oppfinnelsens kontekst enhver adenovirus hvis genom er modifisert ved delesjon og/eller insersjon eller substitusjon av baser. Det dreier seg således mer spesielt om en adenoviral partikkel, generelt infektiøs, omfattende et rekombinant, adenoviralt genom. I henhold til den eller de modifikasjoner som er gitt i genomet, kan den rekombinante virus være effektivt for replikering, det vil si ute av stand til autonom replikering og/eller propar-gering i en celle. Den rekombinante adenovirus kan fremstilles fra enhver serotype av adenovirus og særlig humane adenovirus (for eksempel type C som Ad5, Ad2, Ad7, Adl2, og så videre) eller animalsk (som canin-adenovirus som CAV-2).

Adenoviralt genom: Uttrykket "adenoviralt genom" angir DNA-molekylet som er til stede i en adenovirus, eller dettes sekvens, kopi eller replika. Et rekombinant, adenoviralt genom er en nukleinsyre hvis sekvens tilsvarer sekvensen av et adenovirusgenom og omfatter en eller flere modifikasjoner. Modifikasjonene omfatter for eksempel delesjoner (for eksempel hele eller en del av områdene El, E2, E3, E4, og så videre), insersjoner (for eksempel en eller flere heterologe nukleinsyrer) eller forandringer i bruken av kodoner.

Det rekombinerte, adenovirale genom som er generert ved preparatene og metodene ifølge oppfinnelsen er fortrinnsvis og fordelaktig et "komplett" eller "funksjonelt" genom, det vil si at det ikke nødvendiggjør anvendelse av andre områder for rekombinering eller ligering for fremstilling av virale forråd i de valgte enkapsideringslinjer. Et slikt "komplett" genom omfatter således fortrinnsvis minst en enkapsideringssekvens og en heterolog nukleinsyre, frankert av en ITR-sekvens ved hver ende. Et annet fordelaktig karakteristikum for plasmidene ifølge oppfinnelsen skyldes det faktum at det oppnådde, komplette, rekombinante adenovirale genom ikke er avbrutt av områder av pro-karyotplasmidet. På grunn av dette inneholder genomproduktene i det vesentlige ikke områder fra plasmidet med de innledningsvis nevnte mangler. Således er, i plasmidene ifølge oppfinnelsen, ITR'ene av det adenovirale genom ikke forenet, noe som tillater å oppnå lineære, komplette, rekombinante virale genomer som direkte kan benyttes for å fremstille de rekombinante virus.

Fortrinnsvis omfatter det rekombinante, adenovirale genom minst ITR-sekvensene og en sekvens som tillater enkapsidering. De inverse repeterte sekvenser, ITR, utgjør replikasjonsopprinnelsen for adenovirusen. De er lokalisert ved endene av det virale genom der de kan isoleres lett i henhold til klassiske teknikker i molekylærbiologien som velkjent av fagmannen. Nukleotidsekvensen for ITR-sekvensene av de humane adenovirus (særlig serotypen Ad2 og Ad5) er beskrevet i litteraturen på samme måte som canin-adenovirusene (særlig CAV1 og CAV2). Når det gjelder for eksempel adenovirusen Ad5, tilsvarer den venstre ITR-sekvens området som omfatter nukleotidene 1 til 103 av genomet.

Enkapsideringssekvensen (også kalt Psi-sekvensen) er nødvendig for enkapsidering av det virale genom. Den er lokalisert i genomet av villtype-adenoviruset mellom den venstre ITR og området El. Den kan isoleres eller syntetiseres kunstig ved klassiske teknikker innen molekylærbiologien. Nukleotidsekvensen for enkapsideringssekvensen av humane adenovirus (særlig serotypene Ad2 og Ad5) er beskrevet i litteraturen på samme måte som canin-adenovirusene (særlig CAV1 og CAV2). Når det gjelder for eksempel adenovirusen Ad5, omfattes en funksjonell enkapsideringssekvens mellom nukleotidene 194 og 358 av genomet.

I en foretrukken utførelsesform av oppfinnelsen er genomet til adenoviruset berøvet hele eller en del av området El. Området El er essensielt for den virale replikering og dets inaktivering fører til dannelse av virus som en replikasjonsdefekte, det vil si ikke i stand til replikering på autonom måte efter genetisk overføring in vivo. Området El eller ethvert annet betraktet viralt område kan gjøres ikke-funksjonelt ved enhver teknikk som velkjent for fagmannen og særlig ved total suppresjon, substitusjon, partiell delesjon eller addisjon av en eller flere baser i det eller de angjeldende gener. Slike modifikasjoner kan lett gjennomføres direkte på oppfinnelsens plasmider, for eksempel ved hjelp av genetiske spleiseteknikker. Fortrinnsvis er genererte adenovirusgenom berøvet en del av området El mellom nukleotidene 454 og 3328 (fragment PvuII-Bglll) eller 382 og 3446 (fragment HinfII-Sau3A).

Et avkortet rekombinant adenoviralt genom angir et DNA som tilsvarer sekvensen for en terminal del av et adenoviralt genom, det vil si ved en ende (ITR). To avkortede, rekombinante genomer kalles komplementære når de hver bærer en komplementær del av et adenoviralt genom og de kan ved homolog rekombinering rekonstituere et fullstendig rekombinant adenoviralt genom.

Heterolog nukleinsyre: Uttrykket "heterolog nukleinsyre" angir enhver nukleinsyre som er innskutt i det rekombinante, adenovirale genom, hvis overføring, ekspresjon eller funksjonelt studium er tilsiktet. Det dreier seg i det vesentlige om en nukleinsyre med en opprinnelse forskjellig fra en adenovirus ("heterolog") fra en human, animalsk, vegetabilsk, viral (annet enn adenovirus som benyttes som vektor), prokaryotisk, eukaryotisk eller lavere celler eller celler av syntetisk eller halv-syntetisk opprinnelse. Størrelsen på den heterologe nukleinsyre kan variere i den grad at det rekombinante adenovirale genom som inneholder den ikke overskrider den maksimale størrelse som tillater enkapsidering i en adenoviral partikkel (totalt mindre enn 40 kb). Således kan det dreie seg om en nukleinsyre med en lengde over 30 kb, når tilstrekkelige adenovirus-områder er deletert. Nukleinsyren kan i denne forbindelse omfatte et område som koder for et protein, et polypeptid eller et peptid, for eksempel et cDNA, et gDNA eller en syntetisk DNA. Det kan likeledes dreie seg om en nukleinsyre med ukjent struktur som stammer for eksempel fra en klon fra en nukleinsyrebank. Videre kan det adenovirale genom omfatte flere heterologe nukleinsyrer, innskutt i forskjellige seter i genomet.

Beskrivelse av plasmidene

Som antydet ovenfor gjør foreliggende oppfinnelse bruk av to plasmider (prokaryoter), skyttelplasmidet og opphavsplasmidet, hver omfattende et komplementært fragment av en rekombinant adenovirus. Minst et av disse plasmider har en heterolog nukleinsyre (eller et innskytingssete for en slik nukleinsyre) av interesse for genterapi, ved fremstilling av et rekombinant protein eller for en funksjonell "genomics" tilnærming som eksempler. Fortrinnsvis er endene (ITR-sekvensen) av hvert av de avkortede genomer som bæres av hvert av plasmidene flankert (i 5' for den venstre ITR og i 3' for den høyre ITR) av et sete som ikke er til stede i genomet, for å tillate utkutting av det fullstendige genom efter rekombinering. Disse plasmider bærer et stumpt eller avkortet genom av adenovirus og kan ikke individuelt generere et infektiøst antiviralt genom. Disse to plasmider har hver den komplementære del til den andre for, ved ko-integrering, å generere et sluttplasmid som således har hele genomet av adenovirus flankert av to ITR'er og av minst et restriksjonssete som ikke er til stede i genomet. Fragmentet av genomet av den rekombinante adenovirus som er til stede i disse plasmider er et ufullstendig genom som ikke i seg selv kan vise seg infektiøst efterpå. Dette av spesielt interesse da kun ko-integratet av de to plasmider er i stand til å generere et funksjonelt genom.

Slike plasmider er for eksempel vist i figur 1 og er beskrevet i større detalj nedenfor. Disse plasmider er fortrinnsvis prokaryote plasmider som omfatter generelt et plasmid område og et adenoviralt område. Plasmidområdet tillater replikering og/eller seleksjon av plasmidet i vertscelle, særlig i en prokaryotisk vertscelle. Det adenovirale området (stoppgenom) bærer en del av det rekombinante, adenovirale genom som, efter rekombinering med det adenovirale området av det komplementære plasmid (opphav eller skyttel) tillater å rekonstituere det fullstendige, rekombinante adenovirale genom. Området som tillater replikering i de prokaryotiske celler som benyttes i plasmidene ifølge oppfinnelsen kan være av en hvilken som helst funksjonell replikasjonsopprinnelse i de valgte celler. Det kan dreie seg om en replikasjonsopprinnelse fra et plasmid av inkompatibilitetsgruppen P (eksempel = pRK290) som tillater replikering i stammene av E. coli pol A. Mer generelt kan det dreie seg om enhver replikasjonsopprinnelse som stammer fra et plasmid som replikerer seg i prokaryotiske celler. Disse plasmider kan være et derivat av pBR322 (Bolivar et al., 1977), et derivat av puc (Viera og Messing, 1982) eller andre plasmider som stammer fra den samme inkompatibilitets-gruppe, det vil si for eksempel ColEl eller pMBl. Disse plasmider kan således velges i andre inkompatibilitetsgrupper som replikerer seg i Escherichia coli, det kan dreie seg om plasmider som er avledet fra plasmider som stammer fra inkompatibilitetsgruppene for eksempel A, B, Fl, Fil, FIII, FIV, Hl, Hl 1, II, 12, J, K, L, N, OF, P, Q, T, U, W, X, Y, Z eller 9. Andre plasmider kan også benyttes blant hvilke plasmider som ikke replikerer seg i E. coli, men hos andre verter som B. subtilis, Streptomyces, P. putida, P. aeruginosa, Rhizobium meliloti, Agrobaceterium tumefaciens, Staphyloccus aureus, Streptomyces pristinaespiralis, Enterococcus faecium eller Clostridium. Fortrinnsvis benyttes replikasjonsopprinnelser som stammer fra plasmider som replikerer seg i E. coli.

Området som tillater seleksjon av prokaryote celler inneholdende plasmidene ifølge oppfinnelsen kan bestå særlig av ethvert gen som gir resistens mot et produkt og særlig et antibiotikum. Således kan man nevne gener som gir resistens mot kanamycin ( Kan1), ampicillin (Amp1), tetracyklin ( tet1) eller spektinomycin, noe som hyppig benyttes i molekylærbiologien (Maniatis et al., 1989). Seleksjonen av plasmidene kan skje ved andre gener, som gener som koder for resistensmarkører mot et antibiotikum. Rent generelt dreier det seg om et gen som gir bakterien en funksjon den ikke har lenger (dette kan tilsvare et gen som er deletert for et kromosom eller gjort inaktivt), der genet på plasmidet reetablerer den funksjon. Som et eksempel kan det dreie seg om et gen av overførings-RNA som reetablerer en defekt kromosom funksjon (Somoes et al., 1991).

