CN107429252B

CN107429252B - 优化的rpe65启动子和编码序列

Info

Publication number: CN107429252B
Application number: CN201680020425.6A
Authority: CN
Inventors: A·史密斯; R·阿里
Original assignee: UCL Business Ltd
Current assignee: UCL Business Ltd
Priority date: 2015-02-09
Filing date: 2016-02-08
Publication date: 2022-03-29
Anticipated expiration: 2036-02-08
Also published as: WO2016128722A1; EP3769790A1; BR112017017060A2; EP3256169A1; US20180021458A1; EP3256169B1; CY1123947T1; SI3256169T1; SG11201706520UA; MX2021006762A; IL253915B; IL287142B1; ES2830030T3; IL287142A; IL253915A0; GB201502137D0; JP2018510620A; AU2016217654B2; DK3256169T3; JP6963503B2

Abstract

本发明涉及在患者中预防和/或治疗视网膜营养不良，包括利伯先天性黑矇(LCA)。

Description

优化的RPE65启动子和编码序列

技术领域

本发明涉及用于治疗和/或预防视网膜营养不良，特别是视网膜色素上皮的疾病(例如利伯先天性黑矇(Leber congenital amaurosis))的基因疗法。

背景技术

视网膜营养不良(包括遗传性视网膜营养不良(IRD))构成一大类在遗传上和表型上异质的疾病——其特征在于光感受器细胞的逐渐减少以及伴随的视力丧失。在欧洲和美国，IRD影响约每3000 人中的1人。迄今为止，已鉴定与视网膜营养不良相关的约200个基因和另外的50个基因座。这些疾病的大多数是由功能丧失的突变引起的，所述突变通过隐性遗传或X连锁遗传而获得。

关于视力丧失的发病、速度和受影响的主要细胞类型，存在实质性差异。遗传性视网膜变性的最严重形式为各种类型的利伯先天性黑矇(LCA)，该疾病中存在从出生开始的严重视力损伤，以及通常在前20年中视力完全丧失。尽管在视网膜变性中最常受到影响的主要细胞类型是光感受器细胞，但是其他细胞类型(例如视网膜色素上皮 (RPE))中的缺陷也能够导致光感受器功能下降和它们随后的丧失。

由于RPE中的缺陷导致的遗传性视网膜营养不良的实例是由 RPE主导的铁依赖性类视色素异构水解酶RPE65中的缺陷引起的 LCA形式，其占LCA病例的6％至16％。RPE65缺失导致视觉周期的破坏，其导致视杆功能缺失，从而导致光感受器变性。

若干临床和临床前基因替代疗法研究已表明，腺病毒AAV2载体的视网膜下递送是安全的，并且能够使视觉功能增加(Bainbridge et al.2008，Maguire et al.2008，2009，Hauswirth et al.2008，Cideciyan et al 2008，2009)和视皮质活性增加(Ashtari etal.2011)。

然而，在之前对RPE中RPE65基因替代疗法的研究中 (Bainbridge et al.2008)，作者报道了尽管治疗后一名患者的视网膜灵敏度和视觉引导的移动性(mobility)出现改善，但是在视敏度和周围视野(field vision)方面没有显著改善。此外，在其他被治疗的患者中全部测量参数均没有显著改善。视网膜电图响应的改善尚未在任何研究中被报道。还已经观察到，用AAV2/4载体介导的疗法来治疗30月龄的RPE65-/-犬并未补救(rescue)视力或视网膜功能(Le Meur et al.2007)。

因此，需要改进用于视网膜营养不良，特别是遗传性视网膜营养不良，特别是视网膜色素上皮(RPE)的疾病(例如利伯先天性黑矇) 的基因替代疗法。

发明内容

本发明是基于产生用于在RPE中表达基因的优化启动子。该优化启动子如SEQ IDNO:2所示。所述启动子包含Bainbridge et al. (2008)中使用的人RPE65启动子的第865至1614位核苷酸，所述人 RPE65启动子如SEQ ID NO:1所示。将该启动子用在载体中来驱动调控基因在RPE中的表达的用途是有效的，表达水平比使用原始 RPE65启动子的表达水平高约20倍。优化的RPE65启动子均比原始 RPE65启动子更有效，同时相对于光感受器细胞，在RPE细胞中更严格地驱动表达。

此外，如SEQ ID NO:3所示的RPE65的天然编码序列已被优化以产生优化序列，其如SEQ ID NO:4所示。在转染携带泛在CMV 启动子的AAV2/8表达质粒之后，在体外于(人)293T细胞中同时测试优化的RPE65序列和原始RPE65序列以确定对RPE65蛋白产生水平的影响。在优化RPE65编码序列之后，293T细胞中的体外蛋白产生表明，与野生型编码序列相比，由携带优化的编码序列的载体产生的RPE65蛋白的量增加7倍。

还将优化的启动子和优化的RPE65序列在载体中结合以测试它们在RPE65缺陷小鼠中在体内补救视网膜功能的能力。将补救功效与之前在Bainbridge et al(2008)中使用的临床级载体进行比较。给予更低的载体剂量以允许在限制性情况下比较治疗功效。将b波振幅用作补救的量度。出乎意料的是，来自用优化的载体治疗的眼的b波振幅等于或高于来自用300倍更高剂量的原始载体注射的眼的振幅。因此，本发明的启动子和/或编码序列的优化与使用天然序列相比是高度有利的。

因此，本发明提供了视网膜色素上皮(RPE)特异性启动子，其包含：(a)来自SEQ IDNO:1的连续核苷酸序列，其将RPE特异性表达赋予可操作地连接的多核苷酸序列；或(b)与所述(a)的序列具有至少90％的序列同一性并且保留RPE特异性启动子活性的序列。

在另一相关方面，本发明提供了包含本发明的启动子的表达构建体，所述启动子与待以RPE特异性方式表达的序列可操作地连接。

在另一相关方面，本发明提供了包含本发明的启动子或本发明的表达盒的载体。

在另一相关方面，本发明提供了包含本发明的载体或产生本发明的病毒载体的宿主细胞。

在另一相关方面，本发明提供了药物组合物，其包含本发明的载体和可药用载体(carrier)。

在另一相关方面，本发明提供了用于预防或治疗视网膜营养不良的方法中的本发明的载体。

在另一相关方面，本发明提供了本发明的载体用于制备治疗或预防视网膜营养不良的药剂的用途。

在另一相关方面，本发明提供了在需要其的患者中治疗或预防视网膜营养不良的方法，包括将治疗有效量的本发明的载体给予至所述患者。

本发明还提供了包含本发明的启动子的表达构建体和载体，以及包含所述载体的药物组合物，以及所述载体用于治疗或预防视网膜营养不良，特别是视网膜色素上皮疾病(例如利伯先天性黑矇)的用途。

附图说明

图1：视网膜下注射之后，鼠视网膜中由原始RPE65启动子和新 RPE65启动子构型驱动的GFP表达水平和表达方式。使用定量 PCR(A)和蛋白质印迹(B)来评估启动子活性。(C)在视网膜下注射 AAV-RPE65-eGFP(上)或AAV-NA-eGFP(下)之后4周的眼的冷冻切片。

图2：在RPE65编码序列的优化之后，对293T细胞中的体外 RPE65蛋白产生的蛋白质印迹评估(A)和随后的定量(B)。白色柱表示使用未优化的RPE65编码序列的RPE65蛋白产生，黑色柱表示使用优化的RPE65编码序列(SEQ ID NO:4)的RPE65蛋白产生。

图3：治疗后4周，对优化的载体(AAV5-优化的RPE65)和原始载体(AAV2-hRPE65，Bainbridge et al 2008)的治疗功效的比较。该图示出了在治疗后第4周，当两种载体都达到最高表达时的平均暗视b波振幅(平均值±SD)。优化的载体包含新的(NA)RPE65启动子构型和优化的RPE65编码序列。

序列简要说明

SEQ ID NO:1表示Bainbridge et al(2008)中使用的形式的人 RPE65启动子的DNA序列。

SEQ ID NO:2表示优化的RPE65启动子片段的DNA序列。

SEQ ID NO:3表示人RPE65基因的天然cDNA序列。

SEQ ID NO:4表示优化的RPE65基因的cDNA序列(Kozak序列和编码序列)。

SEQ ID NO:5表示人MERTK基因的cDNA序列。

SEQ ID NO:6表示人LRAT基因的cDNA序列。

SEQ ID NO:7表示人TYR基因的cDNA序列。

SEQ ID NO:8表示人GRP143基因的cDNA序列。

SEQ ID NO:9和10表示与RPE65杂交的引物序列。

SEQ ID NO:11和12表示与eGFP杂交的引物序列。

SEQ ID NO:13和14表示与β-肌动蛋白杂交的引物序列。

具体实施方式

应理解，所公开的多核苷酸序列的不同应用可根据本领域的具体需要进行调整。还应理解，本文中使用的术语仅用于描述本发明的具体实施方案的目的，并不意欲进行限制。

此外，如本说明书和所附权利要求书中使用的，单数形式“一”、“一个”和“所述”包括复数指代物，除非上下文另有明确说明。因此，例如，提及“一个多核苷酸”包括“多个多核苷酸”，提及“一个启动子”包括“多个启动子”，提及“一个载体”包括两个或多个这类载体，等等。

本文在上文或下文中引用的全部出版物、专利和专利申请以引用的方式全文纳入本文。

本发明涉及用于在患者中治疗和/或预防视网膜营养不良，特别是视网膜色素上皮疾病(例如利伯先天性黑矇)的基因疗法。

所述患者优选地为哺乳动物。所述哺乳动物可以是商业养殖的动物，例如马、牛、绵羊或猪；实验用动物，例如小鼠或大鼠；或宠物，例如猫、狗、兔或豚鼠。所述患者更优选地为人。

本发明的启动子可用于治疗视网膜营养不良。视网膜营养不良可以为遗传性视网膜营养不良。视网膜营养不良可定义为视网膜的疾病，其特征在于光感受器细胞的逐渐减少和伴随的视力丧失。

视网膜

视网膜由视网膜色素上皮(RPE)细胞层和3层感觉神经细胞组成；即(从外到内)，外核层(包含感光细胞)、内核层(包含双极细胞)和神经节细胞层。

视网膜色素上皮(RPE)

RPE细胞与光感受器外段相互交错。光感受器和RPE细胞之间的空间包含基质，类视色素循环的化合物通过该基质移动。RPE对视网膜功能和类视色素循环具有若干显著的贡献。这些贡献包括光感受器外段盘的吞噬作用，光散射的减少，贡献外部血液-视网膜屏障，维生素A的代谢和免疫抑制微环境的维持(眼免疫赦免)。

视网膜营养不良或变性可与类视色素循环中的异常相关。类视色素循环是使视觉生色团再生的过程。生色团11-顺式-视黄醛的光异构化产生全反式视黄醛，其进而从视紫--红质解离。全反式视黄醛之后被NADPH依赖性酶全反式视黄醇脱氢酶还原成全反式视黄醇 (Baehr et al.2003)。全反式视黄醇随后离开感光细胞，穿过细胞间基质并进入RPE，在其中发生色素再生的最终阶段。卵磷脂视黄醇酰基转移酶(LRAT)使全反式视黄醇酯化为全反式视黄酯。该酯之后被RPE主导的铁依赖性类视色素异构水解酶RPE65转化为11-顺式-视黄醇(Jin et al.2005；Moiseyev et al.2005；Redmond et al. 2005)。NAD-和NADP-依赖性酶11-顺式-视黄醇脱氢酶最终通过11- 顺式-视黄醇的氧化再生出11-顺式-视黄醛。因此，RPE65蛋白是类视色素循环的必需组分。

RPE的遗传性视网膜营养不良

RPE的遗传性视网膜营养不良可包括利伯先天性黑矇、眼白化病和MER原癌基因酪氨酸激酶(MERTK)缺陷以及其他。

利伯先天性黑矇(LCA)

利伯先天性黑矇(LCA)——遗传性视网膜变性的最严重形式之一，是由多个基因中的常染色体隐性突变导致的，所述多个基因其中之一是RPE65(Gu et al.，1997；Marlhens et al.1997；Morimura et al.， 1998)。

