JP7289306B2 - 網膜障害を治療するための組成物及び方法 - Google Patents

Description

本発明は、網膜障害、特に錐体ジストロフィー、錐体桿体ジストロフィー及び色覚異常の治療及び/又は予防のための療法に関する。

マウス及びヒトを含む多くの哺乳動物種では、薄明かりの下で視力を媒介する桿体光受容体の数は、錐体光受容体の数をはるかに上回る。しかし、照明により錐体が昼夜を問わず機能することが可能となる、工業化された世界では、桿体を介した視力は、あまり重要ではない。出生時から桿体機能が無い多くの患者は、偶発的にのみ特定され、実際には、異常な視力を認識することができない。対照的に、錐体機能不全が存在する場合、患者は常に症候性であり、しばしば、錐体機能不全の程度に依存する視覚障害を患う。

いくつかの病状では、錐体だけ(又は主として錐体)が失われるか又は機能不全であり、桿体は比較的保存されたままである。そのような病状は、錐体ジストロフィー又は錐体桿体ジストロフィー(CRD)として知られ得る。錐体又は錐体桿体ジストロフィーは、錐体の一次喪失、又は時に桿体と錐体の両方の同時喪失を特徴とする遺伝性網膜ジストロフィーである。症状は、視力喪失、明るい光に対する過敏症、及び色覚不良を含む。例えば、色覚異常は、出生時からの錐体機能の完全な不存在を有するが、おそらく正常な桿体機能を有する、重度の遺伝性網膜ジストロフィーである。CNGA3、CNGB3及びPDE6Cを含む複数遺伝子における変異が、この疾患に関連している。その疾患を引き起こす遺伝子のそれぞれは、光受容細胞の過分極を引き起こすことによって光を電気信号に変換する錐体光伝達カスケードの必須成分をコードする。例えば、錐体光受容細胞におけるCNGA3又はCNGB3タンパク質の欠損により、細胞は光に応答して過分極することができなくなる。結果として、細胞は最初は生存するが、機能せず、患者は不十分な視力、色覚の欠如、及び羞明(出生時からの)を患う。様々なグループが、錐体の生存及び機能、並びに視力を改善するCNGA3欠損マウスにおける療法プロトコルを開発している。

錐体ジストロフィーの病因に関与する原因遺伝子の他の例としては、KCNV2、PDE6H、GNAT2、及びCACNA2D4が挙げられる。KCNV2遺伝子は、カリウム電位開口型チャネル修飾因子サブファミリーVメンバー2タンパク質をコードする。KCNV2における変異は、超正常桿体網膜電図(ERG)を伴う錐体ジストロフィー、又は網膜錐体ジストロフィー3B型(光の明るいフラッシュに対する超正常ERG応答と組み合わされた生涯にわたる視力喪失を引き起こす、常染色体劣性障害)に関連する。PDE6H遺伝子は、錐体特異的cGMPホスホジエステラーゼの阻害性(ガンマ)サブユニットをコードする。この遺伝子における変異は、網膜錐体ジストロフィー3A型(RCD3A)に関連する。GNAT2遺伝子は、トランスデューシンの錐体特異的アルファサブユニットをコードする。この遺伝子における変異は、乳児発症型錐体ジストロフィーをもたらし得る。CACNA2D4遺伝子は、カルシウムチャネル、電位依存性、アルファ-2/デルタサブユニット4をコードする。この遺伝子における変異は、非進行性錐体機能不全(網膜錐体ジストロフィー4、RCD4)を引き起こし得る。

加齢黄斑変性(AMD)では、視覚障害は、主に中心斑における錐体に富む中心窩の変性によって引き起こされる。したがって、患者は、中心視覚及び視力を失うが、しばしば、周辺斑を比較的よく保存しており、したがって、中心窩の外側の錐体の不足によって制限されるいくらかの有用な残存視覚を有する。

網膜障害、例えば錐体桿体ジストロフィーを治療又は予防するために、錐体の生存及び機能を改善することができる療法を開発する必要性がある。

発明の概要
本発明は、錐体光受容体において遺伝子を発現するための核酸、転写制御ユニット(TCU)、最適化された遺伝子配列、発現構築物、及びベクターを提供する。

本明細書に開示されるTCUは、M/L-オプシン遺伝子座制御領域(LCR)の制御下にあるM-オプシンプロモーター又はその断片を含み、3つすべてのヒト錐体型において高レベルの発現を駆動するのに有用である。

また、錐体光受容体で遺伝子を発現するために最適化されたTCUの制御下にあるヒトCNGA3遺伝子を含む、発現構築物も提供され、TCUは、M/L-オプシン遺伝子座制御領域の制御下にあるM-オプシンプロモーター又はその断片を含む。

いくつかの実施形態において、TCU及び発現構築物は、M-オプシンプロモーター又はその断片における転写開始部位のすぐ下流に6bpの変異(変異「M8」)を含有し、この変異は、この変異を含有するベクター及び発現構築物の治療効果を時間の経過と共に増加させ得る。

配列番号8として提供されるCNGA3遺伝子のコドン最適化配列がさらに提供される。

また、本明細書に開示される発現構築物を含むベクター、例えばウイルスベクターが提供される。発現構築物は、好ましくは、アデノウイルス血清型8(AAV8)又は代替の強力なAAV血清型に由来するベクターを使用して送達される。

本発明はまた、網膜障害又はジストロフィー、例えば以下に限定されないが、錐体ジストロフィー、例えば色覚異常の治療及び/又は予防のために核酸、転写制御ユニット(TCU)、最適化された遺伝子配列、発現構築物、及びベクターを使用する方法を提供する。

したがって、一態様において、本発明は以下を提供する:
5'から3'方向に、
(a)(i)配列番号1; 又は
(ii)前記配列(a)(i)に対して少なくとも90%の配列同一性を有する配列
を含む遺伝子座制御領域(LCR); 及び
(b)(i)配列番号2又は配列番号17のいずれかの少なくとも200個のヌクレオチド; 又は
(ii)前記配列(b)(i)に対して少なくとも90%の配列同一性を有する配列
を含むプロモーターエレメント
を含む、最大2500個のヌクレオチドの長さの転写制御ユニット(TCU)であって、錐体光受容体特異的プロモーター活性を示す、TCU。

上記の態様によれば、プロモーターエレメント(b)は、場合により、配列番号2若しくは配列番号17のいずれかの少なくとも最後の200個若しくは最後の500個のヌクレオチド、又は配列番号2若しくは配列番号17のいずれかの最後の200個若しくは最後の500個のヌクレオチドに対して少なくとも90%の配列同一性を有する配列を含んでもよい。

上記の態様のいずれか1つによれば、プロモーターエレメント(b)は、配列番号3の少なくとも200個のヌクレオチドを含んでよく、場合により、プロモーターエレメント(b)はまた、配列番号3のヌクレオチド1～35から選択される少なくとも10個連続したヌクレオチドの配列、又は配列番号3のヌクレオチド1～35に対して少なくとも90%の配列同一性を有する配列から選択される少なくとも10個連続したヌクレオチドを含む配列を含む。

上記の態様のいずれか1つによれば、プロモーターエレメント(b)は、配列番号3[hG1.7における529bpプロモーターエレメント]若しくは配列番号5[hG1.4における247bpプロモーターエレメント]、又は配列番号3若しくは配列番号5に対して少なくとも90%の配列同一性を有する配列を含んでもよい。

上記の態様のいずれか1つにおいて、プロモーターエレメントは、配列番号16[M8変異]をさらに含んでもよい。例えば、上記の態様のいずれか1つによれば、配列番号2のヌクレオチド1934～1939(GGGCCG)に対応するヌクレオチドは、配列番号16によって置き換えられてもよい。

一態様によれば、TCUは、配列番号4[hG1.7プロモーター構築物の変異体、4つのヌクレオチドが欠けている]、配列番号6[hG1.4構築物]又は配列番号15[製品中のhG1.7プロモーター構築物]を含む。

本発明はまた、本明細書に記載されるTCUを含む発現構築物を提供し、TCUは、錐体光受容体特異的方法で発現させるべき配列に作動可能に連結される。一実施形態において、TCUに作動可能に連結された配列は、CNGA3、CNGB3、PDE6C、PDE6H、GNAT2、KCNV2又はCACNA2D4をコードする遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、作動可能に連結された配列は、配列番号7、8、9、10、11、12、13若しくは14を含むか、又は配列番号7、8、9、10、11、12、13若しくは14に対して少なくとも80%の配列同一性を有し、且つ錐体光受容体機能を救済する(rescue)能力を有する。一実施形態において、作動可能に連結された配列は、配列番号8[CNGA3コドン最適化配列]を含むか、又は配列番号8に対して少なくとも80%の配列同一性を有し、且つ錐体光受容体機能を救済する能力を有する。

本発明はまた、本明細書に記載される核酸、TCU、プロモーター断片、コドン最適化された遺伝子、及び/又は発現構築物のいずれかを含むベクターを提供する。いくつかの実施形態において、ベクターは、ウイルスベクターである。

いくつかの実施形態において、ベクターは、AAVベクターであり、及び/又はAAVゲノム若しくはその誘導体を含む。一実施形態において、誘導体は、キメラ、シャッフル又はキャプシド改変誘導体である。一実施形態において、AAVゲノムは、AAVの天然由来の血清型又は単離物又はクレードに由来する。一実施形態において、AAVゲノムは、AAV血清型2(AAV2)、AAV血清型4(AAV4)、若しくはAAV血清型8(AAV8)に由来し、並びに/又はAAVキャプシドは、AAV8に由来する。好ましい実施形態において、ゲノムは、AAV2に由来し、キャプシドは、AAV8に由来する。一実施形態において、AAVベクターは、CNGA3をコードする遺伝子を保有する。

本発明はさらに、本明細書に開示される核酸若しくはベクターを含有する宿主細胞、並びに本明細書に開示される核酸若しくはウイルスベクターを産生する宿主細胞を提供する。一実施形態において、宿主細胞は、HEK293又はHEK293T細胞である。

また、本明細書に記載される核酸若しくはベクター、並びに薬学的に許容可能な担体を含む、医薬組成物が提供される。

本発明はさらに、網膜障害を予防又は治療する方法において、本明細書に記載される核酸、ベクター、最適化された遺伝子配列、及び/又は発現構築物を使用する方法を提供する。一実施形態において、本明細書に記載される核酸、ベクター、最適化された遺伝子配列、及び/又は発現構築物は、網膜障害の治療又は予防のための医薬の製造において使用される。また、治療上有効量の本明細書に開示されるベクターを投与するステップを含む、網膜障害の治療又は予防を必要とする患者において網膜障害を治療又は予防する方法が提供される。一実施形態において、網膜障害は、色覚異常である。いくつかの実施形態において、ベクターは、直接的な網膜、網膜下、又は硝子体内注射によって患者に投与される。