Fortrinnsvis bærer plasmidet og opphavsplasmidet en forskjellig replikasjonsopprinnelse og/eller en markør for å tillate seleksjon av hvert element.

Det adenovirale området som ligger i hvert av plasmidene tilsvarer i det vesentlige sekvensen av det avkortede adenovirale genom. Disse avkortede genomer, som bæres av hvert av plasmidene er komplementære, det vil si i stand til å generere et fullstendig (og lineært) rekombinant, adenoviralt genom efter homolog rekombinering. Videre er de avkortede genomer som bæres av hvert av plasmidene fortrinnsvis flankert av et eller flere restriksjonsseter som ikke er til stede i et adenoviralt genom for at det fullstendige, rekombinante adenovirale genom som er fremstilt ved rekombinering er flankert av slike seter.

Avkortet genom som er til stede i skyttelplasmidet

Skyttelplasmidet er som nevnt ovenfor, ment for å motta nukleinsyren av interesse, med henblikk på dennes innarbeiding i et rekombinant, adenoviralt genom.

Det adenovirale området av skyttelplasmidet tilsvarer den venstre del eller den høyre del av et adenoviralt genom efter dettes ende (en ITR-sekvens) helt til et valgt, adenoviralt homologiområde som tillater homolog rekombinering mellom to plasmider. Videre omfatter dette adenovirale genom en eller flere genetiske modifikasjoner.

I en første utførelsesform tilsvarer det avkortede genom, som er til stede i skyttelplasmidet den venstre del av det endelige, rekombinante adenovirale genom. I denne utførelsesform omfatter det for eksempel en sekvens som går fra den venstre ITR og helt til området som koder for proteinet pIX (og/eller Iva2), idet den heterologe nukleinsyre er innskutt i hel eller delvis substitusjon for området El. I denne spesielle utførelsesform består det adenovirale homologiområdet av området som koder for proteinet pIX (og/eller Iva2).

I en annen utførelsesform tilsvarer det avkortede genom, som er til stede i skyttelplasmidet den høyre del av det endelige, rekombinante adenovirale genom. I denne utførelsesform omfatter det for eksempel sekvensen som går fra det høyre ITR og helt til området som koder for proteinet pIX (og/eller Iva2), idet den heterologe nukleinsyre er innskutt som hel eller delvis substitusjon for området, for eksempel E4 eller E3.1 denne spesielle utførelsesform består det adenovirale homologiområdet likeledes av området som koder for protein pIX (og/eller Iva2).

I en spesiell utførelsesform består videre homologiområdet av en modifisert adenoviral sekvens. Således kan homologiområdet bestå for eksempel av et adenovirusområde som er modifisert ved endring av bruken av kodonet under anvendelse av degenerering av den genetiske kode. Slike modifikasjoner er beskrevet i WO 99/25861.1 en spesiell ut-førelsesform består det adenovirale homologiområdet av et område som koder for det degenererte protein pIX (og/eller Iva2).

I henhold til den valgte struktur for det endelige, rekombinante adenovirale genom (generert efter rekombinering) skal det være klart at det adenovirale homologiområdet kan tilsvare forskjellige områder i genomet. Således kan det adenovirale området av opphavsplasmidet forløpe fra den venstre ITR og helt til området E3 og det er således dette området som utgjør den adenovirale homologisone. Mer generelt er det adenovirale homologiområdet en sekvens som tilsvarer hele området av et villtype- eller modifisert adenoviralt genom, som tillater rekombinering mellom skyttelplasmidet og opphavsplasmidet for derved å generere det endelige, rekombinante adenovirale genom. Dette homologiområdet er således i det vesentlige identisk i skyttelplasmidet og i opphavsplasmidet. Det kan tilsvare forskjellige deler av genomet av en adenovirus alt efter den benyttede type av konstruksjoner.

En spesiell utførelsesform av oppfinnelsen ligger i et skyttelplasmid som omfatter et avkortet genom omfattende det venstre ITR-området, enkapsideringssekvensen, den heterologe nukleinsyre og et adenoviralt homologiområde som består av et område som koder for villtype eller degenererte protein pIX (og/eller Iva2, jevnfør for eksempel plasmidene pJJl og pIG5).

I en foretrukken modus av oppfinnelsen er videre det avkortede adenovirale genom ved siden av ITR'en flankert av et sete som ikke er til stede i det adenovirale genom, for eksempel Pacl.

Avkortet genom til stede i opphavsplasmidet

Opphavsplasmidet bærer som antydet ovenfor et avkortet, adenoviralt genom som ved rekombinering er i stand til å komplettere det avkortede genom som er til stede i skyttelplasmidet. Dens struktur er således avhengig av strukturen i skyttelplasmidet. Videre kan opphavsplasmidet likeledes inneholde en nukleinsyre som er forskjellig fra den som bæres av skyttelplasmidet.

Når således det adenovirale området av skyttelplasmidet tilsvarer den venstre del av et adenoviralt genom, tilsvarer det avkortede genom som er til stede i opphavsplasmidet dets høyre del som løper fra ITR'en og helt til det adenovirale homologiområdet. Når resiprokt det adenovirale området av skyttelplasmidet tilsvarer den høyre del av et adenoviralt genom, tilsvarer det avkortede genom som er til stede i opphavsplasmidet dens venstre del som forløpet fra ITR'en og helt til det adenovirale homologiområdet. Det avkortede genom som er til stede i opphavsplasmidet, kan tilsvare den høyre del av det endelige, rekombinant adenovirale genom, det omfatter for eksempel sekvensen som går fra den høyre ITR og helt til området som koder for protein pIX (og/eller Iva2). Videre kan genomet omfatte genetiske modifikasjoner som hele eller delvise delesjoner av for eksempel områdene E4 eller E3.

Det avkortede genom som er til stede i opphavsplasmidet, kan også tilsvare den venstre del av det endelige, rekombinante adenovirale genom. I denne utførelsesform omfatter det for eksempel en sekvens som går fra den venstre ITR og helt til en sekvens nær området E4. Videre kan genomet omfatte genetiske modifikasjoner som hele eller delvis delesjoner av hele eller deler av for eksempel området El.

Opphavsplasmidet kan bære et avkortet genom som tilsvarer den høyre del av det adenovirale genom og omfatter et ikke-funksjonelt E3-område. Det kan også bære et ikke-funksjonelt område E4. Videre kan det bære en delesjon av hele eller en del av fasene ORF3 og/eller ORF6 i området E4, eller opphavsplasmidet kan bære et avkortet genom som tilsvarer den høyre del av det adenovirale genom og bærer de funksjonelle områder E3 og E4.

Spesielle eksempler på slike plasmider er representert ved pOSEl, pOSElO-00, pOSE30-00, pOSE 17-00 og pOSE37-00 0'evnfør figurene 1 og 4).

Der er skyttelplasmidet et avkortet genom, som tilsvarer den venstre del av det adenovirale genom og bærer en delesjon av hele eller en del av området El.

To spesielt anvendbare plasmider innenfor oppfinnelsens ramme er plasmidet pOSE 17-00 og plasmidet pIG5. pOSE 17-00 (opphavsplasmid) omfatter replikasjonsopprinnelsen av plasmidet RK2, genet for tetracyklinresistens og har et fragment av det adenovirale genom som begynner ved base 3520 av Ad5 helt til den høyre ITR som er flankert av et Pacl-sete. Dette fragment av genomet har et ikke-funksjonelt E3-område og en sekvens som er modifisert ved pIX og Iva2 som beskrevet i WO 99/25861. Plasmidet pIG5 (skyttelplasmid) har en replikasjonsopprinnelse RK6 og kan ikke replikere særlig i stammer fra E. coli pir-. pIG5 har ITR- og enkapsideringsområder som forutgås av et Pacl-sete, den ønskede ekspresjonskassett og et område som er homologt med pOSE 17-00, en sekvens som er modifisert med pIX og Iva2 som beskrevet i WO 99/25861. Det ønskede genom blir således rekonstituert ved homolog kombinasjon takket være nærværet av det området som er homologt mellom de to plasmider (det vil si den modifiserte sekvens ved pIX og Iva2 som beskrevet i WO 99/25861).

Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen tillater således å generere et komplett (infektiøst) rekombinant genom fra to plasmider som hver tilveiebringer en del av genomet (et

plasmid som bærer den venstre ITR-sekvens som forutgås av et Pacl-sete og en totalitet av virale og ikke-virale sekvenser, og et plasmid som, forutgått av virale og ikke-virale sekvenser, bærer den høyre ITR fulgt av et Pacl-sete, der valget av virale og ikke-virale sekvenser avhenger av valget av den planlagte konstruksjon, idet den rekombinante adenovirusvektor er helt eller delvis deletert for virale gener); hvorved de to plasmider oppviser tilstrekkelige felles sekvenser til å realisere den homologe rekombinasjon og oppviser en overlapping i en sekvens som tillater det homologe rekombineringsevenement. Særlig tillater fremgangsmåten i et skjema som kan sammenlignes med det som er presentert for innføring av eksogene sekvenser i området El, å innføre eksogene sekvenser i området E4 ved hjelp av egnede plasmider. I dette tilfellet finner rekombinasjonen sted mellom et opphavsplasmid (som har de venstre ITR- og enkapsideringsområder forutgått av et restriksjonssete for enzymet PacI og et avkortet, adenoviralt genom nær området E4) og et skyttelplasmid (som har en sekvens nær området E4 som er identisk med opphavsvektoren, som er implikert i rekombinasjonsevenementet, ekspresjonskassetten for den interessante sekvens og derefter den høyre ITR og et unikt Pacl-sete).

Genomet av den fremstilte adenovirus er likeledes berøvet hele eller en del av området E3 og/eller E4 og/eller IVA2. Disse ytterligere delesjoner tillater å øke sikkerheten for vektoren og å forbedre kapasiteten. Fortrinnsvis er det adenovirale genom berøvet en del av området E4 som omfatter minst fasene ORF3 og ORF6. Det adenovirale genom kan likeledes være modifisert som beskrevet i søknad FR 9413355, hvor til det henvises for detaljer, for å unngå risiki for kontaminering med replikasjonspartikler. I en spesiell modus er det oppnådde, fullstendige adenovirale, rekombinante genom et genom kalt "gutless", det vil si berøvet for ethvert område som koder adenovirusen. I denne utførelsesmodus bærer det avkortede genom av plasmiden på den ene side en ITR og enkapsideringsområdet og på den annen side en ITR, idet homologiområdet kan bestå av selve den heterologe nukleinsyre eller av en kunstig sekvens, inkludert i hvert plasmid.

I denne forbindelse kan homologiområdet som er til stede i hvert plasmid rent generelt være en ikke-viral, eventuelt kunstig sekvens som tillater homolog rekombinasjon.