利伯先天性黑矇(LCA)在1869年首次由Theodor Karl Gustav Leber描述。它是视网膜变性的罕见形式，其在儿童失明中占相当大的比例。可从目前的数据获得对LCA发病率和流行率的不同估计。例如，Alstrom和Olson估计LCA的全世界患病率为100000个新生儿中的3个(1957)。更近期的分析估计，LCA的患病率更低，为 1/80000(Stone 2007)。据说LCA占全部遗传性视网膜病变的5％以上，以及全世界的失明学校护理的儿童的约20％(Schappert-Kimmijser et al.1959)。这些统计数据用来说明LCA 造成的发病对个人和整个社会的沉重负担。

LCA的临床特征(在1869年首先由Leber描述)至今仍是用于诊断的主要标准；即以下四个特征：在出生时或邻近出生时严重视力丧失，游走的眼球震颤(不随意眼动形式)，黑矇性瞳孔(如果受影响的眼被光刺激，在受影响的眼的同侧的无反应瞳孔)和色素性视网膜病(Ahmed and Loewenstein 2008；Koenekoop 2004；Leber 1869)；此外，缺乏视网膜电图(ERG)信号的证明代表LCA诊断的绝对标准(den Hollander et al.2008)。尽管通常在回顾中(由于延迟的诊断)认识到，LCA首先出现的临床征象之一发生在婴儿，此时婴儿无法进行视力追踪。这当然是严重视力损伤的非特异性行为征象。

LCA中涉及的RPE特异性基因

RPE65

RPE65是主要位于RPE细胞中的视黄酯结合蛋白。RPE65高度优先地定位于RPE细胞的平滑内质网中，在此处形成11-顺式-视黄醛生色团。尽管RPE65的表达是相对组织特异性的，RPE65也在锥光感受器中表达(Znoiko et al.2002)。最初证明RPE65是11-顺式- 视黄醇从全反式视黄酯再生的途径的必要组分(Gollapalli et al.2003； Mata et al.2004)。假定RPE65作为该反应中的底物伴侣分子发挥作用。

然而，随后的研究已确认RPE65具有酶的作用并且代表至关重要的异构水解酶，其将全反式类视色素再循环为11-顺式-类视色素 (Jin et al.2005；Moiseyev et al.2005；Redmond et al.2005)。还发现RPE65异构水解酶活性依赖于Fe²⁺，因为Fe²⁺结合残基中的突变消除了它的酶活性(Moiseyev et al.2006；Redmond et al.2005)。关键的酶和铁结合残基中的突变消除了该异构水解酶的活性，使视黄酯在RPE中积累，并阻断类视色素循环(Redmond et al.1998；Redmond et al.2005)。在鼠RPE65-/-敲除模型中，还有显示为脂质微滴形式的全反式视黄酯(RPE65的酶底物)的大量累积(Katz and Redmond 2001)。

RPE65突变是造成LCA亚型的原因(Gu et al.，1997；Marlhens et al.1997；Morimura et al.，1998)。RPE65中的突变是导致6至16％ LCA病例的原因，此外是导致2％隐性色素性视网膜炎(RP)病例的原因(Morimura et al.1998；Hanein et al.2004；Simonelli et al. 2007)。若干研究已经报道，与欧洲其余人群和美国人群相比，在地中海人群中LCA相关的RPE65突变更为普遍(Hanein et al.2004； Simonelli et al.2007；Yzeret al.2006)。

RPE65中的突变与若干表型特征相关，包括夜盲症以及在生命的前10年保留最少的视功能(Simonelli et al.2007)。RPE65突变也与特定的眼底外观相关；即盐和胡椒样(salt-and-pepper)视网膜营养不良。与其他LCA相关突变(例如CRB1 中的突变)不同，RPE65突变与正常视网膜厚度和可检测的自发荧光信号相关(Simonelli et al.2007；VanHooser et al.2000)。

Bainbridge et al.2008中使用的人RPE65启动子区如SEQ ID NO: 1所示。人RPE65cDNA序列如SEQ ID NO:3所示。

卵磷脂视黄醇酰基转移酶(LRAT)

除了RPE65，有三种其他形式的严重视网膜营养不良，其由编码在视循环——在暴露于光之后再生视色素的一组生物化学反应——中发挥作用的蛋白的基因中的突变引起。这些蛋白中的一种——卵磷脂视黄醇酰基转移酶(LRAT)，像RPE65一样是RPE特异性的。LRAT是产生RPE65的底物的视循环酶，这两者中任何一个中的缺陷均导致实质上无法区分的病症。然而，虽然RPE65基因是造成全部LCA病例的约6％的原因，LRAT中的突变仅导致独立的LCA病例。人LRAT的cDNA序列如SEQ ID NO:6所示。

眼白化病

眼白化病中涉及的基因

酪氨酸酶(TYR)

酪氨酸酶(TYR)是负责RPE中黑色素生物合成的限速酶。黑色素在视网膜发育、功能和抵御光诱导的氧化应激的保护作用中具有重要作用，并且黑色素水平与AMD相关。除参与AMD之外，酪氨酸酶中的突变也可导致眼皮肤白化病1型(OCA1)，其特征在于先天性色素沉着不足。

黑色素以若干方式在表达酪氨酸酶的细胞中发挥保护功能。首先，黑色素保护这些细胞免受由阳光和紫外辐射诱导的损伤。第二，黑色素可抵消由自由基引起的氧化应激，所述自由基来自脂质过氧化产物和RPE中累积的铁。这类促氧化剂可促进该组织的年龄相关性变性。第三，黑色素对金属离子和外源化学品的高结合能力也为黑色素在眼中的保护性作用提供了支持。与这些发现一致的是，黑色素及其前体对于哺乳动物中视网膜的适当发育是必需的。酪氨酸正常表达、其翻译后修饰或向黑色素小体中的转运中的功能障碍可降低色素沉着、黑色素小体的稳定性和RPE的正常功能。研究者已证明，RPE 细胞的内含物随年龄减少，这可能部分是由于氧化性降解。此外，黑色素中发生若干年龄相关性变化，导致其功能减退。人TYR的cDNA 序列如SEQ ID NO:7所示。

G蛋白偶联受体143(GRP143)

GRP143在RPE中表达。在具有最常见形式的眼白化病(其被称为Nettleship-Falls型或型1)的人中已鉴定多于60个G蛋白偶联受体143(GPR143)突变。人GRP143的cDNA序列如SEQ ID NO:8所示。

MER原癌基因酪氨酸激酶(MERTK)缺陷

MERTK是在RPE细胞中表达的膜酪氨酸激酶，并且对于感光细胞外段的正常吞噬作用是必需的。缺乏功能性的MERTK导致RPE 和感光细胞之间碎片(debris)的累积，其对必需代谢途径产生不利影响。

与感光细胞不同，可用多种病毒载体有效转导RPE，许多研究已证明在皇家外科学院(Royal College of Surgeons)大鼠(其为MERTK 缺陷的天然模型)中MERTK的基因补充(gene supplementation) 后的改善。这些研究中的第一个使用腺病毒载体以将Mertk基因转移至RPE中，导致感光细胞结构和功能的短期改善，如通过ERG所评估的。随后的研究已证明，使用AAV2载体和基于HIV1的慢病毒载体的基因补充能够分别在皇家外科学院大鼠中减少碎片沉积、延长感光细胞存活和维持EGR响应最长达3个月和7个月。然而，即使是慢病毒载体介导的补救(三种测试载体中最有效的)也未能长期阻止感光细胞丢失。

在皇家外科学院大鼠中，MERTK的缺陷损害关键的代谢支持，导致细胞更快地丢失。人MERTK的cDNA序列如SEQ ID NO:5所示。

年龄相关性黄斑变性(AMD)

除了遗传性视网膜营养不良，本发明还适用于治疗AMD。进行性的视网膜退行性疾病，例如年龄相关性黄斑变性(AMD)和色素性视网膜炎(RP)，是无法治疗的失明的主要原因并且对社会产生巨大的社会和经济负担。全世界多达3000万人患有AMD，并且由于不断老龄化的人群，预期该诊断将在未来几十年中显著增加。AMD 是影响黄斑(macula)中光感受器-RPE-脉络膜界面interface)的年龄相关性多因素疾病，并且是由遗传易感因子和环境的相互作用而导致的。RPE是许多视网膜退行性疾病的源头和靶标，并且RPE功能的缺陷能够影响相邻细胞(主要是光感受器)的完整性和存活力。

为了治疗AMD的目的，与本发明的启动子连接的编码序列通常编码抗血管生成多肽，例如sFlt1、sFlt-4，VEGF隔离蛋白 (sequestering protein)，例如与VEGF结合的抗体或抗体片段，VEGF的可溶性受体，血管生成抑制因子(angiostatin)或内皮抑制素(endostatin)；或在RPE中具有抗凋亡作用的多肽，例如Bcl2 和其他Bcl2家族成员、XIAP(还称为BIRC4)和其他IAP/BIRC家族成员。

其他适合于从本发明载体的表达的基因

为了矫正一系列眼病的目的，可由本发明的载体表达的序列还包括编码以下的基因：支持神经元存活的神经营养因子，例如GDNF、 CNTF、PEDF、VEGF、EPO、IGF1和RdCVF1；抗血管生成多肽，例如sFlt1、sFlt-4；VEGF隔离蛋白，例如与VEGF结合的抗体或抗体片段，VEGF的可溶性受体，血管生成抑制因子或内皮抑制素；以及编码在RPE中具有抗凋亡作用的多肽的序列，所述多肽例如Bcl2 和其他Bcl2家族成员、XIAP(还称为BIRC4)和其他IAP/BIRC家族成员。

支持神经元存活的神经营养因子，例如GDNF、CNTF、PEDF、 VEGF、EPO、IGF1和RdCVF1，可用于治疗眼底黄色斑点症 (Stargardt disease)。

抗血管生成多肽，例如sFlt1、sFlt-4；VEGF隔离蛋白，例如与 VEGF结合的抗体或抗体片段，VEGF的可溶性受体，血管生成抑制因子或内皮抑制素；以及编码在RPE中具有抗凋亡作用的多肽的序列，所述多肽例如Bcl2和其他Bcl2家族成员、XIAP(还称为BIRC4) 和其他IAP/BIRC家族成员，可用于治疗糖尿病视网膜病。

另一种可从本发明的载体表达的基因是MYO7A，其与疾病 Usher 1B有关，该疾病被认为部分是由于RPE中缺少由MYO7A编码的蛋白而导致的。

本发明的启动子

本发明的启动子是人RPE65启动子的片段和/或变体，并且具有 RPE特异性启动子活性。它们可以为分离的形式。

本发明的启动子可包含来自SEQ ID NO:1的核苷酸(通常为连续核苷酸)序列，其将RPE特异性表达赋予可操作地连接的多核苷酸序列。SEQ ID NO:1序列的长度为1614个核苷酸，并且不具有 RPE特异性活性。确实具有RPE特异性活性的SEQ ID NO:1的任何截短均是本发明的序列。因此，本发明的启动子序列可例如包含 SEQ ID NO:1的最多达1500或1600个核苷酸，但是优选地，它们包含SEQ ID NO:1的不多于1300，不多于1200，不多于1100，不多于1000，不多于900，不多于800，不多于775，不多于750，不多于700，不多于650，不多于600或不多于500个核苷酸。但是，优选地，本发明的序列包含SEQ ID NO:1的至少500、550、600、 650、700、750、800、900、1000、1100或1200个核苷酸。优选地，本发明的序列源自SEQ ID NO:1的3’端并且包含SEQ ID NO:1的3’ 500、600、650、700、750、800、900、1000、1100或1200个连续核苷酸，或仅缺少SEQ ID NO:1的最多达10、20、30、40、50、60、 70、80、90或100个核苷酸。

本发明的优选启动子包含SEQ ID NO:2的序列或SEQ ID NO:2 的第12-761位核苷酸的序列(SEQ ID NO:2的第1-11位核苷酸不同于SEQ ID NO:1的对应序列；这是克隆的人工产物，其存在并不损害RPE特异性活性，但是对于该活性而言并不是必需的)，通常在 SEQID NO:1的不多于800、不多于850、不多于900、不多于1000、不多于1100或不多于1200个连续核苷酸的序列内。其他优选的启动子包含SEQ ID NO:2的至少750、至少700、至少650、至少600、至少550或至少500个连续核苷酸，优选地在SEQ ID NO:2的3’端的至少500、550、600、650、700或750个核苷酸，或开始于SEQ ID NO:2的第12位核苷酸的至少550、600、650、700或750个核苷酸。

本发明的其他启动子为序列不同于上述序列但是保留RPE特异性启动子活性的启动子。这样的序列与上文定义的SEQ ID NO:1的连续核苷酸的序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性。

