JP6342886B2 - Ａａｖカプシドバリアントを使用した高効率な遺伝子導入のための組成物及び方法 - Google Patents

Ａａｖカプシドバリアントを使用した高効率な遺伝子導入のための組成物及び方法 Download PDF

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Description

本出願は、２０１２年４月１８日に出願された米国仮出願第６１／６３５，２７３号及び２０１３年３月１５日に出願された米国仮出願第６１／７９４，９９５号に基づく優先権を主張し、そのすべての内容は、全体として参照により本明細書に組み込まれる。
本願は、遺伝子治療及び分子生物学の分野に関する。より詳細には、本発明は、治療に有益な導入遺伝子を含むＡＡＶベクターの形質導入効率を向上させるタンパク質カプシドのバリアント（多様体）を含むアデノ随伴ウィルスベクターを提供する。
この発明が関係する技術水準を記述する目的で、複数の刊行物及び特許文献が本明細書を通じて引用される。これらの引用は参照により全体として本明細書に組み込まれる。
アデノ随伴ウィルス（ＡＡＶ）は、小さな（２０ｎｍ）、複製能欠失型の非エンベロープウィルスである。様々な多くのＡＡＶ血清型は、ヒト及びヒト以外の霊長類の特徴を有する。ＡＡＶゲノムは、両端に１４５塩基対の末端逆位繰り返し配列（ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔｓ：ＩＴＲ）を有する一本鎖ＤＮＡから構成されている。２つの翻訳領域（ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ：ＯＲＦ）である、ｒｅｐ及びｃａｐが存在する。ＡＡＶ複製に、ｒｅｐ産物は必須であると同時に、３つのカプシドタンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３）がｃａｐ遺伝子から発現する。ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３はそれぞれ１：１：１０の比で共に存在し、正二十面体カプシドを形成する。（Ｘｉｅ Ｑ他、２００２年）組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶの）ベクター生成の間に、ＩＴＲが隣接した発現カセットが、ＡＡＶカプシドにパッケージ化される。ＡＡＶの複製に必要な遺伝子は、カセットに含まれていない。組換えＡＡＶは、安全、且つ、インビボでの遺伝子導入のために最も広く使用されるウィルスベクターの一つであると考えられている。ベクターは、強力かつ持続的な導入遺伝子発現を提供する複数の組織型の細胞に感染可能である。更に、ベクターは、非病原性であり、低い免疫原性プロファイル（Ｈｉｇｈ ＫＡ、２０１１年）を有する。
遺伝子治療試験における当面の目標の一つは、ベクター投与量を最小限に抑えながら組織の形質導入を最大化するように、ベクターを最適化することである。ＡＡＶカプシドタンパク質が細胞に入ると、プロテアソーム媒介性分解の対象となる。ＡＡＶカプシドにおける表面が露出したチロシン残基のリン酸化は、ユビキチン−プロテアソーム経路を介してウィルスの劣化につながる最初のステップのうちの１つを表す（Ｚｈｏｎｇ Ｌ他、２００７年）。細胞内の制御されたタンパク質分解のほとんどは、この経路を介して行われる。ユビキチン（ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）は、すべての真核細胞で見つけることができる小さなタンパク質（〜８．５ｋＤａ）である。ユビキチンは、基質タンパク質のアミノ酸の側鎖に結合している。最初に結合されたユビキチンを介して、更なるユビキチンタンパク質が基質に付加された後、ポリユビキチン鎖が形成され、劣化のためにマーキングされる（Ｔｈｒｏｗｅｒ ＪＳ 他 ２０００年、 Ｐｅｎｇ Ｊ 他２００３年、Ｂｅｄｆｏｒｄ Ｌ他２０１１年）。表面が露出しているチロシン残基の変異は、ＡＡＶ２ベクターの形質導入効率の増加（Ｚｈｏｎｇ Ｌ他、２００８年）をもたらすことが示されている。更に最近では、いくつかのグループが、この手法は、いくつかの組織において、ＡＡＶ血清６型及び８型を含む他のＡＡＶ血清型にも有効であることが示されている。
臨床的に重要な導入遺伝子を伴うＡＡＶの患者への形質導入を改善する組成物及び方法への需要が当技術分野に明確に存在する。
本発明によれば、本明細書に開示される改変を行わないＡＡＶ血清型（例えば、ＡＡＶｌ、ＡＡＶ２、ＡＡＶ８、ＡＡＶ−ｒｈ７４）と比較した場合に、形質導入効率の向上を示す新規のＡＡＶバリアントが提供される。このような改良されたベクターは、肝臓、筋肉、脳及び網膜を含む種々の組織の形質導入のために有用である。
一実施形態では、改変されたＶＰ１カプシドタンパク質を含むアデノ随伴ウィルス（ＡＡＶ）ベクターが提供され、改変されたカプシドタンパク質はリジン残基の置換を含み、それによってカプシドのユビキチン化を減少させ、標的の組織及び細胞に変異型ＡＡＶを形質導入する効率を向上させる。一実施形態において、ベクターは更に、宿主細胞における異種核酸配列からの産物の発現を指令する制御配列に作動可能に結合された異種核酸（例えば、ＡＡＶ末端逆位繰り返し配列及び異種核酸配列を含むミニ遺伝子）を含む。好ましい実施形態では、ＡＡＶベクターは、以下に記す表に示されるように、ＶＰ１における１つ又は複数のリジン置換を含む。別の実施形態では、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ８血清型のものであり、表３に示すような改変を含んでいる。

