KR20220044899A - 낭성 섬유증의 치료를 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

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쯔잉 옌
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유니버시티 오브 아이오와 리써치 파운데이션
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Abstract

본원에는 폴리뉴클레오티드, rAAV 벡터, 제약 조성물, 및 이를 제조하는 방법 및 예를 들어, 낭성 섬유증 (CF)의 치료를 위해 이를 사용하는 방법이 제공된다. 예를 들어, 본 개시내용은 한 실시양태에서 AV.TL65 캡시드 단백질; 및 CFTRΔR 미니유전자에 작동 가능하게 연결된 F5 인핸서 및 tg83 프로모터를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 아데노 연관 바이러스 (rAAV), 그의 제약 조성물, 및 예를 들어, CF의 치료를 위한 그의 사용 방법을 제공한다.

Description

낭성 섬유증의 치료를 위한 조성물 및 방법
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2019년 4월 15일에 출원된 미국 출원 번호 62/833,972, 2019년 10월 25일에 출원된 미국 출원 번호 62/926,308, 및 2020년 1월 29일에 출원된 미국 출원 번호 62/967,214를 우선권 주장하며, 그 개시내용은 본원에 참조로 포함된다.
아데노 관련 바이러스 (AAV)를 사용한 유전자 요법은 단일 유전자 결함의 치료를 포함하여 새로운 치료 양식이다. 낭성 섬유증 (CF)은 미국에서만 적어도 30,000명, 전 세계적으로 적어도 70,000명에게 영향을 미치는 치명적인 상염색체 열성 장애이다. CF 환자의 평균 생존 연령은 약 40세이다. CF는 상피 세포막을 가로질러 염화물 및 중탄산염 이온을 전도하는 채널인 낭성 섬유증 막횡단 전도도 조절기 (CFTR)를 코딩하는 유전자에서의 돌연변이에 의해 유발된다. 손상된 CFTR 기능은 기도 염증과 진행성 기관지확장증을 유발한다. CF의 단일 유전자 병인 및 환자 집단에서의 다양한 CFTR 돌연변이로 인해, 유전자 요법은 잠재적으로 CF에 대한 보편적인 치유를 제공한다.
인간 파보바이러스 계열의 한 구성원인 아데노 관련 바이러스 (AAV)는 복제를 위해 헬퍼 바이러스에 의존하는 비-병원성 바이러스이다. 이러한 이유로 인해, 재조합 AAV (rAAV) 벡터는 유전자 요법 전임상 연구 및 임상 시험에서 가장 자주 사용되는 벡터 중 하나이다. 실제로, rAAV2를 사용한 CF 폐 질환 임상 시험에 따르면, 다른 유전자 전이 작용제 (예컨대 재조합 아데노바이러스)에 비해 기도 조직에서 바이러스 게놈의 우수한 안전성 프로파일과 장기간 지속성이 모두 입증되었다 (생검에 의해 평가된 바와 같음). 그럼에도 불구하고, rAAV 벡터 유래 CFTR mRNA의 전사가 검출되지 않았기 때문에 유전자 전이는 CF 환자의 폐 기능을 개선시키지 못하였다.
따라서, CF의 치료를 위한 개선된 조성물 및 방법이 관련 기술분야에 여전히 필요하다.
본 개시내용은 특히, rAAV, 제약 조성물, 단리된 폴리뉴클레오티드, 및 이를 제조하는 방법 및 예를 들어, CF의 치료를 위해 이를 사용하는 방법을 제공한다.
한 측면에서, 본 개시내용은 (i) AV.TL65 캡시드 단백질; 및 (ii) CFTRΔR 미니유전자에 작동 가능하게 연결된 F5 인핸서 및 tg83 프로모터를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 아데노 연관 바이러스 (rAAV)를 특징으로 한다.
일부 실시양태에서, AV.TL65 캡시드 단백질은 서열식별번호 (SEQ ID NO): 13의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 13과 적어도 80% 아미노산 서열 동일성을 갖는 그의 변이체를 포함한다.
일부 실시양태에서, F5 인핸서는 서열식별번호: 1 또는 서열식별번호: 14의 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 서열식별번호: 1 또는 서열식별번호: 14와 적어도 80% 핵산 서열 동일성을 갖는 그의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, F5는 서열식별번호: 1의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 다른 실시양태에서, F5 인핸서는 서열식별번호: 14의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, tg83 프로모터는 서열식별번호: 2의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, CFTRΔR 미니유전자는 인간 CFTRΔR 미니유전자이다.
일부 실시양태에서, 인간 CFTRΔR 미니유전자는 서열식별번호: 4의 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된다.
일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 5'에서 3' 방향으로, F5 인핸서, tg83 프로모터, 및 CFTRΔR 미니유전자를 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 rAAV 중 어느 하나 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물을 특징으로 한다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 낭성 섬유증을 치료하는 방법을 특징으로 하며, 이러한 방법은 낭성 섬유증의 치료를 필요로 하는 대상체에게 치료 유효량의 본원에 기재된 rAAV 중 어느 하나 또는 본원에 기재된 제약 조성물 중 어느 하나를 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 하나 이상의 부가의 치료제를 대상체에게 투여하는 것을 추가로 포함한다.
또 다른 측면에서, 포유동물은 인간이다. 한 측면에서, 인간은 신생아이다. 한 측면에서, 인간은 유아이다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 낭성 섬유증의 치료를 필요로 하는 대상체에서 낭성 섬유증을 치료하는 데 사용하기 위한 rAAV를 특징으로 하며, 이러한 rAAV는 (i) AV.TL65 캡시드 단백질; 및 (ii) CFTRΔR 미니유전자에 작동 가능하게 연결된 F5 인핸서 및 tg83 프로모터를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, rAAV는 하나 이상의 부가의 치료제와 조합하여 사용하기 위한 것이다.
일부 실시양태에서, 하나 이상의 부가의 치료제는 증강제 (예를 들어, 프로테아좀 조정제, 예컨대 안트라사이클린 (예를 들어, 독소루비신, 이다루비신, 아클라루비신, 다우노루비신, 에피루비신, 발루비신 또는 미톡산트론), 프로테아좀 억제제 (예를 들어, 보르테조밉, 카르필조밉 및 익사조밉), 트리펩티딜 알데히드 (예를 들어, N-아세틸-l-류실-l-류실-l-노르류신 (LLnL)) 또는 그의 조합), 항생제, 점액 희석제, CFTR 조정제, 점액 용해제, 면역억제제, 생리 식염수, 고장성 식염수, 또는 그의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 증강제는 독소루비신이다. 다른 실시양태에서, 증강제는 이다루비신이다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 부가의 치료제는 면역억제제 (예를 들어, 코르티코스테로이드 (예를 들어, 흡입용 코르티코스테로이드))를 포함한다.
일부 실시양태에서, 투여하는 것은 흡입, 분무, 에어로졸화, 비강내, 기관내, 기관지내, 경구, 정맥내, 피하 또는 근육내로 투여하는 것이다.
일부 실시양태에서, 투여하는 것은 흡입, 분무, 에어로졸화, 비강내, 기관내 및/또는 기관지내로 투여하는 것이다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 서열식별번호: 7의 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 특징으로 한다.
일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 3' 방향으로, 서열식별번호: 5의 서열을 포함하는 3' 비번역 영역 (3'-UTR)을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 3' 방향으로, 서열식별번호: 6의 서열을 포함하는 합성 폴리아데닐화 부위를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 폴리뉴클레오티드의 5' 말단에 5' 아데노 관련 바이러스 (AAV) 역위 말단 반복부 (ITR) 및 폴리뉴클레오티드의 3' 말단에 3' AAV ITR을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 5' AAV ITR은 서열식별번호: 15의 서열 또는 서열식별번호: 15와 적어도 80% 핵산 서열 동일성을 갖는 그의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 3' AAV ITR은 서열식별번호: 16의 서열 또는 서열식별번호: 16과 적어도 80% 핵산 서열 동일성을 갖는 그의 변이체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 서열식별번호: 11 또는 서열식별번호: 17의 서열, 또는 서열식별번호: 11 또는 서열식별번호: 17과 적어도 80% 핵산 서열 동일성을 갖는 그의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 서열식별번호: 11의 서열을 포함한다. 다른 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 서열식별번호: 17의 서열을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 서열식별번호: 18의 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 특징으로 한다. 또 다른 측면에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 서열식별번호: 7, 서열식별번호: 11, 또는 서열식별번호: 17의 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드) 중 어느 하나를 포함하는 재조합 아데노 연관 바이러스 (rAAV)를 특징으로 한다.
일부 실시양태에서, rAAV는 기도 세포에 대한 지향성을 갖는다.
일부 실시양태에서, rAAV는 기도 상피 세포에 대한 지향성을 갖는다.
일부 실시양태에서, rAAV는 폐 상피 세포에 대한 지향성을 갖는다.
일부 실시양태에서, rAAV는 AV.TL65 캡시드 단백질, AAV1 캡시드 단백질, AAV2 캡시드 단백질, AAV5 캡시드 단백질, AAV6 캡시드 단백질, 또는 AAV9 캡시드 단백질을 포함한다.
일부 실시양태에서, rAAV는 AV.TL65 캡시드 단백질을 포함한다.
도 1A-1C는 편광된 인간 CF 기도 상피에서 CFTR-매개 염화물 수송의 기능적 보완을 도시한다. 도 1A는 rAAV2 바이러스 게놈 AV.TL65-SP183-hCFTRΔR이 3가지 캡시드 혈청형 (AV.TL65, AV.1 및 AV.2)으로 패키징되고 정점 (AV.TL65 및 AV.1) 또는 기저외측 표면 (AV.2)으로부터 편광된 인간 CF ALI 배양물을 정점에서 감염시키는 데 사용되었다는 것을 보여준다. AAV2를 사용한 기저외측 감염은 기저외측 표면으로부터 효율적으로 감염되기 때문에 양성 대조군으로서 사용되었다. 2.5 μM 독소루비신 및 20 μM LLnL을 바이러스 접종물에 부가하고 ALI 배양물을 16시간 동안 감염시켰다. 그런 다음 바이러스를 제거하고 프로테아좀 억제제의 부재 하에 배양물을 다시 공급하였다. 도 1B는 각각의 조건에 대한 두 배양물의 Isc 추적을 도시한다. 화살표는 IBMX/포스콜린 (I&F) 및 CFTR 억제제 (GlyH101)의 부가를 표시한다. 도 1C는 감염 후 12일에 평균 +/- SEM ΔIsc를 도시한다.
도 2A-2D는 페럿 기관 및 폐로의 AV.TL65-SP183-hCFTRΔR의 유전자 전이 효율을 보여주는 일련의 그래프이다. 도 2A 및 2B는 기관 (도 2A) 및 폐 (도 2B)에서 500 ng RNA당 hCFTR 및 fCFTR mRNA의 카피 수를 나타낸다. 각각의 종에 대한 플라스미드 CFTR cDNA의 연속 희석액으로부터 생성된 표준 곡선을 사용하여 카피 수를 결정하였다. 도 2C 및 2D는 기관 (도 2C) 및 폐 (도 2D)에서 내인성 fCFTR mRNA에 대한 트랜스진 유래 hCFTR의 비율을 나타낸다. C1-C3은 모의 감염된 군의 동물을 나타내고 A1-A3은 AAV 감염된 군의 동물을 나타낸다. AAV 감염된 동물 3마리에 대한 평균도 표시된다. 점선은 CFTR의 내인성 수준을 나타낸다 (비율 = 1). 데이터는 각각의 군에서 N=3마리 동물에 대한 평균 +/- SEM을 나타낸다.
도 3A-3D는 AV.TL65가 성숙한 페럿 기도를 효과적으로 형질도입한다는 것을 보여주는 일련의 그래프이다. 도 3A는 벡터 및 모의 처리된 동물에 대한 인간 CFTR mRNA 및 내인성 페럿 GAPDH mRNA에 대한 TaqMan® RNA-특이적 PCR (RS-PCR)의 결과를 도시한다. 결과는 hCFTR/fGAPDH mRNA의 비율을 보여준다. 도 3B는 벡터 및 모의 처리된 동물에 대한 내인성 페럿 CFTR mRNA 및 내인성 페럿 GAPDH mRNA에 대한 TaqMan® RS-PCR을 보여준다. 결과는 fCFTR/fGAPDH mRNA의 비율을 보여준다. 도 3C는 100 ng DNA당 각각의 샘플에서의 벡터 게놈 수에 대한 TaqMan® Q-PCR을 보여준다. 도 3D는 각각의 샘플에 대한 hCFTR/fCFTR에 대한 mRNA 카피의 비율을 나타낸다. 1은 CFTR의 내인성 수준 (적색 점선)과 동등하다. 폐 샘플은 fCFTR mRNA의 카피당 트랜스진 유래 hCFTR mRNA의 평균 3.0+/-0.5 카피를 함유하였다. 기관 및 비강 조직 형질도입은 더 가변적이었지만, 트랜스진 유래 hCFTR/fCFTR mRNA의 1개 카피가 평균이었다. 결과는 벡터 처리된 동물에 대한 평균 +/- SEM을 나타낸다.
도 4는 실시예 5에 기재된 실험에 대한 대표적인 CF 흔적을 나타내는 그래프이다.
도 5는 실시예 5에 기재된 실험을 위한 CF 공여자 또는 비-CF 공여자에 대해 표시된 조건 하에서 ΔIsc(μA/cm2)를 나타내는 일련의 그래프이다. 오차 막대는 평균의 표준 오차 (SEM)를 나타낸다.
도 6은 실시예 6에 기재된 실험을 위한 24-웰 트랜스웰 필터 플레이트의 개별 웰로부터의 대표적인 Ieq 흔적 (37℃)를 보여주는 일련의 그래프이다.
도 7은 실시예 6에 기재된 실험, n=4에 대한 각각의 조건에 대한 포스콜린/IBMX 자극 후 평균 CFTR-매개 염화물 분비를 보여주는 일련의 그래프이다. 오차 막대는 SEM을 나타낸다.
도 8A-8D. rAAV 벡터 성능의 시험관내 및 생체내 비교. (A) CF (F508del/F508del) 인간 편광된 ALI 기도 배양물을 증강제의 존재 하에 AV1-SP183-hCFTRΔR 또는 AV.TL65-SP183-hCFTRΔR로 정점에서 감염시켰다 (MOI=100,000 DRP/세포). 그런 다음 감염 후 12일에 우싱(Ussing) 챔버에서 단락 전류 (Isc) 측정을 수행하였다. 포스콜린/IBMX 및 GlyH101 (CFTR 억제제)에 대한 ΔIsc 반응이 표시된다. 데이터는 2명의 공여자로부터의 n=4 트랜스웰에 대한 평균 ± SD를 보여준다. 감염되지 않은 ALI 배양물은 기준선 대조군으로서 제공되었다 (2명의 공여자로부터의 n=4). (B) Isc 측정 후, 각각의 군으로부터의 2개의 트랜스웰 삽입물을 풀링하고 용해하여 역전사효소 정량적-PCR (RT-qPCR)에 의해 벡터 유래 hCFTRΔR mRNA 카피를 정량화하고, 인간 GAPDH mRNA 카피에 대해 정규화하였다. 그런 다음, 값을 hCFTRΔR/GAPDH의 비율로서 표현하였다. 데이터는 n=2에 대한 평균 ± 범위를 보여준다. (C) ALI에서 인간 및 페럿 편광된 기관기관지 상피는 100,000의 감염 다중도 (MOI)에서 AV.TL65-SP183gLuc로 정점에서 감염시켰다. 증강제의 존재 하에 DNase-저항성 입자 (DRP)/세포. 가우시아 루시페라제 활성은 감염 후 5일에 상대 발광 단위 (RLU)로서 측정되었다. 데이터는 각각의 종의 2명의 공여자로부터의 n=6 트랜스웰에 대한 평균 ± SD를 보여준다. (D) 3일령의 페럿 또는 1개월령의 페럿을 증강제와 혼합된 AV.TL65-SP183-hCFTRΔR로 기관내로 감염시켰다 (체중 그램당 4x1010 DRP). 모의 감염된 군에는 증강제를 수반한 PBS를 접종하였다. 그런 다음, 기관 및 폐를 감염 후 11일에 수거하여 GAPDH mRNA 카피 수 정규화를 이용한 RT-qPCR에 의한 벡터 유래 hCFTRΔR 및 내인성 fCFTR mRNA 카피의 정량화를 수행하였다. 데이터는 hCFTRΔR 및 fCFTRΔR의 mRNA 카피의 비율 (hCFTRΔR/fCFTR)을 나타낸다. 데이터는 각각의 군에서 n=3마리 동물에 대한 평균 +/- SD를 보여준다. ns, 유의하게 상이하지 않음.
도 9A-9C. 신생 페럿에서 AV.TL65의 반복 투여. (A) 기관내 투여를 통해 1x1013 DRP/kg의 바이러스를 0, 1 또는 2회 용량으로 투여받는 3개 군의 신생 페럿을 수반하는 연구 설계. 1회 용량을 투여받은 페럿에게는 4주령에 리포터 벡터 AV.TL65-SP183-gLuc를 투여한 반면, 2회 용량을 투여받은 페럿에게는 1주령에 AV.TL65-SP183-fCFTRΔR을 투여하고, 4주령에 AV.TL65-SP183-gLuc을 투여하였다. 표시된 연령에서 혈장 및 BALF 샘플을 수집하였다. (B) AV.TL65-SP183-gLuc의 전달 후 표시된 시점에서 혈장에서의 가우시아 루시페라제 활성. (C) AV.TL65-SP183-gLuc의 전달 후 14일에 BALF에서의 가우시아 루시페라제 활성. 결과는 군당 n=6마리 동물에 대한 평균 ± SD를 보여준다. 통계적 유의성은 일원 ANOVA에 이어 터키 사후 검정으로 분석되었다. ns, 유의하지 않음. RLU, 상대 발광 단위.
도 10A-10C. 유생 페럿에서 AV.TL65의 반복 투여. (A) 기관내 투여를 통해 1x1013 DRP/kg의 바이러스를 0, 1 또는 2회 용량으로 투여받는 3개 군의 유생 페럿을 수반하는 연구 설계. 1회 용량을 투여받은 페럿에게는 8주령에 리포터 벡터 AV.TL65-SP183-gLuc를 투여한 반면, 2회 용량을 투여받은 페럿에게는 4주령에 AV.TL65-SP183-fCFTRΔR을 투여하고 8주령에 AV.TL65-SP183-gLuc를 투여하였다. 표시된 연령에서 혈장 및 BALF 샘플을 수집하였다. (B) AV.TL65-SP183-gLuc의 전달 후 표시된 시점에서 혈장에서의 가우시아 루시페라제 활성. (C) AV.TL65-SP183-gLuc의 전달 후 14일에 BALF에서의 가우시아 루시페라제 활성. 결과는 군당 n=9-10마리 동물에 대한 평균 ± SD를 보여준다. 통계적 유의성은 일원 ANOVA에 이어 터키 사후 검정으로 분석되었다: **P<0.01, ****P<0.0001. RLU, 상대 발광 단위.
도 11A-11D. 감염된 페럿의 BALF 및 혈장에서의 AV.TL65 중화 항체의 역가. (A, B) 도 9A에서 수집된 바와 같은 신생 페럿 샘플은 형질도입 억제 검정을 사용하여 (A) BALF 및 (B) 혈장에서 NAb에 대해 평가되었다. BALF 또는 혈장의 연속 희석액을 A549 세포의 감염 전에 AV.TL65-fLuc와 함께 인큐베이션하였다. NAb의 역가는 반딧불이 루시페라제 활성에 의해 평가된 바와 같이 형질도입의 50% 억제를 발생시키는 BALF 또는 혈장 (희석비)의 농도 (IC50)로서 계산되었다. AV.TL65-fLuc에만 감염된 세포는 기준선 대조군으로서 제공되었고 모의 감염된 세포는 블랭크로서 제공되었다. (C, D) 도 10A에서 수집된 바와 같은 유생 페럿 샘플을 전술한 형질도입 억제 검정을 사용하여 (C) BALF 및 (D) 혈장에서 NAb에 대해 평가하였다. 결과는 군당 n=6마리의 신생 동물 및 군당 n=9-10마리의 유생 동물에 대한 평균 ± SD를 보여준다. 통계적 유의성은 일원 ANOVA에 이어 터키 사후 검정으로 분석되었다: **P<0.01, ****P<0.0001. ns, 유의하지 않음.
도 12A-12B. 항-캡시드 항체 이소형을 정량화하기 위한 ELISA 기반 검정의 개발. 1개월령부터 시작하여 1-2개월 간격으로 4회에 걸쳐 폐가 AV-TL65로 감염된 페럿으로부터 면역 혈장을 생성하였다. 나이브 혈장은 유사한 연령의 페럿으로부터 유래되었다. ELISA 플레이트를 (A) AAV5 또는 (B) AAV2로 코팅한 다음 면역 및 나이브 페럿 혈장의 결합에 대해 평가하였다. 2차 검출 항체는 IgG에 대항한 것이었다. 결과는 각각의 샘플에 대한 2가지 기술적 반복실험에 대한 평균 ± 범위를 보여준다.
도 13A-13F. AV.TL65 감염된 페럿의 혈장에서 IgG, IgM 및 IgA 캡시드 결합 항체의 정량화. (A-F) (A,D) IgG, (B,E) IgM 및 (C,F) IgA에 대한 (A-C) 신생 페럿 및 (D-F) 유생 페럿의 혈장에서 캡시드 결합 항체의 정량화. 결과는 군당 n=6마리의 신생 동물 및 군당 n=9-10마리의 유생 동물에 대한 평균 +/- SD를 보여준다. 통계적 유의성은 일원 ANOVA에 이어 터키 사후 검정으로 분석되었다: *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001, ****P<0.0001. 단일 투여 군과 반복 투여 군 간의 비-표지된 비교는 유의한 차이가 없었다.
도 14A-14F. AV.TL65 감염된 페럿의 BALF에서 IgG, IgM 및 IgA 캡시드 결합 항체의 정량화. (A-F) (A,D) IgG, (B,E) IgM 및 (C,F) IgA에 대한 (A-C) 신생 페럿 및 (D-F) 유생 페럿의 BALF에서 캡시드 결합 항체의 정량화. 결과는 군당 n=6마리의 신생 동물 및 군당 n=9-10마리의 유생 동물에 대한 평균 +/- SD를 보여준다. 통계적 유의성은 일원 ANOVA에 이어 터키 사후 검정으로 분석되었다: *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001, ****P<0.0001. 단일 투여 군과 반복 투여 군 간의 비-표지된 비교는 유의한 차이가 없었다.
