ES2826384T3

ES2826384T3 - Terapia génica para trastornos oculares

Info

Publication number: ES2826384T3
Application number: ES16852859T
Authority: ES
Inventors: Jean Bennett; Jeannette Bennicelli; Junwei Sun
Original assignee: University of Pennsylvania Penn
Current assignee: University of Pennsylvania Penn
Priority date: 2015-12-14
Filing date: 2016-12-13
Publication date: 2021-05-18
Anticipated expiration: 2036-12-13
Also published as: RU2018125468A3; AU2016370487A1; US20210330816A1; EP3389724A2; EP3389724B1; CN109069668B; AU2016370487C1; WO2017106202A2; RU2018125468A; WO2017106202A3; BR112018011838A2; EP3795180A1; HK1258518A1; US11090392B2; EP3795180B1; JP2022088656A; AU2016370487B2; JP2019502378A; MX2018007230A; JP7057281B2

Abstract

Un casete de expresión que tiene una secuencia de ácido nucleico que comprende SEQ ID NO: 1.

Description

DESCRIPCIÓN

Terapia génica para trastornos oculares

Se hace referencia al material de Listado de Secuencias archivado en formato electrónico y etiquetado “16-7660PCT_Seq_Listing_ST25.txt”.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La coroideremia (CHM) es una enfermedad retiniana hereditaria ligada al cromosoma X que se caracteriza por la degeneración de los fotorreceptores, el epitelio pigmentario de la retina (RPE) y la coriocapilar. Los síntomas se desarrollan en la 1a o 2a década de la vida con quejas de mala visión nocturna (nictalopía) y pérdida progresiva de la visión periférica. Los campos visuales se contraen a medida que avanza la enfermedad. Esto culmina con la pérdida de la visión central (agudeza visual) y ceguera ya en la cuarta década de la vida. Se ha descubierto que más de 140 mutaciones en el gen CHM causan coroideremia. Las mutaciones pueden conducir a la producción de una Proteína 1 de Acompañamiento de Rab (REP-1) anormalmente pequeña, no funcional y/o inestable, una disminución en la función de la proteína o pérdida de la producción de la proteína REP-1. La falta de REP-1 normal altera la capacidad de las proteínas Rab para ayudar en el tráfico intracelular. La inmovilidad de las proteínas y los orgánulos dentro de la célula hace que las células funcionen mal y mueran prematuramente.

El gen de la coroideremia, CHM, codifica la Proteína 1 de Acompañamiento de Rab (REP-1), una proteína de 653 aminoácidos involucrada en la regulación del tráfico de membranas. Dado que el locus de CHM está en el cromosoma X, la coroideremia generalmente solo se diagnostica en hombres. Aunque las mujeres portadoras de la enfermedad suelen ser asintomáticas, los exámenes de retina a menudo revelan una degeneración irregular de la retina y el EPR, y las mujeres pueden verse afectadas según el grado de inactivación X del cromosoma X normal (lionización). Coussa, RG, Traboulsi, EI (2012) Choroideremia: a review of general findings and pathogenesis, Ophthalmic Genet 33(2) :57-65. Véase también, Vasireddy et al, AAV-mediated gene therapy for choroideremia: preclinical studies in personalized models. PLoS One. 7 de mayo de 2013; 8(5):e61396.

La acromatopsia es un grupo heterogéneo de enfermedades retinianas hereditarias autosómicas recesivas que se caracterizan por una disminución de la agudeza visual de inicio temprano, ceguera al color alterada o completa, nistagmo, fotoaversión y pérdida de la función de los fotorreceptores de los conos. Alrededor del 80% de los pacientes con acromatopsia muestran mutaciones en la subunidad alfa o beta (A3 y B3) del canal catiónico controlado por cGMP, canal controlado por nucleótidos cíclicos (CNG) de los fotorreceptores de los conos. Homólogos a la enfermedad humana, los ratones deficientes en Cnga3 revelan una pérdida de la funcionalidad específica de los conos que conduce a un mal funcionamiento y degeneración de los fotorreceptores de los conos afectados.

Por tanto, se necesitan composiciones útiles para expresar CNGA3 o CNGB3 en sujetos humanos.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

La coroideremia (CHM) es una degeneración retiniana ligada al cromosoma X que es sintomática en la 1a o 2a década de la vida y causa nictalopía y pérdida de la visión periférica. La enfermedad progresa hasta la mediana edad, cuando la mayoría de los pacientes quedan ciegos. La CHM es una diana favorable para la terapia de aumento génico, ya que la enfermedad se debe a la pérdida de función de una proteína necesaria para la salud de las células retinianas, la Proteína 1 de Acompañamiento de Rab (REP1), que está codificada por el gen CHM. El ADNc de CHM se puede empaquetar en virus adenoasociado recombinante (rAAV), que tiene un historial establecido en estudios de terapia génica humana. Además, existen ensayos sensibles y cuantitativos para documentar la actividad de REP1, incluyendo su capacidad para prenilar proteínas Rab tal como Rab27 y corregir un defecto en la localización y tráfico de Rab27 debido a la falta de prenilación en células deficientes en REP-1.

En un aspecto, se proporciona una secuencia de ADNc de codones optimizados que codifica la Proteína 1 de Acompañamiento de Rab (REP-1). En una realización, la secuencia de ADNc de codones optimizados es una variante de SEQ ID NO: 3. En otra realización, la secuencia de ADNc de codones optimizados es SEQ ID NO: 1. En otra realización, la secuencia de ADNc es de codones optimizados para la expresión en seres humanos.

En otro aspecto, un casete de expresión incluye una secuencia de ácido nucleico de codones optimizados que codifica REP-1. En una realización, el casete de expresión incluye la secuencia de ADNc de SEQ ID NO: 1. En todavía otras realizaciones, la secuencia que codifica REP-1 se coloca entre las secuencias de ITR de AAV 5’ y 3’. En una realización, el genoma vectorial incluye toda la secuencia de ácido nucleico entre, e incluyendo, la ITR 5’ y la ITR 3’.

En otra realización, se proporciona un vector de virus adenoasociado (AAV). El vector de AAV incluye una cápside de AAV y una secuencia de ácido nucleico que comprende secuencias de repetición terminal invertida de AAV y una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína 1 de Acompañamiento de Rab humana (REP-1), y secuencias de control de la expresión que dirigen la expresión de REP-1 en una célula hospedante. En una realización, la secuencia de REP-1 codifica una proteína REP-1 de longitud completa. En una realización, la secuencia de REP-1 es la secuencia proteica de SEQ ID NO: 2.

En un aspecto, se proporciona una secuencia de ADNc de codones optimizados que codifica el canal alfa 3 regulado por nucleótidos cíclicos (CNGA3). En una realización, la secuencia de ADNc de codones optimizados es una variante de SEQ ID NO: 13 o SEQ ID NO: 15. En otra realización, la secuencia de ADNc de codones optimizados es SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 11. En otra realización, la secuencia de ADNc es de codones optimizados para la expresión en seres humanos.

En otro aspecto, un casete de expresión incluye una secuencia de ácido nucleico de codones optimizados que codifica el canal alfa 3 regulado por nucleótidos cíclicos (CNGA3). En una realización, el casete de expresión incluye la secuencia de ADNc de SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13 o SEQ ID NO: 15. En todavía otras realizaciones, la secuencia que codifica CNGA3 se coloca entre secuencias de ITR de AAV 5’ y 3’.

En otro aspecto, un casete de expresión incluye una secuencia de ácido nucleico de codones optimizados que codifica el canal alfa 3 regulado por nucleótidos cíclicos (CNGB3). En una realización, el casete de expresión incluye la secuencia de ADNc de SEQ ID NO: 19 o SEQ ID NO: 21 o s Eq ID NO: 23. En todavía otras realizaciones, la secuencia que codifica CNGB3 se coloca entre las secuencias de ITR de AAV 5’ y 3’.

En otra realización, se proporciona un vector de virus adenoasociado (AAV). El vector de AAV incluye una cápside de AAV y una secuencia de ácido nucleico que comprende secuencias de repetición terminal invertida de AAV y una secuencia de ácido nucleico que codifica CNGA3 humano, y secuencias de control de la expresión que dirigen la expresión de CNGA3 en una célula hospedante. En una realización, la secuencia de CNGA3 codifica una proteína CNGA3 de longitud completa. En una realización, la secuencia de CNGA3 es la secuencia proteica de SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12 o SEQ ID NO: 14.

En otra realización, se proporciona un vector de virus adenoasociado (AAV). El vector de AAV incluye una cápside de AAV y una secuencia de ácido nucleico que comprende secuencias de repetición terminal invertida de AAV y una secuencia de ácido nucleico que codifica CNGB3 humano, y secuencias de control de la expresión que dirigen la expresión de CNGB3 en una célula hospedante. En una realización, la secuencia de CNGB3 codifica una proteína CNGB3 de longitud completa. En una realización, la secuencia de CNGB3 es la secuencia proteica de SEQ ID NO: 20.

En otro aspecto, se proporciona un vector de virus adenoasociado (AAV) que comprende una cápside de AAV8 y un casete de expresión, en el que dicho casete de expresión comprende secuencias de ácido nucleico que codifican REP-1, secuencias de repetición terminal invertida, y secuencias de control de la expresión que dirigen la expresión de REP-1 en una célula hospedante.

En aún otro aspecto, se proporciona un vector de virus adenoasociado (AAV) que comprende una cápside de AAV8 y un casete de expresión, en el que dicho casete de expresión comprende secuencias de ácido nucleico que codifican CNGA3, secuencias de repetición terminal invertida, y secuencias de control de la expresión que dirigen la expresión de CNGA3 en una célula hospedante.

En aún otro aspecto, se proporciona un vector de virus adenoasociado (AAV) que comprende una cápside de AAV8 y un casete de expresión, en el que dicho casete de expresión comprende secuencias de ácido nucleico que codifican CNGB3, secuencias de repetición terminal invertida, y secuencias de control de la expresión que dirigen la expresión de CNGB3 en una célula hospedante.

En otro aspecto, se proporciona un vector de virus adenoasociado (AAV) que comprende una cápside de AAV2 y un casete de expresión, en el que dicho casete de expresión comprende secuencias de ácido nucleico que codifican REP-1, secuencias de repetición terminal invertida, y secuencias de control de la expresión que dirigen la expresión de REP-1 en una célula hospedante.

En aún otro aspecto, se proporciona un vector de virus adenoasociado (AAV) que comprende una cápside de AAV2 y un casete de expresión, en el que dicho casete de expresión comprende secuencias de ácido nucleico que codifican CNGA3, secuencias de repetición terminal invertida, y secuencias de control de la expresión que dirigen la expresión de CNGA3 en una célula hospedante.

En aún otro aspecto, se proporciona un vector de virus adenoasociado (AAV) que comprende una cápside de AAV2 y un casete de expresión, en el que dicho casete de expresión comprende secuencias de ácido nucleico que codifican CNGB3, secuencias de repetición terminal invertida, y secuencias de control de la expresión que dirigen la expresión de CNGB3 en una célula hospedante.

En otro aspecto, se proporciona una composición farmacéutica que incluye un portador, diluyente, excipiente y/o adyuvante farmacéuticamente aceptable y al menos un vector viral como se describe aquí.

En aún un aspecto adicional, una composición farmacéutica comprende un portador, diluyente, excipiente y/o adyuvante farmacéuticamente aceptable, y la secuencia de ácido nucleico, un plásmido, un vector o un vector viral, tal como el rAAV, descrito específicamente aquí.

En otro aspecto, se proporciona un método para tratar la coroideremia. En una realización, el método incluye administrar una composición que incluye el vector de AAV que codifica REP-1, como se describe aquí, a un sujeto que lo necesite.

En otro aspecto, se proporciona un método para tratar la acromatopsia. En una realización, el método incluye administrar una composición que incluye el vector de AAV que codifica CNGA3, como se describe aquí, a un sujeto que lo necesite.

En otro aspecto, se proporciona un método para tratar la acromatopsia. En una realización, el método incluye administrar una composición que incluye el vector de AAV que codifica CNGB3, como se describe aquí, a un sujeto que lo necesite.

En aún otro aspecto, se proporciona un plásmido para producir un vector de AAV. En una realización, el plásmido incluye la secuencia de ADNc de codones optimizados que codifica REP-1 como se describe aquí. En otra realización, el plásmido incluye la secuencia de ADNc de codones optimizados que codifica CNGA3 como se describe aquí. En otra realización, el plásmido incluye una secuencia de ADNc de codones optimizados que codifica CNGB3 que es una secuencia que comparte al menos el 70% de identidad con SEQ ID NO: 19 o SEQ ID NO: 21. En una realización, el plásmido es modular.

En otro aspecto, se proporciona un método para generar un virus rAAV. El método incluye cultivar una célula de empaquetamiento, que porta el plásmido descrito aquí, en presencia de secuencias virales suficientes para permitir el empaquetamiento del genoma viral del casete de expresión génica en una envoltura o cápside infecciosa de AAV. En otro aspecto, se proporciona un AAV recombinante producido según el método.

Otros aspectos y ventajas de la invención serán fácilmente evidentes a partir de la siguiente descripción detallada de la invención.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

La FIG. 1A y la FIG. 1B son geles que muestran la expresión de la proteína REP-1 in vitro después de la transfección de células cultivadas 84-31 HEK. La primera línea de cada gel muestra la expresión de REP-1 de codones optimizados como se describe aquí, expresada a partir del plásmido p944. La segunda línea muestra la expresión de REP-1 nativa a partir del plásmido p742. La tercera línea muestra la expresión endógena de REP-1 por células 84-31 que no fueron transfectadas con un plásmido. La última línea está en blanco. Los geles demuestran que la secuencia de REP-1 de codones optimizados, como se describe aquí, da como resultado un mayor nivel de expresión proteica que la secuencia de REP-1 nativa, y que los niveles de expresión de los plásmidos transfectados exógenamente son muchas veces mayores que la expresión de REP-1 endógenas.

La FIG. 2 es una alineación de la secuencia codificante de REP-1 nativa de SEQ ID NO: 1 frente a la secuencia codificante de REP-1 de codones optimizados de SEQ ID NO: 3.

La FIG. 3 es un alineamiento de la secuencia codificante nativa de CNGA3 de SEQ ID NO: 13 frente a la secuencia codificante de CNGA3 de codones optimizados de SEQ ID NO: 9.

La FIG. 4 es una alineación del ORF nativo de CNGB3 (SEQ ID NO: 19) frente al ORF modificado de CNGB3 (SEQ ID NO: 21) frente al orf modificado de CNGB3 con extremos modificados (SEQ ID NO: 23). Se resaltan las mutaciones de punto.

La FIG. 5 es un mapa de plásmido de p584, descrito aquí. La secuencia de p584 se muestra en SEQ ID NO: 7.

La FIG. 6 es un mapa de plásmido de AAV.hCHMco.Version 2a, descrito aquí. La secuencia de Version 2a se muestra en SEQ ID NO: 25.

La FIG. 7 es un mapa de plásmido de AAV.hCHMco.Version 2b, descrito aquí. La secuencia de Version 2b se muestra en SEQ ID NO: 26.

La FIG. 8 es un mapa de plásmido de AAV.hCHMco.Version 3a, descrita aquí. La secuencia de Version 3a se muestra en SEQ ID NO: 27.

La FIG. 9 es un mapa de plásmido de AAV.hCHMco.Version 3b, descrito aquí. La secuencia de Version 3b se muestra en SEQ ID NO: 28.

FIG. 10 es un mapa de plásmido de AAV.hCHM.Version 1, descrito aquí. La secuencia de Version 1 se muestra en SEQ ID NO: 29.

La FIG. 11 es una representación gráfica del efecto del inserto lambda sobre la impureza del producto AAV. Todos los vectores de la versión a (que contienen lambda) tienen señales Kan+ mucho más reducidas del ensayo de qPCR.

La FIG. 12A es una transferencia Western que muestra la detección de anticuerpos humanos anti-REP-1 de una proteína de ~75-80 kDa en tejidos oculares de ratones CD-1 inyectados con AAV8.2b en 5E9 copias del genoma vectorial (dosis alta). Los animales inyectados con AAV8.2b a 5E8 (dosis baja) mostraron una banda de proteína muy débil a ~75-80 kDa. La FIG. 12B es un análisis de transferencia Western de tejidos oculares de ratones CD1 inyectados con AAV8.3b (2 ratones/grupo) detectados con anticuerpo anti-REP-1, que reveló la presencia de una proteína de ~75-80 kDa en un ojo inyectado con baja dosis y en ambos ojos inyectados con dosis altas de AAV8.3b. En los tejidos oculares de ratones no inyectados no se detectó expresión de REP-1.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

Los métodos y composiciones descritos aquí implican composiciones y métodos para administrar CHM optimizado que codifica REP-1 a sujetos mamíferos para el tratamiento de trastornos oculares, principalmente enfermedades cegadoras tales como coroideremia. Además, los métodos y composiciones descritos aquí implican composiciones y métodos para administrar CNGA3 o CNGB3 optimizadas a sujetos mamíferos para el tratamiento de trastornos oculares, principalmente enfermedades cegadoras como la acromatopsia. En una realización, tales composiciones implican la optimización de codones de la secuencia codificante de REP-1, CNGA3 o CNGB3. Se cree que estas características aumentan la eficacia del producto y aumentan la seguridad, ya que se usa una dosis menor de reactivo. Se prevé que esta optimización del casete transgénico podría maximizar teóricamente el nivel de producción de la proteína experimental en comparación con los niveles que se pueden generar utilizando la secuencia endógena. Sin embargo, también se incluyen aquí composiciones que incluyen las secuencias codificantes de REP1, CNGA3 y CNGB3 nativas, como se muestra en s Eq ID NO: 3, SEQ ID NO: 13 y SEQ ID NO: 19, respectivamente. Debe entenderse que cuando se describe una realización para REP-1, CNGA3 o CNGB3, se pretende que se cite una realización similar para la otra.

Los términos técnicos y científicos utilizados aquí tienen el mismo significado que el que entiende comúnmente un experto en la técnica a la que pertenece esta invención y por referencia a los textos publicados, que proporcionan a un experto en la técnica una guía general de muchos de los términos utilizados en la presente solicitud. Las definiciones contenidas en esta memoria descriptiva se proporcionan para mayor claridad en la descripción de los componentes y composiciones aquí, y no pretenden limitar la invención reivindicada.

El gen de la coroideremia, CHM, codifica la Proteína 1 de Acompañamiento de Rab (REP-1), una proteína de 653 aminoácidos que se cree que está involucrada en el tráfico de membranas. Como se usan aquí, los términos “REP-1” y “CHM” se usan indistintamente cuando se refieren a la secuencia codificante. Dado que el locus de CHM está en el cromosoma X, la coroideremia generalmente solo se diagnostica en hombres. Aunque las mujeres portadoras de la enfermedad suelen ser asintomáticas, los exámenes de retina a menudo revelan una degeneración irregular de la retina y el RPE, y las mujeres pueden verse afectadas según el grado de inactivación X del cromosoma X normal (lionización). Véase, Coussa, citado anteriormente. La secuencia de aminoácidos nativa que codifica la REP-1 humana se da a conocer en GenBank número de acceso P24386, y se reproduce aquí en SEQ ID NO: 2. La secuencia de ácido nucleico humana nativa de CHM se reproduce aquí en SEQ ID NO: 3 (número de acceso NM_000390.2).

Los canales iónicos regulados por nucleótidos cíclicos (CNG) son mediadores clave que subyacen a la transducción de señales en los receptores olfatorios y retinianos. Se sabe que los defectos genéticos en CNGA3 y CNGB3, que codifican dos subunidades estructuralmente relacionadas de canales CNG de los conos, conducen a acromatopsia. CNGA3 es una proteína de 694 aminoácidos. CNGB es una proteína de 809 aminoácidos.

