JP2021523718A - コドン最適化された酸性α−グルコシダーゼ発現カセット及びそれを使用する方法 - Google Patents

コドン最適化された酸性α−グルコシダーゼ発現カセット及びそれを使用する方法 Download PDF

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Abstract

本発明は、酸性α−グルコシダーゼ（ＧＡＡ）をコードする核酸を提供する。ある実施形態では、核酸は、配列番号１〜５に示される配列のいずれかからなる群から選択される配列と約８６％を超える配列同一性を有する。ある実施形態では、酸性α−グルコシダーゼ（ＧＡＡ）をコードする核酸は、１２７個未満のＣｐＧジヌクレオチドを含有する。発現カセット、ベクター、細胞及び細胞株、並びに酸性α−グルコシダーゼ（ＧＡＡ）をコードするこのような核酸を使用する方法もまた提供される。【選択図】 図１８

Description

関連出願
[0001]本出願は、２０１８年５月１６日に出願された米国特許仮出願第６２／６７２，４１９号、及び２０１８年９月２１日に出願された米国特許仮出願第６２／７３４，４５４号の優先権を主張する。全てのテキスト、表、配列リスト及び図面を含む上述の出願の全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
[0002]グリコーゲン蓄積症タイプＩＩは、ポンペ病とも呼ばれ、グリコーゲンの分解を触媒するリソソーム酵素である酸性α−グルコシダーゼ（ＧＡＡ）をコードする遺伝子の突然変異に起因した常染色体劣性疾患である。結果として生じる酵素欠乏は、身体の全組織におけるグリコーゲン及びリソソーム改変の病的蓄積をもたらし、その結果、心筋、呼吸筋、及び骨格筋の機能不全をもたらす（ｖａｎ ｄｅｒ Ｐｌｏｅｇ ＆ Ｒｅｕｓｅｒ、２００８年、Ｌａｎｃｅｔ、３７２巻：１３４２〜１３５３頁）。伝統的に、ポンペ病は、残存ＧＡＡ酵素活性、発症年齢、臓器病変（すなわち、心筋症の存在）、重症度、及び進行速度に基づいて、乳児発症型ポンペ病（ＩＯＰＤ）（乳児ポンペ病（ＩＰＤ）又は早期発症型ポンペ病とも呼ばれる）と遅発型ポンペ病（ＬＯＰＤ）の２つの主要な表現型に分けられている。酵素補充療法（ＥＲＴ）はポンペ病に対して利用可能であるが、治療失敗及び限られた長期有効性をもたらすいくつかの限界（すなわち、限定された生体内分布及び高い免疫原性）を有する（ｖａｎ ｄｅｒ Ｐｌｏｅｇ ＆ Ｒｅｕｓｅｒ、２００８年）。
[0003]本明細書では、ヒトＧＡＡの分泌可能なバージョンの肝臓に指向された発現のために最適化されたカセットが提供される。これらのカセットの最適化は、肝臓からのＧＡＡ分泌の増加をもたらし、肝臓への遺伝子導入が、対象において全身的にＧＡＡ欠乏を交差修正するのに十分なＧＡＡの循環レベルを達成することを可能にする。これらのカセットは、導入遺伝子の発現を増加させ、安全特性を改善し、免疫原性を潜在的に低下させる。これらのカセットは、ポンペ病、並びにＧＡＡで治療可能な他の疾患及び障害を有する対象の遺伝子療法治療として有用である。
[0004]ＧＡＡ発現カセットのコドン最適化を行い、ＧＡＡの発現を改善した。一実施形態では、ＧＡＡをコードする核酸配列を修飾して、ＣｐＧジヌクレオチドを除去した。合計して２０個の新しいコドン最適化された導入遺伝子配列（ＧＡＡ１〜ＧＡＡ２０）を作製した。ＧＡＡ活性のインビトロ比較に基づいて、さらなる最適化のために、５つのコドン最適化配列（ＧＡＡ２、５、７、８及び１３）を選択した。ＧＡＡ１３配列を用いて、５’非翻訳領域（ＵＴＲ）に２９塩基対のポリヌクレオチド配列を付加した後のＧＡＡ発現の差異を分析した。ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ又はＢＧＨ）（野生型及び減少したＣｐＧ）に由来する２つの異なるポリアデニル化配列もまた、ＧＡＡ７、８及び１３について評価された。結果として生じる９個の発現カセット（表１）を、配列番号３０〜３２のカプシド内にパッケージし；１つをＡＡＶ６カプシド内にパッケージした。
[0005]本発明によれば、酸性α−グルコシダーゼ（ＧＡＡ）をコードする核酸、酸性α−グルコシダーゼ（ＧＡＡ）をコードする核酸を含む発現カセット、及び酸性α−グルコシダーゼ（ＧＡＡ）をコードする核酸を含むウイルスベクターが提供される。
[0006]一実施形態では、ＧＡＡをコードする核酸は、配列番号１〜５に示される配列のいずれかと８６％を超える配列同一性を有する。さらなる態様では、ＧＡＡをコードする核酸は、配列番号１〜５に示される配列のいずれかと８７％を超える配列同一性を有する。
[0007]別の実施形態では、ＧＡＡをコードする核酸は、配列番号６〜１５に示される配列のいずれかと８７％を超える配列同一性を有する。特定の態様では、ＧＡＡをコードする核酸は、配列番号６〜１５に示される配列のいずれかと８８％を超える配列同一性を有する。さらなる特定の態様では、ＧＡＡをコードする核酸は、配列番号６〜１５に示される配列のいずれかと８９％を超える配列同一性を有する。さらなる特定の態様では、ＧＡＡをコードする核酸は、配列番号６〜１５に示される配列のいずれかと９０％を超える配列同一性を有する。なおさらなる特定の態様では、ＧＡＡをコードする核酸は、配列番号６〜１５に示される配列のいずれかと９１％を超える配列同一性を有する。
[0008]別の実施形態では、ＧＡＡをコードする核酸は、配列番号１６〜２４に示される配列のいずれかと９１％を超える配列同一性を有する。
[0009]別の実施形態では、ＧＡＡをコードする核酸は、配列番号１〜２４に示される配列のいずれかと９２％を超える配列同一性を有する。
[0010]別の実施形態では、ＧＡＡをコードする核酸は、配列番号１〜２４に示される配列のいずれかと９３％を超える配列同一性を有する。
[0011]別の実施形態では、ＧＡＡをコードする核酸は、配列番号１〜２４に示される配列のいずれかと９４％を超える配列同一性を有する。
[0012]別の実施形態では、ＧＡＡをコードする核酸は、配列番号１〜２４に示される配列のいずれかと９５％を超える配列同一性を有する。
[0013]別の実施形態では、ＧＡＡをコードする核酸は、配列番号１〜２４に示される配列のいずれかと９６％を超える配列同一性を有する。
[0014]別の実施形態では、ＧＡＡをコードする核酸は、配列番号１〜２４に示される配列のいずれかと９７％を超える配列同一性を有する。
[0015]別の実施形態では、ＧＡＡをコードする核酸は、配列番号１〜２４に示される配列のいずれかと９８％を超える配列同一性を有する。
[0016]別の実施形態では、ＧＡＡをコードする核酸は、配列番号１〜２４に示される配列のいずれかと９９％を超える配列同一性を有する。
[0017]別の実施形態では、ＧＡＡをコードする核酸は、配列番号１〜２４に示される配列のいずれかと９９．５％を超える配列同一性を有する。
[0018]別の実施形態では、ＧＡＡをコードする核酸は、配列番号１〜２４に示される配列のいずれかと１００％の配列同一性を有する。
[0019]別の実施形態では、ＧＡＡをコードする核酸は、１２７個未満のＣｐＧジヌクレオチドを含有する。
[0020]別の実施形態では、ＧＡＡをコードする核酸は、１２６個未満のＣｐＧジヌクレオチドを含有する。
[0021]別の実施形態では、ＧＡＡをコードする核酸は、約１２６〜１２０個のＣｐＧジヌクレオチドを含有する。
[0022]別の実施形態では、ＧＡＡをコードする核酸は、約１２０〜１１０個のＣｐＧジヌクレオチドを含有する。
[0023]別の実施形態では、ＧＡＡをコードする核酸は、約１１０〜１００個のＣｐＧジヌクレオチドを含有する。
[0024]別の実施形態では、ＧＡＡをコードする核酸は、約１００〜９０個のＣｐＧジヌクレオチドを含有する。
[0025]別の実施形態では、ＧＡＡをコードする核酸は、約９０〜８０個のＣｐＧジヌクレオチドを含有する。
[0026]別の実施形態では、ＧＡＡをコードする核酸は、約８０〜７０個のＣｐＧジヌクレオチドを含有する。
[0027]別の実施形態では、ＧＡＡをコードする核酸は、約７０〜６０個のＣｐＧジヌクレオチドを含有する。
[0028]別の実施形態では、ＧＡＡをコードする核酸は、約６０〜５０個のＣｐＧジヌクレオチドを含有する。
[0029]別の実施形態では、ＧＡＡをコードする核酸は、約５０〜４０個のＣｐＧジヌクレオチドを含有する。
[0030]別の実施形態では、ＧＡＡをコードする核酸は、約４０〜３０個のＣｐＧジヌクレオチドを含有する。
[0031]別の実施形態では、ＧＡＡをコードする核酸は、約３０〜２０個のＣｐＧジヌクレオチドを含有する。
[0032]別の実施形態では、ＧＡＡをコードする核酸は、２０個未満のＣｐＧジヌクレオチドを含有する。
[0033]別の実施形態では、ＧＡＡをコードする核酸は、約２０〜１０個のＣｐＧジヌクレオチドを含有する。
[0034]別の実施形態では、ＧＡＡをコードする核酸は、１０個未満のＣｐＧジヌクレオチドを含有する。
[0035]別の実施形態では、ＧＡＡをコードする核酸は、約１０〜５個のＣｐＧジヌクレオチドを含有する。
[0036]別の実施形態では、ＧＡＡをコードする核酸は、５個のＣｐＧジヌクレオチドを含有する。
[0037]別の実施形態では、ＧＡＡをコードする核酸は、４個のＣｐＧジヌクレオチドを含有する。
[0038]別の実施形態では、ＧＡＡをコードする核酸は、３個のＣｐＧジヌクレオチドを含有する。
[0039]別の実施形態では、ＧＡＡをコードする核酸は、２個のＣｐＧジヌクレオチドを含有する。
[0040]別の実施形態では、ＧＡＡをコードする核酸は、１個のＣｐＧジヌクレオチドを含有する。
[0041]別の実施形態では、ＧＡＡをコードする核酸は、０個のＣｐＧジヌクレオチドを含有する。
[0042]本発明はまた、発現制御エレメントに作動可能に連結された、本明細書に記載されるＧＡＡをコードする核酸を含む発現カセットを提供する。
[0043]一実施形態では、発現カセットは、配列番号１〜５に示される配列のいずれかと８６％を超える配列同一性（例えば、８７％〜１００％同一性）を有するＧＡＡをコードする核酸を含む。
[0044]別の実施形態では、発現カセットは、配列番号６〜１５に示される配列のいずれかと８７％を超える配列同一性（例えば、８８％〜１００％同一性）を有するＧＡＡをコードする核酸を含む。
[0045]別の実施形態では、発現カセットは、１２７個未満のＣｐＧジヌクレオチド、１２７個未満のＣｐＧジヌクレオチド、１２７個未満のＣｐＧジヌクレオチド、１２６個未満のＣｐＧジヌクレオチド、１２５個未満のＣｐＧジヌクレオチド、１２４個未満のＣｐＧジヌクレオチド、１２３個未満のＣｐＧジヌクレオチド、１２２個未満のＣｐＧジヌクレオチド、１２１個未満のＣｐＧジヌクレオチド、１２０個未満のＣｐＧジヌクレオチド、１１９個未満のＣｐＧジヌクレオチド、１１８個未満のＣｐＧジヌクレオチド、１１７個未満のＣｐＧジヌクレオチド、１１６個未満のＣｐＧジヌクレオチド、１１５個未満のＣｐＧジヌクレオチド、１１４個未満のＣｐＧジヌクレオチド、１１３個未満のＣｐＧジヌクレオチド、１１２個未満のＣｐＧジヌクレオチド、１１１個未満のＣｐＧジヌクレオチド、１１０個未満のＣｐＧジヌクレオチド、１０９個未満のＣｐＧジヌクレオチド、１０８個未満のＣｐＧジヌクレオチド、１０７個未満のＣｐＧジヌクレオチド、１０６個未満のＣｐＧジヌクレオチド、１０５個未満のＣｐＧジヌクレオチド、１０４個未満のＣｐＧジヌクレオチド、１０３個未満のＣｐＧジヌクレオチド、１０２個未満のＣｐＧジヌクレオチド、１０１個未満のＣｐＧジヌクレオチド、１０１個未満のＣｐＧジヌクレオチドに引き続きゼロまでのあらゆる個数のＣｐＧジヌクレオチドを含む、ＧＡＡをコードする核酸を含む。
[0046]一実施形態では、発現制御エレメントは、ＧＡＡをコードする核酸の５’側に位置される。
[0047]別の実施形態では、発現カセットは、ＧＡＡをコードする核酸の３’側に位置するポリアデニル化（ポリＡ）配列を含む。
[0048]別の実施形態では、発現制御エレメント又はポリアデニル化配列は、野生型発現制御エレメント又はポリアデニル化配列と比較してＣｐＧが減少している。
[0049]別の実施形態では、発現制御エレメントは、ＡｐｏＥ／ｈＡＡＴエンハンサー／プロモーター配列を含む。
[0050]別の実施形態では、ポリアデニル化配列は、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）ポリアデニル化配列を含む。
[0051]別の実施形態では、ＡｐｏＥ／ｈＡＡＴエンハンサー／プロモーター配列又はｂＧＨポリアデニル化配列は、野生型ＡｐｏＥ／ｈＡＡＴエンハンサー／プロモーター配列又はｂＧＨポリアデニル化配列と比較してＣｐＧが減少している。
[0052]一態様では、野生型ｂＧＨポリアデニル化配列は、配列番号２７の配列を含む。
[0053]別の態様では、野生型ＡｐｏＥ／ｈＡＡＴエンハンサー／プロモーター配列は、配列番号２８又は２９の配列を含む。
[0054]別の態様では、ＣｐＧが減少したｂＧＨポリアデニル化配列は、配列番号２６の配列を含む。
[0055]別の実施形態では、発現カセットは、発現制御エレメントの３’末端とＧＡＡをコードする核酸の５’末端との間に位置するイントロンをさらに含む。
[0056]別の実施形態では、ＧＡＡは、配列番号２５に示される配列を含むか又はそれからなる。
[0057]本発明は、本明細書に記載されるＧＡＡをコードする核酸を含むアデノウイルス関連ウイルス（ＡＡＶ）ベクターなどのウイルスベクターをさらに提供する。
[0058]一実施形態では、アデノウイルス関連ウイルス（ＡＡＶ）ベクターなどのウイルスベクターは、発現制御エレメントに作動可能に連結された本明細書に記載されるＧＡＡをコードする核酸のいずれかを含む。
[0059]別の実施形態では、アデノウイルス関連ウイルス（ＡＡＶ）ベクターなどのウイルスベクターは、本明細書に記載されるＧＡＡをコードする核酸を含む発現カセットのいずれかを含む。
[0060]別の実施形態では、ＡＡＶベクターは、１つ又は複数のＡＡＶカプシド；及び１つ又は複数のＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）を含み、ＡＡＶ ＩＴＲ（複数可）は、核酸又は発現カセットの５’末端若しくは３’末端に隣接する。
[0061]さらなる実施形態では、ＡＡＶベクターは、１つ又は複数のＩＴＲの５’又は３’に位置するイントロンをさらに含む。
[0062]さらなる実施形態では、少なくとも１つ又は複数のＩＴＲ又はイントロンを含むＡＡＶベクターは、ＣｐＧが減少するように修飾された１つ又は複数のＩＴＲ又はイントロンを有する。
[0063]さらなる実施形態では、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、Ｒｈ１０、Ｒｈ７４、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ−２ｉ８、又は配列番号３０、３１若しくは３２のＶＰ１、ＶＰ２及び／若しくはＶＰ３配列と９０％以上の配列同一性を有する修飾された又はバリアントＡＡＶ ＶＰ１、ＶＰ２及び／若しくはＶＰ３カプシドを含むカプシド血清型；或いはＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、Ｒｈ１０、Ｒｈ７４、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ−２ｉ８、又は配列番号３０、３１若しくは３２のＶＰ１、ＶＰ２及び／若しくはＶＰ３配列と９５％以上の配列同一性を有するカプシド；或いはＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、Ｒｈ１０、Ｒｈ７４、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ−２ｉ８、又は配列番号３０、３１若しくは３２のＶＰ１、ＶＰ２及び／若しくはＶＰ３配列と１００％の配列同一性を有するカプシドを有する。
[0064]さらなる実施形態では、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、Ｒｈ１０、Ｒｈ７４、若しくはＡＡＶ３Ｂ ＡＡＶ血清型のいずれか、又はそれらの組合せのうちの１つ又は複数のＩＴＲとして、１つ又は複数のＩＴＲを含むＡＡＶベクター。
[0065]本発明は、さらに、本明細書に記載されるＧＡＡをコードする核酸、ＧＡＡをコードする核酸を含む発現カセット、又はＧＡＡをコードする核酸若しくはＧＡＡをコードする核酸を含む発現カセットを含むＡＡＶベクターなどのウイルスベクターのいずれかを含む医薬組成物を提供する。
[0066]一実施形態では、医薬組成物は、生物学的に適合性のある担体又は賦形剤中に、本明細書に記載される複数のＡＡＶベクターを含む。
[0067]別の実施形態では、本明細書に記載されるＡＡＶベクターのいずれかを含む医薬組成物は、空ＡＡＶカプシドをさらに含む。
[0068]特定の実施形態では、ＡＡＶベクター及び空ＡＡＶカプシドを含む医薬組成物において、空ＡＡＶカプシド対ＡＡＶベクターの比は、約１００：１〜５０：１、約５０：１〜２５：１、約２５：１〜１０：１、約１０：１〜１：１、約１：１〜１：１０、約１：１０〜１：２５、約１：２５〜１：５０、又は約１：５０〜１：１００の範囲内又はその間である。
[0069]特定の態様では、ＡＡＶベクター及び空ＡＡＶカプシドを含む医薬組成物において、空ＡＡＶカプシド対ＡＡＶベクターの比は、約２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、又は１０：１である。
[0070]別の実施形態では、医薬組成物は界面活性剤を含む。
[0071]本発明は、なおさらに、酸性α−グルコシダーゼ（ＧＡＡ）をコードする核酸、ＧＡＡをコードする核酸を含む発現カセット、又はＧＡＡをコードする核酸若しくはＧＡＡをコードする核酸を含む発現カセットを含むＡＡＶベクターなどのウイルスベクターのいずれかをヒトに投与又は送達することによって、ＧＡＡを必要とするヒトを治療する方法を提供する。
[0072]一実施形態では、酸性α−グルコシダーゼ（ＧＡＡ）を必要とするヒトを治療する方法は、（ａ）本明細書に記載されるＡＡＶベクターなどの核酸、発現カセット若しくはウイルスベクター、又は本明細書に記載される任意の医薬組成物を提供すること；及び（ｂ）ヒトにおいてＧＡＡが発現された場合、再度、ヒトに核酸、発現カセット、ウイルス（例えば、ＡＡＶ）ベクター、又は医薬組成物の一定量を投与することを含む。
[0073]特定の実施形態では、ヒトは、乳児発症型ポンペ病又は遅発型ポンペ病などのポンペ病を有する。
[0074]別の実施形態では、ヒトは、グリコーゲン蓄積症（ＧＳＤ）を有する。
[0075]特定の態様では、ＧＳＤは、ＧＳＤタイプＩ（フォン・ギールケ病）、ＧＳＤタイプＩＩＩ（フォーブス・コリ病）、ＧＳＤタイプＩＶ（アンダーソン病、アミロペクチン症）、ＧＳＤタイプＶ（マッカードル病）、ＧＳＤタイプＶＩ（ハース病）、ＧＳＤタイプＶＩＩ（垂井病）、又は心臓の先天性ＧＳＤ（例えば、心臓の致死的な先天性ＧＳＤ）のいずれかである。
[0076]特定の実施形態では、ＧＡＡをコードする核酸、ＧＡＡをコードする核酸を含む発現カセット、又はＡＡＶベクターは、ヒトの静脈内、動脈内、腔内（intra-cavity）、腔内（intracavitary）、粘膜内、又はカテーテルを介して投与される。
[0077]特定の実施形態では、方法において、ＧＡＡは、増加したレベルで、任意選択で、ＧＡＡを必要としないヒトにおいて見出されるＧＡＡのレベルの１％を超えて発現される。
[0078]特定の実施形態では、ＡＡＶベクターは、ヒトの体重１ｋｇあたり約１×１０８〜約１×１０１４ベクターゲノム（ｖｇ／ｋｇ）の範囲で投与される。
[0079]特定の実施形態では、方法は、ＧＡＡの必要性又は疾患の１つ又は複数の症状を、低下させる、減少させる、又は抑制するか；又はＧＡＡの必要性又は疾患の１つ又は複数の症状の進行又は悪化を、予防又は低減するか；又はＧＡＡの必要性又は疾患の１つ又は複数の症状を、安定化するか；又はＧＡＡの必要性又は疾患の１つ又は複数の症状を、改善する。
[0080]特定の態様では、本発明に従って治療可能な症状は、以下：摂食困難及び／又は体重増加欠如；頭部及び／又は頸部の制御不良；呼吸障害及び／又は肺感染症；心臓の肥大及び／又は肥厚；心臓欠陥；舌肥大；嚥下困難；肝臓肥大；筋力不足；弱筋緊張；脚、腰及び／又は腕の脱力；息切れ；運動困難；睡眠中の呼吸困難；脊椎の湾曲；及び／又は硬い関節のうちの１つ又は複数であり得る。
[0081]本発明はなおさらに、ＧＡＡをコードする核酸を含む細胞、ＧＡＡをコードする核酸を含む発現カセットを含む細胞、及びＧＡＡをコードする核酸又はＧＡＡをコードする核酸を含む発現カセットを含むＡＡＶベクターなどのウイルスベクターを含む細胞を提供する。
[0082]一実施形態では、細胞は、ウイルスベクターを生成する。
[0083]別の実施形態では、細胞は、本明細書に記載されるＡＡＶベクターを生成する。
[0084]なおさらに、本発明はまた、本明細書に記載されるＡＡＶベクターなどのウイルスベクターを生成する方法を提供する。
[0085]一実施形態では、ＡＡＶベクターを生成する方法は、パッケージングヘルパー細胞に、本明細書に記載されるＧＡＡをコードする核酸又はＧＡＡをコードする核酸を含む発現カセットを含むＡＡＶベクターゲノムを導入すること；及びＡＡＶベクターを生成するための条件下でヘルパー細胞を培養することを含む。
[0086]別の実施形態では、ＡＡＶベクターエラーを生成する方法は、パッケージングヘルパー細胞に、本明細書に記載されるＧＡＡをコードする核酸又はＧＡＡをコードする核酸を含む発現カセットを導入すること；及びＡＡＶベクターを生成するための条件下でヘルパー細胞を培養することを含む。
[0087]さらなる実施形態では、細胞は、哺乳動物細胞である。
[0088]さらなる実施形態では、ベクター生成のための細胞は、ベクターをウイルス粒子にパッケージするＡＡＶヘルパー機能などのヘルパー機能を提供する。特定の態様では、ヘルパー機能は、ＡＡＶベクターパッケージングのためのＲｅｐ及び／又はＣａｐタンパク質である。
[0089]さらなる実施形態では、ベクター生成のための細胞は、Ｒｅｐ及び／又はＣａｐタンパク質配列（複数可）をコードするポリヌクレオチド（複数可）で安定に又は一時的にトランスフェクトされ得る。
[0090]さらなる実施形態では、ベクター生成のための細胞は、Ｒｅｐ７８及び／又はＲｅｐ６８タンパク質を提供する。このような細胞において、細胞は、配列（複数可）をコードするＲｅｐ７８及び／又はＲｅｐ６８タンパク質で安定に又は一時的にトランスフェクトされ得る。
[0091]特定の実施形態では、ベクター生成のための細胞は、ヒト胚性腎細胞である。特定の態様では、ベクター生成のための細胞は、ＨＥＫ−２９３細胞である。
ｐＡＡＶ−ＡｐｏＥ／ｈＡＡＴ．ｆｉｘＵＴＲ．ＧＡＡ１３．ＢＧＨ（配列番号１６）の概略図である。 ｐＡＡＶ−ＡｐｏＥ／ｈＡＡＴ．ＧＡＡ１３．ＢＧＨ（配列番号１７）の概略図である。 ｐＡＡＶ−ＡｐｏＥ／ｈＡＡＴ．ＧＡＡ７．ＢＧＨ（配列番号１８）の概略図である。 ｐＡＡＶ−ＡｐｏＥ／ｈＡＡＴ．ＧＡＡ８．ＢＧＨ（配列番号１９）の概略図である。 ｐＡＡＶ−ＡｐｏＥ／ｈＡＡＴ．ＧＡＡ２．ｗｔＢＧＨ（配列番号２０）の概略図である。 ｐＡＡＶ−ＡｐｏＥ／ｈＡＡＴ．ＧＡＡ５．ｗｔＢＧＨ（配列番号２１）の概略図である。 ｐＡＡＶ−ＡｐｏＥ／ｈＡＡＴ．ＧＡＡ７．ｗｔＢＧＨ（配列番号２２）の概略図である。 ｐＡＡＶ−ＡｐｏＥ／ｈＡＡＴ．ＧＡＡ８．ｗｔＢＧＨ（配列番号２３）の概略図である。 ｐＡＡＶ−ＡｐｏＥ／ｈＡＡＴ．ＧＡＡ１３．ｗｔＢＧＨ（配列番号２４）の概略図である。 ＧＡＡ活性アッセイによるＨｕｈ７細胞上清中のＧＡＡ活性レベルの評価を示す図である。 ＧＡＡ活性アッセイによるマウス血漿中のＧＡＡ活性レベルの評価を示す図である。 ＧＡＡウエスタンブロットによるマウス血漿中のＧＡＡレベルの評価を示す図である。 ＧＡＡ活性アッセイによるマウス血漿中のＧＡＡ活性レベルの評価を示す図である。 ＧＡＡウエスタンブロットによるマウス血漿中のＧＡＡレベルの評価を示す図である。 ＧＡＡ活性アッセイによるマウス血漿中のＧＡＡ活性レベルの評価を示す図である。 ＧＡＡ活性アッセイによるラット及びマウス血漿中のＧＡＡ活性レベルの評価を示す図である。 ＧＡＡ活性アッセイによる非ヒト霊長類（雄アカゲザル）の血漿中のＧＡＡ活性レベルの評価を示す図である。 ＧＡＡ活性アッセイによる非ヒト霊長類（アフリカミドリザル）の血漿中のＧＡＡ活性レベルの評価を示す図である。Ｘ軸は、注入後の日数である。 非ヒト霊長類（アフリカミドリザル）の血漿中のＧＡＡレベルをウエスタンブロット法で評価した図であり、特定のデータをグラフ化したものである。 ＳＰＫ−ＡＡＶ−０１、ＳＰＫ−ＡＡＶ−０２又は陰性対照（ＡＡＶ配列番号３０〜３２ベクターにパッケージされた非ＧＡＡ導入遺伝子を有するｒＡＡＶ）で形質導入されたＨｕｈ７細胞の上清中のＧＡＡ活性の評価を示す図である。 ＳＰＫ−ＡＡＶ−０２を２×１０１２、６×１０１２、２×１０１３ｖｇ／ｋｇの用量で単回静脈内投与した後のアカゲザルからの血漿中ＧＡＡ活性の評価を示す図である。
[0113]本発明は、ＧＡＡをコードする修飾された核酸、ＧＡＡをコードする修飾された核酸を含む発現カセット、ＧＡＡをコードする修飾された核酸を含むＡＡＶベクターゲノム、並びにＧＡＡをコードする修飾された核酸を含む組換えＡＡＶベクター及び粒子を提供する。本発明のＧＡＡをコードする修飾された核酸、ＧＡＡをコードする修飾された核酸を含む発現カセット、ＧＡＡをコードする修飾された核酸を含むＡＡＶベクターゲノム、並びに組換えＡＡＶベクター及び粒子は、ポンペ病並びに他のグリコーゲン蓄積症（ＧＳＤ）の治療に有用である。
[0114]本明細書で使用される場合、用語「修飾する」及びその文法的変形は、核酸又はタンパク質が参照又は親の配列から逸脱することを意味する。ＧＡＡをコードする修飾された核酸は、参照（例えば、野生型）又は親の核酸と比較して改変されている。したがって、修飾された核酸は、参照又は親の核酸と実質的に同じ、より大きい、若しくはより少ない活性又は機能を有し得るが、少なくとも、部分的な活性、機能及び／又は参照若しくは親の核酸と配列同一性を保持する。修飾された核酸は、修飾された又はバリアントＧＡＡをコードするように遺伝子的に修飾され得る。
[0115]「ＧＡＡをコードする修飾された核酸」とは、ＧＡＡ核酸が、ＧＡＡをコードする親の非修飾核酸と比較して改変を有することを意味する。修飾の特定の例は、ヌクレオチド置換である。本明細書における用語「修飾」は、ＧＡＡをコードする核酸への言及の各々の例に現れる必要はない。
[0116]特定の実施形態では、ＧＡＡをコードする修飾された核酸について、ＧＡＡタンパク質は、野生型ＧＡＡタンパク質の機能又は活性の少なくとも一部を保持する。ＧＡＡタンパク質の機能又は活性には、グリコーゲン、マルトース及びイソマルトースを分解するリソソーム加水分解酵素である酸性αグルコシダーゼ活性が含まれる。したがって、ＧＡＡをコードする修飾された核酸は、コードされたＧＡＡが、ＧＡＡのリソソーム加水分解酵素活性のある程度又は態様を保持する限り、修飾された形態を含む。
[0117]本明細書に記載されるように、ＧＡＡをコードする修飾された核酸は、参照又は親の核酸と比較して異なる特徴又は特性を示すことができる。例えば、修飾された核酸は、本明細書に記載されるＧＡＡをコードする参照核酸と１００％の同一性を有する配列、並びにＧＡＡをコードする参照核酸と１００％未満の同一性を有する配列を含む。
[0118]用語「同一性」、「相同性」及びそれらの文法的変形は、それらが「整列された」配列である場合、２つ以上の参照実体が同じであることを意味する。したがって、例として、２つの核酸が同一である場合、それらは、少なくとも参照された領域又は部分内で、同じ配列を有する。同一性は、配列の定義された場所（領域又はドメイン）上にあり得る。
[0119]同一性の「場所」又は「領域」は、同一である２つ以上の参照実体の一部を指す。したがって、２つのタンパク質又は核酸配列は、１つ又は複数の配列の場所又は領域にわたって同一である場合、それらはその領域内で同一である。「整列された」配列とは、複数のタンパク質（アミノ酸）又は核酸配列を指し、しばしば、参照配列と比較して、欠落している若しくは追加の塩基又はアミノ酸（ギャップ）に対する補正を含む。
[0120]同一性は、配列の全長又は一部にわたって拡張することができる。ある実施形態では、同一性パーセントを共有する配列の長さは、２、３、４、５若しくはそれ以上の隣接するアミノ酸又は核酸、例えば、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０などの隣接する核酸又はアミノ酸である。さらなる実施形態では、同一性を共有する配列の長さは、２１個以上の隣接するアミノ酸又は核酸、例えば、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０個などの隣接するアミノ酸又は核酸である。さらなる実施形態では、同一性を共有する配列の長さは、４１個以上の隣接するアミノ酸又は核酸、例えば、４２、４３、４４、４５、４５、４７、４８、４９、５０個などの隣接するアミノ酸又は核酸である。さらに別の実施形態では、同一性を共有する配列の長さは、５０個以上の隣接するアミノ酸又は核酸、例えば、５０〜５５、５５〜６０、６０〜６５、６５〜７０、７０〜７５、７５〜８０、８０〜８５、８５〜９０、９０〜９５、９５〜１００、１００〜１５０、１５０〜２００、２００〜２５０、２５０〜３００、３００〜５００、５００〜１，０００個などの隣接するアミノ酸又は核酸である。
[0121]本明細書に記載されるように、ＧＡＡをコードする修飾された核酸は、ＧＡＡをコードする参照核酸と区別することができ、又は１００％の同一性若しくは１００％未満の同一性を示すことができる。
[0122]特定の実施形態では、ＧＡＡをコードする本発明の核酸は、配列番号１〜５に示される任意の核酸と８６％を超える同一であり得る。
[0123]特定の実施形態では、ＧＡＡをコードする本発明の核酸は、配列番号６〜１４に示される任意の核酸と８７％を超える同一であり得る。
[0124]特定の実施形態では、ＧＡＡをコードする本発明の核酸は、配列番号１６〜２４に示される任意の核酸と９１％を超える同一であり得る。
[0125]ＧＡＡをコードするこのような修飾された核酸は、さらに、配列番号１〜２４のいずれかとより大きい同一性を示していてもよく、例えば、８７％を超えて同一；８８％を超えて同一；８９％を超えて同一；９０％を超えて同一；９１％を超えて同一；９２％を超えて同一；９３％を超えて同一；９４％を超えて同一；９５％を超えて同一；９６％を超えて同一；９７％を超えて同一；９８％を超えて同一；９９％を超えて同一；又は１００％同一である。
[0126]２つの配列間の同一性（相同性）の程度又は「同一性パーセント」は、コンピュータプログラム及び／又は数学的アルゴリズムを用いて確認することができる。本発明の目的のために、核酸配列の比較は、ウィスコンシン州マディソンのＧｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐから入手可能なＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎパッケージバージョン９．１を用いて実施される。便宜上、そのプログラムによって指定されたデフォルトパラメータ（ギャップ生成ペナルティ＝１２、ギャップ拡張ペナルティ＝４）は、本明細書において配列同一性を比較するために使用することが意図される。或いは、デフォルトパラメータによるギャップ付きアラインメントを用いて、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎによって提供されるＢｌａｓｔｎ ２．０プログラム（ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／においてワールド・ワイド・ウェブ上で見られる；Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９０年、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ、２１５巻：４０３〜４１０頁）を用いて、核酸配列間及びアミノ酸配列間の同一性及び類似性のレベルを決定することができる。ポリペプチド配列比較のために、ＢＬＡＳＴＰアルゴリズムは、典型的には、ＰＡＭ１００、ＰＡＭ２５０、ＢＬＯＳＵＭ６２又はＢＬＯＳＵＭ５０などのスコアリングマトリックスと組み合わせて使用される。ＦＡＳＴＡ（例えば、ＦＡＳＴＡ２及びＦＡＳＴＡ３）及びＳＳＥＡＲＣＨ配列比較プログラムはまた、同一性の程度を定量するために使用される（Ｐｅａｒｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８５巻：２４４４頁（１９８８年）；Ｐｅａｒｓｏｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．、１３２巻：１８５頁（２０００年）；Ｓｍｉｔｈら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１４７巻：１９５頁（１９８１年））。Ｄｅｌａｕｎａｙベースのトポロジーマッピングを用いたタンパク質構造類似性を定量するためのプログラムがまた開発されている（Ｂｏｓｔｉｃｋら、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ．３０４巻：３２０頁（２００３年））。
[0127]参照又は親の核酸と比較して異なる特徴又は特性を示すＧＡＡをコードする修飾された核酸には、ヌクレオチドの置換が含まれる。例えば、ＧＡＡをコードする修飾された核酸は、ＧＡＡをコードする参照核酸と比較して、ＣｐＧジヌクレオチドの数が減少した核酸を含む。
[0128]ある実施形態では、ＧＡＡをコードする核酸は、１２７個未満のＣｐＧジヌクレオチドを含有する。
[0129]ある実施形態では、ＧＡＡをコードする核酸は、１２６個未満のＣｐＧジヌクレオチドを含有する。
[0130]ある実施形態では、ＧＡＡをコードする核酸は、１２５個未満のＣｐＧジヌクレオチドを含有する。
[0131]ある実施形態では、ＧＡＡをコードする核酸は、１２４個未満のＣｐＧジヌクレオチドを含有する。
[0132]ある実施形態では、ＧＡＡをコードする核酸は、１２３個未満のＣｐＧジヌクレオチドを含有する。
[0133]ある実施形態では、ＧＡＡをコードする核酸は、１２２個未満のＣｐＧジヌクレオチドを含有する。
[0134]ある実施形態では、ＧＡＡをコードする核酸は、１２１個未満のＣｐＧジヌクレオチドを含有する。
[0135]ある実施形態では、ＧＡＡをコードする核酸は、１２０個未満のＣｐＧジヌクレオチドを含有する。
[0136]ある実施形態では、ＧＡＡをコードする核酸は、１１９個未満のＣｐＧジヌクレオチドを含有する。
[0137]ある実施形態では、ＧＡＡをコードする核酸は、１１８個未満のＣｐＧジヌクレオチドを含有する。
[0138]ある実施形態では、ＧＡＡをコードする核酸は、１１７個未満のＣｐＧジヌクレオチドを含有する。
[0139]ある実施形態では、ＧＡＡをコードする核酸は、１１６個未満のＣｐＧジヌクレオチドを含有する。
[0140]ある実施形態では、ＧＡＡをコードする核酸は、１１５個未満のＣｐＧジヌクレオチドを含有する。
[0141]ある実施形態では、ＧＡＡをコードする核酸は、１１４個未満のＣｐＧジヌクレオチドを含有する。
[0142]ある実施形態では、ＧＡＡをコードする核酸は、１１３個未満のＣｐＧジヌクレオチドを含有する。
[0143]ある実施形態では、ＧＡＡをコードする核酸は、１１２個未満のＣｐＧジヌクレオチドを含有する。
[0144]ある実施形態では、ＧＡＡをコードする核酸は、１１１個未満のＣｐＧジヌクレオチドを含有する。
[0145]ある実施形態では、ＧＡＡをコードする核酸は、１１０個未満のＣｐＧジヌクレオチドを含有する。
[0146]ある実施形態では、ＧＡＡをコードする核酸は、１０９個未満のＣｐＧジヌクレオチドを含有する。
[0147]ある実施形態では、ＧＡＡをコードする核酸は、１０８個未満のＣｐＧジヌクレオチドを含有する。
[0148]ある実施形態では、ＧＡＡをコードする核酸は、１０７個未満のＣｐＧジヌクレオチドを含有する。
[0149]ある実施形態では、ＧＡＡをコードする核酸は、１０６個未満のＣｐＧジヌクレオチドを含有する。
[0150]ある実施形態では、ＧＡＡをコードする核酸は、１０５個未満のＣｐＧジヌクレオチドを含有する。
[0151]ある実施形態では、ＧＡＡをコードする核酸は、１０４個未満のＣｐＧジヌクレオチドを含有する。
[0152]ある実施形態では、ＧＡＡをコードする核酸は、１０３個未満のＣｐＧジヌクレオチドを含有する。
[0153]ある実施形態では、ＧＡＡをコードする核酸は、１０２個未満のＣｐＧジヌクレオチドを含有する。
[0154]ある実施形態では、ＧＡＡをコードする核酸は、１０１個未満のＣｐＧジヌクレオチドを含有する。
[0155]ある実施形態では、ＧＡＡをコードする核酸は、１００個未満のＣｐＧジヌクレオチドを含有する。
[0156]ある実施形態では、ＧＡＡをコードする核酸は、９９個未満のＣｐＧジヌクレオチドを含有する。
[0157]ある実施形態では、ＧＡＡをコードする核酸は、９８個未満のＣｐＧジヌクレオチドを含有する。
[0158]ある実施形態では、ＧＡＡをコードする核酸は、９７個未満のＣｐＧジヌクレオチドを含有する。
[0159]ある実施形態では、ＧＡＡをコードする核酸は、９６個未満のＣｐＧジヌクレオチドを含有する。
[0160]ある実施形態では、ＧＡＡをコードする核酸は、９５個未満のＣｐＧジヌクレオチドを含有する。
[0161]ある実施形態では、ＧＡＡをコードする核酸は、９４個未満のＣｐＧジヌクレオチドを含有する。
[0162]ある実施形態では、ＧＡＡをコードする核酸は、９３個未満のＣｐＧジヌクレオチドを含有する。
[0163]ある実施形態では、ＧＡＡをコードする核酸は、９２個未満のＣｐＧジヌクレオチドを含有する。
[0164]ある実施形態では、ＧＡＡをコードする核酸は、９１個未満のＣｐＧジヌクレオチドを含有する。
[0165]ある実施形態では、ＧＡＡをコードする核酸は、９０個未満のＣｐＧジヌクレオチドを含有する。
[0166]ある実施形態では、ＧＡＡをコードする核酸は、８９個未満のＣｐＧジヌクレオチドを含有する。
[0167]ある実施形態では、ＧＡＡをコードする核酸は、８８個未満のＣｐＧジヌクレオチドを含有する。
[0168]ある実施形態では、ＧＡＡをコードする核酸は、８７個未満のＣｐＧジヌクレオチドを含有する。
[0169]ある実施形態では、ＧＡＡをコードする核酸は、８６個未満のＣｐＧジヌクレオチドを含有する。
[0170]ある実施形態では、ＧＡＡをコードする核酸は、８５個未満のＣｐＧジヌクレオチドを含有する。
[0171]ある実施形態では、ＧＡＡをコードする核酸は、８４個未満のＣｐＧジヌクレオチドを含有する。
[0172]ある実施形態では、ＧＡＡをコードする核酸は、８３個未満のＣｐＧジヌクレオチドを含有する。
[0173]ある実施形態では、ＧＡＡをコードする核酸は、８２個未満のＣｐＧジヌクレオチドを含有する。
[0174]ある実施形態では、ＧＡＡをコードする核酸は、８１個未満のＣｐＧジヌクレオチドを含有する。
[0175]ある実施形態では、ＧＡＡをコードする核酸は、８０個未満のＣｐＧジヌクレオチドを含有する。
[0176]ある実施形態では、ＧＡＡをコードする核酸は、７９個未満のＣｐＧジヌクレオチドを含有する。
[0177]ある実施形態では、ＧＡＡをコードする核酸は、７８個未満のＣｐＧジヌクレオチドを含有する。
[0178]ある実施形態では、ＧＡＡをコードする核酸は、７７個未満のＣｐＧジヌクレオチドを含有する。
[0179]ある実施形態では、ＧＡＡをコードする核酸は、７６個未満のＣｐＧジヌクレオチドを含有する。
[0180]ある実施形態では、ＧＡＡをコードする核酸は、７５個未満のＣｐＧジヌクレオチドを含有する。
[0181]ある実施形態では、ＧＡＡをコードする核酸は、７４個未満のＣｐＧジヌクレオチドを含有する。
[0182]ある実施形態では、ＧＡＡをコードする核酸は、７３個未満のＣｐＧジヌクレオチドを含有する。
[0183]ある実施形態では、ＧＡＡをコードする核酸は、７２個未満のＣｐＧジヌクレオチドを含有する。
[0184]ある実施形態では、ＧＡＡをコードする核酸は、７１個未満のＣｐＧジヌクレオチドを含有する。
[0185]ある実施形態では、ＧＡＡをコードする核酸は、７０個未満のＣｐＧジヌクレオチドを含有する。
[0186]ある実施形態では、ＧＡＡをコードする核酸は、６９個未満のＣｐＧジヌクレオチドを含有する。
[0187]ある実施形態では、ＧＡＡをコードする核酸は、６８個未満のＣｐＧジヌクレオチドを含有する。
[0188]ある実施形態では、ＧＡＡをコードする核酸は、６７個未満のＣｐＧジヌクレオチドを含有する。
[0189]ある実施形態では、ＧＡＡをコードする核酸は、６６個未満のＣｐＧジヌクレオチドを含有する。
[0190]ある実施形態では、ＧＡＡをコードする核酸は、６５個未満のＣｐＧジヌクレオチドを含有する。
[0191]ある実施形態では、ＧＡＡをコードする核酸は、６４個未満のＣｐＧジヌクレオチドを含有する。
[0192]ある実施形態では、ＧＡＡをコードする核酸は、６３個未満のＣｐＧジヌクレオチドを含有する。
[0193]ある実施形態では、ＧＡＡをコードする核酸は、６２個未満のＣｐＧジヌクレオチドを含有する。
[0194]ある実施形態では、ＧＡＡをコードする核酸は、６１個未満のＣｐＧジヌクレオチドを含有する。
[0195]ある実施形態では、ＧＡＡをコードする核酸は、６０個未満のＣｐＧジヌクレオチドを含有する。
[0196]ある実施形態では、ＧＡＡをコードする核酸は、５９個未満のＣｐＧジヌクレオチドを含有する。
[0197]ある実施形態では、ＧＡＡをコードする核酸は、５８個未満のＣｐＧジヌクレオチドを含有する。
[0198]ある実施形態では、ＧＡＡをコードする核酸は、５７個未満のＣｐＧジヌクレオチドを含有する。
[0199]ある実施形態では、ＧＡＡをコードする核酸は、５６個未満のＣｐＧジヌクレオチドを含有する。
[0200]ある実施形態では、ＧＡＡをコードする核酸は、５５個未満のＣｐＧジヌクレオチドを含有する。
[0201]ある実施形態では、ＧＡＡをコードする核酸は、５４個未満のＣｐＧジヌクレオチドを含有する。
[0202]ある実施形態では、ＧＡＡをコードする核酸は、５３個未満のＣｐＧジヌクレオチドを含有する。
[0203]ある実施形態では、ＧＡＡをコードする核酸は、５２個未満のＣｐＧジヌクレオチドを含有する。
[0204]ある実施形態では、ＧＡＡをコードする核酸は、５１個未満のＣｐＧジヌクレオチドを含有する。
[0205]ある実施形態では、ＧＡＡをコードする核酸は、５０個未満のＣｐＧジヌクレオチドを含有する。
[0206]ある実施形態では、ＧＡＡをコードする核酸は、４９個未満のＣｐＧジヌクレオチドを含有する。
[0207]ある実施形態では、ＧＡＡをコードする核酸は、４８個未満のＣｐＧジヌクレオチドを含有する。
[0208]ある実施形態では、ＧＡＡをコードする核酸は、４７個未満のＣｐＧジヌクレオチドを含有する。
[0209]ある実施形態では、ＧＡＡをコードする核酸は、４６個未満のＣｐＧジヌクレオチドを含有する。
[0210]ある実施形態では、ＧＡＡをコードする核酸は、４５個未満のＣｐＧジヌクレオチドを含有する。
[0211]ある実施形態では、ＧＡＡをコードする核酸は、４４個未満のＣｐＧジヌクレオチドを含有する。
[0212]ある実施形態では、ＧＡＡをコードする核酸は、４３個未満のＣｐＧジヌクレオチドを含有する。
[0213]ある実施形態では、ＧＡＡをコードする核酸は、４２個未満のＣｐＧジヌクレオチドを含有する。
[0214]ある実施形態では、ＧＡＡをコードする核酸は、４１個未満のＣｐＧジヌクレオチドを含有する。
[0215]ある実施形態では、ＧＡＡをコードする核酸は、４０個未満のＣｐＧジヌクレオチドを含有する。
[0216]ある実施形態では、ＧＡＡをコードする核酸は、３９個未満のＣｐＧジヌクレオチドを含有する。
[0217]ある実施形態では、ＧＡＡをコードする核酸は、３８個未満のＣｐＧジヌクレオチドを含有する。
