CN115135343A - 用于增加或增强基因治疗载体的转导以及用于去除或减少免疫球蛋白的组合物和方法 - Google Patents

用于增加或增强基因治疗载体的转导以及用于去除或减少免疫球蛋白的组合物和方法 Download PDF

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Abstract

本文公开了通过施用阻断、抑制或减少免疫球蛋白G(IgG)和新生儿Fc受体(FcRn)之间的相互作用的药剂来治疗可能发展或已经具有预先存在的基因治疗中和抗体(例如抗FcRn抗体)的患者以减少IgG再循环并增强体内IgG清除率的方法。还公开了使用减少IgG与FcRn相互作用的药剂用于基因疗法治疗有需要的患者的疾病的方法。

Description

用于增加或增强基因治疗载体的转导以及用于去除或减少免 疫球蛋白的组合物和方法
相关申请
本申请要求于2020年1月22日申请的美国临时专利申请No.62/964,565的优先权。上述引用的申请其全部公开内容(包括所有文本、表格、序列表和附图)都通过引用合并于此。
背景技术
可以通过适应性免疫系统靶向腺相关病毒(AAV)和其他病毒载体以及基于脂质、聚合物和蛋白质的纳米颗粒基因治疗方法，从而导致疗效减弱和患者可能对治疗干预完全无效。适应性免疫系统依赖于抗原特异性免疫球蛋白(例如，IgG)抗体的发展，从而导致靶分子的抑制或清除。
新生儿Fc受体(FcRn)在G型免疫球蛋白(IgG)从溶酶体途径离开、回到质膜和细胞外的再循环中发挥核心作用，从而延长IgG血清半衰期(参见，Sockolosky et al.2015,Adv.Drug Deliv.Rev.,91:109-124)。减少IgG与FcRn相互作用的药剂会减少IgG再循环，增强IgG降解/分解代谢，并缩短IgG血清半衰期。在一项人体临床试验中，每周多次给药抗FcRn抗体导致血清IgG平均降低约85％，血清IgG持续降低≥75％长达24天(Ling et al.,2019,Clin.Pharmacol.Ther.,105:1031-1039)。
IdeS是一种天然存在的半胱氨酸蛋白酶，特别是一种内肽酶，由致病菌酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)表达，除了其他几个物种外，它还表现出对人类IgG中发现的靶序列的特异性。IdeS能够在铰链区下方裂解IgG，从而产生F(ab')2和Fc/2片段。IdeS能够裂解人血浆中的IgG，并且可以在给药后4小时至7天之间降低人体内的总IgG水平。
EndoS是一种天然存在的糖苷酶，特别是一种来自化脓性链球菌(S.pyogenes)的糖苷内切酶，其可特异性水解人IgG中的聚糖并改变抗体效应物功能，包括Fc受体结合。
AAV衣壳的中和抗体是基因治疗载体的主要障碍，使某些患者无法获得可能挽救生命的疗法。本文特别描述了通过以下方式治疗可能产生或已经存在针对基因治疗载体的中和抗体的患者的方法：施用减少IgG与FcRn相互作用的药剂，从而减少IgG再循环、增强IgG清除、降解和分解代谢，并降低体内循环IgG或IgG半衰期。本文还特别描述了通过以下方式治疗可能产生或已经具有与异源多核苷酸或由基因治疗载体包裹的异源多核苷酸编码的蛋白质或肽结合的抗体的患者的方法：施用减少IgG与FcRn相互作用的药剂，从而减少IgG再循环、增强IgG清除、降解和分解代谢，并降低体内循环IgG或IgG半衰期。
发明内容
本文公开了使用降低免疫球蛋白G(IgG)与新生儿Fc受体(FcRn)的相互作用和FcRn介导的IgG再循环的试剂以降低抗体(例如，受试者(例如，人类患者)中的IgG)的循环水平或滴度以改善或增强受试者的基因治疗的方法。根据本发明的方法尤其可以用于用预先存在的针对基因治疗载体的中和抗体来治疗患者，以及对之前用基因治疗载体治疗的患者再给药。
在某些实施方案中，一种提高受试者基因疗法治疗的功效的方法包括：(a)向受试者施用减少免疫球蛋白G(IgG)与新生儿Fc受体(FcRn)相互作用的药剂；以及(b)向所述受试者施用包含治疗性异源多核苷酸的重组病毒载体。
在某些实施方案中，所述受试者需要治疗由蛋白质功能或活性丧失引起的疾病，并且所述治疗性异源多核苷酸编码提供或补充所述蛋白质功能或活性的多肽或肽，或者所述受试者需要治疗由蛋白质的功能、活性或表达的获得引起的疾病，并且所述异源多核苷酸被转录成抑制、降低或减少所述蛋白质的所述功能、活性或表达的获得的表达的核酸。
在某些实施方案中，所述受试者中FcRn介导的IgG再循环减少。
在某些实施方案中，IgG清除在所述受试者中增强。
在某些实施方案中，所述减少IgG与FcRn相互作用的药剂选自抗FcRn抗体、FcRn结合亲和体、增强IgG降解的抗体(ABDEG)、FcRn结合肽(FcBP)和结合小分子FcRn拮抗剂。
在某些实施方案中，在治疗受试者的方法中，步骤(a)在执行步骤(b)之前执行。
在某些实施方案中，在治疗受试者的方法中，步骤(b)在执行步骤(a)之前执行。
在某些实施方案中，在治疗受试者的方法中，步骤(a)和步骤(b)大约同时进行。
在某些实施方案中，在治疗受试者的方法中，步骤(a)在执行步骤(b)之前或之后进行两次或更多次。
在某些实施方案中，在治疗受试者的方法中，步骤(b)在执行步骤(a)之前或之后约90天内进行。在某些实施方案中，步骤(b)在执行步骤(a)之前或之后约60天内进行。在某些实施方案中，步骤(b)在执行步骤(a)之前或之后约45天内进行。在某些实施方案中，步骤(b)在执行步骤(a)之前或之后约30天内进行。在某些实施方案中，步骤(b)在执行步骤(a)之前或之后约21天内进行。在某些实施方案中，步骤(b)在执行步骤(a)之前或之后约14天内进行。在某些实施方案中，步骤(b)在执行步骤(a)之前或之后约7天内进行。在某些实施方案中，步骤(b)在执行步骤(a)之前或之后约72小时内进行。在某些实施方案中，步骤(b)在执行步骤(a)之前或之后约48小时内进行。在某些实施方案中，步骤(b)在执行步骤(a)之前或之后约24小时内进行。在某些实施方案中，步骤(b)在执行步骤(a)之前或之后约12小时内进行。在某些实施方案中，步骤(b)在执行步骤(a)之前或之后约6小时内进行。
在某些实施方案中，一种方法还包括向所述受试者施用有效量的蛋白酶或糖苷酶以降解或消化和/或抑制或降低与所述重组病毒载体和/或由所述异源多核苷酸编码的所述多肽或肽和/或所述异源多核苷酸结合的抗体的效应物功能。
在某些实施方案中，所述蛋白酶或糖苷酶在步骤(a)之前、之后或大约同时施用。在某些实施方案中，所述蛋白酶或糖苷酶在步骤(b)之前、之后或大约同时施用。在某些实施方案中，所述蛋白酶或糖苷酶在步骤(a)之前、之后或大约同时施用两次或更多次。在某些实施方案中，所述蛋白酶或糖苷酶在步骤(b)之前、之后或大约同时施用两次或更多次。在某些实施方案中，所述蛋白酶或糖苷酶在步骤(a)或步骤(b)之前或之后约90天内施用。在某些实施方案中，所述蛋白酶或糖苷酶在步骤(a)或步骤(b)之前或之后约60天内施用。在某些实施方案中，所述蛋白酶或糖苷酶在步骤(a)或步骤(b)之前或之后约45天内施用。在某些实施方案中，所述蛋白酶或糖苷酶在步骤(a)或步骤(b)之前或之后约30天内施用。在某些实施方案中，所述蛋白酶或糖苷酶在步骤(a)或步骤(b)之前或之后约21天内施用。在某些实施方案中，所述蛋白酶或糖苷酶在步骤(a)或步骤(b)之前或之后约14天内施用。在某些实施方案中，所述蛋白酶或糖苷酶在步骤(a)或步骤(b)之前或之后约7天内施用。在某些实施方案中，所述蛋白酶或糖苷酶在步骤(a)或步骤(b)之前或之后约72小时内施用。在某些实施方案中，所述蛋白酶或糖苷酶在步骤(a)或步骤(b)之前或之后约48小时内施用。在某些实施方案中，所述蛋白酶或糖苷酶在步骤(a)或步骤(b)之前或之后约24小时内施用。在某些实施方案中，所述蛋白酶或糖苷酶在步骤(a)或步骤(b)之前或之后约12小时内施用。在某些实施方案中，所述蛋白酶或糖苷酶在步骤(a)或步骤(b)之前或之后约6小时内施用。
在某些实施方案中，所述蛋白酶包括半胱氨酸蛋白酶或硫醇蛋白酶。
在某些实施方案中，所述蛋白酶包括来自化脓性链球菌(Streptococcuspyogenes)、马链球菌(Streptococcus equi)或犬支原体(Mycoplasma canis)的蛋白酶。
在某些实施方案中，所述蛋白酶包含SEQ ID NO:3-18、23或48中任一项所示的IdeS或其修饰变体。
在某些实施方案中，所述糖苷酶包括糖苷内切酶。
在某些实施方案中，所述糖苷内切酶包含SEQ ID NO:44-47中任一个所示的序列。
在某些实施方案中，所述蛋白酶或糖苷酶降解或消化和/或抑制或降低人抗体的效应物功能。
在某些实施方案中，所述病毒载体包括慢病毒载体、腺病毒载体或腺相关病毒(AAV)载体。
在某些实施方案中，所述慢病毒载体包含与所述抗体或IgG结合的包膜蛋白。
在某些实施方案中，所述AAV载体包含与所述抗体或IgG结合的衣壳蛋白。
在某些实施方案中，所述AAV载体包含与所述抗体或IgG结合的VP1、VP2和/或VP3衣壳蛋白。
在某些实施方案中，所述AAV载体包含与选自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV3B、AAV-2i8、Rh10、Rh74、SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2VP1、VP2和/或VP3衣壳蛋白的VP1、VP2和/或VP3衣壳蛋白具有60％或更多序列同一性的VP1、VP2和/或VP3衣壳蛋白。
在某些实施方案中，所述AAV载体包含与选自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV3B、AAV-2i8、Rh10、Rh74、SEQ ID NO:1and SEQ ID NO:2VP1、VP2和/或VP3衣壳蛋白的VP1、VP2和/或VP3衣壳蛋白具有100％序列同一性的VP1、VP2和/或VP3衣壳蛋白。
在某些实施方案中，所述受试者具有与所述病毒载体结合的抗体或IgG。
在某些实施方案中，所述受试者不存在与所述病毒载体结合的抗体或IgG。
在某些实施方案中，所述受试者具有与由所述异源多核苷酸编码的所述多肽或肽结合的抗体或IgG。
在某些实施方案中，所述抗体包括IgG、IgM、IgA、IgD和/或IgE。
在某些实施方案中，一种方法包括在进行步骤(a)之前、在进行步骤(a)之后但在执行步骤(b)之前和/或在执行步骤(a)和(b)之后确定所述受试者中病毒载体结合抗体或IgG的存在、量化其量或效应物功能。
在某些实施方案中，一种方法包括在进行步骤(a)之前、在进行步骤(a)之后但在执行步骤(b)之前和/或在执行步骤(a)和(b)之后，分析来自所述受试者的生物样品中病毒载体结合抗体或IgG的存在、存在于所述样品中的病毒载体结合抗体或IgG的量或效应物功能。
在某些实施方案中，所述确定和/或分析步骤在施用减少IgG与FcRn相互作用的药剂或所述蛋白酶或糖苷酶之前和/或之后进行。
在某些实施方案中，来自所述受试者的所述生物样品是血液产品。
在某些实施方案中，所述方法导致所述病毒载体结合抗体或IgG减少20-50％、50-75％、75-90％、90-95％或95％或更多。
在某些实施方案中，来自所述受试者的所述生物样品或血液产品中存在的所述病毒载体结合抗体或IgG小于约1:100,000，其中1份所述生物样品或血液产品稀释于100,000份缓冲液导致50％的病毒载体中和。
在某些实施方案中，来自所述受试者的所述生物样品或血液产品中存在的所述病毒载体结合抗体或IgG小于约1:50,000，其中1份所述生物样品或血液产品稀释于50,000份缓冲液导致50％的病毒载体中和。
在某些实施方案中，来自所述受试者的所述生物样品或血液产品中存在的所述病毒载体结合抗体或IgG小于约1:10,000，其中1份所述生物样品或血液产品稀释于10,000份缓冲液导致50％的病毒载体中和。
在某些实施方案中，来自所述受试者的所述生物样品或血液产品中存在的所述病毒载体结合抗体或IgG小于约1:1,000，其中1份所述生物样品或血液产品稀释于1,000份缓冲液导致50％的病毒载体中和。
在某些实施方案中，来自所述受试者的所述生物样品或血液产品中存在的所述病毒载体结合抗体或IgG小于约1:100，其中1份所述生物样品或血液产品稀释于100份缓冲液导致50％的病毒载体中和。
在某些实施方案中，来自所述受试者的所述生物样品或血液产品中存在的所述病毒载体结合抗体或IgG小于约1:10，其中1份所述生物样品或血液产品稀释于10份缓冲液导致50％的病毒载体中和。
在某些实施方案中，所述生物样品或血液产品中存在的所述病毒载体结合抗体或IgG小于约1:5，其中1份所述生物样品或血液产品稀释于5份缓冲液导致50％的病毒载体中和。
在某些实施方案中，所述生物样品或血液产品中存在的病毒载体结合抗体或IgG的比率小于约1:4，其中1份所述生物样品或血液产品稀释于4份缓冲液导致50％的病毒载体中和。
在某些实施方案中，所述生物样品或血液产品中存在的病毒载体结合抗体或IgG的比率小于约1:3，其中1份所述生物样品或血液产品稀释于3份缓冲液导致50％的病毒载体中和。
在某些实施方案中，所述生物样品或血液产品中存在的病毒载体结合抗体或IgG的比率小于约1:2，其中1份所述生物样品或血液产品稀释于2份缓冲液导致50％的病毒载体中和。
在某些实施方案中，所述生物样品或血液产品中存在的病毒载体结合抗体或IgG的比率小于约1:1，其中1份所述生物样品或血液产品稀释于1份缓冲液导致50％的病毒载体中和。。
在某些实施方案中，所述方法，其还包括在进行步骤(a)之后但在进行步骤(b)之前和/或在执行步骤(a)和(b)之后，确定与由所述异源多核苷酸编码的多肽或肽结合的抗体或IgG的存在或量化其量。
在某些实施方案中，所述方法还包括在进行步骤(a)之后但在进行步骤(b)之前和/或在执行步骤(a)和(b)之后确定与所述异源多核苷酸或核酸结合的抗体或IgG的存在或量化其量。
根据本发明的方法还可以包括将有效降解或消化和/或抑制或降低抗体的效应物功能的蛋白酶或糖苷酶与降低IgG与FcRn相互作用的试剂的组合的使用。
在某些实施方案中，受试者患有肺病(例如，囊性纤维化)、出血性疾病(例如，具有或不具有抑制剂的血友病A或血友病B)、地中海贫血、血液疾病(例如，贫血)、阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病、肌萎缩侧索硬化(ALS)、癫痫、溶酶体贮积病、(例如，天冬氨酰氨基葡萄糖尿、贝敦氏病、晚期婴儿神经元蜡样脂褐质沉积症2型(CLN2)、胱氨酸病、法布里病、戈谢病I、II和III型、糖原贮积病II(庞贝病)、GM2-神经节苷脂沉积症I型(泰-萨克斯病)、GM2-神经节苷脂沉积症II型(桑德霍夫病)、粘脂贮积病I型(唾液酸贮积病I型和II型)、II型(I细胞病)、III型(假贺勒氏病)和IV型、粘多糖贮积病(贺勒氏病及其变体、亨特氏病、山菲利普氏症A、B、C、D型、莫奎欧氏症A和B型、马罗托-拉米和史莱氏病)、尼曼-皮克病A/B型、C1和C2型、辛德勒病I型和II型)、遗传性血管性水肿(HAE)、铜或铁积累障碍(例如威尔逊病或门克斯病)、溶酶体酸性脂肪酶缺乏症、神经或神经退行性疾病、癌症、1型或2型糖尿病、腺苷脱氨酶缺乏症、代谢缺陷(例如糖原贮积病)、实体器官(例如脑、肝、肾、心脏)疾病或传染性病毒(例如乙型和丙型肝炎、艾滋病毒等)、细菌或真菌病。在某些实施方案中，所述受试者患有凝血障碍。在某些实施方案中，所述受试者患有血友病A、具有抑制性抗体的血友病A、血友病B、具有抑制性抗体的血友病B、任何凝血因子VII、VIII、IX、X、XI、V、XII、II缺乏症、血管性血友病因子或FV/FVIII联合缺乏症、地中海贫血、维生素K环氧化物还原酶C1缺乏症或γ-羧化酶缺乏症。
在某些实施方案中，所述受试者患有贫血、与创伤、损伤、血栓形成、血小板减少症、中风、凝血病、弥散性血管内凝血(DIC)相关的出血；与肝素、低分子量肝素、五糖、华法林、小分子抗血栓药(即FXa抑制剂)或血小板疾病，例如伯-苏氏综合征、血小板无力症或贮存池缺陷症相关的过度抗凝。
在某些实施方案中，受试者患有影响或发源于中枢神经系统(CNS)的疾病。在某些实施方案中，所述疾病是神经退化性疾病。在某些实施方案中，CNS或神经退行性疾病是阿尔兹海默氏症、亨廷顿氏病、ALS、遗传性痉挛性半身麻痹、原发性侧索硬化、脊髓性肌萎缩、肯尼迪氏病(Kennedy's disease)、多谷氨酰胺重复疾病或帕金森氏病。在某些实施方案中，CNS或神经退化性疾病为多谷氨酰胺重复疾病。在某些实施方案中，多聚谷氨酰胺重复疾病是脊髓小脑失调(SCA1、SCA2、SCA3、SCA6、SCA7或SCA17)。
在某些实施方案中，所述异源多核苷酸编码蛋白质，所述蛋白质选自：胰岛素、胰高血糖素、生长激素(GH)、甲状旁腺激素(PTH)、生长激素释放因子(GRF)、促卵泡激素(FSH)、促黄体素(LH)、人绒毛膜促性腺激素(hCG)、血管内皮生长因子(VEGF)、血管生成素、血管生长抑制素、粒细胞集落刺激因子(GCSF)、促红细胞生成素(EPO)、结缔组织生长因子(CTGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)、表皮生长因子(EGF)、转化生长因子α(TGFα)、血小板衍生的生长因子(PDGF)、胰岛素生长因子I和II(IGF-I和IGF-II)、TGFβ、激活素、抑制素、骨形态形成蛋白(BMP)、神经生长因子(NGF)、脑源性神经营养因子(BDNF)、神经营养因子NT-3和NT4/5、睫状神经营养因子(CNTF)、胶细胞系衍生的神经营养因子(GDNF)、神经生长因子、集聚蛋白、轴突生长诱向因子-1和轴突生长诱向因子-2、肝细胞生长因子(HGF)、肝配蛋白、头蛋白、音猬因子和酪氨酸羟化酶。
在某些实施方案中，所述异源多核苷酸编码蛋白，该蛋白选自血小板生成素(TPO)、白细胞介素(IL1至IL-36)、单核细胞趋化蛋白、白血病抑制因子、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、Fas配体、肿瘤坏死因子α和β、干扰素α、β和γ、干细胞因子、flk-2/flt3配体、IgG、IgM、IgA、IgD和IgE、嵌合免疫球蛋白、人源化抗体、单一链抗体、T细胞受体、嵌合T细胞受体、单链T细胞受体、I类和II类MHC分子。
在某些实施方案中，所述异源多核苷酸编码CFTR(囊肿性纤维化跨膜调节因子蛋白)、血液凝结(凝固)因子、(因子XIII、因子IX、因子VIII、因子X、因子VII、因子VIIa、蛋白C等)、功能获得型血液凝结因子、抗体、视网膜色素上皮特异性65kDa蛋白(RPE65)、促红细胞生成素、LDL受体、脂蛋白脂肪酶、鸟氨酸转氨甲酰酶、β-球蛋白、α-球蛋白、血影蛋白、α-抗胰蛋白酶、腺苷脱氨酶(ADA)、金属转运蛋白(ATP7A或ATP7)、磺酰胺酶、涉及溶酶体贮积病的酶(ARSA)、次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶、β-25葡萄糖脑苷酶、鞘磷脂酶、溶酶体己糖醛酸酶脱氢酶、分支链酮酸去氢酶、激素、生长因子、类胰岛素生长因子1或2、血小板衍生的生长因子、表皮生长因子、神经生长因子、神经营养因子-3及-4、脑源性神经营养因子、神经胶质衍生的生长因子、转变生长因子α和β、细胞介素、α-干扰素、β-干扰素、干扰素-γ、白介素-2、白介素-4、白介素12、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、淋巴毒素、自杀基因产物、单纯疱疹病毒胸苷激酶、胞嘧啶脱氨酶、白喉毒素、细胞色素P450、脱氧胞苷激酶、肿瘤坏死因子、药物抗性蛋白、肿瘤抑制剂蛋白(例如，p53、Rb、Wt-1、NF1、希佩尔-林道综合征(VHL)、结肠腺瘤息肉病(APC))、具有免疫调节属性的肽、耐受性或免疫原性肽或蛋白Tregitope或hCDRl、胰岛素、葡糖激酶、鸟苷酸环化酶2D(LCA-GUCY2D)、Rab护航蛋白1(无脉络膜)、LCA5(LCA-lebercilin)、鸟氨酸酮酸氨基转移酶(回旋形萎缩)、视网膜劈裂素1(X连锁视网膜劈裂症)、USH1C(阿瑟氏综合征1C)、X连锁色素性视网膜炎GTP酶(XLRP)、MERTK(AR形式的RP：色素性视网膜炎)、DFNB1(连接蛋白26耳聋)、ACHM 2、3和4(色盲)、PKD-1或PKD-2(多囊性肾病)、TPP1、CLN2、硫酸酯酶、N-乙酰氨基葡萄糖-1-磷酸酯转移酶、组织蛋白酶A、GM2-AP、NPC1、VPC2、鞘脂激活蛋白、用于基因组编辑的一或多个锌指核酸酶以及用作基因组编辑的修复模板的一或多个供体序列。
在某些实施方案中，所述异源多核苷酸编码抑制性核酸。在某些实施方案中，所述抑制性核酸选自siRNA、反义分子、miRNA、RNAi、核酶和shRNA。82.根据权利要求80所述的方法，其中所述抑制性核酸与基因、基因的转录物或与选自由以下项组成的群组的多核苷酸重复疾病相关联的基因的转录物结合：亨廷顿蛋白(HTT)基因、与齿状核红核苍白球路易体萎缩症(atrophin1，ATN1)相关联的基因、脊髓延髓肌肉萎缩的X染色体上的雄激素受体、人类Ataxin-1、-2、-3及-7、Cav2.1P/Q压敏钙通道(CACNA1A)、TATA-结合蛋白、Ataxin 8相对链(ATXN8OS)、脊髓小脑失调(1、2、3、6、7、8、12、17型)中的丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶2A55kDa调节亚单位Bβ同工型、X脆性综合征中的FMR1(X脆性智力迟钝1)、X脆性相关联的震颤/失调综合征中的FMR1(X脆性智力迟钝1)、XE脆性智力迟钝中的FMR1(X脆性智力迟钝2)或AF4/FMR2家族成员2；肌强直性营养不良中的肌强直蛋白激酶(MT-PK)；弗里德希氏共济失调中的共济蛋白；肌肉萎缩性侧索硬化中的超氧化歧化酶1(SOD1)基因的突变体；涉及帕金森氏病和/或阿尔兹海默氏症的发病机制的基因；载脂蛋白B(APOB)以及9型前蛋白转换酶枯草杆菌蛋白酶/kexin(PCSK9)，高胆固醇血症；HIV Tat，HIV感染中的转录基因的人类免疫缺乏病毒转活化剂；HIV TAR，HIV TAR是HIV感染中的人类免疫缺乏病毒转活化剂反应元件基因；HIV感染中的C-C趋化因子受体(CCR5)；RSV感染中的劳斯肉瘤病毒(RSV)核衣壳蛋白、丙型肝炎病毒感染中的肝脏特异性微RNA(miR-122)；p53、急性肾损伤或肾脏移植中的移植功能延迟或肾损伤急性肾衰竭；晚期复发或转移性实体恶性肿瘤中的蛋白激酶N3(PKN3)；LMP2，LMP2也称为9型蛋白酶体亚单位β(PSMB9)、转移性黑素瘤；LMP7，也称为8型蛋白酶体亚单位β(PSMB 8)、转移性黑素瘤；MECL1，也称为10型蛋白酶体亚单位β(PSMB 10)、转移性黑素瘤；实体肿瘤中的血管内皮生长因子(VEGF)；实体肿瘤中的驱动蛋白轴蛋白、慢性骨髓白血病中的细胞凋亡抑制剂B细胞CLL/淋巴瘤(BCL-2)；实体肿瘤中的核糖核苷酸还原酶M2(RRM2)；实体肿瘤中的弗林蛋白酶；肝脏肿瘤中的保罗类激酶1(PLK1)、丙型肝炎感染中的二酰基甘油酰基转移酶1(DGAT1)、家族性腺瘤性息肉病中的β-连环蛋白；β2肾上腺素激导性受体、青光眼；糖尿病黄斑水肿(DME)或年龄相关黄斑变性中的RTP801/Redd1，也称为DNA破坏诱发性转录物4蛋白；年龄相关黄斑变性或脉络膜新生血管中的血管内皮生长因子受体I(VEGFR1)、非动脉炎缺血视神经病变中的凋亡蛋白酶2；先天性甲肥厚中的角蛋白6A N17K突变蛋白；流感感染中的A型流感病毒基因组/基因序列：重度急性呼吸道综合征(SARS)感染中的SARS冠状病毒基因组/基因序列；呼吸道融合性病毒感染中的呼吸道融合性病毒基因组/基因序列；埃博拉(Ebola)感染中的埃博拉纤丝病毒基因组/基因序列；乙型和丙型肝炎感染中的乙型和丙型肝炎病毒基因组/基因序列；HSV感染中的单纯疱疹病毒(HSV)基因组/基因序列、柯萨奇病毒B3感染中的柯萨奇病毒B3基因组/基因序列；原发性肌张力障碍中的基因(等位基因特异性沉默)类耐扭蛋白A(TOR1A)的病原性等位基因的沉默、在移植中具有特异性的泛I类和HLA-等位基因；以及常染色体显性遗传性色素性视网膜炎(adRP)中的突变视紫红质基因(RHO)。
在某些实施方案中，由所述异源多核苷酸编码的所述多肽包括基因编辑核酸酶。在某些实施方案中，所述基因编辑核酸酶包括锌指核酸酶(ZFN)或转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)。在某些实施方案中，所述基因编辑核酸酶包含功能性II型CRISPR-Cas9。
在某些实施方案中，本发明的方法的步骤(a)和/或步骤(b)被执行两次或更多次。
在某些实施方案中，所述受试者是哺乳动物。在某些实施方案中，所述受试者是人。
本文还公开了组合物，例如但不限于包装和试剂盒，其具有可用于实施根据本发明的方法的组分。
在某些实施方案中，一种包装或试剂盒在其中装有：(a)包含编码蛋白质或肽的异源多核苷酸的重组病毒载体；(b)减少IgG与FcRn相互作用的药剂；(c)任选地，降解或消化抗体的蛋白酶或糖苷酶；以及(d)具有用于执行本文中所公开的方法的说明的标签。在某些实施方案中，(a)、(b)和(c)在分开的或相同的容器中。
在某些实施方案中，一种包装或试剂盒在其中装有：(a)包含异源多核苷酸的重组病毒载体，该异源多核苷酸被转录成抑制、降低或减少蛋白质表达的核酸；(b)减少IgG与FcRn相互作用的药剂；(c)任选地，降解或消化抗体的蛋白酶或糖苷酶；以及(d)具有用于执行本文中所公开的方法的说明的标签。在某些实施方案中，(a)、(b)和(c)在分开的或相同的容器中。
附图说明
图1A、1B和1C显示了与越来越多的IdeS一起孵育的人类患者血清(图1A)、非人类灵长类动物(恒河猴)血浆(图1B)和仓鼠血浆(图1C)样品中IdeS裂解IgG的SDS-PAGE分析。样品在没有IdeS或有浓度增加的IdeS的情况下在37℃下孵育1小时。通过添加样品缓冲液停止反应。通过非还原性SDS-PAGE和考马斯染色分析样品。
图2是显示了在用不同量的IVIg免疫的动物中输注AAV-Spk1-GAA载体后小鼠血浆中的GAA活性水平的图，其用或不用IdeZ预处理。在IVIg免疫后一天注入AAV-Spk1-GAA载体。在载体施用后2周，通过GAA活性测定评估转基因活性。为每组中的每只小鼠绘制了以nmol/hr/mL为单位的GAA活性。在没有IVIg的情况下，对照小鼠仅施用载体。
图3显示了IdeS输注前后小鼠血浆中的抗Spk1中和抗体(NAb)滴度水平。本研究中的相对NAb滴度水平被指定为低滴度(<1:1，1:1-1:2.5)(粗体)、中等(1:2.5-1:5)(粗斜体)和高滴度(>1:5-1:10)(斜体)。
图4显示了IdeS输注前后小鼠血浆中的抗Spk1 IgG NAb水平(ng/mL)。阴性对照动物未用IVIg或IdeS治疗。IdeS Low是指研究中使用的0.4mg/kg IdeS，IdeS High是指4mg/kg IdeS。
图5显示了在用IVIg免疫然后用IdeS处理的动物中输注AAV-Spk1-GAA载体后小鼠血浆中的GAA活性水平(nmol/hr/mL)。所有动物均接受2×1012vg/kg AAV-Spk1-GAA载体。在来自用IVIg免疫、然后用或不用IdeS处理、最后施用载体的小鼠的血浆样品中测量转基因活性。在载体施用后1周，通过GAA活性测定评估转基因活性。为每组中的每只小鼠绘制了以nmol/hr/mL为单位的GAA活性。
图6显示了在先前输注IVIg(0、300、800或1600mg/kg)并用IdeS(0、0.4、1.0或2.0mg/kg)处理的动物中的GAA活性水平(nmol/hr/Ml)。为每组中的每只小鼠绘制GAA活性。IVIg施用组中未产生相应抗Spk1 NAb滴度(即，NAb滴度<1:1或1:1-1:2.5前IdeS处理)的小鼠被排除在外。
图7显示了C57BL/6小鼠血浆中的抗Spk1NAb滴度水平，其具有人工滴度的人抗衣壳中和IgG，在输注不同的IdeS制剂前和后测量(批次#1和批次#2)。
图8是显示来自给药前和给药AAV-Spk1-hFVIII后1周和2周时的C57BL/6小鼠的血浆中人因子VIII水平的图表，该小鼠具有人工滴度的人抗衣壳中和IgG。
图9是显示在IdeS输注前和后小鼠血浆中抗Spk1衣壳IgG水平(ng/mL)的图表。给予C57BL/6小鼠IVIg以诱导人工滴度的人抗衣壳中和IgG。阴性对照动物未用IVIg或IdeS处理。Low IVIg是指研究中使用的300mg/kg IVIg，Mid IVIg是指800mg/kg，High IVIg是指1600mg/kg。在每个IVIg组中，动物接受剂量增加的IdeS(0、0.4、1.0、2.0mg/kg IdeS)处理。用IVIg处理但没有表现出抗衣壳IgG反应的动物被排除在图表之外。