유전자 요법은 낭성 섬유증 (CF)을 치료하는 유일한 돌연변이-무관한 접근법이다. 본 개시내용은 본원에 기재된 rAAV 벡터 (예를 들어, AV.TL65-SP183-hCFTRΔR)가 편광된 인간 CF 기도 상피에서 CFTR-매개 염화물 수송을 보완하는 데 있어서 예기치 않게 효과적이라는 발견에 적어도 부분적으로 기초한다. 본원에 기재된 rAAV 벡터는 기존의 CF 유전자 요법 접근법에 비해 개선된 기능적 페이로드 용량, 보다 효과적인 세포 전달, 및 보다 효율적인 트랜스진 발현을 달성하기 위해 성분의 조합을 활용한다. 특히, rAAV는 고도로 기능적인 CFTR 미니유전자 (CFTRΔR), 짧지만 고도로 활성인 183 bp 합성 프로모터 (F5 인핸서 및 tg83 프로모터를 포함하는 SP183), 및 인간 기도에 대해 고도로 지향성인 진화된 키메라 rAAV 벡터인 AV.TL65를 포함한다. 한 실시양태에서, 벡터는 인간에게 투여된다. 한 측면에서, 인간은 신생아이다. 한 측면에서, 인간은 유아이다.
정의
용어 "AAV"는 아데노 관련 바이러스를 지칭하며, 자연적으로 발생하는 야생형 바이러스 자체 또는 그의 유도체를 지칭하는 데 사용될 수 있다. 이 용어는 달리 필요한 경우를 제외하고는, 모든 서브타입, 혈청형 및 위형, 및 자연적으로 발생하는 형태와 재조합 형태 둘 다를 포괄한다. AAV 게놈은 단일 가닥 DNA로 구성되며, DNA 가닥의 양쪽 끝에 역위 말단 반복부 (ITR)를 포함하고, 복제 및 캡시드 단백질을 각각 코딩하는 rep 및 cap이라는 2개의 오픈 리딩 프레임을 포함한다. 외래 폴리뉴클레오티드는 천연 rep 및 cap 유전자를 대체할 수 있다. AAV는 다양한 형질도입 프로파일, 또는 본원에서 사용되는 바와 같이 상이한 조직 유형에 대한 "지향성"을 갖는 다양한 상이한 혈청형 캡시드로 제조될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "혈청형"은 정의된 항혈청, 예를 들어, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, 및 AAVrh10과의 캡시드 단백질 반응성에 기초하여 다른 AAV에 의해 확인되고 구별되는 AAV를 지칭한다. 예를 들어, 혈청형 AAV2는 AAV2의 cap 유전자로부터 코딩된 캡시드 단백질 및 동일한 AAV2 혈청형으로부터의 5' 및 3' ITR 서열을 함유하는 게놈을 함유하는 AAV를 지칭하는데 사용된다. 위형화된 AAV는 한 혈청형으로부터의 캡시드 단백질과 제2 혈청형의 5'-3' ITR을 포함하는 바이러스 게놈을 함유하는 AAV를 지칭한다. 위형화된 rAAV는 캡시드 혈청형의 세포 표면 결합 특성 및 ITR 혈청형과 일치하는 유전적 특성을 가질 것으로 예상된다. 위형화된 rAAV는 관련 기술분야에 기재된 표준 기술을 사용하여 생산된다.
용어 "약"은 인용된 값의 ±10%인 값을 의미하기 위해 본원에서 사용된다.
본원에 사용된 바와 같이, "투여하는 것"은 본원에 기재된 조성물 (예를 들어, rAAV 또는 그의 제약 조성물)의 투여량을 대상체에게 제공하는 방법을 의미한다. 본원에 기재된 방법에 활용된 조성물은, 예를 들어 흡입, 분무, 에어로졸화, 비강내, 기관내, 기관지내, 경구, 비경구 (예를 들어, 정맥내, 피하 또는 근육내), 경구, 비강, 직장, 국소 또는 협측으로 투여하는 것을 포함한 임의의 적합한 경로에 의해 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 조성물은 분무기 스프레이어 (예를 들어, MADgic® 후두-기관 점막 분무 장치가 장착됨)를 사용하여 기관내 및/또는 기관지내로 에어로졸화된 입자로 투여된다. 본원에 기재된 방법에 활용된 조성물은 또한 국소 또는 전신으로 투여될 수 있다. 투여 방법은 다양한 요인 (예를 들어, 투여되는 조성물의 성분 및 치료되는 병태의 중증도)에 따라 달라질 수 있다.
용어 "AV.TL65"는 인간 기도에 대해 고도로 지향성인 진화된 키메라 AAV 캡시드 단백질을 지칭한다. AV.TL65는 문헌 [Excoffon et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 106(10):3865-3870, 2009] (이는 그 전체 내용이 본원에 참조로 포함된다)에 기재되어 있고, 또한 AAV2.5T로서 관련 기술분야에 공지되어 있다. AV.TL65는 AAV2 (a.a. 1-128)와 AAV5 (a.a. 129-725) 간의 키메라이며, 1점 돌연변이 (A581T)를 기반으로 한 치환을 수반한다. AV.TL65 캡시드의 아미노산 서열은 하기에 제시된다:
Figure pct00001
"제어 요소" 또는 "제어 서열"은 폴리뉴클레오티드의 복제, 중복, 전사, 스플라이싱, 번역 또는 분해를 포함한 폴리뉴클레오티드의 기능적 조절에 기여하는 분자의 상호작용에 관여하는 뉴클레오티드 서열이다. 조절은 그 프로세스의 빈도, 속도 또는 특이성에 영향을 미칠 수 있으며 본질적으로 향상되거나 억제될 수 있다. 관련 기술분야에 공지된 제어 요소는, 예를 들어 전사 조절 서열, 예컨대 프로모터 및 인핸서를 포함한다. 프로모터는 RNA 폴리머라제와 결합하고 통상적으로 프로모터로부터 (3' 방향으로) 하류에 위치한 코딩 영역의 전사를 개시하는 특정 조건 하에서 가능한 DNA 영역이다. 프로모터는 AAV 프로모터, 예를 들어 P5, P19, P40 및 AAV ITR 프로모터 뿐만 아니라 이종 프로모터를 포함한다.
"발현 벡터"는 관심 폴리펩티드를 코딩하는 영역을 포함하는 벡터이고, 의도된 표적 세포에서의 단백질의 발현을 수행하는데 사용된다. 발현 벡터는 또한 표적에서 단백질의 발현을 용이하게 하기 위해 코딩 영역에 작동적으로 연결된 제어 요소를 포함한다. 제어 요소와 이들이 발현을 위해 작동 가능하게 연결되어 있는 유전자 또는 유전자들의 조합은 때때로 "발현 카세트"로서 지칭되며, 이들 중 많은 것이 관련 기술분야에 공지되어 있고 이용 가능하거나 또는 관련 기술분야에서 이용 가능한 성분으로부터 쉽게 구축될 수 있다.
"유전자"는 전사 및 번역된 후에 특정한 단백질을 코딩할 수 있는 적어도 하나의 오픈 리딩 프레임을 함유하는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다.
용어 "유전자 전달"은 유전자 전이를 위해 외인성 폴리뉴클레오티드를 세포 내로 도입하는 것을 지칭하며, 표적화, 결합, 흡수, 수송, 국소화, 레플리콘 통합 및 발현을 포괄할 수 있다.
용어 "유전자 전이"는 표적화, 결합, 흡수, 수송, 국소화 및 레플리콘 통합을 포괄할 수 있지만, 유전자의 후속 발현과 구별되고 이를 의미하지 않는, 외인성 폴리뉴클레오티드를 세포 내로 도입하는 것을 지칭한다.
용어 "유전자 발현" 또는 "발현"은 유전자 전사, 번역 및 번역 후 변형의 프로세스를 지칭한다.
AAV에 대한 "헬퍼 바이러스"는 AAV (예를 들어, 야생형 AAV)가 포유동물 세포에 의해 복제되고 패키징되도록 하는 바이러스를 지칭한다. 아데노바이러스, 헤르페스 바이러스 및 폭스바이러스 예컨대 백시니아를 포함한, 이러한 AAV에 대한 다양한 헬퍼 바이러스가 관련 기술분야에 공지되어 있다. 아데노바이러스는 하위 군 C의 아데노바이러스 유형 5가 가장 흔히 사용되긴 하지만 수많은 상이한 하위 군을 포괄한다. 인간, 비-인간 포유동물 및 조류 기원의 수많은 아데노바이러스가 공지되어 있으며 기탁 기관 예컨대 ATCC로부터 입수 가능하다. 헤르페스 과의 바이러스는, 예를 들어 단순 포진 바이러스 (HSV) 및 엡스타인-바 바이러스 (EBV), 뿐만 아니라 시토메갈로바이러스 (CMV) 및 가성광견병 바이러스 (PRV)를 포함하며; 이들은 또한 기탁 기관 예컨대 ATCC로부터 입수 가능하다.
"검출 가능한 마커 유전자"는 유전자를 보유하는 세포가 특이적으로 검출되도록 (예를 들어, 마커 유전자를 보유하지 않는 세포와 구별되도록) 하는 유전자이다. 매우 다양한 이러한 마커 유전자가 관련 기술분야에 공지되어 있다.
"선택 가능한 마커 유전자"는 상응하는 선택제의 존재 하에 유전자를 보유하는 세포가 그에 대해 또는 그에 대항하여 특이적으로 선택되도록 하는 유전자이다. 예시로서, 항생제 내성 유전자는 상응하는 항생제의 존재 하에 숙주 세포가 양성으로 선택되도록 하는 양성의 선택 가능한 마커 유전자로서 사용될 수 있다. 다양한 양성 및 음성의 선택 가능한 마커가 관련 기술분야에 공지되어 있으며, 그 중 일부는 하기에 기재되어 있다.
"이종"은 비교 대상이 되는 나머지 실체와 유전자형이 뚜렷이 다른 실체로부터 유래된 것을 의미한다. 예를 들어, 유전 공학 기술에 의해 상이한 세포 유형 내로 도입된 폴리뉴클레오티드는 이종 폴리뉴클레오티드 (발현되는 경우, 이종 폴리펩티드를 코딩할 수 있음)이다.
"숙주 세포", "세포주", "세포 배양물", "패키징 세포주" 및 기타 이러한 용어는 본 개시내용에 유용한 진핵 세포, 예를 들어 포유동물 세포, 예컨대 인간 세포를 의미한다. 이러한 세포는 재조합 벡터, 바이러스 또는 기타 전이 폴리뉴클레오티드에 대한 수용자로서 사용될 수 있으며, 형질도입된 원래 세포의 자손을 포함한다. 단일 세포의 자손이 원래의 모 세포와 (형태 또는 게놈 보체에 있어서) 반드시 완전히 동일할 필요는 없는 것으로 이해된다.
"단리된" 플라스미드, 바이러스 또는 기타 물질은 물질 또는 유사한 물질이 자연적으로 발생하거나 또는 초기에 제조되는 곳에 존재할 수도 있는 다른 성분들 중 적어도 일부가 없는 물질의 제제를 지칭한다. 따라서, 예를 들어 단리된 물질은 정제 기술을 사용하여 근원 혼합물로부터 이를 강화시킴으로써 제조될 수 있다. 강화는 절대 기준, 예컨대 용액 용적당 중량으로 측정될 수 있거나, 또는 근원 혼합물에 존재하는 제2의 잠재적 간섭 물질과 관련하여 측정될 수 있다. 본 개시내용의 실시양태의 강화를 증가시키는 것은 점점 더 일부이다. 따라서, 예를 들어, 2배 강화는 일부이고, 10배 강화는 더 일부이며, 100배 강화는 더 일부이고, 1000배 강화는 훨씬 더 일부이다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "작동 가능한 연결" 또는 "작동 가능하게 연결된"은 성분들이 의도된 방식으로 기능할 수 있도록 기재된 바와 같은 성분들의 물리적 또는 기능적 병치를 지칭한다. 보다 구체적으로, 예를 들어, 작동 가능하게 연결된 2개의 DNA 서열은 2개의 DNA가 DNA 서열 중 적어도 하나가 다른 서열에 생리학적 효과를 발휘할 수 있는 관계로 배열 (시스 또는 트랜스)된다는 것을 의미한다. 예를 들어, 인핸서 및/또는 프로모터는 트랜스진 (예를 들어, 치료 트랜스진, 예컨대 CFTRΔR 미니유전자)과 작동 가능하게 연결될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 "패키징"은 바이러스 벡터, 특히 AAV 벡터의 어셈블리 및 캡시드화를 발생시키는 일련의 세포하 이벤트를 지칭한다. 따라서, 적합한 벡터가 적절한 조건 하에 패키징 세포주 내로 도입되면, 바이러스 입자로 어셈블리될 수 있다. 바이러스 벡터, 특히 AAV 벡터의 패키징과 관련된 기능은 본원 및 관련 기술분야에 기재되어 있다.
용어 "폴리뉴클레오티드"는 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드, 또는 그의 유사체를 포함한, 임의의 길이의 뉴클레오티드의 중합체 형태를 지칭한다. 폴리뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드, 예컨대 메틸화되거나 캡핑된 뉴클레오티드 및 뉴클레오티드 유사체를 포함할 수 있고, 비-뉴클레오티드 성분에 의해 중단될 수 있다. 존재하는 경우, 뉴클레오티드 구조에 대한 변형은 중합체의 어셈블리 전 또는 후에 부여될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은, 용어 폴리뉴클레오티드는 이중 가닥 및 단일 가닥 분자를 상호 교환 가능하게 지칭한다. 달리 명시되거나 요구되지 않는 한, 폴리뉴클레오티드인 본원에 기재된 개시내용의 임의의 실시양태는 이중 가닥 형태와, 이중 가닥 형태를 구성하는 것으로 공지되거나 예측되는 2개의 상보적 단일 가닥 형태 각각 모두를 포괄한다.
용어 "폴리펩티드" 및 "단백질"은 임의의 길이의 아미노산의 중합체를 지칭하기 위해 본원에서 상호 교환 가능하게 사용된다. 이들 용어는 또한 변형된: 예를 들어, 디술피드 결합 형성, 글리코실화, 아세틸화, 인산화, 지질화 또는 표지화 성분과의 접합을 거친 아미노산 중합체를 포괄한다. 유전자 요법 및 이를 위한 조성물의 맥락에서 논의될 때, 폴리펩티드 예컨대 "CFTR" 등은 각각의 무손상 폴리펩티드, 또는 무손상 단백질의 원하는 생화학적 기능을 유지하는 그의 임의의 단편 또는 유전적으로 조작된 유도체를 지칭한다. 유사하게, CFTR 및 유전자 요법에 사용하기 위한 기타 이러한 유전자 (전형적으로 수용자 세포에 전달되는 "트랜스진"으로서 지칭됨)에 대한 언급은 무손상 폴리펩티드 또는 원하는 생화학적 기능을 보유하는 임의의 단편 또는 유전적으로 조작된 유도체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
"제약 조성물"은 대상체에 투여하기에 적합한 바이러스 벡터 (예를 들어, rAAV 벡터) 내로 혼입되거나 또는 바이러스 벡터와 독립적인 (예를 들어, 리포솜, 마이크로입자 또는 나노입자 내로 혼입됨), 치료학적으로 또는 생물학적으로 활성인 작용제 (예를 들어, 트랜스진 (예를 들어, CFTRΔR 미니유전자 (예를 들어, 문헌 [Ostedgaard et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 108(7):2921-6, 2011] 참조))을 포함하는 폴리뉴클레오티드)를 함유하는 임의의 조성물을 의미한다. 이들 제형 중 임의의 것은 널리 공지되고 허용되는 관련 기술분야의 방법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Remington: The Science and Practice of Pharmacy (21st ed.), ed. A.R. Gennaro, Lippincott Williams & Wilkins, 2005, and Encyclopedia of Pharmaceutical Technology, ed. J. Swarbrick, Informa Healthcare, 2006] (이들 각각은 본원에 참조로 포함된다)을 참조한다.
"제약상 허용되는 희석제, 부형제, 담체 또는 아주반트"는 함께 투여되는 제약 조성물의 치료 특성을 유지하면서 대상체에게 생리학적으로 허용되는 희석제, 부형제, 담체 또는 아주반트를 의미한다.
폴리뉴클레오티드에 적용되는 바와 같은 "재조합"은 폴리뉴클레오티드가 클로닝, 제한 및/또는 라이게이션 단계, 및 자연에서 발견되는 폴리뉴클레오티드와 뚜렷이 구별되는 구축물을 발생시키는 기타 절차의 다양한 조합의 산물이라는 것을 의미한다. 재조합 바이러스는 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 바이러스 입자이다. 이러한 용어는 각각, 원래의 폴리뉴클레오티드 구축물의 복제물 및 원래의 바이러스 구축물의 자손을 포함한다.
"재조합 아데노 연관 바이러스 (AAV)" 또는 "rAAV 벡터"는 생체내, 생체외 또는 시험관내에서 세포 내로 전달될, AAV 기원이 아닌 폴리뉴클레오티드 서열 (예를 들어, 하나 이상의 인핸서 및/또는 프로모터에 작동 가능하게 연결될 수 있는 트랜스진을 포함하는 폴리뉴클레오티드)을 포함하는 재조합적으로 생산된 AAV 또는 AAV 입자를 의미한다. rAAV는 임의의 AAV 혈청형으로부터 자연적으로 발생하는 캡시드 단백질을 사용할 수 있다. 일부 실시양태에서, 비-자연적으로 발생하는 (예를 들어, 키메라) 캡시드가 본원에 기재된 rAAV, 예를 들어 AV.TL65에서 사용될 수 있다.
"참조"는 비교 목적으로 사용되는 임의의 샘플, 표준 또는 수준을 의미한다. "정상 참조 샘플" 또는 "야생형 참조 샘플"은, 예를 들어 장애 (예를 들어, 낭성 섬유증)가 없는 대상체로부터의 샘플일 수 있다. "양성 참조" 샘플, 표준 또는 값은 장애 (예를 들어, 낭성 섬유증)가 있는 것으로 공지된 대상체로부터 유래된 샘플, 표준, 값 또는 숫자이며, 이는 하기 기준 중 적어도 하나에 의해 대상체의 샘플과 일치될 수 있다: 연령, 체중, 병기 및 전반적인 건강.
용어 "대상체" 및 "환자"는 임의의 포유동물 (예를 들어, 인간, 영장류, 고양이, 개, 페럿, 소, 말, 돼지, 염소, 래트 또는 마우스)를 지칭하기 위해 본원에서 상호 교환 가능하게 사용된다. 예를 들어, 대상체는 인간이다.
"종결인자"는 연속 판독 전사를 감소시키거나 방지하는 경향이 있는 폴리뉴클레오티드 서열을 지칭한다 (즉, 이는 종결인자의 한쪽에서 기원하는 전사가 종결인자의 다른 쪽으로 계속되는 것을 감소시키거나 방지한다). 전사가 중단되는 정도는 전형적으로 염기 서열 및/또는 종결인자 서열의 길이의 함수이다. 특히, 수많은 분자 생물학적 시스템에서 널리 공지된 바와 같이, 일반적으로 "전사 종결 서열"로서 지칭되는 특정한 DNA 서열은, 아마도 RNA 폴리머라제 분자가 정지되도록 하고/하거나 전사되는 DNA로부터 분리되도록 함으로써 RNA 폴리머라제에 의한 연속 판독 전사를 방해하는 경향이 있는 특이적 서열이다. 이러한 서열-특이적 종결인자의 전형적인 예는 폴리아데닐화 ("폴리A") 서열, 예를 들어 SV40 폴리A를 포함한다. 이러한 서열-특이적 종결인자에 더하여 또는 그 대신에, 프로모터와 코딩 영역 사이에 비교적 긴 DNA 서열의 삽입은 또한, 일반적으로 개재 서열의 길이에 비례하여 코딩 영역의 전사를 방해하는 경향이 있다. 이러한 효과는 아마도, RNA 폴리머라제 분자가 전사되는 DNA로부터 분리되는 일부 경향이 있고 코딩 영역에 도달하기 전에 횡단해야 하는 서열의 길이를 증가시키면 일반적으로, 코딩 영역의 전사가 완료되었거나 또는 가능하게는 시작되기도 전에 분리가 발생할 가능성이 증가하기 때문에 야기되는 것 같다. 따라서 종결인자는 한 방향 ("단방향" 종결인자) 또는 양방향 ("양방향" 종결인자)으로부터의 전사를 방지할 수 있고, 서열-특이적 종결 서열 또는 서열-비특이적 종결인자 또는 둘 다로 구성될 수 있다. 이러한 다양한 종결인자 서열은 관련 기술분야에 공지되어 있으며; 본 개시내용의 맥락 내에서 이러한 서열의 예시적인 사용이 하기에 제공된다.
