JP2024504611A

JP2024504611A - ファブリー病を治療するための組成物および方法

Info

Publication number: JP2024504611A
Application number: JP2023542653A
Authority: JP
Inventors: ショーンアーマー; ダニエルコーエン; クリストファーライリング
Original assignee: Spark Therapeutics Inc
Current assignee: Spark Therapeutics Inc
Priority date: 2021-01-14
Filing date: 2022-01-13
Publication date: 2024-02-01
Also published as: AU2022207185A1; CO2023010599A2; CL2023002015A1; WO2022155665A1; PE20240915A1; EP4277988A1; MX2023008362A; KR20230131246A; CA3208153A1; IL304273A

Abstract

α－ガラクトシダーゼＡ（GLA）をコードする核酸を含むポリヌクレオチドが記載される。また、ポリヌクレオチドを含む発現カセット、ベクター、細胞、および細胞株、ならびにファブリー病等のリソソーム蓄積障害を治療するためにポリヌクレオチドを使用する方法も記載される。

Description

本発明は、遺伝子治療の分野に関する。特に、本発明は、ヒトα－ガラクトシダーゼＡの発現のための最適化カセット、およびリソソーム蓄積症、特にファブリー病を治療するためのその使用方法に関する。

関連出願
本願は、2021年1月14日に出願された米国仮特許出願第63/137,235号および2021年11月19日に出願された米国仮特許出願第63/264,356号の優先権を主張する。前述の出願の全内容は、全てのテキスト、表、配列表および図面を含め、参照により本明細書に組み込まれる。

電子的に提出された配列表の参照
本出願はEFS-Webを介して、ファイル名「SequenceListing4WO」、2022年1月13日の作成日であり、281KBのサイズを有するASCIIフォーマット配列リストとして電子的に提出される配列リストを含む。EFS-Webを介して提出される配列表は本明細書の一部であり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

ファブリー病はX連鎖性リソソーム蓄積症であり、その推定有病率は約4万人に１人である。ファブリー病は、リソソーム酵素α－ガラクトシダーゼＡ（GLA；α-gal A）の欠損によって引き起こされる。酵素欠損は、スフィンゴ糖脂質グロボトリアオシルセラミド（GL3またはGL-3またはGb3）およびグロボトリアオシルスフィンゴシン（リゾ-GL3またはリゾ-GL-3またはリゾ-Gb3）の蓄積をもたらし、進行性腎疾患、末梢神経障害、早期発症脳血管疾患、胃腸症状、肥大型心筋症、不整脈、渦巻状角膜混濁、および被角血管腫をもたらす。酵素補充療法で治療されていないファブリー病患者の、血管疾患による腎臓、心臓、および／または脳の合併症からの平均寿命は、男性では50年であり、女性では70年である（Lidove et al., Int. J. Clin. Pract. 2007;61:293-302）。

酵素補充療法（ERT）は、ファブリー病に利用可能であるが、治癒を表すものではなく、患者の生涯にわたって毎週の静脈内投与を必要とする。さらに、かなりの割合の患者は、α－ガラクトシダーゼに対する中和抗体（NAb）を発現することにより、ERTを無効にする（Linthorst et al., Kidney Int. 2004;66(4):1589-1595）。

ヒトα－ガラクトシダーゼＡ（GLA）の分泌型の肝臓指向性発現のための最適化カセットが、本明細書に開示される。カセットに対するこれらの最適化は、肝臓からのGLA分泌の増加をもたらし、肝臓遺伝子導入が、対象において、全身的にGLA欠損を交差補正するのに十分なGLAの循環レベルを達成することを可能にする。これらのカセットは、ファブリー病ならびにGLAで治療可能な他の疾患および障害を有する対象の遺伝子療法治療として有用である。

１つの一般的な態様では、本発明は、α－ガラクトシダーゼＡ（GLA）をコードする核酸を含むポリヌクレオチドに関し、核酸は、（１）配列番号：１５の配列に対して少なくとも75％の配列同一性を有するポリヌクレオチド、（２）配列番号：１６の配列に対して少なくとも84％の配列同一性を有するポリヌクレオチド、（３）配列番号：１７の配列に対して少なくとも86％の配列同一性を有するポリヌクレオチド、（４）配列番号：１８の配列に対して少なくとも86％の配列同一性を有するポリヌクレオチド、および（５）配列番号：１９の配列に対して少なくとも83％の配列同一性を有するポリヌクレオチドからなる群から選択され、任意に、ＧＬＡは配列番号：１００のアミノ酸配列を含む。

ある実施形態では、核酸は、１４個未満のCpGジヌクレオチドを含み、場合によりCpGジヌクレオチドを含まない。

ある実施形態では、GLAをコードする核酸は、配列番号：１５～１９のいずれかの配列を有する。

ある実施形態では、GLAをコードする核酸は、GLAをコードする核酸内の任意の位置に１以上のイントロンをさらに含む。ある実施形態では、イントロンは、GLAをコードする核酸のヌクレオチド７８と７９の間に位置し、そのヌクレオチド位置は、配列番号：１４の配列を有するGLAのコード配列に関して与えられる。

ある実施形態では、イントロンは、ビトロネクチン1（VTN1）遺伝子、レチノール結合タンパク質4（RBP4）遺伝子、マウスIgG重鎖A（IgHA）遺伝子、およびマウスIgG重鎖μ（IgHμ遺伝子）からなる群から選択される。ある実施形態では、１以上のイントロンは、配列番号：４９～５２の配列から選択される。

ある実施形態では、GLAをコードする核酸は、配列番号：４３～４６のいずれかの配列を有する。

ある実施形態では、GLAは、Gln57Lys、Gln111Glu、Lys213Glu、Lys237Gln、Phe248Thr、Gly334Glu、およびGly346Asnからなる群から選択される１個のアミノ酸置換を有する配列番号：１００のアミノ酸配列を含む。

ある実施形態では、GLAは、Gln57Lys、Gln111Glu、Lys213Glu、Lys237Gln、Phe248Thr、Gly334Glu、およびGly346Asnからなる群から選択される任意の２個のアミノ酸置換を有する配列番号：１００のアミノ酸配列を含む。

ある実施形態では、GLAは、Gln57Lys、Gln111Glu、Lys213Glu、Lys237Gln、Phe248Thr、Gly334Glu、およびGly346Asnからなる群から選択される任意の３個のアミノ酸置換を有する配列番号：１００のアミノ酸配列を含む。

ある実施形態では、GLAは、Gln57Lys、Gln111Glu、Lys213Glu、Lys237Gln、Phe248Thr、Gly334Glu、およびGly346Asnからなる群から選択される任意の４個のアミノ酸置換を有する配列番号：１００のアミノ酸配列を含む。

ある実施形態では、GLAは、Gln57Lys、Gln111Glu、Lys213Glu、Lys237Gln、Phe248Thr、Gly334Glu、およびGly346Asnからなる群から選択される任意の５個のアミノ酸置換を有する配列番号：１００のアミノ酸配列を含む。

ある実施形態では、GLAは、Gln57Lys、Gln111Glu、Lys213Glu、Lys237Gln、Phe248Thr、Gly334Glu、およびGly346Asnからなる群から選択される任意の６個のアミノ酸置換を有する配列番号：１００のアミノ酸配列を含む。

ある実施形態では、GLAは、Gln57Lys、Gln111Glu、Lys213Glu、Lys237Gln、Phe248Thr、Gly334Glu、およびGly346Asnの７個のアミノ酸置換を有する配列番号：１００のアミノ酸配列を含む。

ある実施形態では、GLAは配列番号：４８のアミノ酸配列を含む。

ある実施形態では、GLAをコードする核酸は、配列番号：４７のコード配列を含む。

ある実施形態では、ポリヌクレオチドは、GLAをコードする核酸の5'末端に位置するシグナルペプチド配列をコードする第２の核酸をさらに含む。

ある実施形態では、シグナルペプチド配列は、ヘテロシグナルペプチド配列である。

ある実施形態では、シグナルペプチド配列は、内因性のまたは天然のGLAシグナルペプチド配列である。

ある実施形態では、シグナルペプチドは、ヒトキモトリプシノーゲンB2シグナルペプチド、AHSGシグナルペプチド、CD300シグナルペプチド、LAMP1シグナルペプチド、Notch 2シグナルペプチド、ORM1シグナルペプチド、TFシグナルペプチド、および天然GLAシグナルペプチド、またはこれらの変異体からなる群から選択される。

ある実施形態では、シグナルペプチドは、ヒトキモトリプシノーゲンB2シグナルペプチドであり、場合により、配列番号：４１のアミノ酸配列を有するヒトキモトリプシノーゲンB2シグナルペプチド、またはその変異体である。

ある実施形態では、シグナルペプチドは、ヒトキモトリプシノーゲンB2シグナルペプチドであり、場合により、配列番号：１～５のいずれか１つのコード配列を有するヒトキモトリプシノーゲンB2シグナルペプチドである。

ある実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号：１０１～１０９のいずれかの配列を有する前駆体GLAをコードする。

ある実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号：６４～８１のいずれかの配列を含む。

ある実施形態では、本発明は、発現制御エレメントに作動可能に連結されたGLAをコードする核酸を含むポリヌクレオチドを含む発現カセットに関する。

ある実施形態では、本発明は、発現制御エレメントに作動可能に連結されたヒトGLAをコードする核酸を含むポリヌクレオチドを含む発現カセットに関する。

ある実施形態では、発現制御エレメントは、肝臓特異的発現制御エレメントである。

ある実施形態では、発現カセットの発現制御エレメントは、ポリヌクレオチドの5'に位置し、発現制御エレメントは、任意に、ApoE/hAATエンハンサー/プロモーター配列を含む。

ある実施形態では、発現カセットは、ポリヌクレオチドの3'に位置するポリアデニル化配列をさらに含み、ポリアデニル化配列は、任意に、ウシ成長ホルモン（bGH）ポリアデニル化配列を含む。

ある実施形態では、発現カセットの発現制御エレメントまたはポリアデニル化配列は、野生型の発現制御エレメントまたはポリアデニル化配列と比較してCpGが減少したものである。

ある実施形態では、発現カセットは、発現制御エレメントの3'末端とポリヌクレオチドの5'末端との間に位置するイントロンをさらに含み、このイントロンは任意に、hBB2m1イントロンを含む。

ある実施形態では、AAV ITRは、ポリヌクレオチドまたは発現カセットの5'末端および／または3'末端に隣接する。

ある実施形態では、本発明は、ポリヌクレオチドまたは発現カセットを含むアデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターに関する。

ある実施形態では、AAVベクターは、（ａ）１以上のAAVカプシドと、（ｂ）１以上のAAV逆方向末端反復配列（ITR）とを含み、AAV ITRは、ポリヌクレオチドまたは発現カセットの5'末端または3'末端に隣接する。

ある実施形態では、AAVベクターのITRの少なくとも１つは、CpGが減少するように修飾される。

ある実施形態では、AAVベクターは、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、Rh10、Rh74（配列番号：３５）、AAV3B、AAV-2i8、配列番号：１１０、配列番号：３６、配列番号：３７、および／またはLK03（配列番号：４２）に対して90％以上、95％以上、または100％の配列同一性を有する改変型または変異型AAV VP1、VP2および／またはVP3カプシドを含むカプシド血清型を有する。

ある実施形態では、AAVベクターは、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、Rh10、Rh74、AAV3B、AAV血清型、またはこれらの組み合わせのいずれかの１以上のITRを含む。

ある実施形態では、AAVベクターは、配列番号：２１～３４、５３～５６、および９１～９９のうちの１つのポリヌクレオチド配列を含む。

ある実施形態では、本発明は、ポリヌクレオチドまたは発現カセットを含む非ウイルスベクターに関する。

ある実施形態では、本発明は、生物学的に適合性を有する担体または賦形剤中に複数のAAVベクターまたは非ウイルスベクターを含む医薬組成物に関する。好ましくは、複数のAAVベクターは、治療効果を達成するのに十分な量を提供する。しかしながら、治療効果を達成するために複数の組成物が投与され得る。

ある実施形態では、医薬組成物は、空のAAVカプシドをさらに含む。

ある実施形態では、医薬組成物は、界面活性剤をさらに含む。

ある実施形態では、本発明は、GLAを必要とする対象を治療する方法であって、治療的有効量のポリヌクレオチド、発現カセット、AAVベクター、非ウイルスベクター、または医薬組成物を対象に投与することを含む方法であって、GLAが対象において発現される方法に関する。

ある実施形態では、対象はヒトである。

ある実施形態では、対象はファブリー病を有する。

ある実施形態では、ポリヌクレオチド、発現カセット、AAVベクター、非ウイルスベクター、または医薬組成物は、静脈内に、動脈内に、腔内に、粘膜内に、またはカテーテルを介して、対象に投与される。

ある実施形態では、AAVベクターは、対象の体重1キログラム当たり約1×10⁸～約1×10¹⁴ベクターゲノム（vg/kg）の範囲で対象に投与される。

ある実施形態において、本方法は、GLAもしくはファブリー病の対象の１以上の症状を低減し、減少させ、もしくは阻害し；またはGLAの必要性もしくはファブリー病の１以上の症状の進行もしくは悪化を防止もしくは低減し；またはGLAの必要性もしくはファブリー病の１以上の症状を安定化させ；またはGLAの必要性もしくはファブリー病の１以上の症状を改善する。

ある実施形態では、本発明は、ポリヌクレオチドまたは発現カセットを含む細胞に関する。

ある実施形態では、本発明は、AAVベクターを産生する細胞に関する。

ある実施形態では、本発明は、（ａ）ポリヌクレオチドまたは発現カセットを含むAAVベクターゲノムをパッケージングヘルパー細胞に導入すること；および（ｂ）AAVベクターを産生する条件下でヘルパー細胞を培養することを含む、AAVベクターを産生する方法に関する。

前述の発明の概要、ならびに以下の発明の詳細な説明は、添付の図面と併せて読むとより良く理解される。本発明は、図面に示される正確な実施形態に限定されないことを理解されたい。図面には以下が示される:
図１は、本明細書に記載の発現ベクターの概要図を示す。図２Ａは、AAV形質導入の4週間後のGLA酵素活性アッセイによって決定される、異なるシグナルペプチド（x軸に沿って示される、GLA、SP7、CD300、NOTCH2、ORM1およびTF）を含む、AAVカプシド化GLA発現カセットを投与された雄性（左パネル）および雌性（右パネル）C57Bl/6マウスにおける血清GLA酵素活性を示す棒グラフを示す。図２Ｂは、AAV形質導入の6週間後に測定された、野生型シグナルペプチド（GLA）またはsp7シグナルペプチド（SP7）を有するAAVカプシド形成GLA発現カセットを投与された雌性C57Bl/6マウスにおける血清GLAタンパク質レベルを示す棒グラフである；コントロールは無処置マウスにおけるGLAタンパク質のレベルを示す；バーの高さは群当たり5匹のマウスの平均を示す；エラーバーは平均からの標準偏差を示す；ｔ検定を行い、形質導入マウスにおける血清GLAタンパク質レベルをコントロールと比較した（^*** p＜0.001）。図３は、AAVカプシド化sp7-GLAを投与された、C57Bl/6およびB6;129-GLAマウスにおける血清GLA酵素活性を示す棒グラフである；バーの高さは群当たり10～11匹のマウスの平均を示す；エラーバーは平均からの1標準偏差を示す。図４Ａは、2つの別々の試験（試験1および試験2）にわたって実施され、AAV投与の4週間後に測定された、AAVカプシド化sp7-GLAを投与されたファブリー雄性マウスにおけるAAV投与量漸増の関数としての血清GLA酵素活性を示す棒グラフである；バーの高さは群当たり5匹のマウスの平均血清GLA活性を表す；エラーバーは平均からの標準偏差を示す；横線はAAVカプシド化sp7-GLAを投与されなかった5匹のGLA-/ヌルマウスの群にわたって観察された最大活性として定義される、GLAノックアウト動物において観察された基準（非特異的活性）を示す。図４Ｂは、sp7-GLA AAVベクターについて観察された用量－反応の直線性を示すグラフである；マウス当たりのベクターゲノム投与量の関数として、図４Ａに示されるAAVカプシド形成sp7-GLAで処置されたGLA-/ヌル雄性マウスからのデータを再プロットした；データは単純線形回帰でフィットされた；95％信頼区間が点線によって示される。図５Ａは、AAVカプシド化sp7-GLAを投与された雄性マウスの肝臓におけるGLA活性を示す棒グラフである；活性の基準レベルは、5匹のGLA-/ヌル無処置マウス（コントロール）、および4匹の週齢マッチGLA+/ヌル（WT）雄性マウスに由来するサンプルにおいて決定された；バーの高さは肝臓溶解物における平均GLA活性を表す；エラーバーは平均からの標準偏差を示す。図５Ｂは、AAVカプシド化sp7-GLAを投与されたGLA-/ヌル雄性マウス（コントロール）、または4匹の週齢マッチGLA+/ヌル（WT）雄性マウスの腎臓におけるGLA活性を示す棒グラフである；バーの高さは平均組織GLA活性を表す；エラーバーは平均からの標準偏差を示す。図６は、本明細書に記載のAAVカプシド化CpG非含有コドン最適化GLAカセットを投与されたC57Bl/6マウスにおける血清GLA活性を示す棒グラフである；血清中のGLA活性はAAV形質導入の4週間後にアッセイされた；バーの高さは群当たり5匹のマウスの平均組織GLA活性を表す；エラーバーは平均からの標準偏差を示す。図７は、sp7-GLA（ロットAおよびB）と比較した、コドン最適化GLA変異体（sp7-GLA-co4；sp7-GLA-var45）、7個のアミノ酸置換を有するGLA配列（GLA 7 mut；SPKL0031）、またはイントロン含有変異体（イントロンIgHA；イントロンVTN1；イントロンRBP4；イントロンIgHμ）のAAV投与後42日目のC57Bl/6マウスにおける血清GLA活性を示す棒グラフである。図８Ａは、4.4E11 vg/kg、1.4E12 vg/kg、および4.4E12 vg/kgのAAV-sp7-GLA-co4を投与されたB6;129-GLA -/-マウスにおける血清リゾ-GL3レベルの投与量依存的減少を示す線グラフである。28日間にわたって質量分析によりリゾ-GL3レベルを分析した。図８Ｂは、in vitro 4-メチルウンベリフェリルβ-D-ガラクトピラノシド（4-MU-Gal）アッセイを用いて測定された、血清中のα-gal A活性とリゾ-GL-3レベルとの間の直線関係を示すグラフである。図９Ａは、静脈内投与された4.4E11 vg/kg、1.4E12 vg/kg、および4.4E12 vg/kgのAAV-sp7-GLA-co4の投与量に対応する、B6;129-GLA -/-マウスの血清中のリゾ-GL3レベルの減少を示す棒グラフであり、リゾ-GL3の減少の投与量依存的な増加を示す。図９Ｂは、4.4E11 vg/kg、1.4E12 vg/kg、および4.4E12 vg/kgの投与量でのAAV-sp7-GLA-co4の投与1ヶ月後のB6;129-GLA -/-マウスの腎臓組織におけるリゾ-GL3のレベルの減少を示す棒グラフであり、リゾ-GL3の投与量依存的な減少を示す。図９Ｃは、4.4E11 vg/kg、1.4E12 vg/kg、および4.4E12 vg/kgの用量でのAAV-sp7-GLA-co4の投与1ヶ月後のB6;129-GLA -/-マウスの心臓組織におけるリゾ-GL3のレベルの減少を示す棒グラフであり、lyso-GL3の投与量依存的な減少を示す。図１０Ａは、非ヒト霊長類（カニクイザル）におけるAAV-sp7-GLA-co4の注入後の経時的な血清GLA活性のグラフである。図１０Ｂは、非ヒト霊長類（カニクイザル）におけるAAV-sp7-GLA-co4の注入後の経時的な血清GLA抗原レベルのグラフである。図１１は、2E11 vg/kg（上三角形）、4E11 vg/kg（下三角形）または2E12 vg/kg（菱形）のAAV-sp7-GLA（「AAV-sp7.GLA」と表示される）の投与量にてIV注射した後のGLAノックアウト（B6;129-GLA -/-）マウスにおける、12週間の時間経過にわたって測定された血清GLA抗原レベルのグラフである。コントロールはビヒクルのみを注射した野生型マウス（丸）またはGLAノックアウトマウス（四角）であった（それぞれ、「WT+ビヒクル」および「GLAko」と表示される）。BQLは、定量限界未満を示す。図１２Ａは、2E11 vg/kg、4E11 vg/kgまたは2E12 vg/kgの投与量でのAAV-sp7-GLA（「AAV-sp7.GLA」と表示される）のIV注射の1か月後および3か月後に測定された、GLAノックアウト（B6;129-GLA -/-）マウスの腎臓におけるGL-3レベルの棒グラフである。コントロールは、野生型マウス（「GLA WT」と表示される）およびGLAノックアウトマウス（「GLA KO」と表示される）であった。各条件で、3か月目と1か月目のバーはそれぞれ左から右へ提示される。図１２Ｂは、2E11 vg/kg、4E11 vg/kgまたは2E12 vg/kgの投与量でのAAV-sp7-GLA（「AAV-sp7.GLA」と表示される）のIV注射の1か月後および3か月後に測定された、GLAノックアウト（B6;129-GLA -/-）マウスの腎臓におけるリゾ-GL-3レベルの棒グラフである。コントロールは、野生型マウス（「GLA WT」と表示される）およびGLAノックアウトマウス（「GLA KO」と表示される）であった。各条件で、3か月目と1か月目のバーはそれぞれ左から右へ提示される。図１２Ｃは、2E11 vg/kg、4E11 vg/kgまたは2E12 vg/kgの投与量でのAAV-sp7-GLA（「AAV-sp7.GLA」と表示される）のIV注射の1か月後および3か月後に測定された、GLAノックアウト（B6;129-GLA -/-）マウスの心臓におけるGL-3レベルの棒グラフである。コントロールは、野生型マウス（「GLA WT」と表示される）およびGLAノックアウトマウス（「GLA KO」と表示される）であった。各条件で、3か月目と1か月目のバーはそれぞれ左から右へ提示される。図１２Ｄは、2E11 vg/kg、4E11 vg/kgまたは2E12 vg/kgの投与量でのAAV-sp7-GLA（「AAV-sp7.GLA」と表示される）のIV注射の1か月後および3か月後に測定された、GLAノックアウト（B6;129-GLA -/-）マウスの心臓におけるリゾ-GL-3の棒グラフである。コントロールは、野生型マウス（「GLA WT」と表示される）およびGLAノックアウトマウス（「GLA KO」と表示される）であった。各条件で、3か月目と1か月目のバーはそれぞれ左から右へ提示される。

発明の詳細な説明

様々な刊行物、論文および特許は、背景技術および本明細書全体を通して引用または記載され、これらの参照の各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。本明細書に含まれる文献、行為、材料、装置、論文等の記述は、本発明の文脈を提供するためのものである。そのような記述は、これらの事項のいずれかまたは全てが、開示またはクレームされる発明に関する先行技術の一部を形成することを認めるものではない。

特に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般に理解されるものと同じ意味を有する。そうでない場合、本明細書に引用される特定の用語は、本明細書に記載される意味を有する。

本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「a」、「an」、および「the」は、文脈が明らかに別段の指示をしない限り、複数の参照を含むことに留意されたい。

本明細書および以下の特許請求の範囲を通して、文脈が特に必要としない限り、「含む（comprise）」という単語、ならびに「含む（comprises）」および「含む（comprising）」等の変形例は、記載された整数もしくはステップまたは整数もしくはステップのグループを含むが、任意の他の整数もしくはステップまたは整数もしくはステップのグループを除外しないことを意味すると理解される。本明細書で使用される場合、用語「含む（comprising）」は、用語「含む（containing）」もしくは「含む（including）」で、または場合により、用語「有する（having）」で置換され得る。

本明細書で使用される場合、「からなる（consisting of）」は、特許請求の範囲の要素に特定されていない任意の要素、ステップ、または成分を除外し、そのような要素、ステップ、または成分は、特許請求の範囲の発明に関連する。本明細書で使用される場合、「から本質的になる（consisting essentially of）」は、特許請求の範囲の基本的かつ新規な特徴に実質的に影響を及ぼさない材料またはステップを排除しない。本発明の態様または実施形態の文脈で、本明細書において使用される場合は常に、上述した「含む（containing）」、「含む（including）」、および「有する（having）」の語のいずれも、開示の範囲を変更するために、「からなる（consisting of）」または「から本質的になる（consisting essentially of）」という語に置き換えることができる。

本明細書で使用されるように、複数の列挙された要素の間の接続語「および／または」は、個々の選択肢および組み合わされた選択肢の両方を包含するものとして理解される。例えば、２つの要素が「および／または」によって結合される場合、第１の選択肢は、第２の要素を伴わない第１の要素の適用可能性を指す。第２の選択肢は、第１の要素を含まない第２の要素の適用可能性を指す。第３の選択肢は、第１および第２の要素を一緒に適用可能であることを指す。これらの選択肢のうちのいずれか１つは、その意味の範囲内にあると理解され、したがって、本明細書で使用される「および／または」という語の要件を満たす。２つ以上の選択肢の同時適用可能性もまた、その意味の範囲内にあると理解され、したがって、用語「および／または」の要件を満たす

本明細書に開示される特徴の全ては、任意の組み合わせで組み合わせることができる。本明細書に開示される各特徴は、同じ、同等、または類似の目的を果たす代替的な特徴によって置き換えることができる。

本明細書で使用される「約」という語は、基礎となるパラメータの10％以内の値（すなわち、±10％）を指す。例えば、「約1：10」は、1.1：10.1または0.9：9.9を意味し、約5時間は、4.5時間または5.5時間を意味する、等である。値の文字列の先頭の「約」という語は、値の各々を10％まで変更する。

全ての数値または数値範囲は、文脈上明らかに沿わないことが示されない限り、そのような範囲内の整数および範囲内の整数または値の分数を含む。したがって、例示すると、95％以上の減少という場合、95％、96％、97％、98％、99％、100％等、ならびに95.1％、95.2％、95.3％、95.4％、95.5％等、96.1％、96.2％、96.3％、96.4％、96.5％等を含む。したがって、また例示すると、「1～4」等の数値範囲という場合、2、3、ならびに1.1、1.2、1.3、1.4等を含む。例えば、「1～4週間」は、7日間、8日間、9日間、10日間、11日間、12日間、13日間、14日間、15日間、16日間、17日間、18日間、19日間、20日間、21日間、22日間、23日間、24日間、25日間、26日間、27日間、または28日間を含む。

さらに、「0.01～10」等の数値範囲という場合、0.011、0.012、0.013等、ならびに9.5、9.6、9.7、9.8、9.9等を含む。例えば、対象の体重当たり「約0.01～約10 mg/kg」の投与量は、0.011 mg/kg、0.012 mg/kg、0.013 mg/kg、0.014 mg/kg、0.015 mg/kg等、ならびに9.5 mg/kg、9.6 mg/kg、9.7 mg/kg、9.8 mg/kg、9.9 mg/kg等を含む。

より大きい（more）（より大きい（greater））またはより小さい整数への言及は、それぞれ、言及する数値より大きいまたは小さい任意の数を含む。したがって、例えば、2より大きいという場合、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15等を含む。例えば、非ウイルスベクターおよび／または免疫細胞モジュレーターの「2回以上」の投与は、3回、4回、5回、6回、7回、8回、9回、10回、11回、12回、13回、14回、15回、またはそれ以上の回数を含む。

さらに、「1～90」等の数値範囲への言及は、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5等、ならびに81、82、83、84、85等を含む。例えば、「約1分～約90日の間」は、1.1分、1.2分、1.3分、1.4分、1.5分等、ならびに1日、2日、3日、4日、5日、・・・、81日、82日、83日、84日、85日等を含む。

本出願の読者を助ける試みにおいて、説明は、種々の段落またはセクションに分離されているか、または本発明のある実施形態を対象とする。これらの分離は、段落またはセクションまたは実施形態の実質を別の段落またはセクションまたは実施形態の実質から切り離すものと見なすべきではない。反対に、当業者は、説明が広範な応用を有し、企図され得る様々なセクション、段落、およびセンテンスの全ての組合せを包含することを理解するだろう。任意の実施形態の議論は、例示的なものにすぎず、特許請求の範囲を含む本開示の範囲がこれらの実施例に限定されることを示唆することを意図しない。