好ましい実施形態では、変異型カプシドタンパク質を含む本発明のＡＡＶベクターは、治療用ペプチド又は治療用核酸の発現に有用である。このようなペプチドは、以下に限定されるものではないが、抗ウィルスＲＮＡｉ分子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子又はその機能的断片が含まれる。更なる発現産物としては、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、キメラ免疫グロブリン、ヒト化抗体、又は、一本鎖抗体が含まれる。一態様において、発現産物は、ＨＣＶ感染及び複製を阻害するのに有用なＲＮＡｉである。別の実施形態において、発現産物は、目的の標的細胞をダウンモジュレーション（抑制）するために有用なアンチセンス核酸である。
本発明の別の実施形態では、生物学的に適合する担体中に本発明の変異型ＡＡＶベクターを含む医薬組成物が提供される。また、本明細書に開示されるベクターを含む細胞培養物も本発明に包含される。
本発明はまた、対象の細胞に導入遺伝子を送達する方法を含み、当該方法は、ＡＡＶベクターと細胞とを接触させる工程を含む。当該ＡＡＶベクターは導入遺伝子を含み、当該ベクターにおけるＶＰ１カプシド配列におけるリジン置換の特徴の存在が、ユビキチン化の低減及び形質導入効率の上昇と関連している。
最後の形態として、本発明は、感染した細胞では効果を有さないが、２つのウィルスのバリアントの構造的類似性により、有益な導入遺伝子を担持するウィルスバリアントの抗体中和を阻止するのには有効である、おとりウィルスバリアント（ｄｅｃｏｙ ｖｉｒａｌ ｖａｒｉａｎｔｓ）を提供する。この目的の典型的なカプシドバリアントの例としては、Ｋ３８Ｒ、Ｋ１４３Ｒ、Ｋ５１０Ｒ及びＫ７０９Ｒが含まれる。
ＡＡＶ１、ＡＡＶ２及びＡＡＶ８の表面に存在するリジン（Ｌｙｓｉｎｅｓ）。ここで使用されるＡＡＶ血清型のＰＤＢ数は、以下の通りである。ＡＡＶ１：３ＮＧ９、ＡＡＶ２：１ＬＰ３、及び、ＡＡＶ８：２ＱＡ０。矢印は、それぞれのリジン残基を示す。図１Ａは、ＡＡＶ１ ＶＰ３の表面に１１個のリジンが存在する場合を示している。残基に付された色は、以下のとおりである。Ｋ２５８ 赤、Ｋ４５９ 青、Ｋ４９１ 黄色、Ｋ４９３マゼンタ、Ｋ５０８ シアン、Ｋ５２８ ダークサーモン、Ｋ５３３ 黄緑、Ｋ５４５ ライトブルー（青灰色）、Ｋ５６７ ダークサーモン、Ｋ６６６ ライトシアン、Ｋ７０７ 灰色。図１Ｂは、ＡＡＶ２ ＶＰ３の表面に１０個のリジンが存在する場合を示している。残基に付された色は、以下のとおりである。Ｋ２５８ 赤、Ｋ４９０ 黄色、Ｋ５０７ シアン、Ｋ５２７ ダークサーモン、Ｋ５３２ 黄緑、Ｋ５４４ ライトブルー（青灰色）、Ｋ５４９ 明るい黄色、Ｋ５５６ ライトマゼンタ、Ｋ６６５ ライトシアン、Ｋ７０６ 灰色。図１Ｃは、ＡＡＶ２ ＶＰ３の表面に８個のリジンが存在する場合を示している。残基に付された色は、以下のとおりである。Ｋ２５９ 赤、Ｋ３３３ 緑、Ｋ５１０ シアン、Ｋ５３０ ダークサーモン、Ｋ５４７ライトブルー（青灰色）、Ｋ５６９ダークサーモン、Ｋ６６８ ライトシアン、Ｋ７０９ 灰色。ＡＡＶ１のＫ５２８及びＫ５６７、並びに、ＡＡＶ８のＫ５３０及びＫ５６９が構造内で横に並んでおり、同じ色で示されていることに注意されたい。 ＡＡＶ８カプシドの幾つかのリジン残基を、アルギニンへと変異させた。動物から血液を、尾静脈を介してウィルス注射後８週間、収集した。ｈＦ．ＩＸレベルをＥＬＩＳＡによって検出した。図２Ａでは、高信頼度及び中信頼度でソフトウェアによってユビキチン化すると予測された残基が、アルギニンに変異した。一マウスあたり、２．５×１０10のウィルス粒子が、尾静脈（Ｂ、Ｃ）から注入された。低信頼度でソフトウェアによってユビキチン化すると予測された残基が、アルギニンに変異した。一マウスあたり、２．５×１０9のウィルス粒子が、尾静脈から注入された。図２Ｂは、Ｋ５６９ＲとＫ６６８Ｒのカプシド変異である。図２Ｃは、Ｋ３８Ｒ、Ｋ１４３Ｒ、Ｋ２５９Ｒ、Ｋ５１０Ｒ、Ｋ５４７Ｒカプシド変異の影響を、Ｋ５３０Ｒ変異の影響と比較したものである。 ＫからＲまでのカプシド変異の組み合わせ。図３Ａは、Ｋ１３７Ｒ、Ｋ３３Ｒ及びＫ５３０Ｒ変異の組み合わせであり、これらは野生型よりも高いが、Ｋ５３０Ｒと統計的に異ならない。図３Ｂでは、Ｋ７０９Ｒ変異がＡＡＶ８形質導入に負の影響を及ぼし、Ｋ（１３７／３３３／５３０）Ｒ変異体へのＫ７０９Ｒ変異の付加も、ウィルスの形質導入を減少させる。図３Ｃは、複数リジンのアルギニンへの変異の組み合わせでは形質導入を増加させない。図３Ｄでは、３リジンのアルギニン残基への変異と、４又は６チロシンのフェニルアラニン残基への変異との組み合わせが、形質導入速度を低下させる。 ＡＡＶｌ形質導入を示す。図４Ａは、３つの異なるＭＯＩ ５Ｋ、５０Ｋ及び５００ＫでのＡＡＶ−１リジン変異体により形質導入されたＨＨＬ５−Ｂ７肝細胞のＣＴＬによる死滅である。ペプチド（ＡＡＶ１には ＩＰＱＹＧＹＬＴＬを、 ＡＡＶ２にはＶＰＱＹＧＹＬＴＬ）を陽性対照として使用した。ＬＤＨ放出は、細胞死滅と相関する。図４Ｂは、ＧＦＰ陽性細胞及びＧＦＰ発現の合計数を、５０Ｋ及び５００ＫのＭＯＩでの異なる構造間で比較したものである。 ＡＡＶ２形質導入を示す。図５Ａは、ＡＡＶ２ Ｋ１３７Ｒ、Ｋ５２７Ｒ又はＫ５３２Ｒ変異体と、ＷＴ ＡＡＶ２とを、ＨＨＬ５細胞株の形質導入率の観点で比較した。細胞を、１０Ｋ、５０Ｋ、１００Ｋ及び５００ＫのＭＯＩでトランスフェクトし、２４時間後にＧＦＰ発現を調べた。図５Ｂは、試験したバリアントのＬＤＬ放出により測定された細胞傷害性（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）を示すグラフである。 肝細胞を標的としたＣＴＬアッセイを、高濃度でＡＡＶ−２ベクターを使用して形質導入した後、ＨＬＡが一致したエフェクター細胞を使用してインキュベートした。図に示すように、ＡＡＶベクターは、野生型ＡＡＶ−２カプシド又は単一リジンの変異をコードしていた。エフェクターは、インビトロで、ＡＡＶ−２ ＭＨＣクラスＩ エピトープＶＰＱＹＧＹＬＴＬに対して増殖されたＰＢＭＣから得られたものであり、エフェクター対標的比は１０：１とした。結果は、野生型ベクターに対するＣＴＬ活性のパーセンテージとして表されている（最大細胞傷害性対象（ｍａｘｉｍｕｍ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｃｏｎｔｒｏｌ）として１０％ＳＤＳで処理した細胞と比較した、バックグラウンドを差し引いた後の％細胞傷害性）。 ＲＨ７４のデータである。ヒトＦ．ＩＸ．専用のＥＬＩＳＡによって測定された、血漿中のヒトＦ．ＩＸの導入遺伝子発現レベルである。図７Ａは、ＴＭＲの定義＝Ｋ（１３７／３３３／５３０）Ｒ、ＨＭＦの定義＝Ｙ（２５３／２７５／４４７／７０３／７０７／７３３）Ｆ。図７Ｂは、ＨＭＲの定義：Ｋ（１３７／２５９／３３３／５３０／５５２／５６９）Ｒ、１９５／２０２の定義：Ｇ１９５Ａ＋Ｌ１９９Ｖ＋Ｓ２０１Ｐ＋Ｇ２０２Ｎ。ＨＭＲ＋１９５／２０２、ＨＭＲ＋１９５／２０２＋Ｋ（３８）Ｒ、ＨＭＲ＋１９５／２０２＋Ｋ（５１）Ｒ、ＨＭＲ＋１９５／２０２＋Ｋ（６１）Ｒ、及び、ＨＭＲ＋１９５／２０２＋Ｋ（７７）Ｒは、マウスへの注入において高いｈＦＩＸ生成量となったが、ＨＭＲ＋１９５／２０２＋Ｋ（１２２／１２３）Ｒ又はＨＭＲ＋１９５／２０２＋Ｋ（１４２／４１３）Ｒを注入した場合は、検出可能なｈＦＩＸ量を生成しなかった。図７Ｃでは、ＲＨＭ１３＿１変異体は、Ｒｈ７４ ＷＴと比較して同様のｈＦＩＸレベルを生成したのに対し、ＲＨＭ１７＿１で処置されたマウスから得られたｈＦＩＸレベルは、バックグラウンドレベルを超えなかった。図７Ｄでは、ＲＨＭ１４＿２変異体はＲｈ７４ ＷＴと比較して同様のｈＦＩＸレベルを生成した。ＲＨＭ１５＿１性能は、ＡＡＶ８とＡＡＶｒｈ７４ ＷＴとの間であった。
本発明では、ＡＡＶカプシド上のリジン残基をアルギニン残基へと変異させることにより、ＡＡＶの形質導入効率を向上させることができることを発見した。我々の最初の実験では、ユビキチン化の標的となると予測されるリジン残基を一箇所置換した場合、改変されていないＡＡＶベクターを投与した動物と比較して、マウスにおけるヒト第ＩＸ因子（ＦＩＸ）導入遺伝子の高レベルの発現をもたらすことが示された。本明細書に説明するＡＡＶリジン変異体は、野生型ＡＡＶカプシドと比較してより高い効率で、肝臓、中枢神経系、筋肉及び他の器官を標的とするベクターを作製するのに利用することができる。この発見は、血友病Ａ及びＢ、ハンチントン病、並びに、対象の標的組織への望ましい導入遺伝子の形質導入レベルが要求されるその他のあらゆる疾患を治療するための治療薬を開発するのに使用することができると考えられる。
以下の定義は、本発明の理解を容易にするために提供される。
Ｉ．定義
「遺伝子治療（Ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ）」は、疾患、一般的に遺伝性疾患を治療するために、個々の細胞及び／又は組織へと遺伝子を挿入することであり、欠損変異体対立遺伝子が交換又は機能的なもので補足される。
パルボウィルス科の「アデノ随伴ウィルス（ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ）」とは、一本鎖ＤＮＡのゲノムを有する小さなウィルスである。これらのウィルスは、１９番染色体上の特定の部位に遺伝物質を挿入することができ、ヒトにおける病原性疾患と関係しないことから、好ましい。
「治療的（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ）」ペプチド又はタンパク質とは、細胞又は対象におけるタンパク質中の欠損又は欠陥に起因する症状を緩和又は軽減させることができるペプチド又はタンパク質である。あるいは、「治療的」ペプチド又はタンパク質とは、対象に利益を付与するもの、例えば、抗癌効果を与えるペプチド又はタンパク質である。治療的ペプチド及びタンパク質としては、以下に限定されないが、ＣＦＴＲ（嚢胞性線維症膜貫通調節タンパク質）、ジストロフィン（ジストロフィンミニ遺伝子のタンパク質産物を含む、 Ｖｉｎｃｅｎｔ他、（１９９３年）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ５：１３０、参照）、ウトロフィン（Ｔｉｎｓｌｅｙ他、（１９９６年）Ｎａｔｕｒｅ ３８４：３４９）、凝固因子（第ＸＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、等）、モノクローナル抗体（Ｌｅｗｉｓ他、２００２年）、エリスロポエチン、ＬＤＬ受容体、リポタンパク質リパーゼ、オルニチントランスカルバミラーゼ、β−グロビン、α−グロビン、スペクトリン、α‐アンチトリプシン、アデノシンデアミナーゼ、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、β−グルコセレブロシダーゼ、スフィンゴミエリナーゼ、リソソームヘキソサミニダーゼ、分岐鎖ケト酸脱水素酵素、ホルモン、成長因子（例えば、インスリン様成長因子１及び２、血小板由来増殖因子、上皮増殖因子、神経成長因子、神経栄養因子−３及び−４、脳由来神経栄養因子、グリア由来成長因子、形質転換成長因子α及び、等）、サイトカイン（例えば、α‐インターフェロン、β−インターフェロン、インターフェロンγ、インターロイキン‐２、インターロイキン−４、インターロイキン１２、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、リンホトキシン）、自殺遺伝子産物（例えば、単純ヘルペスウィルスチミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ、ジフテリア毒素、シトクロムＰ４５０、デオキシシチジンキナーゼ、及び、腫瘍壊死因子）、癌治療、腫瘍抑制遺伝子産物で使用される薬剤に対する耐性を付与するタンパク質（例えば、ｐ５３、Ｒｂ、Ｗｔ−１、ＮＦ１、ＶＨＬ、ＡＰＣ等）、及び、必要とする対象物において治療効果を有するその他の任意のペプチド又はタンパク質、が挙げられる。
治療用ペプチド又はタンパク質の更なる例としては、以下に限定されないが、嚢胞性線維症（及び肺の他の疾患）、血友病Ａ、血友病Ｂ、サラセミア、貧血及び他の血液疾患、ＡＩＤＳ、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、てんかん及び他の神経疾患、癌、糖尿病、筋ジストロフィー（例えば、デュシェンヌ型、ベッカー型）、ゴーシェ病、ハーラー病、アデノシンデアミナーゼ欠損症、グリコーゲン貯蔵疾患及び他の代謝障害、網膜の変性疾患（眼の他の疾患）、並びに、固形臓器（例えば、脳、肝臓、腎臓、心臓）の疾患を含む疾患状態の治療に使用され得るペプチド又はタンパク質が含まれる。
本明細書で使用されている「プロモーター（ｐｒｏｍｏｔｅｒ）」という用語は、組換え産物をコードするＤＮＡ配列に隣接して位置するＤＮＡ配列を指すのに使用できる。プロモーターは、好ましくは、隣接するＤＮＡ配列に作動可能に結合されている。プロモーターが存在しない場合に発現する組換え産物の量と比較して、プロモーターがある場合には、典型的には、ＤＮＡ配列から発現された組換え産物の量を増加させる。一の生物からのプロモーターを、別の生物に由来するＤＮＡ配列から組換え産物の発現を増強するために利用することができる。例えば、脊椎動物のプロモーターを、脊椎動物のクラゲＧＦＰの発現のために使用し得る。さらに、一つのプロモーターエレメントは、タンデムに接続された複数のＤＮＡ配列について発現された組換え産物の量を増加させることができる。したがって、一つのプロモーター要素は、一つ又は複数の組換え産物の発現を増強することができる。複数のプロモーターエレメントが、当業者に周知である。