Det rekombinante genom kan likeledes bære kassetter som kan kuttes ut in vivo (WO 97/47757) eller genetisk modifiserte sekvenser (gener av fibre eller "penton") som tillater å modifisere virusets tropisme. Videre kan den genomiske organisasjon for viruset likeledes være modifisert for å forbedre sikkerheten for de fremstilte virus (WO 96/13596).

Som antydet tidligere er det rekombinante adenovirusgenom fortrinnsvis flankert av et eller flere restriksjonsseter som er fraværende i genomet. Dette eller disse seter tillater på enkel og effektiv måte å kutte ut plasmidets rekombinante, adenovirale genom. Den genomiske sekvens til adenovirus er kjent og tilgjengelig og fagmannen kan selektere ved rutineforsøk de restriksjonsseter som er fraværende i dette genom. Som eksempel kan nevnes sete PacI, NspV og Swal (for Ad5) eller Snabl (i Ad2). Det er likeledes mulig å gjøre visse seter unike ved å modifisere sekvensen av det adenovirale genom. Således kan andre enzymer benyttes hvis de tilsvarende restriksjonsseter er supprimert, modifisert eller deletert i den adenovirale sekvens som er konstruert hos E. coli. Setene kan være posisjonert direkte ved siden av endene av det adenovirale genom eller noen basepar i avstand fra dette.

Plasmidene kan konstrueres ved bruk av adenovirus av forskjellige opprinnelser. Forskjellige serotyper av adenovirus, der struktur og egenskaper kan variere noe, er karakteriserte. Blant disse serotyper foretrekker man innenfor rammen av oppfinnelsen å benytte humane adenovirus av type 2 eller 5 (Ad2 eller Ad5) eller adenovirus av animalsk opprinnelse (se WO 94/26914). Blant adenovirusene av animalsk opprinnelse som kan benyttes innenfor rammen av foreliggende oppfinnelse kan nevnes adenovirus av canin, bovin, murin (for eksempel Mavl, se Beard et al. i "Virology", 75 (1990) 81), ovin, porcin, aviær eller også simien (for eksempel SAV) opprinnelse. Fortrinnsvis er adenovirusen av animalsk opprinnelse en canin-adenovirus og helst en CAV2-adenovirus [for eksempel stammen manhattan eller A26/61 (ATCC VR-800)]. Det benyttede adenovirus kan være adenovirus av human opprinnelse eller av animalsk opprinnelse. US 5922576 beskriver en fremgangsmåte for å fremstille rekombinante andenovirus som inneholder heterologe sekvenser. Fremgangsmåten omfatter homolog rekombinasjon av to plasmider med overlappende sekvenser, hvor et linearisert skyttelplasmid kontransfekteres i en egnet vertscelle sammen med et supercoilet plasmid. I vertscellen vil overlappende sekvenser i de to plasmidene komme i kontakt ved homolog rekombinasjon. Bett AJ. et al, PNAS, 1994, Vol. 91, side 8802-8806, beskriver adenovirusvektorer med ulike delesjoner eller insersjoner i El eller E3 området og viser at disse områdene egner seg bra for innsetting av heterologe sekvenser.

Homolog rekombinasjon og produksjon av virus

Det homologe rekombinasjonstrinn (som tillater rekonstruksjon av det fullstendige genom) kan realiseres i henhold til teknikker som er velkjente for fagmannen ved transfeksjon (eller ko-transfeksjon) av plasmider i en egnet celle, fortrinnsvis en prokaryotisk celle. I en spesiell utførelsesform gjennomføres den homologe rekombinasjon i E. coli under anvendelse av en stamme polA for å selektere de homologe rekombinasjonsevenementer. Det er klart at konstruksjonen også kan gjennomføres i fravær av systemet som tillater å selektere rekombinasjonsevenementene. Således kan slike rekombinasjonsevenementer søkes ved miniprepfremstilling, tap eller ervervelse av en markør eller også avsøkes ved hjelp av radioaktive prober som er spesifikke for skjøtene som oppnås eller tapes. Videre eksisterer det andre teknikker som tillater å seleksjonere homologe rekombinasjonsevenementer i E. coli. Blant disse kan nevnes anvendelsen av termofølsomme plasmider for deres replikering (Hamilton et al., 1989), anvendelse av ikke-replikative, sirkulære molekyler (beskrevet for eksempel av Slater og Maurer, 1993), anvendelse av stammer hvori den benyttede vektor ikke-replikeres (Miller og Mekalanos, 1988, Zeff et al., 1994), og så videre. Alle disse systemer kan benyttes i stedet for stammene polA og en transformasjon med et plasmid avledet fra pBR322, eller dettes tallrike derivater, eller andre PolA-avhengige replikasjons-plasmider eller også plasmider som ikke replikeres i Escherichia coli.

Enhver prokaryotisk celle som inneholder et plasmid som beskrevet ovenfor kan benyttes. Det kan særlig dreie seg om enhver bakterie for hvilken det eksisterer et vektorsystem med hvilket rekombinante DNA kan innføres. For eksempel kan nevnes Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Bacillus subtilis, Pseudomonas putida, Pseudomonas aeruginosa, Agrobacterium tumefaciens, Rhizobium meliloti eller bakterier av genus Streptomyces. Disse celler oppnås fordelaktig ved transformering i henhold til teknikker som er velkjente for fagmannen. Transformeringen kan særlig gjennomføres ved CaCk-transformeringsteknikken (Dagert og Ehrlich, 1979), eller den som anvendes av Hanahan et al. (1983) eller enhver teknikk avledet fra denne (Maniatis et al., 1989), samt ved elektrotransformering (Wirth et al., 1989). Det kan særlig henvises til de generelle teknikker under "Molekylær Biologi" nedenfor.

En annen gjenstand for oppfinnelsen ligger i en fremgangsmåte for fremstilling av rekombinante adenovirusgenomer. I henhold til denne prosess blir prokaryotiske celler som beskrevet ovenfor dyrket og så i et andre trinn gjenvinnes plasmidene. Fortrinnsvis realiseres kultur i et tidsrom tilstrekkelig langt til å gi egnede plasmidmengder. Plasmidet kan gjenvinnes ved enhver teknikk som kjent for fagmannen for fremstilling av plasmidisk DNA. Således kan det gjenvinnes ved fremstilling av et klart lysat, fulgt av en sentrifugering i cesiumkloridgradient (Maniatis et al., 1989). Andre teknikker kan benyttes som anvender andre lyseringsmetoder eller anvendelse av for eksempel triton X-100 (Ausubel et al., 1987) eller også en anionbyttekolonne efter lyseringstrinnet og separering av det plasmidiske DNA i forhold til hovedandelen av kromosomisk DNA og proteinene. De således gjenvunne plasmider kan derefter renses og behandles i nærvær av restriksjonsenzymet som tilsvarer setene som kanter det virale genom. Dette tillater i et enkelt trinn å generere et lineært, rekombinant adenovirusgenom som direkte kan anvendes for klonal fremstilling av de rekombinante virus.

I denne forbindelse består en første metode for fremstilling av rekombinante virus i å transfektere det virale genom som fremstilles fra plasmidene i en kompetent enkapsideringscellelinje, det vil som i trans bærer alle de funksjoner som er nødvendige for komplementering av den defektive virus. Disse funksjoner integreres fortrinnsvis i genomet av cellen, noe som reduserer risiki for rekombinasjonen og gir en øket stabilitet for cellelinjen.

En andre tilnærmelse består i, i en egnet cellelinje, å ko-transfektere det fremstilte, rekombinante genom og DNA av en eller flere hjelperplasmider eller -virus. I henhold til denne metode er det ikke nødvendig å ha til disposisjon en kompetent cellelinje som er i stand til og komplementere alle de defektive funksjoner av den rekombinante adenovirus. En del av disse funksjoner blir derved komplementert av den eller de foreliggende hjelpervirus. Disse er i seg selv defekte.

Blant de anvendbare cellelinjer kan særlig nevnes den embryonære human-nyrecelle-linje 293 (Graham et al, "J. Gen. Virol", 36 (1977) 59). Denne linje inneholder særlig, integrert i sitt genom, den venstre del av genomet av den humane adenovirus Ad5 (12%). Transfeksjonen kan fortrinnsvis gjennomføres direkte med digesteringsproduktet av det oppnådde plasmid i henhold til den prosess som er beskrevet nedenfor uten rensetrinnet for det adenovirale genom. Andre linjer er for eksempel linjer fremstilt fra embryonære retinusceller (HER), leverceller, og så videre. Det kan dreie seg om linjer som komplementerer funksjonene El (293, PERC-6-celler), El og E4 (IGRP2), El og E2, og så videre. Slike linjer er beskrevet i teknikken og kan benyttes av fagmannen.

De således fremstilte adenovirus kan isoleres eller renses ved for fagmannen kjente teknikker (cesiumklorid, kromatografi, og så videre). De kan benyttes for forskjellige anvendelser som fremstilling av terapeutiske eller profylaktiske produkter in vitro, ex vivo eller in vivo, eller likeledes for funksjonell analyse av genomet (og opprettelse av banker).

Fordelene ved anvendelse av den nye prosess er de følgende:

En forenkling og en større hastighet i genereringen av rekombinanten, uten nødvendig-heten for et avsøkingstrinn forbundet med de multiple seleksjonssystemer som er lagt på fremgangsmåte og struktur for en ikke-funksjonell parenteral vektor.

I motsetning til de prosesser som allerede er beskrevet, er robustheten ved fremgangsmåten basert på simultaniteten for seleksjonstrykkene som i et enkelt trinn fører til seleksjonen av det enkle sluttplasmid som bærer det funksjonelle adenovirale genom. Genereringen av en ny rekombinant vektor i et enkelt trinn reduserer vesentlig den arbeidstid som er nødvendig sammenlignet med de kjente prosesser. Ethvert avsøkings-trinn blir unødvendig, den nødvendige arbeidsmengde forbedres betydelig sammenlignet med de kjente prosesser. Videre åpner den manglende nødvendighet for av-søkning for veien for samtidig generering av tallrike rekombinante, adenovirale vektorer med en og samme intervenant.

En annen fordel ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen ligger i det ikke-levedyktige aspekt for de to plasmider som er rekruttert for generering av sluttplasmidet som bærer det funksjonelle genom. Ingen av de to utgangsplasmider har separat totaliteten av de funksjoner som tillater generering av et funksjonelt, adenoviralt genom. I ekstreme tilfeller med et tap i pålagte seleksjoner (antibiotika) og hvis to konstruksjonstyper (den ønskede konstruksjon og utgangsplasmidene) måtte eksistere sammen efter rekombinasjon i den bakterielle kilde, vil resultatet ikke ha noen innvirkning på genereringen av det ønskede rekombinante vektor når først denne blanding er transfektert inn i den produserende eukaryotiske celle. Kun den ønskede konstruksjon som oppnås ved den homologe rekombinasjon er levedyktig og forsterker seg i den produserende eukaryotiske celle, mens utgangsplasmidene ikke er levedyktige (fravær av minst et ITR-område for hvert plasmid).