图10是实施例13所述研究的五组Tg32小鼠中的每一组在第0天(D0)和第2天(D2)在小鼠血浆中评估的NAb滴度图。上虚线和下虚线表示分别为检测上限(ULOD)和检测下限(LLOD)。统计显著性通过Wilcoxin配对非参数t检验定义为p<0.0234＝*，p<0.0039＝**，而通过Mann-Whitney非配对非参数t检验，p<0.5。
图11是实施例13中描述的研究的五组Tg32小鼠中的每一组在第0天(D0)和第2天(D2)的小鼠血浆中通过ELISA测定的抗-Spk1 IgG浓度图。抗Spk1 IgG ELISA。统计显著性通过Wilcoxin配对非参数t检验定义为p<0.0313＝**，而通过Mann-Whitney非配对非参数t检验定义为p<0.0152＝*，p<0.0022＝**。
图12显示了组合施用抗-FcRn药剂和IdeS以消除受试者中的高滴度中和抗体(NAb)以实现AAV转导的构思的图示。
图13示意性地显示了在新西兰白兔中进行的再给药研究。
图14示意性地显示了在食蟹猴中的抗FcRn研究。
具体实施方式
本文提供了改善基因治疗的益处或有效性的方法，其包括施用抑制或减少IgG与新生儿Fc受体(FcRn)相互作用的药剂。本文还提供了减少与病毒载体(例如重组病毒载体)结合或与通过由重组病毒载体包裹的治疗性异源多核苷酸编码的核酸或多肽、蛋白质或肽结合，或与治疗性异源多核苷酸结合的循环抗体的方法。本文还提供了向具有结合和/或中和基因治疗载体的抗体的受试者施用基因治疗载体的方法。本文还提供了将基因治疗载体再给药或重新施用给先前施用了基因治疗载体的受试者的方法，并且其中受试者已经产生了结合和/或中和基因治疗载体的抗体。
在某些实施方案中，一种方法包括向受试者施用有效量的药剂以减少IgG与FcRn的相互作用。FcRn负责通过称为IgG再循环的过程延长IgG型免疫球蛋白的血清半衰期。FcRn位于许多细胞类型的内体区室中。当内吞IgG通过内体途径移动时，IgG的Fc部分与酸性早期内体中的FcRn结合以形成FcRn-IgG复合物。FcRn-IgG复合物被运输离开溶酶体途径(其通常会降解或分解IgG)并返回质膜和细胞表面。升高的细胞外pH值导致复合物解离并将IgG从细胞中释放出来并返回到循环中，从而延长IgG的血清半衰期。减少或抑制IgG与FcRn的相互作用将减少IgG再循环，增加或增强IgG清除、降解和分解代谢，并导致循环中IgG的量减少(滴度降低)(可在血液、血清或血浆中测量)。较低滴度的循环IgG意味着较低滴度的结合和/或中和基因治疗载体的循环抗体。施用可抑制或减少IgG和FcRn之间相互作用的药剂将减少IgG再循环，增加或增强IgG清除、降解和分解代谢，并导致循环中IgG的量减少(滴度降低)，并改善或增强基因治疗的疗效。
如本文所使用的，“减少所述IgG与FcRn的相互作用”和“减少IgG与FcRn的相互作用”包括任何减少或抑制IgG与FcRn的相互作用或IgG-FcRn结合。在以下文献中综述了减少IgG与FcRn相互作用并可用于本发明的试剂：Low et al.,2009,AAPS J.,11:432-434,Sockolosky et al.,2015,Adv.Drug Deliv.Rev.,91:109-124,Zuercher et al.,2019,Autoimm.Rev.,doi.org/10.1016/j.autrev.2019.102366,and Pyzik et al.,2019,Frontiers Immunol.,doi:103389/fimmu.2019.01540。可以通过检测或测量一种或多种信号活性或FcRn活性的下游读数，包括血清或血浆IgG水平来评估IgG与FcRn相互作用的减少、降低或抑制。减少IgG与FcRn的相互作用的药剂在本文中也称为“抗FcRn试剂”或“FcRn拮抗剂”。
可用于本发明的降低IgG和FcRn相互作用的药剂的实施例包括，例如但不限于，结合FcRn的抗体、ABDEGs(增强IgG降解的抗体)、FcRn结合肽(包括具有GHFGGXY共有基序的那些，其中X是疏水氨基酸并且该基序被二硫键环包围)、FcRn结合亲和体以及小分子FcRn拮抗剂。
可用于本发明的抗FcRn抗体的一个实施例是M281(nipocalimab)，一种完全人源的抗FcRn抗体，其抑制FcRn介导的再循环并减少致病性IgG，同时保留IgG的产生(参见Linget al.2019)。可用于本发明的其他抗FcRn抗体包括，例如但不限于，在国际专利申请出版物WO2018023136,WO2019118791和WO2020018910中描述的抗体，它们各自通过引用整体并入本文，包括所有文本、表格、序列表和附图。
在某些实施方案中，抗-FcRn抗体包含轻链和重链，并且轻链包含与SEQ ID NO:49的序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性的序列；并且该重链包含与SEQ ID NO:50的序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性的序列。
在某些实施方案中，抗-FcRn抗体包含轻链和/或重链，并且轻链包含与SEQ IDNO:49的序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性的序列；并且该重链包含与SEQ IDNO:50的序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性的序列。
在某些实施方案中，抗-FcRn抗体包含轻链和/或重链，并且所述轻链包含至少一个选自SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52和SEQ ID NO:53的互补决定区(CDR)序列；而所述重链包含至少一个选自SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55和SEQ ID NO:56的CDR序列。
在某些实施方案中，抗FcRn抗体包含轻链和/或重链，并且轻链包含SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52和SEQ ID NO:53的互补决定区(CDR)序列；并且重链包含SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55和SEQ ID NO:56的CDR序列。
在某些实施方案中，抗FcRn抗体包含轻链，该轻链包含与SEQ ID NO:49的序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性的序列。
在某些实施方案中，抗-FcRn抗体包含轻链，该轻链包含SEQ ID NO：49的序列。
在某些实施方案中，抗FcRn抗体包含重链，该重链包含与SEQ ID NO:50的序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性的序列。
在某些实施方案中，抗-FcRn抗体包含包含SEQ ID NO:50的序列的重链。
可用于本发明的FcRn结合肽的一个实施例是SYN1436，其结合FcRn并降低总体血清IgG水平(参见Mezo et al.,2008,Bioorg.Med.Chem.,16:6394-6405)。
亲和体(affibody)分子是亲和蛋白结构域，58个氨基酸长，具有折叠的反平行三螺旋束结构。可用于本发明的抗-FcRn亲和体包括例如但不限于ZFcRn和在Seijseng etal.,2018,Scientific Reports,8:5141,doi:10.1038/s41598-018-23481-5中描述的其他抗体。
在Wang et al.,2013,Bioorg.Med.Chem.Let.,23:1253–1256中描述了减少IgG与FcRn的相互作用并可用于本发明的小分子FcRn拮抗剂的实施例。
ABDEG是IgG分子，其中Fc部分被设计为在生理和内体pH值下以高亲和力结合FcRn。
国际专利申请公布WO2015/100299中描述了具有以增加的亲和力与FcRn结合并且可以用于本发明的变体Fc区的FcRn拮抗剂组合物的实施例。
依伽莫德(Efgartigimod)是(通过ABDEG技术)修饰过的人IgG1衍生的Fc片段，其以高亲和力结合FcRn，并防止FcRn与循环IgG相互作用和回收循环IgG(Ulrichts et al.,2018,J.Clin.Invest.,128:4372-4386)。
洛利昔珠单抗(Rozanolixizumab)是一种IgG4P同种型抗FcRn单克隆抗体，当以7mg/kg的剂量施用时，可将人体IgG水平降低约45％(Kiessling et al.,2017,Sci.Transl.Med.,9:aan1208.doi:10.1126/scitranslmed.aan1208)。
SYNT001是一种FcRn阻断单克隆抗体，其可减少人类所有循环IgG亚型和IgG免疫复合物(Blumberg et al.,2019,Sci.Adv.,5:eaax9586)。
在某些实施方案中，减少IgG与FcRn相互作用的药剂抑制由FcRn和IgG之间的相互作用介导的信号传导。
在某些实施方案中，减少IgG与FcRn相互作用的药剂是肽、蛋白质、小分子、核酸、适体、寡核苷酸、亲和体、抗体或其组合。
在某些实施方案中，减少IgG与FcRn相互作用的药剂选自依加莫德、M281、洛利昔珠单抗、SYNT001和IMVT-1401。
在某些实施方案中，降低IgG与FcRn相互作用的药剂是选自单克隆抗体或其片段、多克隆抗体或其片段、嵌合抗体、人源化抗体和单链抗体的抗体。
在某些实施方案中，减少IgG与FcRn相互作用的药剂是包含IgG和FcRn结合位点的双特异性试剂。
在某些实施方案中，减少IgG与FcRn相互作用的药剂是IgG的重组Fc部分或其生物活性部分或其蛋白质模拟物。
在某些实施方案中，循环IgG减少至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％。
本文进一步提供了一种组合物，例如，作为包装或试剂盒提供，其具有(a)包含编码蛋白质或肽或核酸的异源多核苷酸的重组病毒载体；(b)减少IgG与FcRn相互作用的药剂，(c)任选地，降解或消化抗体的蛋白酶或糖苷酶；(d)带有用于执行本文所述方法的说明的标签，其中(a)、(b)和(c)在分开的容器或相同的容器中提供。
在某些实施方案中，一种方法另外包括向受试者施用有效量的糖苷酶，以抑制或降低与重组病毒载体和/或核酸和/或由异源多核苷酸编码的蛋白质或肽结合的抗体的效应物功能。在某些实施方案中，一种方法另外包括向受试者施用有效降解或消化抗体的量的内肽酶或有效抑制或降低抗体或与重组病毒载体和/或核酸和/或由异源多核苷酸编码的蛋白质或肽结合的抗体的效应物功能的内切糖苷酶。
在某些实施方案中，一种方法另外包括向受试者施用有效量的糖苷酶，以减少与重组病毒载体和/或核酸和/或由异源多核苷酸编码的蛋白质或肽结合的抗体与Fc受体的结合。在某些实施方案中，一种方法另外包括向受试者施用有效量的糖苷内切酶，以减少与重组病毒载体和/或核酸和/或由异源多核苷酸编码的蛋白质或肽结合的抗体与Fc受体的结合。
本发明的方法可广泛应用于增强基因疗法治疗。例如，通过施用减少IgG与FcRn相互作用的药剂来克服对AAV衣壳的NAb或其他基因治疗递送模式，有可能使得能治疗具有预先存在的AAV中和抗体滴度的患者，以及使得能够重复给以前施用了AAV基因治疗产品而未达到有效水平或由于时间或其他混杂问题导致失去有效水平的患者给药。例如，减少IgG与FcRn相互作用的药剂的施用与IdeS的施用相结合，可以进一步增强基因疗法治疗具有预先存在的NAb的患者的功效。此外，本文的方法能够将肝基因转移到儿科人群中，由于发育过程中肝细胞扩增和转基因表达的潜在损失，这被认为是基因治疗难以处理的。在另一实施例中，在本发明的方法中，施用减少IgG与FcRn相互作用的药剂，以及任选地与施用蛋白酶(例如，IdeS)或糖苷酶(例如，EndoS)组合，将减少或清除针对AAV衣壳的中和抗体，并且能够治疗以前被认为不适合基因治疗或在AAV基因治疗后产生AAV抗体的患者。
在某些实施方案中，可用于本发明的病毒载体包括，例如但不限于，AAV颗粒。在某些实施方案中，可用于本发明的病毒载体包括例如但不限于逆转录病毒、腺病毒、辅助依赖性腺病毒、杂合腺病毒、单纯疱疹病毒、慢病毒、痘病毒、爱泼斯坦-巴尔病毒、牛痘病毒和人巨细胞病毒载体，包括其重组形式。
作为病毒载体的修饰语(诸如重组型AAV(rAAV)载体)以及序列的修饰语(诸如重组型多核苷酸及多肽)的术语“重组型”意指组合物已以一般不存在于自然界中的方式被操控(即，经工程改造)。重组型AAV载体的特定实施例将是：其中将通常在野生型AAV基因组中不存在的核酸(异源多核苷酸)插入病毒基因组内。其实施例将是：其中将编码治疗蛋白或多核苷酸序列的核酸(例如，基因)克隆至载体中，该载体含有或不含有基因在AAV基因组内通常所缔合的5’、3’和/或内含子区域。尽管参考AAV载体以及诸如多核苷酸之类的序列时，本文中并未始终使用术语“重组型”，但尽管有任何此类省略，包括AAV载体、多核苷酸等的重组型形式也明确地包括在内。
“rAAV载体”例如通过使用分子方法以去除野生型AAV基因组的全部或一部分且经诸如编码治疗蛋白或多核苷酸序列之类的核酸的非天然(异源)核酸置换而衍生自野生型AAV基因组。通常，针对rAAV载体，保留AAV基因组的一种或两种反向末端重复(ITR)序列。因为相对于AAV基因组核酸，AAV基因组的全部或一部分已经非天然序列置换，诸如经编码治疗蛋白或多核苷酸序列的异源核酸置换，所以rAAV区别于AAV基因组。因此，掺入非天然(异源)序列将AAV定义为“重组型”AAV载体，其可称为“rAAV载体”。
重组型AAV载体序列可包装-在本文中称为“颗粒”-以用于离体、活体外或活体内细胞的后续感染(转导)。在重组型载体序列衣壳化或包装至AAV颗粒中的情况下，颗粒也可称为“rAAV”、“rAAV颗粒”和/或“rAAV病毒粒子”。这种rAAV、rAAV颗粒及rAAV病毒粒子包括衣壳化或包装载体基因组的蛋白。在AAV的情况下，特定实施例包括衣壳蛋白。
可以缩写为“vg”的“载体基因组”是指最终经包装或衣壳化以形成rAAV颗粒的重组型质粒序列的部分。在重组型质粒用于构建或制造重组型AAV载体的情况下，AAV载体基因组不包括不对应于重组型质粒的载体基因组序列的“质粒”的部分。重组型质粒的该非载体基因组部分称为对于质粒的克隆及扩增至关重要的“质粒主链”，其为繁殖及重组型AAV载体产生所需的过程，但自身不包装或衣壳化至rAAV颗粒中。因此，“载体基因组”是指由rAAV包装或衣壳化的核酸。
如本文中所使用，关于AAV载体的术语“血清型”是指具有衣壳的AAV在血清学上不同于其他AAV血清型。血清区别性是基于与另一AAV相比，抗体与一种AAV之间缺乏交叉反应性来确定的。交叉反应性差异通常归因于衣壳蛋白序列/抗原决定簇的差异(例如归因于AAV血清型的VP1、VP2和/或VP3序列差异)。由于衣壳蛋白序列的同源性，针对一种AAV的抗体可能与一种或多种其他AAV血清型发生交叉反应。
在传统定义下，血清型是指目标病毒已经针对所有现有和特征性血清型的血清进行中和活性测试，并且未发现能中和目标病毒的抗体。由于更多天然存在的病毒分离株被发现和/或衣壳突变体被产生，因此与任何目前存在的血清型可能存在血清学差异，也可能没有血清学差异。因此，在新病毒(例如，AAV)没有血清学差异的情况下，该新病毒(例如，AAV)将是相应血清型的亚群或变体。在许多情况下，尚未对具有衣壳序列修饰的突变病毒进行中和活性的血清学测试，以根据传统的血清型定义确定它们是否属于另一种血清型。因此，为方便起见和避免重复，术语“血清型”广义上既是指血清学上不同的病毒(例如AAV)，也是指可能在给定血清型的亚群或变体内的血清学上不同的病毒(例如AAV)。
rAAV载体包括任何病毒株或血清型。例如，并且不限于，rAAV载体基因组或颗粒(衣壳，诸如VP1、VP2和/或VP3)可基于任何AAV血清型，例如诸如AAV-1、-2、-3、-4、-5、-6、-7、-8、-9、-10、-11、-12、-rh74、-rh10、AAV3B或AAV-2i8。这些载体可基于相同病毒株或血清型(或亚群或变体)，或彼此不同。例如，并且不限于，基于一种血清型基因组的rAAV质粒或载体基因组或颗粒(衣壳)可与包装载体的衣壳蛋白中的一或多者一致。另外，rAAV质粒或载体基因组可基于不同于包装载体基因组的衣壳蛋白中的一或多者的AAV血清型基因组，在此情况下三种衣壳蛋白中的至少一者可以是不同的AAV血清型，例如，AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、-rh74、-rh10、AAV3B、AAV-2i8、SPK1(SEQ ID NO:1)、SPK 2(SEQ ID NO:2)或其变体。更具体而言，rAAV2载体基因组可包含除来自不同血清型的衣壳外的AAV2 ITR，诸如例如AAV1、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、-rh74、-rh10、AAV3B、AAV-2i8、SPK1(SEQ ID NO:1)、SPK2(SEQ ID NO:2)或其变体。因此，rAAV载体包括与特定血清型以及也可以称为“假型”的“混合”血清型的基因/蛋白序列特性相同的基因/蛋白序列。
在某些实施方案中，rAAV质粒或载体基因组或颗粒基于爬行动物或无脊椎动物AAV变体，例如蛇和蜥蜴细小病毒(Pénzes et al.,2015,J.Gen.Virol.,96:2769–2779)或昆虫和虾细小病毒(Roekring et al.,2002,Virus Res.,87:79–87)。
在某些实施方案中，重组质粒或载体基因组或颗粒基于博卡病毒变体。例如，Guido et al.,2016,World J.Gastroenterol.,22:8684–8697中描述了人类博卡病毒变体。
在某些实施方案中，rAAV载体包括与一或多个AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、-rh74、-rh10、AAV3B、AAV-2i8、SPK1(SEQ ID NO:1)、SPK2(SEQ ID NO:2)衣壳蛋白(VP1、VP2和/或VP3序列)至少70％或更多(例如，75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％等)一致的衣壳序列或由该衣壳序列组成。在某些实施方案中，rAAV载体包括与一或多个AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、-rh74-rh10、或AAV3B、ITR至少70％或更多(例如，75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％等)一致的序列或由该序列组成。
在某些实施方案中，rAAV载体包括其AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV3B、Rh10、Rh74和AAV-2i8变体(例如，ITR和衣壳变体，诸如氨基酸插入、添加、取代和删除)，例如，如WO 2013/158879(国际申请PCT/US2013/037170)、WO 2015/013313(国际申请案PCT/US 2014/047670)和US2013/0059732(美国申请No.13/594,773)中所阐述的。
rAAV(例如AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、-rh74、-rh10、AAV3B、AAV-2i8、SPK1(SEQ ID NO:1)、SPK2(SEQ ID NO:2)和变体、杂合体及嵌合序列)可使用本领域技术人员已知的重组型技术构建成包括侧接有一或多个功能性AAV ITR序列的一或多个异源多核苷酸序列(转基因)。根据急救、复制以及将重组型载体包装至rAAV载体颗粒中的需要，这种AAV载体通常保留至少一种功能性侧接ITR序列。因此，rAAV载体基因组将包括对于复制和包装而言顺式需要的序列(例如，功能性ITR序列)。
在某些实施方案中，用于本发明的慢病毒可以是人类免疫缺陷病毒1(HIV-1)、人类免疫缺陷病毒2(HIV-2)、猿免疫缺陷病毒(SIV)、猫免疫缺陷病毒(FIV)、牛免疫缺陷病毒(BIV)、杰姆布拉纳(Jembrana)病病毒(JDV)、马传染性贫血病毒(EIAV)或山羊关节炎脑炎病毒(CAEV)。慢病毒载体能够在体外和体内提供异源多核苷酸序列的有效递送、整合和长期表达到非分裂细胞中。多种慢病毒载体是本领域已知的，参见Naldini et al.(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,93:11382-11388(1996)；Science,272:263-267(1996)),Zufferey et al.,(Nat.Biotechnol.,15:871-875,1997),Dull et al.,(JVirol.1998Nov；72(11):8463-71,1998),美国专利Nos.6,013,516和5,994,136，其中任何一个都可以是用于本发明的合适的病毒载体。
免疫反应，例如体液免疫，可以在暴露于野生型病毒的受试者中针对野生型病毒发展。甚至在用采用病毒载体的基因治疗方法进行治疗之前，这种暴露可能导致受试者中预先存在的抗体与基于野生型病毒的病毒载体结合。
免疫反应，例如体液免疫，也可以针对重组病毒载体和/或异源多核苷酸或通过由病毒载体包裹的异源多核苷酸编码的蛋白质或肽产生，从而导致抑制或减少病毒载体细胞转导、异源多核苷酸表达或功能，或由异源多核苷酸编码的蛋白质或肽在施用了病毒载体的受试者中的功能或活性。
与本发明中使用的病毒载体结合的抗体(例如重组病毒载体，可称为“中和”抗体)可减少或抑制可用于基因治疗的病毒载体的细胞转导。结果，虽然不受理论的束缚，但细胞转导被减少或抑制，从而减少了病毒包装的异源多核苷酸向细胞中的引入以及随后表达到蛋白质或肽中，以及适当时随后翻译到蛋白质或肽中。此外，与异源多核苷酸或通过由病毒载体包裹的异源多核苷酸编码的蛋白质或肽结合的抗体可以抑制异源多核苷酸的表达、异源多核苷酸的功能或活性或由异源多核苷酸编码的蛋白质或肽的功能或活性。
因此，在受试者中可以存在与重组病毒载体(例如，AAV)结合的抗体和/或可以存在与由异源多核苷酸编码的蛋白质或肽结合的抗体。此外，可以存在与重组病毒载体包裹的异源多核苷酸结合的抗体。
在受试者中的与重组病毒载体(例如AAV)结合或与异源多核苷酸编码的蛋白质或肽结合的IgG抗体(如果它们产生的话)可以通过使用如本文所述的减少IgG与FcRn的相互作用的药剂而减少。减少IgG与FcRn的相互作用会导致IgG再循环减少(也称为IgG清除率提高)，从而降低循环IgG的滴度(血液、血浆或血清中的IgG水平降低)，这可以通过本领域已知的标准测定法测量。
与重组病毒载体(例如，AAV)结合或与由异源多核苷酸编码的蛋白质或肽结合的抗体(如果产生的话)可以另外被本文所述的蛋白酶降解或消化。与重组病毒载体(例如，AAV)结合或与由异源多核苷酸编码的蛋白质或肽结合的抗体(如果产生的话)也可以如本文所述使它们的效应物功能降低或抑制。
如本文所使用的，关于抗体的“效应物功能”是指抗体的正常功能属性。抗体功能属性的非限制性示例包括，例如，与抗原结合；补体级联的激活(称为补体依赖性细胞毒性)；与效应物细胞(例如巨噬细胞、单核细胞、自然杀伤细胞和嗜酸性粒细胞)上的Fc受体结合，以发挥抗体依赖性细胞毒性(ADCC)；并作为由吞噬细胞和树突状细胞之类的免疫细胞摄取结合抗原/病原体的信号。因此，抗体效应物功能的降低或抑制可以指任何一种或多种前述非限制性功能属性。效应物功能测定法在本领域中是已知的并且例如在WO2016012285中描述。
“Fc受体”是指任何Fc受体。除了新生儿Fc受体(FcRn)之外，Fc受体的非限制性示例还包括存在于细胞上的Fcγ免疫球蛋白受体(FcγR)。在人类中，FcγR是指Fc受体家族中的一种、一些或全部，其包括FcγRI(CD64)、FcγRIIA(CD32A)、FcγRIIB(CD32B)、FcγRIIIA(CD16a)和FcγRIIIB(CD16b)。FcγR包括FcγRI(CD64)、FcγRIIA(CD32A)、FcγRIIB(CD32B)、FcγRIIIA(CD16a)和FcγRIIIB(CD16b)的天然存在的多态性。
在某些实施方案中，抗体与病毒载体的结合通过减少IgG与FcRn相互作用的药剂、蛋白酶或糖苷酶来减少或抑制。
在某些实施方案中，通过糖苷酶减少或抑制与效应物细胞(例如巨噬细胞、单核细胞、自然杀伤细胞或嗜酸性粒细胞)上的Fc受体结合的抗体。在某些实施方案中，内切糖苷酶水解抗体的Fc相互作用域上的聚糖结构。在某些实施方案中，内切糖苷酶水解IgG的Fc相互作用域上的聚糖结构，例如Asn-297位(Kabat编号)处的N-连接的双触角聚糖。
在某些实施方案中，通过减少IgG与FcRn相互作用的药剂、蛋白酶或糖苷酶来减少或抑制补体级联的抗体活化。
在某些实施方案中，通过减少或抑制IgG与FcRn相互作用的药剂、蛋白酶或糖苷酶来减少或抑制由免疫细胞(例如吞噬细胞或树突状细胞)进行的抗体刺激或摄取。
在某些实施方案中，在施用重组病毒(例如，AAV)载体之前，将减少IgG与FcRn相互作用的药剂施用给受试者。在某些实施方案中，在施用重组病毒(例如，AAV)载体后，将减少IgG与FcRn相互作用的药剂施用给受试者。在某些实施方案中，重组病毒(例如，AAV)载体和减少IgG与FcRn相互作用的药剂基本上同时或大约同时施用。
在某些实施方案中，除了减少IgG与FcRn相互作用的药剂外，还在施用重组病毒(例如，AAV)载体之前向受试者施用蛋白酶和/或糖苷酶。
在某些实施方案中，在施用蛋白酶和/或糖苷酶之后，和/或在施用重组病毒(例如，AAV)载体之后，将减少IgG与FcRn相互作用的药剂施用给受试者。
在某些实施方案中，重组病毒(例如，AAV)载体和减少IgG与FcRn相互作用的药剂基本上与施用减少IgG与FcRn相互作用的药剂同时或大约同时施用。
在某些实施方案中，在向受试者施用内肽酶(例如但不限于IdeS)之前向受试者施用减少IgG与FcRn的相互作用的药剂(例如但不限于抗FcRn抗体)，然后向受试者施用重组病毒(例如，AAV)载体。在某些实施方案中，减少IgG与FcRn相互作用的药剂，例如但不限于抗-FcRn抗体，在施用内肽酶(例如但不限于IdeS)之前多于一次地施用给受试者。在某些实施方案中，将减少IgG与FcRn相互作用的药剂，例如但不限于抗-FcRn抗体，向受试者施用至少2次、至少3次、至少4次或至少5次，然后施用内肽酶，例如但不限于IdeS。
在某些实施方案中，在施用蛋白酶和/或糖苷酶之前，在1周、2周、3周、4周、5周、6周或更多周的时间段内向受试者施用减少IgG与FcRn相互作用的药剂，并且在施用蛋白酶和/或糖苷酶之后，将重组病毒(例如，AAV)载体施用给受试者。
在某些实施方案中，在向受试者施用蛋白酶和/或糖苷酶之前约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约8小时、约9小时、约10小时、约15小时、约20小时、约1天、约2天、约3天、约4天、约5天、约6天或约1周将减少IgG与FcRn相互作用的药剂向受试者施用，并且在施用蛋白酶和/或糖苷酶之后，将重组病毒(例如，AAV)载体施用给受试者。
在某些实施方案中，在向受试者施用内肽酶(例如但不限于IdeS)之前1周、2周、3周、4周、5周、6周或更多周的时间段内将减少IgG与FcRn相互作用的药剂(例如但不限于抗FcRn抗体)施用给受试者，并且在施用内肽酶之后，向受试者施用重组病毒(例如，AAV)载体。
在某些实施方案中，在向受试者施用内肽酶(例如但不限于IdeS)之前约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约8小时、约9小时、约10小时、约15小时、约20小时、约1天、约2天、约3天、约4天、约5天、约6天或约1周将减少IgG与FcRn相互作用的药剂(例如但不限于抗FcRn抗体)向受试者施用，并且在施用内肽酶之后，将重组病毒(例如，AAV)载体施用给受试者。
抗体包括任何IgG、IgM、IgA、IgD和/或IgE。因此，在某些实施方案中，本发明尤其涉及消化、降解或降低或抑制这五类抗体中的任何一类、这五类抗体中的任何两类、这五类抗体中的任何三类、这五类抗体中的任何四类或这五类抗体中的所有五类的效应物功能。
可以在施用重组病毒载体之前和/或之后分析、测量或确定受试者中的抗体水平。还可以在施用减少IgG与FcRn相互作用的药剂或蛋白酶或糖苷酶之前和/或之后分析、测量或确定受试者中的抗体水平。还可以在施用重组病毒载体之前和/或之后以及施用减少IgG与FcRn相互作用的药剂或蛋白酶或糖苷酶之前和/或之后多次分析或测量受试者中的抗体水平。
