KR20210021310A - 코돈-최적화된 산 알파-글루코시다제 발현 카세트 및 이를 사용하는 방법 - Google Patents

코돈-최적화된 산 알파-글루코시다제 발현 카세트 및 이를 사용하는 방법 Download PDF

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션 아머
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Abstract

본 발명은 산 α- 글루코시다제(GAA)를 인코딩하는 핵산을 제공한다. 특정 구현예에서, 핵산은 SEQ ID NO: 1-5로 제시된 서열 중 임의의 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 서열에 대해 약 86% 초과의 서열 동일성을 갖는다. 특정 구현예에서, 산 α-글루코시다제(GAA)를 인코딩하는 핵산은 127개 미만의 CpG 디뉴클레오티드를 함유한다. 발현 카세트, 벡터, 세포 및 세포주 및 산 α- 글루코시다제(GAA)를 인코딩하는 이러한 핵산을 사용하는 방법이 또한 제공된다.

Description

코돈-최적화된 산 알파-글루코시다제 발현 카세트 및 이를 사용하는 방법
관련 출원
본 출원은 2018년 5월 16일에 출원된 미국 특허 가출원 번호 62/672,419 및 2018년 9월 21일에 출원된 미국 특허 가출원 번호 62/734,454에 대한 우선권을 주장한다. 모든 텍스트, 표, 서열 목록 및 도면을 포함하여 상기 출원의 전체 내용이 본원에 참조로 포함된다.
도입
폼페병이라고도 불리는 글리코겐 축적병 타입 II는 글리코겐의 분해를 촉매하는 리소좀 효소 산 α-글루코시다제(GAA)를 인코딩하는 유전자의 돌연변이로 인한 상염색체 열성 질환이다. 결과적인 효소 결핍은 신체의 모든 조직에서 글리코겐의 병리학적 축적 및 리소좀 변화를 초래하여, 심장, 호흡기 및 골격근 기능 장애를 초래한다(van der Ploeg & Reuser, 2008 Lancet, 372:1342-1353). 전통적으로 폼페병은 두 가지 주요 표현형으로 분리되었다 - 잔여 GAA 효소 활성, 발병 연령, 장기 침범(즉, 심근병증의 존재), 중증도 및 진행 속도에 기초하여 영아-발병 폼페병(IOPD)(또한, 영아형 폼페병(IPD) 또는 조기-발병 폼페병) 및 후기-발병 폼페병(LOPD). 효소 대체 요법(ERT)은 폼페병에 이용가능하다: 그러나, 이는 치료 실패와 제한된 장기 효능으로 이어지는 몇 가지 제한(즉, 제한된 생체분포 및 높은 면역원성)을 갖는다(van der Ploeg & Reuser, 2008).
개요
본원에는 인간 GAA의 분비가능한 버젼의 간-지향적 발현에 최적화된 카세트가 개시되어 있다. 카세트에 대한 이러한 최적화는 간에서 GAA 분비를 증가시키고 간 유전자 전달을 가능하게 하여 대상체에서 GAA 결핍을 전신적으로 교차-교정하기에 충분한 GAA의 순환 수준을 달성할 수 있게 한다. 이들 카세트는 증가된 전이유전자 발현, 개선된 안전성 특징 및 잠재적으로 감소된 면역원성을 달성한다. 이들 카세트는 폼페병 및 GAA로 치료가능한 기타 질병 및 장애를 가진 대상체의 유전자 요법 치료로서 유용할 것이다.
GAA 발현 카세트의 코돈 최적화가 수행되어 GAA의 발현을 개선시켰다. 한 구현예에서, GAA를 인코딩하는 핵산 서열을 변형시켜 CpG 디뉴클레오티드를 제거하였다. 총 20개의 새로운 코돈 최적화된 전이유전자 서열이 생성되었다(GAA1-GAA20). GAA 활성의 시험관내 비교를 기반으로 하여, 추가 최적화를 위해 5개의 코돈-최적화된 서열을 선택하였다(GAA 2, 5, 7, 8 및 13). GAA13 서열은 5' 비번역 영역(UTR)에 29-염기쌍 폴리뉴클레오티드 서열을 추가한 후 GAA 발현에서의 차이를 분석하는데 사용되었다. 소 성장 호르몬(bGH 또는 BGH)(야생형 및 CpG-감소)에서 유래된 두 가지 다른 폴리아데닐화 서열 또한 GAA7, 8 및 13에 대해 평가되었다. 생성된 9개의 발현 카세트(표 1)를 SEQ ID NO: 30-32 캡시드 내에 패키징하였다; 하나는 또한 AAV6 캡시드에 패키징하였다.
본 발명에 따르면, 산 α-글루코시다제(GAA)를 인코딩하는 핵산, 산 α-글루코시다제(GAA)를 인코딩하는 핵산을 포함하는 발현 카세트 및 산 α-글루코시다제(GAA)를 인코딩하는 핵산을 포함하는 바이러스 벡터가 제공된다.
한 구현예에서, GAA를 인코딩하는 핵산은 SEQ ID NO: 1-5로 제시된 서열중 임의의 서열에 대해 86% 초과의 서열 동일성을 갖는다. 추가 양태에서, GAA를 인코딩하는 핵산은 SEQ ID NO: 1-5로 제시된 서열 중 임의의 서열에 대해 87% 초과의 서열 동일성을 갖는다.
또 다른 구현예에서, GAA를 인코딩하는 핵산은 SEQ ID NO: 6-15로 제시된 서열 중 임의의 서열에 대해 87% 초과의 서열 동일성을 갖는다. 특정 양태에서, GAA를 인코딩하는 핵산은 SEQ ID NO: 6-15로 제시된 서열 중 임의의 서열에 대해 88% 초과의 서열 동일성을 갖는다. 추가의 특정 양태에서, GAA를 인코딩하는 핵산은 SEQ ID NO: 6-15로 제시된 서열 중 임의의 서열에 대해 89% 초과의 서열 동일성을 갖는다. 추가의 특정 양태에서, GAA를 인코딩하는 핵산은 SEQ ID NO: 6-15로 제시된 서열 중 임의의 서열에 대해 90% 초과의 서열 동일성을 갖는다. 더욱 추가의 특정 양태에서, GAA를 인코딩하는 핵산은 SEQ ID NO: 6-15로 제시된 서열 중 임의의 서열에 대해 91% 초과의 서열 동일성을 갖는다.
또 다른 구현예에서, GAA를 인코딩하는 핵산은 SEQ ID NO: 16-24로 제시된 서열 중 임의의 서열에 대해 91% 초과의 서열 동일성을 갖는다.
또 다른 구현예에서, GAA를 인코딩하는 핵산은 SEQ ID NO: 1-24로 제시된 서열 중 임의의 서열에 대해 92% 초과의 서열 동일성을 갖는다.
또 다른 구현예에서, GAA를 인코딩하는 핵산은 SEQ ID NO: 1-24로 제시된 서열 중 임의의 서열에 대해 93% 초과의 서열 동일성을 갖는다.
또 다른 구현예에서, GAA를 인코딩하는 핵산은 SEQ ID NO: 1-24로 제시된 서열 중 임의의 서열에 대해 94% 초과의 서열 동일성을 갖는다.
또 다른 구현예에서, GAA를 인코딩하는 핵산은 SEQ ID NO: 1-24로 제시된 서열 중 임의의 서열에 대해 95% 초과의 서열 동일성을 갖는다.
또 다른 구현예에서, GAA를 인코딩하는 핵산은 SEQ ID NO: 1-24로 제시된 서열 중 임의의 서열에 대해 96% 초과의 서열 동일성을 갖는다.
또 다른 구현예에서, GAA를 인코딩하는 핵산은 SEQ ID NO: 1-24로 제시된 서열 중 임의의 서열에 대해 97% 초과의 서열 동일성을 갖는다.
또 다른 구현예에서, GAA를 인코딩하는 핵산은 SEQ ID NO: 1-24로 제시된 서열 중 임의의 서열에 대해 98% 초과의 서열 동일성을 갖는다.
또 다른 구현예에서, GAA를 인코딩하는 핵산은 SEQ ID NO: 1-24로 제시된 서열 중 임의의 서열에 대해 99% 초과의 서열 동일성을 갖는다.
또 다른 구현예에서, GAA를 인코딩하는 핵산은 SEQ ID NO: 1-24로 제시된 서열 중 임의의 서열에 대해 99.5% 초과의 서열 동일성을 갖는다.
또 다른 구현예에서, GAA를 인코딩하는 핵산은 SEQ ID NO: 1-24로 제시된 서열 중 임의의 서열에 대해 100% 서열 동일성을 갖는다.
또 다른 구현예에서, GAA를 인코딩하는 핵산은 127개 미만의 CpG 디뉴클레오티드를 포함한다.
또 다른 구현예에서, GAA를 인코딩하는 핵산은 126개 미만의 CpG 디뉴클레오티드를 포함한다.
또 다른 구현예에서, GAA를 인코딩하는 핵산은 약 126-120개의 CpG 디뉴클레오티드를 포함한다.
또 다른 구현예에서, GAA를 인코딩하는 핵산은 약 120-110개의 CpG 디뉴클레오티드를 포함한다.
또 다른 구현예에서, GAA를 인코딩하는 핵산은 약 110-100개의 CpG 디뉴클레오티드를 포함한다.
또 다른 구현예에서, GAA를 인코딩하는 핵산은 약 100-90개의 CpG 디뉴클레오티드를 포함한다.
또 다른 구현예에서, GAA를 인코딩하는 핵산은 약 90-80개의 CpG 디뉴클레오티드를 포함한다.
또 다른 구현예에서, GAA를 인코딩하는 핵산은 약 80-70개의 CpG 디뉴클레오티드를 포함한다.
또 다른 구현예에서, GAA를 인코딩하는 핵산은 약 70-60개의 CpG 디뉴클레오티드를 포함한다.
또 다른 구현예에서, GAA를 인코딩하는 핵산은 약 60-50개의 CpG 디뉴클레오티드를 포함한다.
또 다른 구현예에서, GAA를 인코딩하는 핵산은 약 50-40개의 CpG 디뉴클레오티드를 포함한다.
또 다른 구현예에서, GAA를 인코딩하는 핵산은 약 40-30개의 CpG 디뉴클레오티드를 포함한다.
또 다른 구현예에서, GAA를 인코딩하는 핵산은 약 30-20개의 CpG 디뉴클레오티드를 포함한다.
또 다른 구현예에서, GAA를 인코딩하는 핵산은 20개 미만의 CpG 디뉴클레오티드를 포함한다.
또 다른 구현예에서, GAA를 인코딩하는 핵산은 약 20-10개의 CpG 디뉴클레오티드를 포함한다.
또 다른 구현예에서, GAA를 인코딩하는 핵산은 10개 미만의 CpG 디뉴클레오티드를 포함한다.
또 다른 구현예에서, GAA를 인코딩하는 핵산은 약 10-5개의 CpG 디뉴클레오티드를 포함한다.
또 다른 구현예에서, GAA를 인코딩하는 핵산은 5개 CpG 디뉴클레오티드를 포함한다.
또 다른 구현예에서, GAA를 인코딩하는 핵산은 4개 CpG 디뉴클레오티드를 포함한다.
또 다른 구현예에서, GAA를 인코딩하는 핵산은 3개 CpG 디뉴클레오티드를 포함한다.
또 다른 구현예에서, GAA를 인코딩하는 핵산은 2개 CpG 디뉴클레오티드를 포함한다.
또 다른 구현예에서, GAA를 인코딩하는 핵산은 1개 CpG 디뉴클레오티드를 포함한다.
또 다른 구현예에서, GAA를 인코딩하는 핵산은 0개 CpG 디뉴클레오티드를 포함한다.
본 발명은 또한 발현 조절 요소에 작동가능하게 연결된 본원에 제시된 바와 같은 GAA를 인코딩하는 핵산을 포함하는 발현 카세트를 제공한다.
한 구현예에서, 발현 카세트는 SEQ ID NO: 1-5로 제시된 서열 중 임의의 서열에 대해 86% 초과의 서열 동일성(예를 들어, 87% - 100% 동일성)을 갖는 GAA를 인코딩하는 핵산을 포함한다.
또 다른 구현예에서, 발현 카세트는 SEQ ID NO: 6-15로 제시된 서열 중 임의의 서열에 대해 87% 초과의 서열 동일성(예를 들어, 88% - 100% 동일성)을 갖는 GAA를 인코딩하는 핵산을 포함한다.
또 다른 구현예에서, 발현 카세트는 127개 미만의 CpG 디뉴클레오티드, 127개 미만의 CpG 디뉴클레오티드, 127개 미만의 CpG 디뉴클레오티드, 126개 미만의 CpG 디뉴클레오티드, 125개 미만의 CpG 디뉴클레오티드, 124개 미만의 CpG 디뉴클레오티드, 123개 미만의 CpG 디뉴클레오티드, 122개 미만의 CpG 디뉴클레오티드, 121개 미만의 CpG 디뉴클레오티드, 120개 미만의 CpG 디뉴클레오티드, 119개 미만의 CpG 디뉴클레오티드, 118개 미만의 CpG 디뉴클레오티드, 117개 미만의 CpG 디뉴클레오티드, 116개 미만의 CpG 디뉴클레오티드, 115개 미만의 CpG 디뉴클레오티드, 114개 미만의 CpG 디뉴클레오티드, 113개 미만의 CpG 디뉴클레오티드, 112개 미만의 CpG 디뉴클레오티드, 111개 미만의 CpG 디뉴클레오티드, 110개 미만의 CpG 디뉴클레오티드, 109개 미만의 CpG 디뉴클레오티드, 108개 미만의 CpG 디뉴클레오티드, 107개 미만의 CpG 디뉴클레오티드, 106개 미만의 CpG 디뉴클레오티드, 105개 미만의 CpG 디뉴클레오티드, 104개 미만의 CpG 디뉴클레오티드, 103개 미만의 CpG 디뉴클레오티드, 102개 미만의 CpG 디뉴클레오티드, 101개 미만의 CpG 디뉴클레오티드, 101개 미만의 CpG 디뉴클레오티드, 및 기타 등등(영(0)개까지의 CpG 디뉴클레오티드)를 갖는 GAA를 인코딩하는 핵산을 포함한다.
한 구현예에서, 발현 조절 요소는 GAA를 인코딩하는 핵산의 5'에 위치한다.
또 다른 구현예에서, 발현 카세트는 GAA를 인코딩하는 핵산의 3'에 위치하는 폴리-아데닐화(polyA) 서열을 포함한다.
또 다른 구현예에서, 발현 조절 요소 또는 폴리-아데닐화 서열은 야생형 발현 조절 요소 또는 폴리-아데닐화 서열과 비교하여 감소된 CpG이다.
또 다른 구현예에서, 발현 조절 요소는 ApoE/hAAT 인핸서/프로모터 서열을 포함한다.
또 다른 구현예에서, 폴리-아데닐화 서열은 소 성장 호르몬(bGH) 폴리아데닐화 서열을 포함한다.
또 다른 구현예에서, ApoE/hAAT 인핸서/프로모터 서열 또는 bGH 폴리아데닐화 서열은 야생형 ApoE/hAAT 인핸서/프로모터 서열 또는 bGH 폴리아데닐화 서열과 비교하여 감소된 CpG이다.
한 양태에서, 야생형 bGH 폴리아데닐화 서열은 SEQ ID NO: 27의 서열을 포함한다.
또 다른 양태에서, 야생형 ApoE/hAAT 인핸서/프로모터 서열은 SEQ ID NO: 28 또는 29의 서열을 포함한다.
또 다른 양태에서, CpG 감소된 bGH 폴리아데닐화 서열은 SEQ ID NO: 26의 서열을 포함한다.
또 다른 구현예에서, 발현 카세트는 발현 조절 요소의 3' 말단과 GAA를 인코딩하는 핵산의 5' 말단 사이에 위치하는 인트론을 추가로 포함한다.
또 다른 구현예에서, GAA는 SEQ ID NO: 25로 제시된 서열을 포함하거나 그로 구성된다.
본 발명은 추가로 본원에 제시된 바와 같은 GAA를 인코딩하는 핵산을 포함하는 아데노바이러스 관련 바이러스(AAV) 벡터와 같은 바이러스 벡터를 제공한다.
한 구현예에서, 바이러스 벡터, 예컨대 아데노바이러스-관련 바이러스(AAV) 벡터는 발현 조절 요소에 작동가능하게 연결된 본원에 제시된 바와 같은 GAA를 인코딩하는 임의의 핵산을 포함한다.
또 다른 구현예에서, 바이러스 벡터, 예컨대 아데노바이러스-관련 바이러스(AAV) 벡터는 본원에 제시된 바와 같은 GAA를 인코딩하는 핵산을 포함하는 임의의 발현 카세트를 포함한다.
또 다른 구현예에서, AAV 벡터는 AAV 캡시드 중 하나 이상; 및 하나 이상의 AAV 역 말단 반복(ITR)을 포함하며, 여기서 AAV ITR(들)은 핵산 또는 발현 카세트의 5' 또는 3' 말단에 측접한다.
추가의 구현예에서, AAV 벡터는 하나 이상의 ITR의 5' 또는 3'에 위치하는 인트론을 추가로 포함한다.
추가의 구현예에서, 적어도 하나 이상의 ITR 또는 인트론을 포함하는 AAV 벡터는 감소된 CpG를 갖도록 변형된 하나 이상의 ITR 또는 인트론을 갖는다.
추가의 구현예에서, AAV 벡터는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, Rh10, Rh74, AAV3B, AAV-2i8 또는 SEQ ID NO: 30, 31 또는 32 VP1, VP2 및/또는 VP3 서열에 대해 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 변형된 또는 변이체 AAV VP1, VP2 및/또는 VP3 캡시드, 또는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, Rh10, Rh74, AAV3B, AAV-2i8, 또는 SEQ ID NO: 30, 31 또는 32 VP1, VP2 및/또는 VP3 서열에 대해 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 캡시드, 또는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, Rh10, Rh74, AAV3B, AAV-2i8, 또는 SEQ ID NO: 30, 31 또는 32 VP1, VP2 및/또는 VP3 서열에 대해 100% 서열 동일성을 갖는 캡시드를 포함하는 캡시드 혈청형을 갖는다.
추가의 구현예에서, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, Rh10, Rh74 또는 AAV3B AAV 혈청형 또는 이의 조합물 중 임의의 것의 하나 이상의 ITR로서 하나 이상의 ITR을 포함하는 AAV 벡터.
본 발명은 추가로 본원에 제시된 바와 같은 GAA를 인코딩하는 핵산, GAA를 인코딩하는 핵산을 포함하는 발현 카세트, 또는 GAA를 인코딩하는 핵산 또는 GAA를 인코딩하는 핵산을 포함하는 발현 카세트를 포함하는 바이러스 벡터, 예컨대 AAV 벡터 중 임의의 것을 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
한 구현예에서, 약학적 조성물은 생물학적으로 양립가능한 담체 또는 부형제 중의 본원에 제시된 바와 같은 복수의 AAV 벡터를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 본원에 제시된 바와 같은 AAV 벡터 중 임의의 벡터를 포함하는 약학적 조성물은 빈 AAV 캡시드를 추가로 포함한다.
특정 구현예에서, AAV 벡터 및 빈 AAV 캡시드를 포함하는 약학적 조성물에서, 빈 AAV 캡시드 대 AAV 벡터의 비율은 약 100:1-50:1 이내 또는 그 사이, 약 50:1-25:1, 약 25:1-10:1, 약 10:1-1:1, 약 1:1-1:10, 약 1:10-1:25, 약 1:25-1:50 또는 약 1:50-1:100이다.
특정 양태에서, AAV 벡터 및 빈 AAV 캡시드를 포함하는 약학적 조성물에서, 빈 AAV 캡시드 대 AAV 벡터의 비율은 약 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1 또는 10:1이다.
또 다른 구현예에서, 약학적 조성물은 계면활성제를 포함한다.
본 발명은 또한 추가로 GAA를 인코딩하는 핵산, GAA를 인코딩하는 핵산을 포함하는 발현 카세트, 또는 GAA를 인코딩하는 핵산 또는 GAA를 인코딩하는 핵산을 포함하는 발현 카세트를 포함하는 바이러스 벡터 예컨대, AAV 벡터 중 임의의 것을 인간에게 투여하거나 전달함으로써 산 α-글루코시다제(GAA)를 필요로하는 인간을 치료하는 방법을 제공한다.
한 구현예에서, 산 α-글루코시다제(GAA)를 필요로하는 인간을 치료하는 방법은 (a) 본원에 제시된 바와 같은 핵산, 발현 카세트 또는 바이러스 벡터, 예컨대 AAV 벡터, 또는 본원에 제시된 바와 같은 임의의 약학적 조성물을 제공하는 단계; 및 (b) 일정량의 핵산, 발현 카세트, 바이러스(예를 들어, AAV) 벡터 또는 약학적 조성물을 인간에게 투여하는 단계로서, GAA는 인간에서 발현되는, 단계를 포함한다.
특정 구현예에서, 인간은 영아 발병 폼페병 또는 후기 발병 폼페병과 같은 폼페병을 갖는다.
다른 구현예에서, 인간은 글리코겐 축적병(GSD)을 갖는다.
특정 양태에서, GSD는 GSD 타입 I(폰기에르케병), GSD 타입 III(포르브스-코리병), GSD 타입 IV(앤더슨병, 아밀로펙틴증), GSD 타입 V(맥아들병), GSD 타입 VI(허스병), GSD 타입 VII(타루이병) 또는 심장의 선천성 GSD(예를 들어, 심장의 선천성 치사 GSD) 중 임의의 것이다.
특정 구현예에서, GAA를 인코딩하는 핵산, GAA를 인코딩하는 핵산을 포함하는 발현 카세트, 또는 AAV 벡터는 인간에게 정맥내, 동맥내, 공동내, 강내, 점막내 또는 카테터를 통해 투여된다.
특정 구현예에서, 방법에서 GAA는 증가된 수준으로, 선택적으로 GAA를 필요로하지 않는 인간에서 발견되는 GAA 수준의 1% 초과로 발현된다.
특정 구현예에서, AAV 벡터는 인간 체중의 킬로그램 당 약 1X108 내지 약 1X1014 벡터 게놈(vg/kg)의 범위로 투여된다.
특정 구현예에서, 방법은 GAA를 필요로 하는 사람 또는 질병의 하나 이상의 증상을 감소, 저하 또는 억제하거나; GAA를 필요로 하는 사람 또는 질병의 하나 이상의 증상의 진행 또는 악화를 예방 또는 감소시키거나; GAA를 필요로 하는 사람 또는 질병의 하나 이상의 증상을 안정화시키거나; GAA를 필요로 하는 사람 또는 질병의 하나 이상의 증상을 개선한다.
특정 양태에서, 본 발명에 따라 치료가능한 증상은 다음 중 하나 이상일 수 있다: 식사 행동 장애 및/또는 체중 비증가; 머리 및/또는 목 조절 불량; 호흡 문제 및/또는 폐 감염; 심장 비대 및/또는 두꺼워지는 심장; 심장 결함; 혀 비대; 연하 곤란; 간 비대; 약한 근력; 약한 근긴장; 다리, 허리 및/또는 팔 쇠약; 호흡 곤란; 운동의 어려움; 수면 중 호흡 곤란; 척추만곡증; 및/또는 관절 강직.
본 발명은 여전히 추가로 GAA를 인코딩하는 핵산을 포함하는 세포, GAA를 인코딩하는 핵산을 포함하는 발현 카세트를 포함하는 세포 및 GAA를 인코딩하는 핵산 또는 GAA를 인코딩하는 핵산을 포함하는 발현 카세트를 포함하는 바이러스 벡터, 예컨대 AAV 벡터를 포함하는 세포를 제공한다.
한 구현예에서, 세포는 바이러스 벡터를 생산한다.
또 다른 구현예에서, 세포는 본원에 제시된 바와 같은 AAV 벡터를 생산한다.
여전히 추가로, 본 발명은 또한 본원에 제시된 바와 같은 바이러스 벡터, 예컨대 AAV 벡터를 생산하는 방법을 제공한다.
한 구현예에서, AAV 벡터를 생산하는 방법은 GAA를 인코딩하는 핵산 또는 본원에 제시된 바와 같은 GAA를 인코딩하는 핵산을 포함하는 발현 카세트를 포함하는 AAV 벡터 게놈을 패키징 헬퍼 세포에 도입하는 단계; 및 AAV 벡터를 생산하기 위한 조건 하에서 헬퍼 세포를 배양하는 단계를 포함한다.
또 다른 구현예에서, AAV 벡터를 생산하는 방법은 본원에 제시된 바와 같은 GAA를 인코딩하는 핵산 또는 GAA를 인코딩하는 핵산을 포함하는 발현 카세트를 패키징 헬퍼 세포에 도입하는 단계; 및 AAV 벡터를 생산하기 위한 조건 하에서 헬퍼 세포를 배양하는 단계를 포함한다.
추가의 구현예에서, 세포는 포유동물 세포이다.
추가의 구현예에서, 벡터 생산을 위한 세포는 벡터를 바이러스 입자 내로 패키징하는 AAV 헬퍼 기능과 같은 헬퍼 기능을 제공한다. 특정 양태에서, 헬퍼 기능은 AAV 벡터 패키징을 위한 Rep 및/또는 Cap 단백질이다.
추가의 구현예에서, 벡터 생산을 위한 세포는 Rep 및/또는 Cap 단백질 서열(들)을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드(들)로 안정하게 또는 일시적으로 형질감염될 수 있다.
추가의 구현예에서, 벡터 생산을 위한 세포는 Rep78 및/또는 Rep68 단백질을 제공한다. 이러한 세포에서, 세포는 Rep78 및/또는 Rep68 단백질 폴리뉴클레오티드 인코딩 서열(들)로 안정하게 또는 일시적으로 형질감염될 수 있다.
특정 구현예에서, 벡터 생산을 위한 세포는 인간 배아 신장 세포이다. 특정 양태에서, 벡터 생산을 위한 세포는 HEK-293 세포이다.
도 1은 pAAV-ApoE/hAAT.fixUTR.GAA13.BGH (SEQ ID NO: 16)의 개략도를 보여준다.
도 2는 pAAV-ApoE/hAAT.GAA13.BGH (SEQ ID NO: 17)의 개략도를 보여준다.
도 3은 pAAV-ApoE/hAAT.GAA7.BGH (SEQ ID NO: 18)의 개략도를 보여준다.
도 4는 pAAV-ApoE/hAAT.GAA8.BGH (SEQ ID NO: 19)의 개략도를 보여준다.
도 5는 pAAV-ApoE/hAAT.GAA2.wtBGH (SEQ ID NO: 20)의 개략도를 보여준다.
도 6은 pAAV-ApoE/hAAT.GAA5.wtBGH (SEQ ID NO: 21)의 개략도를 보여준다.
도 7은 pAAV-ApoE/hAAT.GAA7.wtBGH (SEQ ID NO: 22)의 개략도를 보여준다.
도 8은 pAAV-ApoE/hAAT.GAA8.wtBGH (SEQ ID NO: 23)의 개략도를 보여준다.
도 9는 pAAV-ApoE/hAAT.GAA13.wtBGH. (SEQ ID NO: 24)의 개략도를 보여준다.
도 10은 GAA 활성 검정에 의한 Huh7 세포 상청액에서의 GAA 활성 수준의 평가를 보여준다.
도 11은 GAA 활성 검정에 의한 마우스 혈장내 GAA 활성 수준의 평가를 보여준다.
도 12는 GAA 웨스턴 블롯에 의한 마우스 혈장내 GAA 수준의 평가를 보여준다.
도 13은 GAA 활성 검정에 의한 마우스 혈장내 GAA 활성 수준의 평가를 보여준다.
도 14는 GAA 웨스턴 블롯에 의한 마우스 혈장내 GAA 수준의 평가를 보여준다.
도 15는 GAA 활성 검정에 의한 마우스 혈장내 GAA 활성 수준의 평가를 보여준다.
도 16은 GAA 활성 검정에 의한 래트 및 마우스 혈장내 GAA 활성 수준의 평가를 보여준다.
도 17은 GAA 활성 검정에 의한 비인간 영장류(수컷 레서스 원숭이)의 혈장 내 GAA 활성 수준의 평가를 보여준다.
도 18은 GAA 활성 검정에 의한 비인간 영장류(아프리카 녹색 원숭이)의 혈장 내 GAA 활성 수준의 평가를 보여준다. X-축은 주입 후 일수이다.
도 19는 웨스턴 블롯에 의한 비인간 영장류(아프리카 녹색 원숭이)의 혈장 내 GAA 수준의 평가를 보여주며, 특정 데이터가 그래프로 제시된다.
도 20은 SPK-AAV-01, SPK-AAV-02 또는 음성 대조군(AAV SEQ ID NO: 30-32 벡터에 패키징된 비-GAA 전이유전자를 갖는 rAAV)으로 형질도입된 Huh7 세포의 상청액중의 GAA 활성의 평가를 보여준다.
도 21은 2x1012, 6x1012, 2x1013 vg/kg의 용량으로 SPK-AAV-02를 단일 정맥내 투여한 후 레서스 원숭이로부터의 혈장 내 GAA 활성의 평가를 보여준다.
