KR20220161268A - 유전자 치료 벡터의 형질도입을 증가 또는 향상시키고 면역글로불린을 제거 또는 감소시키기 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

유전자 치료 벡터의 형질도입을 증가 또는 향상시키고 면역글로불린을 제거 또는 감소시키기 위한 조성물 및 방법 Download PDF

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Abstract

면역글로불린 G(IgG)와 신생아 Fc 수용체(FcRn) 사이의 상호작용을 차단, 억제 또는 감소시키는 제제, 예를 들어, 항-FcRn 항체를 투여하여 IgG 재순환을 감소시키고 생체 내 IgG 제거를 향상시킴으로써 기존 유전자 요법 중화 항체를 이미 갖고 있거나 발달시킬 수 있는 환자를 치료하는 방법이 본원에 개시된다. 또한, 질병의 유전자 요법 치료를 필요로 하는 환자에서 질병의 유전자 요법 치료를 위해 IgG와 FcRn의 상호작용을 감소시키는 제제를 이용하는 방법이 개시된다.

Description

유전자 치료 벡터의 형질도입을 증가 또는 향상시키고 면역글로불린을 제거 또는 감소시키기 위한 조성물 및 방법
관련 출원
[0001] 본 출원은 2020년 1월 22일자로 출원된 미국 가특허출원 번호 62/964,565에 대한 우선권을 주장한다. 상기 출원의 전체 내용은 모든 본문, 표, 서열 목록 및 도면을 포함하여, 본원에 참조로 포함된다.
도입
[0002] 아데노-관련 바이러스(AAV) 및 기타 바이러스 벡터뿐만 아니라 지질-, 중합체- 및 단백질-기반 나노입자 유전자 치료 접근법은 적응 면역 시스템에 의해 표적화될 수 있으며, 이는 효능을 둔화시키고 환자가 치료적 개입에 완전히 불응하게 될 가능성을 초래한다. 적응-면역 시스템은 표적 분자의 억제 또는 제거를 유도하는 항원-특이적 면역글로불린(예를 들어, IgG) 항체의 발달에 의존한다.
[0003] 신생아 Fc 수용체(FcRn)는 G 유형의 면역글로불린(IgG)을 리소좀 경로로부터 다시 원형질막 및 세포 외부로 재순환하는데 중심적인 역할을 하며, 따라서 IgG 혈청 반감기를 연장시킨다(Sockolosky et al. 2015, Adv. Drug Deliv. Rev., 91:109-124 참조). IgG와 FcRn의 상호작용을 감소시키는 제제는 IgG 재순환을 감소시키고, IgG 분해/이화작용을 향상시키고, IgG 혈청 반감기를 감소시킨다. 인간 임상 시험에서, 항-FcRn 항체를 매주 여러 번 투여하면 평균 혈청 IgG가 약 85% 감소하였고, 최대 24일 동안 혈청 IgG가 ≥ 75% 지속적으로 감소하였다(Ling et al., 2019, Clin. Pharmacol. Ther., 105:1031-1039).
[0004] IdeS는 자연 발생 시스테인 프로테아제, 특히 몇몇 다른 종에 추가하여, 인간 IgG에서 발견되는 표적 서열에 대한 특이성을 나타내는 병원성 박테리아 스트렙토코쿠스 피오게네스(Streptococcus pyogenes)에 의해 발현되는 엔도펩티다제이다. IdeS는 힌지 영역 아래에서 IgG를 절단하여, F(ab')2 및 Fc/2 단편을 생성할 수 있다. IdeS는 인간 혈장에서 IgG를 절단할 수 있고, 투여 후 4시간 내지 7일 사이에 인간에서 총 IgG 수준을 감소시킬 수 있다.
[0005] EndoS는 인간 IgG로부터 글리칸을 특이적으로 가수분해하고 Fc 수용체 결합을 포함하는 항체 이펙터 기능을 변경시키는 S. 피오게네스로부터의 자연 발생 글리코시다제, 특히 엔도글리코시다제이다.
[0006] AAV 캡시드에 대한 중화 항체는 유전자 치료 벡터에 대한 주요 장애물이며, 특정 환자는 잠재적으로 생명을 구할 수 있는 요법에 접근할 수 없다. 특히, IgG와 FcRn의 상호작용을 감소시키는 제제를 투여하고, 이에 의해 IgG 재순환을 감소시키고, IgG 제거, 분해 및 이화작용을 향상시키고, 생체 내 순환 IgG 또는 IgG 반감기를 감소시킴으로써 유전자 치료 벡터에 대한 기존 중화 항체를 이미 갖고 있거나 발달시킬 수 있는 환자를 치료하는 방법이 본원에 기재된다. 또한, 특히, IgG와 FcRn의 상호작용을 감소시키는 제제를 투여하고, 이에 의해 IgG 재순환을 감소시키고, IgG 제거, 분해 및 이화작용을 향상시키고, 생체 내 순환 IgG 또는 IgG 반감기를 감소시킴으로써 이종성 폴리뉴클레오티드 또는 유전자 치료 벡터에 의해 캡시드화된 이종성 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된 단백질 또는 펩티드에 결합하는 기존 항체를 이미 갖고 있거나 발달시킬 수 있는 환자를 치료하는 방법이 본원에 기재된다.
개요
[0007] 대상체에서 유전자 요법을 개선하거나 향상시키기 위해, 항체(예를 들어, 대상체(예를 들어, 인간 환자)에서 IgG)의 순환 수준 또는 역가를 감소시키기 위해 면역글로불린 G(IgG)와 신생아 Fc 수용체(FcRn)의 상호작용 및 FcRn-매개 IgG 재순환을 감소시키는 제제를 이용하는 방법이 본원에 기재된다. 본 발명에 따른 방법은 특히 유전자 치료 벡터에 대한 기존 중화 항체를 갖는 환자를 치료하고 이전에 유전자 치료 벡터로 치료된 환자에게 재투여하는데 사용될 수 있다.
[0008] 특정 구체예에서, 대상체에서 유전자 요법 치료의 효능을 향상시키는 방법은 (a) IgG와 FcRn의 상호작용을 감소시키는 제제를 대상체에 투여하고, (b) 치료적 이종성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 바이러스 벡터를 대상체에 투여하는 것을 포함한다.
[0009] 특정 구체예에서, 대상체는 단백질의 기능 또는 활성의 손실에 의해 야기되는 질병에 대한 치료를 필요로 하고, 치료적 이종성 폴리뉴클레오티드는 단백질의 기능 또는 활성을 제공하거나 보충하는 폴리펩티드 또는 펩티드를 인코딩하거나, 대상체는 단백질의 기능, 활성 또는 발현의 획득에 의해 야기되는 질병에 대한 치료를 필요로 하고, 이종성 폴리뉴클레오티드는 단백질의 기능, 활성 또는 발현의 획득의 발현을 억제, 감소 또는 저하시키는 핵산으로 전사된다.
[0010] 특정 구체예에서, FcRn-매개 IgG 재순환은 대상체에서 감소된다.
[0011] 특정 구체예에서, IgG 제거는 대상체에서 향상된다.
[0012] 특정 구체예에서, IgG와 FcRn의 상호작용을 감소시키는 제제는 항-FcRn 항체, FcRn 결합 아피바디, IgG 분해를 향상시키는 항체(ABDEG), FcRn 결합 펩티드(FcBP) 및 소분자 FcRn 길항제로 구성된 군으로부터 선택된다.
[0013] 특정 구체예에서, 대상체를 치료하는 방법에서, 단계 (a)는 단계 (b)가 수행되기 전에 수행된다.
[0014] 특정 구체예에서, 대상체를 치료하는 방법에서, 단계 (b)는 단계 (c)가 수행되기 전에 수행된다.
[0015] 특정 구체예에서, 대상체를 치료하는 방법에서, 단계 (a) 및 단계 (b)는 거의 동시에 수행된다.
[0016] 특정 구체예에서, 대상체를 치료하는 방법에서, 단계 (a)는 단계 (b)가 수행되기 전 또는 후에 2회 이상 수행된다.
[0017] 특정 구체예에서, 대상체를 치료하는 방법에서, 단계 (b)는 단계 (a)가 수행되기 전 또는 후에 약 90일 이내에 수행된다. 특정 구체예에서, 단계 (b)는 단계 (a)가 수행되기 전 또는 후에 약 60일 이내에 수행된다. 특정 구체예에서, 단계 (b)는 단계 (a)가 수행되기 전 또는 후에 약 45일 이내에 수행된다. 특정 구체예에서, 단계 (b)는 단계 (a)가 수행되기 전 또는 후에 약 30일 이내에 수행된다. 특정 구체예에서, 단계 (b)는 단계 (a)가 수행되기 전 또는 후에 약 21일 이내에 수행된다. 특정 구체예에서, 단계 (b)는 단계 (a)가 수행되기 전 또는 후에 약 14일 이내에 수행된다. 특정 구체예에서, 단계 (b)는 단계 (a)가 수행되기 전 또는 후에 약 7일 이내에 수행된다. 특정 구체예에서, 단계 (b)는 단계 (a)가 수행되기 전 또는 후에 약 72시간 이내에 수행된다. 특정 구체예에서, 단계 (b)는 단계 (a)가 수행되기 전 또는 후에 약 48시간 이내에 수행된다. 특정 구체예에서, 단계 (b)는 단계 (a)가 수행되기 전 또는 후에 약 24시간 이내에 수행된다. 특정 구체예에서, 단계 (b)는 단계 (a)가 수행되기 전 또는 후에 약 12시간 이내에 수행된다. 특정 구체예에서, 단계 (b)는 단계 (a)가 수행되기 전 또는 후에 약 6시간 이내에 수행된다.
[0018] 특정 구체예에서, 방법은 재조합 바이러스 벡터 및/또는 이종성 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된 폴리펩티드 또는 펩티드 및/또는 이종성 폴리뉴클레오티드에 결합하는 항체의 이펙터 기능을 분해 또는 소화 및/또는 억제 또는 감소시키는데 효과적인 양의 프로테아제 또는 글리코시다제를 대상체에 투여하는 것을 추가로 포함한다.
[0019] 특정 구체예에서, 프로테아제 또는 글리코시다제는 단계 (a) 이전, 이후 또는 거의 동시에 투여된다. 특정 구체예에서, 프로테아제 또는 글리코시다제는 단계 (b) 이전, 이후 또는 거의 동시에 투여된다. 특정 구체예에서, 프로테아제 또는 글리코시다제는 단계 (a) 이전, 이후 또는 거의 동시에 2회 이상 투여된다. 특정 구체예에서, 프로테아제 또는 글리코시다제는 단계 (b) 이전, 이후 또는 거의 동시에 2회 이상 투여된다. 특정 구체예에서, 프로테아제 또는 글리코시다제는 단계 (a) 또는 단계 (b) 이전 또는 이후에 약 90일 이내에 투여된다. 특정 구체예에서, 프로테아제 또는 글리코시다제는 단계 (a) 또는 단계 (b) 이전 또는 이후에 약 60일 이내에 투여된다. 특정 구체예에서, 프로테아제 또는 글리코시다제는 단계 (a) 또는 단계 (b) 이전 또는 이후에 약 45일 이내에 투여된다. 특정 구체예에서, 프로테아제 또는 글리코시다제는 단계 (a) 또는 단계 (b) 이전 또는 이후에 약 30일 이내에 투여된다. 특정 구체예에서, 프로테아제 또는 글리코시다제는 단계 (a) 또는 단계 (b) 이전 또는 이후에 약 21일 이내에 투여된다. 특정 구체예에서, 프로테아제 또는 글리코시다제는 단계 (a) 또는 단계 (b) 이전 또는 이후에 약 14일 이내에 투여된다. 특정 구체예에서, 프로테아제 또는 글리코시다제는 단계 (a) 또는 단계 (b) 이전 또는 이후에 약 7일 이내에 투여된다. 특정 구체예에서, 프로테아제 또는 글리코시다제는 단계 (a) 또는 단계 (b) 이전 또는 이후에 약 72시간 이내에 투여된다. 특정 구체예에서, 프로테아제 또는 글리코시다제는 단계 (a) 또는 단계 (b) 이전 또는 이후에 약 48시간 이내에 투여된다. 특정 구체예에서, 프로테아제 또는 글리코시다제는 단계 (a) 또는 단계 (b) 이전 또는 이후에 약 24시간 이내에 투여된다. 특정 구체예에서, 프로테아제 또는 글리코시다제는 단계 (a) 또는 단계 (b) 이전 또는 이후에 약 12시간 이내에 투여된다. 특정 구체예에서, 프로테아제 또는 글리코시다제는 단계 (a) 또는 단계 (b) 이전 또는 이후에 약 6시간 이내에 투여된다.
[0020] 특정 구체예에서, 프로테아제는 시스테인 프로테아제 또는 티올 프로테아제를 포함한다.
[0021] 특정 구체예에서, 프로테아제는 스트렙토코쿠스 피오게네스, 스트렙토코쿠스 에쿠이(Streptococcus equi) 또는 마이코플라스마 카니스(Mycoplasma canis)로부터의 프로테아제를 포함한다.
[0022] 특정 구체예에서, 프로테아제는 SEQ ID NO: 3-18, 23 또는 48 중 어느 하나에 제시된 IdeS 또는 이의 변형된 변이체를 포함한다.
[0023] 특정 구체예에서, 글리코시다제는 엔도글리코시다제를 포함한다.
[0024] 특정 구체예에서, 엔도글리코시다제는 SEQ ID NO: 44-47 중 어느 하나에 제시된 서열을 포함한다.
[0025] 특정 구체예에서, 프로테아제 또는 글리코시다제는 인간 항체의 이펙터 기능을 분해 또는 소화 및/또는 억제 또는 감소시킨다.
[0026] 특정 구체예에서, 바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터 또는 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터를 포함한다.
[0027] 특정 구체예에서, 렌티바이러스 벡터는 항체 또는 IgG가 결합하는 외피 단백질을 포함한다.
[0028] 특정 구체예에서, AAV 벡터는 항체 또는 IgG가 결합하는 캡시드 단백질을 포함한다.
[0029] 특정 구체예에서, AAV 벡터는 항체 또는 IgG가 결합하는 VP1, VP2 및/또는 VP3 캡시드 단백질을 포함한다.
[0030] 특정 구체예에서, AAV 벡터는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV3B, AAV-2i8, Rh10, Rh74, SEQ ID NO: 1 및 SEQ ID NO: 2 VP1, VP2 및/또는 VP3 캡시드 단백질로 구성된 군으로부터 선택된 VP1, VP2 및/또는 VP3 캡시드 단백질에 대해 60% 이상의 서열 동일성을 갖는 VP1, VP2 및/또는 VP3 캡시드 단백질을 포함한다.
[0031] 특정 구체예에서, AAV 벡터는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV3B, AAV-2i8, Rh10, Rh74, SEQ ID NO: 1 및 SEQ ID NO: 2 VP1, VP2 및/또는 VP3 캡시드 단백질로 구성된 군으로부터 선택된 VP1, VP2 및/또는 VP3 캡시드 단백질에 대해 100% 서열 동일성을 갖는 VP1, VP2 및/또는 VP3 캡시드 단백질을 포함한다.
[0032] 특정 구체예에서, 대상체는 바이러스 벡터에 결합하는 항체 또는 IgG를 갖는다.
[0033] 특정 구체예에서, 바이러스 벡터에 결합하는 항체 또는 IgG는 대상체로부터 부재한다.
[0034] 특정 구체예에서, 대상체는 이종성 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된 폴리펩티드 또는 펩티드에 결합하는 항체 또는 IgG를 갖는다.
[0035] 특정 구체예에서, 항체는 IgG, IgM, IgA, IgD 및/또는 IgE를 포함한다.
[0036] 특정 구체예에서, 방법은 단계 (a)를 수행하기 전, 단계 (a)를 수행한 후 그러나 단계 (b)를 수행하기 전 및/또는 단계 (a) 및 (b)를 수행한 후에 대상체에 존재하는 바이러스 벡터 결합 항체 또는 IgG의 존재를 결정하거나, 그 양 또는 이펙터 기능을 정량화하는 것을 포함한다.
[0037] 특정 구체예에서, 방법은 단계 (a)를 수행하기 전, 단계 (a)를 수행한 후 그러나 단계 (b)를 수행하기 전 및/또는 단계 (a) 및 (b)를 수행한 후에 샘플에 존재하는 바이러스 벡터 결합 항체 또는 IgG의 존재, 양 또는 이펙터 기능에 대해 대상체로부터의 생물학적 샘플을 분석하는 것을 포함한다.
[0038] 특정 구체예에서, 결정 및/또는 분석 단계는 IgG와 FcRn의 상호작용을 감소시키는 제제 또는 프로테아제 또는 글리코시다제의 투여 전 및/또는 후에 수행된다.
[0039] 특정 구체예에서, 대상체로부터의 생물학적 샘플은 혈액 생성물이다.
[0040] 특정 구체예에서, 상기 방법은 바이러스 벡터 결합 항체 또는 IgG의 20-50%, 50-75%, 75-90%, 90-95% 또는 95% 이상의 감소를 초래한다.
[0041] 특정 구체예에서, 대상체로부터의 생물학적 샘플 또는 혈액 생성물에 존재하는 바이러스 벡터 결합 항체 또는 IgG는 약 1:100,000 미만이고, 여기서 100,000부의 완충액에 희석된 1부의 생물학적 샘플 또는 혈액 생성물이 50% 바이러스 벡터 중화를 초래한다.
[0042] 특정 구체예에서, 대상체로부터의 생물학적 샘플 또는 혈액 생성물에 존재하는 바이러스 벡터 결합 항체 또는 IgG는 약 1:50,000 미만이고, 여기서 50,000부의 완충액에 희석된 1부의 생물학적 샘플 또는 혈액 생성물이 50% 바이러스 벡터 중화를 초래한다.
[0043] 특정 구체예에서, 대상체로부터의 생물학적 샘플 또는 혈액 생성물에 존재하는 바이러스 벡터 결합 항체 또는 IgG는 약 1:10,000 미만이고, 여기서 10,000부의 완충액에 희석된 1부의 생물학적 샘플 또는 혈액 생성물이 50% 바이러스 벡터 중화를 초래한다.
[0044] 특정 구체예에서, 대상체로부터의 생물학적 샘플 또는 혈액 생성물에 존재하는 바이러스 벡터 결합 항체 또는 IgG는 약 1:1,000 미만이고, 여기서 1,000부의 완충액에 희석된 1부의 생물학적 샘플 또는 혈액 생성물이 50% 바이러스 벡터 중화를 초래한다.
[0045] 특정 구체예에서, 대상체로부터의 생물학적 샘플 또는 혈액 생성물에 존재하는 바이러스 벡터 결합 항체 또는 IgG는 약 1:100 미만이고, 여기서 100부의 완충액에 희석된 1부의 생물학적 샘플 또는 혈액 생성물이 50% 바이러스 벡터 중화를 초래한다.
[0046] 특정 구체예에서, 대상체로부터의 생물학적 샘플 또는 혈액 생성물에 존재하는 바이러스 벡터 결합 항체 또는 IgG는 약 1:10 미만이고, 여기서 10부의 완충액에 희석된 1부의 생물학적 샘플 또는 혈액 생성물이 50% 바이러스 벡터 중화를 초래한다.
[0047] 특정 구체예에서, 생물학적 샘플 또는 혈액 생성물에 존재하는 바이러스 벡터 결합 항체 또는 IgG는 약 1:5 미만이고, 여기서 5부의 완충액에 희석된 1부의 생물학적 샘플 또는 혈액 생성물이 50% 바이러스 벡터 중화를 초래한다.
[0048] 특정 구체예에서, 생물학적 샘플 또는 혈액 생성물에 존재하는 바이러스 벡터 결합 항체 또는 IgG의 비는 약 1:4 미만이고, 여기서 4부의 완충액에 희석된 1부의 생물학적 샘플 또는 혈액 생성물이 50% 바이러스 벡터 중화를 초래한다.
[0049] 특정 구체예에서, 생물학적 샘플 또는 혈액 생성물에 존재하는 바이러스 벡터 결합 항체 또는 IgG의 비는 약 1:3 미만이고, 여기서 3부의 완충액에 희석된 1부의 생물학적 샘플 또는 혈액 생성물이 50% 바이러스 벡터 중화를 초래한다.
[0050] 특정 구체예에서, 대상체, 생물학적 샘플 또는 혈액 생성물에 존재하는 바이러스 벡터 결합 항체 또는 IgG의 비는 약 1:2 미만이고, 여기서 2부의 완충액에 희석된 1부의 생물학적 샘플 또는 혈액 생성물이 50% 바이러스 벡터 중화를 초래한다.
[0051] 특정 구체예에서, 대상체, 생물학적 샘플 또는 혈액 생성물에 존재하는 바이러스 벡터 결합 항체 또는 IgG의 비는 약 1:1 미만이고, 여기서 1부의 완충액에 희석된 1부의 생물학적 샘플 또는 혈액 생성물이 50% 바이러스 벡터 중화를 초래한다.
[0052] 특정 구체예에서, 상기 방법은 단계 (a)를 수행한 후 그러나 단계 (b)를 수행하기 전 및/또는 단계 (a) 및 (b)를 수행한 후에 이종성 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된 폴리펩티드 또는 펩티드에 결합하는 항체 또는 IgG의 존재를 결정하거나 그 양을 정량화하는 것을 추가로 포함한다.
[0053] 특정 구체예에서, 상기 방법은 단계 (a)를 수행한 후 그러나 단계 (b)를 수행하기 전 및/또는 단계 (a) 및 (b)를 수행한 후에 이종성 폴리뉴클레오티드 또는 핵산에 결합하는 항체 또는 IgG의 존재를 결정하거나 그 양을 정량화하는 것을 추가로 포함한다.
[0054] 본 발명에 따른 방법은 또한 IgG와 FcRn의 상호작용을 감소시키는 제제와 조합하여 항체의 이펙터 기능을 분해 또는 소화 및/또는 억제 또는 감소시키는데 효과적인 프로테아제 또는 글리코시다제의 사용을 포함할 수 있다.
[0055] 특정 구체예에서, 대상체는 폐 질환(예를 들어, 낭성 섬유증), 출혈 장애(예를 들어, 억제제가 있거나 없는 혈우병 A 또는 혈우병 B), 지중해 빈혈, 혈액 장애(예를 들어, 빈혈), 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병, 근위축성 측삭 경화증(ALS), 간질, 리소좀 축적병(예를 들어, 아스파르틸글루코사민뇨증, 바텐병, 후기 영아 신경세포 세로이드 리포푸신증 타입 2(CLN2), 시스틴증, 파브리병, 고셔병 타입 I, II 및 III, 글리코겐 축적병 II(폼페병), GM2-강글리오시드증 타입 I(테이 삭스병), GM2-강글리오시드증 타입 II(샌드호프병), 점액지질증 타입 I(시알산증 타입 I 및 II), II(I-세포병), III(슈도-헐러병) 및 IV, 점액다당류 축적병(헐러병 및 변이체, 헌터, 산필리포 타입 A, B, C, D, 모르키오 타입 A 및 B, 마로토-라미 및 슬라이병), 니만-픽병 타입 A/B, C1 및 C2 및 쉰들러병 타입 I 및 II), 유전성 맥관부종(HAE), 구리 또는 철 축적 장애(예를 들어, 윌슨병 또는 멘케스병), 리소좀 산 리파제 결핍, 신경학적 또는 신경퇴행성 장애, 암, 타입 1 또는 타입 2 당뇨병, 아데노신 데아미나제 결핍, 대사 결함(예를 들어, 글리코겐 축적병), 고형 장기(예를 들어, 뇌, 간, 신장, 심장)의 질환, 또는 감염성 바이러스(예를 들어, B형 및 C형 간염, HIV 등), 박테리아 또는 진균 질환을 갖는다. 특정 구체예에서, 대상체는 혈액 응고 장애를 갖는다. 특정 구체예에서, 대상체는 혈우병 A, 억제 항체를 갖는 혈우병 A, 혈우병 B, 억제 항체를 갖는 혈우병 B, 임의의 응고 인자 결핍증: VII, VIII, IX, X, XI, V, XII, II, 폰 빌레브란트 인자, 또는 조합된 FV/FVIII 결핍증, 지중해 빈혈, 비타민 K 에폭사이드 환원효소 C1 결핍증 또는 감마-카르복실라제 결핍증을 갖는다.
[0056] 특정 구체예에서, 대상체는 빈혈, 외상과 관련된 출혈, 손상, 혈전증, 저혈소판증, 뇌졸중, 응고병증, 파종성 혈관 내 응고(DIC); 헤파린, 저분자량 헤파린, 오당류, 와파린, 소분자 항혈전제(즉, FXa 억제제), 또는 버나드 술리에 증후군, 글란츠만 혈소판기능저하증 또는 저장 풀 결핍증과 같은 혈소판 장애와 관련된 과잉-항응고를 갖는다.
[0057] 특정 구체예에서, 대상체는 중추 신경계(CNS)에 영향을 미치거나 기원하는 질병을 갖는다. 특정 구체예에서, 질병은 신경퇴행성 질병이다. 특정 구체예에서, CNS 또는 신경퇴행성 질병은 알츠하이머병, 헌팅턴병, ALS, 유전성 강직반마비, 원발성 측삭 경화증, 척추 근육 위축증, 케네디병, 폴리글루타민 반복 질환 또는 파킨슨병이다. 특정 구체예에서, CNS 또는 신경퇴행성 질병은 폴리글루타민 반복 질환이다. 특정 구체예에서, 폴리글루타민 반복 질환은 척수소뇌성 실조증(SCA1, SCA2, SCA3, SCA6, SCA7 또는 SCA17)이다.
[0058] 특정 구체예에서, 이종성 폴리뉴클레오티드는 인슐린, 글루카곤, 성장 호르몬(GH), 부갑상선 호르몬(PTH), 성장 호르몬 방출 인자(GRF), 난포 자극 호르몬(FSH), 황체형성 호르몬(LH), 인간 융모색식샘 자극호르몬(hCG), 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 앤지오포이에틴, 앤지오스타틴, 과립구 집락 자극 인자(GCSF), 에리트로포이에틴(EPO), 결합 조직 성장 인자(CTGF), 염기성 섬유모세포 성장 인자(bFGF), 산성 섬유모세포 성장 인자(aFGF), 표피 성장 인자(EGF), 형질전환 성장 인자 α(TGFα), 혈소판 유래 성장 인자(PDGF), 인슐린 성장 인자 I 및 II(IGF-I 및 IGF-II), TGFβ, 액티빈, 인히빈, 골 형성 단백질(BMP), 신경 성장 인자(NGF), 뇌 유래 신경영양 인자(BDNF), 뉴로트로핀 NT-3 및 NT4/5, 섬모 신경영양 인자(CNTF), 신경아교세포주 유래 신경영양 인자(GDNF), 뉴투린, 아그린, 네트린-1 및 네트린-2, 간세포 성장 인자(HGF), 에프린, 노긴, 소닉 헤지호그 및 티로신 하이드록실라제로 구성된 군으로부터 선택된 단백질을 인코딩한다.
[0059] 특정 구체예에서, 이종성 폴리뉴클레오티드는 트롬보포이에틴(TPO), 인터루킨(IL1 내지 IL-36), 단핵구 화학유인 단백질, 백혈병 억제 인자, 과립구-대식세포 집락 자극 인자, Fas 리간드, 종양 괴사 인자 α 및 β, 인터페론 α, β 및 γ, 줄기 세포 인자, flk-2/flt3 리간드, IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE, 키메라 면역글로불린, 인간화된 항체, 단일 사슬 항체, T 세포 수용체, 키메라 T 세포 수용체, 단일 사슬 T 세포 수용체, 클래스 I 및 클래스 II MHC 분자로 구성된 군으로부터 선택된 단백질을 인코딩한다.
[0060] 특정 구체예에서, 이종성 폴리뉴클레오티드는 CFTR(낭성 섬유증 막횡단 조절 단백질), 혈액 응고(응고) 인자(인자 XIII, 인자 IX, 인자 VIII, 인자 X, 인자 VII, 인자 VIIa, 단백질 C 등), 기능 획득 혈액 응고 인자, 항체, 망막 색소 상피-특이적 65 kDa 단백질(RPE65), 에리트로포이에틴, LDL 수용체, 지단백질 리파제, 오르니틴 트랜스카르바밀라제, β-글로빈, α-글로빈, 스펙트린, α-항트립신, 아데노신 데아미나제(ADA), 금속 수송체(ATP7A 또는 ATP7), 설파미다제, 리소좀 축적병(ARSA)에 관여하는 효소, 하이포크산틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제, β-25 글루코세레브로시다제, 스핑고미엘리나제, 리소좀 헥소사미니다제, 분지쇄 케토산 데하이드로게나제, 호르몬, 성장 인자, 인슐린-유사 성장 인자 1 또는 2, 혈소판 유래 성장 인자, 표피 성장 인자, 신경 성장 인자, 신경영양 인자-3 및 -4, 뇌 유래 신경영양 인자, 아교세포 유래 성장 인자, 형질전환 성장 인자 α 및 β, 사이토카인, α-인터페론, β-인터페론, 인터페론-γ, 인터루킨-2, 인터루킨-4, 인터루킨 12, 과립구-대식세포 집락 자극 인자, 림프독소, 자살 유전자 생성물, 단순 헤르페스 바이러스 티미딘 키나제, 시토신 데아미나제, 디프테리아 독소, 사이토크롬 P450, 데옥시시티딘 키나제, 종양 괴사 인자, 약물 내성 단백질, 종양 억제인자 단백질(예를 들어, p53, Rb, Wt-1, NF1, Von Hippel-Lindau (VHL), 선종성 결장폴립증(APC)), 면역조절 특성을 갖는 펩티드, 관용성 또는 면역원성 펩티드 또는 단백질 트레지톱(Tregitope) 또는 hCDR1, 인슐린, 글루코키나제, 구아닐레이트 사이클라제 2D(LCA-GUCY2D), Rab 에스코트 단백질 1(범맥락막위축), LCA 5(LCA-레버실린), 오르니틴 케톤산 아미노트랜스퍼라제(유전성 망막위축증(Gyrate Atrophy)), 레티노스키신 1(X-연결된 망막층간분리), USH1C(어셔 증후군 1C), X-연결된 색소성 망막염 GTPase(XLRP), MERTK(AR 형태의 RP: 색소성 망막염), DFNB1(코넥신 26 난청), ACHM 2, 3 및 4(완전색맹), PKD-1 또는 PKD-2(다낭성 신장 질환), TPP1, CLN2, 설파타제, N-아세틸글루코사민-1-포스페이트 트랜스퍼라제, 카텝신 A, GM2-AP, NPC1, VPC2, 스핑고지질 활성화제 단백질, 유전체 편집을 위한 하나 이상의 아연 핑거 뉴클레아제, 및 유전체 편집을 위한 복구 주형으로 사용되는 하나 이상의 공여자 서열을 인코딩한다.
[0061] 특정 구체예에서, 이종성 폴리뉴클레오티드는 억제성 핵산을 인코딩한다. 특정 구체예에서, 억제성 핵산은 siRNA, 안티센스 분자, miRNA, RNAi, 리보자임 및 shRNA로 구성된 군으로부터 선택된다. 특정 구체예에서, 억제성 핵산은 헌팅틴(HTT) 유전자, 치상핵적핵담창구시상하핵 위축증과 관련된 유전자(아트로핀 1, ATN1), 척수구근 근위축증에서 X 염색체 상의 안드로겐 수용체, 인간 어택신-1, -2, -3 및 -7, Cav2.1 P/Q 전압-의존성 칼슘 채널(CACNA1A), TATA-결합 단백질, 어택신 8 반대 가닥(ATXN8OS), 척수소뇌성 실조증에서 세린/트레오닌-단백질 포스파타제 2A 55 kDa 조절 서브유닛 B 베타 아이소형(타입 1, 2, 3, 6, 7, 8, 12 17), 취약 X 증후군에서 FMR1(취약 X 정신 지체 1), 취약 X-관련 떨림/운동실조 증후군에서 FMR1(취약 X 정신 지체 1), 취약 XE 정신 지체에서 FMR1(취약 X 정신 지체 2) 또는 AF4/FMR2 패밀리 구성원 2; 근긴장 디스트로피에서 마이오토닌-단백질 키나제(MT-PK); 프리드리히 운동실조에서 프라탁신; 근위축성 측삭 경화증에서 수퍼옥사이드 디스뮤타제 1(SOD1) 유전자의 돌연변이체; 파킨슨병 및/또는 알츠하이머병의 발병기전에 관여하는 유전자; 아포지단백질 B(APOB) 및 프로단백질 전환효소 서브틸리신/케신 타입 9(PCSK9), 고콜레스테롤혈증; HIV 감염에서 인간 면역결핍 바이러스 트랜스활성화제의 전사 유전자인 HIV Tat; HIV 감염에서 인간 면역결핍 바이러스 트랜스활성화제 반응 요소 유전자인 HIV TAR; HIV 감염에서 C-C 케모카인 수용체(CCR5); RSV 감염에서 Rous 육종 바이러스(RSV) 뉴클레오캡시드 단백질, C형 간염 바이러스 감염에서 간-특이적 마이크로RNA(miR-122); p53, 급성 신장 손상 또는 이식편 기능 지연 신장 이식 또는 신장 손상 급성 신부전; 진행 재발성 또는 전이성 고형 악성종양에서 단백질 키나제 N3(PKN3); LMP2, 프로테아좀 서브유닛 베타-타입 9(PSMB 9)로도 알려진 LMP2, 전이성 흑색종; 프로테아좀 서브유닛 베타-타입 8(PSMB 8)로도 알려진 LMP7, 전이성 흑색종; 프로테아좀 서브유닛 베타-타입 10(PSMB 10)으로도 알려진 MECL1, 전이성 흑색종; 고형 종양에서 혈관 내피 성장 인자(VEGF); 고형 종양에서 키네신 방추 단백질, 만성 골수성 백혈병에서 아폽토시스 억제인자 B-세포 CLL/림프종(BCL-2); 고형 종양에서 리보뉴클레오티드 환원효소 M2(RRM2); 고형 종양의 푸린; 간 종양에서 폴로-유사 키나제 1(PLK1), C형 간염 감염에서 디아실글리세롤 아실트랜스퍼라제 1(DGAT1), 가족성 선종성 폴립증에서 베타-카테닌; 베타2 아드레날린 수용체, 녹내장; 당뇨병 황반 부종(DME) 또는 연령-관련 황반 변성에서 DNA 손상-유도성 전사체 4 단백질로도 알려진 RTP801/Redd1; 연령-관련 황반 변성 또는 맥락막 혈관신생에서 혈관 내피 성장 인자 수용체 I(VEGFR1), 비-동맥 허혈성 시신경병증에서 카스파제 2; 선천성 손발톱비대증에서 케라틴 6A N17K 돌연변이체 단백질; 인플루엔자 감염에서 인플루엔자 A 바이러스 유전체/유전자 서열; 중증 급성 호흡기 증후군(SARS) 감염에서 SARS 코로나바이러스 유전체/유전자 서열; 호흡기 세포 융합 바이러스 감염에서 호흡기 세포 융합 바이러스 유전체/유전자 서열; 에볼라 감염에서 에볼라 필로바이러스 유전체/유전자 서열; B형 및 C형 간염 감염에서 B형 및 C형 간염 바이러스 유전체/유전자 서열; 단순 헤르페스 바이러스(HSV) 감염에서 HSV 유전체/유전자 서열, 콕사키바이러스 B3 감염에서 콕사키바이러스 B3 유전체/유전자 서열; 원발성 근긴장이상, 범-부류 I에서 토르신 A(TOR1A)와 같은 유전자의 병원성 대립유전자 및 이식에 특이적인 HLA-대립유전자의 침묵(대립유전자-특이적 침묵); 및 상염색체 우성 유전 색소성 망막염(adRP)에서 돌연변이체 로돕신 유전자(RHO)로 구성된 군으로부터 선택된 유전자, 유전자의 전사체, 또는 폴리뉴클레오티드 반복 질환과 관련된 유전자의 전사체에 결합한다.
