ES2862912T3 - Composición y procedimientos para la transferencia genética de alta eficiencia utilizando variantes de cápside de VAA - Google Patents

Abstract

Vector virus adenoasociado (VAA) que comprende una proteína de cápside VP1 que comprende una o más sustituciones de lisina seleccionadas de entre K61R, K84R, K137R, K143R, K161R, K459R, K533R y K707R de la proteína de cápside VP1 del VAA1, en el que dicho vector comprende además un minigén que comprende repeticiones terminales invertidas de VAA y una secuencia de ácidos nucleicos heteróloga operablemente ligada a secuencias reguladoras que dirigen la expresión de un producto a partir de la secuencia de ácidos nucleicos heteróloga en una célula huésped, en el que dicha sustitución de lisina resulta eficaz para inhibir la ubiquitinación de dicha proteína de cápside, incrementando de esta manera la transducción de dicho vector VAA en una célula diana, en comparación con un vector VAA que comprende la proteína de cápside VP1 de VAA1 sin la sustitución o sustituciones de lisina.

Description

DESCRIPCIÓN

Composición y procedimientos para la transferencia genética de alta eficiencia utilizando variantes de cápside de VAA

Campo de la invención

La presente invención se define mediante las reivindicaciones. La presente exposición se refiere de manera general a los campos de la terapia génica y la biología molecular. Más específicamente, la presente exposición proporciona vectores víricos adenoasociados que comprenden variantes de cápside proteica que mejoran la eficiencia de transducción de los vectores VAA que comprenden transgenes terapéuticamente beneficiosos.

Antecedentes de la invención

El virus adenoasociado (VAA) es un virus pequeño (20 nm) sin cubierta y sin capacidad de replicación. Se han caracterizado muchos serotipos de VAA diferentes en seres humanos y primates no humanos. El genoma de VAA comprende ADN de cadena sencilla con repeticiones terminales invertidas (RTI) de 145 pb en ambos extremos. Existen dos marcos de lectura abierta (ORF, por sus siglas en inglés): rep y cap. Aunque los productos de rep resultan esenciales para la replicación del VAA, se expresan 3 proteínas de cápside (VP1, VP2 y VP3) a partir del gen cap. VP1, VP2 y VP3 se reúnen en proporción 1:1:10 para formar una cápside icosahédrica (Xie Q. et al., 2002). Durante la producción de vector VAA recombinante (VAAr), se empaqueta un casete de expresión flanqueado por RTI en la cápside de VAA. Los genes requeridos para la replicación del VAA no están incluidos en el casete. El VAA recombinante se considera uno de los vectores víricos más seguros y es uno de los más ampliamente utilizados para la transferencia génica in vivo. Los vectores pueden infectar células de múltiples tipos tisulares, proporcionando una fuerte y persistente expresión del transgén. También son no patogénicos y presentan un perfil de baja inmunogenicidad (High KA, 2011).

Uno de los objetivos inmediatos de las pruebas de terapia génica es la optimización de vectores para maximizar la transducción de tejidos, minimizando simultáneamente la dosis de vector. Tras la entrada en la célula, las proteínas de cápside de VAA están sujetas a degradación mediada por el proteasoma. La fosforilación de los residuos de tirosina expuestos en la superficie de la cápside del VAA representa una de las primeras etapas que conduce a la degradación del virus mediante la vía de ubiquitina-proteasoma (Zhong L. et al., 2007). La mayor parte de la proteólisis regulada en la célula se produce por dicha ruta. La ubiquitina es una proteína pequeña (~8.5 kDa) que puede encontrarse en todas las células eucarióticas. La ubiquitina se encuentra unida a la cadena lateral de los aminoácidos de una proteína de sustrato. Tras unir proteínas de ubiquitina adicionales al sustrato mediante la ubiquitina inicialmente unida, se forma una cadena poliubiquitina y el sustrato se marca para la degradación (Thrower J.S. et al., 2000, Peng J. et al., 2003, Bedford L. et al., 2011). Se ha mostrado que la mutación de residuos de tirosina expuestos en la superficie conduce a un incremento de la eficiencia de la transducción de los vectores VAA2 (Zhong L. et al., 2008). Más recientemente, varios grupos han mostrado que la estrategia resulta eficaz además con otros serotipos de VAA en varios tejidos, incluyendo VAA de serotipos 6 y 8.

Existe una clara necesidad en la técnica de composiciones y procedimientos que mejoren la transducción de VAA portador de transgenes clínicamente importantes en pacientes que lo necesitan.

Sumario

De acuerdo con la presente invención, se proporcionan nuevas variantes de VAA caracterizadas por las reivindicaciones adjuntas, que muestran una eficiencia de transducción incrementada en comparación con los serotipos de VAA (por ejemplopor ejemplo, VAA1, VAA2, VAA8 y VAA-rh74) que no presentan las modificaciones divulgadas en la presente memoria. Dichos vectores mejorados resultan útiles para la transducción de una diversidad de tejidos, incluyendo hígado, músculo, cerebro y retina.

También se describe en la presente memoria un vector virus adenoasociado (VAA) que comprende una proteína de cápside VP1 alterada, en el que la proteína de cápside alterada comprende sustituciones del residuo lisina, que de esta manera reducen la ubiquitinación de la cápside e incrementan la eficiencia de transducción del VAA variante en los tejidos y células diana. El vector puede comprender además un ácido nucleico heterólogo (por ejemplopor ejemplo, un minigén que comprende repeticiones terminales invertidas del VAA y una secuencia de ácidos nucleicos heteróloga) operablemente ligado a secuencias reguladoras que dirigen la expresión de un producto a partir de la secuencia de ácidos nucleicos heteróloga en una célula huésped. Preferentemente, el vector VAA puede comprender una o más sustituciones de lisina en VP1 tal como se proporciona en las tablas proporcionadas en la presente memoria. Además, el vector VAA puede ser de serotipo VAA8 y contiene una alteración prevista en la tabla 3.

Preferentemente, los vectores VAA de la exposición que comprenden las proteínas de cápside variantes resultan útiles para la expresión de péptidos terapéuticos o ácidos nucleicos terapéuticos. Entre dichos péptidos se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, una molécula de ARNi antivírica, factor VIII, factor IX o un fragmento funcional del mismo. Entre los productos de expresión adicionales se incluyen, por ejemplo, IgG, IgM, IgA, IgD, IgE, inmunoglobulinas quiméricas, anticuerpos humanizados o anticuerpos de cadena sencilla. El producto de expresión puede ser un ARNi que resulta útil para inhibir la infección y replicación por el VHC. El producto de expresión también puede ser un ácido nucleico antisentido útil para regular negativamente una célula diana de interés.

En la presente memoria se describe además una composición farmacéutica que comprende los vectores VAA variantes de la exposición en un portador biológicamente compatible. Se encuentran comprendidos en la presente exposición, además, cultivos celulares que comprenden los vectores divulgados en la presente memoria.

En la presente memoria se describe además un procedimiento de administración de un transgén en una célula en un sujeto, en el que dicho procedimiento comprende la etapa de poner en contacto la célula con un vector VAA tal como se da a conocer en la presente memoria, en el que dicho vector VAA comprende el transgén, en el que la presencia de sustitución de lisina en la secuencia de la cápside VP1 en dicho vector está asociada a una ubiquitinación reducida y una eficiencia de transducción incrementada.

Finalmente, en la presente memoria se describen, además, variantes víricas de señuelo que son ineficientes en la infección de células pero que resultan eficaces en el bloqueo de la neutralización de anticuerpos de variantes víricas que portan transgenes beneficiosos debido a las similitudes estructurales de las dos variantes víricas. Entre los ejemplos de variantes de cápside con este fin se incluyen, por ejemplo, K38R, K143R, K510R y K709R

Breve descripción de los dibujos

Figura 1: lisinas sobre la superficie de VAA1, VAA2 y VAA8: los números de PDB de los serotipos de VAA utilizados en la presente memoria son los siguientes: VAA1: 3NG9, VAA2: 1LP3 y VAA8. 2QA0. Las flechas representan los residuos de lisina respectivos. (A) Hay 11 lisinas sobre la superficie de VP3 del VAA1. Los colores de los residuos son los siguientes: K258 rojo, K459 azul, K491 amarillo, K493 magenta, K508 cian, K528 salmón oscuro, K533 verde pálido, K545 azul pálido (pizarra), K567 salmón oscuro, K666 cian pálido y K707 gris. (B) Hay 10 lisinas sobre la superficie de VP3 del VAA2. Los colores de los residuos son los siguientes: K258 rojo, k490 amarillo, K507 cian, k 527 salmón oscuro, K532 verde pálido, K544 azul pálido (pizarra), K549 amarillo pálido, K556 magenta pálido, K665 cian pálido, K706 gris (C). Hay 8 lisinas sobre la superficie de VP3 del VAA8. Los colores de los residuos son los siguientes: K259 rojo, k 333 verde, K510 cian, K530 salmón oscuro, K547 azul pálido (pizarra), K569 salmón oscuro, K668 cian pálido y K709 gris. Observar que K528 y K567 del VAA1 y K530 y K569 de VAA8 son contiguos en la estructura y muestran el mismo color.

Figura 2: se mutaron varios residuos de lisina de la cápside de VAA8 a arginina. Se extrajo sangre de los animales 8 semanas después de la inyección de virus por la vena de la cola. Se detectaron los niveles de hF.IX mediante ELISA (A) Los residuos que el software predecía que se encontraban ubiquitinados con niveles de confianza altos e intermedios se mutaron a arginina. Se inyectaron 2,5x1010 partículas víricas en cada ratón por la vena de la cola (B, C). Los residuos que el software predecía con baja confianza que se encontraban ubiquitinados se mutaron a arginina. Se inyectaron 2,5x109 partículas víricas en cada ratón por la vena de la cola. (B) mutaciones de cápside K569R y K668R (C) se comparó el efecto de las mutaciones de cápside K38R, K143R, K259R, K510R y K547R con el efecto de la mutación K530R.