상세한 설명
본 발명은 GAA를 인코딩하는 변형된 핵산, GAA를 인코딩하는 변형된 핵산을 포함하는 발현 카세트, GAA를 인코딩하는 변형된 핵산을 포함하는 AAV 벡터 게놈, 및 GAA를 인코딩하는 변형된 핵산을 포함하는 재조합 AAV 벡터 및 입자를 제공한다. 본 발명의 GAA를 인코딩하는 변형된 핵산, GAA를 인코딩하는 변형된 핵산을 포함하는 발현 카세트, GAA를 인코딩하는 변형된 핵산을 포함하는 AAV 벡터 게놈, 및 재조합 AAV 벡터 및 입자는 폼페병뿐만 아니라 다른 글리코겐 축적병(GSD)을 치료하는데 유용하다.
본원에 사용된 용어 "변형하다" 및 이의 문법적 변형은 핵산 또는 단백질이 참조 또는 어미 서열에서 벗어남을 의미한다. GAA를 인코딩하는 변형된 핵산은 참조(예를 들어, 야생형) 또는 어미 핵산과 비교하여 변경되었다. 따라서, 변형된 핵산은 참조 또는 어미 핵산과 실질적으로 동일하거나 더 크거나 더 적은 활성 또는 기능을 가질 수 있으며, 적어도 참조 또는 어미 핵산에 대한 부분적 활성, 기능 및/또는 서열 동일성을 유지한다. 변형된 핵산은 변형되거나 변이된 GAA를 인코딩하기 위해 유전자 변형될 수 있다.
"GAA를 인코딩하는 변형된 핵산"은 GAA를 인코딩하는 비변형된 어미 핵산과 비교하여 GAA 핵산이 변경되었음을 의미한다. 변형의 특정 예는 뉴클레오티드 치환이다. 본원에서 용어 "변형"은 GAA를 인코딩하는 핵산에 대한 언급의 각 경우에 나타낼 필요는 없다.
특정 구현예에서, GAA를 인코딩하는 변형된 핵산에 있어서, GAA 단백질은 야생형 GAA 단백질의 기능 또는 활성의 적어도 일부를 보유한다. GAA 단백질의 기능 또는 활성은 글리코겐, 말토스 및 이소말토스를 분해하는 리소좀 가수분해효소인 산 알파 글루코시다제 활성을 포함한다. 따라서, GAA를 인코딩하는 변형된 핵산은 엔코딩된 GAA가 GAA의 리소좀 가수분해효소 활성의 일부 정도 또는 양태를 보유하는 한 변형된 형태를 포함한다.
본원에 제시된 바와 같이, GAA를 인코딩하는 변형된 핵산은 참조 또는 어미 핵산과 비교하여 상이한 특성 또는 특징을 나타낼 수 있다. 예를 들어, 변형된 핵산은 본원에 제시된 바와 같은 GAA를 인코딩하는 참조 핵산에 대해 100% 동일성을 갖는 서열뿐만 아니라 GAA를 인코딩하는 참조 핵산에 대해 100% 미만의 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
용어 "동일성", "상동성" 및 이의 문법적 변형은 둘 이상의 언급된 대상이 "정렬된" 서열일 경우 동일함을 의미한다. 따라서, 예를 들어, 두 핵산이 동일한 경우, 적어도 언급된 영역 또는 부분 내에서 이들은 동일한 서열을 갖는다. 동일성은 규정된 서열 영역(부위 또는 도메인)에 걸쳐 있을 수 있다.
동일성의 "영역" 또는 "부위"는 동일한 두 개 이상의 참조된 존재물의 일부를 나타낸다. 따라서, 두 개의 단백질 또는 핵산 서열이 하나 이상의 서열 영역 또는 부위에 걸쳐 동일한 경우 이들은 해당 영역 내에서 동일성을 공유한다. "정렬된" 서열은 참조 서열과 비교하여 종종 누락되거나 추가된 염기 또는 아미노산(갭)에 대한 수정을 함유하는 다수의 단백질(아미노산) 또는 핵산 서열을 나타낸다.
동일성은 서열의 전체 길이 또는 일부에 걸쳐 확장될 수 있다. 특정 구현예에서, 동일성 퍼센트를 공유하는 서열의 길이는 2, 3, 4, 5개 이상의 연속 아미노산 또는 핵산, 예를 들어, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개 등의 연속 핵산 또는 아미노산이다. 추가의 구현예에서, 동일성을 공유하는 서열의 길이는 21개 이상의 연속 아미노산 또는 핵산, 예를 들어 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40개 등의 연속 아미노산 또는 핵산이다. 추가의 구현예에서, 동일성을 공유하는 서열의 길이는 41개 이상의 연속 아미노산 또는 핵산, 예를 들어 42, 43, 44, 45, 45, 47, 48, 49, 50개 등의 연속 아미노산 또는 핵산이다. 더욱 추가의 구현예에서, 동일성을 공유하는 서열의 길이는 50개 이상의 연속 아미노산 또는 핵산, 예를 들어 50-55, 55-60, 60-65, 65-70, 70-75, 75-80, 80-85, 85-90, 90-95, 95-100, 100-150, 150-200, 200-250, 250-300, 300-500, 500-1,000개 등의 연속 아미노산 또는 핵산이다.
본원에 제시된 바와 같이, GAA를 인코딩하는 변형된 핵산은 GAA를 인코딩하는 참조 핵산과 구별되거나 100% 동일성 또는 100% 미만의 동일성을 나타낼 수 있다.
특정 구현예에서, GAA를 인코딩하는 본 발명의 핵산은 SEQ ID NO: 1-5에 제시된 임의의 핵산에 대해 86% 초과로 동일할 수 있다.
특정 구현예에서, GAA를 인코딩하는 본 발명의 핵산은 SEQ ID NO: 6-14에 제시된 임의의 핵산에 대해 87% 초과로 동일할 수 있다.
특정 구현예에서, GAA를 인코딩하는 본 발명의 핵산은 SEQ ID NO: 16-24에 제시된 임의의 핵산에 대해 91% 초과로 동일할 수 있다.
GAA를 인코딩하는 이러한 변형된 핵산은 SEQ ID NO: 1-24 중 임의의 것에 대해 심지어 더 큰 동일성 예를 들어, 87% 초과의 동일성; 88% 초과의 동일성, 89% 초과의 동일성, 90% 초과의 동일성, 91% 초과의 동일성, 92% 초과의 동일성, 93% 초과의 동일성, 94% 초과의 동일성, 95% 초과의 동일성, 96% 초과의 동일성, 97% 초과의 동일성, 98% 초과의 동일성, 99% 초과의 동일성 또는 100% 동일성을 나타낼 수 있다.
두 서열 사이의 동일성(상동성) 또는 "동일성 퍼센트"의 정도는 컴퓨터 프로그램 및/또는 수학적 알고리즘을 사용하여 확인할 수 있다. 본 발명의 목적을 위해, 핵산 서열의 비교는 Genetics Computer Group(Madison, Winsconsin)으로부터 입수가능한 GCG Wisconsin Package 버전 9.1을 사용하여 수행된다. 편의상, 그 프로그램에 의해 지정된 기본 매개변수(갭 생성 패널티 = 12, 갭 확장 패널티 = 4)는 서열 동일성을 비교하기 위해 본원에서 사용하기 위한 것이다. 대안적으로, 기본 매개변수와 갭 정렬을 사용하는 National Center for Biotechnology Information에서 제공하는 Blastn 2.0 프로그램(월드 와이드 웹 ncbi.nlm.nih.gov/blast/에서 찾을 수 있음; Altschul et al., 1990, J Mol Biol 215:403-410)은 핵산 서열과 아미노산 서열 사이의 동일성 및 유사성 수준을 결정하는데 사용될 수 있다. 폴리펩티드 서열 비교를 위해 BLASTP 알고리즘은 일반적으로 PAM100, PAM 250, BLOSUM 62 또는 BLOSUM 50과 같은 스코어링 매트릭스와 함께 사용된다. FASTA(예를 들어, FASTA2 및 FASTA3) 및 SSEARCH 서열 비교 프로그램은 또한 동일성의 정도를 정량화하는데 사용된다(Pearson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988); Pearson, Methods Mol Biol. 132:185 (2000); and Smith et al., J. Mol. Biol. 147:195 (1981)). Delaunay-기반 토폴로지 맵핑을 사용하여 단백질 구조 유사성을 정량화하는 프로그램 또한 개발되었다(Bostick et al., Biochem Biophys Res Commun. 304:320(2003)).
참조 또는 어미 핵산과 비교하여 상이한 특성 또는 특징을 나타내는 GAA를 인코딩하는 변형된 핵산은 뉴클레오티드의 치환을 포함한다. 예를 들어, GAA를 인코딩하는 변형된 핵산은 GAA를 인코딩하는 참조 핵산과 비교하여 감소된 수의 CpG 디뉴클레오티드를 갖는 핵산을 포함한다.
특정 구현예에서, GAA를 인코딩하는 핵산은 127개 미만의 CpG 디뉴클레오티드를 포함한다.
특정 구현예에서, GAA를 인코딩하는 핵산은 126개 미만의 CpG 디뉴클레오티드를 포함한다.
특정 구현예에서, GAA를 인코딩하는 핵산은 125개 미만의 CpG 디뉴클레오티드를 포함한다.
특정 구현예에서, GAA를 인코딩하는 핵산은 124개 미만의 CpG 디뉴클레오티드를 포함한다.
특정 구현예에서, GAA를 인코딩하는 핵산은 123개 미만의 CpG 디뉴클레오티드를 포함한다.
특정 구현예에서, GAA를 인코딩하는 핵산은 122개 미만의 CpG 디뉴클레오티드를 포함한다.
특정 구현예에서, GAA를 인코딩하는 핵산은 121개 미만의 CpG 디뉴클레오티드를 포함한다.
특정 구현예에서, GAA를 인코딩하는 핵산은 120개 미만의 CpG 디뉴클레오티드를 포함한다.
특정 구현예에서, GAA를 인코딩하는 핵산은 119개 미만의 CpG 디뉴클레오티드를 포함한다.
특정 구현예에서, GAA를 인코딩하는 핵산은 118개 미만의 CpG 디뉴클레오티드를 포함한다.
특정 구현예에서, GAA를 인코딩하는 핵산은 117개 미만의 CpG 디뉴클레오티드를 포함한다.
특정 구현예에서, GAA를 인코딩하는 핵산은 116개 미만의 CpG 디뉴클레오티드를 포함한다.
특정 구현예에서, GAA를 인코딩하는 핵산은 115개 미만의 CpG 디뉴클레오티드를 포함한다.
특정 구현예에서, GAA를 인코딩하는 핵산은 114개 미만의 CpG 디뉴클레오티드를 포함한다.
특정 구현예에서, GAA를 인코딩하는 핵산은 113개 미만의 CpG 디뉴클레오티드를 포함한다.
특정 구현예에서, GAA를 인코딩하는 핵산은 112개 미만의 CpG 디뉴클레오티드를 포함한다.
특정 구현예에서, GAA를 인코딩하는 핵산은 111개 미만의 CpG 디뉴클레오티드를 포함한다.
특정 구현예에서, GAA를 인코딩하는 핵산은 110개 미만의 CpG 디뉴클레오티드를 포함한다.
특정 구현예에서, GAA를 인코딩하는 핵산은 109개 미만의 CpG 디뉴클레오티드를 포함한다.
특정 구현예에서, GAA를 인코딩하는 핵산은 108개 미만의 CpG 디뉴클레오티드를 포함한다.
특정 구현예에서, GAA를 인코딩하는 핵산은 107개 미만의 CpG 디뉴클레오티드를 포함한다.
특정 구현예에서, GAA를 인코딩하는 핵산은 106개 미만의 CpG 디뉴클레오티드를 포함한다.
특정 구현예에서, GAA를 인코딩하는 핵산은 105개 미만의 CpG 디뉴클레오티드를 포함한다.
특정 구현예에서, GAA를 인코딩하는 핵산은 104개 미만의 CpG 디뉴클레오티드를 포함한다.
특정 구현예에서, GAA를 인코딩하는 핵산은 103개 미만의 CpG 디뉴클레오티드를 포함한다.
특정 구현예에서, GAA를 인코딩하는 핵산은 102개 미만의 CpG 디뉴클레오티드를 포함한다.
특정 구현예에서, GAA를 인코딩하는 핵산은 101개 미만의 CpG 디뉴클레오티드를 포함한다.
특정 구현예에서, GAA를 인코딩하는 핵산은 100개 미만의 CpG 디뉴클레오티드를 포함한다.
특정 구현예에서, GAA를 인코딩하는 핵산은 99개 미만의 CpG 디뉴클레오티드를 포함한다.
특정 구현예에서, GAA를 인코딩하는 핵산은 98개 미만의 CpG 디뉴클레오티드를 포함한다.
특정 구현예에서, GAA를 인코딩하는 핵산은 97개 미만의 CpG 디뉴클레오티드를 포함한다.
특정 구현예에서, GAA를 인코딩하는 핵산은 96개 미만의 CpG 디뉴클레오티드를 포함한다.
특정 구현예에서, GAA를 인코딩하는 핵산은 95개 미만의 CpG 디뉴클레오티드를 포함한다.
특정 구현예에서, GAA를 인코딩하는 핵산은 94개 미만의 CpG 디뉴클레오티드를 포함한다.
특정 구현예에서, GAA를 인코딩하는 핵산은 93개 미만의 CpG 디뉴클레오티드를 포함한다.
특정 구현예에서, GAA를 인코딩하는 핵산은 92개 미만의 CpG 디뉴클레오티드를 포함한다.
특정 구현예에서, GAA를 인코딩하는 핵산은 91개 미만의 CpG 디뉴클레오티드를 포함한다.
특정 구현예에서, GAA를 인코딩하는 핵산은 90개 미만의 CpG 디뉴클레오티드를 포함한다.
특정 구현예에서, GAA를 인코딩하는 핵산은 89개 미만의 CpG 디뉴클레오티드를 포함한다.
특정 구현예에서, GAA를 인코딩하는 핵산은 88개 미만의 CpG 디뉴클레오티드를 포함한다.
특정 구현예에서, GAA를 인코딩하는 핵산은 87개 미만의 CpG 디뉴클레오티드를 포함한다.
특정 구현예에서, GAA를 인코딩하는 핵산은 86개 미만의 CpG 디뉴클레오티드를 포함한다.
특정 구현예에서, GAA를 인코딩하는 핵산은 85개 미만의 CpG 디뉴클레오티드를 포함한다.
특정 구현예에서, GAA를 인코딩하는 핵산은 84개 미만의 CpG 디뉴클레오티드를 포함한다.
특정 구현예에서, GAA를 인코딩하는 핵산은 83개 미만의 CpG 디뉴클레오티드를 포함한다.
특정 구현예에서, GAA를 인코딩하는 핵산은 82개 미만의 CpG 디뉴클레오티드를 포함한다.
특정 구현예에서, GAA를 인코딩하는 핵산은 81개 미만의 CpG 디뉴클레오티드를 포함한다.
특정 구현예에서, GAA를 인코딩하는 핵산은 80개 미만의 CpG 디뉴클레오티드를 포함한다.
특정 구현예에서, GAA를 인코딩하는 핵산은 79개 미만의 CpG 디뉴클레오티드를 포함한다.
특정 구현예에서, GAA를 인코딩하는 핵산은 78개 미만의 CpG 디뉴클레오티드를 포함한다.
특정 구현예에서, GAA를 인코딩하는 핵산은 77개 미만의 CpG 디뉴클레오티드를 포함한다.
특정 구현예에서, GAA를 인코딩하는 핵산은 76개 미만의 CpG 디뉴클레오티드를 포함한다.
특정 구현예에서, GAA를 인코딩하는 핵산은 75개 미만의 CpG 디뉴클레오티드를 포함한다.
특정 구현예에서, GAA를 인코딩하는 핵산은 74개 미만의 CpG 디뉴클레오티드를 포함한다.
특정 구현예에서, GAA를 인코딩하는 핵산은 73개 미만의 CpG 디뉴클레오티드를 포함한다.
특정 구현예에서, GAA를 인코딩하는 핵산은 72개 미만의 CpG 디뉴클레오티드를 포함한다.
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특정 구현예에서, GAA를 인코딩하는 핵산은 70개 미만의 CpG 디뉴클레오티드를 포함한다.
특정 구현예에서, GAA를 인코딩하는 핵산은 69개 미만의 CpG 디뉴클레오티드를 포함한다.
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특정 구현예에서, GAA를 인코딩하는 핵산은 64개 미만의 CpG 디뉴클레오티드를 포함한다.
특정 구현예에서, GAA를 인코딩하는 핵산은 63개 미만의 CpG 디뉴클레오티드를 포함한다.
특정 구현예에서, GAA를 인코딩하는 핵산은 62개 미만의 CpG 디뉴클레오티드를 포함한다.
특정 구현예에서, GAA를 인코딩하는 핵산은 61개 미만의 CpG 디뉴클레오티드를 포함한다.
특정 구현예에서, GAA를 인코딩하는 핵산은 60개 미만의 CpG 디뉴클레오티드를 포함한다.
특정 구현예에서, GAA를 인코딩하는 핵산은 59개 미만의 CpG 디뉴클레오티드를 포함한다.
특정 구현예에서, GAA를 인코딩하는 핵산은 58개 미만의 CpG 디뉴클레오티드를 포함한다.
특정 구현예에서, GAA를 인코딩하는 핵산은 57개 미만의 CpG 디뉴클레오티드를 포함한다.
특정 구현예에서, GAA를 인코딩하는 핵산은 56개 미만의 CpG 디뉴클레오티드를 포함한다.
특정 구현예에서, GAA를 인코딩하는 핵산은 55개 미만의 CpG 디뉴클레오티드를 포함한다.
특정 구현예에서, GAA를 인코딩하는 핵산은 54개 미만의 CpG 디뉴클레오티드를 포함한다.
특정 구현예에서, GAA를 인코딩하는 핵산은 53개 미만의 CpG 디뉴클레오티드를 포함한다.
특정 구현예에서, GAA를 인코딩하는 핵산은 52개 미만의 CpG 디뉴클레오티드를 포함한다.
특정 구현예에서, GAA를 인코딩하는 핵산은 51개 미만의 CpG 디뉴클레오티드를 포함한다.
특정 구현예에서, GAA를 인코딩하는 핵산은 50개 미만의 CpG 디뉴클레오티드를 포함한다.
특정 구현예에서, GAA를 인코딩하는 핵산은 49개 미만의 CpG 디뉴클레오티드를 포함한다.
특정 구현예에서, GAA를 인코딩하는 핵산은 48개 미만의 CpG 디뉴클레오티드를 포함한다.
특정 구현예에서, GAA를 인코딩하는 핵산은 47개 미만의 CpG 디뉴클레오티드를 포함한다.
특정 구현예에서, GAA를 인코딩하는 핵산은 46개 미만의 CpG 디뉴클레오티드를 포함한다.
특정 구현예에서, GAA를 인코딩하는 핵산은 45개 미만의 CpG 디뉴클레오티드를 포함한다.
특정 구현예에서, GAA를 인코딩하는 핵산은 44개 미만의 CpG 디뉴클레오티드를 포함한다.
특정 구현예에서, GAA를 인코딩하는 핵산은 43개 미만의 CpG 디뉴클레오티드를 포함한다.
특정 구현예에서, GAA를 인코딩하는 핵산은 42개 미만의 CpG 디뉴클레오티드를 포함한다.
특정 구현예에서, GAA를 인코딩하는 핵산은 41개 미만의 CpG 디뉴클레오티드를 포함한다.
특정 구현예에서, GAA를 인코딩하는 핵산은 40개 미만의 CpG 디뉴클레오티드를 포함한다.
특정 구현예에서, GAA를 인코딩하는 핵산은 39개 미만의 CpG 디뉴클레오티드를 포함한다.
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특정 구현예에서, GAA를 인코딩하는 핵산은 37개 미만의 CpG 디뉴클레오티드를 포함한다.
특정 구현예에서, GAA를 인코딩하는 핵산은 36개 미만의 CpG 디뉴클레오티드를 포함한다.
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특정 구현예에서, GAA를 인코딩하는 핵산은 34개 미만의 CpG 디뉴클레오티드를 포함한다.
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특정 구현예에서, GAA를 인코딩하는 핵산은 30개 미만의 CpG 디뉴클레오티드를 포함한다.
특정 구현예에서, GAA를 인코딩하는 핵산은 29개 미만의 CpG 디뉴클레오티드를 포함한다.
특정 구현예에서, GAA를 인코딩하는 핵산은 28개 미만의 CpG 디뉴클레오티드를 포함한다.
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특정 구현예에서, GAA를 인코딩하는 핵산은 24개 미만의 CpG 디뉴클레오티드를 포함한다.
특정 구현예에서, GAA를 인코딩하는 핵산은 23개 미만의 CpG 디뉴클레오티드를 포함한다.
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특정 구현예에서, GAA를 인코딩하는 핵산은 21개 미만의 CpG 디뉴클레오티드를 포함한다.
특정 구현예에서, GAA를 인코딩하는 핵산은 20개 미만의 CpG 디뉴클레오티드를 포함한다.
특정 구현예에서, GAA를 인코딩하는 핵산은 19개 미만의 CpG 디뉴클레오티드를 포함한다.
특정 구현예에서, GAA를 인코딩하는 핵산은 18개 미만의 CpG 디뉴클레오티드를 포함한다.
특정 구현예에서, GAA를 인코딩하는 핵산은 17개 미만의 CpG 디뉴클레오티드를 포함한다.
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특정 구현예에서, GAA를 인코딩하는 핵산은 14개 미만의 CpG 디뉴클레오티드를 포함한다.
특정 구현예에서, GAA를 인코딩하는 핵산은 13개 미만의 CpG 디뉴클레오티드를 포함한다.
특정 구현예에서, GAA를 인코딩하는 핵산은 12개 미만의 CpG 디뉴클레오티드를 포함한다.
특정 구현예에서, GAA를 인코딩하는 핵산은 11개 미만의 CpG 디뉴클레오티드를 포함한다.
특정 구현예에서, GAA를 인코딩하는 핵산은 10개 미만의 CpG 디뉴클레오티드를 포함한다.
특정 구현예에서, GAA를 인코딩하는 핵산은 9개 미만의 CpG 디뉴클레오티드를 포함한다.
특정 구현예에서, GAA를 인코딩하는 핵산은 8개 미만의 CpG 디뉴클레오티드를 포함한다.
특정 구현예에서, GAA를 인코딩하는 핵산은 7개 미만의 CpG 디뉴클레오티드를 포함한다.
특정 구현예에서, GAA를 인코딩하는 핵산은 6개 미만의 CpG 디뉴클레오티드를 포함한다.
특정 구현예에서, GAA를 인코딩하는 핵산은 5개 미만의 CpG 디뉴클레오티드를 포함한다.
특정 구현예에서, GAA를 인코딩하는 핵산은 4개 미만의 CpG 디뉴클레오티드를 포함한다.
특정 구현예에서, GAA를 인코딩하는 핵산은 3개 미만의 CpG 디뉴클레오티드를 포함한다.
특정 구현예에서, GAA를 인코딩하는 핵산은 2개 미만의 CpG 디뉴클레오티드를 포함한다.
특정 구현예에서, GAA를 인코딩하는 핵산은 1개 미만의 CpG 디뉴클레오티드를 포함한다.
용어 "벡터"는 핵산의 삽입 또는 혼입에 의해 조작될 수 있는 작은 담체 핵산 분자, 플라스미드, 바이러스(예를 들어, AAV 벡터) 또는 기타 비히클을 나타낸다. 이러한 벡터는 유전자 조작(즉, "클로닝 벡터")을 위해, 폴리뉴클레오티드를 세포에 도입/전달하기 위해, 및 삽입된 폴리뉴클레오티드를 세포에서 전사 또는 번역하는데 사용할 수 있다. "발현 벡터"는 숙주 세포에서 발현에 필요한 필수 조절 영역을 가진 유전자 또는 핵산 서열을 포함하는 특수화된 벡터이다.
벡터 핵산 서열은 일반적으로 적어도 세포에서 증식을 위한 복제 기점 및 선택적으로 추가 요소, 예컨대 이종 폴리뉴클레오티드 서열, 발현 조절 요소(예를 들어, 프로모터, 인핸서), 인트론, 역 말단 반복(ITR), 선택가능한 마커(예를 들어, 항생제 내성), 폴리아데닐화 신호를 포함한다.
바이러스 벡터는 바이러스 게놈을 포함하는 하나 이상의 핵산 요소로부터 유래되거나 이에 기초한다. 특정 바이러스 벡터는 렌티바이러스 및 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터를 포함한다.
벡터의 변형인자, 예컨대 재조합 AAV(rAAV) 벡터는 물론 서열의 변형인자, 예컨대 재조합 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드로서 용어 "재조합"은 조성물이 일반적으로 자연에서 발생하지 않는 방식으로 조작(manipulate)(즉, 조작(engineer))되었음을 의미하다. 재조합 AAV 벡터의 특정 예는 야생형 AAV 게놈에 일반적으로 존재하지 않는 클릭 산 서열이 AAV 게놈 내에 삽입되는 경우일 것이다. 용어 "재조합"은 폴리뉴클레오티드와 같은 서열뿐만 아니라 AAV 벡터와 관련하여 본원에서 항상 사용되는 것은 아니지만, 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 형태는 임의의 이러한 생략에도 불구하고 명시적으로 포함되는 것이다.
"재조합 AAV 벡터" 또는 "rAAV"는 분자 방법을 이용하여 AAV 게놈에서 야생형 게놈을 제거하고 이종성 핵산으로 지칭되는 비-천연 핵산 서열로 대체함으로써 AAV의 야생형 게놈으로부터 유도된다. 전형적으로, AAV에 있어서, AAV 게놈의 하나 또는 둘 모두의 역 말단 반복부(ITR) 서열은 AAV 벡터에 유지된다. rAAV는 AAV 게놈과 구별되는데, AAV 게놈 전부 또는 일부가 AAV 게놈 핵산과 관련하여 비-천연 서열로 대체되었기 때문이다. 따라서, 비-천연 서열의 혼입은 "재조합" 벡터로서 AAV 벡터를 정의하는데, 이는 "rAAV 벡터"로서 언급될 수 있다.
rAAV 서열은 생체외, 시험관내 또는 생체내에서 세포의 후속 감염(형질도입)을 위해 포장될 수 있다 - 본원에서는 "입자"로서 언급된다. 재조합 AAV 벡터 서열이 AAV 입자 내로 캡슐화되거나 패키징되는 경우, 입자는 또한 "rAAV 벡터" 또는 "rAAV 입자"로서 언급될 수 있다. 이러한 rAAV 입자는 벡터 게놈을 캡슐화하거나 패키징하는 단백질을 포함하며, AAV의 경우, 이들은 캡시드 단백질로 언급된다.
벡터 "게놈"은 재조합 플라스미드 서열의 일부를 나타내며, 이는 궁극적으로 패키징되거나 캡슐화되어 바이러스(예를 들어, rAAV) 입자를 형성한다. 재조합 플라스미드가 재조합 벡터를 작제하거나 제작하는데 사용되는 경우, 벡터 게놈은 재조합 플라스미드의 벡터 게놈 서열에 상응하지 않는 "플라스미드"의 일부를 포함하지 않는다. 재조합 플라스미드의 이러한 비 벡터 게놈 부분은 "플라스미드 백본"으로서 언급될 수 있으며, 이는 증식 및 재조합 바이러스 생산에 필요한 공정인 플라스미드 클로닝 및 증폭에 중요하며, 이 자체로는 바이러스(예를 들어, AAV) 입자 내로 패키징되거나 캡슐화되지 않는다. 따라서, 벡터 "게놈"은 바이러스(예를 들어, AAV)에 의해 패키징되거나 캡슐화되는 핵산을 지칭한다.
재조합 AAV 입자를 생산하기 위한 숙주 세포는 비제한적으로, 미생물, 효모 세포, 곤충 세포 및 포유동물 세포를 포함하며, 이는 이종성 rAAV 벡터의 수령체로서 사용될 수 있거나 사용되었다. 안정한 인간 세포주인 HEK293(예를 들어, 수탁 번호 ATCC CRL1573의 아메리칸 타입 컬처 콜렉션을 통해 용이하게 입수가능)로부터의 세포가 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 아데노바이러스 타입-5 DNA 단편으로 형질전환되고 아데노바이러스 E1a 및 E1b 유전자를 발현하는 변형된 인간 배아 신장 세포주(예를 들어, HEK293)는 재조합 AAV 입자를 생성하는데 사용된다. 변형된 HEK293 세포주는 용이하게 형질감염되며, rAAV 입자를 생산하는 특히 편리한 플랫폼을 제공한다. 재조합 AAV 생산에 적절한 다른 숙주 세포주는 국제 출원 PCT/2017/024951에 기술되어 있다.
특정 구현예에서, AAV 헬퍼 기능은 AAV 발현 벡터의 형질감염 이전에 또는 동시에 AAV 헬퍼 작제물로 숙주 세포를 형질감염시킴으로써 숙주 세포 내로 도입된다. AAV 헬퍼 기능을 갖는 숙주 세포는 "헬퍼 세포" 또는 "패키징 헬퍼 세포"로서 언급될 수 있다. 따라서, AAV 헬퍼 작제물은 생산적인 AAV 형질도입에 필요한 누락된 AAV 기능을 보완하기 위해 AAV rep 및/또는 cap 유전자의 적어도 일시적인 발현을 제공하는데 종종 사용된다. AAV 헬퍼 작제물은 종종 AAV ITR이 결여되어 있으며, 자체적으로 복제하거나 패키징할 수 없다. 이들 작제물은 플라스미드, 파지, 트랜스포손, 코스미드, 바이러스 또는 비리온의 형태로 존재할 수 있다. 많은 AAV 헬퍼 작제물, 예컨대 Rep 및 Cap 발현 생성물 둘 모두를 인코딩하는 일반적으로 사용된 플라스미드 pAAV/Ad 및 pIM29+45가 설명되어 있다. Rep 및/또는 Cap 발현 생성물을 인코딩하는 많은 다른 벡터가 공지되어 있다.
