ES2830030T3 - Promotor y secuencias codificantes de RPE65 optimizados - Google Patents

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Abstract

Una construcción de expresión que comprende un promotor específico del epitelio pigmentario de la retina (RPE) y una secuencia polinucleotídica operativamente unida, en donde el promotor específico de RPE comprende: (a) una secuencia de nucleótidos contiguos a partir de la SEQ ID NO: 1 que confiere expresión específica de RPE en una secuencia polinucleotídica operativamente unida, o (b) una secuencia que tiene al menos el 90 % de identidad de secuencia con dicha secuencia de (a) y que conserva la actividad del promotor específico de RPE, y en donde la secuencia polinucleotídica operativamente unida comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 4.

Description

DESCRIPCIÓN
Promotor y secuencias codificantes de RPE65 optimizados
Campo de la invención
La presente invención se refiere a la terapia génica para el tratamiento y/o prevención de distrofias de la retina, en particular trastornos del epitelio pigmentario de la retina, tal como la amaurosis congénita de Leber.
Antecedentes de la invención
Las distrofias de la retina, incluidas las distrofias de la retina hereditarias (IRD, por sus siglas en inglés), forman un gran grupo de enfermedades genéticamente y fenotípicamente heterogéneas que se caracterizan por la pérdida progresiva de células fotorreceptoras y la pérdida concomitante de la visión. Las IRD afectan aproximadamente a 1 de cada 3000 personas en Europa y Estados Unidos. Hasta la fecha se han identificado aproximadamente 200 genes y otros 50 locus asociados con distrofia de la retina. La mayoría de estos trastornos están causados por mutaciones de pérdida de función adquiridas por herencia recesiva o ligada a X.
Existe una variación sustancial con respecto al inicio, tasa de pérdida de visión y tipo de célula primaria afectada. Las formas más graves de degeneración de la retina hereditaria son los diversos tipos de amaurosis congénita de Leber (LCA, por sus siglas en inglés), en los que hay una discapacidad visual grave desde el nacimiento y, con frecuencia, pérdida completa de la visión durante las dos primeras décadas. Aunque el tipo de célula primaria más comúnmente afectado en la degeneración de la retina es la célula fotorreceptora, los defectos en otros tipos celulares, tal como el epitelio pigmentario de la retina (PRE, por sus siglas en inglés), pueden provocar una reducción de la función de los fotorreceptores y su posterior pérdida.
Un ejemplo de distrofia de la retina hereditaria debido a un defecto en el RPE es una forma de LCA causada por defectos en la isomerohidrolasa retinoide dependiente de hierro predominante del RPE, RPE65, que representa entre el 6 y el 16 % de los casos de LCA. Su ausencia da como resultado la interrupción del ciclo visual que conduce a la ausencia de la función de los bastones y, en consecuencia, la degeneración de los fotorreceptores.
Varios estudios clínicos y preclínicos de terapia de reemplazo génico han demostrado que el suministro subretiniano de vectores adenovíricos AAV2 es segura y puede dar como resultado un aumento de la función visual (Bainbridge et al. 2008, Maguire et al. 2008, 2009, Hauswirth et al. 2008, Cideciyan et al 2008, 2009) y actividad en la corteza visual (Ashtari et al. 2011).
Sin embargo, en una investigación previa sobre el reemplazo de terapia génica de RPE65 en el RPE (Bainbridge et al. 2008), los autores informaron que, aunque hubo mejoras en la sensibilidad de la retina y la movilidad guiada visual en un paciente con el tratamiento, no hubo mejoras significativas en la agudeza visual y la visión de campo periférico. Adicionalmente, no hubo mejoras significativas en todos los parámetros medidos en los otros pacientes tratados. Las mejoras en las respuestas electrorretinográficas aún no se han informado en ningún estudio. También se ha observado que el tratamiento de perros RPE65 -/- a los 30 meses con terapia mediada por vectores AAV2/4 no rescató la visión o la función de la retina (Le Meur et al. 2007).
Por lo tanto, existe la necesidad de mejorar las terapias de reemplazo génico para las distrofias de la retina, especialmente distrofias de la retina hereditarias, en particular para trastornos del epitelio pigmentario de la retina (RPE) tal como la amaurosis congénita de Leber.
Bainbridge et al. (2008) describe el efecto de la terapia génica sobre la función visual en la Amaurosis Congénita de Leber.
El documento WO 2009/105690 describe métodos y sistemas para el suministro de polinucleótidos en el espacio subretiniano de la mácula o fóvea de un ojo.
El documento WO 2013/173129 describe composiciones y métodos para la prevención o el tratamiento de la neovascularización ocular.
El número de registro de la base de datos Geneseq. BAY70761 describe una secuencia promotora relacionada con el tratamiento de AMD.
Sumario de la invención
La invención es tal como se define en las reivindicaciones.
La presente invención se basa en la creación de un promotor optimizado para expresar genes en el RPE. Este promotor optimizado se muestra en la SEQ ID NO: 2. El promotor comprende los nucleótidos 865 a 1614 del promotor de RPE65 humano utilizado en Bainbridge. et al. (2008), que se muestra en la SEQ ID NO: 1. El uso de este promotor en un vector para impulsar la expresión de un gen de control en el RPE fue eficaz con un nivel de expresión aproximadamente 20 veces mayor que el del promotor de RPE65 original. El promotor de RPE65 optimizado fue tanto más potente que el promotor de RPE65 original como más estricto en la conducción de la expresión en células del RPE en relación con las células fotorreceptoras.
Además, la secuencia codificante natural de RPE65, que se muestra en la SEQ ID NO: 3, se ha optimizado para proporcionar una secuencia optimizada que se muestra en la SEQ ID NO: 4. La secuencia RPE65 optimizada se probó junto con la secuencia RPE65 original in vitro en células 293T (humanas) para determinar el efecto sobre los niveles de producción de proteína RPE65, después de la transfección de un plásmido de expresión de AAV2/8 que lleva el promotor de CMV ubicuo. La producción de proteínas in vitro en células 293T después de la optimización de la secuencia codificante de RPE65 mostró un aumento de siete veces en la cantidad de proteína RPE65 producida a partir del vector que lleva la secuencia codificante optimizada en comparación con la secuencia codificante de tipo silvestre.
El promotor optimizado y la secuencia RPE65 optimizada también se han combinado en un vector para probar su capacidad para rescatar la función de la retina in vivo en ratones deficientes en RPE65. La eficacia del rescate se comparó con el vector de grado clínico previamente utilizado en Bainbridge et al (2008). Se administraron dosis de vector más bajas para permitir la comparación de la eficacia del tratamiento en circunstancias limitantes, se utilizó la amplitud de la onda b como medida de rescate. Sorprendentemente, las amplitudes de la onda b de los ojos tratados con el vector optimizado fueron tan altas o más altas que las amplitudes de los ojos inyectados con una dosis 300 veces mayor del vector original. Por lo tanto, la optimización del promotor y/o de la secuencia codificante de acuerdo con la invención es muy ventajosa en comparación con el uso de secuencias naturales.
Por consiguiente, la invención proporciona una construcción de expresión que comprende un promotor específico del epitelio pigmentario de la retina (RPE) y una secuencia polinucleotídica operativamente unida, en donde el promotor específico de RPE comprende:
(a) una secuencia de nucleótidos contiguos a partir de la SEQ ID NO: 1 que confiere expresión específica de RPE en una secuencia polinucleotídica operativamente unida, o
(b) una secuencia que tiene al menos el 90 % de identidad de secuencia con dicha secuencia de (a) y que conserva la actividad del promotor específico de RPE,
y en donde la secuencia polinucleotídica operativamente unida comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 4.
En el presente documento se divulga un promotor específico del epitelio pigmentario de la retina (RPE) que comprende: (a) una secuencia de nucleótidos contiguos de la SEQ ID NO: 1 que confiere expresión específica de RPE en una secuencia polinucleotídica operativamente unida, o (b) una secuencia que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con dicha secuencia de (a) y que conserva la actividad del promotor específico de RPE.
En otra realización relacionada, la invención proporciona un vector que comprende una construcción de expresión de acuerdo con la invención, en donde preferentemente el vector es un vector vírico.
En otra realización relacionada, la invención proporciona una célula hospedadora que contiene un vector de la invención o produce un vector vírico de la invención.
En otra realización relacionada, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un vector de la invención y un transportador farmacéuticamente aceptable.
En otra realización relacionada, la invención proporciona un vector de la invención para su uso en un método para prevenir o tratar distrofia de la retina.
También se describe el uso de un vector de la invención en la fabricación de un medicamento para el tratamiento o la prevención de la distrofia de la retina.
También se describe un método para tratar o prevenir la distrofia de la retina en un paciente que lo necesite, que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un vector de la invención a dicho paciente.
La divulgación también proporciona construcciones y vectores de expresión que comprenden los promotores divulgados, así como composiciones farmacéuticas que comprenden dichos vectores, y el uso de dichos vectores en el tratamiento o prevención de distrofias de la retina, en particular trastornos del epitelio pigmentario de la retina tal como la amaurosis congénita de Leber.
Breve descripción de las Figuras
Figura 1: Niveles de expresión de GFP y patrón impulsado por el promotor de RPE65 original y las nuevas configuraciones del promotor de RPE65 en retinas murinas después de la inyección subretiniana. Evaluación de la actividad del promotor utilizando PCR cuantitativa (A) y transferencia de proteínas (B). (C) Criosecciones de los ojos 4 semanas después de la inyección subretiniana de AAV-RPE65-eGFP (arriba) o AAV-NA-eGFP (abajo). Figura 2: Evaluación por transferencia Western (A) y posterior cuantificación (B) de producción de proteína RPE65 in vitro en células 293T después de la optimización de la secuencia codificante de RPE65. La barra blanca muestra la producción de proteína RPE65 utilizando la secuencia codificante de RPE65 sin optimizar, la barra negra muestra la producción de proteína RPE65 utilizando la secuencia codificante de RPE65 optimizada (SEQ ID NO: 4).
Figura 3: Comparación de la eficacia del tratamiento del vector optimizado (AAV5-RPE65 optimizado) y el vector original (AAV2-hRPE65, Bainbridge et al 2008), 4 semanas después del tratamiento. El gráfico muestra las amplitudes promedio de la onda b escotópica (media ± DE) a las 4 semanas después del tratamiento, cuando ambos vectores alcanzaron la expresión máxima. El vector optimizado comprende la nueva configuración del promotor de (NA) RPE65 y la secuencia codificante de RPE65 optimizada.
Breve descripción de las secuencias
La SEQ ID NO: 1 muestra la secuencia de ADN del promotor de RPE65 humano en la forma utilizada en Bainbridge et al (2008)
La SEQ ID NO: 2 muestra la secuencia de ADN del fragmento de promotor de RPE65 optimizado
La SEQ ID NO: 3 muestra la secuencia de ADNc natural del gen RPE65 humano
La SEQ ID NO: 4 muestra la secuencia de ADNc del gen RPE65 optimizado (secuencia de Kozak y secuencia codificante)
La SEQ ID NO: 5 muestra la secuencia de ADNc del gen MERTK humano
La SEQ ID NO: 6 muestra la secuencia de ADNc del gen LRAT humano
La SEQ ID NO: 7 muestra la secuencia de ADNc del gen TYR humano
La SEQ ID NO: 8 muestra la secuencia de ADNc del gen GRP143 humano
Las SEQ ID NO: 9 y 10 muestran secuencias de cebadores que hibridan con RPE65
Las SEQ ID NO: 11 y 12 muestran secuencias de cebadores que hibridan con eGFP
Las SEQ ID NO: 13 y 14 muestran secuencias de cebadores que hibridan con p-actina
Descripción detallada de la invención
La invención es tal como se define en las reivindicaciones.
Debe entenderse que las diferentes aplicaciones de las secuencias polinucleotídicas divulgadas pueden adaptarse a las necesidades específicas de la técnica. También debe entenderse que la terminología usada en el presente documento tiene únicamente el fin de describir realizaciones particulares de la invención y no se pretende que sea limitante.
Además, como se usa en esta memoria descriptiva y en las reivindicaciones adjuntas, las formas en singular "un", "uno/a" y "el/la" incluyen las referencias en plural, salvo que el contenido indique claramente lo contrario. Por lo tanto, por ejemplo, la referencia a "un polinucleótido" incluye "polinucleótidos", la referencia a "un promotor" incluye "promotores", la referencia a "un vector" incluye dos o más de dichos vectores y similares.
La presente invención se refiere a la terapia génica para el tratamiento y/o prevención de la distrofia de la retina, en particular trastornos del epitelio pigmentario de la retina tal como la amaurosis congénita de Leber, en un paciente.
El paciente es preferentemente un mamífero. El mamífero puede ser un animal de granja comercial, tal como un caballo, una vaca, una oveja o un cerdo, un animal de laboratorio, tal como un ratón o una rata, o una mascota, tal como un gato, un perro, un conejo o un conejillo de indias. El paciente es más preferentemente un ser humano.
Los promotores divulgados pueden usarse para tratar distrofias de la retina. Las distrofias de la retina pueden ser distrofias de la retina hereditarias. La distrofia de la retina se puede definir como una enfermedad de la retina, caracterizada por la pérdida progresiva de células fotorreceptoras y la pérdida concomitante de la visión.
La retina
La retina está compuesta por la capa de células del epitelio pigmentario de la retina (RPE) y 3 capas de células neurosensoriales; a saber (de exterior a interior), la capa nuclear exterior (que contiene células fotorreceptoras), la capa nuclear interior (que contiene células bipolares) y la capa de células ganglionares.
El epitelio pigmentario de la retina (RPE)
Las células del RPE se interdigitan con los segmentos externos del fotorreceptor. El espacio entre los fotorreceptores y las células del RPE contiene una matriz a través de la cual se mueven los compuestos del ciclo retinoide. El RPE tiene varias contribuciones dignas de mención a la función de la retina y al ciclo retinoide. Estas incluyen la fagocitosis de los discos del segmento externo de los fotorreceptores, reducción de la dispersión de la luz, la contribución a la barrera hematorretiniana externa, el metabolismo de la vitamina A y el mantenimiento de un microambiente inmunosupresor (privilegio inmunitario ocular).
La distrofia o degeneración de la retina puede estar relacionada con anomalías en el ciclo retinoide. El ciclo retinoide es el proceso mediante el cual se regeneran los cromóforos visuales. La fotoisomerización del cromóforo 11-c/s-retinal crea todo-frans-retinal, que, a su vez, se disocia de la rodopsina. Todo-frans-retinal se reduce a todo-frans-retinol por la enzima dependiente de NADPH todo-frans-retinol deshidrogenasa (Baehr ef al. 2003). Todo-frans-el retinol abandona posteriormente la célula fotorreceptora, viaja a través de la matriz intercelular y entra en el RPE, donde se producen las etapas finales de la regeneración del pigmento. La lecitina retinol aciltransferasa (LRAT) esterifica todofrans-retinol a todo-frans-retinil éster. Este se convierte después en 11-c/s-retinol por la isomerohidrolasa retinoide dependiente de hierro predominante del RPE RPE65 ((Jin ef al. 2005; Moiseyev ef al. 2005; Redmond ef al. 2005). La enzima dependiente de NAD y NADP 11-c/s-retinol deshidrogenasa finalmente regenera 11-c/s-retinal a través de la oxidación de 11-c/s-retinol. Como tal, la proteína RPE65 es un componente esencial del ciclo retinoide.