"치료 유전자", "예방 유전자", "표적 폴리뉴클레오티드", "트랜스진", "관심 유전자" 등은 일반적으로 벡터를 사용하여 전이될 유전자 또는 유전자들을 지칭한다. 전형적으로, 본 개시내용의 맥락에서, 이러한 유전자는 rAAV 벡터 (이 벡터는 역위 말단 반복부 (ITR) 영역에 의해 플랭킹되므로, 복제되고 rAAV 입자로 캡시드화될 수 있음) 내에 위치한다. 표적 폴리뉴클레오티드는 다수의 상이한 적용을 위한 rAAV 벡터를 생성하기 위해 본 개시내용에서 사용될 수 있다. 이러한 폴리뉴클레오티드는 하기를 포함하나, 그에 제한되지는 않는다: (i) 구조적 단백질 또는 효소의 누락, 결함 또는 최적 이하 수준으로 인한 결핍을 완화하기 위해 다른 형태의 유전자 요법에 유용한 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; (ii) 안티센스 분자로 전사되는 폴리뉴클레오티드; (iii) 전사 또는 번역 인자와 결합하는 유인물로 전사되는 폴리뉴클레오티드; (iv) 세포성 조정제 예컨대 시토카인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; (v) 수용자 세포가 특이적 약물, 예컨대 헤르페스 바이러스 티미딘 키나제 유전자에 대해 감수성이 되도록 할 수 있는 폴리뉴클레오티드; (vi) 다양한 암의 치료를 위한 E1A 종양 억제 유전자 또는 p53 종양 억제 유전자와 같은 암 요법을 위한 폴리뉴클레오티드; 및 (vii) 유전자 편집을 위한 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, CRISPR). 수용자 숙주 세포에서 트랜스진의 발현을 수행하기 위해, 한 실시양태에서 자체 프로모터 또는 이종 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 다수의 적합한 프로모터가 관련 기술분야에 공지되어 있으며, 이들의 선택은 구성적 발현, 유도성 발현, 세포 특이적 또는 조직 특이적 발현 등을 원하는지 여부에 관계없이, 표적 폴리뉴클레오티드의 원하는 발현 수준에 의존한다. rAAV 벡터는 또한 선택 가능한 마커를 함유할 수 있다. 예시적인 트랜스진은 낭성 섬유증 막횡단 전도도 조절기 (CFTR) 또는 그의 유도체 (예를 들어, CFTRΔR 미니유전자 (예를 들어, 문헌 [Ostedgaard et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 108(7):2921-6, 2011] (이는 그 전체 내용이 본원에 참조로 포함됨) 참조)), α-항트립신, β-글로빈, γ-글로빈, 티로신 히드록실라제, 글루코세레브로시다제, 아릴 술파타제 A, 인자 VIII, 디스트로핀, 에리트로포이에틴, 알파 1-항트립신, 계면활성제 단백질 SP-D, SP-A 또는 SP-C, 에리트로포이에틴, 또는 시토카인, 예를 들어, IFN-알파, IFNγ, TNF, IL-1, IL-17, 또는 IL-6, 또는 항원, 예컨대 바이러스, 박테리아, 종양 또는 진균 항원인 예방 단백질, 또는 항원의 에피토프, 예컨대 인간 호흡기 바이러스로부터의 것, 예를 들어, HBoV 단백질, 인플루엔자 바이러스 단백질, RSV 단백질 또는 SARS 단백질을 포함하나 이에 제한되지는 않는 인플루엔자 바이러스 또는 RSV를 표적으로 하는 중화 항체 또는 그의 단편을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
"치료 유효량"은 임상적으로 관련된 방식으로 대상체의 병태, 또는 장애 또는 질환, 예를 들어, 낭성 섬유증의 증상을 향상, 억제 또는 개선하기 위해 투여되는 조성물의 양을 의미한다. 대상체에서의 임의의 개선은 치료를 달성하기에 충분한 것으로 간주된다. 한 실시양태에서, 치료하기에 충분한 양은 낭성 섬유증의 한 가지 이상의 증상의 발생을 감소, 억제 또는 예방하는 양이거나, 또는 낭성 섬유증의 한 가지 이상의 증상의 중증도, 또는 대상체가 낭성 섬유증의 한 가지 이상의 증상을 앓는 동안의 기간을 감소시키는 양이다 (예를 들어, 본원에 기재된 조성물로 처리되지 않은 대조군 대상체에 비해 적어도 약 10%, 약 20%, 또는 약 30% 만큼, 또는 적어도 약 50%, 약 60%, 또는 약 70%, 또는 적어도 약 80%, 약 90%, 약 95%, 약 99%, 또는 그 초과 만큼 감소시킨다). 본원에 기재된 방법 (예를 들어, 낭성 섬유증의 치료)을 실행하기 위해 사용되는 제약 조성물의 유효량은 투여 방식 및 치료되는 대상체의 연령, 체중 및 일반적인 건강에 따라 다양하다. 의사 또는 연구원이 적절한 양과 투여 요법을 결정할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 "형질도입" 또는 "형질도입하는 것"은 rAAV에서의 외인성 폴리뉴클레오티드, 예를 들어, 트랜스진을 숙주 세포 내로 도입하여, 세포에서의 폴리뉴클레오티드, 예를 들어 트랜스진의 발현을 유도하는 프로세스를 지칭하는 용어이다. 이러한 프로세스는 일반적으로 1) AAV가 세포 표면 수용체와 결합된 후 AAV의 세포내 이입, 2) 세포의 세포질에서 엔도솜 또는 다른 세포내 구획으로부터의 탈출, 3) 바이러스 입자 또는 바이러스 게놈의 핵으로의 트래피킹, 4) 바이러스 입자의 코팅 해제, 및 원형 중간체를 포함한 발현 가능한 이중 가닥 AAV 게놈 형태의 생성을 포함한다. rAAV 발현 가능한 이중 가닥 형태는 핵 에피솜으로서 지속될 수 있거나 또는 임의로 숙주 게놈에 통합될 수 있다. AAV가 세포 표면 수용체와 결합된 후 AAV의 세포내 이입, 엔도솜 또는 다른 세포내 구획으로부터 세포의 세포질로의 탈출, 바이러스 입자 또는 바이러스 게놈의 핵으로의 트래피킹, 또는 바이러스 입자의 코팅 해제, 및 원형 중간체를 포함한 발현 가능한 이중 가닥 AAV 게놈 형태의 생성 중 임의의 것 또는 그의 조합의 변경은 발현 수준 또는 발현 지속성의 변경, 또는 핵으로의 트래피킹의 변경, 또는 도입된 폴리뉴클레오티드를 발현하는 숙주 세포 또는 세포 집단의 유형 또는 상대적 수의 변경을 발생시킬 수 있다. rAAV를 통해 도입된 폴리뉴클레오티드의 변경된 발현 또는 지속성은, 예를 들어 ELISA, 유동 세포계수법 및 웨스턴 블롯에 의한 단백질 발현, 혼성화 검정, 예를 들어, 노던 블롯, 서던 블롯 및 겔 이동 운동성 검정에 의한 DNA 및 RNA 생산의 측정, 또는 정량적 또는 비정량적 역전사, 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR), 또는 디지털 액적 PCR 검정을 포함하나 이에 제한되지는 않는, 관련 기술분야에 널리 공지된 방법에 의해 결정될 수 있다.
개체 또는 세포의 "처리"는, 예를 들어 이러한 개체에서 예방적, 치유적 또는 기타 유익한 효과를 이끌어내는, 처리가 시작될 때 그 개체 또는 세포의 자연적인 과정을 변경하려는 시도에 있어서 임의의 유형의 개입이다. 예를 들어, 개체의 치료는 유전적이거나 유도된 유전적 결핍 (예를 들어, 낭성 섬유증), 바이러스, 박테리아 또는 기생 유기체에 의한 감염, 신생물 또는 재생 불량 병태, 또는 면역 체계 기능 장애 에컨대 자가면역 또는 면역억제를 포함한 (이에 제한되지는 않는다) 임의의 병리학적 상태로 인한 병리를 감소 또는 제한하기 위해 시행될 수 있다. 치료는 조성물, 예컨대 제약 조성물의 투여, 및 조성물로 처리된 상용성 세포의 투여를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 치료는 예방적으로 또는 치료적으로, 즉 병리학적 사건의 개시 또는 병인체와의 접촉 이전 또는 이후에 수행될 수 있다. 치료는 병리학적 상태의 한 가지 이상의 증상을 감소시킬 수 있다. 예를 들어, 낭성 섬유증의 증상은 관련 기술분야에 공지되어 있으며, 예를 들어 지속적인 기침, 쌕쌕거림, 호흡곤란, 운동 불내성, 반복되는 폐 감염, 염증이 있는 비강 또는 코막힘, 악취 또는 기름진 변, 불량한 체중 증가 및 성장, 장폐색, 변비, 땀의 염분 농도 상승, 췌장염 및 폐렴을 포함한다. 장애 (예를 들어, 낭성 섬유증)의 한 가지 이상의 증상에 있어서의 개선 또는 그의 부재를 검출하는 것은 성공적인 치료를 나타낸다.
"변이체"는 천연 또는 참조 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드와 실질적으로 상동인 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드를 지칭한다. 예를 들어, 변이체 폴리뉴클레오티드는 천연 또는 참조 폴리뉴클레오티드와 실질적으로 상동일 수 있지만, 하나 또는 복수 개의 결실, 삽입 및/또는 치환으로 인해 천연 또는 참조 폴리뉴클레오티드와 상이한 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는다. 또 다른 예에서, 변이체 폴리펩티드는 천연 또는 참조 폴리펩티드와 실질적으로 상동일 수 있지만, 하나 또는 복수 개의 결실, 삽입 및/또는 치환으로 인해 천연 또는 참조 폴리펩티드와 상이한 아미노산 서열을 갖는다. 변이체 폴리펩티드-코딩 폴리뉴클레오티드 서열은 천연 또는 참조 폴리뉴클레오티드 서열과 비교할 때 뉴클레오티드의 하나 이상의 부가, 결실 또는 치환을 포함하지만, 활성을 유지하는 변이체 단백질 또는 그의 단편을 코딩하는 서열을 포괄한다. 광범위한 돌연변이유발 접근법이 관련 기술분야에 공지되어 있으며 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 적용될 수 있다.
변이체 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열은 천연 또는 참조 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 그 초과 동일할 수 있다. 천연 서열과 변이체 서열 간의 상동성의 정도 (동일성 퍼센트)는, 예를 들어 월드 와이드 웹에서 이러한 목적을 위해 통상적으로 이용되는 무료로 이용 가능한 컴퓨터 프로그램 (예를 들어, 기본 설정이 있는 BLASTp 또는 BLASTn)을 사용하여 두 서열을 비교함으로써 결정될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 "벡터"는 폴리뉴클레오티드를 포함하거나 폴리뉴클레오티드와 회합하고 시험관내 또는 생체내에서 세포로의 폴리뉴클레오티드의 전달을 매개하는데 사용될 수 있는 거대분자 또는 거대분자의 회합을 지칭한다. 예시적인 벡터는, 예를 들어 플라스미드, 바이러스 벡터, 리포솜 및 기타 유전자 전달 비히클을 포함한다. 전달될 폴리뉴클레오티드 (종종 트랜스진으로서 지칭됨)는 유전자 요법에서의 관심 코딩 서열 (예컨대, 치료 또는 관심 단백질을 코딩하는 유전자), 백신 개발에 있어서의 관심 코딩 서열 (예컨대, 포유동물에서 면역 반응을 유도하기에 적합한 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드를 발현하는 폴리뉴클레오티드), 및/또는 선택 가능하거나 검출 가능한 마커를 포함할 수 있다.
폴리뉴클레오티드
본 개시내용은 rAAV 벡터 내로 혼입될 수 있거나, 또는 rAAV 벡터의 제조에 사용될 수 있는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 이러한 폴리뉴클레오티드는 5' AAV ITR (예를 들어, AAV2 5' ITR), F5 인핸서, tg83 프로모터, 5' 비번역 영역 (UTR), CFTRΔR 미니유전자, '3 UTR, 폴리아데닐화 부위, 및/또는 3' AAV ITR (예를 들어, AAV2 3' ITR)로부터 선택된 하나 이상의 요소를 포함한, 임의의 적합한 요소 또는 성분을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드가 일반적으로 rAAV 벡터 내로 혼입되지만, 관련 기술분야에 공지된 다른 유형의 벡터와 관련하여 전달 또는 투여될 수 있음을 이해해야 한다.
한 측면에서, 본 개시내용은 서열식별번호: 7의 서열, 또는 서열식별번호: 7의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 서열식별번호: 1의 서열을 포함하는 F5 인핸서, 서열식별번호: 2의 서열을 포함하는 tg83 프로모터, 및/또는 서열식별번호: 4의 서열을 포함하는 hCFTRΔR 미니유전자를 포함한다. 또 다른 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 서열식별번호: 14의 서열을 포함하는 F5 인핸서, 서열식별번호: 2의 서열을 포함하는 tg83 프로모터, 및/또는 서열식별번호: 4의 서열을 포함하는 hCFTRΔR 미니유전자를 포함한다.
일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 3' 방향으로, 서열식별번호: 5의 서열, 또는 서열식별번호: 5의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 3' 비번역 영역 (3'-UTR)을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 3' 방향 (예를 들어, 3'-UTR에 대해 3')으로, 서열식별번호: 6의 서열을 포함하는 합성 폴리아데닐화 부위를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 폴리뉴클레오티드의 5' 말단에 5' 아데노 관련 바이러스 (AAV) 역위 말단 반복부 (ITR) 및/또는 폴리뉴클레오티드의 3' 말단에 3' AAV ITR을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 서열식별번호: 11의 서열, 또는 그의 변이체, 예를 들어 서열식별번호: 11의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 서열식별번호: 1의 서열을 포함하는 F5 인핸서, 서열식별번호: 2의 서열을 포함하는 tg83 프로모터, 및/또는 서열식별번호: 4의 서열을 포함하는 hCFTRΔR 미니유전자를 포함한다. 또 다른 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 서열식별번호: 14의 서열을 포함하는 F5 인핸서, 서열식별번호: 2의 서열을 포함하는 tg83 프로모터, 및/또는 서열식별번호: 4의 서열을 포함하는 hCFTRΔR 미니유전자를 포함한다.
다른 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 서열식별번호: 17의 서열, 또는 그의 변이체, 예를 들어 서열식별번호: 17의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 서열식별번호: 1의 서열을 포함하는 F5 인핸서, 서열식별번호: 2의 서열을 포함하는 tg83 프로모터, 및/또는 서열식별번호: 4의 서열을 포함하는 hCFTRΔR 미니유전자를 포함한다. 또 다른 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 서열식별번호: 14의 서열을 포함하는 F5 인핸서, 서열식별번호: 2의 서열을 포함하는 tg83 프로모터, 및/또는 서열식별번호: 4의 서열을 포함하는 hCFTRΔR 미니유전자를 포함한다.
폴리뉴클레오티드 중 임의의 것은 5' AAV ITR을 함유할 수 있다. 임의의 AAV 혈청형 (예를 들어, AAV2)으로부터의 5' AAV ITR을 포함한 임의의 적합한 5' AAV ITR이 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 5' AAV ITR은 서열식별번호: 9의 서열, 또는 그의 변이체, 예를 들어 서열식별번호: 9의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 또 다른 예에서, 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 서열식별번호: 15의 서열, 또는 그의 변이체, 예를 들어 서열식별번호: 15의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 5' AAV ITR을 포함한다. 폴리뉴클레오티드 중 임의의 것은 3' AAV ITR을 함유할 수 있다. 임의의 AAV 혈청형 (예를 들어, AAV2)으로부터의 3' AAV ITR을 포함한 임의의 적합한 3' AAV ITR이 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 3' AAV ITR은 서열식별번호: 10의 서열, 또는 그의 변이체, 예를 들어 서열식별번호: 10의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 또 다른 예에서, 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 서열식별번호: 16의 서열, 또는 그의 변이체, 예를 들어 서열식별번호: 16의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 3' AAV ITR을 포함한다. ITR 서열은, 예를 들어 서열식별번호: 15 및 서열식별번호: 16에서와 같이 팔린드롬성일 수 있으며, 여기서 5' 말단 상의 ITR 서열은 역방향 가닥에 위치하고, 3' 말단 상의 ITR 서열은 정방향 가닥에 위치한다.
폴리뉴클레오티드 중 임의의 것은 F5 인핸서를 함유할 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 출원 번호 16/082,767 (이는 그 전체 내용이 본원에 참조로 포함된다)을 참조한다. 일부 실시양태에서, F5 인핸서는 서열식별번호: 1 또는 서열식별번호: 14의 서열, 또는 그의 변이체, 예를 들어 서열식별번호: 1 또는 서열식별번호: 14의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, F5는 서열식별번호: 1의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 다른 실시양태에서, F5 인핸서는 서열식별번호: 14의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.
폴리뉴클레오티드 중 임의의 것은 tg83 프로모터를 함유할 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 출원 번호 16/082,767을 참조한다. 일부 실시양태에서, tg83 프로모터는 서열식별번호: 2의 서열, 또는 그의 변이체, 예를 들어 서열식별번호: 2의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
폴리뉴클레오티드 중 임의의 것은 5'-UTR을 함유할 수 있다. 임의의 적합한 5'-UTR이 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 5'-UTR은 서열식별번호: 3의 서열, 또는 그의 변이체, 예를 들어 서열식별번호: 3의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
폴리뉴클레오티드 중 임의의 것은 CFTRΔR 미니유전자를 코딩하는 서열을 함유할 수 있다. 인간 CFTRΔR (hCFTRΔR) 또는 페럿 CFTRΔR을 포함한 임의의 적합한 CFTRΔR 미니유전자가 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, hCFTRΔR 미니유전자를 코딩하는 서열은 서열식별번호: 4의 서열, 또는 그의 변이체, 예를 들어 서열식별번호: 4의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다
폴리뉴클레오티드 중 임의의 것은 3'-UTR을 함유할 수 있다. 임의의 적합한 3'-UTR이 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 3'-UTR은 서열식별번호: 3의 서열, 또는 그의 변이체, 예를 들어 서열식별번호: 5의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
폴리뉴클레오티드 중 임의의 것은 폴리아데닐화 부위를 함유할 수 있다. 임의의 적합한 폴리아데닐화 부위가 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 폴리아데닐화 부위는 서열식별번호: 6의 서열, 또는 그의 변이체, 예를 들어 서열식별번호: 6의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
한 측면에서, 본 개시내용은 서열식별번호: 8의 서열, 또는 그의 변이체, 예를 들어 서열식별번호: 8의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 서열식별번호: 1의 서열을 포함하는 F5 인핸서, 서열식별번호: 2의 서열을 포함하는 tg83 프로모터, 및/또는 서열식별번호: 4의 서열을 포함하는 hCFTRΔR 미니유전자를 포함한다. 또 다른 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 서열식별번호: 14의 서열을 포함하는 F5 인핸서, 서열식별번호: 2의 서열을 포함하는 tg83 프로모터, 및/또는 서열식별번호: 4의 서열을 포함하는 hCFTRΔR 미니유전자를 포함한다.
한 측면에서, 본 개시내용은 서열식별번호: 11의 서열, 또는 그의 변이체, 예를 들어 서열식별번호: 11의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 서열식별번호: 1의 서열을 포함하는 F5 인핸서, 서열식별번호: 2의 서열을 포함하는 tg83 프로모터, 및/또는 서열식별번호: 4의 서열을 포함하는 hCFTRΔR 미니유전자를 포함한다. 또 다른 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 서열식별번호: 14의 서열을 포함하는 F5 인핸서, 서열식별번호: 2의 서열을 포함하는 tg83 프로모터, 및/또는 서열식별번호: 4의 서열을 포함하는 hCFTRΔR 미니유전자를 포함한다.
한 측면에서, 본 개시내용은 서열식별번호: 12의 서열, 또는 그의 변이체, 예를 들어, 서열식별번호: 12의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 서열식별번호: 1의 서열을 포함하는 F5 인핸서, 서열식별번호: 2의 서열을 포함하는 tg83 프로모터, 및/또는 서열식별번호: 4의 서열을 포함하는 hCFTRΔR 미니유전자를 포함한다. 또 다른 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 서열식별번호: 14의 서열을 포함하는 F5 인핸서, 서열식별번호: 2의 서열을 포함하는 tg83 프로모터, 및/또는 서열식별번호: 4의 서열을 포함하는 hCFTRΔR 미니유전자를 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 서열식별번호: 18의 서열, 또는 그의 변이체, 예를 들어 서열식별번호: 18의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 서열식별번호: 1의 서열을 포함하는 F5 인핸서, 서열식별번호: 2의 서열을 포함하는 tg83 프로모터, 및/또는 서열식별번호: 4의 서열을 포함하는 hCFTRΔR 미니유전자를 포함한다. 또 다른 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 서열식별번호: 14의 서열을 포함하는 F5 인핸서, 서열식별번호: 2의 서열을 포함하는 tg83 프로모터, 및/또는 서열식별번호: 4의 서열을 포함하는 hCFTRΔR 미니유전자를 포함한다.
폴리뉴클레오티드는 또한 하나 이상의 검출 가능한 마커를 함유할 수 있다. 예를 들어, 박테리아 베타-갈락토시다제 (lacZ) 유전자; 인간 태반 알칼리성 포스파타제 (AP) 유전자, 및 시험관내 및 생체내 모두에서 리포터 분자로서 사용된 다양한 세포 표면 마커를 코딩하는 유전자를 포함한, 다양한 마커가 공지되어 있다. 폴리뉴클레오티드는 또한 하나 이상의 선택 가능한 마커를 함유할 수 있다.
재조합 AAV 벡터
재조합 AAV 벡터는 특히 질환 예컨대 낭성 섬유증에 대한 인간 유전자 요법을 위한 잠재적으로 강력한 도구이다. 유전자 요법에 대한 다른 접근법에 비해 rAAV 벡터의 주요 이점은 일반적으로 에피솜으로 존재하거나 숙주 세포에 안정적으로 통합되기 위해 표적 세포의 지속적인 복제가 필요하지 않다는 것이다. 일반적으로, 본 개시내용은 AV.TL65 캡시드 단백질; 및 트랜스진에 작동 가능하게 연결된 F5 인핸서 및 tg83 프로모터를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 rAAV를 제공한다.
예를 들어, 한 측면에서, 본 개시내용은 (i) AV.TL65 캡시드 단백질; 및 (ii) CFTRΔR 미니유전자에 작동 가능하게 연결된 F5 인핸서 및 tg83 프로모터를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 rAAV를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 (i) AV.TL65 캡시드 단백질; 및 (ii) CFTRΔR 미니유전자에 작동 가능하게 연결된 F5 인핸서 및 tg83 프로모터를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 낭성 섬유증의 치료를 필요로 하는 대상체에서 낭성 섬유증을 치료하는 데 사용하기 위한 rAAV를 제공한다.
일부 실시양태에서, AV.TL65 캡시드 단백질은 서열식별번호: 13의 아미노산 서열, 또는 그의 변이체, 예를 들어 서열식별번호: 13의 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, F5 인핸서는 서열식별번호: 1 또는 서열식별번호: 14의 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 그의 변이체, 예를 들어, 서열식별번호: 1 또는 서열식별번호: 14의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, F5는 서열식별번호: 1의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 다른 실시양태에서, F5 인핸서는 서열식별번호: 14의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, tg83 프로모터는 서열식별번호: 2의 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 그의 변이체, 예를 들어 서열식별번호: 2의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
임의의 적합한 CFTRΔR 미니유전자 또는 그의 유도체가 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, CFTRΔR 미니유전자는 인간 CFTRΔR 미니유전자이다. 다른 실시양태에서, CFTRΔR 미니유전자는 페럿 CFTRΔR 미니유전자이다. 일부 실시양태에서, 인간 CFTRΔR 미니유전자는 서열식별번호: 4의 서열, 또는 그의 변이체, 예를 들어 서열식별번호: 4의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된다.
