ES2923877T3 - Vectores VAA para el tratamiento de la retinitis pigmentosa dominante - Google Patents
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- C12N2750/00011—Details
- C12N2750/14011—Parvoviridae
- C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
- C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
Abstract
Los aspectos de la divulgación se relacionan con métodos y composiciones para tratar la retinosis pigmentaria. En algunos aspectos, la descripción proporciona composiciones y métodos para administrar un ácido nucleico de interferencia (por ejemplo, un ARN de interferencia) a un sujeto para reducir la expresión de uno o ambos alelos de un gen rho endógeno (por ejemplo, un alelo rho mutante asociado con retinitis pigmentosa) en el sujeto. En algunas realizaciones, también se administra al sujeto un gen rho de reemplazo que es resistente al ácido nucleico que interfiere. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Vectores VAA para el tratamiento de la retinitis pigmentosa dominante
Referencia cruzada a solicitudes relacionadas
La presente solicitud reivindica el beneficio de la solicitud de patente provisional US n° 62/302.122, presentada el 1 de marzo de 2016, y de la solicitud de patente provisional US n° 62/398.451, presentada el 22 de septiembre de 2016.
Antecedentes
La retinitis pigmentosa autosómica dominante (RPad) es una enfermedad que conduce a la ceguera y que afecta a 1 de cada 12.000 personas. Una fracción considerable de estos individuos porta una mutación en el gen (rho) para la rodopsina, el pigmento proteico de captación de la luz en las células fotorreceptoras de la retina. La enfermedad es dominante porque la herencia del gen mutado de cualquiera de los padres conduce a degeneración retiniana y finalmente a ceguera. Más de 100 mutaciones diferentes identificadas en rho conducen a ceguera. Actualmente no existe ningún tratamiento aprobado de tipo farmacológico o de terapia génica para la RPad. Por lo tanto, existe una necesidad de opciones de tratamiento eficaz referidas a todas y cada una de las causas de la RPad y afecciones asociadas. Cualesquiera referencias a métodos de tratamiento del cuerpo humano o animal mediante cirugía o terapia y los métodos diagnósticos puestos en práctica en el cuerpo humano o animal (ver el art. 53(c) EPC) deben reformularse conforme al artículo 54(4) o (5) EPC.
Descripción resumida
La invención se define en las reivindicaciones adjuntas y se refiere a un ARN sintético, a una composición que comprende un ARN sintético, a un vector codificante de un ARNhc, a un vector codificante de un miARN artificial, a vectores o composiciones de la invención para la utilización en la reducción de la expresión de RHO en un sujeto, y a vectores o composiciones de la invención para la utilización en el tratamiento de la retinitis pigmentosa en un sujeto. Se describen realizaciones de la invención en los párrafos numerados siguientes:
(1) . Molécula sintética de ácido ribonucleico (ARN) que comprende:
una cadena de sentido de secuencia GUGGCAUUCUACAUCUUCA (SEC ID n° 7), y
una cadena antisentido de secuencia UGAAGAUGUAGAAUGCCAC (SEC ID n° 8)
(2) . La molécula sintética de ARN del párrafo 1, en la que el ARN es un ARN interfiriente pequeño (ARNip). (3) . La molécula sintética de ARN del párrafo 1, en la que el ARN es un ARN de horquilla corto (ARNhc), opcionalmente en el que el ARNhc comprende además un bucle que comprende ARN de secuencia UCAAGAG (SEC ID n° 9) o ARN de secuencia UGUGCUU (SEC ID n° 10.
(4) . La molécula sintética de ARN del párrafo 1, en la que el ARN es un microARN (miARN) artificial, opcionalmente en el que el miARN artificial comprende ARN de secuencia:
UGCUGUUGACAGUGAGCGA(X)nUAGUGAAGCCACAGAUGUA(Y)nCUGCCUACUGC CUCGGA (SEC ID n° 19), y en la que:
(X)n comprende SEC ID n° 7 y (Y)n comprende SEC ID n° 8.
(5) . El ARN sintético de cualquiera de los párrafos 1 a 4 comprende además una secuencia sobresaliente no hibridada en el extremo 5' o 3'.
(6) . El ARN sintético del párrafo 5, en el que la secuencia sobresaliente no hibridada comprende una secuencia de bases repetidas.
(7) . El a Rn sintético del párrafo 6, en el que la secuencia de bases repetidas comprende bases repetidas de uracilo (U), opcionalmente en el que la secuencia sobresaliente no hibridada es UU.
(8) . Una composición que comprende el ARN sintético de cualquiera de los párrafos 1 a 7, opcionalmente en la que la composición comprende además uno o más portadores fisiológicamente aceptables y/o uno o más adyuvantes fisiológicamente aceptables.
(9) . Vector que codifica:
a) el ARNhc del párrafo 3, o
b) el miARN artificial del párrafo 4.
(10) . El vector del párrafo 9, en el que el ARNhc se selecciona de cualquiera de las SEC ID n° 11 a 18.
(11) . El vector del párrafo 10, en el que el vector es un plásmido de expresión, opcionalmente en el que el vector es un vector vírico, opcionalmente en el que el vector vírico comprende un vector vírico adenoasociado.
(12) . La composición del párrafo 8, o el vector de cualquiera de los párrafos 9 a 11 para la utilización en la reducción de la expresión de RHO en un sujeto o el tratamiento de la retinitis pigmentosa (RP) en un sujeto, en el que el tratamiento de la RP comprende silenciar uno o ambos alelos del gen RHO.
(13) . La composición o el vector para la utilización según el párrafo 12 comprende, además, un gen RHO recombinante que no contiene una secuencia que es la diana de un ARN interfiriente de la composición o el vector.
(14). La composición o el vector para la utilización según el párrafo 13, en el que el gen RHO comprende la secuencia de SEC ID n° 42.
Aspectos de la solicitud se refieren a composiciones y métodos para el tratamiento de la retinitis pigmentosa (p. ej., la retinitis pigmentosa dominante) en un sujeto (p. ej., en un ser humano). En algunas opciones, uno o ambos alelos del gen rodopsina (gen rho) de un sujeto se silencian mediante la administración de una molécula de ARN interfiriente en el sujeto (p. ej., en un sujeto que presenta retinitis pigmentosa, por ejemplo, en un ser humano que presenta retinitis pigmentosa dominante). En algunas opciones, se administra un gen rho de sustitución en el sujeto para proporcionar una proteína RHO funcional a fin de restaurar la función del fotorreceptor en el sujeto. En algunas opciones, el gen rho de sustitución presenta una o más sustituciones de nucleótidos respecto al alelo o alelos del gen endógeno que provocan que el gen de sustitución sea resistente a los efectos del ARN interfiriente. En algunas opciones, el gen rho de sustitución es un gen rho humano (p. ej., un gen rho humano de tipo salvaje) que incluye una o más sustituciones (p. ej., 1, 2, 3, 4, 5 o más) que provocan que el gen sea resistente (también se conoce como "endurecido") frente a la degradación mediada por la molécula de ARN interfiriente. En algunas opciones, la sustitución o sustituciones de nucleótidos se encuentran en la secuencia codificante del gen rho. En algunas opciones, la sustitución o sustituciones de nucleótidos son silenciosas (p. ej., no alteran la secuencia de aminoácidos de la proteína RHO). En algunas opciones, la sustitución o sustituciones de aminoácidos introducen un cambio de un aminoácido, aunque la proteína RHO resultante todavía es suficientemente funcional para resultar terapéuticamente eficaz (para restaurar o mantener por lo menos una visión parcial, o visión normal).
En algunas opciones, puede administrarse un ARN interfiriente y/o un gen de sustitución en el sujeto mediante la utilización de cualquier técnica adecuada. En algunas opciones, se proporciona un ARN interfiriente en el sujeto en la forma de un gen que codifica el ARN interfiriente. En algunas opciones, el gen que codifica el ARN interfiriente se proporciona al sujeto en un virus adenoasociado recombinante (VAAr). En algunas opciones, el gen de sustitución se proporciona al sujeto en un VAAr. En algunas opciones, el gen que codifica el ARN interfiriente y el gen de sustitución se proporcionan en el mismo VAA (por ejemplo, ambos se encuentran codificados en el mismo genoma recombinante, flanqueado por repeticiones terminales invertidas (RTI) del VAA). En algunas opciones, ambos genes se encuentran bajo el control del mismo promotor. En algunas opciones, los genes se encuentran bajo el control de dos promotores diferentes. En algunas opciones, el gen que codifica el ARN interfiriente y el gen de sustitución se proporcionan en VAAr diferentes.
En algunas opciones, el ARN interfiriente es una molécula sintética de ácido ribonucleico (ARN) que comprende:
a) una cadena de sentido de secuencia CUGCCUACAUGUUUCUGCU (SEC ID n° 1) y una cadena antisentido de secuencia AGCAGAAACAUGUAGGCAG (SEC ID n° 2),
b) una cadena de sentido de secuencia CCUACAUGUUUCUGCUGAU (SEC ID n° 3) y una cadena antisentido de secuencia AUCAGCAGAAACAUGUAGG (SEC ID n° 4),
c) una cadena de sentido de secuencia g Ca UGGUCa Uc AUCAUGGU (SEC ID n° 5) y una cadena antisentido de secuencia ACCAUGAUGAUGACCAUGC (SEC ID n° 6), o
d) una cadena de sentido de secuencia g Ug GCAUUc Ua CAUCUUCA (SEC ID n° 7) y una cadena antisentido de secuencia UGAAGAUGUAGAAUGCCAC (SEC ID n° 8).
En algunas opciones, la molécula de ARN sintético es un ARN interfiriente corto (ARNic). En algunas opciones, el ARN interfiriente es un ARN de horquilla corto (ARNhc). En algunas opciones, el ARNhc comprende un bucle que presenta un ARN de secuencia UCa Ag AG (SEC ID n° 9) o ARN de secuencia UGUGCUU (Se C ID n° 10).
En algunas opciones, la molécula sintética de ARN es un microARN artificial (miARN). En algunas opciones, el miARN artificial presenta una secuencia de ARN:
UGCUGUUGACAGUGAGCGA(X)nUAGUGAAGCCACAGAUGUA(Y)nCUGCCUACUGC CUCGGA (SEC ID n° 19), en la que:
a) (X)n comprende SEC ID n° 1 y (Y)n comprende SEC ID n° 2,
b) (x)n comprende SEC ID n° 3 y (Y)n comprende SEC ID n° 4,
c) (x)n comprende SEC ID n° 5 y (Y)n comprende SEC ID n° 6, o
d) (x)n comprende SEC ID n° 7 y (Y)n comprende SEC ID n° 8.
En algunas opciones, un ARN sintético indicado anteriormente o en otros sitios en la presente solicitud comprende además una secuencia sobresaliente no hibridada en el extremo 5' y/o 3'. En algunas opciones, la secuencia sobresaliente no hibridada comprende una secuencia de bases repetidas. En algunas opciones, la secuencia de bases repetidas comprende bases repetidas de uracilo (U). En algunas opciones, la secuencia sobresaliente no hibridada es UU.
En algunas opciones, una composición (p. ej., una composición para la administración en un sujeto) comprende uno o más (p. ej., 2, 3 o 4) de los ARN interfirientes (p. ej., moléculas sintéticas de ARN) indicadas anteriormente o en otros sitios en la presente solicitud. En algunas opciones, una composición (p. ej., una composición para la administración en un sujeto) comprende un ácido nucleico (p. ej., un ADN) que codifica uno o más (p. ej., 2, 3 o 4) de
los ARN interfirientes (p. ej., moléculas sintéticas de ARN) indicadas anteriormente o en otros sitios en la presente solicitud.
En algunas opciones, una composición incluye además uno o más portadores fisiológicamente aceptables y/o uno o más adyuvantes fisiológicamente aceptables.
En algunas opciones, un vector codifica uno o más (1,2, 3 o 4, o más) ARNhc y/o miARN artificiales (p. ej., indicados anteriormente o en otros sitios en la presente memoria). En algunas opciones, los ARNhc presentan una secuencia de una o más SEC ID n° 11 a 18.
En algunas opciones, un vector codifica un gen rho de sustitución.
En algunas opciones, un vector codifica un gen rho de sustitución y/o uno o más ARNhc y/o miARN artificiales (p. ej., indicados anteriormente o en otros sitios en la presente memoria).
En algunas opciones, el vector es un plásmido de expresión. En algunas opciones, el vector es un genoma vírico recombinante (p. ej., un genoma de vAAr). En algunas opciones, el vector es un vector vírico. En algunas opciones, el vector vírico comprende un genoma de VAAr.
En algunas opciones, un método para reducir la expresión de RHO en un sujeto incluye administrar en el mismo una composición que incluye uno o más ARN interfirientes y/o uno o más vectores cada uno de los cuales codifica (p. ej., es capaz de expresar) uno o más ARN interfirientes indicados anteriormente o en otros sitios en la presente memoria.
En algunas opciones, un método de tratamiento de la retinitis pigmentosa (RP) en un sujeto incluye administrar en el sujeto tanto una composición que comprende un ARN interfiriente o un vector que expresa un ARN interfiriente, como una composición que comprende un gen rho recombinante (por ejemplo, un vector codificante del gen rho recombinante), en el que el gen rho es resistente al reconocimiento por el ARN interfiriente.
En algunas opciones, el gen rho recombinante se administra utilizando un VAAr. En algunas opciones, el ARN interfiriente y el gen rho recombinante se administran utilizando el mismo VAAr. En algunas opciones, el ARN interfiriente y el gen rho recombinante se encuentran ambos bajo el control de la expresión con una única secuencia de promotor. En algunas opciones, cada uno de ARN interfiriente y gen rho recombinante se encuentra bajo el control de la expresión por secuencias de promotor independientes (p. ej., promotores constitutivos o inducibles). En algunas opciones, el ARN interfiriente y/o gen rho modificado se encuentran bajo el control de la expresión de (p. ej., conectados operativamente) un promotor humano o un promotor de una especie diferente (p. ej., un promotor vírico, un promotor procariótico o un promotor eucariótico, por ejemplo, un promotor de un primate no humano, de roedor, perro, gato, cerdo o de otra especie). En algunas opciones, el promotor es un promotor de ARN polimerasa III (p. ej., el promotor H1 de la ARN polimerasa III) o un promotor de la ARN polimerasa II, o un promotor de la ARN polimerasa I. En algunas opciones, el ARN interfiriente y el ARNhc se encuentran bajo el control de la expresión de un promotor de la ARN polimerasa III (p. ej., el promotor H1 de la ARN polimerasa III). En algunas opciones, el ARN interfiriente es un miARN artificial, y el miARN artificial se encuentra bajo el control de expresión de un promotor de la ARN polimerasa II. En algunas opciones, el gen rho recombinante se encuentra bajo el control de la expresión de un promotor constitutivo o inducible (p. ej., un promotor humano, un promotor específicamente ocular). En algunas opciones, el promotor constitutivo o inducible es un promotor de ratón (p. ej., un promotor de opsina de ratón (MOPS)).
En algunas opciones, el sujeto es un mamífero. En algunas opciones, el mamífero es un roedor o un perro. En algunas opciones, el mamífero es un ser humano (p. ej., un ser humano que presenta, o que es conocido que presenta, por ejemplo, se le ha diagnosticado, retinitis pigmentosa, por ejemplo, retinitis pigmentosa dominante). Estos aspectos y otros se señalan en los dibujos, ejemplos y reivindicaciones, posteriormente.
