TW202016310A - 經密碼子最佳化之酸性α葡萄糖苷酶表現盒及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

本發明提供編碼酸性α葡萄糖苷酶(GAA)之核酸。在某些實施例中，核酸與選自由如SEQ ID NO:1-5所闡述之序列中之任一者組成之群之序列具有高於約86%的序列一致性。在某些實施例中，編碼酸性α葡萄糖苷酶(GAA)之核酸含有少於127個CpG二核苷酸。亦提供使用該等編碼酸性α葡萄糖苷酶(GAA)之核酸的表現盒、載體、細胞及細胞株及方法。

Description

經密碼子最佳化之酸性α葡萄糖苷酶表現盒及其使用方法
亦稱為龐培氏病(Pompe disease)之II型肝糖貯積病為一種常染色體隱性遺傳病，其由編碼催化肝醣降解之溶酶體酶酸性α葡萄糖苷酶(GAA)之基因中之突變引起。所得酶缺乏症導致肝醣及溶酶體改變在身體之所有組織中病理性積累，引起心肌、呼吸及骨骼肌功能異常(van der Ploeg & Reuser, 2008 Lancet, 372:1342-1353)。傳統上，基於殘餘GAA酶活性、發作年齡、器官參與(亦即，心肌症之存在)、嚴重程度及發展速率將龐培氏病分成兩個主要表型-嬰兒發作型龐培氏病(IOPD) (亦稱作嬰兒型龐培氏病(IPD)或早發型龐培氏病)及晚發型龐培氏病(LOPD)。酶替代療法(ERT)可用於龐培氏病；然而，其具有若干限制(亦即，受限生物分佈及高免疫原性)，導致治療失敗及受限長期功效(van der Ploeg & Reuser, 2008)。
本文揭示用於肝定向表現分泌型人類GAA之最佳化盒。對盒之此等最佳化使得來自肝之GAA分泌增加，且使得肝基因轉移能夠達至足以在個體中全身性交叉校正GAA缺乏症之GAA之循環量。此等盒實現增加之轉殖基因表現、改善之安全性特徵及潛在地降低之免疫原性。此等盒將適用作患有可用GAA治療之龐培氏病及其他疾病及病症之個體的基因療法治療。
進行GAA表現盒之密碼子最佳化以改善GAA之表現。在一個實施例中，編碼GAA之核酸序列經修飾以消除CpG二核苷酸。總計形成20個新的經密碼子最佳化之轉殖基因序列(GAA1-GAA20)。基於GAA活性之活體外比較，選擇5個經密碼子最佳化之序列(GAA 2、5、7、8及13)以用於進一步最佳化。在將29個鹼基對之聚核苷酸序列添加至5'非轉譯區(UTR)後使用GAA13序列分析GAA之表現的差異。亦針對GAA7、8及13評估來源於牛生長激素(bGH或BGH)之兩個不同的聚腺苷酸化序列(野生型及CpG減少型)。將所得9個表現盒(表1)封裝於SEQ ID NO:30-32衣殼內；一個亦封裝至AAV6衣殼中。
根據本發明，存在編碼酸性α葡糖苷酶(GAA)之所提供核酸、包含編碼酸性α葡萄糖苷酶(GAA)之核酸之表現盒及包含編碼酸性α葡糖苷酶(GAA)之核酸之病毒載體。
在一個實施例中，編碼GAA之核酸與如SEQ ID NO:1-5所闡述之序列中之任一者具有高於86%的序列一致性。在額外態樣中，編碼GAA之核酸與如SEQ ID NO:1-5所闡述之序列中之任一者具有高於87%的序列一致性。
在另一實施例中，編碼GAA之核酸與如SEQ ID NO:6-15所闡述之序列中之任一者具有高於87%的序列一致性。在特定態樣中，編碼GAA之核酸與如SEQ ID NO:6-15所闡述之序列中之任一者具有高於88%的序列一致性。在額外特定態樣中，編碼GAA之核酸與如SEQ ID NO:6-15所闡述之序列中之任一者具有高於89%的序列一致性。在其他特定態樣中，編碼GAA之核酸與如SEQ ID NO:6-15所闡述之序列中之任一者具有高於90%的序列一致性。在又額外特定態樣中，編碼GAA之核酸與如SEQ ID NO:6-15所闡述之序列中之任一者具有高於91%的序列一致性。
在另一實施例中，編碼GAA之核酸與如SEQ ID NO:16-24所闡述之序列中之任一者具有高於91%的序列一致性。
在另一實施例中，編碼GAA之核酸與如SEQ ID NO:1-24所闡述之序列中之任一者具有高於92%的序列一致性。
在另一實施例中，編碼GAA之核酸與如SEQ ID NO:1-24所闡述之序列中之任一者具有高於93%的序列一致性。
在另一實施例中，編碼GAA之核酸與如SEQ ID NO:1-24所闡述之序列中之任一者具有高於94%的序列一致性。
在另一實施例中，編碼GAA之核酸與如SEQ ID NO:1-24所闡述之序列中之任一者具有高於95%的序列一致性。
在另一實施例中，編碼GAA之核酸與如SEQ ID NO:1-24所闡述之序列中之任一者具有高於96%的序列一致性。
在另一實施例中，編碼GAA之核酸與如SEQ ID NO:1-24所闡述之序列中之任一者具有高於97%的序列一致性。
在另一實施例中，編碼GAA之核酸與如SEQ ID NO:1-24所闡述之序列中之任一者具有高於98%的序列一致性。
在另一實施例中，編碼GAA之核酸與如SEQ ID NO:1-24所闡述之序列中之任一者具有高於99%的序列一致性。
在另一實施例中，編碼GAA之核酸與如SEQ ID NO:1-24所闡述之序列中之任一者具有高於99.5%的序列一致性。
在另一實施例中，編碼GAA之核酸與如SEQ ID NO:1-24所闡述之序列中之任一者具有100%的序列一致性。
在另一實施例中，編碼GAA之核酸含有少於127個CpG二核苷酸。
在另一實施例中，編碼GAA之核酸含有少於126個CpG二核苷酸。
在另一實施例中，編碼GAA之核酸含有約126-120個CpG二核苷酸。
在另一實施例中，編碼GAA之核酸含有約120-110個CpG二核苷酸。
在另一實施例中，編碼GAA之核酸含有約110-100個CpG二核苷酸。
在另一實施例中，編碼GAA之核酸含有約100-90個CpG二核苷酸。
在另一實施例中，編碼GAA之核酸含有約90-80個CpG二核苷酸。
在另一實施例中，編碼GAA之核酸含有約80-70個CpG二核苷酸。
在另一實施例中，編碼GAA之核酸含有約70-60個CpG二核苷酸。
在另一實施例中，編碼GAA之核酸含有約60-50個CpG二核苷酸。
在另一實施例中，編碼GAA之核酸含有約50-40個CpG二核苷酸。
在另一實施例中，編碼GAA之核酸含有約40-30個CpG二核苷酸。
在另一實施例中，編碼GAA之核酸含有約30-20個CpG二核苷酸。
在另一實施例中，編碼GAA之核酸含有少於20個CpG二核苷酸。
在另一實施例中，編碼GAA之核酸含有約20-10個CpG二核苷酸。
在另一實施例中，編碼GAA之核酸含有少於10個CpG二核苷酸。
在另一實施例中，編碼GAA之核酸含有約10-5個CpG二核苷酸。
在另一實施例中，編碼GAA之核酸含有5個CpG二核苷酸。
在另一實施例中，編碼GAA之核酸含有4個CpG二核苷酸。
在另一實施例中，編碼GAA之核酸含有3個CpG二核苷酸。
在另一實施例中，編碼GAA之核酸含有2個CpG二核苷酸。
在另一實施例中，編碼GAA之核酸含有1個CpG二核苷酸。
在另一實施例中，編碼GAA之核酸含有0個CpG二核苷酸。
本發明亦提供包含編碼如本文所闡述之GAA之核酸，該核酸以可操作方式連接至表現控制元件。
在一個實施例中，表現盒包含編碼GAA之核酸，該核酸與如SEQ ID NO:1-5所闡述之序列中之任一者具有高於86%的序列一致性(例如，87%-100%的一致性)。
在另一實施例中，表現盒包含編碼GAA之核酸，該核酸與如SEQ ID NO:6-15所闡述之序列中之任一者具有高於87%的序列一致性(例如，88%-100%的一致性)。
在另一實施例中，表現盒包含編碼GAA之核酸，該核酸具有少於127個二核苷酸、少於127個二核苷酸、少於127個二核苷酸、少於126個二核苷酸、少於125個二核苷酸、少於124個二核苷酸、少於123個二核苷酸、少於122個二核苷酸、少於121個二核苷酸、少於120個二核苷酸、少於119個二核苷酸、少於118個二核苷酸、少於117個二核苷酸、少於116個二核苷酸、少於115個二核苷酸、少於114個二核苷酸、少於113個二核苷酸、少於112個二核苷酸、少於111個二核苷酸、少於110個二核苷酸、少於109個二核苷酸、少於108個二核苷酸、少於107個二核苷酸、少於106個二核苷酸、少於105個二核苷酸、少於104個二核苷酸、少於103個二核苷酸、少於102個二核苷酸、少於101個二核苷酸、少於101個CpG二核苷酸及依此類推一直降至零(0)個CpG二核苷酸。
在一個實施例中，表現控制元件定位於編碼GAA之核酸之5'處。
在另一實施例中，表現盒包括定位於編碼GAA之核酸之3'處的聚腺苷酸化(poly-adenylation；polyA)序列。
在另一實施例中，表現控制元件或聚腺苷酸化序列與野生型表現控制元件或聚腺苷酸化序列相比CpG減少。
在另一實施例中，表現控制元件包含ApoE/hAAT增強子/啟動子序列。
在另一實施例中，聚腺苷酸化序列包含牛生長激素(bGH)聚腺苷酸化序列。
在另一實施例中，ApoE/hAAT增強子/啟動子序列或bGH聚腺苷酸化序列與野生型ApoE/hAAT增強子/啟動子序列或bGH聚腺苷酸化序列相比CpG減少。
在一個態樣中，野生型bGH聚腺苷酸化序列包含SEQ ID NO: 27之序列。
在另一態樣中，野生型ApoE/hAAT增強子/啟動子序列包含SEQ ID NO:28或29之序列。
在另一態樣中，CpG減少之bGH聚腺苷酸化序列包含SEQ ID NO:26之序列。
在另一實施例中，表現盒進一步包含定位於表現控制元件之3'端與編碼GAA之核酸之5'端之間之內含子。
在另一實施例中，GAA包含如SEQ ID NO:25所闡述之序列或由其組成。
本發明進一步提供病毒載體，諸如包含編碼如本文所闡述之GAA之核酸的腺病毒相關病毒(AAV)載體。
在一個實施例中，諸如腺病毒相關病毒(AAV)載體之病毒載體包含編碼如本文所闡述之GAA之核酸中之任一者，該等核酸以可操作方式連接至表現控制元件。
在另一實施例中，諸如腺病毒相關病毒(AAV)載體之病毒載體包含表現盒中之任一者，該等表現盒包含編碼如本文所闡述之GAA之核酸。
在另一實施例中，AAV載體包含：一或多個AAV衣殼；及一或多個AAV反向末端重複序列(ITR)，其中AAV ITR側接核酸或表現盒之5'端或3'端。
在額外實施例中，AAV載體進一步包含定位於一或多個ITR之5'或3'處之內含子。
在額外實施例中，包含至少一或多個ITR或內含子之AAV載體具有經修飾以具有減少之CpG之一或多個ITR或內含子。
在額外實施例中，AAV載體具有衣殼血清型，其包含與AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、Rh10、Rh74、AAV3B、AAV-2i8或SEQ ID NO:30、31或32 VP1、VP2及/或VP3序列具有90%或更高的序列一致性之經修飾或變異AAV VP1、VP2及/或VP3衣殼；或與AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、Rh10、Rh74、AAV3B、AAV-2i8或SEQ ID NO:30、31或32 VP1、VP2及/或VP3序列具有95%或更高的序列一致性之衣殼、或與AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、Rh10、Rh74、AAV3B、AAV-2i8或SEQ ID NO:30、31或32 VP1、VP2及/或VP3序列具有100%的序列一致性之衣殼。
在額外實施例中，AAV載體包含一或多個ITR，如以下中之任一者之一或多個ITR：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、Rh10、Rh74或AAV3B AAV血清型或其組合。
本發明額外提供醫藥組合物，其包含以下中之任一者：編碼GAA之核酸、包含編碼GAA之核酸的表現盒或諸如包含編碼GAA之核酸的AAV載體之病毒載體或包含編碼如本文所闡述之GAA之核酸的表現盒。
在一個實施例中，醫藥組合物在生物相容性載劑或賦形劑中包含複數個如本文所闡述之AAV載體。
在另一實施例中，包含如本文所闡述之AAV載體中之任一者的醫藥組合物進一步包含空AAV衣殼。
在特定實施例中，在包含AAV載體及空AAV衣殼之醫藥組合物中，空AAV衣殼與AAV載體之比值為約100:1-50:1、約50:1-25:1、約25:1-10:1、約10:1-1:1、約1:1-1:10、約1:10-1:25、約1:25-1:50或約1:50-1:100內或之間。
在特定態樣中，在包含AAV載體及空AAV衣殼之醫藥組合物中，空AAV衣殼與AAV載體之比值為約2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1或10:1。
在另一實施例中，醫藥組合物包括界面活性劑。
本發明再進一步提供藉由向人類投與或遞送以下中之任一者治療需要酸性α葡萄糖苷酶(GAA)之人類之方法：編碼GAA之核酸、包含編碼GAA之核酸之表現盒或諸如AAV載體之病毒載體，該等病毒載體包含編碼GAA之核酸或表現盒，該等表現盒包含編碼GAA之核酸。
在一個實施例中，治療需要酸性α葡萄糖苷酶(GAA)之人類之方法包括：(a)提供如本文所闡述之核酸、表現盒或諸如AAV載體之病毒載體或如本文所闡述之任何醫藥組合物；及(b)向人類投與一定量之核酸、表現盒、病毒(例如，AAV)載體或醫藥組合物，其中GAA在該人類中表現。
在特定實施例中，人類患有龐培氏病，諸如嬰兒發作型龐培氏病或晚發型龐培氏病。
在另一實施例中，人類患有肝糖貯積病(GSD)。
在特定態樣中，GSD為以下中之任一者：I型GSD (馮吉爾克氏病(von Gierke's disease))、III型GSD (福貝斯-柯里氏病(Forbes-Cori disease))、IV型GSD (安德森病(Anderson disease)，澱粉黏膠質病)、V型GSD (麥克阿德爾氏病(McArdle disease))、VI型GSD (赫氏病(Hers disease))、VII型GSD (塔瑞氏病(Tarui disease))或先天性心臟GSD (例如，致死性先天性心臟GSD)。
在特定實施例中，編碼GAA之核酸、包含編碼GAA之核酸之表現盒或AAV載體經靜脈內、動脈內、腔室內、腔內、黏膜內或經由導管向人類投與。
在特定實施例中，在方法中GAA之表現水準比在不需要GAA之人類中發現的GAA表現水準提高，視情況高出1%的表現水準。
在特定實施例中，AAV載體係公斤人類體重投與約1 × 108 至約1 × 1014 個載體基因組(vg/kg)之範圍。
在特定實施例中，方法減少、減輕或抑制需要GAA或疾病的一或多種症狀；或預防或減少需要GAA或疾病的一或多種症狀之發展或惡化；或使需要GAA或疾病的一或多種症狀穩定；或改善需要GAA或疾病的一或多種症狀。
在特定態樣中，可根據本發明治療之症狀可為以下中之一或多者：進食困難及/或體重不增長；頭部及/或頸部控制差；呼吸問題及/或肺部感染；心臟增大及/或增厚；心臟缺陷；舌部增大；吞咽困難；肝增大；肌肉強度差；肌肉張力弱；腿部、腰部及/或手臂無力；呼吸短促；運動困難；睡眠時呼吸困難；脊椎彎曲；及/或關節僵硬。
本發明又額外提供：包含編碼GAA之核酸之細胞；包含表現盒之細胞，該等表現盒包含編碼GAA之核酸；及包含諸如AAV載體之病毒載體之細胞，該等病毒載體包含編碼GAA之核酸或表現盒，該等表現盒包含編碼GAA之核酸。
在一個實施例中，細胞產生病毒載體。
在另一實施例中，細胞產生如本文所闡述之AAV載體。
再此外，本發明亦提供產生諸如如本文所闡述之AAV載體之病毒載體的方法。
在一個實施例中，產生AAV載體之方法包括：將包含編碼GAA之核酸或包含編碼如本文所闡述之GAA之核酸之表現盒的AAV載體基因組引入封裝輔助細胞中；及在產生AAV載體之條件下培養輔助細胞。
在另一實施例中，產生AAV載體誤差之方法包括：將編碼GAA之核酸或包含編碼如本文所闡述之GAA之核酸之表現盒引入封裝輔助細胞中；及在產生AAV載體之條件下培養輔助細胞。
在額外實施例中，細胞為哺乳動物細胞。
在額外實施例中，用於載體產生之細胞提供輔助功能，諸如AAV輔助功能，其將載體封裝至病毒顆粒中。在一特定態樣中，輔助功能為用於AAV載體封裝之Rep及/或Cap蛋白。
在額外實施例中，用於載體產生之細胞可經編碼Rep及/或Cap蛋白序列之聚核苷酸穩定地或暫時地轉染。
在額外實施例中，用於載體產生之細胞提供Rep78及/或Rep68蛋白。在該等細胞中，細胞可經Rep78及/或Rep68蛋白聚核苷酸編碼序列穩定地或暫時地轉染。
在特定實施例中，用於載體產生之細胞為人類胚胎腎細胞。在一特定態樣中，用於載體產生之細胞為HEK-293細胞。
相關申請
本申請案主張2018年5月16日申請之美國臨時專利申請案第62/672,419號及2018能9月21日申請之美國臨時專利申請案第62/734,454號之優先權。前述申請案之全部內容以引用之方式併入本文中，包括所有文本、表格、序列表及圖式。
本發明提供編碼GAA之經修飾之核酸、包含編碼GAA之經修飾之核酸的表現盒、包含編碼GAA之經修飾之核酸的AAV載體基因組及包含編碼GAA之經修飾之核酸的重組型AAV載體及顆粒。本發明之編碼GAA之經修飾之核酸、包含編碼GAA之經修飾之核酸的表現盒、包含編碼GAA之經修飾之核酸的AAV載體基因組及重組型AAV載體及顆粒適用於治療龐培氏病以及其他肝糖貯積病(GSD)。
如本文所用，術語「修飾」及其語法變化形式意謂核酸或蛋白質不同於參考或親本序列。與參考(例如，野生型)或親本核酸相比，已改變編碼GAA之經修飾之核酸。因此，經修飾之核酸可具有與參考或親本核酸相比實質上相同、更高或更低的活性或功能，但至少保持與參考或親本核酸之部分活性、功能及或序列一致性。經修飾核酸可經基因修飾以編碼經修飾或變異GAA。
「編碼GAA之經修飾之核酸」意謂GAA核酸與編碼GAA之親本未修飾之核酸相比具有改變。修飾之特定實例為核苷酸取代。本文中之術語「修飾」無需出現在對編碼GAA之核酸作出之參考的各例子中。
在特定實施例中，對於編碼GAA之經修飾之核酸，GAA蛋白保持至少一部分野生型GAA蛋白之功能或活性。GAA蛋白之功能或活性包括酸性α葡萄糖苷酶活性、降解肝醣、麥芽糖及異麥芽糖之溶酶體水解酶。因此，編碼GAA之經修飾之核酸包括修飾之形式，只要經編碼GAA保持一定程度或態樣之GAA之溶酶體水解酶活性。
如本文所闡述，與參考或親本核酸相比，編碼GAA之經修飾之核酸可展現不同特點或特徵。舉例而言，經修飾之核酸包括與編碼如本文所闡述之GAA之參考核酸具有100%的一致性之序列以及與編碼GAA之參考核酸具有低於100%的一致性之序列。
術語「一致性」、「同源性」及其語法變化形式意謂兩個或更多個參考實體在其為「比對」序列時相同。因此，藉助於實例，在兩個核酸一致時，該等核酸至少在參考區或部分內具有相同序列。一致性可在序列之界定區域(區或結構域)內。
一致性之「區域」或「區」係指相同的兩個或更多個參考實體之部分。因此，在兩個蛋白質或核酸序列在一或多個序列區域或區內一致時，其在該區內共用一致性。「比對」序列係指多個蛋白質(胺基酸)或核酸序列，其與參考序列相比通常含有缺失或額外鹼基或胺基酸(空隙)之校正。
