JP2022529457A - 嚢胞性線維症の治療のための組成物及び方法 - Google Patents

Abstract

本願で提供されるのは、例えば嚢胞性線維症（ＣＦ）の治療のため、ポリヌクレオチド、ｒＡＡＶベクター、医薬組成物、及びそれらを作製及び使用する方法である。例えば、本開示は組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を提供し、一実施形態において、これはＡＶ．ＴＬ６５カプシドタンパク質、ならびにＣＦＴＲΔＲミニ遺伝子に作動可能に連結されたＦ５エンハンサー及びｔｇ８３プロモーターを含むポリヌクレオチド、その医薬組成物、及び、例えばＣＦの治療のためのその使用方法を含む。

Description

アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を使用した遺伝子治療は、単一遺伝子欠損の治療を含む、新たな治療法である。嚢胞性線維症（ＣＦ）は、米国だけで少なくとも３０，０００人、世界中で少なくとも７０，０００人が罹患している致命的な常染色体劣性疾患である。ＣＦ患者の平均生存年齢は約４０歳である。ＣＦは、上皮細胞膜を通して塩化物及び重炭酸イオンを伝導するチャネルである嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）をコードする遺伝子の突然変異によって引き起こされる。ＣＦＴＲ機能の障害は、気道の炎症と進行性の気管支拡張症を引き起こす。ＣＦは単一遺伝子病因であり、患者集団において様々なＣＦＴＲ突然変異があるため、遺伝子治療は潜在的にＣＦの普遍的な治療法を提供する。

ヒトパルボウイルスファミリーのメンバーであるアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、複製をヘルパーウイルスに依存する非病原性ウイルスである。このため、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターは、遺伝子治療の前臨床試験及び臨床試験で最も頻繁に使用されている。実際、ｒＡＡＶ２を用いたＣＦ肺疾患の臨床試験では、他の遺伝子導入剤（組換えアデノウイルスなど）と比較して、気道組織におけるウイルスゲノムの良好な安全性プロファイルと長期持続性の両方が実証された（生検で評価）。それにもかかわらず、ｒＡＡＶベクター由来のＣＦＴＲｍＲＮＡの転写が検出されなかったため、遺伝子導入はＣＦ患者の肺機能を改善することができなかった。

したがって、当技術分野において、ＣＦの治療のための改善された組成物及び方法に対する必要性が残っている。

本開示はとりわけ、例えばＣＦの治療のための、ｒＡＡＶ、医薬組成物、単離されたポリヌクレオチド、及びそれらを作製及び使用する方法を提供する。
一態様において、本開示は、（ｉ）ＡＶ．ＴＬ６５カプシドタンパク質；及び（ｉｉ）ＣＦＴＲΔＲミニ遺伝子に作動可能に連結されたＦ５エンハンサー及びｔｇ８３プロモーターを含むポリヌクレオチドを含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を特徴とする。

いくつかの実施形態において、ＡＶ．ＴＬ６５カプシドタンパク質は、配列番号１３のアミノ酸配列、又は配列番号１３に対して少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するそのバリアントを含む。

いくつかの実施形態において、Ｆ５エンハンサーは、配列番号１又は配列番号１４のポリヌクレオチド配列、あるいは配列番号１又は配列番号１４に対して少なくとも８０％の核酸配列同一性を有するそのバリアントを含む。いくつかの実施形態において、Ｆ５は配列番号１のポリヌクレオチド配列を含む。他の実施形態では、Ｆ５エンハンサーは、配列番号１４のポリヌクレオチド配列を含む。

いくつかの実施形態において、ｔｇ８３プロモーターは配列番号２のポリヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態において、ＣＦＴＲΔＲミニ遺伝子は、ヒトＣＦＴＲΔＲミニ遺伝子である。

いくつかの実施形態において、ヒトＣＦＴＲΔＲミニ遺伝子は、配列番号４の配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる。
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、５’から３’方向に、Ｆ５エンハンサー、ｔｇ８３プロモーター、及びＣＦＴＲΔＲミニ遺伝子を含む。

別の態様において、本開示は、本明細書に記載のｒＡＡＶのいずれか１つ及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を特徴とする。
別の態様において、本開示は、嚢胞性線維症を治療する方法であって、それを必要とする対象に、治療有効量の本明細書に記載のｒＡＡＶのいずれか１つ又は本明細書に記載の医薬組成物のいずれか１つを投与することを含む方法を特徴とする。いくつかの実施形態では、この方法は、１つ以上の追加の治療薬を対象に投与することをさらに含む。

別の態様において、哺乳類はヒトである。一態様において、ヒトは新生児である。一態様において、ヒトは若年者である。
別の態様において、本開示は、それを必要とする対象における嚢胞性線維症の治療に使用するためのｒＡＡＶを特徴とし、ｒＡＡＶは、（ｉ）ＡＶ．ＴＬ６５カプシドタンパク質；及び（ｉｉ）ＣＦＴＲΔＲミニ遺伝子に作動可能に連結されたＦ５エンハンサー及びｔｇ８３プロモーターを含むポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶは、１つ以上の追加の治療薬と組み合わせて使用するためのものである。

いくつかの実施形態において、１つ以上の追加の治療薬は、増強剤（例えば、アントラサイクリンなどのプロテアソーム調節剤（例えば、ドキソルビシン、イダルビシン、アクラルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン、バルビシン、又はミトキサントロン）、プロテアソーム阻害剤（例えば、ボルテゾミブ、カルフィルゾミブ、及びイキサゾミブ）、トリペプチジルアルデヒド（例えば、Ｎ－アセチル－ｌ－ロイシル－ｌ－ロイシル－ｌ－ノルロイシン（ＬＬｎＬ））、又はそれらの組み合わせ）、抗生物質、粘液希釈剤、ＣＦＴＲモジュレーター、粘液溶解薬、免疫抑制剤、生理食塩水、高張食塩水、又はそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、増強剤はドキソルビシンである。他の実施形態では、増強剤はイダルビシンである。いくつかの実施形態において、１つ以上の追加の治療薬は免疫抑制剤（例えば、コルチコステロイド（例えば、吸入コルチコステロイド））を含む。

いくつかの実施形態において、投与は、吸入、噴霧化、エアロゾル化、鼻腔内、気管内、気管支内、経口、静脈内、皮下、又は筋肉内によるものである。
いくつかの実施形態において、投与は、吸入、噴霧化、エアロゾル化、鼻腔内、気管内、及び／又は気管支内によるものである。

別の態様において、本開示は、配列番号７の配列を含む単離されたポリヌクレオチドを特徴とする。
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、３’方向に、配列番号５の配列を含む３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）をさらに含む。

いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、３’方向に、配列番号６の配列を含む合成ポリアデニル化部位をさらに含む。
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドの５’末端に５’アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）及びポリヌクレオチドの３’末端に３’ＡＡＶ ＩＴＲをさらに含む。いくつかの実施形態において、５’ＡＡＶ ＩＴＲは、配列番号１５の配列又は配列番号１５に対して少なくとも８０％の核酸配列同一性を有するそのバリアントを含む。いくつかの実施形態において、３’ＡＡＶ ＩＴＲは、配列番号１６の配列又は配列番号１６に対して少なくとも８０％の核酸配列同一性を有するそのバリアントを含む。

いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号１１又は配列番号１７の配列、あるいは配列番号１１又は配列番号１７に対して少なくとも８０％の核酸配列同一性を有するそのバリアントを含む。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは配列番号１１の配列を含む。他の実施形態では、ポリヌクレオチドは配列番号１７の配列を含む。

別の態様において、本開示は、配列番号１８の配列を含む単離されたポリヌクレオチドを特徴とする。別の態様において、本開示は、本明細書に記載のポリヌクレオチド（例えば、配列番号７、配列番号１１、又は配列番号１７の配列を含むポリヌクレオチド）のいずれか１つを含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を特徴とする。

いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶは気道細胞に対して向性を有する。
いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶは気道上皮細胞に対して向性を有する。
いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶは肺上皮細胞に対して向性を有する。

いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶは、ＡＶ．ＴＬ６５カプシドタンパク質、ＡＡＶ１カプシドタンパク質、ＡＡＶ２カプシドタンパク質、ＡＡＶ５カプシドタンパク質、ＡＡＶ６カプシドタンパク質、又はＡＡＶ９カプシドタンパク質を含む。

いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶはＡＶ．ＴＬ６５カプシドタンパク質を含む。

図１Ａ～１Ｃは、極性化したヒトＣＦ気道上皮におけるＣＦＴＲを介した塩化物輸送の機能的補完を示している。図１Ａは、ｒＡＡＶ２ウイルスゲノムＡＶ．ＴＬ６５－ＳＰ１８３－ｈＣＦＴＲΔＲが３つのカプシド血清型（ＡＶ．ＴＬ６５、ＡＶ．１、及びＡＶ．２）にパッケージングされたことを示しており、頂端（ａｐｉｃａｌ）（ＡＶ．ＴＬ６５及びＡＶ．１）又は基底外側表面（ＡＶ．２）から極性化したヒトＣＦ ＡＬＩ培養物を頂端で感染させるために使用される。基底外側表面からは効率的に感染するため、ＡＡＶ２による基底外側での感染を陽性対照として使用した。２．５μＭドキソルブシン及び２０μＭ ＬＬｎＬをウイルス接種物に添加し、ＡＬＩ培養物を１６時間感染させた。次にウイルスを除去し、プロテアソーム阻害剤の非存在下で培養物に再び栄養補給をした。図１Ｂは、各条件の２つの培養物のＩｓｃトレースを示す。矢印は、ＩＢＭＸ／フォルスコリン（Ｉ＆Ｆ）及びＣＦＴＲ阻害剤（ＧｌｙＨ１０１）の追加を示す。図１Ｃは、感染後１２日での平均＋／－ＳＥＭΔＩｓｃを示す。 図２Ａ～２Ｄは、フェレットの気管及び肺へのＡＶ．ＴＬ６５－ＳＰ１８３－ｈＣＦＴＲΔＲの遺伝子導入効率を示す一連のグラフである。図２Ａ及び２Ｂは、気管（図２Ａ）及び肺（図２Ｂ）内の５００ｎｇＲＮＡあたりのｈＣＦＴＲ及びｆＣＦＴＲｍＲＮＡのコピー数を示す。コピー数は、各種のプラスミドＣＦＴＲｃＤＮＡの段階希釈から生成した標準曲線を使用して決定した。図２Ｃ及び２Ｄは、気管（図２Ｃ）及び肺（図２Ｄ）内の内因性ｆＣＦＴＲｍＲＮＡに対する導入遺伝子由来のｈＣＦＴＲの比率を示す。Ｃ１～Ｃ３は模擬感染群の動物を表し、Ａ１～Ａ３はＡＡＶ感染群の動物を表す。３個体のＡＡＶ感染動物の平均も示されている。破線はＣＦＴＲの内因性レベルを表す（比率＝１）。データは、各群のＮ＝３の動物の平均＋／－ＳＥＭを示している。 図３Ａ～３Ｄは、ＡＶ．ＴＬ６５が成熟したフェレットの気道を効果的に形質導入することを示す一連のグラフである。図３Ａは、ベクター及び模擬処理動物のヒトＣＦＴＲｍＲＮＡ及び内因性フェレットＧＡＰＤＨｍＲＮＡのＴａｑＭａｎ（商標）ＲＮＡ特異的ＰＣＲ（ＲＳ－ＰＣＲ）の結果を示す。結果は、ｈＣＦＴＲ／ｆＧＡＰＤＨｍＲＮＡの比率を示している。図３Ｂは、ベクター及び模擬処理動物の内因性フェレットＣＦＴＲｍＲＮＡ及び内因性フェレットＧＡＰＤＨｍＲＮＡのＴａｑＭａｎ（商標）ＲＳ－ＰＣＲを示す。結果は、ｆＣＦＴＲ／ｆＧＡＰＤＨｍＲＮＡの比率を示している。図３Ｃは、各サンプルの１００ｎｇＤＮＡあたりのベクターゲノム数についてのＴａｑＭａｎ（商標）Ｑ－ＰＣＲを示す。図３Ｄは、各サンプルのｈＣＦＴＲ／ｆＣＦＴＲのｍＲＮＡコピーの比率を示す。１はＣＦＴＲの内因性レベルに等しい（赤い破線）。肺サンプルには、ｆＣＦＴＲｍＲＮＡの１コピーあたり平均３．０＋／－０．５コピーの導入遺伝子由来のｈＣＦＴＲｍＲＮＡが含まれていた。気管及び鼻組織の形質導入はより変動的であったが、平均では導入遺伝子由来のｈＣＦＴＲ／ｆＣＦＴＲｍＲＮＡは１コピーであった。結果は、ベクターで処理された動物の平均＋／－ＳＥＭを示している。 図４は、実施例５に記載された実験の代表的なＣＦトレースを示すグラフである。 図５は、実施例５に記載の実験のＣＦドナー又は非ＣＦドナーについて示された条件下でのΔＩｓｃ（μＡ／ｃｍ^２）を示す一連のグラフである。エラーバーは、平均の標準誤差（ＳＥＭ）を示す。 図６は、実施例６に記載された実験の２４ウェルトランスウェルフィルタープレートの個々のウェルからの代表的なＩ_ｅｑトレース（３７℃）を示す一連のグラフである。 図７は、実施例６に記載された実験（ｎ＝４）の各条件でのフォルスコリン／ＩＢＭＸ刺激後の平均ＣＦＴＲ媒介塩化物分泌を示す一連のグラフである。エラーバーはＳＥＭを示す。 図８Ａ～８Ｄ。ｒＡＡＶベクターの性能のｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏ比較。（Ａ）ＣＦ（Ｆ５０８ｄｅｌ／Ｆ５０８ｄｅｌ）ヒト極性化ＡＬＩ気道培養物を、増強剤の存在下でＡＶ１－ＳＰ１８３－ｈＣＦＴＲΔＲ又はＡＶ．ＴＬ６５－ＳＰ１８３－ｈＣＦＴＲΔＲ（ＭＯＩ＝１００，０００ＤＲＰ／細胞）に頂端で感染させた。次に、感染後１２日目にウッシングチャンバーで短絡電流（Ｉｓｃ）測定を行った。フォルスコリン／ＩＢＭＸ及びＧｌｙＨ１０１（ＣＦＴＲ阻害剤）に対するΔＩｓｃ応答も示されている。データは、２個体のドナーからのｎ＝４トランスウェルの平均±ＳＤを示している。感染していないＡＬＩ培養物は、ベースラインコントロールとして機能した（２個体のドナーからのｎ＝４）。（Ｂ）Ｉｓｃ測定後、各群の２つのトランスウェルインサートをプールして溶解し、逆転写酵素定量ＰＣＲ（ＲＴ－ｑＰＣＲ）によってベクター由来のｈＣＦＴＲΔＲｍＲＮＡコピーを定量し、ヒトＧＡＰＤＨｍＲＮＡコピーに対して正規化した。次に、値をｈＣＦＴＲΔＲ／ＧＡＰＤＨの比率として表した。データは、ｎ＝２の平均±範囲を示している。（Ｃ）ＡＬＩにおけるヒト及びフェレットの極性化気管気管支上皮は、増強剤の存在下、ＤＮａｓｅ耐性粒子（ＤＲＰ）／細胞の感染多重度（ＭＯＩ）１００，０００でＡＶ．ＴＬ６５－ＳＰ１８３ｇＬｕｃに頂端で感染した。ガウシアルシフェラーゼ活性を、感染後５日目に相対発光単位（ＲＬＵ）として測定した。データは、各種の２個体のドナーからのｎ＝６トランスウェルの平均±ＳＤを示している。（Ｄ）生後３日目のフェレット又は生後１か月のフェレットに、増強剤を混合したＡＶ．ＴＬ６５－ＳＰ１８３－ｈＣＦＴＲΔＲ（体重１グラムあたり４×１０^１０ＤＲＰ）を気管内感染させた。模擬感染群には、増強剤を含むＰＢＳを接種した。次に、気管と肺を感染後１１日目に採取し、ＲＴ－ｑＰＣＲによってベクター由来のｈＣＦＴＲΔＲと内因性ｆＣＦＴＲｍＲＮＡコピーを、ＧＡＰＤＨｍＲＮＡコピー数で正規化して定量化した。データは、ｈＣＦＴＲΔＲとｆＣＦＴＲΔＲのｍＲＮＡコピーの比率（ｈＣＦＴＲΔＲ／ｆＣＦＴＲ）を表す。データは各群のｎ＝３の動物の平均＋／－ＳＤを示しており、ｎｓは有意差のないことを示す。 図９Ａ～９Ｃ。新生仔フェレットへのＡＶ．ＴＬ６５の反復投与。（Ａ）気管内投与により１×１０^１３ＤＲＰ／ｋｇで０回分、１回分、又は２回分のウイルスを投与される新生仔フェレットの３つの群を含む研究デザイン。１回投与するフェレットには４週齢でレポーターベクターＡＶ．ＴＬ６５－ＳＰ１８３－ｇＬｕｃを投与し、２回投与するフェレットには１週齢でＡＶ．ＴＬ６５－ＳＰ１８３－ｆＣＦＴＲΔＲと、４週齢でＡＶ．ＴＬ６５－ＳＰ１８３－ｇＬｕｃを投与した。血漿及びＢＡＬＦサンプルを、示された年齢で収集した。（Ｂ）ＡＶ．ＴＬ６５－ＳＰ１８３－ｇＬｕｃの送達後の示された時点での血漿中のガウシアルシフェラーゼ活性。（Ｃ）ＡＶ．ＴＬ６５－ＳＰ１８３－ｇＬｕｃの送達後１４日でのＢＡＬＦにおけるガウシアルシフェラーゼ活性。結果は、１群あたりｎ＝６の動物の平均±ＳＤを示している。統計的有意性を、一元配置分散分析とそれに続くテューキーの事後検定で分析した。ｎｓ、有意差なし。ＲＬＵ、相対発光単位。 図１０Ａ～１０Ｃ。幼若フェレットへのＡＶ．ＴＬ６５の反復投与。（Ａ）気管内投与により１×１０^１３ＤＲＰ／ｋｇで０回分、１回分、又は２回分のウイルスを投与される幼若フェレットの３つの群を含む研究デザイン。１回投与するフェレットには８週齢でレポーターベクターＡＶ．ＴＬ６５－ＳＰ１８３－ｇＬｕｃを投与し、２回投与するフェレットには４週齢でＡＶ．ＴＬ６５－ＳＰ１８３－ｆＣＦＴＲΔＲと、８週齢でＡＶ．ＴＬ６５－ＳＰ１８３－ｇＬｕｃを投与した。血漿及びＢＡＬＦサンプルを、示された年齢で収集した。（Ｂ）ＡＶ．ＴＬ６５－ＳＰ１８３－ｇＬｕｃの送達後の示された時点での血漿中のガウシアルシフェラーゼ活性。（Ｃ）ＡＶ．ＴＬ６５－ＳＰ１８３－ｇＬｕｃの送達後１４日でのＢＡＬＦにおけるガウシアルシフェラーゼ活性。結果は、１群あたりｎ＝９～１０の動物の平均±ＳＤを示している。統計的有意性を、一元配置分散分析とそれに続くテューキーの事後検定で分析した：＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。ＲＬＵ、相対発光単位。 図１１Ａ～１１Ｄ。感染したフェレットのＢＡＬＦ及び血漿中のＡＶ．ＴＬ６５中和抗体の力価。（Ａ、Ｂ）図９Ａで収集された新生仔フェレットのサンプルを、形質導入阻害アッセイを使用して、（Ａ）ＢＡＬＦ及び（Ｂ）血漿中のＮＡｂについて評価した。Ａ５４９細胞の感染前に、ＢＡＬＦ又は血漿の段階希釈液をＡＶ．ＴＬ６５－ｆＬｕｃとともにインキュベートした。ＮＡｂの力価を、ホタルルシフェラーゼ活性によって評価されるように、形質導入の５０％阻害（ＩＣ５０）をもたらしたＢＡＬＦ又は血漿の濃度（希釈比）で計算した。ＡＶ．ＴＬ６５－ｆＬｕｃのみで感染させた細胞はベースラインコントロールとして機能し、模擬感染細胞はブランクとして機能した。（Ｃ、Ｄ）図１０Ａで収集された幼若フェレットサンプルを、上記の形質導入阻害アッセイを使用して、（Ｃ）ＢＡＬＦ及び（Ｄ）血漿中のＮＡｂについて評価した。結果は、１群あたりｎ＝６の新生仔動物及び１群あたりｎ＝９～１０の幼若動物の平均±ＳＤを示している。統計的有意性を、一元配置分散分析とそれに続くテューキーの事後検定で分析した：＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。ｎｓ、有意差なし。 図１２Ａ～１２Ｂ。抗カプシド抗体アイソタイプを定量化するためのＥＬＩＳＡベースアッセイの開発。免疫血漿は、ＡＶ－ＴＬ６５に感染したフェレットから、生後１か月から１～２か月間隔で４回肺に生成された。ナイーブな血漿は、同程度の年齢のフェレットに由来していた。ＥＬＩＳＡプレートを（Ａ）ＡＡＶ５又は（Ｂ）ＡＡＶ２でコーティングし、免疫及びナイーブフェレット血漿の結合について評価した。二次検出抗体はＩｇＧに対するものであった。結果は、各サンプルの２つの技術的複製の平均±範囲を示している。 図１３Ａ～１３Ｆ。ＡＶ．ＴＬ６５に感染したフェレットの血漿中のＩｇＧ、ＩｇＭ、及びＩｇＡカプシド結合抗体の定量化。（Ａ～Ｆ）（Ａ、Ｄ）ＩｇＧ、（Ｂ、Ｅ）ＩｇＭ、及び（Ｃ、Ｆ）ＩｇＡについての、（Ａ～Ｃ）新生仔及び（Ｄ～Ｆ）幼若フェレットの血漿中のカプシド結合抗体の定量化。結果は、１群あたりｎ＝６の新生仔動物及び１群あたりｎ＝９～１０の幼若動物の平均＋／－ＳＤを示している。統計的有意性を、一元配置分散分析とそれに続くテューキーの事後検定で分析した：＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。単回投与群と反復投与群の間のラベルなしの比較は、有意差がなかった。 図１４Ａ～１４Ｆ。ＡＶ．ＴＬ６５に感染したフェレットのＢＡＬＦ中のＩｇＧ、ＩｇＭ、及びＩｇＡカプシド結合抗体の定量化。（Ａ～Ｆ）（Ａ、Ｄ）ＩｇＧ、（Ｂ、Ｅ）ＩｇＭ、及び（Ｃ、Ｆ）ＩｇＡについての、（Ａ～Ｃ）新生仔及び（Ｄ～Ｆ）幼若フェレットのＢＡＬＦ中のカプシド結合抗体の定量化。結果は、１群あたりｎ＝６の新生仔動物及び１群あたりｎ＝９～１０の幼若動物の平均＋／－ＳＤを示している。統計的有意性を、一元配置分散分析とそれに続くテューキーの事後検定で分析した：＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。単回投与群と反復投与群の間のラベルなしの比較は、有意差がなかった。