[0062] 특정 구체예에서, 이종성 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된 단백질은 유전자 편집 뉴클레아제를 포함한다. 특정 구체예에서, 유전자 편집 뉴클레아제는 아연 핑거 뉴클레아제(ZFN) 또는 전사 활성화제-유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN)를 포함한다. 특정 구체예에서, 유전자 편집 뉴클레아제는 기능성 타입 II CRISPR-Cas9를 포함한다.
[0063] 특정 구체예에서, 본 발명의 방법의 단계 (a) 및/또는 단계 (b)는 2회 이상 수행된다.
[0064] 특정 구체예에서, 대상체는 포유동물이다. 특정 구체예에서, 대상체는 인간이다.
[0065] 또한, 본 발명에 따른 방법을 실시하는데 사용될 수 있는 성분을 갖는 조성물, 예를 들어 그리고 비제한적으로, 패키지 및 키트가 본원에 개시된다.
[0066] 특정 구체예에서, 패키지 또는 키트는 그 안에 배치된 (a) 단백질 또는 펩티드를 인코딩하는 이종성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 바이러스 벡터; (b) IgG와 FcRn의 상호작용을 감소시키는 제제; (c) 선택적으로, 항체를 분해하거나 소화하는 프로테아제 또는 글리코시다제; 및 (d) 본원에 개시된 바와 같은 방법을 수행하기 위한 설명서가 있는 라벨을 갖는다. 특정 구체예에서, (a), (b) 및 (c)는 별도의 또는 동일한 용기에 있다.
[0067] 특정 구체예에서, 패키지 또는 키트는 그 안에 배치된 (a) 단백질의 발현을 억제, 감소 또는 저하시키는 핵산으로 전사되는 이종성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 바이러스 벡터; (b) IgG와 FcRn의 상호작용을 감소시키는 제제; (c) 선택적으로, 항체를 분해하거나 소화하는 프로테아제 또는 글리코시다제; 및 (d) 본원에 개시된 바와 같은 방법을 수행하기 위한 설명서가 있는 라벨을 갖는다. 특정 구체예에서, (a), (b) 및 (c)는 별도의 또는 동일한 용기에 있다.
도면의 설명
[0068] 도 1a, 1b 및 1c는 IdeS의 양을 증가시키면서 인큐베이션된, 인간 환자 혈청(도 1a), 비인간 영장류(레서스 원숭이) 혈장(도 1b) 및 햄스터 혈장(도 1c)의 샘플에서 IdeS에 의한 IgG의 절단의 SDS-PAGE 분석을 보여준다. 샘플을 IdeS 없이 또는 IdeS의 농도를 증가시키면서 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 샘플 완충액을 첨가하여 반응을 중단시켰다. 비환원 SDS-PAGE 및 쿠마시 염색에 의해 샘플을 분석하였다.
[0069] 도 2는 IdeZ가 있거나 없이 전처리된 다양한 양의 IVIg로 면역화된 동물에서 AAV-Spk1-GAA 벡터의 주입 후 뮤린 혈장에서 GAA 활성 수준을 보여주는 그래프이다. AAV-Spk1-GAA 벡터는 IVIg 면역화 1일 후에 주입되었다. 트랜스진 활성은 벡터 투여 2주 후에 GAA 활성 검정에 의해 평가되었다. nmol/hr/mL의 GAA 활성은 각 그룹의 각 마우스에 대해 플롯팅된다. 대조군 마우스는 IVIg의 부재하에 벡터만을 투여받았다.
[0070] 도 3은 IdeS 주입 전 및 후의 뮤린 혈장에서 항-Spk1 중화 항체(NAb) 역가 수준을 보여준다. 이 연구에서 상대적인 NAb 역가 수준은 낮은 역가(<1:1, 1:1-1:2.5)(볼드체), 중간-범위 역가(1:2.5-1:5)(볼드 이탤릭체) 및 높은 역가(>1:5-1:10)(이탤릭체)로 지정된다.
[0071] 도 4는 IdeS 주입 전 및 후의 뮤린 혈장에서 항-Spk1 IgG NAb 수준(ng/mL)을 보여준다. 음성 대조군 동물은 IVIg 또는 IdeS로 처리되지 않았다. IdeS Low는 연구에 사용된 0.4 mg/kg IdeS를 나타내고, IdeS High는 4 mg/kg IdeS를 나타낸다.
[0072] 도 5는 IVIg로 면역된 후 IdeS로 처리된 동물에서 AAV-Spk1-GAA 벡터의 주입 후 뮤린 혈장에서 GAA 활성 수준(nmol/hr/mL)을 보여준다. 모든 동물은 2x1012 vg/kg AAV-Spk1-GAA 벡터를 받았다. 트랜스진 활성은 IVIg로 면역된 후 IdeS로 처리되거나 처리되지 않고, 마지막으로 벡터가 투여된 마우스의 혈장 샘플에서 측정되었다. 트랜스진 활성은 벡터 투여 1주 후에 GAA 활성 검정에 의해 평가되었다. nmol/hr/mL의 GAA 활성은 각 그룹의 각 마우스에 대해 플롯팅된다.
[0073] 도 6은 이전에 IVIg(0, 300, 800 또는 1600 mg/kg)를 주입하고 IdeS(0, 0.4, 1.0 또는 2.0 mg/kg)로 처리된 동물에서 AAV-Spk1-GAA 벡터(2 x 1012 vg/kg)의 주입 2주 후에 GAA 활성 수준(nmol/hr/mL)을 보여준다. GAA 활성은 각 그룹의 각 마우스에 대해 플롯팅된다. 상응하는 항-Spk1 NAb 역가가 발생하지 않은(즉, IdeS 처리 전 NAb 역가 <1:1 또는 1:1-1:2.5를 가짐) IVIg 투여된 그룹의 마우스는 제외되었다.
[0074] 도 7은 상이한 IdeS 제조물(로트 #1 및 로트 #2)을 주입하기 전 및 후에 측정된, 인간 항-캡시드 중화 IgG의 인공 역가를 갖는 C57BL/6 마우스의 혈장에서 항-Spk1 NAb 역가 수준을 보여준다.
[0075] 도 8은 AAV-Spk1-hFVIII 투여 전 및 투여 1주 및 2주 후에, 인간 항-캡시드 중화 IgG의 인공 역가를 갖는 C57BL/6 마우스로부터의 혈장에서 인간 인자 VIII의 수준을 보여주는 그래프이다.
[0076] 도 9는 IdeS 주입 전 및 후의 마우스 혈장에서 항-Spk1 캡시드 IgG 수준(ng/mL)을 보여주는 그래프이다. 인간 항-캡시드 중화 IgG의 인공 역가를 유도하기 위해 C57BL/6 마우스에게 IVIg를 제공하였다. 음성 대조군 동물은 IVIg 또는 IdeS로 처리되지 않았다. 낮은 IVIg는 연구에 사용된 300 mg/kg IVIg를 나타내고, 중간 IVIg는 800 mg/kg을 나타내며, 높은 IVIg는 1600 mg/kg을 나타낸다. 각 IVIg 그룹 내에서, 동물은 증가하는 용량의 IdeS(0, 0.4, 1.0, 2.0 mg/kg IdeS)로 처리되었다. IVIg로 처리되었지만 항-캡시드 IgG 반응이 없는 동물은 그래프에서 제외되었다.
[0077] 도 10은 실시예 13에 기재된 연구의 5개 그룹의 Tg32 마우스 각각에 대해 0일(D0) 및 2일(D2)에 마우스 혈장에서 평가된 NAb 역가의 그래프이다. 상단 및 하단 점선은 각각 검출 상한(ULOD) 및 검출 하한(LLOD)을 나타낸다. 통계적 유의성은 Wilcoxin 대응 비모수 t-테스트에 의해 p<0.0234 =*, p<0.0039=**, Mann-Whitney 비대응 비모수 t-테스트에 의해 p<0.5로 정의된다.
[0078] 도 11은 실시예 13에 기재된 연구의 5개 그룹의 Tg32 마우스 각각에 대해 0일(D0) 및 2일(D2)에 마우스의 혈장에서 ELISA에 의해 결정된 항-Spk1 IgG 농도의 그래프이다. 항-Spk1 IgG ELISA. 통계적 유의성은 Wilcoxin 대응 비모수 t-테스트에 의해 p<0.0313=**, Mann-Whitney 비대응 비모수 t-테스트에 의해 p<0.0152=*, p<0.0022=**로 정의된다.
[0079] 도 12는 AAV 형질도입을 가능하게 하는 대상체에서 고역가 중화 항체(NAb)를 제거하기 위해 항-FcRn 제제 및 IdeS의 조합 투여 개념의 그래프 표현을 제공한다.
[0080] 도 13은 뉴질랜드 흰토끼에 대한 재투여 연구를 개략적으로 보여준다.
[0081] 도 14는 사이노몰구스 원숭이에서 항-FcRn 연구를 개략적으로 보여준다.
상세한 설명
[0082] IgG와 신생아 Fc 수용체(FcRn)의 상호작용을 억제하거나 감소시키는 제제의 투여를 포함하는 유전자 요법의 이점 또는 효과를 개선하는 방법이 본원에 제공된다. 또한, 재조합 바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터에 결합하거나, 재조합 바이러스 벡터에 의해 캡시드화된 치료적 이종성 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된 폴리펩티드, 단백질 또는 펩티드 또는 핵산에 결합하거나, 치료적 이종성 폴리뉴클레오티드에 결합하는 순환 항체를 감소시키는 방법이 본원에 제공된다. 또한, 유전자 치료 벡터에 결합 및/또는 중화시키는 항체를 갖는 대상체에 유전자 치료 벡터를 투여하는 방법이 본원에 제공된다. 또한, 유전자 치료 벡터가 이전에 투여된 대상체에 유전자 치료 벡터를 재용량 또는 재투여하는 방법이 본원에 제공되며, 여기서 대상체는 유전자 치료 벡터에 결합 및/또는 중화시키는 항체를 발달시켰다.
[0083] 특정 구체예에서, 방법은 IgG와 FcRn의 상호작용을 감소시키는데 효과적인 양의 제제를 대상체에 투여하는 것을 포함한다. FcRn은 IgG 재순환이라고 하는 과정을 통해 IgG 유형의 면역글로불린의 혈청 반감기를 연장시키는 역할을 한다. FcRn은 많은 세포 유형의 엔도솜 구획에 위치한다. 세포내이입된 IgG가 엔도솜 경로를 통해 이동할 때, IgG의 Fc 부분은 산성의 초기 엔도솜에서 FcRn에 의해 결합되어 FcRn-IgG 복합체를 형성한다. FcRn-IgG 복합체는 리소좀 경로(일반적으로 IgG를 분해하거나 이화작용함)로부터 멀리 이동하여 원형질막 및 세포 표면으로 되돌아간다. 상승된 세포 외 pH는 복합체의 해리 및 세포로부터 다시 순환으로의 IgG의 방출을 야기하고, 따라서 IgG의 혈청 반감기를 연장시킨다. IgG와 FcRn의 상호작용을 감소시키거나 억제하는 것은 IgG 재순환을 감소시키고, IgG 제거, 분해 및 이화작용을 증가 또는 향상시키고, (혈액, 혈청 또는 혈장에서 측정 가능한 바와 같이) 순환에서 더 적은 양(감소된 역가)의 IgG를 초래할 것이다. 순환 IgG의 더 낮은 역가는 유전자 치료 벡터에 결합 및/또는 중화시키는 순환 항체의 더 낮은 역가를 의미한다. IgG와 FcRn 사이의 상호작용을 억제하거나 감소시킬 수 있는 제제의 투여는 IgG 재순환을 감소시키고, IgG 제거, 분해 및 이화작용을 증가 또는 향상시킬 것이며, 순환에서 IgG의 더 적은 양(감소된 역가), 및 유전자 요법 치료의 개선되거나 강화된 효능을 초래할 것이다.
[0084] 본원에서 사용되는 "IgG와 FcRn의 상호작용 감소" 및 "IgG와 FcRn의 상호작용을 감소시키는"은 IgG와 FcRn의 상호작용 또는 IgG-FcRn 결합의 임의의 감소 또는 억제를 포함한다. IgG와 FcRn의 상호작용을 감소시키고 본 발명에서 사용될 수 있는 제제는 문헌[Low et al., 2009, AAPS J., 11:432-434, Sockolosky et al., 2015, Adv. Drug Deliv. Rev., 91:109-124, Zuercher et al., 2019, Autoimm. Rev., doi.org/10.1016/j.autrev.2019.102366, and Pyzik et al., 2019, Frontiers Immunol., doi: 103389/fimmu.2019.01540]에서 검토된다. 감소, 저하 또는 억제된 IgG와 FcRn의 상호작용은 IgG의 혈청 또는 혈장 수준을 포함하는 FcRn 활성의 하류 판독 또는 하나 이상의 신호전달 활성을 검출하거나 측정함으로써 평가될 수 있다. IgG와 FcRn의 상호작용을 감소시키는 제제는 또한 본원에서 "항-FcRn 제제" 또는 "FcRn 길항제"로 지칭된다.
[0085] 본 발명에서 사용될 수 있는 IgG와 FcRn의 상호작용을 감소시키는 제제의 예는, 예를 들어 그리고 비제한적으로, FcRn에 결합하는 항체, ABDEG(IgG 분해를 향상시키는 항체), FcRn-결합 펩티드(GHFGGXY 컨센서스 모티프를 갖는 것들 포함, 여기서 X는 소수성 아미노산이고 모티프는 디설파이드 루프에 의해 둘러싸여 있음), FcRn-결합 아피바디 및 소분자 FcRn 길항제를 포함한다.
[0086] 본 발명에서 사용될 수 있는 항-FcRn 항체의 예는 IgG 생산을 보존하면서 FcRn-매개 재순환을 억제하고 병원성 IgG를 감소시키는 완전한 인간 항-FcRn 항체인 M281(니포칼리맙)이다(Ling et al. 2019 참조). 본 발명에서 사용될 수 있는 다른 항-FcRn 항체는, 예를 들어 그리고 비제한적으로, 국제 특허 출원 공개 WO2018023136, WO2019118791 및 WO2020018910에 기재된 항체를 포함하며, 이들 각각은 모든 텍스트, 표, 서열 목록 및 도면을 포함하여, 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
[0087] 특정 구체예에서, 항-FcRn 항체는 경쇄 및 중쇄를 포함하고, 경쇄는 SEQ ID NO: 49의 서열에 대해 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하고; 중쇄는 SEQ ID NO: 50의 서열에 대해 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
[0088] 특정 구체예에서, 항-FcRn 항체는 경쇄 및/또는 중쇄를 포함하고, 경쇄는 SEQ ID NO: 49의 서열에 대해 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하고; 중쇄는 SEQ ID NO: 50의 서열에 대해 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
[0089] 특정 구체예에서, 항-FcRn 항체는 경쇄 및/또는 중쇄를 포함하고, 경쇄는 SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52 및 SEQ ID NO: 53으로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 상보성 결정 영역(CDR) 서열을 포함하고; 중쇄는 SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55 및 SEQ ID NO: 56으로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 CDR 서열을 포함한다.
[0090] 특정 구체예에서, 항-FcRn 항체는 경쇄 및/또는 중쇄를 포함하고, 경쇄는 SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52 및 SEQ ID NO: 53의 상보성 결정 영역(CDR) 서열을 포함하고; 중쇄는 SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55 및 SEQ ID NO: 56의 CDR 서열을 포함한다.
[0091] 특정 구체예에서, 항-FcRn 항체는 SEQ ID NO: 49의 서열에 대해 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
[0092] 특정 구체예에서, 항-FcRn 항체는 SEQ ID NO: 49의 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
[0093] 특정 구체예에서, 항-FcRn 항체는 SEQ ID NO: 50의 서열에 대해 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다.
[0094] 특정 구체예에서, 항-FcRn 항체는 SEQ ID NO: 50의 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다.
[0095] 본 발명에서 사용될 수 있는 FcRn-결합 펩티드의 예는 FcRn에 결합하고 전체 혈청 IgG 수준을 감소시키는 SYN1436이다(Mezo et al., 2008, Bioorg. Med. Chem., 16:6394-6405 참조).
[0096] 아피바디 분자는 폴딩된 역-평행 3-나선 다발 구조를 갖는 58개 아미노산 길이의 친화성 단백질 도메인이다. 본 발명에서 사용될 수 있는 항-FcRn 아피바디는, 예를 들어 그리고 비제한적으로, ZFcRn 및 문헌[Seijseng et al., 2018, Scientific Reports, 8:5141, doi:10.1038/s41598-018-23481-5]에 기재된 다른 것들을 포함한다.
[0097] IgG와 FcRn의 상호작용을 감소시키고 본 발명에서 사용될 수 있는 소분자 FcRn 길항제의 예는 문헌[Wang et al., 2013, Bioorg. Med. Chem. Let., 23:1253-1256]에 기재되어 있다.
[0098] ABDEG는 Fc-부분이 생리학적 및 엔도솜 pH 모두에서 FcRn에 대해 높은 친화도로 결합하도록 공학처리된 IgG 분자이다.
[0099] FcRn에 대해 증가된 친화도로 결합하고 본 발명에서 사용될 수 있는 변이체 Fc 영역을 갖는 FcRn 길항제 조성물의 예는 국제 특허 출원 공개 WO2015/100299에 기재되어 있다.
[0100] 에프가르티지모드(Efgartigimod)는 FcRn에 높은 친화도로 결합하고 FcRn이 순환 IgG와 상호작용하고 이를 재순환시키는 것을 방지하는 변형된(ABDEG 기술에 의해) 인간 IgG1 유래 Fc 단편이다(Ulrichts et al., 2018, J. Clin. Invest., 128:4372-4386).
[0101] 로자놀릭시주맙(Rozanolixizumab)은 7 mg/kg의 용량으로 투여될 때 인간에서 IgG 수준을 약 45%만큼 감소시키는 IgG4P 아이소형 항-FcRn 모노클로날 항체이다(Kiessling et al., 2017, Sci. Transl. Med., 9:aan1208. doi: 10.1126/scitranslmed.aan1208).
[0102] SYNT001은 인간에서 모든 순환 IgG 서브타입 및 IgG 면역 복합체를 감소시키는 FcRn-차단 모노클로날 항체이다(Blumberg et al., 2019, Sci. Adv., 5:eaax9586).
[0103] 특정 구체예에서, IgG와 FcRn의 상호작용을 감소시키는 제제는 FcRn과 IgG 사이의 상호작용에 의해 매개되는 신호전달을 억제한다.
[0104] 특정 구체예에서, IgG와 FcRn의 상호작용을 감소시키는 제제는 펩티드, 단백질, 소분자, 핵산, 압타머, 올리고뉴클레오티드, 아피바디, 항체 또는 이들의 조합이다.
[0105] 특정 구체예에서, IgG와 FcRn의 상호작용을 감소시키는 제제는 에프가르티지모드, M281, 로자놀릭시주맙, SYNT001 및 IMVT-1401로부터 선택된다.
[0106] 특정 구체예에서, IgG와 FcRn의 상호작용을 감소시키는 제제는 모노클로날 항체 또는 이의 단편, 폴리클로날 항체 또는 이의 단편, 키메라 항체, 인간화된 항체 및 단일 사슬 항체로 구성된 군으로부터 선택된 항체이다.
[0107] 특정 구체예에서, IgG와 FcRn의 상호작용을 감소시키는 제제는 IgG 및 FcRn에 대한 결합 부위를 포함하는 이중특이적 제제이다.
[0108] 특정 구체예에서, IgG와 FcRn의 상호작용을 감소시키는 제제는 IgG의 재조합 Fc 부분 또는 이의 생물학적 활성 부분 또는 이의 프로테오미메틱(proteo-mimetic)이다.
[0109] 특정 구체예에서, 순환 IgG는 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99% 또는 100%만큼 감소된다.
[0110] (a) 단백질 또는 펩티드를 인코딩하는 이종성 폴리뉴클레오티드 또는 핵산을 포함하는 재조합 바이러스 벡터; (b) IgG와 FcRn의 상호작용을 감소시키는 제제, (c) 선택적으로, 항체를 분해하거나 소화하는 프로테아제 또는 글리코시다제; 및 (d) 본원에 기술된 방법을 수행하기 위한 설명서가 있는 라벨을 갖는, 예를 들어, 패키지 또는 키트로서 제공되는 조성물이 본원에 추가로 제공되며, 여기서 (a), (b) 및 (c)는 별도의 또는 동일한 용기(들)에 제공된다.
[0111] 특정 구체예에서, 방법은 재조합 바이러스 벡터, 및/또는 핵산, 및/또는 이종성 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된 단백질 또는 펩티드에 결합하는 항체의 이펙터 기능을 억제하거나 감소시키는데 효과적인 양의 글리코시다제를 대상체에 투여하는 것을 추가로 포함한다. 특정 구체예에서, 방법은 재조합 바이러스 벡터, 및/또는 핵산, 및/또는 이종성 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된 단백질 또는 펩티드에 결합하는 항체의 이펙터 기능을 억제하거나 감소시키는데 효과적인 항체 또는 엔도글리코시다제를 분해 또는 소화하는데 효과적인 양의 엔도펩티다제를 대상체에 투여하는 것을 추가로 포함한다.
[0112] 특정 구체예에서, 방법은 재조합 바이러스 벡터, 및/또는 핵산, 및/또는 이종성 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된 단백질 또는 펩티드에 결합하는 항체의 Fc 수용체 결합을 감소시키는데 효과적인 양의 글리코시다제를 대상체에 투여하는 것을 추가로 포함한다. 특정 구체예에서, 방법은 재조합 바이러스 벡터, 및/또는 핵산, 및/또는 이종성 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된 단백질 또는 펩티드에 결합하는 항체의 Fc 수용체 결합을 감소시키는데 효과적인 양의 엔도글리코시다제를 대상체에 투여하는 것을 추가로 포함한다.
[0113] 본 발명의 방법은 유전자 요법 치료의 향상에 널리 적용될 수 있다. 예를 들어, IgG와 FcRn의 상호작용을 감소시키는 제제의 투여에 의해 NAb를 AAV 캡시드 또는 다른 방식의 유전자 치료 전달로 극복하는 것은 기존 AAV 중화 항체 역가를 갖는 환자의 치료를 가능하게 할뿐만 아니라 유효 수준이 달성되지 않았거나 시간 또는 기타 혼란스러운 문제로 인해 손실된 경우 이전에 AAV 유전자 치료 생성물을 투여받은 환자의 반복 투여를 가능하게 할 가능성이 있다. 예를 들어, IdeS의 투여와 조합된 IgG와 FcRn의 상호작용을 감소시키는 제제의 투여는 기존 NAb를 갖는 환자의 유전자 요법 치료의 효능을 추가로 향상시킬 수 있다. 추가로, 본원의 방법은 소아 집단으로의 간 유전자 전달을 가능하게 하며, 이는 발달 중 간세포 확장 및 트랜스진 발현의 잠재적 손실로 인해 유전자 치료로 다루기 힘든 것으로 여겨져 왔다. 추가의 예에서, 본 발명의 방법에서, 선택적으로 프로테아제(예를 들어, IdeS) 또는 글리코시다제(예를 들어, EndoS)의 투여와 조합된 IgG와 FcRn의 상호작용을 감소시키는 제제의 투여는 AAV 캡시드에 대한 중화 항체를 감소시키거나 제거하고 이전에 유전자 치료에 적합하지 않은 것으로 여겨지거나 AAV 유전자 치료 후 AAV 항체를 발달시킨 환자의 치료를 가능하게 할 것이다.
[0114] 특정 구체예에서, 본 발명에서 사용될 수 있는 바이러스 벡터는, 예를 들어 그리고 비제한적으로, AAV 입자를 포함한다. 특정 구체예에서, 본 발명에서 사용될 수 있는 바이러스 벡터는, 예를 들어 그리고 비제한적으로, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 헬퍼-의존성 아데노바이러스, 하이브리드 아데노바이러스, 단순 헤르페스 바이러스, 렌티바이러스, 폭스바이러스, 엡스타인-바 바이러스, 백시니아 바이러스 및 인간 사이토메갈로바이러스 벡터(이들의 재조합 버전 포함)를 포함한다.
[0115] 바이러스 벡터, 예를 들어, 재조합 AAV(rAAV) 벡터의 수식어뿐만 아니라 재조합 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드와 같은 서열의 수식어로서 용어 "재조합"은 조성물이 일반적으로 자연에서 발생하지 않는 방식으로 조작(즉, 공학처리)되었음을 의미한다. 재조합 AAV 벡터의 특정 예는 야생형 AAV 유전체(이종성 폴리뉴클레오티드)에 정상적으로 존재하지 않는 핵산이 바이러스 유전체 내에 삽입된 경우일 것이다. 그 예는 치료적 단백질 또는 폴리뉴클레오티드 서열을 인코딩하는 핵산(예를 들어, 유전자)이, 유전자가 AAV 유전체 내에 정상적으로 결합되어 있는 5 ', 3' 및/또는 인트론 영역을 갖거나 갖지 않는 벡터 내로 클로닝되는 경우일 것이다. 용어 "재조합"이 AAV 벡터뿐만 아니라 폴리뉴클레오티드와 같은 서열과 관련하여 항상 사용되는 것은 아니지만, AAV 벡터, 폴리뉴클레오티드 등을 포함하는 재조합 형태는 모든 이러한 생략에도 불구하고 명시적으로 포함된다.
[0116] 예를 들어, "rAAV 벡터"는 분자 방법을 사용하여 야생형 AAV 유전체의 전부 또는 일부를 제거하고 치료적 단백질 또는 폴리뉴클레오티드 서열을 인코딩하는 핵산과 같은 비-천연(이종성) 핵산으로 대체함으로써 AAV의 야생형 유전체로부터 유래된다. 전형적으로, rAAV 벡터의 경우, AAV 유전체의 하나 또는 둘 모두의 역 말단 반복(ITR) 서열이 유지된다. rAAV는, 예를 들어, 치료적 단백질 또는 폴리뉴클레오티드 서열을 인코딩하는 이종성 핵산을 갖는 AAV 유전체 핵산과 관련하여 AAV 유전체의 전부 또는 일부가 비-천연 서열로 대체되었기 때문에 AAV 유전체와 구별된다. 따라서, 비-천연(이종성) 서열의 혼입은 AAV를 "재조합" AAV 벡터로서 정의하며, 이는 "rAAV 벡터"로서 지칭될 수 있다.
[0117] 재조합 AAV 벡터 서열은 패키징될 수 있고- 생체 외, 시험관 내 또는 생체 내에서 세포의 후속 감염(형질도입)을 위한 "입자"로서 본원에서 지칭된다. 재조합 벡터 서열이 AAV 입자로 캡시드화되거나 패키징되는 경우, 입자는 "rAAV", "rAAV 입자" 및/또는 "rAAV 비리온"으로도 지칭될 수 있다. 이러한 rAAV, rAAV 입자 및 rAAV 비리온은 벡터 유전체를 캡시드화하거나 패키징하는 단백질을 포함한다. 특정 예는, AAV의 경우 캡시드 단백질을 포함한다.
[0118] "vg"로 축약될 수 있는 "벡터 유전체"는 궁극적으로 패키징되거나 캡시드화되어 rAAV 입자를 형성하는 재조합 플라스미드 서열의 부분을 지칭한다. 재조합 플라스미드가 재조합 AAV 벡터를 작제 또는 제조하는데 사용되는 경우, AAV 벡터 유전체는 재조합 플라스미드의 벡터 유전체 서열에 상응하지 않는 "플라스미드"의 부분을 포함하지 않는다. 재조합 플라스미드의 이러한 비-벡터 유전체 부분은 증식 및 재조합 AAV 벡터 생산에는 필요하지만, 자체적으로 rAAV 입자로 패키징되거나 캡시드화되지 않는 과정인 플라스미드의 클로닝 및 증폭에 중요한 "플라스미드 백본"으로 지칭된다. 따라서, "벡터 유전체"는 rAAV에 의해 패키징되거나 캡시드화된 핵산을 지칭한다.
[0119] AAV 벡터와 관련하여 본원에서 사용되는 용어 "혈청형"은 다른 AAV 혈청형과 혈청학적으로 구별되는 캡시드를 의미한다. 혈청학적 특수성은 다른 AAV에 비해 하나의 AAV에 대한 항체 간의 교차-반응성의 결여에 기초하여 결정된다. 교차-반응성의 차이는 일반적으로 캡시드 단백질 서열/항원성 결정인자의 차이 때문이다(예를 들어, AAV 혈청형의 VP1, VP2 및/또는 VP3 서열 차이 때문이다). 하나의 AAV에 대한 항체는 캡시드 단백질 서열의 상동성으로 인해 하나 이상의 다른 AAV 혈청형과 교차-반응할 수 있다.
[0120] 기존의 정의에서, 혈청형은 관심 바이러스가 중화 활성에 대해 모든 기존의 및 특성화된 혈청형에 특이적인 혈청에 대해 검사를 받았고 관심 바이러스를 중화시키는 항체는 발견되지 않았음을 의미한다. 더 많은 자연 발생 바이러스 분리물이 발견되고/되거나 캡시드 돌연변이체가 생성됨에 따라, 현재 존재하는 혈청형 중 임의의 것과 혈청학적 차이가 있을 수도 있고 없을 수도 있다. 따라서, 새로운 바이러스(예를 들어, AAV)가 혈청학적 차이를 갖지 않는 경우, 이 새로운 바이러스(예를 들어, AAV)는 상응하는 혈청형의 서브그룹 또는 변이체일 것이다. 많은 경우에, 중화 활성을 위한 혈청학 검사는 혈청형의 전통적인 정의에 따라 다른 혈청형을 갖는지를 결정하기 위해 캡시드 서열 변형을 갖는 돌연변이체 바이러스에 대해 아직 수행되지 않았다. 따라서, 편의상 그리고 반복을 피하기 위해, 용어 "혈청형"은 혈청학적으로 별개인 바이러스(예를 들어, AAV)뿐만 아니라 주어진 혈청형의 서브그룹 또는 변이체 내에 있을 수 있는 혈청학적으로 별개가 아닌 바이러스(예를 들어, AAV) 둘 모두를 지칭한다.
[0121] rAAV 벡터는 임의의 바이러스 균주 또는 혈청형을 포함한다. 예를 들어 그리고 비제한적으로, rAAV 벡터 유전체 또는 입자(캡시드, 예를 들어, VP1, VP2 및/또는 VP3)는, 예를 들어, AAV-1, -2, -3, -4, -5, -6, -7, -8, -9, -10, -11, -12, -rh74, -rh10, AAV3B 또는 AAV-2i8과 같은 임의의 AAV 혈청형에 기초할 수 있다. 이러한 벡터는 동일한 균주 또는 혈청형(또는 서브그룹 또는 변이체)에 기초하거나, 서로 상이할 수 있다. 예를 들어 그리고 비제한적으로, 하나의 혈청형 유전체에 기초한 rAAV 플라스미드 또는 벡터 유전체 또는 입자(캡시드)는 벡터를 패키징하는 캡시드 단백질 중 하나 이상과 동일할 수 있다. 또한, rAAV 플라스미드 또는 벡터 유전체는 벡터 유전체를 패키징하는 캡시드 단백질 중 하나 이상과 구별되는 AAV 혈청형 유전체에 기초할 수 있으며, 이 경우에 3개의 캡시드 단백질 중 적어도 하나는 상이한 AAV 혈청형, 예를 들어, 이를 테면, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, -rh74, -rh10, AAV3B, AAV-2i8, SPK1(SEQ ID NO: 1), SPK2 (SEQ ID NO: 2) 또는 이의 변이체일 수 있다. 보다 구체적으로, rAAV2 벡터 유전체는 AAV2 ITR을 포함할 수 있지만, 상이한 혈청형, 예를 들어, 이를 테면, AAV1, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, -rh74, -rh10, AAV3B, AAV-2i8, SPK1(SEQ ID NO: 1), SPK2(SEQ ID NO: 2) 또는 이의 변이체로부터의 캡시드를 포함할 수 있다. 따라서, rAAV 벡터는 "슈도형"으로도 지칭될 수 있는 "혼합된" 혈청형뿐만 아니라 특정 혈청형에 특징적인 유전자/단백질 서열과 동일한 유전자/단백질 서열을 포함한다.
[0122] 특정 구체예에서, rAAV 플라스미드 또는 벡터 유전체 또는 입자는 파충류 또는 무척추동물 AAV 변이체, 예를 들어, 뱀 및 도마뱀 파르보바이러스(Penzes et al., 2015, J. Gen. Virol., 96:2769-2779) 또는 곤충 및 새우 파르보바이러스(Roekring et al., 2002, Virus Res., 87:79-87)를 기반으로 한다.
[0123] 특정 구체예에서, 재조합 플라스미드 또는 벡터 유전체 또는 입자는 보카바이러스 변이체를 기반으로 한다. 인간 보카바이러스 변이체는, 예를 들어, 문헌[Guido et al., 2016, World J. Gastroenterol., 22:8684-8697]에 기재되어 있다.
[0124] 특정 구체예에서, rAAV 벡터는 하나 이상의 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, -rh74, -rh10, AAV3B, AAV-2i8, SPK1(SEQ ID NO: 1), SPK2(SEQ ID NO: 2) 캡시드 단백질(VP1, VP2 및/또는 VP3 서열)에 대해 적어도 70% 이상(예를 들어, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 등) 동일한 캡시드 서열을 포함하거나 이로 구성된다. 특정 구체예에서, rAAV 벡터는 하나 이상의 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, -rh74, -rh10 또는 AAV3B, ITR(들)에 대해 적어도 70% 이상(예를 들어, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 등) 동일한 서열을 포함하거나 이로 구성된다.
[0125] 특정 구체예에서, rAAV 벡터는, 예를 들어, WO 2013/158879(국제 출원 PCT/US2013/037170), WO 2015/013313(국제 출원 PCT/US2014/047670) 및 US 2013/0059732(US 출원 번호 13/594,773)에 제시된 바와 같은 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV3B, Rh10, Rh74 및 이의 AAV-2i8 변이체(예를 들어, ITR 및 캡시드 변이체, 예를 들어, 아미노산 삽입, 첨가, 치환 및 결실)를 포함한다.
[0126] rAAV, 예를 들어, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, -rh74, -rh10, AAV3B, AAV-2i8, SPK1(SEQ ID NO: 1), SPK2(SEQ ID NO: 2) 및 변이체, 하이브리드 및 키메라 서열은 하나 이상의 기능성 AAV ITR 서열이 측면에 있는 하나 이상의 이종성 폴리뉴클레오티드 서열(트랜스진)을 포함하도록 숙련된 기술자에게 공지된 재조합 기술을 사용하여 작제될 수 있다. 이러한 AAV 벡터는 전형적으로 rAAV 벡터 입자로의 재조합 벡터의 구제, 복제 및 패키징에 필요한 적어도 하나의 기능성 측면 ITR 서열(들)을 보유한다. 따라서, rAAV 벡터 유전체는 복제 및 패키징에 필요한 서열(예를 들어, 기능성 ITR 서열)을 시스로(in cis) 포함할 것이다.
[0127] 특정 구체예에서, 본 발명에서 사용되는 렌티바이러스는 인간 면역결핍-1(HIV-1), 인간 면역결핍-2(HIV-2), 유인원 면역결핍 바이러스(SIV), 고양이 면역결핍 바이러스(FIV), 소 면역결핍 바이러스(BIV), 젬브라나병(Jembrana Disease) 바이러스(JDV), 말 감염성 빈혈 바이러스(EIAV), 또는 염소 관절염 뇌염 바이러스(CAEV)일 수 있다. 렌티바이러스 벡터는 시험관 내 및 생체 내 둘 모두에서 이종성 폴리뉴클레오티드 서열의 비분할 세포로의 효율적인 전달, 통합 및 장기간 발현을 제공할 수 있다. 다양한 렌티바이러스 벡터가 당 분야에 공지되어 있다(문헌[Naldini et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:11382-11388 (1996); Science, 272: 263-267 (1996)), Zufferey et al., (Nat. Biotechnol., 15:871-875, 1997), Dull et al., (J Virol. 1998 Nov;72(11):8463-71, 1998), U.S. Pat. Nos. 6,013,516 and 5,994,136] 참조, 이들 중 임의의 것은 본 발명에서 사용하기에 적합한 바이러스 벡터일 수 있다).
