BR112021014400A2 - Genoma do vírus do herpes recombinante, vírus do herpes, composição farmacêutica, e, métodos para intensificar, aumentar, elevar e/ou suplementar os níveis de um polipeptídeo cftr em uma ou mais células, para reduzir ou inibir a destruição progressiva do pulmão, para fornecer alívio profilático, paliativo ou terapêutico de um ou mais sinais ou sintomas de fibrose cística e para fornecer alívio profilático, paliativo ou terapêutico de um ou mais sinais ou sintomas de copd - Google Patents

Genoma do vírus do herpes recombinante, vírus do herpes, composição farmacêutica, e, métodos para intensificar, aumentar, elevar e/ou suplementar os níveis de um polipeptídeo cftr em uma ou mais células, para reduzir ou inibir a destruição progressiva do pulmão, para fornecer alívio profilático, paliativo ou terapêutico de um ou mais sinais ou sintomas de fibrose cística e para fornecer alívio profilático, paliativo ou terapêutico de um ou mais sinais ou sintomas de copd Download PDF

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Abstract

genoma do vírus do herpes recombinante, vírus do herpes, composição farmacêutica, e, métodos para intensificar, aumentar, elevar e/ou suplementar os níveis de um polipeptídeo cftr em uma ou mais células, para reduzir ou inibir a destruição progressiva do pulmão, para fornecer alívio profilático, paliativo ou terapêutico de um ou mais sinais ou sintomas de fibrose cística e para fornecer alívio profilático, paliativo ou terapêutico de um ou mais sinais ou sintomas de copd. a presente divulgação fornece ácidos nucleicos recombinantes compreendendo um ou mais polinucleotídeos que codificam um polipeptídeo regulador de condutância transmembranar de fibrose cística (cftr) (por exemplo, um polipeptídeo cftr humano); vírus que compreendem os ácidos nucleicos recombinantes; composições e formulações compreendendo os ácidos nucleicos recombinantes e/ou vírus; métodos de seu uso (por exemplo, para o tratamento de uma doença pulmonar crônica, como a fibrose cística); e artigos de fabricação ou kits dos mesmos.

Description

1 / 101 GENOMA DO VÍRUS DO HERPES RECOMBINANTE, VÍRUS DO HERPES, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, E, MÉTODOS PARA INTENSIFICAR, AUMENTAR, ELEVAR E/OU SUPLEMENTAR OS NÍVEIS DE UM POLIPEPTÍDEO CFTR EM UMA OU MAIS CÉLULAS,
PARA REDUZIR OU INIBIR A DESTRUIÇÃO PROGRESSIVA DO PULMÃO, PARA FORNECER ALÍVIO PROFILÁTICO, PALIATIVO OU TERAPÊUTICO DE UM OU MAIS SINAIS OU SINTOMAS DE FIBROSE CÍSTICA E PARA FORNECER ALÍVIO PROFILÁTICO, PALIATIVO OU TERAPÊUTICO DE UM OU MAIS SINAIS OU SINTOMAS DE COPD REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS
[001] Este pedido reivindica o benefício prioritário do Pedido Provisório U.S. 62/802.871, depositado em 8 de fevereiro de 2019, que é incorporado neste documento por referência em sua totalidade.
APRESENTAÇÃO DE LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS EM ARQUIVO DE TEXTO ASCII
[002] O conteúdo da seguinte submissão em arquivo de texto ASCII é incorporado aqui por referência em sua totalidade: um formulário legível por computador (CRF) da Listagem de Sequência (nome do arquivo: 7613420001140SEQLIST.txt, data de registro: 17 de janeiro de 2020, tamanho: 44 KB).
CAMPO DA INVENÇÃO
[003] A presente divulgação se refere, em parte, a ácidos nucleicos recombinantes compreendendo um ou mais polinucleotídeos que codificam um polipeptídeo regulador de condutância transmembranar de fibrose cística (CFTR), vírus compreendendo o mesmo, composições farmacêuticas e formulações dos mesmos e métodos de seu uso (por exemplo, para fornecer alívio profilático, paliativo ou terapêutico de um ou mais sinais ou sintomas de uma doença pulmonar crônica, como fibrose cística).
FUNDAMENTO
2 / 101
[004] O regulador de condutância transmembranar da fibrose cística (CFTR) é um canal de bicarbonato e cloreto ativado por AMPc que é crítico para a homeostase pulmonar. A redução ou perda da função do canal CFTR geralmente leva à estase do muco, infecções bacterianas crônicas e as respostas inflamatórias crônicas que as acompanham, que promovem a destruição progressiva do pulmão. Foi sugerido que as diminuições na expressão de CFTR são um componente da patologia pulmonar observada em pacientes com doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD), e as mutações de perda de função no gene CFTR levam às terríveis consequências associadas à fibrose cística (CF). Mais de 2.000 mutações únicas no gene CFTR foram descritas.
[005] A CF é uma doença hereditária caracterizada pelo acúmulo de muco espesso e pegajoso que pode danificar muitos órgãos do corpo; no entanto, as consequências patológicas mais graves estão associadas aos pulmões. Os pacientes com CF apresentam muco desidratado nos pulmões que leva à obstrução das vias aéreas, infecções bacterianas crônicas (e respostas inflamatórias associadas), bronquiectasia e, por fim, insuficiência respiratória. Atualmente, mais de 70.000 pessoas vivem com fibrose cística em todo o mundo. Historicamente, crianças nascidas com CF morriam quando bebês e, em 1980, a sobrevida média era de menos de 20 anos. Embora os avanços médicos nas últimas três décadas tenham melhorado drasticamente a qualidade de vida e a expectativa de vida dos pacientes com CF (40,6 anos nos Estados Unidos a partir de 2013), existe uma clara necessidade de novas opções de tratamento visando a correção molecular de deficiências de CFTR observadas em pacientes com CF, bem como em pacientes que sofrem de outras doenças pulmonares crônicas como a COPD.
[006] Todas as referências aqui citadas, incluindo pedidos de patente, publicações de patentes, literatura não patentária e números de acessão NCBI/UniProtKB/Swiss-Prot, são aqui incorporadas por referência
3 / 101 em sua totalidade, como se cada referência individual fosse especificamente e individualmente indicada para ser incorporada por referência.
BREVE SUMÁRIO
[007] A fim de atender a essas e outras necessidades, são fornecidos aqui ácidos nucleicos recombinantes (por exemplo, genomas de vírus de herpes recombinantes) que codificam um ou mais polipeptídeos CFTR para uso em vírus (por exemplo, vírus de herpes), composições e formulações farmacêuticas, medicamentos e/ou métodos úteis para o tratamento de deficiências de CFTR em um sujeito em necessidade do mesmo e/ou para fornecer alívio profilático, paliativo ou terapêutico de um ou mais sinais ou sintomas de uma doença pulmonar crônica, como fibrose cística.
[008] Os presentes inventores mostraram que os vírus recombinantes aqui descritos eram capazes de transduzir de forma eficaz células epiteliais das vias aéreas derivadas de um paciente com CF e expressar com sucesso seus polipeptídeos CFTR humanos exógenos codificados (ver, por exemplo, Exemplo 2). Além disso, os presentes inventores mostraram que os vírus recombinantes aqui descritos expressam CFTR humano funcional de comprimento total que foi adequadamente transportado para a membrana plasmática (ver, por exemplo, Exemplo 2). Além disso, os presentes inventores demonstraram que os vírus recombinantes aqui descritos resgataram o fenótipo doente em culturas organotípicas 3D clinicamente relevantes preparadas a partir de biópsias colhidas de múltiplos pacientes com CF que abrigam várias mutações CFTR subjacentes (ver, por exemplo, Exemplo 3). Além disso, os presentes inventores demonstraram que os vetores de HSV recombinantes podem ser administrados aos pulmões de animais imunocompetentes através de múltiplas vias e, além disso, que uma via de administração inalada não invasiva expressa níveis semelhantes de um transgene codificado, enquanto induzindo menos invasão celular para os pulmões (ver, por exemplo, Exemplo 4). Sem desejar estar limitado pela
4 / 101 teoria, acredita-se que aumentar, elevar e/ou suplementar os níveis de polipeptídeos CFTR em uma ou mais células (por exemplo, uma ou mais células epiteliais das vias aéreas e/ou uma ou mais células das glândulas submucosas) de um indivíduo em necessidade do mesmo pela administração de um ou mais dos ácidos nucleicos, vírus, medicamentos e/ou composições recombinantes aqui descritos irá: 1) reduzir ou evitar o acúmulo de muco em um ou mais órgãos (por exemplo, os pulmões) do indivíduo; 2) reduzir ou prevenir a obstrução das vias aéreas no indivíduo; 3) reduzir ou prevenir infecções bacterianas crônicas e/ou a inflamação crônica associada nos pulmões do indivíduo; 4) reduzir ou prevenir bronquiectasias no indivíduo; 5) reduzir, inibir ou tratar a destruição progressiva do pulmão no indivíduo; e/ou 6) fornecer alívio profilático, paliativo ou terapêutico de um ou mais sinais ou sintomas de uma doença pulmonar crônica (por exemplo, fibrose cística, COPD, etc.).
[009] Por conseguinte, certos aspectos da presente divulgação se referem a um genoma de vírus do herpes recombinante compreendendo um ou mais polinucleotídeos que codificam um polipeptídeo regulador de condutância transmembranar de fibrose cística (CFTR). Em algumas modalidades, o genoma do vírus do herpes recombinante é competente para replicação. Em algumas modalidades, o genoma do vírus do herpes recombinante é defeituoso na replicação. Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, o genoma do vírus do herpes recombinante compreende um ou mais polinucleotídeos que codificam o polipeptídeo CFTR em um ou mais loci de genes virais. Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, o genoma do vírus do herpes recombinante é selecionado de um genoma do vírus do herpes simplex recombinante, um genoma do vírus da varicela zóster recombinante, um genoma do citomegalovírus humano recombinante, um genoma do
5 / 101 herpesvírus 6A recombinante, um genoma do vírus recombinante genoma do herpesvírus 6B, um genoma do herpesvírus 7 recombinante, um genoma do herpesvírus associado ao sarcoma de Kaposi recombinante e quaisquer combinações ou derivados dos mesmos.
[0010] Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, o polipeptídeo CFTR é um polipeptídeo CFTR humano. Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, o polipeptídeo CFTR compreende uma sequência com pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO 6. Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, o polipeptídeo CFTR compreende uma sequência com pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93% , pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5. Em algumas modalidades, o polipeptídeo CFTR compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5.
[0011] Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, o genoma do vírus do herpes recombinante é um genoma do vírus do herpes simplex recombinante. Em algumas modalidades, o genoma do vírus do herpes simplex recombinante é um genoma do vírus do herpes simplex do tipo 1 recombinante (HSV-1), um genoma do vírus do herpes simplex do tipo 2 recombinante (HSV-2) ou quaisquer derivados dos mesmos. Em algumas modalidades, o genoma do vírus do herpes simplex recombinante é um genoma HSV-1 recombinante.
6 / 101
[0012] Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, o genoma do vírus do herpes simplex recombinante compreende uma mutação de inativação. Em algumas modalidades, a mutação de inativação está em um gene do vírus do herpes simplex. Em algumas modalidades, a mutação de inativação é uma deleção da sequência de codificação do gene do vírus do herpes simplex. Em algumas modalidades, o gene do vírus do herpes simplex é selecionado da Proteína Celular Infectada (ICP) 0 (uma ou ambas as cópias), ICP4 (uma ou ambas as cópias), ICP22, ICP27, ICP47, timidina cinase (tk), Região Única Longa (UL) 41 e UL55. Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, o genoma do vírus do herpes simplex recombinante compreende uma mutação de inativação em uma ou em ambas as cópias do gene ICP4. Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, o genoma do vírus do herpes simplex recombinante compreende uma mutação de inativação no gene ICP22. Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, o genoma do vírus do herpes simplex recombinante compreende uma mutação de inativação no gene UL41. Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, o genoma do vírus do herpes simplex recombinante compreende uma mutação de inativação em uma ou em ambas as cópias do gene ICP0. Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, o genoma do vírus do herpes simplex recombinante compreende uma mutação de inativação no gene ICP27. Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, o genoma do vírus do herpes simplex recombinante compreende uma mutação de inativação no gene ICP47. Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, o genoma do
7 / 101 vírus do herpes simplex recombinante compreende uma mutação de inativação no gene UL55. Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, o genoma do vírus do herpes simplex recombinante compreende uma mutação de inativação na região de Dobradiça. Em algumas modalidades, o genoma do vírus do herpes simplex recombinante compreende uma deleção da região de Dobradiça.
[0013] Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, o genoma do vírus do herpes simplex recombinante compreende um ou mais polinucleotídeos que codificam o polipeptídeo CFTR em um ou mais loci de genes virais. Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, o genoma do vírus do herpes simplex recombinante compreende um ou mais polinucleotídeos que codificam o polipeptídeo CFTR em um ou ambos do loci do gene viral ICP4. Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, o genoma do vírus do herpes simplex recombinante compreende um ou mais polinucleotídeos que codificam o polipeptídeo CFTR no locus do gene viral ICP22. Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, o genoma do vírus do herpes simplex recombinante compreende um ou mais polinucleotídeos que codificam o polipeptídeo CFTR no locus do gene viral UL41. Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, o genoma do vírus do herpes simplex recombinante compreende um ou mais polinucleotídeos que codificam o polipeptídeo CFTR em um ou ambos dos loci do gene viral ICP0. Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, o genoma do vírus do herpes simplex recombinante compreende um ou mais polinucleotídeos que codificam o polipeptídeo CFTR no locus do gene viral ICP27. Em algumas
8 / 101 modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, o genoma do vírus do herpes simplex recombinante compreende um ou mais polinucleotídeos que codificam o polipeptídeo CFTR no locus do gene viral ICP47. Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, o genoma do vírus do herpes simplex recombinante compreende um ou mais polinucleotídeos que codificam o polipeptídeo CFTR no locus do gene viral UL55.
[0014] Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, o genoma do vírus do herpes recombinante tem citotoxicidade reduzida quando introduzido em uma célula alvo em comparação com um genoma do vírus do herpes de tipo selvagem correspondente. Em algumas modalidades, a célula é uma célula humana. Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, a célula alvo é uma célula do trato respiratório. Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, a célula alvo é uma célula epitelial das vias aéreas ou uma célula das glândulas submucosas.
[0015] Outros aspectos da presente divulgação se referem a um vírus do herpes compreendendo qualquer um dos genomas do vírus do herpes recombinante aqui descritos. Em alguns aspectos, o vírus do herpes é competente para replicação. Em algumas modalidades, o vírus do herpes é defeituoso na replicação. Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, o vírus do herpes tem citotoxicidade reduzida em comparação com um vírus do herpes de tipo selvagem correspondente. Em algumas modalidades, o vírus do herpes reduziu a citotoxicidade quando introduzido em uma célula alvo em comparação com um vírus do herpes de tipo selvagem correspondente. Em algumas modalidades, a célula é uma célula humana. Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades
9 / 101 anteriores, a célula alvo é uma célula do trato respiratório. Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, a célula alvo é uma célula epitelial das vias aéreas ou uma célula das glândulas submucosas. Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, o vírus do herpes é selecionado de um vírus do herpes simplex, um vírus da varicela zoster, um citomegalovírus humano, um herpesvírus 6A, um herpesvírus 6B, um herpesvírus 7, um herpesvírus associado ao sarcoma de Kaposi e quaisquer combinações ou derivados dos mesmos. Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, o vírus do herpes é um vírus do herpes simplex. Em algumas modalidades, o vírus do herpes simplex é um HSV-1, um HSV-2 ou qualquer derivado do mesmo. Em algumas modalidades, o vírus do herpes simplex é um HSV-1.
[0016] Outros aspectos da presente divulgação se referem a uma composição farmacêutica compreendendo qualquer um dos genomas de vírus do herpes recombinantes aqui descritos e/ou qualquer um dos vírus do herpes aqui descritos e um excipiente farmaceuticamente aceitável. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica é adequada para uso tópico, transdérmico, subcutâneo, intradérmico, oral, intranasal, intratraqueal, sublingual, bucal, retal, vaginal, inalado, intravenoso, intra-arterial, intramuscular, intracardíaco, intraósseo, intraperitoneal, transmucoso, intravítreo, sub-retiniana, intra-articular, peri-articular, local e/ou epicutânea. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica é adequada para administração oral, intranasal, intratraqueal e/ou inalada. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica é adequada para administração inalada. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica é adequada para administração inalada não invasiva. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica é adequada para uso em um inalador de pó seco, um inalador de dose medida pressurizado, um inalador de névoa suave, um
10 / 101 nebulizador, um dispositivo aerossol eletro-hidrodinâmico ou qualquer combinação dos mesmos. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica é adequada para nebulização (por exemplo, usando um nebulizador de malha vibratória). Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, a composição farmacêutica compreende um tampão de fosfato. Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, a composição farmacêutica compreende glicerol. Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, a composição farmacêutica compreende um transportador lipídico. Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, a composição farmacêutica compreende um transportador de nanopartícula.
[0017] Outros aspectos da presente divulgação se referem ao uso de qualquer um dos ácidos nucleicos recombinantes, vírus do herpes e/ou composições farmacêuticas aqui descritas como um medicamento.
[0018] Outros aspectos da presente divulgação se referem ao uso de qualquer um dos ácidos nucleicos recombinantes, vírus do herpes e/ou composições farmacêuticas aqui descritas em uma terapia.
[0019] Outros aspectos da presente divulgação se referem ao uso de qualquer um dos ácidos nucleicos recombinantes, vírus do herpes e/ou composição farmacêutica aqui descritos na produção ou fabricação de um medicamento para o tratamento de um ou mais sinais ou sintomas de uma deficiência de CFTR e/ou uma doença pulmonar crônica (por exemplo, fibrose cística, COPD, etc.).
[0020] Outros aspectos da presente divulgação se referem a um método de intensificar, aumentar, elevar e/ou suplementar os níveis de um polipeptídeo CFTR em uma ou mais células de um sujeito, o método compreendendo administrar ao sujeito uma quantidade eficaz de qualquer um
11 / 101 dos genomas de vírus de herpes recombinantes aqui descritos, qualquer um dos vírus de herpes aqui descritos e/ou qualquer uma das composições farmacêuticas aqui descritas.
Em algumas modalidades, uma ou mais células são uma ou mais células do trato respiratório.
Em algumas modalidades, uma ou mais células são uma ou mais células epiteliais das vias aéreas e/ou uma ou mais células das glândulas submucosas.
Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, o sujeito sofre de uma doença pulmonar crônica.
Em algumas modalidades, a doença pulmonar crônica é fibrose cística ou doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD). Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, o sujeito é um humano.
Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, o genoma do sujeito compreende uma mutação de perda de função em um gene CFTR . Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, o genoma do vírus do herpes recombinante, o vírus do herpes e/ou a composição farmacêutica são administrados por via oral, intranasal, intratraqueal, sublingual, bucal, tópica, retal, via inalação, transdérmica, subcutânea, intradérmica, intravenosa, intra- arterial, intramuscular, intracardíaca, intraóssea, intraperitoneal, transmucosa, vaginal, intravítrea, intraorbital, subrretinal, intra-articular, periarticular, local e/ou epicutânea ao sujeito.
Em algumas modalidades, o genoma do vírus do herpes recombinante, o vírus do herpes e/ou a composição farmacêutica são administrados por via oral, intranasal, intratraqueal ou por inalação ao sujeito.
Em algumas modalidades, o genoma do vírus do herpes recombinante, o vírus do herpes e/ou a composição farmacêutica são administrados por inalação ao sujeito.
Em algumas modalidades, o genoma do vírus do herpes recombinante, o vírus do herpes e/ou a composição farmacêutica são administrados por via oral, intranasal, intratraqueal ou por inalação ao sujeito.
Em algumas modalidades, o genoma do vírus do herpes recombinante, o vírus
12 / 101 do herpes e/ou a composição farmacêutica são administrados usando um inalador de pó seco, um inalador dosado pressurizado, um inalador de névoa suave, um nebulizador ou um dispositivo de aerossol eletro-hidrodinâmico. Em algumas modalidades, o genoma do vírus do herpes recombinante, o vírus do herpes e/ou a composição farmacêutica são administrados por meio de um nebulizador (por exemplo, um nebulizador de malha vibratória).
[0021] Outros aspectos da presente divulgação se referem a um método de redução ou inibição da destruição progressiva do pulmão em um sujeito em necessidade do mesmo, o método compreendendo administrar ao sujeito uma quantidade eficaz de qualquer um dos genomas do vírus do herpes recombinante aqui descritos, qualquer um dos vírus do herpes aqui descritos, e/ou qualquer uma das composições farmacêuticas aqui descritas. Em algumas modalidades, o sujeito sofre de uma doença pulmonar crônica. Em algumas modalidades, a doença pulmonar crônica é fibrose cística ou doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD). Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, o sujeito é um humano. Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, o genoma do sujeito compreende uma mutação de perda de função em um gene CFTR . Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, o genoma do vírus do herpes recombinante, o vírus do herpes e/ou a composição farmacêutica são administrados por via oral, intranasal, intratraqueal, sublingual, bucal, tópica, retal, via inalação, transdérmica, subcutânea, intradérmica, intravenosa, intra-arterial, intramuscular, intracardíaca, intraóssea, intraperitoneal, transmucosa, vaginal, intravítrea, intraorbital, subrretinal, intra-articular, periarticular, local e/ou epicutânea ao sujeito. Em algumas modalidades, o genoma do vírus do herpes recombinante, o vírus do herpes e/ou a composição farmacêutica são administrados por via oral, intranasal, intratraqueal ou por inalação ao sujeito.
13 / 101 Em algumas modalidades, o genoma do vírus do herpes recombinante, o vírus do herpes e/ou a composição farmacêutica são administrados por inalação ao sujeito. Em algumas modalidades, o genoma do vírus do herpes recombinante, o vírus do herpes e/ou a composição farmacêutica são administrados por via oral, intranasal, intratraqueal ou por inalação ao sujeito. Em algumas modalidades, o genoma do vírus do herpes recombinante, o vírus do herpes e/ou a composição farmacêutica são administrados usando um inalador de pó seco, um inalador dosado pressurizado, um inalador de névoa suave, um nebulizador ou um dispositivo de aerossol eletro-hidrodinâmico. Em algumas modalidades, o genoma do vírus do herpes recombinante, o vírus do herpes e/ou a composição farmacêutica são administrados por meio de um nebulizador (por exemplo, um nebulizador de malha vibratória).
[0022] Outros aspectos da presente divulgação se referem a um método de fornecimento de alívio profilático, paliativo ou terapêutico de um ou mais sinais ou sintomas de fibrose cística em um sujeito em necessidade do mesmo, o método compreendendo administrar ao sujeito uma quantidade eficaz de qualquer um dos genomas de vírus de herpes recombinantes aqui descritos, qualquer um dos vírus de herpes aqui descritos e/ou qualquer uma das composições farmacêuticas aqui descritas. Em algumas modalidades, um ou mais sinais ou sintomas de fibrose cística são selecionados de uma tosse persistente que produz muco espesso, muco espesso e pegajoso que se acumula nas vias respiratórias, respiração ofegante, falta de ar, sinusite, infecções pulmonares repetidas, passagens nasais inflamadas, bronquiectasia, pólipos nasais, hemoptise, pneumotórax, pancreatite, pneumonia recorrente, insuficiência respiratória e quaisquer combinações dos mesmos. Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, o sujeito é um humano. Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, o genoma do sujeito compreende uma mutação de perda de função em um gene CFTR . Em
14 / 101 algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, o genoma do vírus do herpes recombinante, o vírus do herpes e/ou a composição farmacêutica são administrados por via oral, intranasal, intratraqueal, sublingual, bucal, tópica, retal, via inalação, transdérmica, subcutânea, intradérmica, intravenosa, intra-arterial, intramuscular, intracardíaca, intraóssea, intraperitoneal, transmucosa, vaginal, intravítrea, intraorbital, subrretinal, intra-articular, periarticular, local e/ou epicutânea ao sujeito. Em algumas modalidades, o genoma do vírus do herpes recombinante, o vírus do herpes e/ou a composição farmacêutica são administrados por via oral, intranasal, intratraqueal ou por inalação ao sujeito. Em algumas modalidades, o genoma do vírus do herpes recombinante, o vírus do herpes e/ou a composição farmacêutica são administrados por inalação ao sujeito. Em algumas modalidades, o genoma do vírus do herpes recombinante, o vírus do herpes e/ou a composição farmacêutica são administrados por via oral, intranasal, intratraqueal ou por inalação ao sujeito. Em algumas modalidades, o genoma do vírus do herpes recombinante, o vírus do herpes e/ou a composição farmacêutica são administrados usando um inalador de pó seco, um inalador dosado pressurizado, um inalador de névoa suave, um nebulizador ou um dispositivo de aerossol eletro-hidrodinâmico. Em algumas modalidades, o genoma do vírus do herpes recombinante, o vírus do herpes e/ou a composição farmacêutica são administrados por meio de um nebulizador (por exemplo, um nebulizador de malha vibratória).
[0023] Outros aspectos da presente divulgação se referem a um método de fornecimento de alívio profilático, paliativo ou terapêutico de um ou mais sinais ou sintomas de COPD em um sujeito em necessidade do mesmo, o método compreendendo a administração ao sujeito de uma quantidade eficaz de qualquer um dos genomas de vírus de herpes recombinantes aqui descritos, qualquer um dos vírus de herpes aqui descritos e/ou qualquer uma das composições farmacêuticas aqui descritas. Em
15 / 101 algumas modalidades, um ou mais sinais ou sintomas de COPD são selecionados de falta de ar, respiração ofegante, aperto no peito, excesso de muco nos pulmões, tosse crônica, cianose, infecções respiratórias frequentes e quaisquer combinações dos mesmos.
Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, o sujeito é um humano.
Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, o genoma do sujeito compreende uma mutação de perda de função em um gene CFTR . Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, o genoma do vírus do herpes recombinante, o vírus do herpes e/ou a composição farmacêutica são administrados por via oral, intranasal, intratraqueal, sublingual, bucal, tópica, retal, via inalação, transdérmica, subcutânea, intradérmica, intravenosa, intra-arterial, intramuscular, intracardíaca, intraóssea, intraperitoneal, transmucosa, vaginal, intravítrea, intraorbital, subrretinal, intra-articular, periarticular, local e/ou epicutânea ao sujeito.