포유동물 세포를 형질도입할 수 있는 재조합 AAV 입자를 생성하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 재조합 AAV 입자는 미국 특허 9,408,904; 및 국제 출원 PCT/US2017/025396 및 PCT/US2016/064414에 기술된 바와 같이 생성될 수 있다.
용어 "핵산" 및 "폴리뉴클레오타이드"는 데옥시리보핵산(DNA) 및 리보핵산(RNA)을 포함하는 모든 형태의 핵산, 올리고뉴클레오티드를 나타내기 위해 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 핵산은 게놈 DNA, cDNA 및 안티센스 DNA, 및 스프라이싱된 및 스플라이싱되지 않은 mRNA, rRNA, tRNA 및 억제성 DNA 또는 RNA(RNAi, 예를 들어, 작은 또는 짧은 헤어핀(sh)RNA, 마이크로RNA(miRNA), 작은 또는 짧은 간섭 (si)RNA, 트랜스-스플라이싱 RNA, 또는 안티센스 RNA)를 포함한다. 핵산은 천연 발생, 합성, 및 의도적으로 변형되거나 변경된 폴리뉴클레오티드(예를 들어, 변이 핵산)를 포함한다. 핵산, 예컨대 cDNA, 게놈 DNA, RNA 및 이의 단편은 단일- 또는 이중-가닥일 수 있다.
폴리뉴클레오티드는 단일, 이중, 또는 삼중의 선형 또는 원형일 수 있고, 임의의 길이일 수 있다. 폴리뉴클레오티드를 논의함에 있어서, 특정 폴리뉴클레오티드의 서열 또는 구조는 5'에서 3' 방향으로 서열을 제공한다는 협약에 따라 본원에 기재될 수 있다.
"전이유전자"는 본원에서 세포 또는 유기체내로 의도되거나 도입된 이종성 핵산을 편리하게 나타내기 위해 사용된다. 전이유전자는 GAA를 인코딩하는 변형된 핵산과 같은 임의의 이종성 핵산을 포함한다.
용어 "형질도입하다" 및 이의 문법적 변형은 rAAV 벡터와 같은 분자의 세포 또는 숙주 유기체로의 도입을 나타낸다. 이종성 핵산/전이유전자는 수령체 세포의 게놈 핵산 내로 통합될 수 있거나 없다. 도입된 이종성 핵산은 또한 수령체 세포 또는 숙주 유기체에서 염색체 외적으로 또는 단지 일시적으로 존재할 수 있다.
"형질도입된 세포"는 전이유전자이 도입된 세포이다. 따라서, "형질도입된" 세포(예를 들어, 포유동물에서, 예를 들어, 세포 또는 조직 또는 기관 세포)는 예를 들어, 핵산(예를 들어, 전이유전자)의 세포로의 혼입 후에 세포에서의 유전자 변화를 의미한다. 따라서, "형질도입된" 세포는 외인성 핵산이 도입된 세포 또는 이의 자손이다. 세포(들)는 번식되고 도입된 단백질이 발현될 수 있다. 유전자 치료 용도 및 방법의 경우 형질도입된 세포가 대상체에 존재할 수 있다.
"발현 조절 요소"는 작동가능하게 연결된 핵산의 발현에 영향을 미치는 핵산 서열(들)을 나타낸다. 본원에 제시된 바와 같은 발현 조절 요소는 프로모터 및 인핸서를 포함한다. AAV 벡터를 포함하는 벡터 서열은 하나 이상의 "발현 조절 요소"를 포함할 수 있다. 전형적으로, 적절한 이종성 폴리뉴클레오티드 전사 및 적절한 경우 번역을 촉진하기 위해 상기 요소가 포함된다(예를 들어, 프로모터, 인핸서, 인트론에 대한 스플라이싱 신호, mRNA의 인-프레임(in-frame) 번역을 가능하게 하는 유전자의 정확한 판독 프레임의 유지 및 정지 코돈 등). 상기 요소는 전형적으로 "시스 작용" 요소로 언급되는 시스로 작용하나, 트랜스로도 작용할 수 있다.
발현 조절은 전사, 번역, 스플라이싱, 메시지 안정성 등의 수준으로 이루어질 수 있다. 전형적으로, 전사를 조절하는 발현 조절 요소는 전사되는 핵산의 5' 말단(즉, "업스트림") 근처에 병렬된다. 발현 조절 요소는 또한 전사되는 서열의 3' 말단(즉, "다운스트림") 또는 전사물 내(예를 들어, 인트론 내)에 위치될 수 있다. 발현 조절 요소는 전사되는 서열에 인접하거나, 심지어 상당한 거리로 전사되는 서열과 떨어진 거리(예를 들어, 폴리뉴클레오티드로부터 1-10, 10-25, 25-50, 50-100, 100 내지 500개 이상의 뉴클레오티드)에 위치될 수 있다. 그럼에도 불구하고, AAV 벡터의 길이 제한으로 인해, 발현 조절 요소는 전형적으로 이종성 핵산의 전사 시작 지점으로부터 1 내지 1000개의 뉴클레오티드 내에 있을 것이다.
기능적으로, 작동가능하게 연결된 핵산의 발현은 요소(예를 들어, 프로모터)가 핵산의 전사 및 적절하게는 전사물의 번역을 조절하도록 요소에 의해 적어도 부분적으로 조절 가능하다. 발현 조절 요소의 특정 예는 일반적으로 전사되는 핵산 서열의 5'에 위치되는 프로모터이다. 프로모터는 전형적으로 프로모터가 존재하지 않는 경우에 발현되는 양에 비해 작동가능하게 연결된 핵산으로부터 발현되는 양을 증가시킨다.
본원에서 사용되는 바와 같은 "인핸서"는 이종성 핵산에 인접하여 위치되는 서열을 나타낼 수 있다. 인핸서 요소는 전형적으로 프로모터 요소의 업스트림에 위치하나 또한 기능하며, 서열의 다운스트림 또는 서열 내에 위치할 수 있다. 그러므로, 인핸서 요소는 이종성 핵산 서열의 업스트림 또는 다운스트림의 10 - 50개 염기쌍, 50 -100개 염기 쌍, 100 - 200개 염기 쌍, 또는 200 - 300개 이상의 염기쌍 업스트림 또는 다운스트림에 위치할 수 있다. 인핸서 요소는 전형적으로 프로모터 요소에 의해 제공되는 발현 이상으로 작동가능하게 연결된 핵산의 발현을 증가시킨다.
발현 작제물은 특정 세포 또는 조직 유형에서 발현을 유도하는 역할을 하는 조절 요소를 포함할 수 있다. 발현 조절 요소(예를 들어, 프로모터)는 본원에서 "조직-특이적 발현 조절 요소/프로모터"로 언급되는 특정 조직 또는 세포 유형에서 활성인 것을 포함한다. 조직-특이적 발현 조절 요소는 전형적으로 특정 세포 또는 조직(예를 들어, 간)에서 활성이다. 발현 조절 요소는 전형적으로 특정 세포, 조직 또는 기관에서 활성인데, 이는 이들이 특정 세포, 조직 또는 기관 유형에 고유한 전사 활성제 단백질, 또는 다른 전사 조절인자에 의해 인지되기 때문이다. 상기 조절 요소는 당업자에게 공지되어 있다(예를 들어, 문헌[Sambrook et al. (1989) and Ausubel et al. (1992)] 참조).
발현 작제물에서 조직 특이적 조절 요소의 혼입은 단백질 또는 억제성 RNA를 인코딩하는 이종성 핵산의 발현을 위한 적어도 부분적 조직 향성을 제공한다. 간에서 활성인 프로모터의 예는 특히, 트랜스티레틴(TTR) 유전자 프로모터; 인간 알파 1-항트립신(hAAT) 프로모터; 알부민(문헌[Miyatake, et al. J. Virol., 71:5124-32 (1997)] 참조); B형 간염 바이러스 코어 프로모터(문헌[Sandig, et al., Gene Ther. 3:1002-9 (1996)] 참조); 알파-태아단백질(AFP)(문헌[Arbuthnot, et al., Hum. Gene. Ther., 7:1503-14 (1996)] 참조)이 있다. 간에서 활성인 인핸서의 예는 아포지질단백질 E(apoE) HCR-1 및 HCR-2이다(Allan et al., J. Biol. Chem., 272:29113-19 (1997)).
발현 조절 요소는 또한 많은 상이한 세포 유형에서 폴리뉴클레오티드의 발현을 유도할 수 있는 편재성 또는 뒤섞인(promiscuous) 프로모터/인핸서를 포함한다. 상기 요소는 사이토메갈로바이러스(CMV) 즉시 초기 프로모터/인핸서 서열, 라우스 육종 바이러스(RSV) 프로모터/인핸서 서열 및 다양한 포유동물 세포 유형에서 활성인 다른 바이러스 프로모터/인핸서, 또는 자연에 존재하지 않는 합성 요소(예를 들어, 문헌[Boshart et al, Cell, 41:521-530 (1985)] 참조), SV40 프로모터, 디하이드로폴레이트 환원효소 프로모터, 세포질 β-액틴 프로모터 및 포스포글리세롤 키나제(PGK) 프로모터를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
발현 조절 요소는 또한 조절 가능한 방식으로, 즉, 신호 또는 자극이 작동가능하게 연결된 이종성 폴리뉴클레오티드의 발현을 증가시키거나 감소시키는 방식으로 발현을 부여할 수 있다. 신호 또는 자극에 반응하여 작동가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드의 발현을 증가시키는 조절 가능한 요소는 또한 "유도성 요소"(즉, 신호에 의해 유도됨)로 언급된다. 특정 예는 호르몬(예를 들어, 스테로이드) 유도성 프로모터를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 전형적으로, 상기 요소에 의해 부여되는 증가 또는 감소의 양은 존재하는 신호 또는 자극의 양에 비례하고; 신호 또는 자극의 양이 클수록, 발현에서의 증가 또는 감소가 크다. 특정한 비제한적인 예는 아연-유도성 양 메탈로티오닌(MT) 프로모터; 스테로이드 호르몬-유도성 마우스 유방 종양 바이러스(MMTV) 프로모터; T7 중합효소 프로모터 시스템(WO 98/10088); 테트라사이클린-억제성 시스템(Gossen, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:5547-5551 (1992)); 테트라사이클린-유도성 시스템(Gossen, et al., Science. 268:1766-1769 (1995); 또한 문헌[Harvey, et al., Curr. Opin. Chem. Biol. 2:512-518 (1998)] 참조); RU486-유도성 시스템(Wang, et al., Nat. Biotech. 15:239-243 (1997) 및 Wang, et al., Gene Ther. 4:432-441 (1997)]; 및 라파마이신-유도성 시스템(Magari, et al., J. Clin. Invest. 100:2865-2872 (1997); Rivera, et al., Nat. Medicine. 2:1028-1032 (1996))을 포함한다. 이러한 상황에서 유용할 수 있는 다른 조절가능한 조절 요소는 특정 생리학적 상태, 예를 들어, 온도, 급성기, 발달에 의해 조절되는 것이다.
발현 조절 요소는 또한 이종성 폴리뉴클레오티드에 대한 고유 요소(들)를 포함한다. 천연 조절 요소(예를 들어, 프로모터)는 이종성 폴리뉴클레오티드의 발현이 고유 발현을 모방해야 하는 것이 요망되는 경우에 사용될 수 있다. 천연 요소는 이종성 폴리뉴클레오티드의 발현이 시간적 또는 발달적으로, 또는 조직-특이적 방식으로, 또는 특정 전사 자극에 반응하여 조절되어야 하는 경우에 사용될 수 있다. 다른 천연 발현 조절 요소, 예를 들어, 인트론, 폴리아데닐화 부위 또는 코작 컨센서스 서열이 또한 사용될 수 있다.
용어 "작동가능하게 연결된"은 핵산 서열의 발현에 필요한 조절 서열이 핵산 서열의 발현을 달성하기 위해 핵산 서열에 대해 적절한 위치에 배치되는 것을 의미한다. 이러한 동일한 정의는 종종 발현 벡터, 예를 들어 rAAV 벡터에서 핵산 서열 및 전사 조절 요소(예를 들어, 프로모터, 인핸서, 및 종결 요소)의 배열에 적용된다.
핵산과 작동가능하게 연결된 발현 조절 요소의 예에서, 조절 요소가 핵산의 발현을 조절하는 관계가 존재한다. 더욱 특히, 예를 들어, 작동가능하게 연결된 2개의 DNA 서열은 2개의 DNA가 DNA 서열 중 적어도 하나가 다른 서열에 대해 생리학적 효과를 발휘할 수 있는 관계가 되도록 배열(시스 또는 트랜스)되는 것을 의미한다.
따라서, 벡터에 대한 추가 요소는 발현 조절(예를 들어, 프로모터/인핸서) 요소, 전사 종결 신호 또는 정지 코돈, 서열에 측접한 5' 또는 3' 비번역 영역(예를 들어, 폴리아데닐화(폴리A) 서열), 예를 들어, AAV ITR 서열의 하나 이상의 카피, 또는 인트론을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
추가 요소는, 예를 들어, 패키징을 개선시키고, 오염 핵산의 존재를 감소시키기 위한, 예를 들어, 충전재(filler) 또는 스터퍼(stuffer) 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. AAV 벡터는 일반적으로 약 4 kb 내지 약 5.2 kb, 또는 약간 더 큰 크기 범위를 갖는 DNA의 삽입물을 전형적으로 수용한다. 따라서, 더 짧은 서열에 대해, 바이러스 입자로의 AAV 벡터 패키징에 대해 허용가능한 바이러스 게놈 서열의 정상 크기이거나 이에 가까운 길이로 조절하기 위해 스터퍼 또는 충전재를 포함시킨다. 다양한 구현예에서, 충전재/스터퍼 핵산 서열은 핵산의 비번역(비-단백질 인코딩) 세그먼트이다. 4.7 Kb 미만의 핵산 서열에 있어서, 충전재 또는 스터퍼 폴리뉴클레오티드 서열은 서열과 조합(예를 들어, 벡터로 삽입)되는 경우에 약 3.0 내지 5.5Kb, 또는 약 4.0 내지 5.0Kb, 또는 약 4.3 내지 4.8Kb의 전체 길이를 갖는 길이를 갖는다.
조성물의 수식어구로 사용되는 경우 용어 "분리된"은 조성물이 인간의 손에 의해 제조되거나, 자연적으로 발생하는 생체내 환경으로부터 완전히 또는 적어도 부분적으로 분리됨을 의미한다. 일반적으로, 분리된 조성물은 이들이 일반적으로 자연적으로 관련되는 하나 이상의 물질, 예를 들어, 하나 이상의 단백질, 핵산, 지질, 탄수화물, 세포막을 실질적으로 비함유한다.
용어 "분리된"은 인간의 손에 의해 생성된 조합, 예를 들어, AAV 벡터 게놈 및 약학적 제형을 패키징하거나 캡시드화하는 rAAV 서열 또는 rAAV 입자를 배제하지 않는다. 용어 "분리된"은 또한 하이브리드/키메라, 다량체/올리고머, 변형(예를 들어, 인산화, 당화, 지질화) 또는 유도체화된 형태, 또는 인간의 손에 의해 생성된 숙주 세포에서 발현된 형태와 같은 조성물의 대안적인 물리적 형태를 배제하지 않는다.
용어 "실질적으로 순수한"은 관심 화합물(예를 들어, 핵산, 올리고뉴클레오티드, 단백질 등)을 적어도 50-60 중량%로 포함하는 제조물을 나타낸다. 제조물은 적어도 75 중량%, 또는 적어도 85 중량%, 또는 약 90-99 중량%의 관심 화합물을 포함할 수 있다. 순도는 관심 화합물에 적절한 방법(예를 들어, 크로마토그래피 방법, 아가로스 또는 폴리아크릴아미드 젤 전기영동, HPLC 분석 등)에 의해 측정된다.
특정 뉴클레오티드 서열 또는 아미노산 서열을 언급하는 경우 어구 "~를 필수구성으로 포함하는"은 해당 SEQ ID NO의 특성을 갖는 서열을 의미한다. 예를 들어, 아미노산 서열과 관련하여 사용되는 경우, 상기 어구는 서열 자체 및 서열의 기본 및 신규 특징에 영향을 미치지 않는 분자 변형을 포함한다.
본 발명의 GAA를 인코딩하는 변형된 핵산을 포함하는 핵산, 발현 벡터(예를 들어, AAV 벡터 게놈), 플라스미드는 재조합 DNA 기술 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 뉴클레오티드 서열 정보의 이용 가능성은 다양한 수단에 의한 본 발명의 분리된 핵산 분자의 제조를 가능하게 한다. GAA를 인코딩하는 핵산은 세포 발현 또는 시험관내 번역 및 화학적 합성 기술을 통해 다양한 표준 클로닝, 재조합 DNA 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 폴리뉴클레오티드의 순도는 시퀀싱, 젤 전기영동 등을 통해 결정될 수 있다. 예를 들어, 핵산은 하이브리드화 또는 컴퓨터-기반 데이터베이스 스크리닝 기술을 이용하여 분리될 수 있다. 상기 기술은 (1) 상동성 뉴클레오티드 서열을 검출하기 위한 프로브와 게놈 DNA 또는 cDNA 라이브러리의 하이브리드화; (2) 예를 들어, 발현 라이브러리를 이용하여 공유된 구조적 특징을 갖는 폴리펩티드를 검출하기 위한 항체 스크리닝; (3) 관심 핵산 서열에 어닐링할 수 있는 프라이머를 이용한 게놈 DNA 또는 cDNA에 대한 중합효소 연쇄 반응(PCR); (4) 관련 서열의 서열 데이터베이스의 컴퓨터 검색; 및 (5) 공제된 핵산 라이브러리의 차별적 스크리닝을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
핵산은 임의의 편리한 클로닝 벡터에서 DNA로서 유지될 수 있다. 일 구현예에서, 클론은 적합한 E. 콜라이 숙주 세포에서 증식되는 플라스미드 클로닝/발현 벡터, 예를 들어, pBluescript(Stratagene, La Jolla, CA)에서 유지된다. 대안적으로, 핵산은 포유동물 세포, 예를 들어 AAV 벡터에서의 발현에 적합한 벡터에 유지될 수 있다. 번역 후 변형이 단백질 기능에 영향을 미치는 경우, 핵산 분자는 포유동물 세포에서 발현될 수 있다.
본원에 기재된 바와 같은 rAAV 벡터는 숙주 세포에서 인코딩된 단백질의 발현을 허용하는 방식으로 위치된 세포에서의 이종성 핵산의 발현에 필요한 조절 요소를 선택적으로 포함할 수 있다. 발현에 필요한 이러한 조절 요소는 본원에 제시되고 당업자에게 공지된 프로모터 서열, 인핸서 서열 및 전사 개시 서열을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 방법 및 용도는 분열 및/또는 비-분열 세포를 포함하는 숙주 세포로 핵산(전이유전자)을 전달(형질도입)하는 것을 포함한다. 본 발명의 핵산, rAAV 벡터, 방법, 용도 및 약학적 제형은 치료 방법으로서 이종성 핵산에 의해 인코딩된 서열을 이를 필요로 하는 대상체에 전달하거나, 투여하거나, 제공하는 방법에서 추가로 유용하다. 이러한 방식으로, 핵산은 전사되고, 단백질은 대상체에서 생체내에서 생성될 수 있다. 대상체는 단백질로부터 이익을 얻을 수 있거나 이를 필요로 할 수 있는데, 이는 대상체가 단백질 결핍이거나, 대상체에서의 단백질의 생성이 치료 방법으로서 또는 달리 일부 치료 효과를 부여할 수 있기 때문이다.
본 발명은 인간 및 수의학 적용을 포함하는 동물에서 유용하다. 따라서, 적합한 대상체는 인간과 같은 포유동물뿐만 아니라 비-인간 포유동물을 포함한다. 용어 "대상체"는 동물, 전형적으로 포유동물, 예를 들어, 인간, 비-인간 영장류(유인원, 긴팔원숭이, 고릴라, 침팬지, 오랑우탄, 마카크), 가축(개 및 고양이), 농장 동물(가금류, 예를 들어, 닭 및 오리, 말, 소, 염소, 양, 돼지) 및 실험 동물(마우스, 래트, 토끼, 기니아 피그)를 나타낸다. 인간 대상체는 태아, 신생아, 유아, 청소년 및 성인 대상체를 포함한다. 대상체는 동물 질병 모델, 예를 들어, 폼페병, 단백질/효소 결핍 및 글리코겐 축적병(GSD)의 마우스 및 다른 동물 모델 및 당업자에게 공지된 다른 동물 모델을 포함한다.
본 발명에 따른 치료에 적합한 대상체는 불충분한 양의 GAA를 갖거나 생성할 위험이 있는 대상체, 또는 비정상적인, 부분적으로 기능적이거나 비기능적인 GAA를 생성하는 대상체를 포함한다. 이러한 대상체가 본 발명의 방법에 따라 치료하기에 적합한지의 여부를 결정하기 위해 대상체는 GAA 활성에 대해 시험될 수 있다. 본 발명에 따른 치료에 적합한 대상체는 또한 GAA로부터 이익이 있을 대상체를 포함한다. GAA로부터 이익이 있을 대상체는 글리코겐 축적병(GSD)을 갖는 대상체를 포함한다. 처리된 대상체는 치료 후 주기적으로, 예를 들어 1-4주마다, 1-6개월마다, 6-12개월마다, 또는 1, 2, 3, 4, 5년 이상 마다 모니터링될 수 있다.
대상체는 면역 반응 예를 들어, AAV에 대한 항체에 대해 시험될 수 있다. 따라서, 후보 대상체는 본 발명의 방법에 따라 치료하기 전에 스크리닝될 수 있다. 대상체는 또한 치료 후 AAV에 대한 항체에 대해 시험될 수 있으며, 선택적으로 치료 후 일정 기간 동안 모니터링될 수 있다. 기존의 또는 발달중인 AAV 항체를 갖는 대상체는 면역억제제 또는 본원에 제시된 다른 요법으로 처리될 수 있다.
본 발명에 따른 치료에 적합한 대상체는 또한 AAV에 대항 항체를 갖거나 이를 생성할 위험이 있는 대상체를 포함한다. rAAV 벡터는 몇몇 기술을 이용하여 상기 대상체에 투여되거나 전달될 수 있다. 예를 들어, AAV 빈 캡시드(즉, GAA를 인코딩하는 변형된 핵산이 결여된 AAV)는 대상체에서 AAV 항체에 결합하도록 전달됨으로써 이종성 핵산을 포함하는 rAAV 벡터가 대상체의 세포를 형질도입시키게 할 수 있다.
본 발명의 변형된 핵산, 발현 카세트 및 rAAV 벡터는 GAA 결핍의 치료에 사용될 수 있다. 따라서, 다양한 구현예에서, GAA를 인코딩하는 변형된 핵산, GAA를 인코딩하는 변형된 핵산을 포함하는 발현 카세트 및 본 발명의 rAAV 벡터는 치료제 및/또는 예방제로서 사용될 수 있다.
특정 구현예에서, GAA를 인코딩하는 변형된 핵산, GAA를 인코딩하는 변형된 핵산을 포함하는 발현 카세트 및 본 발명의 rAAV 벡터는 폼페병 및 기타 글리코겐 축적병의 치료에 사용될 수 있다. GAA를 인코딩하는 변형된 핵산, GAA를 인코딩하는 변형된 핵산을 포함하는 발현 카세트 및 본 발명의 rAAV 벡터를 폼페병 또는 또 다른 글리코겐 축적병을 갖는 환자에게 투여하면 GAA 단백질의 발현을 유도하여 글리코겐의 축적을 저해, 억제 또는 감소시키거나 글리코겐을 분해하여 결국 폼페병의 하나 이상의 부작용 또는 증상을 저하시키거나 감소시킬 수 있다.
본 발명의 GAA를 인코딩하는 변형된 핵산, GAA를 인코딩하는 변형된 핵산을 포함하는 발현 카세트 및 rAAV 벡터가 투여된 대상체, 동물 또는 환자는 치료제 및/또는 예방제로서 본 발명의 GAA를 인코딩하는 변형된 핵산, GAA를 인코딩하는 변형된 핵산을 포함하는 발현 카세트 및 rAAV 벡터의 효능을 입증, 측정 및/또는 평가하기 위해 다양한 테스트, 검정 및 기능 평가에 의해 평가될 수 있다. 이러한 테스트 및 검정은 비제한적으로, 혈액 또는 혈장과 같은 생물학적 샘플에서 GAA 활성(예컨대, 표준 GAA 활성 검정법 이용) 및/또는 GAA 양(예컨대, 항-GAA 항체를 사용한 웨스턴 블롯)의 측정; 근육 샘플과 같은 조직내 글리코겐 함량 측정; 근육(예컨대, 상완 삼두근, 대퇴사 두근, 횡격막 및 심장의 근육), 척수(경추 흉추 및 요추 척수 분절의 복부 뿔에 있는 ChAT-양성 운동 뉴런의 검사 및 계수, 및 별아교세포 반응 및 미세아교세포 활성화의 평가 포함)의 조직학적 평가; 조용한 호흡 동안의 호흡 기능 평가; 앞다리 철사-매달리기 시험; 그립 강도 측정; 운동 협조의 로타로드 시험(예컨대, 로타로드 프로토콜에 의해); 심비대를 보여줄 수 있는 흉부 x-레이; 심장 기능을 검사하기 위한 심전도(ECG); 근병증을 보여줄 수 있는 근전도(EMG); 피부 섬유아세포에서 GAA 활성 측정; 건조 혈액 샘플에서 GAA 활성 검정; 증가시 폼페병의 비특이적 마커인 혈청 크레아틴 키나아제에 대한 혈액/혈청 검사; 폼페병에서 근육으로부터의 방출 지표로서 상승될 수 있는 아미노트랜스퍼라제, 알라닌 아미노트랜스퍼라제 또는 락테이트 데하이드로게나제에 대한 혈액/혈청 검사; 소변 중 글루코스 테트라사카라이드에 대한 시험(폼페병에 대한 민감하고 비특이적인 마커); 혈장 내 총 GAA 단백질 및 활성에 의해 평가된 정점 및 정상 상태 벡터-유래된 GAA 효소 수준의 분석; 폐 기능 검사; 근육 기능 검사; 세포 액포에서 글리코겐의 존재에 대한 근육 생검 및 염색; 간 건강의 바이오마커; 리소좀 건강 검사; AAV 캡시드에 대한 면역 반응 테스트; GAA 전이유전자 단백질 생성물에 대한 면역 반응 테스트; 6분 도보 테스트(6MWT); 강제 활력 테스트; (혈장 내에서 측정된 총 GAA 단백질 및 활성에 의해 평가된) 정점 및 정상 상태 AAV 벡터-유래된 GAA 효소 수준; 보행, 계단, 가워(gower) 및 의자(GSGC) 테스트; Rasch-구축 메디칼 리서치 카운실(Medical Research Council; MRC) 등급 척도를 이용한 근력 테스트; 환자가 보고한 생활 활동/사회적 참여; 수면다원촬영(PSG)으로부터의 정량적 수면 및 수면 호흡 측정; 환자가 보고한 피로, 주간 졸음 및 수면의 질 측정; Walton 및 Gardner-Medwin(WGM) 스코어; 비제한적으로, 비강 압력(SNIP; sniff nasal inspiratory pressure) 및 최대 흡기압력 및 호기 압력(각각 MEP 및 MEP)을 포함하는 호흡 기능 검사; 간 바이오마커; β헥소사미니다제(β헥소) 테스트; 비제한적으로 짧은 형태-36 건강 조사(SF-36)를 포함하는 건강 결과 측정; Rasch-구축 폼페-특이적 활성(R-PAct) 척도; 피로 심각도 스코어(FSS); 및 환자 보고한 결과 측정 정보 시스템(PROMIS) 항목 뱅크를 포함한다.
추가로, 본 발명의 GAA를 인코딩하는 변형된 핵산, GAA를 인코딩하는 변형된 핵산을 포함하는 발현 카세트 및 rAAV 벡터는 글리코겐 축적병(GSD)의 치료에 사용될 수 있다. 글리코겐 축적병은 예를 들어, GSD 타입 I(폰기에르케병), GSD 타입 II(폼페병), GSD 타입 III(포르브스-코리 병), GSD 타입 IV(앤더슨병, 아밀로펙틴증), GSD 타입 V(맥아들병), GSD 타입 VI(허스병), GSD 타입 VII(타루이병) 또는 심장의 선천성 치사 글리코겐 축적병을 포함한다.
