KR20230131246A - 파브리병을 치료하기 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

파브리병을 치료하기 위한 조성물 및 방법 Download PDF

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Abstract

α-갈락토시다제 A(GLA)를 인코딩하는 핵산을 포함하는 폴리뉴클레오타이드가 기술되어 있다. 또한 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 카세트, 벡터, 세포 및 세포주뿐만 아니라 파브리병과 같은 리소좀 축적 장애를 치료하기 위한 폴리뉴클레오타이드의 사용 방법도 기술되어 있다.

Description

파브리병을 치료하기 위한 조성물 및 방법
본 출원은 2021년 1월 14일에 출원된 미국 가특허 출원 제63/137,235호 및 2021년 11월 19일에 출원된 미국 가특허 출원 제63/264,356호를 우선권으로 주장한다. 모든 텍스트, 표, 서열 목록 및 도면을 포함하여 전술한 출원의 전체 내용은 참조로 본원에 포함된다.
전자적으로 제출된 서열 목록에 대한 참조
본 출원은 파일명이 "SequenceListing4WO"이고 생성 날짜가 2022년 1월 13일이며 크기가 281KB인 ASCII 형식의 서열 목록으로 EFS-Web을 통해 전자적으로 제출된 서열 목록을 포함한다. EFS-Web을 통해 제출된 서열 목록은 본 명세서의 일부이며 그 전체 내용은 참조로 본원에 포함된다.
발명의 분야
본 발명은 유전자 치료 분야에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 인간 α-갈락토시다제 A의 발현을 위한 최적화된 카세트 및 리소좀 축적병(lysosomal storage disease), 특히 파브리병(Fabry disease)을 치료하기 위한 이의 사용 방법에 관한 것이다.
파브리병은 유병률이 약 1:40,000으로 추정되는, X-연관 리소좀 축적병이다. 파브리병은 리소좀 효소 α-갈락토시다제 A(GLA; α-gal A)의 결핍으로 인해 발생한다. 효소 결핍은 글리코스핑고지질 글로보트리아오실세라미드(GL3 또는 GL-3 또는 Gb3) 및 글로보트리아오실스핑고신(lyso-GL3 또는 lyso-GL-3 또는 lyso-Gb3)의 축적으로 이어져 진행성 신장 질환, 말초 신경병증, 조기 발병 뇌혈관 질환, 위장관 증상, 비대성 심근병증, 부정맥, 각막 와상문(corneal whorls) 및 혈관각화종을 유발한다. 혈관 질환의 신장, 심장 및/또는 뇌 합병증으로 인해 효소 대체 요법으로 치료받지 않은 파브리 환자의 평균 수명은 남성의 경우 50년, 여성의 경우 70년이다(Lidove et al., Int. J. Clin. Pract. 2007;61:293-302).
효소 대체 요법(ERT)은 파브리병에 사용할 수 있지만 환자의 평생 동안 매주 정맥 투여를 필요로 하여 치유를 나타내지 않는다. 또한, 상당한 비율의 환자가 α-갈락토시다제에 대한 중화 항체(NAb)를 발생시켜 ERT를 비효과적으로 만든다(Linthorst et al.,　Kidney Int. 2004;66(4):1589-1595).
발명의 개요
인간 α-갈락토시다제 A(GLA)의 분비성 버전의 간-지시적 발현을 위한 최적화된 카세트가 본원에 개시된다. 카세트에 대한 이러한 최적화는 간으로부터의 GLA 분비를 증가시키고 간 유전자 전달을 가능하게 하여 대상체에서 전신적으로 GLA 결핍을 교차 교정하기에 충분한 GLA 순환 수준을 달성한다. 이들 카세트는 파브리병 및 GLA로 치료할 수 있는 다른 질환 및 장애를 가진 대상체의 유전자 요법 치료로서 유용할 것이다.
하나의 일반적인 측면에서, 본 발명은 α-갈락토시다제 A(GLA)를 인코딩하는 핵산을 포함하는 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이며, 여기서 핵산은 (1) 서열 번호 15의 서열과 적어도 75%의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오타이드, (2) 서열 번호 16의 서열과 적어도 84%의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오타이드, (3) 서열 번호 17의 서열과 적어도 86%의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오타이드, (4) 서열 번호 18의 서열과 적어도 86%의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오타이드, 및 (5) 서열 번호 19의 서열과 적어도 83%의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오타이드로 이루어진 군으로부터 선택되며, 선택적으로, GLA는 서열 번호 100의 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시양태에서, 핵산은 14개 미만의 CpG 디뉴클레오타이드, 선택적으로 0개의 CpG 디뉴클레오타이드를 함유한다.
특정 실시양태에서, GLA를 인코딩하는 핵산은 서열 번호 15-19 중 어느 하나의 서열을 갖는다.
특정 실시양태에서, GLA를 인코딩하는 핵산은 GLA를 인코딩하는 핵산 내의 어디든 위치하는 하나 이상의 인트론을 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 인트론은 GLA를 인코딩하는 핵산의 뉴클레오타이드 78과 79 사이에 위치하며, 여기서 뉴클레오타이드 위치는 서열 번호 14의 서열을 갖는 GLA의 코딩 서열과 관련하여 주어진다.
특정 실시양태에서, 인트론은 비트로넥틴1(VTN1) 유전자, 레티놀 결합 단백질 4(RBP4) 유전자, 마우스 IgG 중쇄 A(IgHA) 유전자 및 마우스 IgG 중쇄 μ(IgHμ) 유전자로부터의 인트론으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 실시양태에서, 하나 이상의 인트론은 서열 번호 49-52의 서열로부터 선택된다.
특정 실시양태에서, GLA를 인코딩하는 핵산은 서열 번호 43-46 중 어느 하나의 서열을 갖는다.
특정 실시양태에서, GLA는 Gln57Lys, Gln111Glu, Lys213Glu, Lys237Gln, Phe248Thr, Gly334Glu, 및 Gly346Asn으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나의 아미노산 치환을 갖는 서열 번호 100의 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시양태에서, GLA는 Gln57Lys, Gln111Glu, Lys213Glu, Lys237Gln, Phe248Thr, Gly334Glu, 및 Gly346Asn으로 이루어진 군으로부터 선택된 임의의 2개의 아미노산 치환을 갖는 서열 번호 100의 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시양태에서, GLA는 Gln57Lys, Gln111Glu, Lys213Glu, Lys237Gln, Phe248Thr, Gly334Glu, 및 Gly346Asn으로 이루어진 군으로부터 선택된 임의의 3개의 아미노산 치환을 갖는 서열 번호 100의 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시양태에서, GLA는 Gln57Lys, Gln111Glu, Lys213Glu, Lys237Gln, Phe248Thr, Gly334Glu, 및 Gly346Asn으로 이루어진 군으로부터 선택된 임의의 4개의 아미노산 치환을 갖는 서열 번호 100의 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시양태에서, GLA는 Gln57Lys, Gln111Glu, Lys213Glu, Lys237Gln, Phe248Thr, Gly334Glu, 및 Gly346Asn으로 이루어진 군으로부터 선택된 임의의 5개의 아미노산 치환을 갖는 서열 번호 100의 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시양태에서, GLA는 Gln57Lys, Gln111Glu, Lys213Glu, Lys237Gln, Phe248Thr, Gly334Glu, 및 Gly346Asn으로 이루어진 군으로부터 선택되는 임의의 6개의 아미노산 치환을 갖는 서열 번호 100의 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시양태에서, GLA는 Gln57Lys, Gln111Glu, Lys213Glu, Lys237Gln, Phe248Thr, Gly334Glu, 및 Gly346Asn의 7개 아미노산 치환을 갖는 서열 번호 100의 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시양태에서, GLA는 서열 번호 48의 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시양태에서, GLA를 인코딩하는 핵산은 서열 번호 47의 코딩 서열을 포함한다.
특정 실시양태에서, 폴리뉴클레오타이드는 GLA를 인코딩하는 핵산의 5' 말단에 위치한 신호 펩타이드 서열을 인코딩하는 제2 핵산을 추가로 포함한다.
특정 실시양태에서, 신호 펩타이드 서열은 이종 신호 펩타이드 서열이다.
특정 실시양태에서, 신호 펩타이드 서열은 내인성 또는 천연 GLA 신호 펩타이드 서열이다.
특정 실시양태에서, 신호 펩타이드는 인간 키모트립시노겐 B2 신호 펩타이드, AHSG 신호 펩타이드, CD300 신호 펩타이드, LAMP1 신호 펩타이드, 노치 2 신호 펩타이드, ORM1 신호 펩타이드, TF 신호 펩타이드 및 천연 GLA 신호 펩타이드 또는 이의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 실시양태에서, 신호 펩타이드는 인간 키모트립시노겐 B2 신호 펩타이드, 선택적으로 서열 번호 41의 아미노산 서열을 갖는 인간 키모트립시노겐 B2 신호 펩타이드 또는 이의 변이체이다.
특정 실시양태에서, 신호 펩타이드는 인간 키모트립시노겐 B2 신호 펩타이드, 선택적으로 서열 번호 1-5 중 어느 하나의 코딩 서열을 갖는 인간 키모트립시노겐 B2 신호 펩타이드이다.
특정 실시양태에서, 폴리뉴클레오타이드는 서열 번호 101-109 중 어느 하나의 서열을 갖는 전구체 GLA를 인코딩한다.
특정 실시양태에서, 폴리뉴클레오타이드는 서열 번호 64-81 중 어느 하나의 서열을 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 발현 조절 요소에 작동가능하게 연결된 GLA를 인코딩하는 핵산을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 카세트에 관한 것이다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 발현 조절 요소에 작동 가능하게 연결된, 인간 GLA를 인코딩하는 핵산을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 카세트에 관한 것이다.
특정 실시양태에서, 발현 조절 요소는 간-특이적 발현 조절 요소이다.
특정 실시양태에서, 발현 카세트의 발현 조절 요소는 폴리뉴클레오타이드의 5'에 위치하며, 여기서 발현 조절 요소는 선택적으로 ApoE/hAAT 인핸서/프로모터 서열을 포함한다.
특정 실시양태에서, 발현 카세트는 폴리뉴클레오타이드의 3'에 위치한 폴리아데닐화 서열을 추가로 포함하고, 여기서 폴리아데닐화 서열은 선택적으로 소 성장 호르몬(bGH) 폴리아데닐화 서열을 포함한다.
특정 실시양태에서, 발현 카세트의 발현 조절 요소 또는 폴리아데닐화 서열은 야생형 발현 조절 요소 또는 폴리아데닐화 서열과 비교하여 CpG-감소된다.
특정 실시양태에서, 발현 카세트는 발현 조절 요소의 3' 말단과 폴리뉴클레오타이드의 5' 말단 사이에 위치한 인트론을 추가로 포함하고, 여기서 인트론은 선택적으로 hBB2m1 인트론을 포함한다.
특정 실시양태에서 AAV ITR(들)는 폴리뉴클레오타이드 또는 발현 카세트의 5' 및/또는 3' 말단 측면에 있다(flank).
특정 실시양태에서, 본 발명은 폴리뉴클레오타이드 또는 발현 카세트를 포함하는 아데노 관련 바이러스(AAV) 벡터에 관한 것이다.
특정 실시양태에서, AAV 벡터는 (a) 하나 이상의 AAV 캡시드, 및 (b) 하나 이상의 AAV 역 말단 반복부(ITR)를 포함하고, 여기서 AAV ITR(들)은 폴리뉴클레오타이드 또는 발현 카세트의 5' 또는 3' 말단의 측면에 있다.
특정 실시양태에서, AAV 벡터의 ITR 중 적어도 하나 이상은 감소된 CpG를 갖도록 변형된다.
특정 실시양태에서, AAV 벡터는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, Rh10, Rh74(서열 번호 35), AAV3B, AAV-2i8, 서열 번호 110, 서열 번호 36, 서열 번호 37, 및/또는 LK03(서열 번호 42)에 대해 90% 이상, 95% 이상, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 변형 또는 변이 AAV VP1, VP2 및/또는 VP3 캡시드를 포함하는 캡시드 혈청형을 가진다.
특정 실시양태에서, AAV 벡터는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, Rh10, Rh74, AAV3B, AAV 혈청형, 또는 이들의 조합 중 어느 하나 이상의 ITR을 포함한다.
특정 실시양태에서, AAV 벡터는 서열 번호 21-34, 53-56, 및 91-99 중 하나의 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 폴리뉴클레오타이드 또는 발현 카세트를 포함하는 비-바이러스 벡터에 관한 것이다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 생물학적으로 적합한 담체 또는 부형제에 다수의 AAV 벡터 또는 비-바이러스 벡터를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다. 바람직하게는, 복수의 AAV 벡터는 치료 효과를 달성하기에 충분량을 제공한다. 그러나, 치료 효과를 달성하기 위해 다수의 조성물이 투여될 수도 있다.
특정 실시양태에서, 약학 조성물은 빈(empty) AAV 캡시드를 추가로 포함한다.
특정 실시양태에서, 약학 조성물은 계면활성제를 추가로 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 GLA를 필요로 하는 대상체에게 치료 유효량의 폴리뉴클레오타이드, 발현 카세트, AAV 벡터, 비-바이러스 벡터 또는 약학 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체를 치료하는 방법에 관한 것으로, 여기서 GLA는 대상체에서 발현된다.
특정 실시예에서, 대상체는 인간이다.
특정 실시양태에서, 대상체는 파브리병을 갖는다.
특정 실시양태에서, 폴리뉴클레오타이드, 발현 카세트, AAV 벡터, 비-바이러스 벡터, 또는 약학 조성물은 대상체에게 정맥내, 동맥내, 강내, 점막내 또는 카테터를 통해 투여된다.
특정 실시양태에서, AAV 벡터는 대상체의 체중 킬로그램당 약 1x108 내지 약 1x1014 벡터 게놈(vg/kg)의 범위로 대상체에게 투여된다.
특정 실시양태에서, 방법은 GLA 필요성 또는 파브리병의 하나 이상의 증상을 감소, 저하 또는 억제하거나; 또는 GLA 필요성 또는 파브리병의 하나 이상의 증상의 진행 또는 악화를 예방 또는 감소시키거나; 또는 GLA 필요성 또는 파브리병의 하나 이상의 증상을 안정화시키거나; 또는 GLA 필요성 또는 파브리병의 하나 이상의 증상을 개선한다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 폴리뉴클레오타이드 또는 발현 카세트를 포함하는 세포에 관한 것이다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 AAV 벡터를 생산하는 세포에 관한 것이다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 (a) 폴리뉴클레오타이드 또는 발현 카세트를 포함하는 AAV 벡터 게놈을 팩키징 헬퍼 세포에 도입하는 단계; 및 (b) 상기 헬퍼 세포를 상기 AAV 벡터를 생산하기 위한 조건 하에서 배양하는 단계를 포함하는, 본 발명의 AAV 벡터를 생산하는 방법에 관한 것이다.
전술한 요약 뿐만 아니라 본 발명의 하기 상세한 설명은 첨부된 도면과 결부하여 읽을 때 더 잘 이해될 것이다. 본 발명은 도면에 나타낸 정확한 실시양태에 제한되지 않는다는 것을 이해해야 한다. 도면에서:
도 1은 본원에 기술된 발현 벡터의 개략도를 나타낸다.
도 2A는 AAV 형질도입 후 4주째에 GLA 효소 활성 검정에 의해 결정된, 상이한 신호 펩타이드(GLA, SP7, CD300, NOTCH2, ORM1 및 TF, x-축을 따라 표시됨)를 포함하는 AAV-캡시드화 GLA 발현 카세트가 투여된 수컷(왼쪽 패널) 및 암컷(오른쪽 패널) C57Bl/6 마우스에서의 혈청 GLA 효소 활성을 보여주는 막대 그래프를 보여준다.
도 2B는 야생형 신호 펩타이드(GLA) 또는 sp7 신호 펩타이드(SP7)를 갖는 AAV-캡시드화 GLA 발현 카세트가 투여된 암컷 C57Bl/6 마우스에서 AAV 형질도입 6주 후에 측정된 혈청 GLA 단백질 수준을 보여주는 막대 그래프이다; 대조군은 비처리 마우스에서 GLA 단백질의 수준을 나타내고; 막대 높이는 그룹당 5마리 마우스의 평균을 나타내고; 오차 막대는 평균에서 1 표준 편차를 나타내고; 형질도입된 마우스 대 대조군의 혈청 GLA 단백질 수준을 비교하기 위해 t-검정을 수행하였다(***p < 0.001).
도 3은 AAV-캡시드화 sp7-GLA가 투여된 C57Bl/6 및 B6;129-GLA 마우스에서의 혈청 GLA 효소 활성을 나타내는 막대 그래프이다; 막대 높이는 그룹당 평균 10~11마리 마우스의 평균을 나타내고; 오차 막대는 평균에서 1 표준 편차를 나타낸다.
도 4A는 AAV-캡시드화 sp7-GLA가 투여된 파브리 수컷 마우스에서 AAV 용량 증량의 함수로서 혈청 GLA 효소 활성을 나타내는 막대 그래프로, 2개의 개별 연구(연구 1 및 연구 2)에 걸쳐 수행되었으며, AAV 투여 4주 후 측정되었으며; 막대 높이는 그룹당 5마리 마우스의 평균 혈청 GLA 활성을 나타내고; 오차 막대는 평균에서 1 표준 편차를 나타내고; 수평선은 AAV-캡시드화 sp7-GLA가 투여되지 않은 5마리의 GLA-/눌(null) 마우스 그룹에서 관찰된 최대 활성으로 정의된 바와 같은 GLA 녹아웃 동물에서 관찰된 기저(비특이적 활성)를 나타낸다.
도 4B는 sp7-GLA AAV 벡터에 대해 관찰된 용량-반응의 선형성을 나타내는 그래프이다; 도 4A에 도시된 AAV-캡시드화 sp7-GLA로 처리된 GLA-/눌 수컷 마우스로부터의 데이터를 마우스당 벡터 게놈 투여량의 함수로서 재플롯팅하였다; 데이터는 단순 선형 회귀로 피팅되었다; 95% 신뢰 구간이 점선으로 표시된다.
도 5A는 AAV-캡시드화 sp7-GLA가 투여된 수컷 마우스의 간에서 GLA 활성을 나타내는 막대 그래프이다; 활성의 기저 수준은 5마리의 GLA-/눌 비처리 마우스(대조군) 및 4마리의 연령 일치 GLA+/눌(WT) 수컷 마우스에서 유래한 샘플에서 결정되었고; 막대 높이는 간 용해물의 평균 GLA 활성을 나타내며; 오차 막대는 평균에서 1 표준 편차를 나타낸다.
도 5B는 GLA-/눌 수컷 마우스(대조군), 또는 AAV-캡시드화 sp7-GLA가 투여된 4마리의 연령 일치 GLA+/눌(WT) 수컷 마우스의 신장에서 GLA 활성을 나타내는 막대 그래프이다. 막대 높이는 평균 조직 GLA 활성을 나타낸다. 오차 막대는 평균에서 1 표준 편차를 나타낸다.
도 6은 본원에 기재된 AAV-캡시드화 CpG-무함유, 코돈-최적화된 GLA 카세트가 투여된 C57Bl/6 마우스에서의 혈청 GLA 활성을 나타내는 막대 그래프이다; 혈청 내 GLA 활성은 AAV 형질도입 후 4주에 분석되었다; 막대 높이는 그룹당 5마리 마우스의 평균 조직 GLA 활성을 나타내고; 오차 막대는 평균에서 1 표준 편차를 나타낸다.
도 7은 코돈-최적화된 GLA 변이체(sp7-GLA-co4; sp7-GLA-var45), 7개 아미노산 치환을 갖는 GLA 서열(GLA 7 mut; SPKL0031), 또는 인트론 함유 변이체(인트론 IgHA; 인트론 VTN1; 인트론 RBP4; 인트론 IgHμ)의 AAV 투여 후 42일에 C57Bl/6 마우스에서의 혈청 GLA 활성을 sp7-GLA(로트 A 및 B)의 것과 비교하여 나타내는 막대 그래프이다
도 8A는 4.4E11 vg/kg, 1.4E12 vg/kg, 및 4.4E12 vg/kg의 AAV-sp7-GLA-co4가 투여된 B6;129-GLA -/- 마우스에서 혈청 lyso-GL3 수준의 용량 의존적 감소를 보여주는 선 그래프이다. Lyso-GL3 수준이 28일 동안 질량 분석법으로 분석되었다.
도 8B는 시험관 내 4-메틸움버리페릴 β-D-갈락토피라노시드(4-MU-Gal) 검정을 사용하여 측정된, 혈청 중 α-gal A 활성과 lyso-GL-3 수준 사이의 선형 관계를 보여주는 그래프이다.
도 9A는 정맥내로 투여된 4.4E11 vg/kg, 1.4E12 vg/kg, 및 4.4E12 vg/kg의 AAV-sp7-GLA-co4의 용량에 대응하는 1개월 동안의 B6;129-GLA -/- 마우스의 혈청 내 lyso-GL3 수준의 감소를 나타내는 막대 그래프로, lyso-GL3 감소의 용량 의존적 증가를 입증한다.
도 9B는 AAV-sp7-GLA-co4를 4.4E11 vg/kg, 1.4E12 vg/kg, 및 4.4E12 vg/kg의 용량으로 투여하고 1개월 후 B6;129-GLA -/- 마우스의 신장 조직에서 lyso-GL3 수준의 감소를 나타내는 막대 그래프로, lyso-GL3의 용량 의존적 감소를 입증한다.
도 9C는 AAV-sp7-GLA-co4를 4.4E11 vg/kg, 1.4E12 vg/kg, 및 4.4E12 vg/kg의 용량으로 투여하고 1개월 후 B6;129-GLA -/- 마우스의 심장 조직에서 lyso-GL3 수준의 감소를 나타내는 막대 그래프로, lyso-GL3의 용량 의존적 감소를 입증한다.
도 10A는 비인간 영장류(사이노몰구스 마카크(cynomolgus macaques))에서 AAV-sp7-GLA-co4의 주입 후 시간 경과에 따른 혈청 GLA 활성의 그래프이다.
도 10B는 비인간 영장류(사이노몰구스 마카크)에서 AAV-sp7-GLA-co4의 주입 후 시간 경과에 따른 혈청 GLA 항원 수준의 그래프이다.
도 11은 2E11 vg/kg(위쪽 삼각형), 4E11 vg/kg(아래쪽 삼각형) 또는 2E12 vg/kg(다이아몬드)의 용량으로 AAV-sp7-GLA("AAV-sp7.GLA"로 표시됨)의 IV 주사 후 GLA 녹아웃(B6;129-GLA -/-) 마우스에서 12주의 시간 경과에 걸쳐 측정된 혈청 GLA 항원 수준의 그래프이다. 대조군은 비히클만 주입된 야생형 마우스(원) 또는 GLA 녹아웃 마우스(사각형)(각각 "WT + 비히클" 및 "GLAko"로 표시됨)였다. BQL은 정량 한계 미만을 나타낸다.
도 12A는 2E11 vg/kg, 4E11 vg/kg 또는 2E12 vg/kg의 용량으로 AAV-sp7-GLA("AAV-sp7.GLA"로 표시됨)의 IV 주사 후 1개월 및 3개월에 측정된, GLA 녹아웃(B6;129-GLA -/-) 마우스의 신장에서의 GL-3 수준의 막대 그래프이다. 대조군은 야생형 마우스("GLA WT"로 표시됨) 및 GLA 녹아웃 마우스("GLA KO"로 표시됨)였다. 각 조건에서 3개월 및 1개월 막대가 각각 왼쪽에서 오른쪽으로 표시된다.
도 12B는 2E11 vg/kg, 4E11 vg/kg 또는 2E12 vg/kg의 용량으로 AAV-sp7-GLA("AAV-sp7.GLA"로 표시됨)의 IV 주사 후 1개월 및 3개월에 측정된, GLA 녹아웃(B6;129-GLA -/-) 마우스의 신장에서의 lyso-GL-3 수준의 막대 그래프이다. 대조군은 야생형 마우스("GLA WT"로 표시됨) 및 GLA 녹아웃 마우스("GLA KO"로 표시됨)였다. 각 조건에서 3개월 및 1개월 막대가 각각 왼쪽에서 오른쪽으로 표시된다.
도 12C는 2E11 vg/kg, 4E11 vg/kg 또는 2E12 vg/kg의 용량으로 AAV-sp7-GLA("AAV-sp7.GLA"로 표시됨)의 IV 주사 후 1개월 및 3개월에 측정된, GLA 녹아웃(B6;129-GLA -/-) 마우스의 심장에서의 GL-3 수준의 막대 그래프이다. 대조군은 야생형 마우스("GLA WT"로 표시됨) 및 GLA 녹아웃 마우스("GLA KO"로 표시됨)였다. 각 조건에서 3개월 및 1개월 막대가 각각 왼쪽에서 오른쪽으로 표시된다.
도 12D는 2E11 vg/kg, 4E11 vg/kg 또는 2E12 vg/kg의 용량으로 AAV-sp7-GLA("AAV-sp7.GLA"로 표시됨)의 IV 주사 후 1개월 및 3개월에 측정된, GLA 녹아웃(B6;129-GLA -/-) 마우스의 심장에서의 lyso-GL-3 수준의 막대 그래프이다. 대조군은 야생형 마우스("GLA WT"로 표시됨) 및 GLA 녹아웃 마우스("GLA KO"로 표시됨)였다. 각 조건에서 3개월 및 1개월 막대가 각각 왼쪽에서 오른쪽으로 표시된다.
발명의 상세한 설명
다양한 간행물, 기사 및 특허가 배경 및 명세서 전반에 걸쳐 인용되거나 설명되어 있다; 이들 각각의 참고문헌은 그 전체가 참조로 본원에 포함된다. 본 명세서에 포함된 문서, 행위, 재료, 장치, 물품 등에 대한 논의는 본 발명의 맥락을 제공하기 위한 것이다. 이러한 논의는 이러한 문제 중 일부 또는 전부가 개시되거나 청구된 발명과 관련하여 선행 기술의 일부를 이룬다는 것을 인정하는 것이 아니다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 기술자에게 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 그렇지 않으면, 본원에 인용된 특정 용어는 명세서에 제시된 것과 같은 의미를 갖는다.
본원 및 이어지는 청구범위에서 사용되는 단수형 "a", "an" 및 "the"는 문맥상 명백하게 달리 지시하지 않는 한 복수형을 포함한다는 점에 유의해야 한다.
문맥상 달리 요구되지 않는 한, 본 명세서 및 이어지는 청구범위 전체에 걸쳐, 단어 "포함한다" 및 "포함하다" 및 "포함하는"과 같은 변형은 명시된 정수 또는 그룹 또는 단계 또는 정수의 그룹의 포함을 내포하되 다른 정수 또는 단계 또는 정수 또는 단계의 그룹을 제외하지는 않는 것으로 이해될 것이다. 본원에서 사용되는 경우 "포함하는"이라는 용어는 "함유하는" 또는 "포함한"이라는 용어로 대체될 수 있으며, 때때로 본원에서 "갖는"이라는 용어와 함께 사용되는 경우도 있다.
본원에서 사용된 "이루어지는"은 청구항 요소에 명시되지 않은 요소, 단계 또는 성분을 제외하며, 그러한 요소, 단계 또는 성분은 청구된 발명과 관련된다. 본원에서 사용되는 경우, "필수적으로 이루어지는"은 청구범위의 기본적이고 신규한 특성에 실질적으로 영향을 미치지 않는 재료 또는 단계를 배제하지 않는다. "포함하는", "함유하는", "포함한" 및 "갖는"의 전술한 용어 중 임의의 용어는 본 발명의 측면 또는 실시양태의 맥락에서 본원에서 사용될 때마다 본 개시의 범위를 다양하게 하기 위해 용어 "이루어지는" 또는 "필수적으로 이루어지는"으로 대체될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 다수의 인용된 요소 사이의 접속 용어 "및/또는"은 개별 및 조합된 옵션을 모두 포함하는 것으로 이해된다. 예를 들어 두 요소가 "및/또는"으로 결합된 경우, 첫 번째 옵션은 두 번째 요소 없이 첫 번째 요소의 적용 가능성을 나타낸다. 두 번째 옵션은 첫 번째 요소 없이 두 번째 요소의 적용 가능성을 나타낸다. 세 번째 옵션은 첫 번째 요소와 두 번째 요소를 함께 적용할 수 있는 가능성을 나타낸다. 이러한 옵션 중 어느 하나가 의미 내에 속하는 것으로 이해되며, 따라서 본원에서 사용되는 용어 "및/또는"의 요구 사항을 충족한다. 2 이상의 옵션을 동시에 적용할 수 있는 것도 의미에 속하는 것으로 이해되므로 "및/또는"이라는 용어의 요구 사항을 충족한다.
본원에 개시된 모든 특징은 임의의 조합으로 결합될 수 있다. 명세서에 개시된 각 기능은 동일하거나 동등하거나 유사한 목적을 제공하는 대안적 특징으로 대체될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "약"은 기본 파라미터의 10% 이내(즉, 플러스 또는 마이너스 10%)의 값을 의미한다. 예를 들어, "약 1:10"은 1.1:10.1 또는 0.9:9.9를 의미하고, 약 5시간은 4.5시간 또는 5.5시간 등을 의미한다. 일련의 값의 시작 부분에 있는 용어 "약"은 각 값을 10%까지 변경한다.
모든 숫자 값 또는 숫자 범위는 문맥에서 달리 명확하게 나타내지 않는 한 그러한 범위 내의 정수 및 값의 분수 또는 범위 내의 정수를 포함한다. 따라서, 예를 들어, 95% 이상의 감소에 대한 언급은 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100% 등 뿐만 아니라 95.1%, 95.2%, 95.3%, 95.4%, 95.5%, etc., 96.1%, 96.2%, 96.3%, 96.4%, 96.5% 등등을 포함한다. 따라서, 또한 예시하기 위해, "1-4"와 같은 숫자 범위에 대한 언급은 2, 3뿐만 아니라 1.1, 1.2, 1.3, 1.4 등을 포함한다. 예를 들어, "1 내지 4주"는 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 또는 28일을 포함한다.
또한, "0.01 내지 10"과 같은 수치 범위에 대한 언급은 0.011, 0.012, 0.013 등 뿐만 아니라 9.5, 9.6, 9.7, 9.8, 9.9 등등을 포함한다. 예를 들어, 대상체의 체중 "약 0.01 mg/kg 내지 약 10 mg/kg"의 용량은 0.011 mg/kg, 0.012 mg/kg, 0.013 mg/kg, 0.014 mg/kg, 0.015 mg/kg 등 뿐만 아니라 9.5 mg/kg, 9.6 mg/kg, 9.7 mg/kg, 9.8 mg/kg, 9.9 mg/kg 등등을 포함한다.
보다 (크거나) 또는 미만의 정수에 대한 언급은 각각 참조 숫자보다 크거나 작은 임의의 숫자를 포함한다. 따라서, 예를 들어, 2보다 큰 언급은 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 등을 포함한다. 예를 들어, 비-바이러스 벡터 및/또는 면역 세포 조절제의 "2회 이상" 투여는 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15회 이상을 포함한다.
또한, "1 내지 90"과 같은 숫자 범위에 대한 언급은 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5 등 뿐만 아니라 81, 82, 83, 84, 85 등을 포함한다. 예를 들어, "약 1분 내지 약 90일"은 1.1분, 1.2분, 1.3분, 1.4분, 1.5분 등뿐만 아니라 1일, 2일, 3일, 4일, 5일…. 81일, 82일, 83일, 84일, 85일 등등을 포함한다.
본 출원의 독자를 돕기 위해, 설명은 다양한 단락 또는 섹션으로 분리되거나 본 발명의 특정 실시양태에 관한 것이다. 이러한 분리는 단락 또는 섹션 또는 실시양태의 내용을 다른 단락 또는 섹션 또는 실시양태의 내용과 분리하는 것으로 간주되어서는 안 된다. 반대로, 당업자는 설명이 폭넓은 적용을 가지며 고려될 수 있는 다양한 섹션, 단락 및 문장의 모든 조합을 포함한다는 것을 이해할 것이다. 임의의 실시양태에 대한 설명은 단지 예시를 위한 것이며 청구범위를 비롯한 본 발명의 범위가 이들 예에 한정되는 것으로 제안하려는 의도는 아니다.
본원에 제공된 설명은 GLA를 인코딩하는 변형된 핵산, GLA를 인코딩하는 변형된 핵산을 포함하는 발현 카세트, GLA를 인코딩하는 변형된 핵산을 포함하는 바이러스 벡터, 및 GLA를 인코딩하는 변형된 핵산을 포함하는 비-바이러스 벡터를 포함한다. 본 발명은 또한 GLA를 인코딩하는 변형된 핵산을 포함하는 재조합 AAV 입자, GLA를 인코딩하는 변형된 핵산을 포함하는 비-바이러스 입자, GLA를 인코딩하는 변형된 핵산을 포함하는 약학 조성물, 파브리병 뿐만 아니라 GLA 결핍을 특징으로 하는 다른 리소좀 저장 장애를 치료하는 방법, 및 파브리병 뿐만 아니라 GLA 결핍을 특징으로 하는 다른 리소좀 저장 장애를 치료하는데 사용하기 위한 본원에 제공된 다양한 작제물도 포함한다.
핵산
용어 "핵산" 및 "폴리뉴클레오타이드"는 본원에서 데옥시리보핵산(DNA) 및 리보핵산(RNA)을 포함하는 모든 형태의 핵산, 올리고뉴클레오타이드를 지칭하기 위해 상호교환적으로 사용된다. 핵산을 논의할 때, 특정 폴리뉴클레오타이드의 서열 또는 구조는 본원에서 5'에서 3' 방향으로 서열을 제공하는 관례에 따라 기술될 수 있다.
특정 실시양태에서, 핵산은 게놈 DNA, cDNA, 안티센스 DNA/RNA, 플라스미드 DNA, 선형 DNA(폴리- 및 올리고-뉴클레오타이드), 염색체 DNA, 스플라이싱되거나 스플라이싱되지 않은 mRNA, rRNA, tRNA 억제 DNA 또는 RNA(RNAi, 예를 들어, 작거나 짧은 헤어핀 (sh)RNA, 마이크로RNA(miRNA), 작거나 짧은 간섭(si)RNA, 트랜스-스플라이싱 RNA 또는 안티센스 RNA), 잠금 핵산 유사체(LNA), 올리고뉴클레오타이드 DNA(ODN) 단일 및 이중 가닥, 면역자극 서열(ISS), 리보스위치 및 리보자임을 포함한다.
특정 실시양태에서, 핵산은 자연 발생, 합성 및 의도적으로 변형되거나 변경된 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 핵산은 단일, 이중 또는 삼중, 선형 또는 원형일 수 있으며 임의의 길이일 수 있다.
특정 실시양태에 따르면, 폴리뉴클레오타이드는 단일 가닥 DNA(ssDNA) 또는 이중 가닥 DNA(dsDNA) 분자이다. 특정 실시양태에 따르면, 폴리뉴클레오타이드는 치료용, 예를 들어 치료적 전이유전자를 인코딩하는 ssDNA 또는 dsDNA를 위한 것이다. 특정 실시양태에 따르면, dsDNA 분자는 미니서클, 나노플라스미드, 개방형 선형 듀플렉스 DNA 또는 폐쇄형 선형 듀플렉스 DNA(CELiD/ceDNA/도기본(doggybone) DNA)이다. 특정 실시양태에 따르면, ssDNA 분자는 폐쇄형 원형 또는 개방형 선형 DNA이다.
본원에서 "전이유전자"는 세포 또는 유기체에 도입될 예정이거나 도입된 핵산을 편리하게 지칭하기 위해 사용된다. 전이유전자는 GLA를 인코딩하는 변형된 핵산과 같은 이종 폴리뉴클레오타이드 서열, 또는 단백질 또는 펩타이드 또는 핵산(예를 들어, miRNA 등)을 인코딩하는 이종 핵산과 같은 임의의 핵산을 포함한다. 전이유전자 및 이종 핵산/폴리뉴클레오타이드 서열이라는 용어는 본원에서 상호교환적으로 사용된다.