变体的序列同一性百分数优选地在SEQ ID NO:1的对应部分的全长上进行测量，或在与变体序列比对的SEQ ID NO:1的500、600、 700、800、900、1000、1100或1200个核苷酸部分上进行测量。

可使用任何适合的算法来计算序列同一性。例如，PILEUP和 BLAST算法可用于计算同一性或比对序列(例如鉴定等同或对应的序列(通常在它们的默认设置上))，例如Altschul S.F.(1993)J Mol Evol 36:290-300；Altschul，S，F et al(1990)J Mol Biol215:403-10中所述。用于进行BLAST分析的软件可通过(美国)国家生物技术信息中心(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)公开获得。该算法包括：首先通过鉴定查询序列中长度W的短字段(word)来确定高得分序列对(HSP)，所述长度W的短字段当与数据库序列中相同长度的字段比对时匹配或满足一些正值阈值得分T。T是指相邻字段得分阈值 (Altschul etal，上文)。这些初始的相邻字段命中作为开始检索的种子，以找到包含它们的HSP。字段命中在沿着每个序列的两个方向上延伸，直到累积的比对得分增加。当出现以下情况时停止在每个方向上的字段命中的延伸：累积比对得分从其最大获取值下降了数量 X；由于一个或多个负评分残基比对的积聚，累积得分达到零或零以下；或到达任一序列的末端。BLAST算法参数W、T和X确定比对的灵敏度和速度。BLAST程序默认使用字长(W)为11，BLOSUM62 评分矩阵(参见Henikoff and Henikoff(1992)Proc.Natl.Acad.Sci. USA 89:10915-10919)比对(B)为50，预期值(E)为10，M＝5，N＝4，以及两条链的比较。

BLAST算法对两条序列之间的相似性进行统计学分析；参见，例如Karlin andAltschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90: 5873-5787。BLAST算法提供的相似性的一种量度是最小和概率 (P(N))，其提供了两个多核苷酸或氨基酸序列之间偶然发生匹配的概率的指示(indication)。例如，如果第一序列与第二序列之间比较的最小和概率小于约1，优选地小于约0.1，更优选地小于约0.01，最优选地小于约0.001，则认为第一序列与第二序列相似。或者， UWGCG程序包提供了BESTFIT程序，其可用于计算同一性(例如以其默认参数使用)(Devereux et al(1984)Nucleic Acids Research 12，387-395)。

本发明的启动子也可包含非天然存在于RPE65启动子区中的另外的核苷酸序列。因此本发明的启动子序列可位于更长序列中的任意位置，只要保留RPE 65特异性启动子活性。另外的序列可在上文定义的序列的5’端或3’端或两端。

本发明的启动子也可与其他调控元件串联使用，所述其他调控元件例如一个或多个其他启动子或增强子或基因座调控区(LCR)。

本发明的启动子可以以RPE特异性的方式在RPE中驱动基因表达。RPE特异性表达可被定义为仅存在于RPE中而不存在于其他细胞型中的表达。RPE特异性表达可被定义为这样的表达，即在RPE 中比在其他细胞型(特别是感光细胞)中高约10倍、20倍、50倍或 100倍或更多倍以上。可通过本领域技术人员已知的任何适当的标准技术来测量在RPE和其他细胞型中的表达。例如，可通过定量实时 PCR来测量RNA表达水平。可通过蛋白质印迹法或免疫组织化学法来测量蛋白质表达。

本发明的启动子可用于驱动RPE中基因的显著增加的表达。显著增加的表达可被定义为，当与由原始RPE65启动子(Bainbridge et al 2008)驱动的表达比较时，RPE中基因的约10倍、20倍、50倍、 100倍、200倍或300倍以上的表达。可通过本领域技术人员已知的任何适当的标准技术来测量在RPE和其他细胞型中的表达。例如，可通过定量实时PCR来测量RNA表达水平。可通过蛋白质印迹法或免疫组织化学法来测量蛋白表达。

本发明的启动子可用于驱动RPE中任何蛋白的表达。本发明的启动子可用于在RPE中驱动通常不在RPE中表达的蛋白(例如GFP) 的表达。

表达构建体

本发明还提供了包含本发明的启动子的表达构建体，所述启动子与待以RPE特异性的方式表达的序列可操作地连接。

表达构建体可被定义为能够驱动来自包含编码序列的多核苷酸序列的蛋白表达的多核苷酸序列。

因此，表达构建体可例如包含RPE65、MERTK、LRAT、TYR 或GRP143编码序列，例如选自SEQ ID NO:3至8的多核苷酸，或保留从选自SEQ ID NO:3至8的序列翻译的蛋白的功能的SEQ ID NO:3至8的变体。

选自SEQ ID NO:3至8的多核苷酸的变体可定义为SEQ ID NO:3至8的序列的任意变体，包括核酸序列中的天然存在的变体。所述变体可定义为与SEQ ID NO:3至8中的任一个具有至少约60％、 70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性，其中从所述变体序列翻译的多肽保留其功能。变体可定义为与SEQ ID NO:3至8中的任一个具有至少约60％、70％、80％、90％、95％、 96％、97％、98％或99％的序列同一性，其中从所述变体序列翻译的多肽具有补救RPE功能的能力。补救RPE功能可定义为补救RPE 功能的至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、 98％、99％或100％。可通过本领域技术人员已知的任何适合的标准技术来分析RPE功能，例如通过视网膜响应的视网膜电图分析。

所述变体可定义为与SEQ ID NO:3至8中的任一个具有至少约 60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性，其中从变体序列翻译产生的多肽与从SEQ ID NO:3至8翻译的多肽相同。

术语“可操作地连接的”是指一种并置(juxtaposition)，其中所述组件所处的关系允许它们以其预期方式发挥功能。与编码序列“可操作地连接的”调控序列以这样的方式连接：即在与调控序列相容的条件下实现编码序列的表达。可将相同或不同多核苷酸的多个拷贝引入到表达构建体中。

表达构建体可包含与SEQ ID NO:4可操作地连接的本发明的启动子。

“密码子优化”涉及改变天然存在的多核苷酸序列以增强在靶生物体(例如人)中的表达的过程。在本发明的一个实施方案中，已将人RPE65基因SEQ ID NO:3优化以产生SEQID NO:4。在SEQ ID NO:4的优化RPE65中，7个罕用密码子(包括串联的一对)被更经常出现的那些和/或经常存在于高表达的人基因中的那些替换。除了1 个隐蔽剪接位点，还去除了4个隐蔽的过早出现(premature)的多聚腺苷酸化位点和1个50个碱基对的同向重复。

载体

本发明提供了包含本发明的启动子和表达构建体的载体。所述载体可以是任何类型，例如可以是质粒载体或微环DNA。

然而，本发明的载体通常为病毒载体。病毒载体可基于单纯疱疹病毒、腺病毒或慢病毒。病毒载体可以是腺相关病毒(AAV)载体或其衍生物。

病毒载体衍生物可以是嵌合的、改组的(shuffled)或衣壳修饰的衍生物。

病毒载体可包含来自AAV的天然来源的血清型、分离株或进化枝(clade)的AAV基因组。

血清型可例如为AAV2、AAV5或AAV8。

基因疗法的功效通常取决于所提供的DNA的充分和高效的递送。该过程通常由病毒载体介导。腺相关病毒(AAV)(细小病毒家族成员)通常用于基因疗法。包含病毒基因的野生型AAV将它们的基因组物质插入到宿主细胞的染色体19中(Kotin，et al.1990)。AAV 单链DNA基因组包含两个反向末端重复(ITR)和两个开放阅读框，包含结构(cap)和包装(rep)基因(Hermonat et al.1984)。

对于治疗目的，除治疗性基因以外唯一需要的顺式序列为ITR。因此AAV病毒是经修饰的：从基因组中去除病毒基因，产生重组AAV (rAAV)。重组AAV仅包含治疗性基因，两种ITR。病毒基因的去除使rAAV不能主动地将其基因组插入到宿主细胞DNA中。相反，rAAV 基因组通过ITR来融合，形成环状、游离的结构，或插入到预先存在的染色体断裂中。对于病毒产生，将现在从rAAV中去除的结构和包装基因以辅助质粒的形式、以反式提供。

AAV是特别具有吸引力的载体，因为它通常是非致病性的；大多数人在其生命过程中已被该病毒感染，但病毒并未产生有害作用 (Erles et al.1999)。尽管如此，在基因疗法中使用rAAV具有若干缺点，尽管这些缺点中的大多数仅适用于rAAV的全身给药。然而，重要的是认识到这些可能的限制，即使它们不与rAAV的眼部给药直接相关。感染可引发以下免疫应答：

因为人群中的大多数对AAV为血清反应阳性，针对rAAV的中和抗体能够损害基因递送(Moskalenko et al.2000；Sun et al.2003)。

全身性递送的rAAV能够引发衣壳蛋白指导的T细胞应答，导致转导细胞的凋亡(Manno et al.2006)。

rAAV载体能够引发补体激活(Zaiss et al.2008)。

因为rAAV递送通常是非特异性的，载体可在肝内累积 (Michelfelder etal.2009)。

眼部组织的免疫赦免(解剖学屏障和免疫调节因子导致的)使眼很大程度上免于以上列出的有害免疫应答(Taylor 2009)。

AAV载体受限于相对小的包装能力(约4.8kb)和转导后表达的缓慢开始(Dong etal.1996)。尽管有这些小缺点，AAV已成为视网膜基因疗法最常用的病毒载体。

大多数载体构建体是基于AAV血清型2(AAV2)。AAV2通过硫酸肝素蛋白聚糖受体结合于靶细胞(Summerford and and Samulski 1998)。AAV基因组同所有AAV血清型的那些基因组一样，能够被包封在许多不同的衣壳蛋白中。AAV2能够被包装在它的天然 AAV2衣壳(AAV2/2)中，或能够与其他衣壳形成假型病毒(例如 AAV1衣壳中的AAV2基因组；AAV5衣壳中的AAV2/1、AAV2基因组；AAV8衣壳中的AAV2/5和AAV2基因组；AAV2/8)。

rAAV通过血清型特异性受体介导的内吞作用来转导细胞。影响 rAAV转基因表达的动力学的主要因素是病毒粒子在内体 (endosome)中脱壳的速率(Thomas et al.2004)。这又取决于包封遗传物质的衣壳的类型(同上)。在脱壳之后，通过经由互补链的从头合成来形成双链分子，从而稳定线性单链rAAV基因组 (Vincent-Lacaze et al.1999)。使用自身互补DNA可通过产生双链转基因DNA而避开这一阶段。Natkunarajah等人发现，与单链AAV2/8相比，自身互补的AAV2/8基因表达开始得更快并且表达量更高(2008)。因此，当与从标准单链构建体的转基因表达相比时，通过避开与第二链合成相关的时间延迟可提高基因表达水平。随后的调查自身互补DNA在其他AAV假型(例如AAV2/5)中的影响的研究已产生了类似的结果(Kong et al.2010；Petersen-Jones et al. 2009)。该技术的一个限制是，因为AAV的包装能力为约4.8kb，自身互补的重组基因组必须为适当大小的(即2.3kb或更小)。

除了改变包装能力，用其他AAV衣壳假型化的AAV2基因组能够改变转基因表达的细胞特异性和动力学。例如，当用AAV4衣壳将 AAV2假型化时，转基因表达被特异性地针对RPE细胞(Le Meur et al.2007)。此外，据报道称AAV2/8比AAV2/2或AAV2/5更有效地转导光感受器(Natkunarajah et al.2008)。

AAV基因组

本发明的载体可包括腺相关病毒(AAV)基因组或其衍生物。

AAV基因组是编码产生AAV病毒粒子所需的功能的多核苷酸序列。这些功能包括操控AAV在宿主细胞中的复制和包装周期的那些，包括使AAV基因组衣壳化至AAV病毒粒子中。天然存在的AAV病毒是复制缺陷型的，并且依赖于提供的反向辅助功能以完成复制和包装周期。因此，在另外去除了AAV rep和cap基因之后，本发明的载体的AAV基因组是复制缺陷型的。