Distrofias de la retina hereditarias del RPE
Las distrofias de la retina hereditaria del RPE pueden incluir, entre otras, amaurosis congénita de Leber, albinismo ocular y deficiencia de tirosina cinasa del protooncogén MER (MERTK, por sus siglas en inglés).
Amaurosis congénita de Leber (LCA)
La Amaurosis congénita de Leber (LCA), una de las formas más graves de degeneración de la retina hereditaria, está causada por mutaciones autosómicas recesivas en numerosos genes, uno de los cuales es RPE65 (Gu ef al., 1997; Marlhens ef al. 1997; Morimura ef al., 1998).
La amaurosis congénita de Leber (LCA) se describió por primera vez por Theodor Karl Gustav Leber en 1869. Es una forma rara de degeneración de la retina, que representa una proporción significativa de ceguera infantil. Se encuentran disponibles estimaciones variables de la incidencia y prevalencia de LCA a partir de los datos actuales. Por ejemplo, Alstrom y Olson estimaron que la prevalencia mundial de LCA es de 3 por cada 100.000 recién nacidos (1957). Un análisis más reciente estima que la LCA es menos prevalente, de 1 en 80.000 (Stone 2007). Se dice que la LCA representa más del 5 % de todas las retinopatías hereditarias y aproximadamente el 20 % de los niños que asisten a escuelas para ciegos en todo el mundo (Schappert-Kimmijser ef al. 1959). Estas estadísticas sirven para ilustrar la importante carga de morbilidad infligida por la lCa , tanto en el individuo como en la sociedad en su conjunto.
Las características clínicas de la LCA, descritas por primera vez por Leber en 1869, siguen siendo el criterio principal para el diagnóstico en la actualidad; concretamente, el cuarteto de pérdida visual grave en o cerca del nacimiento, nistagmus errante (una forma de movimiento ocular involuntario), pupilas amauróticas (una pupila que no responde en el lado ipsilateral del ojo afectado, si el ojo afectado es estimulado por la luz) y retinopatía pigmentaria (Ahmed y Loewenstein 2008; Koenekoop 2004; Leber 1869). Además, la demostración de la ausencia de señales electrorretinográficas (ERG) representa un criterio absoluto para el diagnóstico de LCA (den Hollander ef al. 2008). Aunque con frecuencia se aprecia en retrospectiva (debido a un diagnóstico tardío), uno de los primeros signos clínicos de LCA se produce en los bebés cuando no pueden rastrear visualmente. Este es, por supuesto, un signo de comportamiento inespecífico de discapacidad visual grave.
Genes específicos de RPE implicados en LCA
RPE65
RPE65 es una proteína de unión a retinil éster ubicada principalmente en las células del RPE. El RPE65 se localiza de manera altamente preferencial en el retículo endoplásmico liso de las células del RPE, donde se forma el cromóforo 11-c/s-retinal. Aunque la expresión de RPE65 es relativamente específica de tejido, RPE65 también se expresa en fotorreceptores conos (Znoiko ef al. 2002). Se demostró originalmente que RPE65 era un componente necesario de la vía por la cual 11-c/s-retinol se regenera a partir de todo-frans-retinil éster (Gollapalli ef al. 2003; Mata ef al. 2004). Se planteó la hipótesis de que RPE65 funcionaba como un sustrato acompañante en esta reacción.
Sin embargo, estudios posteriores han confirmado que el RPE65 tiene un papel enzimático y representa la isomerohidrolasa vital que recicla todofrans-retinoides a 11-c/s-retinoides (Jin ef al. 2005; Moiseyev ef al. 2005; Redmond ef al. 2005). También se encontró que la actividad isomerohidrolasa de RPE65 era dependiente de Fe2+, ya que las mutaciones en restos de unión a Fe2+ suprimen su actividad enzimática (Moiseyev ef al. 2006; Redmond ef al.
2005). Las mutaciones en los restos enzimáticos y de unión a hierro clave suprimieron esta actividad isomerohidrolasa, provocaron la acumulación de retinil ésteres en el RPE y bloquearon el ciclo retinoide (Redmond ef al. 1998; Redmond ef al. 2005). También hay una acumulación masiva de todofrans-retinil éster (el sustrato enzimático de RPE65), que aparece como gotitas de lípidos, en el modelo murino nuligénico RPE65 -/- (Katz y Redmond 2001).
Las mutaciones de RPE65 son responsables de un subtipo de LCA (Gu ef al., 1997; Marlhens ef al. 1997; Morimura et al., 1998). Las mutaciones en RPE65 son responsables del 6 al 16 % de los casos de LCA y, además, del 2 % de los casos de Retinosis pigmentaria recesiva (RP) (Mormura et al. 1998; Hanein et al. 2004; Simonelli et al. 2007). Varios estudios han informado una mayor prevalencia de mutaciones de RPE65 asociadas a LCA en la población Mediterránea en comparación con el resto de Europa y Estados Unidos (Hanein et al. 2004; Simonelli et al. 2007; Yzer et al. 2006).
Las mutaciones en RPE65 están asociados con varias características fenotípicas, incluyendo la ceguera nocturna y la conservación de la función visual mínima en la primera década de vida (Simonelli et al. 2007). Las mutaciones de RPE65 también se asocian con un aspecto fundoscópico particular; concretamente, distrofia de la retina en sal y pimienta (véase la Figura 7; Stone 2007). A diferencia de otras mutaciones asociadas con LCA, tal como las de CRB1, las mutaciones de RPE65 están asociadas con un grosor retiniano normal y señales de autofluorescencia detectables (Simonelli et al. 2007; Van Hooser et al. 2000).
La región promotora de RPE65 humano utilizada en Bainbridge et al. 2008 se muestra en la SEQ ID NO: 1. La secuencia de ADNc de RPE65 humano se muestra en la SEQ ID NO: 3.
Lecitina retinol aciltransferasa (LRAT)
Aparte de RPE65, existen otras tres formas de distrofia de la retina grave causada por mutaciones en genes que codifican proteínas que funcionan en el ciclo visual: un conjunto de reacciones bioquímicas que regeneran el pigmento visual al exponerse a la luz. Una de estas, la lecitina retinol aciltransferasa (LRAT), es específica de RPE como RPE65. LRAT es la enzima del ciclo visual que genera el sustrato para RPE65, y los defectos en cualquiera de ellos dan como resultado condiciones prácticamente indistinguibles. Sin embargo, mientras que el gen RPE65 es responsable de aproximadamente el 6 % de todos los casos de LCA, las mutaciones en LRAT solo explican casos aislados de LCA. La secuencia de ADNc de LRAT humana se muestra en la SEQ ID NO: 6.
Albinismo ocular
Gen implicado en el albinismo ocular
Tirosinasa (TYR)
La tirosinasa (TYR) es la enzima limitante de la velocidad responsable de la biosíntesis de melanina en el RPE. La melanina tiene un papel importante en el desarrollo, función y protección de la retina contra el estrés oxidativo inducido por la luz, y los niveles de melanina están asociados con AMD. Además de estar implicado en AMD, las mutaciones en la Tirosinasa también pueden causar Albinismo oculocutáneo de tipo 1 (OCA1, por sus siglas en inglés), que se caracteriza por hipopigmentación congénita.
La melanina puede ejercer una función protectora en las células que expresan tirosinasa de varias formas. En primer lugar, la melanina protege a estas células del daño inducido por la luz solar y la radiación ultravioleta. EN segundo lugar, la melanina puede contrarrestar el estrés oxidativo causado por los radicales libres derivados de los productos de peroxidación lipídica y el hierro acumulado en el RPE. Dichos prooxidantes pueden contribuir a la degeneración de estos tejidos relacionada con la edad. En tercer lugar, la alta capacidad de unión de la melanina a los iones metálicos y las sustancias químicas exógenas también respalda el papel protector de la melanina en el ojo. De acuerdo con estos hallazgos, la melanina y sus precursores son fundamentales para el correcto desarrollo de la retina en mamíferos. Las disfunciones en la expresión normal de tirosinasa, su modificación postraduccional o el tráfico hacia los melanosomas pueden disminuir la pigmentación, la estabilidad de los melanosomas y las funciones normales del RPE. Los investigadores han demostrado que el contenido de las células del RPE disminuye con la edad, quizás en parte debido a la degradación oxidativa. Además, se producen varios cambios relacionados con la edad en la melanina, contribuyendo a su deterioro funcional. La secuencia de ADNc de TYR humana se muestra en la SEQ ID NO: 7.
Receptor 143 acoplado a proteína G (GRP143)
GRP143 se expresa en el RPE. Se han identificado más de 60 mutaciones del receptor 143 acoplado a proteína G (GPR143) en personas con la forma más común de albinismo ocular, que se llama de tipo Nettleship-Falls o de tipo 1. La secuencia de ADNc de GRP143 humano se muestra en la SEQ ID NO: 8.
Deficiencia de tirosina cinasa del protooncogén MER (MERTK)
MERTK es una tirosina cinasa de membrana que se expresa en las células del RPE y es esencial para la fagocitosis normal de los segmentos externos de las células fotorreceptoras. La falta de funcionamiento de MERTK da como resultado la acumulación de desechos entre el RPE y las células fotorreceptoras que afecta negativamente a las vías metabólicas esenciales.
En contraste con las células fotorreceptoras, el RPE se puede transducir de manera eficaz con una variedad de vectores víricos y varios estudios han demostrado mejoras después de la suplementación génica de MERTK en rata Royal College of Surgeons, que es un modelo de deficiencia de MERTK de origen natural. El primero de estos estudios utilizó un vector de adenovirus para transferir el gen Mertk al RPE, que conduce a una mejora a corto plazo en la estructura y función de las células fotorreceptoras, según lo evaluado por ERG. Estudios posteriores han demostrado que la suplementación génica con el vector AAV2 y los vectores lentivíricos basados en HIV1 puede reducir la deposición de desechos, prolongar la supervivencia de las células fotorreceptoras y mantener las respuestas de ERG en ratas Royal College of Surgeons hasta 3 y 7 meses, respectivamente. Sin embargo, incluso el rescate mediado por vectores lentivíricos, el más eficaz de los tres vectores probados, no ha evitado la pérdida de células fotorreceptoras a largo plazo.
En las ratas Royal College of Surgeons, la deficiencia de MERTK compromete el apoyo metabólico crítico, conduciendo a una pérdida más rápida de células. La secuencia de ADNc de MERTK humana se muestra en la SEQ ID NO: 5.
Degeneración Macular Relacionada con la Edad (AMD, por sus siglas en inglés)
Además de las distrofias de la retina hereditarias, la invención también es aplicable al tratamiento de AMD. Las enfermedades degenerativas de la retina progresivas, tal como la degeneración macular relacionada con la edad (AMD) y la retinosis pigmentaria (RP), son las principales causas de ceguera no tratable y tienen una enorme carga social y financiera para la sociedad. Hasta 30 millones de personas en todo el mundo padecen AMD y se espera que este diagnóstico aumente drásticamente en las próximas décadas debido al envejecimiento de las poblaciones. La AMD es una enfermedad multifactorial asociada al envejecimiento que afecta la interfaz fotorreceptor-RPE-coroides en la mácula y está causada por la interacción de factores de susceptibilidad genética y medio ambiente. El RPE es la fuente y la diana de muchas enfermedades degenerativas de la retina y los defectos en la función del RPE pueden afectar la integridad y la viabilidad de las células vecinas, principalmente los fotorreceptores.
Con el fin de tratar la AMD, la secuencia codificante unida al promotor divulgado generalmente codificará un polipéptido antiangiogénico, por ejemplo sFltl, sFlt-4, una proteína secuestradora de VEGF, tal como un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une a VEGF, un receptor soluble para VEGF, angiostatina o endostatina; o un polipéptido con efectos anti apoptóticos en el RPE, tal como Bcl2 y otros miembros de la familia de Bcl2, XIAP (también conocido como BIRC4) y otros miembros de la familia IAP/B|Rc .
Genes adicionales adecuados para la expresión a partir de vectores de la invención
En el presente documento se divulgan secuencias que pueden expresarse a partir de vectores de la invención con el fin de corregir una variedad de trastornos oculares, incluidos genes que codifican factores neurotróficos que apoyan la supervivencia de las neuronas, por ejemplo, GDNF, CNTF, PEDF, VEGF, EPO, IGF1 y RdCVFI; polipéptidos antiangiogénicos tal como sFltl, sFlt-4; una proteína secuestradora de VEGF, tal como un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une a VEGF, un receptor soluble para VEGF, angiostatina o endostatina; y secuencias que codifican polipéptidos con efectos antiapoptóticos en el RPE, tal como Bcl2 y otros miembros de la familia de Bcl2, XIAP (también conocido como BIRC4) y otros miembros de la familia IAP/BIRC.
Los factores neurotróficos que apoyan la supervivencia de las neuronas, por ejemplo, GDNF, CNTF, PEDF, VEGF, EPO, IGF1 y RdCVFI pueden ser útiles para el tratamiento de la enfermedad de Stargardt.
Los polipéptidos antiangiogénicos tal como sFltl, sFlt-4; una proteína secuestradora de VEGF, tal como un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une a VEGF, un receptor soluble para VEGF, angiostatina o endostatina; y secuencias que codifican polipéptidos con efectos antiapoptóticos en el RPE, tal como Bcl2 y otros miembros de la familia de Bcl2, XIAP (también conocido como BIRC4) y otros miembros de la familia IAP/BIRC pueden ser útiles para el tratamiento de la retinopatía diabética.
Otro gen que puede expresarse a partir de los vectores de la invención es MYO7A, que está implicado en la enfermedad Usher 1B, que se cree que está causada en parte por la ausencia de la proteína codificada por MYO7A en el RPE.
Promotores
Los promotores de la divulgación son fragmentos y/o variantes del promotor de RPE65 humano y tienen actividad promotora específica de RPE. Pueden estar en forma aislada.
Un promotor de la divulgación puede comprender una secuencia de nucleótidos, nucleótidos generalmente contiguos, de la SEQ ID NO: 1 que confiere expresión específica de RPE en una secuencia polinucleotídica operativamente unida. La secuencia de la SEQ ID NO: 1 tiene una longitud de 1614 nucleótidos y no tiene actividad específica de RPE. Cualquier truncamiento de la SEQ ID NO: 1 que tenga actividad específica de RPE es una secuencia de la divulgación. Las secuencias promotoras de la divulgación pueden comprender, por ejemplo, hasta 1500 o 1600 nucleótidos de la SEQ ID NO: 1 pero preferentemente contienen no más de 1300, no más de 1200, no más de 1100, no más de 1000, no más de 900, no más de 800, no más de 775, no más de 750, no más de 700, no más de 650, no más de 600 o no más de 500 nucleótidos de la SEQ ID NO: 1. Preferentemente, sin embargo, las secuencias de la divulgación comprenden al menos 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 900, 1000, 1100 o 1200 nucleótidos de la SEQ ID NO: 1. Preferentemente, la secuencia de la divulgación deriva del extremo 3' de la SEQ ID NO: 1 e incluye los 500, 600, 650, 700, 750, 800, 900, 1000, 1100 o 1200 nucleótidos contiguos 3' de la SEQ ID NO: 1 o carece sólo de hasta 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 nucleótidos de la SEQ ID NO: 1.
