JP2018529336A - 網膜色素変性症の治療 - Google Patents
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Abstract
Description
(a)配列番号1に対して少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列;
(b)配列番号3に対して少なくとも80%の同一性を有するヌクレオチド配列;および
(c)配列番号3のヌクレオチド配列
からなる群から選択される配列を含み、好ましくはここで前記ヌクレオチド配列にコードされるタンパク質は、配列番号1によって表されるタンパク質の天然の機能を実質的に保持する。
(a)配列番号3に対して少なくとも80%の同一性を有するヌクレオチド配列であって、該配列が配列番号2の位置30に対応する位置のC、配列番号2の位置33に対応する位置のT、配列番号2の位置48に対応する位置のA、配列番号2の位置57に対応する位置のA、配列番号2の位置60に対応する位置のT、配列番号2の位置69に対応する位置のT、配列番号2の位置72に対応する位置のA、配列番号2の位置171に対応する位置のC、配列番号2の位置189に対応する位置のC、配列番号2の位置441に対応する位置のT、配列番号2の位置537に対応する位置のT、配列番号2の位置546に対応する位置のC、配列番号2の位置786に対応する位置のT、配列番号2の位置792に対応する位置のT、配列番号2の位置966に対応する位置のA、配列番号2の位置969に対応する位置のA、配列番号2の位置990に対応する位置のA、配列番号2の位置1011に対応する位置のT、配列番号2の位置1014に対応する位置のT、配列番号2の位置1029に対応する位置のT、配列番号2の位置1299に対応する位置のA、配列番号2の位置1689に対応する位置のC、配列番号2の位置3355に対応する位置のA、配列番号2の位置3357に対応する位置のG、配列番号2の位置3363に対応する位置のG、配列番号2の位置3403に対応する位置のT、配列番号2の位置3404に対応する位置のC、配列番号2の位置3405に対応する位置のT、配列番号2の位置3408に対応する位置のA、配列番号2の位置3409に対応する位置のA、配列番号2の位置3410に対応する位置のG、配列番号2の位置3432に対応する位置のG、配列番号2の位置3438に対応する位置のC、および配列番号2の位置3456に対応する位置のAから選択されるヌクレオチドのうち1個以上、好ましくは全部を含む、前記ヌクレオチド配列;または(b)配列番号3のヌクレオチド配列からなる群から選択される前記バリアントをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを提供する。ポリヌクレオチドは前記ヌクレオチドのうちの2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33または34個を含
んでもよい。
(a)配列番号9に示されるヌクレオチド配列、
(b)配列番号3の配列を含むが、(i)配列番号10の配列、(ii)配列番号10および配列番号3の配列において配列番号10の片側もしくは両側に配列番号10に隣接する75個までの付加的なヌクレオチドの配列、もしくは(iii)配列番号10の中に由来する390個以上の連続したヌクレオチドに対応する欠失を持つヌクレオチド配列;または
(c)(a)もしくは(b)に従ったヌクレオチド配列であるが、その5’および3’端の1つまたは両方で片側の端当たり最大150個のヌクレオチドまでトランケートされた前記ヌクレオチド配列
を含んでもよい。
(a)少なくとも部分的に網膜を剥離し網膜下ブレブを形成するのに有効な量の溶液の網膜下注入による対象者への投与であって、該溶液がポリヌクレオチドまたはウイルスベクターを含まない、前記投与;および
(b)ステップ(a)により形成されたブレブ中への網膜下注入による医薬組成物の投与であって、該医薬がポリヌクレオチドまたはウイルスベクターを含む、前記投与
のステップを含む。
網膜色素変性症GTPアーゼ制御因子(RPGR)はおそらくグアニンヌクレオチド放出因子として働き、正常な視覚に必須である。研究により、RPGRはおそらく微小管構築および輸送制御への関与を通じて繊毛の生成における役割を果たすことが示唆されてきた。繊毛は、シグナリングおよび細胞運動を含む多数の生物活性に関与し得る、細胞表面からの指のような突起物である。繊毛はまた、聴覚、嗅覚および視覚を含む一連の感覚受容にも必要であり、繊毛は重要な視細胞の細胞小器官である。
本発明のRPGRORF15をコードするヌクレオチド配列は野生型遺伝子配列、例えば配列番号2のヌクレオチド配列に関してコドン最適化されている。
(a)配列番号1に対してい少なくとも80%以上の同一性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列;
(b)配列番号3に対して少なくとも80%以上の同一性を有するヌクレオチド配列;および
(c)配列番号3のヌクレオチド配列、
からなる群から選択される配列を含み、好ましくはここで、該ヌクレオチド配列にコードされるタンパク質は配列番号1に代表されるタンパク質の天然の機能を実質的に保持する。
(a)RPに伴う網膜色素の変化の臨床的所見;
(b)視細胞(例えば錐体細胞、好ましくは錐体および桿体細胞)の細胞死;および/または
(c)視覚機能の悪化
の同程度またはより高度な予防を助けるタンパク質をコードする。
網膜色素変性症(RP)は、一般的に桿体視細胞の進行性の変性により引き起こされる、遺伝性網膜ジストロフィーの表現型上で結び付いた群である。網膜色素上皮(RPE)および錐体視細胞もまた疾患進行中に変性し得る。
本明細書中に開示される医薬は、網膜色素変性症(RP)の治療または予防に関連して哺乳類の、好ましくはヒトの眼に与えられてもよい。
網膜は、眼の内側後房を覆い、視神経を介して脳へと伝えられる視覚世界の画像を感覚する多層状の膜である。眼の内側から外側の順番に、網膜は神経感覚上皮および網膜色素上皮の層、網膜色素上皮の外側にある脈絡膜を含む。
網膜神経感覚上皮は光を直接感じる視細胞を抱える。それは、以下の層:内境界膜(ILM);神経線維層;神経節細胞層;内網状層;内顆粒層;外網状層;外顆粒層(視細胞の核);外境界膜(ELM);および桿体錐体の視細胞(内節および外節)を含む。
網膜色素上皮(RPE)は網膜神経感覚上皮のすぐ外側に位置する細胞の色素層である。RPEは、視細胞への栄養および他の物質の輸送、ならびに視覚を向上させるための散乱光吸収を含む多数の機能を行う。
脈絡膜は、眼のRPEおよび外側の強膜の間にある血管層である。脈絡膜の脈管構造は網膜への酸素および栄養の供給を可能にする。