AAV基因组可以是正义或反义的单链形式，或者可以是双链形式。使用双链形式使得可在靶细胞中避开DNA复制步骤，因此能够加速转基因表达。

AAV基因组可以来自AAV的任何天然来源的血清型或分离株或进化枝。如技术人员已知的，可根据多种生物体系对天然存在的AAV 病毒进行分类。

通常按照AAV病毒的血清型来提及它们。血清型对应于AAV的变异亚种，其由于衣壳表面抗原的表达特征而具有不同的反应性，该反应性可用于将所述变异亚种与其他变异亚种区分。通常，具有特定 AAV血清型的病毒无法与特异性针对任何其他AAV血清型的中和抗体有效地交叉反应。AAV血清型包括AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、 AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10和AAV11，以及重组血清型，例如最近从灵长类动物大脑中鉴定的Rec2和Rec3。在本发明的载体中，基因组可来自任何AAV血清型。衣壳也可来自任何 AAV血清型。基因组和衣壳可来自相同血清型或不同血清型。

在本发明的载体中，优选地，所述基因组来自AAV血清型2 (AAV2)、AAV血清型4(AAV4)、AAV血清型5(AAV5)或AAV血清型8(AAV8)。最优选地，所述基因组来自AAV2，但是其他特别适用于本发明的血清型包括AAV4、AAV5和AAV8，其可高效地转导眼内组织例如视网膜色素上皮。优选地，所述衣壳来自AAV5或AAV8。

AAV血清型的综述可参见Choi等人(Curr Gene Ther.2005；5(3)； 299-310)和Wu等人(Molecular Therapy.2006；14(3)，316-327)。用于本发明的AAV基因组序列或AAV基因组元件(包括ITR序列、rep 或cap基因)可来自以下登录号的AAV全基因组序列：腺相关病毒1NC_002077、AF063497；腺相关病毒2NC_001401；腺相关病毒3 NC_001729；腺相关病毒3BNC_001863；腺相关病毒4NC_001829；腺相关病毒5Y18065、AF085716；腺相关病毒6NC_001862；鸟类 AAV ATCC VR-865AY186198、AY629583、NC_004828；鸟类AAV 菌株DA-1NC_006263、AY629583；牛AAV NC_005889、AY388617。

也可以按照进化枝或克隆来提及AAV病毒。这是指天然来源的 AAV病毒的系统发生关系，并且通常是指可追溯到共同祖先的AAV 病毒的系统发生组，并且包括其全部后代。另外，可按照具体的分离株(即天然存在的具体AAV病毒的遗传分离株)来提及AAV病毒。术语遗传分离株描述了经历了与其他天然存在的AAV病毒的有限遗传混合的AAV病毒群，从而在遗传水平上限定了可识别的不同群体。

可用于本发明的AAV的进化枝和分离株的实例包括：

进化枝A：AAV1 NC_002077、AF063497、AAV6 NC_001862、 Hu.48 AY530611、Hu 43AY530606、Hu 44 AY530607、Hu 46 AY530609；

进化枝B:Hu.19 AY530584、Hu.20 AY530586、Hu 23 AY530589、Hu22 AY530588、Hu24 AY530590、Hu21 AY530587、 Hu27 AY530592、Hu28 AY530593、Hu 29 AY530594、Hu63AY530624、Hu64 AY530625、Hu13 AY530578、Hu56 AY530618、 Hu57 AY530619、Hu49AY530612、Hu58 AY530620、Hu34 AY530598、 Hu35 AY530599、AAV2 NC_001401、Hu45AY530608、Hu47 AY530610、Hu51 AY530613、Hu52 AY530614、Hu T41 AY695378、 Hu S17AY695376、Hu T88 AY695375、Hu T71 AY695374、Hu T70 AY695373、Hu T40 AY695372、HuT32 AY695371、Hu T17 AY695370、Hu LG15 AY695377；

进化枝C:Hu9 AY530629、Hu10 AY530576、Hu11 AY530577、 Hu53 AY530615、Hu55AY530617、Hu54 AY530616、Hu7 AY530628、 Hu18 AY530583、Hu15 AY530580、Hu16AY530581、Hu25 AY530591、 Hu60 AY530622、Ch5 AY243021、Hu3 AY530595、Hu1 AY530575、Hu4 AY530602 Hu2、AY530585、Hu61 AY530623；

进化枝D:Rh62 AY530573、Rh48 AY530561、Rh54 AY530567、 Rh55 AY530568、Cy2AY243020、AAV7 AF513851、Rh35 AY243000、 Rh37 AY242998、Rh36 AY242999、Cy6AY243016、Cy4 AY243018、 Cy3 AY243019、Cy5 AY243017、Rh13 AY243013；

进化枝E:Rh38 AY530558、Hu66 AY530626、Hu42 AY530605、 Hu67 AY530627、Hu40AY530603、Hu41 AY530604、Hu37 AY530600、 Rh40 AY530559、Rh2 AY243007、Bb1AY243023、Bb2 AY243022、 Rh10 AY243015、Hu17 AY530582、Hu6 AY530621、Rh25AY530557、 Pi2 AY530554、Pi1 AY530553、Pi3 AY530555、Rh57 AY530569、Rh50 AY530563、Rh49 AY530562、Hu39 AY530601、Rh58 AY530570、 Rh61 AY530572、Rh52 AY530565、Rh53AY530566、Rh51 AY530564、 Rh64 AY530574、Rh43 AY530560、AAV8 AF513852、Rh8AY242997、 Rh1 AY530556；

进化枝F:Hu14(AAV9)AY530579、Hu31 AY530596、Hu32 AY530597、克隆分离株AAV5Y18065、AF085716、AAV 3 NC_001729、AAV 3B NC_001863、AAV4 NC_001829、Rh34AY243001、Rh33 AY243002、Rh32 AY243003/

技术人员能够根据他们的公知常识选择适用于本发明的AAV的血清型、进化枝、克隆或分离株。

然而应理解，本发明还包括使用可能尚未被鉴定或表征的其他血清型的AAV基因组。AAV血清型决定了AAV病毒感染的组织特异性(或向性)。因此，根据本发明，用于给予至患者的AAV病毒的优选的AAV血清型为对RPE内靶细胞的感染具有天然向性或高感染效率的那些。

通常，AAV的天然来源的血清型或分离株或进化枝的AAV基因组包含至少一种反向末端重复序列(ITR)。本发明的载体通常包含两个ITR，优选在基因组的每一端一个。ITR序列以顺式发挥作用以提供复制的功能性起点，并且允许载体整合至细胞基因和从细胞基因组切除。优选的ITR序列是AAV2及其变体的那些。AAV基因组通常包含包装基因，例如rep和/或cap基因，其编码AAV病毒粒子的包装功能。Rep基因编码蛋白Rep78、Rep68、Rep52和Rep40或其变体中的一种或多种。Cap基因编码一种或多种衣壳蛋白，例如VP1、 VP2和VP3或其变体。这些蛋白组成AAV病毒粒子的衣壳。衣壳变体如下文所讨论。

优选地，为了对患者进行给药的目的而使AAV基因组衍生化。这样的衍生化在本领域中是标准的，并且本发明包括使用AAV基因组的任何已知的衍生物和可通过应用本领域已知的技术产生的衍生物。AAV基因组的衍生化和AAV衣壳的衍生化在上文引用的Couraand Nardi(Virology Journal，2007，4:99)中以及Choi et al和Wu et al 中综述。

AAV基因组的衍生物包括允许来自本发明的载体的Rep-1转基因的体内表达的AAV基因组的任何截短形式或修饰形式。通常，可显著截短AAV基因组以包含最小病毒序列但仍保留上述功能。这优选地是为了安全性原因以降低载体与野生型病毒重组的风险，以及避免由靶细胞中存在的病毒基因蛋白引发细胞免疫应答。

通常，衍生物将包含至少一个反向末端重复序列(ITR)，优选多于一个ITR，例如两个ITR或多个。一个或多个ITR可源自具有不同血清型的AAV基因组，或可以为嵌合或突变ITR。优选的突变 ITR具有trs(末端分解位点(terminal resolution site))的缺失。该缺失使基因组持续复制以产生包含编码序列和互补序列的单链基因组(即自身互补的AAV基因组)。这使得绕过靶细胞中的DNA复制，因此使转基因表达加快。

一个或多个ITR优选地位于包含本发明的启动子和转基因的表达构建体盒的侧翼。优选包含一个或多个ITR以促进本发明的载体包装到病毒粒子中。在优选的实施方案中，ITR元件是衍生物中唯一从天然AAV基因组保留的序列。因此，衍生物将优选地不包含天然基因组的rep和/或cap基因以及天然基因组的任何其他序列。由于上述原因，这是优选的，以及为了降低载体被整合到宿主细胞基因组中的可能性。另外，减小AAV基因组的大小使得能够增加将除转基因以外的其他序列元件(例如调控元件)掺入载体中的灵活性。

对于AAV2基因组，因此在本发明的衍生物中可去除以下部分：一个反向末端重复(ITR)序列，所述复制(rep)基因和衣壳(cap) 基因。然而，在一些实施方案(包括体外实施方案)中，衍生物可另外包含一种或多种rep和/或cap基因，或AAV基因组的其他病毒序列。

衍生物可以是一种或多种天然存在的AAV病毒的嵌合、改组或衣壳修饰的衍生物。本发明包括在相同载体中提供来自不同的AAV 血清型、进化枝、克隆或分离株的衣壳蛋白序列。本发明包括将一种血清型的基因组包装到另一种血清型的衣壳中，即假型化。

通常选择嵌合、改组或衣壳修饰的衍生物以提供病毒载体的一种或多种所需功能。因此，与包含天然存在的AAV基因组(例如AAV2 的基因组)的AAV病毒载体相比，这些衍生物可表现出增加的基因递送效率、降低的免疫原性(体液或细胞免疫原性)、改变的向性范围和/或改善的针对特定细胞型的靶向。增加的基因递送效率可受到以下的影响：细胞表面的改善的受体或共受体结合、改善的内化作用、改善的细胞内和进入细胞核的运输、改善的病毒粒子的脱壳，以及改善的单链基因组向双链形式的转化。增加的效率也可涉及改变的向性范围或特定细胞群的靶向，以使载体剂量不会因给予到不需要载体的组织而被稀释。

嵌合的衣壳蛋白包括通过天然存在的AAV血清型的两种或多种衣壳编码序列之间的重组而产生的那些。这可例如通过标记补救法来进行，在该方法中，将一种血清型的非传染性衣壳序列与不同血清型的衣壳序列共转染，并且使用定向选择来选择具有所需特性的衣壳序列。不同血清型的衣壳序列可通过细胞内的同源重组来改变以产生新的嵌合衣壳蛋白。

嵌合衣壳蛋白也包括通过以下改造而产生的那些：改造衣壳蛋白序列以在两种或多种衣壳蛋白之间(例如不同血清型的两种或多种衣壳蛋白之间)转移特定的衣壳蛋白结构域、表面环或特定的氨基酸残基。

改组或嵌合衣壳蛋白也可通过DNA改组或通过易错PCR来产生。杂合AAV衣壳基因可通过以下方法产生：使相关AAV基因(例如编码多个不同血清型的衣壳蛋白的那些)的序列随机片段化，随后在自身引发的聚合酶反应中重组所述片段，这也可导致序列同源区中的交换。可对通过改组若干血清型的衣壳基因的方式产生的杂合 AAV基因的文库进行筛选以鉴定具有所需功能的病毒克隆。类似地，易错PCR可用于随机突变AAV衣壳基因以产生不同的变体文库，该文库之后可用于选择所需特性。

也可对衣壳基因序列进行遗传修饰以引入相对于天然野生型序列的特定缺失、置换或插入。特别地，可通过将非相关的蛋白或肽的序列插入到衣壳编码序列的开放阅读框或衣壳编码序列的N端和/或 C端来修饰衣壳基因。

非相关蛋白或肽可有利地为作为特定细胞型的配体发挥作用的非相关蛋白或肽，从而赋予改善的对靶细胞的结合或改善的载体靶向特定细胞群的特异性。

非相关蛋白也可以为有助于纯化作为产生过程一部分的病毒粒子的蛋白(即表位或亲和标签)。通常选择插入位点以不干扰病毒粒子的其他功能，例如内化作用，病毒粒子的运输。技术人员能够根据他们的公知常识来鉴定适合的插入位点。特定的位点在上文引用的 Choi et al中公开。

本发明还包括提供了与天然AAV基因组不同的次序和构型的 AAV基因组的序列。本发明还包括用来自另一种病毒的序列或由来自多于一种病毒的序列组成的嵌合基因来替换一种或多种AAV序列或基因。所述嵌合基因可由来自不同病毒物种的两种或多种相关病毒蛋白的序列组成。