図1は、緑色(M)オプシンコアプロモーターに対する遺伝子座制御領域(LCR)の位置効果を評価するための、トランスジェニックマウスにおけるインビボ(in vivo)レポーター遺伝子発現研究の結果を示す。左上: LCR、転写ユニット、及びエクソンの位置を示す、正常なヒトの赤色及び緑色色素遺伝子アレイ。左下: 10倍の拡大スケールで示される改変された視覚色素遺伝子アレイ。開始部位及び転写の方向は、矢印で示される。P_赤色=ヒト赤色色素遺伝子プロモーター。P_緑色=ヒト緑色色素遺伝子プロモーター。AP、ヒト胎盤アルカリホスファターゼ。lacZ、大腸菌(E. coli)β-ガラクトシダーゼ。右: 左に示される構築物についてのキメラ又は生殖細胞系列伝達マウスにおいてAPのみ(赤色)、lacZのみ(濃緑色)、APとlacZの両方(黄色)、又はlacZ＞＞AP(薄緑色)を発現する導入遺伝子発現細胞の割合を示す円グラフ。同じES細胞株に由来する異なるマウスからの細胞数をプールして、単一の円グラフを生成した。生殖細胞系列creマウスと交配させることによってPGK-neoマーカーが切除されたマウス系統についての細胞数は、対応する親系統についての円グラフのすぐ右側に示される。 図2は、赤色(L-)及び緑色(M-)オプシンプロモーターの染色体配置の概略図を示す(枠で囲まれた上部)。以前に開発された転写ユニット(pR2.1及びPR1.7)、及びこの研究で開示される操作された転写制御ユニットの概略図。LCR=遺伝子座制御領域。 図3は、hG1.4 TCUの制御下で緑色蛍光タンパク質(GFP)を発現するAAVssh10ベクターで形質導入された錐体細胞の形質導入パターンを示す。AAVshh10-hG1.4(M8)-GFPで形質導入されたヒト胚性幹細胞由来の網膜の凍結切片が示される。錐体細胞の形質導入パターンは、GFP画像化によって可視化された(A)。青色オプシン(S-オプシン; B)とGFP(B')との共局在、及び赤色/緑色オプシン(L/M-オプシン; C)とGFP(C')との共局在は、青色オプシン(S-オプシン)又は赤色/緑色オプシン(L/Mオプシン)のいずれかに結合する抗体を使用した染色後に示される。 図4は、TCUにM8配列を含めることにより、CNGA3ノックアウトマウスにおける明所視応答の救済が増強されることを示す。M8配列有り又は無しの様々なTCUによって駆動されるコドン最適化CNGA3(coCNGA3)構築物を保有するAAV2/8ベクターで処置されたCnga3ノックアウトマウスの明所視網膜電図(ERG)応答が示される。注射の1ヶ月後(左の棒)及び2ヶ月後(右の棒)でのERG応答が示される。右端の群(この群は2週で処置された)を除いて、すべての動物は1ヶ月齢で処置された。 図5は、コドン最適化されたCNGA3が、CNGA3ノックアウトマウスにおいて、野生型CNGA3遺伝子よりも効果的に明所視応答を救済することを示す。コドン最適化されたCNGA3(コドン最適化（「co」）)及び野生型CNGA3構築物(非コドン最適化（「非co」）)を保有するAAV2/8ベクターで処置されたCnga3ノックアウトマウスにおける明所視ERG応答。 図6は、hG1.4 TCUの制御下でCNGA3を発現するAAV2/8ベクターが、CNGA3ノックアウトマウスにおける錐体機能の回復に有効であることを示す。(A)AAV8処置及び未処置Cnga3ノックアウトマウスの明所視ERGトレース。A波及びB波に注釈を付ける。Y軸はμVを示す。光度設定: 10Cdsm^-2。(B)AAV2/8-hG1.4(M8).coCNGA3又はAAV2/5-hG1.4(M8).coCNGA3のいずれかで処置されたCnga3ノックアウトマウスの明所視ERG応答。光度設定: 10Cdsm^-2。 図7は、処置の6ヶ月後までの、2つの異なる最適化TCUの制御下でCNGA3を発現するAAV2/8ベクターによる網膜感度の長期的なインビボ救済を示す。Cnga3欠損マウスに、2週齢で網膜下にAAV2/8-hG1.4(M8).coCNGA3(n=14)又はAAV2/8-hG1.7(M8).coCNGA3(n=13)のいずれかを注射した(両方について力価1×10¹²vg/ml)。未処置(n=3)。光度設定: 10Cdsm-2。 図8は、hG1.7 TCUの制御下でCNGA3を発現するAAV2/8ベクターで処置してから3～4ヶ月後の、インビボでの錐体の増加した生存を示す。3～4ヶ月齢のC57BL/6Jマウス(A)、又はAAV2/8-hG1.7(M8).coCNGA3を注射していない(B)又は2週齢で注射した(C)同月齢のCnga3欠損マウス由来のフラットマウント網膜の単一平面共焦点画像。網膜を錐体アレスチンで染色し、透明化した。スケールバー: 5μm。 図9は、hG1.7 TCUの制御下でCNGA3を発現するAAV2/8ベクターで処置してから13ヶ月後の、インビボでの錐体の長期の増加した生存を示す。2週齢でAAV2/8-hG1.7(M8).coCNGA3を注射した14ヶ月齢のCnga3欠損マウス由来のフラットマウント網膜のZ投影共焦点画像(A、B)又は単一平面共焦点画像(C、D)。未処置は、この月齢で陽性PNA染色を示さない。網膜フラットマウントを、PNA(A、C)及び錐体アレスチン(B、D)で染色し、透明化した。スケールバー: 10μm(A、B)、5μm(C、D)。 図10は、hG1.7 TCUの制御下でCNGA3を発現するAAV2/8ベクターで処置してから3～4ヶ月後の、インビボでの錐体細胞と支持ニューロン(双極細胞)との間のシナプス完全性の改善の定量化を示す。評価は、シナプスマーカーGpr179のシグナル強度を使用して行った。Gpr179染色のシグナル強度の分析は、3～4ヶ月齢のC57BL/6Jマウス、又はAAV2/8-hG1.7(M8).coCNGA3を注射していない又は2週齢で注射した同月齢のCnga3欠損マウス由来のフラットマウント網膜の単一平面共焦点画像について実施した。網膜をGpr179及びPNAで染色し、次いで透明化した。いくつかの錐体茎関連Gpr179染色(錐体茎を確認するためにPNA染色を使用)及び10個を超える桿体小球関連Gpr179染色に対してフリーハンドの線を引くことによって、Gpr179染色をトレースした(A)。シグナル強度が出力された(B; 白色線: Gpr179、赤色線: PNA)。各原点からのシグナル強度のピークを平均し、錐体茎 対 桿体小球関連GPr179 比(CP/RS)を計算した。4つの異なる位置からのCP/RSを、統計分析に使用した(ボンフェローニの多重比較検定(ns: p＞0.05、**: p≦0.01、*: p≦0.05))。エラーバーはSEMを示す(C)。 図11は、AAV8ベクター中のhG1.4 TCUの制御下でのCNGA3の発現が、それぞれAAVベクターAnc80L65、AAV44.9、又はAAV5と比べて、CNGA3欠損マウスにおける改善されたERG応答をもたらすことを示す。(A)Anc80L65とAAV8の比較。hG1.4(M8).coCNGA3発現カセットを保有するAAV-Anc80L65又はAAV8を、2週齢のCnga3欠損マウスに送達した。**: p≦0.01、*: p≦0.05。エラーバーはSEMを示す。(B)4週齢のCnga3欠損マウスにおけるCNGA3の送達に関するAAV8とAAV44.9の比較。エラーバーはSEMを示す。(C)AAV5とAAV8の比較。hG1.4(M8).coCNGA3発現カセットを保有するAAV5又はAAV8を、2週齢のCnga3欠損マウスに送達した。**: p≦0.01、*: p≦0.05。エラーバーはSEMを示す。 図11-1の続きである。 図12は、公知の錐体プロモーターについて観察された発現レベルと比べて、M8変異を保有するTCU hG1.4及びhG1.7についての改善された発現レベルを示す。(A)17～19週齢のhEBを、2つの異なる緑色オプシンプロモーター(hG1.4及びhG1.7)の下でeGFPを発現するAAVShH10で形質導入し、2週後に収集した(各プロモーターについてn=6～8)。解離後、細胞を、フローサイトメトリーによって、GFP陽性細胞における相対中央値蛍光強度(MFI)について分析した(同じ日の実験で分析されたAAVShH10-eGFPで形質導入されたhEBにおける相対MFIを、AAV ShH10-1.7L-eGFPで形質導入されたEBにおけるMFIに対する比として計算した)。アスタリスクは、有意差を示す(p≦0.01)。エラーバーはSEMを示す。(B)AAV2/8-CAR-CNGA3で処置されたか、又は未処置のままの処置Cnga3ノックアウトマウスの明所視ERG応答。Y軸はμVを示す。光度設定: 10Cdsm^-2。

配列の簡単な説明
配列番号1は、ヒトM/Lオプシン遺伝子座制御領域の1.2kb断片のDNA配列を示す。
配列番号2は、ヒトMオプシンプロモーターの2.0kb断片のDNA配列を示す。
配列番号3は、ヒトMオプシンプロモーターの500bp断片のDNA配列を示す。
配列番号4は、hG1.7(M8)構築物の変異体(variant)のDNA配列を示し、これは、ヒトM/Lオプシン遺伝子座制御領域の1.2kb断片と、それに続くヒトMオプシンプロモーターの500bp断片からなり、前記オプシンプロモーター断片は、M8変異を含む。
配列番号5は、ヒトMオプシンプロモーターの200bp断片のDNA配列を示す。
配列番号6は、hG1.4(M8)構築物のcDNA配列を示し、これは、ヒトM/Lオプシン遺伝子座制御領域の1.2kb断片と、それに続くヒトMオプシンプロモーターの200bp断片からなり、前記オプシンプロモーター断片は、M8変異を含む。
配列番号7は、ヒトCNGA3遺伝子のcDNA配列を示す。
配列番号8は、ヒトCNGA3遺伝子のコドン最適化cDNA配列を示す。
配列番号9は、ヒトPDE6C遺伝子のcDNA配列を示す。
配列番号10は、ヒトPDE6H遺伝子のcDNA配列を示す。
配列番号11は、ヒトGNAT2遺伝子のcDNA配列を示す。
配列番号12は、ヒトKCNV2遺伝子のcDNA配列を示す。
配列番号13は、ヒトCACNA2D4遺伝子のcDNA配列を示す。
配列番号14は、ヒトCNGB3遺伝子のcDNA配列を示す。
配列番号15は、hG1.7(M8)構築物のDNA配列を示し、これは、ヒトM/Lオプシン遺伝子座制御領域の1.2kb断片と、それに続く配列GATC、及びヒトMオプシンプロモーターの500bp断片を含み、前記オプシンプロモーター断片は、M8変異を含む。
配列番号16は、M8変異の配列を示す。
配列番号17は、M8変異を含有するヒトMオプシンプロモーターの2.0kb断片のDNA配列を示す。

発明の詳細な説明
開示されるポリヌクレオチド配列の様々な適用は、当技術分野における特定の必要性に合わせて調整し得ることを理解されたい。また、本明細書で使用される用語は、本発明の特定の実施形態を単に説明するためのものであり、限定することを意図するものではないことも理解されたい。

さらに、本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形の「1つの(a)」、「1つの(an)」及び「その(the)」は、その内容が別段明白に指示しない限り、複数の参照対象を含む。したがって、例えば、「ポリヌクレオチド」への言及は「複数のポリヌクレオチド」を含み、「プロモーター」への言及は「複数のプロモーター」を含み、「ベクター」への言及は2つ以上のそのようなベクターを含むなどである。「M/Lオプシン」及び「L/Mオプシン」は、緑色及び赤色オプシンを指すために互換的に使用される。

本明細書において引用されるすべての刊行物、特許及び特許出願は、上記又は下記にかかわらず、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。

転写制御ユニット(TCU)
一態様において、本発明は、錐体光受容細胞における遺伝子の発現について最適化されたTCUを提供する。一実施形態において、本開示は、M/Lオプシン遺伝子座制御領域(LCR)の断片を含むTCUを提供する。好ましい実施形態において、TCUは、ヒトM/Lオプシン遺伝子座制御領域(LCR)の断片を含む。

別の実施形態において、本開示は、プロモーター領域、例えばMオプシンプロモーター又はその断片を含むTCUを提供する。好ましい実施形態において、本明細書に開示されるTCUは、ヒトMオプシンプロモーター又はその断片を含む。

いくつかの実施形態において、TCUは、ヒトM/Lオプシン遺伝子座制御領域(LCR)の断片及び/若しくは変異体、並びにヒトMオプシンプロモーター若しくはその断片を含み、TCUは、錐体光受容体特異的プロモーター活性を有する。

一実施形態において、TCUは、作動可能に連結されたポリヌクレオチド配列の錐体光受容体特異的発現を与える、配列番号1からのヌクレオチド、典型的には連続したヌクレオチドの配列を含むLCRを含む。配列番号1に対して少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、又は少なくとも99%の配列同一性を有する配列を含むLCRがさらに企図される。いくつかの実施形態において、LCRは、1つ以上のヌクレオチドの欠失又は挿入を含有し、その欠失又は挿入は、改変されたLCRに作動可能に連結された遺伝子ペイロードの錐体光受容体特異的発現を無効化しない。

一実施形態において、TCUは、Mオプシンプロモーター又はその断片を含み、Mオプシンプロモーター又はその断片は、作動可能に連結されたポリヌクレオチド配列に対して錐体光受容体特異的発現を与える、配列番号2又は配列番号17からのヌクレオチド、典型的には連続したヌクレオチドの配列を含む。Mオプシンプロモーター又はその断片は、例えば、配列番号2又は配列番号17の最大1200個のヌクレオチド、好ましくは配列番号2又は配列番号17の1100個以下、1000個以下、900個以下、800個以下、700個以下、600個以下、500個以下、400個以下、300個以下、又は200個以下のヌクレオチドを含んでもよい。いくつかの実施形態において、Mオプシンプロモーターの断片は、配列番号2又は配列番号17の少なくとも200個、300個、400個又は500個のヌクレオチドを含む。配列番号2又は配列番号17の少なくとも200個、少なくとも300個、少なくとも400個、又は少なくとも500個連続したヌクレオチドに対して少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、又は少なくとも99%の配列同一性を有するMオプシンプロモーターの断片がさらに企図される。いくつかの実施形態において、Mオプシンプロモーター又はその断片は、1つ以上のヌクレオチドの欠失又は挿入を含有し、その欠失又は挿入は、改変されたMオプシンプロモーター又は断片に作動可能に連結された遺伝子ペイロードの錐体光受容体特異的発現を無効化しない。いくつかの実施形態において、Mオプシンプロモーター又はその断片は、配列番号2又は配列番号17から本質的になる。いくつかの実施形態において、Mオプシンプロモーター又はその断片は、配列番号2又は配列番号17からなる。

好ましくは、TCUは、配列番号3又は配列番号3と実質的に同一である配列を含むMオプシンプロモーターの断片を含む。配列番号3の少なくとも200個、少なくとも300個、少なくとも400個、若しくは少なくとも500個のヌクレオチド、又は配列番号3の少なくとも200個、少なくとも300個、少なくとも400個、若しくは少なくとも500個のヌクレオチドに対して少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、又は少なくとも99%の配列同一性を有する配列を含むMオプシンプロモーターの断片を含むTCUがさらに企図される。いくつかの実施形態において、Mオプシンプロモーターの断片は、配列番号3から本質的になる。いくつかの実施形態において、Mオプシンプロモーターの断片は、配列番号3からなる。

いくつかの実施形態において、TCUは、配列番号3の少なくとも200個のヌクレオチド、又は配列番号3の少なくとも200個のヌクレオチドに対して少なくとも90%の配列同一性を有する配列、並びに配列番号3のヌクレオチド1～35の少なくとも10個、少なくとも15個、少なくとも20個、少なくとも25個、少なくとも30個若しくは少なくとも35個連続したヌクレオチドを含む配列を含む。いくつかの実施形態において、TCUは、配列番号3の少なくとも200個のヌクレオチド、又は配列番号3の少なくとも200個のヌクレオチドに対して少なくとも90%の配列同一性を有する配列、並びに配列番号3のヌクレオチド1～35に対応する少なくとも10個、少なくとも15個、少なくとも20個、少なくとも25個、少なくとも30個若しくは少なくとも35個連続したヌクレオチドに対して少なくとも90%の配列同一性を有する配列を含む。

好ましくは、TCUは、配列番号5又は配列番号5と実質的に同一である配列を含むMオプシンプロモーターの断片を含む。いくつかの実施形態において、Mオプシンプロモーターの断片は、配列番号5から本質的になる。いくつかの実施形態において、Mオプシンプロモーターの断片は、配列番号5からなる。

TCUにおける使用について企図される追加のプロモーター及びその断片は、上記の配列とは配列が異なるが、錐体光受容体特異的プロモーター活性を保持するプロモーター又はプロモーター断片である。そのような配列は、上に定義されるように、配列番号2又は配列番号17からの連続したヌクレオチドの配列に対して少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、又は少なくとも99%の配列同一性を有する。変異体の配列同一性パーセンテージは、好ましくは、変異体配列とアラインメントされた配列番号2若しくは配列番号17の対応する部分の全長にわたって、又は配列番号2若しくは配列番号17の500個、600個、700個、800個、900個、1000個、1100個又は1200個のヌクレオチドセクションにわたって測定される。配列番号3及び/又は配列番号5に対して少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、又は少なくとも99%の配列同一性を有する配列を含むプロモーター及びその断片がさらに企図される。