Em algumas modalidades, o genoma do vírus do herpes recombinante, o vírus do herpes e/ou a composição farmacêutica são administrados por via oral, intranasal, intratraqueal ou por inalação ao sujeito.
Em algumas modalidades, o genoma do vírus do herpes recombinante, o vírus do herpes e/ou a composição farmacêutica são administrados por inalação ao sujeito.
Em algumas modalidades, o genoma do vírus do herpes recombinante, o vírus do herpes e/ou a composição farmacêutica são administrados por via oral, intranasal, intratraqueal ou por inalação ao sujeito.
Em algumas modalidades, o genoma do vírus do herpes recombinante, o vírus do herpes e/ou a composição farmacêutica são administrados usando um inalador de pó seco, um inalador dosado pressurizado, um inalador de névoa suave, um nebulizador ou um dispositivo de aerossol eletro-hidrodinâmico.
Em algumas modalidades, o genoma do vírus do herpes recombinante, o vírus do herpes e/ou a composição farmacêutica são administrados por meio de um
16 / 101 nebulizador (por exemplo, um nebulizador de malha vibratória).
[0024] Outros aspectos da presente divulgação se referem a um artigo de fabricação ou kit compreendendo qualquer um dos genomas do vírus do herpes recombinante, vírus do herpes, medicamentos e/ou composições farmacêuticas aqui descritos e instruções para a administração do genoma do vírus do herpes recombinante, vírus do herpes, medicamento, ou composição farmacêutica. Em algumas modalidades, o artigo de fabricação ou kit compreende ainda um dispositivo para aerossolizar o genoma do vírus do herpes recombinante, vírus do herpes, medicamento e/ou composição farmacêutica. Em algumas modalidades, o dispositivo é um inalador de pó seco, um inalador dosado pressurizado, um inalador de névoa suave, um nebulizador ou um dispositivo aerossol eletro-hidrodinâmico. Em algumas modalidades, o dispositivo é um nebulizador (por exemplo, um nebulizador de malha vibratória).
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0025] FIGS. 1A-1I mostram esquemas de genomas de vírus herpes simplex de tipo selvagem e modificados. FIG. 1A mostra um genoma de vírus herpes simplex de tipo selvagem. FIG. 1B mostra um genoma de vírus herpes simplex modificado compreendendo deleções da sequência de codificação de ICP4 (ambas as cópias), com um cassete de expressão contendo um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo CFTR humano integrado em cada um dos loci ICP4. FIG. 1C mostra um genoma de vírus herpes simplex modificado compreendendo deleções das sequências de codificação de ICP4 (ambas as cópias) e UL41, com um cassete de expressão contendo um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo CFTR humano integrado em cada um dos loci ICP4. FIG. 1D mostra um genoma de vírus herpes simplex modificado compreendendo deleções das sequências de codificação de ICP4 (ambas as cópias) e UL41, com um cassete de expressão contendo um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo CFTR integrado no
17 / 101 locus UL41. FIG. 1E mostra um genoma de vírus herpes simplex modificado compreendendo deleções das sequências de codificação de ICP4 (ambas as cópias) e ICP22, com um cassete de expressão contendo um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo CFTR humano integrado em cada um dos loci ICP4. FIG. 1F mostra um genoma de vírus herpes simplex modificado compreendendo deleções das sequências de codificação de ICP4 (ambas as cópias) e ICP22, com um cassete de expressão contendo um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo CFTR integrado no locus ICP22. FIG. 1G mostra um genoma de vírus herpes simplex modificado compreendendo deleções das sequências de codificação de ICP4 (ambas as cópias), UL41 e ICP22, com um cassete de expressão contendo um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo CFTR humano integrado em cada um dos loci ICP4. FIG. 1H mostra um genoma de vírus herpes simplex modificado compreendendo deleções das sequências de codificação de ICP4 (ambas as cópias), UL41 e ICP22, com um cassete de expressão contendo um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo CFTR integrado no locus UL41. FIG. 1I mostra um genoma de vírus herpes simplex modificado compreendendo deleções das sequências de codificação de ICP4 (ambas as cópias), UL41 e ICP22, com um cassete de expressão contendo um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo CFTR integrado no locus ICP22.
[0026] FIG. 2 mostra a expressão de CFTR humano em células epiteliais primárias de pequenas vias aéreas (SAECs) derivadas de pacientes com fibrose cística (CF) infectadas nas multiplicidades indicadas de infecção (MOIs) com um vetor HSV-CFTR, conforme avaliado por análise qRT-PCR. SAECs de CF infectados simulados foram usados como um controle negativo. Os dados são apresentados como a média de duas repetições ± SEM.
[0027] FIG. 3 mostra a expressão da proteína CFTR humana em SAECs primários derivados de pacientes com CF infectados nos MOIs indicados com um vetor HSV-CFTR, conforme avaliado por análise de
18 / 101 western blot. SAECs de CF infectados simulados foram usados como um controle negativo. GAPDH foi usado como um controle de carregamento.
[0028] FIGS. 4A-4B mostram imagens de imunofluorescência representativas da expressão da proteína CFTR humana em SAECs de pacientes com CF primário com infecção simulada ou infectado com HSV- CFTR. FIG. 4A mostra o aumento dependente da dose na expressão da proteína CFTR humana após a infecção de SAECs CF primários com o aumento de MOIs de HSV-CFTR. FIG. 4B mostra a localização celular relativa da proteína CFTR humana em SAECs de CF primários infectados com HSV-CFTR (MOI 3) ou com infecção simulada (MOI 0). A coloração DAPI foi usada para visualizar os núcleos.
[0029] FIG. 5 mostra a funcionalidade da proteína CFTR humana em SAECs primários derivados de pacientes com CF infectados nos MOIs indicados com um vetor HSV-CFTR, conforme avaliado por um ensaio de absorção de corante fluorescente. SAECs de CF infectados simulados foram usados como um controle negativo. Os dados são apresentados como a média ± SEM.
[0030] FIGS. 6A-6C mostram análises de organoides intestinais derivados do paciente com fibrose cística G542X / G542X (PDOs) infectados com HSV-CFTR nos MOIs indicados. Veículo sozinho ou um vetor HSV que codifica mCherry (mCherry) foram usados como controles negativos; G418 foi usado como controle positivo. FIG. 6A mostra imagens de campo claro representativas de G542X / G542X PDOs 24 horas após o tratamento do veículo ou após a transdução com HSV-CFTR ou HSV-mCherry em um MOI de 10. PDOs tratados com veículo isolados de um indivíduo saudável (tipo selvagem) foram incluídos e fotografados como um comparador. FIG. 6B mostra imagens representativas de organoides corados com calceína e a quantificação do tamanho médio dos organoides antes da adição de forscolina (Frsk) (t = 0). FIG. 6C mostra imagens representativas de organoides corados
19 / 101 com calceína e a quantificação do tamanho médio dos organoides 60 minutos após a adição de 2 µM de Frsk (t = 60). *** p <0,001; **** p <0,0001.
[0031] FIGS. 7A-7B mostram análises de organoides intestinais derivados do paciente com fibrose cística F508del / F508del (PDOs) infectados com HSV-CFTR nos MOIs indicados. Veículo sozinho ou um vetor HSV que codifica mCherry (mCherry) foram usados como controles negativos; Orkambi® foi usado como controle positivo. FIG. 7A mostra imagens representativas de organoides corados com calceína e a quantificação do tamanho médio dos organoides antes da adição de forscolina (Frsk) (t = 0). FIG. 7B mostra imagens representativas de organoides corados com calceína e a quantificação do tamanho médio dos organoides 60 minutos após a adição de 2 µM de Frsk (t = 60). *p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001; ****p<0,0001.
[0032] FIGS. 8A-8B mostram análises de organoides intestinais derivados de pacientes com fibrose cística W1282X / W1282X (PDOs) infectados com HSV-CFTR nos MOIs indicados. Veículo sozinho ou um vetor HSV que codifica mCherry (mCherry) foram usados como controles negativos. FIG. 8A mostra imagens representativas de organoides corados com calceína e a quantificação do tamanho médio dos organoides antes da adição de forscolina (Frsk) (t = 0). FIG. 8B mostra imagens representativas de organoides corados com calceína e a quantificação do tamanho médio dos organoides 60 minutos após a adição de 2 µM de Frsk (t = 60). *p<0,05; ***p<0,001.
[0033] FIGS. 9A-9B mostram análises de organoides intestinais derivados do paciente com fibrose cística F508del / F508del (PDOs) infectados com HSV-CFTR nos MOIs indicados. Veículo sozinho ou um vetor HSV que codifica mCherry (mCherry) foram usados como controles negativos; Orkambi® foi usado como controle positivo. FIG. 9A mostra imagens representativas de organoides corados com calceína e a quantificação do tamanho médio dos organoides antes da adição de forscolina (Frsk) (t = 0).
20 / 101 FIG. 9B mostra imagens representativas de organoides corados com calceína e a quantificação do tamanho médio dos organoides 60 minutos após a adição de 2 µM de Frsk (t = 60). ****p<0,0001.
[0034] FIGS. 10A-10C mostram análises de ácido nucleico e proteína mCherry em biópsias de pulmão e traqueia colhidas 48 horas após a administração intranasal ou intratraqueal de um vetor HSV que codifica mCherry (HSV-mCherry) ou controle de veículo (simulação). FIG. 10A mostra os níveis de transcritos de mCherry presentes em biópsias de pulmão e traqueia, conforme avaliado por análise de qRT-PCR. Os dados são apresentados como a média de seis repetições ± SEM para HSV-mCherry; os dados são apresentados como a média de quatro repetições ± SEM para o controle do veículo. FIG. 10B mostra imagens de imunofluorescência representativas da expressão da proteína mCherry em biópsias de pulmão após administração intranasal de HSV-mCherry ou controle de veículo. A coloração DAPI foi usada para visualizar os núcleos; a coloração com citoqueratina foi usada para visualizar as células epiteliais. FIG. 10C mostra imagens de imunofluorescência representativas da expressão da proteína mCherry em biópsias de pulmão após administração intratraqueal de HSV- mCherry ou controle de veículo. A coloração DAPI foi usada para visualizar os núcleos; a coloração com citoqueratina foi usada para visualizar as células epiteliais.
DESCRIÇÃO DETALHADA
[0035] A descrição a seguir apresenta métodos exemplificativos, parâmetros e semelhantes. Deve ser reconhecido, no entanto, que tal descrição não se destina a ser uma limitação no escopo da presente divulgação, mas, em vez disso, é fornecida como uma descrição de modalidades exemplificativas. I. Técnicas Gerais
[0036] As técnicas e procedimentos descritos ou referenciados neste documento são geralmente bem compreendidos e comumente empregados
21 / 101 usando metodologia convencional por aqueles versados na técnica, tais como, por exemplo, as metodologias amplamente utilizadas descritas em Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3d edition (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel, et al. eds., (2003)); the series Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.): PCR 2: A Practical Approach (M.J. MacPherson, B.D. Hames and G.R. Taylor eds. (1995)), Harlow and Lane, eds. (1988); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed., 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J.E. Cellis, ed., 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (R.I. Freshney), ed., 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (J.P. Mather and P.E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B. Griffiths, and D.G. Newell, eds., 1993-8) J. Wiley and Sons; Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller and M.P. Calos, eds., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999). II. Definições
[0037] Antes de descrever a invenção em detalhes, deve ser entendido que esta invenção não está limitada às composições particulares ou sistemas biológicos que podem, é claro, variar. Também deve ser entendido que a terminologia usada neste documento tem o propósito de descrever modalidades particulares apenas e não se destina a ser limitante.
[0038] Conforme usado neste documento, as formas singulares "um/uma", "um/uma" e "o/a" incluem as formas do plural referentes, a menos que o contexto indique claramente o contrário. Assim, por exemplo, a referência a "uma molécula" inclui opcionalmente uma combinação de duas ou mais dessas moléculas e semelhantes.
[0039] Conforme usado neste documento, o termo "e/ou" inclui
22 / 101 quaisquer e todas as combinações de um ou mais dos itens listados associados. Por exemplo, o termo "a e/ou b" pode referir-se a "a sozinho", "b sozinho", "a ou b" ou "a e b"; o termo "a, b e/ou c" pode referir-se a "a sozinho", "b sozinho", "c sozinho", "a ou b", "a ou c", "b ou c", "a , b, ou c ”,“ a e b ”,“ a e c ”,“ b e c ”ou“ a, b e c ”; etc.
[0040] Conforme usado neste documento, o termo "cerca de" refere- se à faixa de erro usual para o respectivo valor prontamente conhecido pelo versado neste campo técnico. A referência a "cerca de" um valor ou parâmetro inclui neste documento (e descreve) modalidades que se referem a esse valor ou parâmetro, per se.
[0041] Entende-se que os aspectos e as modalidades da invenção descritos neste documento incluem "compreendendo", "consistindo" e "consistindo essencialmente em" aspectos e modalidades.
[0042] Como utilizado, os termos "polinucleotídeo", "sequência de ácido nucleico", "ácido nucleico" e variações dos mesmos devem ser genéricos para polidesoxirribonucleotídeos (contendo 2-desoxi-D-ribose), para polirribonucleotídeos (contendo D-ribose), para qualquer outro tipo de polinucleotídeo que é um N-glicosídeo de uma base de purina ou pirimidina e para outros polímeros contendo espinhas dorsais não nucleotídicas, desde que os polímeros contenham nucleobases em uma configuração que permita o pareamento de base e empilhamento de base, conforme encontrado no DNA e RNA. Assim, estes termos incluem tipos conhecidos de modificações de sequência de ácido nucleico, por exemplo, substituição de um ou mais dos nucleotídeos de ocorrência natural por um análogo e modificações inter- nucleotídeos.
[0043] Um ácido nucleico está ligado de forma operacional quando é colocado em uma relação funcional com outra sequência de ácido nucleico. Por exemplo, um promotor ou intensificador está operacionalmente ligado a uma sequência de codificação se afetar a transcrição da sequência, ou um sítio
23 / 101 de ligação ao ribossoma está operacionalmente ligado a uma sequência de codificação se estiver posicionado de modo a facilitar a tradução. Geralmente, "operacionalmente ligado" ou "operavelmente ligado" significa que as sequências de DNA ou RNA sendo ligadas são contíguas.
[0044] Como utilizado neste documento, o termo "vetor" refere-se a elementos distintos que são usados para introduzir ácidos nucleicos heterólogos nas células para expressão ou replicação dos mesmos. Um vetor de expressão inclui vetores capazes de expressar ácidos nucleicos que estão operacionalmente ligados a sequências regulatórias, tais como regiões promotoras, que são capazes de efetuar a expressão de tais ácidos nucleicos. Assim, um vetor de expressão pode referir-se a um construto de DNA ou RNA, tal como um plasmídeo, um fago, vírus recombinante ou outro vetor que, após introdução em uma célula hospedeira apropriada, resulta na expressão dos ácidos nucleicos. Os vetores de expressão apropriados são bem conhecidos pelos versados na técnica e incluem aqueles que são replicáveis em células eucarióticas e aqueles que permanecem epissômicos ou aqueles que se integram no genoma da célula hospedeira.
[0045] Como utilizado neste documento, uma "estrutura de leitura aberta" ou "ORF" refere-se a um trecho contínuo de ácidos nucleicos, DNA ou RNA, que codificam uma proteína ou polipeptídeo. Normalmente, os ácidos nucleicos compreendem um sinal de início de tradução ou códon de iniciação, como ATG ou AUG, e um códon de terminação.
[0046] Como utilizado neste documento, uma "região não traduzida" ou "UTR" refere-se a ácidos nucleicos não traduzidos nas extremidades 5' e/ou 3' de uma estrutura de leitura aberta. A inclusão de uma ou mais UTRs em um polinucleotídeo pode afetar a regulação pós-transcricional, a estabilidade do mRNA e/ou a tradução do polinucleotídeo.
[0047] Como utilizado neste documento, o termo "transgene" refere- se a um polinucleotídeo que é capaz de ser transcrito em RNA e traduzido
24 / 101 e/ou expresso em condições apropriadas após ser introduzido em uma célula. Em algumas modalidades, ele confere uma propriedade desejada a uma célula na qual foi introduzido ou, de outra forma, leva a um resultado terapêutico ou diagnóstico desejado.
[0048] Os termos "polipeptídeo", "peptídeo" e "proteína" são usados de modo intercambiável aqui para se referir a um polímero de resíduos de aminoácidos.
[0049] Como utilizado neste documento, um "sujeito", "hospedeiro" ou um "indivíduo" refere-se a qualquer animal classificado como mamífero, incluindo humanos, animais domésticos e de fazenda, e zoológico, de esportes ou animais de estimação, como cães, cavalos, gatos, vacas, bem como animais usados em pesquisas, como camundongos, ratos, hamsters, coelhos e primatas não humanos, etc. Em algumas modalidades, o mamífero é um humano.
[0050] Como utilizado neste documento, os termos "formulação farmacêutica" ou "composição farmacêutica" referem-se a uma preparação que está em uma forma que permite que a atividade biológica do(s) ingrediente(s) ativo(s) seja eficaz e que não contém componentes adicionais que são inaceitavelmente tóxicos para um sujeito ao qual a composição ou formulação seria administrada. Excipientes "farmaceuticamente aceitáveis" (por exemplo, veículos, aditivos) são aqueles que podem ser razoavelmente administrados a um mamífero para fornecer uma dose eficaz do(s) ingrediente(s) ativo(s) empregado(s).
[0051] Como utilizado neste documento, uma "quantidade eficaz" é pelo menos a quantidade mínima necessária para afetar uma melhoria mensurável ou prevenção de um ou mais sintomas de um distúrbio particular. Uma “quantidade eficaz” pode variar de acordo com fatores como o estado da doença, idade, sexo e peso do paciente. Uma quantidade terapeuticamente eficaz também é uma na qual quaisquer efeitos tóxicos ou prejudiciais dos componentes são compensados pelos efeitos terapeuticamente benéficos. Para
25 / 101 uso profilático, os resultados benéficos ou desejados incluem resultados como eliminar ou reduzir o risco, diminuir a gravidade ou retardar o início da doença, suas complicações e fenótipos patológicos intermediários que se apresentam durante o desenvolvimento da doença. Para uso terapêutico, os resultados benéficos ou desejados incluem resultados clínicos, como diminuição de um ou mais sintomas decorrentes da doença, aumento da qualidade de vida de quem sofre da doença, diminuição da dose de outros medicamentos usados para tratar os sintomas da doença, retardamento da progressão da doença e/ou prolongamento da sobrevida. Uma quantidade eficaz pode ser administrada em uma ou mais administrações. Para os fins da presente divulgação, uma quantidade eficaz de um ácido nucleico, vírus e/ou composição farmacêutica recombinante é uma quantidade suficiente para realizar o tratamento profilático ou terapêutico, direta ou indiretamente. Como é entendido no contexto clínico, uma quantidade eficaz de um ácido nucleico, vírus e/ou composição farmacêutica recombinante pode ou não ser alcançada em conjunto com outra droga, composto ou composição farmacêutica. Assim, uma "quantidade eficaz" pode ser considerada no contexto da administração de um ou mais agentes terapêuticos, e um único agente pode ser considerado administrado em uma quantidade eficaz se, em conjunto com um ou mais outros agentes, um resultado desejável puder ser ou for alcançado.
[0052] Conforme usado neste documento, "tratamento" se refere à intervenção clínica projetada para alterar o curso natural do indivíduo ou célula sendo tratada durante o curso da patologia clínica. Os efeitos desejáveis do tratamento incluem diminuir a taxa de progressão da doença / distúrbio / defeito, melhoria ou paliação do estado da doença / distúrbio / defeito e remissão ou melhora do prognóstico. Por exemplo, um indivíduo é “tratado” com sucesso se um ou mais sintomas associados a uma doença pulmonar crônica (por exemplo, fibrose cística ou COPD) são atenuados ou eliminados.
[0053] Como utilizado neste documento, o termo "retardar a
26 / 101 progressão de" uma doença / distúrbio / defeito refere-se a adiar, dificultar, atrasar, retardar, estabilizar e/ou adiar o desenvolvimento da doença / distúrbio / defeito (por exemplo, fibrose cística ou COPD). Esse atraso pode variar em diferentes períodos de tempo, dependendo do histórico da doença e/ou do indivíduo a ser tratado. Como é evidente para um versado na técnica, um atraso suficiente ou significativo pode, com efeito, abranger a prevenção, em que o indivíduo não desenvolve a doença. III. Sequência de Ácido Nucleico Recombinante
[0054] Certos aspectos da presente divulgação se referem a ácidos nucleicos recombinantes (por exemplo, ácidos nucleicos recombinantes isolados) compreendendo um ou mais (por exemplo, um ou mais, dois ou mais, três ou mais, quatro ou mais, cinco ou mais, dez ou mais, etc.) polinucleotídeos que codificam um polipeptídeo CFTR (por exemplo, um polipeptídeo CFTR humano). Em algumas modalidades, o ácido nucleico recombinante compreende um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo CFTR. Em algumas modalidades, o ácido nucleico recombinante compreende dois polinucleotídeos que codificam um polipeptídeo CFTR. Em algumas modalidades, o ácido nucleico recombinante compreende três polinucleotídeos que codificam um polipeptídeo CFTR.
[0055] Em algumas modalidades, o ácido nucleico recombinante é um vetor. Em algumas modalidades, o ácido nucleico recombinante é um vetor viral. Em algumas modalidades, o ácido nucleico recombinante é um vetor viral de herpes. Em algumas modalidades, o ácido nucleico recombinante é um amplicon do vírus do herpes simplex. Em algumas modalidades, o ácido nucleico recombinante é um genoma do vírus do herpes recombinante. Em algumas modalidades, o ácido nucleico recombinante é um genoma de vírus herpes simplex recombinante. Em algumas modalidades, o ácido nucleico recombinante é um genoma do vírus do herpes simplex tipo 1 (HSV-1) recombinante.
27 / 101 Polinucleotídeos que codificam polipeptídeos reguladores de condutância transmembranar de fibrose cística (CFTR)
[0056] Em algumas modalidades, a presente divulgação se refere a um ácido nucleico recombinante compreendendo um ou mais polinucleotídeos compreendendo a sequência de codificação de um gene CFTR (por exemplo, um gene CFTR humano), ou quaisquer porções do mesmo. A sequência de qualquer gene CFTR adequado (incluindo qualquer isoforma do mesmo) conhecido na técnica pode ser codificada por um polinucleotídeo da presente divulgação, incluindo, por exemplo, um gene CFTR humano (ver, por exemplo, NCBI Gene ID: 1080; SEQ ID NO : 1 ou SEQ ID NO: 3), um gene CFTR de chimpanzé (ver, por exemplo, NCBI Gene ID: 463674), um gene CFTR de camundongo (ver, por exemplo, NCBI Gene ID: 12638), um gene CFTR de rato (ver, por exemplo, NCBI Gene ID: 24255), um gene CFTR de cão (ver, por exemplo, NCBI Gene ID: 492302), um gene CFTR de coelho (ver, por exemplo, NCBI Gene ID: 100009471), um gene CFTR de vaca (ver, por exemplo, NCBI Gene ID: 281067), um gene CFTR de macaco rhesus (ver, por exemplo, NCBI Gene ID: 574346), etc. Em algumas modalidades, um polinucleotídeo da presente divulgação compreende uma sequência com pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, em pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência com a sequência de qualquer um dos genes CFTR aqui descritos ou conhecidos na técnica (e/ou as sequências de codificação dos mesmos). Os métodos de identificação de homólogos / ortólogos do gene CFTR de espécies adicionais são conhecidos por aqueles versados na técnica, incluindo, por exemplo, o uso de um programa de alinhamento de sequência de ácido nucleico, como o BLAST® blastn suite.
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[0057] Em algumas modalidades, um polinucleotídeo da presente divulgação compreende uma variante otimizada por códons de qualquer um dos genes CFTR aqui descritos ou conhecidos na técnica. Em algumas modalidades, um polinucleotídeo da presente divulgação compreende uma variante otimizada por códons da sequência de codificação de qualquer um dos genes CFTR aqui descritos ou conhecidos na técnica. Em algumas modalidades, o uso de uma variante otimizada por códons de um gene CFTR aumenta a estabilidade e/ou o rendimento da expressão heteróloga (RNA e/ou proteína) do polipeptídeo CFTR codificado em uma célula alvo (por exemplo, uma célula humana alvo, como um célula epitelial das vias aéreas humanas), em comparação com a estabilidade e/ou rendimento de expressão heteróloga de uma sequência de tipo selvagem não otimizada para códons correspondente. Qualquer método adequado conhecido na técnica para realizar a otimização de códon de uma sequência para expressão em uma ou mais células alvo (por exemplo, uma ou mais células do pulmão) pode ser usado, incluindo, por exemplo, pelos métodos descritos por Fath et al . (PLoS One. 2011 Mar 3;6(3): e17596).
[0058] Em algumas modalidades, um ou mais polinucleotídeos da presente divulgação compreendem a sequência de codificação de um gene CFTR humano.
[0059] Em algumas modalidades, um polinucleotídeo da presente divulgação compreende uma sequência com pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, em pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência com a sequência de SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, um polinucleotídeo da presente divulgação compreende a sequência de SEQ ID NO: 1.
29 / 101
[0060] Em algumas modalidades, um polinucleotídeo da presente divulgação compreende um truncamento 5', um truncamento 3' ou um fragmento da sequência de SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, o truncamento 5', truncamento 3' ou fragmento da sequência da SEQ ID NO: 1 é um polinucleotídeo que tem pelo menos 25, pelo menos 50, pelo menos 75, pelo menos 100, pelo menos 125, pelo menos pelo menos 150, pelo menos 175, pelo menos 200, pelo menos 250, pelo menos 300, ou pelo menos 350, pelo menos 400, pelo menos 450, pelo menos 500, pelo menos 750, pelo menos 1000, pelo menos 1250, pelo menos 1500, pelo menos 1750, pelo menos 2000, pelo menos 2250, pelo menos 2500, pelo menos 2750, pelo menos 3000, pelo menos 3250, pelo menos 3500, pelo menos 3750, pelo menos 4000, pelo menos 4250, mas menos de 4443 nucleotídeos consecutivos de SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, um polinucleotídeo da presente divulgação compreende uma sequência com pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, em pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência com a sequência de ácidos nucleicos 1-4440 de SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, um polinucleotídeo da presente divulgação compreende a sequência de ácidos nucleicos 1-4440 de SEQ ID NO: 1.