ベクターは何らかの存在物のある環境から別の環境への移動を可能にするかまたは推進するツールである。本発明に従えば、例としては、組換え核酸技術に使用される一部のベクターは、核酸断片(例えば、異種性のcDNA断片などの、異種性のDNA断片)などの存在物が標的細胞に移動されることを可能にする。ベクターは細胞内における異種性の核酸(例えば、DNAまたはRNA)の維持、核酸断片を含むベクターの複製の促進、または核酸断片にコードされるタンパク質の発現促進の目的に役立ち得る。
好ましい実施形態では、本発明のベクターはウイルスベクターである。好ましくは、ウイルスベクターはウイルスベクター粒子の形態にある。
好ましい一実施形態では、本発明のベクターはアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターである。好ましくは、AAVベクターはAAV粒子の形態にある。
本発明の別の実施形態では、ウイルスベクターはレトロウイルスベクターである。
本発明の別の実施形態では、ウイルスベクターはアデノウイルスベクターである。
本発明のベクターはまた、RPGRORF15導入遺伝子のin vitroまたはin vivoの発現をもたらすエレメントを含んでもよい。これらは発現制御配列と呼ばれてもよい。したがって、ベクターは典型的には導入遺伝子をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された発現制御配列(例えばプロモーター配列を含む)を含む。
本発明の一実施例では、ウイルス(例えばAAV)ベクターは網膜下注入、網膜への直接注入または硝子体内注入により対象者の眼に投与される。
網膜下注入は網膜下腔、すなわち網膜神経感覚上皮の下への注入である。網膜下注入の間、注入される物質は視細胞と網膜色素上皮(RPE)層の間に向けられ、その間に空間を生じる。
本発明のベクターは、局所的な網膜剥離が第1液の網膜下注入により生じる2ステップ法により正確性と安全性を高めて送達されてもよい。第1液はベクターを含まない。2回目の網膜下注入は次に、1回目の網膜下注入により生じたブレブの網膜下液中にベクターを含む医薬を送達するために使用される。医薬を送達する注入は網膜を剥離するために使用されないため、特定の体積の溶液がこの第2ステップにおいて注入されてもよい。
(a)少なくとも部分的に網膜を剥離し網膜下ブレブを形成するのに有効な量の溶液の網膜下注入による対象者への投与であって、該溶液がベクターを含まない、前記投与;および
(b)ステップ(a)により形成されたブレブ中への網膜下注入による医薬組成物の投与であって、該医薬がベクターを含む前記投与
によって送達される。
網膜は薄く透明であり網膜の下にある乱れて重度に色素沈着した上皮に対して見るのが困難であるため、例えば末期の網膜変性中など、ある状況下では、網膜の同定は困難である。青色生体染色色素(例えばBrilliant Peel(登録商標)、Geuder;MembraneBlue-Dual(登録商標)、ドルク)の使用により、網膜剥離手順(すなわち、本発明の2ステップ網膜下注入法におけるステップ(a))において生じた網膜の穴の同定が容易になり、硝子体腔中に逆流するリスク無しに同一の穴を通じて医薬を投与できるようになるかもしれない。
本発明の医薬、例えばベクターは医薬組成物に製剤化されてもよい。これらの組成物は、該医薬に加えて薬学的に許容可能な担体、希釈剤、賦形剤、緩衝液、安定剤または当技術分野においてよく公知である他の物質を含んでもよい。そのような物質は無毒性であるべきであり、活性成分の有効性に干渉すべきではない。担体または他の物質の正確な性質は当業者によって投与経路、例えば網膜下注入、網膜への直接注入または硝子体内注入に従って決定されてもよい。
本発明の文脈において防ぐことに関する言及は予防的な治療により一般的に関連するが、本明細書における治療に関するすべての言及は、根治の、対症的なおよび予防的な治療を含むものと理解されるべきである。治療はまた、疾患の重症度の進行を止めることも含んでもよい。
本明細書において言及される特定のタンパク質およびヌクレオチドに加えて、本発明はまた、バリアント、派生体、アナログ、ホモログおよびそれらの断片の使用も含む。
〔実施例1A:X連鎖性網膜色素変性症のマウスモデル系〕
例えばマウスや犬のような特定の種は、ヒトRPGRに相同な遺伝子を有する(図1に示される黄色のエキソン配列を比較せよ)。そのような種は故にヒトRPGRにおける変異により引き起こされるX連鎖性網膜色素変性症の潜在的なモデルになり得る。2つのマウスモデルが、本研究における治療用ベクターの安全性と有効性を試験するために得られた。両者は相同遺伝子Rpgrにおいて変更を有する。
1.Rpgr-/-系統:この系統は、β-ガラクトシダーゼおよびネオマイシン耐性マーカーをコードする遺伝子を含む配列により、エキソン4の一部からエキソン6の一部までを標的とした破壊により操作された(Hong D.H. et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 3649-3654)。
2.Rd9系統:この系統はフレームシフトにつながる32bpの天然に発生する挿入変異を備える(Thompson D.A. et al. (2012) PLoS One 7: e35865)。
RPGRのコドン最適化
合成RPGRORF15配列が、高度に変異しやすいプリンリッチ領域を安定化するために、コドン最適化(coRPGR、「最適化」;配列番号3)を使用して調製された(図2)。
クローニング効率および配列フィデリティーが、標準的なクローニングベクターにおける野生型およびコドン最適化配列の間で比較された(図3A-D)。
結果として得られたクローンのサンガーシーケンシングは、coRPGR配列を使用する場合に、不明瞭な塩基の読み出しがより少ない傾向が見出されたため、より容易であり、より良い全体的な信号対雑音比を伴っていることが見出された(図4)。
wtRPGRORF15およびcoRPGRORF15それぞれの4つの独立に作製されたプラスミド大量調製産物について、DNA配列を確認するためのゴールドスタンダードであるサンガーシーケンシング(Sanger F et al. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463-5467)を使用し、商用契約者としてIS 9001資格を有しGLP認定された実験室(Source BioScience, UK)においてシーケンスを行った。
タンデム質量分析法(LC/MS-MS)を用いた液体クロマトグラフィーが、coRPGR導入遺伝子産物のタンパク質配列を確認するために行われた(図5)。
全体としては、コドン最適化RPGRORF15(coRPGR)配列は野生型配列に比べて優れた配列フィデリティーおよび発現レベルの増加を示し、したがってXLRP遺伝子置換治療の治療上の可能性を改善しそうであると考えられた。