配列同一性は、任意の適切なアルゴリズムを使用して計算することができる。例えば、PILEUP及びBLASTアルゴリズムを使用して、例えば、Altschul S. F. (1993) J Mol Evol 36:290-300; Altschul, S, F et al (1990) J Mol Biol 215:403-10に記載されるようにして、同一性を計算し、又は配列をアラインメントする(例えば、同等の又は対応する配列を同定する)(典型的にはそれらのデフォルト設定上で)ことができる。BLAST分析を実施するためのソフトウェアは、National Center for Biotechnology Information(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)から公けに入手することができる。このアルゴリズムは、最初に、データベース配列中の同じ長さのワードとアラインメントさせた場合、何らかの正の値の閾値スコアTに一致する、又はこれを満たす、照会配列中の長さWのショートワードを同定することによって、ハイスコアの配列対(HSP)を同定することを含む。Tは、近傍ワードスコア閾値と呼ばれる(Altschul et al、前掲)。これらの最初の近傍ワードのヒットは、それらを含有するHSPを見つけるための検索を開始するためのシードとして働く。ワードヒットは、累積的なアラインメントスコアが増加し得る限り、それぞれの配列に沿って両方向に延長される。それぞれの方向におけるワードヒットのための延長は、累積的なアラインメントスコアがその最大達成値から量Xだけ減少した場合; 累積的なスコアが、1つ以上の負のスコアリング残基アラインメントの蓄積によってゼロ以下になる場合; 又は、いずれかの配列の末端に到達した場合に停止する。BLASTアルゴリズムパラメーターW、T及びXは、アラインメントの感度及び速度を決定する。BLASTプログラムは、デフォルトとして、ワード長(W)11、BLOSUM62スコアリングマトリックス(Henikoff and Henikoff (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915-10919を参照)アラインメント(B)50、期待値(E)10、M=5、N=4、及び両鎖の比較を用いる。

BLASTアルゴリズムは、2つの配列間の類似性の統計分析を実施する。例えば、Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5787を参照されたい。BLASTアルゴリズムによって提供される類似性の1つの尺度は、2つのポリヌクレオチド間又はアミノ酸配列間のマッチが偶然生じる確率の表示を提供する、最小合計確率(P(N))である。例えば、配列は、第1の配列の第2の配列に対する比較において、最小合計確率が約1未満、好ましくは約0.1未満、より好ましくは約0.01未満、最も好ましくは約0.001未満である場合、別の配列に類似していると考えられる。或いは、UWGCGパッケージは、(例えば、そのデフォルト設定で使用される)同一性の計算に使用可能なBESTFITプログラムを提供する(Devereux et al (1984) Nucleic Acids Research 12, 387-395)。

いくつかの実施形態において、TCUは、M8変異配列TCTAGA(配列番号16)を含有するMオプシンプロモーター又はその断片を含む。一実施形態において、TCUは、配列番号16の1、2、3、4、5、又は6個のヌクレオチドを含有するM-オプシンプロモーター又はその断片を含む。例えば、配列番号2のヌクレオチド1934～1939(GGGCCG)に対応するヌクレオチドは、配列番号16によって置き換えられてもよい。

いくつかの実施形態において、TCUは、M/LオプシンLCR及び/又はM-オプシンプロモーター領域中に天然には見られない追加のヌクレオチド配列を含む。追加のヌクレオチド配列は、LCR又はM-オプシンプロモーター領域のいずれかの5'又は3'であってよい。いくつかの実施形態において、追加の配列は、LCRとM-オプシンプロモーター領域との間に位置する。一実施形態において、配列「GATC」は、LCR領域とM-オプシン領域との間に位置する。

一実施形態において、TCUは、配列番号4を含む。一実施形態において、TCUは、配列番号6を含む。一実施形態において、TCUは、配列番号15を含む。

配列番号4、配列番号6又は配列番号15に対して少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、又は少なくとも99%の配列同一性を有する配列を含むTCUがさらに企図される。

一実施形態において、TCUは、配列番号4から本質的になる。一実施形態において、TCUは、配列番号6から本質的になる。一実施形態において、TCUは、配列番号15から本質的になる。

一実施形態において、TCUは、配列番号4からなる。一実施形態において、TCUは、配列番号6からなる。一実施形態において、TCUは、配列番号15からなる。

錐体光受容体特異的プロモーター活性が保持される限り、TCUを、より大きな配列内のどこにさらに位置していてもよい。実施形態において、本明細書に記載されるTCUは、本明細書に記載される錐体光受容体特異的方法で発現させるべき遺伝子(例えば、ペイロード)の5'、又はすぐ5'に位置する。

TCUはまた、他の調節エレメント、例えば1つ以上のさらなるプロモーター、エンハンサー、及び/又はLCRと共にタンデムで使用することができる。

TCUは、単離された核酸分子の形態で提供してもよい。

本開示によって提供されるTCUは、錐体光受容体特異的方法で錐体光受容体における遺伝子(ペイロード)の発現を駆動するために使用することができる。錐体光受容体特異的発現は、錐体光受容体のみに存在するが、他の細胞型に顕著には存在しない発現として定義し得る。錐体光受容体特異的発現は、錐体光受容体において、他の細胞型、特に桿体光受容細胞におけるよりも約10倍多い、20倍多い、50倍多い、又は100倍若しくはそれを超えて多い発現として定義し得る。錐体光受容体及び他の細胞型における発現は、当業者に公知の任意の適切な標準技術によって測定することができる。例えば、RNA発現レベルは、定量的リアルタイムPCRによって測定することができる。タンパク質発現は、ウェスタンブロット又は免疫組織化学によって測定することができる。本明細書で提供されるTCUは、すべての錐体光受容体亜型において作動可能に連結された遺伝子の発現を提供する。

本開示によって提供されるTCUは、参照TCU又はプロモーターと比べて、錐体光受容体における遺伝子の顕著に増加した発現を駆動するために使用することができる。顕著に増加した発現は、参照TCU又はプロモーター(元のM-オプシンプロモーターを含むがこれに限定されない)によって駆動される発現と比べた場合、錐体光受容体における遺伝子の約10倍、20倍、50倍、100倍、200倍、又は300倍を超える発現として定義することができる。錐体光受容体及び他の細胞型における発現は、当業者に公知の任意の適切な標準技術によって測定することができる。例えば、RNA発現レベルは、定量的リアルタイムPCRによって測定することができる。タンパク質発現は、ウェスタンブロット又は免疫組織化学によって測定することができる。

本開示によって提供されるTCUは、GFPなどの錐体光受容体では通常発現されないタンパク質を発現するヌクレオチド配列を含む、錐体光受容体におけるヌクレオチド配列をコードするタンパク質の発現を駆動するために使用することができる。

例えば、本開示で提供されるTCUは、錐体光受容体の正常な機能に必要な、錐体光受容体における遺伝子を発現するのに有用であり、この遺伝子としては、以下に限定されないが、グアニンヌクレオチド結合タンパク質G(t)サブユニットアルファ-2(GNAT2)、環状ヌクレオチド開口型カチオンチャネルアルファ-3(CNGA3)、環状ヌクレオチド開口型カチオンチャネルベータ-3(CNGB3)、錐体cGMP特異的3',5'-環状ホスホジエステラーゼサブユニットアルファ'(PDE6C)、網膜錐体ロドプシン感受性cGMP3',5'-環状ホスホジエステラーゼサブユニットガンマ(PDE6H)、カリウム電位開口型チャネルサブファミリーVメンバー2(KCNV2)、及び電位依存性カルシウムチャネルサブユニットアルファ-2/デルタ-4(CACNA2D4)(錐体の正常な機能に必須なタンパク質である)が挙げられる。したがって、本発明は、錐体光受容体において、例えば、GNAT2、CNGA3、CNGB3、PDE6C、PDE6H、KCNV2、及びCACNA2D4遺伝子を発現するためのTCU及び方法を提供する。PDE6C、GNAT2、CNGA3及びCNGB3遺伝子は、色覚異常に寄与する遺伝子の4つである。PDE6Cは、錐体cGMP特異的3',5'-環状ホスホジエステラーゼのアルファサブユニットである。GNAT2は、錐体光伝達カスケードの必須エレメントである錐体トランスデューシンのアルファ成分である。CNGA3は、光に応答して閉じ、それによって錐体細胞を過分極させる錐体環状ヌクレオチド開口型イオンチャネルのアルファサブユニットである。CNGB3は、光に応答して閉じ、それによって錐体細胞を過分極させる錐体環状ヌクレオチド開口型イオンチャネルのベータサブユニットである。

発現構築物
本発明はまた、錐体光受容体特異的方法で発現させるべき配列、例えば遺伝子配列に作動可能に連結された、本明細書に開示されるTCUを含む発現構築物を提供する。

用語「作動可能に連結された」は、記載される成分が、それらの意図された方法で機能することを可能にする関係にある並置を指す。コード配列に「作動可能に連結された」制御配列は、コード配列の発現が制御配列と適合する条件下で達成されるように連結される。同じ又は異なるポリヌクレオチドの多重コピーを、発現構築物に導入してもよい。発現構築物は、コード配列を含有するポリヌクレオチド配列からタンパク質発現を駆動することができるポリヌクレオチド配列として定義し得る。

したがって、発現構築物は、例えば、PDE6H、PDE6C、GNAT2、KCNV2、CACNA2D4、CNGA3又はCNGB3コード配列、例えば、配列番号7～14から選択されるポリヌクレオチド、又は配列番号7～14から選択される配列から翻訳されるタンパク質の機能性を保持する配列番号7～14の変異体を含んでもよい。

配列番号7～14からなる群から選択されるポリヌクレオチドの変異体は、核酸配列における天然に存在する変異体を含む、配列番号7～14の配列の任意の変異体として定義し得る。変異体は、配列番号7～14のいずれか1つに対して少なくとも約60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%又は99%の配列同一性を有すると定義することができ、変異体配列から翻訳されるポリペプチドは、その機能性を保持する。変異体は、配列番号7～14のいずれか1つに対して少なくとも約60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%又は99%の配列同一性を有すると定義することができ、変異体配列から翻訳されるポリペプチドは、錐体光受容体機能を救済する能力を有する。実施形態において、変異体は、コード配列のコドン最適化型である。

本開示によって企図される発現構築物は、錐体光受容体機能を救済し得る。錐体光受容体機能の救済は、錐体光受容体機能の少なくとも約50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%を回復させることと定義することができる。錐体光受容体機能は、当業者に公知の任意の適切な標準技術によって、例えば、網膜応答の網膜電図検査分析によって分析することができる。

錐体光受容体機能の救済はまた、錐体生存を延長することと定義することができる。錐体生存の延長は、錐体ジストロフィーの影響を受けた錐体光受容体と比べた場合、錐体光受容体が機能的である時間を、約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、100%、又は100%を超えて延長することと定義することができる。錐体光受容体機能は、当業者に公知の任意の適切な標準技術によって、例えば、網膜応答の網膜電図検査分析によって分析することができる。錐体生存の延長の例はまた、ERG活性の改善又はERG活性の喪失の遅延、網膜感度の改善又は網膜感度の進行性喪失の遅延/停止、光受容細胞の喪失の遅延又は停止、視力の改善、又は視力喪失の遅延/停止を含む。

本発明の発現構築物は、CNGA3遺伝子に作動可能に連結されたTCUを含んでもよい。いくつかの実施形態において、CNGA3遺伝子配列は、配列番号7を含む。いくつかの実施形態において、CNGA3遺伝子は、コドン最適化配列を含む。「コドン最適化」は、標的生物、例えばヒトにおける発現を増強するために、天然に存在するポリヌクレオチド配列を変更するプロセスに関する。本発明の一実施形態において、ヒトCNGA3遺伝子、配列番号7は、最適化されて、配列番号8を作製する。配列番号8の最適化されたCNGA3 cDNAにおいて、希少コドンは、より頻繁に生じるもの、及び/又は高度に発現されるヒト遺伝子で頻繁に見つかるものと置き換えられている。

一実施形態において、発現構築物は、配列番号8に作動可能に連結されたTCUを含む。

ベクター
本発明は、本明細書に開示される核酸、TCU、プロモーター及びその断片、最適化された遺伝子、及び発現構築物を含むベクターを提供する。ベクターは、任意のタイプのものであってよく、例えば、プラスミドベクター又はミニサークルDNAであってもよい。

療法の効力は、一般に、示されたDNAの適切で効率的な送達に依存する。このプロセスは、通常、ウイルスベクターによって媒介される。したがって、本発明は、例えば単純ヘルペスウイルス、アデノウイルス、又はレンチウイルスに基づき得る、ウイルスベクターを提供する。ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクター又はその誘導体であってもよい。AAVは、一般に非病原性であるため、特に魅力的なベクターである; 大多数の人々は、悪影響無しに、生涯このウイルスに感染している。解剖学的障壁及び免疫調節因子の結果である眼組織の免疫特権により、眼は、有害な免疫学的応答から大部分免除される。

一実施形態において、ウイルスベクターは、AAVの天然由来の血清型、単離物若しくはクレード、又はその誘導体からのAAVゲノムを含む。

「AAVゲノム」は、AAVウイルス粒子の産生に必要とされる機能をコードするポリヌクレオチド配列である。これらの機能は、AAVゲノムのAAVウイルス粒子へのキャプシド形成を含む、宿主細胞におけるAAVの複製及びパッケージングサイクルにおいて作動するものを含む。天然に存在するAAVウイルスは、複製欠損性であり、複製及びパッケージングサイクルの完了に関して、トランス(trans)でのヘルパー機能の提供に依存する。したがって、及びAAV rep遺伝子及びcap遺伝子のさらなる除去により、本発明のベクターのAAVゲノムは、複製欠損性である。

AAVゲノムは、一本鎖形態(ポジティブセンス又はネガティブセンスのいずれか)であってもよく、又は二本鎖形態であってもよい。二本鎖形態の使用により、標的細胞におけるDNA複製ステップの回避が可能となり、そのため、導入遺伝子の発現を加速させることができる。