본원에 제시된 바와 같이 rAAV는 이들이 세포를 침투하고, 핵산/유전자 물질을 세포 내로 도입시킬 수 있기 때문에 유전자 요법 벡터로서 유용하다. AAV는 인간에서 병원성 질병과 관련되지 않으므로, rAAV 벡터는 실질적인 AAV 발병기전 또는 질병을 야기시키지 않고 인간 환자에 이종성 폴리뉴클레오티드 서열(예를 들어, 치료 단백질 및 제제)을 전달할 수 있다.
rAAV 벡터는 분열 및 비-분열 세포를 위한 향성을 포함하여 상기 적용에 대한 다수의 바람직한 특징을 갖는다. 이들 벡터로의 초기 임상 경험은 또한 지속된 독성이 없는 것을 나타내었으며, 면역 반응은 전형적으로 최소이거나 검출가능하지 않았다. AAV는 수용체-매개 세포내이입 또는 트랜스사이토시스에 의해 생체내에서 광범위한 세포 유형을 감염시키는 것으로 공지되어 있다. 이들 벡터 시스템은 많은 조직, 예컨대 망막 상피, 간, 골격근, 기도, 뇌, 관절 및 조혈 줄기 세포를 표적으로 하여 인간에서 시험되었다.
예를 들어, GAA의 다수의 복사체 및 그로 인해 GAA 단백질의 더 많은 양을 제공할 수 있는 rAAV 벡터를 도입하는 것이 바람직할 수 있다. 개선된 rAAV 벡터 및 이들 벡터를 생성시키기 위한 방법은 문헌[Wright J.F. (Hum Gene Ther 20:698-706, 2009)]을 포함하는 다수의 참고문헌, 특허 및 특허 출원에 상세히 기재되어 있다.
rAAV 벡터의 직접 전달 또는 인간 세포의 생체외 형질도입에 이은 체내로의 주입은 이종성 핵산을 발현시키고 이에 의해 지혈에 유익한 치료 효과를 발휘시킬 것이다. GAA를 인코딩하는 변형된 핵산의 맥락에서, 투여는 글리코겐의 양 또는 축적을 저하, 억제 또는 감소시키거나, 글리코겐의 축적을 방지하거나 글리코겐을 분해한다. 이는 결국 근육 긴장도 및/또는 근력을 촉진 또는 개선하고/거나 간 비대를 저하 또는 감소시키는 것과 같은 폼페병의 하나 이상의 부작용을 저해, 억제, 감소 또는 저하시킬 수 있다.
재조합 AAV 벡터뿐만 아니라 이의 방법 및 용도는 임의의 바이러스 균주 또는 혈청형을 포함한다. 비제한적인 예로서, 재조합 AAV 벡터는, 예를 들어, AAV (SEQ ID NOs:30-32), LK03 (SEQ ID NO: 33), AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, Rh10, Rh74, AAV3B 또는 AAV-2i8과 같은 임의의 AAV 게놈을 기초로 할 수 있다. 상기 벡터는 동일한 균주 또는 혈청형(또는 서브그룹 또는 변이체)을 기초로 할 수 있거나, 서로 상이할 수 있다. 비제한적인 예로서, 특정 혈청형 게놈을 기초로 하는 재조합 AAV 벡터는 벡터를 패키징하는 캡시드 단백질의 혈청형과 동일할 수 있다. 또한, 재조합 AAV 벡터 게놈은 벡터를 패키징하는 AAV 캡시드 단백질의 혈청형과 구별되는 AAV 혈청형 게놈에 기초할 수 있다. 예를 들어, AAV 벡터 게놈은 AAV2에 기초할 수 있는 반면, 3개의 캡시드 단백질 중 적어도 하나는 예를 들어, AAV (SEQ ID NO: 30-32), LK03 (SEQ ID NO: 33), AAV1, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, Rh10, Rh74, AAV3B 또는 AAV-2i8 또는 이들의 변이체일 수 있다.
특정 구현예에서, 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터는 예를 들어, WO 2013/158879(국제 출원 PCT/US2013/037170호), WO 2015/013313(국제 출원 PCT/US2014/047670호) 및 US 2013/0059732(미국 특허 번호 9,169,299호, LK01, LK02, LK03 등을 개시함)에 기재된 바와 같은 AAV (SEQ ID NO: 30-32), LK03 (SEQ ID NO: 33), AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, Rh10, Rh74, AAV3B 및 AAV-2i8뿐만 아니라 이들의 변이체(예를 들어, 캡시드 변이체, 예컨대, 아미노산 삽입, 첨가, 치환 및 결실)를 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "혈청형"은 다른 AAV 혈청형과 혈청학적으로 구별되는 캡시드를 갖는 AAV를 나타내는데 사용되는 구별법이다. 혈청학적 특이성은 또 다른 AAV와 비교하여 하나의 AAV에 대한 항체 사이의 교차-반응성의 결여를 기초로 하여 결정된다. 상기 교차-반응성 차이는 일반적으로 캡시드 단백질 서열/항원 결정인자에서의 차이로 인한 것이다(예를 들어, AAV 혈청형의 VP1, VP2, 및/또는 VP3 서열 차이로 인함). 캡시드 변이체를 포함하는 AAV 변이체가 참조 AAV 또는 다른 AAV 혈청형과 혈청학적으로 구별되지 않을 수 있는 가능성에도 불구하고, 이들은 참조 또는 다른 AAV 혈청형과 비교하여 적어도 하나의 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기에 의해 상이하다.
전통적 정의 하에서, 혈청형은 관심 바이러스가 중화 활성에 대해 모든 현존하고 특성규명된 혈청형에 특이적인 혈청에 대해 시험되었고, 관심 바이러스를 중화시키는 항체가 발견되지 않았음을 의미한다. 더 많은 자연 발생 바이러스 분리물이 발견되고/되거나 캡시드 돌연변이체가 생성됨에 따라, 현존하는 혈청형 중 임의의 혈청형과 혈청학적 차이가 있을 수도 있고 그렇지 않을 수도 있다. 따라서, 새로운 바이러스(예를 들어, AAV)가 혈청학적 차이를 갖지 않는 경우, 이러한 새로운 바이러스(예를 들어, AAV)는 상응하는 혈청형의 서브그룹 또는 변이체일 것이다. 많은 경우에, 중화 활성에 대한 혈청학적 시험은 캡시드 서열 변형을 갖는 돌연변이체 바이러스가 전통적인 혈청형 정의에 따라 다른 혈청형인지의 여부를 결정하기 위해 이들 돌연변이체 바이러스에 대해 아직 수행되지 않았다. 따라서, 편의성 및 반복 회피를 위해, 용어 "혈청형"은 혈청학적으로 구별되는 바이러스(예를 들어, AAV) 뿐만 아니라 제공된 혈청형의 서브그룹 또는 변이체 내에 존재할 수 있는 혈청학적으로 구별되지 않는 바이러스(예를 들어, AAV) 둘 모두를 광범위하게 나타낸다.
본원에 제시된 바와 같이 AAV 캡시드 단백질은 참조 또는 어미 AAV 혈청형, 예컨대 AAV (SEQ ID NO: 30-32), LK03 (SEQ ID NO: 33), AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, Rh10, Rh74, AAV3B 또는 AAV-2i8에 대해 100% 미만의 서열 동일성을 나타낼 수 있으나, 공지된 AAV 유전자 또는 단백질, 예컨대 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, Rh10, Rh74, AAV3B 또는 AAV-2i8과 구별되며 동일하지 않다. 일 구현예에서, 변형된/변이체 AAV 캡시드 단백질은 참조 또는 어미 AAV 캡시드 단백질, 예컨대 AAV (SEQ ID NO: 30-32), LK03 (SEQ ID NO: 33), AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, Rh10, Rh74, AAV3B 또는 AAV-2i8에 대해 적어도 80%, 85%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5% 등, 99.9% 이하로 동일한 서열을 포함하거나 이로 구성된다.
rAAV 벡터는 생물학적으로 양립가능한 담체로의 주입을 통해, 예를 들어 정맥내 주사를 통해 환자에게 투여될 수 있다. rAAV 벡터는 단독으로 또는 다른 분자와 조합되어 투여될 수 있다. 따라서, rAAV 벡터 및 다른 조성물, 제제, 약물, 생물학적 제제(단백질)가 약학적 조성물에 혼입될 수 있다. 상기 약학적 조성물은 무엇보다도 생체내 또는 생체외에서 대상체에 투여 및 전달하는데 유용하다.
특정 구현예에서, 약학적 조성물은 또한 약학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 함유한다. 상기 부형제는 조성물을 투여받는 개체에게 유해한 면역 반응을 자체적으로 유도하지 않고, 과도한 독성 없이 투여될 수 있는 임의의 약학적 제제를 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "약학적으로 허용되는" 및 "생리학적으로 허용되는"은 생물학적으로 허용되는 제형, 기체, 액체 또는 고체 또는 이들의 혼합물을 의미하며, 이는 하나 이상의 투여 경로, 생체내 전달 또는 접촉에 적합하다. "약학적으로 허용되는" 또는 "생리학적으로 허용되는" 조성물은 생물학적으로 또는 달리 바람직하지 않은 물질이며, 예를 들어, 상기 물질은 실질적인 바람직하지 않은 생물학적 효과를 유발하지 않으면서 대상체에 투여될 수 있다. 따라서, 상기 약학적 조성물은, 예를 들어, 대상체에 핵산, 벡터, 바이러스 입자 또는 단백질을 투여하는데 사용될 수 있다.
약학적으로 허용되는 부형제는 액체, 예를 들어, 물, 염수, 글리세롤, 당 및 에탄올을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 약학적으로 허용되는 염은 또한, 예를 들어, 광산염, 예를 들어, 하이드로클로라이드, 하이드로브로마이드, 포스페이트, 설페이트 등; 및 유기산의 염, 예를 들어, 아세테이트, 프로피오네이트, 말로네이트, 벤조에이트 등을 그 안에 포함할 수 있다. 부형제는 또한 알부민과 같은 단백질을 포함한다. 또한, 보조 물질, 예를 들어, 습윤제 또는 에멀젼화제, pH 완충 물질 등이 이러한 비히클에 존재할 수 있다.
약학적 조성물은 염으로 제공될 수 있으며, 염산, 황산, 아세트산, 락트산, 타르타르산, 말산, 숙신산 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는 많은 산으로 형성될 수 있다. 염은 상응하는 자유 염기 형태보다 수성 또는 다른 양성자성 용매에 더 가용성인 경향이 있다. 다른 경우에, 제조물은 4.5 내지 5.5의 pH 범위의 1-50 mM 히스티딘, 0.1%-2% 수크로스, 및 2-7% 만니톨 중 임의의 것 또는 모두를 함유할 수 있는 동결건조된 분말일 수 있으며, 이는 사용 전에 완충액과 조합된다.
약학적 조성물은 약학적 투여 또는 생체내 접촉 또는 전달과 상용성인 용매(수성 또는 비수성), 용액(수성 또는 비수성), 에멀젼(예를 들어, 수중유 또는 유중수), 현탁액, 시럽, 엘릭서, 분산액 및 현탁 매질, 코팅, 등장성 및 흡수 촉진제 또는 지연제를 포함한다. 수성 및 비수성 용매, 용액 및 현탁액은 현탁제 및 증점제를 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 허용되는 담체는 정제(코팅되거나 비코팅됨), 캡슐(경질 또는 연질), 마이크로비드, 분말, 과립 및 결정을 포함한다. 보충 활성 화합물(예를 들어, 보존제, 항균제, 항바이러스제 및 항진균제)이 또한 조성물에 혼입될 수 있다.
약학적 조성물은 본원에 기재되거나 당업자에게 공지된 바와 같이 특정 투여 또는 전달 경로와 상용되도록 제형화될 수 있다. 따라서, 약학적 조성물은 다양한 경로에 의한 투여에 적합한 담체, 희석제, 또는 부형제를 포함한다.
비경구 투여에 적합한 조성물은 활성 화합물의 수성 및 비수성 용액, 현탁액 또는 에멀젼을 포함하며, 상기 제조물은 전형적으로 멸균되고 의도된 수령체의 혈액과 등장성이 될 수 있다. 비제한적인 예시적 예는 물, 완충 염수, 행크 용액, 링거액, 덱스트로스, 프룩토스, 에탄올, 동물, 식물성 또는 합성 오일을 포함한다. 수성 주사 현탁액은 현탁액의 점도를 증가시키는 물질, 예를 들어, 소듐 카르복시메틸 셀룰로스, 소르비톨, 또는 덱스트란을 함유할 수 있다.
또한, 활성 화합물의 현탁액은 적절한 오일 주입 현탁액으로서 제조될 수 있다. 적합한 친유성 용매 또는 비히클은 지방 오일, 예를 들어, 참기름, 또는 합성 지방산 에스테르, 예를 들어, 에틸 올레에이트 또는 트리글리세라이드, 또는 리포솜을 포함한다. 선택적으로, 현탁액은 또한 적합한 안정화제 또는 화합물의 용해도를 증가시켜 고도로 농축된 용액의 제조를 허용하는 제제를 함유할 수 있다.
공용매 및 애쥬번트가 제형에 첨가될 수 있다. 공용매의 비제한적인 예는 하이드록실기 또는 다른 극성 기, 예를 들어, 알콜, 예를 들어, 이소프로필 알콜; 글리콜, 예를 들어, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 글리콜 에테르; 글리세롤; 폴리옥시에틸렌 알콜 및 폴리옥시에틸렌 지방산 에스테르를 함유한다. 애쥬번트는, 예를 들어, 계면활성제, 예를 들어, 대두 레시틴 및 올레산; 소르비탄 에스테르, 예를 들어, 소르비탄 트리올레에이트; 및 폴리비닐피롤리돈을 포함한다.
약학적 조성물이 제조된 후, 이들은 적절한 용기에 넣고, 치료를 위해 라벨링될 수 있다. 상기 라벨링은 양, 빈도, 및 투여 방법을 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물, 방법 및 용도에 적절한 약학적 조성물 및 전달 시스템은 당 분야에 공지되어 있다(예를 들어, 문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy (2003) 20th ed., Mack Publishing Co., Easton, PA; Remington's Pharmaceutical Sciences (1990) 18th ed., Mack Publishing Co., Easton, PA; The Merck Index (1996) 12th ed., Merck Publishing Group, Whitehouse, NJ; Pharmaceutical Principles of Solid Dosage Forms (1993), Technonic Publishing Co., Inc., Lancaster, Pa.; Ansel and Stoklosa, Pharmaceutical Calculations (2001) 11th ed., Lippincott Williams & Wilkins, Baltimore, MD; 및 Poznansky et al., Drug Delivery Systems (1980), R. L. Juliano, ed., Oxford, N.Y., pp. 253-315] 참조).
"유효량" 또는 "충분한 양"은 단일 또는 다중 용량으로, 단독으로 또는 하나 이상의 다른 조성물(치료제 또는 면역억제제, 예를 들어, 약물), 치료, 프로토콜 또는 치료 요법제와 조합하여 임의의 지속기간(장기 또는 단기)의 검출가능한 반응, 임의의 지속 기간(예를 들어, 몇 분, 몇 시간, 수 일, 수 개월, 수년 또는 치유 기간) 동안 임의의 측정가능하거나 검출가능한 정도의 대상체에서의 예상되거나 원하는 결과 또는 대상체에 대한 이점을 제공하는 양을 나타낸다.
용량은 상이할 수 있으며, 치료가 지시되는 질병의 유형, 발병, 진행, 중증도, 빈도, 지속 기간, 또는 확률, 원하는 임상 종점, 이전 또는 동시 치료, 대상체의 전반적 건강, 연령, 성별, 인종 또는 면역학적 적격성 및 당업자에 의해 인지될 다른 요인에 좌우될 수 있다. 임의의 불리한 부작용, 합병증 또는 치료 또는 요법의 다른 위험 인자 및 대상체의 상태에 의해 나타난 바와 같이, 투여 양, 수, 빈도 또는 지속기간은 비례적으로 증가되거나 감소될 수 있다. 당업자는 치료적 또는 예방적 이점을 제공하기에 충분한 양을 제공하는데 필요한 투여량 및 시기에 영향을 줄 수 있는 요인을 인지할 것이다.
치료 효과를 달성하기 위한 용량, 예를 들어, 체중 킬로그램 당 벡터 게놈(vg/kg)의 용량은 투여 경로, 치료 효과를 달성하는 데 필요한 이종성 폴리뉴클레오티드 발현의 수준, 치료되는 특정 질병, 바이러스 벡터에 대한 임의의 숙주 면역 반응, 이종성 폴리뉴클레오티드 또는 발현 생성물(단백질)에 대한 숙주 면역 반응, 및 발현된 단백질의 안정성을 포함하나, 이에 제한되지는 않는 여러 요인에 기초하여 상이할 것이다. 당업자는 상기 언급된 요인뿐만 아니라 다른 요인에 기초하여 특정 질병 또는 장애를 갖는 환자를 치료하기 위한 rAAV/벡터 게놈 용량 범위를 결정할 수 있다.
일반적으로, 용량은 치료 효과를 달성하기 위해 대상체의 체중 킬로그램 당 적어도 1x108개 이상의 벡터 게놈(vg/kg), 예를 들어, 대상체의 체중 킬로그램 당 적어도 1 x109, 1x1010, 1x1011, 1x1012, 1x1013 또는 1x1014개 이상의 벡터 게놈(vg/kg)의 범위일 것이다. 마우스에서 1x1010 - 1x1011, 및 개에서 1x1012 - 1x1013 범위의 rAAV 용량이 효과적이었다. 용량은, 예를 들어, 6x1012개 미만 vg/kg의 용량일 수 있다. 더욱 특히, 5x1011 vg/kg 또는 1x1012 vg/kg의 용량.
rAAV 벡터 용량은 이종성 핵산 서열, 인코딩된 단백질 또는 억제성 핵산, 또는 rAAV 벡터에 대한 실질적인 면역 반응이 없도록 전형적으로 용량 스펙트럼의 하단에 있는 수준일 수 있다. 보다 구체적으로, 약 5x1011 내지 약 5x1012 vg/kg, 또는 보다 구체적으로 약 5x1011 vg/kg 또는 약 1x1012 vg/kg과 같은 최대 6x1012 vg/kg 미만의 용량.
본원에서 사용되는 "단위 투여 형태"는 치료될 대상체에 대한 단일 투여량으로 적합한 물리적으로 별개의 단위; 하나 이상의 용량으로 투여되는 경우 원하는 효과(예를 들어, 예방 또는 치료 효과)를 생성하도록 계산되는 선택적으로 약학적 담체(부형제, 희석제, 비히클 또는 충전제)와 회합된 일정량을 함유하는 각각의 단위를 나타낸다. 단위 투여 형태는, 예를 들어, 액체 조성물, 또는 냉동-건조되거나 동결건조된 상태의 조성물을 포함할 수 있는 앰풀 및 바이알 내에 존재할 수 있고; 예를 들어, 멸균 액체 담체가 생체내 투여 또는 전달 전에 첨가될 수 있다. 개별 단위 투여 형태는 다중-용량 키트 또는 용기에 포함될 수 있다. rAAV 입자 및 이의 약학적 조성물은 투여의 용이성 및 투여량의 균일성을 위해 단일 또는 다중 단위 투여 형태로 패키징될 수 있다.
비록 질병의 진행 또는 악화를 감소시키거나, 줄이거나, 억제하거나, 억누르거나, 제한하거나, 제어하는 것이 만족스러운 결과이지만, 치료를 위한 "유효량" 또는 "충분한 양"(예를 들어, 개선을 위하거나, 치료 이점 또는 개선을 제공하기 위함)의 용량은 전형적으로 질병의 하나, 다수 또는 모든 유해한 증상, 결과 또는 합병증, 하나 이상의 유해한 증상, 장애, 질병, 병리, 또는, 예를 들어, 질병에 의해 야기되거나 질병과 관련된 합병증에 대한 반응을 측정가능한 정도로 제공하는데 효과적이다.
유효량 또는 충분한 양은 단일 투여로 제공될 수 있으나 반드시 그럴 필요는 없으며, 다수의 투여를 필요로 할 수 있고, 단독으로 또는 또 다른 조성물(예를 들어, 제제), 치료, 프로토콜 또는 치료 요법과 함께 투여될 수 있으나 반드시 그럴 필요는 없을 수 있다. 예를 들어, 양은 대상체의 요구, 치료되는 질병의 유형, 상태 및 중증도 또는 치료의 부작용(존재시)에 의해 지시되는 바와 같이 비례적으로 증가될 수 있다. 또한, 유효량 또는 충분한 양은 제2 조성물(예를 들어, 또 다른 약물 또는 제제), 치료, 프로토콜 또는 치료 요법 없이 단일 또는 다중 용량으로 제공되는 경우 효과적이거나 충분할 필요는 없는데, 제공된 대상체에서 효과적이거나 충분한 것으로 간주되기 위해 상기 용량 이상의 추가 용량, 양 또는 지속기간, 또는 추가 조성물(예를 들어, 약물 또는 제제), 치료, 프로토콜 또는 치료 요법이 포함될 수 있기 때문이다. 효과적인 것으로 간주되는 양은 또한 GAA 결핍(예를 들어, 폼페병) 또는 또 다른 글리코겐 축적병의 치료를 위한 GAA를 인코딩하는 변형된 핵산의 투여와 같은 또 다른 치료, 치료 요법 또는 프로토콜의 사용의 감소를 발생시키는 양을 포함한다.
따라서, 본 발명의 방법 및 용도는 또한 무엇보다도 또 다른 화합물, 제제, 약물, 치료 요법, 치료 프로토콜, 과정 또는 치료법의 감소된 필요성 또는 사용을 발생시키는 방법 및 용도를 포함한다. 예를 들어, GAA 결핍의 경우, 본 발명의 방법 또는 용도는 대상체에서 결핍성 또는 결함성 GAA에 대한 보충을 위해 해당 대상체에서 재조합 GAA의 덜 빈번하거나 감소된 용량 또는 투여의 제거가 존재하는 경우 치료 이점을 갖는다. 따라서, 본 발명에 따르면, 또 다른 치료 또는 요법의 필요성 또는 사용을 감소시키는 방법 및 용도가 제공된다.
유효량 또는 충분한 양은 치료되는 각각의 대상체 및 모든 대상체, 또는 해당 군 또는 집단의 대다수의 치료되는 대상체에서 효과적일 필요는 없다. 유효량 또는 충분한 양은 군 또는 일반 집단이 아닌 특정 대상체에서의 효과 또는 충분함을 의미한다. 상기 방법에 대해 전형적인 바와 같이, 일부 대상체는 해당 치료 방법 또는 용도에 대한 더 큰 반응, 또는 더 적은 반응 또는 무반응을 나타낼 것이다.
대상체로의 투여 또는 생체내 전달은 질병에 의해 야기되거나 이와 관련된 불리한 증상, 상태, 합병증 등의 발생 전에 수행될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 조성물, 방법 및 용도에 대한 후보로서 상기 대상체를 확인하기 위해 스크린(예를 들어, 유전학적)이 이용될 수 있다. 따라서, 상기 대상체는 기능성 유전자 생성물(예를 들어, GSD로 이어지는 GAA 또는 단백질 결핍)에서 불충분한 양 또는 결핍에 대해 양성으로 스크리닝되거나, 이상, 부분적 기능성 또는 비-기능성 유전자 생성물(예를 들어, GAA 또는 GSD와 관련된 단백질)을 생성하는 대상체를 포함한다.
본원에 개시된 바와 같은 본 발명의 방법 및 용도에 따른 대상체로의 투여 또는 생체내 전달은 대상체가 치료를 위해 표적화된 질병을 갖는 것으로 확인되거나, 질병의 하나 이상의 증상을 갖거나, 대상체가 질병의 하나 이상의 증상을 갖지 않더라도 본원에 기재된 바와 같이 양성으로 스크리닝되거나 확인된 후 1-2, 2-4, 4-12, 12-24 또는 24-72시간 이내에 실시될 수 있다. 물론, 본 발명의 방법 및 용도는 대상체가 치료에 대해 표적화된 질병을 갖는 것으로 확인되거나, 질병의 하나 이상의 증상을 갖거나, 본원에 기재된 바와 같이 양성으로 스크리닝되고 확인된 후 1-7, 7-14, 14-24, 24-48, 48-64 이상의 일, 개월 또는 년 동안 실시될 수 있다.
용어 "개선시키다"는 대상체의 질병 또는 이의 증상, 또는 근본적인 세포 반응에서 검출가능하거나 측정가능한 개선을 의미한다. 검출가능하거나 측정가능한 개선은 질병, 또는 질병에 의해 야기되거나 질병과 관련된 합병증의 발생, 빈도, 중증도, 진행 또는 지속기간에서의 주관적 또는 객관적 축소, 감소, 저해, 억제, 제한 또는 제어, 또는 질병의 증상 또는 근본 원인 또는 결과에서의 개선, 또는 질병의 역전을 포함한다.
폼페병의 경우, 유효량은, 예를 들어, 글리코겐 생성 또는 축적을 억제하거나 감소시키거나 글리코겐 분해 또는 제거를 향상 또는 증가시키는 양일 것이다. 유효량은 또한, 식사 행동 장애 및/또는 체중 비증가; 머리 및/또는 목 조절 불량; 호흡 문제 및/또는 폐 감염; 심장 비대 및/또는 두꺼워지는 심장; 심장 결함; 혀 비대; 연하 곤란; 간 비대; 약한 근력; 약한 근긴장; 다리, 허리 및/또는 팔 쇠약; 호흡 곤란; 운동의 어려움; 수면 중 호흡 곤란; 척추만곡증; 및/또는 관절 강직; 약한 근긴장 및/또는 근력 결핍을 개선시키거나 완화시키는 양일 것이다. 유효량은 또한 GAA를 필요로 하거나 폼페병을 갖는 대상체 또는 환자에서 하나 이상의 증상을 감소 또는 억제하거나, 하나 이상의 증상의 진행 또는 악화를 방지 또는 감소시키거나, 하나 이상의 증상을 안정화시키거나, 하나 이상의 증상을 개선시키는 양일 것이다.
치료 용량은 다른 요인 중에서 대상체의 연령 및 일반적 상태, 질병 또는 장애의 중증도에 좌우될 것이다. 인간에서의 치료학적 유효량은 개별 환자의 반응에 기초하여 담당의에 의해 결정될 수 있는 비교적 넓은 범위에 속할 것이다.
약학적 조성물과 같은 조성물은 인코딩된 단백질의 생성을 가능하게 하도록 대상체에 전달될 수 있다. 특정 구현예에서, 약학적 조성물은 수령체가 대상체에서 치료적 유효량의 단백질을 생성할 수 있도록 충분한 유전자 물질을 포함한다.
조성물은 염수, 완충 염수, 덱스트로스 및 물을 포함하나 이에 제한되지는 않는 임의의 멸균의 생체적합성 약학적 담체 중에 제형화되고/거나 투여될 수 있다. 조성물은 단독으로 또는 지혈에 영향을 미치는 다른 제제(예를 들어, 보조 인자)와 조합되어 제형화되고/거나 환자에게 투여될 수 있다.
본 발명의 방법 및 용도는 전신, 국부 또는 국소, 또는 임의의 경로, 예를 들어, 주사 또는 주입에 의한 전달 및 투여를 포함한다. 생체내 약학적 조성물의 전달은 일반적으로 통상적인 주사기를 이용한 주사를 통해 달성될 수 있지만, 대류-강화 전달과 같은 다른 전달 방법이 고려된다(예를 들어, 미국 특허 번호 5,720,720 참조). 예를 들어, 조성물은 피하, 표피, 근내, 경막내, 안와내, 점막내, 비내, 복막내, 정맥내, 흉막내, 동맥내, 강내, 경구, 간내, 문맥 경유, 또는 근내 전달될 수 있다. 다른 투여 방식은 경구 및 폐 투여, 좌약 및 경피 적용을 포함한다. 폼페병 또는 기타 글리코겐 축적병을 갖는 환자의 치료를 전문으로 하는 임상의는 환자의 상태 및 치료 목적(예를 들어, 향상되거나 감소된 GAA 수준)을 포함하나 이에 제한되지는 않는 다수의 기준에 기초하여 아데노바이러스-관련 벡터의 투여를 위한 최적 경로를 결정할 수 있다.
조성물은 단독으로 투여될 수 있다. 특정 구현예에서, rAAV 입자는 면역억제제 없이 치료 효과를 제공한다. 치료 효과는 선택적으로 면역억제제를 투여하지 않고 일정 기간, 예를 들어, 2-4, 4-6, 6-8, 8-10, 10-14, 14-20, 20-25, 25-30 또는 30-50일 이상, 예를 들어, 50-75, 75-100, 100-150, 150-200일 이상 동안 지속된다. 따라서, 치료 효과는 일정 기간 동안 제공된다.
본 발명의 rAVV 벡터, 방법 및 용도는 원하는 치료적이거나, 이롭거나, 추가적이거나, 상승작용적이거나, 상보적인 활성 또는 효과를 갖는 임의의 화합물, 제제, 약물, 치료 또는 다른 치료 요법 또는 프로토콜과 조합될 수 있다. 예시적인 조합 조성물 및 치료는 제2 활성제, 예를 들어, 생물학적 제제(단백질), 제제(예를 들어, 면역억제제) 및 약물을 포함한다. 상기 생물학적 제제(단백질), 제제, 약물, 치료 및 요법은 본 발명의 임의의 다른 방법 또는 사용 전에, 실질적으로 동시 또는 후에 투여되거나 수행될 수 있다.