일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 5'에서 3' 방향으로, F5 인핸서, tg83 프로모터, 및 CFTRΔR 미니유전자를 포함한다. 일부 특정한 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 5'에서 3' 방향으로, 5' AAV ITR (예를 들어, AAV2 5' ITR), F5 인핸서, tg83 프로모터, 5' 비번역 영역 (UTR), CFTRΔR 미니유전자, '3-UTR, 폴리아데닐화 부위, 및 3' AAV ITR (예를 들어, AAV2 3' ITR)을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 폴리뉴클레오티드 중 임의의 것, 예를 들어 서열식별번호: 7, 서열식별번호: 11 또는 서열식별번호: 17의 서열, 또는 그의 변이체, 예를 들어 , 서열식별번호: 7, 서열식별번호: 11 또는 서열식별번호: 17의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 rAAV를 제공한다. 예를 들어, 본 개시내용은 서열식별번호: 17의 서열, 또는 그의 변이체, 예를 들어, 서열식별번호: 17의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 rAAV를 제공한다. 일부 실시양태에서, rAAV는 기도 상피 세포 (예를 들어, 폐 상피 세포)에 대한 지향성을 갖는다. 일부 실시양태에서, rAAV는 AV.TL65 캡시드 단백질, AAV1 캡시드 단백질, AAV2 캡시드 단백질, AAV5 캡시드 단백질, AAV6 캡시드 단백질, 또는 AAV9 캡시드 단백질을 포함한다. 일부 실시양태에서, rAAV는 AV.TL65 캡시드 단백질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 서열식별번호: 1의 서열을 포함하는 F5 인핸서, 서열식별번호: 2의 서열을 포함하는 tg83 프로모터, 및/또는 서열식별번호: 4의 서열을 포함하는 hCFTRΔR 미니유전자를 포함한다. 또 다른 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 서열식별번호: 14의 서열을 포함하는 F5 인핸서, 서열식별번호: 2의 서열을 포함하는 tg83 프로모터, 및/또는 서열식별번호: 4의 서열을 포함하는 hCFTRΔR 미니유전자를 포함한다.
이종 폴리뉴클레오티드는 재조합 기술에 의해 AAV 게놈 코딩 영역 내로 또는 그 대신에 (즉, AAV rep 및 cap 유전자 대신에) 통합되지만, 일반적으로 AAV 역위 말단 반복부 (ITR) 영역에 의해 어느 한 쪽에 플랭킹된다. 이것은, 예를 들어 ITR이 복제-적격 AAV 게놈을 재생할 수 있는 재조합의 가능성을 감소시키기 위해 AAV 기원의 임의의 개재 서열 없이 (반드시 그런 것은 아니지만) 직접적인 병치로 코딩 서열로부터의 상류 및 하류 둘 다에 나타난다는 것을 의미한다. 그러나, 단일 ITR은 2개의 ITR을 포함하는 구성과 정상적으로 관련된 기능을 수행하기에 충분할 수 있으며 (예를 들어, WO 94/13788 참조), 따라서 단 하나의 ITR을 갖는 벡터 구축물이 본 개시내용의 패키징 및 생산 방법과 연계해서 이용될 수 있다.
rep에 대한 천연 프로모터는 자기 조절되며, 생산되는 AAV 입자의 양을 제한할 수 있다. rep 유전자는 또한 rep가 벡터 구축물의 일부로서 제공되거나 별도로 제공되는지 여부에 관계없이, 이종 프로모터에 작동 가능하게 연결될 수 있다. rep 유전자 발현에 의해 강하게 하향 조절되지 않는 임의의 이종 프로모터가 적합하지만; 유도성 프로모터는 rep 유전자의 구성적 발현이 숙주 세포에 부정적인 영향을 미칠 수 있기 때문에 일부이다. 매우 다양한 유도성 프로모터가 관련 기술분야에 공지되어 있으며; 예시로, 중금속 이온 유도성 프로모터 (예컨대 메탈로티오네인 프로모터); 스테로이드 호르몬 유도성 프로모터 (예컨대 MMTV 프로모터 또는 성장 호르몬 프로모터); 및 프로모터, 예컨대 T7 RNA 폴리머라제의 존재 하에 활성인 T7 파지로부터의 것을 포함한다. 유도성 프로모터의 하나의 서브클래스는 rAAV 벡터의 복제 및 패키징을 보완하는 데 사용되는 헬퍼 바이러스에 의해 유도되는 프로모터이다. 아데노바이러스 E1A 단백질에 의해 유도될 수 있는 아데노바이러스 초기 유전자 프로모터; 아데노바이러스 주요 후기 프로모터; 헤르페스바이러스 단백질, 예컨대 VP16 또는 1CP4에 의해 유도될 수 있는 헤르페스바이러스 프로모터; 뿐만 아니라 백시니아 또는 폭스바이러스 유도성 프로모터를 포함한 다수의 헬퍼 바이러스 유도성 프로모터가 또한 기재되었다.
다양한 AAV 게놈의 상대적인 캡시드화 크기 제한을 감안할 때, 게놈 내로 큰 이종 폴리뉴클레오티드를 삽입하려면 AAV 서열의 일부분을 제거해야 한다. 복제-적격 AAV ("RCA")를 생성할 가능성을 감소시키기 위해, 어떠한 경우에도 하나 이상의 AAV 유전자를 제거하는 것이 바람직하다. 따라서, rep, cap, 또는 둘 다에 대한 코딩 또는 프로모터 서열은 한 실시양태에서 제거되는데, 이는 이들 유전자에 의해 제공되는 기능이 트랜스로 제공될 수 있기 때문이다.
그 결과로 생긴 벡터는 이들 기능에 있어서 "결함"이 있는 것으로서 지칭된다. 벡터를 복제하고 패키징하기 위해, 누락된 기능은 다양한 누락된 rep 및/또는 cap 유전자 산물에 필요한 기능을 함께 코딩하는 패키징 유전자 또는 그의 복수 개로 보완된다. 패키징 유전자 또는 유전자 카세트는 한 실시양태에서 AAV ITR에 의해 플랭킹되지 않고, 한 실시양태에서 rAAV 게놈과 어떠한 실질적인 상동성도 공유하지 않는다. 따라서, 벡터 서열과 별도로 제공된 패키징 유전자 간의 복제 동안 상동 재조합을 최소화하기 위해, 2개의 폴리뉴클레오티드 서열의 중첩을 피하는 것이 바람직하다. 상동성 수준 및 상응하는 재조합 빈도는 상동 서열의 길이 및 공유된 동일성 수준이 증가함에 따라 증가한다. 주어진 시스템에서 문제가 될 상동성의 수준은 관련 기술분야에 공지된 바와 같이, 이론적으로 결정되고 실험적으로 확인될 수 있다. 그러나, 전형적으로, 중복 서열이 그의 전체 길이에 걸쳐 적어도 80% 동일한 경우 약 25개 미만의 뉴클레오티드 서열인 경우 또는 그의 전체 길이에 걸쳐 적어도 70% 동일한 경우 약 50개 미만의 뉴클레오티드 서열인 경우에 재조합은 실질적으로 감소되거나 제거될 수 있다. 물론, 훨씬 더 낮은 수준의 상동성은 재조합 가능성을 추가로 감소시킨다. 임의의 중복 상동성이 없더라도, RCA를 생성하는 일부 잔류 빈도가 있는 것으로 보인다. WO 98/27204 (Allen et al.)에 기재된 바와 같이, AAV의 복제 및 캡시드화 기능을 "분할"함으로써, RCA를 생성하는 빈도의 추가 감소 (예를 들어, 비상동 재조합에 의함)를 수득할 수 있다.
rAAV 벡터 구축물, 및 상보적 패키징 유전자 구축물은 본 개시내용에서 다수의 상이한 형태로 구현될 수 있다. 바이러스 입자, 플라스미드 및 안정적으로 형질전환된 숙주 세포는 모두 일시적으로 또는 안정적으로 이러한 구축물을 패키징 세포 내로 도입하는 데 사용될 수 있다.
본 개시내용의 특정 실시양태에서, AAV 벡터 및 상보적 패키징 유전자(들)가 있다면, 이들은 박테리아 플라스미드, AAV 입자, 또는 그의 임의의 조합의 형태로 제공된다. 다른 실시양태에서, AAV 벡터 서열, 패키징 유전자(들), 또는 둘 다는 유전적으로 변경된 (예를 들어, 유전적으로 변경된) 진핵 세포의 형태로 제공된다. AAV 벡터 서열, AAV 패키징 유전자 또는 둘 다를 발현하도록 유전적으로 변경된 숙주 세포의 발달은 신뢰할 수 있는 수준에서 발현되는 물질의 확립된 공급원을 제공한다.
따라서 다양한 상이한 유전적으로 변경된 세포가 본 개시내용의 맥락에서 사용될 수 있다. 예시로서, 포유동물 숙주 세포는 안정적으로 통합된 rAAV 벡터의 적어도 하나의 무손상 카피와 함께 사용될 수 있다. 프로모터에 작동 가능하게 연결된 적어도 AAV rep 유전자를 포함하는 AAV 패키징 플라스미드는 복제 기능을 공급하기 위해 사용될 수 있다 (미국 특허 번호 5,658,776에 기재된 바와 같음). 또 다른 한편으론, 프로모터에 작동 가능하게 연결된 AAV rep 유전자를 갖는 안정한 포유동물 세포주는 복제 기능을 공급하는데 사용될 수 있다 (예를 들어, Trempe et al., (WO 95/13392); Burstein et al. (WO 98/23018); 및 Johnson et al. (미국 특허 번호 5,656,785) 참조). 상기 기재된 바와 같은 캡시드화 단백질을 제공하는 AAV cap 유전자는 AAV rep 유전자와 함께 또는 별도로 제공될 수 있다 (예를 들어, 상기 참조된 출원 및 특허 뿐만 아니라 Allen et al. (WO 98/27204) 참조). 다른 조합이 가능하고 본 개시내용의 범위 내에 포함된다.
rAAV, 예를 들어 AV.TL65 캡시드 단백질을 함유하는 rAAV를 생산하기 위한 접근법은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Excoffon et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 106(10):3865-3870, 2009] 및 미국 특허 번호 10,046,016 (이들 각각은 그 전체 내용이 본원에 참조로 포함된다)을 참조한다.
증강제
본원에 기재된 rAAV는 AAV 형질도입의 증강제와 조합하여 사용되어, 트랜스진의 형질도입 및/또는 발현의 상당한 증가를 달성할 수 있다. 임의의 적합한 증강제가 사용될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 7,749,491 (이는 그 전체 내용이 본원에 참조로 포함된다)에는 적합한 증강제가 기재되어 있다. 증강제는 프로테아좀 조정제일 수 있다. 프로테아좀 조정제는 안트라사이클린 (예를 들어, 독소루비신, 이다루비신, 아클라루비신, 다우노루비신, 에피루비신, 발루비신 또는 미톡산트론), 프로테아좀 억제제 (예를 들어, 보르테조밉, 카르필조밉 및 익사조밉), 트리펩티딜 알데히드 (예를 들어, N-아세틸-l-류실-l-류실-l-노르류신 (LLnL)), 또는 그의 조합일 수 있다. 일부 실시양태에서, 증강제는 독소루비신이다. 다른 실시양태에서, 증강제는 이다루비신이다.
rAAV 및 증강제(들)는 동일한 조성물 또는 상이한 조성물 (예를 들어, 제약 조성물) 중에서, 세포와 접촉되거나 또는 대상체에게 투여될 수 있다. rAAV와 증강제(들)의 접촉 또는 투여는 순차적 (예를 들어, rAAV에 이어 증강제(들), 또는 그 반대) 또는 동시적일 수 있다.
제약 조성물
본 개시내용은 본원에 기재된 rAAV 중 임의의 것을 포함하는 제약 조성물을 포함한 제약 조성물을 제공한다. 제약 담체는 하나 이상의 제약상 허용되는 담체, 부형제, 희석제, 완충제 등을 포함할 수 있다.
예를 들어, 한 측면에서, 본 개시내용은 (i) AV.TL65 캡시드 단백질; 및 (ii) CFTRΔR 미니유전자에 작동 가능하게 연결된 F5 인핸서 및 tg83 프로모터를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 rAAV를 포함하는 제약 조성물을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 낭성 섬유증의 치료를 필요로 하는 대상체에서 낭성 섬유증을 치료하는데 사용하기 위한 rAAV를 포함하는 제약 조성물을 제공하며, rAAV는 하기를 포함한다: (i) AV.TL65 캡시드 단백질; 및 (ii) CFTRΔR 미니유전자에 작동 가능하게 연결된 F5 인핸서 및 tg83 프로모터를 포함하는 폴리뉴클레오티드.
일부 실시양태에서, AV.TL65 캡시드 단백질은 서열식별번호: 13의 아미노산 서열, 또는 그의 변이체, 예를 들어 서열식별번호: 13의 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, F5 인핸서는 서열식별번호: 1 또는 서열식별번호: 14의 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 그의 변이체, 예를 들어, 서열식별번호: 1 또는 서열식별번호: 14의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, F5는 서열식별번호: 1의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 다른 실시양태에서, F5 인핸서는 서열식별번호: 14의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, tg83 프로모터는 서열식별번호: 2의 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 그의 변이체, 예를 들어 서열식별번호: 2의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
임의의 적합한 CFTRΔR 미니유전자 또는 그의 유도체가 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, CFTRΔR 미니유전자는 인간 CFTRΔR 미니유전자이다. 다른 실시양태에서, CFTRΔR 미니유전자는 페럿 CFTRΔR 미니유전자이다. 일부 실시양태에서, 인간 CFTRΔR 미니유전자는 서열식별번호: 4의 서열, 또는 그의 변이체, 예를 들어 서열식별번호: 4의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된다.
일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 5'에서 3' 방향으로, F5 인핸서, tg83 프로모터, 및 CFTRΔR 미니유전자를 포함한다. 일부 특정한 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 5'에서 3' 방향으로, 5' AAV ITR (예를 들어, AAV2 5' ITR), F5 인핸서, tg83 프로모터, 5' 비번역 영역 (UTR), CFTRΔR 미니유전자, 3'-UTR, 폴리아데닐화 부위, 및 3' AAV ITR (예를 들어, AAV2 3' ITR)을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 rAAV를 포함하는 제약 조성물을 제공하며, rAAV는 본원에 기재된 폴리뉴클레오티드, 예를 들어 서열식별번호: 7, 11 또는 17의 서열, 또는 그의 변이체, 예를 들어, 서열식별번호: 7, 11, 또는 17의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 중 임의의 것을 포함한다. 예를 들어, rAAV를 포함하는 제약 조성물이 본원에 제공되며, rAAV는 서열식별번호: 17의 서열, 또는 그의 변이체, 예를 들어, 서열식별번호: 17의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, rAAV는 기도 상피 세포 (예를 들어, 폐 상피 세포)에 대한 지향성을 갖는다. 일부 실시양태에서, rAAV는 AV.TL65 캡시드 단백질, AAV1 캡시드 단백질, AAV2 캡시드 단백질, AAV5 캡시드 단백질, AAV6 캡시드 단백질, 또는 AAV9 캡시드 단백질을 포함한다. 일부 실시양태에서, rAAV는 AV.TL65 캡시드 단백질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 서열식별번호: 1의 서열을 포함하는 F5 인핸서, 서열식별번호: 2의 서열을 포함하는 tg83 프로모터, 및/또는 서열식별번호: 4의 서열을 포함하는 hCFTRΔR 미니유전자를 포함한다. 또 다른 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 서열식별번호: 14의 서열을 포함하는 F5 인핸서, 서열식별번호: 2의 서열을 포함하는 tg83 프로모터, 및/또는 서열식별번호: 4의 서열을 포함하는 hCFTRΔR 미니유전자를 포함한다.
본원에 기재된 제약 조성물은 rAAV 단독, 또는 하나 이상의 부가의 치료제와 조합하여 rAAV를 포함할 수 있다. 예시적인 부가의 치료제는 증강제 (예를 들어, 본원에 기재된 임의의 증강제, 예를 들어, 독소루비신 또는 이다루비신), 항생제 (예를 들어, 아지트로마이신 (ZITHROMAX®), 아목시실린 및 클라불란산 (AUGMENTIN®), 클록사실린 및 디클로카실린, 티카르실린 및 클라불란산 (TIMENTIN®), 세팔렉신, 세프디니르, 세프프로질, 세파클로르; 술파메톡사졸 및 트리메토프림 (BACTRIM®), 에리트로마이신/술피속사졸, 에리트로마이신, 클라리트로마이신, 테트라사이클린, 독시사이클린, 미노사이클린, 티게사이클린, 반코마이신, 이미페넴, 메리페넴, 콜리스티메테이트/COLISTIN®, 리네졸리드, 시프로플록사신, 레보플록사신, 또는 그의 조합), 점액 희석제 (예를 들어, 고장성 식염수 또는 도르나제 알파 (PULMOZYME®)), CFTR 조정제 (예를 들어, 이바카프토르 (KALYDECO®), 루마카프토르, 루마카프토르/이바카프토르 (ORKAMBI®), 테자카프토르/이바카프토르 (SYMDEKO®), 또는 TRIKAFTA® (엘렉사카프토르/이바카프토르/테자카프토르)), 점액 용해제 (예를 들어, 아세틸시스테인, 암브록솔, 브롬헥신, 카르보시스테인, 에르도스테인, 메시스테인 및 도르나제 알파), 면역억제제, 생리 식염수, 고장성 식염수, 또는 그의 조합을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
예를 들어, 본원에 기재된 제약 조성물은 하나 이상의 면역억제제를 포함할 수 있다. 임의의 적합한 면역억제제가 사용될 수 있다. 예를 들어, 면역억제제의 비-제한적 예는 코르티코스테로이드 (예를 들어, 흡입용 코르티코스테로이드 (예를 들어, 베클로메타손 (QVAR®), 부데소니드 (PULMICORT®), 부데소니드/포르모테롤 (SYMBICORT®), 시클레소니드 (ALVESCO®), 플루티카손 (FLOVENT HFA®), 플루티카손 프로피오네이트 (FLOVENT DISKUS®), 플루티카손 푸로에이트 (ARNUITY ELLIPTA®), 플루티카손 프로피오네이트/살메테롤 (ADVAIR®), 플루티카손 푸로에이트/우메클리디늄/빌란테롤 (TRELEGY ELLIPTA®), 모메타손 푸로에이트 (ASMANEX®), 또는 모메타손/포르모테롤 (DULERA®), 프레디손, 또는 메틸프레드니손), 폴리클로날 항-림프구 항체 (예를 들어, 말 유래 또는 토끼 유래일 수 있는 항-림프구 글로불린 (ALG) 및 항-흉선세포 글로불린 (ATG) 항체), 모노클로날 항-림프구 항체 (예를 들어, 항-CD3 항체 (예를 들어, 무르모맙 및 알렘투주맙) 또는 항-CD20 항체 (예를 들어, 리툭시맙)), 인터류킨-2 (IL-2) 수용체 길항제 (예를 들어, 다클리주맙 및 바실릭시맙), 칼시뉴린 억제제 (예를 들어, 시클로스포린 A 및 타크롤리무스), 세포 주기 억제제 (예를 들어, 아자티오프린, 미코페놀레이트 모페틸 (MMF) 및 미코페놀산 (MPA)), 라파마이신의 포유동물 표적 (mTOR) 억제제 (예를 들어, 시롤리무스 (라파마이신) 및 에베롤리무스), 메토트렉세이트, 시클로포스파미드, 안트라사이클린 (예를 들어, 독소루비신, 이다루비신, 아클라루비신, 다우노루비신, 에피루비신, 발루비신, 미톡산트론, 또는 그의 조합), 탁산 (예를 들어, TAXOL® (파클리탁셀)), 및 그의 조합 (예를 들어, 칼시뉴린 억제제, 세포 주기 억제제 및 코르티코스테로이드의 조합)을 포함한다.
특정한 실시양태에서, 본원에 기재된 제약 조성물은 하나 이상의 코르티코스테로이드 (예를 들어, 흡입용 코르티코스테로이드 (예를 들어, 베클로메타손 (QVAR®), 부데소니드 (PULMICORT®), 부데소니드/포르모테롤 (SYMBICORT®), 시클레소니드 (ALVESCO®), 플루티카손 (FLOVENT HFA®), 플루티카손 프로피오네이트 (FLOVENT DISKUS®), 플루티카손 푸로에이트 (ARNUITY ELLIPTA®), 플루티카손 프로피오네이트/살메테롤 (ADVAIR®), 플루티카손 푸로에이트/우메클리디늄/빌란테롤 (TRELEGY ELLIPTA®), 모메타손 푸로에이트 (ASMANEX®), 또는 모메타손/포르모테롤 (DULERA®), 프레드니손, 또는 메틸프레드니손)을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 코르티코스테로이드는 흡입용 코르티코스테로이드이다.
면역억제제 (예를 들어, 본원에 기재된 임의의 면역억제제)는 흡입에 의해 투여되거나 또는 전신으로 (예를 들어, 정맥내로 또는 피하로) 투여될 수 있다.
전형적으로, 바이러스 벡터는 제약상 적합한 발열원 없는 완충액, 예컨대 링거 균형 염 용액 (pH 7.4) 중에 있다. 필수는 아니지만, 제약 조성물은 임의로, 정확한 양의 투여에 적합한 단위 투여 형태로 공급될 수 있다. 제약 조성물은 일반적으로 무균 상태이다.
CF를 치료하는 방법
본 개시내용은 CF를 치료 및/또는 예방하는 방법을 제공한다.
예를 들어, 한 측면에서, 본 개시내용은 CF를 치료하는 방법을 제공하며, 이러한 방법은 CF의 치료를 필요로 하는 대상체에게, (i) AV.TL65 캡시드 단백질; 및 (ii) CFTRΔR 미니유전자에 작동 가능하게 연결된 F5 인핸서 및 tg83 프로모터를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 rAAV의 치료 유효량을 투여하는 것을 포함한다. rAAV는 본원에 기재된 폴리뉴클레오티드 중 임의의 것을 포함할 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 낭성 섬유증의 치료를 필요로 하는 대상체에서 낭성 섬유증을 치료하는데 사용하기 위한 rAAV를 특징으로 하며, 이러한 rAAV는 (i) AV.TL65 캡시드 단백질; 및 (ii) CFTRΔR 미니유전자에 작동 가능하게 연결된 F5 인핸서 및 tg83 프로모터를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, rAAV는 하나 이상의 부가의 치료제 (예를 들어, 본원에 기재된 임의의 증강제)와 조합하여 사용하기 위한 것이다. rAAV는 본원에 기재된 폴리뉴클레오티드 중 임의의 것을 포함할 수 있다.