[0128] 체액성 면역과 같은 면역 반응은 야생형 바이러스에 노출된 대상체에서 야생형 바이러스에 대해 발생할 수 있다. 이러한 노출은 바이러스 벡터를 사용한 유전자 치료 방법으로 치료하기 전에도 야생형 바이러스에 기초한 바이러스 벡터에 결합하는 기존 항체를 대상체에서 초래할 수 있다.
[0129] 체액성 면역과 같은 면역 반응은 또한 재조합 바이러스 벡터, 및/또는 이종성 폴리뉴클레오티드 또는 바이러스 벡터에 의해 캡시드화된 이종성 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된 단백질 또는 펩티드에 대해 발생하여, 바이러스 벡터 세포 형질도입, 이종성 폴리뉴클레오티드 발현 또는 기능, 또는 바이러스 벡터가 투여되는 대상체에서 이종성 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된 단백질 또는 펩티드의 기능 또는 활성의 억제 또는 감소를 초래할 수 있다.
[0130] "중화" 항체로 지칭될 수 있는, 본 발명에서 사용되는 바이러스 벡터, 예를 들어, 재조합 바이러스 벡터에 결합하는 항체는 유전자 요법에 유용한 바이러스 벡터의 세포 형질도입을 감소시키거나 억제할 수 있다. 결과적으로, 이론에 얽매이지 않지만, 세포 형질도입이 감소되거나 억제되어 바이러스 패키징된 이종성 폴리뉴클레오티드의 세포 내로의 도입 및 후속 발현 및 적절하게는, 단백질 또는 펩티드로의 후속 번역이 감소된다. 추가로, 이종성 폴리뉴클레오티드 또는 바이러스 벡터에 의해 캡시드화된 이종성 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된 단백질 또는 펩티드에 결합하는 항체는 이종성 폴리뉴클레오티드의 발현, 이종성 폴리뉴클레오티드의 기능 또는 활성 또는 이종성 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된 단백질 또는 펩티드의 기능 또는 활성을 억제할 수 있다.
[0131] 따라서, 재조합 바이러스 벡터(예를 들어, AAV)에 결합하는 항체가 존재할 수 있고/있거나 대상체에서 이종성 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된 단백질 또는 펩티드에 결합하는 항체가 존재할 수 있다. 또한, 재조합 바이러스 벡터에 의해 캡시드화된 이종성 폴리뉴클레오티드에 결합하는 항체가 존재할 수 있다.
[0132] 재조합 바이러스 벡터(예를 들어, AAV)에 결합하거나 이종성 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된 단백질 또는 펩티드에 결합하는 IgG 항체는 본원에 제시된 바와 같이 IgG와 FcRn의 상호작용을 감소시키는 제제를 사용하여 대상체에서 감소될 수 있다. IgG와 FcRn의 상호작용의 감소는 IgG 재순환을 감소시키고(IgG의 강화된 제거로도 지칭됨), 따라서 당 분야에 공지된 표준 검정에 의해 측정될 수 있는 순환 IgG의 역가를 감소시킨다(혈액, 혈장 또는 혈청에서 감소된 수준의 IgG).
[0133] 재조합 바이러스 벡터(예를 들어, AAV)에 결합하거나 이종성 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된 단백질 또는 펩티드에 결합하는 항체는, 이들이 생산되는 경우, 본원에 제시된 바와 같이 프로테아제에 의해 추가로 분해되거나 소화될 수 있다. 재조합 바이러스 벡터(예를 들어, AAV)에 결합하거나 이종성 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된 단백질 또는 펩티드에 결합하는 항체는, 이들이 생산되는 경우, 또한 본원에 제시된 바와 같이 감소되거나 억제된 이펙터 기능을 가질 수 있다.
[0134] 항체와 관련하여 본원에서 사용되는 "이펙터 기능"은 항체의 정상적인 기능적 속성을 의미한다. 항체 기능적 속성의 비제한적인 예는, 예를 들어, 항원에 대한 결합; 보체 캐스케이드의 활성화(보체 의존성 세포독성으로 지칭됨); 항체-의존성 세포의 세포독성(ADCC)에 관여하기 위해 대식세포, 단핵구, 자연 살해 세포 및 호산구와 같은 이펙터 세포의 Fc 수용체에 대한 결합; 및 식세포 및 수지상 세포와 같은 면역 세포에 의한 결합된 항원/병원체의 섭취에 대한 신호를 포함한다. 따라서, 항체 이펙터 기능의 감소 또는 억제는 전술한 비제한적인 기능적 속성 중 임의의 하나 이상을 지칭할 수 있다. 이펙터 기능 검정은 당 분야에 공지되어 있을 뿐만 아니라, 예를 들어, WO2016012285에 기술되어 있다.
[0135] "Fc 수용체"는 임의의 Fc 수용체를 지칭한다. 신생아 Fc 수용체(FcRn)에 추가하여, Fc 수용체의 비제한적인 예는 세포 상에 존재하는 Fc 감마 면역글로불린 수용체(FcγR)를 포함한다. 인간에서, FcγR은 FcγRI(CD64), FcγRIIA(CD32A), FcγRIIB(CD32B), FcγRIIIA(CD16a) 및 FcγRIIIB(CD16b)를 포함하는 Fc 수용체 패밀리의 하나, 일부 또는 전부를 지칭한다. FcγR은 FcγRI(CD64), FcγRIIA(CD32A), FcγRIIB(CD32B), FcγRIIIA(CD16a) 및 FcγRIIIB(CD16b)의 자연 발생 다형태를 포함한다.
[0136] 특정 구체예에서, 바이러스 벡터에 대한 항체 결합은 IgG와 FcRn의 상호작용을 감소시키는 제제, 프로테아제 또는 글리코시다제에 의해 감소되거나 억제된다.
[0137] 특정 구체예에서, 이펙터 세포, 예를 들어, 대식세포, 단핵구, 자연 살해 세포 또는 호산구의 Fc 수용체에 대한 항체 결합은 글리코시다제에 의해 감소되거나 억제된다. 특정 구체예에서, 엔도글리코시다제는 항체의 Fc 상호작용 도메인에서 글리칸 구조를 가수분해한다. 특정 구체예에서, 엔도글리코시다제는 위치 Asn-297(Kabat 넘버링)에서 N-연결된 이중-안테나 글리칸과 같은 IgG의 Fc 상호작용 도메인 상의 글리칸 구조를 가수분해한다.
[0138] 특정 구체예에서, 보체 캐스케이드의 항체 활성화는 IgG와 FcRn의 상호작용을 감소시키는 제제, 프로테아제 또는 글리코시다제에 의해 감소되거나 억제된다.
[0139] 특정 구체예에서, 식세포 또는 수지상 세포와 같은 면역 세포에 의한 항체 자극 또는 섭취 감소는 IgG와 FcRn의 상호작용을 감소시키는 제제, 프로테아제 또는 글리코시다제에 의해 감소되거나 억제된다.
[0140] 특정 구체예에서, IgG와 FcRn의 상호작용을 감소시키는 제제는 재조합 바이러스(예를 들어, AAV) 벡터의 투여 전에 대상체에 투여된다. 특정 구체예에서, IgG와 FcRn의 상호작용을 감소시키는 제제는 재조합 바이러스(예를 들어, AAV) 벡터의 투여 후에 대상체에 투여된다. 특정 구체예에서, 재조합 바이러스(예를 들어, AAV) 벡터 및 IgG와 FcRn의 상호작용을 감소시키는 제제는 실질적으로 동시에 또는 거의 동시에 투여된다.
[0141] 특정 구체예에서, IgG와 FcRn의 상호작용을 감소시키는 제제에 추가하여, 프로테아제 및/또는 글리코시다제는 재조합 바이러스(예를 들어, AAV) 벡터의 투여 전에 대상체에 투여된다. 특정 구체예에서, IgG와 FcRn의 상호작용을 감소시키는 제제는 프로테아제 및/또는 글리코시다제의 투여 후 및/또는 재조합 바이러스(예를 들어, AAV) 벡터의 투여 후에 대상체에 투여된다. 특정 구체예에서, 재조합 바이러스(예를 들어, AAV) 벡터 및 IgG와 FcRn의 상호작용을 감소시키는 제제는 IgG와 FcRn의 상호작용을 감소시키는 제제의 투여와 실질적으로 동시에 또는 거의 동시에 투여된다.
[0142] 특정 구체예에서, IgG와 FcRn의 상호작용을 감소시키는 제제, 이를 테면, 예를 들어 그리고 비제한적으로, 항-FcRn 항체는 엔도펩티다제, 예를 들어 그리고 비제한적으로, IdeS를 대상체에 투여하기 전에 대상체에 투여되고, 이어서 대상체에 재조합 바이러스(예를 들어, AAV) 벡터를 투여한다. 특정 구체예에서, IgG와 FcRn의 상호작용을 감소시키는 제제, 이를 테면, 예를 들어 그리고 비제한적으로, 항-FcRn 항체는 엔도펩티다제, 예를 들어 그리고 비제한적으로, IdeS의 투여 전에 대상체에 1회 이상 투여된다. 특정 구체예에서, IgG와 FcRn의 상호작용을 감소시키는 제제, 이를 테면, 예를 들어 그리고 비제한적으로, 항-FcRn 항체는 엔도펩티다제, 예를 들어 그리고 비제한적으로, IdeS의 투여 전에 대상체에 적어도 2회, 적어도 3회, 적어도 4회 또는 적어도 5회 투여된다.
[0143] 특정 구체예에서, IgG와 FcRn의 상호작용을 감소시키는 제제는 프로테아제 및/또는 글리코시다제의 투여 전 1, 2, 3, 4, 5, 6주 이상의 기간에 걸쳐 대상체에 투여되고, 프로테아제 및/또는 글리코시다제의 투여 후, 재조합 바이러스(예를 들어, AAV) 벡터가 대상체에 투여된다.
[0144] 특정 구체예에서, IgG와 FcRn의 상호작용을 감소시키는 제제는 프로테아제 및/또는 글리코시다제를 대상체에 투여하기 약 1시간, 약 2시간, 약 3시간, 약 4시간, 약 5시간, 약 6시간, 약 7시간, 약 8시간, 약 9시간, 약 10시간, 약 15시간, 약 20시간, 약 1일, 약 2일, 약 3일, 약 4일, 약 5일, 약 6일 또는 약 1주일 전에 대상체에 투여되고, 프로테아제 및/또는 글리코시다제의 투여 후, 재조합 바이러스(예를 들어, AAV) 벡터가 대상체에 투여된다.
[0145] 특정 구체예에서, IgG와 FcRn의 상호작용을 감소시키는 제제, 이를 테면, 예를 들어 그리고 비제한적으로, 항-FcRn 항체는 엔도펩티다제, 예를 들어 그리고 비제한적으로, IdeS의 투여 전 1, 2, 3, 4, 5, 6주 이상의 기간에 걸쳐 대상체에 투여되고, 엔도펩티다제의 투여 후, 재조합 바이러스(예를 들어, AAV) 벡터가 대상체에 투여된다.
[0146] 특정 구체예에서, IgG와 FcRn의 상호작용을 감소시키는 제제, 이를 테면, 예를 들어 그리고 비제한적으로, 항-FcRn 항체는 엔도펩티다제, 예를 들어 그리고 비제한적으로, IdeS를 대상체에 투여하기 약 1시간, 약 2시간, 약 3시간, 약 4시간, 약 5시간, 약 6시간, 약 7시간, 약 8시간, 약 9시간, 약 10시간, 약 15시간, 약 20시간, 약 1일, 약 2일, 약 3일, 약 4일, 약 5일, 약 6일 또는 약 1주일 전에 대상체에 투여되고, 엔도펩티다제의 투여 후, 재조합 바이러스(예를 들어, AAV) 벡터가 대상체에 투여된다.
[0147] 항체는 IgG, IgM, IgA, IgD 및/또는 IgE 중 임의의 것을 포함한다. 따라서, 특정 구체예에서, 본 발명은 특히 이러한 5개 부류의 항체 중 어느 하나, 이러한 5개 부류의 항체 중 임의의 2개, 이러한 5개 부류의 항체 중 임의의 3개, 이러한 5개 부류의 항체 중 임의의 4개 또는 이러한 5개 부류의 항체 중 5개 모두의 이펙터 기능을 소화, 분해 또는 감소시키거나 억제하는 것에 관한 것이다.
[0148] 대상체에서 항체의 수준은 재조합 바이러스 벡터의 투여 전 및/또는 후에 분석, 측정 또는 결정될 수 있다. 대상체에서 항체의 수준은 또한 IgG와 FcRn의 상호작용을 감소시키는 제제 또는 프로테아제 또는 글리코시다제의 투여 전 및/또는 후에 분석, 측정 또는 결정될 수 있다. 대상체에서 항체의 수준은 또한 IgG와 FcRn의 상호작용을 감소시키는 제제 또는 프로테아제 또는 글리코시다제의 투여 전 및/또는 후는 물론 재조합 바이러스 벡터의 투여 전 및/또는 후에 여러 번 분석되거나 측정될 수 있다.
[0149] 대상체에서 항체의 이펙터 기능은 재조합 바이러스 벡터의 투여 전 및/또는 후에 분석, 측정 또는 결정될 수 있다. 대상체에서 항체의 이펙터 기능은 또한 IgG와 FcRn의 상호작용을 감소시키는 제제 또는 프로테아제 또는 글리코시다제의 투여 전 및/또는 후에 분석, 측정 또는 결정될 수 있다. 대상체에서 항체의 이펙터 기능은 또한 IgG와 FcRn의 상호작용을 감소시키는 제제 또는 프로테아제 또는 글리코시다제의 투여 전 및/또는 후는 물론 재조합 바이러스 벡터의 투여 전 및/또는 후에 여러 번 분석되거나 측정될 수 있다.
[0150] 평형 결합 상수의 증가는 IgG와 Fc 수용체 사이의 결합 감소에 해당한다. 따라서, IgG와 FcRn의 상호작용을 감소시키는 제제의 활성 또는 프로테아제 또는 글리코시다제 활성의 결과로서 항체의 Fc 수용체 결합의 감소는 IgG:FcR 상호작용에 대한 평형 결합 상수를 증가시킬 수 있다. 항체의 Fc 수용체 결합의 감소는 IgG:FcR 상호작용에 대한 평형 결합 상수를 적어도 1, 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7 또는 적어도 8배만큼 증가시킬 수 있다.
[0151] 특정 구체예에서, 야생형 바이러스에 대한 노출에 의해 야기되는 대상체에서의 면역 반응(예를 들어, 체액성 면역 반응)은 IgG와 FcRn의 상호작용을 감소시키는 제제 및 재조합 바이러스 벡터를 대상체에 투여하기 전에 야생형 바이러스에 기초하여 재조합 바이러스 벡터에 결합하는 항체를 분해하거나 소화하기에 효과적인 양의 프로테아제 및/또는 글리코시다제를 투여함으로써 치료된다.
[0152] 특정 구체예에서, AAV와 같은 재조합 바이러스 벡터의 투여에 의해 야기되는 면역 반응(예를 들어, 체액성 면역 반응)은 IgG와 FcRn의 상호작용을 감소시키는 제제 및 재조합 바이러스 벡터에 결합하는 항체 또는 이종성 폴리뉴클레오티드 또는 바이러스 벡터에 캡시드화된 이종성 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된 단백질 또는 펩티드에 결합하는 항체를 분해하거나 소화하기에 효과적인 양의 프로테아제 및/또는 글리코시다제를 투여함으로써 치료된다.
[0153] 특정 구체예에서, 대상체에 대한 재조합 바이러스 벡터의 투여보다 IgG와 FcRn의 상호작용을 감소시키는 제제 및 프로테아제 및/또는 글리코시다제의 투여가 선행하여, 이종성 폴리뉴클레오티드 또는 바이러스 벡터에 의해 캡시드화된 이종성 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된 단백질 또는 펩티드에 결합하는 항체 또는 재조합 바이러스 벡터에 대한 면역 반응(예를 들어, 체액성 면역 반응)을 억제하거나 예방한다.
[0154] 특정 구체예에서, IgG와 FcRn의 상호작용을 감소시키는 제제 및 프로테아제 및/또는 글리코시다제는 면역 반응(예를 들어, 체액성 면역 반응) 전에, 예를 들어, 중화 항체의 발달 또는 이종성 폴리뉴클레오티드 또는 바이러스 벡터에 의해 캡시드화된 이종성 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된 단백질 또는 펩티드에 결합하는 항체의 발달 전에 대상체에 투여된다.
[0155] 대상체에서 유전자 치료 벡터의 효능을 증가 또는 향상시키고 유전자 요법 치료를 증가 또는 향상시키기 위한 방법에서 프로테아제 및/또는 글리코시다제의 사용이 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[WO2020016318, WO2020102740 and Leborgne et al., 2020, Nat. Med., 26:1096-1101 (2020)]을 참조하며, 이들 각각은 모든 텍스트, 표, 서열 목록 및 도면을 포함하여, 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
[0156] 프로테아제는 단백질을 분해하거나 소화하는 효소이다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 프로테아제는 또한 펩티다제, 프로테이나제, 펩티드 하이드롤라제 또는 단백질분해 효소로 지정된다.
[0157] 본 발명에서 사용될 수 있는 프로테아제는 기질-특이성에 기초하여 2개의 광범위한 그룹으로 세분될 수 있다. 프로테아제는 N-말단 또는 C-말단을 향해 위치한 펩티드 결합을 가수분해하는 엑소-타입(엑소프로테아제 또는 엑소펩티다제)일 수 있다. 엑소프로테아제 또는 엑소펩티다제의 예는, 예를 들어 그리고 비제한적으로, 플라보자임(Flavozyme)(노보자임(Novozymes)), ProteaAX(Amano), 및 돼지 췌장으로부터의 판크레아틴을 포함한다.
[0158] 본 발명에서 사용될 수 있는 프로테아제는 폴리펩티드 사슬에서 내부적으로 펩티드 결합을 가수분해하는 엔도-타입(엔도프로테아제 또는 엔도펩티다제)일 수 있다. 엔도프로테아제의 예는, 예를 들어 그리고 비제한적으로, IdeS, IdeZ, IgdE, IdeMC, 트립신, 키모트립신, 파파인 및 펩신을 포함한다.
[0159] 본 발명에서 사용될 수 있는 프로테아제의 예는, 예를 들어 그리고 비제한적으로, 스트렙토코쿠스 피오게네스, 스트렙토코쿠스 에쿠이, 마이코플라스마 카니스, S. 아갈락티아에(S. agalactiae) 또는 S. 슈도포르시누스(S. pseudoporcinus)로부터의 시스테인 프로테아제를 포함한다. 특정 구체예에서, 프로테아제는 SEQ ID NO: 3-18 중 어느 하나에 제시된 스트렙토코쿠스 피오게네스로부터의 엔도펩티다아제 IdeS 또는 이의 변형된 변이체를 포함한다. 특정 구체예에서, 프로테아제는 SEQ ID NO: 19 또는 SEQ ID NO: 20에 제시된 프로테아제 또는 이의 변형된 변이체를 포함한다. 특정 구체예에서, 프로테아제는 SEQ ID NO: 21-43 중 어느 하나에 제시된 스트렙토코쿠스 에쿠이로부터의 엔도펩티다아제 IdeZ 또는 이의 변형된 변이체를 포함한다.
[0160] 본 발명에서 사용될 수 있는 다른 프로테아제는, 예를 들어 그리고 비제한적으로, 국제 특허 출원 공개 WO 2017/134274에 기재된 S. 수이스(S. suis), S. 포르시누스, S. 에쿠이로부터의 IgdE 효소를 포함한다. 본 발명에서 사용될 수 있는 다른 프로테아제는, 예를 들어 그리고 비제한적으로, 국제 특허 출원 공개 WO 2018/093868에 기재된 IdeMC 및 호몰로그를 포함한다. 본 발명에서 사용될 수 있는 다른 엔도펩티다제는, 예를 들어 그리고 비제한적으로, 국제 특허 출원 공개 WO 2016/128559에 기재된 N-말단 메티오닌 및 신호 펩티드가 있거나 없는 IdeZ 및 IdeS/IdeZ 하이브리드 단백질을 포함한다. 본 발명에서 사용될 수 있는 다른 프로테아제는, 예를 들어 그리고 비제한적으로, 이를 테면, 문헌[Jordan et al. (2017, N. Engl. J. Med., 377: 442-453), Lannergard and Guss (2006, FEMS Microbiol. Lett., 262:230-235) and Hulting et al., (2009, FEMS Microbiol. Lett., 298:44-50)]에 기재된 프로테아제를 포함한다.
[0161] 글리코시다제는 복잡한 당에서 글리코시드 결합을 가수분해하는 효소이다. 일반적으로 2개의 광범위한 그룹, 즉, 엑소글리코시다제와 엔도글리코시다제가 있다. 글리코시다제는 항체와 같은 당단백질로부터 글리칸/올리고당을 절단하여 방출한다.
[0162] 본 발명에서 사용될 수 있는 엑소글리코시다제는, 예를 들어 그리고 비제한적으로, N-아세틸글루코사미니다제, 푸코시다제, 갈락토시다제, 글루코시다제, 만노시다제, 뉴라미니다제 및 자일로시다제를 포함한다. 본 발명에서 사용될 수 있는 엔도글리코시다제는, 예를 들어 그리고 비제한적으로, EndoS, Endo D, 엔도글리코시다제-H, Endo F1, Endo F2 및 Endo F3을 포함한다.
[0163] 따라서, 특정 구체예에서, 글리코시다제는 엔도글리코시다제를 포함한다. 특정 구체예에서, 글리코시다제는 엑소글리코시다제를 포함한다.
[0164] 엔도글리코시다제의 예는, 예를 들어 그리고 비제한적으로, EndoS를 포함한다. 특정 구체예에서, 엔도글리코시다제는 SEQ ID NO: 44-47 중 어느 하나에 제시된 서열, 또는 이의 변형된 변이체를 포함한다.
[0165] 특정 구체예에서, EndoS 폴리펩티드는 EndoS 폴리펩티드, EndoS 폴리펩티드의 단편, EndoS 폴리펩티드의 변이체, 또는 EndoS 폴리펩티드의 단편의 변이체를 포함하며, 단, 상기 폴리펩티드, 단편, 변이체 또는 단편의 변이체는 면역글로불린(Ig) 엔도글리코시다제 활성을 갖는다.
[0166] 특정 구체예에서, EndoS 폴리펩티드는 S. 피오게네스 EndoS이다. EndoS 폴리펩티드의 변이체는 다른 박테리아와 같은 다른 유기체로부터의 EndoS 폴리펩티드일 수 있다. 특정 구체예에서, 박테리아는 스트렙토코쿠스 에쿠이, 스트렙토코쿠스 주에피더미쿠스(Streptococcus zooepidemicus) 또는 스트렙토코쿠스 피오게네스와 같은 스트렙토코쿠스이다. 대안적으로, 변이체는 코리네박테리움 슈도투베르쿨로시스(Corynebacterium pseudotuberculosis), 예를 들어, CP40 단백질; 엔테로코쿠스 파에칼리스(Enterococcus faecalis), 예를 들어, EndoE 단백질; 또는 엘리자베스킹기아 메닝고셉티카(Elizabethkingia meningoseptica)(이전의 플라보박테리움 메닝고셉티쿰(Flavobacterium meningosepticum)), 예를 들어 EndoF2 단백질로부터 유래될 수 있다.
[0167] EndoS 폴리펩티드는 (a) SEQ ID NO: 44-47 중 어느 하나의 아미노산 서열; 또는 (b) Ig 엔도글리코시다제 활성을 갖는 (a)의 단편; 또는 (c) SEQ ID NO: 44-47 중 어느 하나의 아미노산 서열에 대해 적어도 50% 동일성을 갖고 Ig 엔도글리코시다제 활성을 갖는 (a)의 변이체; 또는 (d) SEQ ID NO: 44-47 중 어느 하나의 아미노산 서열의 상응하는 부분에 대해 적어도 50% 동일성을 갖고 Ig 엔도글리코시다제 활성을 갖는 (b)의 변이체를 포함하거나 이로 구성될 수 있다.
[0168] 특정 구체예에서, 변이체 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 44-47 중 어느 하나의 아미노산 서열 또는 Ig 엔도글리코시다제 활성을 갖는 이의 단편에 대해 적어도 약 60% 이상의 동일성(예를 들어, 60-70%, 70-80% 또는 80-90% 동일성)을 갖는다. 특정 구체예에서, 변이체 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 44-47 중 어느 하나의 아미노산 서열 또는 Ig 엔도글리코시다제 활성을 갖는 이의 단편에 대해 90-100% 동일성을 갖는다.
[0169] 프로테아제는 (a) SEQ ID NO: 3-43 또는 48 중 어느 하나의 아미노산 서열; 또는 (b) 프로테아제 활성을 갖는 (a)의 단편; 또는 (c) SEQ ID NO: 3-43 또는 48 중 어느 하나의 아미노산 서열에 대해 적어도 50% 동일성을 갖고 프로테아제 활성을 갖는 (a)의 변이체; 또는 (d) SEQ ID NO: 3-43 또는 48 중 어느 하나의 아미노산 서열의 상응하는 부분에 대해 적어도 50% 동일성을 갖고 프로테아제 활성을 갖는 (b)의 변이체를 포함하거나 이로 구성될 수 있다. 특정 구체예에서, 변이체 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 3-43 또는 48 중 어느 하나의 아미노산 서열 또는 프로테아제 활성을 갖는 이의 단편에 대해 적어도 약 60% 이상의 동일성(예를 들어, 60-70%, 70-80% 또는 80-90% 동일성)을 갖는다. 특정 구체예에서, 변이체 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 3-43 또는 48 중 어느 하나의 아미노산 서열 또는 프로테아제 활성을 갖는 이의 단편에 대해 90-100% 동일성을 갖는다.
[0170] 특정 구체예에서, 프로테아제 또는 글리코시다제는 이의 천연 신호 서열이 없고, S. 피오게네스의 IdeS의 성숙한 형태인 SEQ ID NO: 48과 같은 추가적인 N-말단 메티오닌을 갖는다(신호 서열은 없지만, 첨가된 N-말단 메티오닌을 가짐). 본 발명의 방법에 따라 사용되는 임의의 프로테아제 또는 글리코시다제는 천연 신호 서열 대신에 첨가된 N-말단 메티오닌을 포함할 수 있다.
[0171] 프로테아제 또는 글리코시다제는 임의의 적합한 용량으로 대상체에 투여될 수 있다. 예를 들어, 적합한 투여량은 약 0.05 mg/kg 내지 약 5 mg/대상체의 체중 kg, 또는 약 0.1 mg/kg 내지 약 4 mg/대상체의 체중 kg일 수 있다.
[0172] 특정 구체예에서, IdeZ는 약 0.01 mg/kg 내지 약 10 mg/대상체의 체중 kg의 투여량으로 투여된다. 예를 들어, 적합한 투여량은 약 0.05 mg/kg 내지 약 5 mg/대상체의 체중 kg, 또는 약 0.1 mg/kg 내지 약 4 mg/대상체의 체중 kg일 수 있다.
[0173] 특정 구체예에서, IdeS는 약 0.01 mg/kg 내지 약 10 mg/대상체의 체중 kg의 투여량으로 투여된다. 예를 들어, 적합한 투여량은 약 0.05 mg/kg 내지 약 5 mg/대상체의 체중 kg, 또는 약 0.1 mg/kg 내지 약 4 mg/대상체의 체중 kg일 수 있다.
[0174] 특정 구체예에서, EndoS는 약 0.01 mg/kg 내지 약 10 mg/대상체의 체중 kg의 투여량으로 투여된다. 예를 들어, 적합한 투여량은 약 0.05 mg/kg 내지 약 5 mg/대상체의 체중 kg, 또는 약 0.1 mg/kg 내지 약 4 mg/대상체의 체중 kg일 수 있다.
[0175] 본 발명에 따른 방법은 본원에서 달리 지시되지 않는 한 임의의 적합한 순서로 수행될 수 있다. 특정 구체예에서, 방법은 먼저 (a) 중화 항체 역가를 감소시키는데 효과적인 양의 IgG와 FcRn의 상호작용을 감소시키는 제제를 대상체에 투여하고; 이후 (b) 재조합 바이러스 벡터를 대상체에 투여하는 것을 포함할 수 있다. 특정 구체예에서, (b) 재조합 바이러스 벡터를 대상체에 투여하는 것은 (a) IgG와 FcRn의 상호작용을 감소시키는 제제를 대상체에 투여한 후 약 1분 내지 약 90일 사이에 수행된다. 특정 구체예에서, (a) IgG와 FcRn의 상호작용을 감소시키는 제제를 대상체에 투여하고 (b) 재조합 바이러스 벡터를 대상체에 투여하는 것은 거의 동시에 수행된다.
[0176] 특정 구체예에서, 방법은 먼저 (a) 이종성 폴리뉴클레오티드를 함유하는 재조합 바이러스 벡터를 대상체에 투여한 다음 (b) 재조합 바이러스 벡터 및/또는 이종성 폴리뉴클레오티드 또는 이종성 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된 단백질 또는 펩티드에 결합하는 항체의 순환 수준을 감소시키는데 효과적인 양의 IgG와 FcRn의 상호작용을 감소시키는 제제를 대상체에 투여하는 것을 포함할 수 있다. 특정 구체예에서, (b) 재조합 바이러스 벡터 및/또는 이종성 폴리뉴클레오티드 또는 이종성 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된 단백질 또는 펩티드에 결합하는 항체의 순환 수준을 감소시키는데 효과적인 양의 IgG와 FcRn의 상호작용을 감소시키는 제제를 대상체에 투여하는 것은 (a) 이종성 폴리뉴클레오티드를 함유하는 재조합 바이러스 벡터를 대상체에 투여한 후 약 1분 내지 약 90일 사이에 수행된다. 특정 구체예에서, (a) 이종성 폴리뉴클레오티드를 함유하는 재조합 바이러스 벡터를 대상체에 투여하고, (b) 재조합 바이러스 벡터 및/또는 이종성 폴리뉴클레오티드 또는 이종성 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된 단백질 또는 펩티드에 결합하는 항체의 순환 수준을 감소시키는데 효과적인 양의 IgG와 FcRn의 상호작용을 감소시키는 제제를 대상체에 투여하는 것은 거의 동시에 수행된다.
[0177] 본 발명에 따른 방법은 IgG와 FcRn의 상호작용을 감소시키는 제제의 투여 또는 재조합 바이러스 벡터의 투여 전, 후 또는 거의 동시에 프로테아제 및/또는 글리코시다제를 대상체에 투여하는 것을 선택적으로 포함할 수 있다.
[0178] 특정 구체예에서, 방법은 먼저 (a) IgG와 FcRn의 상호작용을 감소시키는 제제를 대상체에 투여하고; 이후 (b) 중화 항체를 분해하거나 소화하는데 효과적인 프로테아제 및/또는 글리코시다제를 대상체에 투여하고; 이후 (c) 재조합 바이러스 벡터를 대상체에 투여하는 것을 포함할 수 있다.
[0179] 특정 구체예에서, 방법은 먼저 (a) IgG와 FcRn의 상호작용을 감소시키는 제제를 대상체에 투여하고; 이후 (b) 중화 항체를 분해하거나 소화하는데 효과적인 엔도펩티다제를 대상체에 투여하고; 이후 (c) 재조합 바이러스 벡터를 대상체에 투여하는 것을 포함할 수 있다.
[0180] 특정 구체예에서, 방법은 먼저 (a) 항-FcRn 항체를 대상체에 투여하고; 이후 (b) 중화 항체를 분해하거나 소화하는데 효과적인 IdeS를 대상체에 투여하고; 이후 (c) 재조합 바이러스 벡터를 대상체에 투여하는 것을 포함할 수 있다.
[0181] 중화 항체와 같은 항체는 바이러스 벡터를 투여하기 전에도 재조합 바이러스 벡터 세포 형질도입을 억제하거나 감소시키는 수준으로 기존에 존재할 수 있고 대상체에 존재할 수 있다. 대안적으로, 항체는 재조합 바이러스 벡터의 기반이 되는 바이러스에 노출된 후 대상체에서 발달할 수 있다. 또한, 중화 항체와 같은 항체, 또는 이종성 폴리뉴클레오티드 또는 바이러스 벡터에 의해 캡시드화된 이종성 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된 단백질 또는 펩티드에 결합하는 항체는 재조합 바이러스 벡터의 투여 후 대상체에서 발달할 수 있다.
[0182] 따라서, 본원의 방법은 기존 항체를 갖는 대상체 및 기존 항체를 갖지 않는 대상체에 적용 가능하다. 본원에 기재된 바와 같이, 이러한 대상체는 야생형 바이러스에 노출되고 야생형 바이러스에 기초한 바이러스 벡터에 대한 기존 항체를 발달시킨 대상체뿐만 아니라 바이러스 벡터 유전자 요법 치료를 받고 항체를 발달시켰고 후속적으로 동일한 바이러스 벡터 유전자 요법의 하나 이상의 추가 용량으로 치료될 수 있거나(재투여로 지칭됨) 유전자 요법 치료를 제공하기 위해 동일한 바이러스 벡터를 사용한 상이한 유전자 요법 치료(예를 들어, 상이한 이종성 폴리뉴클레오티드)로 치료될 수 있는 대상체를 포함한다.
[0183] 대상체는 바이러스 벡터 투여 전 및/또는 IgG와 FcRn의 상호작용을 감소시키는 제제, 프로테아제 또는 글리코시다제의 투여 전에 항체에 대해 시험될 수 있다. 시험될 항체의 비제한적인 예는 중화 항체, 본원에 기재된 바와 같은 IgG와 FcRn의 상호작용을 감소시키는 제제 또는 프로테아제 또는 글리코시다제에 결합하는 항체, 이종성 폴리뉴클레오티드에 결합하는 항체 및 이종성 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된 단백질 또는 펩티드에 결합하는 항체를 포함한다. 따라서, 대상체는 재조합 바이러스 벡터의 투여 전 및/또는 IgG와 FcRn의 상호작용을 감소시키는 제제 또는 프로테아제 또는 글리코시다제의 투여 전에, 중화 항체, 본원에 기재된 바와 같은 IgG와 FcRn의 상호작용을 감소시키는 제제 또는 프로테아제 또는 글리코시다제에 결합하는 항체, 이종성 폴리뉴클레오티드에 결합하는 항체 또는 이종성 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된 단백질 또는 펩티드에 결합하는 항체에 대해 스크리닝될 수 있다.
[0184] 본원에 기재된 바와 같은 IgG와 FcRn의 상호작용을 감소시키는 제제 또는 프로테아제 또는 글리코시다제에 결합하는 기존 항체(예를 들어, IgG)를 갖는 대상체는 선택적으로 본 발명의 방법에 따른 방법에 의한 초기 치료로부터 제외될 수 있다. 그러나, IgG와 FcRn의 상호작용을 감소시키는 제제 또는 프로테아제 또는 글리코시다제에 결합하는 항체를 갖거나 발달시키는 모든 대상체가 본 발명에 따른 치료 방법에서 제외될 필요는 없다. 예를 들어, 15 mg/리터 미만의 역가를 갖는 검출 가능한 항-IdeS IgG를 갖는 대상체는 여전히 본 발명에 따른 방법을 사용하여 치료될 수 있다. IgG와 FcRn의 상호작용을 감소시키는 제제의 투여에 의한 순환 IgG의 감소는 또한 IgG와 FcRn의 상호작용을 감소시키는 제제 또는 IdeS에 결합할 수 있는 항체의 감소를 초래할 것으로 예상된다.