Los promotores preferidos de la divulgación comprenden la secuencia de la SEQ ID NO: 2 o la secuencia de nucleótidos 12-761 de la SEQ ID NO: 2 (los nucleótidos 1-11 de la SEQ ID NO: 2 difieren de la secuencia correspondiente de la SEQ ID NO: 1; este es un artefacto de clonación cuya presencia no resta valor a la actividad específica de RPE pero no es necesaria para ello), normalmente dentro de una secuencia de no más de 800, no más de 850, no más de 900, no más de 1000, no más de 1100 o no más de 1200 nucleótidos contiguos de la SEQ ID NO: 1. Otros promotores preferidos comprenden al menos 750, al menos 700, al menos 650, al menos 600, al menos 550 o al menos 500 nucleótidos contiguos de la SEQ ID NO: 2, preferentemente al menos los 500, 550, 600, 650, 700 o 750 nucleótidos que están en el extremo 3 'de la SEQ ID NO: 2 o al menos los 550, 600, 650, 700 o 750 nucleótidos que comienzan con el nucleótido 12 de la SEQ ID NO: 2.
Otros promotores de la divulgación son promotores que difieren en secuencia de las secuencias anteriores pero que conservan la actividad promotora específica de RPE. Tales secuencias tienen al menos el 75 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % de identidad de secuencia con una secuencia de nucleótidos contiguos de la SEQ ID NO: 1 como se define anteriormente.
El porcentaje de identidad de secuencia de variantes se mide preferentemente sobre la longitud completa de la porción correspondiente de la SEQ ID NO: 1, o sobre una sección de 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100 o 1200 nucleótidos de la SEQ ID NO: 1 alineada con la secuencia variante.
La identidad de secuencia se puede calcular usando cualquier algoritmo adecuado. Por ejemplo, los algoritmos PILEUP y BLAST se pueden usar para calcular la identidad o alinear secuencias (tal como identificar secuencias equivalentes o correspondientes (generalmente en su configuración predeterminada), por ejemplo, como se describe en Altschul S. F. (1993) J Mol Evol 36:290-300; Altschul, S, F et al (1990) J Mol Biol 215:403-10. El programa informático para realizar análisis BLAST está disponible públicamente a través del National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Este algoritmo implica identificar primero un par de secuencias de alta puntuación (HSP, por sus siglas en inglés) identificando palabras cortas de longitud W en la secuencia de consulta que coinciden o satisfacen alguna puntuación de umbral de valor positivo T cuando se alinean con una palabra de la misma longitud en una secuencia de base de datos. T se refiere al umbral de la puntuación de palabra vecina (Altschul et al., supra). Estos aciertos de palabra vecina iniciales actúan como semillas para iniciar búsquedas para encontrar HSP que los contengan. Los aciertos de palabra se extienden en ambas direcciones a lo largo de cada secuencia todo el tiempo que pueda aumentarse la puntuación de alineación acumulativa. Las extensiones de los aciertos de palabra en cada dirección se detienen cuando: la puntuación de alineación acumulativa queda fuera por una cantidad X de su valor máximo obtenido; la puntuación acumulativa llega a cero o menos, debido a la acumulación de una o más alineaciones de restos con puntuación negativa; o se alcanza el final de una de las secuencias. Los parámetros del algoritmo BLAST W, T y X determinan la sensibilidad y velocidad de la alineación. El programa BLASTP usa por defecto una longitud de palabra (W) de 11, la matriz de puntuación BLOSUM62 (véase Henikoff y Henikoff (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915-10919) alineaciones (B) de 50, expectativa (E) de 10, M=5, N =4 y una comparación de ambas cadenas.
El algoritmo BLAST realiza un análisis estadístico de la similitud entre dos secuencias; véase, por ejemplo, Karlin y Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5787. Una medida de la similitud proporcionada por el algoritmo BLAST es la probabilidad de suma más pequeña (P(N)), que proporciona una indicación de la probabilidad por la que se produciría una coincidencia entre dos secuencias polinucleotídicas o aminoácidos por casualidad. Por ejemplo, una secuencia se considera similar a otra secuencia si la probabilidad de suma más pequeña en comparación de la primera secuencia con la segunda secuencia es menos de aproximadamente 1, preferentemente menos de aproximadamente 0,1, más preferentemente menos de aproximadamente 0,01 y, lo más preferentemente, menos de aproximadamente 0,001. Como alternativa, el paquete UWGCG proporciona el programa BESTFIT que puede usarse para calcular la identidad (por ejemplo, usado en su configuración predeterminada) (Devereux et al. (1984) Nucleic Acids Research 12, 387-395).
Un promotor de la divulgación también puede incluir secuencias de nucleótidos adicionales que no se encuentran de manera natural en la región promotora de RPE65. Por lo tanto, la secuencia promotora de la divulgación puede colocarse en cualquier lugar dentro de una secuencia más grande siempre que se conserve la actividad promotora específica de RPE 65. La secuencia adicional puede ser 5' o 3', o ambas, a la secuencia definida anteriormente.
El promotor de la divulgación también se puede usar en tándem con otros elementos reguladores tales como uno o más promotores o potenciadores o regiones de control de locus (LCR, por sus siglas en inglés) adicionales.
Los promotores de la divulgación pueden usarse para impulsar la expresión de genes en el RPE de una manera específica del RPE. La expresión específica del RPE puede definirse como una expresión que solo está presente en el RPE, pero no en otros tipos celulares. La expresión específica del RPE puede definirse como una expresión que es más de aproximadamente 10 veces mayor, 20 veces mayor, 50 veces mayor o 100 o más veces mayor en el RPE que en otros tipos celulares, especialmente las células fotorreceptoras. La expresión en el RPE y otros tipos celulares se puede medir mediante cualquier técnica convencional adecuada conocida por el experto en la materia. Por ejemplo, Los niveles de expresión de ARN se pueden medir mediante PCR cuantitativa en tiempo real. La expresión de proteínas se puede medir mediante transferencia Western o inmunohistoquímica.
Los promotores de la divulgación pueden usarse para impulsar una expresión significativamente aumentada de genes en el RPE. La expresión aumentada significativa se puede definir como más de aproximadamente 10 veces, 20 veces, 50 veces, 100 veces, 200 veces o 300 veces la expresión del gen en el RPE en comparación con la expresión impulsada por el promotor de RPE65 original (Bainbridge et al 2008). La expresión en el RPE y otros tipos celulares se puede medir mediante cualquier técnica convencional adecuada conocida por el experto en la materia. Por ejemplo, Los niveles de expresión de ARN se pueden medir mediante PCR cuantitativa en tiempo real. La expresión de proteínas se puede medir mediante transferencia Western o inmunohistoquímica.
Los promotores de la divulgación pueden usarse para impulsar la expresión de cualquier proteína en el RPE. Los promotores divulgados pueden usarse para impulsar la expresión de proteínas que normalmente no se expresan en el RPE, tal como GFP.
Construcciones de expresión
La presente invención también proporciona construcciones de expresión que comprenden los promotores de la divulgación operativamente unidos a una secuencia que se va a expresar de una manera específica del RPE.
Una construcción de expresión puede definirse como una secuencia polinucleotídica capaz de impulsar la expresión de una proteína a partir de una secuencia polinucleotídica que contiene una secuencia codificante.
Por lo tanto, la construcción de expresión puede comprender, por ejemplo, una secuencia codificante de RPE65, MERTK, LRAT, TYR o GRP143, por ejemplo, un polinucleótido seleccionado de las SEQ ID NO: 3 a 8, o una variante de las SEQ ID NO: 3 a 8 que conserva la funcionalidad de la proteína traducida a partir de la secuencia seleccionada de las SEQ ID NO: 3 a 8.
Una variante de un polinucleótido seleccionado del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 3 a 8 puede definirse como cualquier variante de la secuencia de la SEQ ID NO: 3 a 8, incluyendo variantes de origen natural en la secuencia del ácido nucleico. La variante puede definirse como que tiene al menos aproximadamente un 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia con una cualquiera de las SEQ ID NO: 3 a 8, en donde el polipéptido traducido a partir de la secuencia variante conserva su funcionalidad. La variante puede definirse como que tiene al menos aproximadamente un 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia con una cualquiera de las SEQ ID NO: 3 a 8, en donde el polipéptido traducido a partir de la secuencia variante tiene la capacidad de rescatar la función del RPE. Rescatar la función del RPE se puede definir como rescatar al menos aproximadamente el 50 %, 60 %, 70 %, 80 % 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de la función del RPE. La función del RPE se puede analizar mediante cualquier técnica convencional adecuada conocida por el experto en la materia, por ejemplo, por análisis electrorretinográfico de las respuestas de la retina.
La variante puede definirse como que tiene al menos aproximadamente un 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia con una cualquiera de las SEQ ID NO: 3 a 8, en donde el polipéptido resultante traducido a partir de la secuencia variante es el mismo que el traducido de la SEQ ID NO: 3 a 8.
La expresión "operativamente unido" se refiere a una yuxtaposición en la que los componentes descritos están en una relación que les permite funcionar en su manera prevista. Una secuencia de control "operativamente unida" a una secuencia codificante se une de tal manera que la expresión de la secuencia codificante se consigue en condiciones compatibles con las secuencias de control. Pueden introducirse múltiples copias del mismo o diferente polinucleótido en la construcción de expresión.
La construcción de expresión puede comprender un promotor de la divulgación operativamente unido a la SEQ ID NO: 4.
La "optimización de codones" se refiere al proceso de alterar una secuencia polinucleotídica de origen natural para potenciar la expresión en el organismo diana, por ejemplo, seres humanos. En una realización de la presente invención, el gen RPE65 humano, la SEQ ID nO: 3 se ha optimizado para crear la SEQ ID NO: 4. En el RPE65 optimizado de la SEQ ID NO: 4 se han reemplazado siete codones raros (incluyendo un par en tándem) por los que se producen con más frecuencia y/o los que se encuentran con frecuencia en genes humanos altamente expresados. Además, se eliminaron un sitio de corte y empalme críptico, 4 sitios de poliadenilación prematura críptica y una repetición directa de 50 pares de bases.
Vectores
La presente invención proporciona vectores que comprenden los promotores de la divulgación y construcciones de expresión de la invención. El vector puede ser de cualquier tipo, por ejemplo, puede ser un vector plasmídico o un a Dn de minicírculo.
Generalmente, los vectores de la invención son, sin embargo, vectores víricos. El vector vírico puede basarse en el virus del herpes simple, adenovirus o lentivirus. El vector vírico puede ser un vector de virus adenoasociado (AAV) o un derivado del mismo.
El derivado del vector vírico puede ser un derivado quimérico, reordenado o con cápside modificada.
El vector vírico puede comprender un genoma de AAV a partir de un serotipo, aislado o clado de AAV derivado de forma natural.
El serotipo puede ser, por ejemplo, AAV2, AAV5 o AAV8.
La eficacia de la terapia génica es, en general, dependiente del suministro adecuado y eficaz del ADN donado. Este proceso suele estar mediado por vectores víricos. Los virus adenoasociados (AAV, por sus siglas en inglés), un miembro de la familia de los parvovirus, se utilizan comúnmente en terapia génica. El AAV de tipo silvestre, que contiene genes víricos, insertar su material genómico en el cromosoma 19 de la célula hospedadora (Kotin, et al.
1990). El genoma de ADN monocatenario de AAV comprende dos repeticiones terminales invertidas (ITR, por sus siglas en inglés) y dos marcos de lectura abiertos, que contienen genes estructurales (cap) y de empaquetamiento (rep) (Hermonat et al. 1984).
Para fines terapéuticos, las únicas secuencias necesarias en cis, además del gen terapéutico, son las ITR. Por lo tanto, el virus AAV se modifica: los genes víricos se eliminan del genoma, produciendo AAV recombinante (rAAV). Este contiene solo el gen terapéutico, las dos ITR. La eliminación de los genes víricos hace que el rAAV sea incapaz de insertar de manera activa su genoma en el ADN de la célula hospedadora. En lugar de esto, los genomas de rAAV se fusionan a través de las ITR, formando estructuras circulares, episómicas o se insertan en roturas cromosómicas preexistentes. Para la producción vírica, los genes estructurales y de empaquetamiento, ahora eliminados del rAAV, se suministran en trans, en forma de plásmido auxiliar.
El AAV es un vector particularmente atractivo ya que generalmente no es patógeno; la mayoría de las personas se han infectado con este virus durante su vida sin efectos adversos (Erles et al. 1999). A pesar de esto, existen varios inconvenientes en el uso de rAAV en terapia génica, aunque la mayoría de estos solo se aplican a la administración sistémica de rAAV. No obstante, es importante reconocer estas posibles limitaciones, incluso si no es directamente relevante para la administración ocular de rAAV. La infección puede desencadenar las siguientes respuestas inmunitarias:
Como la mayoría de la población humana es seropositiva para AAV, los anticuerpos neutralizantes contra el rAAV pueden afectar al suministro de genes (Moskalenko et al. 2000; Sun et al. 2003).
El rAAV suministrado sistémicamente puede desencadenar una respuesta de linfocitos T dirigida a las proteínas de la cápside, conduciendo a la apoptosis de las células transducidas (Manno et al. 2006).
Los vectores rAAV pueden desencadenar la activación del complemento (Zaiss et al. 2008).
Como el suministro de rAAV generalmente no es específico, el vector puede acumularse en el hígado (Michelfelder et al. 2009).
El privilegio inmunitario del tejido ocular, como resultado de barreras anatómicas y factores inmunomoduladores, deja al ojo en gran parte exento de las respuestas inmunitarias adversas enumeradas anteriormente (Taylor 2009).
Los vectores AAV están limitados por una capacidad de empaquetamiento relativamente pequeña de aproximadamente 4,8 kb y un inicio lento de la expresión después de la transducción (Dong et al. 1996). A pesar de estos pequeños inconvenientes, el AAV se ha convertido en el vector vírico más habitualmente utilizado para la terapia génica de la retina.
La mayoría de las construcciones de vectores se basan en el serotipo 2 de AAV (AAV2). El AAV2 se une a las células diana a través del receptor de proteoglicanos de heparán sulfato (Summerford y Samulski 1998). El genoma de AAV2, como los de todos los serotipos de AAV, puede estar encerrado en varias proteínas de la cápside diferentes. AAV2 se puede empaquetar en su cápside de a AV2 natural (AAV2/2) o se puede pseudotipificar con otras cápsides (por ejemplo, genoma de AAV2 en la cápside de AAV1; AAV2/1, genoma de a Av 2 en la cápside de AAV5; AAV2/5 y genoma de AAV2 en la cápside de a Av 8; AAV2/8).