本发明的载体为病毒载体形式，其包括本发明的启动子和表达构建体。

为了避免产生疑惑，本发明还提供了包含本发明的载体的AAV 病毒粒子。本发明的AAV粒子包括跨衣壳化(transcapsidated)形式，其中具有一种血清型的ITR的AAV基因组或衍生物被包装到不同血清型的衣壳中。本发明的AAV粒子也包括嵌合形式(masaicform)，其中来自两种或多种不同血清型的未经修饰的衣壳蛋白的混合物组成病毒包膜。AAV粒子也包括携带被吸附到衣壳表面的配体的化学修饰形式。例如，这样的配体可包括靶向特定细胞表面受体的抗体。

本发明还提供了包含本发明的载体或AAV病毒粒子的宿主细胞。

载体制备

本发明的载体可通过本领域已知的提供用于基因疗法的载体的标准方法来制备。因此，得到确认的公共结构域(public domain)转染、包装和纯化方法可用于制备适合的载体制品。

如上文所讨论，除本发明的启动子或其变体以外，本发明的载体还可包含天然存在的AAV病毒的全基因组。然而，通常将会使用衍生的基因组，例如具有至少一个反向末端重复序列(ITR)，但是可缺少任何AAV基因(例如rep或cap)的衍生物。

在这类实施方案中，为了将衍生的基因组组装到AAV病毒粒子中，在宿主细胞中，将会提供另外的遗传构建体(其提供AAV和/ 或辅助病毒功能)以及衍生的基因组。这些另外的构建体通常包含编码结构AAV衣壳蛋白(即cap、VP1、VP2、VP3)的基因和编码AAV 生命周期所需的其他功能的基因(例如rep)。在另外的构建体上提供的结构衣壳蛋白的选择将决定所包装的病毒载体的血清型。

用于本发明的特别优选的包装病毒载体包括与AAV5或AAV8 衣壳蛋白组合的AAV2的衍生基因组。

如以上提及的，AAV病毒是无法复制的，因此通常还在一个或多个另外的构建体上提供辅助病毒功能(优选腺病毒辅助功能)以允许AAV复制。

可将全部上述另外的构建体提供为宿主细胞中的质粒或其他游离型元件，或者可将一个或多个构建体整合到宿主细胞的基因组中。

本发明的启动子序列具有补救RPE功能丧失的能力，其可例如通过RPE65基因中的突变而发生。“补救”通常意指视网膜营养不良表型发展的任何改善或减缓，例如在RPE中恢复RPE65蛋白的存在，改善ERG活性或减缓ERG活性丧失，提高视网膜敏感度或减缓/阻止视网膜敏感性的逐渐丧失，减缓或阻止感光细胞的丧失，改善视力或减缓/阻止视力丧失。

也可使用基于实施例中的那些的技术来测试本发明的启动子的特性。特别地，可将本发明的序列组装到本发明的载体中并递送到 RPE65缺陷的测试动物(例如小鼠)的视网膜，观察效果并与对照进行比较。优选地，对照为相同动物的另一只眼，该眼未经处理或用对照载体(例如与本发明的序列相比包含报告基因的载体)进行处理。然后可使用对光的视网膜响应的视网膜电图描记术分析来确认用本发明的载体处理的眼中的感光细胞比未经处理或用对照载体处理的眼中的感光细胞对光更敏感。例如，与未经处理或用对照处理的眼对光的敏感度相比，经处理的眼对光的敏感度高至少1.1、1.2、1.5、2、 5、10、20、50、100、200、500或1000倍。

治疗方法和医学用途

本发明的启动子可用于治疗视网膜营养不良，特别是LCA。这提供了可用于治疗、阻止、缓和或预防疾病的退行性过程的方法。

本发明因此提供了药物组合物，其包括本发明的载体和可药用载体。

本发明还提供了用于预防或治疗视网膜营养不良的方法的载体。

本发明还提供了本发明的载体用于制备治疗或预防视网膜营养不良的药剂的用途。

本发明还提供了在需要其的患者中治疗或预防视网膜营养不良的方法，包括将治疗有效量的本发明的载体给予至患者。

本发明还提供了在需要其的患者中治疗或预防视网膜营养不良的方法，其中所述视网膜营养不良是利伯先天性黑矇(LCA)、年龄相关性黄斑变性(AMD)、眼皮肤病I型、Nettleship-Falls型眼白化病或MERTK缺陷。

根据本发明，优选使用RPE65的一般治疗。更特别地，优选用表达RPE65或LRAT编码序列的载体治疗LCA，用表达基因(其表达的蛋白抑制血管生长或者减少或预防RPE细胞凋亡)的载体来治疗AMD，用酪氨酸酶或GRP143编码序列来治疗眼白化病，以及用 MERTK编码序列来治疗MERTK缺陷。

通常，优选本发明的载体的直接视网膜递送、视网膜下递送或玻璃体内递送，通常通过注射。因此，优选递送到视网膜、视网膜下空间或玻璃体内空间。

本发明因此还提供了在需要其的患者中治疗或预防视网膜营养不良的方法，包括通过直接视网膜注射、视网膜下注射或玻璃体内注射给予患者治疗有效量的本发明的载体。因此，从而在所述患者中治疗或预防视网膜营养不良。

在相关方面，本发明提供了本发明的载体用于治疗或预防视网膜营养不良的方法的用途，所述方法通过直接视网膜注射、视网膜下注射或玻璃体内注射将所述载体给予患者。此外，本发明提供了本发明的载体用于制备通过直接视网膜注射、视网膜下注射或玻璃体内注射来治疗或预防视网膜营养不良的药剂的用途。

本发明还提供了所使用的载体，其中将所述载体直接给予到视网膜、视网膜下空间或玻璃体内空间。

在全部这些实施方案中，可给予本发明的载体以预防视网膜营养不良的一种或多种症状的出现。患者可以是无症状的。受试者可具有易患所述疾病的倾向。所述方法或用途可包括鉴定受试者是否处于发展视网膜营养不良的风险或是否患有视网膜营养不良的步骤。将预防有效量的载体给予所述受试者。预防有效量是预防疾病的一种或多种症状出现的量。

或者，一旦受试者中已出现疾病症状就给予所述载体，即治疗疾病的存在的症状。将治疗有效量的拮抗剂给予所述受试者。治疗有效量是有效缓解疾病的一种或多种症状的量。

所述受试者可以为男性或女性。所述受试者优选地被鉴定为处于患疾病的风险中或患有疾病。

给予载体通常是通过直接视网膜注射或视网膜下注射。这包括直接递送到RPE细胞。所进行的递送通常是直接到患有视网膜营养不良的患者的变性的视网膜或视网膜下。所述载体可转导上述靶细胞而不进入任何其他细胞群。也可使用玻璃体内注射以递送本发明的载体。所述递送可不是视网膜下的或可不通过视网膜下注射。所述递送可不是经玻璃体的。

本发明的载体的剂量可根据多个参数来确定，特别是根据待治疗的患者的年龄、体重和病症；给药途径；和所需的方案。同样，医师能够确定任何具体患者所需的给药途径和剂量。

典型的单一剂量为10¹⁰至10¹²个基因组粒子，这取决于需要转导的剩余的视网膜组织的量。基因组粒子在本文中被定义为包含单链 DNA分子的AAV衣壳，所述单链DNA分子可用序列特异性方法(例如实时PCR)来定量。可将该剂量提供为单一剂量，但是对于另一侧眼或在载体可能由于任何原因(例如手术并发症)没有靶向到视网膜的正确区域的情况下可重复提供该剂量。所述治疗优选地为对每一只眼的单一永久性治疗，但是可以考虑例如在未来的年份中和/或使用不同的AAV血清型来重复注射。

宿主细胞

任何适合的宿主细胞均可用于产生本发明的载体。通常，这样的细胞为被转染的哺乳动物细胞，但是也可使用其他细胞类型，例如昆虫细胞。就哺乳动物产生系统而言，HEK293和HEK293T对于AAV 载体是优选的。也可使用BHK或CHO细胞。

药物组合物和剂量

可将本发明的载体配制成药物组合物。除载体以外，这些组合物还可包括可药用赋形剂、载体、缓冲剂、稳定剂或本领域技术人员公知的其他材料。这样的材料应该是无毒的并且不应当干扰活性成分的功效。载体或其他材料的准确性质可由技术人员根据给药途径(即在本文中，直接视网膜注射、视网膜下注射或玻璃体内注射)来确定。

药物组合物通常为液体形式。液体药物组合物通常包括液体载体，例如水、石油、动物油或植物油、矿物油或合成油。可包括生理盐水溶液、氯化镁、右旋糖(dextrose)或其他糖类溶液，或二醇类 (例如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇)。在一些情况下，可使用表面活性剂，例如普流尼克酸(pluronic acid)(PF68)0.001％。

对于在患病位点的注射，活性成分为水溶液形式，其没有热原并且具有适当的pH、等渗性和稳定性。本领域技术人员完全能够使用例如等渗载体(例如氯化钠注射液、林格注射液、乳酸林格注射液、哈特曼溶液)制备适当的溶液。根据需要可包括防腐剂、稳定剂、缓冲剂、抗氧化剂和/或其他添加剂。

为了延缓释放，载体可被包含于配制用于缓释的药物组合物中例如在根据本领域已知的方法的从生物相容性聚合物形成的微胶囊中或脂质体载体体系中。

在负责给予所述组合物的医学从业者的正常能力范围内能够确定剂量和剂量方案。

组合疗法

启动子、表达构建体、载体和/或药物组合物可与任何其他用于治疗或预防视网膜营养不良的疗法组合使用。

试剂盒

可将所述启动子、表达构建体、载体和/或药物组合物包装到试剂盒中。

实施例

材料和方法

质粒构建

为了产生RPE65启动子的片段，将“全长”人RPE65启动子(bp 1556至+23–Nicolletti et al.1998，Le Meur et al.2007)克隆到亲本质粒pD10.CMV.eGFP中，产生pD10/RPE65prom.eGFP质粒构建体。使用

鉴定限制性位点。选择三个限制性修饰，包括： NsiI、AccI和BglII。在适当的温度下，在适当的缓冲剂中消化 pD10/RPE65prom.eGFP至少1小时。然后使产物在0.8％凝胶上运行 40-60分钟，使用

离心柱凝胶提取试剂盒(NBS Biological Ltd， Cambridgeshire，UK)提取正确的条带并进行连接(如果需要，在产生平端之后)。将连接产物转化到大肠杆菌中(感受态细胞-Bioline)，在Soc培养基(Invitrogen)中孵育30-60分钟，然后铺板于LB/琼脂氨苄青霉素平板上，在37℃下过夜孵育。挑选克隆并使其在12.5％LB 培养基(1/1000氨苄青霉素)中过夜生长。使用GenElute^TM质粒小量制备试剂盒(Sigma Aldrich)从这些细菌制备物中提取DNA。将 DNA至少消化两次以确定正确的质粒构建体。用于产生新质粒构建体的酶如下所示：用于“NA-RPE65.eGFP”的Nsi1和Acc1，用于“BglII-RPE65.eGFP”的BglII。

对于优化的基因构建体研究，通过将密码子优化、内含子优化和 Kozak优化的人RPE65序列从pUC57质粒(由GenScript制备)克隆到含CMV启动子的pD10质粒pD10.CMV.eGFP(Sünkel-Laing and Buch，未发表的研究)中，来产生pD10/CMV.SV40.kozak.RPE65opti。然后将“全长”RPE65启动子克隆到携带优化构建体的质粒中。

密码子优化

通过GenScript’s专用OptimumGene^TM密码子优化工具来实现密码子优化。

病毒产生方案AAV2/8

使用之前所述的293T细胞的三次转染法产生重组AAV2血清型 8病毒(Gao etel.2002)。在10分钟孵育之后，用包括比例为1:1:3 的目的质粒:病毒衣壳质粒:辅助质粒DNA、聚乙烯亚胺(PEI- Polysciences Inc.，Eppelheim，Germany)和DMEM的混合物转染145cm²的293T细胞板(每个病毒批次20个平板)。将经转染的细胞置于培养床上(bedded)24小时。转染后48小时，收集细胞并通过离心浓缩，重悬于TD缓冲液(140mM NaCl、5mM KCl、0.7mM K₂HPO₄、3.5mM MgCl₂、25mM Tris Base[pH＝7.5])中。之后将该溶液通过3-4次冻融循环裂解，然后进行全能核酸酶(Benzonase， Sigma Aldrich，Dorset，UK)处理，然后通过连续的离心和注射器过滤步骤除去细胞碎片。