RPGRの発現がないマウス(Rd9およびRpgr-/-マウス系統)の視細胞の中にRPGRを導入するために使用されたAAV2/8ベクターに、coRPGR配列はパッケージされた。より詳細には、導入遺伝子カセットは、coRPGRポリヌクレオチド配列の上流にロドプシンキナーゼプロモーターおよびコザックコンセンサス配列、ならびにコーディング配列の下流にウシ成長ホルモン由来のポリA配列を備えた。
〔実施例2a〕
コドン最適化RPGR配列をコードするプラスミドのための細菌細胞バンクの作製
RPGR遺伝子のコドン最適化は、参照コドン最適化配列との100%配列フィデリティー、100%プラスミド分離安定性および良好なプラスミド収率を示した工業的に役立つ細菌細胞バンクを生じる能力をもたらすRPGR遺伝子の安定性の改善につながった。
コドン最適化RPGR配列をコードする高品質プラスミドの工業規模での生産
高品質プラスミドDNAが、手短に記載されるように、実施例2aにおいて作製された大腸菌(E.coli)XL10Gold細菌細胞バンクRCB pAAV.RK.coRPGRから製造され、精製された(Schmeer et al. (2014) Pharmaceutical Grade Large-Scale Plasmid DNA Manufacturing Process: 219-242)。細菌細胞バンクの単一バイアルが解凍され、増殖され、工業規模で培養され、細菌細胞塊が次に遠心により回収された。プラスミドDNAはアルカリ細菌細胞溶解により細菌バイオマスから抽出され、結果として生じた可溶性プラスミドDNAは不溶性タンパク質および複合物になったゲノムDNAから遠心および濾過により分離された。プラスミドDNAは複数ステップのクロマトグラフィー過程によりさらに精製された。完全に精製されたプラスミドDNAは、沈殿および接線方向流の濾過および膜濾過により調合緩衝液中に最終的に調製され、10mM Tris + 1mM EDTA、pH8.0中に1.0mg/mLで100mgの高度に精製されたプラスミドDNAが得られ(図10)、rAAVベクターの生産のためのさらなる製造過程において使用するために十分な純度(図11)であった。
RPGR遺伝子のコドン最適化は、rAAVベクター生産のためのさらなる製造過程に十分な量(100mg)および質の高純度プラスミドDNAを生じる能力をもたらす、RPGR遺伝子の安定性の改善につながった。
コドン最適化RPGRをコードするrAAV2/8の工業規模での生産
実施例2bにおいて製造された高品質プラスミドDNAは、大規模な一過的遺伝子導入およびその後の精製(Lock et al. 2010; Human Gene Therapy: 1259-1271)によりin vivoの使用の目的でrAAV8/2ベクターを製造するためにヘルパープラスミドpDP8.ape(PlasmidFactory、Bielefeld、GermanyおよびGrimm D, Kay MA, Kleinschmidt JA. Helper virus-free, optically controllable, and two-plasmid-based production of adeno-associated virus vectors of serotypes 1 to 6. Mol Ther 2003;7:839-850)とともに使用された。手短には、HEK293細胞が、十分な多層細胞培養容器に播種するのに十分な細胞が得られるまで、10%牛胎児血清(FBS)を補ったダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)において37℃かつ5%CO2にて接着培養で生育された。未精製AAVは、生育培地中に分泌されるrAAV粒子を生産するためにpAAV.RK.coRPGRプラスミドおよびpDP8.apeヘルパープラスミドを使用して多層細胞培養容器中で接着して生育するHEK293細胞のリン酸カルシウム一過的遺伝子導入により作製された。該rAAV粒子は細胞培養容器から培地を除去することにより回収され、細胞残渣を除去するために濾過された。rAAVはまず接線方向流の濾過(TFF)および限外濾過により濃縮され、同じTFF装置を使用してダイアフィルトレーションにより部分的に精製された。該rAAVはイオジキサノール不連続グラジエント限外濾過およびイオン交換カラムクロマトグラフィーを使用してさらに精製された。精製されたrAAVは、次に、さらなるTFFに基づく限外濾過およびダイアフィルトレーションにより3.55x1012gp/mlの濃度で最終的な調合緩衝液中に調製された。第2の1.00x1012gp/mlであるより低いrAAV濃度の調製物は、より高い用量形態を調合緩衝液中に希釈することにより製造された。両方の用量形態は50μL分割量でバイアルに入れられ60℃以下で貯蔵された。
RPGR遺伝子のコドン最適化は、in vivoの投薬研究において使用するために十分な量と質の精製rAAVベクターを生じる能力をもたらす、RPGR遺伝子の安定性の改善につながった。
本研究の目的は、好ましい臨床投与経路(ROA)である網膜下投薬を介して投与されるAAV8-RPGR遺伝子治療ベクターのin vivo送達を確立することであった。本研究は、AAV8-RPGRを用いて、C57B/6JマウスにおけるGLP適用で網膜下注入の単回投与試験において行われ、その後4週間および26週間の期間で解析が行われた。
この実施例では、コドン最適化の、RPGR発現レベル増加およびスプライシングの選択的フォームの合成の改善に対する効果が解析された。この目的のため、ヒト胚腎293細胞(HEK293)およびサルウイルス40(SV40)T抗原を発現するHEK293(HEK293T)細胞が使用された。これらの細胞はCAG.coRPGRORF15およびCAG.wtRPGRORF15プラスミド構築物を遺伝子導入され、下に記載される通り導入遺伝子検出のために処理された。
HEK293およびHEK293T細胞は4および2.5x105細胞/mlでそれぞれ6ウェルプレート中に播種され、70%コンフルエント以上になるまで37℃かつ5%CO2にて10%の加熱不活性化牛胎児血清(FBS)および1%ペニシリン/ストレプトマイシン添加DMEM中で培養された。1マイクログラムのプラスミドDNA(CAG.coRPGRORF15およびCAG.wtRPGRORF15)がMirus TransIT(登録商標)-LT1 Transfection Reagent(Geneflow Ltd.、Lichfield、UK)および無血清/無抗生物質培地を使用して細胞に送達された。遺伝子導入された細胞は37℃で48時間インキュベートされた。
