KR20180043373A

KR20180043373A - 색소성망막염의 치료

Info

Publication number: KR20180043373A
Application number: KR1020187009860A
Authority: KR
Inventors: 로버트 맥클라렌; 도미니크 피셔
Original assignee: 옥스포드 유니버시티 이노베이션 리미티드
Priority date: 2015-09-10
Filing date: 2016-09-09
Publication date: 2018-04-27
Also published as: IL257881B; MX2018002899A; RU2020137429A; HK1250727A1; US20210130425A1; US20180273594A1; MX2022003859A; RU2018112506A3; JP7011580B2; RU2018112506A; GB201516066D0; US10836803B2; IL257881A; AU2016320551B2; SG10202013246VA; WO2017042584A1; US20200002392A1; JP2018529336A; AU2016320551A1; CN108699118A

Abstract

본 발명은 색소성망막염 GTPase 조절인자 ORF15 아이소형(RPGR^ORF15)을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것으로, RPGR^ORF15-인코딩 뉴클레오티드 서열은 서열의 복제 정확도를 증가시키기 위해 코돈 최적화되었다.

Description

색소성망막염의 치료

본 발명은 눈 질병의 유전자 요법에서 사용하기 위한 화합물에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 색소성망막염(RP)의 치료 또는 예방에서 사용하기 위한 바이러스 벡터, 특히 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터에 관한 것으로, 바이러스 벡터는 눈으로의 색소성망막염 GTPase 조절인자 ORF15 아이소형(isoform)(RPGR^ORF15))의 전달을 가능하게 한다.

색소성망막염(RP)은 시력의 단계적 감소를 발생시키는 유전적 망막이영양증의 표현형적으로 연관된 그룹이다. RP는 3000-4000명의 사람 당 약 1명이 걸린다.

RP의 초기 증상은 야간 및 주변 시력의 악화를 포함한다. 질병이 진행됨에 따라, 세부 시력, 중심 시력 및 색각이 또한 영향을 받을 수 있다. RP 증상의 발생 연령은 다양하나, 통상적으로 10 내지 30세이며, 악화 속도는 개인마다 다양하다.

RP는 일반적으로 막대 광수용체 세포의 진행성 변성에 의해 야기된다. 그러나, 망막 색소 상피(RPE) 및 원뿔 광수용체 세포가 또한 질병의 진행 동안 변성될 수 있다.

RP는, 예를 들어, 눈의 건강 및 기능과 관련된 많은 상이한 유전자 중 하나에서의 돌연변이에 의해 야기될 수 있다. RP의 모든 단일 유전자 원인 중, 색소성망막염 GTPase 조절인자(RPGR) 유전자에서의 결손으로부터 발생하는 X-연관 질병이 가장 일반적이다.

X-연관 색소성망막염(XLRP)은 색소성망막염의 가장 심한 형태로 간주된다. XLRP로 고통받는 대상체는 삶의 처음 20년 이내에 주변 시야의 제한 및 야맹증을 경험한다. 또한, 눈부심, 눈의 무의식적인 진자 운동, 색각 장애 및 감소된 중심 시력이 상기 질환의 특징이다. 결과로서, 환자는 통상적으로 이의 중등 교육의 완료 전에도 법적으로 실명된다.

RPGR 유전자는 고도로 돌연변이 유발성이며, 이는 생체 내에서 질병-유발 돌여변이가 발생할 가능성을 증가시킨다. 그러나, 이러한 돌연변이유발 특성은 또한 유전자 요법에서 사용하기 위한 RPGR을 인코딩하는 벡터를 생산하는 경우에 문제를 발생시킨다. 실제로, XLRP에 대한 유전자 대체 요법을 개발하려는 이전의 전략은 상기 돌연변이에 의해 방해받았고, 아주 최근에 트랜스진(transgene) 카세트의 ORF15 영역에서 발견된 돌연변이로 인해 유망한 연구 프로그램이 지연되었다. 또 다른 프로그램에서, 대안적인 RPGR 스플라이스 변이체가 웨스턴 블롯에 의해 검출되었다(Wu, Z. et al. (2015) Hum. Mol. Genet. 24: 3956-3970).

RP의 발생을 예방하거나, 질병의 발생 후에 시력을 개선시키기 위한 개선된 요법이 현재 없다. 따라서, 특히 시각 기능에서의 악화를 예방하거나, 병에 걸린 개인의 시력에서의 개선을 가능하게 하기 위해 RP의 치료가 매우 필요하다.

본 발명자는 놀랍게도 색소성망막염 GTPase 조절인자 ORF15 아이소형(RPGR^ORF15) 유전자의 서열이 복제 동안 돌연변이의 발생을 감소시키거나 예방하는(즉, 복제의 정확도를 증가시킴) 것과 같이 서열 안정성을 증가시키도록 조작될 수 있음을 발견하였다. 본 발명자는 또한 유전자의 기능에 영향을 미치는 조작의 위험이 완화될 수 있음을 예기치 않게 발견하였다. 또한, 조작된 유전자는 색소성망막염의 동물 모델을 성공적으로 치료하는 것이 본 발명자에 의해 입증되었다.

따라서, 일 양태에서, 본 발명은 색소성망막염 GTPase 조절인자 ORF15 아이소형(RPGR^ORF15)을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 제공하며, RPGR^ORF15-인코딩 뉴클레오티드 서열은 서열의 복제 정확도를 증가시키기 위해 코돈 최적화되었다.

바람직하게는, 본 발명의 RPGR^ORF15-인코딩 뉴클레오티드 서열은 대안적인 스플라이스 변이체의 생성을 감소시키기 위해 코돈 최적화되었다.

바람직하게는, 본 발명의 RPGR^ORF15-인코딩 뉴클레오티드 서열은 야생형 서열에 비해 새로운 CpG 부위의 생성을 최소화시키거나 피하기 위해 코돈 최적화되었다. 일 구현예에서, 본 발명의 RPGR^ORF15-인코딩 뉴클레오티드 서열은 220, 210, 200, 190, 170, 165, 160, 150, 140, 130, 120, 110 또는 100개 미만의 CpG 부위를 포함한다.

바람직하게는, 본 발명의 RPGR^ORF15-인코딩 뉴클레오티드 서열은 일부 또는 모든 GGN 코돈을 GGC 코돈으로 대체(GGN 코돈이 원형 GGC 코돈이 아닌 경우)함으로써 코돈 최적화되었다.

바람직하게는, 본 발명의 RPGR^ORF15-인코딩 뉴클레오티드 서열은 RPGR^ORF15-인코딩 뉴클레오티드 서열의 퓨린-풍부(즉, GA-풍부) 영역, 예를 들어, ORF 15 엑손 영역(RPGR^ORF15의 뉴클레오티드 1754-3459, 예를 들어, SEQ ID NO:2의 뉴클레오티드 1754-3459에 해당함) 내의 새로운 티민 뉴클레오티드의 도입을 최소화시키거나 피하기 위해 코돈 최적화되었다.

바람직하게는, 본 발명의 RPGR^ORF15-인코딩 뉴클레오티드 서열은 야생형 서열에 비해 GT 부위(즉, 잠재적 스플라이스 공여체 부위)의 수를 감소시키기 위해 코돈 최적화되었다. 일 구현예에서, 본 발명의 RPGR^ORF15-인코딩 뉴클레오티드 서열은 120, 115, 110, 105, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20 또는 10개 미만의 GT 부위를 포함한다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 RPGR^ORF15-인코딩 뉴클레오티드 서열은 105개 미만의 GT 부위를 포함한다.

바람직하게는, 본 발명의 RPGR^ORF15-인코딩 뉴클레오티드 서열은 비정상적 폴리A 신호(예를 들어, AATAAA)의 생성을 피하기 위해 코돈 최적화되었다.

일 구현예에서, 본 발명의 RPGRORF15-인코딩 뉴클레오티드 서열은 야생형 서열에 비해 퓨린 뉴클레오티드의 수를 감소시키기 위해 코돈 최적화되었다. 야생형 서열은, 예를 들어, SEQ ID NO:2의 서열일 수 있다.

바람직하게는, 퓨린 뉴클레오티드의 수는 퓨린 뉴클레오티드를 피리미딘 뉴클레오티드로 대체함으로써 감소된다.

일 구현예에서, 퓨린 뉴클레오티드의 수는 RPGR^ORF15-인코딩 뉴클레오티드 서열의 퓨린-풍부(즉, GA-풍부) 영역, 예를 들어, ORF 15 엑손 영역(RPGR^ORF15의 뉴클레오티드 1754-3459, 예를 들어, SEQ ID NO:2의 뉴클레오티드 1754-3459에 해당함)에서 감소된다.

또 다른 구현예에서, 본 발명의 RPGR^ORF15-인코딩 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:2의 뉴클레오티드 1761, 1776, 1788, 1803, 1824, 1845, 1854, 1881, 1893, 1902, 1909, 1910, 1929, 1932, 1960, 1987, 1988, 1992, 1998, 2020, 2031, 2047, 2049, 2062, 2067, 2076, 2121, 2167, 2169, 2190, 2193, 2208, 2229, 2259, 2283, 2298, 2323, 2343, 2346, 2361, 2373, 2382, 2388, 2403, 2409, 2410, 2412, 2448, 2457, 2472, 2476, 2478, 2505, 2520, 2547, 2574, 2622, 2634, 2661, 2673, 2706, 2712, 2763, 2775, 2796, 2811, 2817, 2832, 2838, 2871, 2886, 2892, 2898, 2910, 2922, 2931, 2937, 2958, 2970, 2997, 3033, 3039, 3069, 3075, 3117, 3129, 3156, 3166, 3235, 3246, 3273, 3285, 3306, 3321, 3369, 3399, 3405 및/또는 3438에 해당하는 위치에서 퓨린 뉴클레오티드를 포함하지 않는다. 바람직하게는, 이들 위치의 뉴클레오티드는 SEQ ID NO:3에서 발견되는 뉴클레오티드에 상응한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 RPGR^ORF15-인코딩 뉴클레오티드 서열은 이들 뉴클레오티드 위치 중 적어도 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90개 또는 전부에서 퓨린 뉴클레오티드를 포함하지 않는다. 바람직하게는, 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:1과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩한다. 더욱 바람직하게는, 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:1의 아미노산 서열을 인코딩한다.

또 다른 구현예에서, 본 발명의 RPGR^ORF15-인코딩 뉴클레오티드 서열은 위치 1761, 1776, 1788, 1803, 1824, 1845, 1854, 1881, 1893, 1902, 1909, 1910, 1929, 1932, 1960, 1987, 1988, 1992, 1998, 2020, 2031, 2047, 2049, 2062, 2067, 2076, 2121, 2167, 2169, 2190, 2193, 2208, 2229, 2259, 2283, 2298, 2323, 2343, 2346, 2361, 2373, 2382, 2388, 2403, 2409, 2410, 2412, 2448, 2457, 2472, 2476, 2478, 2505, 2520, 2547, 2574, 2622, 2634, 2661, 2673, 2706, 2712, 2763, 2775, 2796, 2811, 2817, 2832, 2838, 2871, 2886, 2892, 2898, 2910, 2922, 2931, 2937, 2958, 2970, 2997, 3033, 3039, 3069, 3075, 3117, 3129, 3156, 3166, 3235, 3246, 3273, 3285, 3306, 3321, 3369, 3399, 3405 및/또는 3438의 퓨린 뉴클레오티드를 피리미딘 뉴클레오티드(예를 들어, 티민 또는 시토신)로 대체함으로써 SEQ ID NO:2로부터 유래된다. 바람직하게는, 이들 위치의 뉴클레오티드는 SEQ ID NO:3에서 발견되는 뉴클레오티드에 상응한다. 또 다른 구현예에서, 퓨린 뉴클레오티드는 이들 뉴클레오티드 위치 중 적어도 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90개 또는 전부에서 대체되었다. 바람직하게는, 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:1과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩한다. 더욱 바람직하게는, 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:1의 아미노산 서열을 인코딩한다.

본 발명에 따르면, 퓨린 뉴클레오티드의 수는 야생형 서열(예를 들어, SEQ ID NO:2) 내의 퓨린 뉴클레오티드의 수의 적어도 0.5%, 1%, 1.5%, 2%, 2.5%, 3%, 3.5%, 4%, 4.5% 또는 5%만큼 감소될 수 있다.

본 발명에 따르면, 퓨린 뉴클레오티드의 수는 야생형 서열(예를 들어, SEQ ID NO:2) 내의 퓨린 뉴클레오티드의 수의 0.5-10%, 0.5-7.5%, 0.5-5%, 0.5-4.5%, 0.5-4%, 0.5-3.5%, 0.5-3%, 1-5%, 1-4.5%, 1-4%, 1-3.5% 또는 1-3%만큼 감소될 수 있다.

일 구현예에서, 본 발명의 RPGR^ORF15-인코딩 뉴클레오티드 서열은 야생형 서열에 비해 아데닌 뉴클레오티드의 수를 감소시키기 위해 코돈 최적화되었다. 야생형 서열은, 예를 들어, SEQ ID NO:2의 서열일 수 있다. 또 다른 구현예에서, 아데닌 뉴클레오티드의 수는 적어도 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 또는 200개만큼 감소되었다. 일 구현예에서, SEQ ID NO:2의 뉴클레오티드 58, 114, 123, 129, 181, 213, 219, 226, 237, 285, 306, 309, 315, 324, 330, 339, 400, 444, 456, 478, 480, 594, 606, 618, 697, 744, 807, 852, 877, 888, 891, 921, 930, 960, 1042, 1050, 1116, 1140, 1183, 1194, 1197, 1221, 1249, 1257, 1273, 1276, 1281, 1290, 1293, 1357, 1372, 1413, 1446, 1452, 1464, 1474, 1482, 1519, 1542, 1584, 1608, 1653, 1674, 1692, 1734, 1761, 1776, 1788, 1803, 1824, 1854, 1881, 1893, 1902, 1909, 1929, 1960, 1987, 1992, 1998, 2020, 2047, 2049, 2062, 2067, 2076, 2167, 2169, 2190, 2208, 2229, 2259, 2298, 2323, 2361, 2373, 2382, 2403, 2410, 2412, 2448, 2457, 2472, 2476, 2622, 2661, 2673, 2712, 2775, 2811, 2832, 2886, 2910, 2931, 2958, 3033, 3117, 3129, 3156, 3166, 3235, 3246, 3273, 3306, 3321, 3369, 3405 및/또는 3438에 해당하는 위치의 아데닌은 피리미딘 뉴클레오티드(예를 들어, 티민 또는 시토신)로 대체된다. 바람직하게는, 이들 위치의 뉴클레오티드는 SEQ ID NO:3에서 발견되는 뉴클레오티드에 상응한다.

일 구현예에서, 본 발명의 RPGR^ORF15-인코딩 뉴클레오티드 서열은, 예를 들어, 도 2의 서열 정렬(wtRPGR, "원형"; coRPGR, "최적화")에서 SEQ ID NO:2(wtRPGR)의 퓨린 뉴클레오티드가 SEQ ID NO:3(coRPGR)의 피리미딘 뉴클레오티드와 정렬된 위치에 해당하는 적어도 하나의 위치, 바람직하게는 적어도 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170 또는 180개의 위치, 바람직하게는 모든 위치에서 퓨린 뉴클레오티드를 포함하지 않는다.

또 다른 구현예에서, 본 발명의 RPGR^ORF15-인코딩 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:2의 뉴클레오티드 33, 58, 59, 114, 123, 129, 181, 182, 213, 219, 226, 227, 237, 267, 285, 306, 309, 315, 324, 330, 339, 400, 401, 444, 456, 478, 480, 510, 594, 606, 618, 639, 697, 726, 744, 777, 807, 852, 877, 879, 888, 891, 921, 930, 960, 1042, 1050, 1116, 1140, 1183, 1184, 1194, 1197, 1221, 1249, 1251, 1257, 1273, 1276, 1281, 1290, 1293, 1357, 1372, 1373, 1413, 1446, 1452, 1464, 1474, 1475, 1482, 1519, 1520, 1542, 1584, 1590, 1599, 1608, 1653, 1668, 1674, 1689, 1692, 1734, 1761, 1776, 1788, 1803, 1824, 1845, 1854, 1881, 1893, 1902, 1909, 1910, 1929, 1932, 1960, 1987, 1988, 1992, 1998, 2020, 2031, 2047, 2049, 2062, 2067, 2076, 2121, 2167, 2169, 2190, 2193, 2208, 2229, 2259, 2283, 2298, 2323, 2343, 2346, 2361, 2373, 2382, 2388, 2403, 2409, 2410, 2412, 2448, 2457, 2472, 2476, 2478, 2505, 2520, 2547, 2574, 2622, 2634, 2661, 2673, 2706, 2712, 2763, 2775, 2796, 2811, 2817, 2832, 2838, 2871, 2886, 2892, 2898, 2910, 2922, 2931, 2937, 2958, 2970, 2997, 3033, 3039, 3069, 3075, 3117, 3129, 3156, 3166, 3235, 3246, 3273, 3285, 3306, 3321, 3369, 3399, 3405 및/또는 3438에 해당하는 위치에서 퓨린 뉴클레오티드를 포함하지 않는다. 바람직하게는, 이들 위치의 뉴클레오티드는 SEQ ID NO:3에서 발견되는 뉴클레오티드에 상응한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 RPGR^ORF15-인코딩 뉴클레오티드 서열은 이들 뉴클레오티드 위치 중 적어도 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180개 또는 전부에서 퓨린 뉴클레오티드를 포함하지 않는다. 바람직하게는, 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:1과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩한다. 더욱 바람직하게는, 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:1의 아미노산 서열을 인코딩한다.

본 출원에서 뉴클레오티드 위치는 SEQ ID NO:2의 특정 위치에 '상응하는' 것으로 확인됨이 인지되어야 한다. 이는 본 발명의 서열이 SEQ ID NO:2에 존재하는 서열을 포함해야 함을 의미하는 것으로 해석되어선 안된다. 여기서, RPGR^ORF15-인코딩 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드는 SEQ ID NO:2의 5' 아데닌이 뉴클레오티드 1이 되도록 지정된 규약에 따라 넘버링된다. 개별적 뉴클레오티드의 동일성 및 돌연변이의 위치는 상기 넘버링 규약을 참조하여 본원에 기재된다. 당업자는 SEQ ID NO:2에 대한 서열 정렬을 수행함으로써 상동성 서열에서 유사한 위치을 용이하게 결정할 수 있을 것이다. 상기 정렬의 예는 도 2에 제시된다.

또 다른 구현예에서, 본 발명의 RPGR^ORF15-인코딩 뉴클레오티드 서열은 위치 33, 58, 59, 114, 123, 129, 181, 182, 213, 219, 226, 227, 237, 267, 285, 306, 309, 315, 324, 330, 339, 400, 401, 444, 456, 478, 480, 510, 594, 606, 618, 639, 697, 726, 744, 777, 807, 852, 877, 879, 888, 891, 921, 930, 960, 1042, 1050, 1116, 1140, 1183, 1184, 1194, 1197, 1221, 1249, 1251, 1257, 1273, 1276, 1281, 1290, 1293, 1357, 1372, 1373, 1413, 1446, 1452, 1464, 1474, 1475, 1482, 1519, 1520, 1542, 1584, 1590, 1599, 1608, 1653, 1668, 1674, 1689, 1692, 1734, 1761, 1776, 1788, 1803, 1824, 1845, 1854, 1881, 1893, 1902, 1909, 1910, 1929, 1932, 1960, 1987, 1988, 1992, 1998, 2020, 2031, 2047, 2049, 2062, 2067, 2076, 2121, 2167, 2169, 2190, 2193, 2208, 2229, 2259, 2283, 2298, 2323, 2343, 2346, 2361, 2373, 2382, 2388, 2403, 2409, 2410, 2412, 2448, 2457, 2472, 2476, 2478, 2505, 2520, 2547, 2574, 2622, 2634, 2661, 2673, 2706, 2712, 2763, 2775, 2796, 2811, 2817, 2832, 2838, 2871, 2886, 2892, 2898, 2910, 2922, 2931, 2937, 2958, 2970, 2997, 3033, 3039, 3069, 3075, 3117, 3129, 3156, 3166, 3235, 3246, 3273, 3285, 3306, 3321, 3369, 3399, 3405 및/또는 3438의 퓨린 뉴클레오티드를 피리미딘 뉴클레오티드(예를 들어, 티민 또는 시토신)로 대체함으로써 SEQ ID NO:2로부터 유래된다. 바람직하게는, 이들 위치의 뉴클레오티드는 SEQ ID NO:3에서 발견되는 뉴클레오티드에 상응한다. 또 다른 구현예에서, 퓨린 뉴클레오티드는 이들 뉴클레오티드 위치 중 적어도 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180개 또는 전부에서 대체되었다. 바람직하게는, 퓨린 뉴클레오티드는 이들 뉴클레오티드 위치 전부에서 대체되었다. 바람직하게는, 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:1과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩한다. 더욱 바람직하게는, 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:1의 아미노산 서열을 인코딩한다.

일 구현예에서, RPGR^ORF15-인코딩 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:2의 위치 33에 해당하는 뉴클레오티드가 T이고/이거나, 위치 58에 해당하는 뉴클레오티드가 T이고/이거나, 위치 59에 해당하는 뉴클레오티드가 C이고/이거나, 위치 144에 해당하는 뉴클레오티드가 C이고/이거나, 위치 123에 해당하는 뉴클레오티드가 T이고/이거나, 위치 129에 해당하는 뉴클레오티드가 C이고/이거나, 위치 181에 해당하는 뉴클레오티드가 T이고/이거나, 위치 182에 해당하는 뉴클레오티드가 C이고/이거나, 위치 213에 해당하는 뉴클레오티드가 C이고/이거나, 위치 219에 해당하는 뉴클레오티드가 T이고/이거나, 위치 226에 해당하는 뉴클레오티드가 T이고/이거나, 위치 227에 해당하는 뉴클레오티드가 C이고/이거나, 위치 237에 해당하는 뉴클레오티드가 C이고/이거나, 위치 267에 해당하는 뉴클레오티드가 C이고/이거나, 위치 285에 해당하는 뉴클레오티드가 C이고/이거나, 위치 306에 해당하는 뉴클레오티드가 C이고/이거나, 위치 309에 해당하는 뉴클레오티드가 C이고/이거나, 위치 315에 해당하는 뉴클레오티드가 C이고/이거나, 위치 324에 해당하는 뉴클레오티드가 C이고/이거나, 위치 330에 해당하는 뉴클레오티드가 C이고/이거나, 위치 339에 해당하는 뉴클레오티드가 C이고/이거나, 위치 400에 해당하는 뉴클레오티드가 T이고/이거나, 위치 401에 해당하는 뉴클레오티드가 C이고/이거나, 위치 444에 해당하는 뉴클레오티드가 C이고/이거나, 위치 456에 해당하는 뉴클레오티드가 T이고/이거나, 위치 478에 해당하는 뉴클레오티드가 C이고/이거나, 위치 480에 해당하는 뉴클레오티드가 C이고/이거나, 위치 510에 해당하는 뉴클레오티드가 C이고/이거나, 위치 594에 해당하는 뉴클레오티드가 C이고/이거나, 위치 606에 해당하는 뉴클레오티드가 C이고/이거나, 위치 618에 해당하는 뉴클레오티드가 C이고/이거나, 위치 639에 해당하는 뉴클레오티드가 C이고/이거나, 위치 697에 해당하는 뉴클레오티드가 C이고/이거나, 위치 726에 해당하는 뉴클레오티드가 T이고/이거나, 위치 744에 해당하는 뉴클레오티드가 C이고/이거나, 위치 777에 해당하는 뉴클레오티드가 T이고/이거나, 위치 807에 해당하는 뉴클레오티드가 C이고/이거나, 위치 852에 해당하는 뉴클레오티드가 C이고/이거나, 위치 877에 해당하는 뉴클레오티드가 C이고/이거나, 위치 879에 해당하는 뉴클레오티드가 C이고/이거나, 위치 888에 해당하는 뉴클레오티드가 T이고/이거나, 위치 891에 해당하는 뉴클레오티드가 C이고/이거나, 위치 921에 해당하는 뉴클레오티드가 C이고/이거나, 위치 930에 해당하는 뉴클레오티드가 C이고/이거나, 위치 960에 해당하는 뉴클레오티드가 C이고/이거나, 위치 1042에 해당하는 뉴클레오티드가 C이고/이거나, 위치 1050에 해당하는 뉴클레오티드가 C이고/이거나, 위치 1116에 해당하는 뉴클레오티드가 T이고/이거나, 위치 1140에 해당하는 뉴클레오티드가 T이고/이거나, 위치 1183에 해당하는 뉴클레오티드가 T이고/이거나, 위치 1184에 해당하는 뉴클레오티드가 C이고/이거나, 위치 1194에 해당하는 뉴클레오티드가 T이고/이거나, 위치 1197에 해당하는 뉴클레오티드가 C이고/이거나, 위치 1221에 해당하는 뉴클레오티드가 T이고/이거나, 위치 1249에 해당하는 뉴클레오티드가 C이고/이거나, 위치 1251에 해당하는 뉴클레오티드가 C이고/이거나, 위치 1257에 해당하는 뉴클레오티드가 T이고/이거나, 위치 1273에 해당하는 뉴클레오티드가 C이고/이거나, 위치 1276에 해당하는 뉴클레오티드가 C이고/이거나, 위치 1281에 해당하는 뉴클레오티드가 C이고/이거나, 위치 1290에 해당하는 뉴클레오티드가 T이고/이거나, 위치 1293에 해당하는 뉴클레오티드가 C이고/이거나, 위치 1357에 해당하는 뉴클레오티드가 C이고/이거나, 위치 1372에 해당하는 뉴클레오티드가 T이고/이거나, 위치 1373에 해당하는 뉴클레오티드가 C이고/이거나, 위치 1413에 해당하는 뉴클레오티드가 C이고/이거나, 위치 1446에 해당하는 뉴클레오티드가 C이고/이거나, 위치 1452에 해당하는 뉴클레오티드가 C이고/이거나, 위치 1464에 해당하는 뉴클레오티드가 T이고/이거나, 위치 1474에 해당하는 뉴클레오티드가 T이고/이거나, 위치 1475에 해당하는 뉴클레오티드가 C이고/이거나, 위치 1482에 해당하는 뉴클레오티드가 C이고/이거나, 위치 1519에 해당하는 뉴클레오티드가 T이고/이거나, 위치 1520에 해당하는 뉴클레오티드가 C이고/이거나, 위치 1542에 해당하는 뉴클레오티드가 T이고/이거나, 위치 1584에 해당하는 뉴클레오티드가 T이고/이거나, 위치 1590에 해당하는 뉴클레오티드가 C이고/이거나, 위치 1599에 해당하는 뉴클레오티드가 T이고/이거나, 위치 1608에 해당하는 뉴클레오티드가 C이고/이거나, 위치 1653에 해당하는 뉴클레오티드가 C이고/이거나, 위치 1668에 해당하는 뉴클레오티드가 C이고/이거나, 위치 1674에 해당하는 뉴클레오티드가 T이고/이거나, 위치 1689에 해당하는 뉴클레오티드가 C이고/이거나, 위치 1692에 해당하는 뉴클레오티드가 T이고/이거나, 위치 1734에 해당하는 뉴클레오티드가 T이고/이거나, 위치 1761에 해당하는 뉴클레오티드가 C이고/이거나, 위치 1776에 해당하는 뉴클레오티드가 C이고/이거나, 위치 1788에 해당하는 뉴클레오티드가 C이고/이거나, 위치 1803에 해당하는 뉴클레오티드가 T이고/이거나, 위치 1824에 해당하는 뉴클레오티드가 C이고/이거나, 위치 1845에 해당하는 뉴클레오티드가 C이고/이거나, 위치 1854에 해당하는 뉴클레오티드가 C이고/이거나, 위치 1881에 해당하는 뉴클레오티드가 T이고/이거나, 위치 1893에 해당하는 뉴클레오티드가 T이고/이거나, 위치 1902에 해당하는 뉴클레오티드가 C이고/이거나, 위치 1909에 해당하는 뉴클레오티드가 T이고/이거나, 위치 1910에 해당하는 뉴클레오티드가 C이고/이거나, 위치 1929에 해당하는 뉴클레오티드가 T이고/이거나, 위치 1932에 해당하는 뉴클레오티드가 C이고/이거나, 위치 1960에 해당하는 뉴클레오티드가 C이고/이거나, 위치 1987에 해당하는 뉴클레오티드가 T이고/이거나, 위치 1988에 해당하는 뉴클레오티드가 C이고/이거나, 위치 1992에 해당하는 뉴클레오티드가 C이고/이거나, 위치 1998에 해당하는 뉴클레오티드가 T이고/이거나, 위치 2020에 해당하는 뉴클레오티드가 C이고/이거나, 위치 2031에 해당하는 뉴클레오티드가 C이고/이거나, 위치 2047에 해당하는 뉴클레오티드가 C이고/이거나, 위치 2049에 해당하는 뉴클레오티드가 C이고/이거나, 위치 2062에 해당하는 뉴클레오티드가 C이고/이거나, 위치 2067에 해당하는 뉴클레오티드가 T이고/이거나, 위치 2076에 해당하는 뉴클레오티드가 C이고/이거나, 위치 2121에 해당하는 뉴클레오티드가 C이고/이거나, 위치 2167에 해당하는 뉴클레오티드가 C이고/이거나, 위치 2169에 해당하는 뉴클레오티드가 C이고/이거나, 위치 2190에 해당하는 뉴클레오티드가 C이고/이거나, 위치 2193에 해당하는 뉴클레오티드가 C이고/이거나, 위치 2208에 해당하는 뉴클레오티드가 C이고/이거나, 위치 2229에 해당하는 뉴클레오티드가 C이고/이거나, 위치 2259에 해당하는 뉴클레오티드가 C이고/이거나, 위치 2283에 해당하는 뉴클레오티드가 C이고/이거나, 위치 2298에 해당하는 뉴클레오티드가 C이고/이거나, 위치 2323에 해당하는 뉴클레오티드가 C이고/이거나, 위치 2343에 해당하는 뉴클레오티드가 C이고/이거나, 위치 2346에 해당하는 뉴클레오티드가 C이고/이거나, 위치 2361에 해당하는 뉴클레오티드가 C이고/이거나, 위치 2373에 해당하는 뉴클레오티드가 C이고/이거나, 위치 2382에 해당하는 뉴클레오티드가 C이고/이거나, 위치 2388에 해당하는 뉴클레오티드가 C이고/이거나, 위치 2403에 해당하는 뉴클레오티드가 C이고/이거나, 위치 2409에 해당하는 뉴클레오티드가 C이고/이거나, 위치 2410에 해당하는 뉴클레오티드가 C이고/이거나, 위치 2412에 해당하는 뉴클레오티드가 C이고/이거나, 위치 2448에 해당하는 뉴클레오티드가 C이고/이거나, 위치 2457에 해당하는 뉴클레오티드가 C이고/이거나, 위치 2472에 해당하는 뉴클레오티드가 C이고/이거나, 위치 2476에 해당하는 뉴클레오티드가 C이고/이거나, 위치 2478에 해당하는 뉴클레오티드가 C이고/이거나, 위치 2505에 해당하는 뉴클레오티드가 C이고/이거나, 위치 2520에 해당하는 뉴클레오티드가 C이고/이거나, 위치 2547에 해당하는 뉴클레오티드가 C이고/이거나, 위치 2574에 해당하는 뉴클레오티드가 C이고/이거나, 위치 2622에 해당하는 뉴클레오티드가 C이고/이거나, 위치 2634에 해당하는 뉴클레오티드가 C이고/이거나, 위치 2661에 해당하는 뉴클레오티드가 C이고/이거나, 위치 2673에 해당하는 뉴클레오티드가 C이고/이거나, 위치 2706에 해당하는 뉴클레오티드가 C이고/이거나, 위치 2712에 해당하는 뉴클레오티드가 C이고/이거나, 위치 2763에 해당하는 뉴클레오티드가 C이고/이거나, 위치 2775에 해당하는 뉴클레오티드가 C이고/이거나, 위치 2796에 해당하는 뉴클레오티드가 C이고/이거나, 위치 2811에 해당하는 뉴클레오티드가 C이고/이거나, 위치 2817에 해당하는 뉴클레오티드가 C이고/이거나, 위치 2832에 해당하는 뉴클레오티드가 C이고/이거나, 위치 2838에 해당하는 뉴클레오티드가 C이고/이거나, 위치 2871에 해당하는 뉴클레오티드가 C이고/이거나, 위치 2886에 해당하는 뉴클레오티드가 C이고/이거나, 위치 2892에 해당하는 뉴클레오티드가 C이고/이거나, 위치 2898에 해당하는 뉴클레오티드가 C이고/이거나, 위치 2910에 해당하는 뉴클레오티드가 C이고/이거나, 위치 2922에 해당하는 뉴클레오티드가 C이고/이거나, 위치 2931에 해당하는 뉴클레오티드가 C이고/이거나, 위치 2937에 해당하는 뉴클레오티드가 C이고/이거나, 위치 2958에 해당하는 뉴클레오티드가 C이고/이거나, 위치 2970에 해당하는 뉴클레오티드가 C이고/이거나, 위치 2997에 해당하는 뉴클레오티드가 C이고/이거나, 위치 3033에 해당하는 뉴클레오티드가 C이고/이거나, 위치 3039에 해당하는 뉴클레오티드가 C이고/이거나, 위치 3069에 해당하는 뉴클레오티드가 C이고/이거나, 위치 3075에 해당하는 뉴클레오티드가 C이고/이거나, 위치 3117에 해당하는 뉴클레오티드가 C이고/이거나, 위치 3129에 해당하는 뉴클레오티드가 C이고/이거나, 위치 3156에 해당하는 뉴클레오티드가 C이고/이거나, 위치 3166에 해당하는 뉴클레오티드가 C이고/이거나, 위치 3235에 해당하는 뉴클레오티드가 C이고/이거나, 위치 3246에 해당하는 뉴클레오티드가 C이고/이거나, 위치 3273에 해당하는 뉴클레오티드가 C이고/이거나, 위치 3285에 해당하는 뉴클레오티드가 C이고/이거나, 위치 3306에 해당하는 뉴클레오티드가 C이고/이거나, 위치 3321에 해당하는 뉴클레오티드가 C이고/이거나, 위치 3369에 해당하는 뉴클레오티드가 T이고/이거나, 위치 3399에 해당하는 뉴클레오티드가 C이고/이거나, 위치 3405에 해당하는 뉴클레오티드가 T이고/이거나, 위치 3438에 해당하는 뉴클레오티드가 C인 서열이다.

일 구현예에서, RPGR^ORF15-인코딩 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:2의 뉴클레오티드 1689 및/또는 3438에 해당하는 위치에서 퓨린 뉴클레오티드를 포함하지 않는다. 위치 1689의 뉴클레오티드는 피리미딘, 바람직하게는 C로 대체될 수 있다. 위치 3438의 아데닌은 피리미딘, 바람직하게는 C로 대체될 수 있다.

일 구현예에서, RPGR^ORF15-인코딩 뉴클레오티드 서열은 위치 3405의 아데닌 뉴클레오티드를 CpG 디뉴클레오티드를 도입시키지 않고 피리미딘 뉴클레오티드로 대체함으로써 SEQ ID NO:2로부터 유래된다.