[0185] 대상체는 또한 재조합 바이러스 벡터의 투여 후에 중화 항체, 이종성 폴리뉴클레오티드에 결합하는 항체 또는 이종성 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된 단백질 또는 펩티드에 결합하는 항체에 대해 스크리닝될 수 있다. 기존 항체가 검출되지 않은 대상체에서 이러한 항체가 발달하는지 또는 발달이 방지되는지 결정하기 위해, 또는 IgG와 FcRn의 상호작용을 감소시키는 제제 및 프로테아제 및/또는 글리코시다제가 이러한 기존 항체를 감소시키거나 제거하는지 여부에 관계 없이 기존 항체를 갖는 대상체의 경우에, 재조합 바이러스 벡터의 투여 후 일정 기간 동안 이러한 대상체는 선택적으로 모니터링될 수 있다.
[0186] 특정 구체예에서, IgG와 FcRn의 상호작용을 감소시키는 제제는 중화 항체, 본원에 기재된 바와 같은 IgG와 FcRn의 상호작용을 감소시키는 제제에 결합하는 항체, 이종성 폴리뉴클레오티드에 결합하는 항체 또는 이종성 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된 단백질 또는 펩티드에 결합하는 항체의 존재에 대해 양성 반응을 보인 후에 대상체에 투여된다. 특정 구체예에서, IgG와 FcRn의 상호작용을 감소시키는 제제는 중화 항체, 본원에 기재된 바와 같은 IgG와 FcRn의 상호작용을 감소시키는 제제에 결합하는 항체, 이종성 폴리뉴클레오티드에 결합하는 항체 또는 이종성 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된 단백질 또는 펩티드에 결합하는 항체의 존재에 대해 양성 반응을 보이기 전에 대상체에 투여된다.
[0187] 특정 구체예에서, IgG와 FcRn의 상호작용을 감소시키는 제제 및 프로테아제 및/또는 글리코시다제는 중화 항체, 본원에 기재된 바와 같은 IgG와 FcRn의 상호작용을 감소시키는 제제 또는 프로테아제 또는 글리코시다제에 결합하는 항체, 이종성 폴리뉴클레오티드에 결합하는 항체 또는 이종성 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된 단백질 또는 펩티드에 결합하는 항체의 존재에 대해 양성 반응을 보인 후에 대상체에 투여된다. 특정 구체예에서, IgG와 FcRn의 상호작용을 감소시키는 제제 및 프로테아제 및/또는 글리코시다제는 중화 항체, 본원에 기재된 바와 같은 IgG와 FcRn의 상호작용을 감소시키는 제제, 프로테아제 또는 글리코시다제에 결합하는 항체, 이종성 폴리뉴클레오티드에 결합하는 항체 또는 이종성 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된 단백질 또는 펩티드에 결합하는 항체의 존재에 대해 양성 반응을 보이기 전에 대상체에 투여된다.
[0188] 특정 구체예에서, 대상체는 IgG와 FcRn의 상호작용을 감소시키는 제제의 투여 전 또는 후에, 또는 IgG와 FcRn의 상호작용을 감소시키는 제제 및 프로테아제 및/또는 글리코시다제의 투여 전 또는 후에 항체에 대해 시험되지 않는다. 따라서, 프로테아제 및/또는 글리코시다제의 투여 또는 재조합 바이러스 벡터의 투여 후에 중화 항체, 본원에 기재된 바와 같은 IgG와 FcRn의 상호작용을 감소시키는 제제 또는 프로테아제 또는 글리코시다제에 결합하는 항체, 이종성 폴리뉴클레오티드에 결합하는 항체 또는 이종성 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된 단백질 또는 펩티드에 결합하는 항체에 대한 시험은 본 발명에 따른 치료 방법에서 선택적이다.
[0189] IgG와 FcRn의 상호작용을 감소시키는 제제는 대상체에 임의의 횟수로 투여될 수 있다. 예를 들어, IgG와 FcRn의 상호작용을 감소시키는 제제는 대상체에 2 내지 5회, 2 내지 10회, 2 내지 15회 투여될 수 있다.
[0190] IgG와 FcRn의 상호작용을 감소시키는 제제는 임의의 기간 동안 정기적으로, 예를 들어, 연속적인 날 또는 격일, 또는 비정기적으로 대상체에 투여될 수 있다. 특정 구체예에서, IgG와 FcRn의 상호작용을 감소시키는 제제는 재조합 바이러스 벡터의 투여 전 또는 후 약 1 내지 12주 또는 약 1 내지 10주 또는 약 1 내지 8주 또는 약 1 내지 6주 또는 약 1 내지 약 4주 또는 약 1 내지 3주 또는 약 1 내지 2주 또는 약 2주에 투여된다.
[0191] 프로테아제 또는 글리코시다제는 대상체에 임의의 횟수로 투여될 수 있다. 예를 들어, 프로테아제 및/또는 글리코시다제는 대상체에 2 내지 5회, 2 내지 10회, 2 내지 15회 투여될 수 있다.
[0192] 프로테아제 또는 글리코시다제는 임의의 기간 동안 정기적으로, 예를 들어, 연속적인 날 또는 격일, 또는 비정기적으로 대상체에 투여될 수 있다. 특정 구체예에서, 프로테아제 및/또는 글리코시다제는 IgG와 FcRn의 상호작용을 감소시키는 제제의 투여 또는 재조합 바이러스 벡터의 투여 전 또는 후 약 1 내지 12주 또는 약 1 내지 10주 또는 약 1 내지 8주 또는 약 1 내지 6주 또는 약 1 내지 약 4주 또는 약 1 내지 3주 또는 약 1 내지 2주 또는 약 2주에 투여된다.
[0193] 특정 구체예에서, 재조합 바이러스 벡터는 IgG와 FcRn의 상호작용을 감소시키는 제제가 투여되기 전 또는 후, 또는 프로테아제 또는 글리코시다제가 대상체에 투여되기 전 또는 후에 투여된다. 특정 구체예에서, 재조합 바이러스 벡터는 IgG와 FcRn의 상호작용을 감소시키는 제제 또는 프로테아제 또는 글리코시다제를 대상체에 투여한 후, 예를 들어, 1-12, 12-24 또는 24-48시간 후, 또는 2-4, 4-6, 6-8, 8-10, 10-14, 14-20, 20-25, 25-30, 30-50 또는 50일 초과 후에 대상체에 투여된다. 특정 구체예에서, IgG와 FcRn의 상호작용을 감소시키는 제제 또는 프로테아제 또는 글리코시다제는 재조합 바이러스 벡터를 대상체에 투여한 후, 예를 들어, 1-12, 12-24 또는 24-48시간 후, 또는 2-4, 4-6, 6-8, 8-10, 10-14, 14-20, 20-25, 25-30, 30-50 또는 50일 초과 후에 대상체에 투여된다.
[0194] 재조합 바이러스 벡터, IgG와 FcRn의 상호작용을 감소시키는 제제, 프로테아제 및/또는 글리코시다제는 단독으로 또는 조합하여 투여될 수 있다. 특정 구체예에서, 재조합 바이러스 벡터는 IgG와 FcRn의 상호작용을 감소시키는 제제 및/또는 프로테아제 및/또는 글리코시다제와 별도로 대상체에 투여된다. 특정 구체예에서, 재조합 바이러스 벡터는 IgG와 FcRn의 상호작용을 감소시키는 제제 및/또는 프로테아제 및/또는 글리코시다제와 조합하여 대상체에 투여된다.
[0195] 특정 구체예에서, IgG와 FcRn의 상호작용을 감소시키는 제제 및 프로테아제 및/또는 글리코시다제의 혼합물이 대상체에 1회 이상 투여된다. 특정 구체예에서, IgG와 FcRn의 상호작용을 감소시키는 2개 이상의 제제 또는 2개 이상의 프로테아제 및/또는 글리코시다제가 대상체에 1회 이상 투여된다.
[0196] 특정 구체예에서, 적어도 하나의 면역억제제는 대상체에 재조합 바이러스 벡터, IgG와 FcRn의 상호작용을 감소시키는 제제, 프로테아제 또는 글리코시다제의 투여 전, 실질적으로 동시 또는 투여 후에 대상체에 투여된다. 특정 구체예에서, 면역억제제는 스테로이드와 같은 항염증제이다. 특정 구체예에서, 면역억제제는 프레드니손, 사이클로스포린(예를 들어, 사이클로스포린 A), 마이코페놀레이트, 리툭시맙, 라파마이신 또는 이들의 유도체이다.
[0197] 체액성 면역을 감소시키기 위한 추가 전략은 일반적으로 성분채집술, 보다 구체적으로 혈액 생성물이 관련된 혈장분리반출술로서 지칭되는 항체를 제거, 고갈, 포획 및/또는 불활성화시키는 방법을 포함한다. 성분채집술 또는 혈장분리반출술은 인간 대상체의 혈장이 환자에게 복귀하기 전에 성분의 추가, 제거 및/또는 교체를 통해 혈장을 변형시키는 장치를 통해 생체 외(체외) 순환되는 과정이다. 혈장분리반출술은 혈액 생성물(예를 들어, 혈장)에서 인간 면역글로불린(예를 들어, IgG, IgE, IgA, IgD)을 제거하는데 사용될 수 있다. 이 절차는 재조합 바이러스 벡터에 결합하고/거나, 이종성 폴리뉴클레오티드에 결합하고/거나, 이종성 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된 단백질 또는 펩티드에 결합하고/거나, IgG와 FcRn의 상호작용을 감소시키는 제제에 결합하고/거나, 프로테아제에 결합하고/거나, 글리코시다제에 결합하는 면역글로불린(항체)을 고갈, 포획, 불활성화, 감소 또는 제거하여, 예를 들어, 바이러스 벡터 중화에 기여할 수 있는 치료된 대상체에서의 항체 역가를 감소시킨다. 일례는 AAV 캡시드 친화성 매트릭스 컬럼을 포함하는 장치이다. 이러한 AAV 캡시드 친화성 매트릭스를 통해 혈액 생성물(예를 들어, 혈장)을 통과시키는 것은 AAV 항체 및 모든 아이소형(IgG, IgM 등 포함)의 결합만을 초래할 것이다. 면역흡착(미국 특허 출원 공개 US 2018/0169273 A1)이 또한 면역글로불린, 보다 특히 항-AAV 항체를 고갈시키는데 사용될 수 있다. 친화성 리간드(국제 특허 출원 공개 WO/2018/158397)가 또한 면역글로불린, 보다 특히 항-AAV 항체를 고갈시키는데 사용될 수 있다. 상기 언급된 전략 중 임의의 것은 대상체에 재조합 바이러스 벡터, IgG와 FcRn의 상호작용을 감소시키는 제제, 프로테아제 또는 글리코시다제의 투여 전, 실질적으로 동시 또는 투여 후에 사용될 수 있다.
[0198] 특정 구체예에서, 혈장분리반출술은 대상체에 IgG와 FcRn의 상호작용을 감소시키는 제제의 투여 전 또는 후 및/또는 대상체에 재조합 바이러스 벡터의 투여 전 또는 후에, 본 발명의 방법에서 추가적인 하나 이상의 단계로서 대상체의 혈액 생성물(예를 들어, 혈장)에 대해 수행된다.
[0199] 특정 구체예에서, 혈장분리반출술은 IgG와 FcRn의 상호작용을 감소시키는 제제의 투여 전 또는 후에 대상체의 혈액 생성물(예를 들어, 혈장)에 대해 수행되고, 이어서 재조합 바이러스 벡터가 대상체에 투여된다.
[0200] 특정 구체예에서, 혈장분리반출술은 IgG와 FcRn의 상호작용을 감소시키는 제제의 투여 전 또는 후에 대상체의 혈액 생성물(예를 들어, 혈장)에 대해 수행되고, 이어서 프로테아제 또는 글리코시다제가 대상체에 투여되고, 이어서 재조합 바이러스 벡터가 대상체에 투여된다.
[0201] 특정 구체예에서, 혈장분리반출술은 IgG와 FcRn의 상호작용을 감소시키는 제제의 투여 후에 대상체의 혈액 생성물(예를 들어, 혈장)에 대해 수행되고, 이어서 IdeS 또는 EndoS가 대상체에 투여되고, 이어서 재조합 바이러스 벡터가 대상체에 투여된다.
[0202] 특정 구체예에서, 혈장분리반출술은 IgG와 FcRn의 상호작용을 감소시키는 제제의 투여 후에 대상체의 혈액 생성물(예를 들어, 혈장)에 대해 수행되고, 이어서 IdeS가 대상체에 투여되고, 이어서 재조합 바이러스 벡터가 대상체에 투여된다.
[0203] 본 발명의 방법에서 IgG와 FcRn의 상호작용을 감소시키는 제제의 투여 및 프로테아제(예를 들어, IdeS) 또는 글리코시다제(예를 들어, EndoS)의 투여에 추가하여 혈장분리반출술의 사용은 특히 대상체에서 순환 중화 항체의 역가가 높을 수 있는 유전자 요법의 재투여 치료에 유리할 수 있다.
[0204] 전신 유전자 전달에서 AAV에 대한 체액성 면역을 감소(극복)하거나 회피하기 위한 추가 전략은 항-AAV 항체를 흡착하기 위한 디코이로서 AAV 빈 캡시드 입자 및/또는 캡시드 단백질의 사용, AAV에 대한 체액성 면역 반응을 감소, 저하, 억제, 예방 또는 근절하기 위한 면역억제 약물의 투여, AAV 캡시드 혈청형의 변경 또는 AAV 캡시드를 중화 항체(NAb)에 덜 민감하게 하는 공학처리, 항-AAV 면역글로불린을 흡착하기 위한 혈장 교환 주기의 사용에 의한 항-AAV 항체 역가 감소, 및 풍선 카테터와 같은 전달 기술의 사용에 이어 식염수 플러싱을 포함한다. 또한 추가 전략은 문헌[Mingozzi et al., 2013, Blood, 122:23-36]에 개시되어 있다. 추가 전략은 문헌[Bertin et al., 2020, Sci. Rep. 10:864]에 기재된 대로 AAV-특이적 혈장분리반출술 컬럼을 사용하여 혈장으로부터 총 면역글로불린 풀을 고갈시키지 않으면서 항-AAV 항체를 선택적으로 고갈시키는 것을 포함한다. 대상체에서 AAV 항체를 제거, 고갈, 포획 및/또는 불활성화시키는 성분채집술 전략은 WO2019018439에 기재되어 있다.
[0205] 본 발명에 따르면, IgG와 FcRn의 상호작용을 감소시키는 제제는 리포솜, 나노입자, 지질 나노입자, 중합체, 마이크로입자, 마이크로캡슐, 미셀 또는 세포 외 소포로 캡슐화되거나 복합체화될 수 있다.
[0206] 또한 본 발명에 따르면, 바이러스 입자는 리포솜, 나노입자, 지질 나노입자, 중합체, 마이크로입자, 마이크로캡슐, 미셀 또는 세포 외 소포로 캡슐화되거나 복합체화될 수 있다.
[0207] 또한 본 발명에 따르면, 프로테아제 및/또는 글리코시다제는 리포솜, 나노입자, 지질 나노입자, 중합체, 마이크로입자, 마이크로캡슐, 미셀 또는 세포 외 소포로 캡슐화되거나 복합체화될 수 있다.
[0208] "지질 나노입자" 또는 "LNP"는 재조합 바이러스 벡터 및/또는 프로테아제 및/또는 글리코시다제의 전달에 유용하고 나노스케일, 즉, 약 10 nm 내지 약 1000 nm 또는 약 50 내지 약 500 nm 또는 약 75 내지 약 127 nm의 치수를 갖는 지질-기반 소포를 지칭한다. 이론에 얽매이지 않고, LNP는 면역 시스템으로부터 부분적 또는 완전한 차폐를 갖는 프로테아제, 글리코시다제 또는 재조합 바이러스 벡터를 제공하는 것으로 여겨진다. 차폐는 생체 내에서 프로테아제, 글리코시다제 또는 재조합 바이러스 벡터에 대한 실질적인 면역 반응이 유도되는 것을 피하면서 프로테아제, 글리코시다제 또는 재조합 바이러스 벡터를 조직 또는 세포로 전달할 수 있게 한다. 차폐는 또한 생체 내에서(예를 들어, 인간과 같은 대상체에서) 프로테아제, 글리코시다제 또는 재조합 바이러스 벡터에 대한 실질적인 면역 반응을 유도하지 않고 반복 투여를 허용할 수 있다. 차폐는 또한 생체 내 전달 효율, 치료 효과의 지속 기간 및/또는 치료 효능을 개선하거나 증가시킬 수 있다.
[0209] AAV의 pI(등전점)는 약 6 내지 약 6.5의 범위이다. 따라서, AAV 표면은 약간의 음전하를 운반한다. 따라서, LNP가, 예를 들어, 아미노 지질과 같은 양이온성 지질을 포함하는 것이 유리할 수 있다. 예시적인 아미노 지질은 미국 특허 번호 9,352,042, 9,220,683, 9,186,325, 9,139,554, 9,126,966 9,018,187, 8,999,351, 8,722,082, 8,642,076, 8,569,256, 8,466,122 및 7,745,651 및 미국 특허 공개 번호 2016/0213785, 2016/0199485, 2015/0265708, 2014/0288146, 2013/0123338, 2013/0116307, 2013/0064894, 2012/0172411 및 2010/0117125에 개시되었다.
[0210] 용어 "양이온성 지질" 및 "아미노 지질"은 1개, 2개, 3개 이상의 지방산 또는 지방 알킬 사슬 및 pH-적정 가능한 아미노 기(예를 들어, 알킬아미노 또는 디알킬아미노 기)를 갖는 지질 및 이들의 염을 포함하기 위해 본원에서 상호 교환적으로 사용된다. 양이온성 지질은 전형적으로 양이온성 지질의 pKa 미만의 pH에서 양성자화(즉, 양으로 하전)되고 pKa 이상의 pH에서 실질적으로 중성이다. 양이온성 지질은 또한 적정 가능한 양이온성 지질일 수 있다. 특정 구체예에서, 양이온성 지질은 양성자화 가능한 3차 아민(예를 들어, pH-적정 가능한) 기; 각각의 알킬 사슬이 독립적으로 0 내지 3개(예를 들어, 0, 1, 2 또는 3개)의 이중 결합을 갖는 C18 알킬 사슬; 및 헤드 그룹과 알킬 사슬 사이에 에테르, 에스테르 또는 케탈 결합을 포함한다.
[0211] 양이온성 지질은, 비제한적으로, 1,2-디리놀레일옥시-N,N-디메틸아미노프로판(DLinDMA), 1,2-디리놀레닐옥시-N,N-디메틸아미노프로판(DLenDMA), 1,2-디-γ-리놀레닐옥시-N,N-디메틸아미노프로판(γ-DLenDMA), 2,2-디리놀레일-4-(2-디메틸아미노에틸)-[1,3]-디옥솔란(DLin-K-C2-DMA, DLin-C2K-DMA, XTC2 및 C2K로도 공지됨), 2,2-디리놀레일-4-디메틸아미노메틸-[1,3]-디옥솔란(DLin-K-DMA), 디리놀레일메틸-3-디메틸아미노프로피오네이트(DLin-M-C2-DMA, MC2로도 공지됨), (6Z,9Z,28Z,31Z)-헵타트리아콘타-6,9,28,31-테트라엔-19-일 4-(디메틸아미노)부타노에이트(DLin-M-C3-DMA, MC3로도 공지됨), 이들의 염, 및 이들의 혼합물을 포함할 수 있다. 다른 양이온성 지질은 또한 1,2-디스테아릴옥시-N,N-디메틸-3-아미노프로판(DSDMA), 1,2-디올레일옥시-N,N-디메틸-3-아미노프로판(DODMA), 2,2-디리놀레일-4-(3-디메틸아미노프로필)-[1,3]-디옥솔란(DLin-K-C3-DMA), 2,2-디리놀레일-4-(3-디메틸아미노부틸)-[1,3]-디옥솔란(DLin-K-C4-DMA), DLen-C2K-DMA, γ-DLen-C2K-DMA 및 (DLin-MP-DMA)(1-B11로도 공지됨)를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
[0212] 또한 추가의 양이온성 지질은, 비제한적으로, 2,2-디리놀레일-5-디메틸아미노메틸-[1,3]-디옥산(DLin-K6-DMA), 2,2-디리놀레일-4-N-메틸페피아지노-[1,3]-디옥솔란(DLin-K-MPZ), 1,2-디리놀레일카르바모일옥시-3-디메틸아미노프로판(DLin-C-DAP), 1,2-디리놀레이옥시-3-(디메틸아미노)아세톡시프로판(DLin-DAC), 1,2-디리놀레이옥시-3-모르폴리노프로판(DLin-MA), 1,2-디리놀레오일-3-디메틸아미노프로판(DLinDAP), 1,2-디리놀레일티오-3-디메틸아미노프로판(DLin-S-DMA), 1-리놀레오일-2-리놀레일옥시-3-디메틸아미노프로판(DLin-2-DMAP), 1,2-디리놀레일옥시-3-트리메틸아미노프로판 클로라이드 염(DLin-TMA.Cl), 1,2-디리놀레오일-3-트리메틸아미노프로판 클로라이드 염 (DLin-TAP.Cl), 1,2-디리놀레일옥시-3-(N-메틸피페라지노)프로판(DLin-MPZ), 3-(N,N-디리놀레일아미노)-1,2-프로판디올(DLinAP), 3-(N,N-디올레일아미노)-1,2-프로판디올(DOAP), 1,2-디리놀레일옥소-3-(2-N,N-디메틸아미노)에톡시프로판(DLin-EG-DMA), N,N-디올레일-N,N-디메틸암모늄 클로라이드(DODAC), N-(1-(2,3-디올레일옥시)프로필)-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드(DOTMA), N,N-디스테아릴-N,N-디메틸암모늄 브로마이드(DDAB), N-(1-(2,3-디올레오일옥시)프로필)-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드(DOTAP), 3-(N-(N',N'-디메틸아미노에탄)-카르바모일)콜레스테롤(DC-Chol), N-(1,2-디미리스틸옥시프로프-3-일)-N,N-디메틸-N-하이드록시에틸 암모늄 브로마이드(DMRIE), 2,3-디올레일옥시-N-[2(스퍼민-카르복사미도)에틸]-N,N-디메틸-1-프로판아미늄트리플루오로아세테이트(DOSPA), 디옥타데실아미도글리실 스퍼민(DOGS), 3-디메틸아미노-2-(콜레스트-5-엔-3-베타-옥시부탄-4-옥시)-1-(시스,시스-9,12-옥타데카디엔옥시)프로판(CLinDMA), 2-[5'-(콜레스트-5-엔-3-베타-옥시)-3'-옥사펜톡시)-3-디메틸-1-(시스,시스-9',1-2'-옥타데카디엔옥시)프로판(CpLinDMA), N,N-디메틸-3,4-디올레일옥시벤질아민(DMOBA), 1,2-N,N'-디올레일카르바밀-3-디메틸아미노프로판(DOcarbDAP), 1,2-N,N'-디리놀레일카르바밀-3-디메틸아미노프로판(DLincarbDAP), 덱사메타손-스퍼리민(DS) 및 이치환된 스퍼민(D2S) 또는 이들의 혼합물을 포함할 수 있다.
[0213] LIPOFECTIN®(DOTMA 및 DOPE 포함, GIBCO/BRL로부터 입수 가능) 및 LIPOFECT아민®(DOSPA 및 DOPE 포함, GIBCO/BRL로부터 입수 가능)과 같은 다수의 시판되는 양이온성 지질 제조물이 사용될 수 있다.
[0214] 특정 구체예에서, 양이온성 지질은 LNP의 약 10 중량% 내지 지질 나노입자의 약 85 중량%, 또는 LNP의 약 50 중량% 내지 LNP의 약 75 중량%의 양으로 존재할 수 있다.
[0215] 스테롤은 LNP에 유동성을 부여할 수 있다. 본원에서 사용되는 "스테롤"은 식물(피토스테롤) 또는 동물(동물스테롤) 기원의 임의의 자연 발생 스테롤뿐만 아니라 비자연 발생 합성 스테롤을 지칭하며, 이들 모두는 스테로이드 A-고리의 3-위치에 하이드록실 기의 존재를 특징으로 한다. 스테롤은 리포솜, 지질 소포 또는 지질 입자 제조 분야에서 통상적으로 사용되는 임의의 스테롤, 가장 일반적으로 콜레스테롤일 수 있다. 피토스테롤은 캄페스테롤, 시토스테롤 및 스티그마스테롤을 포함할 수 있다. 스테롤은 또한 미국 특허 출원 공개 2011/0177156에 기재된 것과 같은 스테롤-변형된 지질을 포함한다. 특정 구체예에서, 스테롤은 LNP의 약 5 중량% 내지 지질 나노입자의 약 50 중량% 또는 LNP의 약 10 중량% 내지 LNP의 약 25 중량%의 양으로 존재할 수 있다.
[0216] LNP는 중성 지질을 포함할 수 있다. 중성 지질은 생리학적 pH에서 하전되지 않은 형태 또는 중성 쯔비터이온 형태로 존재하는 임의의 지질 종을 포함할 수 있다. 이러한 지질은, 비제한적으로, 디아실포스파티딜콜린, 디아실포스파티딜에탄올아민, 세라마이드, 스핑고미엘린, 디하이드로스핑고미엘린, 세팔린 및 세레브로시드를 포함한다. 중성 지질의 선택은 일반적으로, 특히, 입자 크기 및 필요한 안정성을 고려하여 안내된다. 특정 구체예에서, 중성 지질 성분은 2개의 아실 기를 갖는 지질(예를 들어, 디아실포스파티딜콜린 및 디아실포스파티딜에탄올아민)일 수 있다.
[0217] 다양한 사슬 길이 및 포화도의 다양한 아실 사슬기를 갖는 지질이 이용 가능하거나 잘 알려진 기술에 의해 분리 또는 합성될 수 있다. 특정 구체예에서, 탄소 사슬 길이가 C14 내지 C22의 범위인 포화 지방산을 함유하는 지질이 사용될 수 있다. 특정 구체예에서, 탄소 사슬 길이가 C14 내지 C22의 범위인 단일 또는 이중 불포화 지방산을 갖는 지질이 사용된다. 추가로, 포화 및 불포화 지방산 사슬의 혼합물을 갖는 지질이 사용될 수 있다. 예시적인 중성 지질은, 비제한적으로, 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스파티딜-에탄올아민(DOPE), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DSPC), 1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(POPC), 또는 임의의 관련 포스파티딜콜린을 포함한다. 중성 지질은 또한 스핑고미엘린, 디하이드로스핑고미엘린, 또는 세린 및 이노시톨과 같은 다른 헤드 그룹을 갖는 인지질을 포함할 수 있다.
[0218] 특정 구체예에서, 중성 지질은 지질 나노입자의 약 0.1 중량% 내지 LNP의 약 75 중량%, 또는 LNP의 약 5 중량% 내지 LNP의 약 15 중량%의 양으로 존재할 수 있다.
[0219] LNP 캡슐화된 프로테아제, 글리코시다제 또는 재조합 바이러스 벡터는 약학적 조성물, 예를 들어, 약학적으로 허용되는 담체 또는 부형제에 혼입될 수 있다. 이러한 약학적 조성물은 무엇보다도 LNP 캡슐화된 프로테아제, 글리코시다제 또는 재조합 바이러스 벡터를 생체 내 또는 생체 외에서 대상체에 투여 및 전달하는데 유용하다.
[0220] LNP의 제조는, 예를 들어 그리고 비제한적으로, 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 및 스테롤을 포함할 수 있는 추가적인 성분과 조합될 수 있다.
[0221] 용어 "PEG"는 2개의 말단 하이드록실 기를 갖는 에틸렌 PEG 반복 단위의 선형, 수용성 중합체인 폴리에틸렌 글리콜을 지칭한다. PEG는 분자량에 따라 분류된다; 예를 들어, PEG 2000은 약 2,000 달톤의 평균 분자량을 갖고, PEG 5000은 약 5,000 달톤의 평균 분자량을 갖는다. PEG는 Sigma Chemical Co. 및 다른 회사로부터 상업적으로 입수 가능하며, 예를 들어, 다음의 기능성 PEG를 포함한다: 모노메톡시폴리에틸렌 글리콜(MePEG-OH), 모노메톡시폴리에틸렌 글리콜-숙시네이트(MePEG-S), 모노메톡시폴리에틸렌 글리콜-숙신이미딜 숙시네이트(MePEG-S-NHS), 모노메톡시폴리에틸렌 글리콜-아민(MePEG-NH2), 모노메톡시폴리에틸렌 글리콜-트레실레이트(MePEG-TRES) 및 모노메톡시폴리에틸렌 글리콜-이미다졸릴-카르보닐(MePEG-IM).
[0222] 특정 구체예에서, PEG는 약 550 내지 약 10,000 달톤의 평균 분자량을 갖는 폴리에틸렌 글리콜일 수 있고, 알킬, 알콕시, 아실 또는 아릴에 의해 선택적으로 치환된다. 특정 구체예에서, PEG는 말단 하이드록실 위치에서 메틸로 치환될 수 있다. 특정 구체예에서, PEG는 약 750 내지 약 5,000 달톤 또는 약 1,000 내지 약 5,000 달톤 또는 약 1,500 내지 약 3,000 달톤 또는 약 2,000 달톤 또는 약 750 달톤의 평균 분자량을 가질 수 있다. PEG는 알킬, 알콕시, 아실 또는 아릴로 선택적으로 치환될 수 있다. 특정 구체예에서, 말단 하이드록실 기는 메톡시 또는 메틸 기로 치환될 수 있다.
[0223] PEG-변형된 지질은 미국 특허 번호 8,936,942 및 7,803,397에 기재된 PEG-디알킬옥시프로필 컨쥬게이트(PEG-DAA)를 포함한다. 유용한 PEG-변형된 지질(또는 지질-폴리옥시에틸렌 컨쥬게이트)은 PEG 부분을 지질 소포의 표면에 고정시키기 위해 다양한 "앵커링" 지질 부분을 가질 수 있다. 적합한 PEG-변형된 지질의 예는 PEG-변형된 포스파티딜에탄올아민 및 포스파티드산, 미국 특허 번호 5,820,873에 기재된 PEG-세라마이드 컨쥬게이트(예를 들어, PEG-CerC14 또는 PEG-CerC20), PEG-변형된 디알킬아민 및 PEG-변형된 1,2-디아실옥시프로판-3-아민을 포함한다. 특정 구체예에서, PEG-변형된 지질은 PEG-변형된 디아실글리세롤 및 디알킬글리세롤일 수 있다. 특정 구체예에서, PEG는 LNP의 약 0.5 중량% 내지 LNP의 약 20 중량%, 또는 LNP의 약 5 중량% 내지 LNP의 약 15 중량%의 양으로 존재할 수 있다.
[0224] 또한, LNP는 PEG-변형된 및 스테롤-변형된 LNP일 수 있다. 추가적인 성분과 조합된 LNP는 동일하거나 별개의 LNP일 수 있다. 즉, 동일한 LNP는 PEG 변형 및 스테롤 변형될 수 있거나, 대안적으로, 제1 LNP는 PEG 변형될 수 있고 제2 LNP는 스테롤 변형될 수 있다. 선택적으로, 제1 및 제2 변형된 LNP는 조합될 수 있다.
[0225] 특정 구체예에서, 캡슐화하기 전에, LNP는 약 10 nm 내지 500 nm 또는 약 50 nm 내지 약 200 nm 또는 75 nm 내지 약 125 nm 범위의 크기를 가질 수 있다. 특정 구체예에서, LNP 캡슐화된 프로테아제, 글리코시다제 또는 재조합 바이러스 벡터는 약 10 nm 내지 500 nm 범위의 크기를 가질 수 있다.
[0226] 용어 "핵산" 및 "폴리뉴클레오티드"는 데옥시리보핵산(DNA) 및 리보핵산(RNA)을 포함하는 모든 형태의 핵산, 올리고뉴클레오티드를 지칭하기 위해 본원에서 상호 교환적으로 사용된다. 핵산은 유전체 DNA, cDNA 및 안티센스 DNA, 및 스플라이싱되거나 스플라이싱되지 않은 mRNA, rRNA tRNA 및 억제성 DNA 또는 RNA(RNAi, 예를 들어, 작거나 짧은 헤어핀 (sh)RNA, 마이크로RNA(miRNA), 작거나 짧은 간섭 (si)RNA, 트랜스-스플라이싱 RNA 또는 안티센스 RNA)를 포함한다.
[0227] 핵산은 자연 발생, 합성, 및 의도적으로 변형되거나 변경된 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 핵산은 단일, 이중 또는 삼중, 선형 또는 원형일 수 있고, 임의의 길이일 수 있다. 핵산을 논의할 때, 특정 폴리뉴클레오티드의 서열 또는 구조는 5'에서 3' 방향으로 서열을 제공하는 규정에 따라 본원에 기술될 수 있다.
[0228] "이종성" 폴리뉴클레오티드 또는 핵산 서열은 세포로의 폴리뉴클레오티드의 벡터 매개 이동/전달을 목적으로 플라스미드 또는 벡터에 삽입된 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 이종성 핵산 서열은 바이러스 핵산과 별개이며, 즉, 바이러스 핵산에 대해 비-천연이다. 일단 세포 내로 이동/전달되면, 벡터 내에 포함된 이종성 핵산 서열은 발현될 수 있다(예를 들어, 전사되고, 적절한 경우 번역됨). 대안적으로, 벡터 내에 함유된 이동/전달된 이종성 폴리뉴클레오티드는 세포에서 발현될 필요가 없다. 용어 "이종성"이 핵산 서열 및 폴리뉴클레오티드와 관련하여 본원에서 항상 사용되는 것은 아니지만, 수식어 "이종성"이 없는 경우에도 핵산 서열 또는 폴리뉴클레오티드에 대한 언급은 그 생략에도 불구하고 이종성 핵산 서열 및 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것으로 의도된다.
[0229] "트랜스진"은 본원에서 세포 또는 유기체에 도입하고자 하거나 도입된 핵산을 편리하게 지칭하는데 사용된다. 트랜스진은 단백질 또는 펩티드를 인코딩하는 이종성 폴리뉴클레오티드 서열 또는 이종성 핵산과 같은 임의의 핵산을 포함한다. 용어 트랜스진 및 이종성 핵산/폴리뉴클레오티드 서열은 본원에서 상호 교환적으로 사용된다.
[0230] 특정 구체예에서, 이종성 폴리뉴클레오티드는 폼페병의 치료를 위한 GAA(산 알파-글루코시다제); 윌슨병의 치료를 위한 ATP7B(구리 수송 ATPase2); 파브리병의 치료를 위한 알파 갈락토시다제; 시트룰린혈증 타입 1의 치료를 위한 ASS1(아르기노숙시네이트 신타제); 고셔병 타입 1의 치료를 위한 베타-글루코세레브로시다제; 테이 삭스병의 치료를 위한 베타-헥소사미니다제 A; C1 억제제 결핍증 타입 I 및 타입 II로도 알려진 유전성 혈관부종(HAE)의 치료를 위한 SERPING1(C1 프로테아제 억제제 또는 C1 에스테라제 억제제); 및 글리코겐 축적병 타입 I(GSDI)의 치료를 위한 글루코스-6-포스파타제로 구성된 군으로부터 선택된 단백질을 인코딩한다.