La acromatopsia es un grupo heterogéneo de trastornos retinianos congénitos, autosómicos recesivos que se manifiestan por disfunción del fotorreceptor cónico de inicio temprano, agudeza visual severamente reducida, daltonismo completo o alterado, y fotofobia. La secuencia de ácido nucleico nativa que codifica CNGA3 humana se da a conocer en GenBank n° de acceso XM_011210554.1, y se reproduce en SEQ ID NO: 13. La secuencia de ácido nucleico nativa que codifica CNGA3 humana se da a conocer en GenBank n° XM_011210554.1, y se reproduce en SEQ ID NO: 13. La secuencia de ácido nucleico nativa para la variante CNGA3 XI humana, que incluye un exón adicional, se da a conocer en GenBank n° NM_001298.2, y se reproduce en SEQ ID NO: 15. La secuencia de ácido nucleico nativa que codifica CNGB3 humana se reproduce en SEQ ID NO: 19.

En ciertas realizaciones de esta invención, un sujeto tiene un “trastorno ocular”, para el cual los componentes, composiciones y métodos de esta invención están diseñados para tratarlo. Tal como se usa aquí, el término “sujeto”, como se usa aquí, significa un animal mamífero, que incluye un ser humano, un animal veterinario o de granja, un animal doméstico o mascota, y animales normalmente usados para la investigación clínica. En una realización, el sujeto de estos métodos y composiciones es un ser humano. Aún otros sujetos adecuados incluyen, sin limitación, murino, rata, canino, felino, porcino, bovino, ovino, primate no humano, y otros. Como se usa aquí, el término “sujeto” se usa indistintamente con “paciente”.

Como se usa aquí, “trastorno ocular” incluye distrofias de conos y bastones y enfermedades de la retina que incluyen, sin limitación, enfermedad de Stargardt (autosómica dominante o autosómica recesiva), retinitis pigmentaria, y distrofia en patrón. En una realización, el sujeto tiene acromatopsia. En otra realización, el sujeto tiene coroideremia o una degeneración retiniana hereditaria ligada al cromosoma X. Los signos clínicos de tales enfermedades oculares incluyen, pero no se limitan a, disminución de la visión periférica, disminución de la visión central (lectura), disminución de la visión nocturna, pérdida de la percepción del color, reducción de la agudeza visual, disminución de la función de los fotorreceptores, cambios pigmentarios, y finalmente ceguera.

Como se usa aquí, el término “tratamiento” o “tratar” se define abarcando la administración a un sujeto de uno o más compuestos o composiciones descritos aquí con el fin de mejorar uno o más síntomas de una enfermedad ocular. De este modo, el “tratamiento” puede incluir uno o más de reducir el inicio o la progresión de una enfermedad ocular, prevenir la enfermedad, reducir la gravedad de los síntomas de la enfermedad, o retrasar su progresión, incluyendo la progresión de la ceguera, eliminar los síntomas de la enfermedad, retrasar la aparición de la enfermedad, o monitorizar la progresión de la enfermedad o la eficacia de la terapia en un sujeto dado.

El término “exógena”, como se usa para describir una secuencia de ácido nucleico o proteína, significa que el ácido nucleico o proteína no se encuentra naturalmente en la posición en la que existe en un cromosoma o célula hospedante. Una secuencia de ácido nucleico exógena también se refiere a una secuencia derivada e insertada en la misma célula hospedante o sujeto, pero que está presente en un estado no natural, por ejemplo un número de copias diferente, o bajo el control de diferentes elementos reguladores.

El término “heterólogo”, como se usa para describir una secuencia de ácido nucleico o proteína, significa que el ácido nucleico o proteína derivó de un organismo diferente o de una especie diferente del mismo organismo que la célula hospedante o sujeto en el que se expresa. El término “heterólogo”, cuando se usa con referencia a una proteína o un ácido nucleico en un plásmido, casete de expresión o vector, indica que la proteína o el ácido nucleico está presente con otra secuencia o subsecuencia con la cual la proteína o el ácido nucleico en cuestión no se encuentra en la misma relación entre sí en la naturaleza.

Las expresiones “porcentaje (%) de identidad”, “identidad de secuencia”, “porcentaje de identidad de secuencia” o “porcentaje idéntico”, en el contexto de las secuencias de ácido nucleico, se refieren a las bases de las dos secuencias que son iguales cuando se alinean en busca de la correspondencia. El porcentaje de identidad se determina comparando dos secuencias alineadas en condiciones óptimas sobre las secuencias que se van a comparar. La longitud de la comparación de identidad de secuencia puede ser la longitud completa de la secuencia codificante de REP-1, CNGA3 o CNGB3, o un fragmento de al menos alrededor de 100 a 150 nucleótidos, o según se desee. Sin embargo, también se puede desear la identidad entre fragmentos más pequeños, por ejemplo de al menos alrededor de nueve nucleótidos, normalmente al menos alrededor de 20 a 24 nucleótidos, al menos alrededor de 28 a 32 nucleótidos, al menos alrededor de 36 o más nucleótidos. También están disponibles múltiples programas de alineación de secuencias para secuencias de ácidos nucleicos. Los ejemplos de tales programas incluyen “Clustal W”, “CAP Sequence Assembly”, “BLAST”, “MAP” y “MEME”, a los que se puede acceder a través de servidores web en Internet. Los expertos en la técnica conocen otras fuentes para tales programas. Alternativamente, también se utilizan las utilidades de Vector NTI. También hay varios algoritmos conocidos en la técnica que se pueden usar para medir la identidad de la secuencia nucleotídica, incluyendo los contenidos en los programas descritos anteriormente. Como otro ejemplo, las secuencias polinucleotídicas se pueden comparar usando Fasta™, un programa en GCG Versión 6.1. También se puede usar software de análisis de secuencias comúnmente disponible, más específicamente BLAST o herramientas de análisis proporcionadas por bases de datos públicas.

El término “aislado” significa que el material se retira de su entorno original (por ejemplo, el entorno natural si es de origen natural). Por ejemplo, un polinucleótido o polipéptido de origen natural presente en un animal vivo no está aislado, pero el mismo polinucleótido o polipéptido, separado de algunos o todos los materiales coexistentes en el sistema natural, está aislado, incluso si posteriormente se reintroduce en el sistema natural. Dichos polinucleótidos podrían ser parte de un vector y/o tales polinucleótidos o polipéptidos podrían ser parte de una composición, y aun así estar aislados en el sentido de que dicho vector o composición no es parte de su entorno natural.

Por “manipulado” se entiende que las secuencias de ácido nucleico que codifican la proteína REP-1 o CNGA3 o CNGB3 descritas aquí se ensamblan y colocan en cualquier elemento genético adecuado, por ejemplo ADN desnudo, fago, transposón, cósmido, episoma, etc., que transfiere las secuencias de REP-1 o CNGA3 o CNGB3 portadas allí a una célula hospedante, por ejemplo para generar sistemas de suministro no virales (por ejemplo, sistemas basados en ARN, ADN desnudo, o similares) o para generar vectores virales en una célula hospedante de empaquetamiento y/o para el suministro a células hospedantes en un sujeto. En una realización, el elemento genético es un plásmido. Los expertos en manipulación de ácidos nucleicos conocen los métodos usados para fabricar tales constructos modificados genéticamente, e incluyen ingeniería genética, ingeniería recombinante, y técnicas sintéticas. Véase, por ejemplo, Green y Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (2012).

El término “transgén”, como se usa aquí, significa una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína exógena o manipulada que está bajo el control de un promotor o secuencia de control de la expresión en un casete de expresión, genoma de rAAV, plásmido recombinante o plásmido de producción, vector, o célula hospedante descritos en esta memoria descriptiva. En ciertas realizaciones, el transgén es una secuencia de CHM (REP-1) humana, que codifica una proteína REP-1 funcional. En algunas realizaciones, el transgén es un ácido nucleico CHM (REP-1) de codones optimizados que codifica la secuencia de aminoácidos de REP-1 expuesta en SEQ ID NO: 2. En ciertas realizaciones, el transgén está codificado por la secuencia expuesta en SEQ. ID NO: 1. En ciertas realizaciones, el transgén de REP1 está codificado por la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 5. SEQ ID NO: 5 incluye extremos modificados, que incluyen sitios de restricción para la clonación en un plásmido, tal como un plásmido de producción descrito aquí.

En ciertas realizaciones, el transgén es una secuencia de CNGA3 humana, que codifica una proteína CNGA3 funcional. En ciertas realizaciones, el transgén es una secuencia que codifica CNGA3 de codones optimizados SEQ ID NO: 10. En ciertas realizaciones, el transgén está codificado por la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 9. En una realización, el transgén incluye extremos modificados, tales como el mostrado en SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO 17 o SEQ ID NO: 18, que incluyen sitios de restricción para la clonación en un plásmido, tal como un plásmido descrito aquí. En ciertas realizaciones, el transgén es una secuencia que codifica CNGA3 de codones optimizados SEQ ID NO: 12. En ciertas realizaciones, el transgén está codificado por la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 11. En ciertas realizaciones, el transgén está codificado por la secuencia codificante nativa de CNGA3, que se expone en SEQ ID NO: 13.

En ciertas realizaciones, el transgén es una secuencia de CNGB3 humana, que codifica una proteína CNGB3 funcional. En ciertas realizaciones, el transgén es una secuencia codificante de CNGB3 de codones optimizados que es una secuencia que comparte al menos el 70% de identidad con SEQ ID NO: 19 o 21. En ciertas realizaciones, el transgén está codificado por la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 23. SEQ ID NO: 23 incluye extremos modificados, que incluyen sitios de restricción para la clonación en un plásmido, tal como un plásmido de producción descrito aquí. Los nucleótidos 13 a 2448 de SEQ ID NO: 23 proporcionan el ORF para CNGB3. En ciertas realizaciones, el transgén es una secuencia que codifica CNGB3 de codones optimizados SEQ ID NO: 20. En ciertas realizaciones, el transgén está codificado por la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 19. En ciertas realizaciones, el transgén está codificado por la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 21. En ciertas realizaciones, el transgén incluye extremos modificados para la clonación en un plásmido, tal como los plásmidos descritos aquí. La SEQ ID NO: 21 es una secuencia de ADNc nueva en la que se han realizado ciertas mutaciones silenciosas en la secuencia codificante nativa. La invención contempla modificaciones adicionales de la secuencia nativa, como se describe aquí.

En una realización, la secuencia de ácido nucleico que codifica REP-1, CNGA o CNGB comprende además un ácido nucleico que codifica un polipéptido de etiqueta unido covalentemente al mismo. El polipéptido de etiqueta se puede seleccionar de “etiquetas epítopo” conocidas que incluyen, sin limitación, un polipéptido de etiqueta myc, un polipéptido de etiqueta glutationa-S-transferasa, un polipéptido de etiqueta de proteína fluorescente verde, un polipéptido de etiqueta myc-piruvato cinasa, un polipéptido de etiqueta His6, un polipéptido de etiqueta de hemaglutinina del virus de la gripe, un polipéptido de etiqueta flag, y un polipéptido de etiqueta de proteína de unión a maltosa.

Un “vector”, como se usa aquí, es una molécula de ácido nucleico en la que se puede insertar un transgén de ácido nucleico exógeno o heterólogo o modificado genéticamente que entonces se puede introducir en una célula hospedante apropiada. Los vectores tienen preferiblemente uno o más orígenes de replicación y uno o más sitios en los que se puede insertar el ADN recombinante. Los vectores a menudo tienen medios convenientes mediante los cuales las células con vectores pueden seleccionarse de aquellas que no los tienen, por ejemplo codifican genes de resistencia a fármacos. Los vectores comunes incluyen plásmidos, genomas virales y (principalmente en levaduras y bacterias) “cromosomas artificiales”. Aquí se describen ciertos plásmidos.

Los “vectores de virus” se definen como virus de replicación defectuosa que contienen el transgén o transgenes de ácido nucleico exógeno o heterólogo CHM (REP-1) o CNGA3 o CNGB3. En una realización, un casete de expresión como se describe aquí puede diseñarse sobre un plásmido que se usa para la administración de fármacos o para la producción de un vector viral. Los vectores virales adecuados son preferiblemente de replicación defectuosa, y se seleccionan entre aquellos que se dirigen a células oculares. Los vectores virales pueden incluir cualquier virus adecuado para terapia génica, incluyendo, pero sin limitarse a, adenovirus; virus del herpes; lentivirus; retrovirus; parvovirus, etc. Sin embargo, para facilitar la comprensión, se hace referencia aquí al virus adenoasociado como un vector de virus ejemplar.

Un “virus de replicación defectuosa” o “vector viral” se refiere a una partícula viral sintética o recombinante en la que un casete de expresión que contiene un gen de interés se empaqueta en una cápside o envoltura viral, en la que cualesquiera secuencias genómicas virales empaquetadas también dentro de la cápside o envoltura viral son deficientes en replicación; es decir, no pueden generar viriones descendientes pero conservan la capacidad de infectar células diana. En una realización, el genoma vectorial viral no incluye genes que codifican las enzimas requeridas para replicarse (el genoma se puede manipular para que sea “débil” - que contiene solo el transgén de interés flanqueado por las señales requeridas para la amplificación y empaquetamiento del genoma artificial), pero estos genes pueden suministrarse durante la producción. Por lo tanto, se considera seguro para uso en terapia génica, ya que la replicación y la infección por viriones descendientes no pueden ocurrir excepto en presencia de la enzima viral requerida para la replicación.

En aún otra realización, el casete de expresión, que incluye cualquiera de los descritos aquí, se emplea para generar un genoma de AAV recombinante.

Como se usa aquí, la expresión “célula hospedante” puede referirse a la línea celular de empaquetamiento en la que se produce un AAV recombinante a partir de un plásmido de producción. Como alternativa, la expresión “célula hospedante” puede referirse a cualquier célula diana en la que se desee la expresión del transgén. De este modo, una “célula hospedante” se refiere a una célula procariota o eucariota que contiene ADN exógeno o heterólogo que se ha introducido en la célula por cualquier medio, por ejemplo electroporación, precipitación con fosfato de calcio, microinyección, transformación, infección viral, transfección, suministro de liposomas, técnicas de fusión de membranas, peletes revestidos de ADN de alta velocidad, infección viral, y fusión de protoplastos.

En ciertas realizaciones aquí, la expresión “célula hospedante” se refiere a cultivos de células oculares de diversas especies de mamíferos para la evaluación in vitro de las composiciones descritas aquí. En otras realizaciones aquí, la expresión “célula hospedante” se refiere a las células empleadas para generar y empaquetar el vector viral o virus recombinante. Aún en otras realizaciones, la expresión “célula hospedante” pretende hacer referencia a las células oculares del sujeto que está siendo tratado in vivo para la enfermedad ocular.

Como se usa aquí, la expresión “células oculares” se refiere a cualquier célula en el ojo o asociada con la función del mismo. La expresión puede referirse a una cualquiera de las células fotorreceptoras, incluyendo fotorreceptores de bastones, fotorreceptores de los conos y las células ganglionares fotosensibles, las células del epitelio pigmentario de la retina (RPE), las células de Mueller, las células coroideas, las células bipolares, las células horizontales, y las células amacrinas. En una realización, las células oculares son las células fotorreceptoras. En otra realización, las células oculares son células de RPE.

Los “plásmidos” generalmente se designan aquí por una p minúscula precedida y/o seguida de letras mayúsculas y/o números, según las convenciones de nomenclatura estándar que son familiares para los expertos en la técnica. Muchos plásmidos y otros vectores de clonación y expresión que se pueden usar según la presente invención son bien conocidos y están fácilmente disponibles para los expertos en la técnica. Además, los expertos pueden construir fácilmente cualquier número de otros plásmidos adecuados para uso en la invención. Las propiedades, construcción y uso de tales plásmidos, así como otros vectores, en la presente invención serán fácilmente evidentes para los expertos a partir de la presente descripción.

Como se usa aquí, la expresión “secuencia de control transcripcional” o “secuencia de control de la expresión” se refiere a secuencias de ADN, tales como secuencias iniciadoras, secuencias potenciadoras y secuencias promotoras, que inducen, reprimen o controlan de otro modo la transcripción de secuencias de ácidos nucleicos que codifican proteínas a las que están operativamente enlazadas.

Como se usa aquí, la expresión “operativamente enlazadas” u “operativamente asociadas” se refiere a ambas secuencias de control de la expresión que son contiguas con la secuencia de ácido nucleico que codifica el REP-1 o CNGA3, y/o secuencias de control de la expresión que actúan en trans o a distancia para controlar la transcripción y expresión de las mismas.

El término “AAV” o “serotipo de AAV”, como se usa aquí, se refiere a las docenas de virus adenoasociados de origen natural y disponibles, así como a AAVs artificiales. Entre los AAVs aislados o manipulados procedentes de seres humanos o primates no humanos (NHP) y bien caracterizados, el AAV2 humano es el primer AAV que se desarrolló como vector de transferencia de genes; se ha utilizado ampliamente para experimentos de transferencia de genes eficientes en diferentes tejidos diana y modelos animales. A menos que se especifique lo contrario, la cápside de AAV, las ITRs y otros componentes de AAV seleccionados descritos aquí, pueden seleccionarse fácilmente entre cualquier ^{AAV, incluyendo, sin limitación, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5,}AaV6, ^{AAV7, AAV8, AAV9, AAV8bp, AAV7M8 y}AAVAnc80, variantes de cualquiera de los AAVs conocidos o mencionados o AAVs aún por descubrir, o variantes o mezclas de los mismos. Véase, por ejemplo, el documento WO 2005/033321. En otra realización, la cápside de AAV es una cápside de AAV8bp, que se dirige preferentemente a las células bipolares. Véase, el documento WO 2014/024282. En otra realización, la cápside de AAV es una cápside de AAV7m8, que ha mostrado un suministro preferencial a la retina externa. Véase, Dalkara et al, In Vivo-Directed Evolution of a New Adeno-Associated Virus for Therapeutic Outer Retinal Gene Delivery from the Vitreous, SciTransl Med 5, 189ra76 (2013). En una realización, la cápside de AAV es una cápside de AAV8. En otra realización, la cápside de AAV es una cápside de AAV9. En otra realización, la cápside de AAV es una cápside de AAV5. En otra realización, la cápside de AAV es una cápside de AAV2.

Como se usa aquí, en relación con AAV, el término variante significa cualquier secuencia de AAV que deriva de una ^{secuencia de}aAv ^{conocida, incluyendo las que comparten al menos el 70%, al menos el 75%, al menos el 80%, al}menos el 85%, al menos el 90%, al menos 95%, al menos 97%, al menos 99% o más de identidad de secuencia con respecto a la secuencia de aminoácidos o de ácido nucleico. En otra realización, la cápside de AAV incluye variantes que pueden incluir hasta alrededor de 10% de variación de cualquier secuencia de cápside de AAV descrita o conocida. Es decir, la cápside de AAV comparte alrededor de 90% de identidad hasta alrededor de 99,9% de identidad, alrededor de 95% hasta alrededor de 99% de identidad, o alrededor de 97% hasta alrededor de 98% de identidad con una cápside de AAV proporcionada aquí y/o conocida en la técnica. En una realización, la cápside de AAV comparte al menos 95% de identidad con una cápside de AAV. Cuando se determina el porcentaje de identidad de una cápside de AAV, la comparación puede realizarse con cualquiera de las proteínas variables (por ejemplo, vp1, vp2 o vp3). En una realización, la cápside de AAV comparte al menos 95% de identidad con la vp3 de AAV8. En otra realización, se usa un AAV autocomplementario.

Las ITRs u otros componentes de AAV pueden aislarse o modificarse fácilmente usando técnicas disponibles para los expertos en la técnica a partir de un AAV. Dicho AAV puede aislarse, diseñarse u obtenerse de fuentes académicas, comerciales o públicas (por ejemplo, la American Type Culture Collection, Manassas, VA). Alternativamente, las secuencias de AAV pueden modificarse a través de medios sintéticos u otros medios adecuados haciendo referencia a secuencias publicadas como las que están disponibles en la bibliografía o en bases de datos tales como, por ejemplo, GenBank, PubMed, o similares. Los virus AAV pueden diseñarse mediante técnicas convencionales de biología molecular, lo que hace posible optimizar estas partículas para el suministro específico de secuencias de ácidos nucleicos a las células, para minimizar la inmunogenicidad, para ajustar la estabilidad y la vida útil de las partículas, para una degradación eficiente, para un suministro preciso al núcleo, etc.