[0218]ある実施形態では、ＧＡＡをコードする核酸は、３７個未満のＣｐＧジヌクレオチドを含有する。
[0219]ある実施形態では、ＧＡＡをコードする核酸は、３６個未満のＣｐＧジヌクレオチドを含有する。
[0220]ある実施形態では、ＧＡＡをコードする核酸は、３５個未満のＣｐＧジヌクレオチドを含有する。
[0221]ある実施形態では、ＧＡＡをコードする核酸は、３４個未満のＣｐＧジヌクレオチドを含有する。
[0222]ある実施形態では、ＧＡＡをコードする核酸は、３３個未満のＣｐＧジヌクレオチドを含有する。
[0223]ある実施形態では、ＧＡＡをコードする核酸は、３２個未満のＣｐＧジヌクレオチドを含有する。
[0224]ある実施形態では、ＧＡＡをコードする核酸は、３１個未満のＣｐＧジヌクレオチドを含有する。
[0225]ある実施形態では、ＧＡＡをコードする核酸は、３０個未満のＣｐＧジヌクレオチドを含有する。
[0226]ある実施形態では、ＧＡＡをコードする核酸は、２９個未満のＣｐＧジヌクレオチドを含有する。
[0227]ある実施形態では、ＧＡＡをコードする核酸は、２８個未満のＣｐＧジヌクレオチドを含有する。
[0228]ある実施形態では、ＧＡＡをコードする核酸は、２７個未満のＣｐＧジヌクレオチドを含有する。
[0229]ある実施形態では、ＧＡＡをコードする核酸は、２６個未満のＣｐＧジヌクレオチドを含有する。
[0230]ある実施形態では、ＧＡＡをコードする核酸は、２５個未満のＣｐＧジヌクレオチドを含有する。
[0231]ある実施形態では、ＧＡＡをコードする核酸は、２４個未満のＣｐＧジヌクレオチドを含有する。
[0232]ある実施形態では、ＧＡＡをコードする核酸は、２３個未満のＣｐＧジヌクレオチドを含有する。
[0233]ある実施形態では、ＧＡＡをコードする核酸は、２２個未満のＣｐＧジヌクレオチドを含有する。
[0234]ある実施形態では、ＧＡＡをコードする核酸は、２１個未満のＣｐＧジヌクレオチドを含有する。
[0235]ある実施形態では、ＧＡＡをコードする核酸は、２０個未満のＣｐＧジヌクレオチドを含有する。
[0236]ある実施形態では、ＧＡＡをコードする核酸は、１９個未満のＣｐＧジヌクレオチドを含有する。
[0237]ある実施形態では、ＧＡＡをコードする核酸は、１８個未満のＣｐＧジヌクレオチドを含有する。
[0238]ある実施形態では、ＧＡＡをコードする核酸は、１７個未満のＣｐＧジヌクレオチドを含有する。
[0239]ある実施形態では、ＧＡＡをコードする核酸は、１６個未満のＣｐＧジヌクレオチドを含有する。
[0240]ある実施形態では、ＧＡＡをコードする核酸は、１５個未満のＣｐＧジヌクレオチドを含有する。
[0241]ある実施形態では、ＧＡＡをコードする核酸は、１４個未満のＣｐＧジヌクレオチドを含有する。
[0242]ある実施形態では、ＧＡＡをコードする核酸は、１３個未満のＣｐＧジヌクレオチドを含有する。
[0243]ある実施形態では、ＧＡＡをコードする核酸は、１２個未満のＣｐＧジヌクレオチドを含有する。
[0244]ある実施形態では、ＧＡＡをコードする核酸は、１１個未満のＣｐＧジヌクレオチドを含有する。
[0245]ある実施形態では、ＧＡＡをコードする核酸は、１０個未満のＣｐＧジヌクレオチドを含有する。
[0246]ある実施形態では、ＧＡＡをコードする核酸は、９個未満のＣｐＧジヌクレオチドを含有する。
[0247]ある実施形態では、ＧＡＡをコードする核酸は、８個未満のＣｐＧジヌクレオチドを含有する。
[0248]ある実施形態では、ＧＡＡをコードする核酸は、７個未満のＣｐＧジヌクレオチドを含有する。
[0249]ある実施形態では、ＧＡＡをコードする核酸は、６個未満のＣｐＧジヌクレオチドを含有する。
[0250]ある実施形態では、ＧＡＡをコードする核酸は、５個未満のＣｐＧジヌクレオチドを含有する。
[0251]ある実施形態では、ＧＡＡをコードする核酸は、４個未満のＣｐＧジヌクレオチドを含有する。
[0252]ある実施形態では、ＧＡＡをコードする核酸は、３個未満のＣｐＧジヌクレオチドを含有する。
[0253]ある実施形態では、ＧＡＡをコードする核酸は、２個未満のＣｐＧジヌクレオチドを含有する。
[0254]ある実施形態では、ＧＡＡをコードする核酸は、１個未満のＣｐＧジヌクレオチドを含有する。
[0255]用語「ベクター」とは、核酸の挿入又は組み込みによって操作することができる小型担体核酸分子、プラスミド、ウイルス（例えば、ＡＡＶベクター）、又は他のビヒクルを指す。このようなベクターは、遺伝子操作（すなわち、「クローニングベクター」）のため、細胞内へのポリヌクレオチドの導入／移入、及び細胞で挿入されたポリヌクレオチドの転写又は翻訳に使用することができる。「発現ベクター」は、宿主細胞における発現に必要とされる必須の調節領域を有する遺伝子又は核酸配列を含む特殊化されたベクターである。
[0256]ベクター核酸配列は、一般的に、細胞で増殖するための少なくとも複製起点、及び任意選択で、異種ポリヌクレオチド配列、発現制御エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー）、イントロン、逆方向末端反復（ＩＴＲ）、選択マーカー（例えば、抗生物質耐性）、ポリアデニル化シグナルなどの付加的エレメントを含有する。
[0257]ウイルスベクターは、ウイルスゲノムを含む１つ又は複数の核酸エレメントに由来するか又はそれに基づく。特定のウイルスベクターには、レンチウイルス及びアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターが含まれる。
[0258]用語「組換え体」は、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターなどのベクターの修飾因子、並びに組換えポリヌクレオチド及びポリペプチドなどの配列の修飾因子として、組成物が、一般的に自然界では起こらない様式で操作された（すなわち、遺伝子操作された）ことを意味する。組換えＡＡＶベクターの特定の例は、野生型ＡＡＶゲノムに通常は存在しないクリック酸配列がＡＡＶゲノム内に挿入される場合である。用語「組換え体」は、ＡＡＶベクター、並びにポリヌクレオチドなどの配列に関しては、本明細書において常に使用されるわけではないが、ポリヌクレオチドを含む組換え体は、このような省略にもかかわらず、明示的に含まれる。
[0259]「組換えＡＡＶベクター」又は「ｒＡＡＶ」は、ＡＡＶゲノムから野生型ゲノムを除去するための分子方法を使用し、異種核酸と呼ばれる非天然核酸配列で置換することによって、ＡＡＶの野生型ゲノムから誘導される。典型的には、ＡＡＶに関して、ＡＡＶゲノムの一方又は両方の逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列は、ＡＡＶベクターに保持される。ｒＡＡＶは、ＡＡＶゲノムの全部又は一部が、ＡＡＶゲノム核酸に関して非天然配列に置換されているため、ＡＡＶゲノムと区別される。したがって、非天然配列の組み込みは、ＡＡＶベクターを「組換え」ベクターとして定義し、これを「ｒＡＡＶベクター」と称することができる。
[0260]ｒＡＡＶ配列は、細胞のその後の感染（形質導入）について、エクスビボ、インビトロ又はインビボでパッケージすることができる（本明細書では「粒子」と称する）。組換えＡＡＶベクター配列がＡＡＶ粒子にカプシド化又はパッケージされる場合、粒子は「ｒＡＡＶベクター」又は「ｒＡＡＶ粒子」とも称することができる。このようなｒＡＡＶ粒子は、ベクターゲノムをカプシド化又はパッケージするタンパク質を含み、ＡＡＶの場合、それらはカプシドタンパク質と称される。
[0261]ベクター「ゲノム」とは、組換えプラスミド配列の部分であって、最終的にウイルス粒子（例えば、ｒＡＡＶ）を形成するようにパッケージされるか又はカプシド化される部分を指す。組換えプラスミドを用いて組換えベクターを構築又は製造する場合、ベクターゲノムは、組換えプラスミドのベクターゲノム配列に対応しない「プラスミド」の部分を含まない。組換えプラスミドのこの非ベクターゲノム部分は、プラスミドのクローニング及び増幅に重要である「プラスミド骨格」と称することができ、このプロセスは、増殖及び組換えウイルス生成に必要であるが、それ自体は、ウイルス（例えば、ＡＡＶ）粒子にパッケージ又はカプシド化されない。したがって、ベクター「ゲノム」とは、ウイルス（例えば、ＡＡＶ）によってパッケージされ又はカプシド化された核酸を指す。
[0262]組換えＡＡＶ粒子を生成するための宿主細胞は、限定されないが、異種ｒＡＡＶベクターのレシピエントとして使用され得る又は使用されてきた微生物、酵母細胞、昆虫細胞、及び哺乳動物細胞を含む。安定なヒト細胞株ＨＥＫ２９３（例えば、受託番号ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５７３下のＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎを介して容易に入手可能）からの細胞を使用することができる。ある実施形態では、アデノウイルス５型ＤＮＡ断片で形質転換され、アデノウイルスＥ１ａ及びＥ１ｂ遺伝子を発現する修飾されたヒト胚腎細胞株（例えば、ＨＥＫ２９３）を用いて、組換えＡＡＶ粒子を作製する。修飾されたＨＥＫ２９３細胞株は、容易にトランスフェクトされ、ｒＡＡＶ粒子を生成するための特に便利なプラットフォームを提供する。組換えＡＡＶ生成に適した他の宿主細胞株は、国際出願ＰＣＴ／２０１７／０２４９５１に記載される。
[0263]ある実施形態では、ＡＡＶヘルパー機能は、ＡＡＶ発現ベクターのトランスフェクションの前に、又はそれと同時に、ＡＡＶヘルパー構築物を宿主細胞にトランスフェクトすることによって、宿主細胞に導入される。ＡＡＶヘルパー機能を有する宿主細胞は、「ヘルパー細胞」又は「パッケージングヘルパー細胞」と称され得る。したがって、ＡＡＶヘルパー構築物は、生産的なＡＡＶ形質導入に必要とされる、欠落しているＡＡＶ機能を補完するために、ＡＡＶ ｒｅｐ及び／又はｃａｐ遺伝子の少なくとも一過性の発現を提供するために時々使用される。ＡＡＶヘルパー構築物は、しばしばＡＡＶ ＩＴＲを欠いており、それ自体で複製もパッケージ化もできない。これらの構築物は、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、ウイルス、又はビリオンの形態であり得る。Ｒｅｐ及びＣａｐ発現生成物の両方をコードする一般的に使用されるプラスミドｐＡＡＶ／Ａｄ及びｐＩＭ２９＋４５などの多数のＡＡＶヘルパー構築物が記載されている。Ｒｅｐ及び／又はＣａｐ発現生成物をコードする多数の他のベクターが公知である。
[0264]哺乳動物細胞を形質導入することができる組換えＡＡＶ粒子を作製する方法は、当該技術分野において公知である。例えば、組換えＡＡＶ粒子は、米国特許第９，４０８，９０４号；国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０２５３９６及び同ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０６４４１４に記載されるように生成することができる。
[0265]用語「核酸」及び「ポリヌクレオチド」は、本明細書において、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）及びリボ核酸（ＲＮＡ）を含む全ての形態の核酸、オリゴヌクレオチドに言及するように互換的に使用される。核酸には、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ及びアンチセンスＤＮＡ、並びにスプライシングされた又はスプライシングされていないｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ及び抑制性ＤＮＡ又はＲＮＡ（ＲＮＡｉ、例えば、低分子又はショートヘアピン（ｓｈ）ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子又は短鎖干渉（ｓｉ）ＲＮＡ、トランス−スプライシングＲＮＡ、又はアンチセンスＲＮＡ）が含まれる。核酸には、天然に存在する、合成の、及び意図的に修飾された又は改変されたポリヌクレオチド（例えば、バリアント核酸）が含まれる。ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、及びそれらの断片などの核酸は、一本鎖又は二本鎖であり得る。
[0266]ポリヌクレオチドは、一重、二重、若しくは三重、線状又は環状であり得、任意の長さであり得る。ポリヌクレオチドの検討において、特定のポリヌクレオチドの配列又は構造は、５’から３’方向に配列を提供する慣例に従って本明細書に記載され得る。
[0267]「導入遺伝子」は、本明細書において、細胞又は生物内に導入されることを意図するか又は導入された異種核酸を便宜的に言及するために使用される。導入遺伝子には、ＧＡＡをコードする修飾された核酸などの任意の異種核酸が含まれる。
[0268]用語「形質導入する」及びその文法的変形は、ｒＡＡＶベクターなどの分子の細胞又は宿主生物への導入を指す。異種核酸／導入遺伝子は、レシピエント細胞のゲノム核酸に組み込まれ得るか又は組み込まれなくてもよい。導入された異種核酸はまた、レシピエント細胞又は宿主生物中に染色体外に又は一時的にのみ存在し得る。
[0269]「形質導入された細胞」は、導入遺伝子が導入されている細胞である。したがって、「形質導入された」細胞（例えば、細胞又は組織又は臓器細胞などの哺乳動物）は、例えば、核酸（例えば、導入遺伝子）を細胞内に取り込んだ後の細胞における遺伝的変化を意味する。したがって、「形質導入された」細胞は、外因性核酸が導入されている細胞、又はその子孫である。細胞（複数可）を増殖させ、導入されたタンパク質を発現させることができる。遺伝子療法の使用及び方法に関して、形質導入された細胞は、対象中にあり得る。
[0270]「発現制御エレメント」とは、作動可能に連結された核酸の発現に影響する核酸配列（複数可）を指す。本明細書に記載される発現制御エレメントには、プロモーター及びエンハンサーが含まれる。ＡＡＶベクターを含むベクター配列は、１つ又は複数の「発現制御エレメント」を含むことができる。典型的には、このようなエレメントは、適した異種ポリヌクレオチド転写、及び必要に応じて翻訳を促進するために含まれる（例えば、プロモーター、エンハンサー、イントロンのスプライシングシグナル、ｍＲＮＡのインフレーム翻訳を可能にする遺伝子の正しいリーディングフレームの維持、及び終止コドンなど）。このようなエレメントは、典型的には、「シス作用性」エレメントと称されるシスに作用するが、トランスにも作用する場合がある。
[0271]発現制御は、転写、翻訳、スプライシング、メッセージ安定性などのレベルで行うことができる。典型的には、転写を調節する発現制御エレメントは、転写された核酸の５’末端（すなわち、「上流」）付近に並置される。発現制御エレメントは、転写された配列の３’末端（すなわち、「下流」）又は転写物内（例えば、イントロン内）に位置することもできる。発現制御エレメントは、かなりの距離においてさえ、転写された配列（例えば、ポリヌクレオチドからの１〜１０、１０〜２５、２５〜５０、５０〜１００、１００〜５００、又はそれ以上のヌクレオチド）に隣接して又は離れて位置させることができる。それにもかかわらず、ＡＡＶベクターの長さの制限のために、発現制御エレメントは、典型的には、異種核酸の転写開始部位から１〜１０００ヌクレオチド以内である。
[0272]機能的には、作動可能に連結された核酸の発現は、エレメント（例えば、プロモーター）によって少なくとも部分的に制御可能であり、その結果、エレメントは、核酸の転写、及び必要に応じて、転写物の翻訳を調節する。発現制御エレメントの具体例は、プロモーターであり、これは、通常、転写された核酸配列の５’側に位置する。プロモーターは、典型的には、プロモーターが存在しない場合に発現される量と比較して、作動可能に連結された核酸から発現される量を増加させる。
[0273]本明細書で使用される「エンハンサー」とは、異種核酸に隣接して位置する配列を指すことができる。エンハンサーエレメントは、典型的には、プロモーターエレメントの上流に位置するが、また機能もし、配列の下流又は配列内に位置することができる。したがって、エンハンサーエレメントは、異種核酸配列の上流又は下流に、１０〜５０塩基対、５０〜１００塩基対、１００〜２００塩基対、又は２００〜３００塩基対、又はより多くの塩基対を位置させることができる。エンハンサーエレメントは、典型的には、プロモーターエレメントによってもたらされる発現よりも、作動可能に連結された核酸の発現を増加させる。
[0274]発現構築物は、特定の細胞型又は組織型における発現を駆動するのに役立つ調節エレメントを含み得る。発現制御エレメント（例えば、プロモーター）は、特定の組織又は細胞型において活性であり、本明細書では「組織特異的発現制御エレメント／プロモーター」と称される。組織特異的発現制御エレメントは、典型的には、特定の細胞又は組織（例えば、肝臓）において活性である。発現制御エレメントは、典型的には、特定の細胞、組織、又は臓器において活性である。これは、それらは、特定の細胞型、組織型、又は臓器型に固有である転写活性化タンパク質、又は転写の他の調節因子によって認識されるためである。このような調節エレメントは、当業者に公知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９年）、及びＡｕｓｕｂｅｌら（１９９２年）を参照されたい）。
[0275]発現構築物における組織特異的な調節エレメントの取り込みは、タンパク質又は抑制性ＲＮＡをコードする異種核酸の発現のための少なくとも部分的な組織指向性を提供する。肝臓において活性であるプロモーターの例は、とりわけ、トランスチレチン（ＴＴＲ）遺伝子プロモーター；ヒトアルファ１−アンチトリプシン（ｈＡＡＴ）プロモーター；アルブミン、Ｍｉｙａｔａｋｅら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、７１巻：５１２４〜３２頁（１９９７年）；Ｂ型肝炎ウイルスコアプロモーター、Ｓａｎｄｉｇら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．３巻：１００２〜９頁（１９９６年）；アルファ−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、Ａｒｂｕｔｈｎｏｔら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ．Ｔｈｅｒ．、７巻：１５０３〜１４頁（１９９６年）である。肝臓において活性であるエンハンサーの例は、アポリポタンパク質Ｅ（ａｐｏＥ）ＨＣＲ−１及びＨＣＲ−２（Ａｌｌａｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７２巻：２９１１３〜１９頁（１９９７年））である。
[0276]発現制御エレメントはまた、多くの異なる細胞型においてポリヌクレオチドの発現を駆動することができるユビキタス又は無差別のプロモーター／エンハンサーを含む。このようなエレメントには、限定されないが、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期プロモーター／エンハンサー配列、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター／エンハンサー配列、及び種々の哺乳動物細胞型において活性である他のウイルスプロモーター／エンハンサー、又は天然に存在しない合成エレメント（例えば、Ｂｏｓｈａｒｔら、Ｃｅｌｌ、４１巻：５２１〜５３０頁（１９８５年）を参照されたい）、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーター、細胞質β−アクチンプロモーター及びホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターが含まれる。
[0277]発現制御エレメントはまた、調節可能な様式、すなわち、シグナル又は刺激が、作動可能に連結された異種性ポリヌクレオチドの発現を増加又は減少させる様式で発現を付与することができる。シグナル又は刺激に応答して作動可能に連結されたポリヌクレオチドの発現を増加させる調節可能なエレメントは、「誘導性エレメント」（すなわち、シグナルによって誘導される）とも称される。特定の例としては、限定されないが、ホルモン（例えば、ステロイド）誘導性プロモーターが挙げられる。典型的には、このようなエレメントによって付与される増加又は減少の量は、存在するシグナル又は刺激の量に比例し、シグナル又は刺激の量が大きいほど、発現の増加又は減少が大きい。特定の非限定的な例には、亜鉛誘導性ヒツジメタロチオニン（ＭＴ）プロモーター；ステロイドホルモン誘導性マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター；Ｔ７ポリメラーゼプロモーターシステム（国際公開第ＷＯ９８／１００８８号）；テトラサイクリン抑制システム（Ｇｏｓｓｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９巻：５５４７〜５５５１頁（１９９２年））；テトラサイクリン誘導システム（Ｇｏｓｓｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６８巻：１７６６〜１７６９頁（１９９５年）；またＨａｒｖｅｙら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２巻：５１２〜５１８頁（１９９８年）参照）；ＲＵ４８６誘導システム（Ｗａｎｇら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１５巻：２３９〜２４３頁（１９９７年）及びＷａｎｇら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．４巻：４３２〜４４１頁（１９９７年））；及びラパマイシン誘導システム（Ｍａｇａｒｉら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１００巻：２８６５〜２８７２頁（１９９７年）；Ｒｉｖｅｒａら、Ｎａｔ．Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．２巻：１０２８〜１０３２頁（１９９６年））が含まれる。この文脈で有用であり得る他の調節可能な制御エレメントは、特定の生理学的状態、例えば、温度、急性期、発生によって調節されるものである。
[0278]発現制御エレメントはまた、異種ポリヌクレオチドの天然エレメント（複数可）を含む。天然の制御エレメント（例えば、プロモーター）は、異種ポリヌクレオチドの発現が天然の発現を模倣すべきであることが望ましい場合に使用され得る。天然のエレメントは、異種ポリヌクレオチドの発現が一時的若しくは発生的に、又は組織特異的な様式で、又は特定の転写刺激に応答して調節される場合に使用され得る。イントロン、ポリアデニル化部位又はＫｏｚａｋコンセンサス配列などの他の天然の発現制御エレメントを使用することもできる。
[0279]用語「作動可能に連結された」とは、核酸配列の発現に必要な調節配列が、核酸配列の発現をもたらすように、配列に対して適切な位置に配置されることを意味する。この同じ定義は、発現ベクター、例えばｒＡＡＶベクター中の核酸配列及び転写制御エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー、及び終結エレメント）の配列に適用されることがある。
[0280]核酸と作動可能に連結した発現制御エレメントの例において、その関係は、制御エレメントが核酸の発現を調節するようなものである。より具体的には、例えば、作動可能に連結された２つのＤＮＡ配列は、２つのＤＮＡが、少なくとも１つのＤＮＡ配列が他の配列に対して生理学的効果を発揮することができるような関係で配列（シス又はトランス）されることを意味する。
[0281]したがって、ベクターのためのさらなるエレメントは、限定されないが、ＡＡＶ ＩＴＲ配列の１つ又は複数のコピー、又はイントロンなどの配列に隣接する発現制御（例えば、プロモーター／エンハンサー）エレメント、転写終結シグナル又は終止コドン、５’又は３’非翻訳領域（例えば、ポリアデニル化（ｐｏｌｙＡ）配列）を含む。
[0282]さらなるエレメントは、例えば、パッケージングを改善し、汚染核酸の存在を低下するために、例えば、充填剤又はスタッファーポリヌクレオチド配列を含む。ＡＡＶベクターは、一般的に約４ｋｂ〜約５．２ｋｂ、又はわずかに大きいサイズ範囲を有するＤＮＡの挿入物を典型的には受容する。したがって、より短い配列については、ウイルス粒子内にＡＡＶベクターをパッケージするのに許容されるウイルスゲノム配列のほぼ又は正常なサイズに長さを調節するために、スタッファー又は充填剤を含める。種々の実施形態では、充填剤／スタッファー核酸配列は、核酸の非翻訳（非タンパク質コード化）セグメントである。４．７ｋｂ未満の核酸配列について、充填剤又はスタッファーポリヌクレオチド配列は、配列と組み合わされた場合（例えば、ベクターに挿入された場合）、約３．０〜５．５ｋｂ、又は約４．０〜５．０ｋｂ、又は約４．３〜４．８ｋｂの全長を有する長さを有する。
[0283]用語「単離された」とは、組成物の修飾因子として使用される場合、組成物がヒトの手で作製されるか、又はそれらの天然に存在するインビボ環境から完全に若しくは少なくとも部分的に分離されることを意味する。一般的に、単離された組成物は、それらが通常自然界で関連付けられた１つ又は複数の物質、例えば、１つ又は複数のタンパク質、核酸、脂質、炭水化物、細胞膜を実質的に含まない。
[0284]用語「単離された」は、ヒトの手で生成された組合せ、例えば、ｒＡＡＶ配列、又はＡＡＶベクターゲノム及び医薬製剤をパッケージ又はカプシド化するｒＡＡＶ粒子を排除しない。用語「単離された」はまた、ハイブリッド／キメラ、多量体／オリゴマー、修飾（例えば、リン酸化、グリコシル化、脂質化）、又は誘導体化された形態、又はヒトの手によって生成された宿主細胞において発現される形態などの組成物の代替の物理的形態を排除しない。
[0285]用語「実質的に純粋な」とは、目的の化合物（例えば、核酸、オリゴヌクレオチド、タンパク質など）を少なくとも５０〜６０重量％含む調製物を指す。調製物は、目的の化合物の少なくとも７５重量％、又は少なくとも８５重量％、又は約９０〜９９重量％を含むことができる。純度は、目的の化合物に適した方法（例えば、クロマトグラフィー法、アガロース又はポリアクリルアミドゲル電気泳動、ＨＰＬＣ分析など）によって測定される。
[0286]特定のヌクレオチド配列又はアミノ酸配列を参照する場合、語句「から本質的になる」とは、所与の配列番号の特徴を有する配列を意味する。例えば、アミノ酸配列を参照して使用する場合、この語句は、配列自体、並びに配列の基本的及び新規な特性に影響を及ぼさない分子修飾を含む。
[0287]本発明のＧＡＡをコードする修飾された核酸を含む核酸、発現ベクター（例えば、ＡＡＶベクターゲノム）、プラスミドは、組換えＤＮＡ技術法を用いて調製することができる。ヌクレオチド配列情報の利用可能性は、種々の手段による本発明の単離された核酸分子の調製を可能にする。ＧＡＡをコードする核酸は、種々の標準的なクローニング、組換えＤＮＡ技術を用いて、細胞発現又はインビトロ翻訳及び化学合成技術を介して作製することができる。ポリヌクレオチドの純度は、配列決定、ゲル電気泳動などによって決定することができる。例えば、核酸は、ハイブリダイゼーション又はコンピュータベースのデータベーススクリーニング技術を用いて単離することができる。このような技術には、限定されないが、（１）ゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡライブラリーをプローブとハイブリダイズさせて、相同なヌクレオチド配列を検出すること；（２）共有された構造的特徴を有するポリペプチドを検出するために、例えば、発現ライブラリーを用いて、抗体スクリーニングを行うこと；（３）目的の核酸配列にアニーリングすることができるプライマーを用いて、ゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡ上でポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行うこと；（４）関連配列の配列データベースをコンピュータで検索すること；及び（５）減算核酸ライブラリーの差分スクリーニングを行うことが含まれる。
[0288]核酸は、任意の好都合なクローニングベクター中でＤＮＡとして維持することができる。一実施形態では、クローンは、プラスミドクローニング／発現ベクター、例えば、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）中に維持され、これは、適切な大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主細胞中で増殖される。或いは、核酸は、哺乳動物細胞における発現に適したベクター、例えば、ＡＡＶベクター中に維持され得る。翻訳後修飾がタンパク質機能に影響を与える場合、核酸分子は、哺乳動物細胞において発現され得る。
[0289]本明細書に開示されるように、ｒＡＡＶベクターは、任意選択で、宿主細胞内でコードされたタンパク質の発現を可能にするような方法で配置された細胞内での異種核酸の発現に必要な調節エレメントを含み得る。発現に必要なこのような調節エレメントは、限定されないが、本明細書に記載され、当業者に公知であるプロモーター配列、エンハンサー配列及び転写開始配列を含む。
[0290]本発明の方法及び使用には、分裂細胞及び／又は非分裂細胞を含む、宿主細胞への核酸（導入遺伝子）の送達（形質導入）が含まれる。本発明の核酸、ｒＡＡＶベクター、方法、使用及び医薬製剤は、治療方法として、異種核酸によってコードされる配列を、それを必要とする対象に送達し、投与し、又は提供する方法において、さらに有用である。このようにして、核酸は、対象においてインビボで転写され、タンパク質が生成される。対象は、タンパク質が欠乏しているため、又は対象におけるタンパク質の生成により、治療方法として若しくは他の方法として、何らかの治療効果を付与し得るために、タンパク質から利益を得ることができ、又はタンパク質を必要とすることができる。
[0291]本発明は、ヒト及び獣医学的用途を含む動物に有用である。したがって、適切な対象には、ヒトなどの哺乳動物、並びにヒト以外の哺乳動物が含まれる。用語「対象」とは、動物、典型的には、ヒト、ヒト以外の霊長類（類人猿、ギブン、ゴリラ、チンパンジー、オランウータン、マカク）、家畜（イヌ及びネコ）、農場動物（ニワトリ及びアヒルなどの家禽、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ブタ）、及び実験動物（マウス、ラット、ウサギ、モルモット）などの哺乳動物を指す。ヒト対象には、胎児、新生児、乳児、幼児及び成人の対象が含まれる。対象には、動物疾患モデル、例えば、ポンペ病などのタンパク質／酵素欠乏のマウス及び他の動物モデル、並びにグリコーゲン蓄積症（ＧＳＤ）及び当業者に公知である他のものが含まれる。
[0292]本発明による治療に適した対象には、不十分な量のＧＡＡを有するか若しくは生成するリスクを有する対象、又は異常な、部分的に機能性若しくは非機能性のＧＡＡを生成する対象が含まれる。対象をＧＡＡ活性について試験して、このような対象が本発明の方法による治療に適しているかどうかを決定することができる。本発明による治療に適した対象にはまた、ＧＡＡから恩恵を受ける対象が含まれる。ＧＡＡから恩恵を受ける可能性のあるこのような対象には、グリコーゲン蓄積症（ＧＳＤ）を有するものが含まれる。治療された対象は、治療後、定期的に、例えば、１〜４週間毎、１〜６ヵ月毎、６〜１２ヵ月毎、又は１、２、３、４、５年若しくはそれ以上毎にモニターされ得る。
[0293]対象は、免疫応答、例えば、ＡＡＶに対する抗体について試験され得る。したがって、候補対象は、本発明の方法による治療前にスクリーニングすることができる。対象はまた、治療後にＡＡＶに対する抗体について試験することができ、任意選択で、治療療後の一定期間、モニターすることができる。ＡＡＶ抗体が既に存在するか又はそれを発生させている対象は、免疫抑制剤、又は本明細書に記載される他のレジメンで治療することができる。
[0294]本発明による治療に適した対象には、ＡＡＶに対する抗体を有する対象又は生成するリスクを有する対象も含まれる。ｒＡＡＶベクターは、いくつかの技術を用いて、このような対象に投与又は送達することができる。例えば、ＡＡＶ空カプシド（すなわち、ＧＡＡをコードする修飾された核酸を欠損するＡＡＶ）は、対象中のＡＡＶ抗体に結合するように送達され得、それによって、異種核酸を含むｒＡＡＶベクターが対象の細胞を形質導入することを可能にする。
[0295]本発明の修飾された核酸、発現カセット及びｒＡＡＶベクターは、ＧＡＡ欠乏の治療に使用することができる。したがって、種々の実施形態では、本発明のＧＡＡをコードする修された核酸、ＧＡＡ及びｒＡＡＶベクターをコードする修飾された核酸を含む発現カセットを、治療剤及び／又は予防剤として用いることができる。
[0296]特定の実施形態では、本発明のＧＡＡをコードする修飾された核酸、ＧＡＡをコードする修飾された核酸及びｒＡＡＶベクターを含む発現カセットを、ポンペ病並びに他のグリコーゲン蓄積症の治療に使用することができる。本発明のＧＡＡをコードする修飾された核酸、ＧＡＡをコードする修飾された核酸及びｒＡＡＶベクターを含む発現カセットをポンペ又は別のグリコーゲン蓄積症の患者に投与すると、グリコーゲンの蓄積を抑制し、阻害し、若しくは低下させ、グリコーゲンの蓄積を防ぎ、又はグリコーゲンを分解し、順に、ポンペ病の１つ又は複数の有害作用又は症状を低下又は減少させることができるＧＡＡタンパク質の発現がもたらされる。
[0297]本発明のＧＡＡをコードする修飾された核酸、ＧＡＡをコードする修飾された核酸及びｒＡＡＶベクターを含む発現カセットを投与された対象、動物又は患者は、本発明のＧＡＡをコードする修飾された核酸、ＧＡＡをコードする修飾された核酸及びｒＡＡＶを含む発現カセットの有効性を、治療薬及び／又は予防薬として実証、測定及び／又は評価するための種々の試験、アッセイ及び機能性評価によって評価することができる。このような試験及びアッセイには、限定されないが、血液又は血漿などの生物学的試料中のＧＡＡ活性（例えば、標準的なＧＡＡ活性アッセイの使用による）及び／又はＧＡＡ量（例えば、抗ＧＡＡ抗体を用いたウエスタンブロットによる）の測定；筋肉試料などの組織におけるグリコーゲン含有量の測定；筋肉（例えば、上腕三頭筋、大腿四頭筋、横隔膜及び心臓）、脊髄（頸部胸部及び腰部脊髄セグメントの前角におけるＣｈＡＴ陽性運動ニューロンの検査及びカウント、並びにアストログリア反応及びミクログリア活性の評価を含む）の組織学的評価、；静かな呼吸中の呼吸機能の評価；前肢ワイヤー−ハンギング試験；握力の測定；運動協調性のロータロッド試験（例えば、ロータロッドプロトコールによる）；心臓肥大を示すことができる胸部Ｘ線；心機能を検査するための心電図（ＥＣＧ）；ミオパチーを示すことができる筋電図（ＥＭＧ）；皮膚線維芽細胞におけるＧＡＡ活性の測定；乾燥させた血液試料中のＧＡＡ活性のアッセイ；上昇した場合にポンペ病の非特異的マーカーになる血清クレアチンキナーゼの血液／血清試験；ポンペ病の筋肉からの放出の指標として上昇する可能性のある、アミノトランスフェラーゼ、アラニンアミノトランスフェラーゼ、又は乳酸デヒドロゲナーゼの血液／血清試験；尿中のグルコース四糖の試験（ポンペ病の強力な非特異的マーカー）；総ＧＡＡタンパク質及び血漿中の活性によって評価されるピーク及び定常状態のベクター由来ＧＡＡ酵素レベルの分析；肺機能の試験；筋肉機能の試験；細胞液胞中のグリコーゲンの存在についての筋肉生検及び染色；肝臓の健康のバイオマーカー；リソソームの健康の検査；ＡＡＶカプシドに対する免疫応答の試験；ＧＡＡ導入遺伝子タンパク質生成物に対する免疫応答の試験；６分間の歩行試験（６ＭＷＴ）；強制された生命力試験；ピーク及び定常状態のＡＡＶベクター由来ＧＡＡ酵素レベル（血漿中で測定された総ＧＡＡタンパク質及び活性によって評価される）；歩行、階段、ガウアー、及び椅子（ＧＳＧＣ）試験；ラッシュが構築した医療研究評議会（ＭＲＣ）の評価尺度を使用した筋力試験；患者が報告した生活活動／社会参加；ポリソムノグラフィー（ＰＳＧ）からの定量的な睡眠及び睡眠呼吸の測定；患者報告の倦怠感、日中の眠気、及び睡眠の質の測定；Ｗａｌｔｏｎ及びＧａｒｄｎｅｒ−Ｍｅｄｗｉｎ（ＷＧＭ）スコア；限定されないが、鼻の吸気圧（ＳＮＩＰ）、及び最大吸気圧と呼気圧（それぞれＭＩＰ及びＭＥＰ）を含む呼吸機能試験；肝臓バイオマーカー；βヘキソサミニダーゼ（βＨｅｘｏ）試験；限定されないが、短い形態の３６健康調査（ＳＦ−３６）を含む健康結果測定；Ｒａｓｃｈが構築したポンペ病の比放射能（Ｒ−ＰＡｃｔ）スケール；倦怠感重症度スコア（ＦＳＳ）；並びに患者報告の結果測定情報システム（ＰＲＯＭＩＳ）アイテムバンクが含まれる。
[0298]さらに、本発明のＧＡＡをコードする修飾された核酸、ＧＡＡをコードする修飾された核酸及びｒＡＡＶベクターを含む発現カセットは、グリコーゲン蓄積症（ＧＳＤ）の治療に使用することができる。グリコーゲン蓄積症には、例えば、ＧＳＤタイプＩ（フォン・ギールケ病）、ＧＳＤタイプＩＩ（ポンペ病）、ＧＳＤタイプＩＩＩ（フォーブス・コリ病）、ＧＳＤタイプＩＶ（アンダーソン病、アミロペクチン症）、ＧＳＤタイプＶ（マッカードル病）、ＧＳＤタイプＶＩ（ハース病）、ＧＳＤタイプＶＩＩ（垂井病）、又は心臓の致死的な先天性グリコーゲン蓄積症が含まれる。
[0299]本明細書に記載されるように、ｒＡＡＶは、細胞を透過し、核酸／遺伝物質を細胞内に導入することができるため、遺伝子療法ベクターとして有用である。ＡＡＶはヒトの病原性疾患と関連付けられないため、ｒＡＡＶベクターは、実質的なＡＡＶの病因又は疾患を引き起こすことなく、異種ポリヌクレオチド配列（例えば、治療タンパク質及び薬剤）をヒト患者に送達することができる。
[0300]ｒＡＡＶベクターは、分裂細胞及び非分裂細胞に対する指向性を含む、このような用途のための多くの望ましい特徴を有する。これらのベクターを用いた初期の臨床経験はまた、持続的な毒性を示さず、免疫応答は一般にごくわずかであるか検出不能である。ＡＡＶは、受容体媒介性のエンドサイトーシス又はトランスサイトーシスにより、インビボで広範な細胞型に感染することが公知である。これらのベクター系は、網膜上皮、肝臓、骨格筋、気道、脳、関節及び造血幹細胞などの多くの組織を標的とするヒトにおいて研究されている。
[0301]例えば、複数コピーのＧＡＡ、従ってより多量のＧＡＡタンパク質を提供することができるｒＡＡＶベクターを導入することが望ましい場合がある。改良されたｒＡＡＶベクター及びこれらのベクターを生成する方法はＷｒｉｇｈｔ Ｊ．Ｆ．（Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、２０巻：６９８〜７０６頁、２００９年）などの多数の参考文献、特許、及び特許出願において詳細に記載される。
[0302]ｒＡＡＶベクターの直接送達又はヒト細胞のエクスビボ形質導入に続く体内への注入は、異種核酸の発現をもたらし、それによって止血に有益な治療効果を発揮する。ＧＡＡをコードする修飾された核酸との関連で、投与は、グリコーゲンの量若しくは蓄積を抑制、阻害又は減少させ、グリコーゲンの蓄積を防止し、又はグリコーゲンを分解する。これは、次に、筋緊張及び／又は筋力の促進又は改善、及び／又は肥大した肝臓の低下又は減少などの、ポンペ病の１つ又は複数の有害作用を抑制し、阻害し、低下させ、又は減少させることができる。
[0303]組換えＡＡＶベクター、並びにその方法及び使用には、任意のウイルス株又は血清型が含まれる。非限定的な例として、組換えＡＡＶベクターは、任意のＡＡＶゲノム、例えば、ＡＡＶ（配列番号３０〜３２）、ＬＫ０３（配列番号３３）、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、Ｒｈ１０、Ｒｈ７４、ＡＡＶ３Ｂ又はＡＡＶ−２ｉ８に基づくことができる。このようなベクターは、同一の株若しくは血清型（又はサブグループ若しくはバリアント）に基づくことができ、又は互いに異なることができる。非限定的な例として、特定の血清型ゲノムに基づく組換えＡＡＶベクターは、ベクターをパッケージするカプシドタンパク質の血清型と同一であり得る。さらに、組換えＡＡＶベクターゲノムは、ベクターをパッケージするＡＡＶカプシドタンパク質の血清型とは異なるＡＡＶ血清型ゲノムに基づくことができる。例えば、ＡＡＶベクターゲノムは、ＡＡＶ２に基づくことができ、３つのカプシドタンパク質のうちの少なくとも１つは、例えば、ＡＡＶ（配列番号３０〜３２）、ＬＫ０３（配列番号３３）、ＡＡＶ１、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、Ｒｈ１０、Ｒｈ７４、ＡＡＶ３Ｂ若しくはＡＡＶ−２ｉ８又はそれらのバリアントであり得る。
[0304]特定の実施形態では、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターには、ＡＶ（配列番号３０〜３２）、ＬＫ０３（配列番号３３）、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＶ１２、Ｒｈ１０、Ｒｈ７４、ＡＡＶ３Ｂ及びＡＡＶ−２ｉ８、並びにそれらのバリアント（例えば、アミノ酸挿入、付加、置換及び欠失などのカプシドバリアント）、例えば、国際公開第ＷＯ２０１３／１５８８７９号（国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０３７１７０）、国際公開第ＷＯ２０１５／０１３３１３号（国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０４７６７０）及び米国特許出願公開第２０１３／００５９７３２号（米国特許第９，１６９，２９９号、ＬＫ０１、ＬＫ０２、ＬＫ０３などを開示する）に記載されているものが含まれる。
[0305]本明細書で使用される場合、用語「血清型」は、他のＡＡＶ血清型と血清学的に区別されるカプシドを有するＡＡＶを指すために使用される区別である。血清学的区別は、別のＡＡＶと比較して１つのＡＡＶに対する抗体間の交差反応性の欠如に基づいて決定される。このような交差反応性の差は、通常、カプシドタンパク質配列／抗原決定基の差（例えば、ＡＡＶ血清型のＶＰ１、ＶＰ２、及び／又はＶＰ３配列の差）によるものである。カプシドバリアントを含むＡＡＶバリアントは、参照ＡＡＶ又は他のＡＡＶ血清型と血清学的に区別され得ない可能性があるにもかかわらず、参照又は他のＡＡＶ血清型と比較して、少なくとも１つのヌクレオチド又はアミノ酸残基で相違する。
[0306]従来の定義では、血清型とは、目的のウイルスが、中和活性のために、全ての既存の及び特徴付けられた血清型に特異的な血清に対して試験されており、目的のウイルスを中和する抗体が見つからなかったことを意味する。より多くの天然に存在するウイルス分離株が発見され、及び／又はカプシド変異体が生成されるにつれて、現存する血清型のいずれとも血清学的差異が存在する場合もあれば、存在しない場合もある。したがって、新しいウイルス（例えば、ＡＡＶ）が血清学的差異を持たない場合、この新しいウイルス（例えば、ＡＡＶ）は、対応する血清型のサブグループ又はバリアントである。多くの場合、カプシド配列修飾を有する変異ウイルスに対して、なおも中和活性の血清学的試験を行う必要があり、従来の血清型の定義に従った別の血清型であるかどうかを決定する必要がある。したがって、便宜上、及び繰り返しを避けるために、用語「血清型」は、広くは、血清学的に区別されるウイルス（例えば、ＡＡＶ）、並びに所与の血清型のサブグループ又はバリアント内にあり得る血清学的に区別されないウイルス（例えば、ＡＡＶ）の両方を指す。