一致性可在序列之整個長度或部分內延伸。在某些實施例中，共用一致性百分比之序列之長度為2、3、4、5個或更多個相鄰胺基酸或核酸，例如6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個等相鄰核酸或胺基酸 在額外實施例中，共用一致性之序列之長度為21個或更多個連續胺基酸或核酸，例如21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40個等相鄰胺基酸或核酸。在其他實施例中，共用一致性之序列之長度為41個或更多個相鄰胺基酸或核酸，例如42、43、44、45、45、47、48、49、50個等相鄰胺基酸或核酸。在又其他實施例中，共用一致性之序列之長度為50個或更多個相鄰胺基酸或核酸，例如50-55、55-60、60-65、65-70、70-75、75-80、80-85、85-90、90-95、95-100、100-150、150-200、200-250、250-300、300-500、500-1,000個等相鄰胺基酸或核酸。
如本文所闡述，編碼GAA之經修飾之核酸可不同於編碼GAA之參考核酸，或展現與編碼GAA之參考核酸100%的一致性或低於100%的一致性。
在特定實施例中，編碼GAA之本發明之核酸可與闡述於SEQ ID NO:1-5中之任何核酸高於86%的一致。
在特定實施例中，編碼GAA之本發明之核酸可與闡述於SEQ ID NO:6-14中之任何核酸高於87%的一致。
在特定實施例中，編碼GAA之本發明之核酸可與闡述於SEQ ID NO:16-24中之任何核酸高於91%的一致。
該等編碼GAA之經修飾之核酸甚至可展現更高的一致性，例如與SEQ ID NO:1-24中之任一者高於87%的一致；高於88%的一致、高於89%的一致、高於90%的一致、高於91%的一致、高於92%的一致、高於93%的一致、高於94%的一致、高於95%的一致、高於96%的一致、高於97%、高於98%的一致、高於99%的一致或100%的一致。
兩個序列之間之一致性(同源性)之程度或「一致性百分比」可使用電腦程式及/或數學演算法確定。出於本發明之目的，核酸序列之比較使用可購自Madison, Wisconsin的the Genetics Computer Group之9.1版GCG Wisconsin Package進行。為方便起見，藉由該程式指定之預設參數(空隙形成罰分=12，空隙擴展罰分=4)意欲在本文中用於比較序列一致性。替代地，使用具有預設參數之空隙比對之由國家生物技術資訊中心(National Center for Biotechnology Information) (以ncbi.nlm.nih.gov/blast/見於全球資訊網上；Altschul等人, 1990, J Mol Biol 215:403-410)提供的Blastn 2.0程式可用於測定核酸序列與胺基酸序列之間之一致性及類似性程度。對於多肽序列比較，BLASTP演算法通常與計分矩陣組合使用，諸如PAM100、PAM 250、BLOSUM 62或BLOSUM 50。FASTA ((例如，FASTA2及FASTA3)及SSEARCH序列比較程式亦用於定量一致性程度(Pearson等人,Proc . Natl . Acad . Sci . USA 85:2444 (1988)；Pearson,Methods Mol Biol . 132:185 (2000)；及Smith等人,J . Mol . Biol . 147:195 (1981))。亦已開發用於使用基於Delaunay之拓樸繪圖定量蛋白質結構類似性的程式(Bostick等人,Biochem Biophys Res Commun . 304:320 (2003))。
與參考或親本核酸相比展現不同特點或特徵的編碼GAA之經修飾之核酸包括核苷酸之取代。舉例而言，編碼GAA之經修飾之核酸包括與編碼GAA之參考核酸相比CpG二核苷酸之數目減少的核酸。
在某些實施例中，編碼GAA之核酸含有少於127個CpG二核苷酸。
在某些實施例中，編碼GAA之核酸含有少於126個CpG二核苷酸。
在某些實施例中，編碼GAA之核酸含有少於125個CpG二核苷酸。
在某些實施例中，編碼GAA之核酸含有少於124個CpG二核苷酸。
在某些實施例中，編碼GAA之核酸含有少於123個CpG二核苷酸。
在某些實施例中，編碼GAA之核酸含有少於122個CpG二核苷酸。
在某些實施例中，編碼GAA之核酸含有少於121個CpG二核苷酸。
在某些實施例中，編碼GAA之核酸含有少於120個CpG二核苷酸。
在某些實施例中，編碼GAA之核酸含有少於119個CpG二核苷酸。
在某些實施例中，編碼GAA之核酸含有少於118個CpG二核苷酸。
在某些實施例中，編碼GAA之核酸含有少於117個CpG二核苷酸。
在某些實施例中，編碼GAA之核酸含有少於116個CpG二核苷酸。
在某些實施例中，編碼GAA之核酸含有少於115個CpG二核苷酸。
在某些實施例中，編碼GAA之核酸含有少於114個CpG二核苷酸。
在某些實施例中，編碼GAA之核酸含有少於113個CpG二核苷酸。
在某些實施例中，編碼GAA之核酸含有少於112個CpG二核苷酸。
在某些實施例中，編碼GAA之核酸含有少於111個CpG二核苷酸。
在某些實施例中，編碼GAA之核酸含有少於110個CpG二核苷酸。
在某些實施例中，編碼GAA之核酸含有少於109個CpG二核苷酸。
在某些實施例中，編碼GAA之核酸含有少於108個CpG二核苷酸。
在某些實施例中，編碼GAA之核酸含有少於107個CpG二核苷酸。
在某些實施例中，編碼GAA之核酸含有少於106個CpG二核苷酸。
在某些實施例中，編碼GAA之核酸含有少於105個CpG二核苷酸。
在某些實施例中，編碼GAA之核酸含有少於104個CpG二核苷酸。
在某些實施例中，編碼GAA之核酸含有少於103個CpG二核苷酸。
在某些實施例中，編碼GAA之核酸含有少於102個CpG二核苷酸。
在某些實施例中，編碼GAA之核酸含有少於101個CpG二核苷酸。
在某些實施例中，編碼GAA之核酸含有少於100個CpG二核苷酸。
在某些實施例中，編碼GAA之核酸含有少於99個CpG二核苷酸。
在某些實施例中，編碼GAA之核酸含有少於98個CpG二核苷酸。
在某些實施例中，編碼GAA之核酸含有少於97個CpG二核苷酸。
在某些實施例中，編碼GAA之核酸含有少於96個CpG二核苷酸。
在某些實施例中，編碼GAA之核酸含有少於95個CpG二核苷酸。
在某些實施例中，編碼GAA之核酸含有少於94個CpG二核苷酸。
在某些實施例中，編碼GAA之核酸含有少於93個CpG二核苷酸。
在某些實施例中，編碼GAA之核酸含有少於92個CpG二核苷酸。
在某些實施例中，編碼GAA之核酸含有少於91個CpG二核苷酸。
在某些實施例中，編碼GAA之核酸含有少於90個CpG二核苷酸。
在某些實施例中，編碼GAA之核酸含有少於89個CpG二核苷酸。
在某些實施例中，編碼GAA之核酸含有少於88個CpG二核苷酸。
在某些實施例中，編碼GAA之核酸含有少於87個CpG二核苷酸。
在某些實施例中，編碼GAA之核酸含有少於86個CpG二核苷酸。
在某些實施例中，編碼GAA之核酸含有少於85個CpG二核苷酸。
在某些實施例中，編碼GAA之核酸含有少於84個CpG二核苷酸。
在某些實施例中，編碼GAA之核酸含有少於83個CpG二核苷酸。
在某些實施例中，編碼GAA之核酸含有少於82個CpG二核苷酸。
在某些實施例中，編碼GAA之核酸含有少於81個CpG二核苷酸。
在某些實施例中，編碼GAA之核酸含有少於80個CpG二核苷酸。
在某些實施例中，編碼GAA之核酸含有少於79個CpG二核苷酸。
在某些實施例中，編碼GAA之核酸含有少於78個CpG二核苷酸。
在某些實施例中，編碼GAA之核酸含有少於77個CpG二核苷酸。
在某些實施例中，編碼GAA之核酸含有少於76個CpG二核苷酸。
在某些實施例中，編碼GAA之核酸含有少於75個CpG二核苷酸。
在某些實施例中，編碼GAA之核酸含有少於74個CpG二核苷酸。
在某些實施例中，編碼GAA之核酸含有少於73個CpG二核苷酸。
在某些實施例中，編碼GAA之核酸含有少於72個CpG二核苷酸。
在某些實施例中，編碼GAA之核酸含有少於71個CpG二核苷酸。
在某些實施例中，編碼GAA之核酸含有少於70個CpG二核苷酸。
在某些實施例中，編碼GAA之核酸含有少於69個CpG二核苷酸。
在某些實施例中，編碼GAA之核酸含有少於68個CpG二核苷酸。
在某些實施例中，編碼GAA之核酸含有少於67個CpG二核苷酸。
在某些實施例中，編碼GAA之核酸含有少於66個CpG二核苷酸。
在某些實施例中，編碼GAA之核酸含有少於65個CpG二核苷酸。
在某些實施例中，編碼GAA之核酸含有少於64個CpG二核苷酸。
在某些實施例中，編碼GAA之核酸含有少於63個CpG二核苷酸。
在某些實施例中，編碼GAA之核酸含有少於62個CpG二核苷酸。
在某些實施例中，編碼GAA之核酸含有少於61個CpG二核苷酸。
在某些實施例中，編碼GAA之核酸含有少於60個CpG二核苷酸。
在某些實施例中，編碼GAA之核酸含有少於59個CpG二核苷酸。
在某些實施例中，編碼GAA之核酸含有少於58個CpG二核苷酸。
在某些實施例中，編碼GAA之核酸含有少於57個CpG二核苷酸。
在某些實施例中，編碼GAA之核酸含有少於56個CpG二核苷酸。
在某些實施例中，編碼GAA之核酸含有少於55個CpG二核苷酸。
在某些實施例中，編碼GAA之核酸含有少於54個CpG二核苷酸。
在某些實施例中，編碼GAA之核酸含有少於53個CpG二核苷酸。
在某些實施例中，編碼GAA之核酸含有少於52個CpG二核苷酸。
在某些實施例中，編碼GAA之核酸含有少於51個CpG二核苷酸。
在某些實施例中，編碼GAA之核酸含有少於50個CpG二核苷酸。
在某些實施例中，編碼GAA之核酸含有少於49個CpG二核苷酸。
在某些實施例中，編碼GAA之核酸含有少於48個CpG二核苷酸。
在某些實施例中，編碼GAA之核酸含有少於47個CpG二核苷酸。
在某些實施例中，編碼GAA之核酸含有少於46個CpG二核苷酸。
在某些實施例中，編碼GAA之核酸含有少於45個CpG二核苷酸。
在某些實施例中，編碼GAA之核酸含有少於44個CpG二核苷酸。
在某些實施例中，編碼GAA之核酸含有少於43個CpG二核苷酸。
在某些實施例中，編碼GAA之核酸含有少於42個CpG二核苷酸。
在某些實施例中，編碼GAA之核酸含有少於41個CpG二核苷酸。
在某些實施例中，編碼GAA之核酸含有少於40個CpG二核苷酸。
在某些實施例中，編碼GAA之核酸含有少於39個CpG二核苷酸。
在某些實施例中，編碼GAA之核酸含有少於38個CpG二核苷酸。
在某些實施例中，編碼GAA之核酸含有少於37個CpG二核苷酸。
在某些實施例中，編碼GAA之核酸含有少於36個CpG二核苷酸。
在某些實施例中，編碼GAA之核酸含有少於35個CpG二核苷酸。
在某些實施例中，編碼GAA之核酸含有少於34個CpG二核苷酸。
在某些實施例中，編碼GAA之核酸含有少於33個CpG二核苷酸。
在某些實施例中，編碼GAA之核酸含有少於32個CpG二核苷酸。
在某些實施例中，編碼GAA之核酸含有少於31個CpG二核苷酸。
在某些實施例中，編碼GAA之核酸含有少於30個CpG二核苷酸。
在某些實施例中，編碼GAA之核酸含有少於29個CpG二核苷酸。
在某些實施例中，編碼GAA之核酸含有少於28個CpG二核苷酸。
在某些實施例中，編碼GAA之核酸含有少於27個CpG二核苷酸。
在某些實施例中，編碼GAA之核酸含有少於26個CpG二核苷酸。
在某些實施例中，編碼GAA之核酸含有少於25個CpG二核苷酸。
在某些實施例中，編碼GAA之核酸含有少於24個CpG二核苷酸。
在某些實施例中，編碼GAA之核酸含有少於23個CpG二核苷酸。
在某些實施例中，編碼GAA之核酸含有少於22個CpG二核苷酸。
在某些實施例中，編碼GAA之核酸含有少於21個CpG二核苷酸。
在某些實施例中，編碼GAA之核酸含有少於20個CpG二核苷酸。
在某些實施例中，編碼GAA之核酸含有少於19個CpG二核苷酸。
在某些實施例中，編碼GAA之核酸含有少於18個CpG二核苷酸。
在某些實施例中，編碼GAA之核酸含有少於17個CpG二核苷酸。
在某些實施例中，編碼GAA之核酸含有少於16個CpG二核苷酸。
在某些實施例中，編碼GAA之核酸含有少於15個CpG二核苷酸。
在某些實施例中，編碼GAA之核酸含有少於14個CpG二核苷酸。
在某些實施例中，編碼GAA之核酸含有少於13個CpG二核苷酸。
在某些實施例中，編碼GAA之核酸含有少於12個CpG二核苷酸。
在某些實施例中，編碼GAA之核酸含有少於11個CpG二核苷酸。
在某些實施例中，編碼GAA之核酸含有少於10個CpG二核苷酸。
在某些實施例中，編碼GAA之核酸含有少於9個CpG二核苷酸。
在某些實施例中，編碼GAA之核酸含有少於8個CpG二核苷酸。
在某些實施例中，編碼GAA之核酸含有少於7個CpG二核苷酸。
在某些實施例中，編碼GAA之核酸含有少於6個CpG二核苷酸。
在某些實施例中，編碼GAA之核酸含有少於5個CpG二核苷酸。
在某些實施例中，編碼GAA之核酸含有少於4個CpG二核苷酸。
在某些實施例中，編碼GAA之核酸含有少於3個CpG二核苷酸。
在某些實施例中，編碼GAA之核酸含有少於2個CpG二核苷酸。
在某些實施例中，編碼GAA之核酸含有少於1個CpG二核苷酸。
術語「載體」係指可藉由插入或合併核酸來操控之小載劑核酸分子、質體、病毒(例如，AAV載體)或其他媒劑。該等載體可用於基因操控(亦即，「選殖載體」)以將聚核苷酸引入/轉移至細胞中及轉錄或轉譯細胞中所插入之聚核苷酸。「表現載體」為特定載體，其含有具有在宿主細胞中表現所需的必需調節區之基因或核酸序列。
載體核酸序列一般含有用於在細胞中繁殖之至少一個複製起點及視情況選用之額外元件，諸如異源聚核苷酸序列、表現控制元件(例如，啟動子、增強子)、內含子、反向末端重複序列(ITR)、可選標記物(例如，抗生素抗性)、聚腺苷酸化信號。
病毒載體來源於或基於一或多種包含病毒基因組之核酸元件。特定病毒載體包括慢病毒及腺相關病毒(AAV)載體。
術語「重組型」，作為載體之修飾語，諸如重組型AAV (rAAV)載體，以及序列之修飾語，諸如重組型聚核苷酸及多肽，意謂組合物已以一般不存在於自然界中之方式操縱(亦即，工程化)。重組型AAV載體之特定實例將為野生型AAV基因組中通常不存在的點選酸序列插入於AAV基因組內的情況。儘管關於AAV載體以及諸如聚核苷酸之序列，本文中並未始終使用術語「重組型」，但儘管有任何該省略，包括聚核苷酸之重組型形式明確地包括在內。
藉由使用分子方法自AAV基因組中移除野生型基因組，且用稱作異源核酸之非天然核酸序列置換，「重組型AAV載體」或「rAAV」來源於AAV之野生型基因組。通常，對於AAV，一個或兩個AAV基因組之反向末端重複(ITR)序列保留在AAV載體中。rAAV區別於AAV基因組，因為相對於AAV基因組核酸，AAV基因組之全部或一部分已用非天然序列置換。因此，併入非天然序列將AAV載體定義為「重組型」載體，其可稱作「rAAV載體」。
rAAV序列可封裝-在本文中稱作「顆粒」-以用於離體、活體外或活體內細胞之後續感染(轉導)。在重組型AAV載體序列衣殼化或封裝至AAV顆粒中之情況下，顆粒亦可稱作「rAAV載體」或「rAAV顆粒」。該等rAAV顆粒包括衣殼化或封裝載體基因組之蛋白質，且在AAV之情況下，其稱作衣殼蛋白。
載體「基因組」係指重組型質體序列之部分，其最終封裝或衣殼化以形成病毒(例如，rAAV)顆粒。在重組型質體用於構建或製造重組型載體之情況下，載體基因組不包括不對應於重組型質體之載體基因組序列的「質體」之部分。重組型質體之此非載體基因組部分可稱為針對質體之選殖及擴增至關重要的「質體主鏈」，其為繁殖及重組型病毒產生所需之過程，但自身不封裝或衣殼化至病毒(例如AAV)顆粒中。因此，載體「基因組」係指由病毒(例如，AAV)封裝或衣殼化之核酸。
用於產生重組型AAV顆粒之宿主細胞包括但不限於微生物、酵母細胞、昆蟲細胞及可用作或已用作異源rAAV載體之受體的哺乳動物細胞。可使用來自穩定人類細胞株、HEK293 (可經由例如美國菌種保存中心在寄存編號ATCC CRL1573下容易獲得)之細胞。在某些實施例中，使用經修飾之人類胚腎細胞株(例如HEK293)產生重組型AAV顆粒，其經腺病毒5型DNA片段轉型且表現腺病毒E1a及E1b基因。經修飾HEK293細胞株易於轉染，且提供產生rAAV顆粒之尤其適宜的平台。適用於重組型AAV產生之其他宿主細胞株描述於國際申請案PCT/2017/024951中。
在某些實施例中，AAV輔助功能藉由在AAV表現載體轉染之前或與AAV表現載體同時用AAV輔助構建體轉染宿主細胞來引入宿主細胞中。具有AAV輔助功能之宿主細胞可稱為「輔助細胞」或「封裝輔助細胞」。因此，AAV輔助構建體有時用於提供AAV rep及/或cap基因之至少短暫表現以補充產生性AAV轉導必需之缺失AAV功能。AAV輔助構築體通常缺乏AAV ITR且可皆不複製或封裝自身。此等構建體可呈質體、噬菌體、轉座子、黏質體、病毒或病毒粒子之形式。已描述多種AAV輔助構建體，諸如編碼Rep及Cap表現產物兩者之常用質體pAAV/Ad及pIM29+45。已知多種其他載體，其編碼Rep及/或Cap表現產物。
產生能夠轉導哺乳動物細胞之重組型AAV顆粒的方法在此項技術中已知。舉例而言，重組型AAV顆粒可如美國專利9,408,904；及國際申請案PCT/US2017/025396及PCT/US2016/064414中所描述來產生。
術語「核酸」及「聚核苷酸」在本文中可互換地使用以指所有核酸、寡核苷酸形式，包括脫氧核糖核酸(DNA)及核糖核酸(RNA)。核酸包括基因組DNA、cDNA及反義DNA、及剪接或未剪接mRNA、rRNA tRNA及抑制性DNA或RNA (RNAi，例如小或短髮夾(sh) RNA、微RNA (miRNA)、小或短干擾(si) RNA、反式剪接RNA或反義RNA)。核酸包括天然存在、合成及刻意修飾或改變的聚核苷酸(例如變異核酸)。核酸，諸如cDNA、基因組DNA、RNA及其片段，其可為單股或雙股。
聚核苷酸可為單鏈體、雙鏈體或三鏈體，線性或環狀，且可以具有任何長度。在論述聚核苷酸時，特定聚核苷酸之序列或結構可在本文中根據在5'至3'方向中提供序列之慣例描述。
「轉殖基因」在本文中用於方便地指代意欲或已引入至細胞或生物體中之異源核酸。轉殖基因包括任何異源核酸，諸如編碼GAA之經修飾之核酸。
術語「轉導」及其語法變化形式係指將分子(諸如rAAV載體)引入至細胞或宿主生物體中。異源核酸/轉殖基因可或可不整合於受體細胞之基因組核酸中。所引入之異源核酸亦可存在於位於染色體外或僅短暫之受體細胞或宿主生物體中。
「經轉導之細胞」為已引入轉殖基因之細胞。因此，「經轉導之」細胞(例如，在哺乳動物中，諸如細胞或組織或器官細胞)意謂細胞在將例如核酸(例如，轉殖基因)併入細胞中之後的基因改變。因此，「經轉導之」細胞為其中已引入外源核酸之細胞或其子代。細胞可經繁殖且所引入蛋白質表現。對於基因療法使用及方法，經轉導細胞可在個體中。
「表現控制元件」係指影響以可操作方式連接之核酸之表現的核酸序列。如本文所闡述之表現控制元件包括啟動子及增強子。包括AAV載體之載體序列可包括一或多個「表現控制元件」。通常，包括該等元件以促進適當異源聚核苷酸轉錄及適當之轉譯(例如啟動子、增強子、用於內含子之剪接信號、維持基因之正確閱讀框架以允許mRNA之框內轉譯及終止密碼子等)。該等元件通常順式起作用，稱為「順式作用」元件，但亦可以反式起作用。
表現控制可在轉錄、轉譯、剪接、訊息穩定性等層面下實現。通常，調節轉錄之表現控制元件鄰接於所轉錄核酸之5'端(亦即，「上游」)處。表現控制元件亦可位於經轉錄序列之3'端(亦即「下游」)或轉錄物內(例如內含子中)。表現控制元件可位於鄰近轉錄序列或遠離轉錄序列之距離處(例如，遠離聚核苷酸1-10、10-25、25-50、50-100、100至500個或更多個核苷酸)，甚至在相當大的距離處。然而，由於AAV載體之長度限制，表現控制元件將通常在來自異源核酸之轉錄起始位點的1至1000個核苷酸內。