본원에서 사용된 "α-갈락토시다제 A" 또는 "GLA" 또는 "α-gal A"는 GLA의 임의의 핵산 또는 단백질을 지칭한다. 특정 실시양태에서, GLA를 인코딩하는 핵산은 인간 GLA 단백질을 인코딩한다. 인트론과 엑손을 포함한 GLA의 전체 DNA 서열은 GenBank Accession No. X14448.1로 이용 가능하다. 인간 GLA 효소는 429개의 아미노산으로 구성되어 있으며 GenBank 접근 번호 X14448.1 및 U78027로 이용 가능하다. 전장 429개 아미노산 인간 GLA 효소는 4개의 N-글리코실화 공통 서열을 포함하는 성숙한 398개 아미노산 서브유닛을 생성하도록 절단되는 31-잔기 신호 펩타이드를 포함하는 전구체 단백질이다. 사용된 문맥에 의해 달리 표시되지 않는 한, GLA에 대한 언급에는 전장 전구체 및 성숙한 α-갈락토시다제 A가 포함된다. GLA의 예는 임의의 자연 발생 GLA, 성숙 및 이의 변이체를 포함한다. 전장 전구체 GLA 효소의 예는 서열 번호 12의 아미노산 서열을 갖는다. 성숙한 GLA 효소의 예는 서열 번호 100의 아미노산 서열을 갖는다. 본원에서 사용되는 "GLA를 인코딩하는 핵산"이란 야생형 GLA 단백질의 기능 또는 활성의 적어도 일부를 갖는 단백질을 인코딩하는 재조합 핵산 분자를 지칭한다. 그러한 핵산의 예는 GLA를 인코딩하는 변형된 핵산 서열을 포함한다.
용어 "돌연변이 단백질"은 단백질을 인코딩하는 유전자에 돌연변이를 가져 소포체(ER)에 정상적으로 존재하는 조건 하에서 단백질이 안정한 입체형태를 달성할 수 없게 만드는 단백질을 포함한다. 안정한 입체형태를 달성하지 못하면 효소는 리소좀으로 운반되기보다 상당한 양이 분해된다. 그러한 돌연변이는 때때로 "입체형태적 돌연변이"로 불린다. 이러한 돌연변이에는 미스센스 돌연변이, 프레임 내 작은 결실 및 삽입이 포함되지만 이에 제한되지 않는다.
특정 실시양태에서 본원에서 사용되는 용어 "돌연변이 GLA"는 GLA를 인코딩하는 유전자에 돌연변이를 가져 효소가 ER에 정상적으로 존재하는 조건 하에서 안정한 입체형태를 달성할 수 없게 만드는 GLA를 포함한다. 안정한 입체형태를 달성하지 못하면 효소는 리소좀으로 운반되기보다 상당한 양이 분해된다.
본원에 사용된 용어 "변형시킨다" 및 이의 문법적 변형은 핵산 또는 단백질이 참조 또는 모 서열로부터 벗어난다는 것을 의미한다. GLA를 인코딩하는 변형된 핵산은 참조(예를 들어, 야생형) 또는 모 핵산과 비교하여 변경되었다. 따라서 변형된 핵산은 참조 또는 모 핵산과 실질적으로 동일하거나 더 크거나 더 적은 활성 또는 기능을 가질 수 있지만, 적어도 참조 또는 모 핵산에 대한 부분적 활성, 기능 및/또는 서열 동일성을 유지한다. 변형된 핵산은 변형 또는 변이 GLA를 인코딩하도록 유전적으로 변형될 수 있다.
"GLA를 인코딩하는 변형된 핵산"은 GLA 핵산이 GLA를 인코딩하는 모의 비변형 핵산과 비교하여 변경을 가짐을 의미한다. 변형의 특정한 예는 뉴클레오타이드 치환이다. 뉴클레오타이드 치환은 동일한 아미노산을 코딩하는 침묵 돌연변이이거나 다른 아미노산을 코딩하는 미스센스 돌연변이일 수 있다. 미스센스 돌연변이는 보존적 또는 비보존적 돌연변이일 수 있다. 변형의 다른 예는 예를 들어 절단 및 삽입을 포함한다. 변형된 핵산은 또한 야생형 단백질 또는 코돈 최적화되지 않은 핵산의 것과 동일한 단백질을 인코딩하는 코돈 최적화된 핵산을 포함할 수 있다. 코돈 최적화는 예를 들어 CpG 디뉴클레오타이드 제거를 포함하여 더 넓은 의미로 사용될 수 있다.
본원에서 "변형"이라는 용어는 GLA를 인코딩하는 핵산에 대한 각 경우의 언급에 나타날 필요는 없다.
특정 실시양태에서, GLA를 인코딩하는 변형된 핵산의 경우, GLA 단백질은 야생형 GLA 단백질의 기능 또는 활성의 적어도 일부를 유지한다. GLA 단백질의 기능 또는 활성에는 α-갈락토시다제 A 활성, 당지질 및 당단백질로부터 말단 알파-갈락토실 모이어티를 가수분해하는 글리코시드 가수분해효소 효소가 포함된다. 따라서, GLA를 인코딩하는 변형된 핵산은 인코딩된 GLA가 GLA의 글리코시드 가수분해효소 활성의 정도 또는 측면을 어느 정도 유지하는 한 변형된 형태를 포함한다.
본원에 기재된 바와 같이, GLA를 인코딩하는 변형된 핵산은 참조 또는 모 핵산과 비교하여 상이한 특징 또는 특성을 나타낼 수 있다. 예를 들어, 변형된 핵산은 본원에 기재된 GLA를 인코딩하는 참조 핵산에 대해 100% 동일성을 갖는 서열뿐만 아니라 GLA를 인코딩하는 참조 핵산에 대해 100% 미만의 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
용어 "동일성", "상동성" 및 이들의 문법적 변형은 2 이상의 참조된 대상체가 "정렬된" 서열일 때의 동일함을 의미한다. 따라서, 예로서, 2개의 핵산이 동일한 경우, 적어도 참조된 영역 또는 부분 내에 동일한 서열을 갖는다. 동일성은 서열의 정의된 부위(영역 또는 도메인)에 걸쳐 있을 수 있다.
대상의 '부위' 또는 '영역'은 동일한 두 개 이상의 참조된 대상의 일부를 지칭한다. 따라서, 2개의 단백질 또는 핵산 서열이 하나 이상의 서열 부위 또는 영역에 걸쳐 동일한 경우 이들은 그 영역 내에서 동일성을 공유한다. "정렬된" 서열은 종종 참조 서열과 비교하여 누락되거나 추가된 염기 또는 아미노산(갭)에 대한 수정을 포함하는 다중 단백질(아미노산) 또는 핵산 서열을 의미한다.
동일성은 서열의 전체 길이 또는 일부에 걸쳐 확장될 수 있다. 특정 실시양태에서, 퍼센트 동일성을 공유하는 서열의 길이는 2, 3, 4, 5개 이상의 연속 아미노산 또는 핵산, 예를 들어 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 등의 연속 핵산 또는 아미노산이다. 특정 실시양태에서, 동일성을 공유하는 서열의 길이는 21개 이상의 연속 아미노산 또는 핵산, 예를 들어 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40 등의 연속 핵산 또는 아미노산이다. 추가 실시양태에서, 동일성을 공유하는 서열의 길이는 41개 이상의 연속 아미노산 또는 핵산, 예를 들어 42, 43, 44, 45, 45, 47, 48, 49, 50 등의 연속 핵산 또는 아미노산이다. 또 상이한 실시양태에서, 동일성을 공유하는 서열의 길이는 50개 이상의 인접 아미노산 또는 핵산, 예를 들어, 50-55, 55-60, 60-65, 65-70, 70-75, 75-80, 80-85, 85-90, 90-95, 95-100, 100-150, 150-200, 200-250, 250-300, 300-500, 500-1,000 등의 연속 핵산 또는 아미노산이다.
본원에 기재된 바와 같이, GLA를 인코딩하는 변형된 핵산은 GLA를 인코딩하는 참조 핵산과 상이하거나, 100% 동일성 또는 100% 미만의 동일성을 나타낼 수 있다.
특정 실시양태에 따르면, GLA를 인코딩하는 핵산은 (1) 서열 번호 15의 서열과 적어도 75% 서열 동일성, 예컨대 서열 번호 15의 서열에 대해 75% 이상 서열 동일성, 76% 이상 서열 동일성, 77% 이상 서열 동일성, 78% 이상 서열 동일성, 79% 이상 서열 동일성, 80% 이상 서열 동일성, 81% 이상 서열 동일성, 82% 이상 서열 동일성, 83% 이상 서열 동일성, 84% 이상 서열 동일성, 85% 이상 서열 동일성, 86% 이상 서열 동일성, 87% 이상 서열 동일성, 88% 이상 서열 동일성, 89% 이상 서열 동일성, 90% 이상 서열 동일성, 91% 이상 서열 동일성, 92% 이상 서열 동일성, 93% 이상 서열 동일성, 94% 이상 서열 동일성, 95% 이상 서열 동일성, 96% 이상 서열 동일성, 97% 이상 서열 동일성, 98% 이상 서열 동일성, 99% 이상 서열 동일성, 99.5% 이상 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오타이드; (2) 서열 번호 16의 서열과 적어도 83% 서열 동일성, 예컨대 서열 번호 16의 서열에 대해 83% 이상 서열 동일성, 84% 이상 서열 동일성, 85% 이상 서열 동일성, 86% 이상 서열 동일성, 87% 이상 서열 동일성, 88% 이상 서열 동일성, 89% 이상 서열 동일성, 90% 이상 서열 동일성, 91% 이상 서열 동일성, 92% 이상 서열 동일성, 93% 이상 서열 동일성, 94% 이상 서열 동일성, 95% 이상 서열 동일성, 96% 이상 서열 동일성, 97% 이상 서열 동일성, 98% 이상 서열 동일성, 99% 이상 서열 동일성, 99.5% 이상 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오타이드; (3) 서열 번호 17의 서열과 적어도 85% 서열 동일성, 예컨대 서열 번호 17의 서열에 대해 85% 이상 서열 동일성, 86% 이상 서열 동일성, 87% 이상 서열 동일성, 88% 이상 서열 동일성, 89% 이상 서열 동일성, 90% 이상 서열 동일성, 91% 이상 서열 동일성, 92% 이상 서열 동일성, 93% 이상 서열 동일성, 94% 이상 서열 동일성, 95% 이상 서열 동일성, 96% 이상 서열 동일성, 97% 이상 서열 동일성, 98% 이상 서열 동일성, 99% 이상 서열 동일성, 99.5% 이상 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오타이드; (4) 서열 번호 18의 서열과 적어도 85% 서열 동일성, 예컨대 서열 번호 18의 서열에 대해 85% 이상 서열 동일성, 86% 이상 서열 동일성, 87% 이상 서열 동일성, 88% 이상 서열 동일성, 89% 이상 서열 동일성, 90% 이상 서열 동일성, 91% 이상 서열 동일성, 92% 이상 서열 동일성, 93% 이상 서열 동일성, 94% 이상 서열 동일성, 95% 이상 서열 동일성, 96% 이상 서열 동일성, 97% 이상 서열 동일성, 98% 이상 서열 동일성, 99% 이상 서열 동일성, 99.5% 이상 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오타이드; 및 (5) 서열 번호 19의 서열과 적어도 82% 서열 동일성, 예컨대 서열 번호 19의 서열에 대해 82% 이상 서열 동일성, 83% 이상 서열 동일성, 84% 이상 서열 동일성, 85% 이상 서열 동일성, 86% 이상 서열 동일성, 87% 이상 서열 동일성, 88% 이상 서열 동일성, 89% 이상 서열 동일성, 90% 이상 서열 동일성, 91% 이상 서열 동일성, 92% 이상 서열 동일성, 93% 이상 서열 동일성, 94% 이상 서열 동일성, 95% 이상 서열 동일성, 96% 이상 서열 동일성, 97% 이상 서열 동일성, 98% 이상 서열 동일성, 99% 이상 서열 동일성, 99.5% 이상 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오타이드로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 실시양태에 따르면, GLA를 인코딩하는 핵산은 서열 번호 15-19의 서열 중 어느 하나에 대해 100% 서열 동일성을 갖는다.
특정 실시양태에서, GLA를 인코딩하는 핵산은 GLA를 인코딩하는 핵산 내의 임의의 위치에 위치하는 하나 이상의 인트론을 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 인트론은 GLA를 인코딩하는 핵산의 뉴클레오타이드 78과 79 사이에 위치하며, 여기서 뉴클레오타이드 위치는 서열 번호 14의 서열을 갖는 GLA의 코딩 서열과 관련하여 주어진다.
특정 실시양태에서, 인트론은 비트로넥틴1(VTN1) 유전자, 레티놀 결합 단백질 4(RBP4) 유전자, 마우스 IgG 중쇄 A(IgHA) 유전자 및 마우스 IgG 중쇄 μ(IgHμ) 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 실시양태에서, 하나 이상의 인트론은 서열 번호 49-52의 서열로부터 선택된다.
특정 실시양태에서, GLA를 인코딩하는 핵산은 서열 번호 43-46 중 어느 하나의 서열을 갖는다.
특정 실시양태에 따르면, 본 발명의 핵산은 서열 번호 100의 아미노산 서열을 갖는 GLA를 인코딩한다.
특정 실시양태에서, GLA는 Gln57Lys, Gln111Glu, Lys213Glu, Lys237Gln, Phe248Thr, Gly334Glu, 및 Gly346Asn으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나의 아미노산 치환을 갖는 서열 번호 100의 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, GLA는 Gln57Lys, Gln111Glu, Lys213Glu, Lys237Gln, Phe248Thr, Gly334Glu, 및 Gly346Asn으로 이루어진 군으로부터 선택된 임의의 2개의 아미노산 치환을 갖는 서열 번호 100의 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, GLA는 Gln57Lys, Gln111Glu, Lys213Glu, Lys237Gln, Phe248Thr, Gly334Glu, 및 Gly346Asn으로 이루어진 군으로부터 선택된 임의의 3개의 아미노산 치환을 갖는 서열 번호 100의 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, GLA는 Gln57Lys, Gln111Glu, Lys213Glu, Lys237Gln, Phe248Thr, Gly334Glu, 및 Gly346Asn으로 이루어진 군으로부터 선택된 임의의 4개의 아미노산 치환을 갖는 서열 번호 100의 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, GLA는 Gln57Lys, Gln111Glu, Lys213Glu, Lys237Gln, Phe248Thr, Gly334Glu, 및 Gly346Asn으로 이루어진 군으로부터 선택된 임의의 5개의 아미노산 치환을 갖는 서열 번호 100의 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, GLA는 Gln57Lys, Gln111Glu, Lys213Glu, Lys237Gln, Phe248Thr, Gly334Glu, 및 Gly346Asn으로 이루어진 군으로부터 선택되는 임의의 6개의 아미노산 치환을 갖는 서열 번호 100의 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, GLA는 Gln57Lys, Gln111Glu, Lys213Glu, Lys237Gln, Phe248Thr, Gly334Glu, 및 Gly346Asn의 7개 아미노산 치환을 갖는 서열 번호 100의 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, GLA는 서열 번호 48의 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시양태에서, GLA를 인코딩하는 핵산은 서열 번호 47의 코딩 서열을 포함한다.
참조 또는 모 핵산과 비교하여 상이한 특징 또는 특성을 나타내는 GLA를 인코딩하는 변형된 핵산은 뉴클레오타이드의 치환을 포함한다. 예를 들어, GLA를 인코딩하는 변형된 핵산은 CpG-감소된 핵산으로 지칭되는 GLA를 인코딩하는 참조 핵산과 비교하여 감소된 수의 CpG 디뉴클레오타이드를 갖는 핵산을 포함한다.
본원에 사용된 "CpG-감소된" 또는 "CpG-고갈된"이라는 어구는 합성에 의해 또는 핵산 서열의 돌연변이에 의해 생성되어 하나 이상의 CpG 디뉴클레오타이드(또는 모티프)가 핵산 서열에서 제거된 핵산 서열을 지칭한다. 특정 실시양태에서, 모든 CpG 모티프는 본원에서 변형된 CpG-비함유 서열로 지칭되는 것을 제공하기 위해 제거된다. CpG 모티프는 코딩 서열(예를 들어, 전이유전자)뿐만 아니라 예를 들어 5' 및 3' 비번역 영역(UTR), 프로모터, 인핸서, 신호 펩타이드, polyA, ITR, 인트론 및 폴리뉴클레오타이드 분자에 존재하는 임의의 기타 서열을 포함하는 비코딩 서열에서도 적절하게 감소되거나 제거된다.
특정 실시양태에 따르면, GLA를 인코딩하는 핵산은 14개 미만의 CpG 디뉴클레오타이드, 예컨대 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1, 또는 0개의 CpG 디뉴클레오타이드를 함유한다.
특정 뉴클레오타이드 서열 또는 아미노산 서열을 언급할 때 "본질적으로 이루어진"이라는 어구는 주어진 서열 번호의 서열 특성을 갖는 서열을 지칭한다. 예를 들어, 아미노산 서열과 관련하여 사용될 때, 이 어구는 서열 자체 및 서열의 기본적이고 신규한 특성에 영향을 미치지 않는 분자 변형을 포함한다.
본 발명의 GLA를 인코딩하는 변형된 핵산을 포함하는 핵산, 발현 벡터, AAV 벡터 게놈, 비-바이러스 벡터, 플라스미드는 재조합 DNA 기술 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 뉴클레오타이드 서열 정보의 이용가능성은 다양한 수단에 의해 본 발명의 분리된 핵산 분자의 제조를 가능하게 한다. GLA를 인코딩하는 핵산은 다양한 표준 클로닝, 재조합 DNA 기술, 세포 발현 또는 시험관 내 번역 및 화학 합성 기술을 사용하여 만들 수 있다. 폴리뉴클레오타이드의 순도는 시퀀싱, 겔 전기영동 등을 통해 결정할 수 있다. 예를 들어, 혼성화 또는 컴퓨터 기반 데이터베이스 스크리닝 기술을 사용하여 핵산을 분리할 수 있다. 그러한 기술은 (1) 동종 뉴클레오타이드 서열을 검출하기 위한 프로브와 게놈 DNA 또는 cDNA 라이브러리의 혼성화; (2) 예를 들어, 발현 라이브러리를 사용하여 구조적 특징을 공유하는 폴리펩타이드를 검출하기 위한 항체 스크리닝; (3) 관심 있는 핵산 서열에 어닐링할 수 있는 프라이머를 사용한 게놈 DNA 또는 cDNA에 대한 폴리머라제 연쇄 반응(PCR); (4) 관련 서열에 대한 서열 데이터베이스의 컴퓨터 검색; 및 (5) 공제 핵산 라이브러리의 차등 스크리닝을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
핵산은 임의의 편리한 클로닝 벡터에서 DNA로 유지될 수 있다. 특정 실시양태에서, 클론은 적합한 대장균 숙주 세포에서 증식되는 pBluescript(Stratagene, La Jolla, CA)와 같은 플라스미드 클로닝/발현 벡터에서 유지된다. 대안적으로, 핵산은 포유동물 세포에서의 발현에 적합한 벡터, 예를 들어 AAV 벡터에서 유지될 수 있다. 번역 후 변형이 단백질 기능에 영향을 미치는 경우 핵산 분자는 포유류 세포에서 발현될 수 있다.
발현 카세트
본 발명은 또한 발현 조절 요소에 작동가능하게 연결된 본원에 기술된 바와 같은 GLA를 인코딩하는 핵산을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 카세트를 제공한다. 특정 실시양태에서, 발현 카세트는 GLA를 인코딩하는 핵산을 포함하고, 여기서 핵산은 (1) 서열 번호 15의 서열과 적어도 75% 서열 동일성(예를 들어, 75%-100% 동일성)을 갖는 폴리뉴클레오타이드, (2) 서열 번호 16의 서열과 적어도 84% 서열 동일성(예를 들어, 84%-100% 동일성)을 갖는 폴리뉴클레오타이드, (3) 서열 번호 17의 서열과 적어도 86% 서열 동일성(예를 들어, 86%-100% 동일성)을 갖는 폴리뉴클레오타이드, (4) 서열 번호 18의 서열과 적어도 86% 서열 동일성(예를 들어, 86%-100% 동일성)을 갖는 폴리뉴클레오타이드, 및 (5) 서열 번호 19의 서열과 적어도 83% 서열 동일성(예를 들어, 83%-100% 동일성)을 갖는 폴리뉴클레오타이드로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 실시양태에서, GLA는 서열 번호 100의 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시양태에서, 발현 카세트는 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 분자에 의해 인코딩되는 폴리펩타이드의 분비를 허용할 적절한 분비 신호 서열 또는 신호 펩타이드를 포함한다. 본원에 사용된 용어 "분비 신호 서열" 또는 "신호 펩타이드" 또는 이의 변형은 세포로부터 작동가능하게 연결된 폴리펩타이드의 분비를 고유 폴리펩타이드에서 관찰되는 분비 수준과 비교하여 향상시키는 기능을 하는 아미노산 서열을 지칭하는 것으로 의도된다. 신호 펩타이드는 전형적으로 길이가 20개 미만인 짧은 아미노산 서열로, 단백질을 소포체 분비 경로로 또는 이를 통해 전달한다. "향상된" 분비란 세포로부터 분비되는 세포에 의해 합성된 폴리펩타이드의 상대적인 비율이 증가됨을 의미하며; 분비 단백질의 절대량까지 증가할 필요는 없다. 특정 실시양태에서, 본질적으로 폴리펩타이드의 전부(즉, 적어도 95%, 97%, 98%, 99% 이상)가 분비된다. 그러나, 분비 수준이 천연 폴리펩타이드와 비교하여 향상되는 한, 본질적으로 폴리펩타이드의 전부 또는 심지어 대부분이 분비될 필요는 없다. 일반적으로, 분비 신호 서열은 소포체 내에서 절단되고, 특정 실시양태에서, 분비 신호 서열은 분비 전에 절단된다. 그러나, 세포로부터의 폴리펩타이드의 분비가 강화되고 폴리펩타이드가 기능하는 한, 분비 신호 서열이 절단될 필요는 없다. 따라서, 특정 실시양태에서, 분비 신호 서열은 부분적으로 또는 전체적으로 유지된다. 분비 신호 서열은 분비된 폴리펩타이드의 분비 신호로부터(즉, 전구체로부터) 전체적으로 또는 부분적으로 유래될 수 있고/있거나, 전체적으로 또는 부분적으로 합성될 수 있다. 분비 신호 서열의 길이는 중요하지 않다; 일반적으로 알려진 분비 신호 서열은 길이가 약 10-15 내지 50-60개 아미노산이다. 또한, 생성된 분비 신호 서열이 작동가능하게 연결된 폴리펩타이드의 분비를 향상시키는 기능을 하는 한, 분비된 폴리펩타이드로부터의 공지된 분비 신호는 변경되거나 변형될 수 있다(예를 들어, 아미노산의 치환, 결실, 절단 또는 삽입에 의해). 본 발명의 분비 신호 서열은 자연 발생 분비 신호 서열 또는 이의 변형을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성될 수 있다. 세포로부터 분비를 지시하는 수많은 분비 단백질 및 서열이 당업계에 공지되어 있다. 본 발명의 분비 신호 서열은 추가로 전체적으로 또는 부분적으로 합성 또는 인공적일 수 있다. 합성 또는 인공 분비 신호 펩타이드는 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 Barash et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 294:835-42 (2002)가 참조된다.
본 개시의 관점에서 당업자에게 공지된 임의의 적합한 신호 펩타이드가 본 발명에 사용될 수 있다. 신호 펩타이드의 예는 신호 펩타이드 데이터베이스(웹사이트: www.signalpeptide.de/)에서 발견되는 것을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 본 발명에 적합한 신호 펩타이드의 예는 야생형 GLA 신호 펩타이드, 인간 키모트립시노겐 B2 신호 펩타이드("sp7"; NCBI 참조 서열 NP_001020371의 18개 아미노산 신호 펩타이드), 알파 2-HS-당단백질(AHSG) 신호 펩타이드, CD300 신호 펩타이드, LAMP1(리소좀-관련 막 당단백질 1) 신호 펩타이드, Notch 2 신호 펩타이드, 오로소뮤코이드(orosomucoid) 1(ORM1) 신호 펩타이드, 트랜스페린(TF) 신호 펩타이드, 세크레콘(secrecon)(Barash et al., Biochem Biophys Res Commun. 2002;294: 835-842에 기재된 인공 신호 서열), 마우스 IgKVIII, 인간 IgKVIII, CD33, tPA, α-1 항트립신 신호 펩타이드 및 천연 분비 알칼리 포스파타제(SEAP)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 상기 언급된 신호 펩타이드의 변이체를 포함하여 소포체 분비 경로를 통해 단백질을 지시하는 임의의 통상적인 신호 서열이 본 발명에 사용될 수 있다.
특정 실시양태에서, 신호 펩타이드는 내인성 또는 천연 GLA 신호 펩타이드 또는 이의 변이체이다.
특정 실시양태에서, 신호 펩타이드는 이종 신호 펩타이드 또는 이의 변이체이다.
특정 실시양태에서, 신호 펩타이드는 서열 번호 1-11 및 13 중 어느 하나의 코딩 서열을 갖는다.
특정 실시양태에서, 신호 펩타이드는 서열 번호 41 및 57-63 중 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는다.
특정 실시양태에서, 발현 카세트는 GLA를 인코딩하는 핵산의 5' 말단에 위치한 신호 펩타이드 서열을 인코딩하는 핵산을 포함한다. 특정 실시양태에서, 신호 펩타이드는 인간 키모트립시노겐 B2 신호 펩타이드이다. 특정 실시양태에서, 신호 펩타이드는 서열 번호 41의 아미노산 서열을 갖는 인간 키모트립시노겐 B2 신호 펩타이드이다. 특정 실시양태에서, 신호 펩타이드는 서열 번호 1-5 중 어느 하나의 코딩 서열을 갖는 인간 키모트립시노겐 B2 신호 펩타이드이다.
특정 실시양태에서, 폴리뉴클레오타이드는 서열 번호 101-109 중 어느 하나의 서열을 갖는 GLA를 인코딩한다.
특정 실시양태에서, 폴리뉴클레오타이드는 서열 번호 64-81 중 어느 하나의 서열을 포함한다.
특정 실시양태에서, 발현 조절 요소는 GLA를 인코딩하는 핵산의 5'에 위치한다.
본원에서 사용되는 용어 "발현 카세트"는 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 분자의 발현에 충분한 핵산 요소를 포함하는 핵산 작제물을 지칭한다. 전형적으로, 발현 카세트는 프로모터 서열에 작동가능하게 연결된 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 분자를 포함한다.
"발현 조절 요소"는 작동 가능하게 연결된 핵산의 발현에 영향을 미치는 핵산 서열(들)을 지칭한다. 본원에 기재된 바와 같은 발현 조절 요소는 프로모터 및 인핸서를 포함한다. AAV 벡터 및 비-바이러스 벡터를 포함하는 벡터 서열은 하나 이상의 "발현 조절 요소"를 포함할 수 있다. 전형적으로, 이러한 요소는 적절한 이종 폴리뉴클레오타이드 전사 및 적절한 번역(예를 들어, 프로모터, 인핸서, 인트론에 대한 스플라이싱 신호, mRNA의 프레임 내 번역을 허용하는 유전자의 정확한 리딩 프레임의 유지 및 정지 코돈 등)을 용이하게 하기 위해 포함된다. 이러한 요소는 일반적으로 "시스 작용" 요소라고 하는 시스로 작용하지만 트랜스로도 작용할 수 있다.
발현 제어는 전사, 번역, 스플라이싱, 메시지 안정성 등의 수준에서 영향을 받을 수 있다. 전형적으로, 전사를 조절하는 발현 조절 요소는 전사된 핵산의 5' 말단(즉, "상류") 근처에 병치된다. 발현 조절 요소는 또한 전사된 서열의 3' 말단(즉, "하류") 또는 전사체 내(예를 들어, 인트론)에 위치할 수 있다. 발현 조절 요소는 전사된 서열에 인접하거나 멀리 떨어져(예를 들어, 폴리뉴클레오타이드로부터 1-10, 10-25, 25-50, 50-100, 100-500, 또는 그 이상의 뉴클레오타이드) 또는 심지어 상당한 거리에 위치할 수 있다. 그럼에도 불구하고, AAV 벡터의 길이 제한으로 인해, AAV 벡터의 발현 조절 요소는 전형적으로 이종 핵산의 전사 시작 부위로부터 1 내지 1000개의 뉴클레오타이드 내에 있을 것이다.
기능적으로, 작동가능하게 연결된 핵산의 발현은 요소가 핵산의 전사 및 적절하게는 전사물의 번역을 조절하도록 요소(예를 들어, 프로모터)에 의해 적어도 부분적으로 제어가능하다. 발현 조절 요소의 특정 예는 일반적으로 전사된 핵산 서열의 5'에 위치한 프로모터이다. 프로모터는 전형적으로 프로모터가 존재하지 않을 때 발현되는 양과 비교하여 작동가능하게 연결된 핵산으로부터 발현되는 양을 증가시킨다.
"작동 가능하게 연결된"이라는 용어는 핵산 서열의 발현에 필요한 조절 서열이 서열에 대해 적절한 위치에 배치되어 핵산 서열의 발현을 매개하는 것을 의미한다. 이와 동일한 정의는 때때로 발현 벡터, 예를 들어 rAAV 벡터 또는 비-바이러스 벡터에서 핵산 서열 및 전사 조절 요소(예를 들어, 프로모터, 인핸서 및 종결 요소)의 배열에 적용된다. 인코딩 서열은 센스 또는 안티센스 방향으로 조절 서열에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 특정 실시양태에서, 프로모터는 이종 프로모터이다.
본원에서 사용되는 용어 "이종 프로모터"는 자연에서 주어진 인코딩 서열에 작동가능하게 연결된 것으로 밝혀지지 않은 프로모터를 비칭한다. 특정 실시양태에서, 발현 카세트는 추가 요소, 예를 들어 인트론, 인핸서, 폴리아데닐화 부위, 우드척 반응 요소(WRE), 및/또는 인코딩 서열의 발현 수준에 영향을 미치는 것으로 알려진 다른 요소를 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "프로모터"는 코딩 서열 또는 기능적 RNA의 발현을 제어할 수 있는 뉴클레오타이드 서열을 지칭한다. 일반적으로, 본 발명의 핵산 분자는 프로모터 서열의 3'에 위치한다. 특정 실시양태에서, 프로모터 서열은 근위 및 보다 원위 상류 요소로 구성되고 인핸서 요소를 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 "인핸서"는 이종 핵산에 인접하여 위치하는 서열을 지칭할 수 있다. 인핸서 요소는 전형적으로 프로모터 요소의 상류에 위치하지만 또한 기능하며 서열의 하류 또는 서열 내에 위치할 수 있다. 따라서, 인핸서 요소는 이종 핵산 서열의 상류 또는 하류에 10-50개 염기쌍, 50-100개 염기쌍, 100-200개 염기쌍 또는 200-300개 염기쌍 또는 그 이상의 염기쌍에 위치할 수 있다. 인핸서 요소는 전형적으로 프로모터 요소에 의해 제공되는 작동가능하게 연결된 핵산의 발현을 증가시킨다.
발현 작제물은 특정 세포 또는 조직 유형에서 발현을 유도하는 역할을 하는 조절 요소를 포함할 수 있다. 발현 조절 요소(예를 들어, 프로모터)는 본원에서 "조직-특이적 발현 조절 요소/프로모터"로 지칭되는 특정 조직 또는 세포 유형에서 활성인 것들을 포함한다. 조직 특이적 발현 조절 요소는 전형적으로 특정 세포 또는 조직(예를 들어, 간)에서 활성화된다. 발현 조절 요소는 특정 세포, 조직 또는 기관 유형에 고유한 전사 활성제 단백질 또는 다른 전사 조절인자에 의해 인식되기 때문에 전형적으로 특정 세포, 조직 또는 기관에서 활성이다. 이러한 조절 요소는 당업자에게 공지되어 있다(예를 들어, Green, M. and Sambrook, J. (2012) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 4th Edition, Vol. II, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York; 및 Ausubel et al. (2010) Current protocols in molecular biology, John Wiley & Sons, New York 참조).
발현 작제물에 조직 특이적 조절 요소를 혼입하면 단백질 또는 억제 RNA를 인코딩하는 이종 핵산의 발현을 위해 적어도 부분적인 조직 친화성이 제공된다. 간에서 활성인 프로모터의 예는 트랜스티레틴(TTR) 유전자 프로모터; 인간 알파 1-항트립신(hAAT) 프로모터; 아포지단백질 A-I 프로모터; 알부민, Miyatake, et al., J. Virol., 71:5124-32 (1997); B형 간염 바이러스 코어 프로모터, Sandig, et al., Gene Ther. 3: 1002-9 (1996); 알파-태아단백질(AFP) (AFP), Arbuthnot, et al., Hum. Gene. Ther., 7:1503-14 (1996); 인간 인자 IX 프로모터; 티록신 결합 글로불린(TBG) 프로모터; TTR 최소 인핸서/프로모터; 알파-항트립신 프로모터; LSP(845nt)(인트론 없는 scAAV 필요); 및 LSP1 프로모터 등이 있다. 간에서 활성인 인핸서의 예는 아포지단백 E(apoE) HCR-1 및 HCR-2이다(Allan et al., J. Biol. Chem., 272:29113-19 (1997)).
발현 조절 요소는 또한 많은 상이한 세포 유형에서 폴리뉴클레오타이드의 발현을 유도할 수 있는 유비쿼터스(ubiquitous) 또는 프로미스큐어스(promiscuous) 프로모터/인핸서를 포함한다. 이러한 요소에는 사이토메갈로바이러스(CMV) 전초기 프로모터/인핸서 서열, 라우스 육종 바이러스(RSV) 프로모터/인핸서 서열 및 다양한 포유동물 세포 유형에서 활성인 기타 바이러스 프로모터/인핸서 또는 자연에 존재하지 않는 합성 요소(예를 들어, Boshart et al., Cell, 41:521-530 (1985) 참조), SV40 프로모터, 디하이드로폴레이트 리덕타제 프로모터, 세포질 b-액틴 프로모터 및 포스포글리세레이트 키나제(PGK)) 프로모터를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
발현 조절 요소는 또한 조절 가능한 방식으로, 즉 신호 또는 자극이 작동가능하게 연결된 이종 폴리뉴클레오타이드의 발현을 증가시키거나 감소시키는 방식으로 발현을 부여할 수 있다. 신호 또는 자극에 반응하여 작동 가능하게 연결된 폴리뉴클레오타이드의 발현을 증가시키는 조절 가능한 요소는 "유도성 요소"(즉, 신호에 의해 유도됨)라고도 한다. 특정 예는 호르몬(예를 들어, 스테로이드) 유도성 프로모터를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 전형적으로, 이러한 요소에 의해 부여되는 증가 또는 감소의 양은 존재하는 신호 또는 자극의 양에 비례한다; 신호 또는 자극의 양이 많을수록 발현의 증가 또는 감소가 커진다. 특정한 비제한적 예는 아연-유도성 양 메탈로티오닌(MT) 프로모터; 스테로이드 호르몬 유도성 마우스 유방 종양 바이러스(MMTV) 프로모터; T7 폴리머라제 프로모터 시스템(WO 98/10088); 테트라사이클린-억제 시스템(Gossen, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:5547-5551 (1992)); 테트라사이클린-유도 시스템(Gossen, et al., Science. 268: 1766-1769 (1995); 또한 Harvey, et al., Curr. Opin. Chem. Biol. 2:512-518 (1998) 참조); RU486-유도 시스템(Wang, et al., Nat. Biotech. 15:239-243 (1997) 및 Wang, et al., Gene Ther. 4:432-441 (1997)]; 및 라파마이신-유도 시스템 (Magari, et al., J. Clin. Invest. 100:2865-2872 (1997); Rivera, et al., Nat. Medicine. 2:1028-1032 (1996))을 포함한다. 이러한 맥락에서 유용할 수 있는 다른 조절 가능한 조절 요소는 특정 생리학적 상태, 예를 들어 온도, 급성기, 발달에 의해 조절되는 것들이 있다.