El rAAV transduce células mediante endocitosis mediada por receptores específicos de serotipos. Un factor importante que influye en la cinética de la expresión transgénica de rAAV es la tasa de pérdida de recubrimiento de partículas de virus dentro del endosoma (Thomas et al. 2004). Esto, a su vez, depende del tipo de cápside que encierra el material genético (Ibid.). Después de desprender el genoma de rAAV lineal monocatenario se estabiliza formando una molécula bicatenaria a través de síntesis de novo de una hebra complementaria (Vincent-Lacaze et al. 1999). El uso de ADN autocomplementario puede evitar esta etapa al producir a Dn transgénico bicatenario. Natkunarajah et al. encontró que la expresión génica de AAV2/8 autocomplementaria era de inicio más rápido y de mayor amplitud, en comparación con AAV2/8 monocatenario (2008). Por lo tanto, evitando el desfase de tiempo asociado con la síntesis de la segunda hebra, aumentan los niveles de expresión génica, en comparación con la expresión transgénica de construcciones monocatenarias convencionales. Estudios posteriores que investigaron el efecto del ADN autocomplementario en otros pseudotipos de AAV (por ejemplo, AAV2/5) han producido resultados similares (Kong et al. 2010; Petersen-Jones et al. 2009). Una advertencia a esta técnica es que, ya que AAV tiene una capacidad de empaquetamiento de aproximadamente 4,8 kb, el genoma recombinante autocomplementario debe tener el tamaño apropiado (es decir, 2,3 kb o menos).
Además de modificar la capacidad de empaquetamiento, la pseudotipificación del genoma de AAV2 con otras cápsides de AAV puede alterar la especificidad celular y la cinética de la expresión transgénica. Por ejemplo, cuando AAV2 está pseudotipificado con la cápside de AAV4, la expresión del transgén se dirige específicamente a las células RPE (Le Meur et al. 2007). Además, Se informa que AAV2/8 transduce fotorreceptores de manera más eficaz que AAV2/2 o AAV2/5 (Natkunarajah et al. 2008).
Genoma de AAV
El vector de la invención puede comprender un genoma de virus adenoasociado (AAV) o un derivado del mismo.
Un genoma de AAV es una secuencia polinucleotídica que codifica las funciones necesarias para la producción de una partícula vírica de AAV. Estas funciones incluyen aquellas que operan en el ciclo de replicación y empaquetamiento para AAV en una célula hospedadora, incluyendo la encapsidación del genoma de AAV en una partícula vírica de AAV. Los virus AAV de origen natural son defectuosos en la replicación y dependen de que se proporcionen las funciones auxiliares en trans para completar un ciclo de replicación y empaquetamiento. En consecuencia y con la eliminación adicional de loa genes rep y cap de AAV, el genoma de AAV del vector de la invención tiene replicación defectuosa.
El genoma de AAV puede estar en forma monocatenaria, de sentido positivo o negativo, o como alternativa en forma bicatenaria. El uso de una forma bicatenaria permite evitar la etapa de replicación de ADN en la célula diana y de esa manera puede acelerar la expresión transgénica.
El genoma de AAV puede ser de cualquier serotipo o aislado o clado derivado de forma natural de AAV. Como saben los expertos en la materia, los virus AAV que se producen en la naturaleza pueden clasificarse de acuerdo con diversos sistemas biológicos.
Habitualmente, los virus AAV se denominan en términos de su serotipo. Un serotipo corresponde a una subespecie variante de AAV que debido a su perfil de expresión de antígenos superficiales de la cápside tiene una reactividad distintiva que puede usarse para distinguirlo de otras subespecies variantes. Generalmente, un virus que tiene un serotipo de AAV particular no reacciona de forma cruzada de manera eficaz con anticuerpos neutralizantes específicos para cualquier otro serotipo de AAV. Los serotipos de AAV incluyen AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV 10 y AAV11, también serotipos recombinantes, tales como Rec2 y Rec3, recientemente identificados de cerebro de primates. En vectores de la invención, el genoma puede derivar de cualquier serotipo de AAV. La cápside también puede derivar de cualquier serotipo de AAV. El genoma y la cápside pueden derivar del mismo serotipo o de serotipos diferentes.
En vectores de la invención, se prefiere que el genoma derive del serotipo 2 de AAV (AAV2), serotipo 4 de AAV (AAV4), serotipo 5 de AAV (AAV5) o serotipo 8 de AAV (AAV8). Lo más preferido es que el genoma derive de AAV2, pero otros serotipos de particular interés para su uso en la invención incluyen AAV4, AAV5 y AAV8, que transducen eficazmente el tejido en el ojo, tal como el epitelio pigmentario de la retina. Se prefiere que la cápside derive de AAV5 o AAV8.
Pueden encontrarse revisiones de los serotipos de AAV en Choi et al. (Curr Gene Ther. 2005; 5(3); 299-310) y Wu et al (Molecular Therapy. 2006; 14(3), 316-327). Las secuencias de los genomas de AAV o de los elementos de los genomas de AAV incluyendo las secuencias ITR, los genes rep o cap para su uso en la invención pueden obtenerse de los siguientes números de registro para secuencias de genoma completo de AAV: Virus adenoasociado 1 NC_002077, AF063497; Virus adenoasociado 2 NC_001401; Virus adenoasociado 3 NC_001729; Virus adenoasociado 3B NC_001863; Virus adenoasociado 4 NC_001829; Virus adenoasociado 5 Y18065, AF085716; Virus adenoasociado 6 NC_001862; AAV aviar ATCC VR-865 AY186198, AY629583, NC_004828; AAV aviar cepa DA-1 NC_006263, AY629583; AAV bovino NC_005889, AY388617.
Los virus AAV también pueden denominarse en términos de clados o clones. Esto se refiere a la relación filogenética de virus AAV derivados de forma natural, y normalmente a un grupo filogenético de virus AAV que pueden rastrearse hasta un ancestro común, e incluye todos los descendientes del mismo. Adicionalmente, los virus AAV pueden denominarse en términos de un aislado específico, es decir, un aislado genético de un virus AAV específico encontrado en la naturaleza. La expresión aislado genético describe una población de virus AAV que ha experimentado mezcla genética limitada con otros virus AAV de origen natural, definiendo de ese modo una población reconociblemente distintiva a nivel genético.
Ejemplos de clados y de aislados de AAV que pueden usarse en la invención incluyen:
Clado A: AAV1 NC_002077, AF063497, AAV6 NC_001862, Hu. 48 AY530611, Hu 43 AY530606, Hu 44 AY530607, Hu 46 AY530609
Clado B: Hu. 19 AY530584, Hu. 20 AY530586, Hu 23 AY530589, Hu22 AY530588, Hu24 AY530590, Hu21 AY530587, Hu27 AY530592, Hu28 AY530593, Hu 29 AY530594, Hu63 AY530624, Hu64 AY530625, Hu13 AY530578, Hu56 AY530618, Hu57 AY530619, Hu49 AY530612, Hu58 AY530620, Hu34 AY530598, Hu35 AY530599, AAV2 NC_001401, Hu45 AY530608, Hu47 AY530610, Hu51 AY530613, Hu52 AY530614, Hu T41 AY695378, Hu S17 AY695376, Hu T88 AY695375, Hu T71 AY695374, Hu T70 AY695373, Hu T40 AY695372, Hu T32 AY695371, Hu T17 AY695370, Hu LG15 AY695377,
Clado C: Hu9 AY530629, Hu10 AY530576, Hu11 AY530577, Hu53 AY530615, Hu55 AY530617, Hu54 AY530616, Hu7 AY530628, Hu18 AY530583, Hu15 AY530580, Hu16 AY530581, Hu25 AY530591, Hu60 AY530622, Ch5 AY243021, Hu3 AY530595, Hu1 AY530575, Hu4 AY530602 Hu2, AY530585, Hu61 AY530623
Clado d: Rh62 AY530573, Rh48 AY530561, Rh54 AY530567, Rh55 AY530568, Cy2 AY243020, AAV7 AF513851, Rh35 AY243000, Rh37 AY242998, Rh36 AY242999, Cy6 AY243016, Cy4 AY243018, Cy3 AY243019, Cy5 AY243017, Rh13 AY243013
Clado E: Rh38 AY530558, Hu66 AY530626, Hu42 AY530605, Hu67 AY530627, Hu40 AY530603, Hu41 AY530604, Hu37 AY530600, Rh40 AY530559, Rh2 AY243007, Bb1 AY243023, Bb2 AY243022, Rh10 AY243015, Hu17 AY530582, Hu6 AY530621, Rh25 AY530557, Pi2 AY530554, Pi1 AY530553, Pi3 AY530555, Rh57 AY530569, Rh50 AY530563, Rh49 AY530562, Hu39 AY530601, Rh58 AY530570, Rh61 AY530572, Rh52 AY530565, Rh53 AY530566, Rh51 AY530564, Rh64 AY530574, Rh43 AY530560, AAV8 AF513852, Rh8 AY242997, Rh1 AY530556 Clado F: Hu14 (AAV9) AY530579, Hu31 AY530596, Hu32 AY530597, aislado clonal AAV5 Y18065, AF085716, AAV 3 NC_001729, AAV 3B NC_001863, AAV4 NC_001829, Rh34 AY243001, Rh33 AY243002, Rh32 AY243003/
Los expertos en la materia pueden seleccionar un serotipo, clado, clon o aislado apropiado de AAV para su uso en la presente invención basándose en su conocimiento general común.
Debe entenderse, sin embargo, que la invención también abarca el uso de un genoma de AAV de otros serotipos que pueden no haberse identificado o caracterizado aún. El serotipo de AAV determina la especificidad tisular de infección (o tropismo) de un virus AAV. Por consiguiente, los serotipos de AAV preferidos para su uso en virus AAV administrados a pacientes de acuerdo con la invención son aquellos que tienen tropismo natural por o una alta eficacia de infección de células diana dentro del RPE.
Generalmente, el genoma de AAV de un serotipo o aislado o clado obtenido de forma natural de AAV comprende al menos una secuencia de repetición terminal invertida (ITR). Los vectores de la invención generalmente comprenden dos ITR, preferentemente una en cada extremo del genoma. Una secuencia ITR actúa en cis para proporcionar un origen de replicación funcional, y permite la integración y escisión del vector a partir del genoma de una célula. Las secuencias ITR preferidas son las de AAV2 y variantes de las mismas. El genoma de AAV generalmente comprende genes de empaquetamiento, tales como los genes rep y/o cap que codifican las funciones de empaquetamiento para una partícula vírica de AAV. El gen rep codifica una o más de las proteínas Rep78, Rep68, Rep52 y Rep40 o variantes de las mismas. El gen cap codifica una o más proteínas de la cápside tales como VP1, VP2 y VP3 o variantes de las mismas. Estas proteínas componen la cápside de una partícula vírica de AAV. Las variantes de cápside se analizan a continuación.
Preferentemente, el genoma de AAV se derivatizará con fines de administración a los pacientes. Dicha derivatización es convencional en la técnica y la presente invención abarca el uso de cualquier derivado conocido de un genoma de AAV, y derivados que pudieran generarse aplicando técnicas conocidas en la técnica. La derivatización del genoma de AAV y de la cápside de AAV se revisan en Coura y Nardi (Virology Journal, 2007, 4:99), y en Choi et al y Wu et al, mencionados anteriormente.
Los derivados de un genoma de AAV incluyen cualquier forma truncada o modificada de un genoma de AAV que permite la expresión de un transgén Rep-1 a partir de un vector de la invención in vivo. Generalmente, es posible truncar el genoma de AAV de forma significativa para que incluya una secuencia vírica mínima, que aún conserve la función anterior. Esto es preferido por motivos de seguridad para reducir el riesgo de recombinación del vector con el virus de tipo silvestre, y también para evitar desencadenar una respuesta inmunitaria celular por la presencia de proteínas de genes víricos en la célula diana.
Generalmente, un derivado incluirá al menos una secuencia de repetición terminal invertida (ITR), preferentemente más de una ITR, tal como dos ITR o más. Una o más de las ITR pueden obtenerse de genomas de AAV que tienen diferentes serotipos, o pueden ser una ITR quimérica o mutante. Una ITR mutante preferida es una que tiene una eliminación de un trs (sitio de resolución terminal). Esta eliminación permite la replicación continuada del genoma para generar un genoma monocatenario que contiene tanto secuencias codificantes como secuencias complementarias, es decir, un genoma de AAV autocomplementario. Esto permite evitar la replicación de ADN en la célula diana, y además posibilita la expresión transgénica acelerada.
La una o más ITR flanquearán preferentemente el casete de construcción de expresión que contiene el promotor y el transgén de la invención. Se prefiere la inclusión de una o más ITR para ayudar al empaquetamiento del vector de la invención en partículas víricas. En realizaciones preferidas, los elementos de ITR serán las únicas secuencias conservadas del genoma de AAV natural en el derivado. Por lo tanto, un derivado preferentemente no incluirá los genes rep y/o cap del genoma natural y cualquier otra secuencia del genoma natural. Esto se prefiere, por las razones descritas anteriormente, y también para reducir la posibilidad de integración del vector en el genoma de la célula hospedadora. Adicionalmente, la reducción del tamaño del genoma de AAV permite una flexibilidad aumentada en la incorporación de otros elementos de secuencia (tales como elementos reguladores) dentro del vector además del transgén.
Con referencia al genoma de AAV2, las siguientes porciones, por lo tanto, podrían eliminarse en un derivado de la invención: Una secuencia de repetición terminal invertida (ITR), los genes de replicación (rep) y de la cápside (cap). Sin embargo, en algunas realizaciones, incluyendo realizaciones in vitro, los derivados pueden incluir uno o más genes rep y/o cap u otras secuencias víricas de un genoma de AAV.
Un derivado puede ser un derivado quimérico, reordenado o de cápside modificada de uno o más virus AAV de origen natural. La invención abarca el suministro de secuencias de proteínas de la cápside de diferentes serotipos, clados, clones o aislados de AAV dentro del mismo vector. La invención abarca el empaquetamiento del genoma de un serotipo en la cápside de otro serotipo, es decir, la pseudotipificación.
Los derivados quiméricos, reordenados o de cápside modificada se seleccionarán generalmente para proporcionar una o más funcionalidades deseadas para el vector vírico. Por lo tanto, estos derivados pueden presentar una eficacia aumentada de suministro génico, inmunogenicidad (humoral o celular) disminuida, un intervalo de tropismo alterado y/o direccionamiento mejorado de un tipo celular particular en comparación con un vector vírico de AAV que comprende un genoma de AAV de origen natural, tal como el de AAV2. La eficacia aumentada de suministro génico puede efectuarse por unión mejorada al receptor o correceptor en una superficie celular, internalización mejorada, tráfico mejorado dentro de la célula y al núcleo, pérdida del recubrimiento de la partícula vírica y conversión mejorada de un genoma monocatenario en una forma bicatenaria. La eficacia aumentada también puede referirse a un intervalo de tropismo o direccionamiento alterado a una población celular específica, de modo que la dosis del vector no se diluya por la administración a tejidos donde no se necesita.
Las proteínas de la cápside quiméricas incluyen aquellas generadas por recombinación entre dos o más secuencias codificantes de la cápside de serotipos de AAV de origen natural. Esto puede realizarse, por ejemplo, mediante un enfoque de rescate de marcadores en que se cotransfectan secuencias de cápside no infecciosas de un serotipo con secuencias de cápside de un serotipo diferente, y se usa selección directa para seleccionar secuencias de cápside que tengan propiedades deseadas. Las secuencias de la cápside de los diferentes serotipos pueden alterarse por recombinación homóloga dentro de la célula para producir proteínas de cápside quiméricas novedosas.
Las proteínas de cápside quiméricas también incluyen aquellas generadas por genomanipulación de secuencias de proteínas de cápside para transferir dominios proteínicos de cápside específicos, bucles superficiales o restos de aminoácidos específicos entre dos o más proteínas de cápside, por ejemplo, entre dos o más proteínas de cápside de diferentes serotipos.