[0061] Em algumas modalidades, um polinucleotídeo da presente divulgação compreende uma sequência com pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, em pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência com a sequência de SEQ ID NO: 3. Em algumas modalidades, um polinucleotídeo da presente divulgação compreende a sequência de SEQ ID
30 / 101 NO: 3.
[0062] Em algumas modalidades, um polinucleotídeo da presente divulgação compreende um truncamento 5', um truncamento 3' ou um fragmento da sequência de SEQ ID NO: 3. Em algumas modalidades, o truncamento 5', truncamento 3' ou fragmento da sequência da SEQ ID NO: 3 é um polinucleotídeo que tem pelo menos 25, pelo menos 50, pelo menos 75, pelo menos 100, pelo menos 125, pelo menos pelo menos 150, pelo menos 175, pelo menos 200, pelo menos 250, pelo menos 300, ou pelo menos 350, pelo menos 400, pelo menos 450, pelo menos 500, pelo menos 750, pelo menos 1000, pelo menos 1250, pelo menos 1500, pelo menos 1750, pelo menos 2000, pelo menos 2250, pelo menos 2500, pelo menos 2750, pelo menos 3000, pelo menos 3250, pelo menos 3500, pelo menos 3750, pelo menos 4000, pelo menos 4250, mas menos de 4260 nucleotídeos consecutivos de SEQ ID NO: 3. Em algumas modalidades, um polinucleotídeo da presente divulgação compreende uma sequência com pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, em pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência com a sequência de ácidos nucleicos 1-4257 de SEQ ID NO: 3. Em algumas modalidades, um polinucleotídeo da presente divulgação compreende a sequência de ácidos nucleicos 1-4257 de SEQ ID NO: 3.
[0063] Em algumas modalidades, um polinucleotídeo da presente divulgação compreende a sequência de codificação de uma variante otimizada por códon de um gene CFTR humano.
[0064] Em algumas modalidades, um polinucleotídeo da presente divulgação compreende uma sequência com pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, em pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%,
31 / 101 pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência com a sequência de SEQ ID NO: 2. Em algumas modalidades, um polinucleotídeo da presente divulgação compreende a sequência de SEQ ID NO: 2.
[0065] Em algumas modalidades, um polinucleotídeo da presente divulgação compreende um truncamento 5', um truncamento 3' ou um fragmento da sequência de SEQ ID NO: 2. Em algumas modalidades, o truncamento 5', truncamento 3' ou fragmento da sequência da SEQ ID NO: 2 é um polinucleotídeo que tem pelo menos 25, pelo menos 50, pelo menos 75, pelo menos 100, pelo menos 125, pelo menos pelo menos 150, pelo menos 175, pelo menos 200, pelo menos 250, pelo menos 300, ou pelo menos 350, pelo menos 400, pelo menos 450, pelo menos 500, pelo menos 750, pelo menos 1000, pelo menos 1250, pelo menos 1500, pelo menos 1750, pelo menos 2000, pelo menos 2250, pelo menos 2500, pelo menos 2750, pelo menos 3000, pelo menos 3250, pelo menos 3500, pelo menos 3750, pelo menos 4000, pelo menos 4250, mas menos de 4443 nucleotídeos consecutivos de SEQ ID NO: 2. Em algumas modalidades, um polinucleotídeo da presente divulgação compreende uma sequência com pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, em pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência com a sequência de ácidos nucleicos 1-4440 de SEQ ID NO: 2. Em algumas modalidades, um polinucleotídeo da presente divulgação compreende a sequência de ácidos nucleicos 1-4440 de SEQ ID NO: 2.
[0066] Em algumas modalidades, um polinucleotídeo da presente divulgação compreende uma sequência com pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%,
32 / 101 pelo menos 89%, em pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência com a sequência de SEQ ID NO: 4. Em algumas modalidades, um polinucleotídeo da presente divulgação compreende a sequência de SEQ ID NO: 4.
[0067] Em algumas modalidades, um polinucleotídeo da presente divulgação compreende um truncamento 5', um truncamento 3' ou um fragmento da sequência de SEQ ID NO: 4. Em algumas modalidades, o truncamento 5', truncamento 3' ou fragmento da sequência da SEQ ID NO: 4 é um polinucleotídeo que tem pelo menos 25, pelo menos 50, pelo menos 75, pelo menos 100, pelo menos 125, pelo menos pelo menos 150, pelo menos 175, pelo menos 200, pelo menos 250, pelo menos 300, ou pelo menos 350, pelo menos 400, pelo menos 450, pelo menos 500, pelo menos 750, pelo menos 1.000, pelo menos 1.250, pelo menos 1.500, pelo menos 1.750, pelo menos 2.000, pelo menos 2.250, pelo menos 2.500, pelo menos 2.750, pelo menos 3.000, pelo menos 3.250, pelo menos 3.500, pelo menos 3.750, pelo menos 4.000, pelo menos 4.250, mas menos de 4.260 nucleotídeos consecutivos de SEQ ID NO: 4. Em algumas modalidades, um polinucleotídeo da presente divulgação compreende uma sequência com pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, em pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência com a sequência de ácidos nucleicos 1-4257 de SEQ ID NO: 4. Em algumas modalidades, um polinucleotídeo da presente divulgação compreende a sequência de ácidos nucleicos 1-4257 de SEQ ID NO: 4.
[0068] Em algumas modalidades, um polinucleotídeo da presente
33 / 101 divulgação compreende uma sequência com pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, em pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com uma sequência de ácido nucleico selecionada de SEQ ID NOS: 1-4. Em algumas modalidades, um polinucleotídeo da presente divulgação compreende uma sequência selecionada de SEQ ID NOS: 1-4. Em algumas modalidades, um polinucleotídeo da presente divulgação compreende uma sequência com pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, em pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com uma sequência de ácido nucleico selecionada de SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2. Em algumas modalidades, um polinucleotídeo da presente divulgação compreende uma sequência selecionada de SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2. Em algumas modalidades, um polinucleotídeo da presente divulgação compreende uma sequência com pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, em pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com uma sequência de ácido nucleico selecionada de SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 4. Em algumas modalidades, um polinucleotídeo da presente divulgação compreende uma sequência selecionada de SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 4.
[0069] Um polinucleotídeo da presente divulgação (por exemplo, codificando um polipeptídeo CFTR humano) pode ainda codificar sequências de codificação e não codificação adicionais. Exemplos de sequências de codificação e não codificação adicionais podem incluir, mas não estão limitados a, sequências que codificam marcadores polipeptídicos adicionais (por exemplo, codificados in-frame com a proteína CFTR a fim de produzir
34 / 101 uma proteína de fusão), íntrons (por exemplo , nativos, modificados, ou íntrons heterólogos), UTRs 5' e/ou 3' (por exemplo, UTRs 5' e/ou 3' nativos, modificados ou heterólogos) e semelhantes. Exemplos de marcadores polipeptídicos adequados podem incluir, mas não estão limitados a qualquer combinação de etiquetas de purificação, tais como etiquetas his, etiquetas marcadoras, proteína de ligação de maltose e etiquetas de glutationa-S- transferase, etiquetas de detecção, tais como etiquetas que podem ser detectadas fotometricamente (por exemplo, proteína fluorescente verde, proteína fluorescente vermelha, etc.) e etiquetas que têm uma atividade enzimática detectável (por exemplo, fosfatase alcalina, etc.), etiquetas contendo sequências secretoras, sequências de sinal, sequências líderes e/ou sequências de estabilização, sítios de clivagem de protease (por exemplo, sítios de clivagem de furina, sítios de clivagem TEV, sítios de clivagem de trombina, etc.), e semelhantes. Em algumas modalidades, as UTRs 5' e/ou 3' aumentam a estabilidade, localização e/ou eficiência de tradução dos polinucleotídeos. Em algumas modalidades, as UTRs 5' e/ou 3' melhoram o nível e/ou a duração da expressão da proteína. Em algumas modalidades, as UTRs 5' e/ou 3' incluem elementos (por exemplo, um ou mais sítios de ligação de miRNA, etc.) que podem bloquear ou reduzir a expressão fora do alvo (por exemplo, inibir a expressão em tipos de células específicos (por exemplo, células neuronais), em momentos específicos do ciclo celular, em estágios de desenvolvimento específicos, etc.). Em algumas modalidades, as UTRs 5' e/ou 3' incluem elementos (por exemplo, um ou mais sítios de ligação de miRNA, etc.) que podem intensificar a expressão de CFTR em tipos de células específicos.
[0070] Em algumas modalidades, um polinucleotídeo da presente divulgação (por exemplo, codificando um polipeptídeo CFTR humano) está operacionalmente ligado a um ou mais (por exemplo, um ou mais, dois ou mais, três ou mais, quatro ou mais, cinco ou mais, dez ou mais, etc.)
35 / 101 sequências regulatórias.
O termo "sequência regulatória" inclui promotores, potenciadores e outros elementos de controle d expressão (por exemplo, sinais de poliadenilação). Qualquer intensificador(es) adequado(s) conhecido(s) na técnica pode ser usado, incluindo, por exemplo, sequências intensificadoras de genes de mamíferos (tais como globina, elastase, albumina, α-fetoproteína, insulina e semelhantes), sequências intensificadoras de um vírus de células eucarióticas (tal como intensificador de SV40 no lado tardio da origem de replicação (pb 100-270), o intensificador de promotor inicial de citomegalovírus, o intensificador de polioma no lado tardio da origem de replicação, intensificadores de adenovírus e semelhantes) e quaisquer combinações dos mesmos.
Qualquer isolador(es) adequado(s) conhecido(s) na técnica pode(m) ser usado(s), incluindo, por exemplo, vírus herpes simplex (HSV) elementos de fronteira da cromatina (CTRL/ligação/isolador de CTCF) CTRL1 e/ou CTRL2, isolador de sítio hipersensível de frango 4 (cHS4 ), elemento de abertura de cromatina onipresente HNRPA2B1 — CBX3 humano (UCOE), a região de fixação de andaime / matriz (S/MAR) do gene beta do interferon humano (IFNB1) e quaisquer combinações dos mesmos.
Qualquer promotor adequado (por exemplo, adequado para a transcrição em células hospedeiras de mamíferos) conhecido na técnica pode ser usado, incluindo, por exemplo, promotores obtidos a partir de genomas de vírus (tais como vírus polioma, vírus da varíola aviária, adenovírus (tal como Adenovírus 2) , vírus do papiloma bovino, vírus do sarcoma aviário, citomegalovírus, um retrovírus, vírus da hepatite B, Vírus Símio 40 (SV40) e semelhantes), promotores de genes heterólogos de mamíferos (como o promotor de actina (por exemplo, o promotor β-actina), um promotor de ubiquitina (por exemplo, um promotor de ubiquitina C (UbC)), um promotor de fosfoglicerato cinase (PGK), um promotor de imunoglobulina, de promotores de proteína de choque térmico e semelhantes), promotores de genes de mamíferos nativos e/ou homólogos (por exemplo, um promotor do
36 / 101 gene CFTR humano), promotores sintéticos (como o promotor CAGG) e quaisquer combinações dos mesmos, desde que tais promotores sejam compatíveis com as células hospedeiras. As sequências regulatórias podem incluir aquelas que dirigem a expressão constitutiva de um ácido nucleico, bem como sequências regulatórias específicas de tecido e/ou induzíveis ou reprimíveis.
[0071] Em algumas modalidades, um polinucleotídeo da presente divulgação está operacionalmente ligado a um ou mais promotores heterólogos. Em algumas modalidades, um ou mais promotores heterólogos são um ou mais dos promotores constitutivos, promotores específicos de tecido, promotores temporais, promotores espaciais, promotores indutíveis e promotores repressíveis. Em algumas modalidades, um ou mais promotores heterólogos são um ou mais dentre o promotor precoce imediato do citomegalovírus humano (HCMV), o promotor do fator de alongamento humano-1 (EF1), o promotor da β-actina humana, o promotor UbC humano, o promotor PGK humano, o promotor CAGG sintético e quaisquer combinações dos mesmos. Em algumas modalidades, um polinucleotídeo da presente divulgação (por exemplo, codificando um polipeptídeo CFTR humano) está operacionalmente ligado a um promotor de HCMV.
[0072] Em algumas modalidades, um polinucleotídeo da presente divulgação não compreende a sequência de codificação (por exemplo, um transgene que codifica) um polipeptídeo de cadeia alfa-1 (VII) de colágeno (COL7). Em algumas modalidades, um polinucleotídeo da presente divulgação não compreende a sequência de codificação de (por exemplo, um transgene que codifica) um polipeptídeo de Lisil hidroxilase 3 (LH3). Em algumas modalidades, um polinucleotídeo da presente divulgação não compreende a sequência de codificação de (por exemplo, uma codificação de transgene) um polipeptídeo citoesquelético 17 de queratina tipo I (KRT17). Em algumas modalidades, um polinucleotídeo da presente divulgação não
37 / 101 compreende a sequência de codificação (por exemplo, um transgene que codifica) um polipeptídeo transglutaminase (TGM) (por exemplo, um polipeptídeo transglutaminase humano, tal como um polipeptídeo TGM1 humano e/ou um polipeptídeo TGM5 humano). Em algumas modalidades, um polinucleotídeo da presente divulgação não compreende a sequência de codificação de (por exemplo, um transgene que codifica) uma proteína cosmética (por exemplo, proteínas de colágeno, fibronectinas, elastinas, lumicanos, vitronectinas / receptores de vitronectina, lamininas, neuromoduladores, fibrilinas, proteínas de matriz extracelular dérmica adicionais, etc.). Em algumas modalidades, um polinucleotídeo da presente divulgação não compreende a sequência de codificação de (por exemplo, um transgene que codifica) um anticorpo (por exemplo, um anticorpo de comprimento total, um fragmento de anticorpo, etc.). Em algumas modalidades, um polinucleotídeo da presente divulgação não compreende a sequência de codificação (por exemplo, um transgene que codifica) um polipeptídeo do tipo Kazal de inibidor de protease de serina (SPINK) (por exemplo, um polipeptídeo SPINK humano, tal como um polipeptídeo SPINK5). Em algumas modalidades, um polinucleotídeo da presente divulgação não compreende a sequência de codificação de (por exemplo, um transgene que codifica) uma filagrina ou polipeptídeo de filagrina 2 (por exemplo, uma filagrina humana ou polipeptídeo de filagrina 2). Em algumas modalidades, um polinucleotídeo da presente divulgação não compreende a sequência de codificação de (por exemplo, um transgene que codifica) um polipeptídeo de cadeia alfa-1 (VII) de colágeno, um polipeptídeo lisil hidroxilase 3, um polipeptídeo citoesquelético 17 de queratina tipo I e/ou quaisquer polipeptídeos quiméricos dos mesmos.
Em algumas modalidades, um polinucleotídeo da presente divulgação não compreende a sequência de codificação de (por exemplo, um transgene que codifica) um polipeptídeo de cadeia alfa-1 (VII) de colágeno, um polipeptídeo de lisil hidroxilase 3, um
38 / 101 polipeptídeo citoesquelético 17 de queratina tipo I, um polipeptídeo transglutaminase (TGM), um polipeptídeo de filagrina, uma proteína cosmética, um anticorpo, um polipeptídeo SPINK e/ou quaisquer polipeptídeos quiméricos dos mesmos. Polipeptídeos reguladores de condutância transmembranar de fibrose cística (CFTR)
[0073] Em algumas modalidades, a presente divulgação se refere a um ou mais polinucleotídeos que codificam um polipeptídeo CFTR (por exemplo, um polipeptídeo CFTR humano) ou quaisquer porções dos mesmos. Qualquer polipeptídeo CFTR adequado conhecido na técnica pode ser codificado por um polinucleotídeo da presente divulgação, incluindo, por exemplo, um polipeptídeo CFTR humano (ver , por exemplo, número de acessão UniProt P13569; SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 6), um polipeptídeo CFTR de chimpanzé (ver, por exemplo, número de acessão UniProt Q2QLE5), um polipeptídeo CFTR de camundongo (ver, por exemplo, número de acessão UniProt P26361), um polipeptídeo CFTR de rato (ver, por exemplo, número de acessão UniProt P34158), um polipeptídeo CFTR de coelho (ver, por exemplo, número de acessão UniProt Q00554), um polipeptídeo CFTR de macaco rhesus (ver, por exemplo, número de acessão UniProt Q00553), etc. Em algumas modalidades, um polipeptídeo CFTR da presente divulgação compreende uma sequência com pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de qualquer um dos polipeptídeos CFTR aqui descritos ou conhecidos na técnica. Os métodos de identificação de homólogos / ortólogos de polipeptídeos CFTR de espécies adicionais são conhecidos por aqueles versados na técnica, incluindo, por exemplo, o uso de
39 / 101 um programa de alinhamento de sequência de aminoácidos, como o BLAST® blastp suite ou OrthoDB.
[0074] Em algumas modalidades, um polipeptídeo CFTR da presente divulgação é um polipeptídeo CFTR humano.
[0075] Em algumas modalidades, um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo CFTR humano é um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade com a sequência de SEQ ID NO: 5. Em algumas modalidades, um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo CFTR humano é um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5.
[0076] Em algumas modalidades, um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo CFTR humano é um polinucleotídeo que codifica um truncamento N-terminal, um truncamento C-terminal ou um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5. Truncamentos N-terminais, truncamentos C-terminais ou fragmentos podem compreender pelo menos 10, pelo menos 12, pelo menos 14, pelo menos 16, pelo menos 18, pelo menos 20, pelo menos 30, pelo menos 40, pelo menos 50, pelo menos 75, pelo menos 100, pelo menos 150, pelo menos 200, pelo menos 250, pelo menos 300, pelo menos 350, pelo menos 400, pelo menos 450, pelo menos 500, pelo menos 550, pelo menos 600, pelo menos 650, pelo menos 700, pelo menos 750, pelo menos 800, pelo menos 850, pelo menos 900, pelo menos 950, pelo menos 1000, pelo menos 1100, pelo menos 1200, pelo menos 1300, pelo menos 1400, mas menos que 1480, aminoácidos consecutivos de SEQ ID NO: 5.
40 / 101
[0077] Em algumas modalidades, um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo CFTR humano é um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade com a sequência de SEQ ID NO: 6. Em algumas modalidades, um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo CFTR humano é um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6.
[0078] Em algumas modalidades, um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo CFTR humano é um polinucleotídeo que codifica um truncamento N-terminal, um truncamento C-terminal ou um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6. Truncamentos N-terminais, truncamentos C-terminais ou fragmentos podem compreender pelo menos 10, pelo menos 12, pelo menos 14, pelo menos 16, pelo menos 18, pelo menos 20, pelo menos 30, pelo menos 40, pelo menos 50, pelo menos 75, pelo menos 100, pelo menos 150, pelo menos 200, pelo menos 250, pelo menos 300, pelo menos 350, pelo menos 400, pelo menos 450, pelo menos 500, pelo menos 550, pelo menos 600, pelo menos 650, pelo menos 700, pelo menos 750, pelo menos 800, pelo menos 850, pelo menos 900, pelo menos 950, pelo menos 1000, pelo menos 1100, pelo menos 1200, pelo menos 1300, pelo menos 1400, mas menos que 1419, aminoácidos consecutivos de SEQ ID NO: 6.
[0079] Em algumas modalidades, um polinucleotídeo da presente divulgação que codifica um polipeptídeo CFTR é um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo compreendendo uma sequência com pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%,
41 / 101 pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO:
6. Em algumas modalidades, um polinucleotídeo da presente divulgação que codifica um polipeptídeo CFTR é um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 6.
[0080] Em algumas modalidades, um polinucleotídeo da presente divulgação que codifica um polipeptídeo CFTR (por exemplo, um polipeptídeo CFTR humano) expressa o polipeptídeo CFTR quando o polinucleotídeo é distribuído em uma ou mais células alvo de um sujeito (por exemplo, uma ou mais células das vias aéreas e/ou pulmões do sujeito). Em algumas modalidades, a expressão do polipeptídeo CFTR (por exemplo, um polipeptídeo CFTR humano) intensifica, eleva, aumenta e/ou suplementa os níveis, função e/ou atividade de um polipeptídeo CFTR em uma ou mais células alvo de um sujeito (por exemplo, em comparação com antes da expressão do polipeptídeo CFTR). Em algumas modalidades, a expressão do polipeptídeo CFTR (por exemplo, um polipeptídeo CFTR humano) reduz a secreção de muco por uma ou mais células e/ou em um ou mais órgãos (por exemplo, os pulmões) do sujeito (por exemplo, em comparação com antes da expressão do polipeptídeo CFTR). Em algumas modalidades, a expressão do polipeptídeo CFTR (por exemplo, um polipeptídeo CFTR humano) reduz e/ou inibe o acúmulo de muco em um ou mais órgãos (por exemplo, os pulmões) do sujeito (por exemplo, em comparação com antes da expressão do polipeptídeo CFTR). Em algumas modalidades, a expressão do polipeptídeo CFTR (por exemplo, um polipeptídeo CFTR humano) reduz, previne ou trata a obstrução das vias aéreas em um sujeito (por exemplo, em comparação com antes da expressão do polipeptídeo CFTR). Em algumas modalidades, a expressão do polipeptídeo CFTR (por exemplo, um polipeptídeo CFTR
42 / 101 humano) reduz, previne ou trata infecções bacterianas crônicas e/ou a inflamação crônica associada nos pulmões de um sujeito (por exemplo, em comparação com antes da expressão do polipeptídeo CFTR). Em algumas modalidades, a expressão do polipeptídeo CFTR (por exemplo, um polipeptídeo CFTR humano) reduz, inibe, previne ou trata bronquiectasia em um sujeito (por exemplo, em comparação com antes da expressão do polipeptídeo CFTR). Em algumas modalidades, a expressão do polipeptídeo CFTR (por exemplo, um polipeptídeo CFTR humano) reduz, inibe, previne ou trata a destruição pulmonar progressiva em um sujeito (por exemplo, em comparação com antes da expressão do polipeptídeo CFTR). Em algumas modalidades, a expressão do polipeptídeo CFTR (por exemplo, um polipeptídeo CFTR humano) fornece alívio profilático, paliativo ou terapêutico de uma doença pulmonar crônica (por exemplo, fibrose cística, distúrbio pulmonar obstrutivo crônico) em um sujeito (por exemplo, em comparação com antes da expressão do polipeptídeo CFTR). Em algumas modalidades, a expressão do polipeptídeo CFTR (por exemplo, um polipeptídeo CFTR humano) fornece alívio profilático, paliativo ou terapêutico de um ou mais sinais ou sintomas de fibrose cística em um sujeito (por exemplo, em comparação com antes da expressão do polipeptídeo CFTR). Sequência de Ácido Nucleico Recombinante
[0081] Em algumas modalidades, a presente divulgação se refere a ácidos nucleicos recombinantes compreendendo qualquer um ou mais dos polinucleotídeos aqui descritos. Em algumas modalidades, o ácido nucleico recombinante é um vetor (por exemplo, um vetor de expressão, um vetor de exibição, etc.). Em algumas modalidades, o vetor é um vetor de DNA ou um vetor de RNA. Geralmente, os vetores adequados para manter, propagar e/ou expressar polinucleotídeos para produzir um ou mais polipeptídeos em um sujeito podem ser usados. Exemplos de vetores adequados podem incluir, por
43 / 101 exemplo, plasmídeos, cosmídeos, epissomas, transposons e vetores virais (por exemplo, vetores adenovirais, vetores virais adeno-associados, vetores virais de vaccinia, vetores virais de Sindbis, vetores de sarampo, vetores virais de herpes, vetores lentivirais, vetores retrovirais, etc.). Em algumas modalidades, o vetor é um vetor viral de herpes. Em algumas modalidades, o vetor é capaz de replicação autônoma em uma célula hospedeira. Em algumas modalidades, o vetor é incapaz de replicação autônoma em uma célula hospedeira. Em algumas modalidades, o vetor pode se integrar em um DNA hospedeiro. Em algumas modalidades, o vetor não pode se integrar em um DNA hospedeiro (por exemplo, é epissômico). Os métodos de produção de vetores contendo um ou mais polinucleotídeos de interesse são bem conhecidos por aqueles versados na técnica, incluindo, por exemplo, por síntese química ou por manipulação artificial de segmentos isolados de ácidos nucleicos (por exemplo, por técnicas de engenharia genética).
[0082] Em algumas modalidades, um ácido nucleico recombinante da presente divulgação é um amplicon do vírus do herpes simplex (HSV). Os amplicons do vírus do herpes, incluindo as características estruturais e métodos para fazer os mesmos, são geralmente conhecidos por aqueles versados na técnica (ver, por exemplo, de Silva S. e Bowers W. “Herpes Virus Amplicon Vectors”. Viruses 2009, 1, 594-629). Em algumas modalidades, o amplicon do vírus do herpes simplex é um amplicon de HSV-1. Em algumas modalidades, o amplicon do vírus do herpes simplex é um amplicon híbrido de HSV-1. Exemplos de amplicons híbridos de HSV-1 podem incluir, mas não estão limitados a, amplicons híbridos HSV / AAV, amplicons híbridos HSV / EBV, amplicons híbridos HSV / EBV / RV e/ou amplicons híbridos HSV /Sleeping Beauty . Em algumas modalidades, o amplicon é um amplicon híbrido de HSV/AAV. Em algumas modalidades, o amplicon é um amplicon híbrido HSV/Sleeping Beauty .
[0083] Em algumas modalidades, um ácido nucleico recombinante da
44 / 101 presente divulgação é um genoma de vírus de herpes recombinante.