프로모터의 다른 예는 포스포글리세레이트 키나제(PKG) 프로모터, CAG(CMV 인핸서, 닭 베타 액틴 프로모터(CBA) 및 토끼 베타 글로빈 인트론의 복합물) 및 기타 구성적 프로모터, NSE(뉴런 특이적 에놀라제), 시냅신 또는 NeuN 프로모터, SV40 초기 프로모터, 마우스 유선 종양 바이러스 LTR 프로모터; 아데노바이러스 주요 후기 프로모터(Ad MLP); 단순 헤르페스 바이러스(HSV) 프로모터, SFFV 프로모터, 라우스 육종 바이러스(RSV) 프로모터, 래트 인슐린 프로모터, TBG 프로모터 및 기타 간 특이적 프로모터, 데스민 프로모터 및 유사한 근육 특이적 프로모터, EF1-알파 프로모터, 합성 프로모터, 하이브리드 프로모터, 다중 조직 특이성을 갖는 프로모터 등을 포함하나 이에 제한되지 않으며, 이들 모두는 잘 알려져 있고 당업자에게 용이하게 이용가능한 프로모터이다. 다른 프로모터는 인간 기원이거나 마우스를 포함하는 다른 종으로부터 유래될 수 있다.
발현 조절 요소는 또한 이종 폴리뉴클레오타이드에 대한 천연 요소(들)를 포함한다. 천연 조절 요소(예를 들어, 프로모터)는 이종 폴리뉴클레오타이드의 발현이 천연 발현을 모방하는 것이 바람직할 때 사용될 수 있다. 천연 요소는 이종 폴리뉴클레오타이드의 발현이 일시적으로 또는 발생적으로, 또는 조직 특이적 방식으로, 또는 특정 전사 자극에 반응하여 조절되어야 할 때 사용될 수 있다. 인트론, 폴리아데닐화 부위 또는 Kozak 공통 서열과 같은 다른 천연 발현 조절 요소도 사용할 수 있다.
핵산과 작동 가능하게 연결되어 있는 발현 조절 요소의 예에서, 관계는 조절 요소가 핵산의 발현을 조절하도록 하는 것이다. 보다 구체적으로, 예를 들어 작동 가능하게 연결된 2개의 DNA 서열은 2개의 DNA 서열 중 적어도 하나가 다른 서열에 생리학적 효과를 발휘할 수 있는 관계로 2개의 DNA가 배열(시스 또는 트랜스)됨을 의미한다.
따라서, 벡터에 대한 추가 요소는 제한 없이 발현 조절(예를 들어, 프로모터/인핸서) 요소, 전사 종결 신호 또는 정지 코돈, 서열 측면에 위치하는 5' 또는 3' 비번역 영역(예를 들어, 폴리아데닐화(폴리 A) 서열), 예컨대 AAV ITR 서열의 하나 이상의 카피 또는 인트론을 포함한다.
추가 요소는 예를 들어 팩키징을 개선하고 오염 핵산의 존재를 감소시키기 위한 필러(filler) 또는 스터퍼(stuffer) 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함한다. AAV 벡터는 전형적으로 일반적으로 약 4kb 내지 약 5.2kb 또는 약간 더 큰 크기 범위를 갖는 DNA의 삽입물을 수용한다. 따라서, 더 짧은 서열의 경우, 바이러스 입자로의 AAV 벡터 팩키징에 허용되는 바이러스 게놈 서열의 정상 크기로 또는 그에 가깝게 길이를 조정하기 위해 스터퍼 또는 필러를 포함시킨다. 특정 실시양태에서, 필러/스터퍼 핵산 서열은 핵산의 비번역(비-단백질 인코딩) 세그먼트이다. 4.7kb 미만의 핵산 서열에 대해, 필러 또는 스터퍼 폴리뉴클레오타이드 서열은 서열과 결합(예를 들어, 벡터에 삽입)될 때 약 3.0-5.5kb, 또는 약 4.0-5.0 kb 또는 약 4.3-4.8kb 사이의 총 길이를 갖는 서열을 갖는다.
특정 실시양태에서, 발현 조절 요소는 GLA를 인코딩하는 핵산의 5'에 위치한 ApoE/hAAT 인핸서/프로모터 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, ApoE/hAAT 인핸서/프로모터 서열은 야생형 ApoE/hAAT 인핸서/프로모터 서열과 비교하여 CpG-감소된다. 특정 실시양태에서, ApoE/hAAT 인핸서/프로모터 서열은 서열 번호 38의 서열을 갖는다.
특정 실시양태에서, 발현 카세트는 GLA를 인코딩하는 핵산의 3'에 위치한 폴리아데닐화(polyA) 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, polyA 서열은 소 성장 호르몬(bGH) 폴리아데닐화 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, bGH 폴리아데닐화 서열은 야생형 bGH 폴리아데닐화 서열과 비교하여 CpG-감소된다. 특정 실시양태에서, bGH 폴리아데닐화 서열은 서열 번호 20의 서열을 갖는다.
특정 실시양태에서, 발현 카세트는 발현 조절 요소의 3' 말단과 GLA를 인코딩하는 핵산의 5' 말단 사이에 위치한 인트론을 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 인트론은 hBB2m1 인트론이다. 특정 실시양태에서, hBB2m1 인트론 서열은 야생형 hBB2m1 인트론 서열과 비교하여 CpG-감소된다. 특정 실시양태에서, hBB2m1 인트론 서열은 서열 번호 39의 서열을 갖는다.
특정 실시양태에서, 발현 카세트는 GLA를 인코딩하는 핵산 내의 임의의 위치에 위치하는 하나 이상의 인트론을 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 인트론은 MAG/G의 공통 뉴클레오타이드 서열과 일치하는 GLA를 인코딩하는 핵산 내의 부위에 위치하며, 여기서 M은 아데닌 또는 시토신이고, "/"는 인트론 삽입 부위를 나타낸다. 특정 실시양태에서, 인트론은 GLA를 인코딩하는 핵산의 뉴클레오타이드 78과 79 사이에 위치하며, 여기서 뉴클레오타이드 위치는 서열 번호 14의 서열을 갖는 GLA의 코딩 서열과 관련하여 주어진다. 본 개시의 관점에서 당업자에게 알려진 임의의 적합한 인트론이 본 발명에 사용될 수 있다. 적합한 인트론의 예는 비트로넥틴1(VTN1) 유전자, 레티놀 결합 단백질 4(RBP4) 유전자, 마우스 IgG 중쇄 A(IgHA) 유전자 및 마우스 IgG 중쇄 μ(IgHμ) 유전자를 포함하나 이에 제한되지 않는다, 특정 실시양태에서, 하나 이상의 인트론은 서열 번호 49-52 중 임의의 서열로부터 선택된다.
특정 실시양태에서, 발현 카세트는 서열 번호 21-34, 53-56, 및 91-99 중 어느 하나의 서열을 갖는다. 특정 실시양태에서, 발현 카세트는 서열 번호 21-34, 53-56, 및 91-99 중 어느 하나의 서열과 적어도 75% 서열 동일성, 적어도 80% 서열 동일성, 적어도 85% 서열 동일성, 적어도 90% 서열 동일성, 적어도 95% 서열 동일성, 적어도 96% 서열 동일성, 적어도 97% 서열 동일성, 적어도 98% 서열 동일성, 적어도 99% 서열 동일성, 적어도 99.5% 서열 동일성, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열을 갖는다.
유전자 전달 시스템
바이러스 벡터
본 발명은 또한 본원에 기재된 GLA를 인코딩하는 핵산을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 아데노 관련 바이러스(AAV) 벡터와 같은 바이러스 벡터를 제공한다.
본원에서 사용되는 용어 "벡터" 또는 "유전자 전달 벡터"는 관심 유전자를 포함하는 핵산 분자를 지칭한다. 벡터의 예는 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노 관련 바이러스 및 렌티바이러스 입자 또는 VLP와 같이 바이러스 입자와 유사하지만 비감염성인 바이러스 입자 또는 바이러스 유사 입자(VLP)에 의해 전달되는 바이러스 벡터; 및 마이크로인젝션, 전기천공법, 리포솜, 대형 천연 폴리머, 대형 합성 폴리머 및 천연 및 합성 성분 둘 다로 구성된 폴리머와 같이 비-바이러스 유전자 전달 시스템에 의해 전달되는 비-바이러스 벡터를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
벡터 핵산 서열은 일반적으로 세포 내 증식을 위한 적어도 하나의 복제 기점 및 선택적으로 이종 폴리뉴클레오타이드 서열, 발현 조절 요소(예를 들어, 프로모터, 인핸서), 인트론, 역 말단 반복부(ITR), 선택 가능한 마커(예를 들어, 항생제 내성), 폴리아데닐화 신호와 같은 추가 요소를 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "유전자 전달 시스템"은 핵산 서열을 포함하는 조성물을 세포 또는 조직으로 전달하는 모든 수단을 의미한다. 예를 들어, 유전자 전달 시스템은 바이러스 유전자 전달 시스템, 예를 들어 원하는 세포 또는 조직으로의 바이러스 벡터의 전달을 용이하게 하는 온전한 바이러스, 변형된 바이러스 및 VLP일 수 있다. 유전자 전달 시스템은 또한 바이러스 외피 단백질을 포함하지 않거나 바이러스 입자 또는 VLP를 형성하지 않는 비-바이러스 전달 시스템, 예를 들어 리포솜 기반 시스템, 폴리머 기반 시스템, 단백질 기반 시스템, 금속 입자 기반 시스템, 펩타이드 케이지 시스템 등일 수 있다.
바이러스 벡터는 바이러스 게놈을 포함하는 하나 이상의 핵산 요소로부터 유래하거나 이를 기반으로 한다. 특정 바이러스 벡터는 렌티바이러스 및 아데노 관련 바이러스(AAV) 벡터를 포함한다.
재조합 AAV(rAAV) 벡터와 같은 벡터의 변형자 및 재조합 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드와 같은 서열의 변형자로서 "재조합"이라는 용어는 조성물이 일반적으로 자연에서 발생하지 않는 방식으로 조작(즉, 공학적 처리)되었음을 의미한다. 용어 "재조합"이 AAV 벡터 및 폴리뉴클레오타이드와 같은 서열과 관련하여 본원에서 항상 사용되는 것은 아니지만, 이러한 생략에도 불구하고 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 형태가 명시적으로 포함된다.
"재조합 AAV 벡터" 또는 "rAAV"는 분자적 방법을 사용하여 AAV 게놈에서 야생형 게놈을 제거하고 이종 핵산으로 일컬어지는 비천연 핵산 서열로 대체함으로써 AAV의 야생형 게놈에서 유래된다. 전형적으로, AAV의 경우 AAV 게놈의 하나 또는 둘 다 역 말단 반복부(ITR) 서열이 AAV 벡터에 유지된다. rAAV는 AAV 게놈의 전체 또는 일부가 AAV 게놈 핵산에 대해 비천연 서열로 대체되었기 때문에 AAV 게놈과 구별된다. 따라서 비-천연 서열의 혼입은 AAV 벡터를 "rAAV 벡터"로 지칭될 수 있는 "재조합" 벡터로 정의한다.
생체 외, 시험관 내 또는 생체 내에서 세포의 후속 감염(형질도입)을 위해 rAAV 서열이 팩키징될 수 있으며 본원에서 "입자"로 지칭된다. 재조합 AAV 벡터 서열이 AAV 입자로 캡시드화되거나 팩키징되는 경우, 입자는 또한 "rAAV 벡터" 또는 "rAAV 입자"로 지칭될 수 있다. 이러한 rAAV 입자에는 벡터 게놈을 캡시드화하거나 팩키징하는 단백질이 포함되며 AAV의 경우 캡시드 단백질이라고 한다.
벡터 "게놈"은 바이러스(예를 들어, rAAV) 입자를 형성하기 위해 궁극적으로 팩키징되거나 캡시드화되는 재조합 플라스미드 서열의 일부를 지칭한다. 재조합 플라스미드를 사용하여 재조합 벡터를 작제 또는 제조하는 경우, 벡터 게놈은 재조합 플라스미드의 벡터 게놈 서열에 해당하지 않는 "플라스미드" 부분을 포함하지 않는다. 재조합 플라스미드의 이 비벡터 게놈 부분은 "플라스미드 백본"으로 지칭될 수 있으며, 이는 전파 및 재조합 바이러스 생산에 필요한 과정인 플라스미드의 클로닝 및 증폭에 중요하다. 가능한 3' ITR 및/또는 5' ITR 클로닝 잔기을 제외하고 플라스미드 백본 자체는 바이러스(예를 들어, AAV) 입자로 팩키징되거나 캡시드화되지 않는다. 따라서, 벡터 "게놈"은 바이러스(예를 들어, AAV)에 의해 팩키징되거나 캡시드화되는 폴리뉴클레오타이드를 지칭한다.
재조합 AAV 입자를 생성하기 위한 숙주 세포는 이종 rAAV 벡터의 수용자로서 사용될 수 있거나 사용된 미생물, 효모 세포, 곤충 세포 및 포유동물 세포를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 안정한 인간 세포주인 HEK293(예를 들어, 수탁 번호 ATCC CRL1573으로 American Type Culture Collection을 통해 쉽게 구할 수 있음)의 세포를 사용할 수 있다. 특정 실시양태에서 아데노바이러스 5형 DNA 단편으로 형질전환되고 아데노바이러스 E1a 및 E1b 유전자를 발현하는 변형된 인간 배아 신장 세포주(예를 들어, HEK293)가 재조합 AAV 입자를 생성하는 데 사용된다. 변형된 HEK293 세포주는 쉽게 형질감염되며 rAAV 입자를 생산하는 데 특히 편리한 플랫폼을 제공한다. 재조합 AAV 생산에 적합한 다른 숙주 세포주는 국제 출원 PCT/2017/024951에 기재되어 있으며, 그 개시 내용은 전체가 본원에 포함된다.
특정 실시양태에서, AAV 헬퍼 기능은 AAV 발현 벡터의 형질감염 이전에 또는 동시에 AAV 헬퍼 작제물로 숙주 세포를 형질감염함으로써 숙주 세포 내로 도입된다. AAV 헬퍼 기능을 갖는 숙주 세포는 "헬퍼 세포" 또는 "팩키징 헬퍼 세포"로 지칭될 수 있다. 따라서 AAV 헬퍼 작제물은 생산적인 AAV 형질도입에 필요한 누락된 AAV 기능을 보완하기 위해 AAV rep 및/또는 cap 유전자의 적어도 일시적인 발현을 제공하기 위해 때때로 사용된다. AAV 헬퍼 작제물은 AAV ITR이 없는 경우가 많으며 자체적으로 복제하거나 팩키징할 수 없다. 이들 작제물은 플라스미드, 파지, 트랜스포손, 코스미드, 바이러스 또는 비리온의 형태일 수 있다. Rep 및 Cap 발현 산물을 모두 인코딩하는 일반적으로 사용되는 플라스미드 pAAV/Ad 및 pIM29+45와 같은 다수의 AAV 헬퍼 작제물이 기술되었다. Rep 및/또는 Cap 발현 산물을 인코딩하는 많은 다른 벡터가 알려져 있다.
포유동물 세포를 형질도입할 수 있는 재조합 AAV 입자를 생성하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 재조합 AAV 입자는 미국 특허 9,408,904; 및 국제 출원 PCT/US2017/025396 및 PCT/US2016/064414에 기술된 바와 같이 제조될 수 있으며, 이들의 개시내용은 전체가 본원에 원용된다.
본 발명은 GLA를 인코딩하는 핵산을 포함하는 세포, GLA를 인코딩하는 핵산을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 카세트를 포함하는 세포, GLA를 인코딩하는 핵산을 포함하는 AAV 벡터와 같은 바이러스 벡터를 포함하는 세포, 및 GLA를 인코딩하는 핵산을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 비-바이러스 벡터를 포함하는 세포를 제공한다. 특정 실시양태에서, 세포는 바이러스 벡터를 생산한다. 특정 실시양태에서, 세포는 본원에 기재된 바와 같은 AAV 벡터를 생산한다.
또한 본원에 기재된 바와 같은 AAV 벡터와 같은 바이러스 벡터를 생산하는 방법이 제공된다. 특정 실시양태에서, AAV 벡터를 생성하는 방법은 다음 단계를 포함한다: GLA를 인코딩하는 핵산을 포함하는 AAV 벡터 게놈 또는 본원에 기재된 바와 같은 GLA를 인코딩하는 핵산을 포함하는 발현 카세트를 팩키징 헬퍼 세포로 도입하는 단계; 및 AAV 벡터를 생성하기 위한 조건 하에서 헬퍼 세포를 배양하는 단계. 특정 실시양태에서, AAV 벡터를 생성하는 방법은 다음 단계를 포함한다: GLA를 인코딩하는 핵산 또는 본원에 기재된 바와 같은 GLA를 인코딩하는 핵산을 포함하는 발현 카세트를 팩키징 헬퍼 세포로 도입하는 단계; 및 AAV 벡터를 생성하기 위한 조건 하에서 헬퍼 세포를 배양하는 단계.
특정 실시양태에서, 세포는 포유동물 세포이다.
특정 실시양태에서, 벡터 생산을 위한 세포는 벡터를 바이러스 입자로 팩키징하는 AAV 헬퍼 기능과 같은 헬퍼 기능을 제공한다. 특정 측면에서, 헬퍼 기능은 AAV 벡터 팩키징을 위한 Rep 및/또는 Cap 단백질이다. 특정 실시양태에서, 벡터 생산을 위한 세포는 Rep 및/또는 Cap 단백질 서열(들)을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드(들)로 안정적으로 또는 일시적으로 형질감염될 수 있다. 특정 실시양태에서, 벡터 생산을 위한 세포는 Rep78 및/또는 Rep68 단백질을 제공한다. 이러한 세포에서, 세포는 Rep78 및/또는 Rep68 단백질 폴리뉴클레오타이드 인코딩 서열(들)로 안정적으로 또는 일시적으로 형질감염될 수 있다.
특정 실시양태에서, 벡터 생산을 위한 세포는 인간 배아 신장 세포이다. 특정 측면에서, 벡터 생산을 위한 세포는 HEK-293 세포이다.
용어 "형질도입" 및 이의 문법적 변형은 rAAV 벡터와 같은 분자를 세포 또는 숙주 유기체로 도입하는 것을 지칭한다. 이종 핵산/전이유전자는 수용 세포의 게놈 핵산에 통합되거나 통합되지 않을 수 있다. 도입된 이종 핵산은 또한 수용체 세포 또는 숙주 유기체에 염색체외로 또는 일시적으로만 존재할 수 있다.
"형질도입된 세포"는 전이유전자가 도입된 세포이다. 따라서, "형질도입된" 세포(예를 들어, 포유동물에서 세포 또는 조직 또는 기관 세포와 같은)는 예를 들어 핵산(예를 들어, 전이유전자)이 세포에 통합된 후 세포의 유전적 변화를 의미한다. 따라서, "형질도입된" 세포는 외인성 핵산이 도입된 세포 또는 이의 자손이다. 세포(들)는 증식될 수 있고 도입된 단백질은 발현될 수 있다. 유전자 치료 용도 및 방법의 경우, 형질도입된 세포가 대상체에 있을 수 있다.
조성물의 수식어로 사용될 때, "단리된"이라는 용어는 조성물이 인간에 의해 만들어지거나 또는 자연적으로 발생하는 생체 내 환경으로부터 완전히 또는 적어도 부분적으로 분리되어 있음을 의미한다. 일반적으로, 단리된 조성물은 자연에서 일반적으로 결합하는 하나 이상의 물질, 예를 들어 하나 이상의 단백질, 핵산, 지질, 탄수화물 또는 세포막이 실질적으로 없다.
"단리된"이라는 용어는 인간에 의해 생성된 조합, 예를 들어 rAAV 서열, 또는 AAV 벡터 게놈 및 약학적 제형을 팩키징하거나 캡시드화하는 rAAV 입자를 배제하지 않는다. 용어 "단리된"은 또한 하이브리드/키메라, 멀티머/올리고머, 변형(예를 들어, 인산화, 글리코실화, 지질화) 또는 유도체화된 형태, 또는 인간에 의해 생산된 숙주 세포에서 발현된 형태와 같은 조성물의 대안적인 물리적 형태를 배제하지 않는다.
용어 "실질적으로 순수한"은 적어도 50-60 중량%의 관심 화합물(예를 들어, 핵산, 올리고뉴클레오타이드, 단백질 등)을 포함하는 제제를 지칭한다. 제제는 적어도 75 중량%, 또는 적어도 85 중량%, 또는 약 90 내지 99 중량%의 관심 화합물을 포함할 수 있다. 순도는 관심 화합물에 적합한 방법(예를 들어, 크로마토그래피 방법, 아가로스 또는 폴리아크릴아미드 겔 전기영동, HPLC 분석 등)에 의해 측정된다.
재조합 AAV 벡터, 뿐만 아니라 이의 방법 및 용도는 임의의 바이러스 균주 또는 혈청형을 포함한다. 비제한적 예로서, 재조합 AAV 벡터는 예를 들어 임의의 AAV 게놈, 예컨대 LK03, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV 12, Rh10, Rh74, AAV3B 또는 AAV-2i8에 기반할 수 있다. 이러한 벡터는 동일한 계통 또는 혈청형(또는 하위군 또는 변이체)을 기반으로 하거나, 서로 상이할 수 있다. 비제한적 예로서, 특정 혈청형 게놈에 기반한 재조합 AAV 벡터는 벡터를 팩키징하는 캡시드 단백질의 혈청형과 동일할 수 있다. 또한, 재조합 AAV 벡터 게놈은 벡터를 팩키징하는 AAV 캡시드 단백질의 혈청형과 상이한 AAV 혈청형 게놈을 기반으로 할 수 있다. 예를 들어, AAV 벡터 게놈은 AAV2를 기반으로 할 수 있는 반면, 3개의 캡시드 단백질 중 적어도 하나는 LK03, AAV1, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, Rh10, Rh74, AAV3B 또는 AAV-2i8, 또는 이들의 변이체일 수 있다.
특정 실시양태에서, 아데노 관련 바이러스(AAV) 벡터는 LK03, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, Rh10, Rh74, AAV3B 및 AAV-2i8 뿐만 아니라, 예를 들어 WO 2013/158879(국제 출원 PCT/US2013/037170), WO 2015/013313(국제 출원 출원 PCT/US2014/047670; RHM4-1, RHM15-1, RHM15-2, RHM15-3/RHM15-5, RHM15-4 및 RHM15-6 개시), US 2013/0059732(미국 특허 번호 9,169,299, LK01, LK02, LK03 등 개시), 및 WO 2016/210170(이들의 개시내용은 그 전체가 본원에 원용됨)에 기재된 바와 같은 이들의 변이체(예를 들어, 캡시드 변이체, 예컨대 아미노산 삽입, 추가, 치환 및 결실)를 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "혈청형"은 다른 AAV 혈청형과 혈청학적으로 구별되는 캡시드를 갖는 AAV를 지칭하기 위해 사용되는 구분이다. 혈청학적 특이성은 다른 AAV와 비교하여 하나의 AAV에 대한 항체 사이의 교차 반응성의 결여를 기반으로 결정된다. 이러한 교차 반응성 차이는 일반적으로 캡시드 단백질 서열/항원 결정기의 차이로 인한 것이다(예를 들어, AAV 혈청형의 VP1, VP2 및/또는 VP3 서열 차이로 인해). 캡시드 변이체를 포함하는 AAV 변이체가 참조 AAV 또는 다른 AAV 혈청형과 혈청학적으로 구별되지 않을 가능성에도 불구하고, 이들은 참조 또는 다른 AAV 혈청형과 비교하여 적어도 하나의 뉴클레오타이드 또는 아미노산 잔기가 다르다.
전통적인 정의 하에서, 혈청형은 관심 있는 바이러스가 중화 활성에 대해 모든 기존 및 특성화된 혈청형에 특이적인 혈청에 대해 시험되었고 관심 있는 바이러스를 중화시키는 항체가 발견되지 않았음을 의미한다. 보다 자연적으로 발생하는 바이러스 단리체가 발견되고/되거나 캡시드 돌연변이가 생성됨에 따라, 현재 존재하는 임의의 혈청형과 혈청학적 차이가 있을 수도 있고 없을 수도 있다. 따라서, 새로운 바이러스(예를 들어, AAV)가 혈청학적 차이가 없는 경우, 이 새로운 바이러스(예를 들어, AAV)는 해당 혈청형의 하위군 또는 변이체가 될 것이다. 많은 경우에, 중화 활성에 대한 혈청 검사는 전통적인 혈청형 정의에 따라 다른 혈청형인지를 확인하기 위해 캡시드 서열 변형이 있는 돌연변이 바이러스에 대해 아직 수행되지 않았다. 따라서, 편의상, 그리고 반복을 피하기 위해 "혈청형"이라는 용어는 광범위하게 혈청학적으로 구별되는 바이러스(예를 들어, AAV)뿐만 아니라 주어진 혈청형의 하위 그룹 또는 변이체 내에 있을 수 있는 혈청학적으로 구별되지 않는 바이러스(예를 들어, AAV)를 둘 다 지칭한다.
본원에 기재된 바와 같이, AAV 캡시드 단백질은 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, Rh10, Rh74(서열 번호 35), AAV3B, LK03(서열 번호 42), AAV-2i8, 서열 번호 110의 서열, 서열 번호 36의 서열 및/또는 서열 번호 37과 같은 참조 또는 모 AAV 혈청형에 대해 100% 미만의 서열 동일성을 나타낼 수 있으나, 알려진 AAV 유전자 또는 단백질, 예컨대 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, Rh10, Rh74(서열 번호 35), AAV3B, LK03(서열 번호 42) 또는 AAV-2i8과 상이하며 동일하지 않다. 특정 실시양태에서, 변형/변이 AAV 캡시드 단백질은 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, Rh10, Rh74(서열 번호 35), AAV3B, LK03(서열 번호 42), AAV-2i8, 서열 번호 110의 서열, 서열 번호 36의 서열, 서열 번호 37의 서열, 및/또는 서열 번호 42와 같은 참조 또는 모 AAV 캡시드 단백질의 서열과 적어도 80%, 85%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5% 등, 최대 99.9%까지 동일한 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
특정 실시양태에서, 아데노 관련 바이러스(AAV) 벡터와 같은 바이러스 벡터는 발현 조절 요소에 작동 가능하게 연결된 본원에 기재된 바와 같은 GLA를 인코딩하는 핵산을 포함하는 임의의 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.
특정 실시양태에서, 아데노 관련 바이러스(AAV) 벡터와 같은 바이러스 벡터는 본원에 제시된 GLA를 인코딩하는 핵산을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 임의의 발현 카세트를 포함한다.
특정 실시양태에서, AAV 벡터는 AAV 캡시드 중 하나 이상; 및 하나 이상의 AAV 역 말단 반복부(ITR)를 포함하며, 여기서 AAV ITR(들)은 폴리뉴클레오타이드 또는 발현 카세트의 5' 또는 3' 말단의 측면에 있다.
특정 실시양태에서, AAV 벡터는 하나 이상의 ITR의 5' 또는 3'에 위치한 인트론을 추가로 포함한다.
특정 실시양태에서, 적어도 하나 이상의 ITR 또는 인트론을 포함하는 AAV 벡터는 감소된 CpG를 갖도록 변형된 하나 이상의 ITR 또는 인트론을 갖는다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 AAV 벡터는 예를 들어 지질 나노입자(LNP)에 캡슐화된 것을 포함하는 비-바이러스 전달 시스템을 통해 전달된다.
비-바이러스 방법
특정 실시양태에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 및 발현 카세트는 비-바이러스 전달 시스템으로 전달 또는 투여된다. 비-바이러스 전달 시스템은 예를 들어 비-바이러스 벡터 또는 세포외 소포와 같은 화학적 방법 및 유전자 총, 전기천공, 입자 충격, 초음파 이용 및 자기감염과 같은 물리적 방법을 포함한다.
본 발명의 GLA 서열을 발현할 수 있는 재조합 세포가 전달 또는 투여에 사용될 수 있다.
미니서클 및 트랜스포손과 같은 네이키드 DNA가 렌티바이러스 벡터의 투여 또는 전달에 사용될 수 있다. 또한, 징크 핑거 뉴클레아제, 메가뉴클레아제, TALEN 및 CRISPR과 같은 유전자 편집 기술을 사용하여 본 발명의 코딩 서열을 전달할 수도 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 및 발현 카세트는 말단 종결된 선형 듀플렉스 DNA의 네이키드 DNA, 미니서클, 트랜스포존으로서 전달된다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 및 발현 카세트는 리포솜, 나노입자, 지질 나노입자, 폴리머, 마이크로입자, 마이크로캡슐, 미셀 또는 세포외 소포와 추가로 캡슐화되거나 복합되는 AAV 벡터 입자 또는 다른 바이러스 입자로 전달되거나 투여된다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 및 발현 카세트는 비-바이러스 벡터와 함께 전달되거나 투여된다.
본원에서 사용되는 "비-바이러스 벡터"는 바이러스 입자 또는 바이러스 유사 입자(VLP)에 의해 전달되지 않는 벡터를 의미한다. 특정 실시양태에 따르면, 비-바이러스 벡터는 캡시드에 의해 전달되지 않는 벡터이다. 벡터는 비-바이러스 전달 나노입자와 캡슐화, 혼합 또는 다르게 결합될 수 있다.
본 개시 개용의 관점에서 당업자에게 공지된 임의의 적합한 비-바이러스 전달 시스템이 본 발명에 사용될 수 있다. 비-바이러스 전달 나노입자는 예를 들어 지질계 나노 입자, 폴리머계 나노입자, 단백질계 나노입자, 마이크로입자, 마이크로캡슐, 금속입자계 나노입자, 펩타이드 케이지 나노입자 등일 수 있다.
본 발명의 비-바이러스 전달 나노입자는 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 작제될 수 있고, 치료 전이유전자를 포함하는 핵산 분자를 포함하는 본 발명의 비-바이러스 벡터는 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 작제될 수 있다.
지질 기반 전달 시스템
지질 기반 전달 시스템은 당업계에 잘 알려져 있으며, 본 개시 개용의 관점에서 당업자에게 공지된 임의의 적합한 지질 기반 전달 시스템이 본 발명에 사용될 수 있다. 지질 기반 전달 시스템의 예는 예를 들어 리포좀, 지질 나노입자, 미셀 또는 세포외 소포를 포함한다.
"지질 나노입자" 또는 "LNP"는 나노스케일, 즉 약 10 nm 내지 약 1000 nm, 또는 약 50 내지 약 500 nm, 또는 약 75 내지 약 127 nm의 치수를 갖는 AAV 및 비-바이러스 벡터의 전달에 유용한 지질 기반 소포를 지칭한다. 이론에 구애됨이 없이, LNP는 폴리뉴클레오타이드, 발현 카세트, AAV 벡터, 또는 면역계로부터 부분적으로 또는 완전히 차폐된 비-바이러스 벡터를 제공하는 것으로 여겨진다. 차폐는 생체 내에서 폴리뉴클레오타이드, 발현 카세트, AAV 벡터 또는 비-바이러스 벡터에 대한 실질적인 면역 반응을 유도하지 않고 폴리뉴클레오타이드, 발현 카세트, AAV 벡터 또는 비-바이러스 벡터의 조직 또는 세포로의 전달을 허용한다. 차폐는 또한 생체 내에서(예를 들어, 인간과 같은 대상에서) 폴리뉴클레오타이드, 발현 벡터, AAV 벡터, 또는 비-바이러스 벡터에 대한 실질적인 면역 반응을 유도하지 않고 반복 투여를 허용할 수 있다. 차폐는 또한 생체 내에서 폴리뉴클레오타이드, 발현 카세트, AAV 벡터 또는 비-바이러스 벡터 전달 효율을 개선하거나 증가시킬 수 있다.
AAV의 pI(등전점)는 약 6 내지 약 6.5의 pH 범위에 있다. 따라서, AAV 표면은 약간의 음전하를 띤다. 이와 같이 LNP가 예를 들어 아미노 지질과 같은 양이온성 지질을 포함하는 것이 유리할 수 있다. 예시적인 아미노 지질은 미국 특허 번호 9,352,042, 9,220,683, 9,186,325, 9,139,554, 9,126,966 9,018,187, 8,999,351, 8,722,082, 8,642,076, 8,569,256, 8,466,122, 및 7,745,651 및 미국 특허 공개 번호 2016/0213785, 2016/0199485, 2015/0265708, 2014/0288146, 2013/0123338, 2013/0116307, 2013/0064894, 2012/0172411, 및 2010/0117125에 기술되어 있으며, 이들의 개시 내용은 그 전체가 본원에 원용된다.
용어 "양이온성 지질" 및 "아미노 지질"은 본원에서 1개, 2개, 3개 또는 그 이상의 지방산 또는 지방 알킬쇄 및 pH-적정가능 아미노 그룹(예를 들어, 알킬아미노 또는 디알킬아미노 그룹)을 갖는 지질 및 그 염을 포함한다. 양이온성 지질은 전형적으로 양이온성 지질의 pKa 미만의 pH에서 양성자화(즉, 양전하)되고 pKa 이상의 pH에서 실질적으로 중성이다. 양이온성 지질은 또한 적정가능한 양이온성 지질일 수 있다. 특정 실시양태에서, 양이온성 지질은 양성자화가능한 3급 아민(예를 들어, pH-적정가능) 그룹; 각각의 알킬쇄가 독립적으로 0 내지 3개(예를 들어, 0, 1, 2 또는 3개)의 이중 결합을 갖는 C18 알킬쇄; 및 헤드 그룹과 알킬쇄 사이에 에테르, 에스테르 또는 케탈 결합을 포함한다.
양이온성 지질은 제한없이 1,2-딜리놀레일옥시-N,N-디메틸아미노프로판(DLinDMA), 1,2-딜리놀레닐옥시-N,N-디메틸아미노프로판(DLenDMA) 1,2-딜리놀레닐옥시-N,N-디메틸아미노프로판(g-DLenDMA), 2,2-딜리놀레일-4-(2-디메틸아미노에틸)-[1,3]-디옥솔란(DLin-K-C2-DMA, DLin-C2K-DMA, XTC2, 및 C2K라고도 함), 2,2-딜리놀레일-4-디메틸아미노메틸-[1,3]-디옥솔란(DLin-K-DMA), 딜리놀레일메틸-3-디메틸아미노프로피오네이트(DLin-M-C2-DMA, MC2라고도 함), (6Z,9Z,28Z,31Z)-헵타트리아콘타-6,9,28,31-테트라엔-l9-일 4-(디메틸아미노)부타노에이트(DLin-M-C3-DMA, MC3라고도 함), 그 염 및 이들의 혼합물을 포함할 수 있다. 다른 양이온성 지질은 또한 1,2-디스테아릴옥시-N,N-디메틸-3-아미노프로판(DSDMA), 1,2-디올레일옥시-N,N-디메틸-3-아미노프로판(DODMA), 2,2-딜리놀레일-4-(3-디메틸아미노프로필)-[1,3]-디옥솔란(DLin-K-C3-DMA), 2,2-딜리놀레일-4-(3-디메틸아미노부틸)-[1,3]-디옥솔란(DLin-K-C4-DMA), DLen-C2K-DMA, y-DLen-C2K-DMA 및(DLin-MP-DMA)(1-B11이라고도 함)을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
또 다른 양이온성 지질은 제한 없이 2,2-딜리놀레일-5-디메틸아미노메틸-[1,3]-디옥산(DLin-K6-DMA), 2,2-딜리놀레일-4-N-메틸페피아지노-[1,3]-디옥솔란(DLin-K-MPZ), 1,2-딜리놀레일카바모일옥시-3-디메틸아미노프로판(DLin-C-DAP), 1,2-딜리놀레일옥시-3-(디메틸아미노)아세톡시프로판(DLin-DAC), 1,2-딜리놀레일옥시-3-모르폴리노프로판(DLin-MA), 1,2-딜리노레일-3-디메틸아미노프로판(DLinDAP), 1,2-딜리놀레일티오-3-디메틸아미노프로판(DLin-S-DMA), 1-리놀레오일-2-리놀레일옥시-3-디메틸아미노프로판(DLin-2-DMAP), 1,2-딜리놀레일옥시-3-트리메틸아미노프로판 클로라이드 염(DLin-TMA.Cl), 1,2-딜리놀레오일-3-트리메틸아미노프로판 클로라이드 염(DLin-TAP.Cl), 1,2-딜리놀레오일옥시-3-(N-메틸피페라지노)프로판(DLin-MPZ), 3-(N,N-딜리놀레일아미노)-1,2-프로판디올(DLinAP), 3-(N,N-디올레일아미노)-1,2-프로판디오(DOAP), 1,2-딜리놀레일옥소-3-(2-N,N-디메틸아미노)에톡시프로판(DLin-EG-DMA), N,N-디올레일-N,N-디메틸암모늄 클로라이드(DODAC), N-(1-(2,3-디올레일옥시)프로필)-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드(DOTMA), N,N-디스테아릴-N,N-디메틸암모늄 브로마이드(DDAB), N-(1-(2,3-디올레일옥시)프로필)-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드(DOTAP), 3-(N-(N',N'-디메틸아미노에탄)카바모일)콜레스테롤(DC-Chol), N-(1,2-디미리스틸옥시프로필-3-일)-N,N-디메틸-N-하이드록시에틸 암모늄 브로마이드(DMRIE), 2,3-디올레일옥시-N-[2(스퍼민-카복사미도)에틸]-N,N-디메틸-1-프로판아미늄트리플루오로아세테이트(DOSPA), 디옥타데실아미도글리실 스퍼민(DOGS), 3-디메틸아미노-2-(콜레스트-5-엔-3-베타-옥시부탄-4-옥시)-1-(시스,시스-9,12-옥타데카디엔옥시)프로판(CLinDMA), 2-[5'-(콜레스트-5-엔-3-베타-옥시)-3'-옥사펜톡시)-3-디메틸-1-(시스,시스-9',1-2'-옥타데카디엔옥시)프로판(CpLinDMA), N,N-디메틸-3,4-디올레일옥시벤질아민(DMOBA), 1,2-N,N'-디올레일카바밀-3-디메틸아미노프로판(DOcarbDAP), 1,2-N,N'-딜리놀레일카바밀-3-디메틸아미노프로판(DLincarbDAP), 덱사메타손-스퍼리민(DS) 및 치환된 스퍼민(D2S) 또는 이들의 혼합물을 포함한다.