本開示の実施形態の詳細な説明
遺伝子治療は、嚢胞性線維症（ＣＦ）を治療するための唯一の突然変異にとらわれないアプローチである。本開示は、少なくとも部分的に、本明細書に記載のｒＡＡＶベクター（例えば、ＡＶ．ＴＬ６５－ＳＰ１８３－ｈＣＦＴＲΔＲ）が、極性化したヒトＣＦ気道上皮におけるＣＦＴＲを介した塩化物輸送を補完するのに予想外に有効であるという発見に基づいている。本明細書に記載のｒＡＡＶベクターは、既存のＣＦ遺伝子治療アプローチと比較して、改善された機能的ペイロード容量、より効果的な細胞送達、及びより効率的な導入遺伝子発現を達成するための構成要素の組み合わせを利用する。特に、ｒＡＡＶは、高機能ＣＦＴＲミニ遺伝子（ＣＦＴＲΔＲ）、短いが高活性の１８３ｂｐ合成プロモーター（Ｆ５エンハンサー及びｔｇ８３プロモーターを含むＳＰ１８３）、及び、ヒトの気道に対し非常に影響を持つ進化したキメラｒＡＡＶベクターＡＶ．ＴＬ６５を含む。一実施形態では、ベクターはヒトに投与される。一態様において、ヒトは新生児である。一態様において、ヒトは若年者である。

定義
「ＡＡＶ」という用語は、アデノ随伴ウイルスを指し、天然に存在する野生型ウイルス自体又はその誘導体を指すために使用され得る。この用語は、他の意味に解すべき場合を除いて、すべての亜型、血清型、偽型、及び天然型と組換え型の両方を包含する。ＡＡＶゲノムは一本鎖ＤＮＡで構成されており、ＤＮＡ鎖の両端の逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）と、複製タンパク質及びカプシドタンパク質をそれぞれコードするｒｅｐ及びｃａｐの２つのオープンリーディングフレームとを含む。外来ポリヌクレオチドは、天然のｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子を置換することができる。ＡＡＶは、様々な形質導入プロファイル、又は本明細書で使用されるように、異なる組織タイプに対する「向性」を有する様々な異なる血清型カプシドで作製することができる。本明細書で使用される場合、「血清型」という用語は、定義された抗血清、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、及びＡＡＶｒｈ１０とのカプシドタンパク質反応性に基づいて識別され、他のＡＡＶから区別されるＡＡＶを指す。例えば、血清型ＡＡＶ２は、ＡＡＶ２のｃａｐ遺伝子からコードされたカプシドタンパク質を含むＡＡＶ、及び同じＡＡＶ２血清型の５’及び３’ＩＴＲ配列を含むゲノムを指すために使用される。偽型ＡＡＶとは、１つの血清型のカプシドタンパク質及び第２の血清型の５’－３’ＩＴＲを含むウイルスゲノムを含むＡＡＶを指す。偽型ｒＡＡＶは、カプシド血清型の細胞表面結合特性、及びＩＴＲ血清型と一致する遺伝的特性を有すると予想される。偽型ｒＡＡＶは、当技術分野で説明されている標準的な技術を使用して生成される。

「約」という用語は、本明細書では、記載された値の±１０％の値を意味するために使用される。
本明細書で使用される場合、「投与する」とは、本明細書に記載の組成物（例えば、ｒＡＡＶ又はその医薬組成物）の投薬量を対象に与える方法を意味する。本明細書に記載の方法で利用される組成物は、任意の適切な経路で投与することができ、これには例えば、吸入、噴霧、エアロゾル化、鼻腔内、気管内、気管支内、経口、非経口（例えば、静脈内、皮下、又は筋肉内）、経口、鼻、直腸、局所、又は頬腔が含まれる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の組成物は、アトマイザー噴霧器を使用して（例えば、ＭＡＤｇｉｃ（商標）喉頭気管粘膜噴霧装置を使用して）気管内及び／又は気管支内にエアロゾル化された粒子で投与される。本明細書に記載の方法で利用される組成物はまた、局所投与又は全身投与することができる。投与方法は、様々な要因（例えば、投与される組成物の成分及び治療される状態の重症度）に応じて変化し得る。

「ＡＶ．ＴＬ６５」という用語は、ヒトの気道に対して非常に影響を持つ、進化したキメラＡＡＶカプシドタンパク質を指す。ＡＶ．ＴＬ６５は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＥｘｃｏｆｆｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０６（１０）：３８６５－３８７０，２００９に記載されており、当技術分野ではＡＡＶ２．５Ｔとしても知られている。ＡＶ．ＴＬ６５は、ＡＡＶ２（ａ．ａ．１～１２８）とＡＡＶ５（ａ．ａ．１２９～７２５）の間のキメラであり、１つの点突然変異（Ａ５８１Ｔ）に基づく置換がある。ＡＶ．ＴＬ６５カプシドのアミノ酸配列を以下に示す：
ＭＡＡＤＧＹＬＰＤＷＬＥＤＴＬＳＥＧＩＲＱＷＷＫＬＫＰＧＰＰＰＰＫＰＡＥＲＨＫＤＤＳＲＧＬＶＬＰＧＹＫＹＬＧＰＦＮＧＬＤ
ＫＧＥＰＶＮＥＡＤＡＡＡＬＥＨＤＫＡＹＤＲＱＬＤＳＧＤＮＰＹＬＫＹＮＨＡＤＡＥＦＱＥＲＬＫＥＤＴＳＦＧＧＮＬＧＲＡＶＦＱ
ＡＫＫＲＶＬＥＰＦＧＬＶＥＥＧＡＫＴＡＰＴＧＫＲＩＤＤＨＦＰＫＲＫＫＡＲＴＥＥＤＳＫＰＳＴＳＳＤＡＥＡＧＰＳＧＳＱＱＬＱ
ＩＰＡＱＰＡＳＳＬＧＡＤＴＭＳＡＧＧＧＧＰＬＧＤＮＮＱＧＡＤＧＶＧＮＡＳＧＤＷＨＣＤＳＴＷＭＧＤＲＶＶＴＫＳＴＲＴＷＶＬ
ＰＳＹＮＮＨＱＹＲＥＩＫＳＧＳＶＤＧＳＮＡＮＡＹＦＧＹＳＴＰＷＧＹＦＤＦＮＲＦＨＳＨＷＳＰＲＤＷＱＲＬＩＮＮＹＷＧＦＲＰ
ＲＳＬＲＶＫＩＦＮＩＱＶＫＥＶＴＶＱＤＳＴＴＴＩＡＮＮＬＴＳＴＶＱＶＦＴＤＤＤＹＱＬＰＹＶＶＧＮＧＴＥＧＣＬＰＡＦＰＰＱ
ＶＦＴＬＰＱＹＧＹＡＴＬＮＲＤＮＴＥＮＰＴＥＲＳＳＦＦＣＬＥＹＦＰＳＫＭＬＲＴＧＮＮＦＥＦＴＹＮＦＥＥＶＰＦＨＳＳＦＡＰ
ＳＱＮＬＦＫＬＡＮＰＬＶＤＱＹＬＹＲＦＶＳＴＮＮＴＧＧＶＱＦＮＫＮＬＡＧＲＹＡＮＴＹＫＮＷＦＰＧＰＭＧＲＴＱＧＷＮＬＧＳ
ＧＶＮＲＡＳＶＳＡＦＡＴＴＮＲＭＥＬＥＧＡＳＹＱＶＰＰＱＰＮＧＭＴＮＮＬＱＧＳＮＴＹＡＬＥＮＴＭＩＦＮＳＱＰＡＮＰＧＴＴ
ＡＴＹＬＥＧＮＭＬＩＴＳＥＳＥＴＱＰＶＮＲＶＡＹＮＶＧＧＱＭＡＴＮＮＱＳＳＴＴＡＰＴＴＧＴＹＮＬＱＥＩＶＰＧＳＶＷＭＥＲ
ＤＶＹＬＱＧＰＩＷＡＫＩＰＥＴＧＡＨＦＨＰＳＰＡＭＧＧＦＧＬＫＨＰＰＰＭＭＬＩＫＮＴＰＶＰＧＮＩＴＳＦＳＤＶＰＶＳＳＦＩ
ＴＱＹＳＴＧＱＶＴＶＥＭＥＷＥＬＫＫＥＮＳＫＲＷＮＰＥＩＱＹＴＮＮＹＮＤＰＱＦＶＤＦＡＰＤＳＴＧＥＹＲＴＴＲＰＩＧＴＲＹ
ＬＴＲＰＬ（配列番号１３）。

「制御要素」又は「制御配列」は、ポリヌクレオチドの複製、複製、転写、スプライシング、翻訳、又は分解を含む、ポリヌクレオチドの機能的調節に寄与する分子の相互作用に関与するヌクレオチド配列である。上記調節は、プロセスの頻度、速度、又は特異性に影響を与えることができ、本質的に促進的又は抑制的であり得る。当技術分野で知られている制御要素には、例えば、プロモーター及びエンハンサーなどの転写調節配列が含まれる。プロモーターは、特定の条件下でＲＮＡポリメラーゼを結合させ、通常はプロモーターの下流（３’方向）に位置するコード領域の転写を開始することが可能なＤＮＡ領域である。プロモーターには、ＡＡＶプロモーター、例えば、Ｐ５、Ｐ１９、Ｐ４０及びＡＡＶ ＩＴＲプロモーター、ならびに異種プロモーターが含まれる。

「発現ベクター」は、目的のポリペプチドをコードする領域を含むベクターであり、意図された標的細胞においてタンパク質の発現をもたらすために使用される。発現ベクターはまた、標的におけるタンパク質の発現を促進するために、コード領域に作動可能に連結された制御要素を含む。制御要素と、それらが発現のために作動可能に連結されている１つ以上の遺伝子との組み合わせは、「発現カセット」と呼ばれることがあり、その多くが当技術分野で知られており、入手可能であるか、又は当技術分野で利用可能な構成要素から容易に構築することができる。

「遺伝子」は、転写及び翻訳された後に特定のタンパク質をコードすることができる少なくとも１つのオープンリーディングフレームを含むポリヌクレオチドを指す。
「遺伝子送達」という用語は、遺伝子導入のために外因性ポリヌクレオチドを細胞に導入することを指し、標的化、結合、取り込み、輸送、局在化、レプリコンの組み込み及び発現を含み得る。

「遺伝子導入」という用語は、外因性ポリヌクレオチドを細胞に導入することを指し、標的化、結合、取り込み、輸送、局在化、及びレプリコンの組み込みを含み得るが、遺伝子のその後の発現とは区別され、それを意味しない。

「遺伝子発現」又は「発現」という用語は、遺伝子の転写、翻訳、及び翻訳後修飾のプロセスを指す。
ＡＡＶの「ヘルパーウイルス」は、ＡＡＶ（例えば、野生型ＡＡＶ）が哺乳類細胞によって複製及びパッケージングされることを可能にするウイルスを指す。アデノウイルス、ヘルペスウイルス、及びワクシニアなどのポックスウイルスを含む、ＡＡＶのための様々なそのようなヘルパーウイルスが当技術分野で知られている。アデノウイルスにはいくつかの異なるサブグループが含まれるが、サブグループＣのアデノウイルス５型が最も一般的に使用されている。ヒト、非ヒト哺乳類及び鳥類起源の多数のアデノウイルスが知られており、ＡＴＣＣなどの寄託機関から入手可能である。ヘルペスファミリーのウイルスには、例えば、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）及びエプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、ならびにサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）及び仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）が含まれ、これらもＡＴＣＣなどの寄託機関からも入手できる。

「検出可能なマーカー遺伝子」は、その遺伝子を保有する細胞を特異的に検出することを可能にする遺伝子である（例えば、マーカー遺伝子を保有しない細胞と区別される）。多種多様なそのようなマーカー遺伝子が当技術分野で知られている。

「選択マーカー遺伝子」は、対応する選択剤の存在下で、その遺伝子を保有する細胞又は保有しない細胞を特異的に選択することを可能にする遺伝子である。例示として、抗生物質耐性遺伝子を、対応する抗生物質の存在下で陽性の宿主細胞を選択することを可能にする陽性選択マーカー遺伝子として使用することができる。様々な陽性及び陰性選択マーカーが当技術分野で知られており、そのいくつかを以下に説明する。

「異種」とは、それが比較される他の実体のものとは遺伝子型が異なる実体に由来することを意味する。例えば、遺伝子工学技術によって異なる細胞型に導入されたポリヌクレオチドは、異種ポリヌクレオチドである（そして、発現される場合、異種ポリペプチドをコードすることができる）。

「宿主細胞」、「細胞株」、「細胞培養物」、「パッケージング細胞株」及び他のそのような用語は、本開示において有用な真核細胞、例えば、ヒト細胞などの哺乳類細胞を示す。これらの細胞は、組換えベクター、ウイルス、又は他のトランスファーポリヌクレオチドのレシピエントとして使用することができ、形質導入された元の細胞の子孫細胞を含む。単一細胞の子孫細胞は、必ずしも元の親細胞と（形態又はゲノムの補足物において）完全に同一であるとは限らないことが理解される。

「単離された」プラスミド、ウイルス、又は他の物質は、ある物質又は類似の物質が自然に発生するか、又はその物質が最初に調製される際に共に存在し得る他の成分の少なくともいくつかを欠いた、物質の調製物を指す。したがって、例えば、単離された物質は、精製技術を使用して、それを供給源混合物から濃縮することにより調製することができる。濃縮度は、溶液の体積あたりの重量などの絶対基準で測定することも、供給源混合物に存在する第２の潜在的に干渉する物質との関係で測定することもできる。本開示の実施形態の濃縮度には様々な候補がある。したがって、例えば、２倍の濃縮が一候補であり、１０倍の濃縮がさらなる候補であり、１００倍の濃縮がさらなる候補であり、１０００倍の濃縮がさらなる候補である。

本明細書で使用される場合、「作動可能な連結」又は「作動可能に連結された」という用語は、意図された方法で機能することを可能にするように記載された構成要素の物理的又は機能的並置を指す。より具体的には、例えば、作動可能に連結された２つのＤＮＡ配列は、少なくとも一方のＤＮＡ配列が他方の配列に生理学的効果を及ぼすことができるような関係で（シス又はトランスで）その２つのＤＮＡが配置されていることを意味する。例えば、エンハンサー及び／又はプロモーターは、導入遺伝子（例えば、ＣＦＴＲΔＲミニ遺伝子などの治療用導入遺伝子）と作動可能に連結されることができる。

本明細書で使用される「パッケージング」は、ウイルスベクター、特にＡＡＶベクターのアセンブリ及びカプシド形成をもたらす一連の細胞内事象を指す。したがって、適切なベクターが適切な条件下でパッケージング細胞株に導入されると、ウイルス粒子にアセンブリされることができる。ウイルスベクター、特にＡＡＶベクターのパッケージングに関連する機能は、本明細書及び当技術分野で説明されている。

「ポリヌクレオチド」という用語は、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド、又はそれらの類似体を含む、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。ポリヌクレオチドは、メチル化又はキャップされたヌクレオチドなどの修飾ヌクレオチド及びヌクレオチドアナログを含んでもよく、非ヌクレオチド成分によって中断（ｉｎｔｅｒｒｕｐｔ）され得る。存在する場合、ヌクレオチド構造への修飾は、ポリマーのアセンブリの前又は後に付与され得る。本明細書で使用されるポリヌクレオチドという用語は、二本鎖分子及び一本鎖分子を互換的に指す。別段の指定又は要求がない限り、ポリヌクレオチドである本明細書に記載の本開示の任意の実施形態は、二本鎖形態、及び、二本鎖形態を構成することが知られている又は予測される２つの相補的な一本鎖形態のそれぞれを包含する。

「ポリペプチド」及び「タンパク質」という用語は、本明細書では互換的に使用され、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指す。この用語には、修飾されたアミノ酸ポリマー、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、脂質化、又は標識成分とコンジュゲーションされたものも含まれる。「ＣＦＴＲ」などのポリペプチドは、遺伝子治療及びそのための組成物の文脈で論じられる場合、それぞれのインタクトなポリペプチド、又はインタクトなタンパク質の所望の生化学的機能を保持するその任意のフラグメント又は遺伝子操作された誘導体を指す。同様に、ＣＦＴＲ、及び遺伝子治療で使用するための他のそのような遺伝子（通常、レシピエント細胞に送達される「導入遺伝子」と呼ばれる）への言及は、インタクトなポリペプチドあるいは所望の生化学的機能を有する任意のフラグメント又は遺伝子操作された誘導体をコードするポリヌクレオチドを含む。