Como se usa aquí, “AAV artificial” significa, sin limitación, un AAV con una proteína de la cápside de origen no natural. Dicha cápside artificial puede generarse mediante cualquier técnica adecuada, usando una secuencia de AAV seleccionada (por ejemplo, un fragmento de una proteína de la cápside vp1) en combinación con secuencias heterólogas que pueden obtenerse de un AAV seleccionado diferente, porciones no contiguas del mismo AAV, de una fuente viral no AAV, o de una fuente no viral. Un AAV artificial puede ser, sin limitación, un AAV pseudotipado, una cápside de AAV quimérica, una cápside de AAV recombinante, o una cápside de AAV “humanizada”. Los vectores pseudotipados, en los que la cápside de un AAV se reemplaza por una proteína de la cápside heteróloga, son útiles en la invención. En una realización, AAV2/5 y AAV2/8 son ejemplos de vectores pseudotipados.

“AAV autocomplementario” se refiere a un plásmido o vector que tiene un casete de expresión en el que se ha diseñado una región codificante portada por una secuencia de ácido nucleico de AAV recombinante para formar un molde de ADN bicatenario intramolecular. Tras la infección, en lugar de esperar la síntesis mediada por células de la segunda hebra, las dos mitades complementarias de scAAV se asociarán para formar una unidad de ADN bicatenario (ADNbc) que está lista para la replicación y transcripción inmediatas. Véase, por ejemplo, D M McCarty et al, “Selfcomplementary recombinant adeno-associated virus (scAAV) vectors promote efficient transduction independently of DNA synthesis”, Gene Therapy, (agosto 2001), Vol 8, Número 16, Páginas 1248-1254. Los AAVs autocomplementarios se describen en, por ejemplo, las patentes U.S. nos 6.596.535; 7.125.717; y 7.456.683.

“Administrar”, como se usa en los métodos, significa suministrar la composición a la célula diana seleccionada que se caracteriza por la enfermedad ocular. En una realización, el método implica suministrar la composición mediante inyección subretiniana al EPR, células fotorreceptoras u otras células oculares. En otra realización, se emplea la inyección intravítrea a las células oculares. En aún otro método, puede emplearse la inyección a través de la vena palpebral a las células oculares. Un experto en la técnica puede seleccionar aún otros métodos de administración dada esta descripción. Por “administrar” o “vía de administración” se entiende el suministro de la composición descrita aquí, con o sin un portador o excipiente farmacéutico, al sujeto. Las vías de administración pueden combinarse, si se desea. En algunas realizaciones, la administración se repite periódicamente. Las composiciones farmacéuticas descritas aquí están diseñadas para el suministro a sujetos que lo necesiten mediante cualquier vía adecuada o una combinación de diferentes vías. El suministro directo al ojo (opcionalmente mediante administración ocular, inyección subretiniana, inyección intrarretiniana, intravítrea, tópica) o suministro por vías sistémicas, por ejemplo, intraarterial, intraocular, intravenosa, intramuscular, subcutánea, intradérmica, y otras vías de administración parentales. Las moléculas de ácido nucleico y/o los vectores descritos aquí pueden suministrarse en una composición única o en múltiples composiciones. Opcionalmente, se pueden suministrar dos o más AAVs diferentes, o múltiples virus [véanse, por ejemplo, los documentos WO202011/126808 y WO 2013/049493]. En otra realización, múltiples virus pueden contener diferentes virus de replicación defectuosa (por ejemplo, AAV y adenovirus), solos o en combinación con proteínas.

Ciertas composiciones descritas aquí son secuencias de ácido nucleico aisladas o manipuladas sintética o recombinantemente que proporcionan nuevas secuencias de codones optimizados que codifican REP-1 o CNGA3 o CNGB3. En una realización, se proporciona una secuencia de ácido nucleico de codones optimizados aislada o modificada que codifica REP-1 humana. En una realización, la secuencia de codones optimizados es SEQ ID NO: 1. En otra realización, la secuencia de codones optimizados incluye sitios de restricción N-terminales y C-terminales para la clonación. En una realización, tal como la descrita en SEQ ID NO: 5, la secuencia codificante de REP-1 incluye un sitio de restricción N-terminal NotI y un sitio de restricción C-terminal BamHI, además de una secuencia consenso de Kozak. Además, la secuencia de codones optimizados, en algunas realizaciones, incluye uno o más sitios de restricción adicionales para permitir la adición de marcadores, tales como una etiqueta de epítopo. Cuando se alinea con la secuencia de ácido nucleico nativa, la REP-1 de codones optimizados puede tener un porcentaje de identidad de al menos 50%, o al menos 60%, o al menos 70%, o al menos 80%, o al menos 90%, incluyendo cualquier número entero entre cualquiera de esos intervalos. En una realización, la REP-1 de codones optimizados tiene un porcentaje de identidad con la secuencia nativa de al menos 51,52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61,62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99%. En una realización, cuando se alinea con la secuencia de ácido nucleico nativa SEQ ID NO: 3, se revela que REP-1 de codones optimizados (SEQ ID NO: 1) tiene un porcentaje de identidad de secuencia de solo 74% (véase la FIG. 2).

En otra realización, se proporciona una secuencia de ácido nucleico de codones optimizados aislada o modificada que codifica CNGA3 humana. En una realización, la secuencia de codones optimizados es SEQ ID NO: 9. En una realización, la secuencia de codones optimizados es una variante de CNGA3 mostrada en SEQ ID NO: 11. En otra realización, la secuencia de codones optimizados incluye sitios de restricción N-terminales y C-terminales para la clonación. En una realización, la secuencia codificante de CNGA3 incluye un sitio de restricción N-terminal NotI y un sitio de restricción C-terminal BglII, además de una secuencia de consenso de Kozak. En SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17 y SEQ ID NO: 18 se pueden encontrar ejemplos de secuencias de CNGA3 que incluyen tales modificaciones. Además, la secuencia de codones optimizados, en algunas realizaciones, incluye uno o más sitios de restricción adicionales para permitir la adición de marcadores, tal como una etiqueta de epítopo. Cuando se alinea con la secuencia de ácido nucleico nativa, la CNGA3 de codones optimizados puede tener un porcentaje de identidad de al menos 50%, o al menos 60%, o al menos 70%, o al menos 80%, o al menos 90%, incluyendo cualquier número entero entre cualquiera de esos intervalos. En una realización, la CNGA3 de codones optimizados tiene un porcentaje de identidad con la secuencia nativa de al menos 51,52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61,62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99%. En una realización, cuando se alinea con la secuencia de ácido nucleico nativa SEQ ID NO: 13, se revela que la CNGA3 de codones optimizados (SEQ ID NO: 9) tiene un porcentaje de identidad de secuencia de solo 80% (véase la FIG. 3).

En otra realización, se proporciona una secuencia de ácido nucleico de codones optimizados aislada o modificada que codifica CNGB3 humana. En una realización, la secuencia de codones optimizados es una secuencia que comparte al menos 70% de identidad con SEQ ID NO: 19 o SEQ ID NO 21. En otra realización, la secuencia de codones optimizados incluye sitios de restricción N-terminales y C-terminales para la clonación, por ejemplo como se muestra en SEQ ID NO: 23. Además, la secuencia de codones optimizados, en algunas realizaciones, incluye uno o más sitios de restricción adicionales para permitir la adición de marcadores, tales como una etiqueta de epítopo. Cuando se alinea con la secuencia de ácido nucleico nativa (como se muestra en SEQ ID NO: 19), la CNGB3 de codones optimizados puede tener un porcentaje de identidad de al menos 50%, o al menos 60%, o al menos 70%, o al menos 80%, o al menos 90%, incluyendo cualquier número entero entre cualquiera de esos intervalos. En una realización, la CNGB3 de codones optimizados tiene un porcentaje de identidad con la secuencia nativa de al menos 51,52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71,72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91,92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99%.

En una realización, las secuencias de ácido nucleico optimizadas que codifican los constructos de REP-1 o CNGA3 descritas aquí se modifican mediante ingeniería genética en cualquier elemento genético adecuado, por ejemplo ADN desnudo, fago, transposón, cósmido, molécula de ARN (por ejemplo, ARNm), episoma, etc., que transfiere las secuencias de REP-1 o CNGA3 portadas allí a una célula hospedante, por ejemplo para generar nanopartículas que portan ADN o ARN, vectores virales en una célula hospedante de empaquetamiento, y/o para el suministro a células hospedantes en un sujeto. En una realización, el elemento genético es un plásmido.

El elemento genético seleccionado puede suministrarse mediante cualquier método adecuado, incluyendo transfección, electroporación, suministro de liposomas, técnicas de fusión de membranas, peletes revestidos de ADN de alta velocidad, infección viral, y fusión de protoplastos. Los métodos usados para obtener tales constructos son conocidos por aquellos con pericia en la manipulación de ácidos nucleicos, e incluyen ingeniería genética, ingeniería recombinante, y técnicas sintéticas. Véase, por ejemplo, Green y Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (2012).

Se proporciona una variedad de casetes de expresión que emplean las SEQ ID Nos. 1 o 5 para la expresión de la proteína REP-1. En una realización, en SEQ ID NO. 25 se muestra un ejemplo de un plásmido que contiene tal casete de expresión. En una realización, en SEQ ID NO. 26 se muestra un ejemplo de un plásmido que contiene tal casete de expresión. En una realización, en SEQ ID NO. 27 se muestra un ejemplo de un plásmido que contiene tal casete de expresión. En una realización, en SEQ ID NO. 28 se muestra un ejemplo de un plásmido que contiene tal casete de expresión. Como se usa aquí, el “genoma vectorial” es la secuencia de ácido nucleico que está empaquetada entre las ITRs 5’ y 3’, incluyendo las propias ITRs. En algunas realizaciones, la expresión “genoma vectorial” se usa indistintamente con “casete de expresión”. De este modo, en una realización, el genoma vectorial incluye una 5’ ITR, un potenciador de CMV, un promotor de beta-actina de pollo, un exón 1 e intrón de CBA, una secuencia de Kozak, CHM de codones optimizados, bGH poli A y una 3’ ITR. En una realización, el genoma vectorial comprende los nt 1 a ^{4233 de SEQ ID}nO: ^{25. En otra realización, el genoma vectorial comprende los nt 1 a 4233 de SEQ ID NO: 26. En}otra realización, el genoma vectorial comprende los nt 1 a 4233 de SEQ ID NO: 27. En otra realización, el genoma vectorial comprende los nt 1 a 4233 de SEQ ID NO: 28.

En otra realización, se proporcionan una variedad de casetes de expresión que emplean SEQ ID Nos. 9, 11 o 13 para la expresión de la proteína CNGA3. En otra realización, se proporciona una variedad de casetes de expresión que emplean las SEQ ID Nos. 19, 21 o 23 para la expresión de la proteína CNGAB. Como se usa aquí, un “casete de expresión” se refiere a una molécula de ácido nucleico que comprende secuencias codificantes para las proteínas REP-1 o CNGA3 o CNGB3 optimizadas, el promotor, y puede incluir otras secuencias reguladoras para las mismas, casete el cual puede diseñarse en un elemento genético o plásmido, y/o empaquetarse en la cápside de un vector viral (por ejemplo, una partícula viral). En una realización, un casete de expresión comprende una secuencia de ácido nucleico de codones optimizados que codifica REP-1. En una realización, el casete proporciona la REP-1 de codones optimizados asociada operativamente con secuencias de control de la expresión que dirigen la expresión de la secuencia de ácido nucleico de codones optimizados que codifica REP-1 en una célula hospedante.

En otra realización, un casete de expresión comprende una secuencia de ácido nucleico de codones optimizados que codifica CNGA3. En una realización, el casete proporciona la CNGA3 de codones optimizados asociada operativamente con secuencias de control de la expresión que dirigen la expresión de la secuencia de ácido nucleico de codones optimizados que codifica CNGA3 en una célula hospedante.

En otra realización, un casete de expresión comprende una secuencia de ácido nucleico de codones optimizados que codifica CNGB3. En una realización, el casete proporciona la CNGB3 de codones optimizados asociada operativamente con secuencias de control de la expresión que dirigen la expresión de la secuencia de ácido nucleico de codones optimizados que codifica CNGB3 en una célula hospedante.

En otra realización, se proporciona un casete de expresión para uso en un vector de AAV. En esa realización, el casete de expresión de AAV incluye al menos una secuencia de repetición terminal invertida (ITR) de AAV. En otra realización, el casete de expresión comprende secuencias 5’ ITR y secuencias 3’ ITR. En una realización, las 5’ y 3’ ITRs flanquean la secuencia de ácido nucleico de codones optimizados que codifica REP-1 o CNGA3 o CNGB3, opcionalmente con secuencias adicionales que dirigen la expresión de la secuencia de ácido nucleico de codones optimizados que codifica REP-1 o CNGA3 o CNGB3 en una célula hospedante. De este modo, como se describe aquí, un casete de expresión de AAV está destinado a describir un casete de expresión como se describe anteriormente flanqueado en su extremo 5’ por una secuencia de repetición terminal invertida (ITR) 5’AAV y, en su extremo 3’, por una ITR 3’ AAV. De este modo, este genoma de rAAV contiene las secuencias mínimas necesarias para empaquetar el casete de expresión en una partícula viral de AAV, es decir, las 5’ y 3’ ITR de AAVs. Las ITRs de AAV se pueden obtener a partir de las secuencias de ITR de cualquier AAV, tal como se describe aquí. Estas ITRs pueden ser del mismo origen de AAV que la cápside empleada en el AAV recombinante resultante, o de un origen de AAV diferente (para producir un pseudotipo de AAV). En una realización, las secuencias de ITR de AAV2, o la versión eliminada de las mismas (DITR), se usan por conveniencia y para acelerar la aprobación reguladora. Sin embargo, se pueden seleccionar ITRs de otras fuentes de AAV. Cada genoma de rAAV puede introducirse después en un plásmido de producción. En una realización, el plásmido de producción es el que se describe aquí, o como se describe en el documento WO2012/158757. Se conocen en la técnica diversos plásmidos para uso en la producción de vectores de rAAV, y son útiles aquí. Los plásmidos de producción se cultivan en las células hospedantes que expresan las proteínas cap y/o rep de AAV. En las células hospedantes, cada genoma de rAAV se rescata y se empaqueta en la proteína de la cápside o la proteína de la envoltura para formar una partícula viral infecciosa.

Un tipo de plásmido de producción es el que se muestra en SEQ ID NO: 7, que se denomina p584. Este plásmido se usa en los ejemplos para la generación del vector rAAV-REP-1. Tal plásmido es aquel que contiene una secuencia de ITR 5’ AAV; un promotor seleccionado; una secuencia poliA; y una 3’ ITR; además, también contiene una secuencia de relleno, tal como lambda. En una realización, se incluye una región de relleno lambda no codificante en el esqueleto del vector. La secuencia de ácido nucleico que codifica REP-1, CNGA3 o CNGB2 se inserta en el lugar entre el promotor seleccionado y la secuencia poliA, o un plásmido similar. Un ejemplo de p584 que incluye la secuencia que codifica REP-1 se puede encontrar en SEQ ID NO: 8. En otra realización, el plásmido de producción se modifica para optimizar la eficiencia de producción del plásmido del vector. Tales modificaciones incluyen la adición de otras secuencias neutras, o la supresión de porción o porciones de o de toda la secuencia de relleno lambda para modular el nivel de superenrollamiento del plásmido vector. Tales modificaciones se contemplan aquí. En otras realizaciones, en el plásmido se incluyen secuencias terminadoras y otras secuencias.

En todavía una realización adicional, se proporciona un vector de virus adenoasociado recombinante (AAV) para el suministro de los constructos REP-1, CNGA3 y CNGB3 y las secuencias optimizadas descritas aquí. Un vector viral de virus adenoasociado (AAV) es una partícula resistente a ADNasa de AAV que tiene una cápside de proteína de AAV en la que se empaquetan secuencias de ácido nucleico para el suministro a células diana. Una cápside de AAV se compone de 60 subunidades de proteínas de la cápside (cap), VP1, VP2 y VP3, que están dispuestas en una simetría icosaédrica en una relación de aproximadamente 1:1:10 a 1:1:20, dependiendo del AAV seleccionado. Los AAVs pueden seleccionarse como fuentes para cápsides de vectores virales de AAV como se identifica anteriormente. Véanse, por ejemplo, Solicitud de Patente Publicada US n° 2007-0036760-A1; Solicitud de Patente Publicada US n° 2009-0197338-A1; documento EP 1310571. Véanse también documento WO 2003/042397 (AAV7 y otros AAV de simio), patente US 7790449 y patente US 7282199 (AAV8), documentos WO 2005/033321 y US 7.906.111 (AAV9), y WO 2006/110689, y WO 2003/042397 (rh.10). Estos documentos también describen otros AAV que pueden seleccionarse para generar AAV. En algunas realizaciones, una cap de AAV para uso en el vector viral se puede generar mediante mutagénesis (es decir, mediante inserciones, supresiones, o sustituciones) de una de las cápsides de AAV mencionadas anteriormente o su ácido nucleico codificante. En algunas realizaciones, la cápside de AAV es quimérica, que comprende dominios de dos o tres o cuatro o más de las proteínas de la cápside de AAV mencionadas anteriormente. En algunas realizaciones, la cápside de AAV es un mosaico de monómeros Vp1, Vp2 y Vp3 de dos o tres AAVs diferentes o AAVs recombinantes. En algunas realizaciones, una composición de rAAV comprende más de una de las cápsides mencionadas anteriormente.

En otra realización, la cápside de AAV incluye variantes que pueden incluir una variación de hasta alrededor del 10% de cualquier secuencia de la cápside de AAV descrita o conocida. Es decir, la cápside de AAV comparte alrededor de 90% de identidad hasta alrededor de 99,9% de identidad, alrededor de 95% hasta alrededor de 99% de identidad, o alrededor de 97% hasta alrededor de 98% de identidad con una cápside de AAV proporcionada aquí y/o conocida en la técnica. En una realización, la cápside de AAV comparte al menos 95% de identidad con una cápside de AAV.

Cuando se determina el porcentaje de identidad de una cápside de AAV, la comparación puede realizarse con cualquiera de las proteínas variables (por ejemplo, vp1, vp2 o vp3). En una realización, la cápside de AAV comparte al menos 95% de identidad con la vp3 de AAV8. En otra realización, se usa un AAV autocomplementario. En una realización, es deseable utilizar una cápside de AAV, que muestra tropismo por la célula diana deseada, por ejemplo fotorreceptores, RPE u otras células oculares. En una realización, la cápside de AAV es un mutante de tirosina de la cápside en el que ciertos restos de tirosina expuestos en la superficie se sustituyen por fenilalanina (F). Tales variantes de AAV se describen, por ejemplo, en Mowat et al, Tyrosine capsid-mutant AAV vectors for gene delivery to the canine retina from a subretinal or intravitreal approach, Gene Therapy 21,96-105 (enero de 2014).

Para empaquetar un casete de expresión o genoma de rAAV o plásmido de producción en viriones, las ITRs son los únicos componentes de AAV requeridos en cis en el mismo constructo que el transgén. En una realización, las secuencias codificantes para la replicación (rep) y/o cápside (cap) se eliminan del genoma de AAV y se suministran en trans o mediante una línea celular de empaquetamiento para generar el vector de AAV. Por ejemplo, como se describe anteriormente, un AAV pseudotipado puede contener ITRs de una fuente que difiera de la fuente de la cápside de AAV. Adicional o alternativamente, se puede utilizar una cápside de AAV quimérica. Pueden seleccionarse aún otros componentes de AAV. Las fuentes de tales secuencias de AAV se describen aquí, y también se pueden aislar o manipular obtenidas de fuentes académicas, comerciales o públicas (por ejemplo, la American Type Culture Collection, Manassas, VA). Alternativamente, las secuencias de AAV pueden obtenerse a través de medios sintéticos u otros medios adecuados haciendo referencia a secuencias publicadas tales como las que están disponibles en la bibliografía o en bases de datos tales como, por ejemplo, GenBank®, PubMed®, o similares.