Breve descripción de los dibujos
Los dibujos y las descripciones breves siguientes proporcionan ejemplos no limitativos de aspectos de las composiciones y métodos descritos en la presente memoria.
La FIG. 1A-C muestra la inactivación de la rodopsina humana etiquetada con GFP medida mediante FACS (separación celular activada por fluorescencia). Este experimento se llevó a cabo en células 293T con tres réplicas biológicas. Se cotransfectaron 500 ng de ADNc de RHO humano etiquetado con GFP, con diferentes ARNic. Las transfecciones se llevaron a cabo utilizando el reactivo de transfección LIPOFECTAMINE® 2000. El control era un ARNic no dirigido que se había adquirido de Dharmacon. Las muestras se incubaron durante 72 horas y después se analizaron mediante citometría de flujo; en primer lugar, controlando la dispersión directa y lateral a fin de excluir las partículas no viables, seguido del control de la expresión de GFP superior al nivel de autofluorescencia. El número de células positivas para GFP tratadas con el ARNic de control se fijó en 100 %.
La FIG. 2 muestra la inactivación de RHO por ARNhc. Este experimento se llevó a cabo en células 293T con tres réplicas biológicas. Se cotransfectaron 200 ng de rodopsina humana etiquetada con GFP, con pUC57 que contenía
ARNhc 131, 765 o 820 controlado con el promotor H1. Las muestras se incubaron durante 72 horas y se midió la inactivación de RHO mediante citometría de flujo, tal como en la FIG. 1.
La FIG. 3 muestra que los ARNhc cortan el a Rn de RHO tanto mutante como de tipo salvaje. Este experimento se llevó a cabo en células 293T con dos réplicas biológicas y tres réplicas de qRT-PCR. Se cotransfectaron 200 ng de rodopsina humana etiquetada con g Fp (T27M o P23H WT) con plásmidos VAAr-H1-ARNhc (131 (SEC ID n° 11), 765 (SEC ID n° 15), o 820 (SEC ID n° 17)) utilizando LIPOFECTAMINE® 2000. El ARNhc no dirigido se diseñó para degradar una proteína de fototransducción no relacionada: una subunidad del canal iónico controlado por GMP cíclico de los bastones. Las muestras se incubaron durante 48 horas y después se procesaron para el análisis mediante qRT-PCR.
La FIG. 4 muestra las cadenas de sentido (SEC ID n° 1) y antisentido (SEC ID n° 2) del ARNic131 en el contexto de secuencia de miR30 (SEC ID n° 28). Tras la expresión a partir de un promotor de ARN polimerasa II, se extrajo el ARNic del precursor con el enzima Drosha en el núcleo y Dicer en el citoplasma.
Las FIGs. 5A-5C muestran (FIG. 5A) una inmunotransferencia de rodopsina en bocados de biopsia obtenidos de las zonas de ampolla y de no ampolla en retinas caninas. La FIG. 5B muestra la cuantificación de las cantidades de monómero de rodopsina, normalizadas respecto a histona. La FIG. 5C es una tabla que muestra las cantidades normalizadas.
Las FIGs. 6A-6B muestran el número absoluto de ARN de RHO canino. La FIG. 6A es un gráfico del número absoluto de ARN de RHO canino. La FIG. 6B es una tabla que muestra el número absoluto de moléculas de ARN. Las FIGs. 7A-7C muestran (FIG. 7A) una inmunotransferencia de la rodopsina en bocados de biopsia obtenidos de las zonas de ampolla y de no ampolla en retinas caninas. La FIG. 7B muestra la cuantificación de las cantidades de monómero de rodopsina, normalizadas respecto a histona. La FIG. 7C es una tabla que muestra las cantidades normalizadas.
Las FIGs. 8A-8B muestran el número absoluto de ARN de RHO canino. La FIG. 8A es un gráfico del número absoluto de ARN de RHO canino. La FIG. 8B es una tabla que muestra el número absoluto de moléculas de ARN. La FIG. 9 ilustra el emparejamiento de bases ejemplar que se produce entre el ARNhc y la secuencia diana de ARNm de RHO humano endógeno o endurecido. Todos los ARNhc emparejan perfectamente las bases con la secuencia diana del ARNm de RHO de perro. Caja blanca: falta de correspondencia entre el ARNhc y el ARNm de RHO de perro endógeno, así como endurecido. Caja gris oscuro: un balanceo débil del emparejamiento de bases que se produce en el ARN entre la guanosina y el uracilo. Caja gris claro: falta de correspondencia entre el ARNhc y el ARNm de RHO endurecido únicamente. Las secuencias corresponden a las SEC ID n° 29 a n° 37 de parte superior a inferior, respectivamente.
La FIG. 10 ilustra el emparejamiento de bases ejemplar que se produce entre el ARNhc134 y la secuencia diana de ARNm de RHO humano endógeno o endurecido. La proximidad de las secuencias diana de los ARNhc 131 y 134 permite utilizar el mismo RHO131 endurecido. Caja gris oscuro: un balanceo débil del emparejamiento de bases que se produce en el ARN entre la guanosina y el uracilo. Caja gris claro: falta de correspondencia entre el ARNhc y el ARNm de RHO endurecido únicamente. Las secuencias corresponden a las SEC ID n° 38 a n° 40 de parte superior a inferior, respectivamente.
La FIG. 11 ilustra un mapa ejemplar de un plásmido codificante de RHO humana etiquetada con GFP.
Las FIGs. 12A-12C muestra ejemplos no limitativos de mapas de plásmidos codificantes de ARNic (FIGs. 12A y 12B) y RHO humana (FIG. 12C).
Las FIGs. 13A-13E muestran el análisis de ARN y de proteínas de la inactivación de la rodopsina con diferentes títulos víricos de VAA2/5-sc-H1-ARNhc820 inyectado por vía subretiniana en perros WT RHO+/+. La FIG. 13A muestra mapas retinianos que muestran la posición de bocados de biopsia utilizados para el análisis de transferencia western y la cuantificación del ARN. Los círculos emparejados gris oscuro, gris y de puntos indican la posición de los bocados de biopsia en las zonas de ampolla/tratadas y de no ampolla/no tratadas para cada réplica de transferencia western, mientras que los círculos negros indican las posiciones de los bocados de biopsia para la cuantificación del ARN. La FIG. 13B muestra un gráfico de columnas que muestra el ARN de rodopsina canina remanente en la zona tratada como porcentaje de los niveles medidos en la zona no tratada de la misma retina. La FIG. 13C muestra una inmunotransferencia que muestra la cantidad de rodopsina en bocados de biopsia obtenidos de zonas tratadas (Tx) y no tratadas (no Tx) de retina canina. Para la normalización se utilizó histona H3. Los gráficos de columnas muestran la proteína rodopsina remanente como porcentaje de los niveles medidos en la zona no tratada de la misma retina. La FIG. 13D es una tabla que muestra los valores numéricos de cada experimento informados como porcentaje del ARN o proteína remanente. La FIG. 13E es otra tabla que muestra los valores numéricos de cada experimento informados como porcentaje de inactivación del ARN o proteína. Las FIGs. 14A-14D muestran la evaluación de la integridad de la CNE y MLE/SI/SE tras la inyección subretiniana de diferentes títulos de VAA2/5-sc-H1-ARNhc820 en perros WT. La FIG. 14A muestra mapas de grosor de la CNE; la fig. 14B muestra mapas de MLE/SI/SE de intensidad normalizada; la FIG. 14C muestra los valores de grosor de la CNE, y la FIG. 14D muestra los valores de intensidad normalizada de las capas MLE/SI/SE.
las figs. 15A-15E muestran el análisis de ARN y de proteínas de la inactivación de la rodopsina con diferentes títulos víricos de VAA2/5-sc-H1-ARNhc820 inyectado por vía subretiniana en perros mutantes RHOT4R/+. La FIG.
15A muestra mapas retinianos que muestran la posición de bocados de biopsia utilizados para el análisis de transferencia western y la cuantificación del ARN. Los círculos emparejados gris oscuro, gris y de puntos indican la posición de los bocados de biopsia en las zonas de ampolla/tratadas y de no ampolla/no tratadas para cada réplica de transferencia western, mientras que los círculos negros indican las posiciones de los bocados de biopsia para la cuantificación del ARN. La FIG. 15B es un gráfico de columnas que muestra la cantidad de ARN de rodopsina canina remanente como porcentaje de los niveles medidos en la zona no tratada de la misma retina. La
FIG. 15C es una inmunotransferencia que muestra la cantidad de rodopsina canina en bocados de biopsia obtenidos de zonas tratadas (Tx) y no tratadas (no Tx) de retina canina. Para la normalización se utilizó histona H3. Los gráficos de columnas muestran la proteína rodopsina canina remanente como porcentaje de los niveles medidos en la zona no tratada de la misma retina. La FIG. 15D es una tabla que muestra los valores numéricos de cada experimento informados como porcentaje del ARN o proteína remanente. La FIG. 15E es otra tabla que muestra los valores numéricos de cada experimento informados como porcentaje de inactivación del ARN o proteína.
Las FIGs. 16A-16D muestran escaneos B de TCO que comprenden las zonas retinianas tratadas (con diferentes títulos víricos de VAA2/5-sc-H1-ARNhc820) y no tratadas de perros RHOT4R/+ 2 semanas después de la exposición a una dosis breve de luz que causa degeneración retiniana aguda en perros mutantes RHOT4R/+. (FIG. 16A) escaneo de TCO de un perro tratado con 1*1012 gv/ml. (FIG. 16B) escaneo de TCO de un perro tratado con 5x1o11 gv/ml. (FIG. 16C) escaneo de TCO de un perro tratado con 2,5x1o11 gv/ml. (FIG. 16D) escaneo de TCO de un perro tratado con 1x1o11 gv/ml.
Las FIGs. 17A-17B muestran el mapa topográfico de grosor de la CNE de un RHOT4R/+ tratado con VAA2/5-sc-H1-ARNhc820 que muestra la protección frente a la degeneración retiniana inducida por la luz. (FIG. 17A) mapa de grosor de la CNE de un perro de control WT no tratado (panel izquierdo) y mapa de grosor de la CNE de EM411-OI tratado con VAA2/5-sc-H1-ARNhc820 a 5x1011 gv/ml y que muestra la preservación del grosor de la CNE en la zona tratada/con ampolla semanas después del daño fotoinducido. Las curvas negra y blanca muestran los límites de la ampolla tal como se observa inmediatamente después de la inyección subretiniana. Los paneles, posteriormente, muestran escaneos B de TCO con la CNE coloreada en gris más oscuro (banda intermedia) con fines de visualización. (FIG. 17B) Se seleccionaron loci fuera y dentro de la ampolla para las mediciones del grosor de la CNE.
La FIG. 18 muestra la histología (tinción H+E) e inmunohistoquímica (la rodopsina se tiñó en verde y muestra una apariencia de tinción ligera en los paneles inferiores de la FIG. 18; la arrestina de conos humanos se tiñó en rojo y muestra una apariencia gris en los paneles inferiores de la FIG. 18) en las zonas tratadas (Tx) y no tratadas (no Tx) de retinas mutantes RHOT4R/+ por vía subretiniana con diferentes títulos víricos de VAA2/5-sc-H1-ARNhc820. Las FIGs. 19A-19F muestran el análisis de ARN y de proteínas de la inactivación de la rodopsina y la sustitución con VAA2/5-sc-HOP-RHO820-H1-ARNhc820 inyectado por vía subretiniana en perros mutantes RHOT4R/+ a un título de 5x1o11 gv/ml. La FIG. 19A muestra mapas retinianos que muestran la posición de bocados de biopsia utilizados para el análisis de transferencia western y la cuantificación del ARN. Los círculos emparejados gris oscuro, gris y de puntos indican la posición de los bocados de biopsia en las zonas de ampolla/tratadas y de no ampolla/no tratadas para cada réplica de transferencia western, mientras que los círculos negros indican las posiciones de los bocados de biopsia para la cuantificación del ARN. La FIG. 19B muestra una inmunotransferencia que muestra la cantidad de rodopsina total (canina RHO820 humana) en bocados de biopsia obtenidos de zonas tratadas (Tx) y no tratadas (no Tx) de retina canina. Para la normalización se utilizó histona H3. Los gráficos de columnas muestran el porcentaje de proteína rodopsina remanente en las zonas tratadas y no tratadas. Observar que la pérdida de la banda de PM inferior (correspondiente a proteína RHO mutante T4R) en las zonas tratadas de EM424-OD y EM425-OD. La FIG. 19C es una tabla que muestra los valores numéricos de cada pareja de bocados utilizada para la cuantificación de proteína. La FIG. 19D es un gráfico de columnas que muestra el ARN de rodopsina canina remanente en las zonas tratadas como porcentaje de ARN de RHO canino medidos en zonas no tratadas. La FIG. 19E es un gráfico de columnas que muestra los niveles de RHO820 humana en las zonas tratadas como porcentaje de los niveles de ARN de RHO canina medidos en zonas no tratadas. La FIG. 19F es una tabla que muestra los valores numéricos de cada pareja de bocados utilizada para la cuantificación del ARN. Las FIGs. 20A-20C muestran las imágenes retinianas in vivo que muestran la protección frente a la degeneración retiniana fotoinducida en la zona de una retina mutante RHOT4R/+ tratada con VAA2/5-sc-HOP-RHO820-H1-ARNhc820 a un título de 5x1011 gv/ml. La FIG. 20A muestra una imagen combinada de cSLO frontal que muestra la zona retiniana 2 semanas después de la exposición lumínica (límite delimitado por flechas blancas) que había sido protegida frente a la degeneración. La flecha gris claro indica la localización dentro de la zona tratada de los escaneos B de TCO mostrados en la FIG. 20B, la flecha gris oscuro indica la localización dentro de la zona no tratada de los escaneos de OCT B mostrados en la FIG. 20C. La FIG. 20B muestra los escaneos B de TCO dentro de la zona tratada antes de la inyección, 11 semanas después de la inyección y 13 semanas después de la inyección/2 semanas después de la exposición lumínica. El grosor de la CNE estaba conservado en toda la zona tratada en ambos puntos temporales tras la inyección del vector vírico. La FIG. 20C muestra los escaneos B de TCO dentro de la zona no tratada antes de la inyección, 11 semanas después de la inyección y 13 semanas después de la inyección/2 semanas después de la exposición lumínica. la c Ne se conservaba hasta 11 semanas después de la inyección, aunque se perdió por completo 2 semanas después de la exposición lumínica.
La FIG. 21 muestra mapas topográficos del grosor de RHOT4R/+ tratado con v Aa 2/5-sc-HOP-RHO820-H1-ARNhc820 a un título de 5x1o11 gv/ml que muestra la protección frente a la degeneración retiniana fotoinducida. La FIG. 22 muestra la inmunohistoquímica (la rodopsina se tiñe de verde y se observa como tinción ligera en los paneles de la FIG. 22; la arrestina de conos humanos se tiñe de rojo y se observa como tinción gris en los paneles inferiores de la FIG. 22) en la zona de transición tratada y zonas no tratadas de retinas mutantes RHOT4R/+ que han recibido la inyección subretiniana de VAA2/5-sc-HOP-RHO820-H1-ARNhc820 a un título de 5x1o11 gv/ml.
Descripción detallada
Aspectos de la solicitud proporcionan métodos y composiciones que resultan útiles para tratar la retinitis pigmentosa en un sujeto (p. ej., en un sujeto que presenta retinitis pigmentosa dominante).
En algunas opciones, la expresión de rodopsina endógena (p. ej., mutante y normal) se reduce o se suprime mediante la utilización de interferencia de ARN, y la proteína faltante se sustituye mediante la administración de un gen para la proteína normal que se manipula para eliminar el sitio diana del inhibidor de ARN.
