MX2014012680A - Composición y métodos para una transferencia génica altamente eficiente utilizando variantes de cápsides de aav. - Google Patents
Composición y métodos para una transferencia génica altamente eficiente utilizando variantes de cápsides de aav.Info
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Abstract
Se dan a conocer composiciones y métodos mejorados para la terapia génica mediata por AAV.
Description
COMPOSICIÓN Y MÉTODOS PARA UNA TRANSFERENCIA GÉNICA
ALTAMENTE EFICIENTE UTILIZANDO VARIANTES DE CÁPSIDES DE
AAV
CAMPO DE LA INVENCIÓN
Esta solicitud se relaciona con los campos de la terapia génica y la biología molecular. Más específicamente, esta invención proporciona vectores virales adenoasociados que comprenden variantes de cápsides proteicas que mejoran la eficiencia de transducción de los vectores AAV que comprenden transgenes terapéuticamente propicios.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
Varias publicaciones y documentos de patente se citan a lo largo de la especificación con el fin de describir el estado de la téenica a la cual pertenece esta invención. Cada una de estas citas se incorpora en este documento para referencia como si se expusiera por completo.
El virus adenoasociado (AAV) es un pequeño virus (20 nm) no envuelto, defectuoso en replicación. Muchos distintos serotipos de AAV se han caracterizado en primates humanos y no humanos. El genoma AAV se comprende de DNA de hebra sencilla con repeticiones terminales invertidas (ITR) de 145 bp en ambos extremos. Hay dos marcos abiertos de lectura (ORF), rep y cap. En tanto que los productos rep son esenciales para la
replicación AAV, 3 proteínas de cápside (VP1 , VP2 y VP3) se expresan a partir del gen cap. VP1, VP2 y VP3 se reúnen en relación 1:1:10 para formar una cápside icosaédrica (Xie Q etal, 2002). Durante la producción de vector AAV recombinante (rAAV), un casete de expresión flanqueado por ITR se empaqueta en cápside de AAV. Los genes requeridos para la replicación de AAV no se incluyen en el casete. El AAV recombinante se considera el más seguro y uno de los vectores virales más ampliamente utilizados para la transferencia génica in vivo. Los vectores pueden infectar células de múltiples tipos de tejidos, lo que proporciona una expresión transgénica fuerte y persistente. También son no patogénicos y tienen un bajo perfil de inmunogenicidad (High KA, 2011).
Uno de los fines inmediatos para las pruebas de terapia génica es optimizar vectores para maximizar la transducción tisular en tanto que se minimiza la dosis de vector. Con la entrada en la célula, las proteínas de cápside de AAV se someten a degradación mediada por proteosoma. La fosforilación de residuos de tirosina expuestos en superficie de la cápside de AAV representa una de las primeras etapas que conduce a degradación del virus mediante la ruta ubiquitina-proteosoma (Zhong L etal, 2007). La mayor parte de la proteólisis regulada en la célula se presenta a través de esta ruta. La ubiquitina es una proteína pequeña (~8.5 kDa) que puede encontrarse en todas las células eucarióticas. La ubiquitina se une a la cadena lateral de los aminoácidos de una proteína sustrato. Después de que proteínas de
ubiquitina adicionales se unen al sustrato mediante la ubiquitina unida inicialmente, se forma una cadena de poliubiquitina y el sustrato se marca para su degradación (Thrower JS et al 2000, Peng J et al 2003, Bedford L et al 2011). Se ha demostrado que la mutación de residuos de tirosina expuestos en superficie conduce a un incremento en la eficiencia de transducción de vectores AAV2 (Zhong L et al, 2008). Más recientemente, varios grupos han mostrado que la estrategia es efectiva también con otros serotipos de AAV en varios tejidos, incluyendo AAV serotipo 6 y 8.
Claramente, en la téenica existe una necesidad de composiciones y métodos que mejoren la transducción de AAV que transporta transgenes clínicamente importantes en los pacientes en necesidad de ello.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN
De acuerdo con la presente invención, se proporcionan variantes de AAV novedosas que exhiben una eficiencia de transducción incrementada en comparación con serotipos de AAV (por ejemplo, AAV1, AAV2, AAV8, AAV-rh74), que carecen de las modificaciones dadas a conocer en este documento. Tales vectores mejorados son útiles para la transducción de una diversidad de tejidos, incluyendo hígado, músculo, cerebro y retina.
En una modalidad, se proporciona un vector viral adenoasociado
(AAV) que comprende una proteína de cápside VP1 alterada, y la proteína de cápside alterada comprende sustituciones de residuos de lisina, lo que en
consecuencia reduce la ubiquitinación de la cápside e incrementa la eficiencia de transducción de AAV variante en tejidos y células objetivo. En una modalidad, el vector además comprende un ácido nucleico heterólogo, (por ejemplo, un minigen que comprende repeticiones terminales invertidas de AAV y una secuencia de ácido nucleico heterólogo) enlazado de manera operable a secuencias reguladoras que dirigen la expresión de un producto a partir de la secuencia de ácido nucleico heterólogo en una célula huésped. En una modalidad preferida, el vector AAV comprende una o más sustituciones de lisina en VP1 como se dispone en las tablas expuestas en este documento. En otra modalidad, el vector AAV es del serotipo AAV8 y contiene una alteración proporcionada en la Tabla 3.
En una modalidad preferida, los vectores AAV de la invención, que comprenden las proteínas de cápside variantes, son útiles para la expresión de péptidos terapéuticos o ácidos nucleicos terapéuticos. Tales péptidos incluyen, sin limitación, una molécula de RNAi antiviral, Factor VIII, Factor IX o un fragmento funcional de los mismos. Los productos de expresión adicionales incluyen, por ejemplo, IgG, IgM, IgA, IgD, IgE, inmunoglobulinas quiméricas, anticuerpos humanizados, o anticuerpos de single sencilla. En un aspecto, el producto de expresión es un RNAi que es útil para inhibir la infección y replicación de HCV. En otra modalidad, el producto de expresión es un ácido nucleico antisentido útil para modular a la baja una célula objetivo de interés.
En otra modalidad de la invención, se proporciona una composición farmacéutica que comprende los vectores AAV variantes de la invención en un portador compatible biológicamente. También, por la presente invención se abarcan cultivos celulares que comprenden los vectores dados a conocer en este documento.
La invención también abarca un método para suministrar un transgen a una célula en un sujeto, y el método comprende la etapa de poner en contacto la célula con un vector AAV, como se da a conocer en este documento, en donde el vector AAV comprende el transgen, en donde la presencia de sustituciones de lisina en la secuencia de cápside VP1 en el vector se asocia con una ubiquitinación reducida y eficiencia de transducción incrementada.
En un aspecto final, la invención proporciona variantes virales de señuelo que son ineficientes en infectar células, pero son efectivas para bloquear la neutralización por anticuerpos de variantes virales que transportan transgenes propicios debido a las similitudes estructurales de las dos variantes virales. Las variantes de cápsides ejemplares para este propósito incluyen, por ejemplo, K38R, K143R, K510Ry K709R.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
Las Figuras 1A-1C muestran lisinas en la superficie de AAV1, AAV2 y AAV8. Los números PDB de serotipos AAV utilizados aquí son de la
siguiente manera: AAV1: 3NG9, AAV2: 1LP3 y AAV8: 2QA0. Las flechas representan los respectivos residuos de lisina. (1A) Hay 11 Usinas en la superficie de AAV1 VP3. Los colores de residuos son de la siguiente manera: K258 rojo, K459 azul, K491 amarillo, K493 magenta, K508 cian, K528 salmón oscuro, K533 verde claro, K545 azul claro (pizarra), K567 salmón oscuro, K666 cian claro, K707 gris. (1B) Hay 10 Usinas en la superficie de AAV2 VP3. Los colores de residuos son de la siguiente manera: K258 rojo, K490 amarillo, K507 cian, K527 salmón oscuro, K532 verde claro, K544 azul claro (pizarra), K549 amarillo claro, K556 magenta claro, K665 cian claro, K706 gris. (1C) Hay 8 Usinas en la superficie de AAV8 VP3. Los colores de residuos son de la siguiente manera: K259 rojo, K333 verde, K510 cian, K530 salmón oscuro, K547 azul claro (pizarra), K569 salmón oscuro, K668 cian claro, K709 gris. Obsérvese que K528 y K567 de AAV1 y K530 y K569 de AAV8 están lado a lado en la estructura y se muestran con el mismo color.
Las Figuras 2A-2C muestran varios residuos de lisina de cápside de
AAV8 mutados a arginina. La sangre de los animales se recolectó 8 semanas después de la inyección viral mediante la vena caudal. Los niveles de hF.IX se detectan por ELISA. (2A) Los residuos que, por el software se pronostican ubiqutinados con alto y medio niveles de confianza, se mutaron a arginina. 2.5 x 1010 partículas virales por ratón se inyectaron mediante la vena caudal.
(2B, 2C) Los residuos que, por el software se pronostican ubiqutinados con bajo nivel de confianza, se mutaron a arginina.2.5 x 109 partículas virales por
ratón se inyectaron mediante la vena caudal. (2B) Mutaciones de cápsides K569R y K668R. (2C) El efecto de las mutaciones de cápsides K38R, K143R, K259R, K510R, K547R se comparan con el efecto de la mutación K530R.
Las Figuras 3A-3D muestran la combinación de las mutaciones de cápsides K a R. (3A) La combinación de mutaciones K137R, K33R y K530R son aún superiores al tipo silvestre pero no estadísticamente diferentes a K530R. (3B) La mutación K709R afecta negativamente la transducción de AAV8; la adición de la mutación K709R al mutante K(137/333/530) R también disminuye la transducción del virus. (3C) La combinación de múltiples mutaciones lisina a arginina no incrementa la tasa de transducción. (3D) La combinación de tres residuos de lisina a arginina con cuatro o seis residuos de tirosina a fenilalanina disminuye la tasa de transducción.
Las Figuras 4A-4B muestran la transducción de AAV1. (4A) Eliminación por CTL de hepatocitos HHL5-B7 transducido con mutantes en lisina AAV-1 a tres diferentes MOI: 5K, 50K y 500K. Se utilizó péptido
(IPQYGYLTL para AAV1 ; VPQYGYLTL para AAV2) como control positivo. La liberación de LDH tiene correlación con la eliminación celular. (4B) El número total de células positivas a GFP y expresión de GFP se comparó entre diferentes construcciones a MOI de 50K y 500K.
Las Figuras 5A-5B muestran la transducción de AAV2. (5A) Los mutantes AAV2 K137R, K527R o K532R se compararon con AAV2 WT desde el punto de vista de la tasa de transducción de la línea celular HHL5.
Las células se transfectaron a MOI de 10K, 50K, 100K y 500K y se verificaron 24 horas después en cuanto a expresión de GFP. (5B) Una gráfica que muestra la citotoxicidad cuando se mide por liberación de LDL de las variantes probadas.
La Figura 6 muestra un ensayo CTL en el cual se transdujeron hepatocitos objetivo con vector AAV-2 a concentraciones crecientes y luego se incubaron con células efectoras coincidentes con HLA. Los vectores AAV codificaban cápside de AAV-2 de tipo silvestre o mutaciones en una sola lisina como se indica. Las efectoras se derivaron a partir de PBMC expandidas in vitro contra epítopo VPQYGYLTL de MHC Clase I de AAV-2, y la relación efectora a objetivo fue 10:1. Los resultados se expresan como porcentaje de actividad CTL (% de citotoxicidad en comparación con células tratadas con SDS al 10% como control de citotoxicidad máxima después de la resta del fondo) con respecto al vector de tipo silvestre.
Las Figuras 7A-7D muestran datos de RH74. Niveles de expresión transgénica de F.IX humano en plasma medido por un ELISA específico para F.IX humano. (7A) Definición de TMR = K(137/333/530)R, Definición de HMF = Y(253/275/447/703/707/733)F. (7B) Definición de HMR:
K(137/259/333/530/552/569) R, Definición de 195/202: G195A + L199V + S201P + G202N. En tanto que HMR + 195/202, HMR + 195/202 + K(38)R,
HMR + 195/202 + K(51)R, HMR + 195/202 + K(61)R, y HMR + 195/202 + K(77)R tuvieron una producción de hFIX superior con la inyección a ratones,
la inyección de HMR + 195/202 + K(122/123)R o HMR + 195/202 + K(142/413)R no produjo hFIX detectable alguno en absoluto. (7C) El muíante RHM13_1 produjo niveles de hFIX similares en comparación con Rh74 WT, mientras que los niveles de hFIX derivados de ratones tratados con RHM17_1 estuvieron apenas por arriba de los niveles de fondo. (7D) El mutante RHM14_2 produjo niveles de hFIX similares en comparación con Rh74 WT; el rendimiento de RHM15_1 estuvo en medio del de AAV8 y AAVrh74 WT.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
De acuerdo con la presente invención, se ha encontrado que mutar los residuos de lisina en las cápsides de AAV a residuos de arginina incrementa la eficiencia de transducción de AAV. Experimentos iniciales mostraron que una sola sustitución de un residuo de lisina, pronosticada como objetivo para ubiquitinación, resultó en niveles superiores de expresión del transgen de factor IX (FIX) humano en ratones, en comparación con animales que reciben vectores AAV sin modificar. Las mutantes en lisina AAV descritas en este documento pueden utilizarse para favorecer la generación de vectores que se orienten al hígado, CNS, músculo, y otros órganos con eficiencia superior, en comparación con las cápsides de AAV de tipo silvestre. De esta manera, este descubrimiento puede utilizarse para desarrollar terapéutica para tratar la hemofilia A, B, enfermedad de
Huntington, y virtualmente cualquier otra enfermedad que requiera niveles incrementados de transducción de transgenes deseables a un tejido objetivo de interés.