Se conocen en la técnica métodos para generar y aislar vectores virales de AAV adecuados para el suministro a un sujeto. Véanse, por ejemplo, patente US 7790449; patente US 7282199; documentos W o 2003/042397; WO 2005/033321, WO 2006/110689; y US 7588772 B2]. En un sistema, una línea de células productoras se transfecta transitoriamente con un constructo que codifica el transgén flanqueado por ITRs y un constructo o constructos que codifican rep y cap. En un segundo sistema, una línea celular de empaquetamiento que proporciona de forma estable rep y cap se transfecta de forma transitoria con un constructo que codifica el transgén flanqueado por ITRs. En cada uno de estos sistemas, los viriones de AAV se producen en respuesta a la infección con adenovirus auxiliares o herpesvirus, lo que requiere la separación de los rAAV del virus contaminante. Más recientemente, se han desarrollado sistemas que no requieren infección con virus auxiliares para recuperar el AAV - las funciones auxiliares necesarias (es decir, adenovirus E1, E2a, VA y E4, o herpesvirus UL5, UL8, UL52 y UL29, y herpesvirus polimerasa), en trans, por el sistema. En estos sistemas más nuevos, las funciones auxiliares se pueden suministrar mediante la transfección transitoria de las células con constructos que codifican las funciones auxiliares requeridas, o las células se pueden manipular para contener de manera estable genes que codifican las funciones auxiliares, cuya expresión se puede controlar a nivel transcripcional o post-transcripcional.

En aún otro sistema, el transgén flanqueado por ITRs y genes rep/cap se introduce en células de insecto mediante infección con vectores basados en baculovirus. Para revisiones sobre estos sistemas de producción, véase en general, por ejemplo, Zhang et al., 2009, “Adenovirus-adeno-associated virus hybrid for large-scale recombinant adenoassociated virus production”, Human Gene Therapy 20:922-929. Los métodos de fabricación y uso de estos y otros sistemas de producción de AAV también se describen a continuación en las siguientes patentes U.S.: 5.139.941; 5.741.683; 6.057.152; 6.204.059; 6.268.213; 6.491.907; 6.660.514; 6.951.753; 7.094.604; 7.172.893; 7.201.898; 7.229.823; y 7.439.065. Véase en general, por ejemplo, Grieger y Samulski, 2005, “Adeno-associated virus as a gene therapy vector: Vector development, production and clinical applications”, Adv. Biochem. Engin/Biotechnol. 99: 119 145; Buning et al., 2008, “Recent developments in adeno-associated virus vector technology”, J. Gene Med. 10:717-733; y las referencias citadas a continuación.

Los métodos usados para construir cualquier realización de esta invención son conocidos por los expertos en manipulación de ácidos nucleicos, e incluyen ingeniería genética, ingeniería recombinante, y técnicas sintéticas. Véase, por ejemplo, Green y Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (2012). De forma similar, los métodos para generar viriones de rAAV son bien conocidos, y la selección de un método adecuado no es una limitación de la presente invención. Véanse, por ejemplo, K. Fisher et al, (1993) J. Virol., 70:520-532 y patente US n25.478.745.

Los vectores de rAAV comprenden una cápside de AAV y un casete de expresión de AAV que comprende secuencias que codifican REP-1 o CNGA3 o CNGB3, tal como se describe anteriormente. En ciertas realizaciones, el casete de expresión de rAAV comprende secuencias de repetición terminal invertida de AAV y una secuencia de ácido nucleico de codones optimizados que codifica REP-1 o CNGA3 o CNGB3, y secuencias de control de la expresión que dirigen la expresión de las proteínas codificadas en una célula hospedante. El casete de expresión de rAAV, en otras realizaciones, comprende además uno o más de un intrón, una secuencia de Kozak, un poliA, y elementos reguladores post-transcripcionales. Dichos vectores de rAAV para uso en composiciones farmacéuticas para el suministro al ojo pueden emplear una cápside de cualquiera de los muchos AAVs conocidos identificados anteriormente.

Otros componentes convencionales de los casetes y vectores de expresión incluyen otros componentes que pueden optimizarse para una especie específica usando técnicas conocidas en la técnica, incluyendo, por ejemplo, optimización de codones, como se describe aquí. Los componentes de los casetes, vectores, plásmidos y virus u otras composiciones descritas aquí incluyen una secuencia promotora como parte de las secuencias de control de la expresión. En otra realización, el promotor es específico de la célula. La expresión “específico de la célula” significa que el promotor particular seleccionado para el vector recombinante puede dirigir la expresión del transgén de REP-1 o CNGA3 o CNGB3 optimizado en un tipo de célula ocular particular. En una realización, el promotor es específico para la expresión del transgén en células fotorreceptoras. En otra realización, el promotor es específico para la expresión en los conos y bastones. En otra realización, el promotor es específico para la expresión en los bastones. En otra realización, el promotor es específico para la expresión en los conos. En una realización, el promotor específico del fotorreceptor es un promotor de rodopsina cinasa humana. Se ha demostrado que el promotor de la rodopsina cinasa es activo tanto en los bastones como en los conos. Véase, por ejemplo, Sun et al, Gene Therapy with a Promoter Targeting Both Rods and Cones Rescues Retinal Degeneration Caused by AIPL1 Mutations, Gene Ther. Enero 2010; 17(1): 117-131. En una realización, el promotor se modifica para añadir uno o más sitios de restricción para facilitar la clonación.

En otra realización, el promotor es un promotor de rodopsina humana. En una realización, el promotor se modifica para incluir restricción en los extremos para la clonación. Véase, por ejemplo, Nathans y Hogness, Isolation and nucleotide sequence of the gene encoding human rhodopsin, PNAS, 81:4851 -5 (agosto 1984). En otra realización, el promotor es una porción o fragmento del promotor de rodopsina humana. En otra realización, el promotor es una variante del promotor de rodopsina humana.

Otros promotores ejemplares incluyen el promotor de la proteína cinasa 1 receptora acoplada a proteína G humana (GRK1) (número de acceso de Genbank AY327580). En otra realización, el promotor es un fragmento de 292 nt (posiciones 1793-2087) del promotor GRK1 (véase, Beltran et al, Gene Therapy 2010 17:1162-74). En otra realización preferida, el promotor es el promotor proximal de la proteína de unión a retinoides interfotorreceptores humanos (IRBP). En una realización, el promotor es un fragmento de 235 nt del promotor hIRBP. En una realización, el promotor es el promotor proximal RPGR (Shu et al, IOVS, mayo 2102). Otros promotores útiles en la invención incluyen, sin limitación, el promotor de opsina rojo, el promotor de opsina rojo-verde, el promotor de opsina azul, el promotor de cGMP-p-fosfodiesterasa (Qgueta et al, IOVS, Invest Ophthalmol Vis Sci. diciembre 2000; 41 (13):4059-63), el promotor de opsina de ratón (Beltran et al 2010, citado anteriormente), el promotor de rodopsina (Mussolino et al, Gene Ther, julio 2011, 18(7):637-45); la subunidad alfa de la transducina de los conos (Morrissey et al, BMC Dev, Biol, Jan 2011, 11:3); promotor de beta fosfodiesterasa (PDE); el promotor de la retinitis pigmentaria (RP1) (Nicord et al, J. Gene Med, Dec 2007, 9(12):1015-23); el promotor NXNL2/NXNL1 (Lambard et al, PloS One, Oct. 2010, 5(10):e13025), el promotor RPE65; el promotor de degeneración retiniana lenta/periferina 2 (Rds/perph2) (Cai et al, Exp Eye Res. agosto 2010; 91 (2):186-94); y el promotor VMD2 (Kachi et al, Human Gene Therapy, 2009 (20:31-9)). En otra realización, el promotor se selecciona de promotor EF1a humano, promotor de rodopsina, rodopsina cinasa, proteína de unión a interfotorreceptores (IRBP), promotores de opsina de los conos (rojo-verde, azul), secuencias en dirección 5’ de la opsina de los conos que contienen la región de control del locus de los conos rojo-verde, de la transducción de los conos, y promotores del factor de transcripción (cremallera de leucina de la retina neural (Nrl) y receptor nuclear específico del fotorreceptor Nr2e3, bZIP).

En otra realización, el promotor es un promotor ubicuo o constitutivo. Un ejemplo de un promotor adecuado es un promotor híbrido de p-actina de pollo (CBA) con elementos potenciadores del citomegalovirus (CMV). En otra realización, el promotor es el promotor CB7. Otros promotores adecuados incluyen el promotor de p-actina humana, el promotor del factor de alargamiento humano 1a, el promotor de citomegalovirus (CMV), el promotor del virus de simio 40, y el promotor de timidina cinasa del virus del herpes simple. Véase, por ejemplo, Damdindorj et al, (agosto 2014). A Comparative Analysis of Constitutive Promoters Located in Adeno-Associated Viral Vectors.PloS ONE 9(8): e106472. Aún otros promotores adecuados incluyen promotores virales, promotores constitutivos, promotores regulables [véanse, por ejemplo, los documentos WO 2011/126808 y WO 2013/04943]. Alternativamente, se puede utilizar un promotor que responda a señales fisiológicas en el casete de expresión, genomas de rAAV, vectores, plásmidos y virus descritos aquí. En una realización, el promotor es de tamaño pequeño, por debajo de 1000 pb, debido a las limitaciones de tamaño del vector de AAV. En otra realización, el promotor está por debajo de 400 pb. Un experto en la técnica puede seleccionar otros promotores. En una realización, el constructo de REP-1 incorpora un promotor ubicuo. En otra realización, el constructo de CNGA3 incorpora un promotor específico de fotorreceptores. En una realización, el constructo de REP-1 incluye un promotor CBA con elementos potenciadores de CMV.

En otra realización, el promotor es un promotor inducible. El promotor inducible puede seleccionarse de promotores conocidos que incluyen el promotor de rapamicina/rapalog, el promotor de ecdisona, el promotor sensible a estrógenos, y el promotor sensible a tetraciclina, o interruptor represor heterodimérico. Véanse, Sochor et al, An Autogenously Regulated Expression System for Gene Therapeutic Ocular Applications. Scientific Reports, 24 de noviembre de 2015; 5:17105 y Daber R, Lewis M., A novel molecular switch. J Mol Biol. 28 de agosto de 2009; 391 (4):661 -70, Epub 21 de junio de 2009.

En otras realizaciones, los constructos de casete, vector, plásmido y virus descritos aquí contienen otras secuencias de iniciación, de terminación, y potenciadoras de la transcripción apropiadas, señales de procesamiento de ARN eficaces tales como señales de ayuste y poliadenilación (poliA); secuencias TATA; secuencias que estabilizan el ARNm citoplásmico; secuencias que mejoran la eficacia de la traducción (es decir, secuencia de consenso de Kozak); intrones; secuencias que mejoran la estabilidad de las proteínas; y, cuando se desee, secuencias que potencian la secreción del producto codificado. El casete de expresión o vector puede contener ninguno, uno o más de cualquiera de los elementos descritos aquí. Los ejemplos de secuencias de poliA adecuadas incluyen, por ejemplo, poliA de SV40, de la hormona del crecimiento bovino (bGH) y de TK. Ejemplos de potenciadores adecuados incluyen, por ejemplo, el potenciador de CMV, el potenciador de RSV, el potenciador de alfa fetoproteína, el promotor/potenciador mínimo de TTR, LSP (promotor de globulina de unión a TH/potenciador de alfa1 -microglobulina/bikunina), entre otros. En una realización, se incluye una secuencia de Kozak en dirección 5’ de la secuencia codificante del transgén para mejorar la traducción del codón de iniciación correcto. En otra realización, el exón 1 y el intrón de CBA están incluidos en el casete de expresión. En una realización, el transgén se coloca bajo el control de un promotor híbrido de p-actina de pollo (CBA). Este promotor consiste en el potenciador temprano inmediato de citomegalovirus (CMV), el promotor de actina p de pollo proximal, y el exón 1 de CBA flanqueado por secuencias del intrón 1.

En una realización, el casete de expresión contiene una 5’ ITR, promotor CBA, potenciador de CMV, exón 1 e intrón de CBA, secuencia de kozak, secuencia de CHM de codones optimizados humana (SEQ ID NO: 1), bGH poli A, y 3’ ITR.

En aún otros aspectos, estas secuencias de ácido nucleico, vectores, casetes de expresión y vectores virales de rAAV son útiles en una composición farmacéutica, que también comprende un portador, amortiguador, diluyente y/o adyuvante farmacéuticamente aceptable, etc. Tales composiciones farmacéuticas se usan para expresar la REP-1 o CNGA3 o CNGB3 optimizada en las células oculares mediante el suministro mediante tales AAVs modificados recombinantemente o AAVs artificiales.

Para preparar estas composiciones farmacéuticas que contienen las secuencias de ácido nucleico, los vectores, los casetes de expresión y los vectores virales de rAAV, las secuencias o vectores o el vector viral se evalúan preferiblemente para determinar la contaminación mediante métodos convencionales, y después se formulan en una composición farmacéutica adecuada para la administración al ojo. Dicha formulación implica el uso de un portador o portador farmacéutica y/o fisiológicamente aceptable, particularmente uno adecuado para la administración al ojo, tal como disolución salina amortiguada u otros amortiguadores, por ejemplo HEPES, para mantener el pH a niveles fisiológicos apropiados, y, opcionalmente, otros agentes medicinales, agentes farmacéuticos, agentes estabilizantes, amortiguadores, portadores, adyuvantes, diluyentes, etc. Para inyección, el portador será típicamente un líquido. Los portadores fisiológicamente aceptables ejemplares incluyen agua estéril sin pirógenos y disolución salina amortiguada con fosfato estéril y sin pirógenos. En la Publicación de Patente US n° 7.629.322 se proporciona una variedad de tales portadores conocidos. En una realización, el portador es una disolución isotónica de cloruro de sodio. En otra realización, el portador es una disolución salina equilibrada. En una realización, el portador incluye Tween. Si el virus se va a almacenar a largo plazo, se puede congelar en presencia de glicerol o Tween20.

En una realización específica ejemplar, la composición del portador o excipiente contiene NaCl 180 mM, NaPi 10 mM, pH 7,3 con 0,0001% - 0,01 % de Pluronic F68 (PF68). La composición exacta del componente salino del amortiguador oscila de 160 mM a 180 mM de NaCl. Opcionalmente, se usa un amortiguador de pH diferente (potencialmente HEPES, bicarbonato de sodio, TRIS) en lugar del amortiguador descrito específicamente. Alternativamente aún, es útil un amortiguador que contiene NaCl al 0,9%.

Opcionalmente, las composiciones de la invención pueden contener, además del rAAV y/o variantes y portador o portadores, otros ingredientes farmacéuticos convencionales, tales como conservantes o estabilizadores químicos. Los conservantes ejemplares adecuados incluyen clorobutanol, sorbato de potasio, ácido sórbico, dióxido de azufre, galato de propilo, parabenos, etilvainillina, glicerina, fenol y paraclorofenol. Los estabilizadores químicos adecuados incluyen gelatina y albúmina.

Las composiciones farmacéuticas que contienen al menos un virus rAAV de replicación defectuosa, como se describe aquí, se pueden formular con un portador, diluyente, excipiente y/o adyuvante fisiológicamente aceptable, para uso en aplicaciones de terapia génica y transferencia génica. En el caso de los vectores virales de AAV, puede usarse la cuantificación de las copias del genoma (“GC”), de los genomas vectoriales (“VG”) o de las partículas víricas como la medida de la dosis contenida en la formulación o suspensión. Puede usarse cualquier método conocido en la técnica para determinar el número de copias del genoma (GC) de las composiciones de virus de replicación defectuosa de la invención. Un método para realizar la titulación del número de GC de AAV es el siguiente: Las muestras de vector de AAV purificadas se tratan primero con ADNasa para eliminar el ADN del genoma de AAV no encapsidado o el ADN plasmídico contaminante del procedimiento de producción. Las partículas resistentes a la ADNasa se someten después a un tratamiento térmico para liberar el genoma de la cápside. Después, los genomas liberados se cuantifican mediante PCR en tiempo real utilizando conjuntos de cebadores/sondas que se dirigen a una región específica del genoma viral (generalmente la señal de poli A). En otro método, la dosis eficaz de un virus adenoasociado recombinante que porta una secuencia de ácido nucleico que codifica el transgén de REP-1 o CNGA3 optimizado se mide como se describe en S.K. McLaughlin et al, 1988 J. Virol., 62:1963.

Como se usa aquí, el término “dosis” puede referirse a la dosis total suministrada al sujeto en el curso del tratamiento, o la cantidad suministrada en una administración de una sola unidad (o unidad múltiple o dosis dividida). Las composiciones farmacéuticas de virus se pueden formular en unidades de dosificación para contener una cantidad de virus de replicación defectuosa que porta las secuencias de ácido nucleico de codones optimizados que codifican REP-1 o CNGA3 o CNGB3 como se describe aquí que está en el intervalo de alrededor de 1,0 x 109 GC a alrededor de 1,0 x 1015 GC, incluyendo todos los números enteros o cantidades fraccionadas dentro del intervalo. En una realización, las composiciones se formulan para contener al menos 1x109, 2x109, 3x109, 4x109, 5x109, 6x109, 7x109, 8x109, o 9x109 GC por dosis, incluyendo todos los números enteros o cantidades fraccionadas dentro del intervalo. En otra realización, las composiciones se formulan para contener al menos 1x1010, 2x1010, 3x1010, 4x1010, 5x1010, 6x1010, 7x1010, 8x1010, o 9x1010 GC por dosis, incluyendo todos los números enteros o cantidades fraccionadas dentro del intervalo. En otra realización, las composiciones se formulan para contener al menos 1x1011, 2x1011, 3x1011, 4x1011, 5x1011, 6x1011, 7x1011, 8x1011, o 9x1011 GC por dosis, incluyendo todos los números enteros o cantidades fraccionadas dentro del intervalo. En otra realización, las composiciones se formulan para contener al menos 1 x1012, 2x1012, 3x1012, 4x1012, 5x1012, 6x1012, 7x1012, 8x1012, o 9x1012 GC por dosis, incluyendo todos los números enteros o cantidades fraccionadas dentro del intervalo. En otra realización, las composiciones se formulan para contener 1x1013, 2x1013, 3x1013, 4x1013, 5x1013, 6x1013, 7x1013, 8x1013, o 9x1013 GC por dosis, incluyendo todos los números enteros o cantidades fraccionadas dentro del intervalo. En otra realización, las composiciones se formulan para contener al menos 1x1014, 2x1014, 3x1014, 4x1014, 5x1014, 6x1014, 7x1014, 8x1014, o 9x1014 GC por dosis, incluyendo todos los números enteros o cantidades fraccionadas dentro del intervalo. En otra realización, las composiciones se formulan para contener al menos 1x1015, 2x1015, 3x1015, 4x1015, 5x1015, 6x1015, 7x1015, 8x1015, o 9x1015 GC por dosis, incluyendo todos los números enteros o cantidades fraccionadas dentro del intervalo. En una realización, para la aplicación humana, la dosis puede oscilar de 1x1010 a aproximadamente 1x1012 GC por dosis, incluyendo todos los números enteros o cantidades fraccionadas dentro del intervalo. Todas las dosis pueden medirse mediante cualquier método conocido, incluyendo el medido por oqPCR o PCR de gotitas digitales (ddPCR) como se describe en, por ejemplo, M. Lock et al, Hum Gene Ther Methods. Abril 2014; 25(2):115-25. Doi: 10.1089/hgtb.2013.131.