在功能上，以可操作方式連接之核酸之表現至少部分可由元件(例如啟動子)控制，使得該元件調節核酸之轉錄且在適當時調節轉錄物之轉譯。表現控制元件之具體實例為啟動子，其通常位於經轉錄核酸序列之5'處。相比於不存在啟動子時表現之量，啟動子通常會增加自以可操作方式連接之核酸表現之量。
如本文所用之「增強子」可指與異源核酸相鄰定位之序列。增強子元件通常位於啟動子元件上游，且亦起作用且亦可位於序列下游或序列內。因此，增強子元素可位於異源核酸序列上游或下游10-50個鹼基對、50-100個鹼基對、100-200個鹼基對或200-300個鹼基對或更多鹼基對。增強子元件通常增加超過啟動子元件所提供之表現的以可操作方式連接之核酸之表現。
表現表達構建體可包含用於驅動特定細胞或組織類型中之表現的調節元件。表現控制元件(例如，啟動子)包括在特定組織或細胞類型中具有活性者，在本文中稱為「組織特異性表現控制元件/啟動子」。組織特異性表現控制元件通常在特定細胞或組織(例如肝)中為活性的。表現控制元件通常在特定細胞、組織或器官中為活性的，因為其由轉錄活化因子蛋白質或轉錄之其他調節因子識別，該等調節因子對於特定細胞、組織或器官類型為獨特的。該等調節元件為熟習此項技術者已知的(參見例如Sambrook等人(1989)及Ausubel等人(1992))。
在表現構建體中併入組織特異性調節元件為編碼蛋白質或抑制性RNA之異源核酸之表現提供至少部分組織向性。在肝中為活性的啟動子之實例為甲狀腺素轉運蛋白(TTR)基因啟動子；人類α1-抗胰蛋白酶(hAAT)啟動子；白蛋白，Miyatake,等人,J . Virol . , 71:5124-32 (1997)；B型肝炎病毒核心啟動子，Sandig,等人Gene Ther . 3:1002-9 (1996)；α-胎蛋白(AFP), Arbuthnot,等人,Hum . Gene . Ther ., 7:1503-14 (1996)以及其他。肝臟中具有活性之增強子之實例為脂蛋白元E (apoE) HCR-1及HCR-2(Allan等人,J . Biol . Chem . , 272:29113-19 (1997))。
表現控制元件亦包括普遍存在的或混雜的啟動子/增強子，其能夠驅動許多不同細胞類型中之聚核苷酸之表現。該等元件包括但不限於巨細胞病毒(CMV)即刻早期啟動子/增強子序列、勞斯肉瘤病毒(RSV)啟動子/增強子序列及在多種哺乳動物細胞類型中具有活性之其他病毒啟動子/增強子，或在自然界中不存在之合成元件(參見例如Boshart等人,Cell , 41:521-530 (1985))、SV40啟動子、二氫葉酸還原酶啟動子、細胞質?-肌動蛋白啟動子及磷酸甘油激酶(PGK)啟動子。
表現控制元件亦可以可調節之方式賦予表現，亦即信號或刺激增加或減少以可操作方式連接之異源聚核苷酸之表現。響應於信號或刺激增加以可操作方式連接之聚核苷酸之表現的可調節元件亦稱為「誘導性元件」 (亦即，藉由信號誘導)。特定實例包括但不限於激素(例如，類固醇)誘導型啟動子。通常，由該等元件賦予之增大或減小的量與存在之信號或刺激的量成比例；信號或刺激的量愈大，則表現之增大或減小愈大。特定非限制性實例包括鋅誘導性綿羊金屬硫蛋白(MT)啟動子；類固醇激素誘導性小鼠乳腺腫瘤病毒(MMTV)啟動子；T7聚合酶啟動子系統(WO 98/10088)；四環素可抑制系統(Gossen,等人,Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 89:5547-5551 (1992))；四環素誘導性系統(Gossen,等人,Science . 268:1766-1769 (1995)；亦參見Harvey,等人,Curr . Opin . Chem . Biol . 2:512-518 (1998))；RU486誘導性系統(Wang,等人.,Nat . Biotech . 15:239-243 (1997)及Wang, 等人,Gene Ther . 4:432-441 (1997)]；及雷帕黴素誘導性系統(Magari,等人,J . Clin . Invest . 100:2865-2872 (1997)；Rivera,等人,Nat . Medicine . 2:1028-1032 (1996))。在此情形下可適用之其他可調節控制元件為藉由特定生理狀態(例如，溫度、急性期、發展)調節之控制元件。
表現控制元件亦包括用於異源聚核苷酸之天然元件。當需要異源聚核苷酸之表現應模擬天然表現時，可以使用天然控制元件(例如，啟動子)。當異源聚核苷酸之表現應在時間上或發育上，或以組織特異性方式，或響應於特定轉錄刺激調節時，可以使用天然元件。亦可使用其他天然表現控制元件，諸如內含子、聚腺苷酸化位點或Kozak共同序列。
術語「以可操作方式連接」意謂核酸序列之表現所必需的調節序列相對於序列置放於適當的位置中以實現核酸序列之表現。此同一定義有時應用於表現載體(例如，rAAV載體)中之核酸序列及轉錄控制元件(例如，啟動子、增強子及終止元件)之配置。
在表現控制元件與核酸以可操作方式連接之實例中，該關係使得控制元件調節核酸之表現。更特定言之，舉例而言，以可操作方式連接之兩個DNA序列意謂兩個DNA以至少一個DNA序列能夠對另一序列施加生理效應之此類關係配置(順式或反式)。
因此，用於載體之額外元件包括但不限於表現控制(例如，啟動子/增強子)元件、轉錄終止信號或終止密碼子、側接諸如AAV ITR序列之一或多個複本之序列的5'或3'非轉譯區(例如，聚腺苷酸化(polyA)序列)或內含子。
其他元件包括例如填充或填充片段聚核苷酸序列，例如以改善封裝且減少雜質核酸之存在。AAV載體通常接受尺寸範圍一般為約4 kb至約5.2 kb或略多之DNA的插入。因此，對於較短序列，包括填充片段或填充以將長度調整至接近或為封裝至病毒顆粒中之AAV載體可接受之病毒基因組序列之正常尺寸。在各種實施例中，填充/填充片段核酸序列為核酸之未轉譯(非蛋白編碼)片段。對於少於4.7 kb之核酸序列，填充或填充片段聚核苷酸序列具有在與序列合併(例如，插入載體中)時序列之總長度介於約3.0-5.5 kb之間或約4.0-5.0 kb之間或約4.3-4.8 kb之間的長度。
術語「經分離」在用作組合物之修飾語時意謂組合物藉由人工製得或與其天然存在之活體內環境完全或至少部分地分離。一般而言，經分離之組合物實質上不含一或多種在自然界中其通常與之締合的材料，例如一或多種蛋白質、核酸、脂質、碳水化合物、細胞膜。
術語「經分離」不排除藉由人工產生之組合，例如封裝或衣殼化AAV載體基因組之rAAV序列或rAAV顆粒及醫藥調配物。術語「經分離」亦不排除替代的物理形式之組合物，諸如雜合體/嵌合體、多聚物/寡聚物、修飾(例如，磷酸化、糖基化、脂質化)或衍生形式或在藉由人工產生之宿主細胞中表現之形式。
術語「實質上純的」係指包含至少50-60重量%之所關注化合物(例如，核酸、寡核苷酸、蛋白質等)之製劑。製劑可包含至少75重量%、或至少85重量%、或約90-99重量%之所關注化合物。純度藉由適合於所關注化合物之方法(例如，層析方法、瓊脂糖或聚丙烯醯胺凝膠電泳、HPLC分析及其類似方法)量測。
片語「基本上由…組成」在提及特定核苷酸序列或胺基酸序列時意謂具有給定SEQ ID NO之特性之序列。舉例而言，在提及胺基酸序列使用時，片語包括序列本身及不會影響該序列之基本及新穎特徵之分子修飾。
可藉由使用重組型DNA技術方法製備核酸、表現載體(例如，AAV載體基因組)、質體，包括本發明之編碼GAA之經修飾之核酸。核苷酸序列資訊之可用性使得能夠藉由多種方式製備本發明之經分離之核酸分子。編碼GAA之核酸可使用各種標準選殖、重組型DNA技術經由細胞表現或活體外轉譯及化學合成技術製得。聚核苷酸之純度可藉由定序、凝膠電泳及其類似方法測定。舉例而言，核酸可使用雜交或基於電腦之資料庫篩檢技術分離。該等技術包括但不限於：(1)使基因組DNA或cDNA庫與探針雜交以偵測同源核苷酸序列；(2)抗體篩檢以偵測具有共用結構特點之多肽，例如使用表現庫；(3)使用能夠黏接至所關注核酸序列之引子在基因組DNA或cDNA上進行聚合酶鏈反應(PCR)；(4)電腦檢索用於相關序列之資料庫；及(5)差分篩檢消減核酸庫。
核酸可維持為任何適宜選殖載體中之DNA。在一個實施例中，純系維持在質體選殖/表現載體，諸如pBluescript (Stratagene, La Jolla, CA)中，其在適合之大腸桿菌(E . coli )宿主細胞中繁殖。可替代地，核酸可維持在適合於在哺乳動物細胞中表現之載體中，例如AAV載體。在轉譯後修飾影響蛋白質功能之情況下，核酸分子可在哺乳動物細胞中表現。
如本文中所揭示，rAAV載體可視情況包含在以使得准許所編碼蛋白質在宿主細胞中表現之此類方式定位之細胞中表現異源核酸所必需的調節元件。表現所需之該等調節元件包括但不限於如本文所闡述且熟習此項技術者已知之啟動子序列、增強子序列及轉錄起始序列。
本發明之方法及用途包括將核酸(轉殖基因)遞送(轉導)至宿主細胞中，包括分裂及/或非分裂細胞。本發明之核酸、rAAV載體、方法、用途及醫藥調配物額外適用於向有需要之個體遞送、投與或提供由異源核酸編碼之序列的方法作為治療方法。以此方式，轉錄核酸且在個體中活體內產生蛋白質。因為個體患有蛋白質缺乏症，或因為個體中之蛋白質之產生可賦予一些治療效應，所以個體可受益於或需要該蛋白質作為治療方法或其他方式。
本發明適用於包括人類及獸醫學應用之動物。適合之個體因此包括哺乳動物，諸如人類以及非人類哺乳動物。術語「個體」係指動物，通常為哺乳動物，諸如人類、非人類靈長類動物(猿、長臂猿、大猩猩、黑猩猩、紅毛猩猩、獼猴)、家畜(狗及貓)、農耕動物(諸如雞及鴨之家禽、馬、奶牛、山羊、綿羊、豬)及實驗動物(小鼠、大鼠、兔、天竺鼠)。人類個體包括胚胎、新生兒、嬰兒、青少年及成年人個體。個體包括動物疾病模型，例如蛋白質/酶缺乏症之小鼠及其他動物模型，諸如龐培氏病及肝糖貯積病(GSD)及熟習此項技術者已知之其他疾病模型。
適合於根據本發明治療之個體包括患有或處於產生不足量GAA或產生異常、部分功能性或非功能性GAA之風險下的個體。可針對GAA活性測試個體以判定該等個體是否適合於根據本發明之方法治療。適合於根據本發明治療之個體亦包括將受益於GAA之彼等個體。可受益於GAA之該等個體包括患有肝糖貯積病(GSD)之個體。在週期性治療，例如每1-4週、1-6個月、6-12個月或1、2、3、4、5年或更久後可監測所治療個體。
可測試個體之免疫反應，例如抗AAV之抗體。因此，可在根據本發明之方法治療之前篩檢候選個體。亦可在治療後測試個體之抗AAV之抗體，且視情況在治療後監測一段時間。具有預先存在或發展中之AAV抗體之個體可用如本文所闡述之免疫抑制劑或其他療法治療。
適合於根據本發明治療之個體亦包括具有或處於產生抗AAV之抗體之風險下的個體。可使用幾種技術向該等個體投與或遞送rAAV載體。舉例而言，可遞送AAV空衣殼(亦即，缺乏編碼GAA之經修飾之核酸)以與個體之AAV抗體結合，藉此使包含異源核酸之rAAV載體轉導個體之細胞。
本發明之經修飾之核酸、表現盒及rAAV載體可用於治療GAA缺乏症。因此，在各種實施例中，本發明之編碼GAA之經修飾之核酸、包含編碼GAA之經修飾之核酸的表現盒及rAAV載體可用作治療劑及/或預防劑。
在特定實施例中，本發明之編碼GAA之經修飾之核酸、包含編碼GAA之經修飾之核酸的表現盒及rAAV載體可用於治療龐培氏病以及其他肝糖貯積病。向患有龐培氏病或另一種肝糖貯積病之患者投與本發明之編碼GAA之經修飾之核酸、包含編碼GAA之經修飾之核酸的表現盒及rAAV載體引起用以遏制、抑制或減少肝糖積累、預防肝糖積累或降解肝糖之GAA蛋白的表現，這可繼而減少或減輕一或多種龐培氏病之不良效應或症狀。
可藉由展示、量測及/或評估作為治療劑及/或預防劑的本發明之編碼GAA之經修飾之核酸、包含編碼GAA之經修飾之核酸的表現盒及rAAV載體之功效的多種測試、檢測及功能性評估來評估經投與本發明之編碼GAA之經修飾之核酸、包含編碼GAA之經修飾之核酸的表現盒及rAAV載體的個體、動物或患者。該等測試及檢測包括但不限於：在諸如血液或血漿之生物樣本中量測GAA活性(諸如藉由使用標準GAA活性檢測)及或GAA量(諸如藉由利用抗GAA抗體之西方墨點)；在諸如肌肉樣本之組織中量測肝糖含量；組織學評估肌肉(諸如來自肱三頭肌、股四頭肌、橫膈膜及心臟之肌肉)、脊柱(包括在頸胸部及腰脊柱節段之腹角中檢查及計數ChAT陽性運動神經元，及評估星形膠質細胞反應(astroglial reaction)及微神經膠質細胞活化(microglial activation))；在平靜呼吸期間評估呼吸功能；前肢掛線測試；量測握力；旋桿測試運動神經協調(諸如藉由旋桿方案)；可顯示心肥大之胸部x射線；檢查心臟功能之心電圖(ECG)；可顯示肌病變之肌電圖(EMG)；量測皮膚纖維母細胞中之GAA活性；檢測乾燥血液樣本中之GAA活性；血清肌酸激酶之血液/血清測試，其在升高時係龐培氏病之非特異性標記物；轉胺酶、丙胺酸轉胺酶或乳酸脫氫酶之血液/血清測試，其可能因在龐培氏病中自肌肉釋放而成為升高之指標；測試尿液中之葡萄糖四糖(龐培氏病之敏感性非特異性標記物)；藉由評估血漿中總GAA蛋白質及活性，分析載體所衍生GAA酶含量之峰值及穩態；測試肺部功能；測試肌肉功能；針對細胞液泡中之肝糖之存在進行肌肉活組織檢查及染色；肝健康狀況之生物標記物；檢查溶酶體健康狀況；測試抗AAV衣殼之免疫反應；測試抗GAA轉殖基因蛋白質產物之免疫反應；六分鐘之步行測試(6MWT)；用力肺活量測試；AAV載體所衍生GAA酶含量之峰值及穩態(藉由在血漿中量測之總GAA蛋白質及活性評估)；步態、樓梯、高爾症候及椅子(gait, stairs, gower, chair(GSGC))測試；使用拉希建立之醫學研究委員會(Rasch-built Medical Research Council；MRC)分級等級之肌肉強度測試；患者報告之生活活動/社會參與；來自多項生理睡眠檢查(polysomnography；PSG)之定量睡眠及睡眠呼吸量測；患者報告之疲乏、日間嗜睡及睡眠品質之量測；沃爾頓及加德納-梅德溫(Walton and Gardner‐Medwin；WGM)評分；呼吸功能測試，包括(但不限於)吸氣鼻內壓(SNIP)及最大吸氣壓及呼氣壓(分別為MIP及MEP)；肝生物標記物；β己醣胺酶(βHexo)測試；健康結果量測，包括(但不限於)短形式-36健康狀況調查(SF-36)；拉希建立之龐培氏特定活動性(R-PAct)等級；疲乏嚴重程度評分(FSS)；及患者報告之結果量測資訊系統(PROMIS)項目庫。
另外，本發明之編碼GAA之經修飾之核酸、包含編碼GAA之經修飾之核酸的表現盒、及rAAV載體可用於治療肝糖貯積病(GSD)。肝糖貯積病包括例如I型GSD (馮吉爾克氏病)、II型GSD (龐培氏病)、III型GSD (福貝斯-柯里氏病)、IV型GSD (安德森病，澱粉黏膠質病)、V型GSD (麥克阿德爾氏病)、VI型GSD (赫氏病)、VII型GSD (塔瑞氏病)或致死性先天性心臟肝糖貯積病。
如本文所闡述，rAAV適用作基因療法載體，因為其可滲透細胞且將核酸/遺傳物質引入細胞中。因為AAV與人類之病原性疾病不相關，所以rAAV載體能夠向人類患者遞送異源聚核苷酸序列(例如，治療蛋白及治療劑)而不引起實質性AAV發病機制或疾病。
rAAV載體具有多種用於該等應用之所需特點，包括用於分裂及非分裂細胞之向性。此等載體之早期臨床經驗亦展現無持久毒性且免疫反應通常極小或不可偵測。已知AAV藉由受體介導之內飲作用或藉由轉胞吞作用活體內感染多種細胞類型。已在人類中靶向多種組織(諸如視網膜上皮、肝、骨骼肌、氣管、大腦、關節及造血幹細胞)測試此等載體系統。
可能需要引入rAAV載體，其可提供例如多個GAA複本且因此提供更多量之GAA蛋白。已在許多參考文獻、專利及專利申請案(包括Wright J.F. (Hum. Gene Ther., 20:698-706, 2009))中詳細描述經改良之rAAV載體及用於產生此等載體之方法。
直接遞送rAAV載體或離體轉導人類細胞隨後輸注至身體中將引起異源核酸之表現，藉此對止血施加有益的治療效應。在編碼GAA之經修飾之核酸之情形下，投藥遏止、抑制或減少肝糖之量或積累，預防肝糖積累或降解肝糖。此繼而可遏制、抑制、減少或減輕一或多種龐培氏病之不良效應，諸如提昇或提高肌肉張力及/或肌肉強度及/或減小或減少增大之肝。
重組型AAV載體以及其方法及用途包括任何病毒株或血清型。作為一非限制性實例，重組型AAV載體可基於任何AAV基因組，例如AAV (SEQ ID NO:30-32)、LK03 (SEQ ID NO:33)、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、Rh10、Rh74、AAV3B或AAV-2i8。該等載體可基於相同病毒株或血清型(或亞群或變異體)，或彼此不同。作為一非限制性實例，基於特定血清型基因組之重組型AAV載體可與封裝載體之衣殼蛋白之血清型一致。另外，重組型AAV載體基因組可基於不同於封裝載體之AAV衣殼蛋白之血清型的AAV血清型基因組。舉例而言，AAV載體基因組可基於AAV2，而三種衣殼蛋白中之至少一者可為例如AAV (SEQ ID NO:30-32)、LK03 (SEQ ID NO:33)、AAV1、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、Rh10、Rh74、AAV3B或AAV-2i8或其變異體。
在特定實施例中，腺相關病毒(AAV)載體包括AAV (SEQ ID NO:30-32)、LK03 (SEQ ID NO:33)、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、Rh10、Rh74、AAV3B及AAV-2i8以及其變異體(例如，衣殼變異體，諸如胺基酸插入、添加、取代及刪除)，例如如WO 2013/158879 (國際申請案PCT/US2013/037170)、WO 2015/013313 (國際申請案PCT/US2014/047670)及US 2013/0059732 (美國專利第9,169,299號揭示LK01、LK02、LK03等)中所闡述。
如本文所用，術語「血清型」為用以指具有血清學上不同於其他AAV血清型的衣殼之AAV之差異。血清型差異係基於與另一種AAV相比，抗體與一種AAV之間缺乏交叉反應性來測定。此類交叉反應性差異通常歸因於衣殼蛋白序列/抗原決定子之差異(例如歸因於AAV血清型之VP1、VP2及/或VP3序列差異)。儘管有可能包括衣殼變異體之AAV變異體可能不在血清學上不同於參考AAV或其他AAV血清型，其與參考或其他AAV血清型相比相差至少一個核苷酸或胺基酸殘基。
在傳統定義下，血清型意謂已針對對所有現有及表徵之血清型具有特異性之用於中和活性的血清測試所關注病毒，且尚未發現中和所關注病毒的抗體。由於發現更多天然存在之病毒分離株及/或產生衣殼突變體，可存在或可不存在與當前現有血清型中之任一者的血清學差異。因此，在新病毒(例如，AAV)無血清學差異之情況下，此新病毒(例如，AAV)將為對應血清型之亞群或變異體。在許多情況下，仍必須對具有衣殼序列修飾之突變病毒進行中和活性之血清學測試以根據血清型之傳統定義判定其是否具有另一血清型。因此，為方便起見且為避免重複，術語「血清型」廣泛地指代血清學上不同的病毒(例如，AAV)以及可能在給定血清型之亞群或變異體內的血清學上並未不同的病毒(例如，AAV)。