일 구현예에서, RPGR^ORF15-인코딩 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:2의 위치 3405에 해당하는 위치에서 아데닌 뉴클레오티드를 포함한다.

일 구현예에서, 인코딩된 RPGR^ORF15 단백질은 인간 RPGR^ORF15이다.

일 구현예에서, RPGR^ORF15-인코딩 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:2의 위치 30에 해당하는 위치의 C, SEQ ID NO:2의 위치 33에 해당하는 위치의 T, SEQ ID NO:2의 위치 966에 해당하는 위치의 A, SEQ ID NO:2의 위치 969에 해당하는 위치의 A, SEQ ID NO:2의 위치 1011에 해당하는 위치의 T, SEQ ID NO:2의 위치 1014에 해당하는 위치의 T, SEQ ID NO:2의 위치 1029에 해당하는 위치의 T, SEQ ID NO:2의 위치 1299에 해당하는 위치의 A, SEQ ID NO:2의 위치 1689에 해당하는 위치의 C, SEQ ID NO:2의 위치 3363에 해당하는 위치의 G, SEQ ID NO:2의 위치 3405에 해당하는 위치의 T, SEQ ID NO:2의 위치 3408에 해당하는 위치의 A, SEQ ID NO:2의 위치 3409에 해당하는 위치의 A, SEQ ID NO:2의 위치 3410에 해당하는 위치의 G, SEQ ID NO:2의 위치 3432에 해당하는 위치의 G, SEQ ID NO:2의 위치 3438에 해당하는 위치의 C 및 SEQ ID NO:2의 위치 3456에 해당하는 위치의 A로부터 선택되는 하나 이상의 뉴클레오티드를 포함한다.

일 구현예에서, RPGR^ORF15-인코딩 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:2의 위치 30에 해당하는 위치의 C, SEQ ID NO:2의 위치 33에 해당하는 위치의 T, SEQ ID NO:2의 위치 48에 해당하는 위치의 A, SEQ ID NO:2의 위치 57에 해당하는 위치의 A, SEQ ID NO:2의 위치 60에 해당하는 위치의 T, SEQ ID NO:2의 위치 69에 해당하는 위치의 T, SEQ ID NO:2의 위치 72에 해당하는 위치의 A, SEQ ID NO:2의 위치 171에 해당하는 위치의 C, SEQ ID NO:2의 위치 189에 해당하는 위치의 C, SEQ ID NO:2의 위치 441에 해당하는 위치의 T, SEQ ID NO:2의 위치 537에 해당하는 위치의 T, SEQ ID NO:2의 위치 546에 해당하는 위치의 C, SEQ ID NO:2의 위치 786에 해당하는 위치의 T, SEQ ID NO:2의 위치 792에 해당하는 위치의 T, SEQ ID NO:2의 위치 966에 해당하는 위치의 A, SEQ ID NO:2의 위치 969에 해당하는 위치의 A, SEQ ID NO:2의 위치 990에 해당하는 위치의 A, SEQ ID NO:2의 위치 1011에 해당하는 위치의 T, SEQ ID NO:2의 위치 1014에 해당하는 위치의 T, SEQ ID NO:2의 위치 1029에 해당하는 위치의 T, SEQ ID NO:2의 위치 1299에 해당하는 위치의 A, SEQ ID NO:2의 위치 1689에 해당하는 위치의 C, SEQ ID NO:2의 위치 3355에 해당하는 위치의 A, SEQ ID NO:2의 위치 3357에 해당하는 위치의 G, SEQ ID NO:2의 위치 3363에 해당하는 위치의 G, SEQ ID NO:2의 위치 3403에 해당하는 위치의 T, SEQ ID NO:2의 위치 3404에 해당하는 위치의 C, SEQ ID NO:2의 위치 3405에 해당하는 위치의 T, SEQ ID NO:2의 위치 3408에 해당하는 위치의 A, SEQ ID NO:2의 위치 3409에 해당하는 위치의 A, SEQ ID NO:2의 위치 3410에 해당하는 위치의 G, SEQ ID NO:2의 위치 3432에 해당하는 위치의 G, SEQ ID NO:2의 위치 3438에 해당하는 위치의 C 및 SEQ ID NO:2의 위치 3456에 해당하는 위치의 A로부터 선택되는 하나 이상의 뉴클레오티드를 포함한다.

일 구현예에서, 본 발명의 RPGR^ORF15-인코딩 뉴클레오티드 서열은 하기로 구성된 군으로부터 선택되는 서열을 포함한다:

(a) SEQ ID NO:1과 적어도 80%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열;

(b) SEQ ID NO:3과 적어도 80%의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열; 및

(c) SEQ ID NO:3의 뉴클레오티드 서열,

바람직하게는, 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된 단백질은 SEQ ID NO:1에 의해 표현되는 단백질의 천연 기능을 실질적으로 보유한다.

또 다른 구현예에서, 본 발명의 RPGR^ORF15-인코딩 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:1과 적어도 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 바람직하게는 아미노산 서열은 SEQ ID NO:1에 의해 표현되는 단백질의 천연 기능을 실질적으로 보유한다.

본 발명은 색소성망막염 GTPase 조절인자 ORF15 아이소형(RPGR^ORF15)을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열 또는 SEQ ID NO:1과 적어도 80%의 동일성을 갖는 이의 기능성 변이체를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 제공하며, 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:2의 위치 30에 해당하는 위치의 C, SEQ ID NO:2의 위치 33에 해당하는 위치의 T, SEQ ID NO:2의 위치 966에 해당하는 위치의 A, SEQ ID NO:2의 위치 969에 해당하는 위치의 A, SEQ ID NO:2의 위치 1011에 해당하는 위치의 T, SEQ ID NO:2의 위치 1014에 해당하는 위치의 T, SEQ ID NO:2의 위치 1029에 해당하는 위치의 T, SEQ ID NO:2의 위치 1299에 해당하는 위치의 A, SEQ ID NO:2의 위치 1689에 해당하는 위치의 C, SEQ ID NO:2의 위치 3363에 해당하는 위치의 G, SEQ ID NO:2의 위치 3405에 해당하는 위치의 T, SEQ ID NO:2의 위치 3408에 해당하는 위치의 A, SEQ ID NO:2의 위치 3409에 해당하는 위치의 A, SEQ ID NO:2의 위치 3410에 해당하는 위치의 G, SEQ ID NO:2의 위치 3432에 해당하는 위치의 G, SEQ ID NO:2의 위치 3438에 해당하는 위치의 C 및 SEQ ID NO:2의 위치 3456에 해당하는 위치의 A로부터 선택되는 뉴클레오티드 중 하나 이상, 바람직하게는 모두를 포함한다. 폴리뉴클레오티드는 상기 뉴클레오티드 중 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 또는 17개를 포함할 수 있다.

본 발명은 또한 색소성망막염 GTPase 조절인자 ORF15 아이소형(RPGR^ORF15)을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열 또는 SEQ ID NO:1과 적어도 80%의 동일성을 갖는 이의 기능성 변이체를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 제공하며, 뉴클레오티드 서열은 하기로 구성된 군으로부터 선택된다:

(a) SEQ ID NO:3과 적어도 80%의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열로서, 상기 서열이 SEQ ID NO:2의 위치 30에 해당하는 위치의 C, SEQ ID NO:2의 위치 33에 해당하는 위치의 T, SEQ ID NO:2의 위치 48에 해당하는 위치의 A, SEQ ID NO:2의 위치 57에 해당하는 위치의 A, SEQ ID NO:2의 위치 60에 해당하는 위치의 T, SEQ ID NO:2의 위치 69에 해당하는 위치의 T, SEQ ID NO:2의 위치 72에 해당하는 위치의 A, SEQ ID NO:2의 위치 171에 해당하는 위치의 C, SEQ ID NO:2의 위치 189에 해당하는 위치의 C, SEQ ID NO:2의 위치 441에 해당하는 위치의 T, SEQ ID NO:2의 위치 537에 해당하는 위치의 T, SEQ ID NO:2의 위치 546에 해당하는 위치의 C, SEQ ID NO:2의 위치 786에 해당하는 위치의 T, SEQ ID NO:2의 위치 792에 해당하는 위치의 T, SEQ ID NO:2의 위치 966에 해당하는 위치의 A, SEQ ID NO:2의 위치 969에 해당하는 위치의 A, SEQ ID NO:2의 위치 990에 해당하는 위치의 A, SEQ ID NO:2의 위치 1011에 해당하는 위치의 T, SEQ ID NO:2의 위치 1014에 해당하는 위치의 T, SEQ ID NO:2의 위치 1029에 해당하는 위치의 T, SEQ ID NO:2의 위치 1299에 해당하는 위치의 A, SEQ ID NO:2의 위치 1689에 해당하는 위치의 C, SEQ ID NO:2의 위치 3355에 해당하는 위치의 A, SEQ ID NO:2의 위치 3357에 해당하는 위치의 G, SEQ ID NO:2의 위치 3363에 해당하는 위치의 G, SEQ ID NO:2의 위치 3403에 해당하는 위치의 T, SEQ ID NO:2의 위치 3404에 해당하는 위치의 C, SEQ ID NO:2의 위치 3405에 해당하는 위치의 T, SEQ ID NO:2의 위치 3408에 해당하는 위치의 A, SEQ ID NO:2의 위치 3409에 해당하는 위치의 A, SEQ ID NO:2의 위치 3410에 해당하는 위치의 G, SEQ ID NO:2의 위치 3432에 해당하는 위치의 G, SEQ ID NO:2의 위치 3438에 해당하는 위치의 C 및 SEQ ID NO:2의 위치 3456에 해당하는 위치의 A로부터 선택되는 뉴클레오티드 중 하나 이상, 바람직하게는 모두를 포함하는 뉴클레오티드 서열; 또는 (b) SEQ ID NO:3의 뉴클레오티드 서열. 폴리뉴클레오티드는 상기 뉴클레오티드 중 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33 또는 34개를 포함할 수 있다.

바람직하게는, 기능성 변이체는 SEQ ID NO:1에 의해 표현되는 단백질의 천연 기능을 실질적으로 보유한다.

일 구현예에서, 본 발명의 RPGR^ORF15-인코딩 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:3과 적어도 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 바람직하게는 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된 단백질은 SEQ ID NO:1에 의해 표현되는 단백질의 천연 기능을 실질적으로 보유한다.

바람직하게는, 본 발명의 RPGR^ORF15-인코딩 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 단백질은 SEQ ID NO:1에 의해 표현되는 단백질에 의해 제공되는 망막 및/또는 시각 기능 세포의 동일하거나 개선된 기능을 제공한다.

바람직한 구현예에서, 본 발명의 RPGR^ORF15-인코딩 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:1의 단백질을 인코딩한다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO:2의 인간 야생형 RPGR^ORF15를 포함하는 동등한 폴리뉴클레오티드에 비해 실질적으로 동일하거나 증가된 복제 정확도를 가질 수 있다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO:2의 인간 야생형 RPGR^ORF15를 포함하는 동등한 폴리뉴클레오티드에 비해 증가된 안정성을 갖고/갖거나 폴리뉴클레오티드 복제 주기 동안 돌연변이가 덜 발생하는 경향이 있을 수 있다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO:2의 인간 야생형 RPGR^ORF15를 포함하는 동등한 폴리뉴클레오티드에 비해 번역 및/또는 단백질 발현의 더 높은 비율을 제공할 수 있다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO:2의 인간 야생형 RPGR^ORF15를 포함하는 동등한 폴리뉴클레오티드에 비해 대안적으로 스플라이싱된 변이체 및/또는 트렁케이션된 단백질의 생성을 감소시키거나 피할 수 있다.

바람직한 구현예에서, 본 발명의 RPGR^ORF15-인코딩 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:3과 실질적으로 동일하거나 증가된 복제 정확도를 갖는다. 복제 정확도는 당업자에게 공지된 다수의 방법 중 임의의 방법, 예를 들어, 본원에 기재된 방법에 의해 측정될 수 있다.

바람직한 구현예에서, 본 발명의 RPGR^ORF15-인코딩 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:3의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.

RPGR^ORF15-인코딩 뉴클레오티드 서열은 165개 미만의 CpG 디뉴클레오티드를 포함하고/하거나 2개 이하의 CpG 섬(island)을 포함할 수 있다. CpG 섬은, 예를 들어, EMBOSS Cpgplot(http://www.ebi.ac.uk/Tools/seqstats/emboss_cpgplot/help/)을 이용한 일상적인 방법을 이용하여 용이하게 확인될 수 있다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드는 야생형 서열에 비해 짧아진 RPGR^orf15를 인코딩할 수 있다. 이와 관련하여, 본원에 기재된 코돈 최적화는 짧아진 서열의 상응하는 부분에 적용된다. 바람직하게는, 짧아진 RPGR^orf15는 RPGR 기능의 손실을 구제하는 능력을 갖는다.

본 발명의 RPGR^orf15 인코딩 서열은 WO2016/001693호에 개시된 짧아진 RPGRorf15를 인코딩할 수 있다.

일 구현예에서, 본 발명의 RPGR^orf15 인코딩 서열은 SEQ ID NO:2의 위치 2485 내지 2940에 해당하는 뉴클레오티드 중 일부 또는 전부의 제거에 의해 짧아진다. 이러한 구현예에 따르면, RPGR^ORF15-인코딩 뉴클레오티드 서열은 바람직하게는 SEQ ID NO:2의 뉴클레오티드 33, 58, 59, 114, 123, 129, 181, 182, 213, 219, 226, 227, 237, 267, 285, 306, 309, 315, 324, 330, 339, 400, 401, 444, 456, 478, 480, 510, 594, 606, 618, 639, 697, 726, 744, 777, 807, 852, 877, 879, 888, 891, 921, 930, 960, 1042, 1050, 1116, 1140, 1183, 1184, 1194, 1197, 1221, 1249, 1251, 1257, 1273, 1276, 1281, 1290, 1293, 1357, 1372, 1373, 1413, 1446, 1452, 1464, 1474, 1475, 1482, 1519, 1520, 1542, 1584, 1590, 1599, 1608, 1653, 1668, 1674, 1689, 1692, 1734, 1761, 1776, 1788, 1803, 1824, 1845, 1854, 1881, 1893, 1902, 1909, 1910, 1929, 1932, 1960, 1987, 1988, 1992, 1998, 2020, 2031, 2047, 2049, 2062, 2067, 2076, 2121, 2167, 2169, 2190, 2193, 2208, 2229, 2259, 2283, 2298, 2323, 2343, 2346, 2361, 2373, 2382, 2388, 2403, 2409, 2410, 2412, 2448, 2457, 2472, 2476, 2478, 2958, 2970, 2997, 3033, 3039, 3069, 3075, 3117, 3129, 3156, 3166, 3235, 3246, 3273, 3285, 3306, 3321, 3369, 3399, 3405 및/또는 3438에 해당하는 위치에서 퓨린 뉴클레오티드를 포함하지 않는다. 바람직하게는, 이들 위치의 뉴클레오티드는 SEQ ID NO:3에서 발견되는 뉴클레오티드에 상응한다. 이러한 구현예에 따른 바람직한 RPGR^ORF15-인코딩 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:9에 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드는 하기를 포함할 수 있다:

(a) SEQ ID NO:9에 제시된 뉴클레오티드 서열;

(b) SEQ ID NO:3의 서열을 포함하나, (i) SEQ ID NO:10의 서열, (ii) SEQ ID NO:10의 서열 및 SEQ ID NO:3의 서열에서 SEQ ID NO:10의 한측 또는 양측 상에서 SEQ ID NO:10에 측접한 75개 이하의 추가 뉴클레오티드, 또는 (iii) SEQ ID NO:10 내로부터의 390개 이상의 연속적 뉴클레오티드에 상응하는 결실을 갖는 뉴클레오티드 서열; 또는

(c) (a) 또는 (b)에 따르지만, 말단 당 150개 이하의 뉴클레오티드만큼 5' 및 3' 말단 중 하나 또는 둘 모두에서 트렁케이션된 뉴클레오티드 서열.

바람직하게는, 결실은 SEQ ID NO:10의 적어도 400, 420 또는 450개의 연속적 뉴클레오티드를 포함한다.

본 발명의 RPGR^orf15 인코딩 서열은 WO2016/014353호에 개시된 짧아진 RPGR^orf15를 인코딩할 수 있다.

일 구현예에서, 본 발명의 RPGR^orf15 인코딩 서열은 SEQ ID NO:2의 위치 2086 내지 3027에 해당하는 뉴클레오티드 중 일부 또는 전부의 제거에 의해 짧아진다.

이러한 구현예에 따르면, RPGR^ORF15-인코딩 뉴클레오티드 서열은 바람직하게는 SEQ ID NO:2의 뉴클레오티드 33, 58, 59, 114, 123, 129, 181, 182, 213, 219, 226, 227, 237, 267, 285, 306, 309, 315, 324, 330, 339, 400, 401, 444, 456, 478, 480, 510, 594, 606, 618, 639, 697, 726, 744, 777, 807, 852, 877, 879, 888, 891, 921, 930, 960, 1042, 1050, 1116, 1140, 1183, 1184, 1194, 1197, 1221, 1249, 1251, 1257, 1273, 1276, 1281, 1290, 1293, 1357, 1372, 1373, 1413, 1446, 1452, 1464, 1474, 1475, 1482, 1519, 1520, 1542, 1584, 1590, 1599, 1608, 1653, 1668, 1674, 1689, 1692, 1734, 1761, 1776, 1788, 1803, 1824, 1845, 1854, 1881, 1893, 1902, 1909, 1910, 1929, 1932, 1960, 1987, 1988, 1992, 1998, 2020, 2031, 2047, 2049, 2062, 2067, 2076, 3033, 3039, 3069, 3075, 3117, 3129, 3156, 3166, 3235, 3246, 3273, 3285, 3306, 3321, 3369, 3399, 3405 및/또는 3438에 해당하는 위치에서 퓨린 뉴클레오티드를 포함하지 않는다. 바람직하게는, 이들 위치의 뉴클레오티드는 SEQ ID NO:3에서 발견되는 뉴클레오티드에 상응한다. 이러한 구현예에 따른 바람직한 RPGR^ORF15-인코딩 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:11에 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된다.

일 구현예에서, RPGR^ORF15-인코딩 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:3을 포함하나, SEQ ID NO:12의 서열 중 일부 또는 전부에 해당하는 결실을 갖는다.

또 다른 구현예에서, 본 발명의 RPGR^orf15 인코딩 서열은 SEQ ID NO:2의 위치 2584 내지 2961에 해당하는 뉴클레오티드 중 일부 또는 전부의 제거에 의해 짧아진다.

이러한 구현예에 따르면, RPGR^ORF15-인코딩 뉴클레오티드 서열은 바람직하게는 SEQ ID NO:2의 뉴클레오티드 33, 58, 59, 114, 123, 129, 181, 182, 213, 219, 226, 227, 237, 267, 285, 306, 309, 315, 324, 330, 339, 400, 401, 444, 456, 478, 480, 510, 594, 606, 618, 639, 697, 726, 744, 777, 807, 852, 877, 879, 888, 891, 921, 930, 960, 1042, 1050, 1116, 1140, 1183, 1184, 1194, 1197, 1221, 1249, 1251, 1257, 1273, 1276, 1281, 1290, 1293, 1357, 1372, 1373, 1413, 1446, 1452, 1464, 1474, 1475, 1482, 1519, 1520, 1542, 1584, 1590, 1599, 1608, 1653, 1668, 1674, 1689, 1692, 1734, 1761, 1776, 1788, 1803, 1824, 1845, 1854, 1881, 1893, 1902, 1909, 1910, 1929, 1932, 1960, 1987, 1988, 1992, 1998, 2020, 2031, 2047, 2049, 2062, 2067, 2076, 2121, 2167, 2169, 2190, 2193, 2208, 2229, 2259, 2283, 2298, 2323, 2343, 2346, 2361, 2373, 2382, 2388, 2403, 2409, 2410, 2412, 2448, 2457, 2472, 2476, 2478, 2505, 2520, 2547, 2574, 2970, 2997, 3033, 3039, 3069, 3075, 3117, 3129, 3156, 3166, 3235, 3246, 3273, 3285, 3306, 3321, 3369, 3399, 3405 및/또는 3438에 해당하는 위치에서 퓨린 뉴클레오티드를 포함하지 않는다. 바람직하게는, 이들 위치의 뉴클레오티드는 SEQ ID NO:3에서 발견되는 뉴클레오티드에 상응한다. 이러한 구현예에 따른 바람직한 RPGR^ORF15-인코딩 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:13에 제시된 서열을 포함하거나 이로 구성된다.

일 구현예에서, RPGR^ORF15-인코딩 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:3을 포함하나, SEQ ID NO:14의 서열 중 일부 또는 전부에 해당하는 결실을 갖는다.

본 발명의 RPGR^ORF15-인코딩 뉴클레오티드 서열은 인간 막대 및 원뿔 광수용체 세포에서 RPGR^ORF15 또는 이의 기능성 변이체의 발현을 유도할 수 있는 프로모터 요소를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결될 수 있다.

본 발명의 RPGR^ORF15-인코딩 뉴클레오티드 서열은 로돕신 키나제(GRK1) 프로모터, 바람직하게는 인간 GRK1 프로모터에 작동 가능하게 연결될 수 있다.

바람직하게는, 프로모터와 별도로, RPGR^ORF15의 발현을 조절하기 위해 추가적인 인핸서 요소가 사용되지 않는다. 따라서, 일 구현예에서, 본 발명의 뉴클레오티드 서열은 인핸서 요소를 포함하지 않는다. 일 구현예에서, 뉴클레오티드 서열은 우드척 간염 조절후 요소(woodchuck hepatitis postregulatory element; WPRE) 요소를 포함하지 않는다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 바이러스 벡터를 제공한다.

일 구현예에서, 바이러스 벡터는 아데노-관련 바이러스(AAV), 레트로바이러스, 렌티바이러스 또는 아데노바이러스 벡터이다.

바람직한 구현예에서, 바이러스 벡터는 바이러스 입자의 형태이다.

바람직한 구현예에서, 바이러스 벡터는 AAV 벡터이다.

AAV 벡터는 임의의 혈청형의 AAV 벡터(예를 들어, 임의의 AAV 혈청형 유전체 및/또는 캡시드 단백질을 포함함)일 수 있으나, 단, 벡터는 눈의 세포를 감염시키거나 형질도입시킬 수 있어야 한다.

일 구현예에서, AAV 벡터는 AAV 혈청형 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 11 유전체를 포함한다. 또 다른 구현예에서, AAV 벡터는 AAV 혈청형 2, 4, 5 또는 8 유전체를 포함한다. 바람직하게는, AAV 벡터는 AAV 혈청형 2 유전체를 포함한다.

일 구현예에서, AAV 벡터 입자는 AAV 혈청형 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 11 캡시드 단백질을 포함한다. 또 다른 구현예에서, AAV 벡터 입자는 AAV 혈청형 2, 4, 5 또는 8 캡시드 단백질을 포함한다. 바람직하게는, AAV 벡터 입자는 AAV 혈청형 8 캡시드 단백질을 포함한다. AAV 혈청형 8 캡시드 단백질은, 예를 들어, AAV8/Y733F 돌연변이체 캡시드 단백질일 수 있다.

일 구현예에서, AAV 벡터 입자는 AAV2 유전체 및 AAV2 캡시드 단백질(AAV2/2); AAV2 유전체 및 AAV5 캡시드 단백질(AAV2/5); 또는 AAV2 유전체 및 AAV8 캡시드 단백질(AAV2/8)을 포함한다. 바람직하게는, AAV 벡터 입자는 AAV2 유전체 및 AAV8 캡시드 단백질(AAV2/8)을 포함한다.

본 발명의 AAV 벡터 입자는 키메라일 수 있거나, 셔플링(shuffling)될 수 있거나, 하나 이상의 천연 발생 AAV의 캡시드-변형된 유도체일 수 있다. 특히, AAV 벡터 입자는 동일 벡터(즉, 슈도타이핑된 벡터(pseudotyped vector)) 내의 AAV의 다양한 혈청형, 클레이드(clade), 클론 또는 분리물로부터의 캡시드 단백질 서열을 포함할 수 있다. 따라서, 일 구현예에서, AAV 벡터는 슈도타이핑된 AAV 벡터 입자의 형태이다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 바이러스 벡터의 생성에 필요한 성분을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 세트를 포함하는 바이러스 벡터 생성 시스템을 제공하며, 바이러스 벡터 유전체는 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함한다.

일 구현예에서, 바이러스 벡터는 아데노-관련 바이러스(AAV), 레트로바이러스, 렌티바이러스 또는 아데노바이러스 벡터이다. 바람직하게는, 바이러스 벡터는 AAV 벡터이다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 본 발명의 바이러스 벡터 생성 시스템에서 사용하기 위한 DNA 작제물을 제공한다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 바이러스 벡터 생성 시스템 또는 DNA 작제물을 포함하는 바이러스 벡터 생성 세포를 제공한다. 바이러스 벡터 생성 세포는, 예를 들어, HEK293, HEK293T, Sf9, C12 또는 HeLa 세포일 수 있다. 바람직하게는, 바이러스 벡터 생성 세포는 HEK293 또는 HEK293T 세포이다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 세포에 도입하는 단계 및 바이러스 벡터의 생성에 적합한 조건하에서 세포를 배양하는 단계를 포함하는 바이러스 벡터를 생성시키기 위한 방법을 제공한다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 바이러스 벡터 생성 세포를 이용하거나, 본 발명의 방법에 의해 획득 가능한 바이러스 벡터를 제공한다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 폴리뉴클레오티드로 형질감염되거나, 본 발명의 바이러스 벡터에 의해 형질도입된 세포를 제공한다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 약학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제와 조합된 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 바이러스 벡터 또는 세포를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 색소성망막염을 치료하거나 예방하는데 사용하기 위한 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 바이러스 벡터를 제공한다. 본 발명은 또한 색소성망막염으로 고통받거나 색소성망막염이 발생할 위험이 있는 대상체에서 광수용체 세포 사멸을 감소시키는데 사용하기 위한 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 바이러스 벡터를 제공한다.

일 구현예에서, 색소성망막염은 X-연관 색소성망막염이다.

일 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 또는 바이러스 벡터는 망막하, 직접 망막 또는 유리체내 주사에 의해 대상체의 눈으로 투여된다. 바람직하게는, 폴리뉴클레오티드 또는 바이러스 벡터는 망막하 주사에 의해 대상체의 눈으로 투여된다. 망막하 주사는 본원에 기재된 2-단계 망막하 주사 방법을 이용하여 수행될 수 있다.

망막하 주사는 바람직하게는 하기 단계를 포함한다:

(a) 망막을 적어도 부분적으로 박리시켜 망막하 수포를 형성시키는데 효과적인 양으로 용액을 망막하 주사에 의해 대상체에 투여하는 단계로서, 용액이 폴리뉴클레오티드 또는 바이러스 벡터를 포함하지 않는 단계; 및

(b) 단계 (a)에 의해 형성된 수포로 망막하 주사에 의해 약물 조성물을 투여하는 단계로서, 약물이 폴리뉴클레오티드 또는 바이러스 벡터를 포함하는 단계.

일 구현예에서, AAV 벡터는 단일 용량으로 대상체로 투여된다.

AAV 벡터는, 예를 들어, mL 당 약 1-2×10⁹, 1-2×10¹⁰, 1-2×10¹¹, 1-2×10¹² 또는 1-2×10¹³ 유전체 입자(gp)의 농도로 현탁액 내에 존재할 수 있다. 따라서, 약 2×10¹⁰ gp의 AAV 벡터의 용량이, 예를 들어, mL 당 약 2×10¹² gp의 농도의 약 10 μL 용량의 AAV 벡터를 주사함으로써 투여될 수 있다. 당업자는 필요에 따라 AAV 벡터의 용량, 부피 및 농도를 용이하게 조정할 수 있다.

투여되는 AAV 벡터의 부피는, 예를 들어, 약 1-500 μL, 예를 들어, 약 10-500, 50-500, 100-500, 200-500, 300-500, 400-500, 50-250, 100-250, 200-250, 50-150, 1-100 또는 1-10 μL일 수 있다. 부피는, 예를 들어, 약 1, 2, 5, 10, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450 또는 500 μL일 수 있다. 바람직하게는, 주사되는 AAV 벡터 조성물의 부피는 약 100 μL이다.

일 구현예에서, AAV 벡터는 눈 당 적어도 2×10⁷, 2×10⁸, 2×10⁹, 2×10¹⁰, 2×10¹¹ 또는 2×10¹² gp의 투여량으로 투여된다. 또 다른 구현예에서, AAV 벡터는 눈 당 약 1-2×10⁷, 1-2×10⁸, 1-2×10⁹, 1-2×10¹⁰, 1-2×10¹¹ 또는 1-2×10¹² gp의 투여량으로 투여된다. 바람직하게는, AAV 벡터는, 바람직하게는 망막하 주사에 의해 눈 당 약 2×10¹¹ gp의 투여량으로 투여된다.

일 구현예에서, 색소성망막염으로 인한 광수용체 세포 변성은 대상체의 생애 동안 실질적으로 예방된다. 광수용체 세포는 원뿔 세포 및/또는 막대 세포, 바람직하게는 원뿔 및 막대 세포를 포함할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 또는 바이러스(예를 들어, AAV) 벡터의 투여시에 처리된 눈에 존재하는 광수용체 세포(예를 들어, 원뿔 세포 및/또는 막대 세포)의 수의 약 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% 또는 1% 미만은 이후 대상체의 생애에 걸쳐 색소성망막염으로 인해 변성된다. 바람직하게는, 생존 세포는 기능성인 채로 남아 있다.

일 구현예에서, 처리된 눈에서 시각 기능은 실질적으로 회복되거나 유지된다. 시각 기능(예를 들어, 본원에 기재된 시각 기능의 시험에 의해 결정됨)은, 예를 들어, 병에 걸린 눈에서 색소성망막염의 발생 전에 존재하는 것과 대략 동일한 수준으로 회복될 수 있다. 대안적으로, 시각 기능은, 예를 들어, 색소성망막염이 발생할 위험이 있는 건강한 대상체, 또는 색소성망막염으로 이미 고통받는 대상체에서 대략 동일한 수준으로 유지될 수 있다(예를 들어, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 바이러스(예를 들어, AAV) 벡터의 투여 후에 색소성망막염의 결과로서 시각 기능의 실질적으로 악화가 없거나 추가 악화가 발생하지 않음).

미처리된 채로 남는 경우, 대부분 또는 모든 막대 세포는 색소성망막염의 결과로서 시간 경과에 따라 변성(예를 들어, 사멸)될 수 있다. 원뿔 세포는 또한 질병의 진행 동안 변성될 수 있다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 바이러스 벡터를 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 색소성망막염을 치료하거나 예방하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 바이러스 벡터를 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 색소성망막염으로 고통받거나 색소성망막염이 발생할 위험이 있는 대상체에서 광수용체 세포 사멸을 감소시키는 방법을 제공한다.

투여 방식(예를 들어, 방법 및 투여량) 및 효과, 및 치료되는 대상체는 본원에 기재된 바와 같을 수 있다.

본 발명은 야생형 RPGR^ORF15 유전자를 포함하는 벡터 또는 폴리뉴클레오티드에 비해 대안적으로 스플라이싱된 변이체 및/또는 트렁케이션된 RPGR^ORF15 단백질의 생성을 감소시키거나 피하기 위한 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 바이러스 벡터의 용도를 추가로 제공한다.

본 발명은 야생형 RPGR^ORF15 유전자를 포함하는 뉴클레오티드 서열에 비해 RPGR^ORF15 유전자를 포함하는 뉴클레오티드 서열의 복제 안정성 및/또는 정확도를 증가시키기 위한 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 바이러스 벡터의 용도를 추가로 제공한다.

본 발명은 야생형 RPGR^ORF15 유전자를 포함하는 벡터 또는 폴리뉴클레오티드에 비해 RPGR^ORF15 단백질의 번역 및/또는 단백질 발현의 더 높은 비율을 달성하기 위한 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 바이러스 벡터의 용도를 추가로 제공한다.

본 발명은 야생형 RPGR^ORF15 유전자를 포함하는 뉴클레오티드 서열에 비해 RPGR^ORF15-인코딩 뉴클레오티드 서열의 수율을 증가시키기 위한 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 바이러스 벡터의 용도를 추가로 제공한다.

