JP7287611B2 - 改良型アデノ随伴ウイルスベクター - Google Patents
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Description
アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターに搭載するベクターゲノムを産生するベクタープラスミドであって、
上記ベクタープラスミドは、上記ベクターゲノムのテンプレートとなるベクターゲノムカセットを備え、
上記ベクターゲノムカセットは、
(1) 目的遺伝子をコードする核酸分子と、(b)上記目的遺伝子の発現を可能にする発現調節領域をコードする核酸分子と、を含む発現カセットと、
(2) 上記発現カセットを挟むように位置するインバーテッドターミナルリピート(ITR)をコードする2つの核酸分子と、を備える、
ベクタープラスミド
が提供される。このベクタープラスミドによれば、目的遺伝子がコードするタンパク質を発現させることができる、アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターに搭載するベクターゲノムを複製することができる。
便宜上、本願で使用される特定の用語は、ここに集めている。別途規定されない限り、本願で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者が一般的に理解するのと同じ意味を有する。文脈で別途明記されない限り、単数形「a」、「an」及び「the」は複数の言及を含む。
1)95%以上の配列相同性を有する塩基配列である、または、
2)1または数塩基が欠失、置換、付加されている塩基配列である、または、
3)相補的な配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列であっても良い。
(1)イオン強度が低く洗浄温度が高い状態として、たとえば0.015MのNaCl/0.0015Mのクエン酸ナトリウム(チトラート)/0.1%SDSで温度50℃が挙げられる。あるいは
(2)ハイブリッド形成中にホルムアミド等の変性剤を使用して、たとえば、50%(vol/vol)ホルムアミドに、0.1%ウシ血清アルブミン/0.1%Ficoll/0.1%polyvinylpyrrolidone/50mMリン酸ナトリウムバッファpH6.5、750mMNaCl、75mMクエン酸ナトリウムで温度42℃とすることが挙げられる。別の例としては、50%ホルムアミド、5×SSC(0.75M NaCl,0.075Mクエン酸ナトリウム),50mM リン酸ナトリウム(pH6.8), 0.1%ピロリン酸ナトリウム, 5×デンハルト液、超音波処理されたサーモンスパームDNA(50μg/ml),0.1%SDS,10%硫酸デキストラン,温度42度,洗浄温度42℃,0.2×SSC,0.1%SDSが挙げられる。また、当業者であれば、クリアで検出可能なハイブリダイゼーションシグナルを得るべく、ストリンジェントな条件を適宜変更できることは、明らかである。
本実施形態において、
アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターに搭載するベクターゲノムを産生するベクタープラスミドであって、
上記ベクタープラスミドは、上記ベクターゲノムのテンプレートとなるベクターゲノムカセットを備え、
上記ベクターゲノムカセットは、
(1) 目的遺伝子をコードする核酸分子と、(b)上記目的遺伝子の発現を可能にする発現調節領域をコードする核酸分子と、を含む発現カセットと、
(2) 上記発現カセットを挟むように位置するインバーテッドターミナルリピート(ITR)をコードする2つの核酸分子と、を備える、
ベクタープラスミド
が提供される。