En algunas opciones, se utiliza un único vector virus adenoasociado (VAA) para administrar tanto el agente de ARN (p. ej., ARN de horquilla corto o microARN artificial) y el gen de RHO recombinante.
En algunas opciones, los ARN de horquilla cortos, los microARN artificiales (a-miR) y/o los enzimas de ARN (ribozimas) pueden diseñarse para degradar el ARNm de la rodopsina mediante la utilización como diana de secuencias que son comunes al ratón, ser humano y perro. Dichas moléculas pueden resultar útiles para someter a ensayo la inhibición en cultivo celular, en ratones y/o en perros, con el fin de desarrollar inhibidores que puedan funcionar en pacientes humanos.
En algunas opciones, se proporcionan ácidos nucleicos interfirientes pequeños (p. ej., ARN) con diana en ARNm de rodopsina humana y de perro. En algunas opciones, cuatro ARN interfirientes pequeños que digieren el ARNm de rodopsina (RHO) humana y canina con el fin de eliminar la rodopsina producida endógenamente en seres humanos y animales. En algunas opciones, dichos ARN interfirientes con diana en la expresión de la rodopsina en sujetos que presentan una forma heredada dominante de retinitis pigmentosa causada por mutaciones en la RHO. Algunas de dichas mutaciones conducen a una forma tóxica de la proteína, la síntesis de la cual debe silenciarse para evitar la degeneración de la retina.
En algunas opciones, se diseña un ácido nucleico interfiriente (p. ej., ARN) con diana en una secuencia que es específica para un gen rho mutante (p. ej., es complementario a una secuencia que está presente en el gen rho mutante y no está presente en un gen rho de tipo salvaje). Sin embargo, en algunas opciones, se diseña un ácido nucleico interfiriente para reconocer una secuencia de tipo salvaje en un gen rho endógeno mutante (p. ej., que presenta una o más mutaciones en otras posiciones que no son la diana del ácido nucleico interfiriente). En opciones adicionales, se proporciona un gen rho funcional (p. ej., de tipo salvaje) que es resistente al ácido nucleico interfiriente para restaurar la actividad de la RHO en el sujeto y, de esta manera, tratar uno o más síntomas de una enfermedad o trastorno asociado a uno o más alelos rho endógenos mutantes que son la diana de un ácido nucleico interfiriente.
En algunas opciones, puede administrarse uno o más ARN interfirientes mediante la utilización de un vector virus adenoasociado (VAA) como ARN de horquilla corto (ARNhc) controlado por un promotor (p. ej., un promotor de ARN polimerasa III u otro promotor constitutivo o inducible adecuado) o como microARN artificiales (miARN) controlados por un promotor (p. ej., mediante la utilización de un promotor de ARN polimerasa II u otro promotor constitutido o inducible adecuado).
En algunas opciones, el mismo vector expresa un gen (ADNc) que codifica la rodopsina normal, pero que es resistente a la acción del ARNic expresado por el virus.
Se proporcionan ejemplos no limitativos de ARN interfirientes en las Tablas 1 a 4.
Tabla 1: ARN interfiriente corto (ARNic)
Tabla 2: ARN de bucle en horquilla
Tabla 3: ARN de horquilla corto (ARNhc)
Tabla 4: microARN (miARN)
En algunas opciones, un gen de rodopsina (rho) normal (p. ej., de tipo salvaje) que es endurecido puede presentar una secuencia basada en el gen rho humano (p. ej., que presenta una secuencia mostrada en el n° de acceso NG_009115.1, también mostrado en SEC ID n° 41) o el ARNm o una parte codificante de proteína del mismo (p. ej., un ARNm que está codificado por los nucleótidos 5001 a 5456 unidos a 7238 a 7406 unidos a 8613 a 8778 unidos a 8895 a 9134 unidos a 9970 a 1l706 de SEC ID n° 41 o una parte codificante de proteína del mismo, por ejemplo la secuencia codificante que consiste en los nucleótidos 5096 a 5456 unidos a 7238 a 7406 unidos a 8613 a 8778 unidos a 8895 a 9134 unidos a 9970 a 10080 de SEC ID n° 41). En algunas opciones, la secuencia de un gen rho normal se modifica para incluir una o más mutaciones (p. ej., 2, 3, 4, 5, 7, 8, 9, 10 o más) que provocan que el gen rho de sustitución sea resistente a uno o más ARN interfirientes que se utilizan como uno o más agentes inactivadores para reducir la expresión del gen rho endógeno mutante en un sujeto bajo tratamiento. Sin embargo, en algunas opciones, un gen rho recombinante que presenta una secuencia normal (p. ej., de tipo salvaje) que no ha sido modificada puede utilizarse en el caso de que presente una secuencia diferente a la del gen o uno o más alelos de rho endógenos que son la diana en el sujeto bajo tratamiento, y en el caso de que los agentes inactivadores utilizados hayan sido diseñados para reconocer el gen o uno o más alelos de rho endógenos y no el gen rho recombinante que se está administrando. En algunas opciones, puede utilizarse un gen rho procedente de una especie diferente a la del sujeto bajo tratamiento. Sin embargo, en algunas opciones, el gen rho (p. ej., un gen rho modificado) puede ser de la misma especie que la del sujeto bajo tratamiento. En algunas opciones, la modificación o modificaciones del gen rho recombinante alteran la secuencia de ácidos nucleicos de la secuencia codificante pero no alteran la proteína codificada (p. ej., son mutaciones silenciosas, por ejemplo, en la tercera posición de un codón que puede incluir uno de entre dos o más nucleótidos diferentes sin modificar el aminoácido codificado). En algunas opciones, un gen rho recombinante no incluye las secuencias de intrón de un gen rho de tipo salvaje. En algunas opciones, un gen rho recombinante codifica un ARNm (o una parte codificante de proteína del mismo) de un gen rho que ha sido modificado para ser resistente a un ARN interfiriente. En algunas opciones, un gen rho recombinante incluye una secuencia codificante de tipo salvaje que ha sido modificada para ser resistente a un ARN interfiriente. En algunas opciones, la secuencia codificante de tipo salvaje modificada se proporciona junto con secuencias de ADNr cadena arriba y/o cadena abajo que no proceden del ARNm de rho de tipo salvaje. En algunas opciones, el gen rho de sustitución recombinante comprende SEC ID n° 42. SEC ID n° 42 (mostrada posteriormente) codifica una parte de una secuencia de ARNm que es resistente a un ejemplo de un ARN interfiriente denominado 820 (p. ej., ARNic820 o ARNhc820, tal como se indica en la presente memoria). Una secuencia de ARN interfiriente 820 indicada en la presente memoria presenta como diana una secuencia correspondiente en ARNm de rho humano endógeno, tal como se ilustra en la FIG. 9, aunque SEC ID n° 42 incluye cuatro sustituciones (subrayadas y en negrita, posteriormente, que corresponden a las posiciones 9014, 9017, 9020 y 9023 de SEC ID n° 41) que provocan que sea resistente al reconocimiento por un ARN interfiriente 820. La secuencia codificante en SEC ID n° 42 se inicia en la posición 88 de SEC ID n° 42. En algunas opciones, el gen rho recombinante que se está administrando puede incluir la secuencia codificante de SEC ID n° 42 (p. ej., desde la posición 88 de SEC ID n° 42), aunque con una secuencia de ARNm cadena arriba diferente. En algunas opciones, un gen rho recombinante puede presentar otra u otras modificaciones de la secuencia (adicionalmente o como alternativas) para provocar que sea resistente a ARN interfirientes adicionales o alternativas (p. ej., otros ARN interfirientes para los que se proporcionan secuencias en la presente memoria). En algunas opciones, puede utilizarse uno o más ARN interfirientes con diana en diferentes zonas de la secuencia codificante del rho endógeno en un sujeto.
SEC ID n° 42 (ejemplo no limitativo de un gen rho humano recombinante "endurecido" modificado):
CCAGCTGGAGCCCTGAGTGGCTGAGCTCAGGCCTTCGCAGCATTCTTGGGTGGGAG
CAGCCACGGGTCAGCCACAAGGGCCACAGCCATGAATGGCACAGAAGGCCCTAAC
TTCTACGTGCCCTTCTCCAATGCGACGGGTGTGGTACGCAGCCCCTTCGAGTACCCA
CAGTACTACCTGGCTGAGCCATGGCAGTTCTCCATGCTGGCCGCCTACATGTTTCTG
CTGATCGTGCTGGGCTTCCCCATCAACTTCCTCACGCTCTACGTCACCGTCCAGCAC
AAGAAGCTGCGCACGCCTCTCAACTACATCCTGCTCAACCTAGCCGTGGCTGACCTC
TTCATGGTCCTAGGTGGCTTCACCAGCACCCTCTACACCTCTCTGCATGGATACTTC
GTCTTCGGGCCCACAGGATGCAATTTGGAGGGCTTCTTTGCCACCCTGGGCGGTGAA
ATTGCCCTGTGGTCCTTGGTGGTCCTGGCCATCGAGCGGTACGTGGTGGTGTGTAAG
CCCATGAGCAACTTCCGCTTCGGGGAGAACCATGCCATCATGGGCGTTGCCTTCACC
TGGGTCATGGCGCTGGCCTGCGCCGCACCCCCACTCGCCGGCTGGTCCAGGTACATC
CCCGAGGGCCTGCAGTGCTCGTGTGGAATCGACTACTACACGCTCAAGCCGGAGGT
CAACAACGAGTCTTTTGTCATCTACATGTTCGTGGTCCACTTCACCATCCCCATGATT
ATCATCTTTTTCTGCTATGGGCAGCTCGTCTTCACCGTCAAGGAGGCCGCTGCCCAG
CAGCAGGAGTCAGCCACCACACAGAAGGCAGAGAAGGAGGTCACCCGCATGGTCA
TCATCATGGTCATCGCTTTCCTGATCTGCTGGGTGCCCTACGCCAGCGTGGCTTTTT
ATATATTCACCCACCAGGGCTCCAACTTCGGTCCCATCTTCATGACCATCCCAGCGT
TCTTTGCCAAGAGCGCCGCCATCTACAACCCTGTCATCTATATCATGATGAACAAGC
AGTTCCGGAACTGCATGCTCACCACCATCTGCTGCGGCAAGAACCCACTGGGTGAC
GATGAGGCCTCTGCTACCGTGTCCAAGACGGAGACGAGCCAGGTGGCCCCGGCCTA
A
De acuerdo con lo anterior, las composiciones en la presente memoria pueden administrarse en un sujeto en necesidad de tratamiento. En algunas opciones, el sujeto presenta o se sospecha que presenta una o más condiciones, enfermedades o trastornos del cerebro y/o del ojo. En algunas opciones, el sujeto presenta, o se sospecha que presenta, una o más de las condiciones, enfermedades y trastornos dados a conocer en la presente memoria. En algunas opciones, el sujeto presenta uno o más alelos rho mutantes endógenos (p. ej., asociados o que causan una enfermedad o trastorno ocular o de la retina). En algunas opciones, el sujeto presenta por lo menos un alelo rho mutante dominante (p. ej., que causa la retinitis pigmentosa dominante). En algunas opciones, el sujeto es un ser humano. En algunas opciones, el sujeto es un primate no humano. Entre los ejemplos no limitativos de sujetos primates no humanos se incluyen macacos (p. ej., Cynomolgus o macacos Rhesus), titis, tamarinos, monos araña, monos lechuza, monos verdes, monos ardilla, babuinos, gorilas, chimpancés y orangutanes. Entre otros sujetos ejemplares se incluyen animales domésticos, tales como perros y gatos; ganado, tal como caballos, vacas, cerdos, ovejas, cabras y pollos, y otros animales, tales como ratones, ratas, cobayas y hámsters.
En algunas opciones, la dosis de partículas de VAAr administradas en una célula o en un sujeto pueden ser del orden de entre 106 y 1014 partículas/ml o de entre 103 y 1015 partículas/ml, o cualesquiera valores comprendidos en dichos intervalos, tal como, por ejemplo, de aproximadamente 106, 107, 108, 109, 1010, 1011, 1012, 1013, o 1014 partículas/ml. En una opción, deben administrarse más de 1013 partículas/ml de VAAr. En algunas opciones, la dosis de partículas de VAAr administradas en un sujeto pueden ser del orden de 106 a 1014 genomas de vector (gv)/ml o de 103 a 1015 gv/ml, o cualesquiera valores comprendidos en dichos intervalos, tal como, por ejemplo, de aproximadamente 106, 107, 108, 109, 1010, 1011, 1012, 1013 o 1014 gv/ml. En una opción, deben administrarse más de 1013 gv/ml de partículas de VAAr. Las partículas de VAAr pueden ser administradas en una sola dosis, o divididas en dos o más administraciones, según se requiera para conseguir la terapia de la enfermedad o trastorno particular bajo tratamiento. En algunas opciones se administran 0,0001 a 10 ml (p. ej., 0,0001 ml, 0,001 ml, 0,01 ml, 0,1 ml, 1 ml y 10 ml) en un sujeto a una dosis.
En algunas opciones, los títulos víricos de VAAr están comprendidos entre 1x101° y 5*1013 gv/ml. En algunas opciones, los títulos víricos de VAAr pueden ser de 1*1010, 2,5*1010, 5*1010, 1*1011, 2,5*1011, 5*1011, 1*1012, 2,5*1012, 5*1012, 1*1013, 2,5*1013, o 5*1013 gv/ml. En algunas opciones, los títulos víricos son inferiores a
1 x io 10 gv/ml. En algunas opciones, los títulos víricos de VAAr son superiores a 1*1015 gv/ml. En algunas opciones, las partículas de VAAr son superiores a 5*1013 gv/ml. En algunas opciones, los títulos víricos de VAAr se administran mediante métodos que se describen adicionalmente en la presente memoria (p. ej., por vía subretiniana o intravítrea).
Las partículas de VAAr pueden ser administradas en una sola dosis, o divididas en dos o más administraciones, según se requiera para conseguir la terapia de la enfermedad o trastorno particular bajo tratamiento. En algunas opciones, se administran entre 1 y 500 microlitros de una composición indicada en la presente solicitud, en un ojo o en los dos ojos de un sujeto. Por ejemplo, en algunas opciones, puede administrarse aproximadamente 1, aproximadamente 10, aproximadamente 50, aproximadamente 100, aproximadamente 200, aproximadamente 300, aproximadamente 400 o aproximadamente 500 microlitros en cada ojo. Sin embargo, debe apreciarse que podrían administrarse volúmenes más pequeños o más grandes en algunas opciones.
En algunas opciones, la exposición proporciona formulaciones de una o más composiciones a base de VAAr dadas a conocer en la presente memoria en soluciones farmacéuticamente aceptables para la administración en una célula o en un animal, solas o en combinación con otra u otras modalidades de terapia, y en particular, para la terapia de células humanas, tejidos y enfermedades que afectan al ser humano.
Si se desea, pueden administrarse vectores de partículas de VAAr o de ácidos nucleicos también en combinación con otros agentes, tales como, p. ej., proteínas o polipéptidos o diversos agentes farmacéuticamente activos, incluyendo una o más administración sistémicas o tópicas de polipéptidos terapéuticos, fragmentos biológicamente activos, o variantes de los mismos. De hecho, no hay virtualmente límite a otros componentes que también pueden incluirse, siempre que los agentes adicionales no provocan un efecto adverso significativo al entrar en contacto con las células diana o tejidos del huésped. De esta manera, las partículas de VAAr pueden administrarse junto con otros agentes diversos según se requiera en el caso particular. Dichas composiciones pueden purificarse a partir de células huésped u otras fuentes biológicas, o alternativamente, pueden sintetizarse químicamente tal como se indica en la presente memoria.
