CN117337331A - 用于增强视觉功能的组合物和方法 - Google Patents

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CN117337331A CN202280035371.6A CN202280035371A CN117337331A CN 117337331 A CN117337331 A CN 117337331A CN 202280035371 A CN202280035371 A CN 202280035371A CN 117337331 A CN117337331 A CN 117337331A
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K·I·格林
R·M·科廷
E·帕斯特
X·任
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Abstract

本披露提供了通过向个体施用包含重组腺相关病毒(rAAV)载体的药物组合物来恢复或增强该个体的视觉功能的组合物和方法，该重组腺相关病毒(rAAV)载体具有编码中波长视锥视蛋白(MW‑视蛋白)的多核苷酸序列。MW‑视蛋白在该个体的视网膜细胞中表达，从而恢复或增强视觉功能。

Description

用于增强视觉功能的组合物和方法
背景技术
遗传性和年龄相关性视网膜变性疾病引起视杆和视锥光感受器的进行性丧失，从而导致失明。尽管丧失了视觉所需的感光细胞，但内视网膜的下游神经元仍然以功能状态存活，为光遗传学疗法提供了靶标。光遗传学方法具有某些限制，包括：a)在微生物视蛋白和化学工程化的哺乳动物受体中的光敏性非常低；b)在视网膜视蛋白中的动力学非常缓慢；以及c)缺少在非常宽的环境光水平范围内以高灵敏度提供自然视觉的适应机制。
因此，本领域需要治疗眼部障碍的改善的光遗传学方法。
发明内容
在本发明的一个方面，本披露提供了一种重组表达载体，其包含第一反向末端重复(ITR)多核苷酸序列、与编码中波长视锥视蛋白(MW-视蛋白)转基因的多核苷酸序列可操作地连接的启动子多核苷酸序列、多聚A多核苷酸序列和第二ITR多核苷酸序列。在另一方面，本披露提供了一种重组表达载体，其包含第一反向末端重复(ITR)多核苷酸序列、与编码中波长视锥视蛋白(MW-视蛋白)转基因的多核苷酸序列可操作地连接的启动子多核苷酸序列、增强子多核苷酸序列、多聚A多核苷酸序列和第二ITR多核苷酸序列。在另一方面，本披露提供了一种重组表达载体，其包含第一反向末端重复(ITR)多核苷酸序列、与编码中波长视锥视蛋白(MW-视蛋白)转基因的多核苷酸序列可操作地连接的启动子多核苷酸序列、多聚A多核苷酸序列、内含子多核苷酸序列和第二ITR多核苷酸序列。在另一方面，本披露提供了一种重组表达载体，其包含第一反向末端重复(ITR)多核苷酸序列、与编码中波长视锥视蛋白(MW-视蛋白)转基因的多核苷酸序列可操作地连接的启动子多核苷酸序列、增强子多核苷酸序列、多聚A多核苷酸序列、内含子多核苷酸序列和第二ITR多核苷酸序列。
在一个实施例中，第一ITR多核苷酸序列包含SEQ ID NO:1的序列。在一个实施例中，启动子多核苷酸序列包含SEQ ID NO:2的序列。在一个实施例中，编码MW-视蛋白转基因的多核苷酸序列经过密码子优化，使得与野生型MW-视蛋白转基因相比，从该MW-视蛋白转基因翻译的MW-视蛋白以更大的量产生。在一个实施例中，编码MW-视蛋白转基因的多核苷酸序列包含与SEQ ID NO:3的序列85％相同的序列。在一个实施例中，编码MW-视蛋白转基因的多核苷酸序列包含与SEQ ID NO:3的序列90％相同的序列。在一个实施例中，编码MW-视蛋白转基因的多核苷酸序列包含SEQ ID NO:3的序列。在一个实施例中，增强子多核苷酸序列包含SEQ ID NO:4的序列。在一个实施例中，多聚A多核苷酸序列包含SEQ ID NO:5的序列。在一个实施例中，内含子多核苷酸序列包含SEQ ID NO:6的序列。在一个实施例中，第二ITR多核苷酸序列包含SEQ ID NO:7的序列。在一个实施例中，重组表达载体进一步包含赋予抗生素抗性的多核苷酸序列。在特定的实施例中，抗生素是卡那霉素。在特定的实施例中，重组表达载体包含SEQ ID NO:8的序列。在特定的实施例中，重组表达载体包含SEQ IDNO:9的序列。
在一个实施例中，重组表达载体是重组病毒载体。在特定的实施例中，重组病毒载体是腺相关病毒载体、慢病毒载体、单纯疱疹病毒载体或逆转录病毒载体。在特定的实施例中，重组病毒载体是腺相关病毒载体。在另一特定的实施例中，重组病毒载体是AAV2。在另一实施例中，重组腺相关病毒载体包含编码变体衣壳多肽的核苷酸序列，与野生型腺相关病毒衣壳相比，该变体衣壳多肽赋予增加的视网膜细胞感染性和/或赋予增加的穿过内界膜的能力。在另一实施例中，变体衣壳多肽具有选自由SEQ ID NO:10-197组成的组的序列。在另一实施例中，变体衣壳多肽具有选自由SEQ ID NO:10-20组成的组的序列。在另一实施例中，变体衣壳多肽具有SEQ ID NO:14的序列。在另一实施例中，变体衣壳多肽具有SEQ IDNO:15的序列。在另一实施例中，变体衣壳多肽具有SEQ ID NO:16的序列。
在本发明的另一方面，本披露提供了一种恢复或增强个体的视觉功能的方法，该方法包括向该个体施用上述重组表达载体，其中该施用提供了MW-视蛋白转基因在个体的视网膜细胞中的表达以及视觉功能的恢复或增强。在一个实施例中，MW-视蛋白转基因在视网膜细胞中的表达提供了个体的模式化视觉和图像识别。在另一实施例中，图像识别是静态图像或模式的图像识别。在又另一实施例中，图像识别是运动图像或模式的图像识别。在一个实施例中，MW-视蛋白转基因在视网膜细胞中的表达提供了在空间模式辨别测定中区分包含垂直线的图像和包含水平线的图像。在另一个实施例中，MW-视蛋白转基因在视网膜细胞中的表达提供了在空间模式辨别测定中区分包含静态线的图像和包含移动线的图像。在另一个实施例中，MW-视蛋白转基因在视网膜细胞中的表达提供了在时间光模式测定中区分闪光和恒定光。在一个实施例中，MW-视蛋白转基因在视网膜细胞中的表达提供了在图像识别测定中在约104W/cm2至约10W/cm2的光强度下识别图像。在一个实施例中，MW-视蛋白转基因在视网膜细胞中的表达提供了在避光测定中区分具有白光的区域和没有白光的区域。在一个实施例中，MW-视蛋白转基因在视网膜细胞中的表达提供了在如下光强度下的图像识别，该光强度比在视网膜细胞中表达通道视紫红质多肽的个体提供图像识别所需的光强度低至少10倍。在一个实施例中，MW-视蛋白转基因在视网膜细胞中的表达提供了如下动力学，该动力学比视紫红质多肽赋予视网膜细胞的动力学快至少2倍。在某些实施例中，经由眼内、玻璃体内或视网膜下注射来施用。
在一些实施例中，个体患有选自以下的眼部疾病：视网膜色素变性、黄斑变性、地图样萎缩、年龄相关性黄斑变性、视网膜劈裂症、莱伯氏先天性黑蒙(Leber's CongenitalAmaurosis)、视锥视杆营养不良、巴尔得-别德尔综合征、无脉络膜症、厄舍综合征、眼底黄色斑点症(Stargardt disease)和别蒂结晶样营养障碍(Bietti crystallinedystrophy)。在其他实施例中，个体由于创伤、头部损伤或作为另一种疾病的并发症(例如糖尿病性视网膜病变)经历视网膜脱离或光感受器丧失。
本发明的另一方面提供了一种包含上述重组表达载体和药学上可接受的赋形剂的药物组合物。在一个实施例中，药学上可接受的赋形剂包含盐水。在另一实施例中，组合物是无菌的。
在另一方面，本披露提供了如上所描述的重组表达载体或如上所描述的药物组合物，其用于治疗有需要的受试者。在一个实施例中，如上所描述的重组表达载体或如上所描述的药物组合物恢复或增强受试者的视觉功能。在另一方面，本披露提供了如上所描述的重组表达载体或如上所描述的药物组合物，其用于制造药物、或用于恢复或增强视觉功能、或用于治疗眼部疾病。
在另一方面，本披露提供了包含如上所描述的重组表达载体的宿主细胞。在另一方面，本披露提供了一种制备如上所描述的重组表达载体的方法，其中该方法包括培养如上所描述的宿主细胞、裂解培养的宿主细胞、和从裂解的培养的宿主细胞中提取和纯化重组表达载体。在另一方面，本披露提供了一种制备如上所描述的药物组合物的方法，其中该方法包括培养如上所描述的宿主细胞、收集培养的宿主细胞的上清液、从收集的上清液中浓缩和纯化重组病毒载体、以及向纯化的重组病毒载体中添加药学上可接受的赋形剂。
在另一方面，本披露提供了一种治疗眼部疾病的方法，该眼部疾病选自视网膜色素变性、黄斑变性、地图样萎缩、年龄相关性黄斑变性、视网膜劈裂症、莱伯氏先天性黑蒙、视锥视杆营养不良、巴尔得-别德尔综合征、无脉络膜症、厄舍综合征、眼底黄色斑点症或别蒂结晶样营养障碍，其中该方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的如上所描述的重组表达载体或如上所描述的药物组合物。在另一实施例中，眼部疾病是视网膜色素变性。在又另一实施例中，眼部疾病是地图样萎缩。
附图说明
图1提供了SEQ ID NO:1-2的多核苷酸序列。
图2提供了SEQ ID NO:3-5的多核苷酸序列。
图3提供了SEQ ID NO:6-7的多核苷酸序列。
图4A-4B提供了SEQ ID NO:8的多核苷酸序列。
图5A-5D提供了SEQ ID NO:9的多核苷酸序列。
图6提供了用REV_Kan转染，然后进行免疫组织化学的293T细胞的荧光图像。
图7提供了ITR稳定性评价研究的示意图。
图8提供了XmaI消化后含有REV_Kan载体的成像的琼脂糖电泳凝胶。当XmaI限制性位点存在于REV_Kan ITR中时，观察到大小为3257、2798和1734bp的DNA片段。
图9示出了使用与反义探针和有义探针的原位杂交在食蟹猴眼中的示例性载体转导。显示了来自一只测试动物(高剂量组，@4.5×1011vg/眼)的具有反义和有义ISH(黑色信号)的眼切片的代表性全载玻片视图。注意反义ISH信号存在于中央视网膜的多灶性区域，但更均匀分布在周边视网膜(如*所示)、睫状体、虹膜、虹膜角膜角、晶状体囊和视神经中。有义ISH信号的定位模式与反义ISH相似。眼切片显示出中等水平的PPIB(内源性对照)和DapB(细菌基因)mRNA信号阴性(未显示)。
图10示出了使用与反义探针和有义探针的原位杂交在眼的各种解剖区域中的示例性载体核酸信号。(A)显示了测试动物(高剂量组，@4.5×1011vg/眼)中眼的不同区域的反义ISH定位。反义ISH信号在黄斑和中央视网膜的多灶性区域中是丰富的，特别是在神经节细胞、神经纤维层、内网层和内核层中。有时，在外核层和光感受器中检测到反义ISH信号。在周边视网膜中更均匀地检测到ISH信号。轻度至中度水平的ISH信号存在于视神经、睫状体、虹膜、虹膜角膜角和晶状体囊后部中。(B)显示了测试动物(高剂量组，1@4.5x1011vg/眼)中眼的不同区域的有义ISH定位。有义ISH信号模式的定位与反义ISH相似。有义ISH信号在黄斑和中央视网膜的多灶性区域中是丰富的，特别是在神经节细胞和内核层细胞内。在周边视网膜中更均匀地检测到ISH信号。轻度至中度水平的ISH信号存在于睫状体、虹膜、虹膜角膜角和晶状体囊后部中。
图11提供了食蟹猴眼的不同区域中(A)反义ISH信号和(B)有义ISH信号的半定量评分。如方法部分中所描述，考虑每个细胞的ISH信号数和表达ISH信号的细胞百分比，开发了改进的H评分。注意到，高剂量组的ISH信号高于低剂量组，但同一剂量组的中期和终末处死动物之间没有显著差异。
图12示出了双重标记ISH实验中一些GRM6+双极细胞中的反义信号。测试动物的眼切片中的双重反义和GRM6 ISH标记实验。单丛实验显示GRM6(ON型双极细胞的标记)ISH信号(小图A中的信号)特异性地在内核层的外部条带中，而反义信号(小图B中的信号)在神经纤维层、神经节细胞、内网层和内核细胞中。如小图C(圆圈)所示，少数细胞显示反义和GRM6ISH信号的双重标记。
图13示出了通过AAV衣壳蛋白免疫染色在视网膜中的示例性载体转导。在神经节细胞核和外周视网膜的内核层注意到AAV衣壳免疫染色，表明示例性载体转导。显示的测试动物切片的代表性图像。晶状体囊和内界膜中衣壳蛋白的存在表明载体粘附于这些膜。
图14示出了示例性载体注射的食蟹猴的视网膜中的视蛋白免疫染色。显示了来自具有抗红/绿(又名长/中波)视蛋白免疫染色的测试动物的眼切片的代表性图像。用抗红/绿免疫染色证明在中央(黄斑)和周边视网膜以及睫状体中观察到MW-视蛋白。插图显示神经节细胞中的点状免疫染色。周边视网膜中的免疫染色跨越多灶性区域中的视神经视网膜的整个厚度，类似缪勒氏(Muller)细胞模式。睫状体和无色素上皮染色最少，但在视神经或眼的其他区域没有免疫染色。
具体实施方式
本披露涉及药物组合物、治疗眼部疾病或病症的方法，该方法包括通过眼内、玻璃体内或视网膜下注射将包含编码MW-视蛋白的多核苷酸序列(例如cDNA)的基因疗法、载体或构建体施用到灵长类动物(例如猴或人)的眼中。在眼内、玻璃体内或视网膜下注射包含编码MW-视蛋白的多核苷酸序列的基因疗法、载体或构建体时，MW-视蛋白转基因在靶细胞或组织中体内表达以产生MW-视蛋白或基因产物，从而产生治疗效果。
以下参考用于说明的实例应用来描述若干方面。应理解，阐述了许多具体细节、关系和方法以提供对本文描述的特征的全面理解。然而，相关领域的普通技术人员将容易认识到，可以在没有一个或多个具体细节的情况下或利用其他方法来实践本文描述的特征。本文描述的特征不受限于所示出的动作或事件的顺序，因为一些动作能以不同的顺序发生和/或与其他动作或事件同时发生。此外，并非需要所有示出的动作或事件来实现根据本文描述的特征的方法。本披露的术语仅用于描述特定情况，而不旨在限制本披露的伴随物、方法和组合物。
除非另有说明，否则如本文所描述的本披露的组合物和方法可以使用分子生物学(包括重组技术)、细胞生物学、生物化学、免疫化学和眼科技术的常规技术和描述，其在本领域技术人员的技能范围内。这样的常规技术包括用于观察和分析受试者的视网膜或视力、克隆和繁殖重组病毒、配制药物组合物以及生化纯化和免疫化学的方法。可以通过参考本文的实例来获得合适技术的具体说明。然而，当然也可使用等效的常规程序。这样的常规技术和描述可以在标准实验室手册中找到，例如Green等人编辑,Genome Analysis:ALaboratory Manual Series[基因组分析：实验室手册系列](卷I-IV)(1999)；Weiner等人编辑,Genetic Variation:A Laboratory Manual[遗传变异：实验室手册](2007)；Dieffenbach,Dveksler编辑,PCR Primer:A Laboratory Manual[PCR引物：实验室手册](2003)；Bowtell和Sambrook,DNA Microarrays:A Molecular Cloning Manual[DNA微阵列：分子克隆手册](2003)；Mount Bioinformatics:Sequence and Genome Analysis[安装生物信息学：序列和基因组分析](2004)；Sambrook和Russell,Condensed Protocols fromMolecular Cloning:A Laboratory Manual[来自分子克隆的精编方案：实验室手册](2006)；以及Sambrook和Russell,Molecular Cloning:A Laboratory Manual[分子克隆：实验室手册](2002)(所有来自冷泉港实验室出版社)；Stryer.L.,Biochemistry[生物化学](第4版)W.H.Freeman[W.H.弗里曼出版社],N.Y.(1995)；Gait,“OligonucleotideSynthesis:A Practical Approach[寡核苷酸合成：实用方法]”IRL Press[IRL出版社],伦敦(1984)；Nelson和Cox,Lehninger,Principles of Biochemistry[生物化学原理],第3版,W.H.Freeman Pub.[W.H.弗里曼出版社],纽约(2000)；以及Berg等人,Biochemistry[生物化学],第5版,W.H.Freeman Pub.[W.H.弗里曼出版社],纽约(2002)，所有这些出于所有目的通过引用以其全文并入本文。
本文使用的章节标题仅用于组织目的，而不应被解释为限制所描述的主题。
定义
除非另有定义，否则本文所使用的所有技术术语具有与本领域普通技术人员通常所理解的相同的含义。
本文所使用的术语仅用于描述特定情况，并不旨在限制。如本文所用的，单数形式“一个/种(a)”、“一个/种(an)”和“该”也旨在包括复数形式，除非上下文另有明确指出。此外，就在具体实施方式和/或权利要求中使用术语“包括(including)”、“包括(includes)”、“具有(having)”、“具有(has)”、“具有(with)”或其变体而言，这样的术语旨在以类似于术语“包含(comprising)”的方式为包含性的。如本文所用的术语“包含”与“包括”或“含有”同义，并且是包含性的或开放式的。
除非另有说明，否则本文中对“或”的任何提及旨在涵盖“和/或”。如本文所用的，术语“约”数值是指该数值加上或减去该数值的10％。术语“约”范围是指该范围减去其最低值的10％并加上其最大值的10％。
术语“受试者”、“患者”或“个体”是指灵长类动物，包括非人灵长类动物，例如非洲绿猴和恒河猴、以及人类。在优选的实施例中，受试者是人类或人类患者。
如本文所用的术语“治疗(treat)”、“治疗(treating)”、“治疗(treatment)”、“改善(ameliorate)”或“改善(ameliorating)”和其他语法等同物包括缓解、消除或改善疾病或病症症状，预防另外的症状，改善或预防症状的基础病因，抑制疾病或病症，例如，阻滞疾病或病症的发展，减轻疾病或病症，引起疾病或病症的消退，减轻由疾病或病症引起的状况，或终止疾病或病症的症状。术语还包括实现治疗益处。治疗益处是指根除或改善所治疗的基础疾病。此外，治疗益处通过根除或改善与基础疾病相关的一种或多种生理症状来实现，使得在患者中观察到改善，尽管在一些实施例中，患者仍患有基础疾病。在某些方面，为了预防益处，将药物组合物施用于处于发生特定疾病的风险的患者，或施用于报告疾病的一种或多种生理症状的患者，即使尚未进行疾病的诊断。
如本文所用的术语“施用(administer)”、“施用(administering)”、“施用(administration)”等可以指用于使治疗组合物或药物组合物能够递送至期望的生物作用部位的方法。这些方法包括眼内、玻璃体内或视网膜下注射到眼中。
如本文所用的术语“有效量”、“治疗有效量”或“药学有效量”可指所施用的至少一种药物组合物或化合物的足够量，其将在一定程度上缓解所治疗的疾病或病症的一种或多种症状。
如本文所用的术语“药学上可接受的”可以指不消除本文披露的化合物的生物活性或性质并且相对无毒的材料，例如载剂或稀释剂(即，当将该材料施用于个体时，其既不引起不期望的生物效应，也不会以有害的方式与包含其的组合物的任何组分相互作用)。
如本文所用的术语“药物组合物”或简称为“组合物”可指任选地与至少一种药学上可接受的化学组分混合的生物活性化合物，该化学组分例如但不限于载剂、稳定剂、稀释剂、分散剂、悬浮剂、增稠剂、赋形剂等。
如本文所用的“AAV载体”或“rAAV载体”是指腺相关病毒(AAV)载体或重组AAV(rAAV)载体，其包含非AAV来源的多核苷酸序列(即，与AAV异源的多核苷酸，例如编码治疗性转基因(例如MW-视蛋白)的多核苷酸序列)，通常是用于细胞遗传转化的目的序列。通常，异源多核苷酸的侧翼为至少一个，通常为两个AAV反向末端重复序列(ITR)。术语rAAV载体涵盖rAAV载体颗粒和rAAV载体质粒。rAAV载体可以是单链的(ssAAV)或自身互补的(scAAV)。
“AAV病毒”或“AAV病毒颗粒”或“rAAV载体颗粒”是指由至少一种AAV衣壳蛋白(通常为野生型AAV的所有衣壳蛋白)和多核苷酸rAAV载体组成的病毒颗粒。如果颗粒包含异源多核苷酸(即不同于野生型AAV基因组的多核苷酸，例如要递送至哺乳动物细胞的转基因)，则其通常称为“rAAV载体颗粒”或简称为“rAAV载体”。因此，rAAV颗粒的产生必然包括rAAV载体的产生，因为这样的载体包含在rAAV颗粒中。
如本文所用的术语“包装”可指可导致rAAV颗粒的组装和衣壳化的一系列细胞内事件。AAV“rep”和“cap”基因是指编码腺相关病毒的复制和衣壳化蛋白的多核苷酸序列。AAV rep和cap在本文中称为AAV“包装基因”。
术语“多肽”可涵盖天然存在的和非天然存在的蛋白质(例如融合蛋白)，其肽、片段、突变体、衍生物和类似物。多肽可以是单体的、二聚体的、三聚体的或多聚体的。此外，多肽可以包含许多不同的结构域，每个结构域具有一种或多种不同的活性。为了避免疑问，“多肽”可以是两个以上氨基酸的任何长度。
如本文所用，“多肽变体”是指其序列含有氨基酸修饰的多肽。在一些情况下，与参考蛋白或多肽(例如天然或野生型蛋白)的氨基酸序列相比，修饰可以是一个或多个氨基酸的插入、复制、缺失、重排或取代。变体可以具有一个或多个氨基酸点取代(其中在一个位置处的单个氨基酸已经改变为另一个氨基酸)、一个或多个插入和/或缺失(其中在参考蛋白质的序列中分别插入或缺失一个或多个氨基酸)、和/或在氨基或羧基末端的任一个或两个处截短氨基酸序列。与参考蛋白或未修饰蛋白相比，变体可具有相同或不同的生物活性。
在一些实施例中，变体可例如与其对应物参考蛋白具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％整体序列同源性，其中该参考蛋白可为天然存在的或非天然存在的、或天然存在的蛋白的衍生物或变体。在一些实施例中，变体可与野生型蛋白质具有至少约90％整体序列同源性。在一些实施例中，变体表现出至少约95％、至少约98％、至少约99％、至少约99.5％或至少约99.9％整体序列同一性。
术语“多核苷酸”或“核酸”是指信使RNA(mRNA)、RNA、基因组RNA(gRNA)、正链RNA(RNA(+))、负链RNA(RNA(-))、基因组DNA(gDNA)、互补DNA(cDNA)或重组DNA。多核苷酸包括单链和双链多核苷酸。优选地，多核苷酸包括与本文描述的任何参考序列具有至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的多核苷酸或变体(参见例如序列表)，通常其中变体保持参考序列的至少一种生物活性。在各种说明性实施例中，本发明部分地考虑了包含多核苷酸的表达载体、病毒载体和转移质粒，以及包含它们的组合物和细胞。
在特定实施例中，本发明提供了编码多肽的至少约5、10、25、50、100、150、200、250、300、350、400、500、1000、1250、1500、1750或2000个或更多个连续氨基酸残基以及所有中间长度的多核苷酸。容易理解，在本文中，“中间长度”是指引用值之间的任何长度，例如6、7、8、9等；101、102、103等；151、152、153等；201、202、203等。
如本文所用，“多核苷酸变体”是指与参考多核苷酸序列显示基本序列同一性的多核苷酸，或在下文定义的严格条件下与参考序列杂交的多核苷酸。这些术语包括如下多核苷酸，这些多核苷酸与参考多核苷酸相比，添加或缺失一个或多个核苷酸，或被不同的核苷酸替换。在这点上，本领域中充分理解，可以对参考多核苷酸进行包括突变、添加、缺失和取代的某些改变，由此改变的多核苷酸保留参考多核苷酸的生物学功能或活性。
如本文所用，“重组”可指生物分子，例如基因或蛋白质，其(1)已从其天然存在的环境中去除，(2)不与自然界中发现基因的多核苷酸的全部或一部分缔合，(3)可操作地连接到其在自然界中不连接的多核苷酸，或(4)在自然界中不存在。术语“重组”可用于指克隆的DNA分离物、化学合成的多核苷酸类似物、或通过异源系统生物合成的多核苷酸类似物、以及由这样的多核苷酸编码的蛋白质和/或mRNA。因此，例如，由微生物合成的蛋白质是重组的，例如，如果它是由细胞中存在的重组基因合成的mRNA合成的。
如本文所用的表述“序列同一性”或例如包含“50％相同的序列”是指在比较窗口上序列在逐个核苷酸基础上或逐个氨基酸基础上相同的程度。因此，“序列同一性百分比”可以如下进行计算：在比较窗口上比较两个最佳比对的序列，确定相同核酸碱基(例如，A、T、C、G、I)或相同氨基酸残基(例如，Ala、Pro、Ser、Thr、Gly、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg、His、Asp、Glu、Asn、Gln、Cys和Met)在两个序列中出现的位置的数量以产生匹配位置的数量，将匹配位置的数量除以比较窗口中位置的总数(即窗口大小)，并将结果乘以100以产生序列同一性百分比。包括与本文描述的任何参考序列具有至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核苷酸和多肽，通常其中多肽变体保持参考多肽的至少一种生物活性。
用于描述两个或更多个多核苷酸或多肽之间的序列关系的术语包括“参考序列”、“比较窗口”、“序列同一性”、“序列同一性百分比”和“基本同一性”。“参考序列”的长度为至少12个，但通常为15至18个，通常为至少25个单体单元，包括核苷酸和氨基酸残基。因为两个多核苷酸可以各自包含(1)在两个多核苷酸之间相似的序列(即，仅完整多核苷酸序列的一部分)，和(2)在两个多核苷酸之间差异的序列，两个(或更多个)多核苷酸之间的序列比较通常通过在“比较窗口”上比较两个多核苷酸的序列以鉴定和比较序列相似性的局部区域来进行。“比较窗口”是指至少6个连续位置，通常约50至约100，更通常约100至约150的概念区段，其中在两个序列最佳比对后将序列与相同数量的连续位置的参考序列进行比较。比较窗口可以包含与参考序列(其不包含添加或缺失)相比约20％或更少的添加或缺失(即，缺口)，用于两个序列的最佳比对。用于比对比较窗口的序列的最佳比对可通过算法的计算机化实现(Wisconsin遗传学软件包版本7.0中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，美国威斯康星州麦迪逊科学大道575号遗传学计算机组(Genetics Computer Group,575ScienceDrive Madison,Wis.,USA))或通过检查和通过所选择的各种方法中的任一种产生的最佳比对(即，导致比对窗口上的最高百分比同源性)来进行。也可参考BLAST家族程序，例如Altschul等人,1997,Nucl.Acids Res.[核酸研究]25:3389中披露的。序列分析的详细讨论可参见Ausubel等人,Current Protocols in Molecular Biology[分子生物学中的当前方案],John Wiley&Sons Inc[约翰威利父子公司],1994-1998,第15章的第19.3单元。
描述多核苷酸取向的术语包括：5'(通常是具有游离磷酸基团的多核苷酸的末端)和3'(通常是具有游离羟基(OH)基团的多核苷酸的末端)。多核苷酸序列能以5'至3'方向或3'至5'方向注释。对于DNA和mRNA，5'至3'链被指定为“有义”链，“正”链或“编码”链，因为其序列与前信使(premRNA)的序列相同[除了RNA中的尿嘧啶(U)，而不是DNA中的胸腺嘧啶(T)]。对于DNA和mRNA，作为由RNA聚合酶转录的链的互补3'至5'链被指定为“模板”链、“反义”链、“负”链或“非编码”链。如本文所用，术语“反向取向”是指以3'至5'取向书写的5'至3'序列或以5'至3'取向书写的3'至5'序列。
术语“互补”和“互补性”是指通过碱基配对规则相关的多核苷酸(即，核苷酸序列)。例如，DNA序列5'A G T C A T G 3'的互补链是3'T C A G T A C 5'。后一序列通常被写为左5'端和右3'端的反向互补序列，5'C A T G A C T 3'。与其反向互补序列相同的序列被称为回文序列。互补性可以是“部分的”，其中仅一些核酸的碱基根据碱基配对规则匹配。或者，核酸之间可以存在“完全”或“全部”互补性。
此外，本领域普通技术人员可以理解，由于遗传密码的简并性，存在许多编码如本文所描述的多肽或其变体片段的核苷酸序列。这些多核苷酸中的一些与任何天然基因的核苷酸序列具有最小同源性。然而，本发明特别考虑了由于密码子使用的差异而变化的多核苷酸，例如针对人和/或灵长类密码子选择而优化的多核苷酸。此外，还可以使用包含本文提供的多核苷酸序列的基因的等位基因。等位基因是由于一个或多个突变如核苷酸的缺失、添加和/或取代而改变的内源基因。
“可操作地连接(Operatively linked或operably linked)”或“偶联”可指遗传元件的并置，其中这些元件处于允许它们以预期方式操作的关系。例如，如果启动子有助于启动编码序列的转录，则启动子可以可操作地连接到编码区。只要保持这种功能关系，在启动子和编码区之间就可以存在插入残基。