一実施形態では、高レベルの構成的発現（ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）が望まれる。このようなプロモーターの例としては、以下に限定されないが、レトロウィルスラウス肉腫ウィルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター／エンハンサー、サイトメガロウィルス（ＣＭＶ）前初期プロモーター／エンハンサー（Ｂｏｓｈａｒｔ他、Ｃｅｌｌ、４１：５２１−５３０（１９８５年））、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロ葉酸還元酵素プロモーター、細胞質のβアクチンプロモーター及びホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、が挙げられる。
別の実施形態では、誘導性プロモーターが所望される場合がある。誘導性プロモーターは、シス又はトランスで、外因的に供給される化合物によって制御されるものであり、以下に限定されないが、亜鉛誘導性ヒツジメタロチオネイン（ＭＴ）プロモーター、デキサメタゾン（Ｄｅｘ）誘導性マウス乳癌ウィルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、Ｔ７ポリメラーゼプロモーターシステム（ＷＯ９８／１００８８）、テトラサイクリン抑制性システム（Ｇｏｓｓｅｎ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．米国、８９：５５４７−５５５１（１９９２年））、テトラサイクリン誘導性システム（Ｇｏｓｓｅｎ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６８：１７６６−１７６９（１９９５年）；Ｈａｒｖｅｙ他，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２：５１２−５１８（１９９８年）も参照）、ＲＵ４８６誘導性システム（Ｗａｎｇ他、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．、１５：２３９−２４３（１９９７年）及びＷａｎｇ他、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，４：４３２−４４１（１９９７年）、及び ラパマイシン誘導性システム（Ｍａｇａｒｉ 他，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１００：２８６５−２８７２（１９９７年）、Ｒｉｖｅｒａ他．，Ｎａｔ．Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．２：１０２８−１０３２（１９９６年））が挙げられる。これに関連して有用であり得る誘導性プロモーターの他のタイプとしては、特定の生理学的状態により調節されるものであり、例えば温度、急性期、又は、複製細胞内でのみといった状態によって調整されるものが考えられる。
別の実施形態では、目的の導入遺伝子又は核酸配列のネイティブプロモーターが使用され得る。導入遺伝子又は核酸配列の発現が天然発現（ｎａｔｉｖｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）を模倣することが望まれる場合に、ネイティブプロモーターが好ましい。導入遺伝子又は他の核酸配列の発現が一時的又は発生学的に調節される、又は、組織に固有の態様で、若しくは、特定の転写刺激に応答して調整される必要がある場合に、ネイティブプロモーターを使用することができる。更なる実施形態において、エンハンサーエレメント、ポリアデニル化部位又はコザックコンセンサス配列のようなその他の天然の発現制御要素を、天然発現を模倣するために使用することができる。
一実施形態では、組換えウィルスゲノムは、組織に固有のプロモーターに作動可能に連結された導入遺伝子を含む。例えば、骨格筋での発現が所望される場合、筋肉中で活性を有するプロモーターを使用することができる。このようなプロモーターとしては、骨格α‐アクチン、ミオシン軽鎖２Ａ、ジストロフィン、筋クレアチンキナーゼをコードする遺伝子からのプロモーター、及び、天然に存在するプロモーターよりも高い活性を有する合成筋肉プロモーターが含まれる。組織固有のプロモーターの例としては、肝臓［アルブミン（Ｍｉｙａｔａｋｅ他、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７１：５１２４−３２、１９９７年）；Ｂ型肝炎ウィルスコアプロモーター（Ｓａｎｄｉｇ他，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．３：１００２−９、１９９６年）、α‐フェトプロテイン（ＡＦＰ）（Ａｒｂｕｔｈｎｏｔ他．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，７：１５０３−１４、１９９６年）、骨［オステオカルシン（Ｓｔｅｉｎ他，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．，２４：１８５−９６、１９９７年）、骨シアロタンパク（Ｃｈｅｎ他，Ｊ．Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．１１：６５４−６４、１９９６年）］、リンパ球［ＣＤ２（Ｈａｎｓａｌ他，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６１：１０６３−８、１９９８年）、免疫グロブリン重鎖、Ｔ細胞レセプター鎖）、ニューロン［ニューロン特異エノラーゼ（ＮＳＥ）プロモーター（Ａｎｄｅｒｓｅｎ他、Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．，１３：５０３−１５、１９９３年）、ニューロフィラメント軽鎖遺伝子（Ｐｉｃｃｉｏｌｉ他，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：５６１１−５、１９９１年）、ニューロン特異的ＶＧＦ遺伝子（Ｐｉｃｃｉｏｌｉ他，Ｎｅｕｒｏｎ，１５：３７３−８４、１９９５年）等が挙げられる。
本明細書で使用されている「エンハンサー（ｅｎｈａｎｃｅｒ）」という用語は、組換え産物をコードするＤＮＡ配列に隣接して位置するＤＮＡ配列を指すのに使用できる。エンハンサーエレメントは、典型的には、プロモーターエレメントの上流に位置している、若しくは、ＤＮＡのコード配列（例えば、組換え産物又は産物に転写又は翻訳されたＤＮＡ配列）の下流又はＤＮＡのコード配列内に位置させることができる。エンハンサーエレメントは、組換え産物をコードするＤＮＡ配列の上流又は下流の１００塩基対、２００塩基対、３００塩基対又はそれを超える塩基対に配置することができる。エンハンサーエレメントは、プロモーターエレメントによる発現増加を上回って、ＤＮＡ配列から発現された組換え産物の量を増加させることができる。複数のエンハンサーエレメントが、当業者に周知である。
本明細書で使用される「核酸（ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）」又は「核酸分子（ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）」は、一本鎖又は二本鎖のいずれかである任意のＤＮＡ又はＲＮＡ分子を指し、一本鎖である場合には、直鎖又は環状の形態のその相補的配列の分子も指す。本明細書において核酸分子を説明する際には、特定の核酸分子の配列又は構造は、５’から３’の方向で配列を提供する通常の慣例に従って記載される。本発明の核酸を指して、「単離された核酸」という言葉が使用されることがある。ＤＮＡについてこの言葉が使用される場合、ＤＮＡ分子が由来する生物の天然のゲノム中においてすぐ隣に位置する配列から分離されるＤＮＡ分子を意味する。例えば、「単離核酸（ｉｓｏｌａｔｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）」は、プラスミド又はウィルスベクターなどのベクターに挿入されたＤＮＡ分子、又は、原核生物細胞、真核生物細胞若しくは宿主生物のゲノムＤＮＡに組み込まれたＤＮＡ分子を含む。
「ベクター（ｖｅｃｔｏｒ）」は、添付の配列又は要素の複製をもたらすように、別の遺伝子配列又はエレメント（ＤＮＡ又はＲＮＡのいずれか）が付加され得るプラスミド、コスミド、バクミド、ファージ、又はウィルスなどの複製単位（レプリコン）である。
「発現オペロン（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｐｅｒｏｎ）」とは、例えば、プロモーター、エンハンサー、翻訳開始シグナル（例えば、ＡＴＧ又はＡＵＧコドン）、ポリアデニル化シグナル、ターミネーター等の転写及び翻訳制御配列を有していてもよい核酸セグメントを指し、宿主細胞又は生物におけるポリペプチドコード配列の発現を促進する。
「形質転換（ｔｒａｎｓｆｏｒｍ）」、「トランスフェクション（ｔｒａｎｓｆｅｃｔ）」、「形質導入（ｔｒａｎｓｄｕｃｅ）」という言葉は、核酸を細胞又は宿主生物に導入することができる任意の方法又は手段を指し、これらの言葉は、同じ意味を伝達するべく交換可能に使用され得る。方法としては、トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、感染、ＰＥＧ融合等が挙げられるが、これらに限定されない。
導入された核酸は、受容細胞又は生物の核酸に組み込まれる（共有結合）場合もあるし、組み込まれない場合もある。細菌、酵母、植物及び哺乳動物の細胞では、例えば、導入された核酸は、エピソームエレメント、又は、プラスミドなどの独立したレプリコンとして維持されてもよい。これに替えて、導入された核酸は、受容細胞又は受容生物の核酸に組み込まれてもよく、当該細胞又は生物中で安定して維持され、更には、受容細胞若しくは生物の子孫細胞又は有機体に受け渡される又は継承され得る。最終的に、導入された核酸は、受容細胞又は宿主生物に一時的に存在してもよい。
「選択マーカー遺伝子（ｓｅｌｅｃｔａｂｌｅ ｍａｒｋｅｒ ｇｅｎｅ）」という言葉は、発現した場合に、形質転換された細胞又は植物に、抗生物質耐性などの選択可能な表現型を付与する遺伝子を意味する。
「作動可能に結合された（ｏｐｅｒａｂｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）」という用語は、コード配列の発現に必要な調節配列が、コード配列の発現をもたらすような当該コード配列に対して適切な位置でＤＮＡ分子中に配置されていることを意味する。転写ユニット及び発現ベクター中のその他の転写制御エレメント（例えば、エンハンサー）の配置ついても、同様の定義が適用される。
本明細書で使用される「オリゴヌクレオチド（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）」という言葉は、本発明の配列、プライマー及びプローブを指し、２つ以上の好ましくは３つを超えるリボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドから構成される核酸分子として定義される。オリゴヌクレオチドの正確なサイズは、種々の要因及びオリゴヌクレオチドの特定の適用及び用途に依存する。
「特異的にハイブリダイズする（ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ ｈｙｂｒｉｄｉｚｅ）」というフレーズは、当該技術分野において一般に使用される予め決められた条件の下でハイブリダイゼーションを可能にするのに十分相補的な（しばしば「実質的に相補的」とも称される）配列の２つの一本鎖核酸分子間の関連付けを指す。特に、非相補的配列の一本鎖核酸とのオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを実質的に除外するべく、この用語は、本発明の一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡ分子内に含まれる実質的に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを指す。
本明細書で使用する「プライマー（ｐｒｉｍｅｒ）」は、一本鎖又は二本鎖で、生物学系に由来する、制限酵素消化により生成される又は合成的に製造されたＤＮＡオリゴヌクレオチドを指し，適切な環境に置かれた場合、鋳型に依存する核酸合成の開始剤として機能的に作用することができる。適切な核酸鋳型、核酸の好適なヌクレオシド三リン酸前駆体、ポリメラーゼ酵素、補因子、及び、適切な温度及びｐＨのような適切な条件が揃った場合には、ポリメラーゼの作用又はプライマー伸長生成物を得ることができる同様の活性によりヌクレオチドを付加することによってプライマーをその３’末端で延長することができる。プライマーは、特定の条件や用途の要件に応じて長さが変化してもよい。例えば、診断用途では、オリゴヌクレオチドプライマーは、典型的には長さ１５〜２５ヌクレオチド又はそれ以上である。プライマーは、所望の伸長産物の合成を刺激するように所望の鋳型に対して十分な相補性を有する必要がある。すなわち、ポリメラーゼ又は類似の酵素による合成の開始に使用するために、適切な近位置に３’ヒドロキシル部分を提供できるように態様で、所望の鋳型鎖とアニーリングすることができる程度に相補性を有する必要がある。しかしながら、プライマー配列は、所望の鋳型に対して厳密な相補性を表す必要はない。例えば、非相補的なヌクレオチド配列を、相補的プライマーの５’末端に結合させることができる。これに替えて、伸長産物の合成のための鋳型−プライマー複合体を機能的に提供する程度にプライマー配列が所望の鋳型鎖の配列と十分な相補性を有するならば、非相補的塩基を、オリゴヌクレオチドプライマー配列内に散在させてもよい。
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、米国特許第４６８３１９５、４８００１９５及び４９６５１８８号広報に記載されており、その開示内容全体が参照により本明細書に組み入れられる。