De karakteristika som er nevnt ovenfor for prosessen ifølge oppfinnelsen medfører en forenkling av konstruksjonen av adenovirale vektorer og åpner for muligheten for generering av rekombinante vektorer. Det kan dreie seg om samtidig å konstruere rekombinante, adenovirale vektorer som bærer kjente sekvenser der man ønsker å validere funksjonen, eller en gruppe rekombinante vektorer som bærer sekvenser av ukjent art der man ønsker å finne funksjonene. I det sistnevnte tilfellet snakker man om adenovirale ekspresjonsbanker.

I en genterapi-anvendelse

Adenovirus kan benyttes for terapeutiske formål. I dette formål kan den heterologe nukleinsyre omfatte et eller flere terapeutiske gener og/eller flere gener som koder for antigeniske peptider.

De terapeutiske gener som således kan overføres, er det ethvert gen hvis transkripsjon og eventuelt transduksjon i målcellen genererer produktene som har en terapeutisk effekt.

Det kan dreie seg om et produkt som er homologt vis-å-vis målcellen (det vil si et produkt som normalt uttrykkes i målcellen når denne ikke oppviser noen patologi). I dette tilfelle tillater ekspresjonen for eksempel å bøte på en utilstrekkelig ekspresjon i cellen eller ekspresjon av et protein som er inaktivt eller lite aktivt på grunn av modifi-kasjon, eller også å overeksprimere proteinet. Det terapeutiske gen kan også kode for en mutant av et cellulært protein, med en øket stabilitet, en modifisert aktivitet, og så videre. Produktet kan likeledes være homologt vis-å-vis målcellen. I dette tilfelle kan det uttrykte protein for eksempel komplettere eller tilveiebringe en defektiv aktivitet i cellen for å tillate denne å kjempe mot en patologi.

Blant de terapeutiske produkter kan mer spesielt nevnes enzymer, blodderivater, hor-moner, lymfokiner: interleukiner, interferoner, TNF, og så videre (WO 93/19191), vekstfaktorer, neurotransmittorer eller deres forløpere eller synteseenzymer, trofiske faktorer: BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3, NT5, og så videre; apo-lipoproteiner: ApoAI, ApoAIV, ApoE, og så videre (WO 94/25073), dystrofin eller et minidystrofin (FR 91/11947), tumorsuppressorgener: p53, Rb, RaplA, DCC, k-rev, og så videre (WO 94/24297), gener som koder for faktorer implikert i koaguleringen: faktorene VII, VIII, IX, mordergener (TK, og så videre), og så videre.

Det terapeutiske gen kan likeledes være et gen eller en antisensesekvens hvis ekspresjon i målcellen tillater å kontrollere ekspresjonen av gener eller transkripsjonen av cellulær mRNA. Slike sekvenser kan for eksempel transkriberes i målcellen til RNA som er komplementær til cellulær mRNA og derved blokkere deres transduksjon til protein i henhold til den teknikk som er beskrevet i EP 140 308.

Som antydet ovenfor kan nukleinsyren av interesse likeledes bære et eller flere gener som koder for et antigenisk peptid, hos mennesker i stand til å generere en immun-respons. Dette kan anvendes i vaksine som tillater å immunisere mennesker, særlig mot mikroorganismer eller virus. Det kan likeledes dreie seg særlig om antigeniske peptider som er spesifikke overfor Epstein Barr-virusen, HIV-virusen, hepatitt-B-virusen (EP 185 573), pseudo-hundegalskapsvirusen eller også spesifikke tumorer (EP 259 212).

Generelt omfatter nukleinsyren av interesse likeledes sekvenser som tillater ekspresjon av det terapeutiske gen og/eller genet som koder for det antigeniske peptid i den infekterte celle. Det kan dreie seg om sekvenser som naturlig er ansvarlig for ekspresjonen av det angjeldende gen, når sekvensene er i stand til å funksjonere i den infekterte celle. Det kan likeledes dreie seg om celler av forskjellig opprinnelse (ansvarlige for ekspresjonen av andre proteiner, eller også syntetiske). Særlig kan det dreie seg om promotersekvenser for eukaryotiske, virale gener. Det kan for eksempel dreie seg om promotersekvenser som stammer fra genomet av celler man ønsker og infektere. På samme måte kan det dreie seg om promotersekvenser som stammer fra genomet av en virus, derunder den benyttede adenovirus. I denne forbindelse kan man for eksempel nevne promoterene for genene EIA, MLP (Major Late Promoter), CMV (cytomegalovirus), RSV (Rous Sarcom-virus), og så videre. Videre kan ekspresjonssekvensene være modifisert ved addisjon av sekvenser for aktivering, regulering, og så videre. Fortrinnsvis kan man benytte promotere som er regulerbare med tetracyklin av typen Tet on/off eller -off/on eller induserbare med ecdyson eller deksametason. Når videre det innskutte gen ikke bærer ekspresjonssekvenser, kan de skytes inn i genomet av det defektive virus nedstrøms en slik sekvens. Til slutt kan nukleinsyren av interesse likeledes, særlig oppstrøms det terapeutiske system, omfatte en signalsekvens som styrer det syntetiske, terapeutiske produkt inn i målcellens sekresjonsveier. Denne signalsekvens kan være den naturlige signalsekvens for det terapeutiske produkt, men det kan likeledes dreie seg om enhver annen funksjonell signalsekvens eller en kunstig signalsekvens.

Farmasøytiske preparat kan inneholde et eller flere rekombinante adenovirus, fremstilt i henhold til denne fremgangsmåte. De farmasøytiske preparater kan formuleres med henblikk på administrering ad topisk, oral, parenteral, intranasal, intravenøs, intramuskulær, subkutan, intraokulær eller transdermal vei eller på annen måte.

Det farmasøytiske preparatet kan inneholde farmasøytisk akseptable bærere for en injiserbar formulering. Det kan særlig dreie seg om sterile, isotoniske saltoppløsninger

(mono- eller dinatriumsulfat, natrium-, kalium-, kalsium- eller magnesiumklorid, eller eventuelt blandinger av slike salter) eller tørkede preparater, eller lyofiliserte, som ved tilsetning av salt eller fysiologisk serum tillater konstituering av injiserbare oppløs-ninger.

Dosene av virusen som benyttes for injeksjon kan tilpasses som funksjon av forskjellige parametere, og særlig som funksjon av det benyttede administreringsmodus, angjeldende patologi, genet som skal uttrykkes eller også den tilsiktede behandlings-varighet. Rent generelt formuleres og administreres de rekombinante adenovirus ifølge oppfinnelsen i form av doser på mellom IO<4>og IO<14>pfu, fortrinnsvis mellom IO<6>og IO<10>pfu. Uttrykket pfu ("plaque forming unit") tilsvarer funksjonskraften for en virusoppløsning og bestemmes ved infeksjon av en egnet cellekultur og måling, generelt efter 15 dager, av antallet infekterte cellepopulasjoner. Bestemmelsesteknikkene for pfu-titeren for en viral oppløsning er godt dokumentert i litteraturen.

I henhold til den innskutte, heterologe DNA-sekvens, kan adenovirusene ifølge oppfinnelsen benyttes for terapi eller forebygging av tallrike sykdommer, inkludert genetiske sykdommer (dystrofi, cystisk fibrose, og så videre), neurodegenerative sykdommer (Alzheimers eller Parkinsons sykdom, ALS, og så videre), cancere, patologier forbundet med lidelser og mangler ved koagulering eller med dyslipoproteinemier, patologier forbundet med virale infeksjoner (hepatitter, AIDS, og så videre), og så videre.

I en anvendelse for produksjon av rekombinante proteiner

Foreliggende oppfinnelse tillater å generere adenovirale vektorer som kan tillate fremstilling av rekombinante proteiner, særlig i human celler i kultur. Det kan dreie seg om proteiner som humanserum albumin, humane interferoner, humane antistoffer, human insulin, hematopoietiske faktorer, faktorer som faktor IX eller VII, trombolytiske faktorer som vevplasminogenaktivatoren, forskjellige vekstfaktorer, trofiske faktorer, cytokiner, peptider av sentralnervesystemet, opioider, enzymer, virale antigener, men også proteiner fra andre organismer som de til planter.

I en anvendelse for funksjonell "genomics"

Ved hjelp av de samme verktøy for fabrikasjon som angitt ovenfor utnyttes prosessen i en anvendelse for validering eller bestemmelse av nye mål med henblikk på den farmasøytiske industri.

Den beskrevne metode kan anvendes til å utnytte et preparat, særlig gjelder dette preparater som tillater oppnåelse og integrering av en nukleinsyre uansett dens art i et første skyttelplasmid innenfor oppfinnelsens ramme samt anvendelse av disse plasmider for å generere et eller flere rekombinante adenovirus ved forskjellige automatiseringsmetoder. Disse rekombinante adenovirus kan så benyttes i de forskjellige modeller in vitro og in vivo for å evaluere funksjonaliteten av sekvensene de bærer. Funksjonaliteten av sekvensene som bæres av de genererte, rekombinante adenovirus kan bedømmes ved en av tallrike funksjonelle tester fagmannen har til disposisjon.

En fremgangsmåte for fremstilling av adenovirale ekspresjonsbanker kan karakteriseres ved de følgende trinn: konstruksjon av en primærbank i en skyttelvektor som beskrevet ovenfor, transformering av en bakteriekultur med primærbanken i nærvær av et opphavs plasmid ifølge oppfinnelsen,

innføring av de oppnådde plasmider, eller komplette adenovirale genomer efter

utskjæring ved enzymatisk digestering, i en produksjonscelle for adenovirusen, eventuell infeksjon av et biologisk materiale omfattende cellene for å analysere

bankens kloner.

Denne fremgangsmåte omfatter således et første fremstillingstrinn for en primærbank av nukleinsyre i skyttelplasmidet ifølge oppfinnelsen før anvendelse av oppfinnelsen og anvendelse av den adenovirale bank i en forsøksmodell. Opprettelsen av en slik primærbank i oppfinnelsens plasmid (skyttelplasmid) kan realiseres ved molekylær biologi-metoder som velkjente for fagmannen. Særlig kan primærbanken konstrueres ved sukse-sjon av de følgende operasjoner:

(a) oppnåelse av mRNA (eller total RNA) fra en cellepopulasjon,

(b) fremstilling av DNA'er som er komplementære til den isolerte mRNA-populasjon, (c) eventuell fremstilling av en nukleinsyrebank hvori cDNA'ene er plassert under kontroll av en sterk promoter, eller mer spesielt under kontroll av en regulerbar

promoter,

(d) innarbeiding av disse cDNA (eller ekspresjonskassetten) i oppfinnelsens skyttelplasmid.

Nukleinsyrebanken kan være klonet inn i en vektor eller et skyttelplasmid som beskrevet ovenfor.