术语“表达载体”或“表达构建体”或“盒”或“质粒”或简单地“载体”可包括任何类型的遗传构建体，包括AAV或rAAV载体，其含有编码基因产物的多核苷酸，其中部分或全部多核苷酸编码序列能够被转录并适用于基因疗法。转录物可被翻译成蛋白质。在一些情况下，它可以被部分地翻译或不翻译。在某些方面，表达包括基因转录和mRNA翻译成基因产物。在其他方面，表达仅包括编码目的基因的多核苷酸的转录。表达载体还可以包含可操作地连接到编码区以促进蛋白质在靶细胞中表达的控制元件。控制元件和与其可操作地连接用于表达的一个或多个基因的组合有时可称为“表达盒”，大量表达盒是本领域已知和可获得的、或可容易地由本领域可获得的组分构建。
存在于表达载体中的“控制元件”或“调节序列”是载体的那些非翻译区--复制起点、选择盒、启动子、增强子、内含子、聚腺苷酸化序列、5'和3'非翻译区--其与宿主细胞蛋白相互作用以进行转录和翻译。这样的元件的强度和特异性可以不同。根据所用的载体系统和宿主，可以使用任何数量的合适的转录和翻译元件，包括普遍存在的启动子和诱导型启动子。
如本文所用的术语“启动子”是指与RNA聚合酶结合的多核苷酸(DNA或RNA)的识别位点。RNA聚合酶启动并转录与启动子可操作地连接的多核苷酸。
术语“增强子”是指DNA区段，其含有能够提供增强的转录的序列，并且在一些情况下可以独立于它们相对于另一个控制序列的方向而起作用。增强子可以与启动子和/或其他增强子元件协同或累加地起作用。
术语“异源”可指在基因型上不同于与之比较的实体的其余部分的实体。例如，通过基因工程技术导入衍生自不同物种的质粒或载体中的多核苷酸可以是异源多核苷酸。从其天然编码序列中去除并可操作地连接到与其天然不连接的编码序列的启动子可以是异源启动子。
术语“MW-视蛋白”或“中波长视蛋白”或“中波长视锥视蛋白”是指智人视锥视蛋白1，即中波敏感的OPN1MW(NCBI RefSeq登录号NM_000513，版本NM_000513.2)，其功能片段或功能衍生物，以及包含它们的融合蛋白。MW-视蛋白在电磁光谱的绿色区域中具有约530nm的λmax。它也被称为“绿色视蛋白”、“M视蛋白”或“MWS视蛋白”。
范围：在整个本披露中，各个方面能以范围形式呈现。应该理解的是，范围形式的描述仅仅是为了方便以及简洁，不应该被理解为对本披露范围的不灵活的限制。因此，范围的描述应当被认为是具有确切披露的所有可能的子范围以及该范围内的单独数值。例如，范围如从1至6的描述应当被认为是具有确切披露的子范围，如从1至3、从1至4、从1至5、从2至4、从2至6、从3至6等，以及该范围内的单独数字，例如1、2、2.7、3、4、5、5.3、和6。作为另一个实例，范围如95％-99％同一性包括具有95％、96％、97％、98％或99％同一性，并且包括如96％-99％、96％-98％、96％-97％、97％-99％、97％-98％和98％-99％同一性的子范围。无论范围的宽度如何，这都适用。除非另有说明，否则所有指定的范围还包括端点。
载体
各种病毒载体可用于基因疗法，包括腺病毒、腺相关病毒、慢病毒、单纯疱疹病毒或逆转录病毒。
在一些实施例中，本披露的药物组合物和方法提供将编码MW-视蛋白转基因的多核苷酸序列(例如，cDNA序列)递送至有需要的人类受试者或患者(例如，诊断患有年龄相关性黄斑变性(AMD)、视网膜色素变性的患者)的视网膜细胞。使用递送系统如rAAV或病毒载体将治疗性转基因的多核苷酸递送至患者也称为基因疗法。
在一些实施例中，编码多核苷酸序列的MW-视蛋白的递送可以使用任何合适的“载体”(也称为“基因递送”或“基因转移媒介物”)进行。载体(例如rAAV)、递送媒介物、基因递送媒介物或基因转移媒介物可涵盖包含要递送至靶细胞的多核苷酸的任何合适的大分子或分子复合物，该靶细胞是例如视网膜细胞，包括光感受器、视网膜神经节细胞、缪勒氏细胞、双极细胞、无长突细胞、水平细胞或视网膜色素上皮细胞。在一些情况下，靶细胞可以是递送多核苷酸分子或基因的任何细胞。
本披露的组合物和方法提供了用于将MW-视蛋白转基因多核苷酸序列递送到非人灵长类动物或人类受试者的眼或视网膜细胞中的任何合适的方法。在特定的实施例中，MW-视蛋白转基因具有SEQ ID NO:3的多核苷酸序列。SEQ ID NO:3具有以下序列：ATGGCCCAACAATGGTCCCTTCAACGACTCGCCGGTAGACACCCACAGGACTCCTACGAAGATTCGACCCAGTCATCCATTTTCACTTACACCAACTCCAACTCCACTCGCGGCCCCTTCGAGGGCCCGAATTATCACATTGCGCCGAGATGGGTGTACCACCTGACTAGCGTGTGGATGATCTTCGTCGTGATCGCCAGCGTGTTCACTAACGGACTGGTGCTGGCCGCGACCATGAAGTTCAAGAAGCTGAGGCACCCTCTGAACTGGATTCTTGTGAACCTGGCCGTGGCCGACCTGGCCGAAACAGTGATCGCCTCAACCATCTCCGTGGTCAACCAGGTCTACGGTTACTTTGTGCTTGGACATCCTATGTGCGTGCTCGAGGGCTACACCGTGTCGCTGTGCGGGATCACTGGATTGTGGTCCCTGGCCATTATCTCGTGGGAGCGGTGGATGGTTGTGTGCAAGCCCTTCGGCAACGTGCGCTTCGATGCAAAGCTGGCTATCGTGGGAATCGCGTTTTCCTGGATCTGGGCCGCCGTCTGGACCGCTCCCCCTATTTTCGGTTGGTCCCGGTACTGGCCCCACGGGCTCAAGACCTCCTGTGGTCCCGACGTGTTCAGCGGATCGTCGTACCCTGGGGTGCAGTCCTACATGATTGTGCTGATGGTCACTTGCTGTATCACGCCGCTGTCTATTATCGTGCTGTGCTACCTCCAAGTCTGGTTGGCCATCCGGGCTGTGGCCAAACAGCAGAAGGAGTCCGAGAGCACCCAGAAAGCCGAAAAGGAAGTGACCCGGATGGTCGTCGTGATGGTGCTGGCATTCTGCTTCTGTTGGGGCCCGTACGCTTTCTTTGCCTGCTTTGCGGCTGCGAACCCGGGCTACCCATTCCATCCTCTCATGGCCGCCCTCCCGGCCTTCTTCGCCAAGTCCGCGACCATCTACAATCCCGTGATCTATGTGTTCATGAACCGGCAGTTCCGCAACTGCATCCTGCAACTCTTCGGAAAGAAAGTGGACGACGGATCCGAACTGTCGAGCGCCTCAAAGACCGAAGTCAGCTCGGTGTCATCCGTGAGCCCAGCATAA。SEQ ID NO:3是密码子优化的多核苷酸序列，其增加人MW-视蛋白的表达，例如，相对于由未经密码子优化的多核苷酸序列编码的人MW-视蛋白的表达。在特定的实施例中，MW-视蛋白转基因具有与SEQ ID NO:3至少85％、90％或95％相同的多核苷酸序列，该序列是密码子优化的多核苷酸序列，其增加人MW-视蛋白的表达，例如相对于由未经密码子优化的多核苷酸序列编码的人MW-视蛋白的表达。在一些情况下，多核苷酸的递送或基因疗法被配制或适用于玻璃体内注射到非人灵长类动物或人类受试者的眼中。
在一些实施例中，合适的载体包括但不限于病毒载体，例如腺病毒、腺相关病毒(AAV)、慢病毒、单纯疱疹病毒和逆转录病毒、脂质体、含脂质复合物、纳米颗粒和能够将多核苷酸递送至视网膜细胞的其他大分子复合物。在一些实施例中，病毒载体包含与多核苷酸可操作地连接的真核启动子，例如巨细胞病毒(CMV)启动子或组成型启动子。在一个实施例中，启动子是鸡β-肌动蛋白启动子。在特定的实施例中，启动子具有与SEQ ID NO:2至少85％、90％、95％或100％相同的多核苷酸序列。SEQ ID NO:2具有以下序列：GACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTCGAGGTGAGCCCCACGTTCTGCTTCACTCTCCCCATCTCCCCCCCCTCCCCACCCCCAATTTTGTATTTATTTATTTTTTAATTATTTTGTGCAGCGATGGGGGCGGGGGGGGGGGGGGGGCCCCCCCCAGGCGGGGCGGGGCGGGGCGAGGGGCGGGGCGGGGCGAGGCGGAAAGGTGCGGCGGCAGCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAGGCGGCGGCGGCGGCGGCCCTATAAAAAGCGAAGCGCGCGGCGGGCGGGAGTCGTTGCGCGCTGCCTTCCCCCCGTGCCCCGCTCCGCCGCCGCCTCGCGCCGCCCGCCCCGGCTCTGACTGACCGCGTTACTCCCACAGGTGAGCGGGCGGGACGGCCCTTCTCCTCCGGGCTGTAATTAGCGCTTGGTTTAATGACGGCTTGTTTCTTTTCTGTGGCTGCGTGAAAGCCTTGAGGGGCTCCGGGAGGGCCCTTTGTGCGGGGGGAGCGGCTCGGGGGGTGCGTGCGTGTGTGTGTGCGTGGGGAGCGCCGCGTGCGGCTCCGCGCTGCCCGGCGGCTGTGAGCGCTGCGGGCGCGGCGCGGGGCTTTGTGCGCTCCGCAGTGTGCGCGAGGGGAGCGCGGCCGGGGGCGGTGCCCCGCGGTGCGGGGGGGGCTGCGAGGGGAACAAAGGCTGCGTGCGGGGTGTGTGCGTGGGGGGGTGAGCAGGGGGTGTGGGCGCGTCGGTCGGGCTGCAACCCCCCCTGCACCCCCCTCCCCGAGTTGCTGAGCACGGCCCGGCTTCGGGTGCGGGGCTCCGTACGGGGCGTGGCGCGGGGCTCGCCGTGCCGGGCGGGGGGTGGCGGCAGGTGGGGGTGCCGGGCGGGGCGGGGCCGCCTCGGGCCGGGGAGGGCTCGGGGGAAGGGGCGCGGCGGCCCCCGGAGCGCCGGCGGCTGTCGAGGCGCGGCGAGCCGCAGCCATTGCCTTTTATGGTAATCGTGCGAGAGGGCGCAGGGACTTCCTTTGTCCCAAATCTGTGCGGAGCCGAAATCTGGGAGGCGCCGCCGCACCCCCTCTAGCGGGCGCGGGGCGAAGCGGTGCGGCGCCGGCAGGAAGGAAATGGGCGGGGAGGGCCTTCGTGCGTCGCCGCGCCGCCGTCCCCTTCTCCCTCTCCAGCCTCGGGGCTGTCCGCGGGGGGACGGCTGCCTTCGGGGGGGACGGGGCAGGGCGGGGTTCGGCTTCTGGCGTGTGACCGGCGGCTCTAGAGCCTCTGCTAACCATGTTCATGCCTTCTTCTTTTTCCTACAG。
在另一个实施例中，启动子是人突触蛋白hSyn启动子(Berry等人(2019)Nat.Comm.[自然通讯]10:1221)、CAG启动子(Miyazaki等人(1989)Gene[基因]79:269)；谷氨酸代谢型受体-6(grm6)启动子(Cronin等人(2014)EMBO Mol.Med.[EMBO分子医学]6:1175)；昴星团启动子(Portales-Casamar等人(2010)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]107:16589)；胆碱乙酰转移酶(ChAT)启动子(Misawa等人(1992)Biol.Chem.[生物化学]267:20392)；囊泡谷氨酸转运蛋白(V-glut)启动子(Zhang等人(2011)Brain Res.[大脑研究]1377:1)；谷氨酸脱羧酶(GAD)启动子(Rasmussen等人(2007)Brain Res.[大脑研究]1144:19；Ritter等人(2016)J.Gene Med.[基因医学杂志]18:27)；胆囊收缩素(CCK)启动子(Ritter等人(2016)J.Gene Med.[基因医学杂志]18:27)；小清蛋白(PV)启动子；生长抑素(SST)启动子；神经肽Y(NPY)启动子；和血管活性肠肽(VIP)启动子。合适的启动子包括但不限于红视锥视蛋白启动子、视紫红质启动子、视紫红质激酶启动子和GluR启动子(例如，GluR6启动子)。合适的启动子包括但不限于卵黄样黄斑营养不良2(VMD2)基因启动子和光感受器间类视黄醇结合蛋白(IRBP)基因启动子。还适合使用的是L7启动子(Oberdick等人(1990)Science[科学]248:223)、thy-1启动子、恢复蛋白启动子(Wiechmann和Howard(2003)Curr.Eye Res.[现代眼科研究杂志]26:25)；BEST启动子；ProB4启动子(Jüttner,J.等人,(2019)Nat.Neurosci.[自然神经科学]22:1345-1356)；ProC2启动子；ProA18启动子；ProB2启动子；ProA6启动子；ProA7启动子；ProA1启动子；ProA4启动子；ProC22启动子；ProD3启动子；ProD4启动子；ProD5启动子；ProD6启动子；ProA14启动子；ProA36启动子；ProD1启动子；ProA5启动子；ProB1启动子；ProA27启动子；ProC29启动子；ProB15启动子；ProA9启动子；ProC8启动子；ProA21启动子；SNCG启动子；ProC17启动子；SynP156启动子；ProA18启动子；ProB4启动子；ProB12启动子；和钙结合蛋白启动子。在特定实施例中，在哺乳动物细胞中可操作的启动子包含位于转录起始位点上游约25至30个碱基处的富含AT的区域和/或在转录起始处上游70至80个碱基处发现的另一序列。
在一些实施例中，RNA可包括目的基因(例如MW-视蛋白)的转录物、内含子、非翻译区(UTR)、终止序列等。在其他实施例中，DNA可包括但不限于序列如启动子序列、目的基因(例如MW-视蛋白)、UTR、增强子序列、内含子序列、终止序列、ITR序列等。在特定的实施例中，增强子具有SEQ ID NO:4的多核苷酸序列。SEQ ID NO:4具有以下序列：AATCAACCTCTGGATTACAAAAATTTGTGAAAGATTGACTGGTATTCTTAACTATGTTGCTCCTTTTACGCTATGTGGATACGCTGCTTTAATGCCTTTGTATCATGCTATTGCTTCCCGTATGGCTTTCATTTTCTCCTCCTTGTATAAATCCTGGTTGCTGTCTCTTTATGAGGAGTTGTGGCCCGTTGTCAGGCAACGTGGCGTGGTGTGCACTGTGTTTGCTGACGCAACCCCCACTGGTTGGGGCATTGCCACCACCTGTCAGCTCCTTTCCGGGACTTTCGCTTTCCCCCTCCCTATTGCCACGGCGGAACTCATCGCCGCCTGCCTTGCCCGCTGCTGGACAGGGGCTCGGCTGTTGGGCACTGACAATTCCGTGGTGTTGTCGGGGAAGGTCTGCTGAGACTCGGGGCTGCTCGCCTGTGTTGCCACCTGGATTCTGCGCGGGACGTCCTTCTGCTACGTCCCTTCGGCCCTCAATCCAGCGGACCTTCCTTCCCGCGGCCTGCTGCCGGCTCTGCGGCCTCTTCCGCGTCTTCGCCTTCGCCCTCAGACGAGTCGGATCTCCCTTTGGGCCGCCTCCCCGC。SEQ ID NO:4的合成符合法规要求，并且是野生型WPR增强子的变体。
在特定的实施例中，内含子具有SEQ ID NO:6的多核苷酸序列。SEQ ID NO:6具有以下序列：CTCATTTCATCTGTGACCCCTCCACTACCCTTTCTTCCTGATTCTTGGAAGCAAATCCAAGACATCACACCCTTCCCTCTGTAAATCTTTACTATGTTCCTCTAGGAGAAAAGGGCTCTTCTCAATACATAACCACAAGTCATCATCACACCGACAAGTGTAACAGTATTTCCTGAATAGCTTCAAATATCCTAGTAGTGTTCAAAAAATGTCATACGTATTTTCAGTCTGCTTGAATCAGGGCTCAAATAAGGTCCACACATTCAGATTGACTGATATGCCTTTTGACTACCTTTGAATCTAGAGGTTCCCTTTCTATCTCCCTGCAATTTATTTGTGGAAGCAAGCAAGTCGTTCATGACGTAGCCTAACAGGCCCCTCTGACGTTGTTCATTATGATTTTTCTGTAAATTGGTAGTTGATCTGAGGATCTGGCCAGAGGCAGGTTGGATTTGTTGGTGTGTTTTGGCAAGGAGAGTGTCTCTTTTCTGGGGTGTTGGCA。合成SEQ ID NO:6并将其掺入重组表达载体中，以保持转基因接近4.5-4.7kB的包装大小限制。此外，在重组表达载体中包含SEQ ID NO:6降低了产生隐蔽剪接位点和替代编码区的无义/改组DNA的风险。设计SEQ ID NO:6以使GC含量最小化。预期用于本发明的其他内含子多核苷酸序列包括人SW-视蛋白、MW-视蛋白和LW-视蛋白内含子多核苷酸序列中的任一种，这些序列被缩短以保持转基因接近4.5-4.7kB的包装大小限制，和/或用合适数量和类型的核苷酸残基取代以最小化GC含量。
在特定的实施例中，终止序列具有SEQ ID NO:5的多核苷酸序列。SEQ ID NO:5具有以下序列：CTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGA。
在特定的实施例中，5'ITR具有SEQ ID NO:1的多核苷酸序列。SEQ ID NO:1具有以下序列：CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT。在另一特定的实施例中，3'ITR具有SEQ ID NO:7的多核苷酸序列。SEQ ID NO:7具有以下序列：AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG。设计SEQ IDNO:1和7以确保重组表达载体在几轮增殖/扩增中的稳定性。
在一些实施例中，用于产生rAAV病毒的rAAV和/或质粒包含以下多核苷酸元件：第一ITR序列；启动子序列；编码MW-视蛋白的序列；增强子序列；多聚A/终止序列、内含子序列；和第二ITR序列。在一些实施例中，在这些多核苷酸元件的每一个之间使用接头序列。在一些实施例中，多核苷酸元件以下列5'至3'方向存在于rAAV和/或质粒中：第一ITR序列；启动子序列；编码MW-视蛋白的序列；增强子序列；多聚A/终止序列、内含子序列；和第二ITR序列。在另一实施例中，rAAV和/或质粒包含SEQ ID NO:8的多核苷酸序列。SEQ ID NO:8具有以下序列：CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTTGTAGTTAATACGCATGGAGCTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGGGTACCGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTCGAGGTGAGCCCCACGTTCTGCTTCACTCTCCCCATCTCCCCCCCCTCCCCACCCCCAATTTTGTATTTATTTATTTTTTAATTATTTTGTGCAGCGATGGGGGCGGGGGGGGGGGGGGGGCCCCCCCCAGGCGGGGCGGGGCGGGGCGAGGGGCGGGGCGGGGCGAGGCGGAAAGGTGCGGCGGCAGCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAGGCGGCGGCGGCGGCGGCCCTATAAAAAGCGAAGCGCGCGGCGGGCGGGAGTCGTTGCGCGCTGCCTTCCCCCCGTGCCCCGCTCCGCCGCCGCCTCGCGCCGCCCGCCCCGGCTCTGACTGACCGCGTTACTCCCACAGGTGAGCGGGCGGGACGGCCCTTCTCCTCCGGGCTGTAATTAGCGCTTGGTTTAATGACGGCTTGTTTCTTTTCTGTGGCTGCGTGAAAGCCTTGAGGGGCTCCGGGAGGGCCCTTTGTGCGGGGGGAGCGGCTCGGGGGGTGCGTGCGTGTGTGTGTGCGTGGGGAGCGCCGCGTGCGGCTCCGCGCTGCCCGGCGGCTGTGAGCGCTGCGGGCGCGGCGCGGGGCTTTGTGCGCTCCGCAGTGTGCGCGAGGGGAGCGCGGCCGGGGGCGGTGCCCCGCGGTGCGGGGGGGGCTGCGAGGGGAACAAAGGCTGCGTGCGGGGTGTGTGCGTGGGGGGGTGAGCAGGGGGTGTGGGCGCGTCGGTCGGGCTGCAACCCCCCCTGCACCCCCCTCCCCGAGTTGCTGAGCACGGCCCGGCTTCGGGTGCGGGGCTCCGTACGGGGCGTGGCGCGGGGCTCGCCGTGCCGGGCGGGGGGTGGCGGCAGGTGGGGGTGCCGGGCGGGGCGGGGCCGCCTCGGGCCGGGGAGGGCTCGGGGGAAGGGGCGCGGCGGCCCCCGGAGCGCCGGCGGCTGTCGAGGCGCGGCGAGCCGCAGCCATTGCCTTTTATGGTAATCGTGCGAGAGGGCGCAGGGACTTCCTTTGTCCCAAATCTGTGCGGAGCCGAAATCTGGGAGGCGCCGCCGCACCCCCTCTAGCGGGCGCGGGGCGAAGCGGTGCGGCGCCGGCAGGAAGGAAATGGGCGGGGAGGGCCTTCGTGCGTCGCCGCGCCGCCGTCCCCTTCTCCCTCTCCAGCCTCGGGGCTGTCCGCGGGGGGACGGCTGCCTTCGGGGGGGACGGGGCAGGGCGGGGTTCGGCTTCTGGCGTGTGACCGGCGGCTCTAGAGCCTCTGCTAACCATGTTCATGCCTTCTTCTTTTTCCTACAGCTCCTGGGCAACGTGCTGGTTATTGTGCTGTCTCATCATTTTGGCAAAGAATTCTGGCCACCATGGCCCAACAATGGTCCCTTCAACGACTCGCCGGTAGACACCCACAGGACTCCTACGAAGATTCGACCCAGTCATCCATTTTCACTTACACCAACTCCAACTCCACTCGCGGCCCCTTCGAGGGCCCGAATTATCACATTGCGCCGAGATGGGTGTACCACCTGACTAGCGTGTGGATGATCTTCGTCGTGATCGCCAGCGTGTTCACTAACGGACTGGTGCTGGCCGCGACCATGAAGTTCAAGAAGCTGAGGCACCCTCTGAACTGGATTCTTGTGAACCTGGCCGTGGCCGACCTGGCCGAAACAGTGATCGCCTCAACCATCTCCGTGGTCAACCAGGTCTACGGTTACTTTGTGCTTGGACATCCTATGTGCGTGCTCGAGGGCTACACCGTGTCGCTGTGCGGGATCACTGGATTGTGGTCCCTGGCCATTATCTCGTGGGAGCGGTGGATGGTTGTGTGCAAGCCCTTCGGCAACGTGCGCTTCGATGCAAAGCTGGCTATCGTGGGAATCGCGTTTTCCTGGATCTGGGCCGCCGTCTGGACCGCTCCCCCTATTTTCGGTTGGTCCCGGTACTGGCCCCACGGGCTCAAGACCTCCTGTGGTCCCGACGTGTTCAGCGGATCGTCGTACCCTGGGGTGCAGTCCTACATGATTGTGCTGATGGTCACTTGCTGTATCACGCCGCTGTCTATTATCGTGCTGTGCTACCTCCAAGTCTGGTTGGCCATCCGGGCTGTGGCCAAACAGCAGAAGGAGTCCGAGAGCACCCAGAAAGCCGAAAAGGAAGTGACCCGGATGGTCGTCGTGATGGTGCTGGCATTCTGCTTCTGTTGGGGCCCGTACGCTTTCTTTGCCTGCTTTGCGGCTGCGAACCCGGGCTACCCATTCCATCCTCTCATGGCCGCCCTCCCGGCCTTCTTCGCCAAGTCCGCGACCATCTACAATCCCGTGATCTATGTGTTCATGAACCGGCAGTTCCGCAACTGCATCCTGCAACTCTTCGGAAAGAAAGTGGACGACGGATCCGAACTGTCGAGCGCCTCAAAGACCGAAGTCAGCTCGGTGTCATCCGTGAGCCCAGCATAAGCGGAAGCTTCCGTAATCAACCTCTGGATTACAAAAATTTGTGAAAGATTGACTGGTATTCTTAACTATGTTGCTCCTTTTACGCTATGTGGATACGCTGCTTTAATGCCTTTGTATCATGCTATTGCTTCCCGTATGGCTTTCATTTTCTCCTCCTTGTATAAATCCTGGTTGCTGTCTCTTTATGAGGAGTTGTGGCCCGTTGTCAGGCAACGTGGCGTGGTGTGCACTGTGTTTGCTGACGCAACCCCCACTGGTTGGGGCATTGCCACCACCTGTCAGCTCCTTTCCGGGACTTTCGCTTTCCCCCTCCCTATTGCCACGGCGGAACTCATCGCCGCCTGCCTTGCCCGCTGCTGGACAGGGGCTCGGCTGTTGGGCACTGACAATTCCGTGGTGTTGTCGGGGAAGGTCTGCTGAGACTCGGGGCTGCTCGCCTGTGTTGCCACCTGGATTCTGCGCGGGACGTCCTTCTGCTACGTCCCTTCGGCCCTCAATCCAGCGGACCTTCCTTCCCGCGGCCTGCTGCCGGCTCTGCGGCCTCTTCCGCGTCTTCGCCTTCGCCCTCAGACGAGTCGGATCTCCCTTTGGGCCGCCTCCCCGCCAGCCTGCTAGCCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGAGAACGCGACCGGTGATCTGCTCATTTCATCTGTGACCCCTCCACTACCCTTTCTTCCTGATTCTTGGAAGCAAATCCAAGACATCACACCCTTCCCTCTGTAAATCTTTACTATGTTCCTCTAGGAGAAAAGGGCTCTTCTCAATACATAACCACAAGTCATCATCACACCGACAAGTGTAACAGTATTTCCTGAATAGCTTCAAATATCCTAGTAGTGTTCAAAAAATGTCATACGTATTTTCAGTCTGCTTGAATCAGGGCTCAAATAAGGTCCACACATTCAGATTGACTGATATGCCTTTTGACTACCTTTGAATCTAGAGGTTCCCTTTCTATCTCCCTGCAATTTATTTGTGGAAGCAAGCAAGTCGTTCATGACGTAGCCTAACAGGCCCCTCTGACGTTGTTCATTATGATTTTTCTGTAAATTGGTAGTTGATCTGAGGATCTGGCCAGAGGCAGGTTGGATTTGTTGGTGTGTTTTGGCAAGGAGAGTGTCTCTTTTCTGGGGTGTTGGCATGTCGACCTGATTTTGTATAACCACTTGCGGTGATCTAGAGCATGGCTATGTAGATAAGTAGCATGGCGGGTTAATCATTAACTACAAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG。