可以在施用重组病毒载体之前和/或之后分析、测量或确定受试者中的抗体的效应物功能。还可以在施用减少IgG与FcRn相互作用的药剂或蛋白酶或糖苷酶之前和/或之后分析、测量或确定受试者中的抗体的效应物功能。还可以在施用重组病毒载体之前和/或之后以及施用减少IgG与FcRn相互作用的药剂或蛋白酶或糖苷酶之前和/或之后多次分析或测量受试者中的抗体的效应物功能。
平衡结合常数的增大对应于IgG和Fc受体之间结合的减少。因此，由于减少IgG与FcRn相互作用的药剂或蛋白酶或糖苷酶的活性而导致抗体与Fc受体结合的减少可导致IgG:FcR相互作用的平衡结合常数的增大。抗体与Fc受体结合的减少可导致IgG:FcR相互作用的平衡结合常数增大至少1倍、至少2倍、至少3倍、或至少4倍、或至少5倍，或至少6倍，或至少7倍或至少8倍。
在某些实施方案中，通过以下方式处理受试者因暴露于野生型病毒而引起的免疫反应(例如体液免疫反应)：在向受试者施用重组病毒载体之前基于野生型病毒施用减少IgG与FcRn相互作用的药剂和有效量的蛋白酶和/糖苷酶以降解或消化与重组病毒载体结合的抗体。
在某些实施方案中，通过以下方式处理通过施用病毒载体(例如AAV)而引起的免疫反应(例如体液免疫反应)：施用减少IgG与FcRn相互作用的药剂和有效量的蛋白酶和/糖苷酶以降解或消化与重组病毒载体结合的抗体或与异源多核苷酸或通过由病毒载体包裹的异源多核苷酸编码的蛋白质或肽结合的抗体。
在某些实施方案中，在向受试者施用重组病毒载体之前，先施用减少IgG与FcRn相互作用的药剂和蛋白酶和/或糖苷酶以抑制或预防针对重组病毒载体或与异源多核苷酸或通过由病毒载体包裹的异源多核苷酸编码的蛋白质或肽结合的抗体的免疫反应(例如，体液免疫反应)。
在某些实施方案中，在免疫反应(例如，体液免疫反应)之前，例如在中和抗体产生或与异源多核苷酸或通过由病毒载体包裹的异源多核苷酸编码的蛋白质或肽结合的抗体产生之前，向受试者施用减少IgG与FcRn相互作用的药剂和蛋白酶和/或糖苷酶。
蛋白酶和/或糖苷酶在增加或增强基因疗法载体的功效以及增加或增强受试者中的基因疗法治疗的方法中的用途是已知的。参见例如WO2020016318、WO2020102740和Leborgne et al.,2020,Nat.Med.,26:1096–1101(2020)，每一者都通过引用整体并入本文，包括所有文本、表格、序列表和附图。
蛋白酶是降解或消化蛋白质的酶。如本文所使用的，蛋白酶也称为肽酶、蛋白酶、肽水解酶或蛋白水解酶。
可用于本发明的蛋白酶可根据其底物特异性细分为两大类。蛋白酶可以是水解位于N-末端或C-末端的肽键的外切型(外切蛋白酶或外肽酶)。外切蛋白酶或外肽酶的实例包括，例如但不限于，风味蛋白酶(Flavozyme)(Novozymes酶)、ProteaAX(Amano)和来自猪胰腺的胰酶。
可用于本发明的蛋白酶可以是水解多肽链内部肽键的内切型(内切蛋白酶或内肽酶)。内切蛋白酶的示例包括，例如但不限于，IdeS、IdeZ、IgdE、IdeMC、胰蛋白酶、糜蛋白酶、木瓜蛋白酶和胃蛋白酶。
可用于本发明的蛋白酶的示例包括，例如但不限于，来自酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、马链球菌(Streptococcus equi)、犬支原体(Mycoplasmacanis)、无乳链球菌(S.agalactiae)或假猪链球菌(S.pseudoporcinus)的半胱氨酸蛋白酶。在某些实施方案中，蛋白酶包括来自酿脓链球菌的内肽酶IdeS或其修饰的变体，如SEQID NO:3-18中任一个所示。在某些实施方案中，蛋白酶包括在SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:20中所示的蛋白酶，或其修饰的变体。在某些实施方案中，蛋白酶包括来自马链球菌的内肽酶IdeZ，或其修饰的变体，如在SEQ ID NO:21-43中的任一个中所示的。
可用于本发明的其他蛋白酶包括，例如但不限于，国际专利申请公布WO2017/134274中描述的来自猪链球菌(S.suis)、豕链球菌(S.porcinus)、马链球菌(S.equi)的IgdE酶。可用于本发明的其他蛋白酶包括，例如但不限于，国际专利申请公布WO2018/093868中描述的IdeMC和同系物。可用于本发明的其他内肽酶包括，例如但不限于，在国际专利申请公布WO2016/128559中描述的具有和不具有N-末端甲硫氨酸和信号肽的IdeZ和IdeS/IdeZ杂合蛋白。可用于本发明的其他蛋白酶包括，例如但不限于，在例如Jordan etal.(2017,N.Engl.J.Med.,377:442-453)、Lannergard and Guss(2006,FEMSMicrobiol.Lett.,262:230-235)和Hulting et al.,(2009,FEMS Microbiol.Lett.,298:44-50)中描述的蛋白酶。
糖苷酶是水解复合糖中糖苷键的酶。通常有两大类，即外切糖苷酶和内切糖苷酶。糖苷酶裂解并由此从糖蛋白如抗体中释放聚糖/寡糖。
可用于本发明的外切糖苷酶包括，例如但不限于，N-乙酰氨基葡萄糖苷酶、岩藻糖苷酶、半乳糖苷酶、葡糖苷酶、甘露糖苷酶、神经氨酸酶和木糖苷酶。可用于本发明的糖苷内切酶包括，例如但不限于，Endo S、Endo D、糖苷内切酶-H、Endo F1、Endo F2和Endo F3。
因此，在某些实施方案中，糖苷酶包括内切糖苷酶。在某些实施方案中，糖苷酶包括外切糖苷酶。
内切糖苷酶的一个示例包括，例如但不限于，Endo S。在某些实施方案中，糖苷内切酶包含在SEQ ID NO:44-47中的任一个中所示的序列，或其修饰的变体。
在某些实施方案中，EndoS多肽包括EndoS多肽、EndoS多肽的片段、EndoS多肽的变体或EndoS多肽的片段的变体，条件是所述多肽、片段、变体或片段的变体具有免疫球蛋白(Ig)内切糖苷酶活性。
在某些实施方案中，EndoS多肽是酿脓链球菌EndoS。EndoS多肽的变体可以是来自另一种生物体(例如另一种细菌)的EndoS多肽。在某些实施方案中，细菌是链球菌属，例如马链球菌(Streptococcus equi)、兽疫链球菌(Streptococcus zooepidemicus)或酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)。替代地，变体可以来自假结核棒状杆菌(Corynebacterium pseudotuberculosis)，例如CP40蛋白；粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)，例如EndoE蛋白；或脑膜炎败血伊丽莎白金菌(Elizabethkingiameningoseptica)(以前称为脑膜脓毒性黄杆菌(Flavobacterium meningosepticum))，例如EndoF2蛋白。
EndoS多肽可以包含以下项或由以下项组成：(a)SEQ ID NO:44-47中任一个的氨基酸序列；(b)(a)的具有Ig内切糖苷酶活性的片段；(c)与SEQ ID NO:44-47中任一个的氨基酸序列具有至少50％同一性并具有Ig内切糖苷酶活性的(a)的变体；或(d)与SEQ ID NO:44-47中任一个的氨基酸序列的相应部分具有至少50％的同一性并且具有Ig内切糖苷酶活性的(b)的变体。
在某些实施方案中，变体多肽与任何SEQ ID NO:44-47的氨基酸序列具有至少约60％或更多的同一性(例如，60-70％、70-80％或80-90％的同一性)，或其具有Ig内切糖苷酶活性的片段。在某些实施方案中，变体多肽与SEQ ID NO:44-47中任一个的氨基酸序列具有90-100％的同一性或其具有Ig内切糖苷酶活性的片段。
蛋白酶可以包含以下项或由以下项组成：(a)SEQ ID NO:3-43或48中任一个的氨基酸序列；(b)(a)的具有蛋白酶活性的片段；(c)与SEQ ID NO:3-43或48中任一个的氨基酸序列具有至少50％同一性并具有蛋白酶活性的(a)的变体；或(d)与SEQ ID NO:3-43或48中任一个的氨基酸序列的相应部分具有至少50％的同一性并且具有蛋白酶活性的(b)的变体。在某些实施方案中，变体多肽与任何SEQ ID NO:3-43或48的氨基酸序列具有至少约60％或更多的同一性(例如，60-70％、70-80％或80-90％的同一性)，或其具有蛋白酶活性的片段。在某些实施方案中，变体多肽与SEQ ID NO:3-43或48中任一个的氨基酸序列具有90-100％的同一性或其具有蛋白酶活性的片段。
在某些实施方案中，蛋白酶或糖苷酶缺乏其天然信号序列并且具有额外的N-末端甲硫氨酸，例如SEQ ID NO:48，其是化脓性链球菌IdeS的成熟形式(没有信号序列，但具有添加的N-末端甲硫氨酸。根据本发明的方法使用的任何蛋白酶或糖苷酶可以包括代替天然信号序列的添加的N-末端甲硫氨酸。
蛋白酶或糖苷酶可以任何合适的剂量施用于受试者。例如，合适的剂量可以是约0.05mg/kg至约5mg/kg受试者体重，或约0.1mg/kg至约4mg/kg受试者体重。
在某些实施方案中，IdeZ以约0.01mg/kg至约10mg/kg受试者体重的剂量施用。例如，合适的剂量可以是约0.05mg/kg至约5mg/kg受试者体重，或约0.1mg/kg至约4mg/kg受试者体重。
在某些实施方案中，IdeS以约0.01mg/kg至约10mg/kg受试者体重的剂量施用。例如，合适的剂量可以是约0.05mg/kg至约5mg/kg受试者体重，或约0.1mg/kg至约4mg/kg受试者体重。
在某些实施方案中，EndoS以约0.01mg/kg至约10mg/kg受试者体重的剂量施用。例如，合适的剂量可以是约0.05mg/kg至约5mg/kg受试者体重，或约0.1mg/kg至约4mg/kg受试者体重。
除非本文另有说明，否则根据本发明的方法可以任何合适的顺序进行。在某些实施方案中，方法可以包括首先(a)向受试者施用有效量的减少IgG与FcRn的相互作用的试剂，以降低中和抗体滴度；然后(b)给受试者施用重组病毒载体。在某些实施方案中，(b)向受试者施用重组病毒载体，是在(a)向受试者施用减少IgG与FcRn相互作用的药剂后约1分钟至约90天之间进行。在某些实施方案中，(a)向受试者施用减少IgG与FcRn相互作用的药剂和(b)向受试者施用重组病毒载体大约同时进行。
在某些实施方案中，一种方法可以包括首先(a)向受试者施用携带异源多核苷酸的重组病毒载体，然后(b)向受试者施用有效量的减少IgG与FcRn相互作用的试剂以降低与重组病毒载体和/或异源多核苷酸或由异源多核苷酸编码的蛋白质或肽结合的抗体的循环水平。在某些实施方案中，(b)向受试者施用有效量的减少IgG与FcRn相互作用的试剂以降低与重组病毒载体和/或异源多核苷酸或由异源多核苷酸编码的蛋白质或肽结合的抗体的循环水平是在(a)向受试者施用携带异源多核苷酸的重组病毒载体后约1分钟至约90天之间进行。在某些实施方案中，(a)向受试者施用携带异源多核苷酸的重组病毒载体与(b)向受试者施用有效量的减少IgG与FcRn相互作用的试剂以降低与重组病毒载体和/或异源多核苷酸或由异源多核苷酸编码的蛋白质或肽结合的抗体的循环水平大约同时进行。
根据本发明的方法可以任选地包括在施用减少IgG与FcRn相互作用的药剂或施用重组病毒载体之前、之后或大约同时向受试者施用蛋白酶和/或糖苷酶。
在某些实施方案中，方法可以包括首先(a)向受试者施用减少IgG与FcRn相互作用的药剂；然后(b)向受试者施用有效降解或消化中和抗体的蛋白酶和/或糖苷酶；然后(c)向受试者施用重组病毒载体。
在某些实施方案中，方法可以包括首先(a)向受试者施用减少IgG与FcRn相互作用的药剂；然后(b)向受试者施用有效降解或消化中和抗体的内肽酶；然后(c)向受试者施用重组病毒载体。
在某些实施方案中，方法可以包括首先(a)向受试者施用抗-FcRn抗体；然后(b)向受试者施用有效降解或消化中和抗体的IdeS；然后(c)向受试者施用重组病毒载体。
抗体，例如中和抗体，可能是预先存在的，并且可能存在于受试者中，甚至在施用病毒载体之前，处于抑制或减少重组病毒载体细胞转导的水平。替代地，抗体可以在暴露于重组病毒载体所基于的病毒后在受试者体内产生。更进一步，抗体，例如中和抗体，或与异源多核苷酸或通过由病毒载体包裹的异源多核苷酸编码的蛋白质或肽结合的抗体可在施用重组病毒载体后在受试者中产生。
因此，本文的方法适用于具有预先存在的抗体的受试者和没有预先存在的抗体的受试者。如本文所述，此类受试者包括已暴露于野生型病毒并基于野生型病毒产生针对病毒载体的预先存在的抗体的受试者，以及已接受病毒载体基因疗法治疗和已经产生了抗体，随后可能用一个或多个额外剂量的相同病毒载体基因治疗(称为再给药)或使用相同的病毒载体用不同的基因疗法治疗(例如，不同的异源多核苷酸)以提供基因疗法治疗的受试者。
可以在施用病毒载体之前和/或在施用减少IgG与FcRn相互作用的药剂、蛋白酶或糖苷酶之前测试受试者的抗体。待测试的抗体的非限制性示例包括中和抗体、本文所述的与减少IgG与FcRn相互作用的药剂或蛋白酶或糖苷酶的结合的抗体、与异源多核苷酸结合的抗体和与由异源多核苷酸编码的蛋白质或肽结合的抗体。因此可以在施用重组病毒载体之前和/或在施用减少IgG与FcRn相互作用的药剂或蛋白酶或糖苷酶之前，筛选受试者的中和抗体、本文所述的与减少IgG与FcRn相互作用的药剂或蛋白酶或糖苷酶结合的抗体、与异源多核苷酸结合的抗体或与由异源多核苷酸编码的蛋白质或肽结合的抗体。
具有预先存在的本文所述的与减少IgG与FcRn相互作用的药剂或蛋白酶或糖苷酶结合的抗体(例如，IgG)的受试者可以任选地通过根据本发明的方法从初始治疗排除。然而，根据本发明的治疗方法，并非所有具有或产生与减少IgG与FcRn相互作用的药剂或蛋白酶或糖苷酶结合的抗体的受试者都需要排除在外。例如，仍然可以使用根据本发明的方法治疗具有滴度小于15mg/每升的可检测到的抗IdeSIgG的受试者。预计通过施用减少IgG与FcRn相互作用的药剂来减少循环IgG也将导致可结合减少IgG与FcRn或IdeS相互作用的药剂的抗体减少。
还可以在施用重组病毒载体后筛选受试者的中和抗体、与异源多核苷酸结合的抗体或与由异源多核苷酸编码的蛋白质或肽结合的抗体。可任选在施用重组病毒载体后监测此类受试者一段时间以确定此类抗体是否在尚未检测到预先存在的抗体的受试者中产生或被阻止产生，或在受试者具有预先存在的抗体的情况下，减少IgG与FcRn相互作用的药剂和蛋白酶和/或糖苷酶是否降低或消除了此类预先存在的抗体。
在某些实施方案中，在针对中和抗体、如本文所述的与减少IgG与FcRn相互作用的药剂结合的抗体、与异源多核苷酸结合的抗体或与由异源多核苷酸编码的蛋白质或肽结合的抗体的存在检测呈阳性后，向受试者施用减少IgG与FcRn相互作用的药剂。在针对中和抗体、如本文所述的与减少IgG与FcRn相互作用的药剂结合的抗体、与异源多核苷酸结合的抗体或与由异源多核苷酸编码的蛋白质或肽结合的抗体的存在检测呈阳性前，向受试者施用减少IgG与FcRn相互作用的药剂。
在某些实施方案中，在针对中和抗体、如本文所述的与减少IgG与FcRn相互作用的药剂或蛋白酶或糖苷酶结合的抗体、与异源多核苷酸结合的抗体或与由异源多核苷酸编码的蛋白质或肽结合的抗体的存在检测呈阳性后，向受试者施用减少IgG与FcRn相互作用的药剂和蛋白酶和/或糖苷酶。在针对中和抗体、如本文所述的与减少IgG与FcRn相互作用的药剂、蛋白酶或糖苷酶结合的抗体、与异源多核苷酸结合的抗体或与由异源多核苷酸编码的蛋白质或肽结合的抗体的存在检测呈阳性前，向受试者施用减少IgG与FcRn相互作用的药剂和蛋白酶和/或糖苷酶。
在某些实施方案中，受试者在施用减少IgG与FcRn相互作用的药剂之前或之后，或在施用减少IgG与FcRn相互作用的药剂蛋白酶和/或糖苷酶之前或之后，不测试受试者的抗体。因此，在根据本发明的治疗方法中，在施用蛋白酶和/或糖苷酶或施用重组病毒载体之后对中和抗体、如本文所述的与减少IgG与FcRn相互作用的药剂或蛋白酶或糖苷酶结合的抗体、与异源多核苷酸结合的抗体或与由异源多核苷酸编码的蛋白质或肽结合的抗体的测试是任选的。
可以将减少IgG与FcRn相互作用的药剂施用于受试者任意次。例如，可以将减少IgG与FcRn相互作用的药剂施用于受试者2至5次、2至10次、2至15次。
可以将减少IgG与FcRn相互作用的药剂定期(例如连续天数或交替天数)或不定期施用于受试者持续任何持续时间。在某些实施方案中，减少IgG与FcRn相互作用的药剂在施用重组病毒载体之前或之后约1至12周，或约1至10周，或约1至8周，或约1至6周，或约1至约4周，或约1至3周，或约1至2周，或约2周施用。
可以将蛋白酶或糖苷酶施用于受试者任意次。例如，可以将蛋白酶或糖苷酶施用于受试者2至5次、2至10次、2至15次。
可以将蛋白酶或糖苷酶定期(例如连续天数或交替天数)或不定期施用于受试者持续任何持续时间。在某些实施方案中，蛋白酶或糖苷酶在施用减少IgG与FcRn相互作用的药剂或施用重组病毒载体之前或之后约1至12周，或约1至10周，或约1至8周，或约1至6周，或约1至约4周，或约1至3周，或约1至2周，或约2周施用。
在某些实施方案中，重组病毒载体在减少IgG与FcRn相互作用的药剂之前或之后施用，或在施用蛋白酶或糖苷酶至受试者之前或之后施用。在某些实施方案中，例如，在向受试者施用减少IgG与FcRn相互作用的药剂或蛋白酶或糖苷酶后1-12、12-24或24-48小时、或2-4、4-6、6-8、8-10、10-14、14-20、20-25、25-30、30-50或超过50天，向受试者施用重组病毒载体。在某些实施方案中，例如在向受试者施用重组病毒载体后1-12、12-24或24-48小时、或2-4、4-6、6-8、8-10、10-14、14-20、20-25、25-30、30-50或超过50天，向受试者施用减少IgG与FcRn相互作用的药剂或蛋白酶或糖苷酶。
重组病毒载体、减少IgG与FcRn相互作用的药剂、蛋白酶和/或糖苷酶可以单独或组合施用。在某些实施方案中，将重组病毒载体与减少IgG与FcRn相互作用的药剂和/或蛋白酶和/或糖苷酶分开施用于受试者。在某些实施方案中，将重组病毒载体与减少IgG与FcRn相互作用的药剂和/或蛋白酶和/或糖苷酶组合施用于受试者。
在某些实施方案中，将减少IgG与FcRn的相互作用的药剂与蛋白酶和/或糖苷酶的混合物给受试者施用一次或多次。在某些实施方案中，将两种或更多种减少IgG与FcRn相互作用的药剂或两种或更多种蛋白酶和/或糖苷酶给受试者施用一次或多次。
在某些实施方案中，至少一种免疫抑制剂在向受试者施用重组病毒载体、减少IgG与FcRn相互作用的药剂、蛋白酶或糖苷酶之前、基本上同时或之后施用给受试者。在某些实施方案中，免疫抑制剂是抗炎剂，例如类固醇。在某些实施方案中，免疫抑制剂是强的松、环孢菌素(例如环孢菌素A)、霉酚酸酯、利妥昔单抗、雷帕霉素或其衍生物。
降低体液免疫的其他策略包括去除、消耗、捕获和/或灭活抗体的方法，通常称为单采术，更具体而言，涉及血液制品的血浆置换术。单采术或血浆置换术是一种过程，其中人类受试者的血浆通过一种设备进行离体(体外)循环，该设备在血浆返回患者之前通过添加、去除和/或更换成分来改变血浆。血浆置换术可用于从血液产品(例如血浆)中去除人免疫球蛋白(例如IgG、IgE、IgA、IgD)。该过程消耗、捕获、灭活、减少或去除与重组病毒载体结合、与异源多核苷酸结合、与由异源多核苷酸编码的蛋白质或肽结合、与减少IgG与FcRn相互作用的药剂结合、与蛋白酶结合和/或与糖苷酶结合，从而降低治疗受试者中可能有助于例如病毒载体中和的抗体效价。一个示例是由AAV衣壳亲和基质柱组成的设备。使血液产品(例如血浆)通过这种AAV衣壳亲和基质将导致仅结合AAV抗体和所有同种型(包括IgG、IgM等)。免疫吸附(美国专利申请公布US 2018/0169273 A1)也可用于消耗免疫球蛋白，更特别是抗AAV抗体。亲和配体(国际专利申请公布WO/2018/158397)也可用于消耗免疫球蛋白，更特别是抗AAV抗体。任何上述策略可以在向受试者施用重组病毒载体、减少IgG与FcRn相互作用的药剂、蛋白酶或糖苷酶之前、基本上同时或之后使用。
在某些实施方案中，在向受试者施用减少IgG与FcRn相互作用的药剂之前或之后，和/或在向受试者施用重组病毒载体之前或之后，对受试者的血液产品(例如血浆)进行血浆置换，作为本发明方法中的一个或多个额外步骤。
在某些实施方案中，在施用减少IgG与FcRn相互作用的药剂之前或之后对受试者的血液产品(例如血浆)进行血浆置换，然后向受试者施用重组病毒载体。
在某些实施方案中，在施用减少IgG与FcRn相互作用的药剂之前或之后，对受试者的血液产品(例如血浆)进行血浆置换，然后向受试者施用蛋白酶或糖苷酶，然后向受试者施用重组病毒载体。
在某些实施方案中，在施用减少IgG与FcRn相互作用的药剂后，对受试者的血液产品(例如血浆)进行血浆置换，然后向受试者施用IdeS或EndoS，然后向受试者施用重组病毒载体。
在某些实施方案中，在施用减少IgG与FcRn相互作用的药剂后，对受试者的血液制品(例如血浆)进行血浆置换，然后向受试者施用IdeS，然后向受试者施用重组病毒载体。
在本发明的方法中，在受试者体内可能有高滴度的循环中和抗体的情况下，除了施用减少IgG与FcRn相互作用的药剂和施用蛋白酶(例如，IdeS)或糖苷酶(例如，EndoS)之外，血浆置换术的使用可能对基因疗法再给药治疗特别有益。
在全身基因转移中减少(克服)或避免对AAV的体液免疫的其他策略包括使用AAV空衣壳颗粒和/或衣壳蛋白作为诱饵来吸附抗AAV抗体，施用免疫抑制药物以减轻、减少、抑制、预防或根除对AAV的体液免疫反应，改变AAV衣壳血清型或将AAV衣壳改造为对中和抗体(NAb)不敏感，使用血浆交换循环来吸附抗AAV免疫球蛋白，从而降低抗AAV抗体滴度，以及使用输送技术，例如球囊导管，然后进行盐水冲洗。在Mingozzi et al.,2013,Blood,122:23-36中描述了更进一步的策略。其他策略包括使用AAV特异性血浆置换柱选择性耗尽抗AAV抗体而不耗尽血浆中的总免疫球蛋白池，如Bertin et al.,2020,Sci.Rep.10:864中描述的。WO 2019018439中描述了在受试者中去除、耗尽、捕获和/或灭活AAV抗体的单采策略。
根据本发明，减少IgG与FcRn相互作用的药剂可以用脂质体、纳米颗粒、脂质纳米颗粒、聚合物、微粒、微囊、胶束或细胞外囊泡包封或与其复合。
同样根据本发明，病毒颗粒可以用脂质体、纳米颗粒、脂质纳米颗粒、聚合物、微粒、微囊、胶束或细胞外囊泡包封或与其复合。
同样根据本发明，蛋白酶和/或糖苷酶可以用脂质体、纳米颗粒、脂质纳米颗粒、聚合物、微粒、微囊、胶束或细胞外囊泡包封或与其复合。
“脂质纳米颗粒”或“LNP”是指基于脂质的囊泡，其适用于递送重组病毒载体和/或蛋白酶和/或糖苷酶且具有纳米级尺寸，即约10nm至约1000nm或约50至约500nm或约75至约127nm。不受理论束缚，相信LNP为蛋白酶、糖苷酶或重组病毒载体提供对免疫系统部分或完全的屏蔽。屏蔽使得能在向组织或细胞递送蛋白酶、糖苷酶或重组病毒载体的同时避免诱发活体内针对蛋白酶、糖苷酶或重组病毒载体的实质性免疫反应。屏蔽也可使得能重复给药而不诱发活体内(例如，诸如人类的受试者内)针对蛋白酶、糖苷酶或重组病毒载体的实质性免疫反应。屏蔽还可提高或增加活体内递送效率、治疗效果的持续时间和/或治疗效果。
AAV的pI(等电点)在约6至约6.5的范围内。因此，AAV表面携带有少量负电荷。因而，对于LNP而言，包含诸如(例如)氨基脂质的阳离子脂质可以是有益的。示例性的氨基脂质已描述于美国专利No.9,352,042,9,220,683、No.9,186,325、No.9,139,554、No.9,126,966 9,018,187、No.8,999,351、No.8,722,082、No.8,642,076、No.8,569,256、No.8,466,122、和No.7,745,651以及美国专利公开No.2016/0213785、No.2016/0199485、No.2015/0265708、No.2014/0288146、No.2013/0123338、No.2013/0116307、No.2013/0064894、No.2012/0172411、和No.2010/0117125。
术语“阳离子脂质”及“氨基脂质”在本文中可互换地使用以包括具有一个、二个、三个或更多个脂肪酸或脂肪烷基链以及pH可滴定氨基(例如，烷基氨基或二烷基氨基)的那些脂质及其盐。阳离子脂质通常在低于阳离子脂质的pKa的pH下质子化(即带正电)且在高于pKa的pH下为实质上中性的。阳离子脂质也可以是可滴定阳离子脂质。在某些实施方案中，阳离子脂质包含：可质子化三级胺(例如，pH可滴定)基团；C18烷基链，其中各烷基链独立地具有0至3个(例如，0、1、2或3个)双键；以及头基与烷基链之间的醚键、酯键或缩酮键。
阳离子脂质可包括(但不限于)1,2-二亚油氧基-N,N-二甲基氨基丙烷(DLinDMA)、1,2-二-γ-亚油氧基-N,N-二甲基氨基丙烷(DLenDMA)、1,2-二-γ-亚麻氧基-N,N-二甲基氨基丙烷(γ-DLenDMA)、2,2-二亚油基-4-(2-二甲氨基乙基)-[1,3]-二氧杂环戊烷(DLin-K-C2-DMA，也称为DLin-C2K-DMA、XTC2和C2K)、2,2-二亚油基-4-二甲氨基甲基-[1,3]-二氧杂环戊烷(DLin-K-DMA)、二亚油酰基甲基-3-二甲氨基丙酸酯(DLin-M-C2-DMA，也称为MC2)、4-(二甲氨基)丁酸(6Z,9Z,28Z,31Z)-三十七烷-6,9,28,31-四烯-19-基酯(DLin-M-C3-DMA，也称为MC3)、其盐及其混合物。其他阳离子脂质还包括(但不限于)1,2-二硬脂基氧基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷(DSDMA)、1,2-二油烯基氧基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷(DODMA)、2,2-二亚油基-4-(3-二甲氨基丙基)--二氧杂环戊烷(DLin-K-C3-DMA)、2,2-二亚油基-4-(3-二甲氨基丁基)-[1,3]-二氧杂环戊烷(DLin-K-C4-DMA)、DLen-C2K-DMA、γ-DLen-C2K-DMA以及(DLin-MP-DMA)(也称为1-B11)。
还有的其他阳离子脂质可包括(但不限于)2,2-二亚油基-5-二甲氨基甲基-[1,3]-二恶烷(DLin-K6-DMA)、2,2-二亚油基-4-N-甲基哌嗪并-[1,3]-二氧杂环戊烷(DLin-K-MPZ)、1,2-二亚油基氨甲酰基氧基-3-二甲基氨基丙烷(DLin-C-DAP)、1,2-二亚油基氧基-3-(二甲氨基)乙酰氧基丙烷(DLin-DAC)、1,2-二亚油基氧基-3-吗啉基丙烷(DLin-MA)、1,2-二亚油酰基-3-二甲基氨基丙烷(DLinDAP)、1,2-二亚油基硫基-3-二甲基氨基丙烷(DLin-S-DMA)、1-亚油酰基-2-亚油氧基-3-二甲基氨基丙烷(DLin-2-DMAP)、1,2-二亚油氧基-3-三甲基氨基丙烷氯盐(DLin-TMA.Cl)、1,2-二亚油酰基-3-三甲基氨基丙烷氯盐(DLin-TAP.Cl)、1,2-二亚油氧基-3-(N-甲基哌嗪基)丙烷(DLin-MPZ)、3-(N,N-二亚油基氨基)-1,2-丙二醇(DLinAP)、3-(N,N-二油烯基氨基)-1,2-丙二醇(DOAP)、1,2-二亚油基氧代基-3-(2-N,N-二甲氨基)乙氧基丙烷(DLin-EG-DMA)、N,N-二油基-N,N-二甲基氯化铵(DODAC)、N-(l-(2,3-二油烯基氧基)丙基)-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTMA)、N,N-二硬脂基-N,N-二甲基溴化铵(DDAB)、N-(l-(2,3-二油酰氧基)丙基)-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTAP)、3-(N-(N',N'-二甲基氨基乙烷)-氨甲酰基)胆固醇(DC-Chol)、N-(l,2-二肉豆蔻基氧基丙-3-基)-N,N-二甲基-N-羟乙基溴化铵(DMRIE)、2,3-二油烯基氧基-N-[2(精胺-甲酰胺基)乙基]-N,N-二甲基-1-丙铵三氟乙酸盐(DOSPA)、二十八烷基酰胺基甘胺酰基精胺(DOGS)、3-二甲氨基-2-(胆甾-5-烯-3-β-氧基丁-4-氧基)-1-(顺，顺-9,12-十八碳二烯氧基)丙烷(CLinDMA)、2-[5'-(胆甾-5-烯-3-β-氧基)-3’-氧杂戊烯氧基)-3-二甲基-1-(顺,顺-9',1-2'-十八碳二烯氧基)丙烷(CpLinDMA)、N,N-二甲基-3,4-二油烯基氧基苯甲胺(DMOBA)、1,2-N,N'-二油烯基氨甲酰基-3-二甲基氨基丙烷(DOcarbDAP)、1,2-N,N'-二亚油基氨甲酰基-3-二甲基氨基丙烷(DLincarbDAP)、地塞米松(dexamethasone)-精胺(DS)和二取代的精胺(D2S)或其混合物。