I et andre trinn tillater kotransformeringen av primærbanken til skyttelplasmidene med et opphavsplasmid som beskrevet ifølge oppfinnelsen, å oppnå en bank av plasmider som bærer funksjonelle adenovirale genomer. Dette trinn kan gjennomføres enten ved samtidig kotransformering av plasmidene i bakterier eller sekvensielle transfeksjoner. Således kan opphavsplasmidet i et første trinn innføres i bakteriene og derefter transfekteres skyttelplasmidene i et andre trinn.

I det tredje trinn blir plasmidene (eller de utskårede, funksjonelle rekombinante genomer) transfektert inn i en transkomplementant celle, noe som tillater å generere en rekombinant adenovirusbank. Fortrinnsvis isoleres de oppnådde plasmider og/eller de renses, og de rekombinante genomer skjæres ut ved behandling med et eller flere egnede enzymer som ikke kutter det adenovirale genom.

I et fjerde trinn tillater infeksjonen av en valgt cellepopulasjon (eller et biologisk materiale) ved hjelp av den rekombinante adenovirusbank, å analysere de biologiske eller funksjonelle egenskaper for klonene i banken. For dette blir den valgte og infekterte cellepopulasjon plassert under betingelser som tillater ekspresjon av nukleinsyre og så å identifisere en søkt fenotype ved studium av cellepopulasjonen. Det er derefter mulig å gå tilbake til induktorvektoren og derved karakterisere den DNA som svarer til den søkte fenotype.

For å tillate mer robuste studier av funksjonaliteten, blir fortrinnsvis klonene behandlet separat og ikke sammenslått. Klonene av primærbanken i skyttelplasmidet transformeres derved individuelt i mikroplaquer i bakterien som allerede har det avkortede, adenovirale opphavsplasmid. Ved vekst i mikroplaquer under seleksjonstrykk (antibiotika) renses de fremstilte DNA'er og transfekteres i den produserende eukaryotiske celle efter utskjæring av genomer med det valgte enzym (for eksempel PacI). En slik prosess er skjematisert i figur 2.

I henhold til fremgangsmåten for fremstilling av de adenovirale ekspresjonsbanker ifølge oppfinnelsen, kan man benytte Gateway®-kloningsteknologien som er utviklet av Life Technologies, Inc. (LTI, Rockville, MA, USA) og som særlig tillater samtidig å generere et antall adenovirus som bærer innskudd som stammer for eksempel fra en komplementær DNA-bank eller en gruppe av sekvenser som erkarakterisertog seleksjonert ved forskjellige metodologier som er velkjente for fagmannen. Gateway®-kloningsteknologien som blant annet er beskrevet i US 5 888 732, tillater å overføre innskudd mellom for eksempel to plasmidiske vektorer under en reaksjon in vitro takket være rekombinasjonsreaksjoner på spesifikke attL-, attR-, attQ- og attP-seter av bakteriofag X av Eschericia coli. Innskytingen av et gen nødvendiggjør ikke nærvær av egnede restriksjonsseter i vektoren, men kun nærværet av korte rekombina-sjonssekvenser kalt atf-sekvensen.

Et Gateway®-kloningssystem består på den ene side i å effektuere en reaksjon kalt LR under hvilken en Entré-klon inneholdende et innskudd av interesse omgitt av atfL-seter, rekombinerer med en Destinasjonsklon inneholdende atfR-seter, for å generere en Ekspresjonsklon. Innskuddet av interesse som bærer av Entré-klonen overføres så til en Ekspresjonsvektor som stammer fra en Destinasjonsklon inneholdende atfB-setene. Gateway®-systemet består på den annen side av å effektuere den inverse reaksjon som kalles BP-reaksjonen under hvilken Ekspresjonsklonen inneholdende et innskudd av interesse omgitt av rekombinasjonsseter attB rekombinerer med en Donor-vektor inneholdende atfB-setene for å gi Entré-klon som inneholder atfL-setene.

Mer spesielt kan man i henhold til den første strategi modifisere et skyttelplasmid med for eksempel pJJl som beskrevet tidligere for å generere et plasmid som er kompatibelt med Gateway®-systemet, som har de egnede atf-seter. I henhold til denne første tilnærmelse er atf-setene fortrinnsvis innført mellom promoteren (CMV) og polyadeny-leringssetene av SV40 av ekspresjonskassetten til skyttelplasmidet. Det således oppnådde plasmid kalles destinasjonsplasmidet i henhold til terminologien ifølge Gateway®-teknologien og kan derefter gå i reaksjon med Entré-klonene ifølge Gateway®-teknologien. Som en konsekvens kan ethvert innskudd som stammer fra en DNA-bank eller en seleksjonert sekvensgruppe, som er klonet i en vektor eller Entré-klon, overføres i skyttelplasmidet ifølge oppfinnelsen for å gi et Ekspresjonsskyttel-plasmid som kan anvendes ifølge oppfinnelsen for å generere den tilsvarende adenovirale vektor.

I henhold til en andre strategi modifiseres det komplette adenovirale plasmid for å være kompatibelt med Gateway®-teknologien. Det dreier seg således om å innføre egnede atf-seter i plasmidet som bærer et adenoviralt genom for å tillate realisering av de beskrevne reaksjoner i Gateway®-kloningssystemet. Fortrinnsvis innføres atf-setene i stedet for området El av det adenovirale genom mellom en promoter og en polyadeny-leringssekvens. Denne strategi tillater så å generere plasmidet som bærer adenovirale genomer omfattende forskjellige innskudd som opprinnelig var til stede i Entré-klonene.

Det kan dreie seg om innskudd som stammer fra fabrikasjon av de komplementære

DNA-banker, innskudd som representanter for gener av den samme familie eller enhver annen opprinnelse. Man genererer et bæreplasmid for adenoviralt genom, modifisert og med atf-sekvensene som er en destinasjonsklon innenfor Gateway®-teknologien og som kalles pAdDEST (eksempel 6, figur 10). Destinasjonsklon som oppnås på denne måte, pAdDEST, kan reagere med enhver annen Entré-klon for å generere et ekspresjonsplasmid som bærer det adenovirale genom, pAdExp, som beskrevet nedenfor i eksempel 6 og i figur 11.

Dette representerer således en ny metode for å validere eller for å identifisere en sekvens forbundet med en fysiologisk eller genetisk effekt som induserer en karakteristisk fenotype. Det kan mer spesielt dreie seg om et gen som provokerer genetiske feil eller et gen som kan være indikativt eller karakteristisk for en genetisk anomali.

I en anvendelse for validering eller bestemmelse av funksjonen til en eller flere sekvenser innenfor rammen av en funksjonell genomisk aktivitet, kan sekvensene være av enhver art og særlig som beskrevet ovenfor, men kan likeledes stamme fra populasjoner av enhver sekvens av ukjente og multiple arter. Disse sekvenser kan være anbragt ved siden av hverandre i forskjellige kassetter for til slutt å innføres i det ønskede, adenovirale genom.

Disse sekvenser kan stamme fra enhver celletype som er levende eller fremstilt kunstig ved forskjellige prosesser som de novo-syntese, mutagenese, sekvenskombinasjon og så videre.

Et stort antall banker kan benyttes som kilde for nukleotidsekvensene innenfor rammen av oppfinnelsen, inkludert, men ikke begrenset til "genomics"ske DNA-banker (særlig kromosomområder, inkludert for eksempel i sYACer eller sBAC-er), cDNA-banker, syntetiske DNA-banker eller banker som enten er normalisert eller ikke og fremstilt fra forskjellige levende vev for retnings- eller antiretningsekspresjon, sekvenser som er generert tilfeldig og med kraften til å generere forskjellige peptider, degenererte sekvenser fra en kjent sekvens og mosaikksekvenser fra kjente sekvenser og så videre.

Særlig kan primærsekvensene som studeres generere antiretninger eller genetiske suppresjonselementer. Det dreier seg om sekvenser som når de eksprimerer seg kan inaktivere et spesielt gen i det studerte biologiske system. Det kan dreie seg om ribo-zym.

Sekvensene som benyttes for å danne banken kan stamme fra forskjellige syntese-prosesser. Særlig tillates stimulering av en styrt molekylærevolusjon som benytter rekombinasjonen, å generere en diversitet av gener under anvendelse av identifiserte evolusjonsmekanismer ("Curr. Op. in Biotech.", 1997, 8: 724-733).

Sekvensene som benyttes for å danne bankene kan likeledes stamme fra bio-informa-tikkanalysen av databanker som inneholder humangenomdata. Disse kan seleksjoneres under anvendelse av genetisk ekspresjonsanalyse som er oppnådd ved forskjellige metoder (EST, Microarrays, DNA-chips, differensial display) "TIBtech", 1996,14, sidene 294-298: "Nature Biotechnologi", 1998, 16, sidene 27-31.

Særlig tillater denne prosess å generere den adenovirale ekspresjonsbank av vilkårlige sekvenser av peptider. Den tillater således å lette seleksjon og identifisering av vilkårlige peptidsekvenser som er i stand til å forbinde seg med protein av interesse. En vilkårlig oligonukleotidsekvensbank innføres i et sete (polylinker) tilsvarende en flek-sible sløye av et naturlig eller syntetisk protein for at peptidene skal presenteres på overflaten av proteinet. Det kan dreie seg om å presentere disse peptider på intracellulær måte (Colas et al, 1996, "Nature", 380: 548-550) eller på overflaten av cellen (Tramonto et al., 1994, "J. Mol. Recognit", 7: 9-24). Til slutt kan peptidene være til stede på det ytre av cellen og innføre et sekresjonssignal i ekspresjonskassetten (Rice et al., 1992, "PNAS", 89, 5467-5471).

En eller flere sekvenser av interesse kan integreres i vektoren.

Det kan dreie seg om til slutt å evaluere en kombinasjon av sekvenser (ekspresjonskassett) eller ko-eksprimere sekvensen av interesse med et annet gen av interesse, for eksempel en genmarkør. Man kan således avgjøre enten å benytte de polycistroniske sekvenser eller å plassere sekvensen(e) som skal uttrykkes i en annen lokasjon forskjellig fra sekvensen av interesse i det adenovirale genom. De polycistroniske sekvenser som kan benyttes er forskjellige. IRES-elementer tillater effektiv traduksjon av to eller flere åpne lesefaser i en enkelt mRNA. Mer spesielt koder en lesefase for protein av interesse (fra en cDNA-bank), mens den andre lesefase koder for en markør som GFP.

Denne prosess tillater å benytte eksisjons/integrasjonssystemene forbundet med en enzymatisk aktivitet. Det kan dreie seg CRE-Lox-systemet (Baubonis et al., "Nucl. Acids Res.", 21: 2025-2029), systemet FLP rekombinase-FRT (Dang et al, "Dev. Gent.", 13: 367-375), systemet Piv av Moraxella lacunata (Lenic et al, 1994, "J. BacterioL", 176-4160) eller systemet ved X,-integrase (Kwon et al, 1997, "Science", 276, 126). Mer spesielt blir en sekvens eller ekspresjonskassetten av cDNA forenet med en replikativ episomal vektor, skåret ut av systemet Cre-lox av det adenovirale genom og overført til de infekterte celler som deles (WO 97/47757).