Las proteínas de cápside reordenadas o quiméricas también pueden generarse por reordenamiento del ADN o por PCR propensa a errores. Pueden crearse genes de cápside de AAV híbridos por fragmentación aleatoria de las secuencias de genes de AAV relacionados, p. ej., aquellos que codifican proteínas de cápside de múltiples serotipos diferentes y después volviendo a ensamblar posteriormente los fragmentos en una reacción de polimerasa de autocebado, que también puede causar entrecruzamientos en regiones de homología de secuencia. Puede explorarse una biblioteca de genes de AAV híbridos creados de esta manera por reordenamiento de genes de cápside de varios serotipos para identificar clones víricos que tengan una funcionalidad deseada. De manera similar, puede usarse PCR propensa a errores para mutar de forma aleatoria genes de la cápside de AAV para crear una biblioteca diversa de variantes que después pueden seleccionarse para una propiedad deseada.
Las secuencias de los genes de la cápside también pueden modificarse genéticamente para introducir eliminaciones, sustituciones o inserciones específicas con respecto a la secuencia de tipo silvestre natural. En particular, los genes de la cápside pueden modificarse por la inserción de una secuencia de una proteína o péptido no relacionados dentro de un marco de lectura abierto de una secuencia codificante de la cápside, o en el extremo N y/o C de una secuencia codificante de la cápside.
La proteína o péptido no relacionados puede ser ventajosamente uno que actúe como ligando para un tipo celular particular, confiriendo de ese modo unión mejorada a una célula diana o mejorando la especificidad del direccionamiento del vector a una población celular particular.
La proteína no relacionada también puede ser una que ayude a la purificación de la partícula vírica como parte del proceso de producción, es decir, una epítopo o etiqueta de afinidad. El sitio de inserción generalmente se seleccionará para que no interfiera con otras funciones de la partícula vírica, p. ej., internalización, tráfico de la partícula vírica. Los expertos en la materia pueden identificar sitios adecuados para la inserción basándose en su conocimiento general común. Se divulgan sitios particulares en Choi et al., mencionados anteriormente.
La invención abarca además el suministro de secuencias de un genoma de AAV en un orden y configuración diferentes a los de un genoma de AAV natural. La invención también abarca el remplazo de una o más secuencias o genes de AAV con secuencias de otro virus o con genes quiméricos compuestos de secuencias de más de un virus. Dichos genes quiméricos pueden estar compuestos de secuencias de dos o más proteínas víricas relacionadas de especies víricas diferentes.
El vector de la invención toma la forma de un vector vírico que comprende los promotores divulgados y las construcciones de expresión de la invención.
Para disipar cualquier duda, la invención también proporciona una partícula vírica de AAV que comprende un vector de la invención. Las partículas de AAV de la invención incluyen formas de cápside intercambiada en las que un genoma o derivado de AAV que tiene una ITR de un serotipo se empaqueta en la cápside de un serotipo diferente. Las partículas de AAV de la invención también incluyen formas de mosaico en las que una mezcla de proteínas de cápside no modificadas de dos o más serotipos diferentes compone la envuelta vírica. La partícula de AAV también incluye formas modificadas químicamente que albergan ligandos adsorbidos a la superficie de la cápside. Por ejemplo, dichos ligandos pueden incluir anticuerpos para dirigirlos a un receptor de superficie celular particular.
La invención proporciona además una célula hospedadora que comprende un vector o partícula vírica de AAV de la invención.
Preparación de vector
El vector de la invención puede prepararse por medios convencionales conocidos en la técnica para el suministro de vectores para terapia génica. Por lo tanto, pueden usarse métodos bien establecidos y públicos de transfección de dominios, empaquetamiento y purificación para preparar una preparación de vector adecuada.
Como se analiza anteriormente, un vector de la invención puede comprender el genoma completo de un virus AAV de origen natural además de un promotor de la divulgación o una variante del mismo. Sin embargo, habitualmente se usará un genoma derivatizado, por ejemplo, un derivado que tiene al menos una secuencia de repetición terminal invertida (ITR), pero que puede carecer de cualquiera de los genes de AAV tales como rep o cap.
En dichas realizaciones, para proporcionar el ensamblaje del genoma derivatizado en una partícula vírica de AAV, se proporcionarán construcciones genéticas adicionales que proporcionan las funciones de virus AAV y/o auxiliares en una célula hospedadora en combinación con el genoma derivatizado. Estas construcciones adicionales generalmente contendrán genes que codifican proteínas estructurales de la cápside de AAV, es decir, cap, VP1, VP2, VP3 y genes que codifican otras funcione necesarias para el ciclo vital de AAV, tales como rep. La selección de las proteínas estructurales de la cápside proporcionadas en la construcción adicional determinará el serotipo del vector vírico empaquetado.
Un vector vírico empaquetado particularmente preferido para su uso en la invención comprende un genoma derivatizado de AAV2 en combinación con proteínas de la cápside de AAV5 o AAV8.
Tal como se menciona anteriormente, los virus AAV son de replicación incompetente y por tanto generalmente también se proporcionarán funciones víricas auxiliares, preferentemente funciones de adenovirus auxiliares en una o más construcciones adicionales para permitir la replicación de AAV.
Todas las construcciones adicionales anteriores pueden proporcionarse como plásmidos u otros elementos episómicos en la célula hospedadora, o como alternativa pueden integrarse una o más construcciones en el genoma de la célula hospedadora.
Las secuencias promotoras de la divulgación tienen la capacidad de rescatar la pérdida de la función del RPE, que puede producirse, por ejemplo, por mutaciones en el gen RPE65. "Rescate" generalmente significa cualquier mejora o ralentización de la progresión de un fenotipo de distrofia de la retina, por ejemplo, restaurar la presencia de la proteína RPE65 en el RPE, mejorar la actividad de ERG o ralentizar la pérdida de actividad de ERG, mejorar la sensibilidad de la retina o ralentizar/detener la pérdida progresiva de la sensibilidad de la retina, ralentizar o detener la pérdida de células fotorreceptoras, mejorar la visión o ralentizar/detener la pérdida de visión.
Las propiedades de los promotores de la divulgación también se pueden probar usando técnicas basadas en las de los Ejemplos. En particular, una secuencia de la invención puede ensamblarse en un vector de la invención y suministrarse a la retina de un animal de prueba deficiente en RPE65, tal como un ratón, y observarse los efectos y compararlos con un control. Preferentemente, el control será el otro ojo del mismo animal, que no se trata o se trata con un vector de control tal como uno que contenga un gen indicador en oposición a una secuencia de la invención. El análisis por electrorretinografía de las respuestas de la retina a la luz se puede utilizar para confirmar que las células fotorreceptoras de los ojos que se tratan son más sensibles a la luz que los fotorreceptores de los ojos que no se tratan o se tratan con un vector de control. La sensibilidad a la luz del ojo tratado puede ser, por ejemplo, al menos 1,1, 1,2, 1,5, 2, 5, 10, 20, 50, 100, 200, 500 o 1000 veces mayor que la del ojo no tratado o tratado con control.
Métodos de tratamiento y usos médicos
Los promotores de la divulgación se pueden usar para tratar la distrofia de la retina, en particular LCA. Esto proporciona un medio por el que el proceso degenerativo de la enfermedad puede tratarse, detenerse, paliarse o prevenirse.
Por lo tanto, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende el vector de la invención y un transportador farmacéuticamente aceptable.
La invención también proporciona un vector para su uso en un método para prevenir o tratar distrofia de la retina.
También se divulga el uso de un vector de la invención en la fabricación de un medicamento para el tratamiento o la prevención de la distrofia de la retina.
También se divulga un método para tratar o prevenir la distrofia de la retina en un paciente que lo necesita, que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un vector de la invención al paciente.
También se divulga un método para tratar o prevenir la distrofia de la retina en un paciente que lo necesita, en el que la distrofia de la retina es amaurosis congénita de Leber (LCA), degeneración macular relacionada con la edad (AMD), albinismo ocular oculocutáneo de tipo 1 o tipo Nettleship-Falls o deficiencia de MERTK.
De acuerdo con la invención, en general, se prefiere el tratamiento con RPE65. Más particularmente, se prefiere que la LCA se trate con vectores que expresan una secuencia codificante de RPE65 o LRAT, la AMD con vectores que expresan genes cuyas proteínas expresadas suprimen el crecimiento de los vasos sanguíneos o reducen o previenen la apoptosis del r Pe , el albinismo ocular con una secuencia codificante de tirosinasa o GRP143 y la deficiencia de MERTK con una secuencia codificante de MERTK.
En general, se prefiere el suministro directo retiniano, subretiniano o intravítreo de vectores de la invención, generalmente por inyección. Por lo tanto, se prefiere el suministro a la retina, al espacio subretiniano o al espacio intravítreo.
Por tanto, la divulgación también proporciona un método para tratar o prevenir la distrofia de la retina en un paciente que lo necesita, que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un vector de la invención al paciente, por inyección directa retiniana, subretiniana o intravítrea. Por consiguiente, la distrofia de la retina se trata o previene de ese modo en dicho paciente.
En un aspecto relacionado, la invención proporciona el uso de un vector de la invención en un método de tratamiento o prevención de la distrofia de la retina mediante administración de dicho vector a un paciente por inyección directa retiniana, subretiniana o intravítrea. También se divulga el uso de un vector de la invención en la fabricación de un medicamento para tratar o prevenir la distrofia de la retina por inyección directa retiniana, subretiniana o intravítrea.
La invención también proporciona un vector para su uso en donde dicho vector se administra directamente en la retina, en el espacio subretiniano o en el espacio intravítreo.
En todas estas realizaciones, el vector de la invención puede administrarse para prevenir la aparición de uno o más síntomas de distrofia de la retina. El paciente puede ser asintomático. El sujeto puede tener una predisposición a la enfermedad. El método o uso puede comprender una etapa de identificación de si un sujeto está en riesgo de desarrollar o tiene, distrofia de la retina. Se administra una cantidad profilácticamente eficaz del vector a dicho sujeto. Una cantidad profilácticamente eficaz es una cantidad que previene la aparición de uno o más síntomas de la enfermedad.
Como alternativa, el vector puede administrarse una vez han aparecido los síntomas de la enfermedad en un sujeto, es decir, para curar los síntomas existentes de la enfermedad. Se administra una cantidad terapéuticamente eficaz del antagonista a dicho sujeto. Una cantidad terapéuticamente eficaz es una cantidad que es eficaz para mejorar uno o más síntomas de la enfermedad.
El sujeto puede ser hombre o mujer. El sujeto se identifica preferentemente, en riesgo de, o que tiene, la enfermedad.
La administración del vector generalmente es por inyección retiniana o subretiniana directa. Esto incluye el suministro directo a las células del RPE. El suministro se realiza generalmente directamente a o de forma subrretiniana a la retina en degeneración en un paciente que padece distrofia de la retina. El vector puede transducir las células diana anteriores sin entrar en ninguna de las otras poblaciones celulares. También puede usarse inyección intravítrea para suministrar el vector de la invención. El suministro puede no ser subretiniano y puede no ser por inyección subretiniana. El suministro puede no ser transvítreo.
La dosis de un vector de la invención puede determinarse de acuerdo con diversos parámetros, especialmente de acuerdo con la edad, el peso y el estado del paciente a tratar; la vía de administración; y el régimen necesario. De nuevo, un médico será capaz de determinar la vía de administración necesaria y la dosificación para cualquier paciente particular.
Una dosis única típica es entre 1010 y 1012 partículas de genoma, dependiendo de la cantidad de tejido retiniano restante que necesita transducción. Una partícula de genoma se define en el presente documento como una cápside de AAV que contiene una molécula de ADN monocatenario que puede cuantificarse con un método específico de secuencia (tal como PCR en tiempo real). Esa dosis puede proporcionarse como una única dosis, pero puede repetirse para el otro ojo o en casos donde el vector puede no haberse dirigido a la región correcta de la retina por cualquier razón (tal como complicación quirúrgica). El tratamiento es preferentemente un único tratamiento permanente para cada ojo, pero pueden considerarse inyecciones repetidas, por ejemplo, en años futuros y/o con diferentes serotipos de AAV.
Células hospedadoras
Puede usarse cualquier célula hospedadora adecuada para producir los vectores de la invención. En general, dichas células serán células de mamífero transfectadas, pero también se pueden usar otros tipos celulares, por ejemplo, células de insectos. En términos de sistemas de producción de células de mamíferos, se prefieren HEK293 y HEK293T para los vectores de AAV. También se pueden usar células BHK o CHO.
Composiciones Farmacéuticas y Dosificaciones
El vector de la invención puede formularse en composiciones farmacéuticas. Estas composiciones pueden comprender, además del vector, un excipiente, transportador, tampón, estabilizador farmacéuticamente aceptable u otros materiales bien conocidos por los expertos en la materia. Dichos materiales no deben ser tóxicos y no deben interferir con la eficacia del principio activo. La naturaleza precisa del transportador u otro material puede determinarse por los expertos de acuerdo con la vía de administración, es decir, en este caso inyección directa retiniana, subretiniana o intravítrea.
La composición farmacéutica normalmente está en forma líquida. Las composiciones farmacéuticas líquidas incluyen, en general, un transportador líquido tal como agua, petróleo, aceites animales o vegetales, aceite mineral o aceite sintético. Puede incluirse solución salina fisiológica, cloruro de magnesio, dextrosa u otra solución de sacáridos o glicoles tales como etilenglicol, propilenglicol o polietilenglicol. En algunos casos, también se puede usar un tensioactivo, tal como ácido plurónico (PF68) al 0,001 %.
Para la inyección en el sitio afectado, el principio activo estará en forma de una solución acuosa que es apirógena y tiene pH, isotonicidad y estabilidad adecuados. Los expertos pertinentes en la materia serán muy capaces de preparar soluciones adecuadas utilizando, por ejemplo, vehículos isotónicos tales como inyección de cloruro de sodio, inyección de Ringer, inyección de Ringer lactato, solución de Hartmann. Pueden incluirse conservantes, estabilizantes, tampones, antioxidantes y/u otros aditivos, según sea necesario.
Para liberación retardada, el vector puede incluirse en una composición farmacéutica que se formula para liberación lenta, tal como en microcápsulas formadas de polímeros biocompatibles o en sistemas de transportadores liposómicos de acuerdo con métodos conocidos en la técnica.
Las dosis y las pautas posológicas se pueden determinar dentro de la experiencia normal del médico responsable de la administración de la composición.
Terapias de combinación
Los promotores, construcciones de expresión, vectores y/o composiciones farmacéuticas se pueden usar en combinación con cualquier otra terapia para el tratamiento o la prevención de la distrofia de la retina.
Kits
Los promotores, construcciones de expresión, vectores y/o composiciones farmacéuticas se pueden empaquetar en un kit.