在另一实施例中，rAAV和/或质粒包含SEQ ID NO:9的多核苷酸序列。SEQ ID NO:9具有以下序列：CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTTGTAGTTAATACGCATGGAGCTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGGGTACCGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTCGAGGTGAGCCCCACGTTCTGCTTCACTCTCCCCATCTCCCCCCCCTCCCCACCCCCAATTTTGTATTTATTTATTTTTTAATTATTTTGTGCAGCGATGGGGGCGGGGGGGGGGGGGGGGCCCCCCCCAGGCGGGGCGGGGCGGGGCGAGGGGCGGGGCGGGGCGAGGCGGAAAGGTGCGGCGGCAGCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAGGCGGCGGCGGCGGCGGCCCTATAAAAAGCGAAGCGCGCGGCGGGCGGGAGTCGTTGCGCGCTGCCTTCCCCCCGTGCCCCGCTCCGCCGCCGCCTCGCGCCGCCCGCCCCGGCTCTGACTGACCGCGTTACTCCCACAGGTGAGCGGGCGGGACGGCCCTTCTCCTCCGGGCTGTAATTAGCGCTTGGTTTAATGACGGCTTGTTTCTTTTCTGTGGCTGCGTGAAAGCCTTGAGGGGCTCCGGGAGGGCCCTTTGTGCGGGGGGAGCGGCTCGGGGGGTGCGTGCGTGTGTGTGTGCGTGGGGAGCGCCGCGTGCGGCTCCGCGCTGCCCGGCGGCTGTGAGCGCTGCGGGCGCGGCGCGGGGCTTTGTGCGCTCCGCAGTGTGCGCGAGGGGAGCGCGGCCGGGGGCGGTGCCCCGCGGTGCGGGGGGGGCTGCGAGGGGAACAAAGGCTGCGTGCGGGGTGTGTGCGTGGGGGGGTGAGCAGGGGGTGTGGGCGCGTCGGTCGGGCTGCAACCCCCCCTGCACCCCCCTCCCCGAGTTGCTGAGCACGGCCCGGCTTCGGGTGCGGGGCTCCGTACGGGGCGTGGCGCGGGGCTCGCCGTGCCGGGCGGGGGGTGGCGGCAGGTGGGGGTGCCGGGCGGGGCGGGGCCGCCTCGGGCCGGGGAGGGCTCGGGGGAAGGGGCGCGGCGGCCCCCGGAGCGCCGGCGGCTGTCGAGGCGCGGCGAGCCGCAGCCATTGCCTTTTATGGTAATCGTGCGAGAGGGCGCAGGGACTTCCTTTGTCCCAAATCTGTGCGGAGCCGAAATCTGGGAGGCGCCGCCGCACCCCCTCTAGCGGGCGCGGGGCGAAGCGGTGCGGCGCCGGCAGGAAGGAAATGGGCGGGGAGGGCCTTCGTGCGTCGCCGCGCCGCCGTCCCCTTCTCCCTCTCCAGCCTCGGGGCTGTCCGCGGGGGGACGGCTGCCTTCGGGGGGGACGGGGCAGGGCGGGGTTCGGCTTCTGGCGTGTGACCGGCGGCTCTAGAGCCTCTGCTAACCATGTTCATGCCTTCTTCTTTTTCCTACAGCTCCTGGGCAACGTGCTGGTTATTGTGCTGTCTCATCATTTTGGCAAAGAATTCTGGCCACCATGGCCCAACAATGGTCCCTTCAACGACTCGCCGGTAGACACCCACAGGACTCCTACGAAGATTCGACCCAGTCATCCATTTTCACTTACACCAACTCCAACTCCACTCGCGGCCCCTTCGAGGGCCCGAATTATCACATTGCGCCGAGATGGGTGTACCACCTGACTAGCGTGTGGATGATCTTCGTCGTGATCGCCAGCGTGTTCACTAACGGACTGGTGCTGGCCGCGACCATGAAGTTCAAGAAGCTGAGGCACCCTCTGAACTGGATTCTTGTGAACCTGGCCGTGGCCGACCTGGCCGAAACAGTGATCGCCTCAACCATCTCCGTGGTCAACCAGGTCTACGGTTACTTTGTGCTTGGACATCCTATGTGCGTGCTCGAGGGCTACACCGTGTCGCTGTGCGGGATCACTGGATTGTGGTCCCTGGCCATTATCTCGTGGGAGCGGTGGATGGTTGTGTGCAAGCCCTTCGGCAACGTGCGCTTCGATGCAAAGCTGGCTATCGTGGGAATCGCGTTTTCCTGGATCTGGGCCGCCGTCTGGACCGCTCCCCCTATTTTCGGTTGGTCCCGGTACTGGCCCCACGGGCTCAAGACCTCCTGTGGTCCCGACGTGTTCAGCGGATCGTCGTACCCTGGGGTGCAGTCCTACATGATTGTGCTGATGGTCACTTGCTGTATCACGCCGCTGTCTATTATCGTGCTGTGCTACCTCCAAGTCTGGTTGGCCATCCGGGCTGTGGCCAAACAGCAGAAGGAGTCCGAGAGCACCCAGAAAGCCGAAAAGGAAGTGACCCGGATGGTCGTCGTGATGGTGCTGGCATTCTGCTTCTGTTGGGGCCCGTACGCTTTCTTTGCCTGCTTTGCGGCTGCGAACCCGGGCTACCCATTCCATCCTCTCATGGCCGCCCTCCCGGCCTTCTTCGCCAAGTCCGCGACCATCTACAATCCCGTGATCTATGTGTTCATGAACCGGCAGTTCCGCAACTGCATCCTGCAACTCTTCGGAAAGAAAGTGGACGACGGATCCGAACTGTCGAGCGCCTCAAAGACCGAAGTCAGCTCGGTGTCATCCGTGAGCCCAGCATAAGCGGAAGCTTCCGTAATCAACCTCTGGATTACAAAAATTTGTGAAAGATTGACTGGTATTCTTAACTATGTTGCTCCTTTTACGCTATGTGGATACGCTGCTTTAATGCCTTTGTATCATGCTATTGCTTCCCGTATGGCTTTCATTTTCTCCTCCTTGTATAAATCCTGGTTGCTGTCTCTTTATGAGGAGTTGTGGCCCGTTGTCAGGCAACGTGGCGTGGTGTGCACTGTGTTTGCTGACGCAACCCCCACTGGTTGGGGCATTGCCACCACCTGTCAGCTCCTTTCCGGGACTTTCGCTTTCCCCCTCCCTATTGCCACGGCGGAACTCATCGCCGCCTGCCTTGCCCGCTGCTGGACAGGGGCTCGGCTGTTGGGCACTGACAATTCCGTGGTGTTGTCGGGGAAGGTCTGCTGAGACTCGGGGCTGCTCGCCTGTGTTGCCACCTGGATTCTGCGCGGGACGTCCTTCTGCTACGTCCCTTCGGCCCTCAATCCAGCGGACCTTCCTTCCCGCGGCCTGCTGCCGGCTCTGCGGCCTCTTCCGCGTCTTCGCCTTCGCCCTCAGACGAGTCGGATCTCCCTTTGGGCCGCCTCCCCGCCAGCCTGCTAGCCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGAGAACGCGACCGGTGATCTGCTCATTTCATCTGTGACCCCTCCACTACCCTTTCTTCCTGATTCTTGGAAGCAAATCCAAGACATCACACCCTTCCCTCTGTAAATCTTTACTATGTTCCTCTAGGAGAAAAGGGCTCTTCTCAATACATAACCACAAGTCATCATCACACCGACAAGTGTAACAGTATTTCCTGAATAGCTTCAAATATCCTAGTAGTGTTCAAAAAATGTCATACGTATTTTCAGTCTGCTTGAATCAGGGCTCAAATAAGGTCCACACATTCAGATTGACTGATATGCCTTTTGACTACCTTTGAATCTAGAGGTTCCCTTTCTATCTCCCTGCAATTTATTTGTGGAAGCAAGCAAGTCGTTCATGACGTAGCCTAACAGGCCCCTCTGACGTTGTTCATTATGATTTTTCTGTAAATTGGTAGTTGATCTGAGGATCTGGCCAGAGGCAGGTTGGATTTGTTGGTGTGTTTTGGCAAGGAGAGTGTCTCTTTTCTGGGGTGTTGGCATGTCGACCTGATTTTGTATAACCACTTGCGGTGATCTAGAGCATGGCTATGTAGATAAGTAGCATGGCGGGTTAATCATTAACTACAAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGGCCCCCCCCCCCCCCCCCGGCGATTCTCTTGTTTGCTCCAGACTCTCAGGCAATGACCTGATAGCCTTTGTAGAGACCTCTCAAAAATAGCTACCCTCTCCGGCATGAATTTATCAGCTAGAACGGTTGAATATCATATTGATGGTGATTTGACTGTCTCCGGCCTTTCTCACCCGTTTGAATCTTTACCTACACATTACTCAGGCATTGCATTTAAAATATATGAGGGTTCTAAAAATTTTTATCCTTGCGTTGAAATAAAGGCTTCTCCCGCAAAAGTATTACAGGGTCATAATGTTTTTGGTACAACCGATTTAGCTTTATGCTCTGAGGCTTTATTGCTTAATTTTGCTAATTCTTTGCCTTGCCTGTATGATTTATTGGATGTTGGAATCGCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCATATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGCCCCGACACCCGCCAACACTATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGCCCCGACACCCGCCAACACCCGCTGACGCGCCCTGACGGGCTTGTCTGCTCCCGGCATCCGCTTACAGACAAGCTGTGACCGTCTCCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGGTTTTCACCGTCATCACCGAAACGCGCGAGACGAAAGGGCCTCGTGATACGCCTATTTTTATAGGTTAATGTCATGATAATAATGGTTTCTTAGACGTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGCCATATTCAACGGGAAACGTCGAGGCCGCGATTAAATTCCAACATGGATGCTGATTTATATGGGTATAAATGGGCTCGCGATAATGTCGGGCAATCAGGTGCGACAATCTATCGCTTGTATGGGAAGCCCGATGCGCCAGAGTTGTTTCTGAAACATGGCAAAGGTAGCGTTGCCAATGATGTTACAGATGAGATGGTCAGACTAAACTGGCTGACGGAATTTATGCCACTTCCGACCATCAAGCATTTTATCCGTACTCCTGATGATGCATGGTTACTCACCACTGCGATCCCCGGAAAAACAGCGTTCCAGGTATTAGAAGAATATCCTGATTCAGGTGAAAATATTGTTGATGCGCTGGCAGTGTTCCTGCGCCGGTTGCACTCGATTCCTGTTTGTAATTGTCCTTTTAACAGCGATCGCGTATTTCGCCTCGCTCAGGCGCAATCACGAATGAATAACGGTTTGGTTGATGCGAGTGATTTTGATGACGAGCGTAATGGCTGGCCTGTTGAACAAGTCTGGAAAGAAATGCATAAACTTTTGCCATTCTCACCGGATTCAGTCGTCACTCATGGTGATTTCTCACTTGATAACCTTATTTTTGACGAGGGGAAATTAATAGGTTGTATTGATGTTGGACGAGTCGGAATCGCAGACCGATACCAGGATCTTGCCATCCTATGGAACTGCCTCGGTGAGTTTTCTCCTTCATTACAGAAACGGCTTTTTCAAAAATATGGTATTGATAATCCTGATATGAATAAATTGCAGTTTCATTTGATGCTCGATGAGTTTTTCTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTTCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGAGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGGCGATTCCGTTGCAATGGCTGGCGGTAATATTGTTCTGGATATTACCAGCAAGGCCGATAGTTTGAGTTCTTCTACTCAGGCAAGTGATGTTATTACTAATCAAAGAAGTATTGCGACAACGGTTAATTTGCGTGATGGACAGACTCTTTTACTCGGTGGCCTCACTGATTATAAAAACACTTCTCAGGATTCTGGCGTACCGTTCCTGTCTAAAATCCCTTTAATCGGCCTCCTGTTTAGCTCCCGCTCTGATTCTAACGAGGAAAGCACGTTATACGTGCTCGTCAAAGCAACCATAGTACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAATATTAACGCTTACAATTTAAATATTTGCTTATACAATCTTCCTGTTTTTGGGGCTTTTCTGATTATCAACCGGGGTACATATGATTGACATGCTAGTTTTACGATTACCGTTCATCGCC。
在一些实施例中，重组表达载体包含第一反向末端重复(ITR)多核苷酸序列、与编码中波长视锥视蛋白(MW-视蛋白)转基因的多核苷酸序列可操作地连接的启动子多核苷酸序列、增强子多核苷酸序列、多聚A多核苷酸序列、内含子多核苷酸序列和第二ITR多核苷酸序列。在一些实施例中，重组表达载体进一步包含赋予抗生素抗性的多核苷酸。在又另一实施例中，该抗生素是氨苄青霉素和/或卡那霉素。
在一些实施例中，本披露提供了重组病毒，例如重组腺相关病毒(rAAV)，其作为用于在受试者中递送和表达MW-视蛋白或其任何功能片段或变体的载体。
在一些实施例中，可以工程化或优化任何合适的病毒载体以用于本披露的组合物和方法。例如，可以改变衍生自腺病毒(Ad)或腺相关病毒(AAV)的重组病毒载体，使其在人类或灵长类受试者中具有复制缺陷。在一些实施例中，杂交病毒载体系统可以使用本领域技术人员已知的方法获得，并用于将编码MW-视蛋白的多核苷酸递送至视网膜细胞。在一些实施例中，病毒递送系统或基因疗法可将包含MW-视蛋白转基因的多核苷酸序列整合到靶细胞基因组(例如，视网膜细胞的基因组)中并导致基因随时间稳定的基因表达。在一些实施例中，MW-视蛋白转基因不整合到靶细胞基因组中，而是由导入靶细胞的质粒或载体表达。
在一个实施例中，重组表达载体是重组病毒载体。在特定的实施例中，重组病毒载体是腺相关病毒载体、慢病毒载体、单纯疱疹病毒载体或逆转录病毒载体。在一些实施例中，用于将MW-视蛋白的多核苷酸序列递送至视网膜细胞的合适的病毒载体是AAV或rAAV，它们是小的无包膜单链DNA病毒。rAAV是非致病性人类细小病毒，并且可以依赖于辅助病毒(包括腺病毒、单纯疱疹病毒、痘苗病毒和CMV)进行复制。暴露于野生型(wt)AAV不相关或已知引起任何人病理学，并且在一般群体中是常见的，使得AAV或rAAV成为用于基因疗法的合适递送系统。用于递送治疗性转基因(例如，MW-视蛋白)的基因疗法的AAV和rAAV可以是任何血清型。在一些实施例中，本披露的药物组合物和方法提供任何合适的AAV血清型(包括AAV1、AAV2、AAV2.5、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、rh10、AAV-DJ和其任何杂交或嵌合AAV)的用途。在一些实施例中，所使用的血清型基于病毒的向性或目的靶细胞的感染性。在一些实施例中，AAV2或rAAV2用于经由眼内、玻璃体内或视网膜下注射将编码MW-视蛋白的多核苷酸序列递送到受试者的眼或视网膜细胞中。
在一些实施例中，包含具有增加的靶细胞(例如视网膜细胞)感染性的变体衣壳蛋白的AAV或rAAV病毒、颗粒或病毒粒子用于在受试者中增加视网膜细胞的转导或增加基因靶向递送至视网膜细胞。在一些实施例中，rAAV病毒粒子在AAV衣壳蛋白的衣壳蛋白GH环/环IV中包含氨基酸修饰。在一些情况下，修饰位点是AAV衣壳蛋白的GH环/环IV的溶剂可及部分。在一些实施例中，rAAV病毒粒子包含变体AAV衣壳蛋白，相对于相应的亲本AAV衣壳蛋白，该变体AAV衣壳蛋白在衣壳蛋白的GH环中包含5个氨基酸至11个氨基酸、例如7个氨基酸序列的插入，并且其中与包含相应的亲本或未修饰的AAV衣壳蛋白的AAV病毒粒子对视网膜细胞的感染性相比，该变体衣壳蛋白赋予增加的视网膜细胞感染性。已知几种AAV衣壳变体，包括7m8变体。其他AAV衣壳变体披露于WO 2018/022905中，其通过引用以其全文并入本文。例如，预期用于本发明的AAV衣壳变体包括具有以下蛋白序列的那些：(1)LAKDATKNA(SEQ ID NO:10)；(2)PAHQDTTKNA(SEQ ID NO:11)；(3)LAHQDTTKNA(SEQ ID NO:12)；(4)LATTSQNKPA(SEQ ID NO:13)；(5)LAISDQTKHA(SEQ ID NO:14)；(6)IARGVAPSSA(SEQ ID NO:15)；(7)LAPDSTTRSA(SEQ ID NO:16)；(8)LAKGTELKPA(SEQ ID NO:17)；(9)LAIIDATKNA(SEQID NO:18)；(10)LAVDGAQRSA(SEQ ID NO:19)；(11)PAPQDTTKKA(SEQ ID NO:20)；(12)LPHQDTTKNA(SEQ ID NO:21)；(13)LAKDATKTIA(SEQ ID NO:22)；(14)LAKQQSASTA(SEQ IDNO:23)；(15)LAKSDQSKPA(SEQ ID NO:24)；(16)LSHQDTTKNA(SEQ ID NO:25)；(17)LAANQPSKPA(SEQ ID NO:26)；(18)LAVSDSTKAA(SEQ ID NO:27)；(19)LAAQGTAKKPA(SEQ IDNO:28)；(20)LAPDQTTRNA(SEQ ID NO:29)；(21)LAASDSTKAA(SEQ ID NO:30)；(22)LAPQDTTKNA(SEQ ID NO:31)；(23)LAKADETRPA(SEQ ID NO:32)；(24)LAHQDTAKNA(SEQ IDNO:33)；(25)LAHQDTKKNA(SEQ ID NO:34)；(26)LAHQDTTKHA(SEQ ID NO:35)；(27)LAHQDTTKKA(SEQ ID NO:36)；(28)LAHQDTTRNA(SEQ ID NO:37)；(29)LAHQDTTNA(SEQ IDNO:38)；(30)LAHQGTTKNA(SEQ ID NO:39)；(31)LAHQVTTKNA(SEQ ID NO:40)；(32)LAISDQSKPA(SEQ ID NO:41)；(33)LADATKTA(SEQ ID NO:42)；(34)LAKDTTKNA(SEQ ID NO:43)；(35)LAKSDQSRPA(SEQ ID NO:44)；(36)LAPQDTKKNA(SEQ ID NO:45)；(37)LATSDSTKAA(SEQ ID NO:46)；(38)LAVDGSQRSA(SEQ ID NO:47)；(39)LPISDQTKHA(SEQ ID NO:48)；(40)LPKDATKTIA(SEQ ID NO:49)；(41)LPPQDTTKNA(SEQ ID NO:50)；(42)PAPQDTTKNA(SEQ IDNO:51)；(43)QAHQDTTKNA(SEQ ID NO:52)；(44)LAHETSPRPA(SEQ ID NO:53)；(45)LAKSTSTAPA(SEQ ID NO:54)；(46)LADQDTTKNA(SEQ ID NO:55)；(47)LAESDQSKPA(SEQ IDNO:56)；(48)LAHKDTTKNA(SEQ ID NO:57)；(49)LAHKTQQKM(SEQ ID NO:58)；(50)LAHQDTTENA(SEQ ID NO:59)；(51)LAHQDTTINA(SEQ ID NO:60)；(52)LAHQDTTKKT(SEQ IDNO:61)；(53)LAHQDTTKND(SEQ ID NO:62)；(54)LAHQDTTKNT(SEQ ID NO:63)；(55)LAHQDTTKNV(SEQ ID NO:64)；(56)LAHQDTTKTM(SEQ ID NO:65)；(57)LAHQNTTKNA(SEQ IDNO:66)；(58)LAHRDTTKNA(SEQ ID NO:67)；(59)LAISDQTNHA(SEQ ID NO:68)；(60)LAKQKSASTA(SEQ ID NO:69)；(61)LAKSDQCKPA(SEQ ID NO:70)；(62)LAKSDQSKPD(SEQ IDNO:71)；(63)LAKSDQSNPA(SEQ ID NO:72)；(64)LAKSYQSKPA(SEQ ID NO:73)；(65)LANQDTTKNA(SEQ ID NO:74)；(66)LAPQNTTKNA(SEQ ID NO:75)；(67)LAPSSIQKPA(SEQ IDNO:76)；(68)LAQQDTTKNA(SEQ ID NO:77)；(69)LAYQDTTKNA(SEQ ID NO:78)；(70)LDHQDTTKNA(SEQ ID NO:79)；(71)LDHQDTTKSA(SEQ ID NO:80)；(72)LGHQDTTKNA(SEQ IDNO:81)；(73)LPHQDTTKND(SEQ ID NO:82)；(74)LPHQDTTKNT(SEQ ID NO:83)；(75)LPHQDTTNNA(SEQ ID NO:84)；(76)LTHQDTTKNA(SEQ ID NO:85)；(77)LTKDATKTIA(SEQ IDNO:86)；(78)LTPQDTTKNA(SEQ ID NO:87)；(79)LVHQDTTKNA(SEQ ID NO:88)。预期用于本发明的其他AAV衣壳变体包括具有以下蛋白序列的那些：(1)KDATKN(SEQ ID NO:89)；(2)HQDTTKN(SEQ ID NO:90)；(3)HQDTTKN(SEQ ID NO:91)；(4)TTSQNKP(SEQ ID NO:92)；(5)ISDQTKH(SEQ ID NO:93)；(6)RGVAPSS(SEQ ID NO:94)；(7)PDSTTRS(SEQ ID NO:95)；(8)KGTELKP(SEQ ID NO:96)；(9)IIDATKN(SEQ ID NO:97)；(10)VDGAQRS(SEQ ID NO:98)；(11)PQDTTKK(SEQ ID NO:99)；(12)HQDTTKN(SEQ ID NO:100)；(13)KDATKTI(SEQ ID NO:101)；(14)KQQSAST(SEQ ID NO:102)；(15)KSDQSKP(SEQ ID NO:103)；(16)HQDTTKN(SEQ ID NO:104)；(17)ANQPSKP(SEQ ID NO:105)；(18)VSDSTKA(SEQ ID NO:106)；(19)AQGTAKKP(SEQID NO:107)；(20)PDQTTRN(SEQ ID NO:108)；(21)ASDSTKA(SEQ ID NO:109)；(22)PQDTTKN(SEQ ID NO:110)；(23)KADETRP(SEQ ID NO:111)；(24)HQDTAKN(SEQ ID NO:112)；(25)HQDTKKN(SEQ ID NO:113)；(26)HQDTTKH(SEQ ID NO:114)；(27)HQDTTKK(SEQ ID NO:115)；(28)HQDTTRN(SEQ ID NO:116)；(29)HQDTTN(SEQ ID NO:117)；(30)HQGTTKN(SEQ ID NO:118)；(31)HQVTTKN(SEQ ID NO:119)；(32)ISDQSKP(SEQ ID NO:120)；(33)DATKT(SEQ IDNO:121)；(34)KDTTKN(SEQ ID NO:122)；(35)KSDQSRP(SEQ ID NO:123)；(36)PQDTKKN(SEQID NO:124)；(37)TSDSTKA(SEQ ID NO:125)；(38)VDGSQRS(SEQ ID NO:126)；(39)ISDQTKH(SEQ ID NO:127)；(40)KDATKTI(SEQ ID NO:128)；(41)PQDTTKN(SEQ ID NO:129)；(42)PQDTTKN(SEQ ID NO:130)；(43)HQDTTKN(SEQ ID NO:131)；(44)HETSPRP(SEQ ID NO:132)；(45)KSTSTAP(SEQ ID NO:133)；(46)DQDTTKN(SEQ ID NO:134)；(47)ESDQSKP(SEQ ID NO:135)；(48)HKDTTKN(SEQ ID NO:136)；(49)HKTQQK(SEQ ID NO:137)；(50)HQDTTEN(SEQ IDNO:138)；(51)HQDTTIN(SEQ ID NO:139)；(52)HQDTTKK(SEQ ID NO:140)；(53)HQDTTKN(SEQID NO:141)；(54)HQDTTKN(SEQ ID NO:142)；(55)HQDTTKN(SEQ ID NO:143)；(56)HQDTTKT(SEQ ID NO:144)；(57)HQNTTKN(SEQ ID NO:145)；(58)HRDTTKN(SEQ ID NO:146)；(59)ISDQTNH(SEQ ID NO:147)；(60)KQKSAST(SEQ ID NO:148)；(61)KSDQCKP(SEQ ID NO:149)；(62)KSDQSKP(SEQ ID NO:150)；(63)KSDQSNP(SEQ ID NO:151)；(64)KSYQSKP(SEQ ID NO:152)；(65)NQDTTKN(SEQ ID NO:153)；(66)PQNTTKN(SEQ ID NO:154)；(67)PSSIQKP(SEQ IDNO:155)；(68)QQDTTKN(SEQ ID NO:156)；(69)YQDTTKN(SEQ ID NO:157)；(70)HQDTTKN(SEQID NO:158)；(71)HQDTTKS(SEQ ID NO:159)；(72)HQDTTKN(SEQ ID NO:160)；(81)HQDTTKN(SEQ ID NO:161)；(74)HQDTTKN(SEQ ID NO:162)；(75)HQDTTNN(SEQ ID NO:163)；(76)HQDTTKN(SEQ ID NO:164)；(77)KDATKTI(SEQ ID NO:165)；(78)PQDTTKN(SEQ ID NO:166)；和(79)HQDTTKN(SEQ ID NO:167)。因此，在另一实施例中，变体衣壳多肽具有选自由SEQ IDNO:10-167组成的组的序列。
预期用于本发明的又其他AAV衣壳变体披露于WO 2021/243085中，其通过引用以其全文并入本文。例如，预期用于本发明的AAV衣壳变体包括具有以下蛋白序列的那些：(1)HQDTTKN(SEQ ID NO:168)；(2)LGETTRA(SEQ ID NO:169)；(3)HQDTTRP(SEQ ID NO:170)；(4)RQDTTKN(SEQ ID NO:171)；(5)HQDSTKN(SEQ ID NO:172)；(6)HQDATKN(SEQ ID NO:173)；(7)HQDTKKP(SEQ ID NO:174)；(8)LSETTRP(SEQ ID NO:175)；(9)HQDTTKK(SEQ IDNO:176)；(10)LGEATRP(SEQ ID NO:177)；(11)LGETTRT(SEQ ID NO:178)；(12)LSEATRP(SEQID NO:179)；(13)KDETKNS(SEQ ID NO:180)；(14)LGETTKP(SEQ ID NO:181)；(15)HQATTKN(SEQ ID NO:182)；(16)LAHQDTTKNS(SEQ ID NO:183)；(17)LALGETTRAA(SEQ ID NO:184)；(18)LAHQDTTRPA(SEQ ID NO:185)；(19)LARQDTTKNA(SEQ ID NO:186)；(20)LAHQDSTKNA(SEQ ID NO:187)；(21)LAHQDATKNA(SEQ ID NO:188)；(22)LAHQDTKKPA(SEQ ID NO:189)；(23)ILSETTRPA(SEQ ID NO:190)；(24)LAHQDTTKKC(SEQ ID NO:191)；(25)LALGEATRPA(SEQID NO:192)；(26)LALGETTRTA(SEQ ID NO:193)；(27)LALSEATRPA(SEQ ID NO:194)；(28)LAKDETKNSA(SEQ ID NO:195)；(29)LALGETTKPA(SEQ ID NO:196)；和(30)LAHQATTKNA(SEQID NO:197)。因此，在另一实施例中，变体衣壳多肽具有选自由SEQ ID NO:168-197组成的组的序列。