通过离子交换色谱法(使用基于Davidoff et al.2004的方法)进行纯化。将洗脱液在Vivaspin 4 10kDa浓缩管(Sartorius Stedim Biotech，Fisher Scientific，Loughborough，UK)中浓缩，在PBS-MK 中清洗，然后浓缩至100-150μl体积，然后等分以于-80℃(长期) 和+4℃(短期)下保存。

293T的转染

将150cm³的HEK-293T细胞平板分成16孔平板。每个孔用0.5 μg所需的质粒DNA和2μg PEI转染，放置于培养床上约60小时。然后使用注射器柱塞(syringe plunger)收集细胞，之后在14,000rpm 下离心至沉淀。

免疫组织化学

准备眼以用于通过角膜穿刺进行固定，然后将其浸没于1％多聚甲醛(PFA，pH7.4，使用微量体积的0.07M二甲胂酸钠-HCl)。将眼在室温下固定最多达1小时，然后从溶液中移出，完全浸没于最适切割温度(OCT)包埋基质中，眼的前部-后部悬浮于包埋管内的水平-垂直轴。然后将这些冷冻并贮存于-20℃，直到需要进行切片。

使用

OTF5000低温恒温器(Bright Instrument Co Ltd，Cambridgeshire，UK)来制备13.5微米冠状切片，从而使得能够看见视网膜的上面和下面。在多聚赖氨酸包被的显微镜载玻片上切片之后，立即收集切片并使其在室温下空气干燥。将切片贮存于-20℃或制备以在荧光封固剂(DAKO)中封固。将切片用作为封固剂附加物的DAPI(溶于封固剂中的0.1％DAPI)染色，或通过浸没于溶于TBS 中的0.2％DAPI中而染色，并在封固前用PBS清洗。将封固的切片贮存于4℃。

使用Zeiss AxioObserver Z1(Carl Zeiss Inc，

Germany) 来使封固的切片成像。使用适合的荧光滤光器，在2.5x、10x和20x 放大率下拍摄照片。GFP图像在10x和20x放大率下在200ms和5000 ms曝光，在2.5x放大率下在9000ms曝光。

组织解剖和RNA/蛋白质提取

通过颈椎脱位术处死小鼠。通过在视神经处拉伸来移出眼，然后在PBS中清洗。通过剥离小心地取出视网膜和RPE-脉络膜，并立即贮存于冰上的干燥收集管中，贮存时间不多于1小时。使用

All-Prep DNA/RNA/蛋白试剂盒处理样品。注意：使用研杵和研钵技术来进行均质化步骤。

RNA提取和定量实时PCR

将RNA在40μl无RNA酶的H₂O中洗脱，并立即贮存于冰上或 -20℃。使用

ND-1000分光光度计定量RNA浓度。使用

逆转录试剂盒，将最多达1μg的RNA(在每个研究中，使用的RNA的量相当于在给定的用于比较的样品组中包含最低量的RNA的样品)加工成cDNA。将1μl cDNA和29μl体积的 RT-PCR主混合物加样到每个孔中，所述主混合物包含50％2x

Sensimix、溶于dH₂O中的1.67％引物混合物(正向引物和反向引物)。将每个样品一式三份地加样。还将包含各目的基因的质粒构建体的标准对数梯度平行加样以进行绝对定量。使用标准条件运行PCR。所使用的引物包括：

RPE65:5’-AATTACCAAATATTGTAAACGGTTCCATC-3’(SEQ ID NO:9)，

5’-TGTTTGAAACTGTGGAGGAACTGTC-3’(SEQ ID NO:10)，

eGFP:5’-GAAGCGCGATCACATGGT-3’(SEQ ID NO:11)和

5’-CCATGCCGAGAGTGATCC-3’(SEQ ID NO:12)；

β-肌动蛋白:5’-GTGGTACGACCAGAGGCATAC-3’(SEQ ID NO:13) 和5’-AAGGCCAACCGTGAAAAGAT-3’(SEQ ID NO:14)。

在所有相关表达实验中，将β-肌动蛋白用作加样对照。使用统计软件(GraphPad，PRISM)，使用单因素ANOVA来分析数据。

蛋白质提取和蛋白质印迹法

使用

All-Prep DNA/RNA/蛋白试剂盒来获得蛋白提取物，但是将该提取物重悬于100μl溶于PBS中的5％SDS(包含蛋白酶抑制剂混合物(cocktail)(SigmaAldrich，Gillingham，UK))中并在95℃下进行热处理，然后贮存于-20℃。在SDS-PAGE之前，使用

蛋白测定法(DC蛋白测定试剂盒，Bio-Rad，Hemel Hempstead UK)来定量蛋白浓度。用稀释剂使蛋白样品达到最高20 μl，用4μl加样染料在95℃下热休克，然后加样并在120V下在浸于 1x Tank缓冲液(1.64％Tris碱、7.82％甘氨酸、0.54％SDS)的凝胶上运行SDS-PAGE约70分钟。对于RPE65和GFP印迹，分别使用 9％和12％的凝胶。然后将经电泳的凝胶半干燥转移至PVDF膜 (Millipore Watford UK)上，之后将膜在5％脱脂乳/溶于于PBS中的1％BSA+0.05％Tween中封闭1小时。之后将膜在一级抗体 (α-GFP或α-RPE65)中封闭，用PBS+0.05％Tween清洗，然后用二级(HRP缀合的)抗体(Pierce Immunopure山羊抗兔和山羊抗小鼠IgG，Perbio Science UK Ltd.，Northumberland UK)的 1:5,000-10,000稀释物封闭。之后将经清洗的印迹浸没于ECL发光试剂(ECL plus GE Healthcare UKLtd.Amersham，UK)中，之后使用化学发光检测(

LAS-1000发光图像分析仪)来成像。使用

软件进行密度分析，并使用非参数成对T检验进行统计学分析。

视网膜下注射

对出生后至少4周的Rd12(Pang et al.2005)和C57BL/6小鼠进行视网膜下注射。在整个眼手术中使用手术显微镜。将1.5cm、34- 号皮下针头(Hamilton，Switzerland)沿切向插入穿过巩膜，产生自封闭的巩膜通道创伤(Tan et al.2009)。将1.5-2.0μl病毒悬浮液注射到视网膜下空间的上半球和下半球内，均产生检眼镜检查可见的大疱性视网膜脱离。将C57BL/6用于启动子研究，并用1×10¹²病毒滴度注射。将Rd12小鼠用于RPE65补救研究。在小鼠的指定的眼中注射RPE65病毒构建体，在对侧的眼中注射RPE65opti病毒构建体。“低剂量”(LD)实验的滴度为1×10⁹vg/mL和1×10¹⁰vg/mL(病毒基因组/毫升)(用每种滴度注射两只小鼠)，全部其他补救实验的滴度为1×10¹¹vg/mL。对所有小鼠都进行两侧注射。

体内治疗功效

为了比较经优化的载体(AAV2/5-经优化的RPE65)和原始载体 (AAV2/2-hRPE65)的治疗功效，用滴度范围从3x10⁷至1x10⁹vg/mL (经优化的构建体)和从1x10¹⁰至1x10¹²vg/mL(原始构建体)的 AAV2/2-hRPE65或AAV2/5-经优化的RPE65来注射Rpe65^-/-小鼠。

通过视网膜电图描记术来评估视网膜功能的恢复。图3示出了在处理后4周，当两种载体都已达到最高表达时的平均暗视b波振幅(平均值±SD)。来自用经优化的载体处理的眼的b波振幅等于或高于来自用300倍更高剂量的原始载体注射的眼的振幅。这证明新载体的效果是原始载体的至少300倍。该评估并未考虑到密码子优化的作用，其并未在小鼠中导致更有效的蛋白翻译。

实施例1：驱动RPE表达的启动子的优化

如上文中“质粒构建体”部分所述，用NsiI和AccI限制性酶来消化“全长”RPE65启动子以产生“NA”RPE65启动子片段。该片段如SEQ ID NO:2所示。还用BglII限制性酶来消化“全长”RPE65 启动子以产生“Bgl”启动子片段。将这些启动子构型(在RPE65转录起始位点附近的基因组DNA片段)与“全长”启动子一起测试以测定相对表达水平和表达的组织特异性。使用驱动GFP表达以有助于转基因表达的定位的启动子进行评估(图1)。图1A示出了对RPE- 脉络膜提取物中的GFP mRNA表达的实时PCR分析，所述GFP mRNA表达来自包含全长RPE65启动子“RPE65”或“NA”片段或“Bgl”片段的AAV2/8载体。RPE65启动子的“NA”片段是有效的，其表达水平比原始RPE65启动子的表达水平高约20倍(图1A)。“Bgl”片段没有作用。对于全部数值，p<0.05。

图1B示出了代表性的GFP表达的蛋白质印迹。在泳道2中，“NA”样品被稀释为1/20。

图1C示出了用包含驱动eGFP的不同启动子的AAV2/8载体注射的眼的薄冷冻切片荧光成像。左图示出了在20x放大率下的eGFP 表达，中图示出了使用DAPI的共染色，右图示出了在2.5x放大率下的eGFP表达。荧光图像表明，优化的hRPE65启动子比正常的 hRPE65启动子更有效，同时在RPE细胞中驱动表达方面更严格，如RPE中的eGFP强度和从光感受器缺失所证明的。

实施例2：RPE65cDNA的优化

为了试图提高人RPE65mRNA的转录后加工(RNA稳定性、核输出和翻译)的功效，对RPE65cDNA的编码序列进行多种修饰。这产生了如SEQ ID NO:4所示的序列。将Kozak序列优化为“CCACCATG”(参见SEQ ID NO:4的第1至8位核苷酸)，以试图实现对起始密码子的更好的识别和随后更有效的翻译。人RPE65基因的天然Kozak序列与所得的优化共有序列的区别相当大。

此外，对RPE65的编码序列进行密码子优化以试图提高密码子使用偏好和CG含量并且去除mRNA中任何隐藏的加工位点和可能的茎环结构。在对RPE65编码序列的优化过程中，替换了7个罕用密码子(包括串联的一对)、1个隐藏的剪接位点、4个隐藏的过早出现的多聚腺苷酸化位点和1个50个碱基对的同向重复。这些改变显著提高了密码子使用频率。在携带泛在CMV启动子的AAV2/8表达质粒的转染之后，(人)293T细胞中在体外共同测试这些改变以确定它们对RPE65蛋白产生水平的影响(图2)。图2A示出了RPE65 表达的蛋白质印迹。图2B示出了对蛋白质印迹的定量。在RPE65 编码序列的优化之后，293T细胞中的体外蛋白产生表明，与野生型编码序列(AAV2/8.RPE65)相比，由携带优化的编码序列的载体(AAV2/8.Optim)产生的RPE65蛋白的量增加7倍(p＜0.05)。

实施例3：治疗功效的体内评估

将由导致最高表达水平的启动子(如SEQ ID NO：2所示的“NA”片段)和如SEQ IDNO：4所示的优化的RPE65编码序列组成的构建体包装到AAV5和AAV8衣壳中，并测试其在RPE65缺陷小鼠中体内补救视网膜功能的能力。将补救功效与Bainbridge et al(2008)中之前使用的临床级载体“AAV2-hRPE65”进行比较。该载体包含人 RPE65编码序列，其由人RPE65启动子的1400bp片段驱动。由于之前的载体已在动物中导致补救，给予更低载体剂量以允许在限制性情况下比较治疗功效(图3)。将b波振幅用作补救的量度。出乎意料的是，来自用优化的载体处理的眼的b波振幅等于或高于来自用 300倍更高剂量的原始载体注射的眼的振幅。这表明新载体的效果是原始载体的至少300倍。

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序列信息

SEQ ID NO：1中的加框序列示出了在SEQ ID NO：2中被去除的SEQ ID NO：1的核苷酸和它们的位置。SEQ ID NO：2中的加框序列示出了所添加的替代从SEQ ID NO：1所示的框中被去除的那些核苷酸的核苷酸。SEQ ID NO：1和2中的加粗且加下划线的文本示出了 SEQID NO：2的开始处的相对位置。