如本文所闡述，AAV衣殼蛋白可展現與諸如AAV (SEQ ID NO:30-32)、LK03 (SEQ ID NO:33)、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、Rh10、Rh74、AAV3B或AAV-2i8之參考或親本AAV血清型少於100%的序列一致性，但與諸如AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、Rh10、Rh74、AAV3B或AAV-2i8之已知AAV基因或蛋白不同且不一致。在一個實施例中，經修飾/變異AAV衣殼蛋白包括以下或由以下組成：與參考或親本AAV衣殼蛋白至少80%、85%、85%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%等、至多99.9%的一致之序列，諸如AAV (SEQ ID NO:30-32)、LK03 (SEQ ID NO:33)、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、Rh10、Rh74、AAV3B或AAV-2i8。
rAAV載體可經由以生物相容性載劑形式輸注，例如經由靜脈內注射向患者投與。rAAV載體可單獨或與其他分子組合投與。因此，rAAV載體及其他組合物、藥劑、藥物、生物製劑(蛋白質)可併入醫藥組合物中。該等醫藥組合物尤其適用於向個體活體內或離體投與及遞送。
在特定實施例中，醫藥組合物亦含有醫藥學上可接受之載劑或賦形劑。該等賦形劑包括自身不誘導有害於接受組合物之個體之免疫反應且可經投與而無異常毒性的任何醫藥劑。
如本文所用，術語「醫藥學上可接受」及「生理學上可接受」意謂生物學上可接受之調配物、其氣態、液體或固體或混合物，其適合於一或多種投藥、活體內遞送或接觸途徑。「醫藥學上可接受」或「生理學上可接受」之組合物為生物學上或以其他方式非所需的材料，例如可向個體投與而不引起實質性非所需生物效應的材料。因此，此類醫藥組合物可例如用於向個體投與核酸、載體、病毒顆粒或蛋白質。
醫藥學上可接受之賦形劑包括但不限於液體，諸如水、鹽水、甘油、糖及乙醇。醫藥學上可接受之鹽亦可包括於其中，例如無機酸鹽，諸如鹽酸鹽、氫溴酸鹽、磷酸鹽、硫酸鹽及其類似鹽；及有機酸鹽，諸如乙酸鹽、丙酸鹽、丙二酸鹽、苯甲酸鹽及其類似鹽。賦形劑亦包括蛋白質，諸如白蛋白。另外，諸如濕潤劑或乳化劑、pH緩衝物質及其類似物之輔助物質可存在於該等媒劑中。
醫藥組合物可以鹽形式提供，且可由多種酸形成，包括但不限於鹽酸、硫酸、乙酸、乳酸、酒石酸、蘋果酸、丁二酸等。與對應游離鹼形式相比，鹽往往會更可溶於水性或其他質子溶劑中。在其他情況下，製劑可為凍乾粉劑，其可含有以下中之任一者或所有：pH範圍為4.5至5.5之1-50 mM組胺酸、0.1%-2%蔗糖及2-7%甘露糖醇，其在使用之前與緩衝液合併。
醫藥組合物包括與醫藥投與或活體內接觸或遞送相容的溶劑(水性或非水性)、溶液(水性或非水性)、乳液(例如，水包油或油包水)、懸浮液、糖漿、酏劑、分散介質及懸浮介質、包衣、等張劑及吸收促進劑或延遲劑。水性及非水性溶劑、溶液及懸浮液可包括懸浮劑及增稠劑。該等藥學上可接受之載劑包括片劑(有包衣或無包衣)、膠囊(硬的或軟的)、微珠、粉劑、顆粒劑及晶體。補充活性化合物(例如，防腐劑、抗細菌劑、抗病毒劑及抗真菌劑)亦可併入組合物中。
如本文中所闡述或熟習此項技術者所知，可以將醫藥組合物調配成與特定的投藥或遞送途徑相容。因此，醫藥組合物包括適合於藉由各種途徑投藥之載劑、稀釋劑或賦形劑。
適合於非經腸投與之組合物包含活性化合物之水性及非水性溶液、懸浮液或乳液，該等製劑通常為無菌的且可與預期接受者之血液等張。非限制性說明性實例包括水、緩衝鹽水、漢克氏溶液(Hanks' solution)、林格氏溶液(Ringer's solution)、右旋糖、果糖、乙醇、動物油、植物油或合成油。水性注射懸浮液可含有增加懸浮液之黏度之物質，諸如羧甲基纖維素鈉、山梨糖醇或聚葡萄糖。
另外，活性化合物之懸浮液可視需要製備成油性注射懸浮液。適合之親脂性溶劑或媒劑包括脂肪油，諸如芝麻油；或合成脂肪酸酯，諸如油酸乙酯或三酸甘油酯；或脂質體。視情況，懸浮液亦可含有適合之穩定劑或增大化合物可溶性以允許製備高度濃縮之溶液之藥劑。
可將共溶劑及佐劑添加至調配物中。共溶劑之非限制性實例含有羥基或其他極性基團，例如醇，諸如異丙醇；二醇，諸如丙二醇、聚乙二醇、聚丙二醇、二醇醚；甘油；聚氧乙烯醇及聚氧乙烯脂肪酸酯。佐劑包括例如界面活性劑，諸如大豆卵磷脂及油酸；脫水山梨糖醇酯，諸如脫水山梨糖醇三油酸酯；及聚乙烯吡咯啶酮。
在已製備醫藥組合物後，可將其置放於適當容器中且標記用於治療。該等標記可包括投與之量、頻率及方法。
適合於本發明之組合物、方法及用途之醫藥組合物及遞送系統為此項技術中已知的(參見例如Remington : The Science and Practice of Pharmacy (2003)第20版, Mack Publishing Co., Easton, PA；Remington ' s Pharmaceutical Sciences (1990)第18版, Mack Publishing Co., Easton, PA；The Merck Index (1996)第12版, Merck Publishing Group, Whitehouse, NJ；Pharmaceutical Principles of Solid Dosage Forms (1993), Technomic Publishing Co., Inc., Lancaster, Pa.；Ansel及Stoklosa,Pharmaceutical Calculations (2001)第11版, Lippincott Williams & Wilkins, Baltimore, MD；及Poznansky等人,Drug Delivery Systems (1980), R. L. Juliano,編, Oxford, N.Y., 第253-315頁)。
「有效量」或「足夠量」係指以單次或多次劑量、單獨或與一種或多種其他組合物(治療劑或免疫抑制劑，諸如藥物)、治療、方案或治療療程藥劑組合提供任何持續時間(長期或短期)之可偵測反應、在個體中或得益於任何可量測或可偵測程度或持續任何持續時間(例如持續數分鐘、數小時、數天、數月、數年或治癒)之個體之預期或所需結果的量。
劑量可變化及視治療所針對之疾病之類型、發作、發展、嚴重程度、頻率、持續時間或機率、所需臨床終點、先前或同時、個體之一般健康狀況、年齡、性別、人種或免疫能力及熟習此項技術者應瞭解之其他因素而定。如由治療或療法之任何不良副作用、併發症或其他風險因素及個體之狀態所指示，劑量、數目、頻率或持續時間可按比例增加或減少。熟習此項技術者應瞭解可能影響提供足以提供治療效益或預防效益之量所需的劑量及時序之因素。
實現治療作用之劑量，例如載體基因組/每公斤體重(vg/kg)之劑量將基於包括但不限於以下之幾種因素變化：投藥途徑、實現治療作用所需之異源聚核苷酸表現量、所治療之特定疾病、對病毒載體之任何宿主免疫反應、對異源聚核苷酸或表現產物(蛋白質)之宿主免疫反應及所表現蛋白質之穩定性。熟習此項技術者可確定rAAV/載體基因組劑量範圍以基於前述因素以及其他因素治療患有特定疾病或病症之患者。
一般而言，劑量將在至少1 × 108 個載體基因組/公斤(vg/kg)個體體重或更多、例如1 × 109 、1 × 1010 、1 × 1011 、1 × 1012 、1 × 1013 或1 × 1014 或更多個載體基因組/公斤(vg/kg)個體體重之範圍內以實現治療作用。在小鼠中1 × 1010 -1 × 1011 vg/kg及狗中1 × 1012 -1 × 1013 vg/kg之範圍內之rAAV劑量為有效的。劑量可為較低的，例如低於6 × 1012 vg/kg之劑量。更特定言之，5 × 1011 vg/kg或1 × 1012 vg/kg之劑量。
rAAV載體劑量可呈一含量，通常呈劑量範圍之下限，以使得不存在針對異源核酸序列、所編碼蛋白質或抑制核酸或rAAV載體之實質性免疫反應。更特定言之，劑量至多但低於6 × 1012 vg/kg、諸如約5 × 1011 至約5 × 1012 vg/kg或更特定言之約5 × 1011 vg/kg或約1 × 1012 vg/kg。
如本文所用之「單位劑型」係指適用作用於待治療之個體之單位劑量的物理離散單位；含有預定量之各單位視情況與在以一或多次劑量投與時經計算以產生所需作用(例如，預防作用或治療作用)的醫藥載劑(賦形劑、稀釋劑、媒劑或填充劑)相關。單位劑型可在例如安瓿及小瓶內，其可包括液體組合物或呈冷凍乾燥或凍乾狀態之組合物；無菌液體載劑，例如其可在投與或活體內遞送之前添加。個別單位劑型可包括於多劑量套組或容器中。為易於投與及劑量均勻性，可將rAAV顆粒及其醫藥組合物封裝在單個或多個單位劑型中。
儘管減輕、減少、抑制、遏制、限制或控制疾病發展或惡化為令人滿意的結果，但治療之「有效量」或「足夠量」(例如，改善或提供治療效益或好轉)之劑量通常可有效地在可量測程度上提供對疾病之一種、多種或所有不良症狀、結果或併發症、例如由疾病引起或與疾病相關一或多種不良症狀、病症、疾病、病變或併發症的反應。
有效量或足夠量可以但無需以單次投藥提供，可能需要多次投藥，且可以但無需單獨或與另一種組合物(例如，藥劑)、治療、方案或治療療法組合投與。舉例而言，如由個體之需要、所治療之疾病之類型、狀態及嚴重程度或治療之副作用(若存在)所指示，該量可按比例增加。另外，若以單次或多次劑量給出而無第二組合物(例如，另一種藥物或藥劑)、治療、方案或治療療法，則有效量或足夠量無需為有效或足夠的，因為可包括高於及超過該等劑量之額外劑量、量或持續時間或額外組合物(例如，藥物或藥劑)、治療、方案或治療療法以在給定個體中視為有效或足夠的。視為有效之量亦包括引起減少使用另一種治療、治療療法或方案，諸如投與用於治療GAA缺乏症(例如，龐培氏病)或另一種肝糖貯積病之編碼GAA之經修飾之核酸的量。
因此，本發明之方法及用途亦尤其包括引起減少需要或使用另一種化合物、藥劑、藥物、治療療法、治療方案、過程或治療物之方法及用途。舉例而言，對於GAA缺乏症，若在給定個體中以較低頻率或減少之劑量或消除投與重組型GAA以補充個體中缺乏或缺陷的GAA，則本發明之方法或用途具有治療效益。因此，根據本發明，提供減少需要或使用另一種治療或療法之方法及用途。
有效量或足夠量既不需要在每一個所治療之個體中有效，亦不需要在給定群組或群體中之大部分所治療個體中有效。有效量或足夠量意謂在特定個體而非群組或一般群體中有效或足夠。正如對該等方法而言典型的，一些個體將展現對給定治療方法或用途更大的反應或更小或無反應。
向個體投與或活體內遞送可在出現由疾病引起或與疾病相關之不良症狀、病況、併發症等之前進行。舉例而言，篩檢(例如，基因篩檢)可用於將該等個體鑑別為本發明組合物、方法及用途之候選者。因此，該等個體包括對於功能性基因產物(例如，導致GSD之GAA或蛋白質缺乏症)之不足量或缺乏症篩檢呈陽性或產生異常、部分地功能性或非功能性基因產物(例如，涉及GSD之GAA或蛋白質)的個體。
根據如本文中所揭示之本發明之方法及用途向個體投與或活體內遞送可在個體已鑑別為患有治療所靶向之疾病、具有疾病之一或多種症狀或即使個體不具有疾病之一或多種症狀但如本文所闡述已篩檢及鑑別呈陽性後1-2、2-4、4-12、12-24或24-72小時內實踐。當然，本發明之方法及用途可在個體已鑑別為患有治療所靶向之疾病、具有疾病之一或多種症狀或如本文所闡述已篩檢及鑑別呈陽性後1-7、7-14、14-24、24-48、48-64天、月或年或更久實踐。
術語「改善」意謂個體之疾病或其症狀或根本細胞反應之可偵測或可量測好轉。可偵測或可量測好轉包括疾病或由疾病引起或與疾病相關之併發症之出現率、頻率、嚴重程度、發展或持續時間之主觀或客觀減輕、減少、抑制、遏制、限制或控制或疾病之症狀或根本病因或結果好轉或疾病逆轉。
對於龐培氏病，有效量將為例如抑制或減少肝糖產生或積累、增強或增加肝糖降解或移除之量。有效量亦將為使以下好轉或改善之量：進食困難及/或體重不增長；頭部及/或頸部控制差；呼吸問題及/或肺部感染；心臟增大及/或增厚；心臟缺陷；舌部增大；吞咽困難；肝增大；肌肉強度差；肌肉張力弱；腿部、腰部及/或手臂無力；呼吸短促；運動困難；睡眠時呼吸困難；脊椎彎曲；及/或關節僵硬；肌肉張力弱及/或肌肉強度缺乏。有效量亦將為減輕或抑制一或多種症狀、或預防或減少一或多種症狀之發展或惡化、或使一或多種症狀穩定、或改善需要GAA或患有龐培氏病之患者或個體之一或多種症狀之量。
除其他因素以外，治療劑量將視個體之年齡及一般狀況、疾病或病症之嚴重程度而定。人類中之治療有效量將在可由醫學從業者基於個別患者之反應來判斷之相對寬的範圍內。
可向個體遞送諸如醫藥組合物之組合物，以允許產生所編碼蛋白質。在一特定實施例中，醫藥組合物包含足夠的遺傳物質以使得接受者能夠在個體中產生治療有效量之蛋白質。
組合物可在任何無菌、生物相容性醫藥載劑(包括但不限於鹽水、緩衝鹽水、右旋糖及水)中調配及/或投與。組合物可單獨或與影響止血之其他藥劑(例如，輔因子)組合調配及/或向患者投與。
本發明之方法及用途包括全身性、區域性或局部或藉由任何途徑，例如藉由注射或輸注遞送及投與。儘管設想其他遞送方法(諸如對流增強之遞送) (參見例如美國專利第5,720,720號)，但活體內遞送醫藥組合物一般可經由使用習知針筒注射來完成。舉例而言，組合物可經由門靜脈或肌肉內經皮下、表皮、皮內、鞘內、眶內、黏膜內、鼻內、腹膜內、靜脈內、胸膜內、動脈內、腔內、經口、肝內遞送。其他投藥模式包括經口及經肺投藥、栓劑及經皮施加。專門治療患有龐培氏病或其他肝糖貯積病之臨床醫師可基於多種準則確定投與腺病毒相關載體之最佳途徑，該等準則包括但不限於：患者之狀況及治療目的(例如，GAA含量增加或減少)。
可單獨投與組合物。在某些實施例中，rAAV顆粒在無免疫抑制劑之情況下提供治療作用。在不投與免疫抑制劑之情況下，治療作用視情況持續一段時間，例如2-4、4-6、6-8、8-10、10-14、14-20、20-25、25-30或30-50天或更久，例如50-75、75-100、100-150、150-200天或更久。因此，提供治療作用維持一段時間。
本發明rAAV載體、方法及用途可與具有所需治療、有益、累加、協同或互補活性或作用之任何化合物、藥劑、藥物、治療或其他治療療法或方案合併。例示性組合組合物及治療包括第二活性劑，諸如生物製劑(蛋白質)、藥劑(例如，免疫抑制劑)及藥物。該等生物製劑(蛋白質)、藥劑、藥物、治療及療法可在本發明之任何其他方法或用途之前、實質上同時或之後投與或進行。
化合物、藥劑、藥物、治療或其他治療療法或方案可以組合組合物投與，或分開投與，諸如同時或連續或依序(之前或之後)遞送或投與核酸、載體或rAAV顆粒。因此，本發明提供組合，其中本發明之方法或用途與本文所闡述或熟習此項技術者已知之任何化合物、藥劑、藥物、治療療法、治療方案、過程、治療物或組合物組合。化合物、藥劑、藥物、治療療法、治療方案、過程、治療物或組合物可在向個體投與本發明之核酸、載體或rAAV顆粒之前、實質上同時或之後投與或進行。
在某些實施例中，當患者具有或處於出現針對rAAV顆粒及/或GAA蛋白之免疫反應之風險下時，本發明之核酸、載體或rAAV顆粒與免疫抑制劑或療法組合向患者投與。該免疫抑制劑或療法可在投與本發明之核酸、載體或rAAV載體之前、實質上同時或之後投與。
在一些實施例中，患有龐培氏病之個體或患者，諸如人類患者已發展出針對GAA蛋白之抑制物(包括抗GAA抗體及/或抗GAA T細胞)，其可在用傳統酶替代療法治療後(例如，在投與以重組方式產生之GAA蛋白後)發生。該等GAA抑制物之發展可發生在接受酶替代療法之患者中，尤其在患者具有不可偵測之GAA含量(如可為嬰兒型龐培氏病之情況)，使得患者之免疫系統將替代GAA蛋白視為「外來的」之情況。在某些實施例中，在投與本發明之rAAV載體之前、實質上同時或之後，向具有GAA抑制物之龐培氏患者投與一或多種意欲在患者中實現對GAA蛋白之免疫耐受性或緩和免疫反應之療法。實現對GAA蛋白之免疫耐受性或緩和免疫反應之該等療法可包括投與一或多種免疫抑制劑，包括但不限於甲胺喋呤、利妥昔單抗(rituximab)、靜脈內γ球蛋白(IVIG)、奧馬珠單抗(omalizumab)及合成疫苗顆粒(SVPTM )-雷帕黴素(囊封在生物可降解奈米顆粒中之雷帕黴素)；及/或投與一或多種免疫抑制方案或程序，諸如B細胞消耗、免疫吸收及血漿清除術(plasmapheresis)。
在某些實施例中，在投與rAAV載體之前、實質上同時或之後，rAAV載體與一或多種免疫抑制劑結合投與。在某些實施例中，例如在投與rAAV載體之後1-12、12-24或24-48小時、或2-4、4-6、6-8、8-10、10-14、14-20、20-25、25-30、30-50或超過50天。若在初始表現量一段時間，例如rAAV載體之後20-25、25-30、30-50、50-75、75-100、100-150、150-200或超過200天後所編碼蛋白質或抑制核酸有所減少，則在投與rAAV載體之後一段時間後如此投與免疫抑制劑。
在某些實施例中，免疫抑制劑為消炎劑。在某些實施例中，免疫抑制劑為類固醇，例如皮質類固醇。在某些實施例中，免疫抑制劑為潑尼松(prednisone)；潑尼龍(prednisolone)；環孢靈(cyclosporine) (例如，環孢靈A)；黴酚酸酯(mycophenolate)；B細胞靶向抗體，例如利妥昔單抗；蛋白酶體抑制劑，例如硼替佐米(bortezomib)；哺乳動物雷帕黴素標靶(mTOR)抑制劑，例如雷帕黴素；酪胺酸激酶抑制劑，例如依魯替尼(ibrutinib)；B細胞活化因子(BAFF)抑制劑；或增殖誘導配位體(APRIL)抑制劑或其衍生物。在某些實施例中，免疫抑制劑為抗IL-1 β劑(例如，抗IL-1β單株抗體康納單抗(canakinumab) (Ilaris® ))或抗IL-6劑(例如，抗IL-6抗體思魯庫單抗(sirukumab)或抗IL-6受體抗體托西利單抗(tocilizumab) (Actemra® ))或其組合。
包括單獨或與IL-10組合使用雷帕黴素之免疫抑制方案可用於降低、減少、抑制、預防或阻斷針對GAA蛋白之體液及細胞免疫反應。用本發明之AAV載體進行之肝基因轉移可用於藉由誘導調節T細胞(Treg)及其他機制誘導對GAA蛋白質之免疫耐受性。減少(克服)或避免針對全身基因轉移中之AAV的體液免疫性之策略包括投與高載體劑量，使用AAV空衣殼作為誘餌以吸收抗AAV抗體，投與免疫抑制藥物以降低、減少、抑制、預防或根除對AAV之體液免疫反應，改變AAV衣殼血清型或工程化AAV衣殼以較不容易中和抗體，使用血漿交換循環以吸收抗AAV免疫球蛋白，藉此減少抗AAV抗體力價，且使用諸如氣囊導管之遞送技術，隨後鹽水沖洗。該等策略描述於Mingozzi等人, 2013, Blood, 122:23-36中。誘導對龐培氏患者中之GAA之耐受性以改善治療性治療之程序及方法綜述於Doerfler等人, 2016, Mol. Ther., 3:15053中。
AAV空衣殼與rAAV載體之比可以在約100:1-50:1、約50:1-25:1、約25:1-10:1、約10:1-1:1、約1:1-1:10、約1:10-1:25、約1:25-1:50或約1:50-1:100內或之間。比率亦可為約2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1或10:1。