Las siguientes definiciones se proporcionan para facilitar la comprensión de la presente invención.
I. DEFINICIONES:
La “terapia génica” es la inserción de genes en las células y/o tejidos de un individuo para tratar una enfermedad, comúnmente enfermedades hereditarias, en donde un alelo muíante defectuoso se reemplaza o complementa con uno funcional.
Los “virus adenoasociados”, de la familia parvovirus, son pequeños virus con un genoma de DNA de hebra sencilla. Estos virus pueden insertar material genético en un sitio específico en el cromosoma 19 y se prefieren dado que no se asocian con enfermedad patogénica en humanos.
Un péptido o proteína “terapéutica” es un péptido o proteína que puede aliviar o reducir los síntomas que resultan de la ausencia o defecto en una proteína en una célula o sujeto. Alternativamente, un péptido o proteína “terapéutica” es una que confiere de otra manera un beneficio a un sujeto, por ejemplo, efectos anticáncer. Los péptidos y proteínas terapéuticos incluyen, pero no se limitan a, CFTR (proteína reguladora transmembranal de fibrosis quística), distrofina (incluyendo el producto proteico de minigenes de distrofina, véase, por ejemplo, Vincent etal., (1993) Nature Genetics 5:130),
utrofina (Tinslcy et ai, (1996) Nature 384:349), factores de coagulación (Factor XIII, Factor IX, Factor X, etc.), anticuerpos monoclonales (Lewis et al., 2002), eritropoyetina, el receptor LDL, lipoproteína lipasa, ornitina transcarbamilasa, b globina, a globina, espectrina, a antitripsina, adenosina desaminasa, hipoxantina guanina fosforibosil transferasa, b glucocerebrosidasa, esfingomielinasa, hexosaminidasa lisosómica, deshidrogenasa de cetoácidos de cadena ramificada, hormonas, factores de crecimiento (por ejemplo, factores de crecimiento similares a insulina 1 y 2, factor de crecimiento derivado de plaquetas, factor de crecimiento epidérmico, factor de crecimiento nervioso, factor neurotrófico 3 y 4, factor neurotrófico derivado de cerebro, factor de crecimiento derivado de la glía, factor de crecimiento transformante a y b, y similares), citocinas (por ejemplo, interferón a, interferón b, interferón y, interleucina 2, interleucina 4, interleucina 12, factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos, linfotoxina), productos génicos suicidas (por ejemplo, timidina cinasa de virus de herpes simplex, citosina desaminasa, toxina diftérica, citocromo P450, desoxicitidina cinasa y factor de necrosis tumoral), proteínas que confieren resistencia a un fármaco utilizado en terapia de cáncer, productos génicos supresores de tumores (por ejemplo, p53, Rb, Wt-1, NF1, VHL, APC, y similares), y cualquier otro péptido o proteína que tenga un efecto terapéutico en un sujeto en necesidad de ello.
Péptidos o proteínas terapéuticos ejemplares adicionales incluyen los
que pueden utilizarse en el tratamiento de un padecimiento incluyendo, pero sin limitarse a, fibrosis quística (y otras enfermedades del pulmón), hemofilia A, hemofilia B, talasemia, anemia y otros trastornos de la sangre, SIDA, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington, esclerosis lateral amiotrófica, epilepsia y otros trastornos neurológicos, cáncer, diabetes mellitus, distrofias musculares (por ejemplo, Duchenne, Becker), enfermedad de Gaucher, enfermedad de Hurler, deficiencia de adenosina desaminasa, enfermedades de almacenamiento de glucógeno y otros defectos metabólicos, enfermedades degenerativas retinianas (y otras enfermedades del ojo), y enfermedades de órganos sólidos (por ejemplo, cerebro, hígado, riñón, corazón).
El término “promotores” o “promotor”, como se utiliza en este documento, puede referirse a una secuencia de DNA que se localiza adyacente a una secuencia de DNA que codifica un producto recombinante. Un promotor preferiblemente se enlaza de manera operativa a una secuencia de DNA adyacente. Un promotor típicamente incrementa una cantidad de producto recombinante expresado a partir de una secuencia de DNA en comparación con una cantidad del producto recombinante expresado cuando no existe promotor. Un promotor de un organismo puede utilizarse para potenciar la expresión de producto recombinante a partir de una secuencia de DNA que se origina a partir de otro organismo. Por ejemplo, un promotor de vertebrado puede utilizarse para la expresión de GFP de medusa en
vertebrados. Además, un elemento promotor puede incrementar una cantidad de productos recombinantes expresados para múltiples secuencias de DNA unidas en tándem. Por tanto, un elemento promotor puede potenciar la expresión de uno o más productos recombinantes. Múltiples elementos promotores se reconocen por los expertos en la téenica.
En una modalidad, se deseará una expresión constitutiva de alto nivel. Ejemplos de tales promotores incluyen, sin limitación, el promotor/potenciador LTR de virus de sarcoma de Rous (RSV) retroviral, el promotor/potenciador temprano inmediato de citomegalovirus (CMV) (véase, por ejemplo, Boshart et al, Cell, 41:521-530 (1985)), el promotor SV40, el promotor de dihidrofolato reductasa, el promotor de b actina citoplásmica y el promotor de fosfoglicerol cinasa (PGK).
En otra modalidad, pueden desearse promotores inducibles. Los promotores inducibles son los que se regulan por compuestos suministrados de manera exógena, ya sea en cis o en trans, incluyendo, sin limitación, el promotor de metalotionina (MT) de oveja inducible por zinc; el promotor de virus tumoral mamario de ratón (MMTV) inducible por dexametasona (Dex); el sistema promotor de T7 polimerasa (WO 98/10088); el sistema reprimible por tetracielina (Gossen et al, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 89:5547-5551 (1992)); el sistema inducible por tetraciclina (Gossen et al., Science,
268:1766-1769 (1995); véase también Harvey et al., Curr. Opin. Chem. Biol., 2:512-518 (1998)); el sistema inducible por RU486 (Wang et al., Nat.
Biotech., 15:239-243 (1997) y Wang et ai, Gene Ther., 4:432-441 (1997)]; y el sistema inducible por rapamicina (Magari et ai, J. Clin. Invest., 100:2865-2872 (1997); Rivera etai, Nat. Medicine.2:1028-1032 (1996)). Otros tipos de promotores inducibles que pueden ser útiles en este contexto son los que se regulan por un estado fisiológico específico, por ejemplo, temperatura, fase aguda o en células en replicación solamente.
En otra modalidad, se utilizará el promotor nativo para el transgen o secuencia de ácido nucleico de interés. El promotor nativo puede preferirse cuando se desea que la expresión del transgen o la secuencia de ácido nucleico deba imitar la expresión nativa. El promotor nativo puede utilizarse cuando la expresión del transgen u otra secuencia de ácido nucleico deba regularse temporalmente o con el desarrollo, o en una forma específica de tejido, o en respuesta a estímulos transcripcionales específicos. En una modalidad adicional, otros elementos de control de expresión nativa, tales como elementos potenciadores, sitios de poliadenilación o secuencias consenso de Kozak, también pueden utilizarse para imitar la expresión nativa.
En una modalidad, el genoma viral recombinante comprende un transgen enlazado de manera operable a un promotor específico de tejido. Por ejemplo, si se desea expresión en músculo esquelético, puede utilizarse un promotor activo en músculo. Estos incluyen los promotores de genes que codifican a actina esquelética, cadena ligera de miosina 2A, distrofina,
creatina cinasa muscular, así como promotores musculares sintéticos con actividades superiores a las de los promotores que se presentan en la naturaleza. Véase Li et al., Nat. Biotech., 17:241-245 (1999). Ejemplos de promotores que son específicos de tejidos se conocen para la albúmina hepática, Miyatake et al. J. Virol., 71:5124-32 (1997); promotor central de virus de hepatitis B, Sandig et al., Gene Ther. 3:1002-9 (1996); alfa fetoproteína (AFP), Arbuthnot et al., Hum. Gene Ther., 7:1503-14 (1996)], hueso (osteocalcina, Stein et al., Mol. Biol. Rep., 24:185-96 (1997); sialoproteína ósea, Chen et al., J. Bone Miner. Res. 11:654-64 (1996)), linfocitos (CD2, Hansal et al., J. Immunol., 161:1063-8 (1998); cadena pesada de inmunoglobulina; cadena a de receptores de células T), neuronal (promotor de enolasa específica de neuronas (NSE), Andersen et al. Cell. Mol. Neurobiol., 13:503-15 (1993); gen de cadena ligera de neurofilamentos, Piccioli et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 88:5611-5 (1991); el gen vgf específico de neuronas, Piccioli et al., Neuron, 15:373-84 (1995)]; entre otros.
El término “potenciadores” o “potenciador”, como se utiliza en este documento, puede referirse a una secuencia de DNA que se localiza adyacente a la secuencia de DNA que codifica un producto recombinante. Los elementos potenciadores típicamente se localizan corriente arriba de un elemento promotor o pueden localizarse corriente abajo de o dentro de una secuencia codificante de DNA (por ejemplo, una secuencia de DNA transcrita o traducida a un producto o productos recombinantes). Por tanto, un
elemento potenciador puede localizarse 100 pares de bases, 200 pares de bases o 300 o más pares de bases corriente arriba o corriente abajo de una secuencia de DNA que codifica el producto recombinante. Los elementos potenciadores pueden incrementar una cantidad de producto recombinante expresado a partir de una secuencia de DNA por arriba de la expresión incrementada ofrecida por un elemento promotor. Múltiples elementos potenciadores se encuentran disponibles fácilmente para los expertos en la téenica.
“Ácido nucleico” o una “molécula de ácido nucleico”, como se utilizan en este documento, se refieren a cualquier molécula de DNA o RNA, de hebra sencilla o doble y, si es de hebra sencilla, la molécula de su secuencia complementaria en forma lineal o circular. Al discutir moléculas de ácido nucleico, una secuencia o estructura de una molécula de ácido nucleico particular puede describirse en este documento de acuerdo con la convención normal para proporcionar la secuencia en dirección 5’ a 3’. Con referencia a los ácidos nucleicos de la invención, el término “ácido nucleico aislado” se utiliza algunas veces. Este término, cuando se aplica a DNA, se refiere a una molécula de DNA que se separa de las secuencias con las cuales está inmediatamente contigua en el genoma que se presenta en la naturaleza del organismo en el cual se originó. Por ejemplo, un “ácido nucleico aislado” puede comprender una molécula de DNA insertada en un vector, tal como un plásmido o vector viral, o integrada en el DNA genómico
de una célula procariótica o eucariótica u organismo hospedador.
Un “vector” es un replicón, tal como un plásmido, cósmido, bácmido, fago o virus, al cual puede unirse otra secuencia o elemento genético (ya sea DNA o RNA) con el fin de llevar a cabo la replicación de la secuencia o elemento unido.
Un “operón de expresión” se refiere a un segmento de ácido nucleico que puede poseer secuencias de control transcripcional y traduccional, tales como promotores, potenciadores, señales de inicio traduccional (por ejemplo, codones ATG o AUG), señales de poliadenilación, terminadores y similares, y que facilitan la expresión de una secuencia codificante polipeptídica en una célula u organismo hospedador.
Los términos “transforman”, “transfectan”, “transducen”, se referirán a cualquier método o medio por el cual se introduce un ácido nucleico en una célula u organismo hospedador y pueden utilizarse de manera intercambiable para transmitir el mismo significado. Tales métodos incluyen, pero no se limitan a, transfección, electroporación, microinyección, infección, fusión con PEG y similares.
El ácido nucleico introducido puede o puede no integrarse (enlazarse de manera covalente) en el ácido nucleico de la célula u organismo receptor. En células bacterianas, de levadura, vegetales y de mamífero, por ejemplo, el ácido nucleico introducido puede mantenerse como elemento episómico o replicón independiente, tal como un plásmido. Alternativamente, el ácido
nucleico introducido puede integrarse en el ácido nucleico de la célula u organismo receptor y mantenerse de manera estable en esa célula u organismo y hacerse pasar además o heredarse por células u organismos descendientes de la célula u organismo receptor. Finalmente, el ácido nucleico introducido puede existir en la célula receptora u organismo hospedador sólo en forma transitoria.
El término “gen marcador seleccionable” se refiere a un gen que, cuando se expresa, confiere un fenotipo seleccionable, tal como resistencia a antibióticos, en una célula o planta transformada.