양이온성 지질의 다수의 시판 제제, 예컨대, LIPOFECTIN®(GIBCO/BRL에서 입수 가능한 DOTMA 및 DOPE 포함), 및 LIPOFECTAMINE®(GIBCO/BRL에서 입수 가능한 DOSPA 및 DOPE 포함)가 사용될 수 있다.
특정 실시양태에서, 양이온성 지질은 약 10 중량%의 LNP 내지 약 85 중량%의 지질 나노입자, 또는 약 50 중량%의 LNP 내지 약 75 중량%의 LNP의 양으로 존재할 수 있다.
스테롤은 LNP에 유동성을 부여할 수 있다. 본원에 사용된 "스테롤"은 식물(피토스테롤) 또는 동물(주스테롤) 기원의 임의의 천연 발생 스테롤 뿐만 아니라 비천연 발생 합성 스테롤을 지칭하며, 이들 모두는 스테로이드 A-고리의 3-위치에 하이드록실 그룹의 존재를 특징으로 한다. 스테롤은 리포좀, 지질 소포 또는 지질 입자 제제 분야에서 통상적으로 사용되는 임의의 스테롤, 가장 통상적으로 콜레스테롤일 수 있다. 피토스테롤에는 캄페스테롤, 시토스테롤 및 스티그마스테롤이 포함될 수 있다. 스테롤은 또한 미국 특허 출원 공개 2011/0177156에 기술된 것과 같은 스테롤-개질된 지질을 포함하며, 이의 개시 내용은 그 전체가 본원에 원용된다. 특정 실시양태에서, 스테롤은 약 5 중량%의 LNP 내지 약 50 중량%의 l지질 나노입자 또는 약 10 중량%의 LNP 내지 약 25 중량%의 LNP의 양으로 존재할 수 있다.
LNP는 중성 지질을 포함할 수 있다. 중성 지질은 생리학적 pH에서 전하를 띠지 않거나 중성 양쪽이온 형태로 존재하는 임의의 지질 종을 포함할 수 있다. 그러한 지질은 디아실포스파티딜콜린, 디아실포스파티딜에탄올아민, 세라미드, 스핑고미엘린, 디하이드로스핑고미엘린, 세팔린 및 세레브로시드를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 중성 지질의 선택은 일반적으로 특히 입자 크기 및 필요한 안정성을 고려하여 결정된다. 특정 실시양태에서, 중성 지질 성분은 2개의 아실 그룹을 갖는 지질(예를 들어, 디아실포스파티딜콜린 및 디아실포스파티딜에탄올아민)일 수 있다.
다양한 쇄 길이 및 포화도를 갖는 다양한 아실 쇄 그룹을 갖는 지질은 입수 가능하거나 잘 알려진 기술에 의해 단리 또는 합성될 수 있다. 특정 실시양태에서, C14 내지 C22 범위의 탄소쇄 길이를 갖는 포화 지방산을 함유하는 지질이 사용될 수 있다. 실시양태의 또 다른 그룹에서, C14 내지 C22 범위의 탄소쇄 길이를 갖는 모노 또는 디불포화 지방산을 갖는 지질이 사용된다. 추가적으로, 포화 및 불포화 지방산 쇄의 혼합물을 갖는 지질이 사용될 수 있다. 예시적인 중성 지질은 제한없이 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스파티딜-에탄올아민(DOPE), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DSPC), 1-팔미토일-2-올레일-sn-글리세로-3-포스포콜린(POPC) 또는 임의의 관련 포스파티딜콜린을 포함한다. 중성 지질은 또한 스핑고미엘린, 디하이드로스핑고미엘린 또는 세린 및 이노시톨과 같은 다른 헤드 그룹을 갖는 인지질로 구성될 수 있다.
특정 실시양태에서, 중성 지질은 약 0.1 중량%의 지질 나노입자 내지 약 75 중량%의 LNP, 또는 약 5 중량%의 LNP 내지 약 15 중량%의 LNP의 양으로 존재할 수 있다.
LNP 캡슐화된 핵산, 발현 카세트, AAV 벡터 및 비-바이러스 벡터는 약학 조성물, 예를 들어 약학적으로 허용되는 담체 또는 부형제에 혼입될 수 있다. 이러한 약학 조성물은 무엇보다도 LNP 캡슐화 핵산, 발현 카세트, AAV 벡터 및 비-바이러스 벡터를 생체 내 또는 생체 외에서 대상체에게 투여 및 전달하는데 유용하다.
LNP 제제는 추가 성분들과 결합될 수 있다. 비제한적 예는 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 및 스테롤을 포함한다.
용어 "PEG"는 2개의 말단 하이드록실 그룹을 갖는 에틸렌 PEG 반복 단위의 선형 수용성 폴리머인 폴리에틸렌 글리콜을 지칭한다. PEG는 분자량에 따라 분류된다; 예를 들어, PEG 2000은 평균 분자량이 약 2,000달톤이고 PEG 5000은 평균 분자량이 약 5,000달톤이다. PEG는 Sigma Chemical Co. 및 다른 회사로부터 상업적으로 입수가능하며, 예를 들어 하기 작용성 PEG를 포함한다: 모노메톡시폴리에틸렌 글리콜(MePEG-OH), 모노메톡시폴리에틸렌 글리콜-숙시네이트(MePEG-S), 모노메톡시폴리에틸렌 글리콜-숙신이미딜 숙시네이트(MePEG-S-NHS), 모노메톡시폴리에틸렌 글리콜-아민(MePEG-NH2), 모노메톡시폴리에틸렌 글리콜-트레실레이트(MePEG-TRES) 및 모노메톡시폴리에틸렌 글리콜-이미다졸릴-카보닐(MePEG-IM).
특정 실시양태에서, PEG는 평균 분자량이 약 550 내지 약 10,000 달톤인 폴리에틸렌 글리콜일 수 있고, 알킬, 알콕시, 아실 또는 아릴로 임의로 치환된다. 특정 실시양태에서, PEG는 말단 하이드록실 위치에서 메틸로 치환될 수 있다. 특정 실시양태에서, PEG는 약 750 내지 약 5,000 달톤, 또는 약 1,000 내지 약 5,000 달톤, 또는 약 1,500 내지 약 3,000 달톤 또는 약 2,000 달톤 또는 약 750 달톤의 평균 분자량을 가질 수 있다. PEG는 알킬, 알콕시, 아실 또는 아릴로 임의로 치환될 수 있다. 특정 실시양태에서, 말단 하이드록실 그룹은 메톡시 또는 메틸 그룹으로 치환될 수 있다.
PEG-개질된 지질은 미국 특허 번호 8,936,942 및 7,803,397에 기술된 PEG-디알킬옥시프로필 접합체(PEG-DAA)를 포함하며, 상기 개시내용은 그 전체가 본원에 원용된다. 유용한 PEG-개질 지질(또는 지질-폴리옥시에틸렌 접합체)은 지질 소포의 표면에 PEG 부분을 고정시키기 위해 다양한 "고정" 지질 부분을 가질 수 있다. 적합한 PEG-개질 지질의 예는 그 개시 내용 전체가 본원에 원용되는 미국 특허 번호 5,820,873에 기술된 PEG-개질 포스파티딜에탄올아민 및 포스파티드산, PEG-세라미드 접합체(예를 들어, PEG-CerCl4 또는 PEG-CerC20), PEG-개질된 디알킬아민 및 PEG-개질된 1,2-디아실옥시프로판-3-아민을 포함한다. 특정 실시양태에서, PEG-개질 지질은 PEG-개질 디아실글리세롤 및 디알킬글리세롤일 수 있다. 특정 실시양태에서, PEG는 약 0.5 중량%의 LNP 내지 약 20 중량%의 LNP, 또는 약 5 중량%의 LNP 내지 약 15 중량%의 LNP의 양을 가질 수 있다.
또한, LNP는 PEG-개질 및 스테롤-개질 LNP일 수 있다. 추가 구성 요소와 결합된 LNP는 동일하거나 별도의 LNP일 수 있다. 즉, 동일한 LNP는 PEG 개질 및 스테롤 개질일 수 있거나, 대안적으로 제1 LNP는 PEG 개질될 수 있고 제2 LNP는 스테롤 개질될 수 있다. 선택적으로, 제1 및 제2 개질된 LNP는 결합될 수 있다.
특정 실시예양태서, 캡슐화 전에 LNP는 약 10 nm 내지 500 nm, 또는 약 50 nm 내지 약 200 nm, 또는 75 nm 내지 약 125 nm 범위의 크기를 가질 수 있다. 특정 실시양태에서, LNP 캡슐화된 핵산, 발현 벡터, AAV 벡터, 또는 비-바이러스 벡터는 약 10 nm 내지 500 nm 범위의 크기를 가질 수 있다.
폴리머 기반 시스템
폴리머 기반 전달 시스템은 당업계에 잘 알려져 있으며, 본 개시 개용의 관점에서 당업자에게 공지된 임의의 적합한 폴리머 기반 전달 시스템 또는 폴리머 나노입자가 본 발명에 사용될 수 있다. DNA는 폴리머 나노입자의 폴리머 매트릭스에 포획되거나 나노입자 표면에 흡착 또는 접합될 수 있다. 유전자 전달을 위해 통상적으로 사용되는 폴리머의 예는 예를 들어 폴리(락트산-코-글리콜산)(PLGA), 폴리락트산(PLA), 폴리(에틸렌 이민)(PEI), 키토산, 덴드리머, 폴리무수물, 폴리카프로락톤 및 폴리메타크릴레이트를 포함한다.
폴리머 기반 비-바이러스 벡터는 약 1 nm 내지 약 1000 nm, 선택적으로 약 10 nm 내지 약 500 nm, 선택적으로 약 50 nm 내지 약 200 nm, 선택적으로 약 100 nm 내지 약 150 nm, 선택적으로 약 150 nm 이하 범위의 상이한 크기를 가질 수 있다.
단백질 기반 시스템
단백질 기반 전달 시스템은 당업계에 잘 알려져 있으며, 본 개시 개용의 관점에서 당업자에게 공지된 임의의 적합한 단백질 기반 전달 시스템 또는 세포 투과 펩타이드(CPP)가 본 발명에 사용될 수 있다.
CPP는 치료 분자를 전달하기 위해 잠재적으로 세포 내 침투가 가능한 짧은 펩타이드(6-30개 아미노산 잔기)이다. 대부분의 CPP는 주로 아르기닌 및 라이신 잔기로 구성되어 양이온성 및 친수성이지만 CPP는 양친매성, 음이온성 또는 소수성일 수도 있다. CPP는 천연 생체 분자(예를 들어, HIV-1 단백질인 Tat)에서 유래되거나 합성 방법으로 얻을 수 있다(예를 들어, 폴리-L-라이신, 폴리아르기닌)(Singh et al., Drug Deliv. 2018;25(1):1996-2006). CPP의 예는 예를 들어 양이온성 CPP(고양전하)(예를 들어, Tat 펩타이드, 페네트라틴, 프로타민, 폴리-L-라이신, 폴리아르기닌 등); 양친매성 CPP(양전하 및 음전하를 띤 아미노산 서열을 모두 포함하는 서로 다른 공급원으로부터 작제된 키메라 또는 융합 펩타이드)(예를 들어, 트랜스포탄, VT5, 박테네신-7(Bac7), 프롤린이 풍부한 펩타이드(PPR), SAP(VRLPPP)3, TP10, pep-1, MPG 등); 막성(membranotropic) CPP(소수성 및 양친매성 성질을 동시에 나타내고, 큰 방향족 잔기와 작은 잔기를 모두 포함함)(예를 들어, gH625, SPIONs-PEG-CPP NP 등); 및 소수성 CPP(비극성 모티프 또는 잔기만 함유)(예를 들어, SG3, PFVYLI, pep-7, 섬유아세포 성장 인자(FGF) 등)를 포함한다.
단백질 기반 비-바이러스 벡터는 약 1 nm 내지 약 1000 nm, 선택적으로 약 10 nm 내지 약 500 nm, 선택적으로 약 50 nm 내지 약 200 nm, 선택적으로 약 100 nm 내지 약 150 nm, 선택적으로 약 150 nm 이하 범위의 상이한 크기를 가질 수 있다.
펩타이드 케이지 시스템
펩타이드 케이지 기반 전달 시스템은 당업계에 잘 알려져 있으며, 본 개시 개용의 관점에서 당업자에게 공지된 임의의 적합한 펩타이드 케이지 기반 전달 시스템이 본 발명에 사용될 수 있다. 일반적으로, 제한된 내부 환경을 형성하는 케이지형 구조로 조립될 수 있는 임의의 단백질성 물질이 사용될 수 있다. 몇 가지 다른 유형의 단백질 "쉘"을 조립하고 다른 유형의 재료를 로딩할 수 있다. 예를 들어, 비-바이러스 물질을 캡슐화하는 바이러스 외피 단백질(들)(예를 들어, CCMV(Cowpea Chlorotic Mottle Virus) 단백질 외피 유래)의 쉘을 포함하는 단백질 케이지 및 비-바이러스 단백질로부터 형성된 단백질 케이지가 기술되어 있다(예를 들어, 미국 특허 번호 6,180,389 및 6,984,386, 미국 특허 출원 20040028694, 및 미국 특허 출원 20090035389 참조, 이들의 개시 내용은 그 전체가 본원에 원용됨). 펩타이드 케이지는 자가 조립하여 단백질 케이지를 형성하는 단백질성 쉘을 포함할 수 있다(예를 들어, 자연적으로 용매에 접근할 수 있는 내부 공동이 있거나, 용매 농도, pH, 평형 비율을 변경하여 제조될 수 있는 구조).
비-바이러스 단백질로부터 유도된 단백질 케이지의 예는 예를 들어, 진핵생물 및 원핵생물 종 모두로부터 유도된 페리틴 및 아포페리틴, 예를 들어 12 및 24 서브유닛 페리틴; 및 열충격 단백질(HSP)로 형성된 단백질 케이지, 예를 들어 내부 코어 공간을 형성하는 24개의 서브유닛 열충격 단백질 부류, Methanococcus jannaschii의 소형 HSP, 대장균의 12량체 Dsp HSP, MrgA 단백질 등을 포함한다. 당업자에 의해 인지되는 바와 같이, 단백질 케이지의 모노머는 천연 발생 또는 아미노산 치환, 삽입 및 결실(예를 들어, 단편)을 포함하는 변이체 형태일 수 있다.
단백질 케이지는 약 1 nm 내지 약 1000 nm, 선택적으로 약 10 nm 내지 약 500 nm, 선택적으로 약 50 nm 내지 약 200 nm, 선택적으로 약 100 nm 내지 약 150 nm, 선택적으로 약 150 nm 이하 범위의 상이한 코어 크기를 가질 수 있다.
약학 조성물
본 발명은 추가로 GLA를 인코딩하는 핵산을 포함하는 임의의 폴리뉴클레오타이드, GLA를 인코딩하는 핵산을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 카세트, GLA를 인코딩하는 핵산을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 AAV 벡터와 같은 바이러스 벡터, 또는 본원에 기재된 GLA를 인코딩하는 핵산을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 비-바이러스 벡터 중 임의의 것을 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
rAAV 벡터 및 비-바이러스 벡터는 예를 들어 정맥내 주사를 통해 생물학적으로 적합한 담체 중 주입을 통해 환자에게 투여될 수 있으며, rAAV 벡터 및 비-바이러스 벡터는 단독으로 또는 다른 분자와 함께 투여될 수 있다. 따라서, rAAV 벡터 및 비-바이러스 벡터 및 다른 조성물, 작용제, 약물, 생물제제(단백질)는 약학 조성물에 혼입될 수 있다. 이러한 약학 조성물은 무엇보다도 생체 내 또는 생체 외에서 대상체에 대한 투여 및 전달에 유용하다.
특정 실시양태에서, 약학 조성물은 또한 약학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 함유한다. 이러한 부형제는 그 자체가 조성물을 투여받는 개체에게 유해한 면역 반응을 유도하지 않고 과도한 독성 없이 투여될 수 있는 임의의 약학적 제제를 포함한다.
본원에서 사용되는 "약학적으로 허용되는" 및 "생리적으로 허용되는"이라는 용어는 하나 이상의 투여 경로, 생체 내 전달 또는 접촉에 적합한 생물학적으로 허용되는 제형, 기체, 액체 또는 고체 또는 이들의 혼합물을 의미한다. "약학적으로 허용되는" 또는 "생리학적으로 허용되는" 조성물은 생물학적으로 또는 달리 바람직하지 않은 것이 아닌 물질이며, 예를 들어 물질은 실질적으로 바람직하지 않은 생물학적 효과를 일으키지 않고 대상체에게 투여될 수 있다. 따라서, 이러한 약학 조성물은 예를 들어 대상체에게 핵산, 벡터, 바이러스 입자 또는 단백질을 투여하는 데 사용될 수 있다.
약학적으로 허용되는 부형제는 물, 식염수, 글리세롤, 당 및 에탄올과 같은 액체를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 약학적으로 허용되는 염, 예를 들어 염산염, 브롬화수소산염, 인산염, 황산염 등과 같은 무기산 염; 및 아세테이트, 프로피오네이트, 말로네이트, 벤조에이트 등과 같은 유기산의 염도 그 안에 포함될 수 있다. 부형제는 또한 알부민과 같은 단백질을 포함한다.
추가로, 습윤제 또는 유화제, pH 완충 물질 등과 같은 보조 물질이 이러한 부형제에 존재할 수 있다.
약학 조성물은 염으로서 제공될 수 있고 염산, 황산, 아세트산, 락트산, 타르타르산, 말산, 숙신산 등을 포함하나 이에 제한되지 않는 상이한 산으로 형성될 수 있다. 염은 해당 유리 염기 형태보다 수용성 또는 기타 양성자 용매에 더 잘 용해되는 경향이 있다. 다른 경우에, 제제는 다음 중 임의의 것 또는 모두를 함유할 수 있는 동결건조된 분말일 수 있다: 4.5 내지 5.5의 pH 범위에서 1-50 mM 히스티딘, 0.1%-2% 수크로스 및 2-7% 만니톨 - 사용하기 전에 완충액과 결합됨.
약학 조성물은 용매(수성 또는 비수성), 용액(수성 또는 비수성), 에멀젼(예를 들어, 수중유 또는 유중수), 현탁액, 시럽, 엘릭시르, 분산액 및 현탁 매질, 코팅제, 약학적 투여 또는 생체 내 접촉 또는 전달에 적합한 등장성 및 흡수 촉진제 또는 지연제를 포함한다. 수성 및 비수성 용매, 용액 및 현탁액은 현탁제 및 증점제를 포함할 수 있다. 이러한 약학적으로 허용되는 담체는 정제(코팅 또는 비코팅), 캡슐(경질 또는 연질), 마이크로비드, 분말, 과립 및 결정을 포함한다. 보조 활성 화합물(예를 들어, 방부제, 항균제, 항바이러스제 및 항진균제)도 조성물에 포함될 수 있다.
약학 조성물은 본원에 기술되거나 당업자에게 공지된 특정 투여 또는 전달 경로에 적합하도록 제형화될 수 있다. 따라서, 약학 조성물은 다양한 경로에 의한 투여에 적합한 담체, 희석제 또는 부형제를 포함한다.
비경구 투여에 적합한 조성물은 활성 화합물의 수성 및 비수성 용액, 현탁액 또는 에멀젼을 포함하며, 이들 제제는 전형적으로 무균이고 의도된 수용자의 혈액과 등장성일 수 있다. 비제한적인 예시적 예는 물, 완충 식염수, 행크스 용액, 링거 용액, 덱스트로스, 프럭토스, 에탄올, 동물성, 식물성 또는 합성 오일을 포함한다. 수성 주사 현탁액은 소듐 카복시메틸 셀룰로오스, 소르비톨 또는 덱스트란과 같이 현탁액의 점도를 증가시키는 물질을 포함할 수 있다.
또한, 활성 화합물의 현탁액은 적절한 오일 주입 현탁액으로 제조될 수 있다. 적합한 친유성 용매 또는 비히클은 참기름과 같은 지방유, 또는 에틸 올레에이트 또는 트리글리세리드와 같은 합성 지방산 에스테르, 또는 리포좀을 포함한다. 선택적으로, 현탁액은 고농축 용액의 제조를 가능하게 하기 위해 화합물의 용해도를 증가시키는 적절한 안정제 또는 제제를 함유할 수도 있다.
공용매 및 보조제가 제형에 첨가될 수 있다. 공용매의 비제한적 예는 하이드록실 그룹 또는 다른 극성 그룹을 갖는 것, 예를 들어 알코올, 예컨대 이소프로필 알코올; 글리콜, 예컨대 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 글리콜 에테르; 글리세롤; 폴리옥시에틸렌 알코올 및 폴리옥시에틸렌 지방산 에스테르를 포함한다. 애쥬번트는 예를 들어 대두 레시틴 및 올레산과 같은 계면활성제; 소르비탄 트리올레이트와 같은 소르비탄 에스테르; 및 폴리비닐피롤리돈을 포함한다.
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 임의의 AAV 벡터를 포함하는 약학 조성물은 빈 AAV 캡시드를 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, AAV 벡터 및 빈 AAV 캡시드를 포함하는 약학 조성물에서, 빈 AAV 캡시드 대 AAV 벡터의 비는 약 100:1-50:1, 약 50:1-25:1, 약 25:1-10:1, 약 10: 1-1:1, 약 1:1-1:10, 약 1:10-1:25, 약 1:25-1:50, 또는 약 1:50-1:100이다. 특정 측면에서, AAV 벡터 및 빈 AAV 캡시드를 포함하는 약학 조성물에서, 빈 AAV 캡시드 대 AAV 벡터의 비는 약 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 또는 10:1이다.
특정 실시양태에서, 약학 조성물은 계면활성제를 포함한다.
약학 조성물은 제조된 후, 적절한 용기에 투입되고 치료용 라벨이 붙여질 수 있다. 이 라벨은 양, 빈도 및 투여 방법을 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물, 방법 및 용도에 적합한 약학 조성물 및 전달 시스템은 당업계에 공지되어 있다(예를 들어, Remington: The Science and Practice of Pharmacy (2003) 20th ed., Mack Publishing Co., Easton, PA; Remington's Pharmaceutical Sciences (1990) 18th ed., Mack Publishing Co., Easton, PA; The Merck Index (1996) 12th ed., Merck Publishing Group, Whitehouse, NJ; Pharmaceutical Principles of Solid Dosage Forms (1993), Technomic Publishing Co., Inc., Lancaster, Pa.; Ansel and Stoklosa, Pharmaceutical Calculations (2001) 11th ed., Lippincott Williams & Wilkins, Baltimore, MD; 및 Poznansky et al., Drug Delivery Systems (1980), R. L. Juliano, ed., Oxford, N.Y., pp. 253-315).
"유효량" 또는 "충분량"은 단일 또는 다중 용량으로 단독으로 또는 하나 이상의 다른 조성물(약물과 같은 치료제 또는 면역억제제), 치료, 프로토콜, 또는 치료 요법 제제와 조합하여, 임의의 기간(장기 또는 단기)의 검출 가능한 반응, 임의의 측정 가능하거나 검출 가능한 정도로 또는 임의의 기간 동안(예를 들어, 수 분, 수 시간, 수 일, 수 개월, 수 년 또는 완치) 대상체에서 예상되거나 원하는 결과 또는 혜택을 제공하는 양을 지칭한다.
약학 조성물과 같은 조성물은 인코딩된 단백질의 생산을 가능하게 하도록 대상체에게 전달될 수 있다. 특정 실시양태에서, 약학 조성물은 수용자가 대상체에서 치료 유효량의 단백질을 생산할 수 있도록 하기에 충분한 유전 물질을 포함한다.
"치료적 유효량"은 대상체에서 원하는 생물학적 또는 의학적 반응을 유도하는 활성 성분 또는 구성 성분의 양을 말한다. 치료적 유효량은 명시된 목적과 관련하여 경험적으로 그리고 일상적인 방식으로 결정될 수 있다. 예를 들어, 최적의 투여량 범위를 확인하는 데 도움이 되도록 선택적으로 시험관 내 분석법을 사용할 수 있다. 특정 유효 용량의 선택은 치료 또는 예방할 질환, 관련 증상, 환자의 체질량, 환자의 면역 상태 및 숙련된 기술자에 의해 알려진 기타 요인을 포함하는 여러 인자의 고려에 기초하여 당업자에 의해 결정될 수 있다(예를 들어, 임상 시험을 통해). 제형에 사용되는 정확한 용량은 투여 경로 및 질환의 중증도에 따라 달라지며, 의사의 판단 및 각 환자의 상황에 따라 결정되어야 한다. 유효 용량은 시험관 내 또는 동물 모델 시험 시스템에서 유도된 용량-반응 곡선에서 외삽할 수 있다.
조성물은 식염수, 완충 식염수, 덱스트로스 및 물을 포함하지만 이에 제한되지 않는 임의의 멸균, 생체적합성 약학적 담체에서 제형화 및/또는 투여될 수 있다. 조성물은 제형화되고/되거나 환자에게 단독으로 투여되거나, 지혈에 영향을 미치는 다른 작용제(예를 들어, 보조 인자)와 함께 투여될 수 있다.
치료 방법
본 발명은 또한 GLA를 필요로 하는 대상체에게 치료 유효량의 본 발명의 핵산, 발현 카세트, AAV 벡터, 비-바이러스 벡터 또는 약학 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 상기 GLA를 필요로 하는 대상체를 치료하는 방법을 추가로 제공하며, 여기서 GLA는 다상체에서 발현된다.
본 발명의 방법 및 용도는 핵산(전이유전자)을, 분열 및/또는 비분열 세포를 포함하는 숙주 세포로 전달(형질도입)하는 것을 포함한다. 본 발명의 폴리뉴클레오타이드, 발현 카세트, rAAV 벡터, 비-바이러스 벡터, 방법, 용도 및 약학적 제형은 추가로 이종 핵산에 의해 인코딩된 단백질을 이를 필요로 하는 대상체에게 전달, 투여 또는 제공하는 방법에 또는 치료 방법으로서 유용하다. 이러한 방식으로, 핵산을 포함하는 폴리뉴클레오타이드는 전사되고 단백질이 대상체에서 생체내에서 생성된다. 대상체가 단백질 결핍을 갖거나, 대상체에서 단백질의 생성이 치료 방법 또는 다른 방법으로서 일부 치료 효과를 부여할 수 있기 때문에, 대상체는 단백질로부터 이익을 얻거나 단백질을 필요로 할 수 있다.
본 발명은 인간을 포함한 동물에서, 그리고 수의학 적용에서 유용하다. 따라서 적합한 대상체는 인간과 같은 포유동물 뿐만 아니라 인간이 아닌 포유동물을 포함한다. 용어 "대상체"는 동물, 전형적으로 포유동물, 예컨대 인간, 비인간 영장류(유인원, 긴팔원숭이, 고릴라, 침팬지, 오랑우탄, 마카크), 가축(개 및 고양이), 농장 동물(가금류, 예컨대 닭 및 오리, 말, 소, 염소, 양, 돼지), 실험 동물(마우스, 래트, 토끼, 기니피그)을 지칭한다. 인간 대상체는 태아, 신생아, 유아, 청소년 및 성인 대상체를 포함한다. 대상체는 파브리병 및 리소좀 축적병과 같은 단백질/효소 결핍의 동물 질환 모델, 예를 들어 마우스 및 다른 동물 모델 및 당업자에게 공지된 기타 모델을 포함한다.
본 발명에 따른 치료에 적절한 대상체는 불충분량의 GLA를 생성하거나 생성할 위험이 있는 대상체, 또는 이상, 부분적 기능성 또는 비기능성 GLA를 생성하는 대상체를 포함한다. 대상체는 본 발명의 방법에 따른 치료에 적합한지 결정하기 위해 GLA 활성에 대해 시험될 수 있다. 본 발명에 따른 치료에 적합한 대상체는 또한 GLA로부터 혜택을 얻을 대상체를 포함한다. GLA로부터 혜택을 얻을 수 있는 이러한 대상체는 리소좀 축적 질환을 가진 대상체를 포함한다. 치료 대상체는 치료 후 주기적으로, 예를 들어 매 1-4주, 1-6개월, 6-12개월 또는 1, 2, 3, 4, 5년 또는 그 이상마다 모니터링될 수 있다.
대상체는 예를 들어 AAV에 대한 항체와 같은 면역 반응에 대해 시험될 수 있다. 따라서 후보 대상은 본 발명의 방법에 따른 치료 전에 선별될 수 있다. 대상체는 또한 치료 후 AAV에 대한 항체에 대해 시험될 수 있고 선택적으로 치료 후 일정 기간 동안 모니터링될 수 있다. AAV 항체가 이미 존재하거나 발달 중인 대상체는 면역억제제 또는 본원에 제시된 다른 요법으로 치료될 수 있다.
본 발명에 따른 치료에 적절한 대상체는 또한 AAV에 대한 항체를 갖거나 생성할 위험이 있는 대상체를 포함한다. rAAV 벡터는 여러 기술을 사용하여 그러한 대상체에게 투여 또는 전달될 수 있다. 예를 들어, AAV 빈 캡시드(즉, GLA를 인코딩하는 변형된 핵산이 결여된 AAV)는 대상체에서 AAV 항체에 결합하도록 전달될 수 있으며, 이에 따라 이종 핵산을 포함하는 rAAV 벡터가 대상체의 세포를 형질도입할 수 있다.
본 발명의 변형된 핵산, 발현 카세트, rAAV 벡터 및 비-바이러스 벡터는 GLA 결핍의 치료에 사용될 수 있다. 따라서, 특정 실시양태에서, 본 발명의 GLA를 인코딩하는 변형된 핵산, GLA를 인코딩하는 변형된 핵산을 포함하는 발현 카세트, rAAV 벡터, 및 비-바이러스 벡터는 치료제 및/또는 예방제로서 사용될 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 GLA를 인코딩하는 변형된 핵산, GLA를 인코딩하는 변형된 핵산을 포함하는 발현 카세트, rAAV 벡터, 및 비-바이러스 벡터는 파브리병의 치료에 사용될 수 있다. 본 발명의 GLA를 인코딩하는 변형된 핵산, GLA를 인코딩하는 변형된 핵산을 포함하는 발현 카세트, rAAV 벡터 및 비-바이러스 벡터를 파브리 또는 또 다른 리소좀 축적병을 앓는 환자에게 투여하면 GLA 단백질의 발현으로 이어진다.
특정 실시양태에서, 본 발명에 따른 방법은 GLA를 필요로 하지 않는 대상체에서 발견되는 GLA 단백질의 정상적인 발현의 적어도 1%, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 또는 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 100%의 수준으로 GLA의 발현 또는 활성을 야기할 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명에 따른 방법은 GLA를 필요로 하지 않는 대상체의 신장에서 발견되는 GLA 단백질의 정상적인 발현의 적어도 1%, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 또는 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 100%의 수준으로 신장에서 GLA의 발현 또는 활성을 초래할 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명에 따른 방법은 GLA를 필요로 하지 않는 대상체의 심장에서 발견되는 GLA 단백질의 정상적인 발현의 적어도 1%, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 또는 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 100%의 수준으로 심장에서 GLA의 발현 또는 활성을 초래할 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명에 따른 방법은 GLA를 필요로 하지 않는 대상체의 간에서 발견되는 GLA 단백질의 정상적인 발현의 적어도 1%, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 또는 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 100%의 수준으로 간에서 GLA의 발현 또는 활성을 초래할 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명에 따른 방법은 GLA를 필요로 하지 않는 대상체의 혈류에서 발견되는 GLA 단백질의 정상적인 발현의 적어도 1%, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 또는 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 100%의 수준으로 혈류에서 GLA의 발현 또는 활성을 초래할 수 있다.
본 발명의 GLA를 인코딩하는 변형된 핵산, GLA를 인코딩하는 변형된 핵산을 포함하는 발현 카세트, rAAV 벡터, 및 비-바이러스 벡터가 투여된 대상체, 동물 또는 환자는 치료제 및/또는 예방제로서 본 발명의 GLA를 인코딩하는 변형된 핵산, GLA를 인코딩하는 변형된 핵산을 포함하는 발현 카세트, rAAV 벡터, 및 비-바이러스 벡터의 효능을 입증, 측정 및/또는 평가하기 위해 다양한 시험, 검정 및 기능적 평가에 의해 평가될 수 있다.
이러한 시험 및 검정에는 혈액, 혈장 또는 소변과 같은 생물학적 샘플에서 GLA 활성(예를 들어, 표준 GLA 활성 분석 사용) 및/또는 GLA 양(예컨대 항-GLA 항체를 사용한 웨스턴 블롯 또는 ELISA 정량화)의 측정(예를 들어, Christensen, E. et al., J Am Soc Nephrol. 2007 Mar;18(3):698-706 참조); 혈장 중 총 GLA 단백질 및 활성에 의해 평가된 피크 및 정상 상태 벡터 유래 GLA 효소 수준의 분석; 면역형광 및 면역조직화학에 의해 조직 중 총 GLA 단백질 및 활성으로 평가된 GLA 효소 수준 및 교차 보정(예를 들어, Christensen, E. et al., 2007, Id 참조); 조직 및 혈청 중 글로보트리아오실세라미드(Gb3 또는 GL3) 및 글로보트리아오실스핑고신(lyso-Gb3 또는 lyso-GL3)의 GLA 기질 축적 측정(예컨대 정량적 액체 크로마토그래피 탠덤 질량 분석법 또는 박층 크로마토그래피를 사용한 지질 분석(예를 들어, Shu et al., J Biol Chem. 2007 Jul 20;282(29):20960-7, 및 Shu et al., J Glycomics Lipidomics. 2012;Suppl 2:1-6 참조); 면역형광 염색 또는 전자 현미경에 의한 Gb3의 발현 수준 측정(예를 들어, Braun et al., Cell Physiol Biochem. 2019;52(5):1139-1150 참조), AAV-형질전환 조직에서 정량적 역전사 효소 PCR에 의한 GLA mRNA에 대한 시험; AAV 캡시드에 대한 면역 반응 시험; GLA 전이유전자 단백질 산물에 대한 면역 반응 시험이 포함되지만 이에 제한되지 않는다.
추가로, 본 발명의 GLA를 인코딩하는 변형된 핵산, GLA를 인코딩하는 변형된 핵산을 포함하는 발현 카세트, rAAV 벡터, 및 비-바이러스 벡터는 리소좀 축적 질환의 치료에 사용될 수 있다. 리소좀 축적 질환은 리소좀 효소 활성이 감소되거나 결여된 것을 특징으로 하는 모든 장애를 포함한다. 특정 실시양태에 따르면, 본 발명의 GLA를 인코딩하는 변형된 핵산, GLA를 인코딩하는 변형된 핵산을 포함하는 발현 카세트, rAAV 벡터 및 비-바이러스 벡터는 GLA를 필요로 하는 환자의 치료에 사용될 수 있다. 특정 실시양태에 따르면, 본 발명의 GLA를 인코딩하는 변형된 핵산, GLA를 인코딩하는 변형된 핵산을 포함하는 발현 카세트, rAAV 벡터, 및 비-바이러스 벡터는 파브리병의 치료에 사용될 수 있다. 특정 실시양태에 따르면, 본 발명의 GLA를 인코딩하는 변형된 핵산, GLA를 인코딩하는 변형된 핵산을 포함하는 발현 카세트, rAAV 벡터, 및 비-바이러스 벡터는 대상체의 조직에서 글리코스핑고지질의 수준을 저하시키는데 사용될 수 있다.