도 1
RPGR의 인간, 마우스 및 개 유전체 서열의 비교.
도 2
코돈 최적화된(상단) 및 야생형(하단) RPGR^ORF15 서열의 비교. 일차 서열에서의 차이는 적색 및 밑줄로 강조되어 있다.
도 3
표준 클로닝 벡터에서의 야생형(A, B) 및 코돈 최적화된(C, D) RPGR 서열 사이의 클로닝 효율 및 서열 정확도의 비교.
소량제조물(minipreparation)(E) 및 대량제조물(megapreparation)(G)로부터의 플라스미드 수율의 비교, 및 동일한 서열 사이에서의 샘플 순도(F)의 비교.
도 4
표준 클로닝 벡터에서의 야생형(A) 및 코돈 최적화된(B) RPGR 서열 사이의 서열 정확도의 비교.
도 5
코돈 최적화된 RPGR 서열의 단백질 생성물의 탠덤 질량 분광법을 이용한 액체 크로마토그래피(LC/MS-MS)는 아미노산의 약 80%를 확인하였다(확인될 수 없는 아미노산은 적색으로 표시됨).
도 6
야생형 및 코돈 최적화된 RPGR-유래(각각 wtRPGR 및 coRPGR) 펩티드의 동일한 분자 질량(220 kDa)을 확인하는 웨스턴 블롯(상단 패널).
웨스턴 블롯 신호 강도의 차이의 플롯은 coRPGR 서열로부터 약 4배 더 높은 RPGR 단백질 생성을 나타낸다(하단 패널).
도 7
RPGR에 천연 발생 돌연변이를 갖는 마우스 모델(C57BL / 6 ^Rd9 ^/ ^Boc )에서 AAV.coRPGR을 이용한 처리 효과의 개관.
처리 6개월 후 전체 망막 용해질에 대한 웨스턴 블롯은 C57BL / 6 ^Rd9 ^/ ^Boc 마우스의 처리된 눈(TE)에서 약 200 kDa의 RPGR 단백질 생성물을 나타내나, 미처리 눈(UE)에서는 나타내지 않는다(A). L, 단백질 래더; +, 양성 대조군(coRPGR 발현 플라스미드로 형질감염된 HEK293T 세포 단백질 용해질); -, 음성 대조군(형질감염되지 않은 HEK293T 세포 단백질 용해질).
처리 6개월 후의 고정되지 않은 냉동절편의 면역조직화학(B). 상단 패널은 미처리 눈에서의 RPGR 염색(녹색)의 결핍을 나타낸다. 처리된 눈(하단)에서, RPGR 염색은 섬모 단백질 Rpgrip(적색)과 공동 국소화되는 것이 관찰될 수 있다. 축척 막대 = 20 μm.
처리 3개월(C) 및 6개월(D) 후의 암 적응(DA) ERG 단일 플래쉬 강도 시리즈. 평균의 적색 흔적은 처리된 눈(TE)으로부터의 것이며, 흑색 흔적은 미처리 눈(UE)으로부터의 것이다. 휘스커(Whisker)는 95% 신뢰 구간을 나타낸다.
도 8
플라스미드 정체 및 구조적 안정성, pAAV.RK.coRPGR의 RCB로부터 제조된 플라스미드. pAAV.RK.coRPGR에 대한 RCB로부터 생성된 플라스미드 DNA에 대한 엔도뉴클레아제 제한 절단 단편 크기. 제한 효소 XmnI으로 예상되는 패턴: 11 + 11 + 161 + 211 + 2681 + 4006 bp; SmaI: 11 + 11 + 161 + 211 + 2681 + 4006 bp (11bp 단편은 아가로스 젤을 통과하여, 가시화되지 않음).
마커: 1 kbp 래더 (PlasmidFactory, Item no. MSM-865-50), 300 ng
레인 1: DNA RCB1729-151023, 미절단, 250 ng
레인 2: DNA RCB1729-151023, 미절단, 250 ng
레인 3: DNA RCB1729-151023, XmnI으로 절단, 250 ng
레인 4: DNA RCB1729-151023, SmaI으로 절단, 250 ng
도 9
pAAV.RK.coRPGR의 100mg 플라스미드 제조를 위한, 플라스미드 정체 및 구조적 안정성. 플라스미드 pAAV.RK.RPGR에 대한 엔도뉴클레아제 제한 절단 단편 크기. 제한 효소 XmnI으로 예상되는 패턴: 11 + 11 + 161 + 211 + 2681 + 4006 bp (11bp 단편은 아가로스 젤을 통과하여, 가시화되지 않음).
마커: 1 kbp 래더 (PlasmidFactory, Item no. MSM-865-50), 300 ng
레인 1: pAAV.RK.coRPGR, 250 ng
레인 2: pAAV.RK.coRPGR, 250 ng
마커: 1 kbp 래더 (PlasmidFactory, Item no. MSM-865-50), 300 ng
레인 3: pAAV.RK.coRPGR, XmaI 절단, 250 ng
레인 4: pAAV.RK.co.RPGR, XmaI 절단, 250 ng
마커: 1 kbp 래더 (PlasmidFactory, Item no. MSM-865-50), 300 ng
도 10
pAAV.RK.coRPGR의 100mg 플라스미드 제조를 위한, A260에 의한 플라스미드 DNA 농도. 계산된 평균 농도: 1.0 mg mL^-1
도 11
DNA 순도. 방법: 220 nm 내지 320 nm의 UV-Scan. pAAV.RK.coRPGR의 100mg 플라스미드 제조를 위한, 220 nm 내지 320 nm의 UV에 의한 플라스미드 순도의 결정.
도 12
HEK293 세포에서의 RPGR^ORF15 발현의 웨스턴 블롯 분석. (A) 3개의 독립적 실험에서 형질감염되지 않은 샘플(UNT)에 비해 CAG.coRPGR^ORF15(co) 또는 CAG.wtRPGR^ORF15(wt)로 형질감염된 세포에서 RPGR^ORF15(흑색 화살표) 발현이 검출되었다. (B) 박스플롯(Boxplot)은 내인성 대조군(β액틴)에 대해 표준화된 후 임의의 단위(AU)로 표현된 농도측정에 의한 RPGR^ORF15 발현 수준의 정량을 나타낸다.
도 13
HEK293T 세포에서의 RPGR^ORF15 발현의 웨스턴 블롯 분석. (A) 형질감염되지 않은 샘플(UNT)에 비해 CAG.coRPGR^ORF15(co) 또는 CAG.wtRPGR^ORF15(wt)로 형질감염된 세포에서 RPGR^ORF15(흑색 화살표) 발현이 검출되었다. 트렁케이션된 단백질(백색 화살표)이 wt 서열로 형질감염된 세포에서 검출되었다. (B) 막대 그래프는 각각의 샘플에서 내인성 대조군(β액틴)에 대해 표준화된 후 농도측정에 의한 RPGR^ORF15 발현 수준의 정량을 나타낸다.

본 발명의 다양한 바람직한 특징 및 구현예는 이제 비제한적인 예에 의해 기재될 것이다.

본 발명의 실시는 달리 나타내지 않는 한 화학, 생화학, 분자생물학, 미생물학 및 면역학의 통상적인 기술을 이용할 것이며, 이는 당업자의 능력 내이다. 상기 기술은 문헌에서 설명된다. 예를 들어, 문헌[Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Ausubel, F.M. et al. (1995 and periodic supplements) Current Protocols in Molecular Biology, Ch. 9, 13 and 16, John Wiley & Sons; Roe, B., Crabtree, J., and Kahn, A. (1996) DNA Isolation and Sequencing: Essential Techniques, John Wiley & Sons; Polak, J.M., and McGee, J.O'D. (1990) In Situ Hybridization: Principles and Practice, Oxford University Press; Gait, M.J. (1984) Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press; 및 Lilley, D.M., and Dahlberg, J.E. (1992) Methods in Enzymology: DNA Structures Part A: Synthesis and Physical Analysis of DNA, Academic Press]을 참조한다. 상기 전반적 문헌 각각은 참조로서 본원에 포함된다.

일 양태에서, 본 발명은 색소성망막염 GTPase 조절인자 ORF15 아이소형(RPGR^ORF15)을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 제공하며, RPGR^ORF15-인코딩 뉴클레오티드 서열은 서열의 복제 정확도를 증가시키기 위해 코돈 최적화되었다.

색소성망막염 GTPase 조절인자 ( RPGR )

색소성망막염 GTPase 조절인자(RPGR)는 구아닌-뉴클레오티드 방출 인자로 작용할 가능성이 높으며, 정상 시력에 필수적이다.

RPGR이 가능하게는 미세소관 조직 및 운송 규제의 관여를 통해 섬모의 생성에 일정한 역할을 하는 것이 연구에서 제안되었다. 섬모는 신호전달 및 세포 운동을 포함하는 다수의 생물학적 활성에 관여할 수 있는 세포의 표면으로부터의 손가락과 유사한 돌출부이다. 섬모는 또한 청각, 냄새 및 시력을 포함하는 다양한 감각 지각에 필수적이며, 이들은 중요한 광수용체 세포 소기관이다.

다수의 RPGR 단백질 아이소형이 RPGR 유전자로부터 발현된다. ORF15 엑손을 포함하는 아이소형이 본 발명과 특히 관련이 있으며, 때때로 ORF15로 언급된다. 이러한 아이소형은 본원에서 RPGR^ORF15로 언급된다. RPGR^ORF15는 망막, 특히 광수용체 세포에서 주로 발현되는 한편, 다른 아이소형은 다른 곳에서 발현되며, 섬모 형성 및/또는 기능에도 관여할 것이다.

인간 야생형 RPGR^ORF15의 예시적인 아미노산 서열은 하기와 같다:

일 구현예에서, 인간 야생형 RPGR^ORF15를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 하기와 같다:

RPGR 유전자에서 300개 이상의 돌연변이가 X-연관 색소성망막염(XLRP)과 연관되어 있다. 또한, RPGR 돌연변이는 XLRP 경우의 약 70%에서 관찰된다. 대부분의 XLRP-관련 RPGR 돌연변이는 ORF15 엑손(RPGR^ORF15의 뉴클레오티드 1754-3459, 예를 들어, SEQ ID NO:2의 뉴클레오티드 1754-3459에 해당함)에서 발생하며, 일반적으로 트렁케이션된 기능장애 단백질을 발생시킨다. RPGR에서의 돌연변이는 광수용체 섬모의 정상적인 기능을 붕괴시킬 가능성이 있으나, 이것이 광수용체의 점진적 상실 및 질병의 특징인 결과로서 발생하는 시력 문제를 야기하는 방식은 불분명하다.

RPGR은 RPGR 유전자의 엑손 15의 퓨린 풍부 영역에서 고도로 돌연변이유발성인 영역으로 인해 RP의 흔한 원인이다. 야생형 RPGR 뉴클레오티드 서열이 상기 목적으로 사용되는 경우 AAV 벡터 클로닝에서 유사한 문제가 발생할 것으로 예상되었다. 상기 문제를 해결하기 위해, 본 발명자는 RPGR 유전자의 엑손 15에서 반복 GA 서열을 분쇄시키고, 보고된 트렁케이션된 RPGR 변이체의 큰 비율을 담당할 수 있는 wt cDNA 내의 다른 잠재적 스플라이스 부위를 피하기 위해 피리미딘 뉴클레오티드를 첨가하는 코돈 최적화를 이용하였다(Wu et al., Human Molecular Genetics 2015: 24(14); 3956-70). 본 발명의 coRPGR은 CpG 서열, 잠재 스플라이스 부위 및 이상 폴리 A 신호를 피하도록 설계되었다.

코돈 최적화

본 발명의 RPGR^ORF15-인코딩 뉴클레오티드 서열은 야생형 유전자 서열, 예를 들어, SEQ ID NO:2의 뉴클레오티드 서열과 관련하여 코돈 최적화되었다.

따라서, 본원에 개시된 최적화 전략을 이용하여 제조된 본 발명의 코돈 최적화된 RPGR 유전자는 야생형 cDNA 서열보다 더 안정적이며, 이에 의해 wtRPGR이 유전자 요법을 통해 전사 기구로 재도입되는 경우 대안적으로 스플라이싱된 변이체 및 트렁케이션된 단백질을 발생시킬 수 있는 wtRPGR과 관련된 문제를 피한다(Wu et al., Human Molecular Genetics 2015: 24(14); 3956-70).

코돈 최적화는 유전 부호에서의 중복을 이용하여 인코딩된 단백질의 동일한 아미노산 서열을 유지하면서 뉴클레오티드 서열이 변경되는 것을 가능하게 한다.

통상적으로, 코돈 최적화는 인코딩된 단백질의 발현에서 증가 또는 감소를 촉진하도록 수행된다. 이는 특정 세포 유형의 코돈 사용으로 뉴클레오티드 서열 내의 코돈 사용을 맞춤화시킴으로써 세포 유형의 특정 tRNA의 상대적 풍부성에서의 편향에 해당하는 세포 코돈 편향을 이용하여 달성된다. 해당 tRNA의 상대적 풍부성과 일치하도록 맞춤화되도록 뉴클레오티드 서열 내의 코돈을 변경시킴으로써, 발현을 증가시키는 것이 가능하다. 역으로, 해당 rRNA가 특정 세포 유형에서 드문 것으로 공지된 코돈을 선택함으로써 발현을 감소시키는 것이 가능하다.

그러나, 본 발명의 코돈 최적화는 세포 발현 수준에 영향을 미치도록 특별히 표적화되지 않는다. 대신, 본 발명은 야생형 서열(예를 들어, SEQ ID NO:2)에 비해 복제의 증가된 정확도(즉, 폴리뉴클레오티드 복제 주기 동안, 예를 들어, 클로닝 과정 동안 또는 천연 세포 주기 동안 돌연변이가 발생하는 경향이 덜함)를 나타내는 서열을 제공하기 위해 RPGR^ORF15의 돌연변이 경향이 있는 야생형 뉴클레오티드 서열(예를 들어, SEQ ID NO:2)을 조작하기 위해 유전 부호에서의 중복을 이용한다.

또한, 본 발명자는 (i) 코돈 최적화되지 않은 인간 cDNA RPGR 작제물에서 관찰되는 대안적 스플라이스 변이체를 코돈 최적화된 서열을 이용하여 피할 수 있고, (ii) 코돈 최적화된 서열로부터의 단백질 발현의 수준이 야생형 서열의 것보다 높아 작제물을 전반적 번역에 대해 더욱 효율적(이론으로 제한하고자 하는 것은 아니지만, 이는 글루타메이트 및 글리신 tRNA의 세포 풀(pool)을 이용하는 반복 GAN 코돈의 수에서의 감소로 인한 것일 수 있음)으로 만드는 것을 제시하였다.

야생형 ORF15 영역은 유전체에서 예상되는 것보다 훨씬 적은 T 및 C 뉴클레오티드를 함유한다. 예를 들어, 위치 2410 내지 3160의 750개의 염기쌍 서열은 야생형 서열 모두에서 C 뉴클레오티드를 함유하지 않는다. 이는 클로닝 및 벡터 생성 동안 부정확하게 재조합될 수 있는 많은 반복 서열을 발생시킨다. 대부분의 코돈은 상기 영역에서 위치 1에서 G로 시작하므로, 선행 코돈의 위치 3으로의 C 뉴클레오티드의 첨가는 본 발명의 코돈 최적화 전략에서 CpG 디뉴클레오티드의 수를 제한하는 것을 고려하여 수행되었다. 이는 이들 디뉴클레오티드 중 너무 많은 것이 트랜스진 DNA를 부자연스러운 것으로 확인하여 C 뉴클레오티드의 메틸화-기반 침묵이 발생하기 쉽게 만들수 있기 때문이다. 예를 들어, SEQ ID NO:3의 위치 2410 내지 3160의 750개의 염기쌍 서열에서, 전체 45개의 C 뉴클레오티드가 코돈 최적화 과정을 통해 첨가되어 45개의 CpG 디뉴클레오티드(6.00%)가 생성된다. 이는 이들 디뉴클레오티드의 예측된 야생형 빈도(6.25%)와 유리하게 비교된다.

RPGR^ORF15의 코돈 서열을 최적화하면서 CpG 디뉴클레오티드를 제한하는 추가 이유는 진핵생물 세포가 선천 면역의 진화적으로 보존된 메커니즘을 갖는다는 점이며, 이는 이들(또는 오히려 주변 세포)에게, 예를 들어, 바이러스 감염에 대한 방어 메커니즘을 제공한다(Willett et al., Frontiers in immunology 2013;4:261). 메틸화되지 않은 CpG 섬은 숙주 세포로부터의 바이러스 DNA로 확인될 수 있어, 프로그램화된 세포 사멸을 잠재적으로 발생시키는 경로(Toll-/Nod-/RIG I-유사 수용체 신호전달 등)를 촉발시킬 수 있다(Krieg et al. The Journal of laboratory and clinical medicine 1996;128:128-133).

또한 추가로, 메틸화되지 않은 CpG 디뉴클레오티드는 염증을 촉발시키는 면역 반응을 자극할 수 있다.

또한, 가능한 경우 글리신을 인코딩하는 4중 축퇴성 코돈 'GGN'에 C 코돈 최적화가 적용되었다. 이는 GGC 및 GGT 둘 모두가 글리신을 인코딩하므로 트랜스진 내의 CpG 디뉴클레오티드의 C 뉴클레오티드의 임의의 이후의 메틸화 및 이후의 티민(T)으로의 탈아미노화가 발생한다 하더라도 RPGR 단백질 서열을 변화시키기 않기 때문이다.

RPGR의 GA 풍부 영역 내의 T 뉴클레오티드의 삽입은 또한 본 발명의 코돈 최적화 과정에서 이상 폴리A 신호(예를 들어, AATAAA) 및 가능한 스플라이스 공여체 부위(GT)를 생성하는 것을 피하기 위해 본 발명의 뉴클레오티드 서열에서 제한되었다. 상기 영역은 반복되는 G 피리미딘 염기 및 5' 방향의 잠재적인 A 뉴클레오티드 분지점을 갖는 다수의 스플라이스 수용체(AG) 서열을 함유하므로 스플라이스 공여체 부위를 피하는 것이 고려사항이다. 코돈 최적화 패턴은 GA 반복을 감소시키고, 또한 조기 폴리A 신호의 이상 스플라이싱 및 생성의 위험을 감소시키기 위한 최적 변형을 결정하기 위해 인 실리코(in silico)에서 광범위하게 모델링되었다. 따라서, 본원에 개시된 최적화 전략을 이용하여 제조된 본 발명의 코돈 최적화된 유전자는 유전자 요법을 통해 전사 기구로 재도입되는 경우 대안적으로 스플라이싱된 변이체 및 트렁케이션된 단백질을 발생시킬 수 있는 야생형 cDNA 서열보다 더 안정적이다(Wu et al., Human Molecular Genetics 2015: 24(14); 3956-70). 이에 의해 본 발명의 코돈 최적화된 유전자는 wtRPGR과 관련된 질병 유발 문제를 피한다.

본 발명자에 의해 개발되고 입증된 원리는 유사한 유리한 특징을 나타내는 SEQ ID NO:3의 변이체를 생성시키기 위해 적합화되고 적용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 SEQ ID NO:3의 특정 서열로 제한되는 것으로 간주되어선 안된다.

복제 정확도는 당업자에게 공지된 다수의 방법 중 임의의 방법에 의해 측정될 수 있다.

예를 들어, RPGR^ORF15-인코딩 뉴클레오티드 서열은 PCR 증폭될 수 있고, 표준 클로닝 벡터로 라이게이션될 수 있다. 이후, 라이게이션 생성물은 세포주(예를 들어, 표준 E. 콜리 균주)로 형질전환될 수 있고, 생성된 다수의 형질전환체 콜로니는 그 안에 포함된 RPGR^ORF15 유전자의 뉴클레오티드 서열을 결정하기 위해 분석될 수 있다. 서열분석 결과는 돌연변이된 서열 및 돌연변이되지 않은 서열을 포함하는 시험된 콜로니의 분획을 결정하기 위해 다양한 RPGR^ORF15-인코딩 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 예상 참조 서열을 포함함) 사이에서 비교될 수 있다.

일 구현예에서, 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드(예를 들어, 콜로니로부터의 서열을 포함하는 플라스미드의 분리에 의해서와 같이 세포 콜로니, 예를 들어, E. 콜리 콜로니로부터 분리된 폴리뉴클레오티드)가, 예를 들어, 생거(Sanger) 서열분석 방법을 이용한 폴리뉴클레오티드 서열분석에 의해 분석되는 경우 9개 미만, 예를 들어, 8, 7, 6, 5, 4, 3 또는 2개 미만의 돌연변이가 RPGR^ORF15-인코딩 뉴클레오티드 서열에 존재한다. 바람직하게는, RPGR^ORF15-인코딩 뉴클레오티드 서열이 서열분석되는 경우 0개의 돌연변이가 존재한다.

또 다른 구현예에서, 시험된 클론(즉, 세포 콜로니로부터 분리된 본 발명의 RPGR^ORF15-인코딩 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 예를 들어, E. 콜리 콜로니로부터 분리된 플라스미드)의 25% 미만, 예를 들어, 20%, 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% 또는 1% 미만이, 예를 들어, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400 또는 500개의 클론이 분석되는 경우 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 RPGR^ORF15-인코딩 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 바람직하게는, 시험된 클론의 0%가 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 RPGR^ORF15-인코딩 뉴클레오티드 서열을 포함한다.

일 구현예에서, 본 발명의 RPGR^ORF15-인코딩 뉴클레오티드 서열은 야생형 서열(예를 들어, SEQ ID NO:2)에 비해 퓨린 뉴클레오티드의 수를 감소시키기 위해 코돈 최적화되었다.

아데닌 및 구아닌은 야생형 RPGR^ORF15-인코딩 뉴클레오티드 서열에서 발견되는 2개의 퓨린 뉴클레오티드이다.

일 구현예에서, 퓨린 뉴클레오티드의 수는 RPGR^ORF15-인코딩 뉴클레오티드 서열의 퓨린-풍부(즉, GA-풍부) 영역, 예를 들어, ORF 15 엑손 영역에서 감소된다.

일 구현예에서, 퓨린 뉴클레오티드의 수는 야생형 서열(예를 들어, SEQ ID NO:2) 내의 퓨린 뉴클레오티드의 수의 적어도 0.5%, 1%, 1.5%, 2%, 2.5%, 3%, 3.5%, 4%, 4.5% 또는 5%만큼 감소된다.

또 다른 구현예에서, 퓨린 뉴클레오티드의 수는 야생형 서열(예를 들어, SEQ ID NO:2) 내의 퓨린 뉴클레오티드의 수의 0.5-10%, 0.5-7.5%, 0.5-5%, 0.5-4.5%, 0.5-4%, 0.5-3.5%, 0.5-3%, 1-5%, 1-4.5%, 1-4%, 1-3.5% 또는 1-3%만큼 감소된다.

본 발명의 RPGR^ORF15의 예시적인 코돈-최적화된 서열은 하기와 같다:

또 다른 구현예에서, 본 발명의 RPGR^ORF15-인코딩 뉴클레오티드 서열은 하기로 구성된 군으로부터 선택되는 서열을 포함한다:

(c) SEQ ID NO:3의 뉴클레오티드 서열,

또 다른 구현예에서, 본 발명의 RPGR^ORF15-인코딩 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:3과 적어도 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8% 또는 99.9%의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 바람직하게는 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된 단백질은 SEQ ID NO:1에 의해 표현되는 단백질의 천연 기능을 실질적으로 보유한다.

바람직하게는, 본 발명의 RPGR^ORF15-인코딩 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:1의 단백질에 비해 색소성망막염으로 고통받거나 색소성망막염이 발생할 위험이 있는 대상체에서 하기의 유사하거나 더 높은 예방을 제공하는 것을 돕는 단백질을 인코딩한다:

(a) RP와 관련된 망막 색소 변화의 임상적 외양;

(b) 광수용체(예를 들어, 원뿔 세포, 바람직하게는 원뿔 및 막대 세포) 세포 사멸; 및/또는

(c) 시각 기능에서의 악화.

본원에서 사용되는 뉴클레오티드 기호 "N"은 IUPAC-IUB 규약에 따라 그 위치에서 임의의 뉴클레오티드(예를 들어, G, A, T 또는 C)가 존재할 수 있음을 나타낸다.

색소성망막염

색소성망막염(RP)은 일반적으로 막대 광수용체 세포의 진행성 변성에 의해 야기되는 유전성 망막이영양증의 표현형적으로 관련된 그룹이다. 망막 색소 상피(RPE) 및 원뿔 광수용체 세포가 또한 질병의 진행 동안 변성될 수 있다.

X 염색체-연관 패턴(즉, 질병과 관련된 유전자가 X 염색체 상에 존재함)으로 유전되는 질병의 형태인 X-연관 색소성망막염(XLRP)은 색소성망막염의 가장 심각한 형태로 간주된다.

RP는 망막의 색소에서의 변화에 의한 임상적 모양을 특징으로 하며, 이는 세동맥 약화 및 시신경 위축을 수반할 수 있다. 망막에서의 변화는 망막 색소의 분산 및 응집으로부터 발생할 수 있다. 이는 과립상 또는 반상으로부터 골소극과 유사한 독특한 국소적 응집의 범위의 모양을 발생시킬 수 있다. 흑색 또는 어두운 갈색의 색소의 성상 농축이 나타날 수 있다. 또한, 망막의 한 사분면에 제한된 색소침착, 디스크로부터 방사상으로 퍼지는 것으로 보이는 이상 및 중증 혈관병증과 관련된 변화가 관찰될 수 있다.

본원에 기재된 RP의 치료 또는 예방은 상기 기재된 RP 표현형의 모양을 감소시키거나 예방할 수 있다. 이는 변성으로부터 광수용체 세포, 예를 들어, 원뿔 세포의 보호를 발생시킬 수 있다. 바람직하게는, 치료는 변성으로부터 원뿔 및 막대 세포 둘 모두를 보호한다.

막대 및 원뿔의 수는 적응 광학, 자가형광 및 광간섭 단층영상(OCT) 스캔과 같은 기술을 이용하여 임상 분야의 당업자에 의해 평가될 수 있다.

바람직하게는, RP의 치료는 시각 기능에서의 유지 또는 개선을 가능하게 한다.

망막의 모양의 시각화 및 시각 기능의 평가는 당업자에 의해 용이하게 수행될 수 있다. 예를 들어, 당업자에 의해 수행될 수 있는 시각 기능 시험은 최고 교정 시력, 시야 검사, 미세시야검사(microperimetry), 색각, 암순응검사, 망막전위도검사 및 원뿔 플리커 융합 검정을 포함한다. 본원에서 사용되는 "시각 기능의 유지 또는 개선"은 처리된 눈의 시력이 본 발명의 방법이 수행되기 전 및 후에 비교되는 경우에 시각 기능의 하나 이상의 상기 검정에 의해 평가시 시력 수준에서의 실질적으로 동일한 수준의 유지 또는 개선으로 이해되어야 한다.

눈의 구조

본원에 개시된 약물은 색소성망막염(RP)의 치료 또는 예방과 관련하여 포유동물, 바람직하게는 인간 눈으로 전달될 수 있다.

눈의 질병의 치료에서의 당업자는 눈의 구조의 상세하고 충분한 이해를 가질 것이다. 그러나, 본 발명과 특히 관련된 하기 구조가 기재된다.

망막

망막은 눈의 내부 후방에 라이닝되어 있고, 시각적 세상의 이미지를 감지하는 다층막이며, 이는 시신경을 통해 뇌와 소통한다. 눈의 내부로부터 외부로의 순서로, 망막은 감각신경 망막층 및 망막 색소 상피와 함께 망막 색소 상피 외부에 놓여 있는 맥락막을 포함한다.

감각신경 망막 및 광수용체 세포

감각신경 망막은 빛을 직접 감지하는 광수용체 세포를 갖는다. 이는 다음과 같은 층을 포함한다: 내경계막(ILM); 신경섬유층; 신경절세포층; 내망상층; 내핵층; 외망상층; 바깥핵층(광수용체의 핵); 외경계막(ELM); 및 막대 및 원뿔의 광수용체(내분절 및 바깥분절).

당업자는 광수용체 세포의 상세한 이해를 가질 것이다. 간단히, 광수용체 세포는 빛을 생물학적 신호로 전환시키는 망막에 위치된 특화된 뉴런이다. 광수용체 세포는 망막 전체에 걸쳐 상이하게 분포된 막대 및 원뿔 세포를 포함한다.

막대 세포는 주로 망막의 외부에 걸쳐 분포되어 있다. 이들은 매우 민감하며, 낮은 빛 수준에서의 시각을 제공한다. 정상 인간 망막에는 평균 약 1억 2천 5백만개의 막대 세포가 존재한다.

원뿔 세포는 망막 전체에 걸쳐 발견되나, 중추의 고해상도 시각을 담당하는 감각신경 망막 내의 구덩이인 와(fovea) 내에 주로 집중되어 있다. 원뿔 세포는 막대 세포보다는 덜 민감하다. 정상 인간 망막에는 평균 약 6백만 내지 7백만개의 원뿔 세포가 존재한다.

망막 색소 상피

망막 색소 상피(RPE)는 감각신경 망막의 외부에 가까이에 위치된 세포의 색소화된 층이다. RPE는 광수용체 세포로의 영양소 및 다른 물질의 운반, 및 시각을 개선시키기 위한 산란광의 흡수를 포함하는 다수의 기능을 수행한다.

맥락막

맥락막은 RPE와 눈의 외부 공막 사이에 위치된 혈관층이다. 맥락막의 혈관구조는 망막으로의 산소 및 영양소의 공급을 가능하게 한다.

벡터

벡터는 한 환경으로부터 또 다른 환경으로의 존재물의 전달을 가능하게 하거나 촉진하는 도구이다. 본 발명에 따라, 예를 들어, 재조합 핵산 기술에 사용되는 일부 벡터는 존재물, 예를 들어, 핵산의 세그먼트(예를 들어, 이종성 DNA 세그먼트, 예를 들어, 이종성 cDNA 세그먼트)가 표적 세포로 전달되는 것을 가능하게 한다. 벡터는 세포 내에서 이종성 핵산(예를 들어, DNA 또는 RNA)을 유지시키거나, 핵산의 세그먼트를 포함하는 벡터의 복제를 촉진하거나, 핵산의 세그먼트에 의해 인코딩되는 단백질의 발현을 촉진하는 목적으로 제공될 수 있다.

벡터는 비-바이러스 또는 바이러스 벡터일 수 있다. 재조합 핵산 기술에서 사용되는 벡터의 예는 플라스미드, 염색체, 인공 염색체 및 바이러스를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 벡터는 또한, 예를 들어, 네이키드 핵산(예를 들어, DNA 또는 RNA)일 수 있다. 가장 간단한 형태에서, 벡터는 벡터 자체가 관심 뉴클레오티드일 수 있다.

일 양태에서, 본 발명은 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다.

본 발명에서 사용되는 벡터는, 예를 들어, 플라스미드 또는 바이러스 벡터일 수 있고, 폴리뉴클레오티드의 발현을 위한 프로모터 및 임의로 프로모터의 조절인자를 포함할 수 있다.

바이러스 벡터

바람직한 구현예에서, 본 발명의 벡터는 바이러스 벡터이다. 바람직하게는, 바이러스 벡터는 바이러스 벡터 입자의 형태이다.

바이러스 벡터는, 예를 들어, 아데노-관련 바이러스(AAV), 레트로바이러스, 렌티바이러스 또는 아데노바이러스 벡터일 수 있다.

당업자는, 예를 들어, 전달되는 트랜스진의 크기 및 유형 및 표적 세포의 유형을 기초로 하여 본 발명의 벡터로서 필요한 목적을 위해 적합한 바이러스를 용이하게 선택할 수 있다. 또한, 바이러스 벡터 및 바이러스 벡터 입자, 예를 들어, AAV, 레트로바이러스, 렌티바이러스 또는 아데노바이러스로부터 유래된 것을 제조하고 변형시키는 방법은 당 분야에 널리 공지되어 있으며, 당업자에 의해 필요 목적에 대해 용이하게 적합화될 수 있다.

아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터

바람직한 구현예에서, 본 발명의 벡터는 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터이다. 바람직하게는, AAV 벡터는 AAV 입자의 형태이다.

AAV 벡터는 AAV 유전체 또는 이의 유도체를 포함할 수 있다.

AAV 유전체는 AAV 입자의 생성에 필요한 기능을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열이다. 이들 기능은 AAV 유전체의 AAV 입자로의 캡시드화를 포함하는 숙주 세포에서의 AAV의 복제 및 패키징 주기에서 작용하는 기능을 포함한다. 천연 발생 AAV는 복제-결여되어 있으며, 복제 및 패키징 주기의 완성을 위해 트랜스의 헬퍼 기능의 공급에 의존한다. 따라서, 본 발명의 벡터의 AAV 유전체는 통상적으로 복제-결여되어 있다.

AAV 유전체는 양성 또는 음성-센스의 단일-가닥 형태일 수 있거나, 대안적으로 이중-가닥 형태일 수 있다. 이중-가닥 형태의 이용은 표적 세포에서의 DNA 복제 단계의 우회를 가능하게 하며, 따라서 트랜스진 발현을 가속화시킬 수 있다.

AAV 유전체는 AAV의 임의의 천연 유래 혈청형, 분리물 또는 클레이드로부터 유래될 수 있다. 따라서, AAV 유전체는 천연 발생 AAV의 전체 유전체일 수 있다. 당업자에게 공지된 바와 같이, 천연 발생하는 AAV는 다양한 생물학적 시스템에 따라 분류될 수 있다.

일반적으로, AAV는 이들의 혈청형과 관련하여 언급된다. 혈청형은 캡시드 표면 항원의 발현의 프로파일로 인해 다른 변이체 아종과 구별하기 위해 이용될 수 있는 특이한 반응성을 갖는 AAV의 변이체 아종에 해당한다. 통상적으로, 특정 AAV 혈청형을 갖는 바이러스는 임의의 다른 AAV 혈청형에 특이적인 중화 항체와 유효하게 교차 반응하지 않는다.

AAV 혈청형은 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10 및 AAV11, 및 또한 최근에 영장류 뇌로부터 확인된 재조합 혈청형, 예를 들어, Rec2 및 Rec3을 포함한다. 이들 AAV 혈청형 중 임의의 혈청형이 본 발명에서 이용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 일 구현예에서, AAV 벡터 입자는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, Rec2 또는 Rec3 AAV 벡터 입자이다.

AAV 혈청형의 개관은 문헌[Choi et al. (2005) Curr. Gene Ther. 5: 299-310 및 Wu et al. (2006) Molecular Therapy 14: 316-27]에서 발견될 수 있다. 본 발명에서 사용하기 위한 ITR 서열, rep 또는 cap 유전자를 포함하는 AAV 유전체의 서열 또는 AAV 유전체의 요소의 서열은 AAV 전체 유전체 서열에 대해 하기 등록 번호로부터 유래될 수 있다: 아데노-관련 바이러스 1 NC_002077, AF063497; 아데노-관련 바이러스 2 NC_001401; 아데노-관련 바이러스 3 NC_001729; 아데노-관련 바이러스 3B NC_001863; 아데노-관련 바이러스 4 NC_001829; 아데노-관련 바이러스 5 Y18065, AF085716; 아데노-관련 바이러스 6 NC_001862; 조류 AAV ATCC VR-865 AY186198, AY629583, NC_004828; 조류 AAV 균주 DA-1 NC_006263, AY629583; 소 AAV NC_005889, AY388617.

AAV는 또한 클레이드 또는 클론과 관련하여 언급될 수 있다. 이는 천연 유래 AAV의 계통발생학적 관계, 및 통상적으로 공통의 조상으로 역 추적될 수 있는 AAV의 계통발생학적 그룹을 나타내며, 이들의 모든 자손을 포함한다. 또한, AAV는 특정 분리물, 즉, 천연에서 발견되는 특정 AAV의 유전적 분리물과 관련하여 언급될 수 있다. 용어 유전적 분리물은 다른 천연 발생 AAV와 제한된 유전적 혼합을 겪음으로써 유전적 수준에서 인지 가능하게 다른 집단을 규정하는 AAV의 집단을 기재한다.

당업자는 이들의 공통의 일반적 지식을 기초로 하여 본 발명에서 사용하기 위한 AAV의 적절한 혈청형, 클레이드, 클론 또는 분리물을 선택할 수 있다. 예를 들어, AAV5 캡시드는 유전적 색각 결함의 성공적인 교정에 의해 입증되는 바와 같이 영장류 원뿔 광수용체를 효과적으로 형질도입시키는 것으로 밝혀졌다(Mancuso et al. (2009) Nature 461: 784-7).

AAV 혈청형은 AAV 바이러스의 감염(또는 향성)의 조직 특이성을 결정한다. 따라서, 본 발명에 따라 환자에게 투여되는 AAV에서 사용하기에 바람직한 AAV 혈청형은 눈 내에서 표적 세포의 높은 감염효율지수 또는 이에 대한 천연 향성을 갖는 혈청형이다. 일 구현예에서, 본 발명에서 사용하기 위한 AAV 혈청형은 감각신경 망막, 망막 색소 상피 및/또는 맥락막의 세포를 감염시키는 혈청형이다.

통상적으로, AAV의 천연 유래 혈청형, 분리물 또는 클레이드의 AAV 유전체는 적어도 하나의 역방위 말단 반복 서열(ITR)을 포함한다. ITR 서열은 기능성 복제 기점을 제공하고, 벡터의 통합 및 세포의 유전체로부터의 절제를 가능하게 하기 위해 시스(cis) 작용한다. 바람직한 구현예에서, 하나 이상의 ITR 서열이 RPGR^ORF15를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열에 측접한다. AAV 유전체는 통상적으로 AAV 입자의 패키징 기능을 인코딩하는 패키징 유전자, 예를 들어, rep 및/또는 cap 유전자를 또한 포함한다. rep 유전자는 단백질 Rep78, Rep68, Rep52 및 Rep40 또는 이들의 변이체 중 하나 이상을 인코딩한다. cap 유전자는 하나 이상의 캡시드 단백질, 예를 들어, VP1, VP2 및 VP3 또는 이들의 변이체를 인코딩한다. 이들 단백질은 AAV 입자의 캡시드를 구성한다. 캡시드 변이체는 하기에 논의된다.