본원에 기재된 조성물 (예를 들어, rAAV 또는 제약 조성물)은 생체내 뿐만 아니라 생체외에서 사용될 수 있다. 생체내 유전자 요법은 본 개시내용의 벡터를 대상체에게 직접 투여하는 것을 포함한다. 제약 조성물은 액체 용액 또는 현탁액으로서, 에멀젼으로서, 또는 사용 전에 액체에 용해 또는 현탁시키기에 적합한 고체 형태로서 공급될 수 있다. 호흡기 내로 투여하기 위한, 한 가지 예시적인 투여 방식은 적절한 에어로졸루빌라이저 장치와 함께 사용될 때 고체 또는 액체 에어로졸을 제공하는 조성물을 사용하는 에어로졸에 의한 것이다. 호흡기에 투여하는 또 다른 일부 방식은 가요성 광섬유 기관지경을 사용하여 벡터를 주입하는 것이다.
본원에 기재된 조성물 (예를 들어, rAAV 또는 제약 조성물)은 임의의 적합한 경로에 의해, 예를 들어 흡입, 분무, 에어로졸화, 비강내, 기관내, 기관지내, 경구, 비경구 (예를 들어, 정맥내, 피하 또는 근육내), 경구, 비강, 직장, 국소 또는 협측으로 투여될 수 있다. 그들은 또한 국소로 또는 전신으로 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 조성물은 분무기 스프레이어 (예를 들어, MADgic® 후두-기관 점막 분무 장치가 장착됨)를 사용하여 기관내 및/또는 기관지내로 에어로졸화된 입자로 투여된다. 일부 실시양태에서, 조성물은 비경구로 투여된다. 다른 일부 실시양태에서, 조성물은 전신으로 투여된다. 벡터는 또한 예시로서 혈관 이식편 [PTFE 및 데이크론(dacron)], 심장 판막, 혈관내 스텐트, 혈관내 포장뿐만 아니라 기타 비-혈관 인공 삽입물을 포함한 생체 인공 삽입물을 통해 도입될 수 있다. 벡터 용액의 전달, 빈도, 조성 및 투여량 범위에 관한 일반적인 기술은 관련 기술분야의 기술 내에 있다.
흡입에 의한 상기도 (비강) 또는 하기도로의 투여를 위해, 본원에 기재된 조성물 (예를 들어, rAAV 또는 제약 조성물)은 취입기, 분무기 또는 가압 팩 또는 에어로졸 스프레이를 전달하는 다른 편리한 수단으로부터 편리하게 전달된다. 가압 팩은 적합한 추진제, 예컨대 디클로로디플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소 또는 다른 적합한 기체를 포함할 수 있다. 가압 에어로졸의 경우, 투여 단위는 계량된 양을 전달하기 위한 밸브를 제공함으로써 결정될 수 있다.
또 다른 한편으론, 흡입 또는 취입에 의한 투여를 위해, 조성물은 건조 분말의 형태, 예를 들어 작용제와 적합한 분말 베이스, 예컨대 락토스 또는 전분의 분말 혼합물의 형태를 취할 수 있다. 분말 조성물은, 예를 들어 캡슐 또는 카트리지, 또는 예를 들어 분말이 흡입기, 취입기 또는 정량 흡입기의 도움으로 투여될 수 있는 젤라틴 또는 블리스터 팩의 단위 투여 형태로 제시될 수 있다.
비강내 투여의 경우, 작용제는 점비제, 액체 스프레이, 예컨대 플라스틱 병 분무기 또는 정량 흡입기를 통해 투여될 수 있다. 전형적인 분무기는 미스토미터(Mistometer) [윈트로프(Wintrop)] 및 메디할러(Medihaler) [리커(Riker)]이다.
본원에 기재된 조성물 (예를 들어, rAAV 또는 제약 조성물)의 투여는, 예를 들어 수용자의 생리학적 상태, 투여 목적이 치료적인지 아니면 예방적인지의 여부, 및 숙련된 의사에게 공지된 기타 요인에 따라 연속적이거나 간헐적일 수 있다. 본원에 기재된 조성물은 동일한 부위 또는 상이한 부위에 1회, 또는 여러 번 (예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20회, 또는 그 초과) 투여될 수 있다. 본 개시내용의 작용제의 투여는 미리 선택된 기간에 걸쳐 본질적으로 연속적일 수 있거나 또는 일련의 간격을 둔 용량 투여일 수 있다.
본원에 기재된 조성물 (예를 들어, rAAV 또는 제약 조성물)은 단독 요법으로서 투여될 수 있다. 본원에 기재된 조성물 (예를 들어, rAAV 또는 제약 조성물)은 또한 하나 이상의 부가의 치료제와 조합하여 투여될 수 있다. CF에 대한 표준 치료 요법을 포함하여 임의의 적합한 부가의 치료제(들)가 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 부가의 치료제는 항생제 (예를 들어, 아지트로마이신 (ZITHROMAX®), 아목시실린 및 클라불란산 (AUGMENTIN®), 클록사실린 및 디클로카실린, 티카르실린 및 클라불란산 (TIMENTIN®), 세팔렉신, 세프디니르, 세프프로질, 세파클로르; 술파메톡사졸 및 트리메토프림 (BACTRIM®), 에리트로마이신/술피속사졸, 에리트로마이신, 클라리트로마이신, 테트라사이클린, 독시사이클린, 미노사이클린, 티게사이클린, 반코마이신, 이미페넴, 메리페넴, 콜리스티메테이트/COLISTIN®, 리네졸리드, 시프로플록사신, 레보플록사신, 또는 그의 조합, 점액 희석제 (예를 들어, 고장성 식염수 또는 도르나제 알파 (PULMOZYME®)), CFTR 조정제 (예를 들어, 이바카프토르 (KALYDECO®), 루마카프토르, 루마카프토르/이바카프토르 (ORKAMBI®), 테자카프토르/이바카프토르 (SYMDEKO®), 또는 TRIKAFTA® (엘렉사카프토르/이바카프토르/테자카프토르)), 점액 용해제 (예를 들어, 아세틸시스테인, 암브록솔, 브롬헥신, 카르보시스테인, 에르도스테인, 메시스테인 및 도르나제 알파), 면역억제제, 생리 식염수, 고장성 식염수, 또는 그의 조합을 포함한다.
예를 들어, 본원에 기재된 조성물 (예를 들어, rAAV 또는 제약 조성물) 중 어느 하나는 하나 이상의 면역억제제와 조합하여 투여될 수 있다. 임의의 적합한 면역억제제가 사용될 수 있다. 예를 들어, 면역억제제의 비-제한적 예는 코르티코스테로이드 (예를 들어, 흡입용 코르티코스테로이드 (예를 들어, 베클로메타손 (QVAR®), 부데소니드 (PULMICORT®), 부데소니드/포르모테롤 (SYMBICORT®), 시클레소니드 (ALVESCO®), 플루티카손 (FLOVENT HFA®), 플루티카손 프로피오네이트 (FLOVENT DISKUS®), 플루티카손 푸로에이트 (ARNUITY ELLIPTA®), 플루티카손 프로피오네이트/살메테롤 (ADVAIR®), 플루티카손 푸로에이트/우메클리디늄/빌란테롤 (TRELEGY ELLIPTA®), 모메타손 푸로에이트 (ASMANEX®), 또는 모메타손/포르모테롤 (DULERA®), 프레디손, 또는 메틸프레드니손), 폴리클로날 항-림프구 항체 (예를 들어, 말 유래 또는 토끼 유래일 수 있는 항-림프구 글로불린 (ALG) 및 항-흉선세포 글로불린 (ATG) 항체), 모노클로날 항-림프구 항체 (예를 들어, 항-CD3 항체 (예를 들어, 무르모맙 및 알렘투주맙) 또는 항-CD20 항체 (예를 들어, 리툭시맙)), 인터류킨-2 (IL-2) 수용체 길항제 (예를 들어, 다클리주맙 및 바실릭시맙), 칼시뉴린 억제제 (예를 들어, 시클로스포린 A 및 타크롤리무스), 세포 주기 억제제 (예를 들어, 아자티오프린, 미코페놀레이트 모페틸 (MMF) 및 미코페놀산 (MPA)), 라파마이신의 포유동물 표적 (mTOR) 억제제 (예를 들어, 시롤리무스 (라파마이신) 및 에베롤리무스), 메토트렉세이트, 시클로포스파미드, 안트라사이클린 (예를 들어, 독소루비신, 이다루비신, 아클라루비신, 다우노루비신, 에피루비신, 발루비신, 미톡산트론, 또는 그의 조합), 탁산 (예를 들어, TAXOL® (파클리탁셀)), 및 그의 조합 (예를 들어, 칼시뉴린 억제제, 세포 주기 억제제 및 코르티코스테로이드의 조합)을 포함한다.
특정한 실시양태에서, 본원에 기재된 조성물 (예를 들어, rAAV, 제약 조성물 및/또는 증강제) 중 어느 하나는 하나 이상의 코르티코스테로이드 (예를 들어, 흡입용 코르티코스테로이드 (예를 들어, 베클로메타손 (QVAR®), 부데소니드 (PULMICORT®), 부데소니드/포르모테롤 (SYMBICORT®), 시클레소니드 (ALVESCO®), 플루티카손 (FLOVENT HFA®), 플루티카손 프로피오네이트 (FLOVENT DISKUS®), 플루티카손 푸로에이트 (ARNUITY ELLIPTA®), 플루티카손 프로피오네이트/살메테롤 (ADVAIR®), 플루티카손 푸로에이트/우메클리디늄/빌란테롤 (TRELEGY ELLIPTA®), 모메타손 푸로에이트 (ASMANEX®), 또는 모메타손/포르모테롤 (DULERA®), 프레드니손, 또는 메틸프레드니손)와 조합하여 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 코르티코스테로이드는 흡입용 코르티코스테로이드이다.
면역억제제 (예를 들어, 본원에 기재된 임의의 면역억제제)는 흡입에 의해 투여되거나 또는 전신으로 (예를 들어, 정맥내로 또는 피하로) 투여될 수 있다.
본원에 기재된 조성물 (예를 들어, rAAV 또는 제약 조성물)은 단독으로 또는 제약상 허용되는 담체와 조합하여 포유동물에게 투여될 수 있다. 상기 언급된 바와 같이, 활성 성분 및 담체의 상대적 비율은 화합물의 용해도 및 화학적 성질, 선택된 투여 경로 및 표준 제약 관행에 의해 결정된다.
본 조성물의 투여량은 투여 형태, 선택된 특정한 화합물 및 치료 중인 특정한 환자의 생리학적 특징에 따라 달라질 것이다. 바람직하지 않은 효과, 예컨대 독성의 위험을 감소시키기 위해 가장 낮은 유효 농도의 바이러스를 활용하는 것이 바람직하다.
실시예
본 발명은 하기 실시예를 참조하여 보다 완전하게 이해될 것이다. 그러나 그것들은 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본원에 기재된 실시예 및 실시양태는 단지 예시를 위한 것이며, 이에 비추어 다양한 변형 또는 변화가 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 제안될 것이며 본 출원의 사상 및 범위 및 첨부된 청구범위 내에 포함되는 것으로 이해된다.
실시예 1: AV.TL65-SP183-CFTRΔR의 개발 및 편광된 인간 CF 기도 상피에서 CFTR-매개 염화물 수송의 기능적 보완
rAAV 벡터는 낭성 섬유증 (CF)의 유전자 요법을 위한 이러한 바이러스의 개발을 방해하는 제한된 패키징 용량을 가지고 있다. 예를 들어, 전체 크기가 >4.9 kb인 바이러스 게놈은 게놈의 끝에서 작은 결실을 발생시킨다. 트랜스진 카세트가 ITR에 직접적으로 연결되는 CFTR 벡터의 경우, 이는 CFTR 기능을 손상시킬 수 있다.
본 연구는 AV.TL65-SP183-hCFTRΔR로서 지칭되는 rAAV 벡터의 개발을 설명한다. 이러한 벡터는 CF 폐 유전자 요법 노력을 가로막고 있는 많은 장애물을 극복할 것으로 예상되는 요소의 조합을 활용한다: 인간 기도에 대해 고도로 지향성인 진화된 키메라 AAV 캡시드 단백질, AV.TL65; 짧지만 고도로 활성인 183개 염기쌍 합성 인핸서 및 프로모터 (F5 인핸서 및 tg83 프로모터를 포함하는 SP183), 및 고도로 기능적인 CFTR 미니유전자 (인간 CFTRΔR (hCFTRΔR로서 지칭됨)). 본원에 기재된 실시예는 서열식별번호: 15의 서열을 포함하는 5' AAV ITR, 서열식별번호: 14의 서열을 포함하는 F5 인핸서 (서열식별번호: 1에서와 같이, 5' EcoRI 부위 및 3' XhoI 부위를 포함할 수 있음), 서열식별번호: 2의 서열을 포함하는 tg83 프로모터, 서열식별번호: 3의 서열을 포함하는 5' UTR, 서열식별번호: 4의 서열을 포함하는 hCFTRΔR 미니유전자, 서열식별번호: 5의 서열을 포함하는 3' UTR, 서열식별번호: 6의 서열을 포함하는 s-pA, 및 서열식별번호: 16의 서열을 포함하는 3' AAV ITR을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 rAAV 벡터를 활용하였다. 예를 들어, 패키징된 폴리뉴클레오티드는 서열식별번호: 17의 서열을 포함할 수 있다. AV.TL65-SP183-hCFTRΔR은 단독으로 또는 rAAV 형질도입의 하나 이상의 증강제 (예를 들어, 소분자 증강제)와 조합하여 사용될 수 있다. 흥미롭게도, 본원에 기재된 바와 같이, 본 발명자들은 AV.TL65가 페럿의 기도를 또한 감염시킬 수 있어 페럿 CF 모델의 사용을 가능하게 할 수 있다고 결정하였다. CFTRΔR 미니유전자의 페럿 버전 (fCFTRΔR)도 이러한 모델에 사용될 수 있다.
놀랍게도, AV.TL65-SP183-hCFTRΔR은 CFTR-매개 염화물 수송을 평가하는 CF 공기-액체 계면 (ALI) 배양물에 대한 일대일 비교에서 AV.1-SP183-hCFTRΔR을 능가하였다 (도 1A-1C). 이들 실험에서, rAAV2 바이러스 게놈 AV.TL65-SP183-hCFTRΔR은 3가지 캡시드 혈청형 (AV.TL65, AV.1 및 AV.2)으로 패키징되었고, 정점 (AV.TL65 및 AV.1) 또는 기저외측 표면 (AV.2)으로부터 편광된 인간 CF ALI 배양물을 정점으로 감염시키는 데 사용되었다. AAV2를 사용한 기저외측 감염은 양성 대조군으로서 사용되었는데, 이는 기저외측 표면으로부터 효율적으로 감염되기 때문이다. 2.5 μM 독소루비신 및 20 μM LLnL을 바이러스 접종물에 부가하고 ALI 배양물을 16시간 동안 감염시켰다. 그런 다음 바이러스를 제거하고 프로테아좀 억제제의 부재 하에 배양물을 다시 공급하였다. AV.TL65를 개발하기 전에, rAAV 혈청형 1 (AV.1)은 인간 ALI 배양물 및 침팬지의 폐에서 시험된 가장 우수한 벡터였다. AV.TL65-SP183-hCFTRΔR은 AV.1-SP183-hCFTRΔR을 약 2배 능가하였다 (도 1B 및 1C). 따라서, 이들 데이터는 편광된 인간 CF 기도 상피에서 CFTR-매개 염화물 수송의 기능적 보완을 입증해 준다.
실시예 2: AV.TL65-SP183-hCFTRΔR의 생체내 발현
본 연구는 신생 페럿 및 성숙한 페럿 기도에서의 hCFTR 발현에 대한 임상 후보 벡터 AV.TL65-SP183-hCFTRΔR의 시험을 설명한다. 이러한 분석의 종말점은 내인성 페럿 CFTR (fCFTR) mRNA에 대한 트랜스진 유래 인간 CFTR (hCFTR)의 비율이었다. 3일령의 신생 페럿을 500 μM 독소루비신 중 100 μl 용적의 6 x 1011 DRP의 AV.TL65-SP183-hCFTRΔR로 감염시켰다. 감염되지 않은 동물에게는 독소루비신과 동일한 용적의 비히클이 제공되었다. 감염 후 10일에, 전체 폐와 기관을 수거하고 액체 질소에서 급속 냉동시켰다. 조직을 분쇄하고 인간 및 페럿 CFTR의 Q-PCR을 위해 mRNA 및 cDNA를 생성하였다. 도 2A-2D에 도시된 바와 같이, AV.TL65-SP183-CFTRΔR은 폐로의 유전자 전달 후 내인성 (페럿) CFTR과 비교하여 인간 CFTR의 240% 더 큰 발현을 발생시켰다. 예기치 않게, 처리된 페럿은 또한 대조군과 비교하여 폐 (기관은 아님)에서 내인성 CFTR에서의 약 90배 증가를 보였으며, 이는 AV.TL65-SP183-CFTRΔR의 수용체 결합 및/또는 감염 프로세스가 내인성 CFTR 발현을 유도할 수 있음을 암시한다. 이론에 얽매이는 것은 아니지만, 이는 부분 기능 CFTR 돌연변이체에 대해 또는 CFTR 조정제를 복용하는 환자에서 부가의 치료 효과를 제공할 수 있었다.
신생 페럿은 점막하샘이 없고 섬모 세포가 거의 없는 미성숙한 기도를 가지고 태어난다. 생후 첫 3주가 끝날 때까지, 페럿의 연골기도 전체에 섬모형성과 점막하샘 형성이 완료된다. 페럿 기도 상피의 표현형과 기도의 분비물이 이러한 성숙 단계에서 변할 것이라는 점을 감안할 때, 본 발명자들은 AV.TL65가 성숙한 페럿 기도를 형질도입하는지 여부를 평가하였다. 이를 위해, 본 발명자들은 1개월령 페럿의 폐를 형질도입할 수 있는 AV.TL65의 능력을 평가하였다. 1개월령 페럿 (N=3)의 폐를, 250 μM 독소루비신의 존재 하에 500 μl 용적의 PBS 중 SP183-hCFTRΔR cDNA를 정착시킨 7.5 x 1012 DRP의 AV.TL65로 형질도입하였다. 모의 감염된 대조군 동물 (N=1)은 250 μM 독소루비신의 존재 하에 벡터가 없는 500 μl PBS를 받았다. 벡터는 기관 삽관을 통해 펜센츄리(PennCentury) 미세 분무기로 폐로 전달되었다. 동일한 동물에서 비강 전달은 또한 유체 점적에 의해 250 μM 독소루비신과 함께 1.5 x 1012 DRP를 함유하는 100 μl를 사용하여 수행되었다. 모의 감염된 비강 전달은 250 μM 독소루비신이 포함된 PBS를 받았다. 감염 후 12일에, 폐엽을 기관, 융기선 및 주변 외막이 있는 비갑개와 함께 별도로 수거하였다. 조직을 급속 냉동하고 분쇄된 샘플을 mRNA와 DNA에 대해 별도로 프로세싱하였다. 1개월령의 성숙한 페럿에서 (도 3A-3D), AV.TL65-SP183-hCFTRΔR은 폐로의 유전자 전달 후 내인성 (페럿) CFTR과 비교하여 인간 CFTR의 3배 더 큰 발현을 발생시켰다. AV.TL65가 분화된 인간 기도 상피의 정점 표면을 효과적으로 형질도입하기 위해 개발되었지만, 이러한 발견은 AV.TL65의 효능을 결정하는 수용체 및 공동 수용체가 페럿에서 보존된다는 것을 시사한다. 참고로, 이들 실험에서, AV.TL65 감염 후 3일령 페럿에서 관찰된 내인성 페럿 CFTR 전사체의 유도 (도 2B)는 성숙한 페럿 폐에서 관찰되지 않았으며 (도 3B), 이는 이러한 생물학이 신생 기도에 특이적일 수 있다는 것을 시사한다. 신생 페럿 및 성숙한 페럿으로부터의 이러한 발견은 CF에 대한 유전자 요법에 대한 본 발명의 접근법이 생체내에서 강력하게 이어진다는 것을 나타낸다.
실시예 3: 큰 안전 마진은 흡입용 독소루비신이 유전자 요법을 증강시키는 임상적 실현 가능성을 나타낸다
흡입용 프로테아좀 억제제의 임상적 실현 가능성은 독소루비신으로 입증되었으며, 이는 흡입용의 에어로졸 제형으로서 투여된 폐암 또는 전이 환자에 대한 2가지 임상 시험에서 시험되었다. 이들 연구에서 최대 허용 용량은 최대 8주기 동안 3주마다 1회 6.0 mg/m2 및 7.5 mg/m2였다. 성숙한 페럿 폐에서 효능을 달성한 독소루비신의 용량 (도 3A-3D)은 0.043 m2의 페럿 신체 표면적을 가정할 때 0.34 mg/m2에 등가인 250 μM 독소루비신 100 μl였다. 따라서, FDA에 의한 일부 mg/m2 상대 성장 스케일링을 사용하여 효과적인 페럿 용량과 최대 허용 인간 용량 사이에 18 내지 22배의 안전 마진이 있을 것으로 예상된다. 독소루비신의 이러한 큰 안전 마진은 rAAV로 형질도입 효율을 개선하기 위해 흡입용 증강제를 활용한다는 개념을 뒷받침해준다.
실시예 4: AV.TL65-SP183-fCFTRΔR로 감염된 유생 및 성체 CF 페럿에서 비강 전위차 (PD) 측정에 의한 CFTR 기능적 보완 및 박테리아 제거
본 실시예는 AV.TL65-SP183-fCFTRΔR 감염 후 비강 PD 측정의 기능적 보완 및 향상된 박테리아 제거를 입증하기 위한 CF 페럿에서의 모델 임상 시험을 설명한다. 이러한 연구는 페럿 CFTR에 대한 면역 반응을 방지하는 내장 교정된 CFTR-KO 페럿 모델을 활용한다. CF 동물의 비강 상피에 AV.TL65-SP183-fCFTRΔR을 전달하면 Vt에서의 CFTR 의존적 변화가 발생할 것으로 예상된다.