El término “enlazado de manera operable” significa que las secuencias reguladoras, necesarias para la expresión de la secuencia codificante, se colocan en la molécula de DNA en las posiciones apropiadas con respecto a la secuencia codificante con el fin de efectuar la expresión de la secuencia codificante. Esta misma definición algunas veces se aplica a la disposición de unidades de transcripción y otros elementos de control de transcripción (por ejemplo, potenciadores) en un vector de expresión.
El término “oligonucleótido”, como se utiliza en este documento, se refiere a secuencias, cebadores y sondas de la presente invención, y se define como molécula de ácido nucleico comprendida de dos o más ribo o desoxirribonucleótidos, preferiblemente más de tres. El tamaño exacto del oligonucleótido dependerá de diversos factores, y de la aplicación y uso particular del oligonucleótido.
La frase “hibridan específicamente” se refiere a la asociación entre dos moléculas de ácido nucleico de hebra sencilla de secuencia suficientemente complementaria para permitir tal hibridación bajo condiciones predeterminadas generalmente utilizadas en la téenica (algunas veces denominada “sustancialmente complementaria”). En particular, el término se refiere a la hibridación de un oligonucleótido con una secuencia sustancialmente complementaria contenida en una molécula de DNA de hebra sencilla o RNA de la invención, a la exclusión sustancial de hibridación del oligonucleótido con ácidos nucleicos de hebra sencilla de secuencia no complementaria.
El término “cebador”, como se utiliza en este documento, se refiere a un oligonucleótido de DNA, de hebra sencilla o de doble hebra, ya sea derivado de un sistema biológico, generado por digestión con enzimas de restricción, o producido de manera sintética, el cual, cuando se coloca en el ambiente apropiado, es capaz de actuar funcionalmente como iniciador de la síntesis de ácidos nucleicos dependiente de molde. Cuando se presenta con un molde de ácido nucleico apropiado, precursores de nucleósido trifosfato adecuados de ácidos nucleicos, una enzima polimerasa, cofactores adecuados y condiciones tales como un temperatura y pH adecuados, el cebador puede extenderse en su extremo terminal 3’ por la adición de nucleótidos por la acción de una polimerasa o actividad similar, para producir un producto de extensión por cebadores. El cebador puede variar en
longitud, lo que depende de las condiciones particulares y requerimiento de la aplicación. Por ejemplo, en aplicaciones de diagnóstico, el cebador oligonucleótido típicamente es de 15-25 o más nucleótidos de longitud. El cebador debe ser de suficiente complementariedad con el molde deseado para preparar la síntesis del producto de extensión deseado, es decir, para ser capaz de alinearse por temperatura con la hebra molde deseada en una forma suficiente para proporcionar la fracción 3’ hidroxilo del cebador en yuxtaposición apropiada para utilizarse en el inicio de la síntesis por una polimerasa o enzima similar. No se requiere que la secuencia de cebador represente un complemento exacto del molde deseado. Por ejemplo, una secuencia de nucleótidos no complementarios puede unirse al extremo 5’ de un cebador de otra manera complementario. Alternativamente, bases no complementarias pueden entremezclarse dentro de la secuencia de cebador de oligonucleótidos, con la condición de que la secuencia de cebador tenga suficiente complementariedad con la secuencia de la hebra molde deseada para proporcionar funcionalmente un complejo molde-cebador para la síntesis del producto de extensión.
La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se ha descrito en las Patentes de E.U. Nos. 4,683,195, 4,800,195, y 4,965,188, cuyas descripciones completas se incorporan para referencia en este documento.
El término “aislado” puede referirse a un compuesto o complejo que se ha separado suficientemente de otros compuestos con los cuales puede
asociarse naturalmente. “Aislado” no pretende excluir mezclas artificiales o sintéticas con otros compuestos o materiales, o la presencia de impurezas que no interfieran con la actividad fundamental o ensayos subsiguientes, y que pueden presentarse, por ejemplo, debido a una purificación incompleta, o la adición de estabilizantes.
El término “respuesta inmune” pretende referirse a cualquier respuesta a un antígeno o determinante antigénico por el sistema inmune de un sujeto vertebrado. Respuestas inmunes ejemplares incluyen respuestas inmunes humorales (por ejemplo, producción de anticuerpos específicos de antígenos) y respuestas inmunes mediadas por células (por ejemplo, proliferación de linfocitos), como se define en este documento a continuación II. MÉTODOS DE USO Y MÉTODOS DE ADMINISTRACIÓN DE LOS VECTORES VIRALES ADENOASOCIADOS VARIANTES DE LA INVENCIÓN
Los métodos de la presente invención proporcionan un medio para suministrar secuencias de ácidos nucleicos heterólogos a una amplia variedad de células huésped, incluyendo células en división y fuera de división. Los vectores y otros reactivos, métodos y formulaciones farmacéuticas de la presente invención adicionalmente son útiles en un método para administrar una proteína o péptido a un sujeto en necesidad de ello, como método de tratamiento o de otra manera. En esta forma, la proteína o péptido puede producirse de esta manera in vivo en el sujeto. El
sujeto puede estar en necesidad de la proteína o péptido dado que el sujeto tiene una deficiencia de la proteína o péptido, o dado que la producción de la proteína o péptido en el sujeto puede impartir cierto efecto terapéutico, como método de tratamiento o de otra manera, y como se explica además a continuación.
En general, la presente invención puede emplearse para suministrar cualquier ácido nucleico extraño con un efecto biológico para tratar o aliviar los síntomas asociados con cualquier trastorno en relación con la expresión génica. Los estados patológicos ilustrativos incluyen, pero no se limitan a: fibrosis quística (y otras enfermedades del pulmón), hemofilia A, hemofilia B, talasemia, anemia y otros trastornos de coagulación sanguínea, SIDA, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington, esclerosis lateral amiotrófica, epilepsia y otros trastornos neurológicos, cáncer, diabetes mellitus, distrofias musculares (por ejemplo, Duchenne, Becker), enfermedad de Gaucher, enfermedad de Hurler, deficiencia de adenosina desaminasa, enfermedades de almacenamiento de glucógeno y otros defectos metabólicos, enfermedades degenerativas retinianas (y otras enfermedades del ojo), enfermedades de órganos sólidos (por ejemplo, cerebro, hígado, riñón, corazón) y similares.
Además, la presente invención puede emplearse para suministrar ácidos nucleicos que codifican anticuerpos monoclonales, o fragmentos de los mismos, de los que se sabe que proporcionan efectos biológicos
propicios para tratar o aliviar los síntomas asociados con cánceres, enfermedades infecciosas y enfermedades autoinmunes, tales como la artritis reumatoide. Otras secuencias pueden codificar, por ejemplo, citocinas tales como interferón alfa, que pueden modular el curso de una enfermedad.
La transferencia génica tiene un uso potencial sustancial en comprender y proporcionar terapia para los estados patológicos. Hay una serie de enfermedades heredadas en las cuales se conocen y se han clonado genes defectuosos. En algunos casos, la función de estos genes clonados se conoce. En general, los estados patológicos anteriores se dividen en dos clases: estados de deficiencia, usualmente de enzimas, los cuales generalmente se heredan en una forma recesiva, y estados desequilibrados, que implican por lo menos algunas veces proteínas reguladoras o estructurales, que se heredan en una forma dominante. Para las enfermedades por estados de deficiencia, la transferencia génica puede utilizarse para llevar a un gen normal a los tejidos afectados para terapia de reemplazo, así como para crear modelos animales para la enfermedad al utilizar mutaciones antisentido. Para los estados patológicos desequilibrados, la transferencia génica puede utilizarse para crear un estado patológico en un sistema modelo, que entonces puede utilizarse en los esfuerzos para contrarrestar el estado patológico. De esta manera, los métodos de la presente invención permiten el tratamiento de las enfermedades genéticas. Como se utiliza en este documento, un estado patológico se trata al remediar
parcialmente o por completo la deficiencia o desequilibrio que da lugar a la enfermedad o la hace más severa. El uso de la integración específica de sitio de secuencias nucleicas, para dar lugar a mutaciones o para corregir los defectos, también es posible.
Finalmente, la actual invención es de utilidad adicional en métodos de diagnóstico y selección, con lo cual un gen de interés se expresa en forma transitoria o estable en un sistema de cultivos celulares o, alternativamente, un modelo animal transgénico.
III. SUJETOS, FORMULACIONES FARMACÉUTICAS, VACUNAS Y MODOS DE ADMINISTRACIÓN
La presente invención es de utilidad en aplicaciones veterinarias y médicas. Los sujetos adecuados incluyen aves y mamíferos, y se prefieren los mamíferos. El término “ave”, como se utiliza en este documento incluye, pero no se limita a, pollos, patos, gansos, codornices, pavos y faisanes. El término “mamífero”, como se utiliza en este documento incluye, pero no se limita a, humanos, bovinos, ovinos, caprinos, equinos, felinos, caninos, lagomorfos, etc. Los sujetos humanos son los más preferidos. Los sujetos humanos incluyen sujetos fetales, neonatos, infantes, jóvenes y adultos.
En modalidades particulares, la presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende una partícula viral de la invención en un portador farmacéuticamente aceptable u otro agente medicinal, agente farmacéutico, portador, adyuvante, diluyente, etc. Para inyección, el portador
típicamente será un líquido. Para otros métodos de administración, el portador puede ser sólido o líquido, tal como agua estéril libre de pirógenos o solución salina estéril libre de pirógenos regulada con fosfatos. Para administración por inhalación, el portador será respirable, y preferiblemente estará en forma de partículas sólidas o líquidas. Como medio de inyección, se prefiere utilizar agua que contiene los aditivos usuales para soluciones de inyección, tales como agentes estabilizantes, sales o solución salina, y/o reguladores.
En otras modalidades, la presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende una célula en la cual un provirus
AAV se integra en el genoma en un portador farmacéuticamente aceptable u otro agente medicinal, agente farmacéutico, portador, adyuvante, diluyente, etc.
Por “farmacéuticamente aceptable” se quiere hacer referencia a un material que no es indeseable biológicamente o de otra manera, por ejemplo, el material puede administrarse a un sujeto sin ocasionar ningún efecto biológico indeseable. De esta manera, tal composición farmacéutica puede utilizarse, por ejemplo, en la transfección de una célula ex vivo o en administrar una partícula viral o célula directamente a un sujeto.
La presente invención además proporciona un método para suministrar un ácido nucleico a una célula. Para métodos in vitro, el virus puede administrarse a la célula por métodos de transducción viral estándar,
como se conoce en la téenica. Preferiblemente, las partículas virales se agregan a las células a la multiplicidad de infección apropiada, de acuerdo con métodos de transducción estándar apropiados para las células objetivo particulares. Los títulos de virus a administrar pueden variar, lo que depende del tipo celular objetivo y el vector viral particular, y pueden determinarse por los expertos en la técnica sin experimentación excesiva. Alternativamente, la administración de un vector parvoviral de la presente invención puede conseguirse por cualquier otro medio conocido en la técnica.
Los vectores virales recombinantes preferiblemente se administran a la célula en una cantidad biológicamente efectiva. Una cantidad
“biológicamente efectiva” del vector viral es una cantidad que es suficiente para resultar en la infección (o transducción) y expresión de la secuencia de ácido nucleico heterólogo en la célula. Si el virus se administra a una célula in vivo (por ejemplo, el virus se administra a un sujeto como se describe posteriormente), una cantidad “biológicamente efectiva” del vector viral es una cantidad que es suficiente para resultar en la transducción y expresión de la secuencia de ácido nucleico heterólogo en una célula objetivo.
La célula a la que debe administrarse el vector viral inventivo puede ser de cualquier tipo, incluyendo, pero sin limitarse a, células neurales (incluyendo células de los sistemas nerviosos periférico y central, en particular, células cerebrales), células pulmonares, células retinianas, células epiteliales (por ejemplo, células de epitelios intestinal y respiratorio), células
musculares, células pancreáticas (incluyendo células de las isletas), células hepáticas, células miocárdicas, células óseas (por ejemplo, células madre de médula ósea), células madre hematopoyéticas, células esplénicas, queratinocitos, fibroblastos, células endoteliales, células prostáticas, células germinales, y similares. Alternativamente, la célula puede ser cualquier célula progenitora. Como alternativa adicional, la célula puede ser una célula madre (por ejemplo, célula madre neural, célula madre hepática). Más aún, las células pueden ser de cualquier especie de origen, como se indica anteriormente.
En modalidades particulares de la invención, las células se remueven de un sujeto, el vector parvoviral se introduce en las mismas, y las células entonces se reponen en el sujeto. Los métodos para remover las células del sujeto para el tratamiento ex vivo, seguido por la introducción nuevamente en el sujeto, se conocen en la téenica. Alternativamente, el vector rAAV se introduce en células de otro sujeto, en células cultivadas, o en células de cualquier otra fuente adecuada, y las células se administran a un sujeto en necesidad de ello.