O genoma do vírus do herpes recombinante pode ser um genoma recombinante de qualquer membro da família Herpesviridae de vírus de DNA conhecido na técnica, incluindo, por exemplo, um genoma do vírus do herpes simplex recombinante, um genoma do vírus da varicela zóster recombinante, um genoma do citomegalovírus humano recombinante, um genoma do herpesvírus 6A recombinante, um genoma do vírus recombinante genoma do herpesvírus 6B, um genoma do herpesvírus 7 recombinante, um genoma do herpesvírus associado ao sarcoma de Kaposi recombinante e quaisquer combinações ou derivados dos mesmos.
Como utilizado neste documento, uma "mutação de inativação" pode referir-se a qualquer mutação que resulta em um gene ou produto regulon (RNA ou proteína) tendo quantidade e/ou função reduzida, indetectável ou eliminada (por exemplo, em comparação com uma sequência correspondente sem a mutação de inativação). Exemplos de mutações de inativação podem incluir, mas não estão limitados a, deleções, inserções, mutações pontuais e rearranjos em sequências de controle da transcrição (promotores, intensificadores, isoladores, etc.) e/ou sequências de codificação de um determinado gene ou regulon.
Qualquer método adequado para medir a quantidade de um gene ou produto regulon conhecido na técnica pode ser usado, incluindo, por exemplo, qPCR, Northern blots, RNAseq, western blots, ELISAs, etc.
Em algumas modalidades, o genoma do vírus do herpes recombinante compreende um ou mais (por exemplo, um ou mais, dois ou mais, três ou mais, quatro ou mais, cinco ou mais, seis ou mais, sete ou mais, oito ou mais, nove ou mais, dez ou mais, etc.) mutações de inativação.
Em algumas modalidades, uma ou mais mutações de inativação estão em um ou mais (por exemplo, um ou mais, dois ou mais, três ou mais, quatro ou mais, cinco ou mais, seis ou mais, sete ou mais, oito ou mais, nove ou mais, dez ou mais, etc.) genes do vírus do herpes.
Em algumas modalidades, o genoma do vírus do herpes recombinante é atenuado (por exemplo, em
45 / 101 comparação com um genoma do vírus do herpes de tipo selvagem correspondente). Em algumas modalidades, o genoma do vírus do herpes recombinante é competente para replicação. Em algumas modalidades, o genoma do vírus do herpes recombinante é defeituoso na replicação.
[0084] Em algumas modalidades, o ácido nucleico recombinante é um genoma de vírus herpes simplex (HSV) recombinante. Em algumas modalidades, o genoma do vírus do herpes simplex recombinante é um genoma do vírus do herpes simplex do tipo 1 (HSV-1), um genoma do vírus do herpes simplex do tipo 2 (HSV-2) recombinante ou quaisquer derivados dos mesmos. Em algumas modalidades, o genoma do vírus do herpes simplex recombinante compreende um ou mais (por exemplo, um ou mais, dois ou mais, três ou mais, quatro ou mais, cinco ou mais, seis ou mais, sete ou mais, oito ou mais, nove ou mais, dez ou mais, etc.) mutações de inativação. Em algumas modalidades, as uma ou mais mutações de inativação estão em uma ou mais (por exemplo, uma ou mais, duas ou mais, três ou mais, quatro ou mais, cinco ou mais, seis ou mais, sete ou mais, oito ou mais, nove ou mais, dez ou mais, etc.) genes de vírus herpes simplex. Em algumas modalidades, o genoma do vírus do herpes simplex recombinante é atenuado (por exemplo, em comparação com um genoma do vírus do herpes simplex de tipo selvagem correspondente). Em algumas modalidades, o genoma do vírus do herpes simplex recombinante é competente para replicação. Em algumas modalidades, o genoma do vírus do herpes simplex recombinante é defeituoso na replicação.
[0085] Em algumas modalidades, o genoma do vírus do herpes simplex recombinante é um genoma HSV-1 recombinante. Em algumas modalidades, o genoma de HSV-1 recombinante pode ser de qualquer cepa de HSV-1 conhecida na técnica, incluindo, por exemplo, cepas 17, Ty25, R62, S25, Ku86, S23, R11, Ty148, Ku47, H166syn, 1319-2005, F-13, M-12, 90237, F-17, KOS, 3083-2008, F12g, L2, CD38, H193, M-15, India 2011,
46 / 101 0116209, F-11I, 66-207, 2762, 369-2007, 3355, MacIntyre, McKrae, 7862, 7- hse, HF10, 1394,2005, 270-2007, OD4, SC16, M-19, 4J1037, 5J1060, J1060, KOS79, 132-1988, 160-1982, H166, 2158-2007, RE, 78326, F18g, F11, 172- 2010, H129, F, E4, CJ994, F14g, E03, E22, E10, E06, E11, E25, E23, E35, E15, E07, E12, E14, E08, E19, E13, ATCC 2011, etc. (ver, por exemplo, Bowen et al. J Virol. 2019 Apr 3;93(8)). Em algumas modalidades, o genoma do HSV-1 recombinante é da cepa KOS. Em algumas modalidades, o genoma do HSV-1 recombinante não é da cepa McKrae. Em algumas modalidades, o genoma do HSV-1 recombinante é atenuado. Em algumas modalidades, o genoma do HSV-1 recombinante é competente para replicação. Em algumas modalidades, o genoma do HSV-1 recombinante é defeituoso na replicação. Em algumas modalidades, o genoma HSV-1 recombinante compreende um ou mais (por exemplo, um ou mais, dois ou mais, três ou mais, quatro ou mais, cinco ou mais, seis ou mais, sete ou mais, oito ou mais, nove ou mais, dez ou mais, etc.) mutações de inativação. Em algumas modalidades, uma ou mais mutações de inativação estão em um ou mais (por exemplo, um ou mais, dois ou mais, três ou mais, quatro ou mais, cinco ou mais, seis ou mais, sete ou mais, oito ou mais, nove ou mais, dez ou mais, etc.) Genes HSV-1.
[0086] Em algumas modalidades, o genoma do vírus do herpes simplex recombinante compreende uma mutação de inativação em pelo menos um, pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis, pelo menos sete, ou todas as oito da proteína celular infectada (ICP) 0 (uma ou ambas as cópias), ICP4 (uma ou ambas as cópias), ICP22, ICP27, ICP47, timidina cinase (tk), genes do vírus do herpes simplex da região única longa (UL) 41 e/ou UL55. Em algumas modalidades, o genoma do vírus do herpes simplex recombinante não compreende uma mutação de inativação (por exemplo, é capaz de expressar) o gene do vírus do herpes simplex ICP0 (uma ou ambas as cópias). Em algumas modalidades, o genoma do vírus do herpes simplex recombinante não compreende uma
47 / 101 mutação de inativação (por exemplo, é capaz de se expressar) no gene do vírus do herpes simplex ICP27. Em algumas modalidades, o genoma do vírus do herpes simplex recombinante não compreende uma mutação de inativação (por exemplo, é capaz de expressar) o gene do vírus do herpes simplex ICP47. Em algumas modalidades, o genoma do vírus do herpes simplex recombinante não compreende uma mutação de inativação (por exemplo, é capaz de expressar) os genes do vírus do herpes simplex ICP0 (uma ou ambas as cópias), ICP27 e/ou ICP47. Em algumas modalidades, o genoma do vírus do herpes simplex recombinante não compreende uma mutação de inativação na região de Dobradiça. Em algumas modalidades, o genoma do vírus do herpes simplex recombinante não compreende uma mutação de inativação no ICP34.5 (uma ou ambas as cópias) e/ou genes do vírus do herpes simplex ICP47 (por exemplo, para evitar a produção de um vírus imunoestimulante). Em algumas modalidades, o genoma do vírus do herpes simplex recombinante não compreende uma mutação de inativação no gene do vírus do herpes simplex ICP34.5 (uma ou ambas as cópias). Em algumas modalidades, o genoma do vírus do herpes simplex recombinante não compreende uma mutação de inativação no gene do vírus do herpes simplex ICP47. Em algumas modalidades, o genoma do vírus do herpes simplex recombinante não compreende uma mutação de inativação nos genes do vírus do herpes simplex ICP34.5 (uma ou ambas as cópias) e ICP47. Em algumas modalidades, o genoma do vírus do herpes simplex recombinante não é oncolítico.
[0087] Em algumas modalidades, o genoma do vírus do herpes simplex recombinante compreende uma mutação de inativação no gene ICP0 (uma ou ambas as cópias). Em algumas modalidades, o genoma do vírus do herpes simplex recombinante compreende uma mutação de inativação no gene ICP0 (uma ou ambas as cópias) e compreende ainda uma mutação de inativação no ICP4 (uma ou ambas as cópias), ICP22, ICP27, ICP47, UL41,
48 / 101 e/ou genes UL55. Em algumas modalidades, o genoma do vírus do herpes simplex recombinante compreende uma mutação de inativação no gene ICP0 (uma ou ambas as cópias) e uma mutação de inativação no gene ICP4 (uma ou ambas as cópias). Em algumas modalidades, o genoma do vírus do herpes simplex recombinante compreende uma mutação de inativação no gene ICP0 (uma ou ambas as cópias) e uma mutação de inativação no gene ICP22. Em algumas modalidades, o genoma do vírus do herpes simplex recombinante compreende uma mutação de inativação no gene ICP0 (uma ou ambas as cópias) e uma mutação de inativação no gene UL41. Em algumas modalidades, o genoma do vírus do herpes simplex recombinante compreende uma mutação de inativação no gene ICP0 (uma ou ambas as cópias), uma mutação de inativação no gene ICP4 (uma ou ambas as cópias) e uma mutação de inativação no gene ICP22. Em algumas modalidades, o genoma do vírus do herpes simplex recombinante compreende uma mutação de inativação no gene ICP0 (uma ou ambas as cópias), uma mutação de inativação no gene ICP4 (uma ou ambas as cópias) e uma mutação de inativação no gene UL41. Em algumas modalidades, o genoma do vírus do herpes simplex recombinante compreende uma mutação de inativação no gene ICP0 (uma ou ambas as cópias), uma mutação de inativação no gene ICP22 e uma mutação de inativação no gene UL41. Em algumas modalidades, o genoma do vírus do herpes simplex recombinante compreende uma mutação de inativação no gene ICP0 (uma ou ambas as cópias), uma mutação de inativação no gene ICP4 (uma ou ambas as cópias) uma mutação de inativação no gene ICP22 e uma mutação de inativação no gene UL41. Em algumas modalidades, a mutação de inativação é uma deleção da sequência de codificação dos genes ICP0 (uma ou ambas as cópias), ICP4 (uma ou ambas as cópias), ICP22 e/ou UL41. Em algumas modalidades, o genoma do vírus do herpes simplex recombinante compreende ainda uma mutação de inativação nos genes ICP27, ICP47 e/ou UL55.
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[0088] Em algumas modalidades, o genoma do vírus do herpes simplex recombinante compreende uma mutação de inativação no gene ICP4 (uma ou ambas as cópias). Em algumas modalidades, o genoma do vírus do herpes simplex recombinante compreende uma mutação de inativação no gene ICP4 (uma ou ambas as cópias) e compreende ainda uma mutação de inativação no ICP0 (uma ou ambas as cópias), ICP22, ICP27, ICP47, UL41, e/ou genes UL55. Em algumas modalidades, o genoma do vírus do herpes simplex recombinante compreende uma mutação de inativação no gene ICP4 (uma ou ambas as cópias) e uma mutação de inativação no gene ICP22. Em algumas modalidades, o genoma do vírus do herpes simplex recombinante compreende uma mutação de inativação no gene ICP4 (uma ou ambas as cópias) e uma mutação de inativação no gene UL41. Em algumas modalidades, o genoma do vírus do herpes simplex recombinante compreende uma mutação de inativação no gene ICP4 (uma ou ambas as cópias), uma mutação de inativação no gene ICP22 e uma mutação de inativação no gene UL41. Em algumas modalidades, a mutação de inativação é uma deleção da sequência de codificação dos genes, ICP4 (uma ou ambas as cópias), ICP22 e/ou UL41. Em algumas modalidades, o genoma do vírus do herpes simplex recombinante compreende ainda uma mutação de inativação nos genes ICP0 (uma ou ambas as cópias), ICP27, ICP47 e/ou UL55.
[0089] Em algumas modalidades, o genoma do vírus do herpes simplex recombinante compreende uma mutação de inativação no gene ICP22. Em algumas modalidades, o genoma do vírus do herpes simplex recombinante compreende uma mutação de inativação no gene ICP22 e compreende ainda uma mutação de inativação em ICP0 (uma ou ambas as cópias), ICP4 (uma ou ambas as cópias), ICP27, ICP47, UL41, e/ou genes UL55. Em algumas modalidades, o genoma do vírus do herpes simplex recombinante compreende uma mutação de inativação no gene ICP22 e um gene UL41 de mutação de inativação. Em algumas modalidades, a mutação
50 / 101 de inativação é uma deleção da sequência de codificação dos genes ICP22 e/ou UL41. Em algumas modalidades, o genoma do vírus do herpes simplex recombinante compreende ainda uma mutação de inativação nos genes ICP0 (uma ou ambas as cópias), ICP4 (uma ou ambas as cópias), ICP27, ICP47 e/ou UL55.
[0090] Em algumas modalidades, o genoma do vírus do herpes simplex recombinante compreende uma mutação de inativação no gene ICP27. Em algumas modalidades, o genoma do vírus do herpes simplex recombinante compreende uma mutação de inativação no gene ICP27 e compreende ainda uma mutação de inativação em ICP0 (uma ou ambas as cópias), ICP4 (uma ou ambas as cópias), ICP22, ICP47, UL41, e/ou genes UL55. Em algumas modalidades, a mutação de inativação é uma deleção da sequência de codificação do gene ICP27.
[0091] Em algumas modalidades, o genoma do vírus do herpes simplex recombinante compreende uma mutação de inativação no gene ICP47. Em algumas modalidades, o genoma do vírus do herpes simplex recombinante compreende uma mutação de inativação no gene ICP47 e compreende ainda uma mutação de inativação em ICP0 (uma ou ambas as cópias), ICP4 (uma ou ambas as cópias), ICP22, ICP27, UL41, e/ou genes UL55. Em algumas modalidades, a mutação de inativação é uma deleção da sequência de codificação do gene ICP47.
[0092] Em algumas modalidades, o genoma do vírus do herpes simplex recombinante compreende uma mutação de inativação no gene UL41. Em algumas modalidades, o genoma do vírus do herpes simplex recombinante compreende uma mutação de inativação no gene UL41 e compreende ainda uma mutação de inativação nos genes ICP0 (uma ou ambas as cópias), ICP4 (uma ou ambas as cópias), ICP22, ICP27, ICP47, e/ou genes UL55. Em algumas modalidades, a mutação de inativação é uma deleção da sequência de codificação do gene UL41.
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[0093] Em algumas modalidades, o genoma do vírus do herpes simplex recombinante compreende uma mutação de inativação no gene UL55. Em algumas modalidades, o genoma do vírus do herpes simplex recombinante compreende uma mutação de inativação no gene UL55 e compreende ainda uma mutação de inativação nos genes ICP0 (uma ou ambas as cópias), ICP4 (uma ou ambas as cópias), ICP22, ICP27, ICP47, e/ou UL41. Em algumas modalidades, a mutação de inativação é uma deleção da sequência de codificação do gene UL55.
[0094] Em algumas modalidades, o genoma do vírus do herpes simplex recombinante compreende uma mutação de inativação (por exemplo, uma deleção) da região de repetição interna (Dobradiça) que compreende as regiões de repetição interna longa (IRL) e de repetição interna curta (IRS). Em algumas modalidades, a inativação (por exemplo, deleção) da região de Dobradiça elimina uma cópia de cada um dos genes ICP4 e ICP0. Em algumas modalidades, a inativação (por exemplo, deleção) da região de Dobradiça inativa adicionalmente (por exemplo, deleta) o promotor para os genes ICP22 e ICP47. Se desejado, a expressão de um ou de ambos os genes pode ser restaurada pela inserção de um promotor precoce imediato no genoma do vírus do herpes simplex recombinante (ver, por exemplo, Hill et al. (1995). Nature 375(6530): 411-415; Goldsmith et al. (1998). J Exp Med 187(3): 341-348). Sem desejar estar limitado pela teoria, acredita-se que a inativação (por exemplo, deleção) da região comum pode contribuir para a estabilidade do genoma do vírus do herpes simplex recombinante e/ou permitir que o genoma do vírus do herpes simplex recombinante acomode mais transgenes e/ou transgenes maiores.
[0095] Em algumas modalidades, o genoma do vírus do herpes simplex recombinante compreende uma mutação de inativação nos genes ICP4 (uma ou ambas as cópias), ICP22 e ICP27. Em algumas modalidades, o genoma do vírus do herpes simplex recombinante compreende uma mutação
52 / 101 de inativação nos genes ICP4 (uma ou ambas as cópias), ICP27 e UL55. Em algumas modalidades, o genoma do vírus do herpes simplex recombinante compreende ainda uma mutação de inativação nos genes ICP4 (uma ou ambas as cópias), ICP22, ICP27, ICP47 e/ou UL55. Em algumas modalidades, a mutação de inativação nos genes ICP4 (uma ou ambas as cópias), ICP27 e/ou UL55 é uma deleção da sequência de codificação dos genes ICP4 (uma ou ambas as cópias), ICP27 e/ou UL55. Em algumas modalidades, a mutação de inativação nos genes ICP22 e ICP47 é uma deleção na região do promotor dos genes ICP22 e ICP47 (por exemplo, as sequências de codificação ICP22 e ICP47 estão intactas, mas não são transcricionalmente ativas). Em algumas modalidades, o genoma do vírus do herpes simplex recombinante compreende uma deleção na sequência de codificação dos genes ICP4 (uma ou ambas as cópias), ICP27 e UL55, e uma deleção na região promotora dos genes ICP22 e ICP47. Em algumas modalidades, o genoma do vírus do herpes simplex recombinante compreende ainda uma mutação de inativação nos genes ICP0 (uma ou ambas as cópias) e/ou genes UL41.
[0096] Em algumas modalidades, o genoma do vírus do herpes simplex recombinante compreende uma mutação de inativação nos genes ICP0 (uma ou ambas as cópias) e ICP4 (uma ou ambas as cópias). Em algumas modalidades, o genoma do vírus do herpes simplex recombinante compreende uma mutação de inativação nos genes ICP0 (uma ou ambas as cópias), ICP4 (uma ou ambas as cópias) e ICP22. Em algumas modalidades, o genoma do vírus do herpes simplex recombinante compreende uma mutação de inativação nos genes ICP0 (uma ou ambas as cópias) , ICP4 (uma ou ambas as cópias), genes ICP22 e ICP27. Em algumas modalidades, o genoma do vírus do herpes simplex recombinante compreende uma mutação de inativação nos genes ICP0 (uma ou ambas as cópias), ICP4 (uma ou ambas as cópias), ICP22, ICP27 e UL55. Em algumas modalidades, a mutação de inativação nos genes ICP0 (uma ou ambas as cópias), ICP4 (uma ou ambas as
53 / 101 cópias), ICP22, ICP27 e/ou UL55 compreende uma deleção da sequência de codificação do ICP0 (uma ou ambas as cópias), ICP4 (uma ou ambas as cópias), ICP22, ICP27 e/ou UL55. Em algumas modalidades, o genoma do vírus do herpes simplex recombinante compreende ainda uma mutação de inativação nos genes ICP47 e/ou UL41.
[0097] Em algumas modalidades, um genoma de vírus herpes simplex recombinante compreende um ou mais polinucleotídeos da presente divulgação em um, dois, três, quatro, cinco, seis, sete ou mais loci de genes virais. Exemplos de loci virais adequados podem incluir, sem limitação, o loci do gene viral do herpes simplex ICP0 (uma ou ambas as cópias), ICP4 (uma ou ambas as cópias), ICP22, ICP27, ICP47, tk, UL41 e/ou UL55. Em algumas modalidades, um genoma de vírus herpes simplex recombinante compreende um ou mais polinucleotídeos da presente divulgação dentro de um ou ambos os loci do gene ICP4 viral (por exemplo, um vírus recombinante carregando um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo CFTR humano em um ou ambos os loci ICP4). Em algumas modalidades, um genoma de vírus herpes simplex recombinante compreende um ou mais polinucleotídeos da presente divulgação dentro do locus do gene ICP22 viral (por exemplo, um vírus recombinante carregando um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo CFTR humano no locus ICP22). Em algumas modalidades, um genoma de vírus herpes simplex recombinante compreende um ou mais polinucleotídeos da presente divulgação dentro do locus do gene UL41 viral (por exemplo, um vírus recombinante carregando um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo CFTR humano no locus UL41). Em algumas modalidades, um genoma de vírus herpes simplex recombinante compreende um ou mais polinucleotídeos da presente divulgação em um ou ambos do loc1 do gene ICP0 viral (por exemplo, um vírus recombinante carregando um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo CFTR humano em um ou ambos os ICP0 loci). Em algumas modalidades, um genoma de vírus herpes
54 / 101 simplex recombinante compreende um ou mais polinucleotídeos da presente divulgação dentro do locus do gene ICP27 viral (por exemplo, um vírus recombinante carregando um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo CFTR humano no locus ICP27). Em algumas modalidades, um genoma de vírus herpes simplex recombinante compreende um ou mais polinucleotídeos da presente divulgação dentro do locus do gene ICP47 viral (por exemplo, um vírus recombinante carregando um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo CFTR humano no locus ICP47). Em algumas modalidades, um genoma de vírus herpes simplex recombinante compreende um ou mais polinucleotídeos da presente divulgação em um ou ambos os loci do gene ICP4 viral e um ou mais polinucleotídeos da presente divulgação dentro do locus do gene ICP22 viral (por exemplo, um vírus recombinante carregando um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo CFTR humano em um ou ambos os loci ICP4, e um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo CFTR humano no locus ICP22). Em algumas modalidades, um genoma de vírus herpes simplex recombinante compreende um ou mais polinucleotídeos da presente divulgação dentro de um ou ambos os loci do gene ICP4 viral e um ou mais polinucleotídeos da presente divulgação dentro do locus do gene UL41 viral (por exemplo, um vírus recombinante carregando um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo CFTR humano em um ou ambos os loci ICP4, e um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo CFTR humano no locus UL41). Em algumas modalidades, um genoma de vírus herpes simplex recombinante compreende um ou mais polinucleotídeos da presente divulgação dentro do locus do gene ICP22 viral e um ou mais polinucleotídeos da presente divulgação dentro do locus do gene UL41 viral (por exemplo, um vírus recombinante carregando um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo CFTR humano no locus ICP22 e um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo CFTR humano no locus UL41). Em algumas modalidades, um genoma de vírus herpes simplex recombinante compreende
55 / 101 um ou mais polinucleotídeos da presente divulgação em um ou ambos os loci do gene ICP4 viral, um ou mais polinucleotídeos da presente divulgação dentro do locus do gene ICP22 viral e um ou mais polinucleotídeos da presente divulgação dentro do locus do gene UL41 viral (por exemplo, um vírus recombinante carregando um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo CFTR humano em um ou ambos os loci ICP4, um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo CFTR humano no locus ICP22, e um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo CFTR humano no locus UL41). Em algumas modalidades, um genoma de vírus herpes simplex recombinante compreende um ou mais polinucleotídeos da presente divulgação em um ou ambos os loci do gene ICP4 viral, um ou mais polinucleotídeos da presente divulgação dentro do locus do gene ICP22 viral, um ou mais polinucleotídeos da presente divulgação dentro do locus do gene UL41 viral, um ou mais polinucleotídeos da presente divulgação dentro de um ou ambos os loci do gene ICP0 viral, um ou mais polinucleotídeos da presente divulgação dentro do locus do gene ICP27 viral e/ou um ou mais polinucleotídeos da presente divulgação no locus do gene ICP47 viral.
[0098] Em algumas modalidades, o genoma do vírus do herpes recombinante (por exemplo, um genoma do vírus do herpes simplex recombinante) foi engenheirado para diminuir ou eliminar a expressão de um ou mais genes do vírus do herpes (por exemplo, um ou mais genes do vírus do herpes tóxico), como um ou ambas as cópias do gene HSV ICP0, uma ou ambas as cópias do gene HSV ICP4, o gene HSV ICP22, o gene HSV UL41, o gene HSV ICP27, o gene HSV ICP47, etc. Em algumas modalidades, o genoma do vírus do herpes recombinante (por exemplo, um genoma do vírus do herpes simplex recombinante) foi engenheirado para reduzir a citotoxicidade do genoma recombinante (por exemplo, quando introduzido em uma célula alvo) em comparação com um genoma do vírus do herpes de tipo selvagem correspondente. Em algumas modalidades, a célula alvo é uma
56 / 101 célula humana (células primárias ou uma linhagem celular derivada das mesmas). Em algumas modalidades, a célula alvo é uma célula da mucosa.