「医薬組成物」とは、対象への投与に適した、ウイルスベクター（例えば、ｒＡＡＶベクター）に組み込まれるか、又はウイルスベクターから独立した（例えば、リポソーム、マイクロ粒子、又はナノ粒子に組み込まれる）治療的又は生物学的に活性な薬剤（例えば、導入遺伝子を含むポリヌクレオチド（例えば、ＣＦＴＲΔＲミニ遺伝子；例えば、Ｏｓｔｅｄｇａａｒｄ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０８（７）：２９２１－６，２０１１参照））を含む任意の組成物を意味する。これらの製剤のいずれも、周知の受け入れられている当技術分野の方法によって調製することができる。例えば、それぞれが参照により本明細書に組み込まれる、レミントン薬科学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ）（第２１版）、Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ編、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｌｋｉｎｓ、２００５、及びＥｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｊ．Ｓｗａｒｂｒｉｃｋ編、Ｉｎｆｏｒｍａ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、２００６を参照されたい。

「薬学的に許容される希釈剤、賦形剤、担体、又はアジュバント」とは、それが投与される医薬組成物の治療特性を保持しながら、対象に生理学的に受け入れられる希釈剤、賦形剤、担体、又はアジュバントを意味する。

ポリヌクレオチドに適用される「組換え」は、ポリヌクレオチドが、クローニング、制限及び／又はライゲーションステップ、及び天然に見られるポリヌクレオチドとは異なる構築物をもたらす他の手順の様々な組み合わせの産物であることを意味する。組換えウイルスは、組換えポリヌクレオチドを含むウイルス粒子である。これらの用語はそれぞれ、元のポリヌクレオチド構築物の複製及び元のウイルス構築物の子孫構築物を含む。

「組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）」又は「ｒＡＡＶベクター」とは、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、又はｉｎ ｖｉｔｒｏのいずれかで細胞に送達される、ＡＡＶ起源ではないポリヌクレオチド配列（例えば、１つ以上のエンハンサー及び／又はプロモーターに作動可能に連結され得る導入遺伝子を含むポリヌクレオチド）を含む組換え的に産生されたＡＡＶ又はＡＡＶ粒子を意味する。ｒＡＡＶは、任意のＡＡＶ血清型に由来する天然に存在するカプシドタンパク質を使用してもよい。いくつかの実施形態において、天然に存在しない（例えば、キメラ）カプシドが、本明細書に記載されるｒＡＡＶ、例えば、ＡＶ．ＴＬ６５において使用され得る。

「参照」とは、比較の目的で使用される任意のサンプル、標準、又はレベルを意味する。「正常な参照サンプル」又は「野生型参照サンプル」は、例えば、障害（例えば、嚢胞性線維症）のない対象からのサンプルであり得る。「陽性参照」サンプル、標準、又は値は、障害（例えば、嚢胞性線維症）を有することが分かっている対象に由来するサンプル、標準、値、又は数であり、以下の基準の少なくとも１つによって対象のサンプルとマッチングされ得る：年齢、体重、病期、及び全体的な健康状態。

「対象」及び「患者」という用語は、本明細書では互換的に使用され、任意の哺乳類（例えば、ヒト、霊長類、ネコ、イヌ、フェレット、ウシ、ウマ、ブタ、ヤギ、ラット、又はマウス）を指す。例えば、対象はヒトである。

「ターミネーター」は、リードスルー転写を減少させ又は防止する（すなわち、ターミネーターの一方の側で生じる転写がターミネーターの他方の側まで継続することを減少させ又は防止する）傾向があるポリヌクレオチド配列を指す。転写が妨害される程度は、典型的には、ターミネーター配列の塩基配列及び／又は長さに依存する。特に、多くの分子生物学的システムでよく知られているように、一般に「転写終結配列」と呼ばれる特定のＤＮＡ配列は、おそらくＲＮＡポリメラーゼ分子を停止させ及び／又は転写されているＤＮＡから離脱させることによって、ＲＮＡポリメラーゼによるリードスルー転写を妨害する傾向がある特定の配列である。そのような配列特異的ターミネーターの典型的な例には、ポリアデニル化（「ポリＡ」）配列、例えば、ＳＶ４０ポリＡが含まれる。そのような配列特異的ターミネーターに加えて、又はそれに代えて、プロモーターとコード領域との間に比較的長いＤＮＡ配列を挿入すると、概ね介在配列の長さに比例して、コード領域の転写を妨害する傾向もある。この効果はおそらく、ＲＮＡポリメラーゼ分子が転写中のＤＮＡから切り離されるいくらかの傾向が常にあり、コード領域に到達する前にトラバースされる配列の長さが長いほど、コード領域の転写が完了する前に、場合によっては転写の開始前に切り離される可能性が高くなるためと考えられる。したがって、ターミネーターは、一方向のみ（「一方向」ターミネーター）又は両方向（「双方向」ターミネーター）からの転写を防止することができ、配列特異的終結配列又は配列非特異的ターミネーター、あるいはそれらの両方から構成され得る。様々なそのようなターミネーター配列が当技術分野で知られている。本開示の文脈内でのそのような配列の例示的な使用が、以下に提供される。

「治療遺伝子」、「予防遺伝子」、「標的ポリヌクレオチド」、「導入遺伝子」、「目的の遺伝子」などは、総じて、ベクターを使用して導入される１つ以上の遺伝子を指す。典型的には、本開示の文脈において、そのような遺伝子は、ｒＡＡＶベクター内に位置する（このベクターは、逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）領域に隣接し、したがって、複製され、ｒＡＡＶ粒子にカプシド形成され得る）。標的ポリヌクレオチドを本開示で使用して、多くの異なる用途のためのｒＡＡＶベクターを生成することができる。そのようなポリヌクレオチドには、限定するものではないが：（ｉ）構造タンパク質又は酵素の欠落、欠陥、又は最適以下のレベルによって引き起こされる欠陥を軽減するために、他の形態の遺伝子治療に有用なタンパク質をコードするポリヌクレオチド；（ｉｉ）アンチセンス分子に転写されるポリヌクレオチド；（ｉｉｉ）転写因子又は翻訳因子に結合するデコイに転写されるポリヌクレオチド；（ｉｖ）サイトカインなどの細胞モジュレーターをコードするポリヌクレオチド；（ｖ）レシピエント細胞をヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ遺伝子などの特定の薬剤に対し感受性にすることができるポリヌクレオチド；（ｖｉ）様々ながんの治療のためのＥ１Ａ腫瘍抑制遺伝子又はｐ５３腫瘍抑制遺伝子などの、がん治療のためのポリヌクレオチド；（ｖｉｉ）遺伝子編集用のポリヌクレオチド（例えば、ＣＲＩＳＰＲ）が含まれる。レシピエント宿主細胞において導入遺伝子の発現をもたらすために、導入遺伝子は、一実施形態において、それ自体の又は異種プロモーターのいずれかであるプロモーターに作動可能に連結されている。多数の適切なプロモーターが当技術分野で知られており、それらの選択は、標的ポリヌクレオチドの所望の発現レベル；構成的発現、誘導性発現、細胞特異的又は組織特異的発現を希望するか否かなどに依存する。ｒＡＡＶベクターはまた、選択マーカーを含み得る。例示的な導入遺伝子には、限定されないが、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）又はその誘導体（例えば、ＣＦＴＲΔＲミニ遺伝子；例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＯｓｔｅｄｇａａｒｄ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０８（７）：２９２１－６，２０１１参照）、α－アンチトリプシン、β－グロビン、γ－グロビン、チロシンヒドロキシラーゼ、グルコセレブロシダーゼ、アリールスルファターゼＡ、第ＶＩＩＩ因子、ジストロフィン、エリスロポエチン、アルファ１－アンチトリプシン、サーファクタントプロテインＳＰ－Ｄ、ＳＰ－Ａ又はＳＰ－Ｃ、エリスロポエチン、又はサイトカイン、例えば、ＩＦＮ－アルファ、ＩＦＮγ、ＴＮＦ、ＩＬ－１、ＩＬ－１７、又はＩＬ－６、又はウイルス、細菌、腫瘍又は真菌抗原などの抗原である予防タンパク質、又はヒト呼吸器ウイルス、例えばインフルエンザウイルス又は、ＲＳＶからのものなどの、ＨＢｏＶタンパク質、インフルエンザウイルスタンパク質、ＲＳＶタンパク質、又はＳＡＲＳタンパク質を含むがこれらに限定されない抗原のエピトープを標的とする中和抗体又はそのフラグメントが含まれる。

「治療有効量」とは、臨床的に適切な方法で、対象の状態、又は障害又は疾患の症状、例えば嚢胞性線維症を改善し、阻害し、又は向上させるために投与される組成物の量を意味する。対象における任意の改善は、治療を達成するのに十分であると見なされる。一実施形態では、治療するのに十分な量は、嚢胞性線維症の発生又は１つ以上の症状を軽減、阻害、又は予防する量であるか、又は、嚢胞性線維症の１つ以上の症状の重症度又は対象がそれを患う期間の長さを軽減する（例えば、本明細書に記載の組成物で治療されていない対照対象と比較して少なくとも約１０％、約２０％、又は約３０％、又は少なくとも約５０％、約６０％、又は約７０％、又は少なくとも約８０％、約９０％、約９５％、約９９％、又はそれ以上軽減する）量である）。本明細書に記載の方法（例えば、嚢胞性線維症の治療）を実施するために使用される医薬組成物の有効量は、投与方法ならびに治療される対象の年齢、体重、及び全体的な健康状態に応じて変化する。医師又は研究者は、適切な量と投与計画を決定することができる。

本明細書で使用される「形質導入」は、外因性ポリヌクレオチド、例えば、ｒＡＡＶ内の導入遺伝子を宿主細胞に導入して、そのポリヌクレオチド、例えば、細胞内の導入遺伝子の発現をもたらすプロセスを指す用語である。このプロセスは一般に、１）細胞表面受容体に結合した後のＡＡＶのエンドサイトーシス、２）細胞のサイトゾル内のエンドソーム又は他の細胞内コンパートメントからのエスケープ、３）ウイルス粒子又はウイルスゲノムの核への輸送、４）ウイルス粒子のコーティング解除、及び環状中間体を含む発現可能な二本鎖ＡＡＶゲノム形態の生成を含む。ｒＡＡＶの発現可能な二本鎖形態は、核エピソームとして存続するか、又は任意で宿主ゲノムに組み込まれ得る。細胞表面受容体に結合した後のＡＡＶのエンドサイトーシス、エンドソーム又は他の細胞内コンパートメントから細胞のサイトゾルへのエスケープ、ウイルス粒子又はウイルスゲノムの核への輸送、又はウイルス粒子のコーティング解除変化及び環状中間体を含む発現性二本鎖ＡＡＶゲノム形態の生成のいずれか又は組み合わせの変化は、発現レベル又は発現の持続性の変化、又は核への輸送の変化、あるいは宿主細胞又は導入されたポリヌクレオチドを発現する細胞集団のタイプ又は相対数の変化をもたらし得る。ｒＡＡＶを介して導入されたポリヌクレオチドの変化した発現又は持続性は、タンパク質発現、例えば、ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリー及びウエスタンブロット、ハイブリダイゼーションアッセイによるＤＮＡ及びＲＮＡ産生の測定、例えば、ノーザンブロット、サザンブロット及びゲルシフト移動度アッセイ、又は定量的又は非定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、又はデジタル液滴ＰＣＲアッセイを含むがこれらに限定されない、当技術分野で周知の方法によって決定することができる。

個体又は細胞の「治療」は、治療が開始された時点での個体又は細胞の自然な経過を変えようとする試みにおける任意のタイプの介入であり、例えば、個体において予防的、治癒的又は他の有益な効果を引き出す。例えば、個人の治療は、遺伝性又は誘発性の遺伝的欠損症（例えば、嚢胞性線維症）、ウイルス、細菌、又は寄生生物による感染、腫瘍性又は非形成性の状態、又は自己免疫又は免疫抑制などの免疫系の機能不全を含む（ただしこれらに限定されない）任意の病的状態によって引き起こされる病状を軽減又は制限するために行われる場合がある。治療には、医薬組成物などの組成物の投与、及び組成物で治療された適合性細胞の投与が含まれる（ただしこれらに限定されない）。治療は、予防的又は治療的に、すなわち、病的事象の開始又は病因物質との接触の前又は後のいずれかに実施することができる。治療は、病的状態の１つ以上の症状を軽減し得る。例えば、嚢胞性線維症の症状は当技術分野で知られており、例えば、持続性の咳、喘鳴、息切れ、運動不耐性、繰り返される肺感染症、炎症を起こした鼻腔又は鼻づまり、悪臭の又は脂っぽい便、不十分な体重増加及び成長、腸の閉塞、便秘、汗の塩分濃度の上昇、膵炎、及び肺炎を含む。障害（嚢胞性線維症など）の１つ以上の症状の改善又は欠如を検出することは、治療の成功を示す。

「バリアント」は、天然又は参照ポリヌクレオチド又はポリペプチドと実質的に相同であるポリヌクレオチド又はポリペプチドを指す。例えば、バリアントポリヌクレオチドは、天然又は参照ポリヌクレオチドと実質的に相同であり得るが、１つ又は複数の欠失、挿入、及び／又は置換のために、天然又は参照ポリヌクレオチドのポリヌクレオチド配列とは異なるポリヌクレオチド配列を有する。別の例において、バリアントポリペプチドは、天然又は参照ポリペプチドと実質的に相同であり得るが、１又は複数の欠失、挿入、及び／又は置換のために、天然又は参照ポリペプチドのアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有する。バリアントポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は、天然又は参照ポリヌクレオチド配列と比較した場合にヌクレオチドの１つ以上の付加、欠失、又は置換を含むが、活性を保持するバリアントタンパク質又はそのフラグメントをコードする配列を包含する。多種多様な突然変異誘発アプローチが当技術分野で知られており、当業者によって適用することができる。

バリアントポリヌクレオチド又はポリペプチド配列は、天然又は参照配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又はそれ以上同一であり得る。天然配列とバリアント配列との間の相同性の程度（同一性パーセント）は、例えば、ワールドワイドウェブ上でこの目的のために一般的に使用される無料で利用可能なコンピュータープログラム（例えば、デフォルト設定のＢＬＡＳＴｐ又はＢＬＡＳＴｎ）を使用して２つの配列を比較することによって決定することができる。

本明細書で使用される「ベクター」は、ポリヌクレオチドを含むか又はポリヌクレオチドと会合し、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏのいずれかで細胞へのポリヌクレオチドの送達を媒介するために使用できる高分子又は高分子の会合を指す。例示的なベクターには、例えば、プラスミド、ウイルスベクター、リポソーム及び他の遺伝子送達ビヒクルが含まれる。送達されるポリヌクレオチドは、時には導入遺伝子と呼ばれ、遺伝子治療において関心のあるコード配列（治療用又は目的のタンパク質をコードする遺伝子など）、ワクチン開発において関心のあるコード配列（哺乳類において免疫応答を誘発するのに適したタンパク質、ポリヌクレオチド又はペプチドを発現するポリヌクレオチドなど）、及び／又は選択マーカー又は検出マーカーを含み得る。

ポリヌクレオチド
本開示は、ｒＡＡＶベクターに組み込まれ得るか、又はｒＡＡＶベクターの調製に使用され得るポリヌクレオチドを提供する。ポリヌクレオチドは、５’ＡＡＶ ＩＴＲ（例えば、ＡＡＶ２ ５’ＩＴＲ）、Ｆ５エンハンサー、ｔｇ８３プロモーター、５’非翻訳領域（ＵＴＲ）、ＣＦＴＲΔＲミニ遺伝子、‘３ＵＴＲ、ポリアデニル化部位、及び／又は３’ＡＡＶ ＩＴＲ（例えば、ＡＡＶ２ ３’ＩＴＲ）から選択される１つ以上の要素を含む、任意の適切な要素又はコンポーネントを含み得る。ポリヌクレオチドは一般にｒＡＡＶベクターに組み込まれるが、それらは当技術分野で知られている他のタイプのベクターとの関連で送達又は投与され得ることが理解されるべきである。

一態様において、本開示は、配列番号７の配列、又は配列番号７のポリヌクレオチド配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を有する配列を含む単離されたポリヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号１の配列を含むＦ５エンハンサー、配列番号２の配列を含むｔｇ８３プロモーター、及び／又は配列番号４の配列を含むｈＣＦＴＲΔＲミニ遺伝子を含む。別のいくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号１４の配列を含むＦ５エンハンサー、配列番号２の配列を含むｔｇ８３プロモーター、及び／又は配列番号４の配列を含むｈＣＦＴＲΔＲミニ遺伝子を含む。

いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、３’方向に、配列番号５の配列、又は配列番号５のポリヌクレオチド配列と少なくとも少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を有する配列を含む３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）をさらに含む。

いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、３’方向（例えば、３’－ＵＴＲに対して３’）に、配列番号６の配列を含む合成ポリアデニル化部位をさらに含む。
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドの５’末端に５’アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）及び／又はポリヌクレオチドの３’末端に３’ＡＡＶ ＩＴＲをさらに含む。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号１１の配列、又はそのバリアント、例えば、配列番号１１のポリヌクレオチド配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号１の配列を含むＦ５エンハンサー、配列番号２の配列を含むｔｇ８３プロモーター、及び／又は配列番号４の配列を含むｈＣＦＴＲΔＲミニ遺伝子を含む。別のいくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号１４の配列を含むＦ５エンハンサー、配列番号２の配列を含むｔｇ８３プロモーター、及び／又は配列番号４の配列を含むｈＣＦＴＲΔＲミニ遺伝子を含む。

他の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号１７の配列、又はそのバリアント、例えば、配列番号１７のポリヌクレオチド配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号１の配列を含むＦ５エンハンサー、配列番号２の配列を含むｔｇ８３プロモーター、及び／又は配列番号４の配列を含むｈＣＦＴＲΔＲミニ遺伝子を含む。別のいくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号１４の配列を含むＦ５エンハンサー、配列番号２の配列を含むｔｇ８３プロモーター、及び／又は配列番号４の配列を含むｈＣＦＴＲΔＲミニ遺伝子を含む。

いずれのポリヌクレオチドも、５’ＡＡＶ ＩＴＲを含み得る。任意のＡＡＶ血清型（例えば、ＡＡＶ２）からの５’ＡＡＶ ＩＴＲを含む、任意の適切な５’ＡＡＶ ＩＴＲを使用することができる。いくつかの実施形態において、５’ＡＡＶ ＩＴＲは、配列番号９の配列、又はそのバリアント、例えば、配列番号９のポリヌクレオチド配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を有する配列を含む。別の例では、いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号１５の配列、又はそのバリアント、例えば、配列番号１５のポリヌクレオチド配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％のの配列同一性を有する配列を含む５’ＡＡＶ ＩＴＲを含む。いずれのポリヌクレオチドも、３’ＡＡＶ ＩＴＲを含み得る。任意のＡＡＶ血清型（例えば、ＡＡＶ２）からの３’ＡＡＶ ＩＴＲを含む、任意の適切な３’ＡＡＶ ＩＴＲを使用することができる。いくつかの実施形態において、３’ＡＡＶ ＩＴＲは、配列番号１０の配列、又はそのバリアント、例えば、配列番号１０のポリヌクレオチド配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を有する配列を含む。別の例では、いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号１６の配列、又はそのバリアント、例えば、配列番号１６のポリヌクレオチド配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を有する配列を含む３’ＡＡＶ ＩＴＲを含む。ＩＴＲ配列は、例えば、配列番号１５及び配列番号１６のようにパリンドロームであり得、ここで、５’末端のＩＴＲ配列はリバース鎖に位置し、３’末端のＩＴＲ配列はフォワード鎖に位置する。