[0231] 특정 구체예에서, 이종성 폴리뉴클레오티드는 인슐린, 글루카곤, 성장 호르몬(GH), 부갑상선 호르몬(PTH), 성장 호르몬 방출 인자(GRF), 난포 자극 호르몬(FSH), 황체형성 호르몬(LH), 인간 융모색식샘 자극호르몬(hCG), 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 앤지오포이에틴, 앤지오스타틴, 과립구 집락 자극 인자(GCSF), 에리트로포이에틴(EPO), 결합 조직 성장 인자(CTGF), 염기성 섬유모세포 성장 인자(bFGF), 산성 섬유모세포 성장 인자(aFGF), 표피 성장 인자(EGF), 형질전환 성장 인자 α(TGFα), 혈소판 유래 성장 인자(PDGF), 인슐린 성장 인자 I 및 II(IGF-I 및 IGF-II), TGFβ, 액티빈, 인히빈, 골 형성 단백질(BMP), 신경 성장 인자(NGF), 뇌 유래 신경영양 인자(BDNF), 뉴로트로핀 NT-3 및 NT4/5, 섬모 신경영양 인자(CNTF), 신경아교세포주 유래 신경영양 인자(GDNF), 뉴투린, 아그린, 네트린-1 및 네트린-2, 간세포 성장 인자(HGF), 에프린, 노긴, 소닉 헤지호그 및 티로신 하이드록실라제로 구성된 군으로부터 선택된 단백질을 인코딩한다.
[0232] 특정 구체예에서, 이종성 폴리뉴클레오티드는 산 α-글루코시다제(GAA)를 인코딩한다. GAA를 인코딩하는 이종성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 바이러스 벡터를 폼페병 또는 다른 글리코겐 축적병을 갖는 대상체에 투여하면 GAA 단백질이 발현될 수 있다. 환자에서 GAA 단백질의 발현은 글리코겐의 축적을 저해, 억제 또는 감소시키고, 글리코겐의 축적을 방지하거나 글리코겐을 분해하고, 이는 차례로 폼페병 또는 다른 글리코겐 축적병의 하나 이상의 부작용을 감소 또는 저하시킬 수 있다.
[0233] 특정 구체예에서, 이종성 폴리뉴클레오티드는 트롬보포이에틴(TPO), 인터루킨(IL-1 내지 IL-36 등), 단핵구 화학유인 단백질, 백혈병 억제 인자, 과립구-대식세포 집락 자극 인자, Fas 리간드, 종양 괴사 인자 α 및 β, 인터페론 α, β 및 γ, 줄기 세포 인자, flk-2/flt3 리간드, IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE, 키메라 면역글로불린, 인간화된 항체, 단일 사슬 항체, T 세포 수용체, 키메라 T 세포 수용체, 단일 사슬 T 세포 수용체, 클래스 I 및 클래스 II MHC 분자로 구성된 군으로부터 선택된 단백질을 인코딩한다.
[0234] 특정 구체예에서, 이종성 폴리뉴클레오티드는 CFTR(낭성 섬유증 막횡단 조절 단백질), 혈액 응고(응고) 인자(인자 XIII, 인자 IX, 인자 VIII, 인자 X, 인자 VII, 인자 VIIa, 단백질 C 등), 기능 획득 혈액 응고 인자, 항체, 망막 색소 상피-특이적 65 kDa 단백질(RPE65), 에리트로포이에틴, LDL 수용체, 지단백질 리파제, 오르니틴 트랜스카르바밀라제, β-글로빈, α-글로빈, 스펙트린, α-항트립신, 아데노신 데아미나제(ADA), 금속 수송체(ATP7A 또는 ATP7), 설파미다제, 리소좀 축적병(ARSA)에 관여하는 효소, 하이포크산틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제, β-25 글루코세레브로시다제, 스핑고미엘리나제, 리소좀 헥소사미니다제, 분지쇄 케토산 데하이드로게나제, 호르몬, 성장 인자, 인슐린-유사 성장 인자 1 또는 2, 혈소판 유래 성장 인자, 표피 성장 인자, 신경 성장 인자, 신경영양 인자-3 및 -4, 뇌 유래 신경영양 인자, 아교세포 유래 성장 인자, 형질전환 성장 인자 α 및 β, 사이토카인, α-인터페론, β-인터페론, 인터페론-γ, 인터루킨-2, 인터루킨-4, 인터루킨 12, 과립구-대식세포 집락 자극 인자, 림프독소, 자살 유전자 생성물, 단순 헤르페스 바이러스 티미딘 키나제, 시토신 데아미나제, 디프테리아 독소, 사이토크롬 P450, 데옥시시티딘 키나제, 종양 괴사 인자, 약물 내성 단백질, 종양 억제인자 단백질(예를 들어, p53, Rb, Wt-1, NF1, Von Hippel-Lindau(VHL), 선종성 결장폴립증(APC)), 면역조절 특성을 갖는 펩티드, 관용성 또는 면역원성 펩티드 또는 단백질 트레지톱 또는 hCDR1, 인슐린, 글루코키나제, 구아닐레이트 사이클라제 2D(LCA-GUCY2D), Rab 에스코트 단백질 1(범맥락막위축), LCA 5(LCA-레버실린), 오르니틴 케톤산 아미노트랜스퍼라제(유전성 망막위축증(Gyrate Atrophy)), 레티노스키신 1(X-연결된 망막층간분리), USH1C(어셔 증후군 1C), X-연결된 색소성 망막염 GTPase(XLRP), MERTK(AR 형태의 RP: 색소성 망막염), DFNB1(코넥신 26 난청), ACHM 2, 3 및 4(완전색맹), PKD-1 또는 PKD-2(다낭성 신장 질환), TPP1, CLN2, 설파타제, N-아세틸글루코사민-1-포스페이트 트랜스퍼라제, 카텝신 A, GM2-AP, NPC1, VPC2, 스핑고지질 활성화제 단백질, 유전체 편집을 위한 하나 이상의 아연 핑거 뉴클레아제, 또는 유전체 편집을 위한 복구 주형으로 사용되는 하나 이상의 공여자 서열을 인코딩한다.
[0235] 특정 구체예에서, 이종성 폴리뉴클레오티드는 빈혈의 치료를 위한 에리트로포이에틴(EPO); 다양한 면역 장애, 바이러스 감염 및 암의 치료를 위한 인터페론-알파, 인터페론-베타 및 인터페론-감마; 다양한 염증성 질환 또는 면역 결핍증의 치료를 위한 IL-1 내지 IL-36 중 어느 하나를 포함하는 인터루킨(IL) 및 상응하는 수용체; 면역 장애의 치료를 위한 케모카인(C-X-C 모티프) 리간드 5(CXCL5)를 포함하는 케모카인; 크론병과 같은 면역 장애의 치료를 위한 과립구-대식세포 집락 자극 인자(G-CSF); 다양한 인간 염증성 질환의 치료를 위한 과립구-대식세포 집락 자극 인자(GM-CSF); 다양한 인간 염증성 질환의 치료를 위한 대식세포 집락 자극 인자(M-CSF); 상피 조직 손상의 치료를 위한 각질 세포 성장 인자(KGF); 재발성 유산, HIV-관련 합병증 및 인슐린 내성의 치료를 위한 단핵구 화학유인 단백질-1(MCP-1)과 같은 케모카인; 다양한 면역 장애의 치료를 위한 종양 괴사 인자(TNF) 및 수용체; 폐기종 또는 만성 폐쇄성 폐질환(COPD)의 치료를 위한 알파1-항트립신; 점액다당류증 I(MPS I)의 치료를 위한 알파-L-이두로니다제; 오르니틴 트랜스카르바모일라제(OTC) 결핍의 치료를 위한 OTC; 페닐케톤뇨증(PKU)의 치료를 위한 페닐알라닌 하이드록실라제(PAH) 또는 페닐알라닌 암모니아-리아제(PAL); 지단백질 리파제 결핍의 치료를 위한 지단백질 리파제; 아포지단백질(Apo) A-I 결핍의 치료를 위한 아포지단백질; 가족성 고콜레스테롤혈증(FH)의 치료를 위한 저밀도 지단백질 수용체(LDL-R); 저알부민혈증의 치료를 위한 알부민; 레시틴 콜레스테롤 아실트랜스퍼라제(LCAT); 카르바모일 합성효소 I; 아르기니노숙시네이트 합성효소; 아르기니노숙시네이트 리아제; 아르기나제; 푸마릴아세토아세테이트 하이드롤라제; 포르포빌리노겐 데아미나제; 호모시스틴뇨증의 치료를 위한 시스타티오닌 베타-신타제; 분지쇄 케토산 데카르복실라제; 이소발레릴-CoA 데하이드로게나제; 프로피오닐 CoA 카르복실라제; 메틸말로닐-CoA 뮤타제; 글루타릴 CoA 데하이드로게나제; 인슐린; 피루베이트 카르복실라제; 간 포스포릴라제; 포스포릴라제 키나제; 글리신 데카르복실라제; H-단백질; T-단백질; 낭성 섬유증 막횡단 조절인자(CFTR); 스타가르트병의 치료를 위한 ATP-결합 카세트, 서브패밀리 A(ABC1), 구성원 4(ABCA4); 또는 디스트로핀을 인코딩한다.
[0236] 용어 "폴리펩티드", "단백질" 및 "펩티드"는 본원에서 상호 교환적으로 사용된다. "폴리뉴클레오티드 서열"에 의해 인코딩된 "폴리펩티드", "단백질" 및 "펩티드"는 자연 발생 단백질과 마찬가지로 전장 천연 서열을 포함함은 물론, 하위서열, 변형된 형태 또는 변이체가 천연 전장 단백질의 어느 정도의 기능을 보유하는 한 기능적 하위서열, 변형된 형태 또는 서열 변이체를 포함한다. 본 발명에서, 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된 이러한 폴리펩티드, 단백질 및 펩티드는 결함이 있거나, 그 발현이 불충분하거나, 또는 치료되는 포유동물에서 결핍인 내인성 단백질과 동일할 수 있지만 반드시 동일할 필요는 없다.
[0237] 특정 구체예에서, 이종성 폴리뉴클레오티드는 siRNA, 안티센스 분자, miRNA, RNAi, 리보자임 및 shRNA로 구성된 군으로부터 선택된 억제성 핵산을 인코딩한다.
[0238] 특정 구체예에서, 억제성 핵산은 헌팅틴(HTT) 유전자, 치상핵적핵담창구시상하핵 위축증과 관련된 유전자(아트로핀 1, ATN1), 척수구근 근위축증에서 X 염색체 상의 안드로겐 수용체, 인간 어택신-1, -2, -3 및 -7, Cav2.1 P/Q 전압-의존성 칼슘 채널(CACNA1A), TATA-결합 단백질, 어택신 8 반대 가닥(ATXN8OS), 척수소뇌성 실조증에서 세린/트레오닌-단백질 포스파타제 2A 55 kDa 조절 서브유닛 B 베타 아이소형(타입 1, 2, 3, 6, 7, 8, 12 17), 취약 X 증후군에서 FMR1(취약 X 정신 지체 1), 취약 X-관련 떨림/운동실조 증후군에서 FMR1(취약 X 정신 지체 1), 취약 XE 정신 지체에서 FMR1(취약 X 정신 지체 2) 또는 AF4/FMR2 패밀리 구성원 2; 근긴장 디스트로피에서 마이오토닌-단백질 키나제(MT-PK); 프리드리히 운동실조에서 프라탁신; 근위축성 측삭 경화증에서 수퍼옥사이드 디스뮤타제 1(SOD1) 유전자의 돌연변이체; 파킨슨병 및/또는 알츠하이머병의 발병기전에 관여하는 유전자; 아포지단백질 B(APOB) 및 프로단백질 전환효소 서브틸리신/케신 타입 9(PCSK9), 고콜레스테롤혈증; HIV 감염에서 인간 면역결핍 바이러스 트랜스활성화제의 전사 유전자인 HIV Tat; HIV 감염에서 인간 면역결핍 바이러스 트랜스활성화제 반응 요소 유전자인 HIV TAR; HIV 감염에서 C-C 케모카인 수용체(CCR5); RSV 감염에서 Rous 육종 바이러스(RSV) 뉴클레오캡시드 단백질, C형 간염 바이러스 감염에서 간-특이적 마이크로RNA(miR-122); p53, 급성 신장 손상 또는 이식편 기능 지연 신장 이식 또는 신장 손상 급성 신부전; 진행 재발성 또는 전이성 고형 악성종양에서 단백질 키나제 N3(PKN3); LMP2, 프로테아좀 서브유닛 베타-타입 9(PSMB 9)로도 알려진 LMP2, 전이성 흑색종; 프로테아좀 서브유닛 베타-타입 8(PSMB 8)로도 알려진 LMP7, 전이성 흑색종; 프로테아좀 서브유닛 베타-타입 10(PSMB 10)으로도 알려진 MECL1, 전이성 흑색종; 고형 종양에서 혈관 내피 성장 인자(VEGF); 고형 종양에서 키네신 방추 단백질, 만성 골수성 백혈병에서 아폽토시스 억제인자 B-세포 CLL/림프종(BCL-2); 고형 종양에서 리보뉴클레오티드 환원효소 M2(RRM2); 고형 종양의 푸린; 간 종양에서 폴로-유사 키나제 1(PLK1), C형 간염 감염에서 디아실글리세롤 아실트랜스퍼라제 1(DGAT1), 가족성 선종성 폴립증에서 베타-카테닌; 베타2 아드레날린 수용체, 녹내장; 당뇨병 황반 부종(DME) 또는 연령-관련 황반 변성에서 DNA 손상-유도성 전사체 4 단백질로도 알려진 RTP801/Redd1; 연령-관련 황반 변성 또는 맥락막 혈관신생에서 혈관 내피 성장 인자 수용체 I(VEGFR1), 비-동맥 허혈성 시신경병증에서 카스파제 2; 선천성 손발톱비대증에서 케라틴 6A N17K 돌연변이체 단백질; 인플루엔자 감염에서 인플루엔자 A 바이러스 유전체/유전자 서열; 중증 급성 호흡기 증후군(SARS) 감염에서 SARS 코로나바이러스 유전체/유전자 서열; 호흡기 세포 융합 바이러스 감염에서 호흡기 세포 융합 바이러스 유전체/유전자 서열; 에볼라 감염에서 에볼라 필로바이러스 유전체/유전자 서열; B형 및 C형 간염 감염에서 B형 및 C형 간염 바이러스 유전체/유전자 서열; 단순 헤르페스 바이러스(HSV) 감염에서 HSV 유전체/유전자 서열, 콕사키바이러스 B3 감염에서 콕사키바이러스 B3 유전체/유전자 서열; 원발성 근긴장이상, 범-부류 I에서 토르신 A(TOR1A)와 같은 유전자의 병원성 대립유전자 및 이식에 특이적인 HLA-대립유전자의 침묵(대립유전자-특이적 침묵); 및 상염색체 우성 유전 색소성 망막염(adRP)에서 돌연변이체 로돕신 유전자(RHO)로 구성된 군으로부터 선택된 유전자, 유전자의 전사체, 또는 폴리뉴클레오티드 반복 질환과 관련된 유전자의 전사체에 결합한다.
[0239] 재조합 바이러스 벡터 용량은 임의의 적절한 용량으로 투여될 수 있다. 일반적으로, 용량은 치료 효과를 달성하기 위해 대상체의 중량 킬로그램당 적어도 1x108, 또는 그 초과, 예를 들어, 1x109, 1x1010, 1x1011, 1x1012, 1x1013 또는 1x1014, 또는 그 초과의 벡터 유전체(vg/kg)의 범위일 것이다. 마우스에서 1x1010 내지 1x1011 vg/kg 및 개에서 1x1012 내지 1x1013 vg/kg 범위의 AAV 용량이 효과적이었다. 보다 구체적으로, 용량은 약 1x1011 vg/kg 내지 약 5x1014 vg/kg 또는 약 5x1011 vg/kg 내지 약 1x1014 vg/kg 또는 약 5x1011 vg/kg 내지 약 5x1013 vg/kg 또는 약 5x1011 vg/kg 내지 약 1x1013 vg/kg 또는 약 5x1011 vg/kg 내지 약 5x1012 vg/kg 또는 약 5x1011 vg/kg 내지 약 1x1012 vg/kg이다. 용량은, 예를 들어, 약 5x1014 vg/kg 또는 약 5x1014 vg/kg 미만, 예를 들어, 약 2x1011 내지 약 2x1014 vg/kg, 특히, 예를 들어, 약 2x1012 vg/kg, 약 6x1012 vg/kg 또는 약 2x1013 vg/kg의 용량일 수 있다.
[0240] 특정 구체예에서, IgG와 FcRn의 상호작용을 감소시키는 제제를 대상체에 투여하는 것은 대상체의 유전자 요법 치료에 유효해지는데 필요한 치료적 이종성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 바이러스 벡터의 용량을 감소시킨다. 특정 구체예에서, IgG와 FcRn의 상호작용을 감소시키는 제제를 대상체에 투여하는 것은 치료적 이종성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 바이러스 벡터의 증가된 용량의 투여를 허용한다.
[0241] 특정 구체예에서, IgG와 FcRn의 상호작용을 감소시키는 제제를 대상체에 투여하는 것에 추가하여, 대상체에 프로테아제 및/또는 글리코시다제의 투여는 대상체의 치료에 유효해지는데 필요한 치료적 이종성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 바이러스 벡터의 용량을 감소시킨다. 특정 구체예에서, IgG와 FcRn의 상호작용을 감소시키는 제제를 대상체에 투여하는 것에 추가하여, 대상체에 프로테아제 및/또는 글리코시다제의 투여는 치료적 이종성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 바이러스 벡터의 증가된 용량의 투여를 허용한다.
[0242] 용량은 다양할 수 있으며, 치료가 지시되는 질병의 유형, 발병, 진행, 중증도, 빈도, 기간 또는 확률, 원하는 임상 종말점, 이전 또는 동시 치료, 대상체의 일반적인 건강 상태, 연령, 성별, 인종 또는 면역학적 수행능력 및 숙련된 기술자에 의해 인식될 다른 인자에 의존한다. 용량, 수, 빈도 또는 기간은 치료 또는 요법의 임의의 부작용, 합병증 또는 다른 위험 인자 및 대상체의 상태에 의해 지시되는 바에 따라, 비례적으로 증가 또는 감소될 수 있다. 숙련된 기술자는 치료적 또는 예방적 이점을 제공하기에 충분한 양을 제공하는데 필요한 투여량 및 시기에 영향을 미칠 수 있는 인자를 인식할 것이다.
[0243] 치료 효과를 달성하기 위한 용량, 예를 들어, 벡터 유전체의 용량/체중 킬로그램(vg/kg)은 투여 경로, 치료 효과를 달성하는데 필요한 이종성 폴리뉴클레오티드의 발현 수준, 치료되는 특정 질환, 재조합 바이러스 벡터에 대한 임의의 숙주 면역 반응, 이종성 폴리뉴클레오티드 또는 발현 생성물(단백질 또는 펩티드 또는 전사된 핵산)에 대한 숙주 면역 반응, 및 발현된 단백질 또는 펩티드 또는 전사된 핵산의 안정성을 포함하나 이에 제한되지 않는 여러 인자에 기초하여 달라질 것이다. 당업자는 전술한 인자뿐만 아니라 다른 인자에 기초하여 특정 질병 또는 장애를 갖는 환자를 치료하기 위한 재조합 바이러스 벡터 유전체의 용량 범위를 결정할 수 있다.
[0244] "유효량" 또는 "충분한 양"은 단일 또는 다중 용량으로, 단독으로 또는 하나 이상의 다른 조성물, 치료, 프로토콜 또는 치료 요법 제제와 함께, 임의의 지속 기간(장기 또는 단기)의 검출 가능한 반응, 임의의 측정 가능하거나 검출 가능한 정도 또는 임의의 지속 기간 동안(예를 들어, 수분, 수시간, 수일, 수개월, 수년 또는 치료되는 동안) 대상체에서 예상되거나 원하는 결과 또는 이익을 제공하는 양을 지칭한다. 질병의 진행 또는 악화를 감소, 저하, 억제, 저해, 제한 또는 제어하는 것이 만족스러운 결과이지만, 치료를 위한(예를 들어, 치료 이점 또는 개선을 제공하거나 개선하기 위한) "유효량" 또는 "충분한 양"의 용량은 전형적으로 측정 가능한 정도로 하나, 다수 또는 모든 부작용, 질병의 결과 또는 합병증, 예를 들어, 질병에 의해 야기되거나 그와 관련된 하나 이상의 불리한 증상, 장애, 질병, 병리 또는 합병증에 대한 반응을 제공하는데 효과적이다.
[0245] 유효량 또는 충분한 양은 단일 투여로 제공될 수 있지만 반드시 필요한 것은 아니며, 다중 투여를 필요로 할 수 있고, 단독으로 또는 다른 조성물(예를 들어, 제제), 치료, 프로토콜 또는 치료 요법과 함께 투여될 수 있으나 반드시 필요한 것은 아니다. 예를 들어, 양은 대상체, 치료되는 질병의 유형, 상태 및 중증도 또는 치료의 부작용(있는 경우)에 의해 지시되는 바에 따라 비례적으로 증가될 수 있다. 또한, 추가 용량, 이러한 용량 이상 및 미만의 양 또는 기간, 또는 추가 조성물(예를 들어, 약물 또는 제제), 치료, 프로토콜 또는 치료 요법이 주어진 대상체에서 효과적이거나 충분한 것으로 간주되기 위해 포함될 수 있으므로, 유효량 또는 충분한 양은 제2 조성물(예를 들어, 다른 약물 또는 제제), 치료, 프로토콜 또는 치료 요법 없이 단일 또는 다중 용량으로 제공되는 경우 효과적이거나 충분할 필요가 없다. 효과적인 것으로 간주되는 양은 또한 리소좀 축적병(예를 들어, 폼페병)의 치료를 위한 재조합 GAA의 투여, 또는 응고 장애(예를 들어, 혈우병 A(HemA) 또는 혈우병 B(HemB))의 치료를 위한 재조합 응고 인자 단백질(예를 들어, FVIII 또는 FIX)의 투여와 같은 다른 치료, 치료 요법 또는 프로토콜의 사용을 감소시키는 양을 포함한다.
[0246] 폼페병의 경우, 유효량은 글리코겐 생산 또는 축적을 억제 또는 감소시키거나, 글리코겐 분해 또는 제거를 향상 또는 증가시키거나, 대상체의 신체 조직에서 리소좀 변화를 감소시키거나, 대상체의 근긴장 및/또는 근력 및/또는 호흡 기능을 개선시키는 GAA의 양일 것이다. 유효량은, 예를 들어, 혈장으로부터의 근모세포에 의한 GAA 흡수의 동역학을 확인함으로써 결정될 수 있다. 약 141-147 nM의 근모세포 GAA 흡수율(K 흡수)이 효과적일 수 있는 것으로 보인다(예를 들어, Maga et al., J. Biol. Chem. 2012 참조). 동물 모델에서, 약 1,000 nmol/hr/mL 초과, 예를 들어, 약 1,000 내지 약 2,000 nmol/hr/mL의 혈장 내 GAA 활성 수준이 치료적으로 효과적인 것으로 관찰되었다.
[0247] HemA 및 HemB의 경우, 일반적으로 말하면, 치료 효과를 달성하기 위해, 정상 개체에서 발견되는 인자 농도의 1%보다 큰 혈액 응고 인자 농도가 중증 질병 표현형을 중등도의 표현형으로 바꾸기 위해 필요하다고 여겨진다. 중증 표현형은 관절 손상 및 생명을 위협하는 출혈을 특징으로 한다. 중등도 질환 표현형을 경증 표현형으로 전환하기 위해서는, 정상의 5%보다 큰 혈액 응고 인자 농도가 필요하다고 여겨진다.
[0248] 정상 인간에서 FVIII 및 FIX 수준은 약 150-200 ng/혈장 mL지만, 더 적거나(예를 들어, 약 100-150 ng/mL의 범위) 더 클 수 있고(예를 들어, 약 200-300 ng/mL의 범위), 예를 들어, 활성화된 부분 트롬보플라스틴 시간(aPTT) 한-단계 응고 검정에 의해 결정된 바와 같이 기능적 응고로 인해 여전히 정상으로 간주된다. 따라서, 대상체/인간에서 FVIII 또는 FIX의 총량이 정상 대상체/인간에 존재하는 FVIII 또는 FIX의 1% 초과, 예를 들어, 100-300 ng/mL의 1%를 초과하도록 치료 효과가 달성될 수 있다.
[0249] 조성물은 조합 조성물로서 대상체에 투여되거나, 이종성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 바이러스 벡터의 동시적 또는 연속적 또는 순차적(전 또는 후에) 전달 또는 투여와 같이, 별도로 투여될 수 있다. 본 발명은 본 발명의 방법 또는 용도가 본원에 제시되거나 당업자에게 공지된 임의의 화합물, 제제, 약물, 치료 요법, 치료 프로토콜, 과정, 치료제 또는 조성물과 조합되는 조합을 제공한다. 화합물, 제제, 약물, 치료 요법, 치료 프로토콜, 과정, 치료제 또는 조성물은 이종성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 바이러스 벡터를 대상체에 투여하기 전, 실질적으로 동시 또는 후에 투여되거나 수행될 수 있다.
[0250] 따라서, 본 발명은 특히 다른 화합물, 제제, 약물, 치료 요법, 치료 프로토콜, 과정 또는 치료제의 필요성 또는 사용을 감소시키는 방법 및 용도를 포함한다. 예를 들어, 혈액 응고 질병의 경우, 본 발명에 따른 치료 방법은 주어진 대상체에서 대상체의 결핍 또는 결함(비정상 또는 돌연변이) 내인성 응고 인자를 보충하기 위한 재조합 응고 인자 단백질의 투여를 덜 빈번하게 하거나 용량을 감소시키거나 투여가 제거된 경우 치료 이점을 갖는다. 또 다른 예에서, 폼페병과 같은 리소좀 축적병의 경우, 본 발명에 따른 치료 방법은 GAA를 포함하는 재조합 바이러스 벡터의 덜 빈번하거나 감소된 용량이 이전에 투여되었거나 대상체에 계속해서 투여된 경우에도 치료적 이점을 갖는다. 따라서, 다른 치료 또는 요법의 필요성 또는 사용을 감소시키는 것이 본 발명에 포함된다.
[0251] 유효량 또는 충분한 양은 치료된 각각의 및 모든 대상체, 또는 주어진 그룹 또는 집단에서 치료된 대상체의 대다수에서 효과적일 필요는 없다. 유효량 또는 충분한 양은 그룹 또는 일반 집단이 아닌 특정 대상체에 대한 효과 또는 충분량을 의미한다. 이러한 방법에 대해 전형적인 바와 같이, 일부 대상체는 주어진 치료 방법 또는 사용에 대해 더 큰 반응을 나타내거나, 반응을 덜 나타내거나 전혀 나타내지 않을 것이다.
[0252] 용어 "개선"은 대상체의 질병 또는 이의 증상, 또는 기저 세포 반응에서 검출 가능하거나 측정 가능한 개선을 의미한다. 검출 가능하거나 측정 가능한 개선은 질병 또는 질병에 의해 야기되거나 이와 관련된 합병증의 발생, 빈도, 중증도, 진행 또는 지속 기간의 주관적 또는 객관적 감소, 저하, 억제, 저해, 제한 또는 제어, 또는 증상 또는 질병의 근본 원인 또는 결과의 개선, 또는 질병의 역전을 포함한다. 폼페병의 경우, 유효량은, 예를 들어, 글리코겐 생산 또는 축적을 억제 또는 감소시키고, 글리코겐 분해 또는 제거를 향상 또는 증가시키고, 근긴장 및/또는 근력 및/또는 호흡 기능을 개선시키는 양일 것이다. HemA 또는 HemB의 경우, 유효량은, 예를 들어, 대상체에서 급성 출혈 에피소드의 빈도 또는 중증도를 감소시키는 양, 또는 예를 들어, 응고 검정에 의해 측정된 바와 같이 응고 시간을 감소시키는 양일 것이다.
[0253] 따라서, 본 발명의 약학적 조성물은 활성 성분이 의도된 치료 목적을 달성하기 위해 유효량으로 함유된 조성물을 포함한다. 치료적 유효 용량을 결정하는 것은 당 분야에 공지된 기술 및 지침을 사용하고 본원에 제공된 교시를 사용하여 충분히 숙련된 의사의 능력 내에 있다.
[0254] 치료 용량은 다른 인자들 중에서 대상체의 연령 및 일반적인 상태, 비정상 표현형의 중증도, 및 발현 수준을 조절하는 제어 서열의 강도에 의존할 것이다. 따라서, 인간에서 치료적 유효량은 벡터-기반 치료에 대한 개별 환자의 반응에 기초하여 의사에 의해 결정될 수 있는 비교적 넓은 범위에 속할 것이다. 이러한 용량은 단독으로 또는 면역억제제 또는 약물과 조합될 수 있다.
[0255] 약학적 조성물과 같은 조성물은 트랜스진 발현 및 선택적으로 인코딩된 단백질의 생산을 허용하도록 대상체에 전달될 수 있다. 특정 구체예에서, 약학적 조성물은 대상체에서 지혈을 개선시키기 위해 대상체가 치료적 유효량의 혈액 응고 인자를 생산할 수 있는 충분한 유전 물질을 포함한다. 특정 구체예에서, 약학적 조성물은 대상체가 치료적 유효량의 GAA를 생산할 수 있는 충분한 이종성 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
[0256] 특정 구체예에서, 대상체에서 치료 효과는 일정 기간, 예를 들어, 2-4, 4-6, 6-8, 8-10, 10-14, 14-20, 20-25, 25-30 또는 30-50일 이상, 예를 들어, 50-75, 75-100, 100-150, 150-200일 이상 지속된다. 따라서, 특정 구체예에서, 재조합 바이러스 벡터는 치료 효과를 제공한다.
[0257] 특정 구체예에서, 재조합 바이러스 벡터는 면역억제제 없이 치료 효과를 제공한다. 특정 구체예에서, 적어도 하나의 면역억제제가 대상체에 재조합 바이러스 벡터의 투여 전, 실질적으로 동시 또는 후에 대상체에 투여된다.
[0258] 특정 구체예에서, 면역 억제제는 항염증제이다. 특정 구체예에서, 면역억제제는 스테로이드이다. 특정 구체예에서, 면역 억제제는 프레드니손, 프레드니솔론, 칼시뉴린 억제제, 사이클로스포린(예를 들어, 사이클로스포린 A), 타크롤리무스, 마이코페놀레이트, CD52 억제제(예를 들어, 알렘투주맙), CTLA4-Ig(예를 들어, 아바타셉트, 벨라타셉트), 항-CD3 mAb, 항-LFA-1 mAb(예를 들어, 에팔리주맙), 항-CD40 mAb(예를 들어, ASKP1240), 항-CD22 mAb(예를 들어, 에프라투주맙), 항-CD20 mAb(예를 들어, 리툭시맙, 오렐리주맙, 오파투무맙, 벨투주맙), 라파마이신 또는 이들의 유도체이다. 추가적인 특정 제제는 안정화 화합물을 포함한다. 본 발명에 따른 방법에서 사용될 수 있는 다른 면역억제제는, 예를 들어 그리고 비제한적으로, TACI-Ig(예를 들어, 아타시셉트), 항-C5 mAb(예를 들어, 에쿨리주맙), 마이코페놀레이트, 아자티오프린, 시롤리무스, 에베롤리무스, TNFR-Ig(예를 들어, 에타너셉트(Enbrel®), 항-TNF mAb(예를 들어, 아달리무맙(Humira®), 인플릭시맙(Remicade®; Avsola®)), 토파시티닙, 항-IL-2R(예를 들어, 바실릭시맙), 항-IL-17 mAb(예를 들어, 세쿠키누맙), 항-IL-6 mAb(예를 들어, 항-IL-6 항체 시루쿠맙, 항-IL-6 수용체 항체 토실리주맙(Actemra®), IL-10 억제제, TGF-베타 억제제, B 세포 표적화 항체(예를 들어, 리툭시맙), 프로테아좀 억제제(예를 들어, 보르테조밉), 라파마이신의 포유류 표적(mTOR) 억제제(예를 들어, 라파마이신), 합성 백신 입자(SVP™)-라파마이신(생물분해성 나노입자에 캡슐화된 라파마이신), 정맥 내 감마 글로불린(IVIG), 오말리주맙, 메토트렉세이트, 티로신 키나제 억제제(예를 들어, 이브루티닙), B-세포 활성화 인자(BAFF)의 억제제(예를 들어, 항-BAFF mAb, 예를 들어, 벨리무맙), 증식-유도 리간드의 억제제(APRIL), 항-IL-1b mAb(예를 들어, 카나키누맙(Haris®)), C3a 억제제, 트레지톱(예를 들어, US10,213,496 참조), 또는 이들의 조합물 및/또는 유도체를 포함한다.
[0259] 조성물은 식염수, 완충 식염수, 덱스트로스 및 물을 포함하나 이에 제한되지 않는 임의의 멸균된 생체적합성 약학적 담체로 투여될 수 있다. 조성물은 환자에게 단독으로, 또는 투여량, 투여 빈도 및/또는 치료 효능에 영향을 미치는 다른 제제와 함께 투여될 수 있다.
[0260] 본 발명의 방법 및 용도는 전신, 영역적 또는 국소적, 또는 임의의 경로, 예를 들어, 주사 또는 주입에 의한 전달 및 투여를 포함한다. 생체 내 약학적 조성물의 전달은 일반적으로 통상적인 주사기를 사용한 주사를 통해 달성될 수 있지만, 대류-향상된 전달과 같은 다른 전달 방법이 구상된다(예를 들어, 미국 특허 번호 5,720,720 참조). 예를 들어, 조성물은 피하, 표피, 피내, 척수강 내, 안와 내, 점막 내, 복강 내, 정맥 내, 흉막 내, 동맥 내, 경구, 간내, 문맥을 통해, 또는 근육 내로 전달될 수 있다. 다른 투여 방식은 경구 및 폐 투여, 좌약 및 경피 적용을 포함한다. 혈액 응고 장애가 있는 환자의 치료를 전문으로 하는 임상의는 환자의 상태 및 치료 목적(예를 들어, 증가된 GAA, 향상된 혈액 응고 등)을 포함하나 이에 제한되지 않는 다수의 기준에 기초하여 아데노바이러스-관련 벡터의 투여를 위한 최적 경로를 결정할 수 있다.
[0261] 본 발명에 따른 치료 방법은 원하는 치료적, 유리한, 부가적, 상승적 또는 보완적 활성 또는 효과를 갖는 임의의 화합물, 제제, 약물, 치료 또는 다른 치료 요법 또는 프로토콜의 추가 사용을 포함하는 조합 요법을 포함한다. 예시적인 조합 조성물 및 치료는 생물학적 제제(단백질), 제제(예를 들어, 면역억제제) 및 약물과 같은 제2 활성제를 포함한다. 이러한 생물학적 제제(단백질), 제제, 약물, 치료 및 요법은 본 발명에 따른 임의의 다른 치료 방법, 예를 들어, 폼페병과 같은 리소좀 축적병에 대해 대상체를 치료하기 위한 치료 방법, 또는 HemA 또는 HemB와 같은 혈액 응고 질병에 대해 대상체를 치료하기 위한 치료 방법 전에, 실질적으로 동시에 또는 후에 투여되거나 수행될 수 있다.
[0262] 화합물, 제제, 약물, 치료 또는 다른 치료 요법 또는 프로토콜은 조합 조성물로서 투여될 수 있거나, 핵산, 벡터, 재조합 벡터(예를 들어, 재조합 바이러스 벡터) 또는 재조합 바이러스 입자의 동시적 또는 연속적 또는 순차적(전 또는 후에) 전달 또는 투여와 같이, 별도로 투여될 수 있다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 치료 방법이 본원에 제시되거나 당업자에게 공지된 임의의 화합물, 제제, 약물, 치료 요법, 치료 프로토콜, 과정, 치료제 또는 조성물과 조합되는 조합을 제공한다. 화합물, 제제, 약물, 치료 요법, 치료 프로토콜, 과정, 치료제 또는 조성물은 본 발명에 따라 환자 또는 대상체에 투여되는 핵산, 벡터, 재조합 벡터(예를 들어, 재조합 바이러스 벡터) 또는 재조합 바이러스 입자의 투여 전, 실질적으로 동시 또는 후에 투여되거나 수행될 수 있다.