Estas dosis anteriores pueden administrarse en una variedad de volúmenes de formulación de portador, excipiente o amortiguador, que oscilan de alrededor de 25 a alrededor de 1000 microlitros, incluyendo todos los números dentro del intervalo, dependiendo del tamaño del área a tratar, el título viral utilizado, la vía de administración y el efecto deseado del método. En una realización, el volumen de portador, excipiente o amortiguador es al menos alrededor de 25 pl. En una realización, el volumen es alrededor de 50 pl. En otra realización, el volumen es alrededor de 75 pl. En otra realización, el volumen es alrededor de 100 pl. En otra realización, el volumen es de alrededor 125 pl. En otra realización, el volumen es alrededor de 150 pl. En otra realización, el volumen es alrededor de 175 pl. En aún otra realización, el volumen es alrededor de 200 pl. En otra realización, el volumen es alrededor de 225 pl. En aún otra realización más, el volumen es alrededor de 250 pl. En aún otra realización más, el volumen es alrededor de 275 pl. En aún otra realización más, el volumen es alrededor de 300 pl. En aún otra realización, el volumen es alrededor de 325 pl. En otra realización, el volumen es alrededor de 350 pl. En otra realización, el volumen es alrededor de 375 pl. En otra realización, el volumen es alrededor de 400 pl. En otra realización, el volumen es alrededor de 450 pl. En otra realización, el volumen es alrededor de 500 pl. En otra realización, el volumen es alrededor de 550 pl. En otra realización, el volumen es alrededor de 600 pl. En otra realización, el volumen es alrededor de 650 pl. En otra realización, el volumen es alrededor de 700 pl. En otra realización, el volumen está entre alrededor de 700 y 1000 pl.

En una realización, los constructos virales se pueden suministrar en dosis de al menos 1x109 a al menos alrededor de 1x1011 GC en volúmenes alrededor de 1 pl a alrededor de 3 pl para animales pequeños, tales como ratones. Para sujetos veterinarios más grandes que tienen ojos alrededor del mismo tamaño que los ojos humanos, son útiles las dosis y volúmenes humanos mayores indicados anteriormente. Véase, por ejemplo, Diehl et al, J. Applied Toxicology, 21:15-23 (2001) para una discusión de buenas prácticas para la administración de sustancias a diversos animales veterinarios.

Es deseable que se utilice la concentración eficaz más baja de virus u otro vehículo de administración para reducir el riesgo de efectos indeseables, tales como toxicidad, displasia retiniana y desprendimiento. El médico tratante puede seleccionar aún otras dosificaciones en estos intervalos, teniendo en cuenta el estado físico del sujeto, preferiblemente humano, que está siendo tratado, la edad del sujeto, el trastorno ocular particular y el grado en el que el trastorno, si es progresivo, se ha desarrollado.

Todavía otro aspecto descrito aquí es un método para tratar, retardar o detener la progresión de la ceguera en un sujeto mamífero que tiene, o está en riesgo de desarrollar, coroideremia. En una realización, un rAAV que porta las secuencias de codones optimizados de REP-1, preferiblemente suspendido en un portador, diluyente, excipiente y/o adyuvante fisiológicamente compatible, puede administrarse a un sujeto deseado, incluyendo un sujeto humano. Este método comprende administrar a un sujeto que lo necesite cualquiera de las secuencias de ácido nucleico, casetes de expresión, genomas de rAAV, plásmidos, vectores o vectores de rAAV o composiciones que los contengan. En una realización, la composición se suministra de forma subretiniana. En otra realización, la composición se suministra por vía intravítrea. En todavía otra realización, la composición se suministra usando una combinación de vías administrativas adecuadas para el tratamiento de enfermedades oculares, y también puede implicar la administración a través de la vena palpebral u otras vías de administración intravenosa o convencional.

Aún otro aspecto descrito aquí es un método para tratar, retardar o detener la progresión de la ceguera en un sujeto mamífero que tiene, o está en riesgo de desarrollar, acromatopsia. En una realización, un rAAV que porta la secuencia nativa, modificada o de codones optimizados de CNGA3 o CNGB3, preferiblemente suspendido en un portador, diluyente, excipiente y/o adyuvante fisiológicamente compatible, puede administrarse a un sujeto deseado, incluyendo un sujeto humano. Este método comprende suministrar a un sujeto que lo necesite cualquiera de las secuencias de ácido nucleico, casetes de expresión, genomas de rAAV, plásmidos, vectores o vectores de rAAV o composiciones que los contengan. En una realización, la composición se suministra de forma subretiniana. En otra realización, la composición se suministra por vía intravítrea. En aún otra realización, la composición se suministra usando una combinación de vías administrativas adecuadas para el tratamiento de enfermedades oculares, y también puede implicar la administración a través de la vena palpebral u otras vías de administración intravenosa o convencional.

Para uso en estos métodos, el volumen y el título viral de cada dosis se determinan individualmente, como se describe adicionalmente aquí, y pueden ser iguales o diferentes de otros tratamientos realizados en el mismo ojo u ojo contralateral. Las dosis, administraciones y regímenes pueden ser determinadas por el médico tratante según las enseñanzas de esta memoria descriptiva. En una realización, la composición se administra en una única dosis seleccionada de las enumeradas anteriormente en un solo ojo afectado. En otra realización, la composición se administra como una dosis única seleccionada de las enumeradas anteriormente en ambos ojos afectados, de forma simultánea o secuencial. La administración secuencial puede implicar un intervalo de tiempo de administración de un ojo a otro, desde intervalos de minutos, horas, días, semanas o meses. En otra realización, el método implica administrar las composiciones a un ojo, dos o más dosis (por ejemplo, dosis divididas). En otra realización, se realizan múltiples inyecciones en diferentes partes del mismo ojo. En otra realización, se realiza en un momento posterior una segunda administración de un rAAV que incluye el casete de expresión seleccionado (por ejemplo, el casete que contiene CHM). Dicho punto de tiempo puede ser semanas, meses o años después de la primera administración. Tal segunda administración se realiza, en una realización, con un rAAV que tiene una cápside diferente del rAAV de la primera administración. En otra realización, el rAAV de la primera y segunda administración tiene la misma cápside.

En todavía otras realizaciones, las composiciones descritas aquí se pueden suministrar en una sola composición o en múltiples composiciones. Opcionalmente, se pueden suministrar dos o más AAV diferentes, o múltiples virus [véanse, por ejemplo, los documentos WO 2011/126808 y WO 2013/049493]. En otra realización, múltiples virus pueden contener diferentes virus de replicación defectuosa (por ejemplo, AAV y adenovirus).

En ciertas realizaciones de la invención, es deseable realizar estudios funcionales y de formación de imágenes de la retina no invasivos para identificar áreas de los fotorreceptores de los bastones y de los conos que se van a seleccionar como dianas para la terapia. En estas realizaciones, se emplean ensayos clínicos de diagnóstico para determinar la ubicación o ubicaciones precisas para una o más inyecciones subretinianas. Estos ensayos pueden incluir electrorretinografía (ERG), perimetría, cartografiado topográfico de las capas de la retina y medida del grosor de sus capas mediante oftalmoscopia láser de barrido confocal (cSLO) y tomografía de coherencia óptica (OCT), cartografiado topográfico de densidad de los conos mediante óptica adaptativa (AO), examen ocular funcional, etc., dependiendo de la especie del sujeto que se esté tratando, su estado físico y salud, y la dosis. En vista de los estudios de formación de imágenes y funcionales, en algunas realizaciones de la invención se realizan una o más inyecciones en el mismo ojo para apuntar a diferentes áreas del ojo afectado. El volumen y el título viral de cada inyección se determinan individualmente, como se describe adicionalmente aquí, y pueden ser iguales o diferentes de otras inyecciones realizadas en el mismo ojo, u ojo contralateral. En otra realización, se realiza una única inyección de mayor volumen para tratar todo el ojo. En una realización, el volumen y la concentración de la composición de rAAV se seleccionan de modo que solo se vea afectada la región de las células oculares dañadas. En otra realización, el volumen y/o concentración de la composición de rAAV es una cantidad mayor, para llegar a porciones más grandes del ojo, incluyendo fotorreceptores no dañados.

En una realización de los métodos descritos aquí, un único suministro intraocular de una composición como se describe aquí, por ejemplo un suministro de AAV de un casete de REP-1 optimizado, es útil para prevenir la pérdida de visión y ceguera en un sujeto en riesgo de desarrollar coroideremia. En otra realización de los métodos descritos aquí, un único suministro intraocular de una composición como se describe aquí, por ejemplo un suministro de AAV de un casete CNGA3 o CNGB3 optimizado, es útil para prevenir la pérdida de visión y ceguera en un sujeto en riesgo de desarrollar acromatopsia.

De este modo, en una realización, la composición se administra antes del inicio de la enfermedad. En otra realización, la composición se administra antes del inicio del deterioro o pérdida de la visión. En otra realización, la composición se administra después del inicio del deterioro o pérdida de la visión. En aún otra realización, la composición se administra cuando funcionan o quedan menos del 90% de los bastones y/o conos o fotorreceptores, en comparación con un ojo no enfermo.

En otra realización, el método incluye realizar estudios adicionales, por ejemplo estudios funcionales y de formación de imágenes para determinar la eficacia del tratamiento. Para el examen en animales, estos ensayos incluyen la evaluación de la función visual y de la retina a través de electrorretinogramas (ERGs) que observan la función de los fotorreceptores de bastones y conos, nistagmo optocinético, pupilometría, prueba de laberinto de agua, preferencia de luz-oscuridad, tomografía de coherencia óptica (para medir el grosor de diversas capas de la retina), histología (grosor de la retina, filas de núcleos en la capa nuclear externa, inmunofluorescencia para documentar la expresión del transgén, recuento de fotorreceptores de los conos, tinción de secciones de retina con aglutinina de cacahuete -que identifica las vainas de fotorreceptores de conos).

Específicamente para sujetos humanos, después de la administración de una dosis de una composición descrita en esta memoria descriptiva, el sujeto se evalúa para determinar la eficacia del tratamiento usando electrorretinogramas (ERGs) para examinar la función de los fotorreceptores de bastones y conos, pupilometría, agudeza visual, sensibilidad al contraste, prueba de visión del color, prueba de campo visual (campos visuales de Humphrey/campos visuales de Goldmann), prueba de movilidad perimetral (carrera de obstáculos), y prueba de velocidad de lectura. Otra prueba útil de eficacia posterior al tratamiento a la que se expone el sujeto después del tratamiento con una composición farmacéutica descrita aquí son la formación de imágenes mediante resonancia magnética funcional (fMRI), las pruebas de sensibilidad a la luz de campo completo, los estudios de estructura de la retina que incluyen tomografía de coherencia óptica, fotografía de fondo de ojo, autofluorescencia de fondo de ojo, oftalmoscopía de barrido láser de óptica adaptativa, pruebas de movilidad, prueba de velocidad y precisión de lectura, microperimetría y/u oftalmoscopía. Estas y otras pruebas de eficacia se describen en la patente US n° 8.147.823; en la publicación de solicitud de patente internacional WO 2014/011210 o WO 2014/124282, en trámite junto con la presente.

En aún otra realización, cualquiera de los métodos descritos anteriormente se realiza en combinación con otra terapia, o terapia secundaria. En todavía otras realizaciones, los métodos de tratamiento de estas enfermedades oculares implican tratar al sujeto con la composición descrita en detalle aquí en combinación con otra terapia, tal como tratamiento con antibióticos, tratamiento paliativo para el dolor, y similares. La terapia adicional puede ser cualquier terapia conocida ahora, o aún desconocida, que ayude a prevenir, detener o mejorar estas mutaciones o defectos o cualquiera de los efectos asociados con ellos. La terapia secundaria puede administrarse antes, al mismo tiempo o después de la administración de las composiciones descritas anteriormente. En una realización, una terapia secundaria implica enfoques no específicos para mantener la salud de las células de la retina, tales como la administración de factores neurotróficos, antioxidantes, agentes antiapoptóticos. Los enfoques no específicos se logran mediante la inyección de proteínas, ADN recombinante, vectores virales recombinantes, células madre, tejido fetal, o células modificadas genéticamente. Estas últimas podrían incluir células modificadas genéticamente que están encapsuladas.

En una realización, un método para generar un rAAV recombinante comprende obtener un plásmido que contiene un casete de expresión de AAV como se describió anteriormente, y cultivar una célula de empaquetamiento que porta el plásmido en presencia de suficientes secuencias virales para permitir el empaquetamiento del genoma viral de AAV en una envoltura o cápside de AAV infeccioso. Los métodos específicos de generación del vector de rAAV se describen anteriormente, y pueden emplearse para generar un vector de rAAV que puede suministrar la REP-1 o CNGA3 o CNGB3 de codones optimizados en los casetes de expresión y genomas descritos anteriormente y en los ejemplos más abajo.

En aún otra realización, se proporciona un vector que comprende cualquiera de los casetes de expresión descritos aquí. Como se describió anteriormente, dichos vectores pueden ser plásmidos de una variedad de orígenes, y son útiles en ciertas realizaciones para la generación de virus de replicación defectuosa recombinantes como se describe más adelante aquí.

En otra realización, el vector es un plásmido que comprende un casete de expresión, en el que el casete de expresión comprende secuencias de repetición terminal invertida de AAV y una secuencia de ácido nucleico de codones optimizados que codifica REP-1, y secuencias de control de la expresión que dirigen la expresión de la proteína codificada en una célula hospedante.

En otra realización, el vector es un plásmido que comprende un casete de expresión, en el que el casete de expresión comprende secuencias de repetición terminal invertida de AAV y una secuencia de ácido nucleico de codones optimizados que codifica CNGA3, y secuencias de control de la expresión que dirigen la expresión de la proteína codificada en una célula hospedante.

En otra realización, el vector es un plásmido que comprende un casete de expresión de AAV, en el que el casete de expresión comprende secuencias de repetición terminal invertida de AAV y una secuencia de ácido nucleico de codones optimizados que codifica CNGB3, y secuencias de control de la expresión que dirigen la expresión de la proteína codificada en una célula hospedante.

Cabe señalar que el término “un” o “una” se refiere a uno o más. Como tal, los términos “un” (o “una”), “uno o más” y “al menos uno” se usan indistintamente aquí.

Las palabras “comprender”, “comprende” y “que comprende” deben interpretarse de manera inclusiva en lugar de exclusivamente. Las palabras “consistir”, “que consiste”, y sus variantes, deben interpretarse exclusivamente, en lugar de inclusivamente. Aunque se presentan diversas realizaciones en la memoria descriptiva usando lenguaje “que comprende”, en otras circunstancias, una realización relacionada también está destinada a ser interpretada y descrita usando el lenguaje “que consiste en” o “que consiste esencialmente en”.

Como se usa aquí, la expresión “alrededor de” significa una variabilidad del 10% de la referencia dada, a menos que se especifique lo contrario.

El término “regulación”, o variaciones del mismo, como se usa aquí se refiere a la capacidad de una composición para inhibir uno o más componentes de una ruta biológica.

A menos que se defina lo contrario en esta memoria descriptiva, los términos técnicos y científicos utilizados aquí tienen el mismo significado que el comúnmente entendido por un experto en la técnica y por referencia a los textos publicados, que proporcionan a un experto en la técnica una guía general para muchos de los términos utilizados en la presente solicitud.

Los siguientes ejemplos son solo ilustrativos y no pretenden limitar la presente invención.

Ejemplo 1 - Diferenciación de células madre pluripotentes en RPE

La coroideremia carece de un modelo de ratón relevante y no existe un modelo canino; por lo tanto, la transducción y expresión se evalúan en un modelo de células retinianas humanas de la enfermedad. Debido a que es imposible obtener células retinianas de un paciente vivo, los RPE se generan a partir de células madre pluripotentes inducidas. Las células madre pluripotentes se dirigen a RPE utilizando el protocolo descrito por Buchholz et al, Rapid and Efficient Directed Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells Into Retinal Pigmented Epithelium, Stem Cells Translational Medicine, 2013; 2:384-393. Véase también, Cereso et al, Proof of concept for AAV2/5-mediated gene therapy in iPSC-derived retinal pigment epithelium of a choroideremia patient, Molecular Therapy - Methods & Clinical Development (2014) 1, 14011. Se conocen en la técnica otros métodos para producir RPE.

Brevemente, la línea de células madre pluripotentes inducidas humanas se mantiene en medio de Eagle modificado de Dulbecco: Mezcla de Nutrientes F-12 (DMEM/F12) que contiene GlutaMAX-I 2 mM, reemplazo de suero inactivo al 20%, aminoácidos no esenciales del medio de Eagle modificado 0,1 mM (MEM NEAA), b-mercaptoetanol 0,1 mM y bFGF 4 ng/ml sobre una capa alimentadora de fibroblastos embrionarios de ratón irradiada o tratada con mitomicina C.

Las células madre pluripotentes se hacen pasar directamente sobre Matrigel (BD Biosciences) en DMEM/F12 con 1X B27, 1X N2 y 1X NEAA (Invitrogen). Desde los días 0 a 2, se añaden 50 ng/ml de Noggin, 10 ng/ml de Dkk1, 10 ng/ml de IGF1 y nicotinamida 10 mM al medio base. Desde los días 2 a 4, se añaden 10 ng/ml de Noggin, 10 ng/ml de Dkk1, 10 ng/ml de IGF1, 5 ng/ml de bFGF y nicotinamida 10 mM al medio base. Desde los días 4 a 6, se añaden 10 ng/ml de Dkk1, 10 ng/ml de IGF1 y 100 ng/ml de Activina A (R&D Systems) al medio base. Desde los días 6 a 14, se añaden 100 ng/ml de Activina A, SU5402 10 pM (EMD Millipore, Darmstadt, Alemania) y VIP 1 mM al medio base. Los experimentos de control se realizan en medio base solo (DMEM/F12, B27, N2, y NEAA).

Las células se enriquecen mecánicamente raspando las células con morfología no RPE. Posteriormente, los RPE restantes se digieren usando TrypLE Express (Invitrogen) durante 5 minutos a 37°C. Las células se hacen pasar a través de un clasificador unicelular de 30 pm y se siembran sobre plástico de cultivo de tejidos revestido con Matrigel, membranas Transwell o portaobjetos con cámara tratados con CC2. Las células enriquecidas se cultivan en DMEM con alto contenido de glucosa con suero bovino fetal (FBS) al 1%, GlutaMAX y piruvato de sodio durante 30 días.

Ejemplo 2 - Células transducidas con AAV-REP-1

Brevemente, el vector viral AAV2/8CMV.CBA-REP-1 que incorpora secuencias de codones optimizados de REP-1 se produce mediante transfección transitoria de células HEK293, y las partículas virales se precipitan del sobrenadante usando polietilenglicol. Véase, por ejemplo, Guo et al, Rapid and simplified purification of recombinant adenoassociated virus, J Virol Methods. Agosto 2012; 183(2): 139-146. Los vectores se purifican mediante centrifugación doble con CsCl, se dializan, y se titulan mediante un ensayo de transferencia de punto.

Para los experimentos de prenilación, los RPE se siembran en placas de 24 pocillos, y se estiman 1,2 x 106 células en confluencia. Las células se transducen con 100.000 vg por célula, y los ensayos de prenilación se realizan 4 semanas después de la transducción. Los experimentos se realizan por triplicado.

Ejemplo 3 - Prenilación

Se realiza un ensayo de prenilación in vitro como se describe en Vasireddy et al, PloS One. 7 de mayo de 2013; 8(5):e61396, citado anteriormente, usando [3H]-geranilgeranil pirofosfato (GGPP) (Perkin Elmer, Boston, MA, USA) como donante de grupo prenilo, en presencia de Rab geranilgeraniltransferasa recombinante y RAB27. La incorporación de grupos prenilo radiomarcados en la proteína RAB27 se mide mediante recuento por centelleo. Para mantener la coherencia, los valores de control se normalizan a 100 y se utilizan como valor base. Todos los experimentos se realizan por triplicado, y la comparación estadística de prenilación entre los grupos experimental y de control se evalúa utilizando la prueba de la t de Student no pareada de dos colas.