본원에 기재된 바와 같이, rAAV는 세포에 침투하여 핵산/유전 물질을 세포에 도입할 수 있기 때문에 유전자 요법 벡터로서 유용하다. AAV는 인간의 병원성 질환과 연관되지 않기 때문에, rAAV 벡터는 실질적인 AAV 병인 또는 질환을 유발하지 않고 인간 환자에게 이종 폴리뉴클레오타이드 서열(예를 들어, 치료 단백질 및 작용제)을 전달할 수 있다.
rAAV 벡터는 분열 및 비분열 세포에 대한 친화성을 포함하여 이러한 적용에 대해 바람직한 많은 특징을 가지고 있다. 이러한 벡터에 대한 초기 임상 경험에서도 지속적인 독성이 없는 것으로 나타났으며 면역 반응은 전형적으로 미미하거나 검출할 수 없었다. AAV는 수용체-매개 엔도사이토시스(endocytosis) 또는 트랜스사이토시스(transcytosis)에 의해 생체 내에서 다양한 세포 유형을 감염시키는 것으로 알려져 있다. 이러한 벡터 시스템은 망막 상피, 간, 골격근, 기도, 뇌, 관절 및 조혈 줄기 세포와 같은 많은 조직을 표적으로 하여 인간에서 시험되었다.
예를 들어 GLA의 다중 카피, 및 따라서 더 많은 양의 GLA 단백질을 제공할 수 있는 rAAV 벡터를 도입하는 것이 바람직할 수 있다. 개선된 rAAV 벡터 및 이들 벡터를 생성하는 방법은 Wright JF(Hum. Gene Ther., 20:698-706, 2009)를 포함한 다수의 참고문헌, 특허 및 특허 출원에 상세히 기술되어 있다.
용량은 다양할 수 있으며, 치료하고자 하는 질환의 유형, 발병, 진행, 중증도, 빈도, 지속 기간 또는 가능성, 원하는 임상 종점, 이전 또는 동시 치료, 일반 건강, 연령, 성별, 인종 또는 대상체의 면역학적 능력 및 당업자에 의해 인식될 다른 인자에 따라 달라진다. 투여량, 횟수, 빈도 또는 기간은 어떤 불리한 부작용, 합병증 또는 치료 또는 요법의 다른 위험 인자 및 대상체의 상태에 의해 지시되는 바와 같이 비례적으로 증가 또는 감소될 수 있다. 당업자는 치료적 또는 예방적 이점을 제공하기에 충분량을 제공하는 데 필요한 투여량 및 시간에 영향을 미칠 수 있는 요인을 알 수 있을 것이다.
치료 효과를 달성하기 위한 용량, 예를 들어 체중 킬로그램당 벡터 게놈에서 rAAV의 용량(vg/kg) 또는 비-바이러스 벡터의 용량은 다음을 포함하지만 이에 제한되지 않는 여러 요인에 따라 달라질 것이다: 투여 경로, 치료 효과를 달성하는 데 필요한 이종 폴리뉴클레오타이드의 발현 수준, 치료되는 특정 질환, 바이러스 벡터에 대한 임의의 숙주 면역 반응, 이종 폴리뉴클레오타이드 또는 발현 산물(단백질)에 대한 숙주 면역 반응, 및 발현되는 단백질의 안정성. 당업자는 전술한 인자뿐만 아니라 다른 인자에 기초하여 특정 질환 또는 장애를 갖는 환자를 치료하기 위한 rAAV/벡터 게놈 또는 비-바이러스 벡터 용량 범위를 결정할 수 있다.
일반적으로, rAAV의 용량은 치료 효과를 달성하기 위해 대상체 체중의 킬로그램 당 적어도 1x108 벡터 게놈(vg/kg), 예를 들어 대상체 체중의 킬로그램 당 1x109, 1x1010, 1x1011, 1x1012, 1x1013 또는 1x1014 이상의 범위일 것이다.
예를 들어 약 5x1011 재조합 AAV vg/kg 또는 약 5x1011 재조합 AAV vg/kg 초과의 용량; 약 1x1012 재조합 AAV vg/kg 또는 약 1x1012 재조합 AAV vg/kg 초과의 용량; 약 2x1012 재조합 AAV vg/kg 또는 약 2x1012 재조합 AAV vg/kg 초과의 용량; 약 3x1012 재조합 AAV vg/kg 또는 약 3x1012 재조합 AAV vg/kg 초과의 용량; 약 4x1012 재조합 AAV vg/kg 또는 약 4x1012 재조합 AAV vg/kg 초과의 용량; 약 5x1012 재조합 AAV vg/kg 또는 약 5x1012 재조합 AAV vg/kg 초과의 용량; 약 1x1013 재조합 AAV vg/kg 또는 약 1x1013 재조합 AAV vg/kg 초과의 용량; 약 2x1013 재조합 AAV vg/kg 또는 약 2x1013 재조합 AAV vg/kg 초과의 용량; 약 3x1013 재조합 AAV vg/kg 또는 약 3x1013 재조합 AAV vg/kg 초과의 용량; 약 4x1013 재조합 AAV vg/kg 또는 약 4x1013 재조합 AAV vg/kg 초과의 용량; 약 5x1013 재조합 AAV vg/kg 또는 약 5x1013 재조합 AAV vg/kg 초과의 용량; 약 6x1013 재조합 AAV vg/kg 또는 약 6x1013 재조합 AAV vg/kg 초과의 용량이다.
투여되는 재조합 AAV vg/kg의 예시적인 용량 범위는 약 5x1011 내지 약 6x1013 재조합 AAV vg/kg의 용량 범위; 약 5x1011 내지 약 5.5x1011 재조합 AAV vg/kg의 용량 범위; 약 5.5x1011 내지 약 6x1011 재조합 AAV vg/kg의 용량 범위; 약 6x1011 내지 약 6.5x1011 재조합 AAV vg/kg의 용량 범위; 약 6.5x1011 내지 약 7x1011 재조합 AAV vg/kg의 용량 범위; 약 7x1011 내지 약 7.5x1011 재조합 AAV vg/kg의 용량 범위; 약 7.5x1011 내지 약 8x1011 재조합 AAV vg/kg의 용량 범위; 약 8x1011 내지 약 8.5x1011 재조합 AAV vg/kg의 용량 범위; 약 8.5x1011 내지 약 9x1011 재조합 AAV vg/kg의 용량 범위; 약 9x1011 내지 약 9.5x1011 재조합 AAV vg/kg의 용량 범위; 약 9.5x1011 내지 약 1x1012 재조합 AAV vg/kg의 용량 범위; 약 1x1012 내지 약 1.5x1012 재조합 AAV vg/kg의 용량 범위; 약 1.5x1012 내지 약 2x1012 재조합 AAV vg/kg의 용량 범위; 약 2x1012 내지 약 2.5x1012 재조합 AAV vg/kg의 용량 범위; 약 2.5x1012 내지 약 3x1012 재조합 AAV vg/kg의 용량 범위; 약 3x1012 내지 약 3.5x1012 재조합 AAV vg/kg의 용량 범위; 약 3.5x1012 내지 약 4x1012 재조합 AAV vg/kg의 용량 범위; 약 4x1012 내지 약 4.5x1012 재조합 AAV vg/kg의 용량 범위; 약 4.5x1012 내지 약 5x1012 재조합 AAV vg/kg의 용량 범위; 약 5x1012 내지 약 5.5x1012 재조합 AAV vg/kg의 용량 범위; 약 5.5x1012 내지 약 6x1012 재조합 AAV vg/kg의 용량 범위; 약 6x1012 내지 약 6.5x1012 재조합 AAV vg/kg의 용량 범위; 약 6.5x1012 내지 약 7x1012 재조합 AAV vg/kg의 용량 범위; 약 7x1012 내지 약 7.5x1012 재조합 AAV vg/kg의 용량 범위; 약 7.5x1012 내지 약 8x1012 재조합 AAV vg/kg의 용량 범위; 약 8x1012 내지 약 8.5x1012 재조합 AAV vg/kg의 용량 범위; 약 8.5x1012 내지 약 9x1012 재조합 AAV vg/kg의 용량 범위; 약 9x1012 내지 약 9.5x1012 재조합 AAV vg/kg의 용량 범위; 약 9.5x1012 내지 약 1x1013 재조합 AAV vg/kg의 용량 범위; 약 1x1013 내지 약 1.5x1013 재조합 AAV vg/kg의 용량 범위; 약 1.5x1013 내지 약 2x1013 재조합 AAV vg/kg의 용량 범위; 약 2x1013 내지 약 2.5x1013 재조합 AAV vg/kg의 용량 범위; 약 2.5x1013 내지 약 3x1013 재조합 AAV vg/kg의 용량 범위; 약 3x1013 내지 약 3.5x1013 재조합 AAV vg/kg의 용량 범위; 약 3.5x1013 내지 약 4x1013 재조합 AAV vg/kg의 용량 범위; 약 4x1013 내지 약 4.5x1013 재조합 AAV vg/kg의 용량 범위; 약 4.5x1013 내지 약 5x1013 재조합 AAV vg/kg의 용량 범위; 약 5x1013 내지 약 5.5x1013 재조합 AAV vg/kg의 용량 범위; 약 5.5x1013 내지 약 6x1013 재조합 AAV vg/kg의 용량 범위; 약 6x1013 내지 약 1x1014 재조합 AAV vg/kg의 용량 범위이다.
특정 실시양태에서, AAV vg/kg은 약 5x1011 vg/kg의 용량으로 투여되고, 약 6x1011 vg/kg의 용량으로 투여되고, 약 7x1011 vg/kg의 용량으로 투여되고, 약 8x1011 vg/kg의 용량으로 투여되고, 약 9x1011 vg/kg의 용량으로 투여되고, 약 1x1012 vg/kg의 용량으로 투여되고, 약 2x1012 vg/kg의 용량으로 투여되고, 약 3x1012 vg/kg의 용량으로 투여되고, 약 4x1012 vg/kg의 용량으로 투여되고, 약 5x1012 vg/kg의 용량으로 투여되고, 약 6x1012 vg/kg의 용량으로 투여되고, 약 7x1012 vg/kg의 용량으로 투여되고, 약 8x1012 vg/kg의 용량으로 투여되고, 약 9x1012 vg/kg의 용량으로 투여되고, 약 1x1013 vg/kg의 용량으로 투여되고, 약 2x1013 vg/kg의 용량으로 투여되고, 약 3x1013 vg/kg의 용량으로 투여되고, 약 4x1013 vg/kg의 용량으로 투여되고, 약 5x1013 vg/kg의 용량으로 투여되고, 약 6x1013 vg/kg의 용량으로 투여된다.
본원에서 사용되는 "단위 투여 형태"는 치료될 대상체에 대한 단일 투여량으로 적합한 물리적으로 분리된 단위를 지칭하며; 각각의 단위는 하나 이상의 용량으로 투여될 때 원하는 효과(예를 들어, 예방 또는 치료 효과)를 생성하도록 계산되는 선택적으로 약학적 담체(부형제, 희석제, 비히클 또는 충전제)와 조합하여 미리 결정된 양을 포함한다. 단위 투여 형태는 예를 들어 액체 조성물, 또는 냉동건조 또는 동결건조 상태의 조성물을 포함할 수 있는 앰플 및 바이알 내에 있을 수 있으며; 예를 들어, 멸균 액체 담체는 생체 내 투여 또는 전달 전에 첨가될 수 있다. 개별 단위 투여 형태는 다중 투여 키트 또는 용기에 포함될 수 있다. rAAV 입자, 비-바이러스 벡터 및 이의 약학 조성물은 투여의 용이성 및 투여량의 균일성을 위해 단일 또는 다중 단위 투여 형태로 포장될 수 있다.
치료를 위한 "유효량" 또는 "충분량"의 용량(예를 들어, 치료적 혜택 또는 개선을 향상시키거나 개선하기 위해)은 질환의 진행 또는 악화를 저하, 감소, 억제, 억지, 제한 또는 제어하는 것이 만족스러운 결과이긴 하지만, 전형적으로 질환의 하나, 다수 또는 모든 불리한 증상, 결과 또는 합병증, 예를 들어 질병으로 인하거나 질병과 관련된 하나 이상의 불리한 증상, 장애, 질병, 병리 또는 합병증에 대한 반응을 측정 가능한 정도로 제공하는 데 효과적이다.
특정 실시양태에서, 본 발명에 따른 방법은 GLA 필요성 또는 파브리병의 하나 이상의 증상을 감소, 저하 또는 억제하거나; 또는 GLA 필요성 또는 파브리병의 하나 이상의 증상의 진행 또는 악화를 예방 또는 감소시키거나; 또는 GLA 필요성 또는 파브리병의 하나 이상의 증상을 안정화시키거나; 또는 GLA 필요성 또는 파브리병의 하나 이상의 증상을 개선한다.
유효량 또는 충분량은 단일 투여로 제공될 수 있지만 반드시 그럴 필요는 없으며, 다중 투여를 필요로 할 수 있고, 단독으로 또는 다른 조성물(예를 들어, 작용제), 치료, 프로토콜 또는 치료 요법과 함께 투여될 수 있지만 반드시 그럴 필요는 없다. 예를 들어, 양은 대상체의 요구, 치료할 질환의 유형, 상태 및 중증도 또는 치료의 부작용(있는 경우)에 따라 비례적으로 증가할 수 있다. 또한, 유효량 또는 충분량은 제2 조성물(예를 들어, 또 다른 약물 또는 작용제), 치료, 프로토콜 또는 치료 요법 없이 단일 또는 다중 용량으로 제공되는 경우 효과적이거나 충분할 필요는 없는데, 왜냐하면 주어진 대상에서 효과적이거나 충분한 것으로 간주되도록 하기 위해 상기한 용량 이상을 넘는 추가 용량, 양 또는 기간, 또는 추가 조성물(예를 들어, 약물 또는 작용제), 치료, 프로토콜 또는 치료 요법이 포함될 수 있기 때문이다. 효과적인 것으로 간주되는 양은 또한 GLA로 치료될 수 있는 GLA 결핍(예를 들어, 파브리병) 또는 다른 리소좀 축적 질환의 치료를 위해 GLA를 인코딩하는 변형된 핵산의 투여와 같이 다른 치료, 치료 요법 또는 프로토콜의 사용을 감소시키는 양을 포함한다.
따라서, 본 발명의 방법 및 용도는 또한 무엇보다도 또 다른 화합물, 작용제, 약물, 치료 요법, 치료 프로토콜, 과정 또는 구제의 필요성 또는 사용을 감소시키는 방법 및 사용을 포함한다. 예를 들어, GLA 결핍의 경우, 본 발명의 방법 또는 사용은 주어진 대상체에서 결핍 또는 결함이 있는 GLA를 보충하기 위해 재조합 GLA의 덜 빈번하거나 감소된 용량 또는 투여의 제거가 요구된다면 치료적 혜택을 가진다. 따라서, 본 발명에 따르면, 또 다른 치료 또는 요법의 필요성 또는 사용을 감소시키는 방법 및 용도가 제공된다.
유효량 또는 충분량은 치료되는 각각의 모든 대상체나 주어진 그룹 또는 집단에서 치료된 대상체의 대다수에 효과적일 필요는 없다. 유효량 또는 충분량은 그룹이나 일반 집단이 아닌 특정 대상체에 대한 유효성 또는 충분성을 의미한다. 그러한 방법에 대해 전형적인 바와 같이, 일부 대상체는 주어진 치료 방법 또는 사용에 대해 더 큰 반응을 나타내거나 더 적은 반응을 나타내거나 전혀 반응하지 않을 것이다.
대상체에 대한 투여 또는 생체 내 전달은 질환에 의해 유발되거나 이와 관련된 불리한 증상, 병태, 합병증 등이 발생하기 전에 수행될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 조성물, 방법 및 사용에 대한 후보로서의 대상체를 식별하기 위해 스크린(예를 들어, 유전적)이 사용될 수 있다. 따라서, 이러한 대상체는 기능적 유전자 산물의 불충분한 양 또는 결핍(예를 들어, GLA 또는 GLA로 치료될 수 있는 리소좀 축적 질환을 유발하는 단백질 결핍)에 대해 양성으로 스크리닝되거나 비정상적, 부분적 기능성 또는 비기능성 유전자 산물(예를 들어, GLA 또는 GLA로 치료될 수 있는 리소좀 축적 질환에 연루된 단백질)을 생성하는 대상체를 포함한다.
본원에 개시된 바와 같은 본 발명의 방법 및 사용에 따라 대상체에 대한 투여 또는 생체내 전달은 대상체가 치료를 목적으로 하는 질환을 갖는 것으로 확인되거나, 질환의 하나 이상의 증상을 갖거나, 대상체가 질환의 하나 이상의 증상을 갖지 않음에도 불구하고 본원에 기술된 바와 같이 스크리닝되고 양성으로 확인된 후1-2, 2-4, 4-12, 12-24 또는 24-72시간 내에 실행될 수 있다. 물론, 본 발명의 방법 및 용도는 대상체가 치료를 목적으로 하는 질환을 갖는 것으로 확인되거나, 질환의 하나 이상의 증상을 갖거나, 본원에 기술된 바와 같이 스크리닝되고 양성으로 확인된 후 1-7, 7-14, 14-24, 24-48, 48-64일 이상, 수 개월 또는 수년 후에 실행될 수 있다.
용어 "개선하다"는 대상체의 질환 또는 이의 증상, 또는 기본적인 세포 반응에서 검출가능하거나 측정가능한 개선을 의미한다. 검출할 수 있거나 측정할 수 있는 개선에는 질환의 발생, 빈도, 중증도, 진행 또는 지속 기간, 또는 질환으로 인해 발생하거나 이와 관련된 합병증의 주관적 또는 객관적 저하, 감소, 억제, 억지, 제한 또는 제어, 또는 질환의 증상이나 기저 원인 또는 결과의 향상, 또는 질환의 역전이 포함된다.
파브리병의 경우, 유효량은 글로보트리아오실스핑고신(lyso-GB3)과 같은 파브리병의 마커를 개선하는 양 및 미국 특허 출원 공개 번호 US 2010-0113517(이의 개시 내용은 그 전체가 본원에 원용됨)에 개시된 것일 수 있다. US 2010/0113517에 개시된 파브리병에 대한 대용 마커의 개선의 비제한적 예는 세포(예를 들어, 섬유아세포) 및 조직에서의 α-Gal A 수준 또는 활성의 증가; GL-3 축적 감소; 호모시스테인 및 혈관 세포 부착 분자-1(VCAM-1)의 감소된 혈장 농도; 심근 세포 및 판막 섬유세포 내 GL-3 축적 감소; 심장 비대(특히 좌심실)의 감소, 판막 부전 및 부정맥의 개선; 단백뇨 개선; CTH, 락토실세라미드, 세라미드와 같은 지질의 요중 농도 감소 및 글루코실세라미드 및 스핑고미엘린의 요중 농도 증가; 사구체 상피 세포에 적층된 봉입체(얼룩말체)의 부재; 신장 기능 개선; 땀저하증 완화; 혈관각화종의 부재; 고주파수 감각신경성 난청, 진행성 난청, 돌발성 난청 또는 이명과 같은 청력 이상 개선이 포함된다. 신경학적 증상의 개선에는 일과성 허혈 발작(TIA) 또는 뇌졸중의 예방; 및 말단 지각이상증(사지의 작열감 또는 따끔거림)으로 나타나는 신경병성 통증의 개선을 포함한다. 파브리병에 대해 평가할 수 있는 또 다른 유형의 임상 지표는 유해한 심혈관 증상의 유병률이다. 파브리병의 일반적인 심장 관련 징후 및 증상에는 좌심실 비대, 판막 질환(특히 승모판 탈출증 및/또는 역류), 조기 관상 동맥 질환, 협심증, 심근 경색, 전도 이상, 부정맥, 울혈성 심부전이 포함된다.
치료 용량은 무엇보다도 대상체의 연령 및 일반적인 상태, 질환 또는 장애의 중증도에 따라 달라질 것이다. 따라서, 인간에서의 치료적 유효량은 개별 환자의 반응에 기초하여 의사가 결정할 수 있는 비교적 넓은 범위에 속할 것이다.
추가 실시양태에서, 인간 대상체에게 투여되는 유효량은 다음을 제공한다:
1 ng/ml 초과, 2 ng/ml, 3 ng/ml 초과, 4 ng/ml 초과, 약 1 ng/ml, 약 2 ng/ml, 약 2.5 ng/ml, 약 3 ng/ml, 또는 약 3.5 ng/ml로 혈장 GLA의 증가; 1 nmol/h/ml 초과, 1.5 nmol/h/ml 초과, 2 nmol/h/ml 초과, 2.5 nmol/h/ml 초과, 3 nmol/h/ml 초과, 4 nmol/h/ml 초과, 5 nmol/h/ml 초과, 6 nmol/h/ml 초과, 7 nmol/h/mL 초과, 약 1 nmol/h/mL, 약 1.5 nmol/h/mL, 약 2 nmol/h/mL, 약 2.5 nmol/h/mL, 약 3 nmol/h/mL, 약 4 nmol/h/mL, 약 5 nmol/h/mL, 약 6 nmol/h/m, 또는 약 7 nmol/h/mL로 혈장 GLA 활성의 증가; 및/또는 40 nmol/L 미만, 30 nmole/L 미만, 10 nmole/L 미만, 5 nmole/L 미만, 2 nmole/L 미만으로 혈장 Lyso-Gb3의 감소. 혈장 GLA, 혈장 GLA 활성 및 혈장 Lyso-Gb3는 Tsukimura et al., Molecular Genetics 및 Metabolism Reports 1 (2014) 288-298에 제공되거나 언급된 것과 같은 표준 기술을 사용하여 측정될 수 있다.
본 발명의 방법 및 용도는 전신, 국부 또는 국소적으로 또는 임의의 경로, 예를 들어 주사 또는 주입에 의한 전달 및 투여를 포함한다. 생체 내 약학 조성물의 전달은 일반적으로 통상적인 주사기를 사용하여 주사를 통해 달성될 수 있지만, 대류-강화 전달과 같은 다른 전달 방법도 구상된다(예를 들어, 미국 특허 번호 5,720,720 참조, 이의 개시 내용은 그 전체가 본원에 원용됨). 예를 들어, 조성물은 피하, 표피, 피내, 척수강내, 안와내, 점막내, 비강내, 복강내, 정맥내, 흉막내, 동맥내, 강내, 경구, 간내, 문맥을 통해 또는 근육내로 전달될 수 있다. 다른 투여 방식에는 경구 및 폐 투여, 좌약 및 경피 적용이 포함된다. 파브리병 또는 기타 리소좀 축적 질환 환자 치료를 전문으로 하는 임상의는 환자의 상태 및 치료 목적을 포함하되 이에 제한되지 않는 여러 기준에 따라 AAV 벡터 및 비-바이러스 벡터 투여를 위한 최적의 경로를 결정할 수 있다.
조성물은 단독으로 투여될 수 있다. 특정 실시양태에서, rAAV 입자 또는 비-바이러스 벡터는 면역억제제 없이 치료 효과를 제공한다. 치료 효과는 선택적으로 일정 기간, 예를 들어, 면역억제제의 투여없이 2-4, 4-6, 6-8, 8-10, 10-14, 14-20, 20-25, 25-30, 또는 30-50일 이상, 예를 들어, 50-75, 75-100, 100-150, 150-200일 이상 동안 지속된다. 따라서 일정 기간 동안 치료 효과가 제공된다.
본 발명의 rAAV 벡터, 비-바이러스 벡터, 방법 및 사용은 원하는 치료적, 유익한, 상가적, 상승적 또는 보완적 활성 또는 효과를 갖는 임의의 화합물, 작용제, 약물, 치료제 또는 다른 치료 요법 또는 프로토콜과 조합될 수 있다. 예시적인 조합 조성물 및 치료제는 생물학적 제제(단백질), 작용제(예를 들어, 면역억제제) 및 약물과 같은 제2 활성제를 포함한다. 이러한 생물학적 제제(단백질), 작용제, 약물, 치료제 및 요법은 본 발명의 임의의 다른 방법 또는 사용 전에, 실질적으로 동시에 또는 후에 투여되거나 수행될 수 있다.
화합물, 작용제, 약물, 치료제 또는 다른 치료 요법 또는 프로토콜은 조합 조성물로서 투여되거나, 또는 핵산, 발현 카세트, rAAV 입자 또는 비-바이러스 벡터의 전달 또는 투여와 동시에 또는 이에 연속적으로 또는 순차적으로(전 또는 후)와 같이 별도로 투여될 수 있다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 방법 또는 사용이 본원에 기재되거나 당업자에게 공지된 임의의 화합물, 작용제, 약물, 치료 요법, 치료 프로토콜, 과정, 치료제 또는 조성물과 조합되는 조합을 제공한다. 화합물, 작용제, 약물, 치료 요법, 치료 프로토콜, 과정, 치료제 또는 조성물은 대상체에 본 발명의 핵산, 발현 카세트, 비-바이러스 벡터 또는 rAAV 입자의 투여 전, 실질적으로 동시 또는 후에 투여 또는 수행될 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 핵산, 발현 벡터, 비-바이러스 벡터 또는 rAAV 입자는 환자가 rAAV 입자 및/또는 GLA 단백질에 대한 면역 반응을 갖거나 발병할 위험이 있는 경우 면역억제제 또는 요법과 조합하여 환자에게 투여된다. 이러한 면역억제제 또는 요법은 본 발명의 핵산, 발현 카세트, 비-바이러스 벡터 또는 rAAV 벡터를 투여하기 전에, 실질적으로 동시에 또는 후에 투여될 수 있다.
특정 실시양태에서, 파브리병을 앓는 인간 환자와 같은 대상체 또는 환자는 전통적인 효소대체 요법으로 치료한 후(예를 들어, 재조합으로 생성된 GLA 단백질의 투여 후)에 발생할 수 있는 GLA 단백질(항-GLA 항체 및/또는 항-GLA T-세포 포함)에 대한 억제제를 발생시킨다. 그러한 GLA 억제제의 발생은 특히 환자가 검출할 수 없는 GLA 수준(유아 파브리병의 경우일 수 있음)을 가지고 있는 경우 효소 대체 요법을 받는 환자에서 발생할 수 있으며, 이에 따라 환자의 면역 체계는 대체 GLA 단백질을 "외래성"으로 인식하게 한다". 특정 실시양태에서, GLA 억제제를 갖는 파브리 환자는 본 발명의 rAAV 벡터 또는 비-바이러스 벡터를 투여하기 전, 실질적으로 동시에 또는 후에 환자의 GLA 단백질에 대한 면역 반응을 완화시키거나 면역 관용을 달성하도록 의도된 하나 이상의 요법을 투여받는다. 면역 관용을 달성하거나 GLA 단백질에 대한 면역 반응을 완화하기 위한 이러한 요법은 메토트렉세이트, 리툭시맙, 정맥내 감마 글로불린(IVIG), 오말리주맙 및 합성 백신 입자(SVP™)-라파마이신(생분해성 나노입자에 캡슐화된 라파마이신)을 포함하나 이에 제한되지 않는 하나 이상의 면역억제제의 투요 및/또는 B-세포 고갈, 면역흡착 및 혈장교환술과 같은 하나 이상의 면역억제 프로토콜 또는 절차의 투여를 포함할 수 있다.
특정 실시양태에서, rAAV 벡터 또는 비-바이러스 벡터는 rAAV 벡터 또는 비-바이러스 벡터를 투여하기 전에, 실질적으로 동시에 또는 후에 하나 이상의 면역억제제와 조합하여 투여된다. 특정 실시양태에서, 하나 이상의 면역억제제는 예를 들어 rAAV 벡터 또는 비-바이러스 벡터가 투여된 후 1-12, 12-24 또는 24-48시간, 또는 2-4, 4-6, 6-8, 8-10, 10-14, 14-20, 20-25, 25-30, 30-50일 또는 50일 초과 후에 투여된다. 이러한 면역억제제의 투여는 rAAV 벡터 또는 비-바이러스 벡터를 투여한 후 일정 기간, 예를 들어, 20-25, 25-30, 30-50, 50-75, 75-100, 100-150, 150-200일 또는 200일 초과 동안 초기 발현 수준 이후 인코딩된 단백질 또는 억제 핵산의 감소가 있는 경우 실시될 수 있다.
특정 실시양태에서, 면역억제제는 항염증제이다.
특정 실시양태에서, 면역억제제는 스테로이드, 예를 들어 코르티코스테로이드이다. 특정 실시양태에서, 면역억제제는 프레드니손, 프레드니솔론, 칼시뉴린 억제제(예를 들어, 사이클로스포린, 타크롤리무스), MMF(마이코페놀산, 예: CellCept®, Myfortic®), CD52 억제제(예를 들어, 알렘투주맙), CTLA4-Ig(예를 들어, 아바타셉트, 벨라타셉트), 항-CD3 mAb, 항-LFA-1 mAb(예를 들어, 에팔리주맙), 항-CD40 mAb(예를 들어, ASKP1240), 항-CD22 mAb(예를 들어, 에프라투주맙), 항-CD20 mAb(예를 들어, 리툭시맙, 오렐리주맙, 오파투무맙, 벨투주맙), 프로테아좀 억제제(예를 들어, 보르테조밉), TACI-Ig(예를 들어, 아타시셉트), 항-C5 mAb(예를 들어, 에쿨리주맙), 마이코페놀레이트, 아자티오프린, 시롤리무스 에베롤리무스, TNFR-Ig, 항-TNF mAb, 토파시티닙, 항-IL-2R(예를 들어, 바실리시맙), 항-IL-17 mAb(예를 들어, 세쿠키누맙), 항-IL-6 mAb(예를 들어, 항-IL-6 항체 시루쿠맙, 항-IL-6 수용체 항체 토실리주맙(Actemra®), IL-10 억제제, TGF-베타 억제제, B 세포 표적 항체(예를 들어, 리툭시맙), 포유류 표적 라파마이신(mTOR) 억제제(예를 들어, 라파마이신), 합성 백신 입자(SVP™)-라파마이신(생분해성 나노입자에 캡슐화된 라파마이신), 정맥내 감마 글로불린(IVIG), 오말리주맙, 메토트렉세이트, 티로신 키나제 억제제(예를 들어, 이브루티닙), 사이클로포스파미드, 핑골리모드, B 세포 활성화 인자(BAFF)의 억제제(예를 들어, 항-BAFF mAb, 예: 벨리무맙), 증식-유도 리간드의 억제제(APRIL), 항-IL-1b mAb(예를 들어, 카나키누맙(Haris®)), C3a 억제제, 트레기톱(Tregitope)(예를 들어, US10,213,496 참조)), 또는 이들의 조합 및/또는 유도체, 및/또는 B-세포 고갈, 면역흡착 및 혈장반출술과 같은 하나 이상의 면역억제 프로토콜 또는 절차의 투여이다.
라파마이신을 단독으로 또는 IL-10과 조합하여 사용하는 것을 포함하는 면역 억제 프로토콜을 사용하여 GLA 단백질에 대한 체액성 및 세포성 면역 반응을 저하, 감소, 억제, 예방 또는 차단할 수 있다. 본 발명의 AAV 벡터를 이용한 간 유전자 전달은 조절 T 세포(Tregs) 및 기타 메커니즘의 유도를 통해 GLA 단백질에 대한 면역 관용을 유도하는 데 사용될 수 있다. 전신 유전자 전달에서 AAV에 대한 체액성 면역을 감소(극복)하거나 피하기 위한 전략에는 고용량의 벡터 투여, 항-AAV 항체를 흡착하기 위한 미끼로서 AAV 빈 캡시드의 사용, AAV에 대한 체액성 면역 반응을 저하, 감소, 억제, 예방 또는 근절하기 위한 면역억제 약물의 투여, 중화 항체에 덜 민감하도록 AAV 캡시드 혈청형 변경 또는 AAV 캡시드 조작, 항-AAV 면역글로불린을 흡착하여 항-AAV 항체 역가를 감소시키기 위한 혈장 교환 주기 사용, 및 풍선 카테터 후 식염수 세척과 같은 전달 기술의 사용이 포함된다. 이러한 전략은 Mingozzi et al., 2013, Blood, 122:23-36에 설명되어 있다. 추가 전략에는 Bertin et al., 2020, Sci. Rep. 10:864. https://doi.org/10.1038/s41598-020-57893-z에 기술된 바와 같이, 혈장에서 총 면역글로불린 풀을 고갈시키지 않고 항-AAV 항체를 선택적으로 고갈시키기 위해 AAV 특이적 혈장 분리 반출 컬럼을 사용하는 것이 포함된다.
AAV 빈 캡시드 대 rAAV 벡터의 비는 예를 들어 약 100:1-50:1, 약 50:1-25:1, 약 25:1-10:1, 약 10:1-1:1, 약 1:1-1:10, 약 1:10-1:25, 약 1:25-1:50, 또는 약 1:50-1:100 내 또는 사이이다. 비는 또한 약 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 또는 10:1일 수 있다.
투여할 AAV 빈 캡시드의 양은 특정 대상체에서 생성된 AAV 항체의 양(역가)에 기초하여 보정될 수 있다. AAV 빈 캡시드는 임의의 혈청형, 예를 들어, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, Rh10, Rh74(서열 번호 35), AAV3B, LK03(서열 번호 42) AAV-2i8, 서열 번호 110의 서열, 서열 번호 36의 서열, 및/또는 서열 번호 37의 서열을 가질 수 있다.
대안적으로 또는 추가로, rAAV 벡터 또는 비-바이러스 벡터는 직접 근육내 주사(예를 들어, 근육의 하나 이상의 지근 섬유)에 의해 전달될 수 있다. 또 다른 대안에서, 대퇴 동맥에 도입된 카테터는 rAAV 벡터 또는 비-바이러스 벡터를 간 동맥을 통해 간으로 전달하기 위해 사용될 수 있다. rAAV 벡터 또는 비-바이러스 벡터를 간으로 직접 전달하여 혈류 및 AAV 항체를 우회하기 위해 내시경 역행 담췌관조영술(ERCP)과 같은 비외과적 수단을 사용할 수도 있다. 악하선의 도관과 같은 다른 도관 시스템이 또한 rAAV 벡터 또는 비-바이러스 벡터를 항-AAV 항체가 발생하거나 이미 존재하는 대상에게 전달하기 위한 포털로 사용될 수 있다.
AAV에 대한 체액성 면역을 감소시키는 추가 전략에는 AAV 항체를 제거, 고갈, 포획 및/또는 불활성화하는 방법이 포함되며, 이는 일반적으로 성분채집술, 특히 혈액 산물이 관련된 혈장반출술로 지칭된다. 성분채집술 또는 혈장반출술은 환자에게 반환되기 전에 구성 요소의 추가, 제거 및/또는 교체를 통해 혈장을 수정하는 장치를 통해 인간 대상체의 혈장이 생체 외(체외)에서 순환되는 과정이다. 혈장반출술 혈액 산물(예를 들어, 혈장)에서 인간 면역글로불린(예를 들어, IgG, IgE, IgA, IgD)을 제거하는 데 사용할 수 있다. 이 절차는 AAV에 결합하는 면역글로불린(항체)을 고갈, 포획, 불활성화, 감소 또는 제거하여 치료 대상체에서 AAV 벡터 중화에 기여할 수 있는 AAV 항체의 역가를 감소시킨다. 일례는 AAV 캡시드 친화성 매트릭스 컬럼으로 구성된 장치이다. AAV 캡시드 친화성 매트릭스를 통해 혈액 산물(예를 들어, 혈장)을 통과하면 AAV 항체 및 모든 이소형(IgG, IgM 등 포함)만 결합하게 된다.
AAV 캡시드 친화성 매트릭스를 사용하는 충분량의 혈장반출술은 AAV 캡시드 항체를 실질적으로 제거하고 인간에서 AAV 캡시드 항체 역가(부하)를 감소시킬 것으로 예측된다. 특정 실시양태에서, 치료 대상체에서 역가는 실질적으로 낮은 수준으로 감소한다(< 1:5 이하, 예컨대 < 1:4, 또는 < 1:3, 또는 < 1:2, 또는 < 1:1). 항체 역가의 감소는 AAV 캡시드 항체를 생성하는 B 림프구가 점진적으로 AAV 캡시드 항체 역가의 혈장반출술 전 정상 상태 수준으로 반등하게 할 것으로 예상되기 때문에 일시적일 것이다.