프로모터가 패키징 유전자 각각에 작동 가능하게 연결될 것이다. 상기 프로모터의 특정 예는 p5, p19 및 p40 프로모터를 포함한다(Laughlin et al. (1979) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 5567-5571). 예를 들어, p5 및 p19 프로모터는 rep 유전자를 발현시키기 위해 일반적으로 사용되는 한편, p40 프로모터는 cap 유전자를 발현시키기 위해 일반적으로 사용된다.

상기 논의된 바와 같이, 본 발명의 벡터에서 사용되는 AAV 유전체는 따라서 천연 발생 AAV의 전체 유전체일 수 있다. 예를 들어, 전체 AAV 유전체를 포함하는 벡터가 시험관 내에서 AAV 벡터 또는 벡터 입자를 제조하기 위해 이용될 수 있다. 그러나, 상기 벡터는 원칙적으로는 환자에 투여될 수 있으나, 이는 실제로는 드물게 수행될 것이다. 바람직하게는, AAV 유전체는 환자로의 투여 목적을 위해 유도체화될 것이다. 상기 유도체화는 당 분야에서 표준이며, 본 발명은 AAV 유전체의 임의의 공지된 유도체, 및 당 분야에 공지된 기술을 적용시킴으로써 생성될 수 있는 유도체의 사용을 포함한다. AAV 유전체 및 AAV 캡시드의 유도체화는 상기 참조된 문헌[Coura and Nardi (2007) Virology Journal 4: 99, 및 Choi et al. and Wu et al.]에 개관되어 있다.

AAV 유전체의 유도체화는 생체 내에서 본 발명의 벡터로부터의 트랜스진의 발현을 가능하게 하는 AAV 유전체의 임의의 트렁케이션되거나 변형된 형태를 포함한다. 통상적으로, 최소의 바이러스 서열을 포함하나, 상기 기능을 보유하는 AAV 유전체를 트렁케이션시키는 것이 가능한다. 이는 야생형 바이러스를 갖는 벡터의 재조합의 위험을 감소시키고, 또한 표적 세포 내의 바이러스 유전자 단백질의 존재에 의한 세포 면역 반응을 촉발시키는 것을 피하는 안전성 이유로 바람직하다.

통상적으로, 유도체는 적어도 하나의 역방위 말단 반복 서열(ITR), 바람직하게는 하나 초과의 ITR, 예를 들어, 2개의 ITR 또는 그 초과를 포함할 것이다. ITR 중 하나 이상은 다양한 혈청형을 갖는 AAV 유전체로부터 유래될 수 있거나, 이는 키메라 또는 돌연변이체 ITR일 수 있다. 바람직한 돌연변이체 ITR은 trs(말단 분해 부위)의 결실을 갖는 것이다. 이러한 결실은 유전체의 지속된 복제를 가능하게 하여 코딩 및 상보성 서열 둘 모두를 함유하는 단일-가닥 유전체, 즉, 자가-상보성 AAV 유전체를 생성시킨다. 이는 표적 세포의 DNA 복제의 우회를 가능하게 하고, 따라서 가속화된 트랜스진 발현을 가능하게 한다.

하나 이상의 ITR은 바람직하게는 어느 한 말단에서 RPGR^ORF15를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열에 측접할 것이다. 하나 이상의 ITR의 포함은, 예를 들어, 숙주 세포 DNA 중합효소의 작용에 의해 단일-가닥 벡터 DNA의 이중-가닥 DNA로의 전환 후에 숙주 세포의 핵에서 본 발명의 벡터의 콘카타머(concatamer) 형성을 돕는데 바람직하다. 상기 에피솜 콘카타머의 형성은 숙주 세포의 생애 동안 벡터 작제물을 보호함으로써 생체 내에서 트랜스진의 장기간 발현을 가능하게 한다.

바람직한 구현예에서, ITR 요소는 유도체 내에서 천연 AAV 유전체로부터 유지된 유일한 서열일 것이다. 따라서, 유도체는 바람직하게는 천연 유전체의 rep 및/또는 cap 유전자 및 천연 유전체의 임의의 다른 서열을 포함하지 않을 것이다. 이는 상기 기재된 이유로 바람직하며, 또한 숙주 세포 유전체로의 벡터의 통합 가능성을 감소시키는데 바람직하다. 또한, AAV 유전체의 크기를 감소시키는 것은 트랜스진에 더하여 벡터 내에 다른 서열 요소(예를 들어, 조절 요소)를 혼입시키는데 있어서 증가된 유연성을 가능하게 한다.

따라서, 본 발명의 유도체에서 다음과 같은 부분이 제거될 수 있다: 1개의 역방위 말단 반복(ITR) 서열, 복제(rep) 및 캡시드(cap) 유전자. 그러나, 일부 구현예에서, 유도체는 하나 이상의 rep 및/또는 cap 유전자 또는 AAV 유전체의 다른 바이러스 서열을 추가로 포함할 수 있다. 천연 발생 AAV는 인간 유전체 19 상의 특정 부위에 높은 빈도로 통합되며, 아주 약간의 빈도의 무작위 통합을 나타내며, 벡터 내에서의 통합 능력의 보유가 치료 환경에서 용인될 수 있다.

유도체가 캡시드 단백질, 즉, VP1, VP2 및/또는 VP3을 포함하는 경우, 유도체는 하나 이상의 천연 발생 AAV의 키메라 유도체, 셔플링된 유도체 또는 캡시드-변형된 유도체일 수 있다. 특히, 본 발명은 동일 벡터(즉, 슈도타이핑된 벡터(pseudotyped vector)) 내의 AAV의 다양한 혈청형, 클레이드, 클론 또는 분리물로부터의 캡시드 단백질 서열의 제공을 포함한다.

키메라 유도체, 셔플링된 유도체 또는 캡시드-변형된 유도체는 통상적으로 바이러스 벡터에 대해 하나 이상의 요망되는 기능을 제공하도록 선택될 것이다. 따라서, 이들 유도체는 천연 발생 AAV 유전체를 포함하는 AAV 벡터, 예를 들어, AAV2의 AAV 벡터에 비해 증가된 유전자 전달의 효율, 감소된 면역원성(체액성 또는 세포성), 특정 세포 유형의 변경된 향성 범위 및/또는 개선된 표적화를 나타낼 수 있다. 유전자 전달의 증가된 효율은 세포 표면에서의 개선된 수용체 또는 공동-수용체 결합, 개선된 내재화, 세포 내 및 핵으로의 개선된 트래피킹(trafficking), 바이러스 입자의 개선된 탈외피 및 단일-가닥 유전체의 이중-가닥 형태로의 개선된 전환에 의해 달성될 수 있다. 증가된 효율은 또한 특정 세포 집단의 변경된 향성 범위 또는 표적화에 관한 것일 수 있으며, 벡터 용량은 이가 필요하지 않은 조직으로의 투여에 의해 희석되지 않는다.

키메라 캡시드 단백질은 천연 발생 AAV 혈청형의 2개 이상의 캡시드 코딩 서열 사이의 재조합에 의해 발생된 것을 포함한다. 이는, 예를 들어, 하나의 혈청형의 비-감염성 캡시드 서열이 상이한 혈청형의 캡시드 서열과 공동-형질감염되는 마커 구제 접근법에 의해 수행될 수 있으며, 요망되는 특성을 갖는 캡시드 서열을 선택하기 위해 직접 선택이 이용된다. 다양한 혈청형의 캡시드 서열은 신규한 키메라 캡시드 단백질을 생성시키기 위해 세포 내에서 상동성 재조합에 의해 변경될 수 있다.

키메라 캡시드 단백질은 또한 2개 이상의 캡시드 단백질 사이, 예를 들어, 상이한 혈청형의 2개 이상의 캡시드 단백질 사이로 특정 캡시드 단백질 도메인, 표면 루프 또는 특정 아미노산 잔기를 전달하도록 캡시드 단백질 서열을 조작함으로써 발생된 것을 포함한다.

셔플링된 캡시드 단백질 또는 키메라 캡시드 단백질은 또한 DNA 셔플링 또는 오류-빈발 PCR에 의해 생성될 수 있다. 하이브리드 AAV 캡시드 유전자는 관련된 AAV 유전자의 서열, 예를 들어, 다수의 상이한 혈청형의 캡시드 단백질을 인코딩하는 서열을 무작위로 단편화시키고, 이후 서열 상동성 영역에서 교차를 또한 야기시킬 수 있는 자가-프라이밍 중합효소 반응에서 상기 단편을 재어셈블리시킴으로써 생성될 수 있다. 여러 혈청형의 캡시드 유전자를 셔플링시킴으로써 상기 방식으로 생성된 하이브리드 AAV 유전자의 라이브러리는 요망되는 기능을 갖는 바이러스 클론을 확인하기 위해 스크리닝될 수 있다. 유사하게, 이후에 요망되는 특성에 대해 선택될 수 있는 다양한 라이브러리의 변이체를 생성시키기 위해 AAV 캡시드 유전자를 무작위로 돌연변이시키기 위해 오류 빈발 PCR이 이용될 수 있다.

캡시드 유전자의 서열은 또한 천연의 야생형 서열과 관련하여 특정 결실, 치환 또는 삽입을 도입시키기 위해 유전학적으로 변형될 수 있다. 특히, 캡시드 유전자는 캡시드 코딩 서열의 열린해독틀 내, 또는 캡시드 코딩 서열의 N-말단 및/또는 C-말단에 관련되지 않은 단백질 또는 펩티드의 서열의 삽입에 의해 변형될 수 있다.

관련되지 않은 단백질 또는 펩티드는 유리하게는 특정 세포 유형에 대한 리간드로서 작용함으로써 표적 세포에 대한 개선된 결합을 부여하거나, 특정 세포 집단으로의 벡터의 표적화의 특이성을 개선시키는 것일 수 있다. 예로는 망막 색소 상피에서 흡수를 차단함으로써 주위 망막 조직의 형질도입을 향상시키는 RGD 펩티드의 사용을 포함할 수 있다(Cronin et al. (2008) ARVO Abstract: D1048). 관련되지 않은 단백질은 또한 생성 과정의 일부로서 바이러스 입자의 정제를 돕는 것, 즉, 에피토프 또는 친화성 태그일 수 있다. 삽입 부위는 통상적으로 바이러스 입자의 다른 기능, 예를 들어, 바이러스 입자의 내재화, 트래피킹을 간섭하지 않도록 선택될 것이다. 당업자는 이들의 공통의 일반적인 지식을 기초로 하여 삽입에 적합한 부위를 확인할 수 있다. 특정 부위가 상기 참조된 문헌[Choi et al.]에 개시되어 있다.

본 발명은 천연 AAV 유전체의 것과 상이한 순서 및 입체형태의 AAV 유전체의 서열의 제공을 추가로 포함한다. 본 발명은 또한 하나 이상의 AAV 서열 또는 유전자의 또 다른 바이러스로부터의 서열 또는 하나 초과의 바이러스로부터의 서열로 구성된 키메라 유전자에 의한 대체를 포함한다. 상기 키메라 유전자는 상이한 바이러스 종의 2개 이상의 관련 바이러스 단백질로부터의 서열로 구성될 수 있다.

본 발명의 벡터는 AAV 유전체 또는 이의 유도체를 포함하는 뉴클레오티드 서열 및 RPGR^ORF15 트랜스진 또는 이의 변이체를 인코딩하는 서열의 형태를 취할 수 있다.

본 발명의 AAV 입자는 하나의 혈청형의 ITR을 갖는 AAV 유전체 또는 유도체가 상이한 혈청형의 캡시드에 패키징되는 캡시드전이 형태를 포함한다. 본 발명의 AAV 입자는 또한 2개 이상의 상이한 혈청형으로부터의 변형되지 않은 캡시드 단백질의 혼합물이 바이러스 캡시드를 구성하는 모자이크 형태를 포함한다. AAV 입자는 또한 캡시드 표면에 흡착된 리간드를 갖는 화학적으로 변형된 형태를 포함한다. 예를 들어, 상기 리간드는 특정 세포 표면 수용체를 표적화시키기 위한 항체를 포함할 수 있다.

따라서, 예를 들어, 본 발명의 AAV 입자는 AAV2 유전체 및 AAV2 캡시드 단백질을 갖는 것(AAV2/2), AAV2 유전체 및 AAV5 캡시드 단백질을 갖는 것(AAV2/5) 및 AAV2 유전체 및 AAV8 캡시드 단백질을 갖는 것(AAV2/8)을 포함한다.

레트로바이러스 및 렌티바이러스 벡터

본 발명의 또 다른 구현예에서, 바이러스 벡터는 레트로바이러스 벡터이다.

레트로바이러스 및 렌티바이러스는 광범위한 목적을 위한 유전자 요법 벡터로 사용하기 위해 적합화되었다.

레트로바이러스는 크게 "단순" 및 "복합"의 2개의 범주로 나뉠 수 있다. 레트로바이러스는 7개의 그룹으로 더 나뉠 수 있다. 이들 그룹 중 5개는 종양발생 잠재성을 갖는 레트로바이러스이다. 나머지 2개 그룹은 렌티바이러스 및 스푸마바이러스이다. 이들 레트로바이러스의 개관은 문헌[Coffin, J.M. et al. (1997) Retroviruses, pp. 758-763, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Eds: J.M. Coffin, S.M. Hughes, H.E. Varmus]에 제시되어 있다.

본 발명에서 사용되는 레트로바이러스 벡터는 임의의 적합한 레트로바이러스로부터 유래될 수 있거나, 임의의 적합한 레트로바이러스로부터 유래되는 것이 가능할 수 있다. 많은 수의 상이한 레트로바이러스가 확인되었고, 당업자는 특정 목적에 적합한 레트로바이러스를 충분히 선택할 수 있다. 예로는 뮤린 백혈병 바이러스(MLV), 인간 T-세포 백혈병 바이러스(HTLV), 마우스 유암 바이러스(MMTV), 라우스 육종 바이러스(RSV), 후지나미(Fujinami) 육종 바이러스(FuSV), 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스(MoMLV), FBR 뮤린 골육종 바이러스(FBR MSV), 몰로니 뮤린 육종 바이러스(Mo-MSV), 아벨손(Abelson) 뮤린 백혈병 바이러스(A-MLV), 조류 골수구종증 바이러스-29(MC29) 및 조류 적모구증 바이러스(AEV)를 포함한다. 레트로바이러스의 상세한 목록은 문헌[Coffin, J.M. et al. (1997) Retroviruses, pp. 758-763, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Eds: J.M. Coffin, S.M. Hughes, H.E. Varmus]에서 발견될 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예에서, 바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터이다.

렌티바이러스 벡터는 레트로바이러스 벡터의 큰 그룹의 일부이다. 렌티바이러스의 상세한 목록은 문헌[Coffin, J.M. et al. (1997) Retroviruses, pp. 758-763, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Eds: J.M. Coffin, S.M. Hughes, H.E. Varmus]에서 발견될 수 있다. 요컨대, 렌티바이러스는 영장류 및 비-영장류 그룹으로 나뉠 수 있다. 영장류 렌티바이러스의 예는 인간 자가-면역결핍 증후군(AIDS)의 병원체인 인간 면역결핍 바이러스(HIV), 및 원숭이 면역결핍 바이러스(SIV)를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 비-영장류 렌티바이러스 그룹은 프로토타입 "슬로우 바이러스" 비스나/매디 바이러스(VMV), 뿐만 아니라 관련 염소 관절염-뇌염 바이러스(CAEV), 말 감염성 빈혈 바이러스(EIAV), 및 더욱 최근에 기재된 고양이 면역결핍 바이러스(FIV) 및 소 면역결핍 바이러스(BIV)를 포함한다.

아데노바이러스 벡터

본 발명의 또 다른 구현예에서, 바이러스 벡터는 아데노바이러스 벡터이다.

아데노바이러스는 RNA 중간체를 통하지 않는 이중 가닥의 선형 DNA 바이러스이다. 유전 서열 상동성을 기초로 하여 6개의 하위 그룹으로 나뉘어지는 아데노바이러스의 50개 초과의 인간 혈청형이 존재한다. 아데노바이러스의 천연 표적은 호흡기 및 위장 상피이며, 이는 일반적으로 단지 경미한 증상을 발생시킨다. 혈청형 2 및 5(95% 서열 상동성을 가짐)가 아데노바이러스 벡터 시스템에서 가장 일반적으로 사용되며, 이는 일반적으로 어린이에서 상기도 감염과 관련된다.

아데노바이러스는 유전자 요법 및 이종성 유전자의 발현을 위한 벡터로 사용되어 왔다. 큰(36 kb) 유전체는 8 kb 이하의 외래 삽입 DNA를 수용할 수 있으며, 상보성 세포주에서 효율적으로 복제하여 10¹² 이하의 매우 높은 역가를 발생시킬 수 있다. 따라서, 아데노바이러스는 일차 비-복제성 세포에서 유전자의 발현을 연구하기 위한 최적의 시스템 중 하나이다.

아데노바이러스 유전체로부터의 바이러스 또는 외래 유전자의 발현은 복제 세포를 필요로 하지 않는다. 아데노바이러스 벡터는 수용체 매개 세포내이입에 의해 세포로 진입한다. 일단 세포 내부에 있으면, 아데노바이러스 벡터는 숙주 염색체에 거의 통합되지 않는다. 대신, 이들은 숙주 핵에서 선형 유전체로서 에피솜적으로(숙주 유전체와는 독립적으로) 작용한다. 그러므로, 재조합 아데노바이러스의 사용은 숙주 유전체로의 무작위 통합과 관련된 문제를 경감시킨다.

프로모터 및 조절 서열

본 발명의 벡터는 또한 시험관 내 또는 생체 내에서 RPGR^ORF15 트랜스진의 발현을 가능하게 하는 요소를 포함할 수 있다. 이들은 발현 조절 서열로 언급될 수 있다. 따라서, 벡터는 통상적으로 트랜스진을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 연결된 발현 조절 서열(예를 들어, 프로모터 서열을 포함함)을 포함한다.

임의의 적합한 프로모터가 이용될 수 있으며, 이의 선택은 당업자에 의해 용이하게 이루어질 수 있다. 프로모터 서열은 항시적으로 활성(즉, 임의의 숙주 세포 배경에서 작동성)일 수 있거나, 대안적으로 특정 숙주 세포 환경에서만 활성일 수 있어, 이에 따라 특정 세포 유형에서의 트랜스진의 표적화된 발현을 가능하게 할 수 있다(예를 들어, 조직-특이적 프로모터). 프로모터는 또 다른 요인, 예를 들어, 숙주 세포 내에 존재하는 요인의 존재에 반응하여 유도성 발현을 나타낼 수 있다. 임의의 사건에서, 벡터가 요법을 위해 투여되는 경우, 프로모터는 표적 세포 배경에서 기능성인 것이 바람직하다.

일부 구현예에서, 트랜스진이 망막 세포 집단에서만 발현되는 것을 가능하게 하기 위해 프로모터가 망막-세포 특이적 발현을 나타내는 것이 바람직하다. 따라서, 프로모터로부터의 발현은, 예를 들어, 감각신경 망막 및 망막 색소 상피의 세포로만 제한된 망막-세포 특이적일 수 있다.

바람직한 프로모터는 임의로 사이토메갈로바이러스(CMV) 인핸서 요소와 조합된 닭 베타-액틴(CBA) 프로모터를 포함한다. 본 발명에서 사용하기 위한 예시적 프로모터는 하이브리드 CBA/CAG 프로모터, 예를 들어, rAVE 발현 카세트(GeneDetect.com)에서 사용되는 프로모터이다. 본 발명에서 사용하기 위한 추가의 예시적 프로모터는 하기 서열을 갖는다:

망막-특이적 유전자 발현을 유도하는 인간 서열을 기초로 한 프로모터의 예는 막대 및 원뿔에 대한 로돕신 키나제(Allocca et al. (2007) J. Virol. 81: 11372-80), 원뿔만에 대한 PR2.1(Mancuso et al. (2009) Nature 461: 784-7) 및/또는 망막 색소 상피에 대한 RPE65(Bainbridge et al. (2008) N. Engl. J. Med. 358: 2231-9)를 포함한다. 일부 구현예에서, RPGR^ORF15-인코딩 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO:7의 뉴클레오티드 서열 또는 이와 적어도 90 또는 95%의 동일성을 갖는 기능성 변이체를 포함할 수 있는 로돕신 키나제(GRK1) 프로모터, 바람직하게는 인간 로돕신 키나제(GRK1) 프로모터에 작동 가능하게 연결된다.

다른 구현예에서, RPGR^ORF15-인코딩 폴리뉴클레오티드가 작동 가능하게 연결되는 프로모터 요소는 SEQ ID NO:8의 핵산 서열 또는 이와 적어도 90 또는 95%의 동일성을 갖는 기능성 변이체를 포함할 수 있는 광수용체간 레티노이드 결합 단백질(IRBP) 프로모터, 바람직하게는 인간 광수용체간 레티노이드 결합 단백질(IRBP) 프로모터에 작동 가능하게 연결된다.

바람직하게는, 프로모터와 별도로, RPGR^ORF15의 발현을 조절하기 위해 추가적인 조절 요소가 사용되지 않는다.

그러나, 본 발명의 벡터는 또한 전사전 또는 전사후에 작용할 수 있는 하나 이상의 추가 조절 서열을 포함할 수 있다. 조절 서열은 천연 트랜스진 유전자좌의 일부일 수 있거나, 이종성 조절 서열일 수 있다. 본 발명의 벡터는 천연 트랜스진 전사물로부터의 5'-UTR 또는 3'-UTR의 일부를 포함할 수 있다.

조절 서열은 트랜스진의 발현을 촉진시키는, 즉, 전사물의 발현을 증가시키거나, mRNA의 핵 유출을 개선시키거나, mRNA의 안정성을 향상시키는 작용을 하는 임의의 서열이다. 상기 조절 서열은, 예를 들어, 인핸서 요소, 조절후 요소 및 아데닐중합체형성 부위를 포함한다. 바람직한 아데닐중합체형성 부위는 하기 제시되는 바와 같을 수 있는 소 성장 호르몬 폴리-A 신호이다:

본 발명의 벡터의 상황에서, 상기 조절 서열은 시스-작용할 것이다. 그러나, 본 발명은 또한 추가의 유전적 작제물에 위치된 트랜스-작용 조절 서열의 사용을 포함한다.

본 발명의 벡터에서 사용하기 위한 바람직한 조절후 요소는 우드척 간염 조절후 요소(WPRE) 또는 이의 변이체이다. WPRE의 예시적 서열은 하기 제시된다:

본 발명은 WPRE가 없는 벡터에 비해 트랜스진의 발현을 증가시키는 WPRE의 임의의 변이체 서열의 사용을 포함한다. 바람직하게는, 변이체 서열은 SEQ ID NO:6과 이의 전체 서열에 걸쳐 적어도 70%의 동일성, 더욱 바람직하게는 SEQ ID NO:6과 이의 전체 서열에 걸쳐 75%, 80%, 85%, 90%, 더욱 바람직하게는 적어도 95%, 96% 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 나타낸다.

본 발명의 벡터에서 이용될 수 있는 또 다른 조절 서열은 스캐폴드-부착 영역(SAR)이다. 추가의 조절 서열은 당업자에 의해 용이하게 선택될 수 있다.

투여 방법

본 발명의 일 구현예에서, 바이러스(예를 들어, AAV) 벡터는 망막하, 직접 망막 또는 유리체내 주사에 의해 대상체의 눈으로 투여된다.

당업자는 개별적 망막하, 직접 망막 또는 유리체내 주사에 친숙할 것이며, 개별적 망막하, 직접 망막 또는 유리체내 주사를 잘 수행할 수 있을 것이다.

바람직하게는, 바이러스(예를 들어, AAV) 벡터는 망막하 주사에 의해 투여된다.

망막하 주사

망막하 주사는 망막하 공간, 즉, 감각신경 망막 아래로의 주사이다. 망막하 주사 동안, 주사되는 물질은 광수용체 세포와 망막 색소 상피(RPE) 층 사이로 향하며, 이 사이에 공간을 발생시킨다.

주사가 작은 망막절개술을 통해 수행되는 경우, 망막 박리가 발생될 수 있다. 주사된 물질에 의해 발생되는 망막의 분리된 부푼 층은 "수포"로 언급된다.

망막하 주사에 의해 발생된 구멍은 주사된 용액이 투여 후에 유리체강으로 유의하게 역류되지 않도록 충분히 작아야 한다. 상기 역류는 약물이 주사되는 경우에 특히 문제가 되는데, 이는 약물의 효과가 표적 구역으로부터 떨어져 향하게 되기 때문이다. 바람직하게는, 주사는 감각신경 망막 내에 자가-밀봉 진입점을 발생시키며, 즉, 주사 바늘이 제거된 후, 바늘에 의해 발생된 구멍은 이러한 구멍을 통해 매우 적은 주사 물질이 방출되거나 실질적으로 주사 물질이 방출되지 않도록 재밀봉된다.

상기 과정을 촉진하기 위해, 전문적인 망막하 주사 바늘이 상업적으로 이용 가능하다(예를 들어, DORC 41G Teflon 망막하 주사 바늘, Dutch Ophthalmic Research Center International BV, Zuidland, The Netherlands). 이들은 망막하 주사를 수행하도록 설계된 바늘이다.

주사 동안 망막에 대한 손상이 발생하지 않고, 충분히 작은 바늘이 사용되는 한, 실질적으로 모든 주사된 물질은 박리된 감각신경 망막과 국소화된 망막 박리 부위의 RPE 사이에 국소화된 채로 남아 있는다(즉, 유리체강으로 역류되지 않는다). 게다가, 단기간에 걸친 수포의 통상적인 지속은 일반적으로 주사된 물질의 유리체로의 적은 누출이 존재하는 것을 나타낸다. 수포는 주사된 물질이 흡수됨에 따라 장기간에 걸쳐 사라질 수 있다.

예를 들어, 광간섭 단층영상을 이용한 눈, 특히 망막의 시각화가 수술전에 이루어질 수 있다.

2-단계 망막하 주사

본 발명의 벡터는 국소화된 망막 박리가 첫번째 용액의 망막하 주사에 의해 발생되는 2-단계 방법을 이용하여 증가된 정확성 및 안전성으로 전달될 수 있다. 첫번째 용액은 벡터를 포함하지 않는다. 이후, 첫번째 망막하 주사에 의해 발생된 수포의 망막하 유체로 벡터를 포함하는 약물을 전달하기 위해 두번째 망막하 주사가 이용된다. 약물을 전달하는 주사는 망막을 박리시키는데 사용되지 않으므로, 특정 부피의 용액이 이러한 두번째 단계로 주사될 수 있다.

본 발명의 일 구현예에서, 바이러스(예를 들어, AAV) 벡터는 하기에 의해 전달된다:

(a) 망막을 적어도 부분적으로 박리시켜 망막하 수포를 형성시키는데 효과적인 양으로 용액을 망막하 주사에 의해 대상체에 투여하는 단계로서, 용액이 벡터를 포함하지 않는 단계; 및

(b) 단계 (a)에 의해 형성된 수포로 망막하 주사에 의해 약물 조성물을 투여하는 단계로서, 약물이 벡터를 포함하는 단계.

망막을 적어도 부분적으로 박리시키기 위해 단계 (a)에서 주사되는 용액의 부피는, 예를 들어, 약 10-1000 μL, 예를 들어, 약 50-1000, 100-1000, 250-1000, 500-1000, 10-500, 50-500, 100-500, 250-500 μL일 수 있다. 부피는, 예를 들어, 약 10, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 또는 1000 μL일 수 있다.

단계 (b)에서 주사되는 약물 조성물의 부피는, 예를 들어, 약 10-500 μL, 예를 들어, 약 50-500, 100-500, 200-500, 300-500, 400-500, 50-250, 100-250, 200-250 또는 50-150 μL일 수 있다. 부피는, 예를 들어, 약 10, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450 또는 500 μL일 수 있다. 바람직하게는, 단계 (b)에서 주사되는 약물 조성물의 부피는 100 μL이다. 더 많은 부피는 망막을 신장시킬 위험을 증가시킬 수 있는 반면, 더 적은 부피는 관찰하기가 어려울 수 있다.

약물을 포함하지 않는 용액(즉, 단계 (a)의 "첫번째 용액")은 하기에 기재되는 바와 같이 약물을 포함하는 용액과 유사하게 제형화될 수 있다. 약물을 포함하지 않는 바람직한 용액은 평형 염 용액(BSS) 또는 망막하 공간의 pH와 삼투질농도와 매치되는 유사한 완충 용액이다.

수술 동안의 망막 시각화

특정 상황하에서, 예를 들어, 말단-단계 망막 변성 동안, 망막을 확인하는 것은 어려운데, 이는 망막이 얇고, 투명하고, 이 위에 있는 찢어지고 과하게 색소화된 상피를 관찰하기가 어렵기 때문이다. 청색 생체 염료(예를 들어, Brilliant Peel^®, Geuder; MembraneBlue-Dual^®, Dorc)의 사용은 망막 박리 절차(즉, 본 발명의 2-단계 망막하 주사 방법에서 단계 (a))에서 만들어진 망막 구멍의 확인을 촉진시킬 수 있어, 약물이 유리체강으로 역류되는 위험 없이 동일 구멍을 통해 투여될 수 있다.

청색 생체 염료의 사용은 또한 두꺼워진 내경계막 또는 망막앞막이 존재하는 망막의 임의의 영역을 확인하는데, 이는 이들 구조 중 어느 쪽을 통한 주사가 망막하 공간으로의 깔끔한 접근을 방해하기 때문이다. 또한, 수술 직후 기간에서의 이들 구조 중 어느 것에서의 수축은 망막 진입 구멍의 신장을 초래할 수 있으며, 이는 약물의 유리체강으로의 역류를 발생시킬 수 있다.

약학적 조성물 및 주사 용액

본 발명의 약물, 예를 들어, 벡터는 약학적 조성물로 제형화될 수 있다. 이들 조성물은 약물에 더하여 약학적으로 허용되는 담체, 희석제, 부형제, 완충제, 안정화제 또는 당 분야에 널리 공지된 다른 물질을 포함할 수 있다. 상기 물질은 비독성이어야 하며, 활성 성분의 효능을 간섭하지 않아야 한다. 담체 또는 다른 물질의 정확한 특성은 투여 경로, 예를 들어, 망막하, 직접 망막 또는 유리체내 주사에 따라 당업자에 의해 결정될 수 있다.

약학적 조성물은 통상적으로 액체 형태이다. 액체 약학적 조성물은 일반적으로 액체 담체, 예를 들어, 물, 석유, 동물 또는 식물 오일, 광유 또는 합성유를 포함한다. 생리학적 식염수, 마그네슘 클로라이드, 덱스트로스 또는 다른 당류 용액, 또는 글리콜, 예를 들어, 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜이 포함될 수 있다. 일부 경우에, 계면활성제, 예를 들어, 플루론산(PF68) 0.001%가 이용될 수 있다.

질병 부위의 주사를 위해, 활성 성분은 발열원이 없고, 적합한 pH, 등장성 및 안정성을 갖는 수용액의 형태일 수 있다. 당업자는, 예를 들어, 등장성 비히클, 예를 들어, 소듐 클로라이드 주사액, 링커 주사액 또는 락테이트화 링거 주사액을 이용하여 적합한 용액을 잘 제조할 수 있다. 보존제, 안정화제, 완충제, 항산화제 및/또는 다른 첨가물이 필요에 따라 포함될 수 있다.

지연 방출을 위해, 약물은 느린 방출을 위해 제형화되는 약학적 조성물, 예를 들어, 당 분야에 공지된 방법에 따른 생체적합성 중합체로부터 형성된 미세캡슐 또는 리포솜 담체 시스템 내에 포함될 수 있다.

치료 방법

본 발명의 상황에서 예방에 대한 언급은 예방적 치료와 더욱 일반적으로 관련되나, 치료에 대한 본원의 모든 언급은 치료적, 완화적 및 예방적 치료를 포함함이 인지되어야 한다. 치료는 또한 질병의 중증도에서 진행을 억제하는 것을 포함할 수 있다.

포유동물, 특히 인간의 치료가 바람직하다. 그러나, 인간 및 수의 치료 둘 모두가 본 발명의 범위 내이다.

변이체, 유도체, 유사체, 동족체 및 단편

본원에 언급된 특정 단백질 및 뉴클레오티드에 더하여, 본 발명은 또한 변이체, 유도체, 유사체, 동족체 및 이들의 단편의 사용을 포함한다.

본 발명의 상황에서, 임의의 제공된 서열의 변이체는 잔기의 특정 서열(아미노산이거나 핵산 잔기이건 간에)이 당해 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드가 이의 기능을 실질적으로 유지하도록 하는 방식으로 변형된 서열이다. 변이체 서열은 천연 발생 단백질에 존재하는 적어도 하나의 잔기의 첨가, 결실, 치환, 변형, 대체 및/또는 변화에 의해 획득될 수 있다.

본 발명의 단백질 또는 폴리펩티드와 관련하여 본원에서 사용되는 용어 "유도체"는 결과로서 발생된 단백질 또는 폴리펩티드가 이의 내인적 기능 중 적어도 하나를 실질적으로 유지하도록 하는 조건으로 서열로부터 또는 서열로의 하나(또는 그 초과)의 아미노산 잔기의 임의의 치환, 변화, 변형, 대체, 결실 및/또는 첨가를 포함한다.

폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드와 관련하여 본원에서 사용되는 용어 "유사체"는 임의의 모방체, 즉, 모방하는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드의 내인적 기능 중 적어도 하나를 갖는 화학적 화합물을 포함한다.

통상적으로, 아미노산 치환은, 예를 들어, 1, 2 또는 3 내지 10 또는 20개의 치환으로 이루어질 수 있으나, 단, 변형된 서열은 필요한 활성 또는 능력을 실질적으로 유지해야 한다. 아미노산 치환은 비-천연 발생 유사체의 사용을 포함할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 단백질은 또한 침묵 변화를 생성시키고, 기능적으로 동등한 단백질을 발생시키는 아미노산 잔기의 결실, 삽입 또는 치환을 가질 수 있다. 계획적 아미노산 치환은 내인적 기능이 유지되는 한 잔기의 극성, 전하, 용해도, 소수성, 친수성 및/또는 양친매성 특성에서의 유사성을 기초로 하여 이루어질 수 있다. 예를 들어, 음성으로 하전된 아미노산은 아스파르트산 및 글루탐산을 포함하고; 양성으로 하전된 아미노산은 리신 및 아르기닌을 포함하고; 유사한 친수성 값을 갖는 하전되지 않은 극성 헤드 기를 갖는 아미노산은 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌 및 티로신을 포함한다.

보존성 치환은, 예를 들어, 하기 표에 따라 이루어질 수 있다. 두번째 컬럼 내의 동일 블록, 바람직하게는 세번째 컬럼 내의 동일 라인의 아미노산이 서로 치환될 수 있다:

본원에서 사용되는 용어 "동족체"는 야생형 아미노산 서열 및 야생형 뉴클레오티드 서열과 특정 상동성을 갖는 존재물을 의미한다. 용어 "상동성"은 "동일성"과 같을 수 있다.

상동성 서열은 대상 서열과 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8% 또는 99.9% 동일할 수 있고, 바람직하게는 적어도 95% 또는 97% 또는 99% 동일할 수 있는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 통상적으로, 동족체는 대상 아미노산 서열과 동일한 활성 부위 등을 포함할 것이다. 상동성은 또한 유사성(즉, 유사한 화학적 특성/기능을 갖는 아미노산 잔기)과 관련하여 고려될 수 있으나, 본 발명의 상황에서, 서열 동일성과 관련하여 상동성을 표현하는 것이 바람직하다.