本実施形態におけるベクタープラスミドは、アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターに搭載するためのベクターゲノムを宿主細胞において産生する。宿主細胞は、ベクタープラスミドからベクターゲノムを産生することができれば任意の宿主細胞(例えば、HEK293細胞)を用いることができる。本実施形態におけるベクタープラスミドは、任意の選択マーカー(例えば、アンピシリン耐性遺伝子をコードする核酸分子)を備えていてもよい。本実施形態におけるベクタープラスミドは、宿主細胞の染色体への挿入に関わる遺伝子をコードする核酸分子が除かれていてもよい。一実施形態において、ベクタープラスミドは、rep遺伝子をコードする核酸分子及びcap遺伝子をコードする核酸分子のうちの少なくとも1つを有さない。一実施形態において、ベクタープラスミドは、任意の核酸分子(例えば、シミアンウイルス40(SV40)ポリAシグナルをコードする核酸分子)を有する。
本実施形態におけるベクタープラスミドは、HGF遺伝子をコードする核酸分子を備えている。本実施形態におけるHGF遺伝子は、治療する被験体又は患者と同じ種由来であってもよく、異なる種由来であってもよい。一実施形態において、HGF遺伝子は、ヒトHGF遺伝子である。HGF遺伝子は、治療する被験体又は患者の種における頻出コドンに置き換えた塩基配列を有していてもよい。一実施形態において、ヒトHGF遺伝子は、ヒトにおける頻出コドンに置き換えた塩基配列を有する。一実施形態において、ヒトHGF遺伝子は、配列番号4の塩基配列を有する。
本実施形態におけるベクタープラスミドは、HGF遺伝子の発現を可能にする短縮型発現調節領域をコードする核酸分子を備えている。本実施形態における短縮型発現調節領域の長さは、そのネイティブの発現調節領域の長さよりも短い。短縮型発現調節領域は、そのネイティブの発現調節領域よりも短いものの、HGF遺伝子の発現を可能にする能力は維持している。従って、短縮型発現調節領域は、HGF遺伝子の発現を可能にする能力を維持するのであれば、そのネイティブの発現調節領域中の任意の長さの1又は複数の塩基配列を欠いている領域であってもよい。本実施形態における短縮型発現調節領域は、プロモーターとしての機能を有する。一実施形態において、短縮型発現調節領域は、機能可能なプロモーター領域とエンハンサー領域を有する。一実施形態において、短縮型発現調節領域の長さは、そのネイティブの発現調節領域の70%、65%、60%、55%、50%、45%、40%、35%及び30%より選択される任意の2つの値の範囲内の長さである。別の実施形態において、短縮型発現調節領域は、そのネイティブの発現調節領域よりも、HGF遺伝子に対する発現能力が向上している。
(a) 以下の5'末端塩基のうちの任意の1つの塩基と、以下の3'末端塩基のうちの任意の1つの塩基との間の塩基配列:
5'末端塩基;150、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、175、180、190、200、250、300、350、400、410、420、430、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、460又は470番目の塩基、
3'末端塩基;700、710、720、730、735、736、737、738、739、740、741、742、743、744、745、746、747、748、749、750、751、752、753、754、755、760、765、770、750、760、770、775、776、777、778、779、780、781、782、783、784、785、786、787、788、789、790、791、792、793、794、795、796、797、798、799又は800番目の塩基、
(b) 以下の5'末端塩基のうちの任意の1つの塩基と、以下の3'末端塩基のうちの任意の1つの塩基との間の塩基配列:
5'末端塩基;156、157、158、159、160、161、162、163、164、165又は166番目の塩基、
3'末端塩基;739、740、741、742、743、744、745、746、747、748又は749番目の塩基、
(c) 5'末端塩基; 438、439、440、441、442、443、444、445、446、447又は448番目の塩基、
3'末端塩基;781、782、783、784、785、786、787、788、789、790又は791番目の塩基、
(d) 配列番号2の塩基配列、