「単離された（ｉｓｏｌａｔｅｄ）」という言葉は、自然界では結合されているであろう他の化合物から十分に分離された化合物又は錯体を指す。「単離された（ｉｓｏｌａｔｅｄ）」というは、他の化合物又は材料との人工的な混合物又は合成混合物を除外するものではなく、また、基本的な活性又はそれに続くアッセイと干渉しない、例えば、不完全な精製又は安定剤の添加によって存在し得る不純物の存在を除外するものではない。
「免疫応答（ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ）」は、抗原又は抗原決定基に対する脊椎動物対象の免疫系の任意の応答を意味する。本明細書で以下に定義されるように、典型的な免疫応答は、体液性免疫応答（例えば、抗原特異的抗体の産生）及び細胞媒介性免疫応答（例えば、リンパ球増殖）を含む。
ＩＩ．本発明の変異型アデノ随伴ウィルスベクターの使用方法及び投与方法
本発明の方法は、分裂細胞及び非分裂細胞の両方を含む幅広い宿主細胞へと、異種核酸配列を送達する手段を提供する。治療方法又はその他の方法として、本発明のベクター及び他の試薬、方法及び医薬製剤は、タンパク質又はペプチドを、必要とする対象に投与する方法おいて更に有用である。したがって、タンパク質又はペプチドは、対象の生体内で産生され得る。治療方法として又はその他の方法として、対象はタンパク質又はペプチドの欠損を有するため、当該タンパク質又はペプチドを必要とする場合がある、又は、対象におけるタンパク質又はペプチドの生産がいくつかの治療効果を与える可能性があるために、対象が当該タンパク質又はペプチドを必要とする場合があり、以下に更に説明する。
概して、本発明は、遺伝子発現に関連する任意の疾患に関連する症状を改善する又は治療するための生物学的効果を有する任意の外来核酸を送達するために用いることができる。疾患の例としては、以下に限定されないが、嚢胞性線維症（及び肺の他の疾患）、血友病Ａ、血友病Ｂ、サラセミア、貧血及び他の血液凝固障害、ＡＩＤＳ、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、てんかん及び他の神経疾患、癌、糖尿病、筋ジストロフィー（例えば、デュシェンヌ型、ベッカー型）、ゴーシェ病、ハーラー病、アデノシンデアミナーゼ欠損症、グリコーゲン貯蔵疾患及び他の代謝障害、網膜の変性疾患（眼の他の疾患）、並びに、固形臓器（例えば、脳、肝臓、腎臓、心臓）の疾患等が挙げられる。
また、本発明は、モノクローナル抗体又はその断片をコードする核酸を送達するために用いることができ、モノクローナル抗体又はその断片は、癌、感染症及び関節リウマチなどの自己免疫疾患に関連する症状を改善するのに有益な生物学的効果を与えることが知られている。他の配列は、例えば、疾患の経過を調節することができるインターフェロンαのようなサイトカインをコードしてもよい。
遺伝子導入は、疾患状態の治療の提供及び理解をする上で、多くの潜在的な用途がある。欠陥遺伝子が知られており、クローン化されている遺伝性疾患が多数存在する。いくつかの場合において、クローン化された遺伝子の機能が知られている。一般的には、上記の疾患状態は、二つのクラスに分類される。一つは、通常は酵素の欠乏状態であり、は一般的に劣性遺伝する欠乏状態であり、もう一つは、優性遺伝され、少なくとも一部が調節タンパク質又は構造タンパク質が関係するアンバランス状態である。欠乏状態の疾患の場合、補充療法のために、影響を受けた組織に正常な遺伝子をもたらすのに、及び、アンチセンス変異を用いた疾患の動物モデルを作成するのに、遺伝子導入を使用することができる。アンバランスな疾患状態の場合、遺伝子導入は、モデルシステムにおける疾患状態を作成するために使用することができ、更には、その疾患状態に対処する試みに使用することができる。このように、本発明の方法は、遺伝子疾患の治療を可能にする。本明細書で使用される場合、疾患を引き起こす又は疾患を重篤にする欠乏又は不均衡を部分的又は完全に改善することによって、疾患状態の治療がなされる。変異を生じさせる又は欠陥を修正する核酸配列の部位特異的組込みを使用することも可能である。
本発明は更に、一時的に又は安定して目的の遺伝子を細胞培養系で、又は、トランスジェニック動物モデルにおいて発現させることにより、診断方法及びスクリーニング方法における利用が可能である。
ＩＩＩ．対象、医薬製剤、ワクチン及び投与様式
本発明は、獣医学分野及び医療分野の両方で利用が期待される。適切な対象としては、鳥類及び哺乳動物の両方が含まれ、哺乳類の方がより好適である。本明細書で使用される「鳥類（ａｖｉａｎ）」という言葉は、これに限定されないが、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、ウズラ、シチメンチョウ及びキジを含む。本明細書で使用される「哺乳動物（ｍａｍｍａｌ）」という言葉は、これに限定されないが、ヒト、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ネコ、イヌ、ウサギ等が含まれる。対象は、人間が最も好ましい。人間の対象としては、胎児、新生児、乳児、未成年及び成人が含まれる。
特定の実施形態において、本発明は、薬学的に許容される担体又は他の薬剤、医薬品、担体、アジュバント、希釈剤などに含有される本発明のウィルス粒子を含む医薬組成物を提供する。注射のために、担体は、典型的には液体である。他の投与方法のために、担体は、滅菌発熱性物質除去蒸留水又は滅菌発熱性物質除去リン酸緩衝生理食塩水などの液体又は固体であってもよい。吸入投与の場合、担体は、呼吸可能な態様であり、好ましくは固体粒状形態又は液体粒状形態である。注入媒体として、注射溶液のための通常の添加剤、例えば、安定化剤、塩又は生理食塩水及び／又は緩衝剤などを含む水を使用することが好ましい。
他の実施形態において、本発明は、ＡＡＶプロウィルスがゲノムに組み込まれた細胞を薬学的に許容される担体又は他の薬剤、医薬品、担体、アジュバント、希釈剤等に含む医薬組成物を提供する。
「薬学的に許容される（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｌｙ ａｃｃｅｐｔａｂｌｅ）」とは、生物学的に望ましくないということがない又は望ましくないことがない材料を意味し、例えば、材料が対象に投与された場合に、任意の望ましくない生物学的効果を引き起こすことがない材料を意味する。このような医薬組成物は、例えば、体外での細胞のトランスフェクション、又は、ウィルス粒子又は細胞を対象に直接的に投与するのに、使用されてもよい。
本発明は更に、核酸を細胞に送達する方法を提供する。インビトロでの方法については、当技術分野で知られているように、標準的なウィルス形質導入法によってウィルスを細胞に投与してもよい。好ましくは、ウィルス粒子は、特定の標的細胞に適した標準的な形質導入方法に従って適切な感染多重度で細胞に添加される。投与するウィルスの力価は、標的細胞の種類及び特定のウィルスベクターに依存して変えることができ、当業者であれば過度の実験をすることなく、決定することができる。これに替えて、本発明のパルボウィルスベクターの投与は、当技術分野で公知の任意の他の手段によって達成することができる。
組換えウィルスベクターは、好ましくは生物学的に有効な量で細胞に投与される。ウィルスベクターの「生物学的に有効な（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ−ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ）」量は、細胞中における異種核酸配列の感染（又は形質導入）及び発現をもたらすのに十分な量である。ウィルスがインビボで細胞に投与される（例えば、ウィルスが以下に説明するように対象に投与される）場合、ウィルスベクターの「生物学的に有効な」量とは、標的細胞において異種核酸配列の形質導入及び発現をもたらすのに十分な量である。
本発明のウィルスベクターを投与する細胞は、任意の種類のものとすることができ、これらに限定されないが、神経細胞（末梢及び中枢神経系の細胞、特に、脳細胞を含む）、肺細胞、網膜細胞、上皮細胞（例えば、腸及び呼吸上皮細胞）、筋肉細胞、膵島細胞を含む膵臓細胞、肝細胞、心筋細胞、骨細胞（例えば、骨髄幹細胞）、造血幹細胞、脾臓細胞、ケラチノサイト、線維芽細胞、内皮細胞、前立腺細胞、生殖細胞等が挙げられる。これに替えて、細胞は、任意の前駆細胞であってもよい。もしくは、細胞は、幹細胞（例えば、神経幹細胞、肝幹細胞）であり得る。更に、細胞は、上記したように、発生源の任意の種類からの細胞であり得る。
本発明の特定の実施形態において、細胞を対象から取り出し、パルボウィルスベクターをその中に導入した後、導入された細胞を対象に戻す。生体外での治療を行うために、対象から細胞を取り出し、導入後対象に戻す方法は、当技術分野で周知である。これに替えて、ｒＡＡＶベクターを、別の対象からの細胞、培養細胞又は他の任意の適切な供給源からの細胞へと導入し、導入後の細胞を、必要とする対象に投与する。
生体外遺伝子治療に適した細胞としては、これらに限定されないが、肝細胞、神経細胞（中枢及び末梢神経系の細胞、特に、脳細胞を含む）、膵臓細胞、脾臓細胞、線維芽細胞（例えば、皮膚線維芽細胞）、ケラチノサイト、内皮細胞、上皮細胞、筋芽細胞、造血細胞、骨髄間質細胞、前駆細胞、及び幹細胞が挙げられる。
対象への細胞の投与量は、対象の年齢、状態及び対象の種、細胞の種類、細胞によって発現される核酸、投与の方法などに応じて変わる。典型的には、一回の投与量として、少なくとも約１０2から約１０8個の細胞、望ましくは、約１０3から約１０6個の細胞が投与される。好ましくは、細胞は、「治療有効量（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａｌｌｙ−ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ａｍｏｕｎｔ）」で投与される。
本明細書で使用する「治療有効量」とは、疾患状態に関連する症状の少なくとも一つを緩和（例えば、最小限にする、減少させる、軽減させる）させるのに十分な量である。又は、「治療有効量」とは、対象の状態にある程度の改善を提供するのに十分な量である。
本発明の更なる態様は、本発明のウィルス粒子を生体内で利用して対象を治療する方法である。投与の対象がヒト又は動物である場合、本発明のパルボウィルス粒子の投与は、ウィルスベクターを投与するための当技術分野で周知の任意の手段によって行うことができる。
例示的な投与様式は、経口、直腸、経粘膜、局所、経皮、吸入、非経口（例えば、静脈内、皮下、皮内、筋肉内及び関節内）投与など、ならびに、組織又は器官への直接注射、あるいは、髄腔内、直接筋肉内、脳室内、静脈内、腹腔内、鼻腔内又は眼内への注射が挙げられる。注射剤は、従来の形態で準備することができ、注射前に、液体溶液又は懸濁液、液体の溶液又は懸濁液に適した固体の状態、又は、エマルジョンとして調剤される。デポの例又は持続放出製剤のために、全身的な方法よりも局所的にウィルスを投与することができる。
本発明の特に望ましい実施形態では、治療に使用されるヌクレオチド配列が、対象の肝臓に送達される。肝臓への投与は、当技術分野で周知の任意の方法によって達成されてもよく、これらに限定されないが、静脈内投与、門脈内投与、胆管内投与、動脈内投与、及び肝実質内への直接注入が挙げられる。
望ましくは、細胞（例えば、肝細胞）は、ペプチド又はタンパク質をコードする組換えパルボウィルスベクターに感染し、感染した細胞はコードされたペプチド又はタンパク質を発現して、（上記で定義したような）治療上有効な量の当該ペプチド又はタンパク質を循環系に分泌する。あるいは、ベクターが送達されて、これらに限定されないが、脳、膵臓、脾臓又は筋肉を含む別の細胞又は組織によって発現される。
他の好ましい実施形態において、本発明のパルボウィルス粒子は、筋肉内投与されるが、より好ましくは、筋肉内注射又は（上記で定義したような）局所投与によって投与される。他の好ましい態様において、本発明のパルボウィルス粒子は、肺に投与される。
本明細書に開示されるパルボウィルスベクターは、任意の適切な手段によって対象の肺に投与することができるが、好ましくは、本発明のパルボウィルスベクターを含有する吸入可能な粒子のエアロゾル懸濁液を被験者が吸入することによって投与される。吸入可能な粒子は、液体又は固体であってもよい。例えば、米国特許第４５０１７２９号広報に記載されているように、当業者に周知の任意の適切な手段によって、本発明のパルボウィルスベクターを含む液体粒子のエアロゾルを生成してもよく、例えば、圧力駆動エアロゾルネブライザー又は超音波ネブライザーを使用して生成してもよい。本発明のウィルスベクターを含む固体粒子のエアロゾルも同様に、製薬分野で周知の技術により、任意の固体粒子状薬剤エアロゾル発生器を用いて生成することができる。
本発明のパルボウィルス粒子の用量は、投与の方法、治療すべき疾患又は状態、個々の治療対象の状態に依存し、送達すべき特定のウィルスベクター及び遺伝子を、通常の方法で決定することができる。治療効果を達成するための例示的な用量は、少なくとも約１０5、１０6、１０7、１０8、１０9、１０10、１０11、１０12、１０13、１０14、１０15、１０16のトランスダクションユニット（ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｎｇ ｕｎｉｔｓ）又はこれを超えるウィルス力価であり、望ましくは、約１０8から１０13トランスダクションユニット、より望ましくは、１０12トランスダクションユニットのウィルス力価である。
以上のように、本発明のパルボウィルスベクター、試薬及び方法を使用することにより、核酸を分裂細胞又は非分裂細胞へと誘導し、そこで安定して異種核酸を発現させることができる。このベクターシステムを使用して、インビトロ又はインビボで、細胞生理機能に影響を与えるタンパク質をコードする遺伝子を、細胞中に導入することが可能である。したがって、本発明のベクターは、このような疾患状態又は細胞生理機能の実験的改変のための遺伝子治療において有用であり得る。