Brevemente, 48 h después de la transducción, las células REP transducidas se lavan con PBS fría. Los sedimentos celulares se recogen y se lavan a fondo con PBS fría. Las células se lisan en hielo durante 30 min usando RIPA inhibidores de proteasas. En un protocolo alternativo, las células se someten a ultrasonidos. Las fracciones citosólicas se recogen centrifugando el lisado a 75.000-100.000 g durante 1-2 h a 4°C.

Los lotes se preparan para la reacción de prenilación como sigue.

El volumen de reacción final utilizado para la prenilación es de 25 pl.

La mezcla de reacción se incuba a 37°C durante 30 min. La reacción se detiene añadiendo etanol/HCl 9:1, y se incuba durante 30 minutos. Las proteínas se recogen en papeles de filtro de fibra de vidrio (papeles Whatman) mediante filtración a vacío (0,1 ml). Los filtros se lavan cuidadosamente con amortiguador de fosfato frío - 3 veces para eliminar el material no unido. Las membranas se secan con cuidado. Los filtros se colocan en 5 ml de cóctel de centelleo, y se realiza el recuento por centelleo. Véase también, Tolmachova et al, CHM/REP1 cDNA delivery by lentiviral vectors provides functional expression of the transgene in the retinal pigment epithelium of choroideremia mice, The Journal of Gene Medicine, 2012; 14-158-68.

Los ensayos para la prueba de concepto de CNGA3 o CNGB3 pueden incluir el uso de un modelo animal mutante espontáneo (por ejemplo, el ratón Cnga3-/- o la oveja Awassi). El modelo de ratón podría cruzarse con un ratón fotorreceptor de “todo conos”, el ratón Nrl-/-, para obtener genosupresiones dobles. Este último ratón (Cnga3-/-Nrl-/-) puede acelerar la identificación de la eficacia. La eficacia podría medirse mediante pupilometría, medidas de agudeza visual y contraste (por ejemplo, usando optocinética), electrorretinogramas, y comportamiento visual. En última instancia, la histología documentará la expresión del transgén con mejores resultados en las otras medidas. También se utilizarán enfoques histológicos para documentar cualquier efecto de la intervención en los fotorreceptores de los conos (número total de fotorreceptores de los conos, densidad, ubicación, etc.).

De manera similar a la coroideremia, como se discutió anteriormente, los ensayos de prueba de concepto para la terapia de aumento génico para la acromatopsia asociada a CNGA3 o CNGB3 pueden incluir el uso de modelos de células madre pluripotentes inducidas (iPSC). Los modelos de iPSC, generados a partir de pacientes con acromatopsia debido a mutaciones de CNGA3 o CNGB3, se diferenciarán en precursores retinianos y/o células fotorreceptoras in vitro. El ADNc de CNGA3 (o CNGB3) de tipo salvaje se suministrará a estas células usando AAV recombinante, y las células se analizarán para determinar la biogénesis y la preservación de la función del canal relevante (regulado por nucleótidos cíclicos, CNG) comprendido por estas subunidades. La función del canal se evaluará mediante electrofisiología en parches de membrana. La restauración del canal debería rescatar las corrientes activadas por cGMP. Estudios adicionales pueden estudiar la sensibilidad de la función del canal antes y después del suministro del ADNc de CNG de tipo salvaje a ligandos fisiológicos.

Ejemplo 4: Expresión in vitro de CHM humano de codones optim izados mediada por AAV

El objetivo de este estudio fue evaluar la capacidad de expresión de CHM mediada por AAV después del suministro génico utilizando una serie de vectores de AAV 2 y AAV8 de siguiente generación que codifican el gen CHM de codones optimizados (SEQ ID NO: 1) en líneas celulares 84-31 y COS-7.

Para maximizar la expresión de CHM, se produjo una secuencia de CHM de codones optimizados (SEQ ID NO: 1). El plásmido de codones optimizados se sintetizó y se utilizó en la creación de todos los casetes de expresión del transgén de CHM de siguiente generación. Para superar el problema potencial de contaminación de genomas de AAV no funcionales, se incluyó una región de relleno lambda no codificante en el esqueleto del vector. La incorporación de relleno no solo aumenta la longitud del plásmido, sino que también disminuye la posibilidad de contaminación del esqueleto del ADN plasmídico mientras se empaqueta el AAV. El impacto de incorporar una región de relleno en el esqueleto del vector para eliminar las impurezas del ADN plasmídico se llevó a cabo como un estudio independiente. Se utilizaron dos esqueletos de plásmidos provirales de AAV recombinantes (copia alta y baja) para generar los diferentes constructos. El plásmido de alto número de copias se diseñó basándose en el origen del vector pUC. El plásmido de bajo número de copias se diseñó basándose en el origen de p15A. Para mejorar aún más la traducción del codón de inicio correcto, se incorporó una secuencia de Kozak en dirección 5’ del codón de inicio.

Se han diseñado un total de cuatro plásmidos para el estudio actual y los descritos en los siguientes ejemplos (Tabla 1). Además, también se generó un plásmido que porta la secuencia nativa de CHM, que actualmente se está utilizando en un ensayo clínico (versión 1). Los mapas de plásmidos para cada una de las Versiones 2a, 2b, 3a y 3b y la Version 1 se muestran en las FIGs. 6-10, respectivamente.

Tabla 1: Características de los plásmidos

La expresión in vitro de estos constructos se evaluó en líneas celulares COS-7 y 84-31. Las características de ingeniería de los constructos de CHM de siguiente generación se muestran en la Tabla. 1.

Se generaron plásmidos de alto número de copias alta y bajo número de copias provirales de AAV recombinantes clonando el ADNc de CHM humano de codones optimizados (hCHM) (SEQ ID NO: 1) en el casete del transgén. El transgén se colocó bajo el control de un promotor híbrido de b actina de pollo (CBA). Este promotor consiste en el potenciador temprano inmediato de citomegalovirus (CMV), el promotor de actina b de pollo proximal, y el exón 1 de CBA flanqueado por secuencias del intrón 1. Los plásmidos provirales de alto y bajo número de copias también contienen repeticiones terminales invertidas de AAV y una secuencia de PoliA. Los esqueletos plasmídicos de siguiente generación utilizados en el estudio actual contienen un relleno de fragmento de fago lambda seguido del gen de selección bacteriana de kanamicina. Los plásmidos adicionales carecen de relleno pero contienen el gen de selección de kanamicina. El vector de alto número de copias es similar al de los plásmidos pUC (~300 copias/célula bacteriana). El plásmido de bajo número de copias (~10 copias/célula bacteriana) tiene un origen de p15A. Para mejorar la traducción del codón de iniciación correcto, todos los constructos de siguiente generación contienen una secuencia de consenso de KOZAK en dirección 5’ del codón de inicio, ATG. La secuencia de los plásmidos generados se verifica usando cebadores que pueden dirigirse específicamente a la secuencia de extensión del promotor potenciador o la secuencia de CHM de codones optimizados. Los mapas de plásmidos y las secuencias de los cinco constructos se muestran en las FIGs 6-10. Se usó la transfección triple estándar con fosfato de calcio para generar los vectores de AAV enumerados a continuación (véase la Tabla 2 para la calificación del vector). Se generaron los serotipos AAV2 y AAV8 de los vectores para garantizar que los resultados sean independientes del serotipo.

Tabla 2: Sumario de vectores AAV2 y AAV8 generados, y concentración de lotes virales

La línea celular 84-31 es un subclón de la línea celular 293 HEK (células renales embrionarias humanas) y expresa constitutivamente proteínas E4 de adenovirus para mejorar la transducción del virus AAV. Las células COS-7 son líneas celulares similares a fibroblastos que derivan de tejidos de riñón de mono. Tanto las células 84-31 como las células COS-7 se sembraron, por separado, en placas de cultivo celular de 6 pocillos y se transdujeron con uno de los diez artículos de ensayo (AAV2 o AAV8) en cinco multiplicidades diferentes de infección (MOIs). Después de 36-48 horas, se recolectaron las células, se lisaron, y las muestras proteicas se prepararon para SDS-PAGE seguido de análisis de transferencia Western para detectar la expresión de CHM exógeno.

Tanto las células 84-31 como las COS-7 se cultivaron en medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) con alto contenido de glucosa con suero bovino fetal al 10% y penicilina/estreptomicina al 1% a 37°C en un entorno provisto de CO2 al 5%. El día antes de la transducción (18-24 h antes), se sembraron células a una densidad de 3E5 en 2 ml de medio de cultivo celular en cada pocillo de una placa de cultivo celular de 6 pocillos. Las células sembradas se incubaron a 37°C en un entorno provisto de CO2 al 5%. Los pocillos de las células COS-7 y 84-31 se infectaron con los vectores de AAV enumerados a continuación en diversas multiplicidades de infección (MOI) (Tabla 3 y Tabla 4). No se añadió virus a las células de control negativo (células no transducidas). Brevemente, se eliminó el medio de cultivo de tejidos, y se añadió una alícuota nueva de 2 ml de medio a cada pocillo de la placa de cultivo de 6 pocillos. Después, se midió la cantidad predeterminada de vector de AAV (directamente del lote) y se añadió a cada pocillo (Tabla 3 y Tabla 4). Para una MOI de 1E4, se diluyó 1 pl del lote de virus respectivo hasta 10 pl con medio de cultivo celular. A partir de esta disolución, se añadió el volumen predeterminado del virus al pocillo respectivo (Tabla 3 y 4). Las células se incubaron con el virus AAV durante 36-48 horas a 37°C con CO2 al 5% hasta la recolección. Las células se observaron al microscopio antes de recolectarlas para comprobar si presentaban anomalías.

Tabla 3: Dosis de infección de vectores de hCHM AAV2 y AAV8 de siguiente generación en células COS-7.

Tabla 4: Tasas de infección de cuatro vectores de hCHM AAV2 y AAV8 de siguiente generación en células 84-31

En primer lugar, se usaron las líneas celulares COS7 y 84-31 para evaluar si la expresión in vitro de CHM es independiente de la línea celular. Una vez que se estableció la independencia, todos los experimentos posteriores se llevaron a cabo solo en células 84-31, que han mostrado una eficiencia de transducción superior con AAV. Los pocillos de células 84-31 se infectaron con los vectores de AAV enumerados a continuación a diversas MOI (véanse las tablas 3 y 4).

Análisis de transferencia Western: 1. Se prepararon lisados celulares. Las células transducidas con AAV, junto con las células de control no tratadas, se recolectaron 36-48 h después de la infección después de un lavado a conciencia con PBS. A continuación, las células se lisaron en hielo usando amortiguador RIPA con inhibidores de proteasas. Los lisados celulares se aclararon centrifugando a 13.000 rpm durante 10 min. 2. Cuantificación y preparación de proteínas. La cuantificación de proteínas de los lisados celulares se llevó a cabo usando el kit de ensayo de proteínas ThermoFisher Micro BCATM siguiendo las instrucciones del fabricante. La concentración proteica se determinó tomando una lectura de OD a 562 nm. Para evaluar la expresión in vitro de CHM, se cargaron entre 40-60 ug de proteína medida, en geles Bis-Tris al 4-12%. 3. Se llevaron a cabo SDS-PAGE y SDS-PAGE de transferencia y análisis de transferencia Western según protocolos conocidos. Brevemente, los geles de proteínas se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa, se bloquearon en leche y se incubaron con los anticuerpos primarios. Para cada transferencia, como anticuerpos primarios se usaron anticuerpo 2F1 anti-REP-1 humana (2F1, dilución 1:1000) y uno de los siguientes: anticuerpo anti-GAPDH (dilución 1:1000), anticuerpo anti-actina (dilución 1:1000) o anticuerpo antitubulina (dilución 1:5000). Después de lavar la transferencia, como anticuerpos secundarios, se usaron anticuerpo anti-IgG de ratón y/o anticuerpo anti-IgG de conejo conjugados con HRP a una concentración de 1:5000. Las transferencias se desarrollaron por quimioluminiscencia usando reactivos de ECL según las instrucciones del fabricante. Controles: 1. Controles de carga: Se utilizó uno de los siguientes: anticuerpo anti-actina, anticuerpo antitubulina o anticuerpo anti-GAPDH como control de carga para demostrar una carga igual de proteína en cada pocillo de los geles. El anticuerpo anti-tubulina detecta una proteína de ~51 kDa. El anticuerpo anti-actina detecta una proteína de ~42 kDa, y el anticuerpo anti-GAPDH detecta una proteína de ~39 kDa. Las transferencias iniciales se sondaron con anticuerpo anti-tubulina o anticuerpo anti-actina o anticuerpo anti-GAPDH, dependiendo de su disponibilidad. Después de los experimentos iniciales, para ser coherentes, se usó el anticuerpo anti-GAPDH como control de carga.

2. Control positivo: Después de que se estableció la producción de proteína hREP-1 en células COS-7 transducidas con AAV2.V2a, los lisados de células AAV2.V2a-Cos-7 se usaron como control positivo en experimentos de transferencia Western posteriores. 3. Control negativo: Se utilizaron células no tratadas como control negativo. Los análisis de los resultados de la transferencia Western de la producción de proteína REP-1 en diversas líneas celulares se resumen en la Tabla. 5.

Tabla 5

El anticuerpo monoclonal específico de REP-1 humana detectó una única proteína hREP-1 de ~75-80 kDa en células transducidas con AAV2.copt.CHM/AAV8.copt.CHM de siguiente generación. No se observó una banda de 75-80 kDa en los lisados celulares de las células de control no tratadas. El sondaje de las transferencias con anticuerpo antiactina/antitubulina/anti-GAPDH mostró una banda de igual densidad en todas las líneas de la transferencia Western, incluyendo los controles no tratados. El anticuerpo anti-actina detectó una banda de peso molecular de proteína a ~42 kDa, el anticuerpo anti-tubulina detectó una proteína a ~51 kDa, y el anticuerpo anti-GAPDH detectó una proteína a ~39 kDa. Todos los anticuerpos detectaron solo bandas específicas de peso molecular de tamaño esperado. No se observaron bandas inespecíficas en ninguna de las transferencias. Se utilizó un marcador de peso molecular previamente teñido para comparar los pesos moleculares de la proteína de interés.

Brevemente, se observó proteína REP-1 con el tamaño esperado en células COS-7 y 84-31 transducidas con AAV2.V2a, AAV2.V2b, AAV2.hCHM.V3a y AAV2.hCHM.V3b. Los controles no tratados no revelaron la presencia de proteína REP-1 humana de tamaño esperado. El marcaje de la transferencia con anticuerpo anti-actina detectó una banda de proteína de igual intensidad en todas las líneas del gel a ~42 kDa. Se utilizó una escalera de proteínas previamente teñida para comparar los pesos moleculares de REP-1 y actina. Datos no mostrados.

Los resultados indican que los vectores de serotipos AAV2 y AAV8 que contienen plásmidos de siguiente generación son capaces de transducir células 84-31 y COS-7 de forma eficaz. La expresión de CHM en los plásmidos de siguiente generación estaba en el intervalo detectable, y demostró una tendencia dependiente de la dosis. La transducción de células con virus hCHM de siguiente generación dio como resultado la producción de proteína REP-1 del tamaño predicho.

Ejemplo 5: Comparación de la expresión proteica in vitro de CHM humano de codones optim izados mediado por AAV con CHM humano nativo mediado por AAV

El objetivo de este estudio fue delinear la eficiencia de transducción de los vectores de AAV (serotipos 2 y 8) que contienen diversas versiones de los casetes transgénicos que contienen CHM midiendo los niveles de proteína REP-1 en un modelo de estudio basado en una línea celular 84-31.

Plásmidos y vectores: Se compararon un total de 5 plásmidos transgénicos en AAV2 o AAV8: Version 1 (que se utilizaba anteriormente en un ensayo clínico en curso) y cuatro versiones de siguiente generación (V2a, V2b, V3a y V3b). Los plásmidos se modificaron por ingeniería genética como se describe en el Ejemplo 4, y las características de los mismos se muestran en la Tabla 1. La Tabla 2 anterior muestra un resumen de los vectores AAV2 y AAV8 generados, y la concentración de los lotes virales.

Diseño del estudio (por ejemplo, grupos de tratamiento)

1. En un experimento piloto, se transdujeron células COS-7 y 84-31 con AAV2.hCHM.Version1, Version2a y Version 2b. Se realizó una transferencia Western para comparar los niveles de eficiencia de la transducción en las dos líneas celulares.

2. Células 84-31, sembradas en placas de 6 pocillos, se transdujeron con uno de los 10 artículos de ensayo (Version 1 ,2a, 2b, 3a y 3b en el fondo AAV2 o AAV8) a una MOI de 3E5. Después de 36-48 horas, las células se recolectaron y lisaron. El lisado se cargó en SDS-PAGE, y se sometió a análisis de transferencia Western adicionales. Los niveles de proteína REP-1 se comparan entre todas las versiones de constructos. Se prepararon dos placas distintas para cada uno de los experimentos AAV2.CHM o AAV8.CHM, y se analizaron, por separado. Administración de material de ensayo

3.4.1 Cultivo celular

Células 83-41 y COS-7 se cultivaron ambas en medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) con alto contenido de glucosa con suero fetal bovino al 10% y 1 % de penicilina/estreptomicina a 37°C en un entorno provisto de CO2 al 5%.

3.4.2 Preparación de células para transducción:

El día antes de la transducción (18-24 h antes), células 83-41 y COS-7 se sembraron a una densidad de 3E5 en 2 ml de medio de cultivo celular por pocillo en una placa de cultivo celular de 6 pocillos. Las células sembradas se incubaron a 37°C en un entorno provisto de CO2 al 5%.

3.4.3 Transducción:

Los pocillos de células 84-31 y Cos-7 se infectaron con vectores de AAV como se describe a continuación a una MOI de 3E5 (véase la Tabla 6 para el experimento piloto y la Tabla 7 para el segundo conjunto de experimentos). No se añadió virus al control negativo (no transducido). Brevemente, en primer lugar, se extrajo el medio de cultivo de tejidos y se reemplazó con 2 ml de medio reciente/pocillo en cada uno de los pocillos de la placa de cultivo celular de 6 pocillos. Después se midió (del lote) la cantidad predeterminada de vector de AAV (véase la tabla 2 para los volúmenes de vector usados para la transducción), y se añadió directamente a cada pocillo. Las células se incubaron con el virus AAV durante 36-48 horas a 37°C con CO2 al 5% hasta la recolección. Las células se observaron al microscopio antes de recolectarlas para comprobar cualquier anomalía. El análisis de transferencia Western se realizó como se describe en el Ejemplo 4.

Tabla 6: Experimento piloto: Dosis de infección de AAV2.Hchm.v1,2a, 2b en células 84-31 y COS-7.

Tabla 7: Dosis de infección de vectores de siguiente generación de AAV.hCHM y V1 (AAV2 y AAV8) en células 84-31

Resultados: Comparación de la expresión de hCHM nativo (AAV2.hCHM.V1) frente CHM de codones optimizados en vectores AAV2a y 2b en células 84-31 y COS-7

En este experimento, las células 84-31 y COS-7 se transdujeron con ningún vector (control sin tratar), AAV2.hCHM.Version1, AAV2.hCHM.Version2a o Aav2.hCHM.Version2b. El análisis de transferencia Western con un anticuerpo anti-REP-1 humana mostró que los niveles de proteína REP-1 eran detectables a ~75-80 kDa en todas las muestras transducidas de AAV2 (VI, V2a, V2b) y en ambas líneas celulares (datos no mostrados). Se observó una expresión proteica ligeramente mejor en la línea celular 84-31 (Tabla 8). El anticuerpo anti-REP1 detectó una cantidad insignificante de proteína REP-1 en las células no tratadas. El marcaje de la transferencia con anticuerpo anti-GAPDH detectó una banda a ~39 kDa en todos los lisados celulares, incluyendo las células no tratadas.

La evaluación densitométrica (cuantificación del nivel de proteína) de las transferencias usando el software ImageJ demostró que después de normalizar los valores a la expresión de la proteína GAPDH endógena, la eficiencia de transducción fue similar en las células 84-31 y COS-7. (Véanse los resultados en la Tabla 8). En base a esto, la línea celular 84-31, que es de origen humano, se usó para experimentos adicionales.