可使用多种市售阳离子脂质制剂，诸如
Figure BDA0003759084060000381
(包括DOTMA和DOPE，可购自GIBCO/BRL)以及
Figure BDA0003759084060000382
(包含DOSPA和DOPE，可购自GIBCO/BRL)。
在某些实施方案中，阳离子脂质可以约10重量％的LNP至约85重量％的脂质纳米颗粒或约50重量％的LNP至约75重量％的LNP的量存在。
固醇可赋予LNP流动性。如本文中所使用的，“固醇”是指植物(植物固醇)或动物(动物固醇)来源的任何天然存在的固醇以及非天然存在的合成固醇，其都通过类固醇A-环的3-位置处的羟基的存在表征。固醇可以是常规用于脂质体、脂质囊泡或脂质颗粒制剂的领域的任何固醇，最通常为胆固醇。植物固醇可包括菜油固醇、谷固醇以及豆固醇。固醇还包括经固醇修饰的脂质，诸如美国专利申请公开2011/0177156中所描述的脂质。在某些实施方案中，固醇可以约5重量％的LNP至约50重量％的脂质纳米颗粒或约10重量％的LNP至约25重量％的LNP的量存在。
LNP可包含中性脂质。中性脂质可包含在生理pH下以不带电或中性两性离子形式存在的任何脂质物质。这种脂质包括(但不限于)二酰基磷脂酰胆碱(diacylphosphatidylcholine)、二酰基磷脂酰乙醇胺(diacylphosphatidylethanolamine)、神经酰胺、鞘磷脂、二氢鞘磷脂、脑磷脂和脑苷脂。对中性脂质的选择一般通过尤其考虑粒度和必要稳定性来进行指导。在某些实施方案中，中性脂质组分可以是具有两个酰基的脂质(例如，二酰基磷脂酰胆碱和二酰基磷脂酰乙醇胺)。
具有不同链长和饱和度的多种酰基链基团的脂质是可用的，或可通过公知技术分离或合成。在某些实施方案中，可使用含有饱和脂肪酸且碳链长度介于C14至C22的范围内的脂质。在某些实施方案中，使用具有单或二不饱和脂肪酸且碳链长度介于C14至C22的范围内的脂质。另外，可使用具有饱和与不饱和脂肪酸链的混合物的脂质。示例性的中性脂质包括(但不限于)1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰基-乙醇胺(DOPE)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DSPC)、1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(POPC)或任何相关磷脂酰胆碱。中性脂质也可由鞘磷脂、二氢鞘磷脂或具有其他头基的磷脂(诸如丝氨酸和肌醇)构成。
在某些实施方案中，中性脂质可以约0.1重量％的脂质纳米颗粒至约75重量％的LNP或约5重量％的LNP至约15重量％的LNP的量存在。
LNP包封的蛋白酶、糖苷酶或重组病毒载体可掺入至医药组合物(例如医药学上可接受的载剂或赋形剂)中。这种医药组合物尤其适用于活体内或离体向受试者施用及递送LNP包封的蛋白酶、糖苷酶或重组病毒载体。
LNP制剂可与额外组分合并，所述额外组分可包括例如(但不限于)聚乙二醇(PEG)及固醇。
术语“PEG”是指聚乙二醇，一种具有两个末端羟基的乙烯PEG重复单元的线性可溶于水的聚合物。PEG根据其分子量分类；例如PEG 2000具有约2,000道尔顿的平均分子量，且PEG 5000具有约5,000道尔顿的平均分子量。PEG可购自Sigma Chemical Co.及其他公司，且包括例如以下功能性PEG：单甲氧基聚乙二醇(MePEG-OH)、单甲氧基聚乙二醇-丁二酸酯(MePEG-S)、单甲氧基聚乙二醇-丁二酸丁二酰亚胺酯(MePEG-S-NHS)、单甲氧基聚乙二醇-胺(MePEG-NH2)、单甲氧基聚乙二醇-三氟乙磺酸酯(MePEG-TRES)以及单甲氧基聚乙二醇-咪唑基-羰基(MePEG-IM)。
在某些实施方案中，PEG可以是具有约550至约10,000道尔顿的平均分子量的聚乙二醇且任选地经烷基、烷氧基、酰基或芳基取代。在某些实施方案中，PEG可在末端羟基位置处经甲基取代。在某些实施方案中，PEG可具有约750至约5,000道尔顿、或约1,000至约5,000道尔顿、或约1,500至约3,000道尔顿、或约2,000道尔顿或约750道尔顿的平均分子量。PEG可任选地经烷基、烷氧基、酰基或芳基取代。在某些实施方案中，末端羟基可经甲氧基或甲基取代。
经PEG修饰的脂质包括美国专利No.8,936,942和No.7,803,397中所描述的PEG-二烷氧基丙基共轭物(PEG-DAA)。适用的经PEG修饰的脂质(或脂质-聚氧化乙烯共轭物)可具有多个“锚定”脂质部分以将PEG部分固定于脂质囊泡的表面上。合适的经PEG修饰的脂质的实施例包括经PEG修饰的磷脂酰乙醇胺以及磷脂酸、美国专利No.5,820,873中所描述的PEG-神经酰胺共轭物(例如，PEG-CerC14或PEG-CerC20)、经PEG修饰的二烷基胺和经PEG修饰的二酰基氧基丙-3-胺。在某些实施方案中，经PEG修饰的脂质可以是经PEG修饰的二酰基甘油和二烷基甘油。在某些实施方案中，PEG可呈约0.5重量％的LNP至约20重量％的LNP或约5重量％的LNP至约15重量％的LNP的量。
此外，LNP可以是经PEG修饰的以及经固醇修饰的LNP。与额外组分合并的LNP可以是相同的或单独的LNP。换言之，相同的LNP可经PEG修饰和固醇修饰，或替代地，第一LNP可经PEG修饰且第二LNP可经固醇修饰。任选地，可合并第一和第二经修饰的LNP。
在某些实施方案中，在包封之前，LNP可具有在约10nm至500nm或约50nm至约200nm或75nm至约125nm的范围内的大小。在某些实施方案中，LNP包封的蛋白酶、糖苷酶或重组病毒载体可以具有在约10nm至500nm的范围内的大小。
术语“核酸”和“多核苷酸”在本文可互换使用，是指所有形式的核酸，寡核苷酸，包括脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)。核酸包括基因组DNA，cDNA和反义DNA，以及剪接或未剪接的mRNA，rRNA tRNA和抑制性DNA或RNA(RNAi，例如，小或短发夹(sh)RNA，微小RNA(miRNA)，小或短干扰(si)RNA，反式剪接RNA或反义RNA)。
核酸包括天然存在的、合成的和有意修饰或改变的多核苷酸。核酸可以是单、双或三链，线性或环状，并且可以具有任何长度。在讨论核酸时，本文中可以根据在5’至3’方向上提供序列的惯例描述特定多核苷酸的序列或结构。
“异源”多核苷酸或核酸序列是指为了将多核苷酸通过载体介导转移/递送至细胞中的目的而插入至质粒或载体中的多核苷酸。异源核酸序列不同于病毒核酸，即相对于病毒核酸而为非天然的。一旦转移/递送至细胞中，则可表达(例如，如果适宜，转录和翻译)包含于载体内的异源核酸序列。替代地，不需要表达含于载体内的在细胞中的被转移/递送的异源多核苷酸。尽管参考核酸序列及多核苷酸时本文中并未始终使用术语“异源”，但即使在修饰语“异源”不存在的情况下，提及的核酸序列或多核苷酸也意指包括异源核酸序列及多核苷酸，尽管有省略也如此。
“转基因”在本文中用于方便地指代拟被引入或已引入至细胞或生物体中的核酸。转基因包括任何核酸，诸如异源多核苷酸序列或编码蛋白质或肽的异源核酸。术语转基因以及异源核酸/多核苷酸序列在本文中可互换地使用。
在某些实施方案中，异源多核苷酸编码选自由以下项组成的群组的蛋白：用于治疗庞贝病的GAA(酸性α-葡糖苷酶)；用于治疗威尔森氏病的ATP7B(铜转运ATPase2)：用于治疗法布里氏病的α-半乳糖苷酶；用于治疗1型瓜氨酸血症的ASS1(精氨酸琥珀酸盐合成酶)；用于治疗1型高歇氏病的P-葡萄糖脑苷酶；用于治疗泰-萨克斯病的β-己醣胺酶A；用于治疗也称为C1抑制剂缺乏I型和II型的遗传性血管性水肿(HAE)的SERPING1(C1蛋白酶抑制剂或C1酯酶抑制剂(C1EI))；以及用于治疗I型肝糖贮积病(GSDI)的葡萄糖-6-磷酸酶。
在某些实施方案中，异源核酸编码选自由以下项组成的群组的蛋白：胰岛素、胰高血糖素、生长激素(GH)、甲状旁腺激素(PTH)、生长激素释放因子(GRF)、促卵泡激素(FSH)、促黄体素(LH)、人绒毛膜促性腺激素(hCG)、血管内皮生长因子(VEGF)、血管生成素、血管生长抑制素、粒细胞集落刺激因子(GCSF)、促红细胞生成素(EPO)、结缔组织生长因子(CTGF)、碱性成纤维母细胞生长因子(bFGF)、酸性成纤维母细胞生长因子(aFGF)、表皮生长因子(EGF)、转变生长因子α(TGFα)、血小板衍生的生长因子(PDGF)、胰岛素生长因子I和II(IGF-I和IGF-II)、TGFβ、激活素、抑制素、骨形态形成蛋白(BMP)、神经生长因子(NGF)、脑源性神经营养因子(BDNF)、神经营养素NT-3及NT4/5、睫状神经营养因子(CNTF)、胶细胞系衍生的神经营养因子(GDNF)、神经营养因子、凝集素、轴突引导因子-1和轴突引导因子-2、肝细胞生长因子(HGF)、肝配蛋白(ephrin)、头蛋白(noggin)、音猬因子(sonic hedgehog)和酪氨酸羟化酶。
在某些实施方案中，异源多核苷酸编码酸性α-葡糖苷酶(GAA)。将包含编码GAA的异源多核苷酸的重组病毒载体施用于患有庞贝病或另一种糖原贮积病的受试者可导致GAA蛋白的表达。GAA蛋白在患者体内的表达可以起到压制、抑制或减少糖原积累、防止糖原积累或降解糖原的作用，这进而可以减少或降低庞贝病或另一种糖原贮积病的一种或多种不良反应。
在某些实施方案中，异源多核苷酸编码选自由以下项组成的群组的蛋白：血小板生成素(TPO)、白介素(IL-1至IL-36，等等)、单核细胞趋化蛋白、白血病抑制因子、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、Fas配体、肿瘤坏死因子α及β、干扰素α、β及γ、干细胞因子、flk-2/flt3配体、IgG、IgM、IgA、IgD及IgE、嵌合免疫球蛋白、人源化抗体、单链抗体、T细胞受体、嵌合T细胞受体、单链T细胞受体、I类和II类MHC分子。
在某些实施方案中，异源多核苷酸编码CFTR(囊肿性纤维化跨膜调节因子蛋白)、血液凝结(凝固)因子、(因子XIII、因子IX、因子VIII、因子X、因子VII、因子VIIa、蛋白C等)、功能获得型血液凝结因子、抗体、视网膜色素上皮特异性65kDa蛋白(RPE65)、促红细胞生成素、LDL受体、脂蛋白脂肪酶、鸟氨酸转氨甲酰酶、β-球蛋白、α-球蛋白、血影蛋白、α-抗胰蛋白酶、腺苷脱氨酶(ADA)、金属转运蛋白(ATP7A或ATP7)、磺酰胺酶、涉及溶酶体贮积病的酶(ARSA)、次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶、β-25葡萄糖脑苷酶、鞘磷脂酶、溶酶体己糖醛酸酶脱氢酶、分支链酮酸去氢酶、激素、生长因子、类胰岛素生长因子1或2、血小板衍生的生长因子、表皮生长因子、神经生长因子、神经营养因子-3及-4、脑源性神经营养因子、神经胶质衍生的生长因子、转变生长因子α和β、细胞介素、α-干扰素、β-干扰素、干扰素-γ、白介素-2、白介素-4、白介素12、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、淋巴毒素、自杀基因产物、单纯疱疹病毒胸苷激酶、胞嘧啶脱氨酶、白喉毒素、细胞色素P450、脱氧胞苷激酶、肿瘤坏死因子、药物抗性蛋白、肿瘤抑制剂蛋白(例如，p53、Rb、Wt-1、NF1、希佩尔-林道综合征(VonHippel-Lindau，VHL)、结肠腺瘤息肉病(APC))、具有免疫调节属性的肽、耐受性或免疫原性肽或蛋白Tregitope或hCDRl、胰岛素、葡糖激酶、鸟苷酸环化酶2D(LCA-GUCY2D)、Rab护航蛋白1(无脉络膜)、LCA5(LCA-lebercilin)、鸟氨酸酮酸氨基转移酶(回旋形萎缩)、视网膜劈裂素1(X连锁视网膜劈裂症)、USH1C(阿瑟氏综合征(Usher's Syndrome)1C)、X连锁色素性视网膜炎GTP酶(XLRP)、MERTK(AR形式的RP：色素性视网膜炎)、DFNB1(连接蛋白26耳聋)、ACHM 2、3和4(色盲)、PKD-1或PKD-2(多囊性肾病)、TPP1、CLN2、硫酸酯酶、N-乙酰氨基葡萄糖-1-磷酸酯转移酶、组织蛋白酶A、GM2-AP、NPC1、VPC2、鞘脂激活蛋白、用于基因组编辑的一或多个锌指核酸酶或者用作基因组编辑的修复模板的一或多个供体序列。
在某些实施方案中，异源多核苷酸编码：用于治疗贫血的促红细胞生成素(EPO)；用于治疗各种免疫病症、病毒感染及癌症的干扰素-α、干扰素-β及干扰素-γ；用于治疗各种发炎性疾病或免疫缺陷的白介素(IL)，包括IL-1至IL-36中的任一者以及对应受体；用于治疗免疫病症的趋化因子，包括趋化因子(C-X-C基序)配体5(CXCL5)；用于治疗诸如克罗恩氏病(Crohn's disease)的免疫病症的粒细胞集落刺激因子(G-CSF)；用于治疗各种人类发炎性疾病的粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)；用于治疗各种人类发炎性疾病的巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)；用于治疗上皮组织损伤的角质细胞生长因子(KGF)；用于治疗反复流产、HIV相关的并发症及胰岛素抗性的趋化因子，诸如单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)；用于治疗各种免疫病症的肿瘤坏死因子(TNF)及受体；用于治疗肺气肿或慢性阻塞性肺病(COPD)的α1-抗胰蛋白酶：用于治疗黏多糖病I(MPS I)的α-L-艾杜糖醛酸酶(iduronidase)；用于治疗OTC缺乏的鸟氨酸转氨甲酰酶(OTC)；用于治疗苯酮尿症(PKU)的苯丙氨酸羟化酶(PAH)或苯丙氨酸氨解离酶(PAL)；用于治疗脂蛋白脂肪酶缺乏症的脂蛋白脂肪酶；用于治疗载脂蛋白(Apo)A-I缺乏症的载脂蛋白；用于治疗家族性高胆固醇血症(FH)的低密度脂蛋白受体(LDL-R)；用于治疗低白蛋白血症的白蛋白；卵磷脂胆固醇转酰酶(LCAT)；氨甲酰基合成酶I；精氨酸琥珀酸盐合成酶；精氨酸琥珀酸盐解离酶；精氨酸酶；反丁烯二酰基乙酰乙酸盐水解酶(fumarylacetoacetate hydrolase)；胆色素原脱氨酶；用于治疗高膀氨酸尿症的胱硫醚P-合成酶；分支链酮酸去羧酶；异戊酰基-CoA去氢酶；丙酰基CoA羧化酶；甲基丙二酰基-CoA突变酶；戊二酰基CoA去氢酶：胰岛素；丙酮酸盐羧化酶；肝磷酸化酶；磷酸化酶激酶；甘氨酸去羧酶；H-蛋白；T-蛋白；囊肿性纤维化跨膜调节因子(CFTR)；用于治疗斯特格氏病(Stargardt disease)的ATP-结合盒、亚家族A(ABC1)、成员4(ABCA4)；或者肌缩蛋白。
由“多核苷酸”序列编码的“多肽”、“蛋白”和“肽”包括全长天然序列(与天然存在的蛋白一样)以及功能子序列、修饰形式或序列变体，只要所述子序列、修饰形式或变体保留了天然全长蛋白的一定程度的功能即可。在本发明中，由所述多核苷酸序列编码的此类多肽、蛋白和肽可以但不必须与在治疗的哺乳动物中有缺陷或表达不足或缺乏的内源蛋白相同。
在某些实施方案中，异源多核苷酸编码抑制性核酸，抑制性核酸选自由以下项组成的群组：siRNA、反义分子、miRNA、RNAi、核糖核酸酶和shRNA。
在某些实施方案中，抑制性核酸与基因、基因的转录物或与选自由以下组成的群组的多核苷酸重复疾病相关联的基因的转录物结合：亨廷顿蛋白(huntingtin，HTT)基因、与齿状核红核苍白球路易体萎缩症(atrophin1，ATN1)相关联的基因、脊髓延髓肌肉萎缩的X染色体上的雄激素受体、人类Ataxin-1、-2、-3及-7、Cav2.1P/Q压敏钙通道(CACNA1A)、TATA-结合蛋白、Ataxin 8相对链(ATXN8OS)、脊髓小脑失调(1、2、3、6、7、8、12、17型)中的丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶2A55 kDa调节亚单位Bβ同工型、X脆性综合征中的FMR1(X脆性智力迟钝1)、X脆性相关联的震颤/失调综合征中的FMR1(X脆性智力迟钝1)、XE脆性智力迟钝中的FMR1(X脆性智力迟钝2)或AF4/FMR2家族成员2；肌强直性营养不良中的肌强直蛋白激酶(MT-PK)；弗里德希氏共济失调(Friedreich's ataxia)中的共济蛋白；肌肉萎缩性侧索硬化中的超氧化歧化酶1(SOD1)基因的突变体；涉及帕金森氏病和/或阿尔兹海默氏症的发病机制的基因；载脂蛋白B(APOB)及9型前蛋白转换酶枯草杆菌蛋白酶/kexin(PCSK9)，高胆固醇血症；HIV Tat，HIV感染中的转录基因的人类免疫缺乏病毒转活化剂；HIV TAR，HIV感染中的人类免疫缺乏病毒转活化剂反应元件基因；HIV感染中的C-C趋化因子受体(CCR5)；RSV感染中的劳斯(Rous)肉瘤病毒(RSV)核衣壳蛋白、丙型肝炎病毒感染中的肝脏特异性微RNA(miR-122)；p53、急性肾损伤或肾脏移植中的移植功能延迟(delayed graft functionkidney transplant)或肾损伤急性肾衰竭；晚期复发或转移性实体恶性肿瘤中的蛋白激酶N3(PKN3)；LMP2，LMP2也称为9型蛋白酶体亚单位β(PSMB9)、转移性黑素瘤；LMP7，也称为8型蛋白酶体亚单位β(PSMB8)、转移性黑素瘤；MECL1，也称为10型蛋白酶体亚单位β(PSMB10)、转移性黑素瘤；实体肿瘤中的血管内皮生长因子(VEGF)；实体肿瘤中的驱动蛋白轴蛋白、慢性骨髓白血病中的细胞凋亡抑制剂B细胞CLL/淋巴瘤(BCL-2)；实体肿瘤中的核糖核苷酸还原酶M2(RRM2)；实体肿瘤中的弗林蛋白酶(Furin)；肝脏肿瘤中的保罗类激酶(polo-likekinase)1(PLK1)、丙型肝炎感染中的二酰基甘油酰基转移酶1(DGAT1)、家族性腺瘤性息肉病中的β-连环蛋白；β2肾上腺素激导性受体、青光眼；糖尿病黄斑水肿(DME)或年龄相关黄斑变性中的RTP801/Redd1，也称为DNA破坏诱发性转录物4蛋白；年龄相关黄斑变性或脉络膜新生血管中的血管内皮生长因子受体I(VEGFR1)、非动脉炎缺血视神经病变中的凋亡蛋白酶2；先天性甲肥厚中的角蛋白6A N17K突变蛋白；流感感染中的A型流感病毒基因组/基因序列：SARS感染中的重度急性呼吸道综合征(SARS)冠状病毒基因组/基因序列；呼吸道融合性病毒感染中的呼吸道融合性病毒基因组/基因序列；埃博拉(Ebola)感染中的埃博拉纤丝病毒基因组/基因序列；乙型和丙型肝炎感染中的乙型和丙型肝炎病毒基因组/基因序列；HSV感染中的单纯疱疹病毒(HSV)基因组/基因序列、柯萨奇病毒(coxsackievirus)B3感染中的柯萨奇病毒B3基因组/基因序列；原发性肌张力障碍中的基因(等位基因特异性沉默)类耐扭蛋白(torsin)A(TOR1A)的病原性等位基因的沉默、在移植中具有特异性的泛I类(pan-class I)和HLA-等位基因；以及常染色体显性遗传性色素性视网膜炎(adRP)中的突变视紫红质基因(RHO)。
重组病毒载体剂量可以任何合适的剂量施用。通常，剂量将在至少1×108或更高的载体基因组/千克受试者体重(vg/kg)的范围内(例如1×109、1×1010、1×1011、1×1012、1×1013或1×1014或更高的载体基因组/千克受试者体重(vg/kg))，以达到治疗效果。小鼠的AAV剂量在1×1010-1×1011vg/kg范围内有效，狗的AAV剂量在1×1012-1×1013vg/kg范围内有效。更特别地，剂量为约1×1011vg/kg至约5×1014vg/kg(含端点)、或约5×1011vg/kg至约1×1014vg/kg(含端点)、或约5×1011vg/kg至约5×1013vg/kg(含端点)、或约5x1011vg/kg至约1x1013vg/kg(含端点)、或约5×1011vg/kg至约5×1012vg/kg(含端点)、或约5×1011vg/kg至约1×1012vg/kg(含端点)。剂量可以是例如约5×1014vg/kg，或小于约5×1014vg/kg，例如从约2×1011至约2×1014vg/kg(含端点)的剂量，特别是，例如，约2×1012vg/kg、或约6×1012vg/kg、或约2×1013vg/kg。
在某些实施方案中，向受试者施用减少IgG与FcRn相互作用的药剂会减少重组病毒载体的剂量，所述重组病毒载体包含对受试者的基因治疗有效所需的治疗性异源多核苷酸。在某些实施方案中，向受试者施用减少IgG与FcRn相互作用的药剂允许施用增加剂量的包含治疗性异源多核苷酸的重组病毒载体。
在某些实施方案中，除了向受试者施用减少IgG与FcRn相互作用的药剂外，还向受试者施用蛋白酶和/或糖苷酶会减少重组病毒载体的剂量，所述重组病毒载体包含对受试者的治疗有效所需的治疗性异源多核苷酸。在某些实施方案中，除了向受试者施用减少IgG与FcRn相互作用的药剂之外，还向受试者施用蛋白酶和/或糖苷酶，允许施用增加剂量的包含治疗性异源多核苷酸的重组病毒载体。
剂量可以变化并且取决于治疗所针对的疾病的类型，发作，进展，严重程度，频率，持续时间或可能性，期望的临床终点，受试者的既往或同时治疗、总体健康、年龄、性别、种族或免疫能力以及本领域技术人员应理解的其他因素。剂量，数量，频率或持续时间可按比例增加或减少，如治疗或疗法的任何不良副作用、并发症或其他危险因素以及受试者的状况所指示。本领域技术人员将理解可影响提供足以提供治疗或预防益处的量所需的剂量和时序的因素。
获得治疗效果的剂量，例如以载体基因组/千克体重(vg/kg)表示的剂量，将基于若干个因素而变化，这些因素包括但不限于：给药途径，达到治疗效果所需的异源多核苷酸表达的水平，治疗的特定疾病，对重组病毒载体的任何宿主免疫应答，对异源多核苷酸或表达产物(蛋白质或肽或转录的核酸)的宿主免疫应答以及表达的蛋白质或肽或转录的核酸的稳定性。本领域技术人员可以基于上述因素以及其他因素来确定用于治疗患有特定疾病或病症的患者的重组病毒载体基因组剂量范围。
“有效量”或“足够量”是指一定数量，其以单剂量或多剂量，单独或与一种或多种其他组合物、治疗、试验方案或治疗方案药剂组合，在受试者中或向受试者提供任何持续时间(长期或短期)的可检测到的反应、任何可测量或可检测的程度或任何持续时间内(例如，数分钟、数小时、数天、数月、数年或已治愈)预期或期望的结果或益处。用于治疗(例如，改善或提供治疗益处或改进)的“有效量”或“足够量”的剂量通常有效地提供可测量程度的针对一种、多种或所有不良症状，疾病的后果或并发症，一种或多种例如由疾病引起或与之相关的不良症状、病症、疾病、病状或并发症的反应，虽然疾病的进展或恶化的降低、减少、抑制、制止、限制或控制是令人满意的结果。
有效量或足够的量可以但不必在单次给药中提供，可以需要多次给药，并且可以但不必单独给药或与另一种组合物(例如药剂)、治疗、试验方案或治疗方案组合给药。例如，该量可以根据受试者的需要，所治疗疾病的类型，状态和严重性或治疗的副作用(如果有的话)所指示来按比例增加。另外，如果以单剂量或多剂量施用而没有第二种组合物(例如另一种药物或药剂)、治疗、试验方案或治疗方案，则有效量或足够的量不必有效或充足，因为可以包括大于或超过所述剂量的额外的剂量、数量或持续时间，或额外的组合物(例如，药物或药剂)，治疗，试验方案或治疗方案，以便被认为在给定的受试者中有效或足够。被认为有效的量还包括导致减少使用另一种治疗、治疗方案或试验方案(例如施用用于治疗溶酶体贮积病(例如庞贝病)的重组GAA，或施用用于治疗凝血障碍(例如血友病A(HemA)或血友病B(HemB)的重组凝血因子蛋白质(例如FVIII或FIX))的量。
针对庞贝病(Pompe disease)，有效量将为例如抑制或减少肝糖产生或积聚、增强或增加肝糖降解或去除、减少受试者的身体组织中的溶酶体改变或提高受试者的肌肉张力和/或肌肉强度和/或呼吸道功能的GAA量。举例而言，有效量可通过利用来自血浆的成肌细胞确定GAA摄入动力学来测定。约141-147nM的成肌细胞GAA摄入比率(K摄入)可呈现为有效的(参见例如e.g.,Maga et al.,J.Biol.Chem.2012)。在动物模型中，大于约1,000nmol/hr/mL(例如，约1,000至约2,000nmol/hr/mL)的血浆中的GAA活性水平已经观测到在治疗学上是有效的。
对于HemA和HemB，通常来说，认为为了达到治疗效果，需要凝血因子浓度大于正常受试者中发现的凝血因子浓度的1％，以改变重症的疾病表型为中度疾病表型。严重的表型以关节损伤和威胁生命的出血为特征。为了将中度疾病表型转化为轻度疾病表型，相信需要大于正常值的5％的凝血因子浓度。
在正常人类中FVIII和FIX含量为约150-200ng/mL血浆，但可以更少(例如，约100-150ng/mL的范围)或更多(例如，约200-300ng/mL的范围)且归因于如例如通过活化部分促凝血酶原激酶时间(aPTT)单阶段凝固测定所确定的功能性凝固，仍视为正常。因此，治疗作用可以实现以使得受试者/人类中的FVIII或FIX的总量大于正常受试者/人类中存在的FVIII或FIX的1％，例如，100-300ng/mL的1％。
组合物可作为组合组合物施用，或与递送或施用包含异源多核苷酸的重组病毒载体(之前或之后)分开地(诸如并行地或连续或按顺序)施用。本发明提供其中本发明的方法和用途与任何化合物、试剂、药物、治疗疗法、治疗方案、过程、治疗物或组合物组合的组合，如本文所述或本领域技术人员已知的。化合物、试剂、药物、治疗疗法、治疗方案、过程、治疗物或组合物可在施用包含异源多核苷酸的重组病毒载体之前、基本上同时或之后施用或执行。
因此，本发明尤其包括导致减少对另一种化合物、药剂、药物、治疗方案、治疗试验方案、方法或疗法的需要或使用的方法和用途。例如，对于血液凝固疾病，如果在给定的受试者中为补充该受试者中缺乏或有缺陷的(异常或突变的)内源性凝血因子而施用重组凝固因子蛋白的频率较少或剂量减少或消除施用，则根据本发明的治疗的方法具有治疗益处。在另一个示例中，对于溶酶体贮积病，例如庞贝病，即使先前已施用较低频率或减少剂量的包含GAA的重组病毒载体，或继续施用于受试者，则根据本发明的治疗方法也具有治疗益处。因此，减少对另一种治疗或疗法的需要或使用包括在本发明中。
有效量或足够量不必对每个治疗的受试者有效，也不必对在给定的群组或群体中大多数治疗的受试者有效。有效量或足够量是指在特定受试者而非群组或普遍群体中有效或充分。作为这类方法的典型情况，一些受试者对给定的治疗方法或用途表现出更大的反应，或更少或没有反应。
术语“改善”是指受试者的疾病或其症状或潜在的细胞反应的可检测或可测量的改善。可检测或可测量的改善包括主观或客观上减少，降低、抑制、制止、限制或控制疾病的发生、频率、严重程度、进展或持续时间、或由疾病引起或与之相关的并发症、或改善疾病的症状、根本病因或后果、或疾病的逆转。对于庞贝病，有效量将是例如抑制或减少糖原产生或积累、增强或增加糖原降解或去除、改善肌张力和/或肌肉力量和/或呼吸功能的量。对于HemA或HemB，有效量将是例如减少受试者中急性出血发作的频率或严重性的量，或例如减少通过例如凝血检定测量的凝血时间的量。
因此，本发明的医药组合物包括其中包含有效量的活性成分以实现预期的治疗目的的组合物。使用本领域已知的技术和指导并使用本文提供的教导，确定治疗有效剂量完全在熟练医师的能力范围内。
治疗剂量将取决于，除其他因素外，受试者的年龄和一般状况，异常表型的严重性以及调节表达水平的控制序列的强度。因此，对人类的治疗有效量将落入一个相对宽的范围内，该范围可以由医师根据单个患者对基于载体的治疗的反应来确定。这样的剂量可以是单独的或与免疫抑制剂或药物组合。
可向受试者递送诸如医药组合物之类的组合物，以便允许转基因表达及任选地所编码蛋白的产生。在某些实施方案中，医药组合物包含足够的遗传物质以使得受试者能够产生治疗有效量的血液凝固因子来改善受试者的止血。在某些实施方案中，药物组合物包含足够的异源多核苷酸以使受试者能够产生治疗有效量的GAA。
在某些实施方案中，在受试者中治疗效果持续一段时间，例如2-4、4-6、6-8、8-10、10-14、14-20、20-25、25-30或30-50天或更长时间，例如50-75天，75-100天，100-150天，150-200天或更长时间。因此，在某些实施方案中，重组病毒载体提供治疗效果。
在某些实施方案中，重组病毒载体在没有免疫抑制剂的情况下提供治疗效果。在某些实施方案中，在向受试者施用重组病毒载体之前、基本上同时或之后向受试者施用至少一种免疫抑制剂。
在某些实施方案中，免疫抑制剂是抗炎剂。在某些实施方案中，免疫抑制剂是类固醇。在某些实施方案中，免疫抑制剂是泼尼松、泼尼松龙、钙调神经磷酸酶抑制剂、环孢菌素(例如环孢素A)、他克莫司、霉酚酸酯、CD52抑制剂(例如阿仑单抗)、CTLA4-Ig(例如，阿巴西普、贝拉西普)、抗CD3 mAb、抗LFA-1mAb(例如，依法珠单抗(efalizumab))、抗CD40 mAb(例如，ASKP1240)、抗CD22 mAb(例如，依帕珠单抗)、抗CD20 mAb(例如,利妥昔单抗(rituximab)、奥瑞珠单抗(orelizumab)、奥法木单抗(ofatumumab)、维妥珠单抗(veltuzumab))、雷帕霉素或其衍生物。其他特定试剂包括稳定化合物。可用于根据本发明的方法的其他免疫抑制剂包括，例如但不限于，TACI-Ig(例如，阿他西普(atacicept))、抗-C5 mAb(例如，依库珠单抗)、霉酚酸酯、硫唑嘌呤(azathioprine)、西罗莫司、依维莫司、TNFR-Ig(例如，依那西普