실험 설계 및 방법
CF 페럿에서 비강 상피에 대한 유전자 요법. AV.TL65-SP183-fCFTRΔR은 단독으로 또는 증강제와 함께 1 x 1012 DRP/kg의 용량으로 5개월령의 성체 CF 페럿의 비강 상피에 전달된다. 연령 일치 비-CF 대조군은 또한 기준선 값을 결정하기 위해 벡터 및/또는 증강제의 부재 하에 평가된다. 비강 경상피 전압 (Vt) 측정은 이전에 설명한 프로토콜을 사용하여 기준선, 및 감염 후 10일, 20일 및 30일에 수행된다. 경상피 전압 측정은 기준선 측정 후 상피 관류액에 순차적으로 부가되는 하기 작용제/용액의 순차적 부가를 사용하여 평가된다: 아밀로라이드 (100 μM), 무염소 용액, 이소프로테레놀 (10 μM), ATP (100 μM) 및 GlyH-101 (100 μM). 이소프로테레놀의 존재 하에 경상피 전압에 있어서의 변화는 CFTR-매개 Cl 투과성을 반영하고 GlyH-101의 부가는 CFTR로 인한 경우 이러한 전압 상의 변화를 차단해야 한다. 한 예에서, 8마리의 CF 동물 (4마리 수컷 및 4마리 암컷) 및 8마리의 비-CF 대조군 (4마리 수컷 및 4마리 암컷)이 평가된다.
CF 페럿의 폐에 대한 유전자 요법. AV.TL65-SP183-fCFTRΔR은 펜 센츄리 미세 분무기를 사용하여 단독으로 또는 증강제와 함께 1 x 1013 DRP/kg의 용량으로 1개월령의 CF 페럿의 폐 상피에 전달된다 (도 3A-3D에 기재된 실험과 유사함). 대조군 CF 및 비-CF 페럿은 대조군 (예를 들어, 비히클 또는 증강제 단독)을 투여받는다. 유전자 전이 시, 폐의 박테리아 집락 형성을 방지하기 위해 사육 중에 사용된 항생제를 CF 동물과 비-CF 동물 모두에게서 제거한다. 감염 후 12일 또는 증강제 단독의 대조군 전달에, 결함 있는 CF 박테리아 제거를 명확하게 보여주는 신생 CF 및 비-CF 페럿에서 이전에 설명한 것과 유사한 절차를 사용하여 펜 센츄리 미세 분무기를 사용하여 암피실린 내성 피. 아에루기노사(P. aeruginosa) (PA01) (1 x 106 CFU/100 그램 체중)과 에리트로마이신 내성 스타필로코쿠스 슈딘테르메디우스(Staphylococcus pseudintermedius) (1 x 106 CFU/100 그램 체중)의 동등한 혼합물로 동물을 시험감염시켰다. 한 예에서, 16마리의 CF 동물은 벡터 투여를 수반한 경우 및 수반하지 않은 경우 (각각의 조건에 대해 4마리 수컷 및 4마리 암컷)로 평가되고 8마리의 비-CF 대조군 (4마리 수컷 및 4마리 암컷)이 평가된다. 박테리아 시험감염 후 24시간에, 하기 종말점의 정량화를 위해 전체 폐 균질액이 생성된다: 1) 혈액 한천 상의 총 박테리아 CFU, 2) 혈액 한천 상의 암피실린 내성 박테리아 CFU, 3) 혈액 한천 상의 에리트로마이신 내성 박테리아 CFU , 4) 트랜스진 및 내인성 CFTR mRNA, 및 5) 벡터 유래 게놈.
실시예 5: 편광된 인간 CF 기도 상피에서의 CFTR 기능적 보완
본 실시예에서는, AV.TL65-SP183-fCFTRΔR을 사용하여 기능적 CFTR의 구조를 평가하기 위해 단락 전류를 측정하였다. 이러한 검정은 우싱 챔버에서 인간 기관지 상피 (HBE)의 정점 막에서 cAMP 조절된 염화물 채널 활성을 평가한다. 아밀로라이드는 상피 Na+ 채널 활동을 차단하는 데 사용되어, 후속 조작 동안 단락 전류에서의 변화 (ΔISC)가 Cl- 수송에 대한 영향에 부차적임을 확인하였다. 음이온 수송 억제제 4,4'-디이소티오시아노-2,2'-스틸벤디술폰산 (DIDS)은 약 120 mM Cl- 농도의 생리학적 링거 용액과 비교하여 낮은 Cl- 농도 (약 5 mM)를 함유하는 완충액에 적용될 때 Cl-/HCO3 - 교환체로 추정되는 음이온 수송체-1의 차단에 더 효과적이다. cAMP 효능제 포스콜린 및 IBMX는 사이클릭 아데노신 모노포스페이트 (cAMP)-의존성 메커니즘을 통해 CFTR을 활성화시킨다. GlyH101은 우싱 챔버 시스템에서 CFTR의 상대적 기여도 (다른 음이온 수송 경로 대비)를 결정할 수 있도록 하는 CFTR의 특이적 억제제이다. 이러한 연구에서, CF HBE (dF508/dF508) (N=6) 세포는 비-CF HBE 세포 (N=6)와 비교되었으며, 세포는 USG 배지에서 성장되었고; 검정은 AAV 및 PI 처리 (AAV, 10K MOI) 후 7일에 수행되었다. 본 실험에서는 페럿 CFTRΔR 미니유전자를 사용하였지만, 다른 예에서는 인간 CFTRΔR을 사용할 수 있다.
도 4는 대표적인 CF 흔적을 보여준다. AV.TL65+독소루비신 또는 AV.TL65+이다루비신으로 처리된 CF HBE에서 포스콜린-자극 CFTR-매개 염화물 수송 (Isc)은 비-CF HBE에서 포스콜린-자극 CFTR-매개 염화물 수송의 50%를 초과하였다 (도 5). AAV, PI 또는 둘 다를 부가하기 전과 후에 경상피 저항 (TEER) 측정은 변화를 나타내지 않았고 영향을 받지도 않았으며 (있는 경우 TEER이 약간 증가했음), 따라서 AV.TL65+독소루비신 또는 AV.TL65+이다루비신 처리에 대한 반응으로 HBE에 대한 유의한 독성 또는 HBE의 세포 사멸을 명확하게 보여주지 않았다.
실시예 6: AV.TL65-SP183-hCFTRΔR은 표준 치료 요법에 비해 CFTR 활성을 상당히 증가시킬 수 있다
AV.TL65-SP183-hCFTRΔR에 의한 CFTR 활성의 보완은 현재 표준 치료 요법인 VX-809 (LUMACAFTOR)와 VX-770 (IVACAFTOR) - ORKAMBI®의 조합과 비교되었다. AV.TL65-SP183-hCFTRΔR + Dox 또는 Ida의 효과는 2개의 별도의 CF HBE P3 세포주: dF508/dF508 및 dF508/R553X에서 VX-770/VX-809 ("VX")와 비교되었다. 세포를 프로테아좀 억제제 (PI) 또는 비히클 및 AV.TL65로 처리하였다 (MOI = 10K, 25K, 80K). 세포를 브론키아라이프(BronchiaLife)/베르텍스(Vertex) 공기-액체 계면 (ALI) 배지에서 성장시키고 AAV 및 PI 처리 후 7일에 검정하였다. 24-웰 플레이트 검정 (TECC-24)을 위한 경상피 세포 전류 클램프 증폭기를 수행하였다. 포스콜린/VX에 의한 CFTR 활성화는 Cl 전도도를 증가시켜 막 탈분극을 유발한다. DMSO의 부가는 약간의 편차만 발생시켰다.
도 6은 24-웰 트랜스웰 필터 플레이트의 개별 웰로부터의 대표적인 Ieq 흔적 (37℃)을 보여준다. AV.TL65-SP183-hCFTRΔR 처리된 세포에서 CFTR 활성에 있어서의 MOI 의존적 증가가 PI의 존재 하에 관찰되었다. PI의 부재 하에 AV.TL65-SP183-hCFTRΔR로 처리된 세포에서는 CFTR 활성 상의 변화가 관찰되지 않았다. VX-809/VX-770은 CFTR 활성을 상당히 증가시켰다.
도 7은 각각의 조건, n=4에 대한 포스콜린 자극 후 평균 CFTR 매개 염화물 분비를 나타내는 곡선 아래 면적 (AUC) 그래프를 도시한다. AAV 또는 PI 또는 둘 다를 부가하기 전과 후에 경상피 저항 측정은 변화를 나타내지 않았고 영향을 받지 않았다.
이들 데이터는 CFTR 활성이 현재 표준 치료, 예를 들어 VX-770/VX-809 조합 치료에 비해 AV.TL65-SP183-hCFTRΔR에 의해 상당히 증가되었음을 입증해 준다.
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실시예 7: 페럿 폐에 대한 AV.TL65의 반복 투여는 연령 의존적 방식으로 형질도입을 감소시키는 항체 반응을 유도한다
유전자 요법을 사용하여 낭성 섬유증 (CF) 폐 질환을 치료하려면 재조합 아데노 연관 바이러스 (rAAV)의 반복 투여가 필요할 수 있다. 그러나 폐에서의 rAAV 매개 면역 반응에 관해서는 거의 공지되어 있지 않다. 본원에서 본 발명자들은 페럿이 폐로의 CFTR 전달 및 중화 항체 (NAb) 반응의 특징 규명을 위한 AV.TL65의 전임상 시험에 적합한 종이라는 것을 입증하였다. AV.TL65-hCFTRΔR은 인간과 페럿 기도 상피 배양물을 모두 효율적으로 형질도입하였고, CF 기도 배양물에서 CFTR Cl- 전류를 보완하였다. AV.TL65-hCFTRΔR을 신생 페럿 및 유생 페럿 폐로 전달하면, 내인성 fCFTR보다 200-300% 더 높은 수준으로 hCFTR mRNA가 생산되었다. AV.TL65의 단일 투여 (AV.TL65-gLuc) 또는 반복 투여 (AV.TL65-fCFTRΔR에 이어 AV.TL65-gLuc)를 신생 페럿 및 유생 페럿에서 수행하였다. 반복 투여는 두 연령 군에서 거의 동등한 혈장 NAb 반응에도 불구하고, 신생 페럿이 아닌 유생 페럿에서 트랜스진 발현을 상당히 감소시켰고 (11배) 기관지폐포 세척액 (BALF) NAb를 증가시켰다. 특히, 두 연령 군 모두는 반복 투여 후 BALF 항-캡시드 결합 IgG, IgM 및 IgA 항체에서의 감소를 명확하게 보여주었다. 유생 페럿에게 독특한 것은 제2 벡터 투여 후 혈장 항-캡시드 결합 IgM의 억제였다. 따라서, 연령 의존적 면역 체계 성숙 및 이소형 전환은 AV.TL65의 반복 투여 후 고 친화성 폐 NAb의 발달에 영향을 미칠 수 있고 폐에서 무딘 AAV 중화 반응에 대한 경로를 제공할 수 있다.
상기 결과는 하기에 보다 상세하게 하기와 같이 수행되었다.
결과
페럿은 폐에 대한 AV.TL65 유전자 요법의 평가에 적합한 전임상 종이다
AV.TL65 캡시드 변이체가 기도에서 CFTR 기능을 보완할 수 있는지 여부를 평가하기 위해, 본 발명자들은 정점 감염 후 인간 CF ALI 배양물에서 CFTR-매개 Cl- 전류를 교정할 수 있는 AV.TL65-SP183-hCFTRΔR 바이러스의 능력을 시험하였다. rAAV1은 이전에, 인간 ALI 배양물의 정점 형질도입을 위해 가장 잘 수행되는 혈청형 중 하나인 것으로 밝혀졌기 때문에, 본 발명자들은 또한 동일한 AV2-F5tg83-hCFTRΔR 바이러스 게놈을 AAV1 캡시드에 유사패키징하고 AV.TL65와의 비교 분석을 수행하였다. 이러한 비교는 AV.TL65-SP183-hCFTRΔR 바이러스에 의한 정점 감염이 동일한 게놈을 정착시킨 rAAV1 바이러스 (AV1.SP183-hCFTRΔR)에 의한 감염 후보다 더 높은 수준의 CFTR-매개 Cl- 전류 (도 8A) 및 CFTR mRNA (도 8B)를 발생시킨다는 것을 입증해 주었다.
AV.TL65가 또한 페럿 기도 상피를 형질도입할 수 있는지 여부를 평가하기 위해, 본 발명자들은 먼저, 분비된 가우시아 루시페라제 (gLuc) 리포터 벡터인 AV.TL65-SP183gLuc를 사용하여 인간 및 페럿으로부터 유래된 잘 분화된 기관기관지 ALI 배양물에서 시험관내 형질도입 검정을 수행하였다 (도 8C). AV.TL65-SP183gLuc에 의한 이들 배양물의 정점 감염은 두 종 간의 gLuc 트랜스진 발현 수준 상의 유의한 차이를 명확하게 보여주지 않았다. 생체내 페럿 폐에 대한 AV.TL65의 지향성을 확인하기 위해, 본 발명자들은 기관내 전달 후 신생 페럿 및 유생 페럿에서 AV.TL65-SP183-hCFTRΔR의 형질도입 효율을 평가하였다. 이들 연구에서, 트랜스진 유래 hCFTRΔR mRNA의 발현은 형질도입 효율에 대한 지수 (즉, hCFTRΔR/fCFTR mRNA 카피의 비율)로서 내인성 fCFTR mRNA를 참조하였다. 이러한 메트릭을 사용하여, 폐에서의 hCFTRΔR mRNA 발현은 신생 페럿과 유생 페럿 모두에서 내인성 fCFTR mRNA보다 2배 내지 3배 더 컸다 (도 8D). 대조적으로, hCFTRΔR mRNA의 기관 발현은 신생 동물에서 내인성 fCFTR mRNA보다 더 낮았고 유생 동물에서는 거의 동등하였다. AV.TL65를 사용한 기관의 낮은 신생 및 고도로 가변적인 유생 형질도입은 잠재적으로 전달 방법으로 인한 것으로, 이 방법은 바이러스를 기관의 중앙에 주입하기 위해 수술을 사용하였다. 전반적으로, 이러한 시험관내 및 생체내 연구는 페럿이 AV.TL65 감염에 대한 폐에서의 면역학적 반응을 연구하기에 적합한 종이라는 것을 나타낸다.
AV.TL65가 신생 페럿의 폐가 아닌 유생 페럿의 폐에 미리 노출되면 제2 투여에 의한 형질도입이 손상된다
본 발명자들은 2개의 rAAV 벡터 (AV.TL65-SP183-fCFTRΔR 및 AV.TL65-SP183-gLuc)를 활용하여 페럿 폐에 대한 AV.TL65의 반복 투여의 실현 가능성을 평가하였다. AV.TL65-SP183-fCFTRΔR이 제1 바이러스 감염을 위해 선택되었는데, 이는 이러한 벡터가 트랜스진 (즉, 페럿 CFTR 또는 fCFTR)에 대한 면역 반응을 상승시키지 않아야 하기 때문이다. 제2 바이러스 감염의 경우, 본 발명자들은 트랜스진 발현의 시간적 및 정량적 분석을 허용하는 강력한 리포터를 원하였고, 따라서 분비된 gLuc 리포터 벡터인 AV.TL65-SP183-gLuc를 선택하였다. 단일 투여 군의 페럿은 AV.TL65-SP183-gLuc 벡터로만 감염되었고 반복 투여 군의 페럿은 AV.TL65-SP183-fCFTRΔR로 먼저 감염되고 두 번째로 AV.TL65-SP183-gLuc로 감염되었다. 본 발명자들은 먼저, 더 어린 동물에서 반복 투여를 평가하였다 (도 9). 본 발명자들은 신생 페럿에서 이러한 연구를 시작하여, 1주령에 반복 투여 군을 AV.TL65-SP183-fCFTRΔR로 감염시킨 다음, 3주 후에 반복 투여 군 및 단일 투여 (나이브) 군 모두를 AV.TL65-SP183-gLuc 바이러스로 감염시켰다 (도 9A). 루시페라제 활성은 AV.TL65-SP183-gLuc로 감염시킨 후 14일 동안 혈액 샘플에서 모니터링되었고, 실험 종료 시 BALF에서 모니터링되었다. 이러한 연구에서 발견된 사실은 혈장에서의 gLuc 활성이 감염 후 5일에 최고조에 달했고 두 투여 군 모두에서 14일까지 안정적으로 유지되었다는 것을 명확하게 보여주었다 (도 9B). 또한 두 투여 군 간의 혈장 gLuc 활성 수준 상의 유의한 차이는 없었다. 유사하게, 감염 후 14일에 BALF에서의 gLuc 활성은 또한, 두 투여 군 간에 유의하게 상이하지 않았다 (도 9C). 혈장 및 BALF 둘 다에서, gLuc 활성은 나이브 (감염되지 않은) 대조군에서의 배경 수준보다 훨씬 높았다 (도 9B 및 9C).
신생 페럿에 대한 이러한 연구는 폐로의 형질도입의 현저한 감소 없이 AV.TL65를 재투여하는 것이 실현 가능하였다는 것을 입증해주었지만; 신생 페럿에서의 미발달된 면역 체계가 AAV 캡시드에 대항하여 허용된 면역학적 상태를 발생시킬 수 있다는 가능성이 남아 있다. 이러한 이유로 인해, 본 발명자들은 대략 1-2세 영아를 나타내는 1개월령에 반복 투여 군에 대해 AV.TL65-SP183-fCFTRΔR로 제1 감염을 시작한 다음, 4주 후에 gLuc 리포터 벡터 (AV.TL65-SP183-gLuc)를 단일 투여 군 및 반복 투여 군 모두에 전달함으로써 유생 페럿에 대한 실험을 반복하였다 (도 10A). 이러한 제2 연구로부터의 결과는 두 군 모두 감염 후 5일에 최대 혈장 gLuc 활성을 명확하게 보여주었지만, 반복 투여 군은 시험된 모든 시점에서 더 낮은 (15배 내지 34배) 혈장 gLuc 활성을 나타내었다. 단일 투여 및 반복 투여의 신생 군에서의 안정적인 혈장 gLuc 발현과 대조적으로 (도 9B), 본 발명자들은 두 유생 군에서 혈장 gLuc 활성이 점차적으로 감소한다는 것을 관찰하였으며, 반복 투여 동물에서 더 가파른 경향을 보였다 (도 10B). 유사하게, BALF gLuc 활성은 또한, 반복 투여 유생 군에서 유의하게 더 낮았다 (11배) (도 10C). 점증적으로, 이러한 연구는 유생 페럿에서 AAV 캡시드에 대항한 NAb 반응의 잠재력을 시사하였지만, 신생 페럿에 대해서는 그렇지 않았다.
AV.TL65의 반복 투여는 BALF 및 혈장에서 더 높은 NAb 반응을 유도한다
이전에 이러한 바이러스에 노출된 유생 페럿의 폐에서 AV.TL65 형질도입의 감소된 효율을 감안할 때, 본 발명자들은 시험 동물의 BALF 및 혈장에서 NAb를 평가하고자 하였다. 항-AV.TL65 NAb의 역가는 인간 기도 세포주인 A594 세포에서 AV.TL65-SP183-fLuc 형질도입의 억제에 대한 IC50으로서 결정되었다. 단일 및 반복 투여된 신생 페럿에서의 유사한 수준의 트랜스진 발현과 일관되게, BALF에서의 NAb 역가는 두 투여 조건 간에 유의하게 상이하지 않았다 (도 11A). 대조적으로, 유생 페럿의 BALF에서의 NAb 역가는 단일 투여 군과 비교 시 반복 투여 군에서 유의하게 더 높았다 (도 11B). 더욱이, 단일 및 반복 투여 군 모두의 더 나이든 동물에 대한 실험에서의 NAb의 절대 역가는 신생 시험 군보다 더 높았으며 (3 내지 5배), 이는 더 나이든 페럿에서 더 완전히 발달된 면역 반응을 시사한다.
혈장 샘플에 대한 유사한 분석은 AV.TL65 감염 전에 대조군 나이브 군 (도 11C 및 11D) 및 시험 군에서 기존 NAb가 없다는 것을 입증해주었다. 두 연령 군에서, 단일 및 반복 투여 동물은 감염 후 혈장 NAb 역가의 점진적인 시간 의존적 증가를 명확하게 보여주었으며 반복 투여의 유생 페럿은 신생 페럿보다 약간 더 높은 혈장 NAb 역가를 발생시켰다 (2 내지 2.8배). 유생 페럿은 또한 단일 투여 감염 후 혈장에서 NAb를 더 빠르게 생산하였으며, 이는 신생 페럿의 경우의 감염 후 10일과 비교 시 감염 후 5일에 출현되었다. 반복 투여 군의 혈장 NAb 수준은 유생 페럿에서의 감염 후 14일 시점을 제외하고는 두 연령 모두에서 단일 투여 군보다 유의하게 더 높았다.