AAVゲノムは、AAVの任意の天然由来の血清型又は単離物又はクレードに由来してもよい。当業者に公知であるように、自然界に存在するAAVウイルスは、様々な生物系に従って分類し得る。

一般に、AAVウイルスは、その血清型に関して言及される。「血清型」は、キャプシド表面抗原のその発現プロファイルのため、他の変異体亜種から区別するために使用することができる特有の反応性を有するAAVの変異体亜種に対応する。典型的には、特定のAAV血清型を有するウイルスは、任意の他のAAV血清型に特異的な中和抗体と効率的に交差反応しない。AAV血清型は、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10及びAAV11、さらに組換え血清型、例えば、霊長類の脳から最近同定されたRec2及びRec3を含む。本発明のベクターにおいて、ゲノムは、任意のAAV血清型に由来してもよい。キャプシドもまた、任意のAAV血清型に由来してよい。ゲノム及びキャプシドは、同じ血清型又は異なる血清型に由来してよい。

一実施形態において、本明細書に開示されるベクターのゲノムは、AAV血清型2(AAV2)、AAV血清型4(AAV4)、AAV血清型(AAV5)又はAAV血清型8(AAV8)に由来する。使用し得る他のAAVベクターとしては、AAV44.9及びAAV-Anc80に由来するベクターが挙げられる。ゲノムはAAV2(ヘパリン硫酸プロテオグリカン受容体を介して標的細胞に結合する)に由来するのが最も好ましいが、本発明における使用に関して特に興味が持たれる他の血清型としては、AAV4、AAV5及びAAV8(網膜色素上皮などの眼における組織を効率的に形質導入する)が挙げられる。

本発明において使用するためのAAVゲノム、又はAAVゲノムのエレメント、例えばITR配列、rep遺伝子若しくはcap遺伝子の配列は、AAV全ゲノム配列に関する以下のアクセッション番号から得てもよい: アデノ随伴ウイルス1 NC_002077、AF063497; アデノ随伴ウイルス2 NC_001401; アデノ随伴ウイルス3 NC_001729; アデノ随伴ウイルス3B NC_001863; アデノ随伴ウイルス4 NC_001829; アデノ随伴ウイルス5 Y18065、AF085716; アデノ随伴ウイルス6 NC_001862; トリAAV ATCC VR-865 AY186198、AY629583、NC_004828; トリAAV株DA-1 NC_006263、AY629583; ウシAAV NC_005889、AY388617。

AAVウイルスはまた、クレード又はクローンに関して言及し得る。これは、天然由来のAAVウイルスの系統発生関係を指し、典型的には、共通祖先まで遡及することができ、そのすべての子孫を含む、AAVウイルスの系統発生群を指す。さらに、AAVウイルスは、特定の単離物、すなわち、自然界で見出された特定のAAVウイルスの遺伝的単離物に関して言及し得る。遺伝的単離物という用語は、他の天然に存在するAAVウイルスとの限定された遺伝子混合を受けたAAVウイルスの集団を説明し、それによって、遺伝子のレベルで認識可能に異なる集団を定義する。

本発明に使用し得るAAVのクレード及び単離物の例としては、以下のものが挙げられる:

クレードA: AAV1 NC_002077、AF063497、AAV6 NC_001862、Hu.48 AY530611、Hu 43 AY530606、Hu 44 AY530607、Hu 46 AY530609、

クレードB: Hu. 19 AY530584、Hu. 20 AY530586、Hu 23 AY530589、Hu22 AY530588、Hu24 AY530590、Hu21 AY530587、Hu27 AY530592、Hu28 AY530593、Hu 29 AY530594、Hu63 AY530624、Hu64 AY530625、Hu13 AY530578、Hu56 AY530618、Hu57 AY530619、Hu49 AY530612、Hu58 AY530620、Hu34 AY530598、Hu35 AY530599、AAV2 NC_001401、Hu45 AY530608、Hu47 AY530610、Hu51 AY530613、Hu52 AY530614、Hu T41 AY695378、Hu S17 AY695376、Hu T88 AY695375、Hu T71 AY695374、Hu T70 AY695373、Hu T40 AY695372、Hu T32 AY695371、Hu T17 AY695370、Hu LG15 AY695377、

クレードC: Hu9 AY530629、Hu10 AY530576、Hu11 AY530577、Hu53 AY530615、Hu55 AY530617、Hu54 AY530616、Hu7 AY530628、Hu18 AY530583、Hu15 AY530580、Hu16 AY530581、Hu25 AY530591、Hu60 AY530622、Ch5 AY243021、Hu3 AY530595、Hu1 AY530575、Hu4 AY530602 Hu2、AY530585、Hu61 AY530623、

クレードD: Rh62 AY530573、Rh48 AY530561、Rh54 AY530567、Rh55 AY530568、Cy2 AY243020、AAV7 AF513851、Rh35 AY243000、Rh37 AY242998、Rh36 AY242999、Cy6 AY243016、Cy4 AY243018、Cy3 AY243019、Cy5 AY243017、Rh13 AY243013、

クレードE: Rh38 AY530558、Hu66 AY530626、Hu42 AY530605、Hu67 AY530627、Hu40 AY530603、Hu41 AY530604、Hu37 AY530600、Rh40 AY530559、Rh2 AY243007、Bb1 AY243023、Bb2 AY243022、Rh10 AY243015、Hu17 AY530582、Hu6 AY530621、Rh25 AY530557、Pi2 AY530554、Pi1 AY530553、Pi3 AY530555、Rh57 AY530569、Rh50 AY530563、Rh49 AY530562、Hu39 AY530601、Rh58 AY530570、Rh61 AY530572、Rh52 AY530565、Rh53 AY530566、Rh51 AY530564、Rh64 AY530574、Rh43 AY530560、AAV8 AF513852、Rh8 AY242997、Rh1 AY530556、

クレードF: Hu14 (AAV9) AY530579、Hu31 AY530596、Hu32 AY530597、クローン単離物AAV5 Y18065、AF085716、AAV 3 NC_001729、AAV 3B NC_001863、AAV4 NC_001829、Rh34 AY243001、Rh33 AY243002、Rh32 AY243003。

当業者は、本発明に使用するためのAAVの適切な血清型、クレード、クローン又は単離物を、共通の一般知識に基づいて選択することができる。

しかし、本発明はまた、未だ同定又は特徴決定されていない可能性がある他の血清型のAAVゲノムの使用も包含することが理解されるべきである。AAV血清型は、AAVウイルスの感染の組織特異性(又はトロピズム)を決定する。したがって、本発明に従って患者に投与されるAAVウイルスに使用するのに好ましいAAV血清型は、標的錐体光受容細胞に対し天然トロピズムを有するものであるか、又は標的錐体光受容細胞の高効率感染性を有するものである。

ウイルス遺伝子を含有する野生型AAVは、ゲノム材料を、宿主細胞の第19番染色体に挿入する。AAV一本鎖DNAゲノムは、2つの逆方向末端反復(ITR)、並びに構造(キャップ(cap))及びパッケージング(rep)遺伝子を含有する2つのオープンリーディングフレームを含む。

典型的には、AAVの天然由来血清型又は単離物又はクレードのAAVゲノムは、少なくとも1つの逆方向末端反復配列(ITR)を含む。本発明のベクターは、典型的には、2つのITR、好ましくはゲノムの各末端に1つのITRを含む。ITR配列は、シス(cis)で作用して機能的な複製起点を提供し、細胞のゲノムからのベクターの組み込み及び切除を可能にする。好ましいITR配列は、AAV2及びその変異体のものである。AAVゲノムは、典型的には、AAVウイルス粒子のパッケージング機能をコードするパッケージング遺伝子、例えばrep遺伝子及び/又はcap遺伝子を含む。rep遺伝子は、タンパク質Rep78、Rep68、Rep52及びRep40又はその変異体の1つ以上をコードする。cap遺伝子は、1つ以上のキャプシドタンパク質、例えばVP1、VP2及びVP3、又はその変異体をコードする。これらのタンパク質は、AAVウイルス粒子のキャプシドを構成する。キャプシド変異体については以下で論じる。

治療目的のために、ITRは、治療遺伝子に加えてシスで提供されてもよい。したがって、AAVウイルスを改変してもよい。すなわち、ウイルス遺伝子をゲノムから除去して、組換えAAV(rAAV)を生成してもよい。rAAVは、治療遺伝子及び少なくとも1つのITRを含有する。ウイルス遺伝子の除去によって、rAAVは、宿主細胞DNAにそのゲノムを積極的に挿入することができなくなる。代わりに、rAAVゲノムは、ITRを介して融合し、環状エピソーム構造を形成するか、又は既存の染色体切断に挿入する。ウイルス産生に関し、ここでrAAVから除去された構造遺伝子及びパッケージング遺伝子は、トランスで、ヘルパープラスミドの形態で供給される。

好ましくは、AAVゲノムは、患者への投与を目的として誘導体化される。そのような誘導体化は当技術分野では標準的であり、本発明は、AAVゲノムの任意の公知の誘導体、及び当技術分野で公知の技術を適用することにより生成することができる誘導体の使用を包含する。

AAVゲノムの誘導体は、インビボにおいて本発明のベクターからRep-1導入遺伝子を発現させることができる、AAVゲノムの任意の切断形態又は改変形態を含む。典型的には、上記の機能を保持しつつ、最小のウイルス配列を含むようにAAVゲノムを大幅に切断することが可能である。これは、ベクターの野生型ウイルスとの組換えのリスクを低減し、また標的細胞におけるウイルス遺伝子タンパク質の存在による細胞性免疫反応の誘発を回避する安全上の理由から好ましい。

典型的には、誘導体は、少なくとも1つの逆方向末端反復配列(ITR)、好ましくは2つ以上のITR、例えば2つのITR又はそれより多くのITRを含む。ITRの1つ以上は、異なる血清型を有するAAVゲノムに由来してもよく、又はキメラITR若しくは変異体ITRであってもよい。好ましい変異体ITRは、trs(末端分解部位)の欠失を有するものである。この欠失によって、ゲノムを連続複製して、コード配列及び相補的配列の両方を含有する一本鎖ゲノム、すなわち、自己相補的AAVゲノムを生成することが可能となる。これにより、標的細胞におけるDNA複製の回避が可能となり、その結果、導入遺伝子の発現を加速させることができる。

1つ以上のITRは、好ましくは、本発明のプロモーター及び導入遺伝子を含有する発現構築物カセットに隣接する。1つ以上のITRを含めることは、本発明のベクターのウイルス粒子へのパッケージングを促進するために好ましい。好ましい実施形態において、ITRエレメントは、誘導体において天然AAVゲノムから保持されている唯一の配列である。したがって、誘導体は、好ましくは、天然ゲノムのrep遺伝子及び/又はcap遺伝子、並びに天然ゲノムの任意の他の配列を含まない。これは、上記の理由のために、また宿主細胞ゲノムへのベクターの組み込みの可能性を低減させるために好ましい。さらに、AAVゲノムのサイズを小さくすることにより、導入遺伝子に加えて、ベクター内に他の配列エレメント(例えば、調節エレメント)を組み込む際に柔軟性を高めることが可能となる。

したがって、AAV2ゲノムに関しては、以下の部分を本発明の誘導体において除去することができる: 1つの逆方向末端反復(ITR)配列、複製(rep)遺伝子及びキャプシド(cap)遺伝子。しかし、インビトロ(in vitro)での実施形態を含むいくつかの実施形態においては、誘導体は、1つ以上のrep遺伝子及び/若しくはcap遺伝子、又はAAVゲノムの他のウイルス配列をさらに含んでもよい。

誘導体は、1つ以上の天然に存在するAAVウイルスのキメラ、シャッフル又はキャプシド改変誘導体であってよい。本発明は、同じベクター内のAAVの異なる血清型、クレード、クローン又は単離物由来のキャプシドタンパク質配列の提供を包含する。本発明は、ある血清型のゲノムを別の血清型のキャプシドにパッケージングすること、すなわちシュードタイプ化することを包含する。

キメラ、シャッフル又はキャプシド改変誘導体は、典型的には、ウイルスベクターに1つ以上の所望の機能性を提供するように選択される。したがって、これらの誘導体は、天然に存在するAAVゲノム、例えばAAV2のゲノムを含むAAVウイルスベクターと比べて、遺伝子送達の効率の増加、免疫原性(液性若しくは細胞性)の減少、トロピズム範囲の変更、及び/又は特定の細胞型の標的化の改善を示し得る。遺伝子送達の効率の増加は、細胞表面での受容体若しくは共受容体結合の改善、内在化の改善、細胞内及び核への輸送の改善、ウイルス粒子の脱殻の改善、及び一本鎖ゲノムから二本鎖形態への変換の改善によってもたらされてもよい。効率の増加はまた、必要とされない組織への投与によってベクター用量が希釈されないように、トロピズム範囲の変更又は特定細胞集団の標的化に関連し得る。

キメラキャプシドタンパク質は、天然に存在するAAV血清型の2つ以上のキャプシドコード配列間の組換えによって生成されるものを含む。これは、例えば、ある血清型の非感染性キャプシド配列が、異なる血清型のキャプシド配列と同時にトランスフェクトされ、指向性選択を使用して所望の特性を有するキャプシド配列について選択する、マーカー救済手法によって実施してもよい。異なる血清型のキャプシド配列は、細胞内の相同組換えによって変更され、新規キメラキャプシドタンパク質を生成することができる。

キメラキャプシドタンパク質はまた、キャプシドタンパク質配列を操作し、2つ以上のキャプシドタンパク質間、例えば、異なる血清型の2つ以上のキャプシドタンパク質間に特定のキャプシドタンパク質ドメイン、表面ループ又は特定のアミノ酸残基を導入することによって生成されるものを含む。