La formulación de excipientes y soluciones portadores farmacéuticamente aceptables es bien conocida por el experto en la materia, al igual que el desarrollo de regímenes de administración y tratamiento adecuados para la utilización de las composiciones particulares indicadas en la presente memoria en una diversidad de regímenes de tratamiento, incluyendo, p. ej., la administración y formulación oral, parenteral, intravenosa, intranasal, intraarticular e intramuscular.
Típicamente, dichas formulaciones pueden contener por lo menos aproximadamente 0,1 % del agente terapéutico (p. ej., partículas de VAAr o células huésped) o más, aunque evidentemente el porcentaje del ingrediente o ingredientes activos pueden modificarse y convenientemente puede ser de entre aproximadamente 1 o 2 %, y aproximadamente 70 % u 80 % o más del peso o volumen de la formulación total. Naturalmente la cantidad del agente o agentes terapéuticos (p. ej., las partículas de VAAr) en cada composición terapéuticamente útil puede prepararse de manera que se obtenga una dosis adecuada en cualquier dosis unitaria dada del compuesto. El experto en la materia de la preparación de dichas formulaciones farmacéuticas contemplará factores tales como solubilidad, biodisponibilidad, semivida biológica, vía de administración, tiempo de almacenamiento del producto, así como otras consideraciones farmacológicas, y de esta manera, puede resultar deseable una diversidad de dosis y regímenes de tratamiento.
Bajo determinadas circunstancias resultará deseable administrar una partícula de VAAr o célula huésped en composiciones farmacéuticas convenientemente formuladas dadas a conocer en la presente memoria por vía subcutánea, intraocular, intravítrea, parenteral, subcutánea, intravenosa, intracerebroventricular, intramuscular, intratecal, oral, intraperitoneal, mediante inhalación oral o nasal, o mediante inyección directa en una o más células, tejidos u órganos mediante inyección directa.
Entre las formas farmacéuticas de las partículas de VAAr o composiciones de células huésped adecuados para la utilización inyectable se incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles. En algunas opciones, la forma es estéril y líquida en la medida que se dé una fácil jeringabilidad. En algunas opciones, la forma es estable bajo las condiciones de preparación y almacenamiento, y se conserva frente a la acción contaminante de los microorganismos, tales como bacterias y hongos. El portador puede ser un solvente o medio de dispersión que contenga, por ejemplo, agua, solución salina, etanol, poliol (p. ej., glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido, y similares), y mezclas adecuadas de los mismos, y/o aceites vegetales. Puede mantenerse la fluidez apropiada, por ejemplo, mediante la utilización de un recubrimiento, tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersiones, y mediante la utilización de tensioactivos.
El término "portador" se refiere a un diluyente, adyuvante, excipiente o vehículo con el que se administra la partícula de VAAr o célula huésped. Dichos portadores farmacéuticos pueden ser líquidos estériles, tales como agua y aceites, incluyendo los de aceite de petróleo, tal como aceite mineral, aceite vegetal, tal como aceite de cacahuete, aceite de soja y aceite de sésamo, aceite animal, o aceite de origen sintético. Las soluciones salinas y soluciones acuosas de dextrosa y glicerol también pueden utilizarse como portadores líquidos.
Las composiciones de la presente exposición pueden administrarse en el sujeto bajo tratamiento por vías estándares, incluyendo, aunque sin limitación, pulmonar, intranasal, oral, inhalación, parenteral, tal como la inyección intravenosa,
tópica, transdérmica, intradérmica, transmucosal, intraperitoneal, intramuscular, intracapsular, intraorbital, intravítrea, intracardíaca, transtraqueal, subcutánea, subcuticular, intraarticular, subcapsular, subaracnoidea, intraespinal, epidural e intraesternal.
Las composiciones de la presente exposición pueden administrarse en el ojo mediante una diversidad de vías. Pueden administrarse por vía intraocular, mediante aplicación tópica en el ojo o mediante inyección intraocular en, por ejemplo, el humor vítreo (inyección intravítrea) o en el espacio entre fotorreceptores subretiniano (inyección subretiniana). En algunas opciones, se administran en las células fotorreceptoras de los bastones. Alternativamente, pueden administrarse localmente mediante inserción o inyección en el tejido circundante al ojo. Pueden administrarse sistémicamente mediante una vía oral o mediante inyección subcutánea, intravenosa o intramuscular. Alternativamente, pueden administrarse mediante un catéter o mediante un implante, en el que dicho implante se realiza en un material poroso, no poroso o gelatinoso, incluyendo membranas tales como membranas o fibras silásticas, polímeros biodegradables o material proteico. Pueden administrarse antes de la aparición de la condición, a fin de prevenir su aparición, por ejemplo, durante la cirugía oftalmológica, o inmediatamente después de la aparición de la condición patológica o durante la ocurrencia de una condición aguda o prolongada.
Para la administración de una solución acuosa inyectable, por ejemplo, la solución puede tamponarse convenientemente, en caso necesario, y el diluyente líquido en primer lugar se convierte en isotónico con suficiente solución salina o glucosa. Dichas soluciones acuosas particulares resultan especialmente adecuadas para la administración intravenosa, intramuscular, intravítrea, subcutánea e intraperitoneal. A este respecto, el experto en la materia conocerá un medio acuoso estéril que pueda utilizarse, a la luz de la presente exposición. Por ejemplo, puede disolverse una dosis en 1 ml de solución isotónica de NaCl y añadirse a 1000 ml de líquido de hipodermoclisis o inyectarse en el sitio de infusión propuesto (ver, por ejemplo, "Remington's Pharmaceutical Sciences", 15a edición, páginas 1035 a 1038 y 1570 a 1580). Se producirá cierta variación en las dosis, según la condición del sujeto bajo tratamiento. La persona responsable de la administración determinará, en cualquier caso, las dosis apropiadas para el sujeto individual. Además, para la administración en el ser humano, las preparaciones deben cumplir las normas de esterilidad, pirogenicidad y de seguridad general y pureza requeridas por, p. ej., la Office of Biologics standards de la FDA.
Las soluciones inyectables estériles se preparan mediante la incorporación de las partículas de VAAr o células huésped en la cantidad requerida en el solvente apropiado con varios de los demás ingredientes indicados anteriormente, tal como se requiere, seguido de la esterilización por filtración. Generalmente, las dispersiones se preparan mediante la incorporación de los diversos ingredientes activos esterilizados en un vehículo estéril que contiene el medio de dispersión básico y/o los demás ingredientes requeridos de entre los señalados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones estériles inyectables, los métodos preferentes de preparación son las técnicas de secado al vacío o de liofilización, que rinden unos polvos del ingrediente activo más cualquier ingrediente deseado adicional a partir de una solución previamente filtrada a esterilidad del mismo.
La cantidad de partículas de VAAr, vector de ácido nucleico o composiciones de células huésped y el tiempo de administración de dichas composiciones se encontrarán comprendidas dentro de las competencias del experto en la materia con el beneficio de las presentes enseñanzas. Sin embargo, es probable que la administración de cantidades terapéuticamente activas de las composiciones dadas a conocer pueda conseguirse mediante una única administración, tal como, por ejemplo, una única inyección de un número suficiente de partículas infecciosas para proporcionar un beneficio terapéutico al paciente sometido a dicho tratamiento. Alternativamente, bajo ciertas circunstancias, puede resultar deseable proporcionar administraciones múltiples o sucesivas de las partículas de VAAr o composiciones de células huésped, durante un periodo de tiempo relativamente corto o relativamente prolongado, según determine el profesional sanitario que supervisa la administración de dichas composiciones.
En algunas opciones, las células de bastón se mantienen estructuralmente intactas y/o viables tras silenciar la expresión génica de la rodopsina celular. En algunas opciones, las células de bastón en las que se ha silenciado la expresión génica de la rodopsina celular presentan segmentos externos acortados que normalmente contendrían rodopsina. En algunas opciones, la longitud de los segmentos externos puede mantenerse o restaurarse (p. ej., parcial o completamente) utilizando el gen de rodopsina añadido exógenamente (endurecido), la expresión del cual es resistente al silenciamiento con las composiciones indicadas en la presente solicitud.
La composición puede incluir partículas de VAAr o células huésped, solas o en combinación con uno o más ingredientes activos adicionales, que pueden obtenerse de fuentes naturales o recombinantes o sintetizarse químicamente. En algunas opciones, las partículas de VAAr se administran en combinación, en la misma composición o administradas como parte del mismo régimen de tratamiento, con un inhibidor del proteasoma, tal como bortezomib, o hidroxiurea.
"Tratar" una enfermedad tal como se utiliza el término en la presente memoria se refiere a reducir la frecuencia o gravedad de por lo menos un indicio o síntoma de una enfermedad o trastorno experimentado por un sujeto. Las composiciones indicadas anteriormente se administran típicamente en el sujeto en una cantidad eficaz, es decir, una cantidad capaz de producir un resultado deseable. El resultado deseable dependerá del agente activo que se
administre. Por ejemplo, una cantidad eficaz de una partícula VAAr puede ser una cantidad de la partícula que sea capaz de transferir un ácido nucleico heterólogo a un órgano, tejido o célula del huésped.
La toxicidad y la eficacia de las composiciones utilizadas en los métodos de la exposición pueden determinarse mediante procedimientos farmacéuticos estándares, utilizando células en cultivo o animales experimentales para determinar la LD50 (la dosis letal para el 50 % de la población). La proporción de dosis entre toxicidad y eficacia, el índice terapéutico, y puede expresarse como la proporción LD50/ED50. Aquellas composiciones que muestran índices terapéuticos elevados resultan preferentes. Aunque pueden utilizarse aquellas que muestran efectos secundarios tóxicos, debe procurarse diseñar un sistema de administración que minimice el daño potencial de dichos efectos secundarios. La dosis de las composiciones indicadas en la presente memoria se encuentra generalmente dentro de un intervalo que incluye una ED50 con poca o ninguna toxicidad. La dosis puede variar dentro de dicho intervalo según la forma de administración utilizada y la vía de administración utilizada.
Aspectos de la exposición se refieren a partículas de virus adenoasociado recombinante (VAAr) para la administración de uno o más vectores de ácido nucleico que comprenden un gen de interés en diversos tejidos, órganos y/o células. En algunas opciones, las partículas de VAAr comprenden una proteína de cápside del VAAr tal como se indica en la presente memoria, p. ej., que comprende una o más sustituciones de aminoácidos. En algunas opciones, el gen de interés codifica un polipéptido o proteína de interés (p. ej., un polipéptido o proteína terapéutico). En algunas opciones, el gen de interés codifica un ARN de interés (p. ej., un ARNm terapéutico, ARNic, ARNhc, microARN, ARN antisentido, ARNt, ARNr o un ribozima). En algunas opciones, un gen de interés es un gen de sustitución (p. ej., un gen específicamente ocular, un gen funcional o un gen RHO funcional). En algunas opciones, un gen de interés comprende o codifica un ARN de interés (p. ej., microARN, ARNic o ARNhc) y un gen de sustitución de interés (p. ej., un gen específicamente ocular, un gen funcional o un gen RHO funcional). En algunas opciones, un gen RHO funcional comprende un gen RHO que comprende sustituciones de nucleótidos silenciosas que lo convierten en incapaz de ser degradado por un ARN de interés (p. ej., microARN, ARNic o ARNhc). En algunas opciones, un ARN de interés y un gen de sustitución de interés se encuentran bajo el control del mismo promotor. En algunas opciones, un ARN de interés y un gen de sustitución de interés se encuentran bajo el control de promotores diferentes. Pueden utilizarse cualesquiera promotores adecuados, por ejemplo, aunque sin limitación, un promotor vírico (p. ej., un promotor del CMV u otro promotor vírico), un promotor microbiano (p. ej., de levadura o bacteriano) o un promotor eucariótico (p. ej., de mamífero).
Las partículas de VAA recombinantes (VAAr) pueden comprender como mínimo (a) una o más zonas de ácidos nucleicos heterólogas que comprenden una secuencia codificante de un gen de interés (p. ej., un ARN de interés y/o un gen de sustitución de interés), y (b) una o más zonas que comprenden secuencias de repetición terminal invertida (RTI) (p. ej., secuencias RTI de tipo salvaje o secuencias RTI manipuladas) que flanquean la zona o zonas de ácidos nucleicos heterólogas. En algunas opciones, el vector de ácido nucleico presenta un tamaño de entre 4 kb y 5 kb (p. ej., un tamaño de entre 4,2 y 4,7 kb). Dicho vector de ácido nucleico puede encapsidarse en una cápside vírica, tal como una cápside de VAA1, VAA2, VAA3, VAA4 o VAA5, que puede comprender una proteína de cápside modificada tal como se indica en la presente memoria. En algunas opciones, el vector de ácido nucleico es circular. En algunas opciones, el vector de ácido nucleico es de cadena sencilla. En algunas opciones, el vector de ácido nucleico es de doble cadena. En algunas opciones, el vector de ácido nucleico de doble cadena puede ser, por ejemplo, un vector autocomplementario que contiene una zona del vector de ácido nucleico que es complementaria a otra zona del vector de ácido nucleico, que inicia la formación de la doble cadena en el vector de ácido nucleico.
La partícula de VAAr puede ser de cualquier serotipo de VAA, incluyendo cualquier derivado o pseudotipo (p. ej., 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 2/1, 2/5, 2/8, o 2/9). Tal como se utiliza en la presente memoria, el serotipo de un vector vírico de VAAr (p. ej., una partícula de VAAr) se refiere al serotipo de las proteínas de cápside del virus recombinante. En algunas opciones, la partícula de VAAr no es VAA2. En algunas opciones, la partícula de VAAr es VAA2. En algunas opciones, la partícula de VAAr es VAA6. En algunas opciones, la partícula de VAAr es un serotipo VAA6 que comprende una proteína de cápside de VAAr tal como se indica en la presente memoria. Entre los ejemplos no limitativos de derivados y pseudotipos se incluyen rVAA2/1, rVAA2/5, rVAA2/8, rVAA2/9, híbrido VAA2-VAA3, VAArh.10,VAAhu.14, VAA3a/3b, VAArh32.33, VAA-HSC15, VVAA-HSC17, VAAhu.37, VAArh.8, CHt-P6, VAA2.5, VAA6.2, VAA2i8, VAA-HSC15/17, VAAM41, VAA9.45, VAA6(Y445F/Y731F), VAA2.5T, VAA-HAE1/2, VAA clon 32/83, VAAShH10, VAA2 (Y->F), VAA8 (Y733F), VAA2.15, VAA2.4, VAAM41 y VAAr3.45. Dichos serotipos y derivados/pseudotipos de VAA, y los métodos de producción de dichos derivados/pseudotipos, son conocidos de la técnica (ver, p.ej., Mol. Ther. abril, 2012;20(4):699-708. doi: 10.1038/mt.2011.287. Pub. elec.: 24 de enero, 2012. The AAV vector toolkit: poised at the clinical crossroads. Asokan A1, Schaffer DV, Samulski RJ.). En algunas opciones, la partícula de VAAr es una partícula de VAAr pseudotipada, que comprende: (a) un vector de ácido nucleico que comprende RTI de un serotipo (p. ej., VAA2) y (b) una cápside que comprende proteínas de cápside derivadas de otro serotipo (p. ej., VAA1, VAA3, v Aa 4, VAA5, Va A6, VAA7, VAA8, VAA9 o VAA10). Los métodos para producir y utilizar vectores VAAr pseudotipados son conocidos de la técnica (ver, p. ej., Duan et al., J. Virol., 75:7662-7671,2001; Halbert et al., J. Virol., 74:1524-1532, 2000; Zolotukhin et al., Methods, 28:158-167, 2002 y Auricchio et al., Hum. Molec. Genet., 10:3075-3081, 2001).