[0263] 특정 구체예에서, IgG와 FcRn의 상호작용을 감소시키는 제제의 투여는 중화 항체, 이종성 폴리뉴클레오티드에 결합하는 항체 및/또는 이종성 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된 단백질 또는 펩티드에 결합하는 항체의 발달을 예방할 수 있다. 본원에 기재된 바와 같이, 이러한 대상체에 IgG와 FcRn의 상호작용을 감소시키는 제제의 투여는 대상체에 바이러스 벡터의 투여 전, 바이러스 벡터의 투여 시점과 실질적으로 동시, 또는 바이러스 벡터의 투여 후일 수 있다.
[0264] 특정 구체예에서, IgG와 FcRn의 상호작용을 감소시키는 제제를 기존 항체를 갖는 대상체에 투여하면 중화 항체, 이종성 폴리뉴클레오티드에 결합하는 항체 및/또는 이종성 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된 단백질 또는 펩티드에 결합하는 항체가 감소한다. IgG와 FcRn의 상호작용을 감소시키는 제제의 투여 후, 이러한 대상체는 이어서 본원의 방법에 따라 재조합 바이러스 벡터를 투여받을 수 있다. 이러한 대상체는 선택적으로 재조합 바이러스 벡터의 투여 후 남아있는 기존 항체의 존재에 대해 평가될 수 있다. 대안적으로, 이러한 대상체는 IgG와 FcRn의 상호작용을 감소시키는 제제가 대상체에서 임의의 이러한 기존 항체를 감소시키거나 제거하는 소정의 시간이 지난 후에 재조합 바이러스 벡터를 투여받을 수 있다.
[0265] 특정 구체예에서, IgG와 FcRn의 상호작용을 감소시키는 제제의 투여는, 재조합 바이러스 벡터가 투여된 대상체로부터 수득된 생물학적 샘플에서 이러한 항체의 측정에 의해 반영된 바와 같이, 중화 항체, 이종성 폴리뉴클레오티드에 결합하는 항체 및/또는 이종성 폴리뉴클레오티드에 인코딩된 단백질 또는 펩티드에 결합하는 항체의 적어도 20% 내지 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 감소, 분해 또는 소화를 초래할 수 있다. 특정 구체예에서, 본 발명에 따른 방법은 중화 항체 및/또는 이종성 폴리뉴클레오티드에 결합하는 항체 및/또는 이종성 폴리뉴클레오티드에 인코딩된 단백질 또는 펩티드에 결합하는 항체의 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%를 감소, 분해 또는 소화시킨다.
[0266] 분석될 수 있는 대상체로부터의 생물학적 샘플의 비제한적인 예는 전혈, 혈청, 혈장 등, 및 이들의 조합을 포함한다. 생물학적 샘플은 세포가 없거나, 세포(예를 들어, 적혈구, 혈소판 및/또는 림프구)를 포함할 수 있다.
[0267] 특정 구체예에서, 대상체의 생물학적 샘플에 존재하는 중화 항체는 약 1:25 미만으로 감소, 분해 또는 소화될 수 있으며, 여기서 25의 완충액에 희석된 1부의 생물학적 샘플이 50% 재조합 바이러스 벡터 중화를 초래한다. 특정 구체예에서, 대상체의 생물학적 샘플에 존재하는 중화 항체는 약 1:20 미만, 약 1:15 미만, 약 1:10 미만, 약 1:5 미만, 약 1:4 미만, 약 1:3 미만, 약 1:2 미만 또는 약 1:1 미만으로 감소, 분해 또는 소화될 수 있으며, 여기서 각각 20, 15, 10, 5, 4, 3, 2 또는 1부의 완충액에 희석된 1부의 생물학적 샘플이 50% 재조합 바이러스 벡터 중화를 초래한다.
[0268] 생물학적 샘플에서 AAV 중화 항체의 예시적인 분석 및 측정이 본원에 개시되고 또한 미국 특허 출원 공개 2016/0123990에 기재되어 있다. Fc 수용체에 대한 항체 결합은 평형 결합 상수를 결정함으로써 측정될 수 있다. 항체의 Fc 수용체 결합의 감소는 IgG:FcR 상호작용에 대한 평형 결합 상수의 증가에 의해 결정된다.
[0269] 본 발명에 따른 방법은 기능 상실 및 기능 획득 유전적 결함 둘 모두에 적용될 수 있다. 본원에서 사용되는 유전적 결함과 관련하여 용어 "기능 상실"은 상기 유전자에 의해 인코딩된 단백질(즉, 돌연변이체 단백질)이 일반적으로 야생형 단백질과 관련된 기능의 부분적 또는 완전한 손실을 나타내는 유전자의 임의의 돌연변이를 지칭한다. 본원에서 사용되는 유전적 결함과 관련하여 용어 "기능 획득"은 상기 유전자에 의해 인코딩된 단백질(즉, 돌연변이체 단백질)이 질병 또는 장애를 유발하거나 이에 기여하는 단백질(즉, 야생형 단백질)과 일반적으로 관련되지 않은 기능을 획득하는 유전자의 임의의 돌연변이를 지칭한다. 기능 획득 돌연변이는 인코딩된 단백질의 기능의 변화를 야기하는 유전자 내의 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드들의 결실, 첨가 또는 치환일 수 있다. 특정 구체예에서, 기능 획득 돌연변이는 돌연변이체 단백질의 기능을 변화시키거나 다른 단백질과의 상호작용을 야기한다. 특정 구체예에서, 기능 획득 돌연변이는, 예를 들어, 변경된 돌연변이체 단백질과 정상 야생형 단백질의 상호작용에 의해 정상 야생형 단백질의 감소 또는 제거를 초래한다.
[0270] 본 발명에 따른 방법에 의해 치료될 수 있는 질병 및 장애는, 예를 들어 그리고 비제한적으로, 폐 질환(예를 들어, 낭성 섬유증), 출혈 장애(예를 들어, 억제제가 있거나 없는 혈우병 A 또는 혈우병 B), 지중해 빈혈, 혈액 장애(예를 들어, 빈혈), 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병, 근위축성 측삭 경화증(ALS), 간질, 리소좀 축적병(예를 들어, 아스파르틸글루코사민뇨증, 바텐병, 후기 영아 신경세포 세로이드 리포푸신증 타입 2(CLN2), 시스틴증, 파브리병, 고셔병 타입 I, II 및 III, 글리코겐 축적병 II(폼페병), GM2-강글리오시드증 타입 I(테이 삭스병), GM2-강글리오시드증 타입 II(샌드호프병), 점액지질증 타입 I(시알산증 타입 I 및 II), II(I-세포병), III(슈도-헐러병) 및 IV, 점액다당류 축적병(헐러병 및 변이체, 헌터, 산필리포 타입 A, B, C, D, 모르키오 타입 A 및 B, 마로토-라미 및 슬라이병), 니만-픽병 타입 A/B, C1 및 C2 및 쉰들러병 타입 I 및 II), 유전성 맥관부종(HAE), 구리 또는 철 축적 장애(예를 들어, 윌슨병 또는 멘케스병), 리소좀 산 리파제 결핍, 신경학적 또는 신경퇴행성 장애, 암, 타입 1 또는 타입 2 당뇨병, 아데노신 데아미나제 결핍, 대사 결함(예를 들어, 글리코겐 축적병), 고형 장기(예를 들어, 뇌, 간, 신장, 심장)의 질환, 또는 감염성 바이러스(예를 들어, B형 및 C형 간염, HIV 등), 박테리아 또는 진균 질환을 포함한다.
[0271] 폼페병이라고도 불리는 글리코겐 축적병 타입 II는 본 발명에 따른 방법에 의해 치료될 수 있다. 폼페병은 글리코겐의 분해를 촉매하는 리소좀 효소 산 α-글루코시다제(GAA)를 인코딩하는 유전자의 돌연변이에 의해 야기되는 상염색체 열성 질환이다. 결과적인 효소 결핍은 신체의 모든 조직에서 글리코겐 및 리소좀의 병리학적 축적을 초래하여, 심장, 호흡기 및 골격근 기능장애를 초래한다(van der Ploeg et al., 2008, Lancet, 372:1342-1353).
[0272] 본 발명에 따른 방법에 의해 치료될 수 있는 혈액 응고 장애는, 예를 들어 그리고 비제한적으로, 혈우병 A, 억제 항체를 갖는 혈우병 A, 혈우병 B, 억제 항체를 갖는 혈우병 B, 임의의 응고 인자 결핍증: VII, VIII, IX, X, XI, V, XII, II, 폰 빌레브란트 인자, 또는 조합된 FV/FVIII 결핍증, 지중해 빈혈, 비타민 K 에폭사이드 환원효소 C1 결핍증 또는 감마-카르복실라제 결핍증을 포함한다.
[0273] 본 발명에 따른 방법에 의해 치료될 수 있는 다른 질병 및 장애는, 예를 들어 그리고 비제한적으로, 빈혈, 외상과 관련된 출혈, 손상, 혈전증, 저혈소판증, 뇌졸중, 응고병증, 파종성 혈관 내 응고(DIC); 헤파린, 저분자량 헤파린, 오당류, 와파린, 소분자 항혈전제(즉, FXa 억제제), 또는 버나드 술리에 증후군, 글란츠만 혈소판기능저하증 또는 저장 풀 결핍증과 같은 혈소판 장애와 관련된 과잉-항응고를 포함한다.
[0274] 특정 구체예에서, 대상체는, 예를 들어 그리고 비제한적으로, 알츠하이머병, 헌팅턴병, ALS, 유전성 강직반마비, 원발성 측삭 경화증, 척추 근육 위축증, 케네디병, 폴리글루타민 반복 질환 또는 파킨슨병과 같은 중추신경계(CNS)에 영향을 미치거나 그에 기인하는 질병 또는 신경퇴행성 질병을 갖는다. 특정 구체예에서, CNS 또는 신경퇴행성 질병은, 예를 들어 그리고 비제한적으로, 척수소뇌성 실조증(SCA1, SCA2, SCA3, SCA6, SCA7 또는 SCA17)과 같은 폴리글루타민 반복 질환이다.
[0275] 본 발명은 인간 및 수의학 분야에서 사용될 수 있다. 따라서 적합한 대상체는 인간과 같은 포유동물 및 비인간 포유동물을 포함한다. 용어 "대상체"는 동물, 전형적으로 포유동물, 예를 들어, 인간, 비인간 영장류(원숭이, 긴팔 원숭이, 고릴라, 침팬지, 오랑우탄, 원숭이), 가축(개 및 고양이), 농장 동물(가금류, 예를 들어, 닭 및 오리, 말, 소, 염소, 양, 돼지) 및 실험 동물(마우스, 래트, 토끼, 기니피그)을 지칭한다. 인간 대상체는 태아, 신생아, 유아, 청소년 및 성인 대상체를 포함한다. 대상체는 또한 동물 질병 모델, 예를 들어, 폼페병(GAA의 손실) 및 글리코겐 축적병(GSD) 및 당업자에게 공지된 다른 것들과 같은 단백질/효소 결핍의 마우스 및 다른 동물 모델을 포함한다.
[0276] 본 발명은 패키징 물질 및 그 안에 하나 이상의 성분을 포함하는 키트와 같은 조성물을 제공한다. 키트는 전형적으로 그 안에 성분의 설명 또는 성분의 시험관 내, 생체 내 또는 생체 외 사용을 위한 설명서를 포함하는 라벨 또는 패키징 삽입물을 포함한다. 키트는 핵산, 재조합 벡터, 바이러스(예를 들어, AAV, 렌티바이러스) 벡터, 또는 바이러스 입자, IgG와 FcRn의 상호작용을 감소시키는 제제(예를 들어, 항-FcRn 항체, FcRn 결합 펩티드, FcRn 결합 아피바디, 소분자 FcRn 길항제), 및 선택적으로 항체를 분해하거나 소화하는 프로테아제 및/또는 글리코시다제와 같은 이러한 성분의 콜렉션을 함유할 수 있다.
[0277] 키트는 키트의 하나 이상의 성분을 수용하는 물리적 구조를 지칭한다. 패키징 물질은 성분을 멸균 상태로 유지할 수 있으며, 이러한 목적에 일반적으로 사용되는 물질(예를 들어, 종이, 골판지 섬유, 유리, 플라스틱, 호일, 앰플, 바이알, 튜브 등)로 제조될 수 있다.
[0278] 라벨 또는 삽입물은 그 안의 하나 이상의 성분의 식별 정보, 용량, 작용 메커니즘, 약동학 및 약력학을 포함하는 활성 성분(들)의 임상 약리학을 포함할 수 있다. 라벨 또는 삽입물은 제조업체, 로트 번호, 제조 위치 및 날짜, 만료 날짜를 식별하는 정보를 포함할 수 있다. 라벨 또는 삽입물은 제조업체 정보, 로트 번호, 제조업체 위치 및 날짜를 식별하는 정보를 포함할 수 있다. 라벨 또는 삽입물은 키트 성분이 사용될 수 있는 질병에 대한 정보를 포함할 수 있다. 라벨 또는 삽입물은 방법, 용도, 또는 치료 프로토콜 또는 치료 요법에서 키트 성분 중 하나 이상을 사용하기 위한 임상의 또는 대상체를 위한 설명서를 포함할 수 있다. 설명서는 투여량, 빈도 또는 기간, 및 본원에 기재된 임의의 방법, 용도, 치료 프로토콜 또는 예방 또는 치료 요법을 실시하기 위한 설명서를 포함할 수 있다.
[0279] 라벨 또는 삽입물은 예방적 또는 치료적 이점과 같이 성분이 제공할 수 있는 모든 이점에 대한 정보를 포함할 수 있다. 라벨 또는 삽입물은 잠재적인 부작용, 합병증 또는 반응에 대한 정보, 예를 들어, 특정 조성물을 사용하는 것이 적절하지 않은 상황과 관련된 대상체 또는 임상의에 대한 경고를 포함할 수 있다. 부작용 또는 합병증은 또한 대상체가 조성물과 양립할 수 없는 하나 이상의 다른 약물을 복용해 왔거나, 복용할 것이거나 또는 현재 복용 중일 때, 또는 대상체가 조성물과 양립할 수 없는 다른 치료 프로토콜 또는 치료 요법을 받았거나, 받을 예정이거나, 현재 받고 있을 때 발생할 수 있으므로, 설명서는 이러한 비양립성에 관한 정보를 포함할 수 있다.
[0280] 라벨 또는 삽입물은 "인쇄물", 예를 들어, 종이 또는 판지이거나, 성분, 키트 또는 패키징 물질(예를 들어, 상자)에 부착되거나 별도이거나, 키트 성분을 함유하는 앰플, 튜브 또는 바이알에 부착된 것을 포함한다.
[0281] 달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기재된 것과 유사하거나 동등한 방법 및 물질이 본 발명의 실시 또는 시험에서 이용될 수 있으나, 적합한 방법 및 물질이 본원에 기재되어 있다.
[0282] 본원에 인용된 모든 특허, 특허 출원, 공보, 및 다른 참고문헌, GenBank 인용 및 ATCC 인용은 그 전체가 참조로 포함된다. 상충의 경우, 정의를 포함하는 본 명세서가 우선할 것이다.
[0283] 본원에 개시된 모든 특징은 임의의 조합으로 조합될 수 있다. 명세서에 개시된 각각의 특징은 동일하거나 동등하거나 유사한 목적을 제공하는 대안적인 특징으로 대체될 수 있다. 따라서, 달리 명시적으로 언급되지 않는 한, 개시된 특징은 동등하거나 유사한 특징의 부류의 예이다.
[0284] 본원에서 사용되는 단수 형태는 문맥이 명백히 달리 지시하지 않는 한 복수의 지시대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "핵산"에 대한 언급은 복수의 이러한 핵산을 포함하고, "벡터"에 대한 언급은 복수의 이러한 벡터를 포함하고, "바이러스" 또는 "입자"에 대한 언급은 복수의 이러한 바이러스/입자를 포함한다.
[0285] 본원에서 사용되는 용어 "약"은 기본 파라미터의 10% 이내(즉, 플러스 또는 마이너스 10%)의 값을 지칭한다. 예를 들어, "약 1:10"은 1.1:10.1 또는 0.9:9.9를 의미하고, 약 5시간은 4.5시간 또는 5.5 시간 등을 의미한다. 일련의 값의 시작 부분에 있는 용어 "약"은 각 값을 10%만큼 수정한다.
[0286] 모든 수치 값 또는 수치 범위는 문맥이 명백히 달리 지시하지 않는 한 이러한 범위 내의 정수 및 범위 내의 값 또는 정수의 분수를 포함한다. 따라서, 예시를 위해, 95% 이상의 감소에 대한 언급은 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100% 등을 포함할 뿐만 아니라 95.1%, 95.2%, 95.3%, 95.4%, 95.5% 등, 96.1%, 96.2%, 96.3%, 96.4%, 96.5% 등을 포함한다. 따라서, 또한 예시를 위해, "1-4"와 같은 수치 범위에 대한 언급은 2, 3을 포함할 뿐만 아니라 1.1, 1.2, 1.3, 1.4 등을 포함한다. 예를 들어, "1-4주"는 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 또는 28일을 포함한다.
[0287] 또한, "0.01 내지 10"과 같은 수치 범위에 대한 언급은 0.011, 0.012, 0.013 등을 포함할 뿐만 아니라 9.5, 9.6, 9.7, 9.8, 9.9 등을 포함한다. 예를 들어, 약 "0.01 mg/kg 내지 약 10 mg/대상체의 체중 kg"의 투여량은 0.011 mg/kg, 0.012 mg/kg, 0.013 mg/kg, 0.014 mg/kg, 0.015 mg/kg 등을 포함할 뿐만 아니라 9.5 mg/kg, 9.6 mg/kg, 9.7 mg/kg, 9.8 mg/kg, 9.9 mg/kg 등을 포함한다.
[0288] 초과(더 큰) 또는 미만과 함께 정수의 언급은 각각 참조 숫자보다 크거나 작은 임의의 숫자를 포함한다. 따라서, 예를 들어, 2 초과에 대한 언급은 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 등을 포함한다. 예를 들어, 재조합 바이러스 벡터, 프로테아제 및/또는 글리코시다제의 "2회 이상"의 투여는 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15회 이상을 포함한다.
[0289] 또한, "1 내지 90"과 같은 수치 범위에 대한 언급은 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5 등을 포함할 뿐만 아니라 81, 82, 83, 84, 85 등을 포함한다. 예를 들어, "약 1분 내지 약 90일"은 1.1분, 1.2분, 1.3분, 1.4분, 1.5분 등을 포함할 뿐만 아니라 1일, 2일, 3일, 4일, 5일.... 81일, 82일, 83일, 84일, 85일 등을 포함한다.
[0290] 본 발명은 본 발명의 다수의 구체예를 설명하기 위해 긍정적인 언어를 사용하여 본원에서 일반적으로 개시된다. 본 발명은 또한 구체적으로 물질 또는 재료, 방법 단계 및 조건, 프로토콜 또는 절차와 같은 특정 주제가 전체적으로 또는 부분적으로 배제된 구체예를 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 특정 구체예에서, 물질 및/또는 방법 단계가 배제된다. 따라서, 본 발명이 본 발명에 포함되지 않은 사항에 관하여 본원에서 일반적으로 명시하고 있지는 않지만, 그럼에도 불구하고 본 발명에서 명백하게 배제되지 않은 양태는 본원에 개시된 것이다.
[0291] 본 발명의 많은 구체예가 개시되었다. 그럼에도 불구하고, 당업자는 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않으며, 다양한 용도 및 조건에 본 발명을 채용하기 위해 이를 다양하게 변형하고 수정할 수 있다. 따라서, 하기 실시예는 청구된 본 발명의 범위를 예시하기 위한 것이며 어떤 식으로든 제한하지 않는다.
실시예
실시예 1
항-FcRn 항체 및 엔도펩티다제를 사용한 조합 치료
[0292] AAV 캡시드 단백질(항-캡시드 IgG)에 특이적인 IgG의 존재 및 발달은 AAV 유전자 요법에서의 중요한 과제인데, 그 이유는 항-캡시드 IgG가 세포 및 조직의 AAV 형질도입을 억제하거나 중화시킬 수 있기 때문이다. 유전자 요법을 개선하기 위한 노력에서, 자연적인 AAV 노출로 인해 또는 이전에 rAAV의 투여로 인해, 기존 AAV 중화 항체(NAb)를 갖는 환자의 rAAV 투여를 가능하게 하기 위해서는 순환 IgG를 감소 및/또는 제거하는 것이 바람직하다.
[0293] NAb를 극복하기 위한 이중 접근법에서, 대상체에 FcRn에 결합하고 IgG와 FcRn의 상호작용을 억제하는 항체(항-FcRn 항체)의 초기 치료 요법을 투여한 다음, IgG-특이적 엔도펩티다제(예를 들어, IdeS)의 요법을 후속 투여한다. FcRn-매개 IgG 재순환을 억제하는 항-FcRn 항체(M281)를 인간에게 3주간 투여하면 혈장에서 IgG를 최대 80% 감소시킬 수 있다는 것이 이전에 밝혀졌다(Ling et al., 2019). 항-FcRn 항체에 의한 IgG의 사전-고갈과 IdeS 투여에 의한 IgG 절단의 조합은 어느 하나의 치료 요법 단독보다 상당히 더 높은 출발 NAb 역가를 잠재적으로 극복할 수 있다.
[0294] 1:160의 NAb 역가를 갖는 대상체를 4개의 시험 그룹에 넣는다: 1) 미처리; 2) 항-FcRn 항체 처리만; 3) IdeS 처리만; 및 4) 항-FcRn 항체 및 IdeS 조합 처리. 항-FcRn 항체는 0, 0.3, 3, 10, 30 및 60 mg/kg(및 더 높은 용량)의 단일 또는 다중 상승 용량으로 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 다른 투여 경로에 의해 주입된다. 항-FcRn 항체의 용량은 1, 2, 3 또는 4주(또는 그 이상) 동안 매주 1회(예를 들어) 투여되고, 이어서 Ides가 0, 0.5, 1 및 2 mg/kg(및 더 높은 용량)의 단일 또는 다중 상승 용량으로 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 다른 투여 경로에 의해 주입된다. NAb 역가는 각 처리 전후에 평가된다.
실시예 2
AAV 재투여의 토끼 모델
[0295] 항-AAV NAb를 유도하기 위해 관심 트랜스진을 운반하는 rAAV 벡터 입자를 토끼에게 주입한다. 토끼가 항-AAV NAb 역가를 발달한 후, IgG와 FcRn의 상호작용을 억제하는 항-FcRn 항체를 투여한다. 항-FcRn 항체의 투여는, 예를 들어, 0, 0.3, 3, 10, 30 및 60 mg/kg(및 더 높은 용량)의 단일 또는 다중 상승 용량으로 2, 3, 4주 이상 동안 수행된다. 항-FcRn 항체 투여 과정 후, IdeS가 0, 0.5, 1 및 2 mg/kg(및 더 높은 용량)의 단일 또는 다중 상승 용량으로 투여된다. IdeS 투여 24 내지 48시간 후, 토끼에게 상이한 트랜스진을 운반하는 추가 rAAV 입자를 주입한다. 이 모델은 항-FcRn 및 IdeS 처리 전후 및 rAAV 재투여 전후를 포함하는 다양한 단계에서 형질도입 효능의 분석을 허용한다.
실시예 3
방법
[0296] 시험관 내 엔도펩티다제에 의한 면역글로불린 G(IgG)의 절단: Spk2 캡시드에 대한 중화 항체(NAb)가 있거나 없는 인간 혈청 또는 비인간 영장류(NHP) 혈장 샘플을 스트렙토코쿠스 피오게네스로부터의 면역글로불린-분해 효소(IdeS; Promega)의 용량을 증가시키면서 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. Promega의 지시에 따라, 1 단위는 37℃에서 30분 내에 1 μg의 재조합 모노클로날 IgG의 ≥ 95%를 절단하는 것으로 정의된다. 반응 부피는 PBS로 조정되었다. 총 IgG의 절단은 SDS-PAGE 및 쿠마시 염색에 의해 평가되었다.
[0297] 절단된 IgG의 SDS-PAGE 분석: 절단된 샘플을 NuPAGE® LDS 샘플 완충액(4X)(ThermoFisher Scientific)을 사용하여 비환원 SDS-PAGE을 위해 제조하고 10분 동안 70℃로 가열하였다. 이후 샘플을 MOPS SDS 러닝 완충액을 사용하여 NuPAGE® Novex 4-12% Bis-Tris 겔로 분석하였다. 겔을 쿠마시 블루로 염색하였다.
[0298] 항-AAV 캡시드 중화 항체(NAb) 역가: AAV-Spk1 또는 AAV-Spk2 캡시드에 대한 중화 항체를 세포 기반, 시험관 내 검정 및 각각 AAV-Spk1 또는 AAV-Spk2 리포터-벡터 캡시드화 레닐라 루시퍼라제 트랜스진을 사용하여 정량화하였다. 간단히 말해서, 초기 계대(#26 미만의 계대) 293E4 세포를 해동하고 2x104개 세포/200 μL/웰로 평평한 바닥 백색 96-웰 플레이트에 플레이팅하였다. 헬퍼 바이러스 단백질, 인간 아데노바이러스 E4의 발현을 유도하기 위해 포나스테론 A(Invitrogen; cat. # H101-01)를 각 웰에 1 μg/mL의 최종 농도로 첨가하였다. 이후 세포를 37℃/5% CO2 인큐베이터에서 밤새 배양하였다. 다음 날, 샘플을 56℃에서 30분 동안 열-불활성화시킨 다음, 희석제로서 우태아 혈청(FBS)을 사용하여 4-포인트 희석액(1:1 내지 1:5)을 제조하였다. 인자 검정 대조군 혈장((FACT; King George Bio-Medical, Inc.)이 검정 성능을 평가하기 위해 3.16배(반-로그) 연속 희석으로 제조되었다. AAV-루시퍼라제 벡터를 DMEM에서 7.5x107 vg/mL로 희석한 다음 FACT 대조군 및 샘플에 첨가하였다. 벡터 및 대조군/샘플을 37℃에서 60분 동안 인큐베이션하였다. "중화된" 대조군/샘플의 웰당 7.5 μL의 부피를 세포가 시딩된 플레이트의 각 웰로 옮기고, 세포를 밤새 인큐베이션을 위해 인큐베이터로 돌려 보냈다. 다음 날 세포를 PBS에서 1회 세척하고, 레닐라 검정 용해 완충액에서 용해시키고, 레닐라 루시퍼라제 검정 시스템(Promega)으로 루시퍼라제 활성을 측정하고, SpectraMax® L 마이크로플레이트 리더에서 판독하였다.
[0299] IVIg를 사용한 인공 면역화 마우스 모델: 수컷 C57BL/6 마우스에서 인공 NAb 역가를 생성하기 위해, 인간 혈액으로부터 정제된 10% 면역글로불린 G(IgG)를 함유하는 정맥 내 면역글로불린(IVIg; Gamunex)을 정맥 내(IV) 벡터 투여 하루 전에 복강 내(IP) 주사하였다. IdeS 또는 IdeZ - IdeS에 비해 마우스 IgG2a 및 IgG3에 대해 개선된 활성을 갖는 스트렙토코쿠스 에쿠이로부터의 유사한 엔도펩티다제 -에 의한 IgG의 시험관 내 절단이 생체 내 형질도입 효율을 구제할 수 있는지 여부를 결정하기 위해, IVIg를 IP 투여 전에 37℃에서 밤새 125 단위의 IdeZ(Promega)로 처리하였다. 총 IgG의 절단은 SDS-PAGE 및 쿠마시 염색에 의해 평가되었다. IVIg 투여 1일 후, 벡터(AAV-Spk1-GAA)를 2x1012 vg/kg으로 투여하였다. 마우스 혈장 샘플을 매주 수집하고, 샘플을 트랜스진(GAA 효소)의 활성에 대해 분석하였다. IdeS에 의한 IgG의 생체 내 절단이 생체 내 형질도입 효율을 구제할 수 있는지 여부를 결정하기 위해, 300 mg/kg IVIg를 IP 투여에 의해 주입하였다. 24시간 후, 0.4 또는 4 mg/kg IdeS를 IV 투여에 의해 주입하였다. 이어서 IdeS 주입 24시간 후, 벡터(AAV-Spk1-GAA)를 2x1012 vg/kg으로 투여하였다.
[0300] GAA 활성 검정: pH 4에서 기질 4-메틸-움벨리페릴-α-D-글루코시드의 절단을 측정함으로써 GAA 활성을 평가하였다(Galjaard et al., Clin Chim Acta 1973; 49(3):361-75). 간단히 말해서, MilliQ 물에 1:250으로 희석된 10 μL 혈장 샘플에 20 μL의 기질을 첨가함으로써 반응을 개시하였다. 반응 혼합물을 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션한 다음, 이어서 pH 10.5에서 카르보네이트 완충액에 의해 중단시켰다. 그 후 표준 곡선을 4-메틸-움벨리페릴-α-D-글루코시드로부터 유리된 청색 형광 염료인 4-메틸움벨리페론으로 플레이팅하였고, 이는 370 nm에서 여기될 때 440 nm에서 형광 방출을 생성하였다.
[0301] 항-AAV 캡시드 IgG 항체: 항-AAV 캡시드 총 IgG 형성은 포획 검정으로 측정되었다. ELISA 플레이트 웰을 1 μg/mL의 AAV-Spk1 캡시드 입자를 함유하는 50 μL의 용액으로 코팅하였다. 총 인간 IgG(Southern Biotech, 0150-01)를 희석하여 10,000 ng/mL 내지 0.5 ng/mL 범위의 10-포인트 표준 곡선을 생성하고 플레이트에 첨가하였다. 역 계산 후 검정의 정량 한계는 460 ng/mL였다. 3개 수준의 품질 대조군 샘플을 제조하고 각 플레이트에 포함시켜 검정 성능을 평가하였다. 캡시드 입자, 표준 물질 및 품질 대조군(QC)을 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 세척 후, 웰을 실온에서 2시간 동안 PBS 중 2% BSA, 0.05% Tween-20으로 차단하였다. 이후, 차단 완충액 중 샘플의 연속 희석액을 플레이트에 부하하고 실온에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 차단 완충액에서 1:5000으로 희석된 호스래디쉬 퍼옥시다제(HRP)-컨쥬게이션된 양 항-인간 IgG 항체(GE Healthcare, cat. # NA933V)를 검출 항체로 사용하고 실온에서 1시간 동안 플레이트에서 인큐베이션하였다. 세척 후, 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘 기질(TMB)과 함께 실온에서 10분 동안 인큐베이션한 후 퍼옥시다제 활성이 나타났다. 반응을 1M 황산으로 중단한 다음, 450 nm에서 광학 밀도(OD)에 대한 흡광도 플레이트 리더로 플레이트를 판독하였다. IgG 농도는 정제된 인간 총 IgG의 연속 희석액으로 만들어진 표준 곡선에 대해 결정되었다.
실시예 4
IdeS는 시험관 내에서 인간, NHP 및 햄스터 샘플로부터 IgG를 절단한다.
[0302] 스트렙토코쿠스 피오게네스로부터의 면역글로불린 G(IgG)-분해 효소(IdeS)는 높은 특이도로 IgG의 4개 인간 서브부류를 모두 절단하는 시스테인 프로테아제이다. IdeS는 IgG 중쇄의 하부 힌지 영역에 있는 Gly236에서 인간 IgG를 가수분해한다.
[0303] 혈청에서 IgG를 절단하는 IdeS의 능력을 분석하기 위해, 증가하는 용량의 IdeS(0-100 단위; Promega)를 항-Spk2 NAb 역가가 있거나 없는 인간 혈청 및 NHP(레서스 원숭이) 혈장 샘플에 첨가하였다. 나이브(<1:1) 또는 상대적인 중간 범위(1:5-1:10) 또는 상대적으로 높은(1:20-1:40) NAb 역가를 갖는 인간 샘플에서, 가장 낮은 용량의 IdeS는 모든 총 IgG(약 150 kD)를 절단하여 Fc 단편을 유리시켰다(약 25 kD)(도 1a). NHP 샘플에서, IgG는 모든 NAb 역가 그룹에서 유사하게 절단되었다(<1:1, 1:50-1:100, >1:100, 도 1b).
[0304] 햄스터는 AAV 재투여를 위한 IdeS 처리를 조사하기 위해 마우스보다 더 나은 모델을 제공할 것으로 예상된다. IdeS는 풀링된 햄스터 혈장(및 양성 대조군으로서 풀링된 인간 혈장)과 함께 증가하는 양의 IdeS(0 내지 50 단위; Promega)를 인큐베이션함으로써 햄스터 IgG를 절단하는 능력에 대해 시험되었다. 비환원 SDS-PAGE 및 쿠마시 블루 염색에 의해 샘플을 분석하였다. IdeS는 시험관 내 풀링된 햄스터 혈장 및 풀링된 인간 혈장에서 IgG를 절단하는데 효과적이었다(도 1c).
[0305] 이러한 결과는 IdeS가 인간 IgG, 레서스 IgG 및 햄스터 IgG의 매우 효율적이고 특이적인 프로테아제임을 입증한다.
실시예 5
IdeS에 의한 IgG의 절단은 시험관 내에서 감소된 NAb 역가를 초래한다
[0306] IdeS에 의한 IgG의 절단이 중화를 감소시키기에 충분한지를 분석하기 위해, AAV 벡터 형질도입 효율을 시험관 내에서 검정하였다. 이 검정에서, 다양한 종으로부터의 혈청 또는 혈장 샘플은 레닐라 루시퍼라제를 인코딩하는 AAV 벡터를 혈장 또는 혈청과 사전-인큐베이션하고, 이들 혼합물과 함께 배양된 인간 세포를 형질도입시킨 다음, 루시퍼라제 활성 수준을 평가함으로써 AAV 캡시드에 대한 중화 항체의 존재에 대해 평가될 수 있다.
[0307] 나이브(<1:1) 또는 높은 항-Spk2 NAb 역가(1:10-1:20)를 갖는 인간 환자 혈청 샘플을 과량의 IdeS(50 단위)가 있거나 없이 전처리한 다음, NAb 역가를 평가하였다. 흥미롭게도, 이전에 보고된 NAb 역가가 1:10-1:20인 환자 샘플은 한 연구에서 IdeS 전처리를 통해 1:5-1:10 NAb 역가로 적어도 2배 감소한 것으로 나타났다. (표 1). 이러한 결과는 IgG 항체가 IdeS에 의해 절단될 때 AAV 벡터 형질도입이 증가함을 입증한다.
표 1 - 과량의 IdeS와 함께 인큐베이션된 인간 혈청의 항-Spk2 NAb 역가 분석.
연구 1
Figure pct00001
연구 2
Figure pct00002
IdeS 엔도펩티다제로 처리한 후 항-Spk2 NAb 역가 분석. 인간 환자 샘플(Spark ID로 지정됨)을 IdeS가 있거나 없이 전처리하였다. NAb 역가는 나중에 시험관 내 벡터 형질도입 검정에 의해 평가되었다.
실시예 6
시험관 내 IdeZ에 의한 IVIg의 분해는 생체 내 벡터의 형질도입 효율을 증가시킨다
[0308] IgG 항체의 이펙터 기능, 예를 들어, 세포독성 및 보체 고정은 Fc 부분에 의해 매개된다. 중화는 항원에 대한 특이성을 위해 중쇄 및 경쇄의 가변 영역에 의존한다. F(ab')2 단편은 여전히 무손상 항원-결합 영역을 포함하지만, 데이터는 IdeS 또는 마우스 IgG2a 및 IgG3에 대해 개선된 활성을 갖는 스트렙토코쿠스 에쿠이의 유사한 엔도펩티다제인 IdeZ에 의한 F(ab')2 단편의 유리가 Fc 부분 없이 감소된 안정성을 야기하고, 따라서 무손상 IgG보다 순환으로부터 F(ab')2 단편의 더 빠른 제거를 야기함을 시사한다. 이 검정은 IdeS 또는 IdeZ에 의해 미리 절단된 중화 항체의 투여가 생체 내 환경에서 AAV에 대한 중화 활성을 감소시킬지 여부를 시험하였다.