全タンパク質溶解物のウェスタンブロット解析により、CAG.coRPGRORF15およびCAG.wtRPGRORF15プラスミドを遺伝子導入したHEK293およびHEK293T細胞においてRPGRORF15タンパク質に対応する約220kDaの顕著なバンド(図12Aおよび13A)が示された。β-アクチン強度により標準化されたRPGRORF15バンド強度の定量により、RPGRの発現は、コドン最適化プラスミドを遺伝子導入したHEK293細胞において、2.79[1.1から17.0]任意の単位(AU)(中央値[Q1からQ3])であり、野生型配列を遺伝子導入した細胞において、0.36[0.08から4.88]AUであるのに比べて高いことが明らかになった。同様に、コドン最適化配列を遺伝子導入したHEK293T細胞は、RPGR発現レベルが4.23±0.11AU(平均±標準偏差)であり、野生型配列を遺伝子導入した細胞が、3.01±0.07AU(平均±標準偏差)であるのに比べて増加を示した(図12Bおよび13B)。
これらの結果により、同義主要コドン導入によるRPGRORF15をコードする配列のコドン適応指標(CAI)の増加は、導入遺伝子の発現レベルの上昇につながり、一方で配列の安定性およびフィデリティーを増加させることによりトランケートされたタンパク質の合成を減少させることが確認された。
RPGR遺伝子治療は、RPGRの完全な喪失(ヌル変異)または機能不全タンパク質につながるRPGRの疾患原因変異を有する標的細胞においてRPGRの発現を再構成することを目的とする。これを達成する1つの方法は、RPGRをコードするヌクレオチド配列の正しいコピーを導入し、次にこれが標的細胞自身の翻訳機構によりRPGRタンパク質に翻訳されることによるものである。そのようなヌクレオチド配列は組換えAAVを用いた形質導入により導入され得る。
AAV2/8.RK.coRPGRおよびAAV2/8.RK.wtRPGRを含む組換えAAV溶液が作製され、品質と力価について調べられた。外科的介入およびAAV2/8による視細胞の形質導入の対照とするために、CAGプロモーター制御下にレポーター遺伝子としてGFPを有する第3の構築物(AAV2/8.CAG.GFP)が使用された。これらのベクター溶液はベクターゲノム数/mlを計算するためにqPCRにより定量された。-80℃貯蔵の分割量が使用直前に氷上で溶解され、2μl容量中1x1010vgでの網膜下送達を可能にするために0.001%Pluronic(登録商標)PF68(BASF、Ludwigshafen、Germany)を含む硝子体網膜手術用の平衡塩類溶液(BSS(登録商標))(Alcon Laboratories、Camberley、UK)中に希釈された。
すべての動物は、予定された用量のAAV溶液を網膜下腔に与えられ、麻酔から順調に回復した。これは、最初に前部の穿刺により眼圧(IOP)を低下させ、その後ベクター懸濁液を用いて半網膜の剥離を作る手術手順により可能になった。この手法は、角膜浮腫を発生することなく、および/または高IOPにより眼内循環を制限することなく、2μl容量までの送達を可能にした。同時に、低下したIOPは、注入の管を通る網膜下液の逆流(すなわち脈絡膜循環または眼球孔への)リスクを低下させた。
特異的シグナルが処置されたマウスに由来する切片で観察され、未処置のマウスに由来する切片では観察されなかった。このシグナルはRPGRエピトープへの抗体結合に由来し、導入遺伝子としてRPGRを持つAAVによる形質導入によるRPGRの発現と一致している。より強力なシグナルが、コドン最適化coRPGRを持つAAVであるAAV2/8.RK.coRPGRで処置された眼に由来する切片において見られた。
ここで適用された手術手法は、マウスの網膜下腔への2μlまでの安全な注入を可能にした。結果的に生じた半網膜剥離はすべての動物で24時間以内に自発的に再接着し、眼の後遺症は全く観察されなかった。同時にそれによって事前穿刺無しの網膜下注入後に見られ得るような(一時的な)角膜浮腫形成および/または眼内循環停止が防がれた。光媒体はその後3週間きれいなままであり、細胞浸潤、虹彩の前部/後部の癒着、または白内障の形成などの眼内病態を示すものは全くなかった。網膜のイメージングにより、AAV2/8.CAG.GFPを与えられた対照群において揺るぎないレベルのGFP導入遺伝子の発現が示された。興味深いことに、直接注入されたのは上側半網膜に限定されていたのにも関わらず、レポータータンパク質GFPは網膜全体に渡ってはっきりと観察された。これは、少なくともある程度の剥離領域外側の細胞の形質導入を示す。GFPの発現は、視細胞に限定されない遍在的な導入遺伝子発現につながる非特異的CAGプロモーターにより駆動された。これは、ロドプシンキナーゼプロモーターがcoRPGRの視細胞特異的発現を駆動する本発明のcoRPGRを有するベクターとは対照的である。
coRPGR遺伝子治療の安全性および有効性
XLRPの遺伝子治療の開発はいくつかの理由により課題のままであった。1つは自発的な変異に遭遇することなくクローニングすることを困難にしているRPGRORF15のプリンリッチで反復性のある配列である。サンガーシーケンシングにより配列の完全性を確認することもまた、高頻度ポリグアニン連続配列(frequent poly-guanine runs)がDNAポリメラーゼを失速または停止させるために問題である。
標本サイズと検出力の計算
標本サイズと検出力の計算はthe University of California、San Francisco Department of Epidemiology & Biostatistics、Division of BiostatisticsのRollin Brantにより提供されたJavaScript(登録商標)に基づくアルゴリズムを使用して行われた。このために使用される第1の評価項目は、本研究における標的細胞集団であるマウス網膜における大部分の視細胞の生理機能を反映する、0.01cd.s/m2の暗順応単一フラッシュ刺激後のa波振幅[μV]であった。これらの網膜電図検査(ERG)の反応が測定され、コホート(C57BL/6J、C57BL/6JRd9/BocおよびRpgr-/yマウス)当たりn=4の平均値と標準偏差がExcelにおいて計算された。標本サイズを計算する前に、C57BL/6J(ターゲットの正常値)とC57BL/6JRd9/Boc(処置前のベースライン)の間およびC57BL/6JとRpgr-/yの間の平均a波振幅の差が計算され、この1/2が、処置による50%の増加を仮定し、各疾患モデルの現在の平均値に加算された。これにより、μ0(未処置コホートの平均)およびμ1(処置されたコホートの平均)の値が提供された。σの値(標本集団の標準偏差)は各疾患モデルにおけるa波振幅の標準偏差に設定された。片側検定の設計が想定され、第1種の過誤率がα=0.05に設定され、要求検出力は標本サイズ計算の90%として規定された。