続く例は、本発明の特定の実施形態を説明するために提供される。したがって、本発明を限定することを意図していない。
［実施例１］
リジンからアルギニンへの変異による、ＡＡＶ形質導入率及びＭＨＣ送達への影響
ＡＡＶ１ベクター及びＡＡＶ８ベクターにおいて標的とすべきリジン残基の特定
ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ８とＲｈ７４カプシドタンパク質（Ｒａｄｉｖｏｊａｃ Ｐ他、２０１０年）におけるユビキチン化部位の候補を予測するＵｂＰｒｅｄソフトウェアを使用した。ＵｂＰｒｅｄは、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｕｂｐｒｅｄ．ｏｒｇ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌにてオンラインで入手可能であり、解析の出力は、指示されたＡＡＶ血清型カプシド配列内のユビキチン化に重要なリジン残基の予測結果である。図１及び表１を参照されたい。結果は以下の通りである。
ＡＡＶ１カプシドタンパク質ＶＰ１配列：ＭＡＡＤＧＹＬＰＤＷＬＥＤＮＬＳＥＧＩＲＥＷＷＤＬＫＰＧＡＰＫＰＫＡＮＱＱＫＱＤＤＧＲＧＬＶＬＰＧＹＫＹＬＧＰＦＮＧＬＤＫＧＥＰＶＮＡＡＤＡＡＡＬＥＨＤＫＡＹＤＱＱＬＫＡＧＤＮＰＹＬＲＹＮＨＡＤＡＥＦＱＥＲＬＱＥＤＴＳＦＧＧＮＬＧＲＡＶＦＱＡＫＫＲＶＬＥＰＬＧＬＶＥＥＧＡＫＴＡＰＧＫＫＲＰＶＥＱＳＰＱＥＰＤＳＳＳＧＩＧＫＴＧＱＱＰＡＫＫＲＬＮＦＧＱＴＧＤＳＥＳＶＰＤＰＱＰＬＧＥＰＰＡＴＰＡＡＶＧＰＴＴＭＡＳＧＧＧＡＰＭＡＤＮＮＥＧＡＤＧＶＧＮＡＳＧＮＷＨＣＤＳＴＷＬＧＤＲＶＩＴＴＳＴＲＴＷＡＬＰＴＹＮＮＨＬＹＫＱＩＳＳＡＳＴＧＡＳＮＤＮＨＹＦＧＹＳＴＰＷＧＹＦＤＦＮＲＦＨＣＨＦＳＰＲＤＷＱＲＬＩＮＮＮＷＧＦＲＰＫＲＬＮＦＫＬＦＮＩＱＶＫＥＶＴＴＮＤＧＶＴＴＩＡＮＮＬＴＳＴＶＱＶＦＳＤＳＥＹＱＬＰＹＶＬＧＳＡＨＱＧＣＬＰＰＦＰＡＤＶＦＭＩＰＱＹＧＹＬＴＬＮＮＧＳＱＡＶＧＲＳＳＦＹＣＬＥＹＦＰＳＱＭＬＲＴＧＮＮＦＴＦＳＹＴＦＥＥＶＰＦＨＳＳＹＡＨＳＱＳＬＤＲＬＭＮＰＬＩＤＱＹＬＹＹＬＮＲＴＱＮＱＳＧＳＡＱＮＫＤＬＬＦＳＲＧＳＰＡＧＭＳＶＱＰＫＮＷＬＰＧＰＣＹＲＱＱＲＶＳＫＴＫＴＤＮＮＮＳＮＦＴＷＴＧＡＳＫＹＮＬＮＧＲＥＳＩＩＮＰＧＴＡＭＡＳＨＫＤＤＥＤＫＦＦＰＭＳＧＶＭＩＦＧＫＥＳＡＧＡＳＮＴＡＬＤＮＶＭＩＴＤＥＥＥＩＫＡＴＮＰＶＡＴＥＲＦＧＴＶＡＶＮＦＱＳＳＳＴＤＰＡＴＧＤＶＨＡＭＧＡＬＰＧＭＶＷＱＤＲＤＶＹＬＱＧＰＩＷＡＫＩＰＨＴＤＧＨＦＨＰＳＰＬＭＧＧＦＧＬＫＮＰＰＰＱＩＬＩＫＮＴＰＶＰＡＮＰＰＡＥＦＳＡＴＫＦＡＳＦＩＴＱＹＳＴＧＱＶＳＶＥＩＥＷＥＬＱＫＥＮＳＫＲＷＮＰＥＶＱＹＴＳＮＹＡＫＳＡＮＶＤＦＴＶＤＮＮＧＬＹＴＥＰＲＰＩＧＴＲＹＬＴＲＰ
リジン
位置 スコア ユビキチン化
２６ ０．５９ Ｎｏ
３１ ０．５５ Ｎｏ
３３ ０．４７ Ｎｏ
３８ ０．６１ Ｎｏ
５１ ０．５４ Ｎｏ
６１ ０．７２ Ｙｅｓ 中信頼度
７７ ０．６３ Ｙｅｓ 低信頼度
８４ ０．７２ Ｙｅｓ 中信頼度
１２２ ０．１７ Ｎｏ
１２３ ０．２６ Ｎｏ
１３７ ０．９０ Ｙｅｓ 高信頼度
１４２ ０．６２ Ｙｅｓ 低信頼度
１４３ ０．８１ Ｙｅｓ 中信頼度
１６１ ０．７０ Ｙｅｓ 中信頼度
１６８ ０．２５ Ｎｏ
１６９ ０．２６ Ｎｏ
２５８ ０．４９ Ｎｏ
３１０ ０．１４ Ｎｏ
３１５ ０．１５ Ｎｏ
３２２ ０．４８ Ｎｏ
４５９ ０．８１ Ｙｅｓ 中信頼度
４７６ ０．４３ Ｎｏ
４９１ ０．２０ Ｎｏ
４９３ ０．２８ Ｎｏ
５０８ ０．６２ Ｙｅｓ 低信頼度
５２８ ０．６７ Ｙｅｓ 低信頼度
５３３ ０．７０ Ｙｅｓ 中信頼度
５４５ ０．６５ Ｙｅｓ 低信頼度
５６７ ０．６６ Ｙｅｓ 低信頼度
６２１ ０．５０ Ｎｏ
６４１ ０．５０ Ｎｏ
６５０ ０．４５ Ｎｏ
６６６ ０．５８ Ｎｏ
６８９ ０．６５ Ｙｅｓ 低信頼度
６９３ ０．６５ Ｙｅｓ 低信頼度
７０７ ０．７８ Ｙｅｓ 中信頼度
凡例：
表示 スコア範囲 感度 特異度
低信頼度 ０．６２＜ｓ＜０．６９ ０．４６４ ０．９０３
中信頼度 ０．６９＜ｓ＜０．８４ ０．３４６ ０．９５０
高信頼度 ０．８４＜ｓ＜１．００ ０．１９７ ０．９８９
ＡＡＶ８カプシドタンパク質ＶＰ１配列：
ＭＡＡＤＧＹＬＰＤＷＬＥＤＮＬＳＥＧＩＲＥＷＷＡＬＫＰＧＡＰＫＰＫＡＮＱＱＫＱＤＤＧＲＧＬＶＬＰＧＹＫＹＬＧＰＦＮＧＬＤＫＧＥＰＶＮＡＡＤＡＡＡＬＥＨＤＫＡＹＤＱＱＬＱＡＧＤＮＰＹＬＲＹＮＨＡＤＡＥＦＱＥＲＬＱＥＤＴＳＦＧＧＮＬＧＲＡＶＦＱＡＫＫＲＶＬＥＰＬＧＬＶＥＥＧＡＫＴＡＰＧＫＫＲＰＶＥＰＳＰＱＲＳＰＤＳＳＴＧＩＧＫＫＧＱＱＰＡＲＫＲＬＮＦＧＱＴＧＤＳＥＳＶＰＤＰＱＰＬＧＥＰＰＡＡＰＳＧＶＧＰＮＴＭＡＡＧＧＧＡＰＭＡＤＮＮＥＧＡＤＧＶＧＳＳＳＧＮＷＨＣＤＳＴＷＬＧＤＲＶＩＴＴＳＴＲＴＷＡＬＰＴＹＮＮＨＬＹＫＱＩＳＮＧＴＳＧＧＡＴＮＤＮＴＹＦＧＹＳＴＰＷＧＹＦＤＦＮＲＦＨＣＨＦＳＰＲＤＷＱＲＬＩＮＮＮＷＧＦＲＰＫＲＬＳＦＫＬＦＮＩＱＶＫＥＶＴＱＮＥＧＴＫＴＩＡＮＮＬＴＳＴＩＱＶＦＴＤＳＥＹＱＬＰＹＶＬＧＳＡＨＱＧＣＬＰＰＦＰＡＤＶＦＭＩＰＱＹＧＹＬＴＬＮＮＧＳＱＡＶＧＲＳＳＦＹＣＬＥＹＦＰＳＱＭＬＲＴＧＮＮＦＱＦＴＹＴＦＥＤＶＰＦＨＳＳＹＡＨＳＱＳＬＤＲＬＭＮＰＬＩＤＱＹＬＹＹＬＳＲＴＱＴＴＧＧＴＡＮＴＱＴＬＧＦＳＱＧＧＰＮＴＭＡＮＱＡＫＮＷＬＰＧＰＣＹＲＱＱＲＶＳＴＴＴＧＱＮＮＮＳＮＦＡＷＴＡＧＴＫＹＨＬＮＧＲＮＳＬＡＮＰＧＩＡＭＡＴＨＫＤＤＥＥＲＦＦＰＳＮＧＩＬＩＦＧＫＱＮＡＡＲＤＮＡＤＹＳＤＶＭＬＴＳＥＥＥＩＫＴＴＮＰＶＡＴＥＥＹＧＩＶＡＤＮＬＱＱＱＮＴＡＰＱＩＧＴＶＮＳＱＧＡＬＰＧＭＶＷＱＮＲＤＶＹＬＱＧＰＩＷＡＫＩＰＨＴＤＧＮＦＨＰＳＰＬＭＧＧＦＧＬＫＨＰＰＰＱＩＬＩＫＮＴＰＶＰＡＤＰＰＴＴＦＮＱＳＫＬＮＳＦＩＴＱＹＳＴＧＱＶＳＶＥＩＥＷＥＬＱＫＥＮＳＫＲＷＮＰＥＩＱＹＴＳＮＹＹＫＳＴＳＶＤＦＡＶＮＴＥＧＶＹＳＥＰＲＰＩＧＴＲＹＬＴＲＮＬ
リジン
位置 スコア ユビキチン化
２６ ０．５２ Ｎｏ
３１ ０．５１ Ｎｏ
３３ ０．１６ Ｎｏ
３８ ０．６２ Ｙｅｓ 低信頼度
５１ ０．５６ Ｎｏ
６１ ０．６８ Ｙｅｓ 低信頼度
７７ ０．６５ Ｙｅｓ 低信頼度
１２２ ０．１７ Ｎｏ
１２３ ０．３２ Ｎｏ
１３７ ０．９２ Ｙｅｓ 高信頼度
１４２ ０．５３ Ｎｏ
１４３ ０．６５ Ｙｅｓ 低信頼度
１６２ ０．２８ Ｎｏ
１６３ ０．２９ Ｎｏ
１７０ ０．２４ Ｎｏ
２５９ ０．４９ Ｎｏ
３１２ ０．０９ Ｎｏ
３１７ ０．１２ Ｎｏ
３２４ ０．４３ Ｎｏ
３３３ ０．７５ Ｙｅｓ 中信頼度
４７８ ０．５９ Ｎｏ
５１０ ０．５０ Ｎｏ
５３０ ０．７１ Ｙｅｓ 中信頼度
５４７ ０．４０ Ｎｏ
５６９ ０．６６ Ｙｅｓ 低信頼度
６２３ ０．４７ Ｎｏ
６４３ ０．４４ Ｎｏ
６５２ ０．５１ Ｎｏ
６６８ ０．６４ Ｙｅｓ 低信頼度
６９１ ０．６６ Ｙｅｓ 低信頼度
６９５ ０．６７ Ｙｅｓ 低信頼度
７０９ ０．６８ Ｙｅｓ 低信頼度
凡例：
表示 スコア範囲 感度 特異度
低信頼度 ０．６２＜ｓ＜０．６９ ０．４６４ ０．９０３
中信頼度 ０．６９＜ｓ＜０．８４ ０．３４６ ０．９５０
高信頼度 ０．８４＜ｓ＜１．００ ０．１９７ ０．９８９
添付の表３は、本発明のＡＡＶ８を含む様々なカプシド変異体を使用して得られたベクターの生成率を示す。表３には、同じ血清型の野生種のベクターの場合と比較して、変異体の形質導入効率が高い、低い又は同等であったかについても示されている。
ＡＡＶ２カプシドタンパク質ＶＰ１配列：
ＭＡＡＤＧＹＬＰＤＷＬＥＤＴＬＳＥＧＩＲＱＷＷＫＬＫＰＧＰＰＰＰＫＰＡＥＲＨＫＤＤＳＲＧＬＶＬＰＧＹＫＹＬＧＰＦＮＧＬＤＫＧＥＰＶＮＥＡＤＡＡＡＬＥＨＤＫＡＹＤＲＱＬＤＳＧＤＮＰＹＬＫＹＮＨＡＤＡＥＦＱＥＲＬＫＥＤＴＳＦＧＧＮＬＧＲＡＶＦＱＡＫＫＲＶＬＥＰＬＧＬＶＥＥＰＶＫＴＡＰＧＫＫＲＰＶＥＨＳＰＶＥＰＤＳＳＳＧＴＧＫＡＧＱＱＰＡＲＫＲＬＮＦＧＱＴＧＤＡＤＳＶＰＤＰＱＰＬＧＱＰＰＡＡＰＳＧＬＧＴＮＴＭＡＴＧＳＧＡＰＭＡＤＮＮＥＧＡＤＧＶＧＮＳＳＧＮＷＨＣＤＳＴＷＭＧＤＲＶＩＴＴＳＴＲＴＷＡＬＰＴＹＮＮＨＬＹＫＱＩＳＳＱＳＧＡＳＮＤＮＨＹＦＧＹＳＴＰＷＧＹＦＤＦＮＲＦＨＣＨＦＳＰＲＤＷＱＲＬＩＮＮＮＷＧＦＲＰＫＲＬＮＦＫＬＦＮＩＱＶＫＥＶＴＱＮＤＧＴＴＴＩＡＮＮＬＴＳＴＶＱＶＦＴＤＳＥＹＱＬＰＹＶＬＧＳＡＨＱＧＣＬＰＰＦＰＡＤＶＦＭＶＰＱＹＧＹＬＴＬＮＮＧＳＱＡＶＧＲＳＳＦＹＣＬＥＹＦＰＳＱＭＬＲＴＧＮＮＦＴＦＳＹＴＦＥＤＶＰＦＨＳＳＹＡＨＳＱＳＬＤＲＬＭＮＰＬＩＤＱＹＬＹＹＬＳＲＴＮＴＰＳＧＴＴＴＱＳＲＬＱＦＳＱＡＧＡＳＤＩＲＤＱＳＲＮＷＬＰＧＰＣＹＲＱＱＲＶＳＫＴＳＡＤＮＮＮＳＥＹＳＷＴＧＡＴＫＹＨＬＮＧＲＤＳＬＶＮＰＧＰＡＭＡＳＨＫＤＤＥＥＫＦＦＰＱＳＧＶＬＩＦＧＫＱＧＳＥＫＴＮＶＤＩＥＫＶＭＩＴＤＥＥＥＩＲＴＴＮＰＶＡＴＥＱＹＧＳＶＳＴＮＬＱＲＧＮＲＱＡＡＴＡＤＶＮＴＱＧＶＬＰＧＭＶＷＱＤＲＤＶＹＬＱＧＰＩＷＡＫＩＰＨＴＤＧＨＦＨＰＳＰＬＭＧＧＦＧＬＫＨＰＰＰＱＩＬＩＫＮＴＰＶＰＡＮＰＳＴＴＦＳＡＡＫＦＡＳＦＩＴＱＹＳＴＧＱＶＳＶＥＩＥＷＥＬＱＫＥＮＳＫＲＷＮＰＥＩＱＹＴＳＮＹＮＫＳＶＮＶＤＦＴＶＤＴＮＧＶＹＳＥＰＲＰＩＧＴＲＹＬＴＲＮＬ
リジン
位置 スコア ユビキチン化
２４ ０．２０ Ｎｏ
２６ ０．４９ Ｎｏ
３３ ０．３８ Ｎｏ
３９ ０．８９ Ｙｅｓ 高信頼度
５１ ０．５３ Ｎｏ
６１ ０．６７ Ｙｅｓ 低信頼度
７７ ０．６８ Ｙｅｓ 低信頼度
９２ ０．５６ Ｎｏ
１０５ ０．５８ Ｎｏ
１２２ ０．１４ Ｎｏ
１２３ ０．１８ Ｎｏ
１３７ ０．８７ Ｙｅｓ 高信頼度
１４２ ０．５８ Ｎｏ
１４３ ０．７７ Ｙｅｓ 中信頼度
１６１ ０．７０ Ｙｅｓ 中信頼度
１６９ ０．３１ Ｎｏ
２５８ ０．５１ Ｎｏ
３０９ ０．１４ Ｎｏ
３１４ ０．１７ Ｎｏ
３２１ ０．４６ Ｎｏ
４９０ ０．７３ Ｙｅｓ 中信頼度
５０７ ０．６１ Ｎｏ
５２７ ０．７８ Ｙｅｓ 中信頼度
５３２ ０．７５ Ｙｅｓ 中信頼度
５４４ ０．６１ Ｎｏ
５４９ ０．６８ Ｙｅｓ 低信頼度
５５６ ０．６２ Ｙｅｓ 低信頼度
６２０ ０．４７ Ｎｏ
６４０ ０．４５ Ｎｏ
６４９ ０．４２ Ｎｏ
６６５ ０．５４ Ｎｏ
６８８ ０．６８ Ｙｅｓ 低信頼度
６９２ ０．６８ Ｙｅｓ 低信頼度
７０６ ０．６６ Ｙｅｓ 低信頼度
凡例：
表示 スコア範囲 感度 特異度
低信頼度 ０．６２≦ｓ≦０．６９ ０．４６４ ０．９０３
中信頼度 ０．６９≦ｓ≦０．８４ ０．３４６ ０．９５０
高信頼度 ０．８４≦ｓ≦１．００ ０．１９７ ０．９８９
ＡＡＶ‐Ｒｈ７４カプシドタンパク質ＶＰ１配列：
ＭＡＡＤＧＹＬＰＤＷＬＥＤＮＬＳＥＧＩＲＥＷＷＤＬＫＰＧＡＰＫＰＫＡＮＱＱＫＱＤＮＧＲＧＬＶＬＰＧＹＫＹＬＧＰＦＮＧＬＤＫＧＥＰＶＮＡＡＤＡＡＡＬＥＨＤＫＡＹＤＱＱＬＱＡＧＤＮＰＹＬＲＹＮＨＡＤＡＥＦＱＥＲＬＱＥＤＴＳＦＧＧＮＬＧＲＡＶＦＱＡＫＫＲＶＬＥＰＬＧＬＶＥＳＰＶＫＴＡＰＧＫＫＲＰＶＥＰＳＰＱＲＳＰＤＳＳＴＧＩＧＫＫＧＱＱＰＡＫＫＲＬＮＦＧＱＴＧＤＳＥＳＶＰＤＰＱＰＩＧＥＰＰＡＧＰＳＧＬＧＳＧＴＭＡＡＧＧＧＡＰＭＡＤＮＮＥＧＡＤＧＶＧＳＳＳＧＮＷＨＣＤＳＴＷＬＧＤＲＶＩＴＴＳＴＲＴＷＡＬＰＴＹＮＮＨＬＹＫＱＩＳＮＧＴＳＧＧＳＴＮＤＮＴＹＦＧＹＳＴＰＷＧＹＦＤＦＮＲＦＨＣＨＦＳＰＲＤＷＱＲＬＩＮＮＮＷＧＦＲＰＫＲＬＮＦＫＬＦＮＩＱＶＫＥＶＴＱＮＥＧＴＫＴＩＡＮＮＬＴＳＴＩＱＶＦＴＤＳＥＹＱＬＰＹＶＬＧＳＡＨＱＧＣＬＰＰＦＰＡＤＶＦＭＩＰＱＹＧＹＬＴＬＮＮＧＳＱＡＶＧＲＳＳＦＹＣＬＥＹＦＰＳＱＭＬＲＴＧＮＮＦＥＦＳＹＮＦＥＤＶＰＦＨＳＳＹＡＨＳＱＳＬＤＲＬＭＮＰＬＩＤＱＹＬＹＹＬＳＲＴＱＳＴＧＧＴＡＧＴＱＱＬＬＦＳＱＡＧＰＮＮＭＳＡＱＡＫＮＷＬＰＧＰＣＹＲＱＱＲＶＳＴＴＬＳＱＮＮＮＳＮＦＡＷＴＧＡＴＫＹＨＬＮＧＲＤＳＬＶＮＰＧＶＡＭＡＴＨＫＤＤＥＥＲＦＦＰＳＳＧＶＬＭＦＧＫＱＧＡＧＫＤＮＶＤＹＳＳＶＭＬＴＳＥＥＥＩＫＴＴＮＰＶＡＴＥＱＹＧＶＶＡＤＮＬＱＱＱＮＡＡＰＩＶＧＡＶＮＳＱＧＡＬＰＧＭＶＷＱＮＲＤＶＹＬＱＧＰＩＷＡＫＩＰＨＴＤＧＮＦＨＰＳＰＬＭＧＧＦＧＬＫＨＰＰＰＱＩＬＩＫＮＴＰＶＰＡＤＰＰＴＴＦＮＱＡＫＬＡＳＦＩＴＱＹＳＴＧＱＶＳＶＥＩＥＷＥＬＱＫＥＮＳＫＲＷＮＰＥＩＱＹＴＳＮＹＹＫＳＴＮＶＤＦＡＶＮＴＥＧＴＹＳＥＰＲＰＩＧＴＲＹＬＴＲＮＬ
リジン
位置 スコア ユビキチン化
２６ ０．６０ Ｎｏ
３１ ０．５３ Ｎｏ
３３ ０．２７ Ｎｏ
３８ ０．２３ Ｎｏ
５１ ０．３８ Ｎｏ
６１ ０．６８ Ｙｅｓ 低信頼度
７７ ０．６５ Ｙｅｓ 低信頼度
１２２ ０．１７ Ｎｏ
１２３ ０．３０ Ｎｏ
１３７ ０．９０ Ｙｅｓ 高信頼度
１４２ ０．３５ Ｎｏ
１４３ ０．３５ Ｎｏ
１６２ ０．３６ Ｎｏ
１６３ ０．３３ Ｎｏ
１６９ ０．２７ Ｎｏ
１７０ ０．２５ Ｎｏ
２５９ ０．４６ Ｎｏ
３１２ ０．１３ Ｎｏ
３１７ ０．１６ Ｎｏ
３２４ ０．４６ Ｎｏ
３３３ ０．７７ Ｙｅｓ 中信頼度
４７８ ０．５１ Ｎｏ
５１０ ０．４９ Ｎｏ
５３０ ０．６７ Ｙｅｓ 低信頼度
５４７ ０．５２ Ｎｏ
５５２ ０．６９ Ｙｅｓ 中信頼度
５６９ ０．６７ Ｙｅｓ 低信頼度
６２３ ０．４９ Ｎｏ
６４３ ０．４４ Ｎｏ
６５２ ０．５４ Ｎｏ
６６８ ０．５６ Ｎｏ
６９１ ０．６８ Ｙｅｓ 低信頼度
６９５ ０．６７ Ｙｅｓ 低信頼度
７０９ ０．６９ Ｙｅｓ 中信頼度
凡例：
表示 スコア範囲 感度 特異度
低信頼度 ０．６２＜ｓ＜０．６９ ０．４６４ ０．９０３
中信頼度 ０．６９＜ｓ＜０．８４ ０．３４６ ０．９５０
高信頼度 ０．８４＜ｓ＜１．００ ０．１９７ ０．９８９
本発明のカプシドバリアントを含むリジンを生成するのに、以下のプライマーのセットを利用した。
変異誘発に使用したプライマー
ＡＡＶ１プライマー：