いずれのポリヌクレオチドも、Ｆ５エンハンサーを含み得る。例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願第１６／０８２，７６７号を参照されたい。いくつかの実施形態において、Ｆ５エンハンサーは、配列番号１又は配列番号１４の配列、又はそれらのバリアント、例えば、配列番号１又は配列番号１４のポリヌクレオチド配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、Ｆ５は配列番号１のポリヌクレオチド配列を含む。他の実施形態では、Ｆ５エンハンサーは、配列番号１４のポリヌクレオチド配列を含む。

いずれのポリヌクレオチドも、ｔｇ８３プロモーターを含み得る。例えば、米国特許出願第１６／０８２，７６７号を参照されたい。いくつかの実施形態において、ｔｇ８３プロモーターは、配列番号２の配列、又はそのバリアント、例えば、配列番号２のポリヌクレオチド配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を有する配列を含む。

いずれのポリヌクレオチドも５’－ＵＴＲを含み得る。任意の適切な５’－ＵＴＲを使用できる。いくつかの実施形態において、５’－ＵＴＲは、配列番号３の配列、又はそのバリアント、例えば、配列番号３のポリヌクレオチド配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を有する配列を含む。

いずれのポリヌクレオチドも、ＣＦＴＲΔＲミニ遺伝子をコードする配列を含み得る。ヒトＣＦＴＲΔＲ（ｈＣＦＴＲΔＲ）又はフェレットＣＦＴＲΔＲを含む任意の適切なＣＦＴＲΔＲミニ遺伝子を使用することができる。いくつかの実施形態において、ｈＣＦＴＲΔＲミニ遺伝子をコードする配列は、配列番号４の配列、又はそのバリアント、例えば、配列番号４のポリヌクレオチド配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を有する配列を含む。

いずれのポリヌクレオチドも３’－ＵＴＲを含み得る。任意の適切な３’－ＵＴＲを使用できる。いくつかの実施形態において、３’－ＵＴＲは、配列番号３の配列、又はそのバリアント、例えば、配列番号５のポリヌクレオチド配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を有する配列を含む。

いずれのポリヌクレオチドも、ポリアデニル化部位を含み得る。任意の適切なポリアデニル化部位を使用することができる。いくつかの実施形態において、ポリアデニル化部位は、配列番号６の配列、又はそのバリアント、例えば、配列番号６のポリヌクレオチド配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を有する配列を含む。

一態様において、本開示は、配列番号８の配列、又はそのバリアント、例えば、配列番号８のポリヌクレオチド配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を有する配列を含む単離されたポリヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号１の配列を含むＦ５エンハンサー、配列番号２の配列を含むｔｇ８３プロモーター、及び／又は配列番号４の配列を含むｈＣＦＴＲΔＲミニ遺伝子を含む。別のいくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号１４の配列を含むＦ５エンハンサー、配列番号２の配列を含むｔｇ８３プロモーター、及び／又は配列番号４の配列を含むｈＣＦＴＲΔＲミニ遺伝子を含む。

一態様において、本開示は、配列番号１１の配列、又はそのバリアント、例えば、配列番号１１のポリヌクレオチド配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を有する配列を含む単離されたポリヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号１の配列を含むＦ５エンハンサー、配列番号２の配列を含むｔｇ８３プロモーター、及び／又は配列番号４の配列を含むｈＣＦＴＲΔＲミニ遺伝子を含む。別のいくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号１４の配列を含むＦ５エンハンサー、配列番号２の配列を含むｔｇ８３プロモーター、及び／又は配列番号４の配列を含むｈＣＦＴＲΔＲミニ遺伝子を含む。

一態様において、本開示は、配列番号１２の配列、又はそのバリアント、例えば、配列番号１２のポリヌクレオチド配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を有する配列を含む単離されたポリヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号１の配列を含むＦ５エンハンサー、配列番号２の配列を含むｔｇ８３プロモーター、及び／又は配列番号４の配列を含むｈＣＦＴＲΔＲミニ遺伝子を含む。別のいくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号１４の配列を含むＦ５エンハンサー、配列番号２の配列を含むｔｇ８３プロモーター、及び／又は配列番号４の配列を含むｈＣＦＴＲΔＲミニ遺伝子を含む。

別の態様において、本開示は、配列番号１８の配列、又はそのバリアント、例えば、配列番号１８のポリヌクレオチド配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を有する配列を含む単離されたポリヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号１の配列を含むＦ５エンハンサー、配列番号２の配列を含むｔｇ８３プロモーター、及び／又は配列番号４の配列を含むｈＣＦＴＲΔＲミニ遺伝子を含む。別のいくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号１４の配列を含むＦ５エンハンサー、配列番号２の配列を含むｔｇ８３プロモーター、及び／又は配列番号４の配列を含むｈＣＦＴＲΔＲミニ遺伝子を含む。

ポリヌクレオチドはまた、１つ以上の検出マーカーを含み得る。そのようなマーカーとして種々のものが知られており、例示として、細菌のベータ－ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）遺伝子、ヒト胎盤アルカリホスファターゼ（ＡＰ）遺伝子、及びｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏの両方でレポーター分子として使用されている様々な細胞表面マーカーをコードする遺伝子が挙げられる。ポリヌクレオチドはまた、１つ以上の選択マーカーを含み得る。

組換えＡＡＶベクター
組換えＡＡＶベクターは、特に嚢胞性線維症などの疾患に対する、ヒト遺伝子治療のための潜在的に強力なツールである。遺伝子治療への他のアプローチに対するｒＡＡＶベクターの主な利点は、エピソームに存在するために、又は宿主細胞に安定して組み込まれるために、標的細胞が継続的に複製される必要が大抵の場合ないことである。総じて、本開示は、ＡＶ．ＴＬ６５カプシドタンパク質と、導入遺伝子に作動可能に連結されたＦ５エンハンサー及びｔｇ８３プロモーターを含むポリヌクレオチドとを含むｒＡＡＶを提供する。

例えば、一態様において、本開示は、（ｉ）ＡＶ．ＴＬ６５カプシドタンパク質；及び（ｉｉ）ＣＦＴＲΔＲミニ遺伝子に作動可能に連結されたＦ５エンハンサー及びｔｇ８３プロモーターを含むポリヌクレオチドを含むｒＡＡＶを提供する。

別の態様において、本開示は、それを必要とする対象における嚢胞性線維症の治療に使用するためのｒＡＡＶを提供し、ｒＡＡＶは、（ｉ）ＡＶ．ＴＬ６５カプシドタンパク質；及び（ｉｉ）ＣＦＴＲΔＲミニ遺伝子に作動可能に連結されたＦ５エンハンサー及びｔｇ８３プロモーターを含むポリヌクレオチドを含む。

いくつかの実施形態において、ＡＶ．ＴＬ６５カプシドタンパク質は、配列番号１３のアミノ酸配列、又はそのバリアント、例えば、配列番号１３のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％のの配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態において、Ｆ５エンハンサーは、配列番号１又は配列番号１４のポリヌクレオチド配列、又はそのバリアント、例えば、配列番号１又は配列番号１４のポリヌクレオチド配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、Ｆ５は、配列番号１のポリヌクレオチド配列を含む。他の実施形態では、Ｆ５エンハンサーは、配列番号１４のポリヌクレオチド配列を含む。

いくつかの実施形態において、ｔｇ８３プロモーターは、配列番号２のポリヌクレオチド配列、又はそのバリアント、例えば、配列番号２のポリヌクレオチド配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を有する配列を含む。

任意の適切なＣＦＴＲΔＲミニ遺伝子又はその誘導体を使用することができる。いくつかの実施形態において、ＣＦＴＲΔＲミニ遺伝子は、ヒトＣＦＴＲΔＲミニ遺伝子である。他の実施形態では、ＣＦＴＲΔＲミニ遺伝子は、フェレットＣＦＴＲΔＲミニ遺伝子である。いくつかの実施形態において、ヒトＣＦＴＲΔＲミニ遺伝子は、配列番号４の配列、又はそのバリアント、例えば、配列番号４のポリヌクレオチド配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を有する配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる。

いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、５’から３’方向に、Ｆ５エンハンサー、ｔｇ８３プロモーター、及びＣＦＴＲΔＲミニ遺伝子を含む。いくつかの特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは、５’から３’の方向に、５’ＡＡＶ ＩＴＲ（例えば、ＡＡＶ２ ５’ＩＴＲ）、Ｆ５エンハンサー、ｔｇ８３プロモーター、５’非翻訳領域（ＵＴＲ）、ＣＦＴＲΔＲミニ遺伝子、‘３－ＵＴＲ、ポリアデニル化部位、及び３’ＡＡＶ ＩＴＲ（例えば、ＡＡＶ２ ３’ＩＴＲ）を含む。

別の態様において、本開示は、本明細書に記載のポリヌクレオチドのいずれか、例えば、配列番号７、配列番号１１、又は配列番号１７の配列、又はそのバリアント、例えば、配列番号７、配列番号１１、又は配列番号１７のポリヌクレオチド配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を有する配列を含むポリヌクレオチドを含むｒＡＡＶを提供する。例えば、本開示は、配列番号１７の配列、又はそのバリアント、例えば、配列番号１７のポリヌクレオチド配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を有する配列を含むポリヌクレオチドを含むｒＡＡＶを提供する。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶは、気道上皮細胞（例えば、肺上皮細胞）に対して向性を有する。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶは、ＡＶ．ＴＬ６５カプシドタンパク質、ＡＡＶ１カプシドタンパク質、ＡＡＶ２カプシドタンパク質、ＡＡＶ５カプシドタンパク質、ＡＡＶ６カプシドタンパク質、又はＡＡＶ９カプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶは、ＡＶ．ＴＬ６５カプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号１の配列を含むＦ５エンハンサー、配列番号２の配列を含むｔｇ８３プロモーター、及び／又は配列番号４の配列を含むｈＣＦＴＲΔＲミニ遺伝子を含む。別のいくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号１４の配列を含むＦ５エンハンサー、配列番号２の配列を含むｔｇ８３プロモーター、及び／又は配列番号４の配列を含むｈＣＦＴＲΔＲミニ遺伝子を含む。

異種ポリヌクレオチドは、組換え技術により、ＡＡＶゲノムのコード領域内に又はそれの代わりに（すなわち、ＡＡＶｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子の代わりに）組み込まれるが、大抵は、ＡＡＶ逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）領域が両側に隣接している。これは、ＩＴＲがコーディング配列の上流と下流の両方に直接並置された状態で現れ、例えば（必須ではないが）複製能力のあるＡＡＶゲノムを再生成し得る組換えの可能性を減らすために、ＡＡＶ起源の配列が介在しないことを意味する。しかしながら、２つのＩＴＲを含む構成に通常関連する機能を実行するために単一のＩＴＲで十分な場合があり（例えば、国際公開第９４／１３７８８号を参照）、したがって、１つのＩＴＲのみを有するベクター構築物を本開示のパッケージング方法及び製造方法と組み合わせて使用することができる。

ｒｅｐの天然のプロモーターは自己調節性であり、生成されるＡＡＶ粒子の量を制限することができる。ｒｅｐ遺伝子はまた、ｒｅｐがベクター構築物の一部として提供されるか、又は別個に提供されるかにかかわらず、異種プロモーターに作動可能に連結され得る。ｒｅｐ遺伝子発現によって強くダウンレギュレーションされない異種プロモーターが適しているが、ｒｅｐ遺伝子の構成的発現は宿主細胞に悪影響を与える可能性があるため、誘導性プロモーターが候補である。多種多様な誘導性プロモーターが当技術分野で知られており、例示として、重金属イオン誘導性プロモーター（メタロチオネインプロモーターなど）；ステロイドホルモン誘導性プロモーター（ＭＭＴＶプロモーター又は成長ホルモンプロモーターなど）；及びＴ７ＲＮＡポリメラーゼの存在下で活性であるＴ７ファージ由来のものなどのプロモーターが挙げられる。誘導性プロモーターの１つのサブクラスは、ｒＡＡＶベクターの複製及びパッケージングを補完するために使用されるヘルパーウイルスによって誘導されるものである。アデノウイルスＥ１Ａタンパク質によって誘導されるアデノウイルス初期遺伝子プロモーター；アデノウイルスの主要な後期プロモーター；ＶＰ１６又は１ＣＰ４などのヘルペスウイルスタンパク質によって誘導されるヘルペスウイルスプロモーター；ならびにワクシニア又はポックスウイルス誘導性プロモーターを含む、多くのヘルパーウイルス誘導性プロモーターも記載されている。

様々なＡＡＶゲノムの相対的なカプシド形成サイズの制限を考えると、ゲノムに大きな異種ポリヌクレオチドを挿入するには、ＡＡＶ配列の一部を除去することが必要となる。複製能力のある（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ－ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）ＡＡＶ（「ＲＣＡ」）を生成する可能性を減らすために、１つ以上のＡＡＶ遺伝子の除去がどのような場合にも望ましい。したがって、一実施形態では、ｒｅｐ、ｃａｐ、又はそれらの両方のコーディング配列又はプロモーター配列が削除される。その理由は、これらの遺伝子によって提供される機能をトランスで提供することができるためである。

結果として得られるベクターは、これらの機能において「欠陥がある」と呼ばれる。ベクターを複製及びパッケージングするために、欠落している機能は、１つ又は複数のパッケージング遺伝子で補完され、これらが一緒になって、様々な欠落しているｒｅｐ及び／又はｃａｐ遺伝子産物に必要な機能をコードする。パッケージング遺伝子又は遺伝子カセットは、一実施形態では、ＡＡＶ ＩＴＲに隣接しておらず、一実施形態では、ｒＡＡＶゲノムと実質的な相同性を共有していない。したがって、ベクター配列と別々に提供されたパッケージング遺伝子との間の複製中の相同組換えを最小限にするために、２つのポリヌクレオチド配列の重複を避けることが望ましい。相同性のレベル及び対応する組換えの頻度は、相同配列の長さの増加及びそれらが共有する同一性のレベルとともに増加する。当技術分野で知られているように、所与のシステムにおいて懸念をもたらす相同性のレベルは、理論的に決定され、実験的に確認され得る。しかしながら、典型的には、重複配列が約２５ヌクレオチド配列未満で、その全長にわたって少なくとも８０％同一である場合、又は約５０ヌクレオチド配列未満で、その全長にわたって少なくとも７０％同一である場合、組換えを実質的に低減又は排除することができる。もちろん、相同性のレベルがさらに低いと、組換えの可能性がさらに低下する。重複する相同性がなくても、ＲＣＡを生成する頻度はいくらか残っているように思われる。Ａｌｌｅｎらの国際公開第９８／２７２０４号に記載されているように、ＡＡＶの複製及びカプシド形成機能を「分割（ｓｐｌｉｔｔｉｎｇ）」することにより、（例えば、非相同組換えにより）ＲＣＡを生成する頻度をさらに減らすことができる。

ｒＡＡＶベクター構築物、及び補完的パッケージング遺伝子構築物は、本開示において、いくつかの異なる形態で実施することができる。ウイルス粒子、プラスミド、及び安定して形質転換された宿主細胞はすべて、そのような構築物を一時的又は安定的にパッケージング細胞に導入するために使用することができる。

本開示の特定の実施形態において、ＡＡＶベクター及び存在する場合は補完的パッケージング遺伝子は、細菌プラスミド、ＡＡＶ粒子、又はそれらの任意の組み合わせの形態で提供される。他の実施形態では、ＡＡＶベクター配列、パッケージング遺伝子のいずれか、又はそれらの両方が、遺伝的に改変された真核細胞の形態で提供される。ＡＡＶベクター配列、ＡＡＶパッケージング遺伝子、又はその両方を発現するように遺伝的に改変された宿主細胞の開発は、信頼できるレベルで発現される物質の確立された供給源を提供する。

したがって、様々な異なる遺伝的に改変された細胞を、本開示に照らして使用することができる。例示として、哺乳類宿主細胞は、安定して組み込まれたｒＡＡＶベクターの少なくとも１つのインタクトコピーと共に使用され得る。プロモーターに作動可能に連結された少なくともＡＡＶｒｅｐ遺伝子を含むＡＡＶパッケージングプラスミドを使用して、複製機能を提供することができる（米国特許第５，６５８，７７６号に記載されているように）。あるいは、プロモーターに作動可能に連結されたＡＡＶｒｅｐ遺伝子を有する安定な哺乳類細胞株を使用して、複製機能を提供することができる（例えば、Ｔｒｅｍｐｅら、（国際公開第９５／１３３９２号）；Ｂｕｒｓｔｅｉｎら（国際公開第９８／２３０１８号）；及びＪｏｈｎｓｏｎら（米国特許第５，６５６，７８５号））。上記のようにカプシド形成タンパク質を提供するＡＡＶｃａｐ遺伝子は、ＡＡＶｒｅｐ遺伝子と一緒に、又は別々に提供することができる（例えば、上記の特許出願及び特許文献ならびにＡｌｌｅｎら（国際公開第９８／２７２０４号）を参照されたい。他の組み合わせが可能であり、本開示の範囲内に含まれる。

ｒＡＡＶ、例えば、ＡＶ．ＴＬ６５カプシドタンパク質を含むｒＡＡＶを生成するためのアプローチは、当技術分野で知られている。例えば、それぞれが参照により本明細書に組み込まれる、Ｅｘｃｏｆｆｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０６（１０）：３８６５－３８７０，２００９及び米国特許第１０，０４６，０１６号を参照されたい。

増強剤
本明細書に記載のｒＡＡＶを、ＡＡＶ形質導入の増強剤と組み合わせて使用して、導入遺伝子の形質導入及び／又は発現の大幅な増加を達成することができる。任意の適切な増強剤を使用できる。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第７，７４９，４９１号は、適切な増強剤を記載している。増強剤は、プロテアソーム調節剤であり得る。プロテアソーム調節剤は、アントラサイクリン（例えば、ドキソルビシン、イダルビシン、アクラルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン、バルルビシン、又はミトキサントロン）、プロテアソーム阻害剤（例えば、ボルテゾミブ、カルフィルゾミブ、及びイキサゾミブ）、トリペプチジルアルデヒド（例えば、Ｎ－アセチル－ｌ－ロイシル－ｌ－ロイシル－ｌ－ノルロイシン（ＬＬｎＬ））、又はそれらの組み合わせであり得る。いくつかの実施形態では、増強剤はドキソルビシンである。他の実施形態では、増強剤はイダルビシンである。

ｒＡＡＶ及び増強剤は、同じ組成物又は異なる組成物（例えば、医薬組成物）に含めて、細胞と接触させるか、又は対象に投与することができる。ｒＡＡＶ及び増強剤の接触又は投与は、連続的（例えば、ｒＡＡＶの後に増強剤、又はその逆）又は同時であり得る。

医薬組成物
本開示は、本明細書に記載のｒＡＡＶのいずれかを含む医薬組成物を含めた医薬組成物を提供する。医薬担体は、１つ以上の薬学的に許容される担体、賦形剤、希釈剤、緩衝剤などを含み得る。

例えば、一態様において、本開示は、ｒＡＡＶを含む医薬組成物を提供し、ｒＡＡＶは、（ｉ）ＡＶ．ＴＬ６５カプシドタンパク質；及び（ｉｉ）ＣＦＴＲΔＲミニ遺伝子に作動可能に連結されたＦ５エンハンサー及びｔｇ８３プロモーターを含むポリヌクレオチドを含む。

別の態様において、本開示は、それを必要とする対象における嚢胞性線維症の治療に使用するためのｒＡＡＶを含む医薬組成物を提供し、ｒＡＡＶは、（ｉ）ＡＶ．ＴＬ６５カプシドタンパク質；及び（ｉｉ）ＣＦＴＲΔＲミニ遺伝子に作動可能に連結されたＦ５エンハンサー及びｔｇ８３プロモーターを含むポリヌクレオチドを含む。