本明細書に提供される説明は、GLAをコードする修飾核酸、GLAをコードする修飾核酸を含む発現カセット、GLAをコードする修飾核酸を含むウイルスベクター、およびGLAをコードする修飾核酸を含む非ウイルスベクターを含む。本発明はまた、GLAをコードする修飾核酸を含む組換えAAV粒子、GLAをコードする修飾核酸を含む非ウイルス粒子、GLAをコードする修飾核酸を含む医薬組成物、ファブリー病ならびにGLA欠損を特徴とする他のリソソーム蓄積症を治療する方法、およびファブリー病ならびにGLA欠損を特徴とする他のリソソーム蓄積症を治療するのに使用するための本明細書に提供される様々なコンストラクトを含む。

核酸
用語「核酸」および「ポリヌクレオチド」は、デオキシリボ核酸（DNA）およびリボ核酸（RNA）を含む、核酸、オリゴヌクレオチドの全ての形態を指すために本明細書において互換的に使用される。核酸を説明する際に、特定のポリヌクレオチドの配列または構造は、5'から3'方向に配列を提供する慣例に従って本明細書に記載することができる。

ある実施形態では、核酸は、ゲノムDNA、cDNA、アンチセンスDNA/RNA、プラスミドDNA、直鎖DNA、（ポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド）、染色体DNA、スプライシングされたまたはスプライシングされていないmRNA、rRNA、tRNAインヒビターDNAまたはRNA（RNAi、例えば、小分子もしくは小ヘアピン（sh）RNA、マイクロRNA（miRNA）、小分子もしくは低分子干渉（si）RNA、トランススプライシングRNA、またはアンチセンスRNA）、ロック核酸アナログ（LNA）、オリゴヌクレオチドDNA（ODN）一本鎖および二本鎖、免疫刺激配列（ISS）、リボスイッチならびにリボザイムを含む。

ある実施形態では、核酸は、天然に存在するポリヌクレオチド、合成ポリヌクレオチド、および意図的に修飾または改変されたポリヌクレオチドを含む。核酸は、一本鎖、二本鎖、または三本鎖、直鎖または環状であり得、任意の長さであり得る。

ある実施形態によると、ポリヌクレオチドは、一本鎖DNA（ssDNA）または二本鎖DNA（dsDNA）分子である。ある実施形態によれば、ポリヌクレオチドは、治療的使用のためのもの、例えば、治療的導入遺伝子をコードするssDNAまたはdsDNAである。ある実施形態によれば、dsDNA分子は、ミニサークル、ナノプラスミド、開放直鎖二本鎖DNAまたは閉鎖末端直鎖状二本鎖DNA（CELiD/ceDNA/doggybone DNA）である。ある実施形態によれば、ssDNA分子は、閉環DNAまたは開放直鎖DNAである。

「導入遺伝子」は、本明細書において、細胞または生物に導入されるための核酸、または導入された核酸を便利に指すために使用される。導入遺伝子には、GLAをコードする修飾核酸等のヘテロポリヌクレオチド配列等の任意の核酸、またはタンパク質もしくはペプチドをコードするヘテロ核酸、または核酸（例えばmiRNA等）が含まれる。導入遺伝子およびヘテロ核酸／ポリヌクレオチド配列という語は、本明細書において互換的に使用される。

本明細書で使用される場合、「α－ガラクトシダーゼＡ」または「GLA」または「α-gal A」は、GLAの任意の核酸またはタンパク質を指す。ある実施形態では、GLAをコードする核酸は、ヒトGLAタンパク質をコードする。イントロンおよびエクソンを含む、GLAの完全なDNA配列は、GenBankアクセッション番号X14448.1にて入手可能である。ヒトGLA酵素は、429個のアミノ酸からなり、GenBankアクセッション番号X14448.1およびU78027にて入手可能である。完全長429アミノ酸ヒトGLA酵素は、切断されて4つのN-グリコシル化コンセンサス配列を含む成熟398アミノ酸サブユニットをもたらす31残基シグナルペプチドを含む前駆体タンパク質である。文脈によって別途示されない限り、GLAという場合、完全長前駆体および成熟α－ガラクトシダーゼＡを含む。 GLAの例としては、天然に存在する任意のGLA、その成熟体および変異体が挙げられる。完全長前駆体GLA酵素の例は、配列番号：１２のアミノ酸配列を有する。成熟GLA酵素の例は、配列番号：１００のアミノ酸配列を有する。本明細書で使用される場合、「GLAをコードする核酸」とは、野生型GLAタンパク質の機能または活性の少なくとも一部を有するタンパク質をコードする組換え核酸分子を指す。このような核酸の例としては、GLAをコードする修飾核酸配列が挙げられる。

「変異タンパク質」という語は、タンパク質をコードする遺伝子に変異を有するタンパク質を含み、小胞体（ER）に通常存在する条件下でタンパク質が安定な立体構造を達成することができない結果となる。安定なコンフォメーションを達成できないことは、リソソームに輸送されるのではなく、分解される酵素の実質的な量をもたらす。このような変異は「コンフォメーション変異」と呼ばれることがある。このような変異には、ミスセンス変異、ならびにインフレームの小さな欠失および挿入が含まれるが、これらに限定されない。

ある実施形態では、用語「変異体GLA」は、ERに通常存在する条件下で酵素が安定なコンフォメーションを達成することができない結果となるGLAをコードする遺伝子に変異を有するGLAを含む。安定なコンフォメーションを達成できないことは、リソソームに輸送されるのではなく、分解される酵素の実質的な量をもたらす。

本明細書で使用される場合、用語「改変する」およびその文法的変形例は、核酸またはタンパク質がリファレンス配列または親配列から逸脱することを意味する。GLAをコードする修飾核酸は、リファレンス（例えば野生型）核酸または親核酸と比較して変化している。したがって、修飾核酸は、リファレンス核酸または親核酸と実質的に同じ、より大きい、またはより小さい活性または機能を有し得るが、リファレンス核酸または親核酸と少なくとも部分的な活性、機能、および／または配列同一性を保持する。修飾核酸は、改変体GLAまたは変異体GLAをコードするように遺伝的に修飾され得る。

「GLAをコードする修飾核酸」は、GLAをコードする親の非修飾核酸と比較してGLA核酸が改変を有することを意味する。改変の特定の例は、ヌクレオチド置換である。ヌクレオチド置換は、同じアミノ酸をコードするサイレント変異、または異なるアミノ酸をコードするミスセンス変異であり得る。ミスセンス変異は、保存的または非保存的変異であり得る。改変の他の例としては、例えば、トランケーションおよび挿入が挙げられる。修飾核酸はまた、野生型タンパク質またはコドン最適化されていない核酸と同じタンパク質をコードするコドン最適化核酸を含み得る。コドン最適化は、例えば、CpGジヌクレオチドを除去することを含む、より広い意味で使用され得る。

本明細書において「改変」という語は、GLAをコードする核酸に対するリファレンスの各例において現れる必要はない。

ある実施形態では、GLAをコードする修飾核酸について、GLAタンパク質は、野生型GLAタンパク質の機能または活性の少なくとも一部を保持する。GLAタンパク質の機能または活性には、α－ガラクトシダーゼＡ活性、糖脂質および糖タンパク質から末端αガラクトシル部分を加水分解するグリコシドヒドロラーゼ酵素が含まれる。したがって、GLAをコードする修飾核酸は、コードされたGLAがGLAのグリコシドヒドロラーゼ活性の所定の程度または態様を保持する限りにおいて改変された形態を含む。

本明細書に記載されるように、GLAをコードする修飾核酸は、リファレンス核酸または親核酸と比較して異なる特徴または特性を示し得る。例えば、修飾核酸は、本明細書に記載のGLAをコードするリファレンス核酸に対して100％の同一性を有する配列、ならびにGLAをコードするリファレンス核酸に対して100％未満の同一性を有する配列を含む。

用語「同一性」、「相同性」、およびその文法的変形例は、２つ以上の参照される実体が「整列された」配列である場合、それらが同じであることを意味する。したがって、例として、２つの核酸が同一である場合、それらは、少なくとも参照される領域または部分内で、同一の配列を有する。同一性は、配列の定義された範囲（領域またはドメイン）にわたり得る。

同一性の「範囲」または「領域」は、同じである２つ以上の参照される実体の一部を指す。したがって、２つのタンパク質または核酸配列が１つ以上の配列の範囲または領域にわたって同一である場合、それらは、その領域内で同一性を共有する。「整列された」配列は、リファレンス配列と比較して、欠失または付加された塩基またはアミノ酸（ギャップ）の補正をしばしば含む、複数のタンパク質（アミノ酸）または核酸配列を指す。

同一性は、配列の全長または一部に及び得る。ある実施形態では、同一性パーセントを共有する配列の長さは、2個、3個、4個、5個またはそれ以上の連続するアミノ酸または核酸、例えば、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個等の連続する核酸またはアミノ酸である。ある実施形態では、同一性を共有する配列の長さは、21個以上の連続するアミノ酸または核酸、例えば、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個、30個、31個、32個、33個、34個、35個、36個、37個、38個、39個、40個等の連続するアミノ酸または核酸である。さらなる実施形態では、同一性を共有する配列の長さは、41個以上の連続するアミノ酸または核酸、例えば、42個、43個、44個、45個、45個、47個、48個、49個、50個等の連続するアミノ酸または核酸である。なおさらなる実施形態では、同一性を共有する配列の長さは、50個以上の連続するアミノ酸または核酸、例えば、50～55個、55～60個、60～65個、65～70個、70～75個、75～80個、80～85個、85～90個、90～95個、95～100個、100～150個、150～200個、200～250個、250～300個、300～500個、500～1,000個等の連続するアミノ酸または核酸である。

本明細書に記載されるように、GLAをコードする修飾核酸は、GLAをコードするリファレンス核酸とは区別されるか、または100％の同一性または100％未満の同一性を示し得る。

ある実施形態によれば、GLAをコードする核酸は、（１）配列番号：１５の配列に対して75％以上の配列同一性、76％以上の配列同一性、77％以上の配列同一性、78％以上の配列同一性、79％以上の配列同一性、80％以上の配列同一性、81％以上の配列同一性、82％以上の配列同一性、83％以上の配列同一性、84％以上の配列同一性、85％以上の配列同一性、86％以上の配列同一性、87％以上の配列同一性、88％以上の配列同一性、89％以上の配列同一性、90％以上の配列同一性、91％以上の配列同一性、92％以上の配列同一性、93％以上の配列同一性、94％以上の配列同一性、95％以上の配列同一性、96％以上の配列同一性、97％以上の配列同一性、98％以上の配列同一性、99％以上の配列同一性、99.5％以上の配列同一性等、配列番号：１５の配列に対して少なくとも75％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；（２）配列番号：１６の配列に対して83％以上の配列同一性、84％以上の配列同一性、85％以上の配列同一性、86％以上の配列同一性、87％以上の配列同一性、88％以上の配列同一性、89％以上の配列同一性、90％以上の配列同一性、91％以上の配列同一性、92％以上の配列同一性、93％以上の配列同一性、94％以上の配列同一性、95％以上の配列同一性、96％以上の配列同一性、97％以上の配列同一性、98％以上の配列同一性、99％以上の配列同一性、99.5％以上の配列同一性等、配列番号：１６の配列に対して少なくとも83％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；（３）配列番号：１７の配列に対して85％以上の配列同一性、86％以上の配列同一性、87％以上の配列同一性、88％以上の配列同一性、89％以上の配列同一性、90％以上の配列同一性、91％以上の配列同一性、92％以上の配列同一性、93％以上の配列同一性、94％以上の配列同一性、95％以上の配列同一性、96％以上の配列同一性、97％以上の配列同一性、98％以上の配列同一性、99％以上の配列同一性、99.5％以上の配列同一性等、配列番号：１７の配列に対して少なくとも85％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；（４）配列番号：１８の配列に対して85％以上の配列同一性、86％以上の配列同一性、87％以上の配列同一性、88％以上の配列同一性、89％以上の配列同一性、90％以上の配列同一性、91％以上の配列同一性、92％以上の配列同一性、93％以上の配列同一性、94％以上の配列同一性、95％以上の配列同一性、96％以上の配列同一性、97％以上の配列同一性、98％以上の配列同一性、99％以上の配列同一性、99.5％以上の配列同一性等、配列番号：１８の配列に対して少なくとも85％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；および（５）配列番号：１６の配列に対して82％以上の配列同一性、83％以上の配列同一性、84％以上の配列同一性、85％以上の配列同一性、86％以上の配列同一性、87％以上の配列同一性、88％以上の配列同一性、89％以上の配列同一性、90％以上の配列同一性、91％以上の配列同一性、92％以上の配列同一性、93％以上の配列同一性、94％以上の配列同一性、95％以上の配列同一性、96％以上の配列同一性、97％以上の配列同一性、98％以上の配列同一性、99％以上の配列同一性、99.5％以上の配列同一性等、配列番号：１６の配列に対して少なくとも82％の配列同一性を有するポリヌクレオチドからなる群から選択される。ある実施形態によれば、GLAをコードする核酸は、配列番号：１５～１９の配列のいずれかに対して100％の配列同一性を有する。

ある実施形態では、GLAをコードする核酸は、GLAをコードする核酸内の任意の場所に位置する１以上のイントロンをさらに含む。ある実施形態では、イントロンは、GLAをコードする核酸のヌクレオチド７８～７９の間に位置し、このヌクレオチド位置は、配列番号：１４の配列を有するGLAのコード配列に関連して与えられる。

ある実施形態によれば、本発明の核酸は、配列番号：１００のアミノ酸配列を有するGLAをコードする。

ある実施形態では、GLAは、Gln57Lys、Gln111Glu、Lys213Glu、Lys237Gln、Phe248Thr、Gly334Glu、およびGly346Asnからなる群から選択される１つのアミノ酸置換を有する配列番号：１００のアミノ酸配列を含む。ある実施形態では、GLAは、Gln57Lys、Gln111Glu、Lys213Glu、Lys237Gln、Phe248Thr、Gly334Glu、およびGly346Asnからなる群から選択される任意の２つのアミノ酸置換を有する配列番号：１００のアミノ酸配列を含む。ある実施形態では、GLAは、Gln57Lys、Gln111Glu、Lys213Glu、Lys237Gln、Phe248Thr、Gly334Glu、およびGly346Asnからなる群から選択される任意の３つのアミノ酸置換を有する配列番号：１００のアミノ酸配列を含む。ある実施形態では、GLAは、Gln57Lys、Gln111Glu、Lys213Glu、Lys237Gln、Phe248Thr、Gly334Glu、およびGly346Asnからなる群から選択される任意の４つのアミノ酸置換を有する配列番号：１００のアミノ酸配列を含む。ある実施形態では、GLAは、Gln57Lys、Gln111Glu、Lys213Glu、Lys237Gln、Phe248Thr、Gly334Glu、およびGly346Asnからなる群から選択される任意の５つのアミノ酸置換を有する配列番号：１００のアミノ酸配列を含む。ある実施形態では、GLAは、Gln57Lys、Gln111Glu、Lys213Glu、Lys237Gln、Phe248Thr、Gly334Glu、およびGly346Asnからなる群から選択される任意の６つのアミノ酸置換を有する配列番号：１００のアミノ酸配列を含む。ある実施形態では、GLAは、Gln57Lys、Gln111Glu、Lys213Glu、Lys237Gln、Phe248Thr、Gly334Glu、およびGly346Asnの７つのアミノ酸置換を有する配列番号：１００のアミノ酸配列を含む。ある実施形態では、GLAは配列番号：４８のアミノ酸配列を含む。

リファレンス核酸または親核酸と比較して異なる特徴または特性を示すGLAをコードする修飾核酸は、ヌクレオチドの置換を含む。例えば、GLAをコードする修飾核酸は、CpG減少核酸と呼ばれる、GLAをコードするリファレンス核酸と比較してCpGジヌクレオチドの数が減少した核酸を含む。

本明細書で使用される場合、「CpGが減少した」または「CpGが枯渇した」という文言は、１以上のCpGジヌクレオチド（またはモチーフ）が核酸配列から除去されるように、合成的にまたは核酸配列の変異によって生成される核酸配列を指す。ある実施形態では、全てのCpGモチーフが除去されて、本明細書にて改変CpG非含有配列と称されるものが提供される。CpGモチーフは、コード配列（例えば導入遺伝子）だけでなく、例えば、5'非翻訳領域（UTR）および3'UTR、プロモーター、エンハンサー、シグナルペプチド、ポリA、ITR、イントロン、ならびにポリヌクレオチド分子中に存在する任意の他の配列を含む非コード配列においても、好適に低減または除去される。

ある実施形態によれば、GLAをコードする核酸は、13個、12個、11個、10個、9個、8個、7個、6個、5個、4個、3個、2個、1個、または0個のCpGジヌクレオチド等、14個未満のCpGジヌクレオチドを含む。

「から本質的になる」という文言は、特定のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を指す場合、所与の配列番号の配列の特性を有する配列を意味する。例えば、アミノ酸配列に関して使用される場合、この文言は、配列自体、および配列の基本的かつ新規な特性に影響を与えない分子改変を含む。

本発明のGLAをコードする修飾核酸を含む核酸、発現ベクター、AAVベクターゲノム、非ウイルスベクター、プラスミドは、組換えDNA技術手法を使用することによって調製され得る。ヌクレオチド配列情報の利用可能性は、種々の手段による本発明の単離された核酸分子の調製を可能にする。GLAをコードする核酸は、細胞発現またはin vitro翻訳および化学合成技術を介して、様々な標準的なクローニング、組換えDNA技術を用いて作製され得る。ポリヌクレオチドの純度は、シークエンシング、ゲル電気泳動等によって決定され得る。例えば、核酸は、ハイブリダイゼーションまたはコンピューターベースのデータベーススクリーニング技術を用いて単離され得る。そのような技術には、（１）相同ヌクレオチド配列を検出するためのプローブとのゲノムDNAまたはcDNAライブラリーのハイブリダイゼーション；（２）例えば発現ライブラリーを用いて、共有された構造的特徴を有するポリペプチドを検出するための抗体スクリーニング；（３）目的の核酸配列にアニーリング可能なプライマーを用いたゲノムDNAまたはcDNA上でのポリメラーゼ連鎖反応（PCR）；（４）関連配列についての配列データベースのコンピュータ検索；および（５）サブトラクションされた核酸ライブラリーのディファレンシャルスクリーニングが含まれるが、これらに限定されない。

核酸は、任意の好都合なクローニングベクターにおいてDNAとして維持され得る。ある実施形態では、クローンは、好適な大腸菌宿主細胞中で増殖されるpBluescript（Stratagene, La Jolla, CA）等のプラスミドクローニング／発現ベクター中に維持される。あるいは、核酸は、哺乳動物細胞における発現に好適なベクター、例えばAAVベクター中に維持され得る。翻訳後修飾がタンパク質機能に影響を及ぼす場合では、核酸分子を哺乳動物細胞において発現させることができる。

発現カセット
本発明はまた、発現制御エレメントに作動可能に連結された、本明細書に記載されるGLAをコードする核酸を含むポリヌクレオチドを含む発現カセットを提供する。ある態様において、発現カセットは、GLAをコードする核酸を含み、この核酸は、（１）配列番号：１５の配列に対して少なくとも75％の配列同一性（例えば、75％～100％の同一性）を有するポリヌクレオチド、（２）配列番号：１６の配列に対して少なくとも84％の配列同一性（例えば、84％～100％の同一性）を有するポリヌクレオチド、（３）配列番号：１７の配列に対して少なくとも86％の配列同一性（例えば、86％～100％の同一性）を有するポリヌクレオチド、（４）配列番号：１８の配列に対して少なくとも86％の配列同一性（例えば、86％～100％の同一性）を有するポリヌクレオチド、および（５）配列番号：１９の配列に対して少なくとも83％の配列同一性（例えば、83％～100％の同一性）を有するポリヌクレオチドからなる群から選択される。

ある実施形態では、GLAは、配列番号：１００のアミノ酸配列を含む。

ある実施形態では、発現カセットは、本発明のポリヌクレオチド分子によってコードされるポリペプチドの分泌を可能にする適切な分泌シグナル配列またはシグナルペプチドを含む。本明細書で使用される場合、用語「分泌シグナル配列」または「シグナルペプチド」またはその変形例は、天然ポリペプチドで見られる分泌レベルと比較して、作動可能に連結されたポリペプチドの細胞からの分泌を増強するように機能するアミノ酸配列を指すことが意図される。シグナルペプチドは、タンパク質を小胞体分泌経路に、または小胞体分泌経路を介して誘導する、典型的には20アミノ酸長未満の短いアミノ酸配列である。「増強された」分泌とは、細胞から分泌される、細胞によって合成されるポリペプチドの相対的割合が増加することを意味し、分泌されるタンパク質の絶対量も増加することは必要とはされない。ある実施形態では、ポリペプチドの本質的に全て（すなわち、少なくとも95％、97％、98％、99％またはそれ以上）が分泌される。しかし、分泌レベルが天然のポリペプチドと比較して増強される限り、ポリペプチドの本質的に全てまたは大部分が分泌されることは必須ではない。一般に、分泌シグナル配列は小胞体内で切断され、ある実施形態では、分泌シグナル配列は分泌前に切断される。しかし、細胞からのポリペプチドの分泌が増強され、かつポリペプチドが機能的である限り、分泌シグナル配列が切断されることは必須ではない。したがって、ある実施形態では、分泌シグナル配列は、部分的にまたは完全に保持される。分泌シグナル配列は、分泌ポリペプチドの分泌シグナルから（すなわち前駆体から）全体的もしくは部分的に誘導され得るものであり、かつ／または全体的もしくは部分的に合成され得る。分泌シグナル配列の長さは重要ではなく、一般に、公知の分泌シグナル配列は、約10～15アミノ酸長から50～60アミノ酸長である。さらに、分泌されたポリペプチドからの公知の分泌シグナルは、得られる分泌シグナル配列が作動可能に連結されたポリペプチドの分泌を増強するように機能する限り、変更または改変（例えば、アミノ酸の置換、欠失、切断または挿入によって）され得る。本発明の分泌シグナル配列は、天然に存在する分泌シグナル配列またはその改変体を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなるものであり得る。細胞からの分泌を指令する多数の分泌タンパク質および配列は、当技術分野で公知である。本発明の分泌シグナル配列はさらに、全体的または部分的に合成または人工であり得る。合成または人工の分泌シグナルペプチドは、当技術分野で公知であり、例えば、Barash et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 294:835-42 (2002).を参照することができる。

本開示に照らして、当業者に公知の任意の好適なシグナルペプチドを本発明において使用することができる。シグナルペプチドの例としては、シグナルペプチドデータベース（www.signalpeptide.de/）から見出されるものが挙げられるが、これらに限定されない。本発明に好適なシグナルペプチドの例としては、野生型GLAシグナルペプチド、ヒトキモトリプシノーゲンB2シグナルペプチド（「sp7」；NCBIリファレンス配列NP_001020371の18アミノ酸シグナルペプチド）、α2-HS-糖タンパク質（AHSG）シグナルペプチド、CD300シグナルペプチド、リソソーム関連膜糖タンパク質1（LAMP1）シグナルペプチド、Notch 2シグナルペプチド、オロソムコイド1（ORM1）シグナルペプチド、トランスフェリン（TF）シグナルペプチド、セクレコン（secrecon）（Barash et al., Biochem Biophys Res Commun. 2002;294: 835-842に記載される人工シグナル配列）、マウスIgKVIII、ヒトIgKVIII、CD33、tPA、a-1アンチトリプシンシグナルペプチド、および天然の分泌型アルカリホスファターゼ（SEAP）が挙げられるが、これらに限定されない。上記のシグナルペプチドの変異体を含む、小胞体分泌経路を介してタンパク質を誘導する任意の従来のシグナル配列を本発明において使用することができる。

ある実施形態では、シグナルペプチドは、内因性または天然のGLAシグナルペプチドまたはその変異体である。

ある実施形態では、シグナルペプチドは、ヘテロシグナルペプチドまたはその変異体である。

ある実施形態では、シグナルペプチドは、配列番号：１～１１および１３のいずれかのコード配列を有する。

ある実施形態では、シグナルペプチドは、配列番号：４１および５７～６３のいずれかのアミノ酸配列を有する。

ある実施形態では、発現カセットは、GLAをコードする核酸の5'末端に位置するシグナルペプチド配列をコードする核酸を含む。ある実施形態では、シグナルペプチドは、ヒトキモトリプシノーゲンB2シグナルペプチドである。ある実施形態では、シグナルペプチドは、配列番号：４１のアミノ酸配列を有するヒトキモトリプシノーゲンB2シグナルペプチドである。ある実施形態では、シグナルペプチドは、配列番号：１～５のいずれかのコード配列を有するヒトキモトリプシノーゲンB2シグナルペプチドである。

ある実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号：１０１～１０９のいずれかの配列を有するGLAをコードする。

ある実施形態では、発現制御エレメントは、GLAをコードする核酸の5'に位置する。

「発現カセット」という語は、本明細書で使用される場合、本発明のポリヌクレオチド分子の発現に十分な核酸エレメントを含む核酸コンストラクトを指す。典型的には、発現カセットは、プロモーター配列に作動可能に連結された本発明のポリヌクレオチド分子を含む。

「発現制御エレメント」は、作動可能に連結された核酸の発現に影響を及ぼす核酸配列を指す。本明細書に記載の発現制御エレメントには、プロモーターおよびエンハンサーが含まれる。AAVベクターおよび非ウイルスベクターを含むベクター配列は、１以上の「発現制御エレメント」を含み得る。典型的には、このようなエレメントは、適切なヘテロポリヌクレオチド転写および適切な翻訳（例えば、プロモーター、エンハンサー、イントロンのスプライシングシグナル、mRNAのインフレーム翻訳を可能にする遺伝子の正確なリーディングフレームの維持、および終止コドン等）を容易にするために含まれる。このようなエレメントは、典型的には、「シス作用」エレメントと称され、シスに作用するが、トランスにも作用し得る。

発現制御は、転写、翻訳、スプライシング、メッセージ安定性等のレベルで影響され得る。典型的には、転写を調節する発現制御エレメントは、転写された核酸の5'末端（すなわち「上流」）付近に並置される。発現制御エレメントはまた、転写された配列の3'末端（すなわち「下流」）または転写物内（例えばイントロン内）に位置し得る。発現制御エレメントは、転写された配列に隣接して、または転写された配列から離れた距離（例えば、ポリヌクレオチドから1～10個、10～25個、25～50個、50～100個、100～500個、またはそれ以上のヌクレオチド）に、かなりの距離であっても、位置し得る。それにもかかわらず、AAVベクターの長さの制限のために、AAVベクター中の発現制御エレメントは、典型的には、ヘテロ核酸の転写開始部位から1～1000ヌクレオチド以内である。

機能的には、作動可能に連結された核酸の発現は、エレメント（例えばプロモーター）によって少なくとも部分的に制御可能であり、その結果、エレメントは、核酸の転写、および必要に応じて、転写物の翻訳を調節する。発現制御エレメントの具体例は、通常、転写された核酸配列の5'に位置するプロモーターである。プロモーターは、典型的には、プロモーターが存在しない場合に発現される量と比較して、作動可能に連結された核酸から発現される量を増加させる。

「作動可能に連結される」という語は、核酸配列の発現に必須の調節配列が、核酸配列の発現を媒介するように、配列に対して適切な位置に配置されることを意味する。この同じ定義は、発現ベクター、例えば、rAAVベクターまたは非ウイルスベクターにおける核酸配列および転写制御エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー、および終結エレメント）の配置に適用されることがある。コード配列は、センスまたはアンチセンスの向きで調節配列に作動可能に連結し得る。ある実施形態では、プロモーターは、ヘテロプロモーターである。

「ヘテロプロモーター」という語は、本明細書で使用される場合、天然の所与のコード配列に作動可能に連結されることが見出されないプロモーターを指す。ある実施形態では、発現カセットは、さらなるエレメント、例えば、イントロン、エンハンサー、ポリアデニル化部位、ウッドチャック応答要素（WRE）、および／またはコード配列の発現レベルに影響を及ぼすことが知られている他のエレメントを含み得る。

本明細書で使用される場合、「プロモーター」という語は、コード配列または機能的RNAの発現を制御することができるヌクレオチド配列を指す。一般に、本発明の核酸分子は、プロモーター配列の3'に位置する。ある実施形態では、プロモーター配列は、近位およびより遠位の上流エレメントからなり、エンハンサーエレメントを含み得る。