Las células adecuadas para terapia génica ex vivo incluyen, pero no se limitan a, células hepáticas, células neurales (incluyendo células de los sistemas nerviosos central y periférico, en particular, células cerebrales), células pancreáticas, células esplénicas, fibroblastos (por ejemplo, fibroblastos cutáneos), queratinocitos, células endoteliales, células
epiteliales, mioblastos, células hematopoyéticas, células del estroma de médula ósea, células progenitoras y células madre.
Las dosificaciones de las células a administrar a un sujeto variarán con la edad, condición y especie del sujeto, el tipo de célula, el ácido nucleico que se expresa por la célula, el modo de administración y similares. Típicamente, por lo menos aproximadamente 102 a aproximadamente 108, de preferencia aproximadamente 103 a aproximadamente 106 células, se administrarán por dosis. Preferiblemente, las células se administrarán en una “cantidad terapéuticamente efectiva”.
Una cantidad “terapéuticamente efectiva”, como se utiliza en este documento, es una cantidad que es suficiente para aliviar (por ejemplo, mitigar, disminuir, reducir) por lo menos uno de los síntomas asociados con un estado patológico. Indicada alternativamente, una cantidad “terapéuticamente efectiva” es una cantidad que es suficiente para proporcionar cierta mejora en la condición del sujeto.
Un aspecto adicional de la invención es un método para tratar sujetos in vivo con las partículas virales inventivas. La administración de las partículas parvovirales de la presente invención, a un sujeto humano o un animal en necesidad de ello, puede ser por cualquier medio conocido en la téenica para administrar vectores virales.
Los modos de administración ejemplares incluyen la administración oral, rectal, a través de mucosas, tópica, transdérmica, por inhalación,
parenteral (por ejemplo, intravenosa, subcutánea, intradérmica, intramuscular e intraarticular), y similares, así como inyección directa del tejido u órgano, alternativamente, inyecciones subaraenoidea, intramuscular directa, intraventricular, intravenosa, intraperitoneal, intranasal o intraocular. Los inyectables pueden prepararse en formas convencionales, ya sea como soluciones o suspensiones líquidas, formas sólidas adecuadas para solución o suspensiones en líquido antes de la inyección, o como emulsiones. Alternativamente, el virus puede administrarse en forma local en lugar de sistémica, por ejemplo, en una formulación de depósito o de liberación sostenida.
En modalidades particularmente preformadas de la invención, la secuencia de nucleótidos de interés se suministra al hígado del sujeto. La administración al hígado puede lograrse por cualquier método conocido en la técnica, incluyendo, pero sin limitarse a, administración intravenosa, administración por vena porta, administración por conductos biliares, administración intraarterial, e inyección directa al parénquima hepático.
Preferiblemente, las células (por ejemplo, células hepáticas) se infectan por un vector parvoviral recombinante que codifica un péptido o proteína, las células expresan el péptido o proteína codificada y lo secretan hacia el sistema circulatorio en una cantidad terapéuticamente efectiva (como se define anteriormente). Alternativamente, el vector se suministra y expresa por otra célula o tejido, incluyendo, pero sin limitarse a, cerebro, páncreas,
bazo o músculo.
En otras modalidades preferidas, las partículas parvovirales inventivas se administran de manera intramuscular, más preferiblemente por inyección intramuscular o por administración local (como se define anteriormente). En otras modalidades preferidas, las partículas parvovirales de la presente invención se administran a los pulmones.
El vector parvoviral dado a conocer en este documento puede administrarse a los pulmones de un sujeto por cualquier medio adecuado, pero preferiblemente se administra al administrar una suspensión en aerosol de partículas respirables comprendidas de los vectores parvovirales inventivos, los cuales inhala el sujeto. Las partículas respirables pueden ser líquidas o sólidas. Los aerosoles de partículas líquidas que comprenden los vectores parvovirales inventivos pueden producirse por cualquier medio adecuado, tal como con un nebulizador de aerosoles impulsado por presión o un nebulizador ultrasónico, como se conoce por los expertos en la téenica.
Véase, por ejemplo, la Patente de E.U. No. 4,501,729. Los aerosoles de partículas sólidas que comprenden los vectores virales inventivos asimismo pueden producirse con cualquier generador de aerosoles de medicamentos en partículas sólidas, por técnicas conocidas en el arte farmacéutico.
Las dosificaciones de las partículas parvovirales inventivas dependerán del modo de administración, la enfermedad o padecimiento a tratarse, la condición del sujeto individual, el vector viral particular y el gen a
suministrarse, y pueden determinarse en forma rutinaria. Las dosis ejemplares para lograr efectos terapéuticos son títulos virales de por lo menos aproximadamente 105, 106, 107, 108, 109, 1010, 1011 , 1012, 1013, 1014, 1015,1016 unidades de transducción o, más preferiblemente, alrededor de 108 a 1013 unidades de transducción, todavía más preferiblemente 1012 unidades de transducción.
En resumen, los vectores parvovirales, reactivos y métodos de la presente invención pueden utilizarse para dirigir un ácido nucleico a células en división o no en división, y para expresar de manera estable el ácido nucleico heterólogo en las mismas. Al utilizar este sistema vector, ahora es posible introducir en las células, in vitro o in vivo, genes que codifican proteínas que afectan la fisiología celular. Los vectores de la presente invención de esta manera pueden ser útiles en terapia génica para los estados patológicos o para la modificación experimental de la fisiología celular.
El siguiente ejemplo se proporciona para ilustrar ciertas modalidades de la invención. No pretende limitar la invención de ninguna manera.
EJEMPLO I
Las mutaciones lisina a arginina afectan la tasa de transducción de AAV y suministro de MHC
identificación de residuos de lisina a orientarse en vectores AAV1 v AAV 8
Se utilizó el software UbPred para predecir los posibles sitios de ubiquitinación en proteínas de cápside de AAV1, AAV2, AAV8 y Rh74 (Radivojac P et al, 2010). El software UbPred se encuentra disponible en línea en http:bwww.ubpred.ora/index.html. El resultado del análisis es la predicción de los residuos de lisina importantes para la ubiquitinación dentro de la secuencia de cápside del serotipo AAV indicado. Véase las Figuras 1A-1 C y Tabla 1. Estos son los siguientes:
Secuencia VP1 de proteína de cápside de AAV1:
MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWDLKPGAPKPKANQQKQDDGRGLVLPG YKYLGPFNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLKAGDNPYLRYNHADAE
FQERLQEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEGAKTAPGKKRPVEQS PQEPDSSSGIGKTGQQPAKKRLNFGQTGDSESVPDPQPLGEPPATPAAVG PTTMASGGG APMADNNEG ADG VG NASG NWHCDSTWLG DRVITTSTRTW ALPTYNNHLYKQISSASTGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDW QRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTTNDGVTTIANNLTSTVQVFSDSEY
QLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFP
SQMLRTGNNFTFSYTFEEVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLNRTQN
QSGSAQNKDLLFSRGSPAGMSVQPKNWLPGPCYRQQRVSKTKTDNNNSN FTWTGASKYNLNGRESIINPGTAMASHKDDEDKFFPMSGVMIFGKESAGAS NTALDNVMITDEEEIKATNPVATERFGTVAVNFQSSSTDPATGDVHAMGAL PGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKNPPPQILIKNTP VPANPPAEFSATKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEVQYTSN
YAKSANVDFTVDNNGLYTEPRPIGTRYLTRP
Posición de lisina Calificación Ubiquitinada
26 0.59 No
31 0.55 No
33 0.47 No
38 0.61 No
51 0.54 No
61 0.72 Sí, Confianza media
77 0.63 Sí, Confianza baja
84 0.72 Sí, Confianza media
122 0.17 No
123 0.26 No
137 0.90 Sí, Confianza alta
142 0.62 Sí, Confianza baja
143 0.81 Sí, Confianza media
161 0.70 Sí, Confianza media
168 0.25 No
169 0.26 No
258 0.49 No
310 0.14 No
315 0.15 No
322 0.48 No
459 0.81 Sí, Confianza media
476 0.43 No
491 0.20 No
493 0.28 No
508 0.62 Sí, Confianza baja
528 0.67 Sí, Confianza baja
533 0.70 Sí, Confianza media
545 0.65 Sí, Confianza baja
567 0.66 Sí, Confianza baja
621 0.50 No
641 0.50 No
650 0.45 No
666 0.58 No
689 0.65 Sí, Confianza baja
693 0.65 Sí, Confianza baja
707 0.78 Sí, Confianza media
Leyenda:
Etiqueta Intervalo de Sensibilidad Especificidad calificación
Confianza baja 0.62 < s < 0.69 0.464 0.903 Confianza media 0.69 < s < 0.84 0.346 0.950 Confianza alta 0.84 < s < 1.00 0.197 0.989
Mutantes deseables en AAV-1
Secuencia VP1 de proteína de cáoside de AAV8:
MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWALKPGAPKPKANQQKQDDGRG LVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLQAGDNPYLRYN HADAEFQERLQEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEGAKTAPGKKR PVEPSPQRSPDSSTGIGKKGQQPARKRLNFGQTGDSESVPDPQPLGEPPA
APSGVGPNTMAAGGGAPMADNNEGADGVGSSSGNWHCDSTWLGDRVIT TSTRTWALPTYNNHLYKQISNGTSGGATNDNTYFGYSTPWGYFDFNRFHC HFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLSFKLFNIQVKEVTQNEGTKTIANNLTSTIQ VFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNNGSQAVGRSSF YCLEYFPSQMLRTGNNFQFTYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLY
YLSRTQTTGGTANTQTLGFSQGGPNTMANQAKNWLPGPCYRQQRVSTTT
GQNNNSNFAWTAGTKYHLNGRNSLANPGIAMATHKDDEERFFPSNGILIFG
KQNAARDNADYSDVMLTSEEEIKTTNPVATEEYGIVADNLQQQNTAPQIGTV
NSQGALPGMVWQNRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGLKHPPP
QILIKNTPVPADPPTTFNQSKLNSFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNP
EIQYTSNYYKSTSVDFAVNTEGVYSEPRPIGTRYLTRNL
Posición de lisina Calificación Ubiquitinada
26 0.52 No
31 0.51 No
33 0.16 No
38 0.62 Sí, Confianza baja
51 0.56 No
61 0.68 Sí, Confianza baja
77 0.65 Sí, Confianza baja
122 0.17 No
123 0.32 No
137 0.92 Sí, Confianza alta
142 0.53 No
143 0.65 Sí, Confianza baja
162 0.28 No
163 0.29 No
170 0.24 No
259 0.49 No
312 0.09 No
317 0.12 No
324 0.43 No
333 0.75 Sí, Confianza media
478 0.59 No
510 0.50 No
530 0.71 Sí, Confianza media
547 0.40 No
569 0.66 Sí, Confianza baja
623 0.47 No
643 0.44 No
652 0.51 No
668 0.64 Sí, Confianza baja
691 0.66 Sí, Confianza baja
695 0.67 Sí, Confianza baja
709 0.68 Sí, Confianza baja
Leyenda:
Etiqueta Intervalo de Sensibilidad Especificidad
calificación
Confianza baja 0.62 < s < 0.69 0.464 0.903
Confianza media 0.69 < s < 0.84 0.346 0.950
Confianza alta 0.84 < s < 1.00 0.197 0.989
La Tabla 3, adjunta a la presente, proporciona el rendimiento del vector obtenido al utilizar los diferentes mutantes en cápside, incluyendo AAV8, de la invención. La tabla también indica si la mutación resultó en eficiencias de transducción incrementadas, disminuidas o comparables, en comparación con los vectores de tipo silvestre del mismo serotipo.