[0307]本明細書に記載されるように、ＡＡＶカプシドタンパク質は、参照又は親のＡＡＶ血清型、例えば、ＡＡＶ（配列番号３０〜３２）、ＬＫ０３（配列番号３３）、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、Ｒｈ１０、Ｒｈ７４、ＡＡＶ３Ｂ又はＡＡＶ−２ｉ８と１００％未満の配列同一性を示すことができるが、公知のＡＡＶ遺伝子又はタンパク質、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、Ｒｈ１０、Ｒｈ７４、ＡＡＶ３Ｂ又はＡＡＶ−２ｉ８とは区別され、同一ではない。一実施形態では、修飾された／バリアントＡＡＶカプシドタンパク質は、参照又は親のＡＡＶカプシドタンパク質、例えば、ＡＡＶ（配列番号３０〜３２）、ＬＫ０３（配列番号３３）、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、Ｒｈ１０、Ｒｈ７４、ＡＡＶ３Ｂ又はＡＡＶ−２ｉ８と少なくとも８０％、８５％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％など、最大９９．９％同一である配列を含むか又はそれからなる。
[0308]ｒＡＡＶベクターは、例えば、静脈内注入を介して、生物学的に適合性のある担体中の注入を介して患者に投与することができる。ｒＡＡＶベクターは、単独で又は他の分子と組み合わせて投与することができる。したがって、ｒＡＡＶベクター及び他の組成物、薬剤、薬物、生物学的製剤（タンパク質）を医薬組成物に組み込むことができる。このような医薬組成物は、特に、対象へのインビボ又はエクスビボでの投与及び送達に有用である。
[0309]特定の実施形態では、医薬組成物はまた、薬学的に許容される担体又は賦形剤を含む。このような賦形剤は、それ自体が、組成物を受け取る個体に有害な免疫応答を誘導せず、過度の毒性なしに投与され得る任意の医薬物質を含む。
[0310]本明細書で使用される場合、用語「薬学的に許容される」及び「生理学的に許容される」とは、１つ又は複数の投与経路、インビボ送達又は接触に適した、生物学的に許容される製剤、気体、液体若しくは固体、又はそれらの混合物を意味する。「薬学的に許容される」又は「生理学的に許容される」組成物は、生物学的又は他には望ましくない物質であり、例えば、実質的な望ましくない生物学的効果を引き起こすことなく、物質を対象に投与することができる。したがって、このような医薬組成物は、例えば、核酸、ベクター、ウイルス粒子又はタンパク質を対象に投与する際に使用することができる。
[0311]薬学的に許容される賦形剤には、限定されないが、水、生理食塩水、グリセロール、糖及びエタノールなどの液体が含まれる。薬学的に許容される塩はまた、本明細書において、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩などの無機酸塩；及び酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩などの有機酸の塩を含み得る。賦形剤はまた、アルブミンなどのタンパク質を含む。さらに、湿潤剤又は乳化剤、ｐＨ緩衝物質などの補助物質がこのようなビヒクルに存在し得る。
[0312]医薬組成物は、塩として提供することができ、限定されないが、塩酸、硫酸、酢酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸などを含む多数の酸で形成することができる。塩は、対応する遊離塩基形態よりも、水性又は他のプロトン性溶媒中でより溶解性である傾向がある。他の場合には、調製物は、使用前に緩衝液と組み合わせて、ｐＨ４．５〜５．５の範囲で、以下：１〜５０ｍＭのヒスチジン、０．１〜２％のスクロース、及び２〜７％のマンニトールのいずれか又は全てを含有し得る凍結乾燥粉末であり得る。
[0313]医薬組成物は、薬学的投与又はインビボ接触若しくは送達に適合性がある、溶媒（水性又は非水性）、溶液（水性又は非水性）、エマルジョン（例えば、水中油又は油中水）、懸濁液、シロップ、エリキシル、分散及び懸濁媒体、被覆剤、等張性及び吸収促進剤又は遅延剤を含む。水性及び非水性溶媒、溶液及び懸濁液は、懸濁剤及び増粘剤を含み得る。このような薬学的に許容される担体には、錠剤（被覆された又は被覆されていない）、カプセル（硬質又は軟質）、マイクロビーズ、粉末、顆粒及び結晶が含まれる。補足的活性化合物（例えば、防腐剤、抗菌剤、抗ウイルス剤及び抗真菌剤）はまた組成物に組み込むことができる。
[0314]医薬組成物は、本明細書に記載されるか又は当業者に公知であるように、投与又は送達の特定の経路と適合性があるように製剤化することができる。したがって、医薬組成物は、種々の経路による投与に適した担体、希釈剤、又は賦形剤を含む。
[0315]非経口投与に適した組成物は、活性化合物の水性及び非水性溶液、懸濁液又はエマルジョンを含み、これらの調製物は、典型的には無菌であり、意図されたレシピエントの血液と等張であり得る。非限定的な例証となる例としては、水、緩衝化生理食塩水、ハンクス液、リンゲル液、デキストロース、フルクトース、エタノール、動物油、植物油又は合成油が挙げられる。水性注入懸濁液は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、又はデキストランなどの懸濁液の粘度を増加させる物質を含み得る。
[0316]さらに、活性化合物の懸濁液は、適切な油注入懸濁液として調製することができる。適切な親油性溶媒又はビヒクルには、ゴマ油などの脂肪油、又はオレイン酸エチル若しくはトリグリセリドなどの合成脂肪酸エステル、又はリポソームが含まれる。任意選択で、懸濁液はまた、高濃度溶液の調製を可能にするために化合物の溶解度を増加させる適切な安定化剤又は試薬を含み得る。
[0317]共溶媒及びアジュバントを製剤に添加することができる。共溶媒の非限定的な例には、ヒドロキシル基又は他の極性基、例えば、イソプロピルアルコールなどのアルコール；プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、グリコールエーテルなどのグリコール；グリセロール；ポリオキシエチレンアルコール及びポリオキシエチレン脂肪酸エステルが含まれる。アジュバントには、例えば、大豆レシチン及びオレイン酸などの界面活性剤；ソルビタントリオレエートなどのソルビタンエステル；及びポリビニルピロリドンが含まれる。
[0318]医薬組成物が調製された後、それらを適切な容器に入れ、治療のためにラベルを付けることができる。このようなラベルには、投与量、頻度、及び方法が含まれ得る。
[0319]本発明の組成物、方法及び使用に適した医薬組成物及び送達システムは、当該技術分野において公知である（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ（２００３年）、第２０版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ；Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９９０年）、第１８版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ；Ｔｈｅ Ｍｅｒｃｋ Ｉｎｄｅｘ （１９９６年）、第１２版、Ｍｅｒｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ、Ｗｈｉｔｅｈｏｕｓｅ、ＮＪ；Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｓｏｌｉｄ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ（１９９３年）、Ｔｅｃｈｎｏｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｉｎｃ．、Ｌａｎｃａｓｔｅｒ、Ｐａ．；Ａｎｓｅｌ ａｎｄ Ｓｔｏｋｌｏｓａ、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎｓ（２００１年）、第１１版、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、ＭＤ；及びＰｏｚｎａｎｓｋｙら、Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ（１９８０年）、Ｒ．Ｌ．Ｊｕｌｉａｎｏ編集、Ｏｘｆｏｒｄ、Ｎ．Ｙ．、２５３〜３１５頁を参照されたい）。
[0320]「有効量」又は「十分量」とは、単回又は複数回用量において、単独で又は組み合わせて、１つ又は複数の他の組成物（薬物などの治療剤又は免疫抑制剤）、治療、プロトコール、又は治療レジメン剤とともに、任意の持続時間（長期又は短期）の検出可能な応答、任意の測定可能若しくは検出可能な程度の対象における又は任意の持続時間（例えば、分、時間、日、月、年、又は治癒）の期待される又は望ましい結果を提供する量を指す。
[0321]用量は様々であり、治療が指示される疾患のタイプ、発症、進行、重症度、頻度、持続期間、又は確率、望ましい臨床エンドポイント、以前の又は同時の治療、対象の一般的な健康、年齢、性別、人種又は免疫学的能力、及び当業者によって認識される他の要因に依存し得る。投薬量、数、頻度又は持続期間は、治療若しくは療法の副作用、合併症又は他の危険因子、及び対象の状態によって示されるように、比例的に増加又は減少させることができる。当業者は、治療的又は予防的利益を提供するのに十分な量を提供するのに必要な投薬量及び時期に影響し得る因子を理解する。
[0322]治療効果を達成するための用量、例えば、体重１ｋｇあたりのベクターゲノム中の用量（ｖｇ／ｋｇ）は、限定されないが、投与経路、治療効果を達成するために必要な異種ポリヌクレオチド発現のレベル、治療された特異的疾患、ウイルスベクターに対する任意の宿主免疫応答、異種ポリヌクレオチド又は発現生成物（タンパク質）に対する宿主免疫応答、及び発現されたタンパク質の安定性を含むいくつかの因子に基づいて変化する。当業者は、前述の因子並びに他の因子に基づいて、特定の疾患又は障害を有する患者を治療するために、ｒＡＡＶ／ベクターゲノム用量範囲を決定することができる。
[0323]一般的に、用量は、対象の体重１キログラムあたり少なくとも１×１０８ベクターゲノム（ｖｇ／ｋｇ）又はそれ以上、例えば、対象の体重１キログラムあたり１×１０９、１×１０１０、１×１０１１、１×１０１２、１×１０１３若しくは１×１０１４（ｖｇ／ｋｇ）、又はそれ以上から治療効果が達成されるまでの範囲になると予想される。１×１０１０〜１×１０１１ｖｇ／ｋｇの範囲のｒＡＡＶ用量はマウスで、１×１０１２〜１×１０１３ｖｇ／ｋｇはイヌで効果的であった。用量は、例えば、６×１０１２ｖｇ／ｋｇ未満の用量であり得る。より詳細には、５×１０１１ｖｇ／ｋｇ又は１×１０１２ｖｇ／ｋｇの用量。
[0324]ｒＡＡＶベクター用量は、異種核酸配列、コードされたタンパク質若しくは阻害性核酸、又はｒＡＡＶベクターに対する実質的な免疫応答が存在しないように、典型的には用量スペクトルの下端のレベルであり得る。より具体的には、最大で６×１０１２ｖｇ／ｋｇ未満の用量、例えば、約５×１０１１〜約５×１０１２ｖｇ／ｋｇ、より具体的には約５×１０１１ｖｇ／ｋｇ又は約１×１０１２ｖｇ／ｋｇ。
[0325]本明細書で使用される「単位投薬形態」とは、治療される対象のための単一の投薬量として適した物理的に離散した単位を指し；各単位は、所望の効果（例えば、予防又は治療効果）をもたらすように、１つ又は複数の用量で投与された場合に計算される、医薬担体（賦形剤、希釈剤、ビヒクル又は充填剤）と任意選択で関連付けた所定量を含有する。単位投薬形態は、例えば、液体組成物、又は凍結−乾燥（freeze-dried）若しくは凍結乾燥（lyophilized）状態の組成物を含み得るアンプル及びバイアル内にあり得；例えば、無菌液体担体は、インビボでの投与又は送達の前に添加され得る。個々の単位投薬形態は、複数回の投薬キット又は容器に含めることができる。ｒＡＡＶ粒子、及びその医薬組成物は、投与の容易さ及び投薬量の均一性のために、単一又は複数の単位投薬形態で包装することができる。
[0326]治療のための「有効量」又は「十分量」の用量（例えば、向上するため、又は治療上の利益又は改善を提供するため）は、典型的には、疾患の１つ、複数若しくはすべての有害な症状、結果又は合併症、例えば、測定可能な程度まで、疾患に起因して又は関連付けられた、１つ又は複数の有害な症状、障害、病気、病態、又は合併症に対して、応答を提供するのに有効であるが、疾患の進行又は悪化を減少、低下、阻害、抑制、制限又は制御することは満足のいく結果である。
[0327]有効量又は十分量は、単一の投与において提供され得るが、必ずしもそうではなく、複数の投与を必要とし得、単独で又は別の組成物（例えば、薬剤）、治療、プロトコール又は治療レジメンと組み合わせて投与され得るが、必ずしもそうではない。例えば、量は、対象の必要性、治療された疾患のタイプ、状態及び重症度、又は治療の副作用（もしあれば）によって示されるように、比例的に増加され得る。さらに、有効量又は十分量は、第２の組成物（例えば、別の薬物又は薬剤）、治療、プロトコール又は治療レジメンを伴わずに、単回又は複数回投薬する場合、有効又は十分である必要はない。これは、追加の用量、このような用量を上回る若しくは超える量又は期間、或いは追加の組成物（例えば、薬物又は薬剤）、治療、プロトコール又は治療レジメンが、所与の対象において有効又は十分と考えられるために含めることができるためである。有効と考えられる量はまた、ＧＡＡ欠乏症（例えば、ポンペ病）又は別のグリコーゲン蓄積症の治療のためのＧＡＡをコードする修飾された核酸の投与などの、別の治療、治療レジメン又はプロトコールの使用の減少をもたらす量を含む。
[0328]したがって、本発明の方法及び使用はまた、とりわけ、別の化合物、薬剤、薬物、療法レジメン、治療プロトコール、プロセス、若しくは救済の減少した必要性又は使用をもたらす方法及び使用を含む。例えば、ＧＡＡ欠乏に関して、本発明の方法又は方法は、対象におけるＧＡＡの欠乏又は欠陥に対して補足するために、組換えＧＡＡ投与の頻度が低い又は低下した用量又は除去が、所与の対象おいて行われる場合、治療上の利益を有する。したがって、本発明によれば、別の治療又は療法の必要性又は使用を減少させる方法及び使用が提供される。
[0329]有効量又は十分量は、治療された各々の及び全ての対象、又は所与の群若しくは集団における治療された対象の大部分において有効である必要はない。有効量又は十分量とは、群又は一般集団ではなく特定の対象における有効性又は十分性を意味する。このような方法に典型的なように、一部の対象は、所与の治療方法又は使用に対して、より大きな反応を示すか、又はより小さい反応を示すか若しくは反応を示さない。
[0330]対象への投与又はインビボ送達は、疾患に起因した又は関連付けられた有害な症状、状態、合併症などの発症に先立って行うことができる。例えば、スクリーニング（例えば、遺伝学的）を用いて、このような対象を、本発明の組成物、方法及び使用のための候補として同定することができる。したがって、このような対象には、機能性遺伝子生成物（例えば、ＧＡＡ、又はＧＳＤにつながるタンパク質欠乏）の不十分な量又は欠乏に関して陽性とスクリーニングされた対象、又は異常、部分的に機能性又は非機能性の遺伝子生成物（例えば、ＧＡＡ、又はＧＳＤに関与するタンパク質）を生成する対象が含まれる。
[0331]本明細書に開示される本発明の方法及び使用に従った対象への投与又はインビボ送達は、対象が、治療の標的となる疾患を有し、疾患の１つ又は複数の症状を有し、又は対象が疾患の１つ又は複数の症状を有さないにもかかわらず、スクリーニングされ、本明細書に記載される陽性であるとして同定された後の１〜２時間、２〜４時間、４〜１２時間、１２〜２４時間、又は２４〜７２時間以内に行うことができる。当然に、本発明の方法及び使用は、対象が、治療の標的となる疾患を有し、疾患の１つ又は複数の症状を有し、又はスクリーニングされ、本明細書に記載される陽性であるとして同定された後の１〜７日、７〜１４日、１４〜２４日、２４〜４８日、４８〜６４日以上、数カ月又は数年後に行うことができる。
[0332]用語「向上する」とは、対象の疾患若しくはその症状、又は根底にある細胞応答における検出可能又は測定可能な改善を意味する。検出可能又は測定可能な改善は、疾患の発生、頻度、重症度、進行、又は期間における主観的若しくは客観的な減少、低下、阻害、抑制、制限若しくは制御、或いは疾患に起因した又は関連付けられた合併症、或いは疾患の症状若しくは基礎原因若しくは結果における改善、或いは疾患の回復を含む。
[0333]ポンペ病の場合、有効量は、例えば、グリコーゲンの生成又は蓄積を阻害若しくは低下させ、グリコーゲンの分解若しくは除去を増強又は増加させる量である。また、有効量は、摂食困難及び／又は体重増加欠如；頭部及び／又は頸部の制御不良；呼吸障害及び／又は肺感染症；心臓の肥大及び／又は肥厚；心臓欠陥；舌肥大；嚥下困難；肝臓肥大；筋力不足；弱筋緊張；脚、腰及び／又は腕の脱力；息切れ；運動困難；睡眠中の呼吸困難；脊椎の湾曲；及び／又は硬い関節；弱筋緊張及び／又は筋力欠如を改善又は向上する量である。有効量はまた、１つ又は複数の症状を減少若しくは抑制し、又は１つ又は複数の症状の進行若しくは悪化を予防若しくは低下し、又は１つ又は複数の症状を安定させ、又はＧＡＡを必要とするか若しくはポンペ病を有する患者若しくは対象における１つ又は複数の症状を改善する量である。
[0334]治療用量は、他の因子の中でも、対象の年齢及び全身状態、疾患又は障害の重症度に依存する。ヒトにおける治療有効量は、個々の患者の反応に基づいて、医師によって決定され得る比較的広い範囲に含まれる。
[0335]医薬組成物などの組成物は、コードされたタンパク質の生成を可能にするために、対象に送達させることができる。特定の実施形態では、医薬組成物は、レシピエントが対象中に治療上有効量のタンパク質を生成することを可能にするのに十分な遺伝物質を含む。
[0336]組成物は、限定されないが、生理食塩水、緩衝化生理食塩水、デキストロース、及び水を含む、任意の無菌の生体適合性のある医薬担体中に処方及び／又は投与することができる。組成物は、単独で、又は止血に影響する他の薬剤（例えば、補因子）と組み合わせて、患者に処方及び／又は投与することができる。
[0337]本発明の方法及び使用は、全身的に、局部的に又は局所的に、又は任意の経路、例えば、注入又は輸注による送達及び投与を含む。インビボでの医薬組成物の送達は、一般的に、従来の注入器を用いた注入によって達成することができるが、対流強化送達などの他の送達方法が考えられる（例えば、米国特許第５，７２０，７２０号を参照されたい）。例えば、組成物は、皮下、表皮内、皮内、くも膜内、眼窩内、粘膜内、鼻腔内、腹腔内、静脈内、胸膜内、動脈内、腔内、経口、肝内、門脈を介して、又は筋肉内に送達され得る。他の投与様式には、経口及び肺投与、坐薬、及び経皮適用が含まれる。ポンペ又は他のグリコーゲン蓄積症の患者の治療を専門とする臨床医は、限定されないが、患者の状態及び治療の目的（例えば、増大又は低下したＧＡＡレベル）などの多数の基準に基づいて、アデノ随伴ウイルスベクターの投与のための最適経路を決定することができる。
[0338]組成物は単独で投与することができる。ある実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、免疫抑制剤なしで治療効果を与える。治療効果は、任意選択で、免疫抑制剤を投与せずに、一定期間、例えば、２〜４、４〜６、６〜８、８〜１０、１０〜１４、１４〜２０、２０〜２５、２５〜３０、又は３０〜５０日以上、例えば、５０〜７５、７５〜１００、１００〜１５０、１５０〜２００日以上維持される。したがって、治療効果は、一定期間与えられる。
[0339]発明ｒＡＡＶベクター、方法及び使用は、所望の治療、有益、相加的、相乗的若しくは相補的活性又は効果を有する任意の化合物、薬剤、薬物、治療又は他の治療レジメン若しくはプロトコールと組み合わせることができる。例示的な組合せ組成物及び治療には、生物学的製剤（タンパク質）、薬剤（例えば、免疫抑制剤）及び薬物などの第２の活性剤が含まれる。このような生物学的製剤（タンパク質）、薬剤、薬物、治療及び療法は、本発明の任意の他の方法又は使用に先立って、実質的に同時に、又はそれに続いて、投与又は実施することができる。
[0340]化合物、薬剤、薬物、治療又は他の療法レジメン若しくはプロトコールは、組合せ組成物として投与することができ、又は核酸、ベクター、若しくはｒＡＡＶ粒子の送達若しくは投与と同時に、又は連続的に（送達の前又は後に）投与するなど、別々に投与することができる。したがって、本発明は、本明細書に記載されるか又は当業者に公知の任意の化合物、薬剤、薬物、療法レジメン、治療プロトコール、プロセス、治療薬又は組成物との組合せで本発明の方法又は使用が行われる組合せを提供する。化合物、薬剤、薬物、治療レジメン、治療プロトコール、プロセス、治療薬又は組成物は、本発明の核酸、ベクター又はｒＡＡＶ粒子の対象への投与に先立って、実質的に同時に、又はその後に投与又は実施することができる。
[0341]ある実施形態では、本発明の核酸、ベクター、又はｒＡＡＶ粒子は、患者がｒＡＡＶ粒子及び／又はＧＡＡタンパク質に対する免疫応答を有するか又は発現するリスクがある場合に、免疫抑制剤又はレジメンと組み合わせて患者に投与される。このような免疫抑制剤又はレジメンは、本発明の核酸、ベクター、又はｒＡＡＶベクターを投与する前、実質的に同時に、又は後に投与することができる。
[0342]一部の実施形態では、ポンペ病のヒト患者などの対象又は患者は、ＧＡＡタンパク質に対する阻害因子（抗ＧＡＡ抗体及び／又は抗ＧＡＡ Ｔ細胞を含む）を発生させており、これは、従来の酵素補充療法による治療後（例えば、組換えにより生成されたＧＡＡタンパク質の投与後）に起こり得る。このようなＧＡＡ阻害因子の発生は、酵素補充療法を受ける患者、特に患者が検出不能なＧＡＡレベル（乳児ポンペ病の場合であり得るように）を有する患者において起こり得、患者の免疫系を、補充ＧＡＡタンパク質を「異物」と見なすようにさせる。ある実施形態では、ＧＡＡ阻害因子を有するポンペ患者は、本発明のｒＡＡＶベクターを投与する前、実質的に同時に、又は後に、患者におけるＧＡＡタンパク質に対する免疫寛容を達成するか又は免疫応答を緩和することを意図した１つ又は複数のレジメンを投与される。ＧＡＡタンパク質に対する免疫寛容を達成するか又は免疫応答を緩和するこのようなレジメンには、限定されないが、メトトレキサート、リツキシマブ、静脈内ガンマグロブリン（ＩＶＩＧ）、オマリズマブ、及び合成ワクチン粒子（ＳＶＰＴＭ）−ラパマイシン（生分解性ナノ粒子中に封入されたラパマイシン）を含む１種又は複数の免疫抑制剤の投与、及び／又はＢ細胞枯渇、免疫吸着、及びプラスマフェレーシスなどの１つ又は複数の免疫抑制プロトコール又は手段の投与が含まれ得る。
[0343]ある実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、ｒＡＡＶベクターを投与する前、実質的に同時に、又は後に、１つ又は複数の免疫抑制剤を併用して投与される。ある実施形態では、ｒＡＡＶベクターの投与後、例えば、１〜１２、１２〜２４若しくは２４〜４８時間、又は２〜４、４〜６、６〜８、８〜１０、１０〜１４、１４〜２０、２０〜２５、２５〜３０、３０〜５０、又は５０日を超える。ｒＡＡＶベクター後の一定期間、例えば、２０〜２５、２５〜３０、３０〜５０、５０〜７５、７５〜１００、１００〜１５０、１５０〜２００、又は２００日を超えて、初期の発現レベル後、コードされたタンパク質又は阻害性核酸が減少した場合、ｒＡＡＶベクター投与後の一定期間後の免疫抑制剤のこのような投与。
[0344]ある実施形態では、免疫抑制剤は、抗炎症剤である。ある実施形態では、免疫抑制剤は、ステロイド、例えばコルチコステロイドである。ある実施形態では、免疫抑制剤は、プレドニゾン、プレドニゾロン、シクロスポリン（例えば、シクロスポリンＡ）、ミコフェノール酸、Ｂ細胞標的化抗体、例えば、リツキシマブ；プロテアソーム阻害剤、例えば、ボルテゾミブ；ラパマイシン（ｍＴＯＲ）阻害剤の哺乳動物標的、例えば、ラパマイシン；チロシンキナーゼ阻害剤、例えば、イブルチニブ；Ｂ細胞活性化因子（ＢＡＦＦ）の阻害剤；又は増殖誘導リガンド（ＡＰＲＩＬ）の阻害剤又はその誘導体である。ある実施形態では、免疫抑制剤は、抗ＩＬ−１β剤（例えば、抗ＩＬ−１βモノクローナル抗体カナキヌマブ（Ｉｌａｒｉｓ（登録商標））又は抗ＩＬ−６剤（例えば、抗ＩＬ−６抗体シルクマブ又は抗ＩＬ−６受容体抗体トシリズマブ（Ａｃｔｅｍｒａ（登録商標））又はそれらの組合せである。
[0345]ラパマイシン単独又はＩＬ−１０との組合せの使用を含む免疫抑制プロトコールは、ＧＡＡタンパク質に対する体液性及び細胞性免疫応答を減少、低下、阻害、予防又はブロックするために使用され得る。本発明のＡＡＶベクターを用いた肝臓遺伝子導入は、調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇｓ）の誘導及び他のメカニズムを介してＧＡＡタンパク質に対する免疫寛容を誘導するために使用することができる。全身性遺伝子導入におけるＡＡＶに対する体液性免疫を低下（克服）又は回避するための戦略には、高ベクター用量での投与、抗ＡＡＶ抗体を吸着するデコイとしてのＡＡＶ空カプシドの使用、ＡＡＶに対する体液性免疫応答を減少、低下、阻害、予防又は根絶するための免疫抑制薬の投与、ＡＡＶカプシド血清型の変更又は中和抗体に対する感受性が低いようにＡＡＶカプシドを操作すること、抗ＡＡＶ免疫グロブリンを吸着するための血漿交換サイクルの使用、それによって抗ＡＡＶ抗体力価を低下させること、及びバルーンカテーテルのような送達技術の使用、続いて生理食塩水洗浄が含まれる。このような戦略は、Ｍｉｎｇｏｚｚｉら、２０１３年、Ｂｌｏｏｄ、１２２巻：２３〜３６頁に記載される。療法治療を改善するために、ポンペ患者においてＧＡＡに対する耐性を誘発する手法及びアプローチは、Ｄｏｅｒｆｌｅｒら、２０１６年、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．、３巻：１５０５３頁に概説される。
[0346]ＡＡＶ空カプシド対ｒＡＡＶベクターの比は、約１００：１〜５０：１、約５０：１〜２５：１、約２５：１〜１０：１、約１０：１〜１：１、約１：１〜１：１０、約１：１０〜１：２５、約１：２５〜１：５０、又は約１：５０〜１：１００の範囲内又はその間であり得る。比はまた、約２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、又は１０：１であり得る。
[0347]投与するＡＡＶ空カプシドの量は、特定の対象において生成されるＡＡＶ抗体の量（力価）に基づいて較正することができる。ＡＡＶ空カプシドは、任意の血清型、例えば、ＡＡＶ（配列番号３０〜３２）、ＬＫ０３（配列番号３３）、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、Ｒｈ１０、Ｒｈ７４、ＡＡＶ３Ｂ又はＡＡＶ−２ｉ８であり得る。
[0348]或いは、又は加えて、ｒＡＡＶベクターは、直接筋肉内注入（例えば、筋肉の１つ又は複数の遅筋繊維）によって送達することができる。別の代替では、大腿動脈に導入されたカテーテルを使用して、肝動脈を介してｒＡＡＶベクターを肝臓に送達させることができる。内視鏡的逆行性胆管膵管造影（ＥＲＣＰ）などの非外科的手段を用いて、ｒＡＡＶベクターを肝臓に直接送達させ、それによって血流及びＡＡＶ抗体をバイパスすることもできる。顎下腺の導管などの他の導管系もまた、ｒＡＡＶベクターを、既存の抗ＡＡＶ抗体を発現するか又は有する対象に送達するための門脈として使用することができる。
[0349]ＡＡＶに対する体液性免疫を低下させるためのさらなる戦略には、ＡＡＶ抗体を除去、枯渇、捕捉、及び／又は不活化する方法が含まれ、一般的にアフェレーシスと呼ばれ、より具体的には、血液生成物が関与するプラスマフェレーシスと呼ばれる。アフェレーシス又はプラスマフェレーシスは、患者に戻す前に、成分の添加、除去及び／又は置換を通して血漿を修飾する装置を通じて、ヒト対象の血漿をエクスビボ（体外）で循環させるプロセスである。プラスマフェレーシスは、血液生成物（例えば、血漿）からヒト免疫グロブリン（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤ）を除去するために使用することができる。この手法は、ＡＡＶに結合する免疫グロブリン（抗体）を枯渇させ、捕捉し、不活化し、低下させ、又は除去することにより、ＡＡＶベクター中和に寄与し得る治療対象におけるＡＡＶ抗体の力価を低下させる。一例は、ＡＡＶカプシド親和性マトリックスカラムで構成されるデバイスである。ＡＡＶカプシド親和性マトリックスに血液生成物（例えば、血漿）を通過させると、ＡＡＶ抗体、及び全てのアイソタイプ（ＩｇＧ、ＩｇＭなどを含む）の結合のみがもたらされる。
[0350]ＡＡＶカプシド親和性マトリックスを用いた十分量のプラスマフェレーシスは、ＡＡＶカプシド抗体を実質的に除去し、ヒトにおけるＡＡＶカプシド抗体力価（負荷）を低下させることが予測される。ある実施形態では、治療された対象における力価は、実質的に低いレベル（＜１：５、又はそれ未満、例えば、＜１：４、又は＜１：３、又は＜１：２、又は＜１：１）に低下される。ＡＡＶカプシド抗体を生成するＢリンパ球は、プラスマフェレーシス前にＡＡＶカプシド抗体力価を定常状態レベルにリバウンドさせることが予想されるため、抗体力価の低下は一時的である。
[0351]既存のＡＡＶ抗体力価が１：１００から１：１に低下した場合、プラスマフェレーシス法の終了後、１時間、３時間、６時間、１２時間及び２４時間にそれぞれ約０．１５％（１：１．２の力価に対応）、０．４３％（１：１．４）、０．９％（１：１．９）、１．７％（１：２．７）、及び３．４％（１：４．４）のＡＡＶ抗体力価のリバウンドが生じる。このような対象からのＡＡＶ抗体の一時的除去は、ＡＡＶベクターを対象に投与することができ、ＡＡＶベクターをＡＡＶ抗体で実質的に中和することなく標的組織を効率的に形質導入することが予測される時間ウィンドウ（例えば、約２４時間以内、例えば１２時間以内、又は６時間以内、又は３時間以内、又は２時間以内、又は１時間以内）に対応する。
[0352]既存のＡＡＶ抗体力価が１：１０００から１：１に低下した場合、プラスマフェレーシス法の終了後、１時間、３時間、６時間、１２時間及び２４時間にそれぞれ約０．１５％（１：２．５の力価に対応）、０．４％（１：５．３）、０．９％（１：９．７）、１．７％（１：１８）、及び３．４％（１：３５）のＡＡＶ抗体力価のリバウンドが生じる。したがって、ＡＡＶベクターの投与のためのウィンドウは、比較的短い。
[0353]ＡＡＶ抗体は、既存であり得、標的細胞の治療的ＧＡＡ遺伝子導入ベクター形質導入を低下又はブロックするレベルで存在し得る。或いは、ＡＡＶ抗体は、ＡＡＶへの曝露又はＡＡＶベクターの投与後に発現し得る。このような抗体がＡＡＶベクターの投与後に発現される場合、これらの対象は、アフェレーシス、より具体的にはプラスマフェレーシスにより治療することもできる。
[0354]一部の実施形態では、本発明の核酸、発現カセット及びＡＡＶベクターは、対症療法及び補助療法と組み合わせて使用することができ、これには、例えば、呼吸補助（人工呼吸器を含む）、筋肉を強化する理学療法、筋力及び身体能力を改善するための理学療法、杖、歩行具及び車椅子の使用を含む作業療法、明瞭な発音及び言語を改善するための言語療法、装具を含む整形外科装置の使用、並びに適切な栄養及び体重増加を確実にするための食事療法及び栄養チューブが含まれる。
[0355]一部の実施形態では、本発明の核酸、発現カセット及びＡＡＶベクターは、薬理学的シャペロン療法（酵素増強療法としても知られる）と組み合わせて使用することができ、１つ又は複数の薬理学的シャペロンは、ポンペ病などのＧＳＤの治療のために、本発明の核酸、発現カセット又はＡＡＶベクターの投与前、同時又は後に投与される。
[0356]一部の実施形態では、本発明の核酸、発現カセット及びＡＡＶベクターは、ＧＡＡタンパク質を安定化し得る１つ又は複数の薬理学的シャペロンと組み合わせて用いることができる。本発明の核酸、発現カセット及びＡＡＶベクターと組み合わせて用いることができる薬理学的シャペロンには、１−デオキシノジリマイシン（１−ＤＮＪ、デュボグルスタットとしても公知である）、Ｎ−ブチル−１−デオキシノジリマイシン（ミグルスタットとしても公知である）、Ｎ−メチル−ＤＮＪ、Ｎ−エチル−ＤＮＪ、Ｎ−プロピル−ＤＮＪ、Ｎ−ペンチル−ＤＮＪ、Ｎ−ヘキシル−ＤＮＪ、Ｎ−ヘプチル−ＤＮＪ、Ｎ−オクチル−ＤＮＪ、Ｎ−ノニル−ＤＮＪ、Ｎ−メチルシクロプロピル−ＤＮＪ、Ｎ−メチルシクロペンチル−ＤＮＪ、Ｎ−２−ヒドロキシエチル−ＤＮＪ、５−Ｎ−カルボキシペンチルＤＮＪ、並びに米国特許第６，５９９，９１９号及び第９，１８１，１８４号、及び国際特許出願公開第ＷＯ／２０１３／１８２６５２号に記載される薬理学的シャペロンが含まれる。
[0357]一部の実施形態では、本発明の核酸、発現カセット及びＡＡＶベクターは、例えば、クレンブテロール、アルブテロール、ホルモテロール及びサルメテロール、並びに国際特許出願公開第ＷＯ／２０１７／０４９１６１号に記載されものを含む１つ又は複数のβ２アゴニストとともに、補助療法と組み合わせて使用することができる。
[0358]特定の実施形態では、本発明の核酸及び発現カセットは、ＡＡＶベクター粒子を介して送達又は投与される。他の実施形態では、本発明の核酸及び発現カセットは、レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルパー依存性アデノウイルス、ハイブリッドアデノウイルス、単純ヘルペスウイルス、レンチウイルス、ポックスウイルス、エプスタイン−バーウイルス、ワクシニアウイルス、及びヒトサイトメガロウイルス粒子を含む他のタイプのウイルス粒子を介して送達又は投与することができる。
[0359]他の実施形態では、本発明の核酸及び発現カセットは、非ウイルス送達システムとともに送達又は投与される。非ウイルス送達システムとしては、例えば、化学的方法、例えばリポソーム、ナノ粒子、脂質ナノ粒子、ポリマー、マイクロ粒子、マイクロカプセル、ミセル、又は細胞外小胞、及び物理的方法、例えば遺伝子銃、エレクトロポレーション、粒子衝撃、超音波利用及び磁化が挙げられる。
[0360]一部の実施形態では、本発明の核酸及び発現カセットは、閉鎖末端線状二重鎖ＤＮＡの裸のＤＮＡ、ミニサークル、トランスポゾンとして送達される。
[0361]他の実施形態では、本発明の核酸及び発現カセットは、リポソーム、ナノ粒子、脂質ナノ粒子、ポリマー、マイクロ粒子、マイクロカプセル、ミセル、又は細胞外小胞とさらにカプセル化又は複合化されたＡＡＶベクター粒子、又は他のウイルス粒子中で送達又は投与される。
[0362]「脂質ナノ粒子」又は「ＬＮＰ」とは、ＡＡＶの送達に有用であり、ナノスケール、すなわち、約１０ｎｍ〜約１０００ｎｍ、又は約５０〜約５００ｎｍ、又は約７５〜約１２７ｎｍの寸法を有する脂質ベースの小胞を指す。理論に拘束されることなく、ＬＮＰは、免疫系からの部分的又は完全な遮蔽を有する核酸、発現カセット、又はＡＡＶベクターを提供するものと考えられる。遮蔽は、核酸、発現カセット、若しくはＡＡＶベクターの組織又は細胞への送達を可能にする一方で、インビボで核酸、発現カセット、又はＡＡＶベクターに対する実質的な免疫応答を誘導することを回避する。遮蔽はまた、核酸、発現ベクター又はＡＡＶベクターに対する実質的な免疫応答をインビボ（例えば、ヒトなどの対象）で誘導することなく、反復投与を可能にし得る。遮蔽はまた、インビボで核酸、発現カセット、又はＡＡＶベクターの送達効率を改善又は増大させ得る。
[0363]ＡＡＶのｐＩ（等電点）は、約６〜約６．５の範囲である。したがって、ＡＡＶ表面は、わずかな負電荷を有する。このようなものとして、ＬＮＰが、例えばアミノ脂質などのカチオン性脂質を含むことが有益であり得る。例示的なアミノ脂質は、米国特許第９，３５２，０４２号、同第９，２２０，６８３号、同第９，１８６，３２５号、同第９，１３９，５５４号、同第９，１２６，９６６号、同第９，０１８，１８７号、同第８，９９９，３５１号、同第８，７２２，０８２号、同第８，６４２，０７６号、同第８，５６９，２５６号、同第８，４６６，１２２号、及び同第７，７４５，６５１号、並びに米国特許出願公開第２０１６／０２１３７８５号、同第２０１６／０１９９４８５号、同第２０１５／０２６５７０８号、同第２０１４／０２８８１４６号、同第２０１３／０１２３３３８号、同第２０１３／０１１６３０７号、同第２０１３／００６４８９４号、同第２０１２／０１７２４１１号、及び同第２０１０／０１１７１２５号に記載される。
[0364]用語「カチオン性脂質」及び「アミノ脂質」は、本明細書において、１つ、２つ、３つ、若しくはそれを超える脂肪酸又は脂肪アルキル鎖及びｐＨ−滴定可能なアミノ基（例えば、アルキルアミノ又はジアルキルアミノ基）を有するそれらの脂質及び塩を含むために、互換的に使用される。カチオン性脂質は、典型的には、カチオン性脂質のｐＫａより低いｐＨでプロトン化され（すなわち、正に荷電され）、ｐＫａより高いｐＨで実質的に中性である。カチオン性脂質はまた、滴定可能なカチオン性脂質であり得る。一部の実施形態では、カチオン性脂質は、プロトン化可能な第三級アミン（例えば、ｐＨ−滴定可能）基；Ｃ１８アルキル鎖を含み、各アルキル鎖は、独立的に、０〜３個（例えば、０、１、２、又は３個）の二重結合；及び頭部基とアルキル鎖との間にエーテル、エステル、又はケタール連結を有することができる。
[0365]カチオン性脂質としては、限定されないが、１，２−ジリノレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、１，２−ジリノレニルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｅｎＤＭＡ）、１，２−ジ−γ−リノレニルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（γ−ＤＬｅｎＤＭＡ）、２，２−ジリノレイル−４−（２−ジメチルアミノエチル）−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−Ｋ−Ｃ２−ＤＭＡ、またＤＬｉｎ−Ｃ２Ｋ−ＤＭＡ、ＸＴＣ２、及びＣ２Ｋとしても公知である）、２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノメチル−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ）、ジリノレイルメチル−３−ジメチルアミノプロピオネート（ＤＬｉｎ−Ｍ−Ｃ２−ＤＭＡ、またＭＣ２としても公知である）、（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）−ヘプタトリアコンタ−６，９，２８，３１−テトラエン−１９−イル ４−（ジメチルアミノ）ブタノエート（ＤＬｉｎ−Ｍ−Ｃ３−ＤＭＡ、またＭＣ３としても公知である）、それらの塩、及びそれらの混合物が含まれ得る。他のカチオン性脂質としては、限定されないが、１，２−ジステアリルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパン（ＤＳＤＭＡ）、１，２−ジオレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパン（ＤＯＤＭＡ）、２，２−ジリノレイル−４−（３−ジメチルアミノプロピル）−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−Ｋ−Ｃ３−ＤＭＡ）、２，２−ジリノレイル−４−（３−ジメチルアミノブチル）−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−Ｋ−Ｃ４−ＤＭＡ）、ＤＬｅｎ−Ｃ２Ｋ−ＤＭＡ、γ−ＤＬｅｎ−Ｃ２Ｋ−ＤＭＡ、及び（ＤＬｉｎ−ＭＰ−ＤＭＡ）（また１−Ｂ１１としても公知である）が挙げられる。
[0366]なおさらに、カチオン性脂質には、限定されないが、２，２−ジリノレイル−５−ジメチルアミノメチル−［１，３］−ジオキサン（ＤＬｉｎ−Ｋ６−ＤＭＡ）、２，２−ジリノレイル−４−Ｎ−メチルペピアジノ−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−Ｋ−ＭＰＺ）、１，２−ジリノレイルカルバモイルオキシ−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ−Ｃ−ＤＡＰ）、１，２−ジリノレイオキシ−３−（ジメチルアミノ）アセトキシプロパン（ＤＬｉｎ−ＤＡＣ）、１，２−ジリノレイオキシ−３−モルホリノプロパン（ＤＬｉｎ−ＭＡ）、１，２−ジリノレオイル−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＡＰ）、１，２−ジリノレイルチオ−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ−Ｓ−ＤＭＡ）、１−リノレオイル−２−リノレイルオキシ−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ−２−ＤＭＡＰ）、１，２−ジリノレイルオキシ−３−トリメチルアミノプロパンクロリド塩（ＤＬｉｎ−ＴＭＡ．Ｃｌ）、１，２−ジリノレオイル−３−トリメチルアミノプロパンクロリド塩（ＤＬｉｎ−ＴＡＰ．Ｃｌ）、１，２−ジリノレイルオキシ−３−（Ｎ−メチルピペラジノ）プロパン（ＤＬｉｎ−ＭＰＺ）、３−（Ｎ，Ｎ−ジリノレイルアミノ）−１，２−プロパンジオール（ＤＬｉｎＡＰ）、３−（Ｎ，Ｎ−ジオレイルアミノ）−１，２−プロパンジオ（ＤＯＡＰ）、１，２−ジリノレイルオキソ−３−（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）エトキシプロパン（ＤＬｉｎ−ＥＧ−ＤＭＡ）、Ｎ，Ｎ−ジオレイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）、Ｎ−（１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、Ｎ，Ｎ−ジステアリル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、Ｎ−（１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＡＰ）、３−（Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル）コレステロール（ＤＣ−Ｃｈｏｌ）、Ｎ−（１，２−ジミリスチルオキシプロパ−３−イル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＭＲＩＥ）、２，３−ジオレイルオキシ−Ｎ−［２（スペルミン−カルボキサミド）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−トリフルオロ酢酸プロパナミニウム（ＤＯＳＰＡ）、ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン（ＤＯＧＳ）、３−ジメチルアミノ−２−（コレスト−５−エン−３−ベータ−オキシブタン−４−オキシ）−１−（ｃｉｓ，ｃｉｓ−９，１２−オクタデカジエノキシ）プロパン（ＣＬｉｎＤＭＡ）、２−［５’−（コレスト−５−エン−３−ベータ−オキシ）−３’−オキサペントキシ）−３−ジメチル−１−（ｃｉｓ，ｃｉｓ−９’，１−２’−オクタデカジエノキシ）プロパン（ＣｐＬｉｎＤＭＡ）、Ｎ，Ｎ−ジメチル−３，４−ジオレイルオキシベンジルアミン（ＤＭＯＢＡ）、１，２−Ｎ，Ｎ’−ジオレイルカルバミル−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＯｃａｒｂＤＡＰ）、１，２−Ｎ、Ｎ’−ジリノレイルカルバミル−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎｃａｒｂＤＡＰ）、デキサメタゾン−スペリミン（ＤＳ）及び二置換スペルミン（Ｄ２Ｓ）又はそれらの混合物が含まれ得る。