Em algumas modalidades, a célula alvo é uma célula do trato respiratório (células primárias ou uma linhagem celular derivada das mesmas). Em algumas modalidades, a célula alvo é uma célula epitelial das vias aéreas (células primárias ou uma linhagem celular derivada das mesmas). Em algumas modalidades, a célula alvo é uma célula do pulmão (células primárias ou uma linhagem celular derivada das mesmas). Em algumas modalidades, a citotoxicidade do genoma do vírus do herpes recombinante é reduzida em pelo menos cerca de 5%, pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 15%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 25%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 35%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 45%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 55%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 65%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95% ou pelo menos cerca de 99% em comparação com um genoma de vírus de herpes de tipo selvagem correspondente (por exemplo, medindo a citotoxicidade relativa de um genoma de vírus herpes simplex recombinante ΔICP4 (uma ou ambas as cópias) versus um genoma de vírus herpes simplex de tipo selvagem em uma célula alvo; medição da citotoxicidade relativa de um ΔICP4 recombinante (uma ou ambas as cópias) / vírus herpes simplex ΔICP22 genoma vs. genoma de vírus herpes simplex de tipo selvagem em uma célula-alvo, etc.). Em algumas modalidades, a citotoxicidade do genoma do vírus do herpes recombinante é reduzida em pelo menos cerca de 1,5 vezes, pelo menos cerca de 2 vezes, pelo menos cerca de 3 vezes, pelo menos cerca de 4 vezes, pelo menos cerca de 5 vezes, em pelo menos cerca de 6 vezes, pelo menos cerca de 7 vezes, pelo menos cerca de 8 vezes, pelo menos cerca de 9 vezes, pelo menos cerca de 10 vezes, pelo menos cerca de 15 vezes, pelo menos cerca de
57 / 101 20 vezes, pelo menos cerca de 25 vezes, pelo menos cerca de 50 vezes, pelo menos cerca de 75 vezes, pelo menos cerca de 100 vezes, pelo menos cerca de 250 vezes, pelo menos cerca de 500 vezes, pelo menos cerca de 750 vezes, pelo menos cerca de 1.000 vezes, ou mais, em comparação com um genoma de vírus de herpes de tipo selvagem correspondente (por exemplo, medindo a citotoxicidade relativa de um genoma de vírus de herpes simplex recombinante ΔICP4 (uma ou ambas as cópias) vs. um genoma de vírus de herpes simplex de tipo selvagem em uma célula alvo; medindo a citotoxicidade relativa de um genoma de vírus de herpes simplex ΔICP4 recombinante (uma ou ambas as cópias) / ΔICP22 vs. um genoma de vírus de herpes simplex de tipo selvagem em uma célula alvo, etc.). Métodos de medição de citotoxicidade são conhecidos por aqueles versados na técnica, incluindo, por exemplo, através do uso de corantes vitais (corantes formazan), biomarcadores de protease, um ensaio de MTT (ou um ensaio usando sais de tetrazólio relacionados, como XTT, MTS, sais de tetrazólio solúveis em água, etc.), medição do teor de ATP, etc.
[0099] Em algumas modalidades, o genoma do vírus do herpes recombinante (por exemplo, um genoma do vírus do herpes simplex recombinante) foi engenheirado para reduzir seu impacto na proliferação da célula alvo após a exposição de uma célula alvo ao genoma recombinante, em comparação com um genoma de vírus herpes de tipo selvagem correspondente. Em algumas modalidades, a célula alvo é uma célula humana (células primárias ou uma linhagem celular derivada das mesmas). Em algumas modalidades, a célula alvo é uma célula da mucosa. Em algumas modalidades, a célula alvo é uma célula do trato respiratório (células primárias ou uma linhagem celular derivada das mesmas). Em algumas modalidades, a célula alvo é uma célula epitelial das vias aéreas (células primárias ou uma linhagem celular derivada das mesmas). Em algumas modalidades, a célula alvo é uma célula do pulmão (células primárias ou uma
58 / 101 linhagem celular derivada das mesmas). Em algumas modalidades, a proliferação de células alvo após a exposição ao genoma recombinante é de pelo menos cerca de 5%, pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 15%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 25%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 35%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 45%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 55%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 65%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95% ou pelo menos cerca de 99% mais rápida em comparação com a proliferação de células alvo após a exposição a um genoma do vírus do herpes de tipo selvagem correspondente (por exemplo, medindo a proliferação celular relativa após a exposição a um genoma do vírus do herpes simplex recombinante ΔICP4 (uma ou ambas as cópias) versus proliferação celular após a exposição a um genoma do vírus do herpes simplex de tipo selvagem em uma célula alvo; medindo o genoma do vírus do herpes simplex de tipo selvagem em uma célula-alvo; proliferação após a exposição a um genoma de vírus de herpes simplex ΔICP4 recombinante (uma ou ambas as cópias) / ΔICP22 versus um genoma de vírus de herpes simplex de tipo selvagem em uma célula alvo, etc.). Em algumas modalidades, a proliferação de células alvo após a exposição ao genoma recombinante é pelo menos cerca de 1,5 vezes, pelo menos cerca de 2 vezes, pelo menos cerca de 3 vezes, pelo menos cerca de 4 vezes, pelo menos cerca de 5 vezes, em pelo menos cerca de 6 vezes, pelo menos cerca de 7 vezes, pelo menos cerca de 8 vezes, pelo menos cerca de 9 vezes, pelo menos cerca de 10 vezes, pelo menos cerca de 15 vezes, pelo menos cerca de 20 vezes, pelo menos cerca de 25 vezes, pelo menos cerca de 50 vezes, pelo menos cerca de 75 vezes, pelo menos cerca de 100 vezes, pelo menos cerca de 250 vezes, pelo menos cerca de 500 vezes, pelo menos cerca de 750 vezes, ou pelo menos cerca de 1.000 vezes mais rápida em
59 / 101 comparação com a proliferação de células alvo após a exposição a um genoma de vírus herpes de tipo selvagem correspondente (por exemplo, medindo a proliferação celular relativa após a exposição a um genoma de vírus herpes simplex recombinante ΔICP4 (uma ou ambas as cópias) vs. proliferação celular após a exposição a um genoma de vírus herpes simplex de tipo selvagem em uma célula-alvo; medir a proliferação celular relativa após a exposição a um genoma de vírus de herpes simplex ΔICP4 recombinante (uma ou ambas as cópias)/ΔICP22 vs. um genoma de vírus de herpes simplex de tipo selvagem em uma célula alvo, etc.). Os métodos de medição da proliferação celular são conhecidos por aqueles versados na técnica, incluindo, por exemplo, através do uso de um ensaio de proliferação de células Ki67, um ensaio de proliferação de células BrdU, etc.
[00100] Um vetor (por exemplo, vetor viral de herpes) pode incluir um ou mais polinucleotídeos da presente divulgação em uma forma adequada para a expressão do polinucleotídeo em uma célula hospedeira. Os vetores podem incluir uma ou mais sequências regulatórias operativamente ligadas ao polinucleotídeo a ser expresso (por exemplo, como descrito acima).
[00101] Em algumas modalidades, um ácido nucleico recombinante (por exemplo, um genoma de vírus herpes simplex recombinante) da presente divulgação compreende um ou mais dos polinucleotídeos aqui descritos inseridos em qualquer orientação no ácido nucleico recombinante. Se o ácido nucleico recombinante compreende dois ou mais polinucleotídeos aqui descritos (por exemplo, dois ou mais, três ou mais, etc.), os polinucleotídeos podem ser inseridos na mesma orientação ou em orientações opostas um ao outro. Sem desejar estar limitado pela teoria, incorporar dois polinucleotídeos (por exemplo, dois transgenes) em um ácido nucleico recombinante (por exemplo, um vetor) em uma orientação antissentido pode ajudar a evitar a leitura e garantir a expressão adequada de cada polinucleotídeo. IV. Vírus
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[00102] Certos aspectos da presente divulgação se referem a vírus que compreendem qualquer um dos polinucleotídeos e/ou ácidos nucleicos recombinantes aqui descritos. Em algumas modalidades, o vírus é capaz de infectar uma ou mais células-alvo de um sujeito (por exemplo, um ser humano). Em algumas modalidades, o vírus é adequado para distribuir os polinucleotídeos e/ou ácidos nucleicos recombinantes em uma ou mais células alvo de um sujeito (por exemplo, um humano). Em algumas modalidades, uma ou mais células alvo são células humanas. Em algumas modalidades, uma ou mais células alvo são uma ou mais células com deficiência de CFTR (por exemplo, uma ou mais células compreendendo uma mutação genômica no gene CFTR nativo). Em algumas modalidades, uma ou mais células alvo são uma ou mais células da mucosa. Em algumas modalidades, uma ou mais células alvo são uma ou mais células epiteliais das vias aéreas. Em algumas modalidades, uma ou mais células-alvo são uma ou mais células do trato respiratório (por exemplo, células epiteliais das vias aéreas (como células caliciformes, células ciliadas, células de Clara, células neuroendócrinas, células basais, células intermediárias ou parabasais, células serosas, células em escova, oncócitos, células colunares não ciliadas e/ou células metaplásicas); células alveolares (como pneumócitos tipo 1, pneumócitos tipo 2 e/ou células cuboidais não ciliadas); células da glândula salivar nos brônquios (como células serosas, células mucosas e/ou células ductais); etc.). Em algumas modalidades, uma ou mais células alvo são uma ou mais células do pulmão.
[00103] Qualquer vírus adequado conhecido na técnica pode ser usado, incluindo, por exemplo, adenovírus, vírus adenoassociado, retrovírus, lentivírus, vírus sendai, vírus herpes, vírus vaccinia e/ou qualquer vírus híbrido ou derivado dos mesmos. Em algumas modalidades, o vírus é atenuado. Em alguns aspectos, o vírus é competente para replicação. Em algumas modalidades, o vírus é defeituoso na replicação. Em algumas
61 / 101 modalidades, o vírus foi modificado para alterar seu tropismo de tecido em relação ao tropismo de tecido de um vírus de tipo selvagem não modificado correspondente. Em algumas modalidades, o vírus tem citotoxicidade reduzida (por exemplo, em uma célula alvo) em comparação com um vírus de tipo selvagem correspondente. Os métodos de produção de um vírus compreendendo ácidos nucleicos recombinantes são bem conhecidos por aqueles versados na técnica.
[00104] Em algumas modalidades, o vírus é um membro da família Herpesviridae de vírus de DNA, incluindo, por exemplo, um vírus herpes simplex, um vírus varicela zoster, um citomegalovírus humano, um herpesvírus 6A, um herpesvírus 6B, um herpesvírus 7 e um herpesvírus associado ao sarcoma de Kaposi, etc. Em algumas modalidades, o vírus herpes é atenuado. Em algumas modalidades, o vírus do herpes é defeituoso na replicação. Em alguns aspectos, o vírus do herpes é competente para replicação. Em algumas modalidades, o vírus do herpes foi engenheirado para reduzir ou eliminar a expressão de um ou mais genes do vírus do herpes (por exemplo, um ou mais genes do vírus do herpes tóxico). Em algumas modalidades, o vírus do herpes reduziu a citotoxicidade em comparação com um vírus do herpes de tipo selvagem correspondente. Em algumas modalidades, o vírus do herpes não é oncolítico.
[00105] Em algumas modalidades, o vírus do herpes é um vírus do herpes simplex. Os vírus herpes simplex compreendendo ácidos nucleicos recombinantes podem ser produzidos por um processo divulgado, por exemplo, em WO2015 / 009952, WO2017 / 176336, WO2019 / 200163, WO2019 / 210219 e/ou WO2020 / 006486. Em algumas modalidades, o vírus herpes simplex é atenuado. Em algumas modalidades, o vírus do herpes simplex é defeituoso na replicação. Em alguns aspectos, o vírus do herpes simplex é competente para replicação. Em algumas modalidades, o vírus do herpes simplex foi projetado para reduzir ou eliminar a expressão de um ou
62 / 101 mais genes do vírus do herpes simplex (por exemplo, um ou mais genes de vírus herpes simplex tóxicos). Em algumas modalidades, o vírus do herpes simplex reduziu a citotoxicidade em comparação com um vírus do herpes simplex de tipo selvagem correspondente. Em algumas modalidades, o vírus do herpes simplex não é oncolítico. Em algumas modalidades, o vírus do herpes simplex é um vírus HSV-1, um HSV-2 ou qualquer derivados dos mesmos. Em algumas modalidades, o vírus do herpes simplex é um vírus HSV-1. Em algumas modalidades, o vírus do herpes simplex é um HSV-1. Em algumas modalidades, o HSV-1 é atenuado. Em algumas modalidades, o HSV-1 é com defeito de replicação. Em algumas modalidades, o HSV-1 é competente para replicação. Em algumas modalidades, o HSV-1 foi engenheirado para reduzir ou eliminar a expressão de um ou mais genes de HSV-1 (por exemplo, um ou mais genes de HSV-1 tóxicos). Em algumas modalidades, o HSV-1 reduziu a citotoxicidade em comparação com um HSV-1 de tipo selvagem correspondente. Em algumas modalidades, o HSV-1 não é oncolítico.
[00106] Em algumas modalidades, o vírus herpes simplex foi modificado para alterar seu tropismo de tecido em relação ao tropismo de tecido de um vírus herpes simplex de tipo selvagem não modificado. Em algumas modalidades, o vírus herpes simplex compreende um envelope modificado. Em algumas modalidades, o envelope modificado compreende uma ou mais (por exemplo, uma ou mais, duas ou mais, três ou mais, quatro ou mais, etc.) glicoproteínas de vírus herpes simplex mutantes. Exemplos de glicoproteínas do vírus do herpes simplex podem incluir, mas não estão limitados a, as glicoproteínas gB, gC, gD, gH e gL. Em algumas modalidades, o envelope modificado altera o tropismo de tecido do vírus do herpes simplex em relação a um vírus herpes simplex de tipo selvagem.
[00107] Em algumas modalidades, a eficiência de transdução (in vitro e/ou in vivo) de um vírus da presente divulgação (por exemplo, um vírus de
63 / 101 herpes) para uma ou mais células alvo (por exemplo, uma ou mais células do trato respiratório) está em pelo menos cerca de 25%. Por exemplo, a eficiência de transdução do vírus para uma ou mais células alvo pode ser pelo menos cerca de 25%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 35%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 45%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 55%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 65%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90% , pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 99%, pelo menos cerca de 99,5% ou mais. Em algumas modalidades, o vírus é um vírus herpes simplex e a eficiência de transdução do vírus para uma ou mais células alvo (por exemplo, uma ou mais células do trato respiratório) é de cerca de 85% a cerca de 100%. Em algumas modalidades, o vírus é um vírus herpes simplex e a eficiência de transdução do vírus para uma ou mais células alvo (por exemplo, uma ou mais células do trato respiratório) é de pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 86%, em pelo menos cerca de 87%, pelo menos cerca de 88%, pelo menos cerca de 89%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 91%, pelo menos cerca de 92%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 94%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99% ou 100%. Os métodos de medição da eficiência de transdução viral in vitro ou in vivo são bem conhecidos por aqueles versados na técnica, incluindo, por exemplo, análise qPCR, sequenciamento profundo, western blotting, análise fluorométrica (tal como hibridação fluorescente in situ (FISH), expressão do gene repórter fluorescente, imunofluorescência, FACS), etc. V. Composições e Formulações Farmacêuticas
[00108] Certos aspectos da presente divulgação se referem a composições farmacêuticas ou formulações compreendendo qualquer um dos ácidos nucleicos recombinantes (por exemplo, um genoma de vírus de herpes
64 / 101 recombinante) e/ou vírus (por exemplo, um vírus de herpes compreendendo um genoma recombinante) aqui descritos (como um vírus herpes simplex compreendendo um genoma de vírus herpes simplex recombinante) e um excipiente ou transportador farmaceuticamente aceitável.
[00109] Em algumas modalidades, a composição ou formulação farmacêutica compreende qualquer um ou mais dos vírus (por exemplo, vírus do herpes) aqui descritos. Em algumas modalidades, a composição ou formulação farmacêutica compreende de cerca de 104 a cerca de 1012 unidades formadoras de placa (PFU) / mL do vírus. Por exemplo, a composição ou formulação farmacêutica pode compreender de cerca de 104 a cerca de 1012, cerca de 105 a cerca de 1012, cerca de 106 a cerca de 1012, cerca de 107 a cerca de 1012, cerca de 108 a cerca de 1012, cerca de 109 a cerca de 1012, cerca de 1010 a cerca de 1012, cerca de 1011 a cerca de 1012, cerca de 104 a cerca de 1011, cerca de 105 a cerca de 1011, cerca de 106 a cerca de 1011, cerca de 107 a cerca de 1011, cerca de 108 a cerca de 1011, cerca de 109 a cerca de 1011, cerca de 1010 a cerca de 1011, cerca de 104 a cerca de 1010, cerca de 105 a cerca de 1010, cerca de 106 a cerca de 1010, cerca de 107 a cerca de 1010, cerca de 108 a cerca de 1010, cerca de 109 a cerca de 1010, cerca de 104 a cerca de 109, cerca de 105 a cerca de 109, cerca de 106 a cerca de 109, cerca de 107 a cerca de 109, cerca de 108 a cerca de 109, cerca de 104 a cerca de 108, cerca de 105 a cerca de 108, cerca de 106 a cerca de 108, cerca de 107 a cerca de 108, cerca de 104 a cerca de 107, cerca de 105 a cerca de 107, cerca de 106 a cerca de 107, cerca de 104 a cerca de 106, cerca de 105 a cerca de 106, ou about 104 a cerca de 105 PFU/mL do vírus. Em algumas modalidades, a composição ou formulação farmacêutica compreende cerca de 104, cerca de 105, cerca de 106, cerca de 107, cerca de 108, cerca de 109, cerca de 1010, cerca de 1011, ou about 1012 PFU/mL do vírus.
[00110] As composições e formulações farmacêuticas podem ser preparadas misturando o(s) ingrediente(s) ativo(s) (tal como um ácido
65 / 101 nucleico recombinante e/ou um vírus) possuindo o grau de pureza desejado com um ou mais transportadores ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis. Os transportadores ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis são geralmente não tóxicos para os destinatários nas dosagens e concentrações utilizadas e podem incluir, mas não estão limitados a: tampões (tais como fosfato, citrato, acetato e outros ácidos orgânicos); antioxidantes (como ácido ascórbico e metionina); conservantes (como cloreto de octadecildimetilbenzil amônio, cloreto de benzalcônio, cloreto de benzetônio, fenol, álcool butílico ou benzílico, alquil parabenos, catecol, resorcinol, ciclo-hexanol, 3-pentanol e m-cresol); aminoácidos (tais como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina ou lisina); baixo peso molecular (menos de cerca de 10 resíduos) polipeptídeos; proteínas (tais como albumina sérica, gelatina ou imunoglobulinas); polióis (como o glicerol, por exemplo, formulações incluindo glicerol a 10%); polímeros hidrofílicos (tais como polivinilpirrolidona); monossacarídeos, dissacarídeos e outros carboidratos (incluindo glicose, manose ou dextrinas); agentes quelantes (como EDTA); açúcares (como sacarose, manitol, trealose ou sorbitol); contraíons formadores de sal (como sódio); complexos de metal (tais como complexos Zn-proteína); e/ou tensoativos não iônicos (tais como polietileno glicol (PEG)). Uma discussão completa sobre transportadores farmaceuticamente aceitáveis está disponível em REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES (Mack Pub. Co., N.J. 1991).
[00111] Em algumas modalidades, a composição ou formulação farmacêutica compreende um ou mais transportadores lipídicos (por exemplo, lipídeo catiônico). Em algumas modalidades, a composição ou formulação farmacêutica compreende um ou mais transportadores de nanopartículas. As nanopartículas são veículos de distribuição de drogas de tamanho submicrônico (menos de cerca de 1000 nm) que podem transportar drogas encapsuladas (como pequenas moléculas sintéticas, proteínas, peptídeos,
66 / 101 células, vírus e bioterapêuticos à base de ácido nucleico) para liberação rápida ou controlada. Uma variedade de moléculas (por exemplo, proteínas, peptídeos, ácidos nucleicos recombinantes, etc.) podem ser eficientemente encapsuladas em nanopartículas usando processos bem conhecidos na técnica. Em algumas modalidades, uma molécula "encapsulada" em uma nanopartícula pode se referir a uma molécula (como um vírus) que está contida na nanopartícula ou ligada a e/ou associada à superfície da nanopartícula, ou qualquer combinação das mesmas. Nanopartículas para uso nas composições ou formulações aqui descritas podem ser qualquer tipo de nanopartícula biocompatível conhecida na técnica, incluindo, por exemplo, nanopartículas compreendendo poli (ácido lático), poli (ácido glicólico), PLGA, PLA, PGA e quaisquer combinações dos mesmos (ver, por exemplo, Vauthier et al. Adv Drug Del Rev. (2003) 55: 519-48; US2007/0148074; US2007/0092575; US2006/0246139; US5753234; US7081483; e WO2006/052285).
[00112] Em algumas modalidades, o transportador ou excipiente farmaceuticamente aceitável pode ser adaptado ou adequado para qualquer via de administração conhecida na técnica, incluindo, por exemplo, intravenosa, intramuscular, subcutânea, cutânea, oral, intranasal, intratraqueal, sublingual, bucal, tópica, transdérmico, intradérmico, intraperitoneal, intraorbital, intravítreo, subrretiniano, transmucoso, intra-articular, por implantação, por inalação, administração intratecal, intraventricular e/ou intranasal. Em algumas modalidades, o transportador ou excipiente farmaceuticamente aceitável é adaptado ou adequado para administração oral, intranasal, intratraqueal e/ou inalada. Em algumas modalidades, o transportador ou excipiente farmaceuticamente aceitável é adaptado ou adequado para administração por inalação. Em algumas modalidades, o transportador ou excipiente farmaceuticamente aceitável é adaptado ou adequado para administração inalada não invasiva. Em algumas modalidades,
67 / 101 o transportador ou excipiente farmaceuticamente aceitável é adaptado ou adequado para nebulização (por exemplo, usando um nebulizador de malha vibratória).
[00113] Em algumas modalidades, a composição ou formulação farmacêutica é adaptada ou adequada para qualquer via de administração conhecida na técnica, incluindo, por exemplo, intravenosa, intramuscular, subcutânea, cutânea, oral, intranasal, intratraqueal, sublingual, bucal, tópica, transdérmica, intradérmica, intraperitoneal, intraorbital, intravítrea, subrretiniana, transmucosa, intra-articular, por implantação, por inalação, administração intratecal, intraventricular ou intranasal. Em algumas modalidades, a composição ou formulação farmacêutica é adaptada ou adequada para administração oral, intranasal, intratraqueal ou inalada. Em algumas modalidades, a composição ou formulação farmacêutica é adaptada ou adequada para administração inalada. Em algumas modalidades, a composição ou formulação farmacêutica é adaptada ou adequada para administração inalada não invasiva. Em algumas modalidades, a composição ou formulação farmacêutica é adaptada ou adequada para nebulização (por exemplo, usando um nebulizador de malha vibratória).
[00114] Em algumas modalidades, a composição ou formulação farmacêutica compreende ainda um ou mais componentes adicionais. Exemplos de componentes adicionais podem incluir, mas não estão limitados a, agentes de ligação (por exemplo, amido de milho pré-gelatinizado, polivinilpirrolidona ou hidroxipropilmetilcelulose, etc.); enchimentos (por exemplo, lactose e outros açúcares, celulose microcristalina, pectina, gelatina, sulfato de cálcio, etilcelulose, poliacrilatos ou hidrogenofosfato de cálcio, etc.); lubrificantes (por exemplo, estearato de magnésio, talco, sílica, dióxido de silício coloidal, ácido esteárico, estearatos metálicos, óleos vegetais hidrogenados, amido de milho, polietileno glicóis, benzoato de sódio, acetato de sódio, etc.); desintegrantes (por exemplo, amido, glicolato de amido
68 / 101 sódico, etc.); agentes umectantes (por exemplo, lauril sulfato de sódio, etc.); soluções salinas; álcoois; polietileno glicóis; gelatina; lactose; amilase; estearato de magnésio; talco; ácido silícico; parafina viscosa; hidroximetilcelulose; polivinilpirrolidona; adoçantes; aromatizantes; agentes perfumantes; corantes; hidratantes; protetores solares; agentes antibacterianos; agentes capazes de estabilizar polinucleotídeos ou prevenir sua degradação e semelhantes. Em algumas modalidades, a composição ou formulação farmacêutica compreende um tampão de fosfato. Em algumas modalidades, a composição ou formulação farmacêutica compreende glicerol (por exemplo, em cerca de 1%, cerca de 2%, cerca de 3%, cerca de 4%, cerca de 5%, cerca de 6%, cerca de 7%, cerca de 8%, cerca de 9%, cerca de 10%, cerca de 15%, etc.). Em algumas modalidades, a composição ou formulação farmacêutica compreende um tampão de fosfato e glicerol. Em algumas modalidades, a composição ou formulação farmacêutica compreende menos que cerca de 15%, menos que cerca de 14%, menos que cerca de 13%, menos que cerca de 12%, menos que cerca de 11%, menos que cerca de 10%, menos que cerca de 9%, menos que cerca de 8%, menos que cerca de 7%, menos que cerca de 6%, menos que cerca de 5%, menos que cerca de 4%, menos que cerca de 3%, menos que cerca de 2%, menos que cerca de 1%, menos que cerca de 0,5%, ou menos que cerca de 0,1% de glicerol. Em algumas modalidades, a composição ou formulação farmacêutica não compreende glicerol.
[00115] As composições e formulações farmacêuticas a serem utilizadas para administração in vivo são geralmente estéreis. A esterilidade pode ser facilmente realizada, por exemplo, pela filtração através de membranas de filtração estéreis.
[00116] Em algumas modalidades, qualquer um dos ácidos nucleicos recombinantes, vírus e/ou composições farmacêuticas ou formulações aqui descritas podem ser usados para entregar um ou mais polinucleotídeos que codificam um polipeptídeo CFTR em uma ou mais células de um sujeito (por
69 / 101 exemplo, uma ou mais células deficientes em CFTR, uma ou mais células que abrigam uma mutação de gene CFTR , uma ou mais células do trato respiratório, etc.). Em algumas modalidades, qualquer um dos ácidos nucleicos recombinantes, vírus e/ou composições ou formulações farmacêuticas aqui descritas podem ser usados no tratamento de uma doença ou condição que se beneficiaria da expressão de um polipeptídeo CFTR (por exemplo, uma doença associada com uma deficiência de CFTR e/ou uma doença associada a uma mutação do gene CFTR ). Em algumas modalidades, qualquer um dos ácidos nucleicos recombinantes, vírus e/ou composições farmacêuticas ou formulações aqui descritas podem ser usados na prevenção ou tratamento de uma doença pulmonar crônica (como fibrose cística, COPD, etc.). Em algumas modalidades, qualquer um dos ácidos nucleicos recombinantes, vírus e/ou composições ou formulações farmacêuticas aqui descritas podem ser usados na prevenção ou tratamento da fibrose cística.