Los métodos para producir partículas de VAAr y vectores de ácido nucleico también son conocidos de la técnica y se encuentran disponibles comercialmente (ver, p. ej., Zolotukhin et al., Production and purification of serotype 1, 2, and
5 recombinant adeno-associated viral vectors. Methods 28 (2002) 158-167, y publicaciones de patente US n° US20070015238 y n° US20120322861, y plásmidos y kits disponibles de la ATCC y Cell Biolabs, Inc.). Por ejemplo, un plásmido que contiene el vector de ácido nucleico puede combinarse con uno o más plásmidos ayudantes, p. ej., que contiene un gen rep (p. ej., codificante de Rep78, Rep68, Rep52 y Rep40) y un gen cap (p. ej., codificante de VP1, VP2 y VP3, incluyendo una zona VP3 modificada tal como se indica en la presente memoria) y transfectarse en una línea celular productora, de manera que la partícula de VAAr puede empaquetarse y posteriormente purificarse.
En algunas opciones, el plásmido o plásmidos ayudantes incluyen un primer plásmido ayudante que comprende un gen rep y un gen cap (p. ej., codificante de una proteína de cápside del VAAr tal como se indica en la presente memoria) y un segundo plásmido ayudante que comprende un gen E1a, un gen E1b, un gen E4, un gen E2a y un gen VA. En algunas opciones, el gen rep es un gen rep derivado de VAA2 o VAA6 y el gen cap se deriva de VAA2 o VAA6 y puede incluir modificaciones en el gen con el fin de producir la proteína de cápside modificada que se indica en la presente memoria. Los plásmidos ayudantes y los métodos de preparación de dichos plásmidos son conocidos de la técnica y se encuentran disponibles comercialmente (ver, p. ej., los plásmidos pDM, pDG, pDP1rs, pDP2rs, pDP3rs, pDP4rs, pDP5rs, pDP6rs, pDG(R484E/R585E) y pDP8.ape de PlasmidFactory, Bielefeld, Alemania; otros productos y servicios se encuentran disponibles de Vector Biolabs, Philadelphia, PA; Cellbiolabs, San Diego, CA; Agilent Technologies, Santa Clara, Ca; y Addgene, Cambridge, MA; pxx6; Grimm et al. (1998), Novel Tools for Production and Purification of Recombinant Adenoassociated Virus Vectors, Human Gene Therapy, vol. 9, 2745-2760; Kern, A. et al. (2003), Identification of a Heparin-Binding Motif on Adeno-Associated Virus Type 2 Capsids, Journal of Virology, Vol.
77, 11072-11081.; Grimm et al. (2003), Helper Virus-Free, Optically Controllable, and Two-Plasmid-Based Production of Adeno-associated Virus Vectors of Serotypes 1 to 6, Molecular Therapy, vol. 7, 839-850; Kronenberg et al. (2005), A Conformational Change in the Adeno-Associated Virus Type 2 Capsid Leads to the Exposure of Hidden VP1 N Termini, Journal of Virology, Vol. 79, 5296-5303, y Moullier, P. y Snyder, R.O. (2008), International efforts for recombinant adeno-associated viral vector reference standards, Molecular Therapy, vol. 16, 1185-1188).
A continuación, se describe un método ejemplar, no limitativo, de producción de partículas de VAAr. Se producen o se obtienen uno o más plásmidos ayudantes, que comprenden ORF de rep y cap para el serotipo de VAA deseado y los genes VA, E2A (DBP) y E4 adenovíricos bajo el control transcripcional de sus promotores nativos. El ORF de cap puede comprender además una o más modificaciones para producir una proteína de cápside modificada tal como se indica en la presente memoria. Las células HEK293 (disponibles de ATCC®) se transfectan mediante transfección mediada por CaPO4, lípidos o moléculas poliméricas, tales como polietilenimina (PEI) con el plásmido o plásmidos ayudantes y un plásmido que contiene un vector de ácido nucleico indicado en la presente memoria. A continuación, las células HEK293 se incuban durante como mínimo 60 horas para permitir la producción de partículas de VAAr. Alternativamente, en otro ejemplo, se infectan líneas celulares productoras estables basadas en Sf9 con un único baculovirus recombinante que contiene el vector de ácido nucleico. Como alternativa adicional, en otro ejemplo, se infectan líneas celulares HEK293 o BHK con un VHS que contiene el vector de ácido nucleico y opcionalmente uno o más VHS ayudantes que contienen los ORF de rep y cap tal como se indica en la presente memoria y los genes adenovíricos VA, E2A (DBP) y E4 bajo el control transcripcional de sus promotores nativos. A continuación, las células HEK293, BHK o Sf9 se incuban durante como mínimo 60 horas para permitir la producción de partículas de VAAr. A continuación, las partículas de VAAr pueden purificarse utilizando cualquier método conocido de la técnica o indicado en la presente memoria, p. ej., con un gradiente escalonado de iodixanol, gradiente de CsCl, cromatografía o precipitación con polietilenglicol (PEG).
La exposición contempla además células huésped que comprenden por lo menos una de las partículas de VAAr o vectores de ácidos nucleicos dados a conocer. Entre dichas células huésped se incluyen células huésped de mamífero, en el que resultan preferentes las células huésped humanas, y pueden aislarse en cultivo celular o de tejidos. En el caso de modelos animales modificados genéticamente (p. ej., el ratón), las células huésped transformadas pueden estar comprendidas dentro del cuerpo de un animal no humano mismo. Bajo algunas opciones, la célula huésped es una célula del linaje eritroide, tal como una célula progenitora eritroide temprana (BFU-E) CD36+ o una célula progenitora eritroide de unidad formadora de colonias eritroides (CFUE-E).
En algunas opciones, las composiciones indicadas en la presente memoria (p. ej., ARNic, ARNhc y/o genes de sustitución de interés) se formulan en una nanopartícula. En algunas opciones, las composiciones indicadas en la presente memoria (p. ej., ARNic, ARNhc y/o genes de sustitución de interés) se formulan en una nanopartícula lipídica. En algunas opciones, las composiciones indicadas en la presente memoria (p. ej., ARNic, ARNhc y/o genes de sustitución de interés) se formulan en un complejo de lípidos-policationes, denominado nanopartícula lipídica catiónica. La formación de la nanopartícula lipídica puede llevarse a cabo mediante métodos conocidos de la técnica y/o tal como se indica en la publicación de patente US n° 20120178702. A modo de ejemplo no limitativo, el policatión puede incluir un péptido catiónico o un polipéptido, tal como, aunque sin limitación, polilisina, poliornitina y/o poliarginina, y los péptidos catiónicos indicados en la publicación de patente internacional n° WO2012013326 o la publicación de patente US n° US20130142818. En algunas opciones, las composiciones indicadas en la presente memoria (p. ej., ARNic, ARNhc y/o genes de sustitución de interés) se formulan en una nanopartícula lipídica que incluye un lípido no catiónico, tal como, aunque sin limitación, colesterol o dioleoíl-fosfatidiletanolamina (DOPE).
Ejemplos
Ejemplo 1: identificación de ARN interfirientes cortos (ARNic) que desactivan RHO.
Mediante la utilización de los principios de diseño de ARN interfirientes cortos (ARNic) descritos por Khvorova y colaboradores45, se diseñaron 14 ARNic para cortar el ARNic de perro específicamente, 12 de los cuales también presentaban como diana el ARNm humano para la rodopsina. Antes de proceder, se utilizó el programa Blast del NCBI (blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) para cribar las posiciones 2 a 19 de los ARNic frente a la base de datos RefSeq humana del NCBI. Se excluyeron dos de los potenciales ARNic debido a que presentaban correspondencias estrechas con otros genes que podrían expresarse en la retina. Se obtuvieron versiones de ARN de 10 de los ARNic a través de GE Healthcare Dharmacon junto con un ARNic no dirigido que se utilizó a modo de control. Dichos ARN se sometieron a ensayo en células que expresaban RHO humana fusionadas con proteína fluorescente verde (GFP; se ilustra un mapa plasmídico ejemplar en la FIG. 11) y se midió la reducción de células fluorescentes verdes mediante separación celular activada por fluorescencia (FACS). La idea era que el corte del ARNm de la RHO reduciría la producción de GFP. Aunque la totalidad de los ARNic se había diseñado basándose en los principios de diseño actuales para los ARNic, solo 3 de los 10 que se sometieron a ensayo llevó a una reducción de 30 % o superior (FIG. 1A-C).
Con el fin de confirmar que dichos ARNic resultarían eficaces como ARN de horquilla cortos expresados a partir de un promotor de ARN polimerasa III y administrados mediante VAA, se clonaron las secuencias de ADN de los ARNhc que expresaban tres de los ARNic (FIG. 2). Curiosamente, la inactivación relativa de RHO utilizando ARNic no predijo con exactitud la supresión relativa de RHO utilizando ARNhc, ya que el ARNic 131 (SEC ID n° 1) fue el ARNic más eficaz pero el menos eficaz de los ARNhc que se sometieron a ensayo. Transfección simple de los ARNic, ya que el ARN puede no predecir con exactitud la eficacia del ARNhc diseñado para producir los mismos ARNic mediante transcripción y procesamiento.
Con el fin de confirmar que los ARNhc resultarían eficaces en el corte de la RHO tanto de tipo salvaje (normal) como mutante, los tres mismos ARNhc clonados en un vector VAA se sometieron a ensayo para su capacidad de digerir los ARNm de RHO de tipo salvaje y dos ARNm de RHO mutantes diferentes, utilizando PCR de transcripción inversa cuantitativa (qRT-PCR) como ensayo (FIG. 3).
La Tabla 5 proporciona las secuencias de ARN correspondientes a secuencias de ARNhc identificadas como capaces de cortar la RHO, incluyendo la cadena de sentido, bucle, cadena antisentido y saliente. Se ilustra cada secuencia con dos secuencias de bucle alternativas en negrita y subrayadas para destacarlas, con las secuencias sobresalientes en cursiva y subrayadas para destacarlas.
Tabla 5: ARN de horquilla corto (ARNhc)
Los ARNic también pueden administrarse en forma de microARN artificiales7 de una estructura similar a la mostrada en la FIG. 4. El microARN ejemplar de la FIG. 4 comprende cadenas de sentido (100) y antisentido (101) de RHO131 (SEC ID n° 1 y 2, respectivamente). La ventaja de dicho modo de expresión es que la producción del ARNic puede hacerse que sea específica de tipo celular mediante la utilización de una secuencia de promotor específica. En este caso, el promotor proximal del gen de rodopsina humana o el promotor de la rodopsina quinasa humana se utilizaría para restringir la expresión a las células fotorreceptoras.
Ejemplo 2: análisis de la KD de RHO en perros RHO+/+
El perro 2190 (portador de rcd1) recibió inyecciones subretinianas de VAA2/5-sc-H1-ARNhc-Rho131 a las concentraciones indicadas en la Tabla 6. El perro fue sacrificado 8 semanas después de la inyección. Se recogieron varios bocados de biopsia neurorretiniana de 3 mm de cada ojo de zonas de ampolla y de zonas sin ampolla.
Tabla 6: perro n° 2190
Los ejemplos no limitativos de constructos VAA2/5-sc-H1-ARNhc indicados en la presente memoria también pueden denominarse constructos VAA2/5-sc-MOP500 rGFP-ARNhc. VAA2/5 indica que el ácido nucleico codificante del ARNhc está flanqueado por RTI de VAA2 y se proporcionan en una partícula de VAAr que comprende las proteínas de cápside de v AA5. En algunas opciones, cualquier ARN interfiriente indicado en la presente memoria y cualquier gen RHO recombinante indicado en la presente memoria puede proporcionarse en el mismo ácido nucleico de VAA (p. ej., flanqueado por RTI de VAA2) en una partícula de VAAr (p. ej., que comprende proteínas de cápside de VAA5). En algunas opciones, cualquier ARN interfiriente indicado en la presente memoria y cualquier gen RHO recombinante indicado en la presente memoria puede proporcionarse en diferentes ácidos nucleicos de VAA (p. ej., cada uno flanqueado por RTI de VAA2, o cada uno flanqueado por RTI de diferentes serotipos de VAA) encapsidados en diferentes partículas de VAAr (p. ej., cada una de las cuales comprende proteínas de cápside de VAA5, o cada una de las cuales presenta proteínas de cápside de diferentes serotipos de v Aa ).
Análisis de transferencia Western:
Dos bocados de biopsia de cada ojo, que representaban zonas de ampolla o sin ampolla, se incubaron en 50 pl de solución tampón A de Lewin (con inhibidores de proteasa) durante 15 minutos sobre hielo. Las muestras se sonicaron a una amplitud de 40 %, 8 pulsos de 15 s ON/l0 s OFF. A continuación, se centrifugaron las muestras y se descartó el pellet. Se midió la concentración de proteínas mediante el método de Bradford. Se inmunotransfirió 1 pg de proteínas totales para visualizar la rodopsina (anticuerpo utilizado: Millipore MAB5356, diluido 1:1000 en tampón de bloqueo ODYSSEY®) y se utilizó anticuerpo antihistona (Abcam ab1791, diluido 1:3000) como control de carga (FIG. 5A) y para normalizar las señales (FIG. 5B). La comparación entre las cantidades de proteína RHO en zonas de ampolla y sin ampolla no era consistente con el diseño experimental (FIG. 5C).
Cuantificación absoluta del ARN de rodopsina canina en retinas caninas:
Con el fin de determinar las cantidades absolutas de ARN de rodopsina presente en la retina después del tratamiento con ribozima, se llevó a cabo una cuantificación absoluta utilizando el método de curva de patrones de Q-PCR. Se utilizó una serie de dilución de cantidades conocidas de ADNc de RHO canina para construir una curva patrón. Se calculó la cantidad total de ARN de RHO canina en cada muestra basándose en dicha curva patrón (FIG. 6A).
Se observó la inactivación parcial de RHO canina con VAA2/5-sc-H1-ARNhc-Rho131. A la concentración más alta utilizada, los niveles de proteína se redujeron en 37 %, mientras que el ARN se redujo en aproximadamente 50 % (FIG. 6B).
Ejemplo 3: análisis adicional de la KD de RHO en perros RHO+/+
El perro 2194 (portador de rcd1) recibió inyecciones subretinianas de VAA2/5-sc-H1-ARNhc-Rho820 a las concentraciones indicadas en la Tabla 7. El perro fue sacrificado 8 semanas después de la inyección. Se recogieron varios bocados de biopsia neurorretiniana de 3 mm de cada ojo de zonas de ampolla y de zonas sin ampolla.