Secuencia VP1 de proteína de cápside de AAV2:
MAADGYLPDWLEDTLSEGIRQWWKLKPGPPPPKPAERHKDDSRG
LVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNEADAAALEHDKAYDRQLDSGDNPYLKYN
HADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEPVKTAPGKKRP
VEHSPVEPDSSSGTGKAGQQPARKRLNFGQTGDADSVPDPQPLGQPPAA
PSGLGTNTMATGSGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSTWMGDRVITT
STRTWALPTYNNHLYKQISSQSGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFS
PRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNDGTTTIANNLTSTVQVFT
DSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYC
LEYFPSQMLRTGNNFTFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLS
RTNTPSGTTTQSRLQFSQAGASDIRDQSRNWLPGPCYRQQRVSKTSADNN
NSEYSWTGATKYHLNGRDSLVNPGPAMASHKDDEEKFFPQSGVLIFGKQG
SEKTNVDIEKVMITDEEEIRTTNPVATEQYGSVSTNLQRGNRQAATADVNTQ
GVLPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIK
NTPVPANPSTTFSAAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYT
SNYNKSVNVDFTVDTNGVYSEPRPIGTRYLTRNL
Posición de lisina Calificación Ubiquitinada
24 0.20 No
26 0.49 No
33 0.38 No
39 0.89 Sí, Confianza alta
51 0.53 No
61 0.67 Sí, Confianza baja
77 0.68 Sí, Confianza baja
92 0.56 No
105 0.58 No
122 0.14 No
123 0.18 No
137 0.87 Sí, Confianza alta
142 0.58 No
143 0.77 Sí, Confianza media 161 0.70 Sí, Confianza media 169 0.31 No
258 0.51 No
309 0.14 No
314 0.17 No
321 0.46 No
490 0.73 Sí, Confianza media 507 0.61 No
527 0.78 Sí, Confianza media 532 0.75 Sí, Confianza media 544 0.61 No
549 0.68 Sí, Confianza baja 556 0.62 Sí, Confianza baja 620 0.47 No
640 0.45 No
649 0.42 No
665 0.54 No
688 0.68 Sí, Confianza baja 692 0.68 Sí, Confianza baja 706 0.66 Sí, Confianza baja
Lcyenda:
Etiqueta Intervalo de Sensibilidad Especificidad
calificación
Confianza baja 0.62 < s £ 0.69 0.464 0.903
Confianza media 0.69 < s £ 0.84 0.346 0.950
Confianza alta 0.84 < s £ 1.00 0.197 0.989
Secuencia VP1 de proteína de cápside de AAV-Rh74:
MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWDLKPGAPKPKANQQKQDNGR
GLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLQAGDNPYLRY
NHADAEFQERLQEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVESPVKTAPGKK
RPVEPSPQRSPDSSTGIGKKGQQPAKKRLNFGQTGDSESVPDPQPIGEPP
AGPSGLGSGTMAAGGGAPMADNNEGADGVGSSSGNWHCDSTWLGDRVI
TTSTRTWALPTYNNHLYKQISNGTSGGSTNDNTYFGYSTPWGYFDFNRFH
CHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNEGTKTIANNLTSTI
QVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNNGSQAVGRSS
FYCLEYFPSQMLRTGNNFEFSYNFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYL
YYLSRTQSTGGTAGTQQLLFSQAGPNNMSAQAKNWLPGPCYRQQRVSTT
LSQNNNSNFAWTGATKYHLNGRDSLVNPGVAMATHKDDEERFFPSSGVLM
FGKQGAGKDNVDYSSVMLTSEEEIKTTNPVATEQYGVVADNLQQQNAAPIV
GAVNSQGALPGMVWQNRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGLKH
PPPQILIKNTPVPADPPTTFNQAKLASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKR
WNPEIQYTSNYYKSTNVDFAVNTEGTYSEPRPIGTRYLTRNL
Posición de lisina Calificación Ubiquitinada
26 0.60 No
31 0.53 No
33 0.27 No
38 0.23 No
51 0.38 No
61 0.68 Sí, Confianza baja
77 0.65 Sí, Confianza baja
122 0.17 No
123 0.30 No
137 0.90 Sí, Confianza alta
142 0.35 No
143 0.35 No
162 0.36 No
163 0.33 No
169 0.27 No
170 0.25 No
259 0.46 No
312 0.13 No
317 0.16 No
324 0.46 No
333 0.77 Sí, Confianza media 478 0.51 No
510 0.49 No
530 0.67 Sí, Confianza baja 547 0.52 No
552 0.69 Sí, Confianza media 569 0.67 Sí, Confianza baja
623 0.49 No
643 0.44 No
652 0.54 No
668 0.56 No
691 0.68 Sí, Confianza baja
695 0.67 Sí, Confianza baja
709 0.69 Sí, Confianza media
Lcyenda:
Etiqueta Intervalo de Sensibilidad Especificidad calificación
Confianza baja 0.62 < s < 0.69 0.464 0.903 Confianza media 0.69 < s < 0.84 0.346 0.950 Confianza alta 0.84 < s < 1.00 0.197 0.989
Mutantes deseables en AAV-rh74 (véase también la Tabla 3)
Los siguientes juegos de cebadores se utilizaron para crear las variantes de cápside que contienen Usina de la invención:
Cebadores utilizados para mutagénesis:
• Cebadores AAV1 :
AAV1 K61 R
Sentido: 5’- CTT CAA CGG ACT CGA CAG GGG GGA GCC -3’ Antisentido: 5’- GGC TCC CCC CTG TCG AGT CCG TTG AAG -3’ AAV1 K84R
Sentido: 5’- GCC TAC GAC CAG CAG CTC AGA GCG GGT GAC -3’ Antisentido: 5’- GTC ACC CGC TCT GAG CTG CTG GTC GTA GGC
-3’
AAV1 K137R
Sentido: 5’- TGG TTG AGG AAG GCG CTA GGA CGG CTC CT -3’ Antisentido: 5’- AGG AGC CGT CCT AGC GCC TTC CTC AAC CA -3’
AAV1 K143R
Sentido: 5’- CTA AGA CGG CTC CTG GAA AGA GAC GTC CGG
TAG -3’
Antisentido: 5’- CTA CCG GAC GTC TCT TTC CAG GAG CCG TCT
TAG -3’
AAV1 K161R
Sentido: 5’- CGG GCA TCG GCA GGA CAG GCC AGC A -3’
Antisentido: 5’- TGC TGG CCT GTC CTG CCG ATG CCC G -3’ AAV1 K459R
Sentido: 5’- AGT CCG GAA GTG CCC AAA ACA GGG ACT TGC
TGT -3’
Antisentido: 5’- ACA GCA AGT CCC TGT TTT GGG CAC TTC CGG
ACT -3’
AAV1 K528R
Sentido: 5’- GCA CTG CTA TGG CCT CAC ACA GAG ACG ACG
AAG -3’
Antisentido: 5’- CTT CGT CGT CTC TGT GTG AGG CCA TAG CAG
TGC -3’
AAV1 K533R
Sentido: 5’- CAA AGA CGA CGA AGA CAG GTT CTT TCC CAT GAG CG -3’
Antisentido: 5’-CGC TCA TGG GAA AGA ACC TGT CTT CGT CGT CTT TG -3’
AAV1 K707R
Sentido: 5’- TGCAGT ACACATCCAATT ATGCAAG ATCTGCCAACG
TTG -3’
Antisentido: 5’- CAACGTTGGCAGATCTTGCATAATTGGATGTGTACTGCA -3’
· Cebadores AAV8
AAV8 K137R
Sentido: 5’- GGT TGA GGA AGG CGC TAG GAC GGC TCC TGG -3’ Antisentido: 5’- CCA GGA GCC GTC CTA GCG CCT TCC TCA ACC -3’
AAV8 K333R
Sentido: 5’- GCA GAA TGA AGG CAC CAG GAC CAT CGC CAA TAA CC -3’
Antisentido: 5’- GGT TAT TGG CGA TGG TCC TGG TGC CTT CAT TCT GC -3’
AAV8 K530R
Sentido: 5’- GCA TCG CTA TGG CAA CAC ACA GAG ACG ACG
AGG -3’
Antisentido: 5’- CCT CGT CGT CTC TGT GTG TTG CCA TAG CGA
TGC -3’
AAV8 K709R
Sentido: 5’-GT AC ACCT CCAACT ACT ACAG AT CT ACAAGT GT GG ACTTT G -3’
Antisentido: 5’- C AAAGT CCAC ACTTGT AG AT CT GT AGT AGTTGG AG GTGT AC -3’
• Cebadores AAV2
AAV2 K39R
Sentido: 5’-GCCCGCAGAGCGGCATAGGGACGACAG-3’
Antisentido: 5’-CTGTCGTCCCTATGCCGCTCTGCGGGC-3’
AAV2 K137R
Sentido: 5’-CCTGGTTGAGGAACCTGTTAGGACGGCTCCGG-3’ Antisentido: 5’-CCGGAGCCGTCCTAACAGGTTCCTCAACCAGG-3’ AAV2 K143R
Sentido: 5’-AGACGGCTCCGGGAAAAAGGAGGCCGGTA-3’ Antisentido: 5’-TACCGGCCTCCTTTTTCCCGGAGCCGTCT-3’ AAV2 K161R
Sentido: 5’-CCTCGGGAACCGGAAGGGCGGGCC-3’
Antisentido: 5’-GGCCCGCCCTTCCGGTTCCCGAGG-3’
AAV2 K490R
Sentido: 5’-CCGCCAGCAGCGAGTATCAAGGACATCTGCGG-3’
Antisentido: 5’-CCGCAGATGTCCTTGATACTCGCTGCTGGCGG-3’ AAV2 K527R
Sentido: 5’-CGGCCATGGCAAGCCACAGGGACGATGAA-3’
Antisentido: 5’-TTCATCGTCCCTGTGGCTTGCCATGGCCG-3’ AAV2 K532R
Sentido: 5’- ACAAGGACGATGAAGAAAGGTTTTTTCCTCAGAGCGG-3’
Antisentido: 5’- CCGCTCTGAGGAAAAAACCTTTCTTCATCGTCCTTGT-3’
· Cebadores AAV-rh74
AAV-rh74 K137R
Sentido: 5’-CTGGTTGAATCGCCGGTTAGGACGGCTCCTG-3’ Antisentido: 5’-GACCAACTTAGCGGCCAATCCTGCCGAGGAC-3’ AAV-rh74 K333R
Sentido: 5’-GCAGAATGAAGGCACCAGGACCATCGCCAATAACC-3’
Antisentido: 5’- GGTTATTGGCGATGGTCCTGGTGCCTTCATTCTGC-3’
AAV-rh74 K530R
Sentido: 5’-GTTGCCATGGCTACCCACAGGGACGACGAA-3’ Antisentido: 5’-TTCGTCGTCCCTGTGGGTAGCCATGGCAAC-3’
AAV-rh74 K552R
Sentido: 5’-GGAAACAGGGAGCTGGAAGAGACAACGTGGACTAT-
3’
Antisentido: 5’-AT AGTCCACGTTGT CT CTT CCAGCT CCCT GTTTCC-3’
AAV-rh74 K569R
Sentido: 5’ -CT AACC AGCG AGG AAG AAAT AAG G ACC ACC AACCC-3’
Antisentido: 5’- GGGTTGGTGGTCCTTATTTCTTCCTCGCTGGTTAG-3’
AAV-rh74 K691 R
Sentido: 5’-CGAGTGGGAGCTGCAGAGGGAGAACAGCAA-3’ Antisentido: 5’-TTGCTGTTCTCCCTCTGCAGCTCCCACTCG-3’
AAV-rh74 K695R
Sentido: 5’-GCTGCAGAAGGAGAACAGCAGACGCTGGAACC-3’ Antisentido: 5’-GGTTCCAGCGTCTGCTGTTCTCCTTCTGCAGC-3’ AAV-rh74 K709R
Sentido: 5’- AGTACACTT CCAACT ACT AC AG AT CT AC AAAT GT G G ACTTTGC-3’
Antisentido: 5’- GCAAAGT CCAC ATTTGT AG AT CT GT AGT AGTTGG AAGT GT ACT -3’
La Tabla 5 proporciona una serie de vectores AAV derivados a partir de mutagénesis, que se utilizaron para empaquetar casetes de expresión de transgenes AAV específicos de hígado para FIX. La eficiencia de empaquetamiento fue indistinguible de la observada con vectores AAV8 sin
modificar de tipo silvestre.
Los mutantes de cápside que contienen 2, 3, 4, 5, 6, 7 o más residuos de lisina alterados en cualquiera de las proteínas de cápside descritas en este documento, para incrementar además la eficiencia de transducción, también se encuentran dentro del alcance de la invención. Los datos también revelan que ciertas mutaciones resultan en variantes que exhibieron una eficiencia de transducción significativamente reducida. Tales variantes pueden utilizarse en combinación con variantes que exhiben eficiencias de transducción incrementadas, para actuar como señuelos para neutralizar o saturar una respuesta inmune dirigida por anticuerpos a los vectores entrantes, lo que en consecuencia habilita a los vectores que transportan transgenes deseables para entrar de manera más eficiente a las células.
Las Figuras 1A-1C muestran diagramas esquemáticos de la
superficie de cápside. Los datos presentados en las Figuras 2A, 2B y 2C demuestran que alterar los residuos de lisina en la cápside VP1 en AAV8 altera el nivel del transgen producido debido a los niveles de transducción alterados. Las Figuras 3A, 3B y 3C muestran los efectos de mutaciones únicas y múltiples sobre la producción de HF.IX en las células transducidas. La Figura 3D demuestra que una combinación de mutaciones, por ejemplo, tres residuos de lisina a arginina con cuatro o seis residuos de tirosina a fenilalanina disminuye las tasas de transducción.
Eliminación por CTL de hepatocitos HHL5-B7 al utilizar mutantes en lisina AAV
Se valoró la eliminación por CTL de hepatocitos transducidos con algunos de los mutantes en lisina AAV dados a conocer aquí. Los siguientes materiales y métodos se emplearon para valorar la eliminación por CTL de hepatocitos transducidos.
Generación de vectores
Los vectores AAV se produjeron en células HEK-293 al utilizar una estrategia de triple transfección como se describe previamente (Matsushita, 1998) y se purificaron con métodos de centrifugación en gradientes de cloruro de cesio (Ayuso, 2010). Péptidos de epítopos AAV se sintetizaron por Genemed Synthesis y se resuspendieron a una concentración de 5 mg/ml en DMSO al 100%.