Figura 3: combinación de las mutaciones de cápside K a R (A) la combinación de las mutaciones K137R, K33R y K530R todavía es más abundante que el tipo salvaje, aunque no es estadísticamente diferente de K530R. (B) La mutación K709R afecta negativamente la transducción del VAA8. La adición de la mutación K709R al mutante K(137/333/530)R también reduce la transducción del virus. (C) La combinación de múltiples mutaciones de lisina a arginina no incrementa la tasa de transducción. (D) La combinación de tres residuos de lisina a arginina con cuatro o seis residuos tirosina a fenilalanina reduce la tasa de transducción.

Figura 4: transducción del VAA1 (A) eliminación por CTL de hepatocitos HHL5-B7 transducidos con mutantes de lisina de VAA-1 a tres MDI diferentes: 5K, 50K y 500K. Se utilizó el péptido (IPQYGYLTL para VAA1; VPQYGYLTL para VAA2) como control positivo. La liberación de LDH se correlaciona con la eliminación celular. (B) Se comparó el número total de células positivas para GFP y la expresión de GFP en diferentes constructos a MDI de 50K y 500K.

Figura 5: transducción del VAA2: A) Se compararon los mutantes del VAA2, K137R, K527R o K532R con el VAA2 WT en términos de tasa de transducción de la línea celular HHL5. Las células se transfectaron a MDI de 10K, 50K, 100K y 500K y se comprobaron 24 horas después para la expresión de GFP. B) Gráfico que muestra la citotoxicidad según medición de la LDL liberada por las variantes sometidas a ensayo.

Figura 6: ensayo de CTL en el que se transdujeron hepatocitos diana con el vector VAA-2 a concentraciones crecientes y después se incubaron con células efectoras de HLA correspondiente. Los vectores VAA codificaban cápside de VAA-2 de tipo salvaje o mutaciones de una lisina, tal como se indica. Se derivaron efectores de PBMC expandidas in vitro contra VAA-2 CMH de clase I epítopo VPQYGYLTL y proporción de efectora diana de 10:1. Los resultados se expresan como porcentaje de la actividad de CTL (% de citotoxicidad respecto a células tratadas con SDS al 10% como control de citotoxicidad máxima tras restar el nivel de fondo) con respecto al vector de tipo salvaje.

Figura 7: datos de RH74: niveles de expresión del transgén humano F.IX en plasma medidos mediante un ELISA específico para F.IX humano.A) Definición de TMR=K(137/333/530)R, Definición de HMF=Y(253/275/447/703/707/733)F. B) Definición de HMR: K(137/259/333/530/552/569)R, Definición de 195/202: G195A+ L199V+ S201P+ G202N. Aunque HMR+195/202, HMR+195/202+K(38)R, HMR+195/202+K(51)R, HMR+195/202+K(61)R y HMR+195/202+K(77)R produjeron un nivel de hFIX más alto tras la inyección en ratones, la inyección de Hm R+195/202+K(122/123)R o HMR+195/202+K(142/413) no produjo un nivel detectable de hFIX en absoluto. C): el mutante RHM13_1 produjo niveles de hFIX similares a Rh74 WT mientras que los niveles de hFIX derivado de ratones tratados con RHM17_1 apenas eran superiores a los niveles de fondo. D) El mutante RHM14_2 produjo niveles de hFIX similares a Rh74 WT; el rendimiento de RHM15_1 se encontraba entre el de VAA8 y el de VAAVrh74 WT.

Descripción detallada

Los presentes inventores han encontrado que la mutación de los residuos de lisina en las cápsides de VAA a residuos de arginina incrementa la eficiencia de transducción del VAA. Los experimentos iniciales de los presentes inventores mostraban que una única sustitución de un residuo de lisina que se predice que es una diana de ubiquitinación resultaba en niveles más elevados de expresión del transgén del factor IX humano (FIX) en ratones en comparación con animales que habían recibido vectores VAA no modificados. Los mutantes de lisina de VAA indicados en la presente memoria pudieron utilizarse ventajosamente para generar vectores con diana en hígado, SNC, músculo y otros órganos con una eficiencia más elevada que las cápsides de VAA de tipo salvaje. De esta manera, dicho resultado puede utilizarse para desarrollar terapéuticos para tratar la hemofilia A y B, la enfermedad de Huntington, y prácticamente cualquier otra enfermedad que requiera niveles de transducción incrementados de transgenes deseables en un tejido diana de interés.

Se proporcionan las definiciones siguientes a fin de facilitar la compresión de la presente exposición.

I. Definiciones:

La "terapia génica" es la inserción de genes en las células y/o tejidos del individuo para tratar enfermedades, comúnmente enfermedades hereditarias en las que un alelo mutante defectuoso se sustituye o se completa con uno funcional.

Los "virus adenoasociados" de la familia de los parvovirus son virus pequeños con un genoma de ADN de cadena sencilla. Dichos virus pueden insertar material genético en un sitio específico en el cromosoma 19 y resultan preferentes debido a que no están asociados a enfermedad patogénica en el ser humano.

Un péptido o proteína "terapéutico" es un péptido o proteína que puede aliviar o reducir los síntomas que resultan de una ausencia o defecto en una proteína en una célula o sujeto. Alternativamente, un péptido o proteína "terapéutico" es uno que de otro modo proporciona un beneficio a un sujeto, por ejemplo, efectos anticáncer. Entre los péptidos y proteínas terapéuticos se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, CFTR (proteína reguladora transmembranal de la fibrosis quística), distrofina (incluyendo el producto proteína de los minigenes de la distrofina; véase, por ejemplo, Vincent et al., Nature Genetics 5:130, 1993), la utrofina (Tinsley et al., Nature 384:349, 1996), los factores de coagulación (Factor XIII, Factor IX, Factor X, etc.), anticuerpos monoclonales (Lewis et al., 2002), eritropoyetina, el receptor de LDL, lipoproteína lipasa, ornitina transcarbamilasa, p-globina, a-globina, espectrina, a-antitripsina, adenosina desaminasa, hipoxantina guanina fosforibosil transferasa, p-glucocerebrosidasa, esfingomielinasa, hexosaminidasa lisosómica, deshidrogenasa de cetoácidos de cadena ramificada, hormonas, factores de crecimiento (por ejemplo, factores 1 y 2 de crecimiento similares a la insulina, factor de crecimiento derivado de plaquetas, factor de crecimiento epidérmico, factor de crecimiento nervioso, factor neurotrófico -3 y -4, factor neurotrófico de origen cerebral, factor de crecimiento derivado de la glía, factores de crecimiento transformante a y p, y similares), citoquinas (por ejemplo, a-interferón, p-interferón, interferón-Y, interleuquina-2, interleuquina-4, interleuquina-12, factor estimulantes de colonias de granulocitos-macrófagos y linfotoxina), productos de gen suicida (por ejemplo, timidina quinasa del virus herpes simplex, citosina desaminasa, toxina diftérica, citocromo P450, desoxicitidina quinasa y factor de necrosis tumoral), proteínas que confieren resistencia a un fármaco utilizado en la terapia del cáncer, productos de gen supresor tumoral (por ejemplo, Rb, p53, Rb, Wt-1, NF1, VHL, APC, y similares), y cualquier otro péptido o proteína que presenta un efecto terapéutico en un sujeto que lo necesita.

Entre los péptidos o proteínas terapéuticos ejemplares adicionales se incluyen los que pueden utilizarse en el tratamiento de una condición patológica, incluyendo, aunque sin limitación, la fibrosis quística (y otras enfermedades pulmonares), hemofilia A, hemofilia B, talasemia, anemia y otros trastornos hematológicos, SIDA, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington, esclerosis lateral amiotrófica, epilepsia y otros trastornos neurológicos, cáncer, diabetes mellitus, distrofias musculares (por ejemplo, de Duchenne y de Becker), enfermedad de Gaucher, enfermedad de Hurler, deficiencia de adenosina desaminasa, enfermedades del almacenamiento del glucógeno y otros defectos metabólicos, enfermedad degenerativas de la retina (y otras enfermedades oculares) y enfermedades de órganos sólidos (por ejemplo, cerebro, hígado, riñón y corazón).

El término "promotores" o "promotor" tal como se utiliza en la presente memoria puede referirse a una secuencia de ADN que se localiza contiguamente a una secuencia de ADN que codifica un producto recombinante. Un promotor preferentemente está ligado operablemente a una secuencia de ADN contigua. Un promotor típicamente incrementa la cantidad de producto recombinante expresado a partir de una secuencia de ADN en comparación con el producto recombinante expresado en el caso de que no haya promotor. Puede utilizarse un promotor de un organismo para potenciar la expresión de un producto recombinante a partir de una secuencia de ADN originada en otro organismo. Por ejemplo, puede utilizarse un promotor de vertebrado para la expresión de GFP de medusa en vertebrados. Además, un elemento promotor puede incrementar la cantidad de productos recombinantes expresados para múltiples secuencias de ADN unidas en tándem. Por lo tanto, un elemento promotor puede potenciar la expresión de uno o más productos recombinantes. El experto ordinario en la materia conoce perfectamente múltiples elementos promotores.

Puede desearse una expresión constitutiva a nivel elevado. Entre los ejemplos de dichos promotores se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, el promotor/potenciador LTR del virus retrovírico del sarcoma de Rous (VSR), el promotor/intensificador temprano inmediato del citomegalovirus (CMV) (ver, por ejemplo, Boshart et al, Cell, 41:521-530, 1985), el promotor del SV40, el promotor de dihidrofolato reductasa, el promotor de la p-actina citoplasmática y el promotor de fosfoglicerol quinasa (PGK).