En conclusión, AAV2.V1, AAV2.V2a y Aav2.V2b indujeron la producción de la proteína REP-1 en las células 84-31 y COS-7 con una eficiencia de transducción similar.

Tabla 8: Evaluación densitométrica de transferencias Western

Comparación de la expresión de CHM nativo frente a CHM de codones optimizados en vectores AAV2 en células 84 31: Utilizando un anticuerpo anti-REP-1 humana, el análisis de transferencia Western de las células 84-31 transducidas con AAV2.hCHM.V2a, V3a, V2b, V3b y VI detectó una banda a ~75-80 kDa en todas las condiciones (datos no mostrados). El anticuerpo anti-REP1 detectó una cantidad insignificante de proteína REP-1 en las células no tratadas. El marcaje de la transferencia con anticuerpo anti-GAPDH detectó una banda a ~39 kDa en todos los lisados celulares, incluyendo las células no tratadas. La evaluación densitométrica (cuantificación del nivel de expresión) de las transferencias utilizando el software ImageJ demostró un aumento en la expresión de AAV2.hCHM.V2a, 3a, 2b, y 3b en comparación con AAV2.hCHM.V1 después de normalizar los valores a la producción de proteína GAPDH endógena. Véase la Tabla 9 y 10 para resultados.

Tabla 9: Valores de proteína REP-1 en células 84-31 tras la transducción con AAV2.hCHM. V1, Va, V2b, V3a o V3b para la PLACA 1 (transferencia Western no mostrada)

Tabla 10: Valores de proteína REP-1 en células 84-31 tras la transducción con AAV2.hCHM. V1, V2a, V2b, V3a o V3b para la PLACA 2 (transferencia Western no mostrada)

Comparación de la expresión de CHM nativo frente a CHM de codones optimizados en vectores AAV8.V1, V2a, V3a, V2b, V3b en células 84-31: El análisis de la transferencia Western de células transducidas con AAV8.V1, AAV8.V2a, AAV8.V3a, AAV8.2b, AAV8.3b, con anticuerpo anti-REP-1 humana detectó una banda a ~75-80 kDa en todas las células transducidas (datos no mostrados). El anticuerpo anti-REP1 detectó una cantidad insignificante de proteína REP-1 en las células no tratadas. El marcaje de la transferencia con anticuerpo anti-GAPDH detectó una banda a ~39 kDa en todos los lisados celulares, incluyendo las células no tratadas. La evaluación densitométrica de las transferencias utilizando el software ImageJ demostró una mayor expresión de AAV8.hCHM.V2a; 3a; 2b; 3b en comparación con AAV8.V1. Los valores se obtienen después de normalizar los valores de CHM, en primer lugar, a la expresión de la proteína GAPDH endógena respectiva, y después se normalizan al nivel de expresión del promedio de la Version 1. Véanse la Tabla 11 y la Tabla 12 para resultados.

Tabla 11: Valores de la expresión de la proteína REP-1 en células 84-31 tras la transducción con AAV8 hCHM Version 1 ,2a, 2b, 3a y 3b - PLACA 1 (transferencia Western no mostrada)

Tabla 12: Valores de la expresión de la proteína REP-1 en células 84-31 tras la transducción con AAV8 hCHM Versión 1 ,2a, 2b, 3a y 3b - PLACA 2 (transferencia Western no mostrada)

Conclusión: Los estudios de expresión comparativos demostraron que la aplicación de vectores de AAV que portan AAV. hCHM. Version 2a, 2b, 3a y 3b de siguiente generación indujeron un aumento de la producción de proteína REP-1 en comparación con la Version 1 (actualmente utilizada en ensayos clínicos) en los vectores de serotipo tanto AAV2 como AAV8 en células 84-31.

Ejemplo 6: Evaluación del efecto del relleno lambda sobre la producción de vectores de AAV mediante análisis de títu los por qPCR

Se realizó un único experimento de qPCR (reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa) en los 8 vectores de AAV mostrados en la Tabla 2 anterior, para evaluar el efecto de las secuencias del relleno lambda sobre la cantidad de impurezas de ADN. Se usó un patrón de plásmido AAV linealizado para generar el patrón del ensayo. Los conjuntos de cebadores y sondas se diseñaron en la región promotora de CMV/CBA para la cuantificación del genoma de AAV correctamente empaquetado o en la región que codifica la resistencia a la kanamicina (KanR) para el empaquetamiento inverso. Los patrones y las muestras de vectores se procesaron en dos conjuntos, uno con el conjunto de sonda-cebador CMV/CBA y el otro con el conjunto de KanR. Los valores de las muestras de vector (copia del genoma viral por ml) se determinaron a partir de cada curva patrón respectiva. El efecto de la secuencia de relleno se evaluó comparando la cantidad relativa de impurezas que contienen KanR en cada lote de vector frente a las secuencias que contienen CMV/CBA.

Reactivos:

Título de vector viral que contiene transgén:

Referencia: Promotor de CMV-CBA

Cebadores: CMV-F: CCC ACT TGG CAG TAC ATC AA

CMV-R: GCC AAG TAG GAA AGT CCC ATA A

Sonda de FAM: /56-FAM/CA TAA TGC C/ZEN/A GGC GGG CCA TTT AC/3IABkFQ/

Título de vector viral que contiene impurezas:

Referencia: Gen de resistencia a la kanamicina

Cebadores:

KAN-F: GAT GGT CGG AAG TGG CAT AA

KAN-R: TGC GCC AGA GTT GTT TCT

Sonda de FAM: /56-FAM/CC GTC AGC C/ZEN/A GTT TAG TCT GAC CA/3IABkFQ/

Reactivo de dilución: Diluyente Q (0,001% de PF-68 en agua libre de nucleasas): Disolución diluida de PF-68 al 1% 1000 veces con agua estéril. Diluyente S: Diluyente Q 2 ng/pl de ADN de esperma de salmón (Agilent Technologies n2 de Cat 201190)

ABI TaqManTM Universal Master Mix (Applied Biosystems 4304437/4326708)

Qiagen PCR Product Purification Kit (Qiagen 28104)

• ABI QuantStudio 6 Flex System

PREPARACIÓN DE MUESTRAS

La disolución de digestión de ADNasa se preparó combinando lo siguiente: Amortiguador de ADNasa (10X) 5 pl, H2O sin nucleasas 30 pl, ADNasa I (Invitrogen, 18068-015) 5 pl

Se mezclaron diez pl de cada muestra de vector de AAV y se incubaron a temperatura ambiente durante 10 minutos. La mezcla de digestión se inactivó añadiendo 50 pl de disolución de SDS/EDTA/NaCl (SDS al 0,2%/EDTA 5 mM/NaCl 0,2 M) e incubando a 95°C durante 10 minutos. Cada muestra de vector de AAV se diluyó 10-100.000 veces en Diluyente S para el análisis de qPCR.

PREPARACIÓN DE PATRÓN DE qPCR

Se preparó ADN patrón de referencia (linealizado) digiriendo el plásmido p1008 (plásmido transgénico de bajo número de copias sin relleno) con XhoI y purificando con el kit de purificación de PCR de Qiagen. El material purificado se analizó en gel de agarosa para confirmar la identidad, y se cuantificó mediante Nanodrop. El número de copias de ADN se determinó a partir de la concentración del lote usando la siguiente equivalencia: 1 pb = 1,096E-21 g. Los patrones de qPCR se prepararon según la siguiente tabla:

Tabla 13

Montaje de la reacción de PCR

Las muestras de ADN extraídas se analizaron por triplicado (3 pocillos) en una única serie de qPCR. La serie incluyó patrones de ADN de referencia por triplicado, con un intervalo que oscila de 103 a 108 copias por pocillo. El control sin molde (NTC) se incluyó como control negativo. Cada preparación de vector de AAV se analizó con conjuntos de cebador/sonda tanto de CMV/CBA como de KanR. De manera similar, para la cuantificación de cada conjunto, los patrones también se analizaron con conjuntos de cebador/sonda de CMV/CBA y KanR.

Tabla 14: Montaje de reacción de PCR

La secuencia de la reacción de PCR se estableció como sigue: 50°C 2 minutos 1 ciclo; 95°C 10 minutos 1 ciclo; 95°C 15 segundos 40 ciclos; 60°C 1 minuto 40 ciclos.

Rendimiento del experimento. Los patrones se prepararon y se procesaron a 103 a 108 copias de ADN por pocillo. El límite inferior del ensayo se estableció en 1000 copias ya que la sensibilidad del ensayo no fue un factor importante para este experimento. Se generó una curva patrón para el experimento utilizando los números de copia de los patrones y valores de CT (ciclo umbral) de los patrones. La regresión lineal de los patrones se realizó utilizando el software ABI (datos no mostrados). El ajuste de la curva patrón tuvo un coeficiente de correlación (valor R2) de 0,998 o mayor, lo que indica un modelo de ajuste confiable. La pendiente de las curvas patrón fue -3,5. La pendiente se utilizó para calcular la eficiencia de la reacción de amplificación, y los valores entre -3,2 y -3,6 representaron la eficiencia de amplificación entre 90% y 110%. Ambas reacciones patrón se llevaron a cabo con una eficiencia del 92,6~93,8%. La precisión de los pocillos por triplicado osciló de 2~10%, lo que indica una buena concordancia entre las réplicas. El control sin molde (NTC) dio como resultado una amplificación no cuantificable por debajo del límite inferior del ensayo.

Tabla 15: Sumario del ajuste de la curva patrón

RESULTADOS:

Determinación del valor de la muestra: Los valores de la muestra (genoma de AAV y número de copias de empaquetamiento inverso) se interpolaron a partir de cada curva patrón coincidente (CMV/CBA o KanR), utilizando valores de CT. El número de copias de ADN interpolado se corrigió para la dilución inicial y/o la dilución de la digestión. Se aplicó un factor de corrección adicional de 2 para tener en cuenta la diferencia entre los patrones de ADN bicatenario y ADN monocatenario en las muestras.

Los resultados del análisis para 8 vectores de AAV se resumen en la tabla siguiente, con una comparación cuantitativa entre la concentración de AAV que contiene transgén (CMV/CBA) y la concentración de impureza que contiene KanR. El análisis de los resultados demuestra que la inserción del relleno lambda en el plásmido transgénico redujo eficazmente la aparición de empaquetamiento del ADN del esqueleto plasmídico (es decir, KanR) durante la producción de AAV de ~7-20 veces (FIG. 11).

Tabla 16: Amplificación mediante qPCR de kanamicina frente a CMV/CBA, expresada como porcentaje

Ejemplo 6: Expresión in vitro de vectores AAV8 de siguiente generación en células iPS mediante transferencia Western.

El objetivo de este estudio fue evaluar la capacidad de la expresión de CHM mediada por AAV después del suministro génico utilizando una serie de vectores AAV2 y AAV8 de siguiente generación que portan el gen que codifica REP-1 de codones optimizados en líneas celulares pluripotentes inducidas (iPSC).

La tecnología de células madre pluripotentes inducidas (iPS) se ha utilizado con éxito como plataforma para evaluar vectores de terapia génica en varios estudios de prueba de concepto y terapia génica, incluyendo las enfermedades oculares. Estas células iPS específicas del paciente proporcionan un valioso sistema de modelo in vitro para estudiar la patogénesis de la enfermedad y establecer un modelo para evaluar la prueba de concepto de la terapia génica cuando los modelos animales relevantes no están disponibles. Como etapa preliminar para evaluar nuestra terapia de aumento génico mediada por AAV para la coroideremia (CHM), hemos generado células iPS de pacientes humanos que albergan mutaciones en el gen causante, CHM, que codifica la Proteína 1 de Acompañamiento de Rab (REP-1) (Véase el ejemplo 1) (El método se describe en NCP.003). Las células iPS generadas se utilizaron para evaluar la expresión in vitro de nuestros constructos CHM de codones optimizados en AAV de siguiente generación.

Los plásmidos y vectores fueron como se describe en el Ejemplo 4. Las células madre pluripotentes inducidas (iPS) son células madre generadas en el laboratorio a partir de células somáticas, células mononucleares de sangre periférica, que se reprogramaron de nuevo a un estado pluripotente. La reprogramación de las células sanguíneas permite el desarrollo de modelos celulares in vitro personalizados para aplicaciones terapéuticas. En este informe, se utilizaron células iPS de individuos afectados por CHM para evaluar la producción in vitro de la proteína REP-1 mediante análisis de transferencia Western. La siguiente tabla (Tabla 17) describe los detalles de las células iPS estudiadas y sus respectivas mutaciones causantes de la enfermedad de CHM.

Tabla 17: Resumen de las células iPS generadas a partir de pacientes con mutaciones de CHM

* Los ensayos de cualificación de las líneas celulares de iPS están en curso.

Diseño del estudio (por ejemplo, grupos de tratamiento)

1. Las células iPS sembradas en una placa de cultivo celular de 12 pocillos se infectan con AAV2. hCHM Version 1, Version 2a; Version 2b; Version 3a; Version 3b (AAV2.V1; V2a; V2b; V3a; V3b) a una MOI de 1E5 o 3E5. Después de 24 horas de transducción, se añadió a las células 1 ml de medio de cultivo de células iPS. Tras 36-48 horas de transducción, las células se recolectaron, se lisaron y se procesaron para SDS-PAGE seguido de análisis de transferencia Western. La producción de la proteína REP-1 se evaluó en células transducidas con todas las versiones de los constructos y se comparó con controles no tratados.

2. Como experimento piloto, tres líneas celulares iPS diferentes sembradas en una placa de cultivo celular de 12 pocillos se transdujeron con AAV8. hCHM Version 1 y AAV8. hCHM Version 2a (AAV8.V1; AAV8.V2a) a una MOI de 1E6. Las líneas celulares iPS derivaron de tres individuos afectados por CHM con mutaciones no relacionadas en el gen REP1, y se sembraron en placas distintas para este fin. Después de 36-48 horas, las células se recolectaron y se lisaron y se sometieron a análisis de transferencia Western en comparación con el lisado de células no tratadas.

Administración de material de ensayo

3.4.1 Cultivo celular

Cultivo de células iPS procedentes de un paciente con CHM. En resumen, las células iPS se cultivaron en fibroblastos embrionarios de ratón (MEFs, alimentadores) en medio de cultivo de células iPS a 37°C en un entorno provisto de CO2 al 5% y O2 al 5%.

3.4.2 Preparación de células para transducción

El día antes de sembrar las células, se recubrieron placas de 12 pocillos con Matrigel como se describe en la referencia NCP.003 (NCP.003: Cultivo de células iPS de pacientes con CHM y controles). Antes de la transducción de células iPS con los respectivos vectores virales AAV2 o AAV8, las células que se cultivan en MEFs se sembraron en Matrigel sin MEFs (cultivo sin alimentador). Las células se sembraron a una densidad de 4,5+E5 a 6+E5 en 1 ml de medio de cultivo de células iPS en cada pocillo de una placa de cultivo celular de 12 pocillos. Las células sembradas se incubaron a 37°C en un entorno provisto de CO2 al 5%, O2 al 5%.

3.4.3 Transducción

Para infectar las células iPS con vectores virales, las células se hicieron crecer hasta aproximadamente 50-60% de confluencia. (Esto puede tardar 2-4 días en condiciones sin alimentador). Una vez que se logró una confluencia del 50-60%, se disocia un pocillo de los 12 pocillos y se realizan recuentos celulares para determinar el número total de células por pocillo. A continuación, se infectaron los pocillos de las células iPS con los vectores de AAV enumerados a continuación a la MOI predeterminada (véanse las Tablas 18 y 19). Antes de la transducción, se retiró el medio de cultivo de células iPS antiguo de las placas. y se añadió 1 ml nuevo de medio de cultivo de células iPS en cada pocillo. Se añadieron directamente a cada pocillo volúmenes predeterminados del virus procedente del lote. Véase la Tabla 18 y la Tabla 19 para obtener información sobre el número total de células infectadas, MOI y el volumen de virus utilizado para la infección. A continuación, las células se incubaron a 37°C en un entorno provisto de CO2 al 5%, O2 al 5% durante 18-24 horas. Después de 18-24 h de transducción, las células se observaron al microscopio en busca de anomalías o muerte celular. En este punto, se añadió otro 1 ml de medio de cultivo de células iPS reciente a cada pocillo que contenía células infectadas y no infectadas, y se incubaron durante 18-24 horas más a 37°C en un entorno provisto de CO2 al 5%, O2 al 5%. Las células se observaron bajo el microscopio antes de la recolección para evaluar cualquier muerte celular o aspecto anormal.

Tabla 18: Detalles de la infección y MOIs de vectores AAV2.hCHMV2a, 2B, 3a, 3b de siguiente generación y vectores AAV2.hCHM.V1 en células iPS derivadas de pacientes con CHM.

Tabla 19: Dosis de infección de vectores AAV8.V2a y AAV8.V1 en tres líneas celulares iPS derivadas de 3 pacientes diferentes con CHM.

Método de medida de resultados - el análisis de transferencia Western se realizó como se describe aquí.

Resultados

5.1 Expresión de AAV2- hCHM V1, V2a, V2b, V3a, V3b en la línea celular iPS JB588: El anticuerpo monoclonal específico de REP-1 humana detectó una única proteína hREP-1 de ~75-80 kDa en las células iPS JB 588 transducidas (Datos no mostrados). No se observó ninguna banda en el caso del control no tratado, lo que confirma la presencia de la enfermedad (datos no mostrados). Se observó que la intensidad de la banda de la proteína REP-1 a una MOI de 3E5 era más fuerte en todos los vectores en comparación con una MOI de 1E5. El suministro mediado por el vector viral AAV2.hCHM recombinante del gen hCHM a células iPS dio como resultado una producción dependiente de la dosis de la proteína REP-1. El sondaje de las transferencias con anticuerpo GAPDH mostró una banda de igual densidad en todos los lisados. GAPDH detectó una proteína a ~39 kDa. Tanto los anticuerpos anti-REP-1 como los anti-GAPDH detectaron solo bandas específicas del peso molecular esperado. No se observaron bandas inespecíficas en las transferencias.

Expresión de AAV8 -hCHM. V1, V2a en células iPS: El anticuerpo monoclonal específico de REP-1 humana detectó una única proteína REP-1 de ~75-80 kDa en las células iPS derivadas del paciente JB527, JB500 y JB588 transducidas (Datos no mostrados). No se observó banda de proteína en el caso del control no tratado. (Datos no mostrados). El sondaje de las transferencias con anticuerpo anti-GAPDH mostró una banda de igual densidad en todos los lisados celulares, incluyendo los lisados celulares procedentes de las células no tratadas. El anticuerpo anti-GAPDH detectó una banda de proteína específica de ~39 kDa. Tanto los anticuerpos anti-REP-1 como anti-GAPDH detectaron solo bandas de proteínas específicas en el peso molecular de tamaño esperado. No se observaron bandas de proteínas inespecíficas detectables en la transferencia.

Conclusiones

Los resultados preliminares presentados en el informe actual revelaron las siguientes observaciones: El análisis de transferencia Western confirmó la presencia de CHM (falta de proteína REP-1) en cada una de las tres iPSCs derivadas del paciente (JB588, JB500, JB527). Los estudios de expresión in vitro demostraron que la infección de células iPS procedentes de pacientes con Ch M con AAV2.hCHM. Version 2a, 2b, 3a, 3b y AAV2.hCHM Version1 (un candidato de ensayo clínico actual) indujo la producción de proteína REP-1 en todas las MOIs ensayadas. La infección de células iPS con AAV8.hCHM.Version 2a y con AAV8.hCHMVersion1 a una MOI de 1E6 dio como resultado la producción de proteína REP1 en las tres líneas celulares iPS CHM. El nivel de producción de REP1 fue mayor en las iPSCs infectadas con AAV8.hCHM.V2a que con AAV8.hCHM.V1.