本明細書で使用される「エンハンサー」は、ヘテロ核酸に隣接して位置する配列を指し得る。エンハンサーエレメントは、典型的には、プロモーターエレメントの上流に位置するが、機能することもあり、配列の下流または配列内に位置し得る。したがって、エンハンサーエレメントは、ヘテロ核酸配列の10～50塩基対、50～100塩基対、100～200塩基対、もしくは200～300塩基対、またはそれ以上の塩基対、上流または下流に位置し得る。エンハンサーエレメントは、典型的には、プロモーターエレメントによって与えられる作動可能に連結された核酸の発現を増加させる。

発現コンストラクトは、特定の細胞または組織型における発現を駆動する働きをする制御エレメントを含み得る。発現制御エレメント（例えばプロモーター）は、本明細書において「組織特異的発現制御エレメント／プロモーター」と称される、特定の組織または細胞型において活性であるものを含む。組織特異的発現制御エレメントは、典型的には、特定の細胞または組織（例えば肝臓）において活性である。発現制御エレメントは、典型的には、特定の細胞、組織、または器官タのイプに特有である、転写活性化タンパク質、または転写の他の調節剤によって認識されるため、特定の細胞、組織、または器官において活性である。このような制御エレメントは、当業者に公知である（例えば、Green, M. and Sambrook, J. (2012） Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 4th Edition, Vol. II, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York；およびAusubel et al. (2010) Current protocols in molecular biology, John Wiley & Sons, New Yorkを参照）。

発現コンストラクトにおける組織特異的制御エレメントの組み込みは、タンパク質または阻害性RNAをコードするヘテロ核酸の発現のための少なくとも部分的な組織指向性を提供する。肝臓において活性であるプロモーターの例は、トランスサイレチン（TTR）遺伝子プロモーター；ヒトα1-アンチトリプシン（hAAT）プロモーター；アポリポタンパク質A-Iプロモーター；アルブミン、Miyatake, et al., J. Virol., 71:5124-32 (1997)；B型肝炎ウイルスコアプロモーター、Sandig, et al., Gene Ther. 3: 1002-9 (1996)；αフェトプロテイン（AFP）, Arbuthnot, et al., Hum. Gene. Ther., 7:1503-14(1996)；ヒト第IX因子プロモーター；チロキシン結合グロブリン（TBG）プロモーター；TTR最小エンハンサー/プロモーター；α抗トリプシンプロモーター；LSP（845 nt）（イントロンレスscAAVを必要とする）；およびLSP1プロモーター等である。肝臓において活性なエンハンサーの例は、アポリポタンパク質E（apoE）HCR-lおよびHCR-2である（Allan et al., J. Biol. Chem., 272:29113-19(1997)）。

発現制御エレメントはまた、多くの異なる細胞型においてポリヌクレオチドの発現を駆動することができる、ユビキタスまたは無差別のプロモーター／エンハンサーを含む。そのようなエレメントとしては、サイトメガロウイルス（CMV）前初期プロモーター／エンハンサー配列、ラウス肉腫ウイルス（RSV）プロモーター／エンハンサー配列、および様々な哺乳動物細胞型において活性な他のウイルスプロモーター／エンハンサー、または天然には存在しない合成エレメント（例えば、Boshart et al., Cell, 41:521-530 (1985)を参照）、SV40プロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーター、細胞質b-アクチンプロモーターおよびホスホグリセリン酸キナーゼ（PGK）プロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。

発現制御エレメントはまた、調節可能な様式で発現を付与することができ、すなわち、シグナルまたは刺激は、作動可能に連結されたヘテロポリヌクレオチドの発現を増加または減少させる。シグナルまたは刺激に応答して、作動可能に連結されたポリヌクレオチドの発現を増加させる調節可能なエレメントは、「誘導性エレメント」とも呼ばれる（すなわち、シグナルによって誘導される）。特定の例としては、ホルモン（例えばステロイド）誘導性プロモーターが挙げられるが、これに限定されない。典型的には、そのようなエレメントによって付与される増加または減少の量は、存在するシグナルまたは刺激の量に比例し、シグナルまたは刺激の量が多い程、発現の増加または減少が大きくなる。特定の非限定的な例としては、亜鉛誘導性ヒツジメタロチオニン（MT）プロモーター;ステロイドホルモン誘導性マウス乳癌ウイルス（MMTV）プロモーター；T7ポリメラーゼプロモーター系（WO 98/10088）；テトラサイクリン抑制系（Gossen, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:5547-5551 (1992））；テトラサイクリン誘導系（Gossen, et al., Science. 268: 1766-1769 (1995);Harvey, et al., Curr. Opin. Chem. Biol. 2:512-518 (1998)を参照）;およびラパマイシン誘導系（Magari, et al., J. Clin. Invest. 100:2865-2872 (1997)；Rivera, et al., Nat. Medicine. 2:1028-1032 (1996)）。この文脈において有用であり得る他の調節可能な制御エレメントは、特定の生理学的状態、例えば、温度、急性期、発達によって調節されるものである。

プロモーターの他の例には、ホスホグリセリン酸キナーゼ（PKG）プロモーター、CAG（CMVエンハンサー、ニワトリβアクチンプロモーター（CBA）およびウサギβグロビンイントロンの混合物）および他の構成的プロモーター、NSE（ニューロン特異的エノラーゼ）、シナプシンまたはNeuNプロモーター、SV40初期プロモーター、マウス乳房腫瘍ウイルスLTRプロモーター;アデノウイルス主要後期プロモーター（Ad MLP）；単純ヘルペスウイルス（HSV）プロモーター、SFFVプロモーター、ラウス肉腫ウイルス（RSV）プロモーター、ラットインスリンプロモーター、TBGプロモーターおよび他の肝臓特異的プロモーター、デスミンプロモーターおよび類似の筋特異的プロモーター、EF1-αプロモーター、合成プロモーター、ハイブリッドプロモーター、多組織特異性を有するプロモーター等が含まれるが、これらには限定されず、これらの全ては当業者に周知かつ容易に入手可能なプロモーターである。他のプロモーターは、ヒト起源のものであっても、マウスを含む他の種由来のものであってもよい。

発現制御エレメントには、ヘテロポリヌクレオチドの天然エレメントも含まれる。天然制御エレメント（例えばプロモーター）は、ヘテロポリヌクレオチドの発現が天然発現を模倣すべきであることが望まれる場合、使用され得る。天然エレメントは、ヘテロポリヌクレオチドの発現が一時的もしくは発達的に、または組織特異的な様式で、または特定の転写刺激に応答して調節される場合に使用され得る。イントロン、ポリアデニル化部位またはKozakコンセンサス配列等の他の天然発現制御エレメントも使用され得る。

核酸と作動可能に結合している発現制御エレメントの例において、この関係は、制御エレメントが核酸の発現を調節するようなものである。より具体的には、例えば、作動可能に連結されている２つのDNA配列は、２つのDNA配列（シスまたはトランス）が、DNA配列のうちの少なくとも１つが、他の配列に生理学的作用を及ぼすことができるような関係で配列することを意味する。

したがって、ベクターのための追加のエレメントとしては、発現制御（例えば、プロモーター/エンハンサー）エレメント、転写終結シグナルもしくは終止コドン、AAV ITR配列の１以上のコピー等の、配列に隣接する5'非翻訳領域もしくは3'非翻訳領域（例えばポリアデニル化（ポリA）配列）、またはイントロンが挙げられるが、限定されない。

さらなるエレメントとしては、例えば、フィラーポリヌクレオチド配列またはスタッファーポリヌクレオチド配列が挙げられ、例えば、パッケージングを改善し、混入核酸の存在を低減する。AAVベクターは、典型的には、一般に約4kb～約5.2kb、またはそれよりわずかに大きいサイズ範囲を有するDNAのインサートを許容する。したがって、より短い配列については、AAVベクターをウイルス粒子にパッケージングするのに許容されるウイルスゲノム配列の通常のサイズに近い、またはそのサイズで長さを調節するために、フィラーまたはスタッファーを含める。ある実施形態では、フィラー／スタッファー核酸配列は、核酸の非翻訳（非タンパク質コード）セグメントである。4.7kb未満の核酸配列については、フィラーまたはスタッファーポリヌクレオチド配列は、配列と組み合わされた（例えば、ベクターに挿入された）場合に、約3.0～5.5kb、または約4.0～5.0kb、または約4.3～4.8kbの全長を有する長さを有する。

ある実施形態では、発現制御エレメントは、GLAをコードする核酸の5'に位置するApoE/hAATエンハンサー/プロモーター配列を含む。ある実施形態では、ApoE/hAATエンハンサー/プロモーター配列は、野生型ApoE/hAATエンハンサー/プロモーター配列と比較してCpGが減少したものである。ある実施形態では、ApoE/hAATエンハンサー/プロモーター配列は、配列番号：３８の配列を有する。

ある実施形態では、発現カセットは、GLAをコードする核酸の3'に位置するポリアデニル化（ポリA）配列を含む。ある実施形態では、ポリA配列は、ウシ成長ホルモン（bGH）ポリアデニル化配列を含む。ある実施形態では、bGHポリアデニル化配列は、野生型bGHポリアデニル化配列と比較してCpGが減少したものである。ある実施形態では、bGHポリアデニル化配列は、配列番号：２０の配列を有する。

ある実施形態では、発現カセットは、発現制御エレメントの3'末端とGLAをコードする核酸の5'末端との間に位置するイントロンをさらに含む。ある実施形態では、イントロンは、hBB2m1イントロンである。ある実施形態では、hBB2m1イントロン配列は、野生型hBB2m1イントロン配列と比較してCpGが減少したものである。ある実施形態では、hBB2m1イントロン配列は、配列番号：３９の配列を有する。

ある実施形態では、発現カセットは、GLAをコードする核酸内の任意の場所に配置された１以上のイントロンをさらに含む。ある実施形態では、イントロンは、MAG/Gのコンセンサスヌクレオチド配列にマッチするGLAをコードする核酸内の部位に位置し、ここで、Mはアデニンまたはシトシンであり、「/」はイントロン挿入の部位を示す。ある実施形態では、イントロンは、GLAをコードする核酸のヌクレオチド７８～７９の間に位置し、ヌクレオチド位置は、配列番号：１４の配列を有するGLAのコード配列に関連して与えられる。本開示に照らして、当業者に公知の任意の好適なイントロンを本発明において使用することができる。好適なイントロンの例としては、ビトロネクチン1（VTN1）遺伝子、レチノール結合タンパク質4（RBP4）遺伝子、マウスIgG重鎖A（IgHA）遺伝子、およびマウスIgG重鎖μ（IgHμ遺伝子）からのイントロンが挙げられるが、これらに限定されない。ある実施形態では、１以上のイントロンは、配列番号：４９～５２のいずれかの配列から選択される。

ある実施形態では、発現カセットは、配列番号：２１～３４、５３～５６、および９１～９９のいずれかの配列を有する。ある実施形態では、発現カセットは、配列番号：２１～３４、５３～５６および９１～９９のいずれかの配列に対して、少なくとも75％の配列同一性、少なくとも80％の配列同一性、少なくとも85％の配列同一性、少なくとも90％の配列同一性、少なくとも95％の配列同一性、少なくとも96％の配列同一性、少なくとも97％の配列同一性、少なくとも98％の配列同一性、少なくとも99％の配列同一性、少なくとも99.5％の配列同一性、または100％の配列同一性の配列を有する。

遺伝子導入システム
ウイルスベクター
本発明は、本明細書に記載のGLAをコードする核酸を含むポリヌクレオチドを含むアデノ随伴ウイルス（AAV）ベクター等のウイルスベクターをさらに提供する。

本明細書で使用される「ベクター」または「遺伝子導入ベクター」という語は、目的の遺伝子を含む核酸分子を指す。ベクターの例としては、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、およびレンチウイルス粒子もしくはウイルス様粒子（VLP）等のウイルス粒子またはウイルス粒子に類似するが非感染性であるVLPによって送達されるウイルスベクター；ならびにマイクロインジェクション、エレクトロポレーション、リポソーム、高分子天然ポリマー、高分子合成ポリマー、および天然成分および合成成分の両方から構成されるポリマー等の非ウイルス遺伝子導入システムによって送達される非ウイルスベクターが挙げられるが、これらに限定されない。

ベクター核酸配列は、一般に、細胞中での増殖のための少なくとも複製起点、および任意に、ヘテロポリヌクレオチド配列、発現制御エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー）、イントロン、逆方向末端反復（ITR）、選択マーカー（例えば抗生物質耐性）、ポリアデニル化シグナル等のさらなる要素を含む。

本明細書中で使用される場合、「送達システム」という語は、核酸配列を含む組成物を細胞または組織に送達する任意の手段を指す。例えば、遺伝子導入システムは、所望の細胞または組織へのウイルスベクターの送達を容易にするためのウイルス遺伝子導入システム、例えば、インタクトウイルス、改変ウイルスおよびVLPであり得る。遺伝子導入システムはまた、ウイルスコートタンパク質を含まないか、またはウイルス粒子もしくはVLPを形成しない非ウイルス送達システム、例えば、リポソーム系システム、ポリマー系システム、タンパク質系システム、金属粒子系システム、ペプチドケージシステム等であり得る。

ウイルスベクターは、ウイルスゲノムを含む１以上の核酸エレメントに由来するか、またはそれに基づく。特定のウイルスベクターには、レンチウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターが含まれる。

組換えAAV（rAAV）ベクター等のベクターの改変体としての「組換え」という語、ならびに組換えポリヌクレオチドおよびポリペプチド等の配列の改変体は、組成物が、一般に自然界には存在しない様式で操作されている（すなわち改変されている）ことを意味する。「組換え」という語は、本明細書では必ずしもAAVベクター、ならびにポリヌクレオチド等の配列に関連して使用されないが、ポリヌクレオチドを含む組換え形態はそのような省略にもかかわらず、明示的に含まれる。

分子法を用いてAAVゲノムから野生型ゲノムを除去し、ヘテロ核酸と称される非天然核酸配列で置き換えることによって、「組換えAAVベクター」または「rAAV」は、AAVの野生型ゲノムに由来する。典型的には、AAVについては、AAVゲノムの一方または両方の逆方向末端反復（ITR）配列は、AAVベクター中に保持される。rAAVは、AAVゲノムの全部または一部がAAVゲノム核酸に関して非天然配列で置換されているため、AAVゲノムと区別される。したがって、非天然配列の組み込みは、AAVベクターを「組換え」ベクターと定義し、これを「rAAVベクター」と呼ぶことができる。

rAAV配列は、細胞のその後の感染（形質導入）のために、ex vivo、in vitroまたはin vivoでパッケージングすることができ、本明細書では「粒子」と呼ばれる。組換えAAVベクター配列がAAV粒子中にカプシド化またはパッケージ化される場合、その粒子は「rAAVベクター」または「rAAV粒子」とも称され得る。そのようなrAAV粒子は、ベクターゲノムをカプシド化またはパッケージ化するタンパク質を含み、AAVの場合、それらはカプシドタンパク質と称される。

ベクター「ゲノム」は、ウイルス（例えばrAAV）粒子を形成するために最終的にパッケージングまたはカプシド化される組換えプラスミド配列の一部を指す。組換えプラスミドが組換えベクターを構築または製造するために使用される場合、ベクターゲノムは、組換えプラスミドのベクターゲノム配列に対応しない「プラスミド」の部分を含まない。組換えプラスミドのこの非ベクターゲノム部分は、プラスミドのクローニングおよび増幅、増殖および組換えウイルス産生に必要とされるプロセスに重要である「プラスミド骨格」ということができる。可能な3' ITRおよび／または5' ITRクローニング残余物を除いて、プラスミド骨格自体は、ウイルス（例えばAAV）粒子にパッケージングまたはカプシド化されない。したがって、ベクター「ゲノム」は、ウイルス（例えばAAV）によってパッケージングまたはカプシド化されたポリヌクレオチドを指す。

組換えAAV粒子を産生するための宿主細胞としては、ヘテロrAAVベクターのレシピエントとして使用され得るか、または使用されている微生物、酵母細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞が挙げられるが、これらに限定されない。安定なヒト細胞株、HEK293（例えば、アクセッション番号ATCC CRL1573の下、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションから容易に入手可能）由来の細胞を使用することができる。ある実施形態では、アデノウイルス5型DNA断片で形質転換され、アデノウイルスE1aおよびE1b遺伝子を発現する改変ヒト胎児腎臓細胞株（例えばHEK293）を使用して、組換えAAV粒子を生成する。改変されたHEK293細胞株は、容易にトランスフェクトされ、rAAV粒子を産生するための特に好都合なプラットフォームを提供する。組換えAAV製造に適した他の宿主細胞株は、国際出願PCT/2017/024951に記載されており、その開示はその全体が本明細書に組み込まれる。

ある実施形態では、AAVヘルパー機能は、AAV発現ベクターのトランスフェクションの前に、またはそれと同時に、AAVヘルパーコンストラクトで宿主細胞をトランスフェクトすることによって、宿主細胞に導入される。AAVヘルパー機能を有する宿主細胞は、「ヘルパー細胞」または「パッケージングヘルパー細胞」ということができる。したがって、AAVヘルパーコンストラクトは、生産的AAV形質導入に必要な欠損AAV機能を補完するために、AAV repおよび／またはcap遺伝子の少なくとも一過性の発現を提供するために使用されることがある。AAVヘルパーコンストラクトは、しばしばAAV ITRを欠き、それ自体を複製もパッケージングもできない。これらのコンストラクトは、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、ウイルス、またはビリオンの形成であり得る。RepおよびCap発現コンストラクトの両方をコードする、一般的に使用されるプラスミドpAAV/AdおよびpIM29+45等の多くのAAVヘルパーコンストラクトが記載される。Repおよび／またはCap発現生成物をコードする多くの他のベクターが知られている。

哺乳動物細胞に形質導入することができる組換えAAV粒子を作製する方法は、当技術分野で公知である。例えば、組換えAAV粒子は、米国特許第9,408,904号；ならびに国際出願PCT/US2017/025396号およびPCT/US2016/064414号に記載されるように産生することができ、それらの開示はその全体が本明細書に組み込まれる。

本発明は、GLAをコードする核酸を含む細胞、GLAをコードする核酸を含むポリヌクレオチドを含む発現カセットを含む細胞、GLAをコードする核酸を含むAAVベクター等のウイルスベクターを含む細胞、およびGLAをコードする核酸を含むポリヌクレオチドを含む非ウイルスベクターを含む細胞を提供する。ある実施形態では、細胞はウイルスベクターを産生する。ある実施形態では、細胞は本明細書に記載のAAVベクターを産生する。

本明細書に記載のAAVベクター等のウイルスベクターを産生する方法もまた提供される。ある実施形態では、AAVベクターを産生する方法は、本明細書に記載のGLAをコードする核酸を含むAAVベクターゲノム、または本明細書に記載のGLAをコードする核酸を含む発現カセットをパッケージングヘルパー細胞に導入すること；ならびにAAVベクターを産生するための条件下でヘルパー細胞を培養することを含む。ある実施形態では、AAVベクターを産生する方法は、GLAをコードする核酸、または本明細書に記載のGLAをコードする核酸を含む発現カセットをパッケージングヘルパー細胞に導入すること；およびAAVベクターを産生するための条件下でヘルパー細胞を培養することを含む。

ある実施形態では、細胞は哺乳動物細胞である。

ある施形態では、ベクター産生のための細胞は、ベクターをウイルス粒子にパッケージングするAAVヘルパー機能等のヘルパー機能を提供する。ある態様では、ヘルパー機能は、AAVベクターパッケージングのためのRepおよび／またはCapタンパク質である。ある実施形態では、ベクター産生のための細胞は、Repおよび／またはCapタンパク質配列をコードするポリヌクレオチドで安定にまたは一時的にトランスフェクトされ得る。ある実施形態では、ベクター産生のための細胞は、Rep78および／またはRep68タンパク質を提供する。そのような細胞において、細胞は、配列をコードするRep78および／またはRep68タンパク質ポリヌクレオチドで安定にまたは一過的にトランスフェクトされ得る。

ある実施形態では、ベクター産生のための細胞は、ヒト胚性腎細胞である。ある態様において、ベクター産生のための細胞は、HEK-293細胞である。

用語「形質導入する」およびその文法的変形例は、rAAVベクター等の分子を細胞または宿主生物に導入することを指す。ヘテロ核酸／導入遺伝子は、レシピエント細胞のゲノム核酸に組み込まれても組み込まれなくてもよい。導入されたヘテロ核酸はまた、染色体外で、または一時的にのみ、レシピエント細胞または宿主生物中に存在し得る。

「形質導入された細胞」とは、導入遺伝子が導入された細胞である。したがって、「形質導入された」細胞（例えば、細胞または組織または臓器細胞等の哺乳動物における）は、例えば、核酸（例えば導入遺伝子）の細胞への組み込み後の細胞における遺伝的変化を意味する。したがって、「形質導入された」細胞は、外因性核酸が導入された細胞、またはその子孫である。細胞は、増殖され、導入されたタンパク質を発現させ得る。遺伝子治療の使用および方法のために、形質導入された細胞は、対象中に存在し得る。

「単離される」という語は、組成物の修飾語として使用される場合、組成物がヒトの手によって作製されるか、またはそれらの天然に存在するin vivo環境から完全にもしくは少なくとも部分的に分離されることを意味する。一般に、単離された組成物は、それらが天然で通常会合する１以上の材料、例えば、１以上のタンパク質、核酸、脂質、炭水化物、または細胞膜を実質的に含まない。

「単離される」という語は、AAVベクターゲノムおよび医薬製剤をパッケージングまたはカプシド化する、ヒトの手によって産生される組み合わせ、例えば、rAAV配列、またはrAAV粒子を除外しない。「単離される」という語はまた、ハイブリッド/キメラ、多量体/オリゴマー、改変体（例えば、リン酸化体、グリコシル化体、脂質化体）もしくは誘導体化された形態、またはヒトの手によって産生される宿主細胞において発現される形態等の、組成物の代替的な物理的形態を排除しない。

「実質的に純粋な」という語は、少なくとも50～60重量％の目的の化合物（例えば、核酸、オリゴヌクレオチド、タンパク質等）を含む調製物を指す。調製物は、少なくとも75重量％、または少なくとも85重量％、または約90～99重量％の目的の化合物を含み得る。純度は、目的の化合物に適した方法（例えば、クロマトグラフィー法、アガロースまたはポリアクリルアミドゲル電気泳動、HPLC分析等）によって測定される。

組換えAAVベクター、ならびにその方法および使用は、任意のウイルス株または血清型を含む。非限定的な例として、組換えAAVベクターは、例えば、LK03、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV 12、Rh10、Rh74、AAV3BまたはAAV-2i8等の任意のAAVゲノムに基づくものであり得る。そのようなベクターは、同じ株もしくは血清型（またはサブグループもしくは変異体）に基づくか、または互いに異なっていてもよい。非限定的な例として、特定の血清型ゲノムに基づく組換えAAVベクターは、ベクターをパッケージングするカプシドタンパク質の血清型と同一であり得る。さらに、組換えAAVベクターゲノムは、ベクターをパッケージングするAAVカプシドタンパク質の血清型とは異なるAAV血清型ゲノムに基づくものであり得る。例えば、AAVベクターゲノムは、AAV2に基づくものであり得、一方、3つのカプシドタンパク質のうちの少なくとも1つは、LK03、AAV1、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、Rh10、Rh74、AAV3BもしくはAAV-2i8、またはこれらの変異体であり得る。

ある実施形態では、アデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターは、LK03、AAV2、AAV4、AAV6、AAV8、AAV9、AAV10、AAV12、Rh10、Rh74、AAV3BおよびAAV-2i8、ならびに、例えば、WO 2013/158879（国際出願PCT/US2013/037170）、WO 2015/013313（RHM4-1、RHM15-2、RHM15-3/RHM15-5、RHM15-4およびRHM15-6を開示する国際出願PCT/US2014/047670）、US2013/0059732（LK01、LK02、LK03等を開示する米国特許第9,169,299号）および国際公開第2016/210170号に記載されるようなそれらの変異体を含み、これらの開示はその全体が本明細書に組み込まれる。

本明細書で使用される場合、「血清型」という語は、他のAAV血清型と血清学的に異なるカプシドを有するAAVを指すために使用される区分である。血清学的特徴は、別のAAVと比較した場合の、１のAAVに対する抗体間の交差反応性の欠如に基づいて決定される。そのような交差反応性の違いは、通常、カプシドタンパク質配列／抗原決定基の違いによる（例えば、AAV血清型のVP1、VP2、および／またはVP3配列の違いによる）。カプシド変異体を含むAAV変異体は、リファレンスAAVまたは他のAAV血清型と血清学的に区別されない可能性があるにもかかわらず、リファレンスまたは他のAAV血清型と比較して、少なくとも１つのヌクレオチドまたはアミノ酸残基が異なる。

従来の規定では、血清型は、目的のウイルスが、中和活性について存在し、特徴付けられた血清型全てに特異的な血清に対して試験される、目的のウイルスを中和する抗体は見出されていないことを意味する。より多くの天然に存在するウイルス単離物が発見され、かつ／またはカプシド変異体が生成されるにつれて、現存する血清型のいずれかとの血清学的差異が存在し得るか、または存在しない。したがって、新しいウイルス（例えばAAV）が血清学的差異を有しない場合、この新しいウイルス（例えばAAV）は、対応する血清型のサブグループまたは変異体であろう。多くの場合、中和活性についての血清学的試験は、カプシド配列改変を有する変異ウイルスについて、それらが血清型の伝統的な定義に従って別の血清型であるかどうかを決定するために、まだ実施されていない。したがって、便宜上、および重複を避けるために、用語「血清型」は、広義には血清学的に異なるウイルス（例えばAAV）ならびに所与の血清型のサブグループまたは変異体内にあり得る血清学的に区別されないウイルス（例えばAAV）の両方を指す。

本明細書に記載されるように、AAVカプシドタンパク質は、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、Rh10、Rh74（配列番号：３５）、AAV3B、LK03（配列番号：４２）、AAV-2i8、配列番号：１１０の配列、配列番号：３６の配列、および／または配列番号：３７等のリファレンス配列または親配列に対して100％未満の配列同一性を示すが、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、Rh10、Rh74（配列番号：３５）、AAV3B、LK03（配列番号：４２）またはAAV-2i8等の既知のAAV遺伝子またはタンパク質とは異なり、同一ではない。ある実施形態では、改変体／変異体AAVカプシドタンパク質は、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、Rh10、Rh74（配列番号：３５）、AAV3B、LK03（配列番号：４２）、AAV-2i8、配列番号：１１０の配列、配列番号：３６の配列、配列番号：３７の配列、および／または配列番号：４２の配列等のリファレンスAAVカプシドタンパク質または親AAVカプシドタンパク質に対して少なくとも80％、85％、85％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％等、99.5％等まで同一の配列を含むか、またはこれらからなる。

ある実施形態では、アデノ随伴ウイルス（AAV）ベクター等のウイルスベクターは、発現制御エレメントに作動可能に連結された、本明細書に記載のGLAをコードする核酸を含むポリヌクレオチドのいずれかを含む。

ある実施形態では、アデノ随伴ウイルス（AAV）ベクター等のウイルスベクターは、本明細書に記載のGLAをコードする核酸を含むポリヌクレオチドを含む発現カセットのいずれかを含む。

ある実施形態では、AAVベクターは、AAVカプシドのうちの１以上；およびAAV ITRがポリヌクレオチドまたは発現カセットの5'末端または3'末端に隣接する１以上のAAV逆方向末端反復（ITR）を含む。

ある実施形態では、AAVベクターは、１以上のITRの5'または3'に位置するイントロンをさらに含む。

ある実施形態では、少なくとも１つ以上のITRまたはイントロンを含むAAVベクターは、減少したCpGを有するように改変された１以上のITRまたはイントロンを有する。

ある実施形態では、本発明のAAVベクターは、例えば、脂質ナノ粒子（LNP）に封入されたものを含む、非ウイルス送達システムを介して送達される。

非ウイルス法
ある実施形態では、本発明のポリヌクレオチドおよび発現カセットは、非ウイルス送達システムと共に送達または投与される。非ウイルス送達システムには、例えば、非ウイルスベクター、または細胞外小胞等の化学的方法、または遺伝子銃、エレクトロポレーション、粒子衝撃、超音波利用、および磁気切断等の物理的方法が含まれる。