Además, pueden desearse promotores inducibles. Los promotores inducibles son los que están regulados por compuestos suministrados exógenamente, en cis o en trans, incluyendo, aunque sin limitación, el promotor de metalotioneína (MT) de oveja inducible por cinc, el promotor del virus del tumor mamario del ratón (VTMR) inducible por dexametasona (Dex), el sistema del promotor de la polimerasa de T7 (documento n° WO 98/10088), el sistema reprimible por tetraciclina (Gossen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:5547-5551, 1992); el sistema inducible por tetraciclina (Gossen et al., Science, 268:1766-1769, 1995; véase también Harvey et al., Curr. Opin. Chem. Biol., 2:512-518, 1998); el sistema inducible por RU486 (Wang et al., Nat. Biotech., 15:239-243, 1997 y Wang et al., Gene Ther., 4:432-441, (1997)], y el sistema inducible por rapamicina (Magari et al., J. Clin. Invest., 100:2865-2872, (1997); Rivera et al., Nat. Medicine. 2:1028-1032, 1996)). Otros tipos de promotores inducibles que pueden resultar útiles en el presente contexto son los que están regulados por un estado fisiológico específico, por ejemplo, la temperatura, la fase aguda o en sólo células replicantes.

Puede utilizarse el promotor nativo del transgén o secuencia de ácidos nucleicos de interés. El promotor nativo puede resultar preferente en el caso de que se desee que la expresión del transgén o la secuencia de ácidos nucleicos deberá imitar la expresión nativa. El promotor nativo puede utilizarse en el caso de que la expresión del transgén u otra secuencia de ácidos nucleicos deba regularse temporalmente o en el desarrollo, o de una manera específica de un tejido, o en respuesta a estímulos transcripcionales específicos. Además, pueden utilizarse otros elementos nativos de control de la expresión, tales como elementos intensificadores, sitios de poliadenilación o secuencias de consenso de Kozak, para imitar la expresión nativa.

El genoma vírico recombinante puede comprender un transgén operablemente ligado a un promotor específico de un tejido. Por ejemplo, en el caso de que se desee la expresión en músculo esquelético, puede utilizarse un promotor activo en el músculo. Entre ellos se incluyen los promotores de genes codificantes de la a-actina esquelética, la cadena ligera 2A de la miosina, la distrofina, la creatín quinasa muscular, así como los promotores musculares sintéticos con actividades superiores a los promotores naturales. Véase Li et al., Nat. Biotech., 17:241-245, 1999. Se conocen ejemplos de promotores que son específicos de tejido para la albúmina hepática (Miyatake et al., J. Virol., 71:5124-32, 1997); el promotor del núcleo del virus de la hepatitis B (Sandig et al., Gene Ther.

3:1002-9, 1996; la alfa-fetoproteína (AFP) (Arbuthnot et al., Hum. Gene Ther., 7:1503-14, 1996], hueso (osteocalcina, Stein et al., Mol. Biol. Rep., 24:185-96, 1997; sialoproteína ósea, Chen et al., J. Bone Miner. Res.

11 :654-64, (1996)), linfocitos (CD2, Hansal et al., J. Immunol., 161:1063-8, (1998)); cadena pesada de inmunoglobulina; cadena a del receptor de las células T), neuronal (promotor de la enolasa neuronal específica (ENE), Andersen et al. Cell. Mol. Neurobiol., 13:503-15, (1993)); gen de la cadena ligera del neurofilamento, Piccioli et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:5611-5, 1991; el gen vgf específico neuronal, Piccioli et al., Neuron, 15:373-84, (1995)], entre otros.

El término "intensificadores" o "intensificador" tal como se utiliza en la presente memoria puede referirse a una secuencia de ADN que se localiza contiguamente a la secuencia de ADN que codifica un producto recombinante. Los elementos intensificadores típicamente se localizan cadena arriba de un elemento promotor o pueden localizarse cadena abajo o dentro de una secuencia codificante de ADN (por ejemplo, una secuencia de ADN transcrita o traducida en un producto o productos recombinantes). Por lo tanto, un elemento intensificador puede localizarse 100 pares de bases, 200 pares de bases o 300 o más pares de bases cadena arriba o cadena abajo de una secuencia de ADN que codifica para un producto recombinante. Los elementos intensificadores pueden incrementar la cantidad de producto recombinante expresada a partir de una secuencia de ADN hasta un nivel superior al nivel de expresión proporcionado por un elemento promotor. Se encuentran disponibles múltiples elementos intensificadores para el experto ordinario en la materia.

La expresión "ácido nucleico" o "molécula de ácido nucleico" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a cualquier molécula de ADN o ARN, de cadena sencilla o de doble cadena y, si es de cadena sencilla, la molécula de su secuencia complementaria en forma lineal o circular. Al comentar las moléculas de ácidos nucleicos, puede describirse en la presente memoria una secuencia o estructura de una molécula particular de ácidos nucleicos según la convención normal de proporcionar la secuencia en la dirección 5' a 3'. En referencia a los ácidos nucleicos de la exposición, en ocasiones se utiliza la expresión "ácido nucleico aislado". Dicha expresión, aplicada al ADN, se refiere a una molécula de ADN que ha sido separada de las secuencias que son inmediatamente contiguas en el genoma natural del organismo en el que se ha originado. Por ejemplo, un "ácido nucleico aislado" puede comprender una molécula de ADN insertada en un vector, tal como un plásmido o vector vírico, o integrada en el ADN genómico de una célula u organismo huésped procariótico o eucariótico.

Un "vector" es un replicón, tal como un plásmido, cósmido, bácmido, fago o virus, al que puede unirse otra secuencia o elemento genético (de ADN o ARN) de manera que se produce la replicación de la secuencia o elemento unido.

Un "operón de expresión" se refiere a un segmento de ácidos nucleicos que puede poseer secuencias de control transcripcional o traduccional, tales como promotores, intensificadores, señales de inicio de traducción (por ejemplo, codones ATG o AUG), señales de poliadenilación, terminadores, y similares, y que facilita la expresión de una secuencia codificante de un polipéptido en una célula u organismo huésped.

Los términos "transforma", "transfecta", "transduce", se refieren a cualquier procedimiento o medio con el que se introduce un ácido nucleico en una célula u organismo huésped y pueden utilizarse intercambiablemente para transmitir el mismo significado. Entre dichos procedimientos se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, transfección, electroporación, microinyección, infección, fusión con PEG y similares.

El ácido nucleico introducido puede encontrarse integrado (unido covalentemente) o no en el ácido nucleico de la célula u organismo huésped. En células bacterianas, de levadura, vegetales y de mamífero, por ejemplo, el ácido nucleico introducido puede mantenerse en forma de un elemento episómico o como un replicón independiente, tal como un plásmido. Alternativamente, el ácido nucleico introducido puede integrarse en el ácido nucleico de la célula u organismo receptor y mantenerse establemente en esa célula u organismo y pasarse posteriormente o heredarse en la células u organismos de la progenie de la célula u organismo receptor. Finalmente, el ácido nucleico introducido puede existir en la célula receptora u organismo huésped solo transitoriamente.

La expresión "gen marcador seleccionable" se refiere a un gen que, al expresarse, confiere un fenotipo seleccionable, tal como resistencia a un antibiótico, a una célula o planta transformada.

La expresión "operablemente ligado" se refiere a que las secuencias reguladoras necesarias para la expresión de la secuencia codificante están situadas en la molécula de ADN en las posiciones apropiadas respecto a la secuencia codificante de manera que se produzca la expresión de la secuencia codificante. Dicha misma definición en ocasiones se aplica a la organización de unidades transcripcionales y otros elementos de control transcripcional (por ejemplo, intensificadores) en un vector de expresión.

El término "oligonucleótido" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a secuencias, cebadores y sondas de la presente exposición, y se define como una molécula de ácidos nucleicos que comprende dos o más ribonucleótidos o desoxirribonucleótidos, preferentemente más de tres. El tamaño exacto del oligonucleótido dependerá de diversos factores y de la aplicación y uso particulares del oligonucleótido.

La expresión "se hibrida específicamente" se refiere a la asociación entre dos moléculas de ácidos nucleicos de cadena sencilla de secuencia suficientemente complementaria para permitir dicha hibridación bajo las condiciones predeterminadas generalmente utilizadas en la técnica (en ocasiones denominadas "sustancialmente complementarias"). En particular, la expresión se refiere a la hibridación de un oligonucleótido con una secuencia sustancialmente complementaria contenida dentro de una molécula de ADN o ARN de cadena sencilla de la exposición, con exclusión sustancial de la hibridación del oligonucleótido con ácidos nucleicos de cadena sencilla de secuencia no complementaria.

El término "cebador" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a un oligonucleótido de ADN, de cadena sencilla o de doble cadena, derivado de un sistema biológico, generado mediante digestión con enzimas de restricción o producido sintéticamente que, al introducirlo en el medio apropiado, es capaz de actuar funcionalmente como un iniciador de la síntesis de ácidos nucleicos dependiente del molde. Al presentarle un molde de ácidos nucleicos apropiado, precursores trifosfato de nucleósido adecuados de los ácidos nucleicos, enzima polimerasa, cofactores y condiciones adecuados, tales como una temperatura y pH adecuados, el cebador puede extenderse en su extremo 3' mediante la adición de nucleótidos por la acción de una polimerasa o actividad similar, rindiendo un producto de extensión del cebador. El cebador puede ser de longitud variable según las condiciones y requisitos particulares de la aplicación. Por ejemplo, en aplicaciones diagnósticas, el cebador oligonucleótido típicamente presenta una longitud de 15 a 25 o más nucleótidos. El cebador debe ser de suficiente complementariedad respecto al molde deseado para cebar la síntesis del producto de extensión deseado, es decir, para poder hibridarse con la cadena molde deseada de una manera suficiente para proporcionar la fracción 3'-hidroxilo del cebador en yuxtaposición apropiada para la utilización en el inicio de la síntesis por una polimerasa o enzima similar. No se requiere que la secuencia del cebador represente un complemento exacto del molde deseado. Por ejemplo, puede unirse una secuencia de nucleótidos no complementaria al extremo 5' de un cebador de otro modo complementario. Alternativamente, pueden intercalarse bases no complementarias dentro de la secuencia del cebador oligonucleótido, con la condición de que la secuencia del cebador presente suficiente complementariedad respecto a la secuencia de la cadena molde deseada para proporcionar funcionalmente un complejo de molde-cebador para la síntesis del producto de extensión.