[00117] Em algumas modalidades, qualquer um dos ácidos nucleicos recombinantes, vírus e/ou composições farmacêuticas ou formulações aqui descritas podem ser usados na preparação de um medicamento útil para distribuir um ou mais polinucleotídeos que codificam um polipeptídeo CFTR em uma ou mais células de um sujeito (por exemplo, uma ou mais células deficientes em CFTR, uma ou mais células que abrigam uma mutação de gene CFTR , uma ou mais células do trato respiratório, etc.). Em algumas modalidades, qualquer um dos ácidos nucleicos recombinantes, vírus e/ou composições ou formulações farmacêuticas aqui descritas podem ser usados na preparação de um medicamento útil para a prevenção ou tratamento de uma doença ou condição que se beneficiaria da expressão de um polipeptídeo CFTR (por exemplo, uma doença associada com uma deficiência de CFTR e/ou uma doença associada a uma mutação do gene CFTR ). Em algumas modalidades, qualquer um dos ácidos nucleicos recombinantes, vírus e/ou composições farmacêuticas ou formulações aqui descritas podem ser usados
70 / 101 na preparação de um medicamento útil para a prevenção ou tratamento de uma doença pulmonar crônica (como fibrose cística, COPD, etc.). Em algumas modalidades, qualquer um dos ácidos nucleicos recombinantes, vírus e/ou composições farmacêuticas ou formulações aqui descritas podem ser usados na preparação de um medicamento útil para a prevenção ou tratamento da fibrose cística. VI. Métodos
[00118] Certos aspectos da presente divulgação se referem a intensificar, aumentar, elevar e/ou suplementar os níveis de um polipeptídeo CFTR em uma ou mais células de um sujeito, compreendendo administrar ao sujeito de qualquer um dos ácidos nucleicos recombinantes, vírus, medicamentos e/ou composições ou formulações farmacêuticas aqui descritas. Em algumas modalidades, o sujeito é um humano. Em algumas modalidades, o genoma do sujeito compreende uma mutação (por exemplo, uma mutação de perda de função) em um gene CFTR endógeno (uma ou ambas as cópias). Em algumas modalidades, o sujeito sofre de uma doença pulmonar crônica, por exemplo, fibrose cística, COPD, etc. Em algumas modalidades, o sujeito sofre de fibrose cística.
[00119] Em algumas modalidades, a administração do ácido nucleico recombinante, vírus, medicamento e/ou composição ou formulação farmacêutica ao sujeito aumenta os níveis de CFTR (níveis de transcrição ou proteína) em pelo menos cerca de 2 vezes em uma ou mais células contatadas ou tratadas do sujeito, em comparação com os níveis endógenos de CFTR em uma ou mais células não tratadas correspondentes no sujeito. Por exemplo, a administração do ácido nucleico recombinante, vírus, medicamento e/ou composição ou formulação farmacêutica pode aumentar os níveis de CFTR (níveis de transcrição ou proteína) em pelo menos cerca de 2 vezes, pelo menos cerca de 3 vezes, pelo menos cerca de 4 - vezes, pelo menos cerca de 5 vezes, pelo menos cerca de 6 vezes, pelo menos cerca de 7 vezes, pelo menos
71 / 101 cerca de 8 vezes, pelo menos cerca de 9 vezes, pelo menos cerca de 10 vezes, pelo menos cerca de 15 vezes, pelo menos cerca de 20 vezes, pelo menos cerca de 25 vezes, pelo menos cerca de 50 vezes, pelo menos cerca de 75 vezes, pelo menos cerca de 100 vezes, pelo menos cerca de 250 vezes, pelo menos cerca de 500 vezes, pelo menos cerca de 750 vezes, pelo menos cerca de 1000 vezes, ou mais em uma ou mais células contatadas ou tratadas do sujeito, em comparação com os níveis endógenos de CFTR em uma ou mais células não tratadas correspondentes no sujeito. Em algumas modalidades, uma ou mais células contatadas ou tratadas são uma ou mais células do trato respiratório (por exemplo, uma ou mais células do epitélio das vias aéreas e/ou uma ou mais células das glândulas submucosas). Os métodos de medição dos níveis de transcrição ou proteína de uma amostra são bem conhecidos por aqueles versados na técnica, incluindo, por exemplo, qPCR, western blot, espectrometria de massa, etc.
[00120] Outros aspectos da presente divulgação se referem a um método de redução dos níveis celulares de sódio em um sujeito em necessidade do mesmo, compreendendo administrar ao sujeito qualquer um dos ácidos nucleicos recombinantes, vírus, medicamentos e/ou composições ou formulações farmacêuticas aqui descritas. Em algumas modalidades, o sujeito é um humano. Em algumas modalidades, o genoma do sujeito compreende uma mutação (por exemplo, uma mutação de perda de função) em um gene CFTR endógeno (uma ou ambas as cópias). Em algumas modalidades, o sujeito sofre de uma doença pulmonar crônica, por exemplo, fibrose cística, COPD, etc. Em algumas modalidades, o sujeito sofre de fibrose cística.
[00121] Em algumas modalidades, a administração do ácido nucleico recombinante, vírus, medicamento e/ou composição ou formulação farmacêutica ao sujeito diminui os níveis de sódio intracelular em pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 15%, pelo menos cerca de 20%, pelo
72 / 101 menos cerca de 25%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 35%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 45%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 55%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 65 %, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 99% ou mais em uma ou mais células contatadas ou tratadas, em comparação com os níveis de sódio intracelular em uma ou mais células não tratadas correspondentes no sujeito. Os métodos de medição dos níveis intracelulares de sódio são geralmente conhecidos por aqueles versados na técnica.
[00122] Outros aspectos da presente divulgação se referem a um método para melhorar uma medida de pelo menos um volume respiratório em um sujeito em necessidade do mesmo, compreendendo administrar ao sujeito qualquer um dos ácidos nucleicos recombinantes, vírus, medicamentos e/ou composições ou formulações farmacêuticas descritas aqui. Em algumas modalidades, o sujeito é um humano. Em algumas modalidades, o genoma do sujeito compreende uma mutação (por exemplo, uma mutação de perda de função) em um gene CFTR endógeno (uma ou ambas as cópias). Em algumas modalidades, o sujeito sofre de uma doença pulmonar crônica, por exemplo, fibrose cística, COPD, etc.
[00123] Em algumas modalidades, a administração do ácido nucleico recombinante, vírus, medicamento e/ou composição ou formulação farmacêutica ao sujeito melhora uma medida de pelo menos um volume respiratório em pelo menos cerca de 5%, pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 15%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 25%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 35%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 45%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 55% , pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 65%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo
73 / 101 menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, em pelo menos cerca de 99% ou mais em comparação com pelo menos um volume respiratório de referência medido no sujeito antes do tratamento. Exemplos de volumes respiratórios adequados que podem ser medidos incluem, por exemplo: Capacidade pulmonar total (TLC), o volume nos pulmões na insuflação máxima; Volume corrente (TV), o volume de ar que entra ou sai dos pulmões durante a respiração tranquila; Volume residual (RV), o volume de ar remanescente nos pulmões após uma expiração máxima; Volume de reserva expiratório (ERV), o volume máximo de ar que pode ser expirado (acima do volume corrente) durante uma expiração forçada; Volume de reserva inspiratório (ERV), o volume máximo de ar que pode ser inalado na posição inspiratória final; Capacidade Inspiratória (IC), a soma de IRV e TV; Capacidade vital inspiratória (IVC), o volume máximo de ar inspirado do ponto de expiração máxima; Vital Capacity (VC), o volume de ar inspirado após a inspiração mais profunda; Capacidade residual funcional (FRC), o volume dos pulmões na posição expiratória final; Capacidade vital forçada (FVC), a determinação da capacidade vital de um esforço expiratório máximo forçado; Volume Expiratório Forçado (tempo) (FEVt), o volume de ar expirado em condições forçadas nos primeiros t segundos; Fluxo Inspiratório Forçado (FIF), uma medida específica da curva inspiratória forçada; Fluxo Expiratório de Pico (PEF), o maior fluxo expiratório forçado medido com um medidor de pico de fluxo; Ventilação voluntária máxima (MVV), o volume de ar expirado em um período específico durante o esforço máximo repetitivo; etc. Métodos de medição de volumes respiratórios são geralmente conhecidos por aqueles versados na técnica.
[00124] Outros aspectos da presente divulgação se referem a um método de redução ou prevenção de infecções bacterianas crônicas dos pulmões de um sujeito em necessidade do mesmo, compreendendo administrar ao sujeito qualquer um dos ácidos nucleicos recombinantes, vírus,
74 / 101 medicamentos e/ou composições farmacêuticas ou formulações aqui descritas. Em algumas modalidades, o sujeito é um humano. Em algumas modalidades, o genoma do sujeito compreende uma mutação (por exemplo, uma mutação de perda de função) em um gene CFTR endógeno (uma ou ambas as cópias). Em algumas modalidades, o sujeito sofre de uma doença pulmonar crônica, por exemplo, fibrose cística, COPD, etc. Em algumas modalidades, o sujeito sofre de fibrose cística. Métodos diretos e indiretos de monitoramento de infecções bacterianas nos pulmões, incluindo melhorias nas mesmas, são conhecidos por aqueles versados na técnica, incluindo, por exemplo, realizar: exames de sangue ou culturas, oximetria, medições de gases no sangue arterial, broncoscopia, transtraqueal culturas de muco, biópsias pulmonares, toracocentese, varreduras de tomografia computadorizada, etc.
[00125] Outros aspectos da presente divulgação se referem a um método de redução, prevenção ou tratamento da inflamação crônica dos pulmões de um sujeito em necessidade do mesmo, compreendendo administrar ao sujeito qualquer um dos ácidos nucleicos recombinantes, vírus, medicamentos e/ou composições farmacêuticas ou formulações aqui descritas. Em algumas modalidades, o sujeito é um humano. Em algumas modalidades, o genoma do sujeito compreende uma mutação (por exemplo, uma mutação de perda de função) em um gene CFTR endógeno (uma ou ambas as cópias). Em algumas modalidades, o sujeito sofre de uma doença pulmonar crônica, por exemplo, fibrose cística, COPD, etc. Em algumas modalidades, o sujeito sofre de fibrose cística. Métodos de medição da inflamação pulmonar, incluindo melhorias na mesma, são bem conhecidos por aqueles versados na técnica, incluindo, por exemplo, medir o óxido nítrico exalado, determinar a porcentagem de eosinófilos no escarro e/ou sangue, etc.
[00126] Outros aspectos da presente divulgação se referem a um método de redução, inibição ou tratamento da destruição progressiva do pulmão em um sujeito em necessidade, compreendendo administrar ao sujeito
75 / 101 qualquer um dos ácidos nucleicos recombinantes, vírus, medicamentos e/ou composições ou formulações farmacêuticas descritas aqui. Em algumas modalidades, o sujeito é um humano. Em algumas modalidades, o genoma do sujeito compreende uma mutação (por exemplo, uma mutação de perda de função) em um gene CFTR endógeno (uma ou ambas as cópias). Em algumas modalidades, o sujeito sofre de uma doença pulmonar crônica, por exemplo, fibrose cística, COPD, etc. Em algumas modalidades, o sujeito sofre de fibrose cística. Os métodos de medição da destruição do pulmão são bem conhecidos por aqueles versados na técnica, incluindo, por exemplo, pelos métodos descritos por Saetta et al. (Am Rev Respir Dis. 1985 May;131(5):764-9).
[00127] Outros aspectos da presente divulgação se referem a um método para fornecer alívio profilático, paliativo ou terapêutico a um ou mais sinais ou sintomas de fibrose cística em um sujeito em necessidade do mesmo, compreendendo administrar ao sujeito uma quantidade eficaz de qualquer um dos ácidos nucleicos recombinantes, vírus, medicamentos e/ou composições ou formulações farmacêuticas aqui descritas. Em algumas modalidades, o sujeito é um humano. Em algumas modalidades, o genoma do sujeito compreende uma mutação (por exemplo, uma mutação de perda de função) em um gene CFTR endógeno (uma ou ambas as cópias).
[00128] Os sinais e sintomas de fibrose cística podem incluir, sem limitação: tosse persistente que produz muco espesso; muco espesso e pegajoso que se acumula nas vias aéreas; respiração ofegante; falta de ar; sinusite; infecções pulmonares repetidas; passagens nasais inflamadas; bronquiectasia; pólipos nasais; hemoptise; pneumotórax; pancreatite; pneumonia recorrente; parada respiratória; e quaisquer combinações dos mesmos
[00129] Outros aspectos da presente divulgação se referem a um método para fornecer alívio profilático, paliativo ou terapêutico a um ou mais
76 / 101 sinais ou sintomas de COPD em um sujeito em necessidade do mesmo, compreendendo administrar ao sujeito uma quantidade eficaz de qualquer um dos ácidos nucleicos recombinantes, vírus, medicamentos e/ou composições ou formulações farmacêuticas aqui descritas. Em algumas modalidades, o sujeito é um humano. Em algumas modalidades, o sujeito é um fumante ou ex-fumante.
[00130] Os sinais e sintomas de COPD podem incluir, sem limitação: falta de ar; respiração ofegante; aperto no peito; excesso de muco nos pulmões; uma tosse crônica; cianose; infecções respiratórias frequentes; e quaisquer combinações dos mesmos.
[00131] Os ácidos nucleicos recombinantes, vírus, medicamentos e/ou composições farmacêuticas ou formulações aqui descritas podem ser administrados por qualquer método ou via adequada conhecida na técnica, incluindo, sem limitação, por via oral, intranasal, intratraqueal, sublingual, bucal, tópica, retal, via inalação, transdérmica, subcutânea, intradérmica, intravenosa, intra-arterial, intramuscular, intracardíaca, intraóssea, intraperitoneal, transmucosa, vaginal, intravítrea, intraorbital, subrretinal, intra-articular, periarticular, local e/ou epicutânea ou quaisquer combinações dos mesmos. A presente divulgação abrange, portanto, métodos de distribuição de qualquer um dos ácidos nucleicos recombinantes, vírus, medicamentos ou composições ou formulações farmacêuticas aqui descritas a um indivíduo (por exemplo, um indivíduo com, ou em risco de desenvolver, uma doença pulmonar crônica, como fibrose cística).
[00132] Em algumas modalidades, os ácidos nucleicos recombinantes, vírus, medicamentos e/ou composições ou formulações farmacêuticas aqui descritas são administrados por via oral, intranasal, intratraqueal e/ou por inalação. Métodos de distribuição de drogas aos pulmões por via oral, intranasal, intratraqueal e/ou inalada por vias de administração ou geralmente conhecidos por um versado na técnica (ver por exemplo, Gardenhire et al. A
77 / 101 Guide to Aerosol Delivery Devices for Respiratory Therapists, 4th Edition, American Association for Respiratory care, 2017; Patil et al. Pulmonary Drug Delivery Strategies: A Concise, Systematic Review, Lung India. 2012. 29(1):44-9; Marx et al. Intranasal Drug Administration – An Attractive Delivery Route for Some Drugs, 2015).
[00133] Em algumas modalidades, os ácidos nucleicos recombinantes, vírus, medicamentos e/ou composições ou formulações farmacêuticas são distribuídos aos pulmões por inalação de uma formulação em aerossol. A inalação pode ocorrer pelo nariz e/ou boca do sujeito. Dispositivos exemplificativos para distribuir os ácidos nucleicos recombinantes, vírus, medicamentos e/ou composições ou formulações farmacêuticas ao pulmão podem incluir, sem limitação, inaladores de pó seco, inaladores pressurizados de dose medida, inaladores de névoa suave, nebulizadores (por exemplo, nebulizadores a jato, nebulizadores ultrassônicos, nebulizadores de malha vibratória), jatos de colisão, jatos extrudados, atomização microfluídica de onda de superfície, geração de aerossol capilar, dispositivos eletro- hidrodinâmicos de aerossol, etc. (ver, por exemplo, Carvalho and McConville. The function and performance of aqueous devices for inhalation therapy.(2016) Journal of Pharmacy and Pharmacology.
[00134] As formulações líquidas podem ser administradas aos pulmões de um sujeito, por exemplo, usando um inalador de dose medida pressurizado (pMDI). Os pMDIs geralmente incluem pelo menos dois componentes: um recipiente em que a formulação líquida é mantida sob pressão em combinação com um ou mais propelentes e um receptáculo usado para reter e acionar o recipiente. O recipiente pode conter uma dose única ou doses múltiplas da formulação. O recipiente pode incluir uma válvula, normalmente uma válvula de medição, a partir da qual o conteúdo do recipiente pode ser descarregado. A droga em aerossol é dispensada a partir do pMDI aplicando uma força no recipiente para empurrá-lo para o receptáculo, abrindo assim a válvula e
78 / 101 fazendo com que as partículas da droga sejam transportadas da válvula através da saída do receptáculo. Após a saída do recipiente, a formulação líquida é atomizada, formando um aerossol. Os pMDIs normalmente empregam um ou mais propelentes para pressurizar o conteúdo do recipiente e para impulsionar a formulação líquida para fora da saída do receptáculo, formando um aerossol. Quaisquer propulsores adequados podem ser utilizados e podem assumir uma variedade de formas, incluindo, por exemplo, um gás comprimido ou um gás liquefeito.
[00135] As formulações líquidas podem ser administradas aos pulmões de um sujeito, por exemplo, usando um nebulizador. Os nebulizadores são geradores de aerossol líquido que convertem a formulação líquida em névoas ou nuvens de pequenas gotículas, muitas vezes com diâmetros inferiores a cerca de 5 mícrons de diâmetro aerodinâmico mediano de massa, que podem ser inalados para o trato respiratório inferior. As gotículas transportam o(s) agente(s) ativo(s) para o nariz, vias respiratórias superiores e/ou pulmões profundos quando a nuvem de aerossol é inalada. Qualquer tipo de nebulizador conhecido na técnica pode ser usado para administrar a formulação a um paciente, incluindo, sem limitação, nebulizadores pneumáticos (jato), nebulizadores eletromecânicos (por exemplo, nebulizadores ultrassônicos, nebulizadores de malha vibratória, etc.), etc. Os nebulizadores pneumáticos (jato) usam um suprimento de gás pressurizado como força motriz para a atomização da formulação líquida. O gás comprimido é fornecido através de um bico ou jato para criar um campo de baixa pressão que arrasta uma formulação líquida circundante e a corta em uma película fina ou filamentos. A película ou os filamentos são instáveis e se quebram em pequenas gotículas que são transportadas pelo fluxo de gás comprimido para a respiração inspiratória. Os defletores inseridos na tela da pluma de gotículas retiram as gotículas maiores e as devolvem ao reservatório de líquido a granel. Nebulizadores eletromecânicos usam força mecânica
79 / 101 gerada eletricamente para atomizar formulações líquidas. A força motriz eletromecânica pode ser aplicada, por exemplo, vibrando a formulação líquida em frequências ultrassônicas ou forçando o líquido a granel através de pequenos orifícios em uma película fina. As forças geram películas líquidas finas ou correntes de filamento que se separam em pequenas gotas para formar um fluxo de aerossol em movimento lento, o qual pode ser arrastado em um fluxo inspiratório. Em algumas modalidades, o nebulizador é um nebulizador de malha vibratória. Exemplos de nebulizadores de malha vibratória incluem, por exemplo, o Phillips InnoSpire, o Aerogen Solo, o PARI eFlow, etc.
[00136] As formulações líquidas podem ser administradas aos pulmões de um sujeito, por exemplo, usando um dispositivo de aerossol eletro- hidrodinâmico (EHD). Dispositivos de aerossol EHD utilizam energia elétrica para aerossolizar soluções ou suspensões de fármaco líquido.
[00137] As formulações de pó seco podem ser administradas aos pulmões de um sujeito, por exemplo, usando um inalador de pó seco (DPI). Os DPIs normalmente usam um mecanismo como uma explosão de gás para criar uma nuvem de pó seco dentro de um recipiente, que pode então ser inalado pelo sujeito. Em um DPI, a dose a ser administrada é armazenada na forma de um pó seco não pressurizado e, após a atuação do inalador, as partículas do pó são inaladas pelo sujeito. Em alguns casos, um gás comprimido pode ser usado para dispensar o pó, semelhante aos pMDIs. Em alguns casos, o DPI pode ser acionado pela respiração (um aerossol é criado em resposta precisa à inspiração). Normalmente, inaladores de pó seco administram uma dose inferior a algumas dezenas de miligramas por inalação para evitar a provocação de tosse. Exemplos de DPIs incluem, por exemplo, o inalador Turbohaler® (AstraZeneca), o inalador Clickhaler® (Innovata), o inalador Diskus® (Glaxo), o EasyHaler® (Orion), o inalador Exubera® (Pfizer), etc.
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[00138] Em algumas modalidades, os ácidos nucleicos recombinantes, vírus, medicamentos e/ou composições ou formulações farmacêuticas são administrados uma vez ao sujeito. Em algumas modalidades, os ácidos nucleicos, vírus, medicamentos e/ou composições farmacêuticas recombinantes são administrados pelo menos duas vezes (por exemplo, pelo menos 2 vezes, pelo menos 3 vezes, pelo menos 4 vezes, pelo menos 5 vezes, pelo menos 10 vezes , etc.) para o sujeito. Em algumas modalidades, pelo menos cerca de 1 hora (por exemplo, pelo menos cerca de 1 hora, pelo menos cerca de 6 horas, pelo menos cerca de 12 horas, pelo menos cerca de 18 horas, pelo menos cerca de 1 dia, pelo menos cerca de 2 dias, pelo menos cerca de 3 dias, pelo menos cerca de 4 dias, pelo menos cerca de 5 dias, pelo menos cerca de 6 dias, pelo menos cerca de 7 dias, pelo menos cerca de 15 dias, pelo menos cerca de 20 dias, pelo menos cerca de 30 dias, pelo menos cerca de 40 dias, pelo menos cerca de 50 dias, pelo menos cerca de 60 dias, pelo menos cerca de 70 dias, pelo menos cerca de 80 dias, pelo menos cerca de 90 dias, pelo menos cerca de 100 dias, pelo menos cerca de 120 dias, etc.) passam entre as administrações (por exemplo, entre a primeira e a segunda administrações, entre a segunda e a terceira administrações, etc.). Em algumas modalidades, os ácidos nucleicos recombinantes, vírus, medicamentos e/ou composições ou formulações farmacêuticas são administrados uma, duas, três, quatro, cinco ou mais vezes por dia ao sujeito. Em algumas modalidades, os ácidos nucleicos recombinantes, vírus, medicamentos e/ou composições ou formulações farmacêuticas são administrados uma, duas, três, quatro, cinco ou mais vezes por mês ao sujeito. Em algumas modalidades, os ácidos nucleicos recombinantes, vírus, medicamentos e/ou composições ou formulações farmacêuticas são administrados uma, duas, três, quatro, cinco ou mais vezes por ano ao sujeito. VII. Células Hospedeiras
[00139] Certos aspectos da presente divulgação se referem a uma ou
81 / 101 mais células hospedeiras compreendendo qualquer um dos ácidos nucleicos recombinantes aqui descritos.
Qualquer célula hospedeira adequada (procariótica ou eucariótica) conhecida na técnica pode ser usada, incluindo, por exemplo: células procarióticas incluindo eubactérias, tais como organismos Gram-negativos ou Gram-positivos, por exemplo Enterobacteriaceae, tais como Escherichia (por exemplo, E. coli ),Enterobacter, Erminia, Klebsiella, Proteus, Salmonella (por exemplo, S. typhimurium), Serratia (por exemplo, S. marcescans), e Shigella, bem como Bacilli como B. subtilis e B. licheniformis; células fúngicas (por exemplo, S. cerevisiae); células de inseto (por exemplo, células S2, etc.); e células de mamífero, incluindo a linhagem CV1 de rim de macaco transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651), linhagem de rim embrionário humano (células 293 ou 293 subclonadas para crescimento em cultura em suspensão), células de rim de hamster bebê (BHK, ATCC CCL 10), células de Sertoli de camundongo (TM4), células de rim de macaco (CV1 ATCC CCL 70), células de rim de macaco verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1587), células de carcinoma cervical humano (HELA, ATCC CCL 2), células renais caninas (MDCK, ATCC CCL 34), células de fígado de rato búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442), células de pulmão humano (W138, ATCC CCL 75), células de fígado humano (Hep G2, HB 8065), tumor mamário de camundongo (MMT 060562, ATCC CCL51), células TRI, células MRC 5, células FS4, linhagem de hepatoma humano (Hep G2), células de ovário de hamster chinês (CHO), incluindo células DHFR" CHO e linhagens de células de mieloma, como NS0 e Sp2 / 0. Em algumas modalidades, a célula hospedeira é uma célula primata humana ou não humana.
Em algumas modalidades, as células hospedeiras são células de uma linhagem celular.
Exemplos de células hospedeiras ou linhagens celulares adequadas podem incluir, mas não estão limitados a, 293, HeLa, SH-Sy5y, Hep G2, CACO-2, A549, L929, 3T3, K562, CHO-K1, MDCK, HUVEC, Vero, Células N20, COS-7, PSN1, VCaP, CHO e
82 / 101 semelhantes.
[00140] Em algumas modalidades, o ácido nucleico recombinante é um vetor viral herpes simplex. Em algumas modalidades, o ácido nucleico recombinante é um amplicon do vírus do herpes simplex. Em algumas modalidades, o ácido nucleico recombinante é um amplicon de HSV-1 ou amplicon de HSV-1 híbrido. Em algumas modalidades, uma célula hospedeira compreendendo um vírus auxiliar é posta em contato com um amplicon HSV- 1 ou amplicon híbrido HSV-1 aqui descrito, resultando na produção de um vírus compreendendo um ou mais ácidos nucleicos recombinantes aqui descritos. Em algumas modalidades, o vírus é coletado do sobrenadante da célula hospedeira contatada. Os métodos de geração de vírus por contato de células hospedeiras compreendendo um vírus auxiliar com um amplicon de HSV-1 ou amplicon de HSV-1 híbrido são conhecidos na técnica.