상동성 서열은 대상 서열과 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85% 또는 90% 동일할 수 있고, 바람직하게는 적어도 95% 또는 97% 또는 99% 동일할 수 있는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 상동성은 또한 유사성과 관련하여 고려될 수 있으나, 본 발명의 상황에서, 서열 동일성과 관련하여 상동성을 표현하는 것이 바람직하다.

바람직하게는, 본원에 상술된 SEQ ID NO 중 어느 하나에 대한 동일성 퍼센트를 갖는 서열에 대한 언급은 언급된 SEQ ID NO의 전장에 걸친 언급된 동일성 퍼센트를 갖는 서열을 나타낸다.

상동성 비교는 육안, 더욱 일반적으로는 용이하게 이용 가능한 서열 비교 프로그램의 도움으로 육안에 의해 수행될 수 있다. 이들 상업적으로 이용 가능한 컴퓨터 프로그램은 2개 이상의 서열 사이의 상동성 또는 동일성 백분율을 계산할 수 있다.

상동성 백분율은 연속 서열에 걸쳐 계산될 수 있으며, 즉, 하나의 서열이 다른 서열과 정렬되고, 한 서열 내의 각각의 아미노산이 한번에 하나의 잔기로 다른 서열 내의 해당 아미노산과 직접 비교된다. 이는 "갭이 없는" 정렬로 언급된다. 통상적으로, 이러한 갭이 없는 정렬은 비교적 짧은 수의 잔기에 걸쳐서만 수행된다.

이는 매우 간단하고 일치하는 방법이나, 이는, 예를 들어, 서열의 달리 동일한 쌍에서, 뉴클레오티드 서열 내의 하나의 삽입 또는 결실이 다음의 코돈이 정렬에서 빠지게 되어 이에 따라 잠재적으로는 전체적인 정렬이 수행되는 경우 상동성 퍼센트에서의 큰 감소를 발생시킬 수 있다는 것을 고려할 수 없다. 결과로서, 대부분의 서열 비교 방법은 전체 상동성 스코어를 부당하게 불리화시키지 않고 가능한 삽입 및 결실을 고려한 최적 정렬을 발생시키도록 설계된다. 이는 국소 상동성을 최대화시키기 위해 서열 정렬 내에 "갭"을 삽입함으로써 달성된다.

그러나, 이들 더욱 복잡한 방법은 정렬에서 발생하는 각각에 갭에 대한 "갭 패널티"를 부여하여, 동일한 아미노산의 동일 수에 대해, 2개의 비교된 서열 사이의 더 높은 관련성을 반영하는 가능한 한 적은 갭을 갖는 서열 정렬이 많은 갭을 갖는 것보다 높은 스코어를 달성할 것이다. 갭의 존재에 대해 비교적 높은 코스트 및 갭 내의 각각의 이후의 잔기에 대해 더 작은 페널티를 부과하는 "어파인 갭 코스트(Affine gap cost)"가 통상적으로 이용된다. 이는 가장 일반적으로 사용되는 갭 스코어링 시스템이다. 높은 갭 페널티는 물론 더 적은 갭을 갖는 최적화된 정렬을 발생시킬 것이다. 대부분의 정렬 프로그램은 갭 페널티가 변형되는 것을 허용한다. 그러나, 서열 비교를 위해 상기 소프트웨어를 이용하는 경우 디폴트 값을 이용하는 것이 바람직하다. 예를 들어, GCG Wisconsin Bestfit 패키지를 이용하는 경우, 아미노산 서열에 대한 디폴트 갭 페널티는 갭에 대해 -12 및 각각의 신장에 대해 -4이다.

따라서, 최대 상동성 백분율의 계산은 먼저 갭 페널티를 고려한 최적 정렬의 발생을 필요로 한다. 상기 정렬을 수행하기 위한 접합한 컴퓨터 프로그램은 GCG Wisconsin Bestfit 패키지(University of Wisconsin, U.S.A.; Devereux et al. (1984) Nucleic Acids Res. 12: 387)이다. 서열 비교를 수행할 수 있는 다른 소프트웨어의 예는 BLAST 패키지(Ausubel et al. (1999) ibid - Ch. 18 참조), FASTA(Atschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 403-410) 및 GENEWORKS 슈트 비교 툴을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. BLAST 및 FASTA 둘 모두는 오프라인 및 온라인 검색에 이용 가능하다(Ausubel et al. (1999) ibid, pages 7-58 to 7-60 참조). 그러나, 일부 적용에 대해, GCG Bestfit 프로그램을 이용하는 것이 바람직하다. BLAST 2 Sequences로 언급되는 또 다른 툴이 또한 단백질 및 뉴클레오티드 서열을 비교하는데 이용 가능하다(FEMS Microbiol. Lett. (1999) 174: 247-50; FEMS Microbiol. Lett. (1999) 177: 187-8 참조).

최종 상동성 퍼센트는 동일성과 관련하여 측정될 수 있으나, 정렬 과정 자체는 통상적으로 올-오어-낫씽(all-or-nothing) 쌍 비교를 기초로 하지 않는다. 대신, 화학적 유사성 또는 진화적 거리(evolutionary distance)를 기초로 하여 스코어를 각각의 쌍을 이룬 비교에 할당하는 스케일드 유사성 스코어 매트릭스(scaled similarity score matrix)가 일반적으로 이용된다. 일반적으로 사용되는 상기 매트릭스의 예는 BLAST 슈트 프로그램에 대한 디폴트 매트릭스인 BLOSUM62 매트릭스이다. GCG Wisconsin 프로그램은 일반적으로 공적 디폴트 값 또는 공급된 경우 맞춤 기호 비교 표를 이용한다(추가 세부사항에 대해서는 사용자 메뉴얼 참조). 일부 적용을 위해, GCG 패키지에 대한 공적 디폴트 값, 또는 다른 소프트웨어의 경우에서, 디폴트 매트릭스, 예를 들어, BLOSUM62를 이용하는 것이 바람직하다.

소프트웨어가 최적 정렬를 생성한 후, 상동성 퍼센트, 바람직하게는 서열 동일성 퍼센트를 계산하는 것이 가능하다. 소프트웨어는 통상적으로 서열 비교의 일부로서 이를 수행하며, 다수의 결과를 발생시킨다.

전장 RPGR^ORF15의 "단편"은 또한 변이체이며, 상기 용어는 통상적으로 기능적 또는, 예를 들어, 검정에서 중요한 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드의 선택된 영역을 나타낸다. 따라서, "단편"은 전장 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드의 일부인 아미노산 또는 핵산 서열을 나타낸다.

상기 변이체는 표준 재조합 DNA 기술, 예를 들어, 부위-특이적 돌연변이유발을 이용하여 제조될 수 있다. 삽입이 이루어져야 하는 경우, 삽입 부위의 어느 한 측면에서 천연-발생 서열에 해당하는 5' 및 3' 측접 영역과 함께 삽입물을 인코딩하는 합성 DNA가 제조될 수 있다. 측접 영역은 천연 발생 서열 내의 부위에 해당하는 편리한 제한 부위를 함유할 것이며, 이에 서열은 적절한 효소(들)로 절단될 수 있고, 합성 DNA가 상기 절단부로 라이게이션될 수 있다. 이후, DNA는 본 발명에 따라 발현되어 인코딩된 단백질을 제조한다. 이들 방법은 단지 DNA 서열의 조작을 위한 당 분야에 공지된 다수의 표준 기술의 예시이며, 다른 공지된 기술이 또한 이용될 수 있다.

상기 명세서에 언급된 모든 간행물은 참조로서 본원에 포함된다. 본 발명의 기재된 생성물, 시스템, 용도, 공정 및 방법의 다양한 변형 및 변화는 본 발명의 범위 및 사상으로부터 벗어남이 없이 당업자에게 명백할 것이다. 본 발명은 특정한 바람직한 구현예와 관련하여 기재되었으나, 청구된 바와 같은 본 발명은 상기 특정 구현예로 부당하게 제한되지 않아야 함이 이해되어야 한다. 또한, 생화학 및 생물공학 또는 관련 분야의 당업자에게 명백한 본 발명을 수행하기 위한 기재된 방식의 다양한 변형은 하기 청구항의 범위 내인 것으로 의도된다.

실시예

실시예 1

실시예 1A - X-연관 색소성망막염에 대한 마우스 모델 시스템

특정 종, 예를 들어, 마우스 및 개는 인간 RPGR과 상동성인 유전자를 갖는다(도 1에 제시된 황색 엑손 서열 비교). 따라서, 상기 종은 인간 RPGR에서의 돌연변이에 의해 야기된 X-연관 색소성망막염에 대한 잠재적인 모델로서 기능할 수 있다.

본 연구에서 치료 벡터의 안전성 및 효능을 시험하기 위해 2개의 마우스 모델을 획득하였다. 둘 모두는 상동성 유전자 Rpgr에서 변경을 갖는다:

1. Rpgr ^-/- 계통: 이 계통은 β-갈락토시다제 및 네오마이신 내성 마커를 인코딩하는 유전자를 함유하는 서열에 의한 엑손 4의 일부로부터 엑손 6의 일부까지의 표적화된 붕괴에 의해 조작되었다(Hong D.H. et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 3649-3654).

2. Rd9 계통: 이 계통은 해독틀(frameshift)을 초래하는 32 bp의 천연 발생 삽입 돌연변이를 특징으로 한다(Thompson D.A. et al. (2012) PLoS One 7: e35865).

Rpgr ^-/- 및 Rd9 마우스 모델 둘 모두는 Rpgr 단백질 발현이 결핍되어 있으나, 단지 매우 가벼운 표현형을 나타낸다(Thompson D.A. et al. (2012) PLoS One 7: e35865).

실시예 1B - RPGR의 코돈 최적화

RPGR 코돈 최적화

합성 RPGR^ORF15 서열을 코돈 최적화(coRPGR, "최적화"; SEQ ID NO:3)를 이용하여 제조하여 고도로 돌연변이 유발성인 퓨린-풍부 영역을 안정화시켰다(도 2).

코돈 최적화된 RPGR 유전자의 특성규명

표준 클로닝 벡터에서 야생형 및 코돈 최적화된 서열 사이에서 클로닝 효율 및 서열 정확도를 비교하였다(도 3A-D).

제한 절단 분석을 이용하여, 24개의 클론 중 단지 3개가 야생형 서열을 성공적으로 특징으로 하는 것으로 밝혀졌다(wtRPGR; 도 3B, 성공적인 클론은 별표로 강조됨). 대조적으로, 24개의 클론 중 18개는 정확한 코돈 최적화 서열을 성공적으로 특징으로 하였다(coRPGR; 도 3D).

소량제조물로부터의 플라스미드 수율은 유사한 수준의 샘플 순도가 유지되더라도(도 3F), wtRPGR보다 coRPGR 서열을 이용하여 더 높은 것으로 밝혀졌다(도 3E). 상기 결과를 뒷받침하여, 대량제조물로부터의 전체 플라스미드 수율(도 3G)이 또한 coRPGR 서열을 이용하는 경우에 더 높았다.

클로닝 동안의 RPGR 돌연변이 빈도의 분석

생성된 클론의 생거-서열분석은 coRPGR 서열을 이용하는 경우 불명료한 염기 콜(call)이 가능성이 덜한 것으로 밝혀짐에 따라 더 용이하고 더 나은 전체적인 신호 대 노이즈 비와 관련되는 것으로 밝혀졌다(도 4).

wtRPGR의 다수의 G-런(G-run) 및 퓨린-풍부 특성으로 인해, 약 4 kb의 DNA 서열을 커버하기 위해 34개의 개별적 서열분석 반응이 수행되어야 했다. ORF15 영역에서, 6개의 잠재적 돌연변이(2개의 결실 및 4개의 삽입) 뿐만 아니라 추가의 점 돌 연변이의 잠재성을 갖는 74개의 불명료한 염기 콜이 발견되었다.

대조적으로, coRPGR은 서열분석하기 더 용이하였고, 이의 서열의 명확한 확인(적어도 2×)이 단지 17회의 반응으로 달성되었다.

서열 정확도의 정량적 분석

wtRPGR^ORF15 및 coRPGR^ORF15의 4개의 독립적으로 생성된 플라스미드 대량제조물 각각을 DNA 서열을 확인하기 위한 최적 표준인 생거 서열분석을 이용하는 상업적 계약자로서 ISO 9001 인증 GLP 공인 실험실(Source BioScience, UK)에서 서열분석하였다(Sanger F et al. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463-5467).

서열분석 데이터와 공개된 참조 데이터(NCBI Gene ID: 6103)의 정렬은 wtRPGR^ORF15 서열분석 데이터에서 평균 20개의 돌연변이(대부분 단일 뉴클레오티드 결실, 삽입 및 점 돌연변이)를 나타내었으나, coRPGR^ORF15에서는 나타내지 않았다.

이러한 분석은 코돈 최적화된 RPGR 서열에서의 훨씬 더 큰 서열 안정성을 명백히 입증한다.

coRPGR 트랜스진 생성물 단백질의 분석

탠덤 질량 분광법을 이용한 액체 크로마토그래피(LC/MS-MS)를 수행하여 coRPGR 트랜스진 생성물의 단백질 서열을 확인하였다(도 5).

RPGR 아미노산의 약 80%가 직접 확인되었다. 단백질의 C-말단을 향한 매우 글루탐산 풍부하고 반복적인 영역의 일부만이 펩티드 분석을 벗어났다(도 5, 적색의 서열). 이는 분광법을 위한 올리고머를 생성하는 특정 모티프의 결핍으로 인한 것이었다. 그러나, C-말단 서열의 완벽한 일치는 어떠한 해독틀이 없는 전장 단백질이 생성된 것을 암시한다.

또한, 웨스턴 분석은 형질감염된 세포로부터의 wtRPGR 및 coRPGR-유래 펩티드의 동일한 분자 질량을 나타내었다(도 6). 이는 코돈 최적화 접근법에 의해 도입된 차이(예를 들어, 삽입 또는 결실)가 없다는 결론을 뒷받침한다.

웨스턴 분석은 또한 코돈 최적화가 더 높은 비율의 번역 및 단백질 생성을 가능하게 함을 명백히 나타낸다(도 6).

결론

전반적으로, 코돈-최적화된 RPGR^ORF15(coRPGR) 서열은 야생형 서열에 비해 우수한 서열 정확도 및 증가된 발현 수준을 나타내었고, 따라서 XLRP 유전자 대체 요법의 치료 잠재성을 개선시킬 수 있는 것으로 간주되었다.

실시예 1C - 코돈 최적화된 RPGR의 AAV-매개 생체내 전달

coRPGR 서열을 AAV2/8 벡터에 패키징시켰고, 이를 RPGR 발현이 결핍된 마우스(Rd9 및 Rpgr ^-/- 마우스 계통)의 광수용체 세포로 RPGR을 도입시키는데 사용하였다. 더욱 상세하게, 트랜스진 카세트는 coRPGR 폴리뉴클레오티드 서열의 업스트림에 로돕신 키나제 프로모터 및 코작 컨센서스 서열, 및 코딩 서열의 다운스트림에 소 성장 호르몬으로부터의 폴리A 서열을 특징으로 하였다.

Rd9 및 Rpgr ^-/- 마우스에서의 RPGR 단백질 발현을 발생시키는 coRPGR

웨스턴 블롯 분석은 AAV.coRPGR 벡터를 이용한 Rd9 및 Rpgr ^-/- 마우스의 처리가 RPGR 단백질 발현을 발생시킨 것을 나타내었다(도 7A). 또한, Rd9 및 Rpgr ^-/- 마우스의 처리 및 미처리 눈에 대해 RPGR에 대한 면역조직화학 염색을 수행하였고, 단백질 생성물의 정확한 국소화를 나타내었다(도 7B).

Rd9 및 Rpgr ^-/- 마우스에서 치료 효과를 발생시키는 coRPGR을 이용한 유전자 증가

Rd9 및 Rpgr ^-/- 마우스 모델 둘 모두를 단지 하나의 눈에서 유전자 요법에 적용시켰고, 망막전위도검사(ERG)를 이용하여 미처리 눈에 비한 처리 눈에서의 기능을 객관적으로 평가하였다.

암적응 후 단일 플래쉬 강도 시리즈의 a-파 및 b-파 진폭의 연구(도 7C, D)는 처리 후의 2개의 시점에서 미처리 그룹에 비해 처리 그룹에서 통계적으로 유의한 진폭(p<0.05)을 나타낸다.

결론적으로, 실시예 4 및 5에 더 상세히 기재되는 상기 데이터는 인간 RPGR의 코돈 최적화된 서열이 예측 크기 및 아미노산 서열을 갖는 야생형 RPGR 단백질을 생성하는 것을 나타낸다. 또한, 코돈 최적화는 더 높은 서열 정확도 및 발현 수준을 발생시킨다. Rpgr 단백질 발현이 본래 결핍된 모델에서 대체 유전자 요법에 의해 적용되는 경우, coRPGR 서열은 RPGR의 발현을 제공한다. 또한, RPGR은 연결 섬모 내의 생리학적 작용 부위에 국소화되어, ERG 연구에 의해 제시되는 바와 같이 망막 구조(내분절 및 외분절 길이) 및 기능을 개선할 수 있다.

실시예 2 - 산업적 규모의 pAAV.RK.coRPGR 플라스미드 제조

실시예 2a

코돈 최적화된 RPGR 서열을 인코딩하는 플라스미드를 위한 박테리아 세포 은행의 생성

유전형 Tet^rD(mcrA)183 D(mcrCB - hsdSMR - mrr)173 endA1 supE44 thi -1 recA1 gyrA96 relA1 lac Hte [F' proAB lacI ^q ZDM15 Tn10 (Tet^r) Amy Cam^r]을 갖는 K-12 에스케리키아 콜리 박테리아 균주 XL10Gold를 플라스미드 pAAV.RK.coRPGR로 형질전환시키고, 앰피실린이 보충된 아가 플레이트 상에 플레이팅하여 코돈 최적화된 RPGR 서열을 갖는 플라스미드 DNA를 함유하는 단일 콜로니를 선택하였다. 단일 콜로니를 선택하고, 배양 배지에 접종하고, 소규모 액체 배양으로 확대시켰다. 세포가 중간 대수 성장 단계가 되면, 이들을 수거하고, 글리세롤을 함유하는 냉동보관 배지에 재현탁시킨 후, 약 50개의 1.5mL 분취액을 1.8mL 냉동바이알(cryovial)에 분배시키고, -80℃에서 동결시켜, 박테리아 세포 은행 RCB pAAV.RK.coRPGR E.coli XL10Gold를 생성시켰다.

세포 은행을 해동시키고, 미니프렙 추출(Birnboim H.C. and Doly J. 1979; A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA in 1979 Nov 24;7(6):1513-23)에 의해 플라스미드 DNA를 제조하고, Xmn1 및 Sma1 엔도뉴클레아제 제한 절단 및 0.8% 아가로스 젤 전기영동 및 0.5mg/mL 에티디움 브로마이드 염색에 의한 이후의 분석에 의해 플라스미드 정체 및 구조적 안정성에 대해 시험하였다(도 8). 도 8은 안정적이고 구조적으로 온전한 pAAV.RK.coRPGR 플라스미드로부터 예상된 제한 절단 단편 패턴을 명백히 나타내며, 이는 세포 은행 배양 확대 및 생성 동안 플라스미드 DNA의 안정적인 유지 및 재생을 입증한다.

세포 은행을 또한 진탕 플라스크에서의 브로쓰 배양 후 플라스미드 수율에 대해 평가하였고, 습윤 세포 덩어리 그램 당 598 μg의 플라스미드 DNA를 생성하였다. 올바른 플라스미드의 높은 플라스미드 수율이 획득되었다.

항생제 함유 및 항생제 비함유 아가 플레이트 상으로의 콜로니의 복제 플레이팅에 의해 분리 안정성을 시험하는 경우 플라스미드 손실의 증거가 또한 없었다. 결과는 100% 플라스미드 보유를 나타내었다.

세포 은행으로부터의 플라스미드 DNA를 생거(Sanger F et al. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463-5467) 서열분석을 이용하여 서열분석하였고, 생성된 서열 분석은 코돈 최적화된 RPGR 서열의 이론적 참조 서열과 비교하는 경우 코돈 최적화된 RPGR 서열이 100% 정확도로 보존된 것을 나타내었다. 다시, 불안정성의 증거가 없었다.

RCB pAAV.RK.coRPGR E.coli XL10Gold를 또한 박테리아 순도(박테리아 오염의 부재가 입증되었음) 및 용균 및 용원성 박테리오파지의 부재(검출되지 않음)에 대해 시험하였다. RCB pAAV.RK.coRPGR E.coli XL10Gold의 종 정체를 또한 API-20E 시험(BioMerieux)을 이용한 생화학적 확인에 의해 확인하였다.

결론

RPGR 유전자의 코돈 최적화는 RPGR 유전자의 안정성을 개선시켜, 참조 코돈 최적화된 서열과의 100% 서열 정확도, 100% 플라스미드 분리 안정성 및 우수한 플라스미드 수율을 나타내는 산업적으로 유용한 박테리아 세포 은행을 발생시키는 능력을 발생시킨다.

실시예 2b

산업적 규모의 코돈 최적화된 RPGR 서열을 인코딩하는 고품질 플라스미드의 생성

간략히 기재된 바와 같이 실시예 2a에서 생성된 E. 콜리 XL10Gold 박테리아 세포 은행 RCB pAAV.RK.coRPGR로부터 고품질 플라스미드 DNA를 제조하고 정제하였다(Schmeer et al. (2014) Pharmaceutical Grade Large-Scale Plasmid DNA Manufacturing Process: 219-242). 박테리아 세포 은행의 단일 바이알을 해동하고, 확대하고, 산업 규모로 배양한 후, 박테리아 세포 덩어리를 원심분리에 의해 수거하였다. 플라스미드 DNA를 알칼리성 박테리아 세포 용해에 의해 박테리아 생물집단으로부터 추출하고, 생성된 가용성 플라스미드 DNA를 원심분리 및 여과에 의해 불용성 단백질 및 복합 유전체 DNA로부터 분리하였다. 플라스미드 DNA를 다단계 크로마토그래피 공정에 의해 추가로 정제하였다. 완전히 정제된 플라스미드 DNA를 침전 및 접선 유동 여과 및 막 여과에 의해 제형 완충액에서 최종적으로 제형화하여 10mM Tris + 1mM EDTA(pH8.0) 중 1.0mg/mL의 고도로 정제된 플라스미드 DNA 100mg을 생성시켰으며(도 10), 이는 rAAV 벡터의 생성을 위한 추가 제조 과정에서 사용하기에 충분한 순도였다(도 11).

정제된 플라스미드를 Xmn1 엔도뉴클레아제 제한 절단 및 0.8% 아가로스 젤 전기영동 및 0.5mg/mL 에티디움 브로마이드 염색에 의한 이후의 분석에 의해 플라스미드 정체 및 구조적 안정성에 대해 시험하였다(도 10). 도 11은 안정적이고 구조적으로 온전한 pAAV.RK.coRPGR 플라스미드로부터 예상된 제한 절단 단편 패턴을 명백히 나타내며, 이는 세포 배양 확대 및 플라스미드 정제 동안 플라스미드 DNA의 안정적인 유지 및 재생을 입증한다.

정제된 플라스미드를 생거 서열분석(Sanger F et al. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463-5467)을 이용하여 서열분석하였고, 생성된 서열 분석은 코돈 최적화된 RPGR 서열의 이론적 참조 서열과 비교하는 경우 코돈 최적화된 RPGR 서열이 100% 정확도로 보존된 것을 나타내었다.

결론

RPGR 유전자의 코돈 최적화는 RPGR 유전자의 안정성을 개선시켜, rAAV 벡터의 생성을 위한 추가 제조 공정을 위한 충분한 양(100mg) 및 품질의 고순도 플라스미드 DNA를 생성시키는 능력을 발생시킨다.

실시예 2c

산업 규모의 코돈 최적화된 RPGR 서열을 인코딩하는 rAAV2/8의 생성

실시예 2b에서 제조된 고품질 플라스미드 DNA를 헬퍼 플라스미드 pDP8.ape(PlasmidFactory, Bielefeld, Germany and Grimm D, Kay MA, Kleinschmidt JA. Helper virus-free, optically controllable, and two-plasmid-based production of adeno-associated virus vectors of serotypes 1 to 6. Mol Ther 2003;7:839-850)와 함께 사용하여 대규모 일시적 형질감염 및 후속 정제에 의한 생체내 사용을 위한 rAAV8/2 벡터를 제조하였다(Lock et al. 2010; Human Gene Therapy: 1259-1271). 간단히, HEK293 세포를 충분한 다층 세포 배양 용기를 시딩하기에 충분한 세포가 이용 가능할때까지 37℃ 및 5% CO₂에서 10% 우태아 혈청(FBS)이 보충된 둘베코 변형 이글 배지(DMEM)에서 부착성 배양으로 성장시켰다. 정제되지 않은 AAV를 pAAV.RK.coRPGR 플라스미드 및 pDP8.ape 헬퍼 플라스미드를 이용하여 다층 세포 배양 용기 내에서 부착성으로 성장하는 HEK293 세포의 칼슘 포스페이트 일시적 형질감염에 의해 생성하여, 성장 배지로 분비되는 rAAV 입자를 생성시켰다. rAAV 입자를 세포 배양 용기로부터의 배지의 제거에 의해 수거하고, 여과시켜, 세포 부스러기를 제거하였다. rAAV를 먼저 접선 유동 여과(TFF) 및 초여과에 의해 농축시키고, 동일한 TFF 장비를 이용한 정용여과에 의해 부분적으로 정제하였다. rAAV를 요오딕사놀(iodixanol) 불연속 구배 초원심분리 및 컬럼 이온 교환 크로마토그래피를 이용하여 추가로 정제하였다. 이후, 정제된 rAAV를 추가 TFF 기반 초여과 및 정용여과에 의해 3.55 x10¹² gp/ml의 농도로 최종 제형 완충액으로 제형화하였다. 1.00 x10¹² gp/ml의 제2의 저농도 rAAV 제형을 더 높은 투여량 형태의 제형 완충액으로의 희석에 의해 제조하였다. 둘 모두의 투여 형태를 50μL 분취액으로 나누고, 60℃ 이하에서 보관하였다.

결론

RPGR 유전자의 코돈 최적화는 RPGR 유전자의 안정성을 개선시켜, 생체내 투여 연구에서 사용하기에 충분한 양 및 품질의 정제된 rAAV 벡터를 생성시키는 능력을 발생시킨다.

실시예 2d

연구의 목적은 바람직한 임상 투여 경로(ROA)인 망막하 투여를 통해 투여되는 AAV8-RPGR 유전자 요법 벡터의 생체내 전달을 확립하는 것이었다. 연구를 C57B/6J 마우스에서 GLP-순응의 망막하 주사 단일 용량 연구로 AAV8-RPGR로 수행한 후, 4주 및 26주 기간 분석하였다.

C57B/6J 착색 마우스 계통을 다음과 같은 이유로 이들 생체내 전달 연구를 위한 관련 종으로 선택하였다. 첫째로, 이러한 계통은 임상 환경에서 적용되는 투여 절차를 매우 유사하게 모방하게 하는 착색된 눈을 갖는다. 둘째로, 이러한 계통의 트랜스제닉 변이체인 RPGR 넉아웃 마우스 모델은 인간에서 예상되는 것과 유사한 연구 AAV8-RPGR 생성물에 대한 생물학적 반응을 나타내었다. 셋째로, 인간 및 마우스 RPGR 단백질은 높은 아미노산 서열 상동성을 공유하며, 마우스 망막 조직의 성공적인 AAV8-RPGR 표적화 및 형질도입이 생체내 약리학적 연구에서 이전에 입증되었다.

동물에 둘 모두의 눈에 비히클(BSS Plus, Alcon Pharma) 또는 AAV8-RPGR(2개의 상이한 gp/눈 투여량)의 단일한 망막하 1μL 주사를 투여하였다. 체중, 독성의 임상 징후, 예를 들어, 음식 소비, 임상 병리학 및 조직병리학의 평가를 포함하는 임의의 독성 효과의 광범위한 평가뿐만 아니라 안구, 외부 안구 구조물, 안구앞부분, 주로 각막 및 수정체의 안구앞부분 및 안저를 포함하는 내부 구조의 정기적인 안과 검사를 수행하였다. 또한, 정기적인 안압측정 평가 및 망막전위도검사 평가를 수행하였다. 망막전위도검사(ERG)는 다양한 빛 강도, 파장 길이, 및 노출 기간에서의 빛 자극 후에 망막에서 발생하는 전위를 기록한다. 망막전위도는 색소 상피에서 내부 핵층까지 연장되는 수백만개의 망막 세포의 복합 활성을 나타낸다. 이는 망막 기능의 평가 및 망막 변성의 초기 단계의 검출로 사용되었다.

AAV8-RPGR 유전자 요법은 마우스에서 잘 용인되었으며, 치료에 대한 심각한 부작용이 관찰되지 않았다. 모든 관찰은 일시적이었고, 비히클 처리 그룹에서 또한 보고된 투여 및 마취 절차와 일치하였다.

전달된 AAV8-RPGR 벡터의 분포를 이해하기 위해, 처리된 동물 그룹을 하위 그룹으로 나누고, 주사 8, 29 및 183일 후에 희생시켰다. AAV8-RPGR 특이적 정량적 PCR 검정(qPCR)에 의한 벡터 수준의 결정을 위해 하위 그룹 각각에서 2, 15 및 92일에 추가의 비-말단 혈액 샘플을 수거하였다. 동물에 둘 모두의 눈에 비히클(BSS Plus, Alcon Pharma) 또는 AAV8-RPGR의 단일한 망막하 1μL 주사를 투여하였다.

8, 29 및 183일의 부검시에 동물로부터 채취된 여러 조직/체액(혈액, 골수, 누액, 뇌, 눈, 심장, 수성 및 유리체 체액, 신장, 간, 폐, 림프절, 시신경, 망막, 타액, 고환, 비장, 소변)으로부터의 qPCR 샘플은 벡터 DNA 정량을 위해 검정될 것이다. 이들 조직/유체에서의 벡터 DNA 정량은 연구 종료시에 qPCR 방법을 통해 수행될 것이다. 이들 결과는 유전자 요법의 성공적인 전달을 확인하고, 마우스 조직을 통한 이의 분포를 맵핑할 것이다.

실시예 3 - coRPGR ^ORF15 트랜스진 생성물 단백질의 시험관내 분석

본 실시예에서, RPGR 발현 수준의 증가 및 스플라이싱 대안적 형태 합성의 개선에 대한 코돈 최적화의 효과를 분석하였다. 이를 위해, 인간 배아 신장 293 세포(HEK293) 및 원숭이 바이러스 40(SV40) T 항원을 발현하는 HEK293(HEK293T) 세포를 사용하였다. 이들 세포를 CAG.coRPGR^ORF15 및 CAG.wtRPGR^ORF15 플라스미드 작제물로 형질감염시키고, 하기 기재되는 바와 같이 트랜스진 검출을 위해 처리하였다.

재료 및 방법

HEK293 및 HEK293T 세포를 6-웰 플레이트에 각각 4 및 2.5 x 10⁵ 세포/ml로 시딩하고, 이들이 70% 컨플루언스를 초과할 때까지 37℃ 및 5% CO₂에서 10% 열 비활성화 우 태아 혈청(FBS) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 DMEM에서 배양하였다. 1 마이크로그램의 플라스미드 DNA(CAG.coRPGR^ORF15 및 CAG.wtRPGR^ORF15)를 Mirus TransIT®-LT1 형질감염 시약(Geneflow Ltd., Lichfield, UK) 및 혈청/항생제 비함유 배지를 이용하여 세포로 전달하였다. 형질감염된 세포를 48시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다.

트랜스진 발현의 분석을 단백질 수준에서 수행하였다. 형질감염 48시간 후, 세포를 인산염-완충 염수(PBS)에서 세척한 후, cOmplete mini EDTA-비함유 프로테아제 억제제 칵테일 정제(Roche Products Ltd., Welwyn Garden City, UK)를 갖는 Radio-Immunoprecipitation Assay(RIPA) 완충액(Sigma-Aldrich Company Ltd., Dorset, UK)을 이용한 세포 용해 및 단백질 용해화를 진행시켰다. 세포 펠렛을 초음파 주파수를 이용한 음파처리로 파쇄시키고, 세포 단편을 10분 동안 13,000 g 및 4℃에서의 원심분리에 의해 제거하였다. 전체 단백질 함량을 제조업체의 설명서에 따라 Pierce™ 비신코닌산(BCA) Protein Assay Kit(Thermo Scientific)를 이용하여 상층액에서 정량하였다.

단백질 발현을 웨스턴 블롯 분석에 의해 평가하였다. 전체 단백질 30 μg을 95℃에서 5분 동안 2 x Laemmli 완충액(Sigma-Aldrich)에서 변성시키고, 2시간 동안 100 V에서 전기영동을 위한 7.5% 소듐 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 젤(Criterion™ TGX™ Precast Gels, Bio-Rad Laboratories Ltd., Hemel Hempstead, UK)에서 분리시켰다. SDS-PAGE에서 분리된 단백질 샘플을 Trans-Blot Turbo™ Transfer Starter System(Bio-Rad)을 이용하여 폴리비닐리덴 디플루오라이드(PVDF) 막(Trans-Blot Turbo™ Midi PVDF, Bio-Rad)으로 옮겼다. 막을 45분 동안 0.1% Tween 20을 함유하는 PBS 중 3% 소 혈청 알부민(BSA)으로 블로킹시키고, 1시간 동안 실온에서 일차 항체와 인큐베이션하였다. 표적 단백질로서 RPGR 및 로딩 대조군으로서 β-액틴을 다음과 같은 일차 항체로 확인하였다: 토끼 폴리클로날 RPGR(1:500, Sigma-Aldrich) 및 마우스 모노클로날 β-액틴(1:30000, Ambion Inc., Thermo Scientific, Nortumberland, UK). 밴드를 ECL 검출 시약의 사용과 함께 호스라디쉬 퍼옥시다제 컨쥬게이션된 이차 항체로 검출하였다. RPGR 단백질 수준을 Image Studio Lite(버전 5.2)를 이용한 농도측정에 의해 정량하고, β-액틴으로 표준화하였다.

결과

전체 단백질 용해질에 대한 웨스턴 블롯 분석은 CAG.coRPGR^ORF15 및 CAG.wtRPGR^ORF15 플라스미드로 형질감염된 HEK293 및 HEK293T 세포에서 RPGR^ORF15 단백질(도 12A 및 13A)에 해당하는 약 220 kDa의 우세한 밴드를 나타내었다. β-액틴의 강도에 의해 표준화된 RPGR^ORF15 밴드 강도의 정량은 RPGR의 발현이 야생형 서열(0.36 [0.08 내지 4.88] 임의 단위(AU))로 형질감염된 세포보다 코돈 최적화된 플라스미드(2.79 [1.1 내지 17.0] AU(중앙값 [Q1 내지 Q3]))로 형질감염된 HEK293 세포에서 더 높은 것을 나타내었다. 유사하게, 코돈 최적화된 서열로 형질감염된 HEK293T 세포는 야생형 서열(3.01 ± 0.07 AU(평균 ± 표준 편차))로 형질감염된 세포와 비교하여 증가된 RPGR 발현 수준(4.23 ± 0.11 AU(평균 ± 표준 편차))을 나타내었다(도 12B 및 13B).