Denne fremgangsmåte letter påvisning av interaksjonen DNA-proteiner. Banken tilsvarer så en sekvenspopulasjon som er i stand til å forbinde seg med DNA. Det dreier seg om polypeptider fra proteiner i stand til naturlig å feste seg til DNA eller kunstige polypeptider. Man søker den sekvens som er mest spesifikk for en gitt DNA-sekvens.

Denne fremgangsmåte tillater å påvise interaksjoner proteiner-proteiner. Kapasiteten for ko-infeksjon av den adenovirale vektor benyttes. Fortrinnsvis benyttes testen på LacZ-komplementering ("PNAS", 1997, 94, 8405-8410). Det cellulære system ko-infekteres med det første konstrukt og cDNA-bankene.

Funksjonalitetstestene som kan anvendes for å analysere de adenovirale ekspresjonsbanker er tallrike og varierte.

Man kan for eksempel benytte komplementeirngstester som består i å identifisere nukleotidsekvensen fra banken hvis ekspresjon fører til en ønsket cellulær fenotype. Mer spesielt tillater den adenovirale ekspresjonsbank og infektere en defekt humancelle for et fenotypisk trekk. Analyse av infekterte celler og merking av celler som vokser samt de tilsiktede fenotypiske trekk og analyse av cDNA som bæres av viruset som er ansvarlige for opptredenen av det fenotypiske trekk. Man likeledes måle uteblivelsen av et fenotypisk trekk efter infeksjon som resulterer i en antisens-aktivitet eller en funksjonell "knock-out".

Fremgangsmåter letter studium av virkningsmodus for et kjemisk molekyl i et biologisk system. Den adenovirale ekspresjonsbank tjener til og infektere celler i det biologiske system som er ansvarlige for medikamentets virkning. Efter infeksjon kan medikamentets virkning være ikke-modifisert, øket eller inhibert. I de to sistnevnte tilfeller letter analysen av de cDNA som bæres av de virale genomer bestemmelsen av de intra-cellulære og/eller ekstracellulære veier som er implikert i virkningen av den kjemiske forbindelse.

Fremgangsmåten kan således anvendes for

søking efter (mål) nukleinsyrer som tillater å trekke opp virkningene av p53 i

prosesser for vekststans og apoptose.

identifisering av cytokiner.

identifisering av syntetiske peptider som affekterer de cellulære prosesser.

søken efter molekyler som er i stand til å effektuere en ekstracellulær presentasjon

av peptidene.

identifisering av mål for tumorale celler som ikke oppviser spesifikke tumorsuppre-sorer.

identifisering av gener som er implikert i metaseprosessene.

Oppfinnelsen angår også et kit som omfatter:

et skyttelplasmid omfattende et første avkortet adenovirusgenom, og et opphavsplasmid omfattende et andre avkortet adenovirusgenom,

idet de to plasmidene er i stand til, ved homolog rekombinasjon mellom de to avkortede adenovirusgenomer, å produsere et sluttplasmid omfattende et komplett, lineært rekombinant adenovirusgenom, flankert av et eller flere restriksjonsseter som ikke er til stede i genomet.

Foreliggende oppfinnelse skal beskrives nærmere ved hjelp av de følgende illustrerende, eksempler i forbindelse med de vedlagte figurer, der: Figur 1 er et skjema som beskriver oppfinnelsens prinsipp. Et skyttelplasmid pJJl og et opphavsplasmid pOSEl som hver har et komplementært fragment som ut-gjør et ko-aggregat ved homolog rekombinasjon i E.coli som genererer et komplett, rekombinant adenovirusgenom som bærer en eksogen sekvens.

Kmr: resistensgen for Kanamycin. Tet R: resistensgen for tetracyklin.

RK2 Ori: replikasjonsopprinnelse for plasmidet RK2. RK6 Ori: replikasjonsopprinnelse for plasmidet RK6;

figur 2 viser den samtidige generering av 96 rekombinante adenovirus som bærer cDNA'er fra en cDNA-bank konstruert i skyttelplasmidet. Anvendelsen av egenskapene ved OSEDRAG-teknologien;

figur 3 viser oppnåelsen av opphavsplasmidet innenfor oppfinnelsens ramme som bærer en ikke-komplett, adenoviral genomsekvens og således er ikke-funksjonelt ved EDRAG-teknologien (Crouzet et al.). Kart for plasmidene pJJ301, pXL3215 og plasmidet pOSE17-00;

figur 4 viser kart for forskjellige versjoner av opphavsplasmider som kan benyttes ifølge oppfinnelsen for å generere forskjellige versjoner av rekombinante, adenovirale vektorer og særlig vektorer som er deletert for El og E3 (pOSE 10-00), vektor som er deletert for El og E3 og utstyrt med området pIX i formen syngen #2 (WO 99/25861) -(pOSE17-00), vektorer som er deletert for El, E3 og E4 (pOSE30-00) og vektorer som er deletert for El, E3 og E4 og utstyrt med området pIX i sin form syngen #2 (pOSE37-00);

figur 5 viser oppnåelsen ved hjelp av en fremgangsmåte ifølge oppfinnelsen av et rekombinant, adenoviralt genom som bærer en ekspresjonskassett av genet LacZ. Kart for skyttelplasmidet pIG5 og opphavsplasmidet pOSE 17-00 og for sluttplasmidet pAdl7-01. Kart for plasmidene pIG5, pOSE17-00 og pAdl7-01;

figur 6 viser oppnåelsen ved hjelp av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen av adenovirale genomer ved hjelp av tre forskjellige skyttelplasmider (pIG5: bærer av en ekspresjonskassett av genet LacZ; plasmidet pIG18: bærer av en ekpre-sjonskassett for luciferasegenet og pIG7: uten ekspresjonskassett).

Enzymatisk kutting av klonene resulterer i ko-transformasjon av skyttelplasmidet og opphavsplasmidet;

figur 7 viser oppnåelsen ved hjelp av oppfinnelsens fremgangsmåte av adenovirale vektorer efter transfeksjon av forskjellige kloner av plasmidet pAD 17-01 inn i produksjonscellen 293. Enzymatisk kutting av de rensede, virale DNA'er fra virus som er forsterket i celle 293;

figur 8 viser oppnåelsen ved hjelp av oppfinnelsens fremgangsmåte av en adenoviral genombank generert via en primær cDNA-bank i skyttelplasmidet pTAOO. Den adenovirale genombank oppnås ved hjelp av det parenterale plasmid pOSE37-10 som er et plasmid som stammer fra pOSE37-00. Kart for plasmidene pTAOO, pOSE37-10 og pAd37-10;

figur 9 viser oppnåelsen av et ekspresjonsplasmid pAdGWExpLacZ som er kompatibelt med Gateway®-systemet (LTI, Rockville, MA, USA) ved homolog rekombinasjon av plasmidene pSHExpLacZ og PxI2689;

figur 10 viser oppnåelsen ved en reaksjon kalt BP av et Destinasjonsplasmid pAdDEST som bærer et komplett, adenoviralt genom, genet ccdB som er letalt for E.coli, omgitt av rekombinasjonssetene attRl og attRl; og

figur 11 viser oppnåelsen av det adenovirale plasmid som bærer et ønsket innskudd

pAdExp ved den reaksjon som kalles LR.

Generelle teknikker ved kloning, molekylær biologi og cellulær biologi

De klassiske metoder innen molekylærbiologien som sentrifugering av plasmidisk DNA i cesiumklorid-etidiumbromid-gradient, kutting med restriksjonsenzymer, elektroforese på gel, transformasjon i E.coli og precipitering av nukleinsyre, og så videre er beskrevet i litteraturen (Maniatis et al., 1989).

Enzymene er levert av New-England Biolabs (Beverly, MA). For ligaturene separeres DNA-fragmentene i henhold til størrelse på agarosegeler fra 0,8 til 1,5%, renset ved GeneClean (BIO101, La Jolla, CA) og inkubert over natten ved 14°C i en buffer Tris-HC1 pH 7,4 50 mM, MgCl210 mM, DTT 10 mM, ATP 2 mM, i nærvær av DNA-ligase av fagen T4.

Det ligerte DNA benyttes for å transformere stammen som er gjort kompetent E.coli TG1 [A(lac proA,B), supE, thi,HsdD5/ F'traD36, proA<+>,B<+>, lacl<q>, lacZAM15] (Maniatis et al., 1982), stammen E.coli ToplO-celler (TOP10 One Shot kit, Invitrogen, Nederland) eller også stammen E.coli polA SF800 (Heffron et al., 1977).

Forsterkning ved PCR (Polymerase Chain Reaction), er likeledes gjennomført i henhold til Maniatis et al., 1989, med de følgende spesifikasjoner: Denatureringstemperatur 95°C, hybrideringstemperatur 55°C, forlengelsestemperatur 72°C. Denne cyklus ble repetert 25 ganger i en PTC-200 Peltier Thermal Cycler (MJ Research, Massachusetts, US).

Oligonukleotidene er syntetisert av firma GENSET (Evry, Frankrike). Sekvenseringen ble gjennomført av firma ESGS (Evry, Frankrike).

EKSEMPLER

Eksempel 1; Konstruksjon av opphavsplasmider

Dette eksempel beskriver oppnåelsen av et adenoviralt genom som er avkortet ved 5'-enden og deletert for områdene El og E3, et adenovirus av typen 5, og flankert av et eneste restriksjonssete ved 3'-delen i et plasmid fra gruppen P-inkompatibilitet som replikerer seg i E.coli.

Plasmidene ifølge oppfinnelsen kan konstrueres på forskjellige måter. I henhold til en foretrukken måte konstrueres plasmidet pOSE 17-00 i henhold til EDRAG-metodologien (FR 2 730 504) ved hjelp av plasmidene pXL3215 og pJJ301. Plasmidet pXL3215 inneholder totaliteten av AD-genomet (minus to delesjoner i områdene El og E3) og har en ekspresjonskassett av genet LacZ, dirigert av RSV-promoteren i området El. Plasmidet pXL3215 er et derivat av plasmidet pXL2689 og inneholder replikasjonsopprinnelsen av plasmidet RK2, tetracyklinresistensgenet (J. Crouzet, "PNAS", 1997).

Plasmidet pJJ301 har en replikasjonsopprinnelse RK6 og kan ikke replikere seg i stammen E.coli pri-. Plasmidet pJJ301 har kanamycinresistensgenet. Plasmidet pJJ301 har et område som er homolog med begynnelsen av det adenovirale genom som bæres av pOSE 17-00. Det dreier seg om en spesiell versjon av området pIX kalt syngen #2 og som er beskrevet i WO 99/25861. Oppstrøms denne sekvens er det innskutt en sekvens som er homolog med området oppstrøms det komplette adenovirale genom i plasmidet pXL3215. Den doble rekombinasjon av plasmidene pXL3215 og pJJ301 gir opphav til pOSE 17-00. Dette plasmid pOSE 17-00 tilsvarer et opphavsplasmid innenfor oppfinnelsens kontekst og er skjematisert i figur 3.