又は
(e) 配列番号3の塩基配列、を有する。
本実施形態におけるベクタープラスミドは、発現カセットを挟むように位置するITRをコードする2つの核酸分子を備えている。本実施形態におけるITRをコードする2つの核酸分子は、発現カセットを挟む構成を指すものであるため、本実施形態にかかるベクタープラスミドは、その機能(AAVベクターに包含可能なベクターゲノムの産生を含む)を発揮する限り、ITR間のセグメント(即ち、ベクターゲノムカセット)の外側に更なるITRをコードする核酸分子を有していてもよい。ITRは、ベクターゲノムカセットの複製開始点として機能し、更には、ウイルス粒子へのパッケージングにも関与する。一実施形態において、上記ITRをコードする2つの核酸分子は、非変異型ITRと変異型ITRをコードする核酸分子である。一実施形態において、変異型ITRをコードする核酸分子は、ベクタープラスミドにおいて非変異型ITRをコードする核酸分子よりも上流(5'末端方向)に位置する。一実施形態において、変異型ITRをコードする核酸分子は、自己相補することができるベクターゲノムがベクターゲノムカセットから生じるように構成された変異を有する。一実施形態において、ベクターゲノムは、発現カセットと、上記発現カセットの逆相補配列をコードする核酸分子を含む逆相補発現カセットと、上記発現カセットと上記逆相補発現カセットの間に位置する上記変異型ITRをコードする核酸分子を含む。従って、かかるベクターゲノムは、発現カセットと逆相補カセットが自己相補的に結合することができる(例えば、図1を参照)。本実施形態のベクターゲノムにおけるITRをコードする核酸分子は、ステムループ構造を形成することができる。一実施形態において、上記ベクターゲノムは、変異型ITRをコードする核酸分子と、非変異型ITRをコードする核酸分子と、非変異型ITRの逆相補配列をコードする核酸分子を含む。
本実施形態において、眼疾患又はこれに伴う疾患治療又は予防用であるAAVベクターが提供される。一実施形態において、眼疾患は、眼症状及び所見も含む。一実施形態において、治療は、疾患(その症状又は所見)の低減も含む。眼疾患は、眼疾患以外の疾患(症状又は所見)を伴っていてもよいが、本実施形態のAAVベクターは、眼疾患又はこれに伴う疾患を少なくとも治療又は予防すること関する。例えば、くも膜下出血については、本実施形態のAAVベクターは、くも膜下出血によって生じる眼疾患(例えば、網膜症(例:増殖性硝子体網膜症))を少なくとも治療又は予防することを指す。少なくとも一実施形態において、眼疾患又はこれに伴う疾患は、眼瞼疾患、涙器疾患、結膜疾患、角膜疾患、強膜疾患、緑内障、網膜色素変性症、無色素性網膜色素変性症、水晶体疾患、眼窩疾患、ぶどう膜疾患、網膜疾患、硝子体疾患からなる群より選択される。一実施形態において、網膜色素変性症は、他臓器の症候群を伴う又は他臓器の症候群を伴わない。他臓器の症候群を伴う網膜色素変性症としては、Usher症候群、Laurence-Moon症候群、Baldet-Biedl症候群、Cockayne症候群、Batten症候群、Hunter症候群、Hurler症候群、脊髄小脳変性症、Kearns-Sayre症候群が挙げられる。一実施形態において、網膜色素変性症は、定型網膜色素変性症及び非定型網膜色素変性症を含む。緑内障としては、原発緑内障、開放隅角緑内障、閉塞隅角緑内障、先天緑内障及び続発緑内障が挙げられる。
本実施形態において、上記AAVベクターを含む眼疾患又はこれに伴う疾患治療又は予防用医薬組成物が提供される。一実施形態において、医薬組成物は、治療上有効量の上記AAVベクターを含む。本実施形態の医薬組成物は、懸濁液、粘性若しくは半粘性ゲル、又は他の固体若しくは半固体組成物等の他のタイプであってもよい。本実施形態の医薬組成物は、薬学的に許容される等張化剤、緩衝液、防腐剤、界面活性剤及び粘度付与剤等の他の成分を含んでもよい。
本実施形態において、眼疾患又はこれに伴う疾患を治療又は予防する方法であって、上記眼疾患又はこれに伴う疾患を患っている被験体に、上記AAVベクターを含む眼疾患又はこれに伴う疾患治療又は予防用医薬組成物を治療上有効量で投与することを含む、方法が提供される。