Figure BDA0003759084060000511
抗-TNF mAb(例如，阿达木单抗
Figure BDA0003759084060000515
英夫利昔单抗(
Figure BDA0003759084060000512
Figure BDA0003759084060000513
))、托法替尼、抗-IL-2R(例如，巴利昔单抗)、抗-IL-17mAb(例如苏金单抗(secukinumab))、抗IL-6mAb(例如抗IL-6抗体西鲁库单抗(sirukumab)、抗IL-6受体抗体托珠单抗
Figure BDA0003759084060000514
IL-10抑制剂、TGF-β抑制剂、B细胞靶向抗体(例如利妥昔单抗)、蛋白酶体抑制剂(例如，硼替佐米)、哺乳动物雷帕霉素靶点(mTOR)抑制剂(例如雷帕霉素)、合成疫苗颗粒(SVPTM)-雷帕霉素(封装在可生物降解纳米颗粒中的雷帕霉素)、静脉丙种球蛋白(IVIG)、奥马珠单抗、甲氨蝶呤、酪氨酸激酶抑制剂(例如，依鲁替尼)、B细胞激活因子(BAFF)抑制剂(例如，抗-BAFF mAb，例如，贝利单抗(belimumab))、增殖诱导配体(APRIL)抑制剂、抗-IL-1b mAb(例如，卡那单抗(
Figure BDA0003759084060000516
))、C3a抑制剂、Tregitope(参见，例如，US10,213,496)，或其组合和/或衍生物。
组合物可在任何无菌、生物兼容性医药载剂(包括(但不限于)盐水、缓冲盐水、右旋糖及水)中施用。组合物可单独或与影响剂量、施用频率和/或治疗功效的其他试剂组合向患者施用。
本发明的方法和用途包括全身地、区域性地或局部地或通过任何途径，例如通过注射或输注，进行递送和给药。药物组合物在体内的递送通常可以通过使用常规注射器的注射来完成，尽管设想了其他递送方法，例如对流增强给药(参见例如美国专利号5,720,720)。例如，组合物可以通过皮下、表皮、皮内、鞘内、眶内、粘膜内、腹膜内、静脉内、胸膜内、动脉内、口服、肝内、经由门静脉内或肌内递送。其他给药方式包括口服和肺部给药，栓剂和透皮施加。专门治疗患有血液凝结病症患者的临床医师可以根据许多标准(包括但不限于：患者的状况和治疗目的(例如，增加GAA、增强血液凝结等))，确定施用腺病毒相关载体的最佳途径。
根据本发明的治疗方法包括组合疗法，所述组合疗法包括额外使用任何化合物、试剂、药物、治疗或其他治疗疗法或具有期望的治疗、有益、累加、协同或互补活性或作用的方案。示例性的组合组合物和治疗包括第二活性剂，诸如生物制剂(蛋白)、试剂(例如，免疫抑制剂)及药物。这种生物制剂(蛋白)、试剂、药物、治疗及疗法可在根据本发明的任何其他治疗方法之前、实质上同时或之后施用或执行，该任何其他治疗方法例如治疗受试者的诸如庞贝病之类的溶酶体贮积病的治疗方法或治疗受试者的诸如HemA或HemB的血液凝固疾病的治疗方法。
化合物、试剂、药物、治疗或其他治疗疗法或方案可作为组合组合物施用，或与递送或施用核酸、载体、重组型载体(例如，重组病毒载体)或重组型病毒颗粒(之前或之后)分开地(诸如并行地或连续或按顺序)施用。本发明因此提供根据本发明的治疗方法与任何化合物、试剂、药物、治疗疗法、治疗方案、过程、治疗物或组合物组合的组合，如本文所述或本领域技术人员已知的。化合物、试剂、药物、治疗疗法、治疗方案、过程、治疗物或组合物可在施用根据本发明向患者或受试者施用的核酸、载体、重组型载体(例如，重组病毒载体)或重组型病毒颗粒之前、实质上同时或之后施用或执行。
在某些实施方案中，向受试者施用减少IgG与FcRn相互作用的药剂可导致阻止中和抗体、与异源多核苷酸结合的抗体和/或与由异源多核苷酸编码的蛋白质或肽结合的抗体的发展。如本文所述，可在向受试者施用病毒载体之前、与施用病毒载体基本上同时、或在施用病毒载体之后向这样的受试者施用减少IgG与FcRn的相互作用的药剂。
在某些实施方案中，向具有预先存在的抗体的受试者施用减少IgG与FcRn相互作用的药剂导致中和抗体、与异源多核苷酸结合的抗体和/或与由异源多核苷酸编码的蛋白质或肽结合的抗体的减少。在施用减少IgG与FcRn相互作用的药剂后，然后可以根据本文的方法对此类受试者施用重组病毒载体。在施用重组病毒载体后，可以任选地评估此类受试者是否存在剩余的预先存在的抗体。替代地，可在预定量的时间过去后，对此类受试者施用重组病毒载体，在此期间减少IgG与FcRn相互作用的药剂导致受试者中任何此类预先存在的抗体减少或消除。
在某些实施方案中，向受试者施用减少IgG与FcRn相互作用的药剂可导致至少20％至50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％的中和抗体、与异源多核苷酸结合的抗体和/或与由异源多核苷酸编码的蛋白质或肽结合的抗体的减少、降解或消化，如从施用重组病毒载体的受试者获得的生物样品中的此类抗体的测量所反映的。在某些实施方案中，根据本发明的方法减少、降解或消化至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％的中和抗体，和/或与异源多核苷酸结合的抗体和/或与由异源多核苷酸编码的蛋白质或肽结合的抗体。
可以分析的来自受试者的生物样品的非限制性示例包括全血、血清、血浆等，以及它们的组合。生物样品可以没有细胞，或者可以包括细胞(例如，红细胞、血小板和/或淋巴细胞)。
在某些实施方案中，受试者生物样品中存在的中和抗体可减少、降解或消化至小于约1:25，其中1份生物样品稀释在25毫升缓冲液中导致50％的重组病毒载体中和。在某些实施方案中，受试者的生物样品中存在的中和抗体可以减少、降解或消化至小于约1:20、小于约1:15、小于约1:10、小于约1:5、小于约1:4、小于约1:3、小于约1:2、或小于约1:1，其中1份生物样品分别稀释在20、15、10、5、4、3，2或1份缓冲液导致50％的重组病毒载体中和。
生物样品中AAV中和抗体的示例性分析和测量在本文中公开并且还在美国专利申请公开2016/0123990中进行了描述。可以通过确定平衡结合常数来测量抗体与Fc受体的结合。抗体与Fc受体结合的减少由IgG:FcR相互作用的平衡结合常数的增加来确定。
根据本发明的方法适用于功能丧失以及增益和功能遗传缺陷。如本文所使用的，关于遗传缺陷的术语“功能丧失”是指基因中的任何突变，其中由所述基因编码的蛋白质(即突变蛋白质)表现出部分或全部丧失通常与野生型蛋白质相关的功能。如本文所用，关于遗传缺陷的术语“功能获得”是指基因中的任何突变，其中由所述基因编码的蛋白质(即突变蛋白质)获得通常不与该蛋白质相关的功能(即野生型蛋白质)导致或促成疾病或病症。功能获得性突变可以是基因中一个或多个核苷酸的缺失、添加或替换，这会导致编码蛋白质的功能发生变化。在某些实施方案中，功能获得性突变改变突变蛋白质的功能或引起与其他蛋白质的相互作用。在某些实施方案中，功能获得性突变导致正常野生型蛋白质减少或去除，例如，通过改变的突变蛋白质与所述正常野生型蛋白质的相互作用来实现。
可以通过根据本发明的方法治疗的疾病和病症包括，例如但不限于：肺病(例如，囊性纤维化)、出血性疾病(例如，具有或不具有抑制剂的血友病A或血友病B)、地中海贫血、血液疾病(例如，贫血)、阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病、肌萎缩侧索硬化(ALS)、癫痫、溶酶体贮积病、(例如，天冬氨酰氨基葡萄糖尿、贝敦氏病、晚期婴儿神经元蜡样脂褐质沉积症2型(CLN2)、胱氨酸病、法布里病、戈谢病I、II和III型、糖原贮积病II(庞贝病)、GM2-神经节苷脂沉积症I型(泰-萨克斯病)、GM2-神经节苷脂沉积症II型(桑德霍夫病)、粘脂贮积病I型(唾液酸贮积病I型和II型)、II型(I细胞病)、III型(假贺勒氏病)和IV型、粘多糖贮积病(贺勒氏病及其变体、亨特氏病、山菲利普氏症A、B、C、D型、莫奎欧氏症A和B型、马罗托-拉米和史莱氏病)、尼曼-皮克病A/B型、C1和C2型、辛德勒病I型和II型)、遗传性血管性水肿(HAE)、铜或铁积累障碍(例如威尔逊病或门克斯病)、溶酶体酸性脂肪酶缺乏症、神经或神经退行性疾病、癌症、1型或2型糖尿病、腺苷脱氨酶缺乏症、代谢缺陷(例如糖原贮积病)、实体器官(例如脑、肝、肾、心脏)疾病或传染性病毒(例如乙型和丙型肝炎、艾滋病毒等)、细菌或真菌病。
II型糖原贮积病，也称为庞贝病，可以通过根据本发明的方法进行治疗。庞贝病是一种常染色体隐性遗传疾病，由编码溶酶体酶酸性α-葡萄糖苷酶(GAA)的基因的突变引起，GAA催化糖原的降解。所产生的酶缺乏导致身体所有组织中糖原的病理性积累和溶酶体改变，从而导致心脏、呼吸和骨骼肌功能障碍(van der Ploeg et al.,2008,Lancet,372:1342-1353)。
可以通过根据本发明的方法治疗的凝血障碍包括，例如但不限于：血友病A、具有抑制性抗体的血友病A、血友病B、具有抑制性抗体的血友病B、任何凝血因子VII、VIII、IX、X、XI、V、XII、II缺乏症、血管性血友病因子或FV/FVIII联合缺乏症、地中海贫血、维生素K环氧化物还原酶C1缺乏症或γ-羧化酶缺乏症。
可以通过根据本发明的方法治疗的其他疾病和病症包括，例如但不限于：贫血、与创伤、损伤、血栓形成、血小板减少症、中风、凝血病、弥散性血管内凝血(DIC)相关的出血；与肝素、低分子量肝素、五糖、华法林、小分子抗血栓药(即FXa抑制剂)或血小板疾病(例如伯-苏氏综合征(Bernard Soulier syndrome)、血小板无力症(Glanzmannthrombasthenia)或贮存池缺陷症)相关的过度抗凝。
在某些实施方案中，受试者患有影响或发源于中枢神经系统(CNS)的疾病或者神经退化性疾病，例如但不限于：阿尔兹海默氏症、亨廷顿氏病、ALS、遗传性痉挛性半身麻痹、原发性侧索硬化、脊髓性肌萎缩、肯尼迪氏病(Kennedy's disease)、多谷氨酰胺重复疾病或帕金森氏病。在某些实施方案中，CNS或神经退化性疾病为多谷氨酰胺重复疾病，例如但不限于：脊髓小脑失调(SCA1、SCA2、SCA3、SCA6、SCA7或SCA17)。
本发明可用于人类和兽医医学应用。因此，合适的受试者包括哺乳动物，例如人类，以及非人类哺乳动物。术语“受试者”是指动物，通常是哺乳动物，例如人，非人灵长类动物(猿，长臂猿，大猩猩(gorilla)，黑猩猩(chimpanzee)，猩猩(orangutan)，猕猴)，家畜(狗和猫)，农场动物(家禽，例如鸡和鸭，马，牛，山羊，绵羊，猪)和实验动物(小鼠，大鼠，兔子，豚鼠)。人类受试者包括胎儿，新生儿，婴儿，少年和成人受试者。受试者还包括动物疾病模型，例如患有蛋白质/酶缺陷(例如庞贝病(GAA的丧失))和糖原贮积病(GSD)以及本领域技术人员已知的其他疾病的小鼠和其他动物模型。
本发明提供了其中包含包装材料和一种或多种组分的试剂盒。试剂盒通常包括标签或包装插页，该标签或包装插页包括组分的描述或其中的组分在体外、体内或离体使用的说明。试剂盒可包含此类组分(例如核酸、重组载体、病毒(例如，AAV、慢病毒)载体、或病毒颗粒)、减少IgG与FcRn相互作用的药剂(例如，抗FcRn抗体、FcRn结合肽、FcRn结合亲和体、小分子FcRn拮抗剂)和任选地降解或消化抗体的蛋白酶和/或糖苷酶的集合。
试剂盒是指容纳试剂盒的一种或多种组分的物理结构。包装材料可以无菌地保持组分，并且可以由通常用于这种目的的材料(例如，纸、波纹纤维、玻璃、塑料、箔、安瓿、小瓶、管等)制成。
标签或插页可包括其中的一种或多种组分的识别信息、剂量、有效成分的临床药理，该临床药理包括作用机理、药代动力学和药效学。标签或插页可以包含标识制造商、批号、制造地点和日期、有效期的信息。标签或插页可包含标识制造商信息、批号、制造商地址和日期的信息。标签或插页可包含有关可能使用试剂盒组分的疾病的信息。标签或插页可包括针对临床医生或受试者在方法、用途或治疗设计方案或治疗方案中使用一种或多种试剂盒组分的说明。所述说明可以包括剂量、频率或持续时间，以及用于实施本文所述的任何方法、用途、治疗设计方案或预防或治疗方案的说明书。
标签或插页可包括关于组分可提供的任何益处(例如预防或治疗益处)的信息。标签或插页可以包括有关潜在的不良副作用，并发症或反应的信息，例如关于不适用于特定组合物的情况而对受试者或临床医生的警告信息。当受试者已经、将要或正在服用一种或多种可能与所述组合物不相容的其他药物时，或者当受试者已经、将要或正在接受另一种可能与所述组合物不相容的治疗设计方案或治疗方案时，也可能发生不良的副作用或并发症，因此，所述说明中可包含有关此类不相容的信息。
标签或插页包括“印刷品”，例如纸或纸板，或单独或附着于组分、试剂盒或包装材料(例如盒子)，或附于包含试剂盒组分的安瓿、试管或小瓶。
除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。尽管与本文描述的那些类似或等同的方法和材料可以用于本发明的实施或测试中，但是本文描述了合适的方法和材料。
本文引用的所有专利、专利申请、出版物和其他参考文献，GenBank引用和ATCC引用均通过引用整体并入本文。如有冲突，将以说明书(包括定义)为准。
本文公开的所有特征可以以任何组合进行组合。说明书中公开的每个特征可以由具有相同、等同或相似目的的替代特征代替。因此，除非另有明确说明，否则公开的特征是等效或类似特征的类别的示例。
如本文使用的，单数形式的“一”，“一个(and)”和“该”包括复数对象，除非上下文另外明确指出。因此，例如，提及“一个核酸”包括多个这样的核酸，提及“一个载体”包括多个这样的载体，并且提及“一种病毒”或“颗粒”包括多种这样的病毒/颗粒。
如本文所使用的术语“约”是指与基础参数相差在10％(即，正负10％)以内的值。例如，“约1:10”表示1.1:10.1或0.9:9.9，约5小时表示4.5小时或5.5小时等。一串值开头的术语“约”将每个值调整10％。
除非上下文另外明确指出，否则所有数值或数值范围均包括该范围内的整数以及该范围内该数值或整数的分数。因此，举例来说，提及减少95％或更多包括减少95％、96％、97％、98％、99％、100％等，以及95.1％、95.2％、95.3％、95.4％、95.5％等，96.1％、96.2％、96.3％、96.4％、96.5％等，依此类推。因此，也为了说明，提及的诸如“1-4”之类的数值范围包括2、3以及1.1、1.2、1.3、1.4等，依此类推。例如，“1至4周”包括7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27天或28天。
此外，提及的数值范围，例如“0.01到10”，包括0.011、0.012、0.013等，以及9.5、9.6、9.7、9.8、9.9等。例如，受试者体重约“0.01mg/kg至约10mg/kg”的剂量包括0.011mg/kg、0.012mg/kg、0.013mg/kg、0.014mg/kg、0.015mg/kg等，以及9.5mg/kg、9.6mg/kg、9.7mg/kg、9.8mg/kg、9.9mg/kg等，依此类推。
提及的带有多于(大于)或小于的整数分别包括大于或小于所提及的数的任何数。因此，例如，提及的多于2包括3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15等，依此类推。例如，施用重组病毒载体、蛋白酶和/或糖苷酶“两次或更多次”包括施用3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15次或更多次。
此外，提及的数值范围，例如“1到90”，包括1.1、1.2、1.3、1.4、1.5等，以及81、82、83、84、85等，依此类推。例如，“约1分钟至约90天之间”包括1.1分钟、1.2分钟、1.3分钟、1.4分钟、1.5分钟等，以及1天、2天、3天、4天、5天……81天、82天、83天、84天、85天等，依此类推。
本文一般使用肯定性语言来公开本发明，以描述本发明的众多实施方案。本发明还具体包括其中全部或部分地排除特定主题的实施方案，特定主题例如物质或材料，方法步骤和条件，设计方案或程序。例如，在本发明的某些实施方案中，排除了材料和/或方法步骤。因此，即使本发明在本文中通常并未就本发明不包括的内容进行表述，但是本文中公开了未在本发明中明确排除的方面。
已经描述了本发明的多个实施方案。然而，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，本领域技术人员可以对本发明进行各种改变和修饰以使其适应各种用途和条件。因此，以下实施例旨在说明而非以任何方式限制本发明的范围。
实施例
实施例1
抗FcRn抗体和内肽酶的联合治疗
AAV衣壳蛋白特异性IgG(抗衣壳IgG)的存在和发展对AAV基因疗法提出了重大挑战，因为抗衣壳IgG可以抑制或中和细胞和组织的AAV转导。在改进基因治疗的努力中，希望减少和/或去除循环IgG，以使具有预先存在的AAV中和抗体(NAb)的患者能够进行rAAV给药，这是由于自然AAV暴露或由于先前使用rAAV给药所致。
在克服NAb的双重方法中，向受试者实施结合FcRn并抑制IgG与FcRn相互作用的抗体(抗FcRn抗体)的初始治疗方案，随后实施IgG特异性内肽酶(例如IdeS)方案。先前已表明，每周3次在人体中施用抑制FcRn介导的IgG再循环(M281)的抗FcRn抗体可导致血浆中IgG减少高达80％(Ling et al.,2019)。抗FcRn抗体对IgG的预消耗与IdeS施用对IgG的裂解相结合，可以潜在地克服比单独的任一治疗方案显著更高的起始NAb滴度。
将NAb滴度为1:160的受试者分为四个测试组：1)未治疗；2)仅抗FcRn抗体治疗；3)仅IdeS治疗；4)抗FcRn抗体与IdeS联合治疗。抗FcRn抗体通过静脉内、皮下、腹膜内或其他施用途径以0、0.3、3、10、30和60mg/kg(和更高剂量)的单次或多次递增剂量输注。抗FcRn抗体剂量每周(例如)施用一次，持续1、2、3或4周(或更多)，然后通过静脉内、皮下、腹膜内或其他施用途径以0、0.5、1和2mg/kg(和更高剂量)的单次或多次递增剂量输注Ides。在每次治疗之前和之后评估NAb滴度。
实施例2
AAV再给药的兔子模型
兔被注入携带目的转基因的rAAV载体颗粒，以诱导抗AAV NAb。在兔子产生抗AAVNAb滴度后，给它们施用抑制IgG与FcRn相互作用的抗FcRn抗体。例如，给药抗-FcRn抗体以0、0.3、3、10、30和60mg/kg(和更高剂量)的单次或多次递增剂量执行2、3、4周或更长时间。在抗FcRn抗体给药过程后，IdeS以0、0.5、1和2mg/kg(和更高剂量)的单次或多次递增剂量施用。在IdeS施用后24至48小时，兔子被注入额外的携带不同转基因的rAAV颗粒。该模型允许分析不同阶段(包括抗FcRn和IdeS治疗之前和之后以及用rAAV再给药之前和之后)的转导功效。
实施例3
方法
内肽酶体外对免疫球蛋白G(IgG)的裂解：将含有或不含有针对Spk2衣壳的中和抗体(NAb)的人血清或非人灵长类动物(NHP)血浆样品与增加剂量的来自化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)的免疫球蛋白降解酶(IdeS；Promega)一起在37℃下孵育1小时。根据Promega的指示，一个单位定义为在37℃下在30分钟内裂解≥95％的1μg重组单克隆IgG。反应体积用PBS调节。通过SDS-PAGE和考马斯染色评估总IgG的裂解。
裂解的IgG的SDS-PAGE分析：裂解的样品使用
Figure BDA0003759084060000591
LDS样品缓冲液(4X)(ThermoFisher Scientific)制备以用于非还原性SDS-PAGE，并加热至70℃持续10分钟。然后使用MOPS SDS电泳缓冲液通过
Figure BDA0003759084060000592
Novex4-12％Bis-Tris凝胶分析样品。凝胶用考马斯蓝染色。
抗AAV衣壳中和抗体(NAb)滴度：AAV-Spk1或AAV-Spk2衣壳的中和抗体分别使用基于细胞的体外测定和包裹海肾荧光素酶转基因的AAV-Spk1或AAV-Spk2报告载体进行量化。简而言之，将早期传代(小于#26的传代)293E4细胞解冻并以2×104个细胞/200μL/孔接种在平底白色96孔板中。将Ponasterone A(Invitrogen；cat.#H101-01)添加到每个孔中，最终浓度为1μg/mL，以诱导辅助病毒蛋白人腺病毒E4的表达。然后将细胞在37℃/5％CO2培养箱中培养过夜。第二天，样品在56℃下热灭活30分钟，然后使用胎牛血清(FBS)作为稀释剂制备4-点稀释液(从1:1到1:5)。以3.16倍(半对数)连续稀释制备因子测定对照血浆(FACT；King George Bio-Medical,Inc.)以评估测定性能。AAV-荧光素酶载体在DMEM中稀释至7.5×107vg/mL，然后添加到FACT对照和样品中。载体和对照/样品在37℃下孵育60分钟。将每孔7.5μL体积的“中和”对照/样品转移到接种有细胞的板的每个孔中，然后将细胞放回培养箱中进行过夜培养。第二天，细胞在PBS中洗涤一次，在Renilla分析裂解缓冲液(AssayLysis Buffer)中裂解，并用Renilla萤光素酶测定系统(Promega)测量萤光素酶活性且在
Figure BDA0003759084060000601
L酶标仪上读数。
使用IVIg的人工免疫小鼠模型：为了在雄性C57BL/6小鼠中建立人工NAb滴度，将含有10％的从人血中纯化的免疫球蛋白G(IgG)的静脉内免疫球蛋白(IVIg；Gamunex)在静脉内(IV)载体施用前一天腹膜内(IP)注射。为了确定IdeS或IdeZ(一种来自马链球菌的类似内肽酶，其与IdeS相比对小鼠IgG2a和IgG3的活性提高)对IgG的体外裂解是否可以挽救体内转导效率，IVIg用125单位的IdeZ(Promega)处理，在37℃下过夜，然后IP给药。通过SDS-PAGE和考马斯染色评估总IgG的裂解。在IVIg给药后一天，以2×1012vg/kg施用载体(AAV-Spk1-GAA)。每周收集小鼠血浆样品，并分析样品的转基因(GAA酶)的活性。为了确定IdeS对IgG的体内裂解是否可以挽救体内转导效率，通过IP给药注入300mg/kg IVIg。24小时后，通过IV给药输注0.4或4mg/kg IdeS。然后在IdeS输注后24小时，以2×1012vg/kg施用载体(AAV-Spk1-GAA)。
GAA活性测定：GAA活性通过测量底物4-甲基-伞形酮基-α-D-葡萄糖苷在pH4下的裂解来评估(Galjaard et al.,Clin Chim Acta 1973；49(3):361-75)。简而言之，通过将20μL底物添加到在MilliQ水中以1:250稀释的10μL血浆样品中来引发反应。将反应混合物在37℃下孵育1小时，然后用pH 10.5的碳酸盐缓冲液停止反应。标准曲线随后用4-甲基伞形酮进行铺板，4-甲基伞形酮是一种从4-甲基-伞形酮-α-D-葡萄糖苷中释放出来的蓝色荧光染料，其在370nm激发时会产生440nm的荧光发射。
抗AAV衣壳IgG抗体：用捕获测定法测量了抗AAV衣壳总IgG的形成。ELISA板孔用50μL的含有1μg/mL AAV-Spk1衣壳颗粒的溶液包被。稀释总人IgG(Southern Biotech，0150-01)以生成10-点标准曲线，范围从10000ng/mL到0.5ng/mL，并添加到板中。反算后，测定的定量限为460ng/mL。制备了三个水平的质量控制样品，并将其包括在每个板上以评估测定性能。衣壳颗粒，标准品和质控品(QC)在4℃下孵育过夜。洗涤后，在室温下用在PBS中的2％BSA、0.05％Tween-20封闭孔2小时。然后，将样品在封闭缓冲液中的系列稀释液加载到板上，并在室温下孵育2小时。将以1:5000在封闭缓冲液中稀释的辣根过氧化物酶(HRP)偶联的绵羊抗人IgG抗体(GE Healthcare，cat.#NA933V)用作检测抗体，并在板上于室温下孵育1小时。洗涤后，在室温下与3,3',5,5'-四甲基联苯胺底物(TMB)孵育10分钟后显示过氧化物酶活性。用1M硫酸终止反应，然后通过吸光度板读数器读取板在450nm处的光密度(OD)。对照由纯化的人总IgG的连续稀释液制成的标准曲线确定IgG浓度。
实施例4
IdeS在体外裂解来自人、NHP和仓鼠样品的IgG
来自化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)的免疫球蛋白G(IgG)降解酶(IdeS)是一种半胱氨酸蛋白酶，它以高特异性裂解所有四种人类IgG亚类。IdeS在IgG重链的下部铰链区的Gly236处水解人IgG。
为了分析IdeS在血清中裂解IgG的能力，将增加剂量的IdeS(0-100单位；Promega)添加到人血清和NHP(恒河猴)血浆样品中，无论其是否具有抗Spk2 NAb滴度。在初始(<1:1)或具有相对中等范围(1:5-1:10)或相对高(1:20-1:40)NAb滴度的人类样品中，最低剂量的IdeS裂解所有IgG(～150kD)以释放Fc片段(～25kD)(图1A)。在NHP样品中，IgG在所有NAb滴度组(<1:1、1:50-1:100、>1:100，图1B)中同样被裂解。
仓鼠有望提供比小鼠更好的模型来检查AAV再次给药的IdeS治疗。通过将增加量的IdeS(0到50个单位；Promega)与合并的仓鼠血浆(合并的人血浆作为阳性对照)一起孵育，测试IdeS裂解仓鼠IgG的能力。通过非还原性SDS-PAGE和考马斯蓝染色分析样品。IdeS在体外可有效裂解合并仓鼠血浆和合并人血浆中的IgG(图1C)。
这些结果表明，IdeS是人IgG、恒河猴IgG和仓鼠IgG的高效和特异性蛋白酶。
实施例5
IdeS对IgG的裂解导致体外NAb滴度降低
为了分析IdeS对IgG的裂解是否足以降低中和作用，在体外测定AAV载体转导效率。在该测定中，可以通过以下方式来评估来自不同物种的血清或血浆样品中是否存在针对AAV衣壳的中和抗体：将编码海肾萤光素酶的AAV载体与血浆或血清预孵育，用这些混合物转导培养中的人类细胞，然后评估荧光素酶活性水平。
初始(<1:1)或具有高抗Spk2 NAb滴度(1:10-1:20)的人类患者血清样品在有或没有过量IdeS(50个单位)的情况下进行预处理，然后评估NAb滴度。有趣的是，在一项研究中，先前报告的NAb滴度为1:10-1:20的患者样品显示在IdeS预处理时至少降低了两倍至1:5-1:10的NAb滴度。
(表1)。这些结果表明，当IgG抗体被IdeS裂解时，AAV载体转导增加。
表1–用过量IdeS孵育的人血清的抗Spk2NAb滴度分析。
研究1
Figure BDA0003759084060000621
研究2
样品# Spark ID IdeS 载体 先前滴度 滴度范围
S1 FBS 否 Spk2 NA <1:1
S2 FBS 是 Spk2 NA <1:1
S3 BRH1450399 否 Spk2 1:2.5 1:2.5
S4 BRH1450399 是 Spk2 1:2.5 1:1
S5 BRH1450436 否 Spk2 ～1:5 1:5
S6 BRH1450436 是 Spk2 ～1:5 1:1
S7 BRH1450427 否 Spk2 1:10 1:10
S8 BRH1450427 是 Spk2 1:10 1:10
用IdeS内肽酶处理后的抗Spk2 NAb滴度分析。人类患者样品(由Spark ID指定)在使用和不使用IdeS的情况下进行了预处理。随后通过体外载体转导测定评估NAb滴度
实施例6
IdeZ体外降解IVIg增加了体内载体的转导效率
IgG抗体的效应物功能(例如细胞毒性和补体固定)由Fc部分介导。中和依赖于重链和轻链的可变区对抗原的特异性。虽然F(ab')2片段仍包含完整的抗原结合区，但数据表明IdeS或IdeZ(IdeS或IdeZ是马链球菌中的一种类似内肽酶，其对小鼠IgG2a和IgG3具有活性)释放F(ab')2片段在没有Fc部分的情况下导致稳定性降低，因此F(ab')2片段从循环中的清除速度比完整的IgG更快。该测定测试了施用被IdeS或IdeZ预裂解的中和抗体是否会导致体内环境中对AAV中和活性的降低。
用IVIg使小鼠免疫，IVIg是人类IgG的集合，包括用或不用0.1mg/kg IdeZ预处理的抗AAV衣壳中和抗体。然后给小鼠施用2×1012vg/kg AAV-Spk1-GAA。与对照小鼠(33,551±13,635nmol/hr/mL)相比，用1.0mg或5.0mg IVIg治疗的小鼠导致血浆中GAA活性水平降低(分别为10,951±1,554nmol/hr/mL和1,041±553nmol/hr/mL))表明IVIg对载体的中和是剂量依赖性的(图2)。