疾患過程に関連し、試験項目のAAV.RK.coRPGRの潜在的な治療効果および/または毒性効果の適切な読み出しである、網膜機能の客観的かつ定量的な生体指標としての第1評価項目として、ERG反応が選択された。コホート内の比較的高い個体間変動性のために、個体内試験パラダイムが選択された:片眼がAAV.RK.coRPGR(ビーラム(verum))で処置され、一方で反対側の眼が対照として使用された。そのような設計において自然な疾患過程を捉え、不活性型物質(AAV.control)の対照注入を備えるために、2つの並行した試験が実施された:無作為に選ばれた片眼のAAV.RK.coRPGRを用いた処置の(必然的な)非盲検試験が、自然な疾患過程に対して治療効果を比べるために使用された。
Rpgr-/y、C57BL/6JRd9/BocおよびC57BL/6Jマウスが、AAV.RK.coRPGR対AAV.control(上側)を試験する盲検両眼処置またはAAV.RK.coRPGR単独を用いた片側処置を与えられた。すべての眼はビーラム(verum)対偽処置または処置対無処置に無作為に指定された。手術は出生後22日(P22)に行われ、その後出生後2か月(PM2)、PM4およびPM6に網膜電図検査(ERG)を実施した。PM6では、走査型レーザー眼底検査(SLO)が、屠殺および組織学またはウェスタンブロッティングのための眼処理前に実施された。
網膜下AAV2/8.RK.coRPGR送達の潜在的毒性効果を探索するために、合計n=47のC57BL/6Jマウスが2つの試験において処置された。24個体が、眼が無作為方式で選択される非盲検の片側処置を受けた。処置は、0.001%PF-68を含むBSS(登録商標)に希釈された1.5x109vgのAAV2/8.RK.coRPGRの単回網膜下注入からなった。残りの23個体は、盲検かつ無作為方式で両側注入を受けた。ビーラム(verum)群における処置は上述の通りであり、一方で対照群は、同じ溶媒(0.001%PF-68を含むBSS(登録商標))に希釈された1.5x109vgのAAV2/8.controlを受けた。両方のベクターが実施例4において詳細に記載される。
両方の試験で合計n=36のC57BL/6JRd9/Bocマウスが処置された。19個体は非盲検片側処置を受け、一方で17個体はC57BL/6Jマウスについて上述されたようにビーラム(verum)または対照を用いた盲検かつ無作為な両側注入のために使用された。これは、AAVに基づくRPGR遺伝子置換遺伝子治療の有効性を調べるために行われた。追跡調査は上述のように予定を組まれた。
Rpgr-/yマウスは、第2のXLRP動物モデルにおけるAAVに基づくRPGR遺伝子置換遺伝子治療の有効性を調べるために使用された。このために、合計n=46個体が上述の2つの別々の試験において処置された。25個体は非盲検片側処置を受け、一方で21個体は上述の通り両側の眼(ビーラム(verum)および対照)において処置された。介入後の読み出しは上述のC57BL/6Jマウスのように予定を組まれた。
標本サイズと検出力の計算
計算された標本サイズはコホート(C57BL/6J、C57BL/6JRd9/BocおよびRpgr-/yマウス)当たり4個の眼(2個体)から収集されたERGデータに基づいた。n=9回の試験の平均a波振幅が各眼について記録された。
6個の眼が手術の質の低さにより試験から除外され、1個は元々存在する前部の変化により除外された。これにより結果として全体のコホートサイズは片側試験ではn=19となり、両側試験ではn=22となった。記録された手術の質の平均[および範囲]は、非盲検では9.0[8-10]、ビーラム(verum)では9.5[8-10]、また対照群では9.3[8-10]であり、すべての群において非常によく似ていた。すべてのマウスが手術後にすぐに回復した。
片側非盲検試験のうちの1個体のマウスは、未処理対照の眼において随伴小眼球による角膜浸潤が予め存在するために除外されなければならなかった。該小眼球は未処置の眼において偽の低いERG記録をもたらすかもしれなかった。これにより、片側試験では合計n=18個体、両側注入では合計n=17個体となった。処置された動物は手術の合併症により除外されなければならないものはなく、すべての動物が良または優の評点を与えられる注入を受け、評点の平均(すべての群で範囲は8-10)は非盲検については9.7、ビーラム(verum)では9.1、対照群では9.0であった。
片側非盲検試験のうちの1個体のマウスは、未処理の眼において予め存在する小眼球のために除外されなければならず、該小眼球は逆側の眼の外科的介入の後に初めて気付かれたものであり、該未処置の眼において偽の低いERG記録をもたらしたはずである。その上、処置された動物の両側試験に由来する1個体は手術の合併症(硝子体内出血を伴う部分的な硝子体内注入)により除外されなければならなかった。これにより結果として、合計では、片側試験はn=24個体になり、両側注入はn=20個体になった。手術成功率はすべてのコホートにおいて高かった:平均[範囲]の評点は非盲検では9.3[8-10]であり、C57BL/6JRd9/Bocマウスにおけるビーラム(verum)および免疫組織化学では9.5[9-10]であった。上側のパネルは、対照処置の眼ではRPGRの発現がないことを示す。AAV.coRPGRを用いた処置により、RPGRの発現およびRpgripとの共局在がもたらされた。スケールバーは20μmを示す。対照群においては9.4[8-10]。長期的な追跡調査では、両側注入された1個体がPM2で、片側注入された2個体がPM4で麻酔から回復しなかった。3時点に由来する合計128の両側ERGデータセットが首尾よく記録され、さらなる解析のために保存された。
RPGRがXLRP3の遺伝的原因として特性決定されてから、RPGR置換治療は興味を集めてきた。それが未だに臨床試験に移行していない目標のままであるという事実は、主にはRPGRが変異による変化を受ける高い傾向を有する複雑な遺伝子であるという事実による。これは、臨床試験申請を支持するデータセットを築くために重大な遅延をもたらしてきた。安全性試験のための規制認可があっても、RPGR遺伝子治療のための臨床グレードAAVの生産は重要な課題である。
AAV.RK.coRPGRの潜在的な毒性効果を探索するために、本発明者らは41頭のC57BL/6Jマウスにおいて同じ用量(1.5μl中の1.5x109vg)を試験した。19頭のマウスが片眼のみで処置され、一方で22頭がAAV.RK.coRPGRまたはAAV.controlのどちらかを用いて盲検両側処置を受けた。ビーラム(verum)群および対照または未処置群の間では、いずれの試験のいかなる時点においても、ERGにおける網膜機能の測定値の間で有意な差はなかった。その上、in vivoの網膜イメージングにより、AAV.RK.coRPGR処置は網膜構造に対して何の影響もないことが示唆された。H&E染色は処置により何の毒性効果もないことを示し、免疫組織化学およびウェスタンブロッティングは処置された個体ではRPGRORF15の発現と局在を示したが、未処置または対照処置の動物ではそうではなかった。以上を合わせると、野生型マウスをAAV.RK.coRPGRで1回処置してもいかなる毒性効果は惹起されず、良好な安全性プロファイルを示した。本発明者らは故にAAV.RK.coRPGRを用いた処置は安全であると結論した。