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) ha sido descrita en las patentes US n° 4.683.195, n° 4.800.195 y n° 4.965.188.

El término "aislado" puede referirse a un compuesto o complejo que se ha separado suficientemente de otros compuestos con los que se encontraría asociado naturalmente. El término "aislado" no pretende excluir mezclas artificiales o sintéticas con otros compuestos o materiales, o la presencia de impurezas que no interfieran con la actividad fundamental o ensayos subsiguientes, y que pueden encontrarse presentes, por ejemplo, debido a una purificación incompleta, o la adición de estabilizantes.

La expresión "respuesta inmunitaria" pretende referirse a cualquier respuesta a un antígeno o determinante antigénico por el sistema inmunitario de un sujeto vertebrado. Entre los ejemplos de respuestas inmunitarias se incluyen las respuestas inmunitarias humorales (por ejemplo, la producción de anticuerpos específicos de antígeno) y las respuestas inmunitarias mediadas por células (por ejemplo, la proliferación de linfocitos), tal como se definen posteriormente en la presente memoria.

II. Procedimientos de utilización y procedimientos de administración de los vectores víricos adenoasociados variantes

Los procedimientos de la presente exposición proporcionan un medio para administrar secuencias de ácidos nucleicos heterólogas en un amplio abanico de células huésped, incluyendo células tanto en división como células que no se dividen. Los vectores y otros reactivos, procedimientos y formulaciones farmacéuticas de la presente exposición resultan adicionalmente útiles en un procedimiento de administración de una proteína o péptido en un sujeto que lo necesita, como procedimiento de tratamiento o de otro tipo. De esta manera, la proteína o péptido puede producirse in vivo en el sujeto. El sujeto puede requerir la proteína o péptido debido a que el sujeto presenta una deficiencia en la proteína o péptido, o debido a que la producción de la proteína o péptido en el sujeto puede proporcionar algún efecto terapéutico, como procedimiento de tratamiento o de otro tipo, y tal como se explica adicionalmente después.

En general, la presente exposición puede utilizarse para administrar cualquier ácido nucleico foráneo con un efecto biológico para tratar o mejorar los síntomas asociados a cualquier trastorno relacionado con la expresión génica. Entre los estados de enfermedad ilustrativos se incluyen, aunque sin limitarse a ellos: fibrosis quística (y otras enfermedades pulmonares), hemofilia A, hemofilia B, talasemia, anemia y otros trastornos de la coagulación sanguínea, SIDA, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington, esclerosis lateral amiotrófica, epilepsia y otros trastornos neurológicos, cáncer, diabetes mellitus, distrofias musculares (por ejemplo, de Duchenne y de Becker), enfermedad de Gaucher, enfermedad de Hurler, deficiencia de adenosina desaminasa, enfermedades del almacenamiento del glucógeno y otros defectos metabólicos, enfermedad degenerativas de la retina (y otras enfermedades oculares) y enfermedades de órganos sólidos (por ejemplo, cerebro, hígado, riñón y corazón), y similares.

Además, la presente exposición puede utilizarse para administrar ácidos nucleicos codificantes de anticuerpos monoclonales o fragmentos de los mismos que es conocido que proporcionan efectos biológicos beneficiosos para tratar o mejorar los síntomas asociados a cánceres, enfermedades infecciosas y enfermedades autoinmunes, tales como la artritis reumatoide. Otras secuencias pueden codificar, por ejemplo, citoquinas, tales como el interferónalfa, que pueden modular el curso de una enfermedad.

La transferencia génica presenta un uso potencial sustancial en la compresión y suministro de terapia para estados de enfermedad. Existen varias enfermedades hereditarias en las que se conocen los genes defectuosos y han sido clonados. En algunos casos, se conoce la función de dichos genes clonados. En general, los estados de enfermedad anteriormente indicados se clasifican en dos clases: estados de deficiencia, habitualmente de enzimas, que generalmente se heredan de modo recesivo, y los estados de desequilibrio, los cuales por lo menos ocasionalmente implican proteínas reguladoras o estructurales, que se hereden de modo dominante. Para las enfermedades de estado de deficiencia, podría utilizarse la transferencia génica para llevar un gen normal a los tejidos afectados para la terapia de reemplazo, así como para crear modelos animales de la enfermedad utilizando mutaciones antisentido. Para los estados de enfermedad de desequilibrio, podría utilizarse la transferencia génica para crear un estado de enfermedad en un sistema modelo, que a continuación podría utilizarse en esfuerzos para contrarrestar el estado de enfermedad. De esta manera, los procedimientos de la presente exposición permiten el tratamiento de enfermedades genéticas. Tal como se utiliza en la presente memoria, un estado de enfermedad se trata remediando parcial o completamente la eficiencia o desequilibrio que causa la enfermedad o la hace más grave. La utilización de la integración específica de sitio de secuencias de ácidos nucleicos para causar mutaciones o para corregir defectos también resulta posible.

Finalmente, la presente exposición encuentra uso adicional en procedimientos diagnósticos y de cribado, en los que un gen de interés se expresa transitoria o establemente en un sistema de cultivo celular, o alternativamente, un modelo de animal transgénico.

III. Sujetos, formulaciones farmacéuticas, vacunas y modos de administración.

La presente exposición encuentra utilidad en aplicaciones tanto veterinarias como médicas. Entre los sujetos adecuados se incluyen tanto aves como mamíferos, resultan preferentes los mamíferos. El término "ave" tal como se utiliza en la presente memoria incluye, aunque sin limitación, pollos, patos, gansos, codornices, pavos y faisanes. El término "mamífero" tal como se utiliza en la presente memoria incluye, aunque sin limitarse a ellos, seres humanos, bovinos, ovinos, caprinos, equinos, felinos, caninos, lagomorfos, etc. Los sujetos humanos son los más preferidos. Entre los sujetos humanos se incluyen sujetos fetales, neonatales, infantiles, juveniles y adultos.

En particular, en la presente memoria se proporciona una composición farmacéutica que comprende una partícula vírica de la exposición en un portador farmacéuticamente aceptable u otros agentes medicinales, agentes farmacéuticos, portadores, adyuvantes, diluyentes, etc. Para la inyección, el portador típicamente será un líquido. Para otros procedimientos de administración, el portador puede ser sólido o líquido, tal como agua estéril libre de pirógenos o solución salina tamponada con fosfato estéril libre de pirógenos. Para la administración mediante inhalación, el portador es respirable y preferentemente se encuentra en forma particulada sólida o líquida. Como medio de inyección, resulta preferente utilizar agua que contiene los aditivos habituales para soluciones para inyección, tales como agentes estabilizadores, sales o solución salina, y/o tampones.

En la presente memoria se proporciona además una composición farmacéutica que comprende una célula en la que se ha integrado un provirus de VAA en el genoma en un portador farmacéuticamente aceptable u otros agentes medicinales, agentes farmacéuticos, portadores, adyuvantes, diluyentes, etc.

La expresión "farmacéuticamente aceptable" se refiere a un material que no es indeseable biológicamente o de otro modo, por ejemplo, el material puede administrarse en el sujeto sin causar ningún efecto biológico no deseable. De esta manera, dicha composición farmacéutica puede utilizarse, por ejemplo, en la transfección de una célula ex vivo o en la administración de una partícula vírica o célula directamente en un sujeto.

En la presente memoria se proporciona además un procedimiento de administración de un ácido nucleico en una célula. Para los procedimientos in vitro, el virus puede administrarse en la célula mediante procedimientos estándares de transducción vírica, tal como se conocen de la técnica. Preferentemente, las partículas víricas se añaden a las células en la multiplicidad de infección apropiada según procedimientos estándares de transducción apropiados para las células diana particulares. Los títulos de virus para la administración pueden variar, dependiendo del tipo de célula diana y el vector vírico particular, y pueden ser determinados por el experto en la materia sin necesidad de experimentación indebida. Alternativamente, puede llevarse a cabo la administración de un vector parvovirus de la presente exposición mediante cualesquiera otros medios conocidos de la técnica.

Los vectores de virus recombinante se administran preferentemente en la célula en una cantidad biológicamente eficaz. Una cantidad "biológicamente eficaz" del vector vírico es una cantidad que resulta suficiente para resultar en infección (o transducción) y en la expresión de la secuencia de ácidos nucleicos heteróloga en la célula. En el caso de que se administre el virus en una célula in vivo (por ejemplo, el virus se administra en un sujeto tal como se indica posteriormente), una cantidad "biológicamente eficaz" del vector vírico es una cantidad que resulta suficiente para resultar en la transducción y expresión de la secuencia de ácidos nucleicos heteróloga en una célula diana.