待投與之AAV空衣殼之量可基於特定個體中產生之AAV抗體之量(力價)來校準。AAV空衣殼可具有任何血清型，例如AAV (SEQ ID NO:30-32)、LK03 (SEQ ID NO:33)、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、Rh10、Rh74、AAV3B或AAV-2i8。
可替代地，或除此以外，可藉由直接肌肉內注射(例如，一或多根慢縮肌纖維)遞送rAAV載體。在另一替代方案中，引入股動脈中之導管可用於經由肝動脈向肝遞送rAAV載體。亦可採用諸如內窺鏡逆行胰膽管造影(ERCP)之非手術方式以將rAAV載體直接遞送至肝，藉此繞過血流及AAV抗體。諸如頜下腺之導管之其他導管系統亦可用作端口以將rAAV載體遞送至出現或具有先前存在的抗AAV抗體之個體中。
減少對AAV之體液免疫性之額外策略包括移除、耗盡、捕捉及/或失活AAV抗體之方法，該等方法通常稱作清除術，且更特定言之，涉及血液產物之血漿清除術。清除術或血漿清除術為一種方法，其中人類個體之血漿在離體(體外)經由在返回至患者之前經由添加、移除及/或置換組分修飾血漿的裝置循環。血漿清除術可用於自血液產物(例如，血漿)移除人類免疫球蛋白(例如，IgG、IgE、IgA、IgD)。此程序耗盡、捕捉、失活、減少或移除結合AAV之免疫球蛋白(抗體)，藉此降低所治療之個體中可促成AAV載體中和之AAV抗體之力價。實例為由AAV衣殼親和力基質管柱構成之裝置。使血液產物(例如血漿)通過AAV衣殼親和力基質將引起僅AAV抗體及所有同型(包括IgG、IgM等)之結合。
預測使用AAV衣殼親和力基質之足夠量的血漿清除術實質上移除AAV衣殼抗體，且降低人類中之AAV衣殼抗體力價(負荷)。在某些實施例中，所治療個體中之力價實質上降低至低水準(至＜ 1:5或更低，諸如＜ 1:4、或＜ 1:3、或＜1:2或＜ 1:1)。抗體力價之降低將為暫時的，因為產生AAV衣殼抗體之B淋巴細胞將預期在血漿清除術之前逐漸引起AAV衣殼抗體力價反彈至穩定狀態水準。
在預先存在之AAV抗體力價自1:100至1:1的情況下，約0.15% (對應於1:1.2之力價)、0.43% (1:1.4)、0.9% (1:1.9)、1.7% (1:2.7)及3.4% (1:4.4)之AAV抗體力價反彈分別發生在完成血漿清除法之後1小時、3小時、6小時、12小時及24小時。自此類個體暫時移除AAV抗體將對應於時間窗(例如，約24小時或更短，諸如12小時或更短、或6小時或更短、或3小時或更短、或2小時或更短、或1小時或更短)，在此期間AAV載體可向個體投與且預測有效地轉導靶組織而不實質性中和AAV載體與AAV抗體。
在預先存在之AAV抗體力價自1:1000至1:1的情況下，約0.15% (對應於1:2.5之力價)、0.4% (1:5.3)、0.9% (1:9.7)、1.7% (1:18)及3.4% (1:35)之AAV抗體力價反彈分別發生在完成血漿清除法之後1小時、3小時、6小時、12小時及24小時。因此，投與AAV載體之窗將相對較短。
AAV抗體可為先前存在的且可以減少或阻斷靶細胞之治療性GAA基因轉移載體轉導之含量存在。可替代地，AAV抗體可在暴露於AAV或投與AAV載體之後出現。若該等抗體在投與AAV載體之後出現，則此等個體亦可經由清除術、更特定言之血漿清除術來治療。
在一些實施例中，本發明之核酸、表現盒及AAV載體可以與對症療法及支持療法組合使用，包括例如呼吸支持(包括機械通氣)、加強肌肉之物理療法、提高強度及物理能力之生理療法、職業性療法(包括使用竹竿、步行器及輪椅)、改善關節及語言之語言療法、使用矯形外科裝置(包括支架)及確保適當的營養及體重增長的膳食療法及飼管。
在一些實施例中，本發明之核酸、表現盒及AAV載體可與藥理學伴隨蛋白療法(亦稱為酶增強療法)組合使用，其中在投與本發明之核酸、表現盒或AAV載體之前、同時或之後投與一或多種藥理學伴隨蛋白以治療GSD，諸如龐培氏病。
在一些實施例中，本發明之核酸、表現盒及AAV載體可與一或多種可穩定GAA蛋白之藥理學伴隨蛋白組合使用。可與本發明之核酸、表現盒及AAV載體組合使用之藥理學伴隨蛋白包括1-脫氧野尻黴素(1-DNJ，亦稱為杜格魯特(duvoglustat))、N -丁基-1-脫氧野尻黴素(亦稱為美格魯特(miglustat))、N-甲基-DNJ、N-乙基-DNJ、N-丙基-DNJ、N-戊基-DNJ、N-己基-DNJ、N-庚基-DNJ、N-辛基-DNJ、N-壬基-DNJ、N-甲基環丙基-DNJ、N-甲基環戊基-DNJ、N-2-羥乙基-DNJ、5-N-羧基戊基DNJ及美國專利6,599,919及9,181,184中及國際專利申請公開案WO/2013/182652中所述之藥理學伴隨蛋白。
在一些實施例中，本發明之核酸、表現盒及AAV載體可與輔助療法、與一或多種β2促效劑組合使用，包括例如克侖特羅(clenbuterol)、沙丁胺醇(albuterol)、福莫特羅(formoterol)及沙美特羅(salmeterol)及如國際專利申請公開案WO/2017/049161中所述。
在特定實施例中，本發明之核酸及表現盒經由AAV載體顆粒遞送或投與。在其他實施例中，本發明之核酸及表現盒可經由其他類型之病毒顆粒，包括逆轉錄病毒、腺病毒、輔助依賴型腺病毒、雜交腺病毒、單純疱疹病毒、慢病毒、痘病毒、埃-巴二氏病毒(Epstein-Barr virus)、痘瘡病毒及人類巨細胞病毒顆粒遞送或投與。
在其他實施例中，本發明之核酸及表現盒藉由非病毒遞送系統遞送或投與。非病毒遞送系統包括例如化學方法，諸如脂質體、奈米顆粒、脂質奈米顆粒、聚合物、微米顆粒、微膠囊、微胞或細胞外囊泡；及物理方法，諸如基因槍、電穿孔、顆粒轟擊、超音波利用率及磁轉染。
在一些實施例中，本發明之核酸及表現盒以封端線性雙螺旋體DNA之裸DNA、微環、轉座子形式遞送。
在其他實施例中，本發明之核酸及表現盒在AAV載體顆粒或其他病毒顆粒中遞送或投與，該等顆粒進一步囊封或與脂質體、奈米顆粒、脂質奈米顆粒、聚合物、微米顆粒、微膠囊、微胞或細胞外囊泡複合。
「脂質奈米顆粒」或「LNP」係指基於脂質之小泡，其適用於遞送AAV且具有奈米級尺寸，亦即約10 nm至約1000 nm、或約50至約500 nm、或約75至約127 nm。不受理論束縛，咸信在部分或完全屏蔽免疫系統之情況下LNP提供核酸、表現盒或AAV載體。屏蔽使核酸、表現盒或AAV載體遞送至組織或細胞，同時避免活體內誘導針對核酸、表現盒或AAV載體之實質性免疫反應。屏蔽亦可允許重複投與而不活體內(例如，諸如人類之個體中)誘導針對核酸、表現載體或AAV載體之實質性免疫反應。屏蔽亦可提高或增大活體內核酸、表現盒或AAV載體遞送效率。
AAV之pI (等電點)在約6至約6.5範圍內。因此，AAV表面攜有輕微負電荷。因此，對於LNP，包含諸如胺基脂質之陽離子脂質可為有益的。例示性胺基脂質已描述於美國專利第9,352,042號、第9,220,683號、第9,186,325號、第9,139,554號、第9,126,966號、第9,018,187號、第8,999,351號、第8,722,082號、第8,642,076號、第8,569,256號、第8,466,122號及第7,745,651號及美國專利公開案第2016/0213785號、第2016/0199485號、第2015/0265708號、第2014/0288146號、第2013/0123338號、第2013/0116307號、第2013/0064894號、第2012/0172411號及第2010/0117125號中。
術語「陽離子脂質」及「胺基脂質」在本文中可互換地使用以包括具有一個、兩個、三個或更多脂肪酸或脂肪烷基鏈及pH可滴定胺基(例如，烷基胺基或二烷基胺基)之彼等脂質及其鹽。陽離子脂質通常在低於陽離子脂質之pKa之pH下質子化(亦即帶正電)且在高於pKa之pH下為實質上中性的。陽離子脂質亦可為可滴定陽離子脂質。在一些實施例中，陽離子脂質包含：可質子化三級胺(例如，pH可滴定)基團；C18烷基鏈，其中各烷基鏈獨立地具有0至3個(例如，0、1、2或3個)雙鍵；及頭基與烷基鏈之間的醚鍵、酯鍵或縮酮鍵。
陽離子脂質可包括但不限於1,2-二亞油氧基-N,N-二甲基胺基丙烷(DLinDMA)、1,2-二亞麻氧基-N,N-二甲基胺基丙烷(DLenDMA)、1,2-二-γ-亞麻氧基-N,N-二甲基胺基丙烷(γ-DLenDMA)、2,2-二亞油基-4-(2-二甲基胺基乙基)-[1,3]-二氧雜環戊烷(DLin-K-C2-DMA，亦稱為DLin-C2K-DMA、XTC2及C2K)、2,2-二亞油基-4-二甲基胺基甲基-[1,3]-二氧雜環戊烷(DLin-K-DMA)、二亞油醯基甲基-3-二甲基胺基丙酸酯(DLin-M-C2-DMA，亦稱為MC2)、4-(二甲基胺基)丁酸(6Z,9Z,28Z,31 Z)-三十七烷-6,9,28,31-四烯-19-基酯(DLin-M-C3-DMA，亦稱為MC3)、其鹽及其混合物。其他陽離子脂質亦包括但不限於1,2-二硬脂基氧基-N,N-二甲基-3-胺基丙烷(DSDMA)、1,2-二油烯基氧基-N,N-二甲基-3-胺基丙烷(DODMA)、2,2-二亞油基-4-(3-二甲基胺基丙基)-[1,3]-二氧雜環戊烷(DLin-K-C3-DMA)、2,2-二亞油基-4-(3-二甲胺基丁基)-[1,3]-二氧雜環戊烷(DLin-K-C4-DMA)、DLen-C2K-DMA、γ-DLen-C2K-DMA及(DLin-MP-DMA) (亦稱為1-B11)。
又其他陽離子脂質可包括但不限於2,2-二亞油基-5-二甲胺基甲基-[1,3]-二噁烷(DLin-K6-DMA)、2,2-二亞油基-4-N-甲基哌嗪并-[1,3]-二氧雜環戊烷(DLin-K-MPZ)、1,2-二亞油基胺甲醯基氧基-3-二甲基胺基丙烷(DLin-C-DAP)、1,2-二亞油基氧基-3-(二甲基胺基)乙醯氧基丙烷(DLin-DAC)、1,2-二亞油基氧基-3-(N-嗎啉基)丙烷(DLin-MA)、1,2-二亞油醯基-3-二甲基胺基丙烷(DLinDAP)、1,2-二亞油基硫基-3-二甲基胺基丙烷(DLin-S-DMA)、1-亞油醯基-2-亞油氧基-3-二甲基胺基丙烷(DLin-2-DMAP)、1,2-二亞油氧基-3-三甲基胺基丙烷氯鹽(DLin-TMA.Cl)、1,2-二亞油醯基-3-三甲基胺基丙烷氯鹽(DLin-TAP.Cl)、1,2-二亞油氧基-3-(N-甲基哌嗪基)丙烷(DLin-MPZ)、3-(N,N-二亞油基胺基)-1,2-丙二醇(DLinAP)、3-(N,N-二油烯基胺基)-1,2-丙二醇(DOAP)、1,2-二亞油基側氧基-3-(2-N,N-二甲基胺基)乙氧基丙烷(DLin-EG-DMA)、N,N-二油基-N,N-二甲基銨氯化物(DODAC)、N-(1-(2,3-二油烯基氧基)丙基)-N,N,N-三甲銨氯化物(DOTMA)、N,N-二硬脂基-N,N-二甲基銨溴化物(DDAB)、N-(1-(2,3-二油醯氧基)丙基)-N,N,N-三甲銨氯化物(DOTAP)、3-(N-(N',N'-二甲基胺基乙烷)-胺甲醯基)膽固醇(DC-Chol)、N-(1,2-二肉豆蔻基氧基丙-3-基)-N,N-二甲基-N-羥乙基銨溴化物(DMRIE)、2,3-二油烯基氧基-N-[2(精胺-甲醯胺基)乙基]-N,N-二甲基-1-丙銨三氟乙酸鹽(DOSPA)、二十八烷基醯胺基甘胺醯基精胺(DOGS)、3-二甲基胺基-2-(膽甾-5-烯-3-β-氧基丁-4-氧基)-1-(順,順-9,12-十八碳二烯氧基)丙烷(CLinDMA)、2-[5'-(膽甾-5-烯-3-β-氧基)-3'-氧雜戊烯氧基)-3-二甲基-1-(順,順-9',1-2'-十八碳二烯氧基)丙烷(CpLinDMA)、N,N-二甲基-3,4-二油烯基氧基苯甲胺(DMOBA)、1,2-N,N'-二油烯基胺甲醯基-3-二甲基胺基丙烷(DOcarbDAP)、1,2-N,N'-二亞油基胺甲醯基-3-二甲基胺基丙烷(DLincarbDAP)、地塞米松-精胺(DS)及二取代精胺(D2S)或其混合物。
可使用多種市售陽離子脂質製劑，諸如LIPOFECTIN® (包括DOTMA及DOPE，可購自GIBCO/BRL)及LIPOFECTAMINE® (包含DOSPA及DOPE，可購自GIBCO/BRL)。
在某些實施例中，陽離子脂質可以約10重量%之LNP至約85重量%之脂質奈米顆粒或約50重量%之LNP至約75重量%之LNP之量存在。
固醇可賦予LNP流動性。如本文所用，「固醇」係指植物(植物固醇)或動物(動物固醇)來源之任何天然存在之固醇以及非天然存在之合成固醇，其所有由類固醇A-環之3-位置處之羥基之存在表徵。固醇可為習知用於脂質體、脂質小泡或脂質顆粒製劑之領域的任何固醇，最常為膽固醇。植物固醇可包括菜油固醇、植固醇及豆固醇。固醇亦包括固醇修飾之脂質，諸如美國專利申請案公開案2011/0177156中所述之脂質。在一些實施例中，固醇可以約5重量%之LNP至約50重量%之脂質奈米顆粒或約10重量%之LNP至約25重量%之LNP之量存在。
LNP可包含中性脂質。中性脂質可包含在生理pH下以不帶電或中性兩性離子形式存在之任何脂質物種。該等脂質包括但不限於二醯基磷脂醯膽鹼、二醯基磷脂醯乙醇胺、腦醯胺、鞘磷脂、二氫鞘磷脂、腦磷脂及腦苷脂。對中性脂質之選擇通常藉由尤其考慮粒度及必需穩定性來進行引導。在一些實施例中，中性脂質組分可為具有兩個醯基之脂質(例如，二醯基磷脂醯膽鹼及二醯基磷脂醯乙醇胺)。
具有不同鏈長及飽和度之多種醯基鏈基團之脂質為可用的，或可藉由熟知技術分離或合成。在一些實施例中，可使用含有飽和脂肪酸且碳鏈長度在C14至C22之範圍內之脂質。在另一組實施例中，使用具有單或二不飽和脂肪酸且碳鏈長度在C14至C22之範圍內之脂質。另外，可使用具有飽和及不飽和脂肪酸鏈之混合物之脂質。例示性中性脂質包括但不限於1,2-二油醯基-sn-甘油基-3-磷脂醯基-乙醇胺(DOPE)、1,2-二硬脂醯基-sn-甘油基-3-磷酸膽鹼(DSPC)、1-棕櫚醯基-2-油醯基-sn-甘油基-3-磷酸膽鹼(POPC)或任何相關磷脂醯膽鹼。中性脂質亦可由鞘磷脂、二氫鞘磷脂或具有其他頭基之磷脂(諸如絲胺酸及肌醇)構成。
在一些實施例中，中性脂質可以約0.1重量%之脂質奈米顆粒至約75重量%之LNP或約5重量%之LNP至約15重量%之LNP之量存在。
LNP囊封之核酸、表現盒及AAV載體可併入醫藥組合物，例如醫藥學上可接受之載劑或賦形劑中。該等醫藥組合物尤其適用於活體內或離體向個體投與及遞送囊封酸、表現盒及AAV載體之LNP。
LNP之製劑可與額外組分合併。非限制性實例包括聚乙二醇(PEG)及固醇。
術語「PEG」係指聚乙二醇，一種具有兩個末端羥基之乙烯PEG重複單元之線性可溶於水的聚合物。PEG由其分子量分類；例如PEG 2000之平均分子量為約2,000道爾頓，且PEG 5000之平均分子量為約5,000道爾頓。PEG可購自Sigma Chemical Co.及其他公司，且包括例如以下功能性PEG：單甲氧基聚乙二醇(MePEG-OH)、單甲氧基聚乙二醇-丁二酸酯(MePEG-S)、單甲氧基聚乙二醇-丁二酸丁二醯亞胺酯(MePEG-S-NHS)、單甲氧基聚乙二醇-胺(MePEG-NH2)、單甲氧基聚乙二醇-三氟乙磺酸酯(MePEG-TRES)及單甲氧基聚乙二醇-咪唑基-羰基(MePEG-IM)。
在一些實施例中，PEG可為平均分子量為約550至約10,000道爾頓之聚乙二醇，且視情況經烷基、烷氧基、醯基或芳基取代。在一些實施例中，PEG可在末端羥基位置處經甲基取代。在另一較佳實施例中，PEG之平均分子量可為約750至約5,000道爾頓、或約1,000至約5,000道爾頓、或約1,500至約3,000道爾頓、或約2,000道爾頓或為約750道爾頓。PEG可視情況經烷基、烷氧基、醯基或芳基取代。在一些實施例中，末端羥基可經甲氧基或甲基取代。
經PEG修飾之脂質包括美國專利第8,936,942號及第7,803,397號中所述之PEG-二烷氧基丙基共軛物(PEG-DAA)。適用的經PEG修飾之脂質(或脂質-聚氧乙烯共軛物)可具有多個「錨定」脂質部分以將PEG部分固定於脂質小泡之表面上。適合的經PEG修飾之脂質之實例包括經PEG修飾之磷脂醯乙醇胺及磷脂酸、美國專利第5,820,873號中所述之PEG-腦醯胺共軛物(例如，PEG-CerC14或PEG-CerC20)、經PEG修飾之二烷基胺及經PEG修飾之1,2-二醯基氧基丙-3-胺。在一些實施例中，經PEG修飾之脂質可為經PEG修飾之二醯基甘油及二烷基甘油。在一些實施例中，PEG可呈約0.5重量%之LNP至約20重量%之LNP、或約5重量%之LNP至約15重量%之LNP之量。
此外，LNP可為經PEG修飾之及經固醇修飾之LNP。與額外組分組合之LNP可為相同的或分開的LNP。換言之，相同LNP可經PEG修飾及固醇修飾，或替代地，第一LNP可經PEG修飾且第二LNP可經固醇修飾。視情況，第一及第二經修飾之LNP可合併。
在一些實施例中，在囊封之前，LNP之尺寸可在約10 nm至500 nm、或約50 nm至約200 nm、或75 nm至約125 nm範圍內。在一些實施例中，LNP囊封之核酸、表現載體或AAV載體之尺寸可在約10 nm至500 nm範圍內。
能夠表現本發明之GAA序列之重組細胞可用於遞送或投與。
諸如微環及轉座子之裸DNA可用於投與或遞送或慢病毒載體。另外，諸如鋅指核酸酶、大範圍核酸酶、TALEN及CRISPR之基因編輯技術亦可用於遞送本發明之編碼序列。
肝糖貯積病(GSD)由最終將肝糖化合物轉化為葡萄糖之酶之缺乏產生。酶缺乏症導致肝糖在組織中積累。在許多情況下，缺陷具有全身性結果，但在一些情況下，缺陷限於特定組織。儘管某些GSD表現為特定症候群，諸如低血糖癲癇或心肥大，但大部分患者經歷肌肉症狀，諸如虛弱及痙攣。
以下為GSD之非限制性實例： 0-肝糖合成酶缺乏症；Ia-葡萄糖-6-磷酸酶缺乏症(馮吉爾克氏病)；II-酸性麥芽糖酶缺乏症(龐培氏病)；III-去分支酶缺乏症(福貝斯-柯里氏病)；IV-轉葡萄糖苷酶缺乏症(安德森疾病，澱粉黏膠質病)；V-肌磷酸化酶缺乏症(麥克阿德爾氏病)；VI-磷酸化酶缺乏症(赫氏病)；及VII-磷酸果糖激酶缺乏症(塔瑞氏病)。
各種形式之GSD影響代謝碳水化合物路徑。儘管在文獻中討論至少14種獨特的GSD，但臨床上引起顯著肌無力之4種為龐培氏病(II型GSD，酸性麥芽糖酶缺乏症)、柯里氏病(IIIa型GSD，去分支酶缺乏症)、麥克阿德爾氏病(V型GSD，肌磷酸化酶缺乏症)及塔瑞氏病(VII型GSD，磷酸果糖激酶缺乏症)。一種形式—馮吉爾克氏病(Ia型GSD，葡萄糖-6-磷酸酶缺乏症)造成具有顯著發病率之臨床上顯著的末梢器官疾病。
一般而言，GSD遺傳為常染色體隱性病況。此等遺傳性酶缺陷通常存在於兒童中，但其中一些，諸如馮吉爾克氏病及龐培氏病具有獨立的成年發病型形式。
GSD可藉由酶替代療法(ERT)，例如藉由以重組方式產生之GAA治療。酶替代療法為用於患有龐培氏病之所有患者之經批准的治療。其涉及靜脈內投與重組型人類酸性α葡萄糖苷酶。由Genzyme (Sanofi Corporation)製造之此治療為Lumizyme (以Myozyme在美國外銷售)，且首先在2006年經美國食品與藥物管理局(FDA)批准。其已批准用於患有龐培氏病之所有患者。ERT之益處可藉由抗體形成減弱，因此ERT亦可與免疫表現組合。
GSD可藉由膳食療法治療，其涉及對膳食療法之嚴格的順適性，可減小肝尺寸、預防低血糖、允許症狀減少，且允許生長及發育。