둘 모두의 플라스미드 작제물을 갖는 전체 RPGR^ORF15 서열의 발현 이외에, 80 kDa 분자량의 추가의 명백한 밴드가 야생형 RPGR^ORF15 서열로 형질감염된 HEK293T 세포에서 검출되었다.이러한 결과는 코돈 최적화가 서열 안정성을 개선시킴으로써 대안적 스플라이싱 형태를 감소시키는 것을 나타내었다.

결론

이들 결과는 동의어의 주요 코돈을 도입시킴에 의한 RPGR^ORF15 코딩 서열의 코돈 적응 지수(CAI)의 증가가 서열의 안정성 및 정확도를 증가시킴에 의해 트렁케이션된 단백질의 합성을 감소시키면서 더 높은 트랜스진 발현 수준을 발생시키는 것을 확인한다.

실시예 4

RPGR 유전자 요법은 RPGR에서 질병 야기 돌연변이를 가져 RPGR의 완전한 상실(불활성화 돌연변이(null mutation)) 또는 기능장애 단백질을 발생시키는 표적 세포에서 RPGR 발현을 재구성하는 것을 목적으로 한다. 이를 달성하는 한 방법은 이후에 표적 세포 자체의 번역 기구에 의해 RPGR 단백질로 번역되는 RPGR-인코딩 뉴클레오티드 서열의 정확한 카피를 도입시킴에 의한 것이다. 상기 뉴클레오티드 서열은 재조합 AAV를 이용한 형질도입에 의해 도입될 수 있다.

본원에서, 본 발명자는 마우스에서 망막하 주사 후에 재조합 AAV 벡터 AAV2/8.RK.coRPGR 및 AAV2/8.RK.wtRPGR의 형질도입 효율을 연구하도록 설계된 파일럿 시험으로부터의 데이터를 제시한다. RPGR 유전자 요법을 임상 시나리오에 더 가깝게 모델링하기 위해, 본 발명자는 Rpgr 발현이 결핍된 Rpgr-/y 마우스를 사용하였다.

Rpgr은 X-연관 색소성망막염의 대부분의 경우에서 영향을 받는 유전자인 RPGR의 뮤린 동족체이며, 따라서 트랜스제닉 Rpgr-/y 마우스는 인간 환자에서 유전적 수준의 불활성화 돌연변이를 모방한다. 코돈 최적화된 RPGR은 야생형 RPGR보다 높은 발현 수준을 특징으로 하며, 동일한 RPGR 단백질 생성물을 발생시키면서 결정적으로 더 큰 서열 정확도를 제공한다. 재조합 AAV 벡터 AAV2/8.RK.coRPGR 및 AAV2/8.RK.wtRPGR은 시험관 내에서 광수용체와 같은 세포를 형질도입시킬 수 있다.

본 연구의 목적은 AAV2/8.RK.coRPGR 또는 AAV2/8.RK.wtRPGR의 망막하 주사 후에 RPGR이 생체내에서 발현되는지의 여부 및 RPGR이 고유한 Rpgr 발현이 결핍된 광수용체 세포에서 연결 섬모에 국소화되는지의 여부를 연구하는 것이었다.

재료 및 방법

AAV2/8.RK.coRPGR 및 AAV2/8.RK.wtRPGR을 함유하는 재조합 AAV 용액을 생성하고, 품질 및 역가에 대해 평가하였다. 외과적 개입 및 AAV2/8에 의한 광수용체 형질도입을 조절하기 위해, CAG 프로모터의 조절하에 리포터 유전자로서 GFP를 갖는 세번째 작제물을 사용하였다(AAV2/8.CAG.GFP). 이들 벡터 용액을 벡터 유전체의 수/ml을 계산하기 위해 qPCR에 의해 정량하였다. -80℃에서 보관된 분취액을 적용 직전에 얼음 상에서 해동시키고, 0.001% Pluronic® PF68(BASF, Ludwigshafen, Germany)을 갖는 유리체망막 수술을 위한 평형 염 용액(BSS®)(Alcon Laboratories, Camberley, UK)에서 2μl 부피에서 1 x 1010vg의 망막하 전달을 가능하게 하도록 희석시켰다.

이러한 파일럿 연구를 위해 Rpgr-/y 마우스를 사용하였는데, 이는 이들이 트랜스진 생성물 RPGR의 잠재적 국소화를 위한 연결 섬모를 유지하면서 Rpgr 발현이 결핍되어 있기 때문이다. 마우스를 상부 반망막 하에서 2μl AAV 용액의 망막하 주사를 위해 마취시켰다.

수술 3주 후, 처리된 Rpgr-/y 마우스를 다시 AAV2/8.RK.coRPGR, AAV2/8.RK.wtRPGR이 투여된 동물에서 자가형광 패턴, 및 AAV2/8.CAG.eGFP가 처리된 동물에서 형질도입 효율의 판독으로서 GFP 형광을 연구하기 위해 공초점 주사 레이저 검안경검사(cSLO)를 이용한 생체내 망막 영상화를 위해 다시 마취시켰다.

영상화 직후, 마우스를 희생시키고, 신속히 핵을 제거하였다. 전체 눈을 고정 없이 면역조직화학을 위해 신속히 처리하였다. 간단히, 고정되지 않은 망막 샘플의 16 μm 섹션을 Hoechst 33342 염료 및 RPGR의 아미노산 379-509에 대해 특이적인 폴리클로날 항체(Sigma, HPA001593)로 염색하였다. 표시된 RPGR 검출에 대한 이차 항체로서 컨쥬게이션된 AlexaFluor 488을 갖는 당나귀 항-토끼(Invitrogen)를 사용하였다. 처리된 Rpgr-/y 마우스의 광수용체 세포에서 RPGR 발현 및 국소화를 연구하기 위해 공초점 현미경(Zeiss LSM710)에서 고배율(오일 침지와 함께 x63) 광학 섹션을 기록하였다. 미처리 마우스를 검정의 특이성을 시험하기 위해 음성 대조군으로 제공하였다.

수술 결과

모든 동물에 망막하 공간에서 의도된 용량의 AAV 용액을 투여하였고, 마취로부터 잘 회복하였다. 이를 벡터 현탁액을 이용하여 반망막 박리를 발생시키기 전에 전방 천자에 의해 안압(IOP)을 먼저 감소시키는 외과 시술에 의해 가능하게 만들었다. 이러한 기술은 각막 부종을 발생시키고/시키거나 높은 IOP로 인해 안내 순환을 제한하지 않고 최대 2μl 부피의 전달을 가능하게 하였다. 동시에, 낮아진 IOP는 주입 관을 통한 망막하액의 역류(즉, 맥락막 순환 또는 안와로의 역류)의 위험을 감소시켰다.

수술 24시간 후의 처리된 마우스의 안저 검사는 모든 경우에서 망막이 완전히 재부착된 것을 나타내었다. 망막 영상화는 안전한 전달 및 리포터 유전자 발현을 나타낸다. 3주 후, cSLO 영상화는 적외선 영상화에서 안저의 명백한 관찰과 함께 우수한 광학 매질을 나타내었다. 자가형광 영상화는 AAV2/8.RK.coRPGR 또는 AAV2/8.RK.wtRPGR로 처리된 Rpgr-/y 마우스의 처리 및 미처리 눈에서 과형광 도트를 나타내었다. AAV2/8.CAG.GFP 벡터가 적용된 마우스는 강하고 편재성인 GFP 유래 형광을 나타내었다. 이는 강한 트랜스진 발현을 나타내었고, 다른 재조합 AAV 벡터가 트랜스진 발현을 발생시키기에 충분한 시간을 가질 가능성이 높았다.

(미)처리 Rpgr-/y 마우스에서 공초점 주사 레이저 검안경검사를 수행하였다. 내부 망막 상의 초점면을 이용한 적외선 기록을 수행하였다. 자가형광 방식의 기록을 수행하였다. 미처리 마우스 및 AAV.RK.wtRPGR 또는 AAV.RK.coRPGR로 처리된 마우스 모두는 과형광의 구두점 패턴을 나타내었다. 동일 감도 설정에서, AAV.CAG.GFP로 처리된 눈은 상 반망막 박리를 넘어서는 광범위하고 강한 GFP 형광을 나타내었고, 이는 망막하 벡터 전달의 부위를 넘어서는 세포의 성공적인 형질도입을 나타낸다.

RPGR 발현을 나타내는 면역조직화학

처리된 마우스로부터의 섹션에서 특정 신호가 관찰되었으나, 미처리 마우스로부터의 섹션에서는 관찰되지 않았다. 이러한 신호는 RPGR 에피토프에 대한 항체 결합으로부터 발생하며, 트랜스진으로서 RPGR을 갖는 AAV를 이용한 형질도입으로 인한 RPGR 발현과 일치한다. 코돈 최적화된 coRPGR을 갖는 AAV인 AAV2/8.RK.coRPGR로 처리된 눈으로부터의 섹션에서 더욱 강한 신호가 관찰되었다.

면역조직화학은 처리된 Rpgr-/y 마우스에서 RPGR을 나타내었다. Rpgr-/y 동물의 미처리 눈은 RPGR 염색의 부재를 나타내었다. AAV.RK.wtRPGR을 이용한 단일 처리는 검출되는 신호를 발생시키며, 이들 대부분은 내분절과 외분절 사이의 영역에 국소화되었다. 코돈 최적화된 벡터로 처리된 Rpgr-/y 마우스는 연결 섬모 마커의 통상적인 콤마형 염색 패턴으로 대부분의 RPGR 발현을 나타내었다.

논의

본원에 적용된 외과 기술은 마우스의 망막하 공간으로의 최대 2μl의 안전한 적용을 가능하게 하였다. 생성된 반망막 박리는 모든 동물에서 24시간 내에 자발적으로 재부착되었고, 안구 후유증은 관찰되지 않았다. 동시에, 이는 사전 천자 없이 망막하 주사 후에 관찰될 수 있는 바와 같은 (일시적) 각막 부종 형성 및/또는 안구내 순환의 중단을 예방하였다. 광학 매질은 이후 3주 동안 투명하게 남아 있었고, 세포 침윤, 홍채의 전면/후면 유착 또는 백내장 형성과 같은 안구내 병리의 징후가 없었다. 망막 영상화는 AAV2/8.CAG.GFP가 투여된 대조군 그룹에서 GFP 트랜스진 발현의 강한 수준을 나타내었다. 흥미롭게도, 즉시 적용이 상 반망막으로 제한되는 경우에도 리포터 단백질 GFP가 전체 망막에 걸쳐 명백하였다. 이는 박리 영역 외부 세포의 적어도 어느 정도의 형질도입을 나타낸다. GFP 발현은 비특이적인 CAG 프로모터에 의해 유도되었으며, 이는 광수용체로 제한되지 않는 편재성 트랜스진 발현을 발생시킨다. 이는 로돕신 키나제 프로모터가 coRPGR의 광수용체 특이적 발현을 유도하는 본 발명의 coRPGR을 갖는 벡터와 대조적이다.

AAV2/8.RK.coRPGR 또는 AAV2/8.RK.wtRPGR로 처리된 눈은 내부 망막에 초점을 맞춘 적외선 이미지에 의해 표시되는 바와 같이 정상 망막 혈관구조 및 신경 섬유층을 나타내었다. 대조적으로, AAV2/8.CAG.eGFP 벡터로 처리된 마우스는 강하고 편재성인 GFP 유래 형광을 나타내었다. 고정되지 않은 섹션은 Rpgr-/y 마우스에서 RPGR 발현 및 연결 섬모로의 국소화를 나타내었다.

이는 RP 동물 모델에서 유전자 요법으로서 AAV를 통한 코돈 최적화 RPGR 벡터 서열의 성공적인 전달에 대한 최초의 증거이다. 트랜스진 발현에 사용된 벡터의 개발 동안 돌연변이가 대안적 단백질 생성물을 야기시킨 이전 연구와 대조적으로, 본 발명의 연구는 야생형 RPGR 단백질 생성물로 번역되는 코돈 최적화된 서열을 기초로 한 RPGR의 발현 및 정확한 국소화를 입증한다.

실시예 5

coRPGR 유전자 요법의 안전성 및 효능

XLRP에 대한 유전자 요법을 개발하는 것은 다수의 이유로 난제로 남아 있다. 하나는 RPGRORF15의 퓨린 풍부 반복 서열이며, 이는 자발적 돌연변이를 조우함이 없이 클로닝하기 어렵게 만든다. 생거 서열분석에 의해 서열의 온전성을 확인하는 것이 또한 문제가 되는데, 이는 빈번한 폴리-구아닌이 DNA 중합효소를 정지시키거나 중지시키기 때문이다.

두번째 문제는 Rpgr/y 및 C57BL/6JRd9/Boc 마우스와 같은 뮤린 질병 모델에서 가벼운 표현형이다. 이들 질병 모델과 야생형 대조군 사이의 비교적 작은 구조적 및 기능적 차이로 인해, 처리 코호트에서 통계적 유의성 수준에 도달하기가 어렵다.

첫번째 포인트를 다루기 위해, 본 발명자는 RPGRORF15 코딩 서열의 일차 뉴클레오티드 서열을 변화시키기 위해 코돈 최적화의 원리를 적용하였다. 동의어 코돈만 사용하였으므로, 코돈 최적화된 RPGR 작제물이 야생형 RPGR 작제물에 비해 우수한 서열 안정성 및 번역 효율을 특징으로 하면서 생성된 아미노산 서열은 변하지 않은 채로 유지되었다. 이러한 이점은 AAV 작제물을 이용한 플라스미드 형질감염 및 형질도입 실험을 이용하는 경우에 시험관 내에서 명백하였다. 이후, 광수용체를 형질도입시키는 잠재성을 입증하기 위해 파일럿 시험에서 동일한 AAV 작제물을 사용하였다(실시예 4). 생성된 RPGR 단백질은 광수용체에서 이의 생리학적 구획인 연결 섬모로 국소화되었다.

파괴적인 Rpgr 돌연변이를 갖거나 갖지 않는 코호트 사이의 작은 차이를 갖는 두번째 문제를 다루기 위해, 본 발명자는 관련성이 있는 객관적이고 정량적인 결과 측정을 기초로 하여 샘플 크기 및 효력 계산을 수행하였다.

본 연구의 목적은 2개의 관련 동물 모델(Rpgr-/y 및 C57BL/6JRd9/Boc 마우스)에서 XLRP3에 대한 유전자 치료제로서 AAV.RK.coRPGR의 효능을 시험하고, 야생형 동물(C57BL/6J)에서 임의의 잠재적 독성 효과를 연구하는 것이었다. 연구 설계는 임상 I상 연구의 규제 승인을 위한 기초로 작용할 잠재성을 갖는 확실한 통계적 증거를 제공하도록 선택되었다.

재료 및 방법

샘플 크기 및 효력 계산

샘플 크기 및 효력 계산을 캘리포니아 대학, 샌프란시스코 역학 및 생물통계 학부, 생물통계 학과(University of California, San Francisco Department of Epidemiology & Biostatistics, Division of Biostatistics)의 롤린 브란트(Rollin Brant)에 의해 제공된 JavaScript 기반 알고리즘을 이용하여 수행하였다. 이에 사용된 일차 결과 측정은 0.01cd.s/m2에서의 암-적응 단일 플래쉬 자극 후의 a-파 진폭[μV]이었으며, 이는 본 연구에서 표적 세포 집단인 마우스 망막에서의 대다수의 광수용체의 생리학을 반영한다. 이들 망막전위도검사(ERG) 반응을 측정하였고, 코호트(C57BL/6J, C57BL/6JRd9/Boc, 및 Rpgr-/y 마우스) 당 n = 4에 대한 평균 및 표준 편차를 엑셀에서 계산하였다. 샘플 크기를 계산하기 전, C57BL/6J(표적 정상 값)와 C57BL/6JRd9/Boc(처리 전의 기준선) 사이 및 C57BL/6J와 Rpgr-/y 사이의 평균 a-파 진폭의 차이를 계산하였고, 이의 ½을 처리로 인한 50% 이득을 가정한 각각의 질병 모델의 현재 평균치에 추가하였다. 이는 μ0(미처리 코호트의 평균) 및 μ1(처리 코호트의 평균)에 대한 값을 제공하였다. σ에 대한 값(샘플링된 집단의 표준 편차)을 각각의 질병 모델에서 a-파 진폭의 표준 편차로 설정하였다. 일방 시험 설계가 가정되었고, 타입 I 에러율은 α = 0.05로 설정하였고, 원하는 효력은 샘플 크기 계산에 대해 90%로 정의하였다.

이후, C57BL/6J 마우스에서 독성 효과를 검출하는 효력을 계산하기 위해 동등한 샘플 크기를 사용하였다. 이를 위해, 기준선에서의 평균 a-파 진폭의 10%의 손실을 독성 효과로 가정하였고, 기준선 표준 편차를 σ로 입력하였다.

시험 설계

질병 과정 및 시험 항목 AAV.RK.coRPGR의 잠재적 치료 및/또는 독성 효과에 대한 적절한 판독과 관련된 망막 기능의 객관적 및 정량적인 바이오마커로서 ERG 반응을 일차 결과 척도로서 선택하였다. 코호트 내에서의 비교적 높은 개체간 변동성으로 인해, 개체내 시험 패러다임을 선택하였다: 한쪽 눈은 AAV.RK.coRPGR(베룸(verum))으로 처리되는 반면, 대측 눈은 대조군으로 제공되었다. 상기 설계에서 자연적인 질병 과정을 포착하고, 비활성 물질(AAV.대조군)을 대조 주사로 사용하기 위해, 2개의 병행 시험을 수행하였다: 자연 질병 과정에 비한 처리 효과를 비교하기 위해 AAV.RK.coRPGR를 이용한 무작위화된 눈의 일방 처리를 이용한 하나(반드시)의 개방 표지 시험을 이용하였다.

두번째 설계는 AAV.RK.coRPGR 또는 AAV.대조군을 투여한 눈의 무작위 선택을 이용한 맹검 시험이었다. 후자의 시험은 수술 및 AAV 노출의 효과에 대한 대조군으로 이용하였다. 모든 129마리의 동물을 출생 후 P22±2일에 이유 처리하였고, 희생시키기 전에 출생 후 2개월(PM2), PM4 및 PM6의 후속 3개 시점에서 시험하였다. ERG를 3개 모두의 시점에서 기록하였고, 마지막 시점 PM6에서 cSLO를 추가로 수행하였다.

효능 및 독성학 연구의 설계

Rpgr-/y, C57BL/6JRd9/Boc, 및 C57BL/6J 마우스를 AAV.RK.coRPGR 대 AAV.대조군(상단)으로 시험하는 맹검 양측 처리 또는 AAV.RK.coRPGR 단독을 이용한 일방 처리에 적용시켰다. 모든 눈을 무작위로 베룸 대 모의 처리 또는 처리 대 미처리로 할당하였다. 수술을 출생 후 22일(P22)에 수행하였고, 출생 후 2개월(PM2), PM4 및 PM6에 망막전위도검사(ERG)를 후속하였다. PM6에서, 주사 레이저 검안경검사(SLO)를 수행한 후, 조직학 또는 웨스턴 블로팅을 위해 희생시키고 눈을 처리하였다.

C57BL/6J 야생형 마우스

망막하 AAV2/8.RK.coRPGR 전달의 잠재적 독성 효과를 연구하기 위해 2개의 시험에서 전체 n=47 C57BL/6J 마우스를 처리하였다. 24마리의 동물에 눈이 무작위 방식으로 선택되는 비맹검 일방 처리를 수행하였다. 처리는 0.001% PF-68을 갖는 BSS®에 희석된 1.5x10⁹vg의 AAV2/8.RK.coRPGR의 단일 망막하 주사로 구성되었다. 나머지 23마리의 동물에 맹검 및 무작위 방식으로 양측 주사를 투여하였다. 베룸 그룹에서의 처리는 상기와 같은 반면, 대조군 그룹에는 동일 비히클(0.001% PF-68을 갖는 BSS®)에 희석된 1.5x109vg AAV2/8.대조군을 투여하였다. 둘 모두의 벡터는 실시예 4에 상세히 기재되어 있다.

3주령에서 이유와 함께 망막하 주사를 수행하였다. 망막하 주사의 품질을 나타내기 위해 외과의에 의해 등급 시스템(0-10)이 사용되었으며, 0/10은 벡터 전달이 없음을 나타내고, 10/10은 망막하 주사 동안 또는 후에 외부(예를 들어, 결막하) 또는 내부(예를 들어, 망막내/유리체내) 출혈과 같은 어떠한 형태의 합병증 없이 완전한 벡터 전달을 나타낸다. 등급 9/10은, 예를 들어, 약간의 결막하 출혈이 있으나 완전한 벡터 전달의 경우에 제공되었다. 불량한 주사는 7 이하의 등급으로 정의되었고, 시험으로부터 배제하였다.

외과적 개입은 출생 후 2개월(PM2) 및 PM4에서 ERG 기록에서의 개체내 변화의 종측 관찰에 의해 추적되었다. PM6에서, 망막의 추가 SLO 영상화를 ERG 기록 직후에 수행하였다. 마우스를 마지막 시점(PM6)에서 희생시키고, 웨스턴 블롯 또는 면역조직화학에 의한 트랜스진 검출을 위해 눈을 절제하였다.

C57BL/6JRd9/Boc 마우스

전체 n=36의 C57BL/6JRd9/Boc 마우스를 둘 모두의 시험에서 처리하였다. 19마리의 동물에 맹검된 일방 처리를 수행한 반면, 17마리의 동물을 C57BL/6J 마우스에 대해 상기 기재된 바와 같이 베룸 또는 대조군으로 맹검되고 무작위화된 양측 주사를 투여하도록 등록하였다. 이는 AAV 기반 RPGR 유전자 대체 유전자 요법의 효능을 평가하기 위해 수행하였다. 추적 조사는 상기와 같이 예정되었다.

Rpgr-/y 마우스

XLRP의 두번째 동물 모델에서 AAV 기반 RPGR 유전자 대체 유전자 요법의 효능을 평가하기 위해 Rpgr-/y 마우스를 사용하였다. 이를 위해, 전체 n=46을 상기 기재된 2개의 별개의 시험에서 처리하였다. 25마리의 동물에 맹검되지 않은 일방 처리를 수행한 반면, 21마리의 동물은 상기 기재된 바와 같이 둘 모두의 눈(베룸 및 대조군)에서 처리하였다. 개입 후 판독은 C57BL/6J 마우스에 대한 상기와 같이 예정되었다.

결과

샘플 크기 및 효력 계산

계산된 샘플 크기는 코호트(C57BL/6J, C57BL/6JRd9/Boc, 및 Rpgr-/y 마우스) 당 4개의 눈(2마리의 동물)으로부터 수집된 ERG 데이터를 기초로 하였다. n = 9 시험의 평균 a-파 진폭을 각각의 눈에 대해 기록하였다.

상기 데이터로부터 μ0, μ1 및 시그마 값을 계산한 후, 제안된 샘플 크기는 16 내지 21 범위였다. C57BL/6JRd9/Boc 마우스는 야생형 대조군(81 ± 7μV)에 비해 가장 작은 진폭(65 ± 11μV, 평균 ± 표준 편차)을 특징으로 하였고, 따라서 n=16의 추정 샘플 크기만 필요로 하였다. Rpgr-/y에 대한 제안된 샘플 크기는 이의 기준선에서의 높은 진폭(728μV)으로 인해 n = 21이었다. 효력 계산은 야생형 마우스에서의 기준선으로부터 10% 진폭의 손실이 n=20의 코호트 크기를 이용하여 100%의 효력으로 검출되는 것을 나타내었다.

C57BL/6J 야생형 마우스

6개의 눈을 불량한 수술로 인해 시험으로부터 배제하였고, 1개의 눈을 미리 존재하는 전방 세그먼트 변화로 인해 배제하였다. 이는 일방 시험에 대해 n=19 및 양측 시험에 대해 n=22의 전체 코호트 크기를 발생시켰다. 문서화된 외과적 품질의 평균[및 범위]은 모든 그룹에서 매우 유사하였다: 개방 표지에 대해 9.0 [8-10], 베룸에 대해 9.5 [8-10] 및 대조군 그룹에 대해 9.3 [8-10]. 모든 마우스는 수술 후에 신속히 회복하였다.

암 또는 명 적응 조건하에서 기록된 신호 강도 시리즈 중 어느 것도 어느 시점에서도 처리된 그룹과 미처리 그룹 사이 또는 베룸과 대조군 그룹 사이에서 유의한 차이를 나타내지 않았다. 주사 레이저 검안경검사(SLO)를 이용한 망막 영상화는 또한 AAV.RK.coRPGR의 망막하 적용 6개월 후까지 망막 구조에 대한 독성 효과가 관찰되지 않음을 확인하였다.

AAV.RK.coRPGR 또는 AAV.대조군의 양측 망막하 주사 후의 C57BL/6J 마우스에서의 ERG 기록은 PM2, PM4 및 시험된 마지막 시점인 PM6으로부터의 데이터를 제공하였다. 반복 측정을 위한 요인별 ANOVA는 모든 분석에서 귀무 가설(차이 없음)을 유지하였다.

전체 망막 용해질의 웨스턴 블롯은 처리된 눈에서 RPGR 트랜스진 발현을 확인하였으나, 대조군 눈에서는 확인하지 않았다. 밴드는 예측된 분자량을 나타내었고, 여분의 밴드는 명백하지 않았다. 고정되지 않은 냉동절편의 면역조직화학은 또한 처리된 눈에서 RPGR 트랜스진 발현 및 천연 Rpgrip과의 공동 국소화를 나타내었으나, 미처리 대조군 눈에서는 나타내지 않았다.

처리된 눈(TE) 및 미처리 눈(UE)으로부터의 망막 절편에서의 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색은 둘 모두의 코호트에서 정상 망막 해부학을 나타내었다. 어느 코호트도 임의의 절편에서 염증 및 변성의 임의의 징후를 나타내지 않았다.

C57BL/6J, C57BL/6JRd9/Boc, 및 Rpgr-/y 마우스의 처리 대 미처리 눈으로부터의 전체 망막 용해질의 웨스턴 블롯을 수행하였다. RpgrORF15 발현은 처리된 눈으로 제한되었고, 약 200kDa의 밴드를 나타내었다. 가장 강한 밴드가 C57BL/6JRd9/Boc 및 이어서 C57BL/6J에서 관찰된 반면, Rpgr-/y 샘플은 가장 약한 발현을 나타내었다. 로딩 대조군으로서 GAPDH(적색)를 사용하였다. 나이브 HEK293T 세포를 음성 대조군(nc)으로 사용하였고, HEK293T 세포를 양성 대조군으로서 coRPGR 발현 플라스미드로 형질감염시켰다.

C57BL/6J 마우스에서의 면역조직화학. 대조군 처리 눈에서 RPGR 발현이 관찰되지 않았다. AAV.coRPGR을 이용한 처리는 RPGR 발현 및 인간 RPGR과 Rpgrip의 공동 국소화를 발생시켰다.

C57BL/6J 마우스에서의 헤마톡실린 및 에오신 염색은 임의의 절편에서 염증 또는 변성의 징후가 없음을 나타내었다. 정상 해부학이 관찰되었다.

C57BL/6JRd9/Boc 마우스

일방 개방 표지 시험의 한마리의 마우스는 미처리 대조군 눈에서 관련 소안구증(microphthalmus)이 있는 기존의 각막 침윤으로 인해 배제하였다. 소안구증은 미처리 눈에서 거짓의 낮은 ERG 기록을 발생시킬 수 있다. 이는 일방 시험에 대해 전체 n=18, 및 양측 주사에 대해 n=17의 동물을 발생시켰다. 처리된 동물 어느 것도 외과적 합병증으로 인해 배제되지 않았고, 주사가 투여된 모든 동물은 개방 표지에 대해 9.7, 베룸에 대해 9.1 및 대조군 그룹에서 9.0의 평균(범위는 모든 그룹에서 8-10이었음)으로 양호하거나 우수한 것으로 평가되었다.

종측 추적 조사에서, 일방 시험으로부터의 2마리의 동물은 PM4에서의 마취로부터 회복되지 않았다. 3개 시점으로부터의 전체 102개의 양측 ERG 데이터 세트는 성공적으로 기록되었고, 추가 분석을 위해 저장되었다. 개방 표지, 일방 시험에서, 반복 측정에 대한 요인별 ANOVA는 첫번째 시점(PM2)에서 귀무 가설(차이 없음)을 유지하였으나, 암 및 명 적응 강도 시리즈 둘 모두에서 더 높은 강도로 처리된 눈에 대해 더 큰 진폭의 경향을 나타내었다. PM4에서, 처리된 눈은 a-파(p = 0.001) 및 b-파(p = 0.002) 둘 모두에 관하여 암 적응 강도 시리즈에 걸쳐 유의하게 높은 진폭으로 반응하였다. 명 적응 반응은 유의하게 상이하지 않았다. 이러한 패턴은 마지막 시점(PM6)까지 지속되었다.

맹검 양측 시험에서, 귀무 가설은 모든 시점에서 유지되었다. 그러나, 베룸 처리된 눈은 항상 더 높은 자극 강도에서 특히 더 높은 진폭에 대한 경향을 다시 나타내었다.

주사 레이저 검안경검사(SLO)를 이용한 망막 영상화는 또한 AAV.RK.coRPGR의 망막하 적용 6개월 후까지 망막 구조에 대한 독성 효과가 관찰되지 않음을 확인하였다. 그러나, 자가형광 영상화는 처리된 C57BL/6JRd9/Boc 마우스에서 질병 표현에서의 변화를 나타내었고: 본 발명자는 마우스에서의 Rpgr 발현의 결핍이 자가형광으로 관찰 가능한 망막 전체에 걸친 과형광 도트와 관련된 반면, 야생형 마우스는 단지 최소의 균일한 자가형광 신호를 갖는 것을 이전에 제시하였다. 흥미롭게도, PM6에서 베룸 처리된 눈에서의 영상화는 벡터가 처음 적용된 상 반망막에서 이들 과형광 도트의 감소를 나타내었다. 반망막 필드는 처리된 눈에서 유의하게 상이하였다: 처리된 상 반망막에서 13±14(평균±표준 편차) 대 동측 전방 망막에서 59±40(p=0.005; n=6, 쌍을 이룬 t-검정). 대측의 미처리 망막에 비한 처리된 망막의 상 반망막을 비교하는 것은 유사한 결과를 발생시켰다(p=0.037; n=6, 쌍을 이룬 t 검정).

전체 망막 용해질의 웨스턴 블롯은 처리된 눈에서 RPGR 트랜스진 발현을 확인하였으나, 대조군 눈에서는 확인하지 않았다. 밴드는 예측된 분자량을 나타내었고, 여분의 밴드는 명백하지 않았다. 고정되지 않은 냉동절편의 면역조직화학은 또한 처리된 눈에서 RPGR 트랜스진 발현 및 천연 Rpgrip과의 공동 국소화를 나타내었으나, 대조군 눈에서는 나타내지 않았다.

Rpgr-/y 마우스

일방 개방 표지 시험의 한마리의 마우스는 대측 눈의 외과적 개입 후에만 인지되고, 미처리 눈에서 거짓의 낮은 ERG 기록을 발생시킬 수 있는 미처리 눈에서의 기존의 소안구증으로 인해 배제시켰다. 또한, 처리된 동물의 양측 시험으로부터의 한마리의 동물을 외과적 합병증(유리체내 출혈을 갖는 부분적 유리체내 주사)으로 인해 배제시켜야했다. 이는 일방 시험에 대해 전체 n=24, 및 양측 주사에 대해 n=20의 동물을 발생시켰다. 수술 성공률은 모든 코호트에서 높았다: 평균 [범위] 등급은 C57BL/6JRd9/Boc 마우스에서 개방 표지에 대해 9.3 [8-10]였고, 베룸 및 면역조직화학에 대해 9.5 [9-10]였다. 상단 패널은 대조군 처리 눈에서 RPGR 발현이 없음을 나타낸다. AAV.coRPGR을 이용한 처리는 RPGR 발현 및 이의 Rpgrip와의 공동 국소화를 발생시켰다. 축척 막대는 20 μm를 나타낸다. 대조군 그룹에서 9.4 [8-10]. 종측 추적 조사에서, PM2에서 양측 주사된 한마리의 동물 및 PM4에서 일방 주사된 2마리의 동물은 마취로부터 회복되지 않았다. 3개 시점으로부터의 전체 128개의 양측 ERG 데이터 세트가 성공적으로 기록되었고, 추가 분석을 위해 저장되었다.

개방 표지, 일방 시험에서, 가장 이른 시점(PM2)에서 눈 사이에 명백한 차이가 없었으나, a-파 및 b-파 진폭 둘 모두에서 PM4(p<0.001) 및 PM6(p<0.001)에서 암 적응 ERG 반응에서 강한 처리 효과가 관찰되었다. 명소시 b-파 반응은 PM6에서 유의하게 더 컸다(p=0.004). 맹검 양측 시험은 PM6에서 암 순응 b-파 반응의 유의하게 증가된 진폭을 나타내었고, 명 적응 b-파 진폭은 PM4에서 유의하게 증가하였다(PM6에서는 증가하지 않음).

AAV.RK.coRPGR로 처리된 Rpgr-/y 마우스의 눈은 처리된 C57BL/6JRd9/Boc 마우스에서도 관찰되는 바와 같이 상 반망막에서 과형광 도트의 감소를 나타내었다. 대조적으로, Rpgr-/y 마우스의 미처리 또는 모의 처리된 눈은 Rpgr-불활성화 돌연변이와 관련된 과형광 도트의 편재성 패턴을 나타내었다.

전체 망막 용해질의 웨스턴 블롯은 처리된 눈에서 RPGR 트랜스진 발현을 확인하였으나, 대조군 눈에서는 확인하지 않았다. 밴드는 예측된 분자량을 나타내었고, 여분의 밴드는 명백하지 않았다. 고정되지 않은 냉동절편의 면역조직화학은 또한 처리된 눈에서 RPGR 트랜스진 발현 및 천연 Rpgrip과의 공동 국소화를 나타내었으나, 대조군 눈에서는 나타내지 않았다. AAV.RK.coRPGR의 일방 망막하 주사 후의 Rpgr-/y 마우스에서의 ERG 기록.

AAV.RK.coRPGR 또는 AAV.대조군의 양측 망막하 주사 후의 Rpgr-/y 마우스에서의 ERG 기록. AAV.RK.coRPGR을 이용한 처리는 암 적응 ERG 진폭의 유의한 개선을 발생시켰다. 명 적응 b-파 진폭에서의 처리 효과는 PM6에서 지속되지 않았다.

적외선 모드의 주사 레이저 검안경검사 영상화를 이용하여, 초점면을 내부 망막 또는 외부 망막으로 설정하였다. 처리된 눈과 모의 또는 대조군 눈 사이의 명백히 상이한 자가형광 패턴: 처리된 눈은 AAV.RK.coRPGR 적용 영역인 상 반망막에서 더 적은 과형광 도트를 나타낸다.