La célula en la que debe administrarse el vector vírico inventivo puede ser de cualquier tipo, incluyendo, aunque sin limitarse a ellas, células neurales (incluyendo células de los sistemas nerviosos periférico y central, en particular, células cerebrales), células pulmonares, células retinianas, células epiteliales (por ejemplo, células epiteliales intestinales y respiratorias), células musculares, células pancreáticas (incluyendo células de los islotes), células hepáticas, células miocárdicas, células óseas (por ejemplo, células madre de médula ósea), células madre hematopoyéticas, células de bazo, queratinocitos, fibroblastos, células endoteliales, células prostáticas, células germinales y similares. Alternativamente, la célula puede ser cualquier célula progenitora. Como alternativa adicional, la célula puede ser una célula madre (por ejemplo, una célula madre neural o célula madre hepática). Además, las células pueden ser de cualquier especie de origen, tal como se ha indicado anteriormente.

En particular, pueden extraerse células de un sujeto, introducirse el vector parvovirus en las mismas, y después reintroducirse las células en el sujeto. Los procedimientos de extracción de células del sujeto para el tratamiento ex vivo, seguido de la reintroducción en el sujeto son conocidos de la técnica. Alternativamente, el vector VAAr se introduce en las células de otro sujeto, en células en cultivo o en células de cualquier otra fuente adecuada, y las células se administran en el sujeto que las necesita.

Entre las células adecuadas para la terapia génica ex vivo se incluyen, aunque sin limitarse a ellas, células hepáticas, células neurales (incluyendo células de los sistemas nerviosos central y periférico, en particular, células cerebrales), células del páncreas, células del bazo, fibroblastos (por ejemplo, fibroblastos de la piel), queratinocitos, células endoteliales, células epiteliales, mioblastos, células hematopoyéticas, células estromales de la médula ósea, células progenitoras y células madre.

Las dosis de las células para administrar en el sujeto variarán con la edad, condición y especie del sujeto, el tipo de célula, el ácido nucleico que expresa la célula, el modo de administración y similares. Típicamente, se administran en cada dosis por lo menos entre aproximadamente 102y aproximadamente 108, preferentemente entre aproximadamente 103 y aproximadamente 106 células. Preferentemente, las células se administran en una "cantidad terapéuticamente eficaz".

Una cantidad "terapéuticamente eficaz" tal como se utiliza en la presente memoria es una cantidad que resulta suficiente para aliviar (por ejemplo, mitigar, disminuir o reducir) por lo menos uno de los síntomas asociados a un estado de enfermedad. Alternativamente indicado, una cantidad "terapéuticamente eficaz" es una cantidad que resulta suficiente para proporcionar alguna mejora en la condición del sujeto.

En la presente memoria se describe además un procedimiento de tratamiento de sujetos in vivo con las partículas víricas inventivas. La administración de las partículas de parvovirus de la presente exposición en un sujeto humano o un animal que lo necesita puede ser mediante cualesquiera medios conocidos de la técnica de administración de vectores víricos.

Entre los modos ejemplares de administración se incluyen la administración oral, rectal, transmucosal, tópica, transdérmica, por inhalación, parenteral (por ejemplo, intravenosa, subcutánea, intradérmica, intramuscular e intraarticular) y similares, así como la inyección directa en un tejido u órgano; alternativamente, inyección intratecal, intramuscular directa, intraventricular, intravenosa, intraperitoneal, intranasal o intraocular. Pueden prepararse inyectables en formas convencionales, como soluciones o suspensiones líquidas, formas sólidas adecuadas para la solución o suspensiones en líquido antes de la inyección, o en forma de emulsiones. Alternativamente, puede administrarse el virus de una manera local en lugar de sistémica, por ejemplo en una formulación depot o de liberación sostenida.

La secuencia de nucleótidos de interés puede administrarse en el hígado del sujeto. La administración en el hígado puede conseguirse mediante cualquier procedimiento conocido de la técnica, incluyendo, aunque sin limitación, la administración intravenosa, la administración intraportal, la administración intrabiliar, la administración intraarterial y la inyección directa en el parénquima hepático.

Preferentemente, las células (por ejemplo, las células hepáticas) son infectadas por un vector parvovirus recombinante codificante de un péptido o proteína; las células expresan el péptido o proteína codificado y lo secretan al sistema circulatorio en una cantidad terapéuticamente eficaz (tal como se ha definido anteriormente). Alternativamente, el vector se administra y expresa en otra célula o tejido, incluyendo, aunque sin limitación, cerebro, páncreas, bazo o músculo.

Las partículas de parvovirus divulgadas pueden administrarse por vía intramuscular, más preferentemente mediante inyección intramuscular o mediante administración local (tal como se ha definido anteriormente). Además, las partículas de parvovirus de la presente exposición pueden administrarse en los pulmones.

El vector parvovirus divulgado en la presente memoria puede administrarse en los pulmones de un sujeto mediante cualesquiera medios adecuados, aunque preferentemente se administra una suspensión de aerosol de partículas respirables que comprenden los vectores parvovirus de la invención, que el sujeto inhala. Las partículas respirables pueden ser líquidas o sólidas. Los aerosoles de partículas líquidas que comprenden los vectores parvovirus inventivos pueden producirse mediante cualesquiera medios adecuados, tal como con un nebulizador de aerosol impulsado por presión o un nebulizador ultrasónico, tal como es conocido por el experto en la materia. Ver, por ejemplo, la patente US n° 4.501.729. De manera similar, los aerosoles de partículas sólidas que comprenden los vectores víricos inventivos pueden producirse con cualquier generador de aerosol de medicamento particulado sólido, mediante técnicas conocidas de la técnica farmacéutica.

Las dosis de las partículas de parvovirus inventivas dependerán del modo de administración, de la enfermedad o condición bajo tratamiento, de la condición del sujeto individual, del vector vírico particular y el gen que debe administrarse y puede determinarse de una manera rutinaria. Son dosis ejemplares para conseguir efectos terapéuticos, los títulos de virus de por lo menos aproximadamente 105, 106, 107, 108, 109, 1010, 1011, 1012, 1013, 1014, 1015 o io 16 unidades transductoras o más, preferentemente entre aproximadamente 108y 1013 unidades transductoras; todavía más preferentemente 1012 unidades transductoras.

En resumen, los vectores parvovirus, reactivos y procedimientos de la presente exposición pueden utilizarse para dirigir un ácido nucleico a células en división o no en división, y para expresar establemente el ácido nucleico heterólogo en las mismas. Utilizando dicho sistema de vector, ahora resulta posible introducir en las células, in vitro o in vivo, genes que codifican proteínas que afectan a la fisiología celular. Los vectores de la presente exposición pueden, de esta manera, resultar útiles en terapia génica para estados de enfermedad o para la modificación experimental de la fisiología celular.

El ejemplo siguiente se proporciona para ilustrar determinadas formas de realización de la invención. No se pretende limitar la invención en modo alguno.

Ejemplo I

Las mutaciones de lisina a arginina afectan a la tasa de transducción del VAA y la administración de CMH. Identificación de residuos de lisina como diana en vectores VAA1 y VAA8

Los presentes inventores utilizando el software UbPred para predecir los posibles sitios de ubiquitinación en las proteínas de cápside de VAA1, VAA2, VAA8 y Rh74 (Radivojac P. etal., 2010). El software UbPred se encuentra disponible en línea en http://www.ubpred.org/index.html. El resultado del análisis es la predicción de los residuos de lisina importantes para la ubiquitinación dentro de la secuencia de cápside del serotipo de VAA indicado. Véase la figura 1 y la tabla 1. Es el siguiente:

Secuencia de proteína de cápside VP1 del VAA1:

MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWDLKPGAPKPKANQQKQDDGRGLVLPGYKYLGPFNGL

DKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLKAGDNPYLRYNHADAEFQERLQEDTSFGGNLGRAVF

QAKKRVLEPLGLVEEGAKTAPGKKRPVEQSPQEPDSSSGIGKTGQQPAKKRLNFGQTGDSES

VPDPQPLGEPPATPAAVGPTTMASGGGAPMADNNEGADGVGNASGNWHCDSTWLGDRVIT

TSTRTWALPTYNNHLYKQISSASTGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINN

NWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTTNDGVTTIANNLTSTVQVFSDSEYQLPYVLGSAHQGCLPP

FPADVFMIPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFTFSYTFEEVPFHSSYAHS

QSLDRLMNPLIDQYLYYLNRTQNQSGSAQNKDLLFSRGSPAGMSVQPKNWLPGPCYRQQRV

SKTKTDNNNSNFTWTGASKYNLNGRESIINPGTAMASHKDDEDKFFPMSGVMIFGKESAGAS

NT ALDNVMITDEEEIKATNP V ATERF GT V A VNFQ S S STDP AT GD VH AMG ALPGM V WQDRD

VYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKNPPPQILIKNTPVPANPPAEFSATKFASFITQYST

GQVSVEIEWELQKENSKRWNPEVQYTSNYAKSANVDFTVDNNGLYTEPRPIGTRYLTRP

Lisina

Leyenda:

Mutantes deseables en VAA-1

Secuencia de proteína de cápside VP1 del VAA8:

MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWALKPGAPKPKANQQKQDDGRGLVLPGYKYLGPFNGL

DKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLQAGDNPYLRYNHADAEFQERLQEDTSFGGNLGRAVF

Q AKKRVLEPLGLVEEGAKT APGKKRP VEPSPQRSPDS ST GIGKKGQQP ARKRLNF GQT GDSE

SVPDPQPLGEPPAAPSGVGPNTMAAGGGAPMADNNEGADGVGSSSGNWHCDSTWLGDRVI

TTSTRTWALPTYNNEÍLYKQISNGTSGGATNDNTYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLI

NNNWGFRPKRLSFKLFNIQVKEVTQNEGTKTIANNLTSTIQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLP

PFPADVFMIPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFQFTYTFEDVPFHSSYAH

SQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTQTTGGTANTQTLGFSQGGPNTMANQAKNWLPGPCYRQQR

VSTTTGQNNNSNFAWTAGTKYHLNGRNSLANPGIAMATHKDDEERFFPSNGILIFGKQNAAR

DNADYSDVMLTSEEEIKTTNPVATEEYGIVADNLQQQNTAPQIGTVNSQGALPGMVWQNRD

VYLQGPrWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPADPPTTFNQSKLNSFITQYST

GQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYYKSTSVDFAVNTEGVYSEPRPIGTRYLTRNL

Lisina

Leyenda:

La tabla 3 adjunta en la presente memoria proporciona el rendimiento de vector obtenido mediante la utilización de los diferentes mutantes de cápside, incluyendo VAA8 de la exposición. La tabla indica además si la mutación resultó en eficiencias de transducción incrementadas, reducidas o comprables en comparación con vectores de tipo salvaje del mismo serotipo.