組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)ベクターの作製
rAAVベクターはアデノウイルスフリーシステムを用いて作製した。図1は、hHGFを搭載している自己相補型rAAVベクターゲノムの模式的な構造を示している。
rAAVベクターとして、自己相補型のscAAV2TM.p42CMV.optHGF(別名:p42又はAAV.p42)を作成した。初めに、配列番号5のベクタープラスミド(pVector-p42)を当業者にとって一般的な方法に従って作成した。図2は、pVector-p42におけるプロモーター(Promoterに対応)及びHGF(Genomeに対応)の挿入位置を示している。短縮型サイトメガロウイルスプロモーターは、野生型ヒトサイトメガロウイルス主要前初期(HCMVMIE)プロモーター(配列番号1、GenBank: K03104.1、全長930b)の443番目から786番目の配列から構成されている(図3、p42CMV、配列番号2)。HGFは、ネイティブなヒトHGF遺伝子の配列をヒト頻出コドンに置き換え最適化させたHGF(codon optimized human HGF; optHGF、配列番号4)を用いた。図2において、一本下線を引いた領域は、変異型ITR領域(配列番号12)を示し、二本下線を引いている領域は、非変異型ITR領域(配列番号13)を示し、太下線を引いた領域は、シミアンウイルス40(SV40)ポリAシグナル(配列番号15)を示す。変異型ITRは、pVector-p42から産生されるベクターゲノムが自己相補することができるように構成された変異を有し且つ野生型ITRよりも短い。また、非変異型ITRも野生型ITRよりも短い。
マウスの硝子体内への投与
NMDAモデルでの検討
動物
本実験には8週齢オスC57BL/6マウス(日本クレア)を用いた。マウスは、14時間/10時間の明暗期のサイクル下で食餌・飲用水へ自由にアクセスできるように飼育した。
マウスを、ケタミン/キシラジン(100mg/kg, 10mg/kg)の腹腔内投与及びオキシブプロカイン塩酸塩点眼(ベノキシール点眼液0.4%, 参天製薬)により麻酔した。麻酔したマウスに1μLのウイルスベクター(AAV.p42)を硝子体内投与した。ウイルス投与の3週間後、1μLのN-メチル-D-アスパラギン酸(NMDA, Wako)をマウスの硝子体内に投与した。ウイルス及びNMDAの濃度は、表2に示している。
網膜中のhHGF RNA発現レベル解析のため、リアルタイムPCRを行った。ウイルス投与4週間後、マウスをイソフルラン麻酔下で頸椎脱臼することにより安楽殺した。マウスから眼球を摘出し、眼科顕微鏡下で神経網膜(内境界膜、神経線維層、神経節細胞層、内網状層、内顆粒層、外網状層、外顆粒層、外境界膜及び視細胞層からなる層)を剥離し、得られた膜(以下、神経網膜)を200μLのRNAlater (Qiagen)に一晩、4℃で浸漬し、-30℃で保存した。神経網膜を350μLのBuffer RLT/β-メルカプトエタノール(100:1)へ移し、ソニケーションにより神経網膜を破砕した。神経網膜からのRNA抽出は、RNeasy Minikit(Qiagen)を用い、製品マニュアルに従って行った。
結果を図4に示している。AAV.p42投与群(p42+NMDA群)は、AAV.p42非投与群(PBS群)と比較し、4674±1634倍(±S.E.)のhHGF RNA発現が確認できた(mean±S.E., t-test, *p<0.05, n=3 (NMDA群はn=2))。
in vivoタンパク質発現量解析
実施例2において取得した神経網膜をPBS中に浸漬して、氷上で冷却した。ソニケーションにより神経網膜を破砕し、破砕された神経網膜を含むサンプルを得た。
結果を図5に示している。AAV.p42投与群(p42+NMDA群)は、AAV.p42非投与群(PBS群及びNMDA群)と比較し、神経網膜中の総タンパク質量あたりのhHGFタンパク質量が1796±439 pg/mg (±S.E.)であることが確認できた(mean±S.E., t-test, *p<0.05, n=3 (NMDA群はn=2))。正常眼圧緑内障モデルのマウスの硝子体内にウイルスベクターAAV.p42を投与した。その結果、神経節細胞層細胞数減少の抑制が認められた(不図示)。