[0309] 0.1 mg/kg IdeZ가 있거나 없이 전처리된 항-AAV 캡시드 중화 항체를 포함하는 인간 IgG의 풀인 IVIg로 마우스를 면역화시켰다. 이후 마우스에 2x1012 vg/kg AAV-Spk1-GAA를 투여하였다. 1.0 mg 또는 5.0 mg IVIg로 처리된 마우스는 대조군 마우스(33,551 ± 13,635 nmol/hr/mL)에 비해 혈장에서 GAA 활성 수준을 감소시켰고(각각 10,951 ± 1,554 nmol/hr/mL and 1,041 ± 553 nmol/hr/mL) IVIg에 의한 벡터 중화가 용량 의존적임을 보여준다(도 2).
[0310] IdeZ와 함께 40 mg/kg IVIg의 전처리는 형질도입 효율을 구제하여, 대조군과 유사한 GAA 활성 수준(37,707 ± 11,449 nmol/hr/mL)을 초래하였다. 200 mg/kg IVIg의 IdeZ 전처리는 한 마리의 동물이 완전히 회복된 활성(41,025 nmol/hr/mL)을 갖도록 벡터 중화(13,440 nmol/hr/mL ± 15,543)를 부분적으로 완화시켰다. 참고로, IdeZ 자체는 AAV 벡터 형질도입 효율을 방해하지 않았다. IVIg 용량 유지는 IgG의 절단을 확인하기 위해 쿠마시 염색을 사용하여 SDS-PAGE에 의해 분석되었다. 이러한 결과는 IdeS/IdeZ에 의한 AAV 캡시드에 대한 중화 항체의 시험관 내 절단이 생체 내 AAV 벡터 형질도입 및 트랜스진 발현을 구제할 수 있음을 나타낸다.
실시예 7
생체 내 IdeS에 의한 IVIg의 분해는 생체 내 벡터의 형질도입 효율을 증가시킨다
[0311] 생체 내 IgG의 절단이 혈장에서 벡터 형질도입 및 트랜스진 발현/활성에 영향을 미칠 수 있는지 여부를 분석하기 위해, 마우스에 먼저 무손상 IVIg를 주입하여 인간 항-캡시드 중화 IgG의 인공 역가를 생성하였다. 24시간 후, 마우스에 2개 농도(0.4 mg/kg 또는 4 mg/kg)의 IdeS를 주입한 다음, IdeS 주입 24시간 후, 모든 마우스에 2x1012 vg/kg AAV-Spk1-GAA를 투여하였다. 항-Spk1 NAb 역가 및 IgG 수준 둘 모두를 IdeS 주입 전 및 IdeS 주입 후(벡터 투여 직전)에 분석하였다.
[0312] IdeS 주입은 NAb(도 3) 및 IgG 수준(도 4) 둘 모두에서 용량 의존적 감소를 유도하였다. IdeS의 최고 용량(4 mg/kg)은 적어도 1:40의 NAb 역가를 <1:1로 낮출 수 있었다.
[0313] 벡터 주입 1주일 후에 GAA 활성을 측정한 경우, 벡터만 투여된 대조군 마우스는 49,387 ± 7,345 nmol/hr/mL의 GAA 활성 수준을 나타내었다(도 5). 300 mg/kg IVIg를 주사한 마우스는 거의 완전한 형질도입 억제와 일치하는 혈장에서의 GAA 트랜스진 활성 수준을 나타내었다(1,702 ± 336 nmol/hr/mL). IdeS는 트랜스진 활성 수준의 용량 의존적 구제를 나타내었다; 0.4 mg/kg IdeS는 GAA 활성의 70% 구제를 초래한 반면(34,408 ± 10,562 nmol/hr/mL), 4 mg/kg IdeS는 99% GAA 활성을 구제하였다(48,948 ± 5,322 nmol/hr/mL). 이러한 결과는 생체 내 IdeS 처리가 중화 항체 역가를 감소시키고 치료에 불응성인 동물에서 AAV 벡터의 투여 및 형질도입을 허용함을 입증한다.
실시예 8
생체 내 IdeS에 의한 IVIg의 분해는 생체 내 벡터의 형질도입 효율을 증가시킨다
[0314] IdeS는 생체 내에서 더 높은 역가의 항-캡시드 IgG를 절단하고 더 높은 정도의 AAV 벡터 중화의 맥락에서 AAV 형질도입을 구제하는 능력에 대해 평가되었다. 마우스(수컷 C57BL/6)에 다양한 용량의 무손상 인간 IVIg(300 mg/kg(낮음), 800 mg/kg(중간) 또는 1600 mg/kg(높은))를 주입하여 인간 항-캡시드 중화 IgG의 인공 역가를 생성하였다. 24시간 후, 마우스에 3개 농도(0.4 mg/kg(낮음), 1 mg/kg(중간) 또는 2 mg/kg(높음))의 IdeS를 주입하였다. IdeS 주입 24시간 후, 마우스에 2x1012 vg/kg의 AAV-Spk1-GAA를 투여하였다. 항-Spk1 NAb 역가는 실시예 1에 기재된 항-AAV 캡시드 NAb 역가 검정을 사용하여, IdeS 주입 전 및 IdeS 주입 후(벡터 투여 직전)에 결정되었다. AAV 형질도입은 벡터 투여 2주 후, 실시예 1에 기재된 바와 같이, GAA 활성 검정을 사용하여 혈장에서 트랜스진 생성물(GAA) 활성의 측정에 의해 평가되었다.
[0315] 모든 용량의 IVIg에 대해, IdeS로 전처리하면 AAV NAb 역가가 용량 의존적으로 감소하였다(표 2). 표 2는 각 그룹의 각 동물에 대한 IdeS 주입 전 및 후 중화 항-Spk1 항체(NAb) 역가를 제시한다. AAV NAb 역가는 낮음(<1:1, 1:1-1:2.5), 낮음 내지 중간 범위(1:2.5-1:5), 중간 내지 높음 범위(1:5-1:10) 및 높음(>1:10-1:20)으로 지정된다. 최고 용량의 IdeS(2 mg/kg)는 >1:160(1600 mg/kg IVIg로 생성됨)의 NAb 역가를 1:1-1:2.5로 감소시킬 수 있었다.
표 2 - IdeS 주입 전 및 후의 뮤린 혈장에서 항-NAb 역가.
Figure pct00003
[0316] 벡터 주입 2주 후 측정된 GAA 활성에 대한 결과는 도 6에 도시되어 있다. 음성 대조군 마우스(벡터만 투여됨)의 혈장은 26,689 ± 12,420 nmol/hr/mL의 GAA 활성 수준을 나타내었다. 300 mg/kg(및 더 높은) IVIg를 주사하고 IdeS를 받지 않은 마우스는 AAV 벡터 형질도입의 NAb 억제와 일치하는 단지 436 ± 41 nmol/hr/mL의 혈장 GAA 활성 수준을 나타내었다. 이전 실시예의 결과와 일관되게, IdeS 전처리는 혈장에서 GAA 활성 수준에 의해 측정된 바와 같이 AAV 벡터 형질도입의 용량 의존적 구제를 초래하였다: 0.4 mg/kg IdeS는 7,702 ± 4,710 nmol/hr/mL의 GAA 활성 수준을 초래하였고, 1 mg/kg IdeS는 15,444 ± 4,226 nmol/hr/mL의 GAA 활성 수준을 초래하였고, 2 mg/kg IdeS는 14,375 ± 2,572 nmol/hr/mL의 GAA 활성 수준을 초래하였다.
[0317] 더 높은 용량의 IVIg(800 또는 1600 mg/kg IVIg)를 받은 그룹은 IdeS가 증가함에 따라 GAA 활성 수준이 용량 의존적으로 증가하는 유사한 경향을 나타내었다. 800 mg/kg IVIg의 경우, 0.4 mg/kg IdeS는 4,188 ± 2,549 nmol/hr/mL의 GAA 활성 수준을 초래하였고, 1 mg/kg IdeS는 17,813 ± 11,283 nmol/hr/mL의 GAA 활성 수준을 초래하였고, 2 mg/kg IdeS는 26,846 ± 7,354 nmol/hr/mL의 GAA 활성 수준을 초래하였다. 1600 mg/kg IVIg의 경우, 0.4 mg/kg IdeS는 580 ± 217 nmol/hr/mL의 GAA 활성 수준을 초래하였고, 1 mg/kg IdeS는 12,511 ± 1,602 nmol/hr/mL의 GAA 활성 수준을 초래하였고, 2 mg/kg IdeS는 11,573 ± 1,313 nmol/hr/mL의 GAA 활성 수준을 초래하였다. 최고 용량의 IVIg(1600 mg/kg)에서, 최저 IdeS 용량(0.4 mg/kg)은 벡터 형질도입을 구제하지 못했다. 그러나, 1600 mg/kg 용량의 IVIg에서, 순환에 존재하는 총 IgG의 초생리학적 수준이 존재하며, 이는 기질의 증가된 양으로 인해 0.4 mg/kg 용량에서 IdeS의 효과를 감소시킬 가능성이 있다.
[0318] 이러한 결과는 생체 내 IdeS 처리가 중화 항체 역가를 감소시키고 바이러스 벡터 유전자 요법 치료 방법에 불응성인 동물에서 바이러스 벡터의 투여 및 형질도입을 허용함을 보여준다.
실시예 9
AAV 재투여의 햄스터 모델
[0319] 햄스터에 관심 트랜스진을 운반하는 rAAV 벡터 입자를 주입하고, 항-AAV NAb의 발달 후(예를 들어, 4주) IdeS를 투여하고, 또 다른 트랜스진을 운반하는 추가 rAAV 입자를 주입한다. 이 모델은 IdeS 처리 전후 및 rAAV 재투여 전후를 포함하는 다양한 단계에서 형질도입 효능의 분석을 허용한다.
[0320] AAV 캡시드에 대한 중화 항체의 효과를 저하시키거나 감소시키는 IdeS의 능력을 평가하기 위해, IgG가 엔도펩티다제 IdeS에 의해 효율적으로 절단되는 종인 시리아 골든 햄스터에서 연구가 수행된다. 햄스터에 먼저 2x1012 vg/kg Spk1-FVIII, Spk1-FIX 또는 다른 Spk1 캡시드화 벡터를 주입한다. 항-Spk1 IgG ELISA 또는 세포-기반 중화 항체 검정에 의한 Spk1 캡시드에 대한 NAb의 발달 측정에 추가하여, 혈장에서 트랜스진 생성물(즉, FVIII, FIX 등)의 발현에 대해 동물을 모니터링한다. NAb 역가의 발달 후, 벡터 주입 후 3-5주 이내에, 동물에게 0, 0.5, 1 및 2 mg/kg(및 더 높은 용량)의 IdeS의 단일 또는 다중 상승 용량을 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 다른 투여 경로에 의해 주입한다. IdeS 투여 후, 동물에 대해 항-Spk1 캡시드 IgG 및/또는 Spk1에 대한 NAb를 측정한다. 동물이 NAb 수준의 충분한 감소를 보일 때, 2x1012 vg/kg Spk1-GAA를 주입한다. 형질도입 후, GAA 발현은 달성된 형질도입 수준을 결정하기 위해 GAA 활성 검정 및/또는 GAA 항원 수준 측정에 의해 혈장에서 측정된다.
[0321] 이러한 연구는 IdeS가 재투여를 가능하게 하기에 충분히 낮은 수준으로 생체 내 AAV 캡시드-특이적 NAb를 감소시키는지 보여준다. 항-FVIII IgG의 측정(생체 내에서 발달한 경우)은 트랜스진 생성물-표적화 NAb를 감소시키는데 있어서 IdeS의 효과에 관한 정보를 제공하고, 효과 상실 전에 허용되는 IdeS 재투여 횟수에 관한 정보를 제공한다.
실시예 10
AAV 재투여의 사이노몰구스 원숭이 모델
[0322] 큰 동물 모델에서 AAV 캡시드에 대한 NAb의 효과를 저하시키거나 감소시키는 IdeS의 능력을 평가하기 위해, 사이노몰구스 원숭이(Macaca fascicularis)에서 연구가 수행된다. 원숭이는 먼저 Spk1 캡시드에 대한 기존 NAb에 대해 스크리닝된다. NAb 양성 동물은 야생 또는 그룹 하우징에서 자연 발생하는 AAV에 대한 노출로 인해 발생할 수 있다. 동물을 음성 또는 양성 NAb 역가에 기초하여, 그리고 양성인 경우, 기존 NAb 역가가 얼마나 높은지에 따라 그룹에 배치한다.
[0323] 연구의 재투여 아암에서, 동물에게 2x1012 vg/kg Spk1-FIX 또는 다른 Spk1 캡시드화 벡터를 투여한다. 항-Spk1 IgG ELISA 또는 세포-기반 NAb 검정에 의한 Spk1 캡시드에 대한 NAb의 발달 측정에 추가하여, 혈장에서 트랜스진 생성물(즉, FIX 또는 기타)의 발현에 대해 동물을 모니터링한다. NAb 역가의 발달 후, 벡터 주입 후 3-5주 이내에, 동물에게 0, 0.5, 1 및 2 mg/kg 및 더 높은 용량의 IdeS의 단일 또는 다중 상승 용량을 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 다른 투여 경로에 의해 주입한다. IdeS 투여 후, 동물에 대해 항-Spk1 캡시드 IgG 및/또는 Spk1에 대한 NAb를 측정한다. 동물이 NAb 수준의 충분한 감소를 보일 때, 2x1012 vg/kg Spk1-GAA를 주입한다. 형질도입 후, GAA 발현은 달성된 형질도입 수준을 결정하기 위해 GAA 활성 검정 및/또는 GAA 항원 수준 평가에 의해 혈장에서 측정된다.
[0324] 연구의 별도 아암은 기존 NAb 역가를 극복하는 IdeS의 능력을 평가한다. 상이한 NAb 역가 수준을 나타내는 동물을 역가에 기초하여 그룹화하고, 0, 0.5, 1 및 2 mg/kg(및 더 높은 용량)의 단일 또는 다중 상승 용량의 IdeS를 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 다른 투여 경로에 의해 주입한다. IdeS 투여 후, 동물에 대해 항-Spk1 캡시드 IgG 및/또는 Spk1에 대한 NAb를 측정하고, 동물이 NAb 수준에서 충분한 감소를 나타낼 때, 2x1012 vg/kg Spk1-GAA를 주입한다. 형질도입 후, GAA 발현은 달성된 형질도입 수준을 결정하기 위해 GAA 활성 검정 및/또는 GAA 항원 수준 측정에 의해 혈장에서 측정된다.
[0325] 이러한 연구는 IdeS가 인간 AAV 투여의 우수한 모델이 되는 종인 사이노몰구스 원숭이에서 재투여를 가능하게 하기에 충분히 낮은 수준으로 생체 내 AAV 캡시드-특이적 NAb를 감소시키는지 보여준다. 이러한 연구는 또한 IdeS 투여에 의해 극복될 수 있는 최대의 기존 NAb 역가를 보여준다. 항-FIX IgG의 측정(생체 내에서 발달한 경우)은 트랜스진 생성물-표적화 NAb를 감소시키는데 있어서 IdeS의 효과에 관한 정보를 제공하고, 효과 상실 전에 허용되는 IdeS 재투여 횟수에 관한 정보를 제공한다.
실시예 11
IdeS 및 AAV-Spk1-hFVIII를 사용한 마우스 연구
[0326] 인간 항-캡시드 중화 IgG의 인공 역가를 갖는 마우스에서 2개의 상이한 IdeS 제조물(로트 1 및 로트 2)를 시험하였다. C57BL/6 마우스에 -2일에 300 mg/kg의 IVIg를 주사한 다음, -1일에 1 mg/kg의 IdeS를 주사하고(AAV의 투여 전), 마지막으로 0일에 인간 인자 VIII를 인코딩하는 AAV-Spk1 벡터(AAV-Spk1-hFVIII)의 5x1010 벡터 유전체를 주사하였다(투여 후). 음성 대조군 동물은 IVIg 또는 IdeS 처리를 받지 않았고, "IdeS 없음" 그룹은 IVIg 및 AAV-Spk1-hFVIII 벡터만을 받았다. 샘플에 대해 8-포인트 역가(1:1 내지 1:160)를 사용하여, 실시예 3에 기재된 것과 유사한 항-AAV 캡시드 중화 검정을 사용하여, IdeS 투여 전 및 후 혈장에서의 중화 항체 역가를 결정하였고, 발광은 GloMax® Discover Microplate 리더(Promega)에서 판독되었다. 역가는 발광이 > 50%만큼 억제된 가장 높은 희석율 또는 범위로서 결정되었다. IdeS 처리 전 및 후의 NAb 역가는 두 로트 모두의 IdeS가 마우스에서 NAb 역가를 감소시키는데 효과적이었음을 보여준다(도 7).
[0327] 인간 FVIII 항원 수준은 벡터 주입 전 및 벡터 주입 1 및 2주 후에 ELISA에 의해 측정되었다(도 8). 생체 내 두 로트 모두의 IdeS 처리는 중화 항체 역가를 감소시키고 AAV 벡터의 투여 및 트랜스진의 발현을 허용하였다.
실시예 12
항-AAV-Spk1 IgG를 사용한 마우스 연구
[0328] 인간 항-캡시드 중화 IgG의 인공 역가를 유도하기 위해 C57BL/6 마우스에게 IVIg를 제공하였다. 3개 농도의 IVIg(300 mg/kg(낮음), 800 mg/kg(중간) 및 1600 mg/kg(높음))가 사용되었으며, 각 IVIg 그룹 내에서, 동물은 증가하는 용량의 IdeS(0, 0.4, 1.0, 2.0 mg/kg)로 처리되었다. 항-Spk1 캡시드 IgG 수준은 ELISA에 의해 평가되었다. 간단히 말해서, 96-웰 플레이트를 Spk1 빈 캡시드로 코팅한 다음, BSA로 차단하고, 세척하고, 1:100으로 희석된 혈장과 함께 2시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 플레이트를 세척하고 HRP로 컨쥬게이션된 이차 항체와 함께 1시간 동안 인큐베이션하였다. 후속적으로, 플레이트를 다시 세척하고 TMB 기질을 사용하여 현상하였다. 450 nm에서 광학 밀도(OD)에 대해 흡광도 플레이트 리더에서 플레이트를 판독하였다. 항체 농도를 결정하기 위해 발광을 인간 IgG의 표준 곡선과 비교하였다. 3개 농도의 IdeS(0.4, 1.0, 2.0 mg/kg)는 모두 IVIg의 3개 농도(낮음, 중간 및 높음) 모두에 대해 항-Spk1 캡시드 IgG의 혈청 수준을 제거하거나 유의하게 감소시켰다(도 9).
실시예 13
항-FcRn 항체 및 엔도펩티다제를 사용한 마우스 연구
[0329] 수컷 Tg32 마우스에서 AAV에 대한 중화 항체를 감소시키기 위한, 단독 및 조합된, 항-FcRn 모노클로날 M281 및 IgG 절단 엔도펩티다제 IdeS의 능력을 평가하는 연구를 수행하였다.
[0330] Tg32 마우스 균주(hFcRn Tg32 또는 FcRn-/- hFcRn 주 32 Tg라고도 함)는 인간 IgG 및 Fc-도메인 기반 치료제의 약동학 및 약력학을 평가하기 위한 표준이며, 마우스 Fcgrt(Fc 수용체, IgG, 알파 사슬 수송체) 유전자에 대한 녹아웃 돌연변이 및 C57BL/6J 배경(Jackson Laboratory; stock # 014565)에서 자체 고유 프로모터(hTg32)의 제어하에 인간 FCGRT 유전자를 발현하는 트랜스진을 보유한다.
[0331] 그룹당 11마리의 수컷 Tg32 마우스를 복강 내 주사를 통해 IVIg(중화 항체 도입을 위해) 또는 둘베코 PBS(DPBS)로 사전 면역화시켰다(-1일). 마우스에 24시간 후 M281 또는 PBS를 주사하고(0일), 1일에 IdeS(Promega) 또는 PBS를 주사하고, 2일에 Spk1-FIX(Spk1 캡시드화된 간-특이적 프로모터 FIX 발현 카세트) AAV 입자를 주사하였다(표 3). NAb 및 항-Spk1 IgG 분석을 위해, IVIg 또는 PBS 주사 후 0일 및 2일에 마우스를 채혈하여 혈장을 수집하였다. 연구를 위한 상세한 투여 및 수집 타임라인은 표 4를 참조한다.
[0332] 표 3. 그룹 및 처리.
Figure pct00004
[0333] 표 4. 투여 및 수집 타임라인.
Figure pct00005
방법
[0334] 혈액 샘플링: 0, 2, 9 및 16일에 약 200 μL의 전혈을 턱밑 정맥을 통해 수집하고 얼음 위에 수집하였다. 혈액 첫 번째 방울을 버리고, 혈액을 9800 g, 4℃에서 10분 동안 원심분리하고, 상청액을 깨끗한 튜브에 분취하여 100 μL 혈장 샘플을 얻었다. 혈장 샘플은 분석 전에 -80℃에서 저장되었다.
[0335] 시험관 내 중화 항체 분석: AAV-Spk1 캡시드에 대한 중화 항체 역가를 시험관 내에서 결정하였다. 간단히 말해서, HEK-293-E4 세포를 웰당 20,000개 세포로 96-웰 플레이트(Corning, Cat# 3595)에 시딩하였다. 세포를 1 μg/mL 포나스테론 A(Fisher Scientific, Cat. # H10101)가 보충된 성장 배지(DMEM, 10% FBS, 2 mM L-글루타민, 1x Pen/Strep)를 사용하여 5% CO2의 가습 분위기로 37℃ 인큐베이터에서 밤새 배양하여 인간 아데노바이러스 단백질 E4의 발현을 유도하였다. 다음 날, 모든 혈장 샘플을 수조를 사용하여 56℃에서 30분 동안 열-불활성화시켰다. 1:2.5 내지 1:160 희석액에 걸친 억제 활성을 평가하기 위해 샘플을 희석하고 열-불활성화된 FBS에서 2배 연속 희석하여 시험하였다. 인자 검정 대조군 혈장(FACT)을 사용하여 실행 사이의 검정 성능을 평가하였다. 희석된 혈장 샘플을 1.5 x 109 vg/mL의 농도로 Spk1-레닐라-루시퍼라제 AAV 리포터 바이러스와 미리 혼합하고, 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다(총 부피 80 μL). 인큐베이션 후, 7.5 μL의 미리 혼합된 혈장/AAV 용액을 HEK-293-E4 세포의 3중 웰에 첨가하고 37℃/5% CO2에서 밤새 인큐베이션하였다. 다음 날, 40 μL의 레닐라 루시퍼라제 용해 완충액을 각 웰의 세포에 첨가하고 GloMax® 광도계를 사용하여 발광을 검정하였다. 중화 항체 역가는 나이브 혈청(FBS만)과 비교할 때 50% 초과의 발광 감소를 초래하는 최저 혈장 희석율로 보고되었다.
[0336] 항-SPK1 캡시드 IgG ELISA 분석: 마우스 혈장에서 항-캡시드 IgG의 존재는 인간 항-AAV Spk1 캡시드 IgG 포획 검정을 사용하여 평가되었다. 간단히 말해서, ELISA 플레이트 웰을 인간 IgG 표준, 품질 대조군(QC) 샘플, 또는 Spk1 캡시드(혈장 샘플 웰)과 함께 4℃에서 밤새 코팅하였다. 표준 곡선은 10 μg/mL에서 4.57 ng/mL 범위의 10-포인트, 3배 희석 시리즈로 구성되었으며, 상단 2개 및 하단 2개 포인트가 앵커 포인트 역할을 한다. 고품질 대조군(HQC), 중간 품질 대조군(MQC) 및 저품질 대조군(LQC) 샘플은 800 ng/mL, 500 ng/mL 및 12 ng/mL의 인간 IgG로 구성되었다. 밤새 코팅 단계 후, 플레이트를 플레이트 세척기를 사용하여 3회 세척한 다음, 실온에서 2시간 동안 희석 완충액으로 차단하였다. 플레이트를 상기와 같이 세척하고, 희석된 혈장 샘플(1:100)을 적절한 웰에 첨가하였다(표준 및 QC 웰에는 희석 완충액만이 첨가되었다). 플레이트를 실온에서 2시간 동안 인큐베이션하고 이전과 같이 세척하였다. 호스래디쉬 퍼옥시다제(HRP) 컨쥬게이션된 양-항-인간 IgG 항체를 플레이트 웰에 첨가하고 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 플레이트를 이전과 같이 세척하였다. 실온으로 평형화된 TMB를 플레이트에 첨가하여 신호 검출을 발생시켰다. 암실에서 10분 동안 실온에서 인큐베이션한 후, 1M 황산을 첨가하여 신호 발생을 중단시켰다. SpectraMax® 플레이트 리더를 사용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하여 신호를 검출하였다. 검정 허용 기준은 표준 및 QC 샘플의 결과를 기반으로 하였다. 혈장 샘플에서 항-캡시드 IgG 수준은 표준 곡선과 비교하여 보간되었다. <457 ng/mL으로 측정된 샘플은 정량 한계 미만(BQL)으로 정의되었다. 검출 가능한 흡광도 범위 미만의 샘플에는 검출 하한(LOD)에 해당하는 152 ng/mL의 값이 할당되었다.
중화 항체 역가의 분석
[0337] NAb 검정의 결과는 도 10 및 표 5에 제시되어 있다. PBS 그룹(그룹 1)의 여러 마우스는 증가된 NAb 역가를 가졌다. "M281만" 그룹(그룹 2)은 2일 후에 NAb 역가를 상당히 감소시켰지만, "IdeS만" 그룹(그룹 3)은 NAb 역가의 유의한 감소를 나타내지 않았다. NAb 빈(bins)은 리포터의 발현을 허용하는 혈장이 희석되는 수준을 반영하고, 이는 검정에서 억제가 있는 값이 특정 값 사이에 속할 수 있기 때문에 NAb 역가를 분류하는 방법이다. 따라서, NAb 역가는 이러한 "빈" 또는 수준 내에 있는 것으로 언급되었다.
[0338] M281 및 IdeS는 둘 모두는 중화 항체 역가를 감소시켰으며, 조합 요법은 모든 마우스를 검출의 최저 한계 미만의 빈으로 감소시켰다. M281 단독은 IdeS보다 NAb를 더 효율적으로 감소시킬 수 있었다.
[0339] 표 5. NAb 역가 빈 변경
Figure pct00006
항-Spk1 캡시드 IgG의 분석
[0340] 항-Spk1 IgG ELISA 수준은 0일과 2일 사이에 "PBS만" 및 "IVIg 없음" 그룹에서 변화하지 않았다(도 11). 항-Spk1 IgG 수준은, 평균적으로, M281만 제공된 마우스(그룹 2)에서 5.21 x 103 ng/mL(0일)에서 3.95 x 103 ng/mL(2일)로 낮아졌고, IdeS만 제공된 마우스(그룹 3)에서 4.21 x 103 ng/mL(0일)에서 6.88 x 102 ng/mL(2일)로 낮아졌다(표 6). M281 및 IdeS를 모두 받은 마우스(그룹 4)는 항-Spk1 IgG 수준이 모두 검정의 검출 한계 미만으로 떨어졌고 152 ng/mL의 값이 할당되었다(도 11). 항-Spk1 IgG 수준은 그룹 2(M281) 및 그룹 4(M281 + IdeS)에서 유의하게 감소되었지만, 그룹 3(IdeS)은 0일에서 2일까지 감소하지 않았다. M281 및 IdeS의 조합을 받은 마우스는 2일에 M281 또는 IdeS 단독에 비해 유의하게 더 낮은 항-Spk1 IgG 수준을 가졌다.
[0341] 표 6. 항-Spk1 IgG의 감소
Figure pct00007
결론
[0342] 따라서, M281 및 IdeS의 조합은 중화 항체 수준을 최저 역가 빈으로 감소시키고 항-Spk1 캡시드 IgG 수준을 검출 한계 미만으로 감소시킬 수 있다. 이러한 결과는 개선된 AAV 유전자 요법을 위해, 높은 NAb 역가를 갖는 환자에서 중화 항체 수준을 감소시키기 위한 항-FcRn 제제(예를 들어, 항-FcRn 항체) 및 IdeS의 조합 전략에 대한 강력한 지지를 제공한다.
[0343] 이러한 결과는 항-FcRn 모노클로날 항체(M281) 및 IdeS가 전임상 마우스 모델에서 항-캡시드 IgG 수준을 감소시키는 효능에 있어서 유사하다는 것을 보여준다. 또한, M281은 항-캡시드 IgG 수준을 검출 불가능한 수준으로 감소시키기 위한 조합 요법으로서 IdeS와 함께 사용될 수 있음이 입증되었다. 항-FcRn 모노클로날 항체 M281와 같은 항-FcRn 제제 및 IdeS의 조합 치료 전략은 IdeS 처리만으로 효과적으로 감소시키기에는 너무 높을 수 있는 항-캡시드 IgG 수준을 갖는 대상체 또는 환자에게 AAV 트랜스진을 전달하는데 유용할 수 있다.
실시예 14
더 높은 용량의 AAV 벡터를 사용한 마우스 연구
[0344] 실시예 13의 연구는 표 7에 제시된 바와 같이 마우스당 더 높은 용량의 AAV 벡터 유전체로 수행된다.
[0345] 표 7. 그룹 및 처리.
Figure pct00008
[0346] 추가 분석은 간에서 벡터 유전체의 정량화, 간에서 FIX 트랜스진의 mRNA 발현의 정량화, 및 혈장에서 FIX 항원의 정량화를 포함한다.
실시예 15
NAb를 제거하고 AAV-기반 유전자 요법을 가능하게 하는 항-FcRn 제제의 사용
[0347] IdeS 처리만으로는 높은 역가의 AAV NAb를 제거하지 못할 수 있거나, 효과적인 AAV 형질도입에 충분할 정도로 AAV NAb를 제거하거나 감소시키지 못할 수 있다. 대상체가 이미 재조합 AAV 벡터를 투여받은 경우와 같이 대상체가 AAV에 대해 높은 NAb를 가질 수 있는 상황에서, 이러한 높은 수준의 NAb는 IdeS 처리만으로는 완전히 제거되지 않을 수 있다. 항-FcRn 제제 및 IdeS의 투여는 고역가 NAb를 보다 효과적으로 제거하고 효과적인 AAV 형질도입을 가능하게 할 수 있다. 예를 들어, 항-FcRn 제제를 여러 번 투여한 후, AAV 벡터의 투여 전에, IdeS가 투여될 수 있다(도 12 참조).
실시예 16
재투여 토끼 연구
[0348] 뉴질랜드 흰토끼에 초기에 단백질을 인코딩하는 트랜스진을 운반하는 AAV 벡터(예를 들어, Spk2-hFIX)를 투여하고, 동일한 캡시드를 갖지만 다른 단백질을 인코딩하는 트랜스진을 운반하는 AAV 벡터(예를 들어, Spk2-hFVIII)를 "재투여"한다(도 13). 대안책은 "재투여" AAV 벡터와는 다른 빈 AAV 벡터 또는 일부 다른 트랜스진을 초기에 투여하는 것을 포함한다. 항-FcRn 제제(예를 들어, 항 -FcRn 항체 M281), IdeS 및 항-FcRn 제제와 IdeS의 조합은 제1 AAV 투여와 제2 AAV 투여 사이에 투여된다.
[0349] 표 8. 그룹 및 처리.
Figure pct00009
[0350] 28, 29일에 중화 항체 역가, 항-캡시드 IgG를 측정한다.
[0351] 58일에 hFIX, hFVIII 항원 및 벡터 유전체를 측정한다.
실시예 17
항-FcRn 연구 - 사이노몰구스 원숭이
[0352] 이 연구는 항-FcRn 및 IdeS 조합 치료가 고역가 NAb-양성 사이노몰구스 원숭이에서 AAV 간 형질도입을 가능하게 할 수 있는지 결정하기 위해 설계되었다. 연구의 개략도(도 14)는 IdeS 투여 전 3주 동안 항-FcRn 항체(M281)를 매주 투여한 후, AAV 벡터 투여를 나타낸다.
[0353] 표 9. 그룹 및 처리.
Figure pct00010
[0354] 종말점은 M281 및 IdeS 약동학(PK) 및 약력학(PD)을 측정하기 위한 -21일과 1일 사이의 출혈, 보체 분석을 위한 AAV 투여 후 다중 출혈, 임상 병리 및 트랜스진 발현을 위한 주간 출혈, T-세포 반응을 위한 PBMC, 생체분포 분석을 위한 냉동 조직; 면역학 분석을 위한 신선한 조직 및 표준 조직병리학을 위한 고정 조직을 포함한다.
실시예 18
[0355] Spk1 (SEQ ID NO: 1):
Figure pct00011
Figure pct00012
[0356] Spk2 (SEQ ID NO: 2):
Figure pct00013
[0357] N 말단 메티오닌 및 신호 서열을 포함하는 IdeS의 서열. (SEQ ID NO: 3, NCBI 참조 서열 번호 WP_010922160.1):
Figure pct00014
[0358] N 말단 메티오닌 및 신호 서열이 없는 IdeS의 성숙한 서열. (SEQ ID NO: 4, Genbank 수탁 번호 ADF13949.1):
Figure pct00015
[0359] SEQ ID NO: 5 내지 18은 WO 2016/128558의 표 C로부터의 예시적인 IdeS 폴리펩티드의 서열이다.
[0360] SEQ ID NO: 5:
Figure pct00016
[0361] SEQ ID NO: 6:
Figure pct00017
[0362] SEQ ID NO: 7:
Figure pct00018
[0363] SEQ ID NO: 8:
Figure pct00019
[0364] SEQ ID NO: 9:
Figure pct00020
[0365] SEQ ID NO: 10:
Figure pct00021
[0366] SEQ ID NO: 11:
Figure pct00022
[0367] SEQ ID NO: 12:
Figure pct00023
[0368] SEQ ID NO: 13:
Figure pct00024
[0369] SEQ ID NO: 14:
Figure pct00025
[0370] SEQ ID NO: 15:
Figure pct00026
[0371] SEQ ID NO: 16:
Figure pct00027
[0372] SEQ ID NO: 17:
Figure pct00028
[0373] SEQ ID NO: 18:
Figure pct00029
[0374] 인간 IgG1에 특이적인 S. 아갈락티아에의 IgdE (SEQ ID NO: 19, WO2017134274):
Figure pct00030
[0375] S. 슈도포르시누스의 IgdE는 인간 IgG1 및 돼지 IgG 둘 모두를 분해한다 (SEQ ID NO: 20, WO2017134274):
Figure pct00031
[0376] NCBI 참조 서열 번호 WP 014622780.1 (SEQ ID NO: 21)로서 이용 가능한 IdeZ의 전체 서열. 이 서열은 N-말단 메티오닌에 이어 33개 아미노산의 분비 신호 서열을 포함한다. N-말단 메티오닌 및 신호 서열(N-말단에서 총 34개 아미노산)이 전형적으로 제거되어 성숙한 IdeZ 단백질을 형성한다:
Figure pct00032
[0377] 전체 서열의 N-말단으로부터 34개 아미노산이 없는 IdeZ의 서열 (SEQ ID NO: 22):
Figure pct00033
[0378] N-말단 메티오닌 및 신호 서열(N-말단에서 총 34개 아미노산)이 없는, IdeZ에 기초한 N-말단 부분을 갖는 IdeS/Z 하이브리드의 서열 (SEQ ID NO: 23):
Figure pct00034
[0379] SEQ ID NO: 24-43은 SEQ ID NO: 22의 IdeZ에 비해 변형된 펩티드에 해당한다.