Secuencia de proteína de cápside VP1 del VAA2:

MAADGYLPDWLEDTLSEGIRQWWKLKPGPPPPKPAERHKDDSRGLVLPGYKYLGPFNGLDK

GEPVNEADAAALEHDKAYDRQLDSGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQA

KKRVLEPLGLVEEPVKTAPGKKRPVEHSPVEPDSSSGTGKAGQQPARKRLNFGQTGDADSVP

DPQPLGQPPAAPSGLGTNTMATGSGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSTWMGDRVITTS

TRTWALPTYNNHLYKQISSQSGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNW

GFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPA

D VFM VPQ Y G YLTLNNG SQ A V GR S SF Y CLE YFP SQMLRT GNNFTF S YTFED VPFH S S Y AH S QS

LDRLMNPL1DQYLYYLSRTNTPSGTTTQSRLQFSQAGASDIRDQSRNWLPGPCYRQQRVSKT

SADNNNSEYSWTGATKYHLNGRDSLVNPGPAMASHKDDEEKFFPQSGVLIFGKQGSEKTNV

D1EKVMITDEEEIRTTNPV ATEQ Y G S V STNLQRGNRQ AAT AD VNT QGVLPGM V W QDRD V YL

QGP1WAK1PHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPANPSTTFSAAKFASFITQYSTGQ

V SVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYNKSVNVDFTVDTNGVY SEPRPIGTRYLTRNL

Lisina

Leyenda:

Secuencia de proteína de cápside VP1 de VAA2-Rh74:

MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWDLKPGAPKPKANQQKQDNGRGLVLPGYKYLGPFNGL

DKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLQAGDNPYLRYNHADAEFQERLQEDTSFGGNLGRAVF

QAKKRVLEPLGLVESPVKTAPGKKRPVEPSPQRSPDSSTGIGKKGQQPAKKRLNFGQTGDSES

VPDPQPIGEPPAGPSGLGSGTMAAGGGAPMADNNEGADGYGSSSGNWHCDSTWLGDRVITT

STRTWALPTYNNHLYKQISNGTSGGSTNDNTYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINN

NWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNEGTKTIANNLTSTIQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPF

PADVFMIPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFEFSYNFEDVPFHSSYAHS

QSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTQSTGGTAGTQQLLFSQAGPNNMSAQAKNWLPGPCYRQQRV

STTLSQNNNSNFAWTGATKYHLNGRDSLVNPGVAMATHKDDEERFFPSSGVLMFGKQGAG

KDNVD YS SVMLTSEEEIKTTNPVATEQY G VV ADNLQQQNAAPIV GA VNSQGALPGM VWQN

RDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPADPPTTFNQAKLASFITQ

YSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYYKSTNVDFAVNTEGTYSEPRPIGTRYLTRNL

Lisina

Leyenda:

Mutantes deseables en VAA-rh74 (véase también la tabla 3)

Se utilizaron los conjuntos de cebadores siguientes para crear las variantes de cápside que contiene lisina de la exposición:

Cebadores utilizados para la mutagénesis:

• Cebadores de VAA1:

VAA1 K61R

sentido: 5'- CTT CAA CGG ACT CGA CAG GGG GGA GCC -3'

antisentido: 5'- GGC TCC CCC CTG TCG AGT CCG TTG AAG -3'

VAA1 K84R

sentido: 5'- GCC TAC GAC CAG CAG CTC AGA GCG GGT GAC -3'

antisentido: 5'- GTC ACC CGC TCT GAG CTG CTG GTC GTA GGC -3'

VAA1 K137R

sentido: 5'- TGG TTG AGG AAG GCG CTA GGA CGG CTC CT -3'

antisentido: 5'- AGG AGC CGT CCT AGC GCC TTC CTC AAC CA -3'

VAA1 K143R

sentido: 5'- CTA AGA CGG CTC CTG GAA AGA GAC GTC CGG TAG -3'

antisentido: 5'- CTA CCG GAC GTC TCT TTC CAG GAG CCG TCT TAG -3'

VAA1 K161R

sentido: 5'- CGG GCA TCG GCA GGA CAG GCC AGC A -3'

antisentido: 5'- TGC TGG CCT GTC CTG CCG ATG CCC G -3'

VAA1 K459R

sentido: 5'- AGT CCG GAA GTG CCC AAA ACA GGG ACT TGC TGT -3'

antisentido: 5'- ACA GCA AGT CCC TGT TTT GGG CAC TTC CGG ACT -3'

VAA1 K528R

sentido: 5'- GCA CTG CTA TGG CCT CAC ACA GAG ACG ACG AAG -3'

antisentido: 5'- CTT CGT CGT CTC TGT GTG AGG CCA TAG CAG TGC -3'

VAA1 K533R

sentido: 5'- CAA AGA CGA CGA AGA CAG GTT CTT TCC CAT GAG CG -3'

antisentido: 5'-CGC TCA TGG GAA AGA ACC TGT CTT CGT CGT CTT TG -3'

VAA1 K707R

sentido: 5'- TGCAGTACACATCCAATTATGCAAGATCTGCCAACG TTG -3'

antisentido: 5'- CAACGTTGGCAGATCTTGCATAATTGGATGTGTACTGCA -3'

• Cebadores de VAA8:

VAA8 K137R

sentido: 5'- GGT TGA GGA AGG CGC TAG GAC GGC TCC TGG -3'

antisentido: 5'- CCA GGA GCC GTC CTA GCG CCT TCC TCA ACC -3'

VAA8 K333R

sentido: 5'- GCA GAA TGA AGG CAC CAG GAC CAT CGC CAA TAA CC -3'

antisentido: 5'- GGT TAT TGG CGA TGG TCC TGG TGC CTT CAT TCT GC -3'

VAA8 K530R

sentido: 5'- GCA TCG CTA TGG CAA CAC ACA GAG ACG ACG AGG -3'

antisentido: 5'- CCT CGT CGT CTC TGT GTG TTG CCA TAG CGA TGC -3'

VAA8 K709R

sentido: 5'- GTACACCTCCAACTACTACAGATCTACAAGTGTGGACTTTG -3'

antisentido: 5'- CAAAGTCCACACTTGTAGATCTGTAGTAGTTGGAGGTGTAC -3'

• Cebadores de VAA2:

VAA2 K39R

sentido: 5'-GCCCGCAGAGCGGCATAGGGACGACAG-3' antisentido: 5'-CTGTCGTCCCTATGCCGCTCTGCGGGC-3'

VAA2 K137R

sentido: 5'-CCTGGTTGAGGAACCTGTTAGGACGGCTCCGG-3' antisentido: 5'-CCGGAGCCGTCCTAACAGGTTCCTCAACCAGG-3'

VAA2 K143R

sentido: 5'-AGACGGCTCCGGGAAAAAGGAGGCCGGTA-3'

antisentido: 5'-TACCGGCCTCCTTTTTCCCGGAGCCGTCT-3'

VAA2 K161R

sentido: 5'-CCTCGGGAACCGGAAGGGCGGGCC-3'

antisentido: 5'-GGCCCGCCCTTCCGGTTCCCGAGG-3'

VAA2 K490R

sentido: 5'-CCGCCAGCAGCGAGTATCAAGGACATCTGCGG-3' antisentido: 5'-CCGCAGATGTCCTTGATACTCGCTGCTGGCGG-3'

VAA2 K527R

sentido: 5'-CGGCCATGGCAAGCCACAGGGACGATGAA-3'

antisentido: 5'-TTCATCGTCCCTGTGGCTTGCCATGGCCG-3'

VAA2 K532R

sentido: 5'-ACAAGGACGATGAAGAAAGGTTTTTTCCTCAGAGCGG-3' antisentido: 5'-CCGCTCTGAGGAAAAAACCTTTCTTCATCGTCCTTGT-3' Cebadores de VAA-rh74:

VAA-rh74 K137R

sentido: 5'-CTGGTTGAATCGCCGGTTAGGACGGCTCCTG-3'

antisentido: 5'-GACCAACTTAGCGGCCAATCCTGCCGAGGAC-3'

VAA-rh74 K333R

sentido: 5'-GCAGAATGAAGGCACCAGGACCATCGCCAATAACC-3' antisentido: 5'-GGTTATTGGCGATGGTCCTGGTGCCTTCATTCTGC-3' VAA-rh74 K530R

sentido: 5'-GTTGCCATGGCTACCCACAGGGACGACGAA-3'

antisentido: 5'-TTCGTCGTCCCTGTGGGTAGCCATGGCAAC-3'

VAA-rh74 K552R

sentido: 5'-GGAAACAGGGAGCTGGAAGAGACAACGTGGACTAT-3' antisentido: 5'-ATAGTCCACGTTGTCTCTTCCAGCTCCCTGTTTCC-3'

VAA-rh74 K569R

sentido: 5'-CTAACCAGCGAGGAAGAAATAAGGACCACCAACCC-3' antisentido: 5'-GGGTTGGTGGTCCTTATTTCTTCCTCGCTGGTTAG-3'

VAA-rh74 K691R

sentido: 5'-CGAGTGGGAGCTGCAGAGGGAGAACAGCAA-3'

antisentido: 5'-TTGCTGTTCTCCCTCTGCAGCTCCCACTCG-3'

VAA-rh74 K695R

sentido: 5'-GCTGCAGAAGGAGAACAGCAGACGCTGGAACC-3' antisentido: 5'-GGTTCCAGCGTCTGCTGTTCTCCTTCTGCAGC-3'

VAA-rh74 K709R

sentido: 5'-AGTACACTTCCAACTACTACAGATCTACAAATGTGGACTTTGC-3' antisentido: 5'-GCAAAGTCCACATTTGTAGATCTGTAGTAGTTGGAAGTGTACT-3' La tabla 5 proporciona una serie de vectores VAA derivado de la mutagénesis que se utilizaron para empaquetar casetes de expresión de transgén de VAA específicamente hepáticos para FIX. La eficiencia de empaquetamiento era indistinguible de la observada con los vectores VAA8 no modificados, de tipo salvaje.