화합물, 제제, 약물, 치료 또는 다른 치료 요법 또는 프로토콜은 조합 조성물로서 투여되거나, 핵산, 벡터 또는 rAAV 입자의 동시 또는 일련의 또는 순차적(전 또는 후) 전달 또는 투여와 같이 개별적으로 투여될 수 있다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 방법 또는 용도가 본원에 기재되거나 당업자에게 공지된 임의의 화합물, 제제, 약물, 치료 요법, 치료 프로토콜, 공정, 치료제 또는 조성물과 조합된 조합을 제공한다. 화합물, 제제, 약물, 치료 요법, 치료 프로토콜, 공정, 치료제 또는 조성물은 본 발명의 핵산, 벡터 또는 rAAV 입자의 대상체로의 투여 전, 실질적으로 동시에 또는 후에 투여되거나 수행될 수 있다.
특정 구현예에서, 본 발명의 핵산, 벡터 또는 rAAV 입자는 면역억제제 또는 요법과 조합되어 환자에게 투여되며, 여기에서 환자는 rAAV 입자 및/또는 GAA 단백질에 대한 면역 반응을 갖거나 발달시킬 위험을 갖는다. 이러한 면역억제제 또는 요법은 본 발명의 핵산, 벡터 또는 rAAV 벡터 투여 전, 실질적으로 동시에 또는 투여 후에 투여될 수 있다.
일부 구현예에서, 폼페병을 갖는 대상체 또는 환자, 예컨대 인간 환자는 GAA 단백질에 대한 억제제(항-GAA 항체 및/또는 항-GAA T-세포 포함)를 발달시켰으며, 이는 (예를 들어, 재조합에 의해 생성된 GAA 단백질의 투여 후) 전통적인 효소 대체 요법으로의 치료 후 발생할 수 있다. 이러한 GAA 억제제의 발달은 효소 대체 요법을 받은 환자, 특히 (유아 폼페병의 경우일 수 있는 바와 같이) 환자가 감지할 수 없는 GAA 수준을 갖는 환자에서 발생할 수 있으며, 환자의 면역 체계가 대체 GAA 단백질을 "외래"로서 감지하게 한다. 특정 구현예에서, GAA 억제제를 갖는 폼페병 환자에는 본 발명의 rAAV 벡터를 투여하기 전, 실질적으로 동시에 또는 투여 후에 환자에서 GAA 단백질에 대한 면역 반응을 완화하거나 면역 내성을 달성하기 위해 의도된 하나 이상의 요법제가 투여된다. GAA 단백질에 대한 면역 반응을 완화시키거나 면역 내성을 달성하기 위한 이러한 요법은 비제한적으로, 메토트렉세이트, 리툭시맙, 정맥내 감마 글로불린(IVIG), 오말리주맙 및 합성 백신 입자(SVPTM)-라파마이신(생분해성 나노입자에 캡슐화된 라파마이신)을 포함하는 하나 이상의 면역억제제의 투여 및/또는 B-세포 고갈, 면역흡착 및 혈장채집과 같은 하나 이상의 면역억제 프로토콜 또는 절차의 투여를 포함할 수 있다.
특정 구현예에서, rAAV 벡터는 rAAV 벡터를 투여하기 전, 실질적으로 동시에 또는 후에 하나 이상의 면역억제제와 함께 투여된다. 특정 구현예에서, 예를 들어, rAAV 벡터를 투여한 후 1-12, 12-24 또는 24-48시간, 또는 2-4, 4-6, 6-8, 8-10, 10-14, 14-20, 20-25, 25-30, 30-50일, 또는 50일 초과 후. 일정 기간 동안 예를 들어, rAAV 벡터 후 20-25, 25-30, 30-50, 50-75, 75-100, 100-150, 150-200일 또는 200일 초과 동안 초기 발현 수준 후, 인코딩된 단백질 또는 억제 핵산의 감소가 있는 경우, rAAV 벡터를 투여한 후 일정 기간 후에 면역억제제의 상기 투여.
특정 구현예에서, 면역억제제는 항염증제이다. 특정 구현예에서, 면역억제제는 스테로이드, 예를 들어 코르티코스테로이드이다. 특정 구현예에서, 면역 억제제는 프레드니손, 프레드니솔론, 사이클로스포린(예를 들어, 사이클로스포린 A), 마이코페놀레이트, B 세포 표적화 항체, 예를 들어 리툭시맙; 프로테아좀 억제제, 예를 들어 보르테조밉; 라파마이신(mTOR) 억제제의 포유동물 표적, 예를 들어 라파마이신; 티로신 키나제 억제제, 예를 들어 이브루티닙; B-세포 활성화 인자(BAFF)의 억제제; 또는 증식-유도 리간드(APRIL)의 억제제 또는 이의 유도체이다. 특정 구현예에서, 면역억제제는 항-IL-1 β 제제(예를 들어, 항-IL-1β 모노클로날 항체 카나키누맙(Ilaris®)) 또는 항-IL-6 제제(예를 들어, 항-IL-6 항체 시루쿠맙 또는 항-IL-6 수용체 항체 토실리주맙(Actemra®)), 또는 이의 조합물이다.
라파마이신을 단독으로 또는 IL-10과 함께 사용하는 것을 포함하는 면역-억제 프로토콜은 GAA 단백질에 대한 체액성 및 세포성 면역 반응을 감소, 저하, 억제, 방지 또는 차단하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 AAV 벡터를 사용한 간 유전자 전달은 조절 T 세포(Treg) 및 다른 메카니즘의 유도를 통해 GAA 단백질에 대한 면역 내성을 유도하는데 사용될 수 있다. 전신 유전자 전달에서 AAV에 대한 체액성 면역을 감소(극복)하거나 회피하기 위한 전략은 고용량 벡터 투여, 항-AAV 항체를 흡착하기 위한 미끼로서 AAV 빈 캡시드 사용, AAV에 대한 체액성 면역 반응을 감소, 저하, 억제, 방지 또는 근절하기 위해 면역억제 약물 투여, 중화 항체에 덜 민감하도록 AAV 캡시드 혈청형 변경 또는 AAV 캡시드 조작, 항-AAV 면역글로불린을 흡착하여 항-AAV 항체 역가를 감소시키기 위한 혈장 교환 주기 이용, 및 전달 기술, 예컨대 벌룬 카테터에 이어서 염수 플러싱의 사용을 포함한다. 이러한 전략은 문헌 [Mingozzi et al., 2013, Blood, 122:23-36]에 기술되어 있다. 치료학적 처리를 개선하기 위해 폼페병 환자에서 GAA에 대한 내성을 유도하는 절차 및 접근 방식은 문헌[Doerfler et al., 2016, Mol. Ther., 3:15053]에서 검토된다.
AAV 빈 캡시드 대 rAAV 벡터의 비율은 약 100:1-50:1, 약 50:1-25:1, 약 25:1-10:1, 약 10:1-1:1, 약 1:1-1:10, 약 1:10-1:25, 약 1:25-1:50, 또는 약 1:50-1:100 이내 또는 그 사이일 수 있다. 비율은 또한 약 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 또는 10:1일 수 있다.
투여할 AAV 빈 캡시드의 양은 특정 대상체에서 생성된 AAV 항체의 양(역가)을 기초로 하여 측정될 수 있다. AAV 빈 캡시드는 임의의 AAV 혈청형, 예를 들어, AAV (SEQ ID NO: 30-32), LK03 (SEQ ID NO: 33), AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, Rh10, Rh74, AAV3B 또는 AAV-2i8일 수 있다.
대안적으로 또는 추가로, rAAV 벡터는 직접 근내 주사(예를 들어, 근육의 하나 이상의 느린-연축 섬유)에 의해 전달될 수 있다. 또 다른 대안에서, 대퇴 동맥으로 도입된 카테터는 간 동맥을 통해 간으로 rAAV 벡터를 전달하는데 사용될 수 있다. 내시경 역행 담췌관 조영술(ERCP)과 같은 비-수술적 수단이 또한 이용되어 rAAV 벡터를 간에 직접 전달함으로써 혈류 및 AAV 항체를 우회할 수 있다. 턱밑샘의 관과 같은 다른 관 시스템이 또한 기존 항-AAV 항체를 발생시키거나 이를 갖는 대상체에 rAAV 벡터를 전달하기 위한 문으로서 사용될 수 있다.
AAV에 대한 체액성 면역을 감소시키기 위한 추가 전략은 일반적으로 성분채W집 및 더욱 특히, 혈액 생성물이 관련되는 경우 혈장분리로서 언급되는 AAV 항체를 제거, 고갈, 포획 및/또는 불활성화시키는 방법을 포함한다. 성분채집 또는 혈장분리는 인간 대상체의 혈장이 환자에게 되돌아가기 전에 성분의 추가, 제거 및/또는 대체를 통해 혈장을 변경하는 장치에 의해 생체외(체외)에서 순환되는 과정이다. 혈장분리는 혈액 생성물(예를 들어, 혈장)로부터 인간 면역글로불린(예를 들어, IgG, IgE, IgA, IgD)을 제거하는데 사용될 수 있다. 이러한 절차는 AAV에 결합하는 면역글로불린(항체)을 고갈, 포획, 불활성화, 감소 또는 제거하여 AAV 벡터 중화에 기여할 수 있는 처리된 대상체에서의 AAV 항체의 역가를 감소시킨다. 예로는 AAV 캡시드 친화성 매트릭스 칼럼으로 구성된 장치가 있다. AAV 캡시드 친화성 매트릭스를 통해 혈액 생성물(예를 들어, 혈장)을 통과시키면 단지 AAV 항체 및 모든 아이소형(IgG, IgM 등 포함)과의 결합만 발생시킬 것이다.
AAV 캡시드 친화성 매트릭스를 사용한 충분한 양의 혈장분리는 AAV 캡시드 항체를 실질적으로 제거하고, 인간에서 AAV 캡시드 항체 역가(로드)를 감소시킬 것으로 예상된다. 특정 구현예에서, 치료된 대상체의 역가는 실질적으로 낮은 수준(<1:5 이하, 예컨대 <1:4, 또는 <1:3, 또는 <1:2, 또는 <1:1로)으로 감소된다. AAV 캡시드 항체를 생성하는 B 림프구가 AAV 캡시드 항체 역가를 혈장분리 전에 정상 상태 수준으로 점차적으로 반동시킬 것으로 예상되기 때문에 항체 역가의 감소는 일시적일 것이다.
기존 AAV 항체 역가가 1:100에서 1:1로 감소한 경우, 약 0.15%(1:1.2 역가에 해당) 0.43%(1:1.4), 0.9%(1:1.9), 1.7%(1:2.7) 및 3.4%(1:4.4)의 AAV 항체 역가 반등은 혈장분리 완료 후 각각 1시간, 3시간, 6시간, 12시간 및 24시간째에 발생한다. 이러한 대상체로부터의 AAV 항체의 일시적 제거는, AAV 벡터가 대상체에 투여될 수 있으며, AAV 항체로의 AAV 벡터의 실질적인 중화 없이 표적 조직을 효율적으로 형질도입시킬 수 있는 것으로 예측되는 기간(예를 들어, 약 24시간 이내, 예컨대 12시간 이내, 또는 6시간 이내, 또는 3시간 이내, 또는 2시간 이내, 또는 1시간 이내)에 상응할 것이다.
기존 AAV 항체 역가가 1:1000에서 1:1로 감소한 경우, 약 0.15%(1:2.5 역가에 해당), 0.4%(1:5.3), 0.9%(1:9.7), 1.7%(1:18) 및 3.4%(1:35)의 AAV 항체 역가 반등은 혈장분리법 완료 후 각각 1시간, 3시간, 6시간, 12시간 및 24시간에 발생한다. 따라서, AAV 벡터의 투여 기간은 비교적 짧아질 것이다.
AAV 항체는 이미 존재할 수 있으며, 표적 세포의 치료용 GAA 유전자 전달 벡터 형질도입을 감소 또는 차단하는 수준으로 존재할 수 있다. 대안적으로, AAV 항체는 AAV에 노출되거나 AAV 벡터의 투여 후에 발생할 수 있다. 이러한 항체가 AAV 벡터의 투여 후에 발생하는 경우, 이들 대상체는 또한 성분채집, 더욱 특히 혈장분리를 통해 처리될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 핵산, 발현 카세트 및 AAV 벡터는 예를 들어 호흡기 지원(기계적 환기 포함), 근육 강화를 위한 물리 요법, 근력 및 신체 능력 향상을 위한 물리 요법, 지팡이, 보행기 및 휠체어 사용을 포함한 작업 요법, 관절 및 언어 개선을 위한 언어 요법, 교정기를 포함한 정형외과 장치의 사용, 및 적절한 영양 및 체중 증가를 보장하기 위한 식이 요법 및 공급 튜브를 포함하는 증상 및 지원 요법과 조합되어 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 핵산, 발현 카세트 및 AAV 벡터는 약물학적 샤페론 요법(효소 증진 요법으로도 알려짐)과 조합되어 사용될 수 있으며, 여기서 하나 이상의 약물학적 샤페론은 폼페병과 같은 GSD의 치료를 위한 본 발명의 핵산, 발현 카세트 또는 AAV 벡터의 투여 전, 동시에 또는 후에 투여된다.
일부 구현예에서, 본 발명의 핵산, 발현 카세트 및 AAV 벡터는 GAA 단백질을 안정화시킬 수 있는 하나 이상의 약물학적 샤페론과 조합되어 사용될 수 있다. 본 발명의 핵산, 발현 카세트 및 AAV 벡터와 조합하여 사용될 수 있는 약물학적 샤페론은 1-데옥시노지리마이신(1-DNJ, 듀보글루스타트로도 알려짐), N-부틸-1-데옥시노지리마이신(미글루스타트로도 알려짐), N-메틸-DNJ, N-에틸-DNJ, N-프로필-DNJ, N-펜틸-DNJ, N-헥실-DNJ, N-헵틸-DNJ, N-옥틸-DNJ, N-노닐-DNJ, N-메틸사이클로프로필-DNJ, N-메틸사이클로펜틸-DNJ, N-2-하이드록시에틸-DNJ, 5-N-카르복시펜틸 DNJ, 및 미국 특허 6,599,919 및 9,181,184 및 국제 특허 출원 공개 WO/2013/182652에 설명되어 있는 약물학적 샤페론을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 핵산, 발현 카세트 및 AAV 벡터는 국제 특허 출원 공개 번호 WO/2017/049161에 기술된 것으로서 예를 들어, 클렌부테롤, 알부테롤, 포르모테롤 및 살메테롤을 포함하는 하나 이상의 β2 효능제와 함께 보조 요법과 조합하여 사용될 수 있다.
특정 구현예에서, 본 발명의 핵산 및 발현 카세트는 AAV 벡터 입자를 통해 전달되거나 투여된다. 다른 구현예에서, 본 발명의 핵산 및 발현 카세트는 레트로바이러스, 아데노바이러스, 헬퍼-의존성 아데노바이러스, 하이브리드 아데노바이러스, 단순 포진 바이러스, 렌티바이러스, 폭스바이러스, 엡스타인-바르 바이러스, 백시니아 바이러스 및 인간 사이토메갈로바이러스 입자를 포함하는 다른 유형의 바이러스 입자를 통해 전달되거나 투여될 수 있다.
다른 구현예에서, 본 발명의 핵산 및 발현 카세트는 비-바이러스 전달 시스템으로 전달되거나 투여된다. 비-바이러스 전달 시스템에는 예를 들어, 화학적 방법, 예컨대 리포솜, 나노입자, 지질 나노입자, 폴리머, 마이크로입자, 마이크로캡슐, 미셀 또는 세포외 소포 및 물리적 방법, 예컨대 유전자 총, 전기천공, 입자 충격, 초음파 이용 및 자기감염이 포함된다.
일부 구현예에서, 본 발명의 핵산 및 발현 카세트는 폐쇄 말단 선형 듀플렉스 DNA의 네이키드 DNA, 미니서클, 트랜스포손으로서 전달된다.
다른 구현예에서, 본 발명의 핵산 및 발현 카세트는 리포솜, 나노입자, 지질 나노입자, 폴리머, 마이크로입자, 마이크로캡슐, 미셀, 또는 세포외 소포로 추가로 캡슐화되거나 복합화되는 AAV 벡터 입자 또는 다른 바이러스 입자로 전달되거나 투여된다.
"지질 나노입자" 또는 "LNP"는 AAV의 전달에 유용하고 나노규모의 치수, 즉 약 10 nm 내지 약 1000 nm, 또는 약 50 내지 약 500 nm, 또는 약 75 내지 약 127 nm를 갖는 지질-기반 소포를 나타낸다. 이론에 얽매이지 않고, LNP는 면역계로부터 부분적 또는 완전한 차폐를 갖는 핵산, 발현 카세트 또는 AAV 벡터를 제공하는 것으로 여겨진다. 차폐는 핵산, 발현 카세트 또는 AAV 벡터를 조직 또는 세포에 전달하는 것을 허용하면서, 핵산, 발현 카세트 또는 AAV 벡터에 대한 실질적인 면역 반응을 생체내에서 유도하는 것을 회피한다. 차폐는 또한 핵산, 발현 벡터 또는 AAV 벡터에 대한 실질적인 면역 반응을 생체내(예를 들어, 인간과 같은 대상체에서) 유도하지 않으면서 반복 투여를 허용할 수 있다. 차폐는 또한 생체내 핵산, 발현 카세트 또는 AAV 벡터 전달 효율을 개선하거나 증가시킬 수 있다.
AAV의 pI(등전점)은 약 6 내지 약 6.5 범위에 있다. 따라서, AAV 표면은 약간의 음전하를 수송한다. 따라서, LNP가 예를 들어, 아미노 지질과 같은 양이온성 지질을 포함하는 것이 유익할 수 있다. 예시적인 아미노 지질은 미국 특허 번호 9,352,042, 9,220,683, 9,186,325, 9,139,554, 9,126,966 9,018,187, 8,999,351, 8,722,082, 8,642,076, 8,569,256, 8,466,122, 및 7,745,651 및 미국 특허 공개 번호 2016/0213785, 2016/0199485, 2015/0265708, 2014/0288146, 2013/0123338, 2013/0116307, 2013/0064894, 2012/0172411, 및 2010/0117125에 기술되어 있다.
용어 "양이온성 지질" 및 "아미노 지질"은 1, 2, 3개 이상의 지방산 또는 지방 알킬 사슬 및 pH-적정가능한 아미노기(예를 들어, 알킬아미노 또는 디알킬아미노 기)를 갖는 지질 및 이의 염을 포함하는 것으로 본원에 상호교환적으로 사용된다. 양이온성 지질은 전형적으로 양이온성 지질의 pKa 미만의 pH에서 양성자화(즉, 양으로 하전)되며, pKa 초과의 pH에서 실질적으로 중성이다. 양이온성 지질은 또한 적정가능한 양이온성 지질일 수 있다. 일부 구현예에서, 양이온성 지질은 양성자화가능한 삼차 아민(예를 들어, pH-적정가능한) 기; C18 알킬 사슬(여기에서 각각의 알킬 사슬은 독립적으로 0 내지 3(예를 들어, 0, 1, 2 또는 3)개 이중 결합; 및 헤드 기와 알킬 사슬 사이의 에테르, 에스테르 또는 케탈 결합을 포함한다.
양이온성 지질은 비제한적으로 1,2-디리놀레일옥시-N,N-디메틸아미노프로판(DLinDMA), 1,2-디리놀레닐옥시-N,N-디메틸아미노프로판(DLenDMA), 1,2-디-γ-리놀레닐옥시-N,N-디메틸아미노프로판(γ-DLenDMA), 2,2-디리놀레일-4-(2-디메틸아미노에틸)-[1,3]-디옥솔란(DLin-C2K-DMA로서 공지된 DLin-K-C2-DMA, XTC2, 및 C2K), 2,2-디리놀레일-4-디메틸아미노메틸-[1,3]-디옥솔란(DLin-K-DMA), 딜리놀레일메틸-3-디메틸아미노프로피오네이트(DLin-M-C2-DMA(MC2라고도 공지됨)),(6Z,9Z,28Z,31Z)-헵타트리아콘타-6,9,28,31-테트라엔-19-일 4-(디메틸아미노)부타노에이트(DLin-M-C3-DMA, MC3라고도 공지됨), 이의 염, 및 이들의 혼합물을 포함할 수 있다. 다른 양이온성 지질은 또한 비제한적으로 1,2-디스테아릴옥시-N,N-디메틸-3-아미노프로판(DSDMA), 1,2-디올레일옥시-N,N-디메틸-3-아미노프로판(DODMA), 2,2-디리놀레일-4-(3-디메틸아미노프로필)-[1,3]-디옥솔란(DLin-K-C3-DMA), 2,2-디리놀레일-4-(3-디메틸아미노부틸)-[1,3]-디옥솔란(DLin-K-C4-DMA), DLen-C2K-DMA, γ-DLen-C2K-DMA 및 (DLin-MP-DMA)(1-B11이라고도 함)을 포함한다.
추가의 양이온성 지질은 비제한적으로 2,2-디리놀레일-5-디메틸아미노메틸-[1,3]-디옥산(DLin-K6-DMA), 2,2-디리놀레일-4-N-메틸페피아지노-[1,3]-디옥솔란(DLin-K-MPZ), 1,2-디리놀레일카르바모일옥시-3-디메틸아미노프로판(DLin-C-DAP), 1,2-디리놀레이옥시-3-(디메틸아미노)아세톡시프로판(DLin-DAC), 1,2-디리놀레이옥시-3-모르폴노프로판(DLin-MA), 1,2-디리놀레오일-3-디메틸아미노프로판(DLinDAP), 1,2-디리놀레일티오-3-디메틸아미노프로판(DLin-S-DMA), 1-리놀레오일-2-리놀레일옥시-3-디메틸아미노프로판(DLin-2-DMAP), 1,2-디리놀레일옥시-3-트리메틸아미노프로판 클로라이드 염(DLin-TMA.Cl), 1,2-디리놀레오일-3-트리메틸아미노프로판 클로라이드 염(DLin-TAP.Cl), 1,2-디리놀레일옥시-3-(N-메틸피페라지노)프로판(DLin-MPZ), 3-(N,N-디리놀레일아미노)-1,2-프로판디올(DLinAP), 3-(N,N-디올레일아미노)-1,2-프로판디오(DOAP), 1,2-디리노레일옥소-3-(2-N,N-디메틸아미노)에톡시프로판(DLin-EG-DMA), N,N-디올레일-N,N-디메틸암모늄클로라이드(DODAC), N-(1-(2,3-디올레일옥시)프로필)-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드(DOTMA), N,N-디스테아릴-N,N-디메틸암모늄 브로마이드(DDAB), N-(1-(2,3-디올레오일옥시)프로필)-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드(DOTAP), 3-(N-(N',N'-디메틸아미노에탄)-카르바모일)콜레스테롤(DC-Chol), N-(1,2-디미리스틸옥시프로프-3-일)-N,N-디메틸-N-하이드록시에틸 암모늄 브로마이드(DMRIE), 2,3-디올레일옥시-N-[2(스페르민-카르복사미도)에틸]-N,N-디메틸-1-프로파나미늄트리플루오로아세테이트(DOSPA), 디옥타데실아미도글리실 스페르민(DOGS), 3-디메틸아미노-2-(콜레스트-5-엔-3-베타-옥시부탄-4-옥시)-1-(시스,시스-9,12-옥타데카디에녹시)프로판(CLinDMA), 2-[5'-(콜레스트-5-엔-3-베타-옥시)-3'-옥사펜톡시)-3-디메틸-1-(시스,시스-9',1-2'-옥타데카디에녹시)프로판(CpLinDMA), N,N-디메틸-3,4-디올레일옥시벤질아민(DMOBA), 1,2-N,N'-디올레일카르바밀-3-디메틸아미노프로판(DOcarbDAP), 1,2-N,N'-디리놀레일카르바밀-3-디메틸아미노프로판(DLincarbDAP), 덱사메타손-스페리민(DS) 및 이치환된 스페르민(D2S) 또는 이들의 혼합물을 포함할 수 있다.
LIPOFECTIN®(DOTMA 및 DOPE 포함, GIBCO/BRL에서 입수 가능) 및 LIPOFECTAMINE®(DOSPA 및 DOPE 포함, GIBCO/BRL에서 입수 가능)과 같은 양이온성 지질의 여러 상업적 제조물을 사용할 수 있다.
특정 구현예에서, 양이온성 지질은 LNP의 약 10 중량% 내지 지질 나노입자의 약 85 중량%, 또는 LNP의 약 50 중량% 내지 LNP의 약 75 중량%의 양으로 존재할 수 있다.
스테롤은 LNP에 유동성을 부여할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 "스테롤"은 식물(피토스테롤) 또는 동물(주스테롤) 기원의 임의의 자연 발생 스테롤 및 비-자연 발생 합성 스테롤을 나타내며, 이들 모두는 스테로이드 A-고리의 3-위치에서 하이드록실 기의 존재를 특징으로 한다. 스테롤은 리포좀, 지질 소포 또는 지질 입자 제조물 분야에서 통상적으로 사용되는 임의의 스테롤, 가장 일반적으로는 콜레스테롤일 수 있다. 피토스테롤에는 캄페스테롤, 시토스테롤 및 스티그마스테롤이 포함될 수 있다. 스테롤은 또한 미국 특허 출원 공개 2011/0177156에 기재된 것과 같은 스테롤-변형된 지질을 포함한다. 일부 구현예에서, 스테롤은 LNP의 약 5 중량% 내지 지질 나노입자의 약 50 중량% 또는 LNP의 약 10 중량% 내지 LNP의 약 25 중량%의 양으로 존재할 수 있다.
LNP는 중성 지질을 포함할 수 있다. 중성 지질은 생리학적 pH에서 하전되지 않은 또는 중성의 양쪽성이온 형태로 존재하는 임의의 지질 종을 포함할 수 있다. 이러한 지질은 비제한적으로, 디아실포스파티딜콜린, 디아실포스파티딜에탄올아민, 세라미드, 스핑고미엘린, 디하이드로스핑고미엘린, 세팔린 및 세레브로시드를 포함한다. 일반적으로 중성 지질의 선택은 특히 입자 크기 및 필요한 안정성을 고려하여 안내된다. 일부 구현예에서, 중성 지질 성분은 2개의 아실기를 갖는 지질(예를 들어, 디아실포스파티딜콜린 및 디아실포스파티딜에탄올아민)일 수 있다.
다양한 사슬 길이 및 포화도의 다양한 아실 사슬 기를 갖는 지질이 이용가능하거나 잘 알려진 기술에 의해 분리되거나 합성될 수 있다. 일부 구현예에서, 탄소 사슬 길이가 C14 내지 C22 범위인 포화 지방산을 함유하는 지질이 사용될 수 있다. 다른 군의 구현예에서, 탄소 사슬 길이가 C14 내지 C22 범위인 모노 또는 이중 불포화 지방산을 갖는 지질이 사용된다. 추가로, 포화 및 불포화 지방산 사슬의 혼합물을 갖는 지질이 사용될 수 있다. 예시적인 중성 지질은 비제한적으로 1,2- 디올레오일-sn-글리세로-3-포스파티딜-에탄올아민(DOPE), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DSPC), 1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(POPC) 또는 임의의 관련 포스파티딜콜린을 포함한다. 중성 지질은 또한 스핑고미엘린, 디하이드로스핑고미엘린, 또는 세린 및 이노시톨과 같은 다른 헤드 기를 갖는 인지질을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 중성 지질은 지질 나노입자의 약 0.1 중량% 내지 LNP의 약 75 중량%, 또는 LNP의 약 5 중량% 내지 LNP의 약 15 중량%의 양으로 존재할 수 있다.
LNP 캡슐화된 핵산, 발현 카세트 및 AAV 벡터는 약학적 조성물, 예를 들어 약학적으로 허용되는 담체 또는 부형제에 혼입될 수 있다. 이러한 약학적 조성물은 특히, LNP 캡슐화된 산, 발현 카세트 및 AAV 벡터를 생체내 또는 생체외에서 대상체에게 투여 및 전달하는데 유용하다.
LNP의 제조물은 추가 성분과 조합될 수 있다. 비-제한적인 예는 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 및 스테롤을 포함한다.
용어 "PEG"는 2개의 하이드록실 말단 기를 갖는 에틸렌 PEG 반복 단위의 선형 수용성 중합체인 폴리에틸렌 글리콜을 나타낸다. PEG는 분자량에 따라 분류된다; 예를 들어, PEG 2000은 약 2,000 달톤의 평균 분자량을 가지며, PEG 5000은 약 5,000 달톤의 평균 분자량을 갖는다. PEG는 Sigma Chemical Co. 및 기타 회사로부터 시중에서 입수가능하며, 예를 들어 다음과 같은 기능성 PEG를 포함한다: 모노메톡시폴리에틸렌 글리콜(MePEG-OH), 모노메톡시폴리에틸렌 글리콜-숙시네이트(MePEG-S), 모노메톡시폴리에틸렌 글리콜-숙신이미딜 숙시네이트(MePEG-S-NHS), 모노메톡시폴리에틸렌 글리콜-아민(MePEG-NH2), 모노메톡시폴리에틸렌 글리콜-트레실레이트(MePEG-TRES) 및 모노메톡시폴리에틸렌 글리콜-이미다졸릴-카르보닐(MePEG-IM).