本発明のGLA配列を発現することができる組換え細胞は、送達または投与に使用され得る。

ミニサークルおよびトランスポゾン等の裸のDNAは、投与または送達またはレンチウイルスベクターのために使用され得る。さらに、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、TALEN、およびCRISPR等の遺伝子編集技術も、本発明のコード配列を送達するために使用され得る。

ある実施形態では、本発明のポリヌクレオチドおよび発現カセットは、末端閉鎖直鎖二本鎖DNAの裸のDNA、ミニサークル、トランスポゾンとして送達される。

ある実施形態では、本発明のポリヌクレオチドおよび発現カセットは、リポソーム、ナノ粒子、脂質ナノ粒子、ポリマー、マイクロ粒子、マイクロカプセル、ミセル、または細胞外小胞とさらにカプセル化または複合体化されたAAVベクター粒子または他のウイルス粒子中で送達または投与される。

ある実施形態では、本発明のポリヌクレオチドおよび発現カセットは、非ウイルスベクターと共に送達または投与される。

本明細書で使用される場合、「非ウイルスベクター」は、ウイルス粒子またはウイルス様粒子（VLP）によって送達されないベクターを指す。ある実施形態によれば、非ウイルスベクターは、カプシドによって送達されないベクターである。ベクターは、非ウイルス送達ナノ粒子にカプセル化、混合、または他の方法で会合され得る。

本開示に照らして、当業者に公知の任意の好適な非ウイルス送達システムを本発明において使用することができる。非ウイルス送達ナノ粒子は、例えば、脂質系ナノ粒子、ポリマー系ナノ粒子、タンパク質系ナノ粒子、マイクロ粒子、マイクロカプセル、金属粒子系ナノ粒子、ペプチドケージナノ粒子等であり得る。

本発明の非ウイルス送達ナノ粒子は、当技術分野で公知の任意の方法によって構築することができ、治療的導入遺伝子を含む核酸分子を含む本発明の非ウイルスベクターは、当技術分野で公知の任意の方法によって構築され得る。

脂質系送達システム
脂質系送達システムは当技術分野において周知であり、本開示に照らして当業者に公知の任意の適切な脂質系送達システムを本発明において使用することができる。脂質系送達システムの例としては、例えば、リポソーム、脂質ナノ粒子、ミセル、または細胞外小胞が挙げられる。

「脂質ナノ粒子」または「LNP」は、ナノスケール、すなわち、約10～約1000 nm、または約50～約500 nm、または約75～約127 nmの範囲を有する、AAVおよび非ウイルスベクターの送達に有用な脂質系小胞を指す。理論に束縛されるものではないが、LNPは、免疫系からの部分的または完全な遮蔽を有するポリヌクレオチド、発現カセット、AAVベクター、または非ウイルスベクターを提供すると考えられる。遮蔽は、組織または細胞へのポリヌクレオチド、発現カセット、AAVベクター、または非ウイルスベクターの送達を可能にし、一方、in vivoでポリヌクレオチド、発現カセット、AAVベクター、または非ウイルスベクターに対する実質的な免疫応答を誘導することを回避する。遮蔽はまた、in vivoで（例えば、ヒト等の対象において）、ポリヌクレオチド、発現ベクター、AAVベクター、または非ウイルスベクターに対する実質的な免疫応答を誘導することなく、反復投与を可能にし得る。遮蔽はまた、in vivoで、ポリヌクレオチド、発現カセット、AAVベクター、または非ウイルスベクター送達効率を改善または増加させ得る。

AAVのpI（等電点）は、約6～約6.5のpH範囲にある。したがって、AAV表面は、わずかな負電荷を有する。したがって、LNPが、例えば、アミノ脂質等のカチオン性脂質を含むことが有益であり得る。例示的なアミノ脂質は、米国特許第9,352,042号、第9,220,683号、第9,186,325号、第9,139,554号、第9,126,966号、第9,018,187号、第8,999,351号、第8,722,082号、第8,642,076号、第8,569,256号、第8,466,122号、および第7,745,651号ならびに米国特許公報第2016/0213785号、第2016/0199485号、第2015/0265708号、第2014/0288146号、第2013/0123338号、第2013/0116307号、第2013/0064894号、第2012/0172411号、および第2010/0117125号に記載されており、これらの開示はその全体が本明細書に組み込まれる。

「カチオン性脂質」および「アミノ脂質」という語は、本明細書において互換的に使用され、1、2、3、またはそれ以上の脂肪酸または脂肪アルキル鎖およびpH滴定可能なアミノ基（例えば、アルキルアミノ基またはジアルキルアミノ基）を有する脂質およびその塩を含む。カチオン性脂質は、典型的には、カチオン性脂質のpKa未満のpHでプロトン化（すなわち、正に帯電）され、そのpKaを超えるpHで実質的に中性である。カチオン性脂質は、滴定可能なカチオン性脂質であってもよい。ある実施形態では、カチオン性脂質は、プロトン化可能な第三級アミノ基（例えば、pH滴定可能）；C18アルキル鎖（ここで、各アルキル鎖は独立して、0～3個（例えば、0個、1個、2個、または3個）の二重結合を有する）；ならびに頭部基とアルキル鎖との間のエーテル、エステル、またはケタール結合を含む。

カチオン性脂質としては、l,2-ジリノレイルオキシ-N,N-ジメチルアミノプロパン（DLinDMA）、1,2-ジリノレニルオキシ-N,N-ジメチルアミノプロパン（DLenDMA）、1,2-ジ-イ-リノレニルオキシ-N,N-ジメチルアミノプロパン（g-DLenDMA）、2,2-ジリノレイル-4-(2-ジメチルアミノエチル)-[l,3]-ジオキソラン（DLin-K-C2-DMA（DLin-C2K-DMA、XTC2、およびC2Kとしても知られる））、2,2-ジリノレイル-4-ジメチルアミノメチル-[l,3]-ジオキソラン（DLin-K-DMA）、ジリノレイルメチル-3-ジメチルアミノプロピオネート（DLin-K-DMA M-C2-DMA（MC2としても知られる））、(6Z,9Z,28Z,3l Z)-ヘプタトリアコンタ-6,9,28,3l-テトラエン-19-イル 4-(ジメチルアミノ)ブタノエート（DLin-M-C3-DMA（MC3としても知られる））、これらの塩、およびこれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。他のカチオン性脂質としてはまた、1,2-ジステアリルオキシ-N,N-ジメチル-3-アミノプロパン（DSDMA）、1,2-ジオレイルオキシ-N,N-ジメチル-3-アミノプロパン（DODMA）、2,2-ジリノレイル-4-(3-ジメチルアミノプロピル）-[l,3]-ジオキソラン（DLin-K-C3-DMA）、2,2-ジリノレイル-4-(3-ジメチルアミノブチル）-[l,3]-ジオキソラン（DLin-K-C4-DMA）、DLen-C2K-DMA、y-DLen-C2K-DMA、および（DLin-MP-DMA）（1-B11としても知られる）が挙げられるが、これらに限定されない。

さらに別のカチオン性脂質としては、2,2-ジリノレイル-5-ジメチルアミノメチル-[l,3]-ジオキサン（DLin-K6-DMA）、2,2-ジリノレイル-4-N-メチルペピアジノ-[l,3]-ジオキソラン（DLin-K-MPZ）、l,2-ジリノレイルカルバモイルオキシ-3-ジメチルアミノプロパン（DLin-C-DAP）、l,2-ジリノレイルオキシ-3-(ジメチルアミノ)アセトキシプロパン（DLin-DAC）、2-ジリノレイル-3-アセトキシプロパン（DLin-MA）、1,2-ジリノレイル-3-ジメチルアミノプロパン（DLinDAP）、1,2-ジリノレイルチオ-3-ジメチルアミノプロパン（DLin-S-DMA）、l-リノレイル-2-リノレイルオキシ-3-ジメチルアミノプロパン（DLin-2-DMAP）、1,2-ジリノレイルオキシ-3-トリメチルアミノプロパンクロリド塩（DLin-TMA.Cl）、l,2-ジリノレイル-3-トリメチルアミノプロパンクロリド塩（DLin-TAP.Cl）、l,2-ジリノレイルオキシ-3-（N-メチルピペラジノ）プロパン（DLin-MPZ）、3-(N,N-ジリノレイルアミノ)-l、2-プロパンジオール（DLinAP）、3-(N,N-ジオレイルアミノ)-l,2-プロパンジオ（DOAP）、l,2-ジリノレイルオキソ-3-(2-N,N-ジメチルアミノ）エトキシプロパン（DLin-EG-DMA）、N,N-ジオレイル-N,N-ジメチルアンモニウムクロリド（DODAC）、N-(l-(2,3-ジオレイルオキシ)プロピル)-N,N,N-トリメチルアンモニウムクロリド（DOTMA）、N,N-ジステアリル-N,N-ジメチルアンモニウムブロミド（DDAB）、N-(l-(2,3-ジオレオイルオキシ)プロピル)-N,N,N-トリメチルアンモニウムクロリド（DOTAP）、3-(N(N',N'-ジメチルアミノエタン)-カルバモイル)コレステロール（DC-Chol）、N-(l,2-ジミリスチルオキシオキシプロパ-3-イル)-N,N-ジメチル-N-ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（DMRIE）、2,3-ジオレイルオキシ-N-[2(スペルミン-カルボキシアミド)エチル]-N,N-ジメチル-l-プロパンアンモニウムトリフルオロアセテート（DOSPA）、ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン（DOGS）、3-ジメチルアミノ-2-(コレスト-5-エン-3-β-オキシブタン-4-オキシ)-l-(シス,シス-9,l2-オクタデカジエンオキシ)プロパン（CLinDMA）、2-[5'-(コレスト-5-エン-3-β-オキシ)-3-ジメチル-l-(シス,シス-9',l-2'-オクタデカジエノキシ)プロパン（CpLinDMA）、N,N-ジメチル-3,4-ジオレイルオキシベンジルアミン（DMOBA）、l,2-N,N'-ジオレイルカルバミル-3-ジメチルアミノプロパン（DOcarbDAP）、l,2-N,N'-ジリノレイルカルバミル-3-ジメチルアミノプロパン（DLincarbDAP）、デキサメタゾン-スペリミン（DS）および二置換スペルミン（D2S）またはこれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。

LIPOFECTIN（登録商標）（GIBCO/BRLから入手可能なDOTMAおよびDOPEを含む）、およびLIPOFECT AMINE（登録商標）（GIBCO/BRLから入手可能なDOSPAおよびDOPEを含む）等のカチオン性脂質の多数の市販の調製物を使用することができる。

ある実施形態において、カチオン性脂質は、LNPの約10重量％～脂質ナノ粒子の約85重量％、またはLNPの約50重量％～LNPの約75重量％の量で存在し得る。

ステロールは、LNPに流動性を与え得る。本明細書で使用される場合、「ステロール」は、植物（フィトステロール）または動物（ズーステロール）起源の任意の天然に存在するステロール、ならびに天然に存在しない合成ステロールを指し、これらは全て、ステロイドA環の3位におけるヒドロキシル基の存在を特徴とする。ステロールは、リポソーム、脂質小胞または脂質粒子調製物の分野で従来使用されている任意のステロール、最も一般的にはコレステロールであり得る。フィトステロールには、カンペステロール、シトステロール、およびスチグマステロールが含まれ得る。ステロールはまた、米国特許出願公開第2011/0177156号に記載されているもの等のステロール修飾脂質を含み、その開示はその全体が本明細書に組み込まれる。ある実施形態では、ステロールは、LNPの約5重量％～脂質ナノ粒子の約50重量％、またはLNPの約10重量％～LNPの約25重量％の量で存在し得る。

LNPは、中性脂質を含み得る。中性脂質は、生理学的pHで非荷電または中性双性イオン形態のいずれかで存在する任意の脂質種を含み得る。そのような脂質としては、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、セラミド、スフィンゴミエリン、ジヒドロスフィンゴミエリン、セファリン、およびセレブロシドが挙げられるが、これらに限定されない。中性脂質の選択は、一般に、とりわけ、粒径および必要な安定性を考慮することによって導かれる。ある実施形態では、中性脂質成分は、２つのアシル基を有する脂質（例えば、ジアシルホスファチジルコリンおよびジアシルホスファチジルエタノールアミン）であり得る。

様々な鎖長および飽和度の様々なアシル鎖基を有する脂質が利用可能であるか、または周知の技術によって単離もしくは合成することができる。ある実施形態では、C14～C22の範囲の炭素鎖長を有する飽和脂肪酸を含有する脂質を使用することができる。別の群の実施形態では、C14～C22の範囲の炭素鎖長を有するモノ不飽和脂肪酸またはジ不飽和脂肪酸を有する脂質が使用される。さらに、飽和および不飽和の脂肪酸鎖の混合物を有する脂質を使用することができる。例示的な中性脂質としては、l,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスファチジル-エタノールアミン（DOPE）、l,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（DSPC）、1-パルミトイル-2-オレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（POPC）、または任意の関連ホスファチジルコリンが挙げられるが、限定されない。中性脂質はまた、スフィンゴミエリン、ジヒドロスフィンゴミエリン、またはセリンおよびイノシトール等の他の頭部基を有するリン脂質から構成され得る。

ある実施形態では、中性脂質は、脂質ナノ粒子の約0. 1重量％～LNPの約75重量％、またはLNPの約5重量％～LNPの約15重量％の量で存在し得る。

LNP封入核酸、発現カセット、AAVベクター、および非ウイルスベクターは、医薬組成物、例えば、薬学的に許容される担体または賦形剤に組み込むことができる。このような医薬組成物は、とりわけ、LNP封入核酸、発現カセット、AAVベクター、および非ウイルスベクターの、in vivoまたはex vivoでの対象への投与および送達に有用である。

LNPの調製物は、さらなる成分と組み合わせることができる。非限定的な例としては、ポリエチレングリコール（PEG）およびステロールが挙げられる。

「PEG」という語は、２つの末端ヒドロキシル基を有するエチレンPEGリピート単位の直鎖状水溶性ポリマーであるポリエチレングリコールを指す。PEGは、その分子量によって分類され、例えば、PEG 2,000は約2,000ダルトンの平均分子量を有し、PEG 5,000は約5,000ダルトンの平均分子量を有する。PEGは、Sigma Chemical Co. および他の会社から市販されており、例えば、次の官能基のPEGを含む:モノメトキシポリエチレングリコール（MePEG-OH）、モノメトキシポリエチレングリコールサクシネート（MePEG-S）、モノメトキシポリエチレングリコールスクシンイミジルサクシネート（MePEG-S-NHS）、モノメトキシポリエチレングリコールアミン（MePEG-NH2）、モノメトキシポリエチレングリコールトレシレート（MePEG-TRES）、およびモノメトキシポリエチレングリコールイミダゾリルカルボニル（MePEG-IM）。

ある実施形態では、PEGは、約550～約10,000ダルトンの平均分子量を有するポリエチレングリコールであり得、アルキル、アルコキシ、アシルまたはアリールによって任意に置換されている。ある実施形態では、PEGは、末端ヒドロキシル位置にてメチルで置換され得る。ある実施形態では、PEGは、約750～約5,000ダルトン、または約1,000～約5,000ダルトン、または約1,500～約3,000ダルトン、または約2,000ダルトン、または約750ダルトンの平均分子量を有し得る。PEGは、アルキル、アルコキシ、アシルまたはアリールで置換され得る。ある実施形態では、末端ヒドロキシル基は、メトキシ基またはメチル基で置換され得る。

PEG修飾脂質は、米国特許第8,936,942号および第7,803,397号に記載されているPEG-ジアルキルオキシプロピルコンジュゲート（PEG-DAA）を含み、これらの開示は、その全体が本明細書に組み込まれる。有用なPEG修飾脂質（または脂質－ポリオキシエチレンコンジュゲート）は、PEG部分を脂質小胞の表面に固定するための様々な「アンカー」脂質部分を有し得る。好適なPEG修飾脂質の例としては、PEG修飾ホスファチジルエタノールアミンおよびホスファチジン酸、PEG－セラミド複合体（例えば、PEG-CerCl4またはPEG-CerC20）が挙げられ、これらは米国特許第5,820,873号に記載されており、その開示の全体（PEG修飾ジアルキルアミンおよびPEG修飾l,2-ジアシルオキシプロパン-3-アミン）が本明細書に組み込まれる。ある実施形態では、PEG修飾脂質は、PEG修飾ジアシルグリセロールおよびジアルキルグリセロールであり得る。ある実施形態では、PEGは、LNPの約0. 5重量％～LNPの約20重量％、またはLNPの約5重量％～LNPの約15重量％の量であり得る。

さらに、LNPは、PEG修飾LNPおよびステロール修飾LNPであり得る。LNPは、さらなる成分と組み合わされて、同じまたは別個のLNPであり得る。換言すると、同じLNPをPEG修飾し、ステロール修飾することができ、あるいは、第１のLNPをPEG修飾し、第２のLNPをステロール修飾することができる。場合により、第１および第２の修飾LNPを組み合わせることができる。

ある実施形態では、封入前のLNPは、約10～500 nm、または約50～約200 nm、または75～約125 nmの範囲のサイズを有し得る。ある実施形態では、LNP封入核酸、発現ベクター、AAVベクター、または非ウイルスベクターは、約10～500 nmの範囲のサイズを有し得る。

ポリマー系システム

ポリマー系送達システムは当技術分野において周知であり、本開示を考慮して当業者に公知の任意の好適なポリマー系送達システムまたはポリマーナノ粒子を本発明において使用することができる。DNAは、ポリマーナノ粒子のポリマーマトリックス中に捕捉され得るか、またはナノ粒子の表面上に吸着もしくはコンジュゲートされ得る。遺伝子送達のために一般に使用されるポリマーの例としては、例えば、ポリ（乳酸-co-グリコール酸）（PLGA）、ポリ乳酸（PLA）、ポリ（エチレンイミン）（PEI）、キトサン、デンドリマー、ポリ無水物、ポリカプロラクトン、およびポリメタクリレートが挙げられる。

ポリマー系非ウイルスベクターは、約1～約1000 nm、場合により約10～約500 nm、場合により約50～約200 nm、場合により約100～約150 nm、場合により約150n m以下の範囲の異なるサイズを有し得る。

タンパク質系システム
タンパク質系送達システムは当技術分野において周知であり、本開示を考慮して当業者に公知の任意の好適なタンパク質系送達システムまたは細胞膜透過性ペプチド（CPP）を本発明において使用することができる。

CPPは、治療用分子を送達するための細胞内透過が潜在的に可能である短ペプチド（6～30アミノ酸残基）である。CPPの大部分は主にアルギニンおよびリシン残基からなり、それらをカチオン性および親水性にするが、CPPはまた、両親媒性、アニオン性、または疎水性であり得る。CPPは天然の生体分子（例えば、Tat、HIV-1タンパク質）に由来するか、または合成法（例えば、ポリ-L-リシン、ポリアルギニン）によって得ることができる（Singh et al., Drug Deliv. 2018;25(1):1996-2006）。CPPの例としては、例えば、カチオン性CPP（高度に正に荷電）（例えば、Tatペプチド、ペネトラチン、プロタミン、ポリ-L-リシン、ポリアルギニン等）；両親媒性CPP（正および負に荷電したアミノ酸配列の両方を含む、様々な供給源から構築されたキメラまたは融合ペプチド）（例えば、トランスポータン、VT5、バクテネシン-7（Bac7）、プロリンリッチペプチド（PPR）、SAP（VRLPP）3、TP10、pep-1、MPG等）；膜親和性CPP（疎水性および両親媒性の性質の両方を同時に呈し、大きな芳香族残基および小さな残基の両方を含む）（例えば、gH625、SPION-PEG-CPP NP等）；および疎水性CPP（非極性のモチーフまたは残基のみを含む）（例えば、SG3、PFVYLI、pep-7、線維芽細胞増殖因子（FGF）等）が挙げられる。

タンパク質系非ウイルスベクターは、約1～約1000 nm、場合により約10～約500 nm、場合により約50～約200 nm、場合により約100～約150 nm、場合により約150 nm以下の範囲の様々なサイズを有し得る。

ペプチドケージシステム
ペプチドケージ系送達システムは当技術分野で周知であり、本開示を考慮して当業者に公知の任意の好適なペプチドケージ系送達システムを本発明で使用することができる。一般に、拘束された内部環境を形成するケージ様構造に組み立てることができる任意のタンパク質性材料を使用することができる。いくつかの異なる種類のタンパク質「シェル」を組み立て、異なる種類の材料を装填することができる。例えば、非ウイルス性材料を封入するウイルス性コートタンパク質（例えば、カウピークロロティックモットルウイルス（Cowpea Chlorotic Mottle Virus）（CCMV）タンパク質コート由来）のシェルを含むタンパク質ケージ、ならびに非ウイルス性タンパク質から形成されるタンパク質ケージが記載されている（例えば、米国特許第6,180,389号および第6,984,386号、米国特許出願第20040028694号、ならびに米国特許出願第20090035389号を参照。これらの開示はその全体が本明細書に組み込まれる）。ペプチドケージはタンパク質ケージ（例えば、溶媒に自然に接近可能であるか、または溶媒濃度、pH、平衡比を変更することによってそのようにすることができる内部空洞を有する構造）を形成するように自己会合するタンパク質性シェルを含み得る。

非ウイルスタンパク質に由来するタンパク質ケージの例としては、例えば、真核生物種および原核生物種の両方に由来するフェリチンおよびアポフェリチン、例えば、12サブユニットおよび24サブユニットフェリチン；ならびに熱ショックタンパク質（HSP）、例えば、内部コア空間を形成する24サブユニット熱ショックタンパク質のクラス、メタノカルドコックス・ヤンナスキイ（Methanococcus jannaschii）の小HSP、大腸菌のドデカメリックDsp HSP、MrgAタンパク質等から形成されるタンパク質ケージが挙げられる。当業者によって理解されるように、タンパク質ケージのモノマーは、天然に存在するか、または合成することができるアミノ酸置換、挿入および欠失を含む変異体（例えば断片）であり得る。

タンパク質ケージは、約1～約1000 nm、場合により約10～約500 nm、場合により約50～約200 nm、場合により約100～約150 nm、場合により約150 nm以下の範囲の様々なコアサイズを有し得る。

医薬組成物
本発明はさらに、GLAをコードする核酸、GLAをコードする核酸を含むポリヌクレオチドを含む発現カセット、GLAをコードする核酸を含むポリヌクレオチドを含むAAVベクター等のウイルスベクター、または本明細書に記載のGLAをコードする核酸を含むポリヌクレオチドを含む非ウイルスベクターを含むポリヌクレオチドのいずれかを含む医薬組成物提供する。

rAAVベクターおよび非ウイルスベクターは、生物学的に適合性を有する担体中への注入を介して、例えば静脈内注射を介して患者に投与することができる。rAAVベクターおよび非ウイルスベクターは、単独で、または他の分子と組み合わせて投与することができる。したがって、rAAVベクターおよび非ウイルスベクターならびに他の組成物、薬剤、薬物、生物製剤（タンパク質）は、医薬組成物に組み込まれ得る。このような医薬組成物は、とりわけ、in vivoまたはex vivoでの対象への投与および送達に有用である。

ある実施形態では、医薬組成物はまた、薬学的に許容される担体または賦形剤を含む。そのような賦形剤には、それ自体は組成物を受容する個体に有害な免疫応答を誘導せず、過度の毒性なしに投与することができる任意の医薬剤が含まれる。

本明細書で使用される場合、用語「薬学的に許容される」および「生理学的に許容される」は、生物学的に許容される製剤、気体、液体、もしくは固体、またはそれらの混合物を意味し、これは1つ以上の投与、in vivo送達、または接触の経路に適している。「薬学的に許容される」または「生理学的に許容される」組成物は、生物学的にまたは他の点で望ましくないものではない材料であり、例えば、材料は、実質的に望ましくない生物学的効果を引き起こすことなく対象に投与され得る。したがって、このような医薬組成物は、例えば、核酸、ベクター、ウイルス粒子またはタンパク質を対象に投与する際に使用することができる。

薬学的に許容される賦形剤としては、水、生理食塩水、グリセロール、糖およびエタノール等の液体が挙げられるが、これらに限定されない。薬学的に許容される塩、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩等の鉱酸塩；および酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩等の有機酸塩もその中に含まれ得る。賦形剤には、アルブミン等のタンパク質も含まれる。

さらに、湿潤剤または乳化剤、pH緩衝物質等の補助物質が、そのようなビヒクル中に存在し得る。

医薬組成物は、塩として提供することができ、塩酸、硫酸、酢酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸等を含むが、これらに限定されない様々な酸を用いて形成することができる。塩は、水性または他のプロトン性溶媒中で、対応する遊離塩基形態よりも可溶性である傾向がある。他の場合においては、調製物は、次のいずれかまたは全てを含み得る凍結乾燥粉末であり得る：4.5～5.5のpH範囲で、使用前に緩衝液と組み合わせられる、1～50 mMヒスチジン、0.l～2％スクロース、および2～7％マンニトール。

医薬組成物は、医薬投与またはin vivo接触もしくは送達に適合する、溶媒（水性または非水性）、溶液（水性または非水性）、エマルジョン（例えば、水中油型または油中水型）、懸濁液、シロップ、エリキシル、分散媒体および懸濁媒体、コーティング、等張および吸収促進または遅延剤を含む。水性および非水性の溶媒、溶液および懸濁液は、懸濁化剤および増粘剤を含み得る。そのような薬学的に許容される担体には、錠剤（コーティングまたは非コーティング）、カプセル剤（硬質または軟質）、マイクロビーズ、粉末、顆粒および結晶が含まれる。補助的な活性化合物（例えば、防腐剤、抗菌剤、抗ウイルス剤および抗真菌剤）もまた、組成物に組み込むことができる。

医薬組成物は、本明細書に記載されるか、または当業者に知られるように、特定の投与経路または送達経路に適合するように製剤化することができる。したがって、医薬組成物は、様々な経路による投与に適した担体、希釈剤、または賦形剤を含む。

非経口投与に適した組成物は、活性化合物の水性および非水性の溶液、懸濁液またはエマルジョンを含み、これらの調製物は、典型的には無菌であり、意図されるレシピエントの血液と等張であり得る。非限定的な例としては、水、緩衝生理食塩水、ハンクス液、リンゲル液、デキストロース、フルクトース、エタノール、動物性油、植物油または合成油が挙げられる。水性注射懸濁液は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、またはデキストラン等の、懸濁液の粘度を増加させる物質を含有し得る。

さらに、活性化合物の懸濁液は、適切な油性注射懸濁液として調製することができる。好適な親脂性溶媒またはビヒクルとしては、ゴマ油等の脂肪油、またはオレイン酸エチルまたはトリグリセリド等の合成脂肪酸エステル、またはリポソームが挙げられる。場合により、懸濁液は、高濃度溶液の調製を可能にするために、化合物の溶解度を増加させる好適な安定剤または薬剤を含有してもよい。

共溶媒およびアジュバントを製剤に添加することができる。共溶媒の非限定的な例としては、ヒドロキシル基または他の極性基、例えば、イソプロピルアルコール等のアルコール;プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、グリコールエーテル等のグリコール；グリセロール；ポリオキシエチレンアルコールおよびポリオキシエチレン脂肪酸エステルが挙げられる。アジュバントとしては、例えば、大豆レシチンおよびオレイン酸等の界面活性剤；トリオレイン酸ソルビタン等のソルビタンエステル；ならびにポリビニルピロリドンが挙げられる。

ある実施形態では、本明細書に記載のAAVベクターのいずれかを含む医薬組成物は、空のAAVカプシドをさらに含む。ある実施形態では、AAVベクターおよび空のAAVカプシドを含む医薬組成物において、空のAAVカプシド対AAVベクターの比は、約100：1～50：1、約50：1～25：1、約25：1～10：1、約10：1～1：1、約1：1～1：10、約1：10～1：25、約1：25～1：50、または約1：50～1：100の範囲内またはその間である。特定の態様では、AAVベクターおよび空のAAVカプシドを含む医薬組成物において、空のAAVカプシド対AAVベクターの比は、約2：1、約3：1、約4：1、約5：1、約6：1、約7： 1、約8：1、約9： 1、または約10：1である。