[00141] Em algumas modalidades, a célula hospedeira é uma célula de levedura. Em algumas modalidades, a célula hospedeira complementar expressa um ou mais genes que estão inativados em qualquer um dos vetores virais aqui descritos. Em algumas modalidades, a célula hospedeira complementar é colocada em contato com um genoma de vírus de herpes recombinante (por exemplo, um genoma de vírus de herpes simplex recombinante) aqui descrito. Em algumas modalidades, o contato de uma célula hospedeira complementar com um genoma do vírus do herpes recombinante resulta na produção de um vírus do herpes compreendendo um ou mais ácidos nucleicos recombinantes aqui descritos. Em algumas modalidades, o vírus é coletado do sobrenadante da célula hospedeira contatada. Os métodos de geração de vírus por contato de células hospedeiras complementares com um vírus herpes simplex recombinante são geralmente descritos em WO2015/009952, WO2017/176336, WO2019/200163, WO2019/210219 e/ou WO2020/006486. VIII. Artigos de Fabricação ou Kits
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[00142] Certos aspectos da presente divulgação se referem a um artigo de fabricação ou um kit compreendendo qualquer um dos ácidos nucleicos recombinantes, vírus, medicamentos e/ou composições ou formulações farmacêuticas aqui descritas. Em algumas modalidades, o artigo de fabricação ou kit compreende uma bula compreendendo instruções para administrar o ácido nucleico recombinante, vírus, medicamento e/ou composição farmacêutica ou formulação para tratar uma deficiência de CFTR (por exemplo, em um sujeito portador de mutações genéticas homozigóticas de perda de função CFTR ) e/ou para fornecer alívio profilático, paliativo ou terapêutico de um ou mais sinais ou sintomas de uma doença pulmonar crônica (como fibrose cística ou COPD). Em algumas modalidades, o artigo ou fabricação ou kit compreende ainda um dispositivo para administrar (por exemplo, aerossolizar) o ácido nucleico recombinante, vírus, medicamento e/ou composição ou formulação farmacêutica. Em algumas modalidades, o dispositivo é um nebulizador (por exemplo, um nebulizador de malha vibratória).
[00143] Recipientes adequados para os ácidos nucleicos recombinantes, vírus, medicamentos e/ou composições ou formulações farmacêuticas podem incluir, por exemplo, garrafas, frascos, sacos, tubos e seringas. O recipiente pode ser formado a partir de uma variedade de materiais, como vidro, plástico (como policloreto de vinil ou poliolefina) ou liga metálica (como aço inoxidável ou hastelloy). Em algumas modalidades, o recipiente compreende um rótulo no recipiente ou associado ao recipiente, em que o rótulo indica as instruções de uso. O artigo de fabricação ou kit pode incluir ainda outros materiais desejáveis do ponto de vista comercial e do usuário, incluindo outros tampões, diluentes, filtros, inaladores, nebulizadores, dispositivos de administração intranasal, uma bula e semelhantes.
[00144] O relatório descritivo é considerado suficiente para permitir
84 / 101 que um versado na técnica pratique a presente divulgação. Várias modificações da invenção em adição às apresentadas e descritas aqui serão evidentes para os versados na técnica a partir da descrição anterior e estão dentro do escopo das reivindicações anexas.
EXEMPLOS
[00145] A invenção será mais completamente compreendida pela referências aos seguintes exemplos. Eles não devem, no entanto, ser interpretados como limitantes do escopo da invenção. Entende-se que os exemplos e modalidades descritos neste documento são apenas para fins ilustrativos, e que várias modificações ou alterações à luz dos mesmos serão sugeridas para pessoas versadas na técnica e devem ser incluídas dentro do espírito e alcance deste pedido e escopo das reivindicações anexas. Exemplo 1: vetores de vírus herpes simplex modificados que codificam uma proteína CFTR humana
[00146] Para fazer vetores de genoma de vírus de herpes simplex modificados capazes de expressar polipeptídeos CFTR em uma célula de mamífero alvo (como células do pulmão), um genoma de vírus de herpes simplex (FIG. 1A) é primeiro modificado para inativar um ou mais genes de vírus de herpes simplex. Essas modificações podem diminuir a toxicidade do genoma em células de mamíferos. Em seguida, as variantes desses construtos virais recombinantes modificadas / atenuadas são geradas de modo que carreguem um ou mais polinucleotídeos que codificam o polipeptídeo CFTR desejado. Estas variantes incluem: 1) um genoma de HSV-1 modificado com ΔICP4 recombinante compreendendo cassetes de expressão contendo a sequência de codificação (por exemplo, SEQ ID NO: 2) de um polipeptídeo CFTR humano (por exemplo, SEQ ID NO: 5) sob o controle de um promotor heterólogo integrado em cada locus ICP4 (FIG. 1B); 2) um genoma de HSV- 1 modificado com ΔICP4 / ΔUL41 recombinante compreendendo cassetes de expressão contendo a sequência de codificação de um polipeptídeo CFTR
85 / 101 humano sob o controle de um promotor heterólogo integrado em cada locus ICP4 (FIG. 1C); 3) um genoma de HSV-1 modificado com ΔICP4 / ΔUL41 recombinante compreendendo um cassete de expressão contendo a sequência de codificação de um polipeptídeo CFTR humano sob o controle de um promotor heterólogo integrado no locus UL41 (FIG. 1D); 4) um genoma de HSV-1 modificado com ΔICP4 / ΔICP22 recombinante compreendendo cassetes de expressão contendo a sequência de codificação de um polipeptídeo CFTR humano sob o controle de um promotor heterólogo integrado em cada locus ICP4 (FIG. 1E); 5) um genoma de HSV-1 modificado com ΔICP4 / ΔICP22 recombinante compreendendo um cassete de expressão contendo a sequência de codificação de um polipeptídeo CFTR humano sob o controle de um promotor heterólogo integrado no locus ICP22 (FIG. 1F); 6) um genoma de HSV-1 modificado com ΔICP4 / ΔUL41 / ΔICP22 recombinante compreendendo cassetes de expressão contendo a sequência de codificação de um polipeptídeo CFTR humano sob o controle de um promotor heterólogo integrado em cada locus ICP4 (FIG. 1G); 7) um genoma de HSV-1 modificado com ΔICP4 / ΔUL41 / ΔICP22 recombinante compreendendo um cassete de expressão contendo a sequência de codificação de um polipeptídeo CFTR humano sob o controle de um promotor heterólogo integrado no locus UL41 (FIG. 1H); e 8) um genoma de HSV-1 modificado com ΔICP4 / ΔUL41 / ΔICP22 recombinante compreendendo um cassete de expressão contendo a sequência de codificação de um polipeptídeo CFTR humano sob o controle de um promotor heterólogo integrado no locus ICP22 (FIG. 1I)
[00147] Esses vetores de genoma de vírus de herpes simplex modificados são transfectados em células modificadas para expressar um ou mais genes de vírus de herpes. Estas células modificadas secretam no sobrenadante da cultura de células um vírus herpes simplex de replicação defeituosa com os genomas modificados empacotados nele. O sobrenadante é
86 / 101 então recolhido, concentrado e esterilizado por filtração através de um filtro de 5 µm. Exemplo 2: construção e caracterização in vitro de um vetor HSV-1 que codifica CFTR humano em culturas 2D
[00148] Os ensaios clínicos iniciais de terapia genética pulmonar ocorreram no início da década de 1990, após a descoberta do defeito genético responsável pela fibrose cística. O adenovírus recombinante foi um dos primeiros vetores testados para distribuição de CFTR ; no entanto, os vetores baseados em adeno falharam nesses ensaios principalmente devido à escassez de receptores virais na superfície apical do pulmão e à gravidade da resposta imune do hospedeiro à distribuição viral repetida. Os outros vetores de terapia genética viral administrados a pacientes com CF foram baseados em vírus adenoassociados (vários sorotipos de AAV foram testados no ambiente clínico de CF). Grandes estudos de administração repetida de vetores de terapia genética baseados em AAV forneceram resultados decepcionantes na melhoria da função pulmonar de CF em pacientes dosados. Muito parecido com o adenovírus, os vetores AAV recombinantes não infectam e forma eficaz a superfície apical do pulmão e, devido às limitações físicas do tamanho da carga codificada, os vetores AAV não distribuem de forma eficaz o CFTRhumano de comprimento total. Apesar de mais de duas décadas de esforço intensivo, as terapias genéticas baseadas em vírus ainda precisam ajudar os pacientes com CF (ou qualquer outra doença pulmonar obstrutiva).
[00149] No momento, de acordo com a US Cystic Fibrosis Foundation, não há ensaios clínicos em andamento de terapias genéticas virais no CF e apenas dois vetores de terapia genética baseados em vírus estão em desenvolvimento pré-clínico (ambos baseados em AAV, um vetor que, como observado acima, já falhou em vários ensaios clínicos em pacientes com CF). Em vez disso, o foco mudou de vetores baseados em vírus para métodos não virais de distribuição de CFTR (por exemplo, plasmídeos de DNA ou mRNAs
87 / 101 complexados com lipossomas). Infelizmente, esses vetores não virais tiveram sucesso apenas limitado, devido, pelo menos em parte, aos obstáculos significativos enfrentados pela instabilidade do produto e/ou distribuição / transfecção ineficiente de formulações lipossômicas. Ao todo, mais de 25 ensaios clínicos envolvendo mais de 470 pacientes testando vetores genéticos virais e não virais não mostraram benefício clínico, em grande parte devido à transferência ineficiente de genes para células-alvo e depuração imunomediada do hospedeiro após exposição repetida.
[00150] Para este fim, um vetor de vírus herpes simplex tipo 1 (HSV- 1) que codifica CFTR humano de comprimento completo (HSV-CFTR) foi desenvolvido como uma nova terapia genética para o tratamento de pacientes com CF. Sem desejar estar limitado pela teoria, acredita-se que uma abordagem baseada em HSV supera muitos dos obstáculos experimentados por outros vetores de terapia genética para CF, incluindo a capacidade de codificar CFTR humano de comprimento total, a alta eficiência de transdução de células alvo (o HSV infecta preferencialmente a membrana apical das células epiteliais polarizadas), a estabilidade do vírus e a segurança clínica estabelecida da administração repetida de um produto que emprega a mesma espinha dorsal viral do HSV-CFTR no contexto do ambiente altamente inflamatório da pele ferida (Identificador ClinicalTrials.gov: NCT03536143). O exemplo a seguir descreve experimentos que mostram que este novo vetor de terapia genética baseado em HSV foi capaz de expressar CFTR humano de comprimento total funcional em células epiteliais das vias aéreas derivadas de pacientes com fibrose cística (SAECs) de uma maneira dependente da dose.
[00151] HSV-CFTR foi construído conforme descrito no Exemplo 1 acima. SAECs primários de pacientes com CF cultivados em cultura 2D não foram infectados (simulação) ou foram infectados com HSV-CFTR em multiplicidades de infecção (MOIs) de 0,3, 1 ou 3. A expressão de CFTR humano foi avaliada 48 horas após a infecção em células colhidas por PCR de
88 / 101 transcrição reversa quantitativa (qRT-PCR). Transcritos de CFTR otimizados por códon foram detectados em CF SAECs primários infectados em um MOI tão baixo quanto 0,3 e pareceram mostrar um aumento dependente da dose na expressão do transgene até um MOI de 3,0 (FIG. 2). Pouco ou nenhum RNA de CFTR exógeno foi observado em amostras de controle com infecção simulada, demonstrando a especificidade do ensaio para o transgene humano codificado por HSV.
[00152] A expressão da proteína CFTR em SAECs CF primários infectados com HSV-CFTR foi avaliada por meio de análise de Western blot. GAPDH foi usado como um controle para garantir o carregamento consistente das amostras. SAECs de pacientes com CF superexpressaram CFTR humano quando infectados com HSV-CFTR, em comparação com células de controle com infecção simulada (FIG. 3). Curiosamente, enquanto a proteína CFTR endógena em células com infecção simulada resolvida como uma única banda ligeiramente maior do que 150 kDa (o tamanho previsto de CFTR humano de comprimento total é 168 kDa), a proteína CFTR exógena expressa em células transduzidas por HSV-CFTR apareceu como um dupleto de tamanho significativamente maior. O CFTR humano é conhecido por existir em três formas diferentes dependendo do estado de glicosilação: (1) não glicosilado; (2) núcleo glicosilado; e (3) complexo glicosilado, totalmente maduro (Scanlin, 2001, Respir Res, 2(5), pp. 276-9). O aparecimento de uma única banda de baixo peso molecular em células de paciente com CF simulada infectada sugeriu que a proteína endógena (mutante) existe apenas na forma não glicosilada, indicativa de uma variante de proteína imatura que não trafega adequadamente através do retículo endoplasmático (ER) para a superfície celular. Em forte contraste, o aparecimento das duas formas maiores de CFTR em células infectadas com HSV-CFTR revelou extensa modificação pós-tradução do transgene humano, provavelmente representando o núcleo glicosilado e variantes glicosiladas complexas de
89 / 101 CFTR, sugerindo maturação adequada e tráfego da proteína exógena através do ER.
[00153] A expressão da proteína CFTR e a localização relativa foram examinadas em seguida por imunofluorescência. SAECs primários de pacientes com CF foram transduzidos com HSV-CFTR nos MOIs indicados por 48 horas, e a coloração de imunofluorescência para CFTR humano foi realizada. Uma amostra de controle de infecção simulada foi adicionada para mostrar os níveis de linha de base e a localização celular da proteína CFTR mutante endógena nessas células doentes. Quando analisados no contexto das células de controle, os dados de imunofluorescência demonstraram que os SAECs transduzidos exibiram um aumento dependente da dose de HSV- CFTR na expressão da proteína CFTR (FIG. 4A). Ao comparar a localização celular relativa de CFTR expressa em SAECs de pacientes com CF infectados com HSV-CFTR e simulados de infecção (FIG. 4B), a CFTR expressa em células não infectadas parecia ser relegada para a região perinuclear (sugestivo de aprisionamento e renovação em o ER), enquanto CFTR foi encontrado em todo o citoplasma e na superfície celular de células HSV- CFTR transduzidas (indicativo de maturação adequada e tráfego através do ER). Estes dados estavam de acordo com os dados de western blot que sugeriram que o CFTR expresso em HSV-CFTR de tipo selvagem foi totalmente glicosilado enquanto o CFTR mutante endógeno foi não glicosilado (FIG. 3).
[00154] Finalmente, a funcionalidade do CFTR humano expresso por HSV-CFTR em SAECs de pacientes com CF infectados foi confirmada usando um ensaio de captação de corante fluorescente di-hidrorodamina 6G (dR6G) que foi previamente validado como um ponto final funcional para restauração de CFTR mediada por vírus em cultura de células epiteliais de paciente com CF 2D (Wersto, 1996, Proc Natl Acad Sci USA, 93(3), pp. 1167-72). Resumidamente, HSV-CFTR ou SAECs de pacientes com CF
90 / 101 primário com infecção simulada foram incubados com meio de cultura de células contendo dR6G por 15 minutos, lavados quatro vezes com PBS, lisados em tampão RIPA e a excitação 526 nm / fluorescência de emissão de 555 nm foi lida para cada amostra um leitor de placas. O dR6G é em si não fluorescente, mas é convertido no composto fluorescente rodamina 6G mediante captação celular e exposição à desidrogenases intracelulares, um processo que depende da presença de CFTR funcional (Wersto, 1996, Proc Natl Acad Sci USA, 93(3) , pp. 1167-72). Um ensaio de BCA foi realizado em cada lisado celular para quantificar o teor de proteína total e a fluorescência relativa por µg de proteína total foi calculada para cada amostra (FIG. 5). A infecção por HSV-CFTR de SAECs primários de pacientes com CF causou um aumento modesto e dependente da dose na captação de dR6G em comparação com controles de infecção simulada, indicando que HSV-CFTR foi capaz de restaurar a função CFTR nessas células epiteliais primárias doentes. Exemplo 3: variação de dose in vitro de HSV-CFTR e farmacologia em culturas organotípicas 3D usando organoides derivados de pacientes com
CF
[00155] As mutações no gene CFTR são classificadas em uma das seis classes pelo mecanismo primário que leva ao mau funcionamento do CFTR. As mutações que afetam a síntese e o processamento resultam em doenças mais graves porque pouca ou nenhuma proteína atinge a superfície da célula; mutações que não interferem com o tráfego luminal, mas reduzem o efluxo aniônico mediado por CFTR, muitas vezes levam a sintomas menos graves devido à retenção de alguma função residual de CFTR na membrana apical (Foundation, 2019, 2018 Annual Data Report, Bethesda: Cystic Fibrosis Foundation). Como as mutações de CFTR afetam estágios distintos da síntese e função de proteínas, os esforços recentes de desenvolvimento de drogas têm se concentrado em terapias moduladoras de pequenas moléculas direcionando
91 / 101 uma fonte específica do defeito da proteína. Por exemplo, ivacaftor, subclassificado como um "potenciador" de proteína CFTR, aumenta a secreção de cloreto de CFTR membranal (proporcionando benefício clínico para pessoas com mutações de condutância e gating CFTR classe III e IV específicas), enquanto o elexacaftor, subclassificado como um "corretor" de proteína CFTR, age facilitando o dobramento adequado e o processamento celular do CFTR que, de outra forma, seria degradado pela via de controle de qualidade do retículo endoplasmático (proporcionando benefício clínico para pessoas com mutações de tráfico CFTR classe II específicas) (Clancy, 2019, Am J Respir Crit Care Med, 186(7), pp. 593-7). Embora a recente aprovação do FDA de quatro dessas terapias moduladoras tenha sido uma bênção para os pacientes com CF que albergam as mutações específicas que respondem a essas drogas, esses moduladores tratam apenas um subconjunto da população com CF. Em particular, a necessidade de intervenção medicamentosa eficaz são os pacientes portadores de mutações de classe I (responsáveis por ~ 10% dos casos de CF em todo o mundo), abrangendo estrutura, emenda e mutações sem sentido que resultam em expressão de CFTR gravemente reduzida ou ausente, já que esses pacientes sofrem com as formas mais severas e mortais de CF (Wilschanski, 2012, Front Pharmacol, 20(3), pp. 1-3).
[00156] Devido à falta de modelos animais de CF adequados, estudos de eficácia em células epiteliais brônquicas diferenciadas de interface ar- líquido derivadas de materiais de explante pulmonar de pacientes com CF têm sido usados para alguns esforços de desenvolvimento de drogas após experimentação de prova de conceito em sistemas celulares 2D heterólogos (Neuberger, 2011, Methods Mol Biol, 741(1), pp. 39-54) (Randell, 2011, Methods Mol Biol, 742(1), pp. 285-310). No entanto, a disponibilidade limitada de tecidos de explante pulmonar e os procedimentos invasivos necessários para obter células brônquicas de pacientes com CF sem doença em estágio final levaram ao desenvolvimento de sistemas organotípicos 3D
92 / 101 derivados de tecidos de "fácil acesso" colhidos de pacientes mutantes CFTR , para testar novas terapêuticas para tratar a CF. Uma dessas tecnologias, usando um ensaio de intumescimento induzido por forscolina (FIS), emprega organoides intestinais derivados de pacientes com CF (PDOs) para estudar a função da proteína CFTR sozinha ou em resposta à intervenção farmacêutica (Dekkers, 2013, Nat Med, 19(7), pp. 939-45), e provou ser um avanço no desenvolvimento de drogas para CF. Quando expostos à forscolina, os organoides aumentam rapidamente seu teor de AMP cíclico, o que por sua vez resulta na abertura do canal CFTR. Organoides derivados de biópsias retiradas de indivíduos saudáveis intumescem como consequência do transporte de íons e água para o lúmen organoide mediado por CFTR, enquanto organoides derivados de biópsias de pacientes mutantes de CFTR (ou organoides de tipo selvagem expostos a inibição farmacológica específica da função da proteína CFTR) têm capacidade de intumescimento reduzida ou completamente inibida (Boj, 2017, J Vis Exp, 120(1), p. e55159). O uso de PDOs CF permite a medição quantitativa da função da proteína CFTR (por meio da detecção de intumescimento de organoide) após o tratamento com novas terapêuticas, e os resultados positivos deste sistema organotípico 3D mostraram se correlacionar diretamente com o benefício clínico, incluindo ambas as alterações nas respostas pulmonares e concentração de cloreto no suor em pacientes com CF tratados (Berkers, 2019, Cell Rep, 26(7), pp. 1701- 1708).
[00157] O seguinte exemplo descreve experiências que mostram que o vetor HSV-1 HSV-CFTR recombinante, caracterizado no Exemplo 2 acima, foi capaz de resgatar o fenótipo cístico de PDOs CF, independentemente da mutação CFTR subjacente.
[00158] A capacidade do HSV-CFTR de restaurar a expressão funcional do CFTR foi testada em culturas organotípicas 3D clinicamente relevantes usando organoides intestinais derivados de quatro pacientes com
93 / 101 CF diferentes; (1) uma paciente do sexo feminino homozigótica para uma mutação F508del CFTR (mutação de classe II), (2) um paciente do sexo masculino também homozigoto para a mutação F508del, (3) uma paciente do sexo feminino homozigótica para uma mutação G542X sem sentido de CFTR (mutação de classe I), e (4) uma paciente do sexo feminino homozigótica para uma mutação CFTR sem sentido W1282X (mutação de classe I). Para avaliar a atividade de CFTR em organoides transduzidos, a morfologia e o tamanho dos organoides foram avaliados 24 ou 48 horas após a infecção, e um ensaio FIS foi realizado conforme descrito anteriormente (Boj, 2017, J Vis Exp, 120(1), p. e55159). Para infecção eficiente dos organoides CF, os organoides foram cortados em pequenos fragmentos, incubados em solução com HSV- CFTR nos MOIs indicados por 1 hora, e semeados em placas de fundo claro de 96 poços para análise. O ensaio FIS foi conduzido 24 ou 48 horas após a semeadura, conforme descrito em mais detalhes abaixo.
[00159] Primeiro, o G542X / G542X PDO foi infectado em MOIs de 10, 20 e 40 para avaliar o impacto do vetor no intumescimento do organoide e na viabilidade celular. Organoides intestinais derivados de um paciente saudável foram semeados em paralelo como um comparador. Surpreendentemente, os organoides transduzidos com HSV-CFTR mostraram formação de lúmen e uma morfologia cística clara imitando PDOs de tipo selvagem 24 horas após a infecção, sugerindo correção funcional completa do fenótipo doente pelo vetor engenheirado antes da adição de forscolina (FIG. 6A) . Um vetor HSV que expressa mCherry foi usado como um controle negativo para mostrar que as alterações na morfologia de PDO observadas nas amostras tratadas com HSV-CFTR não foram devido a uma resposta não específica à infecção viral. Em seguida, um ensaio FIS foi realizado 48 horas após a infecção. Em t = 0, antes da adição de forscolina e subsequente ativação de CFTR, os organoides transduzidos com HSV-CFTR já possuíam uma área de lúmen significativamente alargada, em comparação com os
94 / 101 organoides tratados com veículo ou infectados com mCherry, de acordo com as observações de 24 horas pós-infecção (FIG. 6B). Curiosamente, apenas um aumento moderado no intumescimento organoide foi observado 60 minutos após a adição de forscolina (t = 60) em organoides transduzidos com HSV- CFTR, provavelmente devido a esses organoides já estarem perto de seu potencial máximo de intumescimento antes da exposição à forscolina (FIG. 6C). A mutação G542X / G542X pode ser (pelo menos parcialmente) corrigida pela exposição ao aminoglicosídeo geneticina (G418) que permite a leitura translacional da mutação sem sentido, e G418 foi incluído neste ensaio como um controle positivo. Enquanto os PDOs G542X / G542X intumesceram na presença de G418 em t = 60, o tamanho organoide médio nessas amostras de controle positivo foi significativamente menor do que aqueles dos PDOs expostos a HSV-CFTR (FIGS. 6B e 6C). Toxicidade leve a moderada do vetor nos PDOs G542X / G542X foi observada 48 horas após a infecção quando HSV-CFTR foi usado em um MOI de 20 ou 40, e a toxicidade em um MOI≥20 é provavelmente causadora da capacidade diminuída para intumescimento observado nestes organoides, em comparação com as amostras infectadas em um MOI de 10. No entanto, embora um efeito citotóxico em MOIs elevados tenha sido observado, os organoides tratados ainda superaram o controle de pequenas moléculas positivas.
[00160] Porque HSV-CFTR corrigiu organoides doentes para a morfologia de tipo selvagem (grande lúmen cístico) em todos os MOIs testados dentro de 24 horas, e as doses mais altas de HSV-CFTR pareceram impactar negativamente os organoides nos ensaios de intumescimento, os três PDOs de fibrose cística restantes foram testados em doses mais baixas de HSV-CFTR (MOIs de 1, 5 e 10) e foram analisados por meio do ensaio FIS 24 horas após a infecção. Primeiro, HSV-CFTR foi testado em PDOs derivados de um paciente que é homozigoto para a mutação F508del de CFTR. F508del é a mutação mais comum em pacientes com fibrose cística;
95 / 101 pelo menos uma cópia deste alelo é encontrada em aproximadamente 85% dos pacientes com CF em todo o mundo, e F508del é responsável por cerca de 70% das mutações de perda de função de CFTR (Maiuri, 2015, Ann Transl Med, 3(Supple 1), p. S24). A maioria das culturas organoides F508del testadas mostrou uma morfologia cística (tipo selvagem) 24 horas após a infecção com HSV-CFTR, mesmo na dose mais baixa testada (MOI de 1). O tamanho médio dos organoides F508del tratados com HSV-CFTR foi significativamente aumentado em comparação com o controle do veículo ou organoides infectados com mCherry antes da adição de forscolina (FIG. 7A). Nenhuma mudança significativa no tamanho organoide médio foi detectada após a adição de forscolina em amostras transduzidas com HSV-CFTR, uma vez que esses organoides já estão em ou perto de sua capacidade máxima de intumescimento, ou seja, "pré-intumescidos" (FIG. 7B). É importante ressaltar que a correção funcional do defeito de CFTR em organoides F508del foi considerada semelhante entre os organoides tratados com HSV-CFTR antes do tratamento com forscolina e os organoides expostos a Orkambi®de controle positivo 60 minutos após o tratamento com forscolina (FIG. 7A vs. FIG. 7B). Orkambi® é uma terapia combinada de lumacaftor / ivacaftor aprovada pela FDA para o tratamento de pacientes com CF com 2 anos ou mais que são homozigotos para a mutação F508del. Nenhuma citotoxicidade aparente atribuível ao vetor foi observada em qualquer um dos MOIs testados.