Los mutantes de cápside que contienen 2, 3, 4, 5, 6, 7 o más residuos de lisina alterados en cualquiera de las proteínas de cápside indicadas en la presente memoria para incrementar adicionalmente la eficiencia de transducción también se encuentran comprendidos dentro del alcance de la exposición. Los datos revelan además que determinadas mutaciones resultan en variantes que muestran una eficiencia de transducción significativamente reducida. Dichas variantes podrían utilizarse en combinación con variantes que muestran eficiencias de transducción incrementadas, para actuar como señuelos para neutralizar o saturar una respuesta inmune dirigida a anticuerpos contra los vectores entrantes, permitiendo de esta manera que los vectores portadores de los transgenes deseables entren más eficientemente en las células.

La figura 1 muestra diagramas esquemáticos de la superficie de la cápside. Los datos presentados en las figuras 2A, 2B y 2C demuestran que la alteración de los residuos de lisina en la cápside VP1 de VAA8 altera el nivel de transgén producido debido a los niveles alterados de transducción. Las figuras 3A, 3B y 3C muestran los efectos de permutaciones únicas y múltiples sobre la producción de HF.IX en células transducidas. La figura 3D muestra que una combinación de mutaciones, por ejemplo, tres residuos de lisina a arginina con cuatro o seis residuos de tirosina a fenilalanina, reducen las tasas de transducción.

Eliminación por CTL de hepatocitos HHL5-B7 mediante la utilización de VAA mutantes de lisina

Los presentes inventores evaluaron la eliminación por CTL de hepatocitos transducidos con determinados VAA mutantes de lisina divulgados en la presente memoria. Se utilizaron los materiales y procedimientos siguientes para evaluar la eliminación por CTL de hepatocitos transducidos.

Generación de vector

Se produjeron vectores VAA en células HEK-293 mediante la utilización de un enfoque de triple transducción tal como se ha descrito anteriormente (Matsushita, 1998) y se purificaron mediante procedimientos de centrifugación en gradiente de cloruro de cesio (Ayuso, 2010). Se obtuvieron péptidos epitópicos de VAA sintetizados en Genemed Synthesis y se resuspendieron a una concentración de 5 mg/ml en DMSO al 100%.

Expansión in vitro de células T

Se descongelaron, lavaron, contaron y resuspendieron PBMC humanas (Cellular Technology Ltd.) a una concentración de 2x106 células/ml en medio para linfocitos AIM-V (Gibco) que contenía suero humano al 3% (Bioreclamation), L-glutamina al 1% (Gibco) y penicilina/estreptomicina al 1% (Gibco). Para cada condición de expansión, se añadieron 1x106 células (500 j l) a cada pocillo en una placa de 24 pocillos (BD Falcon) en un volumen de 500 jl. También se añadieron 1x106 (500 j l ) adicionales de esplenocitos irradiados (3000 rad) autólogos a cada pocillo como células nodriza, junto con 2.5 jg/m l de p-2-microglobulina humana (Lee Biosolutions) y 10 ng/ml de IL-7 recombinante humana (R&D Systems). Las células se expandieron en presencia de péptido de VAA a una concentración final de 10 ng/ml a 37°C en 5% de CO2. Se añadió IL-2 humana (Roche) a una concentración de 10 ng/ml al cultivo celular, después de las primeras 24 horas y subsiguientemente se reabasteció cada 48 horas. Las células se dividieron en nuevos pocillos según resultase necesario y se repitió la estimulación antigénica (antígeno y células nodriza) cada 7 a 10 días durante 3 rondas de reestimulación.

Ensayo de CTL

Se llevó a cabo un ensayo de CTL tal como se ha descrito anteriormente (Pien, 2009). Brevemente, se midió la liberación de lactato deshidrogenasa (LDH) tras la lisis de la diana mediada por CTL, con el ensayo de citotoxicidad no radioactivo Cyto Tox 96 (Promega). Se sembraron cuatro mil células diana hepatocitos HHL5 en cada pocillo de una placa de 96 pocillos de fondo plano Microtest Primaria (BD Falcon) en DMEM que no contenía suero. Las células diana se transdujeron a un m D i de 5000, 50,000 y 500,000 de cápside de VAA y se incubaron durante 18 horas a 37°C, con 5% de CO2. Tras el tratamiento y la incubación, las células diana sembradas se lavaron una vez con medio antes de la adición de linfocitos T citotóxicos específicos de epítopo, expandidos tal como se ha indicado anteriormente. Se añadieron CTL en una proporción de células efectoras-diana de 10:1 durante 4 horas a 37°C, 5% de CO2, y se midió la LDH tras una incubación de 30 minutos a temperatura ambiente con lectura del sustrato enzimático a 490 nm utilizando un espectrofotómetro (Spectramax).

Citometría de flujo

La expresión de GFP tras la transducción de VAA se midió mediante citometría de flujo. Se sembraron hepatocitos humanos de las líneas celulares HHL5 o Huh7 en DMEM que contenía suero de feto bovino al 10%, L-glutamina al 1% (Gibco) y penicilina/estreptomicina al 1% (Gibco) a una densidad de 250,000 células/pocillo en una placa de ^{24 pocillos Primaria Multiwell} (Bd ^{Falcon). Las células se transdujeron a una MDI de 5000, 50000, o 5000000 de} vector VAA y se incubaron durante 18 horas a 37°C, con 5% de CO2. Tras la incubación, las células se tripsinizaron, se lavaron dos veces con PBS, FBS al 2% y se fijaron con paraformaldehído al 2%. Las muestras se adquirieron en un citómetro de flujo FACS Canto II utilizando el FACSDiva® (BD Biosciences) y se llevó a cabo un análisis adicional utilizando el software Flowjo® (Treestar).

Resultados del ensayo de CTL

Con el fin de llevar a cabo adicionalmente el efecto de las mutaciones de lisina sobre la transducción vírica, los presentes inventores utilizaron un ensayo in vitro de citotoxicidad mediada por CTL previamente desarrollado por el laboratorio de los presentes inventores a fin de someter a ensayo la funcionalidad de los vectores VAA (Pien et al.). Los resultados de transducción de VAA1 y VAA2 se muestran en las figuras 4, 5 y 6. En la figura 4, todas las mutaciones de lisina en la cápside VAA-1 resultaron en una reducción de la eliminación mediada por CTL de las células diana, sugiriendo que las mutaciones de la lisina conducen a un procesamiento y presentación de antígeno superficial menos eficientes con la transducción. Además, el efecto de las mutaciones de lisina aparentemente es aditivo, ya que los mutantes triples y cuádruples de lisina mostraban la mayor reducción de la eliminación mediada por CTL (figura 4A, B). Las mutaciones de la cápside VAA-2 mostraron un efecto similar. Véanse las figuras 5 y 6. La figura 7 muestra los resultados de transducción obtenidos al someter a ensayo las variantes de Rh74.

En resumen, los presentes inventores han encontrado que la mutación de los residuos de lisina en las cápsides de VAA a residuos de arginina incrementa la eficiencia de transducción del VAA. Los experimentos de los presentes inventores identificaron varias variantes que, tras la transducción, resultaron en niveles más elevados de expresión del transgén del factor IX humano (FIX) en ratones en comparación con animales que habían recibido vectores VAA no modificados.

Referencias

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TABLA 1

Comparison of AAV1, AAV2 and AAV8 lysine positions and their Ubiqutination predictions

Color Label: |Verd^iconftañá|!faja , A zul: con fianza m edia NRojo: confianza elevada Black: No ubiquitination prediction

AAV1 MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWDLKPGAPKPKANQQKQDDGRGLVLPGYKYLGPFNGLD60 AAV8 MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWALKPGAPKPKANQq S q DDGRGLVLPGYKYLGPFNGLD 60 AAV2 MAADGYLPDWLEDTLSEGIRQVWVKLKPGPPPPKPAERH^DDSRGLVLPGYKYLGPFNGLD60 AAV-rh74 MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWDLKPGAPKPKANQq K q DNGRGLVLPGYKYLGPFNGLD 60

AAV1 ^GEPVNAADAAALEHDjpAYDQQLjJ¡'AGDNPYLRYNHADAEFQERLQEDTSFGGNLGRAVFQ 120 AAV8 ¿ÜGEPVNAADAAALEHD |AYDQQLQAGDNPYLRYNHADAEFQERLQEDTSFGGNLGRAVFQ120 AAV2 y^GEPVNEADAAALEHDL ^AYDRQLDSGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQ 120 AAV-rh74 2GEPVNAADAAALEHD^AYDQQLQAGDNPYLRYNHADAEFQERLQEDTSFGGNLGRAVFQ120