ある実施形態では、医薬組成物は界面活性剤を含む。

医薬組成物が調製された後、それらを適切な容器に入れ、治療のためにラベルすることができる。そのようなラベルは、投与の量、頻度、および方法を含むことができる。

本発明の組成物、方法および使用に適した医薬組成物および送達システムは、当分野で知られている（例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy (2003) 20th ed., Mack Publishing Co., Easton, PA; Remington' s Pharmaceutical Sciences (1990) 18th ed., Mack Publishing Co., Easton, PA; The Merck Index (1996) 12th ed., Merck Publishing Group, Whitehouse, NJ; Pharmaceutical Principles of Solid Dosage Forms (1993), Technomic Publishing Co., Inc., Lancaster, Pa.; Ansel and Stoklosa, Pharmaceutical Calculations (2001) 11th ed., Lippincott Williams & Wilkins, Baltimore, MD;およびPoznansky et al., Drug Delivery Systems (1980), R. L. Juliano, ed., Oxford, N.Y., pp. 253-315を参照）。

「有効量」または「十分量」は、単回もしくは複数回の投与量で、単独で、または１つ以上の他の組成物（薬物等の治療剤または免疫抑制剤）、治療、プロトコール、もしくは治療レジメンと組み合わせて、任意の期間（長期または短期）の検出可能な応答、任意の測定可能または検出可能な程度の対象における予測されるまたは所望の結果、または任意の期間（例えば、数分間、数時間、数日間、数ヶ月間、数年間、または治癒される）、対象に対する利益を提供する量を指す。

医薬組成物等の組成物は、コードされたタンパク質の産生を可能にするように、対象に送達され得る。ある実施形態では、医薬組成物は、レシピエントが対象において治療的有効量のタンパク質を産生することを可能にするのに十分な遺伝物質を含む。

「治療的有効量」とは、対象において所望の生物学的または医学的な応答を誘発する活性成分または成分の量を指す。治療的有効量は、記載された目的に関連して、経験的に、かつ日常的な方法で決定され得る。例えば、in vitroアッセイが必要に応じて使用され、最適な投薬量範囲を同定するのを助け得る。特定の有効用量の選択は、処置または予防される疾患、関連する症状、患者の体重、患者の免疫状態および当業者に公知の他の因子を含むいくつかの因子を考慮して、当業者によって（例えば、臨床試験を介して）決定され得る。製剤に使用される正確な投与量はまた、投与経路、および疾患の重症度に依存し、医師の判断および各患者の状況に従って決定されるべきである。有効用量は、in vitroまたは動物モデル試験系から得られた用量応答曲線から推定され得る。

組成物は、生理食塩水、緩衝生理食塩水、デキストロース、および水を含むが、これらに限定されない、任意の無菌の生体適合性医薬担体中で製剤化および／または投与され得る。組成物は、単独で、または止血に影響を及ぼす他の薬剤（例えば、補助因子）と組み合わせて、製剤化され、かつ／または患者に投与され得る。

治療方法
本発明はさらに、治療的有効量の本発明の核酸、発現カセット、AAVベクター、非ウイルスベクター、または医薬組成物を対象に投与することを含む、GLAを必要とする対象を治療する方法を提供し、ここでGLAは対象において発現されるものである。

本発明の方法および使用は、分裂細胞および／または非分裂細胞を含む宿主細胞への核酸（導入遺伝子）の送達（形質導入）を含む。本発明のポリヌクレオチド、発現カセット、rAAVベクター、非ウイルスベクター、方法、使用および医薬製剤は、治療の方法として、ヘテロ核酸によってコードされるタンパク質を、それを必要とする対象に送達、投与、または提供する方法においてさらに有用である。このようにして、核酸を含むポリヌクレオチドが転写され、タンパク質が対象においてin vivoで産生される。対象は、タンパク質の欠損を有するため、または対象におけるタンパク質の産生が、処置または他の方法として一定の治療効果を付与し得るため、タンパク質から利益を得るか、またはタンパク質を必要とし得る。

本発明は、ヒトおよび獣医学的用途を含む動物において有用である。したがって、好適な対象には、ヒト等の哺乳動物、ならびに非ヒト哺乳動物が含まれる。「対象」という語は、動物、典型的には、ヒト、非ヒト霊長類（類人猿、テナガザル、ゴリラ、チンパンジー、オランウータン、マカク）、飼育動物（イヌおよびネコ）、家畜（ニワトリおよびアヒル等の家禽、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ブタ）、および実験動物（マウス、ラット、ウサギ、モルモット）等の哺乳動物を指す。ヒト対象には、胎児、新生児、乳児、小児および成人対象が含まれる。対象には、動物疾患モデル、例えば、ファブリー病、およびリソソーム蓄積症等のタンパク質／酵素欠損のマウスおよび他の動物モデル、ならびに当業者に公知の他のものが含まれる。

本発明に従う治療に適した対象には、不十分な量のGLAを有するか、または不十分な量のGLAを産生するリスクがある対象、または異常な、機能が部分的な、もしくは不能なGLAを産生する対象が含まれる。対象をGLA活性について試験し、本発明の方法による治療に適切であるかどうかを決定することができる。本発明に従う治療に適した対象には、GLAから利益を受ける対象も含まれる。GLAから利益を得ることができるそのような対象には、リソソーム蓄積症を有する対象が含まれる。治療された対象は、治療後、周期的に、例えば、1～4週間毎、1～6ヶ月毎、6～12ヶ月毎、または1年、2年、3年、4年、5年毎、またはそれ以上の年毎にモニターされ得る。

対象は、免疫応答、例えば、AAVに対する抗体について試験することができる。したがって、候補の対象は、本発明の方法による治療の前にスクリーニングすることができる。対象はまた、治療後にAAVに対する抗体について試験することができ、場合により、治療後のある期間にわたってモニターすることができる。既存のAAV抗体または発達中のAAV抗体を有する対象は、免疫抑制剤、または本明細書に記載の他のレジメンで治療され得る。

本発明に従う治療に適した対象には、AAVに対する抗体を有するか、またはAAVに対する抗体を産生するリスクがある対象も含まれる。 rAAVベクターは、いくつかの技術を使用して、そのような対象に投与または送達され得る。例えば、AAV空カプシド（すなわち、GLAをコードする修飾核酸を欠くAAV）を送達して、対象におけるAAV抗体に結合させ、それによって、ヘテロ核酸を含むrAAVベクターが対象の細胞に形質導入することを可能にし得る。

本発明の修飾核酸、発現カセット、rAAVベクター、および非ウイルスベクターは、GLA欠損症の治療に使用され得る。したがって、ある実施形態では、GLAをコードする修飾核酸、GLAをコードする修飾核酸を含む発現カセット、rAAVベクター、および本発明の非ウイルスベクターは、治療剤および／または予防剤として使用され得る。

ある実施形態では、本発明のGLAをコードする修飾核酸、GLAをコードする修飾核酸を含む発現カセット、rAAVベクター、および非ウイルスベクターは、ファブリー病の治療に使用することができる。ファブリー病または別のリソソーム蓄積症を有する患者へのGLAをコードする修飾核酸、GLAをコードする修飾核酸を含む発現カセット、rAAVベクター、および本発明の非ウイルスベクターの投与は、GLAタンパク質の発現をもたらす。

ある実施形態では、本発明による方法は、GLAを必要としない対象において見出されるGLAタンパク質の正常発現の少なくとも1％、少なくとも5％、少なくとも10％、少なくとも15％、少なくとも20％、少なくとも25％、少なくとも30％、少なくとも35％、少なくとも40％、少なくとも45％、または少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも100％であるレベルにて、GLAの発現または活性をもたらし得る。

ある実施形態では、本発明による方法は、GLAを必要としない対象の腎臓において見出されるGLAタンパク質の正常発現の少なくとも1％、少なくとも5％、少なくとも10％、少なくとも15％、少なくとも20％、少なくとも25％、少なくとも30％、少なくとも35％、少なくとも40％、少なくとも45％、または少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも100％であるレベルにて、腎臓におけるGLAの発現または活性をもたらし得る。

ある実施形態では、本発明による方法は、GLAを必要としない対象の心臓において見出されるGLAタンパク質の正常発現の少なくとも1％、少なくとも5％、少なくとも10％、少なくとも15％、少なくとも20％、少なくとも25％、少なくとも30％、少なくとも35％、少なくとも40％、少なくとも45％、または少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも100％であるレベルにて、心臓におけるGLAの発現または活性をもたらし得る。

ある実施形態では、本発明による方法は、GLAを必要としない対象の肝臓において見出されるGLAタンパク質の正常発現の少なくとも1％、少なくとも5％、少なくとも10％、少なくとも15％、少なくとも20％、少なくとも25％、少なくとも30％、少なくとも35％、少なくとも40％、少なくとも45％、または少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも100％であるレベルにて、肝臓におけるGLAの発現または活性をもたらし得る。

ある実施形態では、本発明による方法は、GLAを必要としない対象の血流中に見出されるGLAタンパク質の正常発現の少なくとも1％、少なくとも5％、少なくとも10％、少なくとも15％、少なくとも20％、少なくとも25％、少なくとも30％、少なくとも35％、少なくとも40％、少なくとも45％、または少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも100％であるレベルにて、血流中のGLAの発現または活性をもたらし得る。

本発明のGLAをコードする修飾核酸、GLAをコードする修飾核酸を含む発現カセット、rAAVベクター、および非ウイルスベクターを投与された対象、動物、または患者は、本発明のGLAをコードする修飾核酸、GLAをコードする修飾核酸を含む発現カセット、rAAVベクター、ならびに治療剤および／または予防剤としての非ウイルスベクターの効力を実証、測定、および／または評価するための様々な試験、アッセイ、および機能評価によって評価され得る。

そのような試験およびアッセイとしては、血液、血漿、または尿等の生物学的サンプル中のGLA活性（例えば、標準的なGLA活性アッセイの使用による）および／またはGLA量（例えば、抗GLA抗体によるウェスタンブロット、またはELISA定量の使用による）の測定（例えば、Christensen, E. et al., J Am Soc Nephrol. 2007 Mar;18(3):698-706を参照）；血漿中の総GLAタンパク質および活性によって評価されるピークおよび定常状態ベクター由来GLA酵素レベルの分析；免疫蛍光および免疫組織化学によって組織中の総GLAタンパク質および活性によって評価されるGLA酵素レベルの分析および交差補正（例えば、Christensen, E. et al., 2007, Idを参照。）；組織中および血清中のグロボトリアオシルセラミド（Gb3またはGL3）およびグロボトリアオシルスフィンゴシン（リゾGb3またはリゾGL3）のGLA基質蓄積の測定（例えば、定量的液体クロマトグラフィータンデム質量分析または薄層クロマトグラフィーによる脂質分析による（例えば、Shu et al., J Biol Chem. 2007 Jul 20;282(29):20960-7、およびShu et al., J Glycomics Lipidomics. 2012;Suppl 2:1-6を参照）；免疫蛍光染色または電子顕微鏡法によるGb3の発現レベルの測定（例えば、Braun et al., Cell Physiol Biochem. 2019;52(5):1139-1150を参照）；AAV形質導入組織における定量的逆転写酵素PCRによるGLA mRNAの試験；AAVカプシドに対する免疫応答の試験；GLA導入遺伝子タンパク質生成物に対する免疫応答の試験が挙げられるが、これら限定されない。

さらに、本発明のGLAをコードする修飾核酸、GLAをコードする修飾核酸を含む発現カセット、rAAVベクター、および非ウイルスベクターは、リソソーム蓄積症の治療に使用することができる。リソソーム蓄積症には、リソソーム酵素活性の低下または欠如を特徴とする任意の障害が含まれる。ある実施形態によれば、本発明のGLAをコードする修飾核酸、GLAをコードする修飾核酸を含む発現カセット、rAAVベクター、および非ウイルスベクターは、GLAを必要とする患者の治療に使用することができる。ある実施形態によれば、本発明のGLAをコードする修飾核酸、GLAをコードする修飾核酸を含む発現カセット、rAAVベクター、および非ウイルスベクターは、ファブリー病の治療に使用することができる。ある実施形態によれば、本発明のGLAをコードする修飾核酸、GLAをコードする修飾核酸を含む発現カセット、rAAVベクター、および非ウイルスベクターを使用して、対象の組織中のスフィンゴ糖脂質のレベルを低下させることができる。

本明細書に記載されるように、rAAVは細胞に浸透し、核酸／遺伝物質を細胞に導入し得るため、遺伝子治療ベクターとして有用である。AAVはヒトにおける病原性疾患と関連しないため、rAAVベクターは実質的なAAV病因または疾患を引き起こすことなく、ヒト患者にヘテロポリヌクレオチド配列（例えば、治療用タンパク質および薬剤）を送達し得る。

rAAVベクターは、分裂細胞および非分裂細胞に対する親和性を含む、そのような用途に望ましい多くの特徴を有する。これらのベクターを用いた初期の臨床経験もまた、持続的な毒性を示さず、免疫応答は、典型的には最小限であるか、または検出不可能であることを示した。AAVは、in vivoで、受容体依存性エンドサイトーシスまたはトランスサイトーシスによって、多種多様な細胞型に感染することが知られている。これらのベクター系は、網膜上皮、肝臓、骨格筋、気道、脳、関節および造血幹細胞等の多くの組織を標的とするヒトにおいて試験されている。

例えば、GLAの複数のコピー、したがってより多量のGLAタンパク質を提供することができるrAAVベクターを導入することが望ましい場合がある。改善されたrAAVベクター、およびこれらのベクターを産生するための方法は、Wright J.F.（Hum. Gene Ther., 20:698-706, 2009）を含む多くの参考文献、特許、および特許出願に詳細に記載されている。

投与量は、様々であり得、治療が向けられる疾患の型、発症、進行、重症度、頻度、期間、または確率、所望の臨床的エンドポイント、以前のまたは同時期の治療、対象の一般的な健康、年齢、性別、人種または免疫学的能力、および当業者によって理解される他の因子に依存する。投与量、回数、頻度、または期間は、治療または療法の任意の有害な副作用、合併症または他のリスク因子、および対象の状態によって示されるように、比例的に増加または減少させることができる。当業者は、治療的または予防的な利益を提供するのに十分な量を提供するために必要とされる投与量およびタイミングに影響を及ぼし得る因子を理解するだろう。

投与経路、治療効果を達成するのに必要なヘテロポリヌクレオチド発現のレベル、治療される特定の疾患、ウイルスベクターに対する任意の宿主免疫応答、ヘテロポリヌクレオチドまたは発現産物（タンパク質）に対する宿主免疫応答、および発現されるタンパク質の安定性を含むが、これらに限定されないいくつかの因子に基づいて、治療効果を達成するための投与量、例えば、ベクターゲノム/体重キログラム（vg/kg）のrAAVの投与量、または非ウイルスベクターの投与量は変化し得る。当業者は、特定の疾患または障害を有する患者を処置するためのrAAV/ベクターゲノムまたは非ウイルスベクター投与量範囲を、前述の因子ならびに他の因子に基づいて決定することができる。

一般に、rAAVの投与量は、治療効果を達成するために、対象の体重1キログラム当たり少なくとも1×10⁸ベクターゲノム（vg/kg）、またはそれ以上、例えば、1×10⁹、1×10¹⁰、1×10¹¹、1×10¹²、1×10¹³もしくは1×10¹⁴、またはそれ以上の、対象の体重1キログラム当たりのベクターゲノム（vg/kg）に及ぶ。

例えば、約5×10¹¹ 組換えAAV vg/kgまたは約5×10¹¹ 組換えAAV vg/kgより大きい投与量；約1×10¹² 組換えAAV vg/kgまたは約1×10¹² 組換えAAV vg/kgより大きい投与量；約2×10¹² 組換えAAV vg/kgまたは約2×10¹² 組換えAAV vg/kgより大きい投与量；約3×10¹² 組換えAAV vg/kgまたは約3×10¹² 組換えAAV vg/kgより大きい投与量；約4×10¹² 組換えAAV vg/kgまたは約4×10¹² 組換えAAV vg/kgより大きい投与量；約5×10¹² 組換えAAV vg/kgまたは約5×10¹² 組換えAAV vg/kgより大きい投与量；約1×10¹³ 組換えAAV vg/kgまたは約1×10¹³ 組換えAAV vg/kgより大きい投与量；約2×10¹³ 組換えAAV vg/kgまたは約2×10¹³ 組換えAAV vg/kgより大きい投与量；約3×10¹³ 組換えAAV vg/kgまたは約3×10¹³ 組換えAAV vg/kgより大きい投与量；約4×10¹³ 組換えAAV vg/kgまたは約4×10¹³ 組換えAAV vg/kgより大きい投与量；約5×10¹³ 組換えAAV vg/kgまたは約5×10¹³ 組換えAAV vg/kgより大きい投与量；約6×10¹³ 組換えAAV vg/kgまたは約6×10¹³ 組換えAAV vg/kgより大きい投与量。

投与される組換えAAV vg/kgの例示的な投与量範囲は、約5x10¹¹～約6×10¹³ 組換えAAV vg/kgの投与量範囲；約5×10¹¹～約5.5×10¹¹ 組換えAAV vg/kgの投与量範囲；約5.5×10¹¹～約6×10¹¹ 組換えAAV vg/kgの投与量範囲；約6×10¹¹～約6.5×10¹¹ 組換えAAV vg/kgの投与量範囲；約6.5×10¹¹～約7×10¹¹ 組換えAAV vg/kgの投与量範囲；約7×10¹¹～約7.5×10¹¹ 組換えAAV vg/kgの投与量範囲；約7.5×10¹¹～約8×10¹¹ 組換えAAV vg/kgの投与量範囲；約8×10¹¹～約8.5×10¹¹ 組換えAAV vg/kgの投与量範囲；約8.5×10¹¹～約9×10¹¹ 組換えAAV vg/kgの投与量範囲；約9×10¹¹～約9.5×10¹¹ 組換えAAV vg/kgの投与量範囲；約9.5×10¹¹～約1×10¹² 組換えAAV vg/kgの投与量範囲；約1×10¹²～約1.5×10¹² 組換えAAV vg/kgの投与量範囲；約1.5×10¹²～約2×10¹² 組換えAAV vg/kgの投与量範囲；約2×10¹²～約2.5×10¹² 組換えAAV vg/kgの投与量範囲；約2.5×10¹²～約3×10¹² 組換えAAV vg/kgの投与量範囲；約3×10¹²～約3.5×10¹² 組換えAAV vg/kgの投与量範囲；約3.5×10¹²～約4×10¹² 組換えAAV vg/kgの投与量範囲；約4×10¹²～約4.5×10¹² 組換えAAV vg/kgの投与量範囲；約4.5×10¹²～約5×10¹² 組換えAAV vg/kgの投与量範囲；約5×10¹²～約5.5×10¹² 組換えAAV vg/kgの投与量範囲；約5.5×10¹²～約6×10¹² 組換えAAV vg/kgの投与量範囲；約6×10¹²～約6.5×10¹² 組換えAAV vg/kgの投与量範囲；約6.5×10¹²～約7×10¹² 組換えAAV vg/kgの投与量範囲；約7×10¹²～約7.5×10¹² 組換えAAV vg/kgの投与量範囲；約7.5×10¹²～約8×10¹² 組換えAAV vg/kgの投与量範囲；約8×10¹²～約8.5×10¹² 組換えAAV vg/kgの投与量範囲；約8.5×10¹²～約9×10¹² 組換えAAV vg/kgの投与量範囲；約9×10¹²～約9.5×10¹² 組換えAAV vg/kgの投与量範囲；約9.5×10¹²～約1×10¹³の組換えAAV vg/kg 投与量範囲；約1×10¹³～約1.5×10¹³ 組換えAAV vg/kgの投与量範囲；約1.5×10¹³～約2×10¹³ 組換えAAV vg/kgの投与量範囲；約2×10¹³～約2.5×10¹³ 組換えAAV vg/kgの投与量範囲；約2.5×10¹³～約3×10¹³ 組換えAAV vg/kgの投与量範囲；約3×10¹³～約3.5×10¹³ 組換えAAV vg/kgの投与量範囲；約3.5×10¹³～約4×10¹³ 組換えAAV vg/kgの投与量範囲；約4×10¹³～約4.5×10¹³ 組換えAAV vg/kgの投与量範囲；約4.5×10¹³～約5×10¹³ 組換えAAV vg/kgの投与量範囲；約5×10¹³～約5.5×10¹³ 組換えAAV vg/kgの投与量範囲；約5.5×10¹³～約6×10¹³ 組換えAAV vg/kgの投与量範囲；約6×10¹³～約1×10¹⁴ 組換え型AAV vg/kgの投与量範囲である。

ある実施形態では、AAV vg/kgは、約5×10¹¹ vg/kgの投与量で投与され、約6×10¹¹ vg/kgの投与量で投与され、約7×10¹¹ vg/kgの投与量で投与され、約8×10¹¹ vg/kgの投与量で投与され、約9×10¹¹ vg/kgの投与量で投与され、約1×10¹² vg/kgの投与量で投与され、約2×10¹² vg/kgの投与量で投与され、約3×10¹² vg/kgの投与量で投与され、約4×10¹² vg/kgの投与量で投与され、約5×10¹² vg/kgの投与量で投与され、約6×10¹² vg/kgの投与量で投与され、約7×10¹² vg/kgの投与量で投与され、約8×10¹² vg/kgの投与量で投与され、約9×10¹² vg/kgの投与量で投与され、約1×10¹³ vg/kgの投与量で投与され、約2×10¹³ vg/kgの投与量で投与され、約3×10¹³ vg/kgの投与量で投与され、約4×10¹³ vg/kgの投与量で投与され、約5×10¹³ vg/kgの投与量で投与され、約6×10¹³ vg/kgの投与量で投与される。

本明細書で使用される「単位剤形（unit dosage form）」は、治療される対象のための単位用量として適した物理的に別個の単位を指し；1回以上の投与量で投与される場合、各単位は所望の効果（例えば、予防的または治療的効果）を生じるように計算される、薬学的担体（賦形剤、希釈剤、ビヒクルまたは充填剤）と任意に関連する所定の量を含む。単位剤形は、例えば、液体組成物、または凍結乾燥したもしくは凍結乾燥状態の組成物を含み得るアンプルおよびバイアル内に存在し得;例えば、無菌液体担体は、投与またはin vivo送達の前に添加され得る。個々の単位剤形は、マルチドーズキットまたは容器に含まれ得る。rAAV粒子、非ウイルスベクター、およびその医薬組成物は、投与の容易さおよび投与量の均一性のために、単一または複数の単位剤形に包装することができる。

処置のための「有効量」または「十分量」の投与量（例えば、治療上の利益または改善を改善または提供するための）は、典型的には、疾患の1つ、複数、または全ての有害な症状、結果もしくは合併症、例えば、疾患によって引き起こされるか、もしくは疾患に関連する１以上の有害な症状、障害、疾患、病状、または合併症に対する応答を測定可能な程度に提供するのに有効であるが、疾患の進行または悪化を低減する、減少させる、阻害する、抑制する、制限する、または制御することは満足のいく結果である。

ある実施形態では、本発明による方法は、GLA必要のもしくはファブリー病の１以上の症状を低減し、減少させ、もしくは阻害し；またはGLAの必要性もしくはファブリー病の１以上の症状の進行もしくは悪化を防止もしくは低減し；またはGLA必要性もしくはファブリー病の１以上の症状を安定化させ；またはGLA必要性もしくはファブリー病の１以上の症状を改善する。

有効量または十分量は、単回投与で提供される必要はなく、複数回投与とすることができ、単独で、または別の組成物（例えば薬剤）、治療、プロトコールまたは治療レジメンと組み合わせて投与することができるが、これらも必須ではない。例えば、その量は、対象の必要性、治療される疾患の種類、状態および重症度、または治療の副作用（生じ得る場合）によって示されるように、比例的に増加され得る。加えて、所与の対象において有効または十分であるとみなされるためには、そのような投与量を超える追加の投与量、量もしくは期間、または追加の組成物（例えば、薬物または薬剤）、治療、プロトコールもしくは治療レジメンが含まれ得るため、第２の組成物（例えば、別の薬物または薬剤）を伴わずに単回または複数回の投与量で与えられる場合、有効量または十分量は、有効または十分である必要はない。有効であると考えられる量はまた、GLA欠乏症（例えばファブリー病）またはGLAで治療し得る別のリソソーム蓄積症の治療のためのGLAをコードする修飾核酸の投与等の、別の治療、治療レジメンまたはプロトコールの使用の低減をもたらす量を含む。

したがって、本発明の方法および使用はまた、とりわけ、別の化合物、薬剤、薬物、治療レジメン、治療プロトコール、プロセス、もしくは療法の必要性または使用の低減をもたらす方法および使用を含む。例えば、GLA欠損症については、所定の対象において、対象における欠乏または欠損したGLAを補うための組換えGLAの投与のより少ない頻度または低減された投与量または排除が必要とされる場合、本発明の方法または使用は治療的利益を有する。したがって、本発明によれば、別の治療または治療の必要性または使用を低減する方法および使用が提供される。

有効量または十分量は、処置される各対象および全ての対象において有効である必要はなく、所定のグループまたは集団において処置される対象の大多数において有効である必要もない。有効量または十分量は、あるグループまたは一般集団ではなく、特定の対象における有効性または十分性を意味する。そのような方法に典型的であるように、所与の治療方法または使用に対して、より大きな反応を示すか、またはほとんどもしくは全く反応を示さない対象も存在するだろう。

対象への投与またはin vivo送達は、疾患によって引き起こされるか、または疾患に関連する有害な症状、状態、合併症等の発生前に実施され得る。例えば、スクリーニング（例えば遺伝子）を用いて、本発明の組成物、方法および使用の候補としてそのような対象が同定され得る。したがって、そのような対象には、機能的遺伝子産物の不十分な量または欠損（例えば、GLA、またはGLAで治療され得るリソソーム蓄積症をもたらすタンパク質欠損）について陽性とスクリーニングされるか、または異常な、部分機能的もしくは非機能的な遺伝子産物（例えば、GLA、またはGLAで治療され得るリソソーム蓄積症に関与するタンパク質）を産生するものが含まれる。

本明細書に開示されるような本発明の方法および使用に従う、対象への投与またはin vivo送達は、対象が治療について標的とされる疾患を有するか、疾患の１つ以上の症状を有すると同定された後、または対象が疾患の１つ以上の症状を有さないにもかかわらず、本明細書に記載されるように陽性であるとスクリーニングおよび同定された後、1～2時間、2～4時間、4～12時間、12～24時間または24～72時間以内に実施され得る。もちろん、本発明の方法および使用は、対象が治療の標的とされる疾患を有すると同定された後、疾患の１つ以上の症状を有すると同定された後、または本明細書に記載されるように陽性であるとスクリーニングおよび同定された後、1～7日間、7～14日間、14～24日間、24～48日間、48～64日間またはそれ以上の日数、月数または年数で実施され得る。

「改善する」という語は、対象の疾患もしくはその症候、または根底にある細胞反応の検出可能なまたは測定可能な向上を改善する。検出可能または測定可能な改善には、疾患の発生、頻度、重症度、進行、もしくは期間における主観的もしくは客観的な減少、低減、阻害、抑制、制限もしくは制御、または疾患によって引き起こされるか、もしくは疾患に関連する合併症、または疾患の症状もしくは根本的原因もしくは結果の改善、または疾患の回復が含まれる。

ファブリー病については、有効量は、グロボトリアオシルスフィンゴシン（リゾ-GB3）および米国特許出願公開第2010-0113517号に開示されているもの等のファブリー病のマーカーを改善する量であり、その開示はその全体が本明細書に組み込まれる。米国特許出願公開第2010/0113517号に開示されるファブリー病のサロゲートマーカーにおける改善の非限定的な例としては、細胞（例えば線維芽細胞）および組織におけるα-Gal Aのレベルまたは活性の増加；GL-3蓄積の減少；ホモシステインおよび血管細胞接着分子-1（VCAM-1）の血漿中濃度の減少；心筋細胞および弁膜線維細胞（valvular fibrocytes）内のGL-3蓄積の減少；心肥大（特に左心室）の低減、弁閉鎖不全、および不整脈の改善；蛋白尿の改善；CTH、ラクトシルセラミド、セラミド等の脂質の尿中濃度の減少、ならびにグルコシルセラミドおよびスフィンゴミエリンの尿中濃度の増加；糸球体上皮細胞における積層封入体（ゼブラ小体）の欠如；腎機能の改善；多汗症の軽減；被角血管腫の欠如；高頻度感音性難聴、進行性難聴、突発性難聴、または耳鳴等の聴覚異常の改善が挙げられる。神経症状の改善には、一過性虚血発作（TIA）または脳卒中の予防；および肢端知覚異常症（四肢の灼熱感や刺痛）として現れる神経障害性疼痛の改善が含まれる。ファブリー病について評価することができる別のタイプの臨床マーカーは、有害な心血管症状の有病率である。ファブリー病の一般的な心臓関連徴候および症状には、左心室肥大、弁膜症（特に、僧帽弁逸脱および／または僧帽弁逆流症）、早発性冠動脈疾患、狭心症、心筋梗塞、伝導異常、不整脈、うっ血性心不全が含まれる。