기존 AAV 항체 역가를 1:100에서 1:1로 감소시킨 경우, 혈장반출술 완료 후 각각 1시간, 3시간, 6시간, 12시간 및 24시간에 약 0.15%(역가 1:1.2에 해당) 0.43%(1:1.4), 0.9%(1:1.9), 1.7%(1:2.7) 및 3.4%(1:4.4)의 AAV 항체 역가 반등이 발생한다. 그러한 대상체로부터 AAV 항체의 일시적 제거는 AAV 벡터가 대상체에게 투여될 수 있고 AAV 벡터를 AAV 항체로 실질적으로 중화시키지 않고 표적 조직을 효율적으로 형질도입할 것으로 예측되는 시간 창(예를 들어, 약 24시간 이하, 예컨대 12시간 이하, 또는 6시간 이하, 또는 3시간 이하, 또는 2시간 이하 또는 1시간 이하)에 해당할 것이다.
기존 AAV 항체 역가를 1:1000에서 1:1로 감소시킨 경우, 혈장반출술법 완료 후 각각 1시간, 3시간, 6시간, 12시간 및 24시간에 약 0.15%(역가 1:2.5에 해당) 0.4%(1:5.3), 0.9%(1:9.7), 1.7%(1:18) 및 3.4%(1:35)의 AAV 항체 역가 반등이 발생한다. 따라서, AAV 벡터의 투여 기간은 비교적 짧을 것이다.
AAV 항체는 이미 존재할 수 있고 표적 세포의 치료적 GLA 유전자 전달 벡터 형질도입을 감소시키거나 차단하는 수준으로 존재할 수 있다. 또는, AAV 항체는 AAV에 노출되거나 AAV 벡터가 투여된 후에 발생할 수도 있다. 이러한 항체가 AAV 벡터의 투여 후 발생하는 경우, 이들 대상체는 또한 성분채집술, 보다 특히 혈장반출술을 통해 치료될 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드, 발현 카세트, AAV 벡터 및 비-바이러스 벡터는 인간 혈장에서 항체(예를 들어, IgG) 수준을 감소시키는 방법과 함께 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드, 발현 카세트, AAV 벡터 및 비-바이러스 벡터는 IgG와 신생 Fc 수용체(FcRn), 예컨대 항-FcRn 항체의 상호작용을 차단, 억제 또는 감소시켜 생체 내에서 IgG 재순환을 감소시키고 IgG 청소율을 향상시키는 작용제, 및/또는 바이러스 벡터, 예컨대 재조합 바이러스 벡터에 결합하거나, 재조합 바이러스 벡터에 의해 캡슐화된 치료용 이종 폴리뉴클레오타이드에 의해 인코딩된 핵산, 폴리펩타이드, 단백질 또는 펩타이드에 결합하거나, 치료용 이종 폴리뉴클레오타이드에 결합하는 순환 항체를 감소시키는 작용제와 함께 사용될 수 있다.
특정 실시양태에서, 바이러스 벡터에 대한 항체 결합은 IgG와 FcRn, 프로테아제 또는 글리코시다아제의 상호작용을 감소시키는 작용제에 의해 감소되거나 억제된다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 폴리펩타이드, 발현 카세트, AAV 벡터 또는 비-바이러스 벡터는 엔도펩티다아제(예를 들어, Streptococcus pyogenes로부터의 IdeS) 또는 이의 변형된 변이체, 또는 엔도글리코시다아제(예를 들어, S. pyogenes EndoS) 또는 이의 변형된 변이체와 조합하여 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 폴리펩타이드, 발현 카세트, AAV 벡터 또는 비-바이러스 벡터는 AAV 캡시드에 대한 중화 항체를 감소시키거나 제거하고 이전에 유전자 치료에 적합하지 않은 것으로 간주되거나 AAV 유전자 치료 후 AAV 항체가 발생한 환자의 치료를 가능하게 하는 엔도펩티다제(예를 들어, Streptococcus pyogenes로부터의 IdeS) 또는 이의 변형된 변이체, 또는 엔도글리코시다제(예를 들어, S. pyogenes로부터의 EndoS) 또는 이의 변형된 변이체와 조합하여 사용될 수 있다. 이러한 전략은 Leborgne et al., 2020, Nat. Med., 26:1096-1101 (2020)에 기술되어 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 핵산, 발현 카세트, AAV 벡터 및 비-바이러스 벡터는 예를 들어 기관지확장제; 보청기; 국소 피부 보습제; 이뇨제, ACE 억제제, 심장 장치 등과 같은 전형적인 심장 치료제; 통증 완화 또는 신장 보호용 약물; 항혈전 및 항부정맥 요법에 의한 뇌졸중 예방; 항단백뇨제, 신장 투석 및/또는 말기 신부전의 경우 신장 이식; 및 메토클로프라미드, H2 차단제 및 적절한 영양을 보장하고 위장 증상을 관리하기 위한 식이 요법과 조합하여 사용될 수 있다(예를 들어, Germain, Orphanet J Rare Dis. 2010 Nov 22;5:30; Ortiz et al., Mol Genet Metab. 2018 Apr;123(4):416-427; 및 Mehta et al., QJM: Inter. Jour. Med. 2010 Sept;103(9):641-659 참조).
특정 실시양태에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드, 발현 카세트 및 AAV 벡터는 약리학적 샤페론 요법(또한 효소 강화 요법으로도 알려짐)과 조합하여 사용될 수 있으며, 여기서 하나 이상의 약리학적 샤페론은 파브리병과 같은 리소좀 축적 질환의 치료를 위한 본 발명의 폴리뉴클레오타이드, 발현 카세트, AAV 벡터 또는 비-바이러스 벡터의 투여 전, 동시 또는 후에 투여된다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드, 발현 카세트, AAV 벡터 및 비-바이러스 벡터는 GLA 단백질을 안정화할 수 있는 하나 이상의 약리학적 샤페론과 조합하여 사용될 수 있다. 본 발명의 폴리뉴클레오타이드, 발현 카세트 및 AAV 벡터와 조합하여 사용될 수 있는 약리학적 샤페론은 예를 들어 1-데옥시갈락토노지리마이신(DGJ), 미갈라스타트 하이드로클로라이드(미갈라스타트), α-3,4-디-에피-호모노지리마이신, 4-에피-파고민, α-알로-호모노지리마이신, N-메틸-데옥시갈락토노지리마이신, β-1-C-부틸-데옥시갈락토노지리마이신, α-갈락토-호모노지리마이신, 칼리스테긴 A3, 칼리스테긴 B2, 칼리스테긴 B3, N-메틸-칼리스테긴 A3, N-메틸-칼리스테긴 B2 및 N-메틸-칼리스테긴 B3, 및 미국 특허 제6,274,597호, 6,774,135호 및 6,599,919호(이들의 개시내용은 그 전체가 본원에 원용됨)에 기술된 다른 것들을 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 및 발현 카세트는 AAV 벡터 입자를 통해 전달되거나 투여된다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 및 발현 카세트는 레트로바이러스, 아데노바이러스, 헬퍼-의존성 아데노바이러스, 하이브리드 아데노바이러스, 단순 헤르페스 바이러스, 렌티바이러스, 폭스바이러스, 엡스타인-바 바이러스, 백시니아 바이러스 및 인간 사이토메갈로바이러스 입자를 포함한 기타 타입의 바이러스 입자를 통해 전달되거나 투여될 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 및 발현 카세트는 비-바이러스 벡터를 통해 전달되거나 투여될 수 있다.
키트
본 발명은 팩키징 재료 및 그 안에 하나 이상의 구성 요소가 있는 키트를 제공한다. 키트는 전형적으로 구성 요소에 대한 설명, 또는 안에 있는 구성 요소의 시험관 내, 생체 내 또는 생체 외 사용 지침을 포함하는 라벨 또는 포장 삽입물을 포함한다. 키트는 이러한 구성 요소, 예를 들어 rAAV 입자 또는 비-바이러스 벡터, 및 선택적으로 또 다른 화합물, 작용제, 약물 또는 조성물과 같은 제2 활성제의 집합체를 함유할 수 있다.
키트는 키트의 하나 이상의 구성 요소를 포함하는 물리적 구조를 나타낸다.
포장재는 구성 요소를 무균 상태로 유지할 수 있으며 이러한 목적에 일반적으로 사용되는 재료(예를 들어, 종이, 골판지 섬유, 유리, 플라스틱, 호일, 앰플, 바이알, 튜브 등)로 만들어질 수 있다.
라벨 또는 삽입물은 그 안의 하나 이상의 구성 요소, 투여량, 작용 메커니즘을 포함한 활성 성분(들)의 임상 약리학, 약동학 및 약력학의 식별 정보를 포함할 수 있다. 라벨 또는 삽입물에는 제조업체의 정보, 로트 번호, 제조 위치 및 날짜, 만료 날짜를 식별하는 정보가 포함될 수 있다. 라벨 또는 삽입물에는 키트 구성 요소를 사용할 수 있는 질환에 대한 정보가 포함될 수 있다. 라벨 또는 삽입물은 방법, 사용 또는 치료 프로토콜 또는 치료 요법에서 하나 이상의 키트 구성 요소를 사용하기 위한 임상의 또는 대상체를 위한 지침을 포함할 수 있다. 지침은 본원에 기술된 임의의 방법, 용도, 치료 프로토콜 또는 예방적 또는 치료적 요법을 실시하기 위한 투여량, 빈도 또는 기간 및 지침을 포함할 수 있다.
라벨 또는 삽입물에는 예방적 또는 치료적 혜택과 같이 구성 요소가 제공할 수 있는 모든 혜택에 대한 정보가 포함될 수 있다. 라벨 또는 삽입물은 특정 조성물을 사용하는 것이 적절하지 않은 상황에 대해 대상체 또는 임상의에게 경고하는 것과 같은 잠재적 부작용, 합병증 또는 반응에 대한 정보를 포함할 수 있다. 부작용 또는 합병증은 대상체가 조성물과 양립할 수 없는 하나 이상의 다른 약물을 복용하였거나 복용할 것이거나 현재 복용 중인 경우, 또는 대상체가 조성물과 양립할 수 없는 다른 치료 프로토콜 또는 치료 요법을 받았거나 받을 예정이거나 현재 받고있는 중인 경우 발생할 수 있으며, 따라서 지침에는 그러한 비양립성에 대한 정보가 포함될 수 있다.
라벨 또는 삽입물은 "인쇄물", 예를 들어 종이 또는 판지를 포함하거나, 구성 요소, 키트 또는 포장재(예를 들어, 상자)와 분리되거나 이에 부착되거나, 키트 구성 요소가 포함된 앰플, 튜브 또는 바이알에 부착된다. 라벨 또는 삽입물은 바코드 인쇄 라벨, 디스크, 광학 디스크, 예컨대 CD- 또는 DVD-ROM/RAM, DVD, MP3, 자기 테이프, 또는 전기 저장 매체, 예컨대 RAM 및 ROM 또는 자기/광 저장 매체, FLASH 매체 또는 메모리 유형 카드와 같은 이들의 하이브리드와 같은 컴퓨터 판독 가능 매체를 추가로 포함할 수 있다.
표 1에서 서열 번호 15-19에 대한 종결 코돈은 굵게 표시된다.
추가 측면 및 실시예
추가 측면 및 실시양태의 제1 세트가 다음에 의해 제공된다:
1. α-갈락토시다제 A(GLA)를 인코딩하는 핵산을 포함하는 폴리뉴클레오타이드로서, 상기 핵산은 (1) 서열 번호 15의 서열과 적어도 75%의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오타이드, (2) 서열 번호 16의 서열과 적어도 84%의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오타이드, (3) 서열 번호 17의 서열과 적어도 86%의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오타이드, (4) 폴리뉴클레오타이드 서열 번호 18의 서열과 적어도 86%의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오타이드, 및 (5) 서열 번호 19의 서열과 적어도 83%의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오타이드로 이루어진 군으로부터 선택되고, 선택적으로 GLA는 서열 번호 100의 아미노산 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오타이드.
2. 항목 1에 있어서, 핵산은 14개 미만의 CpG 디뉴클레오타이드, 선택적으로 0개의 CpG 디뉴클레오타이드를 함유하는 폴리뉴클레오타이드.
3. 항목 1 또는 2에 있어서, 핵산은 서열 번호 15 내지 19 중 어느 하나의 서열을 갖는, 폴리뉴클레오타이드.
4. α-갈락토시다제 A(GLA) 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하는 폴리뉴클레오타이드로서, 상기 GLA 단백질은 Gln57Lys, Gln111Glu, Lys213Glu, Lys237Gln, Phe248Thr, Gly334Glu, 및 Gly346Asn로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는 서열 번호 100의 아미노산 서열을 갖고, 선택적으로 GLA는 서열 번호 48의 아미노산 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오타이드.
5. 항목 4에 있어서, 핵산은 서열 번호 47의 서열을 갖는, 폴리뉴클레오타이드.
6. 항목 1 내지 5 중 어느 하나에 있어서, GLA를 인코딩하는 핵산 내에 위치한 인트론을 추가로 포함하는 폴리뉴클레오타이드.
7. 항목 6에 있어서, 인트론은 GLA를 인코딩하는 핵산의 뉴클레오타이드 78과 79 사이에 위치하고, 여기서 뉴클레오타이드 위치는 서열 번호 14의 서열을 갖는 GLA의 코딩 서열과 관련하여 주어지는, 폴리뉴클레오타이드.
8. 항목 7에 있어서, 인트론은 비트로넥틴1(VTN1) 유전자, 레티놀 결합 단백질 4(RBP4) 유전자, 마우스 IgG 중쇄 A(IgHA) 유전자, 및 마우스 IgG 중쇄 μ(IgHμ) 유전자로부터의 인트론으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 선택적으로 상기 인트론은 서열 번호 49-52 중 하나의 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오타이드.
9. 항목 6 내지 8 중 어느 하나에 있어서, 핵산은 서열 번호 43-46 중 어느 하나의 서열을 갖는, 폴리뉴클레오타이드.
10. 항목 1 내지 9 중 어느 하나에 있어서, GLA를 인코딩하는 핵산의 5' 말단에 위치한 신호 펩타이드 서열을 인코딩하는 제2 핵산을 추가로 포함하는 폴리뉴클레오타이드.
11. 항목 10에 있어서, 신호 펩타이드 서열은 이종 또는 내인성 또는 천연 신호 펩타이드 서열인, 폴리뉴클레오타이드.
12. 항목 10 또는 11에 있어서, 신호 펩타이드는 인간 키모트립시노겐 B2 신호 펩타이드, AHSG 신호 펩타이드, CD300 신호 펩타이드, LAMP1 신호 펩타이드, Notch 2 신호 펩타이드, ORM1 신호 펩타이드, TF 신호 펩타이드, 및 야생형 GLA 신호 펩타이드 또는 이의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택되는, 폴리뉴클레오타이드.
13. 항목 12에 있어서, 신호 펩타이드는 인간 키모트립시노겐 B2 신호 펩타이드인, 폴리뉴클레오타이드.
14. 항목 13에 있어서, 신호 펩타이드를 인코딩하는 핵산은 서열 번호 1 내지 5 중 어느 하나의 서열을 갖는, 폴리뉴클레오타이드.
15. 발현 조절 요소에 작동가능하게 연결된 항목 1 내지 14 중 어느 하나의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 카세트.
16. 항목 15에 있어서, 발현 조절 요소는 간-특이적 발현 조절 요소인, 발현 카세트.
17. 항목 15 또는 16에 있어서, 발현 조절 요소는 GLA를 인코딩하는 핵산의 5'에 위치하는, 발현 카세트.
18. 항목 15 내지 17 중 어느 한 항에 있어서, GLA를 인코딩하는 핵산의 3'에 위치하는 폴리아데닐화 서열을 추가로 포함하는 발현 카세트.
19. 항목 15 내지 18 중 어느 하나에 있어서, 발현 조절 요소 또는 폴리아데닐화 서열은 야생형 발현 조절 요소 또는 폴리아데닐화 서열에 비해 CpG-감소된, 발현 카세트.
20. 항목 15 내지 19 중 어느 하나에 있어서, 발현 조절 요소는 ApoE/hAAT 인핸서/프로모터 서열을 포함하는, 발현 카세트.
21. 항목 15 내지 20 중 어느 하나에 있어서, 폴리아데닐화 서열은 소 성장 호르몬(bGH) 폴리아데닐화 서열을 포함하는, 발현 카세트.
22. 항목 20 또는 21에 있어서, ApoE/hAAT 인핸서/프로모터 서열 또는 bGH 폴리아데닐화 서열은 야생형 ApoE/hAAT 인핸서/프로모터 서열 또는 bGH 폴리아데닐화 서열에 비해 CpG-감소된, 발현 카세트.
23. 항목 20에 있어서, ApoE/hAAT 인핸서/프로모터 서열은 서열 번호 38의 서열을 포함하는, 발현 카세트.
24. 항목 21에 있어서, bGH 폴리아데닐화 서열은 서열 번호 20의 서열을 포함하는, 발현 카세트.
25. 항목 15 내지 24 중 어느 하나에 있어서, 발현 조절 요소의 3' 말단과 핵산의 5' 말단 사이에 위치한 인트론을 추가로 포함하는 발현 카세트.
26. 항목 25에 있어서, 인트론은 hBB2m1 인트론을 포함하는, 발현 카세트.
27. 항목 26에 있어서, 인트론 서열은 서열 번호 39의 서열을 포함하는, 발현 카세트.
28. 항목 1 내지 27 중 어느 하나의 폴리뉴클레오타이드 또는 발현 카세트를 포함하는 아데노 관련 바이러스(AAV) 벡터.
29. 항목 28에 있어서, AAV 벡터는 (a) 하나 이상의 AAV 캡시드, 및 (b) 하나 이상의 AAV 역 말단 반복부(ITR)를 포함하고, 여기서 AAV ITR(들)은 핵산 또는 발현 카세트의 5' 또는 3' 말단의 측면에 있는, AAV 벡터.
30. 항목 29에 있어서, ITR 중 적어도 하나 이상이 감소된 CpG를 갖도록 변형된 AAV 벡터.
31. 항목 28 내지 30 중 어느 하나에 있어서, AAV 벡터는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, Rh10, Rh74(서열 번호 35), AAV3B, LK03(서열 번호 42), AAV-2i8, 서열 번호 110, 서열 번호 36, 및/또는 서열 번호 37에 대해 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 변형된 또는 변이 AAV VP1, VP2 및/또는 VP3 캡시드; 또는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, Rh10, Rh74(서열 번호 35, AAV3B, LK03(서열 번호 42), AAV-2i8, 서열 번호 110, 서열 번호 36, 및/또는 서열 번호 37에 대해 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 캡시드; 또는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, Rh10, Rh74(서열 번호 35), AAV3B, LK03(서열 번호 42) AAV-2i8, 서열 번호 110, 서열 번호 36, 및/또는 서열 번호 37에 대해 100%의 서열 동일성을 갖는 캡시드를 포함하는 캡시드 혈청형을 갖는, AAV 벡터.
32. 항목 28 내지 31 중 어느 하나에 있어서, ITR은 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, Rh10, Rh74, AAV3B AAV 혈청형, 또는 이들의 조합 중 어느 하나 이상의 ITR을 포함하는, AAV 벡터.
33. 서열 번호 21-34 및 53-56 중 어느 하나의 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 AAV 벡터.
34. 생물학적으로 적합한 담체 또는 부형제 중에 항목 28 내지 33 중 어느 하나의 복수의 AAV 벡터를 포함하는 약학 조성물.
35. 항목 34에 있어서, 빈 AAV 캡시드를 추가로 포함하는 약학 조성물.
36. 항목 35에 있어서, 빈 AAV 캡시드 대 AAV 벡터의 비는 약 100:1 내지 약 50:1, 약 50:1 내지 약 25:1, 약 25:1 내지 약 10:1, 약 10:1 내지 약 1:1, 약 1:1 내지 약 1:10, 약 1:10 내지 약 1:25, 약 1:25 내지 약 1:50, 또는 약 1:50 내지 약 1:100인, 약학 조성물.
37. 항목 34 내지 36 중 어느 하나에 있어서, 계면활성제를 추가로 포함하는 약학 조성물.
38. α-갈락토시다제 A(GLA)를 필요로 하는 대상체를 치료하는 방법으로서, 상기 대상체에게 치료 유효량의 항목 1 내지 24 중 어느 하나의 폴리뉴클레오타이드 또는 발현 카세트, 또는 항목 25 내지 30 중 어느 하나의 AAV 벡터, 또는 항목 31 내지 34 중 어느 하나의 약학 조성물를 투여하는 것을 포함하고, 여기서 GLA가 대상체에서 발현되는, 방법.
39. 항목 38에 있어서, 대상체는 파브리병을 앓고 있는, 방법.
40. 항목 38 또는 39에 있어서, 폴리뉴클레오타이드, 발현 카세트, AAV 벡터, 또는 약학 조성물은 대상체에게 정맥내, 동맥내, 강내, 점막내 또는 카테터를 통해 투여되는, 방법.
41. 항목 38 내지 40 중 어느 하나에 있어서, AAV 벡터는 대상체 체중 킬로그램당 약 1x10 8 내지 약 1x1014 벡터 게놈(vg/kg)의 범위로 대상체에게 투여되는, 방법.
42. 항목 38 내지 41 중 어느 하나에 있어서, GLA의 필요성 또는 파브리병의 하나 이상의 증상을 저하, 감소 또는 억제하거나; GLA 필요성 또는 파브리병의 하나 이상의 증상의 진행 또는 악화를 예방하거나 감소시키거나; GLA 필요성 또는 파브리병의 하나 이상의 증상을 안정화시키거나; 또는 GLA 필요성 또는 파브리병의 하나 이상의 증상을 개선하는 방법.
43. 항목 1 내지 27 중 어느 하나의 폴리뉴클레오타이드 또는 발현 카세트를 포함하는 세포.
44. 항목 28 내지 33 중 어느 하나의 AAV 벡터를 생산하는 세포.
45. 항목 28 내지 33 중 어느 하나의 AAV 벡터를 생산하는 방법으로서, (a) 항목 1 내지 22 중 어느 하나의 폴리뉴클레오타이드 또는 발현 카세트를 포함하는 AAV 벡터 게놈을 팩키징 헬퍼 세포에 도입하는 단계; 및 (b) AAV 벡터를 생산하기 위한 조건 하에서 상기 헬퍼 세포를 배양하는 단계를 포함하는 방법.
추가 측면 및 실시예의 제2 세트는 다음을 포함한다:
측면 1은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다:
(a) α-갈락토시다제 A(GLA)를 인코딩하는 핵산 서열 - 여기서 핵산 서열은 서열 번호 15의 서열과 적어도 약 85%의 서열 동일성을 갖고, GLA는 서열 번호 100의 서열과 적어도 95%의 서열 동일성을 가짐 -;
(b) 삽입된 인트론을 포함하는 α-갈락토시다제 A(GLA)를 인코딩하는 핵산 서열 - 여기서 삽입된 인트론을 포함하는 GLA는 삽입된 인트론의 부재 시 서열 번호 100의 서열과 적어도 95%의 서열 동일성을 가짐 -;
(c) α-갈락토시다제 A(GLA)의 아미노 말단에 연결된 신호 펩타이드를 포함하는 전구체 α-갈락토시다제 A를 인코딩하는 핵산 서열 - 여기서 신호 펩타이드는 서열 번호 41, 서열 번호 57, 서열 번호 58, 서열 번호 60, 서열 번호 61, 서열 번호 62, 및 서열 번호 63로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 적어도 80%의 서열 동일성을 갖고; GLA는 서열 번호 100의 서열과 적어도 95%의 서열 동일성을 가짐 -;
(d) 서열 번호 100과 1 내지 7개의 아미노산이 상이한 아미노산 서열을 갖는 α-갈락토시다제 A(GLA)를 인코딩하는 핵산 - 여기서 1 내지 7개의 아미노산 중 적어도 하나는 Gln57Lys, Gln111Glu, Lys213Glu, Lys237Gln, Phe248Thr, Gly334Glu, 및 Gly346Asn으로 이루어진 군으로부터 선택된 치환임 -.
"전구체" α-갈락토시다제 A에 대한 언급은 신호 펩타이드의 존재를 나타낸다. 신호 펩타이드는 GLA와 관련된 자연 발생 펩타이드 또는 상이한 또는 이종 신호 펩타이드일 수 있다.
측면 1(a)의 상이한 실시양태에서, 핵산은 서열 번호 15, 16, 17 또는 18의 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 100%의 서열 동일성, 또는 서열 번호 15, 16, 17 또는 18의 서열의 염기 1-1194과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 100%의 서열 동일성(염기 1-1194는 아미노산 코딩 영역 제공)을 갖고; 독립적으로 GLA는 서열 번호 100의 서열과 적어도 95%, 적어도 98% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는다. 독립적으로에 대한 언급은 서열 번호 15의 서열에 대해 제공된 임의의 서열 동일성이 서열 번호 100에 대해 제공된 임의의 서열 동일성과 조합될 수 있음을 나타낸다. 예를 들어, 서열 번호 15의 서열과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 핵산은 서열 번호 100의 서열과 적어도 95%, 적어도 98% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 GLA를 인코딩할 수 있고; 서열 번호 15의 서열과 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 핵산은 서열 번호 100의 서열과 적어도 95%, 적어도 98% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 GLA를 인코딩할 수 있으며; 서열 번호 15의 서열의 핵산은 서열 번호 100의 서열과 적어도 95%, 적어도 98% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 GLA를 인코딩할 수 있다.
측면 1(b)의 상이한 실시양태에서, 삽입된 인트론의 부재 하에 서열 번호 100의 서열에 대한 GLA의 서열 동일성은 적어도 98% 또는 100%이다.
측면 1(c)의 상이한 실시양태에서, 신호 펩타이드는 서열 번호 41의 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100%의 서열 동일성을 갖거나; 서열 번호 57의 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100%의 서열 동일성을 갖거나; 서열 번호 58의 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100%의 서열 동일성을 갖거나; 서열 번호 59의 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100%의 서열 동일성을 갖거나; 서열 번호 60의 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100%의 서열 동일성을 갖거나; 서열 번호 61의 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100%의 서열 동일성을 갖거나; 서열 번호 62의 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100%의 서열 동일성을 갖거나; 또는 서열 번호 63의 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100%의 서열 동일성을 갖고; 각각 독립적으로 GLA와 관련하여 서열 번호 100의 서열과 적어도 95%, 적어도 98% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는다. 각각 독립적으로에 대한 언급은 서열 식별을 수반하는 제공된 신호 서열 각각이 서열 번호 100의 서열에 대해 제공된 임의의 서열 식별을 갖는 GLA와 조합될 수 있음을 나타낸다. 예를 들어, 서열 번호 41의 서열과 적어도 85%의 서열 동일성을 갖는 신호 펩타이드는 서열 번호 100의 서열과 적어도 95%, 적어도 98% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 GLA와 조합될 수 있고; 서열 번호 41의 서열과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 신호 펩타이드는 서열 번호 100의 서열과 적어도 95%, 적어도 98% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 GLA와 조합될 수 있고; 서열 번호 41의 서열과 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 신호 펩타이드는 서열 번호 100의 서열과 적어도 95%, 적어도 98% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 GLA와 조합될 수 있으며; 서열 번호 41의 서열의 신호 펩타이드는 서열 번호 100의 서열과 적어도 95%, 적어도 98% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 GLA와 조합될 수 있다.
측면 1(c)의 추가 실시양태에서, 신호 펩타이드를 포함하는 전구체 α-갈락토시다제 A는 서열 번호 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108 및 109로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 적어도 95%, 97%, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노 서열을 가지며, 신호 펩타이드를 포함하는 전구체 α-갈락토시다제 A는 서열 번호 109에 대해 적어도 95%, 97%, 99% 또는 100%의 아미노 서열을 갖는다.
측면 1(d)의 상이한 실시양태에서, GLA를 인코딩하는 핵산은 서열 번호 100의 서열과 1 내지 7개의 아미노산 치환이 다르며, 여기서 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7은 아미노산 치환은 각각 Gln57Lys, Gln111Glu, Lys213Glu, Lys237Gln, Phe248Thr, Gly334Glu, 및 Gly346Asn으로 이루어진 군으로부터 선택되고; GLA는 서열 번호 48의 아미노산 서열을 포함한다.
실시양태 1은 서열 번호 47 또는 서열 번호 47의 염기 1-1194과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%의 서열 동일성을 포함하는 핵산을 제공함으로써 측면 1(d) 및 측면 1(d)의 상이한 실시양태를 추가로 설명하거나, 또는 서열 번호 47의 서열 또는 서열 번호 47의 염기 1-1194에 의해 제공된다.
측면 또는 실시양태를 추가로 설명하는 것에 대한 언급은 추가 설명이 참조 측면 또는 실시양태에 제공된 각각의 설명에 적용됨을 제공한다. 예를 들어, 측면 1(d) 및 측면 1(d)의 상이한 실시양태를 추가로 설명하는 실시양태 1은 실시양태 1의 상이한 실시양태가 측면 1(d) 및 측면 1(d)의 상이한 실시양태에서 제공된 임의의 설명에 독립적으로 적용될 수 있음을 제공한다.
실시양태 2는 인트론의 부재 하에 제공되는 GLA가 측면 1(a) 및 측면 1(a)의 상이한 실시양태, 측면 1(b) 및 측면 1(b)의 상이한 실시양태, 측면 (1d) 및 측면 (1d)의 상이한 실시양태, 또는 실시양태 1 중 임의의 것에서 제공된 바와 같은 GLA 서열을 포함하는 것을 제공함으로써 측면 1(b)를 추가로 기술하며, 여기서 인트론은 GLA의 뉴클레오타이드 78과 79 사이에 위치하고, 뉴클레오타이드 위치는 서열 번호 14의 GLA의 코딩 서열에 대해 참조하여 주어진다.
실시양태 3은 제공된 인트론이 서열 번호 49, 50, 51, 또는 52의 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 것을 제공함으로써 측면 1(d) 및 측면 1(d)의 상이한 실시양태 및 실시양태 2를 추가로 기기술한다.
실시양태 4는 인트론을 포함하는 GLA가 서열 번호 43, 44, 45 또는 46의 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 것을 제공함으로써 측면 1(d)를 추가로 기술한다.
실시양태 5는 폴리뉴클레오타이드가 제2 핵산 서열을 추가로 포함하고, 여기서 제2 서열은 GLA 핵산 서열의 5' 말단에 위치하는 신호 펩타이드 서열을 인코딩함을 제공함으로써 측면 1(a) 및 측면 1(a)의 상이한 실시양태, 측면 1(b) 및 측면 1(b)의 상이한 실시양태, 측면 1(d) 및 측면 1(d)의 상이한 실시양태, 및 실시양태 1, 2, 3 및 4를 추가로 기술한다. 신호 펩타이드 서열은 이종, 내인성 또는 자연 신호 펩타이드 서열 또는 이의 유도체일 수 있다.
실시양태 6은 상이한 실시양태를 제공함으로써 실시양태 5를 추가로 기술하고, 펩타이드 신호는 서열 번호 41의 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100%의 서열 동일성을 갖거나; 서열 번호 57의 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100%의 서열 동일성을 갖거나; 서열 번호 58의 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100%의 서열 동일성을 갖거나; 서열 번호 59의 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100%의 서열 동일성을 갖거나; 서열 번호 60의 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100%의 서열 동일성을 갖거나; 서열 번호 61의 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100%의 서열 동일성을 갖거나; 서열 번호 62의 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100%의 서열 동일성을 갖거나; 서열 번호 63의 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는다.
실시양태 7은 측면 1(a) 및 측면 1(a)의 상이한 실시양태, 측면 1(b) 및 측면(1b)의 상이한 실시양태, 측면(1c) 및 측면 1(c)의 상이한 실시양태, 측면 1(d) 및 측면 1(d)의 상이한 실시양태 및 실시양태 1 내지 6 중 임의의 것에서 제공된 바와 같은 GLA 인코딩 서열을 추가로 기술하며, 여기서 GLA 인코딩 서열은 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개 미만의 CpG 디뉴클레오타이드를 포함한다.
측면 2는 측면 1(a) 및 측면 1(a)의 상이한 실시양태, 측면 1(b) 및 측면 1(b)의 상이한 실시양태, 측면 (1c) 및 측면 1(c)의 상이한 실시양태, 측면 1(d) 및 측면 1(d)의 상이한 실시양태, 및 실시양태 1 내지 7에 제공된 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 카세트에 관한 것으로; 여기서 폴리뉴클레오타이드는 발현 조절 요소에 작동가능하게 결합된다.
실시양태 8은 측면 2를 추가로 기술하고, 여기서 폴리펩타이드 설명은 측면 2에 제공된 바와 같고, 측면 2의 상이한 실시양태에서, 발현 조절 요소는 간-특이적 발현 조절 요소이고, 발현 조절 요소는 ApoE/hAAT 인핸서/프로모터 서열을 포함하거나, 또는 서열 번호 38의 서열 또는 서열 번호 38과 적어도 98%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
언급된 측면 또는 실시양태에서의 설명에 대한 언급은 언급된 측면(연관된 실시양태 포함) 및 언급된 실시양태(다른 설명된 실시양태 포함)의 통합을 위해 제공된다. 예를 들어, 측면 2에 제공된 폴리펩타이드 설명에 대한 언급은, 상이한 실시양태에서 측면 1(a) 및 측면 1(a)의 상이한 실시양태; 측면 1(b) 및 측면 1(b)의 상이한 실시양태, 측면 1(c) 및 측면 1(c)의 상이한 실시양태, 측면 1(d) 및 측면 1(d)의 상이한 실시양태, 및 실시양태 1 내지 7에 제공된 폴리뉴클레오타이드를 기술한다.
실시양태 9는 폴리뉴클레오타이드의 5'에 위치하는 발현 제어를 제공함으로써 실시양태 8의 발현 조절 요소를 추가로 기술한다.
실시양태 10은 측면 2, 실시양태 8 및 실시양태 9의 발현 카세트를 추가로 기술하고, 여기서 발현 카세트는 폴리뉴클레오타이드의 3'에 위치한 폴리-아데닐화 서열을 추가로 포함한다. 추가 실시양태에서, 폴리아데닐화 서열은 소 성장 호르몬(bGH) 폴리아데닐화 서열을 포함하고; 서열 번호 20과 적어도 95% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
실시양태 11은 실시양태 2 및 실시양태 9-10의 발현 카세트를 추가로 기술하며, 여기서 인트론은 발현 조절 요소의 3' 말단과 폴리뉴클레오타이드의 5' 말단 사이에 위치한다. 추가의 실시양태에서, 인트론은 서열 번호 39의 서열과 적어도 95% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
실시양태 12는 측면 2 및 실시양태 9-11의 발현 카세트를 추가로 기술하며, 여기서 발현 조절 요소 및/또는 폴리아데닐화 서열은 야생형 발현 조절 요소 또는 폴리아데닐화 서열과 비교하여 CpG-감소된다.
실시양태 13은 측면 1(1(a), 1(b), 1(c) 및 1(d) 및 관련 실시양태 포함) 및 실시양태 1 내지 8의 폴리펩타이드, 및 측면 2 및 실시양태 9 내지 12의 발현 벡터를 추가로 기술하며, 여기서 폴리펩타이드 또는 발현 카세트는 이의 5' 말단 측면에 있는 AAV 역 반복부(ITR) 및/또는 이의 3' 말단 측면에 있는 AAV ITR을 추가로 포함한다. 바람직하게는, 3' 및 5' 말단은 ITR 측면에 있다.
측면 3은 실시양태 13의 폴리뉴클레오타이드 또는 발현 카세트를 포함하는 AAV 플라스미드 게놈에 관한 것이며 복제 기점이 존재한다. 추가 실시양태에서, 선택가능한 마커가 존재한다.
측면 4는 캡시드 및 실시양태 13에 제공된 폴리뉴클레오타이드 또는 발현 카세트를 포함하는 아데노 관련 바이러스(AAV) 벡터에 관한 것이다. AAV 캡시드에 대한 언급은 변형 및 변이 AAV 캡시드와 함께 자연 발생 AAV 캡시드를 포함한다. AAV 캡시드는 폴리뉴클레오타이드 또는 발현 카세트, 바람직하게는 발현 카세트의 세포내 전달을 촉진한다.