いくつかの実施形態において、ＡＶ．ＴＬ６５カプシドタンパク質は、配列番号１３のアミノ酸配列、又はそのバリアント、例えば、配列番号１３のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％のの配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態において、Ｆ５エンハンサーは、配列番号１又は配列番号１４のポリヌクレオチド配列、又はそのバリアント、例えば、配列番号１又は配列番号１４のポリヌクレオチド配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、Ｆ５は、配列番号１のポリヌクレオチド配列を含む。他の実施形態では、Ｆ５エンハンサーは、配列番号１４のポリヌクレオチド配列を含む。

いくつかの実施形態において、ｔｇ８３プロモーターは、配列番号２のポリヌクレオチド配列、又はそのバリアント、例えば、配列番号２のポリヌクレオチド配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を有する配列を含む。

任意の適切なＣＦＴＲΔＲミニ遺伝子又はその誘導体を使用することができる。いくつかの実施形態において、ＣＦＴＲΔＲミニ遺伝子は、ヒトＣＦＴＲΔＲミニ遺伝子である。他の実施形態では、ＣＦＴＲΔＲミニ遺伝子は、フェレットＣＦＴＲΔＲミニ遺伝子である。いくつかの実施形態において、ヒトＣＦＴＲΔＲミニ遺伝子は、配列番号４の配列、又はそのバリアント、例えば、配列番号４のポリヌクレオチド配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を有する配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる。

いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、５’から３’方向に、Ｆ５エンハンサー、ｔｇ８３プロモーター、及びＣＦＴＲΔＲミニ遺伝子を含む。いくつかの特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは、５’から３’の方向に、５’ＡＡＶ ＩＴＲ（例えば、ＡＡＶ２ ５’ＩＴＲ）、Ｆ５エンハンサー、ｔｇ８３プロモーター、５’非翻訳領域（ＵＴＲ）、ＣＦＴＲΔＲミニ遺伝子、‘３－ＵＴＲ、ポリアデニル化部位、及び３’ＡＡＶ ＩＴＲ（例えば、ＡＡＶ２ ３’ＩＴＲ）を含む。

別の態様において、本開示はｒＡＡＶを含む医薬組成物を提供し、ｒＡＡＶは、本明細書に記載のポリヌクレオチドのいずれか、例えば、配列番号７、１１、又は１７の配列、又はそのバリアント、例えば、配列番号７、１１、又は１７のポリヌクレオチド配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を有する配列を含むポリヌクレオチドを含む。例えば、本開示ではｒＡＡＶを含む医薬組成物が提供され、ｒＡＡＶは、配列番号１７の配列、又はそのバリアント、例えば、配列番号１７のポリヌクレオチド配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を有する配列を含むポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶは、気道上皮細胞（例えば、肺上皮細胞）に対して向性を有する。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶは、ＡＶ．ＴＬ６５カプシドタンパク質、ＡＡＶ１カプシドタンパク質、ＡＡＶ２カプシドタンパク質、ＡＡＶ５カプシドタンパク質、ＡＡＶ６カプシドタンパク質、又はＡＡＶ９カプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶは、ＡＶ．ＴＬ６５カプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号１の配列を含むＦ５エンハンサー、配列番号２の配列を含むｔｇ８３プロモーター、及び／又は配列番号４の配列を含むｈＣＦＴＲΔＲミニ遺伝子を含む。別のいくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号１４の配列を含むＦ５エンハンサー、配列番号２の配列を含むｔｇ８３プロモーター、及び／又は配列番号４の配列を含むｈＣＦＴＲΔＲミニ遺伝子を含む。

本明細書に記載の医薬組成物は、ｒＡＡＶ単独、又は１つ以上の追加の治療薬と組み合わせたｒＡＡＶを含み得る。例示的な追加の治療薬には、限定するものではないが、増強剤（例えば、本明細書に記載の任意の増強剤、例えば、ドキソルビシン又はイダルビシン）、抗生物質（例えば、アジスロマイシン（ＺＩＴＨＲＯＭＡＸ（商標））、アモキシシリン及びクラブラン酸（ＡＵＧＭＥＮＴＩＮ（商標））、クロキサシリン及びジクロカシリン、チカルシリン及びクラブラン酸（ＴＩＭＥＮＴＩＮ（商標））、セファレキシン、セフジニル、セフプロジル、セファクロル；スルファメトキサゾール及びトリメトプリム（ＢＡＣＴＲＩＭ（商標））、エリスロマイシン／スルフィソキサゾール、エリスロマイシン、クラリスロマイシン、テトラサイクリン、ドキシサイクリン、ミノサイクリン、チゲサイクリン、バンコマイシン、イミペネム、メリペネム（ｍｅｒｉｐｅｎｅｍ）、コリスチメタート／ＣＯＬＩＳＴＩＮ（商標）、リネゾリド、シプロフロキサシン、レボフロキサシン、又はそれらの組み合わせ）、粘液希釈剤（例えば、高張食塩水又はドルナーゼアルファ（ＰＵＬＭＯＺＹＭＥ（商標）））、ＣＦＴＲモジュレーター（例えば、イバカフトール（ＫＡＬＹＤＥＣＯ（商標））、ルマカフトール、ルマカフトール／イヴァカフトール（ＯＲＫＡＭＢＩ（商標））、テザカフトール／イバカフトール（ＳＹＭＤＥＫＯ（商標））、又はＴＲＩＫＡＦＴＡ（商標）（エレキサカフトール／イバカフトール／テザカフトール））、粘液溶解薬（例えば、アセチルシステイン、アンブロキソール、ブロムヘキシン、カルボシステイン、エルドステイン、メシステイン、及びドルナーゼアルファ）、免疫抑制剤、生理食塩水、高張食塩水、又はそれらの組み合わせが含まれる。

例えば、本明細書に記載の医薬組成物は、１つ以上の免疫抑制剤を含み得る。任意の適切な免疫抑制剤を使用することができる。例えば、免疫抑制剤の非限定的な例には、コルチコステロイド（例えば、吸入コルチコステロイド（例えば、ベクロメタゾン（ＱＶＡＲ（商標））、ブデソニド（ＰＵＬＭＩＣＯＲＴ（商標））、ブデソニド／フォルモテロール（ＳＹＭＢＩＣＯＲＴ（商標））、シクレソニド（ＡＬＶＥＳＣＯ（商標））、フルチカゾン（ＦＬＯＶＥＮＴ ＨＦＡ（商標））、プロピオン酸フルチカゾン（ＦＬＯＶＥＮＴ ＤＩＳＫＵＳ（商標））、フロ酸フルチカゾン（ＡＲＮＵＩＴＹ ＥＬＬＩＰＴＡ（商標））、プロピオン酸フルチカゾン／サルメテロール（ＡＤＶＡＩＲ（商標））、フロ酸フルチカゾン／ウメクリジニウム／ビランテロール（ＴＲＥＬＥＧＹ ＥＬＬＩＰＴＡ（商標））、フロ酸モメタゾン（ＡＳＭＡＮＥＸ（商標））、又はモメタゾン／フォルモテロール（ＤＵＬＥＲＡ（商標））、プレジソン、又はメチルプレドニソン）、ポリクローナル抗リンパ球抗体（例えば、抗リンパ球グロブリン（ＡＬＧ）及び抗胸腺細胞グロブリン（ＡＴＧ））抗体、例えば、ウマ由来又はウサギ由来）、モノクローナル抗リンパ球抗体（例えば、抗ＣＤ３抗体（例えば、ムルモマブ及びアレムツズマブ）又は抗ＣＤ２０抗体（例えば、リツキシマブ））、インターロイキン－２（ＩＬ－２）受容体拮抗薬（例えば、ダクリズマブ及びバシリキシマブ）、カルシニューリン阻害剤（例えば、シクロスポリンＡ及びタクロリムス）、細胞周期阻害剤（例えば、アザチオプリン、ミコフェノール酸モフェチル（ＭＭＦ）、及びミコフェノール酸（ＭＰＡ））、哺乳類ラパマイシン標的タンパク質（ｍＴＯＲ）阻害剤（例えば、シロリムス（ラパマイシン）及びエベロリムス）、メトトレキサート、シクロホスファミド、アントラサイクリン（例えば、ドキソルビシン、イダルビシン、アクラルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン、バルビシン、ミトキサントロン、又はそれらの組み合わせ）、タキサン（例えば、ＴＡＸＯＬ（商標）（パクリタキセル））、及びそれらの組み合わせ（例えば、カルシニューリン阻害剤、細胞周期阻害剤、及びコルチコステロイドの組み合わせ）が挙げられる。

特定の実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物は、１つ以上のコルチコステロイド（例えば、吸入コルチコステロイド（例えば、ベクロメタゾン（ＱＶＡＲ（商標））、ブデソニド（ＰＵＬＭＩＣＯＲＴ（商標））、ブデソニド／フォルモテロール（ＳＹＭＢＩＣＯＲＴ（商標））、シクレソニド（ＡＬＶＥＳＣＯ（商標））、フルチカゾン（ＦＬＯＶＥＮＴ ＨＦＡ（商標））、プロピオン酸フルチカゾン（ＦＬＯＶＥＮＴ ＤＩＳＫＵＳ（商標））、フロ酸フルチカゾン（ＡＲＮＵＴＹ ＥＬＬＩＰＴＡ（商標））、プロピオン酸フルチカゾン／サルメテロール（ＡＤＶＡＩＲ（商標））、フロ酸フルチカゾン／ウメクリジニウム／ビランテロール（ＴＲＥＬＥＧＹ ＥＬＬＩＰＴＡ（商標））、フロ酸モメタゾン（ＡＳＭＡＮＥＸ（商標））、又はモメタゾン／ホルモテロール（ＤＵＬＥＲＡ（商標））、プレジソン、又はメチルプレドニソン）を含み得る。いくつかの実施形態では、コルチコステロイドは吸入コルチコステロイドである。

免疫抑制剤（例えば、本明細書に記載の任意の免疫抑制剤）は、吸入によって投与されるか、又は全身的に（例えば、静脈内又は皮下に）投与され得る。
典型的には、ウイルスベクターは、リンゲルの平衡塩類溶液（ｐＨ７．４）などの薬学的に適切なパイロジェンフリーの緩衝液中にある。必須ではないが、医薬組成物は、任意選択で、正確な量の投与に適した単位剤形で供給され得る。医薬組成物は総じて無菌である。

ＣＦの治療方法
本開示は、ＣＦを治療及び／又は予防する方法を提供する。
例えば、一態様において、本開示は、ＣＦを治療する方法を提供し、この方法は、それを必要とする対象に、（ｉ）ＡＶ．ＴＬ６５カプシドタンパク質；及び（ｉｉ）ＣＦＴＲΔＲミニ遺伝子に作動可能に連結されたＦ５エンハンサー及びｔｇ８３プロモーターを含むポリヌクレオチドを含む治療有効量のｒＡＡＶを投与することを含む。ｒＡＡＶは、本明細書に記載のポリヌクレオチドのいずれかを含み得る。

別の態様において、本開示は、それを必要とする対象における嚢胞性線維症の治療に使用するためのｒＡＡＶを特徴とし、ｒＡＡＶは、（ｉ）ＡＶ．ＴＬ６５カプシドタンパク質；及び（ｉｉ）ＣＦＴＲΔＲミニ遺伝子に作動可能に連結されたＦ５エンハンサー及びｔｇ８３プロモーターを含むポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶは、１つ以上の追加の治療薬（例えば、本明細書に記載の任意の増強剤）と組み合わせて使用するためのものである。ｒＡＡＶは、本明細書に記載のポリヌクレオチドのいずれかを含み得る。

本明細書に記載の組成物（例えば、ｒＡＡＶ又は医薬組成物）は、ｉｎ ｖｉｖｏ及びｅｘ ｖｉｖｏで使用することができる。ｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子治療は、本開示のベクターを対象に直接投与することを含む。医薬組成物は、液体溶液又は懸濁液として、乳濁液として、又は使用前に液体に溶解又は懸濁させるのに適した固体形態として供給することができる。気道への投与の場合、投与の１つの例示的な形態は、適切なエアロゾル化装置と共に使用されるときに固体又は液体エアロゾルのいずれかを提供する組成物を使用するエアロゾルによるものである。気道への別の投与方法は、柔軟な光ファイバー気管支鏡を使用してベクターを注入することである。

本明細書に記載の組成物（例えば、ｒＡＡＶ又は医薬組成物）は、任意の適切な経路で、例えば、吸入、噴霧、エアロゾル化、鼻腔内、気管内、気管支内、経口、非経口（例えば、静脈内、皮下、又は筋肉内）、経口、鼻、直腸、局所、又は頬腔により投与することができる。これらはまた、局所的又は全身的に投与することができる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の組成物は、アトマイザー噴霧器を使用して（例えば、ＭＡＤｇｉｃ（商標）喉頭気管粘膜噴霧装置を使用して）気管内及び／又は気管支内にエアロゾル化された粒子で投与される。いくつかの実施形態では、組成物は非経口で投与される。他のいくつかの実施形態では、組成物は全身投与される。ベクターはまた、例示として、血管移植片（ＰＴＦＥ及びダクロン）、心臓弁、血管内ステント、血管内ペービング（ｉｎｔｒａｖａｓｃｕｌａｒ ｐａｖｉｎｇ）、ならびに他の非血管プロテーゼを含む、バイオプロテーゼによって導入することができる。ベクター溶液の送達、頻度、組成及び用量の範囲に関する一般的な技術は、当業者の範囲内である。

吸入による上気道（鼻）又は下気道への投与のために、本明細書に記載の組成物（例えば、ｒＡＡＶ又は医薬組成物）は、吹送器、ネブライザー又は加圧パック、又はエアロゾルスプレーを送達する他の便利な手段から好都合に送達される。加圧パックは、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素又は他の適切なガスなどの適切な噴射剤を含み得る。加圧エアロゾルの場合、投与量の単位は、計量された量を供給するためのバルブを提供することによって決定することができる。

あるいは、吸入又は吹送による投与の場合、組成物は、乾燥粉末、例えば、薬剤とラクトース又はデンプンなどの適切な粉末ベースとの粉末混合物の形態をとることができる。粉末組成物は、例えば、カプセル又はカートリッジ、又は例えば、吸入器、吹送器又は定量吸入器の助けを借りて粉末を投与することができるゼラチン又はブリスターパックでの単位剤形で提供することができる。

鼻腔内投与の場合、薬剤は、点鼻薬、プラスチックボトルアトマイザー又は定量吸入器などの液体スプレーを介して投与することができる。アトマイザーの典型的なものは、ミストメーター（Ｗｉｎｔｒｏｐ）及びメジヘラー（Ｒｉｋｅｒ）である。

本明細書に記載の組成物（例えば、ｒＡＡＶ又は医薬組成物）の投与は、例えば、レシピエントの生理学的状態、投与の目的が治療か予防か、及び当業者に知られている他の要因に応じて、連続的又は断続的であり得る。本明細書に記載の組成物は、同じ部位又は異なる部位に、１回又は複数回（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、又はそれ以上の回数）投与することができる。本開示の薬剤の投与は、事前に選択された期間にわたって本質的に連続的であり得るか、又は一連の間隔を置いた投与であり得る。

本明細書に記載の組成物（例えば、ｒＡＡＶ又は医薬組成物）は単剤療法として投与することができる。本明細書に記載の組成物（例えば、ｒＡＡＶ又は医薬組成物）は、１つ以上の追加の治療薬と組み合わせて投与することもできる。ＣＦの標準治療を含む、任意の適切な追加の治療薬を使用することができる。いくつかの実施形態において、１つ以上の追加の治療薬は、抗生物質（例えば、アジスロマイシン（ＺＩＴＨＲＯＭＡＸ（商標））、アモキシシリン及びクラブラン酸（ＡＵＧＭＥＮＴＩＮ（商標））、クロキサシリン及びジクロカシリン、チカルシリン及びクラブラン酸（ＴＩＭＥＮＴＩＮ（商標））、セファレキシン、セフジニル、セフプロジル、セファクロル；スルファメトキサゾール及びトリメトプリム（ＢＡＣＴＲＩＭ（商標））、エリスロマイシン／スルフィソキサゾール、エリスロマイシン、クラリスロマイシン、テトラサイクリン、ドキシサイクリン、ミノサイクリン、チゲサイクリン、バンコマイシン、イミペネム、メリペネム（ｍｅｒｉｐｅｎｅｍ）、コリスチメタート／ＣＯＬＩＳＴＩＮ（商標）、リネゾリド、シプロフロキサシン、レボフロキサシン、又はそれらの組み合わせ）、粘液希釈剤（例えば、高張食塩水又はドルナーゼアルファ（ＰＵＬＭＯＺＹＭＥ（商標）））、ＣＦＴＲモジュレーター（例えば、イバカフトール（ＫＡＬＹＤＥＣＯ（商標））、ルマカフトール、ルマカフトール／イヴァカフトール（ＯＲＫＡＭＢＩ（商標））、テザカフトール／イバカフトール（ＳＹＭＤＥＫＯ（商標））、又はＴＲＩＫＡＦＴＡ（商標）（エレキサカフトール／イバカフトール／テザカフトール））、粘液溶解薬（例えば、アセチルシステイン、アンブロキソール、ブロムヘキシン、カルボシステイン、エルドステイン、メシステイン、及びドルナーゼアルファ）、免疫抑制剤、生理食塩水、高張食塩水、又はそれらの組み合わせを含む。

例えば、本明細書に記載の組成物（例えば、ｒＡＡＶ又は医薬組成物）のいずれか１つは、１つ以上の免疫抑制剤と組み合わせて投与することができる。任意の適切な免疫抑制剤を使用することができる。例えば、免疫抑制剤の非限定的な例には、コルチコステロイド（例えば、吸入コルチコステロイド（例えば、ベクロメタゾン（ＱＶＡＲ（商標））、ブデソニド（ＰＵＬＭＩＣＯＲＴ（商標））、ブデソニド／フォルモテロール（ＳＹＭＢＩＣＯＲＴ（商標））、シクレソニド（ＡＬＶＥＳＣＯ（商標））、フルチカゾン（ＦＬＯＶＥＮＴ ＨＦＡ（商標））、プロピオン酸フルチカゾン（ＦＬＯＶＥＮＴ ＤＩＳＫＵＳ（商標））、フロ酸フルチカゾン（ＡＲＮＵＩＴＹ ＥＬＬＩＰＴＡ（商標））、プロピオン酸フルチカゾン／サルメテロール（ＡＤＶＡＩＲ（商標））、フロ酸フルチカゾン／ウメクリジニウム／ビランテロール（ＴＲＥＬＥＧＹ ＥＬＬＩＰＴＡ（商標））、フロ酸モメタゾン（ＡＳＭＡＮＥＸ（商標））、又はモメタゾン／フォルモテロール（ＤＵＬＥＲＡ（商標））、プレジソン、又はメチルプレドニソン）、ポリクローナル抗リンパ球抗体（例えば、抗リンパ球グロブリン（ＡＬＧ）及び抗胸腺細胞グロブリン（ＡＴＧ））抗体、例えば、ウマ由来又はウサギ由来）、モノクローナル抗リンパ球抗体（例えば、抗ＣＤ３抗体（例えば、ムルモマブ及びアレムツズマブ）又は抗ＣＤ２０抗体（例えば、リツキシマブ））、インターロイキン－２（ＩＬ－２）受容体拮抗薬（例えば、ダクリズマブ及びバシリキシマブ）、カルシニューリン阻害剤（例えば、シクロスポリンＡ及びタクロリムス）、細胞周期阻害剤（例えば、アザチオプリン、ミコフェノール酸モフェチル（ＭＭＦ）、及びミコフェノール酸（ＭＰＡ））、哺乳類ラパマイシン標的タンパク質（ｍＴＯＲ）阻害剤（例えば、シロリムス（ラパマイシン）及びエベロリムス）、メトトレキサート、シクロホスファミド、アントラサイクリン（例えば、ドキソルビシン、イダルビシン、アクラルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン、バルビシン、ミトキサントロン、又はそれらの組み合わせ）、タキサン（例えば、ＴＡＸＯＬ（商標）（パクリタキセル））、及びそれらの組み合わせ（例えば、カルシニューリン阻害剤、細胞周期阻害剤、及びコルチコステロイドの組み合わせ）が挙げられる。