ＡＡＶ１ Ｋ６１Ｒ
センス：５’− ＣＴＴ ＣＡＡ ＣＧＧ ＡＣＴ ＣＧＡ ＣＡＧ ＧＧＧ ＧＧＡ ＧＣＣ −３’
アンチセンス：５’− ＧＧＣ ＴＣＣ ＣＣＣ ＣＴＧ ＴＣＧ ＡＧＴ ＣＣＧ ＴＴＧ ＡＡＧ −３’

ＡＡＶ１ Ｋ８４Ｒ
センス：５’− ＧＣＣ ＴＡＣ ＧＡＣ ＣＡＧ ＣＡＧ ＣＴＣ ＡＧＡ ＧＣＧ ＧＧＴ ＧＡＣ −３’
アンチセンス：５’− ＧＴＣ ＡＣＣ ＣＧＣ ＴＣＴ ＧＡＧ ＣＴＧ ＣＴＧ ＧＴＣ ＧＴＡ ＧＧＣ −３’

ＡＡＶ１ Ｋ１３７Ｒ
センス：５’− ＴＧＧ ＴＴＧ ＡＧＧ ＡＡＧ ＧＣＧ ＣＴＡ ＧＧＡ ＣＧＧ ＣＴＣ ＣＴ −３’
アンチセンス：５’− ＡＧＧ ＡＧＣ ＣＧＴ ＣＣＴ ＡＧＣ ＧＣＣ ＴＴＣ ＣＴＣ ＡＡＣ ＣＡ −３’