治療用量は、他の要因の中でも、対象の年齢および全身状態、疾患または障害の重症度に依存する。したがって、ヒトにおける治療的有効量は、個々の患者の反応に基づいて医師が決定することができる比較的広い範囲に入る。

さらなる実施形態では、ヒト対象に投与される有効量は、1 ng/mlより大きい、2 ng/mlより大きい、3 ng/mlより大きい、4 ng/mlより大きい、約1 ng/ml、約2 ng/ml、約2.5 ng/ml、約3 ng/ml、もしくは約3.5ng/mlの範囲への血漿GLAの増加；1 nmol/h/mLより大きい、1.5 nmol/h/mLより大きい、2 nmol/h/mLより大きい、2.5 nmol/h/mLより大きい、3 nmol/h/mLより大きい、4 nmol/h/mLより大きい、5 nmol/h/mLより大きい、6 nmol/h/mLより大きい、7 nmol/h/mLより大きい、約1 nmol/h/mL、約1.5 nmol/h/mL、約2 nmol/h/mL、約2.5 nmol/h/mL、約3 nmol/h/mL、約4 nmol/h/mL、約5 nmol/h/mL、約6 nmol/h/mL、もしくは約7 nmol/h/mLの範囲への血漿中GLA活性の増加；および／または40 nmol/L未満、30 nmol/L未満、10 nmol/L未満、5 nmol/L未満、もしくは2 nmol/L未満への血漿リゾ-Gb3の減少を提供する。血漿GLA、血漿GLA活性および血漿リゾ-Gb3は、Tsukimura et al., Molecular Genetics and Metabolism Reports 1 (2014) 288-298において提供または参照されもの等の標準的な技術を用いて測定することができる。

本発明の方法および使用は、全身的、部分的もしくは局所的、または任意の経路、例えば、注射もしくは注入による送達および投与を含む。in vivoでの医薬組成物の送達は、一般に、従来のシリンジを用いた注射によって達成され得るが、対流強化薬剤送達法（convection-enhanced delivery）等の他の送達方法も想定される（例えば、米国特許第5,720,720号参照。その開示はその全体が本明細書に組み込まれる）。例えば、組成物は、皮下に、表皮内に、皮内に、髄腔内に、眼窩内に、粘膜内に、鼻腔内に、腹腔内に、静脈内に、胸膜内に、動脈内に、腔内に、経口に、肝内に、門脈を介して、または筋肉内に送達され得る。他の投与様式には、経口および肺投与、坐剤、および経皮適用が含まれる。ファブリー病または他のリソソーム蓄積症を有する患者の治療を専門とする臨床医は、患者の状態および治療の目的を含むがこれらに限定されない多くの基準に基づいて、AAVベクターおよび非ウイルスベクターの投与のための最適な経路を決定し得る。

組成物は単独で投与され得る。ある実施形態では、rAAV粒子または非ウイルスベクターは、免疫抑制剤なしで治療効果を提供する。治療効果は、場合により、免疫抑制剤を投与せずに、例えば、2～4日、4～6日、6～8日、8～10日、10～14日、14～20日、20～25日、25～30日、または30～50日以上、例えば、50～75日、75～100日、100～150日、150～200日以上持続される。したがって、治療効果は一定期間提供される。

本発明のrAAVベクター、非ウイルスベクター、方法、および使用は、所望の治療的な、有益な、相加的な、相乗的な、または相補的な活性または効果を有する任意の化合物、薬剤、薬物、治療または他の治療レジメンまたはプロトコールと組み合わせることができる。例示的な組合せ組成物および治療は、生物製剤（タンパク質）、薬剤（例えば免疫抑制剤）および薬物等の第２の活性成分を含む。そのような生物製剤（タンパク質）、薬剤、薬物、治療および療法は、本発明の任意の他の方法または使用の前に、実質的に同時に、または後に、投与または実施され得る。

化合物、薬剤、薬物、治療または他の治療レジメンもしくはプロトコールは、組み合わせ組成物として投与することができ、または核酸、発現カセット、rAAV粒子、もしくは非ウイルスベクターの送達もしくは投与と同時に、もしくは一連の、もしくは連続して（その前もしくは後に）等、別々に投与され得る。したがって、本発明は、本発明の方法または使用が、本明細書に記載されるかまたは当業者に公知の任意の化合物、薬剤、薬物、治療レジメン、治療プロトコール、プロセス、療法または組成物との組合せである組合せを提供する。本発明の核酸、発現カセット、非ウイルスベクター、またはrAAV粒子を対象に投与する前に、実質的に同時に、または後に、化合物、薬剤、薬物、治療レジメン、治療プロトコール、プロセス、療法または組成物は投与または実施され得る。

ある実施形態では、本発明の核酸、発現ベクター、非ウイルスベクター、またはrAAV粒子は、患者がrAAV粒子および／またはGLAタンパク質に対する免疫応答を有するか、または生ずるリスクがある免疫抑制剤またはレジメンと組み合わせて患者に投与される。そのような免疫抑制剤またはレジメンは、本発明の核酸、発現カセット、非ウイルスベクター、またはrAAVベクターを投与する前、実質的に同時に、または後に投与され得る。

ある実施形態では、ファブリー病を有するヒト患者等の対象または患者は、従来の酵素補充療法での治療後（例えば、組換え産生GLAタンパク質の投与後）に起こり得るGLAタンパク質（抗GLA抗体および／または抗GLA T細胞を含む）に対するインヒビターを生じさせている。このようなGLAインヒビターの発生は、酵素補充療法を受けている患者において、特に、患者が検出不可能なGLAレベル（小児ファブリー病の場合であり得る）を有し、患者の免疫系に「異物」とみなすように導く場合に起こり得る。ある実施形態において、GLAインヒビターを有するファブリー患者は、本発明のrAAVベクターまたは非ウイルスベクターを投与する前、実質的に同時に、または後に、患者におけるGLAタンパク質に対する免疫寛容を達成するか、または免疫応答を緩和することを目的とする１以上のレジメンを投与される。GLAタンパク質に対する免疫寛容を達成するか、または免疫応答を緩和するためのそのようなレジメンは、メトトレキサート、リツキシマブ、静注ガンマグロブリン（IVIG）、オマリズマブ、および合成ワクチン粒子（SVPTM）－ラパマイシン（生分解性ナノ粒子中に封入されたラパマイシン）を含むが、これらに限定されない１以上の免疫抑制剤の投与、ならびに／またはB細胞枯渇、免疫吸着、および血漿交換等の１以上の免疫抑制プロトコールまたは手法の投与を含み得る。

ある実施形態では、rAAVベクターまたは非ウイルスベクターは、rAAVベクターまたは非ウイルスベクターを投与する前、実質的に同時に、または後に、１以上の免疫抑制剤と併せて投与される。ある実施形態では、１以上の免疫抑制剤は、rAAVベクターまたは非ウイルスベクターを投与した後、例えば、1～12時間、12～24時間もしくは24～48時間、または2～4日、4～6日、6～8日、8～10日、10～14日、14～20日、20～25日、25～30日、30～50日、もしくはそれらより長期間投与される。rAAVベクターまたは非ウイルスベクターを投与した後のある期間の後の免疫抑制剤のそのような投与は、初期発現レベルの後のある時間、例えば、rAAVベクターまたは非ウイルスベクターの後の20～25日、25～30日、30～50日、50～75日、75～100日、100～150日、150～200日または200日を超える期間、コードされたタンパク質またはインヒビター核酸の減少がある場合に行うことができる。

ある実施形態では、免疫抑制剤は抗炎症剤である。

ある実施形態では、免疫抑制剤は、ステロイド、例えば、コルチコステロイドである。ある実施形態では、免疫抑制剤は、プレドニゾン、プレドニゾロン、カルシニューリンインヒビター（例えば、シクロスポリン、タクロリムス）、MMF（ミコフェノール酸、例えばCellCept（登録商標））、Myfortic（登録商標））、CD52インヒビター（例えば、アレムツズマブ）CTLA4-Ig（アバタセプト、ベラタセプト）、抗CD3モノクローナル抗体、抗LFA-1モノクローナル抗体（例えばエファリズマブ）、抗CD40モノクローナル抗体（例えばエプラツズマブ）、抗CD20モノクローナル抗体（例えばリツキシマブ、オレリズマブ、オファツムマブ、ベルツズマブ）、プロテアソームインヒビター（例えばボルテゾミブ）、TACI-Ig（例えばアタシセプト）、抗C5 mAb（例えばエクリズマブ）、ミコフェノール酸、アザチオプリン、シロリムスエベロリムス、TNFR-Ig、抗TNFモノクローナル抗体、トファシチニブ、抗IL-2R（例えばバシリキシマブ）, 抗IL-17モノクローナル抗体（例えばセクキヌマブ）、抗IL-6モノクローナル抗体（例えば、抗IL-6抗体シルクマブ、抗IL-6受容体抗体トシリズマブ（Actemra（登録商標））、IL-10インヒビター、TGFβインヒビター、B細胞標的化抗体（例えばリツキシマブ）、哺乳類ラパマイシン標的タンパク質（mTOR）インヒビター（例えばラパマイシン）、合成ワクチン粒子（SVPTM）-ラパマイシン（生分解性ナノ粒子封入ラパマイシン）、静注ガンマグロブリン（IVIG）、オマリズマブ、メトトレキサート、チロシンキナーゼインヒビター（例えばイブルチニブ）、シクロホスファミド、フィンゴリモド、B細胞活性化因子（BAFF）インヒビター（例えば、抗BAFFモノクローナル抗体、例えば、ベリムマブ）、増殖誘導リガンド（APRIL）インヒビター、抗IL-1bモノクローナル抗体（例えば、カナキヌマブ（Haris（登録商標））、C3aインヒビター、トレギトープ（例えばUS10,213,496を参照）、またはこれらの組合せおよび／もしくは誘導体、ならびに／またはB細胞枯渇、免疫吸着、および血漿交換等の１以上の免疫抑制プロトコールもしくは手法の投与である。

ラパマイシンの使用を含む免疫抑制プロトコールは、単独で、またはIL-10と組み合わせて、GLAタンパク質に対する体液性および細胞性免疫応答を減少、低減、阻害、予防または遮断するために使用され得る。本発明のAAVベクターを用いた肝臓遺伝子導入は、制御性T細胞（Treg）の誘導および他の機構を介してGLAタンパク質に対する免疫寛容を誘導するために使用され得る。全身性遺伝子導入においてAAVに対する体液性免疫を低減（克服）または回避するための戦略には、高ベクター用量の投与、抗AAV抗体を吸着するためのデコイとしてのAAV空カプシドの使用、AAVに対する体液性免疫応答を減少、低減、阻害、防止または根絶するための免疫抑制薬の投与、AAVカプシド血清型の変更、または中和抗体に対する感受性がより低くなるようなAAVカプシドの改変、抗AAV免疫グロブリンを吸着するための血漿交換サイクルの使用が含まれ、それによって抗AAV抗体力価を低減すること、およびバルーンカテーテル等の送達技術の使用、その後の生理食塩水洗浄が含まれる。そのような戦略は、Mingozzi et al., 2013, Blood, 122:23-36に記載されている。さらなる戦略には、Bertin et al., 2020, Sciに記載されるように、血漿からの総免疫グロブリンプールを枯渇させることなく抗AAV抗体を選択的に枯渇させるために、AAV特異的プラスマフェレーシスカラムを使用することが含まれる。Rep. 10:864. https://doi.org/10.1038/s41598-020-57893-zを参照。

AAV空カプシド対rAAVベクターの比は、例えば、約100：1～50：1、約50：1～25：1、約25：1～10：1、約10：1～1：1、約1：1～1：10、約1：10～1：25、約1：25～1：50、もしくは約1：50～1：100の範囲内またはその間であり得る。比率はまた、約2：1、3： 1、4：1、5：1、6：1、7：1、8：1、9：1、または10：1であり得る。

投与するAAV空カプシドの量は、特定の対象において産生されるAAV抗体の量（力価）に基づいて調整することができる。AAV空カプシドは、任意の血清型、例えば、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、Rh10、Rh74（配列番号：３５）、AAV3B、LK03（配列番号：４２）AAV-2i8、配列番号：１１０の配列、配列番号：３６の配列、および／または配列番号：３７の配列のものであり得る。

あるいは、またはさらに、rAAVベクターまたは非ウイルスベクターは、直接的な筋肉内注射（例えば、筋肉の１以上の遅筋線維）によって送達され得る。別の代替法では、大腿動脈に導入されたカテーテルを使用して、肝動脈を介して肝臓にrAAVベクターまたは非ウイルスベクターを送達することができる。内視鏡的逆行性胆管膵管造影（ERCP）等の非外科的手段を実施して、rAAVベクターまたは非ウイルスベクターを肝臓に直接的に送達し、それによって血流およびAAV抗体をバイパスすることもできる。顎下腺の管等の他の管系もまた、rAAVベクターまたは非ウイルスベクターを、抗AAV抗体を生ずるかまたは既存の抗AAV抗体を有する対象に送達するための門脈として使用され得る。

AAVに対する体液性免疫を減少させるためのさらなる戦略には、一般にアフェレーシスと呼ばれるAAV抗体、より詳細には血液製剤が関与するプラズマフェレーシスを除去、枯渇、捕捉、および／または不活性化する方法が含まれる。アフェレーシスまたはプラズマフェレーシスは、ヒト対象の血漿が患者に戻る前に、成分の添加、除去、および／または置換により血漿を改変するデバイスを通して、ex vivo（体外）で循環されるプロセスである。血漿アフェレーシスを用いて、血液製剤（例えば血漿）からヒト免疫グロブリン（例えば、IgG、IgE、IgA、IgD）を除去することができる。この手順は、AAVに結合する免疫グロブリン（抗体）を枯渇、捕捉、不活性化、減少、または除去し、それによって、AAVベクター中和に寄与し得る、処置された対象におけるAAV抗体の力価を減少させる。一例は、AAVカプシド親和性マトリックスカラムから構成されるデバイスである。AAVカプシド親和性マトリックスを通じて血液製剤（例えば血漿）を通過させると、AAV抗体、および全てのアイソタイプ（IgG、IgM等を含む）のみが結合することになる。

AAVカプシド親和性マトリックスを使用する十分な量のプラズマフェレーシスは、AAVカプシド抗体を実質的に除去し、ヒトにおけるAAVカプシド抗体力価（負荷）を低下させると予測される。ある実施形態では、処置された対象における力価が実質的に低レベルに（＜1：5、またはそれ未満に、例えば＜1：4、または＜1：3、または＜1：2、または＜1：1に）低下する。AAVカプシド抗体を産生するBリンパ球は、プラズマフェレーシス前にAAVカプシド抗体力価を定常状態レベルに徐々に回復させると予想されるため、抗体力価の低下は一時的である。

既存のAAV抗体力価が1：100から1：1に減少した場合、約0.15％（1：1.2の力価に相当する）、0.43％（1：1.4）、0.9％（1：1.9）、1.7％（1：2.7）、および3.4％（1：4.4）のAAV抗体力価リバウンドが、プラズマフェレーシス法の完了後1時間、3時間、6時間、12時間、および24時間でそれぞれ起こる。そのような対象からのAAV抗体の一時的な除去は、AAVベクターが対象に投与され、AAV抗体によるAAVベクターの実質的な中和なしに標的組織を効率的に形質導入することが予測され得る時間ウィンドウ（例えば、約24時間またはそれ以下、例えば、12時間またはそれ以下、または6時間またはそれ以下、または3時間またはそれ以下、または2時間またはそれ以下、または1時間またはそれ以下）に対応する。

既存のAAV抗体力価が1：1000から1：1に減少した場合、約0.15％（1：2.5の力価に相当する）、0.4％（1：5.3）、0.9％（1：9.7）、1.7％（1：18）、および3.4％（1：35）のAAV抗体力価リバウンドが、プラズマフェレーシス法の完了後1時間、3時間、6時間、12時間、および24時間でそれぞれ起こる。したがって、AAVベクターの投与のためのウィンドウは比較的短くなる。

AAV抗体は、既存のものであり得、標的細胞の治療的GLA遺伝子導入ベクター形質導入を低減または遮断するレベルで存在し得る。あるいは、AAV抗体は、AAVへの曝露またはAAVベクターの投与後に発生し得る。このような抗体がAAVベクターの投与後に発生する場合、これらの対象はまた、アフェレーシス、より具体的には、プラズマフェレーシスを介して治療され得る。

ある実施形態では、本発明のポリヌクレオチド、発現カセット、AAVベクター、および非ウイルスベクターは、ヒト血漿中の抗体（例えばIgG）レベルを低下させるための方法と組み合わせて使用され得る。ある実施形態では、本発明のポリヌクレオチド、発現カセット、AAVベクター、および非ウイルスベクターは、抗FcRn抗体等の、IgGと新生児Fc受容体（FcRn）との相互作用を遮断、阻害、もしくは減少させる薬剤と組み合わせて使用され、IgGリサイクルを減少させ、in vivoでIgGクリアランスを増強し、かつ／または、組換えウイルスベクター等の、ウイルスベクターに結合する循環抗体を減少させるか、もしくは組換えウイルスベクターによって封入された治療用ヘテロポリヌクレオチドによってコードされる核酸もしくはポリペプチド、タンパク質もしくはペプチドに結合するか、もしくは治療用ヘテロポリヌクレオチドに結合する薬剤と組み合わせて使用され得る。

ある実施形態では、ウイルスベクターへの抗体結合は、IgGと、FcRn、プロテアーゼまたはグリコシダーゼとの相互作用を低減する薬剤によって低減または阻害される。

ある実施形態では、本発明のポリペプチド、発現カセット、AAVベクター、または非ウイルスベクターは、エンドペプチダーゼ（例えば、化膿性レンサ球菌（Streptococcus pyogenes）由来のIdeS）もしくはその改変変異体、またはエンドグリコシダーゼ（例えば、化膿性レンサ球菌EndoS）もしくはその改変変異体と組み合わせて使用され得る。ある実施形態では、本発明のポリペプチド、発現カセット、AAVベクター、または非ウイルスベクターは、エンドペプチダーゼ（例えば、化膿性レンサ球菌由来のIdeS）もしくはその改変変異体、またはエンドグリコシダーゼ（例えば、化膿性レンサ球菌由来のEndoS）もしくはその改変変異体と組み合わせて対象に投与され、AAVカプシドに対する中和抗体を減少させるか、または除去し、遺伝子治療に適格でないと既にみなされた患者の治療を可能にし、またはAAV遺伝子治療後にAAV抗体を生ずる患者の治療を可能にする。そのような戦略は、Leborgne et al., 2020, Nat. Med., 26:1096-1101 (2020)に記載される。

ある実施形態では、本発明の核酸、発現カセット、AAVベクター、および非ウイルスベクターは、例えば、気管支拡張剤；補聴器；局所皮膚保湿剤；利尿剤、ACE阻害剤、心臓デバイス等の典型的な心臓治療；疼痛緩和または腎保護のための治療薬；抗血栓療法および抗不整脈療法による脳卒中予防；末期腎不全の場合の抗タンパク尿剤、腎臓透析および／または腎臓移植；ならびに適切な栄養および消化器症状を管理を確保するためのメトクロプラミド、H2ブロッカー、および食事療法と組み合わせて使用することができる（例えば、Germain, Orphanet J Rare Dis. 2010 Nov 22;5:30; Ortiz et al., Mol Genet Metab. 2018 Apr;123(4):416-427;およびMehta et al., QJM: Inter. Jour. Med. 2010 Sept;103(9):641-659を参照）。

ある実施形態では、本発明のポリヌクレオチド、発現カセットおよびAAVベクターは、薬学的シャペロン療法（酵素増強療法としても知られる）と組み合わせて使用することができ、１以上の薬学的シャペロンは、ファブリー病等のリソソーム蓄積症の治療のために、本発明のポリヌクレオチド、発現カセット、AAVベクター、または非ウイルスベクターの投与の前、同時、または後に投与され得る。

ある実施形態では、本発明のポリヌクレオチド、発現カセット、AAVベクター、および非ウイルスベクターは、GLAタンパク質を安定化し得る１以上の薬学的シャペロンと組み合わせて使用され得る。本発明のポリヌクレオチド、発現カセットおよびAAVベクターと組み合わせて使用することができる薬学的シャペロンには、例えば、1-デオキシガラクトノジリマイシン（DGJ）、ミガラスタット（Migalastat）塩酸塩、α-3,4-ジ-エピホモノジリマイシン、4-エピホモノジリマイシン、4-エピファゴミン、αアロホモノジリマイシン、N-メチルデオキシガラクトノジリマイシン、β-1-C-ブチルデオキシガラクトノジリマイシン、αガラクトホモノジリマイシン、キャリステジンA3、キャリステジンB2、N-メチルキャリステジンB2およびN-メチルキャリステジンB3、および米国特許第6,274,597号、第6,774,135号、および第6,599,919号に記載されるその他のものが含まれ、これらの開示はその全体が本明細書に組み込まれる。

ある実施形態では、本発明のポリヌクレオチドおよび発現カセットは、AAVベクター粒子を介して送達または投与される。ある実施形態では、本発明のポリヌクレオチドおよび発現カセットは、レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルパー依存性アデノウイルス、ハイブリッドアデノウイルス、単純ヘルペスウイルス、レンチウイルス、ポックスウイルス、エプスタイン・バーウイルス、ワクシニアウイルス、およびヒトサイトメガロウイルス粒子を含む他のタイプのウイルス粒子を介して送達または投与され得る。ある実施形態では、本発明のポリヌクレオチドおよび発現カセットは、非ウイルスベクターを介して送達または投与され得る。

キット
本発明は、パッケージ材料およびその中の１以上の構成要素を有するキットを提供する。キットは、典型的には、その中の構成要素のin vitro、in vivo、またはex vivoでの使用のための構成要素または指示書の説明を含むラベルまたはパッケージ挿入物を含む。キットは、そのような構成要素の集合、例えば、rAAV粒子または非ウイルスベクター、および、場合により、別の化合物、薬剤、薬物または組成物等の第2の活性成分を含み得る。

キットは、キットの１つ以上の成分を収容する物理的構造を指す。

パッケージ材料は、成分を滅菌状態に維持し得るものであり、そのような目的のために一般に使用される材料（例えば、紙、ダンボール原紙、ガラス、プラスチック、ホイル、アンプル、バイアル、チューブ等）から作製され得る。

ラベルまたは挿入物は、その中の１以上の構成要素、用量、作用機序、薬物動態および薬力学を含む活性成分の臨床薬理学の識別情報を含み得る。ラベルまたは挿入物は、製造業者情報、ロット番号、製造場所および日付、有効期限を識別する情報を含み得る。ラベルまたは挿入物は、キット構成要素が使用され得る疾患に関する情報を含み得る。ラベルまたは挿入物は、方法、使用、または治療プロトコールもしくは治療レジメンにおいてキット構成要素のうちの１以上を使用するための、臨床医または対象のための指示書を含み得る。指示書は、用量、用法または期間、および本明細書に記載の方法、使用、治療プロトコールまたは予防もしくは治療レジメンのいずれかを実施するための指示を含み得る。

ラベルまたは挿入物は、予防的または治療的な利益等の、構成要素が提供し得る任意の利益に関する情報を含み得る。ラベルまたは挿入物は、特定の組成物を使用することが適切ではない状況に関する対象または臨床医に対する警告等の、潜在的な有害な副作用、合併症または反応に関する情報を含み得る。有害な副作用または合併症はまた、対象が組成物と不適合であり得る１以上の他の薬剤を有する、服用し得る、もしくは服用している場合、または対象が組成物と不適合であり得る別の治療プロトコールまたは治療レジメンを有する、受け得る、もしくは受けている場合にも起こり得、したがって、指示書は、そのような不適合に関する情報を含み得る。

ラベルまたは挿入物は、「印刷物」、例えば、紙もしくはボール紙、もしくは成分、キットもしくはパッケージ材料（例えば箱）に別々にもしくは貼り付けられた、またはキット構成要素を含むアンプル、チューブもしくはバイアルに取り付けられた「印刷物」を含む。ラベルまたは挿入物は、さらに、バーコード付き印刷ラベル等のコンピュータ可読媒体、ディスク、CD-もしくはDVDROM/RAM等の光ディスク、DVD、MP3、磁気テープ等の光ディスク、またはRAMおよびROM等の電気記憶媒体、または磁気/光記憶媒体、FLASH媒体もしくはメモリ型カード等のこれらのハイブリッドを含み得る。

表１において、配列番号：１５～１９の終止コドンを太字で示す。

さらなる態様および実施形態
さらなる態様および実施形態の第１のセットは、以下に提供される:

１．α－ガラクトシダーゼＡ（GLA）をコードする核酸を含むポリヌクレオチドであって、核酸が、（１）配列番号：１５の配列に対して少なくとも75％の配列同一性を有するポリヌクレオチド、（２）配列番号：１６の配列に対して少なくとも84％の配列同一性を有するポリヌクレオチド、（３）配列番号：１７の配列に対して少なくとも86％の配列同一性を有するポリヌクレオチド、（４）配列番号：１８の配列に対して少なくとも86％の配列同一性を有するポリヌクレオチド、および（５）配列番号：１９の配列に対して少なくとも83％の配列同一性を有するポリヌクレオチドからなる群から選択され、任意に、GLAが配列番号：１００のアミノ酸配列を含む、ポリヌクレオチド。

２．核酸が、14個未満のCpGジヌクレオチドを含み、任意に、0個のCpGジヌクレオチドを含む、１．に記載のポリヌクレオチド。

３．核酸が、配列番号：１５～１９のいずれかの配列を有する、１．または２．に記載のポリヌクレオチド。

４．α－ガラクトシダーゼＡ（GLA）タンパク質をコードする核酸を含むポリヌクレオチドであって、前記GLAタンパク質が、Gln57Lys、Gln111Glu、Lys213Glu、Lys237Gln、Phe248Thr、Gly334Glu、およびGly346Asnからなる群から選択される１以上のアミノ酸置換を有する配列番号：１００のアミノ酸配列を有し、任意に、GLAが配列番号：４８のアミノ酸配列を含む、ポリヌクレオチド。

５．核酸が配列番号：４７の配列を有する、４．に記載のポリヌクレオチド。

６．GLAをコードする核酸内に位置するイントロンをさらに含む、１．～５．のいずれかに記載のポリヌクレオチド。

７．イントロンが、GLAをコードする核酸のヌクレオチド７８および７９の間に位置し、ヌクレオチド位置が、配列番号：１４の配列を有するGLAのコード配列に関して与えられる、６．に記載のポリヌクレオチド。

８．イントロンが、ビトロネクチン1（VTN1）遺伝子、レチノール結合タンパク質4（RBP4）遺伝子、マウスIgG重鎖A（IgHA）遺伝子、およびマウスIgG重鎖μ（IgHμ）遺伝子からのイントロンからなる群から選択され、任意に、イントロンが配列番号：４９～５２の１つの配列を含む、７．に記載のポリヌクレオチド。

９．核酸が、配列番号：４３～４６のいずれかの配列を有する、６．～８．のいずれかに記載のポリヌクレオチド。

１０．GLAをコードする核酸の5'末端に位置するシグナルペプチド配列をコードする第２の核酸をさらに含む、１．～９．のいずれかに記載のポリヌクレオチド。

１１．シグナルペプチド配列が、ヘテロまたは内因性または天然のシグナルペプチド配列である、１０．に記載のポリヌクレオチド。

１２．シグナルペプチドが、ヒトキモトリプシノーゲンB2シグナルペプチド、AHSGシグナルペプチド、CD300シグナルペプチド、LAMP1シグナルペプチド、Notch 2シグナルペプチド、ORM1シグナルペプチド、TFシグナルペプチド、および野生型GLAシグナルペプチド、またはこれらの変異体からなる群から選択される、１０．または１１．に記載のポリヌクレオチド。