Andre opphavsplasmider (pOSElO-00, pOSE30-00, pOSE37-00) er konstruert i henhold til det samme skjema som tillater å generere adenovirale genomer som er deletert i områdene El og E3 (i regionversjon vill pIX eller versjon degenerert pIX (WO 99/25861) eller adenovirale genomer som er deletert i området El, E3 og E4 (i versjon villtyperegion pIX eller versjon degenerert pIX (figur 4).

Eksempel 2; Konstruksjon av skyttelplasmider

Dette eksempel beskriver oppnåelsen av et skyttelplasmid som bærer området 5' av det adenovirale genom (ITR- og enkapsideringsområdet), human adenovirus av typen 5, forutgått av et restriksjonssete Pacl.

Dette plasmid har en RK6-replikasjonsopprinnelse og er ikke i stand til å replikere seg i E.coli som ikke kan transkomplementere for proteinet pir. pIG5-plasmidet inneholder en LacZ-ekspresjonskassett som forutgås av en sekvens som er homolog med en sekvens som er til stede i pOSE 17-00 (sekvensen tilsvarende en del av pIX Iva2-området). Dette plasmid kalles et skyttelplasmid innenfor oppfinnelsens kontekst og har kanamycin-resistensgen (figur 5).

Eksempel 3; Produksjon av et funksjonelt, rekombinant adenoviralt genom Dette eksempel beskriver oppnåelsen av et funksjonelt, adenoviralt genom, deletert for området El og E3, en humanadenovirus av type 5, og flankert ved endene av et restriksjonssete Pacl i et plasmid fra gruppen P-inkompatibilitet som replikerer seg i E.coli og bærer en ekspresjonskassett av genet LacZ.

Den benyttede strategiske integrering er den homologe rekombinering i stammen E.coli mellom pOSE 17-00 og PIG5. Plasmidet pOSE 17-00 innføres i celler av stammen E.coli JM83 Rec<+>lacZ". For dette formål blir cellene som stammer fra et tetracyklinresistent klon gjort kompetente, transformert med plasmidet pIG5 og så platert på LB-medium i nærvær av tetracyklin og kanamycin. Forutsatt at plasmidet pIG5 ikke replikerer seg i stammen JM83, kan tetracyklin- og kanamycinresistens ikke oppstå annet enn ved et homologt rekombineringsevenement mellom de to plasmider. Således er dette felles for området pIX av genomet av Ad5. Det resulterende plasmid har det fullstendig genom av den rekombinante, adenovirale vektor flankert av et Pacl-sete. Kuttinger med enzymene Pacl og Hindlll, EcoRI og så Pacl og Dral, tillater å kontrollere oppnåelsen av den ventede plasmidiske struktur. Dette sluttplasmid bærer et funksjonelt, adenoviralt genom kalt pAdl7-01 (figur 5).

På samme måte gir plasmidet pIG5 og plasmidet pOSE37-00 opphav til et plasmid som bærer et fullstendig, adenoviralt genom, deletert for El, E3 og E4, og utstyrt med et område pIX i formen syngen #2 (WO 99/25861).

I henhold til samme strategi er det således mulig å konstruere andre rekombinante genomer fra samme familie som eventuelt bærer en ekspresjonskassett. pIG7 og pIG18 er benyttet og stammer fra pIG5, pIG7 har ikke ekspresjonskassett, pIG18 har en ekspresjonskassett av Luciferase-genet. I den grad ekspresjonskassetten ikke oppviser sekvenshomologi med genomsekvenser av bakteriekromosomet er 100% av klonene ventet å være positive. Som vist i figur 6, viser 100% av klonene som er analysert fra disse forsøk de ventede nukleotidiske strukturer (figur 6).

pAD 17-01 digereres med Pacl hvorved genomet frigis fra den rekombinante adenovirus. Produktet fra denne digestering kan benyttes som sådant for transfeksjon av transkomplementante pattedyrceller (celler 293) for El-funksjonen av adenovirusen.

Eksempel 4; Produksjon av rekombinante adenovirus

Rekombinante adenovirus kan konstrueres i Escherichia coli ved

(i) innskyting av fragmenter inneholdende et eller flere gener med egnede regulerings-signaler for å uttrykke disse gener i de studerte pattedyrceller, eller (ii) ved delesjon av disse fragmenter av genomet av adenovirusen eller også ved kombinasjon av disse to evenementer for derefter, efter transfeksjon av produksjonscellene, å kunne oppnå et forråd av en slik rekombinant virus.

Plasmidet pAdl7-01 renses fra en kultur av transformerte, kompetente E.coli DH5-celler. Det adenovirale genom settes fri ved digestering i nærvær av enzymet Pacl. Digesteringsproduktene benyttes direkte for produksjon av rekombinante adenovirus. For dette formål blir celler av linje 293 transfektert med produktet fra digesteringen av pAD 17-01 i nærvær av Effectene (Qiagen, Forbundsrepublikken Tyskland). Den rekombinante adenovirus forsterkes i cellelinjen 293, noe som fører til kultursupernatant inneholdende den ikke-rensede, rekombinante adenovirus med en titer på rundt 10<10>pfu/ml.

Konformiteten for den virale DNA verifiseres ved enzymatisk kutting efter rensing av DNA fra den forsterkede virus (figur 7).

De virale partikler renses derefter ved sentrifugering på en cesiumkloridgradient i henhold til kjente teknikker (se særlig Graham et al, "Virology", 52 (1973) 456) eller ved kromatografi. Adenovirusen kan bevares ved -80°C i 20% glycerol.

Eksempel 5; Konstruksjon av adenovirale ekspresjonsbanker

Man benytter skyttelplasmidet utstyrt med replikasjonsopprinnelsene RK6 for å oppnå en primærbank av skyttelplasmidet som via homolog rekombinasjon tjener til å oppnå en bank for rekombinante adenovirusgenomer i plasmidet med replikasjonsopprinnelsen RK2. Denne bank av plasmider med rekombinante adenovirusgenomer transfekteres i den transkomplementante produksjonscelle for å oppnå en bank av rekombinante adenovirus.

Hele trinnet er skjematisk vist i figur 2 og de plasmidiske strukturer som tillater å oppnå den adenovirale ekspresjonsbank er vist i figur 8.

Eksempel 5. 1; Fremstilling av cDNA-banken i skyttelvektoren

For fremstilling av banken i skyttelvektoren (et derivat av pIG5 eller genet LacZ er skåret ut og erstattet med flere kloningsseter, særlig setene Xhol og EcoRI), blir 10-20 ug vektor som er renset ved cesium-gradient digerert med 5 LVug av enzymene Xhol og EcoRI i 90 minutter ved 37°C. Digesteringen bringes på en agarosegel (1% Seakem GTG) og den lineariserte vektor separeres ved elektroforese med TAE-buffer. Båndet som tilsvarer vektoren kuttes efter visualisering på en UV-plate. Vektoren elueres ved hjelp av agarose (Qiaquick DNA Cleanup System, Ouiagen, Forbundsrepublikken Tyskland) og renses med en fenol:kloroform-ekstraksjon fulgt av precipitering ved hjelp av etanol. Denne vektor tillater å oppnå, efter ligering av et innskudd som er testdigerert med EcoRI og Xhol, ca. 5 millioner kloner/ug med en bakgrunnsstøy lavere enn 10%.

Fremstilling av cDNA: cDNA-syntesen oppnås fra en RNA-populasjon som er anriket med mRNA. Syntesen av den første streng skjer i henhold til klassiske protokoller under anvendelse av transkriptasen Superscript II (Stratagéne) ved hjelp av en oligo-dT-primer som har sekvensen av et Xhol-sete ved 5'. Syntesen av den andre streng gjennomføres med enzymet DNA-polymerase av E.coli i nærvær av RNAse H og DNA-ligase av E.coli. Endene som genereres av den andre streng erstattes ved innvirkning av DNA-polymerase T4.

cDNA'ene fraksjoneres i henhold til størrelse ved kromatografi ved filtrering på gel ved hjelp av Biogel A50M som beskrevet tidligere (Soares et al, "PNAS", 91:9228-9232). cDNA'ene som er fraksjonert efter størrelse ligeres på kommersielle EcoRI-adaptorer (Stratagéne) og digereres derefter med EcoRI for å skape cDNA-fragmentene utstyrt med EcoRI (5')- og Xhol (3')-endene. De ikke-ligerte adaptorer elimineres ved kromatografi på en Sepharose CL4B-kolonne (Pharmacia). De cDNA'er som bærer adap-torene fosforyleres under anvendelse av kinasen av T4 polynukleotiden og ligeres under anvendelse av DNA-ligase T4 i EcoRI-, Xhol-setene av skyttelvektoren som er fremstilt som beskrevet ovenfor, ved 16°C i et tidsrom som går helt opp til 48 timer (600 ng vektor + 300 ng innskudd i et volum på 10-20 ul). Banken forsterkes ved elektroporering i stammen pri.l 16+ som tillater å replikere plasmidene utstyrt med en replikasjonsopprinnelse RK6, og bringes så på 100 skåler med 150 mm diameter i Agar-LB-medium, pluss kanamycin. En bank på 5 millioner kloner oppnås. Primær-cDNA-banken i skyttelplasmidet blir derefter normalisert i henhold til den protokoll som er beskrevet av Soaes et al. i 1994. Et seleksjonstrinn av et subensemble av kloner kan gjennomføres under anvendelse av de teknologier som tillater å bestemme ekspresjonsprofilen av klonene som for eksempel ved hjelp DNA-lopper (Amersham, Molecular Dynamics, Affymetrix).

De seleksjonerte kloner som stammer fra den normaliserte cDNA-bank i skyttelplasmidet bringes på mikroplater med 96 brønner i en mengde av en klon pr. brønn. Klonene forsterkes i flytende medium (LB) i nærvær av det tilpassede antibiotikum (kanamycin). Fremstillingen av DNA av hver klon gjennomføres samtidig for 96 brønner i kultur ved hjelp av Quiagen-roboten (Quiagen Biorobot 9600) og Quiaprep 96 Turbo Biorobot-settet (Quiagen, Forbundsrepublikken Tyskland). Disse DNA tas opp i 50 ul TExl. 96 plasmidiske DNA-prøver bringes på plater kalt primærplater.

Eksempel 5. 2: Fremstilling av plasmidbanker av funksjonelle adenovirale

genomer som bærer cDNA'ene

Det adenovirale opphavsgenom som bæres av et RK2-plasmid (pOSE37-00) innføres ved klassisk transformasjon i stammen JM83. En kultur av hver stamme utstyrt med plasmidet (JM83xpOSE37-00) gjøres kompetent ved tekniske standarder ved suksessive vasking med 100 mM CaC^.