在一些实施例中，相对于相应的亲本AAV衣壳蛋白，rAAV病毒粒子可以在衣壳蛋白中缺失至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个或至少20个氨基酸。在一些实施例中，rAAV病毒粒子可以在衣壳蛋白中缺失至少20个、至少25个、至少30个、至少35个、至少40个、至少45个、至少50个、至少55个、至少60个、至少65个、至少70个、至少75个、至少80个、至少85个、至少90个、至少95个或至少100个氨基酸。在一些实施例中，rAAV病毒粒子可以在衣壳蛋白中缺失至多约100个氨基酸、至多约200个、至多约300个或至多约400个氨基酸。在一些实施例中，rAAV病毒粒子可以在衣壳蛋白中缺失约1至约100个、约1至约90个、约1至约80个、约1至约70个、约1至约60个、约1至约50个、约1至约40个、约1至约30个、约1至约20个、约1至约15个、约1至约10个或约1至约5个氨基酸。在一些实施例中，rAAV病毒粒子可以在衣壳蛋白中缺失约5个氨基酸至约20个氨基酸、约5个氨基酸至约19个氨基酸、约5个氨基酸至约18个氨基酸、约5个氨基酸至约17个氨基酸、约5个氨基酸至约16个氨基酸、约5个氨基酸至约15个氨基酸、约5个氨基酸至约14个氨基酸、约5个氨基酸至约15个氨基酸、约5个氨基酸至约12个氨基酸、约5个氨基酸至约11个氨基酸、约5个氨基酸至约10个氨基酸、约5个氨基酸至约9个氨基酸、前约5个氨基酸至约8个氨基酸、约5个氨基酸至约7个氨基酸、或约5个氨基酸至约6个氨基酸。
在一些实施例中，相对于相应的亲本AAV衣壳蛋白，rAAV病毒粒子可以在衣壳蛋白中插入至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个或至少20个氨基酸。在一些实施例中，rAAV病毒粒子可以在衣壳蛋白中插入至少20个、至少25个、至少30个、至少35个、至少40个、至少45个、至少50个、至少55个、至少60个、至少65个、至少70个、至少75个、至少80个、至少85个、至少90个、至少95个或至少100个氨基酸。在一些实施例中，rAAV病毒粒子在衣壳蛋白中插入至多约100个氨基酸、至多约200个、至多约300个或至多约400个氨基酸。在一些实施例中，rAAV病毒粒子可以在衣壳蛋白中插入约1至约100个、约1至约90个、约1至约80个、约1至约70个、约1至约60个、约1至约50个、约1至约40个、约1至约30个、约1至约20个、约1至约15个、约1至约10个、或约1至约5个氨基酸。在一些实施例中，rAAV病毒粒子可以在衣壳蛋白中插入约5个氨基酸至约20个氨基酸、约5个氨基酸至约19个氨基酸、约5个氨基酸至约18个氨基酸、约5个氨基酸至约17个氨基酸、约5个氨基酸至约16个氨基酸、约5个氨基酸至约15个氨基酸、约5个氨基酸至约14个氨基酸、约5个氨基酸至约13个氨基酸、约5个氨基酸至约12个氨基酸、约5个氨基酸至约11个氨基酸、约5个氨基酸至约10个氨基酸、约5个氨基酸至约9个氨基酸、约5个氨基酸至约8个氨基酸、约5个氨基酸至约7个氨基酸、或约5个氨基酸至约6个氨基酸。
在一些实施例中，相对于相应的亲本AAV衣壳蛋白，rAAV病毒粒子可以在衣壳蛋白中取代至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个或至少20个氨基酸。在一些实施例中，rAAV病毒粒子可以在衣壳蛋白中取代约1个氨基酸至约20个氨基酸、约1个氨基酸至约19个氨基酸、约1个氨基酸至约18个氨基酸、约1个氨基酸至约17个氨基酸、约1个氨基酸至约16个氨基酸、约1个氨基酸至约15个氨基酸、约1个氨基酸至约14个氨基酸、约1个氨基酸至约13个氨基酸、约1个氨基酸至约12个氨基酸、约1个氨基酸至约11个氨基酸、约1个氨基酸至约10个氨基酸、约1个氨基酸至约9个氨基酸、约1个氨基酸至约8个氨基酸、约1个氨基酸至约7个氨基酸、约1个氨基酸至约6个氨基酸、约1至约5个氨基酸、约1至约4个氨基酸、约1至约3个氨基酸、或约1至约2个氨基酸。
在一些实施例中，相对于相应的亲本未修饰衣壳蛋白，rAAV病毒粒子可以在衣壳蛋白中插入、缺失或取代总共至少约1个、至少约2个、至少约3个、至少约4个、至少约5个、至少约6个、至少约7个、至少约8个、至少约9个、至少约10个、至少约11个、至少约12个、至少约13个、至少约14个、至少约15个、至少约16个、至少约17个、至少约18个、至少约19个、或至少约20个氨基酸。在一些实施例中，相对于相应的亲本未修饰衣壳蛋白，rAAV病毒粒子可以在衣壳蛋白中插入、缺失或取代总共至少约20个、至少约25个、至少约30个、至少约35个、至少约40个、至少约45个、至少约50个、至少约55个、至少约60个、至少约65个、至少约70个、至少约75个、至少约80个、至少约85个、至少约90个、至少约95个、或至少约100个氨基酸。在一些实施例中，相对于相应的亲本未修饰衣壳蛋白，rAAV病毒粒子可以在衣壳蛋白中插入、缺失或取代总共至少约100个、至少约200个、至少约300个或至少约400个氨基酸。
在一些实施例中，rAAV病毒粒子包含具有与亲本未修饰AAV衣壳蛋白的衣壳蛋白至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约80％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％；至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％同源的氨基酸序列的变体衣壳蛋白。
在一些情况下，修饰可在AAV2的氨基酸587之后，或在另一种AAV血清型的衣壳亚基的相应残基之后。应当注意，残基587基于AAV2衣壳蛋白。也可以在除AAV2之外的AAV血清型(例如，AAV8、AAV9等)中的相应位点掺入修饰。基于各种AAV血清型的衣壳蛋白的氨基酸序列的比较，本领域技术人员将知道，其中对应于AAV2的氨基酸587的修饰位点将在任何给定AAV血清型的衣壳蛋白中。参见，例如，AAV1的GenBank登录号NP_049542；AAV5的GenBank登录号AAD13756；AAV6的GenBank登录号AAB95459；AAV7的GenBank登录号YP_077178；AAV8的GenBank登录号YP_077180；AAV9的GenBank登录号AAS99264和AAV10的GenBank登录号AAT46337。
在一些实施例中，与包含相应的亲本或未修饰的AAV衣壳蛋白的AAV病毒粒子对视网膜细胞的感染性相比，本文描述的衣壳蛋白的氨基酸修饰可使眼细胞的感染性增加。在一些情况下，眼细胞可以是视网膜神经节细胞(RGC)。在一些情况下，视网膜细胞可以是视网膜色素上皮(RPE)细胞。在一些情况下，眼细胞可以是缪勒氏细胞。在一些情况下，眼细胞可以是星形胶质细胞。在一些情况下，视网膜细胞可包括无长突细胞、双极细胞或水平细胞。用于本披露的病毒载体可以包括在受试者中表现出低毒性和/或低免疫原性并且在受试者(例如人类患者)中表达治疗有效量的MW-视蛋白转基因的那些。
在一些实施例中，与包含相应的亲本或未修饰的AAV衣壳蛋白的AAV病毒粒子相比，rAAV变体的视网膜细胞感染性增加至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少100％。在一些实施例中，与包含相应的亲本或未修饰的AAV衣壳蛋白的AAV病毒粒子相比，动物细胞的感染性增加5％至100％、5％至95％、5％至90％；5％至85％、5％至80％、5％至75％、5％至70％、5％至65％、5％至60％、5％至55％、5％至50％、5％至45％、5％至40％、5％至35％、5％至30％、5％至25％、5％至20％、5％至15％、5％至10％。
在一些实施例中，与包含相应的亲本或未修饰的AAV衣壳蛋白的AAV病毒粒子相比，rAAV变体的视网膜细胞感染性增加至少1倍、至少1.1倍、至少1.2倍、至少1.3倍、至少1.4倍、至少1.5倍、至少1.6倍、至少1.7倍、至少1.8倍、至少1.9倍或至少2倍。在一些实施例中，与包含相应的亲本AAV衣壳蛋白的AAV病毒粒子相比，感染性增加至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍或至少10倍。在一些实施例中，与包含相应的亲本或未修饰的AAV衣壳蛋白的AAV病毒粒子相比，感染性增加至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少30倍、至少35倍、至少40倍、至少45倍、至少50倍、至少55倍、至少60倍、至少65倍、至少70倍、至少75倍、至少80倍、至少85倍、至少90倍或至少100倍。
在一些实施例中，与包含相应的亲本或未修饰的AAV衣壳蛋白的AAV病毒粒子相比，视网膜细胞感染性增加10倍至100倍、10倍至95倍、10倍至90倍、10倍至85倍、10倍至80倍、10倍至75倍、10倍至70倍、10倍至65倍、10倍至60倍、10倍至55倍、10倍至50倍、10倍至45倍、10倍至40倍、10倍至35倍、10倍至30倍、10倍至25倍、10倍至20倍、或10倍至15倍。
在一些实施例中，与包含相应的亲本或未修饰的AAV衣壳蛋白的AAV病毒粒子相比，视网膜细胞感染性增加2倍至20倍、2倍至19倍、2倍至18倍、2倍至17倍、2倍至16倍、2倍至15倍、2倍至14倍、2倍至13倍、2倍至12倍、2倍至11倍、2倍至10倍、2倍至9倍、2倍至8倍、2倍至7倍、2倍至6倍、2倍至5倍、2倍至4倍、或2倍至3倍。
在一些实施例中，与包含相应的亲本或未修饰的AAV衣壳蛋白的AAV病毒粒子在受试者眼中穿过ILM的能力相比，本文描述的衣壳蛋白的氨基酸修饰可赋予灵长类或人类受试者眼中穿过内界膜(ILM)的能力增加。在一些实施例中，与包含相应的亲本或未修饰的AAV衣壳蛋白的AAV病毒粒子相比，穿过ILM的能力增加至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少100％。在一些实施例中，与亲本或未修饰的AAV衣壳蛋白相比，穿过ILM的能力增加5％至100％、5％至95％、5％至90％、5％至85％、5％至80％、5％至75％、5％至70％、5％至65％、5％至60％、5％至55％、5％至50％、5％至45％、5％至40％、5％至35％、5％至30％、5％至25％、5％至20％、5％至15％、或5％至10％。
在一些实施例中，与包含相应的亲本AAV衣壳蛋白的AAV病毒粒子相比，穿过ILM的能力增加至少1倍、至少1.1倍、至少1.2倍、至少1.3倍、至少1.4倍、至少1.5倍、至少1.6倍、至少1.7倍、至少1.8倍、至少1.9倍或至少2倍。在一些实施例中，与包含相应的亲本AAV衣壳蛋白的AAV病毒粒子相比，穿过ILM的能力增加至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍或至少10倍。在一些实施例中，与包含相应的亲本或未修饰的AAV衣壳蛋白的AAV病毒粒子相比，穿过ILM的能力增加至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少30倍、至少35倍、至少40倍、至少45倍、至少50倍、至少55倍、至少60倍、至少65倍、至少70倍、至少75倍、至少80倍、至少85倍、至少90倍或至少100倍。
在一些实施例中，与包含相应的亲本或未修饰的AAV衣壳蛋白的AAV病毒粒子相比，穿过ILM的能力增加10倍至100倍、10倍至95倍、10倍至90倍、10倍至85倍、10倍至80倍、10倍至75倍、10倍至70倍、10倍至65倍、10倍至60倍、10倍至55倍、10倍至50倍、10倍至45倍、10倍至40倍、10倍至35倍、10倍至30倍、10倍至25倍、10倍至20倍、或10倍至15倍。
在一些实施例中，与包含相应的亲本或未修饰的AAV衣壳蛋白的AAV病毒粒子相比，穿过ILM的能力增加2倍至20倍、2倍至19倍、2倍至18倍、2倍至17倍、2倍至16倍、2倍至15倍、2倍至14倍、2倍至13倍、2倍至12倍、2倍至11倍、2倍至10倍、2倍至9倍、2倍至8倍、2倍至7倍、2倍至6倍、2倍至5倍、2倍至4倍或2倍至3倍。
在一些实施例中，本披露的病毒载体被测定为载体基因组。在一些情况下，本披露的重组病毒的单位剂量包含1x1010至2x1010、2x1010至3x1010、3x1010至4x1010、4x1010至5x1010、5x1010至6x1010、6x1010至7x1010、7x1010至8x1010、8x1010至9x1010、9x1010至10x1010、1x1011至2x1011、2x1011至3x1011、3x1011至4x1011、4x1011至5x1011、5x1011至6x1011、6x1011至7x1011、7x1011至8x1011、8x1011至9x1011、9x1011至10x1011、1x1012至2x1012、2x1012至3x1012、3x1012至4x1012、4x1012至5x1012、5x1012至6x1012、6x1012至7x1012、7x1012至8x1012、8x1012至9x1012、9x1012至10x1012、1x1013至2x1013、2x1013至3x1013、3x1013至4x1013、4x1013至5x1013、5x1013至6x1013、6x1013至7x1013、7x1013至8x1013、8x1013至9x1013、或9x1013至10x1013个载体基因组。在一些实施例中，本披露的rAAV具有1010至1013、1010至1014、2x1011至4x1011、3x1011至5x1011、4x1011至6x1011、5x1011至7x1011、6x1011至8x1011、7x1011至9x1011、8x1011至10x1011、1x1012至3x1012、2x1012至4x1012、3x1012至5x1012、4x1012至6x1012、5x1012至7x1012、6x1012至8x1012、7x1012至9x1012、8x1012至10x1012、1x1013至5x1013、5x1013至10x1013、1012至5x1012、或5x1012至10x1012个载体基因组。
在一些情况下，本披露的重组病毒具有约1 x E10、约1.5 x E10、约2 x E10、约2.5x E10、约3 x E10、约3.5 x E10、约4 x E10、约4.5 x E10、约5 x E10、约5.5 x E10、约6 x E10、约6.5 x E10、约7 x E10、约7.5 x E10、约8 x E10、约8.5 x E10、约9 x E10、约9.5 x E10、约10 x E10、约1 x E11、约1.5 x E11、约2x E11、约2.5 x E11、约3 x E11、约3.5 x E11、约4x E11、约4.5x E11、约5x E11、约5.5 x E11、约6 x E11、约6.5 x E11、约7x E11、约7.5 x E11、约8 x E11、约8.5 x E11、约9x E11、约9.5 x E11、约10 x E11、约1 xE12、约1.3 x E12、约1.5 x E12、约2 x E12、约2.1 x E12、约2.3 x E12、约2.5 x E12、约2.7 x E12、约2.9 x E12、约3x E12、约3.1 x E12、约3.3 x E12、约3.5x E12、约3.7x E12、约3.9 x E12、约4 x E12、约4.1 x E12、约4.3 x E12、约4.5 x E12、约4.7 x E12、约4.9 xE12、约5x E12、约5.1 x E12、约5.3x E12、约5.5 x E12、约5.7 x E12、约5.9 x E12、约6 xE12、约6.1 x E12、约6.3x E12、约6.5 x E12、约6.7 x E12、约6.9 x E12、约7 x E12、约7.1 x E12、约7.3 x E12、约7.5 x E12、约7.7 x E12、约7.9 x E12、约8 x E12、约8.1 xE12、约8.3 x E12、约8.5 x E12、约8.7 x E12、约8.9 x E12、约9xE12、约9.1x E12、约9.3xE12、约9.5 x E12、约9.7 x E12、约9.9 x E12、约10 x E12、约10.1 x E12、约10.3 x E12、约10.5 x E12、约10.7 x E12、约10.9 x E12、约11 x E12、约11.5 x E12、约12 x E12、约12.5 x E12、约13 x E12、约13.5 x E12、约14 x E12、约14.5 x E12、约15 x E12、约15.5x E12、约16 x E12、约16.5 x E12、约17 x E12、约17.5 x E12、约18 x E12、约18.5 xE12、约19 x E12、约19.5 x E12、约20 x E12、约20.5 x E12、约30 x E12、约30.5 x E12、约40 x E12、约40.5 x E12、约50 x E12、约50.5 x E12、约60 x E12、约60.5 x E12、约70x E12、约70.5 x E12、约80 x E12、约80.5 x E12、约90 x E12、约95 x E12、或约100 xE12个载体基因组，其中E是以10为底取幂的简写，并且xEy是指x乘以10的y次幂/指数。在一些实施例中，重组病毒包含1 x E13个载体基因组。
在一些实施例中，本文披露的药物组合物包含具有至少5 x E11、至少5.5x E11、至少6 x E11、至少6.5 x E11、至少7 x E11、至少7.5 x E11、至少8x E11、至少8.5 x E11、至少9 x E11、至少9.5 x E11、至少10 x E11、至少1x E12、至少1.31 x E12、至少1.51 xE12、至少2 x E12、至少2.1 x E12、至少2.3 x E12、至少2.5 x E12、至少2.7 x E12、至少2.9 x E12、至少3 x E12、至少3.1 x E12、至少3.3 x E12、至少3.5 x E12、至少3.7x E12、至少3.9 x E12、至少4 x E12、至少4.1 x E12、至少4.3 x E12、至少4.5 x E12、至少4.7 xE12、至少4.9 x E12、至少5 x E12、至少5.1 x E12、至少5.3 x E12、至少5.5 x E12、至少5.7 x E12、至少5.9 x E12、至少6 x E12、至少6.1 x E12、至少6.3 x E12、至少6.5 xE12、至少6.7 x E12、至少6.9 x E12、至少7 x E12、至少7.1 x E12、至少7.1 x E12、至少7.3 x E12、至少7.5 x E12、至少7.7 x E12、至少7.9 x E12、至少8 x E12、至少8.1 xE12、至少8.3 x E12、至少8.5 x E12、至少8.7 x E12、至少8.9 x E12、至少9 x E12、至少9.1 x E12、至少9.1 x E12、至少9.3 x E12、至少9.5 x E12、至少9.7 x E12、至少9.9 xE12、至少10 x E12、至少10.1 x E12、至少10.3 x E12、至少10.5 x E12、至少10.7 x E12、至少10.9 x E12、至少11 x E12、至少11.5 x E12、至少12 x E12、至少12.5 x E12、至少13x E12、至少13.5 x E12、至少14 x E12、至少14.5 x E12、至少15 x E12、至少15.5 x E12、至少16 x E12、至少16.5 x E12、至少17 x E12、至少17.5 x E12、至少18 x E12、至少18.5x E12、至少19 x E12、至少19.5 x E12、至少20 x E12、至少20.5 x E12、至少30 x E12、至少30.5 x E12、至少40 x E12、至少40.5 x E12、至少50 x E12、至少50.5 x E12、至少60 xE12、至少60.5 x E12、至少70 x E12、至少70.5 x E12、至少80 x E12、至少80.5 x E12、至少90 x E12、至少95 x E12、或至少100 x E12个载体基因组的重组病毒，其中E是以10为底取幂的简写，并且其中xEy是指x乘以10为底的y次幂/指数。在一些实施例中，本文披露的药物组合物包含具有约1 x E13个载体基因组的重组病毒。
在一些实施例中，使用感染复数(MOI)测定本披露的病毒载体。在一些情况下，MOI是指载体或病毒基因组与可递送多核苷酸的细胞的比率或倍数。在一些情况下，MOI为1x106。在一些情况下，本披露的重组病毒可以具有至少1x101、1x102、1x103、1x104、1x105、1x106、1x107、1x108、1x109、1x1010、1x1011、1x1012、1x1013、1x1014、1x1015、1x1016、1x1017和1x1018MOI。在一些情况下，本披露的重组病毒可以具有1x108至1x1015MOI。在一些情况下，本披露的重组病毒可以具有至多1x101、1x102、1x103、1x104、1x105、1x106、1x107、1x108、1x109、1x1010、1x1011、1x1012、1x1013、1x1014、1x1015、1x1016、1x1017、和1x1018MOI。
在一些实施例中，多核苷酸可以在不使用病毒(即，使用非病毒载体)的情况下递送，并且可以作为多核苷酸的量来测量。通常，任何合适量的多核苷酸可与本披露的药物组合物和方法一起使用。
在一些实施例中，可以使用自互补载体(sc)。使用自互补的AAV载体可以绕过病毒第二链DNA合成的需要，并且可以导致转基因蛋白的更高表达率，如Wu,Hum Gene Ther.[人类基因疗法]2007,18(2):171-82提供的，其通过引用并入本文。
在一些实施例中，载体可以是逆转录病毒载体。逆转录病毒载体可以包括莫洛尼鼠白血病病毒和基于HIV的病毒。在一些实施例中，可以使用基于HIV的病毒载体，其中基于HIV的病毒载体包含至少两种载体，其中gag和pol基因来自HIV基因组，而env基因来自另一种病毒。在一些实施例中，可以使用DNA病毒载体。这些载体可包括痘病毒载体(如正痘病毒或禽痘病毒载体)、疱疹病毒载体(如单纯疱疹病毒I型(HSV)载体[Geller,A.I.等人,J.Neurochem[神经化学杂志],64:487(1995)；Lim,F.等人,DNA Cloning:MammalianSystems[DNA克隆：哺乳动物系统],D.Glover编辑(Oxford Univ.Press.Oxford England[牛津大学出版社，英格兰牛津])(1995)；Geller.A.I.等人,Proc Natl.Acad,Sci.:U.S.A.[美国科学院院报]；90:7603(1993)；Geller,A.I.等人,Proc Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]:87；1149(1990)])、腺病毒载体[LeGal LaSalle等人,Science.[科学]259:988(1993)；Davidson等人,Nat.Genet.[自然遗传]3:219(1993)；Yang等人,J.Virol[病毒学杂志]69:2004(1995)]和腺相关病毒载体[Kaplitt,M.G.等人,Nat Genet.[自然遗传]8:148(1994)]，它们通过引用以其全文并入文中。
在一些实施例中，载体可以是慢病毒载体。用于本披露的慢病毒载体可衍生于人和非人(包括SIV)慢病毒。慢病毒载体的实例可包括载体增殖所需的多核苷酸序列以及与MW-视蛋白转基因可操作地连接的组织特异性启动子。多核苷酸序列可包括病毒LTR、引物结合位点、多聚嘌呤束、att位点和衣壳化位点。
在一些实施例中，载体可以是甲病毒载体。基于甲病毒的载体(如由塞姆利基森林病毒(SFV)和辛德毕斯病毒(SIN)制备的那些)也可用于本披露。甲病毒的用途描述于Lundstrom,K.,Intervirology[国际病毒学]43:247-257,2000和Perri等人,Journal ofVirology[病毒学杂志]74:9802-9807,2000中，其通过引用以其全文并入本文。
在一些实施例中，载体可以是痘病毒载体。痘病毒载体可以将基因导入细胞的细胞质。禽痘病毒载体仅可导致基因或多核苷酸的短期表达。腺病毒载体、腺相关病毒载体和单纯疱疹病毒(HSV)载体可与本披露的组合物和方法一起使用。在一些方面，腺病毒载体可以导致比腺相关病毒更短期的表达(例如，少于约一个月)，并且可以表现出长得多的表达。所选择的特定载体可取决于靶细胞和所治疗的病症。
在一些实施例中，可以使用胶束、微乳液、脂质体、纳米球、纳米颗粒、纳米胶囊、固体脂质纳米颗粒、树状大分子、聚乙烯亚胺衍生物和单壁碳纳米管、以及能够介导多核苷酸递送至靶细胞的其他大分子复合物将载体(例如裸DNA或质粒)递送到细胞、组织或受试者中。在一些情况下，载体可以是有机分子或无机分子。在一些情况下，载体是小分子(即<5kD)或大分子(即>5kD)。
本文还披露了适用于基因疗法以恢复或增强视觉功能的重组腺相关病毒(rAAV)病毒粒子，其包含：(a)变体AAV衣壳蛋白，其中该变体衣壳蛋白赋予相对于包含相应的非变体或未修饰的AAV衣壳蛋白的AAV病毒粒子增加的视网膜细胞感染性；(b)编码MW-视蛋白多肽或治疗性转基因的异源多核苷酸序列。在一些实施例中，用于基因疗法的rAAV是rAAV2。
在一些实施例中，本文披露了用于恢复或增强视觉功能的重组腺相关病毒(rAAV)病毒粒子，其包含：(a)变体AAV衣壳蛋白，其中该变体AAV衣壳蛋白在该衣壳蛋白的溶剂暴露区中包含氨基酸修饰，并且相对于相应的非变体AAV衣壳蛋白显示出增加的视网膜细胞感染性；和(b)包含编码MW-视蛋白的多核苷酸序列的异源多核苷酸，并且其中通过眼内、玻璃体内或视网膜下注射在灵长类或人类受试者的眼中施用有效量的rAAV导致恢复或增强眼的视觉功能。
本文还披露了用于恢复或增强视觉功能的重组腺相关病毒(rAAV)病毒粒子，其包含：(a)变体AAV衣壳蛋白，其中该变体AAV衣壳蛋白在该AAV衣壳蛋白的溶剂暴露区中包含氨基酸修饰，并且其中该变体衣壳蛋白赋予增加的在眼中穿过内界膜(ILM)的能力；和(b)包含编码MW-视蛋白的多核苷酸序列的异源多核苷酸，并且其中通过眼内、玻璃体内或视网膜下注射在灵长类或人类受试者的眼中施用有效量的rAAV导致恢复或增强眼的视觉功能。
本文还披露了用于治疗眼部病症或疾病的单位剂量形式的基因疗法组合物，其包含：(a)重组腺相关病毒(rAAV)病毒粒子，其包含：(i)变体AAV衣壳蛋白，其中该变体AAV衣壳蛋白在该衣壳蛋白的溶剂暴露区中包含氨基酸修饰，并且相对于相应的非变体AAV衣壳蛋白显示出增加的视网膜细胞感染性；和(ii)包含编码MW-视蛋白的多核苷酸序列的异源多核苷酸，其中该MW-视蛋白当被转导时恢复或增强灵长类或人类受试者的眼中的视觉功能；和(b)药学上可接受的赋形剂；其中该rAAV病毒粒子的量足以在通过眼内、玻璃体内或视网膜下注射以单位剂量施用于灵长类动物眼中时至少部分恢复或增强视觉功能。
治疗剂
在一些实施例中，使用基因疗法来递送具有MW-视蛋白活性的治疗性转基因，该治疗性转基因适于或适用于施用于非人灵长类动物或人类受试者的眼或眼的玻璃体。在一些实施例中，包含本文描述衣壳变体的rAAV包含编码MW-视蛋白的异源多核苷酸序列，其用于在眼内、玻璃体内或视网膜下注射至受试者后将MW-视蛋白转基因的序列递送至视网膜细胞中。在一些实施例中，将包含MW-视蛋白转基因的rAAV配制用于基因疗法和玻璃体内注射。在一些实施例中，MW-视蛋白转基因是指其功能片段或变体。在一些实施例中，MW-视蛋白转基因的多核苷酸序列是SEQ ID NO:3。在一些实施例中，MW-视蛋白转基因的多核苷酸序列和/或氨基酸序列(例如，SEQ ID NO:3)被进一步修饰以增强其体内活性、表达、稳定性和/或溶解性。