用IdeZ预处理40mg/kg IVIg挽救了转导效率，导致GAA活性水平(37,707±11,449nmol/hr/mL)与对照相当。200mg/kgIVIg的IdeZ预处理部分减轻了载体中和作用(13,440nmol/hr/mL±15,543)，其中一只动物完全恢复活性(41,025nmol/hr/mL)。值得注意的是，IdeZ本身不会干扰AAV载体转导效率。用考马斯染色通过SDS-PAGE分析IVIg剂量保留以确认IgG的裂解。这些结果表明，IdeS/IdeZ对AAV衣壳的中和抗体的体外裂解可以挽救体内AAV载体转导和转基因表达。
实施例7
IdeS在体内降解IVIg增加了载体在体内的转导效率
为了分析体内IgG的裂解是否会影响血浆中的载体转导和转基因表达/活性，首先给小鼠注入完整的IVIg以产生人抗衣壳中和IgG的人工滴度。24小时后，给小鼠输注两种浓度(0.4mg/kg或4mg/kg)的IdeS，然后在IdeS输注24小时后，给所有小鼠施用2×1012vg/kgAAV-Spk1-GAA。在IdeS输注前和IdeS输注后(紧接在载体施用之前)分析了抗Spk1 NAb滴度和IgG水平。
IdeS输注诱导NAb(图3)和IgG水平(图4)的剂量依赖性降低。最高剂量的IdeS(4mg/kg)能够将至少1:40的NAb滴度降低到<1:1。
在载体输注后一周测量GAA活性时，仅施用载体的对照小鼠显示GAA活性水平为49,387±7,345nmol/hr/mL(图5)。注射300mg/kg IVIg的小鼠在血浆中表现出GAA转基因活性水平(1,702±336nmol/hr/mL)，与几乎完全抑制转导一致。IdeS表现出对转基因活性水平的剂量依赖性挽救；0.4mg/kg IdeS导致挽救了70％的GAA活性(34,408±10,562nmol/hr/mL)，而4mg/kg IdeS挽救了99％的GAA活性(48,948±5,322nmol/hr/mL)。这些结果表明，体内IdeS治疗降低了中和抗体滴度，并且使得能在对治疗无效的动物中给药和转导AAV载体。
实施例8
IdeS在体内降解IVIg增加了载体在体内的转导效率
评估了IdeS在体内裂解更高滴度的抗衣壳IgG的能力，以及在更高程度的AAV载体中和的情况下挽救AAV转导的能力。给小鼠(雄性C57BL/6)输注不同剂量的完整人IVIg(300mg/kg(低)、800mg/kg(中)或1600mg/kg(高)以产生人工滴度的人抗-衣壳中和IgG。在24小时后，给小鼠输注三种浓度(0.4mg/kg(低)、1mg/kg(中)或2mg/kg(高))的IdeS。在IdeS输注24小时后，以2×1012vg/kg对小鼠施用AAV-Spk1-GAA。使用实施例1中描述的抗AAV衣壳NAb滴度测定法，在IdeS输注前和IdeS输注后(紧接在载体施用之前)测定抗Spk1NAb滴度。如实施例1中所述，载体施用两周后，通过使用GAA活性测定法测量血浆中的转基因产物(GAA)活性来评估AAV转导。
对于所有剂量的IVIg，用IdeS预处理产生了AAV NAb滴度的剂量依赖性降低(表2)。表2显示了每组中每只动物在IdeS输注前后的中和抗Spk1抗体(NAb)滴度。AAV NAb滴度被指定为低(<1:1，1:1–1:2.5)、中低范围(1:2.5–1:5)、中高范围(1:5–1:10)和高(>1:10–1:20)。最高剂量的IdeS(2mg/kg)能够将>1:160(用1600mg/kg IVIg产生)的NAb滴度降低到1:1-1:2.5。
表2–IdeS输注前后小鼠血浆中的抗NAb滴度。
Figure BDA0003759084060000651
图6显示了在载体输注后两周测量的GAA活性结果。阴性对照小鼠(仅施用载体)的血浆显示GAA活性水平为26,689±12,420nmol/hr/mL。注射300mg/kg(或更高)IVIg且未接收IdeS的小鼠展示血浆GAA活性水平仅为436±41nmol/hr/mL，这与AAV载体转导的NAb抑制一致。与前面实施例中的结果一致，IdeS预处理导致AAV载体转导的剂量依赖性挽救，如通过血浆中的GAA活性水平测得的：0.4mg/kg IdeS导致GAA活性水平为7,702±4,710nmol/hr/mL、1mg/kg IdeS导致GAA活性水平为15,444±4,226nmol/hr/mL，而2mg/kg IdeS导致GAA活性水平为14,375±2,572nmol/hr/mL。
接收更高剂量的IVIg(800或1600mg/kg IVIg)的组表现出GAA活性水平随IdeS增加而呈剂量依赖性增加的类似趋势。使用800mg/kg IVIg、0.4mg/kg IdeS导致GAA活性水平为4,188±2,549nmol/hr/mL，1mg/kg IdeS导致GAA活性水平为17,813±11,283nmol/hr/mL，而2mg/kg IdeS导致GAA活性水平为26,846±7,354nmol/hr/mL。使用1600mg/kg IVIg，0.4mg/kg IdeS导致GAA活性水平为580±217nmol/hr/mL，1mg/kg IdeS导致GAA活性水平为12,511±1,602nmol/hr/mL，而2mg/kg IdeS导致GAA活性水平为11,573±1,313nmol/hr/mL。在最高剂量的IVIg(1600mg/kg)下，最低的IdeS剂量(0.4mg/kg)未能挽救载体转导。然而，在1600mg/kg剂量的IVIg下，循环中存在超生理水平的总IgG，这可能由于其底物量的增加而降低了0.4mg/kg剂量的IdeS的有效性。
这些结果表明，IdeS体内治疗降低了中和抗体滴度，并允许在对病毒载体基因疗法治疗方法无效的动物中给药和转导病毒载体。
实施例9
AAV再给药的仓鼠模型
仓鼠被注入携带目标转基因的rAAV载体颗粒，在抗AAV Nab产生后(例如，4周)注射IdeS，并注入携带另一种转基因的额外rAAV颗粒。该模型使得能分析不同阶段(包括IdeS治疗前和后以及用rAAV再给药前和后)的转导功效。
为了评估IdeS降解或降低中和抗体对AAV衣壳的影响的能力，在叙利亚金仓鼠(一个其IgG被内肽酶IdeS有效裂解的物种)中进行了一项研究。首先给仓鼠注入2×1012vg/kgSpk1-FVIII、Spk1-FIX或其他Spk1封装载体。除了通过抗-Spk1 IgG ELISA或基于细胞的中和抗体测定来测量针对Spk1衣壳的NAb的产生外，还监测动物在血浆中的转基因产物(即FVIII、FIX等)的表达。在NAb滴度的产生后，在载体输注的3-5周内，通过静脉内、皮下、腹膜内或其他给药途径以0、0.5、1和2mg/kg(和更高的剂量)的单次或多次递增剂量的IdeS向动物输注。在IdeS施用后，通过测量抗Spk1衣壳IgG和/或针对Spk1的Nab来随访动物。当动物显示出NAb水平充分降低时，他们会被输注2×1012vg/kg Spk1-GAA。转导后，通过GAA活性测定和/或GAA抗原水平测量来测定血浆中的GAA表达以确定所达到的转导水平。
这些研究表明，如果IdeS将体内AAV衣壳特异性NAb降低到足够低的水平，从而能够再给药。对抗FVIII IgG(如果在体内产生)的测量可提供有关IdeS在减少转基因产品靶向NAb方面的有效性的信息，以及在失去有效性之前允许的IdeS再给药的轮数。
实施例10
AAV再给药的食蟹猴模型
为了评估IdeS在大型动物模型中降解或减少NAb对AAV衣壳的影响的能力，在食蟹猴(Macaca fascicularis)中进行了一项研究。首先筛选猴子是否存在针对Spk1衣壳的预先存在的NAb。NAb阳性动物可能是由于在野外或群居中暴露于天然存在的AAV所致。根据阴性或阳性NAb滴度将动物分组，如果是阳性，则根据预先存在的NAb滴度有多高进行分组。
在该研究的再给药分支中，动物被给药2×1012vg/kg Spk1-FIX，或其他Spk1封装载体。除了通过抗-Spk1 IgG ELISA或基于细胞的NAb测定来测量针对Spk1衣壳的NAb的产生外，还监测动物在血浆中的转基因产物(即FIX或其他)的表达。在NAb滴度的产生后，在载体输注的3-5周内，通过静脉内、皮下、腹膜内或其他给药途径以0、0.5、1和2mg/kg，以及更高的剂量的单次或多次递增剂量的IdeS向动物输注。在IdeS施用后，通过测量抗Spk1衣壳IgG和/或针对Spk1的Nab来随访动物。当动物显示出NAb水平充分降低时，他们会被输注2×1012vg/kg Spk1-GAA。转导后，通过GAA活性测定和/或GAA抗原水平测量来测定血浆中的GAA表达以确定所达到的转导水平。
该研究的一个单独分支评估了IdeS克服预先存在的NAb滴度的能力。表现出不同NAb滴度水平的动物根据滴度进行分组，通过静脉内、皮下、腹膜内或其他给药途径以0、0.5、1和2mg/kg(和更高的剂量)的单次或多次递增剂量的IdeS向动物输注。在IdeS施用后，通过测量抗Spk1衣壳IgG和/或针对Spk1的Nab来随访动物，并且当动物显示出NAb水平充分降低时，他们会被输注2×1012vg/kg Spk1-GAA。转导后，通过GAA活性测定和/或GAA抗原水平测量来测定血浆中的GAA表达以确定所达到的转导水平。
这些研究表明，如果IdeS将体内AAV衣壳特异性NAb降低到足以使得能在食蟹猴中再给药的水平，食蟹猴是一种人类AAV施用的优秀模型。这些研究还显示了可以通过IdeS施用克服的最大预先存在的NAb滴度。对抗FIX IgG(如果在体内产生)的测量可提供有关IdeS在减少转基因产品靶向NAb方面的有效性的信息，以及在失去有效性之前允许的IdeS再给药的轮数。
实施例11
使用IdeS和AAV-Spk1-hFVIII进行小鼠研究
在具有人抗衣壳中和IgG的人工滴度的小鼠中测试了两种不同的IdeS制剂(第1批和第2批)。C57BL/6小鼠在(用AAV给药前)第-2天注射300mg/kg IVIg，然后在(用AAV给药前)第-1天注射1mg/kg IdeS，最后(在给药后)第0天注射5×1010编码人因子VIII的AAV-Spk1载体(AAV-Spk1-hFVIII)的载体基因组。阴性对照动物未接受IVIg或IdeS治疗，“NoIdeS”组仅接受IVIg和AAV-Spk1-hFVIII载体。血浆中的中和抗体滴度在IdeS施用前和后使用与实施例3中所述类似的抗AAV衣壳中和测定法并且使用样品的8点滴度(1:1至1:160)测定，并且在
Figure BDA0003759084060000681
Discover Microplate Reader(Promega)上读取发光度。滴度被确定为发光被抑制>50％的最高稀释度或范围。IdeS治疗前和后的NAb滴度表明，两个IdeS批次均能有效降低小鼠的NAb滴度(图7)。
人FVIII抗原水平通过ELISA在载体输注前和载体输注后1周和2周测量(图8)。两个批次的体内IdeS处理都降低了中和抗体滴度，并允许用AAV载体给药和转基因的表达。
实施例12
用抗AAV-Spk1 IgG进行小鼠研究
给予C57BL/6小鼠IVIg以诱导人抗衣壳中和IgG的人工滴度。使用了三种浓度(300mg/kg(低)、800mg/kg(中)和1600mg/kg(高))的IVIg，在每个IVIg组中，动物用增加剂量的IdeS(0、0.4、1.0、2.0mg/kg)处理。通过ELISA评估抗Spk1衣壳IgG水平。简而言之，96孔板用Spk1空衣壳包被，然后用BSA封闭，洗涤，并与血浆孵育，稀释1:100，持续2小时。孵育后，洗涤板并与缀合有HRP的二抗孵育1小时。随后，再次洗涤板并使用TMB底物显色。在吸光度板读数器上读取板的在450nm下的光密度(OD)。将发光与人IgG的标准曲线进行比较以确定抗体浓度。所有三种浓度的IdeS(0.4、1.0、2.0mg/kg)消除或显著降低了所有三种浓度(低、中和高)的IVIg的抗Spk1衣壳IgG的血清水平(图9)。
实施例13
用抗FcRn抗体和内肽酶进行的小鼠研究
在雄性Tg32小鼠中进行了一项研究，以评估抗FcRn单克隆M281和IgG裂解肽链内切酶IdeS单独或组合降低AAV的中和抗体的能力。
在C57BL/6J背景中(Jackson Laboratory；stock#014565)，Tg32小鼠品系(也称为hFcRn Tg32或FcRn-/-hFcRn系32Tg)是评估基于人IgG和Fc结构域的治疗剂的药代动力学和药效学的标准，并带有敲除突变小鼠Fcgrt(Fc受体，IgG，α链转运蛋白)基因和在其自身天然启动子(hTg32)控制下表达人FCGRT基因的转基因。
每组11只雄性Tg32小鼠通过腹膜内注射(第-1天)用IVIg(以引入中和抗体)或DulbeccoPBS(DPBS)进行预免疫。24小时后(第0天)给小鼠注射M281或PBS，第1天注射IdeS(Promega)或PBS，第2天注射Spk1-FIX(Spk1包裹肝脏特异性启动子FIX表达盒)AAV颗粒(表3)。在IVIg或PBS注射后第0天和第2天，对小鼠采血以收集血浆，用于NAb和抗Spk1IgG分析。有关该研究的详细给药和收集时间表，参见表4。
表3.组和治疗。
Figure BDA0003759084060000691
Figure BDA0003759084060000701
N＝组中小鼠的数量；IV＝静脉注射；RO＝眶后(retroorbital)；vg＝载体基因组
表4.给药和收集时间表。
Figure BDA0003759084060000702
方法
血液采样：在第0、2、9和16天：通过下颌下静脉采集约200μL全血并收集在冰上。弃去第一滴血液，将血液在9800g、4℃下离心10分钟，然后将上清液分装到干净的试管中，获得100μL血浆样品。血浆样品在分析前储存在-80℃下。
体外中和抗体分析：体外测定AAV-Spk1衣壳的中和抗体滴度。简而言之，将HEK-293-E4细胞以每孔20,000个细胞接种到96孔板(Corning，Cat#3595)上。使用补充有1μg/mLPonasterone A(Fisher Scientific,Cat.#H10101)的生长培养基(DMEM,10％FBS,2mM L-谷氨酰胺,1x Pen/Strep)在37℃培养箱中在5％CO2的湿润气氛中培养细胞过夜以诱导人腺病毒蛋白E4的表达。第二天，使用水浴将所有血浆样品在56℃下热灭活30分钟。样品在热灭活的FBS中以2倍连续稀释进行稀释和测试，以评估从1:2.5到1:160稀释的抑制活性。使用因子测定对照血浆(FACT)来评估运行之间的测定性能。将稀释的血浆样品与浓度为1.5×109vg/mL的Spk1-海肾荧光素酶AAV报告病毒预混合，并在37℃下孵育1小时(总体积为80μL)。孵育后，将7.5μL预混合的血浆/AAV溶液添加到HEK-293-E4细胞一式三份的孔中，并在37℃/5％CO2下孵育过夜。第二天，将40μL海肾萤光素酶裂解缓冲液添加到每个孔中的细胞中，并使用
Figure BDA0003759084060000711
发光计测定发光度。中和抗体滴度被报告为与初始血清(仅FBS)相比导致发光度减少50％以上的最低血浆稀释度。
抗-SPK1衣壳IgG ELISA分析：使用人抗AAV Spk1衣壳IgG捕获测定法评估小鼠血浆中抗衣壳IgG的存在。简而言之，ELISA板孔在4℃下用人IgG标准品、质量控制(QC)样品或Spk1衣壳(血浆样品孔)包被过夜。标准曲线由10点、范围从10μg/mL到4.57ng/mL的3倍稀释系列组成，顶部两个点和底部两个点作为锚点。高质量控制(HQC)、中等质量控制(MQC)和低质量控制(LQC)样品由800ng/mL、500ng/mL和12ng/mL的人IgG组成。在包被过夜步骤之后，使用洗板机将板洗涤3次，然后在室温下用稀释缓冲液封闭2小时。如上所述洗涤板，并将稀释的血浆样品(1:100)添加到适当的孔中(仅将稀释缓冲液添加到标准孔和QC孔中)。将板在室温下孵育2小时并如前所述洗涤。将辣根过氧化物酶(HRP)偶联的绵羊抗人IgG抗体添加到板孔中，并在室温下孵育1小时。温育后，如前所述洗涤板。将平衡至室温的TMB添加到板中以进行信号检测。在室温下避光孵育10分钟后，通过添加1M硫酸停止产生信号。通过使用
Figure BDA0003759084060000712
读板器测量450nm处的吸光度来检测信号。测定验收标准基于标准品和QC样品的结果。通过与标准曲线比较，对血浆样品中的抗衣壳IgG水平进行插值。测量值<457ng/mL的样品定义为低于定量限(BQL)。低于可检测吸光度范围的样品被指定为152ng/mL的值，这是检测下限(LOD)。
中和抗体滴度的分析
NAb测定的结果如图10和表5所示。PBS组(第1组)中的几只小鼠的NAb滴度增加。“仅M281”组(第2组)在两天后显著降低了NAb滴度，而“仅IdeS”组(第3组)未显示NAb滴度显著降低。Nab区间(bin)反映允许报告基因表达的血浆稀释水平，并且是对NAb滴度进行分类的一种方式，因为测定中抑制的值可能落在某些值之间。因此，NAb滴度被描述为在这些“区间”或水平之内。
M281和IdeS都降低了中和抗体滴度，联合治疗将所有小鼠减少到低于最低检测限的区间中。单独的M281能够比IdeS更有效地减少NAb。
表5.Nab滴度区间变化
Figure BDA0003759084060000721
抗Spk1衣壳IgG的分析
在第0天和第2天之间，“仅PBS”和“无IVIg”组的抗Spk1 IgG ELISA水平没有变化(图11)。抗Spk1 IgG水平在仅给予M281(第2组)的小鼠中，平均从5.21×103ng/mL(第0天)降低到3.95×103ng/mL(第2天)，在仅给予IdeS(第3组)的小鼠中，从4.21×103ng/mL(第0天)至6.88×102ng/mL(第2天)(表6)。接受M281和IdeS(第4组)的小鼠的抗Spk1 IgG水平均低于检测限，并被指定为152ng/mL的值(图11)。从第0天到第2天，第2组(M281)和第4组(M281+IdeS)中的抗Spk1IgG水平显著降低，但第3组(IdeS)没有。在第2天，与单独的M281或IdeS相比，接受M281和IdeS组合的小鼠具有显著降低的抗Spk1IgG水平。
表6.抗Spk1 IgG的减少
Figure BDA0003759084060000731
a组中所有测试动物的平均值
bELISA检测不到的吸光度水平
结论
因此，M281和IdeS的组合可以将中和抗体水平降低到最低滴度区间，并将抗Spk1衣壳IgG水平降低到检测限以下。这些结果为抗FcRn药物(如抗FcRn抗体)和IdeS的组合策略提供了强有力的支持，以降低高NAb滴度患者的中和抗体水平，从而改善AAV基因治疗。
这些结果表明，在临床前小鼠模型中，抗FcRn单克隆抗体(M281)和IdeS在降低抗衣壳IgG水平方面的效力相当。此外，已证明M281可与IdeS一起用作联合疗法，以将抗衣壳IgG水平降低至检测不到的水平。抗FcRn药物(例如抗FcRn单克隆抗体M281)和IdeS的联合治疗策略可用于将AAV转基因递送至抗衣壳IgG水平可能过高而无法仅通过IdeS治疗有效降低的受试者或患者。
实施例14
用高剂量AAV载体进行的小鼠研究
实施例13的研究是用每只小鼠更高剂量的AAV载体基因组进行的，如表7所示。
表7.组和治疗。
Figure BDA0003759084060000732
Figure BDA0003759084060000741
N＝组中小鼠的数量；IV＝静脉注射；RO＝眶后；vg＝载体基因组
其他分析包括肝脏中载体基因组的定量、肝脏中FIX转基因的mRNA表达的定量以及血浆中FIX抗原的定量。
实施例15
使用抗FcRn药剂以清除NAb并启用基于AAV的基因治疗
单独的IdeS治疗可能无法消除高滴度的AAVNAb，或者可能无法消除或减少足以有效AAV转导的AAV NAb。在受试者可能对AAV具有高NAb的情况下，例如受试者已经服用重组AAV载体的情况下，单独使用IdeS治疗可能无法完全消除如此高水平的NAb。施用抗FcRn剂和IdeS可以更有效地清除高滴度NAb并且实现有效的AAV转导。例如，可以在施用AAV载体之前多次施用抗FcRn剂，然后施用IdeS(参见图12)。
实施例16
重给药兔子研究
新西兰白兔最初被给药携带编码蛋白质的转基因的AAV载体(例如，Spk2-hFIX)，然后“再给药”具有相同衣壳但携带编码不同蛋白质的转基因的AAV载体(例如，Spk2-hFVIII)(图13)。替代方案包括最初使用空AAV载体或其他一些转基因给药，这与“再给药”AAV载体中的不同。在第一AAV剂量和第二AAV剂量之间施用抗-FcRn剂(例如抗-FcRn抗体M281)、IdeS以及抗-FcRn剂和IdeS的组合。
表8.组和治疗。
Figure BDA0003759084060000751
在第28天、第29天测量中和抗体滴度、抗衣壳IgG。
在第58天测量hFIX、hFVIII抗原和载体基因组。
实施例17
抗FcRn研究-食蟹猴
本研究被设计成确定抗FcRn和IdeS联合治疗是否可以在高滴度NAb阳性食蟹猴中实现AAV肝转导。研究示意图(图14)显示在施用IdeS之前每周施用抗FcRn抗体(M281)持续三周，然后施用AAV载体。
表9.组和治疗。
Figure BDA0003759084060000752
Figure BDA0003759084060000761
终点包括第-21天和第1天之间的出血以测量M281和IdeS药代动力学(PK)和药效学(PD)、AAV施用后用于补体分析的多次出血、临床病理学和转基因表达的每周出血、用于T-细胞反应的PBMC、用于生物分布分析的冷冻组织；用于免疫学分析的新鲜组织和用于标准组织病理学的固定组织。
实施例18
Spk1(SEQ ID NO:1):
MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWDLKPGAPKPKANQQKQDNGRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLQAGDNPYLRYNHADAEFQERLQEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVESPVKTAPGKKRPVEPSPQRSPDSSTGIGKKGQQPAKKRLNFGQTGDSESVPDPQPIGEPPAAPSGVGPNTMAAGGGAPMADNNEGADGVGSSSGNWHCDSTWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISNGTSGGSTNDNTYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNEGTKTIANNLTSTIQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFEFSYNFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTQSTGGTAGTQQLLFSQAGPNNMSAQAKNWLPGPCYRQQRVSTTLSQNNNSNFAWTGATKYHLNGRDSLVNPGVAMATHKDDEERFFPSSGVLMFGKQGAGKDNVDYSSVMLTSEEEIKTTNPVATEQYGVVADNLQQQNAAPIVGAVNSQGALPGMVWQNRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPADPPTTFNQAKLASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYYKSTNVDFAVNTEGTYSEPRPIGTRYLTRNL
Spk2(SEQ ID NO:2):
MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWALQPGAPKPKANQQHQDNARGLVLPGYKYLGPGNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLKAGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRLLEPLGLVEEAAKTAPGKKRPVDQSPQEPDSSSGVGKSGKQPARKRLNFGQTGDSESVPDPQPLGEPPAAPTSLGSNTMASGGGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSQWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSQSGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKKLSFKLFNIQVKEVTQNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFQFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLNRTQGTTSGTTNQSRLLFSQAGPQSMSLQARNWLPGPCYRQQRLSKTANDNNNSNFPWTAASKYHLNGRDSLVNPGPAMASHKDDEEKFFPMHGNLIFGKEGTTASNAELDNVMITDEEEIRTTNPVATEQYGTVANNLQSSNTAPTTRTVNDQGALPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQIMIKNTPVPANPPTTFSPAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYNKSVNVDFTVDTNGVYSEPRPIGTRYLTRPL
IdeS的序列，其包括N末端蛋氨酸和信号序列。(SEQ ID NO:3，NCBI参考序列no.WP_010922160.1):
MRKRCYSTSAAVLAAVTLFVLSVDRGVIADSFSANQEIRYSEVTPYHVTSVWTKGVTPPANFTQGEDVFHAPYVANQGWYDITKTFNGKDDLLCGAATAGNMLHWWFDQNKDQIKRYLEEHPEKQKINFNGEQMFDVKEAIDTKNHQLDSKLFEYFKEKAFPYLSTKHLGVFPDHVIDMFINGYRLSLTNHGPTPVKEGSKDPRGGIFDAVFTRGDQSKLLTSRHDFKEKNLKEISDLIKKELTEGKALGLSHTYANVRINHVINLWGADFDSNGNLKAIYVTDSDSNASIGMKKYFVGVNSAGKVAISAKEIKEDNIGAQVLGLFTLSTGQDSWNQTN
IdeS的成熟序列，其缺乏N端蛋氨酸和信号序列。(SEQ ID NO:4，Genbank登录号no.ADF13949.1):
DSFSANQEIRYSEVTPYHVTSVWTKGVTPPANFTQGEDVFHAPYVANQGWYDITKTFNGKDDLLCGAATAGNMLHWWFDQNKDQIKRYLEEHPEKQKINFNGEQMFDVKEAIDTKNHQLDSKLFEYFKEKAFPYLSTKHLGVFPDHVIDMFINGYRLSLTNHGPTPVKEGSKDPRGGIFDAVFTRGDQSKLLTSRHDFKEKNLKEISDLIKKELTEGKALGLSHTYANVRINHVINLWGADFDSNGNLKAIYVTDSDSNASIGMKKYFVGVNSAGKVAISAKEIKEDNIGAQVLGLFTLSTGQDSWNQTN
SEQ ID NO:5至18是来自WO2016/128558的表C的示例性IdeS多肽的序列。
SEQ ID NO:5:
DSFSANQEIRYSEVTPYHVTSVWTKGVTPPANFTQGEDVFHAPYVANQGWYDITKTFNGKDDLLCGAATAGNMLHWWFDQNKDQIKRYLEEHPEKQKINFRGEQMFDVKEAIDTKNHQLDSKLFEYFKEKAFPYLSTKHLGVFPDHVIDMFINGYRLSLTNHGPTPVKEGSKDPRGGIFDAVFTRGDQSKLLTSRHDFKEKNLKEISDLIKKELTEGKALGLSHTYANVRINHVINLWGADFDSNGNLKAIYVTDSDSNASIGMKKYFVGVNSAGKVAISAKEIKEDNIGAQVLGLFTLSTGQDSWNQTN
SEQ ID NO:6:
DSFSANQEIRYSEVTPYHVTSVWTKGVTPPANFTQGEDVFHAPYVANQGWYDITKTFNGKDDLLCGAATAGNMLHWWFDQNKDQIKRYLEEHPEKQKINFKGEQMFDVKEAIDTKNHQLDSKLFEYFKEKAFPYLSTKHLGVFPDHVIDMFINGYRLSLTNHGPTPVKRGSKDPRGGIFDAVFTRGNQSKLLTSRHDFKEKNLKEISDLIKKELTEGKALGLSHTYANVRINHVINLWGADFDSNGNLKAIYVTDSDSNASIGMKKYFVGVNSAGKVAISAKEIKEDNIGAQVLGLFTLSTGQDSWNQTN