シャッフル又はキメラキャプシドタンパク質はまた、DNAシャッフリング又はエラープローンPCRによって生成してもよい。ハイブリッドAAVキャプシド遺伝子は、関連するAAV遺伝子の配列、例えば、複数の異なる血清型のキャプシドタンパク質をコードするものをランダムに断片化し、続いて、配列相同性の領域においてクロスオーバーを引き起こし得る自己プライミングポリメラーゼ反応で断片を再会合させることによって作製することができる。いくつかの血清型のキャプシド遺伝子をシャッフリングすることによってこのように作製されたハイブリッドAAV遺伝子のライブラリーをスクリーニングして、所望の機能性を有するウイルスクローンを同定することができる。同様に、エラープローンPCRを使用して、AAVキャプシド遺伝子をランダムに変異させ、変異体の多様なライブラリーを作製し、次いで、これを所望の特性について選択してもよい。

キャプシド遺伝子の配列はまた、遺伝的に改変し、天然野生型配列に関して特定の欠失、置換又は挿入を導入してもよい。特に、キャプシド遺伝子は、キャプシドコード配列のオープンリーディングフレーム内に、又はキャプシドコード配列のN末端及び/若しくはC末端に、無関係のタンパク質又はペプチドの配列を挿入することによって改変してもよい。

無関係のタンパク質又はペプチドは、有利には、特定の細胞型に対するリガンドとして作用し、それによって、標的細胞への結合の改善をもたらすか、又は特定の細胞集団に対するベクターの標的化の特異性を改善するものであってもよい。

無関係のタンパク質はまた、産生プロセスの一部として、ウイルス粒子の精製を補助するもの、すなわち、エピトープ又はアフィニティータグであってもよい。挿入の部位は、典型的には、ウイルス粒子の他の機能、例えば、ウイルス粒子の内在化、輸送に干渉しないように選択される。当業者は、共通の一般知識に基づき、挿入に適した部位を同定することができる。

本発明は、天然AAVゲノムのものとは異なる順序及び配置におけるAAVゲノムの配列の提供をさらに包含する。本発明はまた、1つ以上のAAV配列又は遺伝子を、別のウイルス由来の配列と、又は2つ以上のウイルス由来の配列から構成されるキメラ遺伝子と置き換えることも包含する。そのようなキメラ遺伝子は、異なるウイルス種の2つ以上の関連するウイルスタンパク質由来の配列から構成されてもよい。

本発明のベクターは、本発明のプロモーター及び発現構築物を含むウイルスベクターの形態をとる。

疑念を回避するため、本発明はまた、本発明のベクターを含むAAVウイルス粒子も提供する。本発明のAAV粒子は、ある血清型のITRを有するAAVゲノム又は誘導体が、異なる血清型のキャプシドにパッケージングされる、トランスキャプシド化形態を含む。本発明のAAV粒子はまた、2つ以上の異なる血清型由来の未改変キャプシドタンパク質の混合物が、ウイルスエンベロープを構成する、モザイク形態を含む。AAV粒子はまた、キャプシド表面に吸着されたリガンドを有する化学修飾形態を含む。例えば、そのようなリガンドは、特定の細胞表面受容体を標的とするための抗体を含んでもよい。

AAV2ゲノムは、すべてのAAV血清型のゲノムと同様に、いくつかの異なるキャプシドタンパク質に封入することができる。AAV2は、その天然AAV2キャプシドにパッケージングすることができ(AAV2/2)、又は他のキャプシドでシュードタイプ化することができる(例えば、AAV2/1をもたらすAAV1キャプシド中のAAV2ゲノム、又はAAV2/8をもたらすAAV8キャプシド中のAAV2ゲノム)。

好ましい実施形態において、AAVキャプシドは、AAV8に由来する。作動可能に連結された配列がCNGA3遺伝子である、特に好ましい実施形態において、キャプシドは、AAV8であるか、又はAAV5以外の別のキャプシドであることが好ましい。

AAVは、血清型特異的受容体を介したエンドサイトーシスにより細胞に形質導入する。rAAV導入遺伝子発現の速度論に影響を与える主な因子は、エンドソーム内のウイルス粒子の脱殻の速度である。これは、次に、遺伝材料を封入するキャプシドの種類に依存する。脱殻後、直鎖状一本鎖rAAVゲノムは、相補鎖のデノボ(de novo)合成により二本鎖分子を形成することによって安定化される。自己相補的DNAの使用は、二本鎖導入遺伝子DNAを産生することによって、この段階を回避し得る。自己相補的AAV2/8遺伝子発現は、一本鎖AAV2/8と比べて、速やかに開始し、振幅が大きいことが見出されている。したがって、第二鎖合成に関連するタイムラグを回避することによって、標準的な一本鎖構築物からの導入遺伝子発現と比べた場合、遺伝子発現レベルは増加する。他のAAVシュードタイプにおける自己相補的DNAの効果を調べたその後の研究は、同様の結果を生じている。この技術に対する1つの注意点は、AAVが約4.8kbのパッケージング能力を有するため、自己相補的組換えゲノムは適切な大きさでなければならないという点である(すなわち、2.3kb以下)。

パッケージング能力を改変することに加えて、AAV2ゲノムを他のAAVキャプシドでシュードタイプ化することにより、細胞特異性及び導入遺伝子発現の速度論を変更することができる。例えば、AAV2をAAV4キャプシドでシュードタイプ化する場合、導入遺伝子発現は、RPE細胞に特異的に標的化される。さらに、AAV2/8は、AAV2/2又はAAV2/5のいずれよりも効率的に光受容体を形質導入することが報告されている。

ベクターの調製
本発明のベクターは、療法のためのベクターの提供のための当技術分野で公知の標準的な手段によって調製し得る。したがって、十分に確立されたパブリックドメインのトランスフェクション、パッケージング及び精製方法を用いて、適切なベクター調製物を調製することができる。

上で論じたように、本発明のベクターは、本発明のプロモーター又はその変異体に加えて、天然に存在するAAVウイルスの完全ゲノムを含んでもよい。しかし、一般には、誘導体化されたゲノム、例えば、少なくとも1つの逆方向末端反復配列(ITR)を有するが、rep又はcapなどのAAV遺伝子を欠いていてもよい誘導体が使用される。

そのような実施形態において、誘導体化されたゲノムのAAVウイルス粒子への会合を提供するため、AAV及び/又はヘルパーウイルス機能を提供する追加の遺伝的構築物が、誘導体化されたゲノムと組み合わせて、宿主細胞に提供されてもよい。これらの追加の構築物は、典型的には、構造的AAVキャプシドタンパク質、すなわち、cap、VP1、VP2、VP3をコードする遺伝子、及びAAVライフサイクルに必要な他の機能をコードする遺伝子、例えばrepを含有する。追加の構築物上に提供される構造的キャプシドタンパク質の選択は、パッケージングされるウイルスベクターの血清型を決定する。

本発明に使用するのに特に好ましいパッケージングされるウイルスベクターは、AAV8キャプシドタンパク質と組み合わせたAAV2の誘導体化されたゲノムを含む。

上述のように、AAVウイルスは複製不全であり、そのため、ヘルパーウイルス機能、好ましくはアデノウイルスヘルパー機能がまた、AAV複製を可能にするように1つ以上の追加の構築物上に提供されてもよい。rep、cap、及びAdヘルパー機能を含む単一構築物を使用する当業者に公知のシステムも存在し、そのため、追加のヘルパー構築物は必要とされない。

上記の追加の構築物のすべては、宿主細胞中にプラスミド又は他のエピソームエレメントとして提供されてもよく、或いは、1つ以上の構築物は、宿主細胞のゲノムに組み込まれてもよい。

本発明の転写制御ユニットは、例えばCNGA3遺伝子の変異によって起こり得る錐体光受容体機能の喪失を救済する能力を有する。「救済」は、一般に、網膜障害又はジストロフィー表現型の進行の任意の改善又は遅延、例えば、錐体光受容体におけるCNGA3タンパク質の存在の回復、ERG活性の改善又はERG活性の喪失の遅延、網膜感度の改善又は網膜感度の進行性喪失の遅延/停止、光受容細胞の喪失の遅延又は停止、視力の改善、又は視力喪失の遅延/停止を意味する。

本発明の転写制御ユニットの特性はまた、実施例におけるものに基づく技術を使用して試験することができる。特に、本発明の転写制御ユニットは、本発明のベクターに会合され、CNGA3欠損試験動物、例えばマウスの網膜に送達され、効果を観察し、対照と比較することができる。好ましくは、対照は、未処置であるか、又は本発明の配列とは対照的にレポーター遺伝子を含有するものなどの対照ベクターで処置された、同じ動物のもう一方の眼である。次いで、光に対する網膜応答の網膜電図検査分析を使用して、処置された眼における光受容細胞が、未処置の眼又は対照ベクターで処置された眼からの光受容体よりも光に対して感受性であることを確認することができる。処置された眼の光に対する感受性は、例えば、未処置の眼又は対照処置された眼の感受性よりも少なくとも1.1、1.2、1.5、2、5、10、20、50、100、200、500又は1000倍高くてもよい。

治療方法及び医療用途
一態様において、本発明は、網膜障害又はジストロフィーの治療及び/又は予防を必要とする患者における網膜障害又はジストロフィーの治療及び/又は予防のための、核酸分子(例えば、TCU、プロモーター及びその断片、コドン最適化遺伝子、発現構築物、及びベクター)及び方法を提供する。

網膜は、網膜色素上皮(RPE)細胞層、及び3つの神経感覚細胞層: すなわち、(外側から内側へ)、外側の核層(桿体及び錐体光受容細胞を含有する)、内側の核層(双極細胞を含有する)、及び神経節細胞層で構成される。網膜障害又はジストロフィーは、光受容細胞の進行性喪失及び付随する視力喪失を特徴とする、網膜の疾患として定義することができる。網膜障害又はジストロフィーは、遺伝性網膜障害又はジストロフィーであってもよい。

一実施形態において、錐体桿体ジストロフィー及び/又は錐体ジストロフィーの治療及び/又は予防のための核酸分子及び方法が提供される。錐体桿体ジストロフィーは、錐体光受容細胞の進行性喪失及び付随する視力喪失を特徴とする疾患として定義することができ、遺伝性であり得る。一実施形態において、網膜障害は、色覚異常又は黄斑変性である。黄斑変性は、加齢黄斑変性(AMD)、例えば、滲出型若しくは血管新生AMD又は地図状萎縮、遺伝性黄斑変性病状又は遺伝性錐体ジストロフィーであってもよい。

用語「患者」及び「対象」は、互換的に使用し得る。患者は、好ましくは哺乳動物である。哺乳動物は、商業的に飼育された動物、例えば、ウマ、ウシ、ヒツジ若しくはブタ、実験動物、例えば、マウス若しくはラット、又はペット、例えば、ネコ、イヌ、ウサギ若しくはモルモットであってもよい。患者は、より好ましくは、ヒトである。対象は、雄(男性)であっても又は雌(女性)であってもよい。対象は、好ましくは、網膜障害若しくはジストロフィーのリスクがある、又は網膜障害若しくはジストロフィーを有すると同定される。

用語「治療する」、「治療された」、「治療すること」、又は「治療」は、本明細書で使用される場合、治療的処置、並びに予防的若しくは防止的処置の両方を指し、目的は、望ましくない生理学的病状、障害若しくは疾患を予防又は遅延(軽減)すること、又は有益な若しくは所望の臨床結果を得ることである。本発明の目的のために、有益な又は所望の臨床結果としては、以下に限定されないが、症状の軽減; 病状、障害又は疾患の程度の減少; 病状、障害又は疾患の状態の安定化(すなわち、悪化しないこと); 病状、障害又は疾患の発症の遅延又は進行の遅延; 病状、障害又は疾患状態の改善; 及び寛解(部分的であろうと、全体的であろうと)(検出可能であろうと、検出不可能であろうと)、又は病状、障害又は疾患の増強又は改善が挙げられる。治療は、過度のレベルの副作用無しに、臨床的に顕著な応答を誘発することを含む。

患者は無症候性であってもよく、及び/又は疾患に対する素因を有していてもよい。したがって、本発明はまた、対象が、網膜障害、例えば錐体ジストロフィー、例えば以下に限定されないが色覚異常を発症するリスクがあるか否か、又は網膜障害、例えば錐体ジストロフィー、例えば以下に限定されないが色覚異常を有するか否かを同定するステップを含む方法又は使用を提供する。予防上有効量の本明細書に開示される核酸、例えばベクターを、そのような対象に投与してもよい。予防上有効量は、疾患の1つ以上の症状の発症を予防する量である。したがって、いくつかの実施形態において、本明細書に開示される核酸、例えば、ベクターは、網膜障害、例えば錐体ジストロフィー、例えば以下に限定されないが色覚異常の1つ以上の症状の発症を予防又は遅延するために、投与してもよい。或いは、本明細書に開示される核酸、例えば、ベクターは、疾患の症状が対象に現れたら、すなわち、疾患の既存の症状を治癒するために、投与してもよい。治療上有効量の本明細書に開示される核酸、例えばベクターを、そのような対象に投与してもよい。本明細書で使用される場合、「治療上有効量」は、哺乳動物に投与された場合に、所望の治療効果を生じるのに有効である、本明細書に記載される核酸の量を意味する。一実施形態において、本発明は、網膜障害又はジストロフィーを治療及び/又は予防する方法を提供し、本明細書に開示される核酸、例えばベクターは、治療上有効量で必要とする患者に投与される。いくつかの実施形態において、網膜障害又はジストロフィーは、錐体ジストロフィー、例えば、以下に限定されないが、色覚異常である。

本発明はまた、網膜障害又はジストロフィー、例えば錐体ジストロフィー、例えば以下に限定されないが色覚異常の治療又は予防のための医薬の製造における、本明細書に開示される核酸、例えばベクターの使用を提供する。本発明はまた、治療上有効量の本明細書に開示される核酸、例えばベクターを患者に投与するステップを含む、網膜障害の治療又は予防を必要とする患者において網膜障害、例えば錐体ジストロフィー、特に色覚異常を治療又は予防する方法を提供する。

投与方法
一般に、典型的には注射による、本明細書に開示される核酸、例えばベクターの直接的な網膜、網膜下又は硝子体内送達が好ましい。したがって、網膜、網膜下腔又は硝子体内腔への送達が好ましい。

したがって、本発明はまた、直接的な網膜、網膜下又は硝子体内注射によって、治療上有効量の本明細書に開示される核酸、例えばベクターを患者に投与するステップを含む、錐体ジストロフィーの治療又は予防を必要とする患者において錐体ジストロフィー、特に色覚異常を治療又は予防する方法を提供する。