在一些实施例中，将用于本文披露的基因疗法或rAAV的MW-视蛋白转基因多核苷酸序列与SEQ ID NO:3的相应多核苷酸序列相比较，并显示出至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％、99.99％或100％序列同源性。在一些实施例中，将用于本文披露的基因疗法或rAAV的多核苷酸序列与SEQ ID NO:8或SEQID NO:9的多核苷酸序列相比较，并显示出至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％、99.99％或100％序列同源性。
本披露考虑了如本文所披露的包含一种或多种治疗剂的方法和药物组合物。在一些实施例中，治疗剂是MW-视蛋白多肽。在一些实施例中，MW-视蛋白多肽由rAAV载体或基因疗法表达，其在体内被递送到靶细胞、组织或受试者中。基因疗法具有在体内长时间提供治疗剂(例如，MW-视蛋白多肽)的优点，其与施用基于蛋白质的疗法相比，减少了重复注射的需要。基因疗法的这样的优势可以导致治疗剂在体内更持续的递送和表达，这提供了优于当前护理标准的改善。另外，基因疗法还可以在体内提供治疗剂的更靶向递送，例如，递送至靶细胞，并使脱靶效应最小化。在一些实施例中，本文披露的基因产物是MW-视蛋白多肽，其在表达时可导致恢复或增强受试者眼的视觉功能。在一些实施例中，本文披露的基因产物可以是能恢复或增强个体的视觉功能的MW-视蛋白多肽或其片段。
适应症
在一些情况下，如本文所描述的包含变体衣壳蛋白和治疗性转基因的任何血清型的rAAV病毒粒子或其药物组合物可以至少部分改善与视杆和视锥光感受器丧失相关的眼部病症或疾病。在一些实施例中，包含衣壳变体蛋白的rAAV病毒粒子用于将MW-视蛋白转基因递送到人类受试者的眼中。适合用本披露的方法治疗的个体包括患有视网膜变性病症的个体，其中自然光敏感性丧失并且因此视力受损，但是其中视网膜回路中晚期的神经元(例如，输出到大脑的双极细胞或无长突中间神经元或神经节细胞)被保留并且可以通过引入一个或多个视锥视蛋白而直接对光敏感。
本文描述的适应症包括患有DME的患者的地图样萎缩、年龄相关性黄斑变性(AMD)、视网膜静脉阻塞(RVO)后的黄斑水肿、糖尿病性黄斑水肿(DME)、视网膜静脉阻塞和糖尿病性视网膜病变(DR)。本文描述的其他实施例包括视网膜色素变性、黄斑变性、视网膜劈裂症、莱伯氏先天性黑蒙、视锥视杆营养不良、眼底黄色斑点症、巴尔得-别德尔综合征、无脉络膜症、厄舍综合征、和别蒂结晶样营养障碍。在一些情况下，本文披露的方法和药物组合物可用于预防或治疗MW-视蛋白转基因被批准或指示使用的眼部病症或疾病。在一些实施例中，使用基因疗法(例如，基于rAAV的基因疗法)来治疗或预防眼部病症或疾病，该眼部病症或疾病对针对其的至少一种当前护理标准有反应的眼部病症或疾病，包括但不限于患有DME的患者的AMD、RVO后的黄斑水肿、DME和糖尿病性视网膜病变。在一些实施例中，rAAV基因疗法用于治疗或预防以视杆和视锥光感受器丧失为特征的任何眼部病症或障碍。在另一方面，本披露提供了本文提供的药物组合物，其用于治疗疾病，例如：AMD、视网膜色素变性、黄斑变性、视网膜劈裂症、莱伯氏先天性黑蒙、视锥视杆营养不良、巴尔得-别德尔综合征、无脉络膜症、厄舍综合征、别蒂结晶样营养障碍等。在一些实施例中，眼部病症可以是视网膜色素变性。在其他实施例中，个体由于创伤、头部损伤或作为另一种疾病的并发症(例如糖尿病性视网膜病变)经历视网膜脱离或光感受器丧失。
在一些实施例中，眼部病症可以是AMD。AMD可造成中央视觉恶化。可能出现的其他症状包括颜色紊乱和视物变形(扭曲，其中直线呈现波浪状)。在一些实施例中，如本文所披露的方法和药物组合物用于治疗AMD。如果没有另外说明，术语“AMD”可以是干性AMD或湿性AMD。本披露考虑治疗或预防AMD、湿性AMD和/或干性AMD。在一些实施例中，如本文所披露的方法和药物组合物用于治疗AMD。
使用方法
在一些实施例中，本披露提供了用于治疗眼部疾病的方法，该方法包括向需要这样的治疗的人类受试者施用药学有效量的本文提供的药物组合物。在一些实施例中，疾病选自眼部疾病，包括视网膜色素变性、黄斑变性、地图样萎缩、年龄相关性黄斑变性、视网膜劈裂症、莱伯氏先天性黑蒙、视锥视杆营养不良、巴尔得-别德尔综合征、无脉络膜症、厄舍综合征、别蒂结晶样营养障碍和其他遗传性视网膜营养不良如眼底黄色斑点症。在其他实施例中，个体由于创伤、头部损伤或作为另一种疾病的并发症(例如糖尿病性视网膜病变)经历视网膜脱离或光感受器丧失。例如，在一些情况下，个体经历了由钝伤例如爆炸伤(例如，在军事战斗中)引起的视网膜脱离，或者由对头部的冲击(例如在车祸或导致对头部造成冲击的其他事故的过程中)引起的视网膜脱离。在一些情况下，光感受器由于视网膜从下面的RPE的创伤性脱离而丧失，但是内部视网膜神经元是完整的。适合用本披露的方法治疗的个体包括由于急性光损伤、激光暴露或化学毒性而导致光感受器丧失的个体。
在一些实施例中，含有包含变体衣壳蛋白(例如，rAAV.7m8)和编码MW-视蛋白多肽的多核苷酸序列的rAAV的药物组合物用于治疗或预防AMD，包括干性AMD和湿性AMD。在一些实施例中，含有包含变体衣壳蛋白(例如，rAAV.7m8)和编码MW-视蛋白多肽的多核苷酸序列的rAAV的药物组合物用于治疗或预防视网膜色素变性、黄斑变性、视网膜劈裂症、莱伯氏先天性黑蒙、视锥视杆营养不良、巴尔得-别德尔综合征、无脉络膜症、厄舍综合征和别蒂结晶样营养障碍。
在一些情况下，基因疗法的风险较低，因为其在患者一生中仅需要注射一次，或在至少2、5、10、20、30、40或50年内注射不超过一次。在一些情况下，用如本文所披露的MW-视蛋白基因疗法的治疗可以比基于蛋白质的注射更具成本效益，因为基因疗法的治疗效果可以持续更长时间，并且一次性基因疗法注射的成本可能低于多次重复注射蛋白质的组合成本。
此外，由于不需要重复注射，基因疗法解决了与需要重复注射的疗法相关的患者依从性和遵守性挑战，因为不依从性(例如，当患者忘记或错过一次或多次预定注射时)可导致视力丧失和眼部疾病或病症的恶化。在受AMD影响最大的老年患者中，不依从和不遵守需要反复或频繁地往返到医疗机构进行施用的治疗方案的比率较高。因此，经由基因疗法，例如一次性玻璃体内注射，将MW-视蛋白转基因递送到患者的眼中，可以为患者提供更方便的治疗选择，并经由解决不依从性和不遵守性问题来改善患者结果。
在一些实施例中，本文描述的MW-视蛋白基因疗法的使用方法包括根据药物标签重构本文描述的药物组合物的冻干形式(例如，包含MW-视蛋白多核苷酸序列的rAAV)，并将所述重构的MW-视蛋白基因疗法施用于受试者或人类患者。
在一些实施例中，rAAV-MW-视蛋白病毒粒子可经由眼内注射、经由玻璃体内注射、经由视网膜下注射或经由任何其他方便的施用方式或途径施用到个体的眼。其他方便的施用方式或途径可包括例如局部、滴眼剂、眼周、眼内、玻璃体内、结膜下、眼球后、进入巩膜和眼房间等。在一些实施例中，本文披露的方法和药物组合物涉及通过玻璃体内注射进行施用。
如本文所描述的“治疗有效量”可以是可通过临床试验确定的相对宽的范围。对于直接注射到眼或玻璃体内注射，MW-视蛋白基因疗法的治疗有效剂量可以是约1010至1013个载体基因组。
本文还披露了治疗眼部病症或疾病的方法，该方法包括向人类受试者的眼施用适用于基因疗法的rAAV病毒粒子并体内递送如本文所描述的用于表达MW-视蛋白的多核苷酸序列；其中该人类受试者先前已被诊断患有与视网膜病症相关的眼部病症，其中自然光敏感性丧失且因此视力受损。在一些实施例中，将基因疗法施用于用至少一种批准的疗法(例如抗VEGF药剂)预治疗的患者。在一些实施例中，将本文披露的基因疗法施用于用至少一种批准的疗法(例如抗VEGF药剂注射)预治疗并且未显示改善的患者。在一些实施例中，接受本文披露的基因疗法的患者具有一种或多种不利于用需要多次重复注射至眼的疗法治疗患者的风险因素，例如炎症、感染、眼内压升高和/或其他不良作用的风险增加。
在一些实施例中，MW-视蛋白基因疗法或其药物组合物可以作为单剂量或一次性剂量施用。在一些实施例中，可以采用多于一次的施用以在不同间隔的持续时间段内实现期望的基因表达水平，例如在至少2年、或至少3、4、5、6、7、8、9、10年或更多年内不多于一次。在一些实施例中，玻璃体内注射MW-视蛋白基因疗法消除了患者接受批准的蛋白质注射至少1年或2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30年或更多年的需要。
对于递送MW-视蛋白转基因体内基因疗法，能够以单剂量或一次性剂量施用包含编码MW-视蛋白的多核苷酸序列的药物组合物。在一些实施例中，施用给受试者的基因疗法的剂量总数在至少1.5年、至少2年、至少3年、至少4年、至少5年、至少6年、至少7年、至少8年、至少9年或至少10年内不多于一次。在一些实施例中，施用包含编码MW-视蛋白的多核苷酸序列的基因疗法在患者的一生中仅一次或一次。在一些实施例中，一次性施用包含编码MW-视蛋白的多核苷酸序列的基因疗法可在患者中产生持续超过1年，超过2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50或更多年的治疗效果。在一些实施例中，在至少2年或以上、至少3年或以上、至少4年或以上、至少5年或以上、至少6年或以上、至少7年或以上、至少8年或以上、至少9年或以上、或至少10年或以上时间内向患者施用包含编码MW-视蛋白的多核苷酸序列的基因疗法不多于一次。在一些实施例中，将包含编码MW-视蛋白的多核苷酸序列的基因疗法施用给最初对至少一种当前护理标准或至少一种现有疗法(例如抗VEGFT药剂)有反应的患者。在一些实施例中，将基因疗法施用给在接受基因疗法之前接受用抗VEGF疗法的预治疗的患者。
在一些实施例中，包含编码MW-视蛋白的多核苷酸序列的基因疗法的一次性施用消除了患者在眼中接受抗VEGF药剂或任何其他基于蛋白质的治疗剂或护理标准治疗超过一年、超过1.5年、或超过2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50或更多年的需要。在一些实施例中，接受包含编码MW-视蛋白的多核苷酸序列的基因疗法的注射的患者不需要在患者余生在眼中进行抗VEGF药剂或任何其他基于蛋白质的治疗剂或护理标准治疗的任何额外注射。在其他实施例中，接受一次性注射MW-视蛋白基因疗法的患者可以在抗VEGF药剂疗法和/或任何其他批准的治疗剂之后(根据需要，在接受基因疗法后已过去至少1.5、2、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50或更多年之后)开始疗法。
本披露提供了一种增强或恢复个体的视觉功能的方法，该方法包括向个体的眼施用包含本披露的重组病毒载体(或包含该重组病毒载体的病毒颗粒)的药物组合物。施用重组病毒载体(或包含该重组病毒载体的病毒颗粒)后，在视网膜细胞中产生MW-视蛋白。视网膜细胞中MW-视蛋白的产生在个体中提供增强的或恢复的视觉功能。
MW-视蛋白多肽在个体的视网膜细胞中的表达提供了个体的模式化视觉和图像识别。图像识别可以是静态图像和/或运动图像。
MW-视蛋白多肽在个体的视网膜细胞中的表达提供了在约10-4W/cm2至约10W/cm2的光强度下的图像识别。例如，在一些情况下，MW-视蛋白多肽在个体的视网膜细胞中的表达提供了在约10-2W/cm2至约10-4W/cm2、约10-4W/cm2至约1W/cm2、约10-4W/cm2至约10-1W/cm2、或约10-4W/cm2至约5x10-1W/cm2的光强度下的图像识别。在一些情况下，MW-视蛋白多肽在个体的视网膜细胞中的表达提供了在约10-4W/cm2至约10-3W/cm2、约10-3W/cm2至约10-2W/cm2、约10-2W/cm2至约10-1W/cm2、或约10-1W/cm2至约1W/cm2的光强度下的图像识别。在一些情况下，MW-视蛋白多肽在个体的视网膜细胞中的表达提供了在高达2W/cm2、高达3W/cm2、高达4W/cm2、高达5W/cm2、或高达10W/cm2的光强度下的图像识别。MW-视蛋白多肽在个体的视网膜细胞中的表达提供了在小于5W/cm2、小于4W/cm2、小于3W/cm2、或小于2W/cm2的光强度下的图像识别。
MW-视蛋白多肽在个体的视网膜细胞中的表达提供了在如下光强度下的个体的图像识别，该光强度比在视网膜细胞中表达通道视紫红质多肽的个体提供图像识别所需的光强度低至少10倍。例如，MW-视蛋白多肽在个体的视网膜细胞中的表达提供了在如下光强度下的个体的图像识别，该光强度比在视网膜细胞中表达通道视紫红质多肽的个体提供图像识别所需的光强度低至少10倍、低至少25倍、低至少50倍、低至少100倍、低至少150倍、低至少200倍、低至少300倍、低至少400倍、或低至少500倍。
MW-视蛋白多肽在视网膜细胞中的表达提供了如下动力学，该动力学比视紫红质多肽赋予视网膜细胞的动力学快至少2倍。例如，MW-视蛋白多肽在视网膜细胞中的表达提供了如下动力学，该动力学比视紫红质多肽赋予视网膜细胞的动力学快至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少30倍、至少50倍、至少100倍、或100倍以上。
包含编码MW-视蛋白多肽的多核苷酸序列的重组表达载体以如下量施用，与施用重组表达载体前的视觉功能相比，该量有效增加个体的视觉功能至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少2倍、至少5倍、至少10倍或10倍以上。视觉功能的测试在本领域中是已知的，并且可以应用任何已知的测试来评估视觉功能。
本披露提供了包含一种或多种重组表达载体的组合物，这些重组表达载体包含编码MW-视蛋白的多核苷酸序列。当将组合物施用给有需要的个体时，编码MW-视蛋白多肽的多核苷酸序列在有需要的受试者的眼中表达，使得该受试者的眼中产生MW-视蛋白，出现一种或多种有益的临床结果。例如，当将组合物施用给有需要的个体的眼时，编码MW-视蛋白的一种或多种核苷酸序列在有需要的受试者的眼中表达，使得该受试者的眼中产生MW-视蛋白，出现一种或多种有益的临床结果。当编码MW-视蛋白的多核苷酸序列在有需要的受试者的眼中表达，使得受试者的眼中产生一种或多种视锥视蛋白时，出现一种或多种有益的临床结果。
有益的临床结果包括：1)受试者可以在空间模式辨别测定中区分包含垂直线的图像和包含水平线的图像；2)受试者可以在空间模式辨别测定中区分包含静态线的图像和包含移动线的图像；3)受试者可以在时间光模式测定中区分闪光和恒定光；4)受试者可以在图像识别测定中在约104W/cm2至约10W/cm2的光强度下识别图像；和5)受试者可以在避光测定中区分具有白光的区域和没有白光的区域。
组合物是否提供一种或多种上述有益的临床结果可以使用本领域已知的测试来确定。参见例如，Leinonen和Tanila(2017)Behavioural Brain Research[行为大脑研究]pii:S0166-4328(17)30870-7；Caporale等人(2011)Molecular Therapy[分子疗法]19,1212-9；Gaub等人(2014)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]111,E5574-83；Gaub等人(2015)Molecular Therapy[分子疗法]23:1562；以及Berry等人(2017)Nat.Commun.[自然通讯]8:1862。
本披露组合物包含重组表达载体，这些重组表达载体包含编码MW-视蛋白的多核苷酸序列，其中，在以下情况下：i)将该组合物施用于有需要的个体；或ii)将该组合物施用于有需要的个体的眼，使得该多核苷酸序列在有需要的受试者的眼中表达(使得该受试者的眼中产生MW-视蛋白)，该受试者可以在空间模式辨别测定中区分包含垂直线的图像和包含水平线的图像。本披露提供了包含重组表达载体的组合物，这些重组表达载体包含编码MW-视蛋白的多核苷酸序列，其中当该多核苷酸序列在有需要的受试者的眼中表达时(使得该受试者的眼中产生MW-视蛋白)，该受试者可以在空间模式辨别测定中区分包含垂直线的图像和包含水平线的图像。
本披露组合物包含重组表达载体，这些重组表达载体包含编码MW-视蛋白的多核苷酸序列，其中，在以下情况下：i)将该组合物施用于有需要的个体；或ii)将该组合物施用于有需要的个体的眼，使得该多核苷酸序列在有需要的受试者的眼中表达(使得该受试者的眼中产生MW-视蛋白)，该受试者可以在空间模式辨别测定中区分包含静态线的图像和包含移动线的图像。本披露提供了包含重组表达载体的组合物，这些重组表达载体包含编码MW-视蛋白的多核苷酸序列，其中当所述多核苷酸序列在有需要的受试者的眼中表达时(使得该受试者的眼中产生MW-视蛋白)，该受试者可以在空间模式辨别测定中区分包含静态线的图像和包含移动线的图像。
本披露组合物包含重组表达载体，这些重组表达载体包含编码MW-视蛋白的多核苷酸序列，其中，在以下情况下：i)将该组合物施用于有需要的个体；或ii)将该组合物施用于有需要的个体的眼，使得该多核苷酸序列在有需要的受试者的眼中表达(使得该受试者的眼中产生MW-视蛋白)，该受试者可以在时间光模式测定中区分闪光和恒定光。本披露提供了包含重组表达载体的组合物，这些重组表达载体包含编码MW-视蛋白的多核苷酸序列，其中当所述多核苷酸序列在有需要的受试者的眼中表达时(使得该受试者的眼中产生MW-视蛋白)，该受试者可以在时间光模式测定中区分闪光和恒定光。
本披露组合物包含重组表达载体，这些重组表达载体包含编码MW-视蛋白的多核苷酸序列，其中，在以下情况下：i)将该组合物施用于有需要的个体；或ii)将该组合物施用于有需要的个体的眼，使得该多核苷酸序列在有需要的受试者的眼中表达(使得该受试者的眼中产生MW-视蛋白)，该受试者可以在图像识别测定中在约10-4W/cm2至约10W/cm2的光强度下识别图像。本披露提供了包含重组表达载体的组合物，这些重组表达载体包含编码MW-视蛋白的多核苷酸序列，其中当所述多核苷酸序列在有需要的受试者的眼中表达时(使得该受试者的眼中产生MW-视蛋白)，该受试者可以在约10-4W/cm2至约10W/cm2的光强度下(例如，约10-4W/cm2至约10-3W/cm2、约10-3W/cm2至约10-2W/cm2、约10-2W/cm2至约10-1W/cm2、或约10-1W/cm2至约1W/cm2的光强度下)识别图像。在一些情况下，MW-视蛋白多肽在个体的视网膜细胞中的表达提供了在图像识别测定中在高达2W/cm2、高达3W/cm2、高达4W/cm2、高达5W/cm2、或高达10W/cm2的光强度下的图像识别。
本披露组合物包含重组表达载体，这些重组表达载体包含编码MW-视蛋白的多核苷酸序列，其中，在以下情况下：i)将该组合物施用于有需要的个体；或ii)将该组合物施用于有需要的个体的眼，使得MW-视蛋白在有需要的受试者的眼中表达(使得该受试者的眼中产生MW-视蛋白)，该受试者可以在避光测定中区分具有白光的区域和没有白光的区域。本披露提供了包含重组表达载体的组合物，这些重组表达载体包含编码MW-视蛋白的多核苷酸序列，其中当该多核苷酸序列在有需要的受试者的眼中表达时(使得该受试者的眼中产生MW-视蛋白)，该受试者可以在避光测定中区分具有白光的区域和没有白光的区域。
在另一方面，本披露提供了如上所描述的重组表达载体或如上所描述的药物组合物，其用于治疗有需要的受试者。在一个实施例中，如上所描述的重组表达载体或如上所描述的药物组合物恢复或增强受试者的视觉功能。
用于治疗用途的试剂盒
本披露还提供了用于本文描述的组合物的试剂盒。例如，本披露提供了包含如本文所描述的基因疗法系统的试剂盒；包含如本文所描述的基因疗法系统的病毒颗粒或病毒颗粒组；和/或包含如本文所描述的基因疗法系统的多核苷酸或多核苷酸组。
在一些实施例中，试剂盒可另外包含用于本文描述的任何方法的说明书。所包含的说明书可包括以下说明：(i)递送如本文所描述的基因疗法系统；包含如本文所描述的基因疗法系统的病毒颗粒或病毒颗粒组；和/或包含如本文所描述的基因疗法系统的多核苷酸或多核苷酸组。
试剂盒可以进一步包括基于鉴定受试者是否需要治疗来选择适合于治疗的受试者的说明书。说明书可包括关于预期治疗的剂量、给药方案和施用途径的信息。容器可以是单位剂量、散装包装(例如，多剂量包装)或亚单位剂量。本披露的试剂盒中提供的说明书通常是标签或包装插页上的书面说明书。标签或包装插页指示药物组合物用于治疗、延迟发作和/或减轻受试者的疾病或障碍。
本文提供的试剂盒采用合适的包装。合适的包装包括但不限于小瓶、瓶、罐、软包装等。还考虑了与特定装置例如注射器结合使用的包装。试剂盒可具有无菌入口(例如，具有可被皮下注射针刺穿的塞子的小瓶)。在一些实施例中，任选地，试剂盒进一步包含用于施用的装置，例如注射器、过滤针、延长管、插管或视网膜下注射器。
试剂盒任选地可以提供另外的组分，例如缓冲液和解释性信息。通常，试剂盒包括容器和在容器上或与容器相关联的标签或包装插页。在一些实施例中，本披露提供包含上述试剂盒的内容物的制品。
一般技术
除非另有说明，否则本披露的实践将使用分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术，其在本领域的技术范围内。在文献中充分解释了这样的技术，这些文献是例如Molecular Cloning:A Laboratory Manual[分子克隆：实验室手册],第二版(Sambrook等人,1989)Cold Spring Harbor Press[冷泉港出版社]；Oligonucleotide Synthesis[寡核苷酸合成](M.J.Gait编辑1984)；Methods inMolecular Biology[分子生物学方法],Humana Press[胡玛纳出版社]；Cell Biology:ALaboratory Notebook[细胞生物学：实验室笔记本](J.E.Cellis编辑,1989)AcademicPress[学术出版社]；Animal Cell Culture[动物细胞培养](R.I.Freshney编辑1987)；Introduction to Cell and Tissue Culture[细胞和组织培养介绍](J.P.Mather和P.E.Roberts,1998)Plenum Press[普莱纽姆出版社]；Cell and Tissue Culture:Laboratory Procedures[细胞和组织培养：实验室程序](A.Doyle,J.B.Griffiths和D.G.Newell编辑1993-8)J.Wiley and Sons[约翰·威利父子出版社]；Methods inEnzymology[酶学方法](Academic Press,Inc.[学术出版公司])；Handbook ofExperimental Immunology[实验免疫学手册](D.M.Weir和C.C.Blackwell编辑):GeneTransfer Vectors for Mammalian Cells[用于哺乳动物细胞的基因转移载体](J.M.Miller和M.P.Calos编辑,1987)；Current Protocols in Molecular Biology[分子生物学现代方案](F.M.Ausubel等人编辑1987)；PCR:The Polymerase Chain Reaction[PCR：聚合酶链式反应](Mullis等人编辑1994)；Current Protocols in Immunology[免疫学现代方法](J.E.Coligan等人编辑,1991)；Short Protocols in Molecular Biology[分子生物学中的短程序](Wiley and Son[约翰·威利父子出版社],1999)；Immunobiology[免疫生物学](C.A.Janeway和P.Travers,1997)；Antibodies[抗体](P.Finch,1997)；Antibodies:a practice approach[抗体：实用方法](D.Catty.编辑,IRL Press[IRL出版社],1988-1989)；Monoclonal antibodies:a practical approach[单克隆抗体：实用方法](P.Shepherd和C.Dean编辑,Oxford University Press[牛津大学出版社],2000)；Using antibodies:a laboratory manual[使用抗体：实验室手册](E.Harlow和D.Lane,Cold Spring Harbor Laboratory Press[冷泉港实验室出版社],1999)；The Antibodies[抗体](M.Zanetti和J.D.Capra编辑Harwood Academic Publishers[哈伍德学术出版社],1995)；DNA Cloning:A practical Approach[DNA克隆：实用方法],第I和II卷(D.N.Glover编辑1985)；Polynucleotide Hybridization[多核苷酸杂交](B.D.Hames&S.J.Higgins编辑(1985)；Transcription and Translation[转录和翻译](B.D.Hames&S.J.Higgins编辑(1984)；Animal Cell Culture[动物细胞培养](R.I.Freshney编辑(1986)；ImmobilizedCells and Enzymes[固定化细胞和酶](IRL Press[IRL出版社],(1986))；以及B.Perbal,Apractical Guide To Molecular Cloning[分子克隆的实践指南](1984)；F.M.Ausubel等人(编辑)。
药物组合物
根据要使用的施用模式来配制根据本披露的药物组合物。在药物组合物是可注射药物组合物的情况下，它们是无菌的、无热原的和无颗粒的。优选使用等渗配制品。通常，用于等渗性的添加剂可以包括氯化钠、葡萄糖、甘露醇、山梨糖醇和乳糖。在一些情况下，等渗溶液如磷酸盐缓冲盐水是优选的。稳定剂包括明胶和白蛋白。在一些实施例中，向配制品中添加血管收缩剂。
在一些实施例中，组合物可进一步包含药学上可接受的赋形剂。药学上可接受的赋形剂可以是作为媒介物、佐剂、载剂或稀释剂的功能分子。药学上可接受的赋形剂可以是转染促进剂，其可以包括表面活性剂，例如免疫刺激复合物(ISCOMS)、弗氏不完全佐剂、LPS类似物(包括单磷酰脂质A)、胞壁酰肽、醌类似物、囊泡(例如角鲨烯和角鲨烯)、透明质酸、脂质、脂质体、钙离子、病毒蛋白、聚阴离子、聚阳离子或纳米颗粒、或其他已知的转染促进剂。
转染促进剂是聚阴离子、聚阳离子，包括聚-L-谷氨酸(LGS)或脂质。转染促进剂是聚-L-谷氨酸，并且更优选地，聚-L-谷氨酸以小于6mg/ml的浓度存在于本披露的组合物中。转染促进剂还可以包括表面活性剂，例如免疫刺激复合物(ISCOMS)、弗氏不完全佐剂、LPS类似物(包括单磷酰脂质A)、胞壁酰肽、醌类似物和囊泡(例如角鲨烯和角鲨烯)、并且透明质酸也可以与基因构建体一起施用。在一些实施例中，包含编码MW-视蛋白多肽的rAAV病毒粒子和/或重组表达载体的药物组合物还可以包括转染促进剂，例如脂质、脂质体，包括卵磷脂脂质体或本领域已知的其他脂质体，作为DNA-脂质体混合物(参见例如WO 9324640)、钙离子、病毒蛋白、聚阴离子、聚阳离子或纳米颗粒，或其他已知的转染促进剂。优选地，转染促进剂是聚阴离子、聚阳离子，包括聚-L-谷氨酸(LGS)或脂质。本披露的组合物可任选地包含医药剂、药剂、载剂、佐剂、分散剂、稀释剂等。
在一些实施例中，本披露的多核苷酸构建体可以根据已知技术在药物载剂中配制用于施用。参见例如，Remington,The Science and Practice of Pharmacy[雷明顿，药学科学与实践](第21版.2005)。在药物组合物的制造中，rAAV病毒粒子和/或多核苷酸构建体通常与尤其是可接受的载剂混合。载剂可以是固体(包括粉末)或液体或两者，并且优选地与化合物一起配制为单位剂量组合物，例如，其可以含有按重量计0.01％或0.5％至95％或99％的化合物。可将一种或多种化合物掺入本披露的组合物中，这些组合物可通过任何熟知的药学技术制备。
载剂可以是含有例如水、盐水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)及其任何组合的溶剂或分散介质。可以例如通过使用包衣(如卵磷脂)，通过在分散体的情况下维持所需粒度和通过使用表面活性剂来维持适当的流动性，这些表面活性剂是例如聚山梨醇酯(例如，TweenTM、聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80)、十二烷基硫酸钠(月桂基硫酸钠)、月桂基二甲基氧化胺、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、聚乙氧基化醇、聚氧乙烯山梨聚糖、辛苯聚醇(Triton X100TM)、N,N-二甲基十二烷基胺-N-氧化物、十六烷基三甲基溴化铵(HTAB)、聚氧乙烯10月桂基醚、Brij 721TM、胆汁盐(钠、脱氧胆酸盐、胆酸钠)、普朗尼克酸(F-68、F-127)、聚氧乙烯蓖麻油(CremophorTM)、壬基酚乙氧基化物(TergitolTM)、环糊精和乙基苄索氯铵(HyamineTM)。可通过各种抗细菌剂和抗真菌剂(例如，对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、甲酚、抗坏血酸、硫柳汞等)来防止微生物的作用。在许多情况下，将优选在组合物中包含等渗剂，例如糖、多元醇(如甘露醇或山梨糖醇)和氯化钠。可以通过在组合物中包含延迟吸收的药剂(例如单硬脂酸铝和明胶)来实现内部组合物的长时间吸收。在一些实施例中，药物载剂包括磷酸钠、氯化钠、聚山梨醇酯和蔗糖。在一些实施例中，药物组合物包含表面活性剂，例如非离子表面活性剂如聚山梨醇酯、泊洛沙姆或普朗尼克。在一些实施例中，添加非离子表面活性剂减少在悬浮液或溶液中的聚集。对于玻璃体内施用，合适的载剂包括生理盐水、抑菌水、磷酸盐缓冲盐水(PBS)和/或等渗剂，例如甘油。