Tabla 7: perro n° 2194
Análisis de transferencia Western:
Dos bocados de biopsia de cada ojo, que representaban zonas de ampolla o sin ampolla, se incubaron en 50 pl de solución tampón A de Lewin (con inhibidores de proteasa) durante 15 minutos sobre hielo. Las muestras se sonicaron a una amplitud de 40 %, 8 pulsos de 15 s ON/10 s OFF. A continuación, se centrifugaron las muestras y se descartó el pellet. Se midió la concentración de proteínas mediante el método de Bradford. Se inmunotransfirió 1 pg de proteínas totales para visualizar la rodopsina (anticuerpo utilizado: Millipore MAB5356, diluido 1:1000 en tampón de bloqueo
ODYSSEY®). Se utilizó anticuerpo antihistona (ab1791 de Abcam, diluido 1:3000) como control de carga (FIG. 7A) y para normalizar las señales (FIG. 7B). La comparación entre las cantidades de proteína RHO en zonas de ampolla y sin ampolla no era consistente con el diseño experimental (FIG. 7C).
Cuantificación absoluta del ARN de rodopsina canina en retinas caninas:
Con el fin de determinar las cantidades absolutas de ARN de rodopsina presente en la retina después del tratamiento con ribozima, se llevó a cabo una cuantificación absoluta utilizando el método de curva de patrones de Q-PCR. Se utilizó una serie de dilución de cantidades conocidas de ADNc de RHO canina para construir una curva patrón. Se calculó la cantidad total de ARN de RHO canina en cada muestra basándose en dicha curva patrón (FIG. 8A).
Se observó una inactivación completa del ARN y proteína de RHO canina con VAA2/5-sc-H1-ARNhc-Rho820 a la dosis inferior de 1 * 1012 gv/ml (FIG. 8B).
Ejemplo 4: secuencias de ARNm endurecido para el gen de sustitución
En algunas opciones, un ARNm para un gen de sustitución (p. ej., RHO de sustitución) puede sustituirse en una o más posiciones para "endurecerlo" (es decir, para provocar que resulte más resistente a la degradación por ARNic). En algunas opciones, puede incluirse una o más sustituciones de nucleótidos silenciosas en el gen de sustitución respecto al ARNic que se proporciona para inactivar el gen endógeno (p. ej., el gen RHO). Las FIGs. 9 y 10 proporcionan ejemplos no limitativos de sustituciones de nucleótidos que pueden introducirse en el ARNm de la RHO de sustitución. Debería apreciarse que el gen RHO de sustitución puede incluir una o más de dichas sustituciones.
La FIG. 9 ilustra una representación del emparejamiento de bases que se produce entre cada ARNhc y la secuencia diana del ARNm de RHO endógeno humano o endurecido. Todos los ARNhc emparejan perfectamente las bases con la secuencia diana del ARNm de RHO de perro. Caja blanca: falta de correspondencia entre el ARNhc y el ARNm de RHO de perro endógeno, así como endurecido. Caja gris oscuro: un balanceo débil del emparejamiento de bases que se produce en el ARN entre la guanosina y el uracilo. Caja gris claro: falta de correspondencia entre el ARNhc y el ARNm de RHO endurecido únicamente.
La FIG. 10 ilustra una representación del emparejamiento de bases que se produce entre el ARNhc134 y la secuencia diana de ARNm de RHO131 endógeno humano o endurecido. La proximidad de las secuencias diana de los ARNhc 131 y 134 permite utilizar el mismo RHO131 endurecido. Caja gris oscuro: un balanceo débil del emparejamiento de bases que se produce en el ARN entre la guanosina y el uracilo. Caja gris claro: falta de correspondencia entre el ARNhc y el ARNm de RHO endurecido únicamente.
Ejemplo 5: codificación de ARNic y genes de sustitución
En algunas opciones, puede resultar deseable proporcionar ARNic codificado en un vector de ADN. Las FIGs. 12A-B ilustran ejemplos no limitativos de ARNic (p. ej., ARNhc) codificado en un vector de ADN. En algunas opciones, tal como se ilustra adicionalmente en los mapas plasmídicos ejemplares mostrados en las FIGs. 12A-B, el vector de ADN puede codificar adicionalmente secuencias de repetición terminal invertida (RTI) flanqueando el ARNic (p. ej., el ARNhc). En algunas opciones, el vector de ADN codificante del ARNic flanqueado por secuencias de r T i puede utilizarse en la producción de partículas de VAA recombinante que comprenden el ARNic.
En algunas opciones, puede resultar deseable proporcionar un ARNm de RHO de sustitución codificado en un vector de ADN. La FIG. 12C ilustra un ejemplo no limitativo de un ARNm de RHO de sustitución (p. ej., RHO humano) codificado en un vector de ADN. En algunas opciones, tal como se ilustra adicionalmente en el mapa plasmídico ejemplar mostrado en la FIG. 12C, el vector de ADN puede codificar además secuencias de RTI flanqueando el ARNm de RHO de sustitución (p. ej., RHO humana). En algunas opciones, el vector de ADN codificante del ARNm de la RHO de sustitución flanqueado por secuencias de RTI puede utilizarse en la producción de partículas de VAA recombinante que comprenden el gen rho humano. En algunas opciones, puede proporcionarse un vector de ADN similar que incluye tanto el gen rho de sustitución como una o más secuencias codificantes de uno o más ARN interfirientes flanqueados por secuencias de RTI. En algunas opciones, los ARN interfirientes y/o genes rho de sustitución se acoplan operativamente con un promotor (p. ej., un promotor de ARN polimerasa III, o promotor H1 de ARN polimerasa III, u otro promotor tal como se indica en la presente solicitud). Los ARN interfirientes y/o genes rho de sustitución representados en las FIGS. 12A-C se encuentran bajo el control de n promotor H1 de ARN polimerasa III. Los constructos de las FIGs. 12A-C también incluyen un MOP500-rGFP (un segmento -385/+86 del promotor opsina de bastón de ratón (MOP500) cadena arriba de la secuencia invertida de GFP (rGFP) que, por lo tanto, no se Expresa) y que pueden denominarse constructos H1 o constructos MOP500. Sin embargo, el segmento MOP500 (p. ej., MOP500-rGFP) no resulta necesario. De acuerdo con lo anterior, un plásmido o ácido nucleico de VAAr puede codificar un ARN interfiriente yo un gen rho modificado tal como se indica en la presente memoria, cada uno bajo el control del mismo promotor o promotores diferentes (p. ej., un promotor H1) sin un promotor opsina de ratón y/o sin ninguna secuencia codificante de GFP (en cualquier orientación).
Ejemplo 6: análisis de KD de RHO con ARNhc820 en perros WT RHO+/+
El ejemplo 6 incluye la identificación de los títulos víricos de VAA2/5 portadores del reactivo de inactivación ARNhc820 que silencia eficientemente la expresión de la rodopsina tras la inyección subretiniana en perros WT; pruebas de imágenes retinianas in vivo en perros WT de la conservación de la capa (CNE) que contiene los fotorreceptores, aunque la reducción de las capas que contiene rodopsina tras la inyección subretiniana de VAA2/5-sc-H1-ARNhc820; la identificación de los títulos víricos de VAA2/5 portadores del reactivo de inactivación ARNhc820 que silencian eficientemente la expresión de la rodopsina tras la inyección subretiniana en el perro mutante RHOT4R/+, un modelo de origen natural de r HO-ADRP; la identificación de títulos víricos de VAA2/5-sc-H1-ARNhc820 que confiere protección a los fotorreceptores frente a la degeneración retiniana fotoinducida en los perros mutantes RHOT4R/+;pruebas de que la inactivación eficiente de la expresión de la rodopsina conduce a una pérdida de los segmentos externos en los bastones. Debido a que la preservación de los segmentos externos resulta crucial para la fototransducción (el mecanismo por el que los bastones convierten la luz en una señal eléctrica), una terapia óptima para RHO-ADRP debería reducir la RHO nativa, aunque preservar la estructura de los segmentos externos. Estos resultados demuestran que un enfoque de inactivación no resulta suficiente y defiende la utilización de una estrategia combinada de inactivación y sustitución.
Cinco perros WT RHO+/+ recibieron inyecciones subretinianas de VAA2/5-sc-H1-ARNhc-Rho820 en ambos ojos a concentraciones víricas comprendidas entre 1*1011 y 5*1012 gv/ml), tal como se indica en la Tabla 8, a continuación.
Tabla 8: análisis de la KD de RHO con ARNhc820 en perros WT RHO+/+
A las 6-8 semanas de la inyección in vivo, se obtuvieron imágenes retinianas in vivo (cSLO/TCO) y seguidamente se sacrificaron los perros. Se recolectaron varios bocados de biopsia neurorretiniana de 3 mm de ambos ojos (perro 2194) o de solo el ojo OI (otros perros) en zonas tanto de ampolla/tratadas como en zonas sin ampolla/no tratadas, a fin de medir el nivel de expresión de rodopsina canina mediante transferencia Western y el ARN de RHO mediante análisis de qPCR. Se fijó el ojo OD, se incluyó en medio de temperatura óptima de corte y se procesó para histología y tinción inmunohistoquímica.
Análisis de transferencia Western:
Se incubaron hasta tres pares de bocados de biopsia, que representaban zonas de ampolla o zonas sin ampolla, se incubaron en 50 pl de solución tampón A de Lewin (que contiene inhibidores de proteasa) durante 15 min sobre hielo. Las muestras se sonicaron a una amplitud de 40 %, 8 pulsos de 15 s ON/10 s OFF. A continuación, se centrifugaron las muestras y se descartó el pellet. Se midió la concentración de proteínas mediante el método de Bradford. Las muestras se almacenaron a -20°C. Se cargó 1 pg de proteínas totales en el gen para visualizar la rodopsina (anticuerpo utilizado: Millipore MAB5356, diluido 1:1000 en tampón de bloqueo Odyssey). Se utilizó anticuerpo antihistona (ab1791 de Abcam, diluido 1:3000) como control de carga y para normalizar las señales.
Cuantificación absoluta del ARN de rodopsina canina en retinas caninas:
Con el fin de determinar las cantidades absolutas de ARN de rodopsina presente en la retina después del tratamiento con ARNhc820, se llevó a cabo una cuantificación absoluta utilizando el método de curva de patrones de Q-PCR. Se utilizó una serie de dilución de cantidades conocidas de ADNc de RHO canina para construir una curva patrón. Se
utilizó 0,1 nanogramo de ADNc total para la cuantificación. Se calculó la cantidad total de ADNc de RHO canina en cada muestra basándose en dicha curva patrón.
Evaluación mediante imágenes retinianas in vivo de la integridad retiniana en ojos de perros WT RHO /+ que han recibido inyecciones de diferentes títulos víricos de VAA2/5-sc-H1-ARNhc820.
Se utilizaron las imágenes retinianas in vivo mediante cSLO/TCO para evaluar la integridad retiniana de la CNE 6 a 8 semanas después de la inyección subretiniana de diferentes títulos de VAA2/5-sc-H1-ARNhc820. Los mapas topográficos de grosor de la CNE muestran la preservación de esta capa a todos los títulos. La segmentación de la membrana limitante externa (MLE), segmentos internos (SI) y segmentos externos (SE) reveló una reducción de la intensidad de la señal en la zona correspondiente a la zona de ampolla en ojos que habían recibido inyecciones con títulos de 1*1012 y 5*1012 gv/ml. Estos resultados sugieren un acortamiento de los SE y SI de los fotorreceptores como resultado del silenciamiento de RHO y pueden utilizarse para evaluar la eficacia de la KD de RHO in vivo. Las FIGs.
13A-13E muestran el análisis de ARN y de proteínas de la inactivación de la rodopsina con diferentes títulos víricos de VAA2/5-sc-H1-ARNhc820 inyectado por vía subretiniana en perros WT RHO+/+. La FIG. 13A muestra mapas retinianos que muestran la posición de bocados de biopsia utilizados para el análisis de transferencia western y la cuantificación del ARN. Los círculos emparejados gris oscuro, gris y de puntos indican la posición de los bocados de biopsia en las zonas de ampolla/tratadas y de no ampolla/no tratadas para cada réplica de transferencia western, mientras que los círculos negros indican las posiciones de los bocados de biopsia para la cuantificación del ARN. La FIG. 13B muestra un gráfico de columnas que muestra el ARN de rodopsina canina remanente en la zona tratada como porcentaje de los niveles medidos en la zona no tratada de la misma retina. La FIG. 13C muestra una inmunotransferencia que muestra la cantidad de rodopsina en bocados de biopsia obtenidos de zonas tratadas (Tx) y no tratadas (no Tx) de retina canina. Para la normalización se utilizó histona H3. Los gráficos de columnas muestran la proteína rodopsina remanente como porcentaje de los niveles medidos en la zona no tratada de la misma retina. Las FIGs. 13D-13E muestran tablas con los valores numéricos de cada experimento (informados como porcentaje de ARN o proteína remanente, y alternativamente, como porcentaje de inactivación del ARN o proteína, respectivamente).
Las FIGs. 14A-D muestran la evaluación de la integridad de la CNE y MLE/SI/SE tras la inyección subretiniana de diferentes títulos de VAA2/5-sc-H1-ARNhc820 en perros WT. La FIG. 14A muestra mapas de grosor de la CNE; la fig.
14B muestra mapas de MLE/SI/SE de intensidad normalizada; la FIG. 14C muestra los valores de grosor de la CNE, y la FIG. 14D muestra los valores de intensidad normalizada de las capas MLE/SI/SE. Estos resultados sugieren un acortamiento de los SE y SI de los fotorreceptores como resultado del silenciamiento de RHO y pueden utilizarse para evaluar la eficacia de la KD de RHO in vivo.
Se observó una inactivación completa del ARN y proteína de RHO canina en perros WT con VAA2/5-sc-H1-ARNhc820 que han recibido inyecciones subretinianas de títulos víricos de tan solo 1*1012 gv/ml. No se observó ninguna reducción del grosor de la CNE, ni siquiera a la concentración vírica más alta, sugiriendo que la inactivación de la rodopsina no induce la muerte de las células fotorreceptoras. Se observó una reducción de la reflectividad de la tomografía de coherencia óptica (TCO) de las capas MLE/SI/SE en la zona tratada/de ampolla de ojos que han recibido la inyección de títulos víricos elevados que inducen una KD de 100% de la rodopsina. Dicha observación es compatible con el adelgazamiento de dichas capas y puede utilizarse como una medida de resultado in vivo de la eficiencia de la KD.
Ejemplo 7: análisis de la KD de RHO con ARNhc820 en perros mutantes RHOT4R/+
Cuatro perros RHOT4R/+ recibieron inyecciones subretinianas de VAA2/5-sc-H1-ARNhc-Rho820 en ambos ojos a las concentraciones de virus indicadas en la Tabla 9, a continuación.
Tabla 9: KD de RHO con ARNhc820 en perros mutantes RHOT4R/+
Tabla 9 (continuación)
Se llevó a cabo cSLO/TCO 8 semanas después de la inyección y se realizó la exposición lumínica (1 min a 1 mW/cm2) sobre el ojo OI en todos los perros para inducir degeneración retiniana fotoinducida. Se llevó a cabo nuevamente cSLO/TCO en todos los perros, 2 semanas después de la exposición lumínica con el fin de evaluar cualquier efecto de rescate conferido por el tratamiento. Se sacrificaron los perros y se recolectaron varios bocados de biopsia neurorretiniana de 3 mm del ojo OD en zonas tanto con ampolla/tratadas como en zonas sin ampolla/no tratadas, a fin de medir el nivel de expresión de rodopsina canina mediante transferencia Western y el ARN de RHO mediante análisis de qPCR. Se fijó el ojo OI, se incluyó en medio de temperatura óptima de corte y se procesó para histología y tinción inmunohistoquímica.