Expansión in vitro de células T
PBMC humanos (Cellular Technology LTD) se descongelaron, lavaron, contaron y resuspendieron a una concentración de 2 x 106 células/ml en medio para linfocitos AIM-V (Gibco) que contenía suero humano al 3% (Bioreclamation), L-glutamina al 1% (Gibco), y penicilina/estreptomicina al 1% (Gibco). Para cada condición de expansión, 1 x 106 (500 mI) células se agregaron por pozo en una placa de 24 pozos (BD Falcon) en un volumen de 500 mI. 1 x 106 (500 mI) adicionales de esplenocitos irradiados autólogos (3000 rad) también se agregaron a cada pozo como células alimentadoras, en conjunto con 2.5 mg/ml de b-2-microglobulina humana (Lee Biosolutions), y 10 ng/ml de IL-7 recombinante humana (R&D Systems). Las células se expandieron en presencia de péptido AAV a una concentración final de 10 pg/ml a 37 °C en CO2 al 5%. IL-2 humana (Roche), a una concentración de 10 ng/ml, se agregó al cultivo celular después de las primeras 24 horas y se reabasteció cada 48 horas después de ello. Las células se dividieron en nuevos pozos según se requería y el estímulo antigénico (antígeno y células alimentadoras) se repitió cada 7-10 días por hasta 3 rondas de reestímulo.
ENSAYO CTL
El ensayo CTL se realizó como se describe previamente (Píen, 2009). Brevemente, la liberación de lactato deshidrogenasa (LDH) después de la lisis del objetivo mediada por CTL se midió con el CytoTox 96 Non Radioactive Cytotoxicity Assay (Promega). Cuatro mil hepatocitos objetivo HHL5 se cultivaron en placas en cada pozo de una placa de 96 pozos de
fondo plano Microtest Primaria (BD Falcon) en DMEM que no contenía suero. Las celulas objetivo se transdujeron a una MOI de 5000, 50,000 y 500,000 de cápside de AAV y se incubaron por 18 horas a 37 °C y CO2 al 5%. Después del tratamiento e incubación, las células objetivo cultivadas en placa se lavaron una vez con medio antes de la adición de linfocitos T citotóxicos específicos de epítopos, expandidos como se describe anteriormente. Las CTL se agregaron a una relación célula efectora-objetivo de 10:1 por 4 horas a 37 °C, C02 al 5%, y la LDH se midió después de una incubación de 30 minutos a temperatura ambiente con lectura de sustrato enzimático a 490 nm al utilizar un espectrofotómetro (Spectramax).
Citometría de flujo
La expresión de GFP después de la transducción de AAV se midió por citometría de flujo. Hepatocitos humanos de las líneas celulares HHL5 o Huh7 se colocaron en placas en DMEM que contenía suero bovino fetal al 10%, L-glutamina al 1% (Gibco), y penicilina/estreptomicina al 1% (Gibco) a una densidad de 250,000 células/pozo en una placa de 24 pozos Primaria Multiwell (BD Falcon). Las células se transdujeron con 5000, 50000 o 5000000 de MOI de vector AAV y se incubaron por 18 horas a 37 °C y C02 al 5%. Después de la incubación, las células se digirieron con tripsina, se lavaron dos veces con PBS y FBS al 2%, y se fijaron con paraformaldehído al 2%. Las muestras se adquirieron en un citómetro de flujo FACS Canto II al utilizar FACSDiva® (BD Biosciences) y el análisis posterior se realizó al
utilizar el software Flowjo® (Treestar).
RESULTADOS DE ENSAYO CTL
Con el fin de probar además el efecto de las mutaciones en Usina sobre la transducción viral, se utilizó un ensayo de citotoxicidad mediada por CTL in vitro previamente desarrollado por el laboratorio para probar la funcionalidad de los vectores AAV (Pien et al.). Los resultados de transducción de AAV1 y AAV2 se muestran en las Figuras 4, 5 y 6. En las Figuras 4A-4B, todas las mutaciones en lisina en la cápside de AAV-1 resultaron en una disminución en la eliminación mediada por CTL de las células objetivo, lo que sugiere que las mutaciones en lisina condujeron a un procesamiento y presentación menos eficientes del antígeno de superficie con la transducción. Adicionalmente, el efecto de las mutaciones en lisina parece ser aditivo, con las triples y cuádruples mutantes en lisina mostrando la mayor disminución de la eliminación mediada por CTL (Figura 4A, 4B). Las mutaciones a la cápside de AAV-2 mostraron un efecto similar. Véase las
Figuras 5 y 6. Las Figuras 7A-7D muestran los resultados de transducción obtenidos cuando se probaron las variantes Rh74.
En resumen, se ha encontrado que mutar los residuos de lisina en las cápsides de AAV a residuos de arginina incrementa la eficiencia de transducción de AAV. Los experimentos identificaron varias variantes que, con la transducción, resultaron en niveles superiores de expresión del transgen de factor IX (FIX) humano en ratones, en comparación con
animales que reciben vectores AAV sin modificar.
REFERENCIAS
Xie Q, Bu W, Bhatia S, Hare J, Somasundaram T, Azzi A, et al. The atomic structure of adeno-associated virus (AAV-2), a vector for human gene therapy. Proc Nati Acad Sci USA.2002;99:10405-10410
High KA, Aubourg P “rAAV human trial experience” Methods Mol Biol. 2011;807:429-57.
Zhong L, Zhao W, Wu J, Li B, Zolotukhin S, Govindasamy L, Agbandje-McKenna M,
Srivastava A. “A dual role of EGFR protein tyrosine kinase signaling in ubiquitination of AAV2 capsids and viral second-strand DNA synthesis.” Mol Ther.2007 Jul; 15(7): 1323-30. Epub 2007 Apr 17.
Zhong L, Li B, Mah CS, Govindasamy L, Agbandje-McKenna M, Cooper M, Herzog RW, Zolotukhin I, Warrington KH Jr, Weigel-Van Aken KA, Hobbs JA, Zolotukhin S, Muzyczka N, Srivastava A. “Next generation of adeno-associated virus 2 vectors: point mutations in tyrosines lead to high-efficiency transduction at lower doses.” Proc Nati Acad Sci U S A. 2008 Jun 3; 105(22):7827-32.
Thrower JS, Hoffman L, Rechsteiner M, and Pickart C M “Recognition of the polyubiquitin proteolytic signal.” EMBO J. 2000 January 4; 19(1): 94-102.
Bedford L, Lowe J, Dick LR, Mayer RJ, Brownell JE. “Ubiquitin-like
protein conjugation and the ubiquitin-proteasome system as drug targets” Nat Rev Drug Discov.2011 Jan;10(1):29-46
Peng, J; Schwartz; Elias; Thoreen; Cheng; Marsischky; Roelofs; Finlcy et al (Aug 2003). “A proteomics approach to understanding protein ubiquitination”. Nature biotechnology \ (8): 921-6.
Radivojac, P., Vacie, V., Haynes, C., Cocklin, R. R., Mohán, A., Heyen, J. W., Goebl, M. G., and lakoucheva, L. M. Identification, Analysis and Prediction of Protein Ubiquitination Sites. Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics.78(2):365-380. (2010)
Aunque algunas de las modalidades preferidas de la presente invención se han descrito y ejemplificado específicamente en este documento, no se pretende que la invención se limite a tales modalidades. Diversas modificaciones pueden hacerse a la misma sin apartarse del alcance y espíritu de la presente invención, como se expone en las siguientes reivindicaciones.
Tabla 1
Comparación de posiciones de lisinas de AAV1 , AAV2 y AAV8 y sus predicciones de ubiquitinación
Color de etiquetas: Verde: Confianza baja; Azul: Confianza media; Rojo: Confianza alta; Negro: sin predicción de ubiquitinación
AAV1 MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWDLKPGAPKPKANGQKQDDGRGLVIPGYKYLGPFNGLD 60
AAVS MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWALKPGAPKPKANQQSQDOGRGLVLPGYKYLGPFNGLD 60
AAV2 MAADGYLPDWtEDTLSEGIRQWWKLKPGPPPPKPAERI¾jDDSRGLVLPGY YLGPFNGLD 60
AAV-rh74 MAADGYIPDWLEDNLSEGIREWWOLKPGAPKPKANQQKQDNGRGLVLPGYKYLGPFNGLD 60
AAV1 SGEPVNAADAAALEH tÍtíSAYDQQLjjAGONPYLRYNHADAEFQERLQEDTSFGGNLGRAVFQ 120
AAV8 JJGEPVNAADAAALEHO “‘¿AYDQQLQAGDNPYLRYNHADAEFQERLQEDTSFGGNLGRAVFQ 120
AAV2 m SGEPVNEADAAALEHO YDRQUDSGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQ 120
AAV-rtl74 gGEPVNAADAAALHHDUAYDQQlQAGDNPYLRYNHAPAEFQgRtQEDTSFGGNLGRAVFQ 120
AAV1 AKKRVLEPLQLVEEGAjSTAPGfS^kiPVEQSPQ-EPDSSSGIGfSrGQQPAKKRLNFGQTGDS 179
AAV8 AKKRVUEPLGLVEEG/^TAPQKSRPVE PSPQRSPDSST GIGKKGQQPARKRLN FGQTGOS 180
AAV2 AKKRVLEPLGUVEEPVISTAPGKJ^PVEHSPV-EPOSSSGTG^AGQQPARKRLNFGQTGDA 179
AAV*rtl74 AKKRVLEPLGLVESP ASTAPGKKRPVEPSPQRSPDSSTGIGKKGQQPAKKRLNFGQTGOS 180
AAV1 ESVPDPQPLGEPPATPAAVGPTTMASGGGAP ADNNEGADGVGNASGNWHCDSTWLGDRV 239 AAVB ESVPDPQPLGEPPAAPSGVGPNTMAAGGGAPMADNNEGADGVGSSSGNWHCDSTWLGDRV 240 AAV2 DSVPDPGPLGQPPAAPSGLGTNTMATGSGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSTWMGDRV 239 AAV-rtl74 ESVPDPQPIGEPPAGPSGLGSGTMAAGGGAPMADNNEGADGVGSSSGNWHCDSTWLGDRV 240
AAV1 ITTSTRTWALPTYNNHlYKaiSSASTG-ASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQ 298
AAV8 ITTSTRTWALPTYNNHLYKQISNGTSGGATNDNTYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQ 300
AAV2 ITTSTRTWALPTYNNHLYKQIS-SQSGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQ 297
AAV-rti74 ITTSTRTWALPTYNNHLYKQISNGTSGGSTNONTYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWa 300
AAV1 RUNNNWGFRPKRLMFKLFNIQVKEVrrNOGVTTlANNLTSTVQVFSOSEYQLPYVLGSA 358
MV8 RLINNNWGFRPKRLSFKLFNIQVKEVTQNEGTISTIANNLTSTIQVFTDSEYQLPYVLGSA 380
AAV2 RLINN WGFRPKRLNFKLFNIQV EVTQNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVLGSA 357
AAV-rh74 RLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNEGT^TtANNLTSTIQVFTDSEYQLPYVLGSA 360
AAV1 HQGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFTFSYTFEE 418
AAV8 HQGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFQFTYTFED 420
AAV2 HQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFTFSYTFED 417 AAV-fh74 HQGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFEFSYNFED 420
AAV1 VRFHSSYAHSQSLDRLMNPllDQYLYYLNRTQNQSGSAQI^jDLLFSRGSPAGMSVaPKNW 478
AAV8 VPFHSSYAHSQSLDRLMNPUDQYIYYLSRTQTTGGTANTQTLGFSQGGPNTMANQAKNW 480 AAV2 VPFHSSYAHSQSL0RLMNPLIDQYtYYlSRTNTPSGTTTQsRLGFSQAGAS0IRDQ3RNW 477 AAV-rh74 VPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTQSTGGTAGTQQLLFSQAGPNNMSAQAKNW 480
Tabla 2
Predicción de ubiquitinación de cápside AAV8
Software UbPred (http:bwww.ubpred.org/):
Radivojac P., Vacie, V., Haynes, C., Cocklin, R. R., Mohán, A., Hcyen, J. W., Goebl, M. G., 25 and lakoucheva, L. M. Identification, Analysis and Prediction of Protein Ubiquitination Sites. Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics.78(2):365-380. (2010)
Tabla 3
Liberación de MHC
Definición de TMR = K(137/333/530) R
Definición de HMF = Y(253/275/447/703/707/733)F Definición de HMR: K(137/259/333/530/552/569) R
Definición de 195/202: G195A + L199V + S201 P + G202N
Claims (23)
1. Un vector viral adenoasociado (AAV) mejorado, que comprende una proteína de cápside VP1 que comprende una o más sustituciones de lisina, el vector además comprende un minigen que comprende repeticiones terminales invertidas de AAV y una secuencia de ácido nucleico heterólogo enlazada de manera operable a secuencias reguladoras que dirigen la expresión de un producto de la secuencia de ácido nucleico heterólogo en una célula huésped, la sustitución de lisina es efectiva para inhibir la ubiquitinación de la proteína de cápside, lo que en consecuencia incrementa la transducción del vector AAV hacia una célula objetivo.