特定の実施形態では、本明細書に記載の組成物（例えば、ｒＡＡＶ、医薬組成物、及び／又は増強剤）のいずれか１つを、１つ以上のコルチコステロイド（例えば、吸入コルチコステロイド（例えば、ベクロメタゾン（ＱＶＡＲ（商標））、ブデソニド（ＰＵＬＭＩＣＯＲＴ（商標））、ブデソニド／フォルモテロール（ＳＹＭＢＩＣＯＲＴ（商標））、シクレソニド（ＡＬＶＥＳＣＯ（商標））、フルチカゾン（ＦＬＯＶＥＮＴ ＨＦＡ（商標））、プロピオン酸フルチカゾン（ＦＬＯＶＥＮＴ ＤＩＳＫＵＳ（商標））、フロ酸フルチカゾン（ＡＲＮＵＴＹ ＥＬＬＩＰＴＡ（商標））、プロピオン酸フルチカゾン／サルメテロール（ＡＤＶＡＩＲ（商標））、フロ酸フルチカゾン／ウメクリジニウム／ビランテロール（ＴＲＥＬＥＧＹ ＥＬＬＩＰＴＡ（商標））、フロ酸モメタゾン（ＡＳＭＡＮＥＸ（商標））、又はモメタゾン／ホルモテロール（ＤＵＬＥＲＡ（商標））、プレジソン、又はメチルプレドニソン）と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、コルチコステロイドは吸入コルチコステロイドである。

免疫抑制剤（例えば、本明細書に記載の任意の免疫抑制剤）は、吸入によって投与されるか、又は全身的に（例えば、静脈内又は皮下に）投与され得る。
本明細書に記載の組成物（例えば、ｒＡＡＶ又は医薬組成物）は、哺乳類に単独で、又は薬学的に許容される担体と組み合わせて投与することができる。上記のように、有効成分と担体の相対的な比率は、化合物の溶解性及び化学的性質、選択された投与経路、及び標準的な製薬慣行によって決定される。

本組成物の用量は、投与形態、選択された特定の化合物、及び治療中の特定の患者の生理学的特性によって変化する。毒性などの望ましくない影響のリスクを低減するために、ウイルスの最低有効濃度を利用することが望ましい。

実施例
本発明は、以下の実施例を参照することにより、より完全に理解されるであろう。しかしながら、それらは、本発明の範囲を制限するものとして解釈されるべきではない。本明細書に記載の実施例及び実施形態は、例示のみを目的としており、それらに照らして様々な修正又は変更が当業者に示唆され、本願及び添付の特許請求の範囲の趣旨及び範囲に含まれることが理解される。

実施例１：ＡＶ．ＴＬ６５－ＳＰ１８３－ＣＦＴＲΔＲの開発及び極性化したヒトＣＦ気道上皮におけるＣＦＴＲ媒介塩化物輸送の機能的補完
ｒＡＡＶベクターのパッケージング能力は限られており、嚢胞性線維症（ＣＦ）の遺伝子治療のためのこのウイルスの開発が妨げられている。例えば、合計サイズが４．９ｋｂを超えるウイルスゲノムでは、ゲノムの末端に小さな欠失が生じる。導入遺伝子カセットがＩＴＲに直接結合されているＣＦＴＲベクターの場合、これはＣＦＴＲ機能の低下につながる可能性がある。

この研究では、ＡＶ．ＴＬ６５－ＳＰ１８３－ｈＣＦＴＲΔＲと呼ばれるｒＡＡＶベクターの開発について説明する。このベクターは、ＣＦ肺遺伝子治療の取り組みを妨げてきた多くの障害を克服することが期待される要素の組み合わせである、ヒトの気道に対して非常に影響を持つ進化したキメラＡＡＶカプシドタンパク質ＡＶ．ＴＬ６５；短いが非常に活性な１８３塩基対の合成エンハンサー及びプロモーター（Ｆ５エンハンサー及びｔｇ８３プロモーターを含むＳＰ１８３）、及び高機能ＣＦＴＲミニ遺伝子（ヒトＣＦＴＲΔＲ（ｈＣＦＴＲΔＲと呼ばれる））を利用している。本明細書に記載の実施例は、配列番号１５の配列を含む５’ＡＡＶ ＩＴＲ、配列番号１４の配列を含むＦ５エンハンサー（配列番号１のような５’ＥｃｏＲＩ部位及び３’ＸｈｏＩ部位を含み得る）、配列番号２の配列を含むｔｇ８３プロモーター、配列番号３の配列を含む５’ＵＴＲ、配列番号４の配列を含むｈＣＦＴＲΔＲミニ遺伝子、配列番号５の配列を含む３’ＵＴＲ、配列番号６の配列を含むｓ－ｐＡ、及び配列番号１６の配列を含む３’ＡＡＶ ＩＴＲを含むポリヌクレオチドを含むｒＡＡＶベクターを使用した。例えば、パッケージングされたポリヌクレオチドは、配列番号１７の配列を含み得る。ＡＶ．ＴＬ６５－ＳＰ１８３－ｈＣＦＴＲΔＲは、単独で使用することも、ｒＡＡＶ形質導入の１つ以上の増強剤（例えば、小分子増強剤）と組み合わせて使用することもできる。興味深いことに、ここで説明するように、ＡＶ．ＴＬ６５はフェレットの気道にも感染することができ、フェレットＣＦモデルの使用を可能にすることを確認した。ＣＦＴＲΔＲミニ遺伝子のフェレット版（ｆＣＦＴＲΔＲ）もこのようなモデルで使用できる。

驚くべきことに、ＡＶ．ＴＬ６５－ＳＰ１８３－ｈＣＦＴＲΔＲは、ＣＦＴＲ媒介塩化物輸送を評価するＣＦ気液界面（ＡＬＩ）培養での直接比較において、ＡＶ．１－ＳＰ１８３－ｈＣＦＴＲΔＲを上回った（図１Ａ～１Ｃ）。これらの実験では、ｒＡＡＶ２ウイルスゲノムＡＶ．ＴＬ６５－ＳＰ１８３－ｈＣＦＴＲΔＲを３つのカプシド血清型（ＡＶ．ＴＬ６５、ＡＶ．１、及びＡＶ．２）にパッケージングし、極性化したヒトＣＦ ＡＬＩ培養物を頂端で（ＡＶ．ＴＬ６５及びＡＶ．１）又は基底外側表面で（ＡＶ．２）感染させるために使用した。基底外側表面からは効率的に感染するため、ＡＡＶ２による基底外側での感染を陽性対照として使用した。２．５μＭドキソルブシン及び２０μＭ ＬＬｎＬをウイルス接種物に添加し、ＡＬＩ培養物を１６時間感染させた。次にウイルスを除去し、プロテアソーム阻害剤の非存在下で培養物に再び栄養補給をした。ＡＶ．ＴＬ６５を開発する前は、ｒＡＡＶ血清型１（ＡＶ．１）が、ヒトＡＬＩ培養物及びチンパンジーの肺で試験された最高性能のベクターであった。ＡＶ．ＴＬ６５－ＳＰ１８３－ｈＣＦＴＲΔＲはＡＶ．１－ＳＰ１８３－ｈＣＦＴＲΔＲを約２倍上回った（図１Ｂ及び１Ｃ）。したがって、これらのデータは、極性化したヒトＣＦ気道上皮におけるＣＦＴＲ媒介塩化物輸送の機能的補完を示している。

実施例２：ＡＶ．ＴＬ６５－ＳＰ１８３－ｈＣＦＴＲΔＲのｉｎ ｖｉｖｏ発現
この研究では、新生仔及び成熟したフェレット気道におけるｈＣＦＴＲ発現についての臨床候補ベクターＡＶ．ＴＬ６５－ＳＰ１８３－ｈＣＦＴＲΔＲの試験について説明する。これらの分析のエンドポイントは、導入遺伝子由来のヒトＣＦＴＲ（ｈＣＦＴＲ）の、内因性フェレットＣＦＴＲ（ｆＣＦＴＲ）ｍＲＮＡに対する比であった。３日齢の新生仔フェレットを、１００μｌ体積の５００μＭドキソルビシン中６×１０^１１ＤＲＰのＡＶ．ＴＬ６５－ＳＰ１８３－ｈＣＦＴＲΔＲで感染させた。非感染動物には、ドキソルビシンを含む同量のビヒクルを与えた。感染後１０日目に、肺と気管全体を採取し、液体窒素で急速凍結した。組織を粉砕し、ヒト及びフェレットＣＦＴＲのＱ－ＰＣＲ用にｍＲＮＡ及びｃＤＮＡを生成した。図２Ａ～２Ｄに示されるように、ＡＶ．ＴＬ６５－ＳＰ１８３－ＣＦＴＲΔＲでは、肺への遺伝子送達後、内因性（フェレット）ＣＦＴＲと比較してヒトＣＦＴＲの発現が２４０％増加した。予想外にも、処理されたフェレットは、対照と比較して肺（気管ではない）の内因性ＣＦＴＲの約９０倍の増加も示した。これは、ＡＶ．ＴＬ６５－ＳＰ１８３－ＣＦＴＲΔＲの受容体結合及び／又は感染過程が内因性ＣＦＴＲ発現を誘導する可能性があることを意味する。理論に縛られることは望まないが、これは部分機能ＣＦＴＲ変異体又はＣＦＴＲモジュレーターを服用している患者に追加の治療効果を提供する可能性がある。

新生仔フェレットは、粘膜下腺のない、繊毛細胞がほとんど含まれていない未熟な気道の状態で生まれる。生後３週間の終わりまでに、毛様体形成及び粘膜下腺の形成は、フェレットの軟骨気道全体で完了する。フェレット気道上皮の表現型と気道内の分泌物がこの成熟期に変化することを考慮して、ＡＶ．ＴＬ６５が成熟したフェレット気道を形質導入するかどうかを評価した。この目的のために、我々は、ＡＶ．ＴＬ６５が生後１ヶ月のフェレットの肺を形質導入する能力を評価した。生後１ヶ月のフェレット（Ｎ＝３）の肺に、２５０μＭドキソルビシンの存在下で５００μｌ体積のＰＢＳにＳＰ１８３－ｈＣＦＴＲΔＲｃＤＮＡを含む７．５×１０^１２ＤＲＰのＡＶ．ＴＬ６５を形質導入した。模擬感染の対照動物（Ｎ＝１）には、２５０μＭドキソルビシンの存在下でベクターなしの５００μｌのＰＢＳを投与した。ベクターを、気管挿管によりＰｅｎｎＣｅｎｔｕｒｙマイクロスプレーで肺に送達した。同じ動物での経鼻送達も、液体の注入により、２５０μＭドキソルビシンと１．５×１０^１２ＤＲＰを含む１００μｌを使用して行った。模擬感染の経鼻送達には、２５０μＭドキソルビシンを含むＰＢＳを与えた。感染後１２日目に、気管、カリーナ、及び周囲の外膜を伴う鼻甲介と共に、肺葉を別々に採取した。組織を急速凍結し、粉砕したサンプルをｍＲＮＡとＤＮＡ用に別々に処理した。生後１ヶ月の成熟したフェレット（図３Ａ～３Ｄ）では、ＡＶ．ＴＬ６５－ＳＰ１８３－ｈＣＦＴＲΔＲは、肺への遺伝子送達後、内因性（フェレット）ＣＦＴＲと比較して３倍高いヒトＣＦＴＲの発現をもたらした。ＡＶ．ＴＬ６５は、分化したヒト気道上皮の頂端表面を効果的に形質導入するために開発されたが、これらの発見は、ＡＶ．ＴＬ６５の有効性を決定する受容体と補助受容体がフェレットで保存されていることを示唆している。注目すべきことに、これらの実験では、ＡＶ．ＴＬ６５感染後の３日齢のフェレットで観察された内因性フェレットＣＦＴＲ転写物の誘導（図２Ｂ）は、成熟したフェレットの肺では観察されなかった（図３Ｂ）。これは、この生態が新生仔の気道に特有である可能性があることを示唆している。新生仔及び成熟したフェレットからのこれらの発見は、ＣＦの遺伝子治療への本願のアプローチがｉｎ ｖｉｖｏに信頼性をもって移行できることを示している。

実施例３：大きい安全マージンは、遺伝子治療を増強するための吸入ドキソルビシンの臨床的実現可能性を示している
吸入プロテアソーム阻害剤の臨床的実現可能性がドキソルビシンで実証された。ドキソルビシンは、吸入エアロゾル製剤として投与された肺がん又は転移の患者を対象とした２つの臨床試験で試験された。これらの研究における最大耐量は、３週間に１回、６．０ｍｇ／ｍ^２及び７．５ｍｇ／ｍ^２を最大８サイクルであった。成熟したフェレットの肺で有効性を達成したドキソルビシンの用量（図３Ａ～３Ｄ）は、１００μｌの２５０μＭドキソルビシンであった。これは、フェレットの体表面積を０．０４３ｍ^２と仮定すると０．３４ｍｇ／ｍ^２に相当する。したがって、ＦＤＡによるｍｇ／ｍ^２アロメトリースケーリングを使用すると、有効なフェレットの投与量と最大許容ヒト投与量の間には１８～２２倍の安全マージンがあると予想される。ドキソルビシンによるこの大きい安全マージンは、ｒＡＡＶによる形質導入効率を改善するために吸入増強剤を利用するという概念をサポートしている。

実施例４：ＡＶ．ＴＬ６５－ＳＰ１８３－ｆＣＦＴＲΔＲに感染した幼若及び成体のＣＦフェレットにおける鼻電位差（ＰＤ）測定及び細菌クリアランスによるＣＦＴＲ機能的補完
この例では、ＡＶ．ＴＬ６５－ＳＰ１８３－ｆＣＦＴＲΔＲ感染後の鼻ＰＤ測定値の機能的補完と細菌クリアランスの向上を実証するためのＣＦフェレットでのモデル臨床試験について説明する。これらの研究では、フェレットＣＦＴＲに対する免疫応答が防止される腸矯正ＣＦＴＲ－ＫＯフェレットモデルを利用している。ＣＦ動物の鼻上皮へのＡＶ．ＴＬ６５－ＳＰ１８３－ｆＣＦＴＲΔＲの送達は、ＶｔのＣＦＴＲ依存性変化をもたらすと予想される。

実験計画及び方法
ＣＦフェレットの鼻上皮への遺伝子治療。ＡＶ．ＴＬ６５－ＳＰ１８３－ｆＣＦＴＲΔＲは、生後５か月の成体ＣＦフェレットの鼻上皮に１×１０^１２ＤＲＰ／ｋｇの用量で単独又は増強剤と共に送達される。ベースライン値を決定するために、年齢が一致する非ＣＦ対照もベクター及び／又は増強剤の非存在下で評価される。鼻経上皮電圧（Ｖｔ）の測定は、ベースライン時、及び感染後１０、２０、３０日目に、前述のプロトコルを使用して行われる。経上皮電圧測定は、ベースライン測定後に上皮灌流液に順次追加される以下の薬剤／溶液の順次追加を使用して評価される：アミロライド（１００μＭ）、Ｃｌ非含有溶液、イソプロテレノール（１０μＭ）、ＡＴＰ（１００μＭ）、及びＧｌｙＨ－１０１（１００μＭ）。イソプロテレノールの存在下での経上皮電圧の変化は、ＣＦＴＲを介したＣｌ透過性を反映しており、ＧｌｙＨ－１０１の添加は、ＣＦＴＲに起因する場合、この電圧の変化をブロックするはずである。一例では、８個体のＣＦ動物（４個体の雄と４個体の雌）及び８個体の非ＣＦ対照（４個体の雄と４個体の雌）が評価される。

ＣＦフェレットの肺への遺伝子治療。ＡＶ．ＴＬ６５－ＳＰ１８３－ｆＣＦＴＲΔＲは、生後１か月のＣＦフェレットの肺上皮に、Ｐｅｎｎ－Ｃｅｎｔｕｒｙマイクロスプレーを使用して１×１０^１３ＤＲＰ／ｋｇの用量で単独又は増強剤と共に送達される（図３Ａ～３Ｄで説明した実験と同様）。対照ＣＦ及び非ＣＦフェレットには対照（例えば、ビヒクル又は増強剤のみ）を投与する。遺伝子導入時に、ＣＦ動物及び非ＣＦ動物の両方が、肺の細菌コロニー形成を防ぐために飼育中に使用されていた抗生物質から除去される。感染後又は増強剤のみの対照送達後１２日目に、ＣＦ細菌クリアランスの欠陥を実証する新生仔ＣＦ及び非ＣＦフェレットで以前に説明された手順と同様の手順を使用して、Ｐｅｎｎ－Ｃｅｎｔｕｒｙマイクロスプレーを用い、動物をアンピシリン耐性緑膿菌（ＰＡ０１）（１×１０^６ＣＦＵ／１００グラム体重）及びエリスロマイシン耐性スタフィロコッカス・シュードインターメディウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｐｓｅｕｄｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ）（１×１０^６ＣＦＵ／１００グラム体重）の等量混合物で攻撃する。一例では、１６個体のＣＦ動物がベクター投与あり及びなし（各条件で４個体の雄と４個体の雌）及び８個体の非ＣＦ対照（４個体の雄と４個体の雌）で評価される。細菌での攻撃の２４時間後に、以下のエンドポイントの定量化のために全肺ホモジネートが生成される：１）血液寒天培地上の総細菌ＣＦＵ、２）血液寒天培地上のアンピシリン耐性細菌ＣＦＵ、３）血液寒天培地上のエリスロマイシン耐性細菌ＣＦＵ、４）導入遺伝子及び内因性ＣＦＴＲｍＲＮＡ、及び５）ベクター由来のゲノム。

実施例５：極性化したヒトＣＦ気道上皮におけるＣＦＴＲ機能的補完
この例では、ＡＶ．ＴＬ６５－ＳＰ１８３－ｆＣＦＴＲΔＲを用いた機能的ＣＦＴＲのレスキューを評価するために短絡電流を測定した。このアッセイは、Ｕｓｓｉｎｇチャンバー内のヒト気管支上皮（ＨＢＥ）の頂端膜におけるｃＡＭＰ依存性塩素チャネル活性を評価する。アミロライドは、上皮のＮａ^＋チャネル活性を遮断するために使用され、その後の操作中の短絡電流（ΔＩＳＣ）の変化が、Ｃｌ^－輸送に対する効果に続いて生じるようにした。陰イオン輸送阻害剤４，４’－ジイソチオシアノ－２，２’－スチルベンジスルホン酸（ＤＩＤＳ）は、低Ｃｌ^－濃度（約５ｍＭ）を含む緩衝液中で適用すると、Ｃｌ^－／ＨＣＯ_３ ^－交換体の推定陰イオン輸送体（ｐｕｔａｔｉｖｅ ａｎｉｏｎ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ）－１の遮断において、約１２０ｍＭ Ｃｌ^－濃度の生理学的リンガー溶液よりも効果的である。ｃＡＭＰアゴニストであるフォルスコリン及びＩＢＭＸは、サイクリックアデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）依存性メカニズムを介してＣＦＴＲを活性化する。ＧｌｙＨ１０１はＣＦＴＲの特異的阻害剤であり、ＣＦＴＲの相対的な寄与（他の陰イオン輸送経路に対する）をＵｓｓｉｎｇチャンバーシステムで決定することを可能にした。この研究では、ＣＦ ＨＢＥ（ｄＦ５０８／ｄＦ５０８）（Ｎ＝６）細胞を非ＣＦ ＨＢＥ細胞（Ｎ＝６）と比較した。細胞をＵＳＧ培地で増殖させ、アッセイは、ＡＡＶ及びＰＩ処理（ＡＡＶ、１０Ｋ ＭＯＩ）の７日後に行った。この実験では、フェレットＣＦＴＲΔＲミニ遺伝子を使用したが、他の例では、ヒトＣＦＴＲΔＲを使用できる。