Ejemplos
Materiales y métodos
Construcciones de plásmidos
Para crear fragmentos del promotor de RPE65, el promotor de RPE65 humano de 'longitud completa' (pb 1556 a 23 - Nicolletti et al. 1998, Le Meur et al. 2007) se clonó en el plásmido precursor pD10.CMV.eGFP, creando la construcción de plásmido pD10/prom.RPE65eGFP. Los sitios de restricción se identificaron mediante CloneManager®. Se seleccionaron tres modificaciones de restricción, incluyendo: Nsi1, Acc1 y Bg1II. pD10/prom.RPE65eGFP se digirió a la temperatura apropiada durante al menos 1 hora en tampones apropiados. A continuación, los productos se ejecutaron en un gel al 0,8 % durante 40-60 minutos, y las bandas correctas se extrajeron utilizando el kit de extracción de gel NBS® Spin Column (NBS Biological Ltd, Cambridgeshire, RU) y se unieron (después de la formación de extremos romos si era necesario). Los productos de unión se transformaron en E-coli (células competentes - Bioline) incubadas durante 30-60 minutos en Medios Soc (Invitrogen), después se sembró en placas LB/Agar con ampicilina para la incubación durante la noche a 37 °C. Las colonias se recogieron y se cultivaron en medio LB al 12,5 % (ampicilina 1/1000) durante la noche. El ADN se extrajo de estas preparaciones bacterianas usando el kit GenElute™ Plasmid Miniprep (Sigma Aldrich). El ADN se digirió al menos dos veces para determinar la construcción de plásmido correcta. Las enzimas utilizadas para crear nuevas construcciones de plásmidos fueron las siguientes: Nsi1 y Acc1 para 'NA-RPE65.eGFP', Bg111 para 'Bg1II-PPE65.eGFP.
Para el estudio de construcción de genes optimizada, el pD10/CMV.SV40.kozak.RPE65opti se creó clonando la secuencia de RPE65 humano con codón, intrón y Kozak optimizados a partir de un plásmido pUC57 (producido por GenScript) en el plásmido pD10 que contiene el promotor CMV, pD10.CMV.eGFP (Sunkel-Laing y Buch, investigación no publicada). A continuación, se clonó el promotor de RPE65 de "longitud completa" en el plásmido que llevaba la construcción optimizada.
Optimización de codones
La optimización de codones se logró a través de la herramienta de optimización de codones OptimumGeneTM patentada de GenScript.
Protocolo de producción de virus AAV2/8
El virus de serotipo 8 de AAV2 recombinante se produjo usando el método de triple transfección de células 293T descrito previamente (Gao et al. 2002). Se transfectaron placas de 145 cm2 de placas de células 293T (20 placas por lote de virus) con una mezcla que comprendía Plásmido de interés: Plásmido de cápside vírica: ADN de plásmido auxiliar en una relación de 1:1:3, polietilenimina (PEI - Polysciences Inc., Eppelheim, Alemania) y DMEM después de una incubación de 10 minutos. Las células transfectadas se colocaron en lecho durante 24 horas. 48 horas después de la transfección, las células se recogieron, se concentraron por centrifugación, se resuspendieron en tampón TD (NaCl 140 mM, KCl 5 mM, 0,7 mM K2HPO4, MgCl 3,5 mM2, Base Tris 25 mM [pH = 7,5]). Esta se lisa después mediante 3-4 ciclos de congelación-descongelación, seguido de tratamiento con Benzonase (Sigma Aldrich, Dorset, RU), y después se eliminaron los restos celulares mediante sucesivas etapas de centrifugación y filtración con jeringa.
La purificación se realizó mediante cromatografía de intercambio iónico (utilizando un método basado en el de Davidoff et al. 2004). El eluato se concentró en un tubo concentrador Vivaspin 4 de 10 kDa (Sartorius Stedim Biotech, Fisher Scientific, Loughborough, RU), se lavó en PBS-MK, después se concentró a un volumen de 100-150 pl, después se dividió en alícuotas para almacenamiento a -80 °C (largo plazo) o 4 °C (corto plazo).
Transfección de 293T
Una placa de150 cm3 de células HEK-293T se dividió en una placa de 16 pocillos. Cada pocillo se transfectó usando 0,5 pg del ADN plasmídico deseado y 2 pg de PEI y se dejó en el lecho durante ~ 60 horas. Después se recogieron las células usando el émbolo de la jeringa, se centrifugaron después a 14.000 rpm para sedimentar.
Inmunohistoquímica
Los ojos se prepararon para la fijación mediante perforación de la córnea y después se sumergieron en paraformaldehído al 1 % (PFA, pH 7,4, usando volúmenes diminutos de cacodilato de sodio-HCl 0,07 M). Los ojos se dejaron fijar a temperatura ambiente durante una hora, antes de sacarlos de la solución y sumergirlos completamente en la matriz de embebido a temperatura de corte óptima (OCT, por sus siglas en inglés), con la parte anterior-posterior del ojo suspendida en el eje horizontal-vertical dentro de los tubos de embebido. A continuación, se congelaron y se almacenaron a -20 °C hasta que se necesitaron para el corte.
Se prepararon secciones coronales de 13,5 micras usando Bright® OTF5000 Cryostat (Bright Instrument Co Ltd, Cambridgeshire, RU), permitiendo así la visualización de los aspectos tanto superior como inferior de la retina. Los cortes se recogieron inmediatamente después de seccionarlas en portaobjetos de microscopio recubiertos de polilisina y se dejaron secar al aire a temperatura ambiente. Los portaobjetos se almacenaron a -20 °C o se prepararon para montar en medio de montaje fluorescente (DAKO). Los portaobjetos se tiñeron con DAPI como una adición al medio de montaje (DAPI al 0,1 % en el medio) o por inmersión en DAPI al 0,2 % en TBS y lavado con PBS antes de montarlos. Los portaobjetos montados se almacenaron a 4 °C.
Se tomaron imágenes de los portaobjetos montados utilizando Zeiss AxioObserver Z1 (Carl Zeiss Inc, Gottingen, Alemania). Las imágenes se tomaron a un aumento 2,5x, 10x y 20x usando filtros de fluorescencia apropiados. Las imágenes GFP se expusieron a 200 ms y 5000 ms con aumentos de 10x y 20x, y a 9000 ms para aumentos de 2,5x.
Disección de tejidos y extracción de ARN/proteínas
Se sacrificó a los ratones mediante dislocación cervical. Se quitaron los ojos tirando del nervio óptico, seguido de un lavado en PBS. La retina y el RPE-coroide se extrajeron cuidadosamente mediante pelado y se almacenaron inmediatamente en hielo en tubos de recolección secos durante no más de 1 hora. Las muestras se procesaron con el kit Qiagen® All-Prep DNA/RNA/Protein. Nota: la etapa de homogeneización se realizó mediante la técnica mano de mortero y mortero.
Extracción de ARN y PCR cuantitativa en tiempo real
El ARN se eluyó en 40 pl de H20 sin RNasa, y se almacenó inmediatamente en hielo o a - 20 °C. La concentración de ARN se cuantificó usando el espectrofotómetro Nanodrop® ND-1000. Se procesó hasta 1 pg de ARN (en cada investigación, la cantidad de ARN usado correspondía a la muestra que contenía la menor cantidad de ARN dentro de un grupo determinado de muestras para comparar) en ADNc utilizando el kit de transcripción inversa Qiagen® Quantitect®. Se cargó 1 pl de esto en cada pocillo, junto con un volumen de 29 pl de mezcla maestra de RT-PCR; que contenía 2x Bioline® Sensimix al 50 %, mezcla de cebadores al 1,67 % (tanto cebadores directos como inversos) en dH20. Cada muestra se cargó por triplicado. También se cargó en paralelo una escalera logarítmica patrón de una construcción de plásmido que contiene el gen de interés correspondiente para la cuantificación absoluta. La PCR se ejecutó usando condiciones normales.
Los cebadores usados incluyen:
RPE65: 5'-AATTACCAAATATTGTAAACGGTTCCATC-3'(SEQ ID NO: 9),
5'-TGTTTGAAACTGTGGAGGAACTGTC-3'(SEQ ID NO: 10),
eGFP: 5'-GAAGCGCGATCACATGGT-3' (SEQ ID NO: 11) y
5'-CCATGCCGAGAGTGATCC-3' (SEQ ID NO: 12);
P-actina: 5'-GTGGTACGACCAGAGGCATAC-3'(SEQ ID NO: 13) y
5'-AAGGCCAACCGTGAAAAGAT-3'(SEQ ID NO: 14).
En todos los experimentos de expresión relativa, se utilizó p-actina como control de carga. Los datos se analizaron mediante ANOVA de una vía mediante programa informático estadístico (GraphPad, PRISM).
Extracciones de proteínas y transferencias Western
Los extractos de proteínas se obtuvieron utilizando el kit Qiagen® All-Prep DNA/RNA/Protein, pero se resuspendieron y trataron térmicamente a 95 °C en 100 pl de SDS al 5 % en PBS que contenía un cóctel inhibidor de proteasas ((Sigma Aldrich, Gillingham, RU), después se almacenaron a -20 °C. Antes de SDS-PAGE, las concentraciones de proteínas se cuantificaron utilizando el ensayo de proteínas Bio-Rad® (kit de ensayo de proteínas DC, Bio-Rad, Hemel Hempstead RU). Las muestras de proteínas se prepararon hasta 20 pl con diluyente, se sometieron a choque térmico a 95 °C con 4 ml de colorante de carga, después se cargaron y se ejecutaron en un gel para SDS-PAGE a 120 V durante ~70 minutos, se bañaron en 1x Tank Buffer (base Tris al 1,64 %, glicina al 7,82 %, SDS al 0,54 %). Se utilizaron geles al 9 % y al 12 % para las transferencias de RPE65 y GFP, respectivamente. El gel sometido a electroforesis se transfirió después en semiseco a una membrana de PVDF (Millipore Watford RU), después la membrana se bloqueó durante una hora en leche desnatada al 5 %/BSA al 1 % en PBS Tween al 0,05 %. Las membranas se bloquearon después en el anticuerpo primario (a-GFP o a-RPE65), se lavaron con PBS Tween al 0,05 %, se bloquearon después con una dilución 1:5.000-10.000 de anticuerpo secundario (conjugado con HRP) (IgG anti-IgG de conejo de cabra y de ratón de cabra de Pierce Immunopure, Perbio Science RU Ltd., Northumberland RU). A continuación, las transferencias lavadas se sumergieron en reactivo de luminiscencia ECL (ECL más GE Healthcare Ru Ltd. Amersham, RU) y después se obtuvieron imágenes usando detección de quimioluminiscencia (Analizador de Imágenes de Luminiscencia Fujifilm® LAS-1000). El análisis densométrico se llevó a cabo utilizando el programa informático ImageJ®, y se analizó estadísticamente utilizando una prueba T pareada no paramétrica.
Inyección subretiniana
Las inyecciones subretinianas se realizaron en ratones Rd12 (Pang et al. 2005) y C57BL/6 al menos 4 semanas después del nacimiento. Se utilizó un microscopio quirúrgico durante toda la cirugía oftálmica. A 1,5 cm, se insertó una aguja hipodérmica de calibre 34 (Hamilton, Suiza) tangencialmente a través de la esclerótica, creando una herida por túnel escleral autosellante (Tan et al. 2009). Se inyectaron 1,5-2,0 pl de la suspensión vírica dentro de los hemisferios superior e inferior del espacio subretiniano, cada uno de los cuales crea un desprendimiento de retina bulloso visible oftalmoscópicamente. Se utilizaron C57BL/6 para el estudio del promotor y se inyectaron con 1x1012 de título vírico. Se utilizaron ratones Rd12 en los estudios de rescate de RPE65. A los ratones se les inyectaron construcciones víricas de RPE65 en un ojo designado, con las construcciones víricas RPE65opti inyectadas en el ojo contralateral. Los títulos para los experimentos de 'dosis baja' (LD, por sus siglas en inglés) fueron 1x109 y 1x1010 (dos ratones inyectados con cada título), y 1x1011 vg/ml (genomas víricos por mililitro) para todos los demás experimentos de rescate. Todos los ratones se inyectaron bilateralmente.
Eficacia del tratamiento in vivo
Para comparar la eficacia del tratamiento del vector optimizado (AAV2/5-RPE65 optimizado) y el vector original (AAV2/2-hRPE65), se inyectaron ratones Rpe65-/~ con AAV2/2-hRPE65 o con AAV2/5-RPE65optimizado en títulos que varían desde 3x107 hasta 1x109 vg/ml (construcción optimizada) y de 1x1010 hasta 1x1012 vg/ml (construcción original).
La restauración de la función de la retina se evaluó mediante electrorretinografía. El gráfico de la figura 3 muestra las amplitudes promedio de la onda b escotópica (media ± DE) a las 4 semanas después del tratamiento, cuando ambos vectores alcanzaron la expresión máxima. Las amplitudes de la onda b de los ojos tratados con el vector optimizado fueron tan altas o más altas que las amplitudes de los ojos inyectados con una dosis 300 veces superior del vector original. Esto demuestra que el nuevo vector es al menos 300 veces más eficaz que el vector original. Esta evaluación no tiene en cuenta el efecto de la optimización de codones, lo que no conduce a una traducción de proteínas más eficaz en el ratón.
Ejemplo 1: Optimización del promotor que impulsa la expresión de RPE
Como se describe en la sección "Construcciones de plásmidos" anterior, el promotor de RPE65 de "longitud completa" se digirió con las enzimas de restricción NsiI y AccI para crear el fragmento del promotor de RPE65 "NA". Este fragmento se muestra en la SEQ ID NO: 2. El promotor de RPE65 de "longitud completa" también se digirió con la enzima de restricción BglII para crear el fragmento del promotor "Bgl". Estas configuraciones de promotor (fragmentos de ADN genómico alrededor del sitio de inicio de la transcripción de RPE65) se probaron junto con el promotor de "longitud completa" para determinar los niveles de expresión relativos y la especificidad de tejido de la expresión. Las evaluaciones se realizaron con los promotores que impulsan la expresión de GFP para facilitar la localización de la expresión del transgén (Figura 1). La Figura 1A muestra el análisis por PCR en tiempo real de la expresión de ARNm de GFP en extractos de RPE-coroide, de los vectores AAV2/8 que albergan el promotor de RPE65 de longitud completa "RPE65", o los fragmentos "NA" o "Bgl". El fragmento "NÁ' del promotor de RPE65 fue eficaz con un nivel de expresión aproximadamente 20 veces mayor que el promotor de RPE65 original (Figura 1A). El fragmento "Bgl" no tuvo ningún efecto. Para todos los valores, p < 0,05.
La Figura 1B muestra una transferencia Western representativa de la expresión de GFP. La muestra "NA" se diluyó 1/20 en el carril 2.
La Figura 1C muestra imágenes fluorescentes de criosección delgada de ojos inyectados con vectores AAV2/8 que albergan diferentes promotores que impulsan eGFP. Los paneles de la izquierda muestran la expresión de eGFP con un aumento de 20x, los paneles centrales muestran la tinción conjunta con DAPI, los paneles de la derecha muestran la expresión de eGFP con un aumento de 2,5 x. Las imágenes fluorescentes muestran que el promotor de hRPE65 optimizado era más potente que el promotor de hRPE65 normal, así como más riguroso en la impulsión de la expresión en células del RPE, como se muestra por la intensidad de eGFP en el RPE y la ausencia en los fotorreceptores.