在所有情况下，药物组合物必须是无菌的并且必须具有达到易于灌注或注射的程度的流动性。它在制造和储存条件下必须稳定并且必须抗诸如细菌和真菌的微生物污染作用而保存。在一些实施例中，药物组合物可以包括等渗剂，例如盐或甘油。在一些实施例中，将表面活性剂或稳定剂添加到药物组合物中以防止聚集。另外，冷冻保护剂如醇、DMSO、甘油和PEG可在冻干的冷冻或干燥条件下用作稳定剂，或用作制备冷冻悬浮液的稳定剂。
在一个实施例中，药物组合物包含本文披露的rAAV病毒粒子、摩尔浓度为约10mM至约200mM的一种或多种药学上可接受的盐。在一些实施例中，药物组合物中的一种或多种药学上可接受的盐的浓度为约10mM、约20mM、约30mM、约40mM、约50mM、约60mM、约70mM、约80mM、约90mM、约100mM、约110mM、约120mM、约130mM、约140mM、约150mM、约160mM、约170mM、约180mM、约190mM、约200mM、或多于200mM。在一个实施例中，药物组合物包含本文披露的rAAV病毒粒子、浓度为约0.0001％至约0.01％的一种或多种聚合物。在一些实施例中，药物组合物中的一种或多种聚合物的浓度为约0.0001％、约0.0002％、约0.0003％、约0.0004％、约0.0005％、约0.0006％、约0.0007％、约0.0008％、约0.0009％、约0.001％、约0.002％、0.003％、0.004％、约0.005％、约0.006％、约0.007％、约0.008％、约0.009％或约0.01％。在一个实施例中，药物组合物具有约4.5至约7.5的pH。在一些实施例中，药物组合物的pH具有约4.5、约4.6、约4.7、约4.8、约4.9、约5.0、约5.1、约5.2、约5.3、约5.4、约5.5、约5.6、约5.7、约5.8、约5.9、约6.0、约6.1、约6.2、约6.3、约6.4、约6.5、约6.6、约6.7、约6.8、约6.9、约7.0、约7.1、约7.2、约7.3、约7.4或约7.5的pH。在一个实施例中，药物组合物包含本文披露的rAAV病毒粒子、10mM磷酸钠、180mM氯化钠、0.005％泊洛沙姆188，并且具有7.3的pH。
在一些实施例中，对于单位剂量选择较低量或范围的载体基因组以避免聚集。在一些实施例中，对于单位剂量选择较高量或范围的载体基因组，使得可以使用较小体积进行注射。较小体积(例如，小于50、40、30、20、10或5μL)的注射可有助于减少眼压变化和与玻璃体内注射相关的其他不良作用。在一些实施例中，更高浓度的rAAV也有助于确保将治疗性转基因有效递送到靶细胞中。
在一些实施例中，本文披露的药物组合物被设计、工程化或适用于经由眼内、玻璃体内或视网膜下注射施用到灵长类动物(例如，非人灵长类动物和人类受试者)。在一些实施例中，将含有包含编码MW-视蛋白多肽的多核苷酸序列的rAAV病毒粒子的药物组合物配制用于玻璃体内注射到受试者的眼中。在一些实施例中，将药物组合物配制为允许玻璃体内注射体积不超过约2、2.5、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、或200μL的浓度。在一些实施例中，本文披露的治疗方法包括玻璃体内注射体积为约2、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150μL含有包含如本文所披露的编码MW-视蛋白多肽的多核苷酸序列的rAAV的溶液或悬浮液。
如上所讨论的，本披露的另一方面是体内治疗受试者的方法，该方法包括向受试者施用药物组合物，该药物组合物在药学上可接受的载剂中包含本披露的多核苷酸构建体，其中该药物组合物以治疗有效量施用。可以通过本领域已知的用于施用化合物的任何方式向有需要的真核受试者施用本披露的化合物。本发明的另一方面提供了一种包含上述重组表达载体和药学上可接受的赋形剂的药物组合物。在一个实施例中，药学上可接受的赋形剂包含盐水。在另一实施例中，组合物是无菌的。
在另一方面，本披露提供了如上所描述的重组表达载体或如上所描述的药物组合物，其用于制造药物。
适于眼内、玻璃体内或视网膜下施用的本披露的组合物包含本文描述的rAAV病毒粒子和/或多核苷酸构建体的无菌水性和非水性注射溶液，这些制剂优选与预期接受者的玻璃体等渗。这些制剂可以含有抗氧化剂、缓冲液、抑菌剂和溶质，其使组合物与预期接受者的玻璃体等渗。水性和非水性无菌悬浮液可包括悬浮剂和增稠剂。组合物可以存在于单位剂量或多剂量容器中，例如密封的安瓿和小瓶，并且可以储存在冷冻干燥(冻干)条件下，仅需要在临用前添加无菌液体载剂，例如盐水或注射用水。
临时注射溶液和悬浮液可以由前述种类的无菌粉末、颗粒和片剂制备。例如，在本披露的一个方面，提供了密封容器中的单位剂型的包含本披露的多核苷酸或rAAV的可注射的、稳定的、无菌组合物。在一些实施例中，冻干形式的药物组合物与用于在施用之前重构药物组合物的溶液或缓冲液一起提供在试剂盒中。在一些实施例中，本文披露的药物组合物作为溶液、均匀溶液、悬浮液或冷冻悬浮液提供。在一些实施例中，药学上可接受的赋形剂包含防止本文披露的药物组合物中聚集的表面活性剂。在一些实施例中，冷冻悬浮液提供在试剂盒中，该试剂盒可包括注射器和/或用于稀释的缓冲液。在一些实施例中，冷冻悬浮液作为预填充的注射器提供。在一些实施例中，如本文所披露的治疗或预防眼部疾病或病症的方法包括将冷冻悬浮液温热至室温和/或搅动悬浮液以确保在向患者施用或玻璃体内注射之前均匀分布。在一些实施例中，在施用给患者之前稀释悬浮液。
在一些实施例中，包含如本文所披露的MW-视蛋白基因疗法的冻干或悬浮液形式的药物组合物具有约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000μL的体积(或重构体积)。在一些实施例中，包含如本文所披露的MW-视蛋白基因疗法的冻干或悬浮液形式的药物组合物具有0.1至0.5mL、0.1至0.2mL、0.3至0.5mL、0.5至1.0mL、0.5至0.7mL、0.6至0.8mL、0.8至1mL、0.9至1.1mL、1.0至1.2或1.0至1.5mL的体积。在其他实施例中，重构体积不超过约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4或1.5mL。在一些实施例中，在施用之前过滤重构的溶液或悬浮液。在一些实施例中，过滤器或过滤注射器用于在施用给患者之前过滤药物组合物。
此外，本披露提供了本文披露的本披露多核苷酸构建体的脂质体配制品。形成脂质体悬浮液的技术是本领域熟知的。作为水溶性材料，使用常规脂质体技术，可以将本披露的多核苷酸构建体掺入到脂质囊泡中。在这样的情况下，由于化合物的水溶性，化合物将基本上被夹带在脂质体的亲水中心或核心内。所用的脂质层可以是任何常规的组合物，并且可以含有胆固醇或可以不含胆固醇。所产生的脂质体可以通过使用例如标准超声处理和均质化技术来减小尺寸。可以将含有本文披露的化合物的脂质体组合物冻干以产生冻干物，可以用药学上可接受的载剂如水重构该冻干物，以再生脂质体悬浮液。
在一些实施例中，包含本披露的多核苷酸构建体的药物组合物可以含有其他添加剂，例如pH调节添加剂。特别地，有用的pH调节剂包括酸如盐酸、碱或缓冲液如乳酸钠、乙酸钠、磷酸钠、柠檬酸钠、硼酸钠或葡萄糖酸钠。在一些实施例中，使用盐酸和氢氧化钠调节溶液的pH。在一些实施例中，悬浮液处于中性pH，或处于6.5至7.5之间的pH。在一些实施例中，悬浮液的pH是微碱性的(例如，pH约7.5、8、8.2、8.4、8.5或9)。在一些实施例中，悬浮液或溶液的pH是微酸性的(例如，pH约6.5、6.3、6.1、6、5.5或5)。在一些实施例中，将悬浮液冷冻为溶液。在一些实施例中，悬浮液包含冷冻胶束。在一些实施例中，在施用前将悬浮液冷冻并搅动。
此外，组合物可含有微生物防腐剂。有用的微生物防腐剂包括对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯和苯甲醇。本领域熟知的其他添加剂包括例如防粘剂、消泡剂、抗氧化剂(例如棕榈酸抗坏血酸酯、丁基羟基苯甲醚(BHA)、丁基羟基甲苯(BHT)和生育酚，例如α-生育酚(维生素E))、防腐剂、螯合剂(例如EDTA和/或EGTA)、粘度调节剂、张力调节剂(例如糖，如蔗糖、乳糖和/或甘露糖醇)、着色剂、气味剂、遮光剂、悬浮剂、粘合剂、填充剂、增塑剂、润滑剂及其混合物。这样的添加剂的量可由本领域技术人员根据所需的特定性质容易地确定。
在一些实施例中，任何合适的方法可用于如本文所描述的药物组合物中使用的重组病毒(例如rAAV)的生化纯化。重组AAV病毒可直接从细胞或从包含细胞的培养基收获。在冻干或制备rAAV病毒的悬浮液之前，可以使用各种生化方式(例如，凝胶过滤、过滤、层析、亲和纯化、梯度超速离心或尺寸排阻方法)纯化病毒。
在一些实施例中，本文披露的药物组合物适用于基因疗法或用于在人类患者或非人灵长类动物中玻璃体内递送作为治疗剂的MW-视蛋白多肽。在一些实施例中，药物组合物的单位剂量包含1x1010至1x1013个病毒基因组(vg)。在一些实施例中，单位剂量包含约2.1x1011、约2.1x1012或约2.1x1013个载体基因组。在一些实施例中，本披露的药物组合物的单位剂量是1x1010至3x1012个载体基因组。在一些情况下，本披露的药物组合物的单位剂量是1x109至3x1013个载体基因组。在一些情况下，本披露的药物组合物的单位剂量是1x1010至1x1011个载体基因组。在一些情况下，本披露的药物组合物的单位剂量是1x108至3x1014个载体基因组。在一些情况下，本披露的药物组合物的单位剂量是至少1x101、1x102、1x103、1x104、1x105、1x106、1x107、1x108、1x109、1x1010、1x1011、1x1012、1x1013、1x1014、1x1015、1x1016、1x1017和1x1018个载体基因组。在一些情况下，本披露的药物组合物的单位剂量是1x1010至5x1013个载体基因组。在一些情况下，本披露的药物组合物的单位剂量是至多约1x108、1x109、1x1010、1x1011、1x1012、1x1013、1x1014、1x1015、1x1016、1x1017和1x1018个载体基因组。
在一些实施例中，本披露的rAAV的单位剂量是2x1011至8x1011或2x1012至8x1012个载体基因组。在一些实施例中，本披露的rAAV的单位剂量是1010至1013、1010至1011、1011至1012、1012至1013、或1013至1014个载体基因组。
在一些情况下，含有包含编码MW-视蛋白多肽的多核苷酸序列的重组病毒表达载体的组合物以在约50μL至约100μL的体积中约108至约1015个病毒基因组(vg)的量存在于缓冲盐水溶液中，其中该组合物进一步包含磷酸钠、泊洛沙姆188且具有7.3的pH。
在特定实施例中，本披露的多核苷酸构建体能以治疗有效量施用给受试者，该术语如上文定义。药物活性化合物的剂量可以通过本领域已知的方法确定，参见例如，Remington,The Science and Practice of Pharmacy[雷明顿，药学科学与实践](第21版.2005)。任何特定化合物的治疗有效剂量对于给定的披露的多核苷酸构建体和患者之间会在一定程度上变化，并且将取决于患者的病症和递送途径。
在没有进一步详细描述的情况下，据信本领域技术人员基于以上描述可以最大程度地利用本披露。因此，以下特定实施例应解释为仅是说明性的，而不以任何方式限制本披露的其余部分。本文引用的所有出版物出于本文引用的目的或主题通过引用并入。
实例
实例1
重组表达载体介导的密码子优化的人MW-视蛋白mRNA表达的评价
在DMEM+10％FBS中用293T细胞(传代<30次)以2.0xE+6个细胞/孔接种6孔板。18小时至24小时后，每孔仅用2μg的DNA或PEI-Max(对照)转染。转染后3天，回收细胞和培养基，通过离心使细胞沉淀并储存在-80℃下直至准备处理。对于每个样品，按照制造商的说明书用RNeasy Plus试剂盒提取RNA，在20μL水中洗脱并用Nanodrop测定RNA浓度。根据制造商的说明书，用具有RNA酶抑制剂的高容量cDNA逆转录试剂盒，使用2μg总RNA产生cDNA。对于qPCR，每个样品(10ng)用以下提供的每种MWO引物/探针对一式三份运行：
表1
所测试的示例性重组表达载体在5'至3'方向上具有SEQ ID NO:1的第一ITR序列、SEQ ID NO:2的启动子序列、SEQ ID NO:3的MW-视蛋白转基因序列、SEQ ID NO:4的增强子序列、SEQ ID NO:5的多聚A/终止序列、SEQ ID NO:6的内含子序列和SEQ ID NO:7的第二ITR序列。示例性重组表达载体在5'至3'方向上包括第一AAV2 ITR序列、CAG启动子序列、人MW-视蛋白转基因序列、WPRE序列、衍生自人MW-视蛋白基因序列的内含子序列、多聚A/终止序列、第二AAV2 ITR序列。在一些实验中，重组表达载体进一步包含赋予氨苄青霉素抗性的多核苷酸序列(REV_Amp)。在一些实验中，重组表达载体进一步包含赋予卡那霉素抗性的多核苷酸序列(REV_Kan)。qPCR后，报告了以下平均Ct值：
表2
Ct(循环阈值)定义为荧光信号越过阈值(即超过背景水平)所需的qPCR循环数。此处，12.25和12.22的值表明在用REV_Amp载体转染的293T细胞中检测到密码子优化的人MW-视蛋白mRNA。同样，12.19和12.16的值表明在用REV_Kan载体转染的293T细胞中检测到密码子优化的人MW-视蛋白mRNA。与依赖mini-CAG启动子和编码人MW-视蛋白的非密码子优化序列的类似载体相比，具有密码子优化的人MW-视蛋白序列的REV_Kan和REV_Amp载体在转染的293T细胞中表现出更好的mRNA表达(使用hMWO的平均Ct值为17.78，使用cohMWO对#1的平均Ct值为30.22，使用cohMWO对#2的平均Ct值为30.10)。
实例2
重组表达载体介导的密码子优化的人MW-视蛋白表达的评价
在DMEM+10％FBS中用293T细胞(传代<30次)以250,000个细胞/孔接种24孔板。18小时至24小时后，每孔仅用2μg的DNA或PEI-Max(对照)转染。转染后3天，小心地从孔中除去培养基并用新鲜的4％多聚甲醛溶液(4％PFA，1mL/孔)替换10分钟，同时轻轻旋转。除去4％PFA并用PBS洗涤各孔3次，每次5分钟。将细胞在封闭缓冲液(1％BSA，0.1％Triton-X100)中在室温下透化30分钟，同时轻轻旋转。在孵育结束时，用在1％BSA、0.1％TritonX-100中以1:200稀释的一抗替换封闭缓冲液。使与一抗(红色/绿色视蛋白，兔多克隆抗体，MilliporeSigma AB5405)的孵育在4℃下在轻轻旋转下在黑暗中进行过夜。第二天早晨，用PBS冲洗细胞3×5分钟，然后开始在黑暗中在室温下与二抗(在1％BSA、0.1％Triton-X100中以1:10,000稀释)孵育2小时。用PBS再冲洗3次(3x5分钟)后，将盖玻片用含有DAPI的封固培养基封固在载玻片上并用透明指甲油密封。立即对载玻片成像，然后在4℃下在黑暗中储存。
所测试的示例性重组表达载体在5'至3'方向上具有SEQ ID NO:1的第一ITR序列、SEQ ID NO:2的启动子序列、SEQ ID NO:3的MW-视蛋白转基因序列、SEQ ID NO:4的增强子序列、SEQ ID NO:5的多聚A/终止序列、SEQ ID NO:6的内含子序列和SEQ ID NO:7的第二ITR序列。重组表达载体进一步包含赋予卡那霉素抗性的多核苷酸序列(REV_Kan)。成像结果如图6所示。基于右下小图中观察到的荧光与右上小图中观察到的较低荧光相比，表达密码子优化的人MW-视蛋白，并用兔抗视蛋白多克隆抗体检测。
实例3
本发明的重组表达载体的ITR稳定性的评价
本发明的ITR多核苷酸被进一步优化以赋予本发明的重组表达载体相对于不具有这样的ITR序列的重组表达载体的完整性和稳定性。以下描述解释了REV_Kan中ITR稳定性的评价。
根据制造商的高效方案，将REV_Kan(1ng)转化到NESbtl细胞中。将细菌细胞铺在含有50mg/mL卡那霉素的琼脂平板上，并在37℃孵育过夜(12-16h)。挑取四个菌落并用于接种5mL起始培养物(LB+Kan 50mg/mL)。将每种起始培养物在37℃下以250rpm振荡(第1轮)孵育过夜(12-16h)。第二天早上，使用500μL的每个第1轮起始培养物接种新的5mL起始培养物(第2轮)，使剩余的培养物(4.5mL)沉淀，并且使用Qiagen的小量制备试剂盒(miniprepkit)从细胞中提取DNA。重复4次，完成6轮培养。参见图7。
将来自每轮所有克隆的DNA用XmaI酶在37℃消化2小时。消化完成后，将样品加载到1％琼脂糖凝胶上并在150V下运行45分钟。将凝胶成像，并检查条带图案。参见图8。当ITR序列在几轮培养后完整时，预期的DNA迁移图案包括3257、2798、1734、11和11bp条带。如果在5'ITR中发生缺失，预期的DNA迁移图案包括6049、1734和11bp条带。如果在3'ITR中发生缺失，预期的DNA迁移图案包括4985、2798和11bp条带。6049和4985bp处条带的存在表明ITR发生了一些重组。
在六轮培养(约126代)后，没有检测到所有克隆的ITR重组证据，表明回收的REV_Kan重组表达载体的ITR是稳定的。
实例4
在食蟹猴中玻璃体内注射载体介导的密码子优化的人MW-视锥视蛋白表达的分子定位研究，观察期13周
该分子定位研究的目的是确定当经由玻璃体内(IVT)注射施用给食蟹猴时，本发明的示例性病毒粒子的眼部分布。动物用5×1010或4.5×1011个载体基因组(vg)注射一次，观察4周(中期处死)和13周(终末处死)。所测试的病毒粒子内的示例性重组表达载体在5'至3'方向上具有SEQ ID NO:1的第一ITR序列、SEQ ID NO:2的启动子序列、SEQ ID NO:3的MW-视蛋白转基因序列、SEQ ID NO:4的增强子序列、SEQ ID NO:5的多聚A/终止序列、SEQID NO:6的内含子序列和SEQ ID NO:7的第二ITR序列。示例性重组表达载体在5'至3'方向上包括第一AAV2ITR序列、CAG启动子序列、人MW-视蛋白转基因序列、WPRE序列、衍生自人MW-视蛋白基因序列的内含子序列、多聚A/终止序列、第二AAV2 ITR序列。对来自对照和示例性载体注射动物的在改良的戴维森试剂(Modified Davidson’s reagent)中固定的石蜡包埋的眼进行载体序列的原位杂交和人视锥视蛋白和腺相关病毒(AAV)衣壳蛋白的免疫染色。
原位杂交在所有中期和终末尸检动物的测试注射眼中检测了示例性载体序列，但在对侧未注射的和媒介物对照动物眼中未检测。示例性核酸信号位于中央视网膜的多灶性区域(大量存在于黄斑中)，但在周边视网膜中分布更均匀。在睫状体、虹膜、虹膜角膜角、晶状体囊和视神经中也存在信号。在视网膜中，示例性核酸信号大量存在于视网膜神经节细胞和神经纤维层中，在内网层、内核层中和偶尔在外核层和光感受器中的水平中等。DNA酶和RNA酶预处理实验表明视网膜中存在转基因mRNA。双重原位杂交实验显示示例性核酸信号在少数谷氨酸代谢型受体6(GRM6)阳性双极细胞中的定位。与低剂量组(5×1010vg/眼)相比，高剂量组(4.5×1011vg/眼)的示例性核酸信号更高，但同一剂量组的中期和终末处死动物之间没有显著差异。
免疫组织化学表明在载体给药的动物眼中AAV衣壳蛋白和人中波视锥视蛋白的存在，分别证实了示例性载体的转导和转基因产物的存在。
使用ACD公司(Advanced Cell Diagnostics，ACD)(海沃德，加利福尼亚州)和文塔纳医疗系统公司(Ventana Medical Systems)(图森，亚利桑那州)的探针和试剂进行原位杂交(ISH)。用于转基因[密码子优化的人中波视锥视蛋白(MW-视蛋白)]的反义探针和有义探针由ACD基于示例性载体中的序列设计。阳性PPIB和阴性DAPB对照探针组包括在内，以分别确保mRNA质量和特异性。
用分别用携带转基因-ChrimsonR-eGFP和MW-视蛋白的质粒转染的阴性对照和阳性对照细胞系评估示例性载体正义探针和反义探针的特异性。将细胞系加工成福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)块用于定位实验。
对所有研究动物的块进行反义和有义ISH。
杂交方法遵循由ACD和文塔纳系统公司(Ventana systems)建立的使用VentanamRNA Red或Brown色原的方案。简而言之，将5μm切片在60度烘烤60分钟并用于杂交。使用Sakura组织-Tek DR5染色器进行脱蜡和再水化方案，步骤如下：3次二甲苯，每次持续5分钟；2次100％乙醇，持续2分钟；空气干燥5分钟。在98至104摄氏度下在1X修复缓冲液中进行离线手动预处理15分钟。通过首先评估PPIB和DAPB杂交信号，随后对所有载玻片使用相同的条件来进行优化。预处理后，将载玻片转移至Ventana Ultra自动染色器，以完成ISH程序，包括蛋白酶预处理；在43摄氏度杂交2小时，随后进行扩增；以及用HRP和苏木精复染进行检测。
对少数动物进行RNA酶和DNA酶预处理实验以证明示例性载体DNA和MW-视蛋白RNA的存在。将5μm石蜡包埋的眼切片脱蜡，并在室温下用过氧化氢酶处理10分钟，然后进行靶标检索。然后，将载玻片用RNA酶(Qiagen目录号19101)在37℃下处理30分钟，或用DNA酶I(Qiagen目录号79254)在40℃下处理10分钟。然后如上所描述处理载玻片。
对少数动物进行双重标记ISH实验以确定示例性核酸信号在内核层的双极细胞内的定位。分别通过两种不同的显色底物HRP-C1-Teal和AP-C2-Red检测示例性载体反义和GRM6(编码代谢型谷氨酸受体6-mGluR6)探针的信号。
改良的半定量H评分(如下所描述)适于对在眼不同区域的载体核酸定位进行评分。
半定量改良的H评分＝(0ד分数0”细胞的百分比)+(1ד分数1”细胞的百分比)+(2ד分数2”细胞的百分比)+(3ד分数3”细胞的百分比)。分数“0”表示无信号。“1”表示1-3个点/细胞。“2”表示4-10个点/细胞，“3”表示>10个点/细胞且少于10％的成簇细胞，“4”表示>10个点/细胞或多于10％的成簇细胞。
在Ventana Discovery XT自动染色仪上，使用标准Ventana Discovery XT试剂(文塔纳公司(Ventana)，印第安纳波利斯，印第安纳州)对视蛋白和AAV衣壳蛋白进行免疫组织化学(IHC)染色。用于测定的抗体和浓度列于表2中。将载玻片脱蜡，然后根据标准文塔纳公司修复方案，用细胞调节(Cell Conditioning)1(CC1/pH8)溶液覆盖载玻片进行热诱导抗原修复。通过与如下所示的适当的Ventana Discovery OmniMap HRP试剂孵育，随后与Ventana Discovery ChromoMap 3,3’-二氨基联苯胺(DAB)孵育，获得可视化。使用文塔纳公司的苏木精和文塔纳公司的发蓝试剂(Bluing reagent)进行复染，每者4分钟。将载玻片脱水，清洁，并用合成的封固培养基封片。每次运行都包括阳性和阴性对照组织。
原位杂交探针-表3
免疫组织化学抗体-表4
用已知的阳性(用MW-视蛋白转染)和阴性对照细胞沉淀(用ChrimsonR-eGFP转染)评估反义探针和有义探针的特异性。正如所预期的，阳性对照细胞显示具有反义探针和有义探针的大量核酸信号，而阴性细胞对于反义探针和有义探针呈阴性。ISH条件是令人满意的，因为两种细胞系都显示出中等水平的PPIB信号(内源对照)。
确定了探针的特异性后，进一步表征了研究眼组织中的示例性载体核酸分布。用于ISH测定的眼切片显示出中等水平的PPIB且对于DapB(细菌基因)mRNA信号呈阴性，这证实了RNA完整性和ISH测定程序。在未注射的或存档的对照/媒介物对照猕猴眼中没有示例性载体核酸信号。反义ISH信号存在于中央视网膜的多灶性区域中，在黄斑中信号丰富，但在周边视网膜中分布更均匀。在睫状体、虹膜、虹膜角膜角、晶状体囊和视神经中也存在信号。有义ISH信号的定位模式与反义ISH相似(图9)。在视网膜内，ISH信号在视网膜神经节细胞内是丰富的。在神经纤维层、内网层、内核层以及偶尔在外核层、光感受器和血管壁中注意到轻度至中度水平的示例性载体核酸信号(图10)。在角膜、脉络膜和结膜中无ISH信号。与低剂量组(5×1010vg/眼)相比，高剂量组(4.5×1011vg/眼)中的反义和有义ISH信号均较高，但在中期(给药后4周)和终末(给药后13周)处死动物之间ISH信号没有显著差异(图11)。
用RNA酶预处理消除了反义细胞质信号，并揭示了与示例性载体的转导一致的视网膜(主要在神经节细胞内)、睫状体和虹膜角膜角内的核内信号。DNA酶预处理保留了与MW-视蛋白表达一致的视网膜、视神经、睫状体、虹膜和虹膜角膜角的核内和胞浆内ISH信号。晶状体囊和神经纤维层中的ISH信号通过DNA酶去除，但不是通过RNA酶处理，表明示例性载体结合这些膜。
为了研究示例性载体核酸是否定位于内核层的双极细胞中，进行双重反义和GRM6(ON双极细胞的标记物)ISH实验。GRM6 mRNA信号仅定位于内核层，与已发表的报道一致(Nakajima等人1993；Kim等人2008)。如图12所示，几乎没有反义信号与GRM6 ISH阳性双极细胞共定位，这在黄斑中特别明显。
为了进一步证明研究眼中的示例性载体转导，用抗AAV VP1/VP2/VP3抗体进行AAV衣壳蛋白的定位。正如所预期的，阳性对照食蟹猴眼组织在外核层中显示出强的核免疫染色。在阳性对照研究动物中，在神经节细胞核和外周视网膜的外核层、视网膜的内界膜和晶状体后囊内观察到AAV衣壳免疫染色(图13)。神经节细胞和外核层的核染色表明示例性载体转导。晶状体囊和内界膜中衣壳蛋白的存在表明载体粘附于这些膜，与示例性载体核酸检测一致。在眼的其他区域或其他研究动物中没有免疫染色归因于组织固定效应，因为改良的戴维森试剂与多种抗体不相容(Chidlow等人2011)。
针对人中波(又名绿色)和长波(又名红色)视锥视蛋白的多克隆抗体用于证明MW-视蛋白表达(示例性转基因产物)。对于视蛋白，阳性对照细胞(具有人MW-视锥视蛋白转基因)呈免疫阳性，但阴性对照细胞(具有ChrimsonR-eGFP转基因)呈免疫阴性，表明抗体的特异性。
中央(均匀分布)和周边视网膜(多灶性分布)中的光感受器在来自研究动物的眼切片中显示强染色，表明多克隆抗体与食蟹猴视锥视蛋白交叉反应。除了光感受器，示例性载体给药的动物和对照动物的未注射的眼没有显示在眼切片的其他区域具有免疫染色。在所有动物的中央和/或周边视网膜中观察到针对MW-视蛋白的最小(1级)至轻度(2级)免疫染色(表5)，证实了转基因在载体转导的细胞中的翻译。
示例性载体注射的食蟹猴的视网膜中的视蛋白免疫染色-表5
在中央视网膜内，在神经节细胞和神经纤维层中检测到免疫染色，而周边视网膜在跨越视神经视网膜整个厚度的多灶性区域中显示免疫染色，类似缪勒氏细胞模式(图14)，与示例性载体核酸定位一致。此外，睫状体和睫状突的无色素上皮显示最小的免疫染色。在视神经、虹膜、虹膜角膜角、脉络膜、晶状体、结膜和角膜中没有MW-视蛋白染色。MW-视蛋白免疫染色的染色强度低于示例性载体核酸定位的染色强度，并且可归因于使用改良的戴维森试剂的组织固定效应。
与反义探针和有义探针的原位杂交用于证明石蜡包埋的改良戴维森固定的食蟹猴眼切片中的示例性载体转导。在测试物注射的眼中检测到示例性载体序列，但在所有中期和终末尸检动物的对照动物中未检测到。ISH信号位于中央视网膜的多灶性区域，特别是在黄斑中。ISH信号在周边视网膜、睫状体、虹膜、虹膜角膜角、晶状体囊和视神经中均匀分布。如所预期的，载体转导在视网膜神经节细胞中是丰富的。然而，视网膜(内核层)、睫状体和虹膜中的其他细胞类型也被示例性载体转导。
与低剂量组(5×1010vg/眼)相比，高剂量组(4.5×1011vg/眼)的示例性载体核酸信号更高。然而，有趣的是，注意到在中期和终末处死动物之间的示例性载体核酸信号之间没有差异。该观察表明载体在眼中持续长达13周。此外，虹膜角膜角中载体核酸的存在可表明载体的清除途径。
双重原位杂交实验显示示例性载体核酸在少数GRM6阳性ON双极细胞中的定位，并且在黄斑中特别明显。在中央和周边视网膜中，示例性载体核酸分布似乎具有缪勒(Mueller)细胞模式。