ＡＡＶ１ Ｋ１４３Ｒ
センス：５’− ＣＴＡ ＡＧＡ ＣＧＧ ＣＴＣ ＣＴＧ ＧＡＡ ＡＧＡ ＧＡＣ ＧＴＣ ＣＧＧ ＴＡＧ −３’
アンチセンス：５’− ＣＴＡ ＣＣＧ ＧＡＣ ＧＴＣ ＴＣＴ ＴＴＣ ＣＡＧ ＧＡＧ ＣＣＧ ＴＣＴ ＴＡＧ −３’

ＡＡＶ１ Ｋ１６１Ｒ
センス：５’− ＣＧＧ ＧＣＡ ＴＣＧ ＧＣＡ ＧＧＡ ＣＡＧ ＧＣＣ ＡＧＣ Ａ −３’
アンチセンス：５’− ＴＧＣ ＴＧＧ ＣＣＴ ＧＴＣ ＣＴＧ ＣＣＧ ＡＴＧ ＣＣＣ Ｇ −３’

ＡＡＶ１ Ｋ４５９Ｒ
センス：５’− ＡＧＴ ＣＣＧ ＧＡＡ ＧＴＧ ＣＣＣ ＡＡＡ ＡＣＡ ＧＧＧ ＡＣＴ ＴＧＣ ＴＧＴ −３’
アンチセンス：５’− ＡＣＡ ＧＣＡ ＡＧＴ ＣＣＣ ＴＧＴ ＴＴＴ ＧＧＧ ＣＡＣ ＴＴＣ ＣＧＧ ＡＣＴ −３’

ＡＡＶ１ Ｋ５２８Ｒ
センス：５’− ＧＣＡ ＣＴＧ ＣＴＡ ＴＧＧ ＣＣＴ ＣＡＣ ＡＣＡ ＧＡＧ ＡＣＧ ＡＣＧ ＡＡＧ −３’
アンチセンス：５’− ＣＴＴ ＣＧＴ ＣＧＴ ＣＴＣ ＴＧＴ ＧＴＧ ＡＧＧ ＣＣＡ ＴＡＧ ＣＡＧ ＴＧＣ −３’

ＡＡＶ１ Ｋ５３３Ｒ
センス：５’− ＣＡＡ ＡＧＡ ＣＧＡ ＣＧＡ ＡＧＡ ＣＡＧ ＧＴＴ ＣＴＴ ＴＣＣ ＣＡＴ ＧＡＧ ＣＧ −３’
アンチセンス：５’−ＣＧＣ ＴＣＡ ＴＧＧ ＧＡＡ ＡＧＡ ＡＣＣ ＴＧＴ ＣＴＴ ＣＧＴ ＣＧＴ ＣＴＴ ＴＧ −３’

ＡＡＶ１ Ｋ７０７Ｒ
センス：５’− ＴＧＣＡＧＴＡＣＡＣＡＴＣＣＡＡＴＴＡＴＧＣＡＡＧＡＴＣＴＧＣＣＡＡＣＧ ＴＴＧ −３’
アンチセンス：５’− ＣＡＡＣＧＴＴＧＧＣＡＧＡＴＣＴＴＧＣＡＴＡＡＴＴＧＧＡＴＧＴＧＴＡＣＴＧＣＡ −３’
ＡＡＶ８プライマー

ＡＡＶ８ Ｋ１３７Ｒ
センス：５’− ＧＧＴ ＴＧＡ ＧＧＡ ＡＧＧ ＣＧＣ ＴＡＧ ＧＡＣ ＧＧＣ ＴＣＣ ＴＧＧ −３’
アンチセンス：５’− ＣＣＡ ＧＧＡ ＧＣＣ ＧＴＣ ＣＴＡ ＧＣＧ ＣＣＴ ＴＣＣ ＴＣＡ ＡＣＣ −３’

ＡＡＶ８ Ｋ３３３Ｒ
センス：５’− ＧＣＡ ＧＡＡ ＴＧＡ ＡＧＧ ＣＡＣ ＣＡＧ ＧＡＣ ＣＡＴ ＣＧＣ ＣＡＡ ＴＡＡ ＣＣ −３’
アンチセンス：５’− ＧＧＴ ＴＡＴ ＴＧＧ ＣＧＡ ＴＧＧ ＴＣＣ ＴＧＧ ＴＧＣ ＣＴＴ ＣＡＴ ＴＣＴ ＧＣ −３’

ＡＡＶ８ Ｋ５３０Ｒ
センス：５’− ＧＣＡ ＴＣＧ ＣＴＡ ＴＧＧ ＣＡＡ ＣＡＣ ＡＣＡ ＧＡＧ ＡＣＧ ＡＣＧ ＡＧＧ −３’
アンチセンス：５’− ＣＣＴ ＣＧＴ ＣＧＴ ＣＴＣ ＴＧＴ ＧＴＧ ＴＴＧ ＣＣＡ ＴＡＧ ＣＧＡ ＴＧＣ −３’

ＡＡＶ８ Ｋ７０９Ｒ
センス： ５’− ＧＴＡＣＡＣＣＴＣＣＡＡＣＴＡＣＴＡＣＡＧＡＴＣＴＡＣＡＡＧＴＧＴＧＧＡＣＴＴＴＧ −３’
アンチセンス：５’− ＣＡＡＡＧＴＣＣＡＣＡＣＴＴＧＴＡＧＡＴＣＴＧＴＡＧＴＡＧＴＴＧＧＡＧＧＴＧＴＡＣ −３’
ＡＡＶ２プライマー

ＡＡＶ２ Ｋ３９Ｒ
センス：５’−ＧＣＣＣＧＣＡＧＡＧＣＧＧＣＡＴＡＧＧＧＡＣＧＡＣＡＧ−３’
アンチセンス：５’−ＣＴＧＴＣＧＴＣＣＣＴＡＴＧＣＣＧＣＴＣＴＧＣＧＧＧＣ−３’

ＡＡＶ２ Ｋ１３７Ｒ
センス：５’−ＣＣＴＧＧＴＴＧＡＧＧＡＡＣＣＴＧＴＴＡＧＧＡＣＧＧＣＴＣＣＧＧ−３’
アンチセンス：５’−ＣＣＧＧＡＧＣＣＧＴＣＣＴＡＡＣＡＧＧＴＴＣＣＴＣＡＡＣＣＡＧＧ−３’

ＡＡＶ２ Ｋ１４３Ｒ
センス：５’−ＡＧＡＣＧＧＣＴＣＣＧＧＧＡＡＡＡＡＧＧＡＧＧＣＣＧＧＴＡ−３’
アンチセンス：５’−ＴＡＣＣＧＧＣＣＴＣＣＴＴＴＴＴＣＣＣＧＧＡＧＣＣＧＴＣＴ−３’

ＡＡＶ２ Ｋ１６１Ｒ
センス：５’−ＣＣＴＣＧＧＧＡＡＣＣＧＧＡＡＧＧＧＣＧＧＧＣＣ−３’
アンチセンス：５’−ＧＧＣＣＣＧＣＣＣＴＴＣＣＧＧＴＴＣＣＣＧＡＧＧ−３’

ＡＡＶ２ Ｋ４９０Ｒ
センス：５’−ＣＣＧＣＣＡＧＣＡＧＣＧＡＧＴＡＴＣＡＡＧＧＡＣＡＴＣＴＧＣＧＧ−３’
アンチセンス：５’−ＣＣＧＣＡＧＡＴＧＴＣＣＴＴＧＡＴＡＣＴＣＧＣＴＧＣＴＧＧＣＧＧ−３’

ＡＡＶ２ Ｋ５２７Ｒ
センス：５’−ＣＧＧＣＣＡＴＧＧＣＡＡＧＣＣＡＣＡＧＧＧＡＣＧＡＴＧＡＡ−３’
アンチセンス：５’−ＴＴＣＡＴＣＧＴＣＣＣＴＧＴＧＧＣＴＴＧＣＣＡＴＧＧＣＣＧ−３’

ＡＡＶ２ Ｋ５３２Ｒ
センス：５’−ＡＣＡＡＧＧＡＣＧＡＴＧＡＡＧＡＡＡＧＧＴＴＴＴＴＴＣＣＴＣＡＧＡＧＣＧＧ−３’
アンチセンス：５’−ＣＣＧＣＴＣＴＧＡＧＧＡＡＡＡＡＡＣＣＴＴＴＣＴＴＣＡＴＣＧＴＣＣＴＴＧＴ−３’

ＡＡＶ−ｒｈ７４プライマー

ＡＡＶ−ｒｈ７４ Ｋ１３７Ｒ
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ＡＡＶ−ｒｈ７４ Ｋ３３３Ｒ
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ＡＡＶ−ｒｈ７４ Ｋ５３０Ｒ
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ＡＡＶ−ｒｈ７４ Ｋ５５２Ｒ
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ＡＡＶ−ｒｈ７４ Ｋ５６９Ｒ
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ＡＡＶ−ｒｈ７４ Ｋ６９１Ｒ
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ＡＡＶ−ｒｈ７４ Ｋ６９５Ｒ
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ＡＡＶ−ｒｈ７４ Ｋ７０９Ｒ
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表５には、ＦＩＸのための肝臓特異的ＡＡＶ導入遺伝子発現カセットをパッケージ化するのに使用された変異誘発から得られた一連のＡＡＶベクターが示されている。パッケージ化効率は、野生種、非改変型ＡＡＶ８ベクターで観察されるパッケージ化効率と変わらなかった。
形質導入効率を更に向上させるべく、本明細書に記載されるカプシドタンパク質の任意のものに２、３、４、５、６、７又はそれ以上の個数の改変されたリジン残基を含むカプシド変異体についても、本発明の範囲に含まれる。データはまた、特定の変異が、形質導入効率を大幅に減少させるバリアントをもたらすこともあることを明らかにした。投与するベクターに対する免疫反応に向けられた抗体を中和する又は飽和させるためのおとり（ｄｅｃｏｙ）として機能させるべく、このような変異体を、形質導入効率を向上させるバリアントと組み合わせて使用することができ、所望の導入遺伝子をより効率的に細胞に導入することが可能となる。
図１は、カプシド表面を概略的に示した図である。図２Ａ、２Ｂ及び２Ｃに示したデータからは、ＡＡＶ８におけるＶＰ１カプシド中のリジン残基を改変することにより、形質導入レベルが変更され、生成される導入遺伝子のレベルが変更されることが示された。図３Ａ、３Ｂ及び３Ｃは、形質導入された細胞におけるＨＦ．ＩＸ生成に対する一の又は複数の変異の影響を示している。図３Ｄでは、変異の組み合わせ、例えば、３リジンのアルギニン残基への変異と、４又は６チロシンのフェニルアラニン残基への変異との組み合わせが、形質導入速度を低下させることが示されている。
ＡＡＶリジン変異体を使用したＨＨＬ５−Ｂ７肝細胞のＣＴＬ傷害
本明細書に開示されるＡＡＶリジン変異体のうちの特定のものを使用して形質導入された肝細胞のＣＴＬ傷害を評価した。形質導入された肝細胞のＣＴＬ傷害を評価するのに、次に記すような材料及び方法を用いた。
ベクター生成
上記で説明したようなトリプルトランスフェクション法（Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａ、１９９８年）を使用してＨＥＫ−２３９細胞にてＡＡＶベクターを生成し、塩化セシウム勾配遠心分離法（Ａｙｕｓｏ、２０１０）を用いて精製した。Ｇｅｎｅｍｅｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ社によって合成されたＡＡＶエピトープペプチドを、１００％ＤＭＳＯ中５ｍｇ／ｍｌの濃度で再懸濁した。
Ｔ細胞のインビトロでの拡大
ヒトＰＢＭＣ（Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ＬＴＤ）を、解凍し、洗浄し、計数し、３％ヒト血清（Ｂｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎ社）、１％Ｌグルタミン（Ｇｉｂｃｏ社）及び１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ社）を含むＡＩＭ−Ｖリンパ球培地（Ｇｉｂｃｏ社）中に、２×１０6細胞／ｍｌの濃度で再懸濁した。拡張条件それぞれについて、５００μｌの体積の２４ウェルプレート（ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ社）の各ウェル毎に、１ｘ１０6（５００μｌ）細胞が添加された。２．５μｇ／ｍｌのβ−２−ミクログロブリン（Ｌｅｅ Ｂｉｏｓｏｌｕｔｉｏｎｓ社）及び１０ ｎｇ／ｍｌのヒト組換えＩＬ−７（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社）と共に、１ｘ１０6（５００μｌ）の自家照射脾細胞（３０００ｒａｄ）が更に各ウェルにフィーダー細胞として添加した。細胞が最終的に１０μｇ／ｍｌの濃度でＡＡＶペプチド中に存在し、５％ＣＯ2中温度３７℃で拡大された。
ＣＴＬアッセイ
上記に記載したように、ＣＬＴアッセイを行った（Ｐｉｅｎ， ２００９年）。
簡単に説明すると、ＣＴＬ媒介標的の細胞溶解の後、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の放出をＣｙｔｏＴｏｘ ９６非放射性細胞傷害性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて測定した。４０００個のＨＨＬ５肝細胞の標的細胞を、Ｍｉｃｒｏｔｅｓｔ Ｐｒｉｍａｒｉａの平底９６ウェルプレート（ＢＤファルコン社）の各ウェルの、血清を含まないＤＭＥＭ中に播種した。標的細胞は、５０００、５０，０００及び５００，０００ＭＯＩのＡＡＶカプシドで形質導入され、５％ＣＯ2で３７℃で１８時間インキュベートされた。処理及びインキュベーションの後、播種された標的細胞は、上記で説明したように拡大されたエピトープ特異的細胞傷害性Ｔリンパ球を添加する前に、培地で一回洗浄された。５％ＣＯ2で３７℃で４時間、１０：１のエフェクター‐標的細胞比で、ＣＬＴを添加し、室温で３０分間酵素基質を使用してインキュベートした後、分光光度計（スペクトラマックス）を用いて４９０ｎｍでＬＤＨを測定した。
フローサイトメトリー
ＡＡＶの形質導入後、ＧＦＰ発現をフローサイトメトリーにより測定した。
細胞株ＨＨＬ５又はＨｕｈ７からのヒト肝細胞が、１０％ウシ胎児血清、１％Ｌ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ）及びび１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）を含有するＤＭＥＭ中に、Ｐｒｉｍａｒｉａ Ｍｕｌｔｉｗｅｌｌ ２４ウェルプレート（ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ）において２５０，０００細胞／ウェルの密度で播種された。細胞は、５０００、 ５００００及び５００００００ＭＯＩのＡＡＶベクターで形質導入され、５％ＣＯ2で３７℃で１８時間インキュベートされた。インキュベーションの後、細胞を、トリプシン処理し、ＰＢＳ２％ＦＢＳで２回洗浄し、２％パラホルムアルデヒドで固定した。ＦＡＣＳＤｉｖａ（登録商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩ フローサイトメーターでサンプルを取得し、Ｆｌｏｗｊｏ（登録商標）ソフトウェア（Ｔｒｅｅｓｔａｒ）を使用して分析を行った。
ＣＴＬアッセイの結果
ウィルス形質導入におけるリジン変異の効果についてさらに試験するために、我々はＡＡＶベクターの機能性をテストするべく我々の研究室によって以前に開発されたインビトロでのＣＴＬ媒介細胞傷害性アッセイを利用した（ＰＩＥＮ他）。図４、５及び６に、ＡＡＶ１及びＡＡＶ２形質導入の結果が示されている。図４には、ＡＡＶ−１カプシドにおけるリジン変異が全て、標的のセルのＣＬＴ媒介傷害の減少をもたらしており、リジンの変異が、形質導入における効率的な処理を妨げ、表面抗原の存在につながっていることが示唆される。更に、リジン変異の効果は、相加的であるように思われ、３重及び４重リジン変異体の場合、ＣＬＴ媒介傷害が最も減少している（図４Ａ及び４Ｂ）。ＡＡＶ−２カプシドへの変異も、同様な効果を示した。図５及び図６を参照されたい。図７は、Ｒｈ７４変異体が試験された時に得られた形質導入の結果を示す。
本発明では、ＡＡＶカプシド上のリジン残基をアルギニン残基へと変異させることにより、ＡＡＶの形質導入効率を向上させることができることを発見した。我々の実験では、改変されていないＡＡＶベクターを受けた動物と比較して、形質導入の際に、マウスにおけるヒト第ＩＸ因子（ＦＩＸ）導入遺伝子の発現レベルが高くなる、いくつかのバリアントを特定した。
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本発明の好適な実施形態の幾つかが具体的に例示されたが、本発明はかかる実施形態に限定されるものではない。添付の特許請求の範囲に記載される本発明から逸脱することなく本発明の精神内において様々な変形が可能である。