일부 구현예에서, PEG는 평균 분자량이 약 550 내지 약 10,000 달톤인 폴리에틸렌 글리콜일 수 있으며, 선택적으로 알킬, 알콕시, 아실 또는 아릴로 치환된다. 일부 구현예에서, PEG는 하이드록실 말단 위치에서 메틸로 치환될 수 있다. 또 다른 바람직한 구현예에서, PEG는 약 750 내지 약 5,000 달톤, 또는 약 1,000 내지 약 5,000 달톤, 또는 약 1,500 내지 약 3,000 달톤 또는 약 2,000 달톤 또는 약 750 달톤의 평균 분자량을 가질 수 있다. PEG는 알킬, 알콕시, 아실 또는 아릴로 선택적으로 치환될 수 있다. 일부 구현예에서, 하이드록실 말단 기는 메톡시 또는 메틸 기로 치환될 수 있다.
PEG-개질된 지질은 미국 특허 번호 8,936,942 및 7,803,397에 기재된 PEG-디알킬옥시프로필 컨쥬게이트(PEG-DAA)를 포함한다. 유용한 PEG-개질된 지질(또는 지질-폴리옥시에틸렌 컨쥬게이트)은 PEG 부분을 지질 소포체의 표면에 고정하기 위해 다양한 "고정" 지질 부분을 가질 수 있다. 적합한 PEG-개질된 지질의 예는 PEG-개질된 포스파티딜에탄올아민 및 포스파티드산, 미국 특허 번호 5,820,873에 기재된 PEG-세라미드 컨쥬게이트(예를 들어, PEG-CerC14 또는 PEG-CerC20), PEG-개질된 디알킬아민 및 PEG-개질된 1,2-디아실옥시프로판-3-아민을 포함한다. 일부 구현예에서, PEG-개질된 지질은 PEG-개질된 디아실글리세롤 및 디알킬글리세롤일 수 있다. 일부 구현예에서, PEG는 LNP의 약 0.5 중량% 내지 LNP의 약 20 중량%, 또는 LNP의 약 5 중량% 내지 LNP의 약 15 중량%의 양으로 존재할 수 있다.
또한, LNP는 PEG-개질된 및 스테롤-개질된 LNP일 수 있다. 추가 성분과 조합된 LNP는 동일하거나 별도의 LNP일 수 있다. 즉, 동일한 LNP가 PEG 개질되고 스테롤 개질될 수 있거나, 대안적으로, 제1 LNP는 PEG 개질될 수 있으며, 제2 LNP는 스테롤 개질될 수 있다. 선택적으로, 제1 및 제2 개질된 LNP는 조합될 수 있다.
일부 구현예에서, 캡슐화 전에 LNP는 약 10 nm 내지 500 nm, 또는 약 50 nm 내지 약 200 nm, 또는 75 nm 내지 약 125 nm 범위의 크기를 가질 수 있다. 일부 구현예에서, LNP 캡슐화된 핵산, 발현 벡터 또는 AAV 벡터는 약 10 nm 내지 500 nm 범위의 크기를 가질 수 있다.
본 발명의 GAA 서열을 발현할 수 있는 재조합 세포는 전달 또는 투여에 사용될 수 있다.
미니서클 및 트랜스포손과 같은 네이키드 DNA는 투여 또는 전달 또는 렌티바이러스 벡터에 사용될 수 있다. 추가로, 징크 핑거 뉴클레아제, 메가뉴클레아제, TALEN 및 CRISPR과 같은 유전자 편집 기술이 또한 본 발명의 코딩 서열을 전달하는데 이용될 수 있다.
글리코겐 축적병(GSD)은 궁극적으로 글리코겐 화합물을 글루코스로 전환시키는 효소의 부재로 인해 발생한다. 효소 결핍은 조직에서 글리코겐 축적을 초래한다. 많은 경우, 결함은 전신적인 결과를 가져 오지만, 일부 경우에, 결함은 특정 조직으로 제한된다. 대부분의 환자는 쇠약 및 경련과 같은 근육 증상을 경험하지만, 특정 GSD는 저혈당 발작 또는 심비대와 같은 특정 증후군으로 나타난다.
하기는 GSD의 비제한적인 예이다:
0 - 글리코겐 신타제 결핍; Ia-글루코스-6-포스파타제 결핍(폰기에르케병); II-산 말타제 결핍(폼페병); III-탈분지 효소 결핍(포르브스-코리 병); IV-트랜스글루코시다제 결핍(앤더슨병, 아밀로펙틴증); V-마이오포스포릴라제 결핍(맥아들병); VI-포스포릴라제 결핍(허스병); 및 VII-포스포프룩토키나제 결핍(타루이병).
다양한 형태의 GSD는 대사 탄수화물 경로에 영향을 미친다. 문헌에는 적어도 14가지의 고유한 GSD가 논의되었지만, 임상적으로 유의한 근육 약화를 초래하는 4가지는 폼페병(GSD 타입 II, 산 말타제 결핍), 코리병(GSD 타입 IIIa, 탈분지 효소 결핍), 맥아들병(GSD 타입 V, 마이오포스포릴라제 결핍) 및 타루이병(GSD 타입 VII, 포스포프룩토키나제 결핍)이다. 한 형태인 폰기에르케병(GSD 타입 Ia, 글루코스-6-포스파타제 결핍)은 유의한 이환율을 가진 임상적으로 유의한 말단-장기 질환을 유발한다.
일반적으로 GSD는 상염색체 열성 상태로 유전된다. 이러한 유전된 효소 결함은 일반적으로 아동 시절에 존재하지만, 맥아들병 및 폼페병과 같은 일부는 별도의 성인-발병 형태를 가지고 있다.
GSD는 효소 대체 요법(ERT), 예를 들어 재조합적으로 생성된 GAA로 치료될 수 있다. 효소 대체 요법은 모든 폼페병 환자에게 승인된 치료법이다. 이는 재조합 인간 산 α-글루코시다제의 정맥내 투여를 포함한다. Sanofi Corporation인 Genzyme에서 제조한 이 치료제는 Lumizyme(미국 이외의 지역에서 Myozyme으로 판매)이며, 2006년 미국 식품의약국(FDA)에서 처음 승인되었다. 이는 폼페병 환자 모두에게 승인되었다. ERT의 이점은 항체 형성에 의해 약화될 수 있으며, 따라서 ERT는 또한 면역 발현과 조합될 수 있다.
GSD는 식이 요법을 꼼꼼하게 준수하는 식이 요법으로 치료될 수 있고, 간 크기를 줄이고, 저혈당증을 예방하고, 증상을 감소시키고, 성장과 발달을 허용할 수 있다.
폼페병의 추가 치료는 증상이 있고 지원적이다. 대부분의 환자는 어느 정도의 호흡 장애 및/또는 호흡 부전이 있기 때문에 호흡 지원이 필요할 수 있다. 물리 치료는 호흡 근육을 강화하는데 도움이 될 수 있다. 일부 환자는 야간 및/또는 낮 시간 동안 기계적 환기(즉, bipap 또는 볼륨 인공 호흡기)를 통한 호흡 보조를 필요로 할 수 있다. 또한, 호흡기 감염 동안 추가 지원이 필요할 수 있다. 기계적 환기 지원은 비침습적 또는 침습적 기술을 통해 이루어질 수 있다. 호흡 지원 기간에 대한 결정은 환자의 특성에 따라 담당의 및 기타 의료 팀 구성원과 신중하게 상담하여 가족이 내리는 것이 가장 좋다. 고단백 식단은 비유아 형태의 폼페병에 유익할 수 있다.
근력과 신체 능력을 향상시키기 위해 물리 치료가 권장된다. 지팡이 또는 보행기 사용을 포함한 작업 요법이 필요할 수 있다. 결국 일부 개인은 휠체어를 사용해야할 수 있다. 언어 치료는 일부 환자의 발음과 언어를 개선하는데 유익할 수 있다.
일부 환자에게는 보조기를 포함한 정형외과 장치가 권장될 수 있다. 경축 또는 척추 기형과 같은 특정 정형외과적 증상에 대해 수술이 필요할 수 있다.
폼페병은 씹거나 삼키는데 사용되는 근육을 약화시킬 수 있으므로, 적절한 영양과 체중 증가를 보장하기 위한 조치가 필요할 수 있다. 일부 환자는 특화된 고-칼로리 식단이 필요할 수 있으며, 흡인 위험을 낮추기 위해 음식의 크기와 질감을 변경하는 기술을 배워야할 수 있다. 일부 영아는 코를 통해 식도를 거쳐 위(비위관)로 흐르는 영양관을 삽입해야 할 수 있다. 일부 소아에서는 복벽에 있는 작은 수술 구멍을 통해 영양관을 위장에 직접 삽입해야 할 수도 있다. 후기 발병 폼페병을 앓고 있는 일부 개인은 부드러운 식단이 필요할 수 있지만, 소수는 급식 튜브를 필요로 할 수 있다.
대상체는 치료에 대한 부작용에 대해 하나 이상의 간 효소에 대해 시험되거나 그러한 대상체, 전처리가 본 발명의 방법에 따른 치료에 적합한지의 여부를 결정하기 위해 시험될 수 있다. 따라서, 후보 대상체는 본 발명의 방법에 따른 치료 전 또는 후에 하나 이상의 간 효소의 양에 대해 스크리닝될 수 있다. 처리된 대상체는 증가된 간 효소에 대한 치료 후 주기적으로, 예를 들어 1-4주마다, 1-6개월마다, 6-12개월마다, 또는 1, 2, 3, 4, 5년 이상 마다 모니터링될 수 있다.
예시적인 간 효소는 알라닌 아미노트랜스퍼라제(ALT), 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라제(AST) 및 락테이트 데하이드로게나제(LDH)를 포함하지만, 간 손상을 나타내는 다른 효소도 모니터링할 수 있다. 순환에서 이러한 효소의 정상 수준은 일반적으로 상위 수준을 갖는 범위로 정의되며, 그 이상은 효소 수준이 상승된 것으로 간주되어 간 손상을 나타낸다. 정상 범위는 부분적으로 검정을 수행하는 임상 실험실에서 사용하는 표준에 의존적이다.
본 발명은 패키징 물질 및 그 안에 하나 이상의 구성요소를 갖는 키트를 제공한다. 키트는 전형적으로 그 안의 구성요소의 시험관내, 생체내, 또는 생체외 사용을 위한 구성요소의 설명 또는 설명서를 포함하는 라벨 또는 패키징 삽입물을 포함한다. 키트는 상기 구성요소, 예를 들어, rAAV 입자 및 선택적으로 제2 활성물질, 예컨대, 또 다른 화합물, 제제, 약물 또는 조성물의 수집물을 함유할 수 있다.
키트는 키트의 하나 이상의 구성요소를 수용하는 물리적 구조를 나타낸다. 패키징 물질은 구성요소를 멸균 상태로 유지할 수 있고, 상기 목적에 일반적으로 사용되는 물질(예를 들어, 종이, 골판지 섬유, 유리, 플라스틱, 호일, 앰풀, 바이알, 튜브 등)로 제조될 수 있다.
라벨 또는 삽입물은 키트 내의 하나 이상의 구성요소, 용량, 작용 메커니즘, 약동학 및 약역학을 포함하는 활성 성분(들)의 임상 약리학의 확인 정보를 포함할 수 있다. 라벨 또는 삽입물은 제조업체, 로트 번호, 제조 위치 및 날짜, 만료 날짜를 확인하는 정보를 포함할 수 있다. 라벨 또는 삽입물은 제조업체 정보, 로트 번호, 제조업체 위치 및 날짜를 확인하는 정보를 포함할 수 있다. 라벨 또는 삽입물은 키트 구성요소가 사용될 수 있는 질병에 대한 정보를 포함할 수 있다. 라벨 또는 삽입물은 방법, 용도, 또는 치료 프로토콜 또는 치료 요법에서 키트 구성요소 중 하나 이상을 사용하기 위한 임상의 또는 대상체에 대한 지시사항을 포함할 수 있다. 설명서는 투여량, 빈도 또는 지속기간, 및 본원에 기재된 임의의 방법, 용도, 치료 프로토콜 또는 예방 또는 치료 요법을 실시하기 위한 지침을 포함할 수 있다.
라벨 또는 삽입물은 예방적 또는 치료적 이점과 같은 구성요소가 제공할 수 있는 임의의 이점에 대한 정보를 포함할 수 있다. 라벨 또는 삽입물은 특정 조성물을 사용하는 것이 적절하지 않은 상황에 관한 대상체 또는 임상의에 대한 경고와 같은 잠재적인 불리한 부작용, 합병증 또는 반응에 대한 정보를 포함할 수 있다. 대상체가 조성물과 양립할 수 없는 하나 이상의 다른 약물을 복용했거나, 복용할 것이거나, 현재 복용 중인 경우, 또는 대상체가 조성물과 양립하지 않을 또 다른 치료 프로토콜 또는 치료 요법을 받았거나, 받을 것이거나, 현재 받고 있는 경우에 불리한 부작용 또는 합병증이 또한 발생할 수 있으며, 따라서 설명서는 상기 비양립성에 관한 정보를 포함할 수 있다.
라벨 또는 삽입물은 구성요소, 키트 또는 패킹 물질(예를 들어, 박스)와 별개이거나 이에 부착되거나, 키트 구성요소를 함유하는 앰풀, 튜브 또는 바이알에 부착된 "인쇄물", 예를 들어, 종이 또는 판지를 포함한다. 라벨 또는 삽입물은 컴퓨터 판독 가능한 매체, 예를 들어, 바코드 인쇄 라벨, 디스크, 광학 디스크, 예를 들어, CD- 또는 DVD-ROM/RAM, DVD, MP3, 자기 테이프, 또는 전기 저장 매체, 예를 들어, RAM 및 ROM 또는 이들의 하이브리드, 예를 들어, 자기/광학 저장 매체, FLASH 매체 또는 메모리 유형 카드를 추가로 포함할 수 있다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기재된 것과 유사하거나 동등한 방법 및 물질이 본 발명의 실시 또는 시험에서 이용될 수 있으나, 적합한 방법 및 물질이 본원에 기재된다.
본원에 인용된 모든 특허, 특허 출원, 간행물, 및 다른 참고문헌, GenBank 인용 및 ATCC 인용은 이들의 전체내용이 참조로서 포함된다. 상충의 경우, 정의를 포함하는 본 명세서가 우선할 것이다.
본원에 개시된 특징 모두는 임의의 조합으로 조합될 수 있다. 명세서에 개시된 각각의 특징은 동일하거나, 동등하거나, 유사한 목적을 위한 대안적인 특징으로 대체될 수 있다. 따라서, 달리 명백히 언급되지 않는 한, 개시된 특징(예를 들어, GAA를 인코딩하는 변형된 핵산, GAA를 인코딩하는 변형된 핵산을 포함하는 발현 카세트, 및 GAA를 인코딩하는 변형된 핵산을 포함하는 rAAV 입자)은 동등하거나 유사한 특징의 종류의 예이다.
본원에서 사용되는 바와 같은 단수 형태는 문맥이 명백히 달리 지시하지 않는 한 복수의 지시대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "핵산"에 대한 언급은 복수의 상기 핵산을 포함하고, "벡터"에 대한 언급은 복수의 상기 벡터를 포함하고, "바이러스" 또는 "입자"에 대한 언급은 복수의 상기 바이러스/입자를 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같은 모든 수치 값 또는 수치 범위는 문맥이 명백히 달리 지시하지 않는 한 상기 범위 내의 정수 및 범위 내의 값 또는 정수의 분수를 포함한다. 따라서, 예시를 위해, 86% 이상의 동일성에 대한 언급은 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100% 등, 뿐만 아니라 86.1%, 86.2%, 86.3%, 86.4%, 86.5%, 등, 87.1%, 88.2%, 88.3%, 88.4%, 88.5% 등, 및 기타 등등을 포함한다.
초과(더 큰) 또는 미만을 갖는 정수에 대한 언급은 언급된 수보다 크거나 적은 임의의 수를 각각 포함한다. 따라서, 예를 들어, 127 미만의 언급은 숫자 0까지 줄곧 내려가는 126, 125, 124, 123, 122, 121, 120, 119, 118, 117, 116, 115, 114, 113, 112, 111, 110 등을 포함하며; 10 미만은 숫자 0까지 줄곧 내려가는 9, 8, 7 등을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같은, 문맥상 명백히 달리 지시되지 않는 한, 모든 수치 값 또는 범위는 상기 범위 내의 하위 범위와 값 및 정수의 분수, 및 상기 범위 내의 하위 범위 및 정수의 분수를 포함한다. 따라서, 예시를 위해, 1-10과 같은 수치 범위에 대한 언급은 1-2, 1-3, 1-4, 1-5, 1-6, 1-7, 1-8, 1-9, 2-3, 2-4, 2-5, 2-6, 2-7, 2-8, 2-9, 2-10, 3-4, 3-5, 3-6, 3-7, 3-8, 3-9, 3-10, 등; 및 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10뿐만 아니라 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5 등, 및 기타 등등을 포함한다. 따라서, 1-50의 범위에 대한 언급은 50을 포함하여 50까지의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 등, 뿐만 아니라 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5 등, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5 등, 및 기타 등등을 포함한다.
일련의 범위에 대한 언급은 시리즈 내의 상이한 범위의 경계 값을 조합하는 범위를 포함한다. 따라서, 예시를 위해, 일련의 범위, 예를 들어, 1-10, 10-20, 20-30, 30-40, 40-50, 50-60, 60-75, 75-100, 100-150, 150-200, 200-250, 250-300, 300-400, 400-500, 500-750, 750-850의 범위에 대한 언급은 1-20, 1-30, 1-40, 1-50, 1-60, 10-30, 10-40, 10-50, 10-60, 10-70, 10-80, 20-40, 20-50, 20-60, 20-70, 20-80, 20-90, 50-75, 50-100, 50-150, 50-200, 50-250, 100-200, 100-250, 100-300, 100-350, 100-400, 100-500, 150-250, 150-300, 150-350, 150-400, 150-450, 150-500 등의 범위를 포함한다.
본 발명은 일반적으로 다수의 구현예 및 양태를 기재하기 위해 단언적 언어를 이용하여 본원에 개시된다. 본 발명은 또한 물질 또는 재료, 방법 단계 및 조건, 프로토콜, 또는 절차와 같은 특정 주제가 전체적으로 또는 부분적으로 배제된 구현예를 특별히 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 특정 구현예 또는 양태에서, 재료 및/또는 방법 단계가 배제된다. 따라서, 비록 본 발명이 일반적으로 본 발명이 포함하지 않은 것과 관련하여 본원에서 표현되지 않더라도, 본 발명에서 명백히 배제되지 않는 양태가 본원에 개시된다.
본 발명의 다수의 구현예가 기재되었다. 그럼에도 불구하고, 본 발명의 사상 및 범위를 벗어남이 없이 당업자는 본 발명을 다양한 용도 및 조건에 적합화시키기 위해 본 발명의 다양한 변화 및 변형을 가할 수 있다. 따라서, 하기 실시예는 예시하기 위한 것으로, 어떠한 방식으로든 청구된 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 것은 아니다.
실시예 1
표 1 - GAA 발현 카세트 개요
발현 카세트
(SEQ ID NO: 16-24) 		SEQ ID NO 코돈 최적화된 변이체 BGH
PolyA
신호 		(SEQ ID NO: 30-32) 벡터로 패키징됨
pAAV-ApoE/hAAT.fixUTR.GAA13.BGH 16 GAA13 CpG-감소 SPK-AAV-01
pAAV-ApoE/hAAT.GAA13.BGH 17 GAA13 CpG-감소 SPK-AAV-02
pAAV-ApoE/hAAT.GAA7.BGH 18 GAA7 CpG-감소 SPK-AAV-03
pAAV-ApoE/hAAT.GAA8.BGH 19 GAA8 CpG-감소 SPK-AAV-04
pAAV-ApoE/hAAT.GAA2.wtBGH 20 GAA2 wtBGH SPK-AAV-05
pAAV-ApoE/hAAT.GAA5.wtBGH 21 GAA5 wtBGH SPK-AAV-06
pAAV-ApoE/hAAT.GAA7.wtBGH 22 GAA7 wtBGH SPK-AAV-07
pAAV-ApoE/hAAT.GAA8.wtBGH 23 GAA8 wtBGH SPK-AAV-08
pAAV-ApoE/hAAT.GAA13.wtBGH 24 GAA13 wtBGH SPK-AAV-09
pAAV-ApoE/hAAT.GAA13.BGH 17 GAA13 CpG-감소 SPK-AAV-10*
* SPK-AAV-10은 AAV6 캡시드에 패키징되고, 나머지 전부는 국제 특허 출원 공개 WO 2016/210170에 설명된 AAV-4-1 캡시드 변이체에 패키징된다.
GAA 발현 카세트는 도 1 내지 9에 나와 있다. 모두는 5' 및 3' 측접 AAV 역 말단 반복(ITR), 인간 헤모글로빈 서브유닛 베타(HBB2) 인트론을 포함하는 최적화된 GAA 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 간-특이적 ApoE/hAAT 인핸서/프로모터 서열, 이어서 야생형 또는 CpG 감소된 소 성장 호르몬(bGH) 폴리아데닐화(poly A) 서열을 포함한다.
SEQ ID NO: 1: GAA2에 대한 핵산 서열
Figure pct00001
SEQ ID NO: 2: GAA5에 대한 핵산 서열
Figure pct00002
Figure pct00003
SEQ ID NO: 3: GAA7에 대한 핵산 서열
Figure pct00004
Figure pct00005
SEQ ID NO: 4: GAA8에 대한 핵산 서열
Figure pct00006
SEQ ID NO: 5: GAA13에 대한 핵산 서열
Figure pct00007
Figure pct00008
SEQ ID NO: 6: GAA2 + WT BGH poly A에 대한 핵산 서열
Figure pct00009
Figure pct00010
SEQ ID NO: 7: GAA5 + WT BGH poly A에 대한 핵산 서열
Figure pct00011
Figure pct00012
SEQ ID NO: 8: GAA7 + WT BGH poly A에 대한 핵산 서열
Figure pct00013
SEQ ID NO: 9: GAA8 + WT BGH poly A에 대한 핵산 서열
Figure pct00014
Figure pct00015
SEQ ID NO: 10: GAA13 + WT BGH poly A에 대한 핵산 서열
Figure pct00016
Figure pct00017
SEQ ID NO: 11: GAA2 + CpG-감소된 BGH poly A에 대한 핵산 서열
Figure pct00018
Figure pct00019
SEQ ID NO: 12: GAA5 + CpG-감소된 BGH poly A에 대한 핵산 서열
Figure pct00020
SEQ ID NO: 13: GAA7 + CpG-감소된 BGH poly A에 대한 핵산 서열
Figure pct00021
SEQ ID NO: 14: GAA8 + CpG-감소된 BGH poly A에 대한 핵산 서열
Figure pct00022
Figure pct00023
SEQ ID NO: 15: GAA13 + CpG-감소된 BGH poly A에 대한 핵산 서열
Figure pct00024
Figure pct00025
Figure pct00026
Figure pct00027
Figure pct00028
Figure pct00029
Figure pct00030
Figure pct00031
Figure pct00032
Figure pct00033
Figure pct00034
Figure pct00035
Figure pct00036
SEQ ID NO: 25: 분비가능한 GAA 단백질에 대한 아미노산 서열
Figure pct00037
SEQ ID NO: 26: CpG 감소된 BGH poly A 핵산 서열
Figure pct00038
SEQ ID NO: 27: wtBGH poly A 핵산 서열
Figure pct00039
SEQ ID NO: 28: ApaI 제한 부위(밑줄)에 접한 ApoE/hAAT 서열.
Figure pct00040
SEQ ID NO: 29: ApoE/hAAT 서열.
Figure pct00041
AAV 벡터 캡시드:
Figure pct00042
Figure pct00043
실시예 2
연구 설계 - 시험관내 효능(Huh7 세포)
GAA 발현 카세트의 효능을 평가하기 위해, 각각의 카세트에 상응하는 200 ng의 플라스미드 DNA로 Lipofectamine® 2000 (ThermoFisher)를 사용하여 인간 간세포 암종 세포주(Huh7)를 형질감염시켰다. 48시간의 인큐베이션 후, 각 발현 카세트를 보유하는 플라스미드로 형질감염된 세포로부터의 배양 배지의 샘플을 GAA 활성 검정에 의해 GAA 수준에 대해 평가하고, 세포내 단백질 함량에 대해 정규화하였다.
결과
도 10은 GAA 활성 검정에 의한 Huh7 세포에서 시험관내의 다양한 GAA 발현 플라스미드의 평가를 보여준다. 결과는 생물학적 반복실험(n = 3)의 평균이다. 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다.
GAA5.wtBGH를 제외하고, 모든 플라스미드는 녹색 형광 단백질(GFP) 대조군 플라스미드 대비 분비된 GAA의 발현 수준이 증가한 것으로 입증되었으며, 이는 이러한 플라스미드가 GAA 단백질 생성물의 발현을 발생시켰음을 나타낸다(도 10). 일반적으로, "BGH" 플라스미드(CpG-감소된 poly A 서열을 보유)는 "wtBGH" 플라스미드(야생형 bGH poly A를 지님)를 능가하였다. 또한, 코돈 최적화된 서열 GAA2, GAA7, GAA8 및 GAA13은 비교적 유사한 것으로 보였으며, GAA13 플라스미드로 더 높은 발현 경향을 보였다. 어미 spΔGAApar 플라스미드와 비교할 경우 발현 수준의 전반적인 감소가 관찰되었다.
실시예 3
연구 설계 - 마우스에서 유체역학적 주입에 의한 카세트 효능
포유동물에서 다양한 GAA 발현 카세트의 효능을 평가하기 위해, 각 카세트에 상응하는 25 마이크로그램의 플라스미드 DNA를 수컷 C57BL/6마우스(약 8주령)에 유체역학적 주입에 의해 외측 꼬리 정맥에 정맥내로 도입하였다. 주입 후 72시간째에 혈장을 수집하고, GAA 활성 검정 및 웨스턴 블롯에 의해 순환 GAA 효소 존재에 대해 평가하였다.
결과
도 11 및 12는 혈장에서 각각 GAA 활성 검정 및 웨스턴 블롯에 의해 수컷 C57BL/6 마우스에서 유체역학적 주입에 의한 다양한 GAA 발현 카세트의 평가를 보여준다. 도 11에 있어서, GAA의 혈장 수준은 어미 작제물(spΔGAApar)로 정규화하였다. 결과는 생물학적 반복실험(n =4-5)의 평균이다. 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다. NS, 유의하지 않음. * p<0.05, ** p<0.01.
도 12에 있어서, 혈장의 GAA 웨스턴 블롯 분석, 막대 그래프는 하단의 비-특이적 밴드에 대해 정규화된 상단 밴드의 정량화를 나타낸다. 각각의 생물학적 반복실험(군 당 n=4-5)을 보여준다.
유체역학적 주입에 의한 마우스에서 코돈-최적화된 GAA 발현 카세트의 평가는, 이러한 카세트가 어미 GAA 작제물인 spΔGAApar에서 관찰된 것과 유사한 수준으로 마우스 간에서 GAA 전이유전자 생성물을 발현 및 분비할 수 있음을 보여주었다(도 11). Huh7 세포에서 시험관내 연구에서와 같이(실시예 2), CpG-감소된 BGH poly A 서열을 보유하는 GAA 발현 카세트는 야생형 BGH poly A를 갖는 것을 능가하였다. 예기치 않게, 실시예 2의 결과와 비교할 경우, 코돈-최적화된 GAA 작제물 중 일부는 어미 spΔGAApar 플라스미드와 같거나 더 나은 성능을 보였다.
실시예 4
연구 설계 - 마우스에서 벡터 효능
어미 카세트 spΔGAApar와 비교하여 본 발명의 코돈-최적화된 GAA 카세트의 효능을 평가하기 위해, spΔGAApar 및 9개의 코돈-최적화된 카세트를 SEQ ID NO: 30-32 캡시드를 포함하는 AAV 벡터에 패키징하였다(표 1). 군 당 5마리의 수컷 C57BL/6 마우스에 2가지 벡터 용량(5x1011 vg/kg 또는 2x1012 vg/kg) 중 하나를 꼬리 정맥을 통해 정맥내 주입하였다. 순환하는 GAA 활성은 마우스에 AAV 벡터 투여 후 장기간 측정하였다. 혈장은 GAA 활성에 대해 격주로 시험하였다. 70일째에 10개의 시험 동물 군 중 7개를 희생시키고, 나머지 3개 군(SPK-AAV-01, SPK-AAV-02 및 어미 벡터)은 147일째에 희생시켰다.
결과
도 13은 벡터 주입 후 70일째에 혈장내 GAA 활성 검정에 의해 수컷 C57BL/6 마우스에서 AAV(SEQ ID NO: 30-32) 벡터 내로 패키징된 다양한 코돈-최적화된 GAA 발현 카세트의 평가를 보여준다. 결과는 생물학적 반복실험(n =4-5)의 평균이다. 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다. NS, 유의하지 않음. * p<0.05, ** p<0.01.
두 가지 벡터, SPK-AAV-01 및 SPK-AAV-02는 어미 벡터(본원에서 SPK-AAV-11로 지정됨)와 비교할 경우 혈장에서 유의하게 더 높은 GAA 활성을 지속적으로 나타내었다(고용량에서 약 2 내지 3배 더 높음).
도 14는 벡터 주입 후 7일째에 혈장에서 GAA 웨스턴 블롯에 의해 수컷 C57BL/6 마우스에서 AAV(SEQ ID NO: 30-32) 벡터 내로 패키징된 다양한 코돈-최적화된 GAA 발현 카세트의 평가를 보여준다. 결과는 생물학적 반복실험(n =4-5)의 평균이다. 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다. NS, 유의하지 않음. * p<0.05, ** p<0.01.