関連する態様において、本発明は、本明細書に開示される核酸、例えばベクターの、直接的な網膜、網膜下又は硝子体内注射によって患者に前記ベクターを投与することによって網膜障害、例えば錐体ジストロフィー、特に色覚異常を治療又は予防する方法における使用を提供する。

さらに、本発明は、本明細書に開示される核酸、例えばベクターの、直接的な網膜、網膜下又は硝子体内注射によって網膜障害、例えば錐体ジストロフィー、特に色覚異常を治療又は予防するための医薬の製造における使用を提供する。

本発明はまた、網膜障害、例えば錐体ジストロフィー、特に色覚異常の治療に使用するための、本明細書に開示される核酸、例えばベクターを提供し、前記ベクターは、網膜、網膜下腔又は硝子体内腔に直接投与される。

本明細書に開示される核酸、例えばベクターの投与は、典型的には、直接的な網膜又は網膜下注射による。これは、錐体光受容細胞への直接送達を含む。

送達は、典型的には、網膜障害、例えば錐体桿体ジストロフィー、特に色覚異常に罹患している患者における変性網膜に直接的に又は網膜下に行われる。

本明細書に開示される核酸、例えばベクターは、任意の他の細胞集団に入ることなく、上記の標的細胞に対して形質導入し得る。硝子体内注射もまた、本発明のベクターを送達するために使用してもよい。

本明細書に開示される核酸、例えばベクターの用量は、様々なパラメーターに従って、特に、処置されるべき患者の年齢、体重及び病状; 投与経路; 及び必要とされるレジメンに従って決定してもよい。ここでも、医師は、任意の特定の患者にとって必要な投与経路及び投与量を決定することができる。

典型的な単回用量は、形質導入を必要とする残りの網膜組織の量に応じて、10¹⁰～10¹²ゲノム粒子である。ゲノム粒子は、本明細書において、配列特異的方法(例えば、リアルタイムPCR)により定量化することができる、一本鎖DNA分子を含有するAAVキャプシドとして定義される。その用量は、単回用量として提供されてよいが、他方の眼に対して、又は本明細書に開示される核酸、例えばベクターがどんな理由でも(例えば、手術合併症)網膜の正確な領域を標的としなかった可能性がある場合に、繰り返してもよい。処置は、好ましくは、各眼の単一の永続的処置であるが、例えば今後における反復注射、及び/又は異なるAAV血清型を用いる反復注射を考えてもよい。

宿主細胞
本発明はさらに、本明細書に開示される核酸、例えば、ベクター又はウイルスベクター、又はAAVウイルス粒子を含む宿主細胞を提供する。任意の適切な宿主細胞を用いて、本明細書に開示される核酸、例えばベクターを産生することができる。一般に、そのような細胞は、トランスフェクトされた哺乳動物細胞であるが、他の細胞型、例えば昆虫細胞も使用することができる。哺乳動物細胞産生系に関して、AAVベクターに対して、HEK293及びHEK293Tが好ましい。BHK細胞又はCHO細胞を使用してもよい。

医薬組成物及び投与量
本発明はさらに、本明細書に開示される核酸、例えばベクター、並びに薬学的に許容可能な担体、希釈剤、賦形剤、アジュバント、緩衝剤、安定剤、及び/若しくは当業者に周知の他の材料を含む、医薬組成物を提供する。そのような材料は、非毒性であり、活性成分の効力を妨げないべきである。また、薬学的に許容可能な担体、希釈剤、賦形剤、アジュバント、緩衝剤、安定剤、及び/若しくは当業者に周知の他の材料、並びに本明細書に記載される核酸配列、プラスミド、ベクター、若しくはウイルスベクターを含む、医薬組成物が提供される。

担体又は他の材料の正確な性質は、投与経路、すなわち、ここでは直接的な網膜、網膜下又は硝子体内注射に従って、当業者によって決定してもよい。

医薬組成物は、典型的には、液体形態である。液体医薬組成物は、一般に、液体担体、例えば、水、石油、動物油又は植物油、鉱油又は合成油を含む。生理食塩液、塩化マグネシウム、デキストロース又は他の糖溶液又はグリコール、例えば、エチレングリコール、プロピレングリコール若しくはポリエチレングリコールが含まれていてもよい。いくつかの場合において、界面活性剤、例えば、プルロニック酸(PF68)0.001%を使用してもよい。

罹患部位での注射に関して、活性成分は、発熱物質を含まず、適切なpH、等張性及び安定性を有する水溶液の形態である。当業者は、例えば、塩化ナトリウム注射液、リンゲル注射液、乳酸リンゲル注射液、ハルトマン溶液などの等張性ビヒクルを使用して、適切な溶液を十分に調製することができる。必要に応じて、保存剤、安定剤、緩衝剤、抗酸化剤及び/又は他の添加剤が含まれてもよい。

遅延放出に関して、ベクターは、徐放用に製剤化される医薬組成物に、例えば、生体適合性ポリマーから形成されたマイクロカプセルに、又は当技術分野で公知の方法によるリポソーム担体系に含まれてもよい。

投与量及び投与レジメンは、組成物の投与に責任を負う医師の通常の技能の範囲内で決定することができる。活性剤(複数可)の投与量は、使用の理由、個々の対象、及び投与様式に応じて異なってもよい。投与量は、対象の体重、対象の年齢及び健康状態、並びに化合物(複数可)若しくは組成物に対する忍容性に基づいて調整してもよい。

併用療法
本明細書に開示される核酸、TCU、プロモーター、コドン最適化遺伝子、発現構築物、ベクター及び/又は医薬組成物は、網膜障害、例えば錐体ジストロフィー、例えば以下に限定されないが色覚異常の治療及び/又は予防のための任意の他の療法と組み合わせて使用することができる。

キット
本明細書に開示される核酸、TCU、プロモーター、コドン最適化遺伝子、発現構築物、ベクター及び/又は医薬組成物は、キットにパッケージ化することができる。
本明細書はまた、以下の態様を提供する。
[１] 5'から3'方向に、
(a)(i)配列番号1; 又は
(ii)前記配列(a)(i)に対して少なくとも90%の配列同一性を有する配列
を含む遺伝子座制御領域(LCR); 及び
(b)(i)配列番号2又は配列番号17のいずれかの少なくとも200個のヌクレオチド; 又は
(ii)前記配列(b)(i)に対して少なくとも90%の配列同一性を有する配列
を含むプロモーターエレメント
を含む、最大2500個のヌクレオチドの長さの転写制御ユニット(TCU)であって、錐体光受容体特異的プロモーター活性を示す、TCU。
[２] (b)が、
(i)配列番号2又は配列番号17のいずれかの少なくとも最後の200個のヌクレオチド、又は
(ii)前記配列(i)に対して少なくとも90%の配列同一性を有する配列
を含み、前記TCUが、錐体光受容体特異的プロモーター活性を示す、上記[１]に記載のTCU。
[３] (b)が、
(i)配列番号2又は配列番号17のいずれかの少なくとも最後の500個のヌクレオチド、又は
(ii)前記配列(i)に対して少なくとも90%の配列同一性を有する配列
を含み、前記TCUが、錐体光受容体特異的プロモーター活性を示す、上記[２]に記載のTCU。
[４] (b)が、配列番号3の少なくとも200個のヌクレオチドを含む、上記[１]～[３]のいずれかに記載のTCU。
[５] (b)が、配列番号3のヌクレオチド1～35から選択される少なくとも10個連続したヌクレオチドの配列、又は配列番号3のヌクレオチド1～35に対して少なくとも90%の配列同一性を有する配列から選択される少なくとも10個連続したヌクレオチドを含む配列を含む、上記[１]～[４]のいずれかに記載のTCU。
[６] (b)が、
(i)配列番号3; 又は
(ii)前記配列(i)に対して少なくとも90%の配列同一性を有する配列
を含み、前記TCUが、錐体光受容体特異的プロモーター活性を示す、上記[１]～[５]のいずれかに記載のTCU。
[７] 配列番号2のヌクレオチド1934～1939(GGGCCG)が、配列番号16によって置き換えられている、上記[６]に記載のTCU。
[８] 配列番号4又は配列番号15を含む、上記[６]に記載のTCU。
[９] プロモーターエレメントが、配列番号5を含む、上記[１]～[４]のいずれかに記載のTCU。
[１０] 前記TCUが配列番号6を含む、上記[９]に記載のTCU。
[１１] 錐体光受容体特異的方法で発現させるべき配列に作動可能に連結された、上記[１]～[１０]のいずれかに記載のTCUを含む、発現構築物。
[１２] 作動可能に連結された配列が、CNGA3、CNGB3、PDE6C、PDE6H、GNAT2、KCNV2又はCACNA2D4である、上記[１１]に記載の発現構築物。
[１３] 作動可能に連結された配列が、配列番号7、8、9、10、11、12、13若しくは14を含むか、又は配列番号7、8、9、10、11、12、13若しくは14に対して少なくとも80%の配列同一性を有し、且つ錐体光受容体機能を救済する能力を有する、上記[１２]に記載の発現構築物。
[１４] 作動可能に連結された配列が、配列番号8を含むか、又は配列番号8に対して少なくとも80%の配列同一性を有し、且つ錐体光受容体機能を救済する能力を有する、上記[１２]又は[１３]に記載の発現構築物。
[１５] 上記[１]～[１０]のいずれかに記載のTCU、又は上記[１１]～[１４]のいずれかに記載の発現構築物を含む、ベクター。
[１６] ウイルスベクターである、上記[１５]に記載のベクター。
[１７] アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターである、上記[１６]に記載のベクター。
[１８] AAVゲノム又はその誘導体を含む、上記[１７]に記載のベクター。
[１９] ベクターが、AAVゲノム又はその誘導体を含み、AAVキャプシドが、AAV8に由来する、上記[１８]に記載のベクター。
[２０] AAVキャプシドが、AAV8に由来し、発現構築物が、上記[１１]～[１４]のいずれかに従って定義される、上記[１９]に記載のベクター。
[２１] 作動可能に連結された配列が、CNGA3である、上記[２０]に記載のベクター。
[２２] 前記誘導体が、キメラ、シャッフル又はキャプシド改変誘導体である、上記[１８]～[２１]のいずれかに記載のベクター。
[２３] 前記AAVゲノムが、AAVの天然由来の血清型又は単離物又はクレードに由来する、上記[１８]～[２２]のいずれかに記載のベクター。
[２４] 前記AAVゲノムが、AAV血清型2(AAV2)、AAV血清型4(AAV4)、又はAAV血清型8(AAV8)に由来し、及び/又はキャプシドが、AAV8に由来する、上記[２３]に記載のベクター。
[２５] ゲノムが、AAV2に由来し、キャプシドが、AAV8に由来する、上記[２４]に記載のベクター。
[２６] 上記[１５]～[２５]のいずれかに記載のベクターを含有する、又は上記[１５]～[２５]のいずれかに記載のウイルスベクターを産生する、宿主細胞。
[２７] HEK293又はHEK293T細胞である、上記[２６]に記載の細胞。
[２８] 上記[１５]～[２５]のいずれかに記載のベクター及び薬学的に許容可能な担体を含む、医薬組成物。
[２９] 網膜障害を予防又は治療する方法に使用するための、上記[１５]～[２５]のいずれかに記載のベクター。
[３０] 網膜障害の治療又は予防のための医薬の製造における、上記[１５]～[２５]のいずれかに記載のベクターの使用。
[３１] 治療上有効量の上記[１５]～[２５]のいずれかに記載のベクターを患者に投与するステップを含む、網膜障害の治療又は予防を必要とする患者において網膜障害を治療又は予防する方法。
[３２] 網膜障害が、色覚異常である、上記[２９]に記載の使用のためのベクター、又は上記[３０]に記載の使用、又は上記[３１]に記載の方法。
[３３] 治療又は予防が、直接的な網膜、網膜下又は硝子体内注射によって、上記[１５]～[２５]のいずれかに記載のベクターを患者に投与することによる、上記[２９]若しくは[３２]に記載の使用のためのベクター、又は上記[３０]～[３２]のいずれかに記載の使用若しくは方法。
[３４] 前記ベクターが、網膜、網膜下腔又は硝子体内腔に直接投与される、上記[３３]に記載の使用のためのベクター、使用又は方法。

材料及び方法
プラスミド構築
緑色錐体オプシンプロモーターの改良型を作製するために、1250bpの遺伝子座制御領域(LCR)(Smallwood et al., 2002)を、緑色オプシンコアプロモーター(bp -480～+40)の様々な断片と組み合わせて、親プラスミドpAAV/CMV.eGFPに入れ、pAAV/hG1.7.eGFPプラスミド構築物及びpAAV/hG1.4.eGFPを作製した。「M8」変異プロモーターを保有するベクター構築物を、部位特異的変異誘発によって生成した。

治療用遺伝子構築物について、pAAV/coCNGA3は、コドン及びコザック(Kozak)最適化CNGA3配列をpUC57プラスミド(GenScriptによって製造)から、様々な緑色(M)錐体オプシンプロモーター構築物を保有するpAAVプラスミド中にクローニングすることによって作製した。

コドン最適化
コドン最適化は、GenScriptが独占権を有するOptimumGene(商標)コドン最適化ツールにより達成した。

ウイルス産生プロトコルAAV2/8及びAAV2/5
組換えAAV2血清型8ウイルス及びAAV2血清型5ウイルスは、以前記載された(Gao et el. 2002)293T細胞法のトリプルトランスフェクションを使用して産生した。293T細胞プレートの145cm²プレート(ウイルスバッチ当たり20プレート)を、10分間インキュベーションした後、目的のプラスミド:ウイルスキャプシドプラスミド:ヘルパープラスミドDNAを1:1:3の比で含むミックス、ポリエチレンイミン(PEI - Polysciences Inc., Eppelheim, Germany)及びDMEMでトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を24時間置いた。トランスフェクションの48時間後、細胞を回収し、遠心分離によって濃縮し、TD緩衝液(140mM NaCl、5mM KCl、0.7mM K₂HPO₄、3.5mM MgCl₂、25mMトリス塩基[pH=7.5])に再懸濁した。次いで、これを3～4回の凍結融解サイクルによって溶解させ、続いてベンゾナーゼ(Sigma Aldrich, Dorset, UK)処理を行い、次いで、細胞残渣を連続的な遠心分離及びシリンジ濾過ステップによって除去した。