AAV.RK.coRPGRの治療効果は、2つのよく特徴付けられたXLRP3のマウスモデル:Rpgrにおいて天然に発生する変異を備えるトランスジェニックモデルRpgr-/yおよびC57BL/6JRd9/Bocにおいて示された。両方のモデルは網膜においてRpgrORF15の発現を欠くことが示されており、したがってXLRP3関連動物モデルとして選ばれた。しかし、これらの動物モデルを使用する際に注意点がある。最も重要なことには、疾患表現型が驚くほど軽度であり、それ故に必要な統計学的検出力を得るためには試験において比較的大きなコホートを必要とする。結果として、本発明者らは合計約80個体で試験を実施し、Rpgr-/yおよびC57BL/6JRd9/Bocマウスにおける電気生理学的測定値の有意な回復に示されるような有効性の揺るぎない証拠を提供した。
Claims (48)
- 網膜色素変性症GTPアーゼ制御因子ORF15アイソフォーム(retinitis pigmentosa GTPase regulator ORF15 isoform)(RPGRORF15)をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであって、該RPGRORF15をコードするヌクレオチド配列が該配列の複製フィデリティーを増加するようにコドン最適化されている、前記ポリヌクレオチド。
- RPGRORF15をコードするヌクレオチド配列が、野生型配列に比べてプリンヌクレオチドの数を減少するようにコドン最適化されている、請求項1に記載のポリヌクレオチド。
- コードされるRPGRORF15タンパク質がヒトRPGRORF15である、請求項1または2に記載のポリヌクレオチド。
- RPGRORF15をコードするヌクレオチド配列が配列番号2のヌクレオチド33、58、59、114、123、129、181、182、213、219、226、227、237、267、285、306、309、315、324、330、339、400、401、444、456、478、480、510、594、606、618、639、697、726、744、777、807、852、877、879、888、891、921、930、960、1042、1050、1116、1140、1183、1184、1194、1197、1221、1249、1251、1257、1273、1276、1281、1290、1293、1357、1372、1373、1413、1446、1452、1464、1474、1475、1482、1519、1520、1542、1584、1590、1599、1608、1653、1668、1674、1689、1692、1734、1761、1776、1788、1803、1824、1845、1854、1881、1893、1902、1909、1910、1929、1932、1960、1987、1988、1992、1998、2020、2031、2047、2049、2062、2067、2076、2121、2167、2169、2190、2193、2208、2229、2259、2283、2298、2323、2343、2346、2361、2373、2382、2388、2403、2409、2410、2412、2448、2457、2472、2476、2478、2505、2520、2547、2574、2622、2634、2661、2673、2706、2712、2763、2775、2796、2811、2817、2832、2838、2871、2886、2892、2898、2910、2922、2931、2937、2958、2970、2997、3033、3039、3069、3075、3117、3129、3156、3166、3235、3246、3273、3285、3306、3321、3369、3399、3405および/または3438に対応する位置にプリンヌクレオチドを含まない、請求項1〜3のいずれか1項に記載のポリヌクレオチド。
- RPGRORF15コードするヌクレオチド配列が配列番号2のヌクレオチド1689および/または3438に対応する位置にプリンヌクレオチドを含まない、請求項1〜4のいずれか1項に記載のポリヌクレオチド。
- RPGRORF15をコードするヌクレオチド配列が配列番号2の位置3405に対応する位置にTヌクレオチドを含む、請求項1〜5のいずれか1項に記載のポリヌクレオチド。
- RPGRORF15をコードするヌクレオチド配列が請求項4に挙げられたヌクレオチドの位置の少なくとも2、3、4、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180箇所またはすべてにプリンヌクレオチドを含まない、請求項1〜6のいずれか1項に記載のポリヌクレオチド。
- RPGRORF15をコードするヌクレオチド配列が請求項4に挙げられたヌクレオチドの位置の少なくともすべてにプリンヌクレオチドを含まない、請求項1〜7のいずれか1項に記載のポリヌクレオチド。
- RPGRORF15をコードするヌクレオチド配列が以下の:
(a)配列番号1に少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列;および/または
(b)配列番号3に少なくとも80%の同一性を有するヌクレオチド配列;または
(c)配列番号3のヌクレオチド配列
からなる群から選択される配列を含む、請求項1〜8のいずれか1項に記載のポリヌクレオチド。 - 前記アミノ酸配列が配列番号1に少なくとも85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99または100%の同一性を有する、請求項9(a)に記載のポリヌクレオチド。
- RPGRORF15をコードするヌクレオチド配列が、配列番号2の位置30に対応する位置のC、配列番号2の位置33に対応する位置のT、配列番号2の位置966に対応する位置のA、配列番号2の位置969に対応する位置のA、配列番号2の位置1011に対応する位置のT、配列番号2の位置1014に対応する位置のT、配列番号2の位置1029に対応する位置のT、配列番号2の位置1299に対応する位置のA、配列番号2の位置1689に対応する位置のC、配列番号2の位置3363に対応する位置のG、配列番号2の位置3405に対応する位置のT、配列番号2の位置3408に対応する位置のA、配列番号2の位置3409に対応する位置のA、配列番号2の位置3410に対応する位置のG、配列番号2の位置3432に対応する位置のG、配列番号2の位置3438に対応する位置のC、および配列番号2の位置3456に対応する位置のAから選択される1個以上のヌクレオチドを含む、請求項1〜10のいずれか1項に記載のポリヌクレオチド配列。