도 15는 AAV(SEQ ID NO: 30-32) 벡터로 패키징된 코돈-최적화된 GAA 발현 카세트를 마우스에 투여한 후 혈장에서 측정된 GAA 활성 수준을 보여준다. 수컷 C57BL/6 마우스에 2개의 최고 성능의 GAA-발현 AAV(SEQ ID NO: 30-32) 벡터 중 하나를 5x1011(상부 패널) 또는 2x1012 vg/kg(하부 패널) 용량으로 주입하였다(n = 5 동물/군). SPK-AAV-11 벡터(어미 spΔGAApar 작제물)가 투여된 마우스의 혈장에서 측정된 GAA 활성을 비교를 위해 제시하였다. 42일째부터 시작하여, 혈장내 GAA 활성은 SPK-AAV-11 벡터보다 SPK-AAV-01 및 SPK-AAV-02 벡터에 있어서 유의하게 높았다(***p = <0.001, ****p = < 0.0001 Tukey 다중 비교 테스트).
실시예 5
연구 설계 - 래트에서의 효능
이 연구의 목적은 두 가지 다른 래트 계통에서 SPK-AAV-02의 효능을 평가하기 위한 것이다. 순환 GAA 활성은 Wistar Hanover(n = 4) 및 Sprague Dawley(n = 5) 래트에 벡터 투여 후 혈장에서 측정하였다. 수컷 래트에 2x1013 vg/kg의 벡터를 꼬리 정맥을 통해 정맥내 주입하였다.
결과
도 16은 혈장내 GAA 활성 검정에 의해 C57BL/6 마우스와 비교한 수컷 Wistar Hanover 및 Sprague Dawley 래트에서 SPK-AAV-02 (AAV(SEQ ID NO: 30-32)내로 패키징된 pAAV-ApoE/hAAT.GAA13.BGH) 벡터의 평가를 보여준다. 결과는 생물학적 반복실험(n =4-5)의 평균이다. 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다.
GAA 활성 수준은 28째일에 안정되기 시작했으며 GAA 활성은 약 15,000 nmol/hr/mL로 측정되었다. 마우스에는 래트보다 10배 낮은 용량(2x1012 vg/kg의 벡터)으로 SPK-AAV-02를 주입하였다.
실시예 6
연구 설계 - 비인간 영장류(NHP)에서의 효능, 1부
분비가능한 GAA 발현의 장기간 효과를 평가하기 위해, 단일 용량의 SPK-AAV-01, SPK-AAV-02 또는 SPK-AAV-10 벡터를 인간에 계통발생학적으로 가까운 종인 레서스 원숭이(벵골 원숭이)에 투여하고, 동물을 혈장내 GAA 활성 수준에 대해 평가하였다.
수컷 레서스 원숭이(n = 3/용량 코호트)에는 6x1012 vg/kg의 단일 용량의 SPK-AAV-01, SPK-AAV-02 또는 SPK-AAV-10 벡터를 복재 정맥에 30분 IV 주입에 의해 투여하였다. AAV 벡터 투여 후, 동물을 임상 관찰을 위해 매일 모니터링하고, 매주 혈액을 수집하였다.
결과
레서스 원숭이에 6x1012 vg/kg 용량의 GAA-발현 AAV(SEQ ID NO: 30-32) 벡터를 주입하였다(n = 3마리 동물/군). 도 17은 AAV(SEQ ID NO: 30-32) 벡터로 패키징된 GAA 발현 카세트를 수컷 레서스 원숭이에 투여한 후 혈장에서 측정된 GAA 활성 수준을 보여준다. SPK-AAV-01, SPK-AAV-02 및 SPK-AAV-10 벡터 주입된 NHP의 혈장 GAA 활성 수준 간에는 유의한 차이가 관찰되지 않았다.
NHP 연구의 예비 데이터는 마우스 연구에서 관찰된 결과를 확인시켜 주며, SPK-AAV-01 및 SPK-AAV-02의 투여로 인한 혈장 GAA 활성 수준은 유사함을 보여준다(도 17).
실시예 7
연구 설계 - 비인간 영장류의 효능, 2부
이 연구의 주요 목적은 아프리카 녹색 원숭이(AGM; 사바나 원숭이)에서 SPK-AAV-01 및 SPK-AAV-02의 형질도입 프로파일을 평가하기 위한 것이었다. 수컷 AGM(n = 4/용량 코호트)에는 6x1012 vg/kg의 단일 용량의 SPK-AAV-01 또는 SPK-AAV-02 벡터를 복재 정맥에 30분 IV 주입에 의해 투여하였다. AAV 벡터 투여 후, 동물을 임상 관찰을 위해 매일 모니터링하고, 매주 혈액을 수집하였다.
결과
아프리카 녹색 원숭이의 예비 데이터는 SPK-AAV-01 및 SPK-AAV-02의 투여로 인한 혈장 GAA 활성 수준이 유사하다는 마우스 연구에서 관찰된 결과를 확인시켜준다(도 18).
실시예 8
결론
분비가능한 인간 GAA를 발현하는 코돈-최적화된 GAA 카세트는 어미 spΔGAApar 작제물에 비해 상당한 개선을 나타낸다. 특히, SPK-AAV-01 및 SPK-AAV-02는 세포 배양, 설치류 및 두 가지 비인간 영장류 모델에서 분비가능한 인간 GAA의 우수한 효능과 발현을 나타낸다.
실시예 9
연구 설계 - NHP에서 용량 범위
분비가능한 GAA 발현의 용량 반응을 평가하기 위해, 3가지 용량의 SPK-AAV-02 벡터를 인간에 계통발생학적으로 가까운 영장류 종인 레서스 원숭이(벵골 원숭이)에 투여하고, 동물을 1개월의 과정에 걸쳐 GAA 활성 수준에 대해 평가하였다.
수컷 레서스 원숭이(n = 4/용량 코호트)에는 2x1012, 6x1012, 2x1013 vg/kg 용량 중 하나의 SPK-AAV-02 벡터를 복재 정맥에 30분 정맥내(IV) 주입으로 투여하였다. 암컷 레서스 원숭이(n = 4/용량 코호트)에는 2x1013 vg/kg 용량의 SPK-AAV-02 벡터를 복재 정맥에 30분 IV 주입으로 투여하였다. AAV 벡터 투여 후, 동물은 임상 관찰을 위해 매일 모니터링하였다. 혈액은 혈당의 잠재적 변화를 모니터링하기 위한 글루코스 수준을 포함하여 GAA 활성, GAA 항원 수준, 항-GAA IgG 형성, 혈액학 및 임상 화학을 위해 4주 동안 매주 수집하였다.
결과
도 21은 수컷 및 암컷 레서스 원숭이에게 SPK-AAV-02 벡터를 투여한 후 혈장에서 측정된 GAA 활성 수준을 보여준다. 벡터 주입 후 7, 14, 21 및 28일째에 혈장에서 측정된 GAA 활성의 결과는 벡터 용량과 혈장 GAA 활성 수준 사이의 상관관계를 보여준다. 2x1013 vg/kg의 용량으로 주입된 암컷 NHP의 혈장내 GAA 활성 수준은 동일한 용량이 주입된 수컷 NHP에서 측정된 것보다 약 0.5배 낮았다(49.6%).
이러한 NHP 연구 데이터는 마우스 연구에서 관찰된 결과, 즉 분비가능한 GAA 발현을 위한 AAV 벡터로부터 유도된 혈장 GAA 활성 수준이 벡터 투여 후 혈장내 용량 의존적 GAA 활성을 발생시킴을 확인시켜준다(도 21). NHP에서 SPK-AAV-02의 3가지 상승 용량으로의 단일 주입은 NHP 혈장내 용량 의존적 GAA 발현이 입증되었다.
실시예 10
9개월 NHP 연구
각 SPK-AAV-01, SPK-AAV-02 및 SPK-AAV-10을 수컷 레서스 원숭이(벵골 원숭이)에 정맥내 주입을 통해 단일 용량(6x1012 vg/kg)으로 투여하였다. 연구 과정 동안, 분비가능한 GAA 발현 벡터를 투여한 동물의 일부에서 혈장내 활성 GAA 단백질의 감소 및 항-GAA IgG 항체 수준의 수반되는 상승이 관찰되었다. 혈장내 GAA 활성 및 항원 수준의 손실은 인간 전이유전자 단백질 생성물의 IgG-매개된 체액성 면역 제거의 발달로 인한 것 같다. 체액성 면역 반응을 감소시키고 가능하게는 검출가능한 순환 GAA 효소 수준을 회복하기 위해, 183일째부터 시작하여 특정 동물에 매일의 사이클로스포린 A와 조합하여 매달 리툭시맙의 면역억제 요법을 제공하였다.
결과
혈장내 분비된 활성 GAA 수준을 모든 동물에서 검출하였으며, SPK-AAV-01, SPK-AAV-02 및 SPK-AAV-10에 있어서 15일째에 각각 482.07±47.90, 664.43±417.55 및 427.833±307.94 nmol/mL/hr의 정점 평균 활성 수준을 나타내었다. 순환 GAA 항원의 검출가능한 수준이 각각 SPK-AAV-01, SPK-AAV-02 및 SPK-AAV-10을 투여한 동물에 있어서 14.84±2.21, 19.11±23.23, 14.64±16.96 ng/mL의 평균 정점 수준으로 관찰되었다. 순환 GAA의 감소 관찰과 함께, 15일째에 시작하여 순환 항-GAA IgG 수준 증가가 관찰되었다. 간 조직의 qPCR에 의한 벡터 게놈 분석은 간에서 벡터의 존재를 확인시켜 주며, 각각 SPK-AAV-01, SPK-AAV-02 및 SPK-AAV-10을 투여한 동물에 있어서 반수체 게놈 당 6.39±2.72, 11.43±4.23 및 19.01±13.93의 평균 벡터 게놈 복사체를 나타내었다.
간 샘플은 전장 GAA 및 절단된 GAA(리소좀 형태) 단백질 수준 둘 모두에 대해 분석하였다. 연구 샘플은 음성 대조군으로 제공되는 벡터-나이브 레서스 간 샘플과 비교하였으며, 이는 로딩된 단백질 수준에서 검출가능한 수준의 절단된 또는 온전한 GAA를 나타내지 않았다(n = 3). 동물 연구 간에서 전장 단백질의 양은 SPK-AAV-01, SPK-AAV-02 및 SPK-AAV-10을 각각 투여한 동물에서 4.0±7.0, 5.4±9.1, 11.0±11.3 ng의 GAA/총 단백질 mg이었다. 각 코호트는 전장 GAA보다 더 높은 수준의 절단된 GAA를 포함하며, 각각 SPK-AAV-01, SPK-AAV-02 및 SPK-AAV-10을 투여한 동물에서 41.6±57.6, 44.4±74.5, 49.0±40.3ng의 GAA/총 단백질 mg 수준을 나타내었다. GAA 처리와 무관하게, 군 사이의 차이는 유의하지 않았다(전장(온전한) 형태의 경우 P = 0.72; Kruskal-Wallis의 리소좀(절단된) 형태의 경우 P = 0.83). 결론적으로, 본 발명의 AAV 벡터가 투여된 모든 군은 간에서 기준선보다 높은 평균 검출가능한 수준의 GAA를 나타내었다.
결론
각각의 SPK-AAV-01, SPK-AAV-02 및 SPK-AAV-10의 투여는 GAA 항원의 혈장 수준을 검출가능하게 하고 증가시켰으며, 2-3주에 걸쳐 정점에 이르렀고 GAA 활성과 선형적 상관관계를 가지며, 벡터 게놈과 무관하게 유사한 동역학을 나타내었다. 혈장내 GAA 활성 및 GAA 항원 수준 둘 모두는 한 마리를 제외한 모든 동물에서 다음 시점에 걸쳐 연속적으로 감소하였다. AAV 벡터로 처리된 NHP에서 이전에 관찰된 바와 같이, 인간 전이유전자 생성물에 대한 체액 반응이 43일째에 시작되는 것으로 관찰되었으며, 이는 GAA-특이적 IgG 반응을 발달시킨 모든 동물의 혈장내 GAA 항원 수준과 역상관관계가 있다. B-세포 매개된 IgG 반응을 표적으로 하는 면역억제제(리툭시맙)의 투여를 통한 항-GAA IgG 수준의 억제는 동물의 서브셋에서 혈장내 검출가능한 GAA 수준의 회복을 발생시켰다. 모든 군에 있어서, 벡터 게놈 복사체는 GAA의 측정가능한 순환 혈장 수준의 부재하에서도 연구 말기에 간에서 검출가능하였다. 이에 상응하게, GAA 단백질은 연구 말기에 벡터로 처리된 모든 간 조직에서 검출되었으며, 반면 GAA 항원은 처리되지 않은 간 조직에서 검출 한계 미만이었다. 종합하면, 이들 결과는 본 발명의 AAV 벡터가 인간 전이유전자 생성물에 대한 항체 반응의 발단과 무관하게 9개월에 걸쳐 간에서 분비가능한 인간 GAA의 지속가능한 발현을 매개할 수 있음을 나타낸다.
실시예 11
9주 설치류 면역억제 연구
GAA 전이유전자 생성물의 발현 수준은 수컷 및 암컷 C57BL/6 마우스에서 라파마이신 및/또는 프레드니솔론의 존재 및 부재하에 2x1012 vg/kg 단일 용량의 SPK-AAV-02 입자의 정맥내 투여 후 9주 동안 측정하였다. 마우스는 표 2에 제시된 바와 같이 5개 군으로 시험하였다.
표 2 - 군 지정 및 용량 수준
군 동물 수 SPK-AAV-02 (vg/kg) 라파마이신
(2-3 mg/kg)*		 프레드니솔론
(1-0.25 mg/kg)**
수컷 암컷
1 5 5 비히클
2 10 10 2x1012
3 10 10 X
4 10 10 X
5 10 10 X X
vg = 벡터 게놈, X = 투여된 치료제
* 라파마이신은 (-)7일부터 5일까지 매일 2mg/kg으로 전달하였다. 6일째에 출발하여, 전달은 격일로 3mg/kg으로 변경하였다.
**프레드니솔론은 (-)1일부터 15일까지 1mg/kg, 16일부터 22일까지 0.5mg/kg, 및 23일부터 28일까지 0.25mg/kg의 농도로 전달하였다.
면역억제제(들) 투여 군에서, 제제(들)는 AAV 입자 투여 전에 연구의 처음 5주 동안 투여하였다. AAV 투여 완료 후, 동물을 9주 동안 임상 관찰 및 체중에 대해 모니터링하였다. 연구 말기에, 혈액 샘플에 대해 임상 화학 및 혈액학을 수행하고, 선별된 조직에 대해 조직병리학을 수행하였다. rAAV 캡시드 및 혈장 GAA 활성에 대한 IgG 항체를 연구 내내 매주 평가하였다.
결과
혈장내 GAA 활성 수준이 벡터 투여된 모든 동물에서 배경을 초과하는 것으로 검출되었다. 군 1의 비히클-투여된 수컷은 약 300-400 nmol/mL/hr의 배경 수준을 나타내었다. 순환 GAA 활성 수준은 면역억제제 처리군에 따라 약간 상이한 동역학으로 벡터 투여 후 증가하였으나, GAA 활성의 동등한 정점 평균 수준을 나타내었다. 특히, GAA 활성의 정점 평균 수준은 군 2(SPK-AAV-02 단독), 군 3(SPK-AAV-02, 2-3 mg/kg 라파마이신), 군 4(SPK-AAV-02, 1-0.25 mg/kg 프레드니솔론) 및 군 5(SPK-AAV-02, 2-3 mg/kg 라파마이신, 1-0.25 mg/kg 프레드니솔론)에서 수컷의 경우 각각 16114±5411, 14875±6882, 14890±6882 및 21480±6340 nmol/mL/hr였다. GAA 활성의 정점 수준은 임의의 AAV 처리군 간에 통계적으로 유의한 차이가 관찰되지 않았다.
암컷 마우스에서 GAA 활성의 정점 평균 수준은 군 2, 군 3, 군 4 및 군 5에 있어서 각각 7380±4034, 5912±3259, 6096±3249 및 9955±3104 nmol/mL/hr이었다. 이러한 GAA 활성 수준은 비히클-투여된 암컷 동물에서 검출된 배경보다 현저히 높았다. 수컷 마우스에서 볼 수 있듯이, 암컷 마우스에서 GAA 활성의 정점 수준은 임의의 AAV 처리군 간에 통계적으로 유의한 차이가 없었다. 수컷과 암컷 사이의 GAA 활성의 혈장 수준에서의 관찰된 차이는 암컷 마우스에서 간세포의 감소된 AAV 형질도입의 잘 입증된 현상과 일치한다(Davidoff et al., 2003, Blood, 102:480-488; DOI: 10.1182/blood-2002-09-2889).
혈장내 항-rAAV 캡시드 IgG는 SPK-AAV-02 투여된 모든 동물에서 검출되었으며, 군 2, 군 3, 군 4 및 군 5의 수컷에서 각각 86527±92140, 6695±3555, 64368±29635 및 11374±6053 ng/mL의 정점 평균 수준, 및 군 2, 3, 4 및 5의 암컷에서 각각 182009±148148, 66141±77925, 182654±90161 및 57752±59192 ng/ml의 정점 평균 수준을 나타내었다. 수컷 및 암컷 둘 모두에 있어서 군 1(비히클)은 모든 시점에 있어서 검정의 정량적 한계 미만인 항-rAAV 캡시드 IgG 수준을 가졌다.
결론
SPK-AAV-02의 투여는 모든 동물에서 검출가능한 GAA 활성 수준을 발생시켰다. 라파마이신과 프레드니솔론으로의 조합 치료는 수컷 마우스의 경우 22일, 36일 및 42일째에 및 암컷 동물의 경우 43일째에 GAA 활성 수준을 (vs. rAAV 벡터 단독) 통계적으로 증가시켰다. 참고로, 최대 발현에 도달한 시기와 무관하게 GAA 활성의 정점 수준의 차이는 성별 내 AAV 처리군 간에 통계적으로 유의하지 않았다.
rAAV 캡시드에 대해 상승된 체액성 IgG 반응은 SPK-AAV-02를 투여한 모든 군에서 관찰되었다. 두 성별 모두에서 라파마이신의 존재(군 3 및 5)는 벡터 단독과 비교할 경우 항-캡시드 IgG의 형성을 현저하게 감소시켰다. 프레드니솔론으로의 처리는 항-캡시드 IgG 형성에 더 완만한 효과를 보였으며, 군 4에서 수컷은 15일, 43일 및 60일째에 및 암컷은 43일 및 60일째에 현저하게 감소하였다.
마우스에서 라파마이신 및/또는 프레드니솔론에 의한 면역억제는 rAAV 캡시드에 대한 체액성 반응을 감소시켰으며, 혈장내 GAA 활성의 정점 수준에 유의한 영향을 미치지 않았다.
실시예 12
NHP에서 라파마이신과 공동-투여된 4-주 단일 용량
이 연구는 라파마이신의 존재하에 3마리 아프리카 녹색 원숭이(클로로세부스 사베우스(Chlorocebus sabaeus)) 수컷에서 5.5x1013 vg/kg의 단일 용량의 SPK-AAV-02 투여 후 4주의 기간에 걸쳐 순환 GAA 활성(혈장내 GAA 활성 수준)을 평가하였다.
동물에게 AAV 투여 5일 전에 시작하여 4주 연구 내내 계속해서 라파마이신(매일 2mg/kg)을 투여하였다. 단일 용량의 5.5x1013 vg/kg의 SPK-AAV-02를 복재 정맥을 통해 정맥내 투여하였다. AAV 투여 완료 후, 동물을 4주 동안 임상 관찰 및 체중에 대해 모니터링하였다. 연구 말기에, 혈액 샘플에 대해 임상 화학 및 혈액학을 수행하고, 선별된 조직에 대해 조직 병리학을 수행하였다. 혈장 GAA 활성은 연구 내내 매주 측정하였다.
결과
혈장내 GAA 활성 수준은 SPK-AAV-02 투여 후 모든 동물에서 배경보다 높았으며, 세 동물 각각에 대한 정점 활성 수준은 측정된 최종 시점에서 1158.1, 711.9 및 623.8 nmol/mL/hr에 도달하였다(표 3).
표 3 - 라파마이신을 투여한 개별 NHP에 대한 혈장 GAA 활성.
혈장내 GAA 활성(nmol/ml/hr)
개별 NHP 번호
1 2 3 평균 ± SD
기준 2.1 4.9 3.7 3.6 ± 1.4
7일차 777.2 331.3 187.4 432.0 ± 307.5
14일차 924.0 349.9 368.0 547.3 ± 326.4
21일차 973.2 289.6 490.0 584.3 ± 351.4
28일차 1158.1 711.9 623.8 831.3 ± 286.5
결론
SPK-AAV-02의 투여는 모든 3 NHP에서 검출가능한 혈장 GAA 활성을 발생시켰다. SPK-AAV-02와 라파마이신의 조합은 잘 견뎌지며 측정된 모든 테스트에서 유리한 안전성 프로파일을 가졌다.
실시예 13
Gaa -/- 마우스 폼페병 모델에서의 치료 효능
SPK-AAV-02를 3가지 용량(1.25x1011, 5x1011 및 2x1012 vg/kg)으로 투여한 4개월령 Gaa-/- 마우스(폼페병의 확립된 마우스 모델)에 대한 10개월 추적 연구를 수행하였다. 이 연구는 (1) 순환 GAA 효소 활성의 용량-의존적 증가, (2) 근력의 현저한 개선, 및 (3) 유의한 항-GAA 체액성 면역 반응의 부재를 입증하였다.
실시예 14
방법
분비가능한 인간 GAA 전이유전자를 인코딩하는 플라스미드의 단백질 발현 효율을 측정하기 위한 세포-기반 검정
Huh7 세포를 DMEM + 10% FBS + 페니실린/스트렙토마이신/L-글루타민 중에 웰당 5x104 세포로 48-웰 디쉬에 플레이팅하였다. Plasmid Giga Kit(Qiagen)를 사용하여 제조된 플라스미드는 Lipofectamine® 2000을 사용하여 웰당 250 ng으로 세포내로 형질감염시켰다. 세포를 37℃ 및 5% CO2에서 48-72시간 동안 유지하고, 상청액을 수확하여 GAA 활성에 대해 검정될때까지 -80℃에서 저 잔류 미세역가 플레이트에 보관하였다. 상청액을 1:10으로 희석하고, 3 mM의 형광 기질 4-메틸움벨리페릴 α-D-글루코피라노시드와 함께 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 반응은 탄산염 완충액(pH 10.5)을 사용하여 1시간 후 중단시키고 정지 완충액에서 4-메틸움벨리페론(4-MU)을 희석하여 생성된 표준 곡선과 비교하여, 250 pmol/μL에서 시작하고 0 pmol/μL에서 끝나는 12-점 표준 곡선을 생성하였다. 플레이트는 λex 360 nm; λem 449 nm에서 판독하였다.
분비가능한 인간 GAA 전이유전자를 인코딩하는 플라스미드의 효능을 평가하기 위한 플라스미드 DNA의 유체역학적 주입
Plasmid Giga Kit(Qiagen)를 사용하여 제조된 플라스미드를 PBS180 + 0.001% Pluronic에서 희석하였다. 시험할 각 카세트에 상응하는 25 마이크로그램의 플라스미드 DNA를 대략 8주령의 수컷 C57BL/6 마우스에 유체역학적 주입에 의해 외측 꼬리 정맥에 정맥내로 도입하였다. 주입 후 72시간째에, 전혈을 턱밑 정맥 절개를 통해 소듐 시트레이트 튜브에 수집하였다. 첫 번째 혈액 한 방울을 버리고 200 μL의 혈액을 소듐 시트레이트에 수집하고 용혈과 응고를 피하기 위해 튜브를 뒤집었다. 샘플은 4℃에서 10분 동안 10,000 RMP으로 스핀다운시켰다. 혈장을 튜브 내로 분취하고 GAA 활성에 대해 분석할 때까지 -80℃ 냉동고에 보관하였다. 혈장 샘플을 다양한 정도로 희석하고, 3 mM의 형광 기질 4-메틸움벨리페릴 α-D-글루코피라노시드와 함께 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 반응은 탄산염 완충액(pH 10.5)을 사용하여 1시간 후 중단시키고 정지 완충액에서 4-MU를 희석하여 생성된 표준 곡선과 비교하여, 250 pmol/μL에서 시작하고 0 pmol/μL에서 끝나는 12-점 표준 곡선을 생성하였다. 플레이트는 λex 360 nm; λem 449 nm에서 판독하였다.
분비가능한 인간 GAA 전이유전자를 인코딩하는 AAV 벡터의 효능을 측정하기 위한 세포-기반 검정
Huh7 세포를 48-웰 디쉬에 웰당 5x104 세포로 밤새 플레이팅하였다. 스톡 벡터로부터의 SPK-AAV-01 및 SPK-AAV-02를 Opti-MEMTM 또는 DMEM + 10% FBS + 페니실린/스트렙토 마이신/L-글루타민에서 용량 곡선(감염의 다중도, MOI, 범위 2x106-1x104)으로 준비하였다. Huh7 세포에서 기존 배지를 제거하고 바이러스 입자 함유 배지로 교체하였다. 세포를 37℃ 및 5% CO2에서 72시간 동안 유지하고, 상청액을 수확하여 GAA 활성에 대해 검정될 때까지 -80℃의 저 잔류 미세역가 플레이트에 보관하였다. 상청액을 1:10으로 희석하고, 3mM의 형광 기질 4-메틸움벨리페릴 α-D-글루코피라노시드와 함께 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 반응은 탄산염 완충액(pH 10.5)을 사용하여 1시간 후 중단시키고 정지 완충액에서 4-MU를 희석하여 생성된 표준 곡선과 비교하여, 250 pmol/μL에서 시작하고 0 pmol/μL에서 끝나는 12-점 표준 곡선을 생성하였다. 플레이트는 λex 360 nm; λem 449 nm에서 판독하였다.
마우스/래트 혈장에서 GAA 활성 검정
전혈을 턱밑 정맥 절개를 통해 소듐 시트레이트 튜브에 수집하였다. 첫 번째 혈액 한 방울을 버리고 200 μL의 혈액을 소듐 시트레이트에 수집하고; 용혈과 응고를 피하기 위해 튜브를 뒤집었다. 샘플을 4℃에서 10분 동안 10,000rpm으로 스핀다운시켰다. 혈장을 튜브 내로 분취하고 GAA 활성에 대해 분석할 때까지 -80℃ 냉동고에 보관하였다. 혈장 샘플을 다양한 정도로 희석하고, 3 mM의 형광 기질 4-메틸움벨리페릴 α-D-글루코피라노시드와 함께 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 반응은 탄산염 완충액(pH 10.5)으로 1시간 후 중단시키고 정지 완충액에서 4-MU를 희석하여 생성된 표준 곡선과 비교하여 250 pmol/μL에서 시작하고 0 pmol/μL에서 끝나는 12-점 표준 곡선을 생성하였다. 플레이트는 λex 360 nm; λem 449 nm에서 판독하였다.
NHP(레서스/AGM) 혈장에서 GAA 활성 검정
수컷 레서스 원숭이/아프리카 녹색 원숭이에 복재 정맥을 통해 정맥으로 주입하고, 전혈을 소듐 시트레이트 튜브에 수집하고, 이를 용혈과 응고를 피하기 위해 뒤집었다. 샘플은 4℃에서 10분 동안 10,000 RMP로 스핀다운시켰다. 혈장을 튜브내로 분취하고 GAA 활성에 대해 분석할 때까지 -80℃ 냉동고에 보관하였다. 혈장 샘플을 다양한 정도로 희석하고, 3mM의 형광 기질 4-메틸움벨리페릴 α-D-글루코피라노시드와 함께 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 반응은 탄산염 완충액(pH 10.5)을 사용하여 1시간 후 중단시키고 정지 완충액에서 4-MU를 희석하여 생성된 표준 곡선과 비교하여, 250 pmol/μL에서 시작하고 0 pmol/μL에서 끝나는 12-점 표준 곡선 또는 11-점 표준 곡선 (5 μM/mL - 0.49 nM/mL)을 생성하였다. 플레이트는 λex 360 nm; λem 449 nm에서 판독하였다. 테스트된 샘플에 대한 GAA 활성은 4-MU 표준 곡선에서 보간하고, 속도(나노몰/밀리리터/시간(nmol/mL/hr))로 표시하였다.