精製は、イオン交換クロマトグラフィー(Davidoff et al. 2004による方法に基づいた方法を使用)によって実施した。溶出液をVivaspin 4 10kDa濃縮器チューブ(Sartorius Stedim Biotech, Fisher Scientific, Loughborough, UK)中で濃縮し、PBS-MKで洗浄し、次いで、100～150μl容量まで濃縮し、次いで、-80℃(長期)又は+4℃(短期)保存用に等分した。

ヒト幹細胞由来の網膜オルガノイドの生成及び形質導入
ヒトH9胚性幹細胞(ESC)株は、フィーダーを含まない条件でE8培地及びゲルトレックス(geltrex)コーティングされた6ウェルプレートで維持した。hESCを、ディスパーゼ及びコラゲナーゼ溶液を使用して解離させた。ESC凝集塊を収集し、E8培地に再懸濁した。網膜神経上皮の分化について、FGFを含まない培地を培養物に2日間添加した場合、ヒトESCをコンフルエントになるまで維持した。眼胞が観察されるまで、前神経誘導培地(アドバンスト(Advanced)DMEM/F12、MEM非必須アミノ酸、N2サプリメント、100mMグルタミン及びPen/Strep)を添加した。胞を手動で切除し、網膜分化培地(DMEM、F12、Pen/Strep及びB27(レチノイン酸無し))中で96ウェルプレート中に保持し、6週で分化培地に、FBS、タウリン及びグルタマックス(glutamax)を補充し、10週でRAを添加した。

eGFPを駆動する緑色錐体オプシンプロモーター構築物を保有するAAVベクター(血清型SsH10)を、1.2×10¹¹vg/ウェル(1～3個のオルガノイド/ウェル)で培地に添加した。オルガノイドを、さらに28日間培養し、その後、回収して分析した。

免疫組織化学
眼を角膜穿孔により固定のため調製し、次いで、1%パラホルムアルデヒド(PFA、pH7.4)に浸漬した。網膜オルガノイドを、1%パラホルムアルデヒド(PFA、pH7.4)に浸漬することによって固定した。眼を、最大1時間、室温に置いて固定し、その後、溶液から取り出し、最適切断温度(OCT)包埋マトリックスに完全に浸漬し、眼の前部-後部を包埋チューブ内で水平-垂直軸で繋留した。次いで、これらを、切片化が必要になるまで、-20℃で凍結し保存した。

Bright(登録商標)OTF5000 Cryostat(Bright Instrument Co Ltd, Cambridgeshire, UK)を使用して、10～18ミクロンの切片を調製し、それにより、網膜の上面及び下面の両方の可視化が可能となった。ポリリジン被覆顕微鏡用スライド上で切片化した後、切片を直ちに収集し、室温で空気乾燥させた。スライドは-20℃で保存するか、又は直接分析した。

免疫組織化学について、切片を、PBS中の5%ヤギ血清及び1%ウシ血清アルブミン中でブロッキングした。抗錐体オプシン一次抗体(Millipore)を、4℃で一晩インキュベートした。切片を、RTで2時間二次抗体と共にインキュベートし、洗浄した。アレクサ-フルオール(Alexa-fluor)二次抗体(Invitrogen-Molecular Probes)を、1:500希釈で使用した。マウント剤への添加物として(媒体中0.1%DAPI)、又は蛍光マウント剤(DAKO)中でマウントする前にTBS及びPBS洗浄液中の0.2%DAPIに浸漬することによって、スライドをDAPIで染色した。マウントしたスライドは、4℃で保存した。

マウントしたスライドは、Leica DM5500Q共焦点顕微鏡(Leica Biosystems, Germany)又はZeiss AxioObserver Z1(Carl Zeiss Inc, Gottingen, Germany)を使用して画像化した。

網膜下注射
網膜下注射は、Cpfl5(CNGA3欠損)(Hawes et al., 2006)及びC57BL/6マウスに対し、生後約2週で実施した。眼科手術の間、手術用顕微鏡を利用した。1.5cm、34ゲージの皮下注射針(Hamilton, Switzerland)を、強膜を通過して接線方向に挿入し、自己密封性の強膜トンネル創傷を作った(Tan et al. 2009)。1.0～1.5μlのウイルス懸濁液を網膜下腔の上半球及び下半球内に注射し、それぞれ検眼鏡で見ることができる胞状網膜剥離を作った。C57BL/6をプロモーター研究に利用し、1×10¹²ウイルス力価を注射した。Cpfl5マウスは、CNGA3救済研究で使用した。マウスに、指定の眼においてCNGA3ウイルス構築物を注射し、反対の眼には対照ウイルス構築物を注射した。すべてのマウスを左右相称で注射した。

インビボ処置効力
網膜機能の回復は、明所視の網膜電図検査によって評価した。ERGの記録は、両方の眼から同時に得た。一晩(約12時間)の暗順応後、1滴の2.5%フェニレフリン及び1%トロピカミド(Minims, Bausch & Lomb)を、各眼に適用して、瞳孔を拡張させ、滑沢剤を適用することによって眼を湿らせたままにした。ERGは、市販の装置(Espion ERG Diagnosys System)を使用して実施した。明所視単一フラッシュ記録は、30cd/m²のバックグラウンドで、0.1、1、3.16、10、31.6及び75.28cd.s/m²の増加する光強度で得た。示されていない限り、図面は、ベクターがピーク発現に達したときの処置4週後の平均明所視b波振幅(平均±SD)を示す。

実施例1: 錐体特異的転写制御ユニット(TCU)の最適化
赤色オプシン遺伝子の上流に位置するヒト遺伝子座制御領域(LCR)は、タンデムに位置する赤色オプシン(L-オプシン)遺伝子及び緑色オプシン(M-オプシン)遺伝子の両方の発現を増強する(図1、左上を参照)。強力な錐体特異的プロモーターは、以前はLCR及び赤色オプシンプロモーターを利用していたが、それはそれらが物理的に隣接するエレメントであるからである。Smallwoodらによるトランスジェニックマウスでのインビボレポーター遺伝子発現研究では、LCRへの物理的近接性に基づく赤色又は緑色オプシンプロモーターからの異なる発現レベルを調べた。Smallwoodらは、LCRへの物理的近接性に基づく赤色又は緑色オプシンプロモーターからの発現の異なるレベルを実証するために、ヒトの赤色及び緑色アレイのいくつかの誘導体を構築した(図1、左下を参照)。各誘導体は、赤色オプシンプロモーターの制御下にあるアルカリホスファターゼ(AP)レポーター遺伝子、及び緑色オプシンプロモーターの制御下にあるβ-ガラクトシダーゼ(LacZ)からなるものであった。各胚性幹細胞株について、網膜を、複数のキメラファウンダー(chimeric founder)から、又は導入遺伝子を安定して受け継いだ複数の子孫から分析した。後者の場合、分析は、loxP隣接PGK-neoカセットを除去するために生殖細胞系列creマウスと交配させる前及び後の両方で実施した。

天然染色体配置(pPMS107)を使用する野生型構築物では、錐体の65～95%は、AP(赤色オプシンプロモーターの制御下)又はlacZ(緑色オプシンプロモーターの制御下)のいずれかを発現するが、両方は発現しない。2つの転写ユニットの間に9kbのスペーサーを挿入すると(すなわち、LCRと緑色オプシンプロモーターとの間の距離を増加させ、pPMS108を構築する)、lacZ(緑色プロモーター)発現細胞からAP(赤色プロモーター)発現細胞への大きなシフトがもたらされる。2つの転写ユニットの位置を交換し(pPMS101)、LCRの直後に緑色オプシンコアプロモーターを配置すると(pPMS101)、これらのトランスジェニックマウスの発現プロファイルは、ほぼ緑色オプシンコアプロモーター転写のみに偏った(＞99%)。

本開示は、ヒトLCR及び最適化されたヒト緑色オプシンプロモーターを利用する代替的錐体特異的転写制御ユニット(TCU)を提供する。ヒト緑色オプシンプロモーター(0.2kb)の保存されたコアエレメントを同定し、LCR領域及び様々なサイズの緑色オプシンプロモーター(2.0Kb(hG2.0)、1.7Kb(hG1.7)及び1.4Kb(hG1.4)、図2を参照)を使用して、操作された緑色オプシンプロモーターを使用する一連のTCUを作製した。1.7Kbの赤色オプシンプロモーター断片(PR1.7、AGTCによって使用されるプロモーターに類似、Ye et al., 2016)も対照として作製した。

さらに、上記のプロモーターによって駆動されるGFPレポーターを含有する一連のAAVshh10ベクターを作製し、ヒトES由来の網膜培養物における発現を評価した。

試験したすべての構築物は、GFP発現レベル及び錐体細胞特異性の点で同様の形質導入プロファイルを提供した。より小さなプロモーター断片を有する構築物は、AAVベクター内により大きな遺伝子をパッケージングするためのより多くの空間を提供する。

実施例2-最適化されたTCUは、すべての錐体亜型においてレポーター遺伝子の頑強な発現を提供する
本明細書に開示される最適化されたTCUが、錐体細胞においてレポータータンパク質発現を促進する能力を試験するために、ヒトES由来の網膜を、AAVshh10-hG1.4.GFPを用いて形質導入した。すべての錐体亜型(図3B'、C')において頑強なレポーター遺伝子発現(図3A)が観察された。

以前に特徴付けられたヒト錐体アレスチン(CAR)プロモーターと比べて、hG1.4によって提供される発現レベルは、ヒト錐体においてより高く、桿体又は網膜色素上皮(RPE)細胞において異所性発現はなかった。マウスでは、ヒト赤色オプシンプロモーターに基づく錐体プロモーターは、錐体特異的ではなく、桿体でも発現を媒介した(Ye et al., 2016)。

実施例3: TCUのさらなる最適化及びヒトCNGA3遺伝子のコドン最適化
緑色オプシン遺伝子の転写開始部位に対して+5～+10位のGGGCCG配列をTCTAGAに変更すると、結果として生じる発現レベルが2倍になる。したがって、この配列変更(M8)(配列番号16を参照)を、hG1.4及びhG1.7構築物に組み込んだ。

さらに、コドン使用バイアス及びCG含量を改善し、mRNA中の任意の潜在的なプロセッシング部位及び可能性のあるステム-ループ構造を除去しようとするために、CNGA3のコード配列をコドン最適化に供した。

hG1.4(M8)(配列番号6)及びhG1.7(M8)(配列番号15)構築物を、ヒトコドン最適化CNGA3 cDNA(coCNGA3)を保有するAAV2/8ベクターにおいて使用し、ベクターの効力を、錐体機能の網膜電図(ERG)評価を使用してCNGA3ノックアウトマウスモデルで決定した。ベクター投与の1ヶ月後、M8配列無しのベクターに比べて明確な利点はなかった(hG1.7(M8)ベクターは、M8配列無しの対応するベクターに比べてわずかな改善を示すように見えたが)(図4、カラムの左の棒)。これらの動物におけるERG評価を、投与2ヶ月後に繰り返すと、「M8」ベクターを注射された動物における振幅は、さらに増加し(図4、カラムの右の棒)、一方、標準ベクターを注射された動物における振幅は、一定のままであるか(hG1.4)又はわずかに増加した(hG1.7)。最大発現レベルは、CNGA3による色覚異常における良好な機能的救済を達成するために重要であることが実証され、これらの結果は、M8配列を構築物に含めることが、治療に有益であることを示す。

コドン最適化されたCNGA3遺伝子は、野生型ヒトCNGA3遺伝子よりも効果的にCnga3ノックアウトマウスにおける明所視応答を救済した(図5)。野生型ヒトCNGA3遺伝子又はコドン最適化ヒトCNGA3遺伝子のいずれかを駆動する赤色オプシンプロモーター(1.7L)を保有する構築物を、AAV2/8血清型にパッケージングし、Cnga3欠損マウスに網膜下に注射した。明所視ERG応答を、注射の1ヶ月及び2ヶ月後に評価した。コドン最適化ベクターの投与を受けた動物におけるERG応答は、野生型遺伝子の投与を受けた動物におけるよりも一貫して高かった(図5)。

実施例4: CNGA3を発現するAAV2/8ベクターは、CNGA3ノックアウトマウスにおける明所視応答を救済することができ、一方、対応するAA2/5構築物は、最小の救済を提供する
CNGA3を発現するAAV2/5及びAAV2/8ベクターが明所視応答を救済する能力を評価するために、AAV2/8-hG1.4(M8).coCNGA3及びAAV2/5-hG1.4(M8).coCNGA3ウイルスベクターを、1ヶ月齢のcnga3ノックアウトマウスに網膜下に注射した。明所視ERG応答を、投与の4週後に評価した。本発明者らは、最大70μVのERG b波振幅を有するAAV2/8処置眼における頑強な明所視応答を観察した(図6A及びB)。両方の半球(上/下)において網膜下注射を受けた眼は、ERG b波振幅における最大の改善を示した。比較すると、野生型マウスは、同じ実験設定で約100～120μVの振幅を有する。未処置の眼からの応答はなく、AAV2/5処置眼は、最小の応答を提供する(図6A及びB)。このデータは、AAV2/8-hG1.4(M8).coCNGA3ベクターが、高レベルのCNGA3発現を提供すること、及び錐体ERG b波振幅による測定でCNGA3ノックアウトマウスにおける錐体機能を野生型の約60%の錐体機能まで回復させることができることを示す。

CNGA3を発現するAAV2/8ベクターによる網膜感度の救済が長続きすることをさらに実証するために、Cnga3欠損マウスに、2週齢で網膜下にAAV2/8-hG1.4(M8).coCNGA3(n=14)又はAAV2/8-hG1.7(M8).coCNGA3(n=13)(両方について力価1×10¹²vg/ml)のいずれかを注射するか、又は未処置のままとした(n=3)。いずれかのベクターを用いた両方のトランスフェクションは、処置後最大6ヶ月まで、網膜感度の持続的な救済をもたらす(図7)。