SEQ ID NO:7:
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SEQ ID NO:8:
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SEQ ID NO:9:
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SEQ ID NO:10:
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SEQ ID NO:17:
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SEQ ID NO:18:
DDYQRNATEAYAKEVPHQITSVWTKGVTPPANFTQGEDVFHAPYVANQGWYDITKTFNGKDDLLCGAATAGNMLHWWFDQNKDQIERYLEEHPEKQKINFKGEQMFDVKKAIDTKNHQLDSKLFEYFKEKAFPYLSTKHLGVFPDHVIDMFINGYRLSLTNHGPTPVKEGSKDPRGGIFDAVFTRGNQSKLLTSRHDFKEKNLKEISDLIKEELTKGKALGLSHTYANVRINHVINLWGADFDSNGNLKAIYVTDSDSNASIGMKKYFVGVNSAGKVAISAKEIKEDNIGAQVLGLFTLSTGQKSWNQTNGGGHHHHHH
无乳链球菌的对人IgG1特异的IgdE(SEQ ID NO:19,WO2017134274):
NQNNIQETNLVEKNSEDKFIQELNRYKTEIPNFKGFNVWILGDKGYYKNLINLEEIKNIQATLKKERNEEYVFVKLNGKIAHDTTVFLMNKKHKLLKNIEEFKTITQKRLTERGKFPYDTVHSTFEIKDENFIMERLKSSGLSMGKPVDYMGVNGIPIYTKTLSIDNKFAFENNSKDSSYSSNINISEDKIKENDQKILDLIVKSGANNQNLTDEEKVIAFTKYIGEITNYDNEAYRARNVDTEYYRASDLFSVTERKLAMCVGYSVTAARAFNIMGIPSYVVSGKSPQGISHAAVRAYYNRSWHIIDITASTYWKNGNYKTTYSDFIKEYCIDGYDVYDPAKTNNRFKVKYMESNEAFENWIHNNGSKSMLFINESAALKDKKPKDDFVPVTEKEKNELIDKYKKLLSQIPENTQNPGEKNIRDYLKNEYEEILKKDNLFEHEHAEFKESLNLNESFYLQLKKEEKKPSDNLKKEEKPRENSVKERETPAENNDFVSVTEKNNLIDKYKELLSKIPENTQNPGEKNIRNYLEKEYEELLQKDKLFKHEYTEFTKSLNLNETFYSQLKEGEMKLSENPEKGETNTN
假猪链球菌的IgdE降解人IgG1和猪IgG(SEQ ID NO:20,WO2017134274):
RENENVRQLQSENKQMKAVNLQEFSEKLKGEIAENQQFHIFKLGLNNYYIGGVRINELSDLAKNHDFIMIDNRATHNKYGVPHIIIMNKDDVIVHNQEDYNKEMAELTFAGDKPIQSDSYLPQKKRIHALFEIGLDSNRRQLLNAAGLKTPENSVIELDTFKIYSHGLAVDNKYYDEYSHFNNNTNVNITKQRFTENDNLIHNLITTSTAKDQPTDRDKVKTFVMYVANHTIYDWNAANNAVSNISDVNYYLGSDLFSITERKKAMCVGFSTTAARAFNMLGIPAYVVEGKNAQGVDHATARVYYNGKWHTIDGTGFINGNRTRSTLYTESHFRSVGEDSYQLVGLNEDIPFDRNYMKIDKVYEEWAPKQKTADLLLVNKDKSLVGLDRVAYVEPVYVDKNRQDALTQIYKKLKETMESSSKKNPSSGGFSSLLGSASSDIAKLEGSSQLTQEEYDKIHRSMTSILTFFAQLDKDAAEAFEKGNDYKNYLATTKHAQ
IdeZ的完整序列，其可作为NCBI参考序列No.WP014622780.1(SEQ ID NO:21)获得。该序列包括N端甲硫氨酸，后跟33个氨基酸的分泌信号序列。通常去除N端蛋氨酸和信号序列(N端总共34个氨基酸)以形成成熟的IdeZ蛋白：
MKTIAYPNKPHSLSAGLLTAIAIFSLASSNITYADDYQRNATEAYAKEVPHQITSVWTKGVTPLTPEQFRYNNEDVIHAPYLAHQGWYDITKAFDGKDNLLCGAATAGNMLHWWFDQNKTEIEAYLSKHPEKQKIIFNNQELFDLKAAIDTKDSQTNSQLFNYFRDKAFPNLSARQLGVMPDLVLDMFINGYYLNVFKTQSTDVNRPYQDKDKRGGIFDAVFTRGDQTTLLTARHDLKNKGLNDISTIIKQELTEGRALALSHTYANVSISHVINLWGADFNAEGNLEAIYVTDSDANASIGMKKYFVGINAHGHVAISAKKIEGENIGAQVLGLFTLSSGKDIWQKLS
IdeZ的序列，其没有来自完整序列的N端的34个氨基酸(SEQ ID NO:22):
DDYQRNATEAYAKEVPHQITSVWTKGVTPLTPEQFRYNNEDVIHAPYLAHQGWYDITKAFDGKDNLLCGAATAGNMLHWWFDQNKTEIEAYLSKHPEKQKIIFNNQELFDLKAAIDTKDSQTNSQLFNYFRDKAFPNLSARQLGVMPDLVLDMFINGYYLNVFKTQSTDVNRPYQDKDKRGGIFDAVFTRGDQTTLLTARHDLKNKGLNDISTIIKQELTEGRALALSHTYANVSISHVINLWGADFNAEGNLEAIYVTDSDANASIGMKKYFVGINAHGHVAISAKKIEGENIGAQVLGLFTLSSGKDIWQKLS
具有基于IdeZ的N端部分的IdeS/Z杂合体的序列，其没有N端甲硫氨酸和信号序列(在N端总共34个氨基酸)(SEQ ID NO:23):
DDYQRNATEAYAKEVPHQITSVWTKGVTPLTPEQFRYNNEDVFHAPYVANQGWYDITKAFDGKDNLLCGAATAGNMLHWWFDQNKDQIKRYLEEHPEKQKINFNGDNMFDVKKAIDTKNHQLDSKLFNYFKEKAFPGLSARRIGVFPDHVIDMFINGYRLSLTNHGPTPVKEGSKDPRGGIFDAVFTRGNQSKLLTSRHDFKNKNLNDISTIIKQELTKGKALGLSHTYANVSINHVINLWGADFNAEGNLEAIYVTDSDSNASIGMKKYFVGVNAHGHVAISAKKIEGENIGAQVLGLFTLSTGQDSWQKLS
SEQ ID NO:24-43对应于相对于SEQ ID NO:22的IdeZ具有修饰的肽。
SEQ ID NO:24:
DDYQRNATEAYAKEVPHQITSVWTKGVTPLTPEQFRYNNEDVIHAPYLANQGWYDITKAFDGKDNLLCGAATAGNMLHWWFDQNKTEIEAYLSKHPEKQKIIFRNQELFDLKEAIRTKDSQTNSQLFEYFRDKAFPYLSARQLGVMPDLVLDMFINGYYLNVFKTQSTDVKRPYQDKDKRGGIFDAVFTRGNQTTLLTARHDLKNKGLNDISTIIKEELTKGRALALSHTYANVSISHVINLWGADFNAEGNLEAIYVTDSDANASIGMKKYFVGINKHGHVAISAKKIEGENIGAQVLGLFTLSSGKDIWQKLN
SEQ ID NO:25:
DDYQRNATEAYAKEVPHQITSVWTKGVTPLTPEQFRYNNEDVIHAPYLAHQGWYDITKTFNGKDNLLCGAATAGNMLHWWFDQNKTEIEAYLSKHPEKQKIIFNNEELFDLKAAIDTKDSQTNSQLFNYFKEKAFPNLSTRQLGVMPDLVLDMFINGYYLNVFKTQSTDVNRPYQDKDKRGGIFDAVFTRGNQTTLLTARHDFKEKGLKDISTIIKQELTEGRALALSHTYANVSISHVINLWGADFDAEGNLKAIYVTDSDANASIGMKKYFVGINAHGKVAISAKKIEGENIGAQVLGLFTLSSGKDIWQQLS
SEQ ID NO:26:
DSFSANQEIRYSEVTPYHVTSVWTKGVTPLTPEQFRYNNEDVIHAPYLAHQGWYDITKAFDGKDNLLCGAATAGNMLHWWFDQNKTEIEAYLSKHPEKQKIIFNNQELFDLKAAIDTKDSQTNSQLFNYFRDKAFPNLSARQLGVMPDLVLDMFINGYYLNVFKTQSTDVNRPYQDKDKRGGIFDAVFTRGDQTTLLTARHDLKNKGLNDISTIIKQELTEGRALALSHTYANVSISHVINLWGADFNAEGNLEAIYVTDSDANASIGMKKYFVGINAHGHVAISAKKIEGENIGAQVLGLFTLSSGKDIWQKLS
SEQ ID NO:27:
SVWTKGVTPLTPEQFRYNNEDVIHAPYLAHQGWYDITKAFDGKDNLLCGAATAGNMLHWWFDQNKTEIEAYLSKHPEKQKIIFNNQELFDLKAAIDTKDSQTNSQLFNYFRDKAFPNLSARQLGVMPDLVLDMFINGYYLNVFKTQSTDVNRPYQDKDKRGGIFDAVFTRGDQTTLLTARHDLKNKGLNDISTIIKQELTEGRALALSHTYANVSISHVINLWGADFNAEGNLEAIYVTDSDANASIGMKKYFVGINAHGHVAISAKKIEGENIGAQVLGLFTLSSGKDIWQKLS
SEQ ID NO:28:
DDYQRNATEAYAKEVPHQITSVWTKGVTPLTPEQFTQGEDVIHAPYLAHQGWYDITKAFDGKDNLLCGAATAGNMLHWWFDQNKTEIEAYLSKHPEKQKIIFNNQELFDLKAAIDTKDSQTNSQLFNYFRDKAFPNLSARQLGVMPDLVLDMFINGYYLNVFKTQSTDVNRPYQDKDKRGGIFDAVFTRGDQTTLLTARHDLKNKGLNDISTIIKQELTEGRALALSHTYANVSISHVINLWGADFNAEGNLEAIYVTDSDANASIGMKKYFVGINAHGHVAISAKKIEGENIGAQVLGLFTLSSGKDIWQKLS
SEQ ID NO:29:
DDYQRNATEAYAKEVPHQITSVWTKGVTPPEQFTQGEDVIHAPYLAHQGWYDITKAFDGKDNLLCGAATAGNMLHWWFDQNKTEIEAYLSKHPEKQKIIFNNQELFDLKAAIDTKDSQTNSQLFNYFRDKAFPNLSARQLGVMPDLVLDMFINGYYLNVFKTQSTDVNRPYQDKDKRGGIFDAVFTRGDQTTLLTARHDLKNKGLNDISTIIKQELTEGRALALSHTYANVSISHVINLWGADFNAEGNLEAIYVTDSDANASIGMKKYFVGINAHGHVAISAKKIEGENIGAQVLGLFTLSSGKDIWQKLS
SEQ ID NO:30:
DDYQRNATEAYAKEVPHQITSVWTKGVTPPEQFRYNNEDVIHAPYLAHQGWYDITKAFDGKDNLLCGAATAGNMLHWWFDQNKTEIEAYLSKHPEKQKIIFNNQELFDLKAAIDTKDSQTNSQLFNYFRDKAFPNLSARQLGVMPDLVLDMFINGYYLNVFKTQSTDVNRPYQDKDKRGGIFDAVFTRGDQTTLLTARHDLKNKGLNDISTIIKQELTEGRALALSHTYANVSISHVINLWGADFNAEGNLEAIYVTDSDANASIGMKKYFVGINAHGHVAISAKKIEGENIGAQVLGLFTLSSGKDIWQKLS
SEQ ID NO:31:
DDYQRNATEAYAKEVPHQITSVWTKGVTPPEQFTQGEDVIHAPYLAHQGWYDITKAFDGKDNLLCGAATAGNMLHWWFDQNKTEIEAYLSKHPEKQKIIINNQELFDLKAAIDTKDSQTNSQLFNYFRDKAFPNLSARQLGVMPDLVLDMFINGYYLNVFKTQSTDVNRPYQDKDKRGGIFDAVFTRGDQTTLLTARHDLKNKGLNDISTIIKQELTEGRALALSHTYANVSISHVINLWGADFNAEGNLEAIYVTDSDANASIGMKKYFVGINAHGHVAISAKKIEGENIGAQVLGLFTLSSGKDIWQKLS
SEQ ID NO:32:
DDYQRNATEAYAKEVPHQITSVWTKGVTPPEQFTQGEDVIHAPYLAHQGWYDITKAFDGKDNLLCGAATAGNMLHWWFDQNKTEIEAYLSKHPEKQKIIFRNQELFDLKAAIDTKDSQTNSQLFNYFRDKAFPNLSARQLGVMPDLVLDMFINGYYLNVFKTQSTDVNRPYQDKDKRGGIFDAVFTRGDQTTLLTARHDLKNKGLNDISTIIKQELTEGRALALSHTYANVSISHVINLWGADFNAEGNLEAIYVTDSDANASIGMKKYFVGINAHGHVAISAKKIEGENIGAQVLGLFTLSSGKDIWQKLS
SEQ ID NO:33:
DDYQRNATEAYAKEVPHQITSVWTKGVTPPEQFTQGEDVIHAPYLAHQGWYDITKAFDGKDNLLCGAATAGNMLHWWFDQNKTEIEAYLSKHPEKQKIIIRNQELFDLKAAIDTKDSQTNSQLFNYFRDKAFPNLSARQLGVMPDLVLDMFINGYYLNVFKTQSTDVNRPYQDKDKRGGIFDAVFTRGDQTTLLTARHDLKNKGLNDISTIIKQELTEGRALALSHTYANVSISHVINLWGADFNAEGNLEAIYVTDSDANASIGMKKYFVGINAHGHVAISAKKIEGENIGAQVLGLFTLSSGKDIWQKLS
SEQ ID NO:34:
DDYQRNATEAYAKEVPHQITSVWTKGVTPPEQFTQGEDVIHAPYLANQGWYDITKAFDGKDNLLCGAATAGNMLHWWFDQNKTEIEAYLSKHPEKQKIIFRNQELFDLKEAIRTKDSQTNSQLFEYFRDKAFPYLSARQLGVMPDLVLDMFINGYYLNVFKTQSTDVKRPYQDKDKRGGIFDAVFTRGNQTTLLTARHDLKNKGLNDISTIIKEELTKGRALALSHTYANVSISHVINLWGADFNAEGNLEAIYVTDSDANASIGMKKYFVGINKHGHVAISAKKIEGENIGAQVLGLFTLSSGKDIWQKLN
SEQ ID NO:35:
SVWTKGVTPPEQFTQGEDVIHAPYLAHQGWYDITKAFDGKDNLLCGAATAGNMLHWWFDQNKTEIEAYLSKHPEKQKIIFRNQELFDLKAAIDTKDSQTNSQLFNYFRDKAFPNLSARQLGVMPDLVLDMFINGYYLNVFKTQSTDVNRPYQDKDKRGGIFDAVFTRGNQTTLLTARHDLKNKGLNDISTIIKQELTEGRALALSHTYANVSISHVINLWGADFNAEGNLEAIYVTDSDANASIGMKKYFVGINAHGHVAISAKKIEGENIGAQVLGLFTLSSGKDIWQKLS
SEQ ID NO:36:
DDYQRNATEAYAKEVPHQITSVWTKGVTPPEQFTQGEDVIHAPYLAHQGWYDITKAFDGADNLLCGAATAGNMLHWWFDQNKTEIEAYLSKHPEKQKIIFRNQELFDLKAAIDTKDSQTNSQLFNYFRDKAFPNLSARQLGVMPDLVLDMFINGYYLNVFKTQSTDVNRPYQDKDKRGGIFDAVFTRGNQTTLLTARHDLKNKGLNDISTIIKQELTEGRALALSHTYANVSISHVINLWGADFNAEGNLEAIYVTDSDANASIGMKKYFVGINAHGHVAISAKKIEGENIGAQVLGLFTLSSGKDIWQKLS
SEQ ID NO:37:
SVWTKGVTPPEQFTQGEDVIHAPYLAHQGWYDITKAFDGADNLLCGAATAGNMLHWWFDQNKTEIEAYLSKHPEKQKIIFRNQELFDLKAAIDTKDSQTNSQLFNYFRDKAFPNLSARQLGVMPDLVLDMFINGYYLNVFKTQSTDVNRPYQDKDKRGGIFDAVFTRGNQTTLLTARHDLKNKGLNDISTIIKQELTEGRALALSHTYANVSISHVINLWGADFNAEGNLEAIYVTDSDANASIGMKKYFVGINAHGHVAISAKKIEGENIGAQVLGLFTLSSGKDIWQKLS
SEQ ID NO:38:
DDYQRNATEAYAKEVPHQITSVWTKGVTPPEQFTQGEDVIHAPYLAHQGWYDITKAFDGKDNLLCGAATAGNMLHWWFDQNKTEIEAYLSKHPEKQKIIFRNQELFDLKAAIDTKDSQTNSQLFNYFRDKAFPNLSARQLGVMPDLVLDMFINGYYLNVFKTQSTDVNRPYQDKDKRGGIFDAVFTRGNQTTLLTARHDLKNKGLNDISTIIKQELTEGRALALSHTYANVSISHVINLWGADFNAEGNLEAIYVTDSDANASIGMKKYFVGINAHGHVAISAKKIEGENIGAQVLGLFTLSSGKDIWQKLS
SEQ ID NO:39:
DDYQRNATEAYAKEVPHQITSVWTKGVTPLTPEQFTQGEDVFHAPYVANQGWYDITKAFDGKDNLLCGAATAGNMLHWWFDQNKDQIKRYLEEHPEKQKINFNGENMFDVKKAIDTKNHQLDSKLFNYFKEKAFPYLSAKHLGVFPDHVIDMFINGYRLSLTNHGPTPVKEGSKDPRGGIFDAVFTRGNQSKLLTSRHDFKNKNLNDISTIIKQELTKGKALGLSHTYANVRINHVINLWGADFNAEGNLEAIYVTDSDSNASIGMKKYFVGVNAHGHVAISAKKIEGENIGAQVLGLFTLSTGQDSWQKLS
SEQ ID NO:40:
DDYQRNATEAYAKEVPHQITSVWTKGVTPLTPEQFTQGEDVFHAPYVANQGWYDITKAFDGKDNLLCGAATAGNMLHWWFDQNKDQIKRYLEEHPEKQKINFRGENMFDVKEAIRTKNHQLDSKLFEYFKEKAFPYLSAKHLGVFPDHVIDMFINGYRLSLTNHGPTPVKKGSKDPRGGIFDAVFTRGNQSKLLTSRHDFKNKNLNDISTIIKSELTNGKALGLSHTYANVRINHVINLWGADFNAEGNLEAIYVTDSDSNASIGMKKYFVGVNKHGHVAISAKKIEGENIGAQVLGLFTLSTGQDSWQKLN
SEQ ID NO:41:
DDYQRNATEAYAKEVPHQITSVWTKGVTPLTPEQFTQGEDVFHAPYVANQGWYDITKTFNGKDDLLCGAATAGNMLHWWFDQNKDQIKRYLEEHPEKQKINFNGEQMFDVKEAIDTKNHQLDSKLFEYFKEKAFPYLSTKHLGVFPDHVIDMFINGYRLSLTNHGPTPVKEGSKDPRGGIFDAVFTRGNQSKLLTSRHDFKEKNLKEISDLIKQELTEGKALGLSHTYANVRINHVINLWGADFDAEGNLKAIYVTDSDSNASIGMKKYFVGVNAAGKVAISAKKIEGENIGAQVLGLFTLSTGQDSWNQTS
SEQ ID NO:42:
DDYQRNATEAYAKEVPHQITSVWTKGVTPLTPEQFTQGEDVFHAPYVANQGWYDITKTFNGKDDLLCGAATAGNMLHWWFDQNKDQIKRYLEEHPEKQKINFRGEQMFDVKEAIRTKNHQLDSKLFEYFKEKAFPYLSTKHLGVFPDHVIDMFINGYRLSLTNHGPTPVKKGSKDPRGGIFDAVFTRGNQSKLLTSRHDFKEKNLKEISDLIKEELTKGKALGLSHTYANVRINHVINLWGADFDAEGNLKAIYVTDSDSNASIGMKKYFVGVNKAGKVAISAKKIEGENIGAQVLGLFTLSTGQDSWNQTN
SEQ ID NO:43:
DDYQRNATEAYAKEVPHQITSVWTKGVTPPEQFTQGEDVIHAPYVANQGWYDITKAFDGKDNLLCGAATAGNMLHWWFDQNKDQIKRYLEEHPEKQKINFRGEQMFDVKKAIDTKNHQLDSKLFNYFKEKAFPGLSARRIGVFPDHVIDMFINGYRLSLTNHGPTPVKEGSKDPRGGIFDAVFTRGNQSKLLTSRHDFKNKNLNDISTIIKQELTKGKALGLSHTYANVSINHVINLWGADFNAEGNLEAIYVTDSDSNASIGMKKYFVGVNAHGHVAISAKKIEGENIGAQVLGLFTLSTGQDSWQKLS
来自酿脓链球菌的内切糖苷酶EndoS49的蛋白质序列(SEQ ID NO:44,US9,493,752):
MDKHLLVKRTLGCVCAATLMGAALATHHDSLNTVKAEEKTVQTGKTDQQVGAKLVQEIREGKRGPLYAGYFRTWHDRASTGIDGKQQHPENTMAEVPKEVDILFVFHDHTASDSPFWSELKDSYVHKLHQQGTALVQTIGVNELNGRTGLSKDYPDTPEGNKALAAAIVKAFVTDRGVDGLDIDIEHEFTNKRTPEEDARALNVFKEIAQLIGKNGSDKSKLLIMDTTLSVENNPIFKGIAEDLDYLLRQYYGSQGGEAEVDTINSDWNQYQNYIDASQFMIGFSFFEESASKGNLWFDVNEYDPNNPEKGKDIEGTRAKKYAEWQPSTGGLKAGIFSYAIDRDGVAHVPSTYKNRTSTNLQRHEVDNISHTDYTVSRKLKTLMTEDKRYDVIDQKDIPDPALREQIIQQVGQYKGDLERYNKTLVLTGDKIQNLKGLEKLSKLQKLELRQLSNVKEITPELLPESMKKDAELVMVGMTGLEKLNLSGLNRQTLDGIDVNSITHLTSFDISHNSLDLSEKSEDRKLLMTLMEQVSNHQKITVKNTAFENQKPKGYYPQTYDTKEGHYDVDNAEHDILTDFVFGTVTKRNTFIGDEEAFAIYKEGAVDGRQYVSKDYTYEAFRKDYKGYKVHLTASNLGETVTSKVTATTDETYLVDVSDGEKVVHHMKLNIGSGAIMMENLAKGAKVIGTSGDFEQAKKIFDGEKSDRFFTWGQTNWIAFDLGEINLAKEWRLFNAETNTEIKTDSSLNVAKGRLQILKDTTIDLEKMDIKNRKEYLSNDENWTDVAQMDDAKAIFNSKLSNVLSRYWRFCVDGGASSYYPQYTELQILGQRLSNDVANTLKD
来自化脓性链球菌的成熟内切糖苷酶S(EndoS)的蛋白质序列(SEQ ID NO:45,15/328,879,US Pat.8,889,128和9,707,279):
EEKTVQVQKGLPSIDSLHYLSENSKKEFKEELSKAGQESQKVKEILAKAQQADKQAQELAKMKIPEKIPMKPLHGPLYGGYFRTWHDKTSDPTEKDKVNSMGELPKEVDLAFIFHDWTKDYSLFWKELATKHVPKLNKQGTRVIRTIPWRFLAGGDNSGIAEDTSKYPNTPEGNKALAKAIVDEYVYKYNLDGLDVDVEHDSIPKVDKKEDTAGVERSIQVFEEIGKLIGPKGVDKSRLFIMDSTYMADKNPLIERGAPYINLLLVQVYGSQGEKGGWEPVSNRPEKTMEERWQGYSKYIRPEQYMIGFSFYEENAQEGNLWYDINSRKDEDKANGINTDITGTRAERYARWQPKTGGVKGGIFSYAIDRDGVAHQPKKYAKQKEFKDATDNIFHSDYSVSKALKTVMLKDKSYDLIDEKDFPDKALREAVMAQVGTRKGDLERFNGTLRLDNPAIQSLEGLNKFKKLAQLDLIGLSRITKLDRSVLPANMKPGKDTLETVLETYKKDNKEEPATIPPVSLKVSGLTGLKELDLSGFDRETLAGLDAATLTSLEKVDISGNKLDLAPGTENRQIFDTMLSTISNHVGSNEQTVKFDKQKPTGHYPDTYGKTSLRLPVANEKVDLQSQLLFGTVTNQGTLINSEADYKAYQNHKIAGRSFVDSNYHYNNFKVSYENYTVKVTDSTLGTTTDKTLATDKEETYKVDFFSPADKTKAVHTAKVIVGDEKTMMVNLAEGATVIGGSADPVNARKVFDGQLGSETDNISLGWDSKQSIIFKLKEDGLIKHWRFFNDSARNPETTNKPIQEASLQIFNIKDYNLDNLLENPNKFDDEKYWITVDTYSAQGERATAFSNTLNNITSKYWRVVFDTKGDRYSSPVVPELQILGYPLPNADTIMKTVTTAKELSQQKDKFSQKMLDELKIKEMALETSLNSKIFDVTAINANAGVLKDCIEKRQLLKK
完整序列，其包括来自化脓性链球菌的内切糖苷酶EndoS的分泌信号。(SEQ IDNO:46,AAK00850.1):
MDKHLLVKRTLGCVCAATLMGAALATHHDSLNTVKAEEKTVQVQKGLPSIDSLHYLSENSKKEFKEELSKAGQESQKVKEILAKAQQADKQAQELAKMKIPEKIPMKPLHGPLYGGYFRTWHDKTSDPTEKDKVNSMGELPKEVDLAFIFHDWTKDYSLFWKELATKHVPKLNKQGTRVIRTIPWRFLAGGDNSGIAEDTSKYPNTPEGNKALAKAIVDEYVYKYNLDGLDVDVEHDSIPKVDKKEDTAGVERSIQVFEEIGKLIGPKGVDKSRLFIMDSTYMADKNPLIERGAPYINLLLVQVYGSQGEKGGWEPVSNRPEKTMEERWQGYSKYIRPEQYMIGFSFYEENAQEGNLWYDINSRKDEDKANGINTDITGTRAERYARWQPKTGGVKGGIFSYAIDRDGVAHQPKKYAKQKEFKDATDNIFHSDYSVSKALKTVMLKDKSYDLIDEKDFPDKALREAVMAQVGTRKGDLERFNGTLRLDNPAIQSLEGLNKFKKLAQLDLIGLSRITKLDRSVLPANMKPGKDTLETVLETYKKDNKEEPATIPPVSLKVSGLTGLKELDLSGFDRETLAGLDAATLTSLEKVDISGNKLDLAPGTENRQIFDTMLSTISNHVGSNEQTVKFDKQKPTGHYPDTYGKTSLRLPVANEKVDLQSQLLFGTVTNQGTLINSEADYKAYQNHKIAGRSFVDSNYHYNNFKVSYENYTVKVTDSTLGTTTDKTLATDKEETYKVDFFSPADKTKAVHTAKVIVGDEKTMMVNLAEGATVIGGSADPVNARKVFDGQLGSETDNISLGWDSKQSIIFKLKEDGLIKHWRFFNDSARNPETTNKPIQEASLQIFNIKDYNLDNLLENPNKFDDEKYWITVDTYSAQGERATAFSNTLNNITSKYWRVVFDTKGDRYSSPVVPELQILGYPLPNADTIMKTVTTAKELSQQKDKFSQKMLDELKIKEMALETSLNSKIFDVTAINANAGVLKDCIEKRQLLKK