Rpgr-/y 마우스에서의 면역조직화학. 대조군 처리 눈에서 RPGR 발현이 관찰되지 않았다. AAV.coRPGR을 이용한 처리는 RPGR 발현 및 인간 RPGR과 Rpgrip의 공동 국소화를 발생시켰다. 축척 막대는 20 μm를 나타낸다.

논의

RPGR 대체 요법은 XLRP3에 대한 유전적 원인으로서 RPGR의 특성규명 이래로 관심을 끌었다. 임상 시험으로 해석되는 않는 것이 여전히 목표라는 사실은 RPGR이 돌연변이 변화에 대한 높은 성향을 갖는 복잡한 유전자라는 사실에 주로 기인한다. 이는 임상 시험 적용의 지원을 위한 데이터세트의 개발에서 심각한 지연을 야기시킨다. 안전성 시험에 대한 규제 승인을 받더라도, RPGR 유전자 요법을 위한 임상 등급 AAV의 생성은 유의한 난제일 것이다.

이들 데이터는 야생형 동물 C57BL/6J에서 독성 효과가 없음을 나타내며, 2개의 관련된 동물 모델(Rpgr-/y 및 C57BL/6JRd9/Boc 마우스)에서 RPGR 유전자 요법을 위한 새로운 유형의 벡터 작제물의 효능을 나타낸다. 이러한 AAV 기반 벡터는 RPGRORF15의 코돈 최적화된 코딩 서열을 특징으로 하며, 이는 동일한 단백질 생성물인 RPGRORF15를 발생시키면서 작제물을 유전적으로 더 안정적으로 만든다. Rpgr-/y 마우스에서의 광범위한 시험관내 분석 및 파일럿 시험 후(실시예 4), 본 발명은 AAV.RK.coRPGR의 단일한 망막하 적용이 안전하며, Rpgr에서의 돌연변이로 인한 망막 변성의 진행을 중지하거나 늦출 수 있음을 제시한다.

안전성

AAV.RK.coRPGR의 잠재적 독성 효과를 연구하기 위해, 본 발명자는 41마리의 C57BL/6J 마우스에서 동일 용량(1.5μl 중 1.5x109 vg)을 시험하였다. 19마리의 마우스는 한쪽 눈만 처리한 반면, 22마리는 AAV.RK.coRPGR 또는 AAV.대조군을 이용하여 맹검 양측 처리하였다. 베룸 그룹과 대조군 또는 미처리 그룹 사이에서 시험의 어느 시점에서도 ERG의 망막 기능의 측정 사이에 유의한 차이가 없었다. 또한, 생체내 망막 영상화는 망막 구조에 대한 AAV.RK.coRPGR 처리의 영향이 없음을 암시한다. H&E 염색은 처리의 독성 효과가 없음을 나타내었고, 면역조직화학 및 웨스턴 블로팅은 처리된 동물에서 RPGRORF15 발현 및 국소화를 나타내었으나, 미처리 또는 대조군 처리 동물에서는 나타내지 않았다. 종합하면, AAV.RK.coRPGR을 이용한 야생형 마우스의 단일 처리는 어떠한 독성 효과도 유도하지 않았고, 양호한 안전성 프로파일을 나타내었다. 따라서, 본 발명자는 AAV.RK.coRPGR을 이용한 처리가 안전한 것으로 결론내렸다.

효능

AAV.RK.coRPGR의 치료 효과를 XLRP3의 2개의 널리 특성규명된 마우스 모델에서 입증하였다: Rpgr에서 천연 발생 돌연변이를 특징으로 하는 트랜스제닉 모델 Rpgr-/y 및 C57BL/6JRd9/Boc. 돌 모두의 모델은 망막에서 RpgrORF15 발현이 결핍된 것으로 밝혀졌으며, 따라서 XLRP3에 대한 관련 동물 모델로 선택하였다. 그러나, 이들 동물 모델을 이용하면서 약간의 주의사항이 있다. 가장 중요하게는, 질병 표현형이 놀라울 정도로 약하여, 필요한 통계 효력을 얻기 위해 시험에서 비교적 큰 코호트를 필요로 한다. 결과적으로, 본 발명자는 전체 약 80마리의 동물에서 시험을 수행하였고, Rpgr-/y 및 C57BL/6JRd9/Boc 마우스에서 전기생리학적 측정의 유의한 구제에 의해 나타나는 바와 같이 효능의 확실한 증거를 제공하였다.

처리는 가장 가능성 있게는 둘 모두의 동물 모델에서 느린 질병 진행으로 인해 처음에는 명백하지 않았다. 그러나, AAV.RK.coRPGR 처리는 PM4 및 PM6에서 둘 모두의 동물 모델에서 유의한 ERG 구제와 관련이 있었다. 이러한 구제는 암 적응 강도 시리즈에서 더욱 명백하였고, 이는 낮은 강도 범위(약 0.01cd./m2까지의 단일 플래쉬)에서 막대 광수용체의 합계 전위를 반영한다. 더 높은 플래쉬 강도가 혼합 원뿔-막대 반응을 자극하는 것으로 생각된다. 처리 눈과 모의/미처리 눈 사이의 가장 큰 차이가 약 1cd.s/m2의 강도에서 관찰되었고, 이는 막대 및 원뿔 광수용체 둘 모두가 AAV.RK.coRPGR 형질도입으로부터 획득되었을 수 있음을 나타낸다.

종합하면, AAV.RK.coRPGR을 이용한 처리는 안전하고 효과적이다. 야생형 마우스에서의 AAV.RK.coRPGR을 이용한 광수용체의 성공적인 형질도입은 RPGRORF15의 발현과 관련된 독성 효과를 발생시키지 않았다. 또한, XLRP3의 동물 모델의 처리는 처리된 눈에서 ERG 반응의 통계적으로 유의한 구제를 나타내었으나, 미처리 눈에서는 나타내지 않았다. 이들 데이터는 본 발명의 RPGRORF15의 코돈 최적화된 코딩 서열이 눈을 안전하기 처리하기 위해 사용될 수 있음을 입증하였다.

SEQUENCE LISTING <110> Oxford University Innovation Limited <120> Treatment of retinitis pigmentosa <130> P107084PCT <150> GB 1516066.6 <151> 2015-09-10 <160> 14 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1152 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Arg Glu Pro Glu Glu Leu Met Pro Asp Ser Gly Ala Val Phe Thr 1 5 10 15 Phe Gly Lys Ser Lys Phe Ala Glu Asn Asn Pro Gly Lys Phe Trp Phe 20 25 30 Lys Asn Asp Val Pro Val His Leu Ser Cys Gly Asp Glu His Ser Ala 35 40 45 Val Val Thr Gly Asn Asn Lys Leu Tyr Met Phe Gly Ser Asn Asn Trp 50 55 60 Gly Gln Leu Gly Leu Gly Ser Lys Ser Ala Ile Ser Lys Pro Thr Cys 65 70 75 80 Val Lys Ala Leu Lys Pro Glu Lys Val Lys Leu Ala Ala Cys Gly Arg 85 90 95 Asn His Thr Leu Val Ser Thr Glu Gly Gly Asn Val Tyr Ala Thr Gly 100 105 110 Gly Asn Asn Glu Gly Gln Leu Gly Leu Gly Asp Thr Glu Glu Arg Asn 115 120 125 Thr Phe His Val Ile Ser Phe Phe Thr Ser Glu His Lys Ile Lys Gln 130 135 140 Leu Ser Ala Gly Ser Asn Thr Ser Ala Ala Leu Thr Glu Asp Gly Arg 145 150 155 160 Leu Phe Met Trp Gly Asp Asn Ser Glu Gly Gln Ile Gly Leu Lys Asn 165 170 175 Val Ser Asn Val Cys Val Pro Gln Gln Val Thr Ile Gly Lys Pro Val 180 185 190 Ser Trp Ile Ser Cys Gly Tyr Tyr His Ser Ala Phe Val Thr Thr Asp 195 200 205 Gly Glu Leu Tyr Val Phe Gly Glu Pro Glu Asn Gly Lys Leu Gly Leu 210 215 220 Pro Asn Gln Leu Leu Gly Asn His Arg Thr Pro Gln Leu Val Ser Glu 225 230 235 240 Ile Pro Glu Lys Val Ile Gln Val Ala Cys Gly Gly Glu His Thr Val 245 250 255 Val Leu Thr Glu Asn Ala Val Tyr Thr Phe Gly Leu Gly Gln Phe Gly 260 265 270 Gln Leu Gly Leu Gly Thr Phe Leu Phe Glu Thr Ser Glu Pro Lys Val 275 280 285 Ile Glu Asn Ile Arg Asp Gln Thr Ile Ser Tyr Ile Ser Cys Gly Glu 290 295 300 Asn His Thr Ala Leu Ile Thr Asp Ile Gly Leu Met Tyr Thr Phe Gly 305 310 315 320 Asp Gly Arg His Gly Lys Leu Gly Leu Gly Leu Glu Asn Phe Thr Asn 325 330 335 His Phe Ile Pro Thr Leu Cys Ser Asn Phe Leu Arg Phe Ile Val Lys 340 345 350 Leu Val Ala Cys Gly Gly Cys His Met Val Val Phe Ala Ala Pro His 355 360 365 Arg Gly Val Ala Lys Glu Ile Glu Phe Asp Glu Ile Asn Asp Thr Cys 370 375 380 Leu Ser Val Ala Thr Phe Leu Pro Tyr Ser Ser Leu Thr Ser Gly Asn 385 390 395 400 Val Leu Gln Arg Thr Leu Ser Ala Arg Met Arg Arg Arg Glu Arg Glu 405 410 415 Arg Ser Pro Asp Ser Phe Ser Met Arg Arg Thr Leu Pro Pro Ile Glu 420 425 430 Gly Thr Leu Gly Leu Ser Ala Cys Phe Leu Pro Asn Ser Val Phe Pro 435 440 445 Arg Cys Ser Glu Arg Asn Leu Gln Glu Ser Val Leu Ser Glu Gln Asp 450 455 460 Leu Met Gln Pro Glu Glu Pro Asp Tyr Leu Leu Asp Glu Met Thr Lys 465 470 475 480 Glu Ala Glu Ile Asp Asn Ser Ser Thr Val Glu Ser Leu Gly Glu Thr 485 490 495 Thr Asp Ile Leu Asn Met Thr His Ile Met Ser Leu Asn Ser Asn Glu 500 505 510 Lys Ser Leu Lys Leu Ser Pro Val Gln Lys Gln Lys Lys Gln Gln Thr 515 520 525 Ile Gly Glu Leu Thr Gln Asp Thr Ala Leu Thr Glu Asn Asp Asp Ser 530 535 540 Asp Glu Tyr Glu Glu Met Ser Glu Met Lys Glu Gly Lys Ala Cys Lys 545 550 555 560 Gln His Val Ser Gln Gly Ile Phe Met Thr Gln Pro Ala Thr Thr Ile 565 570 575 Glu Ala 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Glu Glu Glu Gly Asp Gln Gly Glu Gly Glu Glu Glu Glu 785 790 795 800 Thr Glu Gly Arg Gly Glu Glu Lys Glu Glu Gly Gly Glu Val Glu Gly 805 810 815 Gly Glu Val Glu Glu Gly Lys Gly Glu Arg Glu Glu Glu Glu Glu Glu 820 825 830 Gly Glu Gly Glu Glu Glu Glu Gly Glu Gly Glu Glu Glu Glu Gly Glu 835 840 845 Gly Glu Glu Glu Glu Gly Glu Gly Lys Gly Glu Glu Glu Gly Glu Glu 850 855 860 Gly Glu Gly Glu Glu Glu Gly Glu Glu Gly Glu Gly Glu Gly Glu Glu 865 870 875 880 Glu Glu Gly Glu Gly Glu Gly Glu Glu Glu Gly Glu Gly Glu Gly Glu 885 890 895 Glu Glu Glu Gly Glu Gly Glu Gly Glu Glu Glu Gly Glu Gly Glu Gly 900 905 910 Glu Glu Glu Glu Gly Glu Gly Lys Gly Glu Glu Glu Gly Glu Glu Gly 915 920 925 Glu Gly Glu Gly Glu Glu Glu Glu Gly Glu Gly Glu Gly Glu Asp Gly 930 935 940 Glu Gly Glu Gly Glu Glu Glu Glu Gly Glu Trp Glu Gly Glu Glu Glu 945 950 955 960 Glu Gly Glu Gly Glu Gly Glu Glu Glu Gly Glu Gly Glu Gly Glu Glu 965 970 975 Gly Glu Gly Glu Gly Glu Glu Glu Glu Gly Glu Gly Glu Gly Glu Glu 980 985 990 Glu Glu Gly Glu Glu Glu Gly Glu Glu Glu Gly Glu Gly Glu Glu Glu 995 1000 1005 Gly Glu Gly Glu Gly Glu Glu Glu Glu Glu Gly Glu Val Glu Gly 1010 1015 1020 Glu Val Glu Gly Glu Glu Gly Glu Gly Glu Gly Glu Glu Glu Glu 1025 1030 1035 Gly Glu Glu Glu Gly Glu Glu Arg Glu Lys Glu Gly Glu Gly Glu 1040 1045 1050 Glu Asn Arg Arg Asn Arg Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Gly Lys 1055 1060 1065 Tyr Gln Glu Thr Gly Glu Glu Glu Asn Glu Arg Gln Asp Gly Glu 1070 1075 1080 Glu Tyr Lys Lys Val Ser Lys Ile Lys Gly Ser Val Lys Tyr Gly 1085 1090 1095 Lys His Lys Thr Tyr Gln Lys Lys Ser Val Thr Asn Thr Gln Gly 1100 1105 1110 Asn Gly Lys Glu Gln Arg Ser Lys Met Pro Val Gln Ser Lys Arg 1115 1120 1125 Leu Leu Lys Asn Gly Pro Ser Gly Ser Lys Lys Phe Trp Asn Asn 1130 1135 1140 Val Leu Pro His Tyr Leu Glu Leu Lys 1145 1150 <210> 2 <211> 3459 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 atgagggagc cggaagagct gatgcccgat tcgggtgctg tgtttacatt tgggaaaagt 60 aaatttgctg aaaataatcc cggtaaattc tggtttaaaa atgatgtccc tgtacatctt 120 tcatgtggag atgaacattc tgctgttgtt accggaaata ataaacttta catgtttggc 180 agtaacaact ggggtcagtt aggattagga tcaaagtcag ccatcagcaa gccaacatgt 240 gtcaaagctc taaaacctga aaaagtgaaa ttagctgcct gtggaaggaa ccacaccctg 300 gtgtcaacag aaggaggcaa tgtatatgca actggtggaa ataatgaagg acagttgggg 360 cttggtgaca ccgaagaaag aaacactttt catgtaatta gcttttttac atccgagcat 420 aagattaagc agctgtctgc tggatctaat acttcagctg ccctaactga ggatggaaga 480 ctttttatgt ggggtgacaa ttccgaaggg caaattggtt taaaaaatgt aagtaatgtc 540 tgtgtccctc agcaagtgac cattgggaaa cctgtctcct ggatctcttg tggatattac 600 cattcagctt ttgtaacaac agatggtgag ctatatgtgt ttggagaacc tgagaatggg 660 aagttaggtc ttcccaatca gctcctgggc aatcacagaa caccccagct ggtgtctgaa 720 attccggaga aggtgatcca agtagcctgt ggtggagagc atactgtggt tctcacggag 780 aatgctgtgt atacctttgg gctgggacaa tttggtcagc tgggtcttgg cacttttctt 840 tttgaaactt cagaacccaa agtcattgag aatattaggg atcaaacaat aagttatatt 900 tcttgtggag aaaatcacac agctttgata acagatatcg gccttatgta tacttttgga 960 gatggtcgcc acggaaaatt aggacttgga ctggagaatt ttaccaatca cttcattcct 1020 actttgtgct ctaatttttt gaggtttata gttaaattgg ttgcttgtgg tggatgtcac 1080 atggtagttt ttgctgctcc tcatcgtggt gtggcaaaag aaattgaatt cgatgaaata 1140 aatgatactt gcttatctgt ggcgactttt ctgccgtata gcagtttaac ctcaggaaat 1200 gtactgcaga ggactctatc agcacgtatg cggcgaagag agagggagag gtctccagat 1260 tctttttcaa tgaggagaac actacctcca atagaaggga ctcttggcct ttctgcttgt 1320 tttctcccca attcagtctt tccacgatgt tctgagagaa acctccaaga gagtgtctta 1380 tctgaacagg acctcatgca gccagaggaa ccagattatt tgctagatga aatgaccaaa 1440 gaagcagaga tagataattc ttcaactgta gaaagccttg gagaaactac tgatatctta 1500 aacatgacac acatcatgag cctgaattcc aatgaaaagt cattaaaatt atcaccagtt 1560 cagaaacaaa agaaacaaca aacaattggg gaactgacgc aggatacagc tcttactgaa 1620 aacgatgata gtgatgaata tgaagaaatg tcagaaatga aagaagggaa agcatgtaaa 1680 caacatgtgt cacaagggat tttcatgacg cagccagcta cgactatcga agcattttca 1740 gatgaggaag tagagatccc agaggagaag gaaggagcag aggattcaaa aggaaatgga 1800 atagaggagc aagaggtaga agcaaatgag gaaaatgtga aggtgcatgg aggaagaaag 1860 gagaaaacag agatcctatc agatgacctt acagacaaag cagaggtgag tgaaggcaag 1920 gcaaaatcag tgggagaagc agaggatggg cctgaaggta gaggggatgg aacctgtgag 1980 gaaggtagtt caggagcaga acactggcaa gatgaggaga gggagaaggg ggagaaagac 2040 aagggtagag gagaaatgga gaggccagga gagggagaga aggaactagc agagaaggaa 2100 gaatggaaga agagggatgg ggaagagcag gagcaaaagg agagggagca gggccatcag 2160 aaggaaagaa accaagagat ggaggaggga ggggaggagg agcatggaga aggagaagaa 2220 gaggagggag acagagaaga ggaagaagag aaggagggag aagggaaaga ggaaggagaa 2280 ggggaagaag tggagggaga acgtgaaaag gaggaaggag agaggaaaaa ggaggaaaga 2340 gcggggaagg aggagaaagg agaggaagaa ggagaccaag gagaggggga agaggaggaa 2400 acagagggga gaggggagga aaaagaggag ggaggggaag tagagggagg ggaagtagag 2460 gaggggaaag gagagaggga agaggaagag gaggagggtg agggggaaga ggaggaaggg 2520 gagggggaag aggaggaagg ggagggggaa gaggaggaag gagaagggaa aggggaggaa 2580 gaaggggaag aaggagaagg ggaggaagaa ggggaggaag gagaagggga gggggaagag 2640 gaggaaggag aaggggaggg agaagaggaa ggagaagggg agggagaaga ggaggaagga 2700 gaaggggagg gagaagagga aggagaaggg gagggagaag aggaggaagg agaagggaaa 2760 ggggaggagg aaggagagga aggagaaggg gagggggaag aggaggaagg agaaggggaa 2820 ggggaggatg gagaagggga gggggaagag gaggaaggag aatgggaggg ggaagaggag 2880 gaaggagaag gggaggggga agaggaagga gaaggggaag gggaggaagg agaaggggag 2940 ggggaagagg aggaaggaga aggggagggg gaagaggagg aaggggaaga agaaggggag 3000 gaagaaggag agggagagga agaaggggag ggagaagggg aggaagaaga ggaaggggaa 3060 gtggaagggg aggtggaagg ggaggaagga gagggggaag gagaggaaga ggaaggagag 3120 gaggaaggag aagaaaggga aaaggagggg gaaggagaag aaaacaggag gaacagagaa 3180 gaggaggagg aagaagaggg gaagtatcag gagacaggcg aagaagagaa tgaaaggcag 3240 gatggagagg agtacaaaaa agtgagcaaa ataaaaggat ctgtgaaata tggcaaacat 3300 aaaacatatc aaaaaaagtc agttactaac acacagggaa atgggaaaga gcagaggtcc 3360 aaaatgccag tccagtcaaa acgactttta aaaaacgggc catcaggttc caaaaagttc 3420 tggaataatg tattaccaca ttacttggaa ttgaagtaa 3459 <210> 3 <211> 3459 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> codon-optimised sequence of RPGRORF15 <400> 3 atgagagagc cagaggagct gatgccagac agtggagcag tgtttacatt cggaaaatct 60 aagttcgctg aaaataaccc aggaaagttc tggtttaaaa acgacgtgcc cgtccacctg 120 tcttgtggcg atgagcatag tgccgtggtc actgggaaca ataagctgta catgttcggg 180 tccaacaact ggggacagct ggggctggga tccaaatctg ctatctctaa gccaacctgc 240 gtgaaggcac tgaaacccga gaaggtcaaa ctggccgctt gtggcagaaa ccacactctg 300 gtgagcaccg agggcgggaa tgtctatgcc accggaggca acaatgaggg acagctggga 360 ctgggggaca ctgaggaaag gaataccttt cacgtgatct ccttctttac atctgagcat 420 aagatcaagc agctgagcgc tggctccaac acatctgcag ccctgactga ggacgggcgc 480 ctgttcatgt ggggagataa ttcagagggc cagattgggc tgaaaaacgt gagcaatgtg 540 tgcgtccctc agcaggtgac catcggaaag ccagtcagtt ggatttcatg tggctactat 600 catagcgcct tcgtgaccac agatggcgag ctgtacgtct ttggggagcc cgaaaacgga 660 aaactgggcc tgcctaacca gctgctgggc aatcaccgga caccccagct ggtgtccgag 720 atccctgaaa aagtgatcca ggtcgcctgc gggggagagc atacagtggt cctgactgag 780 aatgctgtgt ataccttcgg actgggccag tttggccagc tggggctggg aaccttcctg 840 tttgagacat ccgaaccaaa agtgatcgag aacattcgcg accagactat cagctacatt 900 tcctgcggag agaatcacac cgcactgatc acagacattg gcctgatgta tacctttggc 960 gatggacgac acgggaagct gggactggga ctggagaact tcactaatca ttttatcccc 1020 accctgtgtt ctaacttcct gcggttcatc gtgaaactgg tcgcttgcgg cgggtgtcac 1080 atggtggtct tcgctgcacc tcataggggc gtggctaagg agatcgaatt tgacgagatt 1140 aacgatacat gcctgagcgt ggcaactttc ctgccataca gctccctgac ttctggcaat 1200 gtgctgcaga gaaccctgag tgcaaggatg cggagaaggg agagggaacg ctctcctgac 1260 agtttctcaa tgcgacgaac cctgccacct atcgagggaa cactgggact gagtgcctgc 1320 ttcctgccta actcagtgtt tccacgatgt agcgagcgga atctgcagga gtctgtcctg 1380 agtgagcagg atctgatgca gccagaggaa cccgactacc tgctggatga gatgaccaag 1440 gaggccgaaa tcgacaactc tagtacagtg gagtccctgg gcgagactac cgatatcctg 1500 aatatgacac acattatgtc actgaacagc aatgagaaga gtctgaaact gtcaccagtg 1560 cagaagcaga agaaacagca gactattggc gagctgactc aggacaccgc cctgacagag 1620 aacgacgata gcgatgagta tgaggaaatg tccgagatga aggaaggcaa agcttgtaag 1680 cagcatgtca gtcaggggat cttcatgaca cagccagcca caactattga ggctttttca 1740 gacgaggaag tggagatccc cgaggaaaaa gagggcgcag aagattccaa ggggaatgga 1800 attgaggaac aggaggtgga agccaacgag gaaaatgtga aagtccacgg aggcaggaag 1860 gagaaaacag aaatcctgtc tgacgatctg actgacaagg ccgaggtgtc cgaaggcaag 1920 gcaaaatctg tcggagaggc agaagacgga ccagagggac gaggggatgg aacctgcgag 1980 gaaggctcaa gcggggctga gcattggcag gacgaggaac gagagaaggg cgaaaaggat 2040 aaaggccgcg gggagatgga acgacctgga gagggcgaaa aagagctggc agagaaggag 2100 gaatggaaga aaagggacgg cgaggaacag gagcagaaag aaagggagca gggccaccag 2160 aaggagcgca accaggagat ggaagagggc ggcgaggaag agcatggcga gggagaagag 2220 gaagagggcg atagagaaga ggaagaggaa aaagaaggcg aagggaagga ggaaggagag 2280 ggcgaggaag tggaaggcga gagggaaaag gaggaaggag aacggaagaa agaggaaaga 2340 gccggcaaag aggaaaaggg cgaggaagag ggcgatcagg gcgaaggcga ggaggaagag 2400 accgagggcc gcggggaaga gaaagaggag ggaggagagg tggagggcgg agaggtcgaa 2460 gagggaaagg gcgagcgcga agaggaagag gaagagggcg agggcgagga agaagagggc 2520 gagggggaag aagaggaggg agagggcgaa gaggaagagg gggagggaaa gggcgaagag 2580 gaaggagagg aaggggaggg agaggaagag ggggaggagg gcgaggggga aggcgaggag 2640 gaagaaggag agggggaagg cgaagaggaa ggcgaggggg aaggagagga ggaagaaggg 2700 gaaggcgaag gcgaagagga gggagaagga gagggggagg aagaggaagg agaagggaag 2760 ggcgaggagg aaggcgaaga gggagagggg gaaggcgagg aagaggaagg cgagggcgaa 2820 ggagaggacg gcgagggcga gggagaagag gaggaagggg aatgggaagg cgaagaagag 2880 gaaggcgaag gcgaaggcga agaagagggc gaaggggagg gcgaggaggg cgaaggcgaa 2940 ggggaggaag aggaaggcga aggagaaggc gaggaagaag agggagagga ggaaggcgag 3000 gaggaaggag agggggagga ggagggagaa ggcgagggcg aagaagaaga agagggagaa 3060 gtggagggcg aagtcgaggg ggaggaggga gaaggggaag gggaggaaga agagggcgaa 3120 gaagaaggcg aggaaagaga aaaagaggga gaaggcgagg aaaaccggag aaatagggaa 3180 gaggaggaag aggaagaggg aaagtaccag gagacaggcg aagaggaaaa cgagcggcag 3240 gatggcgagg aatataagaa agtgagcaag atcaaaggat ccgtcaagta cggcaagcac 3300 aaaacctatc agaagaaaag cgtgaccaac acacagggga atggaaaaga gcagaggagt 3360 aagatgcctg tgcagtcaaa acggctgctg aagaatggcc catctggaag taaaaaattc 3420 tggaacaatg tgctgcccca ctatctggaa ctgaaataa 3459 <210> 4 <211> 934 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> promoter sequence <400> 4 attgacgtca ataatgacgt atgttcccat agtaacgcca atagggactt tccattgacg 60 tcaatgggtg gagtatttac ggtaaactgc ccacttggca gtacatcaag tgtatcatat 120 gccaagtacg ccccctattg acgtcaatga cggtaaatgg cccgcctggc attatgccca 180 gtacatgacc ttatgggact ttcctacttg gcagtacatc tacgtattag tcatcgctat 240 taccatggtc gaggtgagcc ccacgttctg cttcactctc cccatctccc ccccctcccc 300 acccccaatt ttgtatttat ttatttttta attattttgt gcagcgatgg gggcgggggg 360 gggggggggg cgcgcgccag gcggggcggg gcggggcgag gggcggggcg gggcgaggcg 420 gagaggtgcg gcggcagcca atcagagcgg cgcgctccga aagtttcctt ttatggcgag 480 gcggcggcgg cggcggccct ataaaaagcg aagcgcgcgg cgggcgggag tcgctgcgcg 540 ctgccttcgc cccgtgcccc gctccgccgc cgcctcgcgc cgcccgcccc ggctctgact 600 gaccgcgtta ctcccacagg tgagcgggcg ggacggccct tctcctccgg gctgtaatta 660 gcgcttggtt taatgacggc ttgtttcttt tctgtggctg cgtgaaagcc ttgaggggct 720 ccgggagggc cctttgtgcg gggggagcgg ctcggggctg tccgcggggg gacggctgcc 780 ttcggggggg acggggcagg gcggggttcg gcttctggcg tgtgaccggc ggctctagag 840 cctctgctaa ccatgttcat gccttcttct ttttcctaca gctcctgggc aacgtgctgg 900 ttattgtgct gtctcatcat tttggcaaag aatt 934 <210> 5 <211> 270 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Bovine Growth Hormone poly-A signal sequence <400> 5 tcgctgatca gcctcgactg tgccttctag ttgccagcca tctgttgttt gcccctcccc 60 cgtgccttcc ttgaccctgg aaggtgccac tcccactgtc ctttcctaat aaaatgagga 120 aattgcatcg cattgtctga gtaggtgtca ttctattctg gggggtgggg tggggcagga 180 cagcaagggg gaggattggg aagacaatag caggcatgct ggggatgcgg tgggctctat 240 ggcttctgag gcggaaagaa ccagctgggg 270 <210> 6 <211> 588 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> woodchuck hepatitis postregulatory element (WPRE) example sequence <400> 6 atcaacctct ggattacaaa atttgtgaaa gattgactgg tattcttaac tatgttgctc 60 cttttacgct atgtggatac gctgctttaa tgcctttgta tcatgctatt gcttcccgta 120 tggctttcat tttctcctcc ttgtataaat cctggttgct gtctctttat gaggagttgt 180 ggcccgttgt caggcaacgt ggcgtggtgt gcactgtgtt tgctgacgca acccccactg 240 gttggggcat tgccaccacc tgtcagctcc tttccgggac tttcgctttc cccctcccta 300 ttgccacggc ggaactcatc gccgcctgcc ttgcccgctg ctggacaggg gctcggctgt 360 tgggcactga caattccgtg gtgttgtcgg ggaaatcatc gtcctttcct tggctgctcg 420 cctgtgttgc cacctggatt ctgcgcggga cgtccttctg ctacgtccct tcggccctca 480 atccagcgga ccttccttcc cgcggcctgc tgccggctct gcggcctctt ccgcgtcttc 540 gccttcgccc tcagacgagt cggatctccc tttgggccgc ctccccgc 588 <210> 7 <211> 199 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rhodopsin kinase (GRK1) promoter sequence <400> 7 gggccccaga agcctggtgg ttgtttgtcc ttctcagggg aaaagtgagg cggccccttg 60 gaggaagggg ccgggcagaa tgatctaatc ggattccaag cagctcaggg gattgtcttt 120 ttctagcacc ttcttgccac tcctaagcgt cctccgtgac cccggctggg atttagcctg 180 gtgctgtgtc agccccggg 199 <210> 8 <211> 235 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> interphotoreceptor retinoid-binding protein (IRBP) promoter sequence <400> 8 agcacagtgt ctggcatgta gcaggaacta aaataatggc agtgattaat gttatgatat 60 gcagacacaa cacagcaaga taagatgcaa tgtaccttct gggtcaaacc accctggcca 120 ctcctccccg atacccaggg ttgatgtgct tgaattagac aggattaaag gcttactgga 180 gctggaagcc ttgccccaac tcaggagttt agccccagac cttctgtcca ccagc 235 <210> 9 <211> 3003 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> a preferred RPGRORF15-encoding nucleotide sequence <400> 9 atgagagagc cagaggagct gatgccagac agtggagcag tgtttacatt cggaaaatct 60 aagttcgctg aaaataaccc aggaaagttc tggtttaaaa acgacgtgcc cgtccacctg 120 tcttgtggcg atgagcatag tgccgtggtc actgggaaca ataagctgta catgttcggg 180 tccaacaact ggggacagct ggggctggga tccaaatctg ctatctctaa gccaacctgc 240 gtgaaggcac tgaaacccga gaaggtcaaa ctggccgctt gtggcagaaa ccacactctg 300 gtgagcaccg agggcgggaa tgtctatgcc accggaggca acaatgaggg acagctggga 360 ctgggggaca ctgaggaaag gaataccttt cacgtgatct ccttctttac atctgagcat 420 aagatcaagc agctgagcgc tggctccaac acatctgcag ccctgactga ggacgggcgc 480 ctgttcatgt ggggagataa ttcagagggc cagattgggc tgaaaaacgt gagcaatgtg 540 tgcgtccctc agcaggtgac catcggaaag ccagtcagtt ggatttcatg tggctactat 600 catagcgcct tcgtgaccac agatggcgag ctgtacgtct ttggggagcc cgaaaacgga 660 aaactgggcc tgcctaacca gctgctgggc aatcaccgga caccccagct ggtgtccgag 720 atccctgaaa aagtgatcca ggtcgcctgc gggggagagc atacagtggt cctgactgag 780 aatgctgtgt ataccttcgg actgggccag tttggccagc tggggctggg aaccttcctg 840 tttgagacat ccgaaccaaa agtgatcgag aacattcgcg accagactat cagctacatt 900 tcctgcggag agaatcacac cgcactgatc acagacattg gcctgatgta tacctttggc 960 gatggacgac acgggaagct gggactggga ctggagaact tcactaatca ttttatcccc 1020 accctgtgtt ctaacttcct gcggttcatc gtgaaactgg tcgcttgcgg cgggtgtcac 1080 atggtggtct tcgctgcacc tcataggggc gtggctaagg agatcgaatt tgacgagatt 1140 aacgatacat gcctgagcgt ggcaactttc ctgccataca gctccctgac ttctggcaat 1200 gtgctgcaga gaaccctgag tgcaaggatg cggagaaggg agagggaacg ctctcctgac 1260 agtttctcaa tgcgacgaac cctgccacct atcgagggaa cactgggact gagtgcctgc 1320 ttcctgccta actcagtgtt tccacgatgt agcgagcgga atctgcagga gtctgtcctg 1380 agtgagcagg atctgatgca gccagaggaa cccgactacc tgctggatga gatgaccaag 1440 gaggccgaaa tcgacaactc tagtacagtg gagtccctgg gcgagactac cgatatcctg 1500 aatatgacac acattatgtc actgaacagc aatgagaaga gtctgaaact gtcaccagtg 1560 cagaagcaga agaaacagca gactattggc gagctgactc aggacaccgc cctgacagag 1620 aacgacgata gcgatgagta tgaggaaatg tccgagatga aggaaggcaa agcttgtaag 1680 cagcatgtca gtcaggggat cttcatgaca cagccagcca caactattga ggctttttca 1740 gacgaggaag tggagatccc cgaggaaaaa gagggcgcag aagattccaa ggggaatgga 1800 attgaggaac aggaggtgga agccaacgag gaaaatgtga aagtccacgg aggcaggaag 1860 gagaaaacag aaatcctgtc tgacgatctg actgacaagg ccgaggtgtc cgaaggcaag 1920 gcaaaatctg tcggagaggc agaagacgga ccagagggac gaggggatgg aacctgcgag 1980 gaaggctcaa gcggggctga gcattggcag gacgaggaac gagagaaggg cgaaaaggat 2040 aaaggccgcg gggagatgga acgacctgga gagggcgaaa aagagctggc agagaaggag 2100 gaatggaaga aaagggacgg cgaggaacag gagcagaaag aaagggagca gggccaccag 2160 aaggagcgca accaggagat ggaagagggc ggcgaggaag agcatggcga gggagaagag 2220 gaagagggcg atagagaaga ggaagaggaa aaagaaggcg aagggaagga ggaaggagag 2280 ggcgaggaag tggaaggcga gagggaaaag gaggaaggag aacggaagaa agaggaaaga 2340 gccggcaaag aggaaaaggg cgaggaagag ggcgatcagg gcgaaggcga ggaggaagag 2400 accgagggcc gcggggaaga gaaagaggag ggaggagagg tggagggcgg agaggtcgaa 2460 gagggaaagg gcgagcgcga agagggggag gaagaggaag gcgaaggaga aggcgaggaa 2520 gaagagggag aggaggaagg cgaggaggaa ggagaggggg aggaggaggg agaaggcgag 2580 ggcgaagaag aagaagaggg agaagtggag ggcgaagtcg agggggagga gggagaaggg 2640 gaaggggagg aagaagaggg cgaagaagaa ggcgaggaaa gagaaaaaga gggagaaggc 2700 gaggaaaacc ggagaaatag ggaagaggag gaagaggaag agggaaagta ccaggagaca 2760 ggcgaagagg aaaacgagcg gcaggatggc gaggaatata agaaagtgag caagatcaaa 2820 ggatccgtca agtacggcaa gcacaaaacc tatcagaaga aaagcgtgac caacacacag 2880 gggaatggaa aagagcagag gagtaagatg cctgtgcagt caaaacggct gctgaagaat 2940 ggcccatctg gaagtaaaaa attctggaac aatgtgctgc cccactatct ggaactgaaa 3000 taa 3003 <210> 10 <211> 456 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> deletion sequence <400> 10 gaagaggaag agggcgaggg cgaggaagaa gagggcgagg gggaagaaga ggagggagag 60 ggcgaagagg aagaggggga gggaaagggc gaagaggaag gagaggaagg ggagggagag 120 gaagaggggg aggagggcga gggggaaggc gaggaggaag aaggagaggg ggaaggcgaa 180 gaggaaggcg agggggaagg agaggaggaa gaaggggaag gcgaaggcga agaggaggga 240 gaaggagagg gggaggaaga ggaaggagaa gggaagggcg aggaggaagg cgaagaggga 300 gagggggaag gcgaggaaga ggaaggcgag ggcgaaggag aggacggcga gggcgaggga 360 gaagaggagg aaggggaatg ggaaggcgaa gaagaggaag gcgaaggcga aggcgaagaa 420 gagggcgaag gggagggcga ggagggcgaa ggcgaa 456 <210> 11 <211> 2517 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> a preferred RPGRORF15-encoding nucleotide sequence <400> 11 atgagagagc cagaggagct gatgccagac agtggagcag tgtttacatt cggaaaatct 60 aagttcgctg aaaataaccc aggaaagttc tggtttaaaa acgacgtgcc cgtccacctg 120 tcttgtggcg atgagcatag tgccgtggtc actgggaaca ataagctgta catgttcggg 180 tccaacaact ggggacagct ggggctggga tccaaatctg ctatctctaa gccaacctgc 240 gtgaaggcac tgaaacccga gaaggtcaaa ctggccgctt gtggcagaaa ccacactctg 300 gtgagcaccg agggcgggaa tgtctatgcc accggaggca acaatgaggg acagctggga 360 ctgggggaca ctgaggaaag gaataccttt cacgtgatct ccttctttac atctgagcat 420 aagatcaagc agctgagcgc tggctccaac acatctgcag ccctgactga ggacgggcgc 480 ctgttcatgt ggggagataa ttcagagggc cagattgggc tgaaaaacgt gagcaatgtg 540 tgcgtccctc agcaggtgac catcggaaag ccagtcagtt ggatttcatg tggctactat 600 catagcgcct tcgtgaccac agatggcgag ctgtacgtct ttggggagcc cgaaaacgga 660 aaactgggcc tgcctaacca gctgctgggc aatcaccgga caccccagct ggtgtccgag 720 atccctgaaa aagtgatcca ggtcgcctgc gggggagagc atacagtggt cctgactgag 780 aatgctgtgt ataccttcgg actgggccag tttggccagc tggggctggg aaccttcctg 840 tttgagacat ccgaaccaaa agtgatcgag aacattcgcg accagactat cagctacatt 900 tcctgcggag agaatcacac cgcactgatc acagacattg gcctgatgta tacctttggc 960 gatggacgac acgggaagct gggactggga ctggagaact tcactaatca ttttatcccc 1020 accctgtgtt ctaacttcct gcggttcatc gtgaaactgg tcgcttgcgg cgggtgtcac 1080 atggtggtct tcgctgcacc tcataggggc gtggctaagg agatcgaatt tgacgagatt 1140 aacgatacat gcctgagcgt ggcaactttc ctgccataca gctccctgac ttctggcaat 1200 gtgctgcaga gaaccctgag tgcaaggatg cggagaaggg agagggaacg ctctcctgac 1260 agtttctcaa tgcgacgaac cctgccacct atcgagggaa cactgggact gagtgcctgc 1320 ttcctgccta actcagtgtt tccacgatgt agcgagcgga atctgcagga gtctgtcctg 1380 agtgagcagg atctgatgca gccagaggaa cccgactacc tgctggatga gatgaccaag 1440 gaggccgaaa tcgacaactc tagtacagtg gagtccctgg gcgagactac cgatatcctg 1500 aatatgacac acattatgtc actgaacagc aatgagaaga gtctgaaact gtcaccagtg 1560 cagaagcaga agaaacagca gactattggc gagctgactc aggacaccgc cctgacagag 1620 aacgacgata gcgatgagta tgaggaaatg tccgagatga aggaaggcaa agcttgtaag 1680 cagcatgtca gtcaggggat cttcatgaca cagccagcca caactattga ggctttttca 1740 gacgaggaag tggagatccc cgaggaaaaa gagggcgcag aagattccaa ggggaatgga 1800 attgaggaac aggaggtgga agccaacgag gaaaatgtga aagtccacgg aggcaggaag 1860 gagaaaacag aaatcctgtc tgacgatctg actgacaagg ccgaggtgtc cgaaggcaag 1920 gcaaaatctg tcggagaggc agaagacgga ccagagggac gaggggatgg aacctgcgag 1980 gaaggctcaa gcggggctga gcattggcag gacgaggaac gagagaaggg cgaaaaggat 2040 aaaggccgcg gggagatgga acgacctgga gagggcgaaa aagaggaagg cgagggcgaa 2100 gaagaagaag agggagaagt ggagggcgaa gtcgaggggg aggagggaga aggggaaggg 2160 gaggaagaag agggcgaaga agaaggcgag gaaagagaaa aagagggaga aggcgaggaa 2220 aaccggagaa atagggaaga ggaggaagag gaagagggaa agtaccagga gacaggcgaa 2280 gaggaaaacg agcggcagga tggcgaggaa tataagaaag tgagcaagat caaaggatcc 2340 gtcaagtacg gcaagcacaa aacctatcag aagaaaagcg tgaccaacac acaggggaat 2400 ggaaaagagc agaggagtaa gatgcctgtg cagtcaaaac ggctgctgaa gaatggccca 2460 tctggaagta aaaaattctg gaacaatgtg ctgccccact atctggaact gaaataa 2517 <210> 12 <211> 942 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> deletion sequence <400> 12 ctggcagaga aggaggaatg gaagaaaagg gacggcgagg aacaggagca gaaagaaagg 60 gagcagggcc accagaagga gcgcaaccag gagatggaag agggcggcga ggaagagcat 120 ggcgagggag aagaggaaga gggcgataga gaagaggaag aggaaaaaga aggcgaaggg 180 aaggaggaag gagagggcga ggaagtggaa ggcgagaggg aaaaggagga aggagaacgg 240 aagaaagagg aaagagccgg caaagaggaa aagggcgagg aagagggcga tcagggcgaa 300 ggcgaggagg aagagaccga gggccgcggg gaagagaaag aggagggagg agaggtggag 360 ggcggagagg tcgaagaggg aaagggcgag cgcgaagagg aagaggaaga gggcgagggc 420 gaggaagaag agggcgaggg ggaagaagag gagggagagg gcgaagagga agagggggag 480 ggaaagggcg aagaggaagg agaggaaggg gagggagagg aagaggggga ggagggcgag 540 ggggaaggcg aggaggaaga aggagagggg gaaggcgaag aggaaggcga gggggaagga 600 gaggaggaag aaggggaagg cgaaggcgaa gaggagggag aaggagaggg ggaggaagag 660 gaaggagaag ggaagggcga ggaggaaggc gaagagggag agggggaagg cgaggaagag 720 gaaggcgagg gcgaaggaga ggacggcgag ggcgagggag aagaggagga aggggaatgg 780 gaaggcgaag aagaggaagg cgaaggcgaa ggcgaagaag agggcgaagg ggagggcgag 840 gagggcgaag gcgaagggga ggaagaggaa ggcgaaggag aaggcgagga agaagaggga 900 gaggaggaag gcgaggagga aggagagggg gaggaggagg ga 942 <210> 13 <211> 3081 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> a preferred RPGRORF15-encoding nucleotide sequence <400> 13 atgagagagc cagaggagct gatgccagac agtggagcag tgtttacatt cggaaaatct 60 aagttcgctg aaaataaccc aggaaagttc tggtttaaaa acgacgtgcc cgtccacctg 120 tcttgtggcg atgagcatag tgccgtggtc actgggaaca ataagctgta catgttcggg 180 tccaacaact ggggacagct ggggctggga tccaaatctg ctatctctaa gccaacctgc 240 gtgaaggcac tgaaacccga gaaggtcaaa ctggccgctt gtggcagaaa ccacactctg 300 gtgagcaccg agggcgggaa tgtctatgcc accggaggca acaatgaggg acagctggga 360 ctgggggaca ctgaggaaag gaataccttt cacgtgatct ccttctttac atctgagcat 420 aagatcaagc agctgagcgc tggctccaac acatctgcag ccctgactga ggacgggcgc 480 ctgttcatgt ggggagataa ttcagagggc cagattgggc tgaaaaacgt gagcaatgtg 540 tgcgtccctc agcaggtgac catcggaaag ccagtcagtt ggatttcatg tggctactat 600 catagcgcct tcgtgaccac agatggcgag ctgtacgtct ttggggagcc cgaaaacgga 660 aaactgggcc tgcctaacca gctgctgggc aatcaccgga caccccagct ggtgtccgag 720 atccctgaaa aagtgatcca ggtcgcctgc gggggagagc atacagtggt cctgactgag 780 aatgctgtgt ataccttcgg actgggccag tttggccagc tggggctggg aaccttcctg 840 tttgagacat ccgaaccaaa agtgatcgag aacattcgcg accagactat cagctacatt 900 tcctgcggag agaatcacac cgcactgatc acagacattg gcctgatgta tacctttggc 960 gatggacgac acgggaagct gggactggga ctggagaact tcactaatca ttttatcccc 1020 accctgtgtt ctaacttcct gcggttcatc gtgaaactgg tcgcttgcgg cgggtgtcac 1080 atggtggtct tcgctgcacc tcataggggc gtggctaagg agatcgaatt tgacgagatt 1140 aacgatacat gcctgagcgt ggcaactttc ctgccataca gctccctgac ttctggcaat 1200 gtgctgcaga gaaccctgag tgcaaggatg cggagaaggg agagggaacg ctctcctgac 1260 agtttctcaa tgcgacgaac cctgccacct atcgagggaa cactgggact gagtgcctgc 1320 ttcctgccta actcagtgtt tccacgatgt agcgagcgga atctgcagga gtctgtcctg 1380 agtgagcagg atctgatgca gccagaggaa cccgactacc tgctggatga gatgaccaag 1440 gaggccgaaa tcgacaactc tagtacagtg gagtccctgg gcgagactac cgatatcctg 1500 aatatgacac acattatgtc actgaacagc aatgagaaga gtctgaaact gtcaccagtg 1560 cagaagcaga agaaacagca gactattggc gagctgactc aggacaccgc cctgacagag 1620 aacgacgata gcgatgagta tgaggaaatg tccgagatga aggaaggcaa agcttgtaag 1680 cagcatgtca gtcaggggat cttcatgaca cagccagcca caactattga ggctttttca 1740 gacgaggaag tggagatccc cgaggaaaaa gagggcgcag aagattccaa ggggaatgga 1800 attgaggaac aggaggtgga agccaacgag gaaaatgtga aagtccacgg aggcaggaag 1860 gagaaaacag aaatcctgtc tgacgatctg actgacaagg ccgaggtgtc cgaaggcaag 1920 gcaaaatctg tcggagaggc agaagacgga ccagagggac gaggggatgg aacctgcgag 1980 gaaggctcaa gcggggctga gcattggcag gacgaggaac gagagaaggg cgaaaaggat 2040 aaaggccgcg gggagatgga acgacctgga gagggcgaaa aagagctggc agagaaggag 2100 gaatggaaga aaagggacgg cgaggaacag gagcagaaag aaagggagca gggccaccag 2160 aaggagcgca accaggagat ggaagagggc ggcgaggaag agcatggcga gggagaagag 2220 gaagagggcg atagagaaga ggaagaggaa aaagaaggcg aagggaagga ggaaggagag 2280 ggcgaggaag tggaaggcga gagggaaaag gaggaaggag aacggaagaa agaggaaaga 2340 gccggcaaag aggaaaaggg cgaggaagag ggcgatcagg gcgaaggcga ggaggaagag 2400 accgagggcc gcggggaaga gaaagaggag ggaggagagg tggagggcgg agaggtcgaa 2460 gagggaaagg gcgagcgcga agaggaagag gaagagggcg agggcgagga agaagagggc 2520 gagggggaag aagaggaggg agagggcgaa gaggaagagg gggagggaaa gggcgaagag 2580 gaaggagaag gcgaggaaga agagggagag gaggaaggcg aggaggaagg agagggggag 2640 gaggagggag aaggcgaggg cgaagaagaa gaagagggag aagtggaggg cgaagtcgag 2700 ggggaggagg gagaagggga aggggaggaa gaagagggcg aagaagaagg cgaggaaaga 2760 gaaaaagagg gagaaggcga ggaaaaccgg agaaataggg aagaggagga agaggaagag 2820 ggaaagtacc aggagacagg cgaagaggaa aacgagcggc aggatggcga ggaatataag 2880 aaagtgagca agatcaaagg atccgtcaag tacggcaagc acaaaaccta tcagaagaaa 2940 agcgtgacca acacacaggg gaatggaaaa gagcagagga gtaagatgcc tgtgcagtca 3000 aaacggctgc tgaagaatgg cccatctgga agtaaaaaat tctggaacaa tgtgctgccc 3060 cactatctgg aactgaaata a 3081 <210> 14 <211> 378 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> deletion sequence <400> 14 ggagaggaag gggagggaga ggaagagggg gaggagggcg agggggaagg cgaggaggaa 60 gaaggagagg gggaaggcga agaggaaggc gagggggaag gagaggagga agaaggggaa 120 ggcgaaggcg aagaggaggg agaaggagag ggggaggaag aggaaggaga agggaagggc 180 gaggaggaag gcgaagaggg agagggggaa ggcgaggaag aggaaggcga gggcgaagga 240 gaggacggcg agggcgaggg agaagaggag gaaggggaat gggaaggcga agaagaggaa 300 ggcgaaggcg aaggcgaaga agagggcgaa ggggagggcg aggagggcga aggcgaaggg 360 gaggaagagg aaggcgaa 378