[0367]リポフェクチン（登録商標）（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬから入手可能なＤＯＴＭＡ及びＤＯＰＥを含む）、及びリポフェクタミン（登録商標）（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬから入手可能なＤＯＳＰＡ及びＤＯＰＥを含む）などの多数のカチオン性脂質の市販調製物を使用することができる。
[0368]ある実施形態では、カチオン性脂質は、ＬＮＰの約１０重量％から脂質ナノ粒子の約８５重量％の量で、又はＬＮＰの約５０重量％からＬＮＰの約７５重量％の量で存在し得る。
[0369]ステロールは、ＬＮＰに流動性を与えることがある。本明細書で使用される場合、「ステロール」は、植物（フィトステロール）又は動物（ズーステロール）起源の任意の天然に存在するステロール、並びに非天然の合成ステロールを指し、これらの全ては、ステロイドＡ−環の３位にヒドロキシル基の存在によって特徴付けられる。ステロールは、リポソーム、脂質小胞又は脂質粒子調製の分野において通常使用される任意のステロール、最も一般的にはコレステロールであり得る。フィトステロールは、カンペステロール、シトステロール、及びスチグマステロールであり得る。ステロールはまた、米国特許出願公開第２０１１／０１７７１５６号に記載されるものなどのステロール修飾された脂質を含む。一部の実施形態では、ステロールは、ＬＮＰの約５重量％から脂質ナノ粒子の約５０重量％の量で、又はＬＮＰの約１０重量％からＬＮＰの約２５重量％の量で存在することができる。
[0370]ＬＮＰは、中性脂質を含むことができる。中性脂質は、生理学的ｐＨで非荷電又は中性両性イオン形態のいずれかで存在する任意の脂質種を含み得る。このような脂質には、限定されないが、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、セラミド、スフィンゴミエリン、ジヒドロスフィンゴミエリン、セファリン、及びセレブロシドが含まれる。中性脂質の選択は、一般的に、とりわけ、粒子サイズ及び必要な安定性を考慮することによって導かれる。一部の実施形態では、中性脂質成分は、２つのアシル基（例えば、ジアシルホスファチジルコリン及びジアシルホスファチジルエタノールアミン）を有する脂質であり得る。
[0371]種々の鎖長及び飽和度の種々のアシル鎖基を有する脂質が利用可能であり、又は周知技術によって単離若しくは合成され得る。一部の実施形態では、Ｃ１４〜Ｃ２２の範囲の炭素鎖長を有する飽和脂肪酸を含有する脂質を使用することができる。別の実施形態のグループでは、Ｃ１４〜Ｃ２２の範囲の炭素鎖長を有する一価又は二価の不飽和脂肪酸を有する脂質が使用される。さらに、飽和脂肪酸鎖及び不飽和脂肪酸鎖の混合物を有する脂質を使用することができる。例示的な中性脂質には、限定されないが、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジル−エタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＰＯＰＣ）、又は任意の関連するホスファチジルコリンが含まれる。中性脂質はまた、スフィンゴミエリン、ジヒドロスフィンゴミエリン、又はセリン及びイノシトールなどの他の頭部基を有するリン脂質から構成され得る。
[0372]一部の実施形態では、中性脂質は、脂質ナノ粒子の約０．１重量％からＬＮＰの約７５重量％、又はＬＮＰの約５重量％からＬＮＰの約１５重量％の量で存在することができる。
[0373]ＬＮＰカプセル化された核酸、発現カセット及びＡＡＶベクターは、医薬組成物、例えば、薬学的に許容される担体又は賦形剤中に組み込むことができる。このような医薬組成物は、特に、インビボ又はエクスビボでの対象へのＬＮＰカプセル化された酸、発現カセット及びＡＡＶベクターの投与及び送達に有用である。
[0374]ＬＮＰの調製物は、追加の成分と組み合わせることができる。非限定的な例としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）及びステロールが挙げられる。
[0375]用語「ＰＥＧ」とは、２つの末端ヒドロキシル基を有するエチレンＰＥＧ反復単位の線状の水溶性ポリマーであるポリエチレングリコールを指す。ＰＥＧは、それらの分子量によって分類される；例えば、ＰＥＧ ２０００は約２，０００ダルトンの平均分子量を有し、ＰＥＧ ５０００は約５，０００ダルトンの平均分子量を有する。ＰＥＧは、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．及び他の会社から市販され、例えば、以下の機能性ＰＥＧ：モノメトキシポリエチレングリコール（ＭｅＰＥＧ−ＯＨ）、モノメトキシポリエチレングリコール−スクシネート（ＭｅＰＥＧ−Ｓ）、モノメトキシポリエチレングリコール−スクシンイミジルスクシネート（ＭｅＰＥＧ−Ｓ−ＮＨＳ）、モノメトキシポリエチレングリコール−アミン（ＭｅＰＥＧ−ＮＨ２）、モノメトキシポリエチレングリコール−トレシレート（ＭｅＰＥＧ−ＴＲＥＳ）、及びモノメトキシポリエチレングリコール−イミダゾリル−カルボニル（ＭｅＰＥＧ−ＩＭ）を含む。
[0376]一部の実施形態では、ＰＥＧは、平均分子量が約５５０〜約１０，０００ダルトンであるポリエチレングリコールであり得、任意選択でアルキル、アルコキシ、アシル又はアリールで置換される。一部の実施形態では、ＰＥＧは、末端ヒドロキシル位でメチルで置換され得る。別の好ましい実施形態では、ＰＥＧは、約７５０〜約５，０００ダルトン、又は約１，０００〜約５，０００ダルトン、又は約１，５００〜約３，０００ダルトン、又は約２，０００ダルトン、又は約７５０ダルトンの平均分子量を有することができる。ＰＥＧは、任意選択でアルキル、アルコキシ、アシル又はアリールで置換され得る。一部の実施形態では、末端ヒドロキシル基は、メトキシ又はメチル基で置換され得る。
[0377]ＰＥＧ修飾された脂質には、米国特許第８，９３６，９４２号及び同第７，８０３，３９７号に記載されるＰＥＧ−ジアルキルオキシプロピルコンジュゲート（ＰＥＧ−ＤＡＡ）が含まれる。有用なＰＥＧ修飾された脂質（又は脂質−ポリオキシエチレンコンジュゲート）は、ＰＥＧ部分を脂質小胞の表面に固定するために、種々の「アンカー」脂質部分を有することができる。適切なＰＥＧ修飾された脂質の例としては、米国特許第５，８２０，８７３号に記載されるＰＥＧ修飾されたホスファチジルエタノールアミン及びホスファチジン酸、ＰＥＧ−セラミドコンジュゲート（例えば、ＰＥＧ−ＣｅｒＣ１４又はＰＥＧ−ＣｅｒＣ２０）、ＰＥＧ修飾されたジアルキルアミン及びＰＥＧ修飾された１，２−ジアシルオキシプロパン−３−アミンが挙げられる。一部の実施形態では、ＰＥＧ修飾された脂質は、ＰＥＧ修飾されたジアシルグリセロール及びジアルキルグリセロールであり得る。一部の実施形態では、ＰＥＧは、ＬＮＰの約０．５重量％からＬＮＰの約２０重量％、又はＬＮＰの約５重量％からＬＮＰの約１５重量％の量であり得る。
[0378]さらに、ＬＮＰは、ＰＥＧ修飾された及びステロール修飾されたＬＮＰであり得る。ＬＮＰは、追加的な成分と組み合わされて、同一の又は別個のＬＮＰであり得る。換言すれば、同一のＬＮＰは、ＰＥＧ修飾及びステロール修飾され得るか、又は代わりに、第１のＬＮＰがＰＥＧ修飾され得、第２のＬＮＰがステロール修飾され得る。任意選択で、第１及び第２の修飾されたＬＮＰを組み合わせることができる。
[0379]一部の実施形態では、ＬＮＰをカプセル化する前に、約１０ｎｍ〜５００ｎｍ、又は約５０ｎｍ〜約２００ｎｍ、又は７５ｎｍ〜約１２５ｎｍの範囲のサイズを有することができる。一部の実施形態では、ＬＮＰをカプセル化した核酸、発現ベクター又はＡＡＶベクターは、約１０ｎｍ〜５００ｎｍの範囲のサイズを有することができる。
[0380]本発明のＧＡＡ配列を発現することができる組換え細胞を、送達又は投与のために用いることができる。
[0381]ミニサークル及びトランスポゾンのような裸のＤＮＡは、投与又は送達又はレンチウイルスベクターに用いることができる。さらに、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、及びＣＲＩＳＰＲなどの遺伝子編集技術を用いて、本発明のコード配列を送達させることもできる。
[0382]糖原病（ＧＳＤ）は、最終的には、グリコーゲン化合物をグルコースに変換する酵素が存在しないことに起因する。酵素欠乏は、組織におけるグリコーゲン蓄積をもたらす。多くの場合、欠陥は全身的な結果をもたらすが、場合によっては、欠陥は特定の組織に限定される。ほとんどの患者は、筋力低下及び痙攣などの筋肉症状を経験するが、あるＧＳＤは低血糖発作又は心肥大などの特異的な症候群を呈する。
[0383]以下は、ＧＳＤの非限定的な例である：０−グリコーゲンシンターゼ欠乏症；Ｉａ−グルコース−６−ホスファターゼ欠乏症（フォン・ギールケ病）；ＩＩ−酸性マルターゼ欠乏症（ポンペ病）；ＩＩＩ−脱分岐酵素欠乏症（フォーブス・コリ病）；ＩＶ−トランスグルコシダーゼ欠乏症（アンダーソン病、アミロペクチン症）；Ｖ−ミオホスホリラーゼ欠乏症（マッカードル病）；ＶＩ−ホスホリラーゼ欠乏症（ハース病）；及びＶＩＩ−ホスホフルクトキナーゼ欠乏症（垂井病）。
[0384]ＧＳＤの様々な形態が代謝性炭水化物経路に影響を与える。文献では少なくとも１４種の固有のＧＳＤが検討されているが、臨床的に重大な筋力低下を引き起こす４種のＧＳＤは、ポンペ病（ＧＳＤタイプＩＩ、酸性マルターゼ欠乏症）、コリ病（ＧＳＤタイプＩＩＩａ、脱分枝酵素欠乏症）、マッカードル病（ＧＳＤタイプＶ、ミオホスホリラーゼ欠乏症）、及び垂井病（ＧＳＤタイプＶＩＩ、ホスホフルクトキナーゼ欠乏症）である。１つの型であるフォン・ギールケ病（ＧＳＤタイプＩａ、グルコース−６−ホスファターゼ欠乏症）は、重大な病的状態を伴う臨床的に重大な末端器官疾患を引き起こす。
[0385]一般的に、ＧＳＤは、常染色体劣性疾患として遺伝する。これらの遺伝性酵素欠陥は、通常、小児期にみられるが、マッカードル病及びポンペ病などの一部は、成人発症型のものもある。
[0386]ＧＳＤは、酵素補充療法（ＥＲＴ）により、例えば組換えによって生成したＧＡＡで治療することができる。酵素補充療法は、ポンペ病の全患者に対して承認された治療である。それは、組換えヒト酸性α−グルコシダーゼを静脈内投与することを伴う。Ｓａｎｏｆｉ ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎのＧｅｎｚｙｍｅが製造するこの治療法は、ルミザイム（Ｌｕｍｉｚｙｍｅ）（米国外ではマイオザイム（Ｍｙｏｚｙｍｅ）として販売される）であり、２００６年に米国食品医薬品局（ＦＤＡ）により最初に承認された。それは、ポンペ病の全患者に承認されている。ＥＲＴの利点は、抗体形成によって減弱される可能性があるため、ＥＲＴはまた免疫発現と組み合わせることができる。
[0387]ＧＳＤは、食事療法によって治療することができ、食事レジメンを慎重に遵守し、肝臓のサイズを縮小させ、低血糖を予防し、症状を軽減し、成長及び発達を可能にする。
[0388]ポンペ病の追加治療は、対症的であり、支持的である。ほとんどの患者はある程度の呼吸障害及び／又は呼吸不全を有するため、呼吸補助が必要となる場合がある。理学療法は、呼吸筋の強化に役立ち得る。一部の患者は、夜間及び／又は日中に人工呼吸器（すなわち、ｂｉｐａｐ又はボリュームベンチレーター）を通じて呼吸補助を必要とすることがある。さらに、気道感染中の追加支援が必要な場合がある。人工呼吸器支援は、非侵襲的又は侵襲的手技によって行うことができる。呼吸補助の期間に関する決定は、患者の特徴に基づいて、患者の医師及び医療チームの他のメンバーと慎重に協議した上で、家族が行うのが最善である。高タンパク食は、非乳児型のポンペに有益である可能性がある。
[0389]理学療法は、筋力及び身体能力を改善するために推奨される。杖又は歩行具の使用を含む作業療法が必要となる場合がある。最終的には、一部の個人は、車椅子の使用を必要とすることもある。言語療法は、一部の患者によっては、明瞭な発音及び言語を改善するのに有益であり得る。
[0390]装具を含む整形外科用器具が、一部の患者によっては推奨されることもある。拘縮又は脊椎変形などのある種の整形外科的症状には、外科手術が必要となる場合がある。
[0391]ポンペ病は、咀嚼及び嚥下に使用される筋肉を弱めることがあるため、適切な栄養と体重増加を確保するための対策が必要となることがある。一部の患者は、特殊化された高カロリーの食事を必要とする場合もあり、誤嚥のリスクを低下させるために、食物の大きさ及び質感を変える技術を習得する必要がある場合もある。一部の乳児は、鼻から食道を下り、胃に栄養チューブ（経鼻胃管）を挿入する必要がある場合がある。一部の小児では、腹壁の小さな外科的な開口部から栄養チューブを直接胃に挿入する必要があり得る。遅発型ポンペ病の一部の個体は、軟らかい食事を必要とする人もいるが、栄養チューブを必要とする人はほとんどいない。
[0392]対象は、治療に対する有害反応について、又はこのような対象、治療前に本発明の方法による治療に適切であるかどうかを決定するために、１つ又は複数の肝臓酵素について試験され得る。したがって、本発明の方法による治療の前又は後に、候補対象を１つ又は複数の肝臓酵素の量についてスクリーニングすることができる。治療された対象は、上昇した肝臓酵素について、治療後に、例えば１〜４週間毎、１〜６ヵ月毎、６〜１２ヵ月毎、又は１、２、３、４、５年以上毎に定期的にモニターすることができる。
[0393]肝臓酵素の例としては、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、及び乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）が挙げられるが、肝障害を示す他の酵素もまたモニターすることができる。循環中のこれらの酵素の正常レベルは、典型的には、酵素レベルが上限を超えて上昇していると考えられ、したがって肝障害を示唆する範囲として定義される。正常範囲は、ある程度、アッセイを実施する臨床検査機関によって使用される基準に依存する。
[0394]本発明は、パッケージング材料及びその中の１つ又は複数の成分を備えたキットを提供する。キットは、典型的には、その中の成分のインビトロ、インビボ、又はエクスビボで使用するための成分の説明又は指示書を含む、ラベル又は添付文書を含む。キットは、このような成分、例えば、ｒＡＡＶ粒子、及び任意選択で、別の化合物、薬剤、薬物又は組成物などの第２の活性成分の集合体を含むことができる。
[0395]「キット」とは、キットの１つ又は複数の成分を収容する物理的構造を指す。パッケージング材料は、成分を無菌的に維持することができ、このような目的のために一般的に使用される材料（例えば、紙、波形繊維、ガラス、プラスチック、箔、アンプル、バイアル、チューブなど）で作ることができる。
[0396]ラベル又は添付物は、その中の１つ又は複数の成分、用量、作用機序、薬物動態及び薬力学を含む活性成分（複数可）の臨床薬理学の情報を同定することを含むことができる。ラベル又は添付物には、製造者を識別する情報、ロット番号、製造場所及び日付、使用期限を含めることができる。ラベル又は添付物には、製造者情報を識別する情報、ロット番号、製造場所及び日付を含めることができる。ラベル又は添付物には、キット成分を使用することができる疾患に関する情報を含めることができる。ラベル又は添付物は、方法、使用、又は治療プロトコール若しくは治療レジメンにおいて１つ又は複数のキット成分を使用するために、臨床医又は対象のための指示を含むことができる。指示には、投薬量、頻度又は期間、及び本明細書に記載される方法、使用、治療プロトコール、又は予防若しくは治療レジメンのいずれかを実施するための指示書が含まれ得る。
[0397]ラベル又は添付物は、予防的又は治療的利益などの、成分が提供し得る任意の利益に関する情報を含むことができる。ラベル又は添付物は、特定の組成物を使用することが適切ではない状況に関する対象又は臨床医への警告などの、潜在的な有害な副作用、合併症又は反応に関する情報を含むことができる。有害な副作用又は合併症はまた、対象が、組成物と不適合である場合がある１つ又は複数の他の薬物を有する、服用するになる、若しくは現在服用しているか、又は対象が、組成物と不適合である別の治療プロトコール若しくは治療レジメンを有する、受けるようになる、若しくは現在受けている場合に生じ得、したがって、指示書は、このような不適合に関する情報を含めることができる。
[0398]ラベル又は添付物には、「印刷物」、例えば、紙若しくは厚紙、又は成分、キット若しくは包装材料（例えば、ボックス）、又はキット成分を含有するアンプル、チューブ若しくはバイアルに付着された、分離された若しくは取り付けられたものが含まれる。ラベル又は添付物は、バーコード付き印刷ラベルなどのコンピュータ読取可能媒体、ディスク、ＣＤ若しくはＤＶＤ−ＲＯＭ／ＲＡＭなどの光ディスク、ＤＶＤ、ＭＰ３、磁気テープ、又はＲＡＭ及びＲＯＭなどの電気記憶媒体、又は磁気／光記憶媒体、ＦＬＡＳＨ媒体若しくはメモリタイプカードなどのこれらのハイブリッドをさらに含むことができる。
[0399]別段の定義がない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されたものと類似又は同等の方法及び材料を本発明の実施又は研究に使用することができるが、適切な方法及び材料を本明細書に記載する。
[0400]本明細書に引用される全ての特許、特許出願、刊行物、及び他の参考文献、ＧｅｎＢａｎｋ引用、及びＡＴＣＣ引用は、それらの全体が参照により組み込まれる。矛盾が生じた場合、定義を含む本明細書が支配する。
[0401]本明細書に開示される特徴の全ては、任意の組合せで組み合わせることができる。本明細書に開示される各特徴は、同一、同等又は類似の目的を果たす代替の特徴に置き換えることができる。したがって、特に明示的に述べられない限り、開示される特徴（例えば、ＧＡＡをコードする修飾された核酸、ＧＡＡをコードする修飾された核酸を含む発現カセット、及びＧＡＡをコードする修飾された核酸を含むｒＡＡＶ粒子）は、同等又は類似の特徴の属の例である。
[0402]本明細書で使用される場合、単数形「１つの（ａ）」、「ａｎｄ」、及び「その（ｔｈｅ）」は、文脈が明確に別の意味を示さない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「核酸」への言及は複数のこのような核酸を含み、「ベクター」への言及は複数のこのようなベクターを含み、「ウイルス」又は「粒子」への言及は複数のこのようなウイルス／粒子を含む。
[0403]本明細書で使用される場合、全ての数値又は数値範囲は、文脈が明確に別の意味を示さない限り、このような範囲内の整数及び範囲内の値又は整数の端数を含む。したがって、説明するために、８６％以上の同一性への言及は、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％など、並びに８６．１％、８６．２％、８６．３％、８６．４％、８６．５％など、８７．１％、８８．２％、８８．３％、８８．４％、８８．５％などを含む。
[0404]より大きい（morethan）（超える（greater than））又はより小さい（less than）を伴う整数への言及は、それぞれ参照された数値より大きい又は小さい任意の数を含む。したがって、例えば、１２７未満への言及は、１２６、１２５、１２４、１２３、１２２、１２１、１２０、１１９、１１８、１１７、１１６、１１５、１１４、１１３、１１２、１１１、１１０など、それに引き続きゼロまでのあらゆる数値を含み；１０未満は、９、８、７など、それに引き続きゼロまでのあらゆる数値を含む。
[0405]本明細書で使用される場合、全ての数値又は範囲は、文脈が明確に別の意味を示さない限り、部分範囲並びにこのような範囲内の値及び整数の端数を含む。したがって、説明するために、１〜１０などの数値範囲への言及は、１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、２〜３、２〜４、２〜５、２〜６、２〜７、２〜８、２〜９、２〜１０、３〜４、３〜５、３〜６、３〜７、３〜８、３〜９、３〜１０など；及び１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、並びに１．１、１．２、１．３、１．４、１．５などを含む。したがって、１〜５０の範囲への言及は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０などから、最大５０まで、並びに１．１、１．２、１．３、１．４、１．５など、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５などを含む。
[0406]一連の範囲への言及は、シリーズ内の異なる範囲の境界の値を結合する範囲を含む。したがって、一連の範囲への言及を説明するために、例えば、１〜１０、１０〜２０、２０〜３０、３０〜４０、４０〜５０、５０〜６０、６０〜７５、７５〜１００、１００〜１５０、１５０〜２００、２００〜２５０、２５０〜３００、３００〜４００、４００〜５００、５００〜７５０、７５０〜８５０は、１〜２０、１〜３０、１〜４０、１〜５０、１〜６０、１０〜３０、１０〜４０、１０〜５０、１０〜６０、１０〜７０、１０〜８０、２０〜４０、２０〜５０、２０〜６０、２０〜７０、２０〜８０、２０〜９０、５０〜７５、５０〜１００、５０〜１５０、５０〜２００、５０〜２５０、１００〜２００、１００〜２５０、１００〜３００、１００〜３５０、１００〜４００、１００〜５００、１５０〜２５０、１５０〜３００、１５０〜３５０、１５０〜４００、１５０〜４５０、１５０〜５００などの範囲を含む。
[0407]本発明は、多数の実施形態及び態様を説明するために、肯定的な言語を使用して、本明細書において一般的に開示される。本発明はまた、具体的には、物質又は材料、方法ステップ及び条件、プロトコール、又は手順などの、特定の主題が全部又は一部除外される実施形態を含む。例えば、本発明の特定の実施形態又は態様では、材料及び／又は方法ステップは除外される。したがって、本発明が、本発明において明示的に除外されない態様を含まないものに関して、本明細書において一般的に表現されていないとしても、それにもかかわらず、本明細書において開示される。
[0408]本発明の多くの実施形態が記載されている。それにもかかわらず、当業者は、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、種々の用途及び条件に適合させるために本発明の種々の変更及び修正を行うことができる。したがって、以下の実施例は、いかなる方法であれ、請求された発明の範囲を例示することを意図しているが、限定するものではない。
実施例１
Figure 2021523718
[0409]ＧＡＡ発現カセットを図１〜９に示す。全ては、５’及び３’隣接ＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）、ヒトヘモグロビンサブユニットベータ（ＨＢＢ２）イントロンを含む最適化されたＧＡＡコード配列に作動可能に連結された肝臓特異的ＡｐｏＥ／ｈＡＡＴエンハンサー／プロモーター配列、続いて、野生型又はＣｐＧ減少したウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）ポリアデニル化（ポリＡ）配列を含有する。
配列番号１：ＧＡＡ２の核酸配列
ATGGCTTTCCTGTGGCTGCTGAGCTGCTGGGCTCTGCTGGGCACCACCTTTGGGCTGCTGGTGCCTAGGGAGCTGTCTGGGTCTAGCCCTGTGCTGGAGGAGACTCACCCTGCCCATCAGCAGGGGGCTAGCAGGCCTGGCCCCAGGGATGCTCAGGCCCACCCTGGCAGGCCCAGGGCTGTGCCCACCCAGTGTGATGTGCCCCCCAACAGCAGGTTTGACTGTGCCCCTGACAAGGCCATTACCCAGGAGCAGTGTGAGGCCAGGGGCTGCTGCTACATTCCAGCTAAGCAGGGCCTGCAGGGGGCCCAGATGGGCCAGCCCTGGTGCTTCTTCCCCCCCAGCTATCCTAGCTATAAACTGGAGAACCTGAGCAGCTCTGAGATGGGCTATACTGCCACCCTGACTAGGACTACTCCCACCTTTTTTCCTAAGGATATCCTGACCCTGAGGCTGGATGTGATGATGGAGACTGAGAACAGGCTGCACTTCACTATTAAGGACCCTGCCAATAGGAGGTATGAAGTGCCTCTGGAGACTCCTCATGTGCACTCTAGGGCCCCCAGCCCCCTGTATTCTGTGGAGTTCTCTGAGGAGCCCTTTGGGGTGATTGTGAGGAGGCAGCTGGATGGCAGGGTGCTGCTGAACACCACTGTGGCCCCCCTGTTCTTTGCTGACCAGTTCCTGCAGCTGAGCACCAGCCTGCCCAGCCAGTACATCACTGGGCTGGCTGAGCATCTGAGCCCTCTGATGCTGAGCACCTCTTGGACCAGGATCACCCTGTGGAATAGGGATCTGGCCCCCACCCCTGGGGCTAATCTGTATGGCTCTCATCCCTTTTACCTGGCCCTGGAGGATGGGGGCTCTGCCCATGGGGTGTTTCTGCTGAACAGCAATGCCATGGATGTGGTGCTGCAGCCCTCTCCTGCCCTGAGCTGGAGGAGCACTGGGGGCATCCTGGATGTGTACATCTTCCTGGGCCCTGAGCCCAAGTCTGTGGTCCAGCAGTATCTGGATGTGGTGGGCTACCCCTTTATGCCCCCCTATTGGGGCCTGGGCTTCCACCTGTGCAGGTGGGGGTATTCTTCTACTGCTATCACCAGGCAGGTGGTGGAGAACATGACCAGGGCTCACTTCCCCCTGGATGTGCAGTGGAATGACCTGGACTATATGGACTCTAGGAGGGATTTCACCTTCAACAAGGATGGCTTCAGGGACTTCCCTGCTATGGTCCAGGAGCTGCATCAGGGGGGCAGGAGGTACATGATGATTGTGGACCCTGCCATCAGCAGCTCTGGCCCTGCTGGCAGCTATAGGCCCTATGATGAGGGCCTGAGGAGGGGGGTGTTTATCACTAATGAAACTGGGCAGCCCCTGATTGGCAAGGTGTGGCCTGGCTCTACTGCCTTCCCTGACTTCACCAACCCCACTGCTCTGGCCTGGTGGGAGGACATGGTGGCTGAGTTCCATGACCAGGTGCCTTTTGATGGCATGTGGATTGACATGAATGAGCCCAGCAACTTCATCAGGGGCTCTGAGGATGGGTGCCCCAATAATGAGCTGGAGAACCCCCCCTATGTGCCTGGGGTGGTGGGGGGCACCCTGCAGGCTGCCACTATTTGTGCCAGCTCTCACCAGTTCCTGAGCACCCACTACAACCTGCACAATCTGTATGGCCTGACTGAGGCCATTGCCAGCCACAGGGCCCTGGTGAAGGCCAGGGGCACTAGGCCCTTTGTGATCTCTAGAAGCACCTTTGCTGGCCATGGGAGGTATGCTGGCCACTGGACTGGGGATGTGTGGAGCTCTTGGGAGCAGCTGGCCAGCTCTGTGCCTGAGATCCTGCAGTTCAACCTGCTGGGGGTGCCCCTGGTGGGGGCTGATGTGTGTGGCTTCCTGGGCAACACCTCTGAAGAGCTGTGTGTGAGGTGGACCCAGCTGGGGGCCTTCTACCCTTTCATGAGGAACCACAACAGCCTGCTGAGCCTGCCTCAGGAGCCTTACTCTTTCTCTGAGCCTGCCCAGCAGGCCATGAGGAAGGCCCTGACCCTGAGGTATGCTCTGCTGCCCCACCTGTACACCCTGTTCCACCAGGCCCATGTGGCTGGGGAGACTGTGGCCAGGCCCCTGTTCCTGGAGTTTCCTAAGGATAGCAGCACCTGGACTGTGGACCACCAGCTGCTGTGGGGGGAGGCCCTGCTGATTACCCCTGTGCTGCAGGCTGGCAAGGCTGAGGTGACTGGCTACTTCCCCCTGGGCACTTGGTATGACCTGCAGACTGTGCCTGTGGAAGCCCTGGGCAGCCTGCCTCCCCCCCCTGCTGCCCCCAGGGAGCCTGCCATCCACTCTGAGGGCCAGTGGGTGACCCTGCCTGCCCCCCTGGACACCATTAATGTGCATCTGAGGGCTGGGTATATTATCCCCCTGCAGGGGCCTGGGCTGACTACCACTGAGAGCAGGCAGCAGCCTATGGCCCTGGCTGTGGCTCTGACTAAGGGGGGGGAGGCCAGGGGGGAGCTGTTCTGGGATGATGGGGAGAGCCTGGAGGTGCTGGAGAGGGGGGCCTACACCCAGGTGATTTTCCTGGCCAGGAACAACACCATTGTGAATGAGCTGGTGAGGGTGACCTCTGAGGGGGCTGGCCTGCAGCTGCAGAAAGTGACTGTGCTGGGGGTGGCCACTGCCCCCCAGCAGGTGCTGAGCAATGGGGTGCCTGTGAGCAACTTCACCTACAGCCCTGACACCAAGGTGCTGGATATTTGTGTGAGCCTGCTGATGGGGGAGCAGTTCCTGGTGAGCTGGTGCTGA
配列番号２：ＧＡＡ５の核酸配列
ATGGCTTTCCTGTGGCTGCTGTCTTGCTGGGCCCTGCTGGGGACTACCTTTGGCCTGCTGGTGCCCAGGGAACTGTCTGGCTCTAGCCCAGTGCTGGAGGAGACCCACCCTGCCCACCAGCAGGGGGCTTCTAGGCCTGGCCCCAGGGATGCCCAGGCCCACCCTGGCAGGCCAAGGGCTGTGCCCACCCAGTGTGATGTGCCCCCCAACTCTAGATTTGATTGTGCCCCTGATAAGGCCATCACCCAGGAGCAGTGTGAGGCTAGGGGCTGCTGCTACATCCCTGCTAAGCAGGGCCTGCAGGGGGCTCAGATGGGCCAGCCCTGGTGCTTCTTCCCCCCCAGCTATCCCTCTTACAAGCTGGAGAATCTGAGCAGCTCTGAGATGGGCTACACTGCCACCCTGACCAGGACTACTCCCACCTTCTTCCCCAAGGACATCCTGACCCTGAGGCTGGATGTGATGATGGAGACTGAGAACAGGCTGCATTTCACCATCAAGGATCCTGCCAACAGGAGGTATGAGGTGCCTCTGGAGACCCCCCATGTGCACAGCAGGGCTCCTTCTCCCCTGTACTCTGTGGAGTTCTCTGAGGAACCCTTTGGGGTGATTGTGAGGAGGCAGCTGGATGGCAGGGTCCTGCTGAACACCACTGTGGCCCCCCTGTTCTTTGCTGATCAGTTCCTGCAGCTGTCCACTTCTCTGCCTAGCCAGTACATCACTGGGCTGGCTGAGCACCTGAGCCCTCTGATGCTGAGCACCTCTTGGACTAGGATCACCCTGTGGAACAGGGACCTGGCCCCCACCCCTGGGGCCAACCTGTATGGCAGCCACCCCTTCTATCTGGCCCTGGAGGATGGGGGCTCTGCCCATGGGGTGTTCCTGCTGAATAGCAATGCTATGGATGTGGTGCTGCAGCCCAGCCCTGCCCTGTCTTGGAGGAGCACTGGGGGCATCCTGGATGTGTACATTTTCCTGGGGCCTGAGCCCAAGTCTGTGGTGCAGCAGTACCTGGATGTGGTGGGCTACCCCTTCATGCCTCCCTACTGGGGCCTGGGCTTCCACCTGTGCAGGTGGGGCTACAGCTCTACTGCCATCACCAGGCAGGTGGTGGAGAATATGACCAGGGCCCACTTCCCCCTGGATGTGCAGTGGAATGACCTGGACTACATGGACTCTAGGAGGGACTTCACCTTCAATAAGGATGGCTTCAGAGACTTCCCTGCCATGGTGCAGGAGCTGCATCAGGGGGGCAGGAGGTACATGATGATTGTGGACCCTGCCATCAGCTCTTCTGGCCCTGCTGGCTCTTACAGGCCCTATGATGAGGGCCTGAGGAGGGGGGTGTTCATCACCAATGAGACTGGGCAGCCCCTGATTGGGAAGGTGTGGCCTGGCTCTACTGCCTTCCCTGACTTCACCAATCCTACTGCCCTGGCCTGGTGGGAGGACATGGTGGCTGAGTTCCATGACCAGGTGCCCTTTGATGGCATGTGGATTGACATGAATGAGCCCTCTAATTTCATCAGGGGCTCTGAGGATGGCTGCCCCAACAATGAGCTGGAGAACCCCCCCTATGTGCCTGGGGTGGTGGGGGGCACCCTGCAGGCTGCCACCATCTGTGCTAGCTCTCACCAGTTCCTGAGCACCCACTACAATCTGCATAACCTGTATGGCCTGACTGAGGCCATTGCCAGCCACAGGGCCCTGGTGAAGGCTAGGGGCACCAGGCCCTTTGTGATTTCTAGGAGCACTTTTGCTGGCCATGGCAGGTATGCTGGGCACTGGACTGGGGATGTGTGGTCTAGCTGGGAGCAGCTGGCTTCTTCTGTGCCTGAGATCCTGCAGTTCAACCTGCTGGGGGTGCCTCTGGTGGGGGCTGATGTGTGTGGGTTCCTGGGCAACACTTCTGAGGAGCTGTGTGTGAGGTGGACCCAGCTGGGGGCCTTCTACCCTTTCATGAGGAACCACAACAGCCTGCTGAGCCTGCCCCAGGAGCCCTACAGCTTCTCTGAGCCTGCCCAGCAGGCCATGAGGAAGGCCCTGACCCTGAGGTATGCCCTGCTGCCCCACCTGTACACCCTGTTCCACCAGGCCCATGTGGCTGGGGAGACTGTGGCTAGGCCTCTGTTCCTGGAGTTCCCCAAGGACTCTAGCACCTGGACTGTGGACCACCAGCTGCTGTGGGGGGAGGCCCTGCTGATCACTCCTGTGCTGCAGGCTGGGAAGGCTGAGGTGACTGGCTATTTCCCCCTGGGCACCTGGTATGACCTGCAGACTGTGCCTGTGGAGGCCCTGGGGAGCCTGCCCCCCCCCCCTGCTGCCCCCAGGGAGCCTGCCATCCACTCTGAGGGCCAGTGGGTGACCCTGCCTGCCCCTCTGGATACCATCAATGTGCACCTGAGGGCTGGCTACATCATTCCCCTGCAGGGCCCTGGCCTGACCACTACTGAGTCTAGGCAGCAGCCCATGGCCCTGGCTGTGGCCCTGACCAAGGGGGGGGAGGCTAGGGGGGAGCTGTTTTGGGATGATGGGGAGAGCCTGGAGGTGCTGGAGAGGGGGGCCTACACTCAGGTGATCTTCCTGGCCAGGAACAATACCATTGTGAATGAGCTGGTGAGGGTGACCTCTGAGGGGGCTGGCCTGCAGCTGCAGAAGGTGACTGTGCTGGGGGTGGCCACTGCCCCCCAGCAGGTGCTGAGCAATGGGGTGCCTGTGAGCAACTTCACCTATAGCCCTGATACCAAGGTGCTGGATATTTGTGTGAGCCTGCTGATGGGGGAGCAGTTCCTGGTGAGCTGGTGCTGA
配列番号３：ＧＡＡ７の核酸配列
ATGGCTTTCCTGTGGCTGCTGTCTTGTTGGGCTCTGCTGGGCACCACCTTTGGCCTGCTGGTGCCCAGGGAGCTGTCTGGCAGCAGCCCTGTGCTGGAGGAGACCCACCCTGCTCATCAGCAGGGGGCTAGCAGGCCTGGCCCCAGGGATGCCCAGGCTCACCCTGGGAGACCCAGGGCTGTGCCCACTCAGTGTGATGTGCCCCCCAACAGCAGGTTTGACTGTGCTCCTGACAAGGCTATCACCCAGGAGCAGTGTGAGGCCAGGGGGTGCTGCTACATTCCTGCTAAGCAGGGCCTGCAGGGGGCCCAGATGGGCCAGCCCTGGTGCTTCTTCCCCCCCTCTTATCCCAGCTATAAGCTGGAGAACCTGAGCAGCTCTGAGATGGGCTACACTGCCACCCTGACCAGGACCACTCCCACCTTCTTTCCCAAGGATATTCTGACTCTGAGGCTGGATGTGATGATGGAGACTGAGAACAGGCTGCACTTCACTATCAAGGACCCTGCCAATAGGAGGTATGAGGTGCCCCTGGAGACTCCTCATGTGCATAGCAGGGCCCCTTCTCCTCTGTATTCTGTGGAGTTCTCTGAGGAGCCCTTTGGGGTGATTGTGAGGAGGCAGCTGGATGGCAGGGTGCTGCTGAACACCACTGTGGCCCCCCTGTTCTTTGCTGACCAGTTCCTGCAGCTGAGCACTTCTCTGCCCAGCCAGTACATTACTGGGCTGGCTGAGCATCTGAGCCCCCTGATGCTGAGCACCTCTTGGACCAGGATCACCCTGTGGAACAGGGACCTGGCCCCCACTCCTGGGGCTAACCTGTATGGCTCTCACCCCTTTTACCTGGCCCTGGAGGATGGGGGCTCTGCCCATGGGGTGTTTCTGCTGAACAGCAATGCTATGGATGTGGTGCTGCAGCCCTCTCCAGCCCTGTCTTGGAGGAGCACTGGGGGCATTCTGGATGTGTACATTTTCCTGGGGCCTGAACCCAAGTCTGTGGTGCAGCAGTACCTGGATGTGGTGGGCTACCCCTTCATGCCCCCCTATTGGGGGCTGGGGTTTCACCTGTGCAGGTGGGGCTACAGCAGCACTGCCATCACCAGGCAGGTGGTGGAGAACATGACCAGGGCCCATTTCCCCCTGGATGTGCAGTGGAATGACCTGGACTACATGGATAGCAGGAGGGATTTCACCTTCAACAAGGATGGCTTCAGGGACTTTCCTGCCATGGTGCAGGAGCTGCACCAGGGGGGCAGGAGGTATATGATGATTGTGGACCCTGCTATCAGCAGCTCTGGCCCTGCTGGCTCTTACAGGCCCTATGATGAGGGCCTGAGGAGGGGGGTGTTTATCACTAATGAAACTGGCCAGCCTCTGATTGGCAAGGTCTGGCCTGGCTCTACTGCCTTCCCTGATTTTACTAACCCCACTGCCCTGGCCTGGTGGGAGGACATGGTGGCTGAGTTCCATGATCAGGTGCCTTTTGATGGCATGTGGATTGATATGAATGAACCAAGCAACTTCATCAGAGGCTCTGAGGATGGCTGCCCCAACAATGAGCTGGAGAACCCCCCCTATGTGCCTGGGGTGGTGGGGGGCACTCTGCAGGCTGCCACCATTTGTGCTAGCAGCCACCAGTTCCTGAGCACCCACTACAATCTGCACAACCTGTATGGCCTGACTGAAGCCATTGCCAGCCATAGGGCCCTGGTGAAGGCCAGGGGCACTAGGCCTTTTGTGATCAGCAGGAGCACTTTTGCTGGCCATGGCAGGTATGCTGGCCACTGGACTGGGGATGTGTGGAGCAGCTGGGAGCAGCTGGCCAGCTCTGTGCCTGAGATTCTGCAGTTTAACCTGCTGGGGGTGCCCCTGGTGGGGGCTGATGTGTGTGGCTTCCTGGGCAACACCTCTGAGGAGCTGTGTGTGAGGTGGACCCAGCTGGGGGCCTTTTATCCCTTCATGAGGAACCACAACAGCCTGCTGAGCCTGCCTCAGGAGCCCTACTCTTTCTCTGAGCCTGCCCAGCAGGCCATGAGGAAGGCCCTGACCCTGAGGTATGCCCTGCTGCCCCACCTGTATACCCTGTTCCACCAGGCCCATGTGGCTGGGGAGACTGTGGCCAGGCCCCTGTTCCTGGAGTTCCCCAAGGACAGCAGCACCTGGACTGTGGATCATCAGCTGCTGTGGGGGGAGGCCCTGCTGATCACCCCTGTGCTGCAGGCTGGCAAGGCTGAGGTCACTGGCTACTTCCCTCTGGGCACCTGGTATGACCTGCAGACTGTGCCTGTGGAGGCTCTGGGCAGCCTGCCCCCCCCCCCTGCTGCTCCCAGGGAGCCTGCCATCCACTCTGAGGGCCAGTGGGTGACCCTGCCTGCTCCCCTGGACACCATCAATGTGCACCTGAGGGCTGGCTACATTATCCCCCTGCAGGGCCCAGGGCTGACTACCACTGAGAGCAGACAGCAGCCCATGGCTCTGGCTGTGGCCCTGACCAAGGGGGGGGAAGCTAGGGGGGAGCTGTTCTGGGATGATGGGGAGAGCCTGGAGGTGCTGGAGAGGGGGGCCTATACCCAGGTGATCTTCCTGGCTAGGAACAACACCATTGTCAATGAGCTGGTGAGGGTGACTTCTGAGGGGGCTGGGCTGCAGCTGCAGAAGGTGACTGTGCTGGGGGTGGCCACTGCTCCCCAGCAGGTGCTGAGCAATGGGGTGCCTGTGAGCAACTTCACCTACAGCCCTGACACCAAGGTGCTGGACATCTGTGTGTCTCTGCTGATGGGGGAGCAGTTCCTGGTGAGCTGGTGCTGA
配列番号４：ＧＡＡ８の核酸配列