龐培氏病之額外治療為對症的且支持性的。可能需要呼吸支持，因為大多數患者具有一定程度之呼吸損害及/或呼吸衰竭。物理療法可對增強呼吸肌肉有幫助。一些患者可能需要在一天之夜晚及/或白天期間藉由機械通氣(亦即，雙耳或體積呼吸機)進行呼吸輔助。另外，可能在呼吸道感染期間需要額外支持。機械通氣支持可藉由非侵入性或侵入性技術。關於呼吸支持之持續時間的決定最佳藉由該家族基於患者之特殊性對患者之醫師及醫療小組之其他成員進行謹慎諮詢。高蛋白膳食可有益於非嬰兒形式之龐培氏。
建議生理療法以提高強度及物理能力。可能需要職業性療法，包括使用竹竿或步行器。最終，一些個體可能需要使用輪椅。語言療法可有益於改善一些患者之關節及語言。
可推薦包括支架之整形外科裝置用於一些患者。對於諸如攣縮或脊椎變形之某些矯形外科症狀可能需要手術。
由於龐培氏病可使用於咀嚼及吞咽之肌肉變弱，因此可能需要量測以確保適當營養及體重增長。一些患者可能需要專門的高卡路里飲食且可能需要學習改變食物之尺寸及質地之技術以降低抽吸風險。一些嬰兒可能需要插入穿過鼻、至食道下方且進入胃(鼻胃管)之飼管。在一些兒童中，可需要經由腹壁中的較小手術開口將飼管直接插入胃中。患有晚發型龐培氏病之一些個體可能需要軟的膳食，但很少需要飼管。
可對一或多種肝酶針對治療之不良反應測試個體或以確定該等個體、先前治療是否適合於根據本發明之方法治療。因此可根據本發明之方法在治療之前或之後針對一或多種肝酶之量篩檢候選個體。可在治療升高之肝酶之後週期性地(例如每1-4週、1-6個月、6-12個月或1、2、3、4、5年或更久)監測所治療個體。
例示性肝酶包括丙胺酸轉胺酶(ALT)、天冬胺酸胺基轉移酶(AST)及乳酸脫氫酶(LDH)，然而亦可監測指示肝損傷之其他酶。循環中之此等酶之正常含量循環定義為具有上限含量之範圍，高於該範圍，認為酶含量升高，且因此指示肝臟損傷。正常範圍部分地視進行檢測之臨床實驗室所用的標準而定。
本發明提供其中具有封裝材料及一或多種組分之套組。套組通常包括標籤或藥品說明書，其包括各組分之描述或其中各組分之活體外、活體內或離體使用說明書。套組可含有該等組分之集合，例如rAAV顆粒及視情況選用之第二活性劑，諸如另一種化合物、藥劑、藥物或組合物。
套組係指容納套組之一或多種組分的實體結構。封裝材料可以維持組分無菌，且可以由常用於該等目的之材料(例如紙、波紋狀纖維、玻璃、塑料、箔、安瓿、小瓶、管等)製成。
標籤或插頁可包括其中之一或多種組分之鑑別資訊、劑量、包括作用機制、藥物動力學及藥效學之活性成分之臨床藥理學。標籤或插頁可包括指明製造商、批號、製造地點及日期、使用效期等資訊。標籤或插頁可以包括指明製造商資訊、批號、製造地點及日期的資訊。標籤或插頁可包括關於可使用套組組分之疾病的資訊。標籤或插頁可包括臨床醫師或個體在方法、用途或治療方案或治療療程中使用一或多個套組組分之說明書。說明書可包括用於操作本文所述之任一種方法、用途、治療方案或預防或治療療程中之劑量、頻率或持續時間及說明書。
標籤或插頁可包括關於組分可提供之任何益處之資訊，諸如預防或治療效益。標籤或插頁可包括關於潛在不良副作用、併發症或反應之資訊，諸如個體或臨床醫師關於可能不適合使用特定組合物之情況的警告。當個體已接受、將接受或當前正接受一或多種可能與組合物不相容之其他藥物，或個體已經歷、將經歷或當前正經歷會與組合物不相容之另一治療方案或治療療程時，亦可能出現不良副作用或併發症，且因此，說明書可包括關於該等不相容性之資訊。
標籤或插頁包括「印刷品」，例如紙或紙板，或為單獨或附著在組分、套組或封裝材料(例如盒)上，或附接在含有套組組分的安瓿、管或小瓶上。標籤或插頁可另外包括電腦可讀取媒體，諸如條碼印刷標籤；碟、光碟，諸如CD-ROM/RAM或DVD-ROM/RAM、DVD、MP3、磁帶；或電儲存媒體，諸如RAM及ROM，或此等之混合，諸如磁/光學儲存媒體、FLASH媒體或記憶卡。
除非另外定義，否則本文所用之所有技術及科學術語均具有與本發明所屬領域之一般技術者通常所理解相同之含義。儘管可以採用與本文所述之方法及材料類似或等效之方法及材料來操作或測試本發明，但本文仍會描述適合方法及材料。
本文中引述的所有專利、專利申請案、公開案及其他參考文獻、基因庫引用及ATCC引用均以全文引用之方式併入。若有衝突之情況，將以本說明書(包括定義)為準。
本文揭示之所有特點均可依任何組合合併。本說明書中揭示之各特點可被用於相同、等效或類似目的之替代性特點置換。因此，除非另外明確說明，否則所揭示特點(例如，編碼GAA之經修飾之核酸、包含編碼GAA之經修飾之核酸的表現盒、及包含編碼GAA之經修飾之核酸的rAAV顆粒)為等效或類似特點之屬類實例。
如本文所用，除非上下文另外明確指示，否則單數形式「一(a/an)」及「該」包括複數個指示物。因此，例如，提及「核酸」包括複數個該等核酸，提及「載體」包括複數個該等載體，且提及「病毒」或「顆粒」包括複數個該等病毒/顆粒。
除非上下文另外明確地指示，否則如本文中所用，所有數值或數值範圍包括該等範圍內之整數及該等範圍內之該等值或整數之分數。因此，為了說明，提及86%或更多的一致性包括86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、100%等以及86.1%、86.2%、86.3%、86.4%、86.5%等、87.1%、88.2%、88.3%、88.4%、88.5%等等。
提及具有大於(高於)或小於之整數分別包括大於或小於參考數目之任何數目。因此，例如，提及小於127包括126、125、124、123、122、121、120、119、118、117、116、115、114、113、112、111、110等，一直降至零(0)；及小於10包括9、8、7等，一直降至零(0)。
如本文所用，除非上下文另外明確地指示，否則所有數值或範圍包括該等範圍及子範圍內之該等值及整數之子範圍及分數及錯誤的1以及該等範圍內的整數之子範圍及分數。因此，為了說明，提及數值範圍，諸如1-10包括1-2、1-3、1-4、1-5、1-6、1-7、1-8、1-9、2-3、2-4、2-5、2-6、2-7、2-8、2-9、2-10、3-4、3-5、3-6、3-7、3-8、3-9、3-10等；及1、2、3、4、5、6、7、8、9、10以及1.1、1.2、1.3、1.4、1.5等等。因此，提及1-50之範圍包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20等，直至且包括50，以及1.1、1.2、1.3、1.4、1.5等、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5等等。
提及一系列範圍包括組合系列內不同範圍之邊界之值的範圍。因此，為了說明，提及一系列範圍，例如1-10、10-20、20-30、30-40、40-50、50-60、60-75、75-100、100-150、150-200、200-250、250-300、300-400、400-500、500-750、750-850包括1-20、1-30、1-40、1-50、1-60、10-30、10-40、10-50、10-60、10-70、10-80、20-40、20-50、20-60、20-70、20-80、20-90、50-75、50-100、50-150、50-200、50-250、100-200、100-250、100-300、100-350、100-400、100-500、150-250、150-300、150-350、150-400、150-450、150-500等之範圍。
本文中使用肯定的語言描述多個實施例及態樣來大體揭示本發明。本發明亦特別包括其中特定主題經完全或部分排除的實施例，諸如物質或材料、方法步驟及條件、方案或程序。舉例而言，在本發明之某些實施例或態樣中，排除材料及/或方法步驟。因此，儘管本文中未依本發明不包括的內容來大體表述本發明，但本文揭示了未明確排除於本發明中的態樣。
已描述許多本發明之實施例。然而，熟習此項技術者在不背離本發明之精神及範疇的情況下可對本發明作出各種改變及修改以使其適應各種用途及條件。因此，以下實例旨在說明而非以任何方式限制所主張之本發明之範疇。實例 1 表 1 - GAA 表現盒概述
Figure 108116960-A0304-0001
 * SPK-AAV-010封裝於AAV6衣殼中，且所有其他者封裝於AAV-4-1衣殼變異體中，描述於國際專利申請公開案WO 2016/210170中。
GAA表現盒展示於圖1至9中。所有含有5'及3'側接AAV反向末端重複序列(ITR)，肝特異性ApoE/hAAT增強子/啟動子序列以可操作方式連接至經最佳化之GAA編碼序列，包括人類血紅素子單元β (HBB2)內含子，隨後野生型或CpG減少之牛生長激素(bGH)聚腺苷酸化(poly A)序列。SEQ ID NO:1 ： GAA2之核酸序列
Figure 02_image001
SEQ ID NO:2 ： GAA5之核酸序列
Figure 02_image003
Figure 02_image005
SEQ ID NO:3 ： GAA7之核酸序列
Figure 02_image007
Figure 02_image009
SEQ ID NO:4 ： GAA8之核酸序列
Figure 02_image011
SEQ ID NO:5 ： GAA13之核酸序列
Figure 02_image013
Figure 02_image015
SEQ ID NO:6 ： GAA2加WT BGH poly A之核酸序列
Figure 02_image017
Figure 02_image019
SEQ ID NO:7 ： GAA5加WT BGH poly A之核酸序列
Figure 02_image021
Figure 02_image023
SEQ ID NO:8 ： GAA7加WT BGH poly A之核酸序列
Figure 02_image025
SEQ ID NO:9 ：GAA8加WT BGH poly A之核酸序列
Figure 02_image027
Figure 02_image029
SEQ ID NO:10 ： GAA13加WT BGH poly A之核酸序列
Figure 02_image031
Figure 02_image033
SEQ ID NO:11 ： GAA2加CpG減少之BGH poly A之核酸序列
Figure 02_image035
Figure 02_image037
SEQ ID NO:12 ： GAA5加CpG減少之BGH poly A之核酸序列
Figure 02_image039
SEQ ID NO:13 ： GAA7加CpG減少之BGH poly A之核酸序列
Figure 02_image041
SEQ ID NO:14 ： GAA8加CpG減少之BGH poly A之核酸序列
Figure 02_image043
Figure 02_image045
SEQ ID NO:15 ： GAA13加CpG減少之BGH poly A之核酸序列
Figure 02_image047
Figure 02_image049
＞pAAV-ApoE/hAAT.fixUTR.GAA13.BGH (SEQ ID NO:16)
Figure 02_image051
Figure 02_image053
＞pAAV-ApoE/hAAT.GAA13.BGH (SEQ ID NO:17)
Figure 02_image055
Figure 02_image057
＞pAAV-ApoE/hAAT.GAA7.BGH (SEQ ID NO:18)
Figure 02_image059
Figure 02_image061
＞pAAV-ApoE/hAAT.GAA8.BGH (SEQ ID NO:19)
Figure 02_image063
Figure 02_image065
＞pAAV-ApoE/hAAT.GAA2. wtBGH (SEQ ID NO:20)
Figure 02_image067
Figure 02_image069
＞pAAV-ApoE/hAAT.GAA5.wtBGH (SEQ ID NO:21)
Figure 02_image071
Figure 02_image073
＞pAAV-ApoE/hAAT.GAA7.wtBGH (SEQ ID NO:22)
Figure 02_image075
Figure 02_image077
＞pAAV-ApoE/hAAT.GAA8.wtBGH (SEQ ID NO:23)
Figure 02_image079
Figure 02_image081
＞pAAV-ApoE/hAAT.GAA13.wtBGH (SEQ ID NO:24)
Figure 02_image083
Figure 02_image085
SEQ ID NO:25 ： 分泌型GAA蛋白之胺基酸序列
Figure 02_image087
SEQ ID NO:26 ： CpG減少之BGH poly A  核酸序列
Figure 02_image089
SEQ ID NO:27 ： wtBGH poly A核酸序列
Figure 02_image091
SEQ ID NO:28 ： 由ApaI限制位點界定之ApoE/hAAT序列(下劃線)。
Figure 02_image093
SEQ ID NO:29 ： ApoE/hAAT序列。
Figure 02_image095
AAV載體衣殼：
Figure 02_image097
Figure 02_image099
實例 2 研究設計 - 活體外效能 ( Huh7 細胞 )
為評估GAA表現盒之效能，使用Lipofectamine® 2000 (ThermoFisher)將與各盒對應之200 ng 質體DNA經轉染至人類肝細胞癌細胞株(Huh7)中。在48小時培育之後，藉由GAA活性檢測針對GAA之含量評估來自經攜帶各表現盒之質體轉染之細胞的培養基之樣本，且標準化為細胞內蛋白質含量。結果
圖10展示藉由GAA活性檢測評估Huh7細胞中之活體外不同GAA表現質體。結果為生物複本n=3之平均值。誤差條表示標準差。
除GAA5.wtBGH之外，與綠色螢光蛋白(GFP)對照質體相比，所有質體展示增加之表現量之分泌GAA，指示此等質體引起GAA蛋白產物表現(圖10)。一般而言，「BGH」質體(具有CpG減少之poly A序列)勝過「wtBGH」質體(具有野生型bGH poly A)。另外，經密碼子最佳化之序列GAA2、GAA7、GAA 8及GAA13看起來相對類似，具有自GAA13質體之較高表現的趨勢。在與親本spΔGAApar質體相比時觀測到表現量之總體降低。實例 3 研究設計 - 藉由小鼠中之流體動力學注射之盒效能
為了評估哺乳動物中不同GAA表現盒之效能，藉由流體動力學注射在橫向尾部靜脈中經靜脈內將與各盒對應之25微克質體DNA引入雄性C57BL/6小鼠(大約8週齡)中。在注射後72小時收集血漿且藉由GAA活性檢測及西方墨點評估循環GAA酶存在。結果
圖11及12展示分別藉由GAA活性檢測及西方墨點藉由在雄性C57BL/6小鼠中流體動力學注射在血漿中評估不同GAA表現盒。對於圖11，GAA之血漿含量標準化為親本構建體(spΔGAApar)。結果為生物複本n=4-5之平均值。誤差條表示標準差。NS為不顯著。* p＜0.05，** p＜0.01。
對於圖12，血漿之GAA西方墨點分析，條形圖表示標準化為底部非特異性條帶之上部條帶的定量。展示生物複本(每組n=4-5)中之各者。
藉由流體動力學注射在小鼠中評估經密碼子最佳化之GAA表現盒揭示此等盒能夠表現及分泌來自小鼠肝中之GAA轉殖基因產物其中含量類似於用親本GAA構建體spΔGAApar觀測到之含量(圖11)。如在Huh7細胞中之活體外研究中(實例2)，具有CpG減少之BGH poly A序列之GAA表現盒勝過具有野生型BGH poly A之彼等。出乎意料地，與實例2之結果相比，一些經密碼子最佳化之GAA構建體進行地與親本spΔGAApar質體一樣好或更好。實例 4 研究設計 - 小鼠中之載體效能
為了評估與親本盒spΔGAApar相比本發明之經密碼子最佳化之GAA盒之效能，將spΔGAApar及9個經密碼子最佳化之盒封裝至包含SEQ ID NO:30-32衣殼之AAV載體中(表1)。每組五隻雄性C57BL/6小鼠經由尾部靜脈靜脈內注射有1/2載體劑量(5 × 1011 vg/kg或2 × 1012 vg/kg)。在向小鼠投與AAV載體之後縱向量測循環GAA活性。每週兩次測試血漿之GAA活性。在第70天，處死7/10測試動物組，且在第147天處死剩餘三組(SPK-AAV-01、SPK-AAV-02及親本載體)。結果
圖13展示在載體輸注後70天在血漿中藉由GAA活性檢測評估封裝於雄性C57BL/6小鼠中之AAV (SEQ ID NO:30-32)載體中之不同經密碼子最佳化之GAA表現盒。結果為生物複本n=4-5之平均值。誤差條表示標準差。NS為不顯著。* p＜0.05，** p＜0.01。
在與親本載體(在本文中指定為SPK-AAV-11)相比時，兩個載體SPK-AAV-01及SPK-AAV-02不斷地展示血漿中顯著較高的GAA活性(在高劑量中高大約2至3倍)。
圖14展示載體輸注後7天在血漿中藉由GAA西方墨點評估雄性C57BL/6小鼠中封裝至AAV (SEQ ID NO:30-32)中載體之不同經密碼子最佳化之GAA表現盒。結果為生物複本n=4-5之平均值。誤差條表示標準差。NS為不顯著。* p＜0.05，** p＜0.01。
圖15展示在向小鼠投與封裝至AAV (SEQ ID NO:30-32)載體中之經密碼子最佳化之GAA表現盒後在血漿中量測之GAA活性含量。雄性C57BL/6小鼠注射有5 × 1011 (上圖)或2 × 1012 vg/kg (下圖)之劑量之兩個最佳進行GAA表現AAV (SEQ ID NO:30-32)載體(n=5隻動物/組) 展示在接受SPK-AAV-11載體(親本spΔGAApar構建體)之小鼠之血漿中量測之GAA活性以用於比較。開始於第42天，對於SPK-AAV-01及SPK-AAV-02載體比起SPK-AAV-11載體(***p=＜0.001，****p=＜0.0001 Tukey多重比較測試)，血漿中之GAA活性顯著較高。實例 5 研究設計 - 大鼠中之效能
此研究之目的為評估兩個不同大鼠品系中之SPK-AAV-02之效能。在向Wistar Hanover (n=4)及Sprague Dawley (n=5)大鼠投與載體之後在血漿中量測循環GAA活性。雄性大鼠經由尾部靜脈靜脈內注射有2 × 1013 vg/kg之載體。結果
圖16展示藉由血漿中之GAA活性檢測，與C57BL/6小鼠相比，評估雄性Wistar Hanover及Sprague Dawley大鼠中之SPK-AAV-02 (封裝至AAV (SEQ ID NO:30-32)中之pAAV-ApoE/hAAT.GAA13.BGH)載體。結果為生物複本n=4-5之平均值。誤差條表示標準差。
GAA活性含量在第28天開始平穩，其中GAA活性量測為約15,000 nmol/hr/mL。小鼠以比大鼠低10倍的劑量(2 × 1012 vg/kg之載體)注射有SPK-AAV-02。實例 6 研究設計 - 非人類靈長類動物 ( NHP ) 中之效能 ， 部分 1
為評估分泌型GAA表現之長期效果，向系統發生學上接近人類之物種投與單次劑量之SPK-AAV-01、SPK-AAV-02或SPK-AAV-10載體，針對血漿中之GAA活性含量評估恆河猴(恆河獼猴)及動物。