从化脓性链球菌AP1中分离的EndoS的蛋白质序列，其包括信号序列。(SEQ ID NO:47，美国专利8,889,128和9,707,279):
MDKHLLVKRTLGCVCAATLMGAALATHHDSLNTVKAEEKTVQVQKGLPSIDSLHYLSENSKKEFKEELSKAGQESQKVKEILAKAQQADKQAQELAKMKIPEKIPMKPLHGPLYGGYFRTWHDKTSDPTEKDKVNSMGELPKEVDLAFIFHDWTKDYSLFWKELATKHVPKLNKQGTRVIRTIPWRFLAGGDNSGIAEDTSKYPNTPEGNKALAKAIVDEYVYKYNLDGLDVDVEHDSIPKVDKKEDTAGVERSIQVFEEIGKLIGPKGVDKSRLFIMDSTYMADKNPLIERGAPYINLLLVQVYGSQGEKGGWEPVSNRPEKTMEERWQGYSKYIRPEQYMIGFSFYEENAQEGNLWYDINSRKDEDKANGINTDITGTRAERYARWQPKTGGVKGGIFSYAIDRDGVAHQPKKYAKQKEFKDATDNIFHSDYSVSKALKTVMLKDKSYDLIDEKDFPDKALREAVMAQVGTRKGDLERFNGTLRLDNPAIQSLEGLNKFKKLAQLDLIGLSRITKLDRSVLPANMKPGKDTLETVLETYKKDNKEEPATIPPVSLKVSGLTGLKELDLSGFDRETLAGLDAATLTSLEKVDISGNKLDLAPGTENRQIFDTMLSTISNHVGSNEQTVKFDKQKPTGHYPDTYGKTSLRLPVANEKVDLQSQLLFGTVTNQGTLINSEADYKAYQNHKIAGRSFVDSNYHYNNFKVSYENYTVKVTDSTLGTTTDKTLATDKEETYKVDFFSPADKTKAVHTAKVIVGDEKTMMVNLAEGATVIGGSADPVNARKVFDGQLGSETDNISLGWDSKQSIIFKLKEDGLIKHWRFFNDSARNPETTNKPIQEASLQIFNIKDYNLDNLLENPNKFDDEKYWITVDTYSAQGERATAFSNTLNNITSKYWRVVFDTKGDRYSSPVVPELQILGYPLPNADTIMKTVTTAKELSQQKDKFSQKMLDELKIKEMALETSLNSKIFDVTAINANAGVLKDCIEKRQLLKK
有添加的N-末端蛋氨酸的IdeS的成熟序列(SEQ ID NO:48):
MDSFSANQEIRYSEVTPYHVTSVWTKGVTPPANFTQGEDVFHAPYVANQGWYDITKTFNGKDDLLCGAATAGNMLHWWFDQNKDQIKRYLEEHPEKQKINFNGEQMFDVKEAIDTKNHQLDSKLFEYFKEKAFPYLSTKHLGVFPDHVIDMFINGYRLSLTNHGPTPVKEGSKDPRGGIFDAVFTRGDQSKLLTSRHDFKEKNLKEISDLIKKELTEGKALGLSHTYANVRINHVINLWGADFDSNGNLKAIYVTDSDSNASIGMKKYFVGVNSAGKVAISAKEIKEDNIGAQVLGLFTLSTGQDSWNQTN
实施例19
Figure BDA0003759084060000851
Figure BDA0003759084060000861

Claims (89)

1.一种提高受试者基因疗法治疗的功效的方法，其包括：
(a)向受试者施用减少免疫球蛋白G(IgG)与新生儿Fc受体(FcRn)相互作用的药剂；以及
(b)向所述受试者施用包含治疗性异源多核苷酸的重组病毒载体。
2.根据权利要求1所述的方法，其中
(a)所述受试者需要治疗由蛋白质功能或活性丧失引起的疾病，并且所述异源多核苷酸编码提供或补充所述蛋白质功能或活性的多肽或肽，或
(b)所述受试者需要治疗由蛋白质的功能、活性或表达的获得引起的疾病，并且所述异源多核苷酸被转录成抑制、降低或减少所述蛋白质的所述功能、活性或表达的获得的表达的核酸。
3.根据权利要求1或2的方法，其中所述受试者中FcRn介导的IgG再循环减少。
4.根据权利要求1-3中任一项的方法，其中IgG清除在所述受试者中增强。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述减少IgG与FcRn相互作用的药剂选自抗FcRn抗体、FcRn结合亲和体、增强IgG降解的抗体(ABDEG)、FcRn结合肽(FcBP)和FcRn结合小分子。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中步骤(a)在步骤(b)之前执行。
7.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中步骤(b)在步骤(a)之前执行。
8.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中步骤(a)和步骤(b)大约同时进行。
9.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中步骤(a)在步骤(b)之前或之后进行两次或更多次。
10.根据权利要求1-9中任一项的方法，其中步骤(b)在步骤(a)之前或之后约90天内进行。
11.根据权利要求1-9中任一项的方法，其中步骤(b)在步骤(a)之前或之后约60天内进行。
12.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中步骤(b)在步骤(a)之前或之后约45天内进行。
13.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中步骤(b)在步骤(a)之前或之后约30天内进行。
14.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中步骤(b)在步骤(a)之前或之后约21天内进行。
15.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中步骤(b)在步骤(a)之前或之后约14天内进行。
16.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中步骤(b)在步骤(a)之前或之后约7天内进行。
17.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中步骤(b)在步骤(a)之前或之后约72小时内进行。
18.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中步骤(b)在步骤(a)之前或之后约48小时内进行。
19.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中步骤(b)在步骤(a)之前或之后约24小时内进行。
20.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中步骤(b)在步骤(a)之前或之后约12小时内进行。
21.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中步骤(b)在步骤(a)之前或之后约6小时内进行。
22.根据权利要求1-21中任一项所述的方法，其还包括向所述受试者施用有效量的蛋白酶或糖苷酶以降解或消化和/或抑制或降低与所述重组病毒载体和/或由所述异源多核苷酸编码的所述多肽或肽和/或所述异源多核苷酸结合的抗体的效应物功能。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述蛋白酶或糖苷酶在步骤(a)之前、之后或大约同时施用。
24.根据权利要求22所述的方法，其中所述蛋白酶或糖苷酶在步骤(b)之前、之后或大约同时施用。
25.根据权利要求22所述的方法，其中所述蛋白酶或糖苷酶在步骤(a)之前、之后或大约同时施用两次或更多次。
26.根据权利要求22所述的方法，其中所述蛋白酶或糖苷酶在步骤(b)之前、之后或大约同时施用两次或更多次。
27.根据权利要求22-26中任一项所述的方法，其中所述蛋白酶或糖苷酶在步骤(a)或步骤(b)之前或之后约90天内施用。
28.根据权利要求22-26中任一项所述的方法，其中所述蛋白酶或糖苷酶在步骤(a)或步骤(b)之前或之后约60天内施用。
29.根据权利要求22-26中任一项所述的方法，其中所述蛋白酶或糖苷酶在步骤(a)或步骤(b)之前或之后约45天内施用。
30.根据权利要求22-26中任一项所述的方法，其中所述蛋白酶或糖苷酶在步骤(a)或步骤(b)之前或之后约30天内施用。
31.根据权利要求22-26中任一项所述的方法，其中所述蛋白酶或糖苷酶在步骤(a)或步骤(b)之前或之后约21天内施用。
32.根据权利要求22-26中任一项所述的方法，其中所述蛋白酶或糖苷酶在步骤(a)或步骤(b)之前或之后约14天内施用。
33.根据权利要求22-26中任一项所述的方法，其中所述蛋白酶或糖苷酶在步骤(a)或步骤(b)之前或之后约7天内施用。
34.根据权利要求22-26中任一项所述的方法，其中所述蛋白酶或糖苷酶在步骤(a)或步骤(b)之前或之后约72小时内施用。
35.根据权利要求22-26中任一项所述的方法，其中所述蛋白酶或糖苷酶在步骤(a)或步骤(b)之前或之后约48小时内施用。
36.根据权利要求22-26中任一项所述的方法，其中所述蛋白酶或糖苷酶在步骤(a)或步骤(b)之前或之后约24小时内施用。
37.根据权利要求22-26中任一项所述的方法，其中所述蛋白酶或糖苷酶在步骤(a)或步骤(b)之前或之后约12小时内施用。
38.根据权利要求22-26中任一项所述的方法，其中所述蛋白酶或糖苷酶在步骤(a)或步骤(b)之前或之后约6小时内施用。
39.根据权利要求22-38中任一项所述的方法，其中所述蛋白酶包括半胱氨酸蛋白酶或硫醇蛋白酶。
40.根据权利要求22-38中任一项所述的方法，其中所述蛋白酶包括来自化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)、马链球菌(Streptococcus equi)或犬支原体(Mycoplasmacanis)的蛋白酶。
41.根据权利要求22-38中任一项所述的方法，其中所述蛋白酶包含SEQ ID NO:3-18、23或48中任一项所示的IdeS或其修饰变体。
42.根据权利要求22-38中任一项所述的方法，其中所述糖苷酶包括糖苷内切酶。
43.根据权利要求42所述的方法，其中所述糖苷内切酶包含SEQ ID NO:44-47中任一个所示的序列。
44.根据权利要求22-43中任一项所述的方法，其中所述蛋白酶或糖苷酶降解或消化和/或抑制或降低人抗体的效应物功能。
45.根据权利要求1-44中任一项所述的方法，其中所述病毒载体包括慢病毒载体、腺病毒载体或腺相关病毒(AAV)载体。
46.根据权利要求45所述的方法，其中所述慢病毒载体包含与所述抗体或IgG结合的包膜蛋白。
47.根据权利要求45所述的方法，其中所述AAV载体包含与所述抗体或IgG结合的衣壳蛋白。
48.根据权利要求45所述的方法，其中所述AAV载体包含与所述抗体或IgG结合的VP1、VP2和/或VP3衣壳蛋白。
49.根据权利要求45-48中任一项所述的方法，其中所述AAV载体包含与选自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV3B、AAV-2i8、Rh10、Rh74、SEQ IDNO:1和SEQ ID NO:2VP1、VP2和/或VP3衣壳蛋白的VP1、VP2和/或VP3衣壳蛋白具有60％或更多序列同一性的VP1、VP2和/或VP3衣壳蛋白。
50.根据权利要求45-48中任一项所述的方法，其中所述AAV载体包含与选自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV3B、AAV-2i8、Rh10、Rh74、SEQ IDNO:1and SEQ ID NO:2VP1、VP2和/或VP3衣壳蛋白的VP1、VP2和/或VP3衣壳蛋白具有100％序列同一性的VP1、VP2和/或VP3衣壳蛋白。
51.根据权利要求1-50中任一项所述的方法，其中所述受试者具有与所述病毒载体结合的抗体或IgG。
52.根据权利要求1-50中任一项所述的方法，其中所述受试者不存在与所述病毒载体结合的抗体或IgG。
53.根据权利要求1-52中任一项所述的方法，其中所述受试者具有与由所述异源多核苷酸编码的所述多肽或肽结合的抗体或IgG。
54.根据权利要求22-53中任一项的方法，其中所述抗体包括IgG、IgM、IgA、IgD和/或IgE。
55.根据权利要求1-54中任一项所述的方法，其还包括在进行步骤(a)之前、在进行步骤(a)之后但在执行步骤(b)之前和/或在执行步骤(a)和(b)之后确定所述受试者中病毒载体结合抗体或IgG的存在、量化其量或效应物功能。
56.根据权利要求1-54中任一项所述的方法，其还包括在进行步骤(a)之前、在进行步骤(a)之后但在执行步骤(b)之前和/或在执行步骤(a)和(b)之后，分析来自所述受试者的生物样品中病毒载体结合抗体或IgG的存在、存在于所述样品中的病毒载体结合抗体或IgG的量或效应物功能。
57.根据权利要求55或56所述的方法，其中所述确定和/或分析步骤在施用所述蛋白酶或糖苷酶之前和/或之后进行。
58.根据权利要求56或57所述的方法，其中来自所述受试者的所述生物样品是血液产品。
59.根据权利要求1-58中任一项所述的方法，其中所述方法导致所述病毒载体结合抗体或IgG减少20-50％、50-75％、75-90％、90-95％或95％或更多。
60.根据权利要求56-58中任一项所述的方法，其中来自所述受试者的所述生物样品或血液产品中存在的所述病毒载体结合抗体或IgG小于约1:100,000，其中1份所述生物样品或血液产品稀释于100,000份缓冲液导致50％的病毒载体中和。
61.根据权利要求56-58中任一项所述的方法，其中来自所述受试者的所述生物样品或血液产品中存在的所述病毒载体结合抗体或IgG小于约1:50,000，其中1份所述生物样品或血液产品稀释于50,000份缓冲液导致50％的病毒载体中和。
62.根据权利要求56-58中任一项所述的方法，其中来自所述受试者的所述生物样品或血液产品中存在的所述病毒载体结合抗体或IgG小于约1:10,000，其中1份所述生物样品或血液产品稀释于10,000份缓冲液导致50％的病毒载体中和。
63.根据权利要求56-58中任一项所述的方法，其中来自所述受试者的所述生物样品或血液产品中存在的所述病毒载体结合抗体或IgG小于约1:1,000，其中1份所述生物样品或血液产品稀释于1,000份缓冲液导致50％的病毒载体中和。
64.根据权利要求56-58中任一项所述的方法，其中来自所述受试者的所述生物样品或血液产品中存在的所述病毒载体结合抗体或IgG小于约1:100，其中1份所述生物样品或血液产品稀释于100份缓冲液导致50％的病毒载体中和。
65.根据权利要求56-58中任一项所述的方法，其中来自所述受试者的所述生物样品或血液产品中存在的所述病毒载体结合抗体或IgG小于约1:10，其中1份所述生物样品或血液产品稀释于10份缓冲液导致50％的病毒载体中和。
66.根据权利要求56-58中任一项所述的方法，其中所述生物样品或血液产品中存在的所述病毒载体结合抗体或IgG小于约1:5，其中1份所述生物样品或血液产品稀释于5份缓冲液导致50％的病毒载体中和。
67.根据权利要求56-58中任一项所述的方法，其中所述生物样品或血液产品中存在的病毒载体结合抗体或IgG的比率小于约1:4，其中1份所述生物样品或血液产品稀释于4份缓冲液导致50％的病毒载体中和。
68.根据权利要求56-58中任一项所述的方法，其中所述生物样品或血液产品中存在的病毒载体结合抗体或IgG的比率小于约1:3，其中1份所述生物样品或血液产品稀释于3份缓冲液导致50％的病毒载体中和。
69.根据权利要求56-58中任一项所述的方法，其中所述生物样品或血液产品中存在的病毒载体结合抗体或IgG的比率小于约1:2，其中1份所述生物样品或血液产品稀释于2份缓冲液导致50％的病毒载体中和。
70.根据权利要求56-58中任一项所述的方法，其中所述生物样品或血液产品中存在的病毒载体结合抗体或IgG的比率小于约1:1，其中1份所述生物样品或血液产品稀释于1份缓冲液导致50％的病毒载体中和。。
71.根据权利要求1-70中任一项所述的方法，其还包括在进行步骤(a)之后但在进行步骤(b)之前和/或在执行步骤(a)和(b)之后，确定与由所述异源多核苷酸编码的多肽或肽结合的抗体或IgG的存在或量化其量。
72.根据权利要求1-70中任一项所述的方法，其还包括在进行步骤(a)之后但在进行步骤(b)之前和/或在执行步骤(a)和(b)之后确定与所述异源多核苷酸或核酸结合的抗体或IgG的存在或量化其量。
73.根据权利要求1-72中任一项所述的方法，其中所述受试者患有肺病(例如，囊性纤维化)、出血性疾病(例如，具有或不具有抑制剂的血友病A或血友病B)、地中海贫血、血液疾病(例如，贫血)、阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病、肌萎缩侧索硬化(ALS)、癫痫、溶酶体贮积病、(例如，天冬氨酰氨基葡萄糖尿、贝敦氏病、晚期婴儿神经元蜡样脂褐质沉积症2型(CLN2)、胱氨酸病、法布里病、戈谢病I、II和III型、糖原贮积病II(庞贝病)、GM2-神经节苷脂沉积症I型(泰-萨克斯病)、GM2-神经节苷脂沉积症II型(桑德霍夫病)、粘脂贮积病I型(唾液酸贮积病I型和II型)、II型(I细胞病)、III型(假贺勒氏病)和IV型、粘多糖贮积病(贺勒氏病及其变体、亨特氏病、山菲利普氏症A、B、C、D型、莫奎欧氏症A和B型、马罗托-拉米和史莱氏病)、尼曼-皮克病A/B型、C1和C2型、辛德勒病I型和II型)、遗传性血管性水肿(HAE)、铜或铁积累障碍(例如威尔逊病或门克斯病)、溶酶体酸性脂肪酶缺乏症、神经或神经退行性疾病、癌症、1型或2型糖尿病、腺苷脱氨酶缺乏症、代谢缺陷(例如糖原贮积病)、实体器官(例如脑、肝、肾、心脏)疾病或传染性病毒(例如乙型和丙型肝炎、艾滋病毒等)、细菌或真菌病。
74.根据权利要求1-72中任一项的方法，其中所述受试者患有凝血障碍。
75.根据权利要求1-72中任一项的方法，其中所述受试者患有血友病A、具有抑制性抗体的血友病A、血友病B、具有抑制性抗体的血友病B、任何凝血因子VII、VIII、IX、X、XI、V、XII、II缺乏症、血管性血友病因子或FV/FVIII联合缺乏症、地中海贫血、维生素K环氧化物还原酶C1缺乏症或γ-羧化酶缺乏症。
76.根据权利要求1-72中任一项的方法，其中所述受试者患有贫血、与创伤、损伤、血栓形成、血小板减少症、中风、凝血病、弥散性血管内凝血(DIC)相关的出血；与肝素、低分子量肝素、五糖、华法林、小分子抗血栓药(即FXa抑制剂)或血小板疾病，例如伯-苏氏综合征、血小板无力症或贮存池缺陷症相关的过度抗凝。
77.根据权利要求1-72中任一项的方法，其中所述异源多核苷酸编码蛋白质，所述蛋白质选自：胰岛素、胰高血糖素、生长激素(GH)、甲状旁腺激素(PTH)、生长激素释放因子(GRF)、促卵泡激素(FSH)、促黄体素(LH)、人绒毛膜促性腺激素(hCG)、血管内皮生长因子(VEGF)、血管生成素、血管生长抑制素、粒细胞集落刺激因子(GCSF)、促红细胞生成素(EPO)、结缔组织生长因子(CTGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)、表皮生长因子(EGF)、转化生长因子α(TGFα)、血小板衍生的生长因子(PDGF)、胰岛素生长因子I和II(IGF-I和IGF-II)、TGFβ、激活素、抑制素、骨形态形成蛋白(BMP)、神经生长因子(NGF)、脑源性神经营养因子(BDNF)、神经营养因子NT-3和NT4/5、睫状神经营养因子(CNTF)、胶细胞系衍生的神经营养因子(GDNF)、神经生长因子、集聚蛋白、轴突生长诱向因子-1和轴突生长诱向因子-2、肝细胞生长因子(HGF)、肝配蛋白、头蛋白、音猬因子和酪氨酸羟化酶。
78.根据权利要求1-72中任一项所述的方法，其中所述异源多核苷酸编码蛋白，该蛋白选自血小板生成素(TPO)、白细胞介素(IL1至IL-36)、单核细胞趋化蛋白、白血病抑制因子、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、Fas配体、肿瘤坏死因子α和β、干扰素α、β和γ、干细胞因子、flk-2/flt3配体、IgG、IgM、IgA、IgD和IgE、嵌合免疫球蛋白、人源化抗体、单一链抗体、T细胞受体、嵌合T细胞受体、单链T细胞受体、I类和II类MHC分子。
79.根据权利要求1-72中任一项所述的方法，其中所述异源多核苷酸编码CFTR(囊肿性纤维化跨膜调节因子蛋白)、血液凝结(凝固)因子、(因子XIII、因子IX、因子VIII、因子X、因子VII、因子VIIa、蛋白C等)、功能获得型血液凝结因子、抗体、视网膜色素上皮特异性65kDa蛋白(RPE65)、促红细胞生成素、LDL受体、脂蛋白脂肪酶、鸟氨酸转氨甲酰酶、β-球蛋白、α-球蛋白、血影蛋白、α-抗胰蛋白酶、腺苷脱氨酶(ADA)、金属转运蛋白(ATP7A或ATP7)、磺酰胺酶、涉及溶酶体贮积病的酶(ARSA)、次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶、β-25葡萄糖脑苷酶、鞘磷脂酶、溶酶体己糖醛酸酶脱氢酶、分支链酮酸去氢酶、激素、生长因子、类胰岛素生长因子1或2、血小板衍生的生长因子、表皮生长因子、神经生长因子、神经营养因子-3及-4、脑源性神经营养因子、神经胶质衍生的生长因子、转变生长因子α和β、细胞介素、α-干扰素、β-干扰素、干扰素-γ、白介素-2、白介素-4、白介素12、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、淋巴毒素、自杀基因产物、单纯疱疹病毒胸苷激酶、胞嘧啶脱氨酶、白喉毒素、细胞色素P450、脱氧胞苷激酶、肿瘤坏死因子、药物抗性蛋白、肿瘤抑制剂蛋白(例如，p53、Rb、Wt-1、NF1、希佩尔-林道综合征(VHL)、结肠腺瘤息肉病(APC))、具有免疫调节属性的肽、耐受性或免疫原性肽或蛋白Tregitope或hCDRl、胰岛素、葡糖激酶、鸟苷酸环化酶2D(LCA-GUCY2D)、Rab护航蛋白1(无脉络膜)、LCA5(LCA-lebercilin)、鸟氨酸酮酸氨基转移酶(回旋形萎缩)、视网膜劈裂素1(X连锁视网膜劈裂症)、USH1C(阿瑟氏综合征1C)、X连锁色素性视网膜炎GTP酶(XLRP)、MERTK(AR形式的RP：色素性视网膜炎)、DFNB1(连接蛋白26耳聋)、ACHM 2、3和4(色盲)、PKD-1或PKD-2(多囊性肾病)、TPP1、CLN2、硫酸酯酶、N-乙酰氨基葡萄糖-1-磷酸酯转移酶、组织蛋白酶A、GM2-AP、NPC1、VPC2、鞘脂激活蛋白、用于基因组编辑的一或多个锌指核酸酶以及用作基因组编辑的修复模板的一或多个供体序列。
80.根据权利要求1-72中任一项的方法，其中所述异源多核苷酸编码抑制性核酸。
81.根据权利要求80的方法，其中所述抑制性核酸选自siRNA、反义分子、miRNA、RNAi、核酶和shRNA。
82.根据权利要求80所述的方法，其中所述抑制性核酸与基因、基因的转录物或与选自由以下项组成的群组的多核苷酸重复疾病相关联的基因的转录物结合：亨廷顿蛋白(HTT)基因、与齿状核红核苍白球路易体萎缩症(atrophin1，ATN1)相关联的基因、脊髓延髓肌肉萎缩的X染色体上的雄激素受体、人类Ataxin-1、-2、-3及-7、Cav2.1P/Q压敏钙通道(CACNA1A)、TATA-结合蛋白、Ataxin 8相对链(ATXN8OS)、脊髓小脑失调(1、2、3、6、7、8、12、17型)中的丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶2A 55kDa调节亚单位Bβ同工型、X脆性综合征中的FMR1(X脆性智力迟钝1)、X脆性相关联的震颤/失调综合征中的FMR1(X脆性智力迟钝1)、XE脆性智力迟钝中的FMR1(X脆性智力迟钝2)或AF4/FMR2家族成员2；肌强直性营养不良中的肌强直蛋白激酶(MT-PK)；弗里德希氏共济失调中的共济蛋白；肌肉萎缩性侧索硬化中的超氧化歧化酶1(SOD1)基因的突变体；涉及帕金森氏病和/或阿尔兹海默氏症的发病机制的基因；载脂蛋白B(APOB)以及9型前蛋白转换酶枯草杆菌蛋白酶/kexin(PCSK9)，高胆固醇血症；HIV Tat，HIV感染中的转录基因的人类免疫缺乏病毒转活化剂；HIV TAR，HIV TAR是HIV感染中的人类免疫缺乏病毒转活化剂反应元件基因；HIV感染中的C-C趋化因子受体(CCR5)；RSV感染中的劳斯肉瘤病毒(RSV)核衣壳蛋白、丙型肝炎病毒感染中的肝脏特异性微RNA(miR-122)；p53、急性肾损伤或肾脏移植中的移植功能延迟或肾损伤急性肾衰竭；晚期复发或转移性实体恶性肿瘤中的蛋白激酶N3(PKN3)；LMP2，LMP2也称为9型蛋白酶体亚单位β(PSMB9)、转移性黑素瘤；LMP7，也称为8型蛋白酶体亚单位β(PSMB 8)、转移性黑素瘤；MECL1，也称为10型蛋白酶体亚单位β(PSMB 10)、转移性黑素瘤；实体肿瘤中的血管内皮生长因子(VEGF)；实体肿瘤中的驱动蛋白轴蛋白、慢性骨髓白血病中的细胞凋亡抑制剂B细胞CLL/淋巴瘤(BCL-2)；实体肿瘤中的核糖核苷酸还原酶M2(RRM2)；实体肿瘤中的弗林蛋白酶；肝脏肿瘤中的保罗类激酶1(PLK1)、丙型肝炎感染中的二酰基甘油酰基转移酶1(DGAT1)、家族性腺瘤性息肉病中的β-连环蛋白；β2肾上腺素激导性受体、青光眼；糖尿病黄斑水肿(DME)或年龄相关黄斑变性中的RTP801/Redd1，也称为DNA破坏诱发性转录物4蛋白；年龄相关黄斑变性或脉络膜新生血管中的血管内皮生长因子受体I(VEGFR1)、非动脉炎缺血视神经病变中的凋亡蛋白酶2；先天性甲肥厚中的角蛋白6A N17K突变蛋白；流感感染中的A型流感病毒基因组/基因序列：重度急性呼吸道综合征(SARS)感染中的SARS冠状病毒基因组/基因序列；呼吸道融合性病毒感染中的呼吸道融合性病毒基因组/基因序列；埃博拉(Ebola)感染中的埃博拉纤丝病毒基因组/基因序列；乙型和丙型肝炎感染中的乙型和丙型肝炎病毒基因组/基因序列；HSV感染中的单纯疱疹病毒(HSV)基因组/基因序列、柯萨奇病毒B3感染中的柯萨奇病毒B3基因组/基因序列；原发性肌张力障碍中的基因(等位基因特异性沉默)类耐扭蛋白A(TOR1A)的病原性等位基因的沉默、在移植中具有特异性的泛I类和HLA-等位基因；以及常染色体显性遗传性色素性视网膜炎(adRP)中的突变视紫红质基因(RHO)。
83.根据权利要求1-82中任一项的方法，其中由所述异源多核苷酸编码的所述多肽包括基因编辑核酸酶。
84.根据权利要求83的方法，其中所述基因编辑核酸酶包括锌指核酸酶(ZFN)或转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)。
85.根据权利要求83所述的方法，其中所述基因编辑核酸酶包含功能性II型CRISPR-Cas9。
86.根据权利要求1-85中任一项所述的方法，其中步骤(a)和/或步骤(b)被执行两次或更多次。
87.根据权利要求1-86中任一项所述的方法，其中，所述受试者是人。
88.一种包装，其中装有：
(a)包含编码多肽或肽的异源多核苷酸的重组病毒载体；
(b)减少IgG与FcRn相互作用的药剂；
(c)任选地，降解或消化抗体的蛋白酶或糖苷酶；以及
(d)具有用于执行根据权利要求1-87中任一项所述的方法的说明的标签，其中(a)、(b)和(c)在分开的或相同的容器中。
89.一种包装，其中装有：
(a)包含异源多核苷酸的重组病毒载体，该异源多核苷酸被转录成抑制、降低或减少蛋白质表达的核酸；
(b)减少IgG与FcRn相互作用的药剂；
(c)任选地，降解或消化抗体的蛋白酶或糖苷酶；以及
(d)具有用于执行根据权利要求1-87中任一项所述的方法的说明的标签，其中(a)、(b)和(c)在分开的或相同的容器中。
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CN117126270A (zh) * 2023-10-25 2023-11-28 首都儿科研究所 一种2型人博卡病毒型别特异性抗体及其应用
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