항-AV.TL65 캡시드 항체 이소형을 정량화하기 위한 ELISA 기반 검정의 개발
AAV2/AAV5 캡시드-셔플링 라이브러리로부터 진화하여, AV.TL65의 VP2 및 가장 풍부한 VP3 캡시드 단백질은 VP1에서의 단일 A581T 돌연변이를 수반한 AAV5로부터 유래된다. AV.TL65의 VP1은 AAV2 VP1의 1-131 aa에 이어 A581T 돌연변이를 정착시킨 AAV5 캡시드의 128-724 aa로부터의 N-말단 고유 서열 (VP1u)이 있는 AAV2와 AAV5 캡시드의 혼성체이다. AAV의 VP1u에는 엔도솜으로부터의 비리온 탈출에 중요한 것으로 생각되는 포스포리파제 A2 (PLA2) 촉매 도메인이 정착되어 있다. AV.TL65-감염 페럿의 혈장 및 BALF에서의 AV.TL65 캡시드 특이적 이뮤노글로불린 (IgG, IgM 및 IgA)을 평가하기 위해, AAV 바이러스 입자를 코팅 항원으로서 사용하는 ELISA 검정이 개발되었다. 이러한 방법을 검증하기 위해, 본 발명자들은 AV.TL65 바이러스가 1 내지 2개월 간격으로 4회 폐에 전달된 1개월령의 페럿으로부터 수집된 혈장을 사용하였다. 코팅 항원으로서 AAV5 입자를 사용하면, 나이브와 AV.TL65-면역 혈장 간의 차별적인 IgG 결합은 1:50 희석에서 시작한 것으로 관찰되었으며, 1:1250 희석까지는 나이브 혈장의 결합이 없는 반면 AV.TL65-면역 혈장 항체 결합은 높게 유지되었다 (도 12A). 대조적으로, AAV2를 코팅 항원으로서 사용한 경우, 면역 혈장과 나이브 혈장 간의 혈장 IgG 결합에는 모든 희석액에서 차이가 없었고, IgG 검출 감수성은 AAV5보다 훨씬 더 낮았다 (도 12B). 이러한 발견은 AV.TL65의 표면 항원 에피토프가 AAV5 캡시드와 유사한 면역원성을 나타낸다는 것을 시사하고, 이러한 이유로 인해 본 발명자들은 시험 동물의 BALF 및 혈장에서 항-캡시드 항체 이소형의 분류를 위한 코팅 항원으로서 AAV5를 사용하기로 선택하였다.
다음으로 본 발명자들은 시험 동물의 BALF 및 혈장에서 항-캡시드 항체 이소형 (IgG, IgM 및 IgA)의 분류를 위해 이러한 ELISA 방법을 사용하였다 (도 12 및 13). 일반적으로, 신생 페럿 및 유생 페럿은 단일 투여 군 및 반복 투여 군 모두의 혈장에서 유사한 AAV5 반응성 IgG 반응을 유도했지만, 역가는 반복 감염 후에 더 높았다 (도 13A 및 13D). 대조적으로, 혈장 AAV5-반응성 IgM (도 13B 및 13E) 및 IgA (도 13C 및 13F) 반응은 동물의 연령 및 투여 요법과 관련하여 IgG의 반응과의 차이를 명확하게 보여주었다. 예를 들어, 캡시드 결합 혈장 IgM 수준은 반복 투여 군의 유생 동물에서만 억제된 반면 (도 13B 및 13E), 캡시드 결합 혈장 IgA 수준은 반복 투여 후 두 연령 군에서 모두 억제되었다. 더욱이, 신생 동물은 초기에는 시간이 지남에 따라 가라앉는 제2 바이러스 노출 후 초기에 큰 항-캡시드 IgA 반응을 보인 반면, 유생 동물은 이러한 반응이 결여되었다 (도 13C 및 13F). 이러한 발견은 항체 이소형 전환에 있어서의 연령 의존적 차이가 AV.TL65에 대한 사전 노출에 의해 영향을 받을 수 있음을 시사한다. 예상과 달리, BALF에서의 AAV5 반응성 IgG, IgM 및 IgA는 신생 동물 및 유생 동물 모두에 대해 반복 투여 군과 비교 시, 단일 투여 군에서 유의하게 더 높았다 (도 14). 더욱이, 캡시드 결합 IgG, IgM 및 IgA의 절대 수준은 바이러스에 2회 노출된 유생 동물의 BALF에서의 더 높은 수준의 NAb에도 불구하고 두 연령 군과 투여 조건 간에 일반적으로 유사하였다 (도 11A 및 11B).
재료 및 방법
재조합 AV.TL65 바이러스 벡터의 생산
pAV.TL65repcap (상기 문헌 [Excoffon et al., 2009])은 AV1-SP183-hCFTRΔR, 및 AV.TL65-SP183-hCFTRΔR, AV.TL65-SP183-fCFTRΔR, AV.TL65-SP183-fLuc, AV.TL65-SP183-gLuc의 생산을 위한 AV.TL65 캡시드를 생성하는 데 사용된 AAV 헬퍼 플라스미드였다. 패키징에 사용된 rAAV 프로바이러스 플라스미드는 pAV2.F5tg83-hCFTRΔR 및 pAV2.F5tg83-fCFTRΔR, 뿐만 아니라 pAV2-F5tg83fLuc (반딧불이 루시페라제 리포터) 및 pAV2-F5tg83gLuc (가우시아 루시페라제 리포터)였다. AV.TL65 벡터는 삼중 플라스미드 형질감염 방법을 사용하여 필라델피아 아동 병원 (CHOP)의 벡터 코어에서 생산되었다. 간단히 언급하면, AAV 헬퍼 pAV.TL65repcap 및 아데노바이러스 헬퍼 pAd를 AAV 프로바이러스 벡터 중 하나와 함께 HEK293 세포에 형질감염시켰다. 형질감염된 HEK293 세포로부터 생산된 rAAV 벡터를 CsCl-밀도 구배에서 정제하였다. 역가는 트랜스진에 특이적인 프라이머 및 프로브를 사용하여 정량적 실시간 폴리머라제 연쇄 반응 (qPCR)에 의해 결정되었고, 벡터 스톡의 순도는 은 염색 후 SDS-PAGE에 의해 평가되었다.
인간 및 페럿 기도 상피에서 AV.TL65 벡터의 시험관내 평가
페럿이 AV.TL65의 분석에 적합한 종인지 여부를 평가하기 위해, 본 발명자들은 초기에, 인간과 페럿으로부터 유래된 잘 분화된 기관기관지 ALI 배양물에서 시험관내 형질도입 실험을 수행하였다. 리포터 벡터인 AV.TL65-SP183gLuc는 10,000 DRP (DNase-저항성 입자)/세포의 MOI (감염 다중도)에서 인간 (2명의 공여자로부터의 n=6 트랜스웰) 및 페럿 (2마리의 공여자로부터의 n=6 트랜스웰)의 기도 상피 ALI 배양물에 정점으로 접종되었다. 감염 기간 동안, 배양 배지에 4 μM의 최종 농도로 독소루비신을 보충하고, 감염 5일 후 가우시아 루시페라제 활성의 상대 발광 단위 (RLU)를 레닐라 루시페라제 활성 검정 키트 [프로메가(Promega)]에 대한 제조업제의 지침에 따라 측정하였으며, 이러한 키트는 가우시아 루시페라제와 레닐라 루시페라제의 측정을 위해 설계되었다. 2개의 감염되지 않은 트랜스웰이 대조군으로서 설정되었다.
AV1-SP183-hCFTRΔR 및 AV.TL65-SP183-hCFTRΔR 바이러스로 인간 CF 기도 상피 감염 후 CFTR-매개 전류의 시험관내 비교
hCFTRΔR을 발현하고 CFTR 기능을 보완하기 위한 AV.TL65-SP183-hCFTRΔR 및 AV1-SP183-hCFTRΔR의 유효성은 CF 환자의 근위 기도로부터 유래된 편광된 인간 ALI 배양물 (F508del/F508del)에서 평가되었다. 각각의 벡터는 독소루비신 (2.5 μM) 및 LLnL (20 μM)의 존재 하에 100,000 DRP/세포의 MOI로 ALI 배양물 (2명의 공여자로부터의 n=4 트랜스웰)에 정점으로 적용되었다. 이들 2개의 프로테아좀 조정제는 여러 AAV 혈청형에 의한 형질도입을 증강시키는 것으로 나타났다. 감염 후 12일에, cAMP 자극 (IBMX/포스콜린) 및 CFTR 억제 (GlyH101) 후 단락 전류 상의 변화 (ΔIsc)를 결정하기 위해 이전에 기재된 바와 같이 우싱 챔버에서 CFTR-매개 Cl- 전류를 측정하였다. 감염되지 않은 ALI 배양물 (2명의 공여자로부터의 n=4 트랜스웰)을 기준선 대조군으로서 사용하였다. ΔIsc를 측정한 후, 각각의 바이러스 감염 군으로부터의 2개의 삽입물을 풀링하고 RNeasy® 플러스 미니 키트 [퀴아젠(Qiagene)]를 사용하여 전체 RNA에 대해 용해시켰다. mRNA를 cDNA로 전환시킨 후, 벡터 유래 hCFTRΔR mRNA를 TaqMan® PCR에 의해 정량화하고 인간 GAPDH mRNA로 정규화하였다.
신생 및 유생 페럿 폐에서 AV.TL65 형질도입의 분석
3일령의 신생 페럿 (n=3) 또는 1개월령의 유생 페럿 (n=3)에게 독소루비신 (최종 농도 250 μM)과 혼합된 AV.TL65-SP183-hCFTRΔR 바이러스를 체중 그램당 4x1010 DRP로 기관내로 투여하였다. 모의 감염 군 (n=3)의 페럿에게는 PBS 중 Dox (250 μM)만 접종하였다. 감염 후 11일에 동물을 안락사시키고, 기관 및 폐 조직을 별도로 수거하고, 급속 냉동시키고, 전체 RNA 추출을 위해 분쇄하였다. 트랜스진 hCFTRΔR 및 내인성 fCFTR의 벡터 유래 mRNA를 TaqMan®에 의해 정량화하고, hCFTRΔR 및 fCFTRΔR의 카피 수를 GAPDH로 정규화한 후 hCFTRΔR/fCFTR의 비율로서 표현하였다.
체액 반응 연구를 위해 페럿에게 AV.TL65-SP183-fCFTRΔR 및/또는 AV.TL65-SP183-gLuc를 투여함
본 발명자들은 하기 실험 설계를 사용하여 신생 및 유생 페럿에 대한 AV.TL65 벡터의 반복 투여를 평가하였다. 신생 페럿: AV.TL65-SP183-gLuc 리포터 벡터를 AV.TL65 캡시드에 대해 나이브하거나 또는 1주령에 AV.TL65-SP183-fCFTΔR로 이전에 감염된 4주령의 페럿에 기관내로 투여하였다. 유생 페럿: AV.TL65-SP183-gLuc 리포터 벡터를 AV.TL65 캡시드에 대해 나이브하거나 또는 4주령에 AV.TL65-SP183-fCFTRΔR로 이전에 감염된 8주령의 페럿에 기관내로 투여하였다. 각각의 용량에 대해, 동물에게 AV.TL65-SP183gLuc 또는 AV.TL65-SP183-fCFTRΔR 벡터 (1x1013 DRP/kg) 및 독소루비신 (200 μM 최종 농도)을 함유하는 접종물을 투여하였다. 외과적 기관내 주사는 이소플루오란과 산소의 혼합물로 마취 하에 키트에 투여된 150 μl 접종물을 사용하여 1주령의 신생 페럿에서 수행되었다. 다른 연령대의 경우에는, 케타민과 자일라진의 혼합물을 피하 주사하여 마취 하에 미세 분무기® 에어로졸라이저를 사용하여 바이러스를 기관내로 투여하였다. 에어로졸화를 위한 벡터/독소루비신 접종물의 용적은 페럿 체중으로 정규화되었다 (5 ml/kg).
가우시아 루시페라제 활성의 측정을 위한 출혈 및 기관지폐포 세척액 수집
AV.TL65-SP183-gLuc 리포터 벡터의 전달 후 0일, 5일, 10일 및 14일에 마취된 페럿로부터 혈장을 헤파린 처리된 튜브에 수집하였다. 동물을 EUTHASOL® [비르박 AH 인크.(Virbac AH Inc.)]로 안락사시키고, 체중 300그램당 PBS 5 ml를 점적시킴으로써 기관/폐 카세트로부터 기관지폐포 세척액 (BALF)을 수집하였다. 혈장 및 BALF에서 gLuc 활성은 샘플 수집 후 즉시 측정되었다.
혈장 및 BALF를 사용한 항체 중화 검정
미세 중화 검정은 이전에 보고된 방법에 대한 변형을 사용하여 수행되었다 (Wu et al. Front Immunol. 8:1649, 2017). 혈장 및 BALF에서의 NAb의 역가는 감염 전에 연속 희석된 혈장 또는 BALF와 함께 인큐베이션된 AV.TL65-SP183-fLuc 바이러스로 A549 세포를 감염시킨 후 리포터 유전자 발현에서의 감소로서 정량화되었다. 간단히 언급하면, 페럿으로부터의 모든 혈장 샘플은 열 불활성화되었다 (56℃, 30분). 혈장의 5배 연속 희석액 (1:50에서 시작하여 1:156,250에서 종료함)을 100 μl의 총 용적으로 AV.TL65-SP183-fLuc와 함께 인큐베이션하였다. BALF의 경우에도 동일한 조건을 적용했지만, 연속 희석은 1:5에서 시작하여 1:3125에서 종료되었다. 이들 혼합물을 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하여 항체 결합 및 중화를 용이하게 한 다음, 각각의 희석액에 대해 이중으로 48-웰 플레이트 (1x105/웰, MOI=5000 DRP/세포)의 A549 세포 단층에 적용하였다. 세포를 바이러스 혼합물과 함께 37℃/5% CO2에서 1시간 동안 인큐베이션한 후, 웰에 2% 소 태아 혈청을 함유하는 DMEM을 보충하고 추가로 24시간 동안 인큐베이션하였다. 그런 다음 세포 용해물 중의 반딧불이 루시페라제 활성을 제조업체의 지침에 따라 반딧불이 루시페라제 검정 키트 (프로메가)로 측정하였다. 이러한 검정이 수행될 때마다 AV.TL65-SP183-fLuc로만 감염된 A549 세포가 100% 형질도입을 위한 참조 대조군으로서 사용되었다. 각각의 혈장 또는 BALF 샘플의 중화 역가는 최대 억제 농도의 절반 (IC50)으로서 계산되었다.
혈장 및 BALF에서 캡시드 결합 IgG, IgM 및 IgA의 ELISA 측정
혈장 및 BALF에서 총 캡시드 결합 IgG, IgM 및 IgA를 포착하고 정량화하기 위해 ELISA 절차를 사용하였다. 간단히 언급하면, 탄산염 완충액 중 rAAV5는 4℃에서 밤새 96 웰 ELISA 플레이트와 결합되었다 (1x109 DRP/웰). 시험된 혈장 샘플 (IgG 및 IgM의 경우에는 1:2000로 희석되고, IgA의 경우에는 1:20으로 희석됨) 및 희석되지 않은 BALF 샘플을 각각의 웰에 적용하고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. PBS-T (0.05% 트윈-20)로 3회 세척한 후, 희석된 HRP-접합된 2차 항체를 부가하고 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. HRP-접합된 2차 항체는 치킨 항-페럿 IgG [갈루스 이뮤노텍(Gallus Immunotech) 또는 압캠(Abcam)] 및 염소 항-페럿 IgM 또는 IgA [라이프-바이오 인크.(Life-Bio Inc.)]를 포함하였다. 그런 다음, HRP 반응 산물을 플레이트 판독기에서 흡광도로서 정량화하였다.
통계 분석
실험 데이터는 평균 ± SD로서 제시되며 데이터 분석을 위해 프리즘 7 [그래프패드 소프트웨어, 인크. (GraphPad Software, Inc.; 미국 캘리포니아주 샌디에이고)]이 사용되었다. 통계적 유의성은 일원 분산 분석 (ANOVA)에 이어 터키 검정으로 분석되었다 (*P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001, ****P<0.0001).
동물 보호 윤리 선언문
모든 동물 실험은 아이오와 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회에서 승인한 프로토콜에 따라 수행되었다.
모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 본원에 참조로 포함된다. 전술한 명세서에서, 본 발명은 그의 특정의 바람직한 실시양태와 관련하여 설명되었고, 많은 세부 사항이 예시의 목적으로 제시되었지만, 본 발명이 부가의 실시양태에 감수성이란 것과, 본원의 특정 세부 사항이 본 발명의 기본 원리를 벗어나지 않고서도 상당히 다양할 수 있다는 것이 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> Engelhardt, John F. Yan, Ziying Tang, Yinghua Yuen, Eric Lin, Shen University of Iowa Research Foundation Spirovant Sciences, Inc. <120> COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATMENT OF CYSTIC FIBROSIS <130> 875.193WO1 <140> PCT/US2020/028264 <141> 2020-04-15 <150> US 62/833,972 <151> 2019-04-19 <150> US 62/926,308 <151> 2019-10-25 <150> US 62/967,214 <151> 2020-01-29 <160> 18 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 107 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic nucleic acid sequence <400> 1 gaattcgtgg tgagcgtctg ggcatgtctg ggcatgtctg ggcatgtctg ggcatgtcgg 60 gcattctggg cgtctgggca tgtctgggca tgtctgggca tctcgag 107 <210> 2 <211> 77 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic nucleic acid sequence <400> 2 aacggtgacg tgcacgcgtg ggcggagcca tcacgcaggt tgctatataa gcagagctcg 60 tttagtgaac cgtcaga 77 <210> 3 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic nucleic acid sequence <400> 3 gtcgagcccg agagacc 17 <210> 4 <211> 4287 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic nucleic acid sequence <400> 4 atgcagaggt cgcctctgga aaaggccagc gttgtctcca aacttttttt cagctggacc 60 agaccaattt tgaggaaagg atacagacag cgcctggaat tgtcagacat ataccaaatc 120 ccttctgttg attctgctga caatctatct gaaaaattgg aaagagaatg ggatagagag 180 ctggcttcaa agaaaaatcc taaactcatt aatgcccttc ggcgatgttt tttctggaga 240 tttatgttct atggaatctt tttatattta ggggaagtca ccaaagcagt acagcctctc 300 ttactgggaa gaatcatagc ttcctatgac ccggataaca aggaggaacg ctctatcgcg 360 atttatctag gcataggctt atgccttctc tttattgtga ggacactgct cctacaccca 420 gccatttttg gccttcatca cattggaatg cagatgagaa tagctatgtt tagtttgatt 480 tataagaaga ctttaaagct gtcaagccgt gttctagata aaataagtat tggacaactt 540 gttagtctcc tttccaacaa cctgaacaaa tttgatgaag gacttgcatt ggcacatttc 600 gtgtggatcg ctcctttgca agtggcactc ctcatggggc taatctggga gttgttacag 660 gcgtctgcct tctgtggact tggtttcctg atagtccttg ccctttttca ggctgggcta 720 gggagaatga tgatgaagta cagagatcag agagctggga agatcagtga aagacttgtg 780 attacctcag aaatgatcga 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agccatcacg caggttgcta 300 tataagcaga gctcgtttag tgaaccgtca gagtcgagcc cgagagacca tgcagaggtc 360 gcctctggaa aaggccagcg ttgtctccaa actttttttc agctggacca gaccaatttt 420 gaggaaagga tacagacagc gcctggaatt gtcagacata taccaaatcc cttctgttga 480 ttctgctgac aatctatctg aaaaattgga aagagaatgg gatagagagc tggcttcaaa 540 gaaaaatcct aaactcatta atgcccttcg gcgatgtttt ttctggagat ttatgttcta 600 tggaatcttt ttatatttag gggaagtcac caaagcagta cagcctctct tactgggaag 660 aatcatagct tcctatgacc cggataacaa ggaggaacgc tctatcgcga tttatctagg 720 cataggctta tgccttctct ttattgtgag gacactgctc ctacacccag ccatttttgg 780 ccttcatcac attggaatgc agatgagaat agctatgttt agtttgattt ataagaagac 840 tttaaagctg tcaagccgtg ttctagataa aataagtatt ggacaacttg ttagtctcct 900 ttccaacaac ctgaacaaat ttgatgaagg acttgcattg gcacatttcg tgtggatcgc 960 tcctttgcaa gtggcactcc tcatggggct aatctgggag ttgttacagg cgtctgcctt 1020 ctgtggactt ggtttcctga tagtccttgc cctttttcag gctgggctag ggagaatgat 1080 gatgaagtac agagatcaga gagctgggaa gatcagtgaa agacttgtga ttacctcaga 1140 aatgatcgag aacatccaat ctgttaaggc atactgctgg gaagaagcaa tggaaaaaat 1200 gattgaaaac ttaagacaaa cagaactgaa actgactcgg aaggcagcct atgtgagata 1260 cttcaatagc tcagccttct tcttctcagg gttctttgtg gtgtttttat ctgtgcttcc 1320 ctatgcacta atcaaaggaa tcatcctccg gaaaatattc accaccatct cattctgcat 1380 tgttctgcgc atggcggtca ctcggcaatt tccctgggct gtacaaacat ggtatgactc 1440 tcttggagca ataaacaaaa tacaggattt cttacaaaag caagaatata agacattgga 1500 atataactta acgactacag aagtagtgat ggagaatgta acagccttct gggaggaggg 1560 atttggggaa ttatttgaga aagcaaaaca aaacaataac aatagaaaaa cttctaatgg 1620 tgatgacagc ctcttcttca gtaatttctc acttcttggt actcctgtcc tgaaagatat 1680 taatttcaag atagaaagag gacagttgtt ggcggttgct ggatccactg gagcaggcaa 1740 gacttcactt ctaatgatga ttatgggaga actggagcct tcagagggta aaattaagca 1800 cagtggaaga atttcattct gttctcagtt ttcctggatt atgcctggca ccattaaaga 1860 aaatatcatc tttggtgttt cctatgatga atatagatac agaagcgtca tcaaagcatg 1920 ccaactagaa gaggacatct ccaagtttgc agagaaagac aatatagttc ttggagaagg 1980 tggaatcaca ctgagtggag gtcaacgagc aagaatttct ttagcaagag cagtatacaa 2040 agatgctgat ttgtatttat tagactctcc ttttggatac ctagatgttt taacagaaaa 2100 agaaatattt gaaagctgtg tctgtaaact gatggctaac aaaactagga ttttggtcac 2160 ttctaaaatg gaacatttaa agaaagctga caaaatatta attttgcatg aaggtagcag 2220 ctatttttat gggacatttt cagaactcca aaatctacag ccagacttta gctcaaaact 2280 catgggatgt gattctttcg accaatttag tgcagaaaga agaaattcaa tcctaactga 2340 gaccttacac cgtttctcat tagaaggaga tgctcctgtc tcctggacag aaacaaaaaa 2400 acaatctttt aaacagactg gagagtttgg ggaaaaaagg aagaattcta ttctcaatcc 2460 aatcaactct acgcttcagg cacgaaggag gcagtctgtc ctgaacctga tgacacactc 2520 agttaaccaa ggtcagaaca ttcaccgaaa gacaacagca tccacacgaa aagtgtcact 2580 ggcccctcag gcaaacttga ctgaactgga tatatattca agaaggttat ctcaagaaac 2640 tggcttggaa ataagtgaag aaattaacga agaagactta aaggagtgcc tttttgatga 2700 tatggagagc ataccagcag tgactacatg gaacacatac cttcgatata ttactgtcca 2760 caagagctta atttttgtgc taatttggtg cttagtaatt tttctggcag aggtggctgc 2820 ttctttggtt gtgctgtggc tccttggaaa cactcctctt caagacaaag ggaatagtac 2880 tcatagtaga aataacagct atgcagtgat tatcaccagc accagttcgt attatgtgtt 2940 ttacatttac gtgggagtag ccgacacttt gcttgctatg ggattcttca gaggtctacc 3000 actggtgcat actctaatca cagtgtcgaa aattttacac cacaaaatgt tacattctgt 3060 tcttcaagca cctatgtcaa ccctcaacac gttgaaagca ggtgggattc ttaatagatt 3120 ctccaaagat atagcaattt tggatgacct tctgcctctt accatatttg acttcatcca 3180 gttgttatta attgtgattg gagctatagc agttgtcgca gttttacaac cctacatctt 3240 tgttgcaaca gtgccagtga tagtggcttt tattatgttg agagcatatt tcctccaaac 3300 ctcacagcaa ctcaaacaac tggaatctga aggcaggagt ccaattttca ctcatcttgt 3360 tacaagctta aaaggactat ggacacttcg tgccttcgga cggcagcctt actttgaaac 3420 tctgttccac aaagctctga atttacatac tgccaactgg ttcttgtacc tgtcaacact 3480 gcgctggttc caaatgagaa tagaaatgat ttttgtcatc ttcttcattg ctgttacctt 3540 catttccatt ttaacaacag gagaaggaga aggaagagtt ggtattatcc tgactttagc 3600 catgaatatc atgagtacat tgcagtgggc tgtaaactcc agcatagatg tggatagctt 3660 gatgcgatct gtgagccgag tctttaagtt cattgacatg ccaacagaag gtaaacctac 3720 caagtcaacc aaaccataca agaatggcca actctcgaaa gttatgatta ttgagaattc 3780 acacgtgaag aaagatgaca tctggccctc agggggccaa