図４に代表的なＣＦトレースを示す。ＡＶ．ＴＬ６５＋ドキソルビシン又はＡＶ．ＴＬ６５＋イダルビシンのいずれかで処理されたＣＦ ＨＢＥでのフォルスコリン刺激によるＣＦＴＲ媒介塩化物輸送（Ｉｓｃ）は、非ＣＦ ＨＢＥでのフォルスコリン刺激によるＣＦＴＲ媒介塩化物輸送の５０％を超えた（図５）。ＡＡＶ、ＰＩ、又はその両方の添加の前後の経上皮抵抗（ＴＥＥＲ）測定値に変化は見られず、影響はなかった（あるとすれば、ＴＥＥＲがわずかに増加した）。したがって、ＡＶ．ＴＬ６５＋ドキソルビシン又はＡＶ．ＴＬ６５＋イダルビシン処理に応答したＨＢＥに対する有意な毒性や細胞死がないことが示された。

実施例６：ＡＶ．ＴＬ６５－ＳＰ１８３－ｈＣＦＴＲΔＲは、標準治療と比較してＣＦＴＲ活性を大幅に増加させることができる
ＡＶ．ＴＬ６５－ＳＰ１８３－ｈＣＦＴＲΔＲによるＣＦＴＲ活性の補完を、現在の標準治療であるＶＸ－８０９（ＬＵＭＡＣＡＦＴＯＲ）及びＶＸ－７７０（ＩＶＡＣＡＦＴＯＲ）－ＯＲＫＡＭＢＩ（商標）の組み合わせと比較した。ＡＶ．ＴＬ６５－ＳＰ１８３－ｈＣＦＴＲΔＲ＋Ｄｏｘ又はＩｄａの効果を、２つの別々のＣＦ ＨＢＥ Ｐ３細胞株：ｄＦ５０８／ｄＦ５０８及びｄＦ５０８／Ｒ５５３Ｘで、ＶＸ－７７０／ＶＸ－８０９（「ＶＸ」）と比較した。細胞をプロテアソーム阻害剤（ＰＩ）又はビヒクル及びＡＶ．ＴＬ６５（ＭＯＩ＝１０Ｋ、２５Ｋ、８０Ｋ）で処理した。細胞をＢｒｏｎｃｈｉａＬｉｆｅ／Ｖｅｒｔｅｘ気液界面（ＡＬＩ）培地で増殖させ、ＡＡＶ及びＰＩ処理の７日後にアッセイした。２４ウェルプレートアッセイ用の経上皮細胞電流クランプ増幅器（ＴＥＣＣ－２４）を実施した。フォルスコリン／ＶＸによるＣＦＴＲ活性化は、Ｃｌコンダクタンスの増加を引き起こし、膜の脱分極をもたらした。ＤＭＳＯを追加しても、わずかな偏差しか生じなかった。

図６は、２４穴トランスウェルフィルタープレートの個々のウェルからの代表的なＩ_ｅｑトレース（３７℃）を示す。ＡＶ．ＴＬ６５－ＳＰ１８３－ｈＣＦＴＲΔＲ処理細胞におけるＣＦＴＲ活性のＭＯＩ依存性の増加がＰＩの存在下で観察された。ＰＩなしのＡＶ．ＴＬ６５－ＳＰ１８３－ｈＣＦＴＲΔＲで処理された細胞ではＣＦＴＲ活性の変化は観察されなかった。ＶＸ－８０９／ＶＸ－７７０はＣＦＴＲ活性を有意に増加させた。

図７は、各条件、ｎ＝４でフォルスコリン刺激後の平均ＣＦＴＲ媒介塩化物分泌を示す曲線下面積（ＡＵＣ）グラフを示す。ＡＡＶ又はＰＩ、あるいはそれらの両方の添加前後の経上皮抵抗測定値は変化を示さず、影響を受けなかった。

これらのデータは、ＣＦＴＲ活性が、現在の標準治療、例えばＶＸ－７７０／ＶＸ－８０９併用治療と比較して、ＡＶ．ＴＬ６５－ＳＰ１８３－ｈＣＦＴＲΔＲによって有意に増加することを示している。

配列一覧

実施例７：フェレットの肺にＡＶ．ＴＬ６５を繰り返し投与すると、年齢依存的に形質導入を減少させる抗体反応が誘発される
遺伝子治療を使用して嚢胞性線維症（ＣＦ）肺疾患を治療するには、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）の反復投与が必要な場合がある。しかし、肺のｒＡＡＶを介した免疫応答についてはほとんど知られていない。ここでは、フェレットが、ＡＶ．ＴＬ６５の肺へのＣＦＴＲ送達及び中和抗体（ＮＡｂ）応答の特性評価の前臨床試験のための適した種であることを実証した。ＡＶ．ＴＬ６５－ｈＣＦＴＲΔＲは、ヒトとフェレットの両方の気道上皮培養物を効率的に形質導入し、ＣＦ気道培養物のＣＦＴＲ Ｃｌ^－電流を補完した。ＡＶ．ＴＬ６５－ｈＣＦＴＲΔＲを新生仔及び若年フェレットの肺に送達すると、内因性ｆＣＦＴＲよりも２００～３００％高いレベルでｈＣＦＴＲｍＲＮＡが生成された。ＡＶ．ＴＬ６５の単回投与（ＡＶ．ＴＬ６５－ｇＬｕｃ）又は反復投与（ＡＶ．ＴＬ６５－ｆＣＦＴＲΔＲに続いてＡＶ．ＴＬ６５－ｇＬｕｃ）を、新生仔及び幼若フェレットで行った。反復投与は、幼若フェレットで導入遺伝子発現を有意に減少させ（１１分の１）、気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）ＮＡｂを増加させたが、どちらの年齢層でもほぼ同等の血漿ＮＡｂ応答があったにもかかわらず、新生仔フェレットではそうならなかった。特に、両方の年齢層は、反復投与後のＢＡＬＦ抗カプシド結合ＩｇＧ、ＩｇＭ、及びＩｇＡ抗体の減少を示した。幼若フェレットに特有なのは、２回目のベクター投与後の血漿抗カプシド結合ＩｇＭの抑制であった。したがって、年齢依存性の免疫系の成熟とアイソタイプスイッチングは、ＡＶ．ＴＬ６５の反復投与後の高親和性肺ＮＡｂの発生に影響を与える可能性があり、肺のＡＡＶ中和反応を鈍らせる経路を提供する可能性がある。

上記の結果は、以下のように詳細に実行された。
結果
フェレットは、肺へのＡＶ．ＴＬ６５遺伝子治療の評価に適した前臨床種である。

ＡＶ．ＴＬ６５カプシドバリアントが気道のＣＦＴＲ機能を補完できるか否かを評価するために、ＡＶ．ＴＬ６５－ＳＰ１８３－ｈＣＦＴＲΔＲウイルスが頂端感染後のヒトＣＦ ＡＬＩ培養物でＣＦＴＲ媒介Ｃｌ^－電流を修正する能力を試験した。ｒＡＡＶ１は、ヒトＡＬＩ培養物の頂端形質導入に最も優れた血清型の１つであることが以前に示されたため、同じＡＶ２－Ｆ５ｔｇ８３－ｈＣＦＴＲΔＲウイルスゲノムをＡＡＶ１カプシドに疑似パッケージングし、ＡＶ．ＴＬ６５との比較分析を行った。この比較は、ＡＶ．ＴＬ６５－ＳＰ１８３－ｈＣＦＴＲΔＲウイルスによる頂端感染が、同じゲノムを含むｒＡＡＶ１ウイルス（ＡＶ１．ＳＰ１８３－ｈＣＦＴＲΔＲ）に感染した後のものよりも高いレベルのＣＦＴＲ媒介Ｃｌ^－電流（図８Ａ）及びＣＦＴＲｍＲＮＡ（図８Ｂ）を生じさせることを示した。

ＡＶ．ＴＬ６５がフェレット気道上皮を形質導入することもできるか否かを評価するために、分泌型ガウシアルシフェラーゼ（ｇＬｕｃ）レポーターベクターＡＶ．ＴＬ６５－ＳＰ１８３ｇＬｕｃを使用して、ヒト及びフェレット由来の高分化気管気管支ＡＬＩ培養物で最初にｉｎ ｖｉｔｒｏ形質導入アッセイを実施した。（図８Ｃ）。ＡＶ．ＴＬ６５－ＳＰ１８３ｇＬｕｃによるこれらの培養物の頂端感染は、２つの種の間でｇＬｕｃ導入遺伝子発現のレベルに有意差を示さなかった。ｉｎ ｖｉｖｏでのフェレット肺に対するＡＶ．ＴＬ６５の向性を確認するために、気管内送達後の新生仔及び若年フェレットにおけるＡＶ．ＴＬ６５－ＳＰ１８３－ｈＣＦＴＲΔＲの形質導入効率を評価した。これらの研究では、導入遺伝子由来のｈＣＦＴＲΔＲｍＲＮＡの発現は、形質導入の効率の指標（すなわち、ｈＣＦＴＲΔＲ／ｆＣＦＴＲｍＲＮＡコピーの比率）として内因性ｆＣＦＴＲｍＲＮＡを参照した。この測定基準を使用すると、肺でのｈＣＦＴＲΔＲｍＲＮＡの発現は、新生仔及び幼若フェレットの両方で内因性のｆＣＦＴＲｍＲＮＡよりも２～３倍大きかった（図８Ｄ）。対照的に、ｈＣＦＴＲΔＲｍＲＮＡの気管発現は、新生仔では内因性ｆＣＦＴＲｍＲＮＡよりも低く、幼若動物ではほぼ同等であった。ＡＶ．ＴＬ６５による気管の形質導入が新生仔で低く、幼若動物で非常に変動するのは、気管の中央にウイルスを注入するために手術を使用した送達方法が原因である可能性がある。全体として、これらのｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏ研究は、フェレットがＡＶ．ＴＬ６５感染に対する肺の免疫学的反応の研究に適した種であることを示している。

新生仔ではなく幼若フェレットの肺へのＡＶ．ＴＬ６５の以前の曝露は、２回目の投与により形質導入を損なわせる
２つのｒＡＡＶベクター（ＡＶ．ＴＬ６５－ＳＰ１８３－ｆＣＦＴＲΔＲ及びＡＶ．ＴＬ６５－ＳＰ１８３－ｇＬｕｃ）を使用して、フェレット肺へのＡＶ．ＴＬ６５の反復投与の実現可能性を評価した。ＡＶ．ＴＬ６５－ＳＰ１８３－ｆＣＦＴＲΔＲを、最初のウイルス感染用に選択した。これは、このベクターが導入遺伝子（つまり、フェレットＣＦＴＲすなわちｆＣＦＴＲ）に対する免疫応答を開始するべきではないためである。２回目のウイルス感染については、導入遺伝子発現の時間的及び定量的分析を可能にするしっかりしたレポーターが必要であったため、分泌型ｇＬｕｃレポーターベクターＡＶ．ＴＬ６５－ＳＰ１８３－ｇＬｕｃを選択した。単回投与群のフェレットはＡＶ．ＴＬ６５－ＳＰ１８３－ｇＬｕｃベクターのみで感染させ、反復投与群のフェレットは最初にＡＶ．ＴＬ６５－ＳＰ１８３－ｆＣＦＴＲΔＲで、次にＡＶ．ＴＬ６５－ＳＰ１８３－ｇＬｕｃで感染させた。最初に、若い動物での反復投与を評価した（図９）。新生仔フェレットでこれらの研究を開始し、１週齢の反復投与群をＡＶ．ＴＬ６５－ＳＰ１８３－ｆＣＦＴＲΔＲで感染させ、３週間後に反復投与群と単回投与（ナイーブ）群の両方をＡＶ．ＴＬ６５－ＳＰ１８３－ｇＬｕｃウイルスで感染させた（図９Ａ）。ルシフェラーゼ活性を、ＡＶ．ＴＬ６５－ＳＰ１８３－ｇＬｕｃによる感染後１４日間の血液サンプルと、実験終了時のＢＡＬＦでモニタリングした。この研究からの発見は、血漿中のｇＬｕｃ活性が感染後５日までにピークに達し、両方の投与群で１４日まで安定したままであることを示した（図９Ｂ）。また、２つの投与群間で血漿ｇＬｕｃ活性のレベルに有意差はなかった。同様に、感染後１４日でのＢＡＬＦのｇＬｕｃ活性も、２つの投与群間で有意差はなかった（図９Ｃ）。血漿及びＢＡＬＦの両方で、ｇＬｕｃ活性は、ナイーブ（非感染）対照のバックグラウンドレベルをはるかに上回っていた（図９Ｂ及び９Ｃ）。

新生仔フェレットでのこの研究は、肺への形質導入を大幅に低下させることなく、ＡＶ．ＴＬ６５を再投与することが可能であることを示した。しかし、新生仔フェレットの未発達の免疫系が、ＡＡＶカプシドに対して寛容な免疫状態を生み出している可能性は残っていた。これらの理由から、我々は、おおよそ１～２歳の幼児に匹敵する生後１か月の反復投与群について、ＡＶ．ＴＬ６５－ＳＰ１８３－ｆＣＦＴＲΔＲでの最初の感染を開始し、続いて４週間後に単回投与群と反復投与群の両方にｇＬｕｃレポーターベクター（ＡＶ．ＴＬ６５－ＳＰ１８３－ｇＬｕｃ）を送達することにより、幼若フェレットで実験を繰り返した（図１０Ａ）。この第２の研究の結果は、両方の群において感染後５日で最大の血漿ｇＬｕｃ活性を示したが、反復投与群では、試験したすべての時点で血漿ｇＬｕｃ活性が低かった（１５～３４分の１）。単回投与及び反復投与の新生仔群における安定した血漿ｇＬｕｃ発現とは対照的に（図９Ｂ）、両方の幼若群で血漿ｇＬｕｃ活性の漸減が見られ、反復投与動物でより急な傾向を示した（図１０Ｂ）。同様に、ＢＡＬＦｇＬｕｃ活性も、反復投与の幼若群で有意に低かった（１１分の１）（図１０Ｃ）。累積的に、これらの研究は、新生仔フェレットではなく、幼若フェレットにおけるＡＡＶカプシドに対するＮＡｂ応答の可能性を示唆した。

ＡＶ．ＴＬ６５の反復投与は、ＢＡＬＦ及び血漿でより高いＮＡｂ応答を誘発する
以前にこのウイルスに曝露された幼若フェレットの肺におけるＡＶ．ＴＬ６５形質導入の効率の低下を考慮して、我々は、試験動物のＢＡＬＦ及び血漿中のＮＡｂを評価することを試みた。抗ＡＶ．ＴＬ６５ＮＡｂの力価を、ヒト気道細胞株であるＡ５９４細胞におけるＡＶ．ＴＬ６５－ＳＰ１８３－ｆＬｕｃ形質導入の阻害のＩＣ_５０として決定した。単回投与及び反復投与の新生仔フェレットにおける同様のレベルの導入遺伝子発現と一致して、ＢＡＬＦのＮＡｂ力価は２つの投与条件間で有意差はなかった（図１１Ａ）。対照的に、幼若フェレットのＢＡＬＦのＮＡｂ力価は、単回投与群と比較して、反復投与で有意に高かった（図１１Ｂ）。さらに、単回投与群と反復投与群の両方のより高齢の動物を用いた実験におけるＮＡｂの絶対力価は、新生仔試験群よりも高く（３～５倍）、より高齢のフェレットでより完全に発達した免疫応答を示唆している。

血漿サンプルに関する同様の分析は、対照のナイーブ群（図１１Ｃ及び１１Ｄ）及びＡＶ．ＴＬ６５感染前の試験群に既存のＮＡｂがないことを示した。両方の年齢群で、単回投与及び反復投与の動物は、感染後の血漿ＮＡｂ力価の漸進的な時間依存性の増加を示し、反復投与の幼若フェレットは、新生仔フェレットよりもわずかに高い血漿ＮＡｂ力価（２～２．８倍）を生成した。幼若フェレットはまた、新生仔フェレットの１０日と比較して、感染後５日で現れるように、単回投与感染後の血漿中でより迅速にＮＡｂを産生した。反復投与群の血漿ＮＡｂのレベルも、幼若フェレットの感染後１４日の時点を除いて、両方の年齢で単回投与群のレベルよりも有意に高かった。

抗ＡＶ．ＴＬ６５カプシド抗体アイソタイプを定量化するためのＥＬＩＳＡベースのアッセイの開発
ＡＡＶ２／ＡＡＶ５カプシドシャッフリングライブラリから進化した、ＡＶ．ＴＬ６５のＶＰ２及び最も豊富なＶＰ３カプシドタンパク質は、ＶＰ１に単一のＡ５８１Ｔ変異を持つＡＡＶ５に由来する。ＡＶ．ＴＬ６５のＶＰ１は、ＡＡＶ２ ＶＰ１の１～１３１ａａからのＮ末端固有配列（ＶＰ１ｕ）とそれに続くＡ５８１Ｔ変異を含むＡＡＶ５カプシドの１２８～７２４ａａとを有するＡＡＶ２及びＡＡＶ５カプシドのハイブリッドである。ＡＡＶのＶＰ１ｕには、エンドソームからのビリオンの脱出に重要であると考えられているホスホリパーゼＡ２（ＰＬＡ２）触媒ドメインが含まれている。ＡＶ．ＴＬ６５に感染したフェレットの血漿及びＢＡＬＦ中のＡＶ．ＴＬ６５カプシド特異的免疫グロブリン（ＩｇＧ、ＩｇＭ、及びＩｇＡ）を評価するために、コーティング抗原としてＡＡＶウイルス粒子を使用するＥＬＩＳＡアッセイを開発した。この方法を検証するために、ＡＶ．ＴＬ６５ウイルスが１～２か月間隔で４回肺に送達された、生後１か月のフェレットから収集した血漿を使用した。コーティング抗原としてＡＡＶ５粒子を使用すると、ナイーブ血漿とＡＶ．ＴＬ６５免疫血漿との間のＩｇＧ結合の差異が、１：５０希釈から見られ、１：１２５０希釈までにナイーブ血漿の結合は見られなくなったが、ＡＶ．ＴＬ６５免疫血漿では抗体結合は高いままであった（図１２Ａ）。対照的に、コーティング抗原としてＡＡＶ２を使用した場合、すべての希釈率で免疫血漿とナイーブ血漿の間で血漿ＩｇＧ結合に差はなく、ＩｇＧの検出感度はＡＡＶ５よりもはるかに低かった（図１２Ｂ）。これらの発見は、ＡＶ．ＴＬ６５の表面抗原エピトープがＡＡＶ５カプシドと同様の免疫原性を提示することを示唆しており、これらの理由から、我々は試験動物のＢＡＬＦ及び血漿中の抗カプシド抗体アイソタイプの分類のためのコーティング抗原としてＡＡＶ５を使用することにした。