2. El vector AAV de conformidad con la reivindicación 1 , que tiene un serotipo seleccionado del grupo que consiste en AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV-rh74, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8 y AAV9.
3. El vector AAV de conformidad con la reivindicación 1, que comprende una proteína de cápside VP1 que tiene por lo menos una sustitución de lisina en un residuo de lisina mostrado en las tablas, en donde la o las sustituciones incrementan la eficiencia de transducción.
4. El vector AAV de conformidad con la reivindicación 2, que comprende una proteína de cápside AAV8 VP1 alterada, seleccionada del grupo que consiste en AAV8 K137R, AAV8 K333R y AAV8 K530R.
5. El vector AAV de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones previas, en donde el producto de expresión de la secuencia de ácido nucleico heterólogo es un peptido o ácido nucleico terapéutico.
6. El vector AAV de conformidad con la reivindicación 5, en donde el péptido terapéutico es un factor de coagulación seleccionado del grupo que consiste en Factor VIII, Factor IX o un fragmento funcional de los mismos.
7. El vector AAV8 de conformidad con la reivindicación 4, en donde el producto de expresión de la secuencia de ácido nucleico heterólogo es una IgG, IgM, IgA, IgD, IgE, inmunoglobulina quimérica, anticuerpo humanizado, o un anticuerpo de cadena sencilla.
8. El vector AAV8 de conformidad con la reivindicación 7, en donde el producto de expresión de la secuencia de ácido nucleico heterólogo es una inmunoglobulina quimérica.
9. El vector AAV8 de conformidad con la reivindicación 4, en donde el producto de expresión de la secuencia de ácido nucleico heterólogo es un anticuerpo de cadena sencilla.
10. El vector AAV de conformidad con la reivindicación 5, en donde el producto de expresión es un RNAi antiviral.
11. El vector AAV de conformidad con la reivindicación 10, en donde el RNA inhibitorio es efectivo para inhibir la infección y replicación de HCV.
12. El vector AAV de conformidad con la reivindicación 10, en donde el RNA inhibitorio es efectivo para inhibir la expresión de un gen objetivo eucariótico.
13. El vector AAV de conformidad con la reivindicación 4, en donde el transgen codifica una citocina modificadora de la enfermedad.
14. El vector AAV de conformidad con la reivindicación 4, en donde el transgen codifica un par de nucleasas de dedos de zinc.
15. El vector AAV de conformidad con la reivindicación 1, que comprende 2, 3 o 4 sustituciones de lisina.
16. El vector AAV de conformidad con la reivindicación 3, que además comprende un segundo vector AAV que comprende una proteína de cápside VP1 que tiene por lo menos una sustitución de lisina en un residuo de lisina mostrado en las tablas, en donde la sustitución reduce la eficiencia de transducción, y el suministro del segundo vector AAV es efectivo para neutralizar una respuesta de anticuerpos a un primer vector AAV.
17. Una composición farmacéutica que comprende el vector AAV de acuerdo con la reivindicación 3, y un portador compatible fisiológico para el mismo.
18. Un cultivo celular que comprende el vector AAV de acuerdo con la reivindicación 1.
19. Un método para suministrar un transgen a una célula en un sujeto, el método comprende la etapa de poner en contacto la célula con la composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 17, en donde el vector AAV comprende el transgen, en donde la presencia de la sustitución de lisina en la proteína de cápside VP1 se asocia con una reducción en la ubiquitinación de la cápside, lo que en consecuencia incrementa la eficiencia de transducción de las células objetivo con el vector.
20. El método de conformidad con la reivindicación 19, en donde el transgen es el Factor IX.
21. Una composición farmacéutica que comprende los vectores AAV de acuerdo con la reivindicación 16, y un portador compatible fisiológico para los mismos.
22. Un método para suministrar un transgen a una célula en un sujeto, el método comprende la etapa de poner en contacto la célula con la composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 21, en donde el primer vector AAV comprende el transgen, en donde la presencia de la sustitución de lisina en la proteina de cápside VP1 se asocia con una reducción en la ubiquitinación de la cápside, lo que en consecuencia incrementa la eficiencia de transducción de las células objetivo con el vector y el segundo vector exhibe una eficiencia de transducción reducida con respecto al tipo silvestre y es efectivo para neutralizar una respuesta de anticuerpos indeseable al primer vector AAV.
23. El método de conformidad con la reivindicación 22, en donde el transgen es el Factor IX.
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|---|---|---|---|---|
| DK2359867T3 (en) * | 2005-04-07 | 2015-01-05 | Univ Pennsylvania | A method for increasing an AAV vector function |
| PT2191001T (pt) | 2007-04-09 | 2016-09-23 | Univ Florida | Composições com vetores raav possuindo proteínas da cápside modificadas com tirosina e métodos para o seu uso |
| US9725485B2 (en) * | 2012-05-15 | 2017-08-08 | University Of Florida Research Foundation, Inc. | AAV vectors with high transduction efficiency and uses thereof for gene therapy |
| WO2010138263A2 (en) | 2009-05-28 | 2010-12-02 | University Of Massachusetts | Novel aav 's and uses thereof |
| WO2012149393A2 (en) | 2011-04-29 | 2012-11-01 | Selecta Biosciences, Inc. | Tolerogenic synthetic nanocarriers for antigen-specific deletion of t effector cells |
| SI2839014T1 (sl) | 2012-04-18 | 2021-05-31 | The Children's Hospital Of Philadelphia | Sestavek in postopki za zelo učinkovit prenos genov z uporabo variant kapside AAV-JA |
| US10294281B2 (en) | 2012-05-15 | 2019-05-21 | University Of Florida Research Foundation, Incorporated | High-transduction-efficiency rAAV vectors, compositions, and methods of use |
| JP6600624B2 (ja) * | 2013-05-31 | 2019-10-30 | ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア | アデノ随伴ウイルス変異体及びその使用方法 |
| PT3024498T (pt) * | 2013-07-22 | 2020-03-06 | Childrens Hospital Philadelphia | Variante aav e composições, métodos e usos para transferência genética em células, órgãos e tecidos |
| JP6985795B2 (ja) | 2013-09-26 | 2021-12-22 | ユニバーシティ オブ フロリダ リサーチ ファンデーション インコーポレーティッド | 標的遺伝子治療のための合成コンビナトリアルａａｖカプシドライブラリー |
| GB201403684D0 (en) * | 2014-03-03 | 2014-04-16 | King S College London | Vector |
| CA2941640A1 (en) * | 2014-03-04 | 2015-09-11 | University Of Florida Research Foundation, Inc. | Improved raav vectors and methods for transduction of photoreceptors and rpe cells |
| WO2015191508A1 (en) | 2014-06-09 | 2015-12-17 | Voyager Therapeutics, Inc. | Chimeric capsids |
| AU2015311708A1 (en) | 2014-09-07 | 2017-02-02 | Selecta Biosciences, Inc. | Methods and compositions for attenuating exon skipping anti-viral transfer vector immune responses |
| AU2015335923B2 (en) | 2014-10-21 | 2021-04-29 | University Of Massachusetts | Recombinant AAV variants and uses thereof |
| BR112017009497A2 (pt) | 2014-11-05 | 2018-02-06 | Voyager Therapeutics, Inc. | polinucleotídeos de aadc para o tratamento da doença de parkinson |
| GB201420139D0 (en) | 2014-11-12 | 2014-12-24 | Ucl Business Plc | Factor IX gene therapy |
| US10597660B2 (en) | 2014-11-14 | 2020-03-24 | Voyager Therapeutics, Inc. | Compositions and methods of treating amyotrophic lateral sclerosis (ALS) |
| ES2878451T3 (es) | 2014-11-14 | 2021-11-18 | Voyager Therapeutics Inc | Polinucleótidos moduladores |
| EP3230441A4 (en) | 2014-12-12 | 2018-10-03 | Voyager Therapeutics, Inc. | Compositions and methods for the production of scaav |
| US20180030096A1 (en) | 2015-02-03 | 2018-02-01 | University Of Florida Research Foundation, Inc. | Recombinant aav1, aav5, and aav6 capsid mutants and uses thereof |
| WO2016133917A1 (en) | 2015-02-16 | 2016-08-25 | University Of Florida Research Foundation | Raav vector compositions, methods for targeting vascular endothelial cells and use in treatment of type i diabetes |
| WO2016134337A1 (en) * | 2015-02-19 | 2016-08-25 | University Of Florida Research Foundation, Inc. | Site-specific integrating recombinant aav vectors for gene therapy and improved production methods |
| JP6519080B2 (ja) * | 2015-06-22 | 2019-05-29 | ライオン株式会社 | 繊維製品用抗ウイルス組成物 |
| AU2016282781A1 (en) | 2015-06-23 | 2018-01-18 | The Children's Hospital Of Philadelphia | Modified Factor IX, and compositions, methods and uses for gene transfer to cells, organs and tissues |
| CN108137655B (zh) | 2015-09-28 | 2022-04-22 | 北卡罗来纳-查佩尔山大学 | 逃避抗体的病毒载体的方法和组合物 |
| WO2017075119A1 (en) | 2015-10-28 | 2017-05-04 | The Trustees Of The Univeresity Of Pennsylvania | Intrathecal administration of adeno-associated-viral vectors for gene therapy |
| CA3006569A1 (en) | 2015-12-02 | 2017-06-08 | Voyager Therapeutics, Inc. | Assays for the detection of aav neutralizing antibodies |
| KR102598289B1 (ko) | 2016-04-16 | 2023-11-06 | 유니버시티 오브 플로리다 리서치 파운데이션, 인코포레이티드 | 바큘로바이러스 시스템-생산된 재조합 아데노-연관 바이러스의 생물학적 효력을 증진시키는 방법 |
| WO2017189964A2 (en) | 2016-04-29 | 2017-11-02 | Voyager Therapeutics, Inc. | Compositions for the treatment of disease |
| US11326182B2 (en) | 2016-04-29 | 2022-05-10 | Voyager Therapeutics, Inc. | Compositions for the treatment of disease |
| UA124343C2 (uk) | 2016-05-13 | 2021-09-01 | 4Д Молекьюлар Терапьютікс Інк. | Капсиди аденоасоційованого вірусу і спосіб його використання |
| KR20240056729A (ko) | 2016-05-18 | 2024-04-30 | 보이저 테라퓨틱스, 인크. | 조절성 폴리뉴클레오티드 |
| US11951121B2 (en) | 2016-05-18 | 2024-04-09 | Voyager Therapeutics, Inc. | Compositions and methods for treating Huntington's disease |
| EP3851449A1 (en) * | 2016-08-15 | 2021-07-21 | Genzyme Corporation | Methods for detecting aav |
| CA3035522A1 (en) | 2016-08-30 | 2018-03-08 | The Regents Of The University Of California | Methods for biomedical targeting and delivery and devices and systems for practicing the same |
| WO2018071831A1 (en) * | 2016-10-13 | 2018-04-19 | University Of Massachusetts | Aav capsid designs |
| CN110325203A (zh) | 2017-01-07 | 2019-10-11 | 西莱克塔生物科技公司 | 与合成纳米载体偶联的免疫抑制剂的模式化给药 |
| JP7081767B2 (ja) * | 2017-01-30 | 2022-06-07 | 学校法人日本医科大学 | アデノ随伴ウイルス（ａａｖ）キャプシドタンパク質の変異体 |
| AU2018224044B2 (en) | 2017-02-21 | 2024-01-25 | The Uab Research Foundation | Modified AAV capsid proteins and uses thereof |
| JOP20190200A1 (ar) | 2017-02-28 | 2019-08-27 | Univ Pennsylvania | تركيبات نافعة في معالجة ضمور العضل النخاعي |
| US10550405B2 (en) | 2017-03-15 | 2020-02-04 | The University Of North Carolina At Chapel Hill | Rational polyploid adeno-associated virus vectors and methods of making and using the same |
| CA3054711A1 (en) | 2017-03-15 | 2018-09-20 | The University Of North Carolina At Chapel Hill | Polyploid adeno-associated virus vectors and methods of making and using the same |
| MX2019011599A (es) | 2017-03-30 | 2019-12-19 | Univ Queensland | Moleculas quimericas y usos de las mismas. |
| CN111108198A (zh) | 2017-05-05 | 2020-05-05 | 沃雅戈治疗公司 | 治疗亨廷顿病的组合物和方法 |
| CA3061652A1 (en) | 2017-05-05 | 2018-11-08 | Voyager Therapeutics, Inc. | Compositions and methods of treating amyotrophic lateral sclerosis (als) |
| WO2018226887A1 (en) | 2017-06-07 | 2018-12-13 | Spark Therapeutics, Inc. | ENHANCING AGENTS FOR IMPROVED CELL TRANSFECTION AND/OR rAAV VECTOR PRODUCTION |