SEQ ID NO：1RPE65启动子区Genbank No.NG_008472.1

SEQ ID NO：2优化的RPE65启动子片段

SEQ ID NO：3人RPE65的cDNA Genbank No.NM_000329.2

ATGTCTATCCAGGTTGAGCATCCTGCTGGTGGTTACAAGAAACTGTTTGAAACTGTGGAGGAACTGTCCTCGCCG CTCACAGCTCATGTAACAGGCAGGATCCCCCTCTGGCTCACCGGCAGTCTCCTTCGATGTGGGCCAGGACTCTTT GAAGTTGGATCTGAGCCATTTTACCACCTGTTTGATGGGCAAGCCCTCCTGCACAAGTTTGACTTTAAAGAAGGA CATGTCACATACCACAGAAGGTTCATCCGCACTGATGCTTACGTACGGGCAATGACTGAGAAAAGGATCGTCATA ACAGAATTTGGCACCTGTGCTTTCCCAGATCCCTGCAAGAATATATTTTCCAGGTTTTTTTCTTACTTTCGAGGA GTAGAGGTTACTGACAATGCCCTTGTTAATGTCTACCCAGTGGGGGAAGATTACTACGCTTGCACAGAGACCAAC TTTATTACAAAGATTAATCCAGAGACCTTGGAGACAATTAAGCAGGTTGATCTTTGCAACTATGTCTCTGTCAAT GGGGCCACTGCTCACCCCCACATTGAAAATGATGGAACCGTTTACAATATTGGTAATTGCTTTGGAAAAAATTTT TCAATTGCCTACAACATTGTAAAGATCCCACCACTGCAAGCAGACAAGGAAGATCCAATAAGCAAGTCAGAGATC GTTGTACAATTCCCCTGCAGTGACCGATTCAAGCCATCTTACGTTCATAGTTTTGGTCTGACTCCCAACTATATC GTTTTTGTGGAGACACCAGTCAAAATTAACCTGTTCAAGTTCCTTTCTTCATGGAGTCTTTGGGGAGCCAACTAC ATGGATTGTTTTGAGTCCAATGAAACCATGGGGGTTTGGCTTCATATTGCTGACAAAAAAAGGAAAAAGTACCTC AATAATAAATACAGAACTTCTCCTTTCAACCTCTTCCATCACATCAACACCTATGAAGACAATGGGTTTCTGATT GTGGATCTCTGCTGCTGGAAAGGATTTGAGTTTGTTTATAATTACTTATATTTAGCCAATTTACGTGAGAACTGG GAAGAGGTGAAAAAAAATGCCAGAAAGGCTCCCCAACCTGAAGTTAGGAGATATGTACTTCCTTTGAATATTGAC AAGGCTGACACAGGCAAGAATTTAGTCACGCTCCCCAATACAACTGCCACTGCAATTCTGTGCAGTGACGAGACT ATCTGGCTGGAGCCTGAAGTTCTCTTTTCAGGGCCTCGTCAAGCATTTGAGTTTCCTCAAATCAATTACCAGAAG TATTGTGGGAAACCTTACACATATGCGTATGGACTTGGCTTGAATCACTTTGTTCCAGATAGGCTCTGTAAGCTG AATGTCAAAACTAAAGAAACTTGGGTTTGGCAAGAGCCTGATTCATACCCATCAGAACCCATCTTTGTTTCTCAC CCAGATGCCTTGGAAGAAGATGATGGTGTAGTTCTGAGTGTGGTGGTGAGCCCAGGAGCAGGACAAAAGCCTGCT TATCTCCTGATTCTGAATGCCAAGGACTTAAGTGAAGTTGCCCGGGCTGAAGTGGAGATTAACATCCCTGTCACC TTTCATGGACTGTTCAAAAAATCTTGA

SEQ ID NO：4优化的RPE65cDNA(Kozak序列和编码序列)

CCACCATGAGTATCCAGGTGGAACATCCCGCAGGGGGGTATAAGAAACTGTTTGAGACCGTCGAAGAACTGAGCA GCCCTCTGACCGCACATGTCACCGGAAGAATCCCCCTGTGGCTGACAGGATCACTGCTGAGATGCGGACCAGGAC TGTTCGAAGTGGGAAGCGAACCTTTCTACCACCTGTTTGACGGACAGGCCCTGCTGCATAAGTTCGACTTCAAGG AGGGGCACGTGACTTACCATCGGCGGTTCATCCGAACCGACGCCTATGTCCGGGCTATGACAGAGAAGAGAATCG TGATTACTGAGTTCGGCACCTGCGCCTTTCCAGATCCCTGTAAGAACATTTTCTCCAGGTTCTTTTCTTACTTTC GCGGCGTCGAGGTGACAGACAACGCACTGGTCAACGTGTACCCTGTGGGGGAGGATTACTATGCCTGCACTGAAA CCAACTTCATCACCAAGATTAATCCAGAGACACTGGAAACTATCAAACAGGTGGACCTGTGCAACTACGTCAGTG TGAATGGCGCCACCGCTCACCCCCATATCGAGAACGATGGGACAGTCTACAACATTGGCAATTGCTTCGGGAAGA ACTTTAGCATCGCCTACAACATCGTGAAGATCCCCCCTCTGCAGGCTGACAAGGAGGATCCTATCTCTAAAAGTG AAATTGTGGTCCAGTTCCCTTGTTCTGACCGGTTTAAGCCAAGTTACGTCCACTCATTCGGCCTGACACCAAACT ATATCGTCTTTGTGGAGACTCCCGTGAAGATTAATCTGTTCAAATTTCTGAGCTCCTGGTCTCTGTGGGGGGCTA ACTACATGGACTGCTTCGAGAGTAATGAAACAATGGGAGTGTGGCTGCACATCGCAGATAAGAAACGAAAGAAAT ACCTGAACAATAAGTACCGGACTAGCCCCTTCAACCTGTTTCACCATATCAACACCTATGAGGACAATGGATTTC TGATTGTCGATCTGTGCTGTTGGAAGGGCTTCGAGTTCGTGTACAACTATCTGTACCTGGCAAACCTGCGCGAAA ATTGGGAGGAAGTGAAGAAAAATGCTCGAAAAGCACCTCAGCCAGAAGTCAGGCGCTACGTGCTGCCACTGAACA TCGACAAGGCTGATACAGGCAAAAACCTGGTGACTCTGCCCAATACCACAGCAACTGCCATCCTGTGCTCCGACG AGACCATTTGGCTGGAGCCCGAAGTGCTGTTCTCTGGACCTCGCCAGGCCTTCGAATTTCCACAGATTAATTACC AGAAGTACTGCGGCAAACCCTATACCTACGCTTATGGACTGGGCCTGAACCACTTCGTGCCTGATAGACTGTGCA AGCTGAATGTCAAGACCAAAGAGACATGGGTGTGGCAGGAACCTGACTCATACCCCAGCGAGCCTATCTTTGTGA GCCATCCAGATGCCCTGGAGGAAGACGATGGCGTGGTCCTGAGCGTGGTCGTGTCCCCAGGAGCAGGACAGAAGC CAGCCTATCTGCTGATTCTGAACGCTAAAGATCTGTCCGAAGTGGCAAGAGCAGAGGTGGAGATCAATATCCCAG TCACATTTCACGGGCTGTTCAAAAAGTCCTAA

SEQ ID NO：5人MERTK的cDNA Genbank No.NM_006343.2

ATGGGGCCGGCCCCGCTGCCGCTGCTGCTGGGCCTCTTCCTCCCCGCGCTCTGGCGTAGAGCTATCACTGAGGCA AGGGAAGAAGCCAAGCCTTACCCGCTATTCCCGGGACCTTTTCCAGGGAGCCTGCAAACTGACCACACACCGCTG TTATCCCTTCCTCACGCCAGTGGGTACCAGCCTGCCTTGATGTTTTCACCAACCCAGCCTGGAAGACCACATACA GGAAACGTAGCCATTCCCCAGGTGACCTCTGTCGAATCAAAGCCCCTACCGCCTCTTGCCTTCAAACACACAGTT GGACACATAATACTTTCTGAACATAAAGGTGTCAAATTTAATTGCTCAATCAGTGTACCTAATATATACCAGGAC ACCACAATTTCTTGGTGGAAAGATGGGAAGGAATTGCTTGGGGCACATCATGCAATTACACAG TTTTATCCAGATGATGAAGTTACAGCAATAATCGCTTCCTTCAGCATAACCAGTGTGCAGCGTTCAGACAATGGG TCGTATATCTGTAAGATGAAAATAAACAATGAAGAGATCGTGTCTGATCCCATCTACATCGAAGTACAAGGACTT CCTCACTTTACTAAGCAGCCTGAGAGCATGAATGTCACCAGAAACACAGCCTTCAACCTCACCTGTCAGGCTGTG GGCCCGCCTGAGCCCGTCAACATTTTCTGGGTTCAAAACAGTAGCCGTGTTAACGAACAGCCTGAAAAATCCCCC TCCGTGCTAACTGTTCCAGGCCTGACGGAGATGGCGGTCTTCAGTTGTGAGGCCCACAATGACAAAGGGCTGACC GTGTCCAAGGGAGTGCAGATCAACATCAAAGCAATTCCCTCCCCACCAACTGAAGTCAGCATCCGTAACAGCACT GCACACAGCATTCTGATCTCCTGGGTTCCTGGTTTTGATGGATACTCCCCGTTCAGGAATTGCAGCATTCAGGTC AAGGAAGCTGATCCGCTGAGTAATGGCTCAGTCATGATTTTTAACACCTCTGCCTTACCACATCTGTACCAAATC AAGCAGCTGCAAGCCCTGGCTAATTACAGCATTGGTGTTTCCTGCATGAATGAAATAGGCTGGTCTGCAGTGAGC CCTTGGATTCTAGCCAGCACGACTGAAGGAGCCCCATCAGTAGCACCTTTAAATGTCACTGTGTTTCTGAATGAA TCTAGTGATAATGTGGACATCAGATGGATGAAGCCTCCGACTAAGCAGCAGGATGGAGAACTGGTGGGCTACCGG ATATCCCACGTGTGGCAGAGTGCAGGGATTTCCAAAGAGCTCTTGGAGGAAGTTGGCCAGAATGGCAGCCGAGCT CGGATCTCTGTTCAAGTCCACAATGCTACGTGCACAGTGAGGATTGCAGCCGTCACCAGAGGGGGAGTTGGGCCC TTCAGTGATCCAGTGAAAATATTTATCCCTGCACACGGTTGGGTAGATTATGCCCCCTCTTCAACTCCGGCGCCT GGCAACGCAGATCCTGTGCTCATCATCTTTGGCTGCTTTTGTGGATTTATTTTGATTGGGTTGATTTTATACATC TCCTTGGCCATCAGAAAAAGAGTCCAGGAGACAAAGTTTGGGAATGCATTCACAGAGGAGGATTCTGAATTAGTG GTGAATTATATAGCAAAGAAATCCTTCTGTCGGCGAGCCATTGAACTTACCTTACATAGCTTGGGAGTCAGTGAG GAACTACAAAATAAACTAGAAGATGTTGTGATTGACAGGAATCTTCTAATTCTTGGAAAAATTCTGGGTGAAGGA GAGTTTGGGTCTGTAATGGAAGGAAATCTTAAGCAGGAAGATGGGACCTCTCTGAAAGTGGCAGTGAAGACCATG AAGTTGGACAACTCTTCACAGCGGGAGATCGAGGAGTTTCTCAGTGAGGCAGCGTGCATGAAAGACTTCAGCCAC CCAAATGTCATTCGACTTCTAGGTGTGTGTATAGAAATGAGCTCTCAAGGCATCCCAAAGCCCATGGTAATTTTA CCCTTCATGAAATACGGGGACCTGCATACTTACTTACTTTATTCCCGATTGGAGACAGGACCAAAGCATATTCCT CTGCAGACACTATTGAAGTTCATGGTGGATATTGCCCTGGGAATGGAGTATCTGAGCAACAGGAATTTTCTTCAT CGAGATTTAGCTGCTCGAAACTGCATGTTGCGAGATGACATGACTGTCTGTGTTGCGGACTTCGGCCTCTCTAAG AAGATTTACAGTGGCGATTATTACCGCCAAGGCCGCATTGCTAAGATGCCTGTTAAATGGATCGCCATAGAAAGT CTTGCAGACCGAGTCTACACAAGTAAAAGTGATGTGTGGGCATTTGGCGTGACCATGTGGGAAATAGCTACGCGG GGAATGACTCCCTATCCTGGGGTCCAGAACCATGAGATGTATGACTATCTTCTCCATGGCCACAGGTTGAAGCAG CCCGAAGACTGCCTGGATGAACTGTATGAAATAATGTACTCTTGCTGGAGAACCGATCCCTTAGACCGCCCCACC TTTTCAGTATTGAGGCTGCAGCTAGAAAAACTCTTAGAAAGTTTGCCTGACGTTCGGAACCAAGCAGACGTTATT TACGTCAATACACAGTTGCTGGAGAGCTCTGAGGGCCTGGCCCAGGGCTCCACCCTTGCTCCACTGGACTTGAAC ATCGACCCTGACTCTATAATTGCCTCCTGCACTCCCCGCGCTGCCATCAGTGTGGTCACAGCAGAAGTTCATGAC AGCAAACCTCATGAAGGACGGTACATCCTGAATGGGGGCAGTGAGGAATGGGAAGATCTGACTTCTGCCCCCTCT GCTGCAGTCACAGCTGAAAAGAACAGTGTTTTACCGGGGGAGAGACTTGTTAGGAATGGGGTCTCCTGGTCCCAT TCGAGCATGCTGCCCTTGGGAAGCTCATTGCCCGATGAACTTTTGTTTGCTGACGACTCCTCAGAAGGCTCAGAAGTCCTGATGTGA