ATGGCCTTCCTGTGGCTGCTGTCTTGCTGGGCTCTGCTGGGGACCACCTTTGGCCTGCTGGTCCCCAGGGAGCTGTCTGGCTCTTCTCCTGTCCTGGAGGAGACCCACCCTGCCCACCAGCAGGGGGCTAGCAGGCCTGGCCCCAGGGATGCCCAGGCCCACCCTGGCAGGCCCAGGGCTGTGCCCACCCAGTGTGATGTGCCTCCCAACAGCAGGTTTGACTGTGCCCCTGACAAGGCCATCACCCAGGAGCAGTGTGAGGCCAGGGGCTGCTGCTATATCCCTGCCAAGCAGGGCCTGCAGGGGGCTCAGATGGGCCAGCCCTGGTGCTTCTTTCCCCCCTCTTATCCTAGCTATAAGCTGGAGAACCTGAGCAGCTCTGAGATGGGGTACACTGCCACCCTGACCAGGACCACCCCCACTTTCTTCCCTAAGGACATCCTGACCCTGAGGCTGGATGTGATGATGGAGACTGAGAATAGGCTGCACTTTACTATCAAGGACCCTGCCAACAGGAGGTATGAGGTGCCTCTGGAGACCCCCCATGTGCATTCTAGGGCCCCCAGCCCCCTGTACTCTGTGGAGTTCTCTGAGGAGCCCTTTGGGGTGATTGTGAGGAGACAGCTGGATGGCAGGGTCCTGCTGAACACCACTGTGGCTCCCCTGTTTTTTGCTGACCAGTTCCTGCAGCTGAGCACCAGCCTGCCCAGCCAGTACATCACTGGGCTGGCTGAGCACCTGAGCCCCCTGATGCTGAGCACCAGCTGGACCAGGATCACCCTGTGGAACAGGGATCTGGCTCCTACCCCTGGGGCCAACCTGTATGGCTCTCACCCCTTTTACCTGGCCCTGGAGGATGGGGGCTCTGCCCATGGGGTGTTCCTGCTGAACAGCAATGCTATGGATGTGGTGCTGCAGCCCAGCCCTGCCCTGAGCTGGAGGTCTACTGGGGGCATCCTGGATGTGTACATCTTTCTGGGGCCTGAGCCCAAGTCTGTGGTGCAGCAGTACCTGGATGTGGTGGGCTATCCTTTTATGCCCCCCTATTGGGGCCTGGGCTTCCACCTGTGCAGGTGGGGCTACAGCAGCACTGCCATCACCAGACAGGTGGTGGAGAACATGACCAGGGCCCACTTCCCCCTGGATGTGCAGTGGAATGACCTGGACTACATGGACAGCAGGAGGGACTTCACCTTTAACAAGGATGGCTTTAGGGACTTCCCTGCCATGGTGCAGGAGCTGCATCAGGGGGGCAGGAGGTACATGATGATTGTGGACCCAGCCATCAGCAGCTCTGGGCCTGCTGGGTCTTACAGGCCCTATGATGAGGGCCTGAGGAGGGGGGTGTTCATCACCAATGAGACTGGCCAGCCCCTGATTGGCAAGGTGTGGCCTGGGAGCACTGCCTTCCCTGATTTTACCAACCCCACTGCCCTGGCCTGGTGGGAGGATATGGTGGCTGAGTTTCATGACCAGGTGCCCTTTGATGGCATGTGGATTGACATGAATGAGCCCAGCAATTTCATCAGGGGCTCTGAGGATGGCTGCCCCAACAATGAGCTGGAGAATCCTCCCTATGTGCCTGGGGTGGTGGGGGGCACCCTGCAGGCTGCCACCATCTGTGCCTCTAGCCACCAGTTCCTGAGCACCCACTATAACCTGCATAACCTGTATGGCCTGACTGAGGCCATTGCCAGCCATAGAGCCCTGGTGAAGGCCAGAGGGACCAGGCCCTTTGTGATCTCTAGGAGCACCTTTGCTGGCCATGGCAGGTATGCTGGCCACTGGACTGGGGATGTGTGGAGCTCTTGGGAGCAGCTGGCCAGCTCTGTGCCAGAGATCCTGCAGTTCAACCTGCTGGGGGTGCCTCTGGTGGGGGCTGATGTGTGTGGCTTCCTGGGCAATACCTCTGAAGAGCTGTGTGTGAGGTGGACTCAGCTGGGGGCCTTCTATCCCTTCATGAGGAACCACAACAGCCTGCTGTCTCTGCCCCAGGAGCCCTACAGCTTCTCTGAGCCTGCTCAGCAGGCTATGAGGAAGGCCCTGACCCTGAGGTATGCCCTGCTGCCCCATCTGTACACCCTGTTCCACCAGGCCCATGTGGCTGGGGAGACTGTGGCCAGGCCCCTGTTTCTGGAGTTTCCCAAGGACAGCAGCACCTGGACTGTGGACCATCAGCTGCTGTGGGGGGAGGCTCTGCTGATTACCCCTGTGCTGCAGGCTGGCAAGGCTGAGGTGACTGGGTACTTCCCCCTGGGGACTTGGTATGACCTGCAGACTGTGCCTGTGGAAGCTCTGGGCAGCCTGCCCCCACCCCCTGCTGCCCCTAGGGAGCCTGCCATCCACTCTGAGGGCCAGTGGGTGACCCTGCCTGCCCCTCTGGACACCATCAATGTGCACCTGAGGGCTGGCTATATCATCCCCCTGCAGGGCCCTGGGCTGACCACCACTGAGAGCAGGCAGCAGCCCATGGCCCTGGCTGTGGCCCTGACTAAGGGGGGGGAGGCCAGGGGGGAGCTGTTCTGGGATGATGGGGAGAGCCTGGAGGTGCTGGAGAGAGGGGCCTACACCCAGGTGATCTTTCTGGCCAGGAACAACACCATTGTGAATGAGCTGGTGAGGGTGACTTCTGAGGGGGCTGGCCTGCAGCTGCAGAAGGTGACTGTGCTGGGGGTGGCCACTGCCCCCCAGCAGGTGCTGAGCAATGGGGTGCCTGTGTCTAACTTCACCTACAGCCCTGATACTAAGGTGCTGGATATCTGTGTGAGCCTGCTGATGGGGGAGCAGTTTCTGGTGAGCTGGTGCTGA
配列番号５：ＧＡＡ１３の核酸配列
ATGGCCTTTCTGTGGCTGCTGTCCTGCTGGGCCCTGCTGGGGACCACCTTTGGCCTGCTGGTGCCCAGGGAGCTGTCTGGGAGCAGCCCAGTGCTGGAGGAGACCCACCCTGCCCACCAGCAGGGGGCCAGCAGGCCTGGCCCTAGGGATGCCCAGGCCCACCCTGGCAGGCCCAGGGCTGTGCCTACCCAGTGTGATGTGCCACCCAATTCTAGGTTTGACTGTGCTCCTGACAAGGCCATCACTCAGGAGCAGTGTGAAGCTAGGGGGTGCTGCTACATCCCAGCCAAGCAGGGCCTGCAGGGGGCCCAGATGGGCCAGCCCTGGTGCTTCTTCCCCCCCAGCTACCCTAGCTACAAGCTGGAGAATCTGAGCAGCTCTGAGATGGGCTACACTGCTACCCTGACCAGGACCACTCCTACCTTCTTCCCCAAGGACATCCTGACTCTGAGGCTGGATGTCATGATGGAGACTGAAAATAGGCTGCACTTCACCATCAAGGACCCTGCCAATAGGAGGTATGAGGTGCCTCTGGAGACCCCCCATGTGCATAGCAGGGCTCCCAGCCCCCTGTATTCTGTGGAGTTCTCTGAGGAGCCCTTTGGGGTCATTGTGAGGAGACAGCTGGATGGGAGGGTGCTGCTGAACACTACTGTGGCTCCCCTGTTCTTTGCTGACCAGTTCCTGCAGCTGTCTACCAGCCTGCCCAGCCAGTACATCACTGGGCTGGCTGAGCATCTGAGCCCCCTGATGCTGAGCACCAGCTGGACCAGGATCACTCTGTGGAACAGGGATCTGGCCCCCACTCCTGGGGCCAACCTGTATGGGAGCCATCCCTTCTACCTGGCCCTGGAGGATGGGGGCTCTGCCCATGGGGTGTTCCTGCTGAACAGCAATGCCATGGATGTGGTGCTGCAGCCTAGCCCTGCCCTGAGCTGGAGGAGCACTGGGGGCATCCTGGATGTCTACATCTTCCTGGGGCCTGAGCCCAAGTCTGTGGTGCAGCAGTATCTGGATGTGGTGGGGTATCCCTTCATGCCCCCCTACTGGGGCCTGGGCTTTCACCTGTGCAGGTGGGGCTACAGCAGCACTGCCATCACCAGGCAGGTGGTGGAGAACATGACCAGGGCCCACTTCCCTCTGGATGTGCAGTGGAATGACCTGGACTATATGGATTCTAGGAGAGACTTTACTTTTAACAAGGATGGCTTCAGGGATTTCCCTGCCATGGTGCAGGAGCTGCACCAGGGGGGCAGGAGGTACATGATGATTGTGGACCCTGCTATTAGCAGCTCTGGCCCTGCTGGGTCTTACAGGCCTTATGATGAGGGCCTGAGGAGGGGGGTGTTCATCACCAATGAGACTGGCCAGCCCCTGATTGGCAAGGTGTGGCCTGGCAGCACTGCCTTCCCTGACTTCACCAACCCCACTGCCCTGGCCTGGTGGGAGGACATGGTGGCTGAGTTCCATGACCAGGTGCCCTTTGATGGGATGTGGATTGACATGAATGAGCCCTCTAACTTCATCAGGGGGTCTGAGGATGGCTGCCCCAACAATGAGCTGGAGAACCCCCCCTATGTGCCTGGGGTGGTGGGGGGCACTCTGCAGGCTGCCACTATCTGTGCTTCTTCTCACCAGTTTCTGAGCACCCACTATAATCTGCACAACCTGTATGGCCTGACTGAGGCCATTGCCAGCCATAGGGCCCTGGTGAAGGCCAGGGGCACCAGGCCCTTTGTGATCAGCAGGTCTACCTTTGCTGGCCATGGCAGGTATGCTGGCCACTGGACTGGGGATGTGTGGTCTTCTTGGGAGCAGCTGGCCAGCTCTGTGCCTGAGATCCTGCAGTTCAACCTGCTGGGGGTGCCTCTGGTGGGGGCTGATGTGTGTGGCTTTCTGGGCAACACCTCTGAGGAGCTGTGTGTGAGGTGGACCCAGCTGGGGGCCTTTTACCCCTTCATGAGGAACCACAATAGCCTGCTGAGCCTGCCCCAGGAGCCTTACTCTTTCTCTGAGCCTGCCCAGCAGGCCATGAGGAAGGCCCTGACTCTGAGGTATGCCCTGCTGCCCCATCTGTATACCCTGTTTCACCAGGCCCATGTGGCTGGGGAGACTGTGGCTAGGCCTCTGTTTCTGGAGTTCCCTAAGGACTCTAGCACCTGGACTGTGGACCACCAGCTGCTGTGGGGGGAGGCCCTGCTGATCACCCCTGTGCTGCAGGCTGGCAAGGCTGAGGTGACTGGCTACTTCCCCCTGGGCACCTGGTATGACCTGCAGACTGTGCCTGTGGAGGCCCTGGGGAGCCTGCCTCCCCCCCCTGCTGCCCCCAGGGAGCCTGCCATTCATTCTGAGGGCCAGTGGGTGACCCTGCCTGCCCCTCTGGACACCATCAATGTGCACCTGAGGGCTGGGTACATCATCCCCCTGCAGGGCCCTGGCCTGACCACCACTGAGAGCAGGCAGCAGCCCATGGCCCTGGCTGTGGCTCTGACCAAGGGGGGGGAGGCCAGGGGGGAGCTGTTCTGGGATGATGGGGAGTCTCTGGAGGTGCTGGAGAGGGGGGCCTACACCCAGGTGATCTTTCTGGCCAGGAACAATACTATTGTGAATGAGCTGGTGAGGGTGACCTCTGAGGGGGCTGGCCTGCAGCTGCAGAAGGTGACTGTGCTGGGGGTGGCCACTGCCCCCCAGCAGGTCCTGAGCAATGGGGTGCCTGTGAGCAACTTCACCTACTCTCCTGACACCAAGGTGCTGGACATTTGTGTGTCTCTGCTGATGGGGGAGCAGTTCCTGGTGAGCTGGTGCTGA
配列番号６：ＧＡＡ２＋ＷＴ ＢＧＨポリＡの核酸配列
ATGGCTTTCCTGTGGCTGCTGAGCTGCTGGGCTCTGCTGGGCACCACCTTTGGGCTGCTGGTGCCTAGGGAGCTGTCTGGGTCTAGCCCTGTGCTGGAGGAGACTCACCCTGCCCATCAGCAGGGGGCTAGCAGGCCTGGCCCCAGGGATGCTCAGGCCCACCCTGGCAGGCCCAGGGCTGTGCCCACCCAGTGTGATGTGCCCCCCAACAGCAGGTTTGACTGTGCCCCTGACAAGGCCATTACCCAGGAGCAGTGTGAGGCCAGGGGCTGCTGCTACATTCCAGCTAAGCAGGGCCTGCAGGGGGCCCAGATGGGCCAGCCCTGGTGCTTCTTCCCCCCCAGCTATCCTAGCTATAAACTGGAGAACCTGAGCAGCTCTGAGATGGGCTATACTGCCACCCTGACTAGGACTACTCCCACCTTTTTTCCTAAGGATATCCTGACCCTGAGGCTGGATGTGATGATGGAGACTGAGAACAGGCTGCACTTCACTATTAAGGACCCTGCCAATAGGAGGTATGAAGTGCCTCTGGAGACTCCTCATGTGCACTCTAGGGCCCCCAGCCCCCTGTATTCTGTGGAGTTCTCTGAGGAGCCCTTTGGGGTGATTGTGAGGAGGCAGCTGGATGGCAGGGTGCTGCTGAACACCACTGTGGCCCCCCTGTTCTTTGCTGACCAGTTCCTGCAGCTGAGCACCAGCCTGCCCAGCCAGTACATCACTGGGCTGGCTGAGCATCTGAGCCCTCTGATGCTGAGCACCTCTTGGACCAGGATCACCCTGTGGAATAGGGATCTGGCCCCCACCCCTGGGGCTAATCTGTATGGCTCTCATCCCTTTTACCTGGCCCTGGAGGATGGGGGCTCTGCCCATGGGGTGTTTCTGCTGAACAGCAATGCCATGGATGTGGTGCTGCAGCCCTCTCCTGCCCTGAGCTGGAGGAGCACTGGGGGCATCCTGGATGTGTACATCTTCCTGGGCCCTGAGCCCAAGTCTGTGGTCCAGCAGTATCTGGATGTGGTGGGCTACCCCTTTATGCCCCCCTATTGGGGCCTGGGCTTCCACCTGTGCAGGTGGGGGTATTCTTCTACTGCTATCACCAGGCAGGTGGTGGAGAACATGACCAGGGCTCACTTCCCCCTGGATGTGCAGTGGAATGACCTGGACTATATGGACTCTAGGAGGGATTTCACCTTCAACAAGGATGGCTTCAGGGACTTCCCTGCTATGGTCCAGGAGCTGCATCAGGGGGGCAGGAGGTACATGATGATTGTGGACCCTGCCATCAGCAGCTCTGGCCCTGCTGGCAGCTATAGGCCCTATGATGAGGGCCTGAGGAGGGGGGTGTTTATCACTAATGAAACTGGGCAGCCCCTGATTGGCAAGGTGTGGCCTGGCTCTACTGCCTTCCCTGACTTCACCAACCCCACTGCTCTGGCCTGGTGGGAGGACATGGTGGCTGAGTTCCATGACCAGGTGCCTTTTGATGGCATGTGGATTGACATGAATGAGCCCAGCAACTTCATCAGGGGCTCTGAGGATGGGTGCCCCAATAATGAGCTGGAGAACCCCCCCTATGTGCCTGGGGTGGTGGGGGGCACCCTGCAGGCTGCCACTATTTGTGCCAGCTCTCACCAGTTCCTGAGCACCCACTACAACCTGCACAATCTGTATGGCCTGACTGAGGCCATTGCCAGCCACAGGGCCCTGGTGAAGGCCAGGGGCACTAGGCCCTTTGTGATCTCTAGAAGCACCTTTGCTGGCCATGGGAGGTATGCTGGCCACTGGACTGGGGATGTGTGGAGCTCTTGGGAGCAGCTGGCCAGCTCTGTGCCTGAGATCCTGCAGTTCAACCTGCTGGGGGTGCCCCTGGTGGGGGCTGATGTGTGTGGCTTCCTGGGCAACACCTCTGAAGAGCTGTGTGTGAGGTGGACCCAGCTGGGGGCCTTCTACCCTTTCATGAGGAACCACAACAGCCTGCTGAGCCTGCCTCAGGAGCCTTACTCTTTCTCTGAGCCTGCCCAGCAGGCCATGAGGAAGGCCCTGACCCTGAGGTATGCTCTGCTGCCCCACCTGTACACCCTGTTCCACCAGGCCCATGTGGCTGGGGAGACTGTGGCCAGGCCCCTGTTCCTGGAGTTTCCTAAGGATAGCAGCACCTGGACTGTGGACCACCAGCTGCTGTGGGGGGAGGCCCTGCTGATTACCCCTGTGCTGCAGGCTGGCAAGGCTGAGGTGACTGGCTACTTCCCCCTGGGCACTTGGTATGACCTGCAGACTGTGCCTGTGGAAGCCCTGGGCAGCCTGCCTCCCCCCCCTGCTGCCCCCAGGGAGCCTGCCATCCACTCTGAGGGCCAGTGGGTGACCCTGCCTGCCCCCCTGGACACCATTAATGTGCATCTGAGGGCTGGGTATATTATCCCCCTGCAGGGGCCTGGGCTGACTACCACTGAGAGCAGGCAGCAGCCTATGGCCCTGGCTGTGGCTCTGACTAAGGGGGGGGAGGCCAGGGGGGAGCTGTTCTGGGATGATGGGGAGAGCCTGGAGGTGCTGGAGAGGGGGGCCTACACCCAGGTGATTTTCCTGGCCAGGAACAACACCATTGTGAATGAGCTGGTGAGGGTGACCTCTGAGGGGGCTGGCCTGCAGCTGCAGAAAGTGACTGTGCTGGGGGTGGCCACTGCCCCCCAGCAGGTGCTGAGCAATGGGGTGCCTGTGAGCAACTTCACCTACAGCCCTGACACCAAGGTGCTGGATATTTGTGTGAGCCTGCTGATGGGGGAGCAGTTCCTGGTGAGCTGGTGCTGACTCGAGAGATCTACCGGTGAATTCACCGCGGGTTTAAACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGGCTAGCTCTAGA
配列番号７：ＧＡＡ５＋ＷＴ ＢＧＨポリＡの核酸配列
ATGGCTTTCCTGTGGCTGCTGTCTTGCTGGGCCCTGCTGGGGACTACCTTTGGCCTGCTGGTGCCCAGGGAACTGTCTGGCTCTAGCCCAGTGCTGGAGGAGACCCACCCTGCCCACCAGCAGGGGGCTTCTAGGCCTGGCCCCAGGGATGCCCAGGCCCACCCTGGCAGGCCAAGGGCTGTGCCCACCCAGTGTGATGTGCCCCCCAACTCTAGATTTGATTGTGCCCCTGATAAGGCCATCACCCAGGAGCAGTGTGAGGCTAGGGGCTGCTGCTACATCCCTGCTAAGCAGGGCCTGCAGGGGGCTCAGATGGGCCAGCCCTGGTGCTTCTTCCCCCCCAGCTATCCCTCTTACAAGCTGGAGAATCTGAGCAGCTCTGAGATGGGCTACACTGCCACCCTGACCAGGACTACTCCCACCTTCTTCCCCAAGGACATCCTGACCCTGAGGCTGGATGTGATGATGGAGACTGAGAACAGGCTGCATTTCACCATCAAGGATCCTGCCAACAGGAGGTATGAGGTGCCTCTGGAGACCCCCCATGTGCACAGCAGGGCTCCTTCTCCCCTGTACTCTGTGGAGTTCTCTGAGGAACCCTTTGGGGTGATTGTGAGGAGGCAGCTGGATGGCAGGGTCCTGCTGAACACCACTGTGGCCCCCCTGTTCTTTGCTGATCAGTTCCTGCAGCTGTCCACTTCTCTGCCTAGCCAGTACATCACTGGGCTGGCTGAGCACCTGAGCCCTCTGATGCTGAGCACCTCTTGGACTAGGATCACCCTGTGGAACAGGGACCTGGCCCCCACCCCTGGGGCCAACCTGTATGGCAGCCACCCCTTCTATCTGGCCCTGGAGGATGGGGGCTCTGCCCATGGGGTGTTCCTGCTGAATAGCAATGCTATGGATGTGGTGCTGCAGCCCAGCCCTGCCCTGTCTTGGAGGAGCACTGGGGGCATCCTGGATGTGTACATTTTCCTGGGGCCTGAGCCCAAGTCTGTGGTGCAGCAGTACCTGGATGTGGTGGGCTACCCCTTCATGCCTCCCTACTGGGGCCTGGGCTTCCACCTGTGCAGGTGGGGCTACAGCTCTACTGCCATCACCAGGCAGGTGGTGGAGAATATGACCAGGGCCCACTTCCCCCTGGATGTGCAGTGGAATGACCTGGACTACATGGACTCTAGGAGGGACTTCACCTTCAATAAGGATGGCTTCAGAGACTTCCCTGCCATGGTGCAGGAGCTGCATCAGGGGGGCAGGAGGTACATGATGATTGTGGACCCTGCCATCAGCTCTTCTGGCCCTGCTGGCTCTTACAGGCCCTATGATGAGGGCCTGAGGAGGGGGGTGTTCATCACCAATGAGACTGGGCAGCCCCTGATTGGGAAGGTGTGGCCTGGCTCTACTGCCTTCCCTGACTTCACCAATCCTACTGCCCTGGCCTGGTGGGAGGACATGGTGGCTGAGTTCCATGACCAGGTGCCCTTTGATGGCATGTGGATTGACATGAATGAGCCCTCTAATTTCATCAGGGGCTCTGAGGATGGCTGCCCCAACAATGAGCTGGAGAACCCCCCCTATGTGCCTGGGGTGGTGGGGGGCACCCTGCAGGCTGCCACCATCTGTGCTAGCTCTCACCAGTTCCTGAGCACCCACTACAATCTGCATAACCTGTATGGCCTGACTGAGGCCATTGCCAGCCACAGGGCCCTGGTGAAGGCTAGGGGCACCAGGCCCTTTGTGATTTCTAGGAGCACTTTTGCTGGCCATGGCAGGTATGCTGGGCACTGGACTGGGGATGTGTGGTCTAGCTGGGAGCAGCTGGCTTCTTCTGTGCCTGAGATCCTGCAGTTCAACCTGCTGGGGGTGCCTCTGGTGGGGGCTGATGTGTGTGGGTTCCTGGGCAACACTTCTGAGGAGCTGTGTGTGAGGTGGACCCAGCTGGGGGCCTTCTACCCTTTCATGAGGAACCACAACAGCCTGCTGAGCCTGCCCCAGGAGCCCTACAGCTTCTCTGAGCCTGCCCAGCAGGCCATGAGGAAGGCCCTGACCCTGAGGTATGCCCTGCTGCCCCACCTGTACACCCTGTTCCACCAGGCCCATGTGGCTGGGGAGACTGTGGCTAGGCCTCTGTTCCTGGAGTTCCCCAAGGACTCTAGCACCTGGACTGTGGACCACCAGCTGCTGTGGGGGGAGGCCCTGCTGATCACTCCTGTGCTGCAGGCTGGGAAGGCTGAGGTGACTGGCTATTTCCCCCTGGGCACCTGGTATGACCTGCAGACTGTGCCTGTGGAGGCCCTGGGGAGCCTGCCCCCCCCCCCTGCTGCCCCCAGGGAGCCTGCCATCCACTCTGAGGGCCAGTGGGTGACCCTGCCTGCCCCTCTGGATACCATCAATGTGCACCTGAGGGCTGGCTACATCATTCCCCTGCAGGGCCCTGGCCTGACCACTACTGAGTCTAGGCAGCAGCCCATGGCCCTGGCTGTGGCCCTGACCAAGGGGGGGGAGGCTAGGGGGGAGCTGTTTTGGGATGATGGGGAGAGCCTGGAGGTGCTGGAGAGGGGGGCCTACACTCAGGTGATCTTCCTGGCCAGGAACAATACCATTGTGAATGAGCTGGTGAGGGTGACCTCTGAGGGGGCTGGCCTGCAGCTGCAGAAGGTGACTGTGCTGGGGGTGGCCACTGCCCCCCAGCAGGTGCTGAGCAATGGGGTGCCTGTGAGCAACTTCACCTATAGCCCTGATACCAAGGTGCTGGATATTTGTGTGAGCCTGCTGATGGGGGAGCAGTTCCTGGTGAGCTGGTGCTGACTCGAGAGATCTACCGGTGAATTCACCGCGGGTTTAAACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGGCTAGCTCTAGA
配列番号８：ＧＡＡ７＋ＷＴ ＢＧＨポリＡの核酸配列
ATGGCTTTCCTGTGGCTGCTGTCTTGTTGGGCTCTGCTGGGCACCACCTTTGGCCTGCTGGTGCCCAGGGAGCTGTCTGGCAGCAGCCCTGTGCTGGAGGAGACCCACCCTGCTCATCAGCAGGGGGCTAGCAGGCCTGGCCCCAGGGATGCCCAGGCTCACCCTGGGAGACCCAGGGCTGTGCCCACTCAGTGTGATGTGCCCCCCAACAGCAGGTTTGACTGTGCTCCTGACAAGGCTATCACCCAGGAGCAGTGTGAGGCCAGGGGGTGCTGCTACATTCCTGCTAAGCAGGGCCTGCAGGGGGCCCAGATGGGCCAGCCCTGGTGCTTCTTCCCCCCCTCTTATCCCAGCTATAAGCTGGAGAACCTGAGCAGCTCTGAGATGGGCTACACTGCCACCCTGACCAGGACCACTCCCACCTTCTTTCCCAAGGATATTCTGACTCTGAGGCTGGATGTGATGATGGAGACTGAGAACAGGCTGCACTTCACTATCAAGGACCCTGCCAATAGGAGGTATGAGGTGCCCCTGGAGACTCCTCATGTGCATAGCAGGGCCCCTTCTCCTCTGTATTCTGTGGAGTTCTCTGAGGAGCCCTTTGGGGTGATTGTGAGGAGGCAGCTGGATGGCAGGGTGCTGCTGAACACCACTGTGGCCCCCCTGTTCTTTGCTGACCAGTTCCTGCAGCTGAGCACTTCTCTGCCCAGCCAGTACATTACTGGGCTGGCTGAGCATCTGAGCCCCCTGATGCTGAGCACCTCTTGGACCAGGATCACCCTGTGGAACAGGGACCTGGCCCCCACTCCTGGGGCTAACCTGTATGGCTCTCACCCCTTTTACCTGGCCCTGGAGGATGGGGGCTCTGCCCATGGGGTGTTTCTGCTGAACAGCAATGCTATGGATGTGGTGCTGCAGCCCTCTCCAGCCCTGTCTTGGAGGAGCACTGGGGGCATTCTGGATGTGTACATTTTCCTGGGGCCTGAACCCAAGTCTGTGGTGCAGCAGTACCTGGATGTGGTGGGCTACCCCTTCATGCCCCCCTATTGGGGGCTGGGGTTTCACCTGTGCAGGTGGGGCTACAGCAGCACTGCCATCACCAGGCAGGTGGTGGAGAACATGACCAGGGCCCATTTCCCCCTGGATGTGCAGTGGAATGACCTGGACTACATGGATAGCAGGAGGGATTTCACCTTCAACAAGGATGGCTTCAGGGACTTTCCTGCCATGGTGCAGGAGCTGCACCAGGGGGGCAGGAGGTATATGATGATTGTGGACCCTGCTATCAGCAGCTCTGGCCCTGCTGGCTCTTACAGGCCCTATGATGAGGGCCTGAGGAGGGGGGTGTTTATCACTAATGAAACTGGCCAGCCTCTGATTGGCAAGGTCTGGCCTGGCTCTACTGCCTTCCCTGATTTTACTAACCCCACTGCCCTGGCCTGGTGGGAGGACATGGTGGCTGAGTTCCATGATCAGGTGCCTTTTGATGGCATGTGGATTGATATGAATGAACCAAGCAACTTCATCAGAGGCTCTGAGGATGGCTGCCCCAACAATGAGCTGGAGAACCCCCCCTATGTGCCTGGGGTGGTGGGGGGCACTCTGCAGGCTGCCACCATTTGTGCTAGCAGCCACCAGTTCCTGAGCACCCACTACAATCTGCACAACCTGTATGGCCTGACTGAAGCCATTGCCAGCCATAGGGCCCTGGTGAAGGCCAGGGGCACTAGGCCTTTTGTGATCAGCAGGAGCACTTTTGCTGGCCATGGCAGGTATGCTGGCCACTGGACTGGGGATGTGTGGAGCAGCTGGGAGCAGCTGGCCAGCTCTGTGCCTGAGATTCTGCAGTTTAACCTGCTGGGGGTGCCCCTGGTGGGGGCTGATGTGTGTGGCTTCCTGGGCAACACCTCTGAGGAGCTGTGTGTGAGGTGGACCCAGCTGGGGGCCTTTTATCCCTTCATGAGGAACCACAACAGCCTGCTGAGCCTGCCTCAGGAGCCCTACTCTTTCTCTGAGCCTGCCCAGCAGGCCATGAGGAAGGCCCTGACCCTGAGGTATGCCCTGCTGCCCCACCTGTATACCCTGTTCCACCAGGCCCATGTGGCTGGGGAGACTGTGGCCAGGCCCCTGTTCCTGGAGTTCCCCAAGGACAGCAGCACCTGGACTGTGGATCATCAGCTGCTGTGGGGGGAGGCCCTGCTGATCACCCCTGTGCTGCAGGCTGGCAAGGCTGAGGTCACTGGCTACTTCCCTCTGGGCACCTGGTATGACCTGCAGACTGTGCCTGTGGAGGCTCTGGGCAGCCTGCCCCCCCCCCCTGCTGCTCCCAGGGAGCCTGCCATCCACTCTGAGGGCCAGTGGGTGACCCTGCCTGCTCCCCTGGACACCATCAATGTGCACCTGAGGGCTGGCTACATTATCCCCCTGCAGGGCCCAGGGCTGACTACCACTGAGAGCAGACAGCAGCCCATGGCTCTGGCTGTGGCCCTGACCAAGGGGGGGGAAGCTAGGGGGGAGCTGTTCTGGGATGATGGGGAGAGCCTGGAGGTGCTGGAGAGGGGGGCCTATACCCAGGTGATCTTCCTGGCTAGGAACAACACCATTGTCAATGAGCTGGTGAGGGTGACTTCTGAGGGGGCTGGGCTGCAGCTGCAGAAGGTGACTGTGCTGGGGGTGGCCACTGCTCCCCAGCAGGTGCTGAGCAATGGGGTGCCTGTGAGCAACTTCACCTACAGCCCTGACACCAAGGTGCTGGACATCTGTGTGTCTCTGCTGATGGGGGAGCAGTTCCTGGTGAGCTGGTGCTGACTCGAGAGATCTACCGGTGAATTCACCGCGGGTTTAAACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGGCTAGCTCTAGA
配列番号９：ＧＡＡ８＋ＷＴ ＢＧＨポリＡの核酸配列
ATGGCCTTCCTGTGGCTGCTGTCTTGCTGGGCTCTGCTGGGGACCACCTTTGGCCTGCTGGTCCCCAGGGAGCTGTCTGGCTCTTCTCCTGTCCTGGAGGAGACCCACCCTGCCCACCAGCAGGGGGCTAGCAGGCCTGGCCCCAGGGATGCCCAGGCCCACCCTGGCAGGCCCAGGGCTGTGCCCACCCAGTGTGATGTGCCTCCCAACAGCAGGTTTGACTGTGCCCCTGACAAGGCCATCACCCAGGAGCAGTGTGAGGCCAGGGGCTGCTGCTATATCCCTGCCAAGCAGGGCCTGCAGGGGGCTCAGATGGGCCAGCCCTGGTGCTTCTTTCCCCCCTCTTATCCTAGCTATAAGCTGGAGAACCTGAGCAGCTCTGAGATGGGGTACACTGCCACCCTGACCAGGACCACCCCCACTTTCTTCCCTAAGGACATCCTGACCCTGAGGCTGGATGTGATGATGGAGACTGAGAATAGGCTGCACTTTACTATCAAGGACCCTGCCAACAGGAGGTATGAGGTGCCTCTGGAGACCCCCCATGTGCATTCTAGGGCCCCCAGCCCCCTGTACTCTGTGGAGTTCTCTGAGGAGCCCTTTGGGGTGATTGTGAGGAGACAGCTGGATGGCAGGGTCCTGCTGAACACCACTGTGGCTCCCCTGTTTTTTGCTGACCAGTTCCTGCAGCTGAGCACCAGCCTGCCCAGCCAGTACATCACTGGGCTGGCTGAGCACCTGAGCCCCCTGATGCTGAGCACCAGCTGGACCAGGATCACCCTGTGGAACAGGGATCTGGCTCCTACCCCTGGGGCCAACCTGTATGGCTCTCACCCCTTTTACCTGGCCCTGGAGGATGGGGGCTCTGCCCATGGGGTGTTCCTGCTGAACAGCAATGCTATGGATGTGGTGCTGCAGCCCAGCCCTGCCCTGAGCTGGAGGTCTACTGGGGGCATCCTGGATGTGTACATCTTTCTGGGGCCTGAGCCCAAGTCTGTGGTGCAGCAGTACCTGGATGTGGTGGGCTATCCTTTTATGCCCCCCTATTGGGGCCTGGGCTTCCACCTGTGCAGGTGGGGCTACAGCAGCACTGCCATCACCAGACAGGTGGTGGAGAACATGACCAGGGCCCACTTCCCCCTGGATGTGCAGTGGAATGACCTGGACTACATGGACAGCAGGAGGGACTTCACCTTTAACAAGGATGGCTTTAGGGACTTCCCTGCCATGGTGCAGGAGCTGCATCAGGGGGGCAGGAGGTACATGATGATTGTGGACCCAGCCATCAGCAGCTCTGGGCCTGCTGGGTCTTACAGGCCCTATGATGAGGGCCTGAGGAGGGGGGTGTTCATCACCAATGAGACTGGCCAGCCCCTGATTGGCAAGGTGTGGCCTGGGAGCACTGCCTTCCCTGATTTTACCAACCCCACTGCCCTGGCCTGGTGGGAGGATATGGTGGCTGAGTTTCATGACCAGGTGCCCTTTGATGGCATGTGGATTGACATGAATGAGCCCAGCAATTTCATCAGGGGCTCTGAGGATGGCTGCCCCAACAATGAGCTGGAGAATCCTCCCTATGTGCCTGGGGTGGTGGGGGGCACCCTGCAGGCTGCCACCATCTGTGCCTCTAGCCACCAGTTCCTGAGCACCCACTATAACCTGCATAACCTGTATGGCCTGACTGAGGCCATTGCCAGCCATAGAGCCCTGGTGAAGGCCAGAGGGACCAGGCCCTTTGTGATCTCTAGGAGCACCTTTGCTGGCCATGGCAGGTATGCTGGCCACTGGACTGGGGATGTGTGGAGCTCTTGGGAGCAGCTGGCCAGCTCTGTGCCAGAGATCCTGCAGTTCAACCTGCTGGGGGTGCCTCTGGTGGGGGCTGATGTGTGTGGCTTCCTGGGCAATACCTCTGAAGAGCTGTGTGTGAGGTGGACTCAGCTGGGGGCCTTCTATCCCTTCATGAGGAACCACAACAGCCTGCTGTCTCTGCCCCAGGAGCCCTACAGCTTCTCTGAGCCTGCTCAGCAGGCTATGAGGAAGGCCCTGACCCTGAGGTATGCCCTGCTGCCCCATCTGTACACCCTGTTCCACCAGGCCCATGTGGCTGGGGAGACTGTGGCCAGGCCCCTGTTTCTGGAGTTTCCCAAGGACAGCAGCACCTGGACTGTGGACCATCAGCTGCTGTGGGGGGAGGCTCTGCTGATTACCCCTGTGCTGCAGGCTGGCAAGGCTGAGGTGACTGGGTACTTCCCCCTGGGGACTTGGTATGACCTGCAGACTGTGCCTGTGGAAGCTCTGGGCAGCCTGCCCCCACCCCCTGCTGCCCCTAGGGAGCCTGCCATCCACTCTGAGGGCCAGTGGGTGACCCTGCCTGCCCCTCTGGACACCATCAATGTGCACCTGAGGGCTGGCTATATCATCCCCCTGCAGGGCCCTGGGCTGACCACCACTGAGAGCAGGCAGCAGCCCATGGCCCTGGCTGTGGCCCTGACTAAGGGGGGGGAGGCCAGGGGGGAGCTGTTCTGGGATGATGGGGAGAGCCTGGAGGTGCTGGAGAGAGGGGCCTACACCCAGGTGATCTTTCTGGCCAGGAACAACACCATTGTGAATGAGCTGGTGAGGGTGACTTCTGAGGGGGCTGGCCTGCAGCTGCAGAAGGTGACTGTGCTGGGGGTGGCCACTGCCCCCCAGCAGGTGCTGAGCAATGGGGTGCCTGTGTCTAACTTCACCTACAGCCCTGATACTAAGGTGCTGGATATCTGTGTGAGCCTGCTGATGGGGGAGCAGTTTCTGGTGAGCTGGTGCTGACTCGAGAGATCTACCGGTGAATTCACCGCGGGTTTAAACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGGCTAGCTCTAGA
配列番号１０：ＧＡＡ１３＋ＷＴ ＢＧＨポリＡの核酸配列
ATGGCCTTTCTGTGGCTGCTGTCCTGCTGGGCCCTGCTGGGGACCACCTTTGGCCTGCTGGTGCCCAGGGAGCTGTCTGGGAGCAGCCCAGTGCTGGAGGAGACCCACCCTGCCCACCAGCAGGGGGCCAGCAGGCCTGGCCCTAGGGATGCCCAGGCCCACCCTGGCAGGCCCAGGGCTGTGCCTACCCAGTGTGATGTGCCACCCAATTCTAGGTTTGACTGTGCTCCTGACAAGGCCATCACTCAGGAGCAGTGTGAAGCTAGGGGGTGCTGCTACATCCCAGCCAAGCAGGGCCTGCAGGGGGCCCAGATGGGCCAGCCCTGGTGCTTCTTCCCCCCCAGCTACCCTAGCTACAAGCTGGAGAATCTGAGCAGCTCTGAGATGGGCTACACTGCTACCCTGACCAGGACCACTCCTACCTTCTTCCCCAAGGACATCCTGACTCTGAGGCTGGATGTCATGATGGAGACTGAAAATAGGCTGCACTTCACCATCAAGGACCCTGCCAATAGGAGGTATGAGGTGCCTCTGGAGACCCCCCATGTGCATAGCAGGGCTCCCAGCCCCCTGTATTCTGTGGAGTTCTCTGAGGAGCCCTTTGGGGTCATTGTGAGGAGACAGCTGGATGGGAGGGTGCTGCTGAACACTACTGTGGCTCCCCTGTTCTTTGCTGACCAGTTCCTGCAGCTGTCTACCAGCCTGCCCAGCCAGTACATCACTGGGCTGGCTGAGCATCTGAGCCCCCTGATGCTGAGCACCAGCTGGACCAGGATCACTCTGTGGAACAGGGATCTGGCCCCCACTCCTGGGGCCAACCTGTATGGGAGCCATCCCTTCTACCTGGCCCTGGAGGATGGGGGCTCTGCCCATGGGGTGTTCCTGCTGAACAGCAATGCCATGGATGTGGTGCTGCAGCCTAGCCCTGCCCTGAGCTGGAGGAGCACTGGGGGCATCCTGGATGTCTACATCTTCCTGGGGCCTGAGCCCAAGTCTGTGGTGCAGCAGTATCTGGATGTGGTGGGGTATCCCTTCATGCCCCCCTACTGGGGCCTGGGCTTTCACCTGTGCAGGTGGGGCTACAGCAGCACTGCCATCACCAGGCAGGTGGTGGAGAACATGACCAGGGCCCACTTCCCTCTGGATGTGCAGTGGAATGACCTGGACTATATGGATTCTAGGAGAGACTTTACTTTTAACAAGGATGGCTTCAGGGATTTCCCTGCCATGGTGCAGGAGCTGCACCAGGGGGGCAGGAGGTACATGATGATTGTGGACCCTGCTATTAGCAGCTCTGGCCCTGCTGGGTCTTACAGGCCTTATGATGAGGGCCTGAGGAGGGGGGTGTTCATCACCAATGAGACTGGCCAGCCCCTGATTGGCAAGGTGTGGCCTGGCAGCACTGCCTTCCCTGACTTCACCAACCCCACTGCCCTGGCCTGGTGGGAGGACATGGTGGCTGAGTTCCATGACCAGGTGCCCTTTGATGGGATGTGGATTGACATGAATGAGCCCTCTAACTTCATCAGGGGGTCTGAGGATGGCTGCCCCAACAATGAGCTGGAGAACCCCCCCTATGTGCCTGGGGTGGTGGGGGGCACTCTGCAGGCTGCCACTATCTGTGCTTCTTCTCACCAGTTTCTGAGCACCCACTATAATCTGCACAACCTGTATGGCCTGACTGAGGCCATTGCCAGCCATAGGGCCCTGGTGAAGGCCAGGGGCACCAGGCCCTTTGTGATCAGCAGGTCTACCTTTGCTGGCCATGGCAGGTATGCTGGCCACTGGACTGGGGATGTGTGGTCTTCTTGGGAGCAGCTGGCCAGCTCTGTGCCTGAGATCCTGCAGTTCAACCTGCTGGGGGTGCCTCTGGTGGGGGCTGATGTGTGTGGCTTTCTGGGCAACACCTCTGAGGAGCTGTGTGTGAGGTGGACCCAGCTGGGGGCCTTTTACCCCTTCATGAGGAACCACAATAGCCTGCTGAGCCTGCCCCAGGAGCCTTACTCTTTCTCTGAGCCTGCCCAGCAGGCCATGAGGAAGGCCCTGACTCTGAGGTATGCCCTGCTGCCCCATCTGTATACCCTGTTTCACCAGGCCCATGTGGCTGGGGAGACTGTGGCTAGGCCTCTGTTTCTGGAGTTCCCTAAGGACTCTAGCACCTGGACTGTGGACCACCAGCTGCTGTGGGGGGAGGCCCTGCTGATCACCCCTGTGCTGCAGGCTGGCAAGGCTGAGGTGACTGGCTACTTCCCCCTGGGCACCTGGTATGACCTGCAGACTGTGCCTGTGGAGGCCCTGGGGAGCCTGCCTCCCCCCCCTGCTGCCCCCAGGGAGCCTGCCATTCATTCTGAGGGCCAGTGGGTGACCCTGCCTGCCCCTCTGGACACCATCAATGTGCACCTGAGGGCTGGGTACATCATCCCCCTGCAGGGCCCTGGCCTGACCACCACTGAGAGCAGGCAGCAGCCCATGGCCCTGGCTGTGGCTCTGACCAAGGGGGGGGAGGCCAGGGGGGAGCTGTTCTGGGATGATGGGGAGTCTCTGGAGGTGCTGGAGAGGGGGGCCTACACCCAGGTGATCTTTCTGGCCAGGAACAATACTATTGTGAATGAGCTGGTGAGGGTGACCTCTGAGGGGGCTGGCCTGCAGCTGCAGAAGGTGACTGTGCTGGGGGTGGCCACTGCCCCCCAGCAGGTCCTGAGCAATGGGGTGCCTGTGAGCAACTTCACCTACTCTCCTGACACCAAGGTGCTGGACATTTGTGTGTCTCTGCTGATGGGGGAGCAGTTCCTGGTGAGCTGGTGCTGACTCGAGAGATCTACCGGTGAATTCACCGCGGGTTTAAACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGGCTAGCTCTAGA
配列番号１１：ＧＡＡ２＋ＣｐＧ減少したＢＧＨポリＡの核酸配列