１３．シグナルペプチドが、ヒトキモトリプシノーゲンB2シグナルペプチドである、１２．に記載のポリヌクレオチド。

１４．シグナルペプチドをコードする核酸が、配列番号：１～５のいずれかの配列を有する、１３．に記載のポリヌクレオチド。

１５．発現制御エレメントに作動可能に連結された、１．～１４．のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含む発現カセット。

１６．発現制御エレメントが、肝臓特異的発現制御エレメントである、１５．に記載の発現カセット。

１７．発現制御エレメントが、GLAをコードする核酸の5'に位置する、１５．または１６．に記載の発現カセット。

１８．GLAをコードする核酸の3'に位置するポリアデニル化配列をさらに含む、１５．～１７．のいずれかに記載の発現カセット。

１９．発現制御エレメントまたはポリアデニル化配列が、野生型発現制御エレメントまたはポリアデニル化配列と比較してCpGが減少したものである、１５．～１８．のいずれかに記載の発現カセット。

２０．発現制御エレメントが、ApoE/hAATエンハンサー/プロモーター配列を含む、１５．～１９．のいずれかに記載の発現カセット。

２１．ポリアデニル化配列が、ウシ成長ホルモン（bGH）ポリアデニル化配列を含む、１５．～２０．のいずれかに記載の発現カセット。

２２．ApoE/hAATエンハンサー/プロモーター配列またはbGHポリアデニル化配列が、野生型ApoE/hAATエンハンサー/プロモーター配列またはbGHポリアデニル化配列と比較して、CpGが減少したものである、２０．または２１．に記載の発現カセット。

２３．ApoE/hAATエンハンサー/プロモーター配列が、配列番号：３８の配列を含む、２０．に記載の発現カセット。

２４．bGHポリアデニル化配列が、配列番号：２０の配列を含む、２１．に記載の発現カセット。

２５．発現制御エレメントの3'末端と核酸の5'末端との間に位置するイントロンをさらに含む、１５．～２４．のいずれかに記載の発現カセット。

２６．イントロンがhBB2m1イントロンを含む、２５．に記載の発現カセット。

２７．イントロン配列が、配列番号：３９の配列を含む、２６．に記載の発現カセット。

２８．１．～２７．のいずれかに記載のポリヌクレオチドまたは発現カセットを含む、アデノ随伴ウイルス（AAV）ベクター。

２９．AAVベクターが、（ａ）１つ以上のAAVカプシド、および（ｂ）AAV ITRが核酸または発現カセットの5'または3'末端に隣接する、１つ以上のAAV逆方向末端反復（ITR）を含む、２８．に記載のAAVベクター。

３０．少なくとも１つ以上のITRが、減少したCpGを有するように改変されている、２９．に記載のAAVベクター。

３１．AAVベクターが、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、Rh10、Rh74（配列番号：３５）、AAV3B, LK03（配列番号：４２）、AAV-2i8、配列番号：１１０、配列番号：３６、および／もしくは配列番号：３７に対して90％以上の配列同一性を有する改変または修飾または変異AAV VP1、VP2および／またはVP3カプシド；またはAAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、Rh10、Rh74（配列番号：３５、AAV3B、LK03（配列番号：４２）、AAV-2i8、配列番号：１１０、配列番号：３６、および／もしくは配列番号：３７に対して95％以上の配列同一性を有するカプシド；またはAAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、Rh10、Rh74（配列番号：３５）、AAV3B、LK03（配列番号：４２）、AAV-2i8、配列番号：１１０、配列番号：３６、および／もしくは配列番号：３７と100％の配列同一性を有するカプシドを含むカプシド血清型を有する、２８．～３０．のいずれかに記載のAAVベクター。

３２．ITRが、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、Rh10、Rh74、AAV3B AAV血清型のいずれかの１以上のITR、またはこれらの組み合わせを含む、２８．～３１．のいずれかに記載のAAVベクター。

３３．配列番号：２１～３４および５３～５６のいずれかのポリヌクレオチド配列を含む、AAVベクター。

３４．生物学的に適合性を有する担体または賦形剤中に、２８．～３３．のいずれかの複数のAAVベクターを含む、医薬組成物。

３５．空のAAVカプシドをさらに含む、３４．に記載の医薬組成物。

３６．空のAAVカプシド対AAVベクターの比が、約100：1～約50：1、約50：1～約25：1、約25：1～約10：1、約10：1～約1：1、約1：1～約1：10、約1：10～約1：25、約1：25～約1：50、または約1：50～約1：100である、３５．に記載の医薬組成物。

３７．界面活性剤をさらに含む、３４．～３６．のいずれかに記載の医薬組成物。

３８．α－ガラクトシダーゼＡ（GLA）を必要とする対象を治療する方法であって、治療的有効量の１．～２４．のいずれかに記載のポリヌクレオチドもしくは発現カセット、または２５．～３０．のいずれかに記載のAAVベクター、または３１．～３４．のいずれかに記載の医薬組成物を対象に投与することを含み、GLAが該対象において発現される、方法。

３９．対象がファブリー病を有する、３８．に記載の方法。

４０．ポリヌクレオチド、発現カセット、AAVベクター、または医薬組成物が、静脈内に、動脈内に、腔内に、粘膜内に、またはカテーテルを介して、対象に投与される、３８．または３９．に記載の方法。

４１．AAVベクターが、対象の体重1キログラム当たり約1×10⁸～約1×10¹⁴ベクターゲノム（vg/kg）の範囲で対象に投与される、３８．～４０．のいずれかに記載の方法。

４２．方法が、GLAの必要性もしくはファブリー病の１以上の症状を低減し、減少させ、もしくは阻害し；またはGLAの必要性もしくはファブリー病の１以上の症状の進行もしくは悪化を防止もしくは低減し；またはGLAの必要性もしくはファブリー病の１以上の症状を安定化させ；またはGLAの必要性もしくはファブリー病の１以上の症状を改善する、３８．～４１．のいずれかに記載の方法。

４３．１．～２７．のいずれかに記載のポリヌクレオチドまたは発現カセットを含む、細胞。

４４．２８．～３３．のいずれかに記載のAAVベクターを産生する、細胞。

４５．（Ａ）１．～２２．のいずれかのポリヌクレオチドまたは発現カセットを含むAAVベクターゲノムをパッケージングヘルパー細胞に導入すること；および（ｂ）AAVベクターを産生する条件下でヘルパー細胞を培養することを含む、２８．～３３．のいずれかに記載のAAVベクターを産生する方法。

さらなる態様および実施形態の第２のセットは：

態様１は、以下からなる群から選択される核酸配列を含むポリヌクレオチドを対象とする：
（ａ）α－ガラクトシダーゼＡ（GLA）をコードする核酸配列であって、核酸配列が配列番号：１５の配列に対して少なくとも約85％の配列同一性を有し、かつGLAが配列番号：１００の配列に対して少なくとも95％の配列同一性を有する、核酸配列；
（ｂ）挿入されたイントロンを含むα－ガラクトシダーゼＡ（GLA）をコードする核酸配列であって、挿入されたイントロンを含むGLAが、挿入されたイントロンの非存在下で、配列番号：１００の配列に対して少なくとも95％の配列同一性を有する、核酸配列；
（ｃ）α－ガラクトシダーゼＡ（GLA）のアミノ末端に連結されたシグナルペプチドを含む前駆体α－ガラクトシダーゼＡをコードする核酸配列であって、シグナルペプチドが、配列番号：４１、配列番号：５７、配列番号：５８、配列番号：６０、配列番号：６１、配列番号：６２、および配列番号：６３からなる群から選択される配列に対して少なくとも80％の配列同一性を有し；かつGLAが配列番号：１００の配列に対して少なくとも95％の配列同一性を有する、核酸配列；
（ｄ）配列番号：１００と1～7個のアミノ酸が異なるアミノ酸配列を有するα－ガラクトシダーゼＡ（GLA）をコードする核酸であって、1～7個のアミノ酸の少なくとも１つが、Gln57Lys、Gln111Glu、Lys213Glu、Lys237Gln、Phe248Thr、Gly334Glu、およびGly346Asnからなる群から選択される置換である、核酸。

「前駆体」α－ガラクトシダーゼＡという場合、シグナルペプチドの存在を示す。シグナルペプチドは、GLAに関連する天然に存在するペプチド、または異なるもしくはヘテロシグナルペプチドであり得る。

態様１（ａ）の異なる実施形態では、核酸は、配列番号：１５、１６、１７もしくは１８の配列に対して少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、もしくは100％の配列同一性、または配列番号：１５、１６、１７もしくは１８の配列の１～１１９４番目の塩基に対して少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、もしくは100％の配列同一性（塩基１～１１９４はアミノ酸コード領域を提供する）を有し；独立して、GLAは配列番号：１００の配列に対して少なくとも95％、少なくとも98％、または100％の配列同一性を有する。独立してという場合、配列番号：５の配列に対する、提供される配列同一性のいずれかが、配列番号：１００の配列の提供される配列同一性のいずれかと組み合され得ることを示す。例えば、配列番号：１５の配列に対して少なくとも90％の配列同一性を有する核酸は、配列番号：１００の配列に対して少なくとも95％、少なくとも98％、または100％の配列同一性を有するGLAをコードし得；配列番号：１５の配列に対して少なくとも95％の配列同一性を有する核酸は、配列番号：１００の配列に対して少なくとも95％、少なくとも98％、または100％の配列同一性を有するGLAをコードし得；配列番号：１５の配列の核酸は、配列番号：１００の配列に対して少なくとも95％、少なくとも98％、または100％の配列同一性を有するGLAをコードし得る。

態様１（ｂ）の異なる実施形態では、配列番号：１００の配列に対するGLAの配列同一性は、挿入されたイントロンの非存在下で少なくとも98％または100％である。

態様１（ｃ）の異なる実施形態では、シグナルペプチドは、配列番号：４１の配列に対して少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％もしくは100％の配列同一性を有し；配列番号：５７の配列に対して少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％もしくは100％の配列同一性を有し；配列番号：５８の配列に対して少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％もしくは100％の配列同一性を有し；配列番号：５９の配列に対して少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％もしくは100％の配列同一性を有し；配列番号：６０の配列に対して少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％もしくは100％の配列同一性を有し；配列番号：６１の配列に対して少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％もしくは100％の配列同一性を有し；配列番号：６２の配列に対して少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％もしくは100％の配列同一性を有し；または配列番号：６３の配列に対して少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％もしくは100％の配列同一性を有し；GLAに関して、それぞれ独立して、配列番号：１００の配列に対して少なくとも95％、少なくとも98％もしくは100％の配列同一性を有する。それぞれ独立してという場合、配列同定に伴う、提供されるシグナル配列のそれぞれが、配列番号：1００の配列に対して、提供される配列同一性のいずれかを有するGLAと組み合わされ得ることを示す。例えば、配列番号：４１の配列に対して少なくとも85％の配列同一性を有するシグナルペプチドは、配列番号：１００の配列に対して少なくとも95％、少なくとも98％、または100％の配列同一性を有するGLAと組み合わされ得；配列番号：４１の配列に対して少なくとも90％の配列同一性を有するシグナルペプチドは、配列番号：１００の配列に対して少なくとも95％、少なくとも98％、または100％の配列同一性を有するGLAと組み合わされ得；配列番号：４１の配列に対して少なくとも95％の配列同一性を有するシグナルペプチドは、配列番号：１００の配列に対して少なくとも95％、少なくとも98％、または100％の配列同一性を有するGLAと組み合わされ得；かつ配列番号：４１の配列のシグナルペプチドは、配列番号：１００の配列に対して少なくとも95％、少なくとも98％、または100％の配列同一性を有するGLAと組み合わされ得る。

態様１（ｃ）のさらなる実施形態では、シグナルペプチドを含む前駆体α－ガラクトシダーゼＡは、配列番号：１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８および１０９からなる群から選択される配列に対して少なくとも95％、97％、99％または100％の同一性を有するアミノ酸配列を有し；かつシグナルペプチドを含む前駆体α－ガラクトシダーゼＡは、配列番号：１０９に対して少なくとも95％、97％、99％または100％のアミノ酸配列を有する。

態様１（ｄ）の異なる実施形態では、GLAをコードする核酸は、1～7個のアミノ酸置換によって配列番号：１００の配列と異なり、1個、2個、3個、4個、5個、6個、または7個のアミノ酸置換の各々は、Gln57Lys、Gln111Glu、Lys213Glu、Lys237Gln、Phe248Thr、Gly334Glu、およびGly346Asnからなる群から選択され、GLAは配列番号：４８のアミノ酸配列を含む。

実施形態１は、配列番号：４７、もしくは配列番号：４７の塩基１～１１９４に対して少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％の配列同一性を含むか、または配列番号：４７もしくは配列番号：４７の塩基１～１１９４の配列によって提供される、核酸を提供することによる、態様１（ｄ）および態様１（ｄ）の異なる実施形態をさらに記載する。

態様または実施形態をさらに記載するという場合、さらなる説明が、参照の態様または実施形態において提供される説明の各々に適用されることを提供する。例えば、態様１（ｄ）および態様１（ｄ）の異なる実施形態をさらに説明する実施形態１は、実施形態１の異なる実施形態が、態様１（ｄ）および態様１（ｄ）の異なる実施形態において提供される任意の説明に、独立して適用され得ることを提供する。

実施形態２は、イントロンの非存在下で提供されるGLAが、態様１（ａ）および態様１（ａ）の異なる実施形態、態様１（ｂ）および態様１（ｂ）の異なる実施形態、態様１（ｄ）および態様１（ｄ）の異なる実施形態のいずれか、または実施形態１において提供されるGLA配列を含み、イントロンがGLAのヌクレオチド７８と７９の間に位置し、ヌクレオチド位置が配列番号：１４のGLAのコード配列を参照して与えられる、ことを提供することによる、態様１（ｂ）をさらに記載する。

実施形態３は、態様１（ｄ）および態様１（ｄ）の異なる実施形態、ならびに実施形態２は、イントロンが、配列番号：４９、５０、５１、または５２の配列に対して少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、または100％の配列同一性を有することを提供することによる、実施形態２をさらに記載する。

実施形態４は、イントロンを含むGLAが、配列番号：４３、４４、４５または４６の配列に対して少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％または100％の配列同一性を有することを提供することによる、態様１（ｄ）をさらに記載する。

実施形態５は、態様１（ａ）および態様１（ａ）の異なる実施形態、態様１（ｂ）および態様１（ｂ）の異なる実施形態、態様１（ｄ）および態様１（ｄ）の異なる実施形態、ならびに、ポリヌクレオチドを提供することによる実施形態１、２、３、および４をさらに記載し、第２の配列は、GLA核酸配列の5'末端に位置するシグナルペプチド配列をコードする。シグナルペプチド配列は、ヘテロ、内在性もしくは天然のシグナルペプチド配列、またはこれらの誘導体であり得る。

実施形態６は、異なる実施形態において提供することによる実施形態５をさらに記載し、ペプチドシグナルは、配列番号：４１の配列に対して少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％もしくは100％の配列同一性を有し；配列番号：５７の配列に対して少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％もしくは100％の配列同一性を有し；配列番号：５８の配列に対して少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％もしくは100％の配列同一性を有し；配列番号：５９の配列に対して少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％もしくは100％の配列同一性を有し；配列番号：６０の配列に対して少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％もしくは100％の配列同一性を有し；配列番号：６１の配列に対して少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％もしくは100％の配列同一性を有し；配列番号：６２の配列に対して少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％もしくは100％の配列同一性を有し；または配列番号：６３の配列と少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％もしくは100％の配列同一性を有する。

実施形態７は、態様１（ａ）および態様１（ａ）の異なる実施形態、態様（１ｂ）および態様１（ｂ）の異なる実施形態、態様１（ｃ）および態様１（ｃ）の異なる実施形態、態様１（ｄ）および態様１（ｄ）の異なる実施形態ならびに実施形態１～６のいずれかに提供される配列をコードするGLAをさらに記載し、GLAコード配列は、14個、13個、12個、11個、10個、9個、8個、7個、6個、5個、4個、3個、2個または1個より少ないCpGジヌクレオチドを含む。

態様２は、態様１（ａ）および態様１（ａ）の異なる実施形態、態様１（ｂ）および態様１（ｂ）の異なる実施形態、態様１（ｃ）および態様１（ｃ）の異なる実施形態、態様１（ｄ）および態様１（ｄ）の異なる実施形態、ならびに実施形態１～７の異なる実施形態において提供されるポリヌクレオチドを含む発現カセットを対象とし、ポリヌクレオチドは、発現制御エレメントに作動可能に連結される。

実施形態８は、ポリペプチドの説明が態様２および態様２の異なる実施形態に提供される通りであり、発現制御エレメントが肝臓特異的発現制御エレメントであり、発現制御エレメントがApoE/hAATエンハンサー/プロモーター配列を含むか、または配列番号：３８の配列もしくは配列番号：３８に対して少なくとも98％の配列同一性を有する配列を含む、態様２をさらに説明する。

参照される態様または実施形態における説明という場合、参照される態様（関連する実施形態を含む）および参照される実施形態（異なる説明される実施形態を含む）の組み込みを提供する。例えば、態様２で提供されるポリペプチドの説明という場合、異なる実施形態では、態様１（ａ）および態様１（ａ）の異なる実施形態；態様１（ｂ）および態様１（ｂ）の異なる実施形態、態様１（ｃ）および態様１（ｃ）の異なる実施形態、態様１（ｄ）および態様１（ｄ）の異なる実施形態、ならびに実施形態１～７で提供されるポリヌクレオチドが記載される。

実施形態９は、発現制御がポリヌクレオチドの5'に位置することを提供することによる、実施形態８の発現制御エレメントをさらに記載する。

実施形態１０は、発現カセットがポリヌクレオチドの3'に位置するポリアデニル化配列をさらに含む、実施形態２、実施形態８および実施形態９の発現カセットをさらに記載する。さらなる実施形態では、ポリアデニル化配列がウシ成長ホルモン（bGH）ポリアデニル化配列を含み、配列番号：２０に対して少なくとも95％または100％の配列同一性を有する配列を含む。

実施形態１１は、イントロンが発現制御エレメントの3'末端とポリヌクレオチドの5'末端との間に位置する、態様２および実施形態９～１０の発現カセットをさらに記載する。さらなる実施形態では、イントロンは、配列番号：３９の配列に対して少なくとも95％または100％の配列同一性を有する配列を含む。

実施形態１２は、発現制御エレメントおよび／またはポリアデニル化配列が、野生型発現制御エレメントまたはポリアデニル化配列と比較してCpGが減少したものである、態様２および実施形態９～１１の発現カセットをさらに記載する。

実施形態１３は、態様１（１（ａ）、１（ｂ）、１（ｃ）および１（ｄ）ならびに関連する実施形態を含む）および実施形態１～８のポリペプチド、ならびに態様２および実施形態９～１２の発現ベクターをさらに記載し、ポリペプチドまたは発現カセットは、その5'末端に隣接するAAV逆方向反復（ITR）および／またはその3'末端に隣接するAAV ITRをさらに含む。好ましくは、3'末端および5'末端はITRに隣接している。

態様３は、実施形態１３のポリヌクレオチドまたは発現カセットを含むAAVプラスミドゲノムを対象とし、複製起点が存在する。さらなる実施形態では、選択マーカーが存在する。

態様４は、実施形態１３で提供されるカプシドおよびポリヌクレオチドまたは発現カセットを含むアデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターを対象とする。AAVカプシドへという場合、修飾および変異AAVカプシドと共に天然に存在するAAVカプシドを含む。AAVカプシドは、ポリヌクレオチドまたは発現カセット、好ましくは発現カセットの細胞内送達を促進する。

実施形態１４は、態様４のAAVベクター、ならびに実施形態１３のポリペプチドおよび発現カセットを記載さらにし、ITRは、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、Rh10、Rh74、もしくはAAV3B血清型のいずれか、またはこれらの組み合わせの１以上のITRを含む。

実施形態１５は、異なる実施形態において、5'末端で5' ITRに隣接するものが、5'クローニングレムナントであり、かつ／または3'末端で3' ITRに隣接するものが、3'クローニングレムナントである、態様４、実施形態１３、および実施形態１４をさらに記載する。

実施形態１６は、5' ITRおよび／または3' ITRが、減少したCpGを有するように改変されている、態様４及び実施形態１３～１５をさらに記載する。

実施形態１７は、発現カセットが、配列番号：２１～３４、５３～５６および９１～９９のいずれかの配列に対して少なくとも95％、少なくとも98％、または100％の配列同一性を有する配列を含む、態様４および実施形態１３～１６のAAVベクターをさらに記載する。

実施形態１８は、発現カセットが、配列番号：９１～９５のいずれかの配列に対して少なくとも95％、少なくとも98％または100％の配列同一性を有する配列を含むか、またはその配列からなる、態様４および実施形態１３～１７のAAVベクターをさらに記載する。

実施形態１９は、カプシドが、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、Rh10、Rh74（配列番号：３５）、AAV3B、LK03（配列番号：４２）もしくはAAV-2i8に対して少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、もしくは100％の配列同一性を有するVP1、VP2および／もしくはVP3を含み；配列番号：１１０または４２の配列に対して少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、もしくは100％の配列同一性を有するVP1を含み；または配列番号：１１０もしくは配列番号：４２の配列に対して少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、もしくは100％の配列同一性を有するVP1、および／もしくは配列番号：３６の配列に対して少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、もしくは100％の配列同一性を有するVP2、および／もしくは配列番号：３７の配列に対して少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、もしくは100％の配列同一性を有するVP3を含む、態様４および態様１３～１８のカプシドをさらに記載する。

態様５は、態様４および実施形態１３～１９で提供されるAAVベクターと、生物学的に適合性を有する担体または賦形剤とを含む医薬組成物を対象とする。

実施形態２０は、AAVベクターが、ヒト対象におけるGLA活性を増加させ、好ましくはグロボトリアオシルスフィンゴシンを減少させるのに有効な量で提供される、態様５の医薬組成物をさらに記載する。

実施形態２１は、空のAAVカプシドをさらに含む、態様５の医薬組成物をさらに記載する。空のAAVカプシドへという場合、投与されるAAVベクターにおいて使用されるのと同じカプシドを示すが、カプシドはAAVベクターを欠く。さらなる態様において、空のAAVカプシド対AAVベクターの比は、約100：1～1：100；約100：1～約50：1；約50：1～約25：1；約25：1～約10：1；約10：1～約1：1；約1：1～約1：10；約1：10～約1：25；約1：25～約1：50；または約1：50～約1：100である。

実施形態２２は、組成物が界面活性剤さらに含む、態様５ならびに実施形態２０および２１の医薬組成物をさらに記載する。

態様６は、以下からなる群から選択されるポリペプチドを対象とする：
（ａ）α－ガラクトシダーゼＡのアミノ末端に連結されたシグナルペプチドを含む前駆体α－ガラクトシダーゼＡをコードする核酸配列であって、シグナルペプチドが、配列番号：４１、配列番号：５７、配列番号：５８、配列番号：５９、配列番号：６０、配列番号：６１、配列番号：６２、および配列番号：６３からなる群から選択される配列に対して少なくとも80％の配列同一性を有し；前記GLAが、配列番号：１００の配列に対して少なくとも95％の配列同一性を有する、核酸配列；および
（ｂ）配列番号：１００の配列と1～7個のアミノ酸が異なるアミノ酸配列を有するα－ガラクトシダーゼＡ（GLA）であって、前記1～7個のアミノ酸の少なくとも１つは、Gln57Lys、Gln111Glu、Lys213Glu、Lys237Gln、Phe248Thr、Gly334Glu、およびGly346Asnからなる群から選択される置換である、GLA。

態様６（ａ）の異なる実施形態では、シグナルペプチドは、配列番号：４１の配列に対して少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％もしくは100％の配列同一性を有し；配列番号：５７の配列に対して少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％もしくは100％の配列同一性を有し；配列番号：５８の配列に対して少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％もしくは100％の配列同一性を有し；配列番号：６０の配列に対して少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％もしくは100％の配列同一性を有し；配列番号：６１の配列に対して少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％もしくは100％の配列同一性を有し；配列番号：６２の配列に対して少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％もしくは100％の配列同一性を有し；または配列番号：６３の配列に対して少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％もしくは100％の配列同一性を有し；それぞれ独立して、GLAに関して、配列番号：１００の配列に対して少なくとも95％、少なくとも98％、または100％の配列同一性を有する。

態様６（ｂ）の異なる実施形態では、GLAが、配列番号：１００と1～7個のアミノ酸置換が異なるアミノ酸配列を有し、1個、2個、3個、4個、5個、6個、または7個のアミノ酸置換は、それぞれ独立して、Gln57Lys、Gln111Glu、Lys213Glu、Lys237Gln、Phe248Thr、Gly334Glu、およびGly346Asnからなる群から選択され；GLAは配列番号：４８のアミノ酸配列を含む。

態様７は、GLAを必要とする対象を治療する方法であって、治療的有効量のポリヌクレオチド、発現カセット、AAVベクター、医薬組成物、もしくはポリペプチド、またはさらなる態様および実施形態の第２のセットにおいて上記の態様および実施形態のいずれかを対象に投与することを含む方法を対象とする。好ましくは、対象はヒトである。

実施形態２３は、対象がファブリー病を有し；方法がGLAの必要性またはファブリー病の１つ以上の症状を低減し、減少させ、または阻害し；方法がGLAの必要性またはファブリー病の１以上の症状の進行または悪化を予防または低減し；方法がGLAの必要性またはファブリー病の１以上の症状を安定化させ；または方法がGLAまたはファブリー病の必要性の1つ以上の症状を改善する、態様７をさらに記載する。

実施形態２４は、AAVベクターが対象の体重1キログラム当たり約1×10⁸～約1×10¹⁴ベクターゲノム（vg/kg）の範囲で対象に投与される、態様７および実施形態２３をさらに記載する。

態様８は、（ｉ）態様７、実施形態２２および実施形態２３に記載の方法；または（ｉｉ）医薬の調製において使用するための、さらなる態様および実施形態の第２のセットにおける、ポリヌクレオチド、発現カセット、AAVベクター、医薬組成物、もしくはポリペプチド、または上記の態様および実施形態のいずれかを対象とする。

本明細書に開示される特徴の全ては、任意の組み合わせで組み合わせることができる。本明細書に開示される各特徴は、同じ、同等、または同様の目的を果たす代替的な特徴によって置き換えられ得る。したがって、特に明記しない限り、開示される特徴（例えば、GLAをコードする修飾核酸、GLAをコードする修飾核酸を含む発現カセット、GLAをコードする修飾核酸を含むrAAV粒子、およびGLAをコードする修飾核酸を含む非ウイルスベクター）は、同等または類似の特徴の種類の例である。

本発明のいくつかの実施形態を説明した。それにもかかわらず、当業者は、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、本発明の種々の変更および修正を行い、それを種々の使用および条件に適合させることができる。したがって、以下の実施例は、例示することを意図するものであり、クレームされる本発明の範囲を決して限定するものではない。

実施例１－GLA発現カセットの概要
図１および表２に示すようにGLA発現カセットを設計した。表２は、前駆体α－ガラクトシダーゼＡ（シグナルペプチド＋GLA部分）および発現カセットの配列を参照する。表２に提供される全ての配列は、5'隣接および3'隣接AAV逆方向末端反復（ITR）、肝臓特異的ApoE/hAATエンハンサー/プロモーター配列、ヒトヘモグロビンサブユニットβ（HBB2）イントロン、シグナルペプチド、ヒトGLAコード配列、およびウシ成長ホルモン（bGH）ポリアデニル化（ポリA）配列を含んだ。

発現カセットは、AAVカプシド、例えば、国際特許出願公開WO 2016/210170に記載されるAAV-4-1カプシド変異体（それらの内容はその全体が本明細書に組み込まれる）、または米国特許第9169299号に記載されるLK03カプシド変異体（その内容はその全体が本明細書に組み込まれる）にカプシド化されることによって、AAVウイルス粒子にパッケージングされる。ウイルス粒子は一般に、当技術分野で周知の三重トランスフェクションプロトコールを使用して生成される。