[0380] SEQ ID NO: 24:
Figure pct00035
[0381] SEQ ID NO: 25:
Figure pct00036
[0382] SEQ ID NO: 26:
Figure pct00037
[0383] SEQ ID NO: 27:
Figure pct00038
[0384] SEQ ID NO: 28:
Figure pct00039
[0385] SEQ ID NO: 29:
Figure pct00040
[0386] SEQ ID NO: 30:
Figure pct00041
[0387] SEQ ID NO: 31:
Figure pct00042
[0388] SEQ ID NO: 32:
Figure pct00043
[0389] SEQ ID NO: 33:
Figure pct00044
[0390] SEQ ID NO: 34:
Figure pct00045
[0391] SEQ ID NO: 35:
Figure pct00046
[0392] SEQ ID NO: 36:
Figure pct00047
[0393] SEQ ID NO: 37:
Figure pct00048
[0394] SEQ ID NO: 38:
Figure pct00049
[0395] SEQ ID NO: 39:
Figure pct00050
[0396] SEQ ID NO: 40:
Figure pct00051
[0397] SEQ ID NO: 41:
Figure pct00052
[0398] SEQ ID NO: 42:
Figure pct00053
[0399] SEQ ID NO: 43:
Figure pct00054
[0400] 스트렙토코쿠스 피오게네스로부터의 엔도글리코시다제 EndoS49에 대한 단백질 서열 (SEQ ID NO: 44, US 9,493,752):
Figure pct00055
[0401] S. 피오게네스로부터의 성숙한 엔도글리코시다제 S(EndoS)의 단백질 서열. (SEQ ID NO: 45, 15/328,879, 미국 특허 8,889,128 및 9,707,279):
Figure pct00056
[0402] 스트렙토코쿠스 피오게네스로부터의 엔도글리코시다제 EndoS의 분비 신호를 포함하는 전체 서열 (SEQ ID NO: 46, AAK00850.1):
Figure pct00057
[0403] 신호 서열을 포함하는, S. 피오게네스 API로부터 분리된 EndoS의 단백질 서열. (SEQ ID NO: 47,미국 특허 8,889,128 및 9,707,279):
Figure pct00058
[0404] N-말단 메티오닌이 첨가된 IdeS의 성숙한 서열 (SEQ ID NO: 48):
Figure pct00059
실시예 19
Figure pct00060
Figure pct00061
SEQUENCE LISTING <110> SPARK THERAPEUTICS, INC. <120> COMPOSITIONS AND METHODS FOR INCREASING OR ENHANCING TRANSDUCTION OF GENE THERAPY VECTORS AND FOR REMOVING OR REDUCING IMMUNOGLOBULINS <130> 023637-0559397 <140> PCT/US2021/014770 <141> 2021-01-22 <150> 62/964,565 <151> 2020-01-22 <160> 57 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 738 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 1 Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser 1 5 10 15 Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Asp Leu Lys Pro Gly Ala Pro Lys Pro 20 25 30 Lys Ala Asn Gln Gln Lys Gln Asp Asn Gly Arg Gly Leu Val Leu Pro 35 40 45 Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro 50 55 60 Val Asn Ala Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp 65 70 75 80 Gln Gln Leu Gln Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Arg Tyr Asn His Ala 85 90 95 Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Gln Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly 100 105 110 Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe 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polypeptide <400> 30 Asp Asp Tyr Gln Arg Asn Ala Thr Glu Ala Tyr Ala Lys Glu Val Pro 1 5 10 15 His Gln Ile Thr Ser Val Trp Thr Lys Gly Val Thr Pro Pro Glu Gln 20 25 30 Phe Arg Tyr Asn Asn Glu Asp Val Ile His Ala Pro Tyr Leu Ala His 35 40 45 Gln Gly Trp Tyr Asp Ile Thr Lys Ala Phe Asp Gly Lys Asp Asn Leu 50 55 60 Leu Cys Gly Ala Ala Thr Ala Gly Asn Met Leu His Trp Trp Phe Asp 65 70 75 80 Gln Asn Lys Thr Glu Ile Glu Ala Tyr Leu Ser Lys His Pro Glu Lys 85 90 95 Gln Lys Ile Ile Phe Asn Asn Gln Glu Leu Phe Asp Leu Lys Ala Ala 100 105 110 Ile Asp Thr Lys Asp Ser Gln Thr Asn Ser Gln Leu Phe Asn Tyr Phe 115 120 125 Arg Asp Lys Ala Phe Pro Asn Leu Ser Ala Arg Gln Leu Gly Val Met 130 135 140 Pro Asp Leu Val Leu Asp Met Phe Ile Asn Gly Tyr Tyr Leu Asn Val 145 150 155 160 Phe Lys Thr Gln Ser Thr Asp Val Asn Arg Pro Tyr Gln Asp Lys Asp 165 170 175 Lys Arg Gly Gly Ile Phe Asp Ala Val Phe Thr Arg Gly Asp Gln Thr 180 185 190 Thr Leu Leu Thr Ala Arg His Asp Leu Lys Asn Lys Gly Leu Asn Asp 195 200 205 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Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr 130 135 140 Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys 145 150 155 160 Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr 165 170 175 Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His 180 185 190 Lys Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys 195 200 205 Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser 210 215 <210> 50 <211> 445 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 50 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr 20 25 30 Ala Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Gly Ala Ser Gly Ser Gln Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Leu Ala Ile Gly Asp Ser Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala 115 120 125 Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu 130 135 140 Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly 145 150 155 160 Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser 165 170 175 Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu 180 185 190 Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr 195 200 205 Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr 210 215 220 Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe 225 230 235 240 Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro 245 250 255 Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val 260 265 270 Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 275 280 285 Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val 290 295 300 Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 305 310 315 320 Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser 325 330 335 Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro 340 345 350 Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val 355 360 365 Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 370 375 380 Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp 385 390 395 400 Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 405 410 415 Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 420 425 430 Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 435 440 445 <210> 51 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 51 Thr Gly Thr Gly Ser Asp Val Gly Ser Tyr Asn Leu Val Ser 1 5 10 <210> 52 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 52 Gly Asp Ser Glu Arg Pro Ser 1 5 <210> 53 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 53 Ser Ser Tyr Ala Gly Ser Gly Ile Tyr Val 1 5 10 <210> 54 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 54 Thr Tyr Ala Met Gly 1 5 <210> 55 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 55 Ser Ile Gly Ala Ser Gly Ser Gln Thr Arg Tyr Ala Asp Ser 1 5 10 <210> 56 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 56 Leu Ala Ile Gly Asp Ser Tyr 1 5 <210> 57 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6) <223> A hydrophobic amino acid <400> 57 Gly His Phe Gly Gly Xaa Tyr 1 5

Claims (89)

  1. 대상체에서 유전자 요법 치료의 효능을 향상시키는 방법으로서,
    (a) 면역글로불린 G(IgG)와 신생아 Fc 수용체(FcRn)의 상호작용을 감소시키는 제제를 대상체에 투여하는 단계; 및
    (b) 치료적 이종성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 바이러스 벡터를 상기 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    (a) 상기 대상체가 단백질의 기능 또는 활성의 손실로 인한 질병에 대한 치료를 필요로 하고, 상기 이종성 폴리뉴클레오티드가 상기 단백질의 기능 또는 활성을 제공하거나 보충하는 폴리펩티드 또는 펩티드를 인코딩하거나,
    (b) 상기 대상체가 단백질의 기능, 활성 또는 발현의 획득에 의해 야기되는 질병에 대한 치료를 필요로 하고, 상기 이종성 폴리뉴클레오티드가 상기 단백질의 상기 기능, 활성 또는 발현의 획득의 발현을 억제, 감소 또는 저하시키는 핵산으로 전사되는 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, FcRn-매개 IgG 재순환이 상기 대상체에서 감소되는 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, IgG 제거가 상기 대상체에서 향상되는 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 IgG와 FcRn의 상호작용을 감소시키는 제제가 항-FcRn 항체, FcRn 결합 아피바디, IgG 분해를 향상시키는 항체(ABDEG), FcRn 결합 펩티드(FcBP) 및 FcRn 결합 소분자로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (a)가 단계 (b) 전에 수행되는 방법.
  7. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)가 단계 (a) 전에 수행되는 방법.
  8. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (a) 및 단계 (b)가 거의 동시에 수행되는 방법.
  9. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (a)가 단계 (b) 이전 또는 이후에 2회 이상 수행되는 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)가 단계 (a) 이전 또는 이후에 약 90일 이내에 수행되는 방법.
  11. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)가 단계 (a) 이전 또는 이후에 약 60일 이내에 수행되는 방법.
  12. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)가 단계 (a) 이전 또는 이후에 약 45일 이내에 수행되는 방법.
  13. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)가 단계 (a) 이전 또는 이후에 약 30일 이내에 수행되는 방법.
  14. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)가 단계 (a) 이전 또는 이후에 약 21일 이내에 수행되는 방법.
  15. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)가 단계 (a) 이전 또는 이후에 약 14일 이내에 수행되는 방법.
  16. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)가 단계 (a) 이전 또는 이후에 약 7일 이내에 수행되는 방법.
  17. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)가 단계 (a) 이전 또는 이후에 약 72시간 이내에 수행되는 방법.
  18. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)가 단계 (a) 이전 또는 이후에 약 48시간 이내에 수행되는 방법.
  19. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)가 단계 (a) 이전 또는 이후에 약 24시간 이내에 수행되는 방법.
  20. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)가 단계 (a) 이전 또는 이후에 약 12시간 이내에 수행되는 방법.
  21. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)가 단계 (a) 이전 또는 이후에 약 6시간 이내에 수행되는 방법.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 바이러스 벡터 및/또는 상기 이종성 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된 상기 폴리펩티드 또는 펩티드 및/또는 상기 이종성 폴리뉴클레오티드에 결합하는 항체의 이펙터 기능을 분해 또는 소화 및/또는 억제 또는 감소시키는데 효과적인 양의 프로테아제 또는 글리코시다제를 상기 대상체에 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  23. 제22항에 있어서, 상기 프로테아제 또는 글리코시다제가 단계 (a) 이전, 이후 또는 거의 동시에 투여되는 방법.
  24. 제22항에 있어서, 상기 프로테아제 또는 글리코시다제가 단계 (b) 이전, 이후 또는 거의 동시에 투여되는 방법.
  25. 제22항에 있어서, 상기 프로테아제 또는 글리코시다제가 단계 (a) 이전, 이후 또는 거의 동시에 2회 이상 투여되는 방법.
  26. 제22항에 있어서, 상기 프로테아제 또는 글리코시다제가 단계 (b) 이전, 이후 또는 거의 동시에 2회 이상 투여되는 방법.
  27. 제22항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로테아제 또는 글리코시다제가 단계 (a) 또는 단계 (b) 이전 또는 이후에 약 90일 이내에 투여되는 방법.
  28. 제22항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로테아제 또는 글리코시다제가 단계 (a) 또는 단계 (b) 이전 또는 이후에 약 60일 이내에 투여되는 방법.
  29. 제22항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로테아제 또는 글리코시다제가 단계 (a) 또는 단계 (b) 이전 또는 이후에 약 45일 이내에 투여되는 방법.
  30. 제22항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로테아제 또는 글리코시다제가 단계 (a) 또는 단계 (b) 이전 또는 이후에 약 30일 이내에 투여되는 방법.
  31. 제22항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로테아제 또는 글리코시다제가 단계 (a) 또는 단계 (b) 이전 또는 이후에 약 21일 이내에 투여되는 방법.
  32. 제22항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로테아제 또는 글리코시다제가 단계 (a) 또는 단계 (b) 이전 또는 이후에 약 14일 이내에 투여되는 방법.
  33. 제22항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로테아제 또는 글리코시다제가 단계 (a) 또는 단계 (b) 이전 또는 이후에 약 7일 이내에 투여되는 방법.
  34. 제22항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로테아제 또는 글리코시다제가 단계 (a) 또는 단계 (b) 이전 또는 이후에 약 72시간 이내에 투여되는 방법.
  35. 제22항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로테아제 또는 글리코시다제가 단계 (a) 또는 단계 (b) 이전 또는 이후에 약 48시간 이내에 투여되는 방법.
  36. 제22항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로테아제 또는 글리코시다제가 단계 (a) 또는 단계 (b) 이전 또는 이후에 약 24시간 이내에 투여되는 방법.
  37. 제22항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로테아제 또는 글리코시다제가 단계 (a) 또는 단계 (b) 이전 또는 이후에 약 12시간 이내에 투여되는 방법.
  38. 제22항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로테아제 또는 글리코시다제가 단계 (a) 또는 단계 (b) 이전 또는 이후에 약 6시간 이내에 투여되는 방법.
  39. 제22항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로테아제가 시스테인 프로테아제 또는 티올 프로테아제를 포함하는 방법.
  40. 제22항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로테아제가 스트렙토코쿠스 피오게네스, 스트렙토코쿠스 에쿠이 또는 마이코플라스마 카니스로부터의 프로테아제를 포함하는 방법.
  41. 제22항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로테아제가 SEQ ID NO: 3-18, 23 또는 48 중 어느 하나에 제시된 IdeS 또는 이의 변형된 변이체를 포함하는 방법.
  42. 제22항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 글리코시다제가 엔도글리코시다제를 포함하는 방법.
  43. 제42항에 있어서, 상기 엔도글리코시다제가 SEQ ID NO: 44-47 중 어느 하나에 제시된 서열을 포함하는 방법.
  44. 제22항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로테아제 또는 글리코시다제가 인간 항체의 이펙터 기능을 분해 또는 소화 및/또는 억제 또는 감소시키는 방법.
  45. 제1항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이러스 벡터가 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터 또는 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터를 포함하는 방법.
  46. 제45항에 있어서, 상기 렌티바이러스 벡터가 상기 항체 또는 IgG가 결합하는 외피 단백질을 포함하는 방법.
  47. 제45항에 있어서, 상기 AAV 벡터가 항체 또는 IgG가 결합하는 캡시드 단백질을 포함하는 방법.
  48. 제45항에 있어서, 상기 AAV 벡터가 항체 또는 IgG가 결합하는 VP1, VP2 및/또는 VP3 캡시드 단백질을 포함하는 방법.
  49. 제45항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 AAV 벡터가 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV3B, AAV-2i8, Rh10, Rh74, SEQ ID NO: 1 및 SEQ ID NO: 2 VP1, VP2 및/또는 VP3 캡시드 단백질로 구성된 군으로부터 선택된 VP1, VP2 및/또는 VP3 캡시드 단백질에 대해 60% 이상의 서열 동일성을 갖는 VP1, VP2 및/또는 VP3 캡시드 단백질을 포함하는 방법.
  50. 제45항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 AAV 벡터가 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV3B, AAV-2i8, Rh10, Rh74, SEQ ID NO: 1 및 SEQ ID NO: 2 VP1, VP2 및/또는 VP3 캡시드 단백질로 구성된 군으로부터 선택된 VP1, VP2 및/또는 VP3 캡시드 단백질에 대해 100% 서열 동일성을 갖는 VP1, VP2 및/또는 VP3 캡시드 단백질을 포함하는 방법.
  51. 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 상기 바이러스 벡터에 결합하는 항체 또는 IgG를 갖는 방법.
  52. 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이러스 벡터에 결합하는 항체 또는 IgG가 상기 대상체에 부재하는 방법.
  53. 제1항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 상기 이종성 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된 상기 폴리펩티드 또는 펩티드에 결합하는 항체 또는 IgG를 갖는 방법.
  54. 제22항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 IgG, IgM, IgA, IgD 및/또는 IgE를 포함하는 방법.
  55. 제1항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (a)를 수행하기 전, 단계 (a)를 수행한 후 그러나 단계 (b)를 수행하기 전 및/또는 단계 (a) 및 (b)를 수행한 후에 상기 대상체에 존재하는 바이러스 벡터 결합 항체 또는 IgG의 존재를 결정하거나, 그 양 또는 이펙터 기능을 정량화하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  56. 제1항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (a)를 수행하기 전, 단계 (a)를 수행한 후 그러나 단계 (b)를 수행하기 전 및/또는 단계 (a) 및 (b)를 수행한 후에 상기 샘플에 존재하는 바이러스 벡터 결합 항체 또는 IgG의 존재, 양 또는 이펙터 기능에 대해 상기 대상체로부터의 생물학적 샘플을 분석하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  57. 제55항 또는 제56항에 있어서, 상기 결정 및/또는 분석 단계가 상기 프로테아제 또는 글리코시다제의 투여 전 및/또는 후에 수행되는 방법.
  58. 제56항 또는 제57항에 있어서, 상기 대상체로부터의 상기 생물학적 샘플이 혈액 생성물인 방법.
  59. 제1항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 상기 바이러스 벡터 결합 항체 또는 IgG의 20-50%, 50-75%, 75-90%, 90-95% 또는 95% 이상의 감소를 초래하는 방법.
  60. 제56항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체로부터의 상기 생물학적 샘플 또는 혈액 생성물에 존재하는 상기 바이러스 벡터 결합 항체 또는 IgG가 약 1:100,000 미만이고, 여기서 100,000부의 완충액에 희석된 1부의 상기 생물학적 샘플 또는 혈액 생성물이 50% 바이러스 벡터 중화를 초래하는 방법.
  61. 제56항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체로부터의 상기 생물학적 샘플 또는 혈액 생성물에 존재하는 상기 바이러스 벡터 결합 항체 또는 IgG가 약 1:50,000 미만이고, 여기서 50,000부의 완충액에 희석된 1부의 상기 생물학적 샘플 또는 혈액 생성물이 50% 바이러스 벡터 중화를 초래하는 방법.
  62. 제56항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체로부터의 상기 생물학적 샘플 또는 혈액 생성물에 존재하는 상기 바이러스 벡터 결합 항체 또는 IgG가 약 1:10,000 미만이고, 여기서 10,000부의 완충액에 희석된 1부의 상기 생물학적 샘플 또는 혈액 생성물이 50% 바이러스 벡터 중화를 초래하는 방법.
  63. 제56항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체로부터의 상기 생물학적 샘플 또는 혈액 생성물에 존재하는 상기 바이러스 벡터 결합 항체 또는 IgG가 약 1:1,000 미만이고, 여기서 1,000부의 완충액에 희석된 1부의 상기 생물학적 샘플 또는 혈액 생성물이 50% 바이러스 벡터 중화를 초래하는 방법.
  64. 제56항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체로부터의 상기 생물학적 샘플 또는 혈액 생성물에 존재하는 상기 바이러스 벡터 결합 항체 또는 IgG가 약 1:100 미만이고, 여기서 100부의 완충액에 희석된 1부의 상기 생물학적 샘플 또는 혈액 생성물이 50% 바이러스 벡터 중화를 초래하는 방법.
  65. 제56항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체로부터의 상기 생물학적 샘플 또는 혈액 생성물에 존재하는 상기 바이러스 벡터 결합 항체 또는 IgG가 약 1:10 미만이고, 여기서 10부의 완충액에 희석된 1부의 상기 생물학적 샘플 또는 혈액 생성물이 50% 바이러스 벡터 중화를 초래하는 방법.
  66. 제56항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생물학적 샘플 또는 혈액 생성물에 존재하는 상기 바이러스 벡터 결합 항체 또는 IgG가 약 1:5 미만이고, 여기서 5부의 완충액에 희석된 1부의 상기 생물학적 샘플 또는 혈액 생성물이 50% 바이러스 벡터 중화를 초래하는 방법.
  67. 제56항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생물학적 샘플 또는 혈액 생성물에 존재하는 바이러스 벡터 결합 항체 또는 IgG의 비가 약 1:4 미만이고, 여기서 4부의 완충액에 희석된 1부의 상기 생물학적 샘플 또는 혈액 생성물이 50% 바이러스 벡터 중화를 초래하는 방법.
  68. 제56항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생물학적 샘플 또는 혈액 생성물에 존재하는 바이러스 벡터 결합 항체 또는 IgG의 비가 약 1:3 미만이고, 여기서 3부의 완충액에 희석된 1부의 상기 생물학적 샘플 또는 혈액 생성물이 50% 바이러스 벡터 중화를 초래하는 방법.
  69. 제1항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체, 생물학적 샘플 또는 혈액 생성물에 존재하는 바이러스 벡터 결합 항체 또는 IgG의 비가 약 1:2 미만이고, 여기서 2부의 완충액에 희석된 1부의 상기 생물학적 샘플 또는 혈액 생성물이 50% 바이러스 벡터 중화를 초래하는 방법.
  70. 제1항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체, 생물학적 샘플 또는 혈액 생성물에 존재하는 바이러스 벡터 결합 항체 또는 IgG의 비가 약 1:1 미만이고, 여기서 1부의 완충액에 희석된 1부의 상기 생물학적 샘플 또는 혈액 생성물이 50% 바이러스 벡터 중화를 초래하는 방법.
  71. 제1항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (a)를 수행한 후 그러나 단계 (b)를 수행하기 전 및/또는 단계 (a) 및 (b)를 수행한 후에 상기 이종성 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된 폴리펩티드 또는 펩티드에 결합하는 항체 또는 IgG의 존재를 결정하거나 그 양을 정량화하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  72. 제1항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (a)를 수행한 후 그러나 단계 (b)를 수행하기 전 및/또는 단계 (a) 및 (b)를 수행한 후에 상기 이종성 폴리뉴클레오티드 또는 핵산에 결합하는 항체 또는 IgG의 존재를 결정하거나 그 양을 정량화하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  73. 제1항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 폐 질환(예를 들어, 낭성 섬유증), 출혈 장애(예를 들어, 억제제가 있거나 없는 혈우병 A 또는 혈우병 B), 지중해 빈혈, 혈액 장애(예를 들어, 빈혈), 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병, 근위축성 측삭 경화증(ALS), 간질, 리소좀 축적병(예를 들어, 아스파르틸글루코사민뇨증, 바텐병, 후기 영아 신경세포 세로이드 리포푸신증 타입 2(CLN2), 시스틴증, 파브리병, 고셔병 타입 I, II 및 III, 글리코겐 축적병 II(폼페병), GM2-강글리오시드증 타입 I(테이 삭스병), GM2-강글리오시드증 타입 II(샌드호프병), 점액지질증 타입 I(시알산증 타입 I 및 II), II(I-세포병), III(슈도-헐러병) 및 IV, 점액다당류 축적병(헐러병 및 변이체, 헌터, 산필리포 타입 A, B, C, D, 모르키오 타입 A 및 B, 마로토-라미 및 슬라이병), 니만-픽병 타입 A/B, C1 및 C2 및 쉰들러병 타입 I 및 II), 유전성 맥관부종(HAE), 구리 또는 철 축적 장애(예를 들어, 윌슨병 또는 멘케스병), 리소좀 산 리파제 결핍, 신경학적 또는 신경퇴행성 장애, 암, 타입 1 또는 타입 2 당뇨병, 아데노신 데아미나제 결핍, 대사 결함(예를 들어, 글리코겐 축적병), 고형 장기(예를 들어, 뇌, 간, 신장, 심장)의 질환, 또는 감염성 바이러스(예를 들어, B형 및 C형 간염, HIV 등), 박테리아 또는 진균 질환을 갖는 방법.
  74. 제1항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 혈액 응고 장애를 갖는 방법.
  75. 제1항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 혈우병 A, 억제 항체를 갖는 혈우병 A, 혈우병 B, 억제 항체를 갖는 혈우병 B, 임의의 응고 인자 결핍증: VII, VIII, IX, X, XI, V, XII, II, 폰 빌레브란트 인자, 또는 조합된 FV/FVIII 결핍증, 지중해 빈혈, 비타민 K 에폭사이드 환원효소 C1 결핍증 또는 감마-카르복실라제 결핍증을 갖는 방법.
  76. 제1항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 빈혈, 외상과 관련된 출혈, 손상, 혈전증, 저혈소판증, 뇌졸중, 응고병증, 파종성 혈관 내 응고(DIC); 헤파린, 저분자량 헤파린, 오당류, 와파린, 소분자 항혈전제(즉, FXa 억제제), 또는 버나드 술리에 증후군, 글란츠만 혈소판기능저하증 또는 저장 풀 결핍증과 같은 혈소판 장애와 관련된 과잉-항응고를 갖는 방법.
  77. 제1항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이종성 폴리뉴클레오티드가 인슐린, 글루카곤, 성장 호르몬(GH), 부갑상선 호르몬(PTH), 성장 호르몬 방출 인자(GRF), 난포 자극 호르몬(FSH), 황체형성 호르몬(LH), 인간 융모색식샘 자극호르몬(hCG), 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 앤지오포이에틴, 앤지오스타틴, 과립구 집락 자극 인자(GCSF), 에리트로포이에틴(EPO), 결합 조직 성장 인자(CTGF), 염기성 섬유모세포 성장 인자(bFGF), 산성 섬유모세포 성장 인자(aFGF), 표피 성장 인자(EGF), 형질전환 성장 인자 α(TGFα), 혈소판 유래 성장 인자(PDGF), 인슐린 성장 인자 I 및 II(IGF-I 및 IGF-II), TGFβ, 액티빈, 인히빈, 골 형성 단백질(BMP), 신경 성장 인자(NGF), 뇌 유래 신경영양 인자(BDNF), 뉴로트로핀 NT-3 및 NT4/5, 섬모 신경영양 인자(CNTF), 신경아교세포주 유래 신경영양 인자(GDNF), 뉴투린, 아그린, 네트린-1 및 네트린-2, 간세포 성장 인자(HGF), 에프린, 노긴, 소닉 헤지호그 및 티로신 하이드록실라제로 구성된 군으로부터 선택된 단백질을 인코딩하는 방법.
  78. 제1항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이종성 폴리뉴클레오티드가 트롬보포이에틴(TPO), 인터루킨(IL1 내지 IL-36), 단핵구 화학유인 단백질, 백혈병 억제 인자, 과립구-대식세포 집락 자극 인자, Fas 리간드, 종양 괴사 인자 α 및 β, 인터페론 α, β 및 γ, 줄기 세포 인자, flk-2/flt3 리간드, IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE, 키메라 면역글로불린, 인간화된 항체, 단일 사슬 항체, T 세포 수용체, 키메라 T 세포 수용체, 단일 사슬 T 세포 수용체, 클래스 I 및 클래스 II MHC 분자로 구성된 군으로부터 선택된 단백질을 인코딩하는 방법.
  79. 제1항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이종성 폴리뉴클레오티드가 CFTR(낭성 섬유증 막횡단 조절 단백질), 혈액 응고(응고) 인자(인자 XIII, 인자 IX, 인자 VIII, 인자 X, 인자 VII, 인자 VIIa, 단백질 C 등), 기능 획득 혈액 응고 인자, 항체, 망막 색소 상피-특이적 65 kDa 단백질(RPE65), 에리트로포이에틴, LDL 수용체, 지단백질 리파제, 오르니틴 트랜스카르바밀라제, β-글로빈, α-글로빈, 스펙트린, α-항트립신, 아데노신 데아미나제(ADA), 금속 수송체(ATP7A 또는 ATP7), 설파미다제, 리소좀 축적병(ARSA)에 관여하는 효소, 하이포크산틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제, β-25 글루코세레브로시다제, 스핑고미엘리나제, 리소좀 헥소사미니다제, 분지쇄 케토산 데하이드로게나제, 호르몬, 성장 인자, 인슐린-유사 성장 인자 1 또는 2, 혈소판 유래 성장 인자, 표피 성장 인자, 신경 성장 인자, 신경영양 인자-3 및 -4, 뇌 유래 신경영양 인자, 아교세포 유래 성장 인자, 형질전환 성장 인자 α 및 β, 사이토카인, α-인터페론, β-인터페론, 인터페론-γ, 인터루킨-2, 인터루킨-4, 인터루킨 12, 과립구-대식세포 집락 자극 인자, 림프독소, 자살 유전자 생성물, 단순 헤르페스 바이러스 티미딘 키나제, 시토신 데아미나제, 디프테리아 독소, 사이토크롬 P450, 데옥시시티딘 키나제, 종양 괴사 인자, 약물 내성 단백질, 종양 억제인자 단백질(예를 들어, p53, Rb, Wt-1, NF1, Von Hippel-Lindau (VHL), 선종성 결장폴립증(APC)), 면역조절 특성을 갖는 펩티드, 관용성 또는 면역원성 펩티드 또는 단백질 트레지톱(Tregitope) 또는 hCDR1, 인슐린, 글루코키나제, 구아닐레이트 사이클라제 2D(LCA-GUCY2D), Rab 에스코트 단백질 1(범맥락막위축), LCA 5(LCA-레버실린), 오르니틴 케톤산 아미노트랜스퍼라제(유전성 망막위축증(Gyrate Atrophy)), 레티노스키신 1(X-연결된 망막층간분리), USH1C(어셔 증후군 1C), X-연결된 색소성 망막염 GTPase(XLRP), MERTK(AR 형태의 RP: 색소성 망막염), DFNB1(코넥신 26 난청), ACHM 2, 3 및 4(완전색맹), PKD-1 또는 PKD-2(다낭성 신장 질환), TPP1, CLN2, 설파타제, N-아세틸글루코사민-1-포스페이트 트랜스퍼라제, 카텝신 A, GM2-AP, NPC1, VPC2, 스핑고지질 활성화제 단백질, 유전체 편집을 위한 하나 이상의 아연 핑거 뉴클레아제, 및 유전체 편집을 위한 복구 주형으로 사용되는 하나 이상의 공여자 서열을 인코딩하는 방법.
  80. 제1항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이종성 폴리뉴클레오티드가 억제성 핵산을 인코딩하는 방법.
  81. 제80항에 있어서, 상기 억제성 핵산이 siRNA, 안티센스 분자, miRNA, RNAi, 리보자임 및 shRNA로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
  82. 제80항에 있어서, 상기 억제성 핵산이 헌팅틴(HTT) 유전자, 치상핵적핵담창구시상하핵 위축증과 관련된 유전자(아트로핀 1, ATN1), 척수구근 근위축증에서 X 염색체 상의 안드로겐 수용체, 인간 어택신-1, -2, -3 및 -7, Cav2.1 P/Q 전압-의존성 칼슘 채널(CACNA1A), TATA-결합 단백질, 어택신 8 반대 가닥(ATXN8OS), 척수소뇌성 실조증에서 세린/트레오닌-단백질 포스파타제 2A 55 kDa 조절 서브유닛 B 베타 아이소형(타입 1, 2, 3, 6, 7, 8, 12 17), 취약 X 증후군에서 FMR1(취약 X 정신 지체 1), 취약 X-관련 떨림/운동실조 증후군에서 FMR1(취약 X 정신 지체 1), 취약 XE 정신 지체에서 FMR1(취약 X 정신 지체 2) 또는 AF4/FMR2 패밀리 구성원 2; 근긴장 디스트로피에서 마이오토닌-단백질 키나제(MT-PK); 프리드리히 운동실조에서 프라탁신; 근위축성 측삭 경화증에서 수퍼옥사이드 디스뮤타제 1(SOD1) 유전자의 돌연변이체; 파킨슨병 및/또는 알츠하이머병의 발병기전에 관여하는 유전자; 아포지단백질 B(APOB) 및 프로단백질 전환효소 서브틸리신/케신 타입 9(PCSK9), 고콜레스테롤혈증; HIV 감염에서 인간 면역결핍 바이러스 트랜스활성화제의 전사 유전자인 HIV Tat; HIV 감염에서 인간 면역결핍 바이러스 트랜스활성화제 반응 요소 유전자인 HIV TAR; HIV 감염에서 C-C 케모카인 수용체(CCR5); RSV 감염에서 Rous 육종 바이러스(RSV) 뉴클레오캡시드 단백질, C형 간염 바이러스 감염에서 간-특이적 마이크로RNA(miR-122); p53, 급성 신장 손상 또는 이식편 기능 지연 신장 이식 또는 신장 손상 급성 신부전; 진행 재발성 또는 전이성 고형 악성종양에서 단백질 키나제 N3(PKN3); LMP2, 프로테아좀 서브유닛 베타-타입 9(PSMB 9)로도 알려진 LMP2, 전이성 흑색종; 프로테아좀 서브유닛 베타-타입 8(PSMB 8)로도 알려진 LMP7, 전이성 흑색종; 프로테아좀 서브유닛 베타-타입 10(PSMB 10)으로도 알려진 MECL1, 전이성 흑색종; 고형 종양에서 혈관 내피 성장 인자(VEGF); 고형 종양에서 키네신 방추 단백질, 만성 골수성 백혈병에서 아폽토시스 억제인자 B-세포 CLL/림프종(BCL-2); 고형 종양에서 리보뉴클레오티드 환원효소 M2(RRM2); 고형 종양의 푸린; 간 종양에서 폴로-유사 키나제 1(PLK1), C형 간염 감염에서 디아실글리세롤 아실트랜스퍼라제 1(DGAT1), 가족성 선종성 폴립증에서 베타-카테닌; 베타2 아드레날린 수용체, 녹내장; 당뇨병 황반 부종(DME) 또는 연령-관련 황반 변성에서 DNA 손상-유도성 전사체 4 단백질로도 알려진 RTP801/Redd1; 연령-관련 황반 변성 또는 맥락막 혈관신생에서 혈관 내피 성장 인자 수용체 I(VEGFR1), 비-동맥 허혈성 시신경병증에서 카스파제 2; 선천성 손발톱비대증에서 케라틴 6A N17K 돌연변이체 단백질; 인플루엔자 감염에서 인플루엔자 A 바이러스 유전체/유전자 서열; 중증 급성 호흡기 증후군(SARS) 감염에서 SARS 코로나바이러스 유전체/유전자 서열; 호흡기 세포 융합 바이러스 감염에서 호흡기 세포 융합 바이러스 유전체/유전자 서열; 에볼라 감염에서 에볼라 필로바이러스 유전체/유전자 서열; B형 및 C형 간염 감염에서 B형 및 C형 간염 바이러스 유전체/유전자 서열; 단순 헤르페스 바이러스(HSV) 감염에서 HSV 유전체/유전자 서열, 콕사키바이러스 B3 감염에서 콕사키바이러스 B3 유전체/유전자 서열; 원발성 근긴장이상, 범-부류 I에서 토르신 A(TOR1A)와 같은 유전자의 병원성 대립유전자 및 이식에 특이적인 HLA-대립유전자의 침묵(대립유전자-특이적 침묵); 및 상염색체 우성 유전 색소성 망막염(adRP)에서 돌연변이체 로돕신 유전자(RHO)로 구성된 군으로부터 선택된 유전자, 유전자의 전사체, 또는 폴리뉴클레오티드 반복 질환과 관련된 유전자의 전사체에 결합하는 방법.
  83. 제1항 내지 제82항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이종성 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된 상기 폴리펩티드가 유전자 편집 뉴클레아제를 포함하는 방법.
  84. 제83항에 있어서, 상기 유전자 편집 뉴클레아제가 아연 핑거 뉴클레아제(ZFN) 또는 전사 활성화제-유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN)를 포함하는 방법.
  85. 제83항에 있어서, 상기 유전자 편집 뉴클레아제가 기능성 타입 II CRISPR-Cas9를 포함하는 방법.
  86. 제1항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (a) 및/또는 단계 (b)가 2회 이상 수행되는 방법.
  87. 제1항 내지 제86항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 인간인 방법.
  88. 패키지 안에 배치된
    (a) 폴리펩티드 또는 펩티드를 인코딩하는 이종성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 바이러스 벡터;
    (b) IgG와 FcRn의 상호작용을 감소시키는 제제;
    (c) 선택적으로, 항체를 분해하거나 소화하는 프로테아제 또는 글리코시다제; 및
    (d) 제1항 내지 제87항 중 어느 한 항에 따른 방법을 수행하기 위한 설명서가 있는 라벨을 갖는 패키지로서, 여기서 (a), (b) 및 (c)가 별도의 또는 동일한 용기에 있는, 패키지.
  89. 패키지 안에 배치된
    (a) 단백질의 발현을 억제, 감소 또는 저하시키는 핵산으로 전사되는 이종성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 바이러스 벡터;
    (b) IgG와 FcRn의 상호작용을 감소시키는 제제;
    (c) 선택적으로, 항체를 분해하거나 소화하는 프로테아제 또는 글리코시다제; 및
    (d) 제1항 내지 제87항 중 어느 한 항에 따른 방법을 수행하기 위한 설명서가 있는 라벨을 갖는 패키지로서, 여기서 (a), (b) 및 (c)가 별도의 또는 동일한 용기에 있는, 패키지.
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