Claims

색소성망막염 GTPase 조절인자 ORF15 아이소형(RPGR^ORF15)을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드로서, RPGR^ORF15-인코딩 뉴클레오티드 서열이 서열의 복제 정확도를 증가시키기 위해 코돈 최적화된, 폴리뉴클레오티드.
제1항에 있어서, RPGR^ORF15-인코딩 뉴클레오티드 서열이 야생형 서열에 비해 퓨린 뉴클레오티드의 수를 감소시키기 위해 코돈 최적화된 폴리뉴클레오티드.
제1항 또는 제2항에 있어서, 인코딩된 RPGR^ORF15 단백질이 인간 RPGR^ORF15인 폴리뉴클레오티드.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, RPGR^ORF15-인코딩 뉴클레오티드 서열이 SEQ ID NO:2의 뉴클레오티드 33, 58, 59, 114, 123, 129, 181, 182, 213, 219, 226, 227, 237, 267, 285, 306, 309, 315, 324, 330, 339, 400, 401, 444, 456, 478, 480, 510, 594, 606, 618, 639, 697, 726, 744, 777, 807, 852, 877, 879, 888, 891, 921, 930, 960, 1042, 1050, 1116, 1140, 1183, 1184, 1194, 1197, 1221, 1249, 1251, 1257, 1273, 1276, 1281, 1290, 1293, 1357, 1372, 1373, 1413, 1446, 1452, 1464, 1474, 1475, 1482, 1519, 1520, 1542, 1584, 1590, 1599, 1608, 1653, 1668, 1674, 1689, 1692, 1734, 1761, 1776, 1788, 1803, 1824, 1845, 1854, 1881, 1893, 1902, 1909, 1910, 1929, 1932, 1960, 1987, 1988, 1992, 1998, 2020, 2031, 2047, 2049, 2062, 2067, 2076, 2121, 2167, 2169, 2190, 2193, 2208, 2229, 2259, 2283, 2298, 2323, 2343, 2346, 2361, 2373, 2382, 2388, 2403, 2409, 2410, 2412, 2448, 2457, 2472, 2476, 2478, 2505, 2520, 2547, 2574, 2622, 2634, 2661, 2673, 2706, 2712, 2763, 2775, 2796, 2811, 2817, 2832, 2838, 2871, 2886, 2892, 2898, 2910, 2922, 2931, 2937, 2958, 2970, 2997, 3033, 3039, 3069, 3075, 3117, 3129, 3156, 3166, 3235, 3246, 3273, 3285, 3306, 3321, 3369, 3399, 3405 및/또는 3438에 해당하는 위치에서 퓨린 뉴클레오티드를 포함하지 않는 폴리뉴클레오티드.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, RPGR^ORF15-인코딩 뉴클레오티드 서열이 SEQ ID NO:2의 뉴클레오티드 1689 및/또는 3438에 해당하는 위치에서 퓨린 뉴클레오티드를 포함하지 않는 폴리뉴클레오티드.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, RPGR^ORF15-인코딩 뉴클레오티드 서열이 SEQ ID NO:2의 위치 3405에 해당하는 위치에서 T 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, RPGR^ORF15-인코딩 뉴클레오티드 서열이 제4항에 나열된 뉴클레오티드 위치 중 적어도 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180개 또는 전부에서 퓨린 뉴클레오티드를 포함하지 않는 폴리뉴클레오티드.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, RPGR^ORF15-인코딩 뉴클레오티드 서열이 제4항에 나열된 뉴클레오티드 위치 중 적어도 전부에서 퓨린 뉴클레오티드를 포함하지 않는 폴리뉴클레오티드.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, RPGR^ORF15-인코딩 뉴클레오티드 서열이 하기로 구성된 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드:
(a) SEQ ID NO:1과 적어도 80%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열; 및/또는
(b) SEQ ID NO:3과 적어도 80%의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열; 또는
(c) SEQ ID NO:3의 뉴클레오티드 서열.
제9항에 있어서, 상기 (a)의 아미노산 서열이 SEQ ID NO:1과 적어도 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100%의 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, RPGR^ORF15-인코딩 뉴클레오티드 서열이 SEQ ID NO:2의 위치 30에 해당하는 위치의 C, SEQ ID NO:2의 위치 33에 해당하는 위치의 T, SEQ ID NO:2의 위치 966에 해당하는 위치의 A, SEQ ID NO:2의 위치 969에 해당하는 위치의 A, SEQ ID NO:2의 위치 1011에 해당하는 위치의 T, SEQ ID NO:2의 위치 1014에 해당하는 위치의 T, SEQ ID NO:2의 위치 1029에 해당하는 위치의 T, SEQ ID NO:2의 위치 1299에 해당하는 위치의 A, SEQ ID NO:2의 위치 1689에 해당하는 위치의 C, SEQ ID NO:2의 위치 3363에 해당하는 위치의 G, SEQ ID NO:2의 위치 3405에 해당하는 위치의 T, SEQ ID NO:2의 위치 3408에 해당하는 위치의 A, SEQ ID NO:2의 위치 3409에 해당하는 위치의 A, SEQ ID NO:2의 위치 3410에 해당하는 위치의 G, SEQ ID NO:2의 위치 3432에 해당하는 위치의 G, SEQ ID NO:2의 위치 3438에 해당하는 위치의 C 및 SEQ ID NO:2의 위치 3456에 해당하는 위치의 A로부터 선택되는 하나 이상의 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, RPGR^ORF15-인코딩 뉴클레오티드 서열이 SEQ ID NO:2의 위치 30에 해당하는 위치의 C, SEQ ID NO:2의 위치 33에 해당하는 위치의 T, SEQ ID NO:2의 위치 48에 해당하는 위치의 A, SEQ ID NO:2의 위치 57에 해당하는 위치의 A, SEQ ID NO:2의 위치 60에 해당하는 위치의 T, SEQ ID NO:2의 위치 69에 해당하는 위치의 T, SEQ ID NO:2의 위치 72에 해당하는 위치의 A, SEQ ID NO:2의 위치 171에 해당하는 위치의 C, SEQ ID NO:2의 위치 189에 해당하는 위치의 C, SEQ ID NO:2의 위치 441에 해당하는 위치의 T, SEQ ID NO:2의 위치 537에 해당하는 위치의 T, SEQ ID NO:2의 위치 546에 해당하는 위치의 C, SEQ ID NO:2의 위치 786에 해당하는 위치의 T, SEQ ID NO:2의 위치 792에 해당하는 위치의 T, SEQ ID NO:2의 위치 966에 해당하는 위치의 A, SEQ ID NO:2의 위치 969에 해당하는 위치의 A, SEQ ID NO:2의 위치 990에 해당하는 위치의 A, SEQ ID NO:2의 위치 1011에 해당하는 위치의 T, SEQ ID NO:2의 위치 1014에 해당하는 위치의 T, SEQ ID NO:2의 위치 1029에 해당하는 위치의 T, SEQ ID NO:2의 위치 1299에 해당하는 위치의 A, SEQ ID NO:2의 위치 1689에 해당하는 위치의 C, SEQ ID NO:2의 위치 3355에 해당하는 위치의 A, SEQ ID NO:2의 위치 3357에 해당하는 위치의 G, SEQ ID NO:2의 위치 3363에 해당하는 위치의 G, SEQ ID NO:2의 위치 3403에 해당하는 위치의 T, SEQ ID NO:2의 위치 3404에 해당하는 위치의 C, SEQ ID NO:2의 위치 3405에 해당하는 위치의 T, SEQ ID NO:2의 위치 3408에 해당하는 위치의 A, SEQ ID NO:2의 위치 3409에 해당하는 위치의 A, SEQ ID NO:2의 위치 3410에 해당하는 위치의 G, SEQ ID NO:2의 위치 3432에 해당하는 위치의 G, SEQ ID NO:2의 위치 3438에 해당하는 위치의 C 및 SEQ ID NO:2의 위치 3456에 해당하는 위치의 A로부터 선택되는 하나 이상의 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열.
색소성망막염 GTPase 조절인자 ORF15 아이소형(RPGR^ORF15)을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열 또는 SEQ ID NO:1과 적어도 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100%의 동일성을 갖는 이의 기능성 변이체를 포함하는 폴리뉴클레오티드로서, 뉴클레오티드 서열이 SEQ ID NO:2의 위치 30에 해당하는 위치의 C, SEQ ID NO:2의 위치 33에 해당하는 위치의 T, SEQ ID NO:2의 위치 966에 해당하는 위치의 A, SEQ ID NO:2의 위치 969에 해당하는 위치의 A, SEQ ID NO:2의 위치 1011에 해당하는 위치의 T, SEQ ID NO:2의 위치 1014에 해당하는 위치의 T, SEQ ID NO:2의 위치 1029에 해당하는 위치의 T, SEQ ID NO:2의 위치 1299에 해당하는 위치의 A, SEQ ID NO:2의 위치 1689에 해당하는 위치의 C, SEQ ID NO:2의 위치 3363에 해당하는 위치의 G, SEQ ID NO:2의 위치 3405에 해당하는 위치의 T, SEQ ID NO:2의 위치 3408에 해당하는 위치의 A, SEQ ID NO:2의 위치 3409에 해당하는 위치의 A, SEQ ID NO:2의 위치 3410에 해당하는 위치의 G, SEQ ID NO:2의 위치 3432에 해당하는 위치의 G, SEQ ID NO:2의 위치 3438에 해당하는 위치의 C 및 SEQ ID NO:2의 위치 3456에 해당하는 위치의 A로부터 선택되는 하나 이상의 뉴클레오티드를 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
색소성망막염 GTPase 조절인자 ORF15 아이소형(RPGR^ORF15)을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열 또는 SEQ ID NO:1과 적어도 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100%의 동일성을 갖는 이의 기능성 변이체를 포함하는 폴리뉴클레오티드로서, 뉴클레오티드 서열이 하기로 구성된 군으로부터 선택되는, 폴리뉴클레오티드:
(a) SEQ ID NO:3과 적어도 80%의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열로서, 상기 서열이 SEQ ID NO:2의 위치 30에 해당하는 위치의 C, SEQ ID NO:2의 위치 33에 해당하는 위치의 T, SEQ ID NO:2의 위치 48에 해당하는 위치의 A, SEQ ID NO:2의 위치 57에 해당하는 위치의 A, SEQ ID NO:2의 위치 60에 해당하는 위치의 T, SEQ ID NO:2의 위치 69에 해당하는 위치의 T, SEQ ID NO:2의 위치 72에 해당하는 위치의 A, SEQ ID NO:2의 위치 171에 해당하는 위치의 C, SEQ ID NO:2의 위치 189에 해당하는 위치의 C, SEQ ID NO:2의 위치 441에 해당하는 위치의 T, SEQ ID NO:2의 위치 537에 해당하는 위치의 T, SEQ ID NO:2의 위치 546에 해당하는 위치의 C, SEQ ID NO:2의 위치 786에 해당하는 위치의 T, SEQ ID NO:2의 위치 792에 해당하는 위치의 T, SEQ ID NO:2의 위치 966에 해당하는 위치의 A, SEQ ID NO:2의 위치 969에 해당하는 위치의 A, SEQ ID NO:2의 위치 990에 해당하는 위치의 A, SEQ ID NO:2의 위치 1011에 해당하는 위치의 T, SEQ ID NO:2의 위치 1014에 해당하는 위치의 T, SEQ ID NO:2의 위치 1029에 해당하는 위치의 T, SEQ ID NO:2의 위치 1299에 해당하는 위치의 A, SEQ ID NO:2의 위치 1689에 해당하는 위치의 C, SEQ ID NO:2의 위치 3355에 해당하는 위치의 A, SEQ ID NO:2의 위치 3357에 해당하는 위치의 G, SEQ ID NO:2의 위치 3363에 해당하는 위치의 G, SEQ ID NO:2의 위치 3403에 해당하는 위치의 T, SEQ ID NO:2의 위치 3404에 해당하는 위치의 C, SEQ ID NO:2의 위치 3405에 해당하는 위치의 T, SEQ ID NO:2의 위치 3408에 해당하는 위치의 A, SEQ ID NO:2의 위치 3409에 해당하는 위치의 A, SEQ ID NO:2의 위치 3410에 해당하는 위치의 G, SEQ ID NO:2의 위치 3432에 해당하는 위치의 G, SEQ ID NO:2의 위치 3438에 해당하는 위치의 C 및 SEQ ID NO:2의 위치 3456에 해당하는 위치의 A로부터 선택되는 하나 이상의 뉴클레오티드를 포함하는, 뉴클레오티드 서열; 또는
및
(b) SEQ ID NO:3의 뉴클레오티드 서열.
제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, RPGR^ORF15-인코딩 뉴클레오티드 서열이 인간 막대 및 원뿔 광수용체 세포에서 RPGR^ORF15 또는 이의 기능성 변이체의 발현을 유도할 수 있는 프로모터 요소를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드.
제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, RPGR^ORF15-인코딩 뉴클레오티드 서열이 로돕신 키나제(GRK1) 프로모터, 바람직하게는 인간 GRK1 프로모터에 작동 가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드.
제16항에 있어서, 상기 GRK1 프로모터가 SEQ ID NO:7의 뉴클레오티드 서열 또는 이와 적어도 90 또는 95%의 동일성을 갖는 기능성 변이체를 포함하는 폴리뉴클레오티드.
제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, RPGR^ORF15-인코딩 뉴클레오티드 서열이 165개 미만의 CpG 디뉴클레오티드를 포함하고/하거나 2개 이하의 CpG 섬(island)을 포함하는 폴리뉴클레오티드.
제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드가 SEQ ID NO:2의 인간 야생형 RPGR^ORF15를 포함하는 동등한 폴리뉴클레오티드에 비해 실질적으로 동일하거나 증가된 복제 정확도를 갖는 폴리뉴클레오티드.
제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드가 SEQ ID NO:2의 인간 야생형 RPGR^ORF15를 포함하는 동등한 폴리뉴클레오티드에 비해 증가된 안정성을 갖고/갖거나 폴리뉴클레오티드 복제 주기 동안 돌연변이가 덜 발생하는 경향이 있는 폴리뉴클레오티드.
제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드가 SEQ ID NO:2의 인간 야생형 RPGR^ORF15를 포함하는 동등한 폴리뉴클레오티드에 비해 번역 및/또는 단백질 발현의 높은 비율을 제공하는 폴리뉴클레오티드.
제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드가 SEQ ID NO:2의 인간 야생형 RPGR^ORF15를 포함하는 동등한 폴리뉴클레오티드에 비해 대안적으로 스플라이싱된 변이체 및/또는 트렁케이션된 단백질의 생성을 감소시키거나 피하는 폴리뉴클레오티드.
제1항 내지 제22항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 바이러스 벡터.
제23항에 있어서, 바이러스 벡터가 아데노-관련 바이러스(AAV), 레트로바이러스, 렌티바이러스 또는 아데노바이러스 벡터인 바이러스 벡터.
제23항 또는 제24항에 있어서, 바이러스 벡터가 AAV 벡터인 바이러스 벡터.
제23항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 바이러스 벡터가 바이러스 입자의 형태인 바이러스 벡터.
제26항에 있어서, 바이러스 벡터가 캡시드전이된(transcapsidated) AAV 벡터인 바이러스 벡터.
제26항에 있어서, 바이러스 벡터가 AAV2 유전체 및 AAV5(AAV2/5) 또는 AAV8(AAV2/8) 캡시드 단백질을 포함하는 바이러스 벡터.
제25항 또는 제26항에 있어서, 바이러스 벡터가 AAV2 유전체 및/또는 AAV8 캡시드 단백질을 포함하는 AAV 벡터인 AAV 벡터.
바이러스 벡터의 생성에 필요한 성분을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 세트를 포함하는 바이러스 벡터 생성 시스템으로서, 바이러스 벡터 유전체가 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 바이러스 벡터 생성 시스템.
제1항 내지 제22항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제30항의 바이러스 벡터 생성 시스템에서 사용하기 위한 DNA 작제물.
제1항 내지 제22항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드, 제30항의 바이러스 벡터 생성 시스템, 또는 제31항의 DNA 작제물을 포함하는 바이러스 벡터 생성 세포.
제1항 내지 제22항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드를 세포에 도입하는 단계 및 바이러스 벡터의 생성에 적합한 조건하에서 세포를 배양하는 단계를 포함하는 바이러스 벡터를 생성하기 위한 방법.
제32항의 바이러스 벡터 생성 세포를 이용하거나, 제33항의 방법에 의해 획득 가능한 바이러스 벡터.
제1항 내지 제22항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드로 형질감염되거나, 제23항 내지 제29항 또는 제34항 중 어느 한 항의 바이러스 벡터에 의해 형질도입된 세포.
제33항 또는 제35항에 있어서, 상기 세포가 HEK293 또는 HEK293T 세포인 방법 또는 세포.
약학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제와 조합된 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드, 제23항 내지 제29항 또는 제34항 중 어느 한 항의 바이러스 벡터, 또는 제35항의 세포를 포함하는 약학적 조성물.
색소성망막염을 치료하거나 예방하는데 사용하기 위한 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드 또는 제23항 내지 제29항 또는 제34항 중 어느 한 항의 바이러스 벡터.
색소성망막염으로 고통받거나 색소성망막염이 발생할 위험이 있는 대상체에서 광수용체 세포 사멸을 감소시키는데 사용하기 위한 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드 또는 제23항 내지 제29항 또는 제34항 중 어느 한 항의 바이러스 벡터.
제38항 또는 제39항에 있어서, 색소성망막염이 X-연관 색소성망막염인 폴리뉴클레오티드 또는 바이러스 벡터.
제38항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 바이러스 벡터가 망막하, 직접 망막 또는 유리체내 주사에 의해 대상체의 눈으로 투여되는 폴리뉴클레오티드 또는 바이러스 벡터.
제38항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 망막하 주사가 하기 단계를 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 바이러스 벡터:
(a) 망막을 적어도 부분적으로 박리시켜 망막하 수포를 형성시키는데 효과적인 양으로 용액을 망막하 주사에 의해 대상체에 투여하는 단계로서, 용액이 폴리뉴클레오티드 또는 바이러스 벡터를 포함하지 않는 단계; 및
(b) 단계 (a)에 의해 형성된 수포로 망막하 주사에 의해 약물 조성물을 투여하는 단계로서, 약물이 폴리뉴클레오티드 또는 바이러스 벡터를 포함하는 단계.
제38항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 바이러스 벡터가 단일 용량으로 대상체에 투여되는 폴리뉴클레오티드 또는 바이러스 벡터.
제38항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 색소성망막염으로 인한 광수용체 세포 변성이 대상체의 생애 동안 실질적으로 예방되는 폴리뉴클레오티드 또는 바이러스 벡터.
제38항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 시각 기능이 처리된 눈에서 실질적으로 회복되거나 유지되는 폴리뉴클레오티드 또는 바이러스 벡터.
제1항 내지 제22항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드 또는 제23항 내지 제29항 또는 제34항 중 어느 한 항의 바이러스 벡터를 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 색소성망막염을 치료하거나 예방하는 방법.
제1항 내지 제22항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드 또는 제23항 내지 제29항 또는 제34항 중 어느 한 항의 바이러스 벡터를 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 색소성망막염으로 고통받거나 색소성망막염이 발생할 위험이 있는 대상체에서 광수용체 세포 사멸을 감소시키는 방법.
(a) 야생형 RPGR^ORF15 유전자를 포함하는 벡터 또는 폴리뉴클레오티드에 비해 대안적으로 스플라이싱된 변이체 및/또는 트렁케이션된 RPGR^ORF15 단백질의 생성을 감소시키거나 피하고/하거나, (b) 야생형 RPGR^ORF15 유전자를 포함하는 뉴클레오티드 서열에 비해 RPGR^ORF15 유전자를 포함하는 뉴클레오티드 서열의 복제 안정성 및/또는 정확도를 증가시키고/시키거나, (c) 야생형 RPGR^ORF15 유전자를 포함하는 벡터 또는 폴리뉴클레오티드에 비해 RPGR^ORF15 단백질의 번역 및/또는 단백질 발현의 더 높은 비율을 달성하고/하거나, (d) 야생형 RPGR^ORF15 유전자를 포함하는 뉴클레오티드 서열에 비해 RPGR^ORF15-인코딩 뉴클레오티드 서열의 수율을 증가시키기 위한, 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드 또는 제23항 내지 제 29항 또는 제34항 중 어느 한 항의 바이러스 벡터의 용도.