atgactgtca aagatctcac 3840 agcaaaatac acagaaggtg gaaatgccat attagagaac atttccttct caataagtcc 3900 tggccagagg gtgggcctct tgggaagaac tggatcaggg aagagtactt tgttatcagc 3960 ttttttgaga ctactgaaca ctgaaggaga aatccagatc gatggtgtgt cttgggattc 4020 aataactttg caacagtgga ggaaagcctt tggagtgata ccacagaaag tatttatttt 4080 ttctggaaca tttagaaaaa acttggatcc ctatgaacag tggagtgatc aagaaatatg 4140 gaaagttgca gatgaggttg ggctcagatc tgtgatagaa cagtttcctg ggaagcttga 4200 ctttgtcctt gtggatgggg gctgtgtcct aagccatggc cacaagcagt tgatgtgctt 4260 ggctagatct gttctcagta aggcgaagat cttgctgctt gatgaaccca gtgctcattt 4320 ggatccagta acataccaaa taattagaag aactctaaaa caagcatttg ctgattgcac 4380 agtaattctc tgtgaacaca ggatagaagc aatgctggaa tgccaacaat ttttggtcat 4440 agaagagaac aaagtgcggc agtacgattc catccagaaa ctgctgaacg agaggagcct 4500 cttccggcaa gccatcagcc cctccgacag ggtgaagctc tttccccacc ggaactcaag 4560 caagtgcaag tctaagcccc agattgctgc tctgaaagag gagacagaag aagaggtgca 4620 agatacaagg ctttagagag cagcataaat gttgacatgg gacatttgct catggaattg 4680 gcaggcctaa taaagagctc agatgcatcg atcagagtgt gttggttttt tgtgtgtact 4740 gaggaacccc tagtgatgga gttggccact ccctctctgc gcgctcgctc gctcactgag 4800 gccgggcgac caaaggtcgc ccgacgcccg ggctttgccc gggcggcctc agtgagcgag 4860 cgagcgcgca gagagggagt ggcc 4884 <210> 18 <211> 7749 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic nucleic acid sequence <400> 18 ccactccctc tctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc 60 gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca 120 actccatcac taggggttcc tcagatctga attcgtggtg agcgtctggg catgtctggg 180 catgtctggg catgtctggg catgtcgggc attctgggcg tctgggcatg tctgggcatg 240 tctgggcatc tcgagaacgg tgacgtgcac gcgtgggcgg agccatcacg caggttgcta 300 tataagcaga gctcgtttag tgaaccgtca gagtcgagcc cgagagacca tgcagaggtc 360 gcctctggaa aaggccagcg ttgtctccaa actttttttc agctggacca gaccaatttt 420 gaggaaagga tacagacagc gcctggaatt gtcagacata taccaaatcc cttctgttga 480 ttctgctgac aatctatctg aaaaattgga aagagaatgg gatagagagc tggcttcaaa 540 gaaaaatcct aaactcatta atgcccttcg gcgatgtttt ttctggagat ttatgttcta 600 tggaatcttt ttatatttag gggaagtcac caaagcagta cagcctctct tactgggaag 660 aatcatagct tcctatgacc cggataacaa ggaggaacgc tctatcgcga tttatctagg 720 cataggctta tgccttctct ttattgtgag gacactgctc ctacacccag ccatttttgg 780 ccttcatcac attggaatgc agatgagaat agctatgttt agtttgattt ataagaagac 840 tttaaagctg tcaagccgtg ttctagataa aataagtatt ggacaacttg ttagtctcct 900 ttccaacaac ctgaacaaat ttgatgaagg acttgcattg gcacatttcg tgtggatcgc 960 tcctttgcaa gtggcactcc tcatggggct aatctgggag ttgttacagg cgtctgcctt 1020 ctgtggactt ggtttcctga tagtccttgc cctttttcag gctgggctag ggagaatgat 1080 gatgaagtac agagatcaga gagctgggaa gatcagtgaa agacttgtga ttacctcaga 1140 aatgatcgag aacatccaat ctgttaaggc atactgctgg gaagaagcaa tggaaaaaat 1200 gattgaaaac ttaagacaaa cagaactgaa actgactcgg aaggcagcct atgtgagata 1260 cttcaatagc tcagccttct tcttctcagg gttctttgtg gtgtttttat ctgtgcttcc 1320 ctatgcacta atcaaaggaa tcatcctccg gaaaatattc accaccatct cattctgcat 1380 tgttctgcgc atggcggtca ctcggcaatt tccctgggct gtacaaacat ggtatgactc 1440 tcttggagca ataaacaaaa tacaggattt cttacaaaag caagaatata agacattgga 1500 atataactta acgactacag aagtagtgat ggagaatgta acagccttct gggaggaggg 1560 atttggggaa ttatttgaga aagcaaaaca aaacaataac aatagaaaaa cttctaatgg 1620 tgatgacagc ctcttcttca gtaatttctc acttcttggt actcctgtcc tgaaagatat 1680 taatttcaag atagaaagag gacagttgtt ggcggttgct ggatccactg gagcaggcaa 1740 gacttcactt ctaatgatga ttatgggaga actggagcct tcagagggta aaattaagca 1800 cagtggaaga atttcattct gttctcagtt ttcctggatt atgcctggca ccattaaaga 1860 aaatatcatc tttggtgttt cctatgatga atatagatac agaagcgtca tcaaagcatg 1920 ccaactagaa gaggacatct ccaagtttgc agagaaagac aatatagttc ttggagaagg 1980 tggaatcaca ctgagtggag gtcaacgagc aagaatttct ttagcaagag cagtatacaa 2040 agatgctgat ttgtatttat tagactctcc ttttggatac ctagatgttt taacagaaaa 2100 agaaatattt gaaagctgtg tctgtaaact gatggctaac aaaactagga ttttggtcac 2160 ttctaaaatg gaacatttaa agaaagctga caaaatatta attttgcatg aaggtagcag 2220 ctatttttat gggacatttt cagaactcca aaatctacag ccagacttta gctcaaaact 2280 catgggatgt gattctttcg accaatttag tgcagaaaga agaaattcaa tcctaactga 2340 gaccttacac cgtttctcat tagaaggaga tgctcctgtc tcctggacag aaacaaaaaa 2400 acaatctttt aaacagactg gagagtttgg ggaaaaaagg aagaattcta ttctcaatcc 2460 aatcaactct acgcttcagg cacgaaggag gcagtctgtc ctgaacctga tgacacactc 2520 agttaaccaa ggtcagaaca ttcaccgaaa gacaacagca tccacacgaa aagtgtcact 2580 ggcccctcag gcaaacttga ctgaactgga tatatattca agaaggttat ctcaagaaac 2640 tggcttggaa ataagtgaag aaattaacga agaagactta aaggagtgcc tttttgatga 2700 tatggagagc ataccagcag tgactacatg gaacacatac cttcgatata ttactgtcca 2760 caagagctta atttttgtgc taatttggtg cttagtaatt tttctggcag aggtggctgc 2820 ttctttggtt gtgctgtggc tccttggaaa cactcctctt caagacaaag ggaatagtac 2880 tcatagtaga aataacagct atgcagtgat tatcaccagc accagttcgt attatgtgtt 2940 ttacatttac gtgggagtag ccgacacttt gcttgctatg ggattcttca gaggtctacc 3000 actggtgcat actctaatca cagtgtcgaa aattttacac cacaaaatgt tacattctgt 3060 tcttcaagca cctatgtcaa ccctcaacac gttgaaagca ggtgggattc ttaatagatt 3120 ctccaaagat atagcaattt tggatgacct tctgcctctt accatatttg acttcatcca 3180 gttgttatta attgtgattg gagctatagc agttgtcgca gttttacaac cctacatctt 3240 tgttgcaaca gtgccagtga tagtggcttt tattatgttg agagcatatt tcctccaaac 3300 ctcacagcaa ctcaaacaac tggaatctga aggcaggagt ccaattttca ctcatcttgt 3360 tacaagctta aaaggactat ggacacttcg tgccttcgga cggcagcctt actttgaaac 3420 tctgttccac aaagctctga atttacatac tgccaactgg ttcttgtacc tgtcaacact 3480 gcgctggttc caaatgagaa tagaaatgat ttttgtcatc ttcttcattg ctgttacctt 3540 catttccatt ttaacaacag gagaaggaga aggaagagtt ggtattatcc tgactttagc 3600 catgaatatc atgagtacat tgcagtgggc tgtaaactcc agcatagatg tggatagctt 3660 gatgcgatct gtgagccgag tctttaagtt cattgacatg ccaacagaag gtaaacctac 3720 caagtcaacc aaaccataca agaatggcca actctcgaaa gttatgatta ttgagaattc 3780 acacgtgaag aaagatgaca tctggccctc agggggccaa atgactgtca aagatctcac 3840 agcaaaatac acagaaggtg gaaatgccat attagagaac atttccttct caataagtcc 3900 tggccagagg gtgggcctct tgggaagaac tggatcaggg aagagtactt tgttatcagc 3960 ttttttgaga ctactgaaca ctgaaggaga aatccagatc gatggtgtgt cttgggattc 4020 aataactttg caacagtgga ggaaagcctt tggagtgata ccacagaaag tatttatttt 4080 ttctggaaca tttagaaaaa acttggatcc ctatgaacag tggagtgatc aagaaatatg 4140 gaaagttgca gatgaggttg ggctcagatc tgtgatagaa cagtttcctg ggaagcttga 4200 ctttgtcctt gtggatgggg gctgtgtcct aagccatggc cacaagcagt tgatgtgctt 4260 ggctagatct gttctcagta aggcgaagat cttgctgctt gatgaaccca gtgctcattt 4320 ggatccagta acataccaaa taattagaag aactctaaaa caagcatttg ctgattgcac 4380 agtaattctc tgtgaacaca ggatagaagc aatgctggaa tgccaacaat ttttggtcat 4440 agaagagaac aaagtgcggc agtacgattc catccagaaa ctgctgaacg agaggagcct 4500 cttccggcaa gccatcagcc cctccgacag ggtgaagctc tttccccacc ggaactcaag 4560 caagtgcaag tctaagcccc agattgctgc tctgaaagag gagacagaag aagaggtgca 4620 agatacaagg ctttagagag cagcataaat gttgacatgg gacatttgct catggaattg 4680 gcaggcctaa taaagagctc agatgcatcg atcagagtgt gttggttttt tgtgtgtact 4740 gaggaacccc tagtgatgga gttggccact ccctctctgc gcgctcgctc gctcactgag 4800 gccgggcgac caaaggtcgc ccgacgcccg ggctttgccc gggcggcctc agtgagcgag 4860 cgagcgcgca gagagggagt ggcccccccc cccccccccc ctgcagcctg gcgtaatagc 4920 gaagaggccc gcaccgatcg cccttcccaa cagttgcgca gcctgaatgg cgaatggacg 4980 cgccctgtag cggcgcatta agcgcggcgg gtgtggtggt tacgcgcagc gtgaccgcta 5040 cacttgccag cgccctagcg cccgctcctt tcgctttctt cccttccttt ctcgccacgt 5100 tcgccggctt tccccgtcaa gctctaaatc gggggctccc tttagggttc cgatttagtg 5160 ctttacggca cctcgacccc aaaaaacttg attagggtga tggttcacgt agtgggccat 5220 cgccctgata gacggttttt cgccctttga cgttggagtc cacgttcttt aatagtggac 5280 tcttgttcca aactggaaca acactcaacc ctatctcggt ctattctttt gatttataag 5340 ggattttgcc gatttcggcc tattggttaa aaaatgagct gatttaacaa aaatttaacg 5400 cgaattttaa caaaatatta acgcttacaa tttcctgatg cggtattttc tccttacgca 5460 tctgtgcggt atttcacacc gcatatggtg cactctcagt acaatctgct ctgatgccgc 5520 atagttaagc cagccccgac acccgccaac acccgctgac gcgccctgac gggcttgtct 5580 gctcccggca tccgcttaca gacaagctgt gaccgtctcc gggagctgca tgtgtcagag 5640 gttttcaccg tcatcaccga aacgcgcgag acgaaagggc ctcgtgatac gcctattttt 5700 ataggttaat gtcatgataa taatggtttc ttagacgtca ggtggcactt ttcggggaaa 5760 tgtgcgcgga acccctattt gtttattttt ctaaatacat tcaaatatgt atccgctcat 5820 gagacaataa ccctgataaa tgcttcaata atattgaaaa aggaagagta tgagtattca 5880 acatttccgt gtcgccctta ttcccttttt tgcggcattt tgccttcctg tttttgctca 5940 cccagaaacg ctggtgaaag taaaagatgc tgaagatcag ttgggtgcac gagtgggtta 6000 catcgaactg gatctcaaca gcggtaagat ccttgagagt tttcgccccg aagaacgttt 6060 tccaatgatg agcactttta aagttctgct atgtggcgcg gtattatccc gtattgacgc 6120 cgggcaagag caactcggtc gccgcataca ctattctcag aatgacttgg ttgagtactc 6180 accagtcaca gaaaagcatc ttacggatgg catgacagta agagaattat gcagtgctgc 6240 cataaccatg agtgataaca ctgcggccaa cttacttctg acaacgatcg gaggaccgaa 6300 ggagctaacc gcttttttgc acaacatggg ggatcatgta actcgccttg atcgttggga 6360 accggagctg aatgaagcca taccaaacga cgagcgtgac accacgatgc ctgtagcaat 6420 ggcaacaacg ttgcgcaaac tattaactgg cgaactactt actctagctt cccggcaaca 6480 attaatagac tggatggagg cggataaagt tgcaggacca cttctgcgct cggcccttcc 6540 ggctggctgg tttattgctg ataaatctgg agccggtgag cgtgggtctc gcggtatcat 6600 tgcagcactg gggccagatg gtaagccctc ccgtatcgta gttatctaca cgacggggag 6660 tcaggcaact atggatgaac gaaatagaca gatcgctgag ataggtgcct cactgattaa 6720 gcattggtaa ctgtcagacc aagtttactc atatatactt tagattgatt taaaacttca 6780 tttttaattt aaaaggatct aggtgaagat cctttttgat aatctcatga ccaaaatccc 6840 ttaacgtgag ttttcgttcc actgagcgtc agaccccgta gaaaagatca aaggatcttc 6900 ttgagatcct ttttttctgc gcgtaatctg ctgcttgcaa acaaaaaaac caccgctacc 6960 agcggtggtt tgtttgccgg atcaagagct accaactctt tttccgaagg taactggctt 7020 cagcagagcg cagataccaa atactgttct tctagtgtag ccgtagttag gccaccactt 7080 caagaactct gtagcaccgc ctacatacct cgctctgcta atcctgttac cagtggctgc 7140 tgccagtggc gataagtcgt gtcttaccgg gttggactca agacgatagt taccggataa 7200 ggcgcagcgg tcgggctgaa cggggggttc gtgcacacag cccagcttgg agcgaacgac 7260 ctacaccgaa ctgagatacc tacagcgtga gcattgagaa agcgccacgc ttcccgaagg 7320 gagaaaggcg gacaggtatc cggtaagcgg cagggtcgga acaggagagc gcacgaggga 7380 gcttccaggg ggaaacgcct ggtatcttta tagtcctgtc gggtttcgcc acctctgact 7440 tgagcgtcga tttttgtgat gctcgtcagg ggggcggagc ctatggaaaa acgccagcaa 7500 cgcggccttt ttacggttcc tggccttttg ctggcctttt gctcacatgt tctttcctgc 7560 gttatcccct gattctgtgg ataaccgtat taccgccttt gagtgagctg ataccgctcg 7620 ccgcagccga acgaccgagc gcagcgagtc agtgagcgag gaagcggaag agcgcccaat 7680 acgcaaaccg cctctccccg cgcgttggcc gattcattaa tgcaggctgc aggggggggg 7740 ggggggggg 7749 1

Claims (24)

  1. (i) AV.TL65 캡시드 단백질 또는 그의 변이체; 및 (ii) CFTRΔR 미니유전자 또는 그의 변이체에 작동 가능하게 연결된 F5 인핸서 또는 그의 변이체, 및 tg83 프로모터 또는 그의 변이체를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 아데노 연관 바이러스 (rAAV).
  2. 제1항에 있어서, AV.TL65 캡시드 단백질이 서열식별번호: 13의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 변이체가 서열식별번호: 13과 적어도 80% 아미노산 서열 동일성을 포함하는 것인 rAAV.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, F5 인핸서가 서열식별번호: 1의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하거나 또는 그의 변이체가 서열식별번호: 1과 적어도 80% 핵산 서열 동일성을 포함하는 것인 rAAV.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, F5 인핸서가 서열식별번호: 14의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하거나 또는 그의 변이체가 서열식별번호: 14와 적어도 80% 핵산 서열 동일성을 포함하는 것인 rAAV.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, tg83 프로모터가 서열식별번호: 2의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하거나 또는 그의 변이체가 서열식별번호: 2와 적어도 80% 핵산 서열 동일성을 포함하는 것인 rAAV.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, CFTRΔR 미니유전자가 인간 CFTRΔR 미니유전자인 rAAV.
  7. 제6항에 있어서, 인간 CFTRΔR 미니유전자가 서열식별번호: 4의 서열, 또는 서열식별번호: 4와 적어도 80% 핵산 서열 동일성을 포함하는 그의 변이체를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 것인 rAAV.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리뉴클레오티드가 5'에서 3' 방향으로, F5 인핸서, tg83 프로모터, 및 CFTRΔR 미니유전자를 포함하는 것인 rAAV.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 rAAV 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물.
  10. 낭성 섬유증의 치료를 필요로 하는 대상체에게 치료 유효량의 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 rAAV 또는 제9항의 제약 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 낭성 섬유증을 치료하는 방법.
  11. 제10항에 있어서, 하나 이상의 부가의 치료제를 대상체에게 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  12. 제11항에 있어서, 하나 이상의 부가의 치료제가 항생제, 점액 희석제, CFTR 조정제, 점액 용해제, 생리 식염수, 고장성 식염수, 면역억제제, 또는 그의 조합을 포함하는 것인 방법.
  13. 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 투여하는 것이 흡입, 분무, 또는 에어로졸화에 의한 것이거나, 또는 비강내, 기관내, 기관지내, 경구, 정맥내, 피하 또는 근육내 투여인 방법.
  14. 제13항에 있어서, 투여하는 것이 흡입, 분무, 또는 에어로졸화에 의한 것이거나, 또는 비강내, 기관내 및/또는 기관지내 투여인 방법.
  15. 서열식별번호: 7의 서열 또는 서열식별번호: 7과 적어도 80% 핵산 서열 동일성을 갖는 그의 변이체를 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
  16. 제15항에 있어서, 3' 방향으로, 서열식별번호: 5의 서열을 포함하는 3' 비번역 영역 (3'-UTR) 또는 서열식별번호: 5와 적어도 80% 핵산 서열 동일성을 갖는 그의 변이체를 추가로 포함하는 폴리뉴클레오티드.
  17. 제15항 또는 제16항에 있어서, 3' 방향으로, 서열식별번호: 6의 서열을 포함하는 합성 폴리아데닐화 부위 또는 서열식별번호: 6과 적어도 80% 핵산 서열 동일성을 갖는 그의 변이체를 추가로 포함하는 폴리뉴클레오티드.
  18. 제15항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리뉴클레오티드의 5' 말단에 5' 아데노 관련 바이러스 (AAV) 역위 말단 반복부 및 폴리뉴클레오티드의 3' 말단에 3' AAV ITR을 추가로 포함하는 폴리뉴클레오티드.
  19. 제18항에 있어서, 서열식별번호: 17의 서열 또는 서열식별번호: 17과 적어도 80% 핵산 서열 동일성을 갖는 그의 변이체를 포함하는 폴리뉴클레오티드.
  20. 제15항 내지 제19항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 아데노 연관 바이러스 (rAAV).
  21. 제20항에 있어서, 기도 상피 세포에 대한 지향성을 갖는 rAAV.
  22. 제21항에 있어서, 폐 상피 세포에 대한 지향성을 갖는 rAAV.
  23. 제20항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, AV.TL65 캡시드 단백질, AAV1 캡시드 단백질, AAV2 캡시드 단백질, AAV5 캡시드 단백질, AAV6 캡시드 단백질, 또는 AAV9 캡시드 단백질을 포함하는 rAAV.
  24. 제23항에 있어서, AV.TL65 캡시드 단백질을 포함하는 rAAV.
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