次に、このＥＬＩＳＡ法を使用して、試験動物のＢＡＬＦ及び血漿中の抗カプシド抗体アイソタイプ（ＩｇＧ、ＩｇＭ、及びＩｇＡ）を分類した（図１２及び１３）。全般的に、新生仔及び幼若フェレットは、単回投与群と反復投与群の両方の血漿で同様のＡＡＶ５反応性ＩｇＧ応答を誘発したが、力価は反復感染後により高くなった（図１３Ａ及び１３Ｄ）。対照的に、血漿ＡＡＶ５反応性ＩｇＭ（図１３Ｂ及び１３Ｅ）及びＩｇＡ（図１３Ｃ及び１３Ｆ）応答は、動物の年齢及び投薬計画に関して、ＩｇＧの応答との違いを示した。例えば、カプシド結合血漿ＩｇＭレベルは、反復投与群の幼若動物でのみ抑制された（図１３Ｂ及び１３Ｅ）のに対し、カプシド結合血漿ＩｇＡレベルは、反復投与後の両方の年齢群で抑制された。さらに、新生仔動物は、最初は２回目のウイルス曝露に続いて、最初は大きな抗カプシドＩｇＡ応答を開始し、時間と共に低下したが、幼若動物はこの応答を欠いていた（図１３Ｃ及び１３Ｆ）。これらの発見は、抗体アイソタイプスイッチングの年齢依存性の違いが、ＡＶ．ＴＬ６５への以前の曝露によって影響を受ける可能性があることを示唆している。予想に反して、ＢＡＬＦにおけるＡＡＶ５反応性ＩｇＧ、ＩｇＭ及びＩｇＡは、新生仔及び幼若動物の両方で、反復投与群と比較して、単回投与群で有意に高かった（図１４）。さらに、カプシド結合ＩｇＧ、ＩｇＭ、及びＩｇＡの絶対レベルは、ウイルスに２回曝露された幼若動物のＢＡＬＦでのＮＡｂのレベルが高いにもかかわらず、両方の年齢群と投与条件の間でほぼ同じであった（図１１Ａ及び１１Ｂ）。

材料及び方法
組換えＡＶ．ＴＬ６５ウイルスベクターの作製
ｐＡＶ．ＴＬ６５ｒｅｐｃａｐ（Ｅｘｃｏｆｆｏｎら、２００９年、上記）は、ＡＶ１－ＳＰ１８３－ｈＣＦＴＲΔＲ、及びＡＶ．ＴＬ６５－ＳＰ１８３－ｈＣＦＴＲΔＲ、ＡＶ．ＴＬ６５－ＳＰ１８３－ｆＣＦＴＲΔＲ、ＡＶ．ＴＬ６５－ＳＰ１８３－ｆＬｕｃ、ＡＶ．ＴＬ６５－ＳＰ１８３－ｇＬｕｃの産生のためのＡＶ．ＴＬ６５カプシドを生成するために使用されるＡＡＶヘルパープラスミドである。パッケージングに使用されたｒＡＡＶプロウイルスプラスミドは、ｐＡＶ２．Ｆ５ｔｇ８３－ｈＣＦＴＲΔＲ及びｐＡＶ２．Ｆ５ｔｇ８３－ｆＣＦＴＲΔＲ、ならびにｐＡＶ２－Ｆ５ｔｇ８３ｆＬｕｃ（ホタルルシフェラーゼレポーター）及びｐＡＶ２－Ｆ５ｔｇ８３ｇＬｕｃ（ガウシアルシフェラーゼレポーター）であった。ＡＶ．ＴＬ６５ベクターは、トリプルプラスミドトランスフェクション法を使用して、フィラデルフィア小児病院（ＣＨＯＰ）のベクターコアで作製された。簡単に説明すると、ＡＡＶヘルパーｐＡＶ．ＴＬ６５ｒｅｐｃａｐとアデノウイルスヘルパーｐＡｄを、ＡＡＶプロウイルスベクターの１つと一緒にＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトした。トランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞から生成されたｒＡＡＶベクターは、ＣｓＣｌ密度勾配で精製された。導入遺伝子に特異的なプライマーとプローブを使用した定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）によって力価を決定し、銀染色後のＳＤＳ－ＰＡＧＥによってベクターストックの純度を評価した。

ヒト及びフェレット気道上皮におけるＡＶ．ＴＬ６５ベクターのｉｎ ｖｉｔｒｏ評価
フェレットがＡＶ．ＴＬ６５の分析に適した種であるかどうかを評価するために、最初に、ヒトとフェレットに由来する高分化気管気管支ＡＬＩ培養物でｉｎ ｖｉｔｒｏ形質導入実験を行った。レポーターベクターＡＶ．ＴＬ６５－ＳＰ１８３ｇＬｕｃを、ヒト（２個体のドナーからのｎ＝６トランスウェル）及びフェレット（２個体のドナーからのｎ＝６トランスウェル）の気道上皮ＡＬＩ培養物の頂端に、１０，０００ＤＲＰ（ＤＮａｓｅ耐性粒子）／細胞のＭＯＩ（感染多重度）で接種した。感染期間中、培養培地に最終濃度４μＭのドキソルビシンを添加し、ガウシアルシフェラーゼとレニラルシフェラーゼの測定用に設計されたレニラルシフェラーゼ活性アッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）の製造元の指示に従って、５日間の感染後にガウシアルシフェラーゼ活性の相対発光単位（ＲＬＵ）を測定した。感染していない２つのトランスウェルを対照として設定した。

ＡＶ１－ＳＰ１８３－ｈＣＦＴＲΔＲ及びＡＶ．ＴＬ６５－ＳＰ１８３－ｈＣＦＴＲΔＲウイルスによるヒトＣＦ気道上皮の感染後のＣＦＴＲ媒介電流のｉｎ ｖｉｔｒｏ比較
ｈＣＦＴＲΔＲの発現及びＣＦＴＲ機能の補完に対するＡＶ．ＴＬ６５－ＳＰ１８３－ｈＣＦＴＲΔＲ及びＡＶ１－ＳＰ１８３－ｈＣＦＴＲΔＲの有効性を、ＣＦ患者の近位気道に由来する極性化したヒトＡＬＩ培養物（Ｆ５０８ｄｅｌ／Ｆ５０８ｄｅｌ）で評価した。各ベクターを、ＡＬＩ培養物（２個体のドナーからのｎ＝４トランスウェル）の頂端に、ドキソルビシン（２．５μＭ）及びＬＬｎＬ（２０μＭ）の存在下で、１００，０００ＤＲＰ／細胞のＭＯＩで適用した。これらの２つのプロテアソーム調節剤は、いくつかのＡＡＶ血清型により形質導入を増強することが示されている。感染後１２日目に、ＣＦＴＲ媒介Ｃｌ^－電流を前述のようにＵｓｓｉｎｇチャンバーで測定し、ｃＡＭＰ刺激（ＩＢＭＸ／フォルスコリン）及びＣＦＴＲ阻害（ＧｌｙＨ１０１）後の短絡電流（ΔＩｓｃ）の変化を測定した。非感染ＡＬＩ培養物（２個体のドナーからのｎ＝４トランスウェル）をベースライン対照として使用した。ΔＩｓｃの測定後、各ウイルス感染群からの２つのインサートをプールし、ＲＮｅａｓｙ（商標）Ｐｌｕｓ Ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎｅ）を使用して全ＲＮＡを溶解した。ｍＲＮＡをｃＤＮＡに変換した後、ベクター由来のｈＣＦＴＲΔＲｍＲＮＡをＴａｑＭａｎ（商標）ＰＣＲで定量し、ヒトＧＡＰＤＨｍＲＮＡに対して正規化した。

新生仔及び幼若フェレットの肺におけるＡＶ．ＴＬ６５形質導入の分析
３日齢の新生仔フェレット（ｎ＝３）又は１か月齢の幼若フェレット（ｎ＝３）に、ドキソルビシン（最終濃度２５０μＭ）と混合した体重１グラムあたり４×１０^１０ＤＲＰのＡＶ．ＴＬ６５－ＳＰ１８３－ｈＣＦＴＲΔＲウイルスを気管内投与した。模擬感染群（ｎ＝３）のフェレットには、ＰＢＳ中のＤｏｘ（２５０μＭ）のみを接種した。感染後１１日目に動物を安楽死させ、気管及び肺組織を別々に採取し、急速凍結し、そして全ＲＮＡ抽出のために粉砕した。導入遺伝子ｈＣＦＴＲΔＲのベクター由来ｍＲＮＡ及び内因性ｆＣＦＴＲをＴａｑＭａｎ（商標）で定量し、ｈＣＦＴＲΔＲ及びｆＣＦＴＲΔＲのコピー数をＧＡＰＤＨに対して正規化し、ｈＣＦＴＲΔＲ／ｆＣＦＴＲの比率として表した。

体液性応答研究のための、ＡＶ．ＴＬ６５－ＳＰ１８３－ｆＣＦＴＲΔＲ及び／又はＡＶ．ＴＬ６５－ＳＰ１８３－ｇＬｕｃのフェレットへの投与
以下の実験計画法を使用して、新生仔及び幼若フェレットへのＡＶ．ＴＬ６５ベクターの反復投与を評価した。新生仔フェレット：ＡＶ．ＴＬ６５－ＳＰ１８３－ｇＬｕｃレポーターベクターを、ＡＶ．ＴＬ６５カプシドにナイーブであるか、１週齢でＡＶ．ＴＬ６５－ＳＰ１８３－ｆＣＦＴＡＲに以前に感染した４週齢のフェレットに気管内投与した。幼若フェレット：ＡＶ．ＴＬ６５－ＳＰ１８３－ｇＬｕｃレポーターベクターを、ＡＶ．ＴＬ６５カプシドにナイーブであるか、４週齢でＡＶ．ＴＬ６５－ＳＰ１８３－ｆＣＦＴＲΔＲに以前に感染した８週齢のフェレットに気管内投与した。各用量について、動物は、ＡＶ．ＴＬ６５－ＳＰ１８３ｇＬｕｃ又はＡＶ．ＴＬ６５－ＳＰ１８３－ｆＣＦＴＲΔＲベクター（１×１０^１３ＤＲＰ／ｋｇ）及びドキソルビシン（２００μＭ最終濃度）を含む接種物を受けた。１週齢の新生仔フェレットに、イソフルランと酸素の混合物による麻酔下でキットに投与された１５０μｌの接種物の外科的気管内注入を行った。他の年齢では、ケタミンとキシラジンの混合物の皮下注射による麻酔下で、ＭｉｃｒｏＳｐｒａｙｅｒ（商標）エアロゾライザーを使用して気管内にウイルスを投与した。エアロゾル化のためのベクター／ドキソルビシン接種物の量は、フェレットの体重に対して正規化された（５ｍｌ／ｋｇ）。

ガウシアルシフェラーゼ活性の測定のための採血及び気管支肺胞洗浄液の収集
ＡＶ．ＴＬ６５－ＳＰ１８３－ｇＬｕｃレポートベクターの送達後０、５、１０、及び１４日目に、麻酔されたフェレットからヘパリン処理されたチューブに血漿を収集した。動物をＥＵＴＨＡＳＯＬ（商標）（Ｖｉｒｂａｃ ＡＨ Ｉｎｃ）で安楽死させ、３００グラム体重あたり５ｍｌのＰＢＳの注入により、気管／肺カセットから気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）を収集した。血漿及びＢＡＬＦ中のｇＬｕｃ活性を、サンプル収集後すぐに測定した。

血漿及びＢＡＬＦを使用した抗体中和アッセイ
マイクロ中和アッセイを、以前に報告された方法（Ｗｕ ｅｔ ａｌ．Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．８：１６４９，２０１７）を変更したものを使用して行った。血漿及びＢＡＬＦ中のＮＡｂの力価を、感染前の段階希釈血漿又はＢＡＬＦとインキュベートしたＡＶ．ＴＬ６５－ＳＰ１８３－ｆＬｕｃウイルスによるＡ５４９細胞の感染後のレポーター遺伝子発現の減少として定量化した。簡単に説明すると、フェレットからのすべての血漿サンプルを熱で不活化した（５６℃、３０分）。血漿の５倍段階希釈（１：５０から開始し、１：１５６，２５０で終了）をＡＶ．ＴＬ６５－ＳＰ１８３－ｆＬｕｃと総量１００μｌでインキュベートした。ＢＡＬＦの場合、同じ条件を適用したが、段階希釈は１：５から開始し、１：３１２５で終了した。これらの混合物を３７℃で１時間インキュベートして抗体の結合と中和を促進し、４８ウェルプレート（１×１０^５／ウェル、ＭＯＩ＝５０００ＤＲＰ／細胞）のＡ５４９細胞の単層に、各希釈率につきデュプリケートで適用した。細胞を３７℃／５％ＣＯ_２でウイルス混合物とともに１時間インキュベートした後、２％ウシ胎仔血清を含むＤＭＥＭをウェルに添加し、さらに２４時間インキュベートした。次に、細胞溶解物中のホタルルシフェラーゼ活性を、ホタルルシフェラーゼアッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）で製造元の指示に従って測定した。このアッセイを実施するたびに、ＡＶ．ＴＬ６５－ＳＰ１８３－ｆＬｕｃのみで感染させたＡ５４９細胞が１００％形質導入の参照対照として機能した。各血漿又はＢＡＬＦサンプルの中和力価を、最大阻害濃度の半分（ＩＣ５０）として計算した。

血漿及びＢＡＬＦ中のカプシド結合ＩｇＧ、ＩｇＭ、及びＩｇＡのＥＬＩＳＡ測定
ＥＬＩＳＡ手順を使用して、血漿及びＢＡＬＦ中の総カプシド結合ＩｇＧ、ＩｇＭ、及びＩｇＡを捕捉及び定量化した。簡単に説明すると、炭酸緩衝液中のｒＡＡＶ５を９６ウェルＥＬＩＳＡプレートに４℃で一晩結合させた（１×１０^９ＤＲＰ／ウェル）。試験した血漿サンプル（ＩｇＧ及びＩｇＭの場合は１：２０００、ＩｇＡの場合は１：２０に希釈）及び未希釈のＢＡＬＦサンプルを各ウェルにアプライし、室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳ－Ｔ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ（商標）－２０）で３回洗浄した後、希釈したＨＲＰ標識二次抗体を添加し、室温で１時間インキュベートした。ＨＲＰ標識二次抗体は、ニワトリ抗フェレットＩｇＧ（Ｇａｌｌｕｓ Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ又はＡｂｅａｍ）及びヤギ抗フェレットＩｇＭ又はＩｇＡ（Ｌｉｆｅ－Ｂｉｏ Ｉｎｃ）を含んでいた。次に、ＨＲＰ反応生成物をプレートリーダーでの吸光度によって定量化した。

統計分析
実験データは平均±ＳＤとして表され、Ｐｒｉｓｍ７（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．米国カリフォルニア州サンディエゴ）がデータ分析に使用された。統計的有意性は、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）とそれに続くテューキー検定（＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１）で分析された。

動物の世話における倫理声明
すべての動物実験は、アイオワ大学の施設内動物管理使用委員会によって承認されたプロトコルに従って実施された。

すべての刊行物、特許及び特許出願は、参照により本明細書に組み込まれる。上記の詳細な説明では、本発明はその特定の好ましい実施形態に関連して説明されており、例示の目的で多くの詳細が示されているが、本発明には追加の実施形態が可能であり、本明細書における特定の詳細は、本発明の基本原理から逸脱することなく大幅に変更され得ることが当業者には明らかである。

Claims (24)

1. （ｉ）ＡＶ．ＴＬ６５カプシドタンパク質又はそのバリアント；及び（ｉｉ）ＣＦＴＲΔＲミニ遺伝子又はそのバリアントに作動可能に連結されたＦ５エンハンサー又はそのバリアント及びｔｇ８３プロモーター又はそのバリアントを含むポリヌクレオチドを含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）。
2. ＡＶ．ＴＬ６５カプシドタンパク質は配列番号１３のアミノ酸配列を含むか、又は前記バリアントは配列番号１３に対して少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有する、請求項１に記載のｒＡＡＶ。
3. Ｆ５エンハンサーは配列番号１のポリヌクレオチド配列を含むか、又は前記そのバリアントは配列番号１に対して少なくとも８０％の核酸配列同一性を有する、請求項１又は２に記載のｒＡＡＶ。
4. Ｆ５エンハンサーは配列番号１４のポリヌクレオチド配列を含むか、又は前記そのバリアントは配列番号１４に対して少なくとも８０％の核酸配列同一性を有する、請求項１又は２に記載のｒＡＡＶ。
5. ｔｇ８３プロモーターは配列番号２のポリヌクレオチド配列を含むか、又は前記そのバリアントは配列番号２に対して少なくとも８０％の核酸配列同一性を有する、請求項１～４のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ。
6. ＣＦＴＲΔＲミニ遺伝子はヒトＣＦＴＲΔＲミニ遺伝子である、請求項１～５のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ。
7. ヒトＣＦＴＲΔＲミニ遺伝子は、配列番号４の配列を含むポリヌクレオチドによってコードされるか、又は前記そのバリアントは配列番号４に対して少なくとも８０％の核酸配列同一性を有する、請求項６に記載のｒＡＡＶ。
8. 前記ポリヌクレオチドは、５’から３’方向に、Ｆ５エンハンサー、ｔｇ８３プロモーター、及びＣＦＴＲΔＲミニ遺伝子を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ。
9. 請求項１～８のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
10. 嚢胞性線維症を治療する方法であって、それを必要とする対象に、治療有効量の請求項１～８のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ又は請求項９に記載の医薬組成物を投与することを含む方法。
11. １つ以上の追加の治療薬を対象に投与することをさらに含む、請求項１０に記載の方法。
12. 前記１つ以上の追加の治療薬は、抗生物質、粘液希釈剤、ＣＦＴＲモジュレーター、粘液溶解薬、生理食塩水、高張食塩水、免疫抑制剤、又はそれらの組み合わせを含む、請求項１１に記載の方法。
13. 投与は、吸入、噴霧化、エアロゾル化、鼻腔内、気管内、気管支内、経口、静脈内、皮下、又は筋肉内投与によるものである、請求項１０～１２のいずれか一項に記載の方法。
14. 投与は、吸入、噴霧化、エアロゾル化、鼻腔内、気管内、及び／又は気管支内投与によるものである、請求項１３に記載の方法。
15. 配列番号７の配列又は配列番号７と少なくとも８０％の核酸配列同一性を有するそのバリアントを含む、単離されたポリヌクレオチド。
16. ３’方向に、配列番号５の配列又は配列番号５と少なくとも８０％の核酸配列同一性を有するそのバリアントを含む３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）をさらに含む、請求項１５に記載のポリヌクレオチド。
17. ３’方向に、配列番号６の配列又は配列番号６と少なくとも８０％の核酸配列同一性を有するそのバリアントを含む合成ポリアデニル化部位をさらに含む、請求項１５又は１６に記載のポリヌクレオチド。
18. 前記ポリヌクレオチドの５’末端に５’アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆方向末端反復配列及び前記ポリヌクレオチドの３’末端に３’ＡＡＶ ＩＴＲをさらに含む、請求項１５～１７のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
19. 配列番号１７の配列又は配列番号１７に対して少なくとも８０％の核酸配列同一性を有するそのバリアントを含む、請求項１８に記載のポリヌクレオチド。
20. 請求項１５～１９のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）。
21. 気道上皮細胞に対して向性を有する、請求項２０に記載のｒＡＡＶ。
22. 肺上皮細胞に対して向性を有する、請求項２１に記載のｒＡＡＶ。
23. ＡＶ．ＴＬ６５カプシドタンパク質、ＡＡＶ１カプシドタンパク質、ＡＡＶ２カプシドタンパク質、ＡＡＶ５カプシドタンパク質、ＡＡＶ６カプシドタンパク質、又はＡＡＶ９カプシドタンパク質を含む、請求項２０～２２のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ。
24. ＡＶ．ＴＬ６５カプシドタンパク質を含む、請求項２３に記載のｒＡＡＶ。

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