AAV1 AKKRVLEPLGLVEEG. 'S^{t a p g} |rpveqspq-epdsssgig[3 tgqqpakkrlnfgqtgdsi79 AAV8 AKKRVLEPLGLVEEGA ^TAPGKljRPVEPSPQRSPDSSTGIGKKGQQPARKRLNFGQTGDS 180 AAV2 AKKRVLEPLGLVEEPV |^TAPg K |2 rPVEHSPV-EPDSSSGTg[2 aGQQPARKRLNFGQTGDA179 AAV-rh74 AKKRVLEPLGLVESPV IljJTAPGKKrPVEPSPQRSPDSSTGIg K kGQQPAKKRLNFGQTGDS 180

AAV1 ESVPDPQPLGEPPATPAAVGPTTMASGGGAPMADNNEGADGVGNASGNWHCDSTWLGDRV 239 AAV8 ESVPDPQPLGEPPAAPSGVGPNTMAAGGGAPMADNNEGADGVGSSSGNWHCDSTWLGDRV 240 AAV2 DSVPDPQPLGQPPAAPSGLGTNTMATGSGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSTWMGDRV 239 AAV-rh74 ESVPDPQPIGEPPAGPSGLGSGTMAAGGGAPMADNNEGADGVGSSSGNWHCDSTWLGDRV 240

AAV1 ITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSASTG-ASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQ 298 AAV8 ITTSTRTWALPTYNNHLYKQISNGTSGGATNDNTYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQ 300 AAV2 ITTSTRTWALPTYNNHLYKQIS-SQSGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQ 297 AAV-rh74 ITTSTRTWALPTYNNHLYKQISNGTSGGSTNDNTYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQ 300

AAV1 RLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTTNDGVTTIANNLTSTVQVFSDSEYQLPYVLGSA 358 aav8 rlinnnwgfrpkrlsfklfniqvkevtqnegt(2tiannltstiqvftdseyqlpyvlgsa360 AAV2 RLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVLGSA 357 AAV-rh74 RLINMNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNEGtJ J t IANNLTSTIQVFTDSEYQLPYVLGSA 360

AAV1 HQGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFTFSYTFEE 418 AAV8 HQGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFQFTYTFED 420 AAV2 HQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFTFSYTFED 417 AAV-rh74 HQGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFEFSYNFED 420

a a v i v p f h s s y a h s q s ld r lm n p l id q y l y y l n r t q n q s g s a q n | 2 d l l f s r g s p a g m s v q p k n w 478 AAV8 VPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTQTTGGTANTQTLGFSQGGPNTMANQAKNW 480 AAV2 VPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTNTPSGTTTQSRLQFSQAGASDIRDQSRNW477 AAV-rh74 VPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTQSTGGTAGTQQLLFSQAGPNNMSAQAKNW 480 AAV1 LPGPCYRQQRVs K tKTDNNNSNFTWTGAS^YNLNGRESIINPGTAMAShS d DED^FFPMS 538 AAV8 LPGPCYRQQRVSTTTGQNNNSNFAWTAGTKYHLNGRNSLANPGIAMATHySDDEERFFPSN 540 AAV2 LPGPCYRQQRVsJJtSADNNNSEYSWTGAt K y HLNGRDSLVNPGPAMASh S dDEeIJ f FPQS 537 AAV-rh74 LPGPCYRQQRVSTTLSQNNNSNFAWTGAt K y HLNGRDSLVNPGVAMATh[2 d DEERFFPSS 540

AAV1 g vm ifg ^ sa g a sn ta ld n vm itd eeeS a tn p v a te r fg tv a v n fq s s s td p a tg d v h a598 AAV8 g ilifg K q n a a r d n a d ys d v m lts e ee | 2 ttn p v a te e y g iv a d n lq q q n ta p q ig tv n s600

AAV1 MGALPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGG FGLKNPPPQILIKNTPVPANP 658 AAV8 QGALPGMVWQNRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPADP 660 AAV2 QGVLPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPANP 657 AAV-rh74 QGALPGMVWQNRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPADP 660

AAV1 p aefsa tK fasfitq ystg q vsveiew elq ü¿!SensLéJrw n pevq ytsn ya | ISANVDFTVDNN 718 AAV8 m FN Q 4 § LNSFITQYSTGQVSVEIEWELQMENSli2RWNPEIQYTSN TSVDFAVNTE 720 AAV2 STTFSAa K fASFITQYSTGQVSVEIEWELQÍSeNS jRWNPEIQYTSNYI kjjsVNVDFTVDTN 717 AAV-rh74 p ttfn q aK la s fitq ys tg q vs v e ie w e lc m en s ÍRWNPEIQYTSNYYl STNVDFAVNTE720

AAV1 GLYTEPRPIGTRYLTRP- 735

AAV8 GVYSEPRPIGTRYLTRNL 738

AAV2 GVYSEPRPIGTRYLTRNL 735

AAV-rh74 GTYSEPRPIGTRYLTRNL 738

Tabla 2

Software UbPred (http://www.ubpred.ora/):

Radivojac P., Vacic, V., Haynes, C., Cocklin, R. R., Mohan, A., Heyen, J. W., Goebl, M. G. y lakoucheva, L. M., Identification, Analysis and Prediction of Protein Ubiquitination Sites. Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics. 78(2):365-380 (2010;.

Tabla 3

Administración de CMH

Claims (13)

REIVINDICACIONES

1. Vector virus adenoasociado (VAA) que comprende una proteína de cápside VP1 que comprende una o más sustituciones de lisina seleccionadas de entre K6lR, K84R, Kl37R, K143R, K161R, K459R, K533R y K707R de la proteína de cápside VP1 del VAA1, en el que dicho vector comprende además un minigén que comprende repeticiones terminales invertidas de VAA y una secuencia de ácidos nucleicos heteróloga operablemente ligada a secuencias reguladoras que dirigen la expresión de un producto a partir de la secuencia de ácidos nucleicos heteróloga en una célula huésped, en el que dicha sustitución de lisina resulta eficaz para inhibir la ubiquitinación de dicha proteína de cápside, incrementando de esta manera la transducción de dicho vector VAA en una célula diana, en comparación con un vector VAA que comprende la proteína de cápside VP1 de VAA1 sin la sustitución o sustituciones de lisina.

2. Vector virus adenoasociado (VAA) que comprende una proteína de cápside VP1 que comprende una o más sustituciones de lisina seleccionadas de entre K39R, K137R, k 143R, K161R, K490R, K527R y K532r de la proteína de cápside VP1 del VAA2, en el que dicho vector comprende además un minigén que comprende repeticiones terminales invertidas de VAA y una secuencia de ácidos nucleicos heteróloga operablemente ligada a secuencias reguladoras que dirigen la expresión de un producto a partir de la secuencia de ácidos nucleicos heteróloga en una célula huésped, en el que dicha sustitución de lisina resulta eficaz para inhibir la ubiquitinación de dicha proteína de cápside, incrementando de esta manera la transducción de dicho vector VAA en una célula diana, en comparación con un vector VAA que comprende la proteína de cápside VP1 de VAA2 sin la sustitución o más sustituciones de lisina.

3. Vector virus adenoasociado (VAA) que comprende una proteína de cápside VP1 que comprende una o más sustituciones de lisina seleccionadas de entre K137R, K333R, K530R y K569R de la proteína de cápside VP1 del VAA8, en el que dicho vector comprende además un minigén que comprende repeticiones terminales invertidas de VAA y una secuencia de ácidos nucleicos heteróloga operablemente ligada a secuencias reguladoras que dirigen la expresión de un producto a partir de la secuencia de ácidos nucleicos heteróloga en una célula huésped, en el que dicha sustitución de lisina resulta eficaz para inhibir la ubiquitinación de dicha proteína de cápside, incrementando de esta manera la transducción de dicho vector VAA en una célula diana, en comparación con un vector VAA que comprende la proteína de cápside VP1 de VAA8 sin la sustitución o sustituciones de lisina.

4. Vector virus adenoasociado (VAA) que comprende una proteína de cápside VP1 que comprende una o más sustituciones de lisina seleccionadas de entre K137R, K333R, K552R y K709R de la proteína de cápside VP1 del VAA-rh74, en el que dicho vector comprende además un minigén que comprende repeticiones terminales invertidas de VAA y una secuencia de ácidos nucleicos heteróloga operablemente ligada a secuencias reguladoras que dirigen la expresión de un producto a partir de la secuencia de ácidos nucleicos heteróloga en una célula huésped, en el que dicha sustitución de lisina resulta eficaz para inhibir la ubiquitinación de dicha proteína de cápside, incrementando de esta manera la transducción de dicho vector VAA en una célula diana, en comparación con un vector VAA que comprende la proteína de cápside VP1 de VAA-rh74 sin la sustitución o sustituciones de lisina.

5. Vector VAA según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el producto de expresión de la secuencia de ácidos nucleicos heteróloga es un péptido o ácido nucleico terapéutico.

6. Vector VAA según la reivindicación 5, en el que el péptido terapéutico es un factor de coagulación seleccionado del grupo que consiste en Factor VIII, Factor IX y un fragmento funcional de los mismos.

7. Vector VAA según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el producto de expresión de la secuencia de ácidos nucleicos heteróloga es una IgG, IgM, IgA, IgD, IgE, inmunoglobulina quimérica, anticuerpo humanizado o un anticuerpo de una sola cadena.

8. Vector VAA según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el producto de expresión es un ARNi antivírico.

9. Vector VAA según la reivindicación 8, en el que dicho ARN inhibidor resulta eficaz para inhibir la expresión de un gen diana eucariótico.

10. Vector VAA según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, que comprende 2, 3 o 4 sustituciones de lisina.

11. Composición farmacéutica que comprende el vector VAA según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 y un portador fisiológicamente compatible para la misma.

12. Cultivo celular que comprende el vector VAA según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que dicho vector ha sido introducido en la célula.

13. Vector VAA según la reivindicación 6 para utilizar en un procedimiento de tratamiento de la hemofilia A o hemofilia B.