SEQ ID NO：6人LRAT的cDNA Genbank No.NM_004744.3

ATGAAGAACCCCATGCTGGAGGTGGTGTCTTTACTACTGGAGAAGCTGCTCCTCATCTCCAACTTCACGCTCTTT AGTTCGGGCGCCGCGGGCGAAGACAAAGGGAGGAACAGTTTTTATGAAACCAGCTCTTTCCACCGAGGCGACGTG CTGGAGGTGCCCCGGACCCACCTGACCCACTATGGCATCTACCTAGGAGACAACCGTGTTGCCCACATGATGCCC GACATCCTGTTGGCCCTGACAGACGACATGGGGCGCACGCAGAAGGTGGTCTCCAACAAGCGTCTCATCCTGGGC GTTATTGTCAAAGTGGCCAGCATCCGCGTGGACACAGTGGAGGACTTCGCCTACGGAGCTAACATCCTGGTCAAT CACCTGGACGAGTCCCTCCAGAAAAAGGCACTGCTCAACGAGGAGGTGGCGCGGAGGGCTGAAAAGCTGCTGGGC TTTACCCCCTACAGCCTGCTGTGGAACAACTGCGAGCACTTCGTGACCTACTGCAGATATGGCACCCCGATCAGT CCCCAGTCCGACAAGTTTTGTGAGACTGTGAAGATAATTATTCGTGATCAGAGAAGTGTTCTTGCTTCAGCAGTC TTGGGATTGGCGTCTATAGTCTGTACGGGCTTGGTATCATACACTACCCTTCCTGCAATTTTTATTCCATTCTTC CTATGGATGGCTGGCTAA

SEQ ID NO：7人TYR的cDNA Genbank No.NM_000372.4

ATGCTCCTGGCTGTTTTGTACTGCCTGCTGTGGAGTTTCCAGACCTCCGCTGGCCATTTCCCTAGAGCCTGTGTC TCCTCTAAGAACCTGATGGAGAAGGAATGCTGTCCACCGTGGAGCGGGGACAGGAGTCCCTGTGGCCAGCTTTCA GGCAGAGGTTCCTGTCAGAATATCCTTCTGTCCAATGCACCACTTGGGCCTCAATTTCCCTTCACAGGGGTGGAT GACCGGGAGTCGTGGCCTTCCGTCTTTTATAATAGGACCTGCCAGTGCTCTGGCAACTTCATGGGATTCAACTGT GGAAACTGCAAGTTTGGCTTTTGGGGACCAAACTGCACAGAGAGACGACTCTTGGTGAGAAGAAACATCTTCGAT TTGAGTGCCCCAGAGAAGGACAAATTTTTTGCCTACCTCACTTTAGCAAAGCATACCATCAGCTCAGACTATGTC ATCCCCATAGGGACCTATGGCCAAATGAAAAATGGATCAACACCCATGTTTAACGACATCAATATTTATGACCTC TTTGTCTGGATGCATTATTATGTGTCAATGGATGCACTGCTTGGGGGATCTGAAATCTGGAGAGACATTGATTTT GCCCATGAAGCACCAGCTTTTCTGCCTTGGCATAGACTCTTCTTGTTGCGGTGGGAACAAGAAATCCAGAAGCTG ACAGGAGATGAAAACTTCACTATTCCATATTGGGACTGGCGGGATGCAGAAAAGTGTGACATTTGCACAGATGAG TACATGGGAGGTCAGCACCCCACAAATCCTAACTTACTCAGCCCAGCATCATTCTTCTCCTCTTGGCAGATTGTC TGTAGCCGATTGGAGGAGTACAACAGCCATCAGTCTTTATGCAATGGAACGCCCGAGGGACCTTTACGGCGTAAT CCTGGAAACCATGACAAATCCAGAACCCCAAGGCTCCCCTCTTCAGCTGATGTAGAATTTTGCCTGAGTTTGACC CAATATGAATCTGGTTCCATGGATAAAGCTGCCAATTTCAGCTTTAGAAATACACTGGAAGGATTTGCTAGTCCA CTTACTGGGATAGCGGATGCCTCTCAAAGCAGCATGCACAATGCCTTGCACATCTATATGAATGGAACAATGTCC CAGGTACAGGGATCTGCCAACGATCCTATCTTCCTTCTTCACCATGCATTTGTTGACAGTATTTTTGAGCAGTGG CTCCGAAGGCACCGTCCTCTTCAAGAAGTTTATCCAGAAGCCAATGCACCCATTGGACATAACCGGGAATCCTAC ATGGTTCCTTTTATACCACTGTACAGAAATGGTGATTTCTTTATTTCATCCAAAGATCTGGGCTATGACTATAGC TATCTACAAGATTCAGACCCAGACTCTTTTCAAGACTACATTAAGTCCTATTTGGAACAAGCGAGTCGGATCTGG TCATGGCTCCTTGGGGCGGCGATGGTAGGGGCCGTCCTCACTGCCCTGCTGGCAGGGCTTGTGAGCTTGCTGTGT CGTCACAAGAGAAAGCAGCTTCCTGAAGAAAAGCAGCCACTCCTCATGGAGAAAGAGGATTACCACAGCTTGTAT CAGAGCCATTTATAA

SEQ ID NO：8人GRP143的cDNA Genbank No.NM_000273.2

ATGACCCAGGCAGGCCGGCGGGGTCCTGGCACACCCGAGCCGCGTCCGCGAACACAGCCCATGGCCTCCCCGCGC CTAGGGACCTTCTGCTGCCCCACGCGGGACGCAGCCACGCAGCTCGTGCTGAGCTTCCAGCCGCGGGCCTTCCAC GCGCTCTGCCTGGGCAGCGGCGGGCTCCGCTTGGCGCTGGGCCTTCTGCAGCTGCTGCCCGGCCGCCGGCCCGCG GGCCCCGGGTCCCCCGCGACGTCCCCGCCGGCCTCGGTCCGCATCCTGCGCGCTGCCGCTGCCTGCGACCTTCTC GGCTGCCTGGGTATGGTGATCCGGTCCACCGTGTGGTTAGGATTCCCAAATTTTGTTGACAGCGTCTCGGATATG AACCACACGGAAATTTGGCCTGCTGCTTTCTGCGTGGGGAGTGCGATGTGGATCCAGCTGTTGTACAGTGCCTGC TTCTGGTGGCTGTTTTGCTATGCAGTGGATGCTTATCTGGTGATCCGGAGATCGGCAGGACTGAGCACCATCCTG CTGTATCACATCATGGCGTGGGGCCTGGCCACCCTGCTCTGTGTGGAGGGAGCCGCCATGCTCTACTACCCTTCC GTGTCCAGGTGTGAGCGGGGCCTGGACCACGCCATCCCCCACTATGTCACCATGTACCTGCCCCTGCTGCTGGTT CTCGTGGCGAACCCCATCCTGTTCCAAAAGACAGTGACTGCAGTGGCCTCTTTACTTAAAGGAAGACAAGGCATT TACACGGAGAACGAGAGGAGGATGGGAGCCGTGATCAAGATCCGATTTTTCAAAATCATGCTGGTTTTAATTATT TGTTGGTTGTCGAATATCATCAATGAAAGCCTTTTATTCTATCTTGAGATGCAAACAGATATCAATGGAGGTTCT TTGAAACCTGTCAGAACTGCAGCCAAGACCACATGGTTTATTATGGGAATCCTGAATCCAGCCCAGGGATTTCTC TTGTCTTTGGCCTTCTACGGCTGGACAGGATGCAGCCTGGGTTTTCAGTCTCCCAGGAAGGAGATCCAGTGGGAA TCACTGACCACCTCGGCTGCTGAGGGGGCTCACCCATCCCCACTGATGCCCCATGAAAACCCTGCTTCCGGGAAG GTGTCTCAAGTGGGTGGGCAGACTTCTGACGAAGCCCTGAGCATGCTGTCTGAAGGTTCTGATGCCAGCACAATT GAAATTCACACTGCAAGTGAATCCTGCAACAAAAATGAGGGTGACCCTGCTCTCCCAACCCATGGAGACCTATGA

Claims

1.一种表达构建体，其包含启动子和可操作地连接的多核苷酸序列，其中所述启动子由以下组成：

(a)来自SEQ ID NO:1的不多于800个连续核苷酸的序列，其包含SEQ ID NO:2的第12-761位核苷酸；或

(b)与所述(a)的序列具有至少90％的序列同一性的序列，其中所述与所述(a)的序列具有至少90％的序列同一性的序列包含SEQ ID NO:2的第12-761位核苷酸，

并且其中所述可操作地连接的多核苷酸序列包括SEQ ID NO:4的序列。

2.权利要求1的表达构建体，其中所述启动子包括SEQ ID NO:2的序列。

3.权利要求1的表达构建体，其中所述启动子包括SEQ ID NO:2的第12-761位核苷酸。

4.权利要求1的表达构建体，其中所述启动子由SEQ ID NO:2组成。

5.权利要求1的表达构建体，其中所述启动子由SEQ ID NO:2的第12-761位核苷酸组成。

6.一种视网膜色素上皮(RPE)特异性启动子，所述RPE特异性启动子由SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:2的第12-761位核苷酸组成。

7.一种包含权利要求6的启动子的表达构建体，所述启动子与待以RPE特异性方式表达的序列可操作地连接。

8.权利要求7的表达构建体，其中所述可操作地连接的序列为RPE65、MERTK、LRAT、TYR、GRP143或MYO7A编码序列，或编码神经营养因子、抗血管生成多肽或在RPE中具有抗凋亡作用的多肽的序列。

9.权利要求7的表达构建体，其中所述可操作地连接的序列包括选自SEQ ID NO:3至8的序列，或与SEQ ID NO:3至8中任一个具有至少80％的序列同一性并且具有补救RPE功能的能力的序列。

10.一种载体，其包含权利要求1-5中任一项的表达构建体或权利要求6的启动子。

11.权利要求10的载体，其中所述载体为病毒载体。

12.权利要求11的载体，其中所述载体为腺相关病毒(AAV)载体或包含AAV基因组或其衍生物，任选地其中所述衍生物为嵌合的、改组的或衣壳修饰的衍生物。

13.权利要求12的载体，其中所述AAV基因组来自AAV的天然来源的血清型或分离株或进化枝，任选地其中所述AAV基因组来自AAV血清型2(AAV2)、AAV血清型4(AAV4)、AAV血清型5(AAV5)或AAV血清型8(AAV8)，和/或其中所述衣壳来自AAV5或AAV8。

14.权利要求12的载体，其中所述AAV基因组来自AAV2，并且所述衣壳来自AAV5或AAV8。

15.一种宿主细胞，其包含权利要求10的载体或产生权利要求11-14中任一项的病毒载体，任选地其中所述宿主细胞为HEK293或HEK293T细胞。

16.一种药物组合物，其包括权利要求10至14中任一项的载体和可药用的载体(pharmaceutically acceptable carrier)。

17.权利要求10至14中任一项的载体用于制备治疗或预防视网膜营养不良的药剂的用途。

18.权利要求17的用途，其中所述视网膜营养不良是利伯先天性黑矇(LCA)、年龄相关性黄斑变性(AMD)、眼皮肤病I型、Nettleship-Falls型眼白化病或MERTK缺陷。

19.权利要求17的用途，其中所述治疗或预防是通过直接视网膜注射、视网膜下注射或玻璃体内注射将权利要求10至14中任一项的载体给予至患者，任选地其中将所述载体直接给予至视网膜、视网膜下空间或玻璃体内空间。