Claims (23)

  1. 一の又は複数のリジン置換を有するＶＰ１カプシドタンパク質を含むアデノ随伴ウィルス（ＡＡＶ）ベクターであって、
    前記一の又は複数のリジン置換は、ＡＡＶ１ ＶＰ１カプシドタンパク質のＫ１３７Ｒの置換、Ｋ４５９Ｒの置換、Ｋ５２８Ｒの置換、Ｋ５３３Ｒの置換、Ｋ７０７Ｒの置換、及び、Ｋ１３７Ｒ／Ｋ４５９Ｒ／Ｋ５３３Ｒの置換からなる群から選択され、
    前記ベクターは更に、ＡＡＶ末端逆位繰り返し配列及び異種核酸配列を含むミニ遺伝子を含み、
    前記異種核酸配列は、宿主細胞における当該異種核酸配列からの産物の発現を指令する制御配列に作動可能に結合され、
    前記リジン置換は、前記カプシドタンパク質のユビキチン化を阻害するのに有効であり、それによって前記ＡＡＶベクターの標的細胞への形質導入を、前記一の又は複数のリジン置換を有しないＡＡＶ１ ＶＰ１カプシドタンパク質を含むＡＡＶベクターよりも増加させる、ＡＡＶベクター。
  2. 一の又は複数のリジン置換を有するＶＰ１カプシドタンパク質を含むアデノ随伴ウィルス（ＡＡＶ）ベクターであって、
    前記一の又は複数のリジン置換は、ＡＡＶ２ ＶＰ１カプシドタンパク質のＫ１３７Ｒの置換、Ｋ５２７Ｒの置換、及び、Ｋ５３２Ｒの置換からなる群から選択され、
    前記ベクターは更に、ＡＡＶ末端逆位繰り返し配列及び異種核酸配列を含むミニ遺伝子を含み、
    前記異種核酸配列は、宿主細胞における当該異種核酸配列からの産物の発現を指令する制御配列に作動可能に結合され、
    前記リジン置換は、前記カプシドタンパク質のユビキチン化を阻害するのに有効であり、それによって前記ＡＡＶベクターの標的細胞への形質導入を、前記一の又は複数のリジン置換を有しないＡＡＶ２ ＶＰ１カプシドタンパク質を含むＡＡＶベクターよりも増加させる、ＡＡＶベクター。
  3. 一の又は複数のリジン置換を有するＶＰ１カプシドタンパク質を含むアデノ随伴ウィルス（ＡＡＶ）ベクターであって、
    前記一の又は複数のリジン置換は、ＡＡＶ８ ＶＰ１カプシドタンパク質のＫ１３７Ｒの置換、Ｋ２５９Ｒの置換、Ｋ３３３Ｒの置換、Ｋ５３０Ｒの置換、Ｋ５６９Ｒの置換、Ｋ６６８Ｒの置換、及び、Ｋ（１３７／３３３／５３０）Ｒの置換からなる群から選択され、
    前記ベクターは更に、ＡＡＶ末端逆位繰り返し配列及び異種核酸配列を含むミニ遺伝子を含み、
    前記異種核酸配列は、宿主細胞における当該異種核酸配列からの産物の発現を指令する制御配列に作動可能に結合され、
    前記リジン置換は、前記カプシドタンパク質のユビキチン化を阻害するのに有効であり、それによって前記ＡＡＶベクターの標的細胞への形質導入を、前記一の又は複数のリジン置換を有しないＡＡＶ−８ ＶＰ１カプシドタンパク質を含むＡＡＶベクターよりも増加させる、ＡＡＶベクター。
  4. 一の又は複数のリジン置換を有するＶＰ１カプシドタンパク質を含むアデノ随伴ウィルス（ＡＡＶ）ベクターであって、
    前記一の又は複数のリジン置換は、ＡＡＶ−ｒｈ７４ ＶＰ１カプシドタンパク質のＫ（１３７／３３３／５３０）Ｒの置換、Ｋ（１３７／３３３／５３０／５５２）Ｒの置換、Ｋ（１３７／２５９／３３３／５３０／５５２／５６９）Ｒ＋Ｇ１９５Ａ＋Ｌ１９９Ｖ＋Ｓ２０１Ｐ＋Ｇ２０２Ｎの置換、Ｋ（１３７／２５９／３３３／５３０／５５２／５６９）Ｒ＋Ｇ１９５Ａ＋Ｌ１９９Ｖ＋Ｓ２０１Ｐ＋Ｇ２０２Ｎ＋Ｋ３８Ｒの置換、Ｋ（１３７／２５９／３３３／５３０／５５２／５６９）Ｒ＋Ｇ１９５Ａ＋Ｌ１９９Ｖ＋Ｓ２０１Ｐ＋Ｇ２０２Ｎ＋Ｋ５１Ｒの置換、Ｋ（１３７／２５９／３３３／５３０／５５２／５６９）Ｒ＋Ｇ１９５Ａ＋Ｌ１９９Ｖ＋Ｓ２０１Ｐ＋Ｇ２０２Ｎ＋Ｋ６１Ｒの置換、及び、Ｋ（１３７／２５９／３３３／５３０／５５２／５６９）Ｒ＋Ｇ１９５Ａ＋Ｌ１９９Ｖ＋Ｓ２０１Ｐ＋Ｇ２０２Ｎ＋Ｋ７７Ｒの置換からなる群から選択され、
    前記ベクターは更に、ＡＡＶ末端逆位繰り返し配列及び異種核酸配列を含むミニ遺伝子を含み、
    前記異種核酸配列は、宿主細胞における当該異種核酸配列からの産物の発現を指令する制御配列に作動可能に結合され、
    前記リジン置換は、前記カプシドタンパク質のユビキチン化を阻害するのに有効であり、それによって前記ＡＡＶベクターの標的細胞への形質導入を、前記一の又は複数のリジン置換を有しないＡＡＶ−ｒｈ７４ ＶＰ１カプシドタンパク質を含むＡＡＶベクターよりも増加させる、ＡＡＶベクター。
  5. 前記異種核酸配列の発現産物は、治療用ペプチド又は治療用核酸である、請求項１から４の何れか一項に記載のＡＡＶベクター。
  6. 前記治療用ペプチドは、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子又はこれらの機能的断片からなる群から選択される凝固因子である、請求項５に記載のＡＡＶベクター。
  7. 前記異種核酸配列の発現産物は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、キメラ免疫グロブリン、ヒト化抗体又は一本鎖抗体である、請求項１〜４のいずれか１項に記載のＡＡＶベクター。
  8. 前記異種核酸配列の前記発現産物は、キメラ免疫グロブリンである請求項７に記載のＡＡＶベクター。
  9. 前記異種核酸配列の発現産物は、一本鎖抗体である請求項１〜４のいずれか１項に記載のＡＡＶ８ベクター。
  10. 前記発現産物は、抗ウィルス性ＲＮＡｉである、請求項１〜４のいずれか１項に記載のＡＡＶベクター。
  11. 阻害性ＲＮＡが、ＨＣＶ感染及びＨＣＶ複製を阻害するのに有効である請求項１０に記載のＡＡＶベクター。
  12. 阻害性ＲＮＡが、真核生物の標的遺伝子の発現を阻害するのに有効である請求項１０に記載のＡＡＶベクター。
  13. 前記異種核酸配列の発現産物は、疾患の経過を調節することができるサイトカインである請求項１〜４のいずれか１項に記載のＡＡＶベクター。
  14. 前記異種核酸配列の発現産物は、一対のジンクフィンガーヌクレアーゼである請求項１〜４のいずれか１項に記載のＡＡＶベクター。
  15. ２つ、３つ又は４つのリジン置換を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載のＡＡＶベクター。
  16. 請求項１〜４のいずれか１項に記載の前記ＡＡＶベクター及びその生理学的に適合する担体を含む医薬組成物。
  17. 請求項１〜４のいずれか１項に記載の前記ＡＡＶベクターを含む細胞培養物。
  18. 血液、中枢神経系、代謝、筋肉、眼の病気若しくは疾患、又は、感染性の病気若しくは遺伝性の病気の治療に使用するための請求項１６に記載の前記医薬組成物。
  19. 前記異種核酸配列の発現産物は第ＩＸ因子である、請求項１８に記載の医薬組成物。
  20. 請求項１〜４のいずれか１項に記載の前記ＡＡＶベクター及びその生理学的に適合する担体を含む医薬組成物。
  21. 血液、中枢神経系、代謝、筋肉、眼の病気若しくは疾患、又は、感染性の病気若しくは遺伝性の病気の治療において使用するためのものであり、対象の細胞に異種核酸配列の発現産物を送達するためのものである、請求項２０に記載の医薬組成物。
  22. 前記異種核酸配列の発現産物は、第ＩＸ因子である、請求項２１に記載の医薬品組成物。
  23. 前記異種核酸配列の発現産物は、第ＶＩＩＩ因子である、請求項１８又は２１に記載の医薬品組成物。

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