실시양태 14는 측면 4의 AAV 벡터, 및 실시양태 13의 폴리펩타이드 및 발현 카세트를 추가로 기재하고, 여기서 ITR은 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, Rh10, Rh74, 또는 AAV3B 혈청형, 또는 이들의 조합 중 어느 하나 이상의 ITR을 포함한다.
실시양태 15는 측면 4, 실시양태 13 및 실시양태 14를 추가로 설명하고, 여기서 상이한 실시양태에서: 5' 말단에서 5' ITR에 인접하는 것은 5' 클로닝 잔기이고/이거나 3' 말단에서 3' ITR에 인접하는 것은 3' 클로닝 잔기이다.
실시양태 16은 측면 4 및 실시양태 13-15를 추가로 기술하며, 여기서 5' 및/또는 3' ITR은 감소된 CpG를 갖도록 변형된다.
실시양태 17은 측면 4 및 실시양태 13-16의 AAV 벡터를 추가로 기술하고, 여기서 발현 카세트는 서열 번호 21-34, 53-56 및 91-99 중 어느 하나의 서열과 적어도 95%, 적어도 98% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
실시양태 18은 측면 4 및 실시양태 13-17의 AAV 벡터를 추가로 기술하고, 여기서 발현 카세트는 서열 번호 91-95 중 어느 하나의 서열과 적어도 95%, 적어도 98% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
실시양태 19는 측면 4 및 실시양태 13 내지 18의 캡시드를 추가로 기술하고, 여기서 캡시드는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, Rh10, Rh74(서열 번호 35), AAV3B, LK03(서열 번호 42) 또는 AAV-2i8에 의해 제공된 VP1, VP2 및/또는 VP3과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 VP1, VP2 및/또는 VP3 단백질을 포함하거나; 서열 번호 110 또는 42의 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 VP1을 포함하거나; 서열 번호 110 또는 42의 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 VP1 및/또는 서열 번호 36의 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 VP2를 포함하고/거나; 서열 번호 37의 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 VP3을 포함한다.
측면 5는 측면 4 및 실시양태 13-19에 제공된 AAV 벡터 및 생물학적으로 적합한 담체 또는 부형제를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.
실시양태 20은 제5 측면의 약학 조성물을 추가로 기술하며, 여기서, AAV 벡터는 인간 대상체에서 GLA 활성을 증가시키고, 바람직하게는 글로보트리오실스핑고신을 감소시키기에 효과적인 양으로 제공된다.
실시양태 21은 추가로 빈 AAV 캡시드를 포함하는 조성물인 측면 5의 약학 조성물을 기술한다. 빈 AAV 캡시드에 대한 언급은 투여 중인 AAV 벡터에 사용된 것과 동일하지만 캡시드에 AAV 벡터가 없는 캡시드를 나타낸다. 추가 실시양태에서 빈 AAV 캡시드 대 AAV 벡터의 비는 약 100:1 내지 1:100; 약 100:1 내지 약 50:1; 약 50:1 내지 약 25:1; 약 25:1 내지 약 10:1; 약 10:1 내지 약 1:1; 약 1:1 내지 약 1:10; 약 1:10 내지 약 1:25; 약 1:25 내지 약 1:50; 또는 약 1:50 내지 약 1:100이다.
실시양태 22는 추가로, 계면활성제를 추가로 포함하는 실시양태 5 및 실시양태 20 및 21의 약학 조성물을 기술한다.
측면 6은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리펩타이드에 관한 것이다:
(a) α-갈락토시다제 A의 아미노 말단에 결합된 신호 펩타이드를 포함하는 전구체 α-갈락토시다제 A를 인코딩하는 핵산 서열 - 여기서 신호 펩타이드는 서열 번호 41, 서열 번호 57, 서열 번호 58, 서열 번호 59, 서열 번호 60, 서열 번호 61, 서열 번호 62, 및 서열 번호 63의 서열과 적어도 80%의 서열 동일성을 갖고; 상기 GLA는 서열 번호 100의 서열과 적어도 95%의 서열 동일성을 가짐 -; 및
(b) 서열 번호 100의 서열과 1 내지 7개의 아미노산이 상이한 아미노산 서열을 갖는 α-갈락토시다제 A(GLA) - 여기서 상기 1 내지 7개의 아미노산 중 적어도 하나는 Gln57Lys, Gln111Glu, Lys213Glu, Lys237Gln, Phe248Thr, Gly334Glu, 및 Gly346Asn으로 이루어진 군으로부터 선택됨 -.
측면 6(a)의 상이한 실시양태에서, 신호 펩타이드는 서열 번호 41의 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100%의 서열 동일성을 갖거나; 서열 번호 57의 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100%의 서열 동일성을 갖거나; 서열 번호 58의 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100%의 서열 동일성을 갖거나; 서열 번호 60의 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100%의 서열 동일성을 갖거나; 서열 번호 61의 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100%의 서열 동일성을 갖거나; 서열 번호 62의 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100%의 서열 동일성을 갖거나; 서열 번호 63의 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100%의 서열 동일성을 갖고; 각각 독립적으로 GLA와 관련하여 서열 번호 100의 서열과 적어도 95%, 적어도 98% 또는 100%의 서열 동일성을 가진다.
측면 6(b)의 다른 실시양태에서, GLA는 서열 번호 100과 1 내지 7개의 아미노산 치환이 상이한 아미노산 서열을 가지며, 여기서 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7개의 아미노산 치환은 Gln57Lys, Gln111Glu, Lys213Glu, Lys237Gln, Phe248Thr, Gly334Glu, 및 Gly346Asn으로 이루어진 군으로부터 각각 독립적으로 선택되고; GLA는 서열 번호 48의 아미노산 서열을 포함한다.
측면 7은 대상체에게 치료 유효량의 폴리뉴클레오타이드, 발현 카세트, AAV 벡터, 약학 조성물, 또는 폴리펩타이드 또는 추가 측면 및 실시양태의 제2 세트에서 상술된 임의의 측면 및 실시양태를 투여하는 것을 포함하는, GLA를 필요로 하는 대상체를 치료하는 방법에 관한 것이다. 바람직하게는 대상체는 인간이다.
실시양태 23은 대상체가 파브리병을 앓고 있는 측면 7을 추가로 기술하고; 상기 방법은 GLA의 필요성 또는 파브리병의 하나 이상의 증상을 저하, 감소 또는 억제하거나; 상기 방법은 GLA 필요성 또는 파브리병의 하나 이상의 증상의 진행 또는 악화를 예방하거나 감소시키거나; 상기 방법은 GLA 필요성 또는 파브리병의 하나 이상의 증상을 안정화하거나; 상기 방법은 GLA 필요성 또는 파브리병의 하나 이상의 증상을 개선한다.
실시양태 24는 측면 7 및 실시예 23을 추가로 기술하며, 여기서 AAV 벡터는 대상체 체중의 킬로그램당 약 약 1x108 내지 약 1x1014 벡터 게놈(vg/kg)의 범위로 대상체에 투여된다.
측면 8은 (i) 측면 7, 실시양태 22 및 실시양태 23에 기재된 방법; 또는 (ii) 약제의 제조에 사용하기 위한, 폴리뉴클레오타이드, 발현 카세트, AAV 벡터, 약학 조성물, 또는 폴리펩타이드 또는 추가 측면 및 실시양태의 제2 세트에서 상술된 임의의 측면 및 실시양태에 관한 것이다.
본원에 개시된 모든 특징은 임의의 조합으로 결합될 수 있다. 본원에 개시된 각 특징은 동일하거나 동등하거나 유사한 목적을 제공하는 대안적 특징으로 대체될 수 있다. 따라서, 달리 명시적으로 언급되지 않는 한, 개시된 특징(예를 들어, GLA를 인코딩하는 변형된 핵산, GLA를 인코딩하는 변형된 핵산을 포함하는 발현 카세트, GLA를 인코딩하는 변형된 핵산을 포함하는 rAAV 입자, 및 GLA를 인코딩하는 변형된 핵산을 포함하는 비-바이러스 벡터)은 일종의 동등하거나 유사한 특징들의 일례이다.
본 발명의 다수의 실시양태가 설명되었다. 그럼에도 불구하고, 당업자는 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않고 본 발명을 다양한 용도 및 조건에 적용시키기 위해 본 발명을 다양하게 변경 및 수정할 수 있다. 따라서, 하기 실시예는 설명하기 위한 것이며 어떤 식으로든 청구된 본 발명의 범위를 제한하고자 하지 않는다.
실시예
실시예 1 - GLA 발현 카세트 개요
GLA 발현 카세트를 도 1 및 표 2에 나타낸 바와 같이 설계하였다. 표 2는 전구체 α-갈락토시다제 A(신호 펩타이드 + GLA 모이어티) 및 발현 카세트에 대한 서열을 참조한다. 표 2에 제공된 모든 서열은 5' 및 3' 플랭킹 AAV 역 말단 반복부(ITR), 간 특이적 ApoE/hAAT 인핸서/프로모터 서열, 인간 헤모글로빈 서브유닛 베타(HBB2) 인트론, 신호 펩타이드, 인간 GLA 코딩 서열 및 소 성장 호르몬(bGH) 폴리아데닐화(폴리 A) 서열을 포함한다.
GLA 발현 카세트 구성 요소
발현 카세트
신호 펩타이드
GLA 인코딩 모이어티
명명 서열 번호 명명 서열 번호 명명 서열 번호
pAAV_ApoE_hAAT_HBB2m1_
sp7.GLA_BGH228		 21 sp7 1 GLA 14
pAAV_ApoE_hAAT_HBB2m1_spAHSG.GLA_BGH228 22 spAHSG 6 GLA 14
pAAV_ApoE_hAAT_HBB2m1_spCD300.GLA_BGH228 23 spCD300 7 GLA 14
pAAV_ApoE_hAAT_HBB2m1_spGLA.GLA_BGH228 24 spGLA 8 GLA 14
pAAV_ApoE_hAAT_HBB2m1_spLAMP1.GLA_BGH228 25 spLAMP1 9 GLA 14
pAAV_ApoE_hAAT_HBB2m1_spNotch2.GLA_BGH228 26 spNotch2 10 GLA 14
pAAV_ApoE_hAAT_HBB2m1_spORM1.GLA_BGH228 27 spORM1 11 GLA 14
pAAV_ApoE_hAAT_HBB2m1_spTF.GLA_BGH228 29 spTF 13 GLA 14
pAAV_ApoE_hAAT_HBB2m1_sp7.GLAco4_BGH228 91 sp7 2 GLAco4 15
pAAV_ApoE_hAAT_HBB2m1_sp7.GLAcoBC0_BGH228 92 sp7 3 GLAcoBC0 16
pAAV_ApoE_hAAT_HBB2m1_sp7.GLAcoH0_BGH228 93 sp7 4 GLAcoH0 17
pAAV_ApoE_hAAT_HBB2m1_sp7.GLAcoH6_BGH228 94 sp7 5 GLAcoH6 18
pAAV_ApoE_hAAT_HBB2m1_
sp7.GLAv45_BGH228		 95 sp7 2 GLAv45 19
pAAV_ApoE_HAT_sp7_GLA_WT_intronIgHA 96 sp7 2 GLA_WT_intronIgHA 45
pAAV_ApoE_HAT_sp7_GLA_WT_intronIgHμ 97 sp7 2 GLA_WT_intronIgHμ 46
pAAV_ApoE_HAT_sp7_GLA_WT_intronRBP4 98 sp7 2 GLA_WT_intronRBP4 44
pAAV_ApoE_HAT_sp7_GLA_WT_intronVTN1 99 sp7 2 GLA_WT_intronVTN1 43
pSPKL0031 (GLA 7 mut) 28 sp7 2 GLA 7 mut 47
발현 카세트는 그 내용 전체가 본원에 원용되는 국제 특허 출원 공보 WO 2016/210170에 기술된 AAV 캡시드, 예를 들어 AAV-4-1 캡시드 변이체 또는 그 내용 전체가 본원에 원용되는 US9169299에 기술된 LK03 캡시드 변이체에 캡시드화됨으로써 AAV 바이러스 입자에 팩키징된다. 바이러스 입자는 일반적으로 당업계에 잘 알려진 삼중 형질감염 프로토콜을 사용하여 생산된다.
실시예 2 - 신호 펩타이드의 평가
자연 GLA 신호 펩타이드 대신에 상이한 신호 펩타이드를 갖는 GLA 발현 카세트의 효능을 평가하기 위해, 서열 번호 21(sp7.GLA), 서열 번호 23(spCD300.GLA), 서열 번호 24(spGLA.GLA), 서열 번호 26(spNotch2.GLA), 서열 번호 27(spORM1.GLA), 및 서열 번호 29(spTF.GLA)의 서열을 갖는 발현 벡터를 서열 번호 110, 36 및 37 캡시드를 포함하는 AAV 벡터에 팩키징하였다. 그룹당 5-6 마리의 수컷 또는 암컷 C57Bl/6 마우스에 각각 1.25x1010 vg/마우스 또는 5x1010 vg/마우스의 rAAV를 꼬리 정맥을 통해 정맥 주사했다. 마우스 혈청에서 순환하는 GLA 효소 활성 수준을 시험관 내 효소 활성 분석을 사용하여 측정하였다. 형광 4-메틸움벨리페릴(4-MU)의 연속 희석액으로부터 표준 곡선을 생성하였다. GLA 효소 활성은 혈청과 합성 효소 기질인 4-메틸움벨리페릴 β-D-갈락토피라노사이드(4-MU-Gal)의 공동 배양 시간당 방출된 형광 4-MU의 농도로 정의되며, 단위는 nmol x mL-1 x 시간-1이다. GLA 효소 활성의 모든 측정을 위해 GLA 및 4-MU-Gal을 포함하는 개별 조직 샘플의 인큐베이션을 이중으로 수행하였다. 도 2A에 도시된 바와 같이, 키모트립신 B2 유래 신호 펩타이드 sp7을 포함하는 발현 카세트는 야생형 GLA 신호 펩타이드를 포함하는 발현 카세트에 비해 더 높은 수준의 혈청 GLA 활성을 산출하였다.
혈청 내 마우스 GLA의 내인성 수준에 대한 GLA 카세트의 인간 GLA 단백질 발현 수준을 평가하기 위해, 서열 번호 21(sp7.GLA)의 서열 및 서열 번호 24(spGLA.GLA)의 서열을 갖는 발현 벡터를 서열 번호 110, 36 및 37 캡시드를 포함하는 AAV 벡터에 각각 팩키징하였다. 그룹당 5 마리의 암컷 C57Bl/6 마우스에 5x1010 vg/마우스의 rAAV를 꼬리 정맥을 통해 정맥 주사하였다. 혈청 GLA 단백질을 모세관 전기영동을 사용하여 측정하였다. 형질도입 6주 후 수집된 마우스 혈청에서 순환하는 GLA의 수준을 재조합 인간 GLA(ProteinSimple WesTM, Bio-Techne)의 표준 곡선에 대해 정량화하고 μg/mL 단위로 플롯팅하였다(도 2B). 비처리 대조군 C57Bl/6 마우스에서도 GLA 단백질 수준을 측정하였다. 막대 높이는 그룹당 5 마리 마우스의 평균 혈청 GLA 활성을 나타낸다; 오차 막대는 평균에서 1 표준 편차를 나타낸다; 표준 곡선의 정량 한계는 수평선으로 표시된다(정량 하한, 도면에서 "LOD"로 표시됨). GLA 단백질의 수준은 비처리 마우스보다 rAAV(AAV-sp7.GLA 또는 AAV-spGLA.GLA)로 처리된 마우스에서 상당히 더 높았다(t-검정, ***p<0.001). 자연 신호 펩타이드(GLA)와 함께 GLA를 발현하는 rAAV 벡터 및 키모트립시노겐 B2 신호 펩타이드(SP7)와 함께 GLA를 발현하는 rAAV 벡터 둘 모두 C57Bl/6 마우스에서 마우스 GLA의 기준선 내인성 수준 이상으로 혈청 GLA 발현을 유도하였다(도 2B).
실시예 3 - 파브리 마우스 모델에서 GLA 카세트의 평가
수컷 GLA-/눌 녹아웃 마우스 모델을 사용하여 본원에 기재된 발현 카세트의 효능을 평가하였다. 이 마우스 모델은 C57Bl/6 백그라운드가 아닌 혼합 B6;129 백그라운드를 가진다.
10 마리의 C57Bl/6, 11 마리의 B6;129-GLA+/눌 및 11 마리의 B6;129-GLA-/눌 수컷 마우스에 서열 번호 21의 서열을 갖는 발현 카세트(sp7.GLA)(본원에서 AAV-sp7-GLA로 지칭됨)를 포함하는 rAAV(서열 번호 110, 36 및 37 캡시드)를 5x1010 vg/마우스로 꼬리 정맥을 통해 정맥 주사하였다. rAAV를 투여하고 3주, 4주 및 6주 후에 수집된 마우스 혈청에서 GLA의 활성을 혈청과 합성 기질 4-MU-Gal의 공동 인큐베이션 시간당 방출된 형광 4-MU의 농도로 정의하였고, 단위는 nmol x mL-1 x hr-1였으며, 도 3에 플롯팅하였다. 막대 높이는 그룹당 10 내지 11 마리의 마우스 평균을 나타낸다; 오차 막대는 평균에서 1 표준 편차를 나타낸다; 표준 곡선 4 파라미터 피팅 정량 한계는 수평선으로 표시된다(정량의 하한, 도면에서 "LOD"로 표시됨). AAV-sp7-GLA rAAV는 B6;129 마우스에 비해 C57Bl/6 마우스에서 더 큰 효능을 나타냈다. 형질도입 후 혈청 GLA 활성은 B6;129-GLA+/눌 및 B6;129-/눌 마우스 모두에서 낮았으며, 따라서 낮은 효능은 GLA 유전자형 또는 Fabry 표현형의 특이적 결과가 아니다. 따라서, 파브리 모델 마우스(B6;129 GLA 눌 계통)에서 1000 nmol/mL-hr를 초과하는 혈청 GLA 활성을 달성하기 위해, 용량 증량 연구를 수행하여 5x109에서 최대 5x1011 vg/마우스의 AAV 용량 범위에서 GLA 발현을 조사하였다.
실시예 4 - 용량 범위 연구
B6;129 GLA-/눌 수컷 마우스(그룹당 n=5)에 AAV-sp7-GLA를 5x109 vg/마우스, 8.9x109 vg/마우스, 1.6x1010 vg/마우스, 2.8x1010 vg/마우스, 5x1010 vg/마우스, 1.58x1011 vg/마우스, 또는 5x1011 vg/마우스로 꼬리 정맥을 통해 정맥 주사하였다. 연구 1과 연구 2의 두 개별 연구에서 용량 증량을 수행하였다. 형질도입 4주 후 수집된 마우스 혈청에서 GLA의 활성을 혈청과 합성 기질 4-MU의 공동 인큐베이션 시간당 방출된 형광 4-MU의 농도로 측정하였으며, 그 단위는 nmol x mL-1 x hr-1이고, 도 4A 및 도 4B에 플롯팅되었다. 막대 높이는 그룹당 5 마리 마우스의 평균 혈청 GLA 활성을 나타낸다; 오차 막대는 평균에서 1 표준 편차를 나타낸다. 4주차에 5 마리의 형질도입되지 않은 대조군 GLA-/눌 마우스에서 분석에 의해 검출된 백그라운드 혈청 GLA 활성의 최대 수준을 도 4A에 수평선으로 나타내었다. 제시된 바와 같이, GLA 발현은 투여된 AAV의 양에 대해 선형 용량-반응을 나타냈다(도 4B).
실시예 5 - GLA의 신장 흡수
특히 신장에서 GLA의 조직 흡수는 파브리 치료제의 임상 효능에 필수적인 것으로 생각된다. 5 마리의 B6;129 GLA-/눌 수컷 마우스 그룹에 AAV-sp7-GLA를 5x109 vg/마우스, 8.9x109 vg/마우스, 1.6x1010 vg/마우스, 2.8x1010 vg/마우스, 또는 5x1010 vg/마우스로 꼬리 정맥을 통해 정맥 주사하였다. 형질도입 12주 후에 간 및 신장을 수집하고, 조직 용해물 중의 GLA 활성을 조직 용해물 및 합성 기질 4-MU-Gal의 공동 인큐베이션 시간당 방출된 형광 4-MU의 농도로서 측정하였으며, 그 단위는 nmol x mg 총 용해물 단백질-1 x hr-1이고, 도 5A(간) 및 5B(신장)에 플롯팅되었다. 간 및 신장 조직 용해물에서의 GLA 활성을 또한 5 마리의 비처리 B6;129 GLA-/눌 수컷 대조군 마우스와 4 마리의 비처리 연령 일치 B6;129 GLA+/눌(WT) 수컷 마우스에서도 평가하였다. 막대 높이는 평균 조직 GLA 활성을 나타낸다; 오차 막대는 평균에서 1 표준 편차를 나타낸다; 수평선은 각 조직 용해물의 단백질 농도로 정규화된 표준 곡선의 정량적 한계를 나타낸다. 도시된 바와 같이, AAV의 용량 증가는 녹아웃 수컷 마우스의 간 및 신장에서 관찰되는 GLA 활성의 증가로 이어졌다. 또한, 마우스당 2.8x1010 vg 이상의 용량에서 GLA 녹아웃 동물의 간 및 신장에서의 GLA 활성은 정상 동물에서 관찰되는 수준으로 회복되었다.
특히, 간 특이적 전이유전자 프로모터를 포함하는 AAV-sp7-GLA 벡터의 5x1010 vg/마우스 용량이 파브리 마우스의 신장에서 야생형 마우스(B6;129 GLA+/눌, WT)와 관련된 GLA 효소 활성 수준에 근접한 GLA 활성을 달성하였다.
실시예 6 - GLA 코딩 서열의 평가
서열 번호 21(sp7.GLA)의 서열을 갖는 발현 카세트의 GLA 부분에서 CpG 모티프를 고갈시키고 최대 발현을 지원하도록 코돈-최적화하였다. 코돈 최적화된 GLA 변이체 카세트(서열 번호 91(GLAco4), 서열 번호 92(GLAcoBC0), 서열 번호 93(GLAcoH0), 서열 번호 94(GLAcoH6), 및 서열 번호 95(GLAv45))를 AAV 캡시드에 캡슐화하고 그룹당 5 마리의 수컷 C57Bl/6 마우스에 5.0x1010 vg/마우스의 용량으로 형질도입하였다. 4주차에 혈청 GLA 활성을 상대 전이유전자 활성에 대한 프록시로 측정하고 도 6에 플롯팅하였다. 막대 높이는 평균 조직 GLA 활성을 나타낸다; 오차 막대는 평균에서 1 표준 편차를 나타낸다. 도시된 바와 같이, CpG-무함유 또는 CpG-감소된 코돈-최적화된 변이체는 서열 번호 21의 서열을 갖는 카세트의 것과 유사한 혈청 GLA 활성을 입증하였다.
실시예 7 - GLA 발현 카세트의 추가 최적화
서열 번호 21(sp7.GLA)의 서열에 제공된 발현 카세트의 GLA 부분에 추가적인 변형을 하였다. 구조적으로 유도된 돌연변이유발(서열 번호 47(SPKL0031))을 사용하여 7개의 아미노산 치환(Q57K; Q111E; K213E; K237Q; F248T; G334E; G346N)을 포함하는 GLA 변이체("GLA 7 mut")를 생성하였다. 추가적으로, GLA 코딩 서열 서열 번호 14의 뉴클레오타이드 78/79 사이의 sp7-GLA 코딩 서열에 이종 인트론을 도입하여 서열 번호 96(IgHA, 서열 번호 97(IgHμ), 서열 번호 98(RBP4), 및 서열 번호 99(VTN1))를 제공하였다. 발현 카세트 서열 번호 95(도 7에서 sp7-GLA-var45로 언급됨)도 포함되었다. 모든 카세트 서열을 AAV 캡시드에 캡시드화하고 2x109 vg/마우스의 AAV-CAG-Gaussia와 공동 투여되는 2x1010 vg/마우스의 용량으로 그룹당 5 마리의 수컷 C57Bl/6 마우스에 형질도입하였다(변환 효율을 정규화하기 위해 AAV 캡슐화된 발현 카세트는 CAG 프로모터의 제어 하에 가우시아 루시퍼라제를 가짐). 6주차에 혈청 GLA 활성을 상대적 전이유전자 활성에 대한 프록시로 측정하고 도 7에 플롯팅하였다. 막대 높이는 평균 조직 GLA 활성을 나타낸다; 오차 막대는 평균에서 1 표준 편차를 나타낸다. IgHμ 및 RBP4 인트론의 삽입을 제외한 모든 변형은 마우스 혈청에서 통계적으로 유의한 GLA 활성 증가를 가져왔다.
실시예 8 - 파브리병 모델 마우스에서 코돈 최적화된 AAV-sp7-GLA로의 용량 증량 연구
GLA 녹아웃 마우스(5 마리의 수컷 B6;GLA-/- 그룹)에 세가지 용량(4.4E11, 1.4E12 및 4.4E12 vg/kg)의 AAV 캡시드화된 sp7-GLA-co4(AAV-sp7-GLA-co4)를 꼬리 정맥을 통해 정맥내 주사하였다. 혈청을 매주 수집하였다; lyso-GL3의 수준을 질량 분석법으로 분석하고 GLA 활성 수준을 시험관 내 4-MU-Gal 분석을 사용하여 측정하였다. 도 8A에 나타낸 바와 같이, 연구 28일 동안 파브리병의 바이오마커(lyso-GL3) 수준에서 용량 의존적 반응이 관찰되었다. 또한, 혈청 알파-Gal A 활성과 lyso-GL3 수준 사이에 선형 관계가 관찰되었다(도 8B). Lyso-GL3의 용량 의존적 감소가 혈청(도 9A) 및 임상적으로 관련된 신장(도 9B) 및 심장(도 9C) 조직에서 관찰되었다.
실시예 9 - AAV-sp7-GLA-co4의 비인간 영장류(NHP) 연구
4 마리의 수컷 및 4 마리의 암컷 사이노몰구스 마카크에게 1e13 vg/kg으로 AAV-sp7-GLA-co4를 투여하였다. 대조 원숭이에는 비히클을 투여하였다. 혈청을 28일 동안 매주 수집하고, 4-MU-Gal 분석에 의해 GLA 활성 수준에 대해 평가하고(도 10A), 인간 알파-Gal A에 특이적인 ELISA를 사용하여 측정된 GLA 항원 수준에 대해 평가하였다(도 10B). 관찰된 바와 같이, AAV-sp7-GLA-CO4를 투여받은 원숭이의 순환 GLA 항원 및 활성 수준은 유의적으로 대조 수준 이상이었다.
실시예 10 - AAV-sp7-GLA-co4의 용량 증량 NHP 연구
사이노몰구스 마카크에서 60일 GLP 순응 용량을 찾기 위한 연구를 수행하였다. 상기 연구 기간은 피크 발현을 결정하고 잠재적인 안전성 신호를 검출하기에 충분한 창을 제공하기 위한 것이다. AAV-sp7-GLA-co4를 그룹의 NHP에 단일 정맥내(IV) 주입을 통해 아래 표 3에 표시된 용량으로 투여하였다.
그룹 용량
(vg/kg) 		마리수
(수컷 / 암컷)
1 Vehicle 4 / 4
2 2x10 12 4 / 4
3 6x10 12 4 / 4
4 2x10 13 4 / 4
투여 후 60일에 걸쳐 간격을 두고 혈청 샘플을 채취하고 α-GalA 항원, α-GalA 활성 및 항-α-GalA IgG의 수준을 측정하였다. 표준 임상 병리학 및 해부학적 병리학 패널 분석을 수행하였다. 생체분포 및 생식선 전달을 평가하였다.
실시예 11 - 최소 유효 용량 연구
파브리 바이오마커 GL-3 및 lyso-GL-3을 현저하게 감소시키기 위한 최소 유효 용량을 확인하기 위해 마우스에서 용량 범위 연구를 수행하였다. GLA 녹아웃 마우스(B6;129-GLA -/-; GLAko 또는 GLA KO라고도 함)(그룹당 n=20)에 AAV-sp7-GLA(서열 번호 21)를 2E11 vg/kg 내지 2E12 vg/kg 범위의 3가지 용량으로 정맥내(IV) 주사하였다. AAV 주사 후 6주 및 9주 및 12주에 매주 10 마리의 마우스로부터 혈청을 채취하였다. 각 그룹에서 5 마리의 마우스를 1, 3, 6 및 10개월의 정해진 시간에 무작위로 선택하고 GLA 항원, GLA 활성, Fabry 바이오마커 GL-3 및 lyso-GL3에 대해 분석하였다. GLA 활성 수준을 시험관 내 (4-MU-GAL) 분석을 사용하여 측정하였다(데이터는 표시되지 않음). GLA 항원의 수준을 알파-Gal A에 특이적인 ELISA를 사용하여 측정하였다.
GLA 활성과 GLA 항원 발현 수준 사이에 선형 관계로 순환 혈청 GLA에서 용량 의존적 증가가 관찰되었다(도 11). 순환 혈청 GLA2는 2주차에 ~70 ng/ml에서 2E11 vg/kg, ~190 ng/ml에서 4E11 vg/kg 및 ~4 μg/ml에서 2E12 vg/kg으로 안정화되었다(도 11).
파브리 바이오마커 GL-3 및 lyso-GL-3의 수준을 LC/MS로 심장 및 신장에서 측정하고 이원 ANOVA를 사용하여 다중 비교로 분석하였다. 1개월 시점과 3개월 시점 모두에서 모든 용량 수준에서 AAV-sp7-GLA를 투여받은 GLAko 마우스의 심장 및 신장에서 GL3 및 lyso-GL-3 수준은 비히클만을 받은 GLAko 마우스에서의 GL-3 및 lyso-GL-3 수준(도 12A-12D)에 비해 유의하게 감소하였다(p<0.05).
본 발명은 일반적으로 본원에서 본 발명의 수많은 실시양태를 기술하기 위해 긍정적인 언어를 사용하여 개시되었다. 본 발명은 또한 물질 또는 재료, 방법 단계 및 조건, 프로토콜 또는 절차와 같은 특정 대상이 전부 또는 부분적으로 제외된 실시양태를 구체적으로 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 특정 실시양태에서는 재료 및/또는 방법 단계가 제외된다. 따라서, 본 발명이 일반적으로 본 발명이 포함하지 않는 것에 대해 본원에서 표현되지 않더라도, 그래도 본원에서 명시적으로 제외되지 않는 측면이 본원에서 개시된다.