雄性恆河猴(n=3/劑量群組)在6 × 1012 vg/kg之SPK-AAV-01、SPK-AAV-02或SPK-AAV-10載體之單次劑量之隱靜脈中接受30分鐘之IV輸注。在AAV載體投與之後，每日監測動物之臨床觀測結果，且每週收集血液。結果
恆河猴注射有6 × 1012 vg/kg之劑量之GAA表現AAV (SEQ ID NO:30-32)載體(n= 3隻動物/組)。圖17展示在向雄性恆河猴投與封裝至AAV (SEQ ID NO:30-32)載體中之GAA表現盒後在血漿中量測之GAA活性含量。在SPK-AAV-01、SPK-AAV-02及SPK-AAV-10載體注射之NHP之血漿GAA活性含量中觀測不到顯著差異。
NHP研究中之初步資料確認小鼠研究中觀測到之結果，且展示由投與SPK-AAV-01及SPK-AAV-02產生之血漿GAA活性含量類似(圖17)。實例 7 研究設計 - 非人類靈長類動物中之效能 ， 部分 2
此研究之主要目標為在非洲綠猴(AGM；綠猴(Chlorocebus sabaeus ))中評估SPK-AAV-01及SPK-AAV-02之轉導概況。在6 × 1012 vg/kg之單次劑量之SPK-AAV-01或SPK-AAV-02載體之隱靜脈中雄性AGM (n=4/劑量群組)接受30分鐘之IV輸注。在AAV載體投與之後，每日監測動物之臨床觀測結果，且每週收集血液。結果
非洲綠猴中之初步資料確認小鼠研究中觀測到之結果：由投與SPK-AAV-01及SPK-AAV-02引起之血漿GAA活性含量類似(圖18)。實例 8 結論
表現分泌型人類GAA之經密碼子最佳化之GAA盒表示比起親本spΔGAApar構建體的顯著好轉。特定言之，SPK-AAV-01及SPK-AAV-02在細胞培養物、嚙齒動物及兩個非人類靈長類模型中展現分泌型人類GAA之極佳效能及表現。實例 9 研究設計 - NHP 中之劑量範圍
為評估分泌型GAA表現之劑量反應，向系統發生學上接近人類之靈長類物種投與三次劑量之SPK-AAV-02載體，經一個月之時程針對GAA活性含量評估恆河猴(恆河獼猴)及動物。
雄性恆河猴(n=4/劑量群組)在2 × 1012 、6 × 1012 、2 × 1013 vg/kg之SPK-AAV-02載體之劑量之隱靜脈中接受30分鐘之靜脈內(IV)輸注。雌性恆河猴(n=4/劑量群組)在2 × 1013 vg/kg之劑量之SPK-AAV-02載體之隱靜脈中接受30分鐘之IV輸注。在AAV載體投與之後，每日監測動物之臨床觀測結果。每週收集血液維持4週以量測GAA活性、GAA抗原含量、抗GAA IgG形成、血液及臨床化學物質，包括葡萄糖含量以監測血糖之潛在變化。結果
圖21展示在向雄性及雌性恆河猴投與SPK-AAV-02載體後在血漿中量測之GAA活性含量。在載體注射後7、14、21及28天在血漿中量測GAA活性之結果展示載體劑量與血漿GAA活性含量之間之相關性。在以2 × 1013 vg/kg之劑量注射之雌性NHP之血漿中之GAA活性含量比在以相等劑量注射之雄性NHP中量測之彼等低約0.5倍(49.6%)。
此NHP研究中之資料確認在小鼠研究中觀察到之結果，亦即來源於用於分泌型GAA表現之AAV載體的血漿GAA活性含量在載體投與後產生血漿中之劑量依賴型GAA活性(圖21)。以三個遞增劑量單次輸注SPK-AAV-02展示GAA在NHP血漿中之劑量依賴型表現。實例 10 九個月 NHP 研究
向雄性恆河猴(恆河獼猴)經由靜脈內輸注以單次劑量(6 × 1012 vg/kg)投與SPK-AAV-01、SPK-AAV-02及SPK-AAV-10中之各者。在研究過程期間，在用分泌型GAA表現載體給藥之動物的一部分中觀測到血漿中活性GAA蛋白之減少及同時上升的抗GAA IgG抗體含量。血漿中之GAA活性及抗原含量之損失可能歸因於人類轉殖基因蛋白質產物之IgG介導之體液免疫清除之出現。在減少體液免疫反應及可能恢復可偵測循環GAA酶含量之努力中，自第183天開始，給與某些動物每月利妥昔單抗與每日環孢靈A組合之免疫抑制方式。結果
在所有動物中偵測到血漿中之分泌及活性GAA之含量，展現SPK-AAV-01、SPK-AAV-02及SPK-AAV-10分別在第15天峰值平均活性含量為482.07 ± 47.90、664.43 ± 417.55及427.833 ± 307.94 nmol/mL/hr。觀測到循環GAA抗原之可偵測含量，用SPK-AAV-01、SPK-AAV-02及SPK-AAV-10投與之動物之平均峰值含量分別為14.84 ± 2.21、19.11 ± 23.23、14.64 ± 16.96 ng/mL。同時觀測到循環GAA減少，在第15天開始，觀測到循環抗GAA IgG含量增加。藉由肝組織之qPCR分析載體基因組確認載體在肝中之存在，展現對於投與SPK-AAV-01、SPK-AAV-02及SPK-AAV-10之動物，每個單倍體基因組之平均載體基因組複本分別為6.39 ± 2.72、11.43 ± 4.23及19.01 ± 13.93。
分析肝樣本之全長GAA及裂解GAA(溶酶體形式)蛋白質含量。將研究樣本與充當陰性對照之載體未處理之恆河猴肝樣本進行比較，其在負載之蛋白質含量下不呈現可偵測含量之裂解或完整GAA (n=3)。研究動物肝中之全長蛋白質之量分別為投與SPK-AAV-01、SPK-AAV-02及SPK-AAV-10之動物中之GAA/mg總蛋白質之4.0 ± 7.0、5.4 ± 9.1、11.0 ± 11.3 ng。比起全長GAA，各群組含有較高含量之裂解GAA，展現投與SPK-AAV-01、SPK-AAV-02及SPK-AAV-10之動物中GAA/mg之總蛋白質之含量分別為41.6 ± 57.6、44.4 ± 74.5、49.0 ± 40.3 ng。與GAA處理無關，各組之間的差異不顯著(藉由Kruskal-Wallis，對於全長(完整)形式，P=0.72；對於溶酶體(裂解)形式，P=0.83)。在末端，投與本發明之AAV載體之所有組顯示高於肝中之基線之GAA之平均可偵測含量。結論
投與SPK-AAV-01、SPK-AAV-02及SPK-AAV-10中之各者使得可偵測及增加GAA抗原之血漿含量，在第2-3週達至峰值且與GAA活性線性相關，無論載體基因組如何，展現類似動力學。在除一隻以外的全部動物的以下時間點，血漿中之GAA活性及GAA抗原含量均連續下降。如先前在用AAV載體治療之NHP中所觀測到，在第43天開始觀測到對人類轉殖基因產物之體液反應，其與發展GAA特異性IgG反應之所有動物中之血漿中的GAA抗原含量負相關。經由投與靶向B細胞介導之IgG反應之免疫抑制劑(利妥昔單抗)遏制抗GAA IgG含量導致一子組動物血漿中之可偵測GAA含量恢復。對於所有組，在研究結束時可在肝臟中偵測到載體基因組複本，甚至在無可量測之循環血漿GAA含量的情況下。相應地，在研究結束時在用載體治療之所有肝組織中偵測到GAA蛋白，而GAA抗原低於未治療之肝組織中之偵測極限。綜合而言，此等結果指示本發明之AAV載體能夠在9個月內介導分泌型人類GAA在肝中之持久表現，與出現對人類轉殖基因產物抗體反應無關。實例 11 九週嚙齒動物免疫抑制研究
在雄性及雌性C57BL/6小鼠中在存在或不存在雷帕黴素及/或潑尼龍之情況下靜脈內投與單次劑量之2 × 1012 vg/kg之SPK-AAV-02顆粒之後量測GAA轉殖基因產物之表現量持續九週。在5個組中測試小鼠，如表2中所示。表 2 - 組名稱及劑量含量
Figure 108116960-A0304-0002
 vg=載體基因組，X=所投與治療 *自第(-)7天至第5天以2 mg/kg每日遞送雷帕黴素。在第6天開始，遞送變為每隔一天3 mg/kg。 ** 潑尼龍自第(-)1天至第15天以1 mg/kg之濃度、自第16天至第22天以0.5 mg/kg之濃度及自第23天至第28天以0.25 mg/kg之濃度遞送。
在接受免疫抑制劑之組中，在AAV顆粒給藥之前及在研究之前第5週投與藥劑。在完成AAV給藥之後，監測動物之臨床觀測結果及體重持續9週。在研究結束時，對血液樣本進行臨床化學及血液學，且對所選組織進行組織病理組織學。在整個研究中每週評估針對rAAV衣殼之IgG抗體及血漿GAA活性。結果
在投與所有動物之載體中，在高於背景下偵測到血漿中之GAA活性含量。第1組中媒劑投與之雄性展示大致在300-400 nmol/mL/ hr之間的背景含量。視免疫抑制治療組而定，在以略微不同動力學之情況下進行載體投與後GAA活性之循環量上升，但展現GAA活性之相等峰值平均含量。特定言之，對於雄性，第2組(單獨的SPK-AAV-02)、第3組(SPK-AAV-02，2-3 mg/kg雷帕黴素)、第4組(SPK-AAV-02，1-0.25 mg/kg潑尼龍)及第5組(SPK-AAV-02，2-3 mg/kg雷帕黴素，1-0.25 mg/kg潑尼龍)中之GAA活性之峰值平均含量分別為16114 ± 5411、14875 ± 6882、14890 ± 6882及21480 ± 6340 nmol/mL/ hr。在任一AAV治療組之間的峰值GAA活性含量中未觀測到統計學上顯著之差異。
在雌性小鼠中，第2組、第3組、第4組及第5組之GAA活性之峰值平均值含量分別為7380 ± 4034、5912 ± 3259、6096 ± 3249及9955 ± 3104 nmol/mL/ hr。此等GAA活性含量顯著高於媒劑投與之雌性動物中所偵測之背景。如雄性小鼠中所見，雌性小鼠中之GAA活性峰值含量在AAV治療組中之任一者之間統計學上無顯著不同。雄性與雌性之間的GAA活性之血漿含量中觀測到的差異與雌性小鼠中肝細胞之AAV轉導減少之充分記錄的現象一致(Davidoff等人, 2003, Blood, 102:480-488；DOI: 10.1182/blood-2002-09-2889)。
在投與SPK-AAV-02之所有動物中偵測到血漿中之抗rAAV衣殼IgG，展現第2組、第3組、第4組及第5組中之雄性之峰值平均含量分別為86527 ± 92140、6695 ± 3555、64368 ± 29635及11374 ± 6053 ng/mL，且在第2組、第3組、第4組及第5組中之雌性之峰值平均含量分別為182009 ± 148148、66141 ± 77925、182654 ± 90161及57752 ± 59192 ng/ml。對於雄性及雌性，第1組(媒劑)具有低於所有時間點檢測之定量限制之抗rAAV衣殼IgG之含量。結論
投與SPK-AAV-02在所有動物中產生可偵測GAA活性含量。用雷帕黴素及潑尼龍之組合治療使得在雄性小鼠中之第22天、第36天及第42天及雌性動物中之第43天，GAA活性含量以統計方式增加(對比單獨的rAAV載體)。值得注意的，與達至最大表現無關，GAA活性之峰值含量差異在性別內之AAV治療組中之任一者之間為統計學上不顯著的。
在投與SPK-AAV-02之所有組中觀測到針對rAAV衣殼產生之體液IgG反應。在兩種性別中，雷帕黴素之存在(第3組及第5組)在與單獨的載體相比時顯著減少抗衣殼IgG之形成。用潑尼龍進行之治療對抗衣殼IgG形成具有更適度效果，其中在第4組中在雄性第15天、第43天及第60天及在雌性中第43天及第60天時顯著減少。
在小鼠中用雷帕黴素及/或潑尼龍之免疫抑制對rAAV衣殼產生減少之體液反應，且不會顯著影響血漿中之GAA活性的峰值含量。實例 12 在 NHP 中用雷帕黴素共同投與之 4 週的單次劑量
此研究在以5.5 × 1013 vg/kg投與單次劑量之SPK-AAV-02後四週期間在雷帕黴素存在下在三隻雄性非洲綠猴(綠猴)中評估循環GAA活性(血漿中之GAA活性含量)。
在AAV給藥之前5天開始投與動物雷帕黴素(2 mg/kg每日)，且持續整個四週的研究。經由隱靜脈靜脈內投與單次劑量之5.5 × 1013 vg/kg之SPK-AAV-02。在完成AAV給藥之後，監測動物之臨床觀測結果及體重持續4週。在研究結束時，對血液樣本進行臨床化學及血液學，且對所選組織進行組織病理組織學。在整個研究中每週量測血漿GAA活性。結果
在投與SPK-AAV-02之後，所有動物之血漿中之GAA活性含量高於背景，在最終量測之點下三個動物中之每一者之峰值活性含量達至1158.1、711.9及623.8 nmol/mL/hr (表3)。表 3 - 投與雷帕黴素之個別 NHP 之血漿 GAA 活性
Figure 108116960-A0304-0003
 結論
投與SPK-AAV-02在所有三個NHP中產生可偵測GAA活性。SPK-AAV-02與雷帕黴素之組合具有良好耐受性且在所量測之所有測試中具有有利的安全概況。實例 13 Gaa -/- 小鼠龐培氏模型中之治療功效
進行4月齡Gaa -/- 小鼠(龐培氏病之已建立小鼠模型)之10個月跟蹤研究，其以三個劑量(1.25 × 1011 、5 × 1011 及2 × 1012 vg/kg)投與SPK-AAV-02。該研究展示：(1)循環GAA酶活性之劑量依賴型增加，(2)肌肉強度之顯著改善，及(3)無顯著的抗GAA體液免疫反應。實例 14 方法 基於細胞之檢測以量測編碼分泌型人類 GAA 轉殖基因之質體的蛋白質表現效率
在DMEM +10% FBS +青黴素/鏈黴素/L-麩醯胺酸中，以每孔5 × 104 個細胞在48孔培養皿中接種Huh7細胞隔夜。使用Lipofectamine® 2000將使用Plasmid Giga Kit (Qiagen)製備之質體以250 ng/孔轉染至細胞中。將細胞維持在攝氏37度及5% CO2 下48-72小時，收集上清液且將上清液在攝氏-80度下儲存在低滯留微量滴定盤中直至針對GAA活性進行檢測。上清液以1:10稀釋且與3 mM螢光受質4-甲基傘形酮基α-D-葡萄哌喃糖苷一起在攝氏37度下培育1小時。在1小時之後，用碳酸鹽緩衝液(pH 10.5)停止反應且與藉由在停止緩衝液中稀釋4-甲基環己酮(4-MU)產生之標準曲線進行比較，產生在250 pmol/µL處開始且結束於0 pmol/µL之12點標準曲線。在λex 360 nm；λem 449 nm下讀取板。質體 DNA 之流體動力學注射以評估編碼分泌型人類 GAA 轉殖基因之質體的效能
使用Plasmid Giga Kit (Qiagen)製備之質體在PBS180 + 0.001%普洛尼克中稀釋。藉由流體動力學注射將25微克對應於待測試之各盒之質體DNA經靜脈內在橫向尾部靜脈中引入年齡為大約8週齡之雄性C57BL/6小鼠中。注射後72小時，經由刺頜下靜脈將全血收集於檸檬酸鈉管中。丟棄第一血液滴，且將200 µL血液收集至檸檬酸鈉中，且反轉管以避免溶血及凝血。在攝氏4度下在10,000 RMP下短暫離心樣本10分鐘。血漿等分至管中且儲存於攝氏-80度冷凍器中直至針對GAA活性加以分析為止。將血漿樣本稀釋至不同程度且與3 mM螢光受質4-甲基傘形酮基α-D-葡萄哌喃糖苷一起在攝氏37度下培育1小時。在1小時之後，用碳酸鹽緩衝液(pH 10.5)停止反應且與藉由在停止緩衝液中稀釋4-MU產生之標準曲線進行比較，形成以250 pmol/µL開始且以0 pmol/µL結束之12點標準曲線。在λex 360 nm；λem 449 nm下讀取板。基於細胞之檢測以量測編碼分泌型人類 GAA 轉殖基因之 AAV 載體的效能
每孔5 × 104 個細胞在48孔培養皿中接種Huh7細胞隔夜。在Opti-MEMTM 或DMEM +10% FBS +青黴素/鏈黴素/L-麩醯胺酸中，在劑量曲線中製備來自儲備載體之SPK-AAV-01及SPK-AAV-02(感染複數MOI，在2 × 106 - 1 × 104 範圍內)。自Huh7細胞移除現有培養基且經含有病毒顆粒之培養基置換。將細胞維持在攝氏37度及5% CO2 下72小時，收集上清液且將上清液在攝氏-80度下儲存在低滯留微量滴定盤中直至針對GAA活性進行檢測。上清液以1:10稀釋且與3 mM螢光受質4-甲基傘形酮基α-D-葡萄哌喃糖苷一起在攝氏37度下培育1小時。在1小時之後，用碳酸鹽緩衝液(pH 10.5)停止反應且與藉由在停止緩衝液中稀釋4-MU產生之標準曲線進行比較，形成以250 pmol/µL開始且以0 pmol/µL結束之12點標準曲線。在λex 360 nm；λem 449 nm下讀取板。小鼠 / 大鼠血漿中之 GAA 活性檢測
經由刺頜下靜脈將全血收集至檸檬酸鈉管中。丟棄第一血液滴，且將200 µL血液收集至檸檬酸鈉中；反轉管以避免溶血及凝血。在攝氏4度下在10,000 rpm下短暫離心樣本10分鐘。血漿等分至管中且儲存於攝氏-80度冷凍器中直至針對GAA活性加以分析為止。將血漿樣本稀釋至不同程度且與3 mM螢光受質4-甲基傘形酮基α-D-葡萄哌喃糖苷一起在攝氏37度下培育1小時。在1小時之後，用碳酸鹽緩衝液(pH 10.5)停止反應且與藉由在停止緩衝液中稀釋4-MU產生之標準曲線進行比較，形成以250 pmol/µL開始且以0 pmol/µL結束之12點標準曲線。在λex 360 nm；λem 449 nm下讀取板。NHP ( 恆河猴 / AGM ) 血漿中之 GAA 活性檢測
經由隱靜脈經靜脈內注射雄性恆河猴/非洲綠猴，且將全血收集於檸檬酸鈉管中，反轉管以避免溶血及凝血。在攝氏4度下在10,000 RMP下短暫離心樣本10分鐘。血漿等分至管中且儲存於攝氏-80度冷凍器中直至針對GAA活性加以分析為止。將血漿樣本稀釋至不同程度且與3 mM螢光受質4-甲基傘形酮基α-D-葡萄哌喃糖苷一起在攝氏37度下培育1小時。在1小時之後，用碳酸鹽緩衝液(pH 10.5)停止反應且與藉由在停止緩衝液中稀釋4-MU產生之標準曲線進行比較，形成以250 pmol/µL開始且以0 pmol/µL結束之12點標準曲線或11點標準曲線(5 µM/mL-0.49 nM/mL)。在λex 360 nm；λem 449 nm下讀取板。測試樣本之GAA活性自4-MU標準曲線內插且以速度(奈莫耳/毫升/小時(nmol/mL/hr))表示。藉由西方墨點之 Huh7 上清液之 GAA 之蛋白質含量評估
每孔5 × 104 個細胞在48孔培養皿中接種Huh7細胞隔夜。在Opti-MEMTM 或DMEM +10% FBS +青黴素/鏈黴素/L-麩醯胺酸中，在劑量曲線中製備來自儲備載體之SPK-AAV-01及SPK-AAV-02(感染複數MOI，在2 × 106 - 1 × 104 範圍內)。自Huh7細胞移除現有培養基且經含有病毒顆粒之培養基置換。將細胞維持在攝氏37度及5% CO2 下72小時，收集上清液且將上清液在攝氏-80度下儲存在低滯留微量滴定盤中直至針對GAA蛋白含量進行檢測。上清液以1:20稀釋，與RIPA緩衝液一起在攝氏95度下培育5分鐘，且在具有MOPS運行緩衝液之4-12% Bis-Tris NuPage凝膠上運行。使用iBlot® 系統(ThermoFisher)將蛋白質轉移至聚偏二氟乙烯(pvdf)膜，且在Odyssey® TBS緩衝液中在室溫下阻斷1小時。膜在攝氏4度下與1:1000稀釋之初級抗體兔抗人類GAA (Abcam)一起培育隔夜。膜在室溫下與1:10,000稀釋之螢光二級抗兔抗體一起洗滌及培育2小時。將膜洗滌且使用Li-Core® 成像系統成像。將條帶與10 ng Myozyme® 及標記物進行比較。使用Li-Core® 軟體進行密度測定分析，且將條帶相對於Myozyme® 控制進行歸一化。藉由西方墨點之小鼠血漿中之 GAA 之蛋白質含量評估