I en mengde av 40 ul pr. brønn fordeles de kompetente celler (JM83xpOSE37-00) på en mikroplate med 96 dype brønner. DNA av hvert skyttelplasmid transformeres i denne stamme for å oppnå det homologe rekombineringsevenement som genererer det funksjonelle adenovirale genom. 5 ul DNA fra den såkalte primærplaten settes så til 40 ul kompetente celler idet man overholder rekkefølgen. Platene viste 42°C i 1 minutt og bringes så på is i 2 minutter. 1 ml av mediet (LB) inneholdende de to tilpassede antibiotika (kanamycin, tetracyklin) settes til pr. brønn. Efter en første vekst ved 6 timer, blir 50 ul av denne vekst benyttet for å så ut en ny plate med 96 dype brønner utstyrt med 1 ml medium (LB) inneholdende de to tilpassede antibiotika (kanamycin, tetracyklin). Kulturen holdes i 14 timer.

Det plasmidiske DNA som stammer fra denne veksten renses ved hjelp av Quiagen-roboten (Quiagen Biorobot 9600) og sette R.E.A.L. Prep 96 Biorobot, hvortil det føyes et Quiawell-separeringstrinn fra Quiawell 96 Ultra Biorobot Kit-settet med isopropanol-precipitering (Quiagen, Forbundsrepublikken Tyskland). Det oppnådde DNA tas opp i 50 ulTExl. 20 (il av hver DNA (ca. 0,4 ug) transporteres derefter til brønnene i en ny mikroplate-brønn med 96 brønner, idet man overholder rekkefølgen. Denne DNA kuttes med enzymet Pacl for å skjære ut det virale genom. Pr. brønn settes 10 (il reaksjonsblanding (3 ul buffer Nei, 6 (il H20, 1 (il (2,5 U) av Pacl) til 20 (il DNA. Reaksjonen skjer ved 37°C i 1 time og 30 minutter. Platen sentrifugeres og fryses til -20°C inntil det følgende trinn.

Det virale DNA kan digereres med Pacl for å skjære ut det adenovirale genom og derefter transfekteres inn i transkomplementet eukaryotiske celler for å generere den virale bank.

Eksempel 5. 3: Oppnåelse av den adenovirale ekspresjonsbank

Platen på 96 brønner som bærer DNA'ene som er digerert med Pacl bringes til om-givelsestemperatur. De 30 (il DNA som er digerert med Pacl i hver brønn mottar 2 (il Enhancer og 15 (il effectene (Effectene Transfection Reagent, Quiagen, Forbundsrepublikken Tyskland). Den transfektante blanding fordeles derefter i brønnene i en plate på 96 eller 48 brønner eller bringes ut på IGRP2-celler (WO 96/22378) i en mengde av 10<5>celler/cm<2>.

14 timer efter transfeksjon blir 50-75 ul/brønn supernatant av kulturen tatt ut og tjener som inokulum for å infektere en nye plate av nyutsådde, transkompetante celler. Dette forsterkningstrinn gjentas 3-5 ganger for å sikre en homogenitet av de oppnådde virale titere i hver av brønnene. Den oppnådde titer i hver brønn ligger mellom 5x10 o og 5 x IO<9>virale partikler pr. ml. Platen sentrifugeres og fryses til -20°C.

Disse virus kan benyttes direkte i det egnede biologiske system. Efter infeksjon av den cellulære modell med banken, blir en funksjonell analyse bestemt og gjennomført. Man søker mer spesielt en pro-apoptotisk aktivitet, anti-angiogenisk aktivitet eller anti-apoptotisk aktivitet i henhold til den benyttede cellemodell. Rekkefølgen av kloner og derved virus under konstruksjonen av banken tillater lett å øke den angjeldende nukleinsekvens til en funksjonell aktivitet og derved definere et nytt mål.

Eksempel 6: Konstruksjon av et bærerplasmid for et adenoviralt genom som er kompatibelt med kloningssystem Gateway® markedsført av Life

Technologies (LTI, Rockville, MA, USA)

Plasmidet pSHExplacZ genereres, det har CMV-promoter, atfBl-sete, LacZ-genet, a#B2-sete og polyadenyleringssetet av SV40 i en skyttelvektor av type pIG5 (figur 2). For å oppnå dette plasmidet blir cDNA av LacZ-genet som stammer fra plasmidet pSV40-lacZ (Promega), digerert med Hindlll og Dral og skutt inn i setene XmnI eler EcoRV av pENTR-1 A som beskrevet av Life Technologies i US 5 888 732 og gir plasmidet pENTR-LacZ. En reaksjon av LR-typen (Gateway® cloning technology) mellom pENTR-LacZ og pDestl2.2 gir pExpLacZ (denominering av Gateway®-teknologien). To trinn subkloning har lettet den endelige oppnåelse av pSHExplacZ: fragmentet Ncol/Asel av pExpLacZ skytes inn ved Asel og Ncol av pCA350 (avledet av pIG5) å generere plasmidet pSExplacZ. Til slutt ble fragmentet Pacl/Sall av pSExpLacZ skutt inn ved PacJ/Sall av plasmidet pIG7 (avledet fra pIG5). Til slutt gjenfinnes sekvensene: promoter CMV, sete attBl, genet LacZ, sete attBl og polyadenyleringssetet av SV40, i CMV-LacZ-kassetten av skyttelplasmidet pIG5 (eksempel 2). Det således oppnådde plasmid er kalt pSHExplacZ og er vist i figur 9.

Et plasmid kalt pAdGWExpLacZ som er kompatibelt med Gateway®-systemet konstrueres derefter i henhold til EDRAG-metodologien (FR 2 730 504) ved hjelp av plasmidene pSHExplacZ og pXL2689.

Plasmidet pXL2689 som er beskrevet av Crouzet et al. ("PNAS", 1997), har opprin-nelsen av plasmidet RK2, tetracyklin-resistensgenet og et infektiøst, adenoviralt genom som oppviser delesjonen i El og E3. Rekombinasjonen av plasmidene pXL2689 og pSHExpLacZ gir opphav til plasmidet pAdGEWxpLacZ som bærer det adenovirale genom og innskuddet omfattende promoteren CMV, sete attBl, genet LacZ, sete attB2 og polyadenyleringssetet av SV40 (figur 9).

Plasmidet pAdGWExLacZ som oppnås på denne måte omfatter et gen av interesse representert ved LacZ mellom to rekombineringsseter attB av fagen X av E.coli, og reagerer med en vektor kalt donor for Gateway®-systemet (pDONR201) som bærer atfP-setene, et kanamycin-resistensgen (Kn<R>) og genet ccdB som er letalt for E. coli. Plasmidet som stammer fra denne reaksjon kalt BP er, i henhold til Gaeway®-klonings-teknologidenomineringen, pAdDEST (destinasjonsplasmid) og er vist i figur 10.

Til slutt reagerer plasmidet pAdDEST takket være setene attRl og attRl med en klon kalt entré i Gateway®-systemet som bærer et innskudd av interesse omgitt av rekombinasjonsseter attLl og attLl med en reaksjon kalt LR. Det således oppnådde plasmid er kalt pAdExp og bærer et fullstendig adenoviralt genom samt et innskudd av interesse (figur 11).

Referanseliste:

Ausubel et al., 1987, "Current protocols in molecular biology", 1987-1988, John Wiley and Sons, New York.

Bolivar et al., 1977, "Gene" 2:95.

Crouzet et al., 1997, "PNAS", 94, 1414-1419.

Dagert et al., 1979, "Gene", 6, 23-28.

Ditta et al., 1980, "Plasmid", 13, 149-154.

Ghosh-Choudhurry et al., 1986, "Gene", 50, 161-171.

Hamilton et al., 1989, "J. Bacteriol", 171:4617-4622.

D. Hanahan, 1983, "J. Mol. Biol", 166: 557.

Heffron et al., 1977, "Proe. Nati. Acad. Sei. USA", 74, 702-706.

T. Maniatis et al., 1982, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor laboratory, New York.

Miller et al., 1988, "J. Bacteriol.", 170: 2575-2583.

Simoes et al., 1991, "New York Acad. Sei.", 646: 254-258.

N.D. Sinha et al., 1984, "Nucl. Acids Res., 12,4539-4557.

Slater et al., 1993, "J. Bacteriol." 175: 4260-4262.

Viera et al., 1982, "Gene", 19,259-268.

Wirth et al., 1989, "Mol. Gen. Genet", 216, 175-177.

Zeef et al., 1994, "EMBO J.", 13:5113-5120.

Claims

1. Fremgangsmåte for fremstilling av adenovirus,karakterisertved at den omfatter: (a) konstruksjon av et første plasmid (kalt "skyttel" plasmid), fortrinnsvis et prokaryotisk plasmid, omfattende et første avkortet, rekombinant adenoviralt genom som inneholder minst en heterolog nukleinsyre, (b) å bringe det første plasmidet i kontakt et andre plasmid (kalt "foreldre" plasmid) omfattende et andre avkortet, rekombinant adenoviralt genom, komplementært til det første genomet, hvor begge plasmidene er i sirkulær form og gjør det mulig, ved homolog rekombinasjon, å produsere et sluttplasmid som omfatter et fullstendig rekombinant adenoviralt genom, og (c) å kutte det lineære, komplette, rekombinante adenovirale genomet fra sluttplasmidet og innføre dette i en enkapsideringscellelinje for å fremstille de rekombinante adenovirus som inkorporerer det komplette, rekombinante, adenovirale genom, hvor nevnte "skyttel" plasmid og nevnte "foreldre plasmid" begge omfatter en identisk homolog adenoviral region, hvor begge omfatter et origo for replikasjon og en forskjellig seleksjonsmarkør for å selektere hvert element og begge omfatter en ITR sekvens grensende til et restriksjonssete som ikke er tilstede i det adenovirale genom og en eller annen som omfatter en enkapsideringssekvens.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisert vedat den ytterligere omfatter: - anvendelse av de rekombinante adenovirus som har blitt produsert for å infisere: et biologisk materiale omfattende celler, med det formål å analysere egenskaper for nukleinsyren; en cellekultur in vitro eller ex vivo med det formål å fremstille et protein, polypeptid eller peptid som kodes av den heterologe nukleinsyren.

3. Fremgangsmåte ifølge 1 eller 2, for fremstilling av adenovirale ekspresjonsbibliotek.

4. Kit,karakterisert vedat det omfatter et et skyttel plasmid som omfatter et første avkortet adenoviralt genom som omfatter minst en heterolog nukleinsyre og en foreldre plasmid som omfatter et andre avkortet, adenoviralt genom og som omfatter minst en heterolog nukleinsyre, hvor de to plasmidene gjør det mulig, ved homolog rekombinasjon, mellom de to avkortede adenovirus genomene, å produsere et sluttplasmid som omfatter et fullstendig lineært rekombinant adenovirus genom som er flankert av ett eller flere restriksjonsseter som ikke er tilstede i nevnte genom, hvor nevnte "skyttel" plasmid og nevnte "foreldre plasmid" begge omfatter en identisk homolog adenoviral region, hvor begge omfatter et origo for replikasjon og en forskjellig seleksjonsmarkør for å selektere hvert element og begge omfatter en ITR sekvens grensende til et restriksjonssete som ikke er tilstede i det adenovirale genomet og en eller annen som omfatter en enkapsideringssekvens.