実施例２－シグナルペプチドの評価
天然GLAシグナルペプチドの代わりに様々なシグナルペプチドを有するGLA発現カセットの効力を評価するために、配列番号：２１（sp7.GLA）、配列番号：２３（spCD300.GLA）、配列番号：２４（spGLA.GLA）、配列番号：２６（spNotch2.GLA）、配列番号：２７（spORM1.GLA）および配列番号：２９（spTF.GLA）の配列を有する発現カセットを、配列番号：１１０、３６および３７のカプシドを含むAAVベクターにパッケージングした。1群当たり5～6匹の雄性または雌性C57Bl/6マウスに、それぞれ1.25×10¹⁰ vg/マウスまたは5×10¹⁰ vg/マウスのrAAVを尾静脈から静脈内注射した。in vitro酵素活性アッセイを用いて、マウス血清中の循環GLA酵素活性のレベルを測定した。蛍光4-メチルウンベリフェリル（4-MU）の連続希釈物から検量線を作成した。GLA酵素活性は、血清および合成酵素基質4-メチルウンベリフェリルβ-D-ガラクトピラノシド（4-MU-Gal）の共インキュベーションの1時間当たりに放出される蛍光4-MUの濃度として、nmol×mL^-1×hr^-1の単位で定義した。GLA酵素活性の全ての測定について、GLAおよび4-MU-Galを含む個々の組織サンプルのインキュベーションを2回行った。図２Ａに示されるように、キモトリプシンB2由来のシグナルペプチドsp7を含む発現カセットは、野生型GLAシグナルペプチドを含む発現カセットと比較して、より高いレベルの血清GLA活性をもたらした。

血清中のマウスGLAの内因性レベルに対するGLAカセットのヒトGLAタンパク質発現レベルを評価するために、配列番号：２１（sp7.GLA）の配列および配列番号：２４（spGLA.GLA）の配列を有する発現カセットを、配列番号：１１０、３６および３７のカプシドを含むAAVベクターにそれぞれパッケージングした。1群当たり5匹の雌性C57Bl/6マウスに、5×10¹⁰ vg/マウスのrAAVを尾静脈から静脈内注射した。キャピラリー電気泳動を用いて、血清GLAタンパク質を測定した。形質導入の6週間後に採取したマウス血清中の循環GLAのレベルを、組換えヒトGLA（ProteinSimple WesTM, Bio-Techne）の検量線に対して定量し、μg/mLの単位でプロットした（図２Ｂ）。無処置コントロールC57Bl/6マウスにおいてもGLAタンパク質レベルを測定した。バーの高さは群当たり5匹のマウスの平均血清GLA活性を表し、エラーバーは平均からの1標準偏差を示し、検量線の定量限界は横線（定量の下限、図において「LOD」として示される）によって示される。rAAV（AAVsp7.GLAまたはAAVspGLA.GLA）で処置したマウスにおいては、未処置マウスよりも、GLAタンパク質のレベルが有意に高かった（t検定、^***p＜0.001）。その天然シグナルペプチド（GLA）を有するGLAを発現するrAAVベクター、およびキモトリプシノーゲンB2シグナルペプチド（SP7）を有するGLAを発現するrAAVベクターの両方が、C57Bl/6マウスにおけるマウスGLAのベースライン内因性レベルを超える血清GLA発現を誘導した（図２Ｂ）。

実施例３－ファブリーマウスモデルにおけるGLAカセットの評価
雄性GLA-/ヌルノックアウトマウスモデルを用いて、本明細書に記載の発現カセットの有効性を評価した。このマウスモデルは、C57Bl/6バックグラウンドではなく、混合B6;129バックグラウンドを有する。

配列番号：２１（sp7.GLA）の配列を有する発現カセットを含む、5×10¹⁰ vg/マウスのrAAV（配列番号：１１０、３６および３７カプシド）（本明細書ではAAV-sp7-GLAと称する）を、10匹のC57Bl/6、11匹のB6;129-GLA+/ヌルおよび11匹のB6;129-GLA-/ヌルの雄性マウスに尾静脈から静脈内注射した。rAAV投与の3、4、および6週後に採取したマウス血清中のGLAの活性を、血清および合成基質4-MU-Galの共インキュベーション1時間当たりに放出される蛍光4-MUの濃度として、nmol×mL^-1×hr^-1の単位で定義し、図３にプロットする。バーの高さは群当たり10～11匹のマウスの平均を示し、エラーバーは平均からの1標準偏差を示し、検量線4パラメータフィットの定量限界は横線（定量の下限、図において「LOD」として示される）によって示される。AAV-sp7-GLA rAAVは、C57Bl/6マウスにおいては、B6;129マウスと比較して、より高い効力を示した。形質導入後の血清GLA活性は、B6;129-GLA+/ヌルマウスおよびB6;129-/ヌルマウスの両方において低く、したがって、より低い効力はGLA遺伝子型またはファブリー表現型の特異的な結果ではなかった。その結果、ファブリーモデルマウス（B6;129 GLAヌル系）において1000 nmol/mL-hrを超える血清GLA活性を達成するために、5×10⁹ vg/マウスから5×10¹¹ vg/マウスまでのAAV投与量の範囲でのGLA発現を調査するために投与量漸増試験を実施した。

実施例４－投与量決定試験
5×10⁹ vg/マウス、8.9×10⁹ vg/マウス、1.6×10¹⁰ vg/マウス、2.8×10¹⁰ vg/マウス、5×10¹⁰ vg/マウス、1.58×10¹¹ vg/マウス、または5×10¹¹ vg/マウスのAAV-sp7-GLAをB6;129 GLA-/ヌル雄性マウス（群当たりn=5）に静脈内注射した。投与量漸増は、試験1および試験2の2つの別々の研究において行った。形質導入の4週後に採取したマウス血清中のGLAの活性を、血清および合成基質4-MU-Galの共インキュベーションの1時間当たりに放出される蛍光4-MUの濃度として、nmol×mL^-1×hr^-1の単位で測定し、図４Ａおよび図４Ｂにプロットする。バーの高さは群当たり5匹のマウスの平均血清GLA活性を表し、エラーバーは平均からの1標準偏差を示す。5匹の形質導入されていないコントロールGLA-/ヌルマウスにおいて4週目にアッセイによって検出されたバックグラウンド血清GLA活性の最大レベルを図４Ａに横線として示す。示されるように、GLA発現は、投与されたAAVの量に対して線形用量反応を示した（図４Ｂ）。

実施例５－GLAの腎取り込み
特に腎臓におけるGLAの組織取り込みは、ファブリー治療薬の臨床的有効性に不可欠であると考えられている。5×10⁹ vg/マウス、8.9×10⁹ vg/マウス、1.6×10¹⁰ vg/マウス、2.8×10¹⁰ vg/マウス、または5×10¹⁰ vg/マウスのAAV-sp7-GLAを5匹のB6;129 GLA-/ヌル雄性マウスの群に尾静脈から静脈内注射した。形質導入の12週間後に肝臓および腎臓を採取し、nmol×mg総溶解物タンパク質^-1×hr^-1の単位で、組織溶解物および合成基質4-MU-Galの共インキュベーションの1時間当たりに放出される蛍光4-MUの濃度として組織溶解物中のGLA活性を測定し、図５Ａ（肝臓）および図５Ｂ（腎臓）にプロットした。5匹の無処置B6;129 GLA-/ヌル雄性コントロールマウス、および週齢をマッチさせた4匹の無処置のB6;129 GLA+/ヌル（WT）雄性マウスにおいて、肝臓および腎臓の組織溶解物におけるGLA活性も評価した。バーの高さは平均組織GLA活性を表し、エラーバーは平均からの1標準偏差を示し、横線はそれぞれの組織溶解物のタンパク質濃度に対して標準化された検量線の定量限界を示す。示されるように、AAVの投与量漸増は、ノックアウト雄性マウスの肝臓および腎臓において観察されるGLA活性の増加をもたらした。さらに、GLAノックアウト動物の肝臓および腎臓におけるGLA活性は、2.8×10¹⁰ vg/マウス以上の投与量で、正常動物で観察された濃度に回復した。

特に、5×10¹⁰ vg/マウス投与量の、肝臓特異的導入遺伝子プロモーターを含むAAV-sp7-GLAベクターは、ファブリーマウスの腎臓において、野生型マウスに関連するGLA酵素活性の濃度に近いGLA活性を達成した（B6;129GLA+/ヌル、WT）。

実施例６－GLAコード配列の評価
配列番号：２１（sp7.GLA）の配列を有する発現カセットのGLA部分は、CpGモチーフが除去され、最大発現を支持するようにコドン最適化された。AAVカプシド中で、コドン最適化GLA変異体カセット（配列番号：９１（GLAco4）、配列番号：９２（GLAcoBC0）、配列番号：９３（GLAcoH0）、配列番号：９４（GLAcoH6）、および配列番号：９５（GLAv45））をカプシド化し、群当たり5匹の雄性C57Bl/6マウスに5.0x10¹⁰ vg/マウスの投与量で形質導入した。相対的な導入遺伝子活性の代用として4週目の血清GLA活性を測定し、図６にプロットした。バーの高さは平均組織GLA活性を表し、エラーバーは平均からの1標準偏差を示す。示されるように、CpGフリーまたはCpGが減少したコドン最適化変異体は、配列番号：２１の配列を有するカセットのものに匹敵する血清GLA活性を示した。

実施例７－GLA発現カセットのさらなる最適化
配列番号：２１（sp7.GLA）の配列中に提供される発現カセットのGLA部分にさらなる改変を行った。構造的にガイドされた変異誘発を用いて、7個のアミノ酸置換を含むGLA変異体（Q57K；Q111E；K213E；K237Q；F248T；G334E；G346N）（「GLA 7変異体」）を生成した（配列番号：４７（SPKL0031））。さらに、配列番号：１４のGLAコード配列のヌクレオチド78/79の間のsp7-GLAコード配列にヘテロイントロンを導入し、配列番号：９６（IgHA、配列番号：９７（IgHμ）、配列番号：９８（RBP4）、および配列番号：９９（VTN1））を得た。発現カセット配列番号：９５（図７においてsp7-GLA-var45と称される）も含まれた。全てのカセット配列をAAVカプシド中にカプシド化し、2×10⁹ vg/マウスのAAV-CAG-ガウシア（形質導入効率を正規化するために、CAGプロモーターのコントロール下でガウシアルシフェラーゼを有するAAVカプシド化発現カセット）との共投与で、2.5×10¹⁰ vg/マウスの投与量で、群あたり5匹の雄性C57Bl/6マウスに形質導入した。相対的な導入遺伝子活性の代用として、6週目の血清GLA活性を測定し、図７にプロットした。バーの高さは平均組織GLA活性を表し、エラーバーは平均からの1標準偏差を示す。IgHμおよびRBP4イントロンの挿入を除く全ての改変は、マウス血清中のGLA活性の統計的に有意な増加をもたらした。

実施例８－ファブリー病モデルマウスにおけるコドン最適化AAV-sp7-GLAを用いた投与量漸増試験
3投与量（4.4E11 vg/kg、1.4E12 vg/kgおよび4.4E12 vg/kg）のAAVカプシド化sp7-GLA-co4（AAV-sp7-GLA-co4）を、GLAノックアウトマウス（5匹の雄性B6;GLA-/-の群）に尾静脈から静脈内投与した。血清を毎週採取し；リゾ-GL3のレベルを質量分析により分析し、GLA活性レベルをin vitro 4-MU-Galアッセイを用いて測定した。図８Ａに示すように、ファブリー病のバイオマーカー（リゾ-GL3）のレベルにおいて、試験の28日間にわたって投与量依存的な反応が観察された。加えて、血清α-Gal A活性とリゾ-GL3レベルとの間に直線的な関係が観察された（図８Ｂ）。血清（図９Ａ）ならびに臨床的に関連する腎臓（図９Ｂ）および心臓（図９Ｃ）の組織において、リゾ-GL3の投与量依存的な減少が観察された。

実施例９－AAV-sp7-GLA-co4の非ヒト霊長類（NHP）試験
4匹の雄性および4匹の雌性のカニクイザルに1e13 vg/kgのAAV-sp7-GLA-co4を投与した。血清を28日間毎週採取し、4-MU-GalアッセイによりGLA活性レベルを評価し（図１０Ａ）、ヒトα-Gal Aに特異的なELISAを用いて測定したGLA抗原レベルを評価した（図１０Ｂ）。観察されたように、AAV-sp7-GLA-CO4を投与されたサルにおける循環GLA抗原および活性レベルは、コントロールレベルを有意に上回っていた。

実施例１０－AAV-sp7-GLA-co4の投与量漸増NHP試験
カニクイザルを用いて、GLPに準拠した60日の投与量設定試験を実施する。試験期間は、ピーク発現を決定し、潜在的な安全性シグナルを検出するのに十分なウィンドウを提供することを意図している。以下の表３に示す投与量で、AAV-sp7-GLA-co4を単回静脈内（IV）注入により群のNHPに投与する。

投与後60日間の間隔で血清サンプルを採取し、α-GalA抗原、α-GalA活性、および抗α-GalA IgGのレベルを測定する。標準的な臨床病理学および解剖学的病理学パネル分析を行う。生体内分布および生殖細胞伝達を評価する。

実施例１１－最小有効投与量試験
マウスを用いて、投与量決定試験を実施し、ファブリーバイオマーカーのGL-3およびリゾ-GL-3を有意に減少させる最小有効投与量を決定した。GLAノックアウトマウス（B6;129-GLA -/-；GLAkoまたはGLA KOともいう）（群当たりn=20）に、2E11 vg/kg～2E12 vg/kgの範囲の3投与量のAAV-sp7-GLA（配列番号：２１）を静脈内（IV）注射した。6週間毎週、かつAAV注射後9週目および12週目に10匹のマウスから血清を採取した。1か月、3か月、6か月、および10か月の時機テイクダウンについて各群から5匹のマウスを無作為に選択し、GLA抗原、GLA活性、ならびにファブリーバイオマーカーのGL-3およびリゾ-GL3について分析した。in vitro（4-MU-GAL）アッセイを用いて、GLA活性のレベルを測定した（データは示されない）。α-Gal Aに特異的なELISAを用いて、GLA抗原のレベルを測定した。

GLA活性とGLA抗原発現レベルとの間の直線関係にて、循環血清GLAにおける投与量依存的な増加が観察された（図１１）。2週目にて血清GLAは、2E11 vg/kgでは～70 ng/mlで、4E11 vg/kgでは～190 ng/mlで、かつ2E12 vg/kgでは～4 μg/mlで安定化した（図１１）。

心臓および腎臓においてファブリーバイオマーカーのGL-3およびリゾ-GL-3のレベルをLC/MSによって測定し、多重比較を伴う二元配置分散分析（two-way ANOVA）を使用して分析した。1か月および3か月の両方の時点で、AAV-sp7-GLAを投与されたGLAkoマウスの心臓および腎臓におけるGL3およびリゾ-GL-3のレベルは、ビヒクル単独で投与されたGLAkoマウスにおけるGL-3およびリゾ-GL-3のレベルと比較して有意に減少した（p＜0.05）（図１２Ａ～１２Ｄ）。

本明細書において、本発明の多数の実施形態を説明するために肯定的な言葉を用いて、本発明は一般的に開示される。本発明は、具体的には、物質または材料、方法ステップおよび条件、プロトコール、または手順等の、特定の主題が完全にまたは部分的に除外される実施形態も含む。例えば、本発明のある実施形態では、材料および／または方法のステップは除外される。したがって、本発明が含まないものに関して、本明細書では一般に本発明は表現されないが、それにもかかわらず、本発明において明確に除外されない態様は本明細書で開示される。

Claims

ａ）α－ガラクトシダーゼＡ（GLA）をコードする核酸配列であって、前記核酸配列は配列番号：１５の配列に対して少なくとも85％同一であり、かつ前記GLAは配列番号：１００の配列に対して少なくとも95％同一の配列を有する、核酸配列；
ｂ）α－ガラクトシダーゼＡ（GLA）をコードする核酸配列であって、前記核酸配列は前記GLAのコード配列中にイントロンを含み、かつ前記GLAは配列番号：１００の配列に対して少なくとも95％同一の配列を有する、核酸配列；
ｃ）アミノ末端シグナルペプチドを含む前駆体α－ガラクトシダーゼＡ（GLA）をコードする核酸配列であって、前記シグナルペプチドは、配列番号：４１、配列番号：５７、配列番号：５８、配列番号：６０、配列番号：６１、配列番号：６２、および配列番号：６３からなる群から選択される配列に対して少なくとも80％同一の配列を有し；かつ前記GLAは配列番号：１００の配列に対して少なくとも95％同一の配列を有する、核酸配列；ならびに
ｄ）配列番号：１００と１～７個のアミノ酸が異なるアミノ酸配列を有するα－ガラクトシダーゼＡ（GLA）をコードする核酸配列であって、前記１～７個のアミノ酸の少なくとも１つは、Gln57Lys、Gln111Glu、Lys213Glu、Lys237Gln、Phe248Thr、Gly334Glu、およびGly346Asnからなる群から選択される置換である、核酸配列：
からなる群から選択される核酸配列を含むポリヌクレオチド。
α－ガラクトシダーゼＡ（GLA）をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドであって、前記核酸配列は、（１）配列番号：１５の配列に対して少なくとも85％の配列同一性を有する核酸配列、（２）配列番号：１６の配列に対して少なくとも84％の配列同一性を有する核酸配列、（３）配列番号：１７の配列に対して少なくとも86％の配列同一性を有する核酸配列、（４）配列番号：１８の配列に対して少なくとも86％の配列同一性を有する核酸配列、および（５）配列番号：１９の配列に対して少なくとも83％の配列同一性を有する核酸配列からなる群から選択される、ポリヌクレオチド。
配列番号：１５の配列に対して少なくとも95％の同一性を有する核酸配列を含む、請求項１または２に記載のポリヌクレオチド。
前記核酸配列が、配列番号：１００の配列を含むGLAをコードする、請求項３に記載のポリヌクレオチド。
前記核酸配列が、１４個未満のCpGジヌクレオチドを含む、請求項１～４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
前記核酸配列が、配列番号：１５～１９のいずれかの配列、または配列番号：１５～１９のいずれかの塩基１～１１９４を有する、請求項１または２に記載のポリヌクレオチド。
前記核酸配列が配列番号：１５の配列に対して少なくとも95％同一の配列を有し、かつ前記GLAが配列番号：１００の配列に対して少なくとも98％同一の配列を有する、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
前記核酸配列が、Gln57Lys、Gln111Glu、Lys213Glu、Lys237Gln、Phe248Thr、Gly334Glu、およびGly346Asnからなる群から選択される１以上のアミノ酸置換を有する配列番号：１００のアミノ酸配列を有するGLAタンパク質をコードする、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
前記GLAが配列番号：４８のアミノ酸配列を含む、請求項８に記載のポリヌクレオチド。
前記核酸配列が、配列番号：４７の配列または配列番号：４７の塩基１～１１９４を含む、請求項９に記載のポリヌクレオチド。
前記核酸配列が、前記挿入されたイントロンを含む前記GLAをコードし、前記イントロンの非存在下での前記GLAが、請求項１～１０のいずれか一項に記載のGLA配列を含み、前記イントロンが、前記GLAをコードする核酸のヌクレオチド７８と７９の間に位置し、このヌクレオチド位置が、配列番号：１４の配列を有するGLAのコード配列に関して与えられる、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
前記イントロンが、配列番号：４９、配列番号：５０、配列番号：５１および配列番号：５２からなる群から選択される配列を含む、請求項１１に記載のポリヌクレオチド。
前記核酸が配列番号：４３～４６のいずれかの配列を有する、請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
前記ポリヌクレオチドが第２の核酸配列をさらに含み、前記第２の配列が、第１の核酸配列の5'末端に位置するシグナルペプチド配列をコードする、請求項１～１３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
前記シグナルペプチド配列がヘテロシグナルペプチド配列である、請求項１４に記載のポリヌクレオチド。
前記シグナルペプチド配列が、ヒトキモトリプシノーゲンB2シグナルペプチド（配列番号：４１）、AHSGシグナルペプチド（配列番号：５７）、CD300シグナルペプチド（配列番号：５８）、GLAシグナルペプチド（配列番号：５９）、LAMP1シグナルペプチド（配列番号：６０）、Notch 2シグナルペプチド（配列番号：６１）、ORM1シグナルペプチド（配列番号：６２）、TFシグナルペプチド（配列番号：６３）、ならびに野生型GLAシグナルペプチド（配列番号：５９）、または配列番号：４１および配列番号：５７～６３のいずれかの配列に対して少なくとも90％同一の配列を有するこれらの変異体からなる群から選択される、請求項１４に記載のポリヌクレオチド。
前記シグナルペプチドがヒトキモトリプシノーゲンB2シグナルペプチド（配列番号：４１）である、請求項１６に記載のポリヌクレオチド。
前記シグナルペプチドをコードする前記核酸が、配列番号：１～５のいずれかの配列を有する、請求項１７に記載のポリヌクレオチド。
前記ポリヌクレオチドが、前記ポリヌクレオチドの5'末端に隣接するAAV逆方向反復（ITR）および／または前記ポリヌクレオチドの3'末端に隣接するAAV ITRをさらに含む、請求項１～１８のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
前記GLAコード配列が発現制御エレメントに作動可能に連結されている、請求項１～１９のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む発現カセット。
発現制御エレメントが肝臓特異的発現制御エレメントである、請求項２０に記載の発現カセット。
発現制御エレメントが、GLAをコードする核酸の5'に位置する、請求項２０または２１に記載の発現カセット。
GLAをコードする核酸の3'に位置するポリアデニル化配列をさらに含む、請求項２０～２２のいずれか一項に記載の発現カセット。
発現制御エレメントおよび／またはポリアデニル化配列が、野生型発現制御エレメントまたは野生型ポリアデニル化配列と比較してCpGが減少したものである、請求項２０～２３のいずれか一項に記載の発現カセット。
発現制御エレメントが、ApoE/hAATエンハンサー/プロモーター配列を含む、請求項２０～２４のいずれか一項に記載の発現カセット。
ポリアデニル化配列が、ウシ成長ホルモン（bGH）ポリアデニル化配列を含む、請求項２３～２５のいずれか一項に記載の発現カセット。
ApoE/hAATエンハンサー/プロモーター配列が、野生型ApoE/hAATエンハンサー/プロモーター配列と比較してCpGが減少したものである、請求項２５または２６に記載の発現カセット。
ApoE/hAATエンハンサー/プロモーター配列が、配列番号：３８の配列を含む、請求項２７に記載の発現カセット。
bGHポリアデニル化配列が、配列番号：２０の配列を含む、請求項２８に記載の発現カセット。
発現制御エレメントの3'末端とポリヌクレオチドの5'末端との間に位置するイントロンをさらに含む、請求項２０～２９のいずれか一項に記載の発現カセット。
イントロンが、hBB2m1イントロン（配列番号：３９）を含む、請求項３０に記載の発現カセット。
前記発現カセットが、前記発現カセットの5'に隣接するITR、および／または前記発現カセットの3'末端に隣接するITRをさらに含む、請求項２０～３１のいずれか一項に記載の発現カセット。
請求項１９に記載のポリヌクレオチドまたは請求項３２に記載の発現カセット、および複製起点を含む、AAVプラスミドゲノム。
請求項１９に記載のポリヌクレオチドまたは請求項３２に記載の発現カセットとカプシドとを含む、アデノ随伴ウイルス（AAV）ベクター。
前記AAVが前記発現カセットを含み、前記発現カセットが、前記発現カセットの5'に隣接する前記ITRおよび前記発現カセットの3'末端に隣接する前記ITRをさらに含む、請求項３４に記載のAAVベクター。
前記5' ITRおよび前記3' ITRが、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、Rh10、Rh74およびAAV3B ITRからなる群から独立して選択される、請求項３４または３５に記載のAAVベクター。
前記5' ITRおよび3' ITRの少なくとも１以上が、減少したCpGを有するように改変されている、請求項３５または３６に記載のAAVベクター。
前記ベクターが、配列番号：２１～３４、５３～５６および９１～９９のいずれかの配列と少なくとも95％の配列同一性を有する配列を含む、請求項３４に記載のAAVベクター。
前記ベクターが、配列番号：９１～９５のいずれかの配列と少なくとも95％の配列同一性を有する配列からなる、請求項３４に記載のAAVベクター。
前記カプシドが、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、Rh10、Rh74（配列番号：３５）、AAV3B、LK03（配列番号：４２）、AAV-2i8のVP1、VP2またはVP3カプシド；または配列番号：１１０、配列番号：３６もしくは配列番号：３７に対して90％以上の配列同一性を有するAAV VP1、VP2もしくはVP3カプシドを含む、請求項３４～３９のいずれか一項に記載のAAVベクター。
前記カプシドが、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、Rh10、Rh74（配列番号：３５）、AAV3B、LK03（配列番号：４２）もしくはAAV-2i8カプシド；または配列番号：１１０、配列番号：３６、および／もしくは配列番号：３７を含むカプシドである、請求項４０に記載のAAVベクター。
生物学的に適合性を有する担体または賦形剤中に、請求項３４～４１のいずれか一項に記載の複数のAAVベクターを含む、医薬組成物。
前記複数のAAVベクター粒子が、ヒト対象においてGLA活性を増加させるのに有効な量である、請求項４２に記載の医薬組成物。
空のAAVカプシドをさらに含む、請求項４３に記載の医薬組成物。
空のAAVカプシド対AAVベクターの比が、約100：1～約1：100である、請求項４４に記載の医薬組成物。
界面活性剤をさらに含む、請求項４２～４５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
α－ガラクトシダーゼＡ（GLA）を必要とする対象を治療する方法であって、治療的有効量の、請求項１～３２のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドもしくは発現カセット、または請求項３４～４１のいずれか一項に記載のAAVベクター、または請求項４２～４６のいずれか一項に記載の医薬組成物を対象に投与することを含み、GLAが対象において発現される、方法。
対象がファブリー病を有する、請求項４７に記載の方法。
前記方法が、ファブリー病の１以上の症状を低減し、減少させ、または阻害する、請求項４７または４８に記載の方法。
ポリヌクレオチド、発現カセット、AAVベクターまたは医薬組成物が、静脈内に、動脈内に、腔内に、粘膜内に、またはカテーテルを介して、対象に投与される、請求項４７～４９のいずれか一項に記載の方法。
前記AAVが、対象の体重1キログラム当たり約1×10⁸～約1×10¹⁴ベクターゲノム（vg/kg）の範囲で投与される、請求項４７～５０のいずれか一項に記載の医薬組成物。
前記対象がヒトである、請求項４７～５１のいずれか一項に記載の方法。
請求項１～３２のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドもしくは発現カセットまたは請求項３３に記載のAAVプラスミドゲノムを含む、細胞。
請求項３４～４１のいずれか一項に記載のAAVベクターを産生する細胞。
（ａ）請求項３３に記載のAAVベクターゲノムプラスミドをパッケージングヘルパー細胞に導入すること；および（ｂ）AAVベクターを産生する条件下でヘルパー細胞を培養することを含む、請求項３４～４１のいずれか一項に記載のAAVベクターを産生する方法。
ａ）α－ガラクトシダーゼＡ（GLA）のアミノ末端に連結されたシグナルペプチドを含む前駆体α－ガラクトシダーゼＡであって、前記シグナルペプチドは、配列番号：４１、配列番号：５７、配列番号：５８、配列番号：６０、配列番号：６１、配列番号：６２、および配列番号：６３からなる群から選択される配列に対して少なくとも80％同一の配列を有し；かつ前記GLAは配列番号：１００に対して少なくとも95％同一の配列を有する、前駆体GLA；ならびに
ｂ）配列番号：１００と１～７個のアミノ酸が異なるアミノ酸配列を有するα－ガラクトシダーゼＡ（GLA）であって、前記１～７個のアミノ酸の少なくとも１つは、Gln57Lys、Gln111Glu、Lys213Glu、Lys237Gln、Phe248Thr、Gly334Glu、およびGly346Asnからなる群から選択される置換である、GLA：
からなる群から選択されるポリペプチド。
請求項４７～５２のいずれか一項に記載の方法において使用するための、請求項１～１９のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、請求項２０～３２のいずれか一項に記載の発現カセット、請求項３４～４１のいずれか一項に記載のAAVベクター、請求項４２～４６のいずれか一項に記載の医薬組成物、または請求項５６に記載のポリペプチド。