| JOP20190269A1 (ar) | 2017-06-15 | 2019-11-20 | Voyager Therapeutics Inc | بولي نوكليوتيدات aadc لعلاج مرض باركنسون |
| AU2018302016A1 (en) | 2017-07-17 | 2020-02-06 | The Regents Of The University Of California | Trajectory array guide system |
| US20210228738A1 (en) | 2017-07-17 | 2021-07-29 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Compositions and methods for increasing or enhancing transduction of gene therapy vectors and for removing or reducing immunoglobulins |
| US12076369B2 (en) | 2017-09-01 | 2024-09-03 | The Frances Crick Institute Limited | Immunoregulatory molecules and uses therefor |
| WO2019060454A2 (en) | 2017-09-20 | 2019-03-28 | 4D Molecular Therapeutics Inc. | CAPSID VARIANT ADENO-ASSOCIATED VIRUSES AND METHODS OF USE |
| BR112020007157A2 (pt) | 2017-10-13 | 2020-09-24 | Selecta Biosciences, Inc. | métodos e composições para a atenuação de respostas de igm antivetor de transferência viral |
| TWI804518B (zh) | 2017-10-16 | 2023-06-11 | 美商航海家醫療公司 | 肌萎縮性脊髓側索硬化症(als)之治療 |
| US20200237799A1 (en) | 2017-10-16 | 2020-07-30 | Voyager Therapeutics, Inc. | Treatment of amyotrophic lateral sclerosis (als) |
| CR20200282A (es) | 2017-11-27 | 2021-02-18 | 4D Molecular Therapeutics Inc | Cápsides variantes de virus adenoasociados y su uso para inhibir la angiogénesis |
| US11905533B2 (en) | 2017-12-19 | 2024-02-20 | The University Of North Carolina At Chapel Hill | Methods and compositions for delivery of viral vectors across the blood-brain barrier |
| US10610606B2 (en) | 2018-02-01 | 2020-04-07 | Homology Medicines, Inc. | Adeno-associated virus compositions for PAH gene transfer and methods of use thereof |
| US11306329B2 (en) | 2018-02-19 | 2022-04-19 | City Of Hope | Adeno-associated virus compositions for restoring F8 gene function and methods of use thereof |
| AU2019225251A1 (en) | 2018-02-26 | 2020-10-15 | AnTolRx, Inc. | Tolerogenic liposomes and methods of use thereof |
| US20200407750A1 (en) * | 2018-02-27 | 2020-12-31 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Novel adeno-associated virus (aav) vectors, aav vectors having reduced capsid deamidation and uses therefor |
| CN118373887A (zh) * | 2018-03-16 | 2024-07-23 | 国家儿童医院研究所 | 通过衣壳修饰增加组织特异性的基因递送 |
| JP7406677B2 (ja) | 2018-04-03 | 2023-12-28 | ギンコ バイオワークス インコーポレイテッド | 抗体を回避するウイルスベクター |
| WO2019195444A1 (en) | 2018-04-03 | 2019-10-10 | Stridebio, Inc. | Antibody-evading virus vectors |
| MX2020010465A (es) | 2018-04-03 | 2021-01-08 | Vectores de virus para direccionamiento a tejidos oftalmicos. | |
| CA3093347A1 (en) | 2018-04-05 | 2019-10-10 | Genethon | Hybrid recombinant adeno-associated virus serotype between aav9 and aavrh74 with reduced liver tropism |
| US20210363192A1 (en) * | 2018-04-27 | 2021-11-25 | Spark Therapeutics, Inc. | Engineered aav capsids with increased tropism and aav vectors comprising the engineered capsids and methods of making and using same |
| JP2021523718A (ja) * | 2018-05-16 | 2021-09-09 | スパーク セラピューティクス インコーポレイテッドＳｐａｒｋ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ， Ｉｎｃ． | コドン最適化された酸性α−グルコシダーゼ発現カセット及びそれを使用する方法 |
| CA3106640A1 (en) | 2018-07-16 | 2020-01-23 | Selecta Biosciences, Inc. | Methods and compositions of mma constructs and vectors |
| EP3823980A1 (en) | 2018-07-16 | 2021-05-26 | Selecta Biosciences, Inc. | Methods and compositions of otc constructs and vectors |
| US11702673B2 (en) | 2018-10-18 | 2023-07-18 | University Of Florida Research Foundation, Incorporated | Methods of enhancing biological potency of baculovirus system-produced recombinant adeno-associated virus |
| US20220154211A1 (en) | 2019-02-25 | 2022-05-19 | Novartis Ag | Compositions and methods to treat bietti crystalline dystrophy |
| US20220154210A1 (en) | 2019-02-25 | 2022-05-19 | Novartis Ag | Compositions and methods to treat bietti crystalline dystrophy |
| MX2021011468A (es) | 2019-03-21 | 2021-12-15 | Vectores de virus adenoasociados recombinantes. | |
| MX2021013163A (es) | 2019-04-28 | 2022-02-21 | Selecta Biosciences Inc | Métodos para el tratamiento de sujetos con inmunidad preexistente a vectores de transferencia viral. |
| BR112021023594A2 (pt) | 2019-05-28 | 2022-02-08 | Selecta Biosciences Inc | Métodos e composições para resposta imune de vetor de transferência antiviral atenuada |
| RU2751592C2 (ru) | 2019-08-22 | 2021-07-15 | Общество С Ограниченной Ответственностью "Анабион" | Выделенный модифицированный белок VP1 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5), капсид и вектор на его основе |
| JP2022550435A (ja) | 2019-10-04 | 2022-12-01 | ウルトラジェニックス ファーマシューティカル インコーポレイテッド | 組換えａａｖの改善された治療的使用のための方法 |
| AU2020367532A1 (en) | 2019-10-17 | 2022-05-12 | Ginkgo Bioworks, Inc. | Adeno-associated viral vectors for treatment of Niemann-Pick disease type C |
| CN114902051A (zh) | 2020-01-03 | 2022-08-12 | 萨勒普塔医疗公司 | 用于分析aav衣壳蛋白的方法 |
| TW202140791A (zh) | 2020-01-13 | 2021-11-01 | 美商霍蒙拉奇醫藥公司 | 治療苯酮尿症之方法 |
| WO2023172491A1 (en) | 2022-03-07 | 2023-09-14 | Ultragenyx Pharmaceutical Inc. | Modified batch aav production systems and methods |
| EP4103724A1 (en) | 2020-02-14 | 2022-12-21 | Ultragenyx Pharmaceutical Inc. | Gene therapy for treating cdkl5 deficiency disorder |
| US20230235353A1 (en) | 2020-03-19 | 2023-07-27 | Ultragenyx Pharmaceutical Inc. | Compositions and methods for reducing reverse packaging of cap and rep sequences in recombinant aav |
| EP4127189A1 (en) | 2020-03-31 | 2023-02-08 | Ultragenyx Pharmaceutical Inc. | Gene therapy for treating propionic acidemia |
| TW202208632A (zh) | 2020-05-27 | 2022-03-01 | 美商同源醫藥公司 | 用於恢復ｐａｈ基因功能的腺相關病毒組成物及其使用方法 |
| MX2023002016A (es) | 2020-08-19 | 2023-06-26 | Sarepta Therapeutics Inc | Vectores de virus adenoasociados para el tratamiento del sindrome de rett. |
| JP2023546113A (ja) | 2020-10-15 | 2023-11-01 | エフ． ホフマン－ラ ロシュ アーゲー | 同時遺伝子活性化のための核酸構築物 |
| KR20230085929A (ko) | 2020-10-15 | 2023-06-14 | 에프. 호프만-라 로슈 아게 | Va rna 전사를 위한 핵산 구조체 |
| EP4274571A1 (en) | 2021-01-05 | 2023-11-15 | Selecta Biosciences, Inc. | Viral vector dosing protocols |
| BR112023021495A2 (pt) * | 2021-04-23 | 2023-12-19 | Univ Florida | Vetores aavrh74 para terapia gênica de distrofias musculares |
| JP2024531138A (ja) | 2021-08-11 | 2024-08-29 | ウルトラジェニックス ファーマシューティカル インコーポレイテッド | 筋ジストロフィーを処置するための組成物および方法 |
| AR126840A1 (es) | 2021-08-20 | 2023-11-22 | Llc «Anabion» | Proteína de la cápside vp1 modificada aislada del virus adeno-asociado de serotipo 5 (aav5), cápside y vector basado en esta |
| CR20240137A (es) | 2021-08-20 | 2024-07-29 | Biocad Joint Stock Co | Método para obtener una cápside de virus adenoasociado modificada |
| AR126839A1 (es) | 2021-08-20 | 2023-11-22 | Llc «Anabion» | Proteína de la cápside vp1 modificada aislada del virus adeno-asociado de serotipo 9 (aav9), cápside y vector basado en esta |
| WO2023044306A1 (en) * | 2021-09-14 | 2023-03-23 | California Institute Of Technology | Aav capsid variants |
| US20230141563A1 (en) | 2021-10-12 | 2023-05-11 | Selecta Biosciences, Inc. | Methods and compositions for attenuating anti-viral transfer vector igm responses |
| US20230140196A1 (en) | 2021-10-12 | 2023-05-04 | Selecta Biosciences, Inc. | Viral vector dosing protocols |
| WO2023086615A1 (en) | 2021-11-14 | 2023-05-19 | Selecta Biosciences, Inc. | Multiple dosing with viral vectors |
| CN116554278A (zh) * | 2022-01-30 | 2023-08-08 | 上海玮美基因科技有限责任公司 | 变异型腺相关病毒及其在疾病治疗中的应用 |
| US20230357437A1 (en) | 2022-03-09 | 2023-11-09 | Selecta Biosciences, Inc. | Immunosuppressants in combination with anti-igm agents and related dosing |
| WO2023198685A1 (en) | 2022-04-13 | 2023-10-19 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Method for determining aav genomes |
| WO2023220287A1 (en) * | 2022-05-11 | 2023-11-16 | The Children's Hospital Of Philadelphia | Adeno-associated viral vectors for targeting deep brain structures |
| WO2023227438A1 (en) | 2022-05-23 | 2023-11-30 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Raman-based method for the differentiation of aav particle serotype and aav particle loading status |
| AR129500A1 (es) | 2022-06-03 | 2024-09-04 | Hoffmann La Roche | Método para producir partículas de aav recombinante |
| WO2024013239A1 (en) | 2022-07-14 | 2024-01-18 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Method for producing recombinant aav particles |
| WO2024036324A1 (en) | 2022-08-11 | 2024-02-15 | Selecta Biosciences, Inc. | Compositions and methods related to immunoglobulin proteases and fusions thereof |
| TW202416993A (zh) | 2022-08-15 | 2024-05-01 | 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 | 預防或減輕與重組病毒載體相關的不良反應 |
| WO2024056561A1 (en) | 2022-09-12 | 2024-03-21 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Method for separating full and empty aav particles |
| WO2024165456A1 (en) | 2023-02-07 | 2024-08-15 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Method for the detection of anti-aav particle antibodies |
| WO2024194280A1 (en) | 2023-03-21 | 2024-09-26 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Method for the production of recombinant aav particle preparations |
Family Cites Families (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA1202962A (en) | 1982-10-19 | 1986-04-08 | David P. Clifford | Substituted n-phenyl-n'-benzoyl ureas and their use as insecticides and acaricides |
| US4501729A (en) | 1982-12-13 | 1985-02-26 | Research Corporation | Aerosolized amiloride treatment of retained pulmonary secretions |
| US4683195A (en) | 1986-01-30 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences |
| US4965188A (en) | 1986-08-22 | 1990-10-23 | Cetus Corporation | Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences using a thermostable enzyme |
| US6127525A (en) | 1995-02-21 | 2000-10-03 | Cornell Research Foundation, Inc. | Chimeric adenoviral coat protein and methods of using same |
| AU722624B2 (en) | 1996-09-06 | 2000-08-10 | Trustees Of The University Of Pennsylvania, The | An inducible method for production of recombinant adeno-associated viruses utilizing T7 polymerase |
| EP1486567A1 (en) | 2003-06-11 | 2004-12-15 | Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung des öffentlichen Rechts | Improved adeno-associated virus (AAV) vector for gene therapy |
| JP4888876B2 (ja) * | 2003-06-13 | 2012-02-29 | 田平 武 | アルツハイマー病の治療のための組換えアデノ随伴ウィルスベクター |
| DK2359867T3 (en) | 2005-04-07 | 2015-01-05 | Univ Pennsylvania | A method for increasing an AAV vector function |
| CN101528916B (zh) | 2006-04-28 | 2013-09-04 | 宾夕法尼亚大学托管会 | 规模可调的aav生产方法 |
| KR20130040844A (ko) | 2010-03-29 | 2013-04-24 | 더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실바니아 | 약학적으로 유발된 전이유전자 제거 시스템 |
| US9434928B2 (en) | 2011-11-23 | 2016-09-06 | Nationwide Children's Hospital, Inc. | Recombinant adeno-associated virus delivery of alpha-sarcoglycan polynucleotides |
| SI2839014T1 (sl) | 2012-04-18 | 2021-05-31 | The Children's Hospital Of Philadelphia | Sestavek in postopki za zelo učinkovit prenos genov z uporabo variant kapside AAV-JA |
-
2013
- 2013-04-18 SI SI201331862T patent/SI2839014T1/sl unknown
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Legal Events
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| FG | Grant or registration |