in vitroタンパク質発現量解析
マウス神経芽腫細胞株Neuro2a及びマウス横紋筋細胞株C2C12におけるHGF発現量を解析した。1×105 (cells/well)の各細胞を24well plateに播種して培養した。播種の6時間後、1細胞あたり5×105 v.g.のAAV.p42をC2C12のウェルに添加し、播種の20時間後、1細胞あたり5×105 v.g.のAAV.p42をNeuro2aのウェルに添加した。1日間の培養後、各ウェル中の細胞を500μLのPBSで洗浄した後、500μLのDMEM/10%FBSを各ウェルに加えた。細胞を2日間培養し、上清を回収した。回収した上清を3000rpm, 5分, 4℃で遠心し、その上清サンプルを解析に用いた。同様の方法に従って、AAV.p13をC2C12とNeuro2aにトランスダクションし、それぞれから上清サンプルを取得した。
本発明者達は、上述する一般的なssAAVベクターでは、遺伝子発現効率が低いため、自己相補型(Self-complementary)アデノ随伴ウイルス(scAAV)ベクターを用いることにした。scAAVベクターは、最初から二本鎖DNAであるため、搭載した遺伝子の発現効率が高い一方で、ssAAVと比較して搭載できる遺伝子の長さは半減する。従って、全長が約2.2kbpのHGFは、一般的なssAAVには搭載可能であるが、scAAVでは困難であると考えられていた。そこで、本発明者達は、鋭意研究の末、AAVベクター上の由来不明配列を除去し、更に、CMVのプロモーター領域の一部及びAAVのITR領域の一部を削除することでscAAVベクターにHGFを搭載することに成功した。
Claims (9)
- アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターに搭載するベクターゲノムを産生するベクタープラスミドであって、
前記ベクタープラスミドは、前記ベクターゲノムのテンプレートとなるベクターゲノムカセットを備え、
前記ベクターゲノムカセットは、
(1) 目的遺伝子をコードする核酸分子と、(b)前記目的遺伝子の発現を可能にする発現調節領域をコードする核酸分子と、を含む発現カセットと、
(2) 前記発現カセットを挟むように位置するインバーテッドターミナルリピート(ITR)をコードする2つの核酸分子と、を備え
前記発現調節領域は、配列番号2の塩基配列からなり、
前記ITRをコードする2つの核酸分子は、非変異型ITRと変異型ITRをコードする核酸分子を含み、
前記変異型ITRは、配列番号12の塩基配列からなり、
前記非変異型ITRは、配列番号13の塩基配列からなり、
前記目的遺伝子は、肝細胞増殖因子(HGF)遺伝子である、
ベクタープラスミド。 - 前記変異型ITRをコードする核酸分子は、前記非変異型ITRをコードする核酸分子よりも5'末端方向上流に位置する、請求項1に記載のベクタープラスミド。
- 前記ベクターゲノムは、
前記発現カセットと、
前記発現カセットの逆相補配列をコードする核酸分子を含む逆相補発現カセットと、
前記発現カセットと前記逆相補発現カセットの間に位置する前記変異型ITRをコードする核酸分子を含む、請求項1又は2に記載のベクタープラスミド。 - 前記HGF遺伝子は、ヒトHGF遺伝子である、請求項1に記載のベクタープラスミド。
- 前記ヒトHGF遺伝子のコドンは、ヒト頻出コドンに置き換えられている、請求項4に記載のベクタープラスミド。
- 前記ヒトHGF遺伝子は、配列番号4の塩基配列からなる、請求項4又は5に記載のベクタープラスミド。
- 請求項1から6のいずれかに記載のベクタープラスミドから産生されたベクターゲノムを搭載する、AAVベクター。
- 眼疾患又はこれに伴う疾患治療又は予防用である、請求項7に記載のAAVベクター。
- 請求項7又は8に記載のAAVベクターを含む、眼疾患又はこれに伴う疾患治療又は予防用医薬組成物。
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