ATGGCTTTCCTGTGGCTGCTGAGCTGCTGGGCTCTGCTGGGCACCACCTTTGGGCTGCTGGTGCCTAGGGAGCTGTCTGGGTCTAGCCCTGTGCTGGAGGAGACTCACCCTGCCCATCAGCAGGGGGCTAGCAGGCCTGGCCCCAGGGATGCTCAGGCCCACCCTGGCAGGCCCAGGGCTGTGCCCACCCAGTGTGATGTGCCCCCCAACAGCAGGTTTGACTGTGCCCCTGACAAGGCCATTACCCAGGAGCAGTGTGAGGCCAGGGGCTGCTGCTACATTCCAGCTAAGCAGGGCCTGCAGGGGGCCCAGATGGGCCAGCCCTGGTGCTTCTTCCCCCCCAGCTATCCTAGCTATAAACTGGAGAACCTGAGCAGCTCTGAGATGGGCTATACTGCCACCCTGACTAGGACTACTCCCACCTTTTTTCCTAAGGATATCCTGACCCTGAGGCTGGATGTGATGATGGAGACTGAGAACAGGCTGCACTTCACTATTAAGGACCCTGCCAATAGGAGGTATGAAGTGCCTCTGGAGACTCCTCATGTGCACTCTAGGGCCCCCAGCCCCCTGTATTCTGTGGAGTTCTCTGAGGAGCCCTTTGGGGTGATTGTGAGGAGGCAGCTGGATGGCAGGGTGCTGCTGAACACCACTGTGGCCCCCCTGTTCTTTGCTGACCAGTTCCTGCAGCTGAGCACCAGCCTGCCCAGCCAGTACATCACTGGGCTGGCTGAGCATCTGAGCCCTCTGATGCTGAGCACCTCTTGGACCAGGATCACCCTGTGGAATAGGGATCTGGCCCCCACCCCTGGGGCTAATCTGTATGGCTCTCATCCCTTTTACCTGGCCCTGGAGGATGGGGGCTCTGCCCATGGGGTGTTTCTGCTGAACAGCAATGCCATGGATGTGGTGCTGCAGCCCTCTCCTGCCCTGAGCTGGAGGAGCACTGGGGGCATCCTGGATGTGTACATCTTCCTGGGCCCTGAGCCCAAGTCTGTGGTCCAGCAGTATCTGGATGTGGTGGGCTACCCCTTTATGCCCCCCTATTGGGGCCTGGGCTTCCACCTGTGCAGGTGGGGGTATTCTTCTACTGCTATCACCAGGCAGGTGGTGGAGAACATGACCAGGGCTCACTTCCCCCTGGATGTGCAGTGGAATGACCTGGACTATATGGACTCTAGGAGGGATTTCACCTTCAACAAGGATGGCTTCAGGGACTTCCCTGCTATGGTCCAGGAGCTGCATCAGGGGGGCAGGAGGTACATGATGATTGTGGACCCTGCCATCAGCAGCTCTGGCCCTGCTGGCAGCTATAGGCCCTATGATGAGGGCCTGAGGAGGGGGGTGTTTATCACTAATGAAACTGGGCAGCCCCTGATTGGCAAGGTGTGGCCTGGCTCTACTGCCTTCCCTGACTTCACCAACCCCACTGCTCTGGCCTGGTGGGAGGACATGGTGGCTGAGTTCCATGACCAGGTGCCTTTTGATGGCATGTGGATTGACATGAATGAGCCCAGCAACTTCATCAGGGGCTCTGAGGATGGGTGCCCCAATAATGAGCTGGAGAACCCCCCCTATGTGCCTGGGGTGGTGGGGGGCACCCTGCAGGCTGCCACTATTTGTGCCAGCTCTCACCAGTTCCTGAGCACCCACTACAACCTGCACAATCTGTATGGCCTGACTGAGGCCATTGCCAGCCACAGGGCCCTGGTGAAGGCCAGGGGCACTAGGCCCTTTGTGATCTCTAGAAGCACCTTTGCTGGCCATGGGAGGTATGCTGGCCACTGGACTGGGGATGTGTGGAGCTCTTGGGAGCAGCTGGCCAGCTCTGTGCCTGAGATCCTGCAGTTCAACCTGCTGGGGGTGCCCCTGGTGGGGGCTGATGTGTGTGGCTTCCTGGGCAACACCTCTGAAGAGCTGTGTGTGAGGTGGACCCAGCTGGGGGCCTTCTACCCTTTCATGAGGAACCACAACAGCCTGCTGAGCCTGCCTCAGGAGCCTTACTCTTTCTCTGAGCCTGCCCAGCAGGCCATGAGGAAGGCCCTGACCCTGAGGTATGCTCTGCTGCCCCACCTGTACACCCTGTTCCACCAGGCCCATGTGGCTGGGGAGACTGTGGCCAGGCCCCTGTTCCTGGAGTTTCCTAAGGATAGCAGCACCTGGACTGTGGACCACCAGCTGCTGTGGGGGGAGGCCCTGCTGATTACCCCTGTGCTGCAGGCTGGCAAGGCTGAGGTGACTGGCTACTTCCCCCTGGGCACTTGGTATGACCTGCAGACTGTGCCTGTGGAAGCCCTGGGCAGCCTGCCTCCCCCCCCTGCTGCCCCCAGGGAGCCTGCCATCCACTCTGAGGGCCAGTGGGTGACCCTGCCTGCCCCCCTGGACACCATTAATGTGCATCTGAGGGCTGGGTATATTATCCCCCTGCAGGGGCCTGGGCTGACTACCACTGAGAGCAGGCAGCAGCCTATGGCCCTGGCTGTGGCTCTGACTAAGGGGGGGGAGGCCAGGGGGGAGCTGTTCTGGGATGATGGGGAGAGCCTGGAGGTGCTGGAGAGGGGGGCCTACACCCAGGTGATTTTCCTGGCCAGGAACAACACCATTGTGAATGAGCTGGTGAGGGTGACCTCTGAGGGGGCTGGCCTGCAGCTGCAGAAAGTGACTGTGCTGGGGGTGGCCACTGCCCCCCAGCAGGTGCTGAGCAATGGGGTGCCTGTGAGCAACTTCACCTACAGCCCTGACACCAAGGTGCTGGATATTTGTGTGAGCCTGCTGATGGGGGAGCAGTTCCTGGTGAGCTGGTGCTGAAGATCTAGAGCTGAATTCCTGCAGCCAGGGGGATCAGCCTCTACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCTTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCACATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCAGTGGGCTCTATGG
配列番号１２：ＧＡＡ５＋ＣｐＧ減少したＢＧＨポリＡの核酸配列
ATGGCTTTCCTGTGGCTGCTGTCTTGCTGGGCCCTGCTGGGGACTACCTTTGGCCTGCTGGTGCCCAGGGAACTGTCTGGCTCTAGCCCAGTGCTGGAGGAGACCCACCCTGCCCACCAGCAGGGGGCTTCTAGGCCTGGCCCCAGGGATGCCCAGGCCCACCCTGGCAGGCCAAGGGCTGTGCCCACCCAGTGTGATGTGCCCCCCAACTCTAGATTTGATTGTGCCCCTGATAAGGCCATCACCCAGGAGCAGTGTGAGGCTAGGGGCTGCTGCTACATCCCTGCTAAGCAGGGCCTGCAGGGGGCTCAGATGGGCCAGCCCTGGTGCTTCTTCCCCCCCAGCTATCCCTCTTACAAGCTGGAGAATCTGAGCAGCTCTGAGATGGGCTACACTGCCACCCTGACCAGGACTACTCCCACCTTCTTCCCCAAGGACATCCTGACCCTGAGGCTGGATGTGATGATGGAGACTGAGAACAGGCTGCATTTCACCATCAAGGATCCTGCCAACAGGAGGTATGAGGTGCCTCTGGAGACCCCCCATGTGCACAGCAGGGCTCCTTCTCCCCTGTACTCTGTGGAGTTCTCTGAGGAACCCTTTGGGGTGATTGTGAGGAGGCAGCTGGATGGCAGGGTCCTGCTGAACACCACTGTGGCCCCCCTGTTCTTTGCTGATCAGTTCCTGCAGCTGTCCACTTCTCTGCCTAGCCAGTACATCACTGGGCTGGCTGAGCACCTGAGCCCTCTGATGCTGAGCACCTCTTGGACTAGGATCACCCTGTGGAACAGGGACCTGGCCCCCACCCCTGGGGCCAACCTGTATGGCAGCCACCCCTTCTATCTGGCCCTGGAGGATGGGGGCTCTGCCCATGGGGTGTTCCTGCTGAATAGCAATGCTATGGATGTGGTGCTGCAGCCCAGCCCTGCCCTGTCTTGGAGGAGCACTGGGGGCATCCTGGATGTGTACATTTTCCTGGGGCCTGAGCCCAAGTCTGTGGTGCAGCAGTACCTGGATGTGGTGGGCTACCCCTTCATGCCTCCCTACTGGGGCCTGGGCTTCCACCTGTGCAGGTGGGGCTACAGCTCTACTGCCATCACCAGGCAGGTGGTGGAGAATATGACCAGGGCCCACTTCCCCCTGGATGTGCAGTGGAATGACCTGGACTACATGGACTCTAGGAGGGACTTCACCTTCAATAAGGATGGCTTCAGAGACTTCCCTGCCATGGTGCAGGAGCTGCATCAGGGGGGCAGGAGGTACATGATGATTGTGGACCCTGCCATCAGCTCTTCTGGCCCTGCTGGCTCTTACAGGCCCTATGATGAGGGCCTGAGGAGGGGGGTGTTCATCACCAATGAGACTGGGCAGCCCCTGATTGGGAAGGTGTGGCCTGGCTCTACTGCCTTCCCTGACTTCACCAATCCTACTGCCCTGGCCTGGTGGGAGGACATGGTGGCTGAGTTCCATGACCAGGTGCCCTTTGATGGCATGTGGATTGACATGAATGAGCCCTCTAATTTCATCAGGGGCTCTGAGGATGGCTGCCCCAACAATGAGCTGGAGAACCCCCCCTATGTGCCTGGGGTGGTGGGGGGCACCCTGCAGGCTGCCACCATCTGTGCTAGCTCTCACCAGTTCCTGAGCACCCACTACAATCTGCATAACCTGTATGGCCTGACTGAGGCCATTGCCAGCCACAGGGCCCTGGTGAAGGCTAGGGGCACCAGGCCCTTTGTGATTTCTAGGAGCACTTTTGCTGGCCATGGCAGGTATGCTGGGCACTGGACTGGGGATGTGTGGTCTAGCTGGGAGCAGCTGGCTTCTTCTGTGCCTGAGATCCTGCAGTTCAACCTGCTGGGGGTGCCTCTGGTGGGGGCTGATGTGTGTGGGTTCCTGGGCAACACTTCTGAGGAGCTGTGTGTGAGGTGGACCCAGCTGGGGGCCTTCTACCCTTTCATGAGGAACCACAACAGCCTGCTGAGCCTGCCCCAGGAGCCCTACAGCTTCTCTGAGCCTGCCCAGCAGGCCATGAGGAAGGCCCTGACCCTGAGGTATGCCCTGCTGCCCCACCTGTACACCCTGTTCCACCAGGCCCATGTGGCTGGGGAGACTGTGGCTAGGCCTCTGTTCCTGGAGTTCCCCAAGGACTCTAGCACCTGGACTGTGGACCACCAGCTGCTGTGGGGGGAGGCCCTGCTGATCACTCCTGTGCTGCAGGCTGGGAAGGCTGAGGTGACTGGCTATTTCCCCCTGGGCACCTGGTATGACCTGCAGACTGTGCCTGTGGAGGCCCTGGGGAGCCTGCCCCCCCCCCCTGCTGCCCCCAGGGAGCCTGCCATCCACTCTGAGGGCCAGTGGGTGACCCTGCCTGCCCCTCTGGATACCATCAATGTGCACCTGAGGGCTGGCTACATCATTCCCCTGCAGGGCCCTGGCCTGACCACTACTGAGTCTAGGCAGCAGCCCATGGCCCTGGCTGTGGCCCTGACCAAGGGGGGGGAGGCTAGGGGGGAGCTGTTTTGGGATGATGGGGAGAGCCTGGAGGTGCTGGAGAGGGGGGCCTACACTCAGGTGATCTTCCTGGCCAGGAACAATACCATTGTGAATGAGCTGGTGAGGGTGACCTCTGAGGGGGCTGGCCTGCAGCTGCAGAAGGTGACTGTGCTGGGGGTGGCCACTGCCCCCCAGCAGGTGCTGAGCAATGGGGTGCCTGTGAGCAACTTCACCTATAGCCCTGATACCAAGGTGCTGGATATTTGTGTGAGCCTGCTGATGGGGGAGCAGTTCCTGGTGAGCTGGTGCTGAAGATCTAGAGCTGAATTCCTGCAGCCAGGGGGATCAGCCTCTACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCTTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCACATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCAGTGGGCTCTATGG
配列番号１３：ＧＡＡ７＋ＣｐＧ減少したＢＧＨポリＡの核酸配列
ATGGCTTTCCTGTGGCTGCTGTCTTGTTGGGCTCTGCTGGGCACCACCTTTGGCCTGCTGGTGCCCAGGGAGCTGTCTGGCAGCAGCCCTGTGCTGGAGGAGACCCACCCTGCTCATCAGCAGGGGGCTAGCAGGCCTGGCCCCAGGGATGCCCAGGCTCACCCTGGGAGACCCAGGGCTGTGCCCACTCAGTGTGATGTGCCCCCCAACAGCAGGTTTGACTGTGCTCCTGACAAGGCTATCACCCAGGAGCAGTGTGAGGCCAGGGGGTGCTGCTACATTCCTGCTAAGCAGGGCCTGCAGGGGGCCCAGATGGGCCAGCCCTGGTGCTTCTTCCCCCCCTCTTATCCCAGCTATAAGCTGGAGAACCTGAGCAGCTCTGAGATGGGCTACACTGCCACCCTGACCAGGACCACTCCCACCTTCTTTCCCAAGGATATTCTGACTCTGAGGCTGGATGTGATGATGGAGACTGAGAACAGGCTGCACTTCACTATCAAGGACCCTGCCAATAGGAGGTATGAGGTGCCCCTGGAGACTCCTCATGTGCATAGCAGGGCCCCTTCTCCTCTGTATTCTGTGGAGTTCTCTGAGGAGCCCTTTGGGGTGATTGTGAGGAGGCAGCTGGATGGCAGGGTGCTGCTGAACACCACTGTGGCCCCCCTGTTCTTTGCTGACCAGTTCCTGCAGCTGAGCACTTCTCTGCCCAGCCAGTACATTACTGGGCTGGCTGAGCATCTGAGCCCCCTGATGCTGAGCACCTCTTGGACCAGGATCACCCTGTGGAACAGGGACCTGGCCCCCACTCCTGGGGCTAACCTGTATGGCTCTCACCCCTTTTACCTGGCCCTGGAGGATGGGGGCTCTGCCCATGGGGTGTTTCTGCTGAACAGCAATGCTATGGATGTGGTGCTGCAGCCCTCTCCAGCCCTGTCTTGGAGGAGCACTGGGGGCATTCTGGATGTGTACATTTTCCTGGGGCCTGAACCCAAGTCTGTGGTGCAGCAGTACCTGGATGTGGTGGGCTACCCCTTCATGCCCCCCTATTGGGGGCTGGGGTTTCACCTGTGCAGGTGGGGCTACAGCAGCACTGCCATCACCAGGCAGGTGGTGGAGAACATGACCAGGGCCCATTTCCCCCTGGATGTGCAGTGGAATGACCTGGACTACATGGATAGCAGGAGGGATTTCACCTTCAACAAGGATGGCTTCAGGGACTTTCCTGCCATGGTGCAGGAGCTGCACCAGGGGGGCAGGAGGTATATGATGATTGTGGACCCTGCTATCAGCAGCTCTGGCCCTGCTGGCTCTTACAGGCCCTATGATGAGGGCCTGAGGAGGGGGGTGTTTATCACTAATGAAACTGGCCAGCCTCTGATTGGCAAGGTCTGGCCTGGCTCTACTGCCTTCCCTGATTTTACTAACCCCACTGCCCTGGCCTGGTGGGAGGACATGGTGGCTGAGTTCCATGATCAGGTGCCTTTTGATGGCATGTGGATTGATATGAATGAACCAAGCAACTTCATCAGAGGCTCTGAGGATGGCTGCCCCAACAATGAGCTGGAGAACCCCCCCTATGTGCCTGGGGTGGTGGGGGGCACTCTGCAGGCTGCCACCATTTGTGCTAGCAGCCACCAGTTCCTGAGCACCCACTACAATCTGCACAACCTGTATGGCCTGACTGAAGCCATTGCCAGCCATAGGGCCCTGGTGAAGGCCAGGGGCACTAGGCCTTTTGTGATCAGCAGGAGCACTTTTGCTGGCCATGGCAGGTATGCTGGCCACTGGACTGGGGATGTGTGGAGCAGCTGGGAGCAGCTGGCCAGCTCTGTGCCTGAGATTCTGCAGTTTAACCTGCTGGGGGTGCCCCTGGTGGGGGCTGATGTGTGTGGCTTCCTGGGCAACACCTCTGAGGAGCTGTGTGTGAGGTGGACCCAGCTGGGGGCCTTTTATCCCTTCATGAGGAACCACAACAGCCTGCTGAGCCTGCCTCAGGAGCCCTACTCTTTCTCTGAGCCTGCCCAGCAGGCCATGAGGAAGGCCCTGACCCTGAGGTATGCCCTGCTGCCCCACCTGTATACCCTGTTCCACCAGGCCCATGTGGCTGGGGAGACTGTGGCCAGGCCCCTGTTCCTGGAGTTCCCCAAGGACAGCAGCACCTGGACTGTGGATCATCAGCTGCTGTGGGGGGAGGCCCTGCTGATCACCCCTGTGCTGCAGGCTGGCAAGGCTGAGGTCACTGGCTACTTCCCTCTGGGCACCTGGTATGACCTGCAGACTGTGCCTGTGGAGGCTCTGGGCAGCCTGCCCCCCCCCCCTGCTGCTCCCAGGGAGCCTGCCATCCACTCTGAGGGCCAGTGGGTGACCCTGCCTGCTCCCCTGGACACCATCAATGTGCACCTGAGGGCTGGCTACATTATCCCCCTGCAGGGCCCAGGGCTGACTACCACTGAGAGCAGACAGCAGCCCATGGCTCTGGCTGTGGCCCTGACCAAGGGGGGGGAAGCTAGGGGGGAGCTGTTCTGGGATGATGGGGAGAGCCTGGAGGTGCTGGAGAGGGGGGCCTATACCCAGGTGATCTTCCTGGCTAGGAACAACACCATTGTCAATGAGCTGGTGAGGGTGACTTCTGAGGGGGCTGGGCTGCAGCTGCAGAAGGTGACTGTGCTGGGGGTGGCCACTGCTCCCCAGCAGGTGCTGAGCAATGGGGTGCCTGTGAGCAACTTCACCTACAGCCCTGACACCAAGGTGCTGGACATCTGTGTGTCTCTGCTGATGGGGGAGCAGTTCCTGGTGAGCTGGTGCTGAAGATCTAGAGCTGAATTCCTGCAGCCAGGGGGATCAGCCTCTACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCTTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCACATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCAGTGGGCTCTATGG
配列番号１４：ＧＡＡ８＋ＣｐＧ減少したＢＧＨポリＡの核酸配列
ATGGCCTTCCTGTGGCTGCTGTCTTGCTGGGCTCTGCTGGGGACCACCTTTGGCCTGCTGGTCCCCAGGGAGCTGTCTGGCTCTTCTCCTGTCCTGGAGGAGACCCACCCTGCCCACCAGCAGGGGGCTAGCAGGCCTGGCCCCAGGGATGCCCAGGCCCACCCTGGCAGGCCCAGGGCTGTGCCCACCCAGTGTGATGTGCCTCCCAACAGCAGGTTTGACTGTGCCCCTGACAAGGCCATCACCCAGGAGCAGTGTGAGGCCAGGGGCTGCTGCTATATCCCTGCCAAGCAGGGCCTGCAGGGGGCTCAGATGGGCCAGCCCTGGTGCTTCTTTCCCCCCTCTTATCCTAGCTATAAGCTGGAGAACCTGAGCAGCTCTGAGATGGGGTACACTGCCACCCTGACCAGGACCACCCCCACTTTCTTCCCTAAGGACATCCTGACCCTGAGGCTGGATGTGATGATGGAGACTGAGAATAGGCTGCACTTTACTATCAAGGACCCTGCCAACAGGAGGTATGAGGTGCCTCTGGAGACCCCCCATGTGCATTCTAGGGCCCCCAGCCCCCTGTACTCTGTGGAGTTCTCTGAGGAGCCCTTTGGGGTGATTGTGAGGAGACAGCTGGATGGCAGGGTCCTGCTGAACACCACTGTGGCTCCCCTGTTTTTTGCTGACCAGTTCCTGCAGCTGAGCACCAGCCTGCCCAGCCAGTACATCACTGGGCTGGCTGAGCACCTGAGCCCCCTGATGCTGAGCACCAGCTGGACCAGGATCACCCTGTGGAACAGGGATCTGGCTCCTACCCCTGGGGCCAACCTGTATGGCTCTCACCCCTTTTACCTGGCCCTGGAGGATGGGGGCTCTGCCCATGGGGTGTTCCTGCTGAACAGCAATGCTATGGATGTGGTGCTGCAGCCCAGCCCTGCCCTGAGCTGGAGGTCTACTGGGGGCATCCTGGATGTGTACATCTTTCTGGGGCCTGAGCCCAAGTCTGTGGTGCAGCAGTACCTGGATGTGGTGGGCTATCCTTTTATGCCCCCCTATTGGGGCCTGGGCTTCCACCTGTGCAGGTGGGGCTACAGCAGCACTGCCATCACCAGACAGGTGGTGGAGAACATGACCAGGGCCCACTTCCCCCTGGATGTGCAGTGGAATGACCTGGACTACATGGACAGCAGGAGGGACTTCACCTTTAACAAGGATGGCTTTAGGGACTTCCCTGCCATGGTGCAGGAGCTGCATCAGGGGGGCAGGAGGTACATGATGATTGTGGACCCAGCCATCAGCAGCTCTGGGCCTGCTGGGTCTTACAGGCCCTATGATGAGGGCCTGAGGAGGGGGGTGTTCATCACCAATGAGACTGGCCAGCCCCTGATTGGCAAGGTGTGGCCTGGGAGCACTGCCTTCCCTGATTTTACCAACCCCACTGCCCTGGCCTGGTGGGAGGATATGGTGGCTGAGTTTCATGACCAGGTGCCCTTTGATGGCATGTGGATTGACATGAATGAGCCCAGCAATTTCATCAGGGGCTCTGAGGATGGCTGCCCCAACAATGAGCTGGAGAATCCTCCCTATGTGCCTGGGGTGGTGGGGGGCACCCTGCAGGCTGCCACCATCTGTGCCTCTAGCCACCAGTTCCTGAGCACCCACTATAACCTGCATAACCTGTATGGCCTGACTGAGGCCATTGCCAGCCATAGAGCCCTGGTGAAGGCCAGAGGGACCAGGCCCTTTGTGATCTCTAGGAGCACCTTTGCTGGCCATGGCAGGTATGCTGGCCACTGGACTGGGGATGTGTGGAGCTCTTGGGAGCAGCTGGCCAGCTCTGTGCCAGAGATCCTGCAGTTCAACCTGCTGGGGGTGCCTCTGGTGGGGGCTGATGTGTGTGGCTTCCTGGGCAATACCTCTGAAGAGCTGTGTGTGAGGTGGACTCAGCTGGGGGCCTTCTATCCCTTCATGAGGAACCACAACAGCCTGCTGTCTCTGCCCCAGGAGCCCTACAGCTTCTCTGAGCCTGCTCAGCAGGCTATGAGGAAGGCCCTGACCCTGAGGTATGCCCTGCTGCCCCATCTGTACACCCTGTTCCACCAGGCCCATGTGGCTGGGGAGACTGTGGCCAGGCCCCTGTTTCTGGAGTTTCCCAAGGACAGCAGCACCTGGACTGTGGACCATCAGCTGCTGTGGGGGGAGGCTCTGCTGATTACCCCTGTGCTGCAGGCTGGCAAGGCTGAGGTGACTGGGTACTTCCCCCTGGGGACTTGGTATGACCTGCAGACTGTGCCTGTGGAAGCTCTGGGCAGCCTGCCCCCACCCCCTGCTGCCCCTAGGGAGCCTGCCATCCACTCTGAGGGCCAGTGGGTGACCCTGCCTGCCCCTCTGGACACCATCAATGTGCACCTGAGGGCTGGCTATATCATCCCCCTGCAGGGCCCTGGGCTGACCACCACTGAGAGCAGGCAGCAGCCCATGGCCCTGGCTGTGGCCCTGACTAAGGGGGGGGAGGCCAGGGGGGAGCTGTTCTGGGATGATGGGGAGAGCCTGGAGGTGCTGGAGAGAGGGGCCTACACCCAGGTGATCTTTCTGGCCAGGAACAACACCATTGTGAATGAGCTGGTGAGGGTGACTTCTGAGGGGGCTGGCCTGCAGCTGCAGAAGGTGACTGTGCTGGGGGTGGCCACTGCCCCCCAGCAGGTGCTGAGCAATGGGGTGCCTGTGTCTAACTTCACCTACAGCCCTGATACTAAGGTGCTGGATATCTGTGTGAGCCTGCTGATGGGGGAGCAGTTTCTGGTGAGCTGGTGCTGAAGATCTAGAGCTGAATTCCTGCAGCCAGGGGGATCAGCCTCTACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCTTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCACATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCAGTGGGCTCTATGG
配列番号１５：ＧＡＡ１３＋ＣｐＧ減少したＢＧＨポリＡの核酸配列
ATGGCCTTTCTGTGGCTGCTGTCCTGCTGGGCCCTGCTGGGGACCACCTTTGGCCTGCTGGTGCCCAGGGAGCTGTCTGGGAGCAGCCCAGTGCTGGAGGAGACCCACCCTGCCCACCAGCAGGGGGCCAGCAGGCCTGGCCCTAGGGATGCCCAGGCCCACCCTGGCAGGCCCAGGGCTGTGCCTACCCAGTGTGATGTGCCACCCAATTCTAGGTTTGACTGTGCTCCTGACAAGGCCATCACTCAGGAGCAGTGTGAAGCTAGGGGGTGCTGCTACATCCCAGCCAAGCAGGGCCTGCAGGGGGCCCAGATGGGCCAGCCCTGGTGCTTCTTCCCCCCCAGCTACCCTAGCTACAAGCTGGAGAATCTGAGCAGCTCTGAGATGGGCTACACTGCTACCCTGACCAGGACCACTCCTACCTTCTTCCCCAAGGACATCCTGACTCTGAGGCTGGATGTCATGATGGAGACTGAAAATAGGCTGCACTTCACCATCAAGGACCCTGCCAATAGGAGGTATGAGGTGCCTCTGGAGACCCCCCATGTGCATAGCAGGGCTCCCAGCCCCCTGTATTCTGTGGAGTTCTCTGAGGAGCCCTTTGGGGTCATTGTGAGGAGACAGCTGGATGGGAGGGTGCTGCTGAACACTACTGTGGCTCCCCTGTTCTTTGCTGACCAGTTCCTGCAGCTGTCTACCAGCCTGCCCAGCCAGTACATCACTGGGCTGGCTGAGCATCTGAGCCCCCTGATGCTGAGCACCAGCTGGACCAGGATCACTCTGTGGAACAGGGATCTGGCCCCCACTCCTGGGGCCAACCTGTATGGGAGCCATCCCTTCTACCTGGCCCTGGAGGATGGGGGCTCTGCCCATGGGGTGTTCCTGCTGAACAGCAATGCCATGGATGTGGTGCTGCAGCCTAGCCCTGCCCTGAGCTGGAGGAGCACTGGGGGCATCCTGGATGTCTACATCTTCCTGGGGCCTGAGCCCAAGTCTGTGGTGCAGCAGTATCTGGATGTGGTGGGGTATCCCTTCATGCCCCCCTACTGGGGCCTGGGCTTTCACCTGTGCAGGTGGGGCTACAGCAGCACTGCCATCACCAGGCAGGTGGTGGAGAACATGACCAGGGCCCACTTCCCTCTGGATGTGCAGTGGAATGACCTGGACTATATGGATTCTAGGAGAGACTTTACTTTTAACAAGGATGGCTTCAGGGATTTCCCTGCCATGGTGCAGGAGCTGCACCAGGGGGGCAGGAGGTACATGATGATTGTGGACCCTGCTATTAGCAGCTCTGGCCCTGCTGGGTCTTACAGGCCTTATGATGAGGGCCTGAGGAGGGGGGTGTTCATCACCAATGAGACTGGCCAGCCCCTGATTGGCAAGGTGTGGCCTGGCAGCACTGCCTTCCCTGACTTCACCAACCCCACTGCCCTGGCCTGGTGGGAGGACATGGTGGCTGAGTTCCATGACCAGGTGCCCTTTGATGGGATGTGGATTGACATGAATGAGCCCTCTAACTTCATCAGGGGGTCTGAGGATGGCTGCCCCAACAATGAGCTGGAGAACCCCCCCTATGTGCCTGGGGTGGTGGGGGGCACTCTGCAGGCTGCCACTATCTGTGCTTCTTCTCACCAGTTTCTGAGCACCCACTATAATCTGCACAACCTGTATGGCCTGACTGAGGCCATTGCCAGCCATAGGGCCCTGGTGAAGGCCAGGGGCACCAGGCCCTTTGTGATCAGCAGGTCTACCTTTGCTGGCCATGGCAGGTATGCTGGCCACTGGACTGGGGATGTGTGGTCTTCTTGGGAGCAGCTGGCCAGCTCTGTGCCTGAGATCCTGCAGTTCAACCTGCTGGGGGTGCCTCTGGTGGGGGCTGATGTGTGTGGCTTTCTGGGCAACACCTCTGAGGAGCTGTGTGTGAGGTGGACCCAGCTGGGGGCCTTTTACCCCTTCATGAGGAACCACAATAGCCTGCTGAGCCTGCCCCAGGAGCCTTACTCTTTCTCTGAGCCTGCCCAGCAGGCCATGAGGAAGGCCCTGACTCTGAGGTATGCCCTGCTGCCCCATCTGTATACCCTGTTTCACCAGGCCCATGTGGCTGGGGAGACTGTGGCTAGGCCTCTGTTTCTGGAGTTCCCTAAGGACTCTAGCACCTGGACTGTGGACCACCAGCTGCTGTGGGGGGAGGCCCTGCTGATCACCCCTGTGCTGCAGGCTGGCAAGGCTGAGGTGACTGGCTACTTCCCCCTGGGCACCTGGTATGACCTGCAGACTGTGCCTGTGGAGGCCCTGGGGAGCCTGCCTCCCCCCCCTGCTGCCCCCAGGGAGCCTGCCATTCATTCTGAGGGCCAGTGGGTGACCCTGCCTGCCCCTCTGGACACCATCAATGTGCACCTGAGGGCTGGGTACATCATCCCCCTGCAGGGCCCTGGCCTGACCACCACTGAGAGCAGGCAGCAGCCCATGGCCCTGGCTGTGGCTCTGACCAAGGGGGGGGAGGCCAGGGGGGAGCTGTTCTGGGATGATGGGGAGTCTCTGGAGGTGCTGGAGAGGGGGGCCTACACCCAGGTGATCTTTCTGGCCAGGAACAATACTATTGTGAATGAGCTGGTGAGGGTGACCTCTGAGGGGGCTGGCCTGCAGCTGCAGAAGGTGACTGTGCTGGGGGTGGCCACTGCCCCCCAGCAGGTCCTGAGCAATGGGGTGCCTGTGAGCAACTTCACCTACTCTCCTGACACCAAGGTGCTGGACATTTGTGTGTCTCTGCTGATGGGGGAGCAGTTCCTGGTGAGCTGGTGCTGAAGATCTAGAGCTGAATTCCTGCAGCCAGGGGGATCAGCCTCTACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCTTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCACATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCAGTGGGCTCTATGG
＞ｐＡＡＶ−ＡｐｏＥ／ｈＡＡＴ．ｆｉｘＵＴＲ．ＧＡＡ１３．ＢＧＨ（配列番号１６）
CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTGCGGCCTAGTAGGCTCAGAGGCACACAGGAGTTTCTGGGCTCACCCTGCCCCCTTCCAACCCCTCAGTTCCCATCCTCCAGCAGCTGTTTGTGTGCTGCCTCTGAAGTCCACACTGAACAAACTTCAGCCTACTCATGTCCCTAAAATGGGCAAACATTGCAAGCAGCAAACAGCAAACACACAGCCCTCCCTGCCTGCTGACCTTGGAGCTGGGGCAGAGGTCAGAGACCTCTCTGGGCCCATGCCACCTCCAACATCCACTCGACCCCTTGGAATTTCGGTGGAGAGGAGCAGAGGTTGTCCTGGCGTGGTTTAGGTAGTGTGAGAGGGGTACCCGGGGATCTTGCTACCAGTGGAACAGCCACTAAGGATTCTGCAGTGAGAGCAGAGGGCCAGCTAAGTGGTACTCTCCCAGAGACTGTCTGACTCACGCCACCCCCTCCACCTTGGACACAGGACGCTGTGGTTTCTGAGCCAGGTACAATGACTCCTTTCGGTAAGTGCAGTGGAAGCTGTACACTGCCCAGGCAAAGCGTCCGGGCAGCGTAGGCGGGCGACTCAGATCCCAGCCAGTGGACTTAGCCCCTGTTTGCTCCTCCGATAACTGGGGTGACCTTGGTTAATATTCACCAGCAGCCTCCCCCGTTGCCCCTCTGGATCCACTGCTTAAATACGGACGAGGACAGGGCCCTGTCTCCTCAGCTTCAGGCACCACCACTGACCTGGGACAGTGAATACCACTTTCACAATCTGCTAGCGTTTAAACGATCCTGAGAACTTCAGGGTGAGTCTATGGGACCCTTGATGTTTTCTTTCCCCTTCTTTTCTATGGTTAAGTTCATGTCATAGGAAGGGGAGAAGTAACAGGGTACACATATTGACCAAATCAGGGTAATTTTGCATTTGTAATTTTAAAAAATGCTTTCTTCTTTTAATATACTTTTTTGTTTATCTTATTTCTAATACTTTCCCTAATCTCTTTCTTTCAGGGCAATAATGATACAATGTATCATGCCTCTTTGCACCATTCTAAAGAATAACAGTGATAATTTCTGGGTTAAGGCAATAGCAATATTTCTGCATATAAATATTTCTGCATATAAATTGTAACTGATGTAAGAGGTTTCATATTGCTAATAGCAGCTACAATCCAGCTACCATTCTGCTTTTATTTTCTGGTTGGGATAAGGCTGGATTATTCTGAGTCCAAGCTAGGCCCTTTTGCTAATCTTGTTCATACCTCTTATCTTCCTCCCACAGCTCCTGGGCAACCTGCTGGTCTCTCTGCTGGCCCATCACTTTGGCAAAGCACGCGTGCCACCATGGCCTTTCTGTGGCTGCTGTCCTGCTGGGCCCTGCTGGGGACCACCTTTGGCCTGCTGGTGCCCAGGGAGCTGTCTGGGAGCAGCCCAGTGCTGGAGGAGACCCACCCTGCCCACCAGCAGGGGGCCAGCAGGCCTGGCCCTAGGGATGCCCAGGCCCACCCTGGCAGGCCCAGGGCTGTGCCTACCCAGTGTGATGTGCCACCCAATTCTAGGTTTGACTGTGCTCCTGACAAGGCCATCACTCAGGAGCAGTGTGAAGCTAGGGGGTGCTGCTACATCCCAGCCAAGCAGGGCCTGCAGGGGGCCCAGATGGGCCAGCCCTGGTGCTTCTTCCCCCCCAGCTACCCTAGCTACAAGCTGGAGAATCTGAGCAGCTCTGAGATGGGCTACACTGCTACCCTGACCAGGACCACTCCTACCTTCTTCCCCAAGGACATCCTGACTCTGAGGCTGGATGTCATGATGGAGACTGAAAATAGGCTGCACTTCACCATCAAGGACCCTGCCAATAGGAGGTATGAGGTGCCTCTGGAGACCCCCCATGTGCATAGCAGGGCTCCCAGCCCCCTGTATTCTGTGGAGTTCTCTGAGGAGCCCTTTGGGGTCATTGTGAGGAGACAGCTGGATGGGAGGGTGCTGCTGAACACTACTGTGGCTCCCCTGTTCTTTGCTGACCAGTTCCTGCAGCTGTCTACCAGCCTGCCCAGCCAGTACATCACTGGGCTGGCTGAGCATCTGAGCCCCCTGATGCTGAGCACCAGCTGGACCAGGATCACTCTGTGGAACAGGGATCTGGCCCCCACTCCTGGGGCCAACCTGTATGGGAGCCATCCCTTCTACCTGGCCCTGGAGGATGGGGGCTCTGCCCATGGGGTGTTCCTGCTGAACAGCAATGCCATGGATGTGGTGCTGCAGCCTAGCCCTGCCCTGAGCTGGAGGAGCACTGGGGGCATCCTGGATGTCTACATCTTCCTGGGGCCTGAGCCCAAGTCTGTGGTGCAGCAGTATCTGGATGTGGTGGGGTATCCCTTCATGCCCCCCTACTGGGGCCTGGGCTTTCACCTGTGCAGGTGGGGCTACAGCAGCACTGCCATCACCAGGCAGGTGGTGGAGAACATGACCAGGGCCCACTTCCCTCTGGATGTGCAGTGGAATGACCTGGACTATATGGATTCTAGGAGAGACTTTACTTTTAACAAGGATGGCTTCAGGGATTTCCCTGCCATGGTGCAGGAGCTGCACCAGGGGGGCAGGAGGTACATGATGATTGTGGACCCTGCTATTAGCAGCTCTGGCCCTGCTGGGTCTTACAGGCCTTATGATGAGGGCCTGAGGAGGGGGGTGTTCATCACCAATGAGACTGGCCAGCCCCTGATTGGCAAGGTGTGGCCTGGCAGCACTGCCTTCCCTGACTTCACCAACCCCACTGCCCTGGCCTGGTGGGAGGACATGGTGGCTGAGTTCCATGACCAGGTGCCCTTTGATGGGATGTGGATTGACATGAATGAGCCCTCTAACTTCATCAGGGGGTCTGAGGATGGCTGCCCCAACAATGAGCTGGAGAACCCCCCCTATGTGCCTGGGGTGGTGGGGGGCACTCTGCAGGCTGCCACTATCTGTGCTTCTTCTCACCAGTTTCTGAGCACCCACTATAATCTGCACAACCTGTATGGCCTGACTGAGGCCATTGCCAGCCATAGGGCCCTGGTGAAGGCCAGGGGCACCAGGCCCTTTGTGATCAGCAGGTCTACCTTTGCTGGCCATGGCAGGTATGCTGGCCACTGGACTGGGGATGTGTGGTCTTCTTGGGAGCAGCTGGCCAGCTCTGTGCCTGAGATCCTGCAGTTCAACCTGCTGGGGGTGCCTCTGGTGGGGGCTGATGTGTGTGGCTTTCTGGGCAACACCTCTGAGGAGCTGTGTGTGAGGTGGACCCAGCTGGGGGCCTTTTACCCCTTCATGAGGAACCACAATAGCCTGCTGAGCCTGCCCCAGGAGCCTTACTCTTTCTCTGAGCCTGCCCAGCAGGCCATGAGGAAGGCCCTGACTCTGAGGTATGCCCTGCTGCCCCATCTGTATACCCTGTTTCACCAGGCCCATGTGGCTGGGGAGACTGTGGCTAGGCCTCTGTTTCTGGAGTTCCCTAAGGACTCTAGCACCTGGACTGTGGACCACCAGCTGCTGTGGGGGGAGGCCCTGCTGATCACCCCTGTGCTGCAGGCTGGCAAGGCTGAGGTGACTGGCTACTTCCCCCTGGGCACCTGGTATGACCTGCAGACTGTGCCTGTGGAGGCCCTGGGGAGCCTGCCTCCCCCCCCTGCTGCCCCCAGGGAGCCTGCCATTCATTCTGAGGGCCAGTGGGTGACCCTGCCTGCCCCTCTGGACACCATCAATGTGCACCTGAGGGCTGGGTACATCATCCCCCTGCAGGGCCCTGGCCTGACCACCACTGAGAGCAGGCAGCAGCCCATGGCCCTGGCTGTGGCTCTGACCAAGGGGGGGGAGGCCAGGGGGGAGCTGTTCTGGGATGATGGGGAGTCTCTGGAGGTGCTGGAGAGGGGGGCCTACACCCAGGTGATCTTTCTGGCCAGGAACAATACTATTGTGAATGAGCTGGTGAGGGTGACCTCTGAGGGGGCTGGCCTGCAGCTGCAGAAGGTGACTGTGCTGGGGGTGGCCACTGCCCCCCAGCAGGTCCTGAGCAATGGGGTGCCTGTGAGCAACTTCACCTACTCTCCTGACACCAAGGTGCTGGACATTTGTGTGTCTCTGCTGATGGGGGAGCAGTTCCTGGTGAGCTGGTGCTGAAGATCTAGAGCTGAATTCCTGCAGCCAGGGGGATCAGCCTCTACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCTTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCACATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCAGTGGGCTCTATGGCTTCTGAGGCAGAAAGAACCAGCTGGGGCTCGAGATCCACTAGGGCCGCAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG
＞ｐＡＡＶ−ＡｐｏＥ／ｈＡＡＴ．ＧＡＡ１３．ＢＧＨ（配列番号１７）
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＞ｐＡＡＶ−ＡｐｏＥ／ｈＡＡＴ．ＧＡＡ７．ＢＧＨ（配列番号１８）
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＞ｐＡＡＶ−ＡｐｏＥ／ｈＡＡＴ．ＧＡＡ５．ｗｔＢＧＨ（配列番号２１）
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＞ｐＡＡＶ−ＡｐｏＥ／ｈＡＡＴ．ＧＡＡ７．ｗｔＢＧＨ（配列番号２２）
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＞ｐＡＡＶ−ＡｐｏＥ／ｈＡＡＴ．ＧＡＡ８．ｗｔＢＧＨ（配列番号２３）
CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTGCGGCCGCAGGCTCAGAGGCACACAGGAGTTTCTGGGCTCACCCTGCCCCCTTCCAACCCCTCAGTTCCCATCCTCCAGCAGCTGTTTGTGTGCTGCCTCTGAAGTCCACACTGAACAAACTTCAGCCTACTCATGTCCCTAAAATGGGCAAACATTGCAAGCAGCAAACAGCAAACACACAGCCCTCCCTGCCTGCTGACCTTGGAGCTGGGGCAGAGGTCAGAGACCTCTCTGGGCCCATGCCACCTCCAACATCCACTCGACCCCTTGGAATTTCGGTGGAGAGGAGCAGAGGTTGTCCTGGCGTGGTTTAGGTAGTGTGAGAGGGGTACCCGGGGATCTTGCTACCAGTGGAACAGCCACTAAGGATTCTGCAGTGAGAGCAGAGGGCCAGCTAAGTGGTACTCTCCCAGAGACTGTCTGACTCACGCCACCCCCTCCACCTTGGACACAGGACGCTGTGGTTTCTGAGCCAGGTACAATGACTCCTTTCGGTAAGTGCAGTGGAAGCTGTACACTGCCCAGGCAAAGCGTCCGGGCAGCGTAGGCGGGCGACTCAGATCCCAGCCAGTGGACTTAGCCCCTGTTTGCTCCTCCGATAACTGGGGTGACCTTGGTTAATATTCACCAGCAGCCTCCCCCGTTGCCCCTCTGGATCCACTGCTTAAATACGGACGAGGACAGGGCCCTGTCTCCTCAGCTTCAGGCACCACCACTGACCTGGGACAGTGAATAGATCCTGAGAACTTCAGGGTGAGTCTATGGGACCCTTGATGTTTTCTTTCCCCTTCTTTTCTATGGTTAAGTTCATGTCATAGGAAGGGGAGAAGTAACAGGGTACACATATTGACCAAATCAGGGTAATTTTGCATTTGTAATTTTAAAAAATGCTTTCTTCTTTTAATATACTTTTTTGTTTATCTTATTTCTAATACTTTCCCTAATCTCTTTCTTTCAGGGCAATAATGATACAATGTATCATGCCTCTTTGCACCATTCTAAAGAATAACAGTGATAATTTCTGGGTTAAGGCAATAGCAATATTTCTGCATATAAATATTTCTGCATATAAATTGTAACTGATGTAAGAGGTTTCATATTGCTAATAGCAGCTACAATCCAGCTACCATTCTGCTTTTATTTTCTGGTTGGGATAAGGCTGGATTATTCTGAGTCCAAGCTAGGCCCTTTTGCTAATCTTGTTCATACCTCTTATCTTCCTCCCACAGCTCCTGGGCAACCTGCTGGTCTCTCTGCTGGCCCATCACTTTGGCAAAGCACGCGTGCCACCATGGCCTTCCTGTGGCTGCTGTCTTGCTGGGCTCTGCTGGGGACCACCTTTGGCCTGCTGGTCCCCAGGGAGCTGTCTGGCTCTTCTCCTGTCCTGGAGGAGACCCACCCTGCCCACCAGCAGGGGGCTAGCAGGCCTGGCCCCAGGGATGCCCAGGCCCACCCTGGCAGGCCCAGGGCTGTGCCCACCCAGTGTGATGTGCCTCCCAACAGCAGGTTTGACTGTGCCCCTGACAAGGCCATCACCCAGGAGCAGTGTGAGGCCAGGGGCTGCTGCTATATCCCTGCCAAGCAGGGCCTGCAGGGGGCTCAGATGGGCCAGCCCTGGTGCTTCTTTCCCCCCTCTTATCCTAGCTATAAGCTGGAGAACCTGAGCAGCTCTGAGATGGGGTACACTGCCACCCTGACCAGGACCACCCCCACTTTCTTCCCTAAGGACATCCTGACCCTGAGGCTGGATGTGATGATGGAGACTGAGAATAGGCTGCACTTTACTATCAAGGACCCTGCCAACAGGAGGTATGAGGTGCCTCTGGAGACCCCCCATGTGCATTCTAGGGCCCCCAGCCCCCTGTACTCTGTGGAGTTCTCTGAGGAGCCCTTTGGGGTGATTGTGAGGAGACAGCTGGATGGCAGGGTCCTGCTGAACACCACTGTGGCTCCCCTGTTTTTTGCTGACCAGTTCCTGCAGCTGAGCACCAGCCTGCCCAGCCAGTACATCACTGGGCTGGCTGAGCACCTGAGCCCCCTGATGCTGAGCACCAGCTGGACCAGGATCACCCTGTGGAACAGGGATCTGGCTCCTACCCCTGGGGCCAACCTGTATGGCTCTCACCCCTTTTACCTGGCCCTGGAGGATGGGGGCTCTGCCCATGGGGTGTTCCTGCTGAACAGCAATGCTATGGATGTGGTGCTGCAGCCCAGCCCTGCCCTGAGCTGGAGGTCTACTGGGGGCATCCTGGATGTGTACATCTTTCTGGGGCCTGAGCCCAAGTCTGTGGTGCAGCAGTACCTGGATGTGGTGGGCTATCCTTTTATGCCCCCCTATTGGGGCCTGGGCTTCCACCTGTGCAGGTGGGGCTACAGCAGCACTGCCATCACCAGACAGGTGGTGGAGAACATGACCAGGGCCCACTTCCCCCTGGATGTGCAGTGGAATGACCTGGACTACATGGACAGCAGGAGGGACTTCACCTTTAACAAGGATGGCTTTAGGGACTTCCCTGCCATGGTGCAGGAGCTGCATCAGGGGGGCAGGAGGTACATGATGATTGTGGACCCAGCCATCAGCAGCTCTGGGCCTGCTGGGTCTTACAGGCCCTATGATGAGGGCCTGAGGAGGGGGGTGTTCATCACCAATGAGACTGGCCAGCCCCTGATTGGCAAGGTGTGGCCTGGGAGCACTGCCTTCCCTGATTTTACCAACCCCACTGCCCTGGCCTGGTGGGAGGATATGGTGGCTGAGTTTCATGACCAGGTGCCCTTTGATGGCATGTGGATTGACATGAATGAGCCCAGCAATTTCATCAGGGGCTCTGAGGATGGCTGCCCCAACAATGAGCTGGAGAATCCTCCCTATGTGCCTGGGGTGGTGGGGGGCACCCTGCAGGCTGCCACCATCTGTGCCTCTAGCCACCAGTTCCTGAGCACCCACTATAACCTGCATAACCTGTATGGCCTGACTGAGGCCATTGCCAGCCATAGAGCCCTGGTGAAGGCCAGAGGGACCAGGCCCTTTGTGATCTCTAGGAGCACCTTTGCTGGCCATGGCAGGTATGCTGGCCACTGGACTGGGGATGTGTGGAGCTCTTGGGAGCAGCTGGCCAGCTCTGTGCCAGAGATCCTGCAGTTCAACCTGCTGGGGGTGCCTCTGGTGGGGGCTGATGTGTGTGGCTTCCTGGGCAATACCTCTGAAGAGCTGTGTGTGAGGTGGACTCAGCTGGGGGCCTTCTATCCCTTCATGAGGAACCACAACAGCCTGCTGTCTCTGCCCCAGGAGCCCTACAGCTTCTCTGAGCCTGCTCAGCAGGCTATGAGGAAGGCCCTGACCCTGAGGTATGCCCTGCTGCCCCATCTGTACACCCTGTTCCACCAGGCCCATGTGGCTGGGGAGACTGTGGCCAGGCCCCTGTTTCTGGAGTTTCCCAAGGACAGCAGCACCTGGACTGTGGACCATCAGCTGCTGTGGGGGGAGGCTCTGCTGATTACCCCTGTGCTGCAGGCTGGCAAGGCTGAGGTGACTGGGTACTTCCCCCTGGGGACTTGGTATGACCTGCAGACTGTGCCTGTGGAAGCTCTGGGCAGCCTGCCCCCACCCCCTGCTGCCCCTAGGGAGCCTGCCATCCACTCTGAGGGCCAGTGGGTGACCCTGCCTGCCCCTCTGGACACCATCAATGTGCACCTGAGGGCTGGCTATATCATCCCCCTGCAGGGCCCTGGGCTGACCACCACTGAGAGCAGGCAGCAGCCCATGGCCCTGGCTGTGGCCCTGACTAAGGGGGGGGAGGCCAGGGGGGAGCTGTTCTGGGATGATGGGGAGAGCCTGGAGGTGCTGGAGAGAGGGGCCTACACCCAGGTGATCTTTCTGGCCAGGAACAACACCATTGTGAATGAGCTGGTGAGGGTGACTTCTGAGGGGGCTGGCCTGCAGCTGCAGAAGGTGACTGTGCTGGGGGTGGCCACTGCCCCCCAGCAGGTGCTGAGCAATGGGGTGCCTGTGTCTAACTTCACCTACAGCCCTGATACTAAGGTGCTGGATATCTGTGTGAGCCTGCTGATGGGGGAGCAGTTTCTGGTGAGCTGGTGCTGACTCGAGAGATCTACCGGTGAATTCACCGCGGGTTTAAACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGGCTAGCTCTAGACTCGAGATCCACTAGGGCCGCAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG
＞ｐＡＡＶ−ＡｐｏＥ／ｈＡＡＴ．ＧＡＡ１３．ｗｔＢＧＨ（配列番号２４）
CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTGCGGCCGCAGGCTCAGAGGCACACAGGAGTTTCTGGGCTCACCCTGCCCCCTTCCAACCCCTCAGTTCCCATCCTCCAGCAGCTGTTTGTGTGCTGCCTCTGAAGTCCACACTGAACAAACTTCAGCCTACTCATGTCCCTAAAATGGGCAAACATTGCAAGCAGCAAACAGCAAACACACAGCCCTCCCTGCCTGCTGACCTTGGAGCTGGGGCAGAGGTCAGAGACCTCTCTGGGCCCATGCCACCTCCAACATCCACTCGACCCCTTGGAATTTCGGTGGAGAGGAGCAGAGGTTGTCCTGGCGTGGTTTAGGTAGTGTGAGAGGGGTACCCGGGGATCTTGCTACCAGTGGAACAGCCACTAAGGATTCTGCAGTGAGAGCAGAGGGCCAGCTAAGTGGTACTCTCCCAGAGACTGTCTGACTCACGCCACCCCCTCCACCTTGGACACAGGACGCTGTGGTTTCTGAGCCAGGTACAATGACTCCTTTCGGTAAGTGCAGTGGAAGCTGTACACTGCCCAGGCAAAGCGTCCGGGCAGCGTAGGCGGGCGACTCAGATCCCAGCCAGTGGACTTAGCCCCTGTTTGCTCCTCCGATAACTGGGGTGACCTTGGTTAATATTCACCAGCAGCCTCCCCCGTTGCCCCTCTGGATCCACTGCTTAAATACGGACGAGGACAGGGCCCTGTCTCCTCAGCTTCAGGCACCACCACTGACCTGGGACAGTGAATAGATCCTGAGAACTTCAGGGTGAGTCTATGGGACCCTTGATGTTTTCTTTCCCCTTCTTTTCTATGGTTAAGTTCATGTCATAGGAAGGGGAGAAGTAACAGGGTACACATATTGACCAAATCAGGGTAATTTTGCATTTGTAATTTTAAAAAATGCTTTCTTCTTTTAATATACTTTTTTGTTTATCTTATTTCTAATACTTTCCCTAATCTCTTTCTTTCAGGGCAATAATGATACAATGTATCATGCCTCTTTGCACCATTCTAAAGAATAACAGTGATAATTTCTGGGTTAAGGCAATAGCAATATTTCTGCATATAAATATTTCTGCATATAAATTGTAACTGATGTAAGAGGTTTCATATTGCTAATAGCAGCTACAATCCAGCTACCATTCTGCTTTTATTTTCTGGTTGGGATAAGGCTGGATTATTCTGAGTCCAAGCTAGGCCCTTTTGCTAATCTTGTTCATACCTCTTATCTTCCTCCCACAGCTCCTGGGCAACCTGCTGGTCTCTCTGCTGGCCCATCACTTTGGCAAAGCACGCGTGCCACCATGGCCTTTCTGTGGCTGCTGTCCTGCTGGGCCCTGCTGGGGACCACCTTTGGCCTGCTGGTGCCCAGGGAGCTGTCTGGGAGCAGCCCAGTGCTGGAGGAGACCCACCCTGCCCACCAGCAGGGGGCCAGCAGGCCTGGCCCTAGGGATGCCCAGGCCCACCCTGGCAGGCCCAGGGCTGTGCCTACCCAGTGTGATGTGCCACCCAATTCTAGGTTTGACTGTGCTCCTGACAAGGCCATCACTCAGGAGCAGTGTGAAGCTAGGGGGTGCTGCTACATCCCAGCCAAGCAGGGCCTGCAGGGGGCCCAGATGGGCCAGCCCTGGTGCTTCTTCCCCCCCAGCTACCCTAGCTACAAGCTGGAGAATCTGAGCAGCTCTGAGATGGGCTACACTGCTACCCTGACCAGGACCACTCCTACCTTCTTCCCCAAGGACATCCTGACTCTGAGGCTGGATGTCATGATGGAGACTGAAAATAGGCTGCACTTCACCATCAAGGACCCTGCCAATAGGAGGTATGAGGTGCCTCTGGAGACCCCCCATGTGCATAGCAGGGCTCCCAGCCCCCTGTATTCTGTGGAGTTCTCTGAGGAGCCCTTTGGGGTCATTGTGAGGAGACAGCTGGATGGGAGGGTGCTGCTGAACACTACTGTGGCTCCCCTGTTCTTTGCTGACCAGTTCCTGCAGCTGTCTACCAGCCTGCCCAGCCAGTACATCACTGGGCTGGCTGAGCATCTGAGCCCCCTGATGCTGAGCACCAGCTGGACCAGGATCACTCTGTGGAACAGGGATCTGGCCCCCACTCCTGGGGCCAACCTGTATGGGAGCCATCCCTTCTACCTGGCCCTGGAGGATGGGGGCTCTGCCCATGGGGTGTTCCTGCTGAACAGCAATGCCATGGATGTGGTGCTGCAGCCTAGCCCTGCCCTGAGCTGGAGGAGCACTGGGGGCATCCTGGATGTCTACATCTTCCTGGGGCCTGAGCCCAAGTCTGTGGTGCAGCAGTATCTGGATGTGGTGGGGTATCCCTTCATGCCCCCCTACTGGGGCCTGGGCTTTCACCTGTGCAGGTGGGGCTACAGCAGCACTGCCATCACCAGGCAGGTGGTGGAGAACATGACCAGGGCCCACTTCCCTCTGGATGTGCAGTGGAATGACCTGGACTATATGGATTCTAGGAGAGACTTTACTTTTAACAAGGATGGCTTCAGGGATTTCCCTGCCATGGTGCAGGAGCTGCACCAGGGGGGCAGGAGGTACATGATGATTGTGGACCCTGCTATTAGCAGCTCTGGCCCTGCTGGGTCTTACAGGCCTTATGATGAGGGCCTGAGGAGGGGGGTGTTCATCACCAATGAGACTGGCCAGCCCCTGATTGGCAAGGTGTGGCCTGGCAGCACTGCCTTCCCTGACTTCACCAACCCCACTGCCCTGGCCTGGTGGGAGGACATGGTGGCTGAGTTCCATGACCAGGTGCCCTTTGATGGGATGTGGATTGACATGAATGAGCCCTCTAACTTCATCAGGGGGTCTGAGGATGGCTGCCCCAACAATGAGCTGGAGAACCCCCCCTATGTGCCTGGGGTGGTGGGGGGCACTCTGCAGGCTGCCACTATCTGTGCTTCTTCTCACCAGTTTCTGAGCACCCACTATAATCTGCACAACCTGTATGGCCTGACTGAGGCCATTGCCAGCCATAGGGCCCTGGTGAAGGCCAGGGGCACCAGGCCCTTTGTGATCAGCAGGTCTACCTTTGCTGGCCATGGCAGGTATGCTGGCCACTGGACTGGGGATGTGTGGTCTTCTTGGGAGCAGCTGGCCAGCTCTGTGCCTGAGATCCTGCAGTTCAACCTGCTGGGGGTGCCTCTGGTGGGGGCTGATGTGTGTGGCTTTCTGGGCAACACCTCTGAGGAGCTGTGTGTGAGGTGGACCCAGCTGGGGGCCTTTTACCCCTTCATGAGGAACCACAATAGCCTGCTGAGCCTGCCCCAGGAGCCTTACTCTTTCTCTGAGCCTGCCCAGCAGGCCATGAGGAAGGCCCTGACTCTGAGGTATGCCCTGCTGCCCCATCTGTATACCCTGTTTCACCAGGCCCATGTGGCTGGGGAGACTGTGGCTAGGCCTCTGTTTCTGGAGTTCCCTAAGGACTCTAGCACCTGGACTGTGGACCACCAGCTGCTGTGGGGGGAGGCCCTGCTGATCACCCCTGTGCTGCAGGCTGGCAAGGCTGAGGTGACTGGCTACTTCCCCCTGGGCACCTGGTATGACCTGCAGACTGTGCCTGTGGAGGCCCTGGGGAGCCTGCCTCCCCCCCCTGCTGCCCCCAGGGAGCCTGCCATTCATTCTGAGGGCCAGTGGGTGACCCTGCCTGCCCCTCTGGACACCATCAATGTGCACCTGAGGGCTGGGTACATCATCCCCCTGCAGGGCCCTGGCCTGACCACCACTGAGAGCAGGCAGCAGCCCATGGCCCTGGCTGTGGCTCTGACCAAGGGGGGGGAGGCCAGGGGGGAGCTGTTCTGGGATGATGGGGAGTCTCTGGAGGTGCTGGAGAGGGGGGCCTACACCCAGGTGATCTTTCTGGCCAGGAACAATACTATTGTGAATGAGCTGGTGAGGGTGACCTCTGAGGGGGCTGGCCTGCAGCTGCAGAAGGTGACTGTGCTGGGGGTGGCCACTGCCCCCCAGCAGGTCCTGAGCAATGGGGTGCCTGTGAGCAACTTCACCTACTCTCCTGACACCAAGGTGCTGGACATTTGTGTGTCTCTGCTGATGGGGGAGCAGTTCCTGGTGAGCTGGTGCTGACTCGAGAGATCTACCGGTGAATTCACCGCGGGTTTAAACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGGCTAGCTCTAGACTCGAGATCCACTAGGGCCGCAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG
配列番号２５：分泌性ＧＡＡタンパク質のアミノ酸配列
MAFLWLLSCWALLGTTFGLLVPRELSGSSPVLEETHPAHQQGASRPGPRDAQAHPGRPRAVPTQCDVPPNSRFDCAPDKAITQEQCEARGCCYIPAKQGLQGAQMGQPWCFFPPSYPSYKLENLSSSEMGYTATLTRTTPTFFPKDILTLRLDVMMETENRLHFTIKDPANRRYEVPLETPHVHSRAPSPLYSVEFSEEPFGVIVRRQLDGRVLLNTTVAPLFFADQFLQLSTSLPSQYITGLAEHLSPLMLSTSWTRITLWNRDLAPTPGANLYGSHPFYLALEDGGSAHGVFLLNSNAMDVVLQPSPALSWRSTGGILDVYIFLGPEPKSVVQQYLDVVGYPFMPPYWGLGFHLCRWGYSSTAITRQVVENMTRAHFPLDVQWNDLDYMDSRRDFTFNKDGFRDFPAMVQELHQGGRRYMMIVDPAISSSGPAGSYRPYDEGLRRGVFITNETGQPLIGKVWPGSTAFPDFTNPTALAWWEDMVAEFHDQVPFDGMWIDMNEPSNFIRGSEDGCPNNELENPPYVPGVVGGTLQAATICASSHQFLSTHYNLHNLYGLTEAIASHRALVKARGTRPFVISRSTFAGHGRYAGHWTGDVWSSWEQLASSVPEILQFNLLGVPLVGADVCGFLGNTSEELCVRWTQLGAFYPFMRNHNSLLSLPQEPYSFSEPAQQAMRKALTLRYALLPHLYTLFHQAHVAGETVARPLFLEFPKDSSTWTVDHQLLWGEALLITPVLQAGKAEVTGYFPLGTWYDLQTVPVEALGSLPPPPAAPREPAIHSEGQWVTLPAPLDTINVHLRAGYIIPLQGPGLTTTESRQQPMALAVALTKGGEARGELFWDDGESLEVLERGAYTQVIFLARNNTIVNELVRVTSEGAGLQLQKVTVLGVATAPQQVLSNGVPVSNFTYSPDTKVLDICVSLLMGEQFLVSWC
配列番号２６：ＣｐＧ減少したＢＧＨポリＡ核酸配列
AGATCTAGAGCTGAATTCCTGCAGCCAGGGGGATCAGCCTCTACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCTTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCACATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCAGTGGGCTCTATGG
配列番号２７：ｗｔＢＧＨポリＡ核酸配列
AGATCTACCGGTGAATTCACCGCGGGTTTAAACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGGCTAGCTCTAGA
配列番号２８：ＡｐａＩ制限部位（下線）によって隣接されたＡｐｏＥ／ｈＡＡＴ配列
GGGCCCATGCCACCTCCAACATCCACTCGACCCCTTGGAATTTCGGTGGAGAGGAGCAGAGGTTGTCCTGGCGTGGTTTAGGTAGTGTGAGAGGGGTACCCGGGGATCTTGCTACCAGTGGAACAGCCACTAAGGATTCTGCAGTGAGAGCAGAGGGCCAGCTAAGTGGTACTCTCCCAGAGACTGTCTGACTCACGCCACCCCCTCCACCTTGGACACAGGACGCTGTGGTTTCTGAGCCAGGTACAATGACTCCTTTCGGTAAGTGCAGTGGAAGCTGTACACTGCCCAGGCAAAGCGTCCGGGCAGCGTAGGCGGGCGACTCAGATCCCAGCCAGTGGACTTAGCCCCTGTTTGCTCCTCCGATAACTGGGGTGACCTTGGTTAATATTCACCAGCAGCCTCCCCCGTTGCCCCTCTGGATCCACTGCTTAAATACGGACGAGGACAGGGCCC
配列番号２９：ＡｐｏＥ／ｈＡＡＴ配列
ATGCCACCTCCAACATCCACTCGACCCCTTGGAATTTCGGTGGAGAGGAGCAGAGGTTGTCCTGGCGTGGTTTAGGTAGTGTGAGAGGGGTACCCGGGGATCTTGCTACCAGTGGAACAGCCACTAAGGATTCTGCAGTGAGAGCAGAGGGCCAGCTAAGTGGTACTCTCCCAGAGACTGTCTGACTCACGCCACCCCCTCCACCTTGGACACAGGACGCTGTGGTTTCTGAGCCAGGTACAATGACTCCTTTCGGTAAGTGCAGTGGAAGCTGTACACTGCCCAGGCAAAGCGTCCGGGCAGCGTAGGCGGGCGACTCAGATCCCAGCCAGTGGACTTAGCCCCTGTTTGCTCCTCCGATAACTGGGGTGACCTTGGTTAATATTCACCAGCAGCCTCCCCCGTTGCCCCTCTGGATCCACTGCTTAAATACGGACGAGGACA
ＡＡＶベクターカプシド：
ＶＰ１（配列番号３０）
MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWDLKPGAPKPKANQQKQDNGRGLVLPGYKYLGPFNGLD
KGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLQAGDNPYLRYNHADAEFQERLQEDTSFGGNLGRAVFQ
AKKRVLEPLGLVESPVKTAPGKKRPVEPSPQRSPDSSTGIGKKGQQPAKKRLNFGQTGDS
ESVPDPQPIGEPPAAPSGVGPNTMAAGGGAPMADNNEGADGVGSSSGNWHCDSTWLGDRV
ITTSTRTWALPTYNNHLYKQISNGTSGGSTNDNTYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQ
RLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNEGTKTIANNLTSTIQVFTDSEYQLPYVLGSA
HQGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFEFSYNFED
VPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTQSTGGTAGTQQLLFSQAGPNNMSAQAKNW
LPGPCYRQQRVSTTLSQNNNSNFAWTGATKYHLNGRDSLVNPGVAMATHKDDEERFFPSS
GVLMFGKQGAGKDNVDYSSVMLTSEEEIKTTNPVATEQYGVVADNLQQQNAAPIVGAVNS
QGALPGMVWQNRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPADP
PTTFNQAKLASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYYKSTNVDFAVNTE
GTYSEPRPIGTRYLTRNL
ＶＰ２（配列番号３１）
TAPGKKRPVEPSPQRSPDSSTGIGKKGQQPAKKRLNFGQTGDSESVPDPQPIGEPPAGPS
GLGSGTMAAGGGAPMADNNEGADGVGSSSGNWHCDSTWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHL
YKQISNGTSGGSTNDNTYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFK
LFNIQVKEVTQNEGTKTIANNLTSTIQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMIPQ
YGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFEFSYNFEDVPFHSSYAHSQSLDRLM
NPLIDQYLYYLSRTQSTGGTAGTQQLLFSQAGPNNMSAQAKNWLPGPCYRQQRVSTTLSQ
NNNSNFAWTGATKYHLNGRDSLVNPGVAMATHKDDEERFFPSSGVLMFGKQGAGKDNVDY
SSVMLTSEEEIKTTNPVATEQYGVVADNLQQQNAAPIVGAVNSQGALPGMVWQNRDVYLQ
GPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPADPPTTFNQAKLASFITQYS
TGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYYKSTNVDFAVNTEGTYSEPRPIGTRYLTRN
L
ＶＰ３（配列番号３２）
MAAGGGAPMADNNEGADGVGSSSGNWHCDSTWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISN
GTSGGSTNDNTYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQV
KEVTQNEGTKTIANNLTSTIQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMIPQYGYLTL
NNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFEFSYNFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQ
YLYYLSRTQSTGGTAGTQQLLFSQAGPNNMSAQAKNWLPGPCYRQQRVSTTLSQNNNSNF
AWTGATKYHLNGRDSLVNPGVAMATHKDDEERFFPSSGVLMFGKQGAGKDNVDYSSVMLT
SEEEIKTTNPVATEQYGVVADNLQQQNAAPIVGAVNSQGALPGMVWQNRDVYLQGPIWAK
IPHTDGNFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPADPPTTFNQAKLASFITQYSTGQVSV
EIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYYKSTNVDFAVNTEGTYSEPRPIGTRYLTRNL
ＬＫ０３−ＡＡＶ ＶＰ１（配列番号３３）
MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWALQPGAPKPKANQQHQDNARGLVLPGYKYLGPGNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLKAGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRLLEPLGLVEEAAKTAPGKKRPVDQSPQEPDSSSGVGKSGKQPARKRLNFGQTGDSESVPDPQPLGEPPAAPTSLGSNTMASGGGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSQWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSQSGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKKLSFKLFNIQVKEVTQNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFQFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLNRTQGTTSGTTNQSRLLFSQAGPQSMSLQARNWLPGPCYRQQRLSKTANDNNNSNFPWTAASKYHLNGRDSLVNPGPAMASHKDDEEKFFPMHGNLIFGKEGTTASNAELDNVMITDEEEIRTTNPVATEQYGTVANNLQSSNTAPTTRTVNDQGALPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQIMIKNTPVPANPPTTFSPAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYNKSVNVDFTVDTNGVYSEPRPIGTRYLTRPL
実施例２
研究設計−インビトロでの効力（Ｈｕｈ７細胞）
[0410]ＧＡＡ発現カセットの効力を評価するために、各カセットに対応する２００ｎｇのプラスミドＤＮＡを、リポフェクタミン（登録商標）２０００（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いてヒト肝細胞癌腫細胞株（Ｈｕｈ７）にトランスフェクトした。４８時間のインキュベーション後、各発現カセットを有するプラスミドでトランスフェクトされた細胞からの培養培地の試料を、ＧＡＡ活性アッセイによりＧＡＡのレベルについて評価し、細胞内タンパク質含量に正規化した。
結果
[0411]図１０は、ＧＡＡ活性アッセイによるインビトロでのＨｕｈ７細胞における異なるＧＡＡ発現プラスミドの評価を示す。結果は、生物学的複製ｎ＝３の平均である。誤差バーは標準偏差を表す。
[0412]ＧＡＡ５．ｗｔＢＧＨを除いて、全てのプラスミドは、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）対照プラスミドと比較して、分泌されたＧＡＡの発現レベルの増加を示し、これらのプラスミドがＧＡＡタンパク質生成物の発現をもたらしたことを示した（図１０）。一般的に、「ＢＧＨ」プラスミド（ＣｐＧ減少したポリＡ配列を有する）は、「ｗｔＢＧＨ」プラスミド（野生型ｂＧＨポリＡを有する）よりも優れていた。さらに、コドンを最適化した配列ＧＡＡ２、ＧＡＡ７、ＧＡＡ８、及びＧＡＡ１３は、比較的類似しており、ＧＡＡ１３プラスミドからの発現がより高い傾向を示した。親ｓｐΔＧＡＡｐａｒプラスミドと比較した場合、全体的な発現レベルの低下が観察された。
実施例３
研究設計−マウスにおける流体力学的注入によるカセット効力
[0413]哺乳動物における異なるＧＡＡ発現カセットの効力を評価するために、各カセットに対応する２５μｇのプラスミドＤＮＡを、流体力学的注入により側方尾静脈内に雄Ｃ５７ＢＬ／６マウス（約８週齢）に静脈内導入した。血漿を注入後７２時間に回収し、ＧＡＡ活性アッセイ及びウエスタンブロットにより循環ＧＡＡ酵素の存在を評価した。
結果
[0414]図１１及び１２は、血漿中のそれぞれＧＡＡ活性アッセイ及びウエスタンブロットによる、雄Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける流体力学的注入による異なるＧＡＡ発現カセットの評価を示す。図１１では、ＧＡＡの血漿レベルは親構築物（ｓｐΔＧＡＡｐａｒ）に正規化される。結果は、生物学的複製ｎ＝４〜５の平均である。誤差バーは標準偏差を表す。ＮＳ、有意ではない。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。
[0415]図１２では、血漿のＧＡＡウエスタンブロット分析、棒グラフは、底部の非特異的バンドに正規化された上部バンドの定量化を表す。各生物学的複製（各群ｎ＝４〜５）を示す。
[0416]流体力学的注入によるマウスにおけるコドンを最適化したＧＡＡ発現カセットの評価は、これらのカセットが、マウス肝臓からのＧＡＡ導入遺伝子生成物の発現及び分泌が可能であり、親のＧＡＡ構築物ｓｐΔＧＡＡｐａｒで観察されたものと同程度のレベルであることを明らかにした（図１１）。Ｈｕｈ７細胞を用いたインビトロ研究（実施例２）と同様に、ＣｐＧが減少したＢＧＨポリＡ配列を有するＧＡＡ発現カセットは、野生型ＢＧＨポリＡを有するものよりも優れていた。予想外に、実施例２の結果と比較して、いくつかのコドンを最適化したＧＡＡ構築物は、親のｓｐΔＧＡＡｐａｒプラスミドと同様に又はそれよりも良好に機能した。
実施例４
研究設計−マウスにおけるベクターの効力
[0417]本発明のコドンを最適化したＧＡＡカセットの効力を親のカセットｓｐΔＧＡＡｐａｒ、ｓｐΔＧＡＡｐａｒ及び９コドンを最適化したカセットと比較して評価するために、配列番号３０〜３２のカプシドを含むＡＡＶベクターにパッケージした（表１）。群あたり５匹の雄Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、２種類のベクター用量（５×１０１１ｖｇ／ｋｇ又は２×１０１２ｖｇ／ｋｇ）のうち１種類を尾静脈から静脈内注入した。循環ＧＡＡ活性は、マウスへのＡＡＶベクター投与後に縦方向に測定した。血漿は、ＧＡＡ活性について隔週で試験された。７０日目に、１０匹の試験動物群のうち７群を屠殺し、残りの３群（ＳＰＫ−ＡＡＶ−０１、ＳＰＫ−ＡＡＶ−０２、及び親ベクター）を１４７日目に屠殺した。
結果
[0418]図１３は、ベクター注入から７０日後の血漿中のＧＡＡ活性アッセイによる、雄Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおけるＡＡＶ（配列番号３０〜３２）ベクター中にパッケージされた異なるコドンを最適化したＧＡＡ発現カセットの評価を示す。結果は、生物学的複製ｎ＝４〜５の平均である。誤差バーは標準偏差を表す。ＮＳ、有意ではない。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。
[0419]２つのベクターＳＰＫ−ＡＡＶ−０１及びＳＰＫ−ＡＡＶ−０２は、親ベクター（本明細書ではＳＰＫ−ＡＡＶ−１１と称する）と比較して、血漿中のＧＡＡ活性が一貫して有意に高かった（高用量では約２〜３倍高かった）。
[0420]図１４は、ベクター注入から７日後の血漿中のＧＡＡウエスタンブロットによる、雄Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおけるＡＡＶ（配列番号３０〜３２）ベクター中にパッケージされた異なるコドンを最適化したＧＡＡ発現カセットの評価を示す。結果は、生物学的複製ｎ＝４〜５の平均である。誤差バーは標準偏差を表す。ＮＳ、有意ではない。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。
[0421]図１５は、ＡＡＶ（配列番号３０〜３２）ベクター中にパッケージされたコドンを最適化したＧＡＡ発現カセットをマウスに投与した後に血漿中で測定されたＧＡＡ活性レベルを示す。雄Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、２種類の最良に機能するＧＡＡを発現するＡＡＶ（配列番号３０〜３２）ベクターのいずれかの５×１０１１（上段パネル）又は２×１０１２ｖｇ／ｋｇ（下段パネル）の用量で注入した（ｎ＝５匹／群）。比較のために、ＳＰＫ−ＡＡＶ−１１ベクター（親ｓｐΔＧＡＡｐａｒ構築物）を受けたマウスの血漿中で測定されたＧＡＡ活性を示す。４２日目から開始して、血漿中のＧＡＡ活性は、ＳＰＫ−ＡＡＶ−０１及びＳＰＫ−ＡＡＶ−０２ベクターの方がＳＰＫ−ＡＡＶ−１１ベクターよりも有意に高かった（＊＊＊ｐ＝＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＝＜０．０００１ Ｔｕｋｅｙ多重比較試験）。
実施例５
研究設計−ラットにおける効力
[0422]本研究の目的は、２つの異なるラット株におけるＳＰＫ−ＡＡＶ−０２の効力を評価することであった。ウイスターハノーバー（ｎ＝４）及びスプラーグドーリー（ｎ＝５）ラットへのベクター投与後、血漿中の循環ＧＡＡ活性を測定した。雄ラットに２×１０１３ｖｇ／ｋｇのベクターを尾静脈から静脈内注入した。
結果
[0423]図１６は、血漿中のＧＡＡ活性アッセイによるＣ５７ＢＬ／６マウスと比較した、雄ウイスターハノーバー及びスプラーグドーリーラットにおけるＡＡＶ（配列番号３０〜３２）ベクターにパッケージされたＳＰＫ−ＡＡＶ−０２（ｐＡＡＶ−ＡｐｏＥ／ｈＡＡＴ．ＧＡＡ１３．ＢＧＨ）の評価を示す。結果は、生物学的複製ｎ＝４〜５の平均である。誤差バーは標準偏差を表す。
[0424]ＧＡＡ活性のレベルは、２８日目にプラトーになり始め、約１５，０００ｎｍｏｌ／ｈｒ／ｍＬのＧＡＡ活性が測定された。マウスにＳＰＫ−ＡＡＶ−０２をラットより１０倍低い用量（２×１０１２ｖｇ／ｋｇのベクター）で注入した。
実施例６
研究設計−非ヒト霊長類（ＮＨＰ）における効力、第１部
[0425]分泌性ＧＡＡ発現の長期効果を評価するために、ＳＰＫ−ＡＡＶ−０１、ＳＰＫ−ＡＡＶ−０２又はＳＰＫ−ＡＡＶ−１０ベクターの単回用量をヒトに系統発生的に近い種であるアカゲザル（Ｍａｃａｃａ ｍｕｌａｔｔａ）に投与し、動物を血漿中のＧＡＡ活性レベルについて評価した。
[0426]雄のアカゲザル（ｎ＝３／用量コホート）は、６×１０１２ｖｇ／ｋｇのＳＰＫ−ＡＡＶ−０１、ＳＰＫ−ＡＡＶ−０２又はＳＰＫ−ＡＡＶ−１０ベクターを伏在静脈内に３０分間のＩＶ注入を受けた。ＡＡＶベクター投与後、動物を臨床観察のために毎日モニターし、血液を週１回、回収した。
結果
[0427]アカゲザルに６×１０１２ｖｇ／ｋｇのＧＡＡ発現ＡＡＶ（配列番号３０〜３２）ベクターを注入した（ｎ＝３匹／群）。図１７は、ＡＡＶ（配列番号３０〜３２）ベクターにパッケージされたＧＡＡ発現カセットを雄アカゲザルに投与した後の血漿中で測定されたＧＡＡ活性レベルを示す。ＳＰＫ−ＡＡＶ−０１、ＳＰＫ−ＡＡＶ−０２及びＳＰＫ−ＡＡＶ−１０ベクター注入ＮＨＰの血漿ＧＡＡ活性レベル間に有意差は観察されなかった。
[0428]ＮＨＰ研究の予備データは、マウス研究で観察された結果を確認し、ＳＰＫ−ＡＡＶ−０１及びＳＰＫ−ＡＡＶ−０２の投与に起因する血漿中ＧＡＡ活性レベルが類似していることを示す（図１７）。
実施例７
研究設計−非ヒト霊長類における効力、第２部
[0429]本研究の主な目的は、アフリカミドリザル（ＡＧＭ；ミドリザル（Ｃｈｌｏｒｏｃｅｂｕｓ ｓａｂａｅｕｓ））におけるＳＰＫ−ＡＡＶ−０１及びＳＰＫ−ＡＡＶ−０２の形質導入プロファイルを評価することであった。雄のＡＧＭ（ｎ＝４／用量コホート）は、６×１０１２ｖｇ／ｋｇのＳＰＫ−ＡＡＶ−０１又はＳＰＫ−ＡＡＶ−０２ベクターの単回用量を伏在静脈内に３０分間のＩＶ注入を受けた。ＡＡＶベクター投与後、動物を臨床観察のために毎日モニターし、血液を週１回、回収した。
結果
[0430]アフリカミドリザルにおける予備データは、ＳＰＫ−ＡＡＶ−０１及びＳＰＫ−ＡＡＶ−０２の投与に起因する血漿中ＧＡＡ活性レベルが類似していることをマウス研究で観察した結果を確認する（図１８）。
実施例８
結論
[0431]分泌性ヒトＧＡＡを発現するコドンを最適化したＧＡＡカセットは、親のｓｐΔＧＡＡｐａｒ構築物よりも有意な改善を表す。特に、ＳＰＫ−ＡＡＶ−０１及びＳＰＫ−ＡＡＶ−０２は、細胞培養、げっ歯類、及び２つの非ヒト霊長類モデルにおいて、分泌性ヒトＧＡＡの優れた効力及び発現を示す。