[00161] Em seguida, organoides derivados de um paciente homozigoto para uma segunda mutação sem sentido de CFTR (W1282X) foram infectados com HSV-CFTR, e o tamanho do organoide foi quantificado antes e depois da adição de forscolina. De acordo com os dados apresentados na FIG. 6 acima, HSV-CFTR restaurou de forma eficiente o fenótipo cístico de tipo selvagem e aumentou o tamanho do organoide médio 24 horas após a infecção nos PDOs CFTR sem sentido W1282X / W1282X antes da adição de forscolina (FIG. 8A). Novamente, HSV-CFTR em um MOI tão baixo quanto 1 pareceu
96 / 101 corrigir a morfologia da doença antes e depois da adição de forscolina (FIGS. 8A e 8B). G418 também foi incluído nesses experimentos; no entanto, os PDOs W1282X / W1282X não respondem a este aminoglicosídeo de leitura, portanto, nenhum controle positivo pode ser incluído neste experimento (como nenhuma terapia eficaz existe atualmente para todas as mutações CFTR sem sentido). Estes dados sugeriram que HSV-CFTR poderia restaurar a função CFTR em amostras de pacientes nulos CFTR G418 responsivos e G418 não responsivos.
[00162] Finalmente, organoides de um segundo paciente homozigoto F508del foram testados. Os PDOs infectados com HSV-CFTR tiveram um tamanho médio ligeiramente aumentado em comparação com os organoides tratados com veículo, mas esta diferença não foi estatisticamente significativa (FIGS 9A e 9B).
[00163] Os dados desses estudos revelaram que a transdução de organoides intestinais com CF com HSV-CFTR resultou em uma alteração notável da morfologia organoide, de um fenótipo compacto de CF em brotamento para um fenótipo organoide cístico contendo um lúmen bem definido exibindo características de tipo selvagem, dentro de 24 horas de infecção em MOIs variando de 1 a 40. Este fenótipo de tipo selvagem "pré- intumescido" foi demonstrado quantitativamente medindo o tamanho organoide total, antes da adição de forscolina e ativação resultante de CFTR, em comparação com múltiplos controles negativos. Devido à natureza "pré- intumescida" dos organoides transduzidos com HSV-CFTR, a capacidade da forscolina de estimular mais intumescimento foi limitada. A observação de uma morfologia cística corrigida em organoides com CF expostos a baixas doses de HSV-CFTR sugeriu que altos níveis de CFTR de tipo selvagem exógeno expressos em uma minoria de células foram suficientes para estabelecer a correção da doença, indicando um efeito "dominante" desta modalidade terapêutica. Um organoide F508del mostrou uma restauração
97 / 101 ligeiramente menos eficiente do fenótipo de tipo selvagem em comparação com as outras culturas organoides de CF examinadas; no entanto, uma morfologia cística foi observada em todos os organoides com CF infectados com HSV-CFTR em um MOI de 5 ou superior. As diferenças observadas entre as várias culturas organoides intestinais de CF foram provavelmente devido a ligeiras alterações de seu status proliferativo ou de diferenciação no momento da infecção e, portanto, é improvável que o próprio genótipo CFTR tenha contribuído significativamente para a eficiência da transdução HSV- CFTR ou expressão de CFTR funcional. Por outro lado, o HSV-CFTR corrigiu o fenótipo da doença de CF, independentemente da mutação CFTR subjacente neste sistema organotípico 3D clinicamente traduzível.
[00164] Tomados em conjunto, os dados fornecidos nestes exemplos indicam que HSV-CFTR infectou epitélios das vias aéreas relevantes, produziu CFTR humano funcional de forma eficaz e corrigiu molecularmente vários defeitos de CFTR sem toxicidade significativa. Sem desejar estar limitado pela teoria, acredita-se que esses estudos representam o primeiro exemplo de validação experimental de um vetor de terapia genética baseado em HSV atenuado para a distribuição de CFTR humano funcional de comprimento total, apoiando a aplicação de HSV-CFTR como uma nova terapia genética amplamente aplicável para o tratamento de CF. Exemplo 4: administração de prova de conceito in vivo de um vetor baseado em HSV inalado
[00165] O exemplo a seguir descreve um estudo de prova de conceito in vivo examinando a viabilidade de administrar um vetor baseado em HSV à traqueia e/ou pulmões de animais imunocompetentes após administração intranasal ou intratraqueal do vírus.
[00166] Todos os procedimentos conduzidos neste exemplo estavam em conformidade com as leis aplicáveis de bem-estar animal e foram aprovados pelo Comitê Institucional de Uso e Cuidado de Animais (IACUC)
98 / 101 local. 10 camundongos C57BL / 6 de cinco a seis semanas de idade foram usados no estudo, cinco dos quais receberam HSV-mCherry (descrito acima) ou controle de veículo por administração intratraqueal, e cinco dos quais receberam HSV-mCherry ou controle de veículo por administração intranasal. Antes dos procedimentos experimentais, os animais foram vedados com uma injeção intraperitoneal de uma mistura de telazol / dexdomitor e uma pomada oftálmica foi aplicada nos olhos para evitar o ressecamento das córneas.
[00167] Para administração intratraqueal, o pescoço de cada camundongo foi raspado com um barbeador elétrico e creme depilatório foi aplicado para remover todo o pelo remanescente. A área cirúrgica foi então limpa duas vezes com swabs embebidos em etanol 70%, e os camundongos anestesiados foram posicionados em um suporte de contenção em ângulo. Uma pequena incisão no pescoço foi realizada com tesoura cirúrgica e os músculos timo, platisma e traqueal anterior foram afastados para visualização e acesso aos anéis traqueais. Uma injeção intratraqueal de 25µL de 4,9375x108 unidades formadoras de placa (PFUs) de HSV-mCherry foi administrada a três animais, enquanto uma injeção intratraqueal de 25µL de controle de veículo foi administrada a dois animais, e cada camundongo foi mantido em uma posição suspensa até a respiração retornar gradualmente ao normal. O local da incisão foi fechado com pontos simples, atados individualmente.
[00168] Para administração intranasal, os camundongos foram anestesiados conforme descrito acima e posicionados em um suporte de restrição angular. Três camundongos foram inoculados intranasalmente com 4,9375x108 PFUs de vírus formulados em 25 µL (12,5 µL por narina). A taxa de liberação da formulação foi ajustada para permitir ao camundongo inalar o inóculo, sem formar bolhas, durante a fase de inspiração da respiração. Dois camundongos foram administrados com 25 µL de veículo de controle usando o mesmo procedimento. Após a administração, os animais foram mantidos em
99 / 101 posição suspensa até que a respiração voltasse ao normal.
[00169] Todos os animais puderam se recuperar da anestesia e receberam água e comida ad libitum até o momento do sacrifício. 48 horas após a administração, os camundongos foram sacrificados e a lavagem broncoalveolar (BAL) foi realizada nos pulmões esquerdo e direito usando solução salina estéril. O fluido BAL foi coletado, centrifugado e os peletes celulares foram recolhidos. Em seguida, as porções superiores da traqueia foram colhidas e congeladas rapidamente em nitrogênio líquido para quantificação de ácido nucleico. Os pulmões (lobo esquerdo, lobo superior direito, lobo médio direito e lobo inferior direito e pós-cava) foram colhidos individualmente e congelados em nitrogênio líquido para análise de ácido nucleico ou perfundidos em formalina tamponada neutra a 4% e embebidos em parafina para análise de imunofluorescência.
[00170] Para a coloração de imunofluorescência de tecido pulmonar embebido em parafina, um anticorpo de pan citoqueratina conjugado com Alexa Fluor® 488 foi usado para detectar células epiteliais (Invitrogen cat. Nº 53-9003-82) e um anticorpo primário de coelho anti-mCherry (Abcam cat. no. ab213511) e anticorpo secundário conjugado com Alexa Fluor® 594 (Abcam cat. no. ab150080) para detectar células infectadas. As amostras de tecido foram montadas em meio de montagem contendo DAPI para visualizar os núcleos.
[00171] A administração intranasal vs. intratraqueal de HSV-mCherry resultou em níveis semelhantes de transcritos de mCherry sendo detectados no tecido pulmonar de animais transduzidos (FIG. 10A). Curiosamente, enquanto poucos a nenhum transcritos de transgene foram identificados nas traqueias de camundongos expostos por via intranasal, a transcrição robusta de mCherry foi detectada nas traqueias de camundongos expostos por via intratraqueal, sem diferença estatisticamente significativa na expressão do transgene sendo observada entre os pulmões e as traqueias desses animais
100 / 101 tratados de forma invasiva. Além disso, uma maior contagem média de células totais por mL de fluido BAL foi observada nos animais administrados por via intratraqueal (646.667 células / mL e 393.333 células / mL para administração intratraqueal e intranasal, respectivamente), sugerindo um maior influxo de células inflamatórias para os pulmões após administração intratraqueal do vetor baseado em HSV. A expressão da proteína transgene no tecido epitelial do pulmão foi observada em animais expostos intranasalmente (FIG. 10B) e intratraquealmente (FIG. 10C) doseados com HSV-mCherry, mas não nos controles de veículo correspondentes.
[00172] Tomados em conjunto, estes dados indicam que um vetor de HSV projetado pode ser administrado aos pulmões de animais imunocompetentes através de múltiplas vias de administração e, além disso, que uma via de administração inalada não invasiva permite níveis semelhantes de expressão do transgene nos pulmões como um via de administração mais direta e invasiva, ao mesmo tempo que induz menos invasão celular (inflamatória). Exemplo 5: nebulização de HSV-CFTR
[00173] O exemplo a seguir descreve um estudo examinando uma rota de distribuição não invasiva baseada em nebulizador para HSV-CFTR nas vias aéreas de camundongos imunocompetentes de tipo selvagem e deficientes em CFTR.
[00174] 16 camundongos são usados no estudo: 12 animais C57BL / 6 imunocompetentes e 4 animais deficientes em CFTR corrigidos no intestino imunocompetentes. A Tabela 1 fornece um resumo do estudo. 4 animais de tipo selvagem são administrados com HSV-CFTR via instilação intranasal, enquanto os animais restantes são administrados com HSV-CFTR (ou controle do veículo) via nebulização (por exemplo, empregando um nebulizador de malha vibratória). 48 horas após a dosagem, os animais são sacrificados, o líquido BAL é coletado e as amostras de tecido ao longo do
101 / 101 trato respiratório e dos pulmões são coletadas, isto é, a traqueia superior e inferior, os brônquios esquerdo e direito, o pulmão esquerdo e o pulmão direito (lóbulos superior, médio, inferior e pós-cava, individualmente). Tecidos de dois animais / grupo são congelados em nitrogênio líquido e processados para análise de ácido nucleico.
Genomas vetoriais / DNA total de 50ng são quantificados em cada tecido por meio de análise qPCR; transcritos de CFTR humano / RNA total de 50ng são quantificados em cada tecido por meio de análise de qRT-PCR.
Os tecidos dos dois animais / grupo restantes são perfundidos e incluídos em parafina para imunofluorescência / imuno- histoquímica.
O fluido BAL é processado para examinar a infiltração de células imunes nos pulmões.
Tabela 1 - Desenho do Estudo Grupo Tratamento Via n Animais Necrópsia 1 Veículo Inalação 4 C57BL/6 2 HSV-CFTR Instilação intranasal 4 C57BL/6 48 horas 3 HSV-CFTR Inalação 4 C57BL/6 4 HSV-CFTR Inalação 4 CFTRtm1UncTg(FABPCFTR)

Claims (72)

1 / 11 REIVINDICAÇÕES
1. Genoma do vírus do herpes recombinante, caracterizado pelo fato de que compreende um ou mais polinucleotídeos que codificam um polipeptídeo regulador de condutância transmembranar de fibrose cística (CFTR).
2. Genoma do vírus do herpes recombinante de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o genoma do vírus do herpes recombinante é competente para replicação.
3. Genoma do vírus do herpes recombinante de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o genoma do vírus do herpes recombinante é defeituoso na replicação.
4. Genoma do vírus do herpes recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o genoma do vírus do herpes recombinante compreende um ou mais polinucleotídeos que codificam o polipeptídeo CFTR em um ou mais loci de genes virais.
5. Genoma do vírus do herpes recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o genoma do vírus do herpes recombinante é selecionado do grupo que consiste em um genoma do vírus do herpes simplex recombinante, um genoma do vírus da varicela zóster recombinante, um genoma do citomegalovírus humano recombinante, um genoma do herpesvírus 6A recombinante, um genoma do vírus recombinante genoma do herpesvírus 6B, um genoma do herpesvírus 7 recombinante, um genoma do herpesvírus associado ao sarcoma de Kaposi recombinante e quaisquer derivados dos mesmos.
6. Genoma do vírus do herpes recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo CFTR é um polipeptídeo CFTR humano.
7. Genoma do vírus do herpes recombinante de acordo com
2 / 11 qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo CFTR compreende uma sequência com pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93% , pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 6.
8. Genoma do vírus do herpes recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo CFTR compreende uma sequência com pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93% , pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5.
9. Genoma do vírus do herpes recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o genoma do vírus do herpes recombinante é um genoma do vírus do herpes simplex recombinante.
10. Genoma do vírus do herpes recombinante de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o genoma do vírus do herpes simplex recombinante é um genoma do vírus do herpes simplex do tipo 1 recombinante (HSV-1), um genoma do vírus do herpes simplex do tipo 2 (HSV-2) recombinante ou quaisquer derivados dos mesmos.
11. Genoma do vírus do herpes recombinante de acordo com a reivindicação 9 ou reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o genoma do vírus do herpes simplex recombinante é um genoma HSV-1 recombinante.
12. Genoma do vírus do herpes recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 11, caracterizado pelo fato de que o genoma do vírus do herpes simplex recombinante foi engenheirado para reduzir ou eliminar a expressão de um ou mais genes do vírus do herpes
3 / 11 simplex tóxico.
13. Genoma do vírus do herpes recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 12, caracterizado pelo fato de que o genoma do vírus do herpes simplex recombinante compreende uma mutação de inativação.
14. Genoma do vírus do herpes recombinante de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que a mutação de inativação está em um gene do vírus do herpes simplex.
15. Genoma do vírus do herpes recombinante de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que a mutação de inativação é uma deleção da sequência de codificação do gene do vírus do herpes simplex.
16. Genoma do vírus do herpes recombinante de acordo com a reivindicação 14 ou reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o gene do vírus do herpes simplex é selecionado do grupo que consiste em Proteína Celular Infectada (ICP) 0, ICP4, ICP22, ICP27, ICP47, timidina cinase (tk), Região Única Longa (UL) 41 e UL55.
17. Genoma do vírus do herpes recombinante de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o genoma do vírus do herpes simplex recombinante compreende uma mutação de inativação em uma ou ambas as cópias do gene ICP4.
18. Genoma do vírus do herpes recombinante de acordo com a reivindicação 16 ou reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que o genoma do vírus do herpes simplex recombinante compreende uma mutação de inativação no gene ICP22.
19. Genoma do vírus do herpes recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 18, caracterizado pelo fato de que o genoma do vírus do herpes simplex recombinante compreende uma mutação de inativação no gene UL41.
20. Genoma do vírus do herpes recombinante de acordo com
4 / 11 qualquer uma das reivindicações 16 a 19, caracterizado pelo fato de que o genoma do vírus do herpes simplex recombinante compreende uma mutação de inativação em uma ou ambas as cópias do gene ICP0.
21. Genoma do vírus do herpes recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 20, caracterizado pelo fato de que o genoma do vírus do herpes simplex recombinante compreende uma mutação de inativação no gene ICP27.
22. Genoma do vírus do herpes recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 21, caracterizado pelo fato de que o genoma do vírus do herpes simplex recombinante compreende uma mutação de inativação no gene ICP47.
23. Genoma do vírus do herpes recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 22, caracterizado pelo fato de que o genoma do vírus do herpes simplex recombinante compreende uma mutação de inativação no gene UL55.
24. Genoma do vírus do herpes recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 23, caracterizado pelo fato de que o genoma do vírus do herpes simplex recombinante compreende um ou mais polinucleotídeos que codificam o polipeptídeo CFTR em um ou ambos os loci do gene viral ICP4.
25. Genoma do vírus do herpes recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 24, caracterizado pelo fato de que o genoma do vírus do herpes simplex recombinante compreende um ou mais polinucleotídeos que codificam o polipeptídeo CFTR no locus do gene viral ICP22.
26. Genoma do vírus do herpes recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 25, caracterizado pelo fato de que o genoma do vírus do herpes simplex recombinante compreende um ou mais polinucleotídeos que codificam o polipeptídeo CFTR no locus do gene viral
5 / 11 UL41.
27. Genoma do vírus do herpes recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 26, caracterizado pelo fato de que o genoma do vírus do herpes simplex recombinante compreende um ou mais polinucleotídeos que codificam o polipeptídeo CFTR em um ou ambos os loci do gene viral ICP0.
28. Genoma do vírus do herpes recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 27, caracterizado pelo fato de que o genoma do vírus do herpes simplex recombinante compreende um ou mais polinucleotídeos que codificam o polipeptídeo CFTR no locus do gene viral ICP27.
29. Genoma do vírus do herpes recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 28, caracterizado pelo fato de que o genoma do vírus do herpes simplex recombinante compreende um ou mais polinucleotídeos que codificam o polipeptídeo CFTR no locus do gene viral ICP47.
30. Genoma do vírus do herpes recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 29, caracterizado pelo fato de que o genoma do vírus do herpes simplex recombinante compreende um ou mais polinucleotídeos que codificam o polipeptídeo CFTR no locus do gene viral UL55.
31. Genoma do vírus do herpes recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 30, caracterizado pelo fato de que o genoma do vírus do herpes recombinante tem citotoxicidade reduzida quando introduzido em uma célula alvo em comparação com um genoma do vírus do herpes de tipo selvagem correspondente.
32. Genoma do vírus do herpes recombinante de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de que a célula alvo é uma célula humana.
6 / 11
33. Genoma do vírus do herpes recombinante de acordo com a reivindicação 31 ou reivindicação 32, caracterizado pelo fato de que a célula alvo é uma célula epitelial das vias aéreas.
34. Genoma do vírus do herpes recombinante de acordo com 31 a reivindicação ou reivindicação 32, caracterizado pelo fato de que a célula alvo é uma célula do trato respiratório.
35. Vírus do herpes, caracterizado pelo fato de que compreende o genoma do vírus do herpes recombinante como definido em qualquer uma das reivindicações 1-34.
36. Vírus do herpes de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelo fato de que o vírus do herpes é competente para replicação.
37. Vírus do herpes de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelo fato de que o vírus do herpes é defeituoso na replicação.
38. Vírus do herpes de acordo com qualquer uma das reivindicações 35 a 37, caracterizado pelo fato de que o vírus do herpes tem citotoxicidade reduzida em comparação com um vírus do herpes de tipo selvagem correspondente.
39. Vírus do herpes de acordo com qualquer uma das reivindicações 35 a 38, caracterizado pelo fato de que o vírus do herpes é selecionado do grupo que consiste em um vírus herpes simplex, um vírus varicela zoster, um citomegalovírus humano, um herpesvírus 6A, um herpesvírus 6B, um herpesvírus 7 e um herpesvírus associado ao sarcoma de Kaposi.
40. Vírus do herpes de acordo com qualquer uma das reivindicações 35 a 39, caracterizado pelo fato de que o vírus do herpes é um vírus do herpes simplex.
41. Vírus do herpes de acordo com a reivindicação 39 ou reivindicação 40, caracterizado pelo fato de que o vírus do herpes simplex é um vírus do herpes simplex tipo 1 (HSV-1), um vírus do herpes simplex tipo
7 / 11 2 (HSV-2) ou quaisquer derivados dos mesmos.
42. Vírus do herpes de acordo com qualquer uma das reivindicações 39 a 41, caracterizado pelo fato de que o vírus do herpes simplex é um HSV-1.
43. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende o genoma do vírus do herpes recombinante como definido em qualquer uma das reivindicações 1-34 , ou o vírus do herpes como definido em qualquer uma das reivindicações 35-42 e um excipiente farmaceuticamente aceitável.
44. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 43, caracterizada pelo fato de que a composição farmacêutica é adequada para uso tópico, transdérmico, subcutâneo, intradérmico, oral, intranasal, intratraqueal, sublingual, bucal, retal, vaginal, inalado, intravenoso, intra- arterial, intramuscular, intracardíaco, intraósseo, intraperitoneal, transmucoso, intravítreo, sub-retiniana, intra-articular, peri-articular, local ou epicutânea.
45. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 43 ou reivindicação 44, caracterizada pelo fato de que a composição farmacêutica é adequada para administração oral, intranasal, intratraqueal ou inalada.
46. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 43 a 45, caracterizada pelo fato de que a composição farmacêutica é adequada para administração por inalação.
47. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 43 a 46, caracterizada pelo fato de que a composição farmacêutica é adequada para administração inalatória não invasiva.
48. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 43 a 47, caracterizada pelo fato de que a composição farmacêutica é adequada para uso em um inalador de pó seco, um inalador dosado pressurizado, um inalador de névoa suave, um nebulizador, um
8 / 11 dispositivo aerossol eletro-hidrodinâmico ou quaisquer combinações dos mesmos.
49. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 43 a 48, caracterizada pelo fato de que a composição farmacêutica é adequada para uso em um nebulizador.
50. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 49, caracterizada pelo fato de que o nebulizador é um nebulizador de malha vibratória.
51. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 43 a 50, caracterizada pelo fato de que a composição farmacêutica compreende um tampão de fosfato.
52. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 43 a 51, caracterizada pelo fato de que a composição farmacêutica compreende glicerol.
53. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 43 a 52, caracterizada pelo fato de que a composição farmacêutica compreende um transportador lipídico.
54. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 43 a 53, caracterizada pelo fato de que a composição farmacêutica compreende um transportador de nanopartícula.
55. Método para intensificar, aumentar, elevar e/ou suplementar os níveis de um polipeptídeo CFTR em uma ou mais células de um sujeito, o método caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao sujeito uma quantidade eficaz do vírus do herpes como definido em qualquer uma das reivindicações 35-42 ou a composição farmacêutica como definida em qualquer uma das reivindicações 43-54.
56. Método de acordo com a reivindicação 55, caracterizado pelo fato de que uma ou mais células são uma ou mais células do trato respiratório.
9 / 11
57. Método de acordo com a reivindicação 55 ou reivindicação 56, caracterizado pelo fato de que uma ou mais células são uma ou mais células epiteliais das vias aéreas ou uma ou mais células das glândulas submucosas.
58. Método para reduzir ou inibir a destruição progressiva do pulmão em um sujeito em necessidade do mesmo, o método caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao sujeito uma quantidade eficaz do vírus do herpes de qualquer uma das reivindicações 35-42 ou a composição farmacêutica de qualquer uma das reivindicações 43-54.
59. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 55 a 58, caracterizado pelo fato de que o sujeito sofre de uma doença pulmonar crônica.
60. Método de acordo com a reivindicação 59, caracterizado pelo fato de que a doença pulmonar crônica é fibrose cística ou doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD).
61. Método para fornecer alívio profilático, paliativo ou terapêutico de um ou mais sinais ou sintomas de fibrose cística em um sujeito em necessidade do mesmo, o método caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao sujeito uma quantidade eficaz do vírus do herpes como definido em qualquer uma das reivindicações 35-42 ou a composição farmacêutica como definida em qualquer uma das reivindicações 43-54.
62. Método de acordo com a reivindicação 61, caracterizado pelo fato de que um ou mais sinais ou sintomas de fibrose cística são selecionados do grupo que consiste em uma tosse persistente que produz muco espesso, muco espesso e pegajoso que se acumula nas vias respiratórias, respiração ofegante, falta de ar, sinusite, infecções pulmonares repetidas, passagens nasais inflamadas, bronquiectasia, pólipos nasais, hemoptise, pneumotórax, pancreatite, pneumonia recorrente, insuficiência respiratória e quaisquer combinações dos mesmos.
10 / 11
63. Método para fornecer alívio profilático, paliativo ou terapêutico de um ou mais sinais ou sintomas de COPD em um sujeito em necessidade do mesmo, o método caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao sujeito uma quantidade eficaz do vírus do herpes como definido em qualquer uma das reivindicações 35-42 ou a composição farmacêutica como definida em qualquer uma das reivindicações 43-54.
64. Método de acordo com a reivindicação 63, caracterizado pelo fato de que um ou mais sinais ou sintomas de COPD são selecionados do grupo que consiste em falta de ar, respiração ofegante, aperto no peito, excesso de muco nos pulmões, tosse crônica, cianose, infecções respiratórias frequentes e quaisquer combinações dos mesmos.
65. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 55 a 64, caracterizado pelo fato de que o sujeito é um humano.
66. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 55 a 65, caracterizado pelo fato de que o genoma do sujeito compreende uma mutação de perda de função em um gene CFTR .
67. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 55 a 66, caracterizado pelo fato de que o vírus do herpes ou a composição farmacêutica é administrado ao sujeito por via oral, intranasal, intratraqueal ou por inalação.
68. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 55 a 67, caracterizado pelo fato de que o vírus do herpes ou a composição farmacêutica é administrado por inalação ao sujeito.
69. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 55 a 68, caracterizado pelo fato de que o vírus do herpes ou a composição farmacêutica é administrado por meio de administração inalada não invasiva.
70. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 55 a 69, caracterizado pelo fato de que o vírus do herpes ou a composição farmacêutica é administrado usando um inalador de pó seco, um inalador
11 / 11 dosado pressurizado, um inalador de névoa suave, um nebulizador ou um dispositivo de aerossol eletro-hidrodinâmico.
71. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 55-70, caracterizado pelo fato de que o vírus do herpes ou a composição farmacêutica é administrado usando um nebulizador.
72. Método de acordo com a reivindicação 71, caracterizado pelo fato de que o nebulizador é um nebulizador de malha vibratória.
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