- RPGRORF15をコードするヌクレオチド配列が、配列番号2の位置30に対応する位置のC、配列番号2の位置33に対応する位置のT、配列番号2の位置48に対応する位置のA、配列番号2の位置57に対応する位置のA、配列番号2の位置60に対応する位置のT、配列番号2の位置69に対応する位置のT、配列番号2の位置72に対応する位置のA、配列番号2の位置171に対応する位置のC、配列番号2の位置189に対応する位置のC、配列番号2の位置441に対応する位置のT、配列番号2の位置537に対応する位置のT、配列番号2の位置546に対応する位置のC、配列番号2の位置786に対応する位置のT、配列番号2の位置792に対応する位置のT、配列番号2の位置966に対応する位置のA、配列番号2の位置969に対応する位置のA、配列番号2の位置990に対応する位置のA、配列番号2の位置1011に対応する位置のT、配列番号2の位置1014に対応する位置のT、配列番号2の位置1029に対応する位置のT、配列番号2の位置1299に対応する位置のA、配列番号2の位置1689に対応する位置のC、配列番号2の位置3355に対応する位置のA、配列番号2の位置3357に対応する位置のG、配列番号2の位置3363に対応する位置のG、配列番号2の位置3403に対応する位置のT、配列番号2の位置3404に対応する位置のC、配列番号2の位置3405に対応する位置のT、配列番号2の位置3408に対応する位置のA、配列番号2の位置3409に対応する位置のA、配列番号2の位置3410に対応する位置のG、配列番号2の位置3432に対応する位置のG、配列番号2の位置3438に対応する位置のC、および配列番号2の位置3456に対応する位置のAから選択される1個以上のヌクレオチドを含む、請求項1〜11のいずれか1項に記載のポリヌクレオチド配列。
- 網膜色素変性症GTPアーゼ制御因子ORF15アイソフォーム(RPGRORF15)、または配列番号1に少なくとも80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99もしくは100%の同一性を有するその機能的なバリアントをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであって、該ヌクレオチド配列が配列番号2の位置30に対応する位置のC、配列番号2の位置33に対応する位置のT、配列番号2の位置966に対応する位置のA、配列番号2の位置969に対応する位置のA、配列番号2の位置1011に対応する位置のT、配列番号2の位置1014に対応する位置のT、配列番号2の位置1029に対応する位置のT、配列番号2の位置1299に対応する位置のA、配列番号2の位置1689に対応する位置のC、配列番号2の位置3363に対応する位置のG、配列番号2の位置3405に対応する位置のT、配列番号2の位置3408に対応する位置のA、配列番号2の位置3409に対応する位置のA、配列番号2の位置3410に対応する位置のG、配列番号2の位置3432に対応する位置のG、配列番号2の位置3438に対応する位置のC、および配列番号2の位置3456に対応する位置のAから選択される1個以上のヌクレオチドを含む、前記ポリヌクレオチド。
- 網膜色素変性症GTPアーゼ制御因子ORF15アイソフォーム(RPGRORF15)または配列番号1に少なくとも80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99もしくは100%の同一性を有するその機能的なバリアントをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであって、該ヌクレオチド配列が、
(a)配列番号3に少なくとも80%の同一性を有するヌクレオチド配列であって、前記配列が配列番号2の位置30に対応する位置のC、配列番号2の位置33に対応する位置のT、配列番号2の位置48に対応する位置のA、配列番号2の位置57に対応する位置のA、配列番号2の位置60に対応する位置のT、配列番号2の位置69に対応する位置のT、配列番号2の位置72に対応する位置のA、配列番号2の位置171に対応する位置のC、配列番号2の位置189に対応する位置のC、配列番号2の位置441に対応する位置のT、配列番号2の位置537に対応する位置のT、配列番号2の位置546に対応する位置のC、配列番号2の位置786に対応する位置のT、配列番号2の位置792に対応する位置のT、配列番号2の位置966に対応する位置のA、配列番号2の位置969に対応する位置のA、配列番号2の位置990に対応する位置のA、配列番号2の位置1011に対応する位置のT、配列番号2の位置1014に対応する位置のT、配列番号2の位置1029に対応する位置のT、配列番号2の位置1299に対応する位置のA、配列番号2の位置1689に対応する位置のC、配列番号2の位置3355に対応する位置のA、配列番号2の位置3357に対応する位置のG、配列番号2の位置3363に対応する位置のG、配列番号2の位置3403に対応する位置のT、配列番号2の位置3404に対応する位置のC、配列番号2の位置3405に対応する位置のT、配列番号2の位置3408に対応する位置のA、配列番号2の位置3409に対応する位置のA、配列番号2の位置3410に対応する位置のG、配列番号2の位置3432に対応する位置のG、配列番号2の位置3438に対応する位置のC、および配列番号2の位置3456に対応する位置のAから選択される1個以上のヌクレオチドを含む、前記ヌクレオチド配列;および
(b)配列番号3のヌクレオチド配列
からなる群から選択される、前記ポリヌクレオチド。 - RPGRORF15をコードするヌクレオチド配列が、ヒト桿体および錐体視細胞においてRPGRORF15またはその機能的なバリアントの発現を駆動することができるプロモーターエレメントを含むポリヌクレオチドに作動可能に連結される、請求項1〜14のいずれか1項に記載のポリヌクレオチド。
- RPGRORF15をコードするヌクレオチド配列が、ロドプシンキナーゼ(GRK1)プロモーター、好ましくはヒトGRK1プロモーターに作動可能に連結される、請求項1〜15のいずれか1項に記載のポリヌクレオチド。
- 前記GRK1プロモーターが、配列番号7のヌクレオチド配列またはそれに少なくとも90%もしくは95%の同一性を有する機能的なバリアントを含む、請求項16に記載のポリヌクレオチド。
- RPGRORF15をコードするヌクレオチド配列が、165個より少ないCpGジヌクレオチドを含み、かつ/または2個以下のCpGアイランドを含む、請求項1〜17のいずれか1項に記載のポリヌクレオチド。
- 前記ポリヌクレオチドが、配列番号2のヒト野生型RPGRORF15を含む同等なポリヌクレオチドに比べて、複製フィデリティーが実質的に同じかまたは増加している、請求項1〜18のいずれか1項に記載のポリヌクレオチド。