免疫组织化学证明了在视网膜中存在AAV核内衣壳蛋白，证实了示例性载体的转导。此外，在中央和/或周边视网膜和睫状体中证明了MW-视蛋白免疫染色，证实了示例性载体的转基因产物的翻译。在眼切片中衣壳蛋白或MW-视蛋白检测的敏感性降低归因于使用改良的戴维森固定剂造成的抗原损失(Chidlow等人2011)。
序列表
<110> 诺华股份有限公司（NOVARTIS AG）
<120> 用于增强视觉功能的组合物和方法
<130> PAT059037-WO-PCT
<140>
<141>
<150> 63/292,746
<151> 2021-12-22
<150> 63/191,525
<151> 2021-05-21
<160> 206
<170> PatentIn 3.5版
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<212> DNA
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<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸
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<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸
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<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸
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agtacatgac cttatgggac tttcctactt ggcagtacat ctacgtatta gtcatcgcta 600
ttaccatggt cgaggtgagc cccacgttct gcttcactct ccccatctcc cccccctccc 660
cacccccaat tttgtattta tttatttttt aattattttg tgcagcgatg ggggcggggg 720
gggggggggg gcccccccca ggcggggcgg ggcggggcga ggggcggggc ggggcgaggc 780
ggaaaggtgc ggcggcagcc aatcagagcg gcgcgctccg aaagtttcct tttatggcga 840
ggcggcggcg gcggcggccc tataaaaagc gaagcgcgcg gcgggcggga gtcgttgcgc 900
gctgccttcc ccccgtgccc cgctccgccg ccgcctcgcg ccgcccgccc cggctctgac 960
tgaccgcgtt actcccacag gtgagcgggc gggacggccc ttctcctccg ggctgtaatt 1020
agcgcttggt ttaatgacgg cttgtttctt ttctgtggct gcgtgaaagc cttgaggggc 1080
tccgggaggg ccctttgtgc ggggggagcg gctcgggggg tgcgtgcgtg tgtgtgtgcg 1140
tggggagcgc cgcgtgcggc tccgcgctgc ccggcggctg tgagcgctgc gggcgcggcg 1200
cggggctttg tgcgctccgc agtgtgcgcg aggggagcgc ggccgggggc ggtgccccgc 1260
ggtgcggggg gggctgcgag gggaacaaag gctgcgtgcg gggtgtgtgc gtgggggggt 1320
gagcaggggg tgtgggcgcg tcggtcgggc tgcaaccccc cctgcacccc cctccccgag 1380
ttgctgagca cggcccggct tcgggtgcgg ggctccgtac ggggcgtggc gcggggctcg 1440
ccgtgccggg cggggggtgg cggcaggtgg gggtgccggg cggggcgggg ccgcctcggg 1500
ccggggaggg ctcgggggaa ggggcgcggc ggcccccgga gcgccggcgg ctgtcgaggc 1560
gcggcgagcc gcagccattg ccttttatgg taatcgtgcg agagggcgca gggacttcct 1620
ttgtcccaaa tctgtgcgga gccgaaatct gggaggcgcc gccgcacccc ctctagcggg 1680
cgcggggcga agcggtgcgg cgccggcagg aaggaaatgg gcggggaggg ccttcgtgcg 1740
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tgccttcggg ggggacgggg cagggcgggg ttcggcttct ggcgtgtgac cggcggctct 1860
agagcctctg ctaaccatgt tcatgccttc ttctttttcc tacagctcct gggcaacgtg 1920
ctggttattg tgctgtctca tcattttggc aaagaattct ggccaccatg gcccaacaat 1980
ggtcccttca acgactcgcc ggtagacacc cacaggactc ctacgaagat tcgacccagt 2040
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atcacattgc gccgagatgg gtgtaccacc tgactagcgt gtggatgatc ttcgtcgtga 2160
tcgccagcgt gttcactaac ggactggtgc tggccgcgac catgaagttc aagaagctga 2220
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tcgcctcaac catctccgtg gtcaaccagg tctacggtta ctttgtgctt ggacatccta 2340
tgtgcgtgct cgagggctac accgtgtcgc tgtgcgggat cactggattg tggtccctgg 2400
ccattatctc gtgggagcgg tggatggttg tgtgcaagcc cttcggcaac gtgcgcttcg 2460
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ctccccctat tttcggttgg tcccggtact ggccccacgg gctcaagacc tcctgtggtc 2580
ccgacgtgtt cagcggatcg tcgtaccctg gggtgcagtc ctacatgatt gtgctgatgg 2640
tcacttgctg tatcacgccg ctgtctatta tcgtgctgtg ctacctccaa gtctggttgg 2700
ccatccgggc tgtggccaaa cagcagaagg agtccgagag cacccagaaa gccgaaaagg 2760
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ctttctttgc ctgctttgcg gctgcgaacc cgggctaccc attccatcct ctcatggccg 2880
ccctcccggc cttcttcgcc aagtccgcga ccatctacaa tcccgtgatc tatgtgttca 2940
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ccgaactgtc gagcgcctca aagaccgaag tcagctcggt gtcatccgtg agcccagcat 3060
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ttcttaacta tgttgctcct tttacgctat gtggatacgc tgctttaatg cctttgtatc 3180
atgctattgc ttcccgtatg gctttcattt tctcctcctt gtataaatcc tggttgctgt 3240
ctctttatga ggagttgtgg cccgttgtca ggcaacgtgg cgtggtgtgc actgtgtttg 3300
ctgacgcaac ccccactggt tggggcattg ccaccacctg tcagctcctt tccgggactt 3360
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ggacaggggc tcggctgttg ggcactgaca attccgtggt gttgtcgggg aaggtctgct 3480
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ctcctttcgc tttcttccct tcctttctcg ccacgttcgc cggctttccc cgtcaagctc 7860
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ctttgacgtt ggagtccacg ttctttaata gtggactctt gttccaaact ggaacaacac 8040
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<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 50
Leu Pro Pro Gln Asp Thr Thr Lys Asn Ala
1 5 10
<210> 51
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 51
Pro Ala Pro Gln Asp Thr Thr Lys Asn Ala
1 5 10
<210> 52
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 52
Gln Ala His Gln Asp Thr Thr Lys Asn Ala
1 5 10
<210> 53
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 53
Leu Ala His Glu Thr Ser Pro Arg Pro Ala
1 5 10
<210> 54
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 54
Leu Ala Lys Ser Thr Ser Thr Ala Pro Ala
1 5 10
<210> 55
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 55
Leu Ala Asp Gln Asp Thr Thr Lys Asn Ala
1 5 10
<210> 56
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 56
Leu Ala Glu Ser Asp Gln Ser Lys Pro Ala
1 5 10
<210> 57
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 57
Leu Ala His Lys Asp Thr Thr Lys Asn Ala
1 5 10
<210> 58
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 58
Leu Ala His Lys Thr Gln Gln Lys Met
1 5
<210> 59
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 59
Leu Ala His Gln Asp Thr Thr Glu Asn Ala
1 5 10
<210> 60
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 60
Leu Ala His Gln Asp Thr Thr Ile Asn Ala
1 5 10
<210> 61
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 61
Leu Ala His Gln Asp Thr Thr Lys Lys Thr
1 5 10
<210> 62
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 62
Leu Ala His Gln Asp Thr Thr Lys Asn Asp
1 5 10
<210> 63
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 63
Leu Ala His Gln Asp Thr Thr Lys Asn Thr
1 5 10
<210> 64
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 64
Leu Ala His Gln Asp Thr Thr Lys Asn Val
1 5 10
<210> 65
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 65
Leu Ala His Gln Asp Thr Thr Lys Thr Met
1 5 10
<210> 66
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 66
Leu Ala His Gln Asn Thr Thr Lys Asn Ala
1 5 10
<210> 67
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 67
Leu Ala His Arg Asp Thr Thr Lys Asn Ala
1 5 10
<210> 68
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 68
Leu Ala Ile Ser Asp Gln Thr Asn His Ala
1 5 10
<210> 69
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 69
Leu Ala Lys Gln Lys Ser Ala Ser Thr Ala
1 5 10
<210> 70
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 70
Leu Ala Lys Ser Asp Gln Cys Lys Pro Ala
1 5 10
<210> 71
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 71
Leu Ala Lys Ser Asp Gln Ser Lys Pro Asp
1 5 10
<210> 72
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 72
Leu Ala Lys Ser Asp Gln Ser Asn Pro Ala
1 5 10
<210> 73
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 73
Leu Ala Lys Ser Tyr Gln Ser Lys Pro Ala
1 5 10
<210> 74
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 74
Leu Ala Asn Gln Asp Thr Thr Lys Asn Ala
1 5 10
<210> 75
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 75
Leu Ala Pro Gln Asn Thr Thr Lys Asn Ala
1 5 10
<210> 76
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 76
Leu Ala Pro Ser Ser Ile Gln Lys Pro Ala
1 5 10
<210> 77
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 77
Leu Ala Gln Gln Asp Thr Thr Lys Asn Ala
1 5 10
<210> 78
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 78
Leu Ala Tyr Gln Asp Thr Thr Lys Asn Ala
1 5 10
<210> 79
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 79
Leu Asp His Gln Asp Thr Thr Lys Asn Ala
1 5 10
<210> 80
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 80
Leu Asp His Gln Asp Thr Thr Lys Ser Ala
1 5 10
<210> 81
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 81
Leu Gly His Gln Asp Thr Thr Lys Asn Ala
1 5 10
<210> 82
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 82
Leu Pro His Gln Asp Thr Thr Lys Asn Asp
1 5 10
<210> 83
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 83
Leu Pro His Gln Asp Thr Thr Lys Asn Thr
1 5 10
<210> 84
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 84
Leu Pro His Gln Asp Thr Thr Asn Asn Ala
1 5 10
<210> 85
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 85
Leu Thr His Gln Asp Thr Thr Lys Asn Ala
1 5 10
<210> 86
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 86
Leu Thr Lys Asp Ala Thr Lys Thr Ile Ala
1 5 10
<210> 87
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 87
Leu Thr Pro Gln Asp Thr Thr Lys Asn Ala
1 5 10
<210> 88
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 88
Leu Val His Gln Asp Thr Thr Lys Asn Ala
1 5 10
<210> 89
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 89
Lys Asp Ala Thr Lys Asn
1 5
<210> 90
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 90
His Gln Asp Thr Thr Lys Asn
1 5
<210> 91
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 91
His Gln Asp Thr Thr Lys Asn
1 5
<210> 92
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 92
Thr Thr Ser Gln Asn Lys Pro
1 5
<210> 93
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 93
Ile Ser Asp Gln Thr Lys His
1 5
<210> 94
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 94
Arg Gly Val Ala Pro Ser Ser
1 5
<210> 95
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 95
Pro Asp Ser Thr Thr Arg Ser
1 5
<210> 96
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 96
Lys Gly Thr Glu Leu Lys Pro
1 5
<210> 97
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 97
Ile Ile Asp Ala Thr Lys Asn
1 5
<210> 98
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 98
Val Asp Gly Ala Gln Arg Ser
1 5
<210> 99
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 99
Pro Gln Asp Thr Thr Lys Lys
1 5
<210> 100
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 100
His Gln Asp Thr Thr Lys Asn
1 5
<210> 101
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 101
Lys Asp Ala Thr Lys Thr Ile
1 5
<210> 102
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 102
Lys Gln Gln Ser Ala Ser Thr
1 5
<210> 103
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 103
Lys Ser Asp Gln Ser Lys Pro
1 5
<210> 104
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 104
His Gln Asp Thr Thr Lys Asn
1 5
<210> 105
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 105
Ala Asn Gln Pro Ser Lys Pro
1 5
<210> 106
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 106
Val Ser Asp Ser Thr Lys Ala
1 5
<210> 107
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 107
Ala Gln Gly Thr Ala Lys Lys Pro
1 5
<210> 108
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 108
Pro Asp Gln Thr Thr Arg Asn
1 5
<210> 109
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 109
Ala Ser Asp Ser Thr Lys Ala
1 5
<210> 110
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 110
Pro Gln Asp Thr Thr Lys Asn
1 5
<210> 111
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 111
Lys Ala Asp Glu Thr Arg Pro
1 5
<210> 112
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 112
His Gln Asp Thr Ala Lys Asn
1 5
<210> 113
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 113
His Gln Asp Thr Lys Lys Asn
1 5
<210> 114
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 114
His Gln Asp Thr Thr Lys His
1 5
<210> 115
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 115
His Gln Asp Thr Thr Lys Lys
1 5
<210> 116
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 116
His Gln Asp Thr Thr Arg Asn
1 5
<210> 117
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 117
His Gln Asp Thr Thr Asn
1 5
<210> 118
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 118
His Gln Gly Thr Thr Lys Asn
1 5
<210> 119
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 119
His Gln Val Thr Thr Lys Asn
1 5
<210> 120
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 120
Ile Ser Asp Gln Ser Lys Pro
1 5
<210> 121
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 121
Asp Ala Thr Lys Thr
1 5
<210> 122
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 122
Lys Asp Thr Thr Lys Asn
1 5
<210> 123
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 123
Lys Ser Asp Gln Ser Arg Pro
1 5
<210> 124
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 124
Pro Gln Asp Thr Lys Lys Asn
1 5
<210> 125
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 125
Thr Ser Asp Ser Thr Lys Ala
1 5
<210> 126
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 126
Val Asp Gly Ser Gln Arg Ser
1 5
<210> 127
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 127