Análisis de transferencia Western:
Tres pares de bocados de biopsia de cada ojo OI, que representaban zonas con ampolla/tratadas o zonas sin ampolla/no tratadas se incubaron en 50 pl de solución tampón A de Lewin (que contenía inhibidores de proteasa) durante 15 min sobre hielo. Las muestras se sonicaron a una amplitud de 40 %, 8 pulsos de 15 s ON/10 s OFF. A continuación, se centrifugaron las muestras y se descartó el pellet. Se midió la concentración de proteínas mediante el método de Bradford. Las muestras se almacenaron a -20°C. Se cargó 1 pg de proteínas totales en el gel para visualizar la rodopsina (anticuerpo utilizado: Millipore MAB5356, diluido 1:1000 en tampón de bloqueo Odyssey). Se utilizó anticuerpo antihistona (ab1791 de Abcam, diluido 1:3000) como control de carga y para normalizar las señales.
Cuantificación absoluta del ARN de rodopsina canina en retinas caninas:
Con el fin de determinar las cantidades absolutas de ARN de rodopsina presente en la retina después del tratamiento con ARNhc820, se llevó a cabo una cuantificación absoluta utilizando el método de curva de patrones de Q-PCR. Se utilizó una serie de dilución de cantidades conocidas de ADNc de RHO canina para construir una curva patrón. Se utilizó 0,1 nanogramo de ADNc total para la cuantificación. Se calculó la cantidad total de ADNc de RHO canina en cada muestra basándose en dicha curva patrón.
Evaluación mediante imágenes retinianas in vivo del rescate de fotorreceptores de daños fotoinducidos en ojos de perros mutantes RHO T4R/+ que han recibido inyecciones de diferentes títulos víricos de VAA2/5-sc-H1-ARNhc820.
Los ojos de perros mutantes RHO T4R/+ que habían recibido inyecciones subretinianas con títulos víricos comprendidos entre 1*1012 y bajando hasta 1X1011 gv/ml fueron examinados mediante obtención de imágenes por cSLO/TCO 8 semanas después de las inyecciones (antes de la exposición lumínica). El grosor de la CNE en la zona con ampolla/tratada estaba conservado, sugiriendo que ARNhc820 no causa ninguna pérdida de fotorreceptores durante ese periodo. Se utilizó una exposición de 1 min a luz blanca a una intensidad (irradiancia corneal de 1 mW/cm2), que se ha mostrado previamente que causa degeneración retiniana aguda en perros mutantes RHO T4R, pero no en perros WT, para evaluar el nivel de protección conferido por VAA2/5-sc-H1-ARNhc820 eN la zona tratada/con ampolla. Se utilizaron las zonas sin ampolla/no tratadas circundantes como control interno para cada ojo. Dos semanas después de la exposición lumínica, se obtuvieron nuevamente imágenes de las retinas y mostraban una buena preservación del grosor de la CNE en la zona con ampolla/tratada de los ojos que habían recibido inyecciones a títulos de 1*1012 y 5X1011 gv/ml. Se observó un rescate muy leve a 2,5*1011 gv/ml y ninguno al título de 1X1011 gv/ml.
Las FIGs. 15A-15E muestran el análisis de ARN y de proteínas de la inactivación de la rodopsina con diferentes títulos víricos de VAA2/5-sc-H1-ARNhc820 inyectado por vía subretiniana en perros mutantes RHOT4R/+. La FIG. 15A muestra mapas retinianos que muestran la posición de bocados de biopsia utilizados para el análisis de transferencia western y la cuantificación del ARN. Los círculos emparejados gris oscuro, gris y de puntos indican la posición de los bocados de biopsia en las zonas de ampolla/tratadas y de no ampolla/no tratadas para cada réplica de transferencia western, mientras que los círculos negros indican las posiciones de los bocados de biopsia para la cuantificación del ARN. La FIG. 15B es un gráfico de columnas que muestra la cantidad de ARN de rodopsina canina remanente como porcentaje de los niveles medidos en la zona no tratada de la misma retina. La FIG. 15C es una inmunotransferencia que muestra la cantidad de rodopsina canina en bocados de biopsia obtenidos de zonas tratadas (Tx) y no tratadas (no Tx) de retina canina. Para la normalización se utilizó histona H3. Los gráficos de columnas muestran la proteína rodopsina canina remanente como porcentaje de los niveles medidos en la zona no tratada de la misma retina. Las FIGs. 13D
13E muestran tablas con los valores numéricos de cada experimento (informados como porcentaje de ARN o proteína remanente, y alternativamente, como porcentaje de inactivación del ARN o proteína, respectivamente).
Las FIGs. 16A-16D muestran escaneos B de TCO que comprenden las zonas retinianas tratadas (con diferentes títulos víricos de VAA2/5-sc-H1-ARNhc820) y no tratadas de perros RHOT4R/+ 2 semanas después de la exposición a una dosis breve de luz que causa degeneración retiniana aguda en perros mutantes RHOT4R/+. (FIG. 16A) escaneo de TCO de un perro tratado con 1x1o12 gv/ml. (FIG. 16B) escaneo de TCO de un perro tratado con 5x1o11 gv/ml. (FIG. 16C) escaneo de TCO de un perro tratado con 2,5x1o11 gv/ml. (FIG. 16D) escaneo de TCO de un perro tratado con 1 x io 11 gv/ml. Las FIGs. 17A-17B muestran el mapa topográfico de grosor de la CNE de un RHOT4R/+tratado con VAA2/5-sc-H1-ARNhc820 que muestra la protección frente a la degeneración retiniana fotoinducida. (FIG. 17A) mapa de grosor de la CNE de un perro de control WT no tratado (panel izquierdo) y mapa de grosor de la CNE de EM411-OS tratado con VAA2/5-sc-H1-ARNhc820 a 5x1011 vg/ml y que muestra la preservación del grosor de la CNE en la zona tratada/con ampolla semanas después del daño fotoinducido. Las curvas negra y blanca muestran los límites de la ampolla tal como se observa inmediatamente después de la inyección subretiniana. Los paneles, posteriormente, muestran escaneos B de TCO con la CNE coloreada en gris más oscuro (banda intermedia) con fines de visualización. (FIG. 17B) Se seleccionaron loci fuera y dentro de la ampolla para las mediciones del grosor de la CNE.
Se observó una inactivación completa del ARN y proteína (mediante transferencia Western) de RHO canina con VAA2/5-ARNhc-Rho820 a títulos de virus de 1x1o12 y 5x1o11 gv/ml. Se consiguió el rescate completo de la capa nuclear externa (CNE), que contiene los cuerpos celulares de los fotorreceptores, con VAA2/5-ARNhc-Rho820 a títulos de virus de 1x1o12 y 5x1o11 gv/ml.
Evaluación mediante histología e inmunohistoquímica de la protección de los fotorreceptores frente al daño fotoinducido en ojos de perros mutantes RHO T4R/+ que han recibido inyecciones de diferentes títulos víricos de VAA2/5-sc-H1-ARNhc820.
Se examinaron los ojos de los mismos perros mutantes RHOT4R/+ señalados en la Tabla, anteriormente, que habían recibido inyecciones subretinianas con títulos víricos comprendidos entre 1x1012 y bajando hasta 1x1011 gv/ml y posteriormente expuestos lumínicamente (8 semanas después de las inyecciones) durante 1 min a luz blanca a una intensidad (irradiancia corneal de 1 mW/cm2). Dicha dosis de luz se ha mostrado previamente que causa degeneración retiniana aguda en perros mutantes RHO T4R, pero no en perros WT. Se utilizó histología e inmunohistoquímica para evaluar el nivel de protección conferido por el VAA2/5-sc-H1-ARNhc820 en la zona tratada/con ampolla. Se utilizaron las zonas sin ampolla/no tratadas circundantes como control interno para cada ojo. Se utilizaron anticuerpos dirigidos contra la rodopsina (RHO) y arrestina de conos humanos (hCA) para evaluar la integridad de los segmentos externos de los bastones y la morfología de los conos. La FIG. 18 muestra la histología (tinción H+E) e inmunohistoquímica (la rodopsina se tiñó en verde y muestra una apariencia de tinción ligera en los paneles inferiores de la FIG. 18; la arrestina de conos humanos se tiñó en rojo y muestra una apariencia gris en los paneles inferiores de la FIG. 18) en las zonas tratadas (Tx) y no tratadas (no Tx) de retinas mutantes RHOT4R/+ que han recibido inyecciones por vía subretiniana con diferentes títulos víricos de VAA2/5-sc-H1-ARNhc820. Dos semanas después de la exposición lumínica, se observó una buena preservación del grosor de la CNE en la zona con ampolla/tratada de los ojos que habían recibido una inyección de títulos 1x1012 y 5x1o11 gv/ml, mientras que el grosor de la CNE se redujo ligeramente al título de 2,5x1o11 gv/ml y no se observó protección con el título de 1x1o11 gv/ml. Concuerda con la inactivación muy eficiente de la expresión de rodopsina con los títulos de 1x1012 y 5x1o11 gv/ml, y la reducción de la longitud de los bastones de OI observada en las secciones H+E, en combinación con una reducción de la expresión de rodopsina.
Se observó una inactivación completa del ARN y proteína (mediante transferencia Western) de RHO canina con VAA2/5-ARNhc820 a títulos de virus de 1*1012 y 5x1o11 gv/ml. Se consiguió una protección completa de la capa nuclear externa (CNE), que contiene los cuerpos celulares de los fotorreceptores, con VAA2/5-ARNhc82o a títulos de virus de 1x1o12 y 5x1o11 gv/ml. La pérdida de la estructura del segmento externo en los bastones como resultado de una inactivación eficiente de RHO justifica la necesidad de una estrategia combinada de KD y sustitución que permita que los bastones tratados conserven los segmentos externos y sigan siendo funcionales.
Ejemplo 8:
El presente ejemplo proporciona datos que apoyan la terapia génica con RHO-ADRP. Incluye los ensayos en perros mutantes RHOT4R/+ de un constructo de vector VAA2/5 (vAA2/5-sc-HOP-RHO82o-H1-ARNhc82o) que combine tanto el reactivo de inactivación ARNhc82o como el reactivo de sustitución RHO82o (=ARNm de RHO humano endurecido), la identificación de los títulos víricos de VAA2/5-sc-HOP-RHO82o-H1-ARNhc82o que resultan en una inactivación eficiente de la RHO canina endógena y la expresión eficiente de la RHO humana endurecida de sustitución (RHO82o), pruebas de que VAA2/5-sc-HOP-RHO82o-H1-ARNhc82o confiere protección a los fotorreceptores frente a la degeneración retiniana fotoinducida en perros mutantes RHOT4R/+ y pruebas de que se consigue la preservación de los segmentos externos de los bastones en las zonas retinianas tratadas con VAA2/5-sc-HOP-RHO82o-H1-ARNhc82o.
Análisis de la KD y sustitución de RHO con ARNhc82o y RHO82o en perros mutantes RHOT4R/+:
2o
Dos perros RHOT4R/+ recibieron inyecciones subretinianas de VAA2/5-sc-HOP-RHO820-H1-ARNhc820 en ambos ojos a las concentraciones de virus indicadas en la Tabla a continuación (Tabla 10).
Tabla 10.
Se obtuvieron imágenes retinianas in vivo (cSLO/TCO) 11 semanas después de las inyecciones y se realizó la exposición lumínica (1 min a 1 mW/cm2) sobre el ojo OI en todos los perros para inducir degeneración retiniana fotoinducida. Se llevó a cabo nuevamente cSLO/TCO en todos los perros, 2 semanas después de la exposición lumínica con el fin de evaluar cualquier efecto de rescate conferido por el tratamiento. Se sacrificaron los perros y se recolectaron varios bocados de biopsia neurorretiniana de 3 mm del ojo OD tanto de zonas con ampolla/tratadas como de zonas sin ampolla/no tratadas, a fin de medir el nivel de expresión de rodopsina mediante transferencia Western y el ARN de RHO canina y humana mediante análisis de qPCR. Se fijó el ojo O i, se incluyó en medio de temperatura óptima de corte y se procesó para histología y tinción inmunohistoquímica.
Análisis de transferencia Western:
Tres pares de bocados de biopsia de cada ojo OD, que representaban zonas con ampolla/tratadas o zonas sin ampolla/no tratadas se incubaron en 50 pl de solución tampón A de Lewin (que contenía inhibidores de proteasa) durante 15 min sobre hielo. Las muestras se sonicaron a una amplitud de 40 %, 8 pulsos de 15 s ON/10 s OFF. A continuación, se centrifugaron las muestras y se descartó el pellet. Se midió la concentración de proteínas mediante el método de Bradford. Las muestras se almacenaron a -20°C. Se cargó 1 pg de proteínas totales en el gel para visualizar la rodopsina (anticuerpo utilizado: Millipore MAB5356, diluido 1:1000 en tampón de bloqueo Odyssey). Se señala que dicho anticuerpo detecta RHO tanto canina como humana. Debido a la pérdida de glucosilación en Asn2, la rodopsina mutante T4R puede diferenciarse de la proteína RHO WT (canina o humana), ya que presenta un peso molecular (PM) más bajo que puede detectarse en las inmunotransferencias. Las inmunotransferencias de RHO de mutantes RHOT4R/+ heterocigóticos mostraban, de esta manera, dos bandas, correspondientes a las proteínas RHO WT (alto PM) y mutante T4R (bajo PM). Se utilizó anticuerpo antihistona (ab1791 de Abcam, diluido 1:3000) como control de carga y para normalizar las señales.
Cuantificación absoluta del ARN de rodopsina canina y humana en retinas caninas:
Con el fin de determinar las cantidades absolutas tanto de ARN de rodopsina canina endógena como de ARN de RHO820 humana presente en la retina después del tratamiento con VAA2/5-sc-HOP-RHO820-H1-ARNhc820, se llevó a cabo una cuantificación absoluta utilizando el método de curva de patrones de Q-PCR. Se utilizó una serie de dilución de cantidades conocidas de ADNc de RHO canina y humana para construir una curva patrón. Se utilizó 0,1 nanogramo de ADNc total para la cuantificación. Se calculó la cantidad total de ARN de RHO canina y RHO820 humana en cada muestra basándose en dicha curva patrón.
Las FIGs. 19A-19F muestran el análisis de ARN y de proteínas de la inactivación de la rodopsina y la sustitución con VAA2/5-sc-HOP-RHO820-H1-ARNhc820 inyectado por vía subretiniana en perros mutantes RHOT4R/+ a un título de 5X1011 gv/ml. La FIG. 19A muestra mapas retinianos que muestran la posición de bocados de biopsia utilizados para el análisis de transferencia western y la cuantificación del ARN. Los círculos emparejados gris oscuro, gris y de puntos indican la posición de los bocados de biopsia en las zonas de ampolla/tratadas y de no ampolla/no tratadas para cada réplica de transferencia western, mientras que los círculos negros indican las posiciones de los bocados de biopsia para la cuantificación del ARN. La FIG. 19B muestra una inmunotransferencia que muestra la cantidad de rodopsina total (canina RHO820 humana) en bocados de biopsia obtenidos de zonas tratadas (Tx) y no tratadas (no Tx) de retina canina. Para la normalización se utilizó histona H3. Los gráficos de columnas muestran el porcentaje de proteína rodopsina remanente en las zonas tratadas y no tratadas. Observar que la pérdida de la banda de PM inferior (correspondiente a proteína RHO mutante T4R) en las zonas tratadas de EM424-OD y EM425-OD. La FIG. 19C es una tabla que muestra los valores numéricos de cada pareja de bocados utilizada para la cuantificación de proteína. La FIG. 19D es un gráfico de columnas que muestra el a Rn de rodopsina canina remanente en las zonas tratadas como porcentaje de ARN de RHO canino medidos en zonas no tratadas. La FIG. 19E es un gráfico de columnas que muestra los niveles de RHO820 humana en las zonas tratadas como porcentaje de los niveles de ARN de RHO canina
medidos en zonas no tratadas. La FIG. 19F es una tabla que muestra los valores numéricos de cada pareja de bocados utilizada para la cuantificación del ARN.