- 前記ポリヌクレオチドが、配列番号2のヒト野生型RPGRORF15を含む同等なポリヌクレオチドに比べて、安定性が増加し、かつ/またはポリヌクレオチド複製周期中に変異を発生する傾向が小さい、請求項1〜19のいずれか1項に記載のポリヌクレオチド。
- 前記ポリヌクレオチドが、配列番号2のヒト野生型RPGRORF15を含む同等なポリヌクレオチドに比べて高い翻訳効率および/またはタンパク質発現量を与える、請求項1〜20のいずれか1項に記載のポリヌクレオチド。
- 前記ポリヌクレオチドが、配列番号2のヒト野生型RPGRORF15を含む同等なポリヌクレオチドに比べて、選択的スプライシングのバリアントおよび/またはトランケートされたタンパク質の産生を減少させるかまたは回避する、請求項1〜21のいずれか1項に記載のポリヌクレオチド。
- 請求項1〜22のいずれか1項に記載のポリヌクレオチドを含むウイルスベクター。
- ウイルスベクターがアデノ随伴ウイルス(AAV)、レトロウイルス、レンチウイルスまたはアデノウイルスベクターである、請求項23に記載のウイルスベクター。
- ウイルスベクターがAAVベクターである、請求項23または24に記載のウイルスベクター。
- ウイルスベクターがウイルス粒子の形態である、請求項23〜25のいずれか1項に記載のウイルスベクター。
- ウイルスベクターがトランスキャプシデートされた(transcapsidated)AAVベクターである、請求項26に記載のウイルスベクター。
- ウイルスベクターがAAV2ゲノムおよびAAV5(AAV2/5)またはAAV8(AAV2/8)のキャプシドタンパク質を含む、請求項26に記載のウイルスベクター。
- ウイルスベクターがAAV2ゲノムおよび/またはAAV8のキャプシドタンパク質を含むAAVベクターである、請求項25または26に記載のAAVベクター。
- ウイルスベクターの生産に必要な構成要素をコードする1セットのポリヌクレオチドを含むウイルスベクター生産系であって、該ウイルスベクターのゲノムが請求項1〜22のいずれか1項に記載のポリヌクレオチドを含む、前記ウイルスベクター生産系。
- 請求項1〜22のいずれか1項に記載のポリヌクレオチドを含む、請求項30に記載のウイルスベクター生産系における使用のためのDNA構築物。
- 請求項1〜22のいずれか1項に記載のポリヌクレオチド、請求項30に記載のウイルスベクター生産系、または請求項31に記載のDNA構築物を含むウイルスベクター生産細胞。
- 請求項1〜22のいずれか1項に記載のポリヌクレオチドを細胞に導入すること、およびウイルスベクターの生産に好適な条件下で該細胞を培養することを含む、ウイルスベクター生産方法。
- 請求項32に記載のウイルスベクター生産細胞を使用して、または請求項33に記載の方法によって得られるウイルスベクター。
- 請求項1〜22のいずれか1項に記載のポリヌクレオチドを遺伝子導入された、または請求項23〜29もしくは34のいずれか1項に記載のウイルスベクターにより形質導入された細胞。
- 前記細胞がHEK293またはHEK293T細胞である、請求項33に記載の方法または請求項35に記載の細胞。
- 請求項1〜22のいずれか1項に記載のポリヌクレオチド、請求項23〜29もしくは34のいずれか1項に記載のウイルスベクター、または請求項35に記載の細胞を、薬学的に許容可能な担体、希釈剤または賦形剤と組み合わせて含む医薬組成物。
- 網膜色素変性症の治療または予防における使用のための、請求項1〜22のいずれか1項に記載のポリヌクレオチド、または請求項23〜29もしくは34のいずれか1項に記載のウイルスベクター。
- 網膜色素変性症を患っているかまたは発症リスクのある対象者において視細胞の細胞死を減少させる使用のための、請求項1〜22のいずれか1項に記載のポリヌクレオチド、または請求項23〜29もしくは34のいずれか1項に記載のウイルスベクター。
- 網膜色素変性症がX連鎖性網膜色素変性症である、請求項38または39に記載の使用のためのポリヌクレオチドまたはウイルスベクター。
- ウイルスベクターが網膜下注入、網膜への直接注入または硝子体内注入により対象者の眼に投与される、請求項38〜40のいずれか1項に記載の使用のためのポリヌクレオチドまたはウイルスベクター。
- 網膜下注入が以下のステップ:
(a)少なくとも部分的に網膜を剥離し網膜下ブレブを形成するのに有効な量の溶液の網膜下注入による対象者への投与であって、該溶液がポリヌクレオチドまたはウイルスベクターを含まない、前記投与;および
(b)ステップ(a)により形成されたブレブ中への網膜下注入による医薬組成物の投与であって、該医薬がポリヌクレオチドまたはウイルスベクターを含む、前記投与
を含む、請求項38〜41のいずれか1項に記載の使用のためのポリヌクレオチドまたはウイルスベクター。 - ウイルスベクターが対象者に単回投与で投与される、請求項38〜42のいずれか1項に記載の使用のためのポリヌクレオチドまたはウイルスベクター。
- 対象者の生涯の間に網膜色素変性症による視細胞の細胞変性を実質的に防止する、請求項38〜43のいずれか1項に記載の使用のためのポリヌクレオチドまたはウイルスベクター。
- 治療された眼において視覚機能が実質的に回復または維持される、請求項38〜44のいずれか1項に記載の使用のためのポリヌクレオチドまたはウイルスベクター。
- 請求項1〜22のいずれか1項に記載のポリヌクレオチド、または請求項23〜29もしくは34のいずれか1項に記載のウイルスベクターを、それを必要とする対象者に投与することを含む、網膜色素変性症の治療または予防方法。
- 請求項1〜22のいずれか1項に記載のポリヌクレオチド、または請求項23〜29もしくは34のいずれか1項に記載のウイルスベクターを対象者に投与することを含む、網膜色素変性症を患うかまたは発症リスクのある対象者において視細胞の細胞死を減少させる方法。
- (a)野生型RPGRORF15遺伝子を含むベクターもしくはポリヌクレオチドに比べて、選択的スプライシングのバリアントおよび/もしくはトランケートされたRPGRORF15タンパク質の産生を減少させるかもしくは回避するための、ならびに/または
(b)野生型RPGRORF15遺伝子を含むヌクレオチド配列に比べて、RPGRORF15遺伝子を含むヌクレオチド配列の安定性および/もしくは複製フィデリティーを増加させるための、ならびに/または
(c)野生型RPGRORF15遺伝子を含むベクターもしくはポリヌクレオチドに比べてRPGRORF15タンパク質の翻訳および/もしくはタンパク質発現の効率を高めるための、ならびに/または
(d)野生型RPGRORF15遺伝子を含むヌクレオチド配列に比べてRPGRORF15をコードするヌクレオチド配列の収量を増加させるための、
請求項1〜22のいずれか1項に記載のポリヌクレオチド、または請求項23〜29もしくは34のいずれか1項に記載のウイルスベクターの使用。
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