Ile Ser Asp Gln Thr Lys His
1 5
<210> 128
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 128
Lys Asp Ala Thr Lys Thr Ile
1 5
<210> 129
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 129
Pro Gln Asp Thr Thr Lys Asn
1 5
<210> 130
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 130
Pro Gln Asp Thr Thr Lys Asn
1 5
<210> 131
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 131
His Gln Asp Thr Thr Lys Asn
1 5
<210> 132
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 132
His Glu Thr Ser Pro Arg Pro
1 5
<210> 133
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 133
Lys Ser Thr Ser Thr Ala Pro
1 5
<210> 134
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 134
Asp Gln Asp Thr Thr Lys Asn
1 5
<210> 135
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 135
Glu Ser Asp Gln Ser Lys Pro
1 5
<210> 136
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 136
His Lys Asp Thr Thr Lys Asn
1 5
<210> 137
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 137
His Lys Thr Gln Gln Lys
1 5
<210> 138
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 138
His Gln Asp Thr Thr Glu Asn
1 5
<210> 139
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 139
His Gln Asp Thr Thr Ile Asn
1 5
<210> 140
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 140
His Gln Asp Thr Thr Lys Lys
1 5
<210> 141
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 141
His Gln Asp Thr Thr Lys Asn
1 5
<210> 142
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 142
His Gln Asp Thr Thr Lys Asn
1 5
<210> 143
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 143
His Gln Asp Thr Thr Lys Asn
1 5
<210> 144
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 144
His Gln Asp Thr Thr Lys Thr
1 5
<210> 145
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 145
His Gln Asn Thr Thr Lys Asn
1 5
<210> 146
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 146
His Arg Asp Thr Thr Lys Asn
1 5
<210> 147
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 147
Ile Ser Asp Gln Thr Asn His
1 5
<210> 148
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 148
Lys Gln Lys Ser Ala Ser Thr
1 5
<210> 149
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 149
Lys Ser Asp Gln Cys Lys Pro
1 5
<210> 150
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 150
Lys Ser Asp Gln Ser Lys Pro
1 5
<210> 151
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 151
Lys Ser Asp Gln Ser Asn Pro
1 5
<210> 152
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 152
Lys Ser Tyr Gln Ser Lys Pro
1 5
<210> 153
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 153
Asn Gln Asp Thr Thr Lys Asn
1 5
<210> 154
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 154
Pro Gln Asn Thr Thr Lys Asn
1 5
<210> 155
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 155
Pro Ser Ser Ile Gln Lys Pro
1 5
<210> 156
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 156
Gln Gln Asp Thr Thr Lys Asn
1 5
<210> 157
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 157
Tyr Gln Asp Thr Thr Lys Asn
1 5
<210> 158
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 158
His Gln Asp Thr Thr Lys Asn
1 5
<210> 159
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 159
His Gln Asp Thr Thr Lys Ser
1 5
<210> 160
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 160
His Gln Asp Thr Thr Lys Asn
1 5
<210> 161
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 161
His Gln Asp Thr Thr Lys Asn
1 5
<210> 162
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 162
His Gln Asp Thr Thr Lys Asn
1 5
<210> 163
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 163
His Gln Asp Thr Thr Asn Asn
1 5
<210> 164
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 164
His Gln Asp Thr Thr Lys Asn
1 5
<210> 165
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 165
Lys Asp Ala Thr Lys Thr Ile
1 5
<210> 166
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 166
Pro Gln Asp Thr Thr Lys Asn
1 5
<210> 167
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 167
His Gln Asp Thr Thr Lys Asn
1 5
<210> 168
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 168
His Gln Asp Thr Thr Lys Asn
1 5
<210> 169
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 169
Leu Gly Glu Thr Thr Arg Ala
1 5
<210> 170
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 170
His Gln Asp Thr Thr Arg Pro
1 5
<210> 171
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 171
Arg Gln Asp Thr Thr Lys Asn
1 5
<210> 172
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 172
His Gln Asp Ser Thr Lys Asn
1 5
<210> 173
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 173
His Gln Asp Ala Thr Lys Asn
1 5
<210> 174
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 174
His Gln Asp Thr Lys Lys Pro
1 5
<210> 175
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 175
Leu Ser Glu Thr Thr Arg Pro
1 5
<210> 176
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 176
His Gln Asp Thr Thr Lys Lys
1 5
<210> 177
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 177
Leu Gly Glu Ala Thr Arg Pro
1 5
<210> 178
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 178
Leu Gly Glu Thr Thr Arg Thr
1 5
<210> 179
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 179
Leu Ser Glu Ala Thr Arg Pro
1 5
<210> 180
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 180
Lys Asp Glu Thr Lys Asn Ser
1 5
<210> 181
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 181
Leu Gly Glu Thr Thr Lys Pro
1 5
<210> 182
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 182
His Gln Ala Thr Thr Lys Asn
1 5
<210> 183
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 183
Leu Ala His Gln Asp Thr Thr Lys Asn Ser
1 5 10
<210> 184
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 184
Leu Ala Leu Gly Glu Thr Thr Arg Ala Ala
1 5 10
<210> 185
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 185
Leu Ala His Gln Asp Thr Thr Arg Pro Ala
1 5 10
<210> 186
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 186
Leu Ala Arg Gln Asp Thr Thr Lys Asn Ala
1 5 10
<210> 187
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 187
Leu Ala His Gln Asp Ser Thr Lys Asn Ala
1 5 10
<210> 188
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 188
Leu Ala His Gln Asp Ala Thr Lys Asn Ala
1 5 10
<210> 189
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 189
Leu Ala His Gln Asp Thr Lys Lys Pro Ala
1 5 10
<210> 190
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 190
Ile Leu Ser Glu Thr Thr Arg Pro Ala
1 5
<210> 191
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 191
Leu Ala His Gln Asp Thr Thr Lys Lys Cys
1 5 10
<210> 192
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 192
Leu Ala Leu Gly Glu Ala Thr Arg Pro Ala
1 5 10
<210> 193
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 193
Leu Ala Leu Gly Glu Thr Thr Arg Thr Ala
1 5 10
<210> 194
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 194
Leu Ala Leu Ser Glu Ala Thr Arg Pro Ala
1 5 10
<210> 195
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 195
Leu Ala Lys Asp Glu Thr Lys Asn Ser Ala
1 5 10
<210> 196
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 196
Leu Ala Leu Gly Glu Thr Thr Lys Pro Ala
1 5 10
<210> 197
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 197
Leu Ala His Gln Ala Thr Thr Lys Asn Ala
1 5 10
<210> 198
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成引物
<400> 198
gtctgaatcc acccagaagg 20
<210> 199
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成引物
<400> 199
tgcgaagaag gcgtatgg 18
<210> 200
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成探针
<400> 200
tgatggtcct ggcattctgc ttct 24
<210> 201
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成引物
<400> 201
tcacttacac caactccaac tc 22
<210> 202
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成引物
<400> 202
gaagatcatc cacacgctag tc 22
<210> 203
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成探针
<400> 203
ttatcacatt gcgccgagat gggt 24
<210> 204
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成引物
<400> 204
gtccgcgacc atctacaatc 20
<210> 205
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成引物
<400> 205
atccgtcgtc cactttcttt c 21
<210> 206
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成探针
<400> 206
cgaagagttg caggatgcag ttgc 24

Claims (60)

1.一种重组表达载体，其包含第一ITR多核苷酸序列、与编码中波长视锥视蛋白(MW-视蛋白)转基因的多核苷酸序列可操作地连接的启动子多核苷酸序列、多聚A多核苷酸序列、内含子多核苷酸序列和第二ITR多核苷酸序列。
2.一种重组表达载体，其包含第一ITR多核苷酸序列、与编码中波长视锥视蛋白(MW-视蛋白)转基因的多核苷酸序列可操作地连接的启动子多核苷酸序列、增强子多核苷酸序列、多聚A多核苷酸序列和第二ITR多核苷酸序列。
3.一种重组表达载体，其包含第一ITR多核苷酸序列、与编码中波长视锥视蛋白(MW-视蛋白)转基因的多核苷酸序列可操作地连接的启动子多核苷酸序列、增强子多核苷酸序列、多聚A多核苷酸序列、内含子多核苷酸序列和第二ITR多核苷酸序列。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的重组表达载体，其中所述第一ITR多核苷酸序列包含SEQ ID NO:1的序列。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的重组表达载体，其中所述启动子多核苷酸序列包含SEQ ID NO:2的序列。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的重组表达载体，其中所述编码密码子优化的MW-视蛋白转基因的多核苷酸序列包含与SEQ ID NO:3的序列85％相同的序列。
7.根据权利要求1-5中任一项所述的重组表达载体，其中所述编码MW-视蛋白转基因的多核苷酸序列包含与SEQ ID NO:3的序列90％相同的序列。
8.根据权利要求1-5中任一项所述的重组表达载体，其中所述编码MW-视蛋白转基因的多核苷酸包含SEQ ID NO:3的序列。
9.根据权利要求2和4-8中任一项所述的重组表达载体，其中所述增强子多核苷酸序列包含SEQ ID NO:4的序列。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的重组表达载体，其中所述多聚A多核苷酸序列包含SEQ ID NO:5的序列。
11.根据权利要求3-10中任一项所述的重组表达载体，其中所述内含子多核苷酸序列包含SEQ ID NO:6的序列。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的重组表达载体，其中所述第二ITR多核苷酸序列包含SEQ ID NO:7的序列。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的重组表达载体，其中所述重组表达载体进一步包含赋予抗生素抗性的多核苷酸序列。
14.根据权利要求13所述的重组表达载体，其中所述抗生素是卡那霉素。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的重组表达载体，其中所述重组表达载体包含SEQID NO:8的序列。
16.根据权利要求1-15中任一项所述的重组表达载体，其中所述重组表达载体是重组病毒载体。
17.根据权利要求16所述的重组病毒载体，其中所述重组病毒载体是腺相关病毒载体、慢病毒载体、单纯疱疹病毒载体或逆转录病毒载体。
18.根据权利要求17所述的重组病毒载体，其中所述重组病毒载体是腺相关病毒载体。
19.根据权利要求18所述的重组病毒载体，其中所述重组病毒载体是AAV2。
20.根据权利要求18所述的重组病毒载体，其中所述重组腺相关病毒载体包含编码变体衣壳多肽的核苷酸序列，与野生型腺相关病毒衣壳相比，所述变体衣壳多肽赋予增加的视网膜细胞感染性和/或赋予增加的穿过内界膜的能力。
21.根据权利要求19或20中任一项所述的重组表达载体，其中所述重组表达载体包含SEQ ID NO:9的序列。
22.根据权利要求21所述的重组病毒载体，其中所述变体衣壳多肽具有选自由SEQ IDNO:10-197组成的组的序列。
23.根据权利要求20所述的重组病毒载体，其中所述变体衣壳多肽具有选自由SEQ IDNO:10-20组成的组的序列。
24.根据权利要求20所述的重组病毒载体，其中所述变体衣壳多肽具有SEQ ID NO:14的序列。
25.根据权利要求20所述的重组病毒载体，其中所述变体衣壳多肽具有SEQ ID NO:15的序列。
26.根据权利要求20所述的重组病毒载体，其中所述变体衣壳多肽具有SEQ ID NO:16的序列。
27.一种恢复或增强个体的视觉功能的方法，所述方法包括向所述个体施用根据权利要求1-26中任一项所述的重组表达载体，其中所述施用提供了MW-视蛋白转基因在所述个体的视网膜细胞中的表达以及视觉功能的恢复或增强。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述MW-视蛋白转基因在所述视网膜细胞中的表达提供了所述个体的模式化视觉和图像识别。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述图像识别是静态图像或模式的图像识别。
30.根据权利要求28所述的方法，其中所述图像识别是运动图像或模式的图像识别。
31.根据权利要求27-30中任一项所述的方法，其中所述MW-视蛋白转基因在所述视网膜细胞中的表达提供了在空间模式辨别测定中区分包含垂直线的图像和包含水平线的图像。
32.根据权利要求27-30中任一项所述的方法，其中所述MW-视蛋白转基因在所述视网膜细胞中的表达提供了在空间模式辨别测定中区分包含静态线的图像和包含移动线的图像。
33.根据权利要求27-30中任一项所述的方法，其中所述MW-视蛋白转基因在所述视网膜细胞中的表达提供了在时间光模式测定中区分闪光和恒定光。
34.根据权利要求27-30中任一项所述的方法，其中所述MW-视蛋白转基因在所述视网膜细胞中的表达提供了在图像识别测定中在约104W/cm2至约10W/cm2的光强度下识别图像。
35.根据权利要求27-30中任一项所述的方法，其中所述MW-视蛋白转基因在所述视网膜细胞中的表达提供了在避光测定中区分具有白光的区域和没有白光的区域。
36.根据权利要求27-30中任一项所述的方法，其中所述MW-视蛋白转基因在所述视网膜细胞中的表达提供了在如下光强度下的图像识别，所述光强度比在视网膜细胞中表达通道视紫红质多肽的个体提供图像识别所需的光强度低至少10倍。
37.根据权利要求27-30中任一项所述的方法，其中所述MW-视蛋白转基因在所述视网膜细胞中的表达提供了如下动力学，所述动力学比视紫红质多肽赋予视网膜细胞的动力学快至少2倍。
38.根据权利要求27-37中任一项所述的方法，其中所述施用经由眼内注射进行。
39.根据权利要求27-37中任一项所述的方法，其中所述施用经由玻璃体内注射进行。
40.根据权利要求27-37中任一项所述的方法，其中所述施用经由视网膜下注射进行。
41.根据权利要求27-37中任一项所述的方法，其中所述个体患有选自以下的眼部疾病：视网膜色素变性、黄斑变性、地图样萎缩、年龄相关性黄斑变性、视网膜劈裂症、莱伯氏先天性黑蒙、视锥视杆营养不良、巴尔得-别德尔综合征、无脉络膜症、厄舍综合征、眼底黄色斑点症和别蒂结晶样营养障碍。
42.根据权利要求27-37中任一项所述的方法，其中所述个体由于创伤、头部损伤或作为另一种疾病的并发症经历视网膜脱离或光感受器丧失。
43.一种药物组合物，其包含：
a)根据权利要求1-26中任一项所述的重组表达载体；和
b)药学上可接受的赋形剂。
44.根据权利要求43所述的药物组合物，其中所述药学上可接受的赋形剂包含盐水。
45.根据权利要求43-44中任一项所述的药物组合物，其中所述组合物是无菌的。
46.根据权利要求1-26中任一项所述的重组表达载体或根据权利要求43-45中任一项所述的药物组合物，其用于治疗有需要的受试者。
47.根据权利要求1-26中任一项所述的重组表达载体或根据权利要求43-45中任一项所述的药物组合物，其用于恢复或增强受试者的视觉功能。
48.根据权利要求1-26中任一项所述的重组表达载体或根据权利要求43-45中任一项所述的药物组合物在制造用于治疗眼部疾病的药物中的用途。
49.根据权利要求1-26中任一项所述的重组表达载体或根据权利要求43-45中任一项所述的药物组合物，其用于恢复或增强视觉功能。
50.根据权利要求1-26中任一项所述的重组表达载体或根据权利要求43-45中任一项所述的药物组合物，其用于治疗眼部疾病。
51.一种宿主细胞，其包含根据权利要求1-26中任一项所述的重组表达载体。
52.一种制备根据权利要求1-26中任一项所述的重组表达载体的方法，所述方法包括培养根据权利要求51所述的宿主细胞、裂解培养的宿主细胞、和从所述裂解的培养的宿主细胞中提取和纯化所述重组表达载体。
53.一种制备根据权利要求43-45中任一项所述的药物组合物的方法，所述方法包括培养根据权利要求51所述的宿主细胞，收集培养的宿主细胞的上清液，从所收集的上清液中浓缩和纯化重组病毒载体，以及向所纯化的重组病毒载体中添加药学上可接受的赋形剂。
54.一种治疗眼部疾病的方法，所述眼部疾病选自视网膜色素变性、黄斑变性、地图样萎缩、年龄相关性黄斑变性、视网膜劈裂症、莱伯氏先天性黑蒙、视锥视杆营养不良、巴尔得-别德尔综合征、无脉络膜症、厄舍综合征、眼底黄色斑点症或别蒂结晶样营养障碍，所述方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的根据权利要求1-26中任一项所述的重组表达载体或根据权利要求43-45所述的药物组合物。
55.根据权利要求54所述的方法，其中所述眼部疾病是视网膜色素变性。
56.根据权利要求54所述的方法，其中所述眼部疾病是地图样萎缩。
57.根据权利要求20所述的重组病毒载体，其中所述变体衣壳多肽具有选自由SEQ IDNO:168-170组成的组的序列。
58.根据权利要求20所述的重组病毒载体，其中所述变体衣壳多肽具有SEQ ID NO:168的序列。
59.根据权利要求20所述的重组病毒载体，其中所述变体衣壳多肽具有SEQ ID NO:169的序列。
60.根据权利要求20所述的重组病毒载体，其中所述变体衣壳多肽具有SEQ ID NO:170的序列。
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