Evaluación mediante imágenes retinianas in vivo de la protección de los fotorreceptores frente a la degeneración retiniana fotoinducida en ojos de perros mutantes RHOT4R/+ que habían recibido por vía subretiniana VAA2/5-sc-HOP-RHO820-H1-ARNhc820 a un título de 5x1011gv/ml:
Los ojos de 2 perros mutantes RHO T4R/+ en los que se había inyectado por vía subretiniana un título vírico de 5x1011 gv/ml se examinaron mediante imágenes de cSLO/TCO antes de la inyección, 11 semanas después de la inyección (antes de la exposición lumínica) y 2 semanas después del daño fotoinducido. Se utilizó una exposición de 1 min a luz blanca a una intensidad (irradiancia corneal de 1 mW/cm2) que se ha mostrado previamente que causa degeneración retiniana aguda en perros mutantes RHO T4R, pero no en perros WT, para evaluar el nivel de protección conferido por VAA2/5-sc-HOP-RHO820-H1-ARNhc820 en la zona tratada/con ampolla. El grosor de la Cn E en la zona con ampolla/tratada estaba preservado en todos los puntos temporales posteriores a la inyección, sugiriendo que dicho vector constructo no resultaba tóxico y que no se había producido ninguna pérdida de fotorreceptores durante ese periodo. Se utilizaron las zonas sin ampolla/no tratadas circundantes como control interno para cada ojo. Dos semanas después de la exposición lumínica se observó una preservación completa del grosor de la CNE en la zona con ampolla/trada en ambos ojos que habían recibido inyección.
Las FIGs. 20A-20C muestran las imágenes retinianas in vivo que muestran la protección frente a la degeneración retiniana fotoinducida en la zona de una retina mutante RHOT4R/+ tratada con VAA2/5-sc-HOP-RHO820-H1-ARNhc820 a un título de 5x1011 gv/ml. La FIG. 20A muestra una imagen combinada de cSLO frontal que muestra la zona retiniana 2 semanas después de la exposición lumínica (límite delimitado por flechas blancas) que había sido protegida frente a la degeneración. La flecha gris claro indica la localización dentro de la zona tratada de los escaneos B de TCO mostrados en la FIG. 20B, la flecha gris oscuro indica la localización dentro de la zona no tratada de los escaneos de OCT B mostrados en la FIG. 20C. La FIG. 20B muestra los escaneos B de TCO dentro de la zona tratada antes de la inyección, 11 semanas después de la inyección y 13 semanas después de la inyección/2 semanas después de la exposición lumínica. El grosor de la CNE estaba conservado en toda la zona tratada en ambos puntos temporales tras la inyección del vector vírico. La FIG. 20C muestra los escaneos B de TCO dentro de la zona no tratada antes de la inyección, 11 semanas después de la inyección y 13 semanas después de la inyección/2 semanas después de la exposición lumínica. la CNE se conservaba hasta 11 semanas después de la inyección, aunque se perdió por completo 2 semanas después de la exposición lumínica. La FIG. 21 muestra mapas topográficos del grosor de RHOT4R/+ tratado con VAA2/5-sc-HOP-RHO820-H1-ARNhc820 a un título de 5x1011 gv/ml que muestra la protección frente a la degeneración retiniana fotoinducida.
Evaluación mediante histología e inmunohistoquímica de la protección de los fotorreceptores frente al daño fotoinducido en ojos de perros mutantes RHOT4R/+ que habían recibido VAA2/5-sc-HOP-RHO820-H1-ARNhc820 a un título de 5x1011gv/ml:
Se examinaron los ojos de los mismos perros mutantes RHOT4R/+ señalados anteriormente, que habían recibido inyecciones subretinianas de VAA2/5-sc-HOP-RHO820-H1-ARNhc820 con un título de 5x1011 gv/ml y posteriormente expuestos lumínicamente (11 semanas después de las inyecciones) durante 1 min a luz blanca a una intensidad (irradiancia corneal de 1 mW/cm2). Dicha dosis de luz se ha mostrado previamente que causa degeneración retiniana aguda en perros mutantes RHO T4R, pero no en perros WT.
Se utilizó inmunohistoquímica para evaluar el nivel de protección conferido por el VAA2/5-sc-HOP-RHO820-H1-ARNhc820 en la zona tratada/con ampolla. Se utilizaron las zonas sin ampolla/no tratadas circundantes como control interno para cada ojo. Se utilizaron anticuerpos dirigidos contra la rodopsina (RHO) y arrestina de conos humanos (hCA) para evaluar la integridad de los segmentos externos de los bastones y la morfología de los conos. Dos semanas después de la exposición lumínica se había conseguido una excelente preservación del grosor de la CNE en la zona con ampolla/tratada de los ojos que habían recibido inyecciones de título 5x1011 gv/ml. Además, y al contrario de lo observado al tratar las retinas con el reactivo de inactivación ARNhc820, se consiguió la preservación de los segmentos externos de los bastones con el constructo VAA2/5-sc-HOP-RHO820-H1-ARNhc820.
La FIG. 22 muestra la inmunohistoquímica (la rodopsina se tiñó de verde y se observaba como tinción ligera en los paneles de la FIG. 22; la arrestina de conos humanos se tiñó en rojo y mostraba una apariencia gris en los paneles inferiores de la FIG. 22) en la zona de transición tratada y zonas no tratadas de retinas mutantes RHOT4R/+ que habían recibido la inyección subretiniana de VAA2/5-sc-HOP-RHO820-H1-ARNhc820 a un título de 5*1011gv/ml. En la zona tratada se produjo la preservación completa del grosor de la capa nuclear externa (CNE) y de los segmentos externos (SE) de los bastones, mientras que, en la zona no tratada, se habían perdido todos los bastones y la CNE se había reducido a una única fila de cuerpos celulares de conos. En la zona de transición se observaba un claro límite entre las zonas tratada y no tratada.
Se consiguió la inactivación completa del ARN y proteína (mediante transferencia Western) de la RHO canina con VAA2/5-sc-HOP-RHO820-H1-ARNhc820 a un título de virus de 5x1o11 gv/ml. La sustitución eficiente con RHO820 endurecido se consiguió tanto a nivel de ARNm (118 % a 130 %) como de proteína (30 a 33 %), en comparación con los niveles normales de RHO en la retina canina. La sustitución eficiente de la capa nuclear externa (CNE), que contiene los cuerpos celulares de los fotorreceptores, se consiguió con VAA2/5-sc-HOP-RHO820-H1-ARNhc820 a un
título de virus de 5x1011 gv/ml. La preservación completa de los segmentos externos de los bastones como resultado de una sustitución eficiente de Rh O por RHO820 se consiguió con VAA2/5-sc-HOP-RHO820-H1-ARNhc820 a un título de virus de 5x1011 gv/ml.
Referencias:
1. Mao H, Gorbatyuk MS, Rossmiller B, Hauswirth WW, Lewin AS. Long-Term Rescue of Retinal Structure and Function by Rhodopsin RNA Replacement with a Single Adeno-Associated Viral Vector in P23H RHO Transgenic Mice. Hum. Gene Ther. 2012;23:356-366.
2. Rossmiller B, Mao H, Lewin AS. Gene therapy in animal models of autosomal dominant retinitis pigmentosa. Mol. Vis. 2012;18:2479-2496.
3. Gorbatyuk M, Justilien V, Liu J, Hauswirth WW, Lewin AS. Suppression of mouse rhodopsin expression in vivo by AAV mediated siRNA delivery. Vision Res. 2007;47:1202-1208.
4. Khvorova A, Reynolds A, Jayasena SD. Functional siRNAs and miRNAs exhibit strand bias. Cell. 2003;115:209-216.
5. Reynolds A, Leake D, Boese Q, Scaringe S, Marshall WS, Khvorova A. Rational siRNA design for RNA interference. Nat. Biotechnol. 2004;22:326-330.
6. Jensen SMR, Schmitz A, Pedersen FS, Kjems J+, Bramsen JB. Functional Selection of shRNA Loops from Randomized Retroviral Libraries. PLoS ONE. 2012;7:e43095.
7. Zhou H, Xia XG, Xu Z. An RNA polymerase II construct synthesizes short-hairpin RNA with a quantitative indicator and mediates highly efficient r Na í . Nucleic Acids Res. 2005;33:e62-e70.
Equivalentes
Aunque en la presente memoria se han descrito e ilustrado varias opciones, el experto ordinario en la materia podrá contemplar fácilmente una diversidad de otros medios y/o estructuras para realizar la función y/o para obtener los resultados y/o una o más de las ventajas indicadas en la presente memoria, y cada una de dichas variaciones y/o modificaciones se considera que se encuentra comprendida dentro del alcance de las opciones descritas en la presente memoria. Más en general, el experto en la materia apreciará fácilmente que todos los parámetros, dimensiones, materiales y configuraciones indicados en la presente memoria pretenden ser ejemplares y que los parámetros, dimensiones, materiales y/o configuraciones reales dependerán de la aplicación o aplicaciones específicas para las que se utilicen las enseñanzas. El experto en la materia reconocerá, o podrá determinar utilizando nada más que la experimentación rutinaria, muchos equivalentes a las opciones específicas descritas en la presente memoria. Por lo tanto, debe entenderse que las opciones anteriormente descritas se presentan únicamente a título ejemplar y que, dentro del alcance según las reivindicaciones adjuntas y equivalentes de las mismas, podrán ponerse en práctica opciones de modos diferentes a los específicamente descritos y reivindicados. Las opciones de la presente exposición se refieren a cada característica, sistema, artículo, material, kit y/o método individual indicado en la presente memoria. Además, cualquier combinación de dos o más de dichas características, artículos, materiales, kits y/o métodos, en caso de que dichas características, sistemas, artículos, materiales, kits y/o métodos no sean mutuamente inconsistentes, se encuentra incluida dentro del alcance de la presente exposición.
Todas las definiciones, tal como se definen y utilizan en la presente memoria, debe entenderse que tienen prioridad sobre las definiciones de diccionario, las definiciones en documentos y/o los significados ordinarios de los términos definidos.
Los artículos indefinidos "un" y "una", tal como se utilizan en la presente memoria, en la especificación y en las reivindicaciones, a menos que se indique claramente lo contrario, debe entenderse que se refieren a "por lo menos un".
La expresión "y/o", tal como se utiliza en la presente memoria, en la especificación y en las reivindicaciones, debe entenderse que se refiere a "cualquiera o ambos" de los elementos unidos de esta manera, es decir, elementos que se encuentran presentes conjuntamente en algunos casos y que se encuentran disyuntivamente presentes en otros casos. Los elementos múltiples indicados con "y/o" deben interpretarse de la misma manera; es decir, "uno o más" de los elementos unidos de esta manera. Pueden encontrarse presentes opcionalmente otros elementos aparte de los elementos específicamente identificados por la expresión "y/o", estén relacionados o no con aquellos elementos identificados específicamente. De esta manera, a modo de ejemplo no limitativo, una referencia a "A y/o B", utilizada junto con palabras de sentido abierto, tales como "que comprende", puede referirse, en una opción, a únicamente A (incluyendo opcionalmente elementos diferentes de B); en otra opción, a únicamente B (incluyendo opcionalmente elementos aparte de A); en todavía otra opción, tanto a A como a B (incluyendo opcionalmente otros elementos), etc.
Tal como se utiliza en la presente memoria, en la especificación y en las reivindicaciones, "o" debe entenderse que presenta el mismo significado que "y/o", tal como se ha definido anteriormente. Por ejemplo, al separar elementos en una lista, "o" o "y/o" deben interpretarse como incluyentes, es decir, la inclusión de por lo menos un, aunque incluyendo también más de un, de entre varios elementos o lista de elementos, y opcionalmente, elementos adicionales no presentes en la lista. Únicamente términos claramente indicados en sentido contrario, tales como "únicamente un" o "exactamente un" o, utilizado en las reivindicaciones, "que consiste en", se referirán a la inclusión de exactamente un
Claims (15)
- REIVINDICACIONESi. Molécula sintética de ácido ribonucleico (ARN) que comprende:una cadena de sentido de secuencia GUGGCAUUCUACAUCUUCA (SEC ID n° 7), yuna cadena antisentido de secuencia UGAAGAUGUAGAAUGCCAC (SEC ID n° 8)
- 2. Molécula sintética de ARN según la reivindicación 1, en la que el ARN es un ARN interfiriente corto (ARNic).
- 3. Molécula sintética de ARN según la reivindicación 1, en la que el ARN es un ARN de horquilla corto (ARNhc), opcionalmente en el que el ARNhc comprende, además, un bucle que comprende ARN de secuencia UCAAGAG (SEC ID n° 9) o ARN de secuencia UGUGCUU (SEC ID n° 10.
- 4. Molécula sintética de ARN según la reivindicación 1, en la que el ARN es un microARN (miARN) artificial, opcionalmente en el que el miARN artificial comprende ARN de secuencia:UGCUGUUGACAGUGAGCGA(X)nUAGUGAAGCCACAGAUGUA(Y)nCUGCCUACU GCCUCGGA (SEC ID n° 19), y en la que:(X)n comprende SEC ID n° 7 y (Y)n comprende SEC ID n° 8.
- 5. ARN sintético según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende, además, una secuencia sobresaliente no hibridada en el extremo 5' y/o 3'.
- 6. ARN sintético según la reivindicación 5, en el que la secuencia sobresaliente no emparejada comprende una secuencia de bases repetidas.
- 7. ARN sintético según la reivindicación 6, en el que la secuencia de bases repetidas comprende bases repetidas de uracilo (U), opcionalmente en el que la secuencia sobresaliente no emparejada es UU.
- 8. Composición que comprende el ARN sintético según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, opcionalmente en la que la composición comprende, además, uno o más portadores fisiológicamente aceptables y/o uno o más adyuvantes fisiológicamente aceptables.
- 9. Vector que codifica:a) el ARNhc según la reivindicación 3, ob) el miARN artificial según la reivindicación 4.
- 10. Vector según la reivindicación 9, en el que el ARNhc se selecciona de cualquiera de las SEC ID n° 11 a 18.
- 11. Vector según la reivindicación 10, en el que el vector es un plásmido de expresión, opcionalmente en el que el vector es un vector vírico, opcionalmente en el que el vector vírico comprende un vector vírico adenoasociado.
- 12. Vector según la reivindicación 11, en el que el vector vírico comprende un vector vírico adenoasociado de serotipo 5.
- 13. Composición según la reivindicación 8 o el vector según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12 para la utilización en la reducción de la expresión de RHO en un sujeto o el tratamiento de la retinitis pigmentosa (RP) en un sujeto, en el que el tratamiento de la RP comprende silenciar uno o ambos alelos del gen RHO, opcionalmente en el que la retinitis pigmentosa es retinitis pigmentosa autosómica dominante (adRP).
- 14. Composición o el vector para la utilización según la reivindicación 13, que comprende, además, un gen RHO recombinante que no contiene una secuencia que es la diana de un ARN interfiriente de la composición o el vector.
- 15. Composición o el vector para la utilización según la reivindicación 14, en el que el gen RHO comprende la secuencia de SEC ID n° 42.
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