実施例９
研究設計−ＮＨＰにおける用量範囲
[0432]分泌性ＧＡＡ発現の用量反応を評価するために、ヒトに系統発生的に近い霊長類種であるアカゲザル（Ｍａｃａｃａ ｍｕｌａｔｔａ）に３用量のＳＰＫ−ＡＡＶ−０２ベクターを投与し、動物を１か月間にわたってＧＡＡ活性レベルについて評価した。
[0433]雄アカゲザル（ｎ＝４／用量コホート）は、２×１０１２、６×１０１２、２×１０１３ｖｇ／ｋｇの用量のＳＰＫ−ＡＡＶ−０２ベクターのいずれかを伏在静脈内に３０分間の静脈内（ＩＶ）注入を受けた。雌アカゲザル（ｎ＝４／用量コホート）は、２×１０１３ｖｇ／ｋｇの用量のＳＰＫ−ＡＡＶ−０２ベクターを伏在静脈内に３０分間のＩＶ注入を受けた。ＡＡＶベクター投与後、動物を臨床観察のために毎日モニターした。血液は、ＧＡＡ活性、ＧＡＡ抗原レベル、抗ＧＡＡ ＩｇＧ形成、血液学、及びグルコースレベルを含む臨床化学を測定して血糖の潜在的改変をモニターするために、４週間、週１回、回収された。
結果
[0434]図２１は、雄及び雌アカゲザルにＳＰＫ−ＡＡＶ−０２ベクターを投与した後に血漿中で測定されたＧＡＡ活性レベルを示す。ベクター注入から７、１４、２１及び２８日後の血漿中で測定したＧＡＡ活性の結果は、ベクター投薬量と血漿中ＧＡＡ活性レベルの間の相関を示す。２×１０１３ｖｇ／ｋｇの用量で注入された雌ＮＨＰの血漿中ＧＡＡ活性レベルは、同用量で注入された雄ＮＨＰにおいて測定されたものよりも約０．５倍（４９．６％）低かった。
[0435]このＮＨＰ研究のデータは、マウス研究で観察された結果、すなわち、分泌性ＧＡＡ発現のためのＡＡＶベクターに由来する血漿ＧＡＡ活性レベルが、ベクター投与後の血漿中の用量依存性ＧＡＡ活性をもたらすことを確認する（図２１）。ＮＨＰにＳＰＫ−ＡＡＶ−０２を３段階の用量で単回注入したところ、ＮＨＰ血漿中のＧＡＡの用量依存性発現が示された。
実施例１０
９ヵ月のＮＨＰ研究
[0436]ＳＰＫ−ＡＡＶ−０１、ＳＰＫ−ＡＡＶ−０２及びＳＰＫ−ＡＡＶ−１０の各々を、雄マカゲザル（Ｍａｃａｃａ ｍｕｌａｔｔａ）に静脈内注入により単回用量（６×１０１２ｖｇ／ｋｇ）で投与した。研究期間中、分泌性ＧＡＡ発現ベクターで投薬された動物の一部において、血漿中の活性ＧＡＡタンパク質の減少及びそれに伴う抗ＧＡＡ ＩｇＧ抗体レベルの上昇が観察された。血漿中のＧＡＡ活性及び抗原レベルの喪失は、ヒト導入遺伝子タンパク質生成物のＩｇＧ介在性体液性免疫クリアランスの発現によるものと考えられた。体液性免疫応答を低下させ、検出可能な循環ＧＡＡ酵素レベルを回復させるために、１８３日目から開始して、特定の動物に毎日のシクロスポリンＡと組み合わせた月１回のリツキシマブの免疫抑制レジメンを与えた。
結果
[0437]血漿中の分泌型及び活性型ＧＡＡのレベルは全ての動物において検出され、ＳＰＫ−ＡＡＶ−０１、ＳＰＫ−ＡＡＶ−０２及びＳＰＫ−ＡＡＶ−１０について、それぞれ４８２．０７±４７．９０、６６４．４３±４１７．５５及び４２７．８３３±３０７．９４ｎｍｏｌ／ｍＬ／ｈｒの１５日目のピーク平均活性レベルを示した。循環ＧＡＡ抗原の検出可能なレベルは、ＳＰＫ−ＡＡＶ−０１、ＳＰＫ−ＡＡＶ−０２及びＳＰＫ−ＡＡＶ−１０を投与した動物について、それぞれ１４．８４±２．２１、１９．１１±２３．２３、１４．６４±１６．９６ｎｇ／ｍＬの平均ピークレベルで観察された。１５日目から開始して、観察された循環ＧＡＡの減少と同時に、循環抗ＧＡＡ ＩｇＧレベルの増加が観察された。肝臓組織のｑＰＣＲによるベクターゲノムの分析により、肝臓においてベクターの存在が確認され、ＳＰＫ−ＡＡＶ−０１、ＳＰＫ−ＡＡＶ−０２及びＳＰＫ−ＡＡＶ−１０を投与した動物について、それぞれ１倍体ゲノムあたり６．３９±２．７２、１１．４３±４．２３及び１９．０１±１３．９３の平均ベクターゲノムコピーを示した。
[0438]全長ＧＡＡと切断型ＧＡＡ（リソソーム形態）タンパク質レベルの両方について肝臓試料を分析した。研究試料は、陰性対照として役割を果たすベクターナイーブなアカゲザル肝臓試料と比較されたが、タンパク質負荷レベルで切断又は無傷ＧＡＡの検出可能なレベルを示さなかった（ｎ＝３）。研究動物の肝臓における全長タンパク質の量は、ＳＰＫ−ＡＡＶ−０１、ＳＰＫ−ＡＡＶ−０２及びＳＰＫ−ＡＡＶ−１０を投与した動物において、それぞれ４．０±７．０、５．４±９．１、１１．０±１１．３ｎｇのＧＡＡ／ｍｇの総タンパク質であった。各コホートは、完全長ＧＡＡよりも高いレベルの切断型ＧＡＡを含有し、ＳＰＫ−ＡＡＶ−０１、ＳＰＫ−ＡＡＶ−０２及びＳＰＫ−ＡＡＶ−１０を投与した動物において、それぞれ４１．６±５７．６、４４．４±７４．５、４９．０±４０．３ｎｇのＧＡＡ／ｍｇの総タンパク質のレベルを示した。ＧＡＡプロセシングにかかわらず、グループ間の差は有意ではなかった（完全長（無傷）形態でＰ＝０．７２；Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓによるリソソーム（切断）形態でＰ＝０．８３）。終点時に、本発明のＡＡＶベクターを投与された全ての群は、肝臓においてベースラインを超えるＧＡＡの平均検出可能レベルを示した。
結論
[0439]ＳＰＫ−ＡＡＶ−０１、ＳＰＫ−ＡＡＶ−０２及びＳＰＫ−ＡＡＶ−１０の各々の投与は、検出可能なＧＡＡ抗原の血漿レベルを増加させ、２〜３週間でピークに達し、ＧＡＡ活性と直線的に相関をもたらし、ベクターゲノムに関係なく同様の動態を示した。血漿中のＧＡＡ活性とＧＡＡ抗原レベルの両方は、１匹を除く全ての動物において、以下の時間点で連続的に減少した。ＡＡＶベクターで処理されたＮＨＰにおいて以前に観察されたように、ヒト導入遺伝子生成物に対する体液性応答が４３日目から開始して観察され、これは、ＧＡＡ特異的ＩｇＧ応答を発現した全ての動物において血漿中のＧＡＡ抗原レベルと逆相関した。Ｂ細胞媒介性ＩｇＧ応答（リツキシマブ）を標的とする免疫抑制剤の投与を介した抗ＧＡＡ ＩｇＧレベルの抑制は、動物のサブセットにおける血漿中の検出可能なＧＡＡレベルの回復をもたらした。全群について、ベクターゲノムコピーは、測定可能な循環ＧＡＡの血漿レベルがない場合でさえ、研究終了時に肝臓において検出可能であった。それに応じて、研究終了時にベクターで処理された全肝臓組織においてＧＡＡタンパク質が検出されたが、ＧＡＡ抗原は未治療の肝臓組織において検出限界未満であった。総合すると、これらの結果は、本発明のＡＡＶベクターが、ヒト導入遺伝子生成物に対する抗体反応の発現にかかわらず、９ヵ月間にわたって、肝臓において分泌性ヒトＧＡＡの持続的発現を媒介することができることを示す。
実施例１１
９週間のげっ歯類の免疫抑制研究
[0440]雄及び雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスに単回用量の２×１０１２ｖｇ／ｋｇのＳＰＫ−ＡＡＶ−０２粒子をラパマイシン及び／又はプレドニゾロンの存在下又は非存在下で静脈内投与した後、ＧＡＡ導入遺伝子産物の発現レベルを９週間測定した。表２に示されるように、マウスを５群で試験した。
Figure 2021523718
[0441]免疫抑制剤（複数可）を投与される群では、ＡＡＶ粒子投薬前、及び研究の最初の５週間、薬剤（複数可）を投与した。ＡＡＶ投薬の完了後、動物は、９週間、臨床観察及び体重をモニターされた。研究終了時、血液試料について臨床化学及び血液学を実施し、特定の組織について病理組織学を実施した。ｒＡＡＶカプシドに対するＩｇＧ抗体及び血漿ＧＡＡ活性を研究期間を通じて週１回評価した。
結果
[0442]血漿中のＧＡＡ活性のレベルは、ベクターを投与された全ての動物においてバックグラウンドを超えて検出された。１群のビヒクルを投与された雄は、バックグラウンドレベルは約３００〜４００ｎｍｏｌ／ｍＬ／ｈｒを示した。ＧＡＡ活性の循環レベルは、免疫抑制治療群に依存してわずかに異なる動態でベクター投与後に上昇したが、ＧＡＡ活性の同等のピーク平均レベルを示した。特に、ＧＡＡ活性のピーク平均レベルは、２群（ＳＰＫ−ＡＡＶ−０２単独）、３群（ＳＰＫ−ＡＡＶ−０２、２〜３ｍｇ／ｋｇラパマイシン）、４群（ＳＰＫ−ＡＡＶ−０２、１〜０．２５ｍｇ／ｋｇプレドニゾロン）、及び５群（ＳＰＫ−ＡＡＶ−０２、２〜３ｍｇ／ｋｇラパマイシン、１〜０．２５ｍｇ／ｋｇプレドニゾロン）の雄について、それぞれ１６１１４±５４１１、１４８７５±６８８２、１４８９０±６８８２、及び２１４８０±６３４０ｎｍｏｌ／ｍＬ／ｈｒであった。いずれのＡＡＶ治療群の間でも、ピークＧＡＡ活性レベルに統計的有意差は観察されなかった。
[0443]雌マウスでは、ＧＡＡ活性のピーク平均レベルは、２群、３群、４群、及び５群で、それぞれ７３８０±４０３４、５９１２±３２５９、６０９６±３２４９、及び９９５５±３１０４ｎｍｏｌ／ｍＬ／ｈｒであった。ＧＡＡ活性のこれらのレベルは、ビヒクルを投与された雌動物において検出されたバックグラウンドを有意に上回った。雄マウスで見られたように、雌マウスにおけるＧＡＡ活性のピークレベルは、いずれのＡＡＶ治療群の間でも統計学的に有意な差はなかった。雌雄間で観察されたＧＡＡ活性の血漿レベルの差は、雌マウスにおける肝細胞のＡＡＶ形質導入の減少の十分に立証された現象と一致する（Ｄａｖｉｄｏｆｆら、２００３年、Ｂｌｏｏｄ、１０２巻：４８０〜４８８頁；ＤＯＩ：１０．１１８２／ｂｌｏｏｄ−２００２−０９−２８８９）。
[0444]血漿中の抗ｒＡＡＶカプシドＩｇＧは、ＳＰＫ−ＡＡＶ−０２を投与された全動物において検出され、２群、３群、４群、及び５群の雄では、それぞれ８６５２７±９２１４０、６６９５±３５５５、６４３６８±２９６３５、及び１１３７４±６０５３ｎｇ／ｍＬのピーク平均レベルを示し、２群、３群、４群及び５群の雌では、それぞれ１８２００９±１４８１４８、６６１４１±７７９２５、１８２６５４±９０１６１、及び５７７５２±５９１９２ｎｇ／ｍＬのピーク平均レベルを示した。雄と雌はともに群１（ビヒクル）は、全ての時間点でアッセイの定量限界を下回った抗ｒＡＡＶカプシドＩｇＧのレベルを有した。
結論
[0445]ＳＰＫ−ＡＡＶ−０２の投与は、全動物において検出可能なＧＡＡ活性レベルをもたらした。ラパマイシンとプレドニゾロンによる併用治療は、雄マウスでは２２日目、３６日目、及び４２日目に、雌マウスでは４３日目にＧＡＡ活性のレベルを統計学的に増加させた（対ｒＡＡＶベクター単独）。注目すべきことに、最大発現に到達した時期に関係なく、ＧＡＡ活性のピークレベルの差は、性内のいずれものＡＡＶ治療群間で統計学的に有意ではなかった。
[0446]ｒＡＡＶカプシドに対して生じた体液性ＩｇＧ応答は、ＳＰＫ−ＡＡＶ−０２を投与した全ての群において観察された。雌雄ともに、ラパマイシン（３群及び５群）の存在は、ベクター単独と比較した場合、抗カプシドＩｇＧの形成を有意に低下させた。プレドニゾロンによる治療は、抗カプシドＩｇＧ形成に対してより軽度の効果を示し、４群の雄で４３及び６０日目に、雌で４３及び６０日目に有意な低下を示した。
[0447]マウスにおけるラパマイシン及び／又はプレドニゾロンによる免疫抑制は、ｒＡＡＶカプシドに対する体液性応答の減少をもたらし、血漿中のＧＡＡ活性のピークレベルに有意な影響を及ぼさなかった。
実施例１２
ＮＨＰにおいてラパマイシンを同時投与した４週間の単回用量
[0448]本研究は、３匹の雄アフリカミドリザル（ミドリザル（Ｃｈｌｏｒｏｃｅｂｕｓ ｓａｂａｅｕｓ））に、ラパマイシン存在下で、５．５×１０１３ｖｇ／ｋｇのＳＰＫ−ＡＡＶ−０２の単回用量を投与後の４週間にわたり循環ＧＡＡ活性（血漿中のＧＡＡ活性レベル）を評価した。
[0449]動物は、ＡＡＶ投与前の５日からラパマイシン（２ｍｇ／ｋｇ／日）が投与され、４週間の研究期間、継続された。５．５×１０１３ｖｇ／ｋｇのＳＰＫ−ＡＡＶ−０２の単回用量を伏在静脈を介して静脈内に投与した。ＡＡＶ投与の完了後、動物は、４週間、臨床観察及び体重をモニターされた。研究終了時、血液試料について臨床化学及び血液学を実施し、特定の組織について病理組織学を実施した。研究期間中、血漿ＧＡＡ活性を週１回測定した。
結果
[0450]血漿中のＧＡＡ活性のレベルは、ＳＰＫ−ＡＡＶ−０２投与後、全ての動物においてバックグラウンドを超え、測定された最終時点で３匹の各々のピーク活性レベルは１１５８．１、７１１．９、及び６２３．８ｎｍｏｌ／ｍＬ／ｈｒに達した（表３）。
Figure 2021523718
結論
[0451]ＳＰＫ−ＡＡＶ−０２の投与は、３つの全てのＮＨＰにおいて検出可能な血漿ＧＡＡ活性をもたらした。ＳＰＫ−ＡＡＶ−０２とラパマイシンの組合せは、十分に忍容性であり、測定された全ての試験で良好な安全性プロファイルを有した。
実施例１３
Ｇａａ−／−マウスポンペモデルにおける治療有効性
[0452]ＳＰＫ−ＡＡＶ−０２を３用量（１．２５×１０１１、５×１０１１及び２×１０１２ｖｇ／ｋｇ）で投与された４か月齢のＧａａ−／−マウス（ポンペ病の確立されたマウスモデル）の１０か月の追跡研究を行った。本研究は、（１）循環ＧＡＡ酵素活性の用量依存的増加、（２）筋力の有意な改善、及び（３）有意な抗ＧＡＡ体液性免疫応答がないことを示した。
実施例１４
方法
分泌性ヒトＧＡＡ導入遺伝子をコードするプラスミドのタンパク質発現効率を測定するための細胞ベースのアッセイ
[0453]Ｈｕｈ７細胞を、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋ペニシリン／ストレプトマイシン／Ｌ−グルタミン中、ウェルあたり５×１０４細胞で４８ウェルディッシュにおいて一晩プレーティングした。プラスミドギガキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて調製したプラスミドを、リポフェクタミン（登録商標）２０００を用いて、ウェルあたり２５０ｎｇで細胞にトランスフェクトした。細胞を３７℃及び５％ＣＯ２で４８〜７２時間維持し、上清を回収し、ＧＡＡ活性についてアッセイするまで−８０℃で低保持マイクロタイタープレートに保存した。上清を１：１０に希釈し、３ｍＭの蛍光基質４−メチルウンベリフェリルα−Ｄ−グルコピラノシドとともに１時間、３７℃でインキュベートした。反応を１時間後に炭酸塩緩衝液（ｐＨ１０．５）で停止させ、停止緩衝液中で４−メチルウンベリフェロン（４−ＭＵ）を希釈し、２５０ｐｍｏｌ／μＬから開始し、０ｐｍｏｌ／μＬで終了する１２点の標準曲線を作成することによって生成した標準曲線と比較した。プレートをλｅｘ３６０ｎｍ；λｅｍ４４９ｎｍで読み取った。
分泌性ヒトＧＡＡ導入遺伝子をコードするプラスミドの効力を評価するためのプラスミドＤＮＡの流体力学的注入
[0454]プラスミドギガキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて調製したプラスミドを、ＰＢＳ１８０＋０．００１％プルロニック中で希釈した。試験される各カセットに対応する２５μｇのプラスミドＤＮＡを、約８週齢の雄Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、流体力学的注入によって側方尾静脈内に静脈内導入した。注入の７２時間後、顎下静脈を穿刺して全血をクエン酸ナトリウムチューブに回収した。１滴目の血液を捨て、クエン酸ナトリウムに２００μＬの血液を回収し、溶血及び凝固を避けるためにチューブを転倒させた。試料を１０，０００ＲＭＰで１０分間、４℃で遠心分離した。血漿をチューブに分注し、ＧＡＡ活性を分析するまで−８０℃の冷凍庫に保存した。血漿試料を様々な程度に希釈し、３ｍＭの蛍光基質４−メチルウンベリフェリルα−Ｄ−グルコピラノシドとともに３７℃で１時間インキュベートした。反応を１時間後に炭酸塩緩衝液（ｐＨ１０．５）で停止させ、停止緩衝液中で４−ＭＵを希釈し、２５０ｐｍｏｌ／μＬから開始し、０ｐｍｏｌ／μＬで終了する１２点の標準曲線を作成することによって生成した標準曲線と比較した。プレートをλｅｘ３６０ｎｍ；λｅｍ４４９ｎｍで読み取った。
分泌性ヒトＧＡＡ導入遺伝子をコードするＡＡＶベクターの効力を測定するための細胞ベースのアッセイ
[0455]Ｈｕｈ７細胞を、ウェルあたり５×１０４細胞で４８ウェルディッシュに一晩プレーティングした。ストックベクターからのＳＰＫ−ＡＡＶ−０１及びＳＰＫ−ＡＡＶ−０２を、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（商標）又はＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋ペニシリン／ストレプトマイシン／Ｌ−グルタミン中の用量曲線（感染多重度、ＭＯＩ、２×１０６〜１×１０４の範囲）で調製した。既存培地をＨｕｈ７細胞から除去し、ウイルス粒子含有培地に置換した。細胞を３７℃及び５％ＣＯ２で７２時間維持し、上清を回収し、ＧＡＡ活性についてアッセイするまで−８０℃で低保持マイクロタイタープレートに保存した。上清を１：１０に希釈し、３ｍＭの蛍光基質４−メチルウンベリフェリルα−Ｄ−グルコピラノシドとともに１時間、３７℃でインキュベートした。反応を１時間後に炭酸塩緩衝液（ｐＨ１０．５）で停止させ、停止緩衝液中で４−ＭＵを希釈し、２５０ｐｍｏｌ／μＬから開始し、０ｐｍｏｌ／μＬで終了する１２点の標準曲線を作成することによって生成した標準曲線と比較した。プレートをλｅｘ３６０ｎｍ；λｅｍ４４９ｎｍで読み取った。
マウス／ラット血漿中のＧＡＡ活性アッセイ
[0456]顎下静脈を穿刺して全血をクエン酸ナトリウムチューブに回収した。１滴目の血液を捨て、クエン酸ナトリウムに２００μＬの血液を回収し、溶血及び凝固を避けるためにチューブを転倒させた。試料を１０，０００ｒｐｍで１０分間、４℃で遠心分離した。血漿をチューブに分注し、ＧＡＡ活性を分析するまで−８０℃の冷凍庫に保存した。血漿試料を様々な程度に希釈し、３ｍＭの蛍光基質４−メチルウンベリフェリルα−Ｄ−グルコピラノシドとともに３７℃で１時間インキュベートした。反応を炭酸塩緩衝液（ｐＨ１０．５）で１時間後に停止させ、停止緩衝液中で４−ＭＵを希釈し、２５０ｐｍｏｌ／μＬから開始し、０ｐｍｏｌ／μＬで終了する１２点の標準曲線を作成することにより生成した標準曲線と比較する。プレートをλｅｘ３６０ｎｍ；λｅｍ４４９ｎｍで読み取った。
ＮＨＰ（アカゲザル／ＡＧＭ）血漿中のＧＡＡ活性アッセイ
[0457]雄アカゲザル／アフリカミドリザルに伏在静脈を介して静脈内に注入し、全血をクエン酸ナトリウムチューブに回収し、溶血及び凝固を避けるために転倒させた。試料を１０，０００ＲＭＰで１０分間、４℃で遠心分離した。血漿をチューブに分注し、ＧＡＡ活性を分析するまで−８０℃の冷凍庫に保存した。血漿試料を様々な程度に希釈し、３ｍＭの蛍光基質４−メチルウンベリフェリルα−Ｄ−グルコピラノシドとともに３７℃で１時間インキュベートした。反応を１時間後に炭酸塩緩衝液（ｐＨ１０．５）で停止させ、停止緩衝液中で４−ＭＵを希釈し、２５０ｐｍｏｌ／μＬから開始し、０ｐｍｏｌ／μＬで終了する１２点の標準曲線、又は１１点の標準曲線（５μＭ／ｍＬ〜０．４９ｎＭ／ｍＬ）を作成することにより生成した標準曲線と比較した。プレートをλｅｘ３６０ｎｍ；λｅｍ４４９ｎｍで読み取る。試験した試料のＧＡＡ活性を４−ＭＵ標準曲線から内挿し、速度（ナノモル／ミリリットル／時（ｎｍｏｌ／ｍＬ／時））で表した。
ウエスタンブロットによるＨｕｈ７上清中のＧＡＡのタンパク質レベル評価
[0458]Ｈｕｈ７細胞を、ウェルあたり５×１０４細胞で４８ウェルディッシュに一晩プレーティングした。ストックベクターからのＳＰＫ−ＡＡＶ−０１及びＳＰＫ−ＡＡＶ−０２を、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（商標）又はＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋ペニシリン／ストレプトマイシン／Ｌ−グルタミン中の用量曲線（感染多重度、ＭＯＩ、２×１０６〜１×１０４の範囲）で調製した。既存培地をＨｕｈ７細胞から除去し、ウイルス粒子含有培地に置換した。細胞を３７℃及び５％ＣＯ２で７２時間維持し、上清を回収し、ＧＡＡタンパク質レベルについてアッセイするまで−８０℃で低保持マイクロタイタープレートに保存した。上清をＲＩＰＡ緩衝液で１：２０に希釈し、９５℃で５分間インキュベートし、ＭＯＰＳ泳動緩衝液を用いて４〜１２％ビス−Ｔｒｉｓ ＮｕＰａｇｅゲル上で泳動した。タンパク質をｉＢｌｏｔ（登録商標）システム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いてポリビニリデンジフルオリド（ｐｖｄｆ）膜に移し、Ｏｄｙｓｓｅｙ（登録商標）ＴＢＳ緩衝液中で１時間、室温でブロックした。膜を１：１０００に希釈した一次抗体ウサギ抗ヒトＧＡＡ（Ａｂｃａｍ）とともに、一晩、４℃でインキュベートした。膜を洗浄し、１：１０，０００に希釈した蛍光二次抗ウサギ抗体とともに、室温で２時間インキュベートした。膜を洗浄し、Ｌｉ−Ｃｏｒｅ（登録商標）イメージングシステムを用いてイメージングした。バンドを１０ｎｇのマイオザイム（登録商標）及びマーカーと比較した。Ｌｉ−Ｃｏｒｅ（登録商標）ソフトウエアを用いて密度測定解析を行い、バンドをマイオザイム（登録商標）対照に正規化した。
ウエスタンブロットによるマウス血漿中ＧＡＡのタンパク質レベル評価
[0459]雌雄のＣ５７ＢＬ／６マウスに尾静脈から静脈内注入し、顎下静脈を穿刺して全血をクエン酸ナトリウムチューブに回収した。１滴目の血液を捨て、クエン酸ナトリウムに２００μＬの血液を回収し、溶血及び凝固を避けるためにチューブを転倒させた。試料を１０，０００ＲＭＰで１０分間、４℃で遠心分離した。血漿をチューブに分注し、ＧＡＡタンパク質レベルを分析するまで−８０℃の冷凍庫に保存した。血漿をＲＩＰＡ緩衝液で１：２０に希釈し、９５℃で５分間インキュベートし、ＭＯＰＳ泳動緩衝液を用いて４〜１２％ビス−Ｔｒｉｓ ＮｕＰａｇｅゲル上で泳動した。タンパク質をｉＢｌｏｔ（登録商標）システム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いてｐｖｄｆ膜に移し、Ｏｄｙｓｓｅｙ（登録商標）ＴＢＳ緩衝液中で１時間、室温でブロックした。膜を１：１０００に希釈した一次抗体ウサギ抗ヒトＧＡＡ（Ａｂｃａｍ）とともに、一晩、４℃でインキュベートした。膜を洗浄し、１：１０，０００に希釈した蛍光二次抗ウサギ抗体とともに、室温で２時間インキュベートした。膜を洗浄し、Ｌｉ−Ｃｏｒｅ（登録商標）イメージングシステムを用いてイメージングした。バンドを１０ｎｇのマイオザイム（登録商標）及びマーカーと比較した。Ｌｉ−Ｃｏｒｅ（登録商標）ソフトウエアを用いて密度測定解析を行い、バンドをマイオザイム（登録商標）対照に正規化した。
ＷＥＳによるＮＨＰ血漿中ＧＡＡのタンパク質レベル評価
[0460]雄アカゲザル／アフリカミドリザルに伏在静脈を介して静脈内に注入し、全血をクエン酸ナトリウムチューブに回収し、溶血及び凝固を避けるために転倒させた。試料を１０，０００ｒｐｍで１０分間、４℃で遠心分離した。血漿をチューブに分注し、ＧＡＡタンパク質レベルを分析するまで−８０℃の冷凍庫に保存した。血漿試料を試料希釈液で１：６０００に希釈した。それぞれのチップに８点の２倍標準曲線を加え、５０ｎｇ／ｍＬの濃度でマイオザイム（登録商標）を開始した。試料を緩衝液で希釈し、９５℃で５分間変性させ、ＷＥＳ（商標）チップにローディングした。一次抗体を１：１０００希釈で添加し、二次抗体を作動希釈でローディングした。チップをＷＥＳ（商標）タンパク質シンプルソフトウエアに従って泳動し、結果として生じるバンドを分析し、マイオザイム（商標）標準曲線と比較して、非特異的第２バンドに正規化した。
抗ＡＡＶカプシドＩｇＧ抗体
[0461]抗ＡＡＶカプシド総ＩｇＧ形成をＥＬＩＳＡ捕捉アッセイで測定した。ＥＬＩＳＡプレートウェルを、１μｇ／ｍＬのｒＡＡＶ粒子を含有する５０μＬの溶液で被覆した。総ヒトＩｇＧ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ、０１５０−０１）を希釈し、１０，０００ｎｇ／ｍＬ〜０．５ｎｇ／ｍＬの範囲の１０点の標準曲線を作成し、プレートに添加した。アッセイの定量限界は、逆算後に４６０ｎｇ／ｍＬであった。３つのレベルの品質対照試料を調製し、各プレートに含めて、アッセイ性能を評価した。カプシド粒子、標準、及び品質対照を一晩、４℃でインキュベートした。洗浄後、ウェルをＰＢＳ中の２％のＢＳＡ、０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０で２時間、室温でブロックした。ブロッキング緩衝液中の試料の連続希釈物をプレートに装填し、室温で２時間インキュベートした。ブロッキング緩衝液で１：５０００に希釈したＨＲＰコンジュゲートしたヒツジ抗ヒトＩｇＧ抗体（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＮＡ９３３Ｖ）を抗体の検出に使用し、プレート上で１時間、室温でインキュベートした。洗浄後、ペルオキシダーゼ活性は、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン基質（ＴＭＢ）を用いて、１０分間、室温インキュベート中に発色させた。反応を１Ｍ硫酸で停止し、プレートを４５０ｎｍで光学密度（ＯＤ）について吸光プレートリーダーで読み取った。ＩｇＧ濃度は、精製ヒト総ＩｇＧの連続希釈で作成した標準曲線に対して決定された。

Claims (88)

  1. 配列番号１〜５に示される配列のいずれかからなる群から選択される配列と８６％を超える配列同一性を有する、酸性α−グルコシダーゼ（ＧＡＡ）をコードする核酸。
  2. 配列番号１〜５に示される配列のいずれかからなる群から選択される配列と８７％を超える配列同一性を有する、請求項１に記載のＧＡＡをコードする核酸。
  3. 配列番号６〜１５に示される配列のいずれかからなる群から選択される配列と８７％を超える配列同一性を有する、ＧＡＡをコードする核酸。
  4. 配列番号６〜１５に示される配列のいずれかからなる群から選択される配列と８８％を超える配列同一性を有する、請求項３に記載のＧＡＡをコードする核酸。
  5. 配列番号６〜１５に示される配列のいずれかからなる群から選択される配列と８９％を超える配列同一性を有する、請求項３に記載のＧＡＡをコードする核酸。
  6. 配列番号６〜１５に示される配列のいずれかからなる群から選択される配列と９０％を超える配列同一性を有する、請求項３に記載のＧＡＡをコードする核酸。
  7. 配列番号６〜１５に示される配列のいずれかからなる群から選択される配列と９１％を超える配列同一性を有する、請求項３に記載のＧＡＡをコードする核酸。
  8. 配列番号１６〜２４に示される配列のいずれかからなる群から選択される配列と９１％を超える配列同一性を有する、ＧＡＡをコードする核酸。
  9. １２７個未満のＣｐＧジヌクレオチドを含有する、請求項１〜８のいずれか一項に記載のＧＡＡをコードする核酸。
  10. １２７個未満のＣｐＧジヌクレオチドを含有する、ＧＡＡをコードする核酸。
  11. １２６個未満のＣｐＧジヌクレオチドを含有する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のＧＡＡをコードする核酸。
  12. 約１２６〜１２０個のＣｐＧジヌクレオチドを含有する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のＧＡＡをコードする核酸。
  13. 約１２０〜１１０個のＣｐＧジヌクレオチドを含有する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のＧＡＡをコードする核酸。
  14. 約１１０〜１００個のＣｐＧジヌクレオチドを含有する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のＧＡＡをコードする核酸。
  15. 約１００〜９０個のＣｐＧジヌクレオチドを含有する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のＧＡＡをコードする核酸。
  16. 約９０〜８０個のＣｐＧジヌクレオチドを含有する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のＧＡＡをコードする核酸。
  17. 約８０〜７０個のＣｐＧジヌクレオチドを含有する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のＧＡＡをコードする核酸。
  18. 約７０〜６０個のＣｐＧジヌクレオチドを含有する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のＧＡＡをコードする核酸。
  19. 約６０〜５０個のＣｐＧジヌクレオチドを含有する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のＧＡＡをコードする核酸。
  20. 約５０〜４０個のＣｐＧジヌクレオチドを含有する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のＧＡＡをコードする核酸。
  21. 約４０〜３０個のＣｐＧジヌクレオチドを含有する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のＧＡＡをコードする核酸。
  22. 約３０〜２０個のＣｐＧジヌクレオチドを含有する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のＧＡＡをコードする核酸。
  23. ２０個未満のＣｐＧジヌクレオチドを含有する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のＧＡＡをコードする核酸。
  24. 約２０〜１０個のＣｐＧジヌクレオチドを含有する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のＧＡＡをコードする核酸。
  25. １０個未満のＣｐＧジヌクレオチドを含有する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のＧＡＡをコードする核酸。
  26. 約１０〜５個のＣｐＧジヌクレオチドを含有する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のＧＡＡをコードする核酸。
  27. ５個のＣｐＧジヌクレオチドを含有する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のＧＡＡをコードする核酸。
  28. ４個のＣｐＧジヌクレオチドを含有する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のＧＡＡをコードする核酸。
  29. ３個のＣｐＧジヌクレオチドを含有する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のＧＡＡをコードする核酸。
  30. ２個のＣｐＧジヌクレオチドを含有する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のＧＡＡをコードする核酸。
  31. １個のＣｐＧジヌクレオチドを含有する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のＧＡＡをコードする核酸。
  32. ０個のＣｐＧジヌクレオチドを含有する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のＧＡＡをコードする核酸。
  33. 配列番号１〜２４に示される配列のいずれかからなる群から選択される配列と９２％を超える配列同一性を有する、請求項１〜３２のいずれか一項に記載のＧＡＡをコードする核酸。
  34. 配列番号１〜２４に示される配列のいずれかからなる群から選択される配列と９３％を超える配列同一性を有する、請求項１〜３２のいずれか一項に記載のＧＡＡをコードする核酸。
  35. 配列番号１〜２４に示される配列のいずれかからなる群から選択される配列と９４％を超える配列同一性を有する、請求項１〜３２のいずれか一項に記載のＧＡＡをコードする核酸。
  36. 配列番号１〜２４に示される配列のいずれかからなる群から選択される配列と９５％を超える配列同一性を有する、請求項１〜３２のいずれか一項に記載のＧＡＡをコードする核酸。
  37. 配列番号１〜２４に示される配列のいずれかからなる群から選択される配列と９６％を超える配列同一性を有する、請求項１〜３２のいずれか一項に記載のＧＡＡをコードする核酸。
  38. 配列番号１〜２４に示される配列のいずれかからなる群から選択される配列と９７％を超える配列同一性を有する、請求項１〜３２のいずれか一項に記載のＧＡＡをコードする核酸。
  39. 配列番号１〜２４に示される配列のいずれかからなる群から選択される配列と９８％を超える配列同一性を有する、請求項１〜３２のいずれか一項に記載のＧＡＡをコードする核酸。
  40. 配列番号１〜２４に示される配列のいずれかからなる群から選択される配列と９９％を超える配列同一性を有する、請求項１〜３２のいずれか一項に記載のＧＡＡをコードする核酸。
  41. 配列番号１〜２４に示される配列のいずれかからなる群から選択される配列と９９．５％を超える配列同一性を有する、請求項１〜３２のいずれか一項に記載のＧＡＡをコードする核酸。
  42. 配列番号１〜２４からなる群から選択されるＧＡＡをコードする核酸。
  43. 発現制御エレメントに作動可能に連結されている、請求項１〜７及び９〜４２のいずれか一項に記載の核酸を含む発現カセット。
  44. 前記発現制御エレメントが、前記核酸の５’側に位置する、請求項４３に記載の発現カセット。
  45. 前記核酸の３’側に位置するポリアデニル化配列をさらに含む、請求項４４に記載の発現カセット。
  46. 前記発現制御エレメント又はポリアデニル化配列が、野生型発現制御エレメント又はポリアデニル化配列と比較してＣｐＧが減少している、請求項４４又は４５に記載の発現カセット。
  47. 前記発現制御エレメントが、ＡｐｏＥ／ｈＡＡＴエンハンサー／プロモーター配列を含む、請求項４３〜４６のいずれか一項に記載の発現カセット。
  48. 前記ポリアデニル化配列が、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）ポリアデニル化配列を含む、請求項４５〜４７のいずれか一項に記載の発現カセット。
  49. 前記ＡｐｏＥ／ｈＡＡＴエンハンサー／プロモーター配列又はｂＧＨポリアデニル化配列が、野生型ＡｐｏＥ／ｈＡＡＴエンハンサー／プロモーター配列又はｂＧＨポリアデニル化配列と比較してＣｐＧが減少している、請求項４７又は４８に記載の発現カセット。
  50. 前記野生型ｂＧＨポリアデニル化配列が配列番号２７の配列を含む、請求項４９に記載の発現カセット。
  51. 前記野生型ＡｐｏＥ／ｈＡＡＴエンハンサー／プロモーター配列が配列番号２８又は２９の配列を含む、請求項４９に記載の発現カセット。
  52. 前記ＣｐＧが減少したｂＧＨポリアデニル化配列が配列番号２６の配列を含む、請求項４９に記載の発現カセット。
  53. 前記発現制御エレメントの３’末端及び前記核酸の５’末端との間に位置するイントロンをさらに含む、請求項４３〜５２のいずれか一項に記載の発現カセット。
  54. 前記ＧＡＡが配列番号２５に示される配列を含む、請求項１〜５３のいずれか一項に記載の核酸又は発現カセット。
  55. 請求項１〜５４のいずれか一項に記載の核酸又は発現カセットを含むアデノウイルス関連ウイルス（ＡＡＶ）ベクター。
  56. 前記ＡＡＶベクターが、
    ａ）１つ又は複数のＡＡＶカプシド、及び
    ｂ）１つ又は複数のＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）であって、前記ＡＡＶ ＩＴＲが、前記核酸又は前記発現カセットの５’末端又は３’末端に隣接する前記ＡＡＶ ＩＴＲ
    を含む、請求項５５に記載のＡＡＶベクター。
  57. 前記１つ又は複数のＩＴＲの５’又は３’に位置するイントロンをさらに含む、請求項５６に記載のＡＡＶベクター。
  58. 少なくとも１つ又は複数の前記ＩＴＲ又は前記イントロンが、ＣｐＧが減少するように修飾されている、請求項５６又は５７に記載のＡＡＶベクター。
  59. 前記ＡＡＶベクターが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、Ｒｈ１０、Ｒｈ７４、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ−２ｉ８、又は配列番号３０、３１若しくは３２のＶＰ１、ＶＰ２及び／若しくはＶＰ３配列と９０％以上の配列同一性を有する修飾された若しくはバリアントのＡＡＶ ＶＰ１、ＶＰ２及び／若しくはＶＰ３カプシド、或いはＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、Ｒｈ１０、Ｒｈ７４、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ−２ｉ８、又は配列番号３０、３１若しくは３２のＶＰ１、ＶＰ２及び／若しくはＶＰ３配列と９５％以上の配列同一性を有するカプシド、或いはＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、Ｒｈ１０、Ｒｈ７４、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ−２ｉ８、又は配列番号３０、３１若しくは３２のＶＰ１、ＶＰ２及び／又はＶＰ３配列と１００％の配列同一性を有するカプシドを含むカプシド血清型を有する、請求項５５〜５８のいずれか一項に記載のＡＡＶベクター。
  60. 前記ＩＴＲが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、Ｒｈ１０、Ｒｈ７４若しくはＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ血清型、又はそれらの組合せのいずれかの１つ又は複数のＩＴＲを含む、請求項５６〜５９のいずれか一項に記載のＡＡＶベクター。
  61. 生物学的に適合性のある担体又は賦形剤中に、請求項５５〜６０のいずれか一項に記載の複数のＡＡＶベクターを含む医薬組成物。
  62. 空ＡＡＶカプシドをさらに含む、請求項６１に記載の医薬組成物。
  63. 前記空ＡＡＶカプシド対前記ＡＡＶベクターの比が、約１００：１〜５０：１、約５０：１〜２５：１、約２５：１〜１０：１、約１０：１〜１：１、約１：１〜１：１０、約１：１０〜１：２５、約１：２５〜１：５０、又は約１：５０〜１：１００内又はその間である、請求項６２に記載の医薬組成物。
  64. 前記空ＡＡＶカプシド対前記ＡＡＶベクターの比が、約２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、又は１０：１である、請求項６２に記載の医薬組成物。
  65. 界面活性剤をさらに含む、請求項６２〜６４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  66. 酸性α−グルコシダーゼ（ＧＡＡ）を必要とするヒトを治療する方法であって、
    （ａ）請求項１〜５４のいずれか一項に記載の核酸若しくは発現カセット、又は請求項５５〜６０のいずれか一項に記載のＡＡＶベクター、又は請求項６１〜６５のいずれか一項に記載の医薬組成物を提供するステップと；
    （ｂ）前記ヒトに、前記核酸、発現カセット、ＡＡＶベクター、又は医薬組成物の量を投与するステップであって、前記ＧＡＡが前記ヒトにおいて発現される、ステップと
    を含む方法。
  67. 前記ヒトが、ポンペ病を有する、請求項６６に記載の方法。
  68. 前記ヒトが、乳児発症型ポンペ病を有する、請求項６６に記載の方法。
  69. 前記ヒトが、遅発型ポンペ病を有する、請求項６６に記載の方法。
  70. 前記ヒトが、グリコーゲン蓄積症（ＧＳＤ）を有する、請求項６６に記載の方法。
  71. 前記ＧＳＤが、ＧＳＤタイプＩ（フォン・ギールケ病）、ＧＳＤタイプＩＩＩ（フォーブス・コリ病）、ＧＳＤタイプＩＶ（アンダーソン病、アミロペクチン症）、ＧＳＤタイプＶ（マッカードル病）、ＧＳＤタイプＶＩ（ハース病）、ＧＳＤタイプＶＩＩ（垂井病）、及び心臓の致死的な先天性ＧＳＤから選択される、請求項７０に記載の方法。
  72. 前記ＡＡＶベクターが、前記ヒトに静脈内、動脈内、腔内、粘膜内、又はカテーテルを介して投与される、請求項６６〜７１のいずれか一項に記載の方法。
  73. 前記ＧＡＡが、ＧＡＡを必要としないヒトにおいて見出されるＧＡＡの増加したレベル、任意選択で１％を超えるレベルで発現される、請求項６６〜７２のいずれか一項に記載の方法。
  74. 前記ＡＡＶベクターが、前記ヒトの体重１キログラムあたり約１×１０８〜約１×１０１４ベクターゲノム（ｖｇ／ｋｇ）で投与される、請求項６６〜７３のいずれか一項に記載の方法。
  75. 前記ＧＡＡの必要性又は前記疾患の１つ又は複数の症状を、低下させる、減少させる、又は抑制するか；又は前記ＧＡＡの必要性又は前記疾患の１つ又は複数の症状の進行又は悪化を、予防する、又は低下させるか；又は前記ＧＡＡの必要性又は前記疾患の１つ又は複数の症状を、安定化するか；又は前記ＧＡＡの必要性又は前記疾患の１つ又は複数の症状を、改善する、請求項６６〜７４のいずれか一項に記載の方法。
  76. 前記１つ又は複数の症状が、摂食困難；体重増加欠如；頭部制御不良；頸部制御不良；呼吸障害；肺感染症；心臓肥大；心臓肥厚；心臓欠陥；舌肥大；嚥下困難；肝臓肥大；筋力不足；弱筋緊張；脚の脱力；腰の脱力；腕の脱力；息切れ；運動困難；睡眠中の呼吸困難；脊椎の湾曲；及び硬い関節からなる群から選択される、請求項７５に記載の方法。
  77. 請求項１〜５４のいずれか一項に記載の核酸又は発現カセットを含む細胞。
  78. 請求項５５〜６０のいずれか一項に記載のＡＡＶベクターを生成する細胞。
  79. 請求項５５〜６０のいずれか一項に記載のＡＡＶベクターを生成する方法であって、
    ａ．パッケージングヘルパー細胞に、請求項１〜５４のいずれか一項に記載の前記核酸又は発現カセットを含むＡＡＶベクターゲノムを導入するステップと；
    ｂ．前記ＡＡＶベクターを生成する条件下で前記ヘルパー細胞を培養するステップと
    を含む方法。
  80. 請求項５５〜６０のいずれか一項に記載のＡＡＶベクターを生成する方法であって、
    ａ．パッケージングヘルパー細胞に、請求項１〜５４のいずれか一項に記載の前記核酸又は発現カセットを導入するステップと；
    ｂ．前記ＡＡＶベクターを生成する条件下で前記ヘルパー細胞を培養するステップと
    を含む方法。
  81. 前記細胞が、哺乳動物細胞を含む、請求項７７〜８０のいずれか一項に記載の細胞又は方法。
  82. 前記細胞が、前記ベクターをウイルス粒子にパッケージするヘルパー機能を提供する、請求項７７〜８０のいずれか一項に記載の細胞又は方法。
  83. 前記細胞が、ＡＡＶヘルパー機能を提供する、請求項７７〜８０のいずれか一項に記載の細胞又は方法。
  84. 前記細胞がＡＡＶ Ｒｅｐ及び／又はＣａｐタンパク質を提供する、請求項７７〜８０のいずれか一項に記載の細胞又は方法。
  85. 前記細胞が、Ｒｅｐ及び／又はＣａｐタンパク質配列をコードするポリヌクレオチドで安定的又は一時的にトランスフェクトされている、請求項７７〜８０のいずれか一項に記載の細胞又は方法。
  86. 前記細胞が、Ｒｅｐ７８及び／又はＲｅｐ６８タンパク質を提供する、請求項７７〜８０のいずれか一項に記載の細胞又は方法。
  87. 前記細胞が、１つ又は複数の配列をコードするＲｅｐ７８及び／又はＲｅｐ６８タンパク質で安定的又は一時的にトランスフェクトされている、請求項７７〜８０のいずれか一項に記載の細胞又は方法。
  88. 前記細胞が、ＨＥＫ−２９３細胞を含む、請求項７７〜８０のいずれか一項に記載の細胞又は方法。
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