Ejemplo 2: Optimización del ADNc de RPE65
Con el fin de intentar mejorar la eficacia del procesamiento postranscripcional del ARNm de RPE65 humano (estabilidad, exportación y traducción nuclear del ARN) se realizaron varias modificaciones en la secuencia codificante del ADNc de RPE65. Esto dio como resultado la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 4. La secuencia de Kozak se optimizó a "CCACCATG", véanse los nucleótidos 1 a 8 de la SEQ ID NO: 4, para intentar lograr un mejor reconocimiento del codón de inicio y, en consecuencia, una traducción más eficaz. La secuencia de Kozak natural del gen RPE65 humano difería considerablemente de la secuencia de consenso óptima obtenida.
Además, la secuencia codificante de RPE65 se sometió a optimización de codones, para intentar mejorar el sesgo de uso de codones y el contenido en CG, y eliminar cualquier sitio de procesamiento críptico y posibles estructuras de tallo-bucle en el ARNm. Durante la optimización de la secuencia codificante de RPE65, se reemplazaron 7 codones raros (incluido un par en tándem), un sitio de empalme críptico, 4 sitios de poliadenilación críptica prematura y una repetición directa de 50 pares de bases. Estos cambios mejoraron significativamente la frecuencia de uso de codones. Estos cambios se probaron juntos in vitro en células 293T (humanas) para determinar su efecto sobre los niveles de producción de proteína RPE65, después de la transfección de un plásmido de expresión de AAV2/8 que lleva el promotor de CMV ubicuo (Figura 2). La Figura 2A muestra una transferencia Western de la expresión de RPE65. La Figura 2B muestra una cuantificación de la transferencia Western. La producción de proteínas in vitro en células 293T después de la optimización de la secuencia codificante de RPE65 mostró un aumento de siete veces en la cantidad de proteína RPE65 producida a partir del vector que lleva la secuencia codificante optimizada (AAV2/8.Optim) en comparación con la secuencia codificante de tipo silvestre (AAV2/8.RPE65) (p < 0,05).
Ejemplo 3: Evaluación de la eficacia del tratamiento in vivo
Una construcción que consiste en el promotor que dio como resultado el nivel más alto de expresión, el fragmento "NA" mostrado en la SEQ ID NO: 2, y la secuencia codificante de RPE65 optimizada mostrada en la SEQ ID NO: 4, se empaquetó en cápsides de AAV5 y AAV8 y se probó para determinar su capacidad para rescatar la función de la retina in vivo en ratones deficientes en RPE65. La eficacia del rescate se comparó con el vector de grado clínico previamente utilizado en Bainbridge et al (2008), "AAV2-hRPE65". Este vector contenía la secuencia codificante de RPE65 humano impulsada por un fragmento de 1400 pb del promotor de RPE65 humano. Como el vector anterior ya llevó al rescate en animales, se administraron dosis de vector más bajas para permitir la comparación de la eficacia del tratamiento en circunstancias limitantes (Figura 3). La amplitud de la onda b se utilizó como medida de rescate. Sorprendentemente, las amplitudes de la onda b de los ojos tratados con el vector optimizado fueron tan altas o más altas que las amplitudes de los ojos inyectados con una dosis 300 veces mayor del vector original. Esto mostró que el nuevo vector era al menos 300 veces más eficaz que el vector original.
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Información de secuencias
La secuencia encuadrada en la SEQ ID NO: 1 muestra los nucleótidos de la SEQ ID NO: 1 que se eliminaron en la SEQ ID NO: 2 y su posición. La secuencia encuadrada en la SEQ ID NO: 2 muestra los nucleótidos que se añadieron en lugar de los que se eliminaron del recuadro que se muestra en la SEQ ID NO: 1. El texto en negrita y subrayado en las SEQ ID NO: 1 y 2 muestra la posición relativa del comienzo de la SEQ ID NO: 2.
SEQ ID NO: 1 región promotora de RPE65 Genbank N.° NG_008472.1
TATTGTGCAAATAAGTGCTCACTCCAAATTAGTGGTATATTTATTGAAGTTTAATATTGTGTTTGTGATACAGAA GTATTTGCTTTAATTCTAAATAAAAATTTTATGCTTTTATTGCTGGTTTAAGAAGATTTGGATTATCCTTGTACT TTGAGGAGAAGTTTCTTATTTGAAATATTTTGGAAACAGGTCTTTTAATGTGGAAAGATAGATATTAATCTCCTC TTCTATTACTCTCCAAGATCCAACAAAAGTGATTATACCCCCCAAAATATGATGGTAGTATCTTATACTACCATC ATTTTATAGGCATAGGGCTCTTAGCTGCAAATAATGGAACTAACTCTAATAAAGCAGAACGCAAATATTGTAAAT ATTAGAGAGCTAACAATCTCTGGGATGGCTAAAGGATGGAGCTTGGAGGCTACCCAGCCAGTAACAATATTCCGG GCTCCACTGTTGAATGGAGACACTACAACTGCCTTGGATGGGCAGAGATATTATGGATGCTAAGCCCCAGGTGCT ACCATTAGGACTTCTACCACTGTCCCTAACGGGTGGAGCCCATCACATGCCTATGCCCTCACTGTAAGGAAATGA AGCTACTGTTGTATATCTTGGGAAGCACTTGGATTAATTGTTATACAGTTTTGTTGAAGAAGACCCCTAGGGTAA GTAGCCATAACTGCACACTAAATTTAAAATTGTTAATGAGTTTCTCAAAAAAAATGTTAAGGTTGTTAGCTGGTA TAGTATATATCTTGCCTGTTTTCCAAGGACTTCTTTGGGCAGTACCTTGTCTGTGCTGGCAAGCAACTGAGACTT
aatgaaagagtattggagat[atgaatgaattgatgctgt[atactctcagagtgccaaacatataccaatggacaa GAAGGTGAGGCAGAGAGCAGACAGGCATTAGTGACAAGCAAAGATATGCAGAATTTCATTCTCAGCAAATCAAAA GTCCTCAACCTGGTTGGAAGAATATTGGCACTGAATGGTATCAATAAGGTTGCTAGAGAGGGTTAGAGGTGCACA ATGTGCTTCCATAACATTTTATACTTCTCCAATCTTAGCACTAATCAAACATGGTTGAATACTTTGTTTACTATA ACTCTTACAGAGTTATAAGATCTGTGAAGACAGGGACAGGGACAATACCCATCTCTGTCTGGTTCATAGGTGGTA TGTAATAGATATTTTTAAAAATAAGTGAGTTAATGAATGAGGGTGAGAATGAAGGCACAGAGGTATTAGGGGGAG GTGGGCCCCAGAGAATGGTGCCAAGGTCCAGTGGGGTGACTGGGATCAGCTCAGGCCTGACGCTGGCCACTCCCA CCTAGCTCCTTTCTTTCTAATCTGTTCTCATTCTCCTTGGGAAGGATTGAGGTCTCTGGAAAACAGCCAAACAAC TGTTATGGGAACAGCAAGCCCAAATAAAGCCAAGCATCAGGGGGATCTGAGAGCTGAAAGCAACTTCTGTTCCCC CTCCCTCAGCTGAAGGGGTGGGGAAGGGCTCCCAAAGCCATAACTCCTTTTAAGGGATTTAGAAGGCATAAAAAG GCCCCTGGCTGAGAACTTCCTTCTTCATTCTGCAGTTGG
SEQ ID NO: 2 Fragmento de promotor de RPE65 optimizado
AGAT|CTTCGAA[ATACTCTCAGAGTGCCAAACATATACCAATGGACAAGAAGGTGAGGCAGAGAGCAGACAGGCAT TAGTGACAAGCAAAGATATGCAGAATTTCATTCTCAGCAAATCAAAAGTCCTCAACCTGGTTGGAAGAATATTGG CACTGAATGGTATCAATAAGGTTGCTAGAGAGGGTTAGAGGTGCACAATGTGCTTCCATAACATTTTATACTTCT CCAATCTTAGCACTAATCAAACATGGTTGAATACTTTGTTTACTATAACTCTTACAGAGTTATAAGATCTGTGAA GACAGGGACAGGGACAATACCCATCTCTGTCTGGTTCATAGGTGGTATGTAATAGATATTTTTAAAAATAAGTGA GTTAATGAATGAGGGTGAGAATGAAGGCACAGAGGTATTAGGGGGAGGTGGGCCCCAGAGAATGGTGCCAAGGTC CAGTGGGGTGACTGGGATCAGCTCAGGCCTGACGCTGGCCACTCCCACCTAGCTCCTTTCTTTCTAATCTGTTCT CATTCTCCTTGGGAAGGATTGAGGTCTCTGGAAAACAGCCAAACAACTGTTATGGGAACAGCAAGCCCAAATAAA GCCAAGCATCAGGGGGATCTGAGAGCTGAAAGCAACTTCTGTTCCCCCTCCCTCAGCTGAAGGGGTGGGGAAGGG CTCCCAAAGCCATAACTCCTTTTAAGGGATTTAGAAGGCATAAAAAGGCCCCTGGCTGAGAACTTCCTTCTTCAT TCTGCAGTTGG
SEQ ID NO: 3 ADNc de RPE65 humano Genbank N.° NM_000329.2
ATGTCTATCCAGGTTGAGCATCCTGCTGGTGGTTACAAGAAACTGTTTGAAACTGTGGAGGAACTGTCCTCGCCG CTCACAGCTCATGTAACAGGCAGGATCCCCCTCTGGCTCACCGGCAGTCTCCTTCGATGTGGGCCAGGACTCTTT GAAGTTGGATCTGAGCCATTTTACCACCTGTTTGATGGGCAAGCCCTCCTGCACAAGTTTGACTTTAAAGAAGGA CATGTCACATACCACAGAAGGTTCATCCGCACTGATGCTTACGTACGGGCAATGACTGAGAAAAGGATCGTCATA ACAGAATTTGGCACCTGTGCTTTCCCAGATCCCTGCAAGAATATATTTTCCAGGTTTTTTTCTTACTTTCGAGGA GTAGAGGTTACTGACAATGCCCTTGTTAATGTCTACCCAGTGGGGGAAGATTACTACGCTTGCACAGAGACCAAC TTTATTACAAAGATTAATCCAGAGACCTTGGAGACAATTAAGCAGGTTGATCTTTGCAACTATGTCTCTGTCAAT GGGGCCACTGCTCACCCCCACATTGAAAATGATGGAACCGTTTACAATATTGGTAATTGCTTTGGAAAAAATTTT TCAATTGCCTACAACATTGTAAAGATCCCACCACTGCAAGCAGACAAGGAAGATCCAATAAGCAAGTCAGAGATC GTTGTACAATTCCCCTGCAGTGACCGATTCAAGCCATCTTACGTTCATAGTTTTGGTCTGACTCCCAACTATATC GTTTTTGTGGAGACACCAGTCAAAATTAACCTGTTCAAGTTCCTTTCTTCATGGAGTCTTTGGGGAGCCAACTAC ATGGATTGTTTTGAGTCCAATGAAACCATGGGGGTTTGGCTTCATATTGCTGACAAAAAAAGGAAAAAGTACCTC AATAATAAATACAGAACTTCTCCTTTCAACCTCTTCCATCACATCAACACCTATGAAGACAATGGGTTTCTGATT GTGGATCTCTGCTGCTGGAAAGGATTTGAGTTTGTTTATAATTACTTATATTTAGCCAATTTACGTGAGAACTGG GAAGAGGTGAAAAAAAATGCCAGAAAGGCTCCCCAACCTGAAGTTAGGAGATATGTACTTCCTTTGAATATTGAC AAGGCTGACACAGGCAAGAATTTAGTCACGCTCCCCAATACAACTGCCACTGCAATTCTGTGCAGTGACGAGACT ATCTGGCTGGAGCCTGAAGTTCTCTTTTCAGGGCCTCGTCAAGCATTTGAGTTTCCTCAAATCAATTACCAGAAG TATTGTGGGAAACCTTACACATATGCGTATGGACTTGGCTTGAATCACTTTGTTCCAGATAGGCTCTGTAAGCTG AATGTCAAAACTAAAGAAACTTGGGTTTGGCAAGAGCCTGATTCATACCCATCAGAACCCATCTTTGTTTCTCAC CCAGATGCCTTGGAAGAAGATGATGGTGTAGTTCTGAGTGTGGTGGTGAGCCCAGGAGCAGGACAAAAGCCTGCT TATCTCCTGATTCTGAATGCCAAGGACTTAAGTGAAGTTGCCCGGGCTGAAGTGGAGATTAACATCCCTGTCACC TTTCATGGACTGTTCAAAAAATCTTGA
SEQ ID NO: 4 ADNc de RPE65 optimizado (secuencia de Kozak y secuencia codificante)
CCACCATGAGTATCCAGGTGGAACATCCCGCAGGGGGGTATAAGAAACTGTTTGAGACCGTCGAAGAACTGAGCA GCCCTCTGACCGCACATGTCACCGGAAGAATCCCCCTGTGGCTGACAGGATCACTGCTGAGATGCGGACCAGGAC TGTTCGAAGTGGGAAGCGAACCTTTCTACCACCTGTTTGACGGACAGGCCCTGCTGCATAAGTTCGACTTCAAGG AGGGGCACGTGACTTACCATCGGCGGTTCATCCGAACCGACGCCTATGTCCGGGCTATGACAGAGAAGAGAATCG TGATTACTGAGTTCGGCACCTGCGCCTTTCCAGATCCCTGTAAGAACATTTTCTCCAGGTTCTTTTCTTACTTTC GCGGCGTCGAGGTGACAGACAACGCACTGGTCAACGTGTACCCTGTGGGGGAGGATTACTATGCCTGCACTGAAA CCAACTTCATCACCAAGATTAATCCAGAGACACTGGAAACTATCAAACAGGTGGACCTGTGCAACTACGTCAGTG TGAATGGCGCCACCGCTCACCCCCATATCGAGAACGATGGGACAGTCTACAACATTGGCAATTGCTTCGGGAAGA ACTTTAGCATCGCCTACAACATCGTGAAGATCCCCCCTCTGCAGGCTGACAAGGAGGATCCTATCTCTAAAAGTG AAATTGTGGTCCAGTTCCCTTGTTCTGACCGGTTTAAGCCAAGTTACGTCCACTCATTCGGCCTGACACCAAACT ATATCGTCTTTGTGGAGACTCCCGTGAAGATTAATCTGTTCAAATTTCTGAGCTCCTGGTCTCTGTGGGGGGCTA ACTACATGGACTGCTTCGAGAGTAATGAAACAATGGGAGTGTGGCTGCACATCGCAGATAAGAAACGAAAGAAAT ACCTGAACAATAAGTACCGGACTAGCCCCTTCAACCTGTTTCACCATATCAACACCTATGAGGACAATGGATTTC TGATTGTCGATCTGTGCTGTTGGAAGGGCTTCGAGTTCGTGTACAACTATCTGTACCTGGCAAACCTGCGCGAAA ATTGGGAGGAAGTGAAGAAAAATGCTCGAAAAGCACCTCAGCCAGAAGTCAGGCGCTACGTGCTGCCACTGAACA TCGACAAGGCTGATACAGGCAAAAACCTGGTGACTCTGCCCAATACCACAGCAACTGCCATCCTGTGCTCCGACG AGACCATTTGGCTGGAGCCCGAAGTGCTGTTCTCTGGACCTCGCCAGGCCTTCGAATTTCCACAGATTAATTACC AGAAGTACTGCGGCAAACCCTATACCTACGCTTATGGACTGGGCCTGAACCACTTCGTGCCTGATAGACTGTGCA AGCTGAATGTCAAGACCAAAGAGACATGGGTGTGGCAGGAACCTGACTCATACCCCAGCGAGCCTATCTTTGTGA GCCATCCAGATGCCCTGGAGGAAGACGATGGCGTGGTCCTGAGCGTGGTCGTGTCCCCAGGAGCAGGACAGAAGC CAGCCTATCTGCTGATTCTGAACGCTAAAGATCTGTCCGAAGTGGCAAGAGCAGAGGTGGAGATCAATATCCCAG TCACATTTCACGGGCTGTTCAAAAAGTCCTAA