SEQUENCE LISTING <110> Spark Therapeutics <120> Compositions and Methods for Treating Fabry Disease <130> 065830.11034/4WO <150> US 63/137,235 <151> 2021-01-12 <150> US 63/264,356 <151> 2021-11-19 <160> 110 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sp7 signal peptide variant <400> 1 atggccttcc tgtggctgct gtcctgctgg gcactgctgg gcaccacatt tggc 54 <210> 2 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sp7 signal peptide variant <400> 2 atggcctttc tgtggctgct gtcctgctgg gccctgctgg ggaccacctt tggc 54 <210> 3 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sp7 signal peptide variant <400> 3 atggccttcc tgtggctgct gagctgctgg gccctgctgg ggaccacctt tggg 54 <210> 4 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sp7 signal peptide variant <400> 4 atggccttcc tgtggctcct gagctgctgg gccctcctgg ggaccacctt tggg 54 <210> 5 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sp7 signal peptide variant <400> 5 atggccttcc 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Asp Gly Cys Tyr Cys Asp Ser 165 170 175 Leu Glu Asn Leu Ala Asp Gly Tyr Lys His Met Ser Leu Ala Leu Asn 180 185 190 Arg Thr Gly Arg Ser Ile Val Tyr Ser Cys Glu Trp Pro Leu Tyr Met 195 200 205 Trp Pro Phe Gln Lys Pro Asn Tyr Thr Glu Ile Arg Gln Tyr Cys Asn 210 215 220 His Trp Arg Asn Phe Ala Asp Ile Asp Asp Ser Trp Lys Ser Ile Lys 225 230 235 240 Ser Ile Leu Asp Trp Thr Ser Phe Asn Gln Glu Arg Ile Val Asp Val 245 250 255 Ala Gly Pro Gly Gly Trp Asn Asp Pro Asp Met Leu Val Ile Gly Asn 260 265 270 Phe Gly Leu Ser Trp Asn Gln Gln Val Thr Gln Met Ala Leu Trp Ala 275 280 285 Ile Met Ala Ala Pro Leu Phe Met Ser Asn Asp Leu Arg His Ile Ser 290 295 300 Pro Gln Ala Lys Ala Leu Leu Gln Asp Lys Asp Val Ile Ala Ile Asn 305 310 315 320 Gln Asp Pro Leu Gly Lys Gln Gly Tyr Gln Leu Arg Gln Gly Asp Asn 325 330 335 Phe Glu Val Trp Glu Arg Pro Leu Ser Gly Leu Ala Trp Ala Val Ala 340 345 350 Met Ile Asn Arg Gln Glu Ile Gly Gly Pro Arg Ser Tyr Thr Ile Ala 355 360 365 Val Ala Ser Leu Gly Lys Gly Val Ala Cys 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atttgatggt 420 tgttactgtg acagtttgga aaatttggca gatggttata agcacatgtc cttggccctg 480 aataggactg gcagaagcat tgtgtactcc tgtgagtggc ctctttatat gtggcccttt 540 caaaagccca attatacaga aatccgacag tactgcaatc actggcgaaa ttttgctgac 600 attgatgatt cctggaaaag tataaagagt atcttggact ggacatcttt taaccaggag 660 agaattgttg atgttgctgg accagggggt tggaatgacc cagatatgtt agtgattggc 720 aactttggcc tcagctggaa tcagcaagta actcagatgg ccctctgggc tatcatggct 780 gctcctttat tcatgtctaa tgacctccga cacatcagcc ctcaagccaa agctctcctt 840 caggataagg acgtaattgc catcaatcag gaccccttgg gcaagcaagg gtaccagctt 900 agacagggag acaactttga agtgtgggaa cgacctctct caggcttagc ctgggctgta 960 gctatgataa accggcagga gattggtgga cctcgctctt ataccatcgc agttgcttcc 1020 ctgggtaaag gagtggcctg taatcctgcc tgcttcatca cacagctcct ccctgtgaaa 1080 aggaagctag ggttctatga atggacttca aggttaagaa gtcacataaa tcccacaggc 1140 actgttttgc ttcagctaga aaatacaatg cagatgtcat taaaagactt actttaa 1197 <210> 15 <211> 1200 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 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tgacctgagg cacatcagcc cccaggccaa ggccctgctg 840 caggataagg atgtgattgc catcaatcag gaccccctgg ggaagcaggg ctaccagctg 900 aggcaggggg acaactttga ggtgtgggag agacctctgt ctgggctggc ctgggctgtg 960 gccatgatca acaggcagga gattgggggc cccaggagct ataccattgc tgtggcctct 1020 ctggggaagg gggtggcctg caaccctgcc tgcttcatca cccagctgct gcctgtgaag 1080 aggaagctgg gcttctatga gtggaccagc aggctgagga gccacattaa tcccactggc 1140 actgtgctgc tgcagctgga gaacaccatg cagatgtctc tgaaggatct gctgtgataa 1200 <210> 16 <211> 1197 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Partial GLA cDNA, GLA coding sequence, GLAcoBC0 variant <400> 16 ctggacaatg gcctggccag aacccccacc atgggctggc tgcactggga gaggttcatg 60 tgcaaccttg actgccagga ggagcctgac agctgcatct ctgagaagct gttcatggag 120 atggctgagc tcatggtgtc agaggggtgg aaggatgcag gctatgagta cctgtgcata 180 gatgactgct ggatggctcc ccagagggac tcagagggca ggctgcaggc tgaccctcag 240 aggttccccc atggcatcag gcagctggcc aactatgtgc acagcaaggg cctcaagctg 300 ggaatctatg ctgatgtggg caacaaaaca tgtgcaggct 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tcagctggaa ccagcaggtg actcagatgg ccctgtgggc catcatggct 780 gcccccctgt tcatgtctaa tgacctcagg cacatcagcc cacaagccaa ggcactcctc 840 caggacaagg atgtgatagc catcaaccag gaccccttgg ggaagcaggg gtaccagcta 900 aggcaggggg acaactttga ggtgtgggaa aggcccctct cagggcttgc ctgggcagta 960 gctatgatca acaggcagga gattggtggc cccagatctt acactattgc agtggctagc 1020 ctggggaagg gggtggcctg caaccctgcc tgcttcatca cacagctcct cccagtcaag 1080 aggaagttgg ggttctatga gtggacttcc aggctgagat cccacatcaa ccccacaggc 1140 actgtgctgc tgcagctaga gaacaccatg cagatgagcc tgaaggacct cctctga 1197 <210> 18 <211> 1197 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Partial GLA cDNA, GLA coding sequence, GLAcoH6 variant <400> 18 ctggacaatg gcttggccag gactcccacc atgggctggc tgcactggga gaggttcatg 60 tgcaacttgg actgccagga ggagccagac tcctgcatct ctgagaagct cttcatggag 120 atggctgagc tcatggtctc agaggggtgg aaggatgcag ggtatgagta cctctgcatt 180 gatgactgct ggatggcccc tcaaagggat tcagagggta ggctccaggc agacccccag 240 aggttccccc atggcatcag gcagcttgct aactatgtcc acagcaaggg cctgaagctg 300 gggatctatg ctgatgttgg caacaagacc tgtgctggct tcccaggttc ctttgggtac 360 tatgacattg atgcacagac ctttgcagac tggggggtag acctcctaaa gtttgatggg 420 tgctactgtg acagcttgga gaacctggca gatggctaca agcacatgag ccttgccctg 480 aacaggactg gcagaagcat agtgtactcc tgtgagtggc ccctgtacat gtggcccttc 540 cagaagccca actacacaga gatcagacag tactgcaacc actggaggaa ctttgctgac 600 atagatgact cctggaagag cataaagagc atcctggact ggacatcctt caaccaggag 660 aggattgtgg atgtggctgg gccagggggc tggaatgacc cagacatgct tgtgataggc 720 aactttggcc tcagctggaa ccagcaggtg actcagatgg ccctctgggc catcatggct 780 gcccccctgt tcatgagcaa tgacctcagg cacatcagcc cccaagccaa ggccctcctc 840 caggacaagg atgtgatagc catcaatcag gaccccctag gcaagcaggg gtaccagctc 900 agacagggtg acaactttga ggtgtgggaa aggcctctgt caggccttgc ctgggcagtg 960 gctatgatca acaggcagga gattggtggg cctaggagct acaccattgc agtggcctcc 1020 ctggggaagg gagtggcctg caacccagcc tgcttcatca cacagctcct ccctgtgaag 1080 aggaagcttg gcttctatga atggacctcc aggctgagga 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agaattgtgg atgtggcagg ccctgggggc tggaatgacc cagacatgct ggtcattggc 720 aactttggcc tgtcctggaa ccagcaggtg acccagatgg ccctgtgggc catcatggca 780 gcccccctgt tcatgagcaa tgacctgaga cacatcagcc cacaggccaa ggccctgctg 840 caggacaagg atgtgattgc catcaaccag gaccctctgg gcaagcaggg ctaccagctg 900 aggcagggag acaactttga ggtgtgggag aggcccctgt ctggcctggc ctgggcagtg 960 gccatgatca acaggcagga gattggaggc cccaggagct acaccattgc agtggccagc 1020 ctgggcaagg gggtggcctg caacccagcc tgcttcatca cccagctgct gcctgtgaag 1080 aggaagctgg gcttctatga gtggacctcc agactgagga gccacatcaa ccccacaggc 1140 acagtgctgc tgcagctgga gaacaccatg cagatgagcc tgaaggacct gctgtga 1197 <210> 20 <211> 228 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BGH228 polyA sequence <400> 20 ctactgtgcc ttctagttgc cagccatctg ttgtttgccc ctcccccttg ccttccttga 60 ccctggaagg tgccactccc actgtccttt cctaataaaa tgaggaaatt gcatcacatt 120 gtctgagtag gtgtcattct attctggggg gtggggtggg gcaggacagc aagggggagg 180 attgggaaga caatagcagg catgctgggg atgcagtggg ctctatgg 228 <210> 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ccccgttgcc cctctggatc 780 cactgcttaa atacggacga ggacagggcc ctgtctcctc agcttcaggc accaccactg 840 acctgggaca gtgaatagat cctgagaact tcagggtgag tctatgggac ccttgatgtt 900 ttctttcccc ttcttttcta tggttaagtt catgtcatag gaaggggaga agtaacaggg 960 tacacatatt gaccaaatca gggtaatttt gcatttgtaa ttttaaaaaa tgctttcttc 1020 ttttaatata cttttttgtt tatcttattt ctaatacttt ccctaatctc tttctttcag 1080 ggcaataatg atacaatgta tcatgcctct ttgcaccatt ctaaagaata acagtgataa 1140 tttctgggtt aaggcaatag caatatttct gcatataaat atttctgcat ataaattgta 1200 actgatgtaa gaggtttcat attgctaata gcagctacaa tccagctacc attctgcttt 1260 tattttctgg ttgggataag gctggattat tctgagtcca agctaggccc ttttgctaat 1320 cttgttcata cctcttatct tcctcccaca gctcctgggc aacctgctgg tctctctgct 1380 ggcccatcac tttggcaaag cacgcgtgcc accatggcct tcctgtggct gctgtcctgc 1440 tgggcactgc tgggcaccac atttggcctg gacaatggat tggcaaggac gcctaccatg 1500 ggctggctgc actgggagcg cttcatgtgc aaccttgact gccaggaaga gccagattcc 1560 tgcatcagtg agaagctctt catggagatg gcagagctca tggtctcaga 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gcaaaggact gaagctaggg atttatgcag atgttggaaa taaaacctgc 1800 gcaggcttcc ctgggagttt tggatactac gacattgatg cccagacctt tgctgactgg 1860 ggagttgatc tgctaaaatt tgatggttgt tactgtgaca gtttggaaaa tttggcagat 1920 ggttataagc acatgtcctt ggccctgaat aggactggca gaagcattgt gtactcctgt 1980 gagtggcctc tttatatgtg gccctttcaa aagcccaatt atacagaaat ccgacagtac 2040 tgcaatcact ggcgaaattt tgctgacatt gatgattcct ggaaaagtat aaagagtatc 2100 ttggactgga catcttttaa ccaggagaga attgttgatg ttgctggacc agggggttgg 2160 aatgacccag atatgttagt gattggcaac tttggcctca gctggaatca gcaagtaact 2220 cagatggccc tctgggctat catggctgct cctttattca tgtctaatga cctccgacac 2280 atcagccctc aagccaaagc tctccttcag gataaggacg taattgccat caatcaggac 2340 cccttgggca agcaagggta ccagcttaga cagggagaca actttgaagt gtgggaacga 2400 cctctctcag gcttagcctg ggctgtagct atgataaacc ggcaggagat tggtggacct 2460 cgctcttata ccatcgcagt tgcttccctg ggtaaaggag tggcctgtaa tcctgcctgc 2520 ttcatcacac agctcctccc tgtgaaaagg aagctagggt tctatgaatg gacttcaagg 2580 ttaagaagtc 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ctaatacttt ccctaatctc tttctttcag 1080 ggcaataatg atacaatgta tcatgcctct ttgcaccatt ctaaagaata acagtgataa 1140 tttctgggtt aaggcaatag caatatttct gcatataaat atttctgcat ataaattgta 1200 actgatgtaa gaggtttcat attgctaata gcagctacaa tccagctacc attctgcttt 1260 tattttctgg ttgggataag gctggattat tctgagtcca agctaggccc ttttgctaat 1320 cttgttcata cctcttatct tcctcccaca gctcctgggc aacctgctgg tctctctgct 1380 ggcccatcac tttggcaaag cacgcgtgcc accatgtggc tgccttgggc tctgttgctt 1440 ctctgggtcc caggatgttt tgctctggac aatggattgg caaggacgcc taccatgggc 1500 tggctgcact gggagcgctt catgtgcaac cttgactgcc aggaagagcc agattcctgc 1560 atcagtgaga agctcttcat ggagatggca gagctcatgg tctcagaagg ctggaaggat 1620 gcaggttatg agtacctctg cattgatgac tgttggatgg ctccccaaag agattcagaa 1680 ggcagacttc aggcagaccc tcagcgcttt cctcatggga ttcgccagct agctaattat 1740 gttcacagca aaggactgaa gctagggatt tatgcagatg ttggaaataa aacctgcgca 1800 ggcttccctg ggagttttgg atactacgac attgatgccc agacctttgc tgactgggga 1860 gttgatctgc taaaatttga tggttgttac 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gttgtttgcc cctccccctt gccttccttg 2760 accctggaag gtgccactcc cactgtcctt tcctaataaa atgaggaaat tgcatcacat 2820 tgtctgagta ggtgtcattc tattctgggg ggtggggtgg ggcaggacag caagggggag 2880 gattgggaag acaatagcag gcatgctggg gatgcagtgg gctctatggc ttctgaggca 2940 gaaagaacca gctggggctc gagatccact agggccgcag gaacccctag tgatggagtt 3000 ggccactccc tctctgcgcg ctcgctcgct cactgaggcc gggcgaccaa aggtcgcccg 3060 acgcccgggc tttgcccggg cggcctcagt gagcgagcga gcgcgcagct gcctgcagg 3119 <210> 24 <211> 3161 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pAAV_ApoE_hAAT_HBB2m1_spGLA.GLA_BGH228 sequence <400> 24 cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcggc 60 ctcagtgagc gagcgagcgc gcagagaggg agtggccaac tccatcacta ggggttcctg 120 cggcctagta ggctcagagg cacacaggag tttctgggct caccctgccc ccttccaacc 180 cctcagttcc catcctccag cagctgtttg tgtgctgcct ctgaagtcca cactgaacaa 240 acttcagcct actcatgtcc ctaaaatggg caaacattgc aagcagcaaa cagcaaacac 300 acagccctcc ctgcctgctg accttggagc tggggcagag gtcagagacc 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ctcgagatcc 3000 actagggccg caggaacccc tagtgatgga gttggccact ccctctctgc gcgctcgctc 3060 gctcactgag gccgggcgac caaaggtcgc ccgacgcccg ggctttgccc gggcggcctc 3120 agtgagcgag cgagcgcgca gctgcctgca gg 3152 <210> 26 <211> 3143 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pAAV_ApoE_hAAT_HBB2m1_spNotch2.GLA_BGH228 sequence <400> 26 cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcggc 60 ctcagtgagc gagcgagcgc gcagagaggg agtggccaac tccatcacta ggggttcctg 120 cggcctagta ggctcagagg cacacaggag tttctgggct caccctgccc ccttccaacc 180 cctcagttcc catcctccag cagctgtttg tgtgctgcct ctgaagtcca cactgaacaa 240 acttcagcct actcatgtcc ctaaaatggg caaacattgc aagcagcaaa cagcaaacac 300 acagccctcc ctgcctgctg accttggagc tggggcagag gtcagagacc tctctgggcc 360 catgccacct ccaacatcca ctcgacccct tggaatttcg gtggagagga gcagaggttg 420 tcctggcgtg gtttaggtag tgtgagaggg gtacccgggg atcttgctac cagtggaaca 480 gccactaagg attctgcagt gagagcagag ggccagctaa gtggtactct cccagagact 540 gtctgactca cgccaccccc tccaccttgg acacaggacg 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ggttgggata aggctggatt attctgagtc 1320 caagctaggc ccttttgcta atcttgttca tacctcttat cttcctccca cagctcctgg 1380 gcaacctgct ggtctctctg ctggcccatc actttggcaa agcacgcgtg ccaccatggc 1440 cttcctgtgg ctgctgagct gctgggccct gctggggacc acctttgggc tggacaatgg 1500 cctggccaga acccccacca tgggctggct gcactgggag aggttcatgt gcaaccttga 1560 ctgccaggag gagcctgaca gctgcatctc tgagaagctg ttcatggaga tggctgagct 1620 catggtgtca gaggggtgga aggatgcagg ctatgagtac ctgtgcatag atgactgctg 1680 gatggctccc cagagggact cagagggcag gctgcaggct gaccctcaga ggttccccca 1740 tggcatcagg cagctggcca actatgtgca cagcaagggc ctcaagctgg gaatctatgc 1800 tgatgtgggc aacaaaacat gtgcaggctt cccaggctct tttggctact atgacataga 1860 tgcccagacc tttgcagact ggggagttga cctgctgaag tttgatgggt gctactgtga 1920 cagcctggag aacctggctg atgggtacaa gcacatgtcc ctggccctga acaggacagg 1980 caggtccatt gtgtacagct gtgagtggcc cctgtacatg tggcccttcc agaagcccaa 2040 ctacacagag atcagacagt actgcaacca ctggagaaac tttgctgaca ttgatgactc 2100 ctggaagagc atcaagtcca tcctggactg 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aaccagctgg ggctcgagat ccactagggc 3000 cgcaggaacc cctagtgatg gagttggcca ctccctctct gcgcgctcgc tcgctcactg 3060 aggccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgggctttgc ccgggcggcc tcagtgagcg 3120 agcgagcgcg cagctgcctg cagg 3144 <210> 32 <211> 3144 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pAAV_ApoE_hAAT_HBB2m1_sp7.GLAcoH0_BGH228 sequence <400> 32 cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc 60 gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca 120 actccatcac taggggttcc tgcggcctag taggctcaga ggcacacagg agtttctggg 180 ctcaccctgc ccccttccaa cccctcagtt cccatcctcc agcagctgtt tgtgtgctgc 240 ctctgaagtc cacactgaac aaacttcagc ctactcatgt ccctaaaatg ggcaaacatt 300 gcaagcagca aacagcaaac acacagccct ccctgcctgc tgaccttgga gctggggcag 360 aggtcagaga cctctctggg cccatgccac ctccaacatc cactcgaccc cttggaattt 420 cggtggagag gagcagaggt tgtcctggcg tggtttaggt agtgtgagag gggtacccgg 480 ggatcttgct accagtggaa cagccactaa ggattctgca gtgagagcag agggccagct 540 aagtggtact ctcccagaga ctgtctgact 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cactgcttaa atacggacga ggacagggcc ctgtctcctc agcttcaggc accaccactg 840 acctgggaca gtgaatagat cctgagaact tcagggtgag tctatgggac ccttgatgtt 900 ttctttcccc ttcttttcta tggttaagtt catgtcatag gaaggggaga agtaacaggg 960 tacacatatt gaccaaatca gggtaatttt gcatttgtaa ttttaaaaaa tgctttcttc 1020 ttttaatata cttttttgtt tatcttattt ctaatacttt ccctaatctc tttctttcag 1080 ggcaataatg atacaatgta tcatgcctct ttgcaccatt ctaaagaata acagtgataa 1140 tttctgggtt aaggcaatag caatatttct gcatataaat atttctgcat ataaattgta 1200 actgatgtaa gaggtttcat attgctaata gcagctacaa tccagctacc attctgcttt 1260 tattttctgg ttgggataag gctggattat tctgagtcca agctaggccc ttttgctaat 1320 cttgttcata cctcttatct tcctcccaca gctcctgggc aacctgctgg tctctctgct 1380 ggcccatcac tttggcaaag cagccaccat ggcctttctg tggctgctgt cctgctgggc 1440 cctgctgggg accacctttg gcctggacaa tggcctggcc aggaccccca ccatgggctg 1500 gctgcactgg gagagattca tgtgcaacct ggactgccag gaggagcctg acagctgcat 1560 ctctgagaag ctgttcatgg agatggcaga gctgatggtg tctgagggct ggaaggatgc 1620 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Gln Thr Phe Ala 145 150 155 160 Asp Trp Gly Val Asp Leu Leu Lys Phe Asp Gly Cys Tyr Cys Asp Ser 165 170 175 Leu Glu Asn Leu Ala Asp Gly Tyr Lys His Met Ser Leu Ala Leu Asn 180 185 190 Arg Thr Gly Arg Ser Ile Val Tyr Ser Cys Glu Trp Pro Leu Tyr Met 195 200 205 Trp Pro Phe Gln Lys Pro Asn Tyr Thr Glu Ile Arg Gln Tyr Cys Asn 210 215 220 His Trp Arg Asn Phe Ala Asp Ile Asp Asp Ser Trp Lys Ser Ile Lys 225 230 235 240 Ser Ile Leu Asp Trp Thr Ser Phe Asn Gln Glu Arg Ile Val Asp Val 245 250 255 Ala Gly Pro Gly Gly Trp Asn Asp Pro Asp Met Leu Val Ile Gly Asn 260 265 270 Phe Gly Leu Ser Trp Asn Gln Gln Val Thr Gln Met Ala Leu Trp Ala 275 280 285 Ile Met Ala Ala Pro Leu Phe Met Ser Asn Asp Leu Arg His Ile Ser 290 295 300 Pro Gln Ala Lys Ala Leu Leu Gln Asp Lys Asp Val Ile Ala Ile Asn 305 310 315 320 Gln Asp Pro Leu Gly Lys Gln Gly Tyr Gln Leu Arg Gln Gly Asp Asn 325 330 335 Phe Glu Val Trp Glu Arg Pro Leu Ser Gly Leu Ala Trp Ala Val Ala 340 345 350 Met Ile Asn Arg Gln Glu Ile Gly Gly Pro Arg Ser 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Ser Pro Gln Ala Lys Ala Leu Leu Gln Asp Lys Asp Val Ile 290 295 300 Ala Ile Asn Gln Asp Pro Leu Gly Lys Gln Gly Tyr Gln Leu Arg Gln 305 310 315 320 Gly Asp Asn Phe Glu Val Trp Glu Arg Pro Leu Ser Gly Leu Ala Trp 325 330 335 Ala Val Ala Met Ile Asn Arg Gln Glu Ile Gly Gly Pro Arg Ser Tyr 340 345 350 Thr Ile Ala Val Ala Ser Leu Gly Lys Gly Val Ala Cys Asn Pro Ala 355 360 365 Cys Phe Ile Thr Gln Leu Leu Pro Val Lys Arg Lys Leu Gly Phe Tyr 370 375 380 Glu Trp Thr Ser Arg Leu Arg Ser His Ile Asn Pro Thr Gly Thr Val 385 390 395 400 Leu Leu Gln Leu Glu Asn Thr Met Gln Met Ser Leu Lys Asp Leu Leu 405 410 415 <210> 108 <211> 417 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> spTF-GLA <400> 108 Met Arg Leu Ala Val Gly Ala Leu Leu Val Cys Ala Val Leu Gly Leu 1 5 10 15 Cys Leu Ala Leu Asp Asn Gly Leu Ala Arg Thr Pro Thr Met Gly Trp 20 25 30 Leu His Trp Glu Arg Phe Met Cys Asn Leu Asp Cys Gln Glu Glu Pro 35 40 45 Asp Ser Cys Ile Ser Glu Lys Leu Phe Met Glu Met Ala Glu Leu Met 50 55 60 Val Ser Glu 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Met Ala Ala Pro Leu Phe Met Ser Asn Asp Leu 275 280 285 Arg His Ile Ser Pro Gln Ala Lys Ala Leu Leu Gln Asp Lys Asp Val 290 295 300 Ile Ala Ile Asn Gln Asp Pro Leu Gly Lys Gln Gly Tyr Gln Leu Arg 305 310 315 320 Gln Gly Asp Asn Phe Glu Val Trp Glu Arg Pro Leu Ser Gly Leu Ala 325 330 335 Trp Ala Val Ala Met Ile Asn Arg Gln Glu Ile Gly Gly Pro Arg Ser 340 345 350 Tyr Thr Ile Ala Val Ala Ser Leu Gly Lys Gly Val Ala Cys Asn Pro 355 360 365 Ala Cys Phe Ile Thr Gln Leu Leu Pro Val Lys Arg Lys Leu Gly Phe 370 375 380 Tyr Glu Trp Thr Ser Arg Leu Arg Ser His Ile Asn Pro Thr Gly Thr 385 390 395 400 Val Leu Leu Gln Leu Glu Asn Thr Met Gln Met Ser Leu Lys Asp Leu 405 410 415 Leu <210> 109 <211> 426 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> sp7-GLA 7 mut <400> 109 Met Ala Phe Leu Trp Leu Leu Ser Cys Trp Ala Leu Leu Gly Thr Thr 1 5 10 15 Phe Gly Leu Asp Asn Gly Leu Ala Arg Thr Pro Thr Leu Asp Asn Gly 20 25 30 Leu Ala Arg Thr Pro Thr Met Gly Trp Leu His Trp Glu Arg Phe Met 35 40 45 Cys Asn Leu 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Pro Asp Met Leu Val Ile Gly Asn Phe Gly Leu 260 265 270 Ser Trp Asn Gln Gln Val Thr Gln Met Ala Leu Trp Ala Ile Met Ala 275 280 285 Ala Pro Leu Phe Met Ser Asn Asp Leu Arg His Ile Ser Pro Gln Ala 290 295 300 Lys Ala Leu Leu Gln Asp Lys Asp Val Ile Ala Ile Asn Gln Asp Pro 305 310 315 320 Leu Gly Lys Gln Gly Tyr Gln Leu Arg Gln Glu Asp Asn Phe Glu Val 325 330 335 Trp Glu Arg Pro Leu Ser Asn Leu Ala Trp Ala Val Ala Met Ile Asn 340 345 350 Arg Gln Glu Ile Gly Gly Pro Arg Ser Tyr Thr Ile Ala Val Ala Ser 355 360 365 Leu Gly Lys Gly Val Ala Cys Asn Pro Ala Cys Phe Ile Thr Gln Leu 370 375 380 Leu Pro Val Lys Arg Lys Leu Gly Phe Tyr Glu Trp Thr Ser Arg Leu 385 390 395 400 Arg Ser His Ile Asn Pro Thr Gly Thr Val Leu Leu Gln Leu Glu Asn 405 410 415 Thr Met Gln Met Ser Leu Lys Asp Leu Leu 420 425 <210> 110 <211> 738 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VP1 <400> 110 Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser 1 5 10 15 Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Asp Leu Lys Pro Gly 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650 655 Pro Ala Asp Pro Pro Thr Thr Phe Asn Gln Ala Lys Leu Ala Ser Phe 660 665 670 Ile Thr Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu 675 680 685 Leu Gln Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr 690 695 700 Ser Asn Tyr Tyr Lys Ser Thr Asn Val Asp Phe Ala Val Asn Thr Glu 705 710 715 720 Gly Thr Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg 725 730 735 Asn Leu

Claims (57)

  1. 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드:
    a) α-갈락토시다제 A(GLA)를 인코딩하는 핵산 서열 - 여기서 핵산 서열은 서열 번호 15의 서열과 적어도 약 85% 동일하고, GLA는 서열 번호 100의 서열과 적어도 95% 동일한 서열을 가짐 -;
    b) α-갈락토시다제 A(GLA)를 인코딩하는 핵산 서열 - 여기서 핵산 서열은 상기 GLA에 대한 코딩 서열에 인트론을 포함하고, 상기 GLA는 서열 번호 100의 서열과 적어도 95% 동일한 서열을 가짐 -;
    c) 아미노-말단 신호 펩타이드를 포함하는 전구체 α-갈락토시다제 A(GLA)를 인코딩하는 핵산 서열 - 여기서 신호 펩타이드는 서열 번호 41, 서열 번호 57, 서열 번호 58, 서열 번호 60, 서열 번호 61, 서열 번호 62, 및 서열 번호 63으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 적어도 80% 동일한 서열을 갖고; 상기 GLA는 서열 번호 100의 서열과 적어도 95% 동일한 서열을 가짐 -;
    d) 서열 번호 100과 1 내지 7개의 아미노산이 상이한 아미노산 서열을 갖는 α-갈락토시다제 A(GLA)를 인코딩하는 핵산 - 여기서 1 내지 7개의 아미노산 중 적어도 하나는 Gln57Lys, Gln111Glu, Lys213Glu, Lys237Gln, Phe248Thr, Gly334Glu, 및 Gly346Asn으로 이루어진 군으로부터 선택된 치환임 -.
  2. α-갈락토시다제 A(GLA)를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드로서, 상기 핵산 서열은 (1) 서열 번호 15의 서열과 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열, (2) 서열 번호 16의 서열과 적어도 84%의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열, (3) 서열 번호 17의 서열과 적어도 86%의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열, (4) 서열 번호 18의 서열과 적어도 86%의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열, 및 (5) 서열 번호 19의 서열과 적어도 83%의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는, 폴리뉴클레오타이드.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 서열 번호 15의 서열과 적어도 95% 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오타이드.
  4. 제3항에 있어서, 상기 핵산 서열은 서열 번호 100의 서열을 포함하는 GLA를 인코딩하는, 폴리뉴클레오타이드.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산 서열은 14개 미만의 CpG 디뉴클레오타이드를 함유하는, 폴리뉴클레오타이드.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 핵산 서열은 서열 번호 15 내지 19 중 어느 하나의 서열, 또는 서열 번호 15 내지 19 중 어느 하나의 염기 1-1194를 갖는, 폴리뉴클레오타이드.
  7. 제1항에 있어서, 상기 핵산 서열은 서열 번호 15의 서열과 적어도 95% 동일한 서열을 갖고, 상기 GLA는 서열 번호 100의 서열과 적어도 98% 동일한 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드.
  8. 제1항에 있어서, 상기 핵산 서열은 Gln57Lys, Gln111Glu, Lys213Glu, Lys237Gln, Phe248Thr, Gly334Glu, 및 Gly346Asn으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는 서열 번호 100의 아미노산 서열을 갖는 GLA 단백질을 인코딩하는, 폴리뉴클레오타이드.
  9. 제8항에 있어서, 상기 GLA는 서열 번호 48의 아미노산 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오타이드.
  10. 제9항에 있어서, 상기 핵산 서열은 서열 번호 47의 서열 또는 서열 번호 47의 염기 1-1194를 포함하는, 폴리뉴클레오타이드.
  11. 제1항에 있어서, 상기 핵산 서열은 상기 삽입된 인트론을 포함하는 상기 GLA를 인코딩하고, 상기 인트론의 부재하에 상기 GLA는 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 의해 제공된 GLA 서열을 포함하고, 상기 인트론은 GLA를 인코딩하는 핵산의 뉴클레오타이드 78과 79 사이에 위치하고, 상기 뉴클레오타이드 위치는 서열 번호 14의 서열을 갖는 GLA의 코딩 서열과 관련하여 주어지는, 폴리뉴클레오타이드.
  12. 제11항에 있어서, 상기 인트론은 서열 번호 49, 서열 번호 50, 서열 번호 51 및 서열 번호 52로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오타이드.
  13. 제12항에 있어서, 상기 핵산은 서열 번호 43 내지 46 중 어느 하나의 서열을 갖는, 폴리뉴클레오타이드.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 제2 핵산 서열을 추가로 포함하고, 상기 제2 서열은 제1 핵산 서열의 5' 말단에 위치한 신호 펩타이드 서열을 인코딩하는, 폴리뉴클레오타이드.
  15. 제14항에 있어서, 상기 신호 펩타이드 서열은 이종 신호 펩타이드 서열인, 폴리뉴클레오타이드.
  16. 제14항에 있어서, 상기 신호 펩타이드 서열은 인간 키모트립시노겐 B2 신호 펩타이드(서열 번호 41), AHSG 신호 펩타이드(서열 번호 57), CD300 신호 펩타이드(서열 번호 58), GLA 신호 펩타이드(서열 번호 59) LAMP1 신호 펩타이드(서열 번호 60), Notch 2 신호 펩타이드(서열 번호 61), ORM1 신호 펩타이드(서열 번호 62), TF 신호 펩타이드(서열 번호 63), 및 야생형 GLA 신호 펩타이드(서열 번호 59), 또는 서열 번호 41 및 57 내지 63 중 임의의 서열과 적어도 90% 동일한 서열을 갖는 이의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택되는, 폴리뉴클레오타이드.
  17. 제16항에 있어서, 상기 신호 펩타이드는 인간 키모트립시노겐 B2 신호 펩타이드(서열 번호 41)인, 폴리뉴클레오타이드.
  18. 제17항에 있어서, 상기 신호 펩타이드를 인코딩하는 상기 핵산은 서열 번호 1 내지 5 중 어느 하나의 서열을 갖는, 폴리뉴클레오타이드.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 상기 폴리뉴클레오타이드의 5' 말단의 측면에 위치하는 AAV 역 반복부(ITR) 및/또는 상기 폴리뉴클레오타이드의 3' 말단의 측면에 위치하는 AAV ITR을 추가로 포함하는, 폴리뉴클레오타이드.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 카세트로서, 상기 GLA 코딩 서열은 발현 조절 요소에 작동가능하게 연결된, 발현 카세트.
  21. 제20항에 있어서, 발현 조절 요소는 간-특이적 발현 조절 요소인, 발현 카세트.
  22. 제20항 또는 제21항에 있어서, 발현 조절 요소는 GLA를 인코딩하는 핵산의 5'에 위치하는, 발현 카세트.
  23. 제20항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, GLA를 인코딩하는 핵산의 3'에 위치하는 폴리아데닐화 서열을 추가로 포함하는 발현 카세트.
  24. 제20항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 발현 조절 요소 및/또는 폴리아데닐화 서열은 야생형 발현 조절 요소 또는 폴리아데닐화 서열과 비교하여 CpG-감소된, 발현 카세트.
  25. 제20항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 발현 조절 요소는 ApoE/hAAT 인핸서/프로모터 서열을 포함하는, 발현 카세트.
  26. 제23항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리아데닐화 서열은 소 성장 호르몬(bGH) 폴리아데닐화 서열을 포함하는, 발현 카세트.
  27. 제25항 또는 제26항에 있어서, ApoE/hAAT 인핸서/프로모터 서열은 야생형 ApoE/hAAT 인핸서/프로모터 서열에 비해 CpG-감소된, 발현 카세트.
  28. 제27항에 있어서, ApoE/hAAT 인핸서/프로모터 서열은 서열 번호 38의 서열을 포함하는, 발현 카세트.
  29. 제28항에 있어서, 상기 bGH 폴리아데닐화 서열은 서열 번호 20의 서열을 포함하는, 발현 카세트.
  30. 제20항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 발현 조절 요소의 3' 말단과 폴리뉴클레오타이드의 5' 말단 사이에 위치한 인트론을 추가로 포함하는 발현 카세트.
  31. 제30항에 있어서, 인트론은 hBB2m1 인트론(서열 번호 39)을 포함하는, 발현 카세트.
  32. 제20항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 발현 카세트는 상기 발현 카세트의 5' 측면에 있는 ITR 및/또는 상기 발현 카세트의 3' 말단 측면에 있는 ITR을 추가로 포함하는, 발현 카세트.
  33. 제19항의 폴리뉴클레오타이드 또는 제32항의 발현 카세트, 및 복제 기점을 포함하는 AAV 플라스미드 게놈.
  34. 제19항의 폴리뉴클레오타이드 또는 제32항의 발현 카세트 및 캡시드를 포함하는 아데노 관련 바이러스(AAV) 벡터.
  35. 제34항에 있어서, 상기 AAV는 상기 발현 카세트를 포함하고, 상기 발현 카세트는 상기 발현 카세트의 5' 측면에 있는 상기 ITR 및 상기 발현 카세트의 3' 말단 측면에 있는 상기 ITR을 추가로 포함하는, AAV 벡터.
  36. 제34항 또는 제35항에 있어서, 상기 5' ITR 및 상기 3' ITR은 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, Rh10, Rh74 및 AAV3B ITR로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는, AAV 벡터.
  37. 제35항 또는 제36항에 있어서, 상기 5' ITR 및 3' ITR 중 적어도 하나 이상은 감소된 CpG를 갖도록 변형된, AAV 벡터.
  38. 제34항에 있어서, 상기 벡터는 서열 번호 21 내지 34, 53 내지 56 및 91 내지 99 중 어느 하나의 서열과 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는, AAV 벡터.
  39. 제34항에 있어서, 상기 벡터는 서열 번호 91 내지 95 중 어느 하나의 서열과 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 서열로 이루어진, AAV 벡터.
  40. 제34항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 캡시드는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, Rh10, Rh74(서열 번호 35), AAV3B, LK03(서열 번호 42), AAV-2i8의 VP1, VP2 또는 VP3 캡시드; 또는 서열 번호 110, 서열 번호 36 또는 서열 번호 37에 대해 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 AAV VP1, VP2 또는 VP3 캡시드를 포함하는 AAV 벡터.
  41. 제40항에 있어서, 상기 캡시드는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, Rh10, Rh74(서열 번호 35), AAV3B, LK03(서열 번호 42) 또는 AAV-2i8 캡시드; 또는 서열 번호 110, 서열 번호 36, 및/또는 서열 번호 37을 포함하는 캡시드인, AAV 벡터.
  42. 생물학적으로 적합한 담체 또는 부형제 중에 제34항 내지 제41항 중 어느 한 항의 복수의 AAV 벡터를 포함하는 약학 조성물.
  43. 제42항에 있어서, 상기 다수의 AAV 벡터 입자는 인간 대상체에서 GLA 활성을 증가시키기에 유효량인, 약학 조성물.
  44. 제43항에 있어서, 빈(empty) AAV 캡시드를 추가로 포함하는 약학 조성물.
  45. 제44항에 있어서, 빈 AAV 캡시드 대 AAV 벡터의 비는 약 100:1 내지 약 1:100인, 약학 조성물.
  46. 제42항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 계면활성제를 추가로 포함하는 약학 조성물.
  47. α-갈락토시다제 A(GLA)를 필요로 하는 대상체를 치료하는 방법으로서, 상기 대상체에게 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오타이드 또는 발현 카세트 또는 제34항 내지 제41항 중 어느 한 항의 중 어느 한 항의 AAV 벡터, 제42항 내지 제46항 중 어느 한 항의 약학 조성물의 치료 유효량을 투여하는 것을 포함하고, GLA가 대상체에서 발현되는, 방법.
  48. 제47항에 있어서, 대상체는 파브리병(Fabry disease)을 앓는, 방법.
  49. 제47항 또는 제48항에 있어서, 파브리병의 하나 이상의 증상을 감소, 경감 또는 억제하는 방법.
  50. 제47항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리뉴클레오타이드, 발현 카세트, AAV 벡터 또는 약학 조성물은 대상체에게 정맥내(intravenously), 동맥내로(intraarterially), 강내로(intra-cavity), 점막내로(intramucosally) 또는 카테터를 통해(via catheter) 투여되는, 방법.
  51. 제47항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 AAV는 대상체 체중 킬로그램당 약 1x108 내지 약 1x1014 벡터 게놈(vg/kg)의 범위로 대상체에게 투여되는, 방법.
  52. 제47항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 인간인, 방법.
  53. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오타이드 또는 발현 카세트 또는 제33항의 AAV 플라스미드 게놈을 포함하는 세포.
  54. 제34항 내지 제41항 중 어느 한 항의 AAV 벡터를 생산하는 세포.
  55. (a) 제33항의 AAV 벡터 게놈 플라스미드를 팩키징 헬퍼 세포에 도입하는 단계; 및 (b) AAV 벡터를 생산하기 위한 조건 하에서 상기 헬퍼 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 제34항 내지 제41항 중 어느 한 항의 AAV 벡터를 생산하는 방법.
  56. 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리펩타이드:
    a) α-갈락토시다제 A(GLA)의 아미노 말단에 결합된 신호 펩타이드를 포함하는 전구체 α-갈락토시다제 A - 여기서 상기 신호 펩타이드는 서열 번호 41, 서열 번호 57, 서열 번호 58, 서열 번호 60, 서열 번호 61, 서열 번호 62, 및 서열 번호 63으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 적어도 80% 동일한 서열을 갖고; 상기 GLA는 서열 번호 100과 적어도 95% 동일한 서열을 가짐 -; 및
    b) 서열 번호 100과 1 내지 7개의 아미노산이 상이한 아미노산 서열을 갖는 α-갈락토시다제 A(GLA) - 여기서 상기 1 내지 7개의 아미노산 중 적어도 하나는 Gln57Lys, Gln111Glu, Lys213Glu, Lys237Gln, Phe248Thr, Gly334Glu, 및 Gly346Asn으로 이루어진 군으로부터 선택된 치환임 -.
  57. 제47항 내지 제52항 중 어느 한 항의 방법에 사용하기 위한, 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오타이드, 제20항 내지 제32항 중 어느 한 항의 발현 카세트, 제34항 내지 제41항 중 어느 한 항의 AAV 벡터, 제42항 내지 제46항 중 어느 한 항의 약학 조성물, 또는 제56항의 폴리펩타이드.
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