Ejemplo 7: Comparación de la expresión in vivo de CHM humano de codones optim izados en AAV8 frente a CHM humano nativo en AAV

La terapia génica para una serie de enfermedades de la retina depende de la transducción eficaz de las células diana apropiadas, que para la coroideremia son las células del epitelio pigmentario de la retina (RPE) y las células fotorreceptoras. Este informe de estudio se centra en la comparación de la expresión in vivo inducida por el constructo basada en la secuencia de CHM nativa, (Version 1) y cuatro casetes de transgén de siguiente generación empaquetados en un esqueleto de AAV8 en ratones de tipo salvaje. Aquí evaluamos el serotipo AAV8 con el fin de mejorar la transferencia de genes a las células fotorreceptoras.

Nuestros experimentos fueron diseñados para responder las siguientes preguntas: a. ¿Cómo se compararían estos vectores para la transducción in vivo de fotorreceptores: En particular, qué tan eficientemente transduciría el AAV8.CHM de siguiente generación las células fotorreceptoras tras la inyección subretiniana del artículo de ensayo respectivo en comparación con la versión. 1. b. Respuesta a la dosis: Diferirían los vectores AAV8. CHM de siguiente generación y AAV8. CHM-Version1 en la respuesta de la expresión génica a la dosis?.

Detalles experimentales:

Los plásmidos y vectores fueron como se describe en el Ejemplo 4. Ratones (animales): Se usaron ratones CD1 de tipo salvaje para evaluar la expresión in vivo de CHM según se evaluó mediante la producción de proteína REP-1. La raza del ratón CD1 es una raza de ratón suizo exógena cuya colonia mantenemos en el laboratorio. Los detalles del estudio se describen en el protocolo de estudio CAROT PCPR02.01.

3.3 Diseño del estudio (por ejemplo, grupos de tratamiento)

3.3.1 Cría de animales: Se inyectaron a ratones tanto machos como hembras (~3-4 meses de edad) que pesaban ~20-30 g con los artículos de ensayo descritos. Los animales se alojaron en las instalaciones de University of Pennsylvania’s John Morgan University Laboratory Animal Resources (ULAR) según las regulaciones de la University of Pennsylvania’s ULAR. Los ratones se mantuvieron en un ciclo de 12 horas de luz/12 horas de oscuridad. Se proporcionó alimento y agua a voluntad. Todos los animales se identificaron con números de etiqueta de oreja.

3.4 Administración del material de ensayo: Para la administración de la dosis se utilizó la formulación del artículo de ensayo proporcionada por CAROT Vector Core. El material de ensayo se almacenó entre -60 y -80°C. El material de ensayo se descongeló en hielo antes de la dosificación. Para inyecciones intraoculares, el artículo de ensayo se diluye hasta la concentración diana con disolución salina amortiguada con fosfato como se describe en la Tabla 20 de formulación. Se preparó un total de 60 pl de mezcla maestra.

Tabla 20: Tabla de formulación de dosis para inyecciones subretinianas de artículos de ensayo

Preparación del registro de inyecciones antes de las inyecciones subretinianas:

Se mantuvo un registro de inyección con la siguiente información antes de la inyección subretiniana de los artículos de ensayo:

Número de jaula/número de ratón

Identificación del estudio

Raza

Fecha de nacimiento

Fecha de inyección

Nombre del investigador/inyector

Ojo inyectado (izquierdo o derecho)

Material de inyección (vector/serotipo)

Dosis y volumen

Ruta de administración (ROA)

Inyecciones subretinianas: Las inyecciones fueron realizadas por inyección subretiniana por el cirujano. En resumen, los animales se anestesiaron antes de la inyección. La inyección subretiniana del artículo de ensayo se realizó usando una jeringa Hamilton 33G. Los detalles de los artículos de ensayo y las inyecciones se describen en la Tabla 21. A partir de la mezcla maestra de inyección preparada, se administró un volumen de 1,5 pl por inyección. Se inyectó a un ojo por animal con 5E8 vg/ojo, y el ojo contralateral se inyectó con 5E9 vg/ojo.

Tabla 21: Esquema de inyecciones subretinianas y dosis de inyección

Métodos de medida de resultados

Sacrificio de animales: a. Después de inyectar a los animales los artículos de ensayo, se observó a todos los animales durante 48 horas para detectar cualquier anomalía relacionada con la inyección. B. 21-35 días después de la inyección, se observó a los animales en busca de anomalías oculares mediante oftalmoscopia. C. 90-12 días después de la inyección, los animales se sacrificaron, y se recogieron tejidos oculares para evaluar la producción de proteína REP-1 exógena mediante SDS-PAGE seguido de análisis de transferencia Western.

Recolección de tejido ocular: Se recogió tejido ocular para el análisis de transferencia Western después de retirar la lente del ojo utilizando una cuchilla quirúrgica afilada. El ojo (sin la lente) se recogió en tubos de congelador que están marcados adecuadamente.

Análisis de transferencia Western

Brevemente: 1. Preparación de lisado de tejido

а. Tejido ocular de animales inyectados con 2 dosis diferentes de AAV8. CHM de siguiente generación y AAV8.V1, junto con los tejidos animales de control no inyectados, se recogieron después de 21-35 días de inyección sacrificando los animales. B. A continuación, los tejidos se lisaron en hielo usando amortiguador RIPA con inhibidores de proteasas.

c. Los lisados de tejido se aclararon centrifugando a 13.000 rpm durante 10 min.

2. Cuantificación y preparación de proteínas

a. La cuantificación de proteínas de los lisados celulares se llevó a cabo usando el kit de ensayo de proteínas ThermoFisher Micro BCATM siguiendo las instrucciones del fabricante. B. La concentración de proteína se determinó tomando una lectura de OD a 562 nm. C. Para evaluar la expresión in vivo de CHM, se cargaron entre 20-40 ug de proteína medida en geles Bis-Tris al 4-12%.

3. SDS-PAGE y transferencia Western

Los geles de proteína se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa, se bloquearon en leche y se incubaron con los anticuerpos primarios. Como anticuerpos primarios se utilizaron anticuerpo 2F1 anti-REP-1 humana (2F1, dilución 1:1000) y/o anticuerpo anti-GAPDH (dilución 1:1000). Después de lavar la transferencia, se utilizaron, como anticuerpos secundarios, anticuerpo anti-IgG de ratón y/o anticuerpo anti-IgG de conejo conjugados con HRP a una concentración de 1:5000. Las transferencias se desarrollaron por quimioluminiscencia utilizando reactivos de ECL según las instrucciones del fabricante.

4. Controles

a) Controles de carga: Se usó anticuerpo anti-GAPDH como controles de carga para demostrar una carga igual de proteína en cada pocillo de los geles. El anticuerpo anti-GAPDH detecta una proteína de ~39 kDa. B) Control positivo: Como controles positivos, se utilizaron lisados de células COS-7 transducidas con AAV2.V2a. C) Control negativo: Como control negativo, se utilizaron tejidos oculares de animales no inyectados.

Determinación del valor de muestra

Cuantificación del análisis de transferencia Western utilizando el software ImageJ. En resumen, las evaluaciones densitométricas presentadas en este informe se normalizan en primer lugar a los niveles de expresión endógena de la proteína GAPDH de la muestra correspondiente. Después, los niveles de expresión se normalizan nuevamente al nivel de expresión de REP-1 promedio del control no inyectado.

Los detalles de las evaluaciones densitométricas y los cálculos de cambio de veces para representar la expresión de la proteína REP-1 se presentan en la Tabla 22 y 23.

La descripción en breve:

1. En la tabla 22 y 23, la Columna 2 muestra los valores brutos de la proteína REP-1, y la columna 3 muestra los valores brutos de la proteína GAPDH.

2. El valor de GAPDH de cada muestra se normalizó primero a los valores de GAPDH del animal-1 de AAV8.V1, y se muestran en la Tabla 22 en la 4a columna.

3. Los valores de cada muestra también se normalizaron a los valores de GAPDH del animal-2 de AAV8.V1, y se muestran en la Tabla 22 en la 5a columna.

4. A continuación, los valores de REP-1 (Columna 2) se normalizan a la GAPDH normalizada al animal 1 (columna 4) o a la GAPDH previamente normalizada al animal 2 (columna 5). Estos se representan en las columnas 6 y 7 respectivamente.

5. Los valores de REP-1 normalizados se convierten después en número de veces de cambio.

б. Los respectivos valores de REP-1 se normalizan a la expresión de REP-1 en el animal 1 o en el animal 2 del grupo inyectado de AAV8.V1 y se expresan como número de veces de cambio (columnas 8 y 9).

7. La columna 10 representa el número de veces de cambio promedio en la expresión de la proteína REP-1. Resultados

Comparación de la expresión de CHM usando el CHM nativo AAV8.V1 frente a los vectores de CHM de codones optimizados: AAV8.V2a, V2b, V3a y V3b. Se inyectaron a ratones CD1 de tipo salvaje con dos dosis diferentes de cada vector AAV8: una dosis alta de 5E9 vg/ojo y una dosis baja de 5E8 vg/ojo. Los siguientes resultados describen los niveles de proteína REP1 después de la inyección con dosis altas y bajas de AAV8.V1, AAV8.V2a y AAV8.V3a.

Comparación de la expresión de AAV8.V1 frente a AAV8.V2a y AAV8.V3a (vectores con relleno) en animales inyectados con dosis altas (5E9 vg/ojo) de vector viral. El análisis de transferencia Western con anticuerpo humano anti REP-1 detectó una banda de proteína hREP-1 de ~75-80 kDa en ambos tejidos oculares (inyectados con dosis baja y alta) de cada animal tratado con AAV8.V2a o V3a de siguiente generación o el AAV8.Version1 original. Se observa una banda muy tenue (mínima) en el caso de los ratones de control no inyectados, ambos. Se observó una banda de mayor intensidad en los tejidos que se transdujeron con vectores de siguiente generación (AAV8V.2a y AAV8.V3a) en comparación con los tejidos transducidos con Version. 1. Los anticuerpos anti-GAPDH mostraron una banda de ~39 kDa de igual densidad en todas las líneas de la transferencia Western, incluyendo los controles no inyectados. El marcador de proteína previamente teñido se usa para comparar los pesos moleculares de la proteína de interés. La evaluación densitométrica (cuantificación del nivel de expresión) de las transferencias usando el software ImageJ demostró que la producción de REP-1 se incrementó en animales inyectados con uno del AAV8 de siguiente generación. Constructos de dosis altas y bajas (V2a o V3a). (Véase la Tabla 22 para los valores).

Tabla 22: Resultados de la producción cuantificada de la proteína REP-1

para tratamiento con dosis alta (5E9vg) de AAV8 V1, V2a y V2b

* Valores de expresión de REP-1 animal no tratado fue insignificante véanse los valores a continuación:

Tabla 23: Resultados de la producción cuantificada de la proteína REP-1

para tratamiento con dosis baja (5E8 vg) de AAV8 V1, V2a y V2b

Comparación de la expresión de AAV8.V1 frente a AAV8.V2a y AAV8.V3a en animales inyectados con dosis bajas (5E8 vg/ojo) de vector viral

Anticuerpo humano anti REP-1, el análisis de transferencia Western de los tejidos oculares de animales inyectados con AAV8.V2a, V3a de siguiente generación y AAV8.Version1 a una dosis de 5E8 detectó una banda de proteína hREP-1 de ~75-80 kDa en tejidos de ratones inyectados. Se observó una banda tenue (mínima) de REP-1 en los lisados de tejido ocular de los ratones de control no inyectados, ambos. Se observó una banda de mayor intensidad en los lisados de tejido que se transducen con vectores de siguiente generación en comparación con los lisados que se transducen con Versionl. El anticuerpo anti-GAPDH detectó una banda de proteína de igual intensidad a ~39 kDa en todos los lisados celulares. Estos datos demuestran que el suministro de V2a CHM de siguiente generación a través de AAV8 da como resultado niveles robustos de proteína REP-1 en comparación con los niveles producidos después de la inyección de AAV8.V3a o AAV8.V1.

La evaluación densitométrica (cuantificación del nivel de expresión) de las transferencias utilizando el software ImageJ demuestra además una mayor producción de REP-1 en animales inyectados con constructos AAV8.CHM de siguiente generación (especialmente V2a) en comparación con la Version 1. Véase la Tabla 23 para conocer los valores.

Expresión de AAV8.V2b en ratones CD1

Este estudio actual y la evaluación del efecto del relleno lambda sobre la producción de vectores de AAV mediante análisis de títulos por qPCR se llevaron a cabo simultáneamente. Realizamos todas las inyecciones en animales para el estudio de expresión in vivo como se describe en el protocolo de estudio PCPR.02, y se recolectaron todas las muestras. Una vez concluido el estudio de qPCR sobre el elemento de relleno lambda (descrito anteriormente), decidimos llevar a cabo los experimentos de transferencia Western solo para evaluar la expresión de los vectores de AAV sin el relleno, tal como AAV8.2b y AAV8.3b, y excluirlos de más análisis (tal como la comparación con la Version 1).

El anticuerpo anti-REP-1 humano detectó una proteína de ~75-80 kDa en tejidos oculares de ratones CD-1 inyectados con AAV8.2b a 5E9 (dosis alta) de copias del genoma vectorial (FIG. 12A). Los animales inyectados con AAV8.2b a 5E8 (dosis baja) mostraron una banda de proteína muy débil a ~75-80 kDa (FIG. 12A). Los lisados de tejidos oculares de animales de control no inyectados no mostraron la presencia de proteína REP-1. El anticuerpo anti-GAPDH detectó una proteína de ~39 kDa en todos los lisados de tejido ocular, incluyendo los controles no inyectados. Estos datos pueden establecer la dosis mínima para AAV8.2b.

Expresión de AAV8.V3b en ratones CD1

Realizamos un análisis de transferencia Western en tejidos oculares de ratones CD1 inyectados con AAV8.3b (2 ratones/grupo) con anticuerpo anti-REP-1, que reveló la presencia de una proteína de ~75-80 kDa en un ojo inyectado con dosis baja y en ambos ojos inyectados con dosis alta de AAV8.3b. En los tejidos oculares de los ratones no inyectados no se detectó expresión de REP-1 (FIG. 12B). El nivel de REP-1 producido dependió de la dosis en animales inyectados con AAV8.3b. La inyección con una dosis alta de AAV8.3b (5E9 genomas vectoriales) indujo una mayor cantidad de REP-1 en comparación con los ojos inyectados a dosis baja (5E8 genomas vectoriales). El anticuerpo anti-GAPDH detectó una proteína de ~39 kDa en lisados de tejido ocular de todos los animales inyectados y no inyectados.

Estos resultados revelaron las siguientes observaciones:

1) Los vectores AAV8.Version2a, 2b, 3a y 3b de siguiente generación son capaces de transducir tejidos oculares de manera eficiente. 2) La expresión del transgén (CHM de codones optimizados) fue detectable para todos los vectores de siguiente generación. 3) La expresión del transgén (CHM de codones optimizados) depende de la dosis. 4) AAV8.Version2a y AAV8.Version.2b indujeron una mayor producción de proteína REP-1 en comparación con AAV8.Version 1 en tejidos oculares de ratones CD-1. 5) Existe una variación en el nivel exacto de producción de la proteína transgénica entre los ojos inyectados con la misma dosis, lo que refleja la variabilidad en el procedimiento de suministro quirúrgico. Sin embargo, las diferencias en los niveles son grandes entre las dosis baja (5E8) y alta (5E9).

6) AAV8.CHM.V2a y AAV8.V3a dan como resultado niveles mucho más altos de producción de proteína REP-1 que AAV8.V1 después de la administración in vivo de vector de dosis alta (5E9 vg) de forma subretininiana en ratones.

TEXTO LIBRE DE LISTADO DE SECUENCIAS

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un casete de expresión que tiene una secuencia de ácido nucleico que comprende SEQ ID NO: 1.

2. Un vector de virus adenoasociado (AAV) que comprende una cápside de AAV y una secuencia de ácido nucleico que comprende secuencias de repetición terminal invertida de AAV y una secuencia de ácido nucleico que comprende SEQ ID NO: 1 que codifica la Proteína 1 de Acompañamiento de Rab (REP-1) humana, y secuencias de control de la expresión que dirigen la expresión de REP-1 en una célula hospedante.

3. El vector viral de la reivindicación 2, en el que las secuencias de control de la expresión comprenden un promotor.

4. El vector viral de la reivindicación 3, en el que el promotor es:

un promotor de rodopsina; o

un promotor de rodopsina cinasa;

5. El vector viral según la reivindicación 3, en el que el promotor es un promotor específico de la célula ocular; se selecciona de un promotor EF1a humano, un promotor del receptor 6 de glutamato metabotrópico (mGluR6), un promotor de rodopsina, promotores de opsina de los conos y promotores de factores de transcripción (cremallera de leucina de retina neural (Nrl) y receptor nuclear específico de fotorreceptores Nr2e3, bZIP); o

es un promotor inducible, un promotor constitutivo o un promotor específico de tejido; y opcionalmente, en el que el promotor es un promotor inducible seleccionado de promotor de rapamicina/rapalog, promotor de ecdisona, promotor sensible a estrógenos, y promotor sensible a tetraciclina, o interruptor represor heterodimérico.

6. El vector viral de cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5, que comprende además uno o más de un intrón, una secuencia de Kozak, un poliA, y elementos reguladores post-transcripcionales.

7. El vector viral de cualquiera de las reivindicaciones 2 a 6, en el que el vector es un rAAV que tiene una cápside seleccionada de AAV2, AAV5, AAV8, AAV9, AAV8bp, AAV7m8, y variantes de los mismos.

8. El vector viral según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 7, en el que las secuencias de ITR:

proceden de un AAV diferente de aquel que suministra la proteína de la cápside; y/o

proceden de AAV2.

9. Un vector de virus adenoasociado (AAV) que comprende una cápside de AAV8 y un genoma recombinante (rAAV), en el que dicho genoma de rAAV comprende SEQ ID NO: 1 que codifica REP-1, secuencias de repetición terminal invertida y secuencias de control de la expresión que dirigen la expresión de REP-1 en una célula hospedante.

10. Un plásmido para producir un vector de AAV, comprendiendo el plásmido SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 25, o SEQ ID NO: 26, o SEQ ID NO: 27 o SEQ ID NO: 28.

11. Un vector viral que comprende un genoma vectorial que comprende nt 1 a 4233 de SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27 o SEQ ID NO: 28.

12. Un vector viral que comprende un genoma vectorial que comprende una 5’ ITR, un potenciador de CMV, un promotor de beta-actina de pollo, exón 1 e intrón de CBA, una secuencia de Kozak, SEQ ID NO: 1, poli A de bGH, y una 3’ ITR.

13. Un vector viral según cualquiera de las reivindicaciones 2-9, 11 o 12, para uso como medicamento.

14. Una composición farmacéutica que comprende un vector viral según una cualquiera de las reivindicaciones 2-9, 11 o 12.

15. La composición según la reivindicación 14, para uso en el tratamiento de la coroideremia.

16. La composición según la reivindicación 14, o para uso como la reivindicación 15, en la que dicha composición es para administración subretiniana, intravítrea, intravenosa, o en la coroides.

17. La composición según la reivindicación 14, o para uso como en las reivindicaciones 15 y 16, en la que el tratamiento es en un mamífero, y opcionalmente, dicho mamífero es un ser humano.

18. La composición según la reivindicación 14, o para uso como en las reivindicaciones 15 a 17, en la que dicha composición es para administración en combinación con otra terapia.

19. La composición según la reivindicación 14, o para uso como en las reivindicaciones 15-18, en la que dicha composición se administra en una dosis de alrededor de 109 a alrededor de 1013 genomas vectoriales (VG).

20. La composición según la reivindicación 14, o para uso como en las reivindicaciones 15-19, en la que dicha composición se administra en un volumen de alrededor de 100 pl a alrededor de 500 pl.

21. La composición según la reivindicación 14, o para uso como en las reivindicaciones 15-20, en la que dicha composición se administra más de una vez.