SEQ ID NO: 5 ADNc de MERTK humano Genbank N.° NM_006343.2
ATGGGGCCGGCCCCGCTGCCGCTGCTGCTGGGCCTCTTCCTCCCCGCGCTCTGGCGTAGAGCTATCACTGAGGCA AGGGAAGAAGCCAAGCCTTACCCGCTATTCCCGGGACCTTTTCCAGGGAGCCTGCAAACTGACCACACACCGCTG TTATCCCTTCCTCACGCCAGTGGGTACCAGCCTGCCTTGATGTTTTCACCAACCCAGCCTGGAAGACCACATACA GGAAACGTAGCCATTCCCCAGGTGACCTCTGTCGAATCAAAGCCCCTACCGCCTCTTGCCTTCAAACACACAGTT GGACACATAATACTTTCTGAACATAAAGGTGTCAAATTTAATTGCTCAATCAGTGTACCTAATATATACCAGGAC ACCACAATTTCTTGGTGGAAAGATGGGAAGGAATTGCTTGGGGCACATCATGCAATTACACAG TTTTATCCAGATGATGAAGTTACAGCAATAATCGCTTCCTTCAGCATAACCAGTGTGCAGCGTTCAGACAATGGG TCGTATATCTGTAAGATGAAAATAAACAATGAAGAGATCGTGTCTGATCCCATCTACATCGAAGTACAAGGACTT CCTCACTTTACTAAGCAGCCTGAGAGCATGAATGTCACCAGAAACACAGCCTTCAACCTCACCTGTCAGGCTGTG GGCCCGCCTGAGCCCGTCAACATTTTCTGGGTTCAAAACAGTAGCCGTGTTAACGAACAGCCTGAAAAATCCCCC TCCGTGCTAACTGTTCCAGGCCTGACGGAGATGGCGGTCTTCAGTTGTGAGGCCCACAATGACAAAGGGCTGACC GTGTCCAAGGGAGTGCAGATCAACATCAAAGCAATTCCCTCCCCACCAACTGAAGTCAGCATCCGTAACAGCACT GCACACAGCATTCTGATCTCCTGGGTTCCTGGTTTTGATGGATACTCCCCGTTCAGGAATTGCAGCATTCAGGTC AAGGAAGCTGATCCGCTGAGTAATGGCTCAGTCATGATTTTTAACACCTCTGCCTTACCACATCTGTACCAAATC AAGCAGCTGCAAGCCCTGGCTAATTACAGCATTGGTGTTTCCTGCATGAATGAAATAGGCTGGTCTGCAGTGAGC CCTTGGATTCTAGCCAGCACGACTGAAGGAGCCCCATCAGTAGCACCTTTAAATGTCACTGTGTTTCTGAATGAA TCTAGTGATAATGTGGACATCAGATGGATGAAGCCTCCGACTAAGCAGCAGGATGGAGAACTGGTGGGCTACCGG ATATCCCACGTGTGGCAGAGTGCAGGGATTTCCAAAGAGCTCTTGGAGGAAGTTGGCCAGAATGGCAGCCGAGCT CGGATCTCTGTTCAAGTCCACAATGCTACGTGCACAGTGAGGATTGCAGCCGTCACCAGAGGGGGAGTTGGGCCC TTCAGTGATCCAGTGAAAATATTTATCCCTGCACACGGTTGGGTAGATTATGCCCCCTCTTCAACTCCGGCGCCT GGCAACGCAGATCCTGTGCTCATCATCTTTGGCTGCTTTTGTGGATTTATTTTGATTGGGTTGATTTTATACATC TCCTTGGCCATCAGAAAAAGAGTCCAGGAGACAAAGTTTGGGAATGCATTCACAGAGGAGGATTCTGAATTAGTG GTGAATTATATAGCAAAGAAATCCTTCTGTCGGCGAGCCATTGAACTTACCTTACATAGCTTGGGAGTCAGTGAG GAACTACAAAATAAACTAGAAGATGTTGTGATTGACAGGAATCTTCTAATTCTTGGAAAAATTCTGGGTGAAGGA GAGTTTGGGTCTGTAATGGAAGGAAATCTTAAGCAGGAAGATGGGACCTCTCTGAAAGTGGCAGTGAAGACCATG AAGTTGGACAACTCTTCACAGCGGGAGATCGAGGAGTTTCTCAGTGAGGCAGCGTGCATGAAAGACTTCAGCCAC CCAAATGTCATTCGACTTCTAGGTGTGTGTATAGAAATGAGCTCTCAAGGCATCCCAAAGCCCATGGTAATTTTA CCCTTCATGAAATACGGGGACCTGCATACTTACTTACTTTATTCCCGATTGGAGACAGGACCAAAGCATATTCCT CTGCAGACACTATTGAAGTTCATGGTGGATATTGCCCTGGGAATGGAGTATCTGAGCAACAGGAATTTTCTTCAT CGAGATTTAGCTGCTCGAAACTGCATGTTGCGAGATGACATGACTGTCTGTGTTGCGGACTTCGGCCTCTCTAAG AAGATTTACAGTGGCGATTATTACCGCCAAGGCCGCATTGCTAAGATGCCTGTTAAATGGATCGCCATAGAAAGT CTTGCAGACCGAGTCTACACAAGTAAAAGTGATGTGTGGGCATTTGGCGTGACCATGTGGGAAATAGCTACGCGG GGAATGACTCCCTATCCTGGGGTCCAGAACCATGAGATGTATGACTATCTTCTCCATGGCCACAGGTTGAAGCAG CCCGAAGACTGCCTGGATGAACTGTATGAAATAATGTACTCTTGCTGGAGAACCGATCCCTTAGACCGCCCCACC TTTTCAGTATTGAGGCTGCAGCTAGAAAAACTCTTAGAAAGTTTGCCTGACGTTCGGAACCAAGCAGACGTTATT TACGTCAATACACAGTTGCTGGAGAGCTCTGAGGGCCTGGCCCAGGGCTCCACCCTTGCTCCACTGGACTTGAAC ATCGACCCTGACTCTATAATTGCCTCCTGCACTCCCCGCGCTGCCATCAGTGTGGTCACAGCAGAAGTTCATGAC AGCAAACCTCATGAAGGACGGTACATCCTGAATGGGGGCAGTGAGGAATGGGAAGATCTGACTTCTGCCCCCTCT GCTGCAGTCACAGCTGAAAAGAACAGTGTTTTACCGGGGGAGAGACTTGTTAGGAATGGGGTCTCCTGGTCCCAT TCGAGCATGCTGCCCTTGGGAAGCTCATTGCCCGATGAACTTTTGTTTGCTGACGACTCCTCAGAAGGCTCAGAA GTCCTGATGTGA
SEQ ID NO: 6 ADNc de LRAT humano Genbank N.° NM_004744.3
ATGAAGAACCCCATGCTGGAGGTGGTGTCTTTACTACTGGAGAAGCTGCTCCTCATCTCCAACTTCACGCTCTTT AGTTCGGGCGCCGCGGGCGAAGACAAAGGGAGGAACAGTTTTTATGAAACCAGCTCTTTCCACCGAGGCGACGTG CTGGAGGTGCCCCGGACCCACCTGACCCACTATGGCATCTACCTAGGAGACAACCGTGTTGCCCACATGATGCCC GACATCCTGTTGGCCCTGACAGACGACATGGGGCGCACGCAGAAGGTGGTCTCCAACAAGCGTCTCATCCTGGGC GTTATTGTCAAAGTGGCCAGCATCCGCGTGGACACAGTGGAGGACTTCGCCTACGGAGCTAACATCCTGGTCAAT CACCTGGACGAGTCCCTCCAGAAAAAGGCACTGCTCAACGAGGAGGTGGCGCGGAGGGCTGAAAAGCTGCTGGGC TTTACCCCCTACAGCCTGCTGTGGAACAACTGCGAGCACTTCGTGACCTACTGCAGATATGGCACCCCGATCAGT CCCCAGTCCGACAAGTTTTGTGAGACTGTGAAGATAATTATTCGTGATCAGAGAAGTGTTCTTGCTTCAGCAGTC TTGGGATTGGCGTCTATAGTCTGTACGGGCTTGGTATCATACACTACCCTTCCTGCAATTTTTATTCCATTCTTC CTATGGATGGCTGGCTAA
SEQ ID NO: 7 ADNc de TYR humano Genbank N.° NM_000372.4
ATGCTCCTGGCTGTTTTGTACTGCCTGCTGTGGAGTTTCCAGACCTCCGCTGGCCATTTCCCTAGAGCCTGTGTC TCCTCTAAGAACCTGATGGAGAAGGAATGCTGTCCACCGTGGAGCGGGGACAGGAGTCCCTGTGGCCAGCTTTCA GGCAGAGGTTCCTGTCAGAATATCCTTCTGTCCAATGCACCACTTGGGCCTCAATTTCCCTTCACAGGGGTGGAT GACCGGGAGTCGTGGCCTTCCGTCTTTTATAATAGGACCTGCCAGTGCTCTGGCAACTTCATGGGATTCAACTGT GGAAACTGCAAGTTTGGCTTTTGGGGACCAAACTGCACAGAGAGACGACTCTTGGTGAGAAGAAACATCTTCGAT TTGAGTGCCCCAGAGAAGGACAAATTTTTTGCCTACCTCACTTTAGCAAAGCATACCATCAGCTCAGACTATGTC ATCCCCATAGGGACCTATGGCCAAATGAAAAATGGATCAACACCCATGTTTAACGACATCAATATTTATGACCTC TTTGTCTGGATGCATTATTATGTGTCAATGGATGCACTGCTTGGGGGATCTGAAATCTGGAGAGACATTGATTTT GCCCATGAAGCACCAGCTTTTCTGCCTTGGCATAGACTCTTCTTGTTGCGGTGGGAACAAGAAATCCAGAAGCTG ACAGGAGATGAAAACTTCACTATTCCATATTGGGACTGGCGGGATGCAGAAAAGTGTGACATTTGCACAGATGAG TACATGGGAGGTCAGCACCCCACAAATCCTAACTTACTCAGCCCAGCATCATTCTTCTCCTCTTGGCAGATTGTC TGTAGCCGATTGGAGGAGTACAACAGCCATCAGTCTTTATGCAATGGAACGCCCGAGGGACCTTTACGGCGTAAT CCTGGAAACCATGACAAATCCAGAACCCCAAGGCTCCCCTCTTCAGCTGATGTAGAATTTTGCCTGAGTTTGACC CAATATGAATCTGGTTCCATGGATAAAGCTGCCAATTTCAGCTTTAGAAATACACTGGAAGGATTTGCTAGTCCA CTTACTGGGATAGCGGATGCCTCTCAAAGCAGCATGCACAATGCCTTGCACATCTATATGAATGGAACAATGTCC

Claims (12)

REIVINDICACIONES
1. Una construcción de expresión que comprende un promotor específico del epitelio pigmentario de la retina (RPE) y una secuencia polinucleotídica operativamente unida, en donde el promotor específico de RPE comprende:
(a) una secuencia de nucleótidos contiguos a partir de la SEQ ID NO: 1 que confiere expresión específica de RPE en una secuencia polinucleotídica operativamente unida, o
(b) una secuencia que tiene al menos el 90 % de identidad de secuencia con dicha secuencia de (a) y que conserva la actividad del promotor específico de RPE,
y en donde la secuencia polinucleotídica operativamente unida comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 4.
2. La construcción de expresión de la reivindicación 1, en donde el promotor específico de RPE comprende:
(a) no más de 1300 nucleótidos contiguos de la SEQ ID NO: 1, o
(b) una secuencia que tiene al menos el 90 % de identidad de secuencia con dicha secuencia de no más de 1300 nucleótidos contiguos de la SEQ ID NO: 1 y que conserva la actividad del promotor específico de RPE.
3. La construcción de expresión de la reivindicación 2, en donde el promotor específico de RPE comprende:
(a) no más de 800 nucleótidos contiguos de la SEQ ID NO: 1, o
(b) una secuencia que tiene al menos el 90 % de identidad de secuencia con dicha secuencia de no más de 800 nucleótidos contiguos de la SEQ ID NO: 1 y que conserva la actividad del promotor específico de RPE, opcionalmente
en donde el promotor específico de RPE comprende:
(a) la secuencia de la SEQ ID NO: 2 o la secuencia de los nucleótidos 12-761 de la SEQ ID NO: 2, o
(b) una secuencia que tiene al menos el 90 % de identidad de secuencia con dicha secuencia de la SEQ ID NO: 2, o con los nucleótidos 12-761 de la SEQ ID NO: 2, y que conserva la actividad del promotor específico de RPE.
4. La construcción expresión de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicha secuencia de (a) o (b) tiene al menos 500 nucleótidos de longitud.
5. Un vector que comprende una construcción de expresión de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
6. El vector de acuerdo con la reivindicación 5, en donde el vector es un vector vírico.
7. El vector de acuerdo con la reivindicación 6, en donde el vector es un vector de virus adenoasociado (AAV) o comprende un genoma de AAV o un derivado del mismo, opcionalmente
en donde dicho derivado es un derivado quimérico, reordenado o con cápside modificada.
8. El vector de acuerdo con la reivindicación 7, en donde dicho genoma de AAV es de un serotipo o aislado o clado de AAV derivado de forma natural, opcionalmente
en donde dicho genoma de AAV es del serotipo 2 de AAV (AAV2), serotipo 4 de AAV (AAV4), serotipo 5 de AAV (AAV5) o serotipo 8 de AAV (AAV8) y/o en donde la cápside deriva de AAV5 o AAV8, preferentemente en donde el genoma de AAV deriva de AAV2 y la cápside deriva de AAV5 o AAV8.
9. Una célula hospedadora que contiene un vector de la reivindicación 5 o produce un vector vírico de una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, opcionalmente en donde la célula hospedadora es una célula HEK293 o HEK293T.
10. Una composición farmacéutica que comprende un vector de una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 8 y un transportador farmacéuticamente aceptable.
11. El vector de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 8 para su uso en un método para prevenir o tratar distrofia de la retina.
12. El vector para su uso de acuerdo con la reivindicación 11, en donde:
(a) la distrofia de la retina es amaurosis congénita de Leber (LCA), degeneración macular relacionada con la edad (AMD), albinismo ocular oculocutáneo tipo 1 o tipo Nettleship-Falls o deficiencia de MERTK; y/o
(b) el tratamiento o prevención es mediante la administración del vector de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 8 a un paciente por inyección directa retiniana, subretiniana o intravítrea, opcionalmente Ċ
en donde dicho vector se administra directamente en la retina, en el espacio subretiniano o en el espacio intravítreo.
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