実施例5: CNGA3を発現するAAV2/8ベクターは、長期の錐体生存を促進する
CNGA3を発現するAAV2/8ベクターが錐体生存を促進する能力を、2週齢のCnga3欠損マウスにAAV2/8-hG1.7(M8).coCNGA3を注射することによって評価した。注射を受けなかった3～4ヶ月齢のC57BL/6Jマウスは、健康な錐体についての対照として機能した。網膜を単離し、錐体アレスチンで染色し、透明化した。

AAV2/8-hG1.7(M8).coCNGA3で形質導入されたCnga3欠損網膜は(図8Cを参照)、処置3～4ヶ月後にインビボで錐体の生存を示した。生存の程度は、健康な対照の錐体生存と同様であり(図8Aを参照)、未注射Cnga3欠損網膜と比べて顕著に増加した(図8Bを参照)。

CNGA3を発現するAAV2/8ベクターが錐体生存を促進する能力は、長続きし、ベクター処置の13ヶ月後でもまだ観察することができた(図9を参照)。

実施例6: CNGA3を発現するAAV2/8ベクターは、インビボでのシナプス連結性を維持する
CNGA3を発現するAAV2/8ベクターが錐体細胞と支持ニューロン(双極細胞)との間のシナプス完全性を改善する能力を評価するために、2週齢のCnga3欠損マウスに、AAV2/8-hG1.7(M8).coCNGA3を注射した。処置の3～4ヶ月後、網膜を単離し、Gpr179及びPNAで染色し、次いで透明化した。シナプス連結性を、フラットマウント網膜の単一平面共焦点画像においてシナプスマーカーGpr179のシグナル強度を測定することによって決定した。Leica Las Xソフトウェアを使用して、画像を処理した。いくつかの錐体茎関連Gpr179染色(錐体茎を確認するためにPNA染色を使用)及び10個を超える桿体小球関連Gpr179染色に対してフリーハンドの線を引くことによって、Gpr179染色をトレースした(A)。シグナル強度が出力された(B; 白色線: Gpr179、赤色線: PNA)。各原点からのシグナル強度のピークを平均し、錐体茎 対 桿体小球関連GPr179 比(CP/RS)を計算した。4つの異なる位置からのCP/RSを、統計分析に使用した(ボンフェローニの多重比較検定(ns: p＞0.05、**: p≦0.01、*: p≦0.05))。未注射Cnga3欠損マウス及び同じ月齢(3～4ヶ月)の未注射C57BL/6Jマウスからの網膜は、それぞれ陰性対照及び陽性対照として機能した。

図10に示すように、CNGA3を発現するAAV2/8ベクターによるCnga3欠損網膜の形質導入は、健康な対照マウスのシナプス連結性と同様の、未注射Cnga3欠損網膜と比べて有意に改善したシナプス連結性をもたらす。

実施例7: AAV2/8を使用したcoCNGA3送達は、新規の強力なAAV血清型AAV-Anc80、AAV-44.9、及びAAV5を使用した送達よりも大きな利点を提供する
いくつかの異なるAAV血清型及びキャプシドが、遺伝子の発現に利用可能である。例えば、新しく開発されたAnc80-L65キャプシドは、光受容体に対して効率的なトロピズムを有し、AAV8に匹敵するか又はさらにはそれよりも優れていることが示された。さらに、新規血清型AAV44.9はまた、蛍光マーカーと組み合わせて試験した場合、光受容細胞において効率的な形質導入及び高発現を示すことが示されている。したがって、4つの異なるAAVベクターAnc80-L65、AAV44.9、AAV5、及びAAV8が、coCNGA3を発現し、持続的なERG応答を提供する能力を比較した。

hG1.4(M8)-coCNGA3発現カセットを保有するそれぞれのベクター(1.0×10¹²vg/mL)を、2週齢のCnga3欠損マウスの網膜下腔に送達し、単一フラッシュ明所視ERGを、注射後の様々な時点で記録した(図11を参照)。10cd.s/m²の光刺激を、分析に使用した。図11に示すように、AAV8を介した遺伝子導入は、Anc80-L65(図11Aを参照)、AAV44.9(図11Bを参照)、又はAAV5(図11C及び図6を参照)と比べて、より高いERG応答をもたらした。

実施例8: 最適化されたTCUと、以前に知られている錐体特異的プロモーターとの比較
本明細書に開示されるTCUの発現レベルを、利用可能な最も強い錐体特異的プロモーター(1.7L)の発現レベルと比較するために、17～19週齢のヒト胚様体(hEB)を、それぞれhG1.4(M8)、hG1.7(M8)、又はP1.7Lの制御下でeGFPを発現するAAVベクターAAVShH10で形質導入し、2週後に収集した(各プロモーターについてn=6～8)。解離後、細胞を、GFP陽性細胞における相対中央値蛍光強度(MFI)について分析した。異なるベクターで形質導入したhEBにおける相対MFIを、フローサイトメトリーによって評価し、AAV ShH10-1.7L-eGFPで形質導入したEBにおけるMFIに対する比として計算した。図12Aに示すように、構築物hG1.7は、以前に知られているプロモーター1.7Lと比べて、GFP発現における約50%の増加を提供する。

さらに、CNGA3ノックアウトマウスにおいてhCAR(ヒト錐体アレスチン)プロモーターからhCNGA3を駆動するAAV2/8ベクターを試験した。明所視応答救済は、野生型レベルの30%を超えなかった(図12B)。

AAV2/5(Y719F)ベクター及びマウス青色錐体オプシンプロモーターを使用して、CNGA3ノックアウトマウスを救済することができることが報告されている。その研究では、明所視ERG振幅は、P12で注射し、処置の10週後に評価した場合、野生型の30%に達した(Michalakis et al., 2010)。最近、AAV5ベクター及び2.1kb赤色オプシンプロモーターは、CNGA3欠損ヒツジを救済するために使用されている。この研究では、未処置と比べた場合、錐体フリッカーERGが2倍になった(Banin et al, 2015)。しかし、これらのプロモーターは両方とも、ヒト錐体のサブセットでのみ機能することが知られている(青色錐体オプシンプロモーターは、青色錐体でのみ活性であり、2.1赤色オプシンプロモーターは、赤色錐体でのみ活性である)。

Hauswirth研究室によるCNGA3ノックアウトマウスにおいてマウスCNGA3を発現するためのCBAプロモーターを有するAAV2/5ベクターを使用する研究は、マウスが非常に早期に処置された場合(P14、処置の3週後に評価-ウイルス力価1E13)、野生型ERG錐体b波振幅の最大70%の救済を示した(Pang et al., 2012)。本発明者らは、高齢期に同じ動物モデルを処置して(1ヶ月-ウイルス力価7E12)、明所視力の救済における同様の効力を達成した。ヒトにおける色覚異常は、定常性障害であるが、CNGA3マウスモデルは、最初の1ヶ月以内に錐体細胞死を経験し、より早期の処置が有益であることを示す。非特異的CBAプロモーターは、CNGA3試験で使用される可能性は低いが、高レベルのCNGA3発現が、最適な救済にとって重要であるという発明者らの主張を支持する。

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配列情報
配列番号1- M/Lオプシン遺伝子座制御領域(LCR)の1.2kb断片

配列番号2- 2.0kb Mオプシンプロモーター断片、下線付きの配列番号3の500bp断片、斜体のUTR、M8配列無し

配列番号3- 500bp Mオプシン断片、斜体のUTR、下線付きのM8変異

配列番号4- hG1.7(M8)構築物の変異体、1.2kb M/LオプシンLCR断片、500bp Mオプシン断片、斜体のUTR、下線付きのM8変異

配列番号5- 200bp Mオプシン断片、斜体のUTR、下線付きのM8変異

配列番号6- hG1.4(M8)構築物: 1.2kb M/LオプシンLCR断片、200bp Mオプシン断片、斜体のUTR、下線付きのM8変異

配列番号7- 非コドン最適化CNGA3 cDNA

配列番号8- コドン最適化CNGA3 cDNA

配列番号9- PDE6C cDNA、NM_006204.3

配列番号10- PDE6H cDNA、NM_006205.2

配列番号11- GNAT2 cDNA、NM_005272.3

配列番号12- KCNV2 cDNA、NM_133497.3

配列番号13- CACNA2D4 cDNA、NM_172364.4

配列番号14- CNGB3 cDNA、NM_019098.4

配列番号15- hG1.7(M8)構築物、1.2kb M/LオプシンLCR断片、500bp Mオプシン断片、斜体のUTR、下線付きのM8変異

配列番号16- M8変異

配列番号17- 配列番号2 2-2.0kb Mオプシンプロモーター断片、下線付きの配列番号3の500bp断片、斜体のUTR、下線付きのM8変異

Claims (33)

1. 5'から3'方向に、以下の(a)及び(b)：
   (a)(i)配列番号1; 又は
   (ii)前記配列(a)(i)に対して少なくとも90%の配列同一性を有する配列
   を含む遺伝子座制御領域(LCR); 及び
   (b)(i)配列番号17の少なくとも最後の200個のヌクレオチド; 又は
   (ii)前記配列(b)(i)に対して少なくとも90%の配列同一性を有し、かつ配列番号16を含む配列
   を含むプロモーターエレメント
   を含む、最大2500個のヌクレオチドの長さの転写制御ユニット(TCU)であって、錐体光受容体特異的プロモーター活性を示す、TCU。
2. (b)が、
   (i)配列番号17の少なくとも最後の500個のヌクレオチド、又は
   (ii)前記配列(i)に対して少なくとも90%の配列同一性を有し、かつ配列番号16を含む配列
   を含み、前記TCUが、錐体光受容体特異的プロモーター活性を示す、請求項１に記載のTCU。
3. (b)が、
   (i)配列番号3の少なくとも200個のヌクレオチド; 又は
   (ii)配列番号3のヌクレオチド1～35から選択される少なくとも10個連続したヌクレオチドの配列、又は配列番号3のヌクレオチド1～35に対して少なくとも90%の配列同一性を有する配列から選択される少なくとも10個連続したヌクレオチドを含む配列
   を含む、請求項１又は２に記載のTCU。
4. (b)が、
   (i)配列番号3; 又は
   (ii)前記配列(i)に対して少なくとも90%の配列同一性を有する配列
   を含み、前記TCUが、錐体光受容体特異的プロモーター活性を示す、請求項１～３のいずれか一項に記載のTCU。
5. 配列番号4又は配列番号15を含む、請求項１に記載のTCU。
6. 配列番号15を含む、請求項１に記載のTCU。
7. 配列番号15に対して少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、又は少なくとも99%の配列同一性を有する配列を含む、請求項１に記載のTCU。
8. 配列番号15に対して少なくとも95%の配列同一性を有する配列を含む、請求項７に記載のTCU。
9. 配列番号15に対して少なくとも98%の配列同一性を有する配列を含む、請求項７又は８に記載のTCU。
10. 配列番号15に対して少なくとも99%の配列同一性を有する配列を含む、請求項７～９のいずれか一項に記載のTCU。
11. プロモーターエレメントが、配列番号5を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載のTCU。
12. 前記TCUが配列番号6を含む、請求項１に記載のTCU。
13. 錐体光受容体特異的方法で発現させるべき配列に作動可能に連結された請求項１～１２のいずれか一項に記載のTCUを含む、発現構築物。
14. 作動可能に連結された配列が、CNGA3、CNGB3、PDE6C、PDE6H、GNAT2、KCNV2又はCACNA2D4である、請求項１３に記載の発現構築物。
15. 作動可能に連結された配列が、配列番号7、8、9、10、11、12、13若しくは14を含むか、又は配列番号7、8、9、10、11、12、13若しくは14に対して少なくとも90%の配列同一性を有し、且つ錐体光受容体機能を救済する能力を有する、請求項１４に記載の発現構築物。
16. 作動可能に連結された配列が、配列番号8を含むか、又は配列番号8に対して少なくとも90%の配列同一性を有し、且つ錐体光受容体機能を救済する能力を有する、請求項１３～１５のいずれか一項に記載の発現構築物。
17. 作動可能に連結された配列が、配列番号8を含むか、又は配列番号8に対して少なくとも95%の配列同一性を有し、且つ錐体光受容体機能を救済する能力を有する、請求項１６に記載の発現構築物。
18. 請求項１～１２のいずれか一項に記載のTCU、又は請求項１３～１７のいずれか一項に記載の発現構築物を含む、ベクター。
19. ウイルスベクターである、請求項１８に記載のベクター。
20. アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターである、請求項１９に記載のベクター。
21. AAVゲノム又はその誘導体を含む、請求項２０に記載のベクター。
22. ベクターが、AAVゲノム又はその誘導体を含み、AAVキャプシドが、AAV8に由来する、請求項２１に記載のベクター。
23. 作動可能に連結された配列が、CNGA3である、請求項２２に記載のベクター。
24. 前記誘導体が、キメラ、シャッフル又はキャプシド改変誘導体である、請求項２１～２３のいずれか一項に記載のベクター。
25. 前記AAVゲノムが、AAVの天然由来の血清型又は単離物又はクレードに由来する、請求項２１～２４のいずれか一項に記載のベクター。
26. 前記AAVゲノムが、AAV血清型2(AAV2)、AAV血清型4(AAV4)、又はAAV血清型8(AAV8)に由来し、及び/又はキャプシドが、AAV8に由来する、請求項２５に記載のベクター。
27. ゲノムが、AAV2に由来し、キャプシドが、AAV8に由来する、請求項２６に記載のベクター。
28. 請求項１８～２７のいずれか一項に記載のベクターを含有する、又は請求項１８～２７のいずれか一項に記載のウイルスベクターを産生する、宿主細胞。
29. HEK293又はHEK293T細胞である、請求項２８に記載の宿主細胞。
30. 請求項１８～２７のいずれか一項に記載のベクター及び薬学的に許容可能な担体を含む、医薬組成物。
31. 網膜障害を治療又は予防するための、請求項１８～２７のいずれか一項に記載のベクターを有効成分として含む医薬組成物。
32. 網膜障害が、色覚異常である、請求項３１に記載の医薬組成物。
33. 治療又は予防が、直接的な網膜、網膜下又は硝子体内注射によって、前記ベクターを患者に投与することによるものである、請求項３１又は３２に記載の医薬組成物。

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