經由隱靜脈經靜脈內注射雄性及雌性C57BL/6小鼠，且經由刺頜下靜脈將全血收集於檸檬酸鈉管中。丟棄第一血液滴，且將200 µL血液收集至檸檬酸鈉中；反轉管以避免溶血及凝血。在攝氏4度下在10,000 RMP下短暫離心樣本10分鐘。血漿等分至管中且儲存於攝氏-80度冷凍器中直至針對GAA蛋白含量加以分析為止。血漿以1:20稀釋，與RIPA緩衝液一起在攝氏95度下培育5分鐘，且在具有MOPS運行緩衝液之4-12% Bis-Tris NuPage凝膠上運行。使用iBlot® 系統(ThermoFisher)將蛋白質轉移至pvdf膜，且在Odyssey® TBS緩衝液中在室溫下阻斷1小時。膜在攝氏4度下與1:1000稀釋之初級抗體兔抗人類GAA (Abcam)一起培育隔夜。膜在室溫下與1:10,000稀釋之螢光二級抗兔抗體一起洗滌及培育2小時。將膜洗滌且使用Li-Core® 成像系統成像。將條帶與10 ng Myozyme® 及標記物進行比較。使用Li-Core® 軟體進行密度測定分析，且將條帶相對於Myozyme® 控制進行歸一化。藉由 WES 之 NHP 血漿中之 GAA 之蛋白質含量評估
經由隱靜脈經靜脈內注射雄性恆河猴/非洲綠猴，且將全血收集於檸檬酸鈉管中，反轉管以避免溶血及凝血。在攝氏4度下在10,000 rpm下短暫離心樣本10分鐘。血漿等分至管中且儲存於攝氏-80度冷凍器中直至針對GAA蛋白含量加以分析為止。在樣本稀釋劑中以1:6000稀釋血漿樣本。將8點兩倍標準曲線添加至具有以50 ng/mL之濃度初始之Myozyme® 之各晶片中。樣本在緩衝液中稀釋，在攝氏95度下變性5分鐘，且負載至WESTM 晶片(Protein Simple)中。在1:1000稀釋度下添加初級抗體，且在工作稀釋度下負載二級抗體。根據WESTM Protein Simple軟體運行晶片，且分析所得條帶且與Myozyme® 標準曲線進行比較，且相對於非特異性第二條帶進行歸一化。抗 AAV 衣殼 IgG 抗體
用ELISA捕捉檢測量測抗AAV衣殼總IgG形成。ELISA盤孔塗佈有50 µL含有1 µg/mL之rAAV顆粒之溶液。稀釋總人類IgG (Southern Biotech, 0150-01)以產生介於10,000 ng/mL至0.5 ng/mL範圍內之10點標準曲線且添加至盤。在逆計算之後檢測之定量極限為460 ng/mL。製備三種含量之品質對照樣本且包括於各盤上以評估檢測效能。在攝氏4度下培育衣殼顆粒、標準物及品質對照物隔夜。洗滌之後，在室溫下用含2% BSA、0.05% Tween-20之PBS阻斷各孔2小時。將樣本於阻斷緩衝液中之連續稀釋液負載於盤上且在室溫下培育2小時。將在阻斷緩衝液中1:5000稀釋之HRP共軛之綿羊抗人類IgG抗體(GE Healthcare, NA933V)用作偵測抗體且在室溫下在盤上培育1小時。洗滌之後，在室溫下用3,3',5,5'-四甲基聯苯胺基質(TMB)培育10分鐘期間發展過氧化酶活性。用1M硫酸停止反應，且藉由吸收盤讀取器讀取450 nm下之光學密度(OD)之盤。針對用純化人類總IgG之連續稀釋液製備之標準曲線測定IgG濃度。
圖 1 展示pAAV-ApoE/hAAT.fixUTR.GAA13.BGH (SEQ ID NO:16)之示意圖。
圖 2 展示pAAV-ApoE/hAAT.GAA13.BGH (SEQ ID NO:17)之示意圖。
圖 3 展示pAAV-ApoE/hAAT.GAA7.BGH (SEQ ID NO:18)之示意圖。
圖 4 展示pAAV-ApoE/hAAT.GAA8.BGH (SEQ ID NO:19)之示意圖。
圖 5 展示pAAV-ApoE/hAAT.GAA2.wtBGH (SEQ ID NO:20)之示意圖。
圖 6 展示pAAV-ApoE/hAAT.GAA5.wtBGH (SEQ ID NO:21)之示意圖。
圖 7 展示pAAV-ApoE/hAAT.GAA7.wtBGH (SEQ ID NO:22)之示意圖。
圖 8 展示pAAV-ApoE/hAAT.GAA8.wtBGH (SEQ ID NO:23)之示意圖。
圖 9 展示pAAV-ApoE/hAAT.GAA13.wtBGH (SEQ ID NO:24)之示意圖。
圖 10 展示藉由GAA活性檢測評估Huh7細胞上清液中GAA活性含量。
圖 11 展示藉由GAA活性檢測評估小鼠血漿中GAA活性含量。
圖 12 展示藉由GAA西方墨點(western blot)評估小鼠血漿中GAA含量。
圖 13 展示藉由GAA活性檢測評估小鼠血漿中GAA活性含量。
圖 14 展示藉由GAA西方墨點評估小鼠血漿中GAA含量。
圖 15 展示藉由GAA活性檢測評估小鼠血漿中GAA活性含量。
圖 16 展示藉由GAA活性檢測評估大鼠及小鼠血漿中GAA活性含量。
圖 17 展示藉由GAA活性檢測評估非人類靈長類動物(雄性恆河猴(rhesus macaque))之血漿中GAA活性含量。
圖 18 展示藉由GAA活性檢測評估非人類靈長類動物(非洲綠猴(African green monkey))之血漿中GAA活性含量。X軸為注射後天數。
圖 19 展示藉由西方墨點評估非人類靈長類動物(非洲綠猴)之血漿中GAA含量，其中圖形呈現某些資料。
圖 20 展示評估經SPK-AAV-01、SPK-AAV-02轉導或陰性對照(將具有非GAA轉殖基因之rAAV封裝至AAV SEQ ID NO:30-32載體中)之Huh7細胞之上清液中GAA活性。
圖 21 展示在以2 × 1012 、6 × 1012 、2 × 1013 vg/kg之劑量單次靜脈內投與SPK-AAV-02之後評估來自恆河猴之血漿中GAA活性。
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Claims (88)

  1. 一種編碼酸性α葡萄糖苷酶(GAA)之核酸，其中該核酸與選自由如SEQ ID NO:1-5所闡述之序列中之任一者組成之群之序列具有高於86%的序列一致性。
  2. 如請求項1之核酸，其中該核酸與選自由如SEQ ID NO:1-5所闡述之該等序列中之任一者組成之群之序列具有高於87%的序列一致性。
  3. 一種編碼GAA之核酸，其中該核酸與選自由如SEQ ID NO:6-15所闡述之序列中之任一者組成之群之序列具有高於87%的序列一致性。
  4. 如請求項3之核酸，其中該核酸與選自由如SEQ ID NO:6-15所闡述之該等序列中之任一者組成之群之序列具有高於88%的序列一致性。
  5. 如請求項3之核酸，其中該核酸與選自由如SEQ ID NO:6-15所闡述之該等序列中之任一者組成之群之序列具有高於89%的序列一致性。
  6. 如請求項3之核酸，其中該核酸與選自由如SEQ ID NO:6-15所闡述之該等序列中之任一者組成之群之序列具有高於90%的序列一致性。
  7. 如請求項3之核酸，其中該核酸與選自由如SEQ ID NO:6-15所闡述之該等序列中之任一者組成之群之序列具有高於91%的序列一致性。
  8. 一種編碼GAA之核酸，其中該核酸與選自由如SEQ ID NO:16-24所闡述之序列中之任一者組成之群之序列具有高於91%的序列一致性。
  9. 如請求項1至8中任一項之核酸，其中該核酸含有少於127個CpG二核苷酸。
  10. 一種編碼GAA之核酸，其中該核酸含有少於127個CpG二核苷酸。
  11. 如請求項1至10中任一項之核酸，其中該核酸含有少於126個CpG二核苷酸。
  12. 如請求項1至10中任一項之核酸，其中該核酸含有約126-120個CpG二核苷酸。
  13. 如請求項1至10中任一項之核酸，其中該核酸含有約120-110個CpG二核苷酸。
  14. 如請求項1至10中任一項之核酸，其中該核酸含有約110-100個CpG二核苷酸。
  15. 如請求項1至10中任一項之核酸，其中該核酸含有約100-90個CpG二核苷酸。
  16. 如請求項1至10中任一項之核酸，其中該核酸含有約90-80個CpG二核苷酸。
  17. 如請求項1至10中任一項之核酸，其中該核酸含有約80-70個CpG二核苷酸。
  18. 如請求項1至10中任一項之核酸，其中該核酸含有約70-60個CpG二核苷酸。
  19. 如請求項1至10中任一項之核酸，其中該核酸含有約60-50個CpG二核苷酸。
  20. 如請求項1至10中任一項之核酸，其中該核酸含有約50-40個CpG二核苷酸。
  21. 如請求項1至10中任一項之核酸，其中該核酸含有約40-30個CpG二核苷酸。
  22. 如請求項1至10中任一項之核酸，其中該核酸含有約30-20個CpG二核苷酸。
  23. 如請求項1至10中任一項之核酸，其中該核酸含有少於20個CpG二核苷酸。
  24. 如請求項1至10中任一項之核酸，其中該核酸含有約20-10個CpG二核苷酸。
  25. 如請求項1至10中任一項之核酸，其中該核酸含有少於10個CpG二核苷酸。
  26. 如請求項1至10中任一項之核酸，其中該核酸含有約10-5個CpG二核苷酸。
  27. 如請求項1至10中任一項之核酸，其中該核酸含有5個CpG二核苷酸。
  28. 如請求項1至10中任一項之核酸，其中該核酸含有4個CpG二核苷酸。
  29. 如請求項1至10中任一項之核酸，其中該核酸含有3個CpG二核苷酸。
  30. 如請求項1至10中任一項之核酸，其中該核酸含有2個CpG二核苷酸。
  31. 如請求項1至10中任一項之核酸，其中該核酸含有1個CpG二核苷酸。
  32. 如請求項1至10中任一項之核酸，其中該核酸含有0個CpG二核苷酸。
  33. 如請求項1至32中任一項之核酸，其中該核酸與選自由如SEQ ID NO:1-24所闡述之序列中之任一者組成之群之序列具有高於92%的序列一致性。
  34. 如請求項1至32中任一項之核酸，其中該核酸與選自由如SEQ ID NO:1-24所闡述之該等序列中之任一者組成之群之序列具有高於93%的序列一致性。
  35. 如請求項1至32中任一項之核酸，其中該核酸與選自由如SEQ ID NO:1-24所闡述之該等序列中之任一者組成之群之序列具有高於94%的序列一致性。
  36. 如請求項1至32中任一項之核酸，其中該核酸與選自由如SEQ ID NO:1-24所闡述之該等序列中之任一者組成之群之序列具有高於95%的序列一致性。
  37. 如請求項1至32中任一項之核酸，其中該核酸與選自由如SEQ ID NO:1-24所闡述之該等序列中之任一者組成之群之序列具有高於96%的序列一致性。
  38. 如請求項1至32中任一項之核酸，其中該核酸與選自由如SEQ ID NO:1-24所闡述之該等序列中之任一者組成之群之序列具有高於97%的序列一致性。
  39. 如請求項1至32中任一項之核酸，其中該核酸與選自由如SEQ ID NO:1-24所闡述之該等序列中之任一者組成之群之序列具有高於98%的序列一致性。
  40. 如請求項1至32中任一項之核酸，其中該核酸與選自由如SEQ ID NO:1-24所闡述之該等序列中之任一者組成之群之序列具有高於99%的序列一致性。
  41. 如請求項1至32中任一項之核酸，其中該核酸與選自由如SEQ ID NO:1-24所闡述之該等序列中之任一者組成之群之序列具有高於99.5%的序列一致性。
  42. 一種編碼GAA之核酸，其選自由SEQ ID NO:1-24組成之群。
  43. 一種包含如請求項1至7及9至42中任一項之核酸之表現盒，該核酸以可操作方式連接至表現控制元件。
  44. 如請求項43之表現盒，其中該表現控制元件定位於該核酸之5'處。
  45. 如請求項44之表現盒，其進一步包含定位於該核酸之3'處之聚腺苷酸化序列。
  46. 如請求項44或45之表現盒，其中該表現控制元件或聚腺苷酸化序列之CpG比野生型表現控制元件或聚腺苷酸化序列減少。
  47. 如請求項43至46中任一項之表現盒，其中該表現控制元件包含ApoE/hAAT增強子/啟動子序列。
  48. 如請求項45至47中任一項之表現盒，其中該聚腺苷酸化序列包含牛生長激素(bGH)聚腺苷酸化序列。
  49. 如請求項47或48之表現盒，其中該ApoE/hAAT增強子/啟動子序列或bGH聚腺苷酸化序列之CpG比野生型ApoE/hAAT增強子/啟動子序列或bGH聚腺苷酸化序列減少。
  50. 如請求項49之表現盒，其中該野生型bGH聚腺苷酸化序列包含SEQ ID NO:27之序列。
  51. 如請求項49之表現盒，其中該野生型ApoE/hAAT增強子/啟動子序列包含SEQ ID NO:28或29之序列。
  52. 如請求項49之表現盒，其中該CpG減少之bGH聚腺苷酸化序列包含SEQ ID NO:26之序列。
  53. 如請求項43至52中任一項之表現盒，其進一步包含定位於該表現控制元件之3'端與該核酸之5'端之間之內含子。
  54. 如請求項1至53中任一項之核酸序列或表現盒，其中該GAA包含如SEQ ID NO:25所闡述之序列。
  55. 一種腺病毒相關病毒(AAV)載體，其包含如請求項1至54中任一項之核酸或表現盒。
  56. 如請求項55之AAV載體，其中該AAV載體包含： a)一或多個AAV衣殼，及 b)一或多個AAV反向末端重複序列(ITR)，其中該(等) AAV ITR側接該核酸或該表現盒之5'端或3'端。
  57. 如請求項56之AAV載體，其進一步包含定位於該一或多個ITR之5'或3'處之內含子。
  58. 如請求項56或57之AAV載體，其中該等ITR或該內含子中之至少一個或多個係經過修飾，以具有減少之CpG。
  59. 如請求項55至58中任一項之AAV載體，其中該AAV載體具有衣殼血清型，其包含與AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、Rh10、Rh74、AAV3B、AAV-2i8或SEQ ID NO:30、31或32 VP1、VP2及/或VP3序列具有90%或更高的序列一致性之經修飾或變異AAV VP1、VP2及/或VP3衣殼；或與AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、Rh10、Rh74、AAV3B、AAV-2i8或SEQ ID NO:30、31或32 VP1、VP2及/或VP3序列具有95%或更高的序列一致性之衣殼、或與AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、Rh10、Rh74、AAV3B、AAV-2i8或SEQ ID NO:30、31或32 VP1、VP2及/或VP3序列具有100%的序列一致性之衣殼。
  60. 如請求項56至59中任一項之AAV載體，其中該等ITR包含以下任一者的一或多個ITR：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、Rh10、Rh74或AAV3B、AAV血清型或其組合。
  61. 一種醫藥組合物，其在生物相容性載劑或賦形劑中包含複數個如請求項55至60中任一項之AAV載體。
  62. 如請求項61之醫藥組合物，其進一步包含空AAV衣殼。
  63. 如請求項62之醫藥組合物，其中該等空AAV衣殼與該AAV載體之比值為約100:1-50:1、約50:1-25:1、約25:1-10:1、約10:1-1:1、約1:1-1:10、約1:10-1:25、約1:25-1:50或約1:50-1:100內或之間。
  64. 如請求項62之醫藥組合物，其中該等空AAV衣殼與該AAV載體之比值為約2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1或10:1。
  65. 如請求項62至64中任一項之醫藥組合物，其進一步包含界面活性劑。
  66. 一種治療需要酸性α葡萄糖苷酶(GAA)之人類之方法，其包含： (a)提供如請求項1至54中任一項之核酸或表現盒或如請求項55至60中任一項之AAV載體或如請求項61至65中任一項之醫藥組合物；及 (b)向該人類投與一定量之該核酸、表現盒、AAV載體或醫藥組合物，其中該GAA在該人類中表現。
  67. 如請求項66之方法，其中該人類患有龐培氏病(Pompe disease)。
  68. 如請求項66之方法，其中該人類患有嬰兒發作型龐培氏病。
  69. 如請求項66之方法，其中該人類患有晚發型龐培氏病。
  70. 如請求項66之方法，其中該人類患有肝糖貯積病(GSD)。
  71. 如請求項70之方法，其中該GSD選自：I型GSD (馮吉爾克氏病(von Gierke's disease))、III型GSD (福貝斯-柯里氏病(Forbes-Cori disease))、IV型GSD (安德森病(Anderson disease)，澱粉黏膠質病)、V型GSD (麥克阿德爾氏病(McArdle disease))、VI型GSD (赫氏病(Hers disease))、VII型GSD (塔瑞氏病(Tarui disease))、及致死性先天性心臟GSD。
  72. 如請求項66至71中任一項之方法，其中該AAV載體經靜脈內、動脈內、腔室內、黏膜內或經由導管向該人類投與。
  73. 如請求項66至72中任一項之方法，其中該GAA之表現水準比在不需要GAA之人類中發現的表現水準提高，視情況高出1%的表現水準。
  74. 如請求項66至73中任一項之方法，其中該AAV載體係每公斤人類體重投與約1 × 108 至約1 × 1014 個載體基因組(vg/kg)之範圍。
  75. 如請求項66至74中任一項之方法，其中該方法減少、減輕或抑制需要GAA之該人類或該疾病的一或多種症狀；或預防或減少需要GAA之該人類或該疾病的一或多種症狀之發展或惡化；或使需要GAA之該人類或該疾病的一或多種症狀穩定；或改善需要GAA之該人類或該疾病的一或多種症狀。
  76. 如請求項75之方法，其中該一或多種症狀選自由以下組成之群：進食困難；體重不增長；頭部控制差；頸部控制差；呼吸問題；肺部感染；心臟增大；心臟增厚；心臟缺陷；舌部增大；吞咽困難；肝增大；肌肉強度差；肌肉張力弱；腿部無力；腰部無力；手臂無力；呼吸短促；運動困難；睡眠時呼吸困難；脊椎彎曲；及關節僵硬。
  77. 一種細胞，其包含如請求項1至54中任一項之核酸或表現盒。
  78. 一種細胞，其產生如請求項55至60中任一項之AAV載體。
  79. 一種產生如請求項55至60中任一項之AAV載體之方法，其包含 a.將包含如請求項1至54中任一項之該核酸或表現盒之AAV載體基因組引入封裝輔助細胞中；及 b.在產生該AAV載體之條件下培養該輔助細胞。
  80. 一種產生如請求項55至60中任一項之AAV載體之方法，其包含 a.將如請求項1至54之該核酸或表現盒引入封裝輔助細胞中；及 b.在產生該AAV載體之條件下培養該等輔助細胞。
  81. 如請求項77至80中任一項之細胞或方法，其中該細胞包含哺乳動物細胞。
  82. 如請求項77至80中任一項之細胞或方法，其中該細胞提供將該載體封裝至病毒顆粒中之輔助功能。
  83. 如請求項77至80中任一項之細胞或方法，其中該細胞提供AAV輔助功能。
  84. 如請求項77至80中任一項之細胞或方法，其中該細胞提供AAV Rep及/或Cap蛋白。
  85. 如請求項77至80中任一項之細胞或方法，其中該細胞經編碼Rep及/或Cap蛋白序列之聚核苷酸穩定地或暫時地轉染。
  86. 如請求項77至80中任一項之細胞或方法，其中該細胞提供Rep78及/或Rep68蛋白。
  87. 如請求項77至80中任一項之細胞或方法，其中該細胞經Rep78及/或Rep68蛋白聚核苷酸編碼序列穩定地或暫時地轉染。
  88. 如請求項77至80中任一項之細胞或方法，其中該細胞包含HEK-293細胞。
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