웨스턴 블롯에 의한 Huh7 상청액 중 GAA의 단백질 수준 평가
Huh7 세포를 48-웰 디쉬에 웰당 5x104 세포로 밤새 플레이팅하였다. 스톡 벡터로부터의 SPK-AAV-01 및 SPK-AAV-02는 Opti-MEMTM 또는 DMEM + 10% FBS + 페니실린/스트렙토마이신/L-글루타민에서 용량 곡선(감염의 다중도, MOI, 범위 2x106-1x104)으로 준비하였다. Huh7 세포에서 기존 배지를 제거하고 바이러스 입자 함유 배지로 교체하였다. 세포를 37℃ 및 5% CO2에서 72시간 동안 유지하고, 상청액을 수확하여 GAA 단백질 수준에 대해 검정될 때까지 -80℃의 저 잔류 미세역가 플레이트에 보관하였다. 상청액을 95℃에서 5분 동안 인큐베이션한 RIPA 완충액으로 1:20으로 희석하고 MOPS 작동 완충액과 함께 4-12% Bis-Tris NuPage 겔에서 진행시켰다. 단백질을 iBlot® 시스템(ThermoFisher)을 사용하여 폴리비닐리덴 디플루오라이드(pvdf) 막으로 옮기고, Odyssey® TBS 완충액에서 실온에서 1시간 동안 차단하였다. 막은 1:1000으로 희석된 일차 항체인 토끼 항-인간 GAA(Abcam)와 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 막을 세척하고 1:10,000으로 희석된 형광 이차 항-토끼 항체와 2시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 막을 세척하고 Li-Core® 이미징 시스템을 사용하여 이미지화하였다. 밴드는 10 ng의 Myozyme® 및 마커와 비교하였다. 밀도계 분석은 Li-Core® 소프트웨어를 사용하여 수행하였으며 밴드는 Myozyme® 대조군으로 정규화시켰다.
웨스턴 블롯에 의한 마우스 혈장내 GAA의 단백질 수준 평가
수컷 및 암컷 C57BL/6 마우스에 꼬리 정맥을 통해 정맥으로 주입하고, 전혈은 턱밑 정맥 절개를 통해 소듐 시트레이트 튜브에 수집하였다. 첫 번째 혈액 한 방울을 버리고 200 μL의 혈액을 소듐 시트레이트에 수집하고; 용혈과 응고를 피하기 위해 튜브를 뒤집었다. 샘플은 4℃에서 10분 동안 10,000 RMP로 스핀다운시켰다. 혈장을 튜브 내로 분취하고 GAA 단백질 수준에 대해 분석할 때까지 -80℃ 냉동고에 보관하였다. 혈장을 95℃에서 5분 동안 인큐베이션한 RIPA 완충액으로 1:20으로 희석하고 MOPS 작동 완충액과 함께 4-12% Bis-Tris NuPage 겔에서 진행시켰다. 단백질을 iBlot® 시스템(ThermoFisher)을 사용하여 pvdf 막으로 옮기고, Odyssey® TBS 완충액에서 실온에서 1시간 동안 차단하였다. 막은 1:1000으로 희석된 일차 항체인 토끼 항-인간 GAA(Abcam)와 함께 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 막을 세척하고 1:10,000으로 희석된 형광 이차 항-토끼 항체와 2시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 막을 세척하고 Li-Core® 이미징 시스템을 사용하여 이미지화하였다. 밴드는 10 ng의 Myozyme® 및 마커와 비교하였다. 밀도계 분석은 Li-Core® 소프트웨어를 사용하여 수행하였으며 밴드는 Myozyme® 대조군으로 정규화시켰다.
WES에 의한 NHP 혈장내 GAA의 단백질 수준 평가
수컷 레서스 원숭이/아프리카 녹색 원숭이에 복재 정맥을 통해 정맥으로 주입하고, 전혈을 소듐 시트레이트 튜브에 수집하고, 이를 용혈과 응고를 피하기 위해 뒤집었다. 샘플을 4℃에서 10분 동안 10,000 rpm으로 스핀다운시켰다. 혈장을 튜브내로 분취하고 GAA 단백질 수준에 대해 분석할 때까지 -80℃ 냉동고에 보관하였다. 혈장 샘플은 샘플 희석액으로 1:6000 희석하였다. 50 ng/mL의 농도에서 시작하는 Myozyme®을 사용하여 각 칩에 8-점의 2배 표준 곡선을 추가하였다. 샘플을 완충액으로 희석하고, 95℃에서 5분 동안 변성시키고, WESTM 칩(Protein Simple)에 로딩하였다. 일차 항체는 1:1000 희석으로 추가하였고, 이차 항체는 작업 희석으로 로딩하였다. 칩은 WESTM Protein Simple 소프트웨어에 따라 실행하였으며, 결과 밴드를 분석하고 Myozyme® 표준 곡선과 비교하고 비특이적인 제2 밴드로 정규화하였다.
항-AAV 캡시드 IgG 항체
항-AAV 캡시드 총 IgG 형성은 ELISA 포획 검정으로 측정하였다. ELISA 플레이트 웰을 1 μg/mL의 rAAV 입자를 포함하는 용액 50 μL로 코팅하였다. 총 인간 IgG(Southern Biotech, 0150-01)를 희석하여 10,000 ng/mL 내지 0.5 ng/mL 범위의 10-점 표준 곡선을 생성하고 플레이트에 첨가하였다. 역-계산 후 검정의 정량 한계는 460 ng/mL였다. 세 가지 수준의 품질 관리 샘플을 준비하고 각 플레이트에 포함시켜 검정 성능을 평가하였다. 캡시드 입자, 표준 물질 및 품질 대조군을 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 세척 후, PBS 중 2% BSA, 0.05% Tween-20으로 웰을 2시간 동안 실온에서 차단하였다. 차단 완충액 중 샘플의 연속 희석액을 플레이트에 로딩하고 실온에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 차단 완충액에 1:5000으로 희석된 HRP-컨쥬게이션된 양 항-인간 IgG 항체(GE Healthcare, NA933V)를 검출 항체로서 사용하고 실온에서 1시간 동안 플레이트에서 인큐베이션하였다. 세척 후, 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘 기질(TMB)과 함께 실온에서 10분 동안 인큐베이션하는 동안 퍼옥시다제 활성이 발달되었다. 반응을 1M 황산으로 중단시키고, 450 nm에서 광밀도(OD)에 대하여 흡광도 플레이트 판독기로 플레이트를 판독하였다. IgG 농도는 정제된 인간 총 IgG의 연속 희석으로 만들어진 표준 곡선에 대해 결정되었다.
SEQUENCE LISTING <110> SPARK THERAPEUTICS, INC. ANGUELA, Xavier ARMOUR, Sean NORDIN, Jayme <120> CODON-OPTIMIZED ACID ALPHA-GLUCOSIDASE EXPRESSION CASSETTES AND METHODS OF USING SAME <130> 023637-0504752 <140> PCT/US2019/032502 <141> 2019-05-15 <150> 62/672,419 <151> 2018-05-16 <150> 62/734,454 <151> 2018-09-21 <160> 33 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 2808 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified Nucleic Acid <400> 1 atggctttcc tgtggctgct gagctgctgg gctctgctgg gcaccacctt tgggctgctg 60 gtgcctaggg agctgtctgg gtctagccct gtgctggagg agactcaccc tgcccatcag 120 cagggggcta gcaggcctgg ccccagggat gctcaggccc accctggcag gcccagggct 180 gtgcccaccc agtgtgatgt gccccccaac agcaggtttg actgtgcccc tgacaaggcc 240 attacccagg agcagtgtga ggccaggggc tgctgctaca ttccagctaa gcagggcctg 300 cagggggccc agatgggcca gccctggtgc ttcttccccc ccagctatcc tagctataaa 360 ctggagaacc tgagcagctc tgagatgggc tatactgcca ccctgactag gactactccc 420 accttttttc ctaaggatat cctgaccctg aggctggatg tgatgatgga gactgagaac 480 aggctgcact tcactattaa ggaccctgcc aataggaggt 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175 Tyr Leu Thr Leu Asn Asn Gly Ser Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe 180 185 190 Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn 195 200 205 Phe Glu Phe Ser Tyr Asn Phe Glu Asp Val Pro Phe His Ser Ser Tyr 210 215 220 Ala His Ser Gln Ser Leu Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln 225 230 235 240 Tyr Leu Tyr Tyr Leu Ser Arg Thr Gln Ser Thr Gly Gly Thr Ala Gly 245 250 255 Thr Gln Gln Leu Leu Phe Ser Gln Ala Gly Pro Asn Asn Met Ser Ala 260 265 270 Gln Ala Lys Asn Trp Leu Pro Gly Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Val 275 280 285 Ser Thr Thr Leu Ser Gln Asn Asn Asn Ser Asn Phe Ala Trp Thr Gly 290 295 300 Ala Thr Lys Tyr His Leu Asn Gly Arg Asp Ser Leu Val Asn Pro Gly 305 310 315 320 Val Ala Met Ala Thr His Lys Asp Asp Glu Glu Arg Phe Phe Pro Ser 325 330 335 Ser Gly Val Leu Met Phe Gly Lys Gln Gly Ala Gly Lys Asp Asn Val 340 345 350 Asp Tyr Ser Ser Val Met Leu Thr Ser Glu Glu Glu Ile Lys Thr Thr 355 360 365 Asn Pro Val Ala Thr Glu Gln Tyr Gly Val Val Ala Asp Asn Leu Gln 370 375 380 Gln Gln Asn Ala Ala Pro Ile Val Gly Ala Val Asn Ser Gln Gly Ala 385 390 395 400 Leu Pro Gly Met Val Trp Gln Asn Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro 405 410 415 Ile Trp Ala Lys Ile Pro His Thr Asp Gly Asn Phe His Pro Ser Pro 420 425 430 Leu Met Gly Gly Phe Gly Leu Lys His Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile 435 440 445 Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala Asp Pro Pro Thr Thr Phe Asn Gln Ala 450 455 460 Lys Leu Ala Ser Phe Ile Thr Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val 465 470 475 480 Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro 485 490 495 Glu Ile Gln Tyr Thr Ser Asn Tyr Tyr Lys Ser Thr Asn Val Asp Phe 500 505 510 Ala Val Asn Thr Glu Gly Thr Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr 515 520 525 Arg Tyr Leu Thr Arg Asn Leu 530 535 <210> 33 <211> 736 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> AAV vector capsid <400> 33 Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser 1 5 10 15 Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Ala Leu Gln Pro Gly Ala Pro Lys Pro 20 25 30 Lys Ala Asn Gln Gln His Gln Asp Asn Ala Arg Gly Leu Val Leu Pro 35 40 45 Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Gly Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro 50 55 60 Val Asn Ala Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp 65 70 75 80 Gln Gln Leu Lys Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala 85 90 95 Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly 100 105 110 Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Leu Leu Glu Pro 115 120 125 Leu Gly Leu Val Glu Glu Ala Ala Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg 130 135 140 Pro Val Asp Gln Ser Pro Gln Glu Pro Asp Ser Ser Ser Gly Val Gly 145 150 155 160 Lys Ser Gly Lys Gln Pro Ala Arg Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr 165 170 175 Gly Asp Ser Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Leu Gly Glu Pro Pro 180 185 190 Ala Ala Pro Thr Ser Leu Gly Ser Asn Thr Met Ala Ser Gly Gly Gly 195 200 205 Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Asn Ser 210 215 220 Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Gln Trp Leu Gly Asp Arg Val Ile 225 230 235 240 Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu 245 250 255 Tyr Lys Gln Ile Ser Ser Gln Ser Gly Ala Ser Asn Asp Asn His Tyr 260 265 270 Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg Phe His 275 280 285 Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn Trp 290 295 300 Gly Phe Arg Pro Lys Lys Leu Ser Phe Lys Leu Phe Asn Ile Gln Val 305 310 315 320 Lys Glu Val Thr Gln Asn Asp Gly Thr Thr Thr Ile Ala Asn Asn Leu 325 330 335 Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp Ser Glu Tyr Gln Leu Pro Tyr 340 345 350 Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro Ala Asp 355 360 365 Val Phe Met Val Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asn Gly Ser 370 375 380 Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser 385 390 395 400 Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Gln Phe Ser Tyr Thr Phe Glu 405 410 415 Asp Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp Arg 420 425 430 Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Asn Arg Thr 435 440 445 Gln Gly Thr Thr Ser Gly Thr Thr Asn Gln Ser Arg Leu Leu Phe Ser 450 455 460 Gln Ala Gly Pro Gln Ser Met Ser Leu Gln Ala Arg Asn Trp Leu Pro 465 470 475 480 Gly Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Leu Ser Lys Thr Ala Asn Asp Asn 485 490 495 Asn Asn Ser Asn Phe Pro Trp Thr Ala Ala Ser Lys Tyr His Leu Asn 500 505 510 Gly Arg Asp Ser Leu Val Asn Pro Gly Pro Ala Met Ala Ser His Lys 515 520 525 Asp Asp Glu Glu Lys Phe Phe Pro Met His Gly Asn Leu Ile Phe Gly 530 535 540 Lys Glu Gly Thr Thr Ala Ser Asn Ala Glu Leu Asp Asn Val Met Ile 545 550 555 560 Thr Asp Glu Glu Glu Ile Arg Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Gln 565 570 575 Tyr Gly Thr Val Ala Asn Asn Leu Gln Ser Ser Asn Thr Ala Pro Thr 580 585 590 Thr Arg Thr Val Asn Asp Gln Gly Ala Leu Pro Gly Met Val Trp Gln 595 600 605 Asp Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His 610 615 620 Thr Asp Gly His Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Leu 625 630 635 640 Lys His Pro Pro Pro Gln Ile Met Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala 645 650 655 Asn Pro Pro Thr Thr Phe Ser Pro Ala Lys Phe Ala Ser Phe Ile Thr 660 665 670 Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln 675 680 685 Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr Ser Asn 690 695 700 Tyr Asn Lys Ser Val Asn Val Asp Phe Thr Val Asp Thr Asn Gly Val 705 710 715 720 Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Pro Leu 725 730 735

Claims (88)

  1. 산 α-글루코시다제(GAA)를 인코딩하는 핵산으로서, 상기 핵산은 SEQ ID NO: 1-5로 제시된 서열 중 임의의 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 서열에 대해 86% 초과의 서열 동일성을 갖는, 핵산.
  2. 제1항에 있어서, 상기 핵산이 SEQ ID NO: 1-5로 제시된 서열 중 임의의 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 서열에 대해 87% 초과의 서열 동일성을 갖는, 핵산.
  3. GAA를 인코딩하는 핵산으로서, 상기 핵산은 SEQ ID NO: 6-15로 제시된 서열 중 임의의 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 서열에 대해 87% 초과의 서열 동일성을 갖는, 핵산.
  4. 제3항에 있어서, 상기 핵산이 SEQ ID NO: 6-15로 제시된 서열 중 임의의 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 서열에 대해 88% 초과의 서열 동일성을 갖는, 핵산.
  5. 제3항에 있어서, 상기 핵산이 SEQ ID NO: 6-15로 제시된 서열 중 임의의 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 서열에 대해 89% 초과의 서열 동일성을 갖는, 핵산.
  6. 제3항에 있어서, 상기 핵산이 SEQ ID NO: 6-15로 제시된 서열 중 임의의 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 서열에 대해 90% 초과의 서열 동일성을 갖는, 핵산.
  7. 제3항에 있어서, 상기 핵산이 SEQ ID NO: 6-15로 제시된 서열 중 임의의 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 서열에 대해 91% 초과의 서열 동일성을 갖는, 핵산.
  8. GAA를 인코딩하는 핵산으로서, 상기 핵산은 SEQ ID NO: 16-24로 제시된 서열 중 임의의 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 서열에 대해 91% 초과의 서열 동일성을 갖는, 핵산.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산이 127개 미만의 CpG 디뉴클레오티드를 함유하는, 핵산.
  10. GAA를 인코딩하는 핵산으로서, 상기 핵산은 127개 미만의 CpG 디뉴클레오티드를 함유하는, 핵산.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산이 126개 미만의 CpG 디뉴클레오티드를 함유하는, 핵산.
  12. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산이 약 126 - 120개의 CpG 디뉴클레오티드를 함유하는, 핵산.
  13. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산이 약 120 - 110개의 CpG 디뉴클레오티드를 함유하는, 핵산.
  14. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산이 약 110 - 100개의 CpG 디뉴클레오티드를 함유하는, 핵산.
  15. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산이 약 100 - 90개의 CpG 디뉴클레오티드를 함유하는, 핵산.
  16. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산이 약 90 - 80개의 CpG 디뉴클레오티드를 함유하는, 핵산.
  17. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산이 약 80 - 70개의 CpG 디뉴클레오티드를 함유하는, 핵산.
  18. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산이 약 70 - 60개의 CpG 디뉴클레오티드를 함유하는, 핵산.
  19. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산이 약 60 - 50개의 CpG 디뉴클레오티드를 함유하는, 핵산.
  20. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산이 약 50 - 40개의 CpG 디뉴클레오티드를 함유하는, 핵산.
  21. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산이 약 40 - 30개의 CpG 디뉴클레오티드를 함유하는, 핵산.
  22. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산이 약 30 - 20개의 CpG 디뉴클레오티드를 함유하는, 핵산.
  23. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산이 20개 미만의 CpG 디뉴클레오티드를 함유하는, 핵산.
  24. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산이 약 20 - 10개의 CpG 디뉴클레오티드를 함유하는, 핵산.
  25. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산이 10개 미만의 CpG 디뉴클레오티드를 함유하는, 핵산.
  26. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산이 약 10 - 5개의 CpG 디뉴클레오티드를 함유하는, 핵산.
  27. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산이 5개의 CpG 디뉴클레오티드를 함유하는, 핵산.
  28. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산이 4개의 CpG 디뉴클레오티드를 함유하는, 핵산.
  29. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산이 3개의 CpG 디뉴클레오티드를 함유하는, 핵산.
  30. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산이 2개의 CpG 디뉴클레오티드를 함유하는, 핵산.
  31. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산이 1개의 CpG 디뉴클레오티드를 함유하는, 핵산.
  32. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산이 0개의 CpG 디뉴클레오티드를 함유하는, 핵산.
  33. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산이 SEQ ID NO: 1-24로 제시된 서열 중 임의의 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 서열에 대해 92% 초과의 서열 동일성을 갖는, 핵산.
  34. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산이 SEQ ID NO: 1-24로 제시된 서열 중 임의의 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 서열에 대해 93% 초과의 서열 동일성을 갖는, 핵산.
  35. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산이 SEQ ID NO: 1-24로 제시된 서열 중 임의의 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 서열에 대해 94% 초과의 서열 동일성을 갖는, 핵산.
  36. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산이 SEQ ID NO: 1-24로 제시된 서열 중 임의의 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 서열에 대해 95% 초과의 서열 동일성을 갖는, 핵산.
  37. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산이 SEQ ID NO: 1-24로 제시된 서열 중 임의의 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 서열에 대해 96% 초과의 서열 동일성을 갖는, 핵산.
  38. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산이 SEQ ID NO: 1-24로 제시된 서열 중 임의의 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 서열에 대해 97% 초과의 서열 동일성을 갖는, 핵산.
  39. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산이 SEQ ID NO: 1-24로 제시된 서열 중 임의의 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 서열에 대해 98% 초과의 서열 동일성을 갖는, 핵산.
  40. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산이 SEQ ID NO: 1-24로 제시된 서열 중 임의의 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 서열에 대해 99% 초과의 서열 동일성을 갖는, 핵산.
  41. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산이 SEQ ID NO: 1-24로 제시된 서열 중 임의의 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 서열에 대해 99.5% 초과의 서열 동일성을 갖는, 핵산.
  42. SEQ ID NO: 1-24로 구성된 군으로부터 선택되는 GAA를 인코딩하는 핵산.
  43. 발현 조절 요소에 작동가능하게 연결된 제1항 내지 제7항 및 제9항 내지 제42항 중 어느 한 항의 핵산을 포함하는 발현 카세트.
  44. 제43항에 있어서, 상기 발현 조절 요소가 상기 핵산의 5'에 위치하는, 발현 카세트.
  45. 제44항에 있어서, 상기 핵산의 3'에 위치하는 폴리-아데닐화 서열을 추가로 포함하는 발현 카세트.
  46. 제44항 또는 제45항에 있어서, 상기 발현 조절 요소 또는 폴리-아데닐화 서열이 야생형 발현 조절 요소 또는 폴리아데닐화 서열과 비교하여 CpG 감소된, 발현 카세트.
  47. 제43항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 발현 조절 요소가 ApoE/hAAT 인핸서/프로모터 서열을 포함하는, 발현 카세트.
  48. 제45항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리-아데닐화 서열이 소 성장 호르몬(bGH) 폴리아데닐화 서열을 포함하는, 발현 카세트.
  49. 제47항 또는 제48항에 있어서, 상기 ApoE/hAAT 인핸서/프로모터 서열 또는 bGH 폴리아데닐화 서열이 야생형 ApoE/hAAT 인핸서/프로모터 서열 또는 bGH 폴리아데닐화 서열과 비교하여 CpG 감소된, 발현 카세트.
  50. 제49항에 있어서, 상기 야생형 bGH 폴리아데닐화 서열이 SEQ ID NO: 27의 서열을 포함하는, 발현 카세트.
  51. 제49항에 있어서, 상기 야생형 ApoE/hAAT 인핸서/프로모터 서열이 SEQ ID NO: 28 또는 29의 서열을 포함하는, 발현 카세트.
  52. 제49항에 있어서, 상기 CpG 감소된 bGH 폴리아데닐화 서열이 SEQ ID NO: 26의 서열을 포함하는, 발현 카세트.
  53. 제43항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 발현 조절 요소의 3' 말단과 상기 핵산의 5' 말단 사이에 위치하는 인트론을 추가로 포함하는, 발현 카세트.
  54. 제1항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 GAA가 SEQ ID NO: 25로 제시된 서열을 포함하는 핵산 서열 또는 발현 카세트.
  55. 제1항 내지 제54항 중 어느 한 항의 핵산 또는 발현 카세트를 포함하는 아데노바이러스-관련 바이러스(AAV) 벡터.
  56. 제55항에 있어서, 상기 AAV 벡터가
    a) 하나 이상의 AAV 캡시드 및
    b) 하나 이상의 AAV 역 말단 반복(ITR)을 포함하며, 여기서 상기 AAV ITR(들)은 상기 핵산 또는 상기 발현 카세트의 5' 또는 3' 말단에 측접하는, AAV 벡터.
  57. 제56항에 있어서, 상기 하나 이상의 ITR의 5' 또는 3'에 위치하는 인트론을 추가로 포함하는 AAV 벡터.
  58. 제56항 또는 제57항에 있어서, 상기 ITR 또는 상기 인트론 중 적어도 하나 이상이 감소된 CpG를 갖도록 변형된, AAV 벡터.
  59. 제55항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 AAV 벡터가 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, Rh10, Rh74, AAV3B, AAV-2i8 또는 SEQ ID NO: 30, 31 또는 32 VP1, VP2 및/또는 VP3 서열에 대해 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 변형된 또는 변이 AAV VP1, VP2 및/또는 VP3 캡시드, 또는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, Rh10, Rh74, AAV3B, AAV-2i8 또는 SEQ ID NO: 30, 31 또는 32 VP1, VP2 및/또는 VP3 서열에 대해 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 캡시드, 또는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, Rh10, Rh74, AAV3B, AAV-2i8 또는 SEQ ID NO: 30, 31 또는 32 VP1, VP2 및/또는 VP3 서열에 대해 100% 서열 동일성을 갖는 캡시드를 포함하는 캡시드 혈청형을 갖는, AAV 벡터.
  60. 제56항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ITR이 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, Rh10, Rh74 또는 AAV3B, AAV 혈청형 또는 이의 조합물 중 임의의 것의 하나 이상의 ITR을 포함하는, AAV 벡터.
  61. 생물학적으로 양립가능한 담체 또는 부형제에 제55항 내지 제60항 중 어느 한 항의 복수의 AAV 벡터를 포함하는 약학적 조성물.
  62. 제61항에 있어서, 빈 AAV 캡시드를 추가로 포함하는 약학적 조성물.
  63. 제62항에 있어서, 상기 빈 AAV 캡시드 대 상기 AAV 벡터의 비율이 약 100:1-50:1, 약 50:1-25:1, 약 25:1-10:1, 약 10:1-1:1, 약 1:1-1:10, 약 1:10-1:25, 약 1:25-1:50 또는 약 1:50-1:100 이내 또는 그 사이인, 약학적 조성물.
  64. 제62항에 있어서, 상기 빈 AAV 캡시드 대 상기 AAV 벡터의 비율이 약 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1 또는 10:1인, 약학적 조성물.
  65. 제62항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 계면활성제를 추가로 포함하는 약학적 조성물.
  66. 산 α-글루코시다제(GAA)를 필요로 하는 인간을 치료하는 방법으로서,
    (a) 제1항 내지 제54항 중 어느 한 항의 핵산 또는 발현 카세트, 또는 제55항 내지 제60항 중 어느 한 항의 AAV 벡터, 또는 제61항 내지 제65항 중 어느 한 항의 약학적 조성물을 제공하는 단계; 및
    (b) 일정량의 상기 핵산, 발현 카세트, AAV 벡터 또는 약학적 조성물을 상기 인간에게 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 상기 GAA가 상기 인간에서 발현되는, 방법.
  67. 제66항에 있어서, 상기 인간이 폼페병을 갖는, 방법.
  68. 제66항에 있어서, 상기 인간이 영아 발병 폼페병을 갖는, 방법.
  69. 제66항에 있어서, 상기 인간이 후기 발병 폼페병을 갖는, 방법.
  70. 제66항에 있어서, 상기 인간이 글리코겐 축적병(GSD)을 갖는, 방법.
  71. 제70항에 있어서, 상기 GSD가 GSD 타입 I(폰기에르케병), GSD 타입 III(포르브스-코리 병), GSD 타입 IV(앤더슨병, 아밀로펙틴증), GSD 타입 V(맥아들병), GSD 타입 VI(허스병), GSD 타입 VII(타루이병) 및 심장의 치사 선천성 GSD로부터 선택되는, 방법.
  72. 제66항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 AAV 벡터가 상기 인간에게 정맥내, 동맥내, 강내, 점막내 또는 카테터를 통해 투여되는, 방법.
  73. 제66항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 GAA가 GAA를 필요로 하지 않는 인간에서 발견되는 GAA 보다 증가된 수준으로, 선택적으로 1% 초과의 수준으로 발현되는, 방법.
  74. 제66항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 AAV 벡터가 상기 인간 체중 킬로그램 당 약 1x108 내지 약 1x1014 벡터 게놈(vg/kg)의 범위로 투여되는, 방법.
  75. 제66항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 상기 GAA를 필요로 하는 인간 또는 상기 질병의 하나 이상의 증상을 저하, 감소 또는 억제하거나; 상기 GAA를 필요로 하는 인간 또는 상기 질병의 하나 이상의 증상의 진행 또는 악화를 예방 또는 감소시키거나; 상기 GAA를 필요로 하는 인간 또는 상기 질병의 하나 이상의 증상을 안정화시키거나; 상기 GAA를 필요로 하는 인간 또는 상기 질병의 하나 이상의 증상을 개선하는, 방법.
  76. 제75항에 있어서, 상기 하나 이상의 증상이 식사 행동 장애(difficulty eating); 체중 비증가(not gaining weight); 머리 조절 불량(poor head control); 목 조절 불량(poor neck control); 호흡 문제(breathing problem); 폐 감염(lung infection); 심장 비대(enlarged heart); 두꺼워지는 심장(thickening heart); 심장 결함(heart defect); 혀 비대(enlarged tongue); 연하 곤란(difficulty swallowing); 간 비대(enlarged liver); 약한 근력(poor muscle strength); 약한 근긴장(weak muscle tone); 다리 쇠약(weakness in the legs); 허리 쇠약(weakness in the waist); 팔 쇠약(weakness in the arms); 호흡 곤란(shortness of breath); 운동의 어려움(difficulty exercising); 수면 중 호흡 곤란(difficulty breathing while sleeping); 척추만곡증(curvature of the spine); 및 관절 강직(stiff joints)으로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
  77. 제1항 내지 제54항 중 어느 한 항의 핵산 또는 발현 카세트를 포함하는 세포.
  78. 제55항 내지 제60항 중 어느 한 항의 AAV 벡터를 생산하는 세포.
  79. 제55항 내지 제60항 중 어느 한 항의 AAV 벡터를 생산하는 방법으로서,
    a. 제1항 내지 제54항 중 어느 한 항의 상기 핵산 또는 발현 카세트를 포함하는 AAV 벡터 게놈을 패키징 헬퍼 세포에 도입하는 단계; 및
    b. 상기 AAV 벡터를 생산하기 위한 조건 하에 상기 헬퍼 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 방법.
  80. 제55항 내지 제60항 중 어느 한 항의 AAV 벡터를 생산하는 방법으로서,
    a. 제1항 내지 제54항 중 어느 한 항의 상기 핵산 또는 발현 카세트를 패키징 헬퍼 세포에 도입하는 단계; 및
    b. 상기 AAV 벡터를 생산하기 위한 조건 하에 상기 헬퍼 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 방법.
  81. 제77항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포가 포유동물 세포를 포함하는, 세포 또는 방법.
  82. 제77항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포가 상기 벡터를 바이러스 입자 내로 패키징하는 헬퍼 기능을 제공하는, 세포 또는 방법.
  83. 제77항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포가 AAV 헬퍼 기능을 제공하는, 세포 또는 방법.
  84. 제77항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포가 AAV Rep 및/또는 Cap 단백질을 제공하는, 세포 또는 방법.
  85. 제77항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포가 Rep 및/또는 Cap 단백질 서열(들)을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드(들)로 안정하게 또는 일시적으로 형질감염되는, 세포 또는 방법.
  86. 제77항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포가 Rep78 및/또는 Rep68 단백질을 제공하는, 세포 또는 방법.
  87. 제77항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포가 Rep78 및/또는 Rep68 단백질 폴리뉴클레오티드 인코딩 서열(들)로 안정하게 또는 일시적으로 형질감염되는, 세포 또는 방법.
  88. 제77항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포가 HEK-